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JP2023537053A - Ｘｐｒ１：ｋｉｄｉｎｓ２２０タンパク質複合体を介したがんにおけるリン酸塩調節不全の治療的標的化 - Google Patents

Ｘｐｒ１：ｋｉｄｉｎｓ２２０タンパク質複合体を介したがんにおけるリン酸塩調節不全の治療的標的化 Download PDF

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JP2023537053A JP2023508477A JP2023508477A JP2023537053A JP 2023537053 A JP2023537053 A JP 2023537053A JP 2023508477 A JP2023508477 A JP 2023508477A JP 2023508477 A JP2023508477 A JP 2023508477A JP 2023537053 A JP2023537053 A JP 2023537053A
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Abstract

本明細書に開示される主題は、一般に、がん、特に、卵巣癌及び子宮癌を治療するためにＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することを対象とする。本明細書に開示される主題はまた、一般に、ＳＬＣ３４Ａ２の発現を検出することによって、リン酸塩排出に対するがん依存性を決定することを対象とする。ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害するための組成物も記載される。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月７日に出願された米国仮出願第６３／０６２，８９０号の利益を主張する。上記の特定された出願の全容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金番号ＣＡ２４２４５７及びＣＡ２１２２２９に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
電子配列表への参照
電子配列表の内容（「ＢＲＯＤ－５１６０ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、サイズは１８，１８５バイトであり、２０２１年８月６日に作成されたものである）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
［技術分野］
本明細書に開示される主題は、概して、がんの治療におけるＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害、及びＳＬＣ３４Ａ２の発現を検出することによって、リン酸塩排出に対するがん依存性を決定することを対象とする。
卵巣癌及び子宮癌は、中でも女性に影響を与える最も致命的ながんであり、プラチナベースの化学療法及び最近承認されたＰＡＲＰ阻害剤は、一部の患者に有効性を示す２～４が、これらのがんの転帰は、過去２０年間で大幅に改善されていない５、６。明らかに新しい治療の選択肢が必要とされている。
有機リン酸塩ホメオスタシスは十分に理解されているが、リン酸塩の取り込み、貯蔵、及び流出の細胞調整は十分に理解されていない。リン酸塩の取り込みは高度に制御されており、ＳＬＣ３４及びＳＬＣ２０遺伝子ファミリーのメンバーが関与している７～９。酵母及び植物では、特殊な空胞及び代謝物がリン酸塩の貯蔵を調整するが、これらの経路はヒト生物学では解明されていない１０、１１。リン酸塩流出は、唯一の注釈付きヒト排出輸送体（ｅｘｐｏｒｔｅｒ）である異種指向性及びポリトロープ受容体１（ＸＰＲ１）を介して達成される１２。ＸＰＲ１は、様々な組織のリン酸塩ホメオスタシスに関与するが１３～１５、その制御及び機能の機構はほとんど理解されていない１６、１７。
本出願におけるいずれかの文書の引用または特定は、かかる文書が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
一態様では、本発明は、がんの治療を必要としている対象においてがんを治療する方法を提供し、これには、対象に、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介リン酸塩排出を阻害することができる１つ以上の治療薬を投与することが含まれる。ある特定の実施形態では、がんは、卵巣癌、子宮癌、乳癌、胆管癌、肝臓及び肺癌からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、がんは、正常な組織における発現と比較して、腫瘍組織におけるＳＬＣ３４Ａ２のより高い発現を特徴とする。ある特定の実施形態では、１つ以上の治療薬は、ＸＰＲ１の発現もしくは活性を阻害する、ＫＩＤＩＮＳ２２０の発現もしくは活性を阻害する、及び／またはＸＰＲ１／ＫＩＤＩＮＳ２２０の相互作用を妨害する。ある特定の実施形態では、１つ以上の治療薬は、エンベロープウイルス糖タンパク質に由来し、ＸＰＲ１膜受容体と相互作用することができる受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ＲＢＤタンパク質は、融合タンパク質であり、融合タンパク質は、タンパク質の二量体化及び／または安定化することができるドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＲＢＤタンパク質は、Ｆｃドメイン、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及び／または血清アルブミンに融合される。ある特定の実施形態では、ＲＢＤタンパク質は、異種指向性またはポリトロープマウス白血病レトロウイルス（Ｘ－及びＰ－ＭＬＶ）Ｅｎｖに由来する。ある特定の実施形態では、ＲＢＤ融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：ＭＬＶＭＥＧＳＡＦＳＫＰＬＫＤＫＩＮＰＷＧＰＬＩＶＭＧＩＬＶＲＡＧＡＳＶＱＲＤＳＰＨＱＩＦＮＶＴＷＲＶＴＮＬＭＴＧＱＴＡＮＡＴＳＬＬＧＴＭＴＤＴＦＰＫＬＹＦＤＬＣＤＬＶＧＤＹＷＤＤＰＥＰＤＩＧＤＧＣＲＴＰＧＧＲＲＲＴＲＬＹＤＦＹＶＣＰＧＨＴＶＰＩＧＣＧＧＰＧＥＧＹＣＧＫＷＧＣＥＴＴＧＱＡＹＷＫＰＳＳＳＷＤＬＩＳＬＫＲＧＮＴＰＫＤＱＧＰＣＹＤＳＳＶＳＳＧＶＱＧＡＴＰＧＧＲＣＮＰＬＶＬＥＦＴＤＡＧＲＫＡＳＷＤＡＰＫＶＷＧＬＲＬＹＲＳＴＧＡＤＰＶＴＲＦＳＬＴＲＱＶＬＮＶＧＰＲＶＰＩＧＳＶＤＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ （配列番号１）。ある特定の実施形態では、１つ以上の治療薬は、ＲＢＤタンパク質をコードするベクターを含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の治療薬は、ＸＰＲ１に特異的な抗体、ＫＩＤＩＮＳ２２０に特異的な抗体、またはＸＰＲ１／ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体に特異的な抗体を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ＫＩＤＩＮＳ２２０のＷａｌｋｅｒ Ａ／Ｂモチーフを標的とする。ある特定の実施形態では、１つ以上の治療薬は、ディグレーダー分子を含む。ある特定の実施形態では、ディグレーダー分子は、ＬＹＴＡＣ分子であり、それにより、細胞表面タンパク質が標的化される。ある特定の実施形態では、１つ以上の治療薬は、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０の発現を阻害することができる遺伝子修飾剤を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子修飾剤は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＲＮＡｉ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ系、またはメガヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ塩基編集系、プライムエディタ系、またはＣＡＳＴ系である。ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、ＦＧＦ２３の発現もしくは活性を阻害することができる、ＳＬＣ３４Ａ２の抑制を阻害することができる、またはＸＰＲ１阻害に応答して上方もしくは下方制御される１つ以上の遺伝子を調節することができる、１つ以上の薬剤を投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる１つ以上の治療薬は、標準治療の治療レジメン内で共投与される。ある特定の実施形態では、標準治療の治療レジメンは、手術及び化学療法を含む。ある特定の実施形態では、標準治療の治療レジメンは、免疫療法、チェックポイント遮断療法、またはＰＡＲＰ阻害剤の投与を含む。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法を提供し、これには、対照に対してＳＬＣ３４Ａ２の増加した発現を検出することによって、リン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を検出することが含まれ、対象が、リン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を有する場合、本明細書の任意の実施形態によるＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる１つ以上の治療薬を投与することを含み、対象が、リン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を有しない場合、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる１つ以上の治療薬の投与を含まない標準治療の治療を施すことを含む。ある特定の実施形態では、がんは、卵巣癌、子宮癌、乳癌、胆管癌、肝臓及び肺癌からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、標準治療の治療は、手術、化学療法、免疫療法、チェックポイント遮断療法、またはＰＡＲＰ阻害剤の投与のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、方法は、対象から得られた腫瘍試料において、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ２０Ａ１、及びＦＧＦ２３からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を検出することを含む、治療の有効性を監視することをさらに含み、治療は、ＳＬＣ３４Ａ２及び／またはＳＬＣ２０Ａ１が減少した、及び／またはＦＧＦ２３が増加した場合に有効である。ある特定の実施形態では、方法は、対象から得られた腫瘍細胞においてリン酸塩調節不全に関連する形態変化の増加を検出することを含む、治療の有効性を監視することをさらに含み、治療は、リン酸塩調節不全に関連する形態変化の増加が検出された場合に有効である。ある特定の実施形態では、リン酸塩調節不全に関連する形態変化は、腫瘍細胞における空胞様構造を含む。
別の態様では、本発明は、がんに罹患している対象がリン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を有するかどうかを決定する方法を提供し、これには、対象から得られた腫瘍試料においてＳＬＣ３４Ａ２の発現を検出することが含まれ、ＳＬＣ３４Ａ２発現が、正常組織における発現と比較して、腫瘍試料において高い場合、腫瘍は感受性である。ある特定の実施形態では、方法は、ＰＡＸ８を検出することをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、ＳＬＣ３４Ａ２と共変化する任意の遺伝子を検出することをさらに含む。ある特定の実施形態では、がんは、卵巣癌、子宮癌、乳癌、胆管癌、肝臓及び肺癌からなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、がんに罹患している対象がリン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を有するかどうかを決定する方法を提供し、これには、対象から得られた腫瘍試料においてＸＰＲ１コピー数の増幅を検出することが含まれ、ＸＰＲ１コピー数増幅が腫瘍試料において検出された場合、腫瘍は感受性である。ある特定の実施形態では、コピー数は、染色体１上のＸＰＲ１遺伝子座における標的配列決定パネルからの推論によって検出される。ある特定の実施形態では、がんは、卵巣癌、子宮癌、乳癌、胆管癌、肝臓及び肺癌からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、検出することは、免疫組織化学（ＩＨＣ）、インサイチュＲＮＡ－ｓｅｑ、定量的ＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ、ウエスタンブロット、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＲＮＡ－ＦＩＳＨ、質量分析、またはＦＡＣＳのうちの１つ以上を含む。
別の態様では、本発明は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる薬剤を特定するための方法を提供し、これには、がん細胞または細胞集団に候補薬剤を適用することと、候補薬剤による細胞または細胞集団におけるリン酸塩流出の調節を検出し、それにより、薬剤を特定することと、が含まれる。
別の態様では、本発明は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害に感受性であるがんを特定するための方法を提供し、これには、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害剤をがん細胞または細胞集団に適用することと、細胞または細胞集団におけるリン酸塩濃度を検出することと、が含まれ、がんは、リン酸塩濃度が、阻害剤で治療されていない対照細胞または集団と比較して増加した場合、感受性である。ある特定の実施形態では、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害剤は、本明細書の任意の実施形態による１つ以上の治療薬である。ある特定の実施形態では、がん細胞または集団は、それを必要とする対象から得られるか、またはそれに由来する。
例示的な実施形態のこれら及び他の態様、目的、特色、及び利点は、例示的な実施形態の以下の発明を実施するための形態を考慮することにより、当業者には明らかになるであろう。
本発明の特色及び利点の理解は、本発明の原理が利用され得る例示的な実施形態を説明する以下の発明を実施するための形態、及びその添付の図面を参照することによって得られる。
ＸＰＲ１は、ＳＬＣ３４Ａ２過剰発現との関連で卵巣癌において依存性である。ａ．７３３のがん細胞株（ＤｅｐＭａｐ Ａｖａｎａ ２０Ｑ１）にわたって、試験した約１７，０００の遺伝子すべてにわたる細胞株死滅の予測可能性及び選択性。ティール色のドットは、卵巣癌細胞株における依存性を表す。挿入図は、ＸＰＲＲ１の依存性プロファイルを示す。ｂ．ＸＰＲ１への依存性を減少させることによって概ねランク付けされた、すべての細胞株にわたるＸＰＲ１及びＳＬＣ３４Ａ２の発現及び依存性プロファイル。ｃ．リン酸塩輸送の相対的な方向性のために、出願人らは、ＸＰＲ１不活性化が、ＳＬＣ３４Ａ２高卵巣癌における細胞内リン酸塩蓄積のために、有毒であると仮定する。ｄ．陰性及び陽性対照遺伝子と比較してスケーリングされた、ＸＰＲ１の不活性化後の生存率効果。ｅ．ＸＰＲ１の不活性化と組み合わせたゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングは、依存性の潜在的な「修飾」遺伝子を見出すために機能スクリーニングのゲノムスケールの喪失と組み合わされる（ペアワイズ）。ベータスコア（ＭａＧｅＣＫ ＭＬＥによって決定される）は、初期ライブラリから最終時点までの各遺伝子の表現の変化を表す。ティール色の点は、ＸＰＲ１不活性化と組み合わせた場合にのみ顕著な遺伝子であり、一方、藤色の点は、ＸＰＲ１及び対照アーム（腫瘍抑制因子ＣＤＫＮ２Ａなど）において顕著に変化した。ｆ．通常ＸＰＲ１耐性（ＥＳ２）またはＸＰＲ１感受性（ＥＭＴＯＫＡ及びＯＶＩＳＥ）細胞株のＳＬＣ３４Ａ２状態を過剰発現またはノックアウトにより修飾し、ＸＰＲ１依存性をパネルｄのように評価した。 ｓｈＲＮＡを使用した、ＳＬＣ３４Ａ２過剰発現卵巣癌細胞株におけるＸＰＲ１依存性の検証。ａ．下、すべてのがん細胞株にわたるＳＬＣ３４Ａ２の発現を示すバブルプロットであり、ＸＰＲ１への依存度は、点の大きさ及び色によって符号化される（より多くの依存線は、より深い色相のより大きな点を有する）。肺癌細胞株が、ＳＬＣ３４Ａ２の高い発現にもかかわらず、ＸＰＲ１に対する依存を示していないこと、及びいくつかの高度に依存している細胞株が、高レベルのＳＬＣ３４Ａ２を発現していないことに留意されたい。上、ＳＬＣ３４Ａ２ ｍＲＮＡ発現と、少なくとも１０の異なる細胞株によって表される各系統内のＸＰＲ１依存性との間のピアソン相関（Ｒ２）である。ｂ．３つの異なる細胞株を、ＸＰＲ１（ｓｈＸＰＲ１＿２及びｓｈＸＰＲ１＿４）を標的とするドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ、または同じシード配列を有するが、ＸＰＲ１ ｍＲＮＡを抑制するべきではないシード一致対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＳｅｅｄ＿２及びｓｈＳｅｅｄ＿４）で操作した。ｓｈＲＮＡの誘導の３日後、細胞溶解物を、ＫＩＤＩＮＳ２２０（図１１を参照）、ＳＬＣ３４Ａ２（図９を参照）、及びＸＰＲ１のタンパク質レベルにより分析した。ビンキュリンに正規化されたタンパク質レベルは、各バンドの下で発現される。ｃ．ｓｈＲＮＡ試薬を使用したＸＰＲ１の抑制の生存率効果は非常に浸透性が高い。細胞を低密度で播種し、ドキシサイクリンで処理してｓｈＲＮＡの発現を誘導した。播種の１４日後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。ｓｈＸＰＲ１試薬は成長を効果的に抑制するが、ｓｈＳｅｅｄ試薬は細胞成長に影響を及ぼさないことに留意されたい。ｄ．ｓｈＲＮＡの誘導の７日後、生存率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量化を測定した。ＩＧＲＯＶ１及びＯＶＩＳＥはどちらも高いレベルのＳＬＣ３４Ａ２を発現し、ＸＰＲ１に依存すると予測されるが、Ａ２７８０はそうではない。 ゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングは、ＳＬＣ３４Ａ２の高発現との関連で、ＸＰＲ１依存性との関係を検証する。ａ．ゲノムスケールのデュアルノックアウト修飾スクリーニングの実験方法の概要。ＯＶＩＳＥ（Ｃａｓ９発現なし）は、ＸＰＲ１を標的とするｓｇＲＮＡを安定して発現するように操作される。Ｃａｓ９ ＯＲＦ及び第２のｓｇＲＮＡの両方を含有する「オールインワン」レンチウイルスを導入すると、両方の遺伝子がＣａｓ９によって同時に切断される。出願人らは、３つのｓｇＲＮＡ：染色体２（ｓｇＣｈｒ２－２）上の遺伝子砂漠を標的とする１つ、及びＸＰＲ１（ｓｇＸＰＲ１＿１及びｓｇＸＰＲ１＿２）を標的とし、ブルネロゲノムスケールのｓｇＲＮＡライブラリで細胞を感染させる２つを使用した。感染の１５日後、出願人らは細胞ペレット（ＸＰＲ１依存性細胞死のために、ｓｇＸＰＲ１アームではるかに小さい）を収集し、ｓｇＲＮＡを配列決定した。ｂ．ＸＰＲ１及びＳＬＣ３４Ａ２のデュアルノックアウトのウエスタン確認。ゲノムスケールのスクリーニングで使用された３つの細胞株を、対照－、ＸＰＲ１－、またはＳＬＣ３４Ａ２標的化ｓｇＲＮＡを発現する「オールインワン」レンチウイルスで感染させた。ｓｇＸＰＲ１「アンカー」細胞株において、ＸＰＲ１は、対照ウイルスで抑制され、第１の感染がＸＰＲ１標的化ｓｇＲＮＡを提供し、第２の感染がＣａｓ９タンパク質を提供することを示すことに留意されたい。ＮＩＣとは、「感染なし対照（ｎｏ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）」を表す。ｃ．ゲノムスケールの修飾スクリーニングのアームレベルの結果。完全な分析の詳細については、方法を参照されたい。βスコアは、遺伝子が他のすべての遺伝子に対して濃縮または枯渇された程度を表す。 ＸＰＲ１及びＳＬＣ３４Ａ２は、患者試料において過剰発現され、ＸＰＲ１依存性は、マウス異種移植片研究において保持される。ａ．ＳＬＣ３４Ａ２ ｍＲＮＡ発現を、正常（ＧＴＥｘ）、腫瘍（ＴＣＧＡ）、及びがん細胞株（ＣＣＬＥ）試料において比較する。ＣＣＬＥ細胞株については、ＸＰＲ１依存性の状態（ＣＥＲＥＳ＜－０．５）が示される。卵管が多くの卵巣癌／子宮癌の原発組織であることに留意されたい。ｂ．漿液性卵巣癌（ＴＣＧＡ ＯＶ）におけるＸＰＲ１増幅を示す染色体１の約２．５Ｍｂ領域のＸＰＲ１コピー数ヒートマップ。ｃ．パネルａと同様に、ＸＰＲ１ ｍＲＮＡの発現は、示される組織にわたって比較される。ＴＣＧＡ試料については、ＸＰＲ１コピー数の状態（ＧＩＳＴＩＣ）が示される。ｄ．卵巣癌細胞株ＯＶＩＳＥにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９競合腫瘍形成アッセイにおいて、ＸＰＲ１及び示される遺伝子の枯渇がプロットされる。ＧＰＸ４を代謝依存性遺伝子として使用した。ＰＡＸ８は、多くの卵巣癌におけるベンチマーク依存性である。ＰＯＬＲ２Ｄは、汎本質的な陽性対照である。灰色のボックスは、ヒトゲノムの非遺伝子部位を標的とする１５の異なる対照ｓｇＲＮＡの可変性を表す。ｅ．パネルｄと同じであるが、子宮癌細胞株ＳＮＧＭを用いた。ｆ．ドキシサイクリン誘導性ｓｈＸＰＲ１＿２を使用したＸＰＲ１抑制後の播種性卵巣癌腫症のモデルの腫瘍成長。挿入図は線形スケールでの完全な成長曲線を示すが、大きな画像は治療後の成長率である。ｇ．ｆと同じであるが、非標的化ｓｈＳｅｅｄ＿２を用いた。 卵巣癌におけるＳＬＣ３４Ａ２及びＸＰＲ１の過剰発現は、ＰＡＸ８によって駆動される可能性が高い。ａ．組織にわたるＳＬＣ３４Ａ２発現の比較。図４ａ及びｃのような組み合わされたＧＴＥｘ、ＴＣＧＡ、及びＣＣＬＥデータセットを使用して、他のすべての組織に対する各組織におけるＳＬＣ３４Ａ２の差次的発現を比較する。関連する婦人科組織（卵管、卵巣、及び子宮）は、ティール色で強調表示される。ｂ．ＰＡＸ８発現は、正常な組織に対して腫瘍試料において増加する。図４ａと同様に、ＰＡＸ８発現は、示される組織試料にわたって比較される。ｑ値は、複数比較のためのボンフェローニ補正を伴うウイルコクソンの順位和検定による、同じＰＡＸ８発現を有する示される集団の尤度を示す。ｃ．ＰＡＸ８及びＳＬＣ３４Ａ２の発現は、卵管、卵巣、及び子宮組織において高度に相関している。ｄ．ＴＣＧＡ子宮体内子宮内膜癌におけるＸＰＲ１増幅を示す染色体１の約２．５Ｍｂ領域のＸＰＲ１コピー数ヒートマップ２８。各患者試料は、水平線によって表される。赤色はコピー増加、青色はコピー減少を示す。破線の垂直線は、示された遺伝子の位置である。データは、病巣及び染色体アームレベルの両方の増加を示すために最高のコピー増加で順位が付けられた試料のサブセットである。 ＸＰＲ１依存性は、組織培養培地中のリン酸塩レベルによって影響を受けない。ａ．依存性マップ細胞株の成長培地におけるリン酸塩の濃度は、ＸＰＲ１依存性の程度を決定しない。リン酸塩の濃度は、製造業者の配合物から推定した（方法を参照のこと）。ｂ．組織培養培地を操作し、ＸＰＲ１依存性に対するその影響を評価するための実験手順。同じ親がん細胞株を、ホタルルシフェラーゼ及びＣａｓ９、またはウミシイタケルシフェラーゼ単独を発現するように操作した。低リン酸塩ＲＰＭＩ １６４０において細胞株を成長させた１週間後、２つの変異型を一緒に混合し、ｓｇＲＮＡをコードするレンチウイルスに感染させた。レンチウイルスに感染した細胞株を選択した後、ＤｕａｌＧｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してホタル：ウミシイタケルシフェラーゼの比を測定することによって、Ｃａｓ９：親細胞の初期表示を決定した。感染の１週間後（プロトコルの１６日目）、遺伝的摂動が細胞生存率にどの程度有害であったかを、ＤｕａｌＧｌｏを使用して決定した。ｃ．ＸＰＲ１依存性は、低リン酸塩培地条件で維持される。ＳＮＧＭ（ＸＰＲ１に依存する子宮内膜細胞株）及びＥＳ２（ＸＰＲ１に依存しない明細胞卵巣細胞株）を、パネルｂに概説するアッセイにおいてプロファイリングした。プロットの下に表示されるＣＥＲＥＳスコアは、ＸＰＲ１のノックアウト及び示される成長培地における成長の２１日後の細胞株の生存能欠損を表す。 マウス異種移植片における標的検証のためのインビボＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９競合アッセイ。ａ．インビボ競合アッセイのための実験設計。迅速な感染及び選択プロトコルを使用して、プールしたｓｇＲＮＡを、レンチウイルスを介してがん細胞株に導入し、皮下異種移植片として接種し、遺伝子ノックアウトの効果を、組織培養よりも生理学的に関連性のある環境で評価することができる。ｂ．プールしたｓｇＲＮＡで急速に感染させた後、８００万のＳＮＧＭ細胞を皮下異種移植片として接種し、成長させた。示された時点で腫瘍組織を採取した。ｃ．ｄと同じであるが、ＯＶＩＳＥがん細胞株を使用した実験についてである。ｄ．腫瘍異種移植片におけるｓｇＲＮＡの存在量を、ＰＣＲ及び次世代配列決定分析によって評価し、初期時点と比較した倍率変化を、すべての陰性対照遺伝子、及びスクリーニングのいずれかにおける存在量が４倍超の任意の遺伝子のヒートマップとして示す。ｄと同じであるが、ＯＶＩＳＥがん細胞株を使用した実験についてである。 ＸＰＲ１抑制は、播種性卵巣癌腫症における成長を停止させる。ａ．確立された腹腔内卵巣癌腫症に対するＸＰＲ１抑制の効果を評価するための実験設計。ルシフェラーゼを構成的に発現するＩＧＲＯＶ１を操作して、ｓｈＸＰＲ１＿２（ＸＰＲ１を抑制するため）またはｓｈＳｅｅｄ＿２（対照）を誘導的に発現させた。モデルのインビボ成長速度は不明であったため、４つの異なる細胞密度を、マウスの腹腔に接種し、腫瘍成長を、生物発光イメージングを使用して監視した。腫瘍成長の３週間後、各接種群の１匹のマウスにドキシサイクリン固形飼料を与えて、ｓｈＲＮＡの発現を誘導した。動物は治療後２～３週間以内に腹水を発達させたため、研究は終了した。ｂ．ｓｈＸＰＲ１＿２で操作されたＩＧＲＯＶ１細胞の成長速度は、接種された細胞の数に依存しなかった。ｃ．パネルｂと同じであるが、ｓｈＳｅｅｄ＿２．ｄで操作されたＩＧＲＯＶ１細胞を用いた。ｄ．治療時に、腫瘍負荷は４つの異なる群で同等であった。ｅ．治療ごとの動物の数及び腹水を発達させたｓｈＲＮＡ群。ｆ．ルシフェラーゼを構成的に発現するＩＧＲＯＶ１細胞は、研究終了後に示される臓器で検出される。ここでは、細胞をｓｈＸＰＲ１＿２－Ｄｏｘ群のマウスから採取した。 転写プロファイリングは、ＳＬＣ３４Ａ２過剰発現卵巣癌におけるＸＰＲ１不活性化に対するリン酸塩恒常性応答を強調する。ａ．ドキシサイクリンによる処理及びｓｈＲＮＡの誘導後の様々な時点で、細胞内リン酸塩をＯＶＩＳＥ及びＩＧＲＯＶ１細胞株において測定した。ｂ．ＸＰＲ１不活性化後の多重化がん細胞を比較するためのＭｉｘＳｅｑ ｓｃＲＮＡ配列決定結果のＵＭＡＰ投影。ｃ．中央、細胞周期の影響を回帰させた後の上位５００の差次的発現遺伝子の対数倍率変化。左、各細胞株の概要注釈には、ＸＰＲ１依存性（ＸＰＲ１ ＣＥＲＥＳ）、全体的な転写変化（平均ＬＦＣ）、及び単一細胞データで観察された細胞周期停止の程度（ΔＧ０／Ｇ１）が含まれる。右、全体的な転写変化の細胞株間の相関関係。ｄ．示される遺伝子の測定された転写変化は、左側の高度に相関した細胞株（パネルｃを参照）及び右側の他の５つの細胞株についてプロットされる。ｅ．ＸＰＲ１不活性化後のＳＬＣ３４Ａ２タンパク質レベル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅで測定）の定量化。ｆ．示される遺伝子の不活性化後のＯＶＩＳＥ卵巣癌細胞株において放射性リン酸塩の取り込みを測定した。 転写プロファイリングは、ＸＰＲ１抑制後のリン酸塩関連恒常性応答を明らかにする。ａ．細胞の生存率（総タンパク質含有量により測定）を、総リン酸塩と平行して測定した。図９ａに報告される総細胞内リン酸塩は、細胞生存率で割った測定された総リン酸塩を指す。ｂ．多くの異なるがん細胞株にわたるＸＰＲ１不活性化の転写プロファイルを決定するための実験ワークフロー。ＸＰＲ１不活性化の浸透率を最大化するために、細胞株をその倍増時間によりプールし、高い感染多重度（ＭＯＩ）で、小プール内で対照またはＸＰＲ１ ｓｇＲＮＡに感染させた。感染の翌日、細胞をピューロマイシンで選択し、その後、感染後４日目まで成長させた。この時点で、細胞をカウントし、摂動ごとにプールし、ＲＮＡ「ハッシュタグ」を含有する細胞表面標識抗体とともにインキュベートした。次いで、摂動にわたる細胞をプールし、１０倍ゲノミクス単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）パイプラインに供した。各細胞の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）プロファイルを使用して特定の細胞株に割り当て、一方、「ハッシュタグ」バーコードを使用して、その細胞が受けた摂動を決定した。ｃ．細胞株当たりの細胞の総数。差は、各プール内の個々の細胞株の増殖、または使用される高いＭＯＩに対する感受性の差に起因する可能性が高い。ｄ．増幅及び次世代配列決定の前にライブラリの調製に含まれた独自の分子識別子（ＵＭＩ）によって測定された、各細胞について測定した独自の転写物の総数。ｅ．細胞株ごとに収集された細胞の数を、２つの条件（対照及びＸＰＲ１不活性化）間で比較して、生存能欠損が実験の約４日間の時間枠内に観察されるかどうかを決定した。ｆ．細胞周期回帰後、依存性細胞株（ＩＧＲＯＶ１、ＥＦＥ１８４、ＯＶＩＳＥ、ＲＭＧＩ、ＯＶＭＡＮＡ、及びＯＶＣＡＲ４）内でのＸＰＲ１不活性化後に発現が増加した遺伝子を、遺伝子セット濃縮によって分析した。ｇ．ｆと同じであるが、ＸＰＲ１不活性化後に減少した遺伝子についてである。ｈ．ドキシサイクリンを使用したｓｈＸＰＲ１＿２（ＩＧＲＯＶ１）またはｓｈＸＰＲ１＿４ （ＯＶＩＳＥ）の誘導の４日後に、ＥＬＩＳＡを使用して条件培地において分泌されたＦＧＦ２３の量を測定した。この時点で、ＳＬＣ３４Ａ２抑制が観察されることに留意されたい。 ＸＰＲ１のリン酸塩排出能力は、ＳＬＣ３４Ａ２過剰発現がん細胞株における生存能に必要である。ａ．スクリーニングされた７３７のがん細胞（ＤｅｐＭａｐ Ａｖａｎａ ２０Ｑ１）にわたって、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０不活性化の生存能欠損をプロットする。ｂ．ＨＥＫ－２９３Ｔにおける示されるＸＰＲ１オープンリーディングフレームの発現後、Ｖ５タグ付きＯＲＦとＫＩＤＩＮＳ２２０との間の相互作用を、共免疫沈降を使用して評価した。これらの構築物のデザインについては、図１３ａを参照されたい。ｃ．ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０の遺伝子不活性化後、免疫蛍光を使用してＸＰＲ１－Ｖ５の局在化を決定した。ｓｇＸＰＲ１＿１は、内因性ＸＰＲ１及びＸＰＲ１－Ｖ５ ＯＲＦの両方を不活性化するため、染色は予想されないはずであることに留意されたい。ｄ．ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０の遺伝的不活性化の３日後、細胞に放射性リン酸塩を充填し、次いで、流出を後に３０分間測定した。ｅ．示されるＸＰＲ１構築物を、内因性ＸＰＲ１のノックアウトを救出するそれらの能力について試験した。ＸＰＲ１におけるＬ２１８Ｓ変異は、以前に、ＸＰＲ１の流出能力の約５０％のみを有することが示されている。ｆ．ＸＰＲ１不活性化の４～５日後の「空胞様」表現型の位相差画像。矢印は、「空胞様」構造の位置を示す。スケールバー＝２００ｕｍ。ｇ．酸性染料Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを使用して、ＸＰＲ１の不活性化の５日後に生細胞を染色した。ｈ．ＸＰＲ１不活性化後のＯＶＩＳＥがん細胞中の「空胞様」構造（Ｖと標識される）またはリソソーム（Ｌｙｓ）の透過型電子顕微鏡写真。 ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０は、大規模なデータセットにおいて共発現及び共沈される。ａ．ＫＩＤＩＮＳ２２０依存性の検証を、図１ｄのようなＳＬＣ３４Ａ２発現の範囲を有する卵巣及び子宮癌の細胞株において行った。ｂ．ＳＬＣ３４Ａ２発現は、図１ｆのように実施される、ＫＩＤＩＮＳ２２０依存性のために必要であり、十分である。ｃ．ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０のｍＲＮＡレベルは、多くの組織にわたって高度に相関する。ＧＴＥｘ、ＴＣＧＡ、及びＣＣＬＥデータを使用して、ピアソン相関を計算した。ｄ．ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０抑制は両方とも、ＳＬＣ３４Ａ２発現に依存する細胞内リン酸塩の増加を引き起こす。示されるｓｇＲＮＡによる感染の５日後、図９ａのように細胞内リン酸塩を決定した。ｅ．高スループットタンパク質：タンパク質相互作用データベースは、タンパク質複合体の一部としてＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０を関係づける。ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０の相互作用パートナーをＢｉｏＧｒｉｄ及びＢｉｏｐｌｅｘデータベースからダウンロードし、比較した。複数のデータセットにわたって一貫してＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０のインタラクトームに存在した遺伝子は、ｔｅｘｔとして呼び出される。 ＸＰＲ１ドメイン変異体は、局在化及びＫＩＤＩＮＳ２２０において異なる。ａ．ＸＰＲ１ ＷＴは、ＮＭ＿００４７３６（検出された唯一のアイソフォーム）によって産生される６９６アミノ酸タンパク質を指し、一方、ＸＰＲ１（ショート）は、ＮＭ＿００１１３５６６９の６３１アミノ酸産物を指す。すべての構築物は、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、及び免疫蛍光検出のためのＣ末端Ｖ５タグを有する。ｂ．Ｖ５エピトープタグを使用して試験したＸＰＲ１変異体の一部の免疫蛍光局在化。左、ＷＴ ＸＰＲ１は、分泌経路及び細胞質内の点に局在する。中間、ＸＰＲ１（ショート）染色ははるかに拡散しているように見える。Ｌ２１８Ｓ変異は、ＷＴ ＸＰＲ１と同じ局在化パターンを有し、適切な輸送と一致し、以前に観察されたものと同様である（本文を参照）。ｃ．２９３ｓにおけるＸＰＲ１ドメイン変異体と内因性ＫＩＤＩＮＳ２２０との共免疫沈降。これは、図９ｂのトリミングされていないバージョンであり、ＳＰＸドメインのみの構築物を含む（レーン６～～７）。右、実験からの全細胞抽出物（ＷＣＥ）であり、ＫＩＤＩＮＳ２２０の発現レベルが異なることを示す。バックグラウンドシグナルの多くは、同じ実験における内因性ＸＰＲ１の免疫ブロットに起因することに留意されたい。緑色の矢印は、分解産物とは対照的に、ＯＲＦの予想される分子量を示す。ｄ．ガイド耐性ＯＲＦのウエスタンブロット検証。ＯＶＩＳＥ．Ｃａｓ９細胞（親（左）またはＷＴ ＸＰＲ１ ＯＲＦを過剰発現する（右）、図９ｅで使用）を、示されるｓｇＲＮＡで感染させ、感染の５日後に採取した。ＸＰＲ１ ＯＲＦには、ｓｇＸＰＲ１＿２の結合を遮断するための変異が含まれるが、ｓｇＸＰＲ１＿１には含まれない（ｓｇＸＰＲ１＿１では両方のアイソフォームが抑制されるが、ｓｇＸＰＲ１＿２では内因性ＸＰＲ１のみが抑制されることに留意されたい）。 一般的な細胞小器官の染色は、「空胞」とは分類されない。ａ．ｓｇＸＰＲ１＿２をコードするレンチウイルスに感染させた６日後に、ＯＶＩＳＥ．Ｃａｓ９及びＳＮＧＭ．Ｃａｓ９細胞株を、示される染料及び染色を使用して染色及び画像化した。矢印は、位相差による空胞構造の位置を示す（図示せず）。陽性染色は、リソソーム染料ＬＡＭＰ１についてのみ観察された。ｂ．ＸＰＲ１不活性化の４～５日後の「空胞様」表現型の位相差画像。矢印は、「空胞様」構造の位置を示す。スケールバー＝２００ｕｍ。ｃ．ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０対対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｈｒ２－２）のＣＲＩＳＰＲ不活性化の５日後のＸＰＲ１依存性細胞株ＯＶＩＳＥの生細胞ＤＩＣ及び共焦点免疫蛍光画像。酸性細胞小器官をＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（赤色）で、ＤＮＡをＤＡＰＩ（青色）で検出した。矢印は、「空胞様」構造の位置を示す。ｄ．ＸＰＲ１不活性化の５日後のＯＶＩＳＥ．Ｃａｓ９の透過型電子顕微鏡写真。図中にスケールバーを示す。リソソーム及び「空胞様」構造は、それぞれ、「Ｌｙｓ」及び「Ｖ」によって示される。ｅ．ｃと同じであるが、ＫＩＤＩＮＳ２２０の不活性化である。 ＲＢＤ融合タンパク質（５１．２ｋＤａ）の例示的な設計。タンパク質は、３３残基シグナル配列、ＮＺＢ株由来の２０７残基ＲＢＤ、４残基リンカー（ＧＳＶＤ）、及びマウスＩｇＧ１由来の２２７残基Ｆｃを含む。 マウスＸＰＲ１に感染することができる他のウイルス株の分類。 ＸＲＢＤは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の薬物様阻害剤である。ＸＲＢＤタンパク質は、ＸＰＲ１依存性リン酸塩流出を阻害する。リン酸塩流出は、ＩＧＲＯＶ１卵巣癌細胞株を、３２Ｐ標識リン酸塩を補充したリン酸塩を含まないＲＰＭＩとともにインキュベートし、細胞を広範囲に洗浄し、次いで、標準ＲＰＭＩ（約１０ｍＭリン酸塩）において細胞をインキュベートすることによって測定した。３０分後、条件培地を収集し、細胞を洗浄してから溶解した。リン酸塩流出は、溶解物及び条件培地において測定された総３２Ｐに対して、条件培地において測定された３２Ｐのパーセントとして計算した。示される場合、細胞を２５０ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンで７２時間前処理して、ｓｈＸＰＲ１＿２を介してＸＰＲ１抑制を誘導した。示される場合、実験の３２Ｐ取り込み及び流出部分中に、細胞を様々な用量のＸＲＢＤタンパク質で処理した。示される場合、細胞が任意の３２Ｐを排出するのを防ぐために、流出部分中に「リン酸塩なし」ＲＰＭＩを使用した。 ＸＲＢＤは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の薬物様阻害剤である。２９３Ｔ細胞におけるＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０の安定したノックアウトのウエスタンブロット確認。２９３Ｔ細胞を、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０を標的とするＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの両方を含有する「オールインワン」プラスミドで一過性にトランスフェクトした。クローン集団を、限界希釈により単離し、ウエスタンブロットにより分析した。野生型ヒトＸＰＲ１（ｈＸＰＲ１）を、対照としてノックアウトバックグラウンドで再発現させた。 ＸＲＢＤは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の薬物様阻害剤である。ｂで分析した２９３Ｔ細胞のＸＲＢＤフローサイトメトリー分析。細胞を２０ｎＭのＸＲＢＤ－ｍＦｃとともに３７℃で３０分間インキュベートした後、広範囲に洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートした抗マウス二次とともにインキュベートした。左、少なくとも１０，０００の単一細胞からのヒストグラム。右、左に示す集団の蛍光強度の中央値をヒートマップとして表示する。 ＸＲＢＤは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の薬物様阻害剤である。ＸＲＢＤ処理は、卵巣癌細胞株の生存能欠損を引き起こす。示される細胞株を示される濃度でＸＲＢＤタンパク質で処理し、細胞生存率を５日後にＣｅｌｌ Ｔｉｔｒｅ Ｇｌｏ（ＣＴＧ、Ｐｒｏｍｅｇａ）により評価した。右、各細胞株のＸＰＲ１不活性化感受性（ＣＲＩＳＰＲ生存能アッセイによって評価）及びＸＲＢＤ感受性（ビヒクル対照に対して、最大用量のＸＲＢＤを用いた５日間の処理後の細胞生存率の減少）を比較するヒートマップ。下、ＸＰＲ１不活性化感受性とＸＲＢＤ処理との間のピアソン相関係数。 ＸＲＢＤは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の薬物様阻害剤である。肺癌細胞株の小パネルにおけるウエスタンブロット分析及びＸＲＢＤ処理。示される細胞株におけるＸＰＲ１またはＳＬＣ３４Ａ２の不活性化の５日後、ＸＰＲ１またはＳＬＣ３４Ａ２タンパク質レベルをウエスタンブロットにより分析した。下、ｄと同様に細胞生存能を評価した。 ＸＲＢＤは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の薬物様阻害剤である。ＫＩＤＩＮＳ２２０不活性化の有無にかかわらず、ＸＰＲ１を含有する天然タンパク質複合体のグリセロール勾配沈降分析。２９３Ｔ細胞、またはｂでプロファイリングされた安定したＫＩＤＩＮＳ２２０ノックアウト細胞株を溶解し、１ｍｇの溶解物を１０～３０％のグリセロール勾配上に層にし、ＳＷ５５ローターで、４℃で３．５時間、５５，０００ＲＰＭでスピンして、分子量によりタンパク質複合体を分離した。低分子量複合体が低い画分数（すなわち、１～７）に対応し、より大きなタンパク質複合体が大きい数である各勾配から２４画分を収集した。ＸＰＲ１を、免疫ブロットにより画分で検出した。 ＸＲＢＤは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の薬物様阻害剤である。ＦＧＦ２３．２のＲＴ－ＰＣＲ検証、またはドキシサイクリンによる示されるｓｈＲＮＡの誘導の４日後、ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＸＰＲ１、ＦＧＦ２３、またはビンキュリン（ハウスキーピング対照）のレベルを、遺伝子特異的プライマーにより定量化した。示されるデータは、ビンキュリンに対して正規化され、ドキシサイクリン処理（Ｃｔｌ）なしで一致した時間点に対してＬｏｇ２倍率変化として示される。
本明細書の図は、例示のみを目的としており、必ずしも正確な比率ではない。
一般的な定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語及び技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）： ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔ，２００８（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）、Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）、及びＭａｒｔｅｎ Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ Ｊａｎ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、単数及び複数両方の参照を含む。
「任意の」または「任意に」という用語は、後続の記載された事象、状況、または置換基が生じても生じなくてもよく、説明が、事象または状況が生じる場合及び生じない場合を含むことを意味する。
エンドポイントによる数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に包含されるすべての数及び分数、ならびに列挙されるエンドポイントを含む。
パラメータ、量、時間の長さなどの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、指定された値の変動及び値からの変動、例えば、かかる変動が開示される発明において実施するのに適切である限り、指定された値の＋／－１０％以下、＋／－５％以下、＋／－１％以下、及び＋／－０．１％以下の変動を包含する。修飾語「約」または「およそ」が指す値は、それ自体もまた、具体的に、好ましくは、開示されることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「生体試料」は、全細胞及び／または生細胞及び／または細胞残屑を含有し得る。生体試料は、「体液」を含有し得る（またはそれに由来し得る）。本発明は、体液が、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）（耳垢（ｅａｒｗａｘ））、乳糜、糜粥、内リンパ、外リンパ、滲出液、糞便、雌性射精液、胃酸、胃液、リンパ液、粘液（鼻漏及び痰を含む）、心膜液、腹水、胸水、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂（ｓｅｂｕｍ）（皮脂（ｓｋｉｎ ｏｉｌ））、精液、喀痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、嘔吐物、及びそれらのうちの１つ以上の混合物から選択される実施形態を包含する。生体試料には、細胞培養物、体液、体液由来の細胞培養物が含まれる。体液は、例えば、穿刺、または他の収集もしくはサンプリング手順によって、哺乳動物生物から得てもよい。
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書で同義に使用される。哺乳類としては、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、及び愛玩動物が挙げられるが、これらに限定されない。インビボで得られた、またはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの子孫も包含される。
以下に、様々な実施形態を記載する。特定の実施形態は、網羅的な説明として、または本明細書で考察されるより広範な態様への限定として意図されないことに留意されたい。特定の実施形態と併せて記載される一態様は、必ずしもその実施形態に限定されず、任意の他の実施形態（複数可）とともに実施され得る。本明細書全体を通して「一実施形態」、「実施形態」、「例示的な実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特色、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な場所での「一実施形態では」、「実施形態では」、または「例示的な実施形態」という句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すわけではないが、指し得る。さらに、特定の特色、構造、または特徴は、１つ以上の実施形態では、本開示から当業者には明らかであるように、任意の好適な様式で組み合わされ得る。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特色を含むが、他の特色を含まない一方で、異なる実施形態の特色の組み合わせは、本発明の範囲内であることを意図している。例えば、添付の特許請求の範囲では、特許請求される実施形態のいずれかを任意の組み合わせで使用することができる。
Ｂｏｎｄｅｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ”ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．１０．１６．３３９３７４；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．１０．１６．３３９３７４（２０２０年１０月１７日にｂｉｏＲｘｉｖに投稿）に対する言及がなされる。本明細書で引用されるすべての刊行物、公開特許文書、及び特許出願は、各個々の刊行物、公開特許文書、または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されたと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
概要
がん特異的代謝状態を利用することは、がん細胞を死滅させるが、正常な組織を温存するための魅力的な戦略である１。無機リン酸塩は、ＤＮＡの基本的な構成要素であり、多くの経路における中間代謝物であり、重要なシグナル伝達分子であるが、がん治療薬として摂動性リン酸塩ホメオスタシスは探索されていない。多くのがん細胞株にわたる生存能スクリーニングのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９喪失を分析することによって、出願人らは、リン酸塩取り込み輸送体（ｉｍｐｏｒｔｅｒ）であるＳＬＣ３４Ａ２の高発現が、リン酸塩排出輸送体ＸＰＲ１の不活性化に対して細胞を感受性にすることを見出した。この驚くべき発見は、無機リン酸塩の蓄積ががん細胞に有毒である可能性があることを示す。出願人らは、がん細胞株及びマウス異種移植片におけるこの合成致死的相互作用を広範囲に検証し、多くの原発性卵巣癌腫瘍がリン酸塩調節不全に感受性であるという証拠を見出した。機構的に、出願人らはまた、リン酸塩ホメオスタシスを回復することを目的とした転写応答を特定した。出願人らはまた、リン酸塩流出に必要なＸＰＲ１結合パートナー（ＫＩＤＩＮＳ２２０）を特定した。出願人らはまた、出願人らが仮説とする新しい空胞構造が、細胞内リン酸塩の毒性蓄積に関連していることを特定した。出願人らはまた、ウイルスＸＰＲ１結合タンパク質、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が、ＸＰＲ１依存性リン酸塩流出を阻害し、ＸＰＲ１の薬物様阻害剤であることを示す。全体として、これらのデータは、卵巣癌細胞がリン酸塩ホメオスタシスを維持する新しい機構を示し、これらの機構の摂動が卵巣癌における未評価の治療的脆弱性であることを示す。
本明細書に開示される実施形態は、腫瘍細胞（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２を過剰発現する腫瘍）におけるＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出に対する依存の特定に基づいて、がんを治療及び診断する方法を提供する。例示的な実施形態では、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＸＰＲ１依存性リン酸塩流出を阻害し、感受性である腫瘍を治療するために使用することができるＸＰＲ１の薬物様阻害剤である。感受性である腫瘍は、増加したＳＬＣ３４Ａ２（リン酸塩取り込み輸送体）を発現し、ＸＰＲ１／リン酸塩流出阻害に応答してリン酸塩取り込みを十分に抑制せずに、細胞成長阻害を防止する。出願人らは、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出（例えば、ＰＡＸ８）の阻害に対して脆弱であるがんを検出するために単独でまたは組み合わせて使用することができるＳＬＣ３４Ａ２と共変動する（例えば、共変動）遺伝子をさらに特定した。本明細書で使用される場合、「共変動する」という用語は、一緒に上方制御及び下方制御される遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、遺伝子間の「相関」は、共変動する遺伝子を指す。出願人らは、ＸＰＲ１阻害に応答して差次的に発現される遺伝子を特定した。例えば、ＳＬＣ３４Ａ２及びＳＬＣ２０Ａ１は抑制され、ＦＧＦ２３は上方制御される。出願人らは、腫瘍細胞がリン酸塩ホメオスタシスを回復するために発現を変化させると決定した。したがって、これらの機構を標的にすると、感受性である腫瘍の脆弱性をさらに増加させことができる。
本明細書で使用される場合、ＸＰＲ１は、異種指向性及びポリトロープレトロウイルス受容体１（別名：ＩＢＧＣ６、ＳＬＣ５３Ａ１、ＳＹＧ１、Ｘ３）を指す。例示的な配列としては、以下のＮＣＢＩ受入番号が挙げられる：ＮＭ＿００４７３６．４、ＮＭ＿００１１３５６６９．２、ＮＭ＿００１３２８６６２．２、ＮＰ＿００４７２７．２、ＮＰ＿００１１２９１４１．１、及びＮＰ＿００１３１５５９１．１。ＸＰＲ１は、タンパク質全体を標的化することに加えて、治療薬（例えば、小分子、抗体）または発現を検出するための薬剤（例えば、抗体）によって標的化され得るＳＰＸドメイン（Ｎ末端）及びＥＸＳドメイン（Ｃ末端）を含む。ＸＰＲ１は、後生動物においてリン酸塩排出輸送体であり、ＳＰＸドメインを必要としない機能である（例えば、Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｘｐｏｒｔ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＸＰＲ１ ｉｎ ｍｅｔａｚｏａｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１３；３（６）：１８６６－１８７３、Ｌｅｇａｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＸＰＲ１ ｃａｕｓｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｆａｍｉｌｉａｌ ｂｒａｉｎ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｘｐｏｒｔ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１５；４７（６）：５７９－５８１、Ａｎｓｅｒｍｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｎａｌ Ｆａｎｃｏｎｉ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ Ｒｉｃｋｅｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ ａｎｄ Ｐｏｌｙｔｒｏｐｉｃ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｐｈｒｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１７；２８（４）：１０７３－１０７８を参照）。
本明細書で使用される場合、ＫＩＤＩＮＳ２２０は、キナーゼＤ相互作用基質２２０（別名：ＡＲＭＳ、ＳＩＮＯ）を指す。例示的な配列としては、以下のＮＣＢＩ受入番号が挙げられる：ＮＭ＿０２０７３８．４、ＮＭ＿００１３４８７２９．２、ＮＭ＿００１３４８７３１．２、ＮＭ＿００１３４８７３２．２、ＮＭ＿００１３４８７３４．２、ＮＭ＿００１３４８７３５．２、ＮＭ＿００１３４８７３６．２、ＮＭ＿００１３４８７３８．２、ＮＭ＿００１３４８７３９．２、ＮＭ＿００１３４８７４０．２、ＮＭ＿００１３４８７４１．２、ＮＭ＿００１３４８７４２．２、ＮＭ＿００１３４８７４３．２、ＮＭ＿００１３４８７４５．２、ＮＰ＿０６５７８９．１、ＮＰ＿００１３３５６５８．１、ＮＰ＿００１３３５６６０．１、ＮＰ＿００１３３５６６１．１、ＮＰ＿００１３３５６６３．１、ＮＰ＿００１３３５６６４．１、ＮＰ＿００１３３５６６５．１、ＮＰ＿００１３３５６６７．１、ＮＰ＿００１３３５６６８．１、ＮＰ＿００１３３５６６９．１、ＮＰ＿００１３３５６７０．１、ＮＰ＿００１３３５６７１．１、ＮＰ＿００１３３５６７２．１、及びＮＰ＿００１３３５６７４．１。ＫＩＤＩＮＳ２２０は、治療薬（例えば、小分子、抗体）または発現を検出するための薬剤（例えば、抗体）によって標的化され得る、アンキリン反復含有ドメイン（Ｎ末端）及びＫＡＰファミリーＰループドメインを含む。Ｐループドメインは、ＷａｌｋｅｒＡ及びＢモチーフと呼ばれる２つの保存モチーフを特徴とする。Ｗａｌｋｅｒループ、またはＰループ、またはリン酸塩結合ループとしても知られるＷａｌｋｅｒＡモチーフは、リン酸塩結合に関連するタンパク質におけるモチーフである。ＷａｌｋｅｒＢモチーフは、Ａモチーフのかなり下流に位置するほとんどのＰループタンパク質におけるモチーフである。
本明細書で使用される場合、ＳＬＣ３４Ａ２は、溶質担体ファミリー３４メンバー２（別名：ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＡＰＩ－ＩＩｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＰＵＬＡＭ）を指す。例示的な配列としては、以下のＮＣＢＩ受入番号が挙げられる：ＮＭ＿００６４２４．３、ＮＭ＿００１１７７９９８．２、ＮＭ＿００１１７７９９９．１、ＮＰ＿００６４１５．３、ＮＰ＿００１１７１４６９．２、及びＮＰ＿００１１７１４７０．１。ＮａＰｉ２Ｂ輸送体に対するヒト化モノクローナル抗体の相補性決定領域超可変ドメインアミノ酸配列に由来する合成ペプチドは、腫瘍成長を阻害するか、またはがんを治療することについて記載されている（ＵＳ９，１９３，７９７Ｂ２）。
本明細書で使用される場合、ＳＬＣ２０Ａ１は、溶質担体ファミリー２０メンバー１（別名：ＧＬＶＲ１、Ｇｌｖｒ－１、ＰＩＴ１、ＰｉＴ－１）を指す。例示的な配列としては、以下のＮＣＢＩ受入番号が挙げられる：ＮＭ＿００５４１５．５及びＮＰ＿００５４０６．３。
本明細書で使用される場合、ＰＡＸ８は、対になったボックス８を指す。例示的な配列としては、以下のＮＣＢＩ受入番号が挙げられる：ＮＭ＿００３４６６．４、ＮＭ＿０１３９５２．４、ＮＭ＿０１３９５３．４、ＮＭ＿０１３９９２．４、ＮＰ＿００３４５７．１、ＮＰ＿０３９２４６．１、ＮＰ＿０３９２４７．１、及びＮＰ＿０５４６９８．１。
本明細書で使用される場合、ＦＧＦ２３は、線維芽細胞成長因子２３（別名：ＡＤＨＲ、ＦＧＦＮ、ＨＦＴＣ２、ＨＰＤＲ２、ＨＹＰＦ、ＰＨＰＴＣ）を指す。例示的な配列としては、以下のＮＣＢＩ受入番号が挙げられる：ＮＭ＿０２０６３８．３及びＮＰ＿０６５６８９．１。
本発明は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出に依存するあらゆるがんの治療に有用であり得る。他の好ましい実施形態では、がんは、正常組織と比較して、ＳＬＣ３４Ａ２の発現が増加している（例えば、卵巣癌、子宮癌、乳癌、胆管癌、肝臓及び肺癌）。より好ましい実施形態では、がんは、卵巣または子宮癌である。ＳＬＣ３４Ａ２発現の検出は、本明細書の診断方法セクションにさらに記載される。
ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の１つ以上の阻害剤による治療から利益を得ることができる例示的ながんとしては、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、または多発性骨髄腫などの液性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。がんは、肉腫及び癌腫などの固形腫瘍を含み得るが、これらに限定されない。固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、上皮癌、気管支原性肺癌、肝細胞種、結腸直腸癌（例えば、結腸癌、直腸癌）、肛門癌、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌、膵島細胞癌、神経内分泌腫瘍）、乳癌（例えば、腺管癌、小葉癌、炎症性乳癌、明細胞癌、粘液癌）、卵巣癌（例えば、卵巣上皮癌、または漿液性腫瘍、類内膜腫瘍、及び粘液性嚢胞腺癌を含む表面上皮間質性腫瘍、性索間質性腫瘍）、前立腺癌、肝臓及び胆管癌（例えば、肝細胞癌、胆管細胞癌、血管腫）、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、明細胞癌、ウィルムス腫瘍、腎芽腫）、子宮頸癌、子宮癌（例えば、子宮内膜腺癌、子宮乳頭漿液性癌、子宮明細胞癌、子宮肉腫、及び平滑筋肉腫、混合ミュラー腫瘍）、精巣癌、胚細胞腫瘍、肺癌（例えば、肺腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、非小細胞癌、小細胞癌、中皮腫）、膀胱癌、印環細胞癌、頭部及び頸部のがん（例えば、扁平上皮癌）、食道癌（例えば、食道腺癌）、脳の腫瘍（例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、シュワン腫、髄膜腫）、神経芽腫、網膜芽腫、神経内分泌腫瘍、黒色腫、胃のがん（例えば、胃腺癌、消化管間質性腫瘍）、またはカルチノイドが挙げられるが、これらに限定されない。リンパ増殖性障害も増殖性疾患と考えられている。ある特定の例示的な実施形態では、がんは、卵巣癌である。ある特定の他の例示的な実施形態では、がんは、子宮癌である。
別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、対象がリン酸塩調節不全に感受性の腫瘍を有するかどうかを決定すること、及び対象がリン酸塩調節不全に感受性の腫瘍を有する場合、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２００媒介性リン酸塩排出を標的とする１つ以上の治療薬を投与することに基づいてがんを治療する方法を対象とする。別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、腫瘍試料においてＳＬＣ３４Ａ２の発現を検出するか、または腫瘍試料においてＸＰＲ１コピー数の増幅を検出することによって、対象がリン酸塩調節不全に感受性の腫瘍を有するかどうかを決定する方法を提供する。
がん依存性を標的とする治療方法
治療薬
ある特定の実施形態では、本発明は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を標的とする１つ以上の治療薬を提供する。好ましい実施形態では、治療薬は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害剤である。ある特定の実施形態では、治療薬は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体が腫瘍細胞から無機リン酸塩を排出する機能を遮断または妨害する。ある特定の実施形態では、治療薬は、ＸＰＲ １：ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の形成を遮断する。ある特定の実施形態では、治療薬は、ＸＰＲ１の細胞外ドメインを標的とする。ある特定の実施形態では、治療薬は、ＸＰＲ１のＳＰＸドメインまたはＥＸＳドメインを標的とする。ある特定の実施形態では、治療薬は、ＫＩＤＩＮ２２０のアンキリン反復含有ドメインまたはＫＡＰファミリーＰループドメイン（Ｗａｌｋｅｒ Ａ／Ｂモチーフを含む）を標的とする。
ある特定の実施形態では、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を標的とすることは、現在の標準治療と組み合わせて行うことができ、改善された治療及び／またはより少ない毒性を提供し得る。ある特定の実施形態では、１つ以上の治療薬は、治療用ポリペプチド、小分子阻害剤、小分子ディグレーダー（例えば、ＡＴＴＥＣ、ＡＵＴＡＣ、ＬＹＴＡＣ、またはＰＲＯＴＡＣ）、抗体、抗体断片、抗体様タンパク質足場、アプタマー、遺伝子修飾剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ）、ＲＮＡｉ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的な一実施形態では、１つ以上の治療薬は、１つ以上の治療用ポリペプチドを含む。別の例示的な実施形態では、治療用ポリペプチドは、エンベロープ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。別の例示的な実施形態では、１つ以上の治療薬は、ＸＰＲ１に特異的であるか、ＫＩＤＩＮＳ２２０に特異的であるか、またはＸＰＲ１／ＫＩＤＩＮＳ２２００複合体に特異的である１つ以上の抗体を含む。
「治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」、「治療可能薬」、または「治療薬（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）」という用語は、同義に使用され、対象に投与するといくつかの有益な効果を付与する分子もしくは化合物、または分子もしくは化合物の組み合わせを指す。有益な効果には、診断的決定を可能にすること、疾患、症状、障害、または病理学的状態を緩和すること、疾患、症状、障害、または状態の発症を低減または予防すること、ならびに一般に疾患、症状、障害、または病理学的状態に対抗することが含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」、または「軽減すること」または「緩和すること」は、同義に使用される。これらの用語は、治療上の利益及び／または予防上の利益を含むが、これらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、治療中の１つ以上の疾患、状態、または症状の治療上関連する改善またはそれに対する効果を意味する。予防的利益のために、組成物は、特定の疾患、状態、もしくは症状を発達させるリスクのある対象に、または疾患、状態、もしくは症状がまだ現れていない可能性があるにもかかわらず、疾患の生理学的症状のうちの１つ以上を報告する対象に投与され得る。本明細書で使用される場合、「治療すること」は、障害を緩和すること、治癒すること、それが悪化するのを防ぐこと、進行速度を遅らせること、またはそれが再発生するのを防ぐこと（すなわち、再発を防ぐため）を含む。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、当業者によって容易に決定され得る、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与様式などのうちの１つ以上に応じて変動し得る。この用語はまた、本明細書に記載の画像化方法のうちのいずれか１つによる検出のための画像を提供する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の薬剤、従うべき投与レジメン、それが他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、画像化される組織、及びそれが運ばれる物理的送達系のうちの１つ以上に応じて変動し得る。
例えば、対象におけるがんを治療するための方法では、エピジェネティック遺伝子を標的とする阻害剤の組み合わせの有効量は、がん細胞の増殖を低減もしくは防止する、またはがん細胞に対して細胞傷害性であるなどの、抗がん効果をもたらす任意の量である。ある特定の実施形態では、エピジェネティック遺伝子を標的とする阻害剤の有効量は、阻害剤が、エピジェネティック遺伝子を標的とする１つ以上の追加の阻害剤の不在下で投与されたときの阻害剤の有効量と比較して、エピジェネティック遺伝子を標的とする１つ以上の追加の阻害剤と同時にまたは組み合わせて投与されたときに低減する。ある特定の実施形態では、エピジェネティック遺伝子を標的とする阻害剤は、エピジェネティック遺伝子を標的とする１つ以上の追加の阻害剤の不在下で投与された場合、がん細胞の増殖を低減または防止しない。
治療用ポリペプチド
例示的な一実施形態では、がんリン酸塩依存性を標的とする方法は、治療用ポリペプチドを投与することを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド治療薬は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害するために使用される。治療用ポリペプチドは、ＸＰＲ１、ＫＩＤＩＮＳ２２０、またはＸＰＲ１／ＫＩＤＩＮＳ２００複合体への結合によって、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害し得る。例示的な一実施形態では、治療用ポリペプチドは、エンベロープ受容体結合ドメイン（「ＲＢＤ」）である。別の例示的な実施形態では、治療用ポリペプチドは、抗体またはその断片もしくは変異型である。
エンベロープ－受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）
ある特定の実施形態では、タンパク質治療薬は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体に結合し、それを阻害することができる受容体結合タンパク質「ＲＢＤ」タンパク質である。ある特定の例示的な実施形態では、ＲＢＤタンパク質は、エンベロープウイルス糖タンパク質に由来し、ＸＰＲ１膜受容体と相互作用することができる。ＸＰＲ１は、様々なマウス白血病ウイルス（ＭＬＶまたはＭｕＬＶ）の異種指向性及びポリトロープ受容体である。ある特定の実施形態では、「ＲＢＤ」は、Ｘ－ＭＬＶなどのレトロウイルスのためのエンベロープ糖タンパク質の約２３８残基断片であり、断片は、ＸＰＲ１リン酸塩流出を阻害する（例えば、Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｘｐｏｒｔ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＸＰＲ１ ｉｎ ｍｅｔａｚｏａｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１３；３（６）：１８６６－１８７３を参照）。ＲＢＤタンパク質は、本明細書に記載されるように修飾され得る。ある特定の実施形態では、ＲＢＤは、融合タンパク質であり得る。例えば、ＲＢＤは、インビボでの安定性を増加させるためのＦｃ融合タンパク質であり得る。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＲＢＤ融合タンパク質の二量体化を促進する。ある特定の実施形態では、ＲＢＤタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及び／または血清アルブミン（例えば、ＨＳＡまたはＭＳＡ）に連結された融合タンパク質であり得る。ある特定の実施形態では、ＧＳＴドメインは、ＲＢＤ融合タンパク質の二量体化を促進する（例えば、Ｔｕｄｙｋａ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｃａｎ Ｂｅ Ｕｓｅｄ ａｓ ａ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ｆｏｒ ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｐｅｒｉｐｌａｓｍ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９７），６：２１８０－２１８７を参照）。構造分析は、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）がホモ二量体を形成することができることを明らかにした（Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２ Ｏｃｔ ２７；３１（４２）：１０１６９－８４、Ｒｅｉｎｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９２ Ｓｅｐ ５；２２７（１）：２１４－２６、及びＫａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９７ Ｆｅｂ；６（２）：３９９－４０６を参照）。
図１５は、以下の例示的なＲＢＤ Ｆｃ融合タンパク質を示す：ＭＬＶＭＥＧＳＡＦＳＫＰＬＫＤＫＩＮＰＷＧＰＬＩＶＭＧＩＬＶＲＡＧＡＳＶＱＲＤＳＰＨＱＩＦＮＶＴＷＲＶＴＮＬＭＴＧＱＴＡＮＡＴＳＬＬＧＴＭＴＤＴＦＰＫＬＹＦＤＬＣＤＬＶＧＤＹＷＤＤＰＥＰＤＩＧＤＧＣＲＴＰＧＧＲＲＲＴＲＬＹＤＦＹＶＣＰＧＨＴＶＰＩＧＣＧＧＰＧＥＧＹＣＧＫＷＧＣＥＴＴＧＱＡＹＷＫＰＳＳＳＷＤＬＩＳＬＫＲＧＮＴＰＫＤＱＧＰＣＹＤＳＳＶＳＳＧＶＱＧＡＴＰＧＧＲＣＮＰＬＶＬＥＦＴＤＡＧＲＫＡＳＷＤＡＰＫＶＷＧＬＲＬＹＲＳＴＧＡＤＰＶＴＲＦＳＬＴＲＱＶＬＮＶＧＰＲＶＰＩＧＳＶＤＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号２）。ある特定の実施形態では、ｍＦｃタグは、ＲＢＤの二量体化を促進する。ある特定の実施形態では、ｍＦｃタグは、ＲＢＤ融合タンパク質の再利用及び安定性を促進する。Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉら、２０１３は、マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１ Ｆｃ断片にＣ末端融合し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生されるＫｏＲＶ、Ａ－ＭＬＶ、Ｘ－ＭＬＶ（ＮＺＢ－ＩＵ－６株）、及びＰＥＲＶ－Ａ ＲＢＤを開示している。複数のＭＵＬＶは、異なる種の交差反応性を有するＸＰＲ１を使用する。Ｘ－ＭＬＶは、ＸＰＲ１ｈｕｍのみに感染し、Ｐ－ＭＬＶは、ＸＰＲ１ｍｕｓ及びＸＰＲ１ｈｕｍの両方を使用する。ＲＢＤタンパク質は、異種指向性またはポリトロープマウス白血病レトロウイルス（Ｘ－及びＰ－ＭＬＶ）Ｅｎｖに由来し得る。図１６は、マウスＸＰＲ１を介して感染することができ、本発明に適用可能な、他のウイルス株由来のＲＢＤタンパク質を示す。本明細書で使用される場合、由来するＲＢＤタンパク質は、エンベロープウイルス糖タンパク質（例えば、非天然ハイブリッドＸ－及びＰ－ＭＬＶ）由来のＲＢＤタンパク質の任意の非天然ハイブリッドであり得る。本明細書で使用される場合、「ハイブリッドタンパク質」とは、任意の２つ以上の異なるタンパク質（例えば、Ｘ－及びＰ－ＭＬＶの両方からの部分を含有する非天然ハイブリッド）からのセグメントまたは部分を含有する任意のタンパク質を指し、天然に存在しない修飾タンパク質を含む。
ＲＢＤのための遺伝子療法実施形態
例示的な一実施形態では、遺伝子療法を使用して、腫瘍細胞または腫瘍微小環境でＲＢＤを発現させてもよい。ある特定の実施形態では、遺伝子療法は、ＳＬＣ３４Ａ２を過剰発現する腫瘍を有する対象に使用される。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」、「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、及び「遺伝子修飾」という用語は、同義に使用され、遺伝子の発現を修飾または操作して、治療的使用のための生細胞の生物学的特性を変更することを指す。
例示的な一実施形態では、遺伝子治療に使用するためのベクターは、ＲＢＤタンパク質をコードする配列を含み、当該配列を腫瘍細胞に送達するために使用される。ベクターは、遺伝子の発現を制御するための１つ以上の調節エレメントをさらに含み得る。ベクターは、調節／制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み得る。ベクターは、ベクターを腫瘍細胞または腫瘍微小環境に特異的に誘導する標的化部分をさらに含み得る。別の例示的な実施形態では、ベクターは、腫瘍に特異的な向性を有するウイルスベクターを含み得る。
一般に、及び本明細書全体を通して、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子、１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端（例えば、環状）がない核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子、及び当該技術分野で既知の他の様々のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができるベクターのタイプに制限はない。ベクターは、いくつかの異種生物に組み込まれたポリヌクレオチド、遺伝子構築物、または発現ベクターの増殖及び取得に好適なクローニングベクターであり得る。好適なベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ならびにレトロウイルス及びレンチウイルス）に基づく真核生物発現ベクター、及びプラスミドなどの非ウイルスベクターが挙げられる。
例示的な一実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）にパッケージングするためのベクター内に存在する。ウイルスベクターには、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含まれる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、エピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。真核生物細胞において発現のためのかつ発現をもたらすベクターは、本明細書では「真核生物発現ベクター」と称され得る。別の例示的な実施形態では、ベクターは、遺伝子を細胞ゲノムに組み込むか、またはエピソーム的に維持される。
例示的な一実施形態では、ベクターは、追加のＤＮＡセグメントが、例えば、標準的な分子クローニング技法によって挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。
例示的な一実施形態では、ベクターは、ｍＲＮＡベクターである（例えば、Ｓａｈｉｎ，Ｕ，Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ ａｎｄ Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ（２０１４）．ｍＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １３： ７５９－７８０、Ｗｅｉｓｓｍａｎ Ｄ，Ｋａｒｉｋｏ Ｋ．ｍＲＮＡ： Ｆｕｌｆｉｌｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５；２３（９）：１４１６－１４１７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．１３８、Ｋｏｗａｌｓｋｉ ＰＳ，Ｒｕｄｒａ Ａ，Ｍｉａｏ Ｌ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＧ．Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ： Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１９；２７（４）：７１０－７２８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１９．０２．０１２、Ｍａｇａｄｕｍ Ａ，Ｋａｕｒ Ｋ，Ｚａｎｇｉ Ｌ．ｍＲＮＡ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｅａｒｔ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１９；２７（４）：７８５－７９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１８．１１．０１８、Ｒｅｉｃｈｍｕｔｈ ＡＭ，Ｏｂｅｒｌｉ ＭＡ，Ｊａｋｌｅｎｅｃ Ａ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ Ｄ．ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２０１６；７（５）：３１９－３３４．ｄｏｉ：１０．４１５５／ｔｄｅ－２０１６－０００６、及びＫｈａｌｉｌ ＡＳ，Ｙｕ Ｘ，Ｕｍｈｏｅｆｅｒ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ ｍＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｉａ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．２０２０；６（２７）：ｅａｂａ２４２２を参照）。例示的な実施形態では、ＲＢＤタンパク質をコードするｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子を使用して送達され（例えば、Ｒｅｉｃｈｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６を参照）、腫瘍に直接投与される。例示的な実施形態では、ＲＢＤタンパク質をコードするｍＲＮＡは、生体材料媒介性隔離を使用して送達され（例えば、Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０２０を参照）、腫瘍組織に直接投与される。ｍＲＮＡ分子に存在する配列は、本明細書にさらに記載されるように、ｍＲＮＡベクター（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ｍｉＲＮＡ標的部位、及びＷＰＲＥ ）に適用可能である。
調節エレメント
組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結されている、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系での、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞での）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節エレメント（複数可）に連結されることを意味するよう意図されている。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語はまた、目的のポリヌクレオチドに対するプロモーター配列の機能的関係及び位置を指す（例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、その配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される）。典型的には、作動可能に連結されたプロモーターは、目的の配列と近接している。しかしながら、エンハンサーは、その発現を制御するために目的の配列と近接する必要はない。「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列（複数可）の上流に位置する１つ以上のポリヌクレオチドの転写を制御するように機能し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位、ならびにこれらに限定されないが、転写因子結合部位、抑制因子、及び活性化タンパク質結合部位を含む任意の他のＤＮＡ配列、ならびにプロモーターからの転写量を調節するように直接的または間接的に作用する当該技術分野で既知のヌクレオチドの任意の他の配列の結合部位の存在によって構造的に特定される核酸断片を指す。「組織特異的」プロモーターは、特定の種類の分化細胞または組織においてのみ活性である。
別の実施形態では、本発明のベクターは、適切な転写配列（すなわち、開始、終結、プロモーター、及びエンハンサー）、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプライシング及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル）、細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列、翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、及びタンパク質安定性を増強する配列を含むが、これらに限定されない発現制御配列をさらに含む。天然、構成的、誘導性、または組織特異的なプロモーターを含む多数の発現制御配列が当該技術分野で既知であり、本発明により利用され得る。
別の実施形態では、本発明のベクターは、転写後調節領域をさらに含む。好ましい実施形態では、転写後調節領域は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後領域（ＷＰＲＥ）またはその機能的変異型及び断片、ならびにＰＰＴ－ＣＴＳまたはその機能的変異型及び断片である（例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９；７３：２８８６－２８９２及びＫａｐｐｅｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２００１／０４４４８１を参照）。特定の実施形態では、転写後調節領域は、ＷＰＲＥである。本明細書で使用される場合、「ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント」または「ＷＰＲＥ」という用語は、転写されると、遺伝子の発現を増強することができる三次構造を作製するＤＮＡ配列を指す（例えば、Ｌｅｅ Ｙ，ｅｔ ａｈ，Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５；９０（ｌ）：３３－３７及びＤｏｎｅｌｌｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７２（６）：５０８５－５０９２を参照）。
「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むように意図されている。かかる調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。
調節エレメントには、多くの宿主細胞型でのヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの、及びある特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主に目的の所望の組織において発現を指向し得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的または発達段階依存的な様式などの時間依存的な様式で発現を指向してもよく、これはまた、組織または細胞型特異的であってもなくてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、またはそれらの組み合わせを含む。エンハンサーエレメントは、「調節エレメント」という用語によっても包含される。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることを理解するであろう。ベクターが宿主細胞に導入され、それによって、本明細書に記載される核酸によってコードされた融合タンパク質またはペプチドを含む転写物、タンパク質、またはペプチドを産生することができる。
一実施形態では、ベクターは、非腫瘍組織で発現される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含有する。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、転写後レベルでのＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングに関与する小さい（約２２－ｎｔ）の進化的に保存された調節ＲＮＡである（例えば、Ｂａｒｒｅｌ ＤＰ．Ｃｅｌｌ ２００４；１１６：２８１－２９７を参照）。相補領域との塩基対合（最も頻繁には、細胞メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）で）を介して、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳を抑制するように作用するか、または高配列相同性により、ｍＲＮＡの触媒分解を引き起こすことができる。多くのｍｉＲＮＡの非常に差次的な組織発現のために、細胞ｍｉＲＮＡは、遺伝子療法ベクターの組織特異的標的化を媒介するために利用され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＴ）に完全に相補的な標的エレメントのタンデムコピーを操作することにより。
抗体
ある特定の実施形態では、１つ以上の薬剤は抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体が腫瘍細胞から無機リン酸塩を排出する機能を遮断または妨害する。例示的な実施形態では、抗体は、ＸＰＲ１、ＫＩＤＩＮＳ２２０、またはＸＰＲ１／ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体に特異的である。ある特定の実施形態では、抗体は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の形成を遮断する。ある特定の実施形態では、抗体は、ＸＰＲ１を標的とする（例えば、ＷＯ２０２０１５３４６７Ａ１を参照）。ある特定の実施形態では抗体は、ＸＰＲ１の細胞外ドメインを標的とする。ある特定の実施形態では、抗体は、ＸＰＲ１のＳＰＸドメインまたはＥＸＳドメインを標的とする。ある特定の実施形態では、ＸＰＲ１抗体は、アミノ酸５２９からタンパク質の末端まで及ぶ領域を標的とし、これは、一般に、異なる供給業者から入手可能である。ある特定の実施形態では、抗体は、ＫＩＤＩＮＳ２２０のＷａｌｋｅｒ Ａ／Ｂモチーフを標的とする。ある特定の実施形態では、抗体は、リン酸塩結合を遮断するために、ＫＩＤＩＮＳ２２０のＷａｌｋｅｒ Ａ／ＢモチーフまたはＫＡＰファミリーＰループドメインを標的とする。
ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０を認識する抗体が生成され、市販されている（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒウェブサイト：カタログ番号２１８５６－１－ＡＰ、カタログ番号ＰＡ５－１１６４７５、カタログ番号ＰＡ５－１００１５２、カタログ番号ＰＡ５－９７８９７、カタログ番号ＰＡ５－２２１１６、カタログ番号ＭＡ５－３２８６９、カタログ番号ＰＡ５－８２５１１、カタログ番号ＰＡ５－１１１８９４、カタログ番号６６７４８－１－ＩＧ、カタログ番号Ａ３０３－００２Ａ、カタログ番号Ａ３０３－００３Ａ、カタログ番号ＭＡ１－９０６６７、カタログ番号ＰＡ１－４２２９、カタログ番号ＢＳ－７０４１Ｒ、カタログ番号Ａ３０３－００２Ａ－Ｍ、カタログ番号ＲＡ１９０１９、カタログ番号ＲＡ１９０２０、及びカタログ番号ＰＡ５－８２５５２、カタログ番号ＰＡ５－２１９０８、カタログ番号ＰＡ５－３４３３８、カタログ番号１４１７４－１－ＡＰ、カタログ番号ＰＡ５－３４３３７、カタログ番号ＰＡ１－２３５４７を参照）。当業者であれば、リン酸塩流出を阻害するために、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０を遮断するための治療用抗体を容易に生成することができる（例えば、Ｌｕ，ＲＭ．，Ｈｗａｎｇ，ＹＣ．，Ｌｉｕ，ＩＪ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ ２７，１（２０２０）を参照）。
「抗体」という用語は、本明細書で「免疫グロブリン」という用語と同義に使用され、インタクトな抗体、抗体の断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２断片、ならびにそれらの定常領域及び／または可変領域のいずれかで変異されている（例えば、キメラ抗体、部分的にヒト化された抗体、または完全にヒト化された抗体を産生するため、ならびに所望の形質、例えば、増強された結合及び／または低減されたＦｃＲ結合を有する抗体を産生するための変異）インタクトな抗体及び断片を含む。「断片」という用語は、インタクトなまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。断片は、インタクトまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理を介して得ることができる。断片はまた、組換え手段によって得ることもできる。例示的な断片には、ナノボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、またはＦａｂ３断片、Ｆａｂｃ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＶＨＨ、及びｓｃＦｖ、及び／またはＦｖ断片が含まれる。
本明細書で使用される場合、約５０％未満の非抗体タンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも称される）を有する抗体タンパク質、または化学前駆体の調製物は、「実質的に遊離」であると考えられる。４０％、３０％、２０％、１０％、より好ましくは５％（乾燥重量で）の非抗体タンパク質、または化学的前駆体は、実質的に遊離であると考えられる。抗体タンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え的に産生される場合、それは、好ましくは、実質的に培養培地を含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積または質量の約３０％未満、好ましくは約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する。
「抗原結合断片」という用語は、抗原結合（すなわち、特異的結合）について、抗原に結合するか、またはインタクトな抗体（すなわち、それらが由来するインタクトな抗体）と競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。したがって、これらの抗体またはその断片は、本発明の範囲に含まれるが、但し、抗体または断片が標的分子に特異的に結合することを条件とする。
「抗体」という用語は、任意の源（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、ならびにげっ歯類、ウサギ類、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなど）から得られる任意のＩｇクラスまたは任意のＩｇサブクラス（例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４サブクラス）を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、「Ｉｇクラス」または「免疫グロブリンクラス」という用語は、ヒト及び高等哺乳動物において特定されている免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを指す。「Ｉｇサブクラス」という用語は、ＩｇＭ（Ｈ及びＬ）の２つのサブクラス、ＩｇＡの３つのサブクラス（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及び分泌型ＩｇＡ）、ならびにヒト及び高等哺乳動物において特定されているＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）を指す。抗体は、単量体または重合形態で存在することができ、例えば、ＩｇＭ抗体は、五量体形態で存在し、ＩｇＡ抗体は、単量体、二量体、または多量体形態で存在する。
「ＩｇＧサブクラス」という用語は、それぞれ、免疫グロブリンの重鎖（Ｖ１～γ４）によってヒト及び高等哺乳動物において特定されている、免疫グロブリンクラスＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）を指す。「単鎖免疫グロブリン」または「単鎖抗体」（本明細書では同義に使用される）という用語は、重鎖及び軽鎖からなる２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、当該鎖は、例えば、抗原に特異的に結合する能力を有する鎖間ペプチドリンカーによって安定化される。「ドメイン」という用語は、例えば、βプリーツシート及び／または鎖内ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループを含む（例えば、３～４つのペプチドループを含む）重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインは、本明細書において、「定常」ドメインの場合、様々なクラスメンバーのドメイン内の配列変動の相対的な欠如、または「可変」ドメインの場合、様々なクラスメンバーのドメイン内の顕著な変動に基づいて、「定常」または「可変」とさらに称される。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、当該技術分野では、同義に、抗体またはポリペプチド「領域」と称されることが多い。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、同義に、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域、または「ＣＬ」ドメインと称される。抗体重鎖の「定常」ドメインは、同義に、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域、または「ＣＨ」ドメイン）と称される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、同義に、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域、または「ＶＬ」ドメインと称される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、同義に、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＶＨ」領域、または「ＶＨ」ドメインと称される。
「領域」という用語はまた、抗体鎖または抗体鎖ドメインの一部または部分（例えば、本明細書で定義される重鎖もしくは軽鎖の一部もしくは部分、または定常ドメインもしくは可変ドメインの一部もしくは部分）、及び当該鎖またはドメインのより別個の部分または一部を指すことができる。例えば、軽鎖及び重鎖または軽鎖及び重鎖可変ドメインは、本明細書で定義される、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」に散在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」を含む。
「立体構造」という用語は、タンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体、その抗体鎖、ドメイン、または領域）の三次構造を指す。例えば、句「軽（または重）鎖立体構造」は、軽（または重）鎖可変領域の三次構造を指し、句「抗体立体構造」または「抗体断片立体構造」は、抗体またはその断片の三次構造を指す。
「抗体様タンパク質足場」または「操作されたタンパク質足場」という用語は、典型的には組み合わせ工学（ファージディスプレイまたは他の分子選択技術と組み合わせた部位指向的ランダム変異誘発など）によって得られるタンパク質性非免疫グロブリン特異的結合剤を広く包含する。通常、かかる足場は、堅牢で可溶性の小さな単量体タンパク質（クニッツ阻害剤またはリポカリンなど）、または細胞表面受容体の安定して折り畳まれた膜外ドメイン（プロテインＡ、フィブロネクチン、またはアンキリン反復など）に由来する。
かかる足場は、Ｂｉｎｚら（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５，２３：１２５７－１２６８）、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００９，１３：２４５－５５）、Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｄａｍｌｅ（Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６，１７：６５３－６５８）、Ｓｋｅｒｒａ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ ２０００，１３：１６７－１８７）、及びＳｋｅｒｒａ（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００７，１８：２９５－３０４）で広く概説されており、限定されないが、α－ヘリックスのうちの２つに界面を提供する５８残基の３ヘリックスバンドルであるブドウ球菌プロテインＡのＺドメインに基づくアフィボディ（Ｎｙｇｒｅｎ，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｍａｌｌ ｔｈｒｅｅ－ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ．ＦＥＢＳ Ｊ ２００８，２７５：２６６８－２６７６）、異なるプロテアーゼ特異性のために操作することができる、典型的にはヒト起源の（例えば、ＬＡＣＩ－Ｄ１）小さい（約５８残基）堅牢なジスルフィド架橋セリンプロテアーゼ阻害剤に基づく操作されたクニッツドメイン（Ｎｉｘｏｎ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖ ２００６，９：２６１－２６８）、２～３つの露出したループを有するＩｇ様βサンドイッチフォールド（９４残基）を採用するが、中央ジスルフィド架橋を欠く、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの１０番目の細胞外ドメイン（１０Ｆｎ３）に基づくモノボディまたはアドネクチン（Ｋｏｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ，Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ：ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｉｃｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００７，３５２：９５－１０９）、ヒト、昆虫、及び他の多くの生物において豊富である、開放端の４つの構造的に可変なループによって小リガンドのための結合部位を天然に形成する８本鎖βバレルタンパク質（約１８０残基）の多様なファミリーである、リポカリンに由来するアンティカリン（Ｓｋｅｒｒａ，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ－ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｐｏｃｋｅｔ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＦＥＢＳ Ｊ ２００８，２７５：２６７７－２６８３）、典型的には３つの反復βターンから生じる剛性界面を提供する、設計されたアンキリン反復ドメイン（１６６残基）である、ＤＡＲＰｉｎｓ（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，ＤＡＲＰｉｎｓ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ２００８，１３：６９５－７０１）、アビマー（多量体化ＬＤＬＲ－Ａモジュール）（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｖｉｍｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｖｏｌｖｅｄ ｂｙ ｅｘｏｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５，２３：１５５６－１５６１）、及びシステイン豊富ノッチンペプチド（Ｋｏｌｍａｒ，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｃｙｓｔｉｎｅ－ｋｎｏｔ ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＥＢＳ Ｊ ２００８，２７５：２６８４－２６９０）を含む。
抗体の「特異的結合」は、抗体が特定の抗原またはエピトープに対して認識可能な親和性を示し、一般に、顕著な交差反応性を示さないことを意味する。「認識可能な」結合は、少なくとも２５μＭの親和性を有する結合を含む。親和性が１×１０７Ｍ－１（または１μＭ以下の解離係数もしくは１ｎｍ以下の解離係数）を超える抗体は、典型的には、対応してより大きな特異性で結合する。本明細書に記載されるものの中間値はまた、本発明の範囲内であり、本発明の抗体は、例えば、１００ｎＭ以下、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、例えば、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または実施形態では、５００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、または２５ｐＭ以下の親和性の範囲で結合することが意図される。「顕著な交差反応性を示さない」抗体は、その標的（例えば、異なるエピトープまたは別の分子）以外の実体には認識可能に結合しない抗体である。例えば、標的分子に特異的に結合する抗体は、標的分子に認識可能に結合するが、非標的分子またはペプチドと顕著に反応しない。特定のエピトープに特異的な抗体は、例えば、同じタンパク質またはペプチド上の遠隔エピトープと顕著に交差反応しない。特異的結合は、かかる結合を決定するための任意の技術分野で認識される手段に従って決定され得る。好ましくは、特異的結合は、スキャッチャード分析及び／または競合的結合アッセイに従って決定される。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、単一の抗原結合部位と抗原決定基との結合の強度を指す。親和性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の立体化学的適合の近さ、それらの間の接触面積の大きさ、荷電基及び疎水性基の分布などに依存する。抗体親和性は、平衡透析によって、または動的ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）法によって測定され得る。解離定数Ｋｄ及び会合定数Ｋａは、親和性の定量的尺度である。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、構造及び抗原特異性が均一である抗体産生細胞（例えば、Ｂリンパ球またはＢ細胞）のクローン集団に由来する抗体を指す。「ポリクローナル抗体」という用語は、構造及びエピトープ特異性が不均一であるが、共通の抗原を認識する、抗体産生細胞の異なるクローン集団起源の複数の抗体を指す。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、本明細書に記載される、粗製の調製物として体液内に存在し得るか、または精製され得る。
抗体（または「抗体部分」）の「結合部分」という用語は、１つ以上の完全ドメイン、例えば、一対の完全ドメイン、及び標的分子に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片を含む。抗体の結合機能が完全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。結合断片は、組換えＤＮＡ技法によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって産生される。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｖ、単鎖、単鎖抗体、例えば、ｓｃＦｖ、及び単一ドメイン抗体が含まれる。
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にすべて、または少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、超可変領域のうちのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分も含む。
本定義によって包含される抗体またはエピトープ結合タンパク質の部分の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、及びＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片、（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片、（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインならびにＣＨＩドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦｄ’断片、（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、（ｖｉ）抗原に結合するＶＨドメインまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，３４１ Ｎａｔｕｒｅ ５４４（１９８９））、（ｖｉｉ）機能フレームワークに提示される単離されたＣＤＲ領域または単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，２４２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４２３（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，８５ ＰＮＡＳ ５８７９（１９８８））、（ｘ）同じポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，９０ ＰＮＡＳ ６４４４（１９９３）を参照）、（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－Ｃｈ１－ＶＨ－Ｃｈ１）を含む「線状抗体」（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－６２（１９９５）及び米国特許第５，６４１，８７０号）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「遮断」抗体または抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原（複数可）の生物学的活性を阻害するか、または低減するものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の遮断抗体もしくはアンタゴニスト抗体またはその断片は、抗原（複数可）の生物学的活性を完全に阻害する。
抗体は、認識されたポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、本発明は、部分的または完全のいずれかで受容体／リガンド相互作用を妨害する抗体を含む。本発明は、受容体特異的抗体及びリガンド特異的抗体の両方を特色とする。本発明はまた、リガンド結合を防止しないが、受容体活性化を防止する受容体特異的抗体を特色とする。受容体活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書に記載される、またはさもなければ当該技術分野で既知の技法によって決定され得る。例えば、受容体活性化は、免疫沈降に続くウエスタンブロット分析によって、受容体またはその下流基質のうちの１つのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）を検出することによって決定され得る。特定の実施形態では、リガンド活性または受容体活性を、抗体の不在下で、活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供される。
本発明はまた、リガンド結合及び受容体活性化の両方を防止する受容体特異的抗体、ならびに受容体－リガンド複合体を認識する抗体を特色とする。同様に、リガンドに結合し、リガンドの受容体への結合を防止する中和抗体、及びリガンドに結合し、それによって受容体の活性化を防止するが、リガンドが受容体に結合することを防止しない抗体が本発明によって包含される。受容体を活性化する抗体が本発明にさらに含まれる。これらの抗体は、例えば、受容体の二量体化を誘導することによって、受容体アゴニストとして作用し得る、すなわち、リガンド媒介性受容体活性化の生物学的活性のすべてまたはサブセットのいずれかを強化または活性化することができる。抗体は、本明細書に開示されるペプチドの特異的生物学的活性を含む生物学的活性のためのアゴニスト、アンタゴニスト、または逆アゴニストとして指定され得る。抗体アゴニスト及びアンタゴニストは、当該技術分野で既知の方法を使用して作製することができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０２８１号、米国特許第５，８１１，０９７号、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１－１９８８（１９９８）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８－３６７８（１９９８）、Ｈａｒｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６－１７９４（１９９８）、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１５）：３２０９－３２１４（１９９８）、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０－３１７９（１９９８）、Ｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ（Ｐｔ２）：２３７－２４７（１９９８）、Ｐｉｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７－１９０ （１９９７）、Ｌｉａｕｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３－２４１（１９９７）、Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５－１１３０１（１９９７）、Ｔａｒｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５－７６２（１９９５）、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３－１１６７（１９９８）、Ｂａｒｔｕｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４－２０（１９９６）を参照されたい。
本発明のために定義される抗体は、修飾される、すなわち、共有結合が抗体が抗イディオタイプ応答を生成するのを防止しないように、任意の種類の分子の抗体への共有結合によって修飾される誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって修飾されている抗体が含まれる。多数の化学修飾のうちのいずれかは、限定されないが、特定の化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、既知の技法によって実施され得る。加えて、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
単純な結合アッセイを使用して、標的タンパク質に結合するか、またはタンパク質（例えば、受容体及びリガンド）間の相互作用を妨害する薬剤をスクリーニングまたは検出することができる。本発明のある特定の標的は膜貫通タンパク質であるため、いくつかの実施形態では、完全長タンパク質ではなく、これらのタンパク質の可溶性形態を使用するアッセイを使用することができる。可溶性形態には、例えば、膜貫通ドメインを欠くもの、及び／またはその同族の結合パートナーに結合する能力を保持するＩｇＶドメインまたはその断片を含むものが含まれる。さらに、本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのタンパク質相互作用を阻害または増強する薬剤には、組換えペプチド模倣物が含まれ得る。
スクリーニングアッセイに有用な検出方法としては、抗体ベースの方法、レポーター部分の検出、本明細書に記載のサイトカインの検出、及び本明細書に記載の遺伝子シグネチャーの検出が挙げられる。
リガンドタンパク質への受容体タンパク質の結合を決定するためのアッセイの別のバリエーションは、親和性バイオセンサー法の使用によるものである。かかる方法は、圧電効果、電気化学、または偏光解析法、光波誘導、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの光学的方法に基づき得る。
治療用ポリペプチド修飾
ある特定の例示的な実施形態では、本発明の治療的ポリペプチドは、それらが治療的使用のための有利な特性（例えば、安定性及び特異性）を獲得するが、それらの生物学的活性を維持するように、修飾され得る。治療用タンパク質は、インビボで対象に投与されたときに、安定性を増加させるか、またはタンパク質の有効性を改善する特徴を提供するように修飾され得る。治療用タンパク質に関して本明細書で使用される場合、「修飾された」、「修飾」などの用語は、治療用タンパク質の所望の特性を増強する１つ以上の変化を指し、この変化は、治療用タンパク質の一次アミノ酸配列を変更しない。「修飾」は、治療用タンパク質自体の一次アミノ酸配列を変更しない共有結合性化学修飾を含む。かかる所望の特性には、例えば、インビボ半減期を延長すること、安定性を増加させること、クリアランスを低減すること、免疫原性もしくはアレルギー原性を変更すること、特定の抗体の上昇を可能にすること、または細胞標的化が含まれる。実施され得る治療用タンパク質への変更には、担体タンパク質へのコンジュゲーション、リガンドへのコンジュゲーション、抗体へのコンジュゲーション、ＰＥＧ化、ポリシアリル化、ＨＥＳ化、組換えＰＥＧ模倣物、Ｆｃ融合物、アルブミン融合物、ナノ粒子付着、ナノ粒子封入、コレステロール融合物、鉄融合物、アシル化、アミド化、グリコシル化、側鎖酸化、リン酸化、ビオチン化、表面活性物質の付加、アミノ酸模倣物の付加、または非天然アミノ酸の付加が挙げられるが、これらに限定されない。修飾された治療用タンパク質には、類似体も含まれる。「類似体」とは、同一ではないが、類似の機能的または構造的特色を有する分子を意味する。例えば、治療用タンパク質類似体は、対応する天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持する一方で、天然に存在するポリペプチドに対して類似体の機能を増強するある特定の生化学的修飾を有する。かかる生化学的修飾は、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を、例えば、リガンド結合を変化させることなく増加させる可能性がある。類似体は、非天然アミノ酸を含み得る。
本明細書の変数の任意の定義の中の化学基のリストの列挙は、任意の単一の基または列挙した基の組み合わせとしてその変数の定義を含む。本明細書の変数または態様についての実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその部分と組み合わせてその実施形態を含む。
修飾されたタンパク質は、スペーサーまたはリンカーを含み得る。融合タンパク質に関して使用される場合、「スペーサー」または「リンカー」という用語は、融合タンパク質を含むタンパク質を結合するペプチドを指す。一般に、スペーサーは、タンパク質間のいくつかの最小距離または他の空間関係を結合するか、または維持する以外の特定の生物学的活性を有さない。しかしながら、ある特定の実施形態では、スペーサーの構成アミノ酸は、分子の折り畳み、正味電荷、または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を与えるように選択され得る。
本発明の実施形態で使用するための好適なリンカーは、当業者に周知であり、直鎖または分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。リンカーは、好ましい実施形態では、各ペプチドが適切に折り畳まれることを確実にするのに十分な距離で２つのペプチドを分離するために使用される。好ましいペプチドリンカー配列は、可撓性の伸長立体構造を採用し、秩序二次構造を開発するための傾向を示さない。可撓性タンパク質領域における典型的なアミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒが挙げられる。実質的に、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒを含有するアミノ酸配列の任意の並べ替えは、リンカー配列についての上記の基準を満たすことが予想される。Ｔｈｒ及びＡｌａなどの他の近中性アミノ酸も、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして使用され得るさらに他のアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－６２、米国特許第４，９３５，２３３号、及び米国特許第４，７５１， １８０号に開示されている。
タンパク質治療薬の臨床的有効性は、短い血漿半減期及びプロテアーゼ分解に対する感受性によって制限されることが多い。様々な治療用タンパク質（例えば、フィルグラスチム）の研究は、ポリペプチド配列を様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのいずれかにコンジュゲートまたは連結することを含む様々な修飾（参照として、例えば、典型的には、タンパク質及び非タンパク質性ポリマーの両方に共有結合した連結部位、例えば、ＰＥＧを介して）によって、かかる困難が克服され得ることを示している。
ある特定のタンパク質の特性が、タンパク質の水力学的体積を増加させ、それによって腎臓濾過によるそのクリアランスを遅らせる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの結合によって調節され得ることは周知である。（例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９－２１９７７（１９９６）を参照）。かかるＰＥＧコンジュゲート生体分子は、より良い物理的及び熱的安定性、酵素分解に対する感受性に対する保護、溶解性の増加、より長いインビボ循環半減期及びクリアランスの減少、免疫原性及び抗原性の低減、ならびに毒性の低減を含む、臨床的に有用な特性を有することが示されている。したがって、ある特定の薬剤は、ＰＥＧ化されて（例えば、ペプチド残基上で）、例えば、インビボで半減期を延長することによって有効性を増加させるなどの、増強された治療上の利益を提供することができることが想定される。ある特定の実施形態では、薬剤のＰＥＧ化は、薬剤の血清半減期を延長し、特定の薬剤が血液脳関門を通過することができることを可能にするために使用され得る。したがって、一実施形態では、ＰＥＧ化ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０アンタゴニストは、アンタゴニストの薬物動態及び薬力学を改善する。
ペプチドＰＥＧ化方法に関しては、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４３：１２７－３８（１９９４）、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６：１４０－６（１９９３）、Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４６：２５３－６４（１９９５）、Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７：３８－４４（１９９６）、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１６８－７３（１９９７）、Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｈｉｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１－１８（１９９８）、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１４４０－４５（１９９８）、及びＴａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：４５－５２（１９９８）に対する言及がなされる。ポリエチレングリコールまたはＰＥＧは、モノ－（Ｃ１－１０）アルコキシまたはアリールオキシ－ポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されない、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することを意味する。好適なＰＥＧ部分には、例えば、４０ｋＤａメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド（Ｄｏｗ，Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈ．）、６０ｋＤａメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド（Ｄｏｗ，Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈ．）、４０ｋＤａメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド－プロピオンアミド（Ｄｏｗ，Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈ．）、３１ｋＤａα－メチル－ｗ－（３－オキソプロポキシ）、ポリオキシエチレン（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ）、ｍＰＥＧ２－ＮＨＳ－４０ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）、ｍＰＥＧ２－ＭＡＬ－４０ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－４００ＭＡ（（ＰＥＧ）２４０ｋＤａ）（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ－２００ＭＡ（ＰＥＧ２０ｋＤａ）（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ）が含まれる。ＰＥＧ基は、一般に、ペプチド上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、マレイミド、またはエステル基）に対するＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、マレイミド、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）を介したアシル化またはアルキル化により、ペプチド（例えば、ＲＢＤ）に結合する。
ＰＥＧ分子（複数可）は、ペプチドの任意の位置で、任意のＬｙｓ、Ｃｙｓ、またはＫ（ＣＯ（ＣＨ２）２ＳＨ）残基に共有結合され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＢＤタンパク質は、Ｎ末端の任意のアミノ酸に、Ｎ末端アミノ基により直接ＰＥＧ化することができる。ＰＥＧ化を容易にするために、「リンカーアーム」をペプチドに付加することができる。システインのチオール側鎖でのＰＥＧ化は広く報告されている（例えば、Ｃａｌｉｃｅｔｉ ＆ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１２６１－７７（２００３）を参照）。ペプチド中にシステイン残基が存在しない場合、システイン残基は、置換を通して、またはＮ末端アミノ酸にシステインを付加することによって導入することができる。ある特定の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端アミノ酸に付加されるシステイン残基の側鎖を介してＰＥＧ化される。
例示的な実施形態では、ＰＥＧ分子（複数可）は、ＲＢＤタンパク質などのペプチドのＣ末端のアミド基に共有結合され得る。ある特定の実施形態では、本発明の薬剤の修飾に使用されるＰＥＧ分子は分岐しているが、他の実施形態では、ＰＥＧ分子は直鎖であり得る。特定の態様では、ＰＥＧ分子は、分子量が１ｋＤａ～１００ｋＤａである。さらなる態様では、ＰＥＧ分子は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、及び８０ｋＤａから選択される。またさらなる態様では、２０、４０、または６０ｋＤａから選択される。本発明の薬剤に共有結合した２つのＰＥＧ分子が存在する場合、各々が１～４０ｋＤａであり、特定の態様では、それらは、２０及び２０ｋＤａ、１０及び３０ｋＤａ、３０及び３０ｋＤａ、２０及び４０ｋＤａ、または４０及び４０ｋＤａの分子量を有する。特定の態様では、薬剤（例えば、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０アンタゴニスト）は、ｍＰＥＧ－システインを含有する。ｍＰＥＧ－システイン中のｍＰＥＧは、様々な分子量を有し得る。分子量の範囲は、好ましくは５ｋＤａ～２００ｋＤａ、より好ましくは５ｋＤａ～１００ｋＤａ、さらに好ましくは２０ｋＤａ～６０ｋＤａである。ｍＰＥＧは、直鎖状または分岐状であり得る。
本開示は、ＰＥＧ模倣物の使用も企図する。いくつかの追加の有利な特性を付与しながら、ＰＥＧの属性（例えば、増強された血清半減期）を保持する組換えＰＥＧ模倣物が開発されている。例として、治療用タンパク質に組換え的に既に融合されている（例えば、Ａｍｕｎｉｘ’ ＸＴＥＮ技術；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、ＰＥＧと同様の伸長立体構造を形成することができる単純なポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒを含む）は、製造することができる。これにより、製造プロセス中の追加のコンジュゲーション工程の必要性が排除される。さらに、確立された分子生物学技法は、ポリペプチド鎖の側鎖組成の制御を可能にし、免疫原性及び製造特性の最適化を可能にする。
グリコシル化は、タンパク質の物理的特性に劇的に影響を与えることができ、タンパク質の安定性、分泌、及び細胞内局在においても重要であり得る（例えば、Ｓｏｌａ ａｎｄ Ｇｒｉｅｂｅｎｏｗ，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｎ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ Ｏｐｔｉｍｉｚｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１０；２４（１）：９－２１）を参照）。適切なグリコシル化は、生物学的活性に不可欠であり得る。実際、真核生物由来のいくつかの遺伝子は、グリコシル化タンパク質の細胞プロセスを欠く細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた場合、グリコシル化の欠如のために活性がほとんどまたは全くない状態で回収されるタンパク質を産生する。本開示の目的のために、「グリコシル化」は、グリカンをタンパク質、脂質、または他の有機分子に結合させる酵素プロセスを広く指すことを意味する。本開示と併せて「グリコシル化」という用語を使用することは、一般に、（基礎となるグリコシル化部位を除去することによって、または化学的及び／または酵素的手段によりグリコシル化を欠失させることによってのいずれかで）１つ以上の炭水化物部分を付加または欠失させること、及び／または天然配列に存在してもしなくてもよい１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することを意図している。加えて、この語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質及び割合の変化を伴う天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変更することによって達成され得る。ポリペプチドへの変更は、例えば、１つ以上のセリンまたはスレオニン残基（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）またはアスパラギン残基（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）の付加またはそれらによる置換によって行われ得る。Ｎ結合及びＯ結合オリゴ糖の構造、ならびに各種類において見出される糖残基は、異なる場合がある。両方に一般的に見られる糖の一種は、Ｎ－アセチルノイラミン酸（以下、シアル酸と称される）である。シアル酸は、通常、Ｎ結合及びＯ結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷により、糖タンパク質に酸性特性を付与し得る。本開示の特定の実施形態は、Ｎ－グリコシル化変異型の生成及び使用を含む。
本開示は、安定性及びインビボ薬物動態を改善するために、ポリシアリル化、ペプチド及びタンパク質の天然に存在する生分解性ａ－（２→８）結合ポリシアリル酸（「ＰＳＡ」）へのコンジュゲーションの使用も企図する。ＰＳＡは、血清半減期を増加させる血液中の高い見かけ分子量を与える、非常に親水性である生分解性の無毒性の天然ポリマーである。加えて、一連のペプチド及びタンパク質治療薬のポリシアリル化は、著しく低減されたタンパク質分解、インビボ活性での活性の保持、ならびに免疫原性及び抗原性の低減をもたらした（例えば、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ３００（１－２）：１２５－３０を参照）。他のコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ）との修飾と同様に、部位特異的ポリシアリル化のための様々な技法が利用可能である（例えば、Ｔ．Ｌｉｎｄｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０８（１８）７３９７－７４０２（２０１１）を参照）。
コンユゲーションのための追加の好適な構成要素及び分子には、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）などのアルブミン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ポリ（Ｄ－リジン：Ｄ－グルタミン酸）などのポリアミノ酸、ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルス核タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ならびにＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質及び表面抗原、または前述の任意の組み合わせが含まれる。
本開示の１つ以上のポリペプチドへのアルブミンの融合は、例えば、ＨＳＡをコードするＤＮＡまたはその断片が１つ以上のポリペプチド配列をコードするＤＮＡに連結されるように、遺伝子操作によって達成され得る。アルブミン自体は、その循環半減期を延長するために修飾され得る。修飾アルブミンの１つ以上のポリペプチドへの融合は、上述の遺伝子操作技術によって、または化学コンジュゲーションによって達成され得る。得られる融合分子は、非修飾アルブミンとの融合の半減期を超える半減期を有する。（ＷＯ２０１１／０５１４８９を参照）。
コンジュゲートされた脂肪酸鎖（アシル化）を介したアルブミン結合を含む、直接融合のための代替策として、いくつかのアルブミン結合戦略が開発されている。血清アルブミンは脂肪酸の輸送タンパク質であるため、アルブミン結合活性を有するこれらの天然リガンドは、小タンパク質治療薬の半減期延長に使用されている。例えば、糖尿病のための承認された製品であるインスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ）は、遺伝子修飾されたインスリンにコンジュゲートされたミリスチル鎖を含み、長時間作用型インスリン類似体をもたらす。
別の種類の修飾は、別のタンパク質、または担体分子などのポリペプチド配列のＮ及び／またはＣ末端に１つ以上の追加の構成要素または分子をコンジュゲート（例えば、連結）することである。したがって、例示的なポリペプチド配列は、別の構成要素または分子とのコンジュゲートとして提供され得る。コンジュゲート修飾は、第２の分子の追加のまたは相補的な機能または活性を有する活性を保持するポリペプチド配列をもたらし得る。例えば、ポリペプチド配列は、例えば、溶解性、貯蔵、インビボ、または貯蔵半減期、または安定性、免疫原性の低減、インビボでの遅延放出または制御放出などを促進するために、分子にコンジュゲートされ得る。他の機能または活性は、非コンジュゲートポリペプチド配列に対して毒性を低減するコンジュゲート、非コンジュゲートポリペプチド配列よりも効率的に細胞または器官の種類を標的とするコンジュゲート、または本明細書に記載の障害または疾患に関連する原因または影響にさらに対抗するための薬物を含む。
本開示は、１つ以上の特性を改善するために、ポリペプチドの、現在知られている、または将来的に開発される他の修飾の使用を企図する。本開示のポリペプチドの循環半減期を延長する、安定性を増加させる、クリアランスを低減する、またはその免疫原性もしくはアレルギー原性を変更するためのかかる方法の１つは、分子の特徴を修飾するために、他の分子に結合したヒドロキシエチルデンプン誘導体を利用する、ｈｅｓ化によるポリペプチド配列の修飾を伴う。ｈｅｓ化の様々な態様は、例えば、米国特許出願第２００７／０１３４１９７号及び同第２００６／０２５８６０７号に記載されている。
特定の実施形態では、薬剤（例えば、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０アンタゴニスト、ＲＢＤ）は、Ｎ末端アミノ基に共有結合した保護基を含む。例示的な実施形態では、タンパク質のＮ末端アミノ基に共有結合した保護基は、インビボ条件下でアミノ末端の反応性を低減する。アミノ保護基としては、－Ｃ１－１０アルキル、－Ｃ１－１０置換アルキル、－Ｃ２－１０アルケニル、－Ｃ２－１０置換アルケニル、アリール、－Ｃ１－６アルキルアリール、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）１－６－ＣＯＯＨ、－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ（Ｏ）－アリール、－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１－６アルキル、または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－アリールが挙げられる。特定の実施形態では、アミノ末端保護基は、アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル、及びｔ－ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される。他の実施形態では、Ｎ末端アミノ酸の脱アミノ化は、インビボ条件下でアミノ末端の反応性を低減するために使用され得る別の修飾である。
薬剤がポリマーに連結されている薬剤（例えば、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０アンタゴニスト、ＲＢＤ）の化学修飾組成物も、本発明の範囲内に含まれる。選択されたポリマーは、通常、重合の程度を制御することができるように、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドなどの単一の反応性基を有するように修飾される。ポリマーの範囲内には、ポリマーの混合物が含まれる。好ましくは、最終産物調製物の治療的使用のために、ポリマーは、薬学的に許容される。ポリマーまたはその混合物には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物系ポリマー、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、及びポリビニルアルコールが含まれ得るが、これらに限定されない。
他の実施形態では、薬剤（例えば、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０アンタゴニスト、ＲＢＤ）は、ＰＥＧ化、コレステリル化（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌａｔｉｏｎ）、またはパルミトイル化によって修飾される。修飾は、任意のアミノ酸残基に対してであり得る。好ましい実施形態では、修飾は、薬剤（例えば、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０アンタゴニスト、ＲＢＤ）のＮ末端アミノ酸に対して、Ｎ末端アミノ酸に直接、またはＮ末端に付加されたシステイン残基のチオール基もしくはトリメソイルトリス（３，５－ジブロモサリチレート（Ｔｔｄｓ））などのＮ末端に付加されたリンカーへの結合を介してのいずれかである。ある特定の実施形態では、薬剤（例えば、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０アンタゴニスト、ＲＢＤ）のＮ末端は、保護基がシステイン残基のＮ末端アミノ基に結合し、システインチオレート基がＮ－エチルマレイミド、ＰＥＧ基、コレステロール基、またはパルミトイル基で誘導体化されるシステイン残基を含む。他の実施形態では、アセチル化システイン残基は、薬剤のＮ末端に付加され、システインのチオール基は、Ｎ－エチルマレイミド、ＰＥＧ基、コレステロール基、またはパルミトイル基で誘導体化される。ある特定の実施形態では、本発明の薬剤は、コンジュゲートである。ある特定の実施形態では、本発明の薬剤は、リンカーを介してメトキシポリエチレングリコール（複数可）と結合するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
アミノ酸の置換を使用して、本発明の薬剤を修飾することができる。本明細書で使用される「アミノ酸の置換」という語句は、保存的置換と非保存的置換の両方の結果であるアミノ酸の置換を包含する。保存的置換は、ポリペプチド中の別の類似の残基によるアミノ酸残基の置換である。典型的であるが、限定するものではない保存的置換は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間の互いの置換、ヒドロキシ残基を含有するＳｅｒ及びＴｈｒの相互交換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの相互交換、アミド含有残基Ａｓｎ及びＧｌｎ間の相互交換、塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの相互交換、芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒの相互交換、ならびに小さいサイズのアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、及びＧｌｙの相互交換である。非保存的置換とは、ポリペプチドにおいて、アミノ酸残基を、生物学的に類似していない別の残基で置き換えることである。例えば、アミノ酸残基を、実質的に異なる電荷、実質的に異なる疎水性、または実質的に異なる空間配置を有する別の残基で置き換えること。
本開示からの当業者及び当該技術分野の知識は、かかる治療用タンパク質を産生するための様々な方式があることを理解するであろう。一般に、かかる治療用タンパク質は、インビトロまたはインビボのいずれかで産生され得る。治療用タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドとしてインビトロで産生され、次いで、医薬組成物に配合され、対象に投与され得る。かかるインビトロ産生は、例えば、様々な細菌、真核生物、またはウイルス組換え発現系のうちのいずれかにおける、ペプチド合成またはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子からのペプチド／ポリペプチドの発現、続いて発現されたペプチド／ポリペプチドの精製などの当業者に既知の様々な方法によって生じ得る。代替的に、治療用タンパク質は、治療用タンパク質をコードする分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス発現系など）を対象に導入することによってインビボで産生されてもよく、その結果、コードされた治療用タンパク質が発現される。
小分子
ある特定の実施形態では、１つ以上の治療薬は、ＸＰＲ１、ＫＩＮＤＩＮＳ２２０の発現を阻害する、ＸＰＲ１：ＫＩＮＤＩＮＳ２２０複合体の形成を阻害する、またはＸＰＲ１：ＫＩＮＤＩＮＳ２２０複合体によるリン酸塩流出を阻害する小分子を含む。「小分子」という用語は、一般的に医薬品で使用される有機分子と同等であるサイズを有する化合物、好ましくは有機化合物を指す。この用語は、生物学的巨大分子（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸など）を除外する。好ましい小有機分子は、最大約５０００Ｄａ、例えば、最大約４０００、好ましくは最大３０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、さらにより好ましくは最大約１０００Ｄａ、例えば、最大約９００、８００、７００、６００、または最大約５００Ｄａのサイズの範囲である。ある特定の実施形態では、小分子は、アンタゴニストまたはアゴニストとして機能し得る（例えば、酵素活性部位を遮断するか、またはリガンド結合部位に結合することによって受容体を活性化する）。ある特定の実施形態では、低分子は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体が腫瘍細胞から無機リン酸塩を排出する機能を遮断または妨害する。ある特定の実施形態では、小分子は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体の形成を遮断する。
例示的な一実施形態では、小分子は、ＫＩＤＩＮＳ２２０のＷａｌｋｅｒＡ／Ｂモチーフなどのリン酸塩結合ドメインを遮断する（例えば、Ｓａｎｄａｌｌ ＣＦ，Ｚｉｅｈｒ ＢＫ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＪＡ．ＡＴＰ－Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０２０；２５（１９）：４５７２を参照）。ＭＣＣ９５０は、ＷａｌｋｅｒＢモチーフ内にある可能性が高い、ＮＬＲＰ３のＡＴＰ結合領域の直接結合によってＡＴＰ加水分解を抑制するジアリールスルホニル尿素含有化合物である（例えば、Ｃｏｌｌ ＲＣ，Ｈｉｌｌ ＪＲ，Ｄａｙ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．ＭＣＣ９５０ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ＮＬＲＰ３ ＡＴＰ－ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｍｏｔｉｆ ｆｏｒ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１９；１５（６）：５５６－５５９を参照）。
本発明に適用可能な一種の小分子は、ディグレーダー分子である（例えば、Ｄｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｏｆ Ｄｅｇｒａｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２０２０ Ｊｕｌ；４１（７）：４６４－４７４を参照）。「ディグレーダー」及び「ディグレーダー分子」という用語は、分解のためにタンパク質を特異的に標的化することができるすべての化合物（例えば、Ｄｉｎｇら、２０２０に概説されるＡＴＴＥＣ、ＡＵＴＡＣ、ＬＹＴＡＣ、またはＰＲＯＴＡＣ）を指す。タンパク質分解標的化キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）技術は、急速に出現した代替治療戦略であり、現代の薬物開発プログラムで現在直面している多くの課題に対処する可能性がある。ＰＲＯＴＡＣ技術は、プロテアソームによるユビキチン化及び除去のために標的タンパク質を動員する小分子を用いる（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｇｒａｄｅｒ ｏｆ Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｅｘｔｒａ－ Ｔｅｒｍｉｎａｌ（ＢＥＴ）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｐｉｃｏｍｏｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１８，６１，４６２－４８１、Ｂｏｎｄｅｓｏｎ ａｎｄ Ｃｒｅｗｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１７ Ｊａｎ ６；５７：１０７－１２３、及びＬａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｕｌａｒ ＰＲＯＴＡＣ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ＢＣＲ－ＡＢＬ Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１６ Ｊａｎ １１；５５（２）：８０７－８１０を参照）。ある特定の実施形態では、ＬＹＴＡＣは、本明細書に記載される細胞表面タンパク質（例えば、ＸＰＲ１及び／またはＫＩＤＩＮＳ２２０）に特に有利である。
アプタマー
ある特定の実施形態では、１つ以上の薬剤はアプタマーである。核酸アプタマーとは、様々な分子標的、例えば、小分子、タンパク質、核酸、細胞、組織、及び生物に結合するようにインビトロ選択ラウンドの繰り返しまたは同等にＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）により操作されている核酸種である。核酸アプタマーは、古典的なワトソン－クリック塩基対合以外の相互作用を介して分子に特異的結合親和性を有する。アプタマーは、抗体と類似する分子認識特性を提供するため、生物工学的用途及び治療的用途に有用である。それらの区別認識に加えて、アプタマーは、試験管内で完全に操作され得、化学合成によって容易に産生され、望ましい保管特性を有し、かつ治療的用途において免疫原性をほとんどまたは全く誘発しないため、抗体に優る利点を提供する。ある特定の実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ＤＮＡ構築物から発現され得る。他の実施形態では、核酸アプタマーは、別のポリヌクレオチド配列に連結され得る。ポリヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド配列であり得る。アプタマーは、ポリヌクレオチド配列の１つの鎖に共有結合され得る。アプタマーは、ポリヌクレオチド配列にライゲーションされ得る。ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列が、固体支持体に連結され得るか、または別のポリヌクレオチド配列にライゲーションされ得るように、構成され得る。
ファージディスプレイまたはモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）によって生成されるペプチドのようなアプタマーは、選択された標的に特異的に結合し、例えば、結合によって、標的の活性を調節することができ、アプタマーは、機能する標的の能力を遮断し得る。典型的なアプタマーは、サイズが１０～１５ｋＤａ（３０～４５ヌクレオチド）であり、サブナノモル親和性でその標的に結合し、密接に関連する標的を区別する（例えば、アプタマーは、典型的には、同じ遺伝子ファミリーからの他のタンパク質に結合しない）。構造研究は、アプタマーが、抗体－抗原複合体において親和性及び特異性を駆動する、同じ種類の結合相互作用（例えば、水素結合、静電相補性、疎水性接触、立体排除）を使用することができることを示している。
アプタマーは、高い特異性及び親和性、生物学的有効性、ならびに優れた薬物動態特性を含む、研究における、ならびに治療薬及び診断薬としての使用のためのいくつかの所望の特徴を有する。加えて、それらは、抗体及び他のタンパク質生物学的製剤に対する特定の競争上の優位性を提供する。アプタマーは化学合成され、研究、診断、または治療用途の生産需要を満たすために必要に応じて容易にスケーリングされる。アプタマーは、化学的に堅牢である。それらは、本質的に、熱及び変性剤などの要因への曝露後に活性を回復するように適合され、凍結乾燥粉末として室温で長期間（１年超）貯蔵することができる。理論に縛られることなく、固体支持体またはビーズに結合したアプタマーを、長期間貯蔵してもよい。
ホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼなどの細胞内及び細胞外酵素によって速やかに分解され得る。アプタマーは、改善されたインビボ安定性または改善された送達特徴などの改善された特徴をリガンドに付与する修飾されたヌクレオチドを含むことができる。かかる修飾の例としては、リボース及び／またはリン酸塩及び／または塩基の位置での化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸで特定された修飾されたヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号（リボースの２’位、ピリミジンの５位、及びプリンの８位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載）、米国特許第５，７５６，７０３号（様々な２’修飾されたピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載）、及び米国特許第５，５８０，７３７号（２’－アミノ（２’－ＮＨ２）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、及び／または２’－０－メチル（２’－ＯＭｅ）置換基で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する非常に特異的な核酸リガンドを記載）に記載されている。アプタマーの修飾には、環外アミンでの修飾、４－チオウリジンの置換、５－ブロモまたは５－ヨード－ウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオエートまたはアリルホスフェート修飾、メチル化、ならびにイソ塩基のイソシチジン及びイソグアノシンなどの独特な塩基対合の組み合わせも含まれ得る。修飾はまた、キャッピングなどの３’及び５’修飾を含むことができる。本明細書で使用される場合、ホスホロチオエートという用語は、１つ以上の硫黄原子で置き換えられたホスホジエステル結合における１つ以上の非架橋酸素原子を包含する。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾された糖基を含み、例えば、ヒドロキシル基のうちの１つ以上は、ハロゲン、脂肪族基で置き換えられるか、またはエーテルもしくはアミンとして官能化される。一実施形態では、フラノース残基の２’位は、Ｏ－メチル、Ｏ－アルキル、Ｏ－アリル、Ｓ－アルキル、Ｓ－アリル、またはハロ基のいずれかによって置換されている。２’－修飾された糖の合成方法は、例えば、Ｓｐｒｏａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：７３３－７３８（１９９１）、Ｃｏｔｔｅｎ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２６２９－２６３５（１９９１、及びＨｏｂｂｓ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８－５１４５（１９７３）に記載されている。他の修飾が当業者に知られている。ある特定の実施形態では、アプタマーは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２００９０１２４１８号、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｆｆ－ｒａｔｅｓ」に記載される改善されたオフレートを有するアプタマーを含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、アプタマーのライブラリから選択される。かかるライブラリには、Ｒｏｈｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｋｅ Ｓｉｄｅ Ｃｈａｉｎｓ： Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ａｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１４）３，ｅ２０１に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。アプタマーはまた、市販されている（例えば、ＳｏｍａＬｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏを参照）。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される任意の修飾を含有する任意のアプタマーを利用し得る。
プログラム可能な遺伝子修飾剤
ある特定の例示的な実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼを使用して、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０を含有するゲノム領域を編集することができる。プログラム可能な遺伝子修飾剤は、特定の標的配列に結合するように操作することができる酵素である。例示的なプログラム可能な遺伝子修飾剤としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が挙げられる。本発明の文脈では、プログラム可能な遺伝子修飾剤は、ＸＰＲ１及び／またはＫＩＤＩＮＳ２２０のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを標的化及び／または修飾するように設計され得る。修飾は、ＸＰＲ１及び／またはＫＩＤＩＮＳ２２０の発現を低減し得るか、またはＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０複合体形成を阻害する構造的もしくは翻訳後修飾を導入し得る。理論に縛られることなく、正常な細胞は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出阻害に対して脆弱ではないが、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を一時的に阻害することは有利である。したがって、ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、標的化される（例えば、ＲＮＡ塩基編集）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ修飾
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ガイド分子と複合体を形成することができるエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓタンパク質）を含む。ガイド分子は、所与の標的配列に相補的な配列（例えば、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０の領域内の標的配列）を含むように操作され得る。ガイド分子は、複合体を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的配列に一本鎖または二本鎖の切断を導入する標的部位に誘導する。天然の細胞修復経路、ＮＨＥＪ及びＨＤＲは、腸を修復するために使用される。ＮＨＥＪは、切断部位に挿入または欠失を導入し得る。したがって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、発現を低減もしくは排除するか、またはＸＰＲ１／ＫＩＮＤＳ２２０複合体形成を妨げる挿入もしくは欠失を導入するように設計され得る。代替的に、鋳型分子は、ＨＤＲ経路を利用して所望の鋳型配列の挿入を導入するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系で送達することができる。これらの挿入は、発現を低減もしくは排除するか、またはＸＰＲ１／ＫＩＮＤＳ２２０複合体形成を妨げる１つ以上の変異を導入し得る。挿入は、翻訳後修飾部位を除去もしくは導入する、早期停止コドンを導入する、または機能の喪失もしくは機能の低減を伴うタンパク質産物をもたらすスプライス部位を妨害し得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系はまた、追加の機能ドメインで動作するように修飾され得る。かかる実施形態では、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が排除され、死んだＣａｓ（ｄＣａｓ）が作製される。次いで、ｄＣａｓ９は、機能的ドメインと融合される。ｄＣａｓ－ガイド複合体は、機能ドメインを標的配列に指向し、そこで、機能ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列に修飾を導入する。修飾されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系には、ＤＮＡ及びＲＮＡ塩基エディタ、プライマーエディタ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（ＣＡＳＴ）系が含まれ、これらについては、以下にさらに詳細に記載される。
一般に、本明細書及びＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの他の文書で使用されるＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈で「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡプロセシングされた部分反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では「スペーサー」とも称される）、またはその用語が本明細書で使用される「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、Ｃａｓを誘導するためのＲＮＡ（複数可）、例えば、Ｃａｓ９、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指向に関与する転写物及び他のエレメントを総称して指す。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈ではプロトスペーサーとも称される）を特徴とする。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，ＤＯＩ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８を参照されたい。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、一般に、それらのエフェクター分子の構造に基づいて２つのクラスに分類され得、これらは各々、タイプ及びサブタイプによりさらに細分化される。２つのクラスはクラス１及びクラス２である。クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、複数のＣａｓタンパク質で構成されるエフェクターモジュールを有し、その一部は、ｃｒＲＮＡ結合複合体を形成するが、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、単一の多ドメインのｃｒＲＮＡ結合タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを修飾するために使用され得るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを修飾するために使用され得るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。
クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを修飾するために使用され得るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＶに分けられる。Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．１８：６７－８３（特に図１に記載される）。タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、９つのサブタイプ（Ｉ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ１、Ｉ－Ｆ２、Ｉ－Ｆ３、及びＩＧ）に分けられる。Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０２０。クラス１のタイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ヘリカーゼ活性を有することができるＣａｓ３タンパク質を含有し得る。タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、６つのサブタイプ（ＩＩＩ－Ａ、ＩＩＩ－Ｂ、ＩＩＩ－Ｃ、ＩＩＩ－Ｄ、ＩＩＩ－Ｅ、及びＩＩＩ－Ｆ）に分けられる。タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｐａｌｍと呼ばれるＲＮＡ認識モチーフ及びポリヌクレオチドを切断することができるシクラーゼドメインを含むことができるＣａｓ１０を含有し得る。Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０２０。タイプＩＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、３つのサブタイプに分けられる。（ＩＶ－Ａ、ＩＶ－Ｂ、及びＩＶ－Ｃ）。Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０２０。クラス１の系には、トランスポゾン及びプラスミドによって運ばれる変異型を含むことができる、タイプＩ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ、及びＩ－Ｕ変異型を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ変異型も含まれ、これには、Ｔｎ７様トランスポゾンの大きなファミリーによってコードされるサブタイプＩ－Ｆのバージョン、及び同様に分解されたサブタイプＩ－Ｂ系をコードするＴｎ７様トランスポゾンのより小さな群が含まれる。Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１４（３５）（２０１７）；ＤＯＩ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０９０３５１１４、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖ．１，ｎ５，Ｆｉｇｕｒｅ ５も参照されたい。
クラス１の系は、典型的には、いくつかの実施形態では、抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体（カスケード）と称される複合体内の１つ以上のタンパク質、１つ以上の適応タンパク質（例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、ＲＮＡヌクレアーゼ）、及び／または１つ以上のアクセサリータンパク質（例えば、Ｃａｓ４、ＤＮＡヌクレアーゼ）などの補助タンパク質、タンパク質を含有するＣＲＩＳＰＲ関連ロスマンフォールド（ＣＡＲＦ）ドメイン、及び／またはＲＮＡ転写酵素を含むことができる多タンパク質エフェクター複合体を使用する。
クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系エフェクター複合体の骨格は、反復関連ミステリアスタンパク質（ｒｅｐｅａｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＲＡＭＰ）ファミリーサブユニット（例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、及び／またはＣａｓ７）のＲＮＡ認識モチーフドメイン含有タンパク質（複数可）によって形成され得る。ＲＡＭＰタンパク質は、１つ以上のＲＮＡ認識モチーフドメインを有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＲＡＭＰの複数のコピーが存在し得る。いくつかの実施形態では、クラスＩ のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のＣａｓ５、Ｃａｓ６、及び／またはＣａｓ７タンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ６タンパク質は、ＲＮＡｓｅであり、これは、プレｃｒＲＮＡプロセシングに関与し得る。クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に存在する場合、Ｃａｓ６は、任意に、エフェクター複合体と物理的に会合し得る。
クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系エフェクター複合体は、いくつかの実施形態では、大きなサブユニットも含むことができる。大きなサブユニットは、Ｃａｓ８及び／またはＣａｓ１０タンパク質から構成されるか、またはそれを含み得る。例えば、図１及び２を参照されたい。Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ．２０１９．Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ ３７４：２０１８００８７，ＤＯＩ：１０．１０９８／ｒｓｔｂ．２０１８．００８７及びＭａｋａｒｏｖａら、２０２０。
クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系エフェクター複合体は、いくつかの実施形態では、小さなサブユニット（例えば、Ｃａｓ１１）を含むことができる。例えば、図１及び２を参照されたい。Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ．２０１９ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ ３７４：２０１８００８７，ＤＯＩ：１０．１０９８／ｒｓｔｂ．２０１８．００８７。
いくつかの実施形態では、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩ－ＡのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩ－ＣのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩ－ＤのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩ－ＥのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩ－Ｆ１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩ－Ｆ２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩ－Ｆ３のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩ－ＧのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、タイプＩ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ、及びＩ－Ｕ変異型などのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ変異型であってもよく、これは、トランスポゾン及びプラスミドによって運ばれる変異型を含んでもよく、これには、Ｔｎ７様トランスポゾンの大きなファミリーによってコードされるサブタイプＩ－Ｆのバージョン、及び前述の同様に分解されたサブタイプＩ－Ｂ系をコードするＴｎ７様トランスポゾンのより小さな群が含まれる。
いくつかの実施形態では、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩＩＩ－ＡのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩＩＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩＩＩ－ＣのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩＩＩ－ＤのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩＩＩ－ＥのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩＩＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。
いくつかの実施形態では、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、タイプＩＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩＶ－ＡのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩＶ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの実施形態では、タイプＩＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、サブタイプＩＶ－ＣのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。
クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のエフェクター複合体は、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、またはそれらの組み合わせに任意に融合されるＣａｓ３タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のエフェクター複合体は、任意の１つ以上のＣａｓタンパク質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４などの、複数のコピーを有することができる。
クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系
本明細書の別の箇所でより詳細に記載される組成物、系、及び方法は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系とともに使用するために設計及び適合され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。クラス２の系は、単一の大型の多ドメインエフェクタータンパク質を有するという点で、クラス１の系とは区別される。ある特定の例示的な実施形態では、クラス２の系は、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ：ａ ｂｕｒｓｔ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ａｎｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１８：６７－８１（Ｆｅｂ ２０２０）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるタイプＩＩ、タイプＶ、またはタイプＶＩであり得る。クラス２の系の各タイプは、さらにサブタイプに分けられる。Ｍａｒｋｏｖａ ｅｔ ａｌ２０２０（特に図２）を参照されたい。クラス２のタイプＩＩの系は、４つのサブタイプ：ＩＩ－Ａ、ＩＩ－Ｂ、ＩＩ－Ｃ１、及びＩＩ－Ｃ２に分けることができる。クラス２のタイプＶの系は、１７のサブタイプ：Ｖ－Ａ、Ｖ－Ｂ１、Ｖ－Ｂ２、Ｖ－Ｃ、Ｖ－Ｄ、Ｖ－Ｅ、Ｖ－Ｆ１、Ｖ－Ｆ１（Ｖ－Ｕ３）、Ｖ－Ｆ２、Ｖ－Ｆ３、Ｖ－Ｇ、Ｖ－Ｈ、Ｖ－Ｉ、Ｖ－Ｋ（Ｖ－Ｕ５）、Ｖ－Ｕ１、Ｖ－Ｕ２、及びＶ－Ｕ４に分けることができる。クラス２のタイプＩＶの系は、５つのサブタイプ：ＶＩ－Ａ、ＶＩ－Ｂ１、ＶＩ－Ｂ２、ＶＩ－Ｃ、及びＶＩ－Ｄに分けることができる。
これらのタイプの際立った特色は、それらのエフェクター複合体が単一の大型の多ドメインタンパク質からなることである。タイプＶの系は、ＨＮＨヌクレアーゼがＲｕｖ－Ｃ様ヌクレアーゼドメイン配列内に挿入された状態で、標的ＤＮＡの１つの鎖の切断に各々関与する２つの核ドメインを含有する、タイプＩＩのエフェクター（例えば、Ｃａｓ９）とは異なる。タイプＶの系（例えば、Ｃａｓ１２）は、両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのみを含有する。タイプＶＩ（Ｃａｓ１３）は、タイプＩＩ及びＶの系のエフェクターとは無関係であり、２つのＨＥＰＮドメイン及び標的ＲＮＡを含有する。Ｃａｓ１３タンパク質は、標的認識によって引き起こされる副次的活性も示す。いくつかのタイプＶの系はまた、インビトロの関連において、２つの一本鎖ＤＮＡを伴うこの副次的活性を有することが見出されている。
いくつかの実施形態では、クラス２の系は、タイプＩＩの系である。いくつかの実施形態では、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＩＩ－Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＩＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＩＩ－Ｃ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＩＩ－Ｃ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＩＩの系は、Ｃａｓ９の系である。いくつかの実施形態では、タイプＩＩの系は、Ｃａｓ９を含む。
いくつかの実施形態では、クラス２の系は、タイプＶの系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｂ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｂ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｃ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｆ１（Ｖ－Ｕ３）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｆ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｆ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｉ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｋ（Ｖ－Ｕ５）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｕ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｕ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｖ－Ｕ４ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、ＣａｓＸ、及び／またはＣａｓ１４を含む。
いくつかの実施形態では、クラス２の系は、タイプＶＩの系である。いくつかの実施形態では、タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＶＩ－Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＶＩ－Ｂ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＶＩ－Ｂ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＶＩ－Ｃ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＶＩ－Ｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（群２９／３０）、Ｃａｓ１３ｃ、及び／またはＣａｓ１３ｄを含む。
特殊なＣａｓベースの系
いくつかの実施形態では、系は、特殊な機能または活性を行うことができる、Ｃａｓベースの系である。例えば、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の機能ドメインに融合されるか、作動可能に結合されるか、またはそうでなければ会合し得る。ある特定の例示的な実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に死んだＣａｓタンパク質（「ｄＣａｓ」）であり得る、及び／またはニッカーゼ活性を有し得る。ニッカーゼは、二本鎖標的のうちの１本の鎖のみを切断するＣａｓタンパク質である。かかる実施形態では、ｄＣａｓまたはニッカーゼは、機能ドメインを標的配列に送達するか、または標的配列に近接する配列特異的標的化機能を提供する。Ｃａｓタンパク質に融合されるか、作動可能に結合されるか、またはさもなければ会合し得る例示的な機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメイン、核排出シグナル（ＮＥＳ）ドメイン、翻訳活性化ドメイン、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、及びＳＥＴ７／９）、翻訳開始ドメイン、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、及びＳＩＤ４ＸドメインなどのＳＩＤドメイン）、ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）、ヒストン修飾ドメイン（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ）、光誘導性／制御可能ドメイン、化学的誘導性／制御可能ドメイン、トランスポザーゼドメイン、相同組換え機構ドメイン、リコンビナーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、及びこれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。触媒的に死んだＣａｓ９またはニッカーゼＣａｓ９（ＷＯ２０１４／２０４７２５、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐｔ １２；１５４（６）：１３８０－１３８９）、Ｃａｓ１２（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８，２０９５（２０１７）、及びＣａｓ１３（ＷＯ２０１９／００５８８４、ＷＯ２０１９／０６０７４６）を生成するための方法は、当該技術分野で既知であり、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、機能ドメインは、以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、翻訳活性化活性、翻訳開始活性、翻訳抑制活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性、分子スイッチ活性、化学誘導性、光誘導性、及び核酸結合活性のうちの１つ以上を有することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の機能的ドメインは、エピトープタグまたはレポーターを含み得る。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーターの例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自家蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
１つ以上の機能性ドメイン（複数可）は、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）の末端に、その近くに、及び／またはそれに近接して配置され得る。２つ以上の機能性ドメインを有する実施形態では、２つの各々は、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）の末端に、近くに、及びそれに近接して配置され得る。機能性ドメインがエフェクタータンパク質に作動可能に結合されているものなどのいくつかの実施形態では、１つ以上の機能性ドメインは、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）に好適なリンカー（ＧｌｙＳｅｒリンカーを含むが、これらに限定されない）を介して係留または連結され得る。１つを超える機能性ドメインがある場合、機能性ドメインは同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、すべての機能性ドメインは同じである。いくつかの実施形態では、すべての機能性ドメインは互いに異なる。いくつかの実施形態では、機能性ドメインのうちの少なくとも２つは互いに異なる。いくつかの実施形態では、機能性ドメインのうちの少なくとも２つは互いに同じである。
他の好適な機能性ドメインは、例えば、国際出願公開第ＷＯ２０１９／０１８４２３号に見出すことができる。
スプリットＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、スプリットＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。例えば、Ｚｅｔｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（２）： １３９－１４２及びＷＯ２０１９／０１８４２３を参照されたく、その組成物及び技法は、本発明で使用するために使用される、及び／または適合され得る。スプリットＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、本明細書及び本明細書に参照によりさらに詳細に組み込まれる文書に記載される。ある特定の実施形態では、スプリットＣＲＩＳＰＲタンパク質の各部分は、特定の結合対のメンバーに結合され、互いに結合した場合、特定の結合対のメンバーは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の部分を近接して維持する。ある特定の実施形態では、スプリットＣＲＩＳＰＲタンパク質の各部分は、誘導性結合対と会合する。誘導性結合対は、誘導性結合対の両方のメンバーに結合するタンパク質または小分子によって「オン」または「オフ」に切り替えることができるものである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、好ましくは、ドメイン間で分割し、ドメインをそのまま残してもよい。特定の実施形態では、当該Ｃａｓスプリットドメイン（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメイン）は、当該スプリットＣａｓドメイン（複数可）が藻類細胞内の標的核酸配列を処理するように、細胞内に同時にまたは連続して導入され得る。野生型Ｃａｓと比較してスプリットＣａｓのサイズが低減されていることにより、本明細書に記載される細胞透過性ペプチドの使用などの、系を細胞に送達する他の方法が可能になる。
ＤＮＡ及びＲＮＡ塩基編集
いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所に記載の本発明のポリヌクレオチドは、塩基編集系を使用して修飾することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレオチドデアミナーゼに接続または融合される。したがって、いくつかの実施形態では、Ｃａｓベースの系は、塩基編集系であり得る。本明細書で使用される場合、「塩基編集」は、一般に、修飾を行うためにヌクレオチドを切除することを含まない、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓベースまたはＣａｓベースの系を介したポリヌクレオチド修飾のプロセスを指す。塩基編集は、従来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用して行われ得る過剰な望ましくない編集副産物を生成することなく、正確な位置で塩基対を変換することができる。
ある特定の例示的な実施形態では、ヌクレオチドデアミナーゼは、限定されないが、クラス２のタイプＩＩ及びタイプＶ系などのＤＮＡ結合Ｃａｓタンパク質と組み合わせて使用されるＤＮＡ塩基エディタであり得る。ＤＮＡ塩基エディタの２つのクラス：シトシン塩基エディタ（ＣＢＥ）及びアデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）が一般的に知られている。ＣＢＥは、Ｃ・Ｇ塩基対をＴ・Ａ塩基対に変換し（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ．５３３：４２０－４２４、Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５３、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３６：３２４－３２７）、ＡＢＥは、Ａ・Ｔ塩基対をＧ・Ｃ塩基対に変換する。ＣＢＥ及びＡＢＥは、４つの可能な塩基転位型変異（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＣからＴ、ＡからＧ、ＴからＣ、及びＧからＡ）すべてをまとめて媒介することができる。Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ．２０１８．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９（１２）： ７７０－７８８（特に図１ｂ、２ａ～２ｃ、３ａ～３ｆ、及び表１）。いくつかの実施形態では、塩基編集系は、ＣＢＥ及び／またはＡＢＥを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所に記載の本発明のポリヌクレオチドは、塩基編集系を使用して修飾することができる。Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ．２０１８．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｔ．１９（１２）：７７０－７８８。塩基エディタはまた、一般に、ＤＮＡドナー鋳型を必要としない、及び／または相同性指向性修復に依存しない。Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ．５３３：４２０－４２４、Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５３及びＧａｕｄｅｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ．５５１：４６４－４７１。ＤＮＡ内の標的遺伝子座に結合すると、系のガイドＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖との間の塩基対合は、「Ｒループ」中のｓｓＤＮＡの小さなセグメントの置換をもたらす。Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１５６：９３５－９４９。ｓｓＤＮＡバブル内のＤＮＡ塩基は、デアミナーゼなどの酵素構成要素によって修飾される。いくつかの系では、触媒的に無効なＣａｓタンパク質は、変異型であり得るか、または修飾されたＣａｓは、ニッカーゼ官能性を有し得、編集されていないＤＮＡ鎖内でニックを生成して、編集された鎖を鋳型として使用して、細胞が編集されていない鎖を修復するように誘導し得る。Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ．５３３：４２０－４２４、Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５３及びＧａｕｄｅｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ．５５１：４６４－４７１。塩基エディタは、ヌクレオチド（例えば、Ａ：ＴからＧ：Ｃ）の変換を最適化するようにさらに操作され得る。Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４５３－ｚ。
他の例示的なタイプＶ塩基編集系は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／２１３７０８、ＷＯ２０１８／２１３７２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６７２０７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６７２２５、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６７３０７に記載されている。
ある特定の例示的な実施形態では、塩基編集系は、ＲＮＡ塩基編集系であり得る。ＤＮＡ塩基エディタと同様に、ヌクレオチド塩基を変換することができるヌクレオチドデアミナーゼは、Ｃａｓタンパク質に融合され得る。しかしながら、これらの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡに結合することができる必要がある。例示的なＲＮＡ結合Ｃａｓタンパク質には、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９（「ＦｎＣａｓ９」）、及びクラス２のタイプＶＩ Ｃａｓ系などのＲＮＡ結合Ｃａｓ９が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼ、またはシチジンデアミナーゼ活性を有するように操作されたアデノシンデアミナーゼであり得る。ある特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡベースのエディタを使用して、発現したｍＲＮＡにおける翻訳後修飾部位を欠失または導入することができる。修飾された細胞において編集が恒久的であるＤＮＡ塩基エディタとは対照的に、ＲＮＡ塩基エディタは、例えば、特定の免疫応答を調節する際に、より細かい時間的制御が必要とされ得る編集を提供することができる。タイプＶＩのＲＮＡ塩基編集系の例は、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８： １０１９－１０２７、ＷＯ２０１９／００５８８４、ＷＯ２０１９／００５８８６、ＷＯ２０１９／０７１０４８、ＰＣＴ／ＵＳ２００１８／０５１７９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６７２０７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＲＮＡ塩基編集目的に適合され得る例示的なＦｎＣａｓ９系は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ ２０１６／１０６２３６に記載されている。
ＣＢＥ及びＡＢＥを再構成可能な半分に分割するためのスプリットインテインアプローチの使用を含む、塩基編集系の送達のための例示的な方法は、参照により本明細書に組み込まれるＬｅｖｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４４１－０１９－０５０５－５（２０１９）に記載されている。
プライムエディタ
いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所に記載の本発明のポリヌクレオチドは、プライム編集系を使用して修飾することができる（例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔｕｒｅ．５７６：１４９－１５７）。塩基編集系と同様に、プライム編集系は、二本鎖切断を生成することなくポリヌクレオチドを標的修飾することができ、ドナー鋳型を必要としない。さらなるプライム編集系は、１２すべての可能な組み合わせ交換を行うことができる。プライム編集は、「検索及び置換」方法論を介して動作することができ、標的化挿入、欠失、１２すべての可能な塩基対塩基変換、及びそれらの組み合わせを媒介することができる。一般に、ＰＥ１、ＰＥ２、及びＰＥ３（同上）によって例示されるようなプライム編集系は、ＲＮＡプログラム可能ニッカーゼに融合されるか、またはそうでなければ結合されるか、または会合する逆転写酵素、及びｐｅｇＲＮＡ上の伸長部から標的ポリヌクレオチドへの遺伝情報の直接コピーを容易にするプライム編集伸長ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含み得る。本発明とともに使用することができる実施形態には、これら及びそれらの変異型が含まれる。プライム編集は、従来のＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓ系よりもオフターゲット活性が低く、同時に副産物が少なく、従来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と比較して効率がより高いまたは類似するという利点を有し得る。
いくつかの実施形態では、プライム編集ガイド分子は、標的ポリヌクレオチド情報（例えば、配列）を特定し、標的ポリヌクレオチドを置き換える新しいポリヌクレオチドカーゴを含有する両方を行うことができる。ガイド分子から標的ポリヌクレオチドへの転移を開始するために、ＰＥ系は、標的側で標的ポリヌクレオチドをニックして、３’ヒドロキシル基を露出させることができ、これにより、標的ポリヌクレオチド内の標的部位へのガイド分子（例えば、プライム編集ガイド分子またはｐｅｇガイド分子）の編集コード伸長領域の逆転写を直接プライムすることができる。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔｕｒｅ．５７６：１４９－１５７（特に、図１ｂ、１ｃ、関連する考察、及び補足的な考察）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、プライム編集系は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓポリペプチド、逆転写酵素、及びガイド分子から構成され得る。Ｃａｓポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠くことができる。ガイド分子は、標的結合配列、ならびにプライマー結合配列、及び編集されたポリヌクレオチド配列を含有する鋳型を含むことができる。ガイド分子、Ｃａｓポリペプチド、及び／または逆転写酵素は、一緒に結合するか、またはそうでなければ互いに会合して、エフェクター複合体を形成し、標的配列を編集することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、クラス２、タイプＶのＣａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、逆転写酵素に融合される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、逆転写酵素に連結される。
いくつかの実施形態では、プライム編集系は、ＰＥ１系またはその変異型、ＰＥ２系またはその変異型、またはＰＥ３（例えば、ＰＥ３、ＰＥ３ｂ）系であり得る。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔｕｒｅ．５７６：１４９－１５７（特に頁２～３、図２ａ、３ａ～３ｆ、４ａ～４ｂ、拡張データ図３ａ～３ｂ、４）を参照されたい。
ｐｅｇガイド分子は、約１０～２００ヌクレオチド長以上、例えば、１０～／または１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、もしくは２００以上ヌクレオチド長である。ｐｅｇガイド分子の最適化は、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔｕｒｅ．５７６：１４９－１５７（特に、頁３、図２ａ～２ｂ、及び拡張データ図５ａ～ｃ）に記載されるように達成され得る。
ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（ＣＡＳＴ）系
いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所所に記載の本発明のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（「ＣＡＳＴ」）系を使用して修飾することができる。ＣＡＳＴ系は、触媒的に不活性であるか、または触媒的に活性であるように操作されたＣａｓタンパク質を含み得、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ転位を触媒するトランスポザーゼ（またはそのサブユニット）をさらに含む。かかる系は、宿主細胞修復機構に依存することなく、ＤＮＡ分子内の標的部位にＤＮＡ配列を挿入することができる。ＣＡＳＴ系は、クラス１またはクラス２のＣＡＳＴ系であり得る。例示的なクラス１系は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１３２３に記載されている。例示的なクラス２系は、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１０／１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｘ９１８１ （２０１９）及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６６８３５に記載されている。
ガイド分子
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣａｓベースの系は、いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド分子を含むことができる。ガイド分子、ガイド配列、及びガイドポリヌクレオチドという用語は、Ｃａｓを標的ゲノム遺伝子座に誘導することができるポリヌクレオチドを指し、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の引用文献と同様に、同義に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指向するのに標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。ガイド分子は、ポリヌクレオチドであり得る。
ガイド配列（核酸標的化ガイドＲＮＡ内の）が核酸標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指向する能力は、任意の好適なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に、例えば、核酸標的化複合体の構成要素をコードするベクターでのトランスフェクション、続いて、例えば、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどによる標的核酸配列内の優先的標的化（例えば、切断）の評価により、提供され得る（Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．２００４．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３６（４）７０２－７０７）。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的化複合体の構成要素を提供し、試験と対照ガイド配列反応との間の標的配列での結合または切断速度を比較することによって、試験管内で評価されてもよい。他のアッセイが可能であり、当業者は着想するであろう。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、ＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣａｓベースの系に含まれるガイド分子（複数可）（本明細書では、ガイドポリヌクレオチド及びガイド配列とも同義に称される）は、標的核酸配列とハイブリダイズし、核酸標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指向するのに十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列であり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上、または約それ超であり得る。最適なアライメントは、配列をアライメントするための任意の好適なアルゴリズムの使用によって決定され得、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が含まれる。
ガイド配列、及びしたがって核酸標的化ガイドは、任意の標的核酸配列を標的とするように選択され得る。標的配列はＤＮＡであり得る。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び小細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドは、核酸標的化ガイド内の二次構造度を低減するように選択される。いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドの約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下、または約それ未満のヌクレオチドが、最適に折り畳まれた場合、自己相補的塩基対合に関与する。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定され得る。いくつかのプログラムは、最小ギブス自由エネルギーを計算することに基づいている。かかるアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）によって記載されているように、ｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、重心構造予測アルゴリズムを使用する、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＶｉｅｎｎａのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照）。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、直接反復（ＤＲ）配列及びガイド配列またはスペーサー配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合された、またはそれに連結された直接反復配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。ある特定の実施形態では、直接反復配列は、ガイド配列またはスペーサー配列から上流（すなわち、５’）に位置し得る。他の実施形態では、直接反復配列は、ガイド配列またはスペーサー配列から下流（すなわち、３’）に位置し得る。
ある特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。ある特定の実施形態では、直接反復配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１５～３５ｎｔである。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、スペーサー長は、１５～１７ｎｔ、例えば、１５、１６、もしくは１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、例えば、１７、１８、１９、もしくは２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、もしくは２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば、２３、２４、もしくは２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、例えば、２４、２５、２６、もしくは２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、例えば、２７、２８、２９、もしくは３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｔ、または３５ｎｔ以上である。
「ｔｒａｃｒＲＮＡ」配列または類似の用語は、ハイブリダイズするのにｃｒＲＮＡ配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、最適にアラインメントされたときの２つのうちの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒＲＮＡ配列とｃｒＲＮＡ配列との間の相補性の程度は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上、または約それを超える。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０以上、または約それを超えるヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列及びｃｒＲＮＡ配列は、２つの間のハイブリダイゼーションが、ヘアピンなどの二次構造を有する転写物を産生するように、単一の転写物内に含有される。
一般に、相補性の程度は、２つの配列のうちの短い方の長さに沿ったｓｃａ配列及びｔｒａｃｒ配列の最適なアライメントを参照する。最適なアライメントは、任意の好適なアライメントアルゴリズムによって決定され得、ｓｃａ配列またはｔｒａｃｒ配列のいずれか内の自己相補性などの二次構造をさらに説明し得る。いくつかの実施形態では、最適にアラインメントされたときの２つのうちの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｓｃａ配列との間の相補性の程度は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上、または約それを超える。
いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくは１００％、または約それ超であり得、ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５以上、または約それを超えるヌクレオチド長であり得るか、あるいはガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２未満、またはそれより少ないヌクレオチド長であり得、ｔｒａｃｒ ＲＮＡは、３０または５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％または９５％または９５．５％または９６％または９６．５％または９７％または９７．５％または９８％または９８．５％または９９％または９９．５％または９９．９％または１００％超である。オフターゲットは、配列とガイドとの間で１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％または９４％または９３％または９２％または９１％または９０％または８９％または８８％または８７％または８６％または８５％または８４％または８３％または８２％または８１％または８０％未満の相補性であり、オフターゲットは、配列とガイドとの間で１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％の相補性であることが有利である。
本発明によるいくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ（Ｃａｓを標的遺伝子座に誘導することができる）は、（１）真核生物細胞のゲノム標的遺伝子座にハイブリダイズすることができるガイド配列、（２）ｔｒａｃｒ配列、及び（３）ｔｒａｃｒメイト配列を含み得る。（１）～（３）すべては、単一のＲＮＡ、すなわち、ｓｇＲＮＡ（５’から３’方向に配置された）に存在し得るか、またはｔｒａｃｒ ＲＮＡは、ガイド及びｔｒａｃｒ配列を含有するＲＮＡとは異なるＲＮＡであり得る。ｔｒａｃｒは、ｔｒａｃｒメイト配列にハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的配列に指向する。ｔｒａｃｒ ＲＮＡが、ガイド及びｔｒａｃｒ配列を含有するＲＮＡとは異なるＲＮＡ上にある場合、各ＲＮＡの長さは、それらのそれぞれの天然長さから短縮されるように最適化されてもよく、各々は、細胞ＲＮａｓｅによる分解から保護するか、またはそうでなければ安定性を増加させるように独立して化学修飾されてもよい。
ガイド配列への多くの修飾は、当該技術分野で既知であり、本発明の文脈内でさらに企図される。標的配列への結合の特異性を増加させる、及び／またはＣａｓタンパク質の活性を増加させる、及び／またはオフターゲット効果を低減させるために、様々な修飾を使用することができる。例示的なガイド配列修飾は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ ＵＳ２０１９／０４５５８２、具体的には段落［０１７８］～［０３３３］に記載されている。
標的配列、ＰＡＭ、及びＰＦＳ
標的配列
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。「標的ＲＮＡ」という用語は、標的配列であるか、またはそれを含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。換言すれば、標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドであり得るか、またはガイド配列の一部が相補性を有するように設計され、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びガイド分子を含む複合体によって媒介されるエフェクター機能が指向されるポリヌクレオチドの一部であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質内に位置する。
ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列に特異的に結合することができる。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。標的ポリヌクレオチドは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など、またはそれ超）の標的配列を有することができる。標的ポリヌクレオチドは、ベクター上にあり得る。標的ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであり得る。標的ポリヌクレオチドは、エピソームであり得る。標的ポリヌクレオチドの他の形態は、本明細書の他の箇所に記載されている。
標的配列はＤＮＡであり得る。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び小細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列（本明細書では標的ポリヌクレオチドとも称される）は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列であり得る。
ＰＡＭ及びＰＦＳエレメント
ＰＡＭエレメントは、Ｃａｓタンパク質によって認識及び結合され得る配列である。その後、Ｃａｓタンパク質／エフェクター複合体は、ＰＡＭエレメントに隣接する位置でｄｓＤＮＡを巻き戻すことができる。ＲＮＡを標的とするＣａｓタンパク質及びそれらを含む系が、ＰＡＭ配列を必要としないことが理解されるであろう（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ．４６３：５６８－５７１）。代わりに、多くは、本明細書の他の箇所で考察されるＰＦＳに依存する。ある特定の実施形態では、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）またはＰＦＳ（プロトスペーサーフランキング配列または部位）、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列に関連付けられるべきである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の性質に応じて、標的配列は、ＤＮＡ二本鎖（本明細書では非標的配列とも称される）内のその相補配列がＰＡＭの上流または下流であるように選択されるべきである。実施形態では、標的配列の相補配列は、ＰＡＭの下流もしくは３’、またはＰＡＭの上流もしくは５’である。ＰＡＭの正確な配列及び長さ要件は、使用されるＣａｓタンパク質によって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサーに隣接する２～５塩基対配列（すなわち、標的配列）である。本明細書において異なるＣａｓタンパク質の天然ＰＡＭ配列の例を以下に提供し、当業者は、所与のＣａｓタンパク質とともに使用するためのさらなるＰＡＭ配列を特定することができるであろう。
異なるＰＡＭ配列を認識する能力は、系に含まれるＣａｓポリペプチド（複数可）に依存する。例えば、Ｇｌｅｄｉｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６（４）：５０４－５１７を参照されたい。以下の表３は、いくつかのＣａｓポリペプチド及びそれらが認識するＰＡＭ配列を示す。
好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、３’ＰＡＭを認識し得る。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、５’Ｈである３’ＰＡＭを認識し得、Ｈは、Ａ、Ｃ、またはＵである。
さらに、Ｃａｓタンパク質上のＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの操作は、例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＢＰ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１－５．ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４５９２においてＣａｓ９について記載されている、ＰＡＭ特異性のプログラミングを可能にし、標的部位認識忠実度を改善し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の汎用性を増加させ得る。本明細書にさらに詳述されるように、当業者は、Ｃａｓ１３タンパク質が類似して修飾され得ることを理解するであろう。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｐｆ１ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，”ｂｉｏＲｘｉｖ ０９１６１１；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９１６１１（Ｄｅｃ．４，２０１６）。Ｄｏｅｎｃｈらは、ｓｇＲＮＡのプールを作製し、６つの内因性マウス及び３つの内因性ヒト遺伝子のパネルのすべての可能な標的部位にわたってタイリングし、抗体染色及びフローサイトメトリーによってそれらの標的遺伝子のヌル対立遺伝子を産生する能力を定量的に評価した。著者らは、ＰＡＭの最適化が活性を改善することを示し、ｓｇＲＮＡを設計するためのオンラインツールも提供した。
ＰＡＭ配列は、オンラインだけでなく市販されており、適切な設計ツールを使用して、ポリヌクレオチドにおいて特定され得る。かかる自由に入手可能なツールには、ＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒ及びＣＲＩＳＰＲＴａｒｇｅｔが含まれるが、これらに限定されない。Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５（Ｐｔ．３）：７３３－７４０、Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｂｉｓｗａｓｓ ｅｔ ａｌ．２０１３ ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１０：８１７－８２７、及びＧｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５：Ｗ５２－５７。ＰＡＭ特定に対する実験的アプローチは、プラスミド枯渇アッセイ（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０：１１１６－１１２１、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｎａｔｕｒｅ．５２３：４８１－４８５）（ＰＡＭ－ＳＣＮＡＲと呼ばれるハイスループットインビボモデルによってスクリーニングされる）（Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３９－８４３及びＬｅｅｎａｙ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６：２５３）、及びネガティブスクリーニング（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ．１６３：７５９－７７１）を含み得るが、これらに限定されない。
前述のように、ＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、典型的にはＰＡＭ配列に依存しない。代わりに、かかる系は、典型的には、ＰＡＭの代わりにプロトスペーサーフランキング部位（ＰＦＳ）を認識する。したがって、タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、典型的には、ＰＡＭの代わりにプロトスペーサーフランキング部位（ＰＦＳ）を認識する。ＰＦＳは、ＲＮＡ標的のＰＡＭに類似している。タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｃａｓ１３を用いる。Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉから特定されたＣａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）（ＬＳｈＣＡｓ１３ａ）などの、今日までに分析されたいくつかのＣａｓ１３タンパク質は、標的ＲＮＡの３’末端でＧに対して特異的な識別を有する。対応するｃｒＲＮＡ反復部位にＣが存在することは、この位置でのヌクレオチド対合が拒絶されることを示すことができる。しかしながら、いくつかのＣａｓ１３タンパク質（例えば、ＬｗａＣＡｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂ）は、ＰＦＳ嗜好性を有さないようである。例えば、Ｇｌｅｄｉｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６（４）：５０４－５１７を参照されたい。
サブタイプＢなどのいくつかのタイプＶＩタンパク質は、Ｄ（Ｇ、Ｔ、Ａ）の５’認識及びＮＡＮまたはＮＮＡの３’モチーフ要件を有する。一例は、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍで特定されたＣａｓ１３ｂタンパク質（ＢｚＣａｓ１３ｂ）である。例えば、Ｇｌｅｄｉｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６（４）：５０４－５１７を参照されたい。
全体的なタイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＤＮＡを標的とするもの（例えば、タイプＶ及びタイプＩＩ）よりも基質（例えば、標的配列）認識に対して制限規則が少ないようである。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはその系を使用して修飾される。プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインのタイプの１つは、ゲノム内の新しいＤＮＡ結合部位を標的とするためのＺＦモジュールのアレイを伴う、人工ジンクフィンガー（ＺＦ）技術によって提供される。ＺＦアレイの各フィンガーモジュールは、３つのＤＮＡ塩基を標的とする。個々のジンクフィンガードメインのカスタマイズされたアレイを、ＺＦタンパク質（ＺＦＰ）に組み立てる。
ＺＦＰは、機能性ドメインを含むことができる。最初の合成ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＺＦタンパク質をＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩの触媒ドメインに融合することにより開発された。（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，８８３－８８７、Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ Ｆｏｋ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｏｍａｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，１１５６－１１６０）。増加した切断特異性は、各々が短いスペーサーによって分離された異なるヌクレオチド配列を標的とする、対合したＺＦＮヘテロ二量体の使用によって、減少したオフターゲット活性によって達成することができる。（Ｄｏｙｏｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ－ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｂｌｉｇａｔｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，７４－７９）。ＺＦＰはまた、転写活性化因子及び抑制因子として設計することができ、多種多様の生物における多くの遺伝子を標的とするために使用されている。ＺＦＮを使用したゲノム編集の例示的な方法は、例えば、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，７４６，８３８号、同第６，７９４，１３６号、同第６，８２４，９７８号、同第６，８６６，９９７号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、同第７，０３０，２１５号、同第７，２２０，７１９号、同第７，２４１，５７３号、同第７，２４１，５７４号、同第７，５８５，８４９号、同第７，５９５，３７６号、同第６，９０３，１８５、及び同第６，４７９，６２６号に見出され、これらのすべては、参照により具体的に組み込まれる。
ＴＡＬＥヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ系を使用して、ポリヌクレオチドを修飾することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、ＴＡＬＥ単量体、または効率が改善され、特異性が拡大した核酸配列の標的化を可能にする組織化構造の一部としてのＴＡＬＥ単量体もしくは半単量体を含む、単離された、天然に存在しない、組換え、または操作されたＤＮＡ結合タンパク質を使用する。
天然に存在するＴＡＬＥまたは「野生型ＴＡＬＥ」は、多数の種のプロテオバクテリアによって分泌される核酸結合タンパク質である。ＴＡＬＥポリペプチドは、長さが主に３３、３４、または３５アミノ酸であり、主にアミノ酸の１２位及び１３位で互いに異なる、高度に保存された単量体ポリペプチドのタンデム反復から構成される核酸結合ドメインを含有する。有利な実施形態では、核酸はＤＮＡである。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド単量体」、「ＴＡＬＥ単量体」、または「単量体」という用語は、ＴＡＬＥ核酸結合ドメイン内の高度に保存された反復性ポリペプチド配列を指すために使用され、「反復可変ジ残基」または「ＲＶＤ」という用語は、ポリペプチド単量体の１２位及び１３位の高度に可変のアミノ酸を指すために使用される。本開示全体を通して提供されるように、ＲＶＤのアミノ酸残基は、アミノ酸のＩＵＰＡＣ単一文字コードを使用して示される。ＤＮＡ結合ドメイン内に含まれるＴＡＬＥ単量体の一般的な表示は、Ｘ１－１１－（Ｘ１２Ｘ１３）－Ｘ１４－３３または３４もしくは３５であり、下付き文字はアミノ酸位置を示し、Ｘは任意のアミノ酸を表す。Ｘ１２Ｘ１３はＲＶＤを示す。いくつかのポリペプチド単量体では、１３位の可変アミノ酸は欠損または不在であり、かかる単量体では、ＲＶＤは単一のアミノ酸からなる。かかる場合、ＲＶＤは、Ｘ＊として代替的に表されてもよく、Ｘは、Ｘ１２を表し、（＊）は、Ｘ１３が不在であることを示す。ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ単量体のいくつかの反復を含み、これは、（Ｘ１－１１－（Ｘ１２Ｘ１３）－Ｘ１４－３３または３４もしくは３５）ｚとして表されてもよく、有利な実施形態では、ｚは、少なくとも５～４０である。さらなる有利な実施形態では、ｚは、少なくとも１０～２６である。
ＴＡＬＥ単量体は、そのＲＶＤ中のアミノ酸の同一性によって決定されるヌクレオチド結合親和性を有し得る。例えば、ＮＩのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、アデニン（Ａ）に優先的に結合することができ、ＮＧのＲＶＤを有する単量体は、チミン（Ｔ）に優先的に結合することができ、ＨＤのＲＶＤを有する単量体は、シトシン（Ｃ）に優先的に結合することができ、ＮＮのＲＶＤを有する単量体は、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）の両方に優先的に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＩＧのＲＶＤを有する単量体は、Ｔに優先的に結合することができる。したがって、ＴＡＬＥの核酸結合ドメイン内のポリペプチド単量体の反復の数及び順序は、その核酸標的特異性を決定する。いくつかの実施形態では、ＮＳのＲＶＤを有する単量体は、４つすべての塩基対を認識することができ、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣに結合することができる。ＴＡＬＥの構造及び機能は、例えば、Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１（２００９）、Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２（２００９）、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）にさらに記載されている。
本発明の方法で使用されるポリペプチドは、特定の核酸配列を標的とするように設計されたポリペプチド単量体反復を含有する核酸またはＤＮＡ結合領域を有する単離された、天然に存在しない、組換え、または操作された核酸結合タンパク質であり得る。
本明細書に記載されるように、ＨＮまたはＮＨのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、グアニンに優先的に結合し、それにより、グアニン含有標的核酸配列に対して高い結合特異性を有するＴＡＬＥポリペプチドの生成を可能にする。いくつかの実施形態では、ＲＶＤ ＲＮ、ＮＮ、ＮＫ、ＳＮ、ＮＨ、ＫＮ、ＨＮ、ＮＱ、ＨＨ、ＲＧ、ＫＨ、ＲＨ、及びＳＳを有するポリペプチド単量体は、グアニンに優先的に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＲＶＤ ＲＮ、ＮＫ、ＮＱ、ＨＨ、ＫＨ、ＲＨ、ＳＳ、及びＳＮを有するポリペプチドモノマーは、グアニンに優先的に結合することができ、したがって、グアニン含有標的核酸配列に対して高い結合特異性を有するＴＡＬＥポリペプチドの生成を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、ＲＶＤ ＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、及びＳＳを有するポリペプチド単量体は、グアニンに優先的に結合することができ、それにより、グアニン含有標的核酸配列に対して高い結合特異性を有するＴＡＬＥポリペプチドの生成を可能にする。いくつかの実施形態では、グアニンに対する高い結合特異性を有するＲＶＤは、ＲＮ、ＮＨ ＲＨ、及びＫＨである。さらに、ＮＶのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、アデニン及びグアニンに優先的に結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｈ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、及びＳ＊のＲＶＤを有する単量体は、同等の親和性でアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンに結合する。
核酸またはＤＮＡ結合ドメインの１つ以上のポリペプチド単量体の所定のＮ末端からＣ末端の順序は、本発明のポリペプチドが結合する対応する所定の標的核酸配列を決定する。本明細書で使用される場合、単量体及び少なくとも１つ以上の半単量体は、目的の遺伝子座または遺伝子を「標的とするように特異的に順序付けられている」。植物ゲノムでは、天然のＴＡＬＥ結合部位は常に、ＴＡＬＥポリペプチドの非反復Ｎ末端内の潜在性シグナル（ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ）によって特定され得るチミン（Ｔ）で始まり、場合によっては、この領域は、反復０と称され得る。動物ゲノムでは、ＴＡＬＥ結合部位は必ずしもチミン（Ｔ）で始まる必要はなく、本発明のポリペプチドは、Ｔ、Ａ、Ｇ、またはＣで始まるＤＮＡ配列を標的とし得る。ＴＡＬＥ単量体のタンデム反復は、常に、反復性完全長ＴＡＬＥ単量体の最初の２０のアミノ酸のみと同一性を共有し得る配列の半分長の反復または伸長で終わり、この半分の反復は、半単量体と称され得る。したがって、標的とされる核酸またはＤＮＡの長さは、完全な単量体の数＋２に等しい。
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）に記載されるように、ＴＡＬＥポリペプチド結合効率は、直接天然に存在するＴＡＬＥのＤＮＡ結合領域のＮ末端またはＣ末端である「キャッピング領域」からのアミノ酸配列を、操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合領域のＮ末端またはＣ末端の位置にある操作されたＴＡＬＥに含めることによって増加し得る。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドは、Ｎ末端キャッピング領域及び／またはＣ末端キャッピング領域をさらに含む。
Ｎ末端キャッピング領域の例示的なアミノ酸配列は、以下である。
Ｍ Ｄ Ｐ Ｉ Ｒ Ｓ Ｒ Ｔ Ｐ Ｓ Ｐ Ａ Ｒ Ｅ Ｌ Ｌ Ｓ Ｇ Ｐ Ｑ Ｐ Ｄ Ｇ Ｖ Ｑ Ｐ Ｔ Ａ Ｄ Ｒ Ｇ Ｖ Ｓ Ｐ Ｐ Ａ Ｇ Ｇ Ｐ Ｌ Ｄ Ｇ Ｌ Ｐ Ａ Ｒ Ｒ Ｔ Ｍ Ｓ Ｒ Ｔ Ｒ Ｌ Ｐ Ｓ Ｐ Ｐ Ａ Ｐ Ｓ Ｐ Ａ Ｆ Ｓ Ａ Ｄ Ｓ Ｆ Ｓ Ｄ Ｌ Ｌ Ｒ Ｑ Ｆ Ｄ Ｐ Ｓ Ｌ Ｆ Ｎ Ｔ Ｓ Ｌ Ｆ Ｄ Ｓ Ｌ Ｐ Ｐ Ｆ Ｇ Ａ Ｈ Ｈ Ｔ Ｅ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｅ Ｗ Ｄ Ｅ Ｖ Ｑ Ｓ Ｇ Ｌ Ｒ Ａ Ａ Ｄ Ａ Ｐ Ｐ Ｐ Ｔ Ｍ Ｒ Ｖ Ａ Ｖ Ｔ Ａ Ａ Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ Ａ Ｋ Ｐ Ａ Ｐ Ｒ Ｒ Ｒ Ａ Ａ Ｑ Ｐ Ｓ Ｄ Ａ Ｓ Ｐ Ａ Ａ Ｑ Ｖ Ｄ Ｌ Ｒ Ｔ Ｌ Ｇ Ｙ Ｓ Ｑ Ｑ Ｑ Ｑ Ｅ Ｋ Ｉ Ｋ Ｐ Ｋ Ｖ Ｒ Ｓ Ｔ Ｖ Ａ Ｑ Ｈ Ｈ Ｅ Ａ Ｌ Ｖ Ｇ Ｈ Ｇ Ｆ Ｔ Ｈ Ａ Ｈ Ｉ Ｖ Ａ Ｌ Ｓ Ｑ Ｈ Ｐ Ａ Ａ Ｌ Ｇ Ｔ Ｖ Ａ Ｖ Ｋ Ｙ Ｑ Ｄ Ｍ Ｉ Ａ Ａ Ｌ Ｐ Ｅ Ａ Ｔ Ｈ Ｅ Ａ Ｉ Ｖ Ｇ Ｖ Ｇ Ｋ Ｑ Ｗ Ｓ Ｇ Ａ Ｒ Ａ Ｌ Ｅ Ａ Ｌ Ｌ Ｔ Ｖ Ａ Ｇ Ｅ Ｌ Ｒ Ｇ Ｐ Ｐ Ｌ Ｑ Ｌ Ｄ Ｔ Ｇ Ｑ Ｌ Ｌ Ｋ Ｉ Ａ Ｋ Ｒ Ｇ Ｇ Ｖ Ｔ Ａ Ｖ Ｅ Ａ Ｖ Ｈ Ａ Ｗ Ｒ Ｎ Ａ Ｌ Ｔ Ｇ Ａ Ｐ Ｌ Ｎ （配列番号３）
Ｃ末端キャッピング領域の例示的なアミノ酸配列は、以下である。
Ｒ Ｐ Ａ Ｌ Ｅ Ｓ Ｉ Ｖ Ａ Ｑ Ｌ Ｓ Ｒ Ｐ Ｄ Ｐ Ａ Ｌ Ａ Ａ Ｌ Ｔ Ｎ Ｄ Ｈ Ｌ Ｖ Ａ Ｌ Ａ Ｃ Ｌ Ｇ Ｇ Ｒ Ｐ Ａ Ｌ Ｄ Ａ Ｖ Ｋ Ｋ Ｇ Ｌ Ｐ Ｈ Ａ Ｐ Ａ Ｌ Ｉ Ｋ Ｒ Ｔ Ｎ Ｒ Ｒ Ｉ Ｐ Ｅ Ｒ Ｔ Ｓ Ｈ Ｒ Ｖ Ａ Ｄ Ｈ Ａ Ｑ Ｖ Ｖ Ｒ Ｖ Ｌ Ｇ Ｆ Ｆ Ｑ Ｃ Ｈ Ｓ Ｈ Ｐ Ａ Ｑ Ａ Ｆ Ｄ Ｄ Ａ Ｍ Ｔ Ｑ Ｆ Ｇ Ｍ Ｓ Ｒ Ｈ Ｇ Ｌ Ｌ Ｑ Ｌ Ｆ Ｒ Ｒ Ｖ Ｇ Ｖ Ｔ Ｅ Ｌ Ｅ Ａ Ｒ Ｓ Ｇ Ｔ Ｌ Ｐ Ｐ Ａ Ｓ Ｑ Ｒ Ｗ Ｄ Ｒ Ｉ Ｌ Ｑ Ａ Ｓ Ｇ Ｍ Ｋ Ｒ Ａ Ｋ Ｐ Ｓ Ｐ Ｔ Ｓ Ｔ Ｑ Ｔ Ｐ Ｄ Ｑ Ａ Ｓ Ｌ Ｈ Ａ Ｆ Ａ Ｄ Ｓ Ｌ Ｅ Ｒ Ｄ Ｌ Ｄ Ａ Ｐ Ｓ Ｐ Ｍ Ｈ Ｅ Ｇ Ｄ Ｑ Ｔ Ｒ Ａ Ｓ （配列番号４）
本明細書で使用される場合、Ｎ末端キャッピング領域の所定の「Ｎ末端」から「Ｃ末端」方向、反復ＴＡＬＥ単量体を含むＤＮＡ結合ドメイン、及びＣ末端キャッピング領域は、本発明のｄ－ＴＡＬＥまたはポリペプチドにおける異なるドメインの組織化のための構造的基盤を提供する。
Ｎ末端及び／またはＣ末端キャッピング領域全体は、ＤＮＡ結合領域の結合活性を増強するために必要ではない。したがって、ある特定の実施形態では、Ｎ末端及び／またはＣ末端キャッピング領域の断片は、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドに含まれる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドは、Ｎ末端キャッピング領域の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、５４、６０、７０、８０、８７、９０、９４、１００、１０２、１１０、１１７、１２０、１３０、１４０、１４７、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、または２７０アミノ酸を含むＮ末端キャッピング領域断片を含有する。ある特定の実施形態では、Ｎ末端キャッピング領域断片アミノ酸は、Ｎ末端キャッピング領域のＣ末端（ＤＮＡ結合領域近位端）のものである。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）に記載されるように、Ｃ末端の２４０のアミノ酸を含むＮ末端キャッピング領域断片は、完全長キャッピング領域に等しい結合活性を増強する一方で、Ｃ末端１４７アミノ酸を含む断片は、完全長キャッピング領域の有効性の８０％超を保持し、Ｃ末端の１１７のアミノ酸を含む断片は、完全長キャッピング領域の活性の５０％超を保持する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドは、Ｃ末端キャッピング領域の少なくとも６、１０、２０、３０、３７、４０、５０、６０、６８、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２７、１３０、１４０、１５０、１５５、１６０、１７０、１８０アミノ酸を含むＣ末端キャッピング領域断片を含有する。ある特定の実施形態では、Ｃ末端キャッピング領域断片のアミノ酸は、Ｃ末端キャッピング領域のＮ末端（ＤＮＡ結合領域近位端）のものである。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）に記載されるように、Ｃ末端の６８のアミノ酸を含むＣ末端キャッピング領域断片は、完全長キャッピング領域に等しい結合活性を増強する一方で、Ｃ末端の２０のアミノ酸を含む断片は、完全長キャッピング領域の有効性の５０％超を保持する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのキャッピング領域は、本明細書に提供されるキャッピング領域の配列と同一の配列を有する必要はない。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのキャッピング領域は、本明細書に提供されるキャッピング領域のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または同一性を共有する配列を有する。配列同一性は、配列相同性に関連する。相同性比較は、眼で、またはより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行われ得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性パーセント（％）を計算してもよく、２つ以上のアミノ酸または核酸配列によって共有される配列同一性を計算してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのキャッピング領域は、本明細書に提供されるキャッピング領域のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるか、または同一性を共有する配列を有する。
配列相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知のいくつかのコンピュータプログラムのうちのいずれかによって生成され得る。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージのようなアライメントを実行するための好適なコンピュータプログラムも使用することができる。ソフトウェアが最適なアライメントを生成したら、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。ソフトウェアは典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＴＡＬＥポリペプチドは、１つ以上のエフェクタードメインに連結された核酸結合ドメインを含む。「エフェクタードメイン」または「調節及び機能性ドメイン」という用語は、核酸結合ドメインによって認識される核酸配列への結合以外の活性を有するポリペプチド配列を指す。核酸結合ドメインを１つ以上のエフェクタードメインと組み合わせることにより、本発明のポリペプチドは、エフェクタードメインによって媒介される１つ以上の機能または活性を、核酸結合ドメインが特異的に結合する特定の標的ＤＮＡ配列に標的化するように使用され得る。
本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのいくつかの実施形態では、エフェクタードメインによって媒介される活性は、生物学的活性である。例えば、いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ｍＳｉｎ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）などの転写阻害剤（すなわち、抑制因子ドメイン）である。ＳＩＤ４ＸドメインまたはＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）またはＫＲＡＢドメインの断片。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、またはｐ６５活性化ドメインなどの転写エンハンサー（すなわち、活性化ドメイン）である。いくつかの実施形態では、核酸結合は、例えば、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、インベルターゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヌクレアーゼ、転写抑制因子、転写活性化因子、転写因子動員、タンパク質核局在化シグナル、または細胞取り込みシグナルを含むが、これらに限定されないエフェクタードメインと連結される。
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、リゾルバーゼ活性、インベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、核局在化シグナル伝達活性、転写抑制因子活性、転写活性化因子活性、転写因子動員活性、または細胞取り込みシグナル伝達活性を含むがこれらに限定されない活性を示すタンパク質ドメインである。本発明の他の好ましい実施形態は、本明細書に記載の活性の任意の組み合わせを含み得る。
メガヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼまたはその系を使用して、ポリヌクレオチドを修飾することができる。大きな認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドオデオキシリボヌクレアーゼであるメガヌクレアーゼ。メガヌクレアーゼを使用するための例示的な方法は、参照により具体的に組み込まれる米国特許第８，１６３，５１４号、同第８，１３３，６９７号、同第８，０２１，８６７号、同第８，１１９，３６１号、第８，１１９，３８１号、同第８，１２４，３６９号、及び同第８，１２９，１３４号に見出すことができる。
核標的化及び輸送に関連する配列
いくつかの実施形態では、細胞を操作するための組成物中の１つ以上の構成要素（例えば、Ｃａｓタンパク質及び／またはデアミナーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ、またはメガヌクレアーゼ）は、核標的化及び輸送に関連する１つ以上の配列を含み得る。かかる配列は、組成物中の１つ以上の構成要素が、細胞内の配列を標的化するのを容易にし得る。本開示の方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはそのヌクレオチドデアミナーゼタンパク質もしくは触媒ドメインの核への標的化を改善するために、これらの構成要素の一方または両方に１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を提供することが有利であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示の文脈で使用されるＮＬＳは、タンパク質に対して異種である。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号６）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号７）を有するヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号８）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号９）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１０）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン－α由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１１）、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１２）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１３）、ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１４）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１５）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１６）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１７）、肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１８）、マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１９）、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２０）、ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号２１）に由来するＮＬＳ配列を含む。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核生物細胞の核内で検出可能な量でＤＮＡ標的化Ｃａｓタンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有するものである。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ（複数可）、またはこれらの因子の組み合わせに由来し得る。核内の蓄積の検出は、任意の好適な技法によって行われ得る。例えば、検出可能なマーカーは、細胞内の位置が、核の位置を検出するための手段（例えば、ＤＡＰＩなどの核に特異的な染色）などと組み合わせて視覚化され得るように、核酸標的化タンパク質に融合され得る。細胞核はまた、細胞から単離されてもよく、その内容物は次いで、免疫組織化学、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイなどのタンパク質を検出するための任意の好適なプロセスによって分析され得る。核内の蓄積はまた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質に曝露されていない対照、または１つ以上のＮＬＳを欠くＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及び／またはデアミナーゼタンパク質に曝露された対照と比較して、標的配列における核酸標的化複合体形成（例えば、デアミナーゼ活性についてのアッセイ）の効果についてのアッセイ、またはＤＮＡ標的化複合体形成及び／またはＤＮＡ標的化によって影響を受ける遺伝子発現活性の変化についてのアッセイなどによって間接的に決定されてもよい。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及び／またはヌクレオチドデアミナーゼタンパク質には、１つ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異種ＮＬＳが提供され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、アミノ末端またはその付近の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上または約それを超えるＮＬＳ、カルボキシ末端またはその付近の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上または約それを超えるＮＬＳ、またはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端のゼロまたは少なくとも１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端のゼロまたは１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、単一のＮＬＳが２つ以上のコピーに、及び／または１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在し得るように、各々が他のものとは独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳの最も近いアミノ酸が、ＮまたはＣ末端からのポリペプチド鎖に沿って、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０以上のアミノ酸内にあるとき、ＮＬＳは、ＮまたはＣ末端の近くにあるとみなされる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の好ましい実施形態では、タンパク質のＣ末端に結合したＮＬＳ。
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質は、細胞に送達されるか、または細胞内で別個のタンパク質として発現される。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及びデアミナーゼタンパク質の各々に、本明細書に記載される１つ以上のＮＬＳが提供され得る。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及びデアミナーゼタンパク質は、細胞に送達されるか、または融合タンパク質として細胞で発現される。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及びデアミナーゼタンパク質の一方または両方に、１つ以上のＮＬＳが提供される。上述のようにヌクレオチドデアミナーゼがアダプタータンパク質（ＭＳ２など）に融合される場合、アプタマー結合を妨害しない限り、１つ以上のＮＬＳがアダプタータンパク質上に提供され得る。特定の実施形態では、１つ以上のＮＬＳ配列は、ヌクレオチドデアミナーゼとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質との間のリンカー配列としても機能し得る。
ある特定の実施形態では、本開示のガイドは、ヌクレオチドデアミナーゼまたはその触媒ドメインに連結または融合され得るアダプタータンパク質の特定の結合部位（例えば、アプタマー）を含む。かかるガイドがＣＲＩＳＰＲ複合体（例えば、ガイド及び標的に結合するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質）を形成する場合、アダプタータンパク質は結合し、アダプタータンパク質と会合したヌクレオチドデアミナーゼまたはその触媒ドメインは、属性化された機能が有効であるために有利な空間的配向に配置される。
当業者は、アダプター＋ヌクレオチドデアミナーゼの結合を可能にするが、アダプター＋ヌクレオチドデアミナーゼの適切な配置を可能にしない（例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の三次元構造内の立体障害に起因する）ガイドへの修飾は、意図されていない修飾であることを理解するであろう。１つ以上の修飾されたガイドは、本明細書に記載されるように、テトラループ、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３で、好ましくはテトラループまたはステムループ２のいずれかで、ならびに場合によってはテトラループ及びステムループ２の両方で修飾され得る。
いくつかの実施形態では、系の構成要素（例えば、死Ｃａｓタンパク質、ヌクレオチドデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、またはそれらの組み合わせ）は、１つ以上の核排出シグナル（ＮＥＳ）、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。場合によっては、ＮＥＳは、ＨＩＶ Ｒｅｖ ＮＥＳであり得る。ある特定の場合では、ＮＥＳは、ＭＡＰＫ ＮＥＳであり得る。構成要素がタンパク質である場合、ＮＥＳまたはＮＬＳは、構成要素のＣ末端にあってもよい。代替的に、または追加的に、ＮＥＳまたはＮＬＳは、構成要素のＮ末端にあってもよい。いくつかの例では、Ｃａｓタンパク質、及び任意に当該ヌクレオチドデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、１つ以上の異種核排出シグナル（複数可）（ＮＥＳ（複数可））または核局在化シグナル（複数可）（ＮＬＳ（複数可））、好ましくはＨＩＶ Ｒｅｖ ＮＥＳまたはＭＡＰＫ ＮＥＳ、好ましくはＣ末端を含む。
鋳型
いくつかの実施形態では、細胞を操作するための組成物は、鋳型、例えば、組換え鋳型を含む。鋳型は、本明細書に記載の別のベクターの構成要素であるか、別個のベクターに含有されるか、または別個のポリヌクレオチドとして提供されてもよい。いくつかの実施形態では、組換え鋳型は、核酸標的化エフェクタータンパク質によって、核酸標的化複合体の一部としてニックされるか、または切断される標的配列内またはその付近などの相同組換えにおける鋳型として機能するように設計される。
実施形態では、鋳型核酸は、標的位置の配列を変更する。実施形態では、鋳型核酸は、修飾されたまたは天然に存在しない塩基の標的核酸への組み込みをもたらす。
鋳型配列は、標的配列との破損媒介または触媒組換えを受ける場合がある。実施形態では、鋳型核酸は、Ｃａｓタンパク質媒介切断事象によって切断される標的配列上の部位に対応する配列を含み得る。実施形態では、鋳型核酸は、両方に対応する配列、第１のＣａｓタンパク質媒介事象で切断される標的配列上の第１の部位、及び第２のＣａｓタンパク質媒介事象で切断される標的配列上の第２の部位を含み得る。
ある特定の実施形態では、鋳型核酸は、翻訳された配列のコード配列に変更をもたらす配列、例えば、タンパク質産物中のあるアミノ酸の別のアミノ酸への置換、例えば、変異体対立遺伝子の野生型対立遺伝子への形質転換、野生型対立遺伝子の変異体対立遺伝子への形質転換、及び／または停止コドンの導入、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、またはナンセンス変異をもたらす配列を含み得る。ある特定の実施形態では、鋳型核酸は、非コード配列の変更、例えば、エクソンの変更、または５’もしくは３’非翻訳もしくは非転写領域の変更をもたらす配列を含み得る。かかる変更は、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーの変更、及びシス作用またはトランス作用制御エレメントの変更を含む。
標的遺伝子における標的位置と相同性を有する鋳型核酸を使用して、標的配列の構造を変更することができる。鋳型配列を使用して、望ましくない構造、例えば、望ましくないまたは変異体ヌクレオチドを変更することができる。鋳型核酸は、組み込まれた場合、陽性対照エレメントの活性を減少させる、陽性対照エレメントの活性を増加させる、陰性対照エレメントの活性を減少させる、陰性対照エレメントの活性を増加させる、遺伝子の発現を減少させる、遺伝子の発現を増加させる、障害もしくは疾患に対する耐性を増加させる、ウイルス侵入に対する耐性を増加させる、遺伝子産物の生物学的特性を付与する、増加させる、消失させる、もしくは減少させる、例えば、酵素の酵素活性を増加させる、もしくは遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力を増加させる変異を補正するか、または望ましくないアミノ酸残基を変更する配列を含み得る。
鋳型核酸は、標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のヌクレオチドの配列の変化をもたらす配列を含み得る。
テンプレートポリヌクレオチドは、約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００以上、または約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００超以上のヌクレオチド長などの任意の好適な長さのものであってもよい。実施形態では、鋳型核酸は、２２０＋／－１０ヌクレオチド長の２０＋／－１０、３０＋／－１０、４０＋／－１０、５０＋／－１０、６０＋／－１０、７０＋／－１０、８０＋／－１０、９０＋／－１０、１００＋／－１０、１１０＋／－１０、１２０＋／－１０、１３０＋／－１０、１４０＋／－１０、１５０＋／－１０、１６０＋／－１０、１７０＋／－１０、１８０＋／－１０、１９０＋／－１０、２００＋／－１０、２１０＋／－１０ヌクレオチド長であり得る。実施形態では、鋳型核酸は、２２０＋／－２０ヌクレオチド長の３０＋／－２０、４０＋／－２０、５０＋／－２０、６０＋／－２０、７０＋／－２０、８０＋／－２０、９０＋／－２０、１００＋／－２０、１１０＋／－２０、１２０＋／－２０、１３０＋／－２０、１４０＋／－２０、１５０＋／－２０、１６０＋／－２０、１７０＋／－２０、１８０＋／－２０、１９０＋／－２０、２００＋／－２０、２１０＋／－２０ヌクレオチド長であり得る。実施形態では、鋳型核酸は、１０～１，０００、２０～９００、３０～８００、４０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、または５０～１００ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部分に相補的である。最適にアラインメントされた場合、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上、または約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００超以上のヌクレオチド）と重複し得る。いくつかの実施形態では、鋳型配列及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアライメントされた場合、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００以上のヌクレオチド内にある。
外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれる配列（例えば、変異した遺伝子）を含む。組み込みのための配列は、細胞に内因性または外因性の配列であり得る。組み込まれる配列の例としては、タンパク質または非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。したがって、組み込みのための配列は、適切な制御配列（複数可）に作動可能に連結され得る。代替的に、組み込まれる配列は、調節機能を提供し得る。
上流または下流配列は、約２０ｂｐ～約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または２５００ｂｐを含み得る。いくつかの方法では、例示的な上流または下流配列は、約２００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ～約１０００ｂｐ、またはより具体的には約７００ｂｐ～約１０００ｂｐを有する。
上流または下流配列は、約２０ｂｐ～約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または２５００ｂｐを含み得る。いくつかの方法では、例示的な上流または下流配列は、約２００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ～約１０００ｂｐ、またはより具体的には約７００ｂｐ～約１０００ｂｐを有する。
ある特定の実施形態では、一方または両方の相同性アームは、ある特定の配列反復エレメントを含めることを回避するために短縮され得る。例えば、５’相同性アームは、配列反復エレメントを回避するために短縮され得る。他の実施形態では、３’相同性アームは、配列反復エレメントを回避するために短縮され得る。いくつかの実施形態では、５’及び３’相同性アームの両方は、ある特定の配列反復エレメントを含むことを回避するために短縮され得る。
いくつかの方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含んでもよい。かかるマーカーは、標的化組み込みのスクリーニングを簡単にし得る。好適なマーカーの例には、制限部位、蛍光タンパク質、または選択可能なマーカーが含まれる。本開示の外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組換え技法を使用して構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照）。
ある特定の実施形態では、変異を補正するための鋳型核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドとして使用するように設計され得る。一本鎖オリゴヌクレオチドを使用する場合、５’及び３’相同性アームは、長さが最大約２００塩基対（ｂｐ）の範囲、例えば、長さが少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｂｐであり得る。
ある特定の実施形態では、変異を補正するための鋳型核酸は、相同性非依存標的化組み込み系とともに使用するように設計され得る。Ｓｕｚｕｋｉらは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同性非依存標的化組み込みによるインビボゲノム編集を記載する（２０１６，Ｎａｔｕｒｅ ５４０：１４４－１４９）。Ｓｃｈｍｉｄ－Ｂｕｒｇｋらは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用して、ユーザ定義のゲノム位置に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、ユニバーサルドナーＤＮＡを挿入することを記載する（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ｊｕｌ ２８；７：１２３３８）。Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．ｄｅｓｃｒｉｂｅ“Ｐｌｕｇ－ａｎｄ－Ｐｌａｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”（Ｎｅｕｒｏｎ．２０１９ Ａｕｇ ２１；１０３（４）：５８３－５９７）。
ＲＮＡｉ
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾剤は、干渉ＲＮＡであり得る。ある特定の実施形態では、遺伝子の優性変異によって引き起こされる疾患は、ＲＮＡｉを使用して変異遺伝子をサイレンシングすることによって標的化される。場合によっては、ヌクレオチド配列は、１つ以上の干渉ＲＮＡのコード配列を含み得る。ある特定の例では、ヌクレオチド配列は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であり得る。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、内因性マイクロＲＮＡ、及び人工マイクロＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意の種類の干渉ＲＮＡを指す。例えば、それは、ＲＮＡの下流プロセシングの機構にかかわらず、ｓｉＲＮＡとして以前に特定された配列を含む（すなわち、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断をもたらすインビボプロセシングの特定の方法を有すると考えられるが、かかる配列は、本明細書に記載のフランキング配列との関連でベクターに組み込むことができる）。「ＲＮＡｉ」という用語は、遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子と、遺伝子の発現を活性化するＲＮＡｉエフェクター分子の両方を含むことができる。
ある特定の実施形態では、調節剤は、１つ以上の内因性遺伝子をサイレンシングすることを含み得る。本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ分子、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの活性に関して「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシングされた」は、標的遺伝子の細胞におけるｍＲＮＡレベルが、ｍｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉分子の不在下で、細胞で見出されるｍＲＮＡレベルを少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％減少することを指す。１つの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％減少する。
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子と同じ細胞内に存在するか、または発現する場合、遺伝子または標的遺伝子の発現を低減または阻害する能力を有する。二本鎖ＲＮＡ ｓｉＲＮＡは、相補鎖によって形成され得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成することができる核酸を指す。ｓｉＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。典型的には、ｓｉＲＮＡは、少なくとも約１５～５０ヌクレオチド長（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、約１５～５０ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５～５０塩基対長、好ましくは約１９～３０塩基ヌクレオチド長、好ましくは約２０～２５ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である）。
本明細書で使用する場合、「ｓｈＲＮＡ」または「低分子ヘアピンＲＮＡ」（ステムループとも呼ばれる）は、ｓｉＲＮＡの一種である。一実施形態では、これらのｓｈＲＮＡは、短い（例えば、約１９～約２５ヌクレオチド）アンチセンス鎖、続いて、約５～約９ヌクレオチドのヌクレオチドループ、及び類似センス鎖から構成される。代替的に、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行する場合があり、アンチセンス鎖が続き得る。
「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、本明細書で同義に使用され、内因性ＲＮＡであり、そのうちのいくつかは、転写後レベルでタンパク質コード遺伝子の発現を調節することが知られている。内因性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができるゲノムに天然に存在する小さなＲＮＡである。人工マイクロＲＮＡという用語は、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができる内因性マイクロＲＮＡ以外の任意の種類のＲＮＡ配列を含む。マイクロＲＮＡ配列は、Ｌｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，ｐ．９９１－１００８（２００３）、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，１５４０（２００３）、Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｍｂｒｏｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２（２００１）、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８５８－８６１（２００１）、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５－７３９（２００２）、Ｌａｇｏｓ Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８５３－８５７（２００１）、及びＬａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ，９，１７５－１７９（２００３）（参照により組み込まれる）などの刊行物に記載されている。複数のマイクロＲＮＡも前駆体分子に組み込むことができる。さらに、ｍｉＲＮＡ様ステムループは、ｍｉＲＮＡ及び／またはＲＮＡｉ経路を介して内因性遺伝子の発現を調節する目的のために、人工ｍｉＲＮＡ及び短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達するビヒクルとして細胞において発現させることができる。
本明細書で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、二鎖から構成されるＲＮＡ分子を指す。二本鎖分子には、二本鎖構造を形成するためにそれ自体を２倍に戻す単一のＲＮＡ分子から構成される分子が含まれる。例えば、一本鎖ｍｉＲＮＡが由来する前駆体分子のステムループ構造は、プレｍｉＲＮＡと呼ばれ（Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｃｅｌｌ １ １６：２８１－２９７）、ｄｓＲＮＡ分子を含む。
治療薬の投与
治療的使用のために、本明細書に記載の組成物または薬剤は、全身投与、例えば、生理食塩水などの薬学的に許容される緩衝液に配合され得る。好ましい投与経路としては、例えば、患者に連続的かつ持続的なレベルの薬物を提供する皮下、静脈内、腹腔間、筋肉内、または皮内注射が挙げられる。ヒト患者または他の動物の治療は、生理学的に許容される担体において、本明細書で特定される治療薬の治療有効量を使用して実施される。好適な担体及びそれらの配合物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。投与される治療薬の量は、投与様式、患者の年齢及び体重、ならびに新生物の臨床症状に応じて変化する。一般に、量は、新生物に関連する他の疾患の治療に使用される他の薬剤のために使用されるものの範囲内であるが、ある特定の場合では、化合物の特異性の増加のために、より低い量が必要とされる。例えば、治療用化合物は、新生物細胞に対して細胞傷害性である投与量で投与される。
当業者は、動物モデルと比較してヒトの投与量を修正することが当該技術分野で通例であることを認識しているため、ヒト投与量の量は、初めに、マウスで使用される化合物の量から外挿することによって決定することができる。ある特定の実施形態では、投与量は、約１μｇの化合物／Ｋｇ体重～約５０００ｍｇの化合物／Ｋｇ体重、または約５ｍｇ／Ｋｇ体重～約４０００ｍｇ／Ｋｇ体重、または約１０ｍｇ／Ｋｇ体重～約３０００ｍｇ／Ｋｇ体重、または約５０ｍｇ／Ｋｇ体重～約２０００ｍｇ／Ｋｇ体重、または約１００ｍｇ／Ｋｇ体重～約１０００ｍｇ／Ｋｇ体重、または約１５０ｍｇ／Ｋｇ体重～約５００ｍｇ／Ｋｇ体重で変化し得ることが想定される。他の場合において、この用量は、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００ｍｇ／Ｋｇ体重であり得る。他の態様では、用量は、約５ｍｇの化合物／Ｋｇ体～約２０ｍｇの化合物／Ｋｇ体の範囲であり得ることが想定される。他の実施形態では、用量は、約８、１０、１２、１４、１６、または１８ｍｇ／Ｋｇ体重であり得る。もちろん、この投与量は、初めの臨床試験の結果及び特定の患者の必要性に応じて、かかる治療プロトコルで通常行われるように、上向きまたは下向きに調整され得る。
場合によっては、本発明の化合物または組成物は、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年以上の期間にわたって、観察されない有害作用レベル（ＮＯＡＥＬ）のヒト等価投与量（ＨＥＤ）よりも低い用量で投与される。動物研究で決定されたＮＯＡＥＬは、ヒト臨床試験の最大推奨開始用量を決定するのに有用である。例えば、ＮＯＡＥＬは、ヒト等価投与量を決定するために外挿され得る。典型的には、種間のかかる外挿は、体表面積（すなわち、ｍｇ／ｍ２）に正規化される用量に基づいて行われる。特定の実施形態では、ＮＯＡＥＬは、マウス、ハムスター、ラット、フェレット、モルモット、ウサギ、イヌ、霊長類、霊長類（サル、マーモセット、リスサル、ヒヒ）、マイクロブタ、またはミニブタにおいて決定される。ヒト等価用量を決定するためのＮＯＡＥＬの使用及びそれらの外挿に関する考察については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＣＤＥＲ），Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ ２００５を参照されたい。
がんの予防、治療、及び／または管理に有効である予防及び／または治療レジメンで使用される本発明の薬剤の量は、現在処方されている薬剤の投与量に基づいて、及び本明細書に開示され、当該技術分野で知られている方法によって評価することができる。頻度及び投与量はまた、投与される特定の化合物、がんの状態の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、及び患者の過去の病歴に応じて、各患者に特異的な要因により変化する。例えば、がんの治療、予防、及び／または管理に効果的であろう本発明の薬剤の投与量は、化合物を、例えば、本明細書に開示されるか、または当業者に知られている動物モデルなどの動物モデルに投与することによって決定することができる。加えて、任意にインビトロアッセイを用いて、最適な投与量範囲を特定するのを補助することができる。
いくつかの態様では、予防及び／または治療レジメンは、治療有効性の指定された尺度を達成するために、患者に投与される投与量を滴定することを含む。かかる尺度には、患者のがん細胞集団の低減が含まれる。
ある特定の場合では、予防及び／または治療レジメンにおける本発明の化合物の投与量は、参照試料と比較して、予防及び／または治療レジメンを受けた後に患者から抽出された試験検体において見出されるがん細胞の数または量の低減を達成するように調整される。ここで、参照試料は、治療を受ける患者から抽出された検体であり、検体は、より早い時点で患者から抽出される。一態様では、参照試料は、予防及び／または治療レジメンを受ける前に、同じ患者から抽出された検体である。例えば、試験検体におけるがん細胞の数または量は、参照試料においてよりも少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低い。
場合によっては、予防及び／または治療レジメンにおける本発明の化合物の投与量は、所定の参照範囲内にあるがん細胞の数または量を達成するように調整される。これらの実施形態では、試験検体におけるがん細胞の数または量を所定の基準範囲と比較する。
他の実施形態では、予防及び／または治療レジメンにおける本発明の化合物の投与量は、参照試料と比較して、予防及び／または治療レジメンを受けた後に患者から抽出された試験検体において見出されるがん細胞の数または量の低減を達成するように調整され、参照試料は、健康でがんに罹患していない患者から抽出される検体である。例えば、試験検体におけるがん細胞の数または量は、参照試料におけるがん細胞の数または量の少なくとも６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、または２％以内である。
固形腫瘍を有するある特定のヒト患者の治療において、疑われる腫瘍部位から複数の組織検体を抽出することは、実行不可能であることを証明し得る。これらの場合では、ヒト患者の予防及び／または治療レジメンにおける本発明の化合物の投与量は、それらの動物モデルにおけるがん集団を低減するのに有効である動物モデルにおける用量から外挿される。動物モデルでは、予防及び／または治療レジメンは、参照試料と比較して、予防及び／または治療レジメンを受けた後に動物から抽出された試験検体において見出されるがん細胞の数または量の低減を達成するように調整される。参照試料は、予防及び／または治療レジメンを受ける前に、同じ動物から抽出された検体であり得る。特定の実施形態では、試験検体におけるがん細胞の数または量は、参照試料においてよりも少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％低い。動物におけるがん細胞の数または量を低減するのに有効な用量は、等価のヒト用量を提供するために、体表面積（例えば、ｍｇ／ｍ２）に正規化され得る。
本明細書に開示される予防及び／または治療レジメンは、本発明の化合物またはその医薬組成物を、単回用量、または複数回用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０回以上の用量）で、患者に投与することを含む。
一態様では、予防及び／または治療レジメンは、本発明の化合物またはその医薬組成物を複数回用量で投与することを含む。複数回用量で投与される場合、化合物または医薬組成物は、状態を予防、治療、及び／または管理するのに十分な頻度及び量で投与される。例えば、投与頻度は、１日１回～最大約８週間に１回の範囲である。別の例では、投与頻度は、約１週間に１回～最大約６週間に１回の範囲である。別の例では、投与頻度は、約３週間に１回～最大約４週間に１回の範囲である。
一般に、がんを予防、治療、及び／または管理するために対象に投与される本発明の化合物の投与量は、０．０１～５００ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、対象の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、対象に投与される投与量は、対象の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、より好ましくは患者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。別の例では、患者のがんを予防、治療、及び／または管理するために対象に投与される本発明の化合物の投与量は、患者体重の５００ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは２５０ｍｇ／ｋｇ以下、１００ｍｇ／ｋｇ以下、９５ｍｇ／ｋｇ以下、９０ｍｇ／ｋｇ以下、８５ｍｇ／ｋｇ以下、８０ｍｇ／ｋｇ以下、７５ｍｇ／ｋｇ以下、７０ｍｇ／ｋｇ以下、６５ｍｇ／ｋｇ以下、６０ｍｇ／ｋｇ以下、５５ｍｇ／ｋｇ以下、５０ｍｇ／ｋｇ以下、４５ｍｇ／ｋｇ以下、４０ｍｇ／ｋｇ以下、３５ｍｇ／ｋｇ以下、３０ｍｇ／ｋｇ以下、２５ｍｇ／ｋｇ以下、２０ｍｇ／ｋｇ以下、１５ｍｇ／ｋｇ以下、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ／ｋｇ以下、２．５ｍｇ／ｋｇ以下、２ｍｇ／ｋｇ以下、１．５ｍｇ／ｋｇ以下、または１ｍｇ／ｋｇ以下である。
別の実施例では、患者のがんを予防、治療、及び／または管理するために対象に投与される本発明の化合物の投与量は、０．１～５０ｍｇ、０．１ｍｇ～２０ｍｇ、０．１ｍｇ～１５ｍｇ、０．１ｍｇ～１２ｍｇ、０．１ｍｇ～１０ｍｇ、０．１ｍｇ～８ｍｇ、０．１ｍｇ～７ｍｇ、０．１ｍｇ～５ｍｇ、０．１～２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ～２０ｍｇ、０．２５～１５ｍｇ、０．２５～１２ｍｇ、０．２５～１０ｍｇ、０．２５～８ｍｇ、０．２５ｍｇ～７ｍｇ、０．２５ｍｇ～５ｍｇ、０．５ｍｇ～２．５ｍｇ、１ｍｇ～２０ｍｇ、１ｍｇ～１５ｍｇ、１ｍｇ～１２ｍｇ、１ｍｇ～１０ｍｇ、１ｍｇ～８ｍｇ、１ｍｇ～７ｍｇ、１ｍｇ～５ｍｇ、または１ｍｇ～２．５ｍｇの単位用量である。
別の例では、患者のがんを予防、治療、及び／または管理するために対象に投与される本発明の化合物の投与量は、対象の体重の０．０１～１０ｇ／ｍ２の範囲であり、より典型的には、０．１ｇ／ｍ２～７．５ｇ／ｍ２の範囲である。例えば、対象に投与される投与量は、対象の体表面積の０．５ｇ／ｍ２～５ｇ／ｍ２、または１ｇ／ｍ２～５ｇ／ｍ２の範囲である。
別の例では、予防及び／または治療レジメンは、患者に本発明の化合物の有効量を１用量以上投与することを含み、有効量の用量は、少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬ、または少なくとも４００μｇ／ｍＬの本発明の化合物の血漿レベルを達成する。
別の例では、予防及び／または治療レジメンは、患者に本発明の化合物の有効量の複数回用量を投与することを含み、複数回用量は、少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬ、または少なくとも４００μｇ／ｍＬの本発明の化合物の血漿レベルを、少なくとも１日、１ヶ月月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、または３６ヶ月にわたって維持する。
別の実施例では、予防及び／または治療レジメンは、患者に本発明の化合物の有効量の複数回用量を投与することを含み、複数回用量は、少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬ、または少なくとも４００μｇ／ｍＬの本発明の化合物の血漿レベルを、少なくとも１日、１ヶ月月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、または３６ヶ月にわたって維持する。
医薬組成物の放出
本発明による医薬組成物は、投与時に、または投与後の任意の所定の時間もしくは時間期間に、実質的に直ちに活性化合物を放出するように配合され得る。後者の種類の組成物は、一般に制御放出配合物として知られており、これには、（ｉ）長期間にわたって体内で薬物の実質的に一定の濃度をもたらす配合物、（ｉｉ）所定の遅延時間後に長期間にわたって体内で薬物の実質的に一定の濃度をもたらす配合物、（ｉｉｉ）活性物質の血漿レベルの変動に関連する望ましくない副作用を同時に最小限に抑えながら体内で比較的一定の効果的なレベルを維持することにより、所定の時間期間中作用を維持する配合物（鋸歯状運動パターン（ｓａｗｔｏｏｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｔｔｅｒｎ））、（ｉｖ）例えば、胸腺に隣接するか、または接触する制御放出組成物の空間的配置によって作用を局所化する配合物、（ｖ）例えば、用量が１週間または２週間に１回投与されるような、簡便な投与を可能にする配合物、及び（ｖｉ）担体または化学誘導体を使用して、治療薬を特定の細胞型（例えば、新生物細胞）に送達することにより、新生物を標的とする配合物が含まれる。いくつかの用途では、制御放出配合物は、血漿レベルを治療レベルで維持するために、日中の頻繁な投与の必要性を排除する。
放出速度が問題の化合物の代謝速度を超える制御放出を得るために、多くの戦略のうちのいずれかを遂行することができる。一例では、制御放出は、例えば、様々な種類の制御放出組成物及びコーティングを含む、様々な配合物パラメータ及び成分の適切な選択によって得られる。したがって、治療薬は、適切な賦形剤ととともに、投与時に治療薬を制御された様式で放出する医薬組成物に配合される。例として、単一または多単位錠剤またはカプセル組成物、油剤、懸濁液、乳剤、マイクロカプセル、微小球、分子錯体、ナノ粒子、パッチ、及びリポソームが挙げられる。
非経口組成物
医薬組成物は、剤形、配合物で、または従来の非毒性の薬学的に許容される担体及びアジュバントを含有する好適な送達デバイスもしくはインプラントを介して、注射、注入または移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など）によって非経口的に投与されてもよい。かかる組成物の配合物及び調製物は、医薬製剤の分野の当業者に周知である。配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、上記に見出すことができる。
非経口使用のための組成物は、単位剤形（例えば、単回用量アンプル）で、または数回用量を含有し、好適な防腐剤が添加され得るバイアルで提供されてもよい（以下を参照）。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、注入デバイス、もしくは移植用送達デバイスの形態であり得るか、または使用前に水または別の好適なビヒクルで再構成される乾燥粉末として提示され得る。新生物を低減または緩和する活性剤とは別に、組成物は、好適な非経口的に許容される担体及び／または賦形剤を含んでもよい。活性治療薬（複数可）は、制御放出のために微小球、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込まれてもよい。さらに、組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、及び／または分散剤を含み得る。
上述のように、本発明による医薬組成物は、滅菌注射に好適な形態であり得る。かかる組成物を調製するために、好適な活性抗新生物剤（複数可）は、非経口的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁される。許容されるビヒクル及び溶媒の中で、水、適量の塩酸の添加によって好適なｐＨに調整された水、水酸化ナトリウムまたは好適な緩衝液、１，３－ブタンジオール、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液及びデキストロース溶液が用いられ得る。水性配合物は、１つ以上の保存剤（例えば、メチル、エチル、またはｎ－プロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸）を含有してもよい。化合物のうちの１つが水にややまたはわずかに溶解するだけの場合、溶解促進剤または可溶化剤が添加されるか、または溶媒は、１０～６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールを含み得る。
制御放出非経口組成物
制御放出非経口組成物は、水性懸濁液、微小球、マイクロカプセル、磁気微小球、油剤、油懸濁液、または乳濁液の形態であり得る。代替的に、活性薬物は、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、または注入デバイスに組み込まれてもよい。
微小球及び／またはマイクロカプセルの調製に使用するための材料は、例えば、ポリガラクチン、ポリ－（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－Ｌ－グルタム－９）、及びポリ（乳酸）などの生体分解性／生体内分解性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）ポリマーである。制御放出非経口配合物を配合する際に使用され得る生体適合性担体は、炭水化物（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミン）、リポタンパク質、または抗体である。インプラントに使用するための材料は、非生体分解性（例えば、ポリジメチルシロキサン）または生体分解性（例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、もしくはポリ（オルトエステル）、またはそれらの組み合わせ）であり得る。
ベクター送達
本発明はまた、１つ以上のベクターまたは１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む送達系を提供し、１つ以上のベクターまたはポリヌクレオチド分子は、本明細書で考察される、または本明細書に記載の方法のいずれかで定義される特徴を有する組成物である、天然に存在しないまたは操作された組成物の構成要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。核酸標的化系の１つ以上のエレメントの発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、配合物、及びそれらの構成要素は、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の文書で使用されるものである。
一般に、及び本明細書全体を通して、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子、１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端（例えば、環状）がない核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子、及び当該技術分野で既知の他の様々のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。一種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントが、例えば、標準的な分子クローニング技法によって挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）にパッケージングするためのベクター内に存在する。ウイルスベクターには、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含まれる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。真核生物細胞において発現のためのかつ発現をもたらすベクターは、本明細書では「真核生物発現ベクター」と称され得る。組換えＤＮＡ技術に有用な一般的な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）
特定の実施形態では、予め複合体化されたガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（任意に、ＣＲＩＳＰＲタンパク質またはアダプターに融合されたアデノシンデアミナーゼ）は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）として送達される。ＲＮＰは、このプロセスが転写の必要性を回避するため、ＲＮＡ法よりもさらに迅速な編集効果をもたらすという利点を有する。重要な利点は、両方のＲＮＰ送達が一時的であり、オフターゲット効果及び毒性の問題を低減することである。異なる細胞型における効率的なゲノム編集は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２４（６）：１０１２－９）、Ｐａｉｘ ｅｔ ａｌ．（２０１５，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０４（１）：４７－５４）、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４）、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｃｅｌｌ．９；１５３（４）：９１０－８）によって観察されている。
特定の実施形態では、リボ核タンパク質は、ＷＯ２０１６１６１５１６に記載されるように、ポリペプチドベースのシャトル剤によって送達される。ＷＯ２０１６１６１５１６は、細胞透過性ドメイン（ＣＰＤ）に作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）を含む合成ペプチドを使用してポリペプチドカーゴの、ヒスチジンが豊富なドメイン及びＣＰＤへの効率的な形質導入を記載している。同様に、これらのポリペプチドは、真核生物細胞におけるＣＲＩＳＰＲエフェクターベースのＲＮＰの送達に使用することができる。
タンパク質の投与
３０年以上にわたって商業開発されてきた動物及びヒトにおける治療用タンパク質の薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、ならびに毒性プロファイルの理解において、著しい進歩がなされている（例えば、Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１２ Ａｐｒ ２６；３（４）：７３－９２を参照）。ある特定の実施形態では、治療用タンパク質は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、または筋肉内（ＩＭ）注射などの非経口経路によって投与される。分子サイズ、親水性、及び胃分解は、治療用タンパク質の胃腸（ＧＩ）吸収を妨げる主な要因である（例えば、Ｋｅｉｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２０１０ Ａｕｇ；４９（８）：４９３－５０７を参照）。エアロゾル配合物または乾燥粉末吸入器を用いた肺送達は、選択されたタンパク質、例えば、ｅｘｕｂｅｒａ（商標）に使用されている（例えば、Ｓｃｈｅｕｃｈ ａｎｄ Ｓｉｅｋｍｅｉｅｒ，Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００７ Ｎｏｖ；５８ Ｓｕｐｐｌ ５（Ｐｔ ２）：６１５－２５を参照）。硝子体内注射は、局所活性のみを必要とするペプチド及びタンパク質に使用されている（例えば、Ｓｕｒｅｓｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎ：Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｗａｌｌｅ Ｃ．，ｅｄｉｔｏｒ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；２０１１．ｐｐ．８７－１０３を参照）。ある特定の実施形態では、治療用タンパク質のＳＣ投与は、しばしば好ましい経路である。特に、自己投与のためのＳＣ投与の適合性は、治療コストを大幅に削減することになる。
標準治療
本発明の態様は、本明細書に記載されるバイオマーカーのいずれかの検出に基づいて、標準治療内で療法を修正することを含む。一実施形態では、薬剤を含む療法は、薬剤の追加が標準治療の工程内で相乗的である標準治療内で投与される。一実施形態では、薬剤は、腫瘍を、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出（例えば、阻害剤）を標的とする治療薬に対してより脆弱であるように標的とする、及び／またはシフトさせる。一実施形態では、薬剤は、リン酸塩ホメオスタシスに関与する１つ以上の遺伝子の発現または活性を阻害する。本明細書で使用される場合、「標準治療」という用語は、ある特定の種類の疾患のための適切な治療として医療関係者によって受け入れられ、医療専門家によって広く使用されている現在の治療を指す。標準治療は、ベストプラクティス、標準医療、標準療法とも呼ばれる。がんの標準治療には、一般に、手術、リンパ節除去、放射線、化学療法、標的療法、腫瘍を標的とする抗体、及び免疫療法が含まれる。免疫療法は、チェックポイント遮断薬（ＣＢＰ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び養子Ｔ細胞療法を含むことができる。最も一般的ながんの標準治療は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ）に掲載されている。治療臨床試験は、現在の治療を改善するか、またはがん患者の新しい治療に関する情報を入手するのに役立つことを目的とした調査研究である。臨床試験で新しい治療が標準治療法よりも優れていることを示す場合、新しい治療は新しい標準治療とみなされ得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんの標準治療と組み合わせて使用することができる１つ以上の治療薬（例えば、阻害剤）を提供する。標準治療内で組み合わせたＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の標的化は、疾患の治療において、増強された、またはさもなければ以前に不明であった活性を提供し得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんの標準治療の一部である治療（すなわち、治療レジメン）を伴う、本明細書に記載の治療を含む併用療法を提供する。ある特定の実施形態では、卵巣癌を治療するための標準治療は、手術、化学療法、及び標的化療法を含む（例えば、Ｌｈｅｕｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ： Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２０１９ Ｊｕｌ；６９（４）：２８０－３０４を参照）。卵巣癌は、卵巣内または卵巣上に形成されるがんである。症状には、とりわけ、膨満、骨盤痛、腹部腫脹、及び食欲不振などがある。がんが広がる可能性のある一般的な領域には、腹部、リンパ節、肺、及び肝臓の内層が含まれる。卵巣癌の最も一般的な種類は、卵巣癌（全症例の９５％超）である。卵巣癌には５つの主なサブタイプがあり、その中で高悪性度の漿液性癌が最も一般的である。これらの腫瘍は、卵巣を覆う細胞から始まると考えられているが、一部は卵管で形成され得る。卵巣癌のあまり一般的でない種類には、生殖細胞腫瘍及び性索間質腫瘍が含まれる。卵巣癌の診断は、通常、手術中に除去される組織の生検によって確認される。
早期に発見され、治療された場合、卵巣癌はしばしば治癒可能である。治療には通常、手術、放射線療法、及び化学療法のいくつかの組み合わせが含まれる。転帰は、疾患の程度、存在するがんのサブタイプ、及び他の医学的状態に依存する。米国における全５年生存率は４５％である。
卵巣癌が再発する場合、最後の再発がプラチナで治療されてからの時間に基づいて、部分的にプラチナ感受性またはプラチナ耐性とみなされ、部分的にプラチナ感受性のがんは最後の治療から６～１２ヶ月後に再発し、プラチナ耐性がんの間隔は６ヶ月未満である。
プラチナ感受性腫瘍の場合、プラチンは、しばしば他の細胞傷害性剤と組み合わせて、第二選択化学療法に利用される。レジメンには、ペグ化リポソームドキソルビシン、ゲムシタビン、またはパクリタキセルと組み合わせたカルボプラチンが含まれる。腫瘍がプラチナ耐性であると決定された場合、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、及びシクロホスファミド（ＶＡＣ）、またはパクリタキセル、ゲムシタビン、及びオキサリプラチンのいくつかの組み合わせを第二選択療法として使用することができる。
全身療法は、単独で、または標的化療法と組み合わせて、単独から併用化学療法アプローチを含み得る。ある特定の実施形態では、手術は、正確な外科的病期分類のための手術、一次デバルキング手術、間隔デバルキング手術、及び二次デバルキング手術を含む。ある特定の実施形態では、化学療法は、カルボプラチン、シスプラチン、及びパクリタキセルを含む。ある特定の実施形態では、標的化療法は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対するヒト化モノクローナル抗体であるベバシズマブ、及びポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えば、オラパリブ、ニラパリブ、及びルカパリブ）を含む。本発明と組み合わせて使用することができる他の治療法としては、葉酸受容体を標的とする薬剤（例えば、チューブリンを破壊するメイタンシノイドＤＭ４薬物、強力な抗有糸分裂薬に連結された抗ＦＲα抗体からなるＡＤＣであるミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３））が挙げられる。ある特定の実施形態では、チェックポイント遮断療法が、併用療法で使用される。本明細書で使用される場合、チェックポイント遮断療法（ＣＰＢ）は、単独で、または組み合わせてのいずれかで、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３、Ｌａｇ－３、及びＴＩＧＩＴを含むチェックポイント受容体の活性を遮断する抗体を指す。チェックポイント遮断療法は、抗ＴＩＭ３、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ３、またはそれらの組み合わせを含み得る。抗ＰＤ１抗体は、米国特許第８，７３５，５５３号に開示されている。ＬＡＧ－３に対する抗体は、米国特許第９，１３２，２８１号に開示されている。抗ＣＴＬＡ４抗体は、米国特許第９，３２７，０１４号、米国特許第９，３２０，８１１号、及び米国特許第９，０６２，１１１号に開示されている。特定のチェックポイント阻害剤には、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ及びトレメリムマブ）、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ）、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、免疫療法と組み合わせた化学療法は、卵巣癌の治療に使用される。ある特定の実施形態では、併用療法は、好ましくは、プラチナ耐性卵巣癌の患者において、パクリタキセル＋ペムブロリズマブを含む。ある特定の実施形態では、併用療法は、ＰＡＲＰ阻害剤と組み合わせた免疫療法を含む。
一例では、治療薬は、併用療法、すなわち、様々な形態のがんなどの病理学的状態または障害の治療に有用な他の薬剤、例えば、治療薬と組み合わせて投与される。本文脈における「組み合わせて」という用語は、薬剤が、同時にまたは連続してのいずれかで、実質的に同時に与えられることを意味する。連続して投与される場合、第２の薬剤の投与の開始時に、２つの薬剤のうちの第１の薬剤は、場合によっては、治療部位で有効濃度で依然として検出可能である。
新生物の治療のための薬剤または薬剤の組み合わせの投与は、他の構成要素と組み合わせて、新生物の緩和、低減、または安定化に有効である治療薬の濃度をもたらす任意の好適な手段によるものであってもよい。薬剤は、任意の適切な量で任意の好適な担体物質に含有され得、一般に組成物の総重量の１～９５重量％の量で存在する。組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内）投与経路に好適である剤形で提供され得る。医薬組成物は、従来の薬学的慣行に従って配合され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００ ａｎｄ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８－１９９９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
したがって、いくつかの例では、予防及び／または治療レジメンは、１つ以上の追加の抗がん治療薬と組み合わせた本発明の薬剤の投与を含む。一例では、併用療法で使用される１つ以上の追加の抗がん療法薬の投与量は、がんを予防、治療、及び／または管理するために使用されている、または現在使用されているものよりも低い。がんの予防、治療、及び／または管理に現在使用されている１つ以上の追加の抗がん治療薬の推奨投与量は、Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（６０ｔｈｅｄ．，２００６）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含むが、これに限定されない任意の参考文献から得ることができる。
本発明の薬剤及び１つ以上の追加の抗がん治療薬は、別個に、同時に、または連続して投与することができる。様々な態様では、本発明の薬剤及び追加の抗がん治療薬は、５分未満間隔で、３０分未満間隔で、１時間未満間隔で、約１時間間隔で、約１～約２時間間隔で、約２時間～約３時間間隔で、約３時間～約４時間間隔で、約４時間～約５時間間隔で、約５時間～約６時間間隔で、約６時間～約７時間間隔で、約７時間～約８時間間隔で、約８時間～約９時間間隔で、約９時間～約１０時間間隔で、約１０時間～約１１時間間隔で、約１１時間～約１２時間間隔で、約１２時間～１８時間間隔で、１８時間～２４時間間隔で、２４時間～３６時間間隔で、３６時間～４８時間間隔で、４８時間～５２時間間隔で、５２時間～６０時間間隔で、６０時間～７２時間間隔、７２時間～８４時間間隔、８４時間～９６時間間隔、または９６時間～１２０時間間隔で投与される。別の例では、２つ以上の抗がん治療薬は、同じ患者訪問内で投与される。
ある特定の態様では、本発明の薬剤及び追加の抗がん治療薬は、周期的に投与される。サイクリング療法は、抗がん治療薬の一方もしくは両方に対する耐性の発達を低減するため、抗がん治療薬の一方もしくは両方の副作用を回避もしくは低減するため、及び／または療法の有効性を改善するために、一定期間にわたって１つの抗がん治療薬を投与し、続いて一定期間にわたって第２の抗がん治療薬を投与し、この連続投与、すなわち、サイクルを繰り返すことを伴う。一例では、サイクリング療法は、抗がん治療薬の一方に対する耐性の発達を低減するため、抗がん治療薬の一方の副作用を回避もしくは低減するため、及び／または抗がん治療薬の有効性を改善するために、一定期間にわたって第１の抗がん治療薬を投与し、続いて一定期間にわたって第２の抗がん治療薬を投与し、続いて任意に、一定期間にわたって第３の抗がん治療薬を投与するなど、この連続投与、すなわち、サイクルを繰り返すことを伴う。
別の例では、抗がん治療薬は、別個の組成物において対象に同時に投与される。本発明の併用抗がん治療薬は、同じまたは異なる投与経路によって対象に投与され得る。
本発明の薬剤及び追加の抗がん治療薬が、対象に同時に投与される場合、「同時に」という用語は、正確に同時に抗がん治療薬を投与することに限定されるものではなく、むしろ、それらが、一緒に作用し得るような順序で、かつ時間間隔内で（例えば、別様に投与された場合と比較して、相乗的に増加した利益を提供するために）、対象に投与されることを意味する。例えば、抗がん治療薬は、異なる時点で任意の順序で同時にまたは連続して投与され得るが、同時に投与されない場合、所望の治療効果を提供するように、好ましくは相乗的な様式で十分に近い時間で投与されるべきである。本発明の併用抗がん治療薬は、任意の適切な形態で、任意の好適な経路により、別個に投与することができる。併用抗がん治療薬の構成要素が同じ医薬組成物において投与されない場合、それらは、それを必要とする対象に任意の順序で投与され得ることが理解される。例えば、本発明の薬剤は、追加の抗がん治療薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、投与と同時に、または投与後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）に、それを必要とする対象に投与することができる。様々な態様では、抗がん治療薬は、１分間間隔、１０分間間隔、３０分間間隔、１時間未満間隔、１時間間隔、１時間～２時間間隔、２時間～３時間間隔、３時間～４時間間隔、４時間～５時間間隔、５時間～６時間間隔、６時間～７時間間隔、７時間～８時間間隔、８時間～９時間間隔、９時間～１０時間間隔、１０時間～１１時間間隔、１１時間～１２時間間隔、２４時間以内間隔、または４８時間以内間隔で投与される。一例では、抗がん治療薬は、同じ来院中に投与される。別の実施例では、本発明の組み合わせた抗がん治療薬は、１分～２４時間間隔で投与される。
診断方法
本発明は、様々な診断及び／または治療適応症で使用するための、細胞特性の特定、診断、予後、及び操作のためのバイオマーカー（例えば、悪性細胞特異的マーカー）を提供する。ある特定の実施形態では、マーカーは、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ２０Ａ１、ＦＧＦ２３、及び／またはＰＡＸ８であり得る。ある特定の実施形態では、マーカーは、ＳＬＣ３４Ａ２（例えば、ＰＡＸ８）と共変し、したがって、組み合わせてまたは単独で検出され得る遺伝子である。ある特定の実施形態では、腫瘍マーカーを検出することは、がんに罹患している対象が、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害に応答し得ることを示し得る。ある特定の実施形態では、腫瘍マーカーを検出することは、がんに罹患している対象の予後を示し得る。ある特定の実施形態では、腫瘍マーカーを検出することは、治療が有効である（すなわち、治療の有効性を監視する）ことを示し得る。ある特定の実施形態では、正常な組織よりも高いＳＬＣ３４Ａ２を発現する腫瘍細胞は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害に対して脆弱である（治療方法を参照）。ある特定の実施形態では、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害は、ＳＬＣ３４Ａ２及び／またはＳＬＣ２０Ａ１発現の減少、及び／またはＦＧＦ２３発現の増加をもたらす。
ある特定の実施形態では、形態学的変化を使用して、治療が有効であるかを決定することができる。ある特定の実施形態では、対象をＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害剤で治療することにより、腫瘍細胞における空胞様構造が増加する。ある特定の実施形態では、形態学的変化は顕微鏡検査によって検出される。
ある特定の実施形態では、治療方法に記載されるＲＢＤタンパク質は、ＸＰＲ１発現細胞の検出に使用され得る。Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉら、２０１３は、Ｘ－ＭＬＶ Ｅｎｖ ＲＢＤ（ＸＲＢＤ）に由来する可溶性リガンドによるＸＰＲ１の細胞表面発現の監視を示す。ＵＳ９，７９１，４３５Ｂ２及びＵＳ２０１５／００９９６５３Ａ１も参照されたい。
本発明の文脈におけるバイオマーカーは、核酸、タンパク質、反応産物、及び代謝産物、ならびにそれらの多型、変異、変異型、修飾物、サブユニット、断片、及び他の分析物、または試料由来の測定値を包含するが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、バイオマーカーは、本明細書に記載されるシグネチャー遺伝子またはシグネチャー遺伝子産物、及び／または細胞を含む。
バイオマーカーは、１つ以上のバイオマーカーの第１のレベルの発現、活性、及び／または機能を検出し、検出されたレベルを対照のレベルと比較することによって、対象における免疫応答を診断、予測、及び／または病期分類する方法において有用であり、検出されたレベルと対照レベルとの差は対象における免疫応答の存在を示す。
「診断」及び「監視」という用語は、医療行為において一般的であり、十分に理解されている。さらなる説明により、及び限定されないが、「診断」という用語は、一般に、症状及び徴候に基づいて、及び／または様々な診断手順の結果から（例えば、診断された疾患または状態に特徴的な１つ以上のバイオマーカーの存在、不在、及び／または量を知ることから）、対象の疾患または状態を認識、決定、または結論づけるプロセスまたは行為を指す。
「予測する」または「予後」という用語は、一般に、疾患または状態の進行及び回復の見通し（例えば、確率、期間、及び／または程度）に関する予測を指す。本明細書で教示される疾患または状態の良好な予後は、一般に、好ましくは許容される期間内に、疾患または状態からの満足のいく部分的または完全な回復の予測を包含し得る。かかる疾患または状態の良好な予後は、より一般に、好ましくは所与の期間以内に、かかる疾患または状態のさらなる悪化または増悪がないことを予測することを包含し得る。本明細書で教示される疾患または状態の予後不良は、一般に、かかる疾患または状態の標準以下の回復及び／または不十分に遅い回復の予測、またはかかる疾患または状態の回復が実質的にない、もしくはさらに悪化することを包含し得る。
本発明のバイオマーカーは、がんのリスクがあるか、またはがんに罹患している患者集団を特定する方法、または１つ以上のバイオマーカーの検出された発現、活性、及び／または機能レベルに基づいて特定の治療に応答する患者を特定する方法に有用である。これらのバイオマーカーはまた、治療または療法の有効性を決定するために、好適なまたは異常な応答（複数可）について治療及び療法を受けている対象を監視するのに、ならびに症状の治療、その進行の遅延、またはそうでなければその緩和において有効であろう療法及び治療を選択または修正するために有用である。本明細書に提供されるバイオマーカーは、治療の選択を容易にする精度で、疾患の特定の状態にある患者の群を選択するのに有用である。
「監視」という用語は、一般に、経時的に起こり得る任意の変化についての対象における疾患または状態のフォローアップを指す。
用語はまた、疾患の予測も包含する。「予測すること」または「予測」という用語は、一般に、当該疾患または状態を（まだ）有しない対象における疾患または状態の事前宣言、指示、または予測を指す。例えば、対象における疾患または状態の予測は、例えば、特定の期間内または特定の年齢までに、対象が当該疾患または状態を発達させる確率、可能性、またはリスクを示し得る。当該確率、可能性、またはリスクは、とりわけ、絶対値、範囲、または統計として示され得るか、または好適な対照対象もしくは対象集団に対して（例えば、一般的、正常、もしくは健康な対象もしくは対象集団に対して）示され得る。したがって、対象が疾患または状態を発達させる確率、可能性、またはリスクは、好適な対照対象または対象集団に対して、増加もしくは減少として、または倍率増加もしくは倍率減少として有利に示され得る。本明細書で使用される場合、対象において本明細書で教示される状態または疾患の「予測」という用語はまた、対象がかかる状態または疾患の「肯定的な」予測を有すること、すなわち、対象がかかる状態または疾患のリスクを有する（例えば、リスクは、対照対象または対象集団に対して著しく増加する）ことを特に意味し得る。対象において本明細書に記載される本明細書で教示される疾患または状態が「ない予測」という用語は、特に、対象がかかる疾患または状態の「否定的な」予測を有すること、すなわち、かかる疾患または状態を有する対象のリスクが対照対象または対象集団に対して著しく増加しないことを意味し得る。
好適には、正常な免疫状態を有するか、または免疫構成要素を含む疾患を有しない対照対象と比較した、対象における免疫細胞の量または表現型の変化は、対象が、免疫状態が損なわれているか、または免疫構成要素を含む疾患を有するか、または免疫療法から利益を受けるであろうことを示す。
したがって、方法は、参照値を有する患者からの試料中で測定された免疫細胞集団、バイオマーカー、または遺伝子もしくは遺伝子産物シグネチャーの量を比較することに依存し得、当該参照値は、本明細書で教示される疾患または状態の既知の予測、診断、及び／または予後を表す。
例えば、別個の参照値は、本明細書で教示される所与の疾患または状態を有するリスク（例えば、異常に上昇したリスク）の予測か、当該疾患または状態を有するリスクがないまたは通常のリスクの予測かを表し得る。別の例では、別個の参照値は、かかる疾患または状態を有する、異なる程度のリスクの予測を表し得る。
さらなる例では、別個の参照値は、本明細書で教示される所与の疾患または状態の診断か、かかる疾患または状態でないことの診断（例えば、健康であることの、または当該疾患もしくは状態から回復したとの診断など）を表し得る。別の例では、別個の参照値は、様々な重症度のかかる疾患または状態の重症度の診断を表し得る。
さらに別の例では、別個の参照値は、本明細書で教示される所与の疾患または状態の良好な予後か、当該疾患または状態の予後不良かを表してもよい。さらなる例では、別個の参照値は、かかる疾患または状態の様々に好ましいまたは好ましくない予後を表し得る。
かかる比較は、一般に、少なくとも１つの差、及び任意に比較されている値間のかかる差のサイズの存在または不在を決定するための任意の手段を含み得る。比較は、目視検査、測定値の算術的または統計的比較を含み得る。かかる統計的比較には、規則の適用が含まれるが、これに限定されない。
参照値は、他の細胞集団、バイオマーカー、及び遺伝子または遺伝子産物シグネチャーに対して以前に用いられた既知の手順に従って確立され得る。例えば、参照値は、当該疾患または状態の特定の診断、予測、及び／または予後を特徴とする個体または個体の集団（すなわち、疾患または状態の当該診断、予測、及び／または予後が当てはまる個体）において確立され得る。かかる集団は、２個体以上、１０個体以上、１００個体以上、またはさらには数百個体以上を含み得るが、これらに限定されない。
第２の値からの第１の値の「偏差」は、一般に、任意の方向（例えば、増加：第１の値＞第２の値、または減少：第１の値＜第２の値）及び任意の変化の程度を包含し得る。
例えば、偏差は、比較が行われている第２の値に対して、第１の値が、少なくとも約１０％（約０．９倍以下）、少なくとも約２０％（約０．８倍以下）、少なくとも約３０％（約０．７倍以下）、または少なくとも約４０％（約０．６倍以下）、または少なくとも約５０％（約０．５倍以下）、または少なくとも約６０％（約０．４倍以下）、または少なくとも約７０％（約０．３倍以下）、または少なくとも約８０％（約０．２倍以下）、または少なくとも約９０％（約０．１倍以下）減少することを包含し得るが、これらに限定されない。
例えば、偏差は、比較が行われている第２の値に対して、第１の値が、少なくとも約１０％（約１．１倍以上）、または少なくとも約２０％（約１．２倍以上）、または少なくとも約３０％（約１．３倍以上）、または少なくとも約４０％（約１．４倍以上）、または少なくとも約５０％（約１．５倍以上）、または少なくとも約６０％（約１．６倍以上）、または少なくとも約７０％（約１．７倍以上）、または少なくとも約８０％（約１．８倍以上）、または少なくとも約９０％（約１．９倍以上）、または少なくとも約１００％（約２倍以上）、または少なくとも約１５０％（約２．５倍以上）、または少なくとも約２００％（約３倍以上）、少なくとも約５００％（約６倍以上）、または少なくとも約７００％（約８倍以上）増加することを包含し得るが、これらに限定されない。
好ましくは、偏差は、統計的に有意な観察された変化を指し得る。例えば、偏差は、所与の集団における参照値の許容誤差の外側にある観測された変化を指し得る（例えば、標準偏差または標準誤差によって、またはその所定の倍数によって、例えば、±１×ＳＤまたは±２×ＳＤまたは±３×ＳＤまたは±１×ＳＥまたは±２×ＳＥまたは±３×ＳＥによって表される）。偏差はまた、所定の集団における値によって定義される参照範囲外にある値（例えば、当該集団における値の≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧７５％、もしくは≧８０％、もしくは≧８５％もしくは≧９０％もしくは≧９５％、またはさらには≧１００％を含む範囲外）を指し得る。
さらなる実施形態では、観察された変化が所与の閾値またはカットオフを超えている場合、偏差が結論づけられ得る。かかる閾値またはカットオフは、予測方法の選択された感度及び／または特異性、例えば、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の感度及び／または特異性を提供するために、当該技術分野で一般的に知られているように選択され得る。
例えば、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を使用して、許容される感度及び特異性、または陽性予測値（ＰＰＶ）、陰性予測値（ＮＰＶ）、陽性尤度比（ＬＲ＋）、陰性尤度比（ＬＲ－）、Ｙｏｕｄｅｎ指標などのそれ自体が周知である関連性能尺度に基づいて、本診断試験の臨床使用のための所与の免疫細胞集団、バイオマーカー、または遺伝子もしくは遺伝子産物シグネチャーの量の最適カットオフ値を選択することができる。
一実施形態では、シグネチャー遺伝子、バイオマーカー、及び／または細胞は、免疫蛍光、免疫組織化学（ＩＨＣ）、顕微鏡検査、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、質量分析（ＭＳ）、マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（本明細書でさらに記載される）、定量的ＲＴ－ＰＣＲ、単一細胞ｑＰＣＲ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＲＮＡ－ＦＩＳＨ、ＭＥＲＦＩＳＨ（多重（インサイチュ）ＲＮＡ ＦＩＳＨ）、及び／またはインサイチュハイブリダイゼーションによって検出または単離され得る。吸光度アッセイ及び比色アッセイを含む他の方法は、当該技術分野で既知であり、本明細書で使用され得る。検出は、ＲＮＡへのハイブリダイゼーションのためのプライマー及び／またはプローブもしくは蛍光バーコード化オリゴヌクレオチドプローブを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｓ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒ－ｃｏｄｅｄ ｐｒｏｂｅ ｐａｉｒｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８ Ｍａｒ；２６（３）：３１７－２５を参照）。
ＳＬＣ３４Ａ２の検出
ある特定の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２及び／または共変遺伝子の増加した発現の検出は、腫瘍がＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害に感受性であることを示す。ＳＬＣ３４Ａ２発現は、本明細書にさらに記載される任意の方法を使用して、タンパク質またはＲＮＡ転写物の検出によって決定することができる。ＳＬＣ３４Ａ２を検出することができる抗体が開発されており（例えば、ＭＸ３５： Ｙｉｎ ＢＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＭＸ３５ ｄｅｔｅｃｔｓ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＮａＰｉ２ｂ（ＳＬＣ３４Ａ２）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．２００８；８：３、Ｌｅｖａｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＭＸ３５ ａｎｔｉｇｅｎ，ＮａＰｉ２ｂ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；１７（１）：３０３、及びＲｅｂＭａｂ２００： Ｌｏｐｅｓ ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｂｍａｂ２００，ａ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＮａＰｉ２ｂ Ｄｉｓｐｌａｙｓ Ｓｔｒｏｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ： Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（７）：ｅ７０３３２を参照）、本発明に適用可能である。抗ＮａＰｉ２ｂ抗体によるＳＬＣ３４Ａ２の検出は、がんがＮａＰｉ２ｂ標的化抗体薬物コンジュゲートに対して応答性であるかどうかを決定するために記載されている（ＵＳ２０１９／０１６０１８１Ａ１を参照）。開発された任意の今後の抗体も、本発明に適用可能である。ある特定の実施形態では、治療方法に記載される抗体が使用され得る。
ある特定の実施形態では、検出することは、免疫組織化学（ＩＨＣ）、インサイチュＲＮＡ－ｓｅｑ （Ｋｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｓｉｔｕ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，８５７－８６０ （２０１３））、定量的ＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ，ＣＩＴＥ－ｓｅｑ（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，８６５－８６８（２０１７））、ウエスタンブロット、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＭＥＲＦＩＳＨ（Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｂｏｅｔｔｉｇｅｒ，Ａ．Ｎ．，Ｍｏｆｆｉｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．＆ Ｚｈｕａｎｇ，Ｘ．Ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖｅｄ，ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，（２０１５））、ＲＮＡ－ＦＩＳＨ、質量分析、またはＦＡＣＳのうちの１つ以上を含む。
コピー数変動
ある特定の実施形態では、コピー数変動（ＣＮＶ）は、腫瘍（例えば、ＸＰＲ１）において検出される（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．，Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ＤＮＡ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｍａｙ；３０（５）：４１３－２１、Ｔｉｒｏｓｈ，Ｉ． ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２，１８９－１９６（２０１６）；Ｓａｔｈｉｒａｐｏｎｇｓａｓｕｔｉ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂａｓｅｄ ｃｏｐｙ－ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ： ＥｘｏｍｅＣＮＶ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７，２６４８－２６５４ （２０１１）、Ｋｒｕｍｍ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２２，１５２５－１５３２（２０１２）、ｄｅ Ａｒａｕｊｏ Ｌｉｍａ，Ｌ．＆ Ｗａｎｇ，Ｋ．ＰｅｎｎＣＮＶ ｉｎ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８，３８３（２０１７）、Ｆａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｌｉｎｋｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｌｌｅｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２８，１２１７－１２２７（２０１８）、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎｅａｌｉｇｎ：ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０，５４（２０１９）、Ｃｈｅｎ，Ｍ．，Ｇｕｎｅｌ，Ｍ．＆ Ｚｈａｏ，Ｈ．ＳｏｍａｔｉＣＡ： Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８，ｅ７８１４３（２０１３）、Ｓｅｒｉｎ Ｈａｒｍａｎｃｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＣａＳｐＥＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｓ ＣＮＶ ｅｖｅｎｔｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｏｒ ｂｕｌｋ ＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，８９（２０２０）、及びＯｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｌｉａｂｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｕｍｏｒ－Ｏｎｌｙ Ｗｈｏｌｅ－Ｅｘｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ．ＪＣＯ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｆｏｒｍ．２０２０；４を参照）。ある特定の実施形態では、ＸＰＲ１で増幅を検出して、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害に感受性である腫瘍を特定する。ある特定の実施形態では、ＦＩＳＨは、ＣＮＶを検出するために使用される。ある特定の実施形態では、ＣＮＶは、全エキソーム配列決定（ＷＥＳ）または標的化パネル配列決定により検出される。ある特定の実施形態では、ＣＮＶは、標的配列決定パネルからの推論によって検出される。ある特定の実施形態では、ＣＮＶは、ＲＮＡ－ｓｅｑを使用して決定される。
顕微鏡検査
ある特定の実施形態では、形態学的変化は顕微鏡検査によって検出される。顕微鏡検査は、顕微鏡を使用して、肉眼では見えない物体及び物体の領域（正常な眼の分解能範囲内にない物体）を表示する技術分野である（例えば、Ｍｕａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｉｎ： Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ： Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｃｈａｍ（ＣＨ）： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２０１８．Ｃｈａｐｔｅｒ ５．２０１８ Ａｕｇ ３．ＤＯＩ： １０．１００７／９７８－３－３１９－９６５２０－８＿５を参照）。本発明では、任意の顕微鏡検査法（例えば、光学、電子、及び走査プローブ顕微鏡検査、またはＸ線顕微鏡検査）を使用することができる。好ましい実施形態では、位相コントラスト、蛍光、または共焦点顕微鏡検査が使用される。
ＭＳ法
バイオマーカー検出も、質量分析法を使用して評価され得る。質量分析計の様々な構成を使用して、バイオマーカー値を検出することができる。いくつかの種類の質量分析計が利用可能であるか、または様々な構成で製造することができる。一般に、質量分析計は、以下の主要な構成要素：試料入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空系、及び計器制御系、ならびにデータ系を有する。試料入口、イオン源、及び質量分析器の違いは、一般に、器具の種類及びその性能を定義する。例えば、入口は、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源であり得るか、またはマトリックス補助レーザー脱離で使用されるような直接プローブまたはステージであり得る。一般的なイオン源は、例えば、ナノスプレー及びマイクロスプレーまたはマトリックス補助レーザー脱離を含むエレクトロスプレーである。一般的な質量分析器には、四重極質量フィルタ、イオントラップ質量分析器、及び飛行時間質量分析器が含まれる。追加の質量分析法は、当該技術分野で周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７Ｒ－７１６Ｒ（１９９８）；Ｋｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照）。
タンパク質バイオマーカー及びバイオマーカー値は、以下のうちのいずれかによって検出及び測定され得る：エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス補助レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、表面強化レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）、タンデム光時間（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれるもの、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ－ＭＳ）、ＡＰＣＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ－（ＭＳ）．ｓｕｐ．Ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ－ＭＳ）、ＡＰＰＩ－ＭＳ／ＭＳ、及びＡＰＰＩ－（ＭＳ）．ｓｕｐ．Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析、及びイオントラップ質量分析。
試料調製戦略は、タンパク質バイオマーカー及び決定バイオマーカー値の質量分光特徴付けの前に、試料を標識及び濃縮するために使用される。標識方法には、相対及び絶対定量（ｉＴＲＡＱ）のための等圧タグ、ならびに細胞培養中のアミノ酸による安定した同位体標識（ＳＩＬＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。質量分光分析の前に、候補バイオマーカータンパク質の試料を選択的に濃縮するために使用される捕捉試薬には、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替抗体足場（例えば、ダイアボディなど）インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣薬、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、ならびにこれらの修飾物及び断片が含まれるが、これらに限定されない。
イムノアッセイ
イムノアッセイ法は、抗体の対応する標的または分析物への反応に基づいており、特定のアッセイ形式に応じて試料中の分析物を検出することができる。免疫反応性に基づくアッセイ方法の特異性及び感度を改善するために、モノクローナル抗体は、それらの特異的エピトープ認識のためにしばしば使用される。ポリクローナル抗体はまた、モノクローナル抗体と比較して標的に対する親和性の増加のために、様々なイムノアッセイで首尾よく使用されている。イムノアッセイは、幅広い生物学的試料マトリックスとともに使用するために設計されている。イムノアッセイ形式は、定性的、半定量的、及び定量的結果を提供するように設計されている。
定量的結果は、検出される特定の分析物の既知の濃度で作成された標準曲線の使用によって生成され得る。未知の試料からの応答またはシグナルが標準曲線上にプロットされ、未知の試料における標的に対応する量または値が確立される。
多数のイムノアッセイ形式が設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物／バイオマーカーの検出について定量的であり得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかへの標識の付着に依存し、標識構成要素は、直接的または間接的のいずれかで、酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、分析物の直接的、間接的、競合的、またはサンドイッチ検出のためにフォーマットされ得る。他の方法は、例えば、放射性同位体（Ｉ１２５）または蛍光などの標識に依存する。追加の技法には、例えば、凝集、比濁法、濁度測定、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイなどが含まれる（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂｒｉａｎ Ｌａｗ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｔｄ．，２００５ ｅｄｉｔｉｏｎを参照）。
例示的なアッセイ形式としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ、蛍光、化学発光、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）イムノアッセイが挙げられる。バイオマーカーを検出するための手順の例には、バイオマーカー免疫沈降、続いてゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィーなどのサイズ及びペプチドレベルの識別を可能にする定量的方法が含まれる。
検出可能な標識またはシグナル生成材料を検出及び／または定量化する方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素（検出可能な標識が酵素である場合、上記を参照）によって触媒される反応の産物は、限定されないが、蛍光、発光、もしくは放射性であり得るか、またはそれらは可視光または紫外線を吸収し得る。かかる検出可能な標識を検出するのに好適な検出器の例としては、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーター、及び濃度計が挙げられるが、これらに限定されない。
検出のための方法のいずれかは、反応の任意の好適な調製、処理、及び分析を可能にする任意の形式で実施することができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルまたは３８４ウェル）であるか、または任意の好適なアレイまたはマイクロアレイを使用することができる。様々な薬剤の原液は、手動またはロボットで製造することができ、その後のすべてのピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料読み出し、データ収集、及び分析は、検出可能な標識を検出することができる市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、及び検出器具を使用してロボットで行うことができる。
ハイブリダイゼーションアッセイ
かかる用途は、生成されるプロファイルにおいてアッセイされる／プロファイルされる遺伝子の各々について「プローブ」核酸を表示する核酸が用いられるハイブリダイゼーションアッセイである。これらのアッセイでは、標的核酸の試料が、アッセイされる初期の核酸試料から最初に調製され、調製は、標識、例えば、シグナル産生系のメンバーによる標的核酸の標識を含み得る。標的核酸試料の調製後、試料をハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触させ、それにより、アレイ表面に結合したプローブ配列に相補的な標的核酸間に複合体が形成される。次いで、ハイブリダイズされた複合体の存在を、定性的にまたは定量的のいずれかで検出する。主題の方法で用いられる発現プロファイルを生成するために実施され得る特定のハイブリダイゼーション技術には、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２８８，６４４号、同第５，３２４，６３３号、同第５，４３２，０４９号、同第５，４７０，７１０号、同第５，４９２，８０６号、同第５，５０３，９８０号、同第５，５１０，２７０号、同第５，５２５，４６４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５８０，７３２号、同第５，６６１，０２８号、同第５，８００，９９２号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）、ならびにＷＯ９５／２１２６５、ＷＯ９６／３１６２２、ＷＯ９７／１０３６５、ＷＯ９７／２７３１７、ＥＰ３７３２０３、及びＥＰ７８５２８０に記載の技術が含まれる。これらの方法では、発現がアッセイされているバイオマーカーの各々のプローブを含む「プローブ」核酸のアレイを、上述のように標的核酸と接触させる。接触は、ハイブリダイゼーション条件、例えば、上述のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われ、次いで、未結合核酸が除去される。ハイブリダイズされた核酸の結果として生じるパターンは、プローブされているバイオマーカーの各々の発現に関する情報を提供し、発現情報は、遺伝子が発現されるかどうか、典型的には、どのレベルで発現されるかの観点からであり、発現データ、すなわち、発現プロファイルは、定性的及び定量的の両方であり得る。
最適なハイブリダイゼーション条件は、標識されたプローブ及び固定化されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ（例えば、オリゴマー対２００塩基を超えるポリヌクレオチド）及び種類（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）に依存する。核酸の特異的（すなわち、ストリンジェント）ハイブリダイゼーション条件の一般的なパラメータは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（１９８７）（あらゆる目的のために、その全体が組み込まれる）に記載されている。ｃＤＮＡマイクロアレイを使用する場合、典型的なハイブリダイゼーション条件は、５ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳで、６５℃で４時間、続いて２５℃での低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（１ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）での洗浄、続いて２５℃で１０分間の高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）でのハイブリダイゼーションである（Ｓｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐ．１０６１４（１９９６）を参照）。有用なハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｔｉｊｅｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．（１９９３）及びＫｒｉｃｋａ， ”Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９２）にも提供される。
配列決定及び核酸プロファイリング
ある特定の実施形態では、本発明は、標的化核酸プロファイリング（例えば、配列決定、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応など）を伴う（例えば、Ｇｅｉｓｓ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒ－ｃｏｄｅｄ ｐｒｏｂｅ ｐａｉｒｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８ Ｍａｒ；２６（３）：３１７－２５を参照）。ある特定の実施形態では、標的化核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）は、当該技術分野で知られている任意の方法、例えば、次世代配列決定または深部配列決定としても知られているハイスループット配列決定の方法によって配列決定され得る。バーコード（例えば、複製起点特異的バーコード）で標識された核酸標的分子をバーコードで配列決定して、標的分子及びバーコードの両方の配列またはその一部を含有する単回読み取り及び／またはコンティグを産生することができる。例示的な次世代配列決定技術としては、とりわけ、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定、４５４配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、及びナノポア配列決定が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出に対して脆弱である細胞を検出または定量化するための単一細胞ＲＮＡ配列決定を伴う（例えば、Ｋａｌｉｓｋｙ，Ｔ．，Ｂｌａｉｎｅｙ，Ｐ．＆ Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｌｅｖｅｌ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５，４３１－４４５，（２０１１）、Ｋａｌｉｓｋｙ，Ｔ．＆ Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，３１１－３１４（２０１１）、Ｉｓｌａｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｂｙ ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＮＡ－ｓｅｑ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１１）、Ｔａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ－Ｓｅｑ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｃａｐｔｕｒｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５，５１６－５３５，（２０１０）、Ｔａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．ｍＲＮＡ－Ｓｅｑ ｗｈｏｌｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３７７－３８２，（２００９）、Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｍＲＮＡ－Ｓｅｑ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０，７７７－７８２，（２０１２）、及びＨａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．，Ｓｈｅｒ，Ｎ．＆ Ｙａｎａｉ，Ｉ．ＣＥＬ－Ｓｅｑ： Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐ６６６－６７３，２０１２を参照）。
ある特定の実施形態では、本発明は、プレートベースの単一細胞ＲＮＡ配列決定を伴う（例えば、Ｐｉｃｅｌｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，“Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２”Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ９，１７１－１８１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１４．００６を参照）。
ある特定の実施形態では、本発明は、ハイスループット単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを伴う。この点に関して、Ｍａｃｏｓｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，“Ｈｉｇｈｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ”Ｃｅｌｌ １６１，１２０２－１２１４、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４９１７８号、２０１６年３月１７日にＷＯ２０１６／０４０４７６として公開、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，“Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ”Ｃｅｌｌ １６１，１１８７－１２０１、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２７７３４号、２０１６年１０月２０日にＷＯ２０１６１６８５８４Ａ１として公開、Ｚｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１６，“Ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｌｉｎｋｅｄ－ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，３０３－３１１、Ｚｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ”Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，１４０４９ ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４０４９、国際特許公開第ＷＯ２０１４／２１０３５３Ａ２号、Ｚｉｌｉｏｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．Ｊａｎ；１２（１）：４４－７３、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｎｄｅｘｉｎｇ”ｂｉｏＲｘｉｖ ｐｒｅｐｒｉｎｔ ｆｉｒｓｔ ｐｏｓｔｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｆｅｂ．２，２０１７，ｄｏｉ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１０４８４４、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｓｃａｌｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐｌｉｔ ｐｏｏｌ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ”ｂｉｏＲｘｉｖ ｐｒｅｐｒｉｎｔ ｆｉｒｓｔ ｐｏｓｔｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｆｅｂ．２， ２０１７，ｄｏｉ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１０５１６３、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｗｉｔｈ ｓｐｌｉｔ－ｐｏｏｌ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ”Ｓｃｉｅｎｃｅ １５ Ｍａｒ ２０１８、Ｖｉｔａｋ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｏｕｓａｎｄｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｎｄｅｘｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（３）：３０２－３０８，２０１７、Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５７（６３５２）：６６１－６６７，２０１７、Ｇｉｅｒａｈｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑ－Ｗｅｌｌ：ｐｏｒｔａｂｌｅ，ｌｏｗ－ｃｏｓｔ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，３９５－３９８ （２０１７）、及びＨｕｇｈｅｓ，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ－Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”ｂｉｏＲｘｉｖ ６８９２７３；ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６８９２７３（それらの各々のすべての内容及び開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に対する言及がなされる。
ある特定の実施形態では、本発明は、単核ＲＮＡ配列決定を伴う。これに関して、Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４，“Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．１０２－１０６、Ｈａｂｉｂ ｅｔ ａｌ．，２０１６，“Ｄｉｖ－Ｓｅｑ： Ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｕｓ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｒａｒｅ ａｄｕｌｔ ｎｅｗｂｏｒｎ ｎｅｕｒｏｎｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３５３，Ｉｓｓｕｅ ６３０２，ｐｐ．９２５－９２８、Ｈａｂｉｂ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｕｓ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｗｉｔｈ ＤｒｏＮｃ－ｓｅｑ”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｏｃｔ；１４（１０）：９５５－９５８、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９２３９号、２０１７年９月２８日にＷＯ２０１７１６４９３６として公開、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６０８６０号、２０１９年５月１６日にＷＯ／２０１９／０９４９８４として公開、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５５８９４号、２０２０年４月１６日にＷＯ／２０２０／０７７２３６として公開、及びＤｒｏｋｈｌｙａｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｃｏｌｏｎ ａｔ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，”ｂｉｏＲｘｉｖ ７４６７４３；ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／７４６７４３（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に対する言及がなされる。
ある特定の実施形態では、本発明は、記載される配列決定を使用したＡｓｓａｙ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）を伴う。（例えば、Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｏｒ ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｐｅｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ，ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３；１０（１２）： １２１３－１２１８、Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８６－４９０ （２０１５）、Ｃｕｓａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．Ａ．，Ｄａｚａ，Ｒ．，Ａｄｅｙ，Ａ．，Ｐｌｉｎｅｒ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｓｔｅｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．＆ Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｄｅｘｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５ Ｍａｙ ２２；３４８（６２３７）：９１０－４．ｄｏｉ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｂ１６０１．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｍａｙ ７、ＵＳ２０１６０２０８３２３Ａ１、ＵＳ２０１６００６０６９１Ａ１、及びＷＯ２０１７１５６３３６Ａ１を参照）。
スクリーニング方法
ある特定の実施形態では、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる治療薬をスクリーニングする。スクリーニングは、インビトロまたはインビボで行われ得る。例えば、腫瘍微小環境におけるリン酸塩排出を調節する薬剤は、インビボでスクリーニングされ得る。ある特定の実施形態では、がん細胞株は、本明細書に記載されるように、リン酸塩流出についてアッセイされ得る。
本発明のさらなる態様は、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる薬剤を特定するための方法に関し、これには、ａ）がん細胞または細胞集団に候補薬剤を適用すること、ｂ）候補薬剤による細胞または細胞集団におけるリン酸塩流出の調節を検出し、それにより、薬剤を特定すること、が含まれる。「調節する」という用語は、広く、調節されているものの定性的及び／または定量的変化、変更、または変動を意味する。調節が定量的に評価され得る場合、例えば、調節が細胞の定量化可能な特性などの定量化可能な変数の変更を含むか、もしくはそれからなる場合、または定量化可能な変数が調節のための好適な代理物を提供する場合、調節は、測定された変数の増加（例えば、活性化）または減少（例えば、阻害）の両方を具体的に包含する。この用語は、かかる調節の任意の程度、例えば、かかる増加または減少の任意の程度を包含し、より具体的には、測定された変数の統計的に有意な増加または減少を指し得る。例として、調節は、当該調節なしの参照状況と比較して、測定された変数の値の少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約１００％、例えば、少なくとも約１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または少なくとも約５００％増加を包含し得るか、または調節は、当該調節なしの参照状況と比較して、測定された変数の値の少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、例えば、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％減少もしくは低減を包含し得る。好ましくは、調節は、特異的または選択的であってもよく、したがって、免疫細胞または免疫細胞集団の１つ以上の所望の表現型の態様は、他の（意図しない、望ましくない）表現型の態様（複数可）を実質的に変化させることなく調節され得る。
「薬剤」という用語は、本明細書に開示されるように、細胞または細胞集団の１つ以上の表現型の態様を調節することができる任意の状態、物質、または薬剤を広く包含する。かかる条件、物質、または薬剤は、物理的、化学的、生化学的、及び／または生物学的性質のものであり得る。「候補薬剤」という用語は、方法において本明細書に開示されるように、細胞または細胞集団の１つ以上の表現型の態様を調節する能力について調べられている任意の状態、物質、または薬剤を指し、これには、候補薬剤を細胞または細胞集団に適用する（例えば、細胞または細胞集団を候補薬剤に曝露するか、または細胞または細胞集団を候補薬剤と接触させる）こと、及び所望の調節が行われるかどうかを観察することが含まれる。
薬剤には、例えば、本明細書に記載される抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、小分子、またはこれらの組み合わせなどの、生物学的に活性な状態、物質、または薬剤の任意の潜在的なクラスが含まれ得る。
スクリーニング方法は、環境ストレス及び／または状態を評価するために、化学ライブラリのスクリーニングのために、ならびに構造的、合成的、ゲノム的、及び／または生物及び種の多様性をスクリーニングまたは特定するために利用され得る。例えば、細胞培養物は、限定されないが、熱ショック、モル浸透圧濃度、低酸素、低温、酸化ストレス、放射線、飢餓、化学物質（例えば、治療薬または潜在的治療薬）などの環境ストレスに曝露され得る。応力が加えられた後、代表的な試料を、例えば、様々な時点で分析に供し、例えば、生物または細胞からの試料、例えば、生物からの細胞、または標準値などの対照と比較することができる。細胞またはその画分、組織、またはさらには動物全体を、化学ライブラリの異なるメンバーに曝露し、本明細書に記載の方法を実施することによって、化学ライブラリの異なるメンバーを、例えば、ハイスループット方法を使用して、比較的短い時間で、その表現型に対するそれらの効果について同時にスクリーニングすることができる。
いくつかの実施形態では、試験薬剤のスクリーニングは、多数の潜在的な調節剤を含有する組み合わせライブラリを試験することを伴う。組み合わせ化学ライブラリは、試薬などのいくつかの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成される多様な化学剤の集合であり得る。例えば、ポリペプチドライブラリなどの線形組み合わせ化学ライブラリは、所与の薬剤長（例えば、ポリペプチド薬剤中のアミノ酸の数）のために、一組の化学的ビルディングブロック（アミノ酸）をあらゆる可能な方法で組み合わせることによって形成される。何百万もの化学剤は、かかる化学的ビルディングブロックの組み合わせ混合によって合成することができる。
ある特定の実施形態では、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害に感受性であるがんは、がんから腫瘍細胞をスクリーニングすることによって特定される。方法は、がん細胞または細胞集団（例えば、ＲＢＤ）にＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害剤を適用することと、細胞または細胞集団におけるリン酸塩濃度を検出することと、を含み得、がんは、リン酸塩濃度が、阻害剤で処置されていない対照細胞または集団と比較して増加する場合に感受性である。ある特定の実施形態では、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害剤は、本明細書の任意の実施形態による１つ以上の治療薬である。ある特定の実施形態では、がん細胞または集団は、それを必要とする対象から得られるか、またはそれに由来する。例えば、方法は、対象からの腫瘍細胞が成長し、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害に対する感受性についてアッセイされるように、個別化された治療薬を含むことができる。ある特定の実施形態では、特定のがんに由来する細胞株をスクリーニングする。
キットまたは医薬系
本組成物は、新生物の緩和に使用するためのキットまたは医薬系に組み立てられてもよい。本発明のこの態様によるキットまたは医薬系は、箱、カートン、チューブなどの担体手段を含み、バイアル、チューブ、アンプル、またはボトルなどの１つ以上の容器手段をその中に密接に収容する。本発明のキットまたは医薬系はまた、本発明の薬剤を使用するための関連する指示を含み得る。本発明はまた、１つ以上のバイオマーカーに結合するか、または１つ以上のバイオマーカーを検出するために使用することができる検出試薬を含むキットを含み得る。
さらなる実施形態は、例示のみを目的として示され、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例に図示される。
実施例１－新規のＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体を介したリン酸塩調節不全は、卵巣癌における治療上の脆弱性である。
出願人らは、卵巣癌における生存能欠損を有する標的のがん依存性マップを調べることにより、リン酸塩調節不全ががんの治療可能性を有すると仮定した１８、１９。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９でスクリーニングされたすべての７３３のがん細胞株にわたって、リン酸塩排出輸送体ＸＰＲ１は、すべての遺伝子にわたって、特に卵巣癌及び子宮癌において観察される少数の遺伝的依存性について最も選択的及び予測的なプロファイルのうちの１つを有する（図１ａ）。ＸＰＲ１不活性化は、ほとんどのがん細胞株には影響を及ぼさないが、卵巣及び子宮癌細胞株は、ＸＰＲ１に高度の依存性を示す（６３の細胞株のうち１５がＣＥＲＥＳスコア＜－０．６を有する）。この選択的依存性プロファイルは、新興（例えば、ＷＲＮ２０、ＥＧＬＮ１２１）及び十分に確立されたがん治療標的（例えば、ＥＧＦＲまたはＩＫＺＦ１）と同等である。ＸＰＲ１の治療的阻害も、他の高度に選択的であるが挑戦的な標的（例えば、ＰＡＸ８、ＨＧＭ１、及びＷＴ１などの転写因子）よりも実行可能である１２。
次に、出願人らは、ＸＰＲ１への選択的依存性の分子的基礎を追求した。出願人らは、各がん細胞株２２の多くの細胞及び分子的特色間のＸＰＲ１依存性と最も相関する特色から多変量予測モデルを構築した。最も正確なモデルの変数重要度分析（ｒ＝０．３９１）（図１ａ、Ｙ軸）を使用して、最も優勢な予測特色は、リン酸塩取り込み輸送体遺伝子ＳＬＣ３４Ａ２の発現である（図１ｂ、０．３８正規化されたジニ重要度）。高いＳＬＣ３４Ａ２発現とＸＰＲ１依存性との間の相関は、主に卵巣及び子宮組織における強い関係によって駆動される（すべてにおいてＲ２＝０．１５、ｎ＝７３１対卵巣／子宮においてＲ２＝０．３３、ｎ＝６３、図２ａ）。興味深いことに、卵巣癌におけるＳＬＣ３４Ａ２発現の増加は未知の結果であるが、その増強された発現は十分に確立されている２３～２５。
ＳＬＣ３４Ａ２の高発現がＸＰＲ１への依存に関連しているという観察は、ＸＰＲ１不活性化による細胞内リン酸塩の蓄積が卵巣及び子宮癌細胞に対して選択的に毒性であるという仮説を導いた（図１ｃ）。出願人らは、ＳＬＣ３３４Ａ２発現が低いまたは高い卵巣及び子宮癌細胞株のパネルにおけるＸＰＲ１の遺伝的不活性化後に細胞生存能を評価することによって、最初にこれらの知見を検証した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＸＰＲ１不活性化は、ＳＬＣ３４Ａ２高細胞株における細胞生存能を、汎本質的対照の不活性化に類似するレベルまで減少させた。対照的に、出願人らは、ＳＬＣ３４Ａ２低細胞株における生存率の減少を見出さなかった（図１ｄ）。同様に、この生存能欠損は、ｓｈＲＮＡ試薬を使用してＸＰＲ１が抑制されたときに見られる（図２ｂ～ｄ）。
次に、出願人らは、ゲノムスケールの遺伝子機能喪失修飾スクリーニングを実施することによって、ＳＬＣ３４Ａ２（または他の遺伝子）がＸＰＲ１への依存性を付与するためにどの程度必要であるかを体系的に決定しようと試みた（図３ａ～ｂ２６）。試験した約１７，０００の遺伝子のうち、ＸＰＲ１不活性化の生存能欠損を救出した唯一の遺伝子ノックアウトは、ＳＬＣ３４Ａ２であった（図１ｅ、図３ｃ）。出願人らは、いくつかの細胞株においてＳＬＣ３４Ａ２を安定して不活性化または過剰発現することによって、ＳＬＣ３４Ａ２の必要性及び十分性をさらに試験した。変化したＳＬＣ３４Ａ２発現だけでは、成長または生存能の欠損は生じなかった（図１ｂの依存性プロファイルを参照）が、その発現は、ＸＰＲ１依存性を付与するのに必要かつ十分である（図１ｆ）。
代謝環境に感受性である依存性は、しばしば、組織培養とより生理学的に関連する設定との間で異なる場合がある。次に、出願人らは、原発性卵巣または子宮腫瘍におけるリン酸塩調節不全の証拠を見出すことができるかどうか、及び出願人らは、ＸＰＲ１が依存性であると予測される可能性のある腫瘍試料を特定することができるかどうかを出願人らは調査した。出願人らは最初にＸＰＲ１とＳＬＣ３４Ａ２との関係を評価し、出願人らは最初にＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）２７、２８の腫瘍からの一次試料及びＧｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎプロジェクト（ＧＴＥｘ）２９、３０からの正常組織からの証拠を求めた。出願人らは、卵巣癌及び子宮癌が、中でも増強されたＳＬＣ３４Ａ２発現を示す数少ない組織であることを見出した（図５ａ）。興味深いことに、卵管はリン酸塩ホメオスタシスにおいて既知の役割を有さないが、これらの正常試料は、正常な卵巣または子宮組織に対してわずかに高いＳＬＣ３４Ａ２の発現を有する（図４ａ）。これらの腫瘍の起源の細胞であり得る正常な卵管上皮（Ｋｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．,２００８、Ｐｉｅｋ ｅｔ ａｌ．,２００１、Ｊａｒｂｏｅ ｅｔ ａｌ．,２００８、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．,２０２０）と比較して、卵巣癌及び子宮癌において、それぞれ、１６．３倍及び２．６６倍の増加があった（図４ａ）。ほとんどの腫瘍試料は、ＸＰＲ１に高度に依存するがん細胞株として同等のＳＬＣ３４Ａ２発現を有した。
次に、出願人らは、これらの腫瘍試料における高レベルのＳＬＣ３４Ａ２発現を駆動するものの証拠を求めた。ＳＬＣ３４Ａ２は、ペアードボックス８（ＰＡＸ８）転写プログラム３５の構成要素であると以前に報告されている。ＰＡＸ８は、卵巣発がんの過程で増幅及び上方制御される系統定義転写因子である（Ｍｉｔｔａｇ ｅｔ ａｌ．,２００７、Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．,２０１１）。出願人らは、高レベルのＳＬＣ３４Ａ２を発現するすべての卵巣細胞株も、高レベルのＰＡＸ８を発現することを見出した（図５ｂ～ｃ）。これは、ＰＡＸ８発現が卵巣癌におけるＳＬＣ３４Ａ２の過剰発現を駆動することを示している可能性があり、さらなる研究が必要な魅力的な仮説である。
治療仮説（図１ｃ）によれば、腫瘍試料におけるＳＬＣ３４Ａ２の発現の増加は、リン酸塩流出の需要の増加、及びＸＰＲ１への依存を生じさせるであろう。この仮説に沿って、出願人らは、卵巣癌及び子宮癌におけるＸＰＲ１のコピー数増幅の強力な証拠を見出した（図４ｂ）２７。ＸＰＲ１遺伝子座は、卵巣癌において著しい再発性のコピー増加または増幅を受け（図４ｃ；ＧＩＳＴＩＣ３８により、ｑ＝０．００１５）、これらは、多くの場合、局所的であり、ＸＰＲ１のみを含む。子宮試料も、頻繁なＸＰＲ１コピー増加（試料の４４％）を有したが、それらは著しく再発しなかった（図５ｄ、ｑ＝０．５６８；参照３９）。したがって、ＸＰＲ１ ｍＲＮＡ発現レベルは、ＸＰＲ１コピー数変化と相関するが、他の機構が、ＸＰＲ１ ｍＲＮＡ発現をさらに駆動している（図４ｃ）。ＸＰＲ１及びＳＬＣ３４Ａ２の両方の増加した発現の背後にある原因事象は、これらの分析から明らかではないが、出願人らは、増加したＸＰＲ１の発現への依存が、ＳＬＣ３４Ａ２の増加の結果であることを提案する。一緒に、これらのデータは、卵巣腫瘍が正常な組織に対してリン酸塩ホメオスタシスを変化させ、ＳＬＣ３４Ａ２の高発現が、ＸＰＲ１阻害に対する応答を予測するための治療バイオマーカーとして機能し得ることを示す。
次に、出願人らは、ＸＰＲ１依存性が、インビトロ培養からの超生理学的リン酸塩レベルのアーティファクトではないという証拠を求めた。出願人らは、まず、リン酸塩濃度が異なる細胞株の成長培地（１５～約８０ｍｇ／ｄＬの範囲）の間で劇的に変化するが、ＸＰＲ１依存性の強度との相関はなかった（Ｒ２＝０．００、ｎ＝６５８、図６ａ）ことに留意した。さらに、出願人らが、高度にＸＰＲ１依存性の細胞株におけるリン酸塩濃度を約１０倍（７２．８～７．８ｍｇ／ｄＬ）低下させたとき、細胞は、ＸＰＲ１に高度に依存したままであり（図６ｂ～ｃ）、細胞外リン酸塩の生理学的濃度が、がん細胞の生存を阻害するのに十分であることを示す。
次に、出願人らは、ＸＰＲ１不活性化が、がん細胞株異種移植片の開始及び維持に影響を及ぼすかどうかを直接評価した。出願人らは、まず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの腫瘍形成競合アッセイで開発し、このアッセイでは、ｓｇＲＮＡの小さなライブラリが、レンチウイルスを介してインビトロでがん細胞株に送達され、迅速に皮下接種された（図７ａ）。ＸＰＲ１不活性化ｓｇＲＮＡの枯渇は、このアッセイにおいて競争上の不利益を引き起こし、その枯渇は、試験した２つのＳＬＣ３４Ａ２高発現細胞株における組織培養及びすべての異種移植片腫瘍の両方において認められた（図４ｄ～ｅ、補足表１及び図７ｂ～ｅ）。対照的に、他の代謝遺伝子、特にフェロトーシス制御因子ＧＰＸ４は、インビトロでの生存率効果とインビボでの生存率効果との間に差異を示し（図４ｄ～ｅ）、このアッセイが、代謝環境に感受性である依存性を検出することができることを示す。次に、出願人らは、臨床的に関連するモデルである確立された卵巣腹膜癌腫症に対するＸＰＲ１抑制の効果を評価した。出願人らは、ルシフェラーゼを発現するＳＬＣ３４Ａ２高発現卵巣癌細胞株及びＸＰＲ１を標的とするドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡまたはシード一致対照ｓｈＲＮＡ（図２）を腹腔に注射した（図８ａならびに研究設計のための方法及びタイムラインを参照）。腫瘍成長及び生理学的に関連するリン酸塩レベルへの順化の３週間後、腫瘍負荷は動物全体で一貫していた（図８ｂ～ｄ）ため、出願人らは、動物を対照またはドキシサイクリン食餌で治療した（図４ｆ～ｇ、挿入図、１群当たりｎ＝４）。ＸＰＲ１抑制は、ドキシサイクリン治療後の腫瘍進行を２週間顕著に遅延させた（図４ｆ）が、対照ｓｈＲＮＡの誘導は、腫瘍成長に対して顕著な効果を有さなかった（図４ｇ）。まとめると、皮下ｓｇＲＮＡ競合アッセイ及び腹腔内異種移植片の結果は、ＸＰＲ１依存性がインビボで生理学的レベルの無機リン酸塩で保持されることを示す。
次に、出願人らは、ＳＬＣ３４Ａ２過剰発現細胞株が、ＸＰＲ１ノックアウト後に生存能を失う理由についての機械的理解を追求した。治療仮説と一致して、出願人らは、生存能欠損と同じ時間枠で発生したＸＰＲ１のノックダウン後に細胞内リン酸塩の２～４倍の増加を観察した（図９ａ、図１０ａ）。細胞内リン酸塩を管理する機構がヒト生物学において十分に理解されていないため、出願人らは遺伝子発現プロファイリングを追求した１０。出願人らは、多重化された単一細胞ＲＮＡ配列決定アッセイであるＭｉｘＳｅｑ４０を使用して、ＸＰＲ１への依存度が異なる細胞株にわたって転写応答を比較した。出願人らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したＸＰＲ１不活性化の４日後、８つの異なる卵巣及び子宮癌細胞株を表す、２，５０１の単一細胞からデータを収集した。この時点は、二次的な効果ではなく、一次的なリン酸塩恒常性機構を特定するために選択された。この時点で、対照とＸＰＲ１不活性化条件との間で細胞数に顕著な差はなく、生存率効果がまだ発生していなかったことを示している。
出願人らは、最もＸＰＲ１依存性の細胞株の間で強く高度に相関した転写応答を観察した。このシグネチャーに表される正規の遺伝子セットはほとんど存在しない（図１０ｆ～ｉ）が、この転写プログラムは、少なくとも部分的に、出願人らがいくつかの遺伝子の差次的発現に基づいて結論づけるリン酸塩ホメオスタシスを回復しようとする。まず、出願人らは、血清リン酸塩の上昇に応答して、典型的には骨原性骨細胞によって発現される重要なリン酸塩恒常性ホルモンであるＦＧＦ２３の上方制御を観察した（図９ｆ）４１。これは、出願人らが観察する細胞内リン酸塩増加と一致する（図９ａ）。卵管、卵巣、及び子宮組織はリン酸塩ホメオスタシスに関与していないため、これらの細胞株がＦＧＦ２３を調節する能力は部分的であるが（図１０ｊ）驚くべきことである。９
出願人らはまた、リン酸塩取り込みの下方制御を観察した。２つのリン酸塩取り込み輸送体遺伝子、ＳＬＣ２０Ａ１及びＳＬＣ３４Ａ２は、ＸＰＲ１ノックアウト後に顕著に減少した（図９ｆ）。ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質レベルは、ＸＰＲ１のノックアウト後にも劇的に低減され（図９ｇ）、ＸＰＲ１ノックアウトは、ＳＬＣ３４Ａ２の部分的な抑制に起因する可能性が最も高い、リン酸塩取り込みの約６０％の減少を引き起こす（図９ｈ）。これらの結果は、ＳＬＣ３４Ａ２の完全なノックアウトがＸＰＲ１生存能欠損を完全に救出することができ（図１ｅ～ｆを比較）、ＳＬＣ３４Ａ２の調節不全を示すことを考えると、やや逆説的である。ＳＬＣ３４Ａ２の不完全な抑制は（ＰＡＸ８３５のような）代替の調節機構による可能性があるが、この仮説はさらなる研究を必要とする。全体として、これらのデータは、細胞内リン酸塩の増加に対抗しようとするリン酸塩感知機構の存在を強調する。
これらの結果に促されて、出願人らにリン酸塩流出が細胞生存に必要であるという直接的な証拠を求めた。相関依存関係は、多くの場合、同じ経路またはプロセスの一部である遺伝子を特定し、細胞死滅機構を知らせ４２、４３、高度に相関した依存性は、多くの場合、同じ複合体の一部である。出願人らは、無関係の遺伝子であるキナーゼＤ相互作用基質２２０４４～４７（ＫＩＤＩＮＳ２２０、図１１ａ及び図１２ａ～ｂ）の依存性プロファイルが、ＸＰＲ１への依存性と強く相関したことに驚いた。ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０の発現は、多様な組織にわたって高度に相関し（図１２ｃ）、これらの遺伝子がリン酸塩流出を達成するために協力する可能性が高いという仮説を立てることにつながった。実際、ＫＩＤＩＮＳ２２０またはＸＰＲ１の喪失は、細胞内リン酸塩の同様の増加を引き起こす（図１２ｄ）。リン酸塩流出の正確な機構は不明であるが、以前の研究は、ＸＰＲ１及び他の相同体が、ＥＸＳドメインと呼ばれる膜貫通タンパク質ドメインを使用して、リン酸塩流出を達成するためにゴルジ体と原形質膜の間で移動し、原形質膜とゴルジ体との間で移動してリン酸塩流出をもたらし、この移動がＣ末端ＥＸＳドメイン４８、４９を必要とすることを示唆する。興味深いことに、ＫＩＤＩＮＳ２２０も、これらの区画の間を移動する５０。これに促されて、ＸＰＲ１の局在化及びリン酸塩流出がＫＩＤＩＮＳ２２０を必要とするかどうかを評価した。
公的に入手可能な質量分析データベース（図１２ｅ）、共免疫沈降、及び免疫蛍光を使用することにより、出願人らは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０が、リン酸塩流出に必要なタンパク質複合体を形成することを確認した。第一に、出願人らは、従来の免疫沈降アプローチを使用して複合体を特定することができた。出願人らは、ｈｉｓ相互作用がＮ末端ＳＰＸドメインによって媒介されていないが１７、５１、タンパク質の適切な局在化に重要であるＸＰＲ１のＣ末端ＥＸＳドメインの一部を必要とするように見えることを見出した４８（図１１ｂ、図１３ａ～ｃ）。第二に、出願人らは、ＫＩＤＩＮＳ２２０の不活性化が、ＸＰＲ１の誤った局在化を引き起こすことに留意した（図１１ｃ）。最後に、出願人らは、卵巣癌細胞株におけるリン酸塩流出を直接測定し、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０の不活性化が、同様の程度までリン酸塩流出を減少させたことを見出した（図１１ｄ）。ＸＰＲ１ノックアウト後のＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質の喪失（図２ｂ）、及び一方が他方の喪失を補うことができないという知見（図１１ａ）は、これらのタンパク質が、同じタンパク質複合体の機能に必要であり、別個の流出複合体の機能には必要ないことを示す。したがって、以前に接続されていない２つの膜貫通タンパク質の共依存性は、無機リン酸塩を排出する基本的な能力の欠如に集中する。
出願人らは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０が、いくつかの実験により、リン酸塩流出に必要なタンパク質複合体を形成することを確認した。第一に、公的に入手可能な質量分析データセットにおいて、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０は一緒に、分泌経路内の他のタンパク質と相互作用する（図１３ａ）。第二に、出願人らは、共免疫沈降でＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体を確認し、ＸＰＲ１のＥＸＳドメインが、この相互作用に重要であることを見出した（図１１ｂ）。興味深いことに、ＸＰＲ１のＮ末端ＳＰＸドメイン（リン酸塩流出及び調節に関与している）は、ＫＩＤＩＮＳ２２０に結合するのに必要でも十分でもなかった。この物理的相互作用に沿って、ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質レベルは、ＸＰＲ１の抑制時に劇的に減少する（図２ｂ）。第三に、免疫蛍光を使用することにより、出願人らは、ＫＩＤＩＮＳ２２０不活性化が、ＸＰＲ１が点状分泌小胞からよりびまん性の細胞質パターンに誤って局在化することに留意した。最後に、出願人らは、リン酸塩流出を直接測定し、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０不活性化が、同じ程度にリン酸塩流出を損なうことを見出した（図１１ｄ）。重要なことに、ＸＰＲ１ノックアウト後のＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質の喪失（図２ｂ）、及び一方が他方の喪失を補うことができないという知見（図１１ａ）は、これらのタンパク質が、同じタンパク質複合体の機能に必要であり、別個の流出複合体の機能には必要ないことを示す。したがって、以前に接続されていない２つの膜貫通タンパク質の共依存性は、無機リン酸塩を排出する基本的な能力の欠如に集中する。
ＸＰＲ１のリン酸塩流出能力ががん細胞生存能に必要であることをさらに確認するために、出願人らは、稀な脳石灰化障害において報告されているＸＰＲ１の低形質変異を用いた１５、５２。内因性ＸＰＲ１のノックアウトは、完全長の野生型ＸＰＲ１の異所性発現によって救出され得るが、Ｌ２１８Ｓ変異は、適切な局在化にもかかわらず、細胞生存能を支持しなかった（図１１ｅ及び図１３）。この変異は、ある程度の残留リン酸塩流出能力を有し１５、おそらくこれらのがん細胞が部分的な機能喪失にさえ感受性であることを示す。これらのデータは、ＳＬＣ３４Ａ２過剰発現を伴う卵巣癌における細胞生存能に機能的リン酸塩流出が必要であることを明確に示す。
空胞様構造は、植物におけるリン酸塩貯蔵機構として説明されてきた。これらの研究の過程で、出願人らは、ＸＰＲ１依存性細胞が、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０不活性化後のＳＬＣ３４Ａ２の発現が高い細胞の形態における、非細胞質の際立った高度な浸透変化である、細胞質における大きな「空胞様」構造を形成したことに留意した（図１１ｆ及び図１４ａ）。これらの細胞は、細胞質において大きな「空胞様」構造を形成した。これらの構造は、試験されたすべてのＸＰＲ１依存性卵巣癌細胞株において観察され、常に細胞生存能の喪失に先行し（補足動画）、多核細胞において頻繁に出現した。場合によっては、細胞質全体は、出願人らが示す、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、核、または初期エンドソームに由来しないこれらの構造で満たされた（図１４ｂ）。しかしながら、これらの構造を酸性染料Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒで染色し（図１１ｇ）、リソソームマーカーＬＡＭＰ１と共局在しているように見え（図１４ｂ）、それらがリソソーム系に関連している可能性があることを示唆する。透過型電子顕微鏡による超微細構造分析により、これらの構造が二重膜によって結合され、しばしば有窓であることが明らかになった（図１１ｈ）。それらは、リソソームに典型的な電子密度の外観を有さないが、出願人らは、これらの「空胞様」構造とのリソソームの融合を観察した。出願人らは、これらが新規の構造であるが、ヒト生物学５３～５５または他の生物で報告されているリン酸塩貯蔵構造に関連していると仮定する。おそらく、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０の不活性化は、リン酸塩流出のプロセスで使用される小胞の過剰な細胞質蓄積及び融合を引き起こす。４９、５６、５７これらの構造が、これらのがん細胞株で観察された細胞生存または「細胞質密集」を支持しているかどうかは、観察された細胞周期停止（図９ｃ）に関連しており、細胞生存能の喪失はまだ決定されていない。
高濃度のリン酸塩で細胞を処理することは、前に毒性であることが示されているが５８、５９、この研究は、ＳＬＣ３４Ａ２の過剰発現とＸＰＲ１阻害との間の独特な合成致死的相互作用を利用している。ＸＰＲ１不活性化は、ＳＬＣ３４Ａ２の高発現にかかわらず、生物リン酸塩ホメオスタシスの既知の役割を有する組織（例えば、肺癌６０、６１、図２ａ）では毒性ではない。これは、細胞内リン酸塩の増加によりリン酸塩の取り込みを抑制するフィードバック機構に起因する可能性がある（図９で観察され、前に報告されているような１６）。対照的に、ＳＬＣ３４Ａ２の過剰発現は、おそらくＰＡＸ８または別の経路を介して、卵巣癌及び子宮癌におけるこのフィードバック機構を破壊し、細胞内リン酸塩の蓄積及び細胞死をもたらす。このフィードバック機構の同一性、及びその阻害がＸＰＲ１依存性を増強するかどうかは、さらなる研究が必要である。
卵巣癌におけるリン酸塩調節不全を利用するための治療戦略は、おそらくタンパク質リガンドの細胞外結合を介して、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０のリン酸塩流出能力を阻害することに焦点を当てるべきである１２。出願人らは、ＳＬＣ３４Ａ２過剰発現を有する大規模な患者集団がかかる療法に応答すると予想するが、腫瘍内の不均一性を評価する必要がある２３、２５。ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０を阻害することの副作用は、おそらく最小限であり、管理可能である。ほとんどの細胞株がＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０に依存していないため、リン酸塩毒性は個々の細胞に毒性である可能性は低いが、リン酸塩ホメオスタシスにおける生物の摂動は避けるべきである１３、４１。それにもかかわらず、ＸＰＲ１の一過性または部分的な阻害は許容される可能性が高く１５、５２、６２、低リン血症の臨床管理のための先例がある４１、６３。出願人らは、かかる戦略がいつかがん患者に利益をもたらすことを望む。
実施例２－ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０の治療的標的化
出願人らは、ＸＲＢＤが、卵巣癌細胞株におけるＸＰＲ１依存性リン酸塩流出を阻害することによる、ＸＰＲ１の薬物様阻害剤であることを示す（図１７Ａ）。２９３Ｔ細胞におけるＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０の安定したノックアウトを使用して、出願人らは、ＸＰＲ１及びＫＩＤＩＮＳ２２０がタンパク質複合体中にあり、ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質レベルが、ＸＰＲ１不活性化の代理マーカーであり、治療応答の潜在的なバイオマーカーであり得ることを示す（図１７Ｂ及び図２Ｂに対応する）。図１７Ｂで分析した２９３Ｔ細胞のＸＲＢＤフローサイトメトリー分析を使用して、出願人らは、ＫＩＤＩＮＳ２２０の不活性化が、ＸＰＲ１細胞表面局在化の劇的な減少をもたらすことを示す（図１７Ｃ及び図１１Ｃに対応する）。出願人らはさらに、治療が卵巣癌細胞株における生存能欠損を引き起こすように、ＸＲＢＤがＸＲＢＤで卵巣癌細胞株を治療することによる、ＸＰＲ１の薬物様阻害剤であることを示す（図１７Ｄ）。ＸＲＢＤ感受性（ビヒクル対照に対するＸＲＢＤの最大用量での５日間の処理後の細胞生存率の減少）は、各細胞株のＸＰＲ１不活性化感受性（ＣＲＩＳＰＲ生存率アッセイによって評価された）と相関する。出願人らは、肺癌細胞株の小さなパネルにおけるＸＲＢＤ治療を分析した（図１７Ｅ及び図５Ａに対応する）。高レベルで予測バイオマーカー（ＳＬＣ３４Ａ２）を発現するが、肺癌細胞株は、ＳＬＣ３４Ａ２リン酸塩取り込み輸送体を抑制して、ＸＰＲ１阻害時の細胞生存能欠損から保護することができる。ＫＩＤＩＮＳ２２０不活性化の有無にかかわらず、ＸＰＲ１含有天然タンパク質複合体のグリセロール勾配沈降分析を使用して、出願人らは、ＫＩＤＩＮＳ２２０不活性化が、ＸＰＲ１タンパク質複合体の分子量の劇的な低減をもたらすことを示し、タンパク質複合体組成の変化を示唆する（図１７Ｆ）。ＸＰＲ１ ＲＴ－ＰＣＲを使用して、出願人らは、ＸＰＲ１の不活性化が、リン酸塩関連遺伝子の変化（例えば、ＦＧＦ２３の上方制御）をもたらすことを示し、リン酸塩調節不全状態を示す（図１７Ｇ）。
図１７で使用したＸＲＢＤタンパク質の配列は、以下である：
ＭＬＶＭＥＧＳＡＦＳＫＰＬＫＤＫＩＮＰＷＧＰＬＩＶＭＧＩＬＶＲＡＧＡＳＶＱＲＤＳＰＨＱＩＦＮＶＴＷＲＶＴＮＬＭＴＧＱＴＡＮＡＴＳＬＬＧＴＭＴＤＴＦＰＫＬＹＦＤＬＣＤＬＶＧＤＹＷＤＤＰＥＰＤＩＧＤＧＣＲＴＰＧＧＲＲＲＴＲＬＹＤＦＹＶＣＰＧＨＴＶＰＩＧＣＧＧＰＧＥＧＹＣＧＫＷＧＣＥＴＴＧＱＡＹＷＫＰＳＳＳＷＤＬＩＳＬＫＲＧＮＴＰＫＤＱＧＰＣＹＤＳＳＶＳＳＧＶＱＧＡＴＰＧＧＲＣＮＰＬＶＬＥＦＴＤＡＧＲＫＡＳＷＤＡＰＫＶＷＧＬＲＬＹＲＳＴＧＡＤＰＶＴＲＦＳＬＴＲＱＶＬＮＶＧＰＲＶＰＩＧＳＶＤＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ （配列番号２）。
参考文献
１．Ｆａｕｂｅｒｔ， Ｂ．， Ｓｏｌｍｏｎｓｏｎ， Ａ． ＆ ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ， Ｒ． Ｊ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６８， （２０２０）．
２．Ｌｏｒｄ， Ｃ． Ｊ．＆ Ａｓｈｗｏｒｔｈ， Ａ． ＰＡＲＰ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５， １１５２－１１５８ （２０１７）．
３．Ｆｏｎｇ， Ｐ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ）－ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ： ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｄｕｒａｂｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ＢＲＣＡ ｃａｒｒｉｅｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｌａｔｉｎｕｍ－ｆｒｅｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８， ２５１２－２５１９ （２０１０）．
４．Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｏｌａｐａｒｉｂ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐｌａｔｉｎｕｍ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ．Ｍｅｄ．３６６， １３８２－１３９２ （２０１２）．
５．Ｌｈｅｕｒｅｕｘ， Ｓ．， Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ， Ｍ． ＆ Ｏｚａ， Ａ． Ｍ． Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ： Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６９， ２８０－３０４ （２０１９）．
６．Ｖａｕｇｈａｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ： ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １１， ７１９－７２５ （２０１１）．
７．Ｖｉｒｋｋｉ， Ｌ． Ｖ．， Ｂｉｂｅｒ， Ｊ．， Ｍｕｒｅｒ， Ｈ． ＆ Ｆｏｒｓｔｅｒ， Ｉ． Ｃ． Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ： ａ ｔａｌｅ ｏｆ ｔｗｏ ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｉｅｓ．Ａｍ． Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９３， Ｆ６４３－５４ （２００７）．
８．Ｂｌａｉｎｅ， Ｊ．， Ｃｈｏｎｃｈｏｌ， Ｍ． ＆ Ｌｅｖｉ， Ｍ． Ｒｅｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ， ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ａｎｄ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０， １２５７－１２７２ （２０１５）．
９．Ｓａｂｂａｇｈ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｎｐｔ２ｂ ｐｌａｙｓ ａ ｍａｊｏｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０， ２３４８－２３５８ （２００９）．
１０．Ａｚｅｖｅｄｏ， Ｃ． ＆ Ｓａｉａｒｄｉ， Ａ． Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ： Ｔｈｅ Ｉｎｏｓｉｔｏｌ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．４２， ２１９－２３１ （２０１７）．
１１．Ｄｅｓｆｏｕｇｅｒｅｓ， Ｙ．， Ｓａｉａｒｄｉ， Ａ． ＆ Ａｚｅｖｅｄｏ， Ｃ． Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ： ｗｈｅｒｅ’ｓ Ｗａｌｌｙ？ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２０２０） ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＳＴ２０１９０３２８．
１２．Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ， Ｄ．， Ｔｏｕｈａｍｉ， Ｊ．， Ｃｈａｒｎｅｔ， Ｐ．， Ｓｉｔｂｏｎ， Ｍ． ＆ Ｂａｔｔｉｎｉ， Ｊ．－Ｌ． Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｘｐｏｒｔ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＸＰＲ１ ｉｎ ｍｅｔａｚｏａｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．３， １８６６－１８７３ （２０１３）．
１３．Ａｎｓｅｒｍｅｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．Ｒｅｎａｌ Ｆａｎｃｏｎｉ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ Ｒｉｃｋｅｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ ａｎｄ Ｐｏｌｙｔｒｏｐｉｃ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｐｈｒｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２８， １０７３－１０７８ （２０１７）．
１４．Ｘｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．Ｍｕｒｉｎｅ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ－Ｆｅｔａｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｙｓｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａｎ Ｘｐｒ１ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ Ｆｅｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ Ｌａｔｅ Ｇｅｓｔａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．３５， １１６－１２９ （２０２０）．
１５．Ｌｅｇａｔｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＸＰＲ１ ｃａｕｓｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｆａｍｉｌｉａｌ ｂｒａｉｎ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｘｐｏｒｔ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４７， ５７９－５８１ （２０１５）．
１６．Ｌｉ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＸＰＲ１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｆｆｌｕｘ ｂｙ ＩｎｓＰ８ ｉｓ ａｎ ｅｘｅｍｐｌａｒ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ－ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ． Ａ． （２０２０） ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１９０８８３０１１７．
１７．Ｗｉｌｓｏｎ， Ｍ． Ｓ．， Ｊｅｓｓｅｎ， Ｈ． Ｊ．＆ Ｓａｉａｒｄｉ， Ａ． Ｔｈｅ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｈｅｘａｋｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅｓ ＩＰ６Ｋ１ ａｎｄ －２ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＸＰＲ１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｘｐｏｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９４， １１５９７－１１６０８ （２０１９）．
１８．Ｔｓｈｅｒｎｉａｋ， Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ Ｍａｐ．Ｃｅｌｌ １７０， ５６４－５７６．ｅ１６ （２０１７）．
１９．Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４９， １７７９－１７８４ （２０１７）．
２０．Ｃｈａｎ， Ｅ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．ＷＲＮ ｈｅｌｉｃａｓｅ ｉｓ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｅｔｈａｌ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５６８， ５５１－５５６ （２０１９）．
２１．Ｐｒｉｃｅ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＥＧＬＮ１ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ｉｎ Ｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９， ２５６４－２５７９ （２０１９）．
２２．Ｇｈａｎｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ．Ｎａｔｕｒｅ ５６９， ５０３－５０８ （２０１９）．
２３．Ｙｉｎ， Ｂ． Ｗ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＭＸ３５ ｄｅｔｅｃｔｓ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＮａＰｉ２ｂ （ＳＬＣ３４Ａ２） ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．８， ３ （２００８）．
２４．Ｇｒｙｓｈｋｏｖａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＮＡＰＩ２Ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐ．Ｏｎｃｏｌ．３１， ３７－４２ （２００９）．
２５．Ｌｅｖａｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＭＸ３５ ａｎｔｉｇｅｎ， ＮａＰｉ２ｂ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １７， ３０３ （２０１７）．
２６．ＤｅＷｅｉｒｄｔ， Ｐ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１， ７５２ （２０２０）．
２７．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ４７４， ６０９－６１５ （２０１１）．
２８．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ４９７， ６７－７３ （２０１３）．
２９．Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＵＣＳＣ Ｘｅｎａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｐｕｂｌｉｃ ａｎｄ ｐｒｉｖａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄａｔａ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ． ｂｉｏＲｘｉｖ ３２６４７０ （２０１９） ｄｏｉ：１０．１１０１／３２６４７０．
３０．Ｖｉｖｉａｎ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｏｉｌ ｅｎａｂｌｅｓ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ， ｏｐｅｎ ｓｏｕｒｃｅ， ｂｉｇ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５， ３１４－３１６ （２０１７）．
３１．Ｗａｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．Ｔｕｂａｌ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｍ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５， ８６９－８７９ （２０１５）．
３２．Ｅｌｉａｓ， Ｋ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｈａｒｅｄ ｃｅｌｌ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ ｆｏｒ ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃｙｓｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ａｎｄ ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２４６， ４５９－４６９ （２０１８）．
３３．Ｌａｗｒｅｎｓｏｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｔｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｈｉｇｈ－Ｇｒａｄｅ Ｓｅｒｏｕｓ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ． ｂｉｏＲｘｉｖ ３３０５９７ （２０１８） ｄｏｉ：１０．１１０１／３３０５９７．
３４．Ｋｏｂｅｌ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．５， ｅ２３２ （２００８）．
３５．Ｓｈｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．ＰＡＸ８ ｒｅｇｕｌｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｌｉｎｋｓ ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ＨＤＡＣ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｅｌｉｆｅ ８， （２０１９）．
３６．Ｍｉｔｔａｇ， Ｊ．， Ｗｉｎｔｅｒｈａｇｅｒ， Ｅ．， Ｂａｕｅｒ， Ｋ． ＆ Ｇｒｕｍｍｅｒ， Ｒ． Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ ｆｅｍａｌｅ ｐａｘ８－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｒｅ ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｄｅｓｐｉｔｅ ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４８， ７１９－７２５ （２００７）．
３７．Ｃｈｅｕｎｇ， Ｈ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｃｒｏｓｓ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ． Ａ． １０８， １２３７２－１２３７７ （２０１１）．
３８．Ｍｅｒｍｅｌ， Ｃ． Ｈ． ｅｔ ａｌ．ＧＩＳＴＩＣ２．０ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｔ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｆｏｃａｌ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｏｐｙ－ｎｕｍｂｅｒ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１２， Ｒ４１ （２０１１）．
３９．ＴＣＧＡ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐｏｒｔａｌ． ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｔｃｇａ／ｈｏｍｅ．
４０．ＭｃＦａｒｌａｎｄ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｓｔ－ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｄｅｆｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ． ｂｉｏＲｘｉｖ ８６８７５２ （２０１９） ｄｏｉ：１０．１１０１／８６８７５２．
４１．Ｍｉｎｉｓｏｌａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｕｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｉｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ ３， １７０４４ （２０１７）．
４２．Ｗａｉｎｂｅｒｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｌｍａｎａｃ ｏｆ ｃｏ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｏｄｕｌｅｓ ａｓｓｉｇｎｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅｓ． ｂｉｏＲｘｉｖ ８２７０７１ （２０１９） ｄｏｉ：１０．１１０１／８２７０７１．
４３．Ｋｉｍ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｆｉｔｎｅｓｓ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２， （２０１９）．
４４．Ｃａｂｒｅｒａ－Ｐｏｃｈ， Ｎ．， Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｒｕｉｌｏｂａ， Ｌ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｍ． ＆ Ｉｇｌｅｓｉａｓ， Ｔ． Ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｎｄ Ｓｒｃ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｋｉｄｉｎｓ２２０ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９， ２８５９２－２８６０２ （２００４）．
４５．Ｉｇｌｅｓｉａｓ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｋｉｄｉｎｓ２２０， ａ ｎｏｖｅｌ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５， ４００４８－４００５６ （２０００）．
４６．Ａｒｅｖａｌｏ， Ｊ．Ｃ．， Ｙａｎｏ， Ｈ．， Ｔｅｎｇ， Ｋ． Ｋ． ＆ Ｃｈａｏ， Ｍ． Ｖ． Ａ ｕｎｉｑｕｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ａｎｋｙｒｉｎ－ｒｉｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＥＭＢＯ Ｊ．２３， ２３５８－２３６８ （２００４）．
４７．Ｋｏｎｇ， Ｈ．， Ｂｏｕｌｔｅｒ， Ｊ．， Ｗｅｂｅｒ， Ｊ．Ｌ．， Ｌａｉ， Ｃ． ＆ Ｃｈａｏ， Ｍ． Ｖ． Ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１， １７６－１８５ （２００１）．
４８．Ｗｅｇｅ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＥＸＳ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＰＨＯ１ Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｓｈｏｏｔｓ ｔｏ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉａ ａ Ｒｏｏｔ－ｔｏ－Ｓｈｏｏｔ Ｓｉｇｎａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７０， ３８５－４００ （２０１６）．
４９．Ａｒｐａｔ， Ａ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＨＯ１ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｏｌｇｉ ａｎｄ ｔｒａｎｓ－Ｇｏｌｇｉ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ： ＰＨＯ１ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｏｌｇｉ／ｔｒａｎｓ－Ｇｏｌｇｉ ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．５， ｎｏ－ｎｏ （２０１２）．
５０．Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｒｕｉｌｏｂａ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ Ｄ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ ２２０－ｋＤａ ｔｒａｆｆｉｃ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ－９５／ｄｉｓｃｓ ｌａｒｇｅ／ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ－１－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１， １８８８８－１８９００ （２００６）．
５１．Ｗｉｌｄ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｅｎｓｏｒ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２， ９８６－９９０ （２０１６）．
５２．Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｎｃｈｅｚ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＸＰＲ１／ＳＬＣ５３Ａ１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｏｕｔｓｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＰＸ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｆａｍｉｌｉａｌ ｂｒａｉｎ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．９， ６７７６ （２０１９）．
５３．Ｒｕｉｚ， Ｆ． Ａ．， Ｌｅａ， Ｃ． Ｒ．， Ｏｌｄｆｉｅｌｄ， Ｅ． ＆ Ｄｏｃａｍｐｏ， Ｒ． Ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｎｓｅ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ａｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ａｃｉｄｏｃａｌｃｉｓｏｍｅｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９， ４４２５０－４４２５７ （２００４）．
５４．Ｍａｒｋｓ， Ｍ． Ｓ．， Ｈｅｉｊｎｅｎ， Ｈ． Ｆ． Ｇ． ＆ Ｒａｐｏｓｏ， Ｇ． Ｌｙｓｏｓｏｍｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ： ｕｎｕｓｕａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｂｅｃｏｍｅ ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５， ４９５－５０５ （２０１３）．
５５．Ｏｍｅｌｏｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４， ｅ５６３４ （２００９）．
５６．Ｓｎｙｄｅｒ， Ｎ． Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｈ＋ ａｎｄ Ｐｉ Ｂｙｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ａｆｆｅｃｔ Ｃａ２＋ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ａｒｅ Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｏｌｇｉ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ Ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｏｆ ＴＭＥＭ１６５ ａｎｄ ＸＰＲ１．Ｇ３ ７， ３９１３－３９２４ （２０１７）．
５７．Ｗｅｇｅ， Ｓ． ＆ Ｐｏｉｒｉｅｒ， Ｙ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ Ｐｏｌｙｔｒｏｐｉｃ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ （ＸＰＲ１） ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｘｐｏｒｔ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８８， ４８２－４８９ （２０１４）．
５８．Ｈｅ， Ｐ．， Ｍａｎｎ－Ｃｏｌｌｕｒａ， Ｏ．， Ｆｌｉｎｇ， Ｊ．， Ｅｄａｒａ， Ｎ． ＆ Ｒａｚｚａｑｕｅ， Ｍ． Ｓ． Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ： ｆｒｏｍ ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ． ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０１．０２．８９２６３８ （２０２０） ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０１．０２．８９２６３８．
５９．Ｄｉ Ｍａｒｃｏ， Ｇ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ａｍ． Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９４， Ｆ１３８１－７ （２００８）．
６０．Ｆｅｉｌｄ， Ｊ．Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｂｒｕｎ， Ｋ． Ａ．， Ｂｒｏｏｋｓ， Ｄ． Ｐ． ＆ Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｒ． Ｍ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｏｄｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５８， ５７８－５８２ （１９９９）．
６１．Ｈｅｒｎａｎｄｏ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＮａＰｉ－ＩＩｂ／Ｓｌｃ３４ａ２ ｉｎ Ｍｉｃｅ： Ｒｅｎａｌ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．３０， １９２５－１９３７ （２０１５）．
６２．Ａｎｈｅｉｍ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．ＸＰＲ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａ ｒａｒｅ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｆａｍｉｌｉａｌ ｂｒａｉｎ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２６３， １５５９－１５６４ （２０１６）．
６３．Ｗｏｈｒｌｅ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＦＧＦ） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ＦＧＦ２３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ ｒｉｃｋｅｔｓ．Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２８， ８９９－９１１ （２０１３）．
６４．Ｌｉ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｍｏｄｅｌｉｎｇ， ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｓ ｗｉｔｈ ＭＡＧｅＣＫ－ＶＩＳＰＲ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１６， ２８１ （２０１５）．
６５．Ｃｅｒａｍｉ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃＢｉｏ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｐｏｒｔａｌ： ａｎ ｏｐｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄａｔａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２， ４０１－４０４ （２０１２）．
６６．Ｇａｏ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ．Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．６， ｌ１ （２０１３）．
６７．Ｃｏｎｒａｄ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３２， ６０２－６１９ （２０１８）．
本発明の記載される方法、医薬組成物、及びキットの様々な修正及び変形は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明は、特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる修正が可能であり、特許請求される本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるであろう。実際、当業者には明らかである本発明を実施するための記載のモードの様々な修正は、本発明の範囲内であることが意図されている。本出願は、一般に、本発明の原理に従う本発明の任意の変形、使用、または適応を網羅することを意図し、本開示からのかかる逸脱を含むことは、本発明が属する技術分野内の既知の慣習的慣行の範囲内に入るものであり、本明細書に記載される前の本質的な特色に適用され得る。

Claims (37)

  1. がんの治療を必要とする対象におけるそれを治療する方法であって、前記対象に、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる１つ以上の治療薬を投与することを含む、前記方法。
  2. 前記がんが、卵巣癌、子宮癌、乳癌、胆管癌、肝臓及び肺癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記がんが、正常な組織における発現と比較して、腫瘍組織におけるＳＬＣ３４Ａ２のより高い発現を特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記１つ以上の治療薬が、ＸＰＲ１の発現もしくは活性を阻害する、ＫＩＤＩＮＳ２２０の発現もしくは活性を阻害する、及び／またはＸＰＲ１／ＫＩＤＩＮＳ２２０の相互作用を妨害する、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記１つ以上の治療薬が、エンベロープウイルス糖タンパク質に由来し、かつＸＰＲ１膜受容体と相互作用することができる受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）タンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＲＢＤタンパク質が、融合タンパク質であり、前記融合タンパク質が、前記タンパク質を二量体化及び／または安定化することができるドメインを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＲＢＤタンパク質が、Ｆｃドメイン、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及び／または血清アルブミンに融合される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＲＢＤタンパク質が、異種指向性またはポリトロープマウス白血病レトロウイルス（Ｘ－及びＰ－ＭＬＶ）Ｅｎｖに由来する、請求項５～７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記ＲＢＤ融合タンパク質が、以下のアミノ酸配列を含む、請求項６～８のいずれかに記載の方法：
    ＭＬＶＭＥＧＳＡＦＳＫＰＬＫＤＫＩＮＰＷＧＰＬＩＶＭＧＩＬＶＲＡＧＡＳＶＱＲＤＳＰＨＱＩＦＮＶＴＷＲＶＴＮＬ ＭＴＧＱＴＡＮＡＴＳＬＬＧＴＭＴＤＴＦＰＫＬＹＦＤＬＣＤＬＶＧＤＹＷＤＤＰＥＰＤＩＧＤＧＣＲＴＰＧＧＲＲＲＴＲＬＹＤＦＹＶＣＰＧＨＴＶＰＩＧＣＧＧＰＧＥＧＹＣＧＫＷＧＣＥＴＴＧＱＡＹＷＫＰＳＳＳＷＤＬＩＳＬＫＲＧＮＴＰＫＤＱＧＰＣＹＤＳＳＶＳＳＧＶＱＧＡＴＰＧＧＲＣＮＰＬＶＬＥＦＴＤＡＧＲＫＡＳＷＤＡＰＫＶＷＧＬＲＬＹＲＳＴＧＡＤＰＶＴＲＦＳＬＴＲＱＶＬＮＶＧＰＲＶＰＩＧＳＶＤＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ （配列番号２）。
  10. 前記１つ以上の治療薬が、前記ＲＢＤタンパク質をコードするベクターを含む、請求項５～９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記１つ以上の治療薬が、ＸＰＲ１に特異的な抗体、ＫＩＤＩＮＳ２２０に特異的な抗体、またはＸＰＲ１／ＫＩＤＩＮＳ２２０タンパク質複合体に特異的な抗体を含む、請求項４に記載の方法。
  12. 前記抗体が、ＫＩＤＩＮＳ２２０のＷａｌｋｅｒ Ａ／Ｂモチーフを標的とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記１つ以上の治療薬が、ディグレーダー分子を含む、請求項４に記載の方法。
  14. 前記ディグレーダー分子が、ＬＹＴＡＣ分子であり、それにより、細胞表面タンパク質が標的化される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記１つ以上の治療薬が、ＸＰＲ１またはＫＩＤＩＮＳ２２０の発現を阻害することができる遺伝子修飾剤を含む、請求項４に記載の方法。
  16. 前記遺伝子修飾剤が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＲＮＡｉ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ系、またはメガヌクレアーゼを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ塩基編集系、プライムエディタ系、またはＣＡＳＴ系である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記対象に、ＦＧＦ２３の発現または活性を阻害することができる、ＳＬＣ３４Ａ２の抑制を阻害することができる、またはＸＰＲ１阻害に応答して上方もしくは下方制御された１つ以上の遺伝子を調節することができる１つ以上の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１～１７のいずれかに記載の方法。
  19. ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる１つ以上の治療薬が、標準ケア治療レジメン内で共投与される、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記標準ケア治療レジメンが、手術及び化学療法を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記標準ケア治療レジメンが、免疫療法、チェックポイント遮断療法、またはＰＡＲＰ阻害剤の投与を含む、請求項１９のいずれかに記載の方法。
  22. がんの治療を必要とする対象におけるそれを治療する方法であって、
    対照に対してＳＬＣ３４Ａ２の増加した発現を検出することによって、リン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を検出することを含み、
    前記対象が、リン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を有する場合、請求項４～１７のいずれかに記載のＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる１つ以上の治療薬の投与を含み、
    前記対象が、前記リン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を有しない場合、ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる１つ以上の治療薬の投与を含まない標準ケア治療を投与することを含む、前記方法。
  23. 前記がんが、卵巣癌、子宮癌、乳癌、胆管癌、肝臓及び肺癌からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記標準ケア治療が、手術、化学療法、免疫療法、チェックポイント遮断療法、またはＰＡＲＰ阻害剤の投与のうちの１つ以上を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記対象から得られた腫瘍試料において、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ２０Ａ１、及びＦＧＦ２３からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を検出することを含む、前記治療の有効性を監視することをさらに含み、前記治療が、ＳＬＣ３４Ａ２及び／またはＳＬＣ２０Ａ１が減少した、及び／またはＦＧＦ２３が増加した場合に有効である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記対象から得られた腫瘍細胞におけるリン酸塩調節不全に関連する形態変化の増加を検出することを含む、前記治療の有効性を監視することをさらに含み、前記治療は、リン酸塩調節不全に関連する形態変化の増加が検出された場合に有効である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記リン酸塩調節不全に関連する前記形態変化が、腫瘍細胞における空胞様構造を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. がんに罹患している対象がリン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を有するかどうかを決定する方法であって、前記対象から得られた腫瘍試料においてＳＬＣ３４Ａ２の発現を検出することを含み、正常組織における発現と比較して、前記腫瘍試料におけるＳＬＣ３４Ａ２発現がより高い場合、前記腫瘍が感受性である、前記方法。
  29. ＰＡＸ８を検出することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  30. がんに罹患している対象がリン酸塩調節不全に感受性である腫瘍を有するかどうかを決定する方法であって、前記対象から得られた腫瘍試料中のＸＰＲ１コピー数における増幅を検出することを含み、前記ＸＰＲ１コピー数増幅が前記腫瘍試料中で検出された場合、前記腫瘍が感受性である、前記方法。
  31. 前記コピー数が、染色体１上のＸＰＲ１遺伝子座における標的配列決定パネルからの推論によって検出される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記がんが、卵巣癌、子宮癌、乳癌、胆管癌、肝臓及び肺癌からなる群から選択される、請求項２８～３１のいずれかに記載の方法。
  33. 前記検出することが、免疫組織化学（ＩＨＣ）、インサイチュＲＮＡ－ｓｅｑ、定量的ＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ、ウエスタンブロット、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＲＮＡ－ＦＩＳＨ、質量分析、またはＦＡＣＳのうちの１つ以上を含む、請求項２８～３２のいずれかに記載の方法。
  34. ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出を阻害することができる薬剤を特定するための方法であって、
    がん細胞または細胞集団に候補薬剤を適用することと、
    前記候補薬剤による前記細胞または細胞集団におけるリン酸塩流出の調節を検出し、それにより、前記薬剤を特定することと、を含む、前記方法。
  35. ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害に感受性であるがんを特定するための方法であって、
    ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の阻害剤をがん細胞または細胞集団に適用することと、
    前記細胞または細胞集団における前記リン酸塩濃度を検出することであって、前記がんは、前記リン酸塩濃度が、前記阻害剤で治療されていない対照細胞または集団と比較して増加した場合、感受性である、前記検出することと、を含む、前記方法。
  36. 前記ＸＰＲ１：ＫＩＤＩＮＳ２２０媒介性リン酸塩排出の前記阻害剤が、請求項４～１７のいずれかに記載の１つ以上の治療薬である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記がん細胞または集団が、それを必要とする対象から得られるか、またはそれに由来する、請求項３５または３６に記載の方法。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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WO2004080443A1 (en) * 2003-03-14 2004-09-23 Epistem Limited Treatment and/or prevention of non-viral epithelial damage
US8603474B2 (en) * 2008-01-29 2013-12-10 Ludwig Institute For Cancer Research, Ltd. Membrane transporter NaPi2b (SCL34A1) epitope for antibody therapy, antibodies directed thereto, and target for cancer therapy
GB201507030D0 (en) * 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
US20180280549A1 (en) * 2015-10-05 2018-10-04 Metafora Biosystems Receptor-binding domains ligands for the detection, diagnosis and treatment of pancreatic cancer
WO2020153467A1 (ja) * 2019-01-24 2020-07-30 中外製薬株式会社 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体
WO2021030627A1 (en) * 2019-08-13 2021-02-18 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof

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