JP2023533017A - 改変された酸化プロトコルを使用するオリゴヌクレオチドの調製のための方法 - Google Patents
改変された酸化プロトコルを使用するオリゴヌクレオチドの調製のための方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドの製造のための方法であって、新規な酸化プロトコルを適用するスキームに従って、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に選択的に酸化することを含む、方法、及び新たな酸化溶液に関する。TIFF2023533017000011.tif47140
Description
本発明は、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドの製造のための新規な方法であって、スキーム
に従って式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に酸化することを含み、酸化が、特定の酸化溶液及び新規な酸化溶液を利用する、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドの製造のための新規な方法に関する。
オリゴヌクレオチド合成は、原則として、所望の配列が組み立てられるまで、伸長中の鎖の５’末端にヌクレオチド残基を段階的に付加することである。
一般的に、各添加は合成サイクルと呼ばれ、原則として以下の化学反応、
ａ１）固体支持体上の保護されたヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ２）第１のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして固体支持体上の遊離ヒドロキシル基とカップリングさせること、
ａ３）それぞれのＰ結合ヌクレオシド（ホスファイトトリエステル）を酸化又は硫化して、それぞれのホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又はそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ４）任意に、固体支持体上のいずれかの未反応ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ５）固体支持体に結合した第１のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ６）第２のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとしてカップリングして、それぞれのＰ結合二量体を形成すること、
ａ７）前記それぞれのＰ結合ジヌクレオチド（ホスファイトトリエステル）を酸化又は硫化して、それぞれのホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又はそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ８）任意に、いずれかの未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ９）所望の配列が組み立てられるまで、前述の工程ａ５～ａ８を繰り返すこと、からなる。
ａ１）固体支持体上の保護されたヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ２）第１のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして固体支持体上の遊離ヒドロキシル基とカップリングさせること、
ａ３）それぞれのＰ結合ヌクレオシド（ホスファイトトリエステル）を酸化又は硫化して、それぞれのホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又はそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ４）任意に、固体支持体上のいずれかの未反応ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ５）固体支持体に結合した第１のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ６）第２のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとしてカップリングして、それぞれのＰ結合二量体を形成すること、
ａ７）前記それぞれのＰ結合ジヌクレオチド（ホスファイトトリエステル）を酸化又は硫化して、それぞれのホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又はそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ８）任意に、いずれかの未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ９）所望の配列が組み立てられるまで、前述の工程ａ５～ａ８を繰り返すこと、からなる。
酸化工程は、典型的には、ヨウ素と、一般的にピリジンである有機溶媒と、水とを含む酸化溶液を用いて行われる。
しかし、新たに調製した酸化溶液を適用すると、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物の式ＩＩのホスホジエステル化合物への所望の酸化が起こるだけでなく、副反応として、分子中に存在するホスホロチオエートヌクレオチド間結合が、ヌクレオチド間結合でのＰ＝ＳからＰ＝Ｏへの変換によって影響を受け、式ＩＩの化合物内のホスホジエステル結合の含有量が予想よりも高くなり得ることが観察された。
したがって、本発明の目的は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合に影響を及ぼすことなく、式Ｉのホスファイトトリエステル化合物の式ＩＩのホスホジエステル化合物への選択的酸化を可能にする酸化プロトコルを見出すことであった。本発明の更なる目的は、エイジング等の更なる処理を必要とせずに調製された場合に容易に適用することができる酸化溶液を見出すことであった。
本発明の目的は、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドの製造のための方法であって、ヨウ素と、有機溶媒と、水とを含有する酸化溶液を用いて、スキーム
に従って式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に酸化することを含み、酸化溶液が更にヨウ化物を含有することを特徴とする、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドの製造のための方法により達成され得ることが見出された。
以下の定義は、本明細書において本発明を説明するために使用される種々の用語の意味及び範囲を例示し、定義するために記載されている。
「Ｃ１～６－アルキル」という用語は、１～６個の炭素原子、より特定の実施形態では１～４個の炭素原子を有する一価の直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素基を示す。典型的な例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル又はｔ－ブチル、好ましくはメチル又はエチルが挙げられる。
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオチドを含む分子として当業者によって一般的に理解されるように定義される。治療的に価値のあるオリゴヌクレオチドとして使用するために、オリゴヌクレオチドは、典型的には、１０～４０ヌクレオチド、好ましくは１０～２５ヌクレオチドの長さとして合成される。
オリゴヌクレオチドは、任意に改変されていてもよいＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオシドモノマー又はそれらの組合せからなり得る。
本明細書で使用される場合、任意に改変されていてもよいとは、糖部分又は核酸塩基部分の１つ以上の改変の導入によって、等価なＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して改変されたヌクレオシドを指す。
典型的な改変は、糖部分の２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）－置換（２’－ＭＯＥ）置換又はロック核酸（ＬＮＡ）であってもよく、これはリボース部分が２’酸素と４’炭素とを結合する過剰な架橋で改変されている改変ＲＮＡヌクレオチドである。
改変ヌクレオシドという用語はまた、「ヌクレオシド類似体」又は改変「ユニット」又は改変「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。
ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドは、一般的に、２つのヌクレオチドを互いに共有結合するホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）ヌクレオチド間結合によって連結される。
本発明によれば、少なくとも１つのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）からなっていなければならない。したがって、いくつかのオリゴヌクレオチドでは、他の全てのヌクレオチド間結合がホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）からなっていてもよく、又は他のオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオチド間結合の配列が異なっており、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）とホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）の両方のヌクレオチド間結合を含む。
したがって、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドという用語は、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）からならなくてはならず、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）からなるオリゴヌクレオチドを指す。
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵにより示されてもよく、ここで、各文字は、任意に等価機能の改変された核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、ＬＮＡヌクレオシドについては大文字のＡ、Ｔ、Ｇ及びＭｅＣ（５－メチルシトシン）を用いて、ＤＮＡヌクレオシドについては小文字のａ、ｔ、ｇ、ｃ及びＭｅＣを用いて記載される。改変された核酸塩基としては、保護基を有する核酸塩基、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、アセチル、イソブチリル又はジメチルホルムアミジノ（ＷｉｋｉｐｅｄｉａのＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔ－Ｓｙｎｔｈｅｓｅ、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔ－Ｓｙｎｔｈｅｓｅ、２０１６年３月２４日を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、任意に改変されていてもよいＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドモノマー又はそれらの組合せからなり、１０～４０、好ましくは１０～２５ヌクレオチド長である。
オリゴヌクレオチド合成の原理は、当技術分野で周知である（例えば、無料百科事典であるＷｉｋｉｐｅｄｉａのＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２０１６年３月１５日を参照されたい）。
今日、大規模なオリゴヌクレオチド合成は、コンピュータ制御合成装置を使用して自動化された方法で行われている。
原則として、オリゴヌクレオチド合成は固相合成であり、ここで、組み立てられるオリゴヌクレオチドは、その３’末端ヒドロキシ基を介して固体支持体材料に共有結合し、鎖組み立ての全過程にわたってそこに結合したままである。適切な支持体は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＰｒｉｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔ ５Ｇ又はＫｉｎｏｖａｔｅのＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ ｓｕｐｐｏｒｔのような市販のマクロ多孔質ポリスチレン支持体である。
その後の樹脂からの切断は、濃アンモニア水を用いて行うことができる。リン酸塩基及びヌクレオチド塩基上の保護基もこの切断手順内で除去される。
上に概説したように、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドの製造のための方法は、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物の式ＩＩのホスホジエステル化合物への酸化を含んでいる。
酸化溶液は、ヨウ化物を水及び有機溶媒と混合し、その後ヨウ素を添加することによって調製することができる。
ヨウ化物は、ヨウ化水素、ヨウ化アルカリから又は三ヨウ化アルカリから、好ましくはヨウ化水素又はヨウ化アルカリから、より好ましくはヨウ化ナトリウム又はヨウ化カリウムから選択することができる。
有機溶媒は、ピリジン、又はＣ１～６アルキル置換ピリジン、例えばルチジンから選択することができるが、好ましくはピリジンから選択することができる。テトラヒドロフラン等の更なる有機溶媒が存在し得る。
有機溶媒対水の体積比は、原則として１：１～２０：１、好ましくは５：１～１５：１から選択され、より好ましくは９：１である。
酸化溶液中のヨウ素対ヨウ化物のモル比は、１．０：０．１～１．０：３．０、好ましくは１．０：１．０～１．０：２．０の範囲で選択される。
酸化溶液中のヨウ素濃度は、典型的には、１０ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ～６０ｍＭの範囲で適用される。
５０ｍＭのヨウ素含有量に基づいて、酸化溶液が≧１５００μＳ／ｃｍの導電率を有するまでヨウ化物を添加する。
好ましい実施形態では、ヨウ化物はヨウ化カリウムであり、酸化溶液は、５０ｍＭ ＫＩ及び５０ｍＭ Ｉ２の含有量に基づいて、１５００μＳ／ｃｍ以上、好ましくは１６５０～２０５０μＳ／ｃｍ、より好ましくは１７５０～１９５０μＳ／ｃｍの導電率を有する。
１０ｍＭのヨウ素含有量に基づいて、酸化溶液が≧３００μＳ／ｃｍの導電率を有するまでヨウ化物を添加する。
好ましい実施形態では、ヨウ化物はヨウ化カリウムであり、酸化溶液は、１０ｍＭ ＫＩ及び１０ｍＭ Ｉ２に基づいて、３００μＳ／ｃｍ以上、好ましくは３５０～５５０μＳ／ｃｍ、より好ましくは４００～５００μＳ／ｃｍの導電率を有する。
２０ｍＭのヨウ素含有量に基づいて、酸化溶液が≧６００μＳ／ｃｍの導電率を有するまでヨウ化物を添加する。
好ましい実施形態では、ヨウ化物はヨウ化カリウムであり、酸化溶液は、２０ｍＭ ＫＩ及び２０ｍＭ Ｉ２に基づいて、６００μＳ／ｃｍ以上、好ましくは７５０～９５０μＳ／ｃｍ、より好ましくは８００～９００μＳ／ｃｍの導電率を有する。
１００ｍＭのヨウ素含有量に基づいて、酸化溶液が≧３０００μＳ／ｃｍの導電率を有するまでヨウ化物を添加する。
好ましい実施形態では、ヨウ化物はヨウ化カリウムであり、酸化溶液は、１００ｍＭ ＫＩ及び１００ｍＭ Ｉ２に基づいて、３０００μＳ／ｃｍ以上、好ましくは３２００～３９００μＳ／ｃｍ、より好ましくは３３５０～３７５０μＳ／ｃｍの導電率を有する。
典型的には、酸化溶液は、反応溶液中のＰ＝Ｏ含有量が２．５％未満、好ましくは２．０％未満の値に達するように、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に酸化することができる。
本発明の更なる実施形態は、酸化溶液の品質を評価するための方法であって、
ａ）ヨウ素と、有機溶媒と、水とを含む酸化溶液を提供することと、
ｂ）酸化溶液の導電率を測定することと、
ｃ）測定された導電率の特定の閾値に基づいて、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に酸化するための酸化溶液の適合性を評価することと
を含む、方法が提供される。
ａ）ヨウ素と、有機溶媒と、水とを含む酸化溶液を提供することと、
ｂ）酸化溶液の導電率を測定することと、
ｃ）測定された導電率の特定の閾値に基づいて、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に酸化するための酸化溶液の適合性を評価することと
を含む、方法が提供される。
酸化溶液の品質を評価するための方法の更なるより好ましい実施形態として、酸化溶液は更にヨウ化物を含む。
酸化反応の調製に使用されるヨウ素の量は、通常、１．１当量～１５当量、より好ましくは１．５当量～４．５当量の間で選択される。
酸化反応は、１５℃～２７℃、より好ましくは１８℃～２４℃の間で行われる。
上記で概説したように、本発明の好ましい実施形態では、すなわちヨウ素とヨウ化物の化学量論比又は過剰のヨウ化物が存在する比では、酸化溶液は、その調製後すぐに適用することができる。
別の、しかしあまり好ましくない、本発明の実施形態では、ヨウ素とヨウ化物との比を化学量論量未満のヨウ化物と共に使用することができる。
このような酸化溶液は、導電率及び式Ｉのホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に選択的に酸化する可能性に関して、必要な特性を有するまで、一定の時間のエイジングを必要とし得る。
エイジングの最適期間は、酸化溶液がエイジングされる温度によって大きく決定される。低いエイジング温度はより長いエイジング期間をもたらすが、より高いエイジング温度はエイジング時間を著しく短縮する。
例えば、酸化溶液は、２０℃～１００℃の温度で、好ましくは３０℃～６０℃の温度でエイジングすることができる。
酸化溶液のエイジングに必要な時間は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を影響を及ぼすことなく、式Ｉのホスファイトトリエステル化合物の式ＩＩのホスホジエステル化合物への選択的酸化をもたらすのに十分でなければならない。
一般的に、酸化溶液は、少なくとも１日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間又は少なくとも２０日間エイジングすることができる。
期間は、上述のように、エイジング温度に応じて大きく変化し得、３０℃～３５℃のエイジング温度では、１０日～１５０日、より典型的には２０日～６０日で変化し得るが、６０℃～６５℃のエイジング温度では、１日～３０日、より典型的には２日～１５日で変化し得る。
エイジングは、一般的に、一定のプラトーに達するまでの導電率（μＳ／ｃｍ）の増加及びｐＨの低下を伴う。
更なる実施形態では、本発明は、以下：
ａ）１０～１００ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、０．１～３．０モル当量のヨウ化物と、
ｃ）有機溶媒と、
ｄ）水と
を含み得、有機溶媒対水の体積比が２０：１～１：１であり、
好ましくは、
ａ）１５～６０ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、１．０～２．０モル当量のヨウ化物と、
ｃ）有機溶媒と、
ｄ）水と
を含み得、有機溶媒対水の体積比が５：１～１５：１であり、
より好ましくは、
ａ）１５～６０ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、１．０～２．０モル当量のヨウ化水素又はヨウ化アルカリと、
ｃ）ピリジンと、
ｄ）水と
を含み得、ピリジン対水の体積比が５：１～１５：１であり、
更により好ましくは、
ａ）１５～６０ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、１．０～２．０モル当量のヨウ化ナトリウム又はヨウ化カリウムと、
ｃ）ピリジンと、
ｄ）水と
を含み得、ピリジン対水の体積比が９：１である。
ａ）１０～１００ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、０．１～３．０モル当量のヨウ化物と、
ｃ）有機溶媒と、
ｄ）水と
を含み得、有機溶媒対水の体積比が２０：１～１：１であり、
好ましくは、
ａ）１５～６０ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、１．０～２．０モル当量のヨウ化物と、
ｃ）有機溶媒と、
ｄ）水と
を含み得、有機溶媒対水の体積比が５：１～１５：１であり、
より好ましくは、
ａ）１５～６０ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、１．０～２．０モル当量のヨウ化水素又はヨウ化アルカリと、
ｃ）ピリジンと、
ｄ）水と
を含み得、ピリジン対水の体積比が５：１～１５：１であり、
更により好ましくは、
ａ）１５～６０ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、１．０～２．０モル当量のヨウ化ナトリウム又はヨウ化カリウムと、
ｃ）ピリジンと、
ｄ）水と
を含み得、ピリジン対水の体積比が９：１である。
例示として、オリゴヌクレオチドは、以下：
から選択することができる、新たな酸化溶液を含む。
下線が引かれた残基は、２’－ＭＯＥヌクレオシドである。ホスホロチオエート及びホスフェートジエステル結合の位置は、それぞれＳ及びＯによって示される。２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）－５－メチルウリジン（２’－ＭＯＥ ＭｅＵ）ヌクレオシドは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）リボチミジン（２’－ＭＯＥ Ｔ）と呼ばれることがあることに留意されたい。
本明細書に開示される化合物は、以下の核酸塩基配列を有する。
配列番号１：ｃｕｃａｇｔａａｃａｔｔｇａｃａｃｃａｃ
配列番号１：ｃｕｃａｇｔａａｃａｔｔｇａｃａｃｃａｃ
オリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １００及びＰｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＬＨ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ ３３０）を使用して、固相上で標準的なホスホラミダイト化学によって２．２０ｍｍｏｌのスケールで製造した。一般的に、１．４当量のＤＮＡ／ＭＯＥ－ホスホラミダイトを使用した。市販の供給源から受け取った他の試薬（ジクロロ酢酸、１－メチルイミダゾール、４，５－ジシアノイミダゾール、無水酢酸、フェニルアセチルジスルフィド、ピリジン、トリエチルアミン）を使用し、適切な濃度の試薬溶液を調製し（以下の詳細を参照されたい）。酸化剤溶液を新たに調製した（以下を参照されたい）。水酸化アンモニウムを用いて切断及び脱保護を行い、粗オリゴヌクレオチドを得た。
標準試薬溶液
ヨウ素／ヨウ化カリウム溶液の調製
ヨウ化カリウムを室温で水に加えた後、ピリジンを加えた。ヨウ素を添加し、混合物を乾燥窒素の正圧下で１時間撹拌した後、使用した。
ヨウ化カリウムを室温で水に加えた後、ピリジンを加えた。ヨウ素を添加し、混合物を乾燥窒素の正圧下で１時間撹拌した後、使用した。
ヨウ素／ヨウ化ナトリウム溶液の調製
ヨウ化ナトリウム７．４９ｇを室温で水１０１ｇに添加し、続いてピリジン８８６ｇを添加した。ヨウ素１２．７ｇを添加し、混合物を使用前に乾燥窒素の正圧下で１時間撹拌した。
ヨウ化ナトリウム７．４９ｇを室温で水１０１ｇに添加し、続いてピリジン８８６ｇを添加した。ヨウ素１２．７ｇを添加し、混合物を使用前に乾燥窒素の正圧下で１時間撹拌した。
エイジングすることなく異なる酸化剤溶液を使用した酸化例
１は、質量分析で決定された所望の化合物の分子質量に対する１６Ｄａの質量差を有する分子のパーセント比率、すなわち１つのＰ＝Ｓ結合がＰ＝Ｏ結合に変換されている分子のパーセント比率を指す。
ＫＩ（５０ｍＭ）／Ｉ２（５０ｍＭ）溶液の３０～３５℃でのエイジング
溶液を、使用するまで琥珀色のガラス瓶に３０～３５℃で保存した。
溶液を、使用するまで琥珀色のガラス瓶に３０～３５℃で保存した。
熟成（３０～３５℃）ＫＩ（５０ｍＭ）／Ｉ２（５０ｍＭ）溶液を用いた酸化例
１は、質量分析で決定された所望の化合物の分子質量に対する１６Ｄａの質量差を有する分子のパーセント比率、すなわち１つのＰ＝Ｓ結合がＰ＝Ｏ結合に変換されている分子のパーセント比率を指す。
Claims (26)
- 混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドの製造のための方法であって、ヨウ素と、有機溶媒と、水とを含有する酸化溶液を用いて、スキーム
に従って式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に酸化することを含み、
前記酸化溶液が更にヨウ化物を含有することを特徴とする、
前記方法。 - 前記ヨウ化物が、ヨウ化水素から、ヨウ化アルカリから、又は三ヨウ化アルカリから選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記ヨウ化物が、ヨウ化水素から又はヨウ化アルカリから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記ヨウ化物が、ヨウ化アルカリから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸化溶液中のヨウ素対ヨウ化物のモル比が、１．０：０．１～１．０：３．０、好ましくは１．０：１．０～１．０：２．０の範囲で選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒がピリジンから又はＣ１～６アルキル置換ピリジンから選択されるが、好ましくはピリジンから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒がピリジンから選択される、請求項６に記載の方法。
- 有機溶媒対水の体積比が１：１～２０：１、好ましくは５：１～１５：１、より好ましくは９：１である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸化溶液中のヨウ素濃度が１０ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ～６０ｍＭである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 酸化溶液が使用され、前記酸化溶液が５０ｍＭのヨウ素含有量を有し、かつ前記酸化溶液に、前記酸化溶液が１５００μＳ／ｃｍ以上の導電率を有するまでヨウ化物が添加されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- ５０ｍＭ ＫＩ及び５０ｍＭ Ｉ２の含有量に基づいて１５００μＳ／ｃｍ以上、好ましくは１６５０～２０５０μＳ／ｃｍの導電率を有する酸化溶液が使用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 酸化溶液が使用され、前記酸化溶液が１０ｍＭのヨウ素含有量を有し、かつ前記酸化溶液に、前記酸化溶液が３００μＳ／ｃｍ以上の導電率を有するまでヨウ化物が添加されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- １０ｍＭ ＫＩ及び１０ｍＭ Ｉ２の含有量に基づいて３００μＳ／ｃｍ以上、好ましくは３５０～５５０μＳ／ｃｍの導電率を有する酸化溶液が使用される、請求項１～９及び１２のいずれか一項に記載の方法。
- 酸化溶液が使用され、前記酸化溶液が２０ｍＭのヨウ素含有量を有し、かつ前記酸化溶液に、前記酸化溶液が６００μＳ／ｃｍ以上の導電率を有するまでヨウ化物が添加されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- ２０ｍＭ ＫＩ及び２０ｍＭ Ｉ２の含有量に基づいて６００μＳ／ｃｍ以上、好ましくは７５０～９５０μＳ／ｃｍの導電率を有する酸化溶液が使用される、請求項１～９及び１４のいずれか一項に記載の方法。
- 酸化溶液が使用され、前記酸化溶液が１００ｍＭのヨウ素含有量を有し、かつ前記酸化溶液に、前記酸化溶液が３０００μＳ／ｃｍ以上の導電率を有するまでヨウ化物が添加されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- １００ｍＭ ＫＩ及び１００ｍＭ Ｉ２の含有量に基づいて３０００μＳ／ｃｍ以上、好ましくは３２００～３９００μＳ／ｃｍの導電率を有する酸化溶液が使用される、請求項１～９及び１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸化溶液が、反応溶液中のＰ＝Ｏ含有量が２．５％未満、好ましくは２．０％未満の値に達するように、式Ｉの前記中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩの前記ホスホジエステル化合物に酸化することができる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸化溶液の調製に使用される前記ヨウ素の量が、１．１当量～１５当量、より好ましくは１．５当量～４．５当量の間で選択される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 酸化反応のための反応温度が、１５℃～２７℃、より好ましくは１８℃～２４℃の間で選択される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、任意に改変されたＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオシドモノマー、又はその組合せからなり、１０～４０、好ましくは１０～２５ヌクレオチドの長さである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
- ａ）１０～１００ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、０．１～３．０モル当量のヨウ化物と、
ｃ）有機溶媒と、
ｄ）水と
を含み、
有機溶媒対水の体積比が２０：１～１：１である、
酸化溶液。 - ａ）１５～６０ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、１．０～２．０モル当量のヨウ化物と、
ｃ）有機溶媒と、
ｄ）水と
を含み、
有機溶媒対水の体積比が５：１～１５：１である、
請求項２２に記載の酸化溶液。 - ａ）１５～６０ｍＭのヨウ素と、
ｂ）１．０モル当量のヨウ素に関して、１．０～２．０モル当量のヨウ化水素又はヨウ化アルカリと、
ｃ）ピリジンと、
ｄ）水と
を含み、
有機溶媒対水の体積比が５：１～１５：１である、
請求項２２又は２３に記載の酸化溶液。 - 酸化溶液の品質を評価するための方法であって、
ａ）ヨウ素と、有機溶媒と、水とを含む酸化溶液を提供することと、
ｂ）前記酸化溶液の導電率を測定することと、
ｃ）測定された前記導電率の特定の閾値に基づいて、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に酸化するための前記酸化溶液の適合性を評価することと
を含む、前記方法。 - 前記酸化溶液が更にヨウ化物を含む、請求項２５に記載の方法。
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