JP2023536067A - 最適化されたｓｌｃ１３ａ５遺伝子および発現カセットならびにそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、最適化されたＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含むポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびに、ＯＲＦを細胞または対象に送達するための、および対象におけるＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の異常な発現またはＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物の異常な活性に関連する障害、例えばクエン酸輸送体障害を処置するための、その使用方法に関する。【選択図】 図１

Description

［優先権の陳述］
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下、２０２０年７月２３日に出願された米国仮出願番号６３／０５５，７９５の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書中に援用される。

［配列リストの電子出願に関する陳述］
連邦規則法典第３７巻１．８２１条の下で提出されたＡＳＣＩＩテキスト形式の配列リストであって、２０２１年７月１２日に作成されてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された、８，７６９バイトのサイズの５４７０－８８３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題されたものは、紙のコピーの代わりに提供される。この配列リストは、その開示に関して参照により本明細書中に援用される。

［本発明の分野］
本発明は、最適化されたＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含むポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびに、ＯＲＦを細胞または対象に送達するための、および対象におけるＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の異常な発現またはＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物の異常な活性に関連する障害、例えばクエン酸輸送体障害を処置するための、その使用方法に関する。

Ｎａ^＋／クエン酸共輸送体としても知られる溶質担体ファミリー１３（ナトリウム依存性クエン酸輸送体）メンバー５は、ヒトにおいてＳＬＣ１３Ａ５遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＳＬＣ１３Ａ５は、クエン酸を好むトリカルボン酸血漿輸送体である。ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の遺伝子突然変異は、ＳＬＣ１３Ａ５欠乏としても知られる極めて稀なクエン酸輸送体障害の原因である。ＳＬＣ１３Ａ５における突然変異は、生後数日で発作を発症する常染色体劣性のてんかん性脳症を引き起こす。罹患者は、発作、全体的な発育遅延、運動障害、および筋緊張低下を患う。

患児は生後数日以内に始まる発作を示し、それは生涯を通して持続する。彼らは、言語を発することが困難であり、運動発達が制限されて遅く、自立歩行に問題を有する。また、体の硬直や脱力のエピソードとともに音調の問題も報告されている。ほぼ全ての患児に歯のエナメル質の異常が見られる。脳ＭＲＩは正常に見えるか、または白質に微妙な変化を有する。患者の血中クエン酸レベルは軽度に上昇する。

現在までに説明されているＳＬＣ１３Ａ５突然変異は、クエン酸輸送体活性を生じないか、またはその量が減少している。クエン酸は重要な代謝産物であり、細胞におけるエネルギー生成経路において重要な役割を果たすことが知られている。さらに、そのキレート特性に起因して、細胞内外の他のイオンの濃度調節にも関与し得る。ＳＬＣ１３Ａ５輸送体は肝臓細胞において広く研究されているが、ヒトの脳におけるこの輸送体の機能は多くが未知である。

現在のところ、この疾患を治癒する明確な処置は存在しない。クエン酸輸送体障害を有する小児における発作の処置は、一部の患者において困難であることが証明されている。抗発作薬は、一部の患者において発作を良好に制御しているが、大部分の患者は、利用可能な薬物ではあまり良好な結果が得られていない。アセタゾラミドを含む複数の発作薬物およびケトン食が試みられているが、ＳＬＣ１３Ａ５欠乏の症候を管理する有効性は様々である。この集団に有意義かつ長期の治療的利益を提供することが必要とされている。

本発明は、クエン酸輸送体障害のようなＳＬＣ１３Ａ５発現に関連する障害を処置するための、治療的レベルのＳＬＣ１３Ａ５発現を提供することが可能な最適化されたＳＬＣ１３Ａ５遺伝子、発現カセット、およびベクターの開発に部分的に基づく。

したがって、本発明の一態様は、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドに関し、ここでヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。

本発明のさらなる一態様は、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを含む発現カセット、ならびに本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、形質転換された細胞、およびトランスジェニック動物に関する。

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体中に含む医薬製剤に関する。

本発明のさらなる一態様は、細胞においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる方法に関し、その方法は、細胞を本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターと接触させるステップを含み、それにより、細胞においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる。

本発明のさらなる一態様は、対象においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる方法に関し、その方法は、対象に、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を送達するステップを含み、それにより、対象においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる。

本発明のさらなる一態様は、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の異常な発現またはＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物の異常な活性に関連する障害を、処置を必要とする対象において処置する方法に関し、その方法は、ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームが対象において発現されるように、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を対象に投与するステップを含む。

本発明のさらなる一態様は、クエン酸輸送体障害を、処置を必要とする対象において処置する方法に関し、その方法は、ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームが対象において発現されるように、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を対象に投与するステップを含む。

本発明の別の態様は、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の異常な発現またはＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物の異常な活性に関連する障害を、処置を必要とする対象において処置する方法で使用するための、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞に関する。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。

ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ構築物デザインの概要を示す。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔタンパク質発現を示す。ベクターなし（ビヒクル、上パネル）または０．５μｇのｐＵＳＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５_ｏｐｔでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点顕微鏡。トランスフェクション後４８時間のヒトＳＬＣ１３Ａ５に対する抗体で染色したものは、ビヒクルで処置した細胞ではシグナルを示さなかったが、ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔトランスフェクト細胞は、細胞を取り囲む点状パターンを有していた。ＤＡＰＩを用いてＤＮＡを対比染色した。左側パネル：ＤＡＰＩ；中央パネル、抗－ＳＬＣ１３Ａ５；右側パネル、抗－ＳＬＣ１３Ａ５およびＤＡＰＩのマージした画像。 ｈＳＬＣ１３Ａ５_ｏｐｔタンパク質が形質膜に局在化することを示す。０．５μｇのｐＣｂｈ－ＧＦＰおよび０．５μｇのｐＵＳＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５_ｏｐｔでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点顕微鏡。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ蛍光（上の右側パネル、単独；下パネル、ＳＬＣ１３Ａ５およびＤＡＰＩとマージ）は、細胞基質において均一に検出され、形質膜で点状パターンであるＳＬＣ１３Ａ５染色と共局在しなかった（上の左側パネルに単独で示される；下パネルは、ＧＦＰおよびＤＡＰＩとのマージである）。ＤＡＰＩを用いてＤＮＡを対比染色した。 髄腔内ＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ処置により、Ｓｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスにおいて血漿クエン酸レベルが減少することを示す。８×１０^１１ｖｇ ｓｃＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５_ｏｐｔまたはコントロールとしてのビヒクルの髄腔内送達前後に、Ｓｌｃ１３ａ５ノックアウト（ＫＯ）マウスおよび野生型（ＷＴ）同腹子から血漿を単離し、クエン酸をＧＣ／ＭＳ分析により定量化した。図４Ａは、ＳＬＣ１３Ａ５患者と同様に、Ｓｌｃ１３ａ５ ＫＯマウス（右側バー）が、ＷＴマウス（左側バー）と比べて有意に増加したベースライン血漿クエン酸レベルを有することを示す。注入の１ヶ月後、ビヒクルで処置したＷＴマウス（図４Ｂ）およびＫＯマウス（図４Ｃ）（図４Ｂ、右側バー；図４Ｃ、中央バー）は、それらのそれぞれのベースライン血漿レベルと比べて同等の血漿クエン酸レベルを有していたが、ｓｃＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５_ｏｐｔで処置したＫＯマウス（図４Ｃ、右側バー）は、血漿クエン酸レベルが有意に減少した。データは、平均±ＳＥＭとして示した。（^＊ｐ＜０．０５）対応のないスチューデントｔ検定（図４Ａ）または一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後にダネット多重比較検定（図４Ｃ）。ｎ＝９ＷＴおよび１０ＫＯ。 髄腔内ＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ処置により、Ｓｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスにおいてＥＥＧ活動が正常レベルまで減少することを示す。Ｓｌｃ１３ａ５ノックアウト（ＫＯ）マウスおよび野生型（ＷＴ）同腹子を、ビヒクルまたは８×１０^１１ｖｇ ＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔを用いて約３月齢の時点で処置した。注入後約５ヶ月の時点で、マウスに無線テレメトリーを埋め込み、２回の６０時間セッションの間、ＥＥＧ活動を記録した。図５Ａは、ビヒクルまたはＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔで処置されたＷＴおよびＫＯマウスにおける代表的なＥＥＧトレースを示す。ビヒクルで処置したＫＯマウスは、ＷＴマウスまたはベクターで処置したＫＯマウスと比べててんかん発射が増加している。図５Ｂは、てんかんスパイクトレイン（ｓｐｉｋｅ ｔｒａｉｎｓ）の定量化を示す。ビヒクルで処置したＫＯマウス（図５Ｂ、中央バー）は、ビヒクルで処置したＷＴマウス（図５Ｂ、左側バー）およびＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔで処置したＫＯマウス（図５Ｃ、左側バー）と比べてスパイクトレインの数が増加している。データは、平均±ＳＥＭとして示した。Ｆｉｓｈｅｒ事後分析を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて統計的有意差を評価した。ｎ＝１２ＷＴ＋ビヒクル、ｎ＝９ＫＯ＋ビヒクル、ｎ＝７ＫＯ＋ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ。 髄腔内ＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ処置によって、Ｓｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスにおいて発作感受性および発作関連死が減少することを示す。Ｓｌｃ１３ａ５ノックアウト（ＫＯ）マウスおよび野生型（ＷＴ）同腹子を、ビヒクルまたはＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔを用いて約３月齢の時点で処置した。注入後６ヶ月の時点で、ベースライン活動のＥＥＧ記録後、マウスに繰り返し低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）を注入し、けいれん発作までの潜伏時間（図６Ａ）および発作の重症度（図６Ｂ）を、Ｒａｃｉｎｅスケールを用いて測定した。図６Ａは、ビヒクルで処置したＫＯマウスが、ビヒクルで処置したＷＴ同腹子と比べて発作発症までの潜伏時間が有意により短いことを示す。ＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔによる処置は、発作潜伏時間を正常レベルまで完全に減少させた。図６Ｂは、発作重症度が、より高いＲａｃｉｎｅスコアによって示されるように、ビヒクルで処置したＫＯマウスにおいて、ＷＴと比べて有意に増加することを示す。ＫＯマウスにおけるＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔを用いた処置は、発作重症度をＷＴレベルまで回復させた。図６Ｃは、ＫＯマウスにおける発作頻度および重症度の増加が、ＷＴマウスと比べてＰＴＺ注入を生き延びるマウスの割合がより低いことと関連したことを示す。ＫＯマウスにおけるＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔを用いた処置は、発作関連死に対して保護し、生存をＷＴレベルまで回復させた。データは、平均±ＳＥＭとして示した。（^＊ｐ＜０．０５）Ｓｉｄａｋ多重比較検定を伴う二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。ｎ＝８ＷＴ＋ビヒクル、ｎ＝９ＫＯ＋ビヒクル、ｎ＝６ＫＯ＋ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ。

本発明は、以下により詳細に説明される。この説明は、本発明が実施され得る全ての異なる方法または本発明に加えられ得る全ての特徴の詳細なカタログであることを意図しない。例えば、一実施形態に関して例示される特徴が他の実施形態に組み込まれてよく、特定の実施形態に関して例示される特徴がその実施形態から削除されてよい。さらに、本明細書中に示唆される様々な実施形態に対する非常に多くのバリエーションおよび追加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、本発明から逸脱しない。それ故に、以下の明細書は、本発明の一部の特定の実施形態を例示することを意図し、それらの全ての並べ替え、組み合わせおよびバリエーションを網羅的に特定することを意図しない。

文脈が別段の提示をしない限り、本明細書中に記載される本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで用いることができることが明確に意図される。さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施形態では、本明細書中に示される任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略することができると考えられる。例示すると、複合体が構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書が記載する場合は、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせを、単独または任意の組み合わせで省略および否定することができることが明確に意図される。

別段の定義がない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中、本発明の説明において用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみであり、本発明の限定を意図しない。

ヌクレオチド配列は本明細書において、別段の指示がない限り、一本鎖のみによって５’から３’の方向に、左から右に示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または（アミノ酸については）一文字コード、または三文字コードのいずれかによって、どちらも連邦規則法典第３７巻１．８２２条および確立された利用に従って表される。

別段の指示がある場合を除き、当業者に知られている標準的な方法が、組み換えおよび合成ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメントの生産、核酸配列の操作、形質転換された細胞の生産、ｒＡＡＶ構築物の構築、改変されたキャプシドタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列を発現するパッケージングベクター、ならびに一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞に用いられ得る。そのような技術は当業者に知られている。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ４ｔｈ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１２）；Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ．ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。

本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列および他の参考文献は、参考文献それらの全体で参照により援用される。

定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の提示をしない限り、複数形も含むことを意図する。

本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある列挙された事項の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、代替で解釈される場合は（「または（ｏｒ）」）、組み合わせの欠如を指し、および包含する。

さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施形態において、本明細書に示される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも検討する。

さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、本発明の化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能な値を言及する場合、規定される量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することが意図される。

本明細書において用いられる移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、挙げられた材料またはステップおよび特許請求の範囲に記載された発明の基礎的かつ新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを包含するものとして解釈されるべきである。したがって、本明細書において用いられる用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等と解釈すべきでない。

用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（および文法上の変形）は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される場合、挙げられた配列（例えば、配列番号）および挙げられた配列の５’および／または３’またはＮ末端および／またはＣ末端上または２つの末端間（例えばドメイン間）の合計で１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸の両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変更されないものを意味する。合計で１０個以下の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸は、追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を合わせて足した合計数を含む。本発明のポリヌクレオチドに適用される用語「実質的に変更される」とは、挙げられた配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比べて少なくとも約５０％以上の、コードされるポリペプチドを発現する能力の増大または低減を指す。本発明のポリペプチドに適用される用語「実質的に変更される」は、挙げられた配列からなるポリペプチドの活性と比べて少なくとも約５０％以上の、生物学的活性の増大または低減を指す。

本明細書において用いられる用語「パルボウイルス」は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーを包含し、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む。自律的パルボウイルスは、パルボウイルス、エリスロウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス、および、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスは、限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシのパルボウイルス、イヌのパルボウイルス、ニワトリのパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコのパルボウイルス、ガチョウのパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケン（ｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ）のパルボウイルス、ヘビのパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスを含む。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。

ディペンドウイルス属は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む、アデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）を含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；および表１を参照。

本発明の文脈における用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、制限されずに、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ならびに、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤＮ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。複数のさらなるＡＡＶ血清型およびクレードが同定されており（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１－６３８８および表１を参照）、それらも用語「ＡＡＶ」によって包含される。

本発明のパルボウイルス粒子およびゲノムは、限定されないが、ＡＡＶ由来であってよい。様々な血清型のＡＡＶおよび自律的パルボウイルスのゲノム配列、ならびに、ネイティブＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。かかる配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースに見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２およびＡＹ５３０５７９を参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。また、例えば、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： ９３９； Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：６８２３； Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：１３０９； Ｇａｏ ｅｔ ａｌ． ２００２ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１１８５４； Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｖｉｒｏｌ． ３３－：３７５－３８３； Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｖｉｒｏｌ． ３３０：３７５； Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ． １９９６ Ｖｉｒｏｌ． ２２１：２０８； Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：３３８５； Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． １９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：３０９； Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８２：８９１１； Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ． １９８６ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５８：９２１； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ． １９８３ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４５：５５５； Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：３９９４；国際特許公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および、米国特許第６，１５６，３０３号も参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。表１も参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３ ＩＴＲ配列の初期の説明は、Ｘｉａｏ，Ｘ．，（１９９６）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」Ｐｈ．Ｄ．学位論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルバニア州によって提供される（その全体で本明細書中に援用される）。

「キメラ」ＡＡＶ核酸キャプシドコード配列またはＡＡＶキャプシドタンパク質は、２以上のキャプシド配列の部分を組み合わせたものである。「キメラ」ＡＡＶビリオンまたは粒子は、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。

本明細書において用いられる用語「向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）」は、特定の細胞または組織タイプ（単数または複数）へのウイルスの優先的な侵入および／または特定の細胞または組織タイプへの侵入を促進する細胞表面との優先的な相互作用を指し、任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）および好ましくは、細胞における、ウイルスゲノムによって保有される配列の発現（例えば転写、任意に翻訳）、例えば、組み換えウイルスについては、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の発現が続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で調節される核酸配列に関するトランス作用因子が不存在では開始され得ないことを理解している。ｒＡＡＶゲノムの場合は、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス由来であってよく、および／または、組み込まれていないエピソーム、ならびに、ウイルス核酸が細胞内でとり得る任意の他の形態由来であってよい。

用語「向性プロファイル」は、１つまたは複数の標的細胞、組織および／または臓器の形質導入パターンを指す。キメラＡＡＶキャプシドの代表的な例は、末梢臓器の形質導入がほんの少しである中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞の効率的な形質導入によって特徴付けられる向性プロファイルを有する（例えば米国特許番号９，６３６，３７０（ＭｃＣｏｗｎら）、および米国特許公報２０１７／０３６０９６０（Ｇｒａｙら）を参照）。

本明細書において用いられる用語「ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の異常な発現に関連する障害」は、正常な対象または集団における発現レベルと比較して、対象におけるＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の発現の低減または変更によって引き起こされる、またはその症候である、疾患、障害、症候群、もしくは状態を指す。

本明細書において用いられる用語「ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物の異常な活性に関連する障害」は、正常な対象または集団における活性と比較して、対象におけるＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物の活性の低減または変更によって引き起こされる、またはその症候である、疾患、障害、症候群、もしくは状態を指す。一部の実施形態では、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物の異常な活性に関連する障害は、クエン酸輸送体障害、例えば、ＳＬＣ１３Ａ５欠乏であり得る。

本明細書において用いられる、ウイルスベクター（例えばＡＡＶベクター）による細胞の「形質導入」は、細胞内へのベクターの侵入およびウイルスベクター内への核酸の取り込みによる細胞内への遺伝物質の移行およびウイルスベクターを介した細胞内へのその後の移行を意味する。

別段の指示がない限り、「効率的な形質導入」または「効率的な向性」または同様の用語は、適切なポジティブコントロールまたはネガティブコントロールを参照することによって判定することができる（例えば、ポジティブコントロールの形質導入または向性のそれぞれ少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多い、またはネガティブコントロールの形質導入または向性のそれぞれ少なくとも約１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、５００％、１０００％またはそれよりも多い）。

同様に、適切なコントロールに対する参照によって、ウイルスが、標的組織に関して「効率的に形質導入しない」または「効率的な向性を有さない」（または同様の用語）か、判定することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ以外の組織、例えば、肝臓、腎臓、生殖腺および／または生殖細胞を効率的に形質導入しない（すなわち、効率的な向性を有さない）。特定の実施形態では、組織（単数または複数）（例えば、肝臓）の望ましくない形質導入は、望ましい標的組織（単数または複数）（例えば、ＣＮＳ細胞）の形質導入レベルの、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。

用語「５’部分」および「３’部分」は、２以上のエレメント間の空間的関係を定義するための相対的用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「３’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの３’末端にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの３’半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「５’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの５’末端にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの５’半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。

本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「ヌクレオチド配列」は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然起源および非天然起源ヌクレオチドの両方を含む）であってよいが、好ましくは一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。

用語「調節エレメント」は、核酸配列の発現のいくつかの態様を制御する遺伝因子を指す。例えば、プロモーターは、動作可能に連結されたコドン領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。他の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどである。１つまたは複数の調節エレメントが見られる核酸配列またはポリヌクレオチド内の領域は、「調節領域」と呼ばれ得る。

核酸に関して本明細書において用いられる用語「動作可能に連結される」とは、２以上の核酸の間の機能的な連結を指す。例えば、プロモーター配列は、プロモーター配列が異種核酸配列の転写を開始および／または仲介するという理由で、異種核酸配列に「動作可能に連結される」と説明され得る。一部の実施形態では、動作可能に連結された核酸配列は、連続しており、および／または、同一のリーディングフレーム内にある。

本明細書において用いられる用語「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、ポリヌクレオチドの部分、例えばポリペプチドをコードする遺伝子を指す。用語「コード領域」は、オープンリーディングフレームと互換性に用いられ得る。

本明細書において用いられる用語「コドン最適化」は、コード配列（例えばＳＬＣ１３Ａ５に関するコード配列を含む野生型配列）内に通常存在する１つまたは複数のコドンを、同一（同義）アミノ酸に関するコドンで置換することによって、発現を増大させるように最適化されている遺伝子コード配列を指す。この様式において、遺伝子によってコードされるタンパク質は同一であるが、根底となる遺伝子の核酸塩基配列または対応するｍＲＮＡは異なる。一部の実施形態では、最適化は、１つまたは複数のレアコドン（すなわち、特定の種由来の細胞において相対的に稀に生じるｔＲＮＡに関するコドン）を、翻訳の効率を改善するために、より頻繁に生じる同義コドンによって置換する。例えば、ヒトコドン最適化では、コード配列内の１つまたは複数のコドンは、同一アミノ酸に関してヒト細胞においてより頻繁に生じるコドンによって置換される。コドン最適化は、転写および／または翻訳の効率を改善し得る他のメカニズムを通して遺伝子発現を増大することもできる。ストラテジーは、制限されずに、合計ＧＣ含有量（すなわち、コード配列全体におけるグアニンおよびシトシンのパーセント）の増大、ＣｐＧ含有量（すなわち、コード配列におけるＣＧまたはＧＣジヌクレオチドの数）の低減、潜在的スプライスのドナーまたはアクセプター部位の除去、および／または、コザック配列のようなリボソームエントリー部位の付加または除去を含む。望ましくは、コドン最適化遺伝子は、改善されたタンパク質発現を示し、例えば、それによってコードされるタンパク質は、他の点で同様の細胞において野生型遺伝子によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、細胞において、検出可能により大きなレベルで発現される。

本明細書において用いられる用語「配列同一性」は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．１９８４ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７により記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。

有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ・ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから複数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブ・アライメント法の簡易化を用いており；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５：４０３およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得されたものである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。

さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって報告されるｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。

アミノ酸配列同一性の値のパーセンテージは、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「長い方の」配列の残基の合計数で割って決定される。「長い方の」配列は、並べられた領域内の実際の残基が最も多いものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２により導入されるギャップは無視する）。

同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。

アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含んでよい。さらに、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含む配列に関して、一実施形態では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に対する、同一のヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施形態では、短い方の配列におけるヌクレオチドの数を用いて決定される。同一性のパーセントの計算においては、相対的重みづけは、配列バリエーション、例えば挿入、欠失、置換などの様々な出現に割り当てられない。

一実施形態では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列バリエーションは「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算に関して以下に記載される重みづけスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「短い方の」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「長い方の」配列は、並べられた領域内の実際の残基が最も多いものである。

本明細書において用いられる「単離された」核酸またはヌクレオチド配列（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素から、または核酸もしくはヌクレオチド配列と関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、核酸またはヌクレオチド配列を意味する。

同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素から、またはポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドもしくは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリペプチドを意味する。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に加えられる、本明細書において用いられる用語「改変された」は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。

本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」（または文法上の同等物）によって、ウイルスベクターが、出発原料中の他の構成要素の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。

用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「の処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」（または文法上の同等の用語）によって、対象の状態の重症度を減少させること、または、少なくとも部分的に改善または改良すること、および／または、少なくとも１つの臨床症候を緩和、軽減または低減させること、および／または、症状の進行を遅延させることを意味する。

本明細書において用いられる用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｓ）」、または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびその文法上の同等物）は、疾患の発症を遅延または阻害することを意味する。その用語は、疾患の完全な消滅を必要とすることを意味せず、症状の発生率を減少させるため、または症状の発症を遅らせるための、任意のタイプの予防的処置を包含する。

本明細書において用いられる「処置有効（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「治療有効（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」量は、対象に対して何らかの改善または利益を与えるのに十分な量である。別の言い方をすると、「処置有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候の何らかの緩和、軽減、低減または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り治療的効果は完全または治癒的である必要はないことを理解している。

本明細書において用いられる「予防有効」量は、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延させるのに十分な量、および／または、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重症度を、本発明の方法が存在しない場合に生じるであろうものと比較して減少および／または遅延させるのに十分な量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。

ウイルスに関する、「異種ヌクレオチド配列」または「異種核酸」は、それぞれ、ウイルスにおいて天然起源でない配列または核酸である。一般に、異種核酸またはヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームおよび／または非翻訳ＲＮＡを含む。

「ベクター」は、外来遺伝物質を別の細胞（そこで複製および／または発現されることができる）へ運ぶためのビヒクルとして用いられる化合物を指す。外来核酸を含むクローニングベクターは、組み換えベクターと呼ばれる。核酸ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、発現カセット、および人工染色体である。組み換えベクターは典型的に、複製起点、マルチクローニング部位、および選択可能マーカーを含む。核酸配列は典型的に、挿入物（組み換え核酸または導入遺伝子）およびベクターの「主鎖」として働くより大きな配列からなる。遺伝情報を別の細胞へ移行させるベクターの目的は典型的に、標的細胞において、挿入物を単離、増殖、または発現させることである。発現ベクター（発現構築物または発現カセット）は、標的細胞における外因性遺伝子の発現のためのものであり、一般に、外因性遺伝子／ＯＲＦの発現を駆動するプロモーター配列を有する。標的細胞へのベクターの挿入は、細菌および真核生物細胞については形質転換またはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入は、しばしば形質導入と呼ばれる。また、用語「ベクター」は一般に、外来遺伝物質を別の細胞、例えば制限されないが、形質転換される細胞またはナノ粒子へ運ぶ働きをするためのアイテムを説明するために用いられてもよい。

本明細書において用いられる用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（および同様の用語）は、特定の実施形態では、一般に、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス粒子を指し、ビリオン内にパッケージされたウイルス核酸（すなわち、ベクターゲノム）を含む。本発明に係るウイルスベクターは、本発明に係るキメラＡＡＶキャプシドを含み、ＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムまたは任意の他の核酸（ウイルス核酸を含む）をパッケージすることができる。あるいは、一部の文脈においては、用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（および同様の用語）は、ビリオンが不存在のベクターゲノム（例えば、ｖＤＮＡ）、および／または、キャプシドにつながれた、またはキャプシド内にパッケージされた分子を送達するための輸送体として作用するウイルスキャプシドを指すために用いられ得る。

本発明のウイルスベクターはさらに、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される二重鎖パルボウイルス粒子であってよい（その開示は参照によりその全体で本明細書中に援用される）。したがって、一部の実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムがパッケージされ得る。

「組み換えＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、少なくとも１つの逆位末端配列（例えば、１つ、２つ、または３つの逆位末端配列）および１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは一般に、ウイルスを産生するためにシスで１４５塩基の末端反復（単数または複数）（ＴＲ（ｓ））を保持しているが、部分的または完全に合成の配列を含む改変ＡＡＶ ＴＲｓおよび非ＡＡＶ ＴＲｓも、この目的を果たすことができる。全ての他のウイルス配列は必ずしも必要でなく、トランスで供給されてよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。ｒＡＡＶベクターは、２つのＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＴＲｓ）を含んでもよく、それらは一般に、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の５’および３’末端にあるが、それに連続している必要はない。ＴＲｓは、互いに同一または異なってよい。ベクターゲノムは、単一のＩＴＲをその３’または５’末端に含んでもよい。

用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成して逆位末端配列（ＩＴＲ）として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、インテグレーションおよび／またはプロウイルス・レスキューなどの所望の機能を仲介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであってよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもののような非ＡＡＶ ＴＲ配列、または、ＳＶ４０複製起源として作用するＳＶ４０ヘアピンを、ＴＲとして用いることができ、それは、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変されてよい。さらに、ＴＲは、部分的または完全に合成の、例えば、米国特許番号５，４７８，７４５（Ｓａｍｕｌｓｋｉら）に記載の「ダブル－Ｄ配列」であってよい。

パルボウイルスゲノムは、回文構造の配列をその５’および３’両末端に有する。配列の回文構造の性質は、相補塩基対の間の水素結合の形成によって安定化されるヘアピン構造の形成を生じさせる。このヘアピン構造は、「Ｙ」または「Ｔ」形状をとると考えられている。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。

「ＡＡＶ逆位末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む任意のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。ＩＴＲが、例えば、複製、ウイルスパッケージング、インテグレーション、および／またはプロウイルス・レスキューなどの所望の機能を仲介する限り、ＡＡＶ ＩＴＲは、ネイティブのＩＴＲ配列を有する必要はない（例えば、ネイティブのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更されてよい）。

用語「ｒＡＡＶ粒子」および「ｒＡＡＶビリオン」は、本明細書において相互交換可能に用いられる。「ｒＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたｒＡＡＶベクターゲノムを含む。

本発明のウイルスベクターはさらに、国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載される「標的化」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた向性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスのＩＴＲｓおよびウイルスのキャプシドが異なるパルボウイルス由来である）であってよい。

さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含むことができる。

本明細書において用いられる用語「アミノ酸」は、任意の天然起源アミノ酸、それらの改変された形態、および合成アミノ酸を包含し、非天然起源アミノ酸を含む。天然起源、左旋性（Ｌ－）アミノ酸を表２に示す。

あるいは、アミノ酸は、改変されたアミノ酸残基（非限定的な例を表３に示す）であってよく、または、翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）によって改変されたアミノ酸であってよい。

さらに、非天然起源アミノ酸は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９によって記載される「非天然」アミノ酸であってよい。これらの非天然アミノ酸は、目的分子をＡＡＶキャプシドタンパク質に化学的に連結させるために有利に用いることができる。

用語「テンプレート」または「基質」は、本明細書において、パルボウイルスのウイルスＤＮＡを生産するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために用いられる。ベクター生産の目的のために、テンプレートは、典型的に、制限されないが、プラスミド、ネイキッドＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクターなど）を含む、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれる。あるいは、テンプレートは、パッケージング細胞の染色体内に安定的に組み込まれ得る。

本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の生産を仲介するパルボウイルスまたはＡＡＶの非構造的タンパク質をコードする核酸配列を示す。パルボウイルスおよびＡＡＶ複製遺伝子およびタンパク質は、例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。

「Ｒｅｐコード配列」は、パルボウイルスまたはＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の全てをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関しては、Ｒｅｐコード配列は、４つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の全てをコードする必要はなく、実際に、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質のみを発現すると考えられている。代表的な実施形態では、Ｒｅｐコード配列は、少なくとも、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン中へのパッケージングに必要な、複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施形態では、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質およびＡＡＶ Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施形態では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに、さらなる実施形態では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、または、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。

本明細書において用いられる用語「大きなＲｅｐタンパク質」は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求の範囲に記載される発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであってよい。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３を含む任意のパルボウイルスまたはＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更され得る。

当業者は、複製タンパク質は同一のポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに理解する。例えば、ＭＶＭに関しては、ＮＳ－１およびＮＳ－２タンパク質（スプライス変異体）は、互いに独立に発現され得る。同様に、ＡＡＶに関しては、ｐ１９プロモーターは不活化され得て、大きなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は１つのポリヌクレオチドから発現され得て、小さなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は異なるポリヌクレオチドから発現され得る。しかしながら典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現することがより便利である。一部のシステムでは、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター）は、細胞によって認識されなくてよく、したがって、別個の発現カセットから大きなＲｅｐタンパク質および小さなＲｅｐタンパク質を発現する必要がある。他の例では、大きなＲｅｐタンパク質および小さなＲｅｐタンパク質を、別個に、すなわち、別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で発現することが望ましくあり得る。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きな方の比を低減させるように、大きなＲｅｐタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合は、細胞に対する毒性を避けるために、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方調節することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５を参照）。

本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能性パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする（すなわち、ＤＮＡをパッケージすること、および標的細胞に感染することができる）。典型的に、ｃａｐコード配列は、パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドサブユニットの全てをコードするが、機能性キャプシドが生産される限り、全てよりも少ないキャプシドサブユニットがコードされてよい。典型的に、必ずしもではないが、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。

自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤＮ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に記載される。

特性を「実質的に維持する」によって、特性（例えば、活性または他の測定可能な特徴）の少なくとも約７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％が維持されることを意味する。

ＳＬＣ１３Ａ５発現カセットおよびベクター
本発明は、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子によってコードされるタンパク質であるＮａ^＋／クエン酸共輸送体の治療的レベルの発現を提供するためのＳＬＣ１３Ａ５発現カセットの設計、および対象における治療的レベルのＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体を達成するための発現カセットの使用に関する。

したがって、本発明の一態様は、哺乳類のＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドに関し、ここで、ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームは、哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化されている。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類（例えば、サルおよびヒヒ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類など（例えば、ラット、マウス、ハムスターなど）を含む。オープンリーディングフレームは、Ｎａ^＋／クエン酸共輸送体をコードするＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の部分である。一部の実施形態では、哺乳類のＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームは、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームであり得る。本明細書において用いられる哺乳類のＳＬＣ１３Ａ５ ＯＲＦは、哺乳類のＮａ^＋／クエン酸共輸送体をコードするヌクレオチド配列を指し、例えば、ヒトＳＬＣ１３Ａ５ ＯＲＦは、ヒトＮａ^＋／クエン酸共輸送体をコードするヌクレオチド配列を指す。コドン最適化は当技術分野でよく知られている技術であり、異なる種における発現のために最適なコドンは公知である。コドン最適化ＳＬＣ１３Ａ５配列の使用は、対象における内因性ＳＬＣ１３Ａ５配列の発現から、形質導入配列の発現を区別するのを可能にする。

一部の実施形態では、コドン最適化ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームは、野生型配列から改変されている、例えば、１、２、３、４、または５残基が野生型アミノ酸配列と比較して置換、付加、および／または欠失されているアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる、Ｎａ^＋／クエン酸共輸送体タンパク質をコードする。

配列番号１．ヒトＳＬＣ１３Ａ５（ＣＣＤＳ１１０７９．１；ＮＣＢＩアクセッションナンバーＮＭ＿１７７５５０．５）
ATGGCCTCGGCGCTGAGCTATGTCTCCAAGTTCAAGTCCTTCGTGATCTTGTTCGTCACCCCGCTCCTGCTGCTGCCACTCGTCATTCTGATGCCCGCCAAGTTTGTCAGGTGTGCCTACGTCATCATCCTCATGGCCATTTACTGGTGCACAGAAGTCATCCCTCTGGCTGTCACCTCTCTCATGCCTGTCTTGCTTTTCCCACTCTTCCAGATTCTGGACTCCAGGCAGGTGTGTGTCCAGTACATGAAGGACACCAACATGCTGTTCCTGGGCGGCCTCATCGTGGCCGTGGCTGTGGAGCGCTGGAACCTGCACAAGAGGATCGCCCTGCGCACGCTCCTCTGGGTGGGGGCCAAGCCTGCACGGCTGATGCTGGGCTTCATGGGCGTCACAGCCCTCCTGTCCATGTGGATCAGTAACACGGCAACCACGGCCATGATGGTGCCCATCGTGGAGGCCATATTGCAGCAGATGGAAGCCACAAGCGCAGCCACCGAGGCCGGCCTGGAGCTGGTGGACAAGGGCAAGGCCAAGGAGCTGCCAGGGAGTCAAGTGATTTTTGAAGGCCCCACTCTGGGGCAGCAGGAAGACCAAGAGCGGAAGAGGTTGTGTAAGGCCATGACCCTGTGCATCTGCTACGCGGCCAGCATCGGGGGCACCGCCACCCTGACCGGGACGGGACCCAACGTGGTGCTCCTGGGCCAGATGAACGAGTTGTTTCCTGACAGCAAGGACCTCGTGAACTTTGCTTCCTGGTTTGCATTTGCCTTTCCCAACATGCTGGTGATGCTGCTGTTCGCCTGGCTGTGGCTCCAGTTTGTTTACATGAGATTCAATTTTAAAAAGTCCTGGGGCTGCGGGCTAGAGAGCAAGAAAAACGAGAAGGCTGCCCTCAAGGTGCTGCAGGAGGAGTACCGGAAGCTGGGGCCCTTGTCCTTCGCGGAGATCAACGTGCTGATCTGCTTCTTCCTGCTGGTCATCCTGTGGTTCTCCCGAGACCCCGGCTTCATGCCCGGCTGGCTGACTGTTGCCTGGGTGGAGGGTGAGACAAAGTATGTCTCCGATGCCACTGTGGCCATCTTTGTGGCCACCCTGCTATTCATTGTGCCTTCACAGAAGCCCAAGTTTAACTTCCGCAGCCAGACTGAGGAAGAAAGGAAAACTCCATTTTATCCCCCTCCCCTGCTGGATTGGAAGGTAACCCAGGAGAAAGTGCCCTGGGGCATCGTGCTGCTACTAGGGGGCGGATTTGCTCTGGCTAAAGGATCCGAGGCCTCGGGGCTGTCCGTGTGGATGGGGAAGCAGATGGAGCCCTTGCACGCAGTGCCCCCGGCAGCCATCACCTTGATCTTGTCCTTGCTCGTTGCCGTGTTCACTGAGTGCACAAGCAACGTGGCCACCACCACCTTGTTCCTGCCCATCTTTGCCTCCATGTCTCGCTCCATCGGCCTCAATCCGCTGTACATCATGCTGCCCTGTACCCTGAGTGCCTCCTTTGCCTTCATGTTGCCTGTGGCCACCCCTCCAAATGCCATCGTGTTCACCTATGGGCACCTCAAGGTTGCTGACATGGTGAAAACAGGAGTCATAATGAACATAATTGGAGTCTTCTGTGTGTTTTTGGCTGTCAACACCTGGGGACGGGCCATATTTGACTTGGATCATTTCCCTGACTGGGCTAATGTGACACATATTGAGACT

一部の実施形態では、コドン最適化ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームは、配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えば、それと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を、含む、から本質的になる、またはからなる。

配列番号２．ヒトコドン最適化ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム
ATGGCCTCGGCGTTGAGCTACGTGTCCAAGTTCAAGTCCTTTGTGATCCTGTTTGTGACCCCTCTCTTGCTCCTGCCACTCGTGATTCTGATGCCGGCCAAGTTTGTGCGCTGCGCCTACGTGATCATCCTGATGGCAATCTACTGGTGTACCGAAGTCATCCCCCTCGCCGTGACTTCTCTTATGCCGGTGCTGCTGTTCCCGCTGTTCCAAATCCTCGACAGCCGCCAGGTCTGCGTGCAGTACATGAAGGACACCAACATGCTGTTCCTGGGCGGCCTGATTGTGGCCGTGGCAGTGGAGCGGTGGAACCTCCACAAGCGCATCGCCCTGAGGACTCTGCTCTGGGTCGGCGCTAAGCCAGCGCGGCTGATGCTGGGGTTCATGGGAGTGACCGCGCTGCTCTCCATGTGGATCAGCAACACCGCCACTACCGCCATGATGGTCCCGATCGTGGAAGCCATTCTGCAACAGATGGAAGCTACTTCCGCCGCCACTGAAGCGGGACTGGAACTGGTGGACAAGGGAAAGGCCAAGGAACTGCCCGGTTCACAAGTCATCTTCGAGGGACCAACTCTGGGCCAGCAGGAGGACCAAGAGCGCAAGCGGCTGTGCAAGGCCATGACCTTGTGTATCTGCTACGCCGCTTCGATCGGAGGCACTGCCACCCTGACCGGGACTGGACCCAACGTCGTGCTGCTGGGACAGATGAACGAGCTGTTCCCGGATTCCAAGGACCTTGTGAACTTCGCGTCGTGGTTCGCCTTCGCATTCCCTAACATGCTCGTGATGCTGCTCTTTGCATGGCTGTGGCTGCAGTTCGTGTATATGCGGTTTAACTTCAAGAAGTCCTGGGGATGCGGTCTGGAATCCAAGAAGAACGAGAAGGCCGCGCTTAAGGTCCTCCAGGAAGAATACCGGAAATTGGGGCCGCTGAGCTTCGCCGAGATCAACGTGCTCATCTGTTTCTTCCTGCTGGTCATCCTGTGGTTCTCAAGAGATCCTGGTTTCATGCCGGGGTGGCTCACTGTGGCCTGGGTCGAAGGAGAAACCAAATACGTGTCGGATGCGACTGTGGCAATCTTTGTCGCCACGCTCCTGTTCATCGTGCCTTCCCAAAAGCCTAAGTTCAACTTCCGCTCCCAAACCGAAGAGGAGCGCAAAACACCGTTTTACCCTCCACCTCTGTTGGACTGGAAAGTCACCCAGGAAAAGGTCCCATGGGGCATCGTGCTCCTGCTGGGCGGAGGTTTCGCCCTGGCTAAGGGCAGCGAAGCCAGCGGTCTGTCCGTGTGGATGGGAAAACAGATGGAGCCGCTGCACGCTGTGCCCCCTGCTGCCATCACTCTCATTCTGTCCCTGCTTGTCGCCGTGTTTACCGAGTGCACCTCCAACGTCGCTACCACTACTCTGTTCTTGCCCATCTTCGCCTCGATGTCGAGATCCATCGGCCTGAACCCCCTCTACATTATGCTGCCGTGCACCTTGTCCGCCTCCTTCGCGTTCATGCTGCCTGTGGCGACTCCCCCGAATGCTATTGTGTTCACCTACGGCCATCTCAAGGTCGCAGACATGGTCAAGACCGGAGTGATCATGAACATTATTGGCGTGTTCTGCGTGTTCTTGGCCGTGAATACCTGGGGTAGAGCAATTTTCGACCTTGACCACTTCCCGGACTGGGCCAACGTGACCCATATCGAAACT

本発明の別の態様は、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットに関する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒトコドン最適化配列、例えば、配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えば、それと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含むポリヌクレオチドである。

発現カセット内のＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームは、ＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体の発現を高め得る１つまたは複数の発現エレメントに動作可能に連結され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結され得る。一部の実施形態では、本発明のプロモーターは、ユビキタスプロモーター、例えば、Ｋａｒｕｍｕｔｈｉｌ－Ｍｅｌｅｔｈｉｌ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（７）：５０９－５２１に記載のＵｓＰプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーター、例えば、ＵｓＰプロモーター、例えば、配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えば、それと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなるプロモーターに動作可能に連結される。

配列番号３．ＵｓＰプロモーター
GGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAG

一部の実施形態では、ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームは、ポリアデニル化シグナル、例えば、合成ポリアデニル化シグナル、例えば、配列番号４のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなるポリアデニル化シグナルに動作可能に連結される。

配列番号４．合成ポリアデニル化シグナル（ＳｐＡ）
AATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG

当業者は、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて用いられ得ることをさらに理解している。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて構成的または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）または外来であってよく、天然（ｎａｔｕｒａｌ）または合成の配列であることができる。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主において、その転写開始領域が見られないことを意図する。

プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または処置される対象に対してネイティブおよび／または異種核酸配列に対してネイティブであることができる。プロモーター／エンハンサーエレメントは一般に、目的の標的細胞（単数または複数）において機能するように選択される。代表的な実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンス・エレメントは、構成的または誘導性であり得る。

誘導性の発現制御エレメントは、異種核酸配列（単数または複数）の発現に対して調節を提供することが望ましい適用において一般に用いられる。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または組織好適プロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋を含む）、神経組織特異的または好適（脳特異的を含む）、眼（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または好適、骨髄特異的または好適、膵臓特異的または好適、脾臓特異的または好適、および肺特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターを含む。

ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームが標的細胞において転写されて、次いで翻訳される実施形態では、特異的な開始シグナルが一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために用いられる。これらの外因的な翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドン（すなわち翻訳開始部位）および隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な起源であることができる。

特定の実施形態では、発現カセットは、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）、例えば２つのＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。２つのＩＴＲは、同一のヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し得る。ＡＡＶ ＩＴＲは、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ２由来であり得る。それぞれのＩＴＲは独立に、野生型配列または改変配列であり得る。一部の実施形態では、改変ＩＴＲはＤエレメント欠失（ＷＯ０１／９２５５１）を有し得る。Ｄエレメント欠失は、Ｄエレメントとして知られるＩＴＲの部分の除去として定義される。Ｄエレメントはあるいは、Ｄ領域、またはＤ配列、および／または回文ヘアピン構造を形成しないＩＴＲのヌクレオチドと呼ぶことができ、又はそのような名称で知られ得る。一部の実施形態では、発現カセットは、ＡＡＶゲノム、例えば、自己相補ＡＡＶゲノムである。

特定の実施形態では、発現カセットは、プロモーター、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化部位を含み、挙げられた順で含んでもよい。特定の実施形態では、発現カセットは、ＡＡＶ ＩＴＲ、プロモーター、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含み、挙げられた順で含んでもよい。特定の実施形態では、発現カセットは、ＵｓＰプロモーター、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、およびＳｐＡポリアデニル化部位を含み、挙げられた順で含んでもよい。特定の実施形態では、発現カセットは、ＡＡＶ ＩＴＲ、ＵｓＰプロモーター、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、ＳｐＡポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含み、挙げられた順で含んでもよい。特定の実施形態では、発現カセットは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＵｓＰプロモーター、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、ＳｐＡポリアデニル化部位、およびＡＡ２Ｖ ＩＴＲを含み、挙げられた順で含んでもよい。特定の実施形態では、発現カセットは、改変ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＵｓＰプロモーター、ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、ＳｐＡポリアデニル化部位、および野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、挙げられた順で含んでもよい。前述の構成要素は、動作可能な連結である。

一部の実施形態では、発現カセットは、配列番号５のヌクレオチド配列または、それと少なくとも約７０％同一の、例えば、それと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなる。

配列番号５．ＩＴＲを除いたヒトＳＬＣ１３Ａ５発現カセット
GGTTCGGTACCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGTCCGGAACCGGTGCCACCATGGCCTCGGCGTTGAGCTACGTGTCCAAGTTCAAGTCCTTTGTGATCCTGTTTGTGACCCCTCTCTTGCTCCTGCCACTCGTGATTCTGATGCCGGCCAAGTTTGTGCGCTGCGCCTACGTGATCATCCTGATGGCAATCTACTGGTGTACCGAAGTCATCCCCCTCGCCGTGACTTCTCTTATGCCGGTGCTGCTGTTCCCGCTGTTCCAAATCCTCGACAGCCGCCAGGTCTGCGTGCAGTACATGAAGGACACCAACATGCTGTTCCTGGGCGGCCTGATTGTGGCCGTGGCAGTGGAGCGGTGGAACCTCCACAAGCGCATCGCCCTGAGGACTCTGCTCTGGGTCGGCGCTAAGCCAGCGCGGCTGATGCTGGGGTTCATGGGAGTGACCGCGCTGCTCTCCATGTGGATCAGCAACACCGCCACTACCGCCATGATGGTCCCGATCGTGGAAGCCATTCTGCAACAGATGGAAGCTACTTCCGCCGCCACTGAAGCGGGACTGGAACTGGTGGACAAGGGAAAGGCCAAGGAACTGCCCGGTTCACAAGTCATCTTCGAGGGACCAACTCTGGGCCAGCAGGAGGACCAAGAGCGCAAGCGGCTGTGCAAGGCCATGACCTTGTGTATCTGCTACGCCGCTTCGATCGGAGGCACTGCCACCCTGACCGGGACTGGACCCAACGTCGTGCTGCTGGGACAGATGAACGAGCTGTTCCCGGATTCCAAGGACCTTGTGAACTTCGCGTCGTGGTTCGCCTTCGCATTCCCTAACATGCTCGTGATGCTGCTCTTTGCATGGCTGTGGCTGCAGTTCGTGTATATGCGGTTTAACTTCAAGAAGTCCTGGGGATGCGGTCTGGAATCCAAGAAGAACGAGAAGGCCGCGCTTAAGGTCCTCCAGGAAGAATACCGGAAATTGGGGCCGCTGAGCTTCGCCGAGATCAACGTGCTCATCTGTTTCTTCCTGCTGGTCATCCTGTGGTTCTCAAGAGATCCTGGTTTCATGCCGGGGTGGCTCACTGTGGCCTGGGTCGAAGGAGAAACCAAATACGTGTCGGATGCGACTGTGGCAATCTTTGTCGCCACGCTCCTGTTCATCGTGCCTTCCCAAAAGCCTAAGTTCAACTTCCGCTCCCAAACCGAAGAGGAGCGCAAAACACCGTTTTACCCTCCACCTCTGTTGGACTGGAAAGTCACCCAGGAAAAGGTCCCATGGGGCATCGTGCTCCTGCTGGGCGGAGGTTTCGCCCTGGCTAAGGGCAGCGAAGCCAGCGGTCTGTCCGTGTGGATGGGAAAACAGATGGAGCCGCTGCACGCTGTGCCCCCTGCTGCCATCACTCTCATTCTGTCCCTGCTTGTCGCCGTGTTTACCGAGTGCACCTCCAACGTCGCTACCACTACTCTGTTCTTGCCCATCTTCGCCTCGATGTCGAGATCCATCGGCCTGAACCCCCTCTACATTATGCTGCCGTGCACCTTGTCCGCCTCCTTCGCGTTCATGCTGCCTGTGGCGACTCCCCCGAATGCTATTGTGTTCACCTACGGCCATCTCAAGGTCGCAGACATGGTCAAGACCGGAGTGATCATGAACATTATTGGCGTGTTCTGCGTGTTCTTGGCCGTGAATACCTGGGGTAGAGCAATTTTCGACCTTGACCACTTCCCGGACTGGGCCAACGTGACCCATATCGAAACTTGATAGGCGGCCGCGGAGCTCTCGAGAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGACGCGT

本発明のさらなる一態様は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターに関する。適切なベクターは、限定されないが、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクター）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。例えば、核酸は、５’および／または３’ＩＴＲ（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ ＩＴＲ）を含むＡＡＶベクターを含むことができ、からなることができ、またはから本質的になることができる。一部の実施形態では、ベクターは、発現カセットが付着した、または発現カセットが中に埋め込まれた、粒子（例えば、微粒子またはナノ粒子）またはリポソームなどの送達ビヒクルである。ベクターは、発現カセットを細胞へ運ぶのに適切な任意の送達ビヒクルであり得る。

一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスのベクターおよび／またはＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ９であり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含んでよい。他の実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型キャプシドタンパク質と比較して変更された向性を有する改変キャプシドタンパク質、例えば、肝臓脱標的化された、または特定の細胞への向性が高い改変キャプシドタンパク質を含み得る。

一部の実施形態では、ベクターは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、自己相補または二重鎖ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。ｓｃＡＡＶベクターは、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載されている（その開示は参照によりその全体で本明細書中に援用される）。ＳＬＣ１３Ａ５ ＯＲＦを発現するためにｓｃＡＡＶを使用することは、細胞形質導入の数、形質導入細胞あたりのコピー数、またはその両方の増加を提供し得る。

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターを含む形質転換された細胞に関する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、細胞ゲノム内に安定的に組み込まれる。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ細胞であってよい。

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を含む非ヒト・トランスジェニック動物に関する。一部の実施形態では、動物は、実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、または非ヒト霊長類である。

本発明のさらなる一態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体中に含む医薬製剤に関する。

特定の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、単離される。

別の特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、精製される。

ウイルスベクターを産生する方法
本発明はさらに、ウイルスベクターを産生する方法を提供する。特定の１つの実施形態では、本発明は、組み換えＡＡＶ粒子を産生する方法を提供し、その方法は、ＡＡＶ複製を許容する細胞に：（ａ）以下を含む組み換えＡＡＶテンプレート：（ｉ）本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセット、および（ｉｉ）ＩＴＲ；（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチドを；組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で提供するステップを含み；それにより、細胞において組み換えＡＡＶ粒子が産生される。組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、ＡＡＶテンプレートの複製およびＡＡＶキャプシドへのキャプシド形成のために十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）およびアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。特定の実施形態では、ＡＡＶテンプレートは、本発明のポリヌクレオチドに対して５’および３’に位置する２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むが、それらはそれに直接隣接している必要はない。

一部の実施形態では、組み換えＡＡＶテンプレートは、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載されるように、二重鎖ＡＡＶベクターを作成するためにＲｅｐによって分離されないＩＴＲ（ａｎ ＩＴＲ ｔｈａｔ ｉｓ ｎｏｔ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｂｙ Ｒｅｐ）を含む。

ＡＡＶテンプレートならびにＡＡＶ ｒｅｐ配列およびｃａｐ配列は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージングされたＡＡＶテンプレートを含むウイルスベクターが細胞において産生される条件下で提供される。その方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含むことができる。ウイルスベクターは、培地から、および／または細胞を溶解することによって回収することができる。

細胞は、ＡＡＶウイルス複製を許容する細胞であることができる。当技術分野で知られている任意の適切な細胞が用いられ得る。特定の実施形態では、細胞は、哺乳類細胞（例えば、霊長類またはヒト細胞）である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス相補性（ｔｒａｎｓ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス相補性細胞であることができる。

ＡＡＶ複製およびキャプシド配列は、当技術分野で知られている任意の方法によって提供され得る。現在のプロトコルは典型的に、単一プラスミド上のＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。ＡＡＶ複製配列およびパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、そうであることが便利であり得る。ＡＡＶ ｒｅｐ配列および／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失したアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域内への挿入）。ＥＢＶベクターはまた、ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現するためにも用いられ得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターはエピソームであるが、継続的な細胞分裂を通して高いコピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と呼ばれる染色体外エレメントとして細胞内に安定的に組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）。

さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞内に安定的に組み込まれ得る。

典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防ぐために、ＴＲによって挟まれない。

ＡＡＶテンプレートは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて細胞に提供され得る。例えば、テンプレートは、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶテンプレートは、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失したアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域内へ挿入される）。別の例として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５は、ＡＡＶ ＴＲによって挟まれたレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを記載している。ＥＢＶベクターはまた、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上述したように、テンプレートを送達するためにも用いられ得る。

別の代表的な実施形態では、ＡＡＶテンプレートは、複製ｒＡＡＶウイルスによって提供される。さらに他の実施形態では、ＡＡＶテンプレートを含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体内に安定的に組み込まれる。

ウイルス力価を高めるために、生産的なＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を細胞に提供することができる。ＡＡＶ複製のために必要なヘルパーウイルス配列は当技術分野で知られている。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、および米国特許第６，０４０，１８３号および同第６，０９３，５７０号によって記載されるように効率的なＡＡＶ生産を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスのミニプラスミドとして提供され得る。

さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体内に埋め込まれた、または安定した染色体外エレメントとして維持される、ヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にパッケージングすることができず、例えば、ＩＴＲによって挟まれない。

当業者は、ＡＡＶ複製配列およびキャプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を単一のヘルパー構築物上に提供することが有利であり得ると理解している。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であり得る。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであることができる。

１つの特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、ＡＡＶテンプレートをさらに含むことができる。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスの欠失した領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）内へ挿入することができる。

さらなる一実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれば、ＡＡＶテンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供され得る。

別の例示的な実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ＡＡＶテンプレートは、プロウイルスとして細胞内に組み込まれる。あるいは、ＡＡＶテンプレートは、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される。

さらに例示的な実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ＡＡＶテンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ＡＡＶテンプレートは、ＡＡＶ粒子または第二の組み換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。

前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは典型的に、アデノウイルスの複製およびパッケージングのために十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在する場合、ＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス主鎖内に埋め込まれ、５’および３’シス配列によって挟まれ、したがって、これらの配列はアデノウイルスキャプシド内にパッケージングされ得る。上述のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は一般に、ＩＴＲによって挟まれず、したがって、これらの配列はＡＡＶビリオン内にパッケージングされない。

Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４－１２）は、アデノウイルスとＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載している。

ヘルペスウイルスもまた、ＡＡＶパッケージング方法においてヘルパーウイルスとして用いられ得る。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質（単数または複数）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、スケーラブルなＡＡＶベクター生産スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ－２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスタイプＩ（ＨＳＶ－１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９８６およびＷＯ００／１７３７７）。

さらなる代替として、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５－４３によって記載されるように、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞において本発明のウイルスベクターを生産して、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびＡＡＶテンプレートを送達することができる。

混入ヘルパーウイルスを含まないＡＡＶベクターストックを、当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。ＡＡＶはまた、ヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウイルスから分離することもできる（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。いかなる混入ヘルパーウイルスも複製能力がないように、欠失した複製欠損ヘルパーウイルスを用いることができる。さらなる代替として、アデノウイルスの早期遺伝子発現のみがＡＡＶのパッケージングを媒介するために必要とされるので、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーが用いられ得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス突然変異体は当技術分野で知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス突然変異体）。

ＳＬＣ１３Ａ５ベクターを用いる方法
本発明はまた、ＳＬＣ１３Ａ５ ＯＲＦを細胞または対象に送達して、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの治療的または研究目的のために、ＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体の生産を増加させる方法に関する。したがって、本発明の一態様は、細胞においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる方法に関し、その方法は、細胞を、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターと接触させるステップを含み、それにより、細胞においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる。一部の実施形態では、細胞は、インビトロ細胞、エクスビボ細胞、またはインビボ細胞である。本発明のインビトロでの発現は、研究目的のために、例えばインビボでの発現の前に有効性および／または安全性を評価するのに有益であり得る。

本発明の別の態様は、対象においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる方法に関し、その方法は、対象に、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を送達するステップをさらに含み、それにより、対象においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる。一部の実施形態では、対象は、異常なＳＬＣ１３Ａ５遺伝子発現に関連する障害の動物モデルである。

本発明のさらなる一態様は、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の異常な発現またはＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物（例えば、Ｎａ^＋／クエン酸共輸送体）の異常な活性に関連する障害を、処置を必要とする対象において処置する方法に関し、その方法は、対象に、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を送達するステップを含み、それにより、対象においてＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の異常な発現またはＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物の異常な活性に関連する障害を処置する。本発明は、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の異常な発現またはＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物（例えば、Ｎａ^＋／クエン酸共輸送体）の異常な活性に関連する障害を、処置を必要とする対象において処置する方法を提供し、その方法は、対象においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームが発現されるように、対象に、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を投与するステップを含む。一部の実施形態では、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の発現または遺伝子産物に関連する障害は、クエン酸輸送体障害、例えば、ＳＬＣ１３Ａ５欠乏であり得る。

本発明はさらに、クエン酸輸送体障害（例えば、ＳＬＣ１３Ａ５欠乏）を、処置を必要とする対象において処置する方法を提供し、その方法は、対象においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム発現されるように、対象に、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を投与するステップを含む。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、対象に、例えば、全身性に（例えば、静脈内）、または対象の肝臓へ直接送達される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、対象に、例えば、全身性に（例えば、静脈内）、または対象の中枢神経系へ直接（例えば、髄腔内または心室内注入によって脳脊髄液へ）送達される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、髄腔内に送達される。

本発明に係る組み換えウイルスベクターは、獣医学および医療の用途の両方において使用を見いだす。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、キジ、オウム、インコを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類（例えば、サルおよびヒヒ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター等）などを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、青少年、および成人を含む。任意に、対象は、例えば、本明細書中に記載のものを含む障害を対象が有するまたはそのリスクがあると考えられ、または、本明細書中に記載のものを含むポリヌクレオチドの送達によって恩恵を受けるので、本発明の方法「を必要とする」。さらなる選択肢として、対象は、実験動物および／または疾患の動物モデルであってよい。好ましくは、対象はヒトである。

特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、対象の人生においてできる限り早く、例えば、対象が、異常なＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体の発現もしくは活性または任意の上述の疾患または障害が診断されたらすぐに、必要とする対象に投与される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、新生児の診断によって、異常なＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体の発現もしくは活性が同定された後に、新生児対象に投与される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５才よりも前、例えば、１、２、３、４、または５才よりも前に対象に投与される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、出生前診断によって、異常なＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体の発現もしくは活性または上述の疾患または障害のうちの１つの存在が同定された後に、胎児に子宮内へ投与される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、対象が、異常なＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体の発現もしくは活性と関連する症候を発症したらすぐに、または、異常なＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体の発現もしくは活性または上述の疾患または障害のうちの１つを有する疑いがあるか、または有すると診断されたらすぐに、対象に投与される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、対象が、異常なＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体の発現もしくは活性と関連する症候、または疾患／障害を発症する前に、例えば、異常なＳＬＣ１３Ａ５および／またはＮａ^＋／クエン酸共輸送体の発現もしくは活性または上述の疾患または障害のうちの１つを有する疑いがあるか、または有すると診断されるが、症候を示し始めていない対象に、投与される。

特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体内に含む医薬組成物を提供し、他の医学的薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などを含んでいてもよい。注入のために、担体は典型的に液体である。他の投与方法については、担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与については、担体は呼吸用であり、好ましくは固体または液体微粒子の形態である。一部の実施形態では、調剤担体は、Ｄ－ソルビトール（例えば、ＰＢＳ ５％ ｗ／ｖ Ｄ－ソルビトール）であり得る。

「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の点で望ましくないようなものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。

本発明の一態様は、ＳＬＣ１３Ａ５ ＯＲＦを細胞にインビトロで移行させる方法である。本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、適切な量で細胞に導入され得る。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切な標準的な形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞に導入され得る。投与するウイルスベクターまたはキャプシドの力価は、標的細胞のタイプおよび数、ならびに、特定のウイルスベクターまたはキャプシドによって変化し得て、過度の実験をせずに当業者によって決定され得る。特定の実施形態では、少なくとも約１０^３感染単位、より好ましくは少なくとも約１０^５感染単位が、細胞に導入される。

本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターが導入され得る細胞（単数または複数）は、制限されないが、神経系細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に、脳細胞、例えば、ニューロン、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、星状細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、消化管および呼吸器上皮細胞）、骨格筋細胞（筋芽細胞、筋管および筋線維を含む）、横隔膜筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、消化管の細胞（平滑筋細胞、上皮細胞を含む）、心臓細胞（心筋細胞を含む）、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、関節細胞（例えば、軟骨、半月板、滑膜および骨髄を含む）、生殖細胞などを含む、任意のタイプであってよい。あるいは、細胞は、任意の前駆細胞であってよい。さらなる代替として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であってよい。さらなる代替として、細胞は、がんまたは腫瘍細胞であってよい。さらに、細胞は、上述の起源の任意の種由来であってよい。

本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターは、改変細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、対象から取り出されたものであり、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞が対象内に戻される。エクスビボでの処置のために対象から細胞を取り出して、その後に元の対象内に導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許番号５，３９９，３４６を参照）。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターが、別の対象由来の細胞内に、培養細胞内に、または任意の他の適切な由来の細胞内に導入されて、そして、その細胞が、それを必要とする対象に投与される。

エクスビボの遺伝子療法のための適切な細胞は上述のとおりである。対象に投与する細胞の投薬量は、対象の年齢、状態および種、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって異なる。典型的に、少なくとも約１０^２～約１０^８または約１０^３～約１０^６細胞が、薬学的に許容できる担体において、用量あたり投与される。特定の実施形態では、エクスビボでのウイルスベクターによる細胞形質導入は、調剤担体と組み合わせて有効量で対象に投与される。

本発明のさらなる一態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターを、対象に投与する方法である。特定の実施形態では、本方法は、ＳＬＣ１３Ａ５ ＯＲＦを動物対象に送達する方法を含み、その方法は、有効量の本発明に係るウイルスベクターを動物対象に投与するステップを含む。必要とするヒト対象または動物への本発明のウイルスベクターの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によってよい。ウイルスベクターは、効果的な用量で薬学的に許容できる担体において送達されてもよい。

対象に投与されるウイルスベクターの投薬量は、投与モード、処置される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および、送達される核酸に依存し、日常的な様式で決定することができる。治療的効果を達成するために例示的な用量は、少なくとも約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、１０^１６形質導入単位またはそれよりも多く、例えば、約１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５形質導入単位、さらにより好ましくは約１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５形質導入単位（ＴＵ）のウイルス力価である。用量およびウイルス力価形質導入単位は、ベクターまたはウイルスゲノム（ｖｇ）、および／またはｖｇ／対象のｋｇとして計算され得る。例えば、一部の実施形態では、本発明の治療的効果を達成するための用量は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、約１０^１０、１０^１１、もしくは１０^１２ｖｇ／ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）対象またはヒト対象に関する同等用量、または約１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、もしくは１０×１０^１２またはその中の任意の値または範囲／ネズミ対象の量またはヒト対象に関する同等用量、例えば、約１×１０^１０～約１×１０^１２、約５×１０^１０～約９×１０^１１、約１×１０^１１～約５×１０^１２、または約１×１０^１０、約２×１０^１１、約５×１０^１１、約８×１０^１１、約１×１０^１２／ネズミ対象またはヒト対象について同等用量の量で含んでよい。

特定の実施形態では、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって、１回を超える投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれよりも多くの投与）を用いて、所望のレベルの遺伝子発現が達成され得る。

例示的な投与モードは、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介する）、口腔（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼球内、経皮、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および粘膜表面の両方、気道表面を含む、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに、直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳）を含む。投与は、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内、またはその付近）に対するものであってもよい。任意の所定の場合における最も適切な経路は、処置される症状の性質および重症度、ならびに、用いられる特定のベクターの性質に依存する。一部の実施形態では、１よりも多くの投与モードおよび／または投与経路、例えば、実質内投与および脳室内投与などが使用され得る。

一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ、末梢神経系、またはその両方に投与される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ、例えば、脳または脊髄に直接投与される。直接投与は、ＣＮＳ細胞の形質導入の高い特異性をもたらし得て、例えば、形質導入細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くがＣＮＳ細胞である。ＣＮＳにベクターを直接投与するための当技術分野で知られている任意の方法を用いることができる。ベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、大脳（後頭、側頭、頭頂および前頭葉を含む）、皮質、基底核、海馬および扁桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘内に導入され得る。ベクターは、眼の異なる領域、例えば、網膜、角膜または視神経へ投与されてもよい。ベクターは、ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液内に（例えば腰椎穿刺によって）送達されてよい。

送達ベクターは、ＣＮＳの所望の領域（単数または複数）に、制限されないが、髄腔内、脳内、心室内、実質内、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼周囲（例えば、テノン下（ｓｕｂ－Ｔｅｎｏｎ’ｓ）領域）送達または任意のそれらの組み合わせを含む、当技術分野で知られている任意の経路によって投与され得る。

送達ベクターは、ＣＮＳ、末梢神経系、および／または他の組織を含む組織の、より広範な、拡散する形質導入を生じさせる様式で投与され得る。

典型的に、ウイルスベクターは、ＣＮＳおよび／または他の組織内の所望の領域または区画への直接注入（例えば、定位的な注入）によって、液体製剤において投与される。一部の実施形態では、ベクターは、リザーバーおよび／またはポンプを介して送達され得る。他の実施形態では、ベクターは、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の経鼻内投与によって提供され得る。眼または耳への投与は、液滴の局所適用によるものであってよい。さらなる代替として、ベクターは、固体、徐放製剤として投与され得る。パルボウイルスおよびＡＡＶベクターの制御放出は、国際特許公報ＷＯ０１／９１８０３によって記載される。

注入剤は、従来の形態で、液体の溶液または懸濁液、注入前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態として、またはエマルションとして、調製され得る。あるいは、ウイルスベクターを、全身性ではなく局所的な様式で、例えば、デポーまたは徐放性製剤において投与してよい。さらに、ウイルスベクターは、外科的に埋め込み可能なマトリックス、例えば、骨補填材、縫合、ステントなど（例えば米国特許７，２０１，８９８に記載される）に乾燥送達する（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｄｒｉｅｄ）ことができる。

経口投与に適切な医薬組成物は、個別単位、例えば、カプセル、カシェ剤、ロゼンジ、または錠剤において（それぞれ、所定量の本発明の組成物を含んでいる）；粉末または顆粒として；水性または非水性の液体中の溶液または懸濁液として；または、水中油もしくは油中水エマルションとして、提供され得る。経口送達は、本発明のウイルスベクターを、動物の消化管内の消化酵素による分解に耐えることのできる担体と複合化させることによって行われ得る。かかる担体の例は、当技術分野で知られているプラスチックカプセルまたは錠剤を含む。かかる製剤は、薬学の任意の適切な方法によって調製され、組成物および適切な担体を関連させるステップを含む（上記のとおり、１つまたは複数の副成分を含んでよい）。一般に、本発明の実施形態に係る医薬組成物は、組成物を、液体または微細に分割された固体担体、または両方と均一かつ密接に混合して、それから、もし必要ならば、生じた混合物を成形することによって調製される。例えば、錠剤は、組成物を含んでいる粉末または顆粒（１つまたは複数の副成分を含んでよい）を圧縮または成形することによって調製され得る。圧縮錠剤は、適切な機械において、粉末または顆粒のような自由流動形態の組成物を圧縮することによって調製される（結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または表面活性／分散剤（単数または複数）とともに混合されていてもよい）。成形錠剤は、適切な機械において、不活性液体結合剤によって湿らせた粉末化化合物を成形することによって作製される。

口腔（舌下）投与に適切な医薬組成物は、本発明の組成物を、香り付けられたベース、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント内に含んでいるロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）；および、不活性ベース、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア内に組成物を含んでいるトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）を含む。

非経口投与に適切な医薬組成物は、本発明の組成物の滅菌水性および非水性注入溶液を含んでよく、その製剤は、意図されるレシピエントの血液と等張であってもよい。これらの製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および溶質であって、組成物を意図されるレシピエントの血液と等張にするものを含んでよい。水性および非水性滅菌懸濁液、溶液およびエマルションは、懸濁剤および増粘剤を含んでよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、および、オレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性の溶液、エマルションまたは懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝化培地を含む。非経口ビヒクルは、食塩水、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充液（ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、電解質補充液（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくもの）などを含む。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。

組成物は、単位用量または複数回用量のコンテナーにおいて、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルにおいて提供され得て、使用の直前に滅菌液体担体、例えば、生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。

即座の注入溶液および懸濁液は、前述した種類の滅菌された粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。例えば、注入可能な安定した本発明の滅菌組成物が、密封されたコンテナーにおける単位剤形で提供され得る。組成物は、適切な薬学的に許容できる担体を用いて再構成して対象への注入に適切な液体組成物を形成することのできる凍結乾燥物の形態で提供され得る。単位剤形は、約１μｇ～約１０グラムの本発明の組成物、またはその間の任意の値または範囲、例えば、約１μｇ～約５グラム、約２μｇ～約１０μｇ、約１．５μｇ～約７．５グラム、または約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約２０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２５０μｇ、約５００μｇ、約７５０μｇ、約１グラム、約１．２５グラム、約１．５グラム、約１．７５グラム、約２グラム、約３グラム、約４グラム、約５グラム、約６グラム、約７グラム、約８グラム、約９グラム、または約１０グラムであることができる。組成物が実質的に水不溶性である場合は、生理的に許容できる十分な量の乳化剤が、水性担体中に組成物を乳化させるのに十分な量で含まれてよい。そのような有用な乳化剤の１つはホスファチジルコリンである。

直腸投与に適切な医薬組成物は、単位用量の坐薬として提供され得る。これらは、組成物を１つまたは複数の従来の固形担体（例えば、カカオ脂）と混合して、それから、生じた混合物を成形することによって調製され得る。

皮膚への局所適用に適切な本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、エアロゾル、またはオイルの形態をとり得る。用いることのできる担体は、限定されないが、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール類、アルコール類、経皮エンハンサー、および、それらの２以上の組み合わせを含む。一部の実施形態では、例えば、局所送達は、本発明の医薬組成物を、皮膚内へ通過することが可能な脂溶性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と混合することによって行われ得る。

経皮投与に適切な医薬組成物は、長期間、対象の上皮と密接に接触した状態を保つために適用される個別パッチの形態であってよい。経皮投与に適切な組成物は、イオン導入によって送達することもでき（例えば、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照）、典型的に、本発明の組成物の緩衝化されていてもよい水溶液の形態をとる。適切な製剤は、クエン酸またはｂｉｓ／ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ６）またはエタノール／水を含んでよく、０．１～０．２Ｍの活性成分を含んでよい。

本明細書中に開示されるウイルスベクターは、任意の適切な手段によって、例えば、対象が吸入する、ウイルスベクターを含む呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液の投与によって、対象の肺に投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であってよい。ウイルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知のように、任意の適切な手段、例えば、圧力駆動のエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いて生産され得る。例えば、米国特許番号４，５０１，７２９を参照。ウイルスベクターを含む固体粒子のエアロゾルは、調剤分野において公知の技術によって、任意の固体微粒子の薬品エアロゾル発生器を用いて同様に生産され得る。

本発明を記載したが、同じことが、以下の実施例においてより詳細に説明され、それは例示目的のみのために本明細書中に含まれ、本発明の限定を意図しない。

実施例１：
ＳＬＣ１３Ａ５のための遺伝子療法用構築物を、ユビキタスＵｓＰプロモーター（本明細書においてｐＵＳＰとしても呼ばれる）、１７０４ヌクレオチドコドン最適化ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム（ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ）、および合成ポリアデニル化Ａテール（図１）を用いて生産した。理論に拘束されることを望まないが、治療的有効性を改善するためには、形質導入細胞あたり最も高い可能な発現レベルを達成し得るプロモーターを使用するよりむしろ、最大数の細胞を形質導入すべきであると考えられる。したがって、適度～弱いユビキタスプロモーター、例えば、ＵｓＰプロモーターを用いた。構築物を、ＷＴ ＡＡＶ２ ＩＴＲ、Ｄエレメント欠失が欠失したＡＡＶ２ ＩＴＲ、およびＡＡＶ９キャプシドを含むＡＡＶウイルスベクター内に挿入した。

ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現について試験し、ｍＲＮＡ、タンパク質、および位置を試験した。図２は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるベクタータンパク質発現を示す。ベクターなし（ビヒクル、図２の上パネル）またはｐＵＳＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ（ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ、図２の下パネル）でトランスフェクトした細胞の共焦点顕微鏡。トランスフェクション後４８時間、ヒトＳＬＣ１３Ａ５に対する抗体で染色すると、ビヒクルで処置した細胞ではシグナルを示さなかったが、ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔトランスフェクト細胞は、細胞を取り囲む点状パターンを有していた。

図３に示すように、細胞形質膜における局在が見られた。ｐＣｂｈ－ＧＦＰおよびｐＵＳＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点顕微鏡は、トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ蛍光が細胞基質において均一に検出され、形質膜で点状パターンであるＳＬＣ１３Ａ５染色と共局在しないことを示した（図３の上の左側パネルに単独で示される；図３の下のパネルは、ＧＦＰおよびＤＡＰＩとのマージである）。

図４Ａ～４Ｃは、ＡＡＶ９／ＵＳＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔのインビボ髄腔内投与により、ＳＬＣ１３Ａ５ ＫＯマウスにおいて血漿クエン酸レベルが減少したことを示す。ＳＬＣ１３Ａ５患者と同様に、ＳＬＣ１３Ａ５ ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比べて有意に増加したベースライン血漿クエン酸レベルを有する。注入の１月後、ビヒクルで処置したＷＴマウス（図４Ｂ）およびＫＯマウス（図４Ｃ）（図４Ｂ、右側バー；図４Ｃ、中央バー）は、それらのそれぞれのベースライン血漿レベルと比べて同等の血漿クエン酸レベルを有していたが、ｓｃＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５_ｏｐｔで処置したＫＯマウス（図４Ｃ、右側バー）は、血漿クエン酸レベルが有意に減少した。

図５Ａ～５Ｂは、髄腔内ＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ処置により、Ｓｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスにおいてＥＥＧ活動が正常レベルまで減少することを示す。Ｓｌｃ１３ａ５ノックアウト（ＫＯ）マウスおよび野生型（ＷＴ）同腹子を、ビヒクルまたはＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔを用いて約３月齢の時点で処置した。注入後約５ヶ月の時点で、マウスに無線テレメトリーを埋め込み、２回の６０時間セッションの間、ＥＥＧ活動を記録した。図５Ａは、ビヒクルまたはＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔで処置されたＷＴおよびＫＯマウスにおける代表的なＥＥＧトレースを示す。ビヒクルで処置したＫＯマウスは、ＷＴマウスまたはベクターで処置したＫＯマウスと比べててんかん発射が増加している。図５Ｂは、てんかんスパイクトレインの定量化を示す。ビヒクルで処置したＫＯマウス（図５Ｂ、中央バー）は、ビヒクルで処置したＷＴマウス（図５Ｂ、左側バー）およびＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔで処置したＫＯマウス（図５Ｃ、左側バー）と比べてスパイクトレインの数が増加している。

図６Ａ～６Ｃは、髄腔内ＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔ処置によって、Ｓｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスにおいて発作感受性および発作関連死が減少することを示す。Ｓｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスおよびＷＴ同腹子を、ビヒクルまたはＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔを用いて約３月齢の時点で処置した。注入後約６ヶ月の時点で、ベースライン活動のＥＥＧ記録後、マウスに繰り返し低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）を注入し、けいれん発作までの潜伏時間（図６Ａ）および発作の重症度（図６Ｂ）を、Ｒａｃｉｎｅスケールを用いて測定した。図６Ａは、ビヒクルで処置したＫＯマウスが、ビヒクルで処置したＷＴ同腹子と比べて発作発症までの潜伏時間が有意により短いことを示す。ＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔによる処置は、発作潜伏時間を正常レベルまで完全に減少させた。図６Ｂは、発作重症度が、より高いＲａｃｉｎｅスコアによって示されるように、ビヒクルで処置したＫＯマウスにおいて、ＷＴと比べて有意に増加することを示す。ＫＯマウスにおけるＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔを用いた処置は、発作重症度をＷＴレベルまで回復させた。図６Ｃは、ＫＯマウスにおける発作頻度および重症度の増加が、ＷＴマウスと比べてＰＴＺ注入を生き延びるマウスの割合がより低いことと関連したことを示す。ＫＯマウスにおけるＡＡＶ９／ＵｓＰ－ｈＳＬＣ１３Ａ５ｏｐｔを用いた処置は、発作関連死に対して保護し、生存をＷＴレベルまで回復させた。

本明細書中に挙げられる全ての参考文献は、それぞれの個々の文献または特許または特許出願が、具体的および個々に、参照によりその全体で全ての目的に関して援用されると示されるのと同程度まで、それらの全体で全ての目的に関して参照により本明細書中に援用される。

前述の実施例は本発明の例示であり、それらの限定と解釈されるべきでない。本発明は、好ましい実施形態に関して詳細に記載されているが、バリエーションおよび改変が、以下の特許請求の範囲において記載および定義される本発明の範囲および主旨の中に存在する。

Claims (44)

1. ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドであって、
   前記ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、
   ポリヌクレオチド。
2. 請求項１のポリヌクレオチドであって、
   前記ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームが、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
   ポリヌクレオチド。
3. ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
4. 請求項３の発現カセットであって、
   前記ポリヌクレオチドが、請求項１または２のポリヌクレオチドである、
   発現カセット。
5. 請求項３または４の発現カセットであって、
   前記ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームが、プロモーターに動作可能に連結されている、
   発現カセット。
6. 前記プロモーターがＵｓＰプロモーターである、請求項５の発現カセット。
7. 請求項３～６のいずれか一項の発現カセットであって、
   前記ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームが、ポリアデニル化シグナルに動作可能に連結されている、
   発現カセット。
8. 前記ポリアデニル化シグナルが合成ポリアデニル化シグナルである、請求項７の発現カセット。
9. 少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）をさらに含む、請求項３～８のいずれか一項の発現カセット。
10. ２つのＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項９の発現カセット。
11. 前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが同一のヌクレオチド配列を有する、請求項１０の発現カセット。
12. 前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが異なるヌクレオチド配列を有する、請求項１０の発現カセット。
13. 前記２つのＡＡＶ ＩＴＲのうちの１つが改変ＩＴＲである、請求項１０～１２のいずれか一項の発現カセット
14. 前記２つのＡＡＶ ＩＴＲのうちの１つがＤエレメント欠失改変ＩＴＲである、請求項１０～１２のいずれか一項の発現カセット。
15. 前記ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項９～１４のいずれか一項の発現カセット
16. 前記発現カセットが自己相補ＡＡＶゲノムである、請求項３～１５のいずれか一項の発現カセット。
17. 前記発現カセットが、プロモーター、前記ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化部位を含む、請求項３～１６のいずれか一項の発現カセット。
18. 前記発現カセットが、ＡＡＶ ＩＴＲ、プロモーター、前記ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項３～１７のいずれか一項の発現カセット。
19. 前記発現カセットが、ＡＡＶ ＩＴＲ、ＵｓＰプロモーター、前記ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、合成ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項３～１８のいずれか一項の発現カセット。
20. 前記発現カセットが、ＡＡＶ ＩＴＲ、ＵｓＰプロモーター、前記ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、合成ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項３～１９のいずれか一項の発現カセット。
21. 前記発現カセットが、改変ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＵｓＰプロモーター、前記ヒトＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレーム、合成ポリアデニル化部位、および野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項３～２０のいずれか一項の発現カセット。
22. 配列番号５のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一の配列を含む、請求項２０または２１の発現カセット。
23. 請求項１もしくは２のポリヌクレオチドまたは請求項３～２２のいずれか一項の発現カセットを含む、ベクター。
24. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２３のベクター。
25. 前記ベクターがＡＡＶベクターである、請求項２３のベクター。
26. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ９ベクターである、請求項２５のベクター。
27. 請求項１もしくは２のポリヌクレオチド、請求項３～２２のいずれか一項の発現カセット、および／または請求項２３～２６のいずれか一項のベクターを含む、形質転換された細胞。
28. 前記ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターが、細胞ゲノム中に安定的に組み込まれている、請求項２７の形質転換された細胞。
29. 請求項１もしくは２のポリヌクレオチド、請求項３～２２のいずれか一項の発現カセット、請求項２３～２６のいずれか一項のベクター、および／または請求項２７もしくは２８の形質転換された細胞を含む、非ヒト・トランスジェニック動物。
30. 請求項１もしくは２のポリヌクレオチド、請求項３～２２のいずれか一項の発現カセット、請求項２３～２６のいずれか一項のベクター、および／または請求項２７もしくは２８の形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体中に含む、医薬組成物。
31. 細胞においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる方法であって、
    前記細胞を、請求項１もしくは２のポリヌクレオチド、請求項３～２２のいずれか一項の発現カセット、および／または請求項２３～２６のいずれか一項のベクターと接触させるステップを含み、
    それにより前記細胞において前記ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる、
    方法。
32. 対象においてＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる方法であって、
    前記対象に、請求項１もしくは２のポリヌクレオチド、請求項３～２２のいずれか一項の発現カセット、請求項２３～２６のいずれか一項のベクター、および／または請求項２７もしくは２８の形質転換された細胞を送達するステップを含み、
    それにより、前記対象において前記ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームを発現させる、
    方法。
33. ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の異常な発現またはＳＬＣ１３Ａ５遺伝子産物の異常な活性に関連する障害を、処置を必要とする対象において処置する方法であって、
    前記対象に、治療有効量の請求項１もしくは２のポリヌクレオチド、請求項３～２２のいずれか一項の発現カセット、請求項２３～２６のいずれか一項のベクター、および／または請求項２７もしくは２８の形質転換された細胞を、前記ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームが前記対象において発現されるように投与するステップを含む、
    方法。
34. 前記ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の発現に関連する障害が、クエン酸輸送体障害（例えば、ＳＬＣ１３Ａ５欠乏）である、請求項３３の方法。
35. クエン酸輸送体障害（例えば、ＳＬＣ１３Ａ５欠乏）を、処置を必要とする対象において処置する方法であって、
    前記対象に、治療有効量の請求項１もしくは２のポリヌクレオチド、請求項３～２２のいずれか一項の発現カセット、請求項２３～２６のいずれか一項のベクター、および／または請求項２７もしくは２８の形質転換された細胞を、前記ＳＬＣ１３Ａ５オープンリーディングフレームが前記対象において発現されるように投与するステップを含む、
    方法。
36. 前記対象が、前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞の送達前に疾患の症候を示す、請求項３２～３５のいずれか一項の方法。
37. 前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞が子宮内に送達される、請求項３２～３６のいずれか一項の方法。
38. 前記対象がヒトである、請求項３２～３７のいずれか一項の方法。
39. 前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞が前記対象の神経系に送達される、請求項３２～３８のいずれか一項の方法。
40. 前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞が前記対象の肝臓に送達される、請求項３２～３８のいずれか一項の方法。
41. 前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞が静脈内に送達される、請求項３２～４０の方法。
42. 前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞が、髄腔内、脳内、実質内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、または眼周囲送達、またはそれらの任意の組み合わせによって送達される、請求項３９の方法。
43. 前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞が髄腔内に送達される、請求項４２の方法。
44. 前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞が脳室内に送達される、請求項４２の方法。