JP2023524093A

JP2023524093A - Ｒｎａ合成のための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2023524093A
Application number: JP2022566479A
Authority: JP
Inventors: ニクヒルダール，; ニコライエロシェンコ，; ハンヌラジャニエミ，
Original assignee: ヘリックスナノテクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-05-01
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2023-06-08
Also published as: WO2021222856A1; US20210363559A1; EP4143312A1; EP4143312A4; CA3180322A1; KR20230034208A; CN115667509A

Abstract

ＲＮＡ産物を合成するための組成物及び方法が本明細書に提供される。例えば、本公開は、ＲＮＡ産物を産生する方法を提供し、この方法は、インビトロ転写混合物をインキュベートすることを含み、それによって、複数の一本鎖ＲＮＡ分子を含むＲＮＡ産物を産生する。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物は、標的配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むＤＮＡテンプレートと、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を認識する少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼと、少なくとも２つの異なるタイプのリボヌクレオチドを含む複数のリボヌクレオチド（各タイプが異なるヌクレオシドを含む）と、オスモライトを含む転写緩衝液と、を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１日出願の米国仮出願第６３／０１９，１５８号の利益を主張し、その内容はその全体が本明細書に組み込まれる。

ｍＲＮＡ療法を含むＲＮＡ療法は、臨床現場で注目が高まっている。したがって、安全で効果的なＲＮＡ療法を開発及び／または合成する方法が必要である。

本開示は、高収率インビトロ転写のための組成物及び方法を提供する。とりわけ、本開示は、１つまたは複数のオスモライトが、高温でのインビトロ転写（例えば、インビトロＲＮＡ転写）を促進する手段として、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、野生型バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ）と共に使用され得るという洞察を提供し、該ＲＮＡポリメラーゼは、通常はオスモライトの非存在下ではそのような高温では機能しない。本開示はさらに、本明細書に記載の技術（例えば、ＲＮＡ転写を、野生型ＲＮＡポリメラーゼを用いて１つまたは複数のオスモライト（例えば、本明細書に記載のもの）の存在下で、高温（例えば、野生型ＲＮＡポリメラーゼが通常係る１つまたは複数のオスモライトの非存在下では機能しない温度）で行う）が、免疫原性及び／または細胞毒性を低減したＲＮＡを産生し得ることを提供する。このような特性は、例えば、ＲＮＡ産物の治療効力を増加させることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、合成されたＲＮＡ産物のより高い純度が、コードされたタンパク質のより高い効率の翻訳を可能にするため、ｍＲＮＡの生産に特に有用であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、ＲＮＡ産物を産生するために使用することができ、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡであり得るか、またはｍＲＮＡを含み得る。ＲＮＡ産物の例には、例えば、阻害性ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子療法及びワクチンが挙げられる。

とりわけ、本開示は、ＲＮＡ産物を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロ転写混合物をインキュベートする工程を含み、それによって、複数の一本鎖ＲＮＡ分子を含むＲＮＡ産物を産生する。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物は、標的配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むＤＮＡテンプレートと、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を認識する少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼと、少なくとも２つの異なるタイプのリボヌクレオチドを含む複数のリボヌクレオチド（各タイプが異なるヌクレオシドを含む）と、オスモライトを含む転写緩衝液と、を含む。

いくつかの実施形態では、オスモライトは、アミノ酸ベースのオスモライト、メチルアミンオスモライト、炭水化物オスモライト、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、メチルアミンオスモライトは、グリセロホスホリルコリントリメチルアミンＮ－オキシド、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、炭水化物オスモライトは、ソルビトール、グリセロール、ミオニシトール、ジグリセロールホスフェート、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、アミノ酸ベースのオスモライトは、プロリンベースのオスモライト、グリシンベースのオスモライト、エクトインベースのオスモライト、アラニンベースのオスモライト、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、アラニンベースのオスモライトは、ベータアラニンであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸ベースのオスモライトは、グリシンベースのオスモライトであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、グリシンベースのオスモライトは、ベタインであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、ベタインは、インビトロ転写混合物中に、少なくとも０．２５Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．７５Ｍ、少なくとも１Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２Ｍ、または少なくとも２．５Ｍの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ベタインは、インビトロ転写混合物中に、最大１５Ｍ、最大１０Ｍ、少なくとも５Ｍ、または少なくとも２．５Ｍの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ベタインは、インビトロ転写混合物中に、約０．５Ｍ～約１０Ｍ、または約２Ｍ～約５Ｍの濃度で存在する。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ４ビリオンＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらの変異体である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、インキュベートする工程は、少なくとも３７℃の温度で行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、インキュベートする工程は、約４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、またはそれより高い温度で行われる。

いくつかの実施形態では、複数の一本鎖ＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、複数の一本鎖ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の標的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子であるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、５’キャップを含む。

いくつかの実施形態では、複数の一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれが修飾ヌクレオシドを含む、１つまたは複数のリボヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物よりも免疫刺激性が低い。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物のものよりも低い二本鎖ＲＮＡのレベルを有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＲＮＡ産物から任意の二本鎖ＲＮＡを除去する工程を含まない。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物中のものよりも、より高い一本鎖ＲＮＡ分子の量を有する。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡ分子の量は、ＲＮＡ産物中の一本鎖ＲＮＡ分子の百分率である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、インキュベートする工程の後にインビトロ転写混合物からＤＮＡを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去することは、インキュベートする工程の後にインビトロ転写混合物にＤＮａｓｅを加えることを含む。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、固体基質上に固定化される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡを除去することは、インビトロ転写混合物から固体基質を分離することを含む。いくつかの実施形態では、固体基質はビーズである。

いくつかの実施形態では、複数の一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、少なくとも１００ヌクレオチド以上の長さ、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、またはそれより長い長さを有する。いくつかの実施形態では、複数の一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、２００，０００ヌクレオチド以下、１５０，０００ヌクレオチド以下、１００，０００ヌクレオチド以下、または５０，０００ヌクレオチド以下の長さを有する。

いくつかの実施形態では、インキュベートする工程は、標的配列が一本鎖ＲＮＡ分子に転写されるのに十分な時間にわたって行われる。

いくつかの実施形態では、インキュベートする工程は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、またはそれより長時間にわたって行われる。

本開示は、１つまたは複数の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）を、本明細書に記載される方法によって産生されるＲＮＡ産物を含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物よりも免疫刺激性が低い。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）が、細胞培養物中に存在する。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、インビトロ細胞培養物である。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、エクスビボ細胞培養物である。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）が、対象に存在する。いくつかの実施形態では、接触工程は、組成物を対象に投与することを含む。

一部の実施形態では、組成物は、薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような方法は、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物における一本鎖ＲＮＡ分子（複数可）からの発現レベルと比較して、一本鎖ＲＮＡ分子（複数可）からの発現レベルを増加させる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような方法は、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物との接触後の１つまたは複数の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）の生存率と比較して、ＲＮＡ産物との接触後の１つまたは複数の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）の生存率を増加させる。

本開示はまた、インビトロ転写混合物を提供する。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物は、標的配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むＤＮＡテンプレートを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を認識する野生型バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物は、少なくとも２つの異なるタイプのリボヌクレオチドを含む複数のリボヌクレオチドを含み、各タイプは異なるヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物は、アミノ酸ベースのオスモライト、メチルアミンオスモライト、炭水化物オスモライト、またはそれらの組み合わせを含むオスモライトを含む、転写緩衝液を含む。

いくつかの実施形態では、メチルアミンオスモライトは、グリセロホスホリルコリン、トリメチルアミンＮ－オキシド、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、アミノ酸ベースのオスモライトは、プロリンベースのオスモライト、グリシンベースのオスモライト、エクトインベースのオスモライト、アラニンベースのオスモライト、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アラニンベースのオスモライトは、ベータアラニンであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸ベースのオスモライトは、グリシンベースのオスモライトであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、グリシンベースのオスモライトは、ベタインであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、野生型バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであるか、またはそれを含む。

本開示は、ＲＮＡ産物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、本明細書に記載される方法によって産生される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、ガイドＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ産物は、１つまたは複数の標的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、５’キャップを含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、それぞれが修飾ヌクレオシドを含む１つまたは複数のリボヌクレオチドを含む、複数の一本鎖ＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物のものよりも二本鎖ＲＮＡのレベルが低い。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物のものよりも、より大きい一本鎖ＲＮＡ分子の量を有する。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡ分子の量は、ＲＮＡ産物中の一本鎖ＲＮＡ分子の百分率である。

一部の実施形態では、本組成物は、薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

３７℃、４５℃及び５０℃における、ベタイン含有、非含有の、本明細書に記載される例示的なＴ７合成調製物からの二本鎖ＤＮＡの収率を示す折れ線グラフを含む。

異なる転写法を用いて合成されたＲＮＡ分子によるトランスフェクション後のＡ５４９細胞の生存率を示す棒グラフを含み、本明細書に記載される例示的な方法を含む。

異なる転写法を用いて合成されたＲＮＡ分子によるＮＦ－ｋＢレポーターの活性化を示す棒グラフを含み、本明細書に記載される例示的な方法を含む。

異なる転写法を用いて合成されたＦＬｕｃｍＲＮＡでトランスフェクションされたＡ５４９細胞中のルシフェラーゼシグナルを示す棒グラフを含み、本明細書に記載される例示的な方法を含む。

特定の定義
本出願では、特に文脈から明らかではない限り、（ｉ）用語「ａ」は、「少なくとも１つ」を意味すると解されてもよく、（ｉｉ）用語「または」は、「及び／または」を意味すると解されてもよく、（ｉｉｉ）用語「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、項目分けした構成要素または工程が、それら自体で提示されるか、１つまたは複数の追加の構成要素または工程と共に提示されるかにかかわらず、それらを包含すると解されてもよく、（ｉｖ）範囲が指定されている場合は、両端点も含まれる。

約またはおおよそ：「約」及び「おおよそ」という用語は、本明細書において値に関連して使用される場合、文脈において参照値に類似するような値を意味する。一般に、文脈に精通している当業者は、その文脈における「約」または「おおよそ」によって包含される関連する差異の度合いを十分に理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、「約」または「おおよそ」という用語は、参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれより少ない範囲内にある値の範囲を包含し得る。

投与：本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、典型的には、組成物を、細胞、組織、対象または系に投与して、例えば、その組成物である、またはその組成物に含まれている、さもなければその組成物によって送達される、産物の送達を達成することを意味する。当業者は、適切な状況において、対象、例えば、哺乳類、例えばヒトへの投与のために利用され得る種々の経路を知っているであろう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、眼内、経口、非経口、局所などであり得る。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支滴注による）、頬側、経皮的（例えば、皮膚局所、皮内、皮間（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、経皮などのうちの１つまたは複数であるか、またはそれを含み得る）、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、くも膜下腔内、静脈内、心室内、特定臓器内（例えば、肝臓内）、粘膜、経鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内滴注による）、経膣、硝子体などであり得る。いくつかの実施形態では、投与は、単回用量のみを含んでもよい。いくつかの実施形態では、投与は、一定数の用量の適用を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、間欠的な（例えば、時間的な隔たりがある複数の用量の）投薬及び／または定期的な（例えば、一般的な期間を隔てた個々の用量の）投薬を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる持続投薬（例えば、灌流）を含み得る。

比較可能：本明細書で使用される場合、「比較可能」という用語は、２つ以上の薬剤、物質、状況、条件のセットなどであって、互いに同一でなくてもよいが、観察される差または類似性に基づいて結論が合理的に導かれ得ることを当業者が理解できるように、それらの間の比較を可能にするほど十分に類似する、当該２つ以上の薬剤、物質、状況、条件のセットなどを指す。いくつかの実施形態では、比較可能な条件、状況、個体、または集団のセットは、複数の実質的に同一の特徴及び１つまたは少数の変化する特徴によって特徴づけられる。当業者は、文脈において任意の所与の状況で、２つ以上のかかる薬剤、物質、状況、条件のセットなどが比較可能とみなされるために、どの程度の同一性が必要とされるかを理解するであろう。例えば、当業者は、状況、個体、または集団のセットは、異なる状況、個体、または集団のセットの下で、またはそれらを用いて得られた結果または観察された現象の差が、様々なそれらの特徴の差異により引き起こされるか、または様々なそれらの特徴の差異の存在を示すという合理的な結論を保証するための十分な数及び種類の実質的に同一の特徴によって特徴づけられる場合に、互いに比較可能であることを理解するであろう。

発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」という用語は、核酸配列からの任意の遺伝子産物の生成を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、転写産物であり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列の発現は、以下のうちの１つまたは複数を含む：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集等による）；（３）ＲＮＡからポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳；及び／または（４）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾。

宿主細胞：本明細書で使用される場合、外因性ＤＮＡ（組換え体またはその他）が導入された細胞を指す。本開示を読む当業者は、そのような用語が特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指していることを理解するであろう。突然変異または環境的影響のいずれかに起因して、後続の世代においてある特定の修飾が起こる場合があるため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、外因性ＤＮＡ（例えば、組換え核酸配列）を発現するのに適した生命の王国のいずれかから選択される原核生物及び真核生物細胞を含む。例示的な細胞としては、原核生物及び真核生物（単一細胞又は複数細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．等）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ等）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、トリコプルシアニ等）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合物、例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマなどのものが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核生物であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯＫｌ、ＤＸＢ－１１ＣＨＯ－、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、ベロ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む。

「向上する」、「増大する」、「抑制する」または「低減する」：本明細書で使用される場合、「向上する」、「増大する」、「抑制する」、「低減する」という用語、またはそれらの文法的均等物は、ベースラインまたは他の参照測定値に対して相対的な値を示す。いくつかの実施形態では、適切な参照測定値は、特定の作用物質もしくは治療が存在しない（例えば、その前及び／または後の）さもなければ比較可能な条件下での、または適切な比較可能な参照作用物質の存在下での、特定の系における（例えば、一個人における）測定値であるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、適切な参照測定値は、関連性のある作用物質または治療の存在下での、特定の様式で応答することが既知であるまたは予想される比較可能な系における測定値であるか、またはそれを含み得る。

核酸／オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、少なくとも３ヌクレオチド以上のポリマーを指す。いくつかの実施形態において、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、一本鎖部分及び二本鎖部分の両方を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたは複数のホスホジエステル結合を含む骨格を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合及び非ホスホジエステル結合の両方を含む骨格を含む。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、１つもしくは複数のホスホロチオエート、あるいは「ペプチド核酸」のように、５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合及び／または１つもしくは複数のペプチド結合を含む骨格を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、１つもしくは複数の、または全ての、天然残基（例えば、アデニン、シトシン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、グアニン、チミン、ウラシル）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つもしくは複数の、または全ての、非天然残基を含む。いくつかの実施形態では、非天然残基は、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニルシチジン、Ｃ－５プロピニルウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、６－Ｏ－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、及びこれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態では、非天然残基は、天然残基中のものと比較して、１つまたは複数の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡまたはポリペプチドなどの機能遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたは複数のイントロンを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、酵素合成（例えば、相補的なテンプレートに基づく重合、例えば、インビボまたはインビトロでの重合による、組換え細胞もしくは系での再生、または化学合成）によって調製され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、もしくは２０，０００またはそれより多い残基またはヌクレオチド長である。

ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、その当技術分野で認識された意味を指す。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドのサイズの指標としてヌクレオチドの数が使用される場合、特定のヌクレオチド数は、一本鎖上のヌクレオチドの数、例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの数を指す。

薬学的組成物：本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と共に製剤されている活性作用物質を意味する。いくつかの実施形態では、活性作用物質は、関連する集団に投与された場合に所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す、治療計画における投与に適切な単位用量で存在する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、経口投与、例えば、水薬（水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下、及び体内吸収を標的とするもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト；非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは硬膜外注射によるもの、例えば、無菌の溶液もしくは懸濁液、もしくは徐放性製剤としてのもの；局所的適用、例えば、皮膚、肺、もしくは口腔に適用されるクリーム、軟膏、もしくは制御放出性パッチもしくはスプレーとしてのもの；膣内投与もしくは直腸内投与、例えば、ペッサリー、クリーム、もしくは泡状物としてのもの；舌下投与；眼内投与；経皮投与；または経鼻投与、肺内投与、及び他の粘膜表面への投与に適したものを含め、固体または液体形態で投与するために特別に製剤されていてもよい。

薬学的に許容される：本明細書で使用される場合、本明細書に開示される組成物を製剤するために使用される担体、希釈剤、または賦形剤に適用される「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、または賦形剤が組成物中の他の成分に適合しなければならず、そのレシピエントに対して有害であってはならないことを意味する。

ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、一般に、少なくとも３つのアミノ酸またはそれより多い高分子という、その当該技術分野で認識されている意味を有する。当業者は、「ポリペプチド」という用語が、本明細書に挙げる完全な配列を有するポリペプチドを包含するだけでなく、係る完全なポリペプチドの機能的、生物学的に活性、または特性断片、部分またはドメイン（例えば、少なくとも１つの活性を保持する断片、部分またはドメイン）を表すポリペプチドも包含するよう、十分に一般的であるように意図されることを理解するであろう。ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、または両方を含むことができ、かつ、当該技術分野で公知である種々のアミノ酸修飾または類似体のいずれを含んでもよい。有用な修飾としては、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含み得る。

ＲＮＡオリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは一本鎖である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは二本鎖である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖部分の両方を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、上記の「核酸／オリゴヌクレオチド」の定義に記載されるような骨格構造を含むことができる。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、調節ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡなど）、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）オリゴヌクレオチドであり得る。ＲＮＡオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡオリゴヌクレオチドであるいくつかの実施形態において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的には、その３’末端にポリ（Ａ）領域を含む。ＲＮＡオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡオリゴヌクレオチドであるいくつかの実施形態において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的には、その５’末端に、例えば、ｍＲＮＡを認識してリボソームに付着させて翻訳を開始するための、当技術分野で認識されるキャップ構造を含む。

組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、例えば、ｍＲＮＡ合成、ならびに組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）には、標準技術が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実行され得る。前述の技術及び手順は一般に、当該技術分野において周知である従来の方法に従って、かつ本明細書全体を通して引用され、考察される、一般的かつより具体的な様々な参考文献に記載されるように実行され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたく、これらは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、いくつかの実施形態では出生前のヒト形態を含む、ヒト）を意味する。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害、または状態を患っている。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または病状に罹患しやすい。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態のいずれの症状または特徴も示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態への感受性またはそのリスクに特徴的な１つまたは複数の特徴を有する者である。いくつかの実施形態では、対象は患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／または療法が施される及び／または施された個体である。
（発明を実施するための形態）

ｍＲＮＡ療法の臨床的生存率にとって重要な課題は、外因性ＲＮＡに対する自然免疫応答を低下させることである。これらの療法に対する自然免疫応答の大部分は、インビトロ転写中に生成される様々な汚染物質の認識によって実行される。ＲＩＧ－ＩはキャップされていないｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの検出を担当し、ＭＤＡ５及びＰＫＲは小さな異常な転写産物及び大きなｄｓＲＮＡ側産物を検出することができる。自然免疫シグナル伝達はＮＦ－ｋＢ及びＩＲＦアップレギュレーションの経路に収束するため、これらのセンサーによる認識をバイパスすることはＲＮＡベースの治療法にとって非常に重要である。ＰＫＲシグナル伝達は、それ自体で、翻訳機構の阻害によってグローバルタンパク質合成を直接減少させる。これらの経路の活性化は、最終的に、ｍＲＮＡ送達療法の有効性の低下をもたらし得る抗ウイルス状態の確立をもたらす。

合成ＲＮＡを検出する自然免疫センサーの能力を低下させる、化学修飾ヌクレオチド（Ｋａｒｉｋｏｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．２００８、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及び調製物から汚染物質を直接除去する、ＨＰＬＣ精製（Ｋａｒｉｋｏ，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｌｕｄｗｉｇ，＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ，ＮＡＲ２０１１、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の使用を含む、この問題に対処するための実質的な作業が行われている。残念ながら、ＨＰＬＣ精製は高価であり、プロセス中に試料が損失されることにより最適な収率を下回る可能性があり、これは大規模な合成では重要な問題となる。化学修飾ヌクレオチドの使用は、商業用途におけるそれらの使用のためのライセンス契約を必要とし、複雑化する。インビトロ転写条件の最適化に関するより最近の研究は、ＲＮＡに減少した免疫原性を提供しているが（Ｍｕ，ｅｔａｌ．，ＮＡＲ２０１８、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、収率が低いという欠点を伴い、大規模な合成にはひどく高価なものとなる可能性がある。

いくつかの実施形態では、本開示は、大規模な合成を可能にするインビトロ転写からの高収率を維持しながら、我々のｍＲＮＡ療法に対する自然免疫応答を低下させるという問題に対処する技術を提供する。初期の仮説は、高温でのインビトロ転写が、任意の数のメカニズムによってｄｓＲＮＡ側産物の合成を減少させる可能性があるというものであった。考えられるいくつかのメカニズムには、ＤＮＡテンプレートへのＲＮＡポリメラーゼの非特異的結合の減少及びテンプレートの非プロモーター末端におけるポリメラーゼの再開始の減少が含まれる。これらのメカニズムは、ＩＶＴセンスＲＮＡがシスにおいてポリメラーゼ及び自己プライムに再結合することができる（Ｇｈｏｌａｍａｌｉｐｏｕｒ，Ｍｕｄｉｙａｎｓｅｌａｇｅ，＆ＭａｒｔｉｎＮＡＲ２０１８、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及び生成される結果として生じるヘアピンが高収率ＩＶＴ条件下でプロモーター依存性Ｔ７開始と競合し得るという発見と一致する。Ｗｕ，Ａｓａｈａｒａ，Ｔｚｅｒｔｚｉｎｉｓ，＆Ｒｏｙ，ＲＮＡ２０２０（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は最近、耐熱性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体による高温インビトロ転写が、インビトロ転写産物の自己プライミングを減少させることによってｄｓＲＮＡ副産物の合成を減少させることができることを報告した。野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは４５℃を超える温度では不活性であるため、その研究は新規な耐熱性Ｔ７プロモーター依存性ＲＮＡポリメラーゼの設計に依存していた。グリシンベースのオスモライトは高温でタンパク質を安定化させるのを助けることが示されているが（Ｓａｎｔｏｒｏ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９２、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、この分野において、安定なＲＮＡを合成するための高収率な方法に対する必要性が依然として存在する。

本開示は、高収率インビトロ転写のための組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、インビトロ転写反応において、オスモライト、例えばベタインを添加することが、例えば、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを高温、例えば４５℃を超える温度で使用しながら、ＲＮＡの高収率な合成を可能にするという洞察を提供する。さらに、本開示は、オスモライトの存在下でのインビトロ転写によって産生されるＲＮＡが、低減された免疫原性、及び／または高発現を有し得ることを示す。

ＲＮＡ産物を産生するための例示的な方法
本開示は、特に、ＲＮＡ産物を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロ転写混合物をインキュベートする工程を含み、それによって、複数の一本鎖ＲＮＡ分子を含むＲＮＡ産物を産生する。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物は、標的配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むＤＮＡテンプレートと、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を認識する少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼと、少なくとも２つの異なるタイプのリボヌクレオチドを含む複数のリボヌクレオチド（各タイプが異なるヌクレオシドを含む）と、オスモライトを含む転写緩衝液と、を含む。

いくつかの実施形態では、オスモライトは、アミノ酸ベースのオスモライト、メチルアミンオスモライト、炭水化物オスモライト、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、メチルアミンオスモライトは、グリセロホスホリルコリントリメチルアミンＮ－オキシド、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、炭水化物オスモライトは、ソルビトール、グリセロール、ミオニシトール、ジグリセロールホスフェート、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸ベースのオスモライトは、プロリンベースのオスモライト、グリシンベースのオスモライト、エクトインベースのオスモライト、アラニンベースのオスモライト、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アラニンベースのオスモライトは、ベータアラニンであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸ベースのオスモライトは、グリシンベースのオスモライトであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、グリシンベースのオスモライトは、ベタインであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、インキュベートする工程は、少なくとも３７℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも４６℃、少なくとも４７℃、少なくとも４８℃、少なくとも４９℃、少なくとも５０℃、少なくとも５１℃、少なくとも５２℃、少なくとも５３℃、少なくとも５４℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、または少なくとも６５℃の温度で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベートする工程は、最大７５℃、最大７０℃、最大６５℃、最大６０℃、最大５９℃、最大５８℃、最大５７℃、最大５６℃、または最大５５℃の温度で行われる。

いくつかの実施形態では、複数の一本鎖ＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、複数の一本鎖ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の標的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、ポリＡ鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、少なくとも１つのイントロンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、少なくとも１つの非翻訳領域を含む。

いくつかの実施形態では、複数の一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれが修飾ヌクレオシドを含む１つまたは複数のリボヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物よりも免疫刺激性が低い。いくつかの実施形態では、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で産生される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物のものよりも二本鎖ＲＮＡのレベルが低い。いくつかの実施形態では、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で産生される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物のものよりも大きい量の一本鎖ＲＮＡ分子を有する。いくつかの実施形態では、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で産生される。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡ分子の量は、ＲＮＡ産物中の一本鎖ＲＮＡ分子の百分率である。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡ分子の量は、ＲＮＡ産物中の一本鎖ＲＮＡ分子の数である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、インキュベートする工程の後に、インビトロ転写混合物からＤＮＡを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去することは、インキュベートする工程の後に、インビトロ転写混合物にＤＮａｓｅを加えることを含む。

いくつかの実施形態では、インキュベートする工程は、標的配列が一本鎖ＲＮＡ分子に転写されるのに十分な時間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、インキュベートする工程は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、またはそれより長時間にわたって行われる。

ＲＮＡ産物を含む例示的な組成物
本開示は、ＲＮＡ産物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、本明細書に記載される方法によって産生される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、複数の一本鎖ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、複数の一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれが修飾ヌクレオシドを含む１つまたは複数のリボヌクレオチドを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物、例えば、オスモライトの非存在下、かつ約３７℃のインキュベーション温度で産生されたＲＮＡ産物よりも、免疫刺激性が低い。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物、例えば、オスモライトの非存在下、かつ約３７℃のインキュベーション温度で産生されたＲＮＡ産物のものよりも、低いレベルの二本鎖ＲＮＡを有する。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物、例えば、オスモライトの非存在下、かつ約３７℃のインキュベーション温度で産生されたＲＮＡ産物のものよりも、より大きい一本鎖ＲＮＡ分子の量を有する。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡ分子の量は、ＲＮＡ産物中の一本鎖ＲＮＡ分子の百分率である。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に適したあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤もしくは懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤などを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６、参照により本明細書に組み込まれる）は、薬学的組成物を製剤化する際に使用される様々な賦形剤及びその調製のための既知の技術を開示している。好適な薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝食塩水、グリセロール、糖、例えば、マンニトール、スクロース、またはその他、デキストロース、脂肪酸エステルなど、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

薬学的組成物は、必要に応じて、活性化合物と有害な反応を起こさない、またはそれらの活性に干渉しない補助剤（例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤、香味料、及び／または芳香剤など）と混合され得る。特定の実施形態では、静脈内投与に好適な水溶性の担体が使用される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、無菌であり得る。

好適な薬学的組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝液を含有し得る。薬学的組成物は、液体溶液、懸濁液、またはエマルションであり得る。

薬学的組成物は、定型的な手順に従って、ヒトへの投与に適合した薬学的組成物として製剤化され得る。薬学的組成物の調製は、投与様式に適していなければならない。例えば、いくつかの実施形態では、静脈内投与のための組成物は、典型的には、滅菌等張性水性緩衝材における溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔薬を含むことができる。一般に、成分を、単位剤形で、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルもしくはサシェなどの気密封止容器内に乾燥した凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、別々に供給するか、あるいは一緒に混合して供給する。薬学的組成物が注入により投与される場合、組成物は滅菌医薬品等級水、生理食塩水またはブドウ糖／水を含有する注入ボトルで分注され得る。薬学的組成物が注射により投与される場合、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与前に混合され得るように提供され得る。

本明細書において提供される薬学的組成物の説明は、主にヒトへの倫理的投与に好適な薬学的組成物を対象とするが、係る組成物は、一般に、あらゆる種類の動物またはインビトロもしくはエクスビボの細胞への投与に好適であることが当業者により理解されるであろう。ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を様々な動物またはインビトロもしくはエクスビボの細胞への投与に好適なものにするための当該組成物の改変はよく理解されており、当業者、例えば、獣医薬理学者は、たとえ行うにしても、通常の実験を行うだけで、係る改変を設計及び／または実行し得る。

本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であるか、または今後開発される任意の方法により調製され得る。一般的に、そのような調製方法は、活性成分を希釈剤または他の賦形剤及び／もしくは１つもしくは複数の他の補助成分と関連付ける工程と、その後、必要であれば、及び／または望ましい場合、製品を所望の単回もしくは多回投与単位に成形及び／または梱包する工程とを含む。

本開示による薬学的組成物は、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として調製、パッケージング、及び／またはまとめて販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、個別の量の本明細書に記載の薬学的組成物である。

送達の例示的方法
本開示は、１つまたは複数の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）を、本明細書に記載されるＲＮＡ産物を含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物は、本明細書に記載される方法によって産生される。

いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡ産物は、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物、例えば、オスモライトの非存在下、かつ約３７℃のインキュベーション温度で産生されたＲＮＡ産物よりも、免疫刺激性が低い。

いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような方法は、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物における、例えば、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物における一本鎖ＲＮＡ分子（複数可）からの発現レベルと比較して、一本鎖ＲＮＡ分子（複数可）からの発現レベルを増加させる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような方法は、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物との、例えば、約３７℃のインキュベーション温度で、オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物との接触後の１つまたは複数の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）の生存率と比較して、ＲＮＡ産物との接触後の１つまたは複数の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）の生存率を増加させる。

キット
本開示の別の態様は、インビトロ転写混合物のための成分を含む医薬パックまたはキットをさらに提供する。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物の成分は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を認識する野生型バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物の成分は、少なくとも２つの異なるタイプのリボヌクレオチドを含む複数のリボヌクレオチドであるか、またはそれを含み、各タイプは異なるヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物の成分は、オスモライトを含む転写緩衝液であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、オスモライトは、アミノ酸ベースのオスモライト、メチルアミンオスモライト、炭水化物オスモライト、またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、メチルアミンオスモライトは、グリセロホスホリルコリン、トリメチルアミンＮ－オキシド、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、炭水化物オスモライトは、ソルビトール、グリセロール、ミオニシトール、ジグリセロールホスフェート、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸ベースのオスモライトは、プロリンベースのオスモライト、グリシンベースのオスモライト、エクトインベースのオスモライト、アラニンベースのオスモライト、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アラニンベースのオスモライトは、ベータアラニンであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸ベースのオスモライトは、グリシンベースのオスモライトであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、グリシンベースのオスモライトは、ベタインであるか、またはそれを含む。

キットは、任意の適用可能な方法、例えば、本明細書に記載されるような方法において使用され得る。

実施例１：ベタイン含有または不含有の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＨｉＳｃｒｉｂｅポリメラーゼミックスを使用した３７℃のＩＶＴと高温ＩＶＴの対照比較
この実施例は、本明細書に記載される例示的な方法を用いたＲＮＡの合成を記載する。特に、この実施例は、ベタインの存在下での野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた合成反応においてｄｓＲＮＡの量が減少したことを示す。

核酸二次構造がｄｓＲＮＡ生成のアッセイに及ぼす可能性のある任意の効果について概念及び／または制御の実証を試験するために、非構造化であるとみなされたｄｓＤＮＡ配列５１２Ｂを用いて高温ＩＶＴ研究を実施した（Ｍｕ，ｅｔａｌ．，ＮＡＲ２０１８、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

５１２Ｂのシーケンス（５’から３’まで）は以下の通りである：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＣＣＧＧＴＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＡＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＣＧＴＣＴＣＴＡＡＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＴＴＣＡＴＧＴＡＧＣＧＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＣＴＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡＧＡＴＡＧＣＧＧＡＡＡＴＴＣＴＣＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＡＣＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＴＴＣＴＣＣＣ

ｄｓＤＮＡ５１２ＢＩＶＴテンプレートは、５１２ＢｓｓＤＮＡが産生されたＩＤＴプラスミド中間体のＰＣＲ増幅によって生成された。増幅は、０．２５μＭの各プライマー５１２ＢＴ７ｆｗｄ及び５１２Ｂｒｅｖ、１ＸヘルキュラーゼＩＩ緩衝液、２５０ｕＭの各ｄＮＴＰ、１０ｎｇ５１２Ｂプラスミド（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ならびに０．４μＬヘルキュラーゼＩＩ酵素からなる２０μＬの反応物中で実施した。ＰＣＲ産物をＱｉａＱｕｉｃｋＰＣＲＣｌｅａｎＵｐＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、３０μＬ１０ｍＭＴｒｉｓ－ＣｌｐＨ８．５に溶出した。溶出産物の全体を、５０μＬ反応中の１２５ＵのＤｐｎ１酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で処理し、鋳型プラスミドを消化した。消化産物をＣｌｅａｎａｎｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で精製し、１０μＬ１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．５に溶出した。

１００ｎｇＬｕｃ２Ｔ７テンプレート、５ｍＭの各ＮＴＰ、１ＸＨｉＳｃｒｉｂｅ転写緩衝液、及び１μＬのＨｉＳｃｒｉｂｅポリメラーゼミックス（ＮＥＢ）からなり、市販の高収率ＩＶＴ条件を代表する１０μＬの対照反応物を、３７℃で２時間インキュベートした。高温ＩＶＴは、２Ｍベタイン補給含有または非含有で、４５℃及び５０℃の両方で試験した。これらの反応物は、２Ｍベタインの添加有り、もしくは無しの３７℃対照反応と同様の反応セットアップからなる。反応物はその後、それぞれの温度で２時間インキュベートした。

ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅＣ機器（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＲＮＡアプリケーションを用いて決定した。

各ＩＶＴ調製物中のｄｓＲＮＡ夾雑物の相対濃度をアッセイするために、その後ウイルスｄｓＲＮＡ検出キット（ＣｉｓＢｉｏ）の適応プロトコールを行った。使用したｄｓＲＮＡ検出キットは、細胞溶解物中のウイルスゲノム複製を検出するためのアッセイとしてＣｉｓＢｉｏから市販されていた。キットは、２つのｄｓＲＮＡ検出抗体のサンドイッチアッセイを用いた。１つ目はＥｕｒｏｐｉｕｍＣｒｙｐｔａｔｅドナーでラベル付けされ、２つ目はｄ２アクセプターでラベル付けされた。１０μＬの各抗体の１：５０希釈ミックスを総ＲＮＡ１０μＬの溶液に添加し、４℃で一晩インキュベートした。近接する両方の抗体によるｄｓＲＮＡの結合、及び３３０ｎｍの波長光によるドナーの励起は、６６５ｎｍの発光波長で蛍光を発するアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を誘発する。６２０ｎｍにおけるドナー発光シグナルに対する６６５ｎｍにおけるアクセプター発光シグナルの比を計算し、ｄｓＲＮＡ濃度に比例する生シグナル強度値を提供した。すべての比に１０^４の係数を掛けて、データ解析に使用できる処理された信号強度値を得た。（ＶｉｒａｌＤｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ、ＣｉｓＢｉｏ、６４ＲＮＡＰＥＧ。）

すべてのＲＮＡ試料を、４０μＬ１Ｘ溶解バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ）中で１００ｎｇ／ｕＬ総ＲＮＡの作業濃度に希釈した。１Ｘ溶解バッファーでの１：４シリーズ希釈を、各試料について最小濃度０．３９１ｎｇ／μＬまで実施した。抗体溶液は、検出バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ）に各抗体の１：５０希釈液である４００ｕＬを混合して作製した。各ＲＮＡ希釈系列の１０μＬに抗体溶液１０μＬを二重に添加し、低容量９６ウェルアッセイプレート（Ｃｉｓｂｉｏ）中で、４℃で一晩インキュベートした。各反応物における総ｄｓＲＮＡを、６２０ｎｍでのシグナル（ドナー放出）に対する６６５ｎｍでのシグナル（アクセプター放出）の比を計算し、ウイルスｄｓＲＮＡ検出キットに記載されているように１０^４の係数を掛けることによってアッセイした。各総ＲＮＡ濃度における処理されたシグナル比を散布図上にプロットした。アッセイの１つの可能な制限は、ｄｓＲＮＡによる飽和がＦＲＥＴを誘発するには互いに遠すぎる距離で抗体の結合をもたらすため、高濃度のｄｓＲＮＡが低シグナル比から偽陰性をもたらす可能性があることであった。しかしながら、このアッセイは、試料間のｄｓＲＮＡ量の相対的差を評価するのに有用であった。図１に示すように、試料中のベタインの存在は、ｄｓＲＮＡの量の減少と相関していた。

実施例２：本明細書に記載の例示的な方法に従って産生されたＲＮＡ産物と市販の高温転写反応との比較
この実施例は、本明細書に記載されるような例示的なＲＮＡ合成法と、市販の高温転写反応成分を用いた同等の方法との比較を記載する。本実施例は、本明細書に記載される例示的なＲＮＡ合成組成物及び方法が、市販の反応キット及び方法と、やや優れてはいないとしても、同様に実施されることを実証する。

ホタルルシフェラーゼの最適化版をコードするｌｕｃ２遺伝子をｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］（Ｐｒｏｍｅｇａ）から増幅した。増幅は、０．２５μＭの各プライマーＬｕｃ２＿ｆｗｄ及びＬｕｃ２＿ｒｅｖ、１ＸＨｅｒｃｕｌａｓｅＩＩバッファー、２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、３０ｎｇｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．２５Ｍベタイン及び０．４μＬヘルキュラーゼＩＩ酵素からなる２０μＬ反応物で、アニーリング温度７０℃で実施した。ＰＣＲ産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋＰＣＲＣｌｅａｎＵｐＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、３０μＬ１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．５に溶出した。溶出産物の全体を、５０μＬ反応中の１２５ＵのＤｐｎ１酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で処理し、鋳型プラスミドを消化した。消化産物をＱｉａＱｕｉｃｋＰＣＲＣｌｅａｎＵｐＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、５０μＬ１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．５に溶出した。次いで、この消化された一次ＰＣＲ産物を、０．２５μＭの各プライマーＴ７－ＧＧＧ＿ｆｗｄ及び１２０ｐＡ＿ｒｅｖ、１ＸヘルキュラーゼＩＩ緩衝液、２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｎｇＬｕｃ２一次増幅産物、及び０．４μＬヘルキュラーゼＩＩ酵素からなる２０μＬ反応において５０℃で増幅した。この二次ＰＣＲ産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋＰＣＲＣｌｅａｎＵｐＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）でクリーンアップし、３０μＬ１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．５に溶出した。次いで、溶出したＰＣＲ産物を、１％ＥＸゲル（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１０レーンにわたって２０ｕＬの水中に５０ｎｇ／μＬの濃度で１０分間流した。メインバンドを摘出し、ＱｉａＱｕｉｃｋＧｅｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔを用いて処理した。ゲル単離産物を、５０μＬ１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．５に溶出した。テンプレートをさらに濃縮するために、溶出産物を、ＤＮＡＣｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて１０μＬの１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．５に再度クリーンアップした。

使用したプライマー配列は、以下の通りであった：
・Ｌｕｃ２＿ｆｗｄ
ＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣａｔｇｇａａｇａｔｇｃｃａａａａａｃａｔｔａａｇａａｇｇｇｃ
・Ｌｕｃ２＿ｒｅｖ
ＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＧＧＧＧＧＡＣＡＡＣＡＴＴＴＴＧＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＧＧＴＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＴＴＡＧＡＧＡＣＴＣＣＡＴＴＣＧＧＧＴＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＡＴＴＡｃａｃｇｇｃｇａｔｃｔｔｇｃｃｇｃｃ
・Ｔ７－ＧＧＧ＿ｆｗｄ
ｇａａｔｔＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧｃｔｔｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｃａｇａａｇｃ
・１２０ｐＡ＿ｒｅｖ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴａｇａａｔｇｔｇａａｇａａａｃｔｔｔｃｔｔｔｔｔａｔｔａｇ

ｎｇＬｕｃ２Ｔ７テンプレート、７．５ｍＭの各ＮＴＰ、１ＸＨｉＳｃｒｉｂｅ転写緩衝液、及び２μＬのＨｉＳｃｒｉｂｅポリメラーゼミックス（ＮＥＢ）からなり、市販の高収率ＩＶＴ条件を代表する２０μＬの対照反応物を、３７℃で２時間インキュベートした。２Ｍベタイン補給による５０℃のＨｉＳｃｒｉｂｅ反応は、２Ｍベタインを添加した以外は、３７ＣＩＶＴコントロール反応と同じ試薬で構成されていた。その後、これを５０℃で２時間インキュベートした。

当社の高温製造方法の製品と市販の高温転写試薬の製品を比較するために、Ｈｉ－Ｔ７ポリメラーゼミックス（ＮＥＢ）のカスタムメイド独占高収率製剤から産生されたＩＶＴＲＮＡを、市販の試薬を使用して産生したものと比較した。以前の研究（未発表）では、ＮＥＢから得られた独自のバッファー製剤と比較して、社内のＴ７バッファー製剤中のこのようなポリメラーゼミックスからの転写品質が優れていることが判明した。ＮＥＢ独自の高収率Ｈｉ－Ｔ７ポリメラーゼミックスを使用した２０μＬの転写反応には、１５０ｎｇＬｕｃ２Ｔ７テンプレート、７．５ｍＭの各ＮＴＰ、社内Ｔ７転写緩衝液１Ｘ、及びＨｉ－Ｔ７ポリメラーゼミックス（ＮＥＢ）の独自の高収率製剤２μＬが含まれていた。反応物を、５０℃で２時間インキュベートした。

すべてのＩＶＴ製品を、Ｍｏｎａｒｃｈ５０μｇＲＮＡＣｌｅａｎＵｐｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してクリーンアップし、４０μＬヌクレアーゼ不含有の水に溶出した。次いで、溶出産物を、１ＸＤＮａｓｅＩ緩衝液と５ＵのＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ不含有）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）からなる５０μＬ反応で、３７℃で１５分間消化し、ＤＮＡテンプレートを分解した。ＤＮａｓｅＩ処理試料を、Ｍｏｎａｒｃｈ５０ｕｇＲＮＡＣｌｅａｎＵｐｋｉｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用してクリーンアップし、４０μＬヌクレアーゼ不含有の水に溶出した。

ＤＮＡｓｅＩ処理産物を、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を含むＶａｃｃｉｎｉａＣａｐｐｐｉｎｇＥｎｚｙｍｅキットを用いて酵素的にキャッピングし、Ａ５４９細胞培養実験において最適な発現のために天然に存在する２’－Ｏ－メトリエートされた５’ｍ７Ｇキャップを有するｍＲＮＡを産生した。キャッピングの前に、キャッピングを阻害する可能性のある５’二次構造を変性させるために各ＩＶＴＲＮＡを６５℃で５分間変性させ、直ちに氷上に２分間配置した。各２０ｕＬのキャッピング反応物は、６ｕｇＩＶＴＲＮＡ、１Ｘキャッピング緩衝液、０．５ｍＭＧＴＰ、０．２ｍＭＳＡＭ、１０ＵＶａｃｃｉｎｉａＣａｐｐｉｎｇＥｎｚｙｍｅ、及び５０ＵｍＲＮＡキャップ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）から構成されていた。キャッピング反応物を３７℃で１時間インキュベートした。

すべてのキャップされたｍＲＮＡをＭｏｎａｒｃｈ１０ｕｇＲＮＡＣｌｅａｎＵｐｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してクリーンアップし、１０ｕＬヌクレアーゼ不含有の水に溶出した。濃度を表２に列挙する。

実施例３：ベタイン濃度勾配による５０℃でのインビトロ転写
この実施例は、異なるベタイン濃度を使用する本明細書に記載されるような例示的なＲＮＡ合成組成物及び方法を記載する。この実施例は、５０℃で行われる転写反応におけるベタイン濃度の増加がＲＮＡ産物の量の増加をもたらしたことを実証する。

２００ｎｇＴ７テンプレート、５ｍＭの各ＮＴＰ、１ＸＨｉＳｃｒｉｂｅ転写緩衝液、及び２ｕＬのＨｉＳｃｒｉｂｅポリメラーゼミックス（ＮＥＢ）を含む２０μＬのインビトロ転写反応に、０Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、または２Ｍベタインを補充し、５０℃で１時間インキュベートした。

すべてのＩＶＴ産物を、Ｍｏｎａｒｃｈ５００μｇＲＮＡＣｌｅａｎＵｐｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してクリーンアップし、４０μＬヌクレアーゼ不含有の水に溶出した。次いで、溶出産物を、１ＸＤＮａｓｅＩ緩衝液と５ＵのＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ不含有）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）からなる５０μＬ反応物で、３７℃で１５分間消化し、ＤＮＡテンプレートを分解した。ＤＮａｓｅＩ処理試料を、Ｍｏｎａｒｃｈ５００ｕｇＲＮＡＣｌｅａｎＵｐｋｉｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用してクリーンアップし、５０μＬヌクレアーゼ不含有の水に溶出した。０Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、または２Ｍベタインのいずれかを含む各反応の産生物の濃度を表３に提示する。

実施例４：Ａ５４９細胞培養方法
本実施例は、本明細書に記載される例示的なＲＮＡ合成組成物及び方法を用いて合成されたＲＮＡ産物でトランスフェクトした場合の細胞（例えば、Ａ５４９細胞）において観察される効果を記載する。Ａ５４９－Ｄｕａｌは、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０μｇ／ｍＬブラストサイジン、及び１００μｇ／ｍＬゼオシンを添加した高グルコースＧｌｕｔａＭＡＸＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地で培養し、３７℃、及び５％ＣＯ_２で維持した。トランスフェクションの前に、細胞を６，０００細胞／ウェル１ｄで９６ウェルに播種した。１００ｎｇの各ｍＲＮＡを、２μＬｍＲＮＡブースト試薬：１μｇｍＲＮＡ及び２μＬトランスＩＴ－ｍＲＮＡ試薬：１μｇｍＲＮＡを使用してＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を使用してトランスフェクションした。トランスフェクションは、２連で実施した。得られた結果を図２、３、及び４に示す。生存率及びルシフェラーゼ発現は、ＯＮＥ－Ｇｌｏ＋ＴｏｘＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒａｎｄＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて決定した。ＮＦ－κＢ活性化は、製造業者によって記載されているように、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ検出試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いてＳＥＡＰレポーター遺伝子を介して測定した。

実施例５：得られた結果の議論
上記の表１は、任意のオスモライト（例えば、ベタイン）の非存在下で３７℃より高い温度でインビトロ転写を行った場合、ＲＮＡ収率が有意に減少したことを示し、一方、オスモライト（例えば、ベタイン）補充は、そのような高温でのＲＮＡ収量を有意に改善した。表３はさらに、５０℃におけるオスモライト濃度（例えば、ベタイン濃度）とＩＶＴ収率との関係を示す。例えば、表３は、いくつかの実施形態において、０．５Ｍオスモライト（例えば、ベタイン）補充が、補充なしと比較してＲＮＡ収率の改善をもたらすことを示す。いくつかの実施形態では、オスモライト（複数可）は、例えば、少なくとも０．２Ｍ、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍ、少なくとも１Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、少なくとも３Ｍ、少なくとも３．５Ｍ、少なくとも４Ｍ、少なくとも４．５Ｍ、少なくとも５Ｍ、少なくとも５．５Ｍ、少なくとも６Ｍ、少なくとも６．５Ｍ、少なくとも７、少なくとも７．５Ｍ、少なくとも８Ｍ、少なくとも８．５Ｍ、少なくとも９Ｍ、少なくとも９．５Ｍ、少なくとも１０Ｍ、またはそれより高い値を含む、少なくとも０．１Ｍ以上の濃度でインビトロ転写緩衝液混合物中に存在し得る。

図１は、高温（例えば、３７℃以上の温度）でのインビトロ転写から生じるｄｓＲＮＡの減少を示す。示されているデータは、示された各合成方法から得られた試料の異なる希釈因子におけるｄｓＲＮＡの量を反映する。アッセイの１つの可能な制限は、ｄｓＲＮＡによる飽和がＦＲＥＴを誘発するには互いに遠すぎる距離で抗体の結合をもたらすため、高濃度のｄｓＲＮＡが低シグナル比から偽陰性をもたらす可能性があることであった。しかしながら、ｄｓＲＮＡ量の差は、各試料の総ＲＮＡのより低い範囲において明らかである。４５℃での転写はそれ自体でｄｓＲＮＡ量を減少させるように見え、特定の理論に束縛されることを望まないが、いくつかの実施形態では、４５℃での転写収率は大規模合成のためには低い可能性がある。いくつかの実施形態では、５０℃の温度でのオスモライト（例えば、ベタイン）補給によるインビトロ転写は、オスモライト（例えば、ベタイン）を含まない４５℃のＩＶＴ合成と比較して、高収率合成及び低ｄｓＲＮＡ量の両方を可能にする。

このｄｓＲＮＡの減少の影響は、３７℃のインビトロ転写からの高量と比較して、図２、３、及び４に示されたデータから明らかである。改善された生存率は図２に示され、一方、減少した免疫原性は図３に示される。図４の全ての合成方法から同等のルシフェラーゼ発現が観察される。例えば野生型バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを使用する高温インビトロ転写反応にベタインなどのオスモライトを添加することは、免疫原性及び／または毒性を低減したＲＮＡを高収率で産生するのに有用である。

均等物
一般に、本明細書で使用される用語は、特に別段明記されていない限り、当該技術分野において理解されるそれらの意味に従う。本開示に対する様々な改変、修正、及び改善が当業者に容易に起こることは、当業者には理解されるべきである。このような改変、修正、及び改善は、本開示の一部であることを意図しており、本発明の精神及び範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明及び図面は例示のみであり、以下の特許請求の範囲によってさらに詳細に説明される場合、本開示に記載される任意の発明である。

当業者は、本明細書に記載されるアッセイまたは他のプロセスにおいて得られた値に起因する偏差または誤差の典型的な基準を理解するであろう。本発明の背景を記載し、その実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物、ウェブサイト及び他の参考資料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明を実施するための形態に関連して本発明の実施形態を説明してきたが、前述の説明は例示を意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲は、本明細書に添付の特許請求の範囲によって定義され、本明細書に記載される特定の実施形態によって限定されるものではない。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims

ＲＮＡ産物を産生する方法であって、前記方法は、
インビトロ転写混合物をインキュベートする工程を含み、それによって、複数の一本鎖ＲＮＡ分子を含むＲＮＡ産物を産生し、
前記インビトロ転写混合物は、
（ｉ）標的配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むＤＮＡテンプレートと、
（ｉｉ）前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を認識する少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼと、
（ｉｉｉ）複数のリボヌクレオチドであって、少なくとも２つの異なるタイプのリボヌクレオチドを含み、各タイプは異なるヌクレオシドを含む、前記複数のリボヌクレオチドと、
（ｉｖ）オスモライトを含む転写緩衝液と、を含む、前記方法。
前記オスモライトが、アミノ酸ベースのオスモライト、メチルアミンオスモライト、炭水化物オスモライト、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む、請求項１に記載の方法。
前記メチルアミンオスモライトが、グリセロホスホリルコリン、トリメチルアミンＮ－オキシド、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む、請求項２に記載の方法。
前記炭水化物オスモライトが、ソルビトール、グリセロール、ミオニシトール、ジグリセロールホスフェート、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む、請求項２または３に記載の方法。
前記アミノ酸ベースのオスモライトが、プロリンベースのオスモライト、グリシンベースのオスモライト、エクトインベースのオスモライト、アラニンベースのオスモライト、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
前記アラニンベースのオスモライトが、ベータアラニンであるか、またはそれを含む、請求項５に記載の方法。
前記アミノ酸ベースのオスモライトが、グリシンベースのオスモライトであるか、またはそれを含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
前記グリシンベースのオスモライトが、ベタインであるか、またはそれを含む、請求項７に記載の方法。
前記ベタインが、前記インビトロ転写混合物中に、約０．５Ｍ～約１０Ｍ、または約２Ｍ～約５Ｍの濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
前記ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであるか、またはそれを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ４ビリオンＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらの変異体である、請求項１０に記載の方法。
前記バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであるか、またはそれを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
前記インキュベートする工程が少なくとも３７℃の温度で行われる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、前記インキュベートする工程が、約４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、またはそれより高い温度で行われる、請求項１２に記載の方法。
前記複数の一本鎖ＲＮＡ分子が、ガイドＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるか、またはそれを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
前記複数の一本鎖ＲＮＡ分子が、１つまたは複数の標的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子であるか、またはそれを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍＲＮＡ分子が５’キャップを含む、請求項１６に記載の方法。
前記複数の一本鎖ＲＮＡ分子が、それぞれが修飾ヌクレオシドを含む１つまたは複数のリボヌクレオチドを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＮＡ産物が、約３７℃のインキュベーション温度で、前記オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物よりも免疫刺激性が低い、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＮＡ産物が、約３７℃のインキュベーション温度で、前記オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物のものよりも低い二本鎖ＲＮＡのレベルを有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、前記ＲＮＡ産物から任意の二本鎖ＲＮＡを除去する工程を含まない、請求項２０に記載の方法。
前記ＲＮＡ産物が、約３７℃のインキュベーション温度で、前記オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物のものよりも、より高い前記一本鎖ＲＮＡ分子の量を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
前記インキュベートする工程の後に、前記インビトロ転写混合物からＤＮＡを除去することをさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
前記除去することが、前記インキュベートする工程の後に、前記インビトロ転写混合物にＤＮａｓｅを加えることを含む、請求項２３に記載の方法。
前記ＤＮＡテンプレートが固体基質上に固定化されている、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＤＮＡを除去することが、前記インビトロ転写混合物から前記固体基質を分離することを含む、請求項２５に記載の方法。
前記固体基質がビーズである、請求項２５または２６に記載の方法。
前記複数の一本鎖ＲＮＡ分子が、それぞれ、少なくとも１００ヌクレオチド以上の長さ、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、またはそれより長い長さを有する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
前記複数の一本鎖ＲＮＡ分子が、それぞれ２００，０００ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
前記インキュベートする工程が、標的配列が一本鎖ＲＮＡ分子に転写されるのに十分な時間にわたって行われる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
前記インキュベートする工程が、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、またはそれより長時間にわたって行われる、請求項３０に記載の方法。
方法であって、前記方法は、
１つまたは複数の哺乳動物細胞と、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法によって産生されたＲＮＡ産物を含む組成物とを接触させることを含む、前記方法。
前記組成物中の前記ＲＮＡ産物は、約３７℃のインキュベーション温度で、前記オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物よりも免疫刺激性が低い、請求項３２に記載の方法。
前記１つまたは複数の哺乳動物細胞が細胞培養物中に存在する、請求項３２または３３に記載の方法。
前記細胞培養物がインビトロである、請求項３４に記載の方法。
前記細胞培養物がエクスビボである、請求項３４に記載の方法。
前記１つまたは複数の哺乳動物細胞が対象中に存在する、請求項３２または３３に記載の方法。
前記接触させる工程が、前記組成物を前記対象に投与することを含む、請求項３７に記載の方法。
前記組成物が、薬学的組成物である、請求項３８に記載の方法。
前記薬学的組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
前記方法が、約３７℃のインキュベーション温度で、前記オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物における一本鎖ＲＮＡ分子（複数可）からの発現レベルと比較して、前記一本鎖ＲＮＡ分子（複数可）からの発現レベルを増加させる、請求項３２～４０のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、約３７℃のインキュベーション温度で、前記オスモライトの非存在下で産生されるＲＮＡ産物と接触させた１つまたは複数の哺乳動物細胞の生存率と比較して、前記ＲＮＡ産物との接触後の前記１つまたは複数の哺乳動物細胞の生存率を増加させる、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の方法。
インビトロ転写混合物であって、
標的配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むＤＮＡテンプレートと、
前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を認識する、野生型バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼと、
複数のリボヌクレオチドであって、少なくとも２つの異なるタイプのリボヌクレオチドを含み、各タイプは異なるヌクレオシドを含む、前記複数のリボヌクレオチドと、
アミノ酸ベースのオスモライト、メチルアミンオスモライト、炭水化物オスモライト、またはそれらの組み合わせを含むオスモライトを含む、転写緩衝液と、を含む、前記インビトロ転写混合物。
前記メチルアミンオスモライトが、グリセロホスホリルコリン、トリメチルアミンＮ－オキシド、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む、請求項４３に記載のインビトロ転写混合物。
前記炭水化物オスモライトが、ソルビトール、グリセロール、ミオニシトール、ジグリセロールホスフェート、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む、請求項４３または４４に記載のインビトロ転写混合物。
前記アミノ酸ベースのオスモライトが、プロリンベースのオスモライト、グリシンベースのオスモライト、エクトインベースのオスモライト、アラニンベースのオスモライト、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む、請求項４３～４５のいずれか一項に記載のインビトロ転写混合物。
前記アラニンベースのオスモライトが、ベータアラニンであるか、またはそれを含む、請求項４６に記載のインビトロ転写混合物。
前記アミノ酸ベースのオスモライトが、グリシンベースのオスモライトであるか、またはそれを含む、請求項４３～４７のいずれか一項に記載のインビトロ転写混合物。
前記グリシンベースのオスモライトが、ベタインであるか、またはそれを含む、請求項４８に記載のインビトロ転写混合物。
前記野生型バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであるか、またはそれを含む、請求項４３～４９のいずれか一項に記載のインビトロ転写混合物。