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JP2023524032A - ネオアンチゲン情報に基づいた腫瘍浸潤性リンパ球によるがん免疫療法 - Google Patents

ネオアンチゲン情報に基づいた腫瘍浸潤性リンパ球によるがん免疫療法 Download PDF

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Abstract

本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を教育して、養子細胞免疫療法用のＴＩＬの治療用集団に増殖させる方法を提供する。また、提供されるのは、がん患者を、ＴＩＬの治療用集団により処置する方法である。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月３０日出願の米国仮特許出願第６３／０１８，０５９号明細書の利益を主張し、この出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照
配列表の公式コピーが、２０２１年４月３０日に作成されて、１３，００２バイトのサイズを有するファイル名「９１４８２－２４２ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩフォーマット配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されて、本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩフォーマット文献に含有される配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本出願は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を教育して、養子細胞免疫療法用のＴＩＬの治療用集団に増殖させる方法、およびがん患者を処置する関連方法に関する。
免疫療法は、腫瘍抗原に対するＴ細胞媒介性応答が腫瘍細胞を除去するように作用するがん療法への新興のアプローチである。ネオアンチゲンは、体細胞突然変異によって形成される新規の配列の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）提示ペプチドであり、とりわけ有望な免疫療法標的を表す。なぜなら、腫瘍上で排他的に出現することで、最小オフターゲット効果を引き起こすからである。ＴＩＬ療法は、外科的に切除された腫瘍標本からＴＩを単離して、インビトロで増殖させてから、典型的にはリンパ球枯渇前処置レジメン後に患者に再注入する、自己細胞免疫療法のタイプを指す。ＴＩＬ療法は、広範ながんに対して若干の印象的な応答を達成してきた１、２、３、４が、その成功は散発的なままである５。
他方では、原則として、ＴＩＬ療法が広く適用可能な治療法であり得ると考えるいくつかの理由が存在する。第１に、腫瘍の大部分が、時に非常に低い頻度ではあるが、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞によって浸潤されることが知られている６。第２に、単一のネオアンチゲンに反応性のＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を含む高純度のＴＩＬ産物の増殖および注入が、腫瘍退縮を媒介するのに十分であることが示されてきた７、８。ゆえに、がん、および特に転移性がんを効果的に処置するＴＩＬ療法を生成する方法の向上が必要とされている。
本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、養子細胞免疫療法用のＴＩＬの治療用集団に増殖させる方法であって、（ａ）ＴＩＬの第１の集団を、患者から切除された腫瘍から得られた腫瘍細胞から分離する工程と；（ｂ）腫瘍細胞内の複数の患者特有の腫瘍突然変異を、患者由来の腫瘍ＤＮＡおよび／またはＲＮＡならびに正常ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのゲノム分析により検出する工程と；（ｃ）ＴＩＬの第１の集団由来のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質またはその断片との特異的結合を示す、体細胞突然変異に由来するネオアンチゲンを同定する工程と；（ｄ）ネオアンチゲンを、ＴＩＬの第１の集団とインキュベートして、ネオアンチゲンを認識するリンパ球が富化したＴＩＬの第２の集団を生成する工程と；（ｅ）ＴＩＬの第２の集団を、養子細胞免疫療法用のＴＩＬの治療用集団に増殖させる工程とを含む方法を提供する。
特定の態様において、複数の患者特有の腫瘍突然変異を検出する工程が、標的遺伝子パネルの次世代配列決定によるゲノムプロファイリングを含む。一態様において、ゲノムプロファイリングが、全ゲノムプロファイリング、全エクソームプロファイリング、および／またはトランスクリプトームプロファイリングを含む。
他の態様において、ゲノム分析が、発現される遺伝子内の複数の患者特有の腫瘍突然変異を、患者由来の腫瘍試料および正常試料の核酸配列決定によって同定する工程を含み、突然変異が、患者のがん細胞のゲノム内に存在するが、対象由来の正常細胞内に存在しない。
さらに他の態様において、複数の患者特有の腫瘍突然変異が、点突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異、リードスルー突然変異、遺伝子融合突然変異、挿入、欠失、またはそれらの組合せを含み；複数の患者特有の腫瘍突然変異が、親和性が野生型ポリペプチドよりも大きいＨＬＡタンパク質またはその断片に結合する腫瘍特異的ネオエピトープを有する少なくとも１つの突然変異ポリペプチドをコードする。
一部の態様において、方法が、患者のＭＨＣクラス１および２遺伝子型を同定する工程をさらに含む。一態様において、患者のＭＨＣクラス１および２遺伝子型を同定する工程が、腫瘍および／または正常組織からの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）および／またはＲＮＡ配列決定の分析を含む。
特定の態様において、ネオアンチゲンを同定する工程が、（ｉ）ペプチド構築物のライブラリを提供する工程であって、ライブラリの各ペプチド構築物が、ペプチド部分、およびペプチド部分を同定する同定核酸部分を含み、ペプチド構築物の少なくとも１つのペプチド部分が、ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できる、工程と；（ｉｉ）ＨＬＡタンパク質またはその断片を、ペプチド構築物のライブラリと接触させる工程と；（ｉｉｉ）ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できるペプチド部分を含む少なくとも１つのペプチド構築物を、ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できないペプチド部分を含むペプチド構築物から分離する工程と；（ｉｖ）ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できる少なくとも１つのペプチド構築物の同定核酸部分の全てまたは一部を配列決定する工程とを含む。
一部の態様において、ペプチド構築物のライブラリが、対応するタンパク質に及ぼす各突然変異の影響を予測して、非コード領域内のサイレント突然変異および突然変異を除外する、複数の患者特有の腫瘍突然変異の分析から設計されるバリアントペプチドを含む。一態様において、バリアントペプチドが、対応するタンパク質の構造に影響を与えると予測される突然変異を含む。
他の態様において、ネオアンチゲンを同定する工程が、（ｉ）ポリペプチドの遺伝的にコードされるコンビナトリアルライブラリを、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、バイシストロン性（ｂｉｓｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ＤＮＡディスプレイ、Ｐ２Ａ ＤＮＡディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、酵母ディスプレイ、または細菌ディスプレイにより生成する工程であって、コンビナトリアルライブラリが、ポリペプチドをコードする対応する核酸分子に連結されたポリペプチドを含む、工程と；（ｉｉ）コンビナトリアルライブラリを、ＨＬＡタンパク質またはその断片と接触させる工程と；（ｉｉｉ）コンビナトリアルライブラリとの特異的結合を示すＨＬＡタンパク質またはその断片を分離する工程と；（ｉｖ）ＨＬＡタンパク質またはその断片に結合したコンビナトリアルライブラリの核酸分子の全てまたは一部を配列決定して、ネオアンチゲンを同定する工程とを含む。
一態様において、ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリが、対応するタンパク質に及ぼす各突然変異の影響を予測して、非コード領域内のサイレント突然変異および突然変異を除外する、複数の患者特有の腫瘍突然変異の分析から設計されるバリアントペプチドを含む。
特定の態様において、ネオアンチゲンと、ＴＩＬの第１の集団由来のＨＬＡタンパク質またはその断片との間の特異的結合が、（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩα鎖の少なくとも一部およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖の少なくとも一部を、ＭＨＣクラスＩＩα鎖およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖がペプチド結合グルーブを形成するように含むＭＨＣクラスＩＩ構成要素；ならびにスペースホルダー分子および第１のプロセス可能リンカーをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）により形質転換した細胞を培養する工程であって、スペースホルダー分子が、プロセス可能リンカーによってＭＨＣクラスＩＩ構成要素に連結されて、スペースホルダー分子がペプチド結合グルーブ内で結合することによって、ペプチド結合グルーブ内の他のあらゆるペプチドの結合を妨害し；ＭＨＣクラスＩＩ構成要素を生成するように行われる培養する工程と；（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ構成要素を回収する工程と；（ｉｉｉ）プロセス可能リンカーをプロセシングすることによって、スペースホルダー分子をペプチド結合グルーブから放出する工程と；（ｉｖ）ＭＨＣクラスＩＩ構成要素をネオアンチゲンの存在下でインキュベートする工程であって、インキュベーションが、ペプチド結合グルーブへのネオアンチゲンの結合を促進する工程と；（ｖ）ネオアンチゲンに結合したＭＨＣクラスＩＩ構成要素を回収する工程とによって判定される。
一態様において、スペースホルダー分子が、コンセンサス配列ＡＡＸＡＡＡＡＡＡＡＸＡＡ（配列番号７８）を有する。別の態様において、スペースホルダー分子が、ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号７３）；ＡＡＭＡＡＡＡＡＡＡＭＡＡ（配列番号７４）；ＡＡＭＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７５）；ＡＡＦＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７６）；およびＡＳＭＳＡＡＳＡＡＳＭＡＡ（配列番号７７）からなる群から選択される。
一部の態様において、プロセス可能リンカーが、ＭＨＣクラスＩＩ構成要素のＭＨＣクラスＩＩα鎖に連結されている。他の態様において、ネオアンチゲンが結合したＭＨＣクラスＩＩ構成要素を回収する工程が、ＭＨＣクラスＩＩ構成要素を認識する抗体によるアフィニティクロマトグラフィーを含む。
特定の態様において、ネオアンチゲンと、ＴＩＬの第１の集団由来のＨＬＡタンパク質またはその断片との間の特異的結合を、ファージディスプレイによって判定し、ＨＬＡタンパク質またはその断片を、ファージの表面上で発現させ、そしてネオアンチゲンを
ファージとインキュベートして、特異的結合をアッセイする。
一態様において、方法は、ネオアンチゲンと、ＭＨＣクラスＩタンパク質またはその断片との間の特異的結合を判定するインシリコ分析をさらに含み、インシリコ分析が、ネオアンチゲンのペプチド配列に基づく、ＭＨＣ Ｉタンパク質への相対結合を予測する計算アルゴリズムを使用する工程を含む。
別の態様において、方法は、ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、およびそれらの組合せからなる群から選択されるマーカーを発現するＴＩＬを、ＴＩＬの第１の集団および／またはＴＩＬの第２の集団から、セルソーティングを介して除去して、集団内の非疲弊ＴＩＬを富化する工程をさらに含む。
さらに別の態様において、ネオアンチゲンをＴＩＬの第１の集団とインキュベートする工程が、ＴＩＬの第１の集団を、少なくとも１つのサイトカインと接触させる工程をさらに含む。一態様において、少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む。
一部の態様において、ＴＩＬの第２の集団をＴＩＬの治療用集団に増殖させる工程が、ＴＩＬの第２の集団の、患者のリンパ節領域中への注射、患者の胸腺中への注射、および／または静脈内投与を介した患者への全身注射を含む。
他の態様において、ＴＩＬの第２の集団をＴＩＬの治療用集団に増殖させる工程が、ＴＩＬの第２の集団の細胞培養培地に、ＩＬ－２、場合によってはＯＫＴ－３、およびフィーダー細胞を補充する工程を含む。
さらに他の態様において、ＴＩＬの第２の集団をＴＩＬの治療用集団に増殖させる工程が、（ｉ）ＩＬ－２、および場合によってはＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団を培養することによって第１の増殖を実行して、ＴＩＬの第３の集団を生成する工程であって、第１の増殖が、第１の気体透過性の表面領域を提供する閉じたコンテナ内で実行され、第１の増殖を、約３～１４日間実行されて、ＴＩＬの第３の集団が得られ、ＴＩＬの第３の集団が、ＴＩＬの第２の集団よりも、数で少なくとも５０倍大きく、移行が、系を開けることなく起こる、工程と；場合によっては、（ｉｉ）ＴＩＬの第３の集団の細胞培養培地に、追加のＩＬ－２、場合によってはＯＫＴ－３、およびフィーダー細胞を補充することによって第２の増殖を実行して、ＴＩＬの第４の集団を生成する工程であって、第２の増殖を、約７～１４日間実行されて、ＴＩＬの第４の集団が得られ、ＴＩＬの第４の集団が、ＴＩＬの治療用集団であり、第３の増殖が、第２の気体透過性の表面領域を提供する閉じたコンテナ内で実行され、移行が、系を開けることなく起こる、工程とを含む。一態様において、フィーダー細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または照射を受けた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。
別の態様において、方法は、患者由来の腫瘍細胞に由来するオルガノイドによる免疫浸潤アッセイを実行して、ＴＩＬの第１の集団と比較した、ＴＩＬの第２の集団によるオルガノイドの浸潤の増強を確認する工程をさらに含む。
本発明はまた、本明細書中で開示されるＴＩＬの治療用集団、ＤＭＳＯを含む凍結防止媒体、および電解質溶液を含む低温保存組成物を提供する。
一部の態様において、低温保存組成物は、１つまたは複数のスタビライザー、および１つまたは複数のリンパ球増殖因子をさらに含む。一態様において、１つまたは複数のスタビライザーはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、１つまたは複数のリンパ球増殖因子はＩＬ－２を含む。
本発明はまた、がんを有する対象を処置する方法であって、本明細書中で開示されるＴＩＬの治療用集団の有効量を、処置を必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。
一部の態様において、ＴＩＬの治療用集団の有効量を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に施される。一態様において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、２日間の６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でのシクロホスファミドの投与に続く、５日間の２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でのフルダラビンの投与の工程を含む。
他の態様において、方法は、ＴＩＬの治療用集団の投与の次の日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンにより患者を処置する工程をさらに含む。一態様において、高用量ＩＬ－２レジメンが、許容限界量まで８時間毎に１５分のボーラス静注として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
特定の態様において、方法は、ＴＩＬの治療用集団を免疫チェックポイントインヒビタと接触させるか、または患者に免疫チェックポイントインヒビタを投与する工程をさらに含む。一態様において、チェックポイントインヒビタが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－２、４－１ＢＢ、もしくはＶＩＳＴＡインヒビタ、またはそれらの組合せを含む。別の態様において、チェックポイントインヒビタが、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｕｍａｂ）（抗ＣＴＬＡ－４）、ペムブロリズマブ（ｐｅｎｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＰＤ－Ｌ１）、ニボルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、デュルバルマブ（ｄｕｒａｌｕｍａｂ）（抗ＰＤ－Ｌ１）、またはそれらの組合せを含む。
一部の態様において、がんが、黒色腫、卵巣がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺がん、膀胱がん、乳がん、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるがん、頭頚部がん（頭頚部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）が挙げられる）、腎臓がん、および腎細胞がんからなる群から選択される。他の態様において、がんが、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸がん、ＮＳＣＬＣ、およびトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）からなる群から選択される。
さらに他の態様において、ＴＩＬの治療用集団が、静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、または腫瘍内に投与される。
治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離するための従来の方法と、ＴＩＬを富化するためにゲノムツールを使用する記載された改善された方法との比較を示す。 患者からリンパ球を採取することから始まる、本明細書に記載される方法のワークフローのより詳細な概要を示す。 図２に示されるワークフローの単純化されたタイムラインを示し、おおよそのタイミング要件が示されている。 図２に示されるワークフローのより詳細なタイムラインを示し、おおよそのタイミング要件が示されている。 ＤＮＡバーコード化ペプチドの大きなライブラリの効率的な合成および分析のためのプラットフォームとしてのＰｅｐＳｅｑを示す。示されたペプチド－ＤＮＡライブラリは、コードされたペプチドへのＤＮＡの連結を容易にするピューロマイシン（「Ｐｕｒｏ」）アダプターを示す。 候補ネオアンチゲンを同定するための腫瘍エクソームの分析、ＭＨＣ－ＰｅｐＳｅｑアッセイによる候補ネオアンチゲンの特徴付け、およびＭＨＣ－ＰｅｐＳｅｑアッセイにおけるＨＬＡタンパク質に結合したネオアンチゲンに対するＴ細胞応答の評価を示す。 腫瘍エクソームの分析から同定された突然変異の分析のためのＰｅｐＳｅｑライブラリ設計を示す。 ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するネオアンチゲンを同定するために使用したＭＨＣ－ＰｅｐＳｅｑアッセイの実施形態を示す。対照群（「非切断」）では、ＣＬＩＰペプチドはＨＬＡ構築物から除去されず、候補ネオアンチゲンが非特異的に結合するが、試験群（「切断」）では、ＣＬＩＰペプチドの除去により、ＨＬＡ構築物の認識部位が開き、候補ネオアンチゲンの特異的結合を可能にする。 ２人のヒト患者（すなわち、ＴＧ０００６およびＴＧ０００１３）からの富化ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）の同定を示す。エクソーム分析により各患者において同定された突然変異の数は、各患者ＩＤの下に示される。結合アッセイにおいて使用したＨＬＡ複合体のヒト白血球抗原血清型は、各グラフの左上隅に同定されている。富化ペプチドは、より大きなデータポイントとして示される。 ヒト患者ＴＧ０００１３から富化ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）を同定する追加のデータセットを示す。富化ペプチドは、切断されたＨＬＡ複合体のｌｏｇ平均％読み取りが０に近い（すなわち、切断されたＨＬＡ複合体との結合が１００％に近い）ペプチドに対応する各グラフの上部にデータポイントとして表示される。 富化ペプチドのアミノ酸配列、各ペプチドの対応する突然変異、およびヒト患者ＴＧ０００１３に対してペプチドが特異的に結合するＨＬＡ複合体のヒト白血球抗原血清型を示す。 ネオアンチゲンを同定するためのインシリコ予測に対するＭＨＣ－ＰｅｐＳｅｑの比較を示す。インシリコ分析で使用したＩＥＤＢコンセンサス配列は、国立アレルギー感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）（ＮＩＡＩＤ）によって維持される公的リソースである、免疫エピトープデータベースおよび分析リソース（Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）（ＩＥＤＢ）から得られる。 腫瘍細胞の懸濁液からのスフェロイド／オルガノイドの生成を示す。 図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、浸潤アッセイワークフローを示す。図１４Ａでは、オルガノイドが丸底プレート中の腫瘍細胞懸濁液から形成された後、透過性支持体が挿入され、富化されたＴＩＬが、支持体を通って移動してオルガノイドに浸潤することが可能になる。図１４Ｂは、Ｚスタッキングによるオルガノイドの三次元画像の生成を示す。図１４Ｃは、オルガノイドへのリンパ球の浸潤の定量を示す。 図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、浸潤アッセイワークフローを示す。図１４Ａでは、オルガノイドが丸底プレート中の腫瘍細胞懸濁液から形成された後、透過性支持体が挿入され、富化されたＴＩＬが、支持体を通って移動してオルガノイドに浸潤することが可能になる。図１４Ｂは、Ｚスタッキングによるオルガノイドの三次元画像の生成を示す。図１４Ｃは、オルガノイドへのリンパ球の浸潤の定量を示す。 図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、浸潤アッセイワークフローを示す。図１４Ａでは、オルガノイドが丸底プレート中の腫瘍細胞懸濁液から形成された後、透過性支持体が挿入され、富化されたＴＩＬが、支持体を通って移動してオルガノイドに浸潤することが可能になる。図１４Ｂは、Ｚスタッキングによるオルガノイドの三次元画像の生成を示す。図１４Ｃは、オルガノイドへのリンパ球の浸潤の定量を示す。 黒色腫に罹患した患者ＴＧ０００１３に由来するオルガノイドへのＴＩＬ浸潤を示す。 処置群間の差の統計的分析と共に患者ＴＧ０００１３に由来するオルガノイドへのＴＩＬ浸潤を評価する別のデータセットを示す。 患者ＴＧ０００１３からの一般的な非関与（「ＧＵ」）組織と比較した、腫瘍細胞へのＴＩＬの特異的浸潤を示す。 ＣＴ２６結腸癌マウスを用いたネオＴＩＬ分析および治療のためのワークフローの一実施形態を示す。別の実施形態では、対象（例えば、マウスまたはヒト）は、ステップＩＶの前にリンパ球枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を経験する。 ＣＴ２６結腸癌マウスからの富化ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）を示す。富化ペプチドは、切断されたマウスＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ同種抗原でのｌｏｇ平均％読み取りが０に近い（すなわち、切断されたマウス同種抗原との結合が１００％に近い）ペプチドに対応するグラフの上部のデータポイントとして表示される。 富化ペプチドのアミノ酸配列、各ペプチドの対応する突然変異、およびペプチドがＣＴ２６結腸癌マウスに対して特異的に結合するマウスＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ同種抗原を示す。 １日目および７日目に、ＤＭＳＯ、ＩＬ－２、ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）、またはＩＬ－２を伴うペプチドと共培養したＴＩＬの顕微鏡画像を示す。 ＣＴ２６マウス腫瘍オルガノイドにおける免疫浸潤アッセイからの顕微鏡画像を示す。以下の処置をオルガノイドに投与した：１）ＴＩＬ、２）ＴＩＬ＋ＩＬ－２、３）ＴＩＬ＋ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）、４）ＴＩＬ＋ＩＬ－２＋ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）、および５）ＴＩＬ＋ＤＭＳＯ。 図２２の画像に示したＣＴ２６マウス腫瘍に由来するオルガノイドへのＴＩＬ浸潤の定量を示す。ＴＩＬは、数世代の細胞の移動または位置をモニタリングするのに適した赤色蛍光色素である、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＥＲ（商標）ＣＭ－ＤｉＩで染色した。色素は、オルガノイドへのＴＩＬ浸潤の定量を容易にする。画像分析を、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５ソフトウェアによって実施した。処置群間の差の統計的分析も示し、有意差をアスタリスクでマークした。 １）ＴＩＬ、２）ＴＩＬ＋ＩＬ－２、３）ＴＩＬ＋ペプチド（ネオアンチゲン）、４）ＴＩＬ＋ＩＬ－２＋ペプチド（ネオアンチゲン）、および５）ビヒクルの腫瘍内（「ＩＴ」）投与後のＣＴ２６結腸癌マウスにおける平均腫瘍体積を示す。 １）ＴＩＬ＋ＩＬ－２、２）ＴＩＬ＋ペプチド（ネオアンチゲン）、３）ＴＩＬ＋ＩＬ－２＋ペプチド（ネオアンチゲン）、および４）ＴＩＬ＋ビヒクルの静脈内（「ＩＶ」）投与後のＣＴ２６結腸癌マウスにおける平均腫瘍体積を示す。 図２６Ａ～２６Ｅは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２６Ａ、２６Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）または一般的な非関与（ＧＵ）組織（灰色）からの黒色腫患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２６Ｃ）、ＴＮＦα（図２６Ｄ）、およびグランザイムＢ（図２６Ｅ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中のＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって測定した。 図２６Ａ～２６Ｅは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２６Ａ、２６Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）または一般的な非関与（ＧＵ）組織（灰色）からの黒色腫患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２６Ｃ）、ＴＮＦα（図２６Ｄ）、およびグランザイムＢ（図２６Ｅ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中のＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって測定した。 図２６Ａ～２６Ｅは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２６Ａ、２６Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）または一般的な非関与（ＧＵ）組織（灰色）からの黒色腫患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２６Ｃ）、ＴＮＦα（図２６Ｄ）、およびグランザイムＢ（図２６Ｅ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中のＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって測定した。 図２６Ａ～２６Ｅは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２６Ａ、２６Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）または一般的な非関与（ＧＵ）組織（灰色）からの黒色腫患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２６Ｃ）、ＴＮＦα（図２６Ｄ）、およびグランザイムＢ（図２６Ｅ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中のＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって測定した。 図２６Ａ～２６Ｅは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２６Ａ、２６Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）または一般的な非関与（ＧＵ）組織（灰色）からの黒色腫患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２６Ｃ）、ＴＮＦα（図２６Ｄ）、およびグランザイムＢ（図２６Ｅ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中のＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２７Ａ～２７Ｋは、黒色腫におけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。黒色腫患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２７Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｂ）、グランザイムＢ（図２７Ｃ）、およびパーフォリン（図２７Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２７Ｅ）、ＴＮＦα（図２７Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２７Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２７Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２７Ｉ）、ＬＡＧ３（図２７Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２７Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２８Ａ～２８Ｇは、肺がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。肺がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）またはＧＵ組織（灰色）からの肺がん患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２８Ｃ）、グランザイムＢ（図２８Ｂ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中でＭＳＤアッセイによって測定した。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬ馴化培地中のＩＦＮγ（図２８Ｅ）、グランザイムＢ（図２８Ｆ）、およびパーフォリン（図２８Ｇ）の相対的発現を測定した。 図２８Ａ～２８Ｇは、肺がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。肺がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）またはＧＵ組織（灰色）からの肺がん患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２８Ｃ）、グランザイムＢ（図２８Ｂ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中でＭＳＤアッセイによって測定した。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬ馴化培地中のＩＦＮγ（図２８Ｅ）、グランザイムＢ（図２８Ｆ）、およびパーフォリン（図２８Ｇ）の相対的発現を測定した。 図２８Ａ～２８Ｇは、肺がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。肺がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）またはＧＵ組織（灰色）からの肺がん患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２８Ｃ）、グランザイムＢ（図２８Ｂ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中でＭＳＤアッセイによって測定した。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬ馴化培地中のＩＦＮγ（図２８Ｅ）、グランザイムＢ（図２８Ｆ）、およびパーフォリン（図２８Ｇ）の相対的発現を測定した。 図２８Ａ～２８Ｇは、肺がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。肺がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）またはＧＵ組織（灰色）からの肺がん患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２８Ｃ）、グランザイムＢ（図２８Ｂ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中でＭＳＤアッセイによって測定した。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬ馴化培地中のＩＦＮγ（図２８Ｅ）、グランザイムＢ（図２８Ｆ）、およびパーフォリン（図２８Ｇ）の相対的発現を測定した。 図２８Ａ～２８Ｇは、肺がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。肺がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）またはＧＵ組織（灰色）からの肺がん患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２８Ｃ）、グランザイムＢ（図２８Ｂ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中でＭＳＤアッセイによって測定した。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬ馴化培地中のＩＦＮγ（図２８Ｅ）、グランザイムＢ（図２８Ｆ）、およびパーフォリン（図２８Ｇ）の相対的発現を測定した。 図２８Ａ～２８Ｇは、肺がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。肺がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）またはＧＵ組織（灰色）からの肺がん患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２８Ｃ）、グランザイムＢ（図２８Ｂ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中でＭＳＤアッセイによって測定した。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬ馴化培地中のＩＦＮγ（図２８Ｅ）、グランザイムＢ（図２８Ｆ）、およびパーフォリン（図２８Ｇ）の相対的発現を測定した。 図２８Ａ～２８Ｇは、肺がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。肺がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。図２６Ｂは、腫瘍（黒色）またはＧＵ組織（灰色）からの肺がん患者のオルガノイドにおける免疫浸潤アッセイを示す。ＩＦＮγ（図２８Ｃ）、グランザイムＢ（図２８Ｂ）のレベルを、ＴＩＬ馴化培地中でＭＳＤアッセイによって測定した。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬ馴化培地中のＩＦＮγ（図２８Ｅ）、グランザイムＢ（図２８Ｆ）、およびパーフォリン（図２８Ｇ）の相対的発現を測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図２９Ａ～２９Ｋは、結腸がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。結腸がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図２９Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｂ）、グランザイムＢ（図２９Ｃ）、およびパーフォリン（図２９Ｄ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図２９Ｅ）、ＴＮＦα（図２９Ｆ）、およびグランザイムＢ（図２９Ｇ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図２９Ｈ）、ＴＩＭ－３（図２９Ｉ）、ＬＡＧ３（図２９Ｊ）、およびＴＩＧＩＴ（図２９Ｋ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３０Ａ～３０Ｊは、膵臓がんにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性を示す。膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドにおいてＴＩＬ浸潤を測定した（図３０Ａ）。ｑＰＣＲアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｂ）およびグランザイムＢ（図３０Ｃ）の相対的発現を測定した。ＭＳＤアッセイにより、ＴＩＬおよび馴化培地中のＩＦＮγ（図３０Ｄ）、ＴＮＦα（図３０Ｅ）、およびグランザイムＢ（図３０Ｆ）のレベルを測定した。また、ｑＰＣＲアッセイにより、疲弊マーカーＰＤ－１（図３０Ｇ）、ＴＩＭ－３（図３０Ｈ）、ＬＡＧ３（図３０Ｉ）、およびＴＩＧＩＴ（図３０Ｊ）の相対的発現も測定した。 図３１Ａ～３１Ｃは、ネオＴＩＬ（商標）の有効性の推定値を経時的に示す。患者のチューモロイド（ｔｕｍｏｒｏｉｄ）に対して実施した免疫浸潤アッセイにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性は、従来のＴＩＬと比較して数日後も維持される。４８時間アッセイ（図３１Ａ）、７２時間アッセイ（図３１Ｂ）、および１２０時間アッセイ（図３１Ｃ）。 図３１Ａ～３１Ｃは、ネオＴＩＬ（商標）の有効性の推定値を経時的に示す。患者のチューモロイド（ｔｕｍｏｒｏｉｄ）に対して実施した免疫浸潤アッセイにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性は、従来のＴＩＬと比較して数日後も維持される。４８時間アッセイ（図３１Ａ）、７２時間アッセイ（図３１Ｂ）、および１２０時間アッセイ（図３１Ｃ）。 図３１Ａ～３１Ｃは、ネオＴＩＬ（商標）の有効性の推定値を経時的に示す。患者のチューモロイド（ｔｕｍｏｒｏｉｄ）に対して実施した免疫浸潤アッセイにおけるネオＴＩＬ（商標）の有効性は、従来のＴＩＬと比較して数日後も維持される。４８時間アッセイ（図３１Ａ）、７２時間アッセイ（図３１Ｂ）、および１２０時間アッセイ（図３１Ｃ）。 ネオＴＩＬが、従来のＴＩＬと比較して元の患者からの腫瘍組織をどのように選択的に認識したかを示す。がん患者３４から授かった未処置のＴＩＬおよびＩＬ－２処理したＴＩＬならびにネオＴＩＬを、がん患者２４のオルガノイドとインキュベートした。ＴＩＬ浸潤のレベルを、２４時間、４８時間、および７２時間で分析した。 ペプチドを授かった後および急速増殖プロトコール（ＲＥＰ）後のネオＴＩＬの単一細胞配列決定を示す。細胞の９５％がＣＤ４５陽性、９７％がＣＤ３Ｄ陽性、９８％がＣＤ３Ｅ陽性、および８０％がＣＤ３Ｇ陽性であった。
本明細書中で、そして添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。ゆえに、「抗体またはその抗原結合断片」への言及は、１つまたは複数の抗体またはその抗原結合断片に言及し、そして「方法」への言及は、本明細書中で開示されており、かつ／または当業者に知られている等しい工程および方法への言及を含む、等々である。
本明細書中の「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」は、対象の血流を出て腫瘍中に移動した白血球として元々得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとして、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１およびＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、ならびにＭ１マクロファージが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＩＬは、一次ＴＩＬおよび二次ＴＩＬの双方を含む。「一次ＴＩＬ」は、本明細書中で概説される患者組織試料から得られる（時折「フレッシュに収集される」と称される）ものであり、「第２のＴＩＬ」は、増殖した（ｅｘｐａｎｄｅｄまたはｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ）あらゆるＴＩＬ細胞集団である。
ＴＩＬは、通常、細胞表面マーカーを用いて生化学的に、または腫瘍に浸潤して処置を達成する能力によって機能的に定義され得る。ＴＩＬは、通常、以下のバイオマーカーの１つまたは複数を発現することによってカテゴリー化され得る：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲアルファ／ベータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、およびＣＤ２５。加えて、そして代わりに、ＴＩＬは、患者中への再導入により固形腫瘍に浸潤する能力によって機能的に定義され得る。ＴＩＬはさらに、効力によって特徴付けられてもよい。例えば、ＴＩＬは、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）放出が約５０ｐｇ／ｍＬよりも大きいか、約１００ｐｇ／ｍＬよりも大きいか、約１５０ｐｇ／ｍＬよりも大きいか、または約２００ｐｇ／ｍＬよりも大きいならば、強力であると考えられてよい。
「ネオエピトープ」は、当該技術において、特定の事象への曝露または特定の事象の出現（例えば、特定の疾患、障害、または症状、例えば、感染、がん、がんの病期等の発生または進行）の後に、対象において出現または発達するエピトープを指すと理解される。本明細書中で用いられるネオエピトープは、存在および／またはレベルが、事象への曝露または事象の出現と相関するものである。一部の実施形態において、ネオエピトープは、これを（例えば、妥当なレベルにて）発現する細胞に対して免疫応答をトリガーするものである。一部の実施形態において、ネオエピトープは、これを（例えば、妥当なレベルにて）発現する細胞を死滅させるか、そうでなければ破壊する免疫応答をトリガーするものである。一部の実施形態において、ネオエピトープをトリガーする関連事象は、細胞における体細胞突然変異であるか、またはこれを含む。一部の実施形態において、ネオエピトープは、非がん細胞において、免疫応答（例えば、ネオエピトープを発現するがん細胞を標的とするのに十分な免疫応答）をトリガーかつ／または支持するレベルにまで、かつ／または様式で、発現されなかった。一部の実施形態において、ネオエピトープはネオアンチゲンである。
本明細書中で用いられる用語「ネオアンチゲン特異的腫瘍浸潤リンパ球」（Ｎｅｏ－ＴＩＬ（商標）としても示されている）は、本明細書中に記載される方法に従って生成される腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を指す。
用語「標的」、「標的分子」、および「標的剤」は、本明細書中で互換的に用いられており、ライブラリとインキュベートして、標的への特異的結合を示すペプチドを同定するタンパク質、毒素、酵素、病原体、細胞、またはバイオマーカーを指す。
用語「ペプチド」および「ポリペプチド」等は、本明細書中で互換的に用いられており、あらゆる長さのアミノ酸のポリマー形態、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを指す。
本明細書中で用いられる用語「ペプチド構築物」は、同定オリゴヌクレオチドに取り付けられたあらゆる長さのペプチドを指す。取付けは、介在リンカーを介してよく、そして取付けは、共有結合であっても非共有結合であってもよい。同定オリゴヌクレオチドは、翻訳されて構築物のペプチド部分を形成するメッセージであってもよいし、知られており、かつ取り付けられたペプチドを配列決定によって同定するのに用いられ得る他のあらゆる配列であってもよい。「ペプチド構築物セット」は、オリゴヌクレオチドのカスタム設計セットから生成されたペプチド構築物のプールを指す。セットは、ペプチド構築物の種あたり僅か１つのコピーしか含有しなくてもよいが、典型的には、各ペプチド構築物の多くのコピーを含有する。
本明細書中で用いられる用語「結合」は、分子同士が互いに近い安定した会合をもたらす、２つの分子間の引力相互作用を指す。分子結合は、以下のタイプに分類され得る：非共有結合、可逆性共有結合、および不可逆性共有結合。分子結合に関与し得る分子として、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、および小有機分子、例えば医薬化合物が挙げられる。例えば、他の分子と安定した複合体を形成するタンパク質は、多くの場合、受容体と称される一方、その結合パートナーは、リガンドと呼ばれる。また、核酸は、それ自体と、または他のものと安定した複合体、例えば、ＤＮＡ－タンパク質複合体、ＤＮＡ－ＤＮＡ複合体、ＤＮＡ－ＲＮＡ複合体を形成し得る。
本明細書中で用いられる用語「特異的結合」は、標的、例えばポリペプチド抗原に優先的に結合するような、バインダー、例えば抗体の特異性を指す。結合パートナー、例えば、タンパク質、核酸、抗体、または他の親和性捕捉剤等を指す場合、「特異的結合」は、指定されるアッセイ条件下での選択的ハイブリダイゼーションを確実にするような親和性および／または相補性が高い２つ以上の結合パートナーの結合反応を含み得る。典型的には、特異的結合は、バックグラウンドシグナルの標準偏差の少なくとも３倍となろう。ゆえに、指定された条件下で、結合パートナーは、その特定の標的分子に結合して、試料中に存在する他の分子に、かなりの量で結合しない。他の潜在的干渉物質の存在下での特定の標的のバインダーまたは抗体による認識が、そのような結合に特有のものである。好ましくは、標的に特異的であるか、または標的に特異的に結合するバインダー、抗体、または抗体断片は、標的に、他の非標的物質に結合するよりも高い親和性で結合する。また、好ましくは、標的に特異的であるか、または標的に特異的に結合するバインダー、抗体、または抗体断片は、非標的物質、例えば試験試料中に存在するかなりのパーセンテージの非標的物質への結合を回避する。一部の実施形態において、本開示のバインダー、抗体、または抗体断片は、約９０％超の非標的物質への結合を回避するが、より高いパーセンテージが明らかに意図され、かつ好ましい。例えば、本開示のバインダー、抗体、または抗体断片は、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、そして約９９％以上の非標的物質への結合を回避する。他の実施形態において、本開示のバインダー、抗体、または抗体断片は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、もしくは７０％超、または約７５％超、または約８０％超、または約８５％超の非標的物質への結合を回避する。
本明細書中で用いられる用語「捕捉剤」および「捕捉基」は、標的分子上の親和性基もしくはドメインまたはペプチド構築物の親和性タグへの結合またはこれらとの連結を介して、標的分子またはペプチド構築物の捕捉を可能にするあらゆる部分を指す。捕捉剤とその親和性タグとの間の結合は、共有結合および／または非共有結合であってよい。捕捉剤として、例えば、融合ペプチド上の親和性タグに選択的に結合する結合対のメンバー、組換え技術または他の機構によって加えられる化学結合、酵素の補因子等が挙げられる。捕捉剤は、ペプチド構築物と、ハイブリダイゼーション、架橋結合（例えば、ソラレン等のフロクマリンを用いた共有結合性固定）、ライゲーション、化学的に反応性の基を介した取付け、翻訳後修飾による導入等が挙げられる従来の技術を用いて会合され得る。
「配列の決定」、「配列決定」等は、核酸のヌクレオチド塩基配列に関する情報の決定を含む。そのような情報は、核酸の部分配列情報および完全配列情報の同定または決定を含んでよい。配列情報は、様々な程度の統計学的確実性または信頼性により決定されてよい。一態様において、当該用語は、同一性、および核酸における複数の連続したヌクレオチドの順序の決定を含む。「ハイスループット配列決定」または「次世代配列決定」は、本質的に並列に、多く（典型的には数千～数十億）の核酸配列を決定する、すなわち、ＤＮＡ鋳型が、１つずつではなくバルクプロセスでの配列決定用に調製され、そして多くの配列が、好ましくは並列で、またはそれ以外ではそれ自体が並列化され得るウルトラハイスループットシリアルプロセスを用いて読み出される方法を用いた、配列の決定を含む。そのような方法として、以下に限定されないが、パイロシーケンシング（例えば、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴによって商品化されているもの）；ライゲーションによる配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡにおいて商品化されているもの）；修飾ヌクレオチドを用いた合成による配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡによるＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術；Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡによるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）；ならびにＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡのＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＰａｃＢｉｏ ＲＳにおいて商品化されているもの）、イオン検出技術による配列決定（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）技術、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；ＤＮＡナノボールの配列決定（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；ナノポアベースの配列決定技術（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬＴＤ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫによって開発されたもの）、およびそのような高度に並列化された配列決定方法が挙げられる。
用語「エクソーム」は、当該技術において理解される意味に従って用いられており、特定のゲノム内で見出されるエキソン配列のセットを指す。
本明細書中で用いられる用語「突然変異」は、遺伝子を構成するＤＮＡ配列内の永続的な変化を指す。一部の実施形態において、突然変異は、単一のＤＮＡ構築ブロック（ＤＮＡ塩基）から、染色体の大きなセグメントのサイズに及ぶ。一部の実施形態において、突然変異は、ミスセンス突然変異、フレームシフト突然変異、重複、挿入、ナンセンス突然変異、欠失、および反復拡張を含み得る。一部の実施形態において、ミスセンス突然変異は、遺伝子によって製造されるタンパク質内での、あるアミノ酸の、別のものとの置換をもたらす一ＤＮＡ塩基対の変化である。一部の実施形態において、ナンセンス突然変異もまた、一ＤＮＡ塩基対における変化である。しかしながら、あるアミノ酸の、別のものとの置換の代わりに、変更されたＤＮＡ配列は、細胞にシグナルを早期に出して、タンパク質を構築するのを停止させる。一部の実施形態において、挿入は、ＤＮＡ片を加えることによって、遺伝子内のＤＮＡ塩基の数を変える。一部の実施形態において、欠失は、ＤＮＡ片を除去することによって、ＤＮＡ塩基の数を変える。一部の実施形態において、小さな欠失が、遺伝子内の１つまたは少数の塩基対を除去し得る一方、より大きな欠失が、遺伝子全体またはいくつかの隣接遺伝子を除去し得る。一部の実施形態において、重複は、１回または複数回、異常にコピーされる、ＤＮＡ片からなる。一部の実施形態において、フレームシフト突然変異は、ＤＮＡ塩基の付加または消失が遺伝子のリーディングフレームを変える場合に起こる。リーディングフレームは、各々が１つのアミノ酸をコードする、３つの塩基の群からなる。一部の実施形態において、フレームシフト突然変異は、これらの塩基のグループ化をシフトして、アミノ酸のコードを変える。一部の実施形態において、挿入、欠失、および重複は全て、フレームシフト突然変異であり得る。一部の実施形態において、反復拡張は、別のタイプの突然変異である。一部の実施形態において、ヌクレオチド反復は、１列に何回も連続して反復される短いＤＮＡ配列である。例えば、トリヌクレオチド反復は３塩基対配列で構成され、テトラヌクレオチド反復は４塩基対配列で構成される。一部の実施形態において、反復拡張は、短いＤＮＡ配列が反復される回数を増やす突然変異である。
本明細書中で用いられる「小分子」は、５キロダルトン未満、より典型的には１キロダルトン未満の分子を意味する。本明細書中で用いられる「小分子」は、ペプチドを含む。
「親和性タグ」は、当該技術におけるその普通の意味で与えられる。親和性タグは、標的生体材料または化学材料に容易に取り付けられ得るあらゆる生体材料または化学材料である。親和性タグは、適切なあらゆる方法によって、標的生体分子または化学分子に取り付けられてよい。例えば、一部の実施形態において、親和性タグは、遺伝的方法を用いて、標的分子に取り付けられてよい。例えば、親和性タグをコードする核酸配列は、生体分子をコードする配列の近くに挿入されてよい；配列は、親和性タグを生体分子と共に発現させることを可能にするように、核酸内のどこにでも、例えば、その内部に、それに隣接して、またはその近くに、配置されてよい。他の実施形態において、親和性タグはまた、分子が生成（例えば、発現または合成）された後に、標的生体分子または化学分子に取り付けられてもよい。一例として、ビオチン等の親和性タグを、例えば共有結合的に、標的タンパク質またはペプチドに化学的に結合して、ストレプトアビジンへの標的の結合を促進し得る。
親和性タグとして、例えば、金属結合タグ、例えば、ヒスチジンタグ、ＧＳＴ（グルタチオン／ＧＳＴ結合内）、ストレプトアビジン（ビオチン／ストレプトアビジン結合内）が挙げられる。他の親和性タグとして、Ｍｙｃ／Ｍａｘ対内のＭｙｃもしくはＭａｘ、またはポリアミノ酸、例えばポリヒスチジンが挙げられる。本明細書中の種々の場所にて、特定の親和性タグが、結合相互作用と併せて説明される。知られている生体結合パートナーまたは化学結合パートナーであり得る、親和性タグが相互作用する（すなわち結合する）分子は、「認識実体」である。本発明は、親和性タグを使用するあらゆる実施形態において、各々、本明細書中に記載される親和性タグのいずれかの選択を包含する、一連の個々の実施形態を包含することが理解されるべきである。
「認識実体」は、親和性タグに結合することができるあらゆる化学材料または生体材料であってよい。認識実体は、例えば、小分子、例えばマルトース（ＭＢＰ、またはマルトース結合タンパク質に結合する）、グルタチオン、ＮＴＡ／Ｎｉ２＋、ビオチン（ストレプトアビジンに結合し得る）、または抗体であってよい。親和性タグ／認識実体相互作用は、標的分子の、例えば、別の生体材料もしくは化学材料への、または基質（例えば、ニトロセルロース膜または他の固定された基質）への取付けを促進し得る。親和性タグ／認識実体相互作用の例として、ポリヒスチジン／ＮＴＡ／Ｎｉ２＋、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ／グルタチオン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ストレプトアビジン／ビオチン、ビオチン／ストレプトアビジン、抗原（または抗原断片）／抗体（または抗体断片）等が挙げられる。
用語「リボソームディスプレイ」は、ｍＲＮＡ、リボソーム、および対応する目的のタンパク質の三元複合体を産することができる反応系を指す。リボソームディスプレイは、標的抗原またはリガンド結合について、細胞表面受容体、抗体、およびそれらの断片をスクリーニングするのに用いられ得る。反応系を作製する工程は、１）ＤＮＡライブラリを生成して、ライブラリをＲＮＡライブラリに転写する工程と、２）ＲＮＡを精製して、無細胞タンパク質合成系によりインビトロ翻訳する工程と、３）翻訳反応のリボソーム複合体を、標的抗原またはリガンドに結合させる工程と、４）結合したリボソーム複合体を選択する工程と；５）ＲＮＡを複合体から単離して、転写産物をｃＤＮＡに逆転写する工程とを含み得、ｃＤＮＡは、増幅、配列決定、かつ／またはさらに修飾され得る。
本明細書中で用いられる用語、対象への剤の「投与」および「投与すること」は、剤を対象に導入または送達して、その意図される機能を実行するあらゆる経路を含む。投与は、静脈内、筋肉内、腹膜内、または皮下が挙げられる適切なあらゆる経路によって実行され得る。投与として、自己投与、および他者による投与が挙げられる。
用語「有効量」または「治療的有効量」は、疾患処置が挙げられるがこれに限定されない意図される適用に影響を与えるのに十分な、本明細書中に記載される剤または剤の組合せの量を指す。治療的有効量は、意図される適用（インビトロまたはインビボ）、処置される対象および疾患状態（例えば、対象の体重、年齢、および性別）、疾患状態の重症度、または投与の様式に応じて変わってよい。また、当該用語は、標的細胞において特定の応答を誘導するであろう用量に当て嵌まる。具体的な用量は、選択される特定の剤、後に続く投与レジメン、剤が、他の剤と組み合わせて投与されるか、投与のタイミング、投与される組織、および化合物が運ばれる物理的送達系に応じて変わるであろう。
用語「処置」、「処置すること」、「処置する」等は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその病徴を完全に、または部分的に妨げることに関して予防的であってよく、かつ／あるいは疾患に対する部分的治癒もしくは完治、および／または疾患に起因する悪影響に関して治療的であってよい。本明細書中で用いられる「処置」は、哺乳動物における、特にヒトにおける疾患のあらゆる処置を包含し：（ａ）疾患の素因になり得るが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において、疾患が起こることから妨げることと；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症または進行を抑えることと；（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退縮を引き起こし、かつ／または１つもしくは複数の疾患病徴を軽減することとを含む。また、「処置」は、疾患または症状の非存在下ですら、薬理効果を提供するような剤の送達を包含することを意味する。例えば、「処置」は、疾患状態の非存在下で、例えばワクチンの場合、免疫応答を誘発することができるか、または免疫を付与することができる組成物の送達を包含する。
本明細書中で用いられる用語「患者」または「対象」は、例えば、実験目的、診断目的、予防目的、美容目的、および／または治療目的で、提供される組成物が投与されるか、または投与されてよいあらゆる生物を指す。典型的な患者として、動物（例えば哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒト）が挙げられる。一部の実施形態において、患者はヒトである。一部の実施形態において、患者は、１つまたは複数の障害または症状に苦しんでいるか、または敏感である。一部の実施形態において、患者は、障害または症状の１つまたは複数の病徴を示す。一部の実施形態において、患者は、１つまたは複数の障害または症状を有すると診断されている。一部の実施形態において、障害または症状は、がん、または１つもしくは複数の腫瘍の存在であるか、またはこれを含む。一部の実施形態において、障害または症状は、転移性がんである。
本明細書中に記載されるのは、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を生成する方法である。ＴＩＬ療法は、外科的に切除された腫瘍標本からＴＩＬを単離して、インビトロ増殖させてから、リンパ球枯渇前処置レジメン後に患者に再注入する、自己細胞免疫療法である。従来のＴＩＬ療法は、広範ながんに対して若干の印象的な応答を達成してきたが、その成功は散発的なままである。しかしながら、ＴＩＬ療法が広く適用可能な治療法であり得ると考える理由がある。第１に、腫瘍の大部分が、時に非常に低い頻度ではあるが、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞によって浸潤されることが知られている。第２に、単一のネオアンチゲンに反応性のＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を含む高純度のＴＩＬ産物の増殖および注入が、腫瘍退縮を媒介するのに十分であることが示されてきた。
ネオアンチゲン特異的ＴＩＬプロセシングの概要
ネオアンチゲン特異的細胞を絶えず富化できないことが、おそらく、現在のＴＩＬ療法の成功を制限する原因である。例えば、激しい非特異的インビトロ増殖は、Ｔ細胞表示プロファイルを歪めて、多くの場合、特に、腫瘍抗原特異的応答が、疲弊表現型または調節表現型によって支配される程度にまで、所望の標的Ｔ細胞が他の特異性の細胞によって圧倒される。
本明細書中に記載される方法は、新規のペプチド：ＭＨＣスクリーニング技術、または関連する方法論がを適用して、ゲノム分析から、パーソナライズされた免疫原性ネオアンチゲンを予測し、次いでこれらのネオアンチゲンを使用して、最も強力な細胞について、ＴＩＬ調製物を富化する（これは、群として、ネオアンチゲン特異的ＴＩＬとして本明細書中で参照される）のに用いられる、差別化されたアプローチ（図１および図２）である。そのようなパーソナライズされたＴＩＬ療法は、比較的短いタイムラインでなされ得る（図３および図４参照）。また、本明細書中に記載されるのは、ネオアンチゲン特異的ＴＩＬの抗腫瘍有効性のためのパーソナライズされたテストベッドを提供する腫瘍オルガノイドを増殖させる方法である。
一部の実施形態において、本発明は、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞が、以下の非排他的な戦略の１つまたは複数を用いてＴＩＬから富化される治療アプローチを提供する：
（１）表面マーカー発現に基づくセルソーティング：特に、腫瘍－抗原特異的Ｔ細胞が、疲弊したコンパートメント内に存在することが知られており、ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４が挙げられるマーカーの高い発現によって特徴付けられる９。加えて、ネオアンチゲン特異的細胞が、ペプチド：ＭＨＣマルチマー用の表面染色を用いて同定され得る。
（２）予測されるネオアンチゲンペプチドを用いた抗原特異的増殖：「サブトラクティブ」ソーティングに加えて、ネオアンチゲン特異的細胞が、増殖によって富化され得る。予測されたネオ抗原ペプチドの存在下でＴＩＬを培養することによって、所望の特異性の細胞を優先的に増殖させることが可能である。
これらのアームの双方において、ペプチド変更体細胞腫瘍バリアントの典型的に大きなカタログの中から標的ネオアンチゲンの小さなセットを同定する律速工程が、伝統的に必要であった。この制限に対処するために、新規の高度に多重のペプチド：ＭＨＣクラスＩＩ結合アッセイ（「ＭＨＣ－ＰｅｐＳｅｑ」）を、ＭＨＣクラスＩについてのインシリコ予測と合わせる、強力なアプローチが展開される。これは、ネオアンチゲン特異的蛍光標識および／または刺激抗原の構築のための、候補ネオアンチゲンペプチド：ＭＨＣの迅速で信頼性の高い同定を可能にする。これ以外にも、ファージディスプレイまたは関連する方法が、候補ネオアンチゲンペプチド：ＭＨＣを同定するのに用いられる。
（３）ネオアンチゲンペプチド曝露により最小限に増殖したＴＩＬの、プロセシングおよび増殖のためのリンパ節中への注入：エクスビボサイトカイン曝露が、ネオアンチゲンレパートリーおよびＴ細胞動力学を変え得ることが知られている。一態様において、最小限に増殖したＴＩＬは、このＴ細胞の「天然の」プロセシングおよび増殖を保存するリンパ節領域中に直接注射される。このアプローチは、ＴＩＬにインビボプロセシングを用いるので、完全に新規である。
Ｔ細胞富化により、単一細胞配列決定を、潜在的にはペプチド：ＭＨＣマルチマー標識化と併せて用いて、Ｔ細胞ネオアンチゲン特異性を付与する一緒になった再構成ＴＣＲαおよびβ遺伝子を同定することが可能である。これは、Ｔ細胞富化の効率の追加の測定基準を提供することができ、そしてまた、患者特有のネオアンチゲン反応性をユニバーサルドナー細胞に付与して、内因性応答の疲弊した表現型を回避する潜在性を提供する並行遺伝子移入アプローチを可能にする。
腫瘍突然変異および／またはネオエピトープの検出
自己ＴＩＬは、切除された腫瘍の間質から得てもよい。これのために、腫瘍試料が患者から得られて、単一細胞懸濁液が得られる。単一細胞懸濁液は、適切なあらゆる様式で、例えば、機械的に（例えば、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．を用いて腫瘍を分解する）、かつ／または酵素によって（例えば、コラゲナーゼまたはＤＮａｓｅ）得られ得る。
がんは、種々の知られている技術のいずれかを用いて、本明細書中に記載される突然変異および／またはネオエピトープを検出するために（例えば、ネオアンチゲン同一性および／またはネオエピトープ性質、レベルおよび／または頻度を検出するために）スクリーニングされてよい。一部の実施形態において、特定の突然変異もしくはネオエピトープ、またはその発現は、（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡにおける）核酸レベルで検出される。当業者であれば、突然変異もしくはネオエピトープ、またはその発現が、がん細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡを含む試料において検出され得る。さらに、当業者であれば、がん細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡを含む試料として、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、細胞、組織、または臓器が挙げられ得るがこれらに限定されないことを理解するであろう。一部の実施形態において、突然変異もしくはネオエピトープ、またはその発現は、（例えば、がん細胞由来のポリペプチドを含む試料（この試料は、細胞、組織、または臓器が挙げられるがこれらに限定されないポリペプチド複合体または他のより高次の構造であってもよいし、これを含んでもよい）において）タンパク質レベルで検出される。
一部の特定の実施形態において、検出は、核酸配列決定を包含する。一部の実施形態において、検出は、全エクソーム配列決定を包含する。一部の実施形態において、検出は、免疫アッセイを包含する。一部の実施形態において、検出は、マイクロアレイの使用を包含する。一部の実施形態において、検出は、超並列エクソーム配列決定を包含する。一部の実施形態において、検出は、ゲノム配列決定を包含する。一部の実施形態において、検出は、ＲＮＡ配列決定を包含する。一部の実施形態において、検出は、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定を包含する。一部の実施形態において、検出は、質量分析を包含する。
一部の実施形態において、検出は、次世代配列決定（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を包含する。一部の実施形態において、検出は、ゲノム配列決定、ゲノム再配列決定、標的配列決定パネル、トランスクリプトームプロファイリング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）、ＤＮＡ－タンパク質相互作用（ＣｈＩＰ－配列決定）、および／またはエピゲノム特性評価を包含する。一部の実施形態において、患者のゲノムの再配列決定は、例えばゲノム変異を検出するために、利用されてよい。
一部の実施形態において、検出は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫アッセイ、質量分析、マイクロアレイ分析等の技術を用いることを包含する。
一部の実施形態において、検出は、次世代配列決定（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を包含する。一部の実施形態において、検出は、標的とされる遺伝子パネルの次世代配列決定（例えば、ＡＳＨＩＯＮ（登録商標）腫瘍／正常エクソーム－ＲＮＡ試験（ＧＥＭＥＸＴＲＡ（登録商標）、ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ、またはＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮＯＮＥ（登録商標））を包含する。一部の実施形態において、検出は、ゲノムプロファイリングを包含する。
一部の実施形態において、検出は、ＧＥＭＥＸＴＲＡ（登録商標）試験を用いたゲノムプロファイリングを包含する。ＧＥＭＥＸＴＲＡ（登録商標）試験は、包括的なエクソームおよびトランスクリプトームプロファイリングアッセイであり、これらは双方とも、がん患者のケアのために情報を提供して、疾患の将来の研究を可能にする。１９，０００個を超える遺伝子が、体細胞点突然変異、小さな、そして大きな挿入および欠失、ならびに構造再配置の同定のために、ハイブリダイゼーション捕捉および臨床デプス配列決定を介してアッセイされる。また、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）および腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を測定して、免疫腫瘍学療法の適用のために情報を提供する。同定されたバリアントの体細胞起源を確実にするために、生殖細胞系および腫瘍エクソームが双方とも配列決定されて、比較される。また、全トランスクリプトームを配列決定して、遺伝子融合および選択的スプライシング事象の、患者のＲＮＡからの検出を可能にする。ＧＥＭＥＸＴＲＡ（登録商標）は、固形がんおよび血液がんの双方に適用可能である。
一部の実施形態において、検出は、Ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ（ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ）のＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇを用いるゲノムプロファイリングを包含する（Ｃｈｅｎｇ Ｄ Ｔ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｔ Ｎ、Ｚｅｈｉｒ Ａら、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ－Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ（ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ）：Ａ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ－Ｂａｓｅｄ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２０１５年；１７巻（３号）：２５１～２６４頁；およびＲｏｓｓ Ｄ Ｓ、Ｚｅｈｉｒ Ａ、Ｃｈｅｎｇ Ｄ Ｔら、Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２（ＥＲＢＢ２）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｕｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ａ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ－Ｂａｓｅｄ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ．Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２０１７年；１９巻（２号）：２４４～２５４頁参照）。ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴは、点突然変異、小さな、そして大きな挿入または欠失、および再配置の検出を可能にする、複数のオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子の全てのエキソンおよび選択されたイントロンのハイブリダイゼーション捕捉およびディープ配列決定を包含する包括的分子プロファイリングアッセイである。また、ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴは、ゲノムの全体にわたって散在して、ゲノム全体のコピー数の正確な評価に役立つ、遺伝子間の、そしてイントロンの単一ヌクレオチド多型（例えばタイリングプローブ）を捕捉する。一部の実施形態において、プローブは、メガベースを標的とし得る。
一部の実施形態において、検出は、ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮＯＮＥ（登録商標）ＣＤＸ（商標）（「ＦｌＣＤｘ」）アッセイを用いるゲノムプロファイリングを包含する。ＦｌＣＤｘアッセイは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織標本から単離されるＤＮＡを用いた、３２４個の遺伝子および選ばれた遺伝子再配置内の置換、挿入、および欠失の変更（インデル）、ならびにコピー数の変更（ＣＮＡ）、ならびにマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）および腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）が挙げられるゲノムシグネチャーの検出用の次世代配列決定ベースのインビトロ診断デバイスである。ＦｌＣＤｘは、ＮＳＣＬＣ、メラノーマ、乳がん、結腸直腸がん、および卵巣がんが挙げられるいくつかの腫瘍指標について、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。
ＦｌＣＤｘアッセイは、ルーチンのＦＦＰＥ生検または外科的切除標本（その５０～１０００ｎｇが、３０９個のがん関連遺伝子由来の全てのコードエキソンの全ゲノムショットガンライブラリ構築およびハイブリダイゼーションベースの捕捉を受けることとなる）からの単一ＤＮＡ抽出方法、１つのプロモータ領域、１つの非コード（ｎｃＲＮＡ）、および３４個の共通して再配置される遺伝子（そのうち２１個は、コードエキソンも含む）からの選択したイントロン領域を使用する。全体で、アッセイは、合計３２４個の遺伝子における変更を検出する。ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＨｉＳｅｑ ４０００プラットフォームを用いて、ハイブリッド捕捉選択ライブラリが、ハイユニホームデプスまで配列決定される（＞５００×のメジアンカバー率を標的とし、＞１００×のカバー率でエキソンの＞９９％）。続いて、配列データは、塩基置換、インデル、コピー数変更（増幅およびホモ接合性遺伝子欠失）、ならびに選択したゲノム再配置（例えば遺伝子融合）が挙げられる、ゲノム変更の全てのクラスを検出するように設計された、カスタマイズされた分析パイプラインを用いてプロセシングされる。加えて、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）および腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）が挙げられるゲノムシグネチャーが報告される。
一部の実施形態において、検出は、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個、またはそれを超える遺伝子（例えば、オンコジーンおよび／または腫瘍抑制遺伝子）由来のエキソン配列および／またはイントロン配列の配列決定を含んでよい。例えば、文献報告は、ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴを用いて、４６８個のオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子の全てのエキソンおよび選択したイントロンのディープ配列決定を達成してきたことを示している。
代わりに、または加えて、一部の実施形態において、検出は、遺伝子間の、そして／またはイントロンの単一ヌクレオチド多型の配列決定を含んでよい。例えば、文献報告は、ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴを用いて、＞１０００個の遺伝子間の、そしてイントロンの単一ヌクレオチド多型のディープ配列決定を達成してきたことを示している。
一部の実施形態において、検出は、スプライスバリアントの配列決定を包含する。がん細胞は、微環境によって制御をエスケープする機構を発達させることによって適応かつ進化することができる。したがって、選択的スプライシングによって提供される多様性および可塑性は、腫瘍の増殖および／または拡散に適したタンパク質アイソフォームをがん細胞が生成する機会を提供する（Ｄａｖｉｄ Ｃ Ｊ ａｎｄ Ｍａｎｌｅｙ Ｊ Ｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０１０年；２４巻（２１号）：２３４３～２３６４頁）。ゲノム全体のアプローチは、大規模な選択的スプライシングが、腫瘍形成中に起こることを明らかにし（Ｖｅｎａｂｌｅｓ Ｊ Ｐら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９年；１６巻（６号）：６７０～６７６頁）、そして選択的スプライシングパターンのゲノムポートレイトは、腫瘍の分類に有用であると判明した（Ｖｅｎａｂｌｅｓ Ｊ Ｐ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．２００６年；２８巻（４号）：３７８～３８６頁；Ｓｋｏｔｈｅｉｍ Ｒ Ｉら、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００７年；３９巻（７～８号）：１４３２～１４４９頁；Ｏｍｅｎｎ Ｇ Ｓら、Ｄｉｓ Ｍａｒｋｅｒｓ．２０１０年；２８巻（４号）：２４１～２５１頁）。
異常なスプライシング事象の報告、および異なるがんにおける選択的にスプライシングされた転写産物の比率の変化が注目されてきた（Ｒａｊａｎ Ｐら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｕｒｏｌ．２００９年；６巻（８号）：４５４～４６０頁）。これらの事象は、正常細胞対応物において観察されない新規の転写産物をもたらす。代謝、アポトーシス、細胞周期制御、侵入、転移、および血管形成が挙げられる、腫瘍生物学のほぼ全ての領域が、選択的スプライシングによって影響されると報告されてきた（Ｖｅｎａｂｌｅｓ Ｊ Ｐ．、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．２００６年；２８巻（４号）：３７８～３８６頁；Ｇｈｉｇｎａ Ｃら、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８年；９巻（８号）：５５６～５７０頁）。
アポトーシス効果が相反する選択的スプライスバリアントの最も初期の例の１つが、ＢＣＬ－ｘである。ＢＣＬ－ｘプレｍＲＮＡは、２つのスプライスバリアント、抗アポトーシスＢｃ１－ｘＬ（長い形態）およびアポトーシス促進性Ｂｃ１－ｘＳ（短い形態）を生成するように選択的にスプライシングされ得る（Ｂｏｉｓｅ Ｌ Ｈら、Ｃｅｌｌ．１９９３年；７４巻（４号）：５９７～６０８頁）。腫瘍細胞生存を促進する高いＢｃ１－ｘＬ／Ｂｃ１－ｘＳ比が、ヒトリンパ腫、乳がん、およびヒト肝細胞がんが挙げられるいくつかのがん型において見出され得る（Ｍｉｎｎ Ａ Ｊら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６年；２７１巻（１１号）：６３０６～６３１２頁．４４－４６；Ｏｌｏｐａｄｅ Ｏ Ｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｓｃｉ Ａｍ．１９９７年；３巻（４号）：２３０～２３７頁；Ｔａｋｅｈａｒａ Ｔら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００１年；３４巻（１号）：５５～６１頁）。がん細胞において選択的スプライシングを受けるアポトーシス関連遺伝子の別の例として、Ｆａｓ受容体遺伝子がある。
多くの細胞型の細胞表面上で発現されるＦａｓ受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞によって生成されるＦａｓリガンドによって活性化され、これは、死シグナル伝達カスケードを開始して、Ｆａｓ受容体を発現する細胞のアポトーシスに至る（Ｂｏｕｉｌｌｅｔ Ｐら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年；９巻（７号）：５１４～５１９頁）。コードされる膜貫通ドメインを落としているＦａｓの少なくとも３つの短いｍＲＮＡバリアントが存在し、結果として生じる翻訳されたタンパク質バリアントは、おそらく、がん細胞によって分泌されて、Ｆａｓリガンド用のデコイ受容体としての機能を果たすので、がん細胞がアポトーシスからエスケープすることができる（Ｃｈｅｎｇ Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９４年；２６３巻（５１５４号）：１７５９～１７６２頁；Ｃａｓｃｉｎｏ Ｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９５年；１５４巻（６号）：２７０６～２７１３頁）。
Ｈ－Ｒａｓ遺伝子内のイントロン突然変異によって引き起こされる、以前に知られていないスプライシングされたエキソン（ＩＤＸと命名）内で、Ｈ－Ｒａｓオンコジーンの選択的スプライシングが起こる（Ｃｏｈｅｎ Ｊ Ｂら、Ｃｅｌｌ．１９８９年；５８巻（３号）：４６１～４７２頁）。ＩＤＸスプライス部位のこの突然変異は、Ｈ－Ｒａｓ ｍＲＮＡバリアントをもたらし、これは、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）プロセスに対してより耐性であり、結果的に、がんにおいて過剰発現される（Ｂａｒｂｉｅｒ Ｊら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００７年；２７巻（２０号）：７３１５～７３３３頁）。また、選択的スプライシングは、がんにおいて侵襲性かつ転移性の挙動を促進する役割を果たす。ＣＤ４４は、スプライスバリアントが転移と具体的に関連する第１の遺伝子の１つであり、エキソン４－７および６－７を含有するバリアント（それぞれｖ４－７およびｖ６－７）が、転移膵臓がん細胞株内で発現されるが、対応する親腫瘍内で発現されないことが示された（Ｇｕｎｔｈｅｒｔ Ｕら、Ｃｅｌｌ．１９９１年；６５巻（１号）：１３～２４頁）。
突然変異コーリングソフトウェアツール
特定の態様において、Ｐｅｇａｓｕｓヒト研究パイプラインが用いられる。配列は、ＨＧ１９ヒトゲノムまたはＨＧ３８ヒトゲノムに対してアラインされる。一態様において、体細胞突然変異は、３つの別々の突然変異コーラー：Ｓｅｕｒａｔ、Ｍｕｔｅｃｔ、およびＳｔｒｅｌｋａを用いてコールされる。コーラーの複数において見られる全ての突然変異が選択されて、ペプチドを生成するのに用いられた。この理論的根拠は、各コーラーがそれ自体の長所および欠点を有することである。複数のコーラーによってコールされる突然変異を索引することによって、偽陽性を同定するリスクは引き下げられる。最良の実施が、ＤＮＡワークフローおよびＲＮＡワークフローについて行われる。これ以外にも、更なる分析用の候補ネオアンチゲンとしてペプチドを生成するような変化のないＣＬＩＡ認定体細胞コールが用いられる。
一部の実施形態において、単一の、または複数の突然変異コーラーが、ゲノムバリアントをコールするのに利用されてよい。配列決定腫瘍および正常組織からなる試料に用いられ得るコーラーとして、以下がある：Ｓｔｒｅｌｋａ、Ｓｔｒｅｌｋａ２、ＶａｒＤｉｃｔ、ＶａｒＳｃａｎ２、ｑＳＮＰ、Ｓｈｉｍｍｅｒ、ＲＡＤＩＡ、ＳＯＡＰｓｎｖ、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ、ＦａＳＤ－ｓｏｍａｔｉｃ、Ｓａｍｔｏｏｌｓ、ＪｏｉｎｔＳＮＶＭｉｘ、Ｖｉｒｍｉｄ、ＳＮＶＳｎｉｆｆｅｒ、Ｓｅｕｒａｔ、ＣａＶＥＭａｎ、ＭｕＴｅｃｔ、ＭｕＴｅｃｔ２、ＬｏＦｒｅｑ、ＥＢＣａｌｌ、ｄｅｅｐＳＮＶ、ＬｏＬｏＰｉｃｋｅｒ、ＭｕＳＥ、ＭｕｔａｔｉｏｎＳｅｑ、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑ、ＳｎｏｏＰｅｒ、ＦｒｅｅＢａｙｅｓ、ＨａｐＭｕＣ、ＳＰＬＩＮＴＥＲ、Ｐｉｓｃｅｓ、ＤｅｅｐＳＮＶＭｉｎｅｒ、ｓｍＣｏｕｎｔｅｒ、ＤｅｅｐＶａｒｉａｎｔ、Ｃａｋｅ、Ｔｎｓｃｏｐｅ、ＤＮＡｓｃｏｐｅ、ＮｅｏＭｕｔａｔｅ、Ｍａｆｔｏｏｌｓ、ｓｃＡＢＡ、Ｓａｎｉｖａｒ、Ｓａｒｅｋ、ＢＡＴＣＡＶＥ、ＳｏｍａｔｉｃＮｅｔ、ＣｏＶａＣＳ、ＲｅｇＴｏｏｌｓ、ｘＡｔｌａｓ、Ｒ２Ｄ２、ＳｉＮＰｌｅ、Ｂａｍｂｉｎｏ、およびｅｘａｃｔＳＮＰ。腫瘍のみからなる試料に利用され得る配列決定コーラーとして、以下がある：Ｐｌａｔｙｐｕｓ、ＬｕｍｏｓＶａｒ、ＬｕｍｏｓＶａｒ２、ＳＮＶＭｉｘ２、ＳＮＶｅｒ、ＯｕｔＬｙｚｅｒ、ＩＳＯＷＮ、ＳｏｍＶａｒＩＵＳ、ＳｉＮＶＩＣＴ、ＦｒｅｅＢａｙｅｓ、ＳＮＰｉＲ、ｅＳＮＶ－ｄｅｃｔｅｃｔ、ＲＮＡＩｎｄｅｌ、ＶａＤｉｒ、およびＣｌａｉｒｖｏｙａｎｔｅ。
特定の実施形態において、スプライスバリアントを認識する単一の、または複数の突然変異コーラーが、ゲノムバリアントをコールするのに利用されてよい。配列決定腫瘍および正常組織からなる試料に用いられ得るコーラーとして、以下がある：ＲｅｇＴｏｏｌｓ、ＡＳＧＡＬ、ＭＡＴＳ（ｒＭＡＴＳ）、ＳＵＰＰＡ（ＳＵＰＰＡ２）、Ｌｅａｆｃｕｔｔｅｒ、ＭＡＪＩＱ、ＪｕｎｃｔｉｏｎＳｅｑ、ｆｉｎｄＡＳ、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ／Ｃｕｆｆｄｉｆｆ、ＩｓｏｆｏｒｍＳｗｉｔｃｈＡｎａｌｙｚｅＲ、ＡＬＥＸＡ－ｓｅｑ、ＭＩＳＯ、ＳｐｌｉｃｉｎｇＣｏｍｐａｓｓ、Ｆｌｕｘ Ｃａｐａｃｉｔｏｒ、ＪｕｎｃＢＡＳＥ、ＳｐｌｉｃｅＲ、ＦｉｎｅＳｐｌｉｃｅ、ＡＲＨ－ｓｅｑ、Ｓｐｌａｄｄｅｒ、ＤＥＸＳｅｑ、ｅｄｇｅＲ、Ｌｉｍｍａ、ＤｉｆｆＳｐｌｉｃｅ、ｄＳｐｌｉｃｅＴｙｐｅ、ＳｐｌｉｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ、ＨＩＳＡＴ２、ＳＴＡＲ、Ｓｕｂｒｅａｄ、Ｓｕｂｊｕｎｃｔ、ＰｅｎｎＤｉｆｆ、ＤＳＧｓｅｑ、ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅ、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＳｐｌｉｃｅＴｒａｐ、ＰＳＧＩｎｆｅｒ、ＦＤＭ、ＩｓｏＥＭ２、ＭＡＤＳ＋、Ｓｐａｎｋｉ、ＳｐｌｉｃｅＭａｐ、ＣＡＳＰＥＲ、ＡＶＩＳＰＡ、ＰＡＳＡ、ＳｐｌｉｃｅＳｅｑ、ＭＡＴＴ、Ａｓｐｌｉ、ＩＰＳＡ、ＳＡＮＪＵＡＮ、ＶＡＳＴ－Ｔｏｏｌｓ、ＳｐｌｉｃｅＶ、Ａｓｐｒｏｆｉｌｅ、ＤＥＳｅｑ２、Ｙａｎａｇｉ、ＡＢＬａｓ、ＩＲＩＳ、およびＡＳ－Ｑｕａｎｔ。
ＨＬＡタイピング
一部の実施形態において、腫瘍および／または正常組織からの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）および／またはＲＮＡ配列決定が、個々の患者についてＭＨＣクラス１および２遺伝子型を同定するのに用いられ得る。
単一の、または複数のＨＬＡコーラーが、ＨＬＡ型を同定するのに利用され得る。ＤＮＡ配列決定に利用され得るＨＬＡコーラーとして、以下がある：ＢＷＡｋｉｔ、ＰＨＬＡＴ、ＯｐｔｉＴｙｐｅ、ＨＬＡＭｉｎｅｒ、ＨＩＳＡＴ、ＨＩＳＡＴ２、ｘＨＬＡ、ＨＬＡ－Ｖｂｓｅｑ、ＧＡＴＫ ＨＬＡ Ｃａｌｌｅｒ、ＰｏｌｙＳｏｌｖｅｒ、ＨＬＡＲｅｐｏｒｔｅｒ、Ａｔｈｌａｔｅｓ、ＨＬＡｓｅｑ、ＨＬＡｓｓｉｇｎ、ＳＯＡＰ－ＨＬＡ、ＳＴＣ－ＳＥｑ、ＨａｐＬｏｇｉｃ、Ｇｙｐｅｒ、ＨＬＡＴｙｐｈｏｎ、ＨＬＡ－ＬＡ、ＨＬＡ－ＰＲＧ、ＭＨＣ－ＰＲＧ、Ｐｒｏｈｌａｔｙｐｅ、ＧｒａｐｈＴｙｐｅｒ、ＡＬＰＨＬＡＲＤ、Ｏｍｉｘｏｎ、ＳＮＰ２ＨＬＡ、ＨＬＡｓｃａｎ、ＮｅｏＥｐｉｔｏｐｅＰｒｅｄ、およびＡｓｓｉｇｎ。ＲＮＡ配列決定に利用され得るＨＬＡコーラーとして、以下がある：ＢＷＡｋｉｔ、ｓｅｑ２ＨＬＡ、ＰＨＬＡＴ、ＨＬＡＰｒｏｆｉｌｅｒ、ＯｐｔｉＴｙｐｅ、ＨＬＡＭｉｎｅｒ、ＨＬＡＦｏｒｅｓｔ、ａｒｃａｓＨＬＡ、ＨＩＳＡＴ、ＨＩＳＡＴ２、ＨＬＡｓｅｑ、ＨＬＡｓｓｉｇｎ、ＳＴＣ－Ｓｅｑ、ＨＬＡＴｙｐｈｏｎ、ＡＬＰＨＬＡＲＤ、Ｏｍｉｘｏｎ、およびＨＬＡｓｃａｎ。
一部の実施形態において、全エクソーム配列決定データは、Ｐｏｌｙｓｏｌｖｅｒ（多型遺伝子座リゾルバー）を用いて、ＨＬＡタイピングについて分析されてよい（Ｓｈｕｋｌａら、２０１５年）。Ｐｏｌｙｓｏｌｖｅｒは、３つの主要なＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）遺伝子の対立遺伝子を推測するためのアルゴリズムである。例えば、患者のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、Ｐｏｌｙｓｏｌｖｅｒを用いて、全エクソーム配列決定データから推測され得る。他のバリエーションにおいて、全エクソーム配列決定データの非存在下で、患者のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子は、代わりのＨＬＡタイピングアルゴリズムによって、トランスクリプトーム配列決定データから推測され得る。
一実施形態において、ＨＬＡタイピングは、コンピューティングデバイス上でランされる、ＯｐｔｉＴｙｐｅ等の１つまたは複数の技術を用いてインシリコで行われる。Ｓｚｏｌｅｋら、ＯｐｔｉＴｙｐｅ：ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４年１２月１日；３０巻（２３号）（全ての目的についてその全体が本明細書に組み込まれる）参照。また、種々の他のインシリコ技術が用いられてもよい。Ｍａｊｏｒら、ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ １０００ ｇｅｎｏｍｅｓ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ Ｉｌｕｍｉｎａ ｄａｔａ、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３年１１月６日；８巻（１１号）：ｅ７８４１０；Ｗｉｔｔｉｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＧＳ－ｂａｓｅｄ ＨＬＡ－ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５年）参照。
腫瘍突然変異からのペプチドの生成
一部の実施形態において、突然変異のデータは、セクション表題「腫瘍突然変異および／またはネオエピトープの検出」において先に記載されるように獲得される。突然変異のコールは、Ｖａｒｃｏｄｅ、ｃｕｓｔｏｍＰｒｏＤＢ、およびｐｙＧｅｎｏが挙げられるがこれらに限定されない、単一の、または複数のツールを用いて、突然変異タンパク質配列に変換されてよい。ツールは、下流のインビトロの、そしてインシリコのＨＬＡ結合アッセイのためのペプチド配列を生成することとなる。加えて、一部の実施形態において、ペプチドは、各ペプチドがヒトプロテオームに固有であることを確認するための試験を受けることとなる。ペプチドは、非冗長タンパク質配列、基準タンパク質、モデル生物、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ、特許を受けたタンパク質配列、タンパク質データバンクタンパク質、メタゲノムタンパク質、およびトランスクリプトームショットガンアセンブリタンパク質が挙げられる、ＮＣＢＩからのいくつかの異なるタンパク質データベースにアラインされてよい。先で一覧に示されるデータベースを用いて、ｒＢｌａｓｔが、タンパク質ＢＬＡＳＴをランして、ヒトプロテオームに対する同一性が１００％であるタンパク質を同定するのに利用され得る。
特定の態様において、Ｖａｒｃｏｄｅソフトウェアが、ｐｙｔｈｏｎにおいて、ゲノムバリアントデータの影響を予測するのに利用される。Ｖａｒｃｏｄｅは、野生型タンパク質配列および突然変異タンパク質配列を、突然変異および／またはネオエピトープから、所望のペプチドサイズにて生成する。特定の態様において、所望のペプチドサイズは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれを超えるアミノ酸である。一態様において、所望のペプチドサイズは、１５個のアミノ酸である。
Ｖａｒｃｏｄｅ依存関係はＰｙｅｎｓｅｍｂｌであり、これは、ペプチドを生成するためのＥｎｓｅｍｂｌ基準ゲノムデータへのｐｙｔｈｏｎアクセスポイントである。一部の実施形態において、Ｖａｒｃｏｄｅは、タンパク質に及ぼす各突然変異の影響を予測する。ゲノム上の非コード領域内にあるサイレント突然変異および突然変異は、除外される。続いて、Ｖａｒｃｏｄｅは、ペプチド配列の全体にわたって突然変異を生成するのに用いられる。Ｖａｒｃｏｄｅにより生成される突然変異を含有する当該バリアントペプチド（すなわち、候補ネオアンチゲン）を、インシリコ法および／または生化学アッセイによりさらに分析して、どのペプチドが、患者由来のＴＩＬと結合するかを同定する。
ネオアンチゲンの分析
先で同定される戦略（１）および（２）において、ペプチド変更体細胞腫瘍バリアントの典型的に大きなカタログの中から標的ネオアンチゲンの小さなセットを同定する律速工程が、伝統的に必要であった。ペプチド結合を研究する最近開発されたスクリーニング技術は、この制限に対処することができる。
一部の実施形態において、新規の高度に多重のペプチド：標的タンパク質アッセイを、インシリコ予測と合わせて、ネオアンチゲンを同定する。例えば、高度に多重のペプチド：ＭＨＣクラスＩＩ結合アッセイを、ＭＨＣクラスＩ用のインシリコ予測と合わせて用いられる。これは、ネオアンチゲン特異的蛍光標識および／または刺激抗原の構築のための、候補ネオアンチゲンペプチド：ＭＨＣの迅速で信頼性の高い同定を可能にする。当該高度に多重のペプチド：標的タンパク質結合アッセイの例が、米国特許第９，９５８，４５４号明細書；米国特許第１０，２８８，６０８号明細書；米国特許出願公開第２０１６／００２５７２６号明細書；および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１３７７４号明細書に記載されている。
これ以外にも、ファージディスプレイまたは関連方法が、候補ネオアンチゲンペプチド：ＭＨＣを同定するのに用いられる。
他の実施形態において、目的のポリペプチドは、ネオアンチゲンの同定を促進するように遺伝的にコードされている。遺伝的にコードされるポリペプチドライブラリの例が、ｍＲＮＡディスプレイライブラリである。別の例が、複製可能遺伝的ディスプレイパッケージ（ｒｇｄｐ）ライブラリ、例えばファージディスプレイライブラリである。一実施形態において、目的のポリペプチドは、ファージディスプレイライブラリとして遺伝的にコードされている。これらの実施形態において、核酸は、ファージゲノムによって含まれてよい。これらの実施形態において、ポリペプチドは、ファージコートによって含まれてよい。
一部の実施形態において、本発明は、いくつかの核酸を、対応するポリペプチドに翻訳して、前記分子スカフォールドの分子を前記ポリペプチドに連結することによって生成されるポリペプチドの遺伝的にコードされているコンビナトリアルライブラリを生成するのに用いられてよい。ポリペプチドの遺伝的にコードされているコンビナトリアルライブラリは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ、またはｍＲＮＡディスプレイによって生成されてよい。
高度に多重のペプチド：標的タンパク質結合アッセイ
一部の態様において、ネオアンチゲンの同定は、ペプチド構築物のライブラリを提供すること（ライブラリの各ペプチド構築物は、ペプチド部分、およびペプチド部分を同定する同定核酸部分を含み、ペプチド構築物の少なくとも１つのペプチド部分は、ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できる）と；ＨＬＡタンパク質またはその断片を、ペプチド構築物のライブラリと接触させることと；ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できるペプチド部分を含む少なくとも１つのペプチド構築物を、ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できないペプチド部分を含むペプチド構築物から分離することと；ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できる少なくとも１つのペプチド構築物の同定核酸部分の全てまたは一部を配列決定することとを含む。一部の態様において、各ペプチド構築物の同定核酸部分は、ペプチド構築物のペプチド部分をコードするポリヌクレオチド配列またはその相補体を含む。特定の実施において、ＰｅｐＳｅｑプラットフォームが、候補ネオアンチゲンの同定に用いられる。
ＰｅｐＳｅｑは、単離したＴＩＬの候補結合因子としての多数の潜在的ネオアンチゲンを迅速に生成することができる技術である。ＰｅｐＳｅｑは、各ペプチドが、結合実験後のペプチド存在量を監視するのに用いられ得る固有のＤＮＡタグにコンジュゲートしたペプチドライブラリ（１０～５０アミノ酸長）を生成する方法である。重要なことに、ペプチド配列は、少なくとも１００，０００個の固有のプログラム可能ペプチドによる大きな多重化結合アッセイに用いられ得る。あらゆる分子標的についての結合アッセイが、多様なＰｅｐＳｅｑ大ライブラリをスクリーニングするのに用いられ得る。生物学的構造（例えば、単離したＴＩＬの集団）が、多様なペプチドと混合され、非結合ペプチドから分離されてから、「くっついた」ものについてクエリーされ得る。特定のライブラリは、（例えば、エクソーム配列決定および分析からの）標的の以前の知識に基づく、インテリジェントに設計されたライブラリであり得る。ＰｅｐＳｅｑプラットフォームは、米国特許第９，９５８，４５４号明細書；米国特許第１０，２８８，６０８号明細書；および米国特許出願公開番号第２０１６／００２５７２６号明細書（これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）においてより詳細に記載されている。
特定の実施において、ＨＬＡタンパク質またはその断片に結合していると同定されたペプチド構築物は、ＨＬＡタンパク質またはその断片への結合が増強するようにさらに修飾されてよい。これは、ＴＩＬを培養して、ネオアンチゲン特異的ＴＩＬを生成するのに用いられる、ＨＬＡタンパク質への結合が増強したペプチドである。ゆえに、一部の態様において、ネオアンチゲンの同定はさらに、ＨＬＡタンパク質またはその断片に結合していると同定されたペプチド構築物に基づく、ペプチド構築物のライブラリ（以降、「第１のペプチド」と称される）を生成することと、第１のペプチドおよびＨＬＡタンパク質またはその断片の結合の閾値ｚ－スコアを特定することとを含む。ペプチド構築物のライブラリは、第１のペプチドを含むペプチド構築物、およびバリアントペプチドを含む複数のペプチド構築物を含む。方法はさらに、ＨＬＡタンパク質またはその断片を、ペプチドのライブラリと接触させることと、ＨＬＡタンパク質またはその断片への結合が、第１のペプチドと比較して増した、少なくとも１つのバリアントペプチドを同定することとを含む。結合の増大は、第１のペプチドの特定された閾値ｚ－スコアよりも高いｚ－スコアによって示される。ペプチドのｚ－スコアは、第１に、ペプチド構築物のライブラリ内の各ペプチド構築物の相対的存在量レベルを決定してから、相対的存在量レベルの類似性に基づいて、グループ化ペプチド構築物をビンにグループ化することによって、算出され、各ビンは、少なくとも３００個のペプチド構築物を含む。また、各ペプチド構築物の相対的存在量レベルは、ペプチド構築物のライブラリ内の陰性対照ペプチド構築物の相対的存在量レベルの平均に対して正規化される。ビン内の各ペプチド構築物の正規化された相対的存在量レベルは、各ビンの平均および標準偏差を決定するために用いられる。ペプチドのｚ－スコアは、そのビンの平均および標準偏差に基づいて算出される。一部の態様において、ビン内の正規化された相対的存在量レベルの平均および標準偏差の決定は、外れ値相対存在量レベルを有するペプチド構築物を除外する。一部の態様において、ペプチド構築物は、その正規化された相対的存在量レベルが、そのビンの９５％の最も高い密度区間の外側にある場合、外れ値相対存在量レベルを有する。特定の実施において、各ビン内のペプチド構築物の５％が、ビン内の正規化された相対的存在量レベルの平均および標準偏差の決定から除かれる。
一部の実施形態において、ネオアンチゲンの同定はさらに、ペプチド構築物の第２のライブラリを生成することと、ＨＬＡタンパク質またはその断片を、ペプチド構築物の第２のライブラリと接触させることと、ＨＬＡタンパク質またはその断片への結合が、第２のペプチドと比較して増したペプチド構築物の第２のライブラリから、少なくとも１つのバリアントペプチドを同定することとを含む。ペプチド構築物の第２のライブラリは、例えば、ｚ－スコアが、第１のペプチドの閾値ｚ－スコアよりも高いことによって、ＨＬＡタンパク質またはその断片への結合が、第１のペプチドと比較して増していると同定される第２のペプチドに基づく。ゆえに、ペプチド構築物の第２のライブラリは、第２のペプチドを含むペプチド構築物、およびバリアントペプチドを含む第２の複数のペプチド構築物を含む。ＨＬＡタンパク質またはその断片への結合が、第２のペプチドと比較して増しているペプチド構築物の第２のライブラリ由来の少なくとも１つのバリアントペプチドは、ｚ－スコアが第２のペプチドのｚ－スコアよりも高い。
一部の態様において、複数のペプチド構築物のバリアントペプチドは、完全な単一残基突然変異誘発、スライディングウィンドウ突然変異誘発によって、またはアラニンスキャニングもしくはグリシンスキャニング突然変異誘発によって生成される。特定の実施において、複数のバリアントペプチドは、完全な単一残基突然変異誘発、スライディングウィンドウ突然変異誘発、およびアラニンスキャニング突然変異誘発によって生成されるバリアントペプチドの少なくとも１セットを含む。結合標的の向上を見出すこの方法の詳細は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１３７７４号明細書に見出され得る。
ファージディスプレイ
様々なファージベクター（Ｍ１３糸状ファージ、ラムダ、Ｔ４、およびＴ７ファージ）、および共有結合性の融合のための種々のファージコートタンパク質を利用する、様々なファージディスプレイシステムが何年にもわたって開発されている。ファージディスプレイを実行するための技術および方法論が、国際公開第２００９／０９８４５０号パンフレットに見出され得る。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｓｍｉｔｈ（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８巻：１３１５～１３１７頁；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９１／１７２７１号パンフレット；国際公開第９２／２０７９１号パンフレット；国際公開第９２／１５６７９号パンフレット；国際公開第９３／０１２８８号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９２／０９６９０号パンフレット；国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；ｄｅ Ｈａａｒｄら（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４巻：１８２１８～３０頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４巻：１～２０頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２巻：３７１～８頁；Ｆｕｃｈｓら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９巻：１３７０～１３７２頁；Ｈａｙら（１９９２年）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３巻：８１～８５頁；Ｈｕｓｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６巻：１２７５～１２８１頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ １２巻：７２５～７３４頁；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６巻：８８９～８９６頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６２４～６２８頁；Ｇｒａｍら（１９９２年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９巻：３５７６～３５８０頁；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９巻：１３７３～１３７７頁；Ｒｅｂａｒら（１９９６年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７巻：１２９～４９頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１年）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９巻：４１３３～４１３７頁；およびＢａｒｂａｓら（１９９１年）ＰＮＡＳ ８８巻：７９７８～７９８２頁に記載されている。
リボソームディスプレイ
特定の態様において、本明細書中に記載される方法は、ネオアンチゲンを同定するためのリボソームディスプレイの使用を含む。リボソームディスプレイは、目的のタンパク質（例えば候補ネオアンチゲン）のインビトロタンパク質合成を実行するのに用いられ得る。また、リボソームディスプレイは、インビトロタンパク質進化を実行して、所望の特性を有するタンパク質、例えば、特定の標的分子に結合するＦａｂ断片を生じさせるのに用いられ得る。リボソームディスプレイは、ライブラリを生成するのに有用な周知の技術である。この完全にインビトロな方法は、１０１６個のメンバーの多様性を有するライブラリを可能にする。プロセスは、所望の特性を有する（例えば、固定された標的分子に結合する）タンパク質を選択するのに複合体として用いられ得るＲＮＡ前駆体と会合している翻訳されたタンパク質を生じさせる。続いて、所望の特性、例えば、高い結合親和性を示すＲＮＡタンパク質複合体は、ｃＤＮＡに逆転写されて、配列は、ＰＣＲを介して増幅され得る。また、このプロセスは、繰返しまたはタンパク質発現の反復サイクルを提供する。加えて、核酸突然変異は、以降のサイクルにおいて、選択された核酸ライブラリに効率的に導入されて、連続ＤＮＡ多様化、およびそれによるタンパク質進化に至り得る。最終結果は、目的のタンパク質（例えば、ＴＩＬに特異的に結合するネオアンチゲン）を生成するのに用いられ得る核酸配列である。
本明細書中で提供される方法において、目的のタンパク質は、目的のタンパク質が翻訳されることになるリボソームの表面上にディスプレイされる。手短に言うと、ＲＮＡ分子のライブラリが、インビトロ翻訳系において、リボソームが脱落しないようにＲＮＡ分子の３’末端まで翻訳される。これは、ＲＮＡ鋳型内に機能的終止コドンを組み込まないことによって達成される。通常、終止コドンは、リボソームからの新生ポリペプチドの剥離をトリガーする放出因子によって認識される。リボソームディスプレイにおいて、ペプチドは、リボソームから出現するが、複合体から自由に脱落しない。これにより、例えば、新生ポリペプチドは、別のポリペプチドと会合して、機能ダイマーを形成することが可能となる。一部の例において、（ジスルフィド結合を形成するのに重要な）酸化環境内での追加の折畳み工程が存在する。
続いて、数日間安定している、目的の折り畳まれたタンパク質、リボソーム、およびＲＮＡの複合体全体が、目的の翻訳されたタンパク質による結合対リガンドへの特異的結合等の所望の特性の有無に関してスクリーニングされ得る。目的の選択されたタンパク質をコードするＲＮＡは、一本鎖ｃＤＮＡに逆転写され得、これは、二本鎖ＤＮＡに変換され、かつＰＣＲによって増幅されて、選択されたタンパク質（例えばネオアンチゲン）のコード配列が提供され得る。逆転写反応は、リボソームディスプレイ複合体内で会合するｍＲＮＡに対して実行され得、またはｍＲＮＡは、リボソームディスプレイ複合体から単離されてから、逆転写工程に用いられ得る。リボソーム複合体の破壊／解離に適した方法が、当該技術において知られており、ＥＤＴＡ処理および／またはフェノール抽出が挙げられる。
一般に、リボソームディスプレイ用の核酸（ＤＮＡ）構築物は、プロモータ（Ｔ７、ＳＰ６、またはＴ３）、翻訳開始シグナル、例えば、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（原核生物）またはＫｏｚａｋ（真核生物）配列、開始コドン、および目的のタンパク質のコード配列（例えば、ＶＨまたはＶＬ鎖ドメイン）を含有する。１つまたは複数の検出タグをコードする１つまたは複数の核酸配列が、１つまたは複数の検出タグ（例えばヒスチジンタグ）をさらに含むタンパク質の生成を実現するために含まれてよい。完全な新生タンパク質がディスプレイされて、その活性のある高次構造に折り畳まれることを可能にするために、少なくとも２３～３０個のアミノ酸長のスペーサードメインを、Ｃ末端に加えて、タンパク質がリボソームから完全に出ることを可能にすることができる。スペーサーは、ＤＮＡ配列のＲＴ－ＰＣＲ回収のためのプライマーの設計用の知られている配列を提供することができる。
ＤＮＡから終止コドンを除去するために、終止コドンを欠く３’プライマーが、ＰＣＲ構築中に用いられ得る。細菌ベースのディスプレイ系のために設計される構築物は、ＤＮＡの５’末端および３’末端にステム－ループ構造を含有する配列を組み込んで、細菌無細胞系において、ＲＮａｓｅ活性による分解に対してｍＲＮＡを安定させることができる。
本明細書中に記載される方法に用いられるｍＲＮＡ翻訳系は、適切なあらゆる入手可能な系であってよい。原核生物翻訳系または真核生物翻訳系が、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）粗溶解液（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐａ．；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．から商業的に入手可能）、再構成リボソーム系、例えばＰＵＲＥ（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：７５１～７５５頁（２００１年）参照）、または以下に記載される無細胞タンパク質合成系に用いられてよい。
ＰＵＲＥ系は、インビトロタンパク質生合成（例えば、開始、伸長、および終止）に用いられる約３２個の個々に精製された構成要素を含むことができる。一部の実施形態において、構成要素として、開始因子（例えば、ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦ３）、伸長因子（例えば、ＥＦ－Ｇ、ＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓ）、放出因子（例えば、ＲＦ１、ＲＦ３）、終止因子（例えば、ＲＲＦ）、２０個のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、メチオニル－ｔＲＮＡトランスホルミラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、４６個のｔＲＮＡ、ＮＴＰ、クレアチンリン酸、１０－ホルミル－５，６，７，８－テトラヒドロ葉酸、２０個のアミノ酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、およびピロホスファターゼが挙げられる。
リボソームディスプレイが、標的に対して高い親和性を有する抗体断片を首尾よく生成するのに用いられてきた。リボソームディスプレイの詳細な説明が、例えば、Ｈａｎｅｓ、Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻：１４１３０～１４１３５頁（１９９８年）；Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１巻：１１９～１３５頁（１９９９年）；Ｈｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１巻、１０５～１１７頁（１９９９年）；Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ Ｗ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻：２６８～２７３頁（１９９９年）に見出される。
ＩＩ．インビトロ選択のための他のディスプレイ方法
他のインビトロライブラリディスプレイ方法、例えば、以下に限定されないが、ｍＲＮＡディスプレイ、バイシストロン性ディスプレイ、Ｐ２Ａディスプレイ、およびＣＩＳディスプレイ（シス活性ディスプレイ）が、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
ｍＲＮＡディスプレイ
ｍＲＮＡディスプレイにおいて、ＲＮＡライブラリの各メンバーは、これがコードする目的のタンパク質に、ｔＲＮＡのアミノアシル末端を模倣し得る抗生物質であるピューロマイシンへの安定した共有結合によって直接取り付けられる（例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｒ ＷおよびＳｚｏｓｔａｋ Ｊ Ｗ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻：１２２９７～１２３０２頁（１９９７年）参照）。ピューロマイシンは、原核生物または真核生物のいずれにおいても活性があるアミノヌクレオシド抗生物質であり、ストレプトマイセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）に由来する。タンパク質合成は、リボソームにおいて起こる翻訳中に、早期の鎖終止によって阻害される。分子の一部が、チロシル－ｔＲＮＡの３’末端の類似物としての機能を果たし、その構造の一部が、アデノシンの分子を模倣しており、別の一部が、チロシンの分子を模倣している。これは、Ａ部位に入って、成長鎖に移って、ピューロマイシン化された新生鎖の形成および早期の鎖の放出を引き起こす。３’位は、ｔＲＮＡの標準のエステル結合の代わりにアミド結合を含有して、分子を、加水分解に対してかなり耐性にし、かつリボソームに沿う進行を停止させる。
タンパク質合成の他のピューロマイシン類似体インヒビタとして、Ｏ－デメチルピューロマイシン、Ｏ－プロパルギル－ピューロマイシン、９－｛３’－デオキシ－３’－［（４－メチル－Ｌ－フェニルアラニル）アミノ］－β－Ｄ－リボフラノシル｝－６－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノ）プリン［Ｌ－（４－Ｍｅ）－Ｐｈｅ－ＰＡＮＳ］、および６－ジメチルアミノ－９－［３－（ｐ－アジド－Ｌ－ベータ－フェニルアラニルアミノ）－３－デオキシ－ベータ－リボフラノシル］プリンが挙げられる。
ＲＮＡライブラリのメンバーは、以下に限定されないが、ポリヌクレオチドまたは化学リンカー、例えばポリエチレングリコール等のリンカーを介してピューロマイシンにライゲートされ得る（Ｆｕｋｕｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４巻（１９号）：ｅ１２７頁（２００６年））。一部の実施形態において、ＲＮＡを含むポリヌクレオチドリンカーは、３’末端にてピューロマイシンに連結されている。他の実施形態において、ＰＥＧリンカーは、ピューロマイシンに連結されている。
ＲＮＡ分子の３’末端に連結されているピューロマイシンがリボソームに入るにつれ、リボソームにおけるペプチジルトランスフェラーゼ活性の結果として、新生タンパク質（ＲＮＡ分子によってコードされている）への共有結合を確立する。そして、安定したアミド結合が、タンパク質と、ピューロマイシンのＯ－メチルチロシン部分との間で形成される。
ＲＮＡ－ピューロマイシン融合体のＲＮＡライブラリは、本明細書中に記載されるように、インビトロ翻訳を受けて、ＲＮＡ－ピューロマイシン－タンパク質複合体（例えば、ＲＮＡ－ピューロマイシン－ネオアンチゲン複合体）を生成することができる。一部の実施形態において、ＲＮＡ－ピューロマイシン融合体は、患者由来の腫瘍細胞および野生型細胞のエクソーム分析によって同定される候補ネオアンチゲンをコードするＲＮＡ分子を含む。
親和性選択を、ｍＲＮＡディスプレイされたタンパク質ライブラリに対して実行して、所望の特性、例えば結合対リガンドへの特異的結合を有するタンパク質の有無に関してスクリーニングすることができる。ｍＲＮＡディスプレイは、溶液中で、または固体支持体上で実行され得る。目的の選択された、ｍＲＮＡディスプレイされたタンパク質は、アフィニティクロマトグラフィー等の当該技術において知られている標準的な方法によって精製され得る。ｍＲＮＡは、クローニングされ、ＰＣＲ増幅され、かつ／または配列決定して、目的の選択されたタンパク質のコード配列を決定することができる。一実施形態において、選択された、ｍＲＮＡディスプレイされたライブラリは、ＴＩＬに結合するネオアンチゲンの集団を含有する。
一部の態様において、核酸メンバーのライブラリのメンバーは、ピューロマイシンに連結されており、各メンバーは、他の核酸メンバーによってコードされている他のタンパク質とは異なる一次アミノ酸配列を有する、目的の予期されるタンパク質をコードしている。ｍＲＮＡディスプレイ系は、各複合体が、ピューロマイシン、リボソーム、および目的の予期されるタンパク質に連結された様々なｍＲＮＡを有するように、様々な複合体の集団または混合物を含有し得る。
バイシストロン性（Ｂｉｓｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ＤＮＡディスプレイ
バイシストロン性ＤＮＡディスプレイは、目的のタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択に利用することができる（例えば、Ｓｕｍｉｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３７（２２）：ｅ１４７（２００９）を参照のこと）。この方法は、目的のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳タンパク質を、それらのコードＤＮＡと複合体を形成させることに基づき、これは目的のタンパク質の配列を決定するために使用される。典型的に、それがコードするタンパク質に連結され得る複数のＯＲＦを含有するＤＮＡ鋳型が生成される。さらに、カップルした転写／翻訳反応は、油中水エマルジョン（例えば、ミセル）中で区画化される。
一部の場合では、複数のＯＲＦが使用される場合、それらはリボソーム結合側で分離され得る。一部の実施形態では、目的のタンパク質のコード配列は、ストレプトアビジンのコード配列に融合される。一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、リンカーを介してビオチン化される。リンカーは切断可能であり得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳の間、タンパク質はミセル中で発現され得る。１つの非限定的な例示的実施形態では、ＤＮＡ鋳型は候補ネオアンチゲンのコード配列を含有し、候補ネオアンチゲンはミセル中で発現される。実施形態では、候補ネオアンチゲンが形成し、ストレプトアビジン－ビオチン連結などの連結を介して候補ネオアンチゲンをコードするＤＮＡと会合する。候補ネオアンチゲンなどの目的のＤＮＡディスプレイタンパク質をエマルジョンから回収し、親和性選択によってスクリーニングすることができる。目的の選択したＤＮＡディスプレイタンパク質のＤＮＡ鋳型を、ＵＶ照射などの方法によって複合体から切断し、次いでＰＣＲ増幅、クローニング、および／または配列決定することができる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、核酸メンバーのライブラリを生成することを含み、各メンバーは、他の核酸メンバーによってコードされる他のタンパク質とは異なる一次アミノ酸を有する目的の予期されるタンパク質（すなわち、候補ネオアンチゲン）をコードする。一部の実施形態では、ライブラリはＤＮＡメンバーを含み、この方法は、ライブラリをＲＮＡに転写し、無細胞タンパク質合成系においてＲＮＡを翻訳して、油中水エマルジョン中でバイシストロン性ＤＮＡディスプレイ系を生成することを含む。一部の実施形態では、バイシストロン性ＤＮＡディスプレイ系は、結合対リガンドへの特異的結合について選択される目的のタンパク質の集団を含有する。一実施形態では、バイシストロン性ＤＮＡディスプレイ系は、候補ネオアンチゲンの集団を含有し、各候補ネオアンチゲンは、候補ネオアンチゲンをコードするＤＮＡ分子と会合する。
Ｐ２Ａ ＤＮＡディスプレイ
エンドヌクレアーゼＰ２Ａのシス活性を利用するＰ２Ａ ＤＮＡディスプレイでは、Ｐ２Ａおよび目的のタンパク質の融合タンパク質は、それが発現される同じＤＮＡ分子に結合する（例えば、Ｒｅｉｅｒｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３３（１）：ｅ１０を参照のこと）。ＤＮＡ鋳型は、Ｐ２Ａのコード配列、プロモータ、および複製起点に遺伝子に融合された目的のタンパク質をコードするコード配列を含有し得る。当業者に公知の標準的な方法によって、Ｐ２Ａのコード配列を得ることができ、目的のタンパク質との遺伝子融合を構築することができる。
一部の実施形態では、Ｐ２Ａ ＤＮＡディスプレイは、目的のタンパク質を選択するために使用される。目的のタンパク質は、ライブラリの各メンバーが、Ｐ２Ａと目的のタンパク質との間の融合タンパク質を含む、融合タンパク質のライブラリを生成し、所望の特性、例えば、結合対リガンドへの特異的結合に基づいて目的のタンパク質を選択することによって選択することができる。ライブラリは核酸メンバーのライブラリから構築することができ、各メンバーは、Ｐ２Ａのコード配列に遺伝子的に融合された異なる、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ鋳型を含む（すなわち、目的の各タンパク質は、核酸ライブラリの他のメンバーによってコードされる他のタンパク質とは異なる一次アミノ酸配列を有する）。
一部の実施形態では、Ｐ２Ａ ＤＮＡディスプレイライブラリは、例えば、溶液中または固体支持体上で、親和性選択ストラテジーによってスクリーニングすることができる。目的の選択されたタンパク質は、例えば、親和性クロマトグラフィーによって精製することができ、複合体を形成したＤＮＡは、ＰＣＲ増幅、クローニング、および／または配列決定することができる。
ＣＩＳディスプレイ
Ｐ２Ａ ＤＮＡディスプレイと同様に、ＣＩＳディスプレイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写／翻訳されたタンパク質を、それらをコードするＤＮＡ分子に直接連結するためのＤＮＡベースのアプローチを含む（例えば、Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（９）：２８０６～２８１０を参照のこと）。この方法は、ＤＮＡ分子がＣＩＳエレメントを有する場合、ＤＮＡ複製開始タンパク質であるＲｅｐＡを使用して、それが発現されるＤＮＡ分子に非共有結合により結合する。ＤＮＡ分子は、ＲｅｐＡに加えて、目的のタンパク質（例えば、候補ネオアンチゲン）をコードするように作製することができる。
一部の実施形態では、ＣＩＳディスプレイが、目的のタンパク質を選択するために使用される。目的のタンパク質は、各メンバーがＲｅｐＡと目的のタンパク質との間の融合タンパク質を含む、融合タンパク質のＤＮＡライブラリを生成し、所望の特性、例えば、結合対リガンドへの特異的結合に基づいて目的のタンパク質を選択することによって選択することができる。ライブラリは、ライブラリの各メンバーが、ＲｅｐＡのコード配列に遺伝子的に融合された異なる、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ鋳型を含む（すなわち、目的の各タンパク質は、核酸ライブラリの他のメンバーによってコードされる他のタンパク質とは異なる一次アミノ酸配列を有する）、ＤＮＡライブラリから構築することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡライブラリのメンバーは、目的のタンパク質のコード配列、ＲｅｐＡのコード配列、ＣＩＳエレメント、複製起点およびプロモータを含有し、目的のタンパク質のコード配列は、ＲｅｐＡのコード配列に遺伝子的に融合される。ＣＩＳエレメントは、ＲｅｐＡコード配列に遺伝子的に連結することができる。
一部の実施形態では、ライブラリは、ＲｅｐＡと目的のタンパク質との間の融合タンパク質、および融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有する。
ＲｅｐＡ ＤＮＡディスプレイライブラリは、例えば、溶液中または固体支持体上で親和性選択ストラテジーによってスクリーニングすることができる。目的の選択されたタンパク質は、例えば、親和性クロマトグラフィーによって精製することができ、複合体を形成したＤＮＡは、ＰＣＲ増幅、クローニング、および／または配列決定することができる。
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）
本明細書に記載される目的の生物学的に活性なタンパク質（すなわち、ネオアンチゲン）を発現させるために、無細胞タンパク質合成系を使用することができる。精製されたｍＲＮＡ転写物から、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成反応の間にＤＮＡから転写されたｍＲＮＡから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質の合成を支援する細胞抽出物が開発された。
反応ミックス中のポリペプチドのＣＦＰＳは、細菌抽出物および／または定義された試薬を含む。反応ミックスは、少なくともＡＴＰまたはエネルギー源；巨大分子、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの産生物のための鋳型；ポリペプチド合成に必要なアミノ酸、およびそのような補因子、酵素ならびに他の試薬、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子、アミノアシル合成酵素、伸長因子、開始因子などを含む。本発明の一実施形態では、エネルギー源は恒常性エネルギー源である。また、高エネルギーリン酸結合からのＡＴＰの再生を触媒する酵素、例えば、酢酸キナーゼ、クレアチンキナーゼなども含まれ得る。このような酵素は、翻訳に使用される抽出物中に存在し得るか、または反応ミックスに添加され得る。このような合成反応系は当該技術分野で周知であり、文献に記載されている。
無細胞タンパク質合成のための鋳型は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれであってもよい。鋳型は、目的の任意の特定の遺伝子についての配列を含むことができ、全長ポリペプチドまたはその任意の長さの断片をコードすることができる。タンパク質合成鋳型として機能する核酸は、必要に応じて天然源に由来するか、または合成もしくは組換えであり得る。例えば、ＤＮＡは組換えＤＮＡ、例えば、プラスミド、ウイルスなどであり得る。
本明細書で使用される場合、「反応ミックス」という用語は、核酸鋳型からのポリペプチドの合成を触媒することができる反応混合物を指す。反応混合物は、細菌細胞からの抽出物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０抽出物を含む。Ｓ３０抽出物は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｌｅｓｌｅｙ，Ｓ．Ａ．ら（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、２６３２～８に記載されている。合成は、好気性または嫌気性条件のいずれかの下で実施され得る。
一部の実施形態では、細菌抽出物は乾燥される。乾燥された細菌抽出物は、出発材料の固体パーセントを測定することによって決定して、元の固体の１１０％でミリＱ水（例えば、逆浸透水）中で再構成され得る。一実施形態では、１０ｍＬの抽出物の元の固体の１１０％に相当する乾燥抽出物の正確に秤量されたアリコートが、マグネチックスターラー上の撹拌子を備えたガラスビーカー中の１０ｍＬのミリＱ水に添加される。得られた混合物は、粉末が溶解するまで撹拌する。溶解すると、材料を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、すぐに使用しない限り、－８０Ｃで保存する。
反応ミックス中の抽出物の体積パーセントは変動し、抽出物は、通常、総体積の少なくとも約１０％、より通常は少なくとも約２０％であり、一部の場合では、総体積の少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％であり、通常、約７５％以下でもたらされた場合には、さらなる利益がもたらされ得る。
一般的な系は、目的のタンパク質をコードする核酸鋳型を含む。核酸鋳型は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）であり、任意の形態（例えば、線形、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖など）である。核酸鋳型は、所望のタンパク質の生成を導く。
鋳型を維持するために、抽出物を生成するために使用される細胞は、有害な酵素の活性の減少、実質的な減少もしくは排除、または活性が改変された酵素について選択され得る。ヌクレアーゼまたはホスファターゼ活性が改変された（例えば、少なくとも１つの突然変異ホスファターゼもしくはヌクレアーゼ遺伝子またはそれらの組合せを有する）細菌細胞を細胞抽出物の合成に使用して、合成効率を増加させることができる。例えば、ＣＦＰＳのためのＳ３０抽出物を作製するために使用されるＥ．ｃｏｌｉ株は、ＲＮアーゼＥまたはＲＮアーゼＡが欠損していてもよい（例えば、突然変異によって）。
一般的なＣＦＰＳ反応では、目的のタンパク質をコードする遺伝子が転写緩衝剤中で発現され、ＣＦＰＳ抽出物および翻訳緩衝剤中で目的のタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡが生じる。転写緩衝剤、無細胞抽出物および翻訳緩衝剤は、別々に添加され得るか、またはこれらの溶液の２つ以上をそれらの添加前に組み合わされ得るか、もしくは同時に添加され得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的のタンパク質を合成するために、ある時点でＣＦＰＳ抽出物は、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む。一部のＣＦＰＳ系では、ｍＲＮＡは、天然源から精製された後、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、クローニングされたＤＮＡから、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよび／またはファージ由来ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼを使用して合成的に調製された後に、外因的に添加される。他の系では、ｍＲＮＡは、鋳型ＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され、転写および翻訳の両方が、この種類のＣＦＰＳ反応において発生する。一部の実施形態では、転写および翻訳系は、カップルしているか、または同じ反応においてＲＮＡおよびタンパク質の両方の合成を実施する相補的な転写および翻訳系を含む。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳系では、ＣＦＰＳ抽出物は、単一系において転写（ｍＲＮＡを生成するため）および翻訳（タンパク質を合成するため）の両方に必要な全ての成分（外因性または内因性）を含有する。
無細胞タンパク質合成反応混合物は、以下の成分を含む：少なくとも１つのプロモータ、および必要に応じて、１つもしくは複数の他の調節配列（例えば、目的の遺伝子を含有するクローニングまたは発現ベクター）に作動可能に連結した目的の遺伝子を含むＤＮＡまたはＰＣＲ断片などの鋳型核酸；目的の遺伝子が作動可能に連結しているプロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼ、および必要に応じて、鋳型核酸が作動可能に連結している、必要に応じた調節配列に向けられた１つまたは複数の転写因子；リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）；必要に応じて、他の転写因子およびその補因子；リボソーム；転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）；他のまたは必要に応じた翻訳因子（例えば、翻訳開始因子、伸長因子、および終結因子）およびその補因子；１つまたは複数のエネルギー源（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ）；必要に応じて、１つまたは複数のエネルギー再生成分（例えば、ＰＥＰ／ピルビン酸キナーゼ、ＡＰ／酢酸キナーゼまたはクレアチンホスフェート／クレアチンキナーゼ）；必要に応じて、収率および／または効率を増強する因子（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質安定剤、シャペロン）およびその補因子；ならびに；必要に応じて、可溶化剤。反応ミックスは、塩（例えば、酢酸、グルタミン酸、または硫酸のカリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、およびマンガン塩）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、四級アミノエチルおよびアミノエチルデキストランなど）、環状ＡＭＰ、タンパク質または核酸分解酵素の阻害剤、タンパク質合成の阻害剤または調節因子、酸化／還元調整剤（例えば、ＤＴＴ、アスコルビン酸、グルタチオン、および／またはそれらの酸化物）、非変性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、緩衝剤成分、スペルミン、スペルミジン、プトレシンなどを含む、タンパク質合成に特に必要とされるアミノ酸および他の材料をさらに含む。ＣＦＰＳ反応の構成要素は、米国特許第７，３３８，７８９号および同第７，３５１，５６３号、ならびに米国特許出願公開第２０１０／０１８４１３５号により詳細に説明されており、これらの開示は、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
抽出物中に存在する特定の酵素に応じて、例えば、多くの公知のヌクレアーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、またはホスファターゼ阻害剤のうちの１つまたは複数を選択し、合成効率を改善するために有利に使用することができる。
タンパク質および核酸の合成は、典型的に、エネルギー源を必要とする。エネルギーが、ｍＲＮＡを生成するための転写の開始に必要とされる（例えば、ＤＮＡ鋳型が使用される場合、および翻訳を開始するために、例えばＧＴＰの形態の高エネルギーリン酸が使用される）。リボソームによる１つのコドン（３つのヌクレオチド；１つのアミノ酸）の後続の各ステップは、ＧＤＰへのさらなるＧＴＰの加水分解を必要とする。典型的に、ＡＴＰも必要とされる。タンパク質合成の間に重合されるアミノ酸については、最初にアミノ酸が活性化されなければならない。したがって、高エネルギーリン酸結合からのかなりの量のエネルギーが、タンパク質および／または核酸合成を進行させるために必要とされる。
エネルギー源は、所望の化学反応を達成するためのエネルギーを提供するために酵素的に処理され得る化学基質である。ヌクレオシド三リン酸、例えば、ＡＴＰに見出されるものなどの高エネルギーリン酸結合の切断による合成のためのエネルギーの放出を可能にするエネルギー源が一般的に使用される。高エネルギーリン酸結合に変換可能な任意の供給源が特に適している。ＡＴＰ、ＧＴＰ、および他の三リン酸が、通常、タンパク質合成を支援するための等価のエネルギー源として考慮され得る。
合成反応にエネルギーを提供するために、系は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、他のＮＴＰなどの高エネルギー三リン酸化合物を生成または再生することができるグルコース、ピルベート、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド－３－ホスフェート、３－ホスホグリセレートおよびグルコース－６－ホスフェートなどの追加のエネルギー源を含んでもよい。
十分なエネルギーが合成系に最初に存在しない場合、追加のエネルギー源が好ましくは補充される。エネルギー源はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成反応の間に追加または補充されてもよい。
一部の実施形態では、無細胞タンパク質合成反応は、ＮＴＰ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ、アミノ酸、Ｍｇ２＋アセテート、Ｍｇ２＋グルタメート、Ｋ＋アセテート、Ｋ＋グルタメート、フォリン酸、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．２、ＤＴＴ、ピルビン酸キナーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、ＮＡＤ、ＣｏＡ、Ｎａ＋オキサレート、プトレシン、スペルミジン、およびＳ３０抽出物を含むＰＡＮＯｘ－ＳＰ系を使用して実施される。
一部の場合では、無細胞合成反応は、一般的な二次エネルギー源の追加を必要としないが、酸化的リン酸化の同時活性化およびタンパク質合成を使用する。一部の場合では、ＣＦＰＳは、Ｃｙｔｏｍｉｍ（細胞質模倣）系などの反応において実施される。Ｃｙｔｏｍｉｍ系は、最適化されたマグネシウム濃度でポリエチレングリコールの非存在下で実施される反応条件として定義される。この系は、タンパク質合成を阻害することが知られているホスフェートを蓄積しない。
活性な酸化的リン酸化経路の存在は、電子伝達鎖阻害剤などの、経路内のステップを特異的に阻害する阻害剤を使用して試験され得る。酸化的リン酸化経路の阻害剤の例には、シアン化物、一酸化炭素、アジド、カルボニルシアニドｍ－クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、および２，４－ジニトロフェノールなどの毒素、オリゴマイシンなどの抗生物質、ロテノンなどの殺虫剤、ならびにマロネートおよびオキサロアセテートなどのコハク酸デヒドロゲナーゼの競合的阻害剤が含まれる。
一部の実施形態では、無細胞タンパク質合成反応は、ＮＴＰ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ、アミノ酸、Ｍｇ２＋アセテート、Ｍｇ２＋グルタメート、Ｋ＋アセテート、Ｋ＋グルタメート、フォリン酸、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．２、ＤＴＴ、ピルビン酸キナーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、ピルビン酸ナトリウム、ＮＡＤ、ＣｏＡ、Ｎａ＋オキサレート、プトレシン、スペルミジン、およびＳ３０抽出物を含むＣｙｔｏｍｉｍ系を使用して実施される。一部の実施形態では、Ｃｙｔｏｍｉｍ系のエネルギー基質はピルベート、グルタミン酸、および／またはグルコースである。当該系の一部の実施形態では、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）が、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）と置き換えられる。
ジスルフィド結合を低下させ、適切なタンパク質フォールディングを損なう可能性がある酵素を不活化するために、ヨードアセトアミドを用いて細胞抽出物を処理することができる。一部の実施形態では、細胞抽出物は、外因性タンパク質シャペロンを含む。タンパク質シャペロンは、無細胞抽出物を作製するために使用される細菌株によって発現され得るか、またはタンパク質シャペロンは細胞抽出物に添加され得る。外因性タンパク質シャペロンの非限定的な例には、ジスルフィド結合イソメラーゼ（ＰＤＩ）、例えば、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＣ、およびペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）、例えば、限定されないが、ＦｋｐＡが含まれる。一部の実施形態では、抽出物は、ＰＤＩおよびＰＰＩａｓｅの両方、例えば、ＤｓｂＣおよびＦｋｐＡの両方を含む。グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）および／またはグルタチオン（ＧＳＨ）も、適切なタンパク質フォールディングが促進され、異常なタンパク質ジスルフィドの形成が阻止される比率で抽出物に添加され得る。
一部の実施形態では、ＣＦＰＳ反応物は、酸化的リン酸化を実施するための反転膜小胞を含む。これらの小胞は、本明細書に記載の細胞抽出プロセスの調製物の高圧均質化ステップの間に形成され得、反応ミックスに使用される抽出物に残留する。
細胞抽出物を調製する方法は、例えば、Ｚａｗａｄａ，Ｊ．「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｓ」、Ｄｏｕｔｈｗａｉｔｅ，Ｊ．Ａ．およびＪａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．（ｅｄｓ．）、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．８０５、ｐｐ．３１～４１（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０１２）；Ｊｅｗｅｔｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ：４、１～１０（２００８）；Ｓｈｉｎ Ｊ．およびＮｏｒｉｅａｕｘ Ｖ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｇ．、４：８（２０１０）に記載されている。簡潔に述べると、細菌培養物を成長させ、収集し、適切な緩衝剤（例えば、Ｓ３０緩衝剤）中に懸濁し、均質化して細胞を溶解する。
無細胞抽出物は、ＣＦＰＳ反応に使用する前に室温まで解凍することができる。ジスルフィド結合を有するタンパク質を合成する場合に、抽出物を５０μＭのヨードアセトアミドと３０分間インキュベートすることができる。一部の実施形態では、ＣＦＰＳ反応物は、約８ｍＭのグルタミン酸マグネシウム、約１０ｍＭのグルタミン酸アンモニウム、約１３０ｍＭのグルタミン酸カリウム、約３５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、約１．２ｍＭのＡＭＰ、各々約０．８６ｍＭのＧＭＰ、ＵＭＰ、およびＣＭＰ、約２ｍＭのアミノ酸（チロシンについては約１ｍＭ）、約４ｍＭのシュウ酸ナトリウム、約０．５ｍＭのプトレシン、約１．５ｍＭのスペルミジン、約１６．７ｍＭのリン酸カリウム、約１００ｍＭのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、約２～１０μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ鋳型、約１～１０μＭのＥ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＣ、および総濃度約２ｍＭの酸化型（ＧＳＳＧ）グルタチオンを伴う約３０％（ｖ／ｖ）のヨードアセトアミドで処理した抽出物を含む。必要に応じて、無細胞抽出物は１ｍＭの還元型（ＧＳＨ）を含んでもよい。
溶解物の生成
本明細書に記載の方法および系は、目的の標的タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳のために細胞溶解物を使用することができる。便宜上、溶解物の供給源として使用される生物は、供給源生物または宿主細胞と称することができる。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞もしくは植物細胞、またはタンパク質を合成することができる任意の他の細胞型であってもよい。溶解物は、所望のタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を翻訳することができる成分を含み、必要に応じて、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを転写することができる成分を含む。そのような成分には、例えば、ＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの転写を開始するために必要な任意の転写活性化因子、転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、７０Ｓリボソーム、Ｎ１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸、ホルミルメチオニン－ｔＲＮＡｆＭｅｔ合成酵素、ペプチジルトランスフェラーゼ、ＩＦ－１、ＩＦ－２、およびＩＦ－３などの開始因子、ＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓ、およびＥＦ－Ｇなどの伸長因子、ＲＦ－１、ＲＦ－２、およびＲＦ－３などの放出因子が含まれる。
ある実施形態では、溶解物が由来する細菌細胞を使用する。細菌の任意の株に由来する細菌溶解物を本発明の方法において使用することができる。細菌溶解物は、以下の通りに得ることができる。選択された細菌を、当該技術分野で周知であり、実践者により容易に最適化される、特定の細菌を成長させるためのいくつもの増殖培地のいずれかおよび成長条件下で対数期まで成長させる。例えば、合成のための天然の環境では、グルコースおよびホスフェートを含有する培地であって、グルコースが少なくとも約０．２５％（重量／体積）、さらに通常少なくとも約１％；および通常約４％以下、さらに通常約２％以下の濃度で存在する培地で成長させた細菌細胞に由来する細胞溶解物を利用する。そのような培地の例は２ＹＴＰＧ培地であるが、定義済みの栄養源と未定義の栄養源のどちらも使用される、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌を成長させるために適した多くの培地が公開されているので、多くの培養培地がこの目的に適し得ることが当業者には理解されよう。一晩かけて採取した細胞を、細胞ペレットを適切な細胞懸濁緩衝剤中に懸濁させること、および懸濁した細胞を超音波処理によって破壊すること、懸濁した細胞をフレンチプレスで破砕すること、連続フロー高圧均質化、または効率的な細胞溶解のために有用な当該技術分野で公知の任意の他の方法によって溶解させることができる。次いで、細胞溶解物を遠心分離または濾過して大きなＤＮＡ断片および細胞デブリを除去する。
細胞溶解物を作製するために使用される細菌株は、一般に、無細胞合成効率を上昇させるために、ヌクレアーゼおよび／またはホスファターゼ活性を低下させている。例えば、無細胞抽出物を作製するために使用される細菌株は、ヌクレアーゼであるＲＮアーゼＥおよびＲＮアーゼＡをコードする遺伝子に突然変異を有し得る。株は、無細胞合成反応においてそれぞれアミノ酸であるトリプトファン、アルギニン、セリンおよびシステインの分解を妨げる、ｔｎａＡ、ｓｐｅＡ、ｓｄａＡまたはｇｓｈＡなどの遺伝子の欠失などの、細胞合成反応の成分を安定化するための突然変異も有し得る。さらに、株は、プロテアーゼであるｏｍｐＴまたはｌｏｎＰのノックアウトなどの、無細胞合成のタンパク質産物を安定化するための突然変異を有し得る。
停止コドンを含まないＤＮＡ発現カセット
一部の実施形態では、リボソームディスプレイ反応系で使用される核酸鋳型は、目的のタンパク質をコードするＲＮＡを発現することができるＤＮＡ発現カセットを含み、ＲＮＡは作動可能な停止コドンを欠いている。発現カセットにおけるタンパク質コード領域から停止コドンを除去するために、停止コドンを欠くＰＣＲプライマーを使用して、目的のタンパク質のコード領域を増幅させることができ、その結果、翻訳開始からＣ末端アミノ酸をコードする配列までのコード領域全体が増幅する。
ネオアンチゲンライブラリを用いたＭＨＣ結合アッセイ
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、ＭＨＣタンパク質と呼ばれる糖タンパク質をコードする遺伝子の集合体である。ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＨＣタンパク質の主な機能は、ＴＣＲによって認識され得る形態で抗原を提示することである。ＭＨＣタンパク質は、抗原ペプチドの形態で抗原と結合して、ＭＨＣ－ペプチド複合体を形成する。
ヒトおよびマウスのＨ－２領域におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）としても知られているＭＨＣタンパク質は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質の２つのカテゴリーに分類される。これらのタンパク質は、高度に多型性の遺伝子のクラスターから構成される。具体的には、ヒトＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃは、クラスＩ ＭＨＣ分子として知られており、一方、ヒトＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲは、クラスＩＩ ＭＨＣ分子として知られている。ＨＬＡ遺伝子座には、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＮ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃが含まれる。これらの遺伝子座の各々は、ヒト集団において異なる対立遺伝子を含有する。これらの対立遺伝子バリアントによってコードされる異なるサブタイプは、本発明の範囲内にあることが意図される。
ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、非共有結合性会合において１つのα鎖および１つのβ鎖を含むヘテロ二量体膜内在性タンパク質である。α鎖は、２つの細胞外ドメイン（α１およびα２）、ならびに膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞質（ＣＹＴ）ドメインを有する。β鎖は、２つの細胞外ドメイン（β１およびβ２）、ならびにＴＭドメインおよびＣＹＴドメインを含有する。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、３つの細胞外ドメイン（すなわち、α１、α２およびα３）ならびにＴＭドメインおよびＣＹＴドメインを有する糖タンパク質重鎖を含む膜内在性タンパク質である。重鎖は、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）と呼ばれる可溶性サブユニットと非共有結合的に会合している。
一部の実施形態では、本発明の結合アッセイ（例えば、ＭＨＣ－ＰｅｐＳｅｑアッセイ）は、プロセシング可能リンカーによってＭＨＣクラスＩＩ成分、例えばβ鎖に連結したスペースホルダー分子の使用を採用する。本発明のスペースホルダー分子は、ペプチド結合溝における任意の他のペプチドの結合が妨げられるように、ＭＨＣタンパク質のペプチド結合溝に結合できる任意のペプチドであり得る。好ましくは、スペースホルダー分子は、ほぼ中性のｐＨで、中程度の親和性、より好ましくは低い親和性でペプチド結合溝内で結合する。一実施形態では、スペースホルダー分子の長さは、約５から約４０アミノ酸残基、より好ましくは約６から約３０アミノ酸残基、８から約２０アミノ酸残基、さらにより好ましくは約１２から１５アミノ酸残基に及ぶ。さらなる実施形態では、スペースホルダー分子は約１３アミノ酸残基である。適切なスペースホルダー分子の例には、限定されないが、ＣＬＩＰとしても知られている、（一文字アミノ酸コードで）ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号７３）；ＡＡＭＡＡＡＡＡＡＡＭＡＡ（配列番号７４）；ＡＡＭＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７５）；ＡＡＦＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７６）；ＡＳＭＳＡＡＳＡＡＳＭＡＡ（配列番号７７）、およびそれらの機能的等価物が含まれる。一実施形態では、スペースホルダー分子は、コンセンサス配列ＡＡＸＡＡＡＡＡＡＡＸＡＡ（配列番号７８）を有し、Ｘは任意のアミノ酸である。ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝内にスペースホルダー分子を維持する能力は、「空の」分子が形成されるのを阻止する。「空の」ＭＨＣクラスＩＩ分子の形成は、これらの「空の」分子が凝集する傾向があるため、主要な制限要因であるので、機能的なＭＨＣクラスＩＩ成分の単離を困難にしている。
本発明のスペースホルダー分子は、タンパク質を切断できる酵素の標的部位を含有するアミノ酸配列を有するリンカーによって、ＭＨＣ分子に共有結合され得る。このようなリンカーは、本明細書では「プロセシング可能リンカー」と称される。本発明のプロセシング可能リンカーの例には、コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、カリクレイン、トロンビン、およびプラスミノーゲンアクチベーターなどの酵素の標的部位を含有するリンカーが含まれる。本発明の好ましいプロセシング可能リンカーには、トロンビン切断部位を有するリンカーが含まれる。
本発明において有用な適切なリンカーは、様々な方法を使用して設計することもできる。リンカーが、ＭＨＣクラスＩＩ成分のペプチド結合溝へのスペースホルダー分子の結合を妨げないように、例えば、ＭＨＣタンパク質のＸ線結晶学的データを使用して、適切な長さおよび電荷のリンカーを設計することができる。そのような方法は、本発明に含まれる。
本発明のリンカーの長さは、リンカーがスペースホルダー分子とＭＨＣクラスＩＩ成分との間の結合を実質的に阻害しないように、十分に短い（すなわち、サイズが十分に小さい）ことが好ましい。本発明のリンカーの長さは、約１アミノ酸残基～約４０アミノ酸残基、より好ましくは約５アミノ酸残基～約３０アミノ酸残基、さらにより好ましくは約８アミノ酸残基～約２０アミノ酸残基の範囲であり得る。
リンカーの切断は、スペースホルダー分子の放出を促進し、それによってペプチド結合溝を解放する。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ成分を、候補ネオアンチゲンのライブラリ（例えば、腫瘍および野生型細胞のエクソーム分析から設計されたペプチドのＰｅｐＳｅｑライブラリ）とインキュベートして、ＭＨＣクラスＩＩ成分への抗原ペプチド分子の結合を促進することができる。当業者によって容易に決定され得る、結合を可能にするのに十分な時間の後、抗原ペプチド分子に結合したＭＨＣクラスＩＩ成分が回収される。
ある特定の実施形態では、リンカーを切断し、抗原ペプチド分子とインキュベートするステップは、異なる抗原ペプチド分子を使用して繰り返される。これらのステップを繰り返すことの利点は、いくつかの抗原エピトープを認識する多数のＭＨＣクラスＩＩ成分の形成を可能にすることである。さらに、これらのステップは、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の様々な対立遺伝子型で構築されたＭＨＣクラスＩＩ分子を使用して実施することができる。したがって、アッセイのこの機能により、多数の異なるＭＨＣ対立遺伝子の遺伝子型に特有のいくつかのＭＨＣクラスＩＩ成分の生成が可能になる。
あるいは、本発明の結合アッセイ（例えば、ＭＨＣ－ＰｅｐＳｅｑアッセイ）は、ファージディスプレイ系を利用する（例えば、Ｈａｍｍｅｒ Ｊら、Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ａｎｄ ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｃｈｏｒｓ ｉｎ ＨＬＡ－ＤＲ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｅｌｌ（１９９３）７４（１）：１９７～２０３を参照のこと）。ＭＨＣ ＩＩ成分はファージディスプレイで発現される。次いで、ＭＨＣ ＩＩ成分を発現するファージを、候補ネオアンチゲンのライブラリ（例えば、腫瘍および野生型細胞のエクソーム分析から設計されたペプチドのＰｅｐＳｅｑライブラリ）とインキュベートして、ＭＨＣクラスＩＩ成分への抗原ペプチド分子の結合を促進する。当業者によって容易に決定され得る、結合を可能にするのに十分な時間の後、抗原ペプチド分子に結合したＭＨＣクラスＩＩ成分が回収される。
ある特定の態様では、インシリコ分析が、ネオアンチゲンとＭＨＣクラスＩタンパク質またはその断片との間の特異的結合を決定するために使用される。インシリコ分析は、計算アルゴリズムを適用して、ネオアンチゲンのペプチド配列に基づいてＭＨＣ Ｉタンパク質への相対的結合を予測することを含む。ｎｅｔＭＨＣｐａｎなどのツールは、ＭＨＣタンパク質へのペプチド／ネオアンチゲンの結合の予測に使用される（Ｊｕｒｔｚら、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｅｌｕｔｅｄ Ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｄａｔａ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１７）１９９（９）：３３６０～３３６８を参照のこと）。この分析への入力は、目的のペプチド配列およびＭＨＣ対立遺伝子であり、出力は予測される結合親和性である。
ネオアンチゲンとのＴＩＬのインキュベーション
ある特定の態様では、ＭＨＣ結合アッセイまたはインシリコにおいてＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を実証しているネオアンチゲンをプールしてペプチド混合物を形成し、このペプチド混合物を患者の腫瘍から単離されたＴＩＬとインキュベートする。ペプチド混合物とのインキュベーション後、ペプチド特異的に富化されたＴＩＬ集団が生成される（図２を参照のこと）。
一部の態様では、ＴＩＬを、約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、４８時間、または７２時間、ペプチド混合物とインキュベートする。他の態様では、ＴＩＬを、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、またはそれ以上の間、ペプチド混合物とインキュベートする。さらに他の態様では、ＴＩＬを、１から１０日の間（例えば、１から１０日の間、１から９日の間、１から８日の間、１から７日の間、１から６日の間、１から５日の間など）、ペプチド混合物とインキュベートする。
一態様では、約２．５×１０６個のＴＩＬを、８日間、約２．５μｇ／ｍＬのペプチド混合物の存在下で、６ウェル組織処理プレートにおいて、ＨＥＰＥＳ、Ｌ－グルタミン、ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および２－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ １６４０中で培養し、続いてＲＥＰ（急速増殖）を行う。
ネオアンチゲン特異的ＴＩＬの増殖
ある特定の態様では、ネオアンチゲン特異的ＴＩＬ産生は、２段階プロセスである。ｐｒｅ－ＲＥＰ（急速増殖）段階は、ＲＰＭＩなどの標準的な実験用培地中でＴＩＬを成長させ、照射したフィーダー細胞、および抗ＣＤ３抗体などの試薬でＴＩＬを処理して、所望の効果を達成する、段階である。ＲＥＰ段階は、患者を処置するのに十分に多くの培養量でＴＩＬを増殖させる、段階である。
一部の実施形態では、ネオアンチゲン特異的ＴＩＬ産生は、ＨＥＰＥＳ、Ｌ－グルタミン、ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、ＩＬ－２（または他のサイトカイン）、および抗ＣＤ３抗体を補充したＲＰＭＩ １６４０などの標準的な実験用培地中でＴＩＬを成長させ、照射したフィーダー細胞と培養して、所望の効果を達成する、急速増殖段階である。
Ｔ細胞などの腫瘍浸潤リンパ球の増殖は、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、Ｔ細胞は、フィーダーリンパ球およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの組合せの存在下で、非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して急速に増殖させることができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体である、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ（登録商標）、Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である）を含むことができる。あるいは、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子、例えば、約２００～４００Ｉｌｌ／ｍｌ、例えば、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２またはＩＬ－１５、好ましくはＩＬ－２の存在下で、１つまたは複数の抗原（エピトープなどのその抗原部分、または必要に応じてベクターから発現され得るがんの細胞、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、約０．３μＭのＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）またはｇｐ１００：２０９－２１７（２１０Ｍ）を含む）によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激によって急速に増殖させることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されたＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞上にパルスされたがんの同じ抗原による再刺激によって急速に増殖する。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、照射された自己リンパ球、または照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球およびＩＬ－２で再刺激することができる。
あるいは、またはさらに、ＴＩＬは、フィーダー細胞（例えば、照射された同種異系フィーダー細胞、照射された自己フィーダー細胞、および／または人工抗原提示細胞（例えば、ＣＤ３および／またはＣＤ８をコードする核酸で形質導入されたＫ５６２白血病細胞））ならびにインターロイキン－２（ＩＬ－２）またはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）のいずれか、好ましくはＩＬ－２の存在下で、非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して急速に増殖させることができる。この方法の一実施形態では、ＴＩＬの数を増加させることは、約１×１０９～約４×１０９個の同種異系フィーダー細胞および／または自己フィーダー細胞、好ましくは約２×１０９～約３×１０９個の同種異系フィーダー細胞および／または自己フィーダー細胞を使用する。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、例えば、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体である、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ－Ｍｃｎｅｉｌ、Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能である）を含むことができる。あるいは、ＴＩＬは、Ｔ細胞増殖因子、例えば、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２またはＩＬ－１５、好ましくはＩＬ－２の存在下で、例えば、必要に応じてベクターから発現され得る、がんの抗原（エピトープなどのその抗原部分、または細胞を含む１つまたは複数）、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、約０．３μＭのＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）またはｇｐ１００：２０９－２１７（２１０Ｍ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＩＬの刺激によって急速に増殖させることができる。他の適切な抗原には、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼがん抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、およびＶＥＧＦＲ２、またはそれらの抗原部分が含まれ得る。さらに、本明細書に記載の方法で同定されたネオアンチゲンを使用することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されたＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞上にパルスされたがんの同じ抗原による再刺激によって急速に増殖する。あるいは、ＴＩＬは、例えば、照射された自己リンパ球、または照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球および例えばＩＬ－２で再刺激することができる。
増殖したＴＩＬの特異的な腫瘍反応性は、当該技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、腫瘍細胞との共培養後のサイトカイン放出（例えば、インターフェロン－ガンマ）を測定することによって試験することができる。一部の実施形態では、自己Ｔ細胞の成長および活性化を促進するＴ細胞増殖因子は、自己Ｔ細胞と同時に、または自己Ｔ細胞に続いて哺乳動物に投与される。Ｔ細胞増殖因子は、自己Ｔ細胞の成長および活性化を促進する任意の適切な増殖因子であり得る。適切なＴ細胞増殖因子の例には、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、およびＩＬ－２１が含まれ、これらは単独で、またはＩＬ－２とＩＬ－７、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－１２とＩＬ－７、ＩＬ－１２とＩＬ－１５、もしくはＩＬ－１２とＩＬ２などの様々な組合せで使用することができる。
ＴＩＬのゲノム編集
ネオアンチゲンを認識するＴＣＲの遺伝子配列のユニバーサルドナーＴ細胞への導入は、（ａ）メガヌクレアーゼ、（ｂ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、（ｃ）転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、（ｄ）メガＴＡＬＥＮ、または（ｅ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系により達成される。これらの操作されたヌクレアーゼの各々を使用する技術は、当該技術分野で周知である。
一部の実施形態では、ＴＩＬは、１つまたは複数の遺伝子の発現を抑制するように改変される。一部の実施形態では、ＴＩＬは、ゲノム編集によってさらに改変される。ゲノムＤＮＡの標的化切断のための様々な方法および組成物が記載されている。そのような標的化切断事象は、例えば、標的化突然変異誘発を誘導するため、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導するために使用することができる；８，１１０，３７９；８，４０９，８６１；８，５８６，５２６；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０；２００５０２０８４８９；２００５００２６１５７；２００５００６４４７４；２００６００６３２３１；２０１０００２１８２６４；２０１２００１７２９０；２０１１０２６５１９８；２０１３０１３７１０４；２０１３０１２２５９１；２０１３０１７７９８３および２０１３０１７７９６０（これらの開示はそれらの全体が参照により組み込まれる）。
これらの方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などのエラーボーン過程による切断の修復または修復鋳型を使用する修復（相同性指向性修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）またはＨＤＲ）が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化された組込み）をもたらすことができるように、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するために、操作された切断系の使用をしばしば含む。切断は、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの特定のヌクレアーゼの使用、または特定の切断をガイドするために操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ」）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用によって発生し得る。
一部の実施形態では、ＴＩＬは、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子の発現を破壊または低減するように改変される（例えば、ＷＯ２０１４／１５３４７０を参照のこと）。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、ＰＤ１、ＰＤＬ－１もしくはＣＴＬＡ－４（例えば、米国特許出願公開第２０１４０１２０６２２号を参照のこと）、または当該技術分野で公知の他の免疫抑制因子（Ｗｕら（２０１５）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４（７）：ｅｌ０１６７００、Ｍａｈｏｎｅｙら（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １４、５６１～５８４）の破壊または阻害をもたらすように改変される。
患者特有のネオアンチゲン反応性の並行遺伝子移入のためのユニバーサルドナー細胞は、Ｔ細胞の任意の起源に由来し得る。一態様では、ユニバーサルドナーＴ細胞は、臍帯血Ｔ細胞から生成される。臍帯血Ｔ細胞の使用は、ナイーブな表現型、計り知れない増殖能力、および移植レシピエントにおける強力なｉｎ ｖｉｖｏ活性を有するため、本発明にとって有利である。したがって、ユニバーサルドナー細胞の産生は、臍帯血の試料を得ることから始めることができる。臍帯血の試料は、任意の種類の試料であってもよい。例えば、臍帯血の試料は、新鮮な臍帯血または凍結した臍帯血であってもよい。臍帯血の試料は、１人の個体に由来してもよい。臍帯血の試料は、複数の個体、例えば、プールされた臍帯血試料に由来してもよい。
臍帯血Ｔ細胞は、試料からＣＤ６２Ｌを発現する細胞を分離することにより、臍帯血試料から得ることができる。試料からＣＤ６２Ｌを発現する細胞を分離するために、任意の適切な方法を使用することができる。例えば、ＣＤ６２Ｌを発現する細胞は、抗ＣＤ６２Ｌ抗体に結合する能力に基づいて試料から分離することができる。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用して、試料からＣＤ６２Ｌを発現する細胞を分離することができる。ＭＡＣＳでは、磁気ビーズが抗ＣＤ６２Ｌ抗体にコンジュゲートされる。したがって、抗ＣＤ６２Ｌ抗体へのＣＤ６２Ｌ発現細胞の結合は、細胞を磁気ビーズでタグ付けする。したがって、磁気を使用してタグ付き細胞を試料から分離することができる。
分離ステップは手動で実施することができる。あるいは、分離ステップは、細胞の自動分離のために設計されたシステムで実施することができる。一態様では、システムは臍帯Ｔ細胞の自動生成のために構成される。システムは、ＣｌｉｎｉＭａｃｓシステムまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムであってもよい。他の自動細胞分離システムが当該技術分野で公知である。
ＴＩＬ投与
本明細書で提供される方法によるＴＩＬの投与は、注射、輸血、埋め込み、または移植を含むが、これらに限定されない、対象に細胞を投与するための任意の適切な方法で実施することができる。一部の実施形態では、ＴＩＬは、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、髄腔内、静脈内もしくはリンパ管内注射によって、または腹腔内により患者に投与される。一部の実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍組織の切除によって形成された腔に投与されるか（例えば、腔内送達）、または切除前に腫瘍に直接投与される（例えば、腫瘍内送達）。一実施形態では、ＴＩＬは静脈内注射によって投与される。
一実施形態では、本発明は、ＴＩＬの集団でがんを処置する方法であって、患者が、本発明によるＴＩＬの注入の前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される、方法を含む。一部の実施形態では、ＴＩＬの集団を提供することができ、患者が本発明によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。
一実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／ｄを２日間（ＴＩＬ注入の２７日および２６日前）およびフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／ｄを５日間（ＴＩＬ注入の２７日～２３日前）である。一実施形態では、本発明による骨髄非破壊的化学療法およびＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は、生理学的許容範囲まで、８時間ごとに７２０，０００ＩＵ／ｋｇにて静脈内でＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
実験結果は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞および免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）を排除することにより、処置有効性を増強するのに重要な役割を果たすことを示している。したがって、本発明の一部の実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に、患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称されることがある）を利用する。
がんを処置する方法
開示された組成物および方法によって処置されるがんは、ＴＩＬが産生され得るいずれかの固形腫瘍であり得る。がんはまた、転移性および／または再発性であり得る。がんの非限定的な例には、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または中耳のがん、外陰のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、子宮頸がん、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、腹膜、大網、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、軟部組織がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、膀胱がん、および消化管がん、例えば、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、消化管カルチノイド腫瘍、口腔がん、結腸直腸がん、ならびに肝胆道がんが含まれる。
全ての乳がんの約１５％を占めるトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子増幅を欠く非常に浸潤性の種類の腫瘍である。ＴＮＢＣは、タモキシフェンもしくはアロマターゼ阻害剤などのホルモン療法、またはハーセプチン（トラスツズマブ）などのＨＥＲ２受容体を標的とする療法には応答しない。ＴＮＢＣで利用できる標的は限られているため、現在、新しい標的を見つけ、それによってこの種類の乳がんを処置することができるパーソナライズされた医薬を見つけることに強い関心がある。したがって、一部の実施形態では、がんはトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である。
がんの併用療法
開示された組成物および方法は、他のがん免疫療法と組み合わせて使用することができる。２つの異なる種類の免疫療法が存在する：受動免疫療法は、必ずしも患者の免疫応答を開始することなく、がん細胞に対する標的とされた細胞傷害活性を指向するために免疫系の成分を使用するのに対して、能動免疫療法は、内因性免疫応答を能動的に誘発する。受動ストラテジーには、特定の抗原に応答してＢ細胞によって産生されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用が含まれる。１９７０年代のハイブリドーマ技術の開発および腫瘍特異的抗原の同定により、免疫系による破壊のための腫瘍細胞を特異的に標的とすることができるｍＡｂの医薬品開発が可能になった。これまでのところ、ｍＡｂは免疫療法についての最も成功したストーリであり、２０１２年に最も売れた抗がん薬物の上位３つはｍＡｂであった。それらの中には、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などのＢ細胞悪性腫瘍の表面上で高度に発現するＣＤ２０タンパク質に結合するリツキシマブ（リツキサン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）がある。リツキシマブは、化学療法と組み合わせたＮＨＬおよび慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の処置についてＦＤＡによって承認されている。別の重要なｍＡｂはトラスツズマブ（ハーセプチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）であり、ＨＥＲ２の発現を標的とすることによってＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）陽性乳がんの処置に革命をもたらした。
治療用がんワクチンは、抗腫瘍免疫応答を能動的に駆動するために開発されている。感染症を処置するために予防的に使用される予防ワクチンとは異なり、治療用ワクチンは、特定の腫瘍関連抗原に対する免疫応答を刺激することによって、確立されたがんを処置するように設計されている。２０１０年に、ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が、プラセボに対して、ＯＳを４．１ヶ月改善し、死亡リスクを２２％低下させた、ＩＭＰＡＣＴ（免疫療法前立腺腺癌処置（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）試験の結果に基づいて、転移性去勢抵抗性前立腺がんの処置のためにＦＤＡによって承認された。能動免疫療法の利点は、免疫応答の先天性および適応性アームの両方に関与することによって長期にわたる抗がん活性を提供する潜在性があることである。ｍＡｂは典型的に受動免疫療法とみなされるが、それらはまた、「ワクチン接種のような」効果により適応免疫応答も誘導するという証拠が増えている。
最適な「キラー」ＣＤ８ Ｔ細胞応答を生成するには、Ｔ細胞受容体の活性化と共刺激も必要であり、これは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む、腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーのライゲーションによって提供され得る。ＯＸ４０は、活性化（アゴニスト）抗ＯＸ４０ ｍＡｂによる処置が、Ｔ細胞分化および細胞溶解機能を増大し、様々な腫瘍に対する抗腫瘍免疫の増強につながるため、特に興味深いものである。
多数の抗がん薬物が、本方法および組成物と組み合わせるために利用可能である。以下は、照射と併せて、または照射を用いずに使用され得る抗がん（抗新生物）薬物の包括的ではないリストである：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；ＡｃｒＱｎｉｎｅ；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン（Ａｓｐｅｒｌｉｎ）；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシラート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー（Ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシラート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシラート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロミチン塩酸塩（Ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；エルサミトルシン（Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン（Ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）；エンプロマート（Ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；ヨード化ケシ油エチルエステルＩ １３１；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；金Ａｕ１９８；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコル；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド（Ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン（Ｏｘｉｓｕｒａｎ）；パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン（Ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ）；ログレチミド（Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴール（Ｓａｆｍｇｏｌ）；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；塩化ストロンチウムＳｒ８９；スロフェヌル；タリソマイシン（Ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）；タキサン；タキソイド；テコガランナトリウム（Ｔｅｃｏｇａｌａｎ Ｓｏｄｉｕｍ）；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トポテカン塩酸塩；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩（Ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン（Ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビングリシナート（Ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ Ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビンレウロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン（Ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビンゾリジン（Ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ）；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩。
開示された組成物および方法は、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができる。免疫チェックポイント阻害剤とは、チェックポイントシグナル伝達経路におけるタンパク質を阻害する化合物を意味する。チェックポイントシグナル伝達経路におけるタンパク質には、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｉｒ１、ＣＤ２４４、ＨＡＶＣＲ２、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ１、ＣＤ２００Ｒ２、ＣＤ２００Ｒ４、ＬＩＬＲＢ４、ＰＩＬＲＡ、ＩＣＯＳＬ、４－１ＢＢ、またはＶＩＳＴＡが含まれる。免疫チェックポイント阻害剤は、当該技術分野で公知である。
例えば、免疫チェックポイント阻害剤は小分子であってもよい。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、または他の有機分子もしくは無機分子であってもよい。
あるいは、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体またはその断片である。例えば、抗体またはその断片は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｉｒ１、ＣＤ２４４、ＨＡＶＣＲ２、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ１、ＣＤ２００Ｒ２、ＣＤ２００Ｒ４、ＬＩＬＲＢ４、ＰＩＬＲＡ、ＩＣＯＳＬ、４－１ＢＢまたはＶＩＳＴＡなどのチェックポイントシグナル伝達経路におけるタンパク質に特異的である。
抗免疫チェックポイント抗体の例としては、例えば、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｕｍａｂ）（抗ＣＴＬＡ－４）、ペンブロリズマブ（ｐｅｎｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＰＤ－Ｌ１）、ニボルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、およびデュルバルマブ（ｄｕｒａｌｕｍａｂ）（抗ＰＤ－Ｌ１）が含まれる。
本発明は、限定と解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。本出願を通じて引用された全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容、ならびに図面は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１．ネオアンチゲンインフォームドＴＩＬ療法の概要
ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）療法は、外科的に切除された腫瘍検体からＴＩＬを単離して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させてから、リンパ球枯渇前処置レジメン後に患者に再注入する、自己細胞免疫療法である。ＴＩＬ療法は、様々ながんに対して若干の印象的な応答を達成してきたが、その成功は散発的なままである。他方で、原則として、ＴＩＬ療法が広く適用可能な治療法であり得ると考える理由がある。第１に、腫瘍の大部分が、時に非常に低い頻度ではあるが、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞によって浸潤されていることが知られている。第２に、単一のネオアンチゲンに反応性のＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を含む高純度のＴＩＬ産物の増殖および注入が、腫瘍退縮を媒介するのに十分であることが示されている。
本発明者らは、新規ペプチド：ＭＨＣスクリーニング技術（すなわち、「ＰｅｐＳｅｑ」）または関連する方法論（例えば、リボソームディスプレイ）を適用して、ゲノム解析から、パーソナライズされた免疫原性ネオアンチゲンを予測し、次いでこれらのネオアンチゲンを使用して、最も強力な細胞についてＴＩＬ調製物を富化する、差別化されたネオＴＩＬアプローチ（図１および２）を開発した。パーソナライズされたネオＴＩＬ療法は、比較的短いタイムラインで行われ得る（図３および４を参照のこと）。
ＰｅｐＳｅｑプラットフォームは、ＤＮＡバーコード化ペプチドの大きなライブラリの効率的な合成および分析のための方法を提供する（図５を参照のこと）。ネオＴＩＬアプローチの一環として、本発明者らは、細胞産生物の抗腫瘍有効性のためのパーソナライズされたテストベッドを提供する腫瘍オルガノイドを成長させる方法も開発した。
このアプローチの手順の大部分は相互に関連している。本発明者らは、ＩＲＢの承認を受けており、この分野の臨床試験に対して様々な固形腫瘍患者を既に登録しており、これには、以下でさらに詳述されるＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定ならびにオルガノイドの単離、成長および試験に関連する本発明のアプローチのエレメントが含まれる。
実施例２．ヒト腫瘍からのネオアンチゲン特異的ＴＩＬの同定および増殖のための方法
以下の方法により、ヒト腫瘍からのネオアンチゲン特異的ＴＩＬの同定および単離が可能になる。様々な悪性腫瘍を有するヒト患者から新たに切除された腫瘍検体を、各々２つの試料に分割する。最初の試料を使用してＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、全エクソーム配列決定およびＲＮＡｓｅｑを可能にする。生殖細胞系列試料（例えば、血液または頬スワブ）と共に、これにより、体細胞バリアントの同定および関連タンパク質の発現の定量が可能になる。
配列決定データの分析に続いて、腫瘍のゲノム情報を使用して、候補突然変異およびそれらの野生型対応物を網羅する重複ペプチドのライブラリを設計する。これらのペプチドのＤＮＡコードライブラリは、例えば、ＰｅｐＳｅｑプラットフォームまたはファージディスプレイプラットフォームを使用して高度に並列化された形で合成され、一般的に発現されるヒトＭＨＣクラスＩＩタンパク質のパネルに対して並列でアッセイされる。並列して、ＭＨＣクラスＩ結合のインシリコモデルを適用して、候補ネオアンチゲンの第２のサブセットを同定する。得られたデータは、下流の注意のために推定クラスＩまたはＩＩ制限ネオアンチゲンのサブセットの優先順位付けを可能にする。
第２の腫瘍試料は、標準的な方法を使用して単一細胞に解離する。ＰｅｐＳｅｑもしくはファージディスプレイプラットフォームおよび／またはインシリコ予測アプローチによって同定された候補ネオアンチゲンを使用して、この試料からネオアンチゲン反応性Ｔ細胞を富化するための２つの並行アプローチが追求される。第１のアプローチでは、ネオアンチゲン反応性Ｔ細胞の選択的増殖は、解離した腫瘍試料を、サイトカインの存在下で最終候補の（すなわち、優先的な）ネオアンチゲン配列を表すペプチドと培養することによって達成される。代替として、最終候補の配列に対応する蛍光標識化ペプチド：ＭＨＣプローブ（およびおそらく細胞疲弊マーカーと組み合わせて）を使用して、蛍光活性化細胞選別によってネオアンチゲン反応性Ｔ細胞を単離する。いずれの場合も、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来の腫瘍オルガノイドの使用を場合により含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化アッセイを使用して、自己腫瘍細胞に対する細胞産生物の活性を測定する。
実施例３．ヒト腫瘍からのネオアンチゲン特異的ＴＩＬの同定および増殖のための代替方法
様々な悪性腫瘍を有するヒト患者から新たに切除された腫瘍検体を２つの試料に分割する。第１の試料を使用してＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、全エクソーム配列決定およびＲＮＡｓｅｑを可能にする。生殖細胞系列試料（血液または頬スワブ）と共に、これにより、体細胞バリアントの同定および関連タンパク質の発現の定量が可能になる。
配列決定データの分析に続いて、腫瘍のゲノム情報を使用して、候補突然変異およびそれらの野生型対応物を網羅する重複ペプチドのライブラリを設計する。これらのペプチドのＤＮＡコードライブラリは、ＰｅｐＳｅｑプラットフォームを使用して高度に並列して合成され、患者に特有のＭＨＣクラスＩＩ（ＤＲ、ＤＰ、およびＤＱ）に対して並列してアッセイされる。このプロセスにより、選択性および親和性による候補ネオアンチゲンペプチド：ＭＨＣの迅速で信頼性の高い同定が可能になる。結果として、ペプチド変更体細胞腫瘍バリアントの典型的に大きなカタログの中から、標的化されたネオアンチゲンの小さなセットが選択される。
第２の腫瘍試料は、標準的な方法を使用して単一細胞に解離し、処理してＴＩＬおよび腫瘍細胞を単離する。非特異的なｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞増殖の制限に対処するために、ＰｅｐＳｅｑによって同定された候補ネオアンチゲンペプチドの存在下でＴＩＬを継代培養する。このアプローチにより、所望の特異性の細胞の優先的な増殖が可能になる。
このアプローチは、患者由来の腫瘍オルガノイドに対して実施される免疫浸潤アッセイにおいて試験され得るネオアンチゲンペプチド特異的富化ＴＩＬ集団の生成を確実にする。Ｔ細胞が富化されると、単一細胞配列決定を使用して、Ｔ細胞ネオアンチゲン特異性を付与する対になった再配列されたＴＣＲαおよびβ遺伝子を同定することが可能になる。これは、Ｔ細胞富化の効率の追加の測定基準を提供することができ、また、患者特有のネオアンチゲン反応性をユニバーサルドナー細胞に付与して、内因性応答の疲弊した表現型を回避する潜在性を提供する並行遺伝子移入アプローチを可能にする。
明確にするために、リンパ球集団全体は、概して、ペプチドの混合物（すなわち、ネオアンチゲン）とのインキュベーションによる富化後に使用される。
アプローチの効率を試験するために、患者由来の腫瘍オルガノイドに対して免疫浸潤アッセイを実施する。簡潔に述べると、元の検体から単離された腫瘍細胞は、超低親和性（ＵＬＡ）プレートにおいて培養されて、３Ｄ構造（オルガノイド）を形成する。オルガノイドは、抗原の可能性を含む、元の組織の表現型の特徴を再現することが知られている。同じ患者に由来する腫瘍オルガノイドとのネオアンチゲンペプチド特異的ＴＩＬの共培養に続いて、オルガノイドへのＴＩＬ浸潤のレベルは、ｚスタッキングイメージングによって定量される。
ネオアンチゲンペプチド特異的ＴＩＬは、サイトカインの存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることができ、次いで、典型的に、リンパ球枯渇前処置レジメン後に患者に再注入することができる。
実施例４．ヒト患者およびマウスからのＴＩＬの採取
ネオＴＩＬ療法の有効性を試験するために、数人のヒト患者を臨床試験に登録した。患者は、肺がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、および結腸がんと診断されていた。さらに、結腸がんのＢＡＬＢ／ｃマウスモデルをＴＩＬの採取のために使用した。
各ヒト患者およびマウスから腫瘍生検を採取した。単離された腫瘍細胞（ＴＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、およびＴＩＬの数を、各ヒト患者について決定した（表１を参照のこと）。さらに、各ヒト患者および結腸がんのＢＡＬＢ／ｃマウスモデルについて、ＭＨＣ対立遺伝子および突然変異の数を同定した（表２を参照のこと）。
Figure 2023524032000002
Figure 2023524032000003
実施例５．ヒト試料を用いたエクソーム配列決定、ペプチドライブラリ設計、および結合アッセイ
腫瘍エクソームおよび正常細胞からのエクソームの全エクソーム配列決定を使用して、図６および図７に概説されているように、ＰｅｐＳｅｑライブラリを設計した。ＰｅｐＳｅｑライブラリにおけるペプチドは、配列が重複し、野生型残基（「Ｗ」）および突然変異残基（「Ｍ」）を含有した（図７を参照のこと）。
ヒト患者ＴＧ００００６およびＴＧ０００１３について、Ｄａｙら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００３；１１２（６）：８３１～８４２に概説されている方法を使用して、結合アッセイを図８に示すように実施した。結合アッセイにより、各患者に存在する特定のヒト白血球抗原血清型に対して高い親和性を有するペプチドを同定した（図９に示される各グラフの左上隅の大きなデータポイントを参照のこと）。ヒト患者ＴＧ０００１３についてのペプチドライブラリを使用した結合アッセイによる追加の分析を図１０に示す。
ＨＬＡ複合体に対して高い親和性を有するペプチドをコードする核酸を、ＰｅｐＳｅｑペプチド構築物を用いて単離した。これらの核酸を配列決定し、対応するアミノ酸配列をヒト患者ＴＧ０００１３について図１１に示す。
ＭＨＣ－ＰｅｐＳｅｑ結果とインシリコ予測との比較を使用して、図１２に示すように、ネオアンチゲンおよび／またはネオエピトープを同定および確認することができる。
実施例６．ヒト試料を用いた浸潤アッセイ
オルガノイドは、丸底超低親和性（ＵＬＡ）プレート内の腫瘍細胞懸濁液から形成され、透過性支持体が挿入され、富化されたＴＩＬが支持体（すなわち、トランズウェルインサート）を通って移動し、図１３および図１４Ａに示したようにオルガノイドに浸潤することができた。オルガノイドの三次元画像をＺスタッキングで生成し、オルガノイドへのリンパ球の浸潤の定量を、図１４Ｂおよび１４Ｃに示したように実施した。
富化されたＴＩＬを、数世代の細胞の移動または位置をモニタリングするのに適した赤色蛍光色素である、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣＥＬＬＴＲＡＣＫＥＲ（商標）ＣＭ－ＤｉＩで染色して、オルガノイドへのＴＩＬ浸潤の定量を容易にした。以下の処置をオルガノイドに施した：１）ＴＩＬ；２）ＴＩＬ＋ＩＬ－２；３）ＴＩＬ＋ＩＬ－２＋ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）；および４）ＴＩＬ＋ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）。オルガノイドへのＴＩＬ浸潤を、投与から６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および１２０時間後に定量した。
オルガノイドへのＴＩＬ浸潤は、ＴＩＬがＩＬ－２および／またはペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）に曝露されると有意に増加し、最大の浸潤は概して、ＴＩＬがＩＬ－２およびペプチドの両方に曝露されると生じた（図１５および１６を参照のこと）。
本発明者らは、同じ患者から得られた腫瘍対正常組織におけるネオアンチゲンペプチド特異的ＴＩＬ浸潤を比較した。重要なことに、ＩＬ－２で処置したＴＩＬは腫瘍および正常組織に能動的に浸潤するが、ネオアンチゲンペプチド特異的ＴＩＬは正常組織を認識できず、ネオＴＩＬアプローチによって保証される腫瘍選択性が確認される（図１７を参照のこと）。
実施例７．ＣＴ２６結腸癌マウスを用いたネオＴＩＬ分析および治療
ネオＴＩＬを用いてＣＴ２６結腸癌マウスを分析および処置するためのワークフローを図１８に概説する。エクソーム配列決定、ペプチドライブラリ設計、および結合アッセイを、ＣＴ２６結腸癌マウスを用いて実施例５に記載されるように実施した。
結合アッセイにより、ＣＴ２６結腸癌マウスに存在する特定のマウスＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ同種抗原に対して高い親和性を有するペプチドを同定した（図１９に示したグラフの上部のデータポイントを参照のこと）。
マウスＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ同種抗原に対して高い親和性を有するペプチドをコードする核酸を、ＰｅｐＳｅｑペプチド構築物を用いて単離した。これらの核酸を配列決定し、対応するアミノ酸配列を図２０に示す。
実施例８．ＣＴ２６結腸癌マウスを用いた浸潤アッセイおよび腫瘍成長アッセイ
ＣＴ２６結腸癌マウス腫瘍細胞に由来するオルガノイドを用いた浸潤アッセイを、実施例６に記載されるように実施した。１日目および７日目に、ＤＭＳＯ（すなわち、ペプチドビヒクル）、ＩＬ－２、ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）、またはＩＬ－２を伴うペプチドと共培養したＴＩＬの顕微鏡画像を図２１に示す。
このマウスモデルでは、異なる条件での腫瘍オルガノイドとのＴＩＬの共培養（すなわち、処置なしのＴＩＬ、ＴＩＬ＋ＩＬ－２、ＴＩＬ＋ペプチド、ＴＩＬ＋ＩＬ－２＋ペプチド）により、ペプチドおよびＩＬ－２の組合せとのＴＩＬのインキュベーションが、腫瘍オルガノイドにおいて最も高く、統計的に有意な浸潤レベルをもたらすことが示された（Ｐ＜０．０００１）（図２２および２３を参照のこと）。
異なるＴＩＬ処置の腫瘍内（「ＩＴ」）投与または静脈内（「ＩＶ」）投与後のＣＴ２６結腸癌マウスにおいて腫瘍体積を測定した。リンパ球枯渇またはＩＬ－２（ある特定の増殖したＴＩＬ集団に存在するもの以外）は、マウスでは使用しなかった。ＩＴ投与の場合、処置は、１）ＴＩＬ；２）ＴＩＬ＋ＩＬ－２；３）ＴＩＬ＋ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）；４）ＴＩＬ＋ＩＬ－２＋ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）；および５）ビヒクルを含んだ。ＩＶ投与の場合、処置は、１）ＴＩＬ＋ＩＬ－２；２）ＴＩＬ＋ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）；３）ＴＩＬ＋ＩＬ－２＋ペプチド（すなわち、ネオアンチゲン）；および４）ＴＩＬ＋ビヒクルを含んだ。
ＣＴ２６結腸癌マウスモデルを用いたこれらのｉｎ ｖｉｖｏ試験は、リンパ球枯渇コンディショニングがなくても、ネオアンチゲンペプチド特異的ＴＩＬが、腫瘍体積の約５０％の減少を促進することを示す（図２４および２５を参照のこと）。
実施例９．ＴＩＬをトレーニングするためのネオアンチゲンを同定するためのＰｅｐＳｅｑの使用
ＰｅｐＳｅｑを使用して推定クラスＩＩ ＭＨＣ結合因子としてペプチドを同定する。生の配列読み取りを、ＰｅｐＳｅｑライブラリのヌクレオチドコード参照配列と整列させて、各ＭＨＣ試料について生の読み取りカウントおよびペプチドごとの読み取りのマトリクスを生成する。ＰｅｐＳｅｑ結合スコア比を、対になった陰性対照（非切断ＭＨＣ）に対する各ペプチドの各ＭＨＣ ＩＩ試料についての正規化した結合シグナルの比を取ることによって計算する。一定に調整した比の閾値を結合スコアに適用して、ＴＩＬ＋ペプチド細胞培養実験に含めるためのペプチドを選択する。
クラスＩ ＭＨＣへの結合能を有するペプチドを選択するためにインシリコ予測を使用する。インシリコ予測は、ＰｅｐＳｅｑライブラリ全体にわたってタイル化された固有の９ｍｅｒに対して公開されているツールを使用して行う。ペプチドのランダムなセットに関して最小の予測されたＭＨＣ結合パーセンタイルランク（より低いランクはより強い結合に対応する）を有するペプチドを、ＴＩＬ＋ペプチド細胞培養物に含めるために選択する。予測は、患者のクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子（最大６つの対立遺伝子）の各々について生成される。
ペプチドのカスタムプールを、各患者についてのクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣカバレッジについて記載されているアプローチを使用して選択し、最終プールにおいて合計約２４個のペプチドについておよそ半分が最良のクラスＩＩ結合ペプチドから構成され、半分が最良のクラスＩ結合ペプチドから構成される。実験的要因により、クラスＩまたはクラスＩＩについてのプールの組成がわずかに変化する場合がある。
実施例１０．黒色腫、肺がん、結腸がん、および膵臓がんにおけるネオＴＩＬの有効性
腫瘍試料を、標準的な方法を使用して単一細胞に解離し、処理してＴＩＬを単離した。ＴＩＬを、ＰｅｐＳｅｑによって同定された候補ネオアンチゲンペプチドの存在下で継代培養した。このアプローチにより、所望の特異性の細胞の優先的な増殖が可能になる。ＴＩＬを、リンパ球およびＩＬ－２の存在下でマウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を投与することによって非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して急速に増殖させた。
オルガノイドは、丸底超低親和性（ＵＬＡ）プレート内の腫瘍細胞懸濁液から形成され、透過性支持体が挿入され、富化されたＴＩＬが支持体（トランズウェルインサート）を通って移動してオルガノイドに浸潤することができた。富化されたＴＩＬを、数世代の細胞の移動または位置をモニタリングするのに適した赤色蛍光色素である、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｙｂｒａｎｔ（商標）ＣＭ－Ｄｉｌで染色して、オルガノイドへのＴＩＬ浸潤の定量を容易にした。オルガノイドの三次元画像をＺスタッキングで生成し、オルガノイドへのリンパ球の浸潤を定量した（図２６Ａ、２６Ｂ、２７Ａ、２８Ａ、２８Ｂ、２９Ａ、３０Ａ、３１Ａ～３１Ｃ、および３２）。
以下の処置をオルガノイドに施した：１）未処置のＴＩＬ；２）ＴＩＬ＋ＩＬ－２（すなわち、従来のＴＩＬ）；および３）ＴＩＬ＋ペプチド（すなわち、ネオ－ＴＩＬ）。オルガノイドへのＴＩＬ浸潤を、投与から２４時間後に定量した。
黒色腫患者の腫瘍オルガノイドへのＴＩＬ浸潤は、未処置のＴＩＬと比較して、ペプチドに曝露されたＴＩＬ（すなわち、ネオ－ＴＩＬ）で有意に増加した（図２６Ａ、２７Ａを参照のこと）。重要なことに、従来のＴＩＬは腫瘍および正常組織に能動的に浸潤するが、ネオアンチゲンペプチド特異的ＴＩＬ（すなわち、ネオ－ＴＩＬ）は正常組織を認識できず、ネオ－ＴＩＬアプローチによって保証される腫瘍選択性が確認される（図２６Ｂを参照のこと）。
肺がん患者の腫瘍オルガノイドへのＴＩＬ浸潤は、未処置のＴＩＬと比較して、ペプチドに曝露されたＴＩＬ（すなわち、ネオ－ＴＩＬ）で有意に増加した（図２８Ａを参照のこと）。さらに、従来のＴＩＬは腫瘍および正常組織に能動的に浸潤するが、ネオアンチゲンペプチド特異的ＴＩＬ（すなわち、ネオ－ＴＩＬ）は腫瘍組織を選択的に認識した（図２８Ｂを参照のこと）。
さらに、結腸がん患者の腫瘍オルガノイドおよび膵臓がん患者の腫瘍オルガノイドへのＴＩＬ浸潤は、未処置のＴＩＬと比較して、ペプチドに曝露されたＴＩＬ（すなわち、ネオ－ＴＩＬ）で有意に増加した（図２９Ａおよび３０Ａを参照のこと）。
免疫浸潤の経時変化評価では、ネオ－ＴＩＬ浸潤は、従来のＴＩＬと比較して数日後も維持された（図３１Ａ～３１Ｃ）。浸潤能力を維持することに加えて、ネオ－ＴＩＬは３日間の経時変化にわたって元の患者由来の腫瘍組織を選択的に認識したが、従来のＴＩＬは他の患者由来の腫瘍組織を認識し、ネオ－ＴＩＬアプローチによって保証された腫瘍選択性を強調している（図３２を参照のこと）。ネオ－ＴＩＬの分類では、細胞の９５％がＣＤ４５陽性、９７％がＣＤ３Ｄ陽性、９８％がＣＤ３Ｅ陽性、８０％がＣＤ３Ｇ陽性であった（図３３）。
サイトカインの放出を測定するために、使用前にＴＩＬを洗浄して、急速増殖プロトコールで使用したＩＬ－２を除去した。洗浄後、ＴＩＬを自己またはＨＬＡミスマッチの腫瘍細胞と１：１の比で一晩培養した。各共培養物の上清を回収し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびグランザイムＢのレベルを、Ｍｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって測定した。ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢ、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴの遺伝子発現をｑＰＣＲによって測定した。
ネオ－ＴＩＬは、従来のＴＩＬおよび未処置のＴＩＬと比較して有意に増加したレベルのＩＦＮγ、ＴＮＦα、グランザイムＢ、およびパーフォリンによって実証されるように、黒色腫において活性化および細胞傷害特性の増強を示した（図２６Ｃ～２６Ｅおよび２７Ｂ～Ｇを参照のこと）。さらに、急速増殖後、ネオ－ＴＩＬは、より低いレベルの疲弊マーカーＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、およびＴＩＧＩＴを示した（図２７Ｈ～２７Ｋを参照のこと）。同様に、ネオ－ＴＩＬは、肺がん（図２８Ｃ～２８Ｇを参照のこと）、結腸がん（図２９Ｂ～２９Ｋを参照のこと）、および膵臓がん（図３０Ｂ～Ｊを参照のこと）において活性化および細胞傷害特性の増強ならびに疲弊マーカーの発現の減少を示した。
実施例１１．追加の材料および方法
後続のＴＩＬ分離のための単一細胞懸濁液への原発性ヒト腫瘍組織の解離
患者は臨床プロトコールに登録され、腫瘍切除前に治験審査委員会によって承認されたインフォームドコンセントに署名した。
Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈの腫瘍解離キット（＃１３０－０９５－９２９）およびＣＤ４５（ＴＩＬ）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ヒト（＃１３０－１１８－７８０）をそれぞれ使用して、腫瘍を解離し、ＣＤ４５＋ＴＩＬを単離する。簡潔に述べると、腫瘍試料から脂肪、線維、および壊死領域を除去する。次いで、腫瘍を２～４ｍｍの小片に切断する。組織片を、酵素ミックスを含有するｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブに移す（使用する酵素の量は、製造業者のプロトコールに述べられているように腫瘍のサイズに依存する）。適切なｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）プログラムを選択するｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーターを使用して組織を解離する。腫瘍の単一細胞懸濁液を得た後、細胞をＣＤ４５マイクロビーズとインキュベートし、ＣＤ４５＋細胞を製造業者のプロトコールに従って陽性選択によって単離する。ＣＤ４５＋細胞は、腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬとみなされ、さらに使用するまで８５％ヒト血清および１５％ＤＭＳＯを使用して凍結する。
ペプチドと培養したＴＩＬ
解凍および洗浄後、２５０万個（ＴＩＬの数が少ない場合、各条件において１００万個の細胞を使用できる）のＴＩＬを、２４ウェル平底ＴＣ処理プレートの各ウェル中の２ｍＬの完全なＲＰＭＩ＋１０％ＡＢ血清の存在下で３７℃で培養する。完全なＲＰＭＩ培地は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよびＬ－グルタミンを含み、重炭酸ナトリウムを含まず、細胞培養に適した液体の濾過滅菌した、改変されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、Ｒ７６３８－５００ｍｌ）、１０％ヒトＡＢ血清、１０，０００単位のペニシリン／ｍｌ、１０，０００ｕｇストレプトマイシン／ｍｌ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１倍の非必須アミノ酸、５ｕＭの２－メルカプトエタノールを含有する。次いで、２ｍｌの完全なＴＩＬ培地中のＴＩＬを含有するウェル当たり０．６２５ｕｌの各ペプチドを添加する（ペプチドストック濃度はＤＭＳＯ中で４ｍｇ／ｍｌである）。翌日、１ｍＬの上清を各ウェルから取り出し、次いで、各ウェルに対して新鮮なＩＬ－２含有培地（１００Ｕ／ｍｌ）（ＩＬ－２ウェル中）またはＴＩＬ培地のみ（ペプチドウェル中）と置き換える。３日ごとに、多くの成長が観察されるか、または培地の半分が新鮮な培地と交換されると、細胞を継代する。８日目に、１０回のピペッティングにより細胞を取り出し、次いでウェルを１ｍｌの２ｍＭのＥＤＴＡ－ｄＰＢＳ溶液で洗浄した。最後に、細胞を洗浄し、ＴＩＬ培地に溶解し、血球計を使用して計数する。
急速増殖プロトコール
Ｔ細胞は、フィーダーリンパ球およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して急速に増殖させることができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体である、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３を使用して誘導することができる。簡潔に述べると、ＴＩＬ（ペプチドと培養した）を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより洗浄し、ＴＩＬ ＣＭ中に再懸濁し、計数し、生存細胞を以下の表３に示した割合で他の成分に添加する：
Figure 2023524032000004
ＲＥＰを開始してから５日後（５日目）に、培地の半分を各フラスコから吸引する（細胞はフラスコの底に保持される）。培地を、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有するＴＩＬ ＣＭ／ＡＩＭ－Ｖ ５０／５０と置き換える。次いで、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有するＴＩＬ ＣＭ／ＡＩＭ－Ｖ ５０／５０と２／３日ごとに培地を交換する。培養は２週間続ける。２週間後、細胞を計数し、８５％ヒト血清（１５％ＤＭＳＯ含有）凍結培地で凍結する。
ＴＩＬ有効性研究
オルガノイドの生成：腫瘍細胞を、１．５％の増殖因子低減マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３５４２３０）を含有する４０μＬの適切な培地中で、９６ウェルの超低付着スフェロイドマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号４５９１）にウェル当たり５０００個の細胞で播種する。次いで、プレートを室温で２分間、２０００ｒｐｍで遠心分離した。免疫浸潤アッセイで使用するためのスフェロイドを生成するために、加湿インキュベーター内で５％ＣＯ２で細胞を少なくとも７２時間培養した。
ＴＩＬ浸潤およびイメージング：適切な数のＴＩＬ（通常、各オルガノイドに２×１０５個のＴＩＬを添加する）を急速に増殖させた後、計数し、室温で１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。次いでペレットを２ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍ培地に溶解する。この細胞懸濁液では、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＭ－Ｄｉｌ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒの２μＭ溶液；カタログ番号Ｃ７０００）を添加し、それを、暗所で３７℃で４５分間、その後４℃でさらに１５分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、必要量のＴＩＬ完全培地中に再懸濁した。次に、腫瘍オルガノイドを含有する各ウェルに１６０ｕＬのＴＩＬ培地を添加する。次いで、５μｍのＨＴＳトランズウェル９６ウェルパーミアブルサポートレシーバープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３３８７）を超低付着スフェロイドマイクロプレート上に配置して、オルガノイドへのＴＩＬ浸潤を可能にする。次いで、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＭ－Ｄｉｌで染色したＴＩＬを、２×１０５個の細胞／ウェルまたは１：５のチューモロイド：ＴＩＬ比でインサートに播種する。２４時間後、インサートを取り除き、オルガノイドマイクロプレートを３Ｄ Ｚスタックイメージングによって分析し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ソフトウェアを用いて形態計測分析を行って、ＴＩＬ浸潤を定量する。
サイトカイン放出アッセイ：１×１０５個のＴＩＬを使用前に洗浄してＩＬ－２を除去し、次いで自己またはＨＬＡミスマッチの腫瘍細胞（存在する場合）と１：１の比で一晩培養する。次いで、各共培養物からの上清を、製造業者の使用説明書に従って、ＭＳＤプレートによって、ＩＦＮ－Ｙ、グランザイムＢ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－ａについてアッセイする。
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Claims (42)

  1. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、養子細胞免疫療法用のＴＩＬの治療用集団に増殖させる方法であって、
    （ａ）ＴＩＬの第１の集団を、患者から切除された腫瘍から得られた腫瘍細胞から分離する工程と；
    （ｂ）腫瘍細胞内の複数の患者特有の腫瘍突然変異を、患者由来の腫瘍ＤＮＡおよび／またはＲＮＡならびに正常ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのゲノム分析により検出する工程と；
    （ｃ）ＴＩＬの第１の集団由来のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質またはその断片との特異的結合を示す、体細胞突然変異に由来するネオアンチゲンを同定する工程と；
    （ｄ）ネオアンチゲンを、ＴＩＬの第１の集団とインキュベートして、ネオアンチゲンを認識するリンパ球が富化されたＴＩＬの第２の集団を生成する工程と；
    （ｅ）ＴＩＬの第２の集団を、養子細胞免疫療法用のＴＩＬの治療用集団に増殖させる工程と
    を含む方法。
  2. 複数の患者特有の腫瘍突然変異を検出する工程が、標的遺伝子パネルの次世代配列決定によるゲノムプロファイリングを含む、請求項１に記載の方法。
  3. ゲノムプロファイリングが、全ゲノムプロファイリング、全エクソームプロファイリング、および／またはトランスクリプトームプロファイリングを含む、請求項２に記載の方法。
  4. ゲノム分析が、発現される遺伝子内の複数の患者特有の腫瘍突然変異を、患者由来の腫瘍試料および正常試料の核酸配列決定によって同定する工程を含み、突然変異が、患者のがん細胞のゲノム内に存在するが、対象由来の正常細胞内に存在しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 複数の患者特有の腫瘍突然変異が、点突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異、リードスルー突然変異、遺伝子融合突然変異、挿入、欠失、またはそれらの組合せを含み；
    複数の患者特有の腫瘍突然変異が、野生型ポリペプチドよりも大きい親和性でＨＬＡタンパク質またはその断片に結合する腫瘍特異的ネオエピトープを有する少なくとも１つの突然変異ポリペプチドをコードする、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 患者のＭＨＣクラス１および２遺伝子型を同定する工程をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 患者のＭＨＣクラス１および２遺伝子型を同定する工程が、腫瘍および／または正常組織からの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）および／またはＲＮＡ配列決定の分析を含む、請求項６に記載の方法。
  8. ネオアンチゲンを同定する工程が、
    （ｉ）ペプチド構築物のライブラリを提供する工程であって、
    ライブラリの各ペプチド構築物が、ペプチド部分、およびペプチド部分を同定する同定核酸部分を含み、
    ペプチド構築物のうちの少なくとも１つのペプチド部分が、ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できる、工程と；
    （ｉｉ）ＨＬＡタンパク質またはその断片を、ペプチド構築物のライブラリと接触させる工程と；
    （ｉｉｉ）ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できるペプチド部分を含む少なくとも１つのペプチド構築物を、ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できないペプチド部分を含むペプチド構築物から分離する工程と；
    （ｉｖ）ＨＬＡタンパク質またはその断片に特異的に結合できる少なくとも１つのペプチド構築物の同定核酸部分の全てまたは一部を配列決定する工程と
    を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ペプチド構築物のライブラリが、対応するタンパク質に及ぼす各突然変異の影響を予測し、サイレント突然変異および非コード領域内の突然変異を除外する、複数の患者特有の腫瘍突然変異の分析から設計されるバリアントペプチドを含む、請求項８に記載の方法。
  10. バリアントペプチドが、対応するタンパク質の構造に影響を与えると予測される突然変異を含む、請求項９に記載の方法。
  11. ネオアンチゲンを同定する工程が、
    （ｉ）ポリペプチドの遺伝的にコードされるコンビナトリアルライブラリを、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、バイシストロン性ＤＮＡディスプレイ、Ｐ２Ａ ＤＮＡディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、酵母ディスプレイ、または細菌ディスプレイにより生成する工程であって、コンビナトリアルライブラリが、ポリペプチドをコードする対応する核酸分子に連結されたポリペプチドを含む、工程と；
    （ｉｉ）コンビナトリアルライブラリを、ＨＬＡタンパク質またはその断片と接触させる工程と；
    （ｉｉｉ）コンビナトリアルライブラリとの特異的結合を示すＨＬＡタンパク質またはその断片を分離する工程と；
    （ｉｖ）ＨＬＡタンパク質またはその断片に結合したコンビナトリアルライブラリの核酸分子の全てまたは一部を配列決定して、ネオアンチゲンを同定する工程と
    を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  12. ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリが、対応するタンパク質に及ぼす各突然変異の影響を予測し、サイレント突然変異および非コード領域内の突然変異を除外する、複数の患者特有の腫瘍突然変異の分析から設計されるバリアントペプチドを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. バリアントペプチドが、対応するタンパク質の構造に影響を与えることが予測される突然変異を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. ネオアンチゲンと、ＴＩＬの第１の集団由来のＨＬＡタンパク質またはその断片との間の特異的結合が、
    （ｉ）
    ＭＨＣクラスＩＩα鎖の少なくとも一部およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖の少なくとも一部を、ＭＨＣクラスＩＩα鎖およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖がペプチド結合グルーブを形成するように含むＭＨＣクラスＩＩ構成要素；ならびに
    スペースホルダー分子および第１のプロセシング可能リンカー
    をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子により形質転換した細胞を培養する工程であって、スペースホルダー分子が、プロセシング可能リンカーによってＭＨＣクラスＩＩ構成要素に連結され、スペースホルダー分子がペプチド結合グルーブ内で結合することによって、ペプチド結合グルーブ内の他のあらゆるペプチドの結合を妨害し；培養する工程が、ＭＨＣクラスＩＩ構成要素を生成するように行われる、工程と；
    （ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ構成要素を回収する工程と；
    （ｉｉｉ）プロセシング可能リンカーをプロセシングすることによって、スペースホルダー分子をペプチド結合グルーブから放出する工程と；
    （ｉｖ）ＭＨＣクラスＩＩ構成要素をネオアンチゲンの存在下でインキュベートする工程であって、インキュベーションが、ペプチド結合グルーブへのネオアンチゲンの結合を促進する工程と；
    （ｖ）ネオアンチゲンに結合したＭＨＣクラスＩＩ構成要素を回収する工程と
    によって判定される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. スペースホルダー分子が、コンセンサス配列ＡＡＸＡＡＡＡＡＡＡＸＡＡ（配列番号７８）を有する、請求項１４に記載の方法。
  16. スペースホルダー分子が、ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号７３）；ＡＡＭＡＡＡＡＡＡＡＭＡＡ（配列番号７４）；ＡＡＭＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７５）；ＡＡＦＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７６）；およびＡＳＭＳＡＡＳＡＡＳＭＡＡ（配列番号７７）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. プロセシング可能リンカーが、ＭＨＣクラスＩＩ構成要素のＭＨＣクラスＩＩα鎖に連結されている、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ネオアンチゲンが結合したＭＨＣクラスＩＩ構成要素を回収する工程が、ＭＨＣクラスＩＩ構成要素を認識する抗体によるアフィニティクロマトグラフィーを含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ネオアンチゲンと、ＴＩＬの第１の集団由来のＨＬＡタンパク質またはその断片との間の特異的結合が、ファージディスプレイによって判定され、ＨＬＡタンパク質またはその断片が、ファージの表面上で発現され、そしてネオアンチゲンをファージとインキュベートして、特異的結合をアッセイする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  20. ネオアンチゲンと、ＭＨＣクラスＩタンパク質またはその断片との間の特異的結合を判定するインシリコ分析をさらに含み、インシリコ分析が、ネオアンチゲンのペプチド配列に基づいて、ＭＨＣ Ｉタンパク質への相対結合を予測する計算アルゴリズムを使用する工程を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、およびそれらの組合せからなる群から選択されるマーカーを発現するＴＩＬを、ＴＩＬの第１の集団および／またはＴＩＬの第２の集団から、セルソーティングを介して除去して、集団内の非疲弊ＴＩＬを富化する工程をさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ネオアンチゲンをＴＩＬの第１の集団とインキュベートする工程が、ＴＩＬの第１の集団を、少なくとも１つのサイトカインと接触させる工程をさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. ＴＩＬの第２の集団をＴＩＬの治療用集団に増殖させる工程が、ＴＩＬの第２の集団の、患者のリンパ節領域中への注射、患者の胸腺中への注射、および／または静脈内投与を介した患者への全身注射を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. ＴＩＬの第２の集団をＴＩＬの治療用集団に増殖させる工程が、ＴＩＬの第２の集団の細胞培養培地に、ＩＬ－２、場合によってはＯＫＴ－３、およびフィーダー細胞を補充する工程を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ＴＩＬの第２の集団をＴＩＬの治療用集団に増殖させる工程が、
    （ｉ）ＩＬ－２、および場合によってはＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団を培養することによって第１の増殖を実行して、ＴＩＬの第３の集団を生成する工程であって、第１の増殖が、第１の気体透過性の表面領域を提供する閉じたコンテナ内で実行され、第１の増殖が、約３～１４日間実行されて、ＴＩＬの第３の集団が得られ、ＴＩＬの第３の集団が、ＴＩＬの第２の集団よりも、数で少なくとも５０倍大きく、移行が、系の開放なしに起こる、工程と；場合によっては、
    （ｉｉ）ＴＩＬの第３の集団の細胞培養培地に、追加のＩＬ－２、場合によってはＯＫＴ－３、およびフィーダー細胞を補充することによって第２の増殖を実行して、ＴＩＬの第４の集団を生成する工程であって、第２の増殖が、約７～１４日間実行されて、ＴＩＬの第４の集団が得られ、ＴＩＬの第４の集団が、ＴＩＬの治療用集団であり、第３の増殖が、第２の気体透過性の表面領域を提供する閉じたコンテナ内で実行され、移行が、系の開放なしに起こる、工程と
    を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. フィーダー細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または照射を受けた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 患者由来の腫瘍細胞に由来するオルガノイドによる免疫浸潤アッセイを実行して、ＴＩＬの第１の集団と比較した、ＴＩＬの第２の集団によるオルガノイドの浸潤の増強を確認する工程をさらに含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 請求項１～２８のいずれか一項に規定されるＴＩＬの治療用集団、ＤＭＳＯを含む凍結防止媒体、および電解質溶液を含む低温保存組成物。
  30. １つまたは複数のスタビライザー、および１つまたは複数のリンパ球増殖因子をさらに含む、請求項２９に記載の低温保存組成物。
  31. １つまたは複数のスタビライザーはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、１つまたは複数のリンパ球増殖因子はＩＬ－２を含む、請求項３０に記載の低温保存組成物。
  32. がんを有する対象を処置する方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に規定されるＴＩＬの治療用集団の有効量を、処置を必要とする患者に投与する工程を含む方法。
  33. ＴＩＬの治療用集団の有効量を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に施される、請求項３２に記載の方法。
  34. 骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、２日間の６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でのシクロホスファミドの投与、およびそれに続く、５日間の２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でのフルダラビンの投与の工程を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. ＴＩＬの治療用集団の投与の次の日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンにより患者を処置する工程をさらに含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 高用量ＩＬ－２レジメンが、許容限界量まで８時間毎に１５分のボーラス静注として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. ＴＩＬの治療用集団を免疫チェックポイントインヒビタと接触させるか、または患者に免疫チェックポイントインヒビタを投与する工程をさらに含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. チェックポイントインヒビタが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－２、４－１ＢＢ、もしくはＶＩＳＴＡインヒビタ、またはそれらの組合せを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. チェックポイントインヒビタが、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）、ペムブロリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、ニボルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、デュルバルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、またはそれらの組合せを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. がんが、黒色腫、卵巣がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺がん、膀胱がん、乳がん、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるがん、頭頚部がん（頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）が挙げられる）、腎臓がん、および腎細胞癌からなる群から選択される、請求項３２～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. がんが、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸がん、ＮＳＣＬＣ、およびトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）からなる群から選択される、請求項３２～３９のいずれか一項に記載の方法。
  42. ＴＩＬの治療用集団が、静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、または腫瘍内に投与される、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の方法。
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