[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP2023531666A - オキサゾリジノン化合物、オキサゾリジノン化合物を含むリポソーム組成物、およびそれらの使用方法 - Google Patents

オキサゾリジノン化合物、オキサゾリジノン化合物を含むリポソーム組成物、およびそれらの使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023531666A
JP2023531666A JP2022578853A JP2022578853A JP2023531666A JP 2023531666 A JP2023531666 A JP 2023531666A JP 2022578853 A JP2022578853 A JP 2022578853A JP 2022578853 A JP2022578853 A JP 2022578853A JP 2023531666 A JP2023531666 A JP 2023531666A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
akg
liposomal
liposomes
drug
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022578853A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021258013A5 (ja
Inventor
ドラモンド，ダリル，シー．
ティッパーラジュー，スレッシュ，ケイ．
ノーブル，チャールズ，オー．
コシュカレフ，アレクサンダー
キルポーチン，ディミトリィ，ビー．
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Akagera Medicines Inc
Original Assignee
Akagera Medicines Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akagera Medicines Inc filed Critical Akagera Medicines Inc
Publication of JP2023531666A publication Critical patent/JP2023531666A/ja
Publication of JPWO2021258013A5 publication Critical patent/JPWO2021258013A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings
    • C07D263/08—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D263/16—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D263/18—Oxygen atoms
    • C07D263/20—Oxygen atoms attached in position 2
    • C07D263/22—Oxygen atoms attached in position 2 with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to other ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5365—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/10—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing aromatic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

結核、ならびに他のマイコバクテリアおよびグラム陽性細菌感染を処置するための組物成および方法が開示される。これらの組成物は、低毒性薬物の投薬可能性を最大限にするために高効率でカプセル封入された非常に強力であり、選択的なオキサゾリジノンを含有し、血漿の存在下で安定である。組成物は、細菌またはマイコバクテリア感染部位での効率的な蓄積を可能にするために、静脈内投薬後の循環において、長期循環性であり、それらのカプセル封入された薬物を保持する。長期循環特性および薬物の非常に安定した保持と組み合わせた場合に達成され得る高用量は、これらの感染を処置するために典型的に利用される他の薬物の１日１回または１日２回の投与と比較した場合に、投与の頻度を減少させることを可能にする。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０４０，８１０号、および２０２１年６月１８日に出願された米国特許出願第１７／３５１，６３１号の優先権および利益を主張し、それらの全内容は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
分野
本開示は、新規アミノアルキルオキサゾリジノン化合物、新規アミノアルキルオキサゾリジノン化合物を含むリポソーム組成物、ならびに結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）および他のグラム陽性細菌感染の処置におけるアミノアルキルオキサゾリジノン化合物の使用に関する。
マイコバクテリアは、結核（ＴＢ）の原因となる細菌の属である。世界保健機関によれば、世界中のＴＢは、死亡原因の上位１０位に入り、単一の感染性病原体による死亡原因となっている。リファンピシンは、ＴＢを処置するための第１選択薬物として最も効果的である。しかしながら、リファンピシンに耐性である結核菌に感染する症例が増えている。多剤耐性結核（ＭＤＲ－ＴＢ）は、イソニアジドおよびリファンピシンに反応しない細菌によって引き起こされるＴＢの形態である。
結核、ならびに他のマイコバクテリアおよびグラム陽性細菌感染を処置するための組成物および方法が開示される。
本開示の一態様は、式Ｉ：
［式中、
Ｒ２は、アミン（ＮＨ２）またはアセトアミド（ＮＨＣＯＣＨ３）であり、
Ｒ１は、２’位においてアミノアルキルで置換されたテトラゾール環である］
の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
一部の実施形態では、アミノアルキルは、ジメチルアミノアルキルである。一部の実施形態では、オキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体は、オキサゾリジノン環のＲ２位置におけるアミン基またはアセトアミド基のいずれか、およびテトラゾール環上にジメチルアミノエチル基を含む。
一部の実施形態では、式１ａ：
の化合物が提供される。
一部の実施形態では、式１ｂ：
の化合物が提供される。
一部の実施形態では、式１ｃ：
の化合物またはその薬学的に許容される塩が提供される。
一部の実施形態では、式１ｄ：
の化合物またはその薬学的に許容される塩が提供される。
一部の実施形態では、式１ｅ：
の化合物が提供される。
一部の実施形態では、化合物は、Ｅｒｄ／ＨｅｐＧ２およびＨ３７Ｒｖ／ＨｅｐＧ２に対する選択性指数（ＳＩ）が１００～１７００の範囲である。
一部の実施形態では、化合物は、Ｅｒｄ／ＨｅｐＧ２およびＨ３７Ｒｖ／ＨｅｐＧ２に対するＳＩが２００～１７００の範囲である。
一部の実施形態では、化合物は、Ｅｒｄ／ＨｅｐＧ２およびＨ３７Ｒｖ／ＨｅｐＧ２に対するＳＩが３００～１７００の範囲である。
本開示の別の態様は、リポソーム小胞を含むリポソーム組成物を提供し、リポソーム小胞は、式Ｉ：
［式中、
Ｒ２は、アミン（ＮＨ２）またはアセトアミド（ＮＨＣＯＣＨ３）であり、
Ｒ１は、２’位においてアミノアルキルで置換されたテトラゾール環である］
の化合物またはその中の薬学的に許容される塩を含む。
一部の実施形態では、アミノアルキルは、ジメチルアミノアルキルである。一部の実施形態では、オキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体は、オキサゾリジノン環のＲ２位置におけるアミン基またはアセトアミド基のいずれか、およびテトラゾール環上にジメチルアミノエチル基を含む。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、リポソーム小胞を含み、リポソーム小胞は、式１ａ：
の化合物を含む。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、リポソーム小胞を含み、リポソーム小胞は、式１ｂ：
の化合物を含む。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、リポソーム小胞を含み、リポソーム小胞は、式１ｃ：
の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、リポソーム小胞を含み、リポソーム小胞は、式１ｄ：
の化合物を含む。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、リポソーム小胞を含み、リポソーム小胞は、式１ｅ：
の化合物を含む。
一部の実施形態では、リポソーム小胞は、水性媒体中にある。
一部の実施形態では、化合物は、補捉剤でリポソーム小胞に補足され、捕捉剤は、ポリアニオンを含む。一部の実施形態では、捕捉剤は、八硫酸トリエチルアンモニウムスクロースまたは硫酸アンモニウムである。一部の実施形態では、捕捉剤は、八硫酸トリエチルアンモニウムスクロースである。一部の実施形態では、捕捉剤は、硫酸アンモニウムである。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、化合物の塩を含み、塩は、硫酸塩、クエン酸塩、スクロソファート、リン酸化もしくは硫酸化ポリオールとの塩、またはリン酸化ポリアニオンポリマーもしくは硫酸化ポリアニオンポリマーとの塩である。一部の実施形態では、リポソーム組成物は、化合物の硫酸塩を含む。
一部の実施形態では、リポソーム小胞中の化合物は、１ｍｇ／ｍＬ未満の水溶解度を有する。一部の実施形態では、リポソーム小胞中の化合物は、０．１ｍｇ／ｍＬ未満の水溶解度を有する。
一部の実施形態では、リポソーム小胞は、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを含む膜を含む。一部の実施形態では、リポソーム小胞は、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを含む膜を含み、膜は、リポソーム小胞の内部を水性媒体から分離する。一部の実施形態では、ホスファチジルコリンは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）または水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である。一部の実施形態では、ホスファチジルコリンとコレステロールのモル比は、約６０：４０～３５：６５である。一部の実施形態では、ホスファチジルコリンとコレステロールのモル比は、約５５：４５～約３５：６５である。一部の実施形態では、ホスファチジルコリンとコレステロールのモル比は、約５０：５０～約４０：６０である。
一部の実施形態では、ホスファチジルコリンとコレステロールのモル比は、約５０：５０～約４５：５５である。
一部の実施形態では、膜は、ポリマーコンジュゲートされた脂質をさらに含む。
一部の実施形態では、リポソーム小胞は、約５５：４５：２．７５のモル比のＨＳＰＣ、コレステロールおよびポリマーコンジュゲートされた脂質を含む。
一部の実施形態では、ポリマーコンジュゲートされた脂質は、ＰＥＧ（分子量２，０００）－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）またはＰＥＧ（分子量２，０００）－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）である。
一部の実施形態では、リポソーム組成物中のリポソームは、約８０～約１３０ｎｍのＺ平均粒径を有する。
一部の実施形態では、組成物は、非経口投与用の液体医薬製剤である。
本開示の他の態様は、細菌感染を処置する方法に関し、本方法は、それを必要とする対象に、本明細書において提供される、治療有効量のリポソーム組成物を投与することを含む。
一部の実施形態では、細菌感染は、結核菌感染である。一部の実施形態では、リポソーム小胞中の化合物は、約０．０１μｇ／ｍｌ～約０．２５μｇ／ｍｌの範囲の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を有する。一部の実施形態では、リポソーム小胞中の化合物は、約０．０１μｇ／ｍｌ～約０．１μｇ／ｍｌの範囲の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を有する。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、非経口投与される。
一部の実施形態では、本方法は、１種または複数の追加の活性剤を同時にまたは連続的に投与することを含む。一部の実施形態では、１種または複数の活性剤は、ベダキリン、プレトマニド、ピラジナミド、モキシフロキサシン、その薬学的に許容される塩、またはそれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、週１回～６週間毎に１回投与される。
一部の実施形態では、それを必要とする対象への投与後に血中に残存する化合物のパーセンテージは、６時間で投与量の２０％を超える。一部の実施形態では、血中に残存する化合物のパーセンテージは、投与量の１０％を超える。
本開示の態様は、リポソーム組成物を作製する方法に関し、（ｉ）捕捉剤を実質的に含まない媒体中で、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ－脂質を含み、捕捉剤を含有する内部空間を有するリポソームを調製するステップ；（ｉｉ）前記リポソームを水性媒体中で請求項１から８のいずれか１項に記載の化合物と接触させて、前記リポソーム中の前記化合物をカプセル封入するステップ；（ｉｉｉ）カプセル封入されていない化合物を除去するステップ；ならびに（ｉｖ）非経口使用に適した生理学的に許容される媒体中に前記リポソームを提供するステップを含む。
化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６のリポソーム充填に対するｐＨの効果を示すグラフである。 図２Ａおよび図２Ｂは、異なる薬物と脂質（ＤＬ）の比のＴＥＡ－ＳＯＳ捕捉剤を用いた、化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６のリポソーム中へのカプセル封入を示すグラフである。図２Ａは、充填後の薬物と脂質の比（ＤＬ）として表される、リポソームペイロードに対する、リポソームリン脂質（ＰｈＬ）１モルあたりの薬物のグラム数の、添加薬物と脂質（ＤＬ０）の比の効果を示す。図２Ｂは、ＤＬ０に対する充填後ＤＬのパーセントとして算出される、リポソーム充填効率に対するＤＬ０比（薬物と脂質の入力比）の効果を示す。 異なるＤＬ比の捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いた、化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６のリポソーム中へのカプセル封入を示すグラフである。ＡＫＧ－５およびＡＫＧ－１６に関するリポソームペイロードに対するＤＬ０比の効果を示す。 異なるＤＬ比の捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いた、化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６のリポソーム中へのカプセル封入を示すグラフである。ＡＫＧ－５およびＡＫＧ－１６に関するリポソーム充填効率に対するＤＬ０比の効果を示す。 異なるＤＬ比の捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いた、化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６のリポソーム中へのカプセル封入を示すグラフである。ＡＫＧ－３に関するリポソームペイロードに対するＤＬ０比の効果を示す。 異なるＤＬ比の捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いた、化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６のリポソーム中へのカプセル封入を示すグラフである。ＡＫＧ－３に関するリポソーム充填効率に対するＤＬ０比の効果を示す。 図４Ａおよび図４Ｂは、異なるＤＬ０比の捕捉剤としてのＴＥＡ－ＳＯＳおよび硫酸アンモニウムを用いたＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８のカプセル封入を示すグラフである。図４Ａは、リポソームペイロードに対するＤＬ０比の効果を示す。図４Ｂは、充填効率に対するＤＬ０比の効果を示す。 図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、以下の実施例１９に記載される通り、マウス（「マウス」と表記）またはヒト（「ヒト」と表記）の血漿とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの接触時の化合物ＡＫＧ－２８（図５Ａ、図５Ｃ）およびＡＫＧ－３８（図５Ｂ、図５Ｄ）をカプセル封入するリポソームからの迅速な薬物漏出の依存性を示すグラフである。リポソームは、５ｍｏｌ％のＰＥＧ（２０００）－ＤＳＰＥ（「ＤＳＰＥ」と表記）またはＰＥＧ－ＤＳＧ（「ＤＳＧ」と表記）を含有していた。捕捉剤：０．５Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）（図５Ａ、図５Ｂ）、１Ｎ八硫酸トリエチルアンモニウムスクロース（ＴＥＡ－ＳＯＳ）（図５Ｃ、図５Ｄ）。 式Ｉの化合物の番号付き環構造を表す図である。 １０ｍｇ／ｋｇ（菱形）、２０ｍｇ／ｋｇ（四角）、および４０ｍｇ／ｋｇ（丸）のＬｓ－ＡＫＧ２８の単回静脈内用量（ＩＶｘ１）の投与後のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける総薬物の血漿濃度対時間プロファイルを示すグラフである。５％メチルセルロース（ｐＨ３～４）中の５０ｍｇ／ｋｇ（単回経口用量、ＰＯｘ１）のリネゾリドの血漿濃度対時間プロファイルも、比較のために含ませた。平均およびＳＤ濃度を、各時点で提示する。 ２０ｍｇ／ｋｇ（菱形）、４０ｍｇ／ｋｇ（四角）、および８０ｍｇ／ｋｇ（菱形）のＬｓ－ＡＫＧ３８の単回静脈内用量（ＩＶｘ１）の投与後のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける総薬物の血漿濃度対時間プロファイルを示すグラフである。５％メチルセルロース（ｐＨ３～４）中の５０ｍｇ／ｋｇ（単回経口用量、ＰＯｘ１）のリネゾリドの血漿濃度対時間プロファイルも、比較のために含ませた。平均およびＳＤ濃度を、各時点で提示する。 １日目（丸）、１５日目（四角）、２９日目（菱形）、および４３日目（三角）での、１０ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ２８、ＩＶｘ１の投与後のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける総薬物の血漿濃度対時間プロファイルを示すグラフである。平均およびＳＤ濃度を、各時点で提示する。 １日目（丸）、１５日目（四角）、２９日目（菱形）、および４３日目（三角）での、２０ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ２８、ＩＶｘ１の投与後のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける総薬物の血漿濃度対時間プロファイルを示すグラフである。平均およびＳＤ濃度を、各時点で提示する。 １日目（丸）、１５日目（四角）、２９日目（菱形）、および４３日目（三角）での、４０ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ２８、ＩＶｘ１の投与後のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける総薬物の血漿濃度対時間プロファイルを示すグラフである。平均およびＳＤ濃度を、各時点で提示する。 １日目（丸）、１５日目（四角）、２９日目（菱形）、および４３日目（三角）での、２０ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ３８、ＩＶｘ１の投与後のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける総薬物の血漿濃度対時間プロファイルを示すグラフである。平均およびＳＤ濃度を、各時点で提示する。 １日目（丸）、１５日目（四角）、２９日目（菱形）、および４３日目（三角）での、４０ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ３８、ＩＶｘ１の投与後のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける総薬物の血漿濃度対時間プロファイルを示すグラフである。平均およびＳＤ濃度を、各時点で提示する。 １日目（丸）、１５日目（四角）、２９日目（菱形）、および４３日目（三角）での、８０ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ３８、ＩＶｘ１の投与後のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける総薬物の血漿濃度対時間プロファイルを示すグラフである。平均およびＳＤ濃度を、各時点で提示する。 図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃは、ＣＤ－１マウスにおける単回静脈内注射後のＣＤ－１マウスにおける、脂質（非交換性ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ標識）と、リポソームＡＫＧ－２８（図１１Ａ）およびリポソームＡＫＧ－３８（図１１Ｂ）のための薬物との両方の血漿濃度対時間プロファイル、ならびにＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の両方に関する、リポソームからの薬物放出速度の尺度である、血漿薬物と脂質の比の変化（図１１Ｃ）を示すグラフである。平均およびＳＤ濃度を、各時点で提示する。 第１および第４の週用量後のリポソームＡＫＧ－２８およびリポソームＡＫＧ－３８の複数製剤である、比較されたＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の注射用量％として提示される血漿薬物濃度を示すグラフである。マウスに、合計４回の注射にわたって週１回、示された用量および製剤を注射した。 経時的なメスのＣＤ－１マウスの体重に対するＬｓ－ＡＫＧ２８の用量漸増の効果を示すグラフである。 経時的なメスのＣＤ－１マウスの体重に対するＬｓ－ＡＫＧ３８の用量漸増の効果を示すグラフである。 メスのＣＤ－１マウスにおける血液パラメータ（ＲＢＣ、ＨＴＣ、ＰＬＴ、ＷＢＣ）および血液生化学（ＡＬＴ、ＡＳＴ）パラメータに対するＢＰまたはＢＰＭと組み合わせたＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の効果を示すグラフである。 メスのＣＤ－１マウスにおける組織病理学的所見に対するＬｓ－ＡＫＧ２８またはＬｓ－ＡＫＧ３８単剤療法の効果を示すヒートマップである。 経時的なメスのＣＤ－１マウスの体重に対する、ベダキリンおよびプレトマニド（ＢＰ）またはベダキリン、プレトマニド、およびモキシフロキサシン（ＢＰＭ）と組み合わせたＬｓ－ＡＫＧ２８の効果を示すグラフである。 経時的なメスのＣＤ－１マウスの体重に対する、ＢＰまたはＢＰＭと組み合わせたＬｓ－ＡＫＧ３８の効果を示すグラフである。 メスのＣＤ－１マウスにおける血液パラメータ（ＲＢＣ、ＨＴＣ、ＰＬＴ、ＷＢＣ）および血液生化学（ＡＬＴ、ＡＳＴ）パラメータに対する、ＢＰまたはＢＰＭと組み合わせたＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の効果を示すグラフである。 メスのＣＤ－１マウスにおける組織病理学的所見に対するＢＰまたはＢＰＭと組み合わせたＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の効果を示すヒートマップである。 経時的な、単独の、またはＢＰと組み合わせた、５０ｍｇ／ｋｇで週２回（２ｑｗ）または１００ｍｇ／ｋｇで週１回（１ｑｗ）、注射したＬｓ－ＡＫＧ２８で処置したメスのＣＤ－１マウスにおける体重変化を示すグラフである。 単独の、またはＢＰと組み合わせた、１００ｍｇ／ｋｇで２ｑｗまたは２００ｍｇ／ｋｇで１ｑｗ注射したＬｓ－ＡＫＧ３８で処置したメスのＣＤ－１マウスにおける体重変化を示すグラフである。 単独の、またはＢＰと組み合わせた、Ｌｓ－ＡＫＧ２８（５０ｍｇ／ｋｇで２ｑｗもしくは１００ｍｇ／ｋｇで１ｑｗ）またはＬｓ－ＡＫＧ３８（１００ｍｇ／ｋｇで２ｑｗもしくは２００ｍｇ／ｋｇで１ｑｗ）で処置したメスのＣＤ－１マウスにおける血液および血液生化学パラメータを示すグラフである。 単独の、またはＢＰと組み合わせた、Ｌｓ－ＡＫＧ２８（５０ｍｇ／ｋｇで２ｑｗもしくは１００ｍｇ／ｋｇで１ｑｗ）またはＬｓ－ＡＫＧ３８（１００ｍｇ／ｋｇで２ｑｗもしくは２００ｍｇ／ｋｇで１ｑｗ）で処置したメスのＣＤ－１マウスにおける組織病理学的結果を示すヒートマップである。 図１６Ａは、経時的な合計８週間にわたって慢性的に処置されたオスのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける体重に対するＬｓ－ＡＫＧ２８の効果を示すグラフである。図１６Ｂは、経時的な合計８週間にわたって慢性的に処置されたオスのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける体重に対するＬｓ－ＡＫＧ３８の効果を示すグラフである。
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明は、単に例示的であり、説明的なものであって、本開示の組成物および方法を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書には、細菌感染の処置に関する化合物、組成物および方法が開示される。本明細書で使用される場合、用語「化合物」および「薬物」は、互換的に使用される。本開示の一部の態様は、オキサゾリジノンの新規アミノアルキル誘導体に関する。本開示の一部の態様は、オキサゾリジノン化合物の新規アミノアルキル誘導体を合成するプロセスに関する。他の態様は、リポソーム中のオキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体を含む組成物に関する。本開示の他の態様は、細菌感染の処置におけるオキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体、またはオキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体を含むリポソーム組成物の使用に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物および組成物は、マイコバクテリアおよびグラム陽性細菌からの感染を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、細菌感染は、結核菌である。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物および組成物は、マイコバクテリアおよびグラム陽性細菌の増殖を阻害する。これらには、限定されないが、結核菌、マイコバクテリウム・アビウムコンプレックス複合体、ハンセン菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ゴルドナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・アブセッサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、マイコバクテリウム・ムコゲニカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ）、連鎖球菌、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、肺炎ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、緑色連鎖球菌（ｖｉｒｉｄａｎｓ ｇｒｏｕｐ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ノカルジア菌（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、およびコリネバクテリア属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるオキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体は、ヒト腎臓または肝細胞などの哺乳動物細胞と比較した場合、結核菌に対して選択的に活性である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるオキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体は、腎臓または肝細胞の哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞と比較した場合、結核菌に対して少なくとも１０００倍の予想外に高い選択性を示す。一部の実施形態では、本明細書に記載されるオキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体は、少なくとも１００倍の予想外に高い選択性を示す。一部の実施形態では、本明細書に記載されるオキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体は、腎臓または肝細胞の哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞と比較した場合、結核菌に対して１００～６，５００倍、１００～６，０００倍、１００～５，５００倍、１００～５，０００倍、１００～４，５００倍、１００～４，０００倍、１００～３，５００倍、１００～３，０００倍、１００～２，５００倍、１００～２，０００倍、１００～１，５００倍、１００～１，０００倍、５００～６，５００倍、５００～６，０００倍、５００～５，５００倍、５００～５，０００倍、５００～４，５００倍、５００～４，０００倍、５００～３，５００倍、５００～３，０００倍、５００～２，５００倍、５００～２，０００倍、５００～１，５００倍、５００～１，０００倍、１，０００～６，５００倍、１，０００～６，０００倍、１，０００～５，５００倍、１，０００～５，０００倍、１，０００～４，５００倍、１，０００～４，０００倍、１，０００～３，５００倍、１，０００～３，０００倍、１，０００～２，５００倍、１，０００～２，０００倍、１，０００～１，５００倍の予想外に高い選択性を示す。
一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物および組成物は、肝臓、脾臓、または肺におけるマイコバクテリウム常駐マクロファージにおける選択的取り込みを促進し、強力な細胞内死滅を提供するのを助けることができる。マクロファージは、マイコバクテリウムのような外来の感染性病原体と、リポソームなどの実験室由来のナノ粒子の両方を含む、食作用を介した異物粒子のクリアランスに関与する。これは、両者が同じ生物学的保有宿主に共局在化し、疾患の重要な貯蔵場所に活性剤を効果的に濃縮する機会をもたらす。
本開示の態様は、オキサゾリジノンのアミノアルキル誘導体である化合物に関する（図６を参照されたい）。一部の実施形態では、以下の化学式Ｉ：
［式中、
Ｒ２は、アミン（ＮＨ２）またはアセトアミド（ＮＨＣＯＣＨ３）であり、
Ｒ１は、２’位においてアミノアルキルで置換されたテトラゾール環である］
を有する化合物およびその薬学的に許容される塩。
他の実施形態では、以下の化学式Ｉ：
［式中、
Ｒ２は、アミン（ＮＨ２）またはアセトアミド（ＮＨＣＯＣＨ３）であり、
Ｒ１は、１’においてアミノアルキル基で置換されたテトラゾール環である］
を有する化合物およびその薬学的に許容される塩。
一部の実施形態では、アミノアルキルは、ジメチルアミノアルキルである。一部の実施形態では、オキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体は、オキサゾリジノン環のＲ２位置におけるアミン基またはアセトアミド基のいずれか、およびテトラゾール環上にジメチルアミノエチル基を含む。
本開示は、オキサゾリジノン環のＲ２位置におけるアミン基またはアセトアミド基のいずれか、およびテトラゾール環上にジメチルアミノエチル基を含む、本明細書に記載されるオキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体についての非常に特異的な構造－活性相関（ＳＡＲ）を示す。これらの化合物は、（１）哺乳動物細胞（例えば、ヒト腎臓または肝細胞）における活性と比較した場合、結核菌に対して高度に選択的であり、（２）結核菌に対して高度に活性であり、（３）リポソームに効率的に充填される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるオキサゾリジノンのアミノアルキル誘導体は、勾配に基づく薬物充填方法を用いて、８５％またはそれより良好な効率でリポソームに充填する。一部の実施形態では、これらの誘導体の充填効率は、９０％以上である。一部の実施形態では、これらの誘導体の充填は、９５％以上、または定量的でさえある。一部の実施形態では、オキサゾリジノンのアミノアルキル誘導体をリポソームに充填する方法が記載される。一部の実施形態では、充填方法は、リポソーム内部水性空間において、効率的に充填し、その後、弱塩基性両親媒性剤を安定化させるために、膜貫通勾配および捕捉剤を採用する。勾配は、（１）例えばクエン酸溶液を使用して形成される単純なｐＨ勾配、（２）クエン酸または硫酸アンモニウム塩を採用するアンモニウムイオン勾配、（３）アルキル、ジアルキル、またはトリアルキルアンモニウム塩、（４）遷移金属（Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋）の勾配、またはさらに（５）薬物溶解度の膜貫通勾配を含むことができる。参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３１６，７７１号、同第５，８００，８３３号、同第８，１４７，８６７号、同第７，７４４，９２１号、同第８，３４９，３６０号、同第６，１１０，４９１号、米国特許出願公開第２０１８／０３６９１４３Ａ１号、および国際特許出願公開第１９９００１４０５号を参照されたい。Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６２：１９９－２０４も参照されたい。理論に拘束されることなく、リポソーム内部に含まれるカチオンは、弱塩基性薬物のリポソーム内部への蓄積を駆動するか、または薬物分子と直接的に交換することを助ける、膜を横切るｐＨ勾配を確立する上で役割を果たす。これは、一部の実施形態では、勾配の全容量未満での薬物の定量的充填をもたらす。対イオンは、リポソーム内部で薬物と安定な複合体を形成することにより、循環中または貯蔵中の早期漏出に対する製剤の安定化において重要な役割を果たすことができる（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９７，４６９６－４７４０を参照されたい）。
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において採用されるある特定の用語をここに集める。別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、以下の意味を有することを意図される。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象物の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「含んでいる」または「含む」は、所与の実施形態に存在するが、特定されていない要素を含めることができる、組成物、方法、およびそれぞれの構成要素（複数可）を参照するために使用される。
本明細書で使用される場合、用語「から本質的になる」とは、所与の実施形態に必要とされる要素を指す。この用語は、本開示のその実施形態の基本的および新規のまたは機能的特徴（複数可）に実質的に影響しない追加の要素の存在を可能にする。
用語「からなる」は、本明細書に記載されるような組成物、方法、およびそれらの各構成要素を指し、これらは、実施形態のその説明に記載されていない任意の要素を排除する。
用語「含んでいる」には、本明細書において使用される場合、「からなる」および「から本質的になる」を含む。
本明細書において「上記で言及されるように」または「上記で言及された」、「前出の」と言及される場合、先行する頁のいずれかにおいて本明細書内で行われた開示のいずれかに言及される。
本明細書において「本明細書において言及されるように」、「本明細書に記載された」、「本明細書において提供される」、または「本テキストに言及されるように」、または「本明細書に記述された」と言及される場合、本明細書は、先行するかまたは後述の頁のいずれかにおいて明細書内で行われる開示のいずれかに言及される。
本明細書で使用する場合、用語「約」とは、記述値の２０％以内、１０％以内、および５％以内の許容可能な変動を意味する。ある特定の実施形態では、「約」は、±１％、２％、３％、４％、５％、１０％または２０％の変動を意味し得る。
化合物または組成物に関して本明細書で使用される用語「有効量」とは、殺菌効果または静菌効果を引き起こすのに十分な活性化合物（本明細書では活性剤または薬物とも称する）の量を意味する。一実施形態では、有効量は、処置される細菌感染の症状を十分に緩和する活性化合物の量を意味する「治療有効量」である。
本明細書で使用される用語「対象」（または代替的に「患者」）は、予防的または治療的処置を受ける、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
本明細書で使用される「投与」または「投与すること」という用語は、化合物または医薬組成物を、それを必要とする対象に、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、吸入、頬、眼、舌下、膣、直腸などに導入する全ての手段を含む。化合物または組成物の投与は、適切には非経口的である。例えば、化合物または組成物は、優先的には静脈内に投与することができるが、腹腔内にまたは吸入などにより投与することもでき、現在、トリ型結核菌の処置においてリポソームアミカシンについて臨床において使用されている（Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｉｋａｃｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｄｒｕｇｓ．２０１９ Ａｐｒ； ７９（５）：５５５－５６２を参照されたい）。
本明細書で使用される「処置する」、「処置すること」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書に記載されるものなどの治療的または予防的手段を指す。
本明細書で使用される「相乗」および「相乗的」という用語は、一緒に使用される化合物を用いて達成される効果が、化合物を別々に使用することから生じる効果の合計よりも大きいこと、すなわち、別々に投与される２つの活性成分に基づいて予測される効果よりも大きいことを意味する。
用語「薬学的に許容される塩」とは、所望の薬理活性を有する本開示の化合物の、比較的に非毒性な、無機または有機酸付加塩を指す。
用語「アルキル」とは、炭素鎖が別途定義されない限り、直鎖もしくは分枝鎖の、またはそれらの組合せであり得る飽和炭素鎖を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ－およびｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどが挙げられる。
用語「アミノアルキル」とは、アルキル炭素鎖の少なくとも１つの炭素が、アミノ基と結合を形成するアルキルを意味し、上記アミノ基は、第１級アミノ基、モノアルキル置換（第２級）アミノ基、ジアルキル置換（第３級）アミノ基、またはアルキル置換アミノ基であり、アミン窒素原子、およびアミン水素を置換するアルキル鎖は複素環を形成する。
用語「リポソーム」とは、二重層（単層）および／または、中央の水性コンパートメントを囲むリン脂質などの両親媒性分子によって形成される水性コンパートメントによって分離された同心円状の複数の二重層（多層）で構成される小胞を意味する。リポソーム薬物製品では、原薬は、一般的にリポソームに含有される。典型的には、水溶性薬物は水性コンパートメント（複数可）に含有され、疎水性薬物はリポソームの脂質二重層（複数可）に含有される。リポソーム製剤からの薬物の放出、とりわけリポソームクリアランスおよび循環半減期などの他の特徴は、リポソーム中のポリエチレングリコールおよび／またはコレステロールまたは他の潜在的添加剤の存在によって修飾することができる。
「単層リポソーム」は、「単層小胞」とも呼ばれ、単一の閉鎖された水性コンパートメントを画定する１つの脂質二重層膜を含むリポソームである。二重層膜には、内層と外層（リーフレット）の２層の脂質が含まれる。外層の脂質分子は、それらの親水性（「頭部」）部分が外側の水性環境に向かって配向され、それらの疎水性（「尾部」）部分がリポソームの内部に向かって下向きに向かって指向される。脂質の内層は外層の直下にあり、脂質の頭部はリポソームの水性内部に面し、尾部は脂質の外層の尾部に向いている。
「多層リポソーム」は、「多層小胞」または「複数の層状小胞」とも呼ばれ、１を超える脂質二重層膜を含み、これらの膜は、複数の閉鎖した水性コンパートメントを画定する。膜は同心円状に配置されており、異なる膜は水性コンパートメントによって分離されている。
本明細書で使用される「カプセル封入」および「捕捉される」という用語は、リポソーム中またはリポソームとともに、オキサゾリジノン医薬剤の取り込みまたは会合を指す。
用語「ＤＬ」、「ＤＬ比」、「Ｄ／Ｌ」、または「Ｄ／Ｌ比」は、互換的に使用され、薬物対リポソーム脂質の比を指す。特に断らない限り、それはリポソームリン脂質（ＰｈＬ）のモルあたりの薬物のグラムとして表される。
コレステロールに関して「ｍｏｌ％」という用語は、パーセンテージポイントで表されるコレステロールと非ＰＥＧ化リン脂質のモル量の合計に対するコレステロールのモル量を指す。例えば、コレステロールとＨＳＰＣを含有するリポソーム中の「５５ｍｏｌ％コレステロール」とは、４５ｍｏｌ部のＨＳＰＣあたり５５ｍｏｌ部のコレステロールの組成物を指す。
ＰＥＧ－脂質に関して「ｍｏｌ％」という用語は、パーセンテージポイントで表されるＰＥＧ－脂質と非ＰＥＧ化リン脂質のモル量の比を指す。例えば、ＨＳＰＣとＰＥＧ－ＤＳＰＥを含有するリポソーム中の「５ｍｏｌ％ＰＥＧ－ＤＳＰＥ」とは、１００ｍｏｌ部のＨＳＰＣあたり５ｍｏｌ部のＰＥＧ－ＤＳＰＥを有する組成物を指す。
用語「八硫酸スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ ｏｃｔａｓｕｌｆａｔｅ）」、「スクロソファート」、および「スクロオクタ硫酸塩」とは、同じ化合物、八硫酸スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ ｏｃｔａｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）またはそのアニオンを指し、本明細書では互換的に使用される。
化学式中に見られる「Ａｃ」、「Ｍｅ」、および「Ｅｔ」の記号は、それぞれ、アセチル基（ＣＨ３ＣＯ）、メチル基（ＣＨ３）、およびエチル基（Ｃ２Ｈ５）を指す。
様々な態様および実施形態が、以下のサブセクションでさらに詳細に記載される。
化合物
オキサゾリジノンは、タンパク質合成を阻害することによってそれらの機能を発揮する合成抗生物質である。リネゾリド（ＬＺＤ）は、結核菌に対して静菌活性を示すオキサゾリジノン化合物である。しかしながら、ＬＺＤの投与は、貧血、血小板減少症、および末梢神経障害などの重篤な副作用を引き起こすことがある。テジゾリドは、グラム陽性細菌を阻害することが示されているオキサゾリジノン化合物である。リン酸テジゾリドの副作用は類似しているが、一般的にリネゾリドよりも軽度である。しかし、リン酸テジゾリドは、リネゾリドの長期投薬の経験と比較して、結核の処置に必要とされるような長期投薬の経験は限られている。
本開示の態様は、オキサゾリジノンのアミノアルキル誘導体である化合物に関する（図６を参照されたい）。一部の実施形態では、以下の化学式Ｉ：
［式中、
Ｒ２は、アミン（ＮＨ２）またはアセトアミド（ＮＨＣＯＣＨ３）であり、
Ｒ１は、２’位においてアミノアルキルで置換されたテトラゾール環である］
を有する化合物およびその薬学的に許容される塩。
一部の実施形態では、アミノアルキルは、ジメチルアミノアルキルである。一部の実施形態では、オキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体は、オキサゾリジノン環のＲ２位置におけるアミン基またはアセトアミド基のいずれか、およびテトラゾール環上にジメチルアミノエチル基を含む。
他の実施形態では、以下の化学式Ｉ：
［式中、
Ｒ２は、アミン（ＮＨ２）またはアセトアミド（ＮＨＣＯＣＨ３）であり、
Ｒ１は、１’においてアミノアルキルで置換されたテトラゾール環である］
を有する化合物およびその薬学的に許容される塩。
下記の表１の化学構造を有するオキサゾリジノン化合物のアミノアルキル誘導体を実施例１に記載されるように合成した。
本開示の化合物は、遊離形態、例えば、遊離塩基として、遊離酸として、または両性イオンとして存在することができるか、または塩の形態で存在することができる。上記塩は、薬学において慣用的に使用される任意の塩、有機もしくは無機付加塩、または共結晶、特に任意の薬学的に許容される有機もしくは無機付加塩、または共結晶であり得る。特定の塩形態またはイオン形態の化合物を示す化学式は、非解離遊離塩基（または遊離酸）形態のこの化合物も開示することが理解される。
本開示は、化合物の全ての立体異性体形態を包含する。一部の実施形態では、以下の表１の化合物は、実施的に純粋である（すなわち、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、例えば、１００％である）。
一部の実施形態では、化合物は、以下の化学式：
を有する。
一部の実施形態では、化合物は、以下の化学式：
を有する。
一部の実施形態では、化合物は、以下の化学式：
を有する。
一部の実施形態では、化合物は、以下の化学式：
を有する。
一部の実施形態では、化合物は、以下の化学式：
を有する。
本明細書には、マイコバクテリウム感染の処置に有用である、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩が開示される。一部の実施形態では、化合物は、化学式１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄまたは１ｅを有する。一部の実施形態では、化合物は、化学式１ｂを有する。一部の実施形態では、式Ｉの化合物は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）、例えば、結核菌に対して、０．１μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ～０．２５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ～０．５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ～０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．２５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．１μｇ／ｍｌの範囲のＭＩＣを有する。一部の実施形態では、式Ｉの化合物は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）、例えば、結核菌に対して、１μｇ／ｍｌ未満、０．２５μｇ／ｍｌ未満、または０．１μｇ／ｍｌ未満のＭＩＣを有する。一部の実施形態では、式Ｉの化合物は、０．０１μｇ／ｍｌ～０．２５μｇ／ｍｌの範囲のＭＩＣを有する。一部の実施形態では、式Ｉの化合物は、０．０１μｇ／ｍｌ～０．１μｇ／ｍｌの範囲のＭＩＣを有する。ＭＩＣ値は、細菌に応じて、本明細書において提供される範囲よりも低くてもよいことが理解されるべきである。
マイコバクテリウム、例えば、結核菌を処置するための一部の実施形態では、化合物（ＡＫＧ－２８またはＡＫＧ－３８）は０．１μｇ／ｍＬ未満のＭＩＣを有する。マイコバクテリウム、例えば、結核菌を処置するための一部の実施形態では、化合物は、少なくとも１，０００の、結核菌対ヒト腎臓細胞（ＶＥＲＯ）を死滅させる選択性指数（ＳＩ）を有する。マイコバクテリウム、例えば、結核菌を処置するための一部の実施形態では、化合物は、０．１μｇ／ｍＬ未満のＭＩＣ、および少なくとも１，０００の、結核菌対ヒト腎臓細胞（ＶＥＲＯ）を死滅させる選択性指数（ＳＩ）を有する。一部の実施形態では、化合物は、ＡＫＧ－２８（式１ｂ）またはＡＫＧ－３８（式１ｃ）の構造を有する。一部の実施形態では、ＭＩＣは０．０５μｇ／ｍＬ未満であり、ミトコンドリアタンパク質合成阻害（ＳＩ－ＭＰＳ）と比較した結核菌におけるＭＩＣの選択性指数は、ＡＫＧ－２８のように２０を超える。
一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、結核菌用のリネゾリドと比較して、効力を調整した用量で、２～２０倍の増加（約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０）を有する。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を処置するための一部の実施形態では、化合物は、２μｇ／ｍＬ未満の、ＭＲＳＡ株に対するＭＩＣを有する。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を処置するための一部の実施形態では、化合物は、ヒトＶＥＲＯ腎細胞に対して１００μｇ／ｍＬを超えるＩＣ５０を有する。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を処置するための一部の実施形態では、化合物は、２μｇ／ｍＬ未満の、ＭＲＳＡ株に対するＭＩＣ、およびヒトＶＥＲＯ腎細胞に対して１００μｇ／ｍＬを超えるＩＣ５０を有する。一部の実施形態では、化合物は、ＡＫＧ－３８（式１ｃ）、ＡＫＧ－３９（式１ｅ）、およびＡＫＧ－４０（式１ｄ）の構造を有する。
水溶解度
一部の実施形態では、化合物は、塩の形態、例えば、塩酸塩またはメシル酸塩の形態であり、リポソーム中にカプセル封入する前に、１ｍｇ／ｍｌを超えて、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌを超えて（および最大１ｇ／ｍｌ）で水に可溶性である。カプセル封入前の追加の塩には、限定されないが、ベシル酸塩、重酒石酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、エシル酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メチル硫酸塩、ナプシル酸塩、リン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、およびトシル酸塩が含まれ得る。一部の実施形態では、化合物は、リポソーム中にカプセル封入する前に、水和物または溶媒和物または共結晶の形態である。
一部の実施形態では、薬物は、水溶解度が減少した、例えば、１ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ未満（０．１～０．００１ｍｇ／ｍＬ）の異なる塩形態でリポソームの内部に捕捉される。リポソームに一旦捕捉された化合物の塩には、限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、スクロソファート、あるいは種々のリン酸化もしくは硫酸化ポリオールまたはポリアニオンポリマーが含まれる。例示的なポリオールには、限定されないが、スクロース、エリスリトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、およびそれらの組合せが含まれる。例示的なポリアニオンポリマーには、限定されないが、ポリビニルスルホン酸塩、ポリビニルスルホン酸塩、ポリリン酸塩、アクリル酸と硫酸ビニルアルコールとのコポリマー、およびそれらの組合せが含まれる。
化合物の作業ストックを以下のように調製した。粉末形態の化合物（遊離塩基）のアリコートに、１Ｎ水溶液の形態の１～１．５当量のＨＣｌを添加し、混合物を均一になるまでボルテックスした。得られたケーキまたはシロップに、水を典型的には最終１０ｍｇ／ｍｌになるように添加し、完全な溶解を観察した。一部の例では、０．９５当量のＨＣｌを薬物の遊離塩基形態に添加し、２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を調製した。
本開示の化合物の水溶解度は、視覚的に透明な溶液を得るための以下の観察によって例示される。
これらの結果は、本明細書において提供される化合物が、
－リネゾリド（３ｍｇ／ｍｌ）（ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ００６０１）
－ステゾリド（０．２３７ｍｇ／ｍｌ）（ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ１１９０５）
および
－テジゾリド（０．３８２ｍｇ／ｍＬ）（ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ１４５６９）
の公知の水溶解度よりも高い水溶解度を有することを示す。
一部の実施形態では、リポソームへのカプセル封入前に、本明細書に記載される化合物の水溶解度は、上記オキサゾリジノンの少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍である。
本明細書に記載される化合物の優れた水溶性、およびそれらの両親媒性の弱塩基の特性は、膜貫通勾配ベースおよびリポソーム内錯体形成（能動充填）アプローチの効率的な使用を可能とし、薬物の全身投与後に、カプセル封入された薬物の感染組織への送達に好ましい高薬物／担体（薬物／脂質）比および薬物動態特性を有するこれらの化合物のリポソームカプセル封入形態を生成する。本明細書で使用される場合、両親媒性の弱塩基は、７～１２のｐＫａ、および１～６のｌｏｇＰを有する。
リポソーム充填特性および抗マイコバクテリア活性
本明細書に記載される化合物の重要な特徴は、それらの弱い両親媒性塩基特性であり、これらの化合物のリポソームへの膜貫通勾配駆動充填を容易にする。一部の実施形態では、本開示の化合物の弱い塩基特性は、７．０～１２．０、７．５～１１．０、７．８～１０．５、または８．０～１０．０のｐＫａ範囲における電解解離定数によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物の両親媒性特性は、０．５～５．０、１．０～４．０、１．０～３．５、または１．０～３．０の範囲のｌｏｇＰパラメータによって特徴付けられる。リポソーム充填に関してこれらの好ましい特性を有するある特定の実施形態はまた、効率的であり、安定なリポソームカプセル封入に対して好ましくない特性を有する同じクラスの薬物中の類似化合物の活性に適合するかまたはそれを上回るマイコバクテリアに対して優れた活性を有することが、予想外に発見された。
リポソーム組成物
結核、ならびに他のマイコバクテリアおよびグラム陽性細菌感染を処置するための組成物および組成物の使用が開示される。本明細書において提供されるこれらの組成物は、低毒性薬物の投薬可能性を最大にするために高効率でカプセル封入された非常に強力であり、選択的なオキサゾリジノンを含有し、血漿の存在下で安定である。一部の実施形態では、組成物は、細菌またはマイコバクテリア感染部位での効率的な蓄積を可能にするために、静脈内投薬後の循環において、長期循環性であり、それらのカプセル封入薬物を保持する。一部の実施形態では、長期循環特性および薬物の非常に安定した保持と組み合わせた場合に達成され得る高用量は、これらの感染を処置するために典型的に利用される他の薬物の１日１回または１日２回の投与と比較した場合に、投与の頻度を減少させることを可能にする。
本明細書には、細菌感染、特に結核菌感染を処置するための医薬組成物が開示される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ポリアニオンまたはポリアニオンを含有する硫酸塩およびアミノアルキルオキサゾリジノン化合物を含むリポソーム組成物である。
一部の実施形態では、組成物は、媒体中にリポソームを含み、リポソーム内空間は、ポリアニオンおよび式Ｉの化合物を有する水相を含む。一部の実施形態では、組成物は、媒体中にリポソームを含み、リポソーム内空間は、ポリアニオンまたはポリアニオンを含有する硫酸塩および化合物ＡＫＧ－１６、ＡＫＧ－２８またはＡＫＧ－３８を含む。一部の実施形態では、媒体は水性媒体であり、その媒体中の一次組成物は、式Ｉの化合物および対応する捕捉剤である。
式Ｉの化合物は、適切なポリアニオン、例えば、八硫酸スクロース（例えば、トリエチルアンモニウムスクロース八硫酸塩、（ＴＥＡ－ＳＯＳ）勾配から誘導される）または硫酸塩（例えば、硫酸アンモニウム勾配から誘導される）を用いてリポソーム内に捕捉することができる。追加のポリアニオン捕捉剤には、限定されないが、イノシトール六リン酸、イノシトール六硫酸、ポリビニルスルホン酸、硫酸デキストラン、クエン酸塩、ポリリン酸塩、およびスラミンが含まれる。
外側の水性媒体は、典型的には、適切な緩衝剤および等張剤で構成される。適切な緩衝剤には、ヒスチジン、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＴＲＩＳ、リン酸塩、グリシン、イミダゾール、ホウ酸塩、炭酸塩、およびコハク酸塩が含まれ得る。等張剤には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、スクロース、グリセリン、デキストロース、またはマンニトールなどの塩が含まれ得る。
一部の実施形態では、組成物は、１種または複数のリン脂質、ステロール、および任意選択で親水性ポリマーにコンジュゲートされた脂質（ポリマーコンジュゲートされた脂質）から形成された主として単層小胞中のポリアニオンでカプセル封入された、式Ｉ、または式１ａ、１ｂ、１ｃもしくは１ｄの化合物、あるいははその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、組成物は、単層小胞および多層小胞（例えば、２つまたは３つの層を有する）中のポリアニオンでカプセル封入された、式Ｉ、または式１ａ、１ｂ、１ｃもしくは１ｄの化合物、あるいはその薬学的に許容される塩を含むことができる。多層小胞は、単層小胞よりも、循環からより迅速に除去され得ることは理解されるべきである。一部の実施形態では、リン脂質は、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、または卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）である。本明細書で使用される「リン脂質」という用語は、リポソームを形成することができる任意の１つのリン脂質またはリン脂質の組合せを指す。中性リン脂質には、ジアシルホスファチジルコリン、ジアルキルホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、およびジアシルホスファチジルエタノールアミンが含まれ得る。ホスファチジルコリン（ＰＣ）には、卵、大豆もしくは他の植物源から得られるもの、または部分的もしくは完全に合成されるもの、または脂質鎖長および不飽和の可変性のものが含まれ、本組成物における使用に適している。合成、半合成および天然産物のホスファチジルコリンには、限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（大豆ＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、水素化卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）が含まれ、本開示における使用に適したホスファチジルコリンである。荷電リン脂質には、ホスファチジルセリン、ホスファチジル酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、またはＮ－スクシニル－ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリル－ホスファチジルエタノールアミン、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミンなどの頭部修飾された脂質が含まれ得る。
ポリマーコンジュゲートされた脂質は、ポリ（エチレングリコール）コンジュゲートされた（ペグ化された）リン脂質（ＰＥＧ－脂質）、例えば、ＰＥＧ（分子量２，０００）メトキシ－ポリ（エチレングリコール）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール（ＰＥＧ（２０００）－ジステアロイルグリセロール、ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ（分子量２，０００）１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ（分子量２，０００）－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはＰＥＧ（分子量２，０００）Ｎ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］｝（ＰＥＧ－セラミド）を含み得る。ＰＥＧ－脂質成分中のＰＥＧ部分の分子量はまた、５００～１０，０００ｇ／ｍｏｌ、１，５００～６０００ｇ／ｍｏｌの範囲で変化し得るが、好ましくは約２，０００ＭＷである。脂質アンカーへのコンジュゲーションに使用される他のポリマーは、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）（ＰＭＯＺ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリ－Ｎ－ビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリグリセロール、ポリ（ヒドロキシエチルＬ－アスパラギン）（ＰＨＥＡ）、およびポリ（ヒドロキシエチルＬ－グルタミン）（ＰＨＥＧ）を含み得る。
一部の実施形態では、ステロールはコレステロールである。他の例示的なステロールとしては、限定されないが、エルゴステロール、β－シトステロールなどのフィトステロール、およびホパノイドが挙げられる。一部の実施形態では、リン脂質（複数可）とコレステロールの比は、リポソームからの式Ｉの化合物の漏出の十分に減少した量を維持しながら、所望の量のリポソーム膜剛性を提供するように選択される。一部の実施形態では、任意選択のポリマーコンジュゲートされた脂質を添加して、リポソームが凝集する傾向を減少させることができる。ポリマーコンジュゲートされた脂質の種類および量は、血流中の所望レベルのタンパク質結合、リポソーム安定性および循環時間を提供するように選択することができる。例えば、リポソーム小胞は、約４５：５５のモル比でホスファチジルコリン（例えば、ＤＳＰＣまたはＨＳＰＣ）とコレステロールを含む。ホスファチジルコリンとコレステロールのモル比は、約６０：４０～３５：６５、約５０：５０～３５：６５、約５０：５０～約４５：５５の範囲で変化し得る。特に、リポソームは、リン脂質の濃度に対して５モル％のＰＥＧ－脂質濃度に対応する、約５５：４５：２．７５のモル比で、ＨＳＰＣ、コレステロールおよびポリマーコンジュゲートされた脂質（ＰＥＧ－ＤＳＧまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥ）からなる小胞を含むことができる。ＰＥＧ－脂質の濃度は、（非ＰＥＧ化）リン脂質と比較して０．５～１０ｍｏｌ％の範囲で変化することができ、好ましい比は３～１０ｍｏｌ％であり、さらにより好ましい比は４～８ｍｏｌ％である。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、免疫能力のあるマウスにおける静脈内注射から６または２４時間後に、血中に残存する注射用量（ＩＤ）（または注射量）のパーセンテージとして測定される血漿半減期延長などの望ましい薬物動態学的特性を提供し、マウスにおけるｉｖ投与後の薬物と脂質比（ＤＬ比）の変化によって決定した場合、血漿中に２４時間にわたって薬物の安定なカプセル封入を可能にする。一部の実施形態では、血中に残存する薬物のパーセンテージは、６時間で注射用量の２０％を超え、好ましくは３０％を超え、最も好ましくは４０％を超える。２４時間後に血中に保持されるパーセントは、好ましくは、注射用量の１０％を超え、より好ましくは２０％を超える。ＤＬ比は、２４時間で２０％を超え、好ましくは、元の注射されたリポソーム薬物の５０％を超え、最も好ましくは８０％を超える。望ましいリポソーム組成物はまた、バースト放出法を用いると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト血漿の存在下で安定なカプセル封入を示し、リポソームは、２０分間にわたって５０％を超える薬物を保持し、２０分間にわたって、６０％を超える、７０％を超える、好ましくは８０％を超える、最も好ましくは９０％を超えるカプセル封入された薬物を保持する。
本開示のリポソームは、当該技術分野において公知である任意の方法によって作製することができる。例えば、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１－３，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８３； ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３； ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６； ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａを参照されたい。本開示のリポソーム組成物を作製するのに適した方法の例には、膜押出、逆相蒸発、超音波処理、溶媒（例えば、エタノール）注入（マイクロ流体、Ｙ接合およびＴ接合混合を含む）、マイクロ流動化、界面活性剤透析、エーテル注入、および脱水／再水和が含まれる。リポソームのサイズは、押出に使用される膜の孔径、またはマイクロ流動化または任意の他の適切な方法で使用される通過の圧力および数を制御することによって制御することができる。一部の実施形態では、所望の脂質は、最初に薄膜水和またはエタノール注入によって水和され、その後、５０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍ、または２００ｎｍ、またはその組合せなどの規定の孔径の膜を通して押し出すことによってサイズ調整され、７０～１５０ｎｍ、または８０～１３０ｎｍの範囲の平均サイズ、および０．１以下の多分散指数を有するリポソームを生成する。カプセル封入される薬物化合物は、リポソーム形成の前にリポソーム脂質に添加され、リポソームが上記の方法によって形成される水性媒体に溶解され、それによって薬物がリポソーム内に隔離される。一部の実施形態では、薬物化合物は、リポソームの内部空間に組み込まれた捕捉剤を用いて、リポソームにカプセル封入される（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｄ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．）Ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．１４９－１６８を参照されたい）。
一部の実施形態では、本開示のリポソーム組成物を作製する方法は、（ｉ）リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ－脂質を含み、捕捉剤を実質的に含まない媒体中に捕捉剤を含む内部空間を有するリポソームを調製するステップと、（ｉｉ）リポソーム中の化合物をカプセル封入するために、水性媒体中で本開示の化合物と上記リポソームを接触させるステップと、（ｉｉｉ）カプセル封入されていない化合物を除去するステップと、（ｉｖ）非経口使用に適した生理学的に許容される媒体中のリポソームを提供するステップとを含む。一部の実施形態では、リポソームをその中で化合物とともに生成する方法は、（ａ）アンモニウムまたはポリアニオンの置換アンモニウム塩からなる捕捉剤を含有するリポソームを調製するステップと、（ｂ）続いて、膜を横切る電気化学的勾配を形成するためにリポソーム外の捕捉剤を除去するステップと、（ｃ）化合物がリポソームに入り、対応する量のアンモニアまたは置換アンモニアをリポソームから離れることを可能にするのに有効な条件下で、リポソームを化合物と接触させるステップ（それによって、得られるリポソームを横切るｐＨ勾配を消耗または減少させる）とを含む。リポソームの内部に捕捉剤を含有するリポソーム組成物は、捕捉剤の溶液中でリポソームを形成することによって製造することができる。捕捉剤の膜貫通濃度勾配は、リポソーム形成後または薬物の充填（捕捉）前のいずれかで、リポソームの外側の捕捉剤の除去またはリポソームの希釈によって、リポソームを横切って形成することができる。
一部の実施形態では、上記接触は、リポソームを、周囲温度より高く水の沸点より低い温度、好ましくは３０℃～９０℃、４０℃～８０℃、５０℃～８０℃、または６０℃～７５℃の温度で、水性媒体中で薬物とインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、インキュベーションは、５０ｍＭ ＮａＣｌに相当するイオン強度未満、またはより好ましくは、３０ｍＭ ＮａＣｌに相当するイオン強度未満のイオン強度で行われる。インキュベーション後、濃縮塩、例えば、ＮａＣｌ溶液を添加して、イオン強度を５０ｍＭ ＮａＣｌ、または約１００ｍＭ ＮａＣｌのそれよりも高くすることができる。薬物充填インキュベーションステップ後のイオン強度の増加は、リポソームの充填後の凝集の減少に役立った。インキュベーション時間は、数分から数時間の範囲であり得る。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、５～４０分、１０～３０分、または１５～２５分である。インキュベーション後、リポソームを冷却し、次いで周囲温度に到達させる。一部の実施形態では、リポソームを２～１５℃に冷却する。一部の実施形態では、リポソームを４～１０℃に冷却する。冷却ステップ後、濃縮塩、例えば、ＮａＣｌ、溶液を添加して、イオン強度を５０ｍＭ ＮａＣｌ、または約１００ｍＭ ＮａＣｌのそれよりも高くすることができる。薬物充填インキュベーションステップ後のイオン強度の増加は、リポソームの充填後の凝集の減少に役立った。
一部の実施形態では、上記接触はまた、浸透圧（等張）バランス剤の存在下での水性媒質中でのリポソームの薬物とのインキュベーションも含む。一部の実施形態では、浸透平衡剤（浸透剤）は、非イオン性物質である。例示的な非イオン性浸透剤としては、限定されないが、デキストロース（グルコース）、スクロース、トレハロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、およびポリビニルピロリドンが挙げられる。一部の実施形態では、浸透剤の濃度は、薬物充填の前に、リポソームの内部空間における捕捉剤溶液の浸透圧濃度と等しい浸透圧濃度（浸透圧（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）または浸透圧（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）として表される）を有する。捕捉剤溶液の浸透圧濃度は、溶液を脂質と組み合わせてリポソームを形成する前に、任意の公知の方法によって測定することができる。別の実施形態では、浸透剤の濃度は、捕捉剤溶液の浸透圧濃度よりも低く、捕捉剤溶液の浸透圧濃度の約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、または約１０％未満である浸透圧濃度を提供する。さらに別の実施形態では、薬物充填プロセス中の浸透剤の濃度は、２００～４００ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは２５０～３５０ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲である。さらに別の実施形態では、浸透剤はデキストロースであり、濃度は４５ｇ／Ｌである。さらに別の実施形態では、浸透剤は、リポソームと薬物とのインキュベーション中に使用されない。さらに別の実施形態では、上記インキュベーションは、イオン強度調整剤の存在下で実施される。イオン強度調整剤の例は、塩化ナトリウムであり、例えば５～５０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、または約１０ｍＭの濃度でリポソーム－薬物溶液に添加される。リポソームの分野における慣例に反して、本開示の化合物、例えば、ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８は、薬物－リポソーム接触ステップ中に、浸透剤の量が、添加された浸透剤が完全に不在となるまで、捕捉剤溶液（浸透圧的に不均衡なリポソーム）の浸透濃度よりも低い浸透濃度を提供する場合であっても、安定であり、非常に効率的な方法で、本開示のリポソームに充填される。
使用方法
本明細書には、結核菌などのマイコバクテリア、またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）などのグラム陽性細菌の増殖を阻害する方法が開示される。追加のマイコバクテリアおよびグラム陽性細菌には、限定されないが、トリ型結核菌複合体、ハンセン菌、マイコバクテリウム・ゴルドナエ、マイコバクテリウム・アブセッサス、マイコバクテリウム・ムコゲニカム、連鎖球菌、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、肺炎ブドウ球菌、エンテロコッカス・フェシウム、Ｂ群連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、緑色連鎖球菌、リステリア・モノサイトゲネス、ノカルジア菌、およびコリネバクテリア属が含まれる。一部の実施形態では、本明細書において提供される化合物および組成物は、結核菌の薬物耐性株の増殖を阻害する。一部の実施形態では、マイコバクテリア感染を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、本明細書において提供される化合物および組成物は、非結核性マイコバクテリア感染を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本方法は、本開示のアミノアルキルオキサゾリジノンおよび／またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、本開示のアミノアルキルオキサゾリジノン化合物および／またはその薬学的に許容される塩を含む治療有効量のリポソーム組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一部の実施形態では、組成物は、非経口投与のための液体医薬製剤である。一部の実施形態では、液体医薬製剤は、本明細書に記載される適切な量のオキサゾリジノン化合物を含有するリポソーム製剤であり、オキサゾリジノン化合物はリポソームの内部にカプセル封入される。別の実施形態では、その化合物は、硫酸塩、クエン酸塩、八硫酸スクロース、六リン酸イノシトールなどのポリアニオンとリポソームの内部で塩の形態である。一部の実施形態では、化合物は、限定されないが、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびペグ化ホスファチジルエタノールアミンを含む、複数の脂質賦形剤からなるリポソーム内に硫酸塩を含む沈殿したまたはゲル化した塩である。本開示のリポソームは、８５％を超える、９０％を超える、および９５％を超える捕捉効率を示す。一部の実施形態では、捕捉されていない薬物の残存量は、リポソーム組成物から除去される。これは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換、透析、限外濾過、接線流濾過、吸着、または沈殿などの種々の手段によって達成することができる。捕捉されていない薬物除去ステップの間または後に、リポソームを、所望の薬学的に許容される担体、例えば、生理食塩水、等張デキストロース、等張スクロース、リンゲル溶液、またはハンクス溶液に取り込むことができる。緩衝物質を添加して、所望の生理学的に許容されるｐＨを得ることができる。リポソーム組成物は、所望の薬物濃度に合わせて調節され得、例えば、０．２～０．２２μｍフィルターを介して無菌濾過によって滅菌され得る。一部の実施形態では、リポソーム組成物中の化合物濃度は、１～５０ｍｇ／ｍｌ、３～３０ｍｇ／ｍｌ、または５～２５ｍｇ／ｍｌの範囲である。
一部の実施形態では、リポソームは、等張性またはｐＨ制御のための１種または複数の追加の賦形剤と混合される。一部の実施形態では、賦形剤は、限定されないが、塩化ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リン酸緩衝液、およびヒスチジン緩衝液を含む。
他の実施形態では、組成物は経口製剤である。一部の実施形態では、組成物は、液体製剤である。一部の実施形態では、組成物は、固体製剤（例えば、錠剤、カプセル、丸剤、糖衣錠、カプレットなど）である。経口使用に用いる場合、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、乳濁液、硬質または軟質カプセル、シロップまたはエリキシルを調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．））。経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造のために当該技術分野において公知である任意の方法に従って調製することができる。組成物は、口当たりの良い調製物を提供するために、酸化防止剤、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤などの１種または複数の薬剤を含有することができる。錠剤の製造に適している非毒性の薬学的に許容される賦形剤または補助剤と混合した活性成分を含有する錠剤は許容される。適切な賦形剤または補助剤には、限定されないが、例えば、不活性希釈剤、可溶化剤、懸濁化剤、アジュバント、湿潤剤、甘味剤、香料または香味物質、等張物質、コロイド分散剤および界面活性剤が含まれる。
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、顆粒、座薬、溶液、懸濁液および乳濁液、ペースト、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、粉末およびスプレーは、適切な医薬組成物であり得る。
化合物または組成物は、局所的に、経口的に、非経口的に、腹腔内に、および／または直腸に投与することができる。
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、１または複数の用量を経時的に投与することができ、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減量または増量することができる。
化合物および／もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物および／もしくはそれらの薬学的に許容される塩を含むリポソームの投薬量は、広い範囲内で変化することができ、各々の特定の場合には、個々の状態におよび制御されるべき病原体に自然に調節されるべきである。
一部の実施形態では、細菌感染症の処置における使用のために、化合物または医薬リポソーム組成物は、７日毎に１回（すなわち、毎週１回）、１４日毎に１回（すなわち、２週間毎に１回）、２１日毎に１回（すなわち、３週間毎に１回）、２８日毎に１回（すなわち、４週間毎に１回）、４２日毎に１回（すなわち、６週間毎に１回）、それを必要とする対象に投与される。一部の実施形態では、平均週投薬量は、約１ｍｇ～約１５００ｍｇ、約１０～約７００ｍｇ、約２５～約５００ｍｇ、または約７０～約２５０ｍｇである。一部の実施形態では、平均週投薬量は、約１ｍｇ～約１０ｍｇ、約１０ｍｇ～約２５ｍｇ、約２５ｍｇ～約５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ、約１００ｍｇ～約２００ｍｇ、約２００ｍｇ～約３００ｍｇ、約３００ｍｇ～約４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約５００ｍｇ、約５００ｍｇ～約６００ｍｇ、約６００ｍｇ～約７００ｍｇ、約７００ｍｇ～約８００ｍｇ、約８００ｍｇ～約９００ｍｇ、約９００ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１０００ｍｇ～約１１００ｍｇ、約１１００ｍｇ～約１２００ｍｇ、約１２００ｍｇ～約１３００ｍｇ、約１３００ｍｇ～約１４００ｍｇ、約１４００ｍｇ～約１５００ｍｇである。一部の実施形態では、化合物または組成物は、最大１カ月、最大２カ月、最大３カ月、最大４カ月またはそれ以上投与される。特定の治療有効量は、様々な因子、例えば、処置される細菌感染、投与される特定の化合物の活性、採用される医薬組成物、対象の年齢、体重、性別など、投与経路、細菌感染の重症度、特定の化合物と組み合わせて（連続的にまたは同時に）使用される任意選択の薬物／活性剤、および当業者の医師に公知である同様の因子に依存する。一部の実施形態では、化合物または組成物は、結核または他のマイコバクテリウム感染の処置に使用することができる。一部の実施形態では、化合物は、単剤療法として使用することができる。一部の実施形態では、処置は、本明細書に記載される有効量の化合物と、結核菌および他のグラム陽性細菌感染を処置するための有効量の１種または複数の追加の活性剤とを同時におよび／または連続的に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、処置は、本明細書に記載される有効量の化合物と、結核菌および他のグラム陽性細菌感染を処置するための有効量の２種または以上の追加の活性剤（２、３、４種など）を同時におよび／または連続的に投与することを含むことができる。相乗的な抗菌効果は、組合せの個々の化合物の予測される純粋な相加効果よりも大きい抗菌効果を意味する。同時に投与される場合、化合物および活性剤は、同じ組成物中または別々の組成物中に含有され得る。連続的に投与する場合、化合物を含む組成物および追加の活性剤を含む組成物は、時間分離（例えば、２０分、４０分、６０分またはそれ以上）で投与することができる。一部の実施形態では、追加の活性剤は、異なる投与経路を使用して、または異なる注射によって投与することができる。例えば、本開示の化合物は静脈内投与することができ、１種または複数の追加の薬剤を経口投与することができる。
一部の実施形態では、１種または複数（例えば、１、２、３または４種）の追加の活性剤との化合物の投与は、処置期間の長さの減少をもたらすことができる。例えば、１種または複数（例えば、１、２、３または４種）の追加の活性剤との化合物の投与は、１種の活性剤のみによる処置と比較して、処置期間を少なくとも３倍、少なくとも２倍、少なくとも１．５倍短くすることができる。一部の実施形態では、追加の薬剤（複数可）は、抗細菌剤である。一部の実施形態では、追加の活性剤には、限定されないが、フルオロキノリン、例えば、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、またはレボフロキサシン、ベダキリンおよび他のジアリールキノリン類似体（例えば、ＴＢＡＪ－５８７およびＴＢＡＪ－８７６）、デラマニド、プレトマニド、イソニアジド、リファンピシン、リファペンチン、ピラジンアミド、クロファジミン、スペクチンアミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、カナマイシン、カプレオマイシン、アミカシン、ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ＬｅｕＲＳ）阻害剤ＧＳＫ３０３６６５６、トリプトファンシンターゼ阻害剤ＧＳＫ８３９、ＤｐｒＥ１阻害剤ＯＰＣ－１６７８３２およびマコジノン（ＰＢＴＺ－１６９）、Ｔｅｌａｃｅｂｅｃ、ＧＳＫ－６５６、ＴＢＡ－７３７１、ならびにアモキシシリン＋クラブラン酸塩、それらの各々の薬学的に許容される塩、およびそれらの任意の組合せを含むことができる。グラム陽性細菌感染症の処置のために、追加の活性剤には、限定されないが、バンコマイシン、ゲンタマイシン、ダプトマイシン、テイコプラニン、セフタロリン、セフトロビプロール、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、フルオロキノリン（例えば、デラフロキサシン）、テトラサイクリン（例えば、エラバサイクリンおよびオマダサイクリン）、スルホンアミド（例えば、スルファメトキサゾール）、トリメトロプリム、レファムリン、およびそれらの任意の組合せが含まれ得る。一部の実施形態では、処置は、本明細書に記載される有効量の化合物、および有効量のベダキリン、プレトマニド、ピラジンアミド、モキシフロキサシン、もしくはそれらの各々の薬学的に許容される塩、または前述のものの組合せを同時におよび／または連続的に投与することを含むことができる。
本明細書に開示される医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性を示すことなしに、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化させることができる。
投与の文脈において本明細書で使用される「非経口」とは、通常は注射による経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入が含まれる。
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口投与された」という語句は、通常は注射または注入による経腸（すなわち、消化管を介した）および局所投与以外の投与様式を指し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、吸入、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入が含まれる。リポソーム薬物投与には、しばしば（ただし、それだけではない）静脈内注射および注入が用いられる。
一部の実施形態では、液体組成物は、静脈内注射される。一部の実施形態では、化合物または医薬組成物は、７日毎に１回（すなわち、毎週１回）、１４日毎に１回（すなわち、２週間毎に１回）、２１日毎に１回（すなわち、３週間毎に１回）、２８日毎に１回（すなわち、４週間毎に１回）、および４２日毎に１回（すなわち、６週間毎に１回）、それを必要とする対象に投与される。一部の実施形態では、平均週投与量は、約１ｍｇ～約１５００ｍｇ、約１０～約７００ｍｇ、約２５～約５００ｍｇ、または約７０～約２５０ｍｇである。一部の実施形態では、平均週投与量は、約１ｍｇ～約１０ｍｇ、約１０ｍｇ～約２５ｍｇ、約２５ｍｇ～約５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ、約１００ｍｇ～約２００ｍｇ、約２００ｍｇ～約３００ｍｇ、約３００ｍｇ～約４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約５００ｍｇ、約５００ｍｇ～約６００ｍｇ、約６００ｍｇ～約７００ｍｇ、約７００ｍｇ～約８００ｍｇ、約８００ｍｇ～約９００ｍｇ、約９００ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１０００ｍｇ～約１１００ｍｇ、約１１００ｍｇ～約１２００ｍｇ、約１２００ｍｇ～約１３００ｍｇ、約１３００ｍｇ～約１４００ｍｇ、約１４００ｍｇ～約１５００ｍｇである。特定の治療有効量は、様々な因子、例えば、処置される細菌感染、投与される特定の化合物の活性、採用される医薬組成物、対象の年齢、体重、性別など、投与経路、細菌感染の重症度、特定の化合物と組み合わせて（連続的にまたは同時に）使用される任意選択の薬物／活性剤、および当業者の医師に公知である同様の因子に依存する。
一部の実施形態では、細菌感染の処置における使用のために、化合物または医薬経口組成物を１日１回または２回投与する。特定の治療有効量は、様々な因子、例えば、処置される細菌感染、投与される特定の化合物の活性、採用される医薬組成物、対象の年齢、体重、性別など、投与経路、細菌感染の重症度、特定の化合物と組み合わせて（連続的にまたは同時に）使用される任意選択の薬物／活性剤、および当業者の医師に公知である同様の因子に依存する。
行われた実験および達成された結果を含む、以下の実施例は、例示目的でのみ提供され、本開示を限定すると解釈されるべきではない。
［実施例１］
オキサゾリジノン誘導体の合成
化合物ＡＫＧ－１、ＡＫＧ－２、ＡＫＧ－６、ＡＫＧ－８、ＡＫＧ－９およびＡＫＧ－１９を、溶媒としてのＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）中、６０℃でメシル酸テジゾリド（テジゾリド－ＭＳ）と、それぞれのアミンとを反応させることによって合成した（スキーム１）。室温（ＲＴ）で塩基の存在下、メタンスルホニルクロリドを用いたテジゾリドの１°ヒドロキシル基のメシル化によって、テジゾリド－ＭＳを得た。テジゾリド－ＭＳをアジ化ナトリウムで処理した後、得られたアジド（ＡＫＧ－３－Ａ）を還元したところ、精製のために選択された溶離液に応じて、遊離塩基としての中間体１または塩酸塩としてのＡＫＧ－３が得られた。中間体１の対応する酸によるアミド化、次いで、ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃを使用する塩酸塩形成により、化合物ＡＫＧ－１７およびＡＫＧ－１８が得られた。標準的なエステル化条件下でテジゾリドと対応するジアルキルアミノ酸とを反応させたところ、化合物ＡＫＧ－５およびＡＫＧ－２０が得られた。塩基として水素化ナトリウムを使用する２－クロロ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルアミンによるテジゾリドのＯ－アルキル化により、化合物ＡＫＧ－７が得られた。
中間体２を、ビス（ピノコラト）ジボロンを使用する市販のアリールブロミドのホウ素化によって合成した（スキーム２）。容易に入手可能な５－ブロモ－２－フルオロピリジンによる中間体２の鈴木カップリングにより、中間体３が得られ、これを対応するアミンとともに密閉されたチューブ中、ＮＭＰ中で加熱したところ、化合物ＡＫＧ－１１～ＡＫＧ－１５が得られた。
化合物ＡＫＧ－１６、ＡＫＧ－２１～ＡＫＧ－２７を、中間体４から出発する収束合成において調製した（スキーム３および４）。５－ブロモ－２－シアノピリジン上でのアジ化ナトリウムを使用するクリック化学により、中間体４が得られた。中間体４におけるテトラゾールのＮ－アルキル化により、３：１の比の中間体５および６が得られた。これらの中間体の構造を、ＨＭＢＣ分析から推定した。中間体７～１２を合成し、位置異性体を同様の様式で得た（所望の異性体のみがスキーム４中に示される）。中間体２を用いた中間体５～１２の鈴木カップリングおよび適用可能な場合、アミン基の脱保護により、化合物ＡＫＧ－１６、ＡＫＧ－２１～ＡＫＧ－２７が得られた。
容易に入手可能なアリールブロミドのメシル化によって、中間体１３を合成した。中間体１４をヒドラジンで還元することによって、中間体１５を得た（スキーム５）。中間体１５中の第１級アミンのＢｏｃ保護またはアセチル化、次いで、ホウ素化によって、それぞれ、中間体１８および１９が得られた。対応するアリールブロミド中間体を用いたボロン酸中間体の鈴木カップリング（全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許出願公開第２０１０００２２７７２号、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２０１３０４４８４５号）および適用可能な場合、アミン基の脱保護により、化合物ＡＫＧ－２８～ＡＫＧ－３１およびＡＫＧ－３８～ＡＫＧ－４０が得られた。
合成スキーム
中間体１９の合成については、その全体が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許出願公開第２０１０００２２７７２号、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２０１３０４４８４５号を参照されたい。
合成
材料および方法
テジゾリド、（Ｒ）－３－（４－ブロモ－３－フルオロフェニル）－５－（ヒドロキシメチル）オキサゾリジン－２－オンを、Ｓｋｙｃｈｅｍｉｃａｌから購入し、ジメチル－（２－ピペリジン－４－イル－エチル）－アミンを、Ｅｎａｍｉｎｅから購入し、他の試薬および溶媒を、Ａｄａｍｓから購入し、受領した通り使用した。最終生成物の化学構造を、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ分光計（５００ＭＨｚまたは４００ＭＨｚ）上で決定された核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ）によって特徴付けた。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを完全に分離させた。化学シフトは、重水素化溶媒ピークまたは内部標準としてのテトラメチルシラン（内部）を使用して１００万分の１（ｐｐｍ）で表した。１Ｈ ＮＭＲに関するデータは、以下のように記録される：化学シフト（ｄ、ｐｐｍ）、多重度（ｓ、シングレット；ｂｒ ｓ、ブロードシングレット；ｄ、ダブレット；ｔ、トリプレット；ｍ、マルチプレット）、積分値、カップリング定数（Ｈｚ）。１３Ｃ ＮＭＲに関するデータは、化学シフト（ｄ、ｐｐｍ）を単位として記録される。
最終生成物の純度（９５％以上）を、分析的ＨＰＬＣによって確認した。分析的ＨＰＬＣを、Ｓｕｎｆｉｒｅカラム、３．５μｍ（１５０ｃｍ×４．６ｍｍ）および勾配システム（水（０．０１％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０１％ＴＦＡ））および１ｍＬ／分の流速を使用するＡｇｉｌｅｎｔ分析的ＨＰＬＣシステム上で実施し、２５４および２１４ｎｍで検出した。フラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）精製を、Ｓａｎｔａｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのシリカゲル６０（０．０４～０．０６３ｎｍ；２３０～４００メッシュ）を用いて実施した。
手順Ａ。ＮＭＰ（１０ｍＬ）中のテジゾリド－ＭＳ（１．０当量）、Ｒ１Ｒ２ＮＨ（４．０当量）の反応混合物を、密閉チューブ中、６０℃に１５時間加熱した。完了時に（ＬＣＭＳ）、反応物をＨ２Ｏ（４０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、ＦＣを使用して精製したところ、９５％を超える純度の生成物が得られた。
１．テジゾリド－Ｍｓの合成
０℃のＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中のテジゾリド（７．００ｇ、１８．９０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．８３ｇ、３７．８０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ａｒ下、０℃でメタンスルホニルクロリド（３．２５ｇ、２８．３６ｍｍｏｌ）を滴下添加した。ＲＴで２時間撹拌した後、反応混合物を水中に注ぎ入れ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過によって収集した。溶媒を減圧下で除去したところ、黄色の固体として純粋な生成物テジゾリド－Ｍｓ（７．０ｇ、８２．６％収率）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.95 (s, 1H), 8.31 - 8.14 (m, 2H), 7.88 - 7.65 (m, 2H), 7.53 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.14 - 4.96 (m, 1H), 4.59 - 4.39 (m, 5H), 4.28 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 9.2, 6.3 Hz, 1H), 3.28 (s, 3H). MS (ESI+) m/z 449.1 ([M + 1]+).
２．ＡＫＧ－１、２、６、８、９および１９の合成
手順Ａを使用して、テジゾリド－Ｍｓおよびジメチルアミンから白色の固体（０．５ｇ、５６．４％収率）としてＡＫＧ－１を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.94 (s, 1H), 8.32 - 8.13 (m, 2H), 7.83 - 7.64 (m, 2H), 7.54 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.87 (s, 1H), 4.49 (s, 3H), 4.21 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 3.84 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 2.62 (s, 2H), 2.25 (s, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 164.3, 161.0, 158.6, 154.6, 149.9, 145.5, 140.9, 137.6, 132.1, 131.4, 122.6, 119.1, 114.6, 106.0, 72.0, 62.1, 48.7, 46.4, 40.2. MS (ESI+) m/z 398.2 ([M + 1]+).
手順Ａを使用して、テジゾリド－Ｍｓおよびジメチルアミンから白色の固体（０．５２ｇ、５４．８％収率）としてＡＫＧ－２を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 8.94 (s, 1H), 8.29 - 8.11 (m, 2H), 7.81 - 7.65 (m, 2H), 7.52 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H), 4.89 - 4.73 (m, 1H), 4.49 (s, 3H), 4.19 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 8.7, 7.0 Hz, 1H), 2.75 (dd, J = 5.1, 3.7 Hz, 2H), 2.57 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 0.97 (t, J = 7.1 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 164.3, 161.0, 158.6, 154.7, 149.9, 145.5, 141.0, 137.6, 132.1, 131.3, 122.5, 119.1, 114.6, 106.1, 72.6, 56.1, 48.6, 47.7, 40.3, 12.3. MS (ESI+) m/z 426.3 ([M + 1]+).
手順Ａを使用して、テジゾリド－ＭｓおよびＮ，Ｎ－ジメチル－２－（ピペリジン－４－イル）エタン－１－アミンから白色の固体（０．６６ｇ、５８．２％収率）としてＡＫＧ－６を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.93 (s, 1H), 8.30 (dd, J = 8.1, 2.4 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 7.56 - 7.47 (m, 1H), 7.45 - 7.37 (m, 1H), 4.89 - 4.74 (m, 1H), 4.48 (s, 3H), 4.11 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 3.86 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 2.93 (dd, J = 28.8, 10.9 Hz, 2H), 2.80 - 2.64 (m, 2H), 2.50 - 2.04 (m, 11H), 1.69 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 1.48 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 1.37 - 1.19 (m, 4H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 164.7 , 161.3, 158.8 , 154.3 , 149.9 , 145.4 , 140.2 , 137.0, 132.3 , 130.5 , 122.0, 120.0 , 113.8 , 106.4, 71.5 , 61.4 , 57.0 , 55.3 , 54.3 , 48.9 , 45.0 , 39.7 , 33.6 , 32.4. MS (ESI+) m/z 509.2 ([M + 1]+).
手順Ａを使用して、テジゾリド－ＭｓおよびＮ１，Ｎ１－ジエチルプロパン－１，３－ジアミンから白色の固体（０．６２ｇ、５７．６％収率）としてＡＫＧ－８を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.94 (s, 1H), 8.34 - 8.11 (m, 2H), 7.84 - 7.59 (m, 2H), 7.52 (dd, J = 8.6, 2.0 Hz, 1H), 4.80 (dd, J = 8.3, 5.7 Hz, 1H), 4.49 (s, 3H), 4.18 (t, J = 8.9 Hz, 1H), 3.90 (dd, J = 8.8, 6.5 Hz, 1H), 2.94 - 2.77 (m, 2H), 2.66 - 2.53 (m, 7H), 1.65 - 1.51 (m, 2H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 164.3, 161.0, 158.6, 154.6, 149.9, 145.5, 141.0, 137.6, 132.1, 131.4, 122.6, 119.1, 114.6, 106.1, 73.2, 52.1, 50.7, 48.2, 48.0, 46.7, 40.3, 26.4, 11.4. m/z 483.2 ([M + 1]+).
手順Ａを使用して、テジゾリド－ＭｓおよびＮ１，Ｎ１－ジエチルエタン－１，２－ジアミンから白色の固体（０．３６ｇ、３４．４％収率）としてＡＫＧ－９を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.94 (s, 1H), 8.26 - 8.16 (m, 2H), 7.78 - 7.66 (m, 2H), 7.53 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.85 - 4.73 (m, 1H), 4.49 (s, 3H), 4.18 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.90 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 2.88 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.65 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 0.95 (t, J = 7.0 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 164.3, 161.0, 158.6, 154.7, 149.9, 145.5, 141.0, 137.6, 132.1, 131.4, 122.6, 119.1, 114.6, 106.1, 73.3, 52.6, 52.2, 48.1, 47.6, 47.1, 40.3, 12.0. m/z 469.3 ([M + 1]+).
手順Ａを使用して、テジゾリド－Ｍｓおよびエタン－１，２－ジアミンから白色の固体（０．６０ｇ、５５％収率）としてＡＫＧ－１９を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.33 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.58 (s, 3H), 8.23 (q, J = 8.3 Hz, 2H), 7.79 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.25 - 5.19 (m, 1H), 4.49 (s, 3H), 4.33 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 9.1, 6.7 Hz, 1H), 3.52 (s, 2H), 3.43 - 3.23 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 164.26, 160.94, 158.50, 153.79, 149.84, 145.51, 140.58, 137.78, 132.04, 131.42, 122.61, 119.50, 114.94, 106.46, 69.38, 49.59, 47.87, 45.16, 40.34, 35.58.
３．ＡＫＧ－３の合成
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のテジゾリド－Ｍｓ（１．００ｇ、２．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＮ３（０．４４ｇ、６．６９ｍｍｏｌ）を添加した。９０℃で３時間撹拌した後、反応混合物を水中に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによってさらに精製したところ、白色の固体として表題の化合物ＡＫＧ－３－１（０．７ｇ、７９．４％収率）が得られた。
Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＡＫＧ－３－１（０．７ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）およびＰｈ３Ｐ（１．３９ｇ、５．３１ｍｍｏｌ）の反応混合物を、１時間加熱還流した。（ＬＣＭＳ）の完了後、反応物を減圧下で濃縮し、逆相ＦＣを使用して精製した。溶離液としてＤＣＭ中のＭｅＯＨ ０～１０％を使用して精製し、凍結乾燥したところ、黄色の固体として遊離塩基である中間体１（２．５ｇ、７６．５％収率）が得られたが、溶離液としてＨ２Ｏ中の０．００６Ｍ ＨＣｌ中のＭｅＣＮ／０～３０％を用いるＦＣ精製を行ったところ、凍結乾燥後に黄色の固体として塩酸塩であるＡＫＧ－３（０．３５ｇ、４８．８％収率）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.95 (s, 1H), 8.61 (s, 3H), 8.28 - 8.18 (m, 2H), 7.79 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (dd, J= 13.5, 2.1 Hz, 1H), 7.48 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 5.13 - 5.00 (m, 1H), 4.49 (s, 3H), 4.29 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.02 (dd, J = 9.3, 6.6 Hz, 1H), 3.34 - 3.23 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 163.8, 160.4, 158.0, 153.4, 149.4, 145.1, 140.2, 137.2, 131.5, 130.9, 122.1, 118.9, 114.3, 105.9, 69.8, 47.1, 41.4, 39.8. m/z 370.3 ([M -HCl + 1]+).
４．ＡＫＧ－１７の合成
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸（０．６２ｇ、３．２５ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＴＥＡ（０．６３ｇ、６．２５ｍｍｏｌ、２．５当量）の溶液に、Ａｒ下、ＲＴでＨＡＴＵ（１．４４ｇ、３．７８ｍｍｏｌ、１．４当量）を添加した。混合物を０．５時間撹拌した後、中間体１（１．０ｇ、２．７０ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。全混合物をＲＴで一晩撹拌した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示され、それをＨ２Ｏ中に注ぎ入れ、固体を濾過によって収集し、Ｈ２Ｏで洗浄した。固体を減圧下で乾燥し、残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解することによって、それを次のステップにおいて使用した後、ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（４Ｍ、２０ｍＬ）を添加した。全混合物を１６時間撹拌し、溶媒をＮ２によって除去した。残渣を逆相ＦＣ（Ｈ２Ｏ中の０．００６Ｍ ＨＣｌ中のＭｅＣＮ／０～３０％を用いる溶離液）によって精製したところ、凍結乾燥後に黄色の固体として生成物ＡＫＧ－１７（０．５ｇ、３９．５％収率）が得られた。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ8.95 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.23 (q, J= 8.3 Hz, 2H), 8.14 (s, 3H), 7.77 (t, J= 8.6 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.87 - 4.78 (m, 1H), 4.49 (s, 3H), 4.22 (t, J= 9.0 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 9.0, 6.5 Hz, 1H), 3.50 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.98 (dd, J = 12.5, 6.4 Hz, 2H), 2.58 (t, J = 7.1 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170.60, 164.22, 160.97, 158.53, 154.42, 149.78, 145.42, 140.89, 137.79, 132.11, 131.41, 122.61, 119.19, 114.72, 106.23, 105.95, 72.13, 47.77, 40.33, 35.58, 32.58.
５．ＡＫＧ－１８の合成
ＡＫＧ－１７の手順を使用して、中間体１および４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブタン酸から黄色の固体（０．５ｇ、３７．６％収率）としてＡＫＧ－１８を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ8.95 (s, 1H), 8.52 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.29 - 8.08 (m, 5H), 7.77 (t, J= 8.8 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.87 - 4.76 (m, 1H), 4.50 (s, 3H), 4.22 (t, J= 9.0 Hz, 1H), 3.93 - 3.83 (m, 1H), 3.49 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.83 - 2.72 (m, 2H), 2.28 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.88 - 1.75 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 172.59, 164.23, 160.96, 158.52, 154.44, 149.00, 145.39, 140.88, 137.78, 132.10, 131.40, 122.61, 119.17, 114.70, 106.21, 72.17, 47.78, 41.88, 40.37, 38.78, 32.44, 23.60.
６．ＡＫＧ－５の合成
テジゾリド（１．０ｇ、２．７０ｍｍｏｌ）、４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩化水素（０．５７ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．２７ｇ、２．７０ｍｍｏｌ）の混合物に、Ｎ２下でＤＭＦ（２０ｍＬ）中の触媒量のＤＭＡＰ、ＤＣＣ（０．８４ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＲＴで１６時間撹拌した。反応（ＬＣＭＳ）の完了時に、それをＨ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、濾過した。濾液を０．０２Ｍ ＨＣｌでｐＨ＝５～６に酸性化した後、ＲＰ－ＦＣ（０．５％ギ酸／Ｈ２Ｏ中のＭｅＣＮを用いる溶離液）を使用して精製したところ、凍結乾燥後、ギ酸塩として生成物ＡＫＧ－５が得られた。生成物をＨ２Ｏ中に再溶解し、１当量の水性ＨＣｌ（０．０２Ｍ）を添加した。生成物を凍結乾燥したところ、ＨＣｌ塩としてＡＫＧ－５が得られた（６００ｍｇ、４２．７％収率）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.40 (br, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.23 (q, J= 8.5 Hz, 2H), 7.78 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 13.6, 2.1 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 5.03 (dd, J = 5.6, 3.1 Hz, 1H), 4.48 (s, 3H), 4.36 (qd, J = 12.4, 4.2 Hz, 2H), 4.26 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.95 (dd, J = 9.2, 6.2 Hz, 1H), 2.99 - 2.86 (m, 2H), 2.64 (s, 6H), 2.45 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.87 (m, 2H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 172.3, 164.3, 158.8, 154.3, 149.9, 145.6, 140.8, 137.7, 132.0, 131.5, 122.6, 119.4, 114.7, 106.2, 71.1, 64.8, 56.3, 46.7, 40.3, 30.9, 19.9. m/z 469.3 ([M + 1]+). m/z 484.1 ([M -HCl + 1]+).
７．ＡＫＧ－７の合成
テジゾリド（ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１．０ｇ、２．７０ｍｍｏｌ）の混合物に、Ｎ２下、ＲＴでＮａＨ（０．１３ｇ、６０％、５．４０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で０．５時間撹拌した後、２－ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩（９３０ｍｇ、５．４０ｍｍｏｌ）を一度に添加した。全混合物を、ＲＴで３時間撹拌した。ＬＣＭＳにより、反応の完了が示された。反応物を氷／Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）中に注意深く注ぎ入れ、ＤＣＭ（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を飽和ブラインで洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、ＦＣ（ＤＣＭ ０～１５％中のＭｅＯＨを用いる溶離液）を使用して残渣を精製したところ、白色の固体（０．５ｇ、３９．４％収率）としてＡＫＧ－７が得られた。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.93 (s, 1H), 8.30 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 7.53 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.88 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.48 (s, 3H), 4.34 - 4.26 (m, 1H), 4.18 - 4.08 (m, 2H), 4.00 - 3.93 (m, 1H), 3.87 (qd, J = 10.8, 2.9 Hz, 2H), 3.19 - 3.11 (m, 2H), 3.06 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.26 (t, J = 7.2 Hz, 6H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 164.7, 161.1, 159.1, 154.3, 149.8, 145.5, 140.0, 137.0, 132.2, 130.6, 122.0, 120.1, 113.8, 106.3, 71.3, 71.3, 66.9, 51.9, 48.2, 46.6, 39.7, 8.9. m/z 470.3([M + 1]+).
８．ＡＫＧ－２０の合成
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のテジゾリド（１．０ｇ、２．７０ｍｍｏｌ）、４－（ジエチルアミノ）ブタン酸塩化水素（０．６１ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０５ｇ）の反応混合物に、Ｎ２下、ＲＴでＤＣＣ（０．８４ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＲＴで１６時間撹拌した。完了時（ＬＣＭＳ）に、反応物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、濾過した。濾液を０．０２Ｍ ＨＣｌでｐＨ＝５～６に酸性化した後、ＲＰ－ＦＣ（０．５％ＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＭｅＣＮを用いる溶離液）を使用して精製したところ、凍結乾燥後、ギ酸塩として生成物が得られた。次いで、塩をＨ２Ｏ中に再溶解し、１当量のＨＣｌ（０．０２Ｍ）を添加し、凍結乾燥後、ＨＣｌ塩として生成物ＡＫＧ－２０が得られた（０．６１ｇ、４２％収率）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.94 (s, 1H), 8.28 - 8.14 (m, 2H), 7.82 - 7.66 (m, 2H), 7.53 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.11 - 4.97 (m, 1H), 4.49 (s, 3H), 4.43 - 4.33 (m, 2H), 4.27 (t, J= 9.3 Hz, 1H), 4.01 - 3.91 (m, 1H), 3.08 - 2.99 (m, 2H), 2.90 - 2.69 (m, 6H), 1.08 (t, J = 7.2 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 171.00, 164.33, 158.55, 154.32, 149.90, 145.58, 140.71, 137.63, 132.02, 131.45, 122.58, 119.33, 114.69, 106.21, 71.01, 65.04, 46.86, 46.63, 40.31, 29.99, 9.95(s).
９．中間体３の合成
ジオキサン（２００ｍＬ）中の（Ｒ）－３－（４－ブロモ－３－フルオロフェニル）－５－（ヒドロキシメチル）オキサゾリジン－２－オン（９．０ｇ、３１．０２ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（１１．８８ｇ、４６．５４ｍｍｏｌ）およびＫＯＡｃ（４．５６ｇ、４６．５４ｍｍｏｌ）の混合物を、Ａｒを用いて１０分間パージした後、（Ｐｈ３Ｐ）２ＰｄＣｌ２（１．０９ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＡｒで再度パージした後、それを９０℃に１５時間加熱した。ＬＣＭＳにより、反応の完了が示された。それを室温に冷却し、セライト上で濾過したところ、濾液として中間体２が得られた。濾液に、５－ブロモ－２－フルオロピリジン（６．５５ｇ、３７．２２ｍｍｏｌ）、Ｋ３ＰＯ４（１４．４７ｇ、６．８０ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（２０ｍＬ）を添加した。混合物をＡｒで１０分間パージし、（ｄｐｐｆ）ＰｄＣｌ２（２．２７ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＡｒで再度パージした。次いで、それを９０℃に１５時間加熱した。反応をＬＣＭＳによってモニタリングした。完了時に、それを減圧下で濃縮し、残渣をＨ２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ２００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ブラインで洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。濾過し、減圧下で溶媒を除去したところ、残渣が得られ、これをＦＣ（ＤＣＭ ０～１５％中のＭｅＯＨを用いる溶離液）を使用して精製したところ、黄色の固体として生成物である中間体３（６．８ｇ、２ステップについて７１．６％収率）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.43 (s, 1H), 8.23 - 8.14 (m, 1H), 7.72 - 7.61 (m, 2H), 7.49 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 8.6, 2.7 Hz, 1H), 5.27 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.80 - 4.71 (m, 1H), 4.15 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 3.90 (dd, J = 8.9, 6.1 Hz, 1H), 3.75 - 3.67 (m, 1H), 3.63 - 3.55 (m, 1H). MS (ESI+) m/z 307 ([M + 1]+).
１０．ＡＫＧ－１１、１２、１３、１４、１５の合成
手順Ｂを使用。ＮＭＰ（１０ｍＬ）中の中間体３（１．０当量）、Ｒ１Ｒ２ＮＨ（４．０当量）および触媒量のＤＭＡＰを、密閉チューブ中、１００℃に１６時間加熱した。反応の完了時に（ＬＣＭＳ）、それをＨ２Ｏ（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を飽和ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、ＲＰＦＣ（０．１％ＮＨ４ＨＣＯ３／Ｈ２Ｏ中のＭｅＣＮ、０～４０％、Ｃ１８を用いる溶離液）を使用して残渣を精製したところ、生成物が得られた。
手順Ｂを使用。中間体３およびＮ，Ｎ－ジメチル－２－（ピペリジン－４－イル）エタン－１－アミンから白色の固体（０．４０ｇ、３０．１％収率）としてＡＫＧ－１１を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.28 (s, 1H), 7.73 - 7.65 (m, 1H), 7.60 (dd, J = 13.6, 2.1 Hz, 1H), 7.54 (t, J= 8.9 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.25 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.78 - 4.68 (m, 1H), 4.33 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 4.12 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 8.9, 6.2 Hz, 1H), 3.74 - 3.64 (m, 1H), 3.62 - 3.52 (m, 1H), 2.87 - 2.71 (m, 2H), 2.23 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.11 (s, 6H), 1.72 (d, J = 11.5 Hz, 2H), 1.64 - 1.49 (m, 1H), 1.34 (dd, J = 14.3, 7.0 Hz, 2H), 1.18 - 1.04 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 160.68, 158.33, 154.81, 147.54, 139.15, 137.82, 130.32, 120.72, 119.11, 114.35, 106.97, 106.03, 105.74, 73.82, 62.09, 56.98, 46.45, 45.73, 45.39, 34.29, 34.15, 31.94.MS (ESI+) m/z 443.1 ([M + 1]+).
手順Ｂを使用。中間体３およびＮ１，Ｎ１－ジメチルエタン－１，２－ジアミンから白色の固体（０．５２ｇ、４２．６％収率）としてＡＫＧ－１２を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.16 (s, 1H), 7.64 - 7.46 (m, 3H), 7.39 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 6.58 (dd, J= 9.9, 5.6 Hz, 2H), 5.25 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.80 - 4.66 (m, 1H), 4.11 (t, J= 9.0 Hz, 1H), 3.86 (dd, J = 8.9, 6.2 Hz, 1H), 3.76 - 3.65 (m, 1H), 3.61 - 3.49 (m, 1H), 3.37 (dd, J = 12.3, 6.5 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.18 (s, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 160.60, 158.48, 158.19, 154.82, 147.57, 138.92, 137.10, 130.22, 121.18, 118.53, 114.30, 108.37, 106.02, 105.74, 73.81, 62.10, 58.76, 46.45, 45.76, 39.21. MS (ESI+) m/z 375.1 ([M + 1]+).
手順Ｂを使用。中間体３およびＮ１，Ｎ１－ジエチルエタン－１，２－ジアミンから白色の固体（０．６８ｇ、５１．９％収率）としてＡＫＧ－１３を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.17 (s, 1H), 7.67 - 7.46 (m, 3H), 7.39 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 6.63 - 6.44 (m, 2H), 5.25 (s, 1H), 4.74 (dd, J = 9.2, 5.8 Hz, 1H), 4.12 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 8.9, 6.2 Hz, 1H), 3.76 - 3.65 (m, 1H), 3.63 - 3.52 (m, 1H), 3.34 (dd, J= 13.2, 6.2 Hz, 2H), 2.60 - 2.55 (m, 2H), 2.54 - 2.50 (m, 4H), 0.97 (t, J = 7.1 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 160.60, 158.53, 158.18, 154.81, 147.62, 138.91, 137.13, 130.20, 121.16, 118.54, 114.29, 108.24, 105.87, 73.80, 62.10, 52.19, 47.13, 46.45, 39.48, 12.31. MS (ESI+) m/z 417.1 ([M + 1]+).
手順Ｂを使用。中間体３およびＮ１，Ｎ１－ジメチルプロパン－１，３－ジアミンから白色の固体（０．６ｇ、４７．３％収率）としてＡＫＧ－１４を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.16 (s, 1H), 7.63 - 7.54 (m, 2H), 7.50 (t, J= 8.9 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 6.73 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.25 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.78 - 4.68 (m, 1H), 4.11 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 8.9, 6.2 Hz, 1H), 3.75 - 3.66 (m, 1H), 3.64 - 3.53 (m, 1H), 3.33 - 3.23 (m, 2H), 2.28 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.13 (s, 6H), 1.72 - 1.62 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 160.60, 158.62, 158.18, 154.81, 147.62, 138.89, 137.08, 130.19, 121.21, 118.39, 114.29, 108.10, 106.02, 105.74, 73.81, 62.10, 57.44, 46.45, 45.72, 39.58, 27.54. MS (ESI+) m/z 389.1 ([M + 1]+).
手順Ｂを使用。中間体３およびＮ１，Ｎ１－ジエチルプロパン－１，３－ジアミンから白色の固体（０．６５ｇ、４８．０％収率）としてＡＫＧ－１５を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.16 (s, 1H), 7.63 - 7.54 (m, 2H), 7.50 (t, J= 8.9 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 6.75 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.25 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.79 - 4.68 (m, 1H), 4.12 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 8.9, 6.2 Hz, 1H), 3.75 - 3.66 (m, 1H), 3.63 - 3.54 (m, 1H), 3.32 - 3.23 (m, 2H), 2.49 - 2.40 (m, 6H), 1.70 - 1.61 (m, 2H), 0.95 (t, J = 7.1 Hz, 6H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 160.60, 158.65, 158.18, 154.81, 147.64, 138.89, 137.05, 130.18, 121.21, 118.37, 114.29, 108.01, 106.02, 105.74, 73.80, 62.09, 50.81, 46.80, 46.45, 40.11, 27.10, 12.23. MS (ESI+) m/z 417.1 ([M + 1]+).
１１．ＡＫＧ－１６の合成
ＺｎＣｌ２（１１．２ｇ、８１．９ｍｍｏｌ）を、ピリジン（４０ｍＬ）に一部ずつ添加した後、ＲＴでＮａＮ３（８．９０ｇ、１３７ｍｍｏｌ）および５－ブロモ－２－シアノピリジン（１０．０ｇ、５４．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１２０℃で２時間、加熱還流した。混合物をＲＴに冷却した後、それを水（２００ｍＬ）で希釈し、ＲＴで１時間撹拌し、濾過し、水（２００ｍＬ）で洗浄した。濾過された固体を収集し、ＨＣｌ（２００ｍＬ、６Ｍ）中にＲＴで２時間懸濁した。生成物を濾過によって収集し、Ｈ２Ｏで洗浄した。それを減圧下で乾燥したところ、白色の固体として中間体４（１０．０ｇ、８１．３％収率）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.96 (s, 1H), 8.36 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 8.4 Hz, 1H). MS (ESI+) m/z 225.9 227.9 ([M + 1]+).
Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）およびＤＭＦ（２０ｍＬ）中の中間体４（１０．０ｇ、４４．２５ｍｍｏｌ）およびＣａ（ＯＨ）２（７．２０ｇ、９７．３５ｍｍｏｌ）の混合物を、ｒｔで０．５時間撹拌した後、（２－ブロモエチル）ジメチルアミンヒドロブロミド（２５．０ｇ、１０７．３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８０℃で２４時間加熱した。ＬＣＭＳにより、それぞれ、中間体５および６の３：１混合物が示された。混合物をＨ２Ｏ（４０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、ＦＣ（ＤＣＭ ０～１５％中のＭｅＯＨを用いる溶離液）を使用して残渣を精製したところ、粗生成物が得られた。粗生成物を、ＲＰＦＣ（０．１％ＮＨ４ＨＣＯ３／Ｈ２Ｏ中のＭｅＣＮ ０～３０％、Ｃ１８、中間体５が最初に溶出し、次いで、中間体６が溶出する）によってさらに精製したところ、白色の固体として中間体５（０．７４ｇ、５．６％収率）および中間体６（０．２５ｇ、明黄色の固体として）が得られた。
中間体５：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.89 (dd, J = 2.3, 0.6 Hz, 1H), 8.27 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 8.10 (dd, J = 8.4, 0.6 Hz, 1H), 4.87 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.17 (s, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 163.74, 151.48, 145.51, 140.81, 124.40, 122.21, 57.73, 51.54, 45.29. MS (ESI+) m/z 297.1, 299.1 ([M + 1]+). 中間体6: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.98 (s, 1H), 8.38 (dd, J= 8.4, 2 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.00 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 6 Hz, 2H), 2.10 (s, 6H), MS (ESI+) m/z 297.1, 299.1 ([M + 1]+).
ジオキサン（５０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）中の新鮮に調製された中間体２（１．６８ｇ、４．９８ｍｍｏｌ）（中間体３の手順を使用して１．４４ｇの（Ｒ）－３－（４－ブロモ－３－フルオロフェニル）－５－（ヒドロキシメチル）オキサゾリジン－２－オンから）、中間体５（７４０ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）およびＫ３ＰＯ４（１．１６ｇ、５．４８ｍｍｏｌ）の混合物を、Ａｒで１０分パージした。これに、（ｄｐｐｆ）ＰｄＣｌ２（１８２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＡｒで再度パージした。次いで、それを９０℃に１５時間加熱した。ＬＣＭＳにより、反応の完了が示された。それを減圧下で濃縮し、残渣をＨ２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ２００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、ＲＰＦＣ（Ｈ２Ｏ中のＭｅＣＮ、０～４０％を用いる溶離液）を使用して残渣を精製したところ、白色の固体として生成物ＡＫＧ－１６（５２０ｍｇ、４９．０％収率）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.95 (s, 1H), 8.23 (dd, J = 18.3, 8.2 Hz, 2H), 7.82 - 7.66 (m, 2H), 7.54 (dd, J= 8.6, 2.1 Hz, 1H), 5.28 (s, 1H), 4.89 (t, J= 6.1 Hz, 2H), 4.82 - 4.71 (m, 1H), 4.17 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.98 - 3.87 (m, 1H), 3.77 - 3.65 (m, 1H), 3.64 - 3.53 (m, 1H), 2.90 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.19 (s, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 164.17, 161.02, 158.58, 154.81, 149.91, 145.59, 141.03, 137.63, 132.10, 131.39, 122.59, 119.05, 114.47, 105.97, 105.69, 73.95, 62.07, 57.72, 51.46, 46.46, 45.26. MS (ESI+) m/z 428.1 ([M + 1]+).
１２．ＡＫＧ－２１の合成
ジオキサン（３０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）中の中間体２（１．５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）、中間体６（０．９ｇ、３ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（２４７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびＫ３ＰＯ４（１．３ｇ、６ｍｍｏｌ）の溶液を、Ａｒで１０分間パージし、１００℃に１５時間加熱した。反応の完了時に（ＬＣＭＳ）、それを減圧下で濃縮し、残渣をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、ＦＣ（０～１０％のＤＣＭ（ＮＨ４ＯＨの１０％）中のＭｅＯＨを用いる溶離液）を使用して残渣を精製したところ、３５％の収率でＡＫＧ－２１（白色の固体として４５０ｍｇ）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.01 (s, 1H), 8.36 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.81 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 13.6, 2.0 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 5.26 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.08 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.79 - 4.75 (m, 1H), 4.18 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.93 - 3.89 (m, 1H), 3.74 - 3.68 (m, 1H), 3.62 - 3.56 (m, 1H), 2.80 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.13 (s, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ 161.09, 158.64, 154.80, 152.10, (149.45, 149.40), 143.46, (141.35, 141.23), (138.19, 138.15), (132.77, 132.76), (131.53, 131.48), 124.58, (118.69, 118.56), (114.51, 114.49), (105.97, 105.68), 73.96, 62.06, 58.38, 47.26, 46.47, 45.42.
１３．ＡＫＧ－２２の合成
Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）およびジオキサン（８ｍＬ）中の中間体７（５００ｍｇ、１．３５４ｍｍｏｌ）の混合物に、中間体２（６８５ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）、Ｋ３ＰＯ４（８６２ｍｇ、４．０６ｍｍｏｌ）および（ｄｐｐｆ）ＰｄＣｌ２（９９ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコを空にし、Ａｒで埋め戻した。次いで、混合物を９０℃で１６時間撹拌した。水（２０ｍＬ）を添加し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ、４０ｇシリカゲルカラム＠３０ｍＬ／分、石油エーテル中の０～１００％ＥｔＯＡｃで溶出）によって精製したところ、灰色の固体として所望の生成物ＡＫＧ－２２－１（４５０ｍｇ、収率：６６％）が得られた。
ＤＣＭ（８ｍＬ）中のＡＫＧ－２２－１（４５０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）の混合物に、４Ｍ ＨＣｌ／ジオキサン（２ｍＬ）を添加した。次いで、混合物をＲＴで５時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去したところ、灰色の固体として所望の生成物ＡＫＧ－２２（３９０ｍｇ、収率：９９％）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.03 (s, 1H), 8.39 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.19 (brs, 3H), 7.82 - 7.70 (m, 2H), 7.57 (dd, J= 8.8, 2.0 Hz, 1H), 5.18 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 4.81 - 4.74 (m, 1H), 4.17 (t, J= 9.2 Hz, 1H), 3.93 (dd, J = 9.2, 6.4 Hz, 1H), 3.71 (dd, J = 12.4, 3.2 Hz, 1H), 3.59 (dd, J = 12.4, 4.0 Hz, 1H), 3.53 - 3.47 (m, 2H). 13C NMR (400MHz, DMSO-d6) δ (161.07,158.63), 154.82, 152.52, 149.54, 143.25, (141.39,141.28), 138.24, 124.54, (118.66,118.53), 114.60, (106.01,105.73), 73.97, 62.02, 47.37, 46.48, 38.84.
１４．ＡＫＧ－２３の合成
２０ｍＬの１，４－ジオキサンおよび５ｍＬのＨ２Ｏ中の中間体８（１．０ｇ、２．７１ｍｍｏｌ）に、中間体２（４．８６ｍｍｏｌ、１．６３ｇ）、Ｋ３ＰＯ４（１．１４ｇ、５．４２ｍｍｏｌ）および（ｄｐｐｆ）ＰｄＣｌ２（０．２３ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１００℃で１６時間撹拌した。出発材料が消費された後、１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３を添加した。水性相をＥｔＯＡｃ（３Ｘ３０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物をＨ２Ｏで洗浄し、減圧下で濃縮し、ＦＣにより精製したところ、所望の化合物ＡＫＧ－２３－１（１．０ｇ、７０％収率）が得られた。
３０ｍＬのＤＣＭ中のＡＫＧ－２３－１（１．０ｇ、２ｍｍｏｌ）に、１ｍＬのＨＣｌ（１，４－ジオキサン中の４Ｍ）を添加し、混合物を１時間撹拌させた。出発材料が消費された後、混合物を濾過したところ、粗生成物が得られた。粗生成物を３ｍＬのＭｅＯＨ中で１時間撹拌し、濾過したところ、白色の固体として所望の生成物ＡＫＧ－２３（０．５３ｇ、６３％収率）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.97 (s, 1H), 8.26 (m, 5H), 7.83-7.64 (m, 2H), 7.54 (dd, J = 8.6, 1.9 Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.77 (m, 1H), 4.16 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 8.8, 6.2 Hz, 1H), 3.71 (dd, J = 12.3, 3.2 Hz, 1H), 3.61-3.57 (dd, J = 12.3, 3.2 Hz, 1H), 3.53 (m, 3H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 38.31, 46.49, 50.86, 62.01, 73.96, [105.69, 105.97], 114.46, [118.90, 119.03], 122.73, [131.37, 131.47], 132.21, [137.66, 137.70], [140.99, 141.10], 145.42, 149.86, 154.82, [158.57, 161.02], 164.50.
１５．ＡＫＧ－２４の合成
ジオキサン（５０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）中の中間体２（１．６６ｇ、４．９８ｍｍｏｌ）、中間体９（８００ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）およびＫ３ＰＯ４（１．１６ｇ、５．４８ｍｍｏｌ）の混合物を、Ａｒで１０分間パージし、（ｄｐｐｆ）ＰｄＣｌ２（１８２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＡｒで再度パージした。次いで、それを９０℃に１５時間加熱した。ＬＣＭＳにより、反応の完了が示された；それを減圧下で濃縮し、残渣をＨ２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ２００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ブラインで洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、ＲＰＦＣ（Ｈ２Ｏ、０～４０％中のＭｅＣＮを用いる溶離液）を使用して残渣を精製したところ、白色の固体として生成物ＡＫＧ－２４（４４０ｍｇ、３９．０％収率）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.95 (s, 1H), 8.28 - 8.16 (m,2H), 7.81 - 7.67 (m,2H), 7.54 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 5.27 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.93 - 4.70 (m, 3H), 4.17 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 8.9, 6.1 Hz, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.60 (m, 1H), 3.04 (s, 2H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ164.13, 161.03, 158.59, 154.81, 149.94, 149.90, 145.66, 141.09, 140.98, 137.66, 137.62, 132.10, 132.08, 131.41, 131.37, 122.54, 119.15, 119.02, 114.50, 114.47, 105.99, 105.71, 73.95, 62.08, 52.09, 51.60, 46.85, 46.48, 12.26. MS (ESI+) m/z 456 ([M + H]+).
１６．ＡＫＧ－２５の合成
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の中間体４（２．２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（５．５２ｇ、４０ｍｍｏｌ）の混合物に、３－クロロ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン塩化水素（３．９５ｇ、２５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を８０℃に４時間加熱した。それをＨ２Ｏ（４０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ブラインで洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で除去したところ、残渣はＮ－アルキル化の２つの位置異性体の存在を示した。異性体を、ＦＣ（ＤＣＭ ０～１５％中のＭｅＯＨを用いる溶離液）を使用して分離したところ、白色の固体として中間体１０（０．９８ｇ、３１．６％収率）が得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.83 (dd, J = 2.4, 0.8 Hz, 1H), 8.16 (dd, J = 8.0, 0.4 Hz, 1H), 8.01 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 4.78 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 3.2 Hz, 2H), 2.27-2.22 (m, 8H).MS (ESI+) m/z 311.1, 313.1 ([M + 1]+).
ジオキサン（３０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）中の中間体１０（０．７４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、中間体２（１．６２ｇ、４．８ｍｍｏｌ）およびＫ３ＰＯ４（１ｇ、４．８ｍｍｏｌ）の混合物を、Ａｒで１０分間パージし、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（１７５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＡｒで再度パージし、９０℃に１５時間加熱した。それを減圧下で濃縮し、残渣をＨ２Ｏ（８０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ブラインで洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、ＦＣ（ＤＣＭ ０～１５％中のＭｅＯＨを用いる溶離液）を使用して残渣を精製したところ、灰色の固体として生成物ＡＫＧ－２５（０．７３ｇ、６９．５％収率）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.94 (s, 1H), 8.24-8.26 (m, 1H), 8.19-8.21 (m, 1H), 7.78-7.70 (m, 2 H), 7.54 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 5.27 (t, J=5.6 Hz, 1H), 4.80 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 4.77-4.75 (m, 1H), 4.16 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.92 (dd, J=8.8 Hz, 6.0 Hz, 1H), 3.74 - 3.69 (m, 1H), 3.63 - 3.58 (m, 1H), 2.28 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.10 - 2.17 (m, 8H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 164.26, 161.03, 158.58, 154.81, 149.92, 145.58, 141.09, 137.65, 132.10, 131.37, 122.60, 119.12, 118.99, 114.46, 105.98, 105.70, 73.95, 62.07, 55.96, 51.65, 46.47, 45.53, 27.21. MS (ESI+) m/z 442.1 ([M + 1]+).
１７．ＡＫＧ－２６の合成
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の中間体４（５．０ｇ、２２．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、８０℃で３時間、（３－クロロプロピル）ジエチルアミン塩酸塩（８．２３ｇ、５５．３０ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（９．１７ｇ、６６．３６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を冷却し、氷水浴中に注ぎ入れ、ＥＡ（２Ｘ２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を塩水（２Ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒の除去時に、Ｎ－アルキル化位置異性体を含む粗生成物をＦＣ（ＰＥ／ＥＡ＝１：１０）によって精製したところ、白色の固体として中間体１１（１．７０ｇ、２２．６５％）が得られた。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.34 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.00 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 2H), 4.77 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.53-2.49 (m, 6H), 2.26-2.20 (m, 2H), 0.99 (t, J = 7.5 Hz, 6H). MS (ESI+) m/z 339.1, 341.1 ([M + 1]+).
中間体１１（０．６８ｇ、２．００ｍｍｏｌ）、中間体２（１．０７ｇ、３．９９ｍｍｏｌ）、リン酸三カリウム（０．８５ｇ、３．９８５ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．１５ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合物を、１，４－ジオキサン：水（１２ｍＬ、６：１）中に懸濁した。反応物を還流下で１６時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（２Ｘ１００ｍＬ）と水との間に分配し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒の除去時に、位置異性体を含有する残渣を、（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０／１）で溶出するＦＣを使用して精製したところ、灰色の固体としてＡＫＧ－２６（０．５４ｇ、５６．０４％）が得られた。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ8.95 (s, 1H), 8.26-8.19 (m, 2H), 7.78-7.70 (m, 2H), 7.53 (dd, J = 10.5, 2.5 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.83-4.75 (m ,2H), 4.17 (t, J = 11.5 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 11.0, 7.5 Hz, 1H), 3.74-3.69 (m, 1H), 3.62-3.58 (m, 1H), 3.51-3.28 (m, 8H), 2.14 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 0.93 (t, J= 8.5 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 164.24, 161.03, 158.59, 154.52, 149.91, (d, J = 3.2 Hz),145.59, 141.03 (d, J = 11.8 Hz), 137.64 (d, J = 3.2Hz), 132.12, 131.40 (d, J = 4.5 Hz), 122.57, 119.06(d, J = 12.8 Hz), 114.47 (d, J = 2.8 Hz,), 105.97, 105.70, 73.96, 62.07, 51.70, 49.19, 46.75, 46.48. MS (ESI+) m/z 470.1 ([M + 1]+).
１８．ＡＫＧ－２７の合成
ＤＭＦ（４２ｍＬ）中の中間体４（６．３ｇ、２７．８７ｍｍｏｌ）の溶液に、８０℃で３時間、ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）３Ｂｒ（１６．６ｇ、６９．７１ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１１．１ｇ、８０．０２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を冷却し、氷水浴中に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ２００ｍＬ）で抽出した。有機相をブライン（２Ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を蒸発させた。Ｎ－アルキル化の位置異性体を含む粗生成物を、ＦＣ（ＰＥ／ＥＡ＝２：１）によって精製したところ、黄色の固体として中間体１２（１４ｇ、１３．１％）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.89 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.28 (dd, J = 8.4 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.97 (s, 1H), 4.77 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.03 (q, J = 12.4 Hz, 2H), 2.15-2.08 (m, 2H), 1.37 (s, 9H) ppm. MS (ESI+) m/z 383.0 ([M + 1]+).
中間体１２（０．８３ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．３６ｇ、４．３１ｍｍｏｌ）および中間体２（１．２４ｇ、３．６８ｍｍｏｌ）の溶液を、１．４－ジオキサン（３２ｍＬ）および水（８ｍＬ）の中に懸濁した。混合物を、Ｎ２を用いて５分間泡立てた後、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．０７８ｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を入れた。混合物を９０℃で１５時間撹拌した後、ＲＴに冷却した。混合物を、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ１００ｍＬ）と水との間に分配した。有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。濾液を濃縮し、シリカゲル上でのシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０／１）によって精製したところ、白色の固体としてＡＫＧ－２７－１（０．７５ｇ；６６．９％）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.95 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.78-7.70 (m, 2H), 7.54 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 5.26 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.80-4.75 (m, 3H), 4.17 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.91 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.71-3.69 (m, 1H), 3.60-3.59 (m, 1H), 3.06-3.03 (m, 2H), 2.15-2.12 (m, 2H), 1.37 (s, 9H) ppm. MS (ESI+) m/z 514.0 ([M + 1]+).
乾燥ＤＣＭ（１６ｍＬ）中のＡＫＧ－２７－１（０．９ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ２雰囲気下、ＲＴでジオキサン（４．０ｍＬ）中のＨＣｌを添加した。反応混合物を同じ温度で６時間撹拌し、ＲＴに冷却した。混合反応物の溶媒を減圧下で蒸発させたところ、淡黄色の固体としてＡＫＧ－２７（０．６５ｇ、８２．５％）が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.95 (s, 1H), 8.26-8.20 (m, 5H), 7.77-7.70 (m, 2H), 7.53 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 4.77 (s, 1H), 4.51 (s, 2H), 4.16 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.93 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 3.71 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 3.60 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.94 (s, 2H), 2.34 (t, J = 6.8 Hz, 2H) ppm. MS (ESI+) m/z 414.0 ([M + 1]+).
１９．ＡＫＧ－２８～３１の合成
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の（Ｒ）－３－（４－ブロモ－３－フルオロフェニル）－５－（ヒドロキシメチル）オキサゾリジン－２－オン（９ｇ、３１ｍｍｏｌ）の溶液に、（３．９２ｇ、３４ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（３．７６ｇ、３７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＲＴで２時間撹拌した。混合物を水（２Ｘ３０ｍＬ）およびブライン（２Ｘ３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮したところ、中間体１３（１１．４ｇ、収率９９％）が得られた。MS (ESI+) m/z 368 ([M + 1]+).
ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の中間体１３（１１．４ｇ、３１ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウム１，３－ジオキソイソインドリン－２－イド（６．０２ｇ、３２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を９０℃で一晩撹拌した。混合物を冷却し、水（１０００ｍＬ）中に注ぎ入れ、０．５時間撹拌した。沈降物を収集し、減圧下で乾燥したところ、中間体１４（１１ｇ、収率８５％）が得られた。MS (ESI+) m/z 419 ([M + 1]+).
ＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）中の中間体１４（１１ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮＨ２ＮＨ２－Ｈ２Ｏ（８５％、７．７ｇ、１３１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を９０℃で一晩撹拌した。混合物を濾過し、ＥｔＯＨ（２Ｘ５０ｍＬ）でリンスした。濾液を濃縮したところ、中間体１５（７．６ｇ、収率１００％）が得られた。MS (ESI+) m/z 289 ([M + 1]+).
ＴＨＦ（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）中の中間体１５（７．６ｇ、２６．４ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｂｏｃ）２Ｏ（６．９ｇ、３２ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（７．２９ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２時間撹拌した。混合物を水（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（２Ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣をＦＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ、８０ｇシリカゲルカラム＠６５ｍＬ／分、石油エーテル中の０～６０％ＥｔＯＡｃで３０分溶出する）によって精製したところ、中間体１６（７．８ｇ、収率７５％）が得られた。MS (ESI+) m/z 411 ([M + 23]+).
ジオキサン（１００ｍＬ）中の中間体１６（７．８ｇ、２０ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（６．５４ｇ、３０ｍｍｏｌ）およびＫＯＡｃ（２．９４ｇ、３０ｍｍｏｌ）の混合物を、Ａｒで１０分間パージした後、（Ｐｈ３Ｐ）２ＰｄＣｌ２（１．０６ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＡｒで再度パージし、９０℃で一晩撹拌した。混合物を冷却し、水（３００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３Ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物をブライン（２Ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣をＦＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ、８０ｇシリカゲルカラム＠６５ｍＬ／分、石油エーテル中の０～６０％ＥｔＯＡｃで３０分溶出する）によって精製したところ、中間体１８（６．２ｇ、収率７０％）が得られた。MS (ESI+) m/z 459 ([M + 23]+).
手順Ｃ：ジオキサン／Ｈ２Ｏ（１０：１、０．０６Ｍ）中の中間体５／８／９／１０／１１の１つ（１．０当量）、中間体１８／１９の１つ（１．５当量）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２ＤＣＭ（０．１当量）、およびＫ３ＰＯ４（２．０当量）の混合物を、Ｎ２でパージし、９０℃で一晩撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水およびブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣をＦＣによって精製したところ、化合物ＡＫＧ－２８－１／ＡＫＧ－２９－１／ＡＫＧ－３０－１／ＡＫＧ－３１－１／ＡＫＧ－３８／ＡＫＧ－３９／ＡＫＧ－４０の１つが得られた。
ＤＣＭ（１ｍＬ／１００ｍｇ）中の化合物ＡＫＧ－２８－１／ＡＫＧ－２９－１／ＡＫＧ－３０－１／ＡＫＧ－３１－１の１つの溶液に、ＥｔＯＡｃ中の３Ｎ ＨＣｌ（２０当量）を添加した。混合物を２時間撹拌した後、濾過した。固体を減圧下で乾燥したか、または凍結乾燥したところ、最終化合物ＡＫＧ－２８／ＡＫＧ－２９／ＡＫＧ－３０／ＡＫＧ－３１の１つが得られた（２ステップについて収率３５～４４％）。
手順Ｃを使用。この生成物を中間体５および中間体１８から白色の固体（０．３５ｇ、３５％収率）として得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ10.53 (s, 1H), 8.97 (s, 1H), 8.37 (s, 3H), 8.29 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.24 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.69 (dd, J = 13.5, 2.0 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 5.31 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 5.04-4.99 (m, 1H), 4.28 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 9.0, 6.5 Hz, 1H), 3.84 (s, 2H), 3.28 (s, 2H), 2.87 (s, 6H) ppm. 13C NMR (126 MHz, D2O) δ 163.90 (s), 160.30 (s), 158.33 (s), 154.86 (s), 148.55 (s), 142.64 (s), 138.93 (d, J= 11.0 Hz), 137.74 (s), 132.43 (s), 130.39 (s), 122.46 (s), 119.03 (s), 114.36 (s), 106.41 (s), 106.18 (s), 70.31 (s), 55.23 (s), 48.07 (s), 47.69 (s), 43.29 (s), 42.19 (s) ppm. MS (ESI+) m/z 427.1 ([M + 1]+).
手順Ｃを使用。この生成物を中間体８および中間体１８から白色の固体（０．４ｇ、４４％収率）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.97 (s, 1H), 8.57-8.41 m, 6H),8.29-8.13 (m, 2H), 7.80 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.69 (dd, J = 13.5, 2.5 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 5.12 - 5.03 (m, 3H), 4.28 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.02-3.98 (m, 1H), 3.54-3.51 (m, 2H), 3.33-3.26 (m, 2H). 8.28 (s, 1H), 7.73 - 7.65 (m, 1H), 7.60 (dd, J = 13.6, 2.1 Hz, 1H), 7.54 (t, J = 8.9 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.25 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.78 - 4.68 (m, 1H), 4.33 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 4.12 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 8.9, 6.2 Hz, 1H), 3.74 - 3.64 (m, 1H), 3.62 - 3.52 (m, 1H), 2.87 - 2.71 (m, 2H), 2.23 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.11 (s, 6H), 1.72 (d, J = 11.5 Hz, 2H), 1.64 - 1.49 (m, 1H), 1.34 (dd, J = 14.3, 7.0 Hz, 2H), 1.18 - 1.04 (m, 2H) ppm. 13C NMR (101 MHz, D2O) δ161.52, 160.59, 158.12, 154.86, 145.70, 141.05, 140.16, 139.65, 133.57, 130.44, 123.64, 117.70, 114.54, 106.50, 106.22, 70.34, 50.81, 47.68 ppm. MS (ESI+) m/z 399.2 ([M + 1]+).
手順Ｃを使用。この生成物を中間体１０および中間体１８から白色の固体（０．３６ｇ、４０％収率）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.94 (s, 1H), 8.96 (s, 1H), 8.52 (s, 3H), 8.28-8.22 (m, 2H), 7.79 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (dd, J = 13.6, 2.0 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 5.08-5.01 (m, 1H), 4.93 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 4.28 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.00 (dd, J = 9.2, 6.8 Hz, 1H), 3.29 - 3.26 (m, 2H), 3.21-3.16 (m, 2H), 2.75 (d, J = 4.8 Hz, 6H), 2.49-2.43 (m, 2H) ppm. 13C NMR (101 MHz, D2O) δ 162.39 (s), 160.58 (s), 158.11 (s), 154.88 (s), 147.20 (s), 141.66 (s), 139.28 (d, J= 11.3 Hz), 132.86 (s), 130.45 (s), 122.90 (s), 118.44 (d, J = 12.0 Hz), 114.44 (s), 106.46 (s), 106.17 (s), 70.30 (s), 54.56 (s), 50.62 (s), 47.68 (s), 42.89 (s), 42.16 (s), 23.74 (s) ppm. MS (ESI+) m/z 441 ([M + 1]+).
手順Ｃを使用。この生成物を中間体１１および中間体１８から白色の固体（０．３６ｇ、４２％収率）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.10 (s, 1H), 8.96 (s, 1H), 8.390- 8.21 (m, 5H), 7.80 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (dd, J= 13.6, 2.0 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 5.04-4.97 (m, 1H), 4.94 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 4.28 (t, J= 9.2 Hz, 1H), 3.94 (dd, J = 9.6, 6.4 Hz,, 1H), 3.31-3.26 (m, 2H), 3.21-3.17 (m, 2H), 3.15-3.12 (m, 4H), 2.46-2.42 (m, 2H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 6H) ppm. 13C NMR (101 MHz, D2O) δ163.04 (s), 160.53 (s), 158.07 (s), 154.84 (s), 147.95 (d, J = 5.4 Hz), 142.36 (s), 139.05 (d, J = 11.3 Hz), 138.32 (s), 132.44 (s), 130.38 (d, J = 4.0 Hz), 122.50 (s), 118.72 (d, J = 12.8 Hz), 114.35 (s), 106.37 (s), 106.09 (s), 70.29 (s), 50.65 (s), 48.55 (s), 47.64 (d, J = 7.4 Hz), 42.17 (s), 23.05 (s), 8.24 (s) ppm. MS (ESI+) m/z 469 ([M + 1]+).
ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中の中間体１５（７．６ｇ、２６．４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（ＴＥＡ、４．５７ｇ、６．２７ｍＬ、５２．７７ｍｍｏｌ、２．０当量）、次いで、塩化アセチル（ＡｃＣｌ、２．６ｇ、２．７４ｍＬ、３９．５８ｍｍｏｌ、１．５当量）および４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．０２８ｇ、２．６４ｍｍｏｌ、０．０１当量）を、Ｎ２下、０～５℃で添加した。続いて、得られた反応混合物を、０～５℃で２時間撹拌した。ＴＬＣおよびＬＣＭＳが、反応が完了したことを示した時、反応混合物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）でクエンチした。２つの層を分離した後、水性層をＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物をＨ２Ｏ（２Ｘ１００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をＦＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ、８０ｇシリカゲルカラム＠６５ｍＬ／分、石油エーテル中の０～６０％ＥｔＯＡｃで３０分溶出する）によって精製したところ、中間体１７（６．５ｇ、収率７５％）が得られた。MS (ESI+) m/z 332 ([M + 1]+).
１，４－ジオキサン（１００ｍＬ）中の中間体１７（６．５ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）の溶液に、１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン－パラジウム（ＩＩ）ジクロリドジクロロメタン複合体（１．６１ｇ、１．９７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（１０ｇ、３９．３９ｍｍｏｌ）およびＫＯＡｃ（４．８３ｇ、４９．２４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応物を、９０℃で４時間撹拌した。ＴＬＣおよびＬＣＭＳが、反応が完了したことを示した時、反応混合物をＲＴに冷却した後、水（１００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で処理した。２つの層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃ（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を水（２Ｘ５０ｍＬ）および飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮した。残留する褐色の油をＦＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ、８０ｇシリカゲルカラム＠６０ｍＬ／分、石油エーテル中の０～１００％ＥｔＯＡｃで３０分溶出する）によって精製したところ、中間体１９（６．６ｇ、収率８８．７％）が得られた。MS (ESI+) m/z 379 ([M + 1]+).
２０．ＡＫＧ－３８～４０の合成
手順Ｃを使用。この生成物を中間体５および中間体１９から白色の固体（０．４８ｇ、６０％収率）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.95 (s, 1H), 8.29-8.19 (m, 3H), 7.77 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (dd, J= 13.6, 2.0 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 4.89 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.81-4.76 (m, 1H), 4.20 (t, J= 9.2 Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 9.2, 6.8 Hz, 1H), 3.45 (t, J = 5.6Hz, 2H), 2.90 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.19 (s, 6H), 1.85 (s, 3H) ppm. 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170.51 ,164.17 , 154.46 , 149.94 , 145.62 , 140.90, 137.63, 132.07 , 131.39 , 122.59 , 119.25 , 114.66 , 106.18 , 105.90 , 72.34 , 57.71 , 51.45 , 47.67 , 45.25 , 41.87, 22.92 ppm. MS (ESI+) m/z 469.2 ([M + 1]+).
手順Ｃを使用。この生成物を中間体９および中間体１９から白色の固体（０．３５ｇ、４０％収率）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.95 (s, 1H), 8.29-8.19 (m, 3H), 7.76 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (dd, J= 13.6, 2.0 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 4.84-4.76 (m, 3H), 4.21 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.82 (dd, J= 9.2, 6.4 Hz, 1H), 3.46 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.04 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.50-2.47 (m, 4H), 1.85 (s, 3H), 0.87 (t, J= 7.2 Hz, 6H) ppm. 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170.50, 164.11, 154.46, 149.91, 145.68, 137.68, 132.04, 131.40, 122.53, 119.27 (d, J = 13.3 Hz), 114.65, 106.18, 105.90, 72.34, 52.11, 51.61, 47.67, 46.83, 41.87, 40.63, 40.42, 40.22, 40.01, 39.80, 39.59, 39.38, 22.92, 12.28 ppm. MS (ESI+) m/z 497 ([M + 1]+).
手順Ｃを使用。この生成物を中間体１１および中間体１９から白色の固体（０．３６ｇ、５０％収率）として、得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.95 (s, 1H), 8.31 - 8.18 (m, 3H), 7.77 (t, J= 8.8 Hz, 1H), 7.69 (dd, J = 13.6, 2.0 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 4.88 - 4.71 (m, 3H), 4.20 (t, J= 9.2 Hz, 1H), 3.81 (dd, J = 9.2, 6.4 Hz, 1H), 3.45 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.45 (s, 6H), 2.14 (s, 2H), 1.85 (s, 3H), 0.93 (s, 6H) ppm. 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 137.70, 131.45, 114.69, 46.79, 41.86, 40.64, 40.43, 40.22, 40.01, 39.80, 39.59, 39.38 ppm. MS (ESI+) m/z 511 ([M + 1]+).
［実施例２］
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に関するアッセイ
使用される微量液体希釈ＭＩＣ法は、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７およびＧｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．，２００６に記載されている。一晩のインキュベーション後の細菌の目に見える増殖を防止する化合物のＭＩＣまたは最小阻止濃度。
簡単に述べると、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７（Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｌ，Ｆｒａｎｚｂｌａｕ ＳＧ（１９９７）．Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ ａｓｓａｙ ｖｅｒｓｕｓ ＢＡＣＴＥＣ ４６０ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ．ＡＡＣ．４１（５）：１００４－１００９）およびＧｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．，２００６（Ｇｒｕｐｐｏ Ｖ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＣＭ，Ｍａｒｉｅｔｔａ ＫＳ，Ｓｃｈｅｒｍａｎ Ｈ，Ｚｉｎｋ ＥＥ，Ｃｒｉｃｋ ＤＣ，Ａｄａｍｓ ＬＢ，Ｏｒｍｅ ＩＭ，Ｌｅｎａｅｒｔｓ ＡＪ．（２００６）Ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＡＡＣ ５０：１２４５－１２５０）によって記載されたような、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅエンドポイント（ＭＡＢＡ）を用いる微量液体希釈アッセイによって、ＭＩＣを決定した。ＭＡＢＡは、酸化還元指標Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅが、ブロス培地中のマイコバクテリア増殖活性の存在下で青色からピンク色に変わる９６ウェル比色アッセイである。
簡単に述べると、１Ｌのフラスコ中にＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋの４．７ｇの７Ｈ９ブロス粉末（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｍ０１７８）、２ｍＬのグリセロール、および８９８の精製水を、溶解するまで混合しながら添加すること、続いて、同じ１Ｌのフラスコに１００ｍＬのＡＤＣ溶液（１００ｍＬの水に溶解した、６ｇのウシ血清アルブミン、２ｇのデキストロース、および３ｍｇのカタラーゼ）を添加することによって、７Ｈ９完全培地を調製した。化合物を、ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ／ｍＬの濃度にした後、ＤＭＳＯでさらに８０μｇ／ｍＬに、または２μｇ／ｍＬの所望の出発濃度の４０倍に希釈した。第１のウェル中の５０μｌの薬物溶液を、次のウェル中の５０μｌのＤＭＳＯに添加すること、および薬物調製プレート中でこのプロセスを次の８個のウェルに対して前に運ぶことによって、９つの１：２希釈系列を調製した。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ．ｔｂ）Ｈ３４ＲｖおよびＭ．ｔｂ Ｅｒｄｍａｎ株のストックを、培地を用いて３～４ｘ１０７ＣＦＵ／ｍＬのそれらの初期濃度から、５ｘ１０５ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度に希釈し、マルチチャネルピペッターを用いてピペットを上下に動かすことによって完全に混合した。
５ｘ１０５ＣＦＵ／ｍＬを接種した培地１００μｌを全てのウェルに移すことによって、アッセイプレートを調製した。続いて、薬物調製プレートからのそれぞれの薬物希釈液２．５μＬを、アッセイプレート中の対応するウェルに移した。続いて、アッセイプレートをジップロックバッグに入れ、インキュベーターの内部に置き、それらを３７℃でインキュベートした。次に、３および１０日目にプレートリーダー上、ＯＤ６００ｎｍでプレートを読み取った。１０日目のＯＤ６００の読み取り後、１０μｌのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ染料をそれぞれの分析ウェルに添加した。１２日目に、全てのアッセイプレートを、フラットベッドカラースキャナー上で走査した。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いて青色からピンク色への目に見える色の変化をもたらさない、および／または薬物非含有対照ウェルに対してＯＤ６００の８０％以上の減少を示す最も低い連続抗菌濃度（典型的には、２倍連続希釈液）を、これらの化合物に関するＭＩＣと見なした。
２つのユニークな薬物感受性株（Ｍ．ｔｂ ＥｒｄｍａｎおよびＭ．ｔｂ Ｈ３７Ｒｖ）を使用してアッセイを行った。ＭＩＣアッセイを、４％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ｈｕＳＡ）（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ１６５３）の存在下で実施して、潜在的なタンパク質結合を評価することもできる（血清シフトアッセイ）。一般的には、２つのウェルのＭＩＣにおけるシフト（ＭＩＣの４倍のシフト）は有意であると考えられる。ＰＡ－８２４（陽性対照）については、ＭＩＣにおける４倍のシフトが予想される。
ＭＩＣを、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（ＭＡＢＡ）リードアウトによって、またはアッセイの限界内にある、１回の２倍希釈によってのみ一致した、もしくは異なっていた光密度リードアウト（ＯＤ６００）によって測定した。試験した全ての化合物は、Ｍｔｂ ＥｒｄｍａｎとＨ３７Ｒｖとの両方に対してＭＩＣ値の一貫性を示したか、またはＥｒｄｍａｎに対して１～２μｇ／ｍＬのより高いＭＩＣ値、およびＨ３７Ｒｖに対して０．５のＭＩＣを示した１つの化合物ＡＫＧ－４０を除いて、１回の２倍希釈以内にあった。この相違は、Ｅｒｄｍａｎプレート上でのより遅い増殖（より低いＯＤ読み取り）に起因するものであり得る。
リネゾリドは２μｇ／ｍＬ、テジゾリドは０．２５μｇ／ｍＬおよびベダキリンは０．１２５μｇ／ｍＬの予想されるＭＩＣ値を示した。これらの値は、過去のＭＩＣデータおよび公開された値と一致している（Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１９，Ｍａｒ ２７；６３（４），ｐｉｉ：ｅ０１９３９－１８、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１０ Ｊｕｌ；５４（７）：２８４０－６、Ｔｏｒｒｅａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１５ Ａｕｇ；７０（８）：２３００－５）。ＡＫＧ－２８は、０．０３～０．０１５μｇ／ｍＬのＭＩＣを示し、テジゾリドよりも有意に高い活性を示した。アセトアミド基を含有するオキサゾリジノンアナログのうち、ＡＫＧ－３９は、０．５μｇ／ｍＬのＭＩＣを示し、ＡＫＧ－４０は１～０．５μｇ／ｍＬのＭＩＣを示した。０．０６μｇ／ｍＬのＭＩＣを示すＡＫＧ－３８もまた、テジゾリドよりも数倍高い活性を示した。
オキサゾリジノンのＣ５位にアミン基またはアセトアミド基を有する分子は、活性がより高く（ＡＫＧ－３対テジゾリド、ＡＫＧ－２８またはＡＫＧ－３８対ＡＫＧ－１６、ＡＫＧ－３９対ＡＫＧ－２４、ＡＫＧ－４０対ＡＫＧ－２６）、テトラゾール上にアミノアルキル側鎖を有する化合物は、好ましい活性を示した。オキサゾリジノンのＣ５位のｔ－ブトキシカルボニルアミノ（Ｂｏｃ－ＮＨ）基の、第１級アミン（ＡＫＧ－２８－１対ＡＫＧ－２８）またはアセトアミド（ＡＫＧ－２８－１対ＡＫＧ－３８）への置換は、活性の低下をもたらした。ジメチルアミノアルキル側鎖を含有する化合物は、アミノエチルまたはジエチルアミノエチルアナログと比較した場合、特に優れていた（ＡＫＧ－１６対ＡＫＧ－２４、ＡＫＧ－２８対ＡＫＧ－２９、ＡＫＧ－３０対ＡＫＧ－３１）。同様に、テトラゾール環上のより短いジアルキルアミノアルキル側鎖（エチレン対プロピレンなど）は、より高い活性を示した（ＡＫＧ－１６対ＡＫＧ－２５、ＡＫＧ－２４対ＡＫＧ－２６、ＡＫＧ－２８対ＡＫＧ－３０）。テトラゾールの２’位上に置換を有するアナログは、１’位に置換を有するものよりも活性が高かった（ＡＫＧ－１６対ＡＫＧ－２１、ＡＫＧ－２３対ＡＫＧ－２２）。
［実施例３］
ヒト腎臓およびヒト肝細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性に関するアッセイ
アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）またはヒト肝細胞／肝臓（ＨｅｐＧ２；ＡＴＣＣ＃ＨＢ８０６５）細胞中でのＩＣ５０を決定するために、１０倍希釈系列にわたって化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。これらの分子は一般的には、非毒性であると予想されるため、ドキソルビシンの陽性対照を全ての試験において含有させた。データは、全細胞生存曲線、ならびに各化合物に関する実際のＩＣ５０値の計算値として報告される。
接着細胞を、約８０％の集密度まで増殖させた。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ＃２５２００－０７２）を添加することによって細胞をトリプシン処理した後、細胞をスピンダウンし、５ｍｌの増殖培地（ＭＥＭ培地；Ｃｏｒｎｉｎｇ＃１００１０ＣＭ）を添加して、細胞を分散させた。血球計を使用して細胞密度を決定した。増殖培地（１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地；Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３５０１５ＣＶ）を細胞に添加して、適切な細胞濃度に調整した。次いで、２００μｌの細胞（５，０００細胞／ウェル）を９６ウェルの透明平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃９８０４）に添加し、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃で２４時間にわたってプレート中でインキュベートした。
溶媒として増殖培地を使用して試験化合物の連続希釈液を調製する（表２）。これらの化合物を、５ｍｇ／ｍｌの濃度を有するＨＣｌ塩の滅菌水性溶液として提供した。希釈液を作製するために、それぞれの薬物ストックを室温に温め、ボルテックスし、沈降物について目視検査した。固体の薬物が存在していた場合、ストックを６０℃の水浴上で加熱した後、室温近くまで冷却させた。処理濃度に基づいて、２０倍の希釈標準ストックを連続希釈によって作製した。これらのものを増殖培地中で１倍にさらに希釈し、２５０μｇ／ｍｌの最も高い薬物濃度を試験した。
古い培地を吸引し、それを、２００μｌの薬物含有培地と置き換えることによって、各化合物について初期の２５０μｇ／ｍｌの濃度から１：２の希釈系列で化合物をウェルに添加した。プレートを、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃で７２時間にわたってインキュベートした。化合物のインキュベーション期間の終わりに、各ウェル中の培地を、１００μｌの１Ｘ ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ＃Ａ１３２６１）と置き換える。５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃で３０分～２時間、プレートをインキュベートする。３０、６０、および１２０分で読み取りを行う。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して５６０ｎｍの励起および５９０ｎｍの放出で蛍光を読み取る。全ての試料の読取り値から培養培地のみを含有する対照（バックグラウンド対照ウェル）のＲＦＵを差し引くことによって、バックグラウンドを補正する。以下の式を使用して細胞傷害性のパーセンテージを算出する：
細胞傷害性％＝［（ＲＦＵ．培地－ＲＦＵ処理）／ＲＦＵ．培地］×１００％。
以下の式を使用するＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＩＣ５０を決定した：
Ｙ＝１００／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）＊ヒル勾配）））。
驚くべきことに、リン酸テジゾリドのための活性代謝物テジゾリドの置換基を模倣する、オキサゾリジノン環のＣ５側鎖上にヒドロキシル基を含有するアナログの多くは、最も高い肝毒性を示し、ＨｅｐＧ２肝細胞の細胞株に関して１桁のＩＣ５０を示した。 テジゾリドは、ＭＲＳＡの処置について現在認可されている最も活性が高いオキサゾリジノンであり、テトラゾールＤ環、ピリジルＣ環、およびアリールＢ環において本明細書に記載される化合物との構造的類似性を有する（図６を参照されたい）。ここで、しかしながら、肝細胞に対する毒性の増大は、Ｃ５側鎖上の同じ位置にアミノまたはアセトアミド基を有するもの（ＡＫＧ２８－３１、ＡＫＧ３８－４０、およびＡＫＧ－３）と比較した場合、Ｃ５側鎖上にヒドロキシルを有するテオキサゾリジノン（ＡＫＧ－２３、ＡＫＧ－２５、ＡＫＧ－２６、およびＡＫＧ－２７）に関する比較的低い選択性指数をもたらす。
［実施例４］
選択性指数の決定
それぞれ、実験例２および３に記載されるように、哺乳動物細胞、すなわち、アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ）またはヒト肝細胞由来（ＨｅｐＧ２）細胞に対するものと比較した、２つの結核菌株、ＥｒｄｍａｎおよびＨ３７Ｒｖに対する化合物の相対的阻害活性を決定するために、選択性指数（ＳＩ）を算出した。高いＳＩは、体内の正常細胞に対してあまり有害ではない薬物の濃度で結核菌株の好ましい殺傷を示すため、それが好ましい。選択性指数を、以下の式を使用して算出した：
ＳＩ＝ＩＣ５０，哺乳動物／ＭＩＣ細菌
（式中、細菌は、ＥｒｄｍａｎまたはＨ３７Ｒｖ株のいずれかの結核菌であり、哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯまたはＨｅｐＧ２細胞株である）。
ＩＣ５０がＶＥＲＯまたはＨｅｐＧ２細胞について試験した最も高い値より高かった場合、ＳＩは、その最高濃度を使用して算出された比よりも高い（＞）と示される。同様に、ＥｒｄｍａｎまたはＨ３７Ｒｖ株に関するＭＩＣが、試験した薬物の最高濃度（８μｇ／ｍｌ）よりも高い場合、ＳＩは、その最高濃度を使用して算出された比より低い（＜）と示される。両方の数字が試験した最高濃度より上である場合の計算値は、決定されず（ｎｄ）と示される。その結果を、表４に示す。ＳＩは、結核菌株または哺乳動物細胞株のいずれかにおける分子の活性と直接相関せず、結核菌株における効力の増大は、哺乳動物細胞株に対する毒性の増大と直接相関しなかった。例えば、ＡＫＧ－３８は、結核菌の両方の株に対するナノモル濃度のＭＩＣを示したが、それは、パネル中の他の分子と比較して、ＶＥＲＯとＨｅｐＧ２細胞株との両方に対して相対的に不活性であり、高いＳＩを与えた。これは、ＡＫＧ－２８についても同様に見られた。ＡＫＧ－２８とＡＫＧ－３８との両方の分子が、テトラゾール環の２’位にジメチルアミノエチル置換基を有していたことは注目に値する。
一部の実施形態では、目的の化合物は、１００より高い、２００より高い、３００より高い、４００より高い、５００より高い、１０００より高い、１５００より高い、２０００より高い、２５００より高い、３０００より高い、３５００より高い、４０００より高い、４５００より高い、５０００より高い、５５００より高い、６０００より高い、６５００より高い、１００～７０００、１００～６０００、１００～５０００、１００～４０００、１００～３０００、１００～２０００、１００～１０００、１００～９００、１００～８００、１００～７００、１００～６００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～７０００、２００～６０００、２００～５０００、２００～４０００、２００～３０００、２００～２０００、２００～１０００、２００～９００、２００～８００、２００～７００、２００～６００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～７０００、３００～６０００、３００～５０００、３００～４０００、３００～３０００、３００～２０００、３００～１０００、３００～９００、３００～８００、３００～７００、３００～６００、３００～５００、３００～４００のＥｒｄ／ＨｅｐＧ２およびＨ３７Ｒｖ／ＨｅｐＧ２に関するＳＩ指数を有する。一部の実施形態では、目的の化合物は、１００～１７００、２００～１７００、３００～１７００の範囲のＥｒｄ／ＨｅｐＧ２およびＨ３７Ｒｖ／ＨｅｐＧ２に関するＳＩ指数を有する。
オキサゾリジノン環のＣ５側鎖上にアミノまたはアセトアミド基およびテトラゾール環の２’位にアミノアルキル基を有する化合物は、Ｃ５側鎖上にヒドロキシル基を有するものと比較して、比較的高いＳＩを示した。さらに、特定のテトラゾール置換は、ＳＩをさらに改善し、テトラゾール環の２’位のジメチルアミノエチル置換は、同じ位置のメチル、ジエチルアミノエチル、アミノエチル、またはジメチルアミノプロピル置換よりも好ましかった（ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８）。テトラゾール環の１’位にジメチルアミノエチル基を移動させたところ（化合物ＡＫＧ－２１対ＡＫＧ－２８）、予想外に、結核菌に対する活性の劇的な喪失をもたらした。
［実施例５］
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に関するアッセイ
リードオキサゾリジノン阻害剤の活性を測定して、グラム陽性細菌メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する十分な効力を示して、その処置のためにリポソームの形態でのその後の送達を正当化した。一部の実施形態では、３つの評価した株のうちの２つにおけるＭＩＣは、６μｇ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、３つの評価した株のうちの２つにおけるＭＩＣは２μｇ／ｍＬ未満であり、２μｇ／ｍＬ未満がより好ましい。
３つの黄色ブドウ球菌株を、５％ヒツジ血液細胞を添加したトリプチカーゼ大豆寒天プレート上、周囲雰囲気下、３７℃で一晩増殖させた。培養物を無菌的に拭き取り採取し、滅菌水のチューブに移し、光密度を６００ｎｍで０．５に調整した。次いで、培養物を１：１００に希釈して、１２０μＬ中、ウェルあたり約５ｘ１０５個の細胞を送達した。インキュベーション後、被験物質のＭＩＣを、各ウェル中での増殖の存在／非存在によって決定した。ＭＩＣ分析を、３回反復で実施した。
テジゾリドは、米国特許第７，８１６，３７９号に記載された０．５μｇ／ｍｌと同様、０．２０６～０．６１７μｇ／ｍｌのＭＩＣを示した。興味深いことに、オキサゾリジノン環のＲ２に第１級アミン改変を有する全ての分子（ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－２８、ＡＫＧ－２９、およびＡＫＧ－３０）が、３種全てのＭＲＳＡ株に対する無視できる程度の活性を示した（＞５０μｇ／ｍｌ）。同じ位置にアセトアミド基を有する分子（ＡＫＧ－３８、ＡＫＧ－３９、およびＡＫＧ－４０）は、３つのＭＲＳＡ株に対してテジゾリド自体の３分の１～９分の１の活性を示した。

［実施例６］
リポソーム組成物
一般的プロトコール
１．脂質成分（リン脂質（ＰｈＬ）、コレステロール、および必要に応じて、ＰＥＧ－脂質誘導体および／または脂質蛍光標識）を、約６０ｍＭのリン脂質を含む脂質懸濁液を得るために算出された体積（Ｖ）の１０分の１に等しい１００％エタノールの量と混合し、脂質の溶解が完了するまで６５～６８℃の温度で撹拌した。
中性リン脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアルキルホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、およびジアシルホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。水素化大豆ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、および卵スフィンゴミエリンは、好ましいリン脂質の一部である。
ＰＥＧ－脂質成分は、ＰＥＧ（分子量２，０００）－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）またはＮ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（ＰＥＧ－セラミド）を含んでもよい。ＰＥＧ－脂質成分の分子量はまた、１，５００～６，０００ｇ／ｍｏｌで変化してもよいが、好ましくは、約２，０００ＭＷである。
脂質蛍光標識としては、１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニン－５，５’－ジスルホン酸（ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ）、１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドジカルボシアニン－５，５’－ジスルホン酸（ＤｉＩＣ８（５）－ＤＳ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（シアニン７）（１８：０ Ｃｙ７ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ－（シアニン７）（ＤＳＰＥ ＰＥＧ（２０００）－Ｎ－Ｃｙ７）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（シアニン５）（１８：０ Ｃｙ５ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ－（シアニン５）（ＤＳＰＥ ＰＥＧ（２０００）－Ｎ－Ｃｙ５）、１－オレオイル－２－［１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）アミノ］ドデカノイル］－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１２：０ ＮＢＤ ＰＣ）が挙げられる。
２．エタノール性脂質溶液を、均一な懸濁液が得られるまで、６５～６８℃で撹拌しながら、体積Ｖの捕捉剤溶液（０．２５～０．５Ｍ硫酸アンモニウムまたは１Ｎ八硫酸トリエチルアンモニウムスクロース）と混合した。
潜在的な捕捉剤としては、限定されるものではないが、０．１～２ｇ当量／Ｌ（０．１～２Ｎ）、好ましくは、０．２～１．５Ｎの濃度の、スクロースオクタサルフェートのジエチルアンモニウムもしくはトリエチルアンモニウム塩、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、クエン酸、硫酸デキストラン、ポリビニルスルホン酸、またはイノシトールヘキサホスフェートのアンモニウム塩が挙げられる。典型的には、アンモニウム塩が使用され、アンモニウム自体、モノアルキル－、ジアルキル－、またはトリアルキル－アンモニウム塩を含んでもよい。
３．４００～４５０ｐｓｉの圧力、６５～６８℃でサーモバレル（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ）押出装置（Ｌｉｐｅｘ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、トラックエッチド（ｔｒａｃｋ－ｅｔｃｈｅｄ）ポリカーボネートメンブレンのスタック、典型的には、１００ｎｍの名目孔径を有する２つまたは４つのメンブレンおよび名目孔径２００ｎｍを有する１つのメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を介して少なくとも３回、脂質懸濁液を押し出した。２つの１００ｎｍメンブレンを１００ｍｌのＬｉｐｅｘ押出装置中で使用した場合、押出圧力は、典型的には、２６０～３００ｐｓｉであった。得られるリポソームは、約８０～約１３０ｎｍのＺ平均粒径（直径）Ｘｚ、および０．１未満のＰＤＩを有する。
４．押し出された脂質懸濁液（単層および／またはオリゴラメラリポソームを含有することが知られる）を、冷蔵庫（２～８℃）中で冷やし、陽圧下で０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブレンフィルターを通して濾過した。
５．そのように作製された、押し出され、濾過されたリポソーム懸濁液のアリコートを、重力送りのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂサイズ排除カラム（溶離液－１型水）上でのクロマトグラフィーにかけて、リポソーム外の捕捉剤からリポソームを精製した。精製されたリポソームを、カラムの空隙容量画分近くで収集した。スケールアップ試験のために、このステップを、１型またはＵＳＰ「注射用水」内毒素非含有水を用いて８～１０倍容量の交換（またはリポソーム懸濁液の伝導度が２００μＳ／ｃｍ未満に低下するまで）を行う、中空繊維カートリッジ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＭｉｃｒｏＫｒｏｓ ＰＳまたは５００ＫＤａのＭＷＣＯを有するｍＰＥＳメンブレン）上での接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して実施した。
６．精製され、押し出されたリポソーム調製物中の脂質濃度を、コレステロールの濃度を測定すること、および既知のリン脂質／コレステロールモル比について補正することによって、ＵＶ検出を用いるＨＰＬＣを使用して決定した。あるいは、分光測光的ホスホモリブデンブルー法を使用して、リン脂質含量を直接定量した。
７．薬物を、５～２０ｍｇ／ｍｌの薬物の濃度で、塩酸塩の形態で１型または内毒素非含有純水中に溶解した（例えば、ＡＫＧ－３およびＡＫＧ－５を一塩酸塩として使用し、ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－２９を二塩酸塩として使用した）。遊離塩基形態で調製された薬物（例えば、ＡＫＧ－１６、ＡＫＧ－３８）に、等量のＨＣｌを添加した。必要に応じて、溶液のｐＨを、１Ｎ ＮａＯＨ、ＨＣｌ、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）塩基溶液を使用して、ｐＨ２．５～５．５にし、溶液を、陽圧下で０．２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。必要に応じて、そのように作製されたストック溶液中の薬物濃度を、３０５ｎｍでのＵＶ検出を用いるＨＰＬＣによって検証した。
８．ステップ５の精製されたリポソームおよび薬物ストック溶液を、所望の薬物：リン脂質（ＤＬ）比、１．５～３．３ｍｇ／ｍｌの範囲の薬物濃度、ステップ２の捕捉剤溶液の測定されたオスモル濃度に等しいオスモル濃度を提供するのに必要な量の浸透圧剤（典型的には、デキストロース）および水の存在下で混合した。必要に応じて、所望のｐＨ（典型的には、ｐＨ４～ｐＨ７）の緩衝液を添加した。一部の例では、添加される浸透圧剤の量（例えば、約４５ｇ／Ｌのデキストロース）は、捕捉剤溶液の測定されたオスモル濃度より低いオスモル濃度をもたらし、充填を６～８ｍｇ／ｍｌの薬物で行った。
９．薬物－リポソーム混合物を、６５～６８℃で約１５～２０分間一定に撹拌しながらインキュベートし、氷上で急速に冷却した。５～１０分後、混合物を周囲温度に到達させ、計算量の３Ｍ ＮａＣｌストック溶液を添加することによって０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した。
１０．薬物充填リポソームを、重力送りのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂカラム、溶離液－１４０～１４４ｍＭ ＮａＣｌ中の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０（ＨＢＳ－７）上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、カプセル封入されなかった薬物から精製した。リポソーム画分を、カラム空隙容量近くで収集した。スケールアップ試験のために、精製および緩衝液交換を、上記の項目５の下で記載されたＴＦＦを使用し、ＨＢＳ－７緩衝液を用いた１０倍容量の交換を使用して実施した。スケールアッププロセスにおいては、典型的には、約８倍容量の交換が使用された。必要に応じて、精製されたリポソームを、緩衝液を供給せずにＴＦＦプロセスを継続することによって濃縮した。精製された、薬物充填リポソームを、陽圧下で０．２μｍの滅菌ＰＥＳフィルターを使用して無菌的に濾過し、冷蔵庫（２～８℃）中で保存した。
１１．精製された薬物充填リポソーム調製物中の薬物および脂質の濃度を、ＨＰＬＣによって決定した。あるいは、リン脂質定量のために分光測光（ホスホモリブデンブルー）法を使用し、６．５ｍｇ／ｍｌのドデシル硫酸ナトリウムの存在下、７０％イソプロパノール－０．１Ｎ ＨＣｌ中で可溶化したリポソーム試料中でのＵＶ吸収（３０２～３０５ｎｍ）によって薬物を定量した。カプセル封入効率を、
ＥＥ、％＝ＤＬ／ＤＬ０＊１００％
（式中、ＤＬ０は、ＳＥＣまたはＴＦＦ精製前のリポソーム充填混合物中の薬物とリン脂質の比であり、ＤＬは、精製（ステップ１０）後の薬物充填リポソーム中の薬物とリン脂質の比である）
として決定した。
１２．平均リポソームサイズ（Ｚ平均直径、Ｘｚ）および多分散指数（ＰＤＩ）を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｍｕ－Ｖ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ、またはＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ、ＵＳ）上でのキュムラントの方法による動的レーザー散乱を使用して決定した。
［実施例７］
リポソームのｉｎ ｖｉｖｏでの安定性および血中クリアランス
本開示の化合物をカプセル封入するリポソームの薬物カプセル封入の安定性および血中クリアランス速度を、以下の一般的プロトコールに従ってマウスにおいて試験した。３つの群の所与の実験室株のマウス（Ｃ３ＨメスまたはＣＤ－１オス）に、体重１ｋｇあたり９ｍｇの薬物の用量で尾静脈を介して薬物充填リポソームを注射した。時点１および２で、後眼窩洞から血液を採取し、動物を犠牲にした。典型的には、血液採取時点は、注射後、５分、１時間、６時間、および２４時間を含んでいた。血漿を遠心分離によって分離し、必要に応じて、可溶化剤（オクタ硫酸ナトリウム）を含有する、酸性化イソプロパノールで抽出し、薬物および脂質（リポソームが脂質標識、ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳを含む場合）についてＨＰＬＣによって分析した。リポソーム薬物の血中クリアランスを、所与の時点で残存する注射用量のパーセントで表した。薬物カプセル封入のｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を、注射前のＤＬ値と比較して所与の時点での血漿中のＤＬ比のパーセント変化（減少）によって評価した。
［実施例８］
異なるｐＨでのリポソーム中へのＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６の充填
水素形態のＤｏｗｅｘ ５０Ｗｘ８ １００～２００メッシュの５００ｍｌイオン交換カラムに市販のカリウムスクロースオクタサルフェート（水１４５ｍｌ中４０．２ｇ）の溶液を通過させ、得られる遊離酸形態のスクロースオクタサルフェートを原液のトリエチルアミンでｐＨ６．２に滴定することによって、トリメチルアンモニウムスクロースオクタサルフェート捕捉剤溶液を調製した。八硫酸トリエチルアンモニウムスクロース（ＴＥＡ－ＳＯＳ）の濃度（１Ｎ、０．１２５Ｍのスクロースオクタサルフェートに対応する）を、滴定において消費されるトリエチルアミンの量から見積もった。残存するカリウムを、添加方法によってＨｏｒｉｂａ ＬＡＱＵＡＴｗｉｎ Ｋ－１１カリウム分析装置を使用して見積もったところ、初期カリウム量の０．１％未満であった。
捕捉剤として１Ｎトリメチルアンモニウムスクロースオクタサルフェート（ＴＥＡ－ＳＯＳ）を用いて水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）（Ｌｉｐｏｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、コレステロール（３：２のモル比）、および１，２－ジステアロイルグリセロールのメトキシポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ－ＤＳＧ、ＰＥＧ分子量２０００、ＮＯＦ、Ｊａｐａｎ）から構成されるリポソーム（０．５ｍｏｌ％のＨＳＰＣ）を、本質的には上記の一般的プロトコールに記載された通りに調製した。薬物充填ステップを、４．３～７．１の範囲のｐＨを有する１６ｍＭモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）－４ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液の存在下、ならびにいかなる緩衝物質も添加せずに（ｐＨ５．２～５．９）、５００ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬのＤＬ比（ＤＬ０）で実施した。試験した全てのｐＨ範囲で、全ての薬物が、高い効率でリポソーム中にカプセル封入された（９８％を超える、９３．３％の効率で充填された、ｐＨ４．３８のＡＫＧ－１６を除く）（図１）。緩衝物質の添加は、効率的なカプセル封入にとって必要ではなかった。
［実施例９］
異なるＤＬ比でのＴＥＡ－ＳＯＳ捕捉剤を用いたリポソーム中へのＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６のカプセル封入
捕捉剤として１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳを用いたＨＳＰＣ、コレステロール（３：２のモル比）、およびＰＥＧ－ＤＳＧ（ＨＳＰＣの０．５ｍｏｌ％）から構成されるリポソームを、本質的には一般的プロトコール（実施例６）に記載された通りに調製した。薬物充填ステップを、緩衝物質を添加せずに（ｐＨ４．９８～６．２２）、７５０～１５００ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬの範囲のＤＬ０比で実施した。化合物３、５、および１６に関する最大薬物充填は、それぞれ、９００～９３０ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ、９８２～１１９７ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ、および９３８～９５１ｇ／ｍｏｌ ｐＨＬの範囲で観察され、最大薬物充填での、またはその近辺での充填効率は、それぞれ、少なくとも９７．６％、９６．０％、または８５．２％であった（図２Ａおよび図２Ｂ）。
［実施例１０］
捕捉剤として高いＰＥＧ化度または０．２５Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）を用いたリポソーム中へのＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６のカプセル封入
ＨＳＰＣおよび種々のＰＥＧ－ＤＳＧ含量を有するコレステロール（３：２のモル比）および捕捉剤から構成されるリポソームを、一般的プロトコールに従って調製し、２５０または５００ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬのＤＬ０比で実施例９に記載のように化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６を充填した。３つ全ての化合物が、以下の表６に示されるように高い効率でリポソーム中に充填された。
このように、化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６は、高レベルのＰＥＧ化およびリポソーム内薬物捕捉剤としての硫酸アンモニウムとともに、リン脂質－コレステロールリポソーム中に効率的に充填された。しかしながら、捕捉剤として０．２５Ｍ硫酸アンモニウムを使用して５００ｇの薬物／ｍｏｌ ＰｈＬのより高い薬物：脂質比で充填した場合、３つのオキサゾリジノンのうちの２つ（ＡＫＧ－３およびＡＫＧ－１６）に関して充填効率が低下した。
［実施例１１］
捕捉剤として０．５ＭのＡＳを使用するリポソーム中への化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６の充填
ＨＳＰＣおよび０．５ｍｏｌ％または５％ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧ（ＰｈＬに対して）を有するコレステロール（３：２のモル比）および捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）から構成されるリポソームを、一般的プロトコールに従って調製し、５００～１５００ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬの範囲のＤＬ０比で、実施例８に記載のように、化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６を充填した。結果を、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄに示す。３つ全ての化合物が、９３～１００％のカプセル封入効率で４２０～４５０ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬのＤＬ比で両方のリポソーム中に充填された；最大薬物ペイロードは、以下の通りであった：
試験した３つ全ての化合物が、０．５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧを含む調製物ならびに化合物ＡＫＧ－３およびＡＫＧ－１６については、５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧを含有する製剤中、５００ｇの薬物／ｍｏｌ ＰｈＬよりも多く、０．５Ｍ硫酸アンモニウムリポソーム中に充填可能であった。これらの高レベルの充填は、疾患の処置のために投与される薬物の十分な用量を達成し得る点において重要である。充填効率が、０．２５Ｍ硫酸アンモニウムを使用してより低かった、実施例１０よりも充填が有意に改善されたが、これは、より高いオスモル濃度および浸透圧バーストの可能性にも拘わらず、０．５Ｍのより高い硫酸アンモニウム濃度が、リン脂質１モルあたりに充填することができる薬物の量に関して、および好ましくは、低毒性および高用量が改善されたアウトカムをもたらすことができる場合、抗感染剤について改善されることを示している。
［実施例１２］
蛍光脂質標識を含む種々の組成物のリポソーム中への化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、ＡＫＧ－１６、およびＡＫＧ－２８の充填
ＨＳＰＣおよび０．５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧ（ＰｈＬに対して）を有するコレステロール（６０：４０のモル比）、０．１５ｍｏｌ％の脂質蛍光標識ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）、および捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）または１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳから構成されるリポソームを、一般的プロトコールに従って調製し、ｐＨ４．７～５．８（緩衝物質を添加しない）で、実施例１１に記載のように、化合物ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５、およびＡＫＧ－１６を充填した。リポソームは、以下の特徴を有していた：
３つ全ての薬物が、リポソーム中に効率的に充填された。リポソーム充填中のＡＫＧ－５の分解が、ＨＰＬＣ上での第２のピークの出現として検出された。
種々のリン脂質（ＨＳＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ）、または卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ、Ｌｉｐｏｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ））および種々の量のＰＥＧ－ＤＳＧまたはＮ－メトキシポリ（エチレングリコール）オキシカルボニル－１，２－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＰＥＧ分子量２０００、Ｌｉｐｏｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するコレステロール（６０：４０のモル比）、および脂質蛍光標識ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ（ＰｈＬに関して０．１５ｍｏｌ％）から構成されるリポソームを、同じ一般的プロトコールに従って異なる捕捉剤を用いて調製し、同様の様式でＡＫＧ－１６を充填した。示された場合、一般的プロトコールのリポソーム押出しステップに、５０ｎｍ孔径を有する２つのスタックされたポリカーボネートメンブレンを通す押出しを追加した。リポソームは、以下の特徴を有していた：

ＨＳＰＣおよび９．２ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＰＥ（ＰｈＬに対して）を有するコレステロール（３：２のモル比）、０．１５ｍｏｌ％の脂質標識ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ、および捕捉剤としての０．２５Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）から構成されるリポソームを、追加の５０ｎｍの押出しを用いて一般的プロトコールおよび実施例１２に従って調製し、薬物：脂質比（ＤＬ０）１５０ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬでＡＫＧ－２８を充填した。リポソーム（バッチＩＤ９８）は、７３．８ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬのＤＬ比、Ｚ平均リポソームサイズ７７．８ｎｍ、およびサイズ多分散指数（ＰＤＩ）０．０９０を有する。
これらの試験は、ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－５およびＡＫＧ－１６を、中性リン脂質成分としてＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、またはＥＳＭ、または低い（０．５ｍｏｌ％）もしくは高い（５ｍｏｌ％）のＰＥＧ－脂質含量を含む、脂質組成物の範囲を有するリポソーム中に効率的に充填することができることを示している。しかしながら、１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳと比較して、０．２５ＭのＡＳを使用した場合、効率は約５００ｇのＡＫＧ－１６／ｍｏｌ ＰｈＬから１２８ｇのＡＫＧ－１６／ｍｏｌ ＰｈＬまで有意に低下した。０．２５ＭのＡＳを用いてＡＫＧ－２８を充填する場合、同様の低い充填効率（すなわち、７３．８ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ）が観察された。これは、ＴＥＡ－ＳＯＳまたはより高濃度のＡＳが、高濃度の化合物をリポソーム中に充填するために好ましい場合があることを示唆している。
［実施例１３］
マウスにおける実施例１２のリポソームの血中持続性およびｉｎ ｖｉｖｏでのカプセル封入安定性
試験を、上記の一般的プロトコールに記載のようにオスのＣＤ－１マウスに対して実施した。
これらの試験は、変化する中性リン脂質成分（ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、またはＳＭ）から構成され、ＴＥＡ－ＳＯＳ捕捉剤を使用してＡＫＧ－１６を充填されたリポソームが、３０％を超える注射用量に関してゆっくりと除去され、多くの製剤について、６時間で血漿中に残存していたことを示す。さらに、多くの製剤は、０．２５ＭのＡＳを使用して充填されたＡＫＧ－１６を含む、リポソームバッチＩＤ９７を除いて、良好な薬物保持を示したが、０．２５Ｍ硫酸アンモニウムを使用する薬物の充填は、表９に示されたように低い充填効率をもたらすだけでなく、この製剤中でのリポソームからの有意な漏出に起因して６時間で低いＤＬ比（３．７％）ももたらすことを示唆している。
［実施例１４］
異なるＤＬ比の、種々の捕捉剤を用いたリポソーム中への化合物ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８のカプセル封入
ＨＳＰＣおよび０．５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧ（ＰｈＬに対して）を有するコレステロール、０．１５ｍｏｌ％の脂質標識ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ、および捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）または１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳから構成されるリポソームを、一般的プロトコールに従って調製し、ｐＨ４．９５～５．１７（緩衝物質を添加しない）および３００～１０５０ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ（ＡＫＧ－２８）または４００～１４００ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ（ＡＫＧ－３８）の範囲のＤＬ０比で、実施例８に記載のように、化合物ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８を充填した。０．５ＭのＡＳを使用する場合、化合物ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８に関する最大薬物充填量は、それぞれ、４０４～４２４ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬおよび８１８～８４２ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬの範囲であり、９５％を超える充填効率は、それぞれ、３０２ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ（定量的充填）および３８７～７６４ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ（９５．５～９６．７％充填）の薬物充填量であった。１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳを使用する場合、化合物ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８に関する最大薬物充填量は、それぞれ、３１５～３２８ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬおよび９８９ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬの範囲であり、最大充填効率は、それぞれ、２５０ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬおよび４００～７７７ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ（９７．２％を超える充填）の薬物充填量で８３．５％であった（図４Ａおよび図４Ｂ）。
ＡＫＧ－３８は、４００～８００ｇ ＡＫＧ－３８／ｍｏｌ ＰｈＬのほぼ定量的な充填を示したが、得られた薬物と脂質の比は、２５０～１０００ｇ ＡＫＧ－２８／ｍｏｌ ＰｈＬの範囲にわたってＡＫＧ－２８について平坦なままであり、これは、ＡＫＧ－３８よりもＡＫＧ－２８について最大薬物充填量が低いことを示唆している。ＡＫＧ－２８について以前に示されたより高い効力は、ＡＫＧ－２８のリポソーム製剤を結核のような感染症の処置にとって有効なものにすることが理解されるべきである。
［実施例１５］
種々のリン脂質組成、ＰＥＧ化度、および捕捉剤を用いた、リポソーム中への化合物ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８のカプセル封入
捕捉剤としての０．５Ｍ ＡＳまたは１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳを用いたリン脂質（ＰｈＬ）およびコレステロール（３：２のモル比）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、およびＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ（ＰｈＬの０．１５ｍｏｌ％）から構成されるリポソームを、一般的プロトコールに従って調製し、薬物充填量およびカプセル封入効率（ＥＥ）を最適化するために選択されたＤＬ０比で化合物ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８を充填した（添加される緩衝物質の非存在下で）。結果を、以下の表１０および表１１に示す。

本実施例は、ＡＫＧ－２８を、２３０～２７５ｇ ＡＫＧ－２８／ｍｏｌ ＰｈＬの最大薬物充填量で捕捉剤として０．５Ｍ ＡＳまたは１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳを使用してＨＳＰＣから構成されるリポソーム中に効率的に充填することができることを示す。しかしながら、この化合物のために中性リン脂質としてスフィンゴミエリンを含有する製剤は、比較的低い充填を示し、最大でも約１１０ｇ ＡＫＧ－２８／ｍｏｌ ＰｈＬに過ぎなかった。
化合物ＡＫＧ－３８は、薬物を６００ｇ ＡＫＧ－３８／ｍｏｌ ＰｈＬで添加した場合、０．５Ｍ ＡＳもしくは１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳを使用して、５２５～６００ｇ／ｍｏｌの、または８００ｇ ＡＫＧ－３８／ｍｏｌ ＰｈＬで添加した場合、７３５ｇ／ｍｏｌを超える、有意により高いＤ／Ｌ比で充填された。化合物ＡＫＧ－３８の充填は、ＡＫＧ－２８よりもスフィンゴミエリンの存在に対して感受性が低かった。
［実施例１６］
高いＰＥＧ化および捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いた、リポソーム中への化合物ＡＫＧ－１６、ＡＫＧ－２８、ＡＫＧ－２９、およびＡＫＧ－３８のカプセル封入
捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いたＨＳＰＣおよびコレステロール（３：２のモル比）、ＰＥＧ－ＤＳＧ（５ｍｏｌ％）、およびＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ（０．１５ｍｏｌ％）から構成されるリポソームを、一般的プロトコールに従って調製し、薬物充填量およびカプセル封入効率（ＥＥ）を最適化するために選択されたＤＬ０比で化合物ＡＫＧ－１６、ＡＫＧ－２８、ＡＫＧ－２９、またはＡＫＧ－３８を充填した（添加される緩衝物質の非存在下で）。結果を、以下の表１３に示す。
このデータは、テトラゾール環の２位にジメチルアミノエチル置換基を含有する全ての化合物が、８０％を超えてリポソーム中に効率的に充填されたが、同じ位置にアミノエチル置換基を有するＡＫＧ－２９は、１４．５％の効率および４３．６ｇ ＡＫＧ－２９／ｍｏｌ ＰｈＬの最終薬物充填量でリポソーム中にわずかしか充填されなかったことを示す。これは、試験した全ての化合物における滴定可能なアミンの存在にも拘わらず、テトラゾール環に置換されたアンモニウム（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル基）を有する化合物は、同じ位置に第１級アミン（アミノエチル基）を有するものよりも効率的な薬物充填を可能にしたことを示す。
［実施例１７］
マウスにおける実施例１５および１６のリポソームの血中持続性およびｉｎ ｖｉｖｏでのカプセル封入安定性
試験を、上記の一般的プロトコールに記載のようにオスのＣＤ－１マウスに対して実施した。
データは、捕捉剤として全て０．５ＭのＡＳを有する、リポソームバッチＩＤ１２８、１３２、１４２、１４４、および１４５中の薬物が、５分での低いＤＬ比、ならびにＡＫＧ－３８およびＡＫＧ－１６を充填したリポソームについて特に顕著な、６時間でのＤＬ比のさらなる低下によって示されるように、血液との接触時にほとんど即時にカプセル封入された薬物の２５～６０％を喪失することを示していた。かくして、０．５ｍｏｌ％または５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧおよび４０ｍｏｌ％のコレステロール、０．５ＭのＡＳ（捕捉剤として）の製剤は、５分と６時間の両方の時点での初期ＤＬ比の％が８０％を超えていた場合、１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳを用いる製剤（リポソームバッチＩＤ１２９、１３０、１３３～１３５）ほど効率的に薬物を保持できなかった。
［実施例１８］
変化するリン脂質とコレステロールの比を有するＰＥＧ化されたリポソーム中でのＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８の調製および充填
５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥ（ＰｈＬに対して）、０．１５ｍｏｌ％の脂質標識ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ、および捕捉剤としての０．５Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）または１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳを含有するリポソームを、一般的プロトコールに従って調製し、ｐＨ５．０７～５．８２（緩衝物質を添加しない）で、実施例８に記載のように、化合物ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８を充填した。
血液との接触時に迅速な薬物放出に対して捕捉剤として０．５ＭのＡＳを有するリポソームを安定化する試みにおいて（実施例１７に記載されている）、ＤＳＰＣ（一般的には、ＨＳＰＣと比較してより高い薬物漏出安定リポソームをもたらすことが知られている）および減少する割合のコレステロール（Ｃｈｏｌ）を使用するリポソームを調製し、ＤＬ０ ２５０ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬでＡＫＧ－２８、または６００ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬでＡＫＧ－３８を充填した（表１５）。予想に反して、４０ｍｏｌ％から１０ｍｏｌ％のコレステロールへのコレステロール含量の減少は、ＡＫＧ－２８とＡＫＧ－３８との両方に関してカプセル封入効率の劇的な低下をもたらした。より低いコレステロールはまた、凝集に対してリポソームを不安定化した。３０ｍｏｌ％のコレステロール（ＰｈＬ－コレステロールのモル比７０：３０）で、１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳおよび５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥを使用して作製されたＡＫＧ－２８を含有するリポソームは、ＡＫＧ－３８の３０ｍｏｌ％のコレステロール、５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＰＥを含有する製剤と同様、薬物充填中に不可逆的に凝集したが、３０ｍｏｌ％のコレステロールのＡＫＧ－３８の５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧ製剤は、７７．１％または４６２．４ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬの低下した充填効率を示した。
対照的に、ＨＳＰＣを使用して調製され、４０ｍｏｌ％以上のコレステロール、最大で６５ｍｏｌ％のコレステロール（試験した最大値）を含有するリポソームは、８７％を超える優れたカプセル封入効率を示し、ＡＫＧ－２８（ＤＬ０ ２５０ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ）およびＡＫＧ－３８（ＤＬ０ ５００ｇ／ｍｏｌ ＰｈＬ）の両方、ＰＥＧ－脂質（ＰＥＧ－ＤＳＧおよびＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、および捕捉剤（ＡＳまたはＴＥＡ－ＳＯＳ）についてリポソーム凝集を示さなかった（表１６）。
さらに、０．５ＭのＡＳと１Ｎ ＴＥＡ－ＳＯＳ製剤との両方において、このクラスに由来する現在の標準治療薬、リネゾリドを充填するための最適化された製剤の能力を評価した。テジゾリドは、実施例６の一般的プロトコールに従ってリポソーム中への膜貫通勾配支援充填を実施するには水に十分溶解しなかった。リネゾリドに関する両方の場合、カプセル封入効率は５％未満であったが、これは、ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８のこれらのリポソーム製剤が、リネゾリドと比較した場合、薬物を安定にカプセル封入するその能力において劇的に優れていたことを示している。
リポソームのＺ平均サイズ（ｘｚ）および多分散指数（ＰＤＩ）を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を１７３°の測定角で使用する動的光散乱（ＤＬＳ）キュムラント法によって決定した。
［実施例１９］
血漿の存在下でのＡＫＧ－２８またはＡＫＧ－３８および変化する比のリン脂質対コレステロールを含有するＰＥＧ化されたリポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏでのバースト放出
５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＰＥまたはＰＥＧ－ＤＳＧおよび変化する比のＨＳＰＣ対Ｃｈｏｌ（５０～６５ｍｏｌ％のＣｈｏｌ）を含有するＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８のリポソーム製剤のｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性を、マウスＣＤ－１またはヒトのプールされた血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈからのリチウム－ヘパリンで安定化されたもの）の存在下で安定性について評価した。血漿を解凍し、必要に応じて、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．４に調整し、ガラスマイクロファイバーフィルター（ＧＦ／Ｃ）、１μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、および０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して連続的に濾過した。血漿（８０μｌ）を、０．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中、リポソーム薬物製剤（２０μｌ）と混合した。続いて、混合物を３７℃で２０分間インキュベートした後、冷水中に入れた。混合物（０．１ｍＬ）を、２ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂカラム上で遅延なしにクロマトグラフィーにかけ、Ｈｅｐｅｓ緩衝化食塩水（ｐＨ７．０）で溶出し、０．２５ｍＬのリポソーム薬物を空隙容量画分中で収集した。次いで、薬物およびＤｉＩ（３）－ＤＳ脂質標識を、実施例７に記載されたようにＨＰＬＣによって分析し、カプセル封入された残存薬物％を、以下の式：
（Ａｄ／ＡＩ／（Ａｄ，０／ＡＩ，０）＊１００＝カプセル封入された残存薬物％
（式中、Ａｄは、薬物ピークのものであり、ＡＩは脂質標識ピークの面積であり、Ａｄ，０は、血漿とのインキュベーション前の薬物ピークの面積であり、ＡＩ，０は、インキュベーション前の脂質標識ピークのものである）
を使用して決定した。
結果を、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄに示す。ＡＫＧ－２８が封入されたリポソームについては（図５Ａ）、バースト放出現象（リポソームからの薬物放出を示すＤＬ比の急速な低下）が、４０ｍｏｌ％のコレステロールを含有する製剤についてヒト血漿中で観察されたが、４５ｍｏｌ％以上のコレステロールを含む製剤については観察されなかった。ＡＫＧ－３８が封入されたリポソームについては（図５Ｂ）、バースト放出現象は、４０ｍｏｌ％および４５ｍｏｌ％のコレステロール含量を含む製剤についてはヒトとマウスとの両方の血漿中で観察されたが、５０ｍｏｌ％以上のコレステロール含量では観察されなかった。
［実施例２０］
ＡＫＧ－３８および４０または５５ｍｏｌ％のコレステロールを含有する５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質リポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏでの血漿放出およびｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態
０．５Ｍ ＡＳ捕捉剤を使用する実施例１８の３つのリポソーム製剤を、５分と６時間との両方で血中に残存するリポソーム脂質の注射用量のパーセント（％ＩＤ）を測定し、薬物と脂質の比（ＤＬ）の決定によりリポソームからの薬物放出を測定する、実施例７に記載のメスＣＤ－１マウスにおいて２つの時点の薬物動態試験で評価した。５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧまたは５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＰＥを有し、５５ｍｏｌ％のＣｈｏｌを含有するリポソームは、５分で９５％を超える、および６時間で８５％を超える注射前Ｄ／Ｌを示したが、４０ｍｏｌ％のＣｈｏｌを含有するＰＥＧ－ＤＳＧ製剤は、５分と６時間との両方で劇的に低下したＤＬ比を示し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの血漿の存在下での薬物漏出データと一致していた（表１７）。この知見は、ＰＥＧ化されたリポソームドキソルビシンおよびナノリポソームイリノテカンのような、臨床使用について認可されたいくつかの非常に安定なリポソーム薬物は、約５０ｍｏｌ％の比率でコレステロールを含有するため、この知見は、薬物充填リポソーム製剤に関する以前の経験とは対照的であった（例えば、２０１９年８月にアップデートされた、Ｄｏｘｉｌ（Ｃ）薬物情報添付文書、およびＤｒｕｍｍｏｎｄ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｒａｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（６）：３２７１－３２７７を参照されたい）。
［実施例２１］
ＡＫＧ－３、ＡＫＧ－１６、ＡＫＧ－２２、ＡＫＧ－２８、ＡＫＧ－２９、ＡＫＧ－３０、ＡＫＧ－３８、ＡＫＧ－３９、およびＡＫＧ－４０によるミトコンドリアタンパク質合成（ＭＰＳ）の阻害ならびにＭＰＳ阻害と比較した結核菌（Ｈ３７Ｒｖ）に対する選択性
製造業者の使用説明書に従って、ＡｂＣａｍからの比色ＭｉｔｏＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（商標）細胞内ＥＬＩＳＡキット（カタログ＃ａｂ１１０２１）を使用して、ミトコンドリアタンパク質合成の阻害を決定した。ミトコンドリアタンパク質合成阻害は、リネゾリドおよび他のオキサゾリジノンに関する重要な毒性、最も顕著には、眼および末梢ニューロパチー、ならびに乳酸アシドーシスと相関していた（Ｒｅｎｓｌｏ（２０１０）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｅ Ａｎｔｉ Ｉｎｆｅｃｔ Ｔｈｅｒ ８（５）５６５－５７４；Ｆｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５９（１）１７８－１８５；Ｓａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｓａｆ １６（７）８３３－８４３）。複合体ＩＶのミトコンドリアＤＮＡによりコードされるサブユニットＩ（ＣＯＸ－１）および複合体ＩＩの核ＤＮＡによりコードされる７０ｋＤａサブユニット（ＳＤＨ－Ａ）を含む、２つのミトコンドリアタンパク質のレベルを同時に測定した。Ｈ９Ｃ２ラットＢＤＩＸ心筋芽細胞株を、３８４ウェルプレートアッセイ形式でこれらの試験において使用した。細胞を、１０％ＦＢＳおよび１ｘグルタミンを含むＤＭＥＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。細胞を、４７．５μｌ／ウェルで３８４ウェルプレート中に１，５００細胞／ウェルの密度で播種した。２００μＭの高い濃度で出発し、９つの３倍希釈液を含む各化合物の濃度および条件あたり１回の反復物を、２．５μｌで細胞に添加し、３７℃および５％ＣＯ２で５日間、細胞とともにインキュベートした。試験した化合物は、テジゾリドおよびリネゾリド対照、ならびにＡＫＧ－３、ＡＫＧ－１６、ＡＫＧ－２２、ＡＫＧ－２８、ＡＫＧ－２９、ＡＫＧ－３０、ＡＫＧ－３８、ＡＫＧ－３９、およびＡＫＧ－４０を含んでいた。
次いで、ＭｉｔｏＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｅｌｉｓａを、製造業者の使用説明書（Ａｂｃａｍｅカタログ＃ａｂ１１０２１）に従って実施し、プレートリーダー中、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を、１５分間（２０秒～１分間隔）動的モデルにおいて４０５ｎｍでのＳＤＨ－１Ａの検出のために現像し、ＨＲＰを、１５分間（２０秒～１分間隔）動的モードにおいて５００ｎｍでのＣＯＸ－Ｉの検出のために現像した。ＣＯＸ－ＩおよびＳＤＨ－Ａシグナルを、各化合物の濃度に対してＣＯＸ－１／ＳＤＨ－Ａの比としてプロットし、９つの調査化合物の各々および２つの対照についてＩＣ５０を算出した。
μｇ／ｍｌでのＭＰＳ ＩＣ５０を、実施例２に記載のように決定された薬物感受性Ｈ３７Ｒｖ結核菌株におけるＭＩＣで除算することによって、ＭＰＳ選択性指数（ＳＩ－ＭＰＳ）を決定した。試験した２つの化合物、ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－２９は、リネゾリドについて決定されたものよりも１０倍を超えて高く、テジゾリドについて決定されたものよりも２０倍を超えて高いＳＩ－ＭＰＳを有していた。これらの化合物は両方とも、オキサゾリジノン環のＲ２位に第１級アミノ基を含有していた。ミトコンドリアタンパク質合成と比較して結核菌に対するその高い効力（ＭＩＣ＜０．１）および高い選択性のため、ＡＫＧ－２８は、リポソーム中への封入および結核または他のマイコバクテリア疾患の処置のための優れた候補である。
［実施例２２］
リポソームＡＫＧ－２８ロット２７５のスケールアップ調製
ロット２６７。実施例６の一般的手順に従った。ＨＳＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）４．９５ｇ（６．３０ｍｍｏｌ）、コレステロール（Ｄｉｓｈｍａｎ、Ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ）２．９８ｇ（７．７１ｍｍｏｌ）、およびＰＥＧ－ＤＳＰＥ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）８５０ｍｇ（０．３１５ｍｍｏｌ）（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ ４５：５５：２．２５のモル比）を、９ｍｌの無水エタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｅ－７０２３）と混合し、全ての脂質が溶解するまで６８℃浴上で撹拌しながら加熱した。別の容器中で、９３．３ｇの０．５Ｍ水性硫酸アンモニウム（０．２μｍ濾過された）を、６８℃浴上で予め加熱し、熱い脂質エタノール溶液中に撹拌しながら注ぎ入れた。得られた懸濁液を６８℃浴上で２０分間撹拌し、６８℃の水を循環しながら加熱したＬｉｐｅｘ １００ｍｌサーモバレルリポソーム押出装置（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、２つの４７ｍｍの１００ｎｍ孔径および１つの２００ｎｍ孔径のポリカーボネートトラックエッチドメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）のスタックを通して２６０～３００ｐｓｉで８回押し出した。得られた押し出されたリポソームを、冷蔵庫（２～８℃）中で一晩保持し、陽圧下で０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過した。残存する伝導度が２００μＳ／ｃｍ未満（５．２倍量の交換後に１４３μｓ／ｃｍ）に低下するまで、ＭＷカットオフ５００ＫＤａを有するポリスルホン中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上、内毒素非含有水へのＴＦＦ緩衝液交換によって、リポソーム外の捕捉剤（硫酸アンモニウム）を除去した。ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液中のリン脂質濃度を、ホスホモリブデンブルー法によって決定したところ、５７．４ｍＭであった。
２０ｍｇ／ｍｌ水性ストック溶液（ＮａＯＨでｐＨ５．０３に調整）の形態の７２０ｍｇのＡＫＧ－２８（二塩酸塩として）を、ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、４５ｍｇ／ｍｌのデキストロースおよび６ｍｇ／ｍｌの濃度のＡＫＧ－２８の存在下、２５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比の充填混合物を形成させた。一定に撹拌しながら外部加熱によって混合物を６０～６３℃に急速に加熱し、６５℃浴上で撹拌しながらインキュベーションを継続した。２０分間のインキュベーション後、混合物を氷水中で１０℃未満に急速に冷却し、この温度で約１０分間保持した。周囲温度に達し、０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した後、分子量カットオフ５００ＫＤを有するポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって薬物充填リポソームを精製した。リポソームを、透析濾過によって約１２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－２８に予め濃縮し、合計８倍量の交換にわたって内毒素非含有水（ＨＢＳ－７緩衝液）を用いて作製された０．１４４Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ緩衝液ｐＨ７．０中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。精製前の非封入薬物の割合を、濃縮前の透析濾液中、３０５ｎｍで分光測光的に見積もったところ、約０．９％（９９．１％の充填効率に対応する）であることがわかった。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍの滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。この手順を、さらに３回繰り返した（ロット２６９、２７１、２７３）。得られたリポソームは、表１９に示される特徴を有していた。
これらのロットを混合して、リポソーム形態、粒径Ｘｚ １１３．７ｎｍ、ＰＤＩ０．０４１７の１２．０ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－２８を有するロット２７５を得た。
［実施例２３］
リポソームＡＫＧ－３８ロット２７６のスケールアップ調製
ロット２６８。以下の相違で実施例２２のプロトコールを使用した：等量の１Ｎ ＨＣｌ中に薬物を溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８（遊離塩基として）、ｐＨ５．０８を得るように体積を調整することによって、ＡＫＧ－３８（遊離塩基として）のストック水性溶液を調製した。充填混合物は、１３００ｍｇのＡＫＧ－３８を含有しており、これを、８ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８および４５０ｇ／ｍｏｌのリン脂質のＤＬ比で調製し、さらに１０ｍＭのＮａＣｌを含有していた。充填後のリポソームを、約２２ｍｇ／ｍｌの薬物に予め濃縮した；精製前の非封入薬物の割合を、濃縮前の透析濾液中、３０５ｎｍで分光測光的に見積もったところ、約３．２％（９６．８％の充填効率に対応する）であることがわかった。このプロセスを、さらに３回繰り返した（ロット２７０、２７２、２７４）。得られたリポソームは、表２０に示される特徴を有していた。
これらのロットを混合して、リポソーム形態、粒径Ｘｚ １１３．１ｎｍ、ＰＤＩ０．０４５４の２２．３ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８を有するロット２７６を得た。
［実施例２４］
「空のリポソーム」ロット２７７の調製
２ｍｍｏｌのＨＳＰＣ、２．４４４ｍｍｏｌのコレステロールおよび０．１ｍｍｏｌのＰＥＧ－ＤＳＰＥ（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ ４５：５５：２．２５のモル比）をエタノール中に溶解し、リポソーム懸濁液中に形成し、０．５Ｍ硫酸アンモニウムの代わりに、非交換カチオンの硫酸塩、０．１３Ｍ硫酸ナトリウムを採用した以外は、実施例２２に記載のようにポリカーボネートメンブレンを通して押し出した。押し出されたリポソームを、リポソーム外の硫酸ナトリウムから精製し、合計１０倍量の交換にわたってＭＷＣＯ５００ｋＤａを有するポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦ緩衝液交換によってＨＢＳ－７緩衝液中に入れた。精製されたリポソームは、４２．９ｍＭのリン脂質、粒径Ｘｚ１１３．７ｎｍ、およびＰＤＩ０．０６１２を有していた。それらを０．２μｍの滅菌フィルターを無菌的に通過させ、滅菌ＨＢＳ－７を用いて２０ｍＭのリン脂質に調製した。
［実施例２５］
リポソームＡＫＧ－３８ロット２７９
実施例６の一般的手順に従った。ＨＳＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）１３．１０２ｇ（１６．６７ｍｍｏｌ）、コレステロール（Ｄｉｓｈｍａｎ、Ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ）７．８７７ｇ（２０．３７ｍｍｏｌ）、およびＰＥＧ－ＤＳＰＥ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）２．２５０ｇ（０．８３３ｍｍｏｌ）（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ ４５：５５：２．２５のモル比）を、２５ｍｌの無水エタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｅ－７０２３）と混合し、全ての脂質が溶解するまで６８℃浴上で撹拌しながら加熱した。別の容器中で、２５９．１ｇ（２５０ｍｌ）の０．５Ｍ水性硫酸アンモニウム（０．２μｍ濾過された）を、７０℃浴上で予め加熱し、熱い脂質エタノール溶液中に撹拌しながら注ぎ入れた。得られた懸濁液を７０℃浴上で少なくとも２０分間撹拌し、４つの部分に分割した。それぞれの部分を、７０℃の水を循環させながら加熱したＬｉｐｅｘ １００ｍｌサーモバレルリポソーム押出装置（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、２つの４７ｍｍ １００ｎｍ孔径および１つの２００ｎｍ孔径のポリカーボネートトラックエッチドメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）のスタックを通して２８０ｐｓｉで５回押し出した。これらの部分的に押し出されたリポソーム部分を混合し（Ｘｚ １２９．７ｎｍ）、同じメンブレンスタックを通してさらに５回、一緒に押し出したところ、サイズＸｚ １１５．９ｎｍ、ＰＤＩ ０．０２１２のリポソームが得られた。リポソームを、冷蔵庫（２～８℃）中で一晩保持し、陽圧下で０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過した。リン脂質濃度は、６０．２２±０．３４ｍＭであることがわかった。残存する伝導度が５．１倍量の交換後に１８０μＳ／ｃｍに低下するまで、ＭＷカットオフ５００ＫＤａを有するポリスルホン中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上、内毒素非含有水へのＴＦＦ緩衝液交換によって、リポソーム外の捕捉剤（硫酸アンモニウム）を除去した。ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液中のリン脂質濃度を、ホスホモリブデンブルー法によって決定したところ、５４．９７±０．３２ｍＭであった。
ＡＫＧ－３８（遊離塩基）を０．９５当量の１Ｎ ＨＣｌと混合し、内毒素非含有水で埋め合わせて、２０ｍｇ／ｍｌの水性ストック溶液（ｐＨ５．１６）を得た。溶液を、０．２μｍフィルターを通過させ、３９５８ｍｇの薬物を含有する量の濾液をＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、４４．５ｍｇ／ｍｌのデキストロース、１０ｍＭのＮａＣｌ、および８ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８濃度、ｐＨ５．５４の存在下、４５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比で充填混合物を形成させた。５分間一定に撹拌しながら外部加熱によって混合物を６１℃に加熱し、６５℃浴上、さらに２２分間撹拌しながらインキュベーションを継続した。次いで、混合物を氷水浴中に移し、７分間撹拌して、温度を１０℃に低下させ、氷水浴中でさらに８分間保持した。氷浴から取り出し、周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストックを添加することによって０．１Ｍ ＮａＣｌに調製した後、薬物充填リポソーム（ｐＨ６．５３）を、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約２２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８に予め濃縮し、合計８倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍのＰＥＳ大流量滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－３８ ２１．１±０．１９ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比４５４±４．７ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １１６．４ｎｍ、ＰＤＩ ０．０２３１。製剤化された薬物の収量は、３８３４ｍｇ（９６．９％）であった。
［実施例２６］
リポソームＡＫＧ－２８ロット２８１
実施例６の一般的手順に従った。０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含有する４５：５５：２．２５のモル比のＨＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ－ＤＳＰＥから構成される押し出されたリポソームを、実施例２５に記載のように調製した。残存する伝導度が１５０μＳ／ｃｍ（４．１倍量の交換）に低下するまで、ＭＷカットオフ５００ＫＤａを有するポリエーテルスルホン中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上、内毒素非含有水へのＴＦＦ緩衝液交換によって、リポソーム外の捕捉剤（硫酸アンモニウム）を除去した。ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液中のリン脂質濃度を、ホスホモリブデンブルー法によって決定したところ、５５．４ｍＭであった。
２０ｍｇ／ｍｌ水性ストック溶液（ＮａＯＨでｐＨ５．２４に調整）の形態の９６９．５ｍｇのＡＫＧ－２８（二塩酸塩として）を、ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、４４．５ｍｇ／ｍｌのデキストロースおよび６ｍｇ／ｍｌの濃度のＡＫＧ－２８の存在下、２５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比の充填混合物を形成させた。一定に撹拌しながら外部加熱によって混合物を２．５分で６５．４℃に加熱し、６５℃浴上で撹拌しながらインキュベーションを継続した。２０分のインキュベーション後、混合物を氷水中、２．７５分で９．３℃に冷却し、約１０分間、氷水中で保持した。次いで、混合物を周囲温度に到達させた後、０．１Ｍ ＮａＣｌ；ｐＨ６．４３に調整した。１３３．４ｇの充填混合物を、分子量カットオフ５００ＫＤを有するポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによる精製にかけた。リポソームを、透析濾過によって約１２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－２８に予め濃縮し、合計８．１倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。精製前の非封入薬物の割合を、濃縮前の透析濾液中、３０２ｎｍで分光測光的に見積もったところ、約０．７％（９９．３％の充填効率に対応する）であることがわかった。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍの滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－２８ １３．２６±０．２１ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比２５８．２±３．７ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １１７．３ｎｍ、ＰＤＩ ０．０４２１。
［実施例２７］
リポソームＡＫＧ－３８ロット２８５
実施例６の一般的手順に従った。０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含有する４５：５５：２．２５のモル比のＨＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ－ＤＳＰＥから構成される押し出されたリポソームを、本質的には実施例２５に記載のように調製した。残存する伝導度が１３８μＳ／ｃｍ（５．６倍量の交換）に低下するまで、ＭＷカットオフ５００ＫＤａを有するポリエーテルスルホン中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上、内毒素非含有水へのＴＦＦ緩衝液交換によって、リポソーム外の捕捉剤（硫酸アンモニウム）を除去した。ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液中のリン脂質濃度を、ホスホモリブデンブルー法によって決定したところ、５３．１ｍＭであった。
ＡＫＧ－３８（遊離塩基）を０．９５当量の１Ｎ ＨＣｌと混合し、内毒素非含有水で埋め合わせて、１９．９ｍｇ／ｍｌの水性ストック溶液（ｐＨ５．１３）を得た。溶液を、０．２μｍフィルターを通過させ、１４００ｍｇの薬物を含有する量の濾液をＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、４４．５ｍｇ／ｍｌのデキストロース、１０ｍＭのＮａＣｌ、および８ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８濃度、ｐＨ５．５８の存在下、４５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比で充填混合物を形成させた。２．２５分間にわたって一定に撹拌しながら外部加熱によって混合物を６３℃に加熱し、６５℃浴上、合計２１分間撹拌しながらインキュベーションを継続した。次いで、混合物を氷水浴中に移し、３分間撹拌して、温度を１０．３℃に低下させ、氷水浴中でさらに７分にわたって保持した。氷浴から取り出し、周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストックを添加することによって０．１Ｍ ＮａＣｌに調製した後、薬物充填リポソーム（ｐＨ６．７０）を、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約２２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８に予め濃縮し、合計７．７倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。濃縮、精製されたリポソームは、２３．１ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８濃度を有していた。薬物濃度を、ＨＢＳ－７緩衝液で２０ｍｇ／ｍｌに調整し、リポソームを、０．２μｍ ＰＥＳ大流量滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳによって粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－３８ ２０．３５±０．２６ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比４３７．８±６．５ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １２１．１ｎｍ、ＰＤＩ ０．０２００。製剤化された薬物の収量は、１３５５ｍｇ（９６．８％）であった。
［実施例２８］
リポソームＡＫＧ－２８ロット２８６
０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含有し、リポソーム外の捕捉剤を含有しない押し出されたリポソーム（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ ４５：５５：２．２５のモル比）を、実施例２７に記載のように取得した。２０ｍｇ／ｍｌ水性ストック溶液（ＮａＯＨでｐＨ５．１８に調整）の形態の６００ｍｇのＡＫＧ－２８（二塩酸塩として）を、ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、４４．５ｍｇ／ｍｌのデキストロースおよび６ｍｇ／ｍｌの濃度のＡＫＧ－２８の存在下、２５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比の充填混合物を形成させた。混合物を、撹拌しながら６５℃水浴上に置き、４．５分で６０℃に到達させた。合計２０分間撹拌しながらインキュベーションを継続し、混合物を氷水中、２分で１０．０℃に冷却し、約１０分間、氷水浴中で保持した。次いで、混合物を周囲温度に到達させた後、０．１Ｍ ＮａＣｌ；ｐＨ６．２３に調整した。１０４．６ｇの充填混合物を、分子量カットオフ５００ＫＤを有するポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによる精製にかけた。リポソームを、透析濾過によって約１２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－２８に予め濃縮し、合計８．３倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍの滅菌フィルターを無菌的に通過させ（ＨＢＳ－７緩衝液で追い出した）、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－２８ １２．０５±０．１３ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比２３９．４ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １２０．１ｎｍ、ＰＤＩ ０．０２９４。製剤化された薬物の収量は、５５５．５ｍｇ（９２．６％）であった。
［実施例２９］
リポソームＡＫＧ－３８ロット２９２
ロット２８８。実施例６の一般的手順に従った。ＨＳＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）９．１７ｇ（１１．６７ｍｍｏｌ）、コレステロール（Ｄｉｓｈｍａｎ，Ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ）５．５１ｇ（１４．２６ｍｍｏｌ）、およびＰＥＧ－ＤＳＰＥ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）１．５７５ｇ（０．５８３ｍｍｏｌ）を、１７．５ｍｌの無水エタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｅ－７０２３）と混合し、全ての脂質が溶解するまで６９～７０℃の浴上で撹拌しながら加熱した。別の容器中で、１８１．４ｇ（１７５ｍｌ）の０．５Ｍ水性硫酸アンモニウム（０．２μｍ濾過された）を、７０℃浴上で予め加熱し、熱い脂質エタノール溶液中に撹拌しながら注ぎ入れた。得られた懸濁液を７０℃浴上で少なくとも２０分間撹拌し、３つの部分に分割した。それぞれの部分を、７０℃の水を循環させながら加熱したＬｉｐｅｘ １００ｍｌサーモバレルリポソーム押出装置（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、２つの４７ｍｍ １００ｎｍ孔径および１つの２００ｎｍ孔径のポリカーボネートトラックエッチドメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）のスタックを通して２８０ｐｓｉで５回押し出した。これらの部分的に押し出されたリポソーム部分を混合し（Ｘｚ １２６．７ｎｍ）、同じメンブレンスタックを通してさらに４回、一緒に押し出したところ、サイズＸｚ １１９．２ｎｍ、ＰＤＩ ０．０３８５のリポソームが得られた。リポソームを、冷蔵庫（２～８℃）中で一晩保持し、陽圧下で０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過した。リン脂質濃度は、５９．０８±０．４４ｍＭであることがわかった。残存する伝導度が５．４倍量の交換後に１５２μＳ／ｃｍに低下するまで、ＭＷカットオフ５００ＫＤａを有するポリスルホン中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上、内毒素非含有水へのＴＦＦ緩衝液交換によって、リポソーム外の捕捉剤（硫酸アンモニウム）を除去した。ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液中のリン脂質濃度を、ホスホモリブデンブルー法によって決定したところ、５７．７６±０．５３ｍＭであった。
ＡＫＧ－３８（遊離塩基）を０．９５当量の１Ｎ ＨＣｌと混合し、内毒素非含有水で埋め合わせて、１９．７ｍｇ／ｍｌの水性ストック溶液（ｐＨ５．１１）を得た。溶液を、０．２μｍフィルターを通過させ、３５０９ｍｇの薬物を含有する量の濾液をＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、４４．５ｍｇ／ｍｌのデキストロース、１０ｍＭのＮａＣｌ、および８ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８濃度、ｐＨ５．５０の存在下、４５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比で充填混合物を形成させた。５分間にわたって一定に撹拌しながら外部加熱によって混合物を６１．６℃に加熱し、６５℃浴上、さらに２０分間撹拌しながらインキュベーションを継続した。次いで、混合物を氷水浴中に移し、７分間撹拌して、温度を１０℃に低下させ、氷水浴中でさらに８分間保持した。氷浴から取り出し、周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストックを添加することによって０．１Ｍ ＮａＣｌに調製した後、薬物充填リポソームを、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約２２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８に予め濃縮し、合計７．８倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍのＰＥＳ大流量滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－３８ ２２．４７±０．３８ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比４４１．６ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １２１．３ｎｍ、ＰＤＩ ０．０４６５。製剤化された薬物の収量は、３３７５ｍｇ（９６．２％）であった。
ロット２８９。Ｌｓ－２８８のプロセスを、１５０６ｍｇのＡＫＧ－３８を使用して繰り返した（同様に調製された２０．０ｍｇ／ｍｌの水性ストック溶液、ｐＨ５．１５）。溶液を、同じＴＦＦ後の押し出されたリポソーム懸濁液と混合して、４４．５ｍｇ／ｍｌのデキストロース、１０ｍＭ ＮａＣｌ、および８ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８濃度、ｐＨ５．５３の存在下、４５０ｇ／ｍｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比の充填混合物を形成させた。２分間にわたって一定に撹拌しながら外部加熱によって混合物を６４．３℃に加熱し、６５℃浴上、さらに２０分間撹拌しながらインキュベーションを継続した。次いで、混合物を氷水浴中に移し、２．７５分間撹拌して、温度を９．６℃に低下させ、氷水浴中でさらに１４分間保持した。氷浴から取り出した後、充填混合物を周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストック；ｐＨ６．５４を用いて０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した。薬物充填リポソームを、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約２２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８に予め濃縮し、合計８．１倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍのＰＥＳ大流量滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－３８ ２２．８４±０．４１ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比４５２．７ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １２０．３ｎｍ、ＰＤＩ ０．０５２２。製剤化された薬物の収量は、１４０７ｍｇ（９３．４％）であった。
ロット２９０。実施例６の一般的手順に従った。ＨＳＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）７．８６ｇ（１０．００ｍｍｏｌ）、コレステロール（Ｄｉｓｈｍａｎ、Ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ）４．７３ｇ（１２．２２ｍｍｏｌ）、およびＰＥＧ－ＤＳＰＥ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）１．３５ｇ（０．５０ｍｍｏｌ）（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ ４５：５５：２．２５のモル比）を、１５ｍｌの無水エタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｅ－７０２３）と混合し、全ての脂質が溶解するまで６９～７０℃の浴上で撹拌しながら加熱した。別の容器中で、１５５．５ｇ（１５０ｍｌ）の０．５Ｍ水性硫酸アンモニウム（０．２μｍ濾過された）を、７０℃浴上で予め加熱し、熱い脂質エタノール溶液中に撹拌しながら注ぎ入れた。得られた懸濁液を７０℃浴上で少なくとも２０分間撹拌し、２つの部分に分割した。それぞれの部分を、７０℃の水を循環させながら加熱したＬｉｐｅｘ １００ｍｌサーモバレルリポソーム押出装置（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、２つの４７ｍｍ １００ｎｍ孔径および１つの２００ｎｍ孔径のポリカーボネートトラックエッチドメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）のスタックを通して２８０ｐｓｉで４回押し出した。これらの部分的に押し出されたリポソーム部分を混合し（Ｘｚ １３１．５ｎｍ）、同じメンブレンスタックを通してさらに４回、一緒に押し出したところ、サイズＸｚ １２２．７ｎｍ、ＰＤＩ ０．０２１５のリポソームが得られた。リポソームを、冷蔵庫（２～８℃）中で一晩保持し、陽圧下で０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過した。リン脂質濃度は、５８．９９±０．２２ｍＭであることがわかった。残存する伝導度が５．５倍量の交換後に１４６μＳ／ｃｍに低下するまで、ＭＷカットオフ５００ＫＤａを有するポリスルホン中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上、内毒素非含有水へのＴＦＦ緩衝液交換によって、リポソーム外の捕捉剤（硫酸アンモニウム）を除去した。ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液中のリン脂質濃度を、ホスホモリブデンブルー法によって決定したところ、５６．９４±０．４１ｍＭであった。
ＡＫＧ－３８（遊離塩基）を０．９５当量の１Ｎ ＨＣｌと混合し、内毒素非含有水で埋め合わせて、２０ｍｇ／ｍｌの水性ストック溶液（ｐＨ５．１５）を得た。溶液を、０．２μｍフィルターを通過させ、２３１５ｍｇの薬物を含有する量の濾液をＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、４４．５ｍｇ／ｍｌのデキストロース、１０ｍＭのＮａＣｌ、および８．０２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８濃度、ｐＨ５．５２の存在下、４５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比で充填混合物を形成させた。３．２５分間にわたって一定に撹拌しながら外部加熱によって混合物を６４．４℃に加熱し、６５℃浴上、さらに１７分間撹拌しながらインキュベーションを継続した。次いで、混合物を氷水浴中に移し、撹拌して１０℃より下となるように温度を低下させ、合計１０分間氷水浴中で保持し、周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストック；ｐＨ６．６３を用いて０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した。薬物充填リポソームを、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約２２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８に予め濃縮し、合計８．０倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍのＰＥＳ大流量滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－３８ ２２．０７±０．２３ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比４４１．６ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １２０．４ｎｍ、ＰＤＩ ０．０３９５。製剤化された薬物の収量は、２１４１ｍｇ（９２．５％）であった。
ロット２９２。ロット２８８（１５０．３ｇ）、２８９（６１．２ｇ）、および２９０（１９．５ｇ）を混合して、２２．５ｍｇ／ｍｌのリポソーム製剤化されたＡＫＧ－３８で２７８．４ｇのロット２９２を得た。全てのリポソーム製剤を２～８℃で保存した。
［実施例３０］
リポソームＡＫＧ－２８ロット２３５の調製
実施例６の一般的手順に従った。ＨＳＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）９４０ｍｇ（１．２０ｍｍｏｌ）、コレステロール（Ｄｉｓｈｍａｎ，Ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ）５６８ｍｇ（１．４７ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）１６３ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）、および０．００１８ｍｍｏｌの親油性蛍光標識ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，ＵＳＡ）（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ：ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ ４５：５５：２．２５：０．０６７５のモル比、ＨＳＰＣに対して０．１５ｍｏｌ％のＤｉＩ３－ＤＳ）を、２ｍｌの無水エタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｅ－７０２３）と混合し、全ての脂質が溶解するまで６８℃浴上で撹拌しながら加熱した。別の容器中で、２０ｍｌの０．５Ｍ水性硫酸アンモニウム溶液（０．２μｍ濾過された）を、６８℃浴上で予め加熱し、熱い脂質エタノール溶液中に撹拌しながら注ぎ入れた。得られた懸濁液を６８℃浴上で２０分間撹拌し、６８℃の水を循環しながら加熱したＬｉｐｅｘ １００ｍｌサーモバレルリポソーム押出装置（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、２つの４７ｍｍの１００ｎｍ孔径および１つの２００ｎｍ孔径のポリカーボネートトラックエッチドメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）のスタックを通して３００ｐｓｉで８回押し出した。得られた押し出されたリポソームを、冷蔵庫（２～８℃）中で一晩保持し、陽圧下で０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過した。残存する伝導度が６０μＳ／ｃｍ（１０倍量の交換）に低下するまで、ＭＷカットオフ５００ＫＤａを有するポリスルホン中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上、内毒素非含有水へのＴＦＦ緩衝液交換によって、リポソーム外の捕捉剤（硫酸アンモニウム）を除去した。ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液中のリン脂質濃度を、ホスホモリブデンブルー法によって決定したところ、３７．５６±０．６２ｍＭであった。
２０ｍｇ／ｍｌ水性ストック溶液（ＮａＯＨでｐＨ４．９９に調整）の形態の５０ｍｇのＡＫＧ－２８（二塩酸塩として）を、ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、１４０ｍｇ／ｍｌのデキストロースおよび３ｍｇ／ｍｌの濃度のＡＫＧ－２８の存在下、２５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比の充填混合物を形成させた。混合物（ｐＨ５．５３）を６５℃浴上で撹拌しながら２０分間インキュベートし、氷水中で急速に冷却し、氷水浴中で約１０分間保持した。周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストック溶液で０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した後、ｐＨは５．８０であった。薬物充填リポソームを、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約５ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－２８に予め濃縮し、合計１０倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。精製されたリポソームを、シリンジ操作された小型の５００ＫＤの中空繊維カートリッジ（ＭｉｃｒｏＫｒｏｓ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を使用するＴＦＦによってさらに２倍濃縮した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍの滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－２８ ８．２２±０．１６ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比２５７．３±１０．３ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １１８．２ｎｍ、ＰＤＩ ０．０１８８。製剤化された薬物の収量は、４１．４ｍｇ（８２．８％）であった。
［実施例３１］
リポソームＡＫＧ－３８ロット２３６の調製
実施例３０の０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含有するＴＦＦ後の押し出されたリポソームを使用した。ＡＫＧ－３８（遊離塩基）を０．９５当量の１Ｎ ＨＣｌと混合し、内毒素非含有水で埋め合わせて、２０ｍｇ／ｍｌの水性ストック溶液（ｐＨ５．１１）を得た。溶液を、０．２μｍフィルターを通過させ、７０ｍｇの薬物を含有する量の濾液をＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して（実施例３０）、１４０ｍｇ／ｍｌのデキストロースおよび３ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８濃度の存在下、４５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比で充填混合物を形成させた。混合物を６５℃浴上で撹拌しながら２０分間インキュベートし、氷水中で急速に冷却し、氷水浴中で約１０分間保持した。周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストック溶液で０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した後、ｐＨは６．３３であった。薬物充填リポソームを、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約６ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８に予め濃縮し、合計約１０倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。精製されたリポソームを、シリンジ操作された小型の５００ＫＤの中空繊維カートリッジ（ＭｉｃｒｏＫｒｏｓ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を使用するＴＦＦによってさらに２倍濃縮した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍの滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－３８ ９．０４±０．１６ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比４６３．９±１９．８ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １１９．３ｎｍ、ＰＤＩ ０．０２６７。製剤化された薬物の収量は、５６ｍｇ（８０％）であった。
［実施例３２］
血漿の存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのロット２３５および２３６のリポソーム中での封入された薬物の保持
３７℃の８０％マウスのヒト血漿の存在下でのリポソーム中での封入された薬物の保持を、本明細書の実施例１９に記載のように決定した。インキュベーション時間は２０分であった。
これらのリポソームは、血漿と接触した薬物のバースト放出に対して安定的であった。
［実施例３３］
リポソームＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８ロット２３１、２３２（ＨＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ ４５：５５：２．２５のモル比、捕捉剤０．５Ｍ硫酸アンモニウム）の調製
実施例６の一般的手順に従った。ＨＳＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）４．２５５ｇ（５．４１ｍｍｏｌ）、コレステロール（Ｄｉｓｈｍａｎ、Ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ）２．５６ｇ（６．６２ｍｍｏｌ）、およびＰＥＧ－ＤＳＰＥ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）７２９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ ４５：５５：２．２５のモル比）を、９ｍｌの無水エタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｅ－７０２３）と混合し、全ての脂質が溶解するまで７０℃浴上で撹拌しながら加熱した。別の容器中で、９０ｍｌの０．５Ｍ水性硫酸アンモニウム溶液（０．２μｍ濾過された）を、７０℃浴上で予め加熱し、熱い脂質エタノール溶液中に撹拌しながら注ぎ入れた。得られた懸濁液を７０℃浴上で２５分間撹拌し、７０℃の水を循環しながら加熱したＬｉｐｅｘ １００ｍｌサーモバレルリポソーム押出装置（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、２つの４７ｍｍの１００ｎｍ孔径および１つの２００ｎｍ孔径のポリカーボネートトラックエッチドメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）のスタックを通して２６０ｐｓｉで８回押し出した。得られた押し出されたリポソームを、冷蔵庫（２～８℃）中で一晩保持し、陽圧下で０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過した。残存する伝導度が６０μＳ／ｃｍ（１０倍量の交換）に低下するまで、ＭＷカットオフ５００ＫＤａを有するポリスルホン中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上、内毒素非含有水へのＴＦＦ緩衝液交換によって、リポソーム外の捕捉剤（硫酸アンモニウム）を除去した。ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液中のリン脂質濃度を、ホスホモリブデンブルー法によって決定したところ、４６．９７±０．８０ｍＭであった。
ロット２３１。２０ｍｇ／ｍｌ水性ストック溶液（ＮａＯＨでｐＨ５．０２に調整）の形態の３５０ｍｇのＡＫＧ－２８（二塩酸塩として）を、ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、１３７．６ｍｇ／ｍｌのデキストロースおよび２．５３ｍｇ／ｍｌの濃度のＡＫＧ－２８の存在下、２５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比の充填混合物を形成させた。混合物（ｐＨ５．６０）を６５℃浴上で撹拌しながら２０分間インキュベートし、氷水中で急速に冷却し、氷水浴中で約１０分間保持した。周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストック溶液で０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した後、ｐＨは５．６８であった。薬物充填リポソームを、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約９ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－２８に予め濃縮し、合計１０．９倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。精製されたリポソームを、緩衝液を供給せずにＴＦＦ透析濾過を継続することによって約１２ｍｇ／ｍｌの薬物にさらに濃縮した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍの滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－２８ １１．４２±０．０９ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比２４７．７±７．１ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １１６．５ｎｍ、ＰＤＩ ０．０５１１。製剤化された薬物の収量は、３２２．７ｍｇ（９２．２％）であった。
ロット２３２。ＡＫＧ－３８（遊離塩基）を０．９５当量の１Ｎ ＨＣｌと混合し、内毒素非含有水で埋め合わせて、２０ｍｇ／ｍｌの水性ストック溶液（ｐＨ５．０９）を得た。溶液を、０．２μｍフィルターを通過させ、５８０ｍｇの薬物を含有する量の濾液を、本実施例のＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、１３７．６ｍｇ／ｍｌのデキストロース、２．５３ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８濃度、ｐＨ５．７２の存在下、５００ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比で充填混合物を形成させた。混合物を６５℃浴上で撹拌しながら２０分間インキュベートし、氷水中で急速に冷却し、氷水浴中で約１０分間保持した。周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストック溶液で０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した後、ｐＨは６．４０であった。薬物充填リポソームを、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約１２ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８に予め濃縮し、合計８．５倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。精製されたリポソームを、緩衝液を供給せずｎＴＦＦ透析濾過を継続することによってさらに２倍濃縮した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍの滅菌フィルターを無菌的に通過させ、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－３８ １６．０３±０．０７ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比４８７．３±１３．９ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １２０．０ｎｍ、ＰＤＩ ０．００６９。製剤化された薬物の収量は、５３８．９ｍｇ（９２．９％）であった。
［実施例３４］
リポソームＡＫＧ－２８ロット２３３（ＨＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＳＧ ６０：４０：３のモル比、捕捉剤１Ｎ八硫酸トリエチルアンモニウムスクロース）の調製
実施例６の一般的手順に従った。ＨＳＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）１．８８ｇ（２．４ｍｍｏｌ）、コレステロール（Ｄｉｓｈｍａｎ、Ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ）６１９ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）、およびＰＥＧ－ＤＳＧ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＧＳ－０２０、ＮＯＦ、Ｊａｐａｎ）３１２ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を、３ｍｌの無水エタノール中で混合し、全ての脂質が溶解するまで６７℃浴上で撹拌しながら加熱した。別の容器中で、３１．５ｇ（３０ｍｌ）の１Ｎ水性八硫酸トリエチルアンモニウムスクロース溶液（０．２μｍ濾過、ｐＨ６．２０、実施例８を参照）を、６５℃浴上で予め加熱し、熱い脂質エタノール溶液中に撹拌しながら注ぎ入れた。得られた懸濁液を６５℃浴上で５分間撹拌し、６５℃の水を循環しながら加熱したＬｉｐｅｘ １００ｍｌサーモバレルリポソーム押出装置（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、４つの４７ｍｍの１００ｎｍ孔径および１つの２００ｎｍ孔径のポリカーボネートトラックエッチドメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）のスタックを通して４００ｐｓｉで３回押し出した。得られた押し出されたリポソームを、冷蔵庫（２～８℃）中で一晩保持し、陽圧下で０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過した。保持液の伝導度が２１μＳ／ｃｍ（１４．５倍量の交換）に低下するまで、ＭＶカットオフ５００ｋＤａを有するポリスルホン中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上での内毒素非含有水へのＴＦＦ緩衝液交換によってリポソーム外の捕捉剤（ＴＥＡ－ＳＯＳ）から９．２ｇの押し出されたリポソームを精製した。ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液中のリン脂質濃度を、ホスホモリブデンブルー分光測光法によって決定したところ、３１．３２±０．８５ｍＭであった。
２０ｍｇ／ｍｌ水性ストック溶液（ＮａＯＨでｐＨ５．０２に調整）の形態の１４０ｍｇのＡＫＧ－２８（二塩酸塩として）を、ＴＦＦ後のリポソーム懸濁液と混合して、１１６．１ｍｇ／ｍｌのデキストロースおよび２．５２ｍｇ／ｍｌの濃度のＡＫＧ－２８の存在下、２５０ｇ／ｍｏｌの薬物とリン脂質（ＤＬ）の比の充填混合物を形成させた。混合物（ｐＨ５．４３）を６５℃浴上で撹拌しながら２０分間インキュベートし、氷水中で急速に冷却し、氷水浴中で約１０分間保持した。周囲温度に到達させ、３Ｍ ＮａＣｌストック溶液で０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した後、ｐＨは５．８０であった。薬物充填リポソームを、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するＴＦＦによって精製した。リポソームを、透析濾過によって約９ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－２８に予め濃縮し、合計１０．９倍量の交換にわたってＨＢＳ－７緩衝液中でのＴＦＦ交換によってリポソーム外の薬物から精製した。精製されたリポソームを、緩衝液を供給せずにＴＦＦ透析濾過を継続することによって約１２ｍｇ／ｍｌの薬物にさらに濃縮した。濃縮、精製されたリポソームを、０．２μｍの滅菌フィルターを無菌的に通過させ（ＨＢＳ－７緩衝液で追い出した）、ＤＬＳにより粒径について、ならびに分光法により薬物およびリン脂質濃度について分析した。リポソームは、以下の特徴を有していた：ＡＫＧ－２８ １０．６４±０．２０ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比２４６．８±１１．７ｇ／ｍｏｌリン脂質、Ｘｚ １１６．３ｎｍ、ＰＤＩ ０．００２２。製剤化された薬物の収量は、１１８．２ｍｇ（８４．４％）であった。
［実施例３５］
リポソームＡＫＧ－３８ロット２３４の調製物（ＨＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ ４５：５５：２．２５モル比、捕捉剤１Ｎトリエチルアンモニウムスクロオクタ硫酸塩）
実施例６の一般的な手順に従った。ＨＳＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）３．３０ｇ（４．２０ｍｍｏｌ）、コレステロール（Ｄｉｓｈｍａｎ、高純度）１．９８５ｇ（５．１３ｍｍｏｌ）、およびＰＥＧ－ＤＳＰＥ（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）５６７ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）（ＨＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＳＰＥ ４５：５５：２．２５モル比）を７ｍｌの無水エタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｅ－７０２３）中で混合し、全ての脂質が溶解するまで７０℃の浴上で撹拌しながら加熱した。別個の容器中で、１Ｎのトリエチルアンモニウムスクロオクタ硫酸塩（ＴＥＡ－ＳＯＳ）水溶液（０．２ミクロン濾過）１０ｍｌを７０℃の浴上で予熱し、撹拌しながら熱い脂質エタノール溶液に注いだ。得られた懸濁液を７０℃の浴上で１０分間撹拌し、循環７０℃の水で加熱したＬｉｐｅｘ １００ｍｌサーモバレルリポソーム押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、２つの４７ｍｍ １００ｎｍの孔径および１つの２００ｎｍの孔径ポリカーボネートトラックエッチング膜（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）の積層体を通して２６０ｐｓｉで８回、押し出した。得られた押出リポソームを冷蔵庫（２～８℃）中で一晩保持し、０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して陽圧下で濾過した。リン脂質濃度は５４．６ｍＭであった。１１．３３ｇの押出リポソームを、ＭＷカットオフ５００ＫＤａ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のポリスルホン中空繊維カートリッジを用いたＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステム上のエンドトキシン不含水のためのＴＦＦ緩衝交換によりリポソーム外の捕捉剤（ＴＥＡ－ＳＯＳ）から精製し、残留物の導電性が６４μＳ／ｃｍに低下するまで維持した（１３．８体積交換）。ＴＦＦ後リポソーム懸濁液中のリン脂質濃度は、ブルーリンモリブデン酸分光光度法により２８．６７±１．０１ｍＭであると測定した。
ＡＫＧ－３８（遊離塩基）を０．９５当量の１Ｎ ＨＣｌと混合し、エンドトキシン不含水で調製して、２０ｍｇ／ｍｌ水性原液（ｐＨ５．０９）を得た。溶液を０．２μｍフィルターに通し、２５０ｍｇの薬物を含有する濾液の量を、本実施例のＴＦＦ後リポソーム懸濁液と合わせて、１１６．４ｍｇ／ｍｌデキストロース、２．５３ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８濃度、ｐＨ５．２４の存在下で５００ｇ／ｍｏｌの薬物－リン脂質（ＤＬ）比で充填混合物を形成した。混合物を６５℃の浴上で２０分間撹拌しながらインキュベートし、氷水中で迅速に冷却し、氷水浴中で約１０分間保持した。周囲温度に到達し、３Ｍ ＮａＣｌストック溶液で０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した後、ｐＨは６．６０であった。薬物充填リポソームを、分子量カットオフ５００ＫＤのポリスルホン中空繊維カートリッジを用いて、ＴＦＦにより精製した。リポソームを、約１０ｍｇ／ｍｌのＡＫＧ－３８への透析濾過によって予め濃縮し、全８．０体積交換のためにＨＢＳ－７緩衝液中へのＴＦＦ交換によって任意のリポソーム外の薬物から精製した。精製されたリポソームは、緩衝液供給なしでＴＦＦ透析濾過を継続することにより、さらに約２倍濃縮された。濃縮精製リポソームを無菌的に０．２μｍ滅菌フィルターに通し、ＤＬＳにより粒径を分析し、分光光度法により薬物およびリン脂質濃度を分析した。リポソームは、ＡＫＧ－３８ １５．７１±０．３３ｍｇ／ｍｌ、ＤＬ比５１８．６±１８．４ｇ／ｍｏｌリン脂質、リポソームサイズＸｚ １１４．３ｎｍ、ＰＤＩ ０．０２８４の特徴を有した。製剤化薬物の収量２３５．７ｍｇ（９４．３％）。
［実施例３６］
リポソームへのＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８の充填効率および血漿中のリポソームによる薬物保持における浸透剤濃度の影響
実施例６の一般的なプロトコールに従った。０．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび４５：５５：２．２５：０．０６７５のモル比のＨＰＳＣ、コレステロール、ＰＥＧ－ＤＳＰＥおよびＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ（蛍光脂質標識）の脂質組成物を含有する押出リポソームを実施例３０に記載されるように調製した。リポソームを、注射用水（ＷＦＩ）のための無エンドトキシン水（Ｈｙｃｌｏｎｅ）とのＴＦＦ交換により、シリンジ作動マイクロクロスポリスルホン中空繊維カートリッジ（ＭＷＣＯ５００ＫＤａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１３．８体積交換、残留伝導率８８μＳ／ｃｍ、リン脂質濃度５５．４ｍＭ）を用いて、リポソーム外の硫酸アンモニウムから精製した。種々の濃度の浸透剤（デキストロース）の存在下、薬物濃度２．２２ｍｇ／ｍｌおよびＤＬ比２５０ｇ／ｍｏｌリン脂質（ＡＫＧ－２８）または４５０ｇ／ｍｏｌリン脂質（ＡＫＧ－３８）で、リポソームに、薬物（実施例３０および３１に記載されたように水性２０ｍｇ／ｍｌストックとして調製される）を、２０分間、６５℃の水浴中の水溶液中の精製押出リポソームとともにインキュベーションすることによって、ＡＫＧ－２８またはＡＫＧ－３８を充填した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ、溶出液ＨＢＳ－７緩衝液を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりカプセル封入されていない薬物を除去し、薬物およびリン脂質分析の結果から充填（カプセル封入）効率を測定した。浸透剤濃度は、絶対的な用語で、およびリポソームを形成するために使用される０．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液に対して等浸透性であると決定された１６８ｍｇ／ｍｌデキストロース濃度のパーセントとして表した。リポソーム分野における一般的なコンセンサスからの期待に反して、薬物は、低浸透圧条件下（すなわち、リポソーム内捕捉剤溶液の浸透圧よりも低いリポソーム外の溶液の浸透圧で）でさえ、添加された浸透圧平衡剤（デキストロース）の完全な非存在下まで、開示のリポソームに効果的に充填された（封入効率が８５％を超え、大部分が９０％を超える）（表２２）。さらに、実施例１９に記載されたｉｎ ｖｉｔｒｏ血漿放出アッセイの条件下で血漿に曝露すると、浸透剤の最低濃度で充填されたリポソーム中の薬物カプセル封入は、ほぼ完全な（８６．３％）浸透圧平衡で充填されたものと少なくとも同程度に安定であった。
結果は、リポソームが５５ｍｏｌ％Ｃｈｏｌ、４５ｍｏｌ％ＰＣ、５ｍｏｌ％ＨＳＰＣでＰＥＧ－ＤＳＰＥ、および０．５ＭＡＳ捕捉剤でＡＫＧ－２８（表２２）とＡＫＧ－３８（表２３）の両方を効率＞８５％、大部分＞９０％で２５０または５００ｇ／ｍｏｌＰｈＬで充填し、デキストロースゼロパーセントまでの低浸透圧条件下で、低浸透圧条件下で充填したリポソームが血漿の存在下で薬物を効率的に保持することを示した。
［実施例３７］
ラットにおけるＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の全形態（カプセル封入＋放出薬物）の単回用量薬物動態試験
本研究は、ラットにおいてＬｓ－ＡＫＧ２８とＬｓ－ＡＫＧ３８を単回用量として投与したＡＫＧ２８とＡＫＧ３８のＰＫを評価するために行われた。本研究は、雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、体重１ｋｇあたり２０、４０、８０ｍｇのリポソームＡＫＧ－３８（Ｌｓ－ＡＫＧ３８）、または体重１ｋｇあたり１０、２０、４０ｍｇのリポソームＡＫＧ－２８（Ｌｓ－ＡＫＧ２８）のＩＶ投与を用いて行われた。Ｌｓ－ＡＫＧ２８（ロット２７５）およびＬｓ－ＡＫＧ３８（ロット２７６）を、それぞれ実施例２２および２３に記載したように調製した。比較のため、０．５％メチルセルロースを製剤化したリネゾリド５０ｍｇ／ｋｇ体重を強制経口投与し、２０ｍｇ／ｍＬの濃度でｐＨ３～４（Ｓｉｇｍａ Ｍ０４３０）に酸性化した。血漿薬物測定のために、血液０．５ｍｌをリチウムヘパリンチューブに５分、１５分、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、および７２時間で回収した。試料を遠心分離し、得られた血漿を分離し、二重透明ポリプロピレンチューブに移し、ドライアイス上で直ちに凍結し、分析まで－８０℃で保存した。ラットの血漿中濃度をＨＰＬＣにより決定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（バージョン７．０）を用いて非コンパートメントＰＫ分析を行った。Ｌｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８については、このＰＫソフトウェアを使用して、血漿最大濃度（Ｃｍａｘ）、血漿最大濃度を用量で割った値（Ｃｍａｘ／用量）、Ｃｍａｘの時間（Ｔｍａｘ）、最後に測定された濃度（Ｃｌａｓｔ）、最後に測定された濃度の時間（Ｔｌａｓｔ）、０ｈから最後の時点までの時間曲線に対する血漿濃度下面積（ＡＵＣ０－ｌａｓｔ）および０ｈから無限大（ＡＵＣ０－ｉｎｆ）、ＡＵＣ０－ｌａｓｔを用量で割った値（ＡＵＣ０－ｌａｓｔ／用量）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖｄ）、および排出半減期（Ｔ１／２）を推定した。リネゾリドについては、このＰＫソフトウェアを用いて、見かけのクリアランス（ＣＬ／Ｆ）および見かけの分布体積（Ｖｄ／Ｆ）以外の同じＰＫパラメータを推定した。
１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ内投与（ＩＶ×１）でのＬｓ－ＡＫＧ２８の投与後の全薬物の血漿濃度対時間プロファイルを図７に示す。Ｌｓ－ＡＫＧ２８を１０、２０、４０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ×１で投与した後の全薬物の血漿ＰＫパラメータの概要を表２４に示す。
全用量で、Ｌｓ－ＡＫＧ２８の血漿濃度対時間プロファイルは５分から７２時間まで検出可能であった。Ｃｍａｘ／用量およびＡＵＣ／用量の結果に基づき、Ｌｓ－ＡＫＧ２８の血漿ＰＫは１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇ投与後に直線（用量比例）であった。全用量で、Ｌｓ－ＡＫＧ３８（約２．５９ｍＬ／ｈ／ｋｇ）の血漿クリアランス（ＣＬ）はＬｓ－ＡＫＧ２８（約１．６７ｍＬ／ｈ／ｋｇ）より大きかった。同じ用量（２０または４０ｍｇ／ｋｇ）で、Ｌｓ－ＡＫＧ２８のＶｄはＬｓ－ＡＫＧ３８より大きかった。
Ｌｓ－ＡＫＧ３８の２０、４０、および８０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ×１での投与後の全薬物の血漿濃度対時間プロファイルを図８に示す。
Ｌｓ－ＡＫＧ３８の２０、４０、８０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ×１投与後の全薬物の血漿ＰＫパラメータの概要を表２５に示す。
全用量で、Ｌｓ－ＡＫＧ３８の血漿濃度対時間プロファイルは５分から７２時間まで検出可能であった。Ｃｍａｘ／用量およびＡＵＣ／用量の結果に基づいて、Ｌｓ－ＡＫＧ３８の血漿ＰＫは２０、４０、および８０ｍｇ／ｋｇの投与後に直線（用量比例）であった。全用量で、Ｌｓ－ＡＫＧ３８（約２．５９ｍＬ／ｈ／ｋｇ）の血漿クリアランス（ＣＬ）はＬｓ－ＡＫＧ２８（約１．６７ｍＬ／ｈ／ｋｇ）より大きかった。同じ用量（２０または４０ｍｇ／ｋｇ）で、Ｌｓ－ＡＫＧ２８のＶｄはＬｓ－ＡＫＧ３８より大きかった。
Ｌｓ－ＡＫＧ２８を１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ×１で投与した後、ならびにＬｓ－ＡＫＧ３８を２０、４０、および８０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ×１で投与した後の全薬物の血漿濃度対時間プロファイルをそれぞれ図７および図８に示す。単回ＩＶ用量研究では、全用量において、Ｌｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の血漿濃度対時間プロファイルが５分から７２時間まで検出可能であった。Ｌｓ－ＡＫＧ２８の血漿ＰＫは、１０、２０、４０ｍｇ／ｋｇ投与後には直線（用量比例）であった。Ｌｓ－ＡＫＧ３８の血漿ＰＫは、２０、４０、および８０ｍｇ／ｋｇ投与後に直線（用量比例）であった。全用量で、Ｌｓ－ＡＫＧ３８（約２．５９ｍＬ／ｈ／ｋｇ）の血漿クリアランス（ＣＬ）はＬｓ－ＡＫＧ２８（約１．６７ｍＬ／ｈ／ｋｇ）より大きかった。同じ用量（２０または４０ｍｇ／ｋｇ）で、Ｌｓ－ＡＫＧ２８のＶｄはＬｓ－ＡＫＧ３８より大きかった。４０ｍｇ／ｋｇでのＬｓ－ＡＫＧ２８とＬｓ－ＡＫＧ３８の全血漿ＰＫ曝露量は、リネゾリドの血漿ＰＫ（０から最後までのＡＵＣを使用）の約７３倍と約１１０倍高かった。
血漿中のＡＵＣおよび循環中の薬物持続性は、リネゾリドと比較して両リポソーム製剤ではるかに大きかった。ＡＵＣ／用量の値によって見られるように線形用量依存性を有する両リポソーム製剤のＰＫは、Ｌｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８にそれぞれ非常に類似している。
［実施例３８］
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける反復ＩＶ投薬後の全形態（カプセル封入＋放出）のＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の血漿薬物動態（ＰＫ）
本研究は、ラットにおいて、Ｌｓ－ＡＫＧ２８とＬｓ－ＡＫＧ３８の漸増用量で、計８週間、週１回投与したＡＫＧ２８とＡＫＧ３８のＰＫを評価するために行われた。この試験は、Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにＩＶ投与して行われた。Ｌｓ－ＡＫＧ２８（ロット２７５）およびＬｓ－ＡＫＧ３８（ロット２７６）を実施例２２および２３にそれぞれ記載したように調製し、ラットにおける血漿濃度をＨＰＬＣにより決定した。Ｌｓ－ＡＫＧ２８を１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ×１で、１日目、１５日目、２９日目、および４３日目に投与した後の全薬物の血漿濃度対時間プロファイルを、表２６および図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃに示す。Ｌｓ－ＡＫＧ２８を１０、２０、４０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ×１日目、１日目、１５日目、２９日目、４３日目に投与した後の全薬物の血漿ＰＫパラメータの概要を表２６に示す。図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃの全てのデータは、表２６におけるＰＫパラメータ結果を生成するために使用された。
単回および複数回用量のＰＫ研究では、Ｌｓ－ＡＫＧ２８の血漿中動態は初回投薬後に同様であった。１０ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ２８では、血漿ＣｍａｘとＡＵＣは第１、１５、２９、および４３日で同様であった。Ｌｓ－ＡＫＧ２８の２０ｍｇ／ｋｇでは、血漿ＣｍａｘとＡＵＣは２９日目と４３日目に増加した。４０ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ２８では、血漿ＣｍａｘとＡＵＣは１～４３日目の投薬後に増加した。
１日目、１５日目、２９日目、および４３日目にＬｓ－ＡＫＧ３８を２０、４０、および８０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ×１で投与した後の全薬物の血漿濃度対時間プロファイルを表２７および図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃに示す。Ｌｓ－ＡＫＧ３８の２０、４０、８０ｍｇ／ｋｇ静注×１日目、１日目、１５日目、２９日目、４３日目に投与した後の全薬物の血漿ＰＫラメータの概要を表２７に示す。単回および複数回用量のＰＫ試験では、Ｌｓ－ＡＫＧ３８の血漿中動態は初回投薬後と同様であった。２０、４０、８０ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ３８では、血漿ＣｍａｘとＡＵＣは１日目から４３日目に増加した。非細胞傷害性薬物ペイロードを含むペグ化リポソームに対する血液クリアランス（ＡＢＣ）の加速に対する懸念を考慮すると、後のサイクルでクリアランスの増加がないことは驚くべきことであり、ＡＫＧ－２８またはＡＫＧ－３８を含有するリポソームは哺乳動物に慢性的に投薬し得ることが示唆される。
［実施例３９］
ＣＤ－１マウスにおけるＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の薬物およびリポソーム脂質の薬物動態研究
本研究は、ｉｎ ｖｉｖｏ血漿中の薬物およびリポソーム脂質の血中薬物動態パラメータ、ならびにＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８のリポソーム製剤のリポソームにおける薬物保持の安定性を決定するために設計された。試験は、上記実施例７の一般的なプロトコールに記載されているように、雄ＣＤ－１（２０～２２ｇ）マウスについて行われた（時間点あたり５匹のマウス）。Ｌｓ－ＡＫＧ２８（ロット２３５）およびＬｓ－ＡＫＧ３８（ロット２３６）を、それぞれ実施例３０および３１に記載したように調製した。５０ｍｇ／ｋｇ（Ｌｓ－ＡＫＧ２８）または９０ｍｇ／ｋｇ（Ｌｓ－ＡＫＧ３８）の用量のリポソームを時間０に側尾静脈に注射し、血液を注射後０．０８３、１、３、６、２４、および４８時間に採取した。ＡＫＧ－２８、ＡＫＧ－３８および蛍光リポソーム脂質標識（ＤｉＩＣ１８（３）－ＤＳ）の血漿濃度をＨＰＬＣにより決定した。リポソームロット２３５および２３６を標準として、蛍光標識定量からリポソームリン脂質の血漿濃度を計算した。非カプセル封入オキサゾリジノン薬物の組織親和性は、リポソームカプセル封入薬物のそれよりも何倍も高いことが予想されるため（例えば、ラットにおけるリポソームカプセル封入ＡＫＧ－２８のＶｄ３３．２７～４３．７４ｍＬ／ｋｇと比較して、非カプセル封入オキサゾリジノン、リネゾリドのＶｄ２，２９１．２６ｍＬ／ｋｇによって支持されるように、実施例３７を参照されたい）、血漿薬物濃度は主にリポソーム関連薬物に起因すると考えられ、元の（注射前）ＤＬ値に対して標準化された血漿薬物－リポソーム脂質（ＤＬ）比はリポソームによる薬物保持の尺度として採用された。非コンパートメントＰＫ分析は、Ｓｕｍｍｉｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ２．０を用いて行われた。Ｌｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８については、このＰＫソフトウェアを使用して、血漿最大濃度（Ｃｍａｘ）、血漿最大濃度を用量で割った値（Ｃｍａｘ／用量）、Ｃｍａｘの時間（Ｔｍａｘ）、最後に測定された濃度（Ｃｌａｓｔ）、最後に測定された濃度の時間（Ｔｌａｓｔ）、０ｈから最後の時点までの時間曲線に対する血漿濃度下面積（ＡＵＣ０－ｌａｓｔ）および０ｈから無限大（ＡＵＣ０－ｉｎｆ）、ＡＵＣ０－ｌａｓｔを用量で割った値（ＡＵＣ０－ｌａｓｔ／用量）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖｄ）、および排出半減期を推定した。
Ｌｓ－ＡＫＧ２８（図１１Ａ）およびＬｓ－ＡＫＧ３８（図１１Ｂ）の投与後の薬物の血漿濃度対時間プロファイルを示す。血漿中のＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８薬物の血漿ＰＫパラメータの概要を表２８に、リポソームリン脂質の概要を表２９に示す。ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物カプセル封入の安定性を示すＤＬ比の動力学を図１１Ｃおよび表３０に示す。
Ｌｓ－ＡＫＧ２８は、ほぼ完全なｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有し、マウスにおけるＩＶ注射後の４８時間まで、薬物の検出不能な喪失を伴う。Ｌｓ－ＡＫＧ２８の薬物放出の半減期は、一指数式（Ｒ２＝０．８２２）を用いると８６６．３時間である。Ｌｓ－ＡＫＧ２８は薬物放出速度が速い。Ｌｓ－ＡＫＧ３８の薬物放出の半減期は、一指数式（Ｒ２＝０．９５０）を用いると２２．９時間である。
［実施例４０］
リポソームの反復投薬後のマウスにおけるＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８薬物の薬物動態研究、ＡＢＣ効果の存在
抗ＰＥＧ抗体の生成は、加速された血液クリアランスとして公知である現象である、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート（ペグ化リポソーム）を含有するリポソームのより速いクリアランス（ＡＢＣ）効果を、反復注射後に引き起こすことが示されている（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０５（２００５）３０５－３１７； Ｌａｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．ＪＰＥＴ ２９８（２００１）６０７－６１２）。本研究は、種々の組成物を有するＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の種々の用量の反復投与後にＡＢＣ効果があるかどうかを決定するために行われた。リポソームは、実施例３３～３５、ロット２３１、２３２、２３３および２３４に従って調製された。この研究は、実施例７に一般的に記載したように、雄ＣＤ－１マウスに対して行われた。群５匹のマウスを用いた。マウスにおけるＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８の血漿濃度をＨＰＬＣにより決定した。マウスは、指示された用量および製剤を週１回、計４回注射された。薬物は、１回目および４回目の投薬後の６時間の時間点で血漿中で測定した（図１２）。試験した群のいずれも、４回目の注射の有意な加速されたクリアランスを示さなかった（両側偏差ｔ検定、全てのｐ値＞０．０５）。このデータは、これらのリポソーム性オキサゾリジノンは、薬物曝露に有意な負の影響を与えることなく、週１回のサイクルを複数回にわたって慢性的に投薬することができることを確認する。
このデータは、４サイクルの処置後に、本開示のリポソームＡＫＧ－２８またはリポソームＡＫＧ－３８の血液クリアランス速度が、リポソームに関連する細胞傷害性薬物を含有しない他のペグ化リポソームについて以前に報告されたものとは対照的に、増加しなかったことを示す。
［実施例４１］
ＣＤ－１マウスにおけるリポソームＡＫＧ－２８およびリポソームＡＫＧ－３８の用量依存的忍容性
本研究の目的は、マウスに異なる用量で単剤として注射したＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の忍容性を評価することであった。２０～２２ｇ（各群５匹）の雌ＣＤ－１マウスは、Ｌｓ－ＡＫＧ２８（５０、６５、９０または１００ｍｇ／ｋｇ／用量）またはＬｓ－ＡＫＧ３８（５０、９０、１２０または２００ｍｇ／ｋｇ／用量）を週１回、４週間、静脈内注射（尾静脈）で投与された。リポソーム製剤（Ｌｓ－ＡＫＧ２８ロット２３１およびＬｓ－ＡＫＧ３８ロット２３２）は、実施例３３に先に記載したように調製された。対照群は、同量のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、ｐＨ７）を４週間、週１回注射された。研究期間中、体重を週３回測定し、データは０日目に測定した体重に対する体重変化のパーセンテージとして提示した。
研究終了時（最終処置から７２時間後）にＣＯ２吸入を用いて動物を安楽死させた。血液試料を心臓穿刺によって回収し、血液学的分析のためにＥＤＴＡがプレフィルドされたマイクロテーナー（ホモロジーＡＤＶＩＡ １２０／２１２０ｉ Ａｎａｌｙｚｅｒ）および血漿分離のためにリチウムヘパリンでプレフィルドされたマイクロテーナーに移した。血漿を１００００ｒｐｍで５分間遠心分離により細胞画分から分離し、生化学分析に使用した（Ｃｏｂａｓ ６０００ Ａｎａｌｙｚｅｒ）。組織試料（肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、小腸、および柱）を、１０％緩衝ホルマリンをプレフィルドした５０ｍｌチューブに回収し、２４時間後に７０％エタノールに置き換えた。組織をパラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、委員会の認定を受けた獣医病理学者により組織病理学的検査を行った。
図１３Ａおよび図１３Ｂに示されるように、生理食塩水対照群と比較して、Ｌｓ－ＡＫＧ２８については９０ｍｇ／ｋｇまでの用量で、およびＬｓ－ＡＫＧ３８については２００ｍｇ／ｋｇまでの用量で、合計４週間の用量で処理した場合、Ｌｓ－ＡＫＧ２８とＬｓ－ＡＫＧ３８の両方について観察されたマウス体重に有意な影響はなかった。
対照群と比較して、高用量のＬｓ－ＡＫＧ３８（９０、１２０および２００ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスでは、生理食塩水対照群と比較して、赤血球数およびヘマトクリット（図１３Ｃ）の有意な減少はなかった。Ｌｓ－ＡＫＧ２８を投与したマウスでは、このような効果は観察されなかった。最高用量９０ｍｇ／ｋｇ（図１３Ｃ）でＬｓ－ＡＫＧ２８で処理されたマウスにおいて、対照群と比較して血小板数の有意な減少が見られたが、生理食塩水対照と比較して依然として２５％未満の減少であった。Ｌｓ－ＡＫＧ２８またはＬｓ－ＡＫＧ３８のいずれかによる処置は、白血球（ＷＢＣ）数または血中肝酵素（ＡＬＴおよびＡＳＴ）のそれに有意な影響を及ぼさなかった。
組織病理学的分析では、５０および６５ｍｇ／ｋｇのＬｓ－ＡＫＧ２８を投与された動物において被験物質に関連した所見は示されなかった（図１３Ｄ）。９０ｍｇ／ｋｇのＬＳ－ＡＫＧ２８を投与された動物の肝臓、脾臓、および腎臓において、マクロファージ（クッパー細胞を含む）の最小限の空胞化からなる被験物質に関連する所見が認められた。Ｌｓ－ＡＫＧ３８による処置は、９０ｍｇ／ｋｇおよび１２０ｍｇ／ｋｇの用量で、肝臓および脾臓において被験物質に関連した所見と関連していた。肝臓では、５０および９０ｍｇ／ｋｇで軽度から軽度の空胞化およびクッパー細胞の肥大、５０および１２０ｍｇ／ｋｇで中等度のクッパー細胞の空胞化および肥大、９０ｍｇ／ｋｇおよび１２０ｍｇ／ｋｇで空胞化マクロファージの最小限の多巣性凝集が認められた。
最高用量のＬｓ－ＡＫＧ３８（２００ｍｇ／ｋｇ）での処置は、肝臓および脾臓における髄外造血（ＥＭＨ）のわずかな増加、軽微ないし軽度の多巣性混合細胞浸潤、および肝臓におけるごくわずかな個々の肝細胞壊死、ならびにごく軽微な限局性肝細胞壊死と関連していた（図１３Ｄ）。これらの顕微鏡的所見は、被験物質に関連したものとは考えられなかったが、これは、この動物種によくみられるバックグラウンド所見であったためである。
全般的に、Ｌｓ－ＡＫＧ２８とＬｓ－ＡＫＧ３８単独療法の両方は、Ｌｓ－ＡＫＧ２８とＬｓ－ＡＫＧ３８に対してそれぞれ９０と２００ｍｇ／ｋｇのリポソーム薬物を各々の最高評価用量で注射した場合でさえも、マウスにおいて良好なｉｎ ｖｉｖｏ忍容性を示した。
［実施例４２］
マウスにおけるＢＤＱ／ＰＭＤまたはＢＤＱ／ＰＭＤ／ＭＯＸと組み合わせたＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８のｉｎ ｖｉｖｏ忍容性
この実施例では、リポソーム性オキサゾリジノンのｉｎ ｖｉｖｏ忍容性を、治療に関連する抗ＴＢ薬物と併用して評価した。ベダキリン、プレトマンニド、およびリネゾリド（ＢＤＱ／ＰＭＤ／ＬＮＺまたはＢＰＬ）、またはベダキリン、プレトマニド、およびモキシフロキサシン（ＢＤＱ／ＰＭＤ／ＭＯＸＩまたはＢＰＭ）の３つの薬物レジメンは、多剤耐性結核を処置する場合、臨床において強い活性を示したが（Ｃｏｎｒａｄｉｅ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３８２（１０）８９３－９０２ ａｎｄ Ｔｗｅｅｄ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｌａｎｃｅｔ Ｒｅｓｐｉｒ Ｍｅｄ ７（１２）１０４８－１０５８）、ＢＰＬレジメンは、主にリネゾリドの追加に関連する毒性によって制限されている（Ｃｏｎｒａｄｉｅ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３８２（１０）８９３－９０２）。ここでは、２種のリポソーム性オキサゾリジノン、Ｌｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の安全性および忍容性を、ＢＰＬレジメンにおけるリネゾリドの置換またはＢＰＭレジメンへの追加のいずれかにより、両レジメンの一部として使用した場合に評価した。ＣＤ－１マウス（各群５匹）を、Ｌｓ－ＡＫＧ２８（ロット２３１）もしくはＬｓ－ＡＫＧ３８（ロット２３２）単独、またはベダキリン（ＢＤＱ）およびプレトマニド（ＰＭＤ）併用のいずれかで処理した。Ｌｓ－ＡＫＧ２８（ロット２３１）およびＬｓ－ＡＫＧ３８（ロット２３２）を実施例３３に記載したように調製した。さらに、マウスをＢＤＱ、ＰＭＤおよびモキシフロキサシン（ＭＯＸＩ）およびリポソームオキサゾリジノンの三重組合せで同時処理した。
Ｌｓ－ＡＫＧ２８（５０ｍｇ／ｋｇ／用量）およびＬｓ－ＡＫＧ３８（９０ｍｇ／ｋｇ／用量）を、尾静脈を介して週１回、４週間、静脈内注射した。ＢＤＱ、ＰＭＤおよびＭＯＸＩの併用（それぞれ２５／１００／１００ｍｇ／ｋｇ／用量）を1日1回、週５回、４週間強制経口投与した。追加の対照として、マウスは、１００ｍｇ／ｋｇ／用量を1日1回、週５回、４週間、経口的に与えられる、ＢＤＱ／ＰＭＤ／ＭＯＸまたはＢＤＱ／ＰＭＤ（それぞれ２５／１００ｍｇ／ｋｇ／用量）＋リネゾリド（ＬＮＺ）で処理された。体重測定、組織回収および分析は、実施例４１に前述したように行った。
図１４Ａおよび図１４Ｂに示されるように、マウス体重に対するＬｓ－ＡＫＧ２８またはＬｓ－ＡＫＧ３８のいずれも、ＢＤＱ／ＰＭＤ（ＢＰ）またはＢＤＱ／ＰＭＤ／ＭＯＸ（ＢＰＭ）と併用して同時処理した場合には、有意な効果は研究中に観察されなかった。Ｌｓ－ＡＫＧ２８とＬｓＡＫＧ３８はともに、ＢＤＱ／ＰＭＤまたはＢＤＱ／ＰＭＤ／ＭＯＸと組み合わせて良好な忍容性を示し、処置されたマウスにおける血液学または血液生化学に影響を及ぼさなかった（図１４Ｃ）。
組織病理学的データ（図１４Ｄ）は、ＢＤＱ／ＰＭＤと組み合わせたＬｓ－ＡＫＧ２８の場合、処理に関連した変化を示さなかった。Ｌｓ－ＡＫＧ２８＋ＢＤＱ／ＰＭＤ／ＭＯＸの組合せは、肺および心臓における混合細胞および単核細胞浸潤と関連する最小限の事象を有する。単剤療法としてのＬｓ－ＡＫＧ３８による処置は、肝臓において最小限の被験物質に関連した所見（炎症性浸潤および肝細胞壊死）と関連していた。Ｌｓ－ＡＫＧ３８＋ＢＤＱ／ＰＭＤの投与は、処置に関連した所見を示さず、Ｌｓ－ＡＫＧ３８＋ＢＤＱ／ＰＭＤ／ＭＯＸの併用は、肺における最小限の混合細胞浸潤と関連した。ＢＤＱ／ＰＭＤ／ＬＮＺ併用により処理された動物は、肝臓の炎症性浸潤、最小限の肝細胞壊死、および肺の空胞化マクロファージの浸潤の処置関連所見と関連した。したがって、Ｌｓ－ＡＫＧ２８（５０ｍｇ／ｋｇ／用量）とＬｓ－ＡＫＧ３８（９０ｍｇ／ｋｇ／用量）の両方を週１回、４週間投与すると、ＢＤＱ／ＰＭＤまたはＢＤＱ／ＰＭＤ／ＭＯＸと組み合わせたマウスにおいて良好な忍容性が示された。
［実施例４３］
マウスにおけるＢＤＱ／ＰＭＤと組み合わせたＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の忍容性における用量スケジューリングの効果
この研究では、週２回投与したＬｓ－ＡＫＧ２８（５０ｍｇ／ｋｇ／用量）またはＬｓ－ＡＫＧ３８（１００ｍｇ／ｋｇ／用量）のｉｎ ｖｉｖｏ忍容性を、週１回投与したＬｓ－ＡＫＧ２８（１００ｍｇ／ｋｇ／用量）またはＬｓ－ＡＫＧ３８（２００ｍｇ／ｋｇ／用量）と比較した。リポソームを実施例２５（Ｌｓ－ＡＫＧ３８、ロット２７９）および実施例２６（Ｌｓ－ＡＫＧ２８、ロット２８１）に従って調製した。両リポソーム薬物を、ＣＤ－１雌マウス（各群５匹）に単独またはＢＤＱ／ＰＭＤ（ＢＰ）と組み合わせて注射した。ＢＤＱ／ＰＭＤ（それぞれ２５および１００ｍｇ／ｋｇ／用量）を１日１回、週５回、４週間強制経口投与した。対照群には、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、ｐＨ７）を４週間、週１回注射した。血液および組織試料を回収し、実施例４１および４２に記載したように分析した。
Ｌｓ－ＡＫＧ２８またはＬｓ－ＡＫＧ３８を週２回またはより高い用量で週１回投与したマウスの単独療法および併用療法のいずれも、体重（図１５Ａおよび図１５Ｂ）または血球数および生化学（図１５Ｃ）に影響を及ぼさなかった。
回収された組織の組織病理学的分析（図１５Ｄ）では、５０ｍｇ／ｋｇ（２ｑｗ）のＬｓ－ＡＫＧ２８を投与されたマウス５匹中２匹にマクロファージと好中球からなる微小な間質性混合細胞浸潤、および１００ｍｇ／ｋｇ（１ｑｗ）のＬｓ－ＡＫＧ２８を投与された動物５匹中１匹に軽度の間質性混合細胞浸潤が認められた。
Ｌｓ－ＡＫＧ２８＋ＢＰを５０ｍｇ／ｋｇ（１ｑｗ）で投与されたマウスの肺では、マクロファージ（５匹中１匹）または混合型（マクロファージおよび好中球）炎症細胞（５匹中３匹）からなるわずかな間質浸潤が認められた。１００ｍｇ／ｋｇ（１ｑｗ）のＬｓ－ＡＫＧ２８＋ＢＰを投与されたマウスでは、５匹中４匹にわずかな間質性混合細胞浸潤が認められた。さらに、Ｌｓ－ＡＫＧ２８＋ＢＰを１００ｍｇ／ｋｇ（１ｑｗ）で投与された５匹中２匹の動物の肺に、淡い好塩基性異物と関連する軽微な多巣性異物肉芽腫が認められた。これらの顕微鏡的所見は、Ｌｓ－ＡＫＧ２８＋ＢＰ５０ｍｇ／ｋｇ（２ｑｗ）を投与された動物５匹中１匹の肝臓において、軽微な多巣性混合細胞浸潤およびごくわずかな個々の肝細胞壊死がこの種での共通のバックグラウンド所見としての発生のため、被験物質に関連したものとは考えられなかった。
Ｌｓ－ＡＫＧ３８処置に関連する同様の顕微鏡的所見（単独または併用）は、被験物質との関連性はないと考えられ、肝臓および脾臓における髄外造血（ＥＭＨ）のわずかな増加、肝臓におけるわずかないし軽度の多巣性混合細胞浸潤およびごくわずかな個々の肝細胞壊死、肺におけるわずかな限局性肝細胞壊死、ごくわずかな限局性異物肉芽腫（淡い好塩基性異物と関連）、および肺におけるわずかな混合細胞浸潤が含まれた。これらの所見は、その軽微から軽度の性質、散発的な発生率、生理食塩水対照群での存在、およびこの種での共通のバックグラウンド所見としての発生のため、処置に関連したものとはみなされなかった。
したがって、Ｌｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８（単独またはＢＤＱ／ＰＭＤとの併用）をそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、または１００ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇの倍加用量で週１回投与したマウスでは、いずれも忍容性が良好であり、処置動物の体重、血液学的検査、または組織病理学的検査に影響を及ぼさなかった。
［実施例４４］
ラットにおけるＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８のｉｎ ｖｉｖｏ忍容性
本研究の目的は、ラットにおけるＬｓ－ＡＫＧ２８（ロット２７５）とＬｓ－ＡＫＧ３８（ロット２７６）の潜在的毒性を決定することであった。Ｌｓ－ＡＫＧ２８（ロット２７５）およびＬｓ－ＡＫＧ３８（ロット２７６）を、それぞれ実施例２２および２３に記載されるように調製した。雄Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにＬｓ－ＡＫＧ２８（１０、２０または４０ｍｇ／ｋｇ／用量）またはＬｓＡＫＧ－３８（２０、４０または８０ｍｇ／ｋｇ／用量）を８週間、週１回静脈注射（尾静脈）で投与した。対照群には、同量のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、ｐＨ７）を８週間、週１回注射した。研究のエンドポイント前に、イソフルラン麻酔後に腹部大動脈からの放血により動物を安楽死させた。血液および組織試料を回収し、臨床病理学的パラメータを評価した。組織の代表的試料を回収し、１０％中性緩衝液に保存し、パラフィンに包埋し、切片化し、ガラススライド上に載せ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、委員会の認証を受けた獣医病理学者により組織病理学について評価した。血液学的分析はホモロジーＡＤＶＩＡ １２０／２１２０ｉ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行われ、血液生化学的分析はＣｏｂａｓ ６０００ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行われた。
死亡率および瀕死チェック、臨床観察、体重、摂餌量、神経伝導速度（ＮＣＶ）および筋活動電位（ＭＡＰ）、機能観察バッテリー（ＦＯＢ）のパラメータおよびエンドポイントも評価した。
神経伝導速度（ＮＣＶ）および筋活動電位（ＭＡＰ）を８週目に行った。記録セッション中、動物をイソフルランで麻酔した。尾神経ＮＣＶは、尾部の中心骨に沿って走る尾神経の伝導速度を測定する。この神経はラットの他の任意の神経よりも約５０％長く、特に長さ依存性の遠位軸索障害を起こしやすい。ＮＣＶは５０ｍｍの距離にわたって測定され、節電流および膜貫通電流、応答する軸索の構造および平均断面直径、ならびに関連するミエリン鞘の完全性に感受性である。誘発された応答の振幅は、活性化された繊維の数および同期を反映する。データは、尾部の毛髪線の約１０ｍｍ下に位置する活性記録電極（視覚的に決定される）およびさらに５０ｍｍ遠位の刺激カソードで記録した。シグナルの振幅と開始待ち時間を記録し、刺激カソードと活性電極の間の距離を初期脱分極電流の絶対開始待ち時間で割ることにより速度を計算した。
指神経ＮＣＶは、感覚指神経における伝導速度を測定する。指神経は、後足の背面を支配する坐骨神経の遠位端である。神経伝導速度は、節電流および膜貫通電流、応答する軸索の構造および平均断面直径、ならびに関連するミエリン鞘の完全性に感受性である。データは、外果の後方の足首に位置する能動記録電極と後足の第２指の基部に位置する刺激カソードで記録された。シグナルの振幅と開始待ち時間を記録し、刺激カソードと活性電極の間の距離を初期脱分極電流の絶対開始待ち時間で割ることにより速度を計算した。
脛骨運動伝導（開始潜時）は、脛骨神経遠位部の運動線維刺激後のラット後足の内在筋の応答特性を測定する。データは、後足の外側背筋（ヒトの短指伸筋と同等）に位置決めされた活性電極と、外果の後ろの足関節近位に位置決めされた刺激陰極で記録した。運動軸索における神経伝導速度は、誘導された複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の開始潜時から推定した。ＣＭＡＰの振幅は、関連神経の超最大刺激後の応答のピークで測定した。
Ｌｓ－ＡＫＧ２８、Ｌｓ－ＡＫＧ３８関連の予定外死亡、臨床観察、体重への影響（図１６Ａおよび図１６Ｂ）、ＮＣＶおよびＭＡＰ（表３４）、ＦＯＢ（表３５）、摂餌量、凝固パラメータ、臓器重量または肉眼的所見（データは示されていない）への影響はなかった。リポソーム処置群では、Ｌｓ－ＡＫＧ２８またはＬｓ－ＡＫＧ３８に対する効力調整用量（実施例２の結核菌Ｅｒｄｍａｎｎ株に対する遊離薬物効力に基づく）がリネゾリドと比較して１６．５倍増加したにもかかわらず、いずれのリポソーム処置群でも尾部または左指神経の神経コンダクタンス速度が最も低下したのは５％未満であった。
２０ｍｇ／ｋｇ以上の用量でのＬｓ－ＡＫＧ２８およびＬｓ－ＡＫＧ３８の投与は、血小板数の統計学的に有意な低下をもたらした（対照群と比較して最大２０％の差）。他の血液学的および血液生化学的パラメータには、追加の影響は観察されなかった（表３２、表３３）。
雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットへの、１０ｍｇ／ｋｇ／用量以上の用量で週１回８週間の静脈内注射によるＬｓ－ＡＫＧ２８の投与は、脾臓、腎臓、および肝臓の顕微鏡的所見をもたらした（表３６）。脾臓には、２０または４０ｍｇ／ｋｇ／用量を投与したラットにおいて、好塩基性顆粒を伴うごく軽度から中等度のマクロファージ空胞化および好塩基性物質のごく軽度から軽度の蓄積が認められた。４０ｍｇ／ｋｇ／用量を与えられたラットの腎臓では、糸球体メサンギウム細胞の微小空胞化が認められた。肝臓には、全用量で軽微な小葉中心性単細胞壊死および軽微ないし軽度の小葉中心性肝細胞変性が認められた。
２０ｍｇ／ｋｇ／用量以上の用量でのＬｓ－ＡＫＧ３８の投与は、全用量で小葉中心性の軽微な単細胞壊死および小葉中心性の軽微から軽度の肝細胞変性の肝臓の顕微鏡的所見もたらした。
対照的に、Ｌｓ－ＡＫＧ２８とＬｓ－ＡＫＧ３８を投薬したラットは、リネゾリドを投薬されたラットと比較して、全用量で肝単細胞壊死の発生率が増加した。Ｌｓ－ＡＫＧ２８とＬｓ－ＡＫＧ３８を投薬したラットの肝臓では、小葉中心性肝細胞変性の発生率および重症度が全用量で同程度であった。また、Ｌｓ－ＡＫＧ２８を投薬したラットでは、２０または４０ｍｇ／ｋｇ／用量で脾臓に空胞化したマクロファージおよび好塩基性物質が認められ、４０ｍｇ／ｋｇ／用量で腎臓に糸球体メサンギウム細胞の空胞化が認められた。
結論として、８週間にわたる反復静脈内注射によるＬｓ－ＡＫＧ２８の投与は、１０、２０および４０ｍｇ／ｋｇ／用量のラットにおいて良好な忍容性を示した。Ｌｓ－ＡＫＧ３８の８週間にわたる反復静脈内注射による投与は、２０、４０および８０ｍｇ／ｋｇ／用量のラットにおいて良好な忍容性を示した。実施例２は、ＡＫＧ－２８がリネゾリドよりもｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｅｒｄｍａｎｎ株）で結核菌を死滅させる能力が３３倍、ＡＫＧ－３８が１７倍高いことを示した。したがって、効力を修正した場合、ラットは、臨床的に妥当な用量であるリネゾリド８０ｍｇ／ｋｇの１６．５倍である、リネゾリド相当量１３２０～１３３６ｍｇ／ｋｇでは、有意な神経障害（神経伝導速度の変化）、肝酵素の上昇、赤血球数またはヘマトクリットの減少、体重の減少は認められていない。
［実施例４５］
Ｋｒａｍｎｉｋ（肺結核菌感染のＣ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウスモード）におけるリポソームＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８とベダキリンおよびプレトマンニドの併用、またはベダキリン（Ｂ）、プレトマンニド（Ｐａ）、およびモキシフロキサシン（Ｍ）の有効性
Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ（Ｋｒａｍｎｉｋ）マウス感染モデルは、ＴＢ感染後の肺における進行した低酸素性の乾酪性肉芽腫を示す（Ｄｒｉｖｅｒ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，ｖｏｌ．５６，ｐ．３１８１－３１９５）。Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウスにおいて観察された肺病理学は、ＴＢ患者において見られる病変病理学および細菌集団における不均一性に、より近似しており、５０および９０ｍｇ／ｋｇの中等量の週１回投与でのリポソームＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８の有効性を評価するために用いられた。Ｌｓ－ＡＫＧ２８（ロット２７５）およびＬｓ－ＡＫＧ３８（ロット２７６）を、それぞれ実施例２２および２３に記載されるように調製した。Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウスの肺病理は、コラーゲン縁（Ｉ型）、劇症好中球性肺胞炎（ＩＩ型）、および細胞性病変（ＩＩＩ型）により描出された乾酪性壊死性病変として分類された３種類の異なるタイプの病変を示す（Ｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ ８，５９１－６０２を参照されたい）。８～１０週齢のＣ３ＨｅＢ／ＦｅＪ雌マウスをＬＤＡ（低用量エアロゾル感染）に感染させた。Ｇｌａｓ－Ｃｏｌ吸入曝露システムを用いて、約５０～７５桿菌／マウス（Ｅｒｄｍａｎ株）の標的をマウスに感染させた。１回のエアロゾル投与につき５匹のマウスを感染から１日後に屠殺し、細菌の取り込みを決定した。
感染後の８週間で、８匹のマウスを屠殺して、治療開始時の肺および脾臓における細菌負荷を測定した。マウスを屠殺する前に体重を測定した。肺および脾臓の肉眼による病理学的観察を行った。全肺および脾臓を抽出し、－８０℃で凍結した。以前に凍結した組織を回収し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザーを用いて１×ＰＢＳ中でホモジナイズした。肺および脾臓ホモジネートを７Ｈ１１寒天クワッドプレート上にプレートした。ＣＦＵの計数は、乾燥空気インキュベーター内で３７℃にて３～５週間、インキュベートした後に行われた。治療は、経口強制投与または腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、感染後の８週間から開始し、４～６週間連続して継続した（強制経口投与の場合はＭ－Ｆ、腹腔内注射の場合は週１回）。ベダキリン（Ｂ）、プレトマニド（Ｐａ）、モキシフロキサシン（Ｍ）、およびリネゾリド（Ｌ）を計２００μＬ／用量で、４または６週間、週５日、経口強制投与した。ベダキリン（２５ｍｇ／ｋｇ）を最初に投与し、その後、少なくとも１時間後にプレトマンニド（１００ｍｇ／ｋｇ）を投薬した。モキシフロキサシン（１００ｍｇ／ｋｇ）またはリネゾリド（１００ｍｇ／ｋｇ）は、プレトマニド投薬より４時間後に投与された。リポソーム製剤を、計４または６週間、週１回投与した。
投薬時にマウスを毎日観察し、体重を少なくとも週１回測定した。４～６週間の処理完了から２週間後に屠殺した。処置群あたり８匹のマウスを屠殺前に体重測定した。全肺および脾臓を、全投与群について無菌的に採取した。肺および脾臓の肉眼による病理学的観察を図示した。肉眼による病変分析のために肺を撮影した。全肺および脾臓を－８０℃で凍結し、以前凍結した組織を回収し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザーを用いて１×ＰＢＳ、または１×ＰＢＳ中の１０％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかでホモジナイズした（薬剤のキャリーオーバーを避けるためである。＊説明のために下記を参照されたい）。肺および脾臓ホモジネートを、均質化後、７Ｈ１１クワッドプレートを含有する７Ｈ１１寒天またはチャコール上にプレートし、１×ＰＢＳまたは１０％ＢＳＡで連続希釈した。ＣＦＵの計数は、乾燥空気インキュベーター内で３７℃にて５週間、インキュベートした後に行われた。
ＢＰａＭ処置へのＬｓ－ＡＫＧ２８の添加は、肺におけるＢＰａＭに対してさらに０．６４ｌｏｇ１０ＣＦＵ減少をもたらしたが、ＢＰａＭ＋Ｌｓ－ＡＫＧ３８処置は、４週間の処置後にＢＰａＭに対して０．２５対ＢＰａＭのさらなるｌｏｇ１０ＣＦＵ減少を生じさせた。Ｌｓ－ＡＫＧ２８またはＬｓ－ＡＫＧ３８のいずれかをＮＩＸ（ＢＰａＬ）レジメンでリネゾリド（Ｌ）に置換すると、６週間の処置でＢＰａＬよりも有効性が改善した。６週間の処置で、ＢＰａＬレジメンにおけるリネゾリドでＬｓ－ＡＫＧ３８を置換すると、ＢＰａＬ処置群と比較して有効性が有意に改善した。具体的には、ＢＰａＬを６週間投与すると４．１８ｌｏｇ１０ ＣＦＵの減少がみられ、８匹中１匹のプレートではＣＦＵが認められなかった。ＢＰａ＋Ｌｓ－ＡＫＧ２８を６週間投与したところ、４．６８ ｌｏｇ１０ ＣＦＵの減少が認められたが、ＢＰａＬとの統計的有意差は認められなかった。ＢＰａ＋Ｌｓ－ＡＫＧ３８を６週間処理すると、５．２６ｌｏｇ１０ ＣＦＵが減少し、８匹中２匹のプレートでＣＦＵが認められなかった。これは、ＢＰＡＬに対して統計的に有意な減少であった（ｐ＝０．０４、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。
処置の６週間後の脾臓では、ＮＩＸレジメンでリネゾリドのリポソーム製剤を置換すると、ＢＰａＬ処置群と比較して肺の有効性がわずかに改善した。ＮＩＸレジメンによる６週間の処置は３．５６ｌｏｇ１０ＣＦＵの減少をもたらし、８匹中３匹のプレートはＣＦＵを示さなかった。ＢＰａ＋Ｌｓ－ＡＫＧ２８による６週間の処置は、４．１８ｌｏｇ１０ ＣＦＵの減少をもたらし、８匹中５匹のマウスのプレートはＣＦＵを示さなかった。ＢＰａ＋Ｌｓ－ＡＫＧ３８による６週間の処理は、４．３８ｌｏｇ１０ ＣＦＵの減少をもたらし、８匹中６匹のマウスのプレートはＣＦＵを示さなかった。６週間の薬物処置におけるマウスの脾臓のＣＦＵ負荷は低く、検出下限の０．６６ｌｏｇ１０ ＣＦＵに近かった。
測定可能なＣＦＵを有しない全てのマウスを、検出限界０．６６ｌｏｇ ＣＦＵで列挙した。これは、Ｌｓ－ＡＫＧ３８とＬｓ－ＡＫＧ２８が、ベダキリンとプレトマニドを併用した場合、わずか６週間の処置後、両薬剤の中等度および高い認容性用量でリネゾリドよりも活性であることを示す。実施例４２および４３が示すように、Ｌｓ－ＡＫＧ２８とＬｓ－ＡＫＧ３８の両方は、この組み合わせにおいて、本研究で使用された用量の少なくとも２倍の用量で安全に投薬することができる。また、Ｌｓ－ＡＫＧ２８をＢＰａＭのレジメンに追加した場合、この同じく高い忍容性用量で肺と脾臓の両方のＣＦＵがさらに低下することも示されている。
［実施例４６］
肺結核菌感染のＢａｌｂ／ｃモデルにおけるリポソームＡＫＧ－２８単剤療法の有効性
Ｌｓ－ＡＫＧ２８のスケジュールおよび用量依存性の有効性は、結核の慢性Ｂａｌｂ／ｃモデルにおいて５０および１００ｍｇ／ｋｇの臨床的に妥当な用量で遊離リネゾリドと比較して決定された。慢性Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルでは、肺の細菌負荷は結核菌感染後の４～５週間で定常状態に達する（Ｌｅｎａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＡＡＣ ４９（６）２２９４－２３０１）。Ｌｓ－ＡＫＧ２８（ロット２８６）を実施例２８に記載されるように調製した。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、マウスをＧｌａｓ－Ｃｏｌ吸入曝露システムを用いて、ＬＤＡ（低用量エアロゾル感染）で感染させて、結核菌Ｅｒｄｍａｎの約５０～１００桿菌／マウスに感染させた。
マウス（ｎ＝３）を感染から１日後に屠殺し、細菌取り込みを決定した。Ｐｒｅｃｅｌｌｙチューブ（Ｂｅｒｔｉｎ ｃａｔ＃ ＫＴ０３９６１－１－３９６．７）中で全肺を無菌的に回収し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ組織ホモジナイザーを用いて４ｍｌの１×ＰＢＳ中でホモジナイズした。未希釈ホモジネートを２つの大型７Ｈ１１寒天プレート（１５０×１５ｍｍ）に移し、コロニーを計数できるまで、３７℃で乾燥空気インキュベーター中で少なくとも２１日間、密封ジップトップバッグ内でプレートをインキュベートした。エアロゾル感染後の２８日目に、マウス（ｎ＝５）を屠殺し、治療開始時の肺および脾臓における細菌負荷を決定した。マウスを屠殺する前に体重を測定した。肺および脾臓の肉眼による病理学的観察を行った。肺（左葉と上部右［頭蓋］葉に分けられる）＋副葉）と脾臓を無菌的に採取し、－８０℃で凍結した。下部右肺葉［尾側］を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で組織学的検査のために回収した。以前に凍結した組織を回収し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザーを用いて１×ＰＢＳ中でホモジナイズした。肺および脾臓ホモジネートを７Ｈ１１寒天クワッドプレート上にプレートした。ＣＦＵの計数は、乾燥空気インキュベーター内で３７℃で３～５週間インキュベートした後に行う。
５％ＰＥＧ－２００（Ｓｉｇｍａ Ｐ３０１５、ロットＭＫＢＷ３１１９Ｖ）／９５％（０．５％）のメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｍ０４３０、ロット０３１Ｍ０００５１）中のリネゾリドを、エーロゾル感染後の２８日目（月）に強制経口投与により開始し（マウスあたり２００μＬ）、１週間に７日のうち５日を２～８週間継続した。Ｌｓ－ＡＫＧ２８を５０または１００ｍｇ／ｋｇの用量で週１または２回腹腔内注射により投与した。最終屠殺は、２、４または８週間の薬物で処置されたマウスの最終投与日の３日後に行った。マウスを屠殺する前に体重を測定した。肺および脾臓の肉眼による病理学的観察を行った。肺（左葉、右上葉＋副葉に分けられる）および脾臓を無菌的に採取し、－８０℃で凍結し、組織学的検査のために４％のＰＦＡに右下葉を回収した。薬剤のキャリーオーバーを避けるため、以前に凍結した組織を回収し、１×ＰＢＳ中の１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中でホモジナイズした。均質化後、肺および脾臓ホモジネートを１×ＰＢＳおよび１０％ＢＳＡ中で連続希釈し、次に７Ｈ１１寒天または７Ｈ１１クワッドプレートを含むチャコール上にプレートした。ＣＦＵの計数は、乾燥空気インキュベーター内で３７℃で３～５週間インキュベートした後に行った。
肺ＣＦＵ数の減少を表３９に、脾臓ＣＦＵ数を表４０に示す。Ｌｓ－ＡＫＧ２８を５０ｍｇ／ｋｇで週２回または１００ｍｇ／ｋｇで週１回処置すると、肺ではわずか２週間後に１．５Ｌｏｇ１０ ＣＦＵの減少がみられたが、リネゾリド１００ｍｇ／ｋｇでは０．１５Ｌｏｇ１０ ＣＦＵの減少がみられなかった（ｑ１×５）。この減少は、Ｌｓ－ＡＫＧ２８について２週間で脾臓においてほぼ３Ｌｏｇ１０ＣＦＵであった。８週間で、Ｌｓ－ＡＫＧ２８で処置されたマウスは全て、８週間で完全に無菌であった（肺では１．１３、脾臓では０．６６の検出限界未満）のに対し、肺では２．４５ｌｏｇ１０ＣＦＵ、リネゾリド１００ｍｇ／ｋｇの高用量では脾臓では３．１５ｌｏｇ１０ＣＦＵであった。この単剤療法の活性は、ベダキリンのような活性のある併用パートナーが存在せず、わずか８週間で比較的短期間であるオキサゾリジノンには驚くべきものである。例えば、処置の８週間で、リネゾリド単独療法は、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウス（Ｌａｎｏｉｘ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌｓ Ｍｅｃｈ．８，６０３－６１０）において４～６の範囲でｌｏｇ１０ ＣＦＵ数を示し、活性は、３～１４用量／週の範囲のスケジュールで１０００ｍｇ／ｋｇ／週まででさえ中等度のままである（Ｂｉｇｅｌｏｗ ｅｔ ａｌ（２０２１）Ｊ Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．２２３（１１）１８５５－１８６４）。
測定可能なＣＦＵを有しない全てのマウスを、検出限界０．６６ｌｏｇ ＣＦＵに列挙した。
［実施例４７］
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のウサギ心内膜炎モデルにおけるリポソームＡＫＧ－３８の有効性
黄色ブドウ球菌感染、特に血管内系（例えば、ＩＥ；心臓および血液透析装置感染など）を伴うものが蔓延しており、容認できないほど高い罹病率、死亡率および治療後再発率と関連している。これは、ＭＲＳＡの多剤耐性株によってこのような感染が引き起こされる場合に特に当てはまる。さらに、ＭＲＳＡ株が、承認された臨床標準研究所（ＣＬＳＩ）の「感受性」範囲（すなわち、２ｕｇ／ｍｌ以下）内でバンコマイシン（「ワークハウス」抗ＭＲＳＡ薬）に対して最小阻止濃度（ＭＩＣ）を有する場合でさえ、臨床転帰は最適ではないままである。
典型的な高接種血管内バイオフィルムＭＲＳＡ感染モデル、左側大動脈弁ウサギＩＥを、６か月齢および２．２～２．５ｋｇの雌ニュージーランド白色ウサギに使用した。ウサギにキシラジンとケタミンを筋肉注射して全身麻酔を行った。次に、皮膚を露出させるために、右頸動脈上に毛皮を刈り込んだ。右頸動脈上の切断部位を１％リドカインで局所麻酔した。その後、右頸動脈を露出させるために切断を行った。これを分離し、近位結紮し、次にポリエチレンカテーテルを用いて大動脈弁を横切って左心室に逆行性にカニューレ挿入し、その後、研究期間中、左心室に固定し、留置した。カテーテル留置後の４８時間の左側ＩＥ（滅菌大動脈弁および心室の疣贅を誘導するため）では、動物はＭＷ２株の約２×１０５ｃｆｕの静注チャレンジによってＩＥが誘導された。使用したＭＲＳＡ株ＭＷ－２（ＵＳＡ４００－クローナル複合体［ＣＣ］１）は、ｉ）臨床的に由来し、ｉｉ）ゲノム配列を決定し、ｉｉｉ）一般的な院内感染ＭＲＳＡクローン型を示し、ｉｖ）実験ＩＥモデルにおいて毒性を示し、ｖ）ダプトマイシン（ＤＡＰ）にｉｎ ｖｉｔｒｏで感受性である。感染は心臓弁に感染した疣贅から腎臓および脾臓に広がる。
リポソームＡＫＧ－３８（Ｌｓ－ＡＫＧ３８）は、別々の動物群において、４０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量で、１回（ＤＡＰとの併用療法で）または２回（ＤＡＰとの併用療法で１回；次に、さらなるＤＡＰ療法を受けていない「動物の再発群」におけるＤＡＰ処置後の屠殺時に２回目の注入）のいずれかで与えられた。Ｌｓ－ＡＫＧ３８（ロット２９２）を実施例２９に記載されるように調製した。最初のＬｓ－ＡＫＧ３８注入は、ＤＡＰの初回ｉｖ投薬から約１時間後までに行われる。ＤＡＰは、１日２ｍｇ／ｋｇの致死量以下の用量で４日間、単独またはＬｓ－ＡＫＧ３８との併用のいずれかで投与された。
動物を安楽死させ、主要標的臓器は、６日目（ＤＡＰ単独またはＤＡＰ＋単回用量のＬｓ－ＡＫＧ３８）または１２日目（ＤＡＰ＋１日目と６日目のＬｓ－ＡＫＧ３８の２回用量）のいずれかで、滅菌的に取り出され、定量培養された（左側ＩＥに対して血液、心臓疣贅；腎臓および脾臓）。計量、均質化、連続希釈およびプレート培養により、滅菌的に取り出された臓器の標準的調製によって、定量的な標的組織培養を行った。血液の連続希釈および定量培養を同様に行った。血液培養物および異なる処置群の標的臓器のデータは、それぞれｌｏｇ１０ ｃｆｕ／ｍｌまたはｌｏｇ１０ ｃｆｕ／ｇｍ組織（±ＳＤ）の平均値および中央値として算出した。
ウサギにおけるＭＲＳＡの左室心内膜炎モデルからの予備データを以下の表４１に示す。ダプトマイシン単独またはダプトマイシン＋Ｌｓ－ＡＫＧ３８の単回投薬は、接種後の６日目に有意な効果を示さなかった。驚くべきことに、Ｌｓ－ＡＫＧ３８の２回目の注射は１２日目に顕著な有効性をもたらし、５種の全組織におけるウサギの４／５での殺菌、および複数臓器におけるＣＦＵの６ｌｏｇ以上の減少を含んだ。このデータは、心内膜炎が毎日のダプトマイシンの中止後にＬｓ－ＡＫＧ３８で効果的に処置できることを示唆する。
［実施例４８］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける種々の非結核性マイコバクテリアにおけるＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８の活性
ＭＩＣ試験は、ＣＬＳＩ標準Ｍ７－Ａ７（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で推奨されているカルシウムイオンおよびマグネシウムイオン濃度に対してＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）ブロス（カチオン調整）を用いて、マイクロブロス希釈法（Ｏｂｒｅｇｏｎ－Ｈｅｎａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５９，６９０４－６９１２）によって行われた。ＭＩＣ試験はまた、７Ｈ９ブロス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたマイクロブロス希釈法（Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ２４７２６； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４３，２８７－３９３）により行われた。目標は、本発明者らのマイクロブロス希釈法において異なるブロスを用いることにより、ＮＴＭに対して活性を有するより多くの化合物を検出する能力を最適化することであった。ＮＴＭは、７Ｈ１１寒天プレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）上で３５～３７℃で３～２５日間、（細菌株に応じて）大気中で増殖させた。ＣＦＵを寒天プレートから採取し、０．０５％のＴｗｅｅｎ ８０を含むＭＨブロスのいずれかに置かれ、増殖７日後に採取した光学濃度（ＯＤ）吸光度が（ＯＤ）０．０８～０．１（０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ）になるまで周囲空気中で３５～３７℃で増殖させた。次に、細菌細胞懸濁液が、生理食塩水中でそれらを調製することにより、（ＯＤ）０．０８～０．１（０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ）と一致することを確認した。
ブロス（ＭＨ）１８０μｌを９６ウェルプレートの第１カラムに添加した。次に、１００μｌのブロス（ＭＨ）を９６ウェルプレートの他のカラムに添加した。化合物は、ＤＭＳＯ中で１．２８ｍｇ／ｍＬを使用して作製され、試験範囲６４～０．０６２μｇ／ｍｌのために直ちに使用され、２０μｌの化合物がウェルの第１カラムに添加され、１００μｌが連続希釈される。最後に、１００μｌのＮＴＭ細胞懸濁液を、培地のみの対照ウェルを除く全てのウェルに添加した。各微生物に特異的なＱＣ剤 １）陰性対照のみの細菌 ２）陰性対照のみの培地 ３）テジゾリド陽性薬剤対照 ４）任意選択の大腸菌対照。
ＲＧＭは３日目にＯＤについてアッセイされた。その後、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｒｏｗｎ－Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ｖｏｌ．２５（３），ｐ．５４５－５８２）によって推奨されるレサズリンマイクロタイターアッセイプレート法を用いることにより、プレートをアッセイした。簡単に説明すると、この方法は、ＭＩＣ９６ウェルプレートへのレサズリン（７－ヒドロキシ－３Ｈ－フェノキサジン－３－オン１０－オキシド）の添加を使用した。レザズリンは青色の色素であり、それ自体は弱い蛍光を示し、ピンク色で非常に赤い蛍光レゾルフィンに不可逆的に還元される。細菌細胞生存度ＭＩＣアッセイにおける酸化還元指標として使用した。
結果は、ＡＫＧ－２８とＡＫＧ－３８の両方が、異なるＮＴＭ種および系統において、テジゾリドより一般的に強力であることを示す。これは、トリ型結核菌、マイクロバクテリウム・ケロナエ、マイクロバクテリウム・アブセッサス、およびマイクロバクテリウム・カンサシに含まれた。マイクロバクテリウム・マシリエンセでのみ、評価された３株全てにおいてテジゾリドの活性が高かった。
［実施例４９］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結核菌の薬剤耐性株に対する選択された化合物の活性
結核菌の薬剤感受性株に対する活性を示す本開示の化合物は、いくつかの多剤耐性（ＭＤＲ）臨床分離株Ｍ７０、Ｍ２８、Ｍ９４、Ｍ１４（Ｃｈｅｎｇ Ａ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．ｖ．４８，ｐ．５９６－６０１）ａｎｄ ＴＮ５９０４（Ｐａｌａｎｉｓａｍａｙ Ｇ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｅｄｉｎｂ．）ｖｏｌ．８８ ｐ．２９５－３０６）に対する活性についてさらに評価された。
これらの株は、以下の耐性特性によって特徴付けられる。
表４３．本研究において使用した結核菌ＭＤＲ株の薬剤耐性特性。（略語：Ｒ－耐性；Ｓ－感受性；ＳＴＲ－ストレプトマイシン、ＩＮＨ－イソニアジド；ＲＩＦ－リファンピン、ＥＭＢ－エタンブトール、ＰＺＡ－ピラジンアミド。
比較／耐性対照（ＲＩＦ、ＩＮＨ、ＳＴＲ、モキシフロキサシン（ＭＯＸ）、およびリネゾリド（ＬＮＺ））を含む試験化合物のＭＩＣは、本質的に実施例２に記載されたように、アラマーブルーエンドポイント（ＭＡＢＡ）を用いた液体微量希釈法を用いて、以下の修正を加えて決定された。ＤＭＳＯ中の２倍の倍数で連続希釈した試験化合物および比較物質は、１００μＬのＡＤＣが添加された７Ｈ９－グリセロール培地を含有する９６ウェルアッセイプレートのウェルに添加された。化合物をＤＭＳＯ中で希釈し、化合物濃度を所望の範囲に維持し、最終ＤＭＳＯ濃度をウェル中で２％（Ｍ７０、Ｍ２８、Ｍ９４）または２．５％（Ｍ１４、ＴＮ５９０４）に維持したが、ＤＭＳＯ中の溶解度が低いため、ＳＴＲを段階希釈し、水溶液として添加した。ＭＤＲ株および感受性Ｈ３７Ｒｖ株（陽性対照）の細菌ストックを冷蔵庫から取り出し、解凍し、７Ｈ９－ＡＤＣ－グリセロール培地で希釈して、１０６ＣＦＵ／ｍＬ（Ｈ３７Ｒｖ、ＴＮ５９０４）、２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（Ｍ７０、Ｍ１４）、または３×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（Ｍ２８、Ｍ９４）の細菌密度を得、ウェル中の化合物含有培地に希釈した細菌ストック５０μＬを添加した。ウェル中の最終薬物濃度の範囲を以下の表に示す。プレートをジップロックバッグに封入し、３７℃でインキュベートし、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での周期的光学濃度測定により細菌増殖をモニタリングした。１４日目（ＯＤ６００が０．４０に達したか、または０．４０を超えた場合）または１７日目に、アラマーブルー溶液１５μＬをウェルに添加し、インキュベーションを継続し、３日後（増殖が遅いＭ２８株の場合は７日後）にインキュベーション混合物の色を記録した。薬物を含まない対照ウェルと比較して、アラマーブルーで可視的な色変化を生じなかった２倍系列希釈液の最低連続抗菌濃度を、これらの化合物のＭＩＣとみなした。ＯＤ６００に基づくＭＩＣの測定（薬物を含まない対照ウェルと比較してＯＤ６００が８０％以上減少）は、ＭＡＢＡの結果と一致していた。２つのウェルのＭＩＣのシフト（４倍）は有意であると考えられた。結果を以下の表４４に概要する。
比較／対照化合物であるＲＩＦ、ＩＨＮ、ＭＯＸおよびＳＴＲは、ＤＲ－ＴＢ／ＭＤＲ－ＴＢ株およびＨ３７Ｒｖに対して期待されるｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示した。典型的なＭＩＣアッセイの分散の範囲内で、本開示の試験された全ての化合物は、薬物感受性株Ｈ３７Ｒｖに対するものと少なくとも同程度にＭＤＲ－ＴＢ株に対して活性であった。最も活性が高かったのはＡＫＧ－２８、次にＡＫＧ－３８、ＡＫＧ－３であった。化合物ＡＫＧ－２８およびＡＫＧ－３８は、それらの構造的に近い類似体と比較しても最も活性の高い化合物であった。
本開示の種々の態様は、単独で、組み合わせて、または前述の実施形態において具体的に説明されていない種々の配列で使用することができ、したがって、その適用において、前述の説明に記載された、または図面に図示された構成要素の詳細および配列に限定されない。例えば、一実施形態に記載された態様は、他の実施形態に記載された態様と任意の態様で組み合わせることができる。
本開示の特定の実施形態について説明したが、上記の明細書は例示的なものであり、限定的なものではない。本開示の多くの変形は、本明細書の考察により当業者に明らかになる。本開示の全範囲は、特許請求の範囲、それらの同等物の全範囲、およびこのような変形とともに、本明細書を参照することによって決定されるべきである。
参照による組み込み
本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が、引用することにより本明細書の一部をなすものとすることが具体的に示されたのと同程度に、全ての目的のために、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

Claims (45)

  1. 式Ｉ：
    ［式中、
    Ｒ２は、アミン（ＮＨ２）またはアセトアミド（ＮＨＣＯＣＨ３）であり、
    Ｒ１は、２’位においてアミノアルキルで置換されたテトラゾール環である］
    の化合物またはその薬学的に許容される塩。
  2. 前記アミノアルキルがジメチルアミノエチルである、請求項１に記載の化合物。
  3. 式１ｂ：
    を有する、請求項１に記載の化合物。
  4. 式１ｃ：
    を有する、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
  5. 式１ｄまたは式１ｅ：
    を有する、請求項１に記載の化合物。
  6. Ｅｒｄ／ＨｅｐＧ２およびＨ３７Ｒｖ／ＨｅｐＧ２に対する選択性指数（ＳＩ）が１００～１７００の範囲である、請求項１から５のいずれか１項に記載の化合物。
  7. Ｅｒｄ／ＨｅｐＧ２およびＨ３７Ｒｖ／ＨｅｐＧ２に対するＳＩが２００～１７００の範囲である、請求項１から５のいずれか１項に記載の化合物。
  8. Ｅｒｄ／ＨｅｐＧ２およびＨ３７Ｒｖ／ＨｅｐＧ２に対するＳＩが３００～１７００の範囲である、請求項１から５のいずれか１項に記載の化合物。
  9. リポソーム小胞を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム小胞は、式Ｉ：
    ［式中、
    Ｒ２は、アミン（ＮＨ２）またはアセトアミド（ＮＨＣＯＣＨ３）であり、
    Ｒ１は、２’位においてアミノアルキルで置換されたテトラゾール環である］
    の化合物またはその医薬として許容される塩を含む、リポソーム組成物。
  10. 前記アミノアルキルがジメチルアミノエチルである、請求項９に記載のリポソーム組成物。
  11. 前記リポソーム小胞が、式１ｂ：
    の化合物を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
  12. 前記リポソーム小胞が、式１ｃ：
    の化合物を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
  13. 前記リポソーム小胞が、式１ｄまたは式１ｅ：
    の化合物を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
  14. 前記リポソーム小胞が水性媒体中にある、請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  15. 前記化合物が、捕捉剤で前記リポソーム小胞に捕捉され、前記捕捉剤がポリアニオンを含む、請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  16. 前記捕捉剤が、八硫酸トリエチルアンモニウムスクロースまたは硫酸アンモニウムである、請求項１５に記載のリポソーム組成物。
  17. 前記捕捉剤が八硫酸トリエチルアンモニウムスクロースである、請求項１５に記載のリポソーム組成物。
  18. 前記捕捉剤が硫酸アンモニウムである、請求項１５に記載のリポソーム組成物。
  19. 前記化合物の塩を含み、前記塩が、硫酸塩、クエン酸塩、スクロソファート、リン酸化もしくは硫酸化ポリオールとの塩、またはリン酸化もしくは硫酸化ポリアニオンポリマーとの塩である、請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  20. 前記化合物の塩を含み、前記塩が硫酸塩である、請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  21. 前記リポソーム小胞中の前記化合物が１ｍｇ／ｍＬ未満の水溶解度を有する、請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  22. 前記リポソーム小胞中の前記化合物が０．１ｍｇ／ｍＬ未満の水溶解度を有する、請求項９から１３のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記リポソーム小胞が、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを含む膜を含む、請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  24. 前記膜が、前記リポソーム小胞の内部を前記水性媒体から分離する、請求項２３に記載のリポソーム組成物。
  25. 前記ホスファチジルコリンが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）または水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である、請求項２３に記載のリポソーム組成物。
  26. 前記ホスファチジルコリンとコレステロールのモル比が、約６０：４０～約３５：６５である、請求項２３に記載のリポソーム組成物。
  27. 前記ホスファチジルコリンとコレステロールのモル比が、約５５：４５～約３５：６５である、請求項２３に記載のリポソーム組成物。
  28. 前記ホスファチジルコリンとコレステロールのモル比が、約５０：５０～約４５：５５である、請求項２３に記載のリポソーム組成物。
  29. 前記ホスファチジルコリンとコレステロールのモル比が、約５０：５０～約４０：６０である、請求項２３に記載のリポソーム組成物。
  30. 前記膜が、ポリマーコンジュゲートされた脂質をさらに含む、請求項２３から２９のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  31. 前記リポソーム小胞が、約５５：４５：２．７５のモル比のＨＳＰＣ、コレステロールおよびポリマーコンジュゲートされた脂質を含む、請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  32. 前記ポリマーコンジュゲートされた脂質がＰＥＧ（分子量２，０００）－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）またはＰＥＧ（分子量２，０００）－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）である、請求項３０または３１に記載のリポソーム組成物。
  33. 非経口投与用の液体医薬製剤である、請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  34. 前記リポソームが、約８０～約１３０ｎｍの範囲のＺ平均粒径を有する、請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。
  35. 細菌感染を処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項９から１３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物を投与することを含む方法。
  36. 前記細菌感染が結核菌感染である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記リポソーム小胞中の前記化合物が、約０．０１μｇ／ｍｌ～約０．２５μｇ／ｍｌの範囲の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を有する、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 前記リポソーム小胞中の前記化合物が、約０．０１μｇ／ｍｌ～約０．１μｇ／ｍｌの範囲のＭＩＣを有する、請求項３５または３６に記載の方法。
  39. 前記リポソーム組成物を非経口投与することを含む、請求項３５から３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. １種または複数の活性剤を同時にまたは連続的に投与することを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記１種または複数の活性剤が、ベダキリン、プレトマニド、ピラジンアミド、モキシフロキサシン、その薬学的に許容される塩、またはそれらの組合せを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記リポソーム組成物を週１回～６週間毎に１回投与する、請求項３９に記載の方法。
  43. それを必要とする対象への投与後に血中に残存する化合物のパーセンテージが、６時間で投与量の２０％を超える、請求項３９に記載の方法。
  44. それを必要とする対象への投与後に血中に残存する化合物のパーセンテージが、投与量の１０％を超える、請求項３９に記載の方法。
  45. リポソーム組成物を作製する方法であって、
    （ｉ）捕捉剤を実質的に含まない媒体中で、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ－脂質を含み、捕捉剤を含有する内部空間を有するリポソームを調製するステップと、
    （ｉｉ）前記リポソームを水性媒体中で請求項１から８のいずれか１項に記載の化合物と接触させて、前記リポソーム中の前記化合物をカプセル封入するステップと、
    （ｉｉｉ）カプセル封入されていない化合物を除去するステップと、
    （ｉｖ）非経口使用に適した生理学的に許容される媒体中に前記リポソームを提供するステップと
    を含む方法。
JP2022578853A 2020-06-18 2021-06-18 オキサゾリジノン化合物、オキサゾリジノン化合物を含むリポソーム組成物、およびそれらの使用方法 Pending JP2023531666A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063040810P 2020-06-18 2020-06-18
US63/040,810 2020-06-18
US17/351,631 2021-06-18
PCT/US2021/038131 WO2021258013A1 (en) 2020-06-18 2021-06-18 Oxazolidinone compounds, liposome compositions comprising oxazolidinone compounds and methods of use thereof
US17/351,631 US11555033B2 (en) 2020-06-18 2021-06-18 Oxazolidinone compounds, liposome compositions comprising oxazolidinone compounds and method of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023531666A true JP2023531666A (ja) 2023-07-25
JPWO2021258013A5 JPWO2021258013A5 (ja) 2024-06-26

Family

ID=79025353

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022578853A Pending JP2023531666A (ja) 2020-06-18 2021-06-18 オキサゾリジノン化合物、オキサゾリジノン化合物を含むリポソーム組成物、およびそれらの使用方法

Country Status (9)

Country Link
US (4) US11555033B2 (ja)
JP (1) JP2023531666A (ja)
KR (1) KR20230052873A (ja)
AU (1) AU2021292747A1 (ja)
BR (1) BR112022025918A2 (ja)
CA (1) CA3183397A1 (ja)
IL (1) IL299155A (ja)
MX (1) MX2022016063A (ja)
WO (1) WO2021258013A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023531666A (ja) 2020-06-18 2023-07-25 アカゲラ・メディスンズ，インコーポレイテッド オキサゾリジノン化合物、オキサゾリジノン化合物を含むリポソーム組成物、およびそれらの使用方法
EP4296674A1 (en) 2022-06-20 2023-12-27 Université Toulouse III - Paul Sabatier Innovative molecules decreasing virulence of mycobacterium for the treatment of tuberculosis
GB202210829D0 (en) * 2022-07-25 2022-09-07 Micropore Tech Ltd Continuous process

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH085107B2 (ja) 1988-08-04 1996-01-24 ファナック株式会社 電動式射出成形機における位置決め方式
IL91664A (en) 1988-09-28 1993-05-13 Yissum Res Dev Co Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release
EP0648119A1 (en) 1992-07-08 1995-04-19 The Upjohn Company 5'-INDOLINYL OXAZOLIDINONES USEFUL AGAINST $i(MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS)
JPH0873455A (ja) 1994-03-15 1996-03-19 Upjohn Co:The オキサゾリジノン誘導体及びこれを有効成分とする医薬組成物
US5800833A (en) 1995-02-27 1998-09-01 University Of British Columbia Method for loading lipid vesicles
WO1998017256A1 (en) 1996-10-22 1998-04-30 Dmitri Kirpotin Compound-loaded liposomes and methods for their preparation
WO2001094342A1 (en) * 2000-06-05 2001-12-13 Dong A Pharm. Co., Ltd. Novel oxazolidinone derivatives and a process for the preparation thereof
WO2003008389A1 (en) 2001-07-16 2003-01-30 Ranbaxy Laboratories Limited Oxazolidinone derivatives as potential antimicrobials
AU2001269370B2 (en) 2000-07-17 2005-10-27 Ranbaxy Laboratories Limited Oxazolidinone derivatives as antimicrobials
EP1432403B1 (en) 2001-10-03 2010-07-28 Celator Pharmaceuticals, Inc. Liposome loading with metal ions
WO2003075889A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-18 Transave, Inc. An inhalation system for prevention and treatment of intracellular infections
US20050209248A1 (en) 2002-05-15 2005-09-22 Biswajit Das Plymorphic forms of phenyl oxazolidinone derivatives
AU2002319848A1 (en) 2002-07-29 2004-02-25 Ranbaxy Laboratories Limited Oxazolidinone derivatives as antimicrobials
US7498350B2 (en) 2002-11-28 2009-03-03 Astrazeneca Ab Oxazolidinones as antibacterial agents
GB0229518D0 (en) 2002-12-19 2003-01-22 Astrazeneca Ab Chemical compounds
AU2003223034A1 (en) 2003-05-06 2004-11-26 Ranbaxy Laboratories Limited Oxazolidinone derivatives as antimicrobials
US8324398B2 (en) 2003-06-03 2012-12-04 Rib-X Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of biaryl oxazolidinones
JP5043428B2 (ja) 2003-06-03 2012-10-10 リブ−エックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド ビアリール複素環式化合物ならびにその製造および使用方法
KR100854211B1 (ko) 2003-12-18 2008-08-26 동아제약주식회사 신규한 옥사졸리디논 유도체, 그의 제조방법 및 이를유효성분으로 하는 항생제용 약학 조성물
WO2005082899A1 (en) 2004-01-28 2005-09-09 Ranbaxy Laboratories Limited Oxazolidinone derivatives as antimicrobials
EP1746976B1 (en) 2004-05-03 2017-01-11 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for drug delivery
JP2008500317A (ja) 2004-05-25 2008-01-10 アストラゼネカ アクチボラグ 抗菌剤としての３−’４−｛６−置換アルカノイル）ピリジン−３−イル｝−３−フェニル−５−（１ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イルメチル）−１，３−オキサゾリジン−２−オン
EP1753755A1 (en) 2004-05-25 2007-02-21 AstraZeneca AB 3- {4- (pyridin-3-yl) phenyl} -5- (1h-1, 2, 3-triazol-1-ylmethyl) -1, 3-oxazolidin-2-ones as antibacterial agents
WO2006035283A1 (en) 2004-09-27 2006-04-06 Ranbaxy Laboratories Limited Oxazolidinone derivatives as antimicrobials
US8349360B2 (en) 2004-10-06 2013-01-08 Bc Cancer Agency Liposomes with improved drug retention for treatment of cancer
WO2006051408A1 (en) 2004-11-11 2006-05-18 Ranbaxy Laboratories Limited Oxazolidinone derivatives as antimicrobials
EP1745784A1 (en) 2005-06-27 2007-01-24 Ferrer Internacional, S.A. Oxazolidinone derivatives and use thereof as antibiotics
HUE029994T2 (en) 2005-12-08 2017-04-28 Insmed Inc Lipid-based preparations of antinfectants for the treatment of lung infections
KR101023174B1 (ko) 2008-09-24 2011-03-18 주식회사 레고켐 바이오사이언스 사이클릭 아미독심 또는 사이클릭 아미드라존 기를 가지는 신규한 옥사졸리디논 유도체 및 이를 함유하는 의약 조성물
MX366793B (es) 2008-10-10 2019-07-24 Merck Sharp & Dohme Corp Star Metodos para preparar oxazolidinonas y composiciones que las contienen.
KR101739923B1 (ko) 2009-02-03 2017-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒ)-3-(4-(2-(2-메틸테트라졸-5-일)피리딘-5-일)-3-플루오로페닐)-5-히드록시메틸 옥사졸리딘-2-온 디히드로겐 포스페이트의 결정형
US8580767B2 (en) 2009-05-28 2013-11-12 Trius Therapeutics, Inc. Oxazolidinone containing dimer compounds, compositions and methods to make and use
US20120065170A1 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Micurx Pharmaceuticals, Inc. Antimicrobial Cyclocarbonyl Heterocyclic Compounds For Treatment Of Bacterial Infections
KR101629115B1 (ko) 2011-09-29 2016-06-09 수안주 파마 코포레이션 리미티드 바이아릴 헤테로고리로 치환된 옥사졸리디논 항균제
WO2016009401A2 (en) 2014-07-18 2016-01-21 Dr. Reddy's Laboratories Limited Preparation of tedizolid phosphate
WO2016041505A1 (zh) 2014-09-17 2016-03-24 正大天晴药业集团股份有限公司 一种磷酸特地唑胺、其中间体以及它们的制备方法
CN104496979A (zh) 2014-09-17 2015-04-08 博瑞生物医药技术(苏州)有限公司 一种噁唑烷酮类化合物及其中间体的制备方法
CN104327119A (zh) 2014-10-17 2015-02-04 苏州明锐医药科技有限公司 磷酸泰地唑胺的制备方法
WO2016088103A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Sun Pharmaceutical Industries Limited A process for the preparation of tedizolid phosphate
WO2016088102A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Sun Pharmaceutical Industries Limited Processes for the preparation of tedizolid phosphate and its intermediates
WO2016088101A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Sun Pharmaceutical Industries Limited Processes for the preparation of tedizolid phosphate and its intermediates
WO2016088100A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Sun Pharmaceutical Industries Limited Processes for the preparation of tedizolid phosphate and its intermediates
CN108472284A (zh) 2015-09-11 2018-08-31 维纳拓尔斯制药公司 β-内酰胺酶抑制剂
CN108366965B (zh) 2015-10-16 2021-10-01 易普森生物制药有限公司 稳定喜树碱药物组合物
WO2017066964A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxazolidinone compounds and methods of use thereof as antibacterial agents
CN106632298B (zh) 2015-11-03 2021-06-01 上海科胜药物研发有限公司 一种泰地唑胺的制备方法及其中间体
KR101855334B1 (ko) 2015-12-11 2018-06-08 에스티팜 주식회사 옥사졸리디논 유도체의 중간체 제조방법
US20180369143A1 (en) 2015-12-15 2018-12-27 British Columbia Cancer Agency Branch Metal complexed therapeutic agents and lipid-based nanoparticulate formulations thereof
EP3936153B1 (en) 2016-01-11 2024-08-21 Celator Pharmaceuticals, Inc. Inhibiting ataxia telangiectasia and rad3-related protein (atr)
US11040025B2 (en) 2016-02-17 2021-06-22 The Johns Hopkins University Oxazolidinone for treatment of infections with Mycobacterium tuberculosis
WO2018170664A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxazolidinone compounds and methods of use thereof as antibacterial agents
US12109203B2 (en) 2018-07-25 2024-10-08 Zydus Lifesciences Limited Substituted oxazolidinones for the treatment of mammalian infections
EP3914587A4 (en) 2019-01-18 2022-11-23 Merck Sharp & Dohme LLC OXAZOLIDINONE COMPOUNDS AND USES THEREOF AS ANTIBACTERIAL AGENTS
WO2021184339A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxazolidinone compound and methods of use thereof as an antibacterial agent
JP2023531666A (ja) 2020-06-18 2023-07-25 アカゲラ・メディスンズ，インコーポレイテッド オキサゾリジノン化合物、オキサゾリジノン化合物を含むリポソーム組成物、およびそれらの使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL299155A (en) 2023-02-01
US12116361B2 (en) 2024-10-15
US20230219941A1 (en) 2023-07-13
US20220274975A1 (en) 2022-09-01
AU2021292747A2 (en) 2023-04-27
US20210403463A1 (en) 2021-12-30
BR112022025918A2 (pt) 2023-03-14
MX2022016063A (es) 2023-04-11
AU2021292747A1 (en) 2023-02-23
US20230348447A1 (en) 2023-11-02
US11555033B2 (en) 2023-01-17
CA3183397A1 (en) 2021-12-23
US11566023B2 (en) 2023-01-31
US20230126415A1 (en) 2023-04-27
WO2021258013A1 (en) 2021-12-23
KR20230052873A (ko) 2023-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11566023B2 (en) Oxazolidinone compounds, liposome compositions comprising oxazolidinone compounds and method of use thereof
AU763989B2 (en) Quinolone containing liposomes and their use as antibacterial agents
WO2015031284A1 (en) Formulations comprising wetting agents and compounds for the modulation of hemoglobin (s)
JP2019501225A (ja) Ｂ細胞リンパ腫２（ｂｃｌ−２）及び関連タンパク質の阻害
US20210213051A1 (en) Combined pharmaceutical formulation comprising drug-containing liposome composition and platinum preparation
CA2768582C (en) Spectinamides as anti-tuberculosis agents
US12145928B2 (en) Oxazolidinone compounds, liposome compositions comprising oxazolidinone compounds and method of use thereof
WO2018144845A1 (en) Metalloporphyrin microparticles for treatment of anemia and tropical diseases
JP2019525922A (ja) 癌を治療するための方法および組成物
EP4168000A1 (en) Oxazolidinone compounds, liposome compositions comprising oxazolidinone compounds and methods of use thereof
WO2014184726A2 (en) Compounds and their use in therapy
KR20240152302A (ko) 옥사졸리디논 리포좀 조성물
JP2008505145A (ja) 排出ポンプ阻害剤を用いてペプチドデホルミラーゼ阻害剤の感受性を増加するための方法
US20080050425A1 (en) Combination Chemotherapy Comprising 5-Fluorouracil or a Derivative Thereof and a Liposomal Platinum Complex
WO2023122577A2 (en) Methods of treating cancer using liposomal particles comprising anticancer agents and pharmaceutical compositions related thereto
CA3206959A1 (en) Methods for treating and ameliorating cancer
TW202216122A (zh) 微脂體製劑
MXPA00009675A (en) Liposome composition and method for administering a quinolone

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240618

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240618