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JP2023524041A - Ｋｒａｓ特異的抗体及びその使用 - Google Patents

Ｋｒａｓ特異的抗体及びその使用 Download PDF

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JP2023524041A
JP2023524041A JP2022566072A JP2022566072A JP2023524041A JP 2023524041 A JP2023524041 A JP 2023524041A JP 2022566072 A JP2022566072 A JP 2022566072A JP 2022566072 A JP2022566072 A JP 2022566072A JP 2023524041 A JP2023524041 A JP 2023524041A
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kras
seq
antibody
amino acid
acid sequence
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Application number
JP2022566072A
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メリンダ エム マルヴィヒル，
ジョン ジェラール クイン，
ミカ シュテフェック，
ウエイルー ワン，
ジョン ブルーニング，
クリストファー ウィリアムソン ディヴィス，
マリー エヴァンジェリスタ，
ジェームズ トーマス ケルバー，
Original Assignee
ジェネンテック， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

ここに提供されるのは、変異ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体、及びアルキル化変異ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体及びその使用方法である。また、ここには、ＫＲａｓ阻害剤のスクリーニング方法及びここに記載される抗体へのＫＲａｓの結合を測定する方法が提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体がすべての目的のために本明細書に援用される、２０２０年４月３０日出願の米国仮特許出願第６３／０１８３５６号の利益を主張する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：コンピュータ可読形態（ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｒｅａｄａｂｌｅ ｆｏｒｍ：ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：Ｐ３５６３０ＷＯ＿ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年３月２３日、サイズ：６０，９３８バイト）。
発明の分野
本発明は、ＫＲａｓ特異的抗体及びその使用方法に関する。
ＫＲＡＳは、がんの最も頻繁に変異するがん遺伝子の１つである（Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ，Ｏ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２００５ １７５６）。ＫＲＡＳは、細胞表面の受容体から細胞内のエフェクター経路へのシグナル伝達において機能するグアノシン三リン酸化酵素（ＧＴＰａｓｅ）のＲａｓファミリーの１つをコードする（Ｐｙｌａｙｅｖａ－Ｇｕｐｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１ １１）。Ｒａｓ ＧＴＰａｓｅｓは、グアノシン５’－三リン酸（ＧＴＰ）に結合した活性状態と、グアノシン５’－二リン酸（ＧＤＰ）に結合した不活性状態との間を循環している。がんでは、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ駆動型腫瘍を含むＫＲａｓの発がん性変異により、そのＧＴＰａｓｅ活性が損なわれ、ＧＴＰ結合型のＫＲａｓの活性化形態が蓄積される。その結果、ＫＲａｓの下流の経路が構成的に活性化され、増殖の促進とアポトーシスの抑制につながる（Ｐｙｌａｙｅｖａ－Ｇｕｐｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１ １１）。
ＫＲａｓは、がんにおけるその出現率が長く認識されているにもかかわらず、長年にわたり、新薬の開発につながる標的となるとは考えられていなかった（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、Ｆ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５ ２１：８）。ＫＲＡＳＧ１２Ｃ以外にも、がんと関連するＫＲＡＳの他の対立遺伝子がある（Ｈａｉｇｉｓ、ＫＭ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０１７ ３：１０）。したがって、当技術分野には、ＧＤＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）に、ＧＴＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＴＰ）よりも高い親和性で特異的に結合するＫＲａｓ特異的抗体に対するニーズが存在している。
一態様において、本発明は、ヒトＫＲａｓに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、抗体は、ＧＤＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）に、ＧＴＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）よりも高い親和性で特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＳＷＩＩポケットを開き、安定化する。
いくつかの実施形態では、ヒトＫＲａｓは、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＱ６１Ｈ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、及びＫＲａｓＧ１３Ｄからなる群から選択されるＫＲａｓ変異体である。
いくつかの実施様態では、ヒトＫＲａｓは、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、及びＫＲａｓＧ１３Ｄからなる群から選択されるＫＲａｓ変異体である。
いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＧ１２Ｃである。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤でアルキル化される。
いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、又はＪＮＪ－７４６９９１５７でアルキル化したＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合するアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＫＲａｓ変異タンパク質のＳＷＩＩポケットを安定化する。
いくつかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号１６のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（配列番号１）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＱＤＨＤＹＰＬＴ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＦＹＶＲＮＷＦＤＰ（配列番号６）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号１７）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１８）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＹＹＳＹＰＦＴ（配列番号１９）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＳＳＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＱＧＧＹＧＹＰＧＥＳＷＦＤＹ（配列番号２２）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号２４のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号２５）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２６）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＳＹＳＰＰＷＴ（配列番号２７）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号２８）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＦＹＳＹＭＤＶ（配列番号３０）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号３２のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号３３）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号３４）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号３５）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号３６）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３７）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＲＴＩＬＴＧＹＹＧＦＤＹ（配列番号３８）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号４０のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４１）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号４２）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＹＶ（配列番号４３）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号４４）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４５）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号４６）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号４８のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号８１）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号８３）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号８４）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＦＧＰＹＡＦＤＶ（配列番号８６）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号８７のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号８８のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４９）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号５０）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＷＶ（配列番号５１）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号５２）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５３）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号５４）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号５６のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号５７）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号５８）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＮＨＷＶ（配列番号５９）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６０）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６１）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＮＮＹＧＹＲＹＦＤＹ（配列番号６２）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号６４のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号６５）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号６６）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＴＤＮＨＬＷＶ（配列番号６７）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６８）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６９）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＴＳＳＧＹＹＹＦＤＹ（配列番号７０）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号７２のアミノ酸を含む。
いくつかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号７３）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号７４）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＴＷＤＮＳＬＳＶＷＶ（配列番号７５）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号７６）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７７）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＫＧＩＶＧＷＧＦＦＧＭＤＶ（配列番号７８）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号７９のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号８０のアミノ酸を含む。
別の態様では、本発明は、ヒトＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、単離された抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＫＲａｓのアミノ酸Ｗ９９、Ｋ５、Ｌ６、Ｖ７、Ｓ３９、Ｄ５４、Ｌ５４、Ｙ７１、Ｔ７４、及び／又はＧ７５に結合する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のＫＲａｓ抗体の軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとをコードする単離された１つ又は複数の核酸を提供する。別の態様では、本発明は、核酸を含むベクターを提供する。別の態様ではて、本発明は、ベクターを含む宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、検出可能な標識にコンジュゲートする。
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体をコードするベクターの発現に適した条件下で段落の宿主細胞を培養すること、及び抗体を回収することを含む、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する抗体又はその断片を作製するための方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰよりも高い親和性でＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する抗体をスクリーニングする方法であって、
（ａ）抗体ライブラリーを
ｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、
ｉｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤でアルキル化されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、及び
ｉｉｉ）非加水分解性ＧＴＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃ
と接触させること、並びに
（ｂ）非加水分解性ＧＴＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃよりも高い親和性でアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する抗体を選択すること
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ライブラリーは、合成ファージライブラリーである。
別の態様では、本発明は、生体試料を、本明細書に提供されるＫＲａｓ抗体又は抗原結合断片と接触させることを含む、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、生体試料を、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗体と接触させることをさらに含み、ここで、ＫＲａｓ－ＧＤＰの量及びＫＲａｓ－ＧＴＰの量が決定される。
別の態様では、本発明は、検出可能な標識にコンジュゲートした段落［０００６］～［００３７］のいずれか１つに記載のＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片と、前記抗体又はその抗原結合断片を検出するための説明書とを含むキットを提供する。
別の態様では、本発明は、抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片を、ＫＲａｓ変異体と接触させること、化合物をスクリーニンすること、及び抗体又はその抗原結合断片に結合したＫＲａｓ変異体に結合する化合物を同定することを含む、ＫＲａｓ変異体の阻害剤を取得する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、化合物は、ＳＷＩＩポケットでＫＲａｓを共有結合的に修飾する分子を含む。
いくつかの実施形態では、化合物は、ＳＷＩＩポケット内の少なくとも１つの残基をアルキル化する共有結合阻害剤を含む。
いくつかの実施形態では、化合物は、ＳＷＩＩポケットでＫＲａｓを非共有結合的に修飾する分子を含む。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ変異体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈである。
一態様において、本発明は、生体試料を抗ＫＲａｓ抗体又は抗原結合断片と接触させること、及びアルキル化されたＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む、ＫＲａｓのアルキル化を検出する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、検出は、ＫｒａｓＧ１２Ｃの検出を含む。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である。
別の態様では、本発明は、ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片を、哺乳動物に投与すること、及びアルキル化されたＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む、哺乳動物におけるＫＲａｓのアルキル化を検出する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ＫＲａｓ阻害剤で治療された患者におけるＫＲａｓのアルキル化を検出する方法を提供し、この方法は：
（ａ）患者から試料を取得すること；
（ｂ）試料を抗ＫＲａｓ抗体と接触させこと；
（ｃ）抗体又はその抗原結合断片によって結合されたＫＲａｓの量を測定すること
を含む。
いくつかの実施態様では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、又はＪＮＪ－７４６９９１５７である。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片によって結合されるＫＲａｓの量は、患者に投与するＫＲａｓ阻害剤の投与量を決定する。
いくつかの実施形態では、検出は、ＫｒａｓＧ１２Ｃの検出を含む。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である。
いくつかの実施態様において、哺乳動物はヒトである。
別の態様では、本発明は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤で治療された対象におけるＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化を検出する方法を提供し、この方法は：
（ａ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤で治療した後に、抗ＫＲａｓ抗体又は抗原結合断片を対象に投与すること；及び
（ｂ）アルキル化されたＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出すること
を含む。
いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－１９５２、ＡＲＳ－８５３、ＡＲＳ－１６２０、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、又はＪＮＪ－７４６９９１５７である。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である。
一態様では、本発明は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんを治療する方法を提供し、この方法は、そのようながんを有する患者に、抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんは、ＮＳＣＬＣ、結腸がん、又は膵臓がんである。
別の態様では、本発明は、抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片を含む結晶化シャペロンを提供する。
別の態様では、本発明は、ＫＲａｓを結晶化する方法であって、ＫＲａｓが任意にＫＲａｓ阻害剤に結合され、抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片をＫＲａｓと接触させること、及び複合体の結晶構造を解明することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓは、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈである。
別の態様では、本発明は、化合物のＫＲａｓへの結合を測定するためのバイオセンシング表面を提供し、ここで：
（ｉ）バイオセンシング表面は、ＫＲａｓタンパク質と抗ＫＲａｓ抗体又は抗原結合断片が共局在化されたヒドロゲルを含み；
（ｉｉ）ＫＲａｓと、抗体又はその抗原結合断片とは、互いに係合して親和性複合体を形成するために、水素内で十分な自由度を有し；
（ｉｉｉ）ＫＲａｓ及び抗体又はその抗原結合断片の局所濃度は、解離親和定数を少なくとも１０倍上回っており、その局所濃度が親和性複合体の形成を促進し；
（ｉｖ）未結合ＫＲａｓタンパク質及び抗ＫＲａｓ抗体の割合が約５０％未満であり；
（ｖ）ＫＲａｓ阻害剤化合物が、少なくとも５秒間、バイオセンシング表面上に注入され；
（ｖｉ）抗ＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ阻害剤化合物の結合が、少なくとも１つのセンシングチャネル上で測定される。
いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、約１０ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～３００ｎｍ、１０～２５０ｎｍ、又は約１０～２００ｎｍの厚さである。
いくつかの実施形態では、本発明は、ビオチン化されているＫＲａｓへの化合物の結合を測定するためのバイオセンシング表面を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、化合物のＫＲａｓへの結合を測定するためのバイオセンシング表面を提供し、このバイオセンシング表面は、ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップに取り付けられている。
別の態様では、本発明は、抗ＫＲａｓ阻害剤活性について化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、化合物のＫＲａｓへの結合を測定することを含み、ここでＫＲａｓは抗ＫＲａｓ抗体に結合し、結合はバイオセンシング表面を使用して測定される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ変異タンパク質の結合を測定する方法を提供し、この方法は：
（ｉ）バイオセンシング表面をＫＲａｓと接触させて、ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を形成すること；
（ｉｉ）ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片と接触させることであって、抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓタンパク質と比較して過剰モルである、ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片と接触させること；及び
（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴を使用して、抗体又はその抗原結合断片のＫＲａｓへの結合及び親和性を検出すること
を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ変異タンパク質の結合を測定する方法を提供し、この方法は：
（ｉ）バイオセンシング表面を抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片と接触させて、抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面を形成すること；
（ｉｉ）抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面をＫＲａｓと接触させることであって、抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓタンパク質と比較して過剰モルである、抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面をＫＲａｓと接触させること；及び
（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴を使用して、抗体又はその抗原結合断片の ＫＲａｓへの結合及び親和性を検出すること
を含む。
本明細書に記載される種々の実施形態の特性の１つ、いくつか、又はすべてを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成することができることを理解されたい。
Ｒａｓの結晶構造を重ねて示したものである。 アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ特異的モノクローナル抗体を同定するために使用したインビトロファージディスプレイ選択戦略を示している。 ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ１９５２、非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ及び陰性コントロールに結合する選択された抗ＫＲａｓモノクローナル抗体の酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）データを示している。 異なる薬剤でアルキル化したときの、選択された抗ＫＲａｓ抗体１Ａ５（ｘ軸の左側）及び２Ｈ１１（ｘ軸の右側）に結合するＫＲａｓの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析からのデータを示している。 ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ１９５２及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに対する選択された抗ＫＲａｓ抗体１Ａ５及び２Ｈ１１の代表的なＳＰＲトレースを示している。ｘ軸に時間（秒）が、ｙ軸に応答単位が示されている。 選択された抗ＫＲａｓ抗体のエピトープビニングの結果を示している。 ＡＲＳ－１６２０及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰで処理した細胞からの選択された抗ＫＲａｓ抗体１Ａ５及び２Ｈ１１によるアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰの免疫沈降法を示している。 様々な共有結合分子で処理した細胞における１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体結合ＫＲａｓＧ１２Ｃを、Ｈ１１７１ ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異がん細胞におけるＤＭＳＯコントロールとの比較で、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイを使用して示している。 時間（ｙ軸上に時間で示す）及びＡＲＳ－１６２０の用量（ＤＭＳＯコントロールとの比較で、ｘ軸に沿ってμＭで示す）の変化にともなう、Ｈ１１７１ ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異がん細胞におけるＡＲＳ－１６２０処理時のＫＲａｓＧ１２Ｃの１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体での染色を示している。 ＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤ＧＮＥ－１９５２で処理したＨＣＴ１１６ ＫＲａｓＧ１３Ｄ細胞における、１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体による観察可能なＫＲａｓ染色の欠如を示している。 Ｈ１１７１ ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異がん細胞のバルク集団における、ＫＲａｓ経路マーカー、ｐＥＲＫ、ｐＳ６のアルキル化ＫＲａｓ阻害に対するイムノブロット解析を示している。細胞は、ＤＭＳＯ、５μＭのＡＲＳ－８５３、及び／又は５０μｇ／ｍｌのシクロヘキサミドで、示されるように処理された。試料は処理後、又は処理の洗い流しから６、２４、若しくは４８時間後に、示されるように収集した。 免疫蛍光アッセイにおける、異なるＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異がん細胞モデル全体の１Ａ５結合ＫＲａｓＧ１２Ｃを示している。細胞は５μＭのＡＲＳ－１６２０で処理された。各がん細胞モデルにおけるＫＲａｓＧ１２Ｃ発現の相対量が＋符号で示されている。 ＡＲＳ－１６２０の用量を増加させて処理したＨ１１７１ ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異がん細胞における１Ａ５染色（ｙ軸）とｐＳ６染色（ｘ軸）のフローサイトメトリー測定値を、ＤＭＳＯコントロール（左）と比較して示している。 選択した抗ＫＲａｓ抗体１Ａ５及び２Ｈ１１による、ＤＭＳＯ又はＡＲＳ－１６２０で処理したＨ１１７１ ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異がん細胞におけるアルキル化及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの差免疫沈降法を、一組の市販の抗体との比較で示している。 ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ１９５２上の一組の市販の抗体（ｘ軸に示す）を用いたＥＬＩＳＡを、非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＭＰｃＰ、及びＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎのみとの比較で示している。 ＡＲＳ－１６２０の用量滴定に対する１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体（上段）及びｉＤａｂ６（下段）を用いた免疫蛍光を示している。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡが青色で表示されている。ＡＲＳ－１６２０の用量は各画像にｎＭで示されている。 ５０ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ／ｋｇのＡＲＳ－１６２０で８時間及び２４時間処理した後の、雌のＣ／Ｂ１７ ＳＣＩＤマウスにおけるＮＣＩ－Ｈ３５８（高ＫＲａｓＧ１２Ｃ発現）異種移植片上での１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体を用いた免疫組織化学を、ビヒクルのみのコントロールとの比較で示している。 ５０ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ／ｋｇのＡＲＳ－１６２０で８時間処理した後の、雌のＣＲＬヌードマウスにおけるＮＣＩ－Ｈ２１２２（低ＫＲａｓＧ１２Ｃ発現）異種移植片を、ビヒクルのみのコントロールとの比較で示している。 フローサイトメトリーによって測定された、１Ａ５について陽性のＮＣＩ－Ｈ３５８異種移植細胞のパーセンテージを、灰色のバーで示している（左ｙ軸）。ｐＳ６（ＫＲＡＳ経路マーカー）の相対的発現が黒丸で示されている（ｘ軸）。試料は、５０ｍｇ／ｋｇ若しくは２００ｍｇ／ｋｇのＡＲＳ－１６２０又はビヒクルのみのコントロールで８時間又は２４時間処理された。 ２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体の非存在下（上段）又は存在下（下段）で、１～５０μＭの範囲の濃度のＧＮＥ－１９５２、ＡＲＳ－８５３又はＡＲＳ－１６２０で処理したＫＲａｓＷＴのＳＰＲデータを示している。ｘ軸に時間（秒）が、ｙ軸に応答単位が示されている。 ２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体の非存在下（上段）又は存在下（下段）で、ＧＮＥ－１９５２又はＧＮＥ－１９５２の「非弾頭」形態（反応性アクリルアミド機能を欠く）で処理したＫＲａｓＧ１２Ｃ又はＫＲａｓＷＴのＳＰＲデータを示している。ｘ軸に時間（秒）が、ｙ軸に応答単位が示されている。 抗ＫＲａｓ抗体：ＫＲａｓＧ１２Ｃ複合体の結晶構造を示している。図６Ａは、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合した２Ｈ１１ Ｆａｂを示す（上側の構造）。ＫＲａｓの構造はリボンで示されており、ＳＷＩＩ（ＳＷ２）は標識されており、ＧＤＰは棒で示されており、Ｍｇ２＋は球で示されており、Ｃｙｓ１２残基は太い棒で強調されている。２Ｈ１１ Ｆａｂは、透明な表面とリボンで示されている。図６Ａの下側の構造は、２Ｈ１１のＫＲａｓエピトープの表面マッピングであり、上側の構造に対して回転されている。 抗ＫＲａｓ抗体：ＫＲａｓＧ１２Ｃ複合体の結晶構造を示している。図６Ｂは、抗体抗原接触面の拡大図である。ＫＲａｓと直接接触している相補性決定領域（ＣＤＲ）がリボンで示されている。点線は水素結合を示しており、ＳＷＩ、ＳＷＩＩ、ＣＤＲ、ＧＤＰ、及びＣｙｓ１２が示されている。アンカーであるＨＣ．Ｔｒｐ９９は太い棒で示されている。 抗ＫＲａｓ抗体：ＫＲａｓＧ１２Ｃ複合体の結晶構造を示している。図６Ｃは、ＧＮＥ－１９５２の存在下及び非存在下でのＫＲａｓＧ１２Ｃ／２Ｈ１１複合体の比較を示している。ＧＮＥ－１９５２化合物がスティック線画で示されている。両構造のＳＷＩＩ 残基が細い棒で示されており、Ｃｙｓ１２とＨｉｓ９５が示されている。 抗ＫＲａｓ抗体：ＫＲａｓＧ１２Ｃ複合体の結晶構造を示している。図６Ｄは、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合した２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体と、ＫＲａｓに結合したＤＣＡＩ化合物のアライメントを示している。 抗ＫＲａｓ抗体：ＫＲａｓＧ１２Ｃ複合体の結晶構造を示している。図６Ｅは、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合した１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体とＧＮＥ－１９５２ ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰとのアライメントを示している。 抗ＫＲａｓ抗体：ＫＲａｓＧ１２Ｃ複合体の結晶構造を示している。図６Ｆは、ＫＲａｓ ＳＷＩとの結合におけるｉＤａｂ６と２Ｈ１１の構造の比較を示している。 ＫＲａｓ－ＧＤＰ変異体のパネルに結合する１Ａ５及び２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体を用いたＥＬＩＳＡ実験を示している。ｘ軸上にＫＲａｓの遺伝子型（又はＢＳＡコントロール）が、ｙ軸にＯＤ６５０ｎｍが示されている。 ２Ｈ１１共捕獲を行わない単一のＳＷＩＩ結合化合物の動態分析のための例示的な単一サイクルの運動サイクルを示している。ｘ軸に時間が秒で示されており、ｙ軸に応答が相対単位（ＲＵ）で示されている。単一部位の擬一次モデルのフィッティングが行われ、３．２９×１０５（１／Ｍｓ）のｋｏｎ、１．３（１／ｓ）のｋｏｆｆ、約４μＭのＫＤが得られた。 ２Ｈ１１ Ｆａｂ共捕獲を行う単一のＳＷＩＩ結合化合物の動態分析のための例示的な単一サイクルの運動サイクルを示している。ｘ軸に時間が秒で示されており、ｙ軸に応答が相対単位（ＲＵ）で示されている。２つの部位の擬一次モデルがデータへのフィッティングが行われ、高親和性部位について、６．６×１０５のｋｏｎ（１／Ｍｓ）、０．０２５（１／ｓ）のｋｏｆｆ、約４μＭのＫＤという相互作用定数が返された。 ＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＤＰ（灰色の棒）及びＫＲａｓＧ１３Ｄ－ＧＤＰ（白色の棒）に結合する、ｘ軸に示した１１種のＳＷＩＩ結合化合物の、共捕獲ＳＰＲアッセイを使用して決定された２Ｈ１１－Ｆａｂ共協同性因子の値である。 ２Ｈ１１と抗体バリアントＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７及びＡｂ８の軽鎖ＣＤＲ配列とのアライメントを示しており、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３領域が、ＫａｂａｔとＣｈｌｏｔｈｉａ両方の番号付けについて示されている。ＣＤＲ－Ｌ１の接触残基が示されている。 ２Ｈ１１と抗体バリアントＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７及びＡｂ８の軽鎖ＣＤＲ配列とのアライメントを示しており、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３領域が、ＫａｂａｔとＣｈｌｏｔｈｉａ両方の番号付けについて示されている。ＣＤＲ－Ｌ２及びＬ－３の接触残基が示されている。 ２Ｈ１１と抗体バリアントＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７及びＡｂ８の重鎖ＣＤＲ配列のアライメントを示しており、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３領域が、ＫａｂａｔとＣｈｌｏｔｈｉａ両方の番号付けについて示されている。ＣＤＲ－Ｈ１の接触残基が示されている。 ２Ｈ１１と抗体バリアントＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７及びＡｂ８の重鎖ＣＤＲ配列のアライメントを示しており、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３領域が、ＫａｂａｔとＣｈｌｏｔｈｉａ両方の番号付けについて示されている。ＣＤＲ－Ｈ２及びＨ３の接触残基が示されている。
Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。特許出願及び特許公開を含む本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は単数形も含む。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定することを意図するものではないことを理解するべきである。以下に記載されるいずれかの定義が、参照により本明細書に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合には、以下に記載される定義が優先するものとする。
本明細書で使用される「ＫＲａｓ」は、ヒトＫＲａｓタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ヒトＫＲａｓは、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓタンパク質は、変異体（例えば、「変異ＫＲａｓ」又は「ＫＲａｓ変異体」）である。いくつかの実施態様では、変異ＫＲａｓは、配列番号９０のアミノ酸配列に対して１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は発がん性変異体である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓタンパク質は、天然に存在するＫＲａｓ変異体である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓタンパク質は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ（すなわち、１２位にシステイン置換を有するＫＲａｓ）である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓタンパク質は、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＱ６１Ｈ、又はＫＲａｓＧ１３Ｄである。本明細書で使用される「ＫＲａｓ－ＧＤＰ」は、グアノシン５’－二リン酸（ＧＤＰ）に結合したＫＲａｓを指す。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは不活性ＫＲａｓである。いくつかの実施形態では、不活性ＫＲａｓは、ｃ－ＲａｆなどのＲＡＦキナーゼに結合してそのキナーゼ活性をアロステリックに活性化することができない。いくつかの実施形態では、不活性ＫＲａｓは、ＫＲａｓの下流にあるエフェクター経路を活性化しない。いくつかの実施形態では、不活性ＫＲａｓは、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼカスケードを活性化しない。いくつかの実施形態では、不活性ＫＲａｓは、増殖を促進するシグナル伝達カスケードを活性化しない。いくつかの実施形態では、不活性ＫＲａｓは、アポトーシスを抑制するシグナル伝達カスケードを活性化しない。いくつかの実施形態では、不活性ＫＲａｓは、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１の転写を促進するシグナル伝達カスケードを活性化しない。
本明細書で使用される「ＫＲａｓ－ＧＴＰ」は、グアノシン５’－三リン酸（ＧＴＰ）に結合したＫＲａｓを指す。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは活性ＫＲａｓである。いくつかの実施形態では、活性ＫＲａｓは、ｃ－ＲａｆなどのＲＡＦキナーゼに結合してそのキナーゼ活性をアロステリックに活性化することができる。いくつかの実施形態では、活性ＫＲａｓは、ＫＲａｓの下流にあるエフェクター経路を活性化する。いくつかの実施形態では、活性ＫＲａｓは、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼカスケードを活性化する。いくつかの実施形態では、活性ＫＲａｓは、増殖を促進するシグナル伝達カスケードを活性化する。いくつかの実施形態では、活性ＫＲａｓは、アポトーシスを抑制するシグナル伝達カスケードを活性化する。いくつかの実施形態では、活性ＫＲａｓは、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１の転写を促進するシグナル伝達カスケードを活性化する。
本明細書で使用される「抗ＫＲａｓ抗体」は、ＫＲａｓ－ＧＤＰの検出、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰの検出、及び／又はＫＲａｓ－ＧＤＰの安定化に有用であるために十分な特異性と親和性でヒトＫＲａｓ－ＧＤＰに結合するものである。一実施態様において、無関係なＫＲａｓタンパク質への抗ＫＲａｓ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合、同抗体のＫｒａｓへの結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、ＫＲａｓに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８～１０－１３Ｍ、例えば１０－９～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
本明細書で使用される「ＫＲａｓ－ＧＤＰを安定化する」抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合して、ＧＴＰ結合状態よりもＧＤＰ結合状態に優先的にＫＲａｓを固定できる抗体を指す。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰを安定化する抗体は、ＣＬＡＭＰ（すなわち、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｌｏｃｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（分子プローブ発見のための配座ロック抗体）」）とも呼ばれる。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓ抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的且つ説明的な例示的実施形態は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して測定される。いくつかの実施形態では、親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－Ｔ２００、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－Ｓ２００、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－８ｋ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００装置を使用するＳＰＲアッセイを使用して測定される。いくつかの実施形態では、親和性は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される。
本明細書で使用される場合、第１の分子は、第２の分子に結合するための解離定数（ＫＤ）が第３の分子よりも低いとき、第３の分子よりも「高い親和性」で第２の分子に結合する。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、及び抗体断片を含む、様々な抗体構造を包含するが、これらに限定されない。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部分を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と、容易に結晶化するその能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋する能力を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合を構成する個々の抗体が、同一である、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体は除く。このようなバリアントは、一般に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤の各のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない多様な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、医薬製剤中に存在してもよい。
「天然抗体」は、様々な構造を持つ天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、それに続く３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、それに続く１つの定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用する非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行われる。通常、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にあるようなサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にあるようなサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体と抗原との結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインである。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は通常、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと）。抗原結合特異性を付与すために、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用し、それぞれ相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４６２８（１９９１）を参照のこと。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変である、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有する、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）に存在する。（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）。）
例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４－３４、Ｌ２の５０－５６、Ｌ３の８９－９７、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－６５及びＨ３の９５－１０２に生じる。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）。）ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、「特異性決定領域」、すなわち「ＳＤＲ」も含み、それは抗原と接触する残基である。ＳＤＲは、省略－ＣＤＲ、すなわちａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１－３４、Ｌ２の５０－５５、Ｌ３の８９－９６、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－５８、及びＨ３の９５－１０２に生じる。（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９１６３３（２００８）を参照。）別途指示がない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って番号付けされる。
「検出する」という用語は、最も広い意味で使用され、標的分子の定性的及び定量的測定値の両方を含む。一態様において、本明細書に記載される検出方法は、生体試料中のＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの存在を単に確認するために使用される。別の態様では、本方法は、試料中のＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓが検出可能なレベルで存在するかどうかを試験するために使用される。さらに別の態様では、本方法は、試料中のＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの量を定量化し、さらには異なる試料からのＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓのレベルを比較するために使用することができる。
「生体試料」は、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを含む可能性のあるあらゆる生物学的物質を指す。試料は、生体液、例えば、全血又は赤血球、白血球、血小板、血清、及び血漿を含む全血成分、腹水、硝子体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊水、乳、唾液、痰、涙、汗、粘液、脳脊髄液、及びＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを含みうる身体の他の構成成分とすることができる。種々の実施形態では、試料は、任意の動物由来の身体試料である。いくつかの実施形態では、試料は、哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト対象に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又は治療用ＫＲａｓ抗体で治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓアルキル化剤で治療された患者に由来する。特定の実施態様では、生体試料は血清又は血漿である。特定の実施態様では、生体試料は臨床患者由来の血清である。
「捕獲試薬」という用語は、目的の標的（例えば、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓ）に結合する試薬（例えば、抗体）又はそのような試薬の混合物を指し、適切な条件下で、捕獲試薬と目的の標的（例えば、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓ）の複合体を試料の残りから分離することができるように、生体試料中の目的の標的（例えば、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓ）に結合してそれを捕獲することができる。特定の実施形態では、捕獲試薬は、固定化されているか、又は固定化可能である。
「Ｆａｂ」断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインの１つ又は複数のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の、本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書では定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異Ｆｃ領域とを含む。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びている。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中において以下の配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために、互換可能に使用される。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換可能に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、それにはそのような細胞の子孫が含まれる。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらは、継代数によらず、一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されるものと同じ機能又は生物活性を有する変異体の子孫は、本発明に含まれる。
「免疫複合体」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートされている抗体であり、限定されないが、細胞傷害剤を含む。
「個体」又は「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、並びに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、個体又は対象はヒトである。
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超又は９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばＦｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９８７（２００７）を参照のこと。
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗Ｋｒａｓ抗体をコードする単離された核酸」は、抗ＫＲａｓ抗体の重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、これには単一のベクター又は別個のベクター内のそのような１つ又は複数の核酸分子が含まれ、そのような１つ又は複数の核酸分子は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すために使用され、そのような治療製品の使用法、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に提出され、それは米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から一般に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの又はこれに対するアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと若しくはこれに対して特定のアミノ酸配列同一性％を有するか又は含むということもできる）は、次のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なることが理解されるであろう。別途特に指定のない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータープログラムを使用して、直前の段落に記載されたように得られる。
「治療的有効量」は、特定の障害の測定可能な改善又は予防を実現するために必要な少なくとも最低限の濃度である。治療的有効量は、本明細書において、患者の病状、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を引き起こす抗体の能力といった因子によって変動しうる。治療的有効量は、抗体の任意の毒性又は有害な影響よりも治療的に有益な効果が勝ることでもある。
「薬学的製剤」又は「医薬組成物」という用語は、内部に含まれる活性成分の生物活性が有効になることを許すような形態であり、且つ製剤が投与される対象が許容できない毒性のあるいかなる追加の成分も含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療」（及びその文法的な変形語、例えば、「治療する」又は「治療すること」）は、治療される個体の自然の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患のあらゆる直接的又は間接的病理学的帰結の縮小、疾患進行速度の低下、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患、例えばがんの発生を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「ベクター」という用語は、本明細書では、連結している別の核酸を増殖させることのできる核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。ある種のベクターは、それが作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
本明細書でいう「ＫＲａｓ阻害剤」は、ＫＲａｓＧ１２Ｃの場合、ＫＲａｓＧ１２Ｃを、特にＣｙｓ１２残基でアルキル化する共有結合阻害剤を指す。ＫＲａｓＧ１２Ｄ又はＫＲａｓＧ１３Ｄに関連して本明細書で使用される場合、ＫＲａｓ阻害剤は、共有結合阻害剤（例えば、Ａｓｐ１２又はＡｓｐ１３に共有結合する分子）又は本明細書に記載される所与のＫＲａｓ変異体に特異的に結合する非共有結合阻害剤を指すことができる。ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、及びＫＲａｓＱ６１Ｈに関連して本明細書で使用される場合、ＫＲａｓ阻害剤は、本明細書に記載される所与のＫＲａｓ変異体に特異的に結合する非共有結合阻害剤を指すことができる。
「ＡＭＧ－５１０」は、構造：
Figure 2023524041000001
を有し、化学名４－（（Ｓ）－４－アクリロイル－２－メチルピペラジン－１－イル）－６－フルオロ－７－（２－フルオロ－６－ヒドロキシフェニル）－１－（２－イソプロピル－４－メチルピリジン－３－イル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２（１Ｈ）－オンを有する化合物を指す。
「ＭＲＴＸ－８４９」は、構造：
Figure 2023524041000002
を有し、化学名２－（（Ｓ）－４－（７－（８－クロロナフタレン－１－イル）－２－（（Ｓ）－１－メチルピロリジン－２－イル）メトキシ）－５，６，７，８－テトラヒドロピリド［３，４－ｄ］ピリミジン－４－イル）－１－（２－フルオロアクリロイル）ピペラジン－２－イル）アセトニトリルを有する化合物を指す。
「ＡＲＳ－１６２０」は、構造：
Figure 2023524041000003
を有し、化学名（Ｒ）－１－（４－（６－クロロ－８－フルオロ－７－（２－フルオロ－６－ヒドロキシフェニル）キナゾリン－４－イル）ピペラジン－１－イル）プロプ－２－エン－１－オンを有する化合物を指す。
「ＡＲＳ－８５３」は、構造：
Figure 2023524041000004
を有し、化学名１－（３－（４－（（４－クロロ－２－ヒドロキシ－５－（１－メチルシクロプロピル）フェニル）グリシル）ピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル）プロピ－２－エン－１－オンを有する化合物を指す。
「ＧＮＥ－１９５２」は、構造：
Figure 2023524041000005
を有し、化学名（Ｒ）－１－（４－（６－クロロ－７－（５－メチル－１Ｈ－インダゾール－４－イル）キナゾリン－４－イル）ピペラジン－１－イル）プロプ－２－エン－１－オンを有する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、別途指示がない限り、複数への言及を含む。
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」が付く値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体を対象とする実施態様を含む（且つ説明する）。
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態が、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。
ＩＩ．組成物及び方法
Ａ．抗Ｋｒａｓ抗体
ｉ．ヒトＫＲａｓタンパク質
一態様において、本開示は、ヒトＫＲａｓタンパク質内のエピトープのような領域と相互作用するか、又は他の方法で結合する抗体を提供する。ＫＲａｓタンパク質は、ＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路の一部である２１キロダルトンの単量体ＧＴＰａｓｅである。ＫＲａｓは、がん原遺伝子であり、ヒトがんにおいて最も変異頻度の高いがん遺伝子である（Ｈａｉｇｉｓ，ＫＭ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０１７ ３：１０）。
いくつかの実施形態では、ヒトＫＲａｓは、Ｃ－Ｋ－ＲＡＳ、ｃ－Ｋ－ｒａｓタンパク質、ｃ－Ｋ－ｒａｓ２タンパク質、ｃ－Ｋｉｒｓｔｅｎ－ｒａｓタンパク質、細胞ｃ－Ｋｉ－ｒａｓ２がん原遺伝子、Ｋ－ｒａｓ ｐ２１タンパク質、ＫＩ－ＲＡＳ、Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ、ＫＲＡＳ１、ＰＲ３１０ｃ－Ｋ－ｒａｓがん遺伝子、ＲＡＳＫ２、ＲＡＳＫ＿ＨＵＭＡＮ、形質転換タンパク質ｐ２１、ｖ－Ｋｉ－ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ、ＮＳ、ＮＳ３、ＯＥＳ、ＣＦＣ２、ＲＡＬＤ、Ｋ－Ｒａｓ、ＫＲＡＳ１、ＫＲＡＳ２、Ｋ－ＲＡＳ２Ａ、Ｋ＿ＲＡＳ２Ｂ及びＫ－ＲＡＳ４Ｂと様々に呼ばれる。
ヒトＫＲａｓ ｍＲＮＡには、ＫＲａｓタンパク質の２つのバリアントをもたらす２つのスプライスアイソフォームが存在する。「ＫＲａｓアイソフォームｂ」と呼ばれるバリアントは、優勢なバリアントであり、５つのエクソンから構成される。アイソフォームｂは、エクソン４ａを欠き、エクソン４ｂで終止する。２つ目のバリアント（アイソフォームａ）は、エクソン４ａを含む６つのエクソンから構成され、エクソン４ａで終止する稀なバリアントである。本開示において、用語「ＫＲａｓ」は、別途指定のない限り、アイソフォームｂを指す。
ヒトＫＲａｓアイソフォームｂのアミノ酸配列は、配列番号９０として以下に示される。
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
ヒトＫＲａｓアイソフォームａのアミノ酸配列は、配列番号８９として以下に示される。
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
ＫＲａｓの変異と、がんの表現型を含む様々な表現型とそれらの関係については、これまでにも報告されている（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ ｅｎｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒ １９００７０を参照）。ヒトＫＲａｓの複数の変異誘発遺伝子は、ＦＤＡのＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅｓの専門家委員会によって、病原性があると分類された。これには、コード配列バリアントＤ１５３Ｖ、Ｇ６０Ｒ、Ｔ５８Ｉ、Ｐ３４Ｌ、Ｑ２２Ｒ、Ｖ１４Ｉ、及びＫ５Ｎが含まれる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓは、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｖ、又はＡ１４６Ｔに対応する変異を有する変異ＫＲａｓである。本開示のいくつかの実施形態では、ＫＲａｓの追加の変異誘発遺伝子が使用され、それには例えば、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、ＫＲａｓＧ１３Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、及びＫＲａｓＱ６１Ｈが含まれる。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓは、ＧＴＰ及びＧＤＰの結合によってそれぞれ付与される「オン」及び「オフ」コンフォメーションを循環することによって、細胞表面受容体を細胞内エフェクター経路に結合させる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓはＧＤＰに結合しており；これら実施形態では、それはＫＲａｓ－ＧＤＰ、又は不活性ＫＲａｓと称される。他の実施形態では、ＫＲａｓはＧＴＰに結合しており；これら実施形態では、それはＫＲａｓ－ＧＴＰ、又は活性ＫＲａｓと称される。これら２つの状態間の移行は、ＧＴＰ交換のためにＧＤＰを刺激することによりＲａｓタンパク質の活性化を促進するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）により、及びＲａｓ媒介性のＧＴＰ加水分解を加速させるＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）により、制御される（Ｐｙｌａｙｅｖａ－Ｇｕｐｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１ １１）。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓの発がん性変異は、ＫＲａｓ－ＧＤＰとＫＲａｓ－ＧＴＰとの間を移行するその能力を破壊する。いくつかの実施形態では、残基Ｇ１２及びＧ１３における発がん性置換は、立体障害によってＫＲａｓとＧＡＰとの間のファンデルワールス結合の形成を妨げ、したがって、ＲＡＳにおける触媒グルタミン（Ｑ６１）の適切な配向を乱し、これによりＧＴＰ加水分解の顕著な減衰がもたらされる（Ｐｙｌａｙｅｖａ－Ｇｕｐｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ２０１１ １１；Ｓｃｈｅｆｆｚｅｋ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９７ ２７７）。結果として、いくつかの実施形態では、ＫＲａｓは構成的に活性である。
ＫＲａｓは、ＧＤＰ結合状態でのみ明らかになるアロステリックポケットを有している（Ｏｓｔｒｅａｍ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１３ ２８ ５０３：７４７７）。このポケットは、スイッチＩＩポケット、Ｓ－ＩＩＰ、又はＳＷＩＩとして知られている。ＫＲａｓの変異誘発遺伝子の一例であるＫＲａｓＧ１２Ｃは、Ｃｙｓ１２残基への阻害剤の共有結合によって標的化された。これら阻害剤は、ＳＷＩＩポケットの開放を安定化する（Ｏｓｔｒｅａｍ、Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ２８ ５０３：７４７７；Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ、Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６ ６；Ｌｉｔｏ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６ ３５１）。このようなＳＷＩＩ共有結合剤（ＳＷＩＩリガンドとしても知られる）の作用機序は、ポケットへの最初の弱い結合とそれに続くＣｙｓ１２のアルキル化によって、過渡的なＳＷＩＩポケットの安定化を通していると考えられている（Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６ ６）。これによりＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰが不活性状態にロックされ、前臨床モデルで腫瘍増殖を阻害し、有望な臨床活性を示した（Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６ ６；Ｆａｋｉｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１９ ３７）。
ｉｉ．抗Ｋｒａｓ抗体
ヒトＫＲａｓタンパク質に結合する抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓタンパク質に結合し、ここで、ＫＲａｓタンパク質は、アミノ酸配配列番号９０を含んでいる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体はヒトＫＲａｓに結合し、ここで抗体は、ＧＴＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＴＰ）よりも高い親和性で、ＧＤＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＴＰよりも低い解離定数（ＫＤ）で、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、２５℃において、ＫＲａｓ－ＧＴＰよりも低い解離定数（ＫＤ）でＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表面プラズモン共鳴によって決定した場合、ＫＲａｓ－ＧＴＰよりも低い解離定数（ＫＤ）でＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、２５℃での表面プラズモン共鳴によって決定した場合、ＫＲａｓ－ＧＴＰよりも低い解離定数（ＫＤ）でＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、抗ＫＲａｓ抗体がＫＲａｓ－ＧＴＰに結合するよりも低い解離定数（ＫＤ）でＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合するよりも高い特異性でＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合するよりも高い強度でＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＴＰよりも高い会合定数又は親和定数でＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＴＰよりも優先的にＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ ＧＴＰに検出可能な結合を示さない。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰに対し、ＫＲａｓ－ＧＴＰと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、又は少なくとも１００００倍大きな親和性を有している。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰに対し、ＫＲａｓ－ＧＴＰと比較して、１０～１００００倍大きな親和性を有している。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰに対し、ＫＲａｓ－ＧＴＰと比較して、１０～１，０００，０００倍大きな親和性を有している。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体はヒトＫＲａｓに結合し、ここで抗体は、ＧＤＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）よりも高い親和性で、ＧＴＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＴＰ）に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰよりも低い解離定数（ＫＤ）で、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、２５℃において、ＫＲａｓ－ＧＤＰよりも低い解離定数（ＫＤ）でＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表面プラズモン共鳴によって決定した場合、ＫＲａｓ－ＧＤＰよりも低い解離定数（ＫＤ）でＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、２５℃での表面プラズモン共鳴によって決定した場合、ＫＲａｓ－ＧＤＰよりも低い解離定数（ＫＤ）でＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、抗ＫＲａｓ抗体がＫＲａｓ－ＧＤＰに結合するよりも低い解離定数（ＫＤ）でＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合するよりも高い特異性でＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合するよりも高い強度でＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰよりも高い会合定数又は親和定数でＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰよりも優先的にＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、活性ＫＲａｓよりも高い親和性で不活性ＫＲａｓに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、活性ＫＲａｓに結合するよりも高い安定性で不活性ＫＲａｓに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、活性ＫＲａｓに結合するよりも低いＫＤで不活性ＫＲａｓに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、不活性ＫＲａｓに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、活性ＫＲａｓよりも高い特異性で不活性ＫＲａｓに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、活性ＫＲａｓよりも高い強度で不活性ＫＲａｓに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、活性ＫＲａｓよりも優先的に不活性ＫＲａｓに結合する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＫＲａｓの特定のコンフォメーションに結合する及び／又は同コンフォメーションを誘導する抗ＫＲａｓ抗体を提供する。特に、本明細書で提供されるのは、ＳＷＩＩポケットを開く及び／又は安定化する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションを安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの不活性なコンフォメーションを安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ阻害剤が結合できるように、ＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、開いた又は閉じたコンフォメーションでＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、開いた又は閉じたコンフォメーションでＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットへの分子の結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットへの阻害剤の結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットへのリガンドの結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットにおける共有結合ＫＲａｓ阻害剤（例えば、Ｃｙｓ１２をアルキル化するＫＲａｓ阻害剤）の結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合し、残基Ｃｙｓ１２の共有結合（例えば、アルキル化）を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄに結合し、残基Ａｓｐ１２の共有結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３Ｄに結合し、残基Ａｓｐ１３の共有結合を向上させる。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、非共有結合ＫＲａｓ阻害剤（例えば、ＳＷＩＩポケット内の残基１２又は１３に非共有結合するＫＲａｓ阻害剤）の結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄに結合し、残基Ａｓｐ１２の非共有結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄに結合し、残基Ａｓｐ１２の共有結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｖに結合し、残基Ｖａｌ１２の非共有結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｒに結合し、残基Ａｒｇ１２の非共有結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３Ｄに結合し、残基Ａｓｐ１３の非共有結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３Ｄに結合し、残基Ａｓｐ１３の共有結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＱ６１Ｈに結合し、残基Ｈｉｓ６１の非共有結合を向上させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＫＲａｓがより頻繁に特定のコンフォメーションになるようにする抗ＫＲａｓ抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓに特定のコンフォメーションを占有させる。特に、本明細書で提供されるのは、ＫＲａｓが開いたＳＷＩＩポケットをより頻繁に含むようにする抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓがより頻繁に開いたコンフォメーションになるようにする。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ ＳＷＩＩポケットをより頻繁に開かせる及び／又は安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ阻害剤が結合できるように、ＳＷＩＩポケットをより頻繁に開かせ、安定化する。このような実施形態において、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体は、１２位の残基を阻害剤に対してよりアクセスし易くする、及び／又は阻害剤によって安定化することができる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、リガンドがＳＷＩＩポケットに結合する可能性を高める。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットが共有結合ＫＲａｓ阻害剤によって結合される（例えば、アルキル化される）可能性を高める。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合し、残基Ｃｙｓ１２が共有結合阻害剤によって結合される（例えば、アルキル化される）可能性を高める。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットが非共有結合ＫＲａｓ阻害剤によって結合される可能性を高める。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄに結合し、残基Ａｓｐ１２が非共有結合性阻害剤によって結合される可能性を高める。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｖに結合し、残基Ｖａｌ１２が非共有結合性阻害剤によって結合される可能性を高める。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｒに結合し、残基Ａｒｇ１２が非共有結合性阻害剤によって結合される可能性を高める。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３Ｄに結合し、残基Ａｓｐ１３が非共有結合性阻害剤によって結合される可能性を高める。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＱ６１Ｈに結合し、残基Ｈｉｓ６１が非共有結合性阻害剤によって結合される可能性を高める。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＫＲａｓのコンフォメーションに影響を与える抗ＫＲａｓ抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓタンパク質の構造に影響を与える。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓが特定のコンフォメーションを占める相対頻度を変化させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、特定のコンフォメーションに対するＫＲａｓの優先性を変化させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの構造をアロステリックに制御する。特に、本明細書で提供されるのは、ＳＷＩＩポケットの開放を促進する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットの安定化を促進する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＣにおけるＳＷＩＩポケットの安定化を促進する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＤにおけるＳＷＩＩポケットの安定化を促進する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＶにおけるＳＷＩＩポケットの安定化を促進する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＲにおけるＳＷＩＩポケットの安定化を促進する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３ＤにおけるＳＷＩＩポケットの安定化を促進する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＱ６１ＨにおけるＳＷＩＩポケットの安定化を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションの安定化を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットの開放及び安定化を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの不活性なコンフォメーションの安定化を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ阻害剤が結合できるように、ＳＷＩＩポケットの開放及び安定化を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットへのリガンドの結合を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットへの阻害剤の結合を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットへのリガンドの結合を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットの共有結合アルキル化を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合し、残基Ｃｙｓ１２のアルキル化を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、非共有結合ＫＲａｓ阻害剤による結合を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄに結合し、抗体は、非共有結合性阻害剤によって残基Ａｓｐ１２への結合を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｖに結合し、抗体は、非共有結合性阻害剤によって残基Ｖａｌ１２への結合を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｒに結合し、抗体は、非共有結合性阻害剤によって残基Ａｒｇ１２への結合を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３Ｄに結合し、抗体は、非共有結合性阻害剤によって残基Ａｓｐ１３への結合を促進する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＱ６１Ｈに結合し、抗体は、非共有結合性阻害剤によって残基Ｈｉｓ６１への結合を促進する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＫＲａｓの特定のコンフォメーションに結合する及び／又は同コンフォメーションを誘導する抗ＫＲａｓ抗体を提供する。特に、本明細書で提供されるのは、ＳＷＩＩポケットの閉鎖を妨害する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットの閉鎖を防止する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＣのＳＷＩＩポケットの閉鎖を防止する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＤにおけるＳＷＩＩポケットの閉鎖を防止する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＶにおけるＳＷＩＩポケットの閉鎖を防止する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＲにおけるＳＷＩＩポケットの閉鎖を防止する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３ＤにおけるＳＷＩＩポケットの閉鎖を防止する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＱ６１ＨにおけるＳＷＩＩポケットの閉鎖を防止する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓが閉じたコンフォメーションをとることを妨害又は防止する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットの閉じたコンフォメーションを妨害又は防止する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ阻害剤が結合できるように、ＳＷＩＩポケットの閉鎖を妨害又は防止する。いくつかの実施形態において、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの非閉鎖コンフォメーションに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、閉じていないＫＲａｓ ＳＷＩＩポケットのコンフォメーションに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓが閉じたコンフォメーションにある可能性を低下させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓが閉じたコンフォメーションにある頻度を低下させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＫＲａｓの特定のコンフォメーションの誘導をもたらす。特に、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体の結合は、開いたＳＷＩＩポケットをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃに開いたＳＷＩＩポケットをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄに開いたＳＷＩＩポケットをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｖに開いたＳＷＩＩポケットをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｒに開いたＳＷＩＩポケットをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３Ｄに開いたＳＷＩＩポケットをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＱ６１Ｈに開いたＳＷＩＩポケットをもたらす。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、安定的に開いたＳＷＩＩポケットをもたらす。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、開いている可能性のより高いＳＷＩＩポケットをもたらす。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＳＷＩＩポケットの開放をもたらす。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＳＷＩＩポケットの安定化をもたらす。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションの安定化をもたらす。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＳＷＩＩポケットの開放及び安定化をもたらす。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＫＲａｓの不活性なコンフォメーションの安定化をもたらす。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＫＲａｓ阻害剤が結合できるように、ＳＷＩＩポケットの開放及び安定化をもたらす。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＳＷＩＩポケットへの阻害剤の結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＳＷＩＩポケットへのリガンドの結合を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＳＷＩＩポケット共有結合アルキル化を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体のＫＲａｓＧ１２Ｃへの結合は、残基Ｃｙｓ１２のアルキル化を向上させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＫＲａｓの特定のコンフォメーションに特異的に結合する及び／又は同コンフォメーションを特異的に誘導する抗ＫＲａｓ抗体を提供する。特に、本明細書で提供されるのは、ＳＷＩＩポケットを特異的に開く抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットを特異的に安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＤのＳＷＩＩポケットを特異的に安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＶのＳＷＩＩポケットを特異的に安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＲのＳＷＩＩポケットを特異的に安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３ＤのＳＷＩＩポケットを特異的に安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＱ６１ＨのＳＷＩＩポケットを特異的に安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションを特異的に安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットを特異的に開いて安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの不活性なコンフォメーションを特異的に安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ阻害剤が結合できるように、ＳＷＩＩポケットを特異的に開いて安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションに特異的に結合する。
本開示のいくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、クラスＩ抗体と呼ばれ、例えば、抗体１Ａ５、１Ｄ６、２Ｃ１、１Ａ６、１Ｆ４、及び１Ｂ７を含む。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、ＫＲａｓ阻害剤に共有結合したＫＲａｓ（例えば、Ｃｙｓ１２が共有阻害剤によってアルキル化されている）に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、共有結合されたＳＷＩＩ阻害剤の存在下で結合する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、共有結合されたＳＷＩＩリガンドの存在下で結合する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓは、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７からなる群から選択されるＫＲａｓ阻害剤に共有結合する。別の実施形態では、ＫＲａｓは、ＡＲＳ１６２０又はＧＮＥ１９５２などの化合物に共有結合する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、ＳＷＩＩポケットが開いたコンフォメーションにあるＫＲａｓに結合する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、ＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＤのＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＶのＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、ＫＲａｓＧ１２ＲのＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、ＫＲａｓＧ１３ＤのＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、ＫＲａｓＱ６１ＨのＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、開いたコンフォメーショでＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、ＫＲａｓのアルキル化を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、共有結合阻害剤に対するＫＲａｓＧ１２Ｃの結合を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、腫瘍細胞においてインビボでアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰを検出するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、腫瘍細胞においてインビボでアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰを検出するために使用されてもよい。いくつかのそのような実施形態では、検出は、ＫＲａｓ阻害剤（例えば、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７）で治療されている患者におけるＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化をモニタリングするために使用される。
いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、閉じたコンフォメーションと比較して、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションに対して少なくとも５倍、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍大きな親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、閉じたコンフォメーションと比較して、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションに対して２～１０００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、閉じたコンフォメーションと比較して、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションに対して１０～１０００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、閉じたコンフォメーションと比較して、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションに対して１０～１００００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、閉じたコンフォメーションと比較して、ＫＲａｓの開いたコンフォメーションに対して１０～１０００００倍増加した親和性を有している。
本開示のいくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、本明細書に記載されるＫＲａｓのＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを安定化する。いくつかの実施形態では、抗Ｋｒａｓ抗体クラスＩ又はクラスＩＩ抗体である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｄ６である。いくつかの実施形態では、抗体は２Ｃ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ６である。いくつかの実施形態では、抗体は１Ｂ７である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｅ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｈ１１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ａ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は３Ａ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は４Ｇ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｆ４である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ４である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ７である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ８である。
本開示のいくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓに結合し、ＳＷＩＩポケットが開いているＫＲａｓのコンフォメーションを誘導する。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体は、最初に、閉じたＳＷＩＩポケットを有するＫＲａｓに結合し、ＳＷＩＩポケットが開くようにＫＲａｓのコンフォメーションの変化を誘導する。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体の結合は、ＳＷＩＩポケットを開かせる。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットの開放を促進する。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのコンフォメーションを変化させる。いくつかの実施形態では、アルキル化誘導性ＫＲａｓ抗体は、クラスＩＩ抗体である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体は、クラスＩＩ抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＦＡＰＫＲａｓ抗体は、１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、又は４Ｇ１２である。いくつかの実施態様では、抗ＫＲａｓ抗体は、１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、４Ｇ１２、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施態様では、抗Ｋｒａｓ抗体は、２Ｈ１１、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施態様では、抗ＫＲａｓ抗体は、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｅ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｈ１１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ａ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は３Ａ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は４Ｇ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｆ４である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ４である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ７である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ８である。
いくつかの実施形態では、本開示のアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体は、共有結合したＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤又はＳＷＩＩリガンドの非存在下で、ＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを安定化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、最初に、開いたＳＷＩＩポケットを有するＫＲａｓに結合し、本明細書に記載されるＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施形態では、本開示のアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体は、非共有結合ＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤又はＳＷＩＩリガンドの非存在下でＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを安定化する。いくつかの実施形態では、ＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションは、そのような抗体によって結合されていない野生型ＫＲａｓタンパク質におけるよりも開いた状態である可能性が高いとき、ＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションが安定化していると考えられる。いくつかの実施形態では、ＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションは、開いたコンフォメーションが通常存在するよりも頻繁に存在するとき、誘導されたと考えられる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ ＳＷＩＩポケットを開いたコンフォメーションにロックする。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットが閉じるのを防止する。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ及び野生型ＫＲａｓに対する数Ｇ１２Ｃ阻害剤の非共有結合親和性を向上させる。
いくつかの実施形態では、アルキル化誘導性抗ＫＲａｓ抗体は、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びアルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰにほぼ同じ親和性で結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びアルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰに、互いの１０倍以内、５倍以内、又は２倍以内の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びアルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰに、互いの１０倍から２倍の間の親和性で結合する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトＫＲａｓがＫＲａｓ変異体であるヒトＫＲａｓに結合する抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片を提供する。本開示のいくつかの実施形態では、ＫＲａｓ変異体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃである。ＫＲａｓのコドン１２における変異は、ＫＲＡＳが 最も一般的であるがん（すなわち、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））において優勢である（Ｈａｉｇｉｓ，ＫＭ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０１７ ３：１０）。ＫＲａｓＧ１２Ｃは、上記のように変異した残基Ｃｙｓ１２に共有結合する化合物によって標的とされたＫＲＡＳの特定の対立遺伝子である。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異タンパク質に結合する。本開示のいくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＧ１２Ｖである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＧ１２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＱ６１Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＧ１２Ｄである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＧ１３Ｄである。
いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子と共有結合した（例えばアルキル化した）ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合するアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、小分子によって共有結合されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合するアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＭＲＴＸ８４９と共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＡＭＧ－５１０と共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＧＤＣ－６０３６と共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＡＲＳ－３２４８と共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＬＹ３４９９４４６と共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＪＮＪ－７４６９９１５７と共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７に共有結合（例えばアルキル化）する。
いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、本明細書に記載される臨床試料中の、小分子に共有結合した（例えばアルキル化した）ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合するアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、本明細書に記載される患者から採取した腫瘍試料中の小分子によって共有結合されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合するアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかのそのような実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＭＲＴＸ８４９に共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかのそのような実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＡＭＧ－５１０に共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかのそのような実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＧＤＣ－６０３６に共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかのそのような実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＡＲＳ－３２４８に共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかのそのような実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＬＹ３４９９４４６に共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかのそのような実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＪＮＪ－７４６９９１５７に共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかのそのような実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７に共有結合（例えばアルキル化）する。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、本明細書に記載されるＫＲａｓ－ＧＤＰに結合するアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体であり、本明細書に記載される標的係合のレベルの決定のためのバイオマーカーアッセイにおいて使用される。
いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰがアルキル化されているとき、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰがアルキル化されていない場合よりも高い親和性でＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｒ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３Ｄ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は、ＫＲａｓＱ６１Ｈ－ＧＤＰに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、変異ＫＲａｓ－ＧＤＰが共有結合又は非共有結合ＫＲａｓ阻害剤によって結合されているとき、変異ＫＲａｓ－ＧＤＰが共有結合又は非共有結合ＫＲａｓ阻害剤によって結合されていない場合よりも高い親和性で前記変異ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する。
いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰの少なくとも５倍、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍高い親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰより２～１０００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰより１０～１０００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰより１０～１０００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰより１０～１００００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰより１０～１０００００倍増加した親和性を有している。
いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰの少なくとも５倍、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍高い親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰより２～１０００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰより１０～１０００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰより１０～１０００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰより１０～１００００倍増加した親和性を有している。いくつかの実施形態では、アルキル化コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰに対して、非アルキル化ＫＲａｓ－ＧＴＰより１０～１０００００倍増加した親和性を有している。
いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＧ１２Ｄ－ＧＤＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＧ１２Ｄ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＤＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＧ１２Ｒ－ＧＤＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＧ１２Ｒ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＱ６１Ｈ－ＧＤＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＱ６１Ｈ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＧ１３Ｄ－ＧＤＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合断片は、小分子に共有結合したＫＲａｓＧ１３Ｄ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体である。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体２Ｈ１１の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体２Ｈ１１のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体２Ｈ１１の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体２Ｈ１１のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体Ａｂ１の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体Ａｂ１のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体Ａｂ１の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体Ａｂ１のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ１は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ１は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体Ａｂ２の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体Ａｂ２のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体Ａｂ２の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体Ａｂ２のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ２は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ２は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体Ａｂ３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体Ａｂ３のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体Ａｂ３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体Ａｂ３のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ３は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ３は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体Ａｂ４の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体Ａｂ４のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体Ａｂ４の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体Ａｂ４のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ４は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ４は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体Ａｂ５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体Ａｂ５のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体Ａｂ５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体Ａｂ５のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ５は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ５は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体Ａｂ６の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体Ａｂ６のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体Ａｂ６の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体Ａｂ６のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ６は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ６は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体Ａｂ７の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体Ａｂ７のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体Ａｂ７の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体Ａｂ７のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ７は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ７は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体Ａｂ８の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体Ａｂ８のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体Ａｂ８の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体Ａｂ８のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ８は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体Ａｂ８は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１６のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号１６を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態において、配列番号１６において合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号９９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号９９のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号９９を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号９９において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１００のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号１００を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号１００において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号１０１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１０１のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号１０１を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号１０１において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１０２のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号１０２を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号１０２において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１０３のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号１０３を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号１０３において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号１０４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１０４のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号１０４を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号１０４において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号１０５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１０５のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号１０５を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号１０５において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１０６のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号１０６を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号１０６において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号１５のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号１５を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号１５において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１００のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号１６に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号１５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号９９に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号１５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号１００に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号１５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号１０１に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号１５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号１０２に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号１５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号１０３に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号１５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号１０４に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号１５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号１０５に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号１５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号１０６に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号１５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体１Ａ５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体１Ａ５のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体１Ａ５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体１Ａ５のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号８のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号８を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号８において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号７のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号７を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号７において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号８に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号７に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体１Ｄ６の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体１Ｄ６のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体１Ｄ６の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体１Ｄ６のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号２４のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号２４を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態において、配列番号２４において合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号２３のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号２３を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号２３において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号２４に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号２３に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体２Ｃ１の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体２Ｃ１のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体２Ｃ１の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体２Ｃ１のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号３２のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号３２を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号３２において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号３１のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号３１を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号３１において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号３２に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号３１に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体４Ｇ１２の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体４Ｇ１２のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体４Ｇ１２の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体４Ｇ１２のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号４０のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号４０を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号４０において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号３９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号３９のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号３９を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号３９において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号４０に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号３９に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体１Ａ６の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体１Ａ６のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体１Ａ６の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体１Ａ６のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号４８のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号４８を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号４８において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号４７のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号４７を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号４７において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号４８に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号４７に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体１Ｆ４の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体１Ｆ４のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、１Ｆ４の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体１Ｆ４のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異体ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号８８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号８８のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号８８を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号８８において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号８７のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号８７を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号８７において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号８８に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号８７に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体１Ｂ７の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体１Ｂ７のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体１Ｂ７の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体１Ｂ７のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号５６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号５６のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号５６を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号５６において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号５５のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号５５を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号５５において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号５６に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号５５に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体１Ｅ５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体１Ｅ５のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体１Ｅ５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体１Ｅ５のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号６４のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号６４を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号６４において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号６３のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号６３を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号６３において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号６４に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号６３に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体２Ａ３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体２Ａ３のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体２Ａ３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体２Ａ３のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号７２のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号７２を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号７２において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号７１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号７１のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号７１を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号７１において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号７２に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号７１に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表２及び表３に示されるように、抗体３Ａ１２の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表４及び表５に示されるように、抗体３Ａ１２のＶＨ及び／又はＶＬを含む。特定の実施形態では、３Ａ１２の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲ、及び／又は抗体３Ａ１２のＶＨ及び／又はＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ変異ＫＲａｓＧ１２Ｃに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開いて安定化する。
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、配列番号８０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号８０のアミノ酸配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号８０を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号８０において、合計で１～１３個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３。
別の実施形態では、配列番号７９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号７９のアミノ酸配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、配列番号７９を含む抗ＫＲａｓ抗体としてＫＲａｓに結合する能力を維持する。特定の実施形態では、配列番号７９において、合計で１～１１個のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は削除されている。特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。
一実施態様において、抗Ｋｒａｓ抗体は、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
別の態様では、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨと、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬとを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、配列番号８０に示される配列を有するＶＨ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と；配列番号７９に示される配列を有するＶＬ内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
別の態様では、上記に提供される実施形態のいずれかにおけるＶＨ、及び上記に提供される実施形態のいずれかにおけるＶＬを含む抗ＫＲａｓ抗体が提供される。
本発明のさらなる態様では、上記実施形態のいずれかによる抗ＫＲａｓ抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗Ｋｒａｓ抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体又は本明細書において定義される他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。
本発明の一実施形態では、上記実施形態による抗ＫＲａｓ抗体は、ヒトＫＲａｓの１つ以上のアミノ酸エピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ヒトＫＲａｓのアミノ酸Ｗ９９、Ｋ５、Ｌ６、Ｖ７、Ｓ３９、Ｄ５４、Ｌ５４、Ｙ７１、Ｔ７４、及び／又はＧ７５の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、又はすべてに結合し、ここでヒトＫＲａｓはアミノ配列の配列番号９０を含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ヒトＫＲａｓのＷ９９に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ヒトＫＲａｓのＳＷ１及びＳＷ２からの残基に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ヒトＫＲａｓのＳＷ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、以下の表Ａ～Ｄに記載されたアミノ酸残基に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表Ａに記載の残基の３．５、４．０、又は４．５オングストローム（Å）以内に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表Ｂに記載の残基の３．５、４．０、又は４．５Å以内に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表Ｃに記載の残基の３．５、４．０、又は４．５Å以内に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、表Ｄに記載の残基の３．５、４．０、又は４．５Å以内に結合する。
表Ａ：２Ｈ１１の接触残基
Figure 2023524041000006
表Ｂ：２Ｃ１の接触残基
Figure 2023524041000007
表Ｃ：１Ｅ５の接触残基
Figure 2023524041000008
表Ｄ：３Ａ１２の接触残基
Figure 2023524041000009
いくつかの実施形態では、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、及びＡｂ８の接触残基は、図１１Ａ及び図１１Ｂに示される通りである。
本明細書で提供される別の態様では、ＫＲａｓタンパク質（例えば配列番号９０）又はその断片と、本明細書に記載される抗体のＦａｂ、ｓｃＦｖ、又はＩｇＧとを含む融合タンパク質が提供される。そのような一実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に記載されるＫＲａｓタンパク質又はその断片、ｎが少なくとも１である（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含むリンカー、及び本明細書に記載されるＦａｂ、ｓｃＦｖ、又はＩｇＧを含む。そのような一実施態様では、ｎは、１～５、１～８、１～１０又は１～２０の整数である。一実施形態では、ＫＲａｓタンパク質又はその断片は、本明細書に記載されるＦａｂのＮ末端に融合する。そのような一実施形態では、ＫＲａｓとＦａｂのＮ末端との間にリンカーが存在する。別の実施形態では、ＫＲａｓタンパク質又はその断片は、ＦａｂのＣ末端に結合している。そのような一実施形態では、ＫＲａｓタンパク質のＮ末端とＦａｂのＣ末端との間に、本明細書に記載されるリンカーが存在する。
本明細書に記載される融合タンパク質の一実施形態では、ＦａｂはＨＣ配列：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＰＧＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＧＳＩＳＳＳＮＷＷＳＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＫＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１０７）、
及びＬＣ配列：
ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＳＥＮＬＹＦＱＳＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＳＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＬＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＳＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＲＮＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＲＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号１０８）
を含む。
本明細書に記載される融合タンパク質の別の実施形態では、Ｆａｂは、ＨＣ配列：
ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＳＥＮＬＹＦＱＳＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＳＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＬＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＳＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＰＧＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＧＳＩＳＳＳＮＷＷＳＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＫＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１０９）
及びＬＣ配列：
ＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＲＮＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＲＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号１１０）
を含む。
本発明のさらなる態様では、上記実施形態のいずれかによる又は本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体は、異種部分、薬剤、又は標識にコンジュゲートしている。適切な標識の例は、蛍光色素標識、化学発光標識、放射性標識などの直接検出されうる部分と、検出されるために反応させなければならないか又は誘導しなければならない酵素などの部分とを含む、イムノアッセイにおける使用のために知られている多数の標識である。そのような標識の例には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体といったフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ＨＲＰ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化させる酵素、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼとカップリングされたウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環式オキシダーゼ、ビオチン（ＭＵＧを用いて、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン－ＨＲＰ、及びストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼによって検出可能）、スピン標識、バクテリオファージ標識、並びに安定したフリーラジカルなどが含まれる。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、上記実施形態のいずれかによる抗ＫＲａｓ抗体、又は本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体の１つ以上を含む組成物である。また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体をコードする核酸、この核酸を含むベクター、及びこのベクターを含む宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は単離又は精製される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞培地である。
ｉｉｉ．生成の方法
１．ポリクローナル抗体
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に既知である。ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば、免疫剤及び所望であればアジュバントの１回又は複数回の注射によって産生することができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントは、複数回の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物に注射される。免疫剤は、ヒトＫＲａｓ、又はその融合タンパク質を含んでもよい。免疫される哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫剤をコンジュゲートさせることが有用でありうる。そのような免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、及びダイズトリプシン阻害因子が含まれるが、これらに限定されない。用いることができるアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント、及びＭＰＬ－ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が含まれる。免疫プロトコールは、当業者であれば過度な実験を行うことなく選択することができる。哺乳動物は次いで採血され、その血清を抗ＫＲａｓ抗体価についてアッセイすることができる。所望であれば、哺乳動物は、抗体価が増加するか又はプラトーに達するまで追加免疫することができる。
２．モノクローナル抗体
本発明の抗体は、代替的にモノクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよいし、又は組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製されてもよい。
ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適正な宿主動物、例えばハムスターが、上記のように免疫されて、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産生できるリンパ球が誘発される。代替的に、リンパ球はインビトロで免疫されてもよい。免疫化の後、リンパ球は単離され、次いでポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞（融合パートナーと呼ばれる）の増殖又は生存を阻害する１種又は複数種の物質を含有する適切な培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用選択培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むことになり（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支援し、融合していない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である。骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍、並びにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能なＳＰ－２及び誘導体、例えばＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｒｎｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；及びＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫溶媒アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）に記載されるスキャチャード解析によって決定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定されたら、クローンを、限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的方法によって増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的のための適切な培地には、例えば、Ｄ－ＭＥＭ又はＲＰＭＩ－１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、例えば、この細胞をマウスに腹腔内注射することによって、動物内での腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ－セファロースを使用するもの）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などの従来の抗体精製手順によって、培地、腹水、又は血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源として機能する。単離した後、ＤＮＡを発現ベクター内に配置することができ、次いでそれは、宿主細胞、例えば、元来抗体タンパク質を産生しない、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞中にトランスフェクされ、組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成物が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に関する概説論文には、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６－２６２（１９９３）及びＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１－１８８（１９９２）が含まれる。
さらなる実施形態では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４（１９９０）に記載される技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１５９７（１９９１）は、ファージライブラリーを使用した、それぞれ、マウス及びヒト抗体の単離について記載している。その後の刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９７８３（１９９２））、並びに極めて大きいファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組み換えを記載している（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５２２６６（１９９３））。したがって、これら技術は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替手段である。
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を表示するファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択される。そのようなファージライブラリーは、所望の抗原に対してスクリーニングされる。所望の抗原に結合できるＦｖ断片を発現するクローンは、抗原に吸着され、よってライブラリーの非結合クローンから分離される。次いで、結合クローンは抗原から溶出され、抗原吸着／溶出のサイクルを追加することによりさらに濃縮されうる。
可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３４５５（１９９４）に記載されるように、ファージ上に、ＶＨとＶＬとが短い可撓性のペプチドにより共有結合している単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はそれらの各々が定常ドメインに融合して非共有的に相互作用するＦａｂ断片として、機能的に表示することができる。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換えることができ、次いでこれは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合クローンについて検索することができる。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ、１２：７２５７３４（１９９３）に記載されるように、ナイーブなレパートリーを、どのような免疫化もすることなく、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対してヒト抗体の単一起源を提供するために、クローンニングすることができる。最終的には、ナイーブライブラリーは、また、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードさせ、インビトロでの再配列を達成させることによって、合成的に作製することができる。
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で既知の様々な技術によって達成することができる。例えば、ヒトＫＲａｓは、吸着プレートのウェルのコーティングに使用して、吸着プレートに付着させた宿主細胞上で発現させる若しくはセルソーティングに使用するか、又はストレプトアビジンコートされたビーズにより捕獲するためにビオチンにコンジュゲートさせるか、又はジディスプレイライブラリーのパニングのための他のいずれかの方法において使用することができる。
遅い解離動態（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８：３０９３１４（１９９０）及び国際公開第９２／０９６９０号に記載されるような長い洗浄及び一価のファージディスプレイと、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９７８３（１９９２）に記載されるような抗原の低いコーティング密度を使用することによって促進することができる。
本発明の抗ＫＲａｓ抗体のいずれもが、目的とするファージクローンを選択するのに適した抗原スクリーニング手順を設計し、続いて、目的とするファージクローンからのＦｖ配列と、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３に記載される適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長の抗ＫＲａｓ抗体クローンを構築することによって得ることができる。
３．コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体の選択
本明細書に提供される方法は、ヒトＫＲａｓの特定のコンフォメーションに結合する抗体をスクリーニングするために使用することができる。一実施形態では、本発明は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰよりも高い親和性でＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する抗体をスクリーニングするために使用することができる。例えば、この方法は、（ａ）抗体ライブラリーを、ｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、ｉｉ）アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、及びｉｉｉ）非加水分解性ＧＴＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃと接触させることと、（ｂ）非加水分解性ＧＴＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃよりも高い親和力で、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する抗体を選択することを含みうる。
例えば、合成抗体ライブラリーと別個のコンフォメーションのヒトＫＲａｓＧ１２Ｃとを使用して、インビトロ選択戦略を使用することができる。例えば、アルキル化されているか又はアルキル化されていない、ＧＤＰに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃと、ＧＭＰＰｃｐ（非加水分解性ＧＴＰ模倣物）に結合した非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃを使用することができる。合成ファージライブラリーが、小分子Ｇ１２Ｃ阻害剤であるＧＮＥ－１９５２でアルキル化したビオチン化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰと共に溶液中でインキュベートされるバイオパニングが実施されてもよい（Ｌｉ Ｌｉａｎｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２０１７０５８７６８号）。ＡＲＳ－８５３及びＡＲＳ－１６２０のような他の小分子が、Ｃｙｓ１２に共有結合させ、それによってＫＲａｓＧ１２Ｃを開いたＳＷＩＩコンフォメーションにロックするために使用されうる。アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰの独自のコンフォメーションに向けて選択するために、溶液中における過剰な非ビオチン化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＭＰＰｃｐの存在下で選択が行われてもよい。したがって、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰはビオチン化して回収できるため、開いたコンフォメーションのＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ－１９５２に特異的であり、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＭＰＰｃｐには特異的でない抗体が濃縮されうる。
コンフォメーション特異的抗ＫＲａｓ抗体の選択は、例えば、既存の合成Ｆａｂファージディスプレイライブラリー（Ｃ．Ｖ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００４；３４０：１０７３－１０９３；Ｗ．Ｃ．Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００７；３６６：８１５－８２９）を使用して実施することができる。プールされたライブラリーは、ビオチン化ＫＲａｓＧ１２Ｃｉ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ１９５２への溶液中での結合を３～４回繰り返すことができる（最初は５００ｎＭから１０ｎＭまでの範囲）。この溶液をＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ ｂｅａｄｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で捕獲し、５ ｕＭ のビオチンでブロックし、ＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＢＴ）で各３０秒間３回洗浄し、１００ｍＭ ＨＣｌで溶出することができる。溶出したファージは、Ｍ１３－ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えた大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で一晩増幅する前に、１Ｍ トリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和することができる。アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃに特異的な結合剤を濃縮するために、１μＭの可溶性ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ又はＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＭＰＰｃｐの過剰な存在下で選択を行うことができる。選択後、個々のコロニーを摘出し、カルベニシリンとヘルパーファージを補充した２ｘＹＴ培地の９６ウェルのディープウェルプレートで３０℃で一晩増殖させることができる。ファージ上清を、ＫＲａｓＧ１２Ｃｉ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ１９５２、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＭＰＰｃｐに対するファージＥＬＩＳＡに使用して、コンフォメーション特異的ＫＲａｓ標的に特異的なクローン同定することができる。
ｉｖ．組み換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組み換え法及び組成物を使用して生成されうる。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしうる。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸と、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸とを含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それで形質転換される）。一実施形態では、宿主細胞は、真核性であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体を作製する方法であって、上述された、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適切な条件下で培養することと、任意に、抗体を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することとを含む方法が提供される。
抗ＫＲａｓ抗体の組み換え生成のために、例えば上述された、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。そのような核酸は、容易に単離可能であり、従来の手順を用いて（例えば抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
抗体コード化ベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合には、細菌中で生成されうる。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号、及び同第５８４０５２３号を参照。（大腸菌における抗体断片の発現を記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５２５４も参照）。発現の後、抗体を、可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離して、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターのクローニング又は発現宿主として適しており、その中には、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌及び酵母株が含まれており、その結果、部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体が生成される。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照。
また、グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは昆虫細胞と組み合わせて使用することができ、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用することができる。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載している）を参照されたい。
脊椎動物細胞も、宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ １株；ヒト胎児性腎株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒａｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎細胞（ＣＶ １）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲ０－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ ０２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるもの；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＫ－ＣＨＯ細胞（ＵＵｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳＯ、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体生成に適した特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。
ｖ．アッセイ
本明細書に提供される抗ＫＲａｓ抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定されうるか、スクリーニングされうるか、又は特徴付けられうる。
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの既知の方法により、その抗原結合活性について試験される。結合親和性は、当技術分野において一般的な方法によって測定することができる。一実施態様では、抗体のＫＤは、Ｆａｂの溶液結合親和性を、標識されていない抗原の滴定系列の存在下において、最小濃度の（１２５Ｉ）－標識抗原でＦａｂを均衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体でコートされたプレートと結合した抗原を捕獲することにより測定する以下のアッセイにより記載されるように、抗体のＦａｂバージョンと抗原分子を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５８８１）。このアッセイの条件を確立するために、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５ｕｇ／ｍｌの捕獲用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コートし、その後、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２～５時間室温（およそ２３℃）でブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）内で、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］－抗原を、段階希釈した目的のＦａｂと混合する（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ．ａｌ．，（１９９７），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３４５９９の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ－１２の評価と一致）。目的のＦａｂを次いで一晩インキュベートするが、インキュベーションは、確実に平衡に達するように、より長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を捕獲プレートに移して、室温で１時間インキュベートする。次いで、溶液を除去し、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０ｕｌ／ウェルのシンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ－２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）でプレートを１０分間計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選択する。
別の実施形態によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００機器（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップと共に２５℃で使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定される。いくつかの実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。約３～１０μＬ／分（例えば、５μＬ／分）の流量で注入しておよそ１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成する前に、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で約３～１０μｇ／ｍｌ（例えば、０．２μＭ）に希釈することができる。抗原の注入後、エタノールアミン（例えば、１ｍＭ）を注入して、未反応基をブロックすることができる。動力学測定については、本明細書に記載されているようなＦａｂの２倍の段階希釈物（例えば、０．７８ｎＭ～５００ｎＭの濃度）を、２５℃でＴＷＥＥＮ ２０ＴＭ界面活性剤（ＰＢＳＴ）（例えば、０．０５％）を含むＰＢＳに注入することができる。注入の流量は、およそ１０～５０μＬ／分（例えば、２５μＬ／分）とすることができる。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、計算することができる。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算することができる。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照のこと。上記表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、会合速度は、例えばｐＨ約６．８～７．５（例えば、７．２）のＰＢＳ中、１０～５０ｎＭ（例えば、２０ｎＭ）の濃度の抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃における蛍光放出強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過１６ｎｍ）の増減を測定する蛍光消光技術を使用することにより、決定することができる。測定は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定されるように、漸増濃度の抗原の存在下で実施することができる。
別の態様では、ヒトＫＲａｓの結合について本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかと競合する別の抗ＫＲａｓ抗体を同定するために、競合アッセイが使用されうる。特定の実施形態では、そのような競合抗体は、ＫＲａｓの同じエピトープ（例えば、線状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）”Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に示されている。
例示的な競合アッセイでは、それぞれＫＲａｓに結合する第１の標識抗体（例えば、第１の標識抗ＫＲａｓ抗体）及びＫＲａｓへの結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗体（例えば、第２の非標識抗ＫＲａｓ抗体）を含む溶液中で、固定化されたヒトＫＲａｓタンパク質がインキュベーされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在していてもよい。コントロールとして、固定化されたＫＲａｓは、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体のＫＲａｓへの結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化されたＫＲａｓに関連する標識の量を測定する。固定化されたＫＲａｓに関連する標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体がＫＲａｓへの結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。競合アッセイは、ＫＲａｓでトランスフェクされ、細胞表面上に発現された細胞を使用するＦＡＣＳを用いて上述の方式で実施することもできる。加えて、ＫＲａｓを用いるＥＬＩＳＡも、競合アッセイに使用することができる。
別の態様では、ゲルシフトアッセイが、本発明の抗ＫＲａｓ抗体とヒトＫＲａｓといった標的タンパク質との間の相互作用を同定するために使用されうる。例示的なゲルシフトアッセイでは、ヒトＫＲａｓを抗ＫＲａｓ抗体と共にプレインキュベートする。抗ＫＲａｓ抗体と共にプレインキュベートしたＫＲａｓとプレインキュベートしていないコントロールＫＲａｓをゲル電気泳動に供し、二次抗体を調べた。プレインキュベートしたＫＲａｓとＫＲａｓの移動度を比較し、ここで、プレインキュベートしたＫＲａｓとコントロールＫＲａｓの移動度の差が、ＫＲａｓと抗ＫＲａｓ抗体との間の相互作用を示す。
２．結晶構造
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＫＲａｓ抗体とヒトＫＲａｓとの複合体の結晶構造が解明される。例えば、ＫＲａｓ及び抗ＫＲａｓ抗体を精製し、複合体に結晶化し、Ｘ線結晶構造解析によりその構造が決定されうる。
Ｂ．抗ＫＲａｓ抗体の使用方法
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＫＲａｓ抗体、又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、生体試料中のＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの存在を検出するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、試料中のＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、試料中のＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＧ１２Ｖ又はＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＤＰを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＧ１２Ｒ又はＫＲａｓＧ１２Ｒ－ＧＤＰを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＧ１２Ｄ又はＫＲａｓＧ１２Ｄ－ＧＤＰを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＧ１３Ｄ又はＫＲａｓＧ１３Ｄ－ＧＤＰを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＱ６１Ｈ又はＫＲａｓＱ６１Ｈ－ＧＤＰを定量化するのに有用である。
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＫＲａｓ抗体、又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、生体試料中のＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの存在を検出するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、試料中のＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、試料中のＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＧ１２Ｖ又はＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＴＰを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＧ１２Ｒ又はＫＲａｓＧ１２Ｒ－ＧＴＰを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＧ１２Ｄ又はＫＲａｓＧ１２Ｄ－ＧＴＰを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＧ１３Ｄ又はＫＲａｓＧ１３Ｄ－ＧＴＰを定量化するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、ＫＲａｓＱ６１Ｈ又はＫＲａｓＱ６１Ｈ－ＧＴＰを定量化するのに有用である。
本明細書で提供される一態様では、ＫＲａｓタンパク質（例えば、ＫＲａｓＧ１２Ｃ）に対する本明細書に記載される１つ以上のＫＲａｓ阻害剤の標的係合を測定する方法が提供される。一実施態様では、方法は：（ａ）本明細書に記載される患者から試料（例えば、本明細書に記載される腫瘍試料）を得ること；（ｂ）試料を本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片と接触させること；及び（ｃ）抗ＫＲａｓ抗体によって結合されるＫＲａｓのレベルを測定することを含む。このような一実施態様では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７である。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、ＫＲａｓタンパク質（例えば、ＫＲａｓＧ１２Ｃ）に対する本明細書に記載される１つ以上のＫＲａｓ阻害剤の標的係合を測定するためのバイオマーカーアッセイが提供される。いくつかのそのような実施形態では、バイオマーカーアッセイは、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、及びＪＮＪ－７４６９９１５７からなる群から選択される１つ以上のＫＲａｓ阻害剤で治療された患者から採取された臨床試料から臨床設定における標的係合を測定する。いくつかのそのような実施形態では、バイオマーカーアッセイは、そのような患者に対する本明細書に記載されるＫＲａｓ阻害剤の投与量を決定するために使用される
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを検出又は定量化するために使用することのできる標識抗ＫＲａｓ抗体が提供される。標識には、直接検出される標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識）、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体などのフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン類、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼといった色素前駆体を酸化するために過酸化水素を利用する酵素に結合した、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環式オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを検出又は定量化するために使用することのできる標識抗ＫＲａｓ抗体が提供される。標識には、上述のものが含まれるが、それらに限定されない。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるような抗ＫＲａｓ抗体、又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、イムノアッセイにおいて、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ－ＧＤＰなどのＫＲａｓ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの存在を検出するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体、又はそのような抗体を含む組成物は、イムノアッセイにおいて、ＫＲａｓ、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの存在を検出するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体、又はそのような抗体を含む組成物は、本明細書に記載される共有結合ＫＲａｓ阻害剤に結合したＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はＫＲａｓＧ１２Ｄ若しくはＫＲａｓＧ１３ＤなどのＫＲａｓの存在を検出するために有用である。
後述するように、抗ＫＲａｓ抗体、又はそのような抗体を含む組成物は、ＥＬＩＳＡ、及び免疫組織化学を含むがこれらに限定されない様々な異なるアッセイにおいて使用することができる。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるような抗ＫＲａｓ抗体、又はそのような抗体を含む組成物のいずれもが、イムノアッセイにおいて、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ－ＧＴＰなどのＫＲａｓ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの存在を検出するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＫＲａｓ抗体、又はそのような抗体を含む組成物は、本明細書に記載される共有結合ＫＲａｓ阻害剤に結合したＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はＫＲａｓＧ１２Ｄ若しくはＫＲａｓＧ１３ＤなどのＫＲａｓの存在を検出するために有用である。
ｉ．ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）
いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、本明細書に記載されるように、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの存在及び／又は量を検出するためにＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用される。したがって、本明細書で提供されるのは、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを検出する方法であって、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓに対する捕獲試薬として抗ＫＲａｓ抗体を利用するＥＬＩＳＡアッセイを含む方法である。アッセイの第１の工程では、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを含む又は含む疑いのある生体試料を、捕獲（又はコート）抗体と接触させてそれと共にインキュベートし、検出工程で検出できるように、捕獲抗体にＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを捕獲させるか又は捕獲抗体をそれらに結合させる。検出工程は、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓのいずれかと接触すると、それらが存在する場合にＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓに結合する検出可能な抗体の使用を含む。検出手段は、抗体上の標識を、したがって、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの存在又は存在量を検出するために使用される。
特定の実施形態では、アッセイは、以下の工程を利用する。
第１の工程
本明細書のアッセイの第１の工程では、本明細書に記載されるように、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを含む又は含む疑いのある生体試料を、抗ＫＲａｓ抗体である固定化捕獲（又はコート）試薬と接触させてそれと共にインキュベートする。いくつかの実施形態では、これら抗ＫＲａｓ抗体は、モノクローナル抗体であり、任意の種に由来するものであってよい。いくつかの実施形態では、これら抗ＫＲａｓ抗体は、げっ歯類抗体であり、さらなる実施形態では、マウス又はラット抗体、さらなる実施形態では、マウス抗体である。
種々の実施態様では、抗ＫＲａｓは、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体である。抗ＫＲａｓ抗体は、本明細書に開示されるクラスＩ又はクラスＩＩ抗体のいずれであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９１）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９２）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９３）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９５）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９６）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９７）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（配列番号１）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＬＱＤＨＤＹＰＬＴ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＦＹＶＲＮＷＦＤＰ（配列番号６）を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号１７）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１８）、及びアミノ酸配列ＱＱＹＹＳＹＰＦＴ（配列番号１９）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＡＩＳＳＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＤＱＧＧＹＧＹＰＧＥＳＷＦＤＹ（配列番号２２）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号２５）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２６）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＰＰＷＴ（配列番号２７）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号２８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＡＦＹＳＹＭＤＶ（配列番号３０）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号３３）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号３４）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号３５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号３６）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３７）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＥＲＴＩＬＴＧＹＹＧＦＤＹ（配列番号３８）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４１）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号４２）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＹＶ（配列番号４３）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号４４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４５）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号４６）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号８１）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号８３）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号８４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＳＦＧＰＹＡＦＤＶ（配列番号８６）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号５０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＷＶ（配列番号５１）を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号５２）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号５４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号５７）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号５８）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＮＨＷＶ（配列番号５９）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６０）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６１）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＴＮＮＹＧＹＲＹＦＤＹ（配列番号６２）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号６５）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号６６）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＴＤＮＨＬＷＶ（配列番号６７）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６９）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＡＴＳＳＧＹＹＹＦＤＹ（配列番号７０）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号７３）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号７４）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＧＴＷＤＮＳＬＳＶＷＶ（配列番号７５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号７６）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７７）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＫＧＩＶＧＷＧＦＦＧＭＤＶ（配列番号７８）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。
固定化は、従来、非水溶性マトリックス若しくは表面への吸着（米国特許第３，７２０，７６０号）又は非共有結合若しくは共有結合（例えば、グルタルアルデヒド又はカルボジイミド系架橋剤を使用して、例えば、米国特許第３，６４５，８５２号又はＲｏｔｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５７：８７－９８（１９８３）に記載のように硝酸及び還元剤で支持体を事前に活性化するか又はせずに）によるアッセイ手順の前に、又はその後、例えば免疫沈降法によって、捕獲試薬を不溶化することにより達成される。いくつかの実施形態では、捕獲抗体は、ビオチンにコンジュゲートし、ストレプトアビジンでコートされた表面に結合される。他の実施形態では、捕獲抗体は、Ｈｉｓタグ又はＧＳＴなどのタンパク質タグにコンジュゲートし、適切な表面、例えば、ニッケル若しくは銅でコートされた表面、又はグルタチオンでコートされた表面に結合される。
固定化に使用される固体相は、本質的に非水溶性で免疫測定アッセイに有用な任意の不活性支持体又は担体であってよく、例えば、表面、粒子、多孔性マトリックスなどの形態の支持体を含む。一般に使用される支持体の例には、小さなシート、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ゲル、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、及びポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリスチレンなどから製造されるアッセイプレート又は試験管が含まれ、これには、９６ウェルマイクロタイタープレート、並びにろ紙、アガロース、架橋デキストラン、及びその他多糖類といった粒子材料が含まれる。代替的に、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性非水溶性マトリックス、並びに米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号に記載される反応基質が、捕獲試薬の固定化のために適切に採用される。いくつかの実施形態では、固定化された捕獲試薬は、マイクロタイタープレートにコートされる。いくつかの実施形態では、使用される固体相は、一度に複数の試料を分析するために使用することのできるマルチウェルマイクロタイタープレート、例えば、ＮＵＮＣ ＭＡＸＩＳＯＲＢＴＭ又はＩＭＭＵＬＯＮＴＴＭとして販売されているようなＭＩＣＲＯＴＥＳＴＴＭ又はＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。
固体相は、上記で定義された捕獲試薬でコートされ、これらは必要に応じて非共有結合、共有結合、又は物理的結合により連結されていてもよい。結合のための技術には、米国特許第４，３７６，１１０号及びその引用文献に記載されているものが含まれる。共有結合の場合、プレー又は他の固体相が、例えば室温で１時間、当技術分野で周知の条件下で、捕獲試薬と一緒に架橋剤と共にインキュベートされる。
捕獲試薬を固体相基質に結合するために一般的に使用される架橋結合剤には、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４－アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステルが含まれ、これには、例えば、３，３’－ジチオビス（スクシンイミドプロピオネート）、及びビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル－３－（（ｐ－アジドフェニル）－ジチオ）プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することのできる光活性化中間体を生成する。
９６ウェルプレートが利用される場合、少なくとも約１０時間インキュベートすることにより、典型的には０．０５Ｍの炭酸ナトリウムといったバッファーで希釈した捕獲試薬の混合物でコートすることができる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、少なくとも一晩、約４～２０℃、又は約４～８℃の温度で、約８～１２、約９～１０、又は約９．６のｐＨで行われる。コーティング時間の短縮（１～２時間）が望まれる場合、ニトロセルロースフィルターの底を持つ９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮＴＭ）を使用するか、３７℃でコートすることができる。プレートは、積み重ね、アッセイ自体のかなり前にコートしてもよく、次いでアッセイを、手動で、半自動で、又は自動で、例えば、ロボット工学を使用して、複数の試料に対して同時に実行することができる。
次いでコートされたプレートは、典型的には、結合部位に非特異的に結合してそれを飽和させるブロッキング剤で処理され、ウェル上の過剰部位への遊離リガンドのプレートの望ましくない結合を防止する。この目的のために適切なブロッキング剤の例には、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼイン、及び脱脂乳が含まれる。ブロッキング処理は、典型的には、周囲温度の条件下で、約１～４時間、又は約１．５～３時間行われる。
コーティング及びブロッキング後、標準品（精製ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／若しくはアルキル化ＫＲａｓ）又は分析対象の、適切に希釈された生体試料を、固定化相に加える。特定の実施形態では、希釈率は、体積で約５～１５％、又は約１０％である。この目的の希釈のために使用されうるバッファーには、（ａ）０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ ＴＷＥＥＮ ２０ＴＭ 洗剤（Ｐ２０）、０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮＴＭ ３００抗生物質、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ ３－（（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）界面活性剤、０．２％ ベータ－ガンマグロブリン、及び０．３５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；（ｂ）０．５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ Ｐ２０、及び０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮＴＭ ３００、ｐＨ７を含むＰＢＳ，（ｃ）０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｐ２０、０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮＴＭ ３００、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．３５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．３５を含むＰＢＳ；（ｄ）０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｐ２０、０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮＴＭ３００、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ベータ－ガンマグロブリン、及び０．３５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ；並びに（ｅ）０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｐ２０、０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮＴＭ ３００、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ ＣＨＡＰＳ、及び０．３５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳが含まれる。ＰＲＯＣＬＩＮＴＭ ３００は防腐剤として機能し、ＴＷＥＥＮ ２０ＴＭは非特異的結合を排除するための洗浄剤として機能する。
用いられる捕獲試薬の量は、標準品と比較して良好なシグナルを与えるのに十分に大きいが、試料中の、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの最大期待レベルと比較して、過剰モルにならない。特定の実施形態では、付加される生体試料の量は、固定化された捕獲試薬が、試料の適切な希釈後に生体試料中に予想される、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、遊離ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの最大モル濃度の過剰モルになるような量である。この予想されるレベルは、主に、分析される特定の生体試料中の、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、遊離ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの濃度レベルと、患者の臨床状態との間の既知の相関に依存する。したがって、例えば、成人患者は、極めて高い患者の血清中に、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、遊離ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの最大期待濃度を有し、一方小児は、投与される用量に基づいて、小児の血清中に、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、遊離ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの、それよりも低いレベルを有すると思われる。
捕獲試薬の濃度は、生体試料の必要な希釈を考慮して、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの目的の濃度範囲により決定することができる。捕獲試薬の最終濃度は、目的の範囲におけるアッセイの感度が最大になるように経験的に決定することもできる。一般に、過剰モルは、適切には、試料の任意の適切な希釈後の生体試料中の、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの最大予想モル濃度の、約１０倍未満である。
試料と固定化された捕獲試薬とのインキュベーション条件は、アッセイの感度を最大化し、解離を最小化し、試料中に存在する、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、いずれのＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓも確実に固定化された捕獲試薬に結合するように選択される。インキュベーションは、約０℃から約４０℃の範囲の、ほぼ一定の温度、例えば室温又は概ね室温で達成される。インキュベーションの時間は、通常約１０時間以下である。種々の実施形態において、インキュベーション時間は、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓと捕獲試薬との結合を最大化するために、室温又は概ね室温で約０．５から３時間、又は約１．５から約３時間である。本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを生体液中のプロテアーゼが分解することを防止するためにタンパク質阻害剤が付加される場合には、インキュベーションの継続時間はより長くてもよい。
この段階で、インキュベーション混合物のｐＨは、通常、約４～９．５の範囲、又は約６～９の範囲、又は約７～８の範囲にあるであろう。インキュベーションバッファーのｐＨは、捕獲されるＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、アルキル化ＫＲａｓに対する捕獲試薬の特異的結合を有意なレベルに維持するように選択される。この工程の間に所望のｐＨを達成及び維持するために、ボレート、ホスフェート、炭酸塩、トリス－ＨＣｌ又はトリス－リン酸、アセテート、及びバルビタールなど種々のバッファーを用いることができる。用いられる特定のバッファーは本発明にとって重要ではないが、個々のアッセイにおいて、あるバッファーが他のバッファーよりも好ましい場合がある。
任意選択的な第２の工程
アッセイ法の任意選択的な第２の工程では、生体試料を固定化された捕獲試薬から（例えば洗浄によって）分離し、捕獲されていないＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを除去する。洗浄に使用される溶液は、通常、インキュベーション工程について上述した考察及びバッファーを使用して決定されたｐＨを有するバッファー（「洗浄バッファー」）であり、ｐＨは約６～９の範囲である。洗浄は３回以上行われてもよい。洗浄の温度は、通常冷蔵温度から適温であり、アッセイ期間中は一定の温度が維持され、それは典型的に約０～４０℃、又は約４～３０℃である。例えば、洗浄バッファーは、洗浄前にリザーバー内で４℃の氷中に配置することができ、プレート洗浄機をこの工程に利用することができる。また、捕獲されたＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓがその後の工程である程度解離することが懸念される場合には、この段階で架橋結合剤又は他の適切な薬剤を添加して、現在結合しているＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓが捕獲試薬に共有結合することを可能にしてもよい。
第３の工程
次の工程では、いずれかの結合したＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを含む固定化された捕獲試薬を、約２０～４０℃、又は約３６～３８℃の温度で検出可能な抗体と接触させる。２つを接触させる正確な温度及び時間は主に、用いられる検出手段によって決まる。例えば、４－メチルウンベリフェリル－β－ガラクトシド（ＭＵＧ）、ストレプトアビジン－ＨＲＰ、又はストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼが検出手段として使用されるとき、接触は、シグナルを最大に増幅するために、一晩（例えば、約１５～１７時間以上）実行することも可能である。検出可能な抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、好ましくは、バックグラウンドノイズを低減するために、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、同じ抗ＫＲａｓ抗体が、アッセイにおけるコーティング及び検出に使用される。他の実施形態では、バックグラウンドノイズが最小になるように選択されたコーディング及び検出のために、異なる抗ＫＲａｓ抗体を使用することができる。
いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、ヒト抗体に結合する非ヒト種由来の抗体である。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ抗体である。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、マウス抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃγ抗体である。いくつかの実施態様では、検出可能な抗体は直接的に検出可能である。特定の実施態様では、検出可能な抗体はビオチン化される。そのような場合、ビオチン化標識の検出手段は、アビジン又はストレプトアビジン－ＨＲＰとすることができ、検出手段の読み出しは蛍光定量又は比色定量とすることができる。いくつかの実施形態では、抗体はＨＲＰにコンジュゲートしており、検出手段は比色定量である。
遊離ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの予想される最大濃度（上述）に対して過剰モルの検出可能な抗体を、洗浄後のプレートに加える。この抗体（直接的に又は間接的に検出可能）は、モノクローナル抗体であるが、任意の抗体を利用することができる。検出抗体の親和性は、少量の遊離ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを検出できる程度に十分に高くなければならないが、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを捕獲試薬から引き出すほど高くはない。
第４の工程
アッセイ法の最後の工程では、捕獲試薬に結合している試料からの遊離ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓがあればそのレベルを、検出可能な抗体の検出手段を使用して測定する。生体試料が臨床患者に由来する場合、測定工程は、上記３つの工程の結果として生じる反応を標準曲線と比較して、既知の量と比較したＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓのレベルを決定することを含む。
固定化された捕獲試薬に付加される抗体は、直接標識されるか、又は過剰な第１の抗体を洗い流した後に第１の抗体の動物種のＩｇＧに向けられた過剰モルの第２の標識抗体を付加することによって間接的に検出される。後者の間接アッセイでは、標識抗体をインサイチュで生成するために、第１の抗体に対する標識された抗血清を試料に付加する。
第１の抗体又は第２の抗体に使用される標識は、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、遊離ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓと抗ＫＲａｓ抗体との結合を妨害しないいずれかの検出可能な機能である。
適切な標識の例は、蛍光色素標識、化学発光標識、放射性標識などの直接検出されうる部分と、検出されるために反応させなければならないか又は誘導しなければならない酵素などの部分とを含む、イムノアッセイにおける使用のために知られている多数の標識である。そのような標識の例には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体といったフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ＨＲＰ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化させる酵素、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼとカップリングされたウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環式オキシダーゼ、ビオチン（ＭＵＧを用いて、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン－ＨＲＰ、及びストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼによって検出可能）、スピン標識、バクテリオファージ標識、並びに安定したフリーラジカルなどが含まれる。
これら標識をタンパク質又はポリペプチドに共有結合させる従来の方法が利用可能である。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス－イミデート、及びビス－ジアゾ化ベンジジンなどのカップリング剤を使用して、抗体を、上述の蛍光標識、化学発光標識、及び酵素標識でタグ付けすることができる。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号（蛍光分析）及び米国特許第３，６４５，０９０号（酵素）；Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４－１０２１（１９７４）；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４０：２１９－２３０（１９８１）；及びＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７－４１２（１９８２）を参照されたい。
酵素を含むこのような標識の抗体へのコンジュゲーションは、イムノアッセイ技術の当業者にとって標準の操作法である。例えば、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ－ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ ａｎｄ Ｈ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ，Ｖｏｌ．７３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）、ｐｐ．１４７－１６６を参照されたい。また、市販の適切な標識抗体を使用することもできる。
最後の標識抗体を付加した後、結合している抗体の量は、過剰な結合していない標識抗体を洗浄により除去し、次いで標識に適切な検出方法を使用して、結合した標識の量を測定し、測定された量を、生体試料中のＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの量と相関させることによって決定される。例えば、酵素の場合、発色して測定される量は、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの存在量の直接測定値になるであろう。具体的には、ＨＲＰが標識である場合、基質ＴＭＤを使用し、４５０ｎｍの読み取り波長及び６２０ｎｍ又は６３０ｎｍの参照波長を使用して、色を検出してもよい。
一実施例では、第１の非標識抗体に対する酵素標識された第２の抗体を固定化相から洗浄した後、色又は化学発光を、固定化された捕獲試薬を酵素の基質と共にインキュベートすることによって発現させ、測定する。次いで、並行して走らせた標準ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓにより発生させた色又は化学発光と比較することにより、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓの濃度を計算する。
ｉｉ． 免疫組織化学（ＩＨＣ）
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体は、免疫組織化学（ＩＨＣ）において、本明細書に記載されるＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、免疫組織化学を使用して組織試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓなどのＫＲａｓを検出する方法である。免疫組織化学（ＩＨＣ）は、直接標識（直接ＩＨＣ）又は間接標識（間接ＩＨＣ）された結合ドメイン（抗ＫＲａｓ抗体など）の使用による、組織切片中の標的（例えば、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓなどの抗原）及び／又は標的提示細胞のサブセットの局在化であり、その結合ドメインは、標的結合－ドメイン相互作用を通してその標的と反応するものである。次いで、これら相互作用は、言及された標識によって視覚化される。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、前記免疫組織化学は、以下の工程によって特徴付けられると想定される：
（ａ）細胞のサブセットを含む前記組織試料及び／又は結合ドメイン（例えば、抗ＫＲａｓ抗体）が結合した前記細胞のサブセットを含む手段（例えばスライド）を提供する工程；
（ｂ）任意選択的に、前記組織試料を固定する工程；
（ｃ）任意選択的に、前記組織試料を脱水する工程；
（ｄ）任意選択的に、組織試料をパラフィン化させる工程；
（ｅ）結合ドメイン（例えば、抗ＫＲａｓ抗体）を直接又は間接的に検出し、それによって細胞のサブセットを検出する工程。
「固定すること」又は「固定」は、その後のＩＨＣ手順のための標的／細胞のサブセット／前記細胞のサブセットを含む組織試料を調製するのに適した固定手順を意味する。特に「固定」は、組織の構造及び細胞形態を確実に保存するために実行される。適切な固定条件は周知であり、本明細書にも開示されている。代替的に、組織／サブセットを深部凍結（例えば液体窒素中で）により保存することも想定される。
上記すべての前処理工程／措置は、用語「固定」の範囲内にあり、すなわち、固定は、具体的には、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドのような固定用薬剤による固定；及び／又は組織試料／細胞のサブセットの深部凍結を含む、及び／又は任意選択的にパラフィン又は同様の薬剤中への組織／細胞のサブセットの埋め込みも含む。本発明の要旨は、固定手順が標的の量及び／又は質に影響を与え、それによって望ましくない形で結果を変化させるかもしれないため、前記標的を提示する組織／サブセットなどを固定手順に供する前に結合ドメイン（例えば、標的に特異的な一次抗体）をその標的に結合させることが有利であるという驚くべき発見にあることを理解しなければならない。
組織／サブセットはパラフィン化することもできる（通常、固定後）。
異なるＩＨＣプロトコールを実用化する手段及び方法は、当業者によく知られており、さらなる説明なしで、目的である特定の組織／細胞のサブセット／標的に適合されている、適合される／適合させることができる。
ｉｉｉ．表面プラズモン共鳴
一実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の薬物候補を生成するために、新規化学物質の同定及び／又は化学物質の開発を促進することができる。一実施形態では、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットは、本明細書に記載されるように開かれている及び／又は安定化されている。一実施形態では、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットを開くこと及び／又は安定化することは、より親和性の高い化合物結合の確率を増加させ、その結果、弱く結合した化合物が検出される割合を高めることができる。実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、化合物結合の親和性を上昇させず、代わりにＫＲａｓのコンフォメーションを安定化しうる。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は様々な形式の表面干渉法は、センシング表面近くの平均屈折率における関連する変化をモニタリングすることにより、センシング表面に、センシング表面への生体分子の蓄積に感受性である光エバネッセント場を発生させる。エバネッセント場は、表面から離れながら指数関数的に減衰し、表面の屈折率感度の深さを規定する。典型的には、この場の浸透深度は２００～３００ｎＭのオーダーであり、結合したヒドロゲルを使用して二分子複合体形成をサポートすることにより十分に活用できる三次元プローブ量を提供し、ハイドロゲルでコートされたセンサーチップは広く利用可能である。
ヒドロゲルは、多糖類鎖（例えば直鎖状だが、多少の分岐は許容される）を平面上に化学的にグラフト化し、センシング表面から１０～２００ｎｍ延びるヒドロゲルを形成することにより生成することができる。一実施形態では、これら鎖は、反応性基を含むように誘導体化されて、標的分子をヒドロゲルに結合させることができる。一実施形態では、標的はハイドロゲル内で２０～５０ｍｇ／ｍｌの濃度に結合させることができるが、この限界の上下５倍が許容可能である。得られる応答は、結合する分子の分子体積、存在する標的分子の数、及び分子と周囲のバッファーとの間の屈折率コントラストに比例する。
一態様において本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるＫＲａｓ変異体へのＫＲａｓ阻害剤化合物の結合を測定するためのバイオセンシング表面である。一実施形態では、表面は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片に予め結合されている。一実施形態において本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるＫＲａｓ変異体への化合物の結合を測定するためのバイオセンシング表面であり、ここで：
バイオセンシング表面は、ＫＲａｓタンパク質と本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片が共局在化されたヒドロゲルを含み；
ＫＲａｓタンパク質と抗体又はその抗原結合断片とは、互いに係合して親和性複合体を形成するために水素内で十分な自由度を有し；
ここで、ＫＲａｓタンパク質及び抗体又はその抗原結合断片の局所濃度は、解離親和定数を少なくとも１０倍上回っており、その局所濃度が親和性複合体の形成を促進し；
未結合ＫＲａｓタンパク質及び抗体又はその抗原結合断片の割合が約５０％未満であり；
ＫＲａｓ阻害剤化合物が、少なくとも５秒間、バイオセンシング表面上に注入され；
抗体又はその断片抗体へのＫＲａｓ阻害剤化合物の結合が、少なくとも１つのセンシングチャネル上で測定される。
表面の一実施形態において、未結合のＫＲａｓタンパク質及び抗体又はその抗原結合断片の割合は、約４０％、３０％、２５％、２０％、又は１０％未満である。
いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、厚さが約１０ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～３００ｎｍ、１０～２５０ｎｍ、又は約１０～２００ｎｍである。いくつかの実施形態では、水素はストレプトアビジンを含む。
一実施形態では、ＫＲａｓタンパク質はビオチン化されている。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓタンパク質は、ＫＲａｓＧ１２Ｃである。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓタンパク質はＫＲａｓＧ１２Ｄである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓタンパク質は、ＫｒａｓＧ１２Ｖである。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓタンパク質は、ＫＲａｓＧ１２Ｃである。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓタンパク質はＫＲａｓＧ１２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓタンパク質は、ＫｒａｓＧ１３Ｄである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓタンパク質は、ＫｒａｓＱ６１Ｈである。一実施形態では、ＫＲａｓタンパク質は、バイオセンシング表面に適用する前に、バッファー中において約５０～１０００ｎＭ、５０～７５０ｎＭ、５０～５００ｎＭ、１００～１０００ｎＭ、１００～７５０ｎＭ、１００～５００ｎＭ、又は約１００～２５０ｎＭの濃度である。いくつかの実施態様では、ヒドロゲル中のＫＲａｓタンパク質の濃度は、０．５～２ｍＭ、０．５～１．５ｍＭ、０．５～１ｍＭ、０．７５～２ｍＭ、０．７５～１．５ｍＭ、０．７５～１ｍＭ、０．９～２ｍＭ、又は０．９～１．５ｍＭである。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載のＦａｂである。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、約５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、又は１０００ｎＭの濃度で注入される。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、約１５０～２００ｎＭの濃度で注入される。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、２Ｈ１１のＦａｂである。
いくつかの実施形態では、バイオセンシング表面は、ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップに取り付けられている。いくつかの実施態様では、測定は、少なくとも２つのチャネル上で実施される。そのような一実施形態では、少なくとも１つのチャネルは、標準（例えばブランク）センシングチャネルである。
一実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤化合物は、約０．０２５μＭ～５００μＭ、０．０２５μＭ～２５０μＭ、０．０２５μＭ～１００μＭ、０．０２５μＭ～５０μＭ、０．０２５μＭ～２５μＭ、０．０２５μＭ～１０μＭ、０．０３μＭ～５００μＭ、０．０３μＭ～２５０μＭ、０．０３μＭ～１００μＭ、０．０３μＭ～５０μＭ、０．０３μＭ～２５μＭ、０．０３μＭ～１０μＭ、０．０５ｕＭ－５００ｕＭ、０．０５μＭ～２５０μＭ、０．０５μＭ～１００μＭ、０．０５μＭ～５０μＭ、０．０５μＭ～２５μＭ、又は０．０５μＭ～１０μＭの濃度で注入される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤化合物は、約１０、２５、５０、１００、１５０、又は約２５０μＬ／分の速度で、上記に示される濃度で注入される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤化合物は、本明細書に記載される速度及び濃度で、約５、７、８、９、１０、１５、２０、又は約２５秒間注入される。一実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤化合物は、約０．０４～１０μＭの濃度で約１００μＬ／分の速度で約１０秒間ヒドロゲル上に注入される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤化合物は、一連の異なる濃度（例えば、一連の２、３、４、５、６、７、８、又は９の異なる濃度）として提供される。いくつかの実施形態では、各異なる濃度は、本明細書に記載されるようにヒドロゲル上に注入される。
別の態様において本明細書で提供されるのは、抗ＫＲａｓ阻害剤の活性について化合物をスクリーニングする方法であり、この方法は、記載されるＫＲａｓ変異タンパク質に対する化合物の結合を測定することを含み、ここで、ＫＲａｓ変異タンパク質は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片に結合し、結合は、本明細書に記載されるバイオセンシング表面を使用して測定される。
一実施形態では、本明細書に記載されるＫＲａｓ及び抗体又はその抗原結合断片は、ヒドロゲル内で同時に結合される。別の実施形態では、ＫＲａｓは、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片に結合する前に付加される。また別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＫＲａｓとの結合前に付加される。
さらに本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片に対するＫＲａｓ変異タンパク質の結合を測定する方法であり、この方法は：
本明細書に記載されるバイオセンシング表面を、本明細書に記載されるＫＲａｓタンパク質と接触させて、ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を形成すること；
ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片と接触させることであって、抗ＫＲａｓ抗体が、ＫＲａｓタンパク質と比較して過剰モルである、ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片と接触させること；及び
表面プラズモン共鳴を使用して、抗体又はその抗原結合断片のＫＲａｓタンパク質への結合及び親和性を検出すること
を含む。
そのような一実施形態では、バイオセンシング表面はアビジンでコートされる。別のそのような実施形態では、ＫＲａｓタンパク質はビオチン化される。
さらに本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ変異タンパク質の結合を測定する方法であり、この方法は：
本明細書に記載されるバイオセンシング表面を、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片と接触させて、抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面を形成すること；
抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面を、本明細書に記載されるＫＲａｓタンパク質と接触させることであって、抗ＫＲａｓ抗体が、ＫＲａｓタンパク質と比較して過剰モルである、抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面と接触させること；及び
表面プラズモン共鳴を使用して、抗体又はその抗原結合断片のＫＲａｓタンパク質への結合及び親和性を検出すること
を含む。
そのような一実施形態では、バイオセンシング表面はアビジンでコートされる。別のそのような実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ビオチン化される。
ｉｖ．試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出する方法
本明細書で提供されるのは、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出する方法である。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体はヒトＫＲａｓに結合し、ここで抗体は、ＧＤＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）に、ＧＴＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＴＰ）より高い親和性で結合する。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、上述のように、当技術分野で既知の様々な技術を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰはＥＬＩＳＡを使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、本明細書で提供されるように、免疫組織化学を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、ＢＩＯＡＣＯＲＥ ＳＰＲ機器を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、フローサイトメトリー使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、免疫沈降法を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、電気泳動移動度シフトアッセイなどのアフィニティー電気泳動を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、蛍光偏光／異方性を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、質量分析と連動させたアフィニティー精製を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、バイオレイヤー干渉法を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、標識ＫＲａｓ抗体を使用して検出される。
本明細書で提供されるのは、ＫＲａｓがＫＲａｓ変異体である試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出するための方法である。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は発がん性のＫｒａｓである。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ変異体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃである。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ変異体は、ＫＲａｓＧ１２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＧ１２Ｖである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＱ６１Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＧ１２Ｄである。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ変異体は、ＫｒａｓＧ１３Ｄである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかが、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、クラスＩ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、クラスＩＩ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化コンフォメーション特異的抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アルキル化誘導抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットを開く。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットを安定化する。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｅ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｈ１１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ａ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は３Ａ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は４Ｇ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｄ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｃ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｂ７である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｆ４である。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９１）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９２）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９３）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９５）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９６）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９７）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（配列番号１）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＬＱＤＨＤＹＰＬＴ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＦＹＶＲＮＷＦＤＰ（配列番号６）を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号１７）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１８）、及びアミノ酸配列ＱＱＹＹＳＹＰＦＴ（配列番号１９）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＡＩＳＳＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＤＱＧＧＹＧＹＰＧＥＳＷＦＤＹ（配列番号２２）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号２５）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２６）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＰＰＷＴ（配列番号２７）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号２８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＡＦＹＳＹＭＤＶ（配列番号３０）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号３３）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号３４）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号３５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号３６）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３７）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＥＲＴＩＬＴＧＹＹＧＦＤＹ（配列番号３８）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４１）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号４２）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＹＶ（配列番号４３）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号４４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４５）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号４６）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号８１）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号８３）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号８４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＳＦＧＰＹＡＦＤＶ（配列番号８６）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号５０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＷＶ（配列番号５１）を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号５２）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、
及びアミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号５４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号５７）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号５８）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＮＨＷＶ（配列番号５９）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６０）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６１）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＴＮＮＹＧＹＲＹＦＤＹ（配列番号６２）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号６５）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号６６）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＴＤＮＨＬＷＶ（配列番号６７）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６９）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＡＴＳＳＧＹＹＹＦＤＹ（配列番号７０）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号７３）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号７４）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＧＴＷＤＮＳＬＳＶＷＶ（配列番号７５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号７６）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７７）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＫＧＩＶＧＷＧＦＦＧＭＤＶ（配列番号７８）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを定量する（又はその量を決定する）ために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰの存在量を測定するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料中の、本明細書に記載されるＫＲａｓ阻害剤に結合したＫＲａｓ－ＧＤＰの存在量を測定するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰの量は、標準と比較して決定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰの存在量を定量化するために、定量的ウエスタンブロットを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、ＥＬＩＳＡを使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、免疫組織化学を使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、フローサイトメトリーを用いて定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、免疫沈降法後に定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、電気泳動移動度シフトアッセイなどのアフィニティー電気泳動を使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、質量分析と連動させたアフィニティー精製を使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、精製後に定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製後に定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製後に定量化される。
いくつかの実施形態では、方法は、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出することを含む。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、生体試料中において検出される。いくつかの実施形態では、生体試料は、生体液、例えば、全血又は赤血球、白血球、血小板、血清、及び血漿を含む全血成分、腹水、硝子体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊水、乳、唾液、痰、涙、汗、粘液、脳脊髄液、尿、及びＫＲａｓ－ＧＤＰを含みうる身体の他の構成物質である。種々の実施形態では、試料は、任意の動物由来の身体試料である。種々の実施形態では、試料は、ヒト由来の試料である。いくつかの実施形態では、試料は、哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、臨床試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出するとき、ヒト対象に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又は発がん性のＫＲａｓ変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又は発がん性のＫＲａｓ変異を有する患者であって、本明細書に記載のＫＲａｓ阻害剤を投薬された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｃ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｄ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｖ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｒ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１３Ｄ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＱ６１Ｈ発がん性変異を有する患者に由来する。特定の実施態様では、生体試料は血清又は血漿である。特定の実施態様では、生体試料は臨床患者由来の血清である。特定の実施態様では、生体試料は尿である。特定の実施態様では、生体試料は臨床患者由来の尿である。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、がん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、ＫＲａｓＧ１２Ｃ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、ＫＲａｓＧ１２Ｄ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、ＫＲａｓＧ１２Ｖ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、ＫＲａｓＧ１２Ｒ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、ＫＲａｓＧ１３Ｄ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、ＫＲａｓＱ６１Ｈ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料中のＫＲａｓ－ＧＴＰを定量する（又はその量を決定する）ために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料中のＫＲａｓ－ＧＴＰの存在量を測定するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料中の、本明細書に記載されるＫＲａｓ阻害剤に結合したＫＲａｓ－ＧＴＰの存在量を測定するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰの量は、標準と比較して決定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰの存在量を定量化するために、定量的ウエスタンブロットを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、ＥＬＩＳＡを使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、免疫組織化学を使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、フローサイトメトリーを用いて定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、免疫沈降法後に定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、電気泳動移動度シフトアッセイなどのアフィニティー電気泳動を使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、質量分析と連動させたアフィニティー精製を使用して定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、精製後に定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製後に定量化される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製後に定量化される。
いくつかの実施形態では、方法は、試料中のＫＲａｓ－ＧＴＰを検出することを含む。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、生体試料中において検出される。いくつかの実施形態では、生体試料は、生体液、例えば、全血又は赤血球、白血球、血小板、血清、及び血漿を含む全血成分、腹水、硝子体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊水、乳、唾液、痰、涙、汗、粘液、脳脊髄液、尿、及びＫＲａｓ－ＧＴＰを含みうる身体の他の構成物質である。種々の実施形態では、試料は、任意の動物由来の身体試料である。種々の実施形態では、試料は、ヒト由来の試料である。いくつかの実施形態では、試料は、哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、臨床試料中のＫＲａｓ－ＧＴＰを検出するとき、ヒト対象に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又は発がん性のＫＲａｓ変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又は発がん性のＫＲａｓ変異を有する患者であって、本明細書に記載のＫＲａｓ阻害剤を投薬された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｃ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｄ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｖ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｒ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１３Ｄ発がん性変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＱ６１Ｈ発がん性変異を有する患者に由来する。特定の実施態様では、生体試料は血清又は血漿である。特定の実施態様では、生体試料は臨床患者由来の血清である。特定の実施態様では、生体試料は尿である。特定の実施態様では、生体試料は臨床患者由来の尿である。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、がん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、ＫＲａｓＧ１２Ｃ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、ＫＲａｓＧ１２Ｄ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、ＫＲａｓＧ１２Ｖ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、ＫＲａｓＧ１２Ｒ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、ＫＲａｓＧ１３Ｄ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＴＰは、ＫＲａｓＱ６１Ｈ発がん性変異を有するがん患者に由来する試料において検出される。
いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｃ共有結合阻害剤（例えば、Ｃｙｓ１２をアルキル化する化合物）で治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｃ共有結合阻害剤（例えば、Ｃｙｓ１２をアルキル化する化合物）で治療した患者に由来しており、ＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化のレベルは、本明細書に記載のように決定される。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｄ共有結合阻害剤（例えば、Ａｓｐ１２に共有結合する阻害剤）で治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｄ共有結合阻害剤で治療された患者に由来しており、阻害剤のＫＲａｓＧ１２Ｄへの共有結合のレベルは、本明細書に記載されるように決定される。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１３Ｄ共有結合阻害剤（例えば、Ａｓｐ１３に共有結合する阻害剤）で治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１３Ｄ共有結合阻害剤で治療された患者に由来しており、阻害剤のＫＲａｓＧ１３Ｄへの共有結合のレベルは、本明細書に記載のように決定される。
いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｄ非共有結合阻害剤で治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｖ非共有結合阻害剤で治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｒ非共有結合阻害剤で治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１３Ｄ非共有結合阻害剤で治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＱ６１Ｈ非共有結合阻害剤で治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｃ ＳＷＩＩリガンドで治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓ ＳＷＩＩリガンドで治療された患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又は抗ＫＲａｓ抗体で治療された患者に由来する。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、患者のがんの治療をモニタリングする方法の一部として検出される。いくつかのそのような実施形態では、患者におけるがんの治療をモニタリングする方法は、本明細書に記載のバイオマーカーアッセイを使用して実施される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰは、本明細書に記載されるように、患者におけるＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんの治療をモニタリングする方法の一部として検出される。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－１９５２である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－８５３である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＭＲＴＸ８４９である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＭＧ－５１０である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＧＤＣ－６０３６である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－３２４８である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＬＹ３４９９４４６である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＪＮＪ－７４６９９１５７である。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２Ｖ特異的共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２Ｒ特異的共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１３Ｄ特異的共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＱ６１Ｈ特異的共有結合阻害剤を投与されたことがある。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ又はＫＲａｓ－ＧＴＰは、本明細書に記載されるように、患者におけるＫＲａｓＧ１２Ｄ媒介性のがんの治療をモニタリングする方法の一部として検出される。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的非共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ又はＫＲａｓ－ＧＴＰは、本明細書に記載されるように、患者におけるＫＲａｓＧ１３Ｄ媒介性のがんの治療をモニターする方法の一部として検出される。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１３Ｄ特異的共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１３Ｄ特異的非共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ又はＫＲａｓ－ＧＴＰは、本明細書に記載されるように、患者におけるＫＲａｓＧ１２Ｖ媒介性のがんの治療をモニターする方法の一部として検出される。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２Ｖ特異的非共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ又はＫＲａｓ－ＧＴＰは、本明細書に記載されるように、患者におけるＫＲａｓＧ１２Ｒ媒介性のがんの治療をモニターする方法の一部として検出される。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２Ｒ特異的非共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ又はＫＲａｓ－ＧＴＰは、本明細書に記載されるように、患者におけるＫＲａｓＱ６１Ｈ媒介性のがんの治療をモニターする方法の一部として検出される。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＱ６１Ｈ特異的非共有結合阻害剤を投与されたことがある。
ｖ．試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰを検出する方法
本明細書でさらに提供されるのは、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰを検出する方法である。いくつかの実施形態では、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰの相対量が決定される。いくつかの実施形態では、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰの存在量が決定される。いくつかの実施形態では、試料中におけるＫＲａｓ－ＧＴＰに対するＫＲａｓ－ＧＤＰの割合が決定される。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－ＧＤＰよりも高い親和性でＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体は、第１の標識で標識され、ＫＲａｓ－ＧＴＰに優先的に結合する抗ＫＲａｓ抗体は、第２の標識で標識される。いくつかの実施態様では、第１及び第２の標識が検出される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の標識の両方からのシグナルの検出及び定量化により、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰレベルの両方を別々に定量化することができる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体及びＫＲａｓ－ＧＴＰに優先的に結合する抗ＫＲａｓ抗体は、必ずしも別々の標識で標識されるわけではない。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰの量は、標準との比較で決定される。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、上述したように、当技術分野で既知の様々な手段によって検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、ＥＬＩＳＡを使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＤＰは、本明細書で提供されるように、免疫組織化学を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＤＰは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、ＢＩＯＡＣＯＲＥ ＳＰＲ機器を使用して検出される。いくつかのそのような実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰ及び／又はＫＲａｓ－ＧＤＰは、本明細書に提供されるバイオセンシング表面を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、フローサイトメトリーを用いて検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、免疫沈降法を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＤＰは、電気泳動移動度シフトアッセイなどのアフィニティー電気泳動を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、蛍光偏光／異方性を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、質量分析と連動させたアフィニティー精製を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、バイオレイヤー干渉法を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰは、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用して検出される。
上述のように、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかが、試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかが、試料中のＫＲａｓ－ＧＴＰを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、クラスＩ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、クラスＩＩ抗体である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｅ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｈ１１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ａ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は３Ａ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は４Ｇ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｄ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｃ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｂ７である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｆ４である。いくつかの実施態様では、抗ＫＲａｓ抗体は、１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、４Ｇ１２、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施態様では、抗Ｋｒａｓ抗体は、２Ｈ１１、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施態様では、抗ＫＲａｓ抗体は、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ４である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ７である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ８である。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体は、市販の抗体である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体は、ｉＤａｂ６である（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ２００７；２６：３２５０－３２５９）。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体は、抗Ｒａｓ抗体ＥＰ１１２５Ｙ（Ａｂｃａｍ、ａｂ５２９３９）である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ－２Ｂ特異的ウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、カタログ番号１６１５５－１－ＡＰ）である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体は、Ｒａｓ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０５－５１６）である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体は、３Ｂ１０－２Ｆ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＷＨ０００３８４５Ｍ１）である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗ＫＲａｓ抗体は、２３４－４．２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ２４）である。
ｖｉ．ＫＲａｓ阻害剤を得る方法
本明細書でさらに提供されるのは、ＫＲａｓ阻害剤を得る方法である。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ ＳＷＩＩポケットを安定化する及び／又は開く。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１ＨのＫＲａｓ ＳＷＩＩポケットを安定化する及び／又は開く。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを誘導するために使用されうる。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１ＨのＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを誘導するために使用されうる。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓポケットを開いたコンフォメーションにロックする。いくつかの実施形態では、これにより、開いたＳＷＩＩポケットを特異的に標的とする分子をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、これにより、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈの開いたＳＷＩＩポケットを特異的に標的とする分子をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを安定化し、ＳＷＩＩポケットに共有結合する小分子の同定を可能にする。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを安定化し、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１ＨのＳＷＩＩポケットに共有結合する小分子の同定を可能にする。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＲａｓには、ＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを誘導する本開示の抗ＫＲａｓ抗体が結合することができ、抗ＫＲａｓ抗体が結合したＫＲａｓは、ＫＲａｓ阻害剤を得るために使用されうる。
したがって、本明細書で提供されるのは、抗ＫＲａｓ抗体をＫＲａｓと接触させること、化合物のライブラリーをスクリーニングすること、及びＫＲａｓに結合する化合物を同定することを含む、ＫＲａｓ阻害剤を得るための方法である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓに結合する化合物は、ＫＲａｓを阻害する。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ阻害剤は、ＫＲａｓ変異体を阻害する。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ阻害剤は、発がん性のＫｒａｓを阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓＧ１２Ｃを阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓＧ１２Ｒを阻害する。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ阻害剤は、ＫＲａｓＧ１２Ｖを阻害する。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ阻害剤は、ＫＲａｓＱ６１Ｈを阻害する。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ阻害剤は、ＫＲａｓＧ１２Ｄを阻害する。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ阻害剤は、ＫＲａｓＧ１３Ｄを阻害する。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＫＲａｓ抗体のいずれもが、本明細書に記載されるＫＲａｓ変異体のＫＲａｓ阻害剤を得る方法に使用されうる。いくつかの実施形態では、抗Ｋｒａｓ抗体は、本明細書で提供されるクラスＩ又はクラスＩＩ抗体である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｅ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｈ１１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ａ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は３Ａ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は４Ｇ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｄ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｃ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｂ７である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｆ４である。いくつかの実施態様では、抗ＫＲａｓ抗体は、１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、４Ｇ１２、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施態様では、抗Ｋｒａｓ抗体は、２Ｈ１１、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施態様では、抗ＫＲａｓ抗体は、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ４である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ７である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ８である。
いくつかの実施形態では、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が、ＫＲａｓ阻害剤を同定するために実施される。いくつかの実施形態では、化学ライブラリーが、ＫＲａｓ阻害剤を同定するためにスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、天然物、又は天然に存在する化合物のライブラリーが、ＫＲａｓ阻害剤を同定するためにスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、ペプチドライブラリーが、ＫＲａｓ阻害剤を同定するためにスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、ペプチド模倣物ライブラリーが、ＫＲａｓ阻害剤を同定するためにスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片のライブラリーが、ＫＲａｓ阻害剤を同定するためにスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、小分子のライブラリーがスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、共有結合阻害剤のライブラリーがスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、非共有結合性阻害剤のライブラリーがスクリーニングされる。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、スクリーニングにおけるＫＲａｓ阻害剤の同定により得られる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、そのＫＲａｓの結合により同定される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓの結合は、タンパク質－小分子相互作用を検出するために当技術分野で既知の様々な技術のうちの１つを通じて検出される（例えば、ＭｃＦｅｄｒｉｅｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３ ２０：５参照）。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓの結合は、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓの結合は、熱安定性シフトアッセイを使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓの結合は、細胞培養物におけるアミノ酸の安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）に結合したアフィニティーキャプチャを使用して検出される。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓ活性のアッセイにおける変異ＫＲａｓ（例えば、本明細書に記載の変異ＫＲａｓ）活性のその変化により同定される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ活性のアッセイは、ＫＲａｓの生物学に基づいて設計される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓのヌクレオチド結合親和性のその変化により同定される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＲＡＦキナーゼを活性化するＫＲａｓの能力のその変化により同定される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓ ＲＡＦキナーゼ活性化のそのブロックより同定される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ阻害剤は、ＲＡＦキナーゼに結合するＫＲａｓのそのブロックより同定される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓ活性化を示すレポーター、例えば、ＧＬＵＴ１転写レポーターのそのブロックにより同定される。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、本明細書に記載される変異ＫＲａｓに共有結合する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、共有結合阻害剤（例えば、ＫＲａｓをアルキル化する阻害剤）である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＳＷＩＩポケットの残基に共有結合する。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ阻害剤は、ＳＷＩＩポケットに結合してＳＷＩＩポケットをアルキル化する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＳＷＩＩポケットが開いているときにＫＲａｓの表面に露出している残基をアルキル化する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＳＷＩＩポケットの残基に共有結合的に修飾する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、本明細書に記載される変異ＫＲａｓのＳＷＩＩポケット内のシステイン残基に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、本明細書に記載される変異ＫＲａｓのＳＷＩＩポケット内のシステイン残基をアルキル化する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓ ＳＷＩＩポケットのシステイン残基に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓ ＳＷＩＩポケットのシステイン残基をアルキル化する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓをアロステリックに阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、変異ＫＲａｓが活性のＧＴＰ結合状態になることを防止する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、変異ＫＲａｓを、不活性なＧＤＰ結合状態にロックする。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、変異ＫＲａｓのヌクレオチド結合親和性を変化させる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、変異ＫＲａｓを、ＧＴＰよりもＧＤＰに優先的に結合させる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、変異ＫＲａｓを、ＫＲａｓの不活性型に移行させる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＧＥＦ触媒性ヌクレオチド交換をブロックする。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、変異ＫＲａｓの下流のシグナル伝達をブロックする。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤はアルキル化剤である。いくつかの実施形態では、Ｋｒａｓ阻害剤は、ＫＲａｓＧ１２Ｃを阻害し、残基Ｃｙｓ１２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変異ＫＲａｓは、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１３Ｃ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈである。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤が同定され、ここで、そのような阻害剤は、本明細書に記載される変異ＫＲａｓに結合する。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓの分子プローブが同定される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、有機化合物又は無機化合物などの小分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、天然に存在する小分子又は合成小分子である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤はタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤はペプチドである。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は核酸である。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって得られるＫＲａｓ阻害剤が、ＫＲａｓ変異に関連するがんを治療するための薬物として使用されうる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんを治療する薬物として使用される。
ｖｉｉ．生体試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出する方法
本明細書で提供されるのは、ＫＲａｓのアルキル化形態に特異的に結合するＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、生体試料中の共有結合阻害剤の結合によるＫＲａｓＧ１２Ｃの共有結合（例えば、アルキル化）を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、検出は、標的の係合を測定するために本明細書に記載されるバイオマーカーアッセイを使用して行われる。いくつかの実施形態では、クラスＩ抗体が、ＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、クラスＩ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄの共有結合を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、クラスＩ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄの非共有結合を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、クラスＩ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｖの非共有結合を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、クラスＩ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｒの非共有結合を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、クラスＩ抗体は、ＫＲａｓＧ１３Ｄの非共有結合を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、クラスＩ抗体は、ＫＲａｓＱ６１Ｈの非共有結合を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、１Ａ５、１Ｄ６、２Ｃ１、１Ａ６、１Ｆ４、又は１Ｂ７が、アルキル化ＫＲａｓ又は本明細書に記載のＫＲａｓ非共有結合阻害剤に非共有結合したＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、４Ｇ１２、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８が、アルキル化ＫＲａｓ又は本明細書に記載のＫＲａｓ非共有結合阻害剤に非共有結合したＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、２Ｈ１１、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８が、アルキル化ＫＲａｓ又は本明細書に記載のＫＲａｓ非共有結合阻害剤に非共有結合したＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８が、アルキル化ＫＲａｓ又は本明細書に記載のＫＲａｓ非共有結合阻害剤に非共有結合したＫＲａｓを検出するために使用される。
いくつかの実施形態において、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤で治療した対象におけるＫＲａｓＧ１２Ｃの共有結合（例えば、アルキル化）を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤での治療後の対象に、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかを投与すること；及び（ｂ）アルキル化ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－１９５２である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－８５３である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－１６２０、ＭＲＴＸ８４９である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＭＧ－５１０である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＧＤＣ－６０３６である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－３２４８である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＬＹ３４９９４４６である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＪＮＪ－７４６９９１５７である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＬＹ３５３７９８２である。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的共有結合阻害剤で治療した対象における、ＫＲａｓＧ１２Ｄに対する共有結合ＫＲａｓ阻害剤の共有結合を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的共有結合阻害剤での治療後の対象に、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかを投与すること；及び（ｂ）ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的共有結合阻害剤で治療した対象における、ＫＲａｓＧ１２Ｄに対する非共有結合ＫＲａｓ阻害剤の非共有結合を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的非共有結合阻害剤での治療後の対象に、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかを投与すること；及び（ｂ）ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、上述したように、当技術分野で既知の様々な手段によって検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、ＥＬＩＳＡを使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、本明細書で提供されるように、免疫組織化学を使用して検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、ＢＩＯＡＣＯＲＥ ＳＰＲ機器を使用して検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、フローサイトメトリーを使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して検出される。いくつかの実施形態において、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、免疫沈降法を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、電気泳動移動度シフトアッセイなどのアフィニティー電気泳動を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、蛍光偏光／異方性を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、質量分析と連動させたアフィニティー精製を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、バイオレイヤー干渉法を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用して検出される。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、生体試料中において検出される。いくつかの実施形態では、生体試料は、生体液、例えば、全血又は赤血球、白血球、血小板、血清、及び血漿を含む全血成分、腹水、硝子体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊水、乳、唾液、痰、涙、汗、粘液、脳脊髄液、尿、及びアルキル化ＫＲａｓを含みうる身体の他の構成物質である。種々の実施形態では、試料は、任意の動物由来の身体試料である。種々の実施形態では、試料は、ヒト由来の試料である。
いくつかの実施形態では、試料は、哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、臨床試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化状態を検出するとき、ヒト対象に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又は発がん性のＫＲａｓ変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｃ発がん性変異を有する患者に由来する。特定の実施態様では、生体試料は血清又は血漿である。特定の実施態様では、生体試料は臨床患者由来の血清である。特定の実施態様では、生体試料は尿である。特定の実施態様では、生体試料は臨床患者由来の尿である。
ｖｉｉｉ．インビボにおけるＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化の検出方法
本発明のいくつかの実施形態において、抗ＫＲａｓ抗体は、インビボでのＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ－ＧＤＰの検出は、それが生細胞、組織、又は生物体で起こる場合、インビボである。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、細胞中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化をインビボで検出するために使用される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、細胞培養物中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化をインビボで検出するために使用される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、組織中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化をインビボで検出するために使用される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、組織中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化をインビボで検出するために使用される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、腫瘍細胞中のアルキル化ＫＲａｓ－ＧＤＰをインビボで検出するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、生物体中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化をインビボで検出するために使用される。いくつかの実施態様において、生物体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、生体物はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、生体物ドはマウスである。いくつかの実施態様では、生物体はヒトである。インビボでのＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化の検出は、上述したように、当技術分野で既知の様々な手段によって達成することができる。いくつかの実施形態では、インビボでのＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化は、免疫組織化学によって検出される。いくつかの実施形態では、クラスＩ抗体が、ＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、１Ａ５、１Ｄ６、２Ｃ１、１Ａ６、１Ｆ４、又は１Ｂ７が、アルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、４Ｇ１２、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８が、アルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、２Ｈ１１、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８が、アルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８は、アルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される。
ｉｘ．治療方法及び治療のモニタリング方法
本開示のいくつかの実施形態において、ＫＲａｓ 媒介性のがんを治療する方法が提供される。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんを治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかを、そのようながんを有する患者に投与することを含む。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｅ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｈ１１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ａ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は３Ａ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は４Ｇ１２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｄ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は２Ｃ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ａ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体は１Ｂ７である。いくつかの実施態様では、抗Ｋｒａｓ抗体は、２Ｈ１１、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施態様では、抗ＫＲａｓ抗体は、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ１である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ２である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ３である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ４である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ５である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ６である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ７である。いくつかの実施様態では、抗Ｋｒａｓ抗体はＡｂ８である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の治療的有効量が投与される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんは、ＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんは、結腸がんである。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんは、膵臓がんである。いくつかの実施形態では、患者は、ヒト患者である。
いくつかの実施形態では、患者は、以前にＫＲａｓ阻害剤（例えば、本明細書に記載の共有結合ＫＲａｓ阻害剤又は非共有結合ＫＲａｓ阻害剤）を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤が患者に共投与される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤はＳＷＩＩ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓ阻害剤はＳＷＩＩリガンドである。いくつかの実施態様では、ＳＷＩＩ阻害剤は共有結合ＫＲａｓ阻害剤である。一実施形態では、共有結合ＫＲａｓ阻害剤は、本明細書に記載されるように、ＫＲａｓのＳＷＩＩポケットをアルキル化する。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓに対するＳＷＩＩ阻害剤の親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓに対するＳＷＩＩリガンドの親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓに対するＫＲａｓ阻害剤（例えば、本明細書に記載の共有結合ＫＲａｓ阻害剤又は非共有結合ＫＲａｓ阻害剤）の親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、患者は、以前にＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤が患者に共投与される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤はＳＷＩＩ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤はＳＷＩＩリガンドである。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤は共有結合阻害剤である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃに対するＳＷＩＩ阻害剤の親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃに対するＳＷＩＩリガンドの親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃに対するＫＲａｓ阻害剤の親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、患者は、以前にＫＲａｓＧ１２Ｄ共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、以前にＫＲａｓＧ１２Ｄ非共有結合阻害剤を投与されたことがある。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｄ阻害剤（例えば、共有結合又は非共有結合）が患者に共投与される。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｄ阻害剤はＳＷＩＩ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｄ阻害剤はＳＷＩＩリガンドである。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄに対するＳＷＩＩ阻害剤の親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄに対するＳＷＩＩリガンドの親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｄに対するＫＲａｓ阻害剤の親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｖに対するＫＲａｓ阻害剤の親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｒに対するＫＲａｓ阻害剤の親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１３に対するＫＲａｓ阻害剤の親和性を向上させる。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＱ６１Ｈに対するＫＲａｓ阻害剤の親和性を向上させる。
いくつかの実施形態では、患者におけるがんの治療をモニタリングする方法が提供される。いくつかの実施形態では、患者におけるＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんの治療をモニタリングする方法が提供される。いくつかの実施形態では、患者におけるＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんの治療の進捗をモニタリングする方法が提供される。いくつかの実施形態では、直接的な標的係合（例えば、ＫＲａｓＧ１２Ｃの結合）がモニタリングされる。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんの治療をモニタリングした後、毒性を最小限に抑えながら有効性を最大化するための治療用量を選択する。いくつかの実施形態では、患者は、共有結合ＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤で治療されたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２ＣＳＷＩＩリガンドで治療されたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ共有結合阻害剤で治療されたことがある。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化を検出するために使用されうる。いくつかの実施形態では、クラスＩ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、１Ａ５、１Ｄ６、２Ｃ１、１Ａ６、１Ｆ４、又は１Ｂ７が、アルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、４Ｇ１２、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８が、アルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、２Ｈ１１、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８が、アルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施態様では、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７又はＡｂ８。いくつかの実施形態では、Ａｂ１が、アルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合の検出は、上記の技術のいずれかを使用して測定される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合の検出は、表面プラズモン共鳴を使用して測定される。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、患者由来の試料中のＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、試料は、臨床試料である。特定の実施形態では、生体試料は、生体液、例えば、全血又は赤血球、白血球、血小板、血清、及び血漿を含む全血成分、腹水、硝子体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊水、乳、唾液、痰、涙、汗、粘液、脳脊髄液、尿、及びアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃを含みうる身体の他の構成物質である。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＫＲａｓＧ１２Ｃがアルキル化されたことを示す。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＫＲａｓＧ１２Ｃが薬物化されたことを示す。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＫＲａｓＧ１２ＣがＳＷＩＩリガンドによって共有結合されたことを示す。いくつかの実施形態では、患者におけるがんの治療は、ＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化の相対的なレベルを評価することによってモニタリングされる。いくつかの実施形態では、患者におけるがんの治療は、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの割合を評価することによってモニタリングされる。
ｘ．ＫＲａｓの結晶化方法
別の態様において本明細書で提供されるのは、ＫＲａｓを結晶化する方法であり、ＫＲａｓは、本明細書に記載のＫＲａｓ阻害剤に結合していてもよく、本方法は、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体をＫＲａｓ（例えば ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈ）と接触させること、及び複合体の結晶構造を解明することを含む。一実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、本明細書に記載のＳＷＩＩポケットを開く及び／又は安定化する。別の実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、本明細書に記載のＫＲａｓ－ＧＤＰ形態を安定化する。また別の実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓ阻害剤がＳＷＩＩポケット内の少なくとも１つの残基に共有結合又は非共有結合している、本明細書に記載のＳＷＩＩポケットを開く及び／又は安定化する。
さらに本明細書で提供されるのは、ＫＲａｓと共複合化し、それによって結晶化シャペロンとして作用する抗ＫＲａｓ抗体である。本明細書で使用される「結晶化シャペロン」は、目的の標的に結合し、結晶パッキングを強化及び調節し、並びに／又は高品質な位相情報を提供する補助タンパク質を指す。一実施形態では、本明細書に記載のＫＲａｓへの抗ＫＲａｓ抗体の結合は、ＫＲａｓのみと比較したとき、結晶形成を増加させる。一実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、本明細書に記載のＦａｂである。
Ｃ．キット
本発明のアッセイ法は、キットの形態で提供することができる。一実施形態では、そのようなキットは、本明細書に記載の抗ＫＲａｓ抗体又は抗ＫＲａｓ抗体を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、そのようなキットは、以下の基本要素を含むパッケージ化された組み合わせである：本明細書に記載のＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、変異ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓに対する抗ＫＲａｓ抗体を含む捕獲試薬；本明細書に記載のＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓに結合する検出可能な（標識又は非標識）抗体；並びにこれら試薬を使用するアッセイ法の実施方法に関する指示書。これら基本要素は、上記に定義されている。
キットは、捕獲試薬用の固体支持体をさらに含んでもよく、それは、別々の要素として提供されても、又はその上に捕獲試薬が既に固定化されていてもよい。
したがって、キット中の捕獲抗体は、固体支持体に固定化されていても、又はキットに含まれるか若しくはキットとは別に提供されるこのような支持体に固定化されていてもよい。いくつかの実施形態では、捕獲試薬は、固体材料（例えば、マイクロタイタープレート、ビーズ又は櫛）上にコート又は付着させる。検出可能な抗体は、直接検出される標識抗体であってもよいし、異なる種で育てた非標識抗体に対する標識抗体によって検出される非標識抗体であってもよい。標識が酵素である場合、キットは通常、酵素が必要とする基質及び補助因子を含み；標識がフルオロフォである場合、検出可能な発色団を提供する色素前駆体を含み；標識がビオチである場合、アビジン、ストレプトアビジン、ＭＵＧを用いてＨＲＰ又はβ－ガラクトシダーゼにコンジュゲートさせたストレプトアビジンなどのアビジンを含む。
種々の実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体のうちのいずれか１つ以上である。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９１）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９２）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９３）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９５）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９６）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９７）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＧＳＳＩＷＳＳＮ（配列番号９８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（配列番号１）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＬＱＤＨＤＹＰＬＴ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＦＹＶＲＮＷＦＤＰ（配列番号６）を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号１７）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１８）、及びアミノ酸配列ＱＱＹＹＳＹＰＦＴ（配列番号１９）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＡＩＳＳＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＤＱＧＧＹＧＹＰＧＥＳＷＦＤＹ（配列番号２２）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号２５）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２６）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＰＰＷＴ（配列番号２７）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号２８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＡＦＹＳＹＭＤＶ（配列番号３０）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号３３）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号３４）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号３５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号３６）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３７）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＥＲＴＩＬＴＧＹＹＧＦＤＹ（配列番号３８）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４１）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号４２）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＹＶ（配列番号４３）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号４４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４５）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号４６）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号８１）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号８３）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号８４）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＳＦＧＰＹＡＦＤＶ（配列番号８６）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４９）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号５０）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＷＶ（配列番号５１）を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号５２）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５３）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号５４）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号５７）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号５８）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＮＨＷＶ（配列番号５９）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６０）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６１）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＴＮＮＹＧＹＲＹＦＤＹ（配列番号６２）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号６５）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号６６）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＴＤＮＨＬＷＶ（配列番号６７）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６９）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＡＴＳＳＧＹＹＹＦＤＹ（配列番号７０）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＫＲａｓ抗体は、アミノ酸列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号７３）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号７４）を含むＣＤＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＧＴＷＤＮＳＬＳＶＷＶ（配列番号７５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号７６）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７７）を含むＣＤＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＧＫＧＩＶＧＷＧＦＦＧＭＤＶ（配列番号７８）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む。
また、本キットは、典型的には、標準品としてＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓ、並びに安定剤、洗浄及びインキュベーションバッファーなどの添加剤を含む。
キットの構成要素は、様々な試薬の相対量を適切に変えて試薬の溶液中濃度がアッセイの感度を実質的に最大限にするようにした、所定の比率で提供されるであろう。特に、試薬は、通常は凍結乾燥された、賦形剤を含む乾燥粉末として提供されてもよく、それは、溶解時に、試験される試料と組み合わせるのに適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法（例えば、本明細書に記載の、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを検出する方法）における使用のための、本明細書に記載の抗ＫＲａｓ抗体を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを検出する方法における使用のための、櫛にコートされた又は付着した抗ＫＲａｓ抗体をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような、患者のがんの治療をモニタリングする方法における使用のためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のＫＲａｓ阻害剤の、本明細書に記載のＫＲａｓタンパク質（例えば、ＫＲａｓＧ１２Ｃ）への標的係合を測定するためのバイオマーカーアッセイにおける使用のためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰ又はＫＲａｓ－ＧＴＰのアルキル化を検出する方法における使用のためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、ＫＲａｓのアルキル化形態に特異的に結合する１つ以上のＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体を含む。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、キットは、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するために使用される１つ以上の抗ＫＲａｓ抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、生体試料中の共有結合阻害剤の結合によるＫＲａｓＧ１２Ｃの共有結合（例えばアルキル化）を検出するために使用される１つ以上の抗ＫＲａｓ抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のバイオマーカーアッセイに従って、本明細書に記載のＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈを特に含む、ＫＲａｓ、ＫＲａｓ－ＧＤＰ、ＫＲａｓ－ＧＴＰ、及び／又はアルキル化ＫＲａｓを検出し、標的係合を測定する試薬を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化を検出するために使用されるクラスＩ抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＫＲａｓＧ１２Ｄの共有結合を検出するために使用されるクラスＩ抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＫＲａｓＧ１２Ｄの非共有結合を検出するために使用されるクラスＩ抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＫＲａｓＧ１２Ｖの非共有結合を検出するために使用されるクラスＩ抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＫＲａｓＧ１２Ｒの非共有結合を検出するために使用されるクラスＩ抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＫＲａｓＧ１３Ｄの非共有結合を検出するために使用されるクラスＩ抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＫＲａｓＱ６１Ｈの非共有結合を検出するために使用されるクラスＩ抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるＫＲａｓ非共有結合阻害剤に非共有結合したＫＲａｓ又はアルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される１Ａ５、１Ｄ６、２Ｃ１、１Ａ６、１Ｆ４、又は１Ｂ７を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のＫＲａｓ非共有結合阻害剤に非共有結合したＫＲａｓ又はアルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される、１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、４Ｇ１２、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、又はＡｂ８を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のＫＲａｓ非共有結合阻害剤に非共有結合したＫＲａｓ又はアルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される、２Ｈ１１、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７又はＡｂ８を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のＫＲａｓ非共有結合阻害剤に非共有結合したＫＲａｓ又はアルキル化ＫＲａｓを検出するために使用される、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７又はＡｂ８を含む。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤で治療した対象におけるＫＲａｓＧ１２Ｃの共有結合（例えば、アルキル化）を検出する方法における使用のためのキットが提供され、この方法は、（ａ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤での治療後の対象に、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかを投与すること；及び（ｂ）アルキル化ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－１９５２である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－８５３である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－１６２０、ＭＲＴＸ８４９である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＭＧ－５１０である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＧＤＣ－６０３６である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＡＲＳ－３２４８である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＬＹ３４９９４４６である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＪＮＪ－７４６９９１５７である。いくつかの実施態様では、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤は、ＬＹ３５３７９８２である。
いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的共有結合阻害剤で治療した対象における、ＫＲａｓＧ１２Ｄに対する共有結合ＫＲａｓ阻害剤の共有結合を検出する方法における使用のためのキットが提供され、この方法は、（ａ）ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的共有結合阻害剤での治療後の対象に、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかを対象に投与すること；及び（ｂ）ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む。いくつかの実施形態では、ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的共有結合阻害剤で治療した対象における、ＫＲａｓＧ１２Ｄに対する非共有結合ＫＲａｓ阻害剤の非共有結合を検出する方法における使用のためのキットが提供され、この方法は、（ａ）ＫＲａｓＧ１２Ｄ特異的非共有結合阻害剤での治療後の対象に、本明細書に開示される抗ＫＲａｓ抗体のいずれかを投与すること；及び（ｂ）ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるように、当技術分野で既知の様々な手段の１つ以上を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＥＬＩＳＡを使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に提供されるように、免疫組織化学を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態において、キットは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＢＩＯＡＣＯＲＥ ＳＰＲ機器を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む機器。いくつかの実施形態では、キットは、フローサイトメトリーを使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態において、キットは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、免疫沈降法を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、電気泳動移動度シフトアッセイなどのアフィニティー電気泳動を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、蛍光偏光／異方性を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、質量分析と連動させたアフィニティー精製を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、バイオレイヤー干渉法を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用してＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化を検出するための試薬及び説明書を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化の検出における使用のためのものである。いくつかの実施形態では、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化の検出における使用のためのキットが提供され、ここで生体試料は、生体液、例えば、全血又は赤血球、白血球、血小板、血清、及び血漿を含む全血成分、腹水、硝子体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊水、乳、唾液、痰、涙、汗、粘液、脳脊髄液、尿、及びアルキル化ＫＲａｓを含みうる身体の他の構成物質である。いくつかの実施形態では、試料は、任意の動物由来の身体試料である。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト由来の試料である。
いくつかの実施形態では、哺乳動物由来の試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化の検出における使用のためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、臨床試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰのアルキル化状態を検出するとき、ヒト対象に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又は発がん性のＫＲａｓ変異を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料は、臨床患者又はＫＲａｓＧ１２Ｃ発がん性変異を有する患者に由来する。特定の実施態様では、生体試料は血清又は血漿である。特定の実施態様では、生体試料は臨床患者由来の血清である。特定の実施態様では、生体試料は尿である。特定の実施態様では、生体試料は臨床患者由来の尿である。
実施形態
実施形態１． ヒトＫＲａｓに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＧＤＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）に、ＧＴＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＴＰ）よりも高い親和性で特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２． ヒトＫＲａｓに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＧＴＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＴＰ）に、ＧＤＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）よりも高い親和性で特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様３． ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である、実施形態１又は実施形態２に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様４． ＳＷＩＩポケットを開いて安定化する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様５． ヒトＫＲａｓが、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＱ６１Ｈ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、及びＫＲａｓＧ１３Ｄからなる群から選択されるＫＲａｓ変異体である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様６． ヒトＫＲａｓが、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、及びＫＲａｓＧ１３Ｄからなる群から選択されるＫＲａｓ変異体である、実施形態５に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様７． ＫＲａｓ変異体がＫＲａｓＧ１２Ｃである、実施形態６に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様８． ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰが、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤でアルキル化される、実施形態７に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様９． 単離された抗体又は抗原結合断片が、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７でアルキル化されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合するアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である、実施形態８に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１０． ＫＲａｓ変異タンパク質のＳＷＩＩポケットを安定化する、実施形態１～９のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１１．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１２． 軽鎖可変領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、実施形態１１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１３．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）列配列番号１１のアミノ酸配を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７及び配列番号９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１４. 軽鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、及び配列番号１０６ からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つを含む、実施形態１３に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１５．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（配列番号１）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＱＤＨＤＹＰＬＴ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＦＹＶＲＮＷＦＤＰ（配列番号６）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１６． 軽鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態１５に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１７．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号１７）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１８）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＹＹＳＹＰＦＴ（配列番号１９）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＳＳＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＱＧＧＹＧＹＰＧＥＳＷＦＤＹ（配列番号２２）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１８． 軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様１９．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号２５）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２６）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＳＹＳＰＰＷＴ（配列番号２７）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号２８）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＦＹＳＹＭＤＶ（配列番号３０）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２０． 軽鎖可変領域が、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２１．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号３３）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号３４）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号３５）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号３６）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３７）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＲＴＩＬＴＧＹＹＧＦＤＹ（配列番号３８）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２２． 軽鎖可変領域が、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、実施形態２１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２３．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４１）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号４２）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＹＶ（配列番号４３）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号４４）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４５）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号４６）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２４． 軽鎖可変領域が、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、実施形態２３に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２５．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号８１）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号８３）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号８４）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＦＧＰＹＡＦＤＶ（配列番号８６）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２６． 軽鎖可変領域が、配列番号８７のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号８８のアミノ酸配列を含む、実施形態２５に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２７．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４９）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号５０）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＷＶ（配列番号５１）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号５２）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５３）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号５４）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２８． 軽鎖可変領域が、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号５６のアミノ酸配列を含む、実施形態２７に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様２９．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号５７）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号５８）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＮＨＷＶ（配列番号５９）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６０）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６１）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＮＮＹＧＹＲＹＦＤＹ（配列番号６２）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様３０． 軽鎖可変領域が、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号６４のアミノ酸配列を含む、実施形態２９に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様３１．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号６５）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号６６）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＴＤＮＨＬＷＶ（配列番号６７）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６８）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６９）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＴＳＳＧＹＹＹＦＤＹ（配列番号７０）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様３２． 軽鎖可変領域が、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号７２のアミノ酸配列を含む、実施形態３１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様３３．
（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号７３）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号７４）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＴＷＤＮＳＬＳＶＷＶ（配列番号７５）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号７６）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７７）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＫＧＩＶＧＷＧＦＦＧＭＤＶ（配列番号７８）を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様３４． 軽鎖可変領域が、配列番号７９のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号８０のアミノ酸配列を含む、実施形態３３に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様３５． ヒトＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＫＲａｓのアミノ酸Ｗ９９、Ｋ５、Ｌ６、Ｖ７、Ｓ３９、Ｄ５４、Ｌ５４、Ｙ７１、Ｔ７４、及び／又はＧ７５に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様３６． ヒトＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＫＲａｓのアミノ酸Ｗ９９、Ｋ５、Ｌ６、Ｖ７、Ｓ３９、Ｄ５４、Ｌ５４、Ｙ７１、Ｔ７４、及び／又はＧ７５に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様３７． 実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインをコードする単離された１つ又は複数の核酸。
実施態様３８． 実施形態３７に記載の１つ又は複数の核酸を含むベクター。
実施態様３９． 実施形態２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
実施態様４０． 検出可能な標識にコンジュゲートしている、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
実施態様４１． 抗体をコードするベクターの発現に適した条件下で実施形態３６に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗体を回収することを含む、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する抗体又はその断片を作製するための方法。
実施態様４２． 抗体をコードするベクターの発現に適した条件下で実施形態３６に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗体を回収することを含む、ＫＲａｓ－ＧｔＰに結合する抗体又はその断片を作製するための方法。
実施態様４３． ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰよりも高い親和性でＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する抗体のスクリーニング方法であって、
（ａ）抗体ライブラリーを、
ｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、
ｉｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤でアルキル化されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、及び
ｉｉｉ）非加水分解性ＧＴＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃ
と接触させること、並びに
（ｂ）非加水分解性ＧＴＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃよりも高い親和性でアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する抗体を選択すること
を含む方法。
実施態様４４． ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰよりも高い親和性でＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰに結合する抗体のスクリーニング方法であって、
（ａ）抗体ライブラリーを、
ｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰ、
ｉｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤でアルキル化されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰ、及び
ｉｉｉ）非加水分解性ＧＤＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃ
と接触させること、並びに
（ｂ）非加水分解性ＧＤＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃよりも高い親和性でアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰ及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰに結合する抗体を選択すること
を含む方法。
実施態様４５． ライブラリーが合成ファージライブラリーである、実施形態４３又は実施態様４４に記載の方法。
実施態様４６． 生体試料を、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含む、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出するための方法。
実施態様４７． 生体試料を、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗体と接触させることをさらに含み、ＫＲａｓ－ＧＤＰの量及びＫＲａｓ－ＧＴＰの量が決定される、実施形態４６に記載の方法。
実施態様４８． 生体試料を、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含む、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＴＰを検出するための方法。
実施態様４９． 生体試料を、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する抗体と接触させることをさらに含み、ＫＲａｓ－ＧＴＰの量及びＫＲａｓ－ＧＤＰの量が決定される、実施形態４６に記載の方法。
実施態様５０． 検出可能な標識にコンジュゲートした実施形態１～３６のいずれか１つに記載のＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片と、前記抗体又はその抗原結合断片を検出するための説明書とを含むキット。
実施態様５１． 実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片を、ＫＲａｓ変異体と接触させること、化合物をスクリーニングすること、及び抗体又はその抗原結合断片に結合したＫＲａｓ変異体に結合する化合物を同定することを含む、ＫＲａｓ変異体の阻害剤を取得する方法。
実施態様５２． 化合物が、ＳＷＩＩポケットにおいてＫＲａｓを共有結合的に修飾する分子を含む、実施形態５１に記載の方法。
実施態様５３． 化合物が、ＳＷＩＩポケット内の少なくとも１つの残基をアルキル化する共有結合阻害剤を含む、実施形態５２に記載の方法。
実施態様５４． 化合物が、ＳＷＩＩポケットにおいてＫＲａｓを非共有結合的に修飾する分子を含む、実施形態５１に記載の方法。
実施態様５５． ＫＲａｓ変異体が、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈである、実施形態５１～５４のいずれか１つに記載の方法。
実施態様５６． 生体試料を、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させること、及びアルキル化ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む、ＫＲａｓのアルキル化を検出する方法。
実施態様５７． 検出が、ＫＲａｓＧ１２Ｃの検出を含む、実施形態５６に記載の方法。
実施態様５８． 抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である、実施形態５６又は５７に記載の方法。
実施態様５９． 実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片を哺乳動物に投与すること、及びアルキル化ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む、哺乳動物におけるＫＲａｓのアルキル化を検出する方法。
実施態様６０． ＫＲａｓ阻害剤で治療した患者におけるＫＲａｓのアルキル化を検出する方法であって：
（ａ）患者から試料を取得すること；
（ｂ）試料を、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させること；
（ｃ）抗体又はその抗原結合断片によって結合されたＫＲａｓの量を測定すること
を含む方法。
実施態様６１． ＫＲａｓ阻害剤が、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７である、実施形態６０に記載の方法。
実施態様６２． 抗体又はその抗原結合断片によって結合されたＫＲａｓの量が、患者に投与するべきＫＲａｓ阻害剤の投与量を決定する、実施形態６０又は６１に記載の方法。
実施態様６３． 検出が、ＫＲａｓＧ１２Ｃの検出を含む、実施形態５９～６２のいずれか１つに記載の方法。
実施態様６４． 抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である、実施形態５９～６３のいずれか１つに記載の方法。
実施態様６５． 哺乳動物がヒトである、実施形態５９～６３のいずれか１つに記載の方法。
実施態様６６． ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤で治療した対象におけるＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化を検出する方法であって：
（ａ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤による治療後の対象に、抗体１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、４Ｇ１２、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７又はＡｂ８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片を投与すること；及び
（ｂ）アルキル化ＫＲａｓに結合された抗体又はその抗原結合断片を検出すること
を含む方法。
実施態様６７． ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤が、ＡＲＳ－１９５２、ＡＲＳ－８５３、ＡＲＳ－１６２０、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７である、実施形態６６に記載の方法。
実施態様６８． 抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である、実施形態６７に記載の方法。
実施態様６９． ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんを治療する方法であって、そのようながんを有する患者に対し、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む方法。
実施態様７０． ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんが、ＮＳＣＬＣ、結腸がん、又は膵臓がんである、実施形態６９に記載の方法。
実施態様７１． 実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片を含む結晶化シャペロン。
実施態様７２． ＫＲａｓを結晶化するための方法であって、ＫＲａｓが、ＫＲａｓ阻害剤に結合していてもよく、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片をＫＲａｓと接触させること、及び複合体の結晶構造を解明することを含む方法。
実施態様７３． ＫＲａｓが、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈである、実施形態７２に記載の方法。
実施態様７４． 化合物のＫＲａｓへの結合を測定するためのバイオセンシング表面であって：
（ｉ）バイオセンシング表面が、ＫＲａｓタンパク質と実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片とがその中に共局在化するヒドロゲルを含み；
（ｉｉ）ＫＲａｓと抗体又はその抗原結合断片が、互いに係合して親和性複合体を形成するためにヒドロゲル内で十分な自由度を有し；
（ｉｉｉ）ＫＲａｓ及び抗体又はその抗原結合断片の局所濃度は、解離親和定数を少なくとも１０倍上回っており、その局所濃度が親和性複合体の形成を促進し；
（ｉｖ）未結合ＫＲａｓタンパク質及び抗ＫＲａｓ抗体の割合が約５０％未満であり；
（ｖ）ＫＲａｓ阻害剤化合物が、少なくとも５秒間、バイオセンシング表面上に注入され；
（ｖｉ）抗ＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ阻害剤化合物の結合が、少なくとも１つのセンシングチャネル上で測定される、
バイオセンシング表面。
実施態様７５． ヒドロゲルが、約１０ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～３００ｎｍ、１０～２５０ｎｍ、又は約１０～２００ｎｍの厚さである、実施形態７４に記載のバイオセンシング表面。
実施態様７６． ＫＲａｓがビオチン化されている、実施形態７４又は７５に記載のバイオセンシング表面。
実施態様７７． ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップに取り付けられている、実施形態７４～７６のいずれか１つに記載のバイオセンシング表面。
実施態様７８． 抗ＫＲａｓ阻害剤の活性について化合物をスクリーニングする方法であって、ＫＲａｓへの化合物の結合を測定することを含み、ＫＲａｓが抗ＫＲａｓ抗体に結合しており、結合が、実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のバイオセンシング表面を使用して測定される、方法。
実施態様７９． 本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ変異タンパク質の結合を測定する方法であって：
（ｉ）実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のバイオセンシング表面をＫＲａｓと接触させてＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を形成すること；
（ｉｉ）ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させることであって、抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓタンパク質と比較して過剰モルである、ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させること；及び
（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴を使用してＫＲａｓに対する抗体又はその抗原結合断片の結合及び親和性を検出すること
を含む方法。
実施態様８０． 本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ変異タンパク質の結合を測定する方法であって：
（ｉ）実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のバイオセンシング表面を、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させて、抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面を形成すること；
（ｉｉ）抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面をＫＲａｓと接触させることであって、抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓタンパク質と比較して過剰モルである、抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面をＫＲａｓと接触させること；及び
（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴を使用してＫＲａｓに対する抗体又はその抗原結合断片の結合及び親和性を検出すること
を含む方法。
実施態様８１． ＫＲａｓタンパク質へのＫＲａｓ阻害剤の標的係合を測定する方法であって、
（ａ）患者から試料を取得すること；
（ｂ）試料を、本明細書に記載される抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片と接触させること；及び
（ｃ）抗ＫＲａｓ抗体によって結合されたＫＲａｓのレベルを測定すること
を含む方法。
特許請求される本開示の範囲をいかなる意味でも限定することを意図しない以下の実施例において、本開示についてさらに詳細に説明する。添付図面は、本明細書及び本開示の記載に欠くことのできない一部として考慮されることを意図している。以下の実施例は、特許請求される開示を例示するために供与されるのであって、限定するために供与されているのではない。
実施例１：抗ＫＲａｓ抗体の選択及びエピトープマッピング
以下の実施例は、ＫＲａｓＧ１２Ｃの開いたコンフォメーションを認識又は誘導する抗ＫＲａｓ抗体の選択及び特徴づけについて記載する。
材料及び方法
ファージ選択
合成抗体ライブラリーと３つの異なるＫＲａｓＧ１２Ｃコンフォメーション、すなわちアルキル化及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＭＰＰｃｐ（非加水分解性ＧＴＰ模倣物）を使用して、インビトロ選択戦略を開発した（図１Ｂ）。ＫＲａｓアイソフォームＢのアミノ酸残基Ｔ２～Ｋ１６９を使用した。ＧＮＥ－１９５２でアルキル化したビオチン化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰと共に合成ファージライブラリーを溶液中でインキュベートするバイオパニングを４ラウンド実施した。ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰのアルキル化された開いたコンフォメーションへの選択を促進するために、溶液中の過剰な非ビオチン化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＭＰＰｃｐの存在下で選択を行った。
既存の合成Ｆａｂファージディスプレイライブラリーを使用して選択を実施した（Ｃ．Ｖ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００４；３４０：１０７３－１０９３；Ｗ．Ｃ．Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００７；３６６：８１５－８２９）。プールしたライブラリーを、ビオチン化したＫＲａｓＧ１２Ｃｉ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ１９５２に溶液中で結合させることを３～４ラウンド（最初５００ｎＭから１０ｎＭまでの範囲で）繰り返した。この溶液を、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に捕獲させ、５μＭ ビオチンでブロックし、ＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＢＴ）で３０秒ずつ３回洗浄し、１００ｍＭ ＨＣｌで溶出した。溶出したファージを、１Ｍ トリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和し、Ｍ１３－ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で一晩増幅させた。アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃに特異的な結合剤を濃縮するために、１μＭの過剰な可溶性ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ又はＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＭＰＰｃｐの存在下で選択を行なった。選択後、個々のコロニーを採取し、９６ウェルのディープウェルプレートで、カルベニシリン及びヘルパーファージを補充した２ｘＹＴ培地中で、３０℃で一晩増殖させた。ファージ上清を、ＫＲａｓＧ１２Ｃｉ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ１９５２、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＭＰＰｃｐに対するファージＥＬＩＳＡに使用し、標的特異的クローンを同定した。
抗体及びＦａｂの生成
１１の特有のクローンについてＩｇＧが生成された。リードファージクローン由来の配列は、サンガー配列決定により取得した。各クローンの軽鎖及び重鎖のＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１）発現コンストラクトは、遺伝子合成により取得した。ＩｇＧは、２９３個の細胞の一過性トランスフェクションにより生成され、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、続いて標準的な方法を使用するＳＥＣ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）により、精製した。細菌発現Ｆａｂコンストラクトは、遺伝子合成により生成された。組み換えＦａｂｓは、前述のように生成された（Ｔ．Ｎ．Ｌｏｍｂａｎａ，Ｍ．Ｄｉｌｌｏｎ，Ｊ．Ｂｅｖｅｒｓ，３ｒｄ，Ｃ．Ｓｐｉｅｓｓ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ２０１５；５：１７４８８）．
アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃに対する抗体酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
ＧＮＥ－１９５２結合ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰを認識する抗ＫＲａｓ抗体を同定するために、２つの追加の化合物（ＡＲＳ－８５３及びＡＲＳ－１６２０）でアルキル化したＫＲａｓＧ１２Ｃを認識する１１のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の能力を測定した（Ｍ．Ｐ．Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１６；６：３１６－３２９；Ｐ．Ｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６；３５１：６０４－６０８）。ビオチン化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ－１９５２及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰを、ＰＢＳ中０．３μｇ／ｍＬでＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に４℃で一晩３連にコートした。プレートをＰＢＳＢＴで洗浄し、１０μｇ／ｍＬから開始した抗ＫＲａｓ抗体（本明細書に記載される選択された抗ＫＲａｓ抗体及び市販の抗体の両方）の段階希釈を、２５℃で１～２時間振盪しながら加えた。洗浄後、種差に応じたＦｃ特異的ＨＲＰ ２゜抗体を、２５℃で１時間振盪しながら加えた。ＰＢＳＢＴで洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で５分間現像し、６５０ｎｍで検出した。
抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＳＰＲ実験を２５℃のＭａｓｓ－１（Ｂｒｕｋｅｒ）で、ＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ランニングバッファーを使用して実行した。１μｇ／ｍＬの抗ＫＲａｓ抗体を、抗ＨｕＩｇＧ１ Ｆｃ捕獲キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して捕獲した。ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ－１９５２、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＡＲＳ１６２０、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＡＲＳ８５３、及びＫＲａｓＷＴ－ＧＤＰを、溶液中の被分析物として３０μＬ／分の流量で加えた。ＫＲａｓＧ１２－ＧＤＰ＋ＧＮＥ－１９５２を、５００～０ｎＭの希釈系列を使用して滴定した。ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰを、５０００～０ｎＭの希釈系列を使用して滴定した。ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＡＲＳ１６２０を、１０００～０ｎＭの希釈系列を使用して滴定した。ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＡＲＳ８５３を、２００～０ｎＭの希釈系列を使用して滴定した。ＫＲａｓＷＴ－ＧＤＰを、２０００～０ｎＭの希釈系列を使用して滴定した。センサーグラムを１：１のラングミュアモデルにフィッティングし、動態パラメーターを同定した。
エピトープビニング
エピトープビニング実験を、アレイベースイメージャー（ＩＢＩＳ ＭＸ９６、オランダ）で、２５℃のＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ランニングバッファー中で、前述のように実施した（Ｙ．Ｎ．Ａｂｄｉｃｈｅｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４；９：ｅ９２４５１）。簡単には、１０μｇ／ｍＬの抗ＫＲａｓ抗体を、１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５で表面上にアミンカップリングし、１Ｍのエタノールアミンで表面をクエンチした。エピトープビニング実験は、まず２μＭのＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ１９５２を、固定化した抗体の上に流し、次いで、溶液中の抗ＫＲａｓ抗体の各々を１０μｇ／ｍＬ加えることにより行った。抗体を加える前に、抗原が会合するのに十分な時間があった。溶液中に次の抗体を加える前に、１０ｍＭのグリシンｐＨ２．５で表面を再生させた（図１Ｆ）。
免疫沈降
免疫沈降実験は、ＡＲＳ－１６２０又はＤＭＳＯコントロールで処理した細胞上で１Ａ５及び２Ｈ１１を用いて実施した（図１Ｇ）。
結果
ＳＷＩＩ共有結合阻害剤による共有結合的修飾時にアルキル化されたＫＲａｓＧ１２Ｃの固有のコンフォメーションに結合する抗ＫＲａｓ抗体を選択するために、ファージディスプレイ選択を実施した。特異性を確認するためのファージＥＬＩＳＡスクリーニングの後、１１の固有のクローンについてＩｇＧを生成し、その結合特異性をＥＬＩＳＡ（図１Ｃ）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（図１Ｄ、図１Ｅ、及び表１Ａ）によって特徴づけた。すべてのｍＡｂｓは、ＫＤ～１－１３９ｎＭの範囲の親和性でＧＮＥ－１９５２でアルキル化されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合した（表１Ａ）。選択されたｍＡｂと市販の抗ＫＲａｓ抗体ｉＤａｂ６（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ２００７；２６：３２５０－３２５９）のＫＲａｓ－ＧＴＰに対する結合特異性も測定された（表１Ｂ）。
１つのグループ（クローン１Ｄ６、１Ｂ７、２Ｃ１、１Ａ６、及び１Ｆ４）はＧＮＥ－１９５２結合ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰコンフォメーションに選択的であったのに対し、第２のグループ（クローン１Ａ５、１Ｅ５、２Ａ３、２Ｈ１１、３Ａ１２、及び４Ｇ１２）は汎アルキル化選択性のように思われ、ＧＮＥ－１９５２、ＡＲＳ－８５３、及びＡＲＳ－１６２０結合ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰコンフォメーション（表１Ａ）を認識した（表１Ｄ）。エピトープマッピング解析により、これら２つのグループがＧＮＥ－１９５２結合ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ上の２つの異なるが部分的に重なるエピトープに結合することが判明した（図１Ｆ）。
表１Ａ：ＧＤＰに結合した異なるＫＲａｓタンパク質に対する抗ＫＲａｓ抗体の親和性。「ＮＢ」は、結合なしを、「ＮＤ」はデータなしを示す。
Figure 2023524041000010
表１Ｂ：ＧＴＰに結合したＫＲａｓタンパク質に対する抗ＫＲａｓ抗体の親和性。「ＮＢ」は、結合なしを、「ＮＤ」はデータなしを示す。
Figure 2023524041000011
クラスＩ抗ＫＲａｓ抗体１Ａ５は、非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰと比較して＞１００倍向上した親和性で、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに対して高い特異性を有していた。クラスＩ抗ＫＲａｓ抗体は、結合するために共有結合したＳＷＩＩリガンドの存在を必要とし、この形態を認識して高い特異性で結合した。一方、クラスＩＩ抗ＫＲａｓ抗体（１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、及び４Ｇ１２）は、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲにより、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰと非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰの両方への結合を示した（図１Ｃ、図１Ｄ、及び表１Ａ）。クラスＩＩ抗ＫＲａｓ抗体は、結合するために共有結合したＳＷＩＩリガンドの存在を必要としなかった。
免疫沈降実験は、ＡＲＳ－１６２０又はＤＭＳＯコントロールで処理した細胞上で１Ａ５及び２Ｈ１１を用いて実施した。クラスＩ及びＩＩの抗ＫＲａｓ抗体はいずれも、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰを特異的に免疫沈降させたが、非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰは免疫沈降させなかった（図１Ｇ）。
本明細書に記載される方法は、多様な化学種によるＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化によって誘導される固有の開いたコンフォメーションを検出する新規の抗ＫＲａｓ抗体のパネルを生成した。
実施例２：抗ＫＲａｓ抗体のアミノ酸配列
選択された抗ＫＲａｓ抗体のアミノ酸配列を、標準的な技術を使用して決定した。抗ＫＲａｓ抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を表２に、抗ＫＲａｓ抗体の重鎖ＣＤＲを表３に示す。抗ＫＲａｓ抗体の軽鎖可変領域を表４に、抗ＫＲａｓ抗体の重鎖可変領域配列を表５に示す。
表２：抗ＫＲａｓ抗体の軽鎖ＣＤＲ配列
Figure 2023524041000012
表３：抗ＫＲａｓ抗体の重鎖ＣＤＲ配列
Figure 2023524041000013
表４：抗ＫＲａｓ抗体の軽鎖可変領域配列
Figure 2023524041000014
表５：抗ＫＲａｓ抗体の重鎖可変領域配列
Figure 2023524041000015
Figure 2023524041000016
２Ｈ１１抗体の結晶構造に基づき、ＫＲａｓ－ＧＤＰ及びＫＲａｓ－ＧＴＰへの結合親和性がさらに向上した。抗体の一部分を、ＮＮＫコドンを使用してランダム化し、インビトロファージ選択を実施して、親和性が向上したバリアントを同定した。固有の配列をＩｇＧに再フォーマットした。各バリアントの解離速度は、本明細書に記載のＳＰＲによって異なるＫＲａｓタンパク質に対して測定された。表６は、各バリアントがＫＲａｓタンパク質のうちの少なくとも１つに対してより遅い解離速度を呈することを実証するものであり、親和性が向上したことを示している。
表６：異なるＫＲａｓタンパク質に対するＣＬＡＭＰバリアントの解離速度
Figure 2023524041000017
実施例３：親和性を向上させるためのＫＲａｓのＣＬＡＭＰへの繋留
本明細書に記載されるＣＬＡＭＰのＦａｂ、ｓｃＦｖ、又はＩｇＧに対するＫＲａｓタンパク質を含む融合体も作製された。この融合タンパク質は、Ｆａｂ近傍のＫＲａｓの局所濃度の上昇をもたらすことができ、親和性の上昇を呈しえた。ＫＲａｓが２Ｈ１１ ＦａｂのＬＣ又はＨＣのＮ末端に融合した、以下の配列が構築された。
Ａｖｉ．ＴＥＶ．ＫＲａｓ．Ｇ４Ｓ４．２Ｈ１１．Ｆａｂ．ＬＣ
重鎖配列：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＰＧＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＧＳＩＳＳＳＮＷＷＳＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＫＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１０７）
軽鎖配列：
ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＳＥＮＬＹＦＱＳＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＳＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＬＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＳＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＲＮＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＲＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号１０８）
Ａｖｉ．ＴＥＶ．ＫＲａｓ．Ｇ４Ｓ４．２Ｈ１１．Ｆａｂ．ＨＣ
重鎖配列：
ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＳＥＮＬＹＦＱＳＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＳＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＬＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＳＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＰＧＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＧＳＩＳＳＳＮＷＷＳＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＫＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１０９）
軽鎖配列：
ＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＲＮＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＲＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号１１０）
実施例４：細胞内のＫＲａｓＧ１２Ｃアルキル化の検出
以下の実施例は、抗ＫＲａｓ抗体１Ａ５を使用した、ＫＲａｓＧ１２Ｃ変異がん細胞におけるアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの検出について記載する。
材料及び方法
免疫蛍光法及びハイコンテンツイメージング ポリ－Ｌ－リジンコート９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に細胞（細胞株に応じて２００００～４００００個／ウェル）を播種し、完全培地（２％Ｌ－グルタミン及び１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ）を補充した。翌日、細胞を、示された濃度のＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤で処理し、示された時間にわたりインキュベートした。処理の最後に、細胞を、冷たい１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、３％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、１Ｘ ＰＢＳで１０分間洗浄し、ＰＦＡを、５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで室温で１０分間クエンチした。細胞を、１Ｘ ＰＢＳで再度５分間２回洗浄し、次いで１Ｘ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で室温で２０分間透過処理した。その後、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー中で希釈した一次抗体と共に、示された濃度で室温で２時間インキュベートした。次いで細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで１０分ずつ３回洗浄し、コンジュゲートした蛍光性二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．のＡｌｅｘａ４８８抗ヒト及びＡｌｅｘａ６４７抗ウサギ又は抗ラット、１：５００）と共に２０～６０分間インキュベートした。１００ｍｌの３００ｎＭ ＤＡＰＩを各ウェルに１５分間加え、次いで細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで２回、及び１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、その後イメージングした。
イメージングは、膜走査能力を改善するために４０Ｘ水浸レンズと共焦点モードとを使用するＯｐｅｒａ ＰｈｅｎｉｘＴＭ ＨＣＳマシン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）で行った。蛍光強度の定量分析を改善することができるように、各ウェルに４～５のフィールドを取得し、Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）ソフトウェアで分析及び定量化を行った。
ウエスタンブロッティング。ＨＣＣ１１７１細胞（２００００／ｍＬ）を、完全培地（２％Ｌ－グルタミンと１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ）を含むＴ－７５超低付着性ＵＬＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｉｎｃ．）に播種し、一晩増殖させた。翌日、細胞を５ｍＭのＡＲＳ８５３で１８～２４時間処理した。翌日、細胞をペレット化し、１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、新しいタンパク質合成のコントロールとして、化合物を有さず、５０ｍｇ／ｍＬのシクロヘキサミド（Ｓｉｇｍａ）を含む又は含まない完全培地で、２４時間又は４８時間再度満たした。次いで細胞を、処理の最後に回収し、１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、ＨａｌｔＴＭプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ）を含むＲｉｐａ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ）で溶解し、タンパク質を回収した。ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ）を使用してタンパク質を定量し、次いでこれをＮｏｖｅｘＴＭ ４－２０％ Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅゲル上で１００Ｖで３時間反応させ、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）ＴｕｒｂｏＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して移行させた。膜を、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＴＢＳブロッキングバッファーで１時間ブロックし、一次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ：ＫＲＡＳ抗体＃１２０６３－１－ＡＰ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐＥＲＫ（Ｔｈｒ ２０２／Ｔｙｒ ２０４）＃９１０１、Ｔｏｔａｌ ＥＲＫ ＃９１０２、ｐＳ６（Ｓｅｒ ２３５／２３６）＃２２１１、及びＨＳＰ９０ ＃４８７４）と共に一晩インキュベートし、次いで３回にわたりＴＢＳＴで１０分間洗浄し、その後二次抗体（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を加えた。最後に膜を、ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄し、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘマシンでイメージングした。
インビボ蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）。腫瘍薬力学を評価するために、回収した腫瘍を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＴＭ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、リベラーゼＤＬ（０．２Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＫＵ Ｎｏ．５４６６２０２００１）及びＤＮａｓｅ Ｉ（４０Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＫＵ Ｎｏ．１０１０４１５９００１）で３０分間３７℃で消化した。単一細胞懸濁液を調製し、ＥｐＣＡＭ（クローンＥＢＡ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号７４３５４４）及びＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について、４℃で３０分間染色し、洗浄した。細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５１－２０９０ＫＺ）を用いて４℃で３０分間固定し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号 ５１－２０９１ＫＺ）で洗浄した。細胞内染色を、１Ａ５－４８８、ｐＳ６（Ｃｌｏｎｅ Ｎ７－５４８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６１４５７）について４℃で６０分間実施し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。細胞を、ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ ＦＡＣＳマシンで解析した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアバージョン７（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；Ｆｌｏｗｊｏ １０．５．３（ＦｌｏｗＪｏ，ＢＤ，ＣＡ）を使用して解析した。
ＫＲａｓＧ１２Ｃ変異がん細胞中のアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃを特異的に可視化するために１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体を使用することができるかどうかを試験した。ＧＮＥ－１９５２、ＡＲＳ－８５３、ＡＲＳ－１６２０、及びＡＭＧ ５１０を含む様々なＧ１２Ｃ共有結合分子で処理したＨ１１７１ ＫＲａｓＧ１２Ｃ細胞の免疫蛍光（ＩＦ）染色は、１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体（図２Ａ～２Ｃ）により用量依存的に検出されたが、ＨＣＴ１１６ ＫＲａｓＧ１３Ｄ細胞の同染色は検出されず、これにより、複数のＫＲａｓＧ１２Ｃ共有結合分子によって誘導される共通コンフォメーションを認識する１Ａ５の能力がさらに確認された。
ＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化の動態学を細胞中で定量した（図２Ｂ）。これら結果は、アルキル化ＫＲａｓの免疫ブロッティングで得られた値（図２Ｄ）、並びに細胞の混合集団におけるｐＥＲＫ及びｐＭＥＫなどのＫＲａｓ経路マーカーの阻害と一致した。個々の細胞におけるアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの１Ａ５によるＩＦ染色は、ＫＲａｓＧ１２Ｃアルキル化の動態が、驚くべきことに、細胞の膜及び点状区画の両方で極めて同期的に起こることを明らかにする追加情報をもたらした（図２Ａ、図２Ｂ）。ＲＡＳ－ＧＤＰに特異的な抗体は存在しないため、１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体での染色により、アルキル化されたときＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰが細胞内のどこに位置していたかに関する局在化の情報が得られる。１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体は、極めて低いレベルのＫＲａｓＧ１２Ｃタンパク質を発現する多くのＫＲａｓＧ１２Ｃ株において、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰも検出することができた（図２Ｅ）。
ＦＡＣＳは単一細胞の解析を可能にし、またアルキル化レベルを下流のシグナル伝達に対する薬力学的効果と相関させる可能性を有するため、ＦＡＣＳ染色に対する１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体の適用が評価された。１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体は、化合物のレベルが上昇するにつれて、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰのレベルの上昇を特異的に検出した（図２Ｆ）。さらに、細胞を、ＫＲＡＳ活性の下流マーカーである抗ｐＳ６抗体で共染色したところ、予想通り、集団の大部分でｐＳ６レベルの用量依存的な低下が見られた（図２Ｆ）。
実施例５：選択された抗ＫＲａｓ抗体と市販の抗ＫＲａｓ抗体との比較
以下の実施例は、本明細書に開示される選択された抗ＫＲａｓ抗体によるＫＲａｓ結合のコンフォメーション特異性と、一組の市販の抗ＫＲａｓ抗体との比較について記載する。
材料及び方法
市販の抗ＫＲａｓ抗体。使用した市販の抗体は以下の通りである：ウサギＩｇＧを有するｉＤａｂ６（Ｔａｎａｋａ、Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ２００７；２６：３２５０－３２５９）、抗Ｒａｓ抗体（ＥＰ１１２５Ｙ）（Ａｂｃａｍ、ａｂ５２９３９）、ＫＲａｓ－２Ｂ特異的ウサギポリクローナル（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、カタログ番号１６１５５－１－ＡＰ）、Ｒａｓ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０５－５１６）、３Ｂ１０－２Ｆ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＷＨ０００３８４５Ｍ１）、及び２３４－４．２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ２４）（図３Ａ－３Ｄ）。
アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃに対する抗体ＥＬＩＳＡ。ビオチン化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ－１９５２及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰを、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に、ＰＢＳ中０．３μｇ／ｍＬで一晩４℃で３連にコートした。プレートをＰＢＳＢＴで洗浄し、１０μｇ／ｍＬから開始して抗ＫＲａｓ抗体の段階希釈物を、２５℃で１～２時間振盪しながら加えた。洗浄後、種差に応じたＦｃ特異的ＨＲＰ ２゜抗体を、２５℃で１時間振盪しながら加えた。ＰＢＳＢＴで洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で５分間現像し、６５０ｎｍで検出した。
免疫沈降法。選択された抗ＫＲａｓ抗体１Ａ５及び２Ｈ１１、並びに一組の市販の抗体による、ＤＭＳＯ又はＡＲＳ－１６２０で処理したＨ１１７１ ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異がん細胞におけるアルキル化及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの免疫沈降法を実施した。
ＫＲａｓに対する一組の市販の抗体を、そのコンフォメーション特異性を決定するために調査した。非アルキル化及びアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの両方に対して同等の親和性を有する２つの抗体（Ａｂｃａｍ ＥＰ１１２５Ｙ及びＲａｓ１０）が、免疫沈降法及びＥＬＩＳＡによって同定され（図３Ａ、図３Ｂ）、このことは、これら抗体がコンフォメーション特異的でないことを示唆するものであった。一方、ＨＲａｓＧＴＰに対して特異性が高いことが報告されているｉＤａｂ６抗体は、ＥＬＩＳＡにより、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰにほとんど又はまったく結合を示さなかったが、ＧＤＰとＧＭＰＰｃＰ結合形態の両方に、ＧＤＰ結合形態に優先して結合し（図３Ｂ）、細胞内で非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃのみを免疫沈降させることができた（図３Ａ）（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ２００７；２６：３２５０－３２５９）。ｉＤａｂ６抗体はＳＷＩ領域とＳＷＩＩ領域の両方にまたがるエピトープに結合するので、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰのアルキル化によって誘導されるＳＷＩＩコンフォメーションは、ｉＤａｂ６の結合を妨げる可能性がある。１Ａ５と２Ｈ１１のみが、アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃに優先的に結合した。
実施例６：１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体は細胞内のＫＲａｓに結合する
以下の実施例は、選択された抗ＫＲａｓ抗体１Ａ５と市販の抗ＫＲａｓ抗体との、細胞内のＫＲａｓに対する結合能の比較を提供する。
材料及び方法
免疫蛍光及びハイコンテンツイメージング。ポリ－Ｌ－リジンコート９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に細胞（細胞株に応じて２００００～４００００個／ウェル）を播種し、完全培地（２％Ｌ－グルタミン及び１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ）を補充した。翌日、細胞に、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ阻害剤を示された濃度で投与し、示された時間にわたってインキュベートした。処理の最後に、細胞を、冷たい１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、３％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、１Ｘ ＰＢＳで１０分間洗浄し、ＰＦＡを、５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌで室温で数分間クエンチした。細胞を、１Ｘ ＰＢＳで再度５分間２回洗浄し、次いで１Ｘ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で室温で２０分間透過処理した。次いで、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで希釈した一次抗体（１Ａ５若しくはｉＤａｂ６、又は両方）と共に、示された濃度で室温で２時間インキュベートした。次いで細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで１０分ずつ３回洗浄し、コンジュゲートした蛍光二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．のＡｌｅｘａ４８８抗ヒト及びＡｌｅｘａ６４７抗ラビット又は抗ラット、１：５００）と共に２０～６０分間インキュベートした。１００ｍｌの３００ｎＭ ＤＡＰＩを各ウェルに１５分間加え、次いで細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで２回、１ＸＰＢＳで１回洗浄し、その後イメージングした（図３Ｃ）。
イメージングは、膜走査能力を改善するために４０Ｘ水浸レンズと共焦点モードとを使用するＯｐｅｒａ ＰｈｅｎｉｘＴＭ ＨＣＳマシン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）で行った。蛍光強度の定量分析を改善することができるように、各ウェルに４～５のフィールドを取得し、Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）ソフトウェア上で分析及び定量化を行った。
洗い流し実験のために、細胞を前述のようにプレーティングし、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ阻害剤で１８～２４時間処理した。１枚のプレートをコントロールとして２４時間後にイメージングし、他のプレートは冷たい１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、化合物を含まない１５０ｍＬの完全培地と共に２４時間又は４８時間インキュベートし、上述のように染色及びイメージングした。
同じ細胞内の非アルキル化及びアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの両方を共染色及び可視化するために、１Ａ５及びｉＤａｂ６（Ｔａｎａｋａ、Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ２００７；２６：３２５０－３２５９）抗体を併用することができるかどうかを試験した。免疫蛍光（ＩＦ）実験を、１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体及びｉＤａｂ６抗体の両方を使用してＡＲＳ－１６２０の用量滴定で処理したＨ１１７１細胞を用いて実施した。１Ａ５を用いた以前のＩＦ実験と同様に、高濃度のＡＲＳ－１６２０処理と相関する１Ａ５染色の増加が検出された。一方、１Ａ５染色の増加は、ｉＤａｂ６抗体による染色の減少と一致した（図３Ｃ）。
両抗体を用いた共染色により、ＫＲａｓＧ１２Ｃの再合成のモニタリングが可能であった。ＡＲＳ－１６２０によるＫＲａｓＧ１２Ｃ細胞の１６時間にわたる処理は、ＩＦ及びイムノブロット解析によるＫＲａｓＧ１２Ｃのほぼ完全なアルキル化がもたらされた（図２Ｄ）。薬物を洗い流すと、２４時間後に非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの出現が始まり（図２Ｄ）、これは、１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体染色の減少及びｉＤａｂ６抗体染色の増加と一致していた。
このように、１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体は、細胞内のＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰの追跡だけでなく、ＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化の研究に使用することができる。
実施例７：高及び低ＫＲａｓＧ１２Ｃ発現モデルマウスにおけるＡＲＳ－１６２０処理によるアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃの用量依存的なインビボでの検出
以下の実施例は、マウスモデルにおけるＫＲａｓＧ１２Ｃに対する抗ＫＲａｓ抗体のインビボでの結合について記載する。
材料及び方法
インビボ腫瘍研究１６～１７週齢で体重２４～２７ｇの雌Ｃ．Ｂ－１７ ＳＣＩＤ（Ｉｎｂｒｅｄ）マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ．から入手した。それらに、５００万個のＮＣＩ－Ｈ３５８非小細胞癌細胞（１：１の比でＭａｔｒｉｇｅｌを含むハンクス平衡塩類溶液の１：１の混合液に懸濁）を、左右両脇腹に皮下接種した。腫瘍は、平均腫瘍体積が４００～６００ｍｍ３に達するまでモニタリングした。マウスに対し、単回用量０（ビヒクル－１００％ Ｌａｂｒａｓｏｌ）、５０又は２００ｍｇ／ｋｇのＡＲＳ１６２０を、１００μＬの容量で経管栄養により経口（ＰＯ）投与した。投与後８時間又は２４時間に血漿及び腫瘍試料を回収した。
インビボＦＡＣｓアッセイ。腫瘍薬力学を評価するために、回収した腫瘍を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＴＭ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、リベラーゼＤＬ（０．２Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＤＮａｓｅ Ｉ（４０Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間３７℃で消化した。単一細胞懸濁液を調製し、ＥｐＣＡＭ（クローンＥＢＡ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について、４℃で３０分間染色し、洗浄した。細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて４℃で３０分間固定し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄した。細胞内染色を、１Ａ５－４８８、ｐＳ６（Ｃｌｏｎｅ Ｎ７－５４８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）について４℃で６０分間実施し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。細胞を、ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、ＦＡＣＳマシンで解析した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアバージョン７（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；Ｆｌｏｗｊｏ １０．５．３（ＦｌｏｗＪｏ，ＢＤ，ＣＡ）を使用して解析した。
アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃは、新鮮な凍結（ＦＰ）組織として調製された腫瘍試料において容易に検出可能であった（図４Ａ）。より低量のアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃを発現する腫瘍も、１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体によって検出された（図４Ｂ）。インビトロの細胞実験と同様に、１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体は、ＦＡＣＳ実験でアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃをエクスビボの腫瘍試料中で検出することもでき、ＭＡＰＫマーカーｐＳ６で多重化することができた（図４Ｃ）。これら結果は、１Ａ５抗ＫＲａｓ抗体が、ＫＲａｓＧ１２Ｃ腫瘍試料におけるＫＲａｓＧ１２Ｃ阻害剤の直接的な標的係合の測定と、ＲＡＳ経路活性化のマーカーによる多重解析を可能にすることを示している。
以下の実施例は、ポケット内の小分子化合物結合の親和性を向上させるために、クラスＩＩ選択抗ＫＲａｓ抗体（例えば、２Ｈ１１）がアルキル化誘導ＫＲａｓ非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃを認識する能力を使用できるかどうかを試験した実験について記載している。
実施例８：選択された抗ＫＲａｓ抗体は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ及びＫＲａｓＷＴに対するＳＷＩＩリガンド親和性を向上させる
材料及び方法
２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験。シリーズＳ ＳＡ（ストレプトアビジン）チップをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に挿入した。機器を、ランニングバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－３３５０、０．１％ ＣＭ－デキストラン（ｗ／ｖ）、０．１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｎＭ ＧＤＰ、及び２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）にプライミングした。１２位において共有結合ＫＲａｓＧ１２Ｃアルキル化剤で事前にブロックされたＫＲａｓＧ１２Ｃを捕獲し、ＫＲａｓＷＴ及びＫＲａｓＧ１２Ｃの標準として働き、スイッチＩＩ（ＳＷＩＩ）ポケットのみでの親和性測定を可能にするフローチャネル１（ＦＣ１）及びＦＣ３で２０００～２５００応答単位（ＲＵ）を得た。ＫＲａｓＷＴ又はＫＲａｓＧ１２Ｃを、標準チャネル捕獲レベルの１００ＲＵ以内のＦＣ２、ＦＣ４上に捕獲し、ＦＣ ２－１、ＦＣ ４－３モードでデータ収集した。その後、１００μｇ／ｍＬのアミン－ＰＥＧ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を注入することにより、すべてのチャネルをブロックした。２Ｈ１１は、ＦＣ３及びＦＣ４を飽和させるために、実行開始時に２００ｎＭで１２０秒間２回注入し、完全占有を保証するために実行中１４サイクルごとに１００ｎＭで注入した。被分析物試料は、２０～３０秒の接触時間及び３０秒の解離時間の２倍の用量応答で、５０ ３Ｍ～１．７５ ３Ｍで試験された。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １．０の１：１アフィニティーモデルで解析され、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で図が作成された（図５Ａ及び図５Ｂ）。
ＳＷＩＩブロック参照を使用し、ＳＷＩＩポケットへの結合を特異的に検出するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイが開発された。２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体の存在下及び非存在下で、様々なＳＷＩＩ共有結合分子（すなわち、ＧＮＥ－１９５２、ＡＲＳ－８５３、ＡＲＳ－１６２０）、及びアクリルアミド機能を欠くＧＮＥ－１９５２のバージョンの、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰとの親和性を試験した。加えて、ＫＲａｓＷＴ－ＧＤＰを、２Ｈ１１が他のＫＲａｓバリアントのＳＷＩＩポケットを安定化することができるかどうかを試験するために含めた。親和性は、２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体の存在下で大きく強化された（図５Ａ及び図５Ｂ）。２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体は、化学的に多様なＫＲａｓＧ１２Ｃアルキル化剤の親和性を高め、さらに１つの特定の化学種に偏らないことを確認し、リガンドの非存在下においてＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを安定化しうることを示唆した。
実施例９：抗ＫＲａｓ抗体：ＫＲａｓＧ１２Ｃ複合体の結晶構造
以下の実施例は、抗ＫＲａｓ抗体と複合体を形成するＫＲａｓＧ１２Ｃの結晶構造の決定について記載する。
材料及び方法
ＫＲａｓＧ１２Ｃタンパク質の発現及び精製。システイン変異体（Ｓ３９Ｃ、Ｃ５１Ｓ、Ｃ８０Ｌ、Ｃ１１８Ｓ）を有する及び有さないＮ末端Ｈｉｓタグ付きＫＲａｓＧ１２Ｃ（１－１６９）コンストラクトを、ｐＥＴ－５２ｂベクターにクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地において０．５のＯＤ６００吸収度まで３７℃で増殖させ、次いで１６℃に移し、その後０．８のＯＤ６００吸収度において０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導後１６時間目に細胞を回収し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）、及びＥＤＴＡを有さないプロテアーゼ阻害剤を含むバッファー中でマイクロフリューダイザーを通過させることにより、ペレットを溶解させた。細胞溶解物を、１２，０００Ｋで１時間スピンさせることにより清澄化した。清澄化した細胞溶解物を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰを含むバッファーのＨｉＴｒａｐカラムにロードし、結合したＫＲａｓタンパク質を３００ｍＭイミダゾールで溶出した。Ｎ末端のＨｉｓ－タグを、ＴＥＶプロテアーゼと共にインキュベートすることにより切断し、ニッケルカラムを通して除去した。ＫＲａｓタンパク質を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２のバッファー中でサイズ排除Ｓ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により研磨した。ＫＲａｓの純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりアッセイして９５％を上回っている。ＧＤＰをＫＲａｓにロードするために、まず４０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＧＤＰと共に２０℃で１～２時間インキュベートした。次いで、ＥＤＴＡもヌクレオチドも含まないバッファーにバッファー交換した。次いで、ＫＲａｓと２Ｈ１１ Ｆａｂを１：１で複合化し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２のバッファー中でサイズ排除Ｓ７５カラムによりさらに精製した。
ＧＮＥ－１９５２によるＫＲａｓＧ１２Ｃタンパク質のアルキル化。ＧＮＥ－１９５２でＫＲａｓをアルキル化するために、ＫＲａｓＧ１２Ｃを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール及び２ｍＭ ＴＣＥＰのバッファー中において、５ｍＭ ＧＤＰ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５０ ｕＭ ＧＮＥ－１９５２と共に２０℃で一晩インキュベートした。完全なアルキル化を、質量分析を介して質量変化を観察することにより確認した。ＫＲａｓを、サイズ排除Ｓ７５ １６／６０カラムにより２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０％グリセロールのバッファーにバッファー交換した。次いで、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｃと２Ｈ１１ Ｆａｂを１：１で複合化し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌのバッファー中でサイズ排除Ｓ７５カラムによりさらに精製した。
ＫＲａｓＧ１２Ｃと２Ｈ１１のＦａｂの結晶化。ＫＲａｓＧ１２Ｃ／２Ｈ１１の結晶の回折品質の結晶を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム ｐＨ６．５、４０％ ２－メチル ２，４－ペンタンジオール（ＭＰＤ）、７％ Ｐｅｇ ８０００、０．５％酢酸エチル、１０ｍＭスペルミン四塩酸塩の結晶化バッファーに対して、１０ｍｇ／ｍＬ ＫＲａｓ及び２４ｍｇ／ｍＬ ２Ｈ１１ Ｆａｂを含む１．０μＬ＋１．０μＬ蒸気拡散シッティングドロップから１９℃で成長させた。結晶は、２週間で現れ、典型的には１５０×２０×３０μＭに成長した。
ＫＲａｓＧ１２Ｃ／ＧＮＥ－１９５２／２Ｈ１１の回折品質の結晶を、０．１ ＭＥＳ ｐＨ６．０、２１％ Ｐｅｇ ４Ｋ、及び０．２Ｍ硫酸リチウムの結晶化バッファーに対し、１５ｍｇ／ｍＬのＫＲａｓ／２Ｈ１１複合体を含む１．０μＬ＋１．０μＬ蒸気拡散シッティングドロップから、１９℃で成長させた。結晶は、１０日で現れ、１００×１５×３０μＭのサイズに成長した。
ＫＲａｓＧ１２Ｃ／ＧＮＥ－１９５２結晶を、０．１０％ ｎ－オクチル－Ｂ－Ｄ－グルコシド、０．１Ｍクエン酸ナトリウム ｐＨ５．５、２２％ ＰＥＧ ３３５０の結晶化バッファーに対し、ＫＲａｓＧ１２Ｃ／ＧＮＥ－１９５２を含む１．０μＬ＋１．０μＬ蒸気拡散シッティングドロップから１９℃で成長させた。
回折データ収集を準備するために、上記３例の結晶を瞬間凍結させる前に、極低温バッファー（ｃｒｙｏｂｕｆｆｅｒ）として１０％のグリセロールを結晶化バッファーに加えた。
回折データの収集及び構造の決定
ＫＲａｓＧ１２Ｃ／ＧＮＥ－１９５２、ＫＲａｓＧ１２Ｃ／２Ｈ１１、及びＫＲａｓＧ１２Ｃ／ＧＮＥ－１９５２／２Ｈ１１結晶の回折データを、ＰＩＬＡＴＵＳ３ ６Ｍ検出器を使用して、Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ（ＳＳＲＬ）ビームライン又はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）のビームライン５．０．２に単色Ｘ線を使用して収集した。回転法を、完全なデータセットの各々について単結晶に適用した。データ収集プロセスを通して、結晶は極低温度に保たれた。データ縮小を、プログラムＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．，Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ２０１０；６６：１２５－１３２）及びＣＣＰ４プログラムスイート（Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｐｐｌｉｅｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ２００７；４０：６５８－６７４）を使用して行った。
データ縮小統計を表７を示す。表７において、括弧内の値は、最高分解能シェルの値であり、Ｒｓｙｍ＝Σ｜Ｉｈｉ－Ｉｈ｜／ΣＩｈｉ（式中、Ｉｈｉは、反射ｈのｉ番目の対称関連観測値のスケーリングされた強度であり、Ｉｈは、平均値である）であり、Ｒｃｒｙｓｔ＝Σｈ｜Ｆｏｈ－Ｆｃｈ｜／ΣｈＦｏｈ（式中、Ｆｏｈ及びＦｃｈは、反射ｈの観察された構造因子振幅及び計算された構造因子振幅である）であり、Ｒｆｒｅｅの値は、洗練に含まれないランダムに選ばれた５％の反射について計算されている。
表７：結晶学統計
Figure 2023524041000018
構造は、プログラムＰｈａｓｅｒ（Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｐｐｌｉｅｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ２００７；４０：６５８－６７４）を使用して分子置換（ＭＲ）により位相決定された。以前に公開されたＫＲａｓＧ１２Ｄの結晶構造（ＰＤＢコード４ＤＳＵ）とＦａｂ構造Ｆａｂ構造（ＰＤＢコード３Ｒ１Ｇ）が、ＭＲ検索モデルとして使用された。手動での再構築を、グラフィックプログラムＣＯＯＴ（Ｐ．Ｅｍｓｌｅｙ，Ｋ．Ｃｏｗｔａｎ，Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ２００４；６０：２１２６－２１３２）を用いて実施した。構造をさらに、最大尤度目的関数、異方性個別Ｂ因子精密化、及びＴＬＳ精密化を使用したＲＥＦＭＡＣ５プログラム（Ｇ．Ｎ．Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ａ．Ａ．Ｖａｇｉｎ，Ｅ．Ｊ．Ｄｏｄｓｏｎ，Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ １９９７；５３：２４０－２５５）及びＰＨＥＮＩＸ（Ｐ．Ｄ．Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ２０１０；６６：２１３－２２１）を使用して繰り返し構造を精密化し、表７に示す最終統計を達成した。
２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体の作用の固有のモードをさらに理解するために、２Ｈ１１ Ｆａｂと複合体を形成するＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰの結晶構造を、２．２Å分解能で決定した（図６Ａ）。２Ｈ１１は ＳＷＩＩの外表面からＫＲａｓＧ１２Ｃに接近し、ＳＷＩＩポケットの開いたコンフォメーションを実際に安定化する。Ｆａｂ結合は、０．６４の形状相補性スコアで、表面積の約７４５Å２を埋める。エピトープは、ＳＷＩ、ＳＷＩＩ、及びセンターコアベータ－シートからの残基を含む。２Ｈ１１相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１及びＨ３は、ＫＲａｓＧ１２Ｃとの直接接触の大部分に寄与している（図６Ｂ）。１３残基長のＨ３ループは、ＳＷＩＩ領域に結合する。エピトープの中心において、ＨＣ．Ｔｒｐ９９は、ＫＲａｓＧ１２Ｃ残基Ｌｙｓ５、Ｌｅｕ６、Ｖａｌ７、Ｓｅｒ３９、Ａｓｐ５４、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ７１、Ｔｈｒ７４、Ｇｌｙ７５によって囲まれた小さな疎水性ポケットに留まっている（図６Ｃ）。このポケットは、ＳＯＳ依存性のヌクレオチド交換を阻害するインドール含有小分子に結合することが以前発見された（Ｔ．Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０１２；１０９：５２９９－５３０４；Ｑ．Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２０１２；５１：６１４０－６１４３）。興味深いことに、この抗体は、化学的に類似したトリプトファン側鎖を有するこの部位を活用していた。ＣＤＲＨ１は、Ｒａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）結合部位の一部分に対してパッキングすることにより、ＳＷＩ領域の近傍に結合する。ｉＤａｂ６とは異なり、２Ｈ１１は、ＳＷＩ残基とほとんど直接接触せず（図６Ｆ）、したがって結合したヌクレオチドの種類に対する感度は低かった。ＣＤＲ Ｌ２及びＨ２は、少数のファンデルワールス接触をすることにより、ＫＲａｓ認識に関与している。Ｌ２は、ＳＷＩＩヘリックスのＣ末端の先端と接触しているため、ＳＷＩＩループをさらに安定化するが、コンフォメーションを過度に制限することはないという点で特に興味深い。図６Ｅに示されるように、ＳＷＩＩの最も柔軟な部分であるＧｌｎ６０－Ａｌａ６６は、２Ｈ１１との直接接触を完全に有さないため、ＳＷＩＩポケットにおける様々なリガンドの結合を可能にする一定レベルのコンフォメーション柔軟性を維持する。例えば、ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ／２Ｈ１１複合体構造と、ＧＮＥ－１９５２結合ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ構造（図６Ｄ）との比較は、安定化したＳＷＩＩポケットが、阻害剤を収容するために十分に開いており、ＳＷＩＩの柔軟性が、リガンドを完全に包むために内側にわずかに閉じることを可能にすることを示している。この仮説を検証するために、ＧＮＥ－１９５２アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃと複合体を形成する２Ｈ１１の結晶構造を決定した。ＧＮＥ－１９５２の存在は、実際に、ＳＷＩＩ残基の主鎖と側鎖のコンフォメーションのシフトと関連しており（図６Ｃ）、ＫＲａｓとＦａｂ ＣＤＲの構造の残りの部分は一定であった。化合物の結合時、重要な側鎖の反転がＨｉｓ９５に起こり、これによりキナゾリン窒素との水素結合が形成される。この相互作用は、キナゾリン足場化合物に共通するように思われ、２Ｈ１１ Ｆａｂ結合によって変化しなかった（Ｍ．Ｐ．Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１６；６：３１６－３２９）。
実施例１０：選択された抗ＫＲａｓ抗体の他のＫＲａｓ変異体への拡大
以下の実施例は、様々なＫＲａｓ変異体に対する、選択された抗ＫＲａｓ抗体の結合能について記載する。
材料及び方法
アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃに対する抗体ＥＬＩＳＡ。ビオチン化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ＋ＧＮＥ－１９５２及びＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰを、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に、ＰＢＳ中０．３μｇ／ｍＬで一晩４℃で３連にコートした。プレートをＰＢＳＢＴで洗浄し、１０μｇ／ｍＬから開始して抗ＫＲａｓ抗体の段階希釈物を、２５℃で１～２時間振盪しながら加えた。洗浄後、種差に応じたＦｃ特異的ＨＲＰ ２゜抗体を、２５℃で１時間振盪しながら加えた。ＰＢＳＢＴで洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で５分間現像し、６５０ｎｍで検出した。
変異ＫＲａｓ－ＧＤＰタンパク質に対する抗体ＥＬＩＳＡ。ＫＲａｓ－ＧＤＰタンパク質を、ＰＢＳ中において一晩４℃で、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に１０μｇ／ｍＬで３連で直接コートした。プレートを、４％ＢＳＡを使用して２５℃で２時間ブロックした。１０μｇ／ｍＬから開始して１Ａ５及び２Ｈ１１抗体の段階希釈を、２５℃で１～２時間振盪しながら加えた。プレートを、上述のように現像し、読み取った。
２Ｈ１１が、ＫＲａｓＧ１２Ｃ以外のＫＲａｓ変異体においてＧＤＰ結合状態を認識し、ＳＷＩＩ領域の開いたコンフォメーションを安定化する可能性があるかどうかを調査するために、ＫＲａｓ変異体のパネルに対する抗体１Ａ５及び２Ｈ１１の結合を、ＥＬＩＳＡ法により評価した（図７）。極めて驚くべきことに、２Ｈ１１は、ＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＤＰ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ－ＧＤＰ、及びＫＲａｓＱ６１Ｈ－ＧＤＰに対して強い結合を、ＫＲａｓＧ１３Ｄ－ＧＤＰとＫＲａｓＷＴ－ＧＤＰに対してそれより大幅に弱い結合を呈した（図７）。２Ｈ１１抗ＫＲａｓ抗体が複数のＫＲａｓ変異体に結合し、ＳＷＩＩポケット結合剤の親和性を高めることができるとすれば、それは、他のＲＡＳ変異体を標的とする新規リガンドの同定を可能にしうる。
実施例１１：標的及びＣＬＡＭＰ共捕獲を使用したＣＬＡＭＰ協同性ＳＰＲアッセイ
ＢＩＡＣＯＲＥ Ｓ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を分析温度２０℃に設定し、シリーズＳ ＳＡセンサーチップ（すなわち、ストレプトアビジンでプレコートしたハイドロゲルコートセンシングチップ）をドッキングさせた。このシステムを、５０ｍＭ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．２％ポリエチレングリコール（３３５０ Ｄａの平均分子量）、０．１％カルボキシメチル化デキストラン；１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｎＭヌクレオチド（ＧＤＰ、ＧＴＰ又はヌクレオチドアナログ）、０．１ｍＭ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）を含むアッセイバッファーで３回プライミングした。ビオチン化変異ＫＲａｓ（すなわち、ＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＤＰ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ－ＧＤＰ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ－ＧＤＰ及びＫＲａｓＧ１３Ｄ－ＧＤＰ）を、組み換え発現させ、社内で所与の変異ＫＲａｓについて精製し、アッセイバッファー中において１００～５００ｎＭの範囲内の最終濃度を得るために希釈した。次いでこの変異ＫＲａｓ試料をセンシングチャネル上に注入し、２０００ＲＵ～３０００ＲＵの範囲の捕獲密度を得た。これは、光学的に調べたハイドロゲル体積内部のハイドロゲル濃度が約０．９～１．５ｍＭであることに相当する。２つ目のセンシングチャネルは、基準センシングチャネルを提供するために、コートされないままであった。余分な未占有ビオチン部位を、１μＭのビオチンを注入することにより飽和させた。
ＳＷＩＩポケット結合化合物である試験化合物の１０ｍＭストック（ジメチルスルホキシドに溶解）から連続する９つの２倍希釈液を、アッセイバッファーを希釈液として使用して調製し、０．０３９～１０μＭの濃度範囲を得た。各試料及びランニングバッファー中のジメチルスルホキシド濃度は、１％（ｖ／ｖ）に一致させた。このようにして、すべての試験化合物について一組の希釈液が調製された。溶媒補正標準液を提供するために、一定範囲のジメチルスルホキシド濃度を含むアッセイバッファーから調製した連続する６つの試料を調製した。各希釈系列は、低濃度から高濃度まですべてのセンシングチャネルにわたって１００μＬ／分で１０秒間注入され、完全な用量反応を含む単一サイクルを生成した。サイクルを、まずコートされていないセンシングチャネルのサイクルを差し引き、次いで化合物を含まない試料であるブランク単一サイクルを差し引くことにより、二重参照した。各化合物注入シリーズに続いて、ブランク注入サイクルにより、ブランク選択のために近くの近接ブランクを使用することを可能にした。
相互作用定数を得るために、データを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にエクスポートし、運動モデルフィッティングを実施した。単一化合物のデータを図８に示す。このアッセイは、２Ｈ１１ Ｆａｂを使用せずに実施され、したがって、親和性の共同増幅なしでＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＤＰへの化合物結合の相互作用定数が返された。
図８に示されるように、化合物の濃度を上昇させることで、ＫＲａｓＧ１２Ｖ－ＧＤＰコート表面の飽和に近づく用量依存性応答が得られた。単一部位の擬一次モデルのフィッティングが行われ、３．２９×１０５（１／Ｍｓ）のｋｏｎ、１．３（１／ｓ）のｋｏｆｆ、約４μＭのＫＤが得られた。フィッティングされたモデル曲線が実験的な応答サイクルにうまく重なることが観察できる。
２Ｈ１１ Ｆａｂの共同強化因子を決定するために、上記アッセイは、１つ又は複数のＫＲａｓ変異体の捕獲後、ビオチンブロッキングの前に繰り返されたが、２Ｈ１１－Ｆａｂ－ビオチン捕獲工程を含んでいた。
結合反応が概ねプラトーに達し、プレコートした変異ＫＲａｓ表面上に共捕獲された２Ｈ１１の約２５００～３０００ＲＵ（０．５ｍＭ Ｆａｂ）が得られるまで、２Ｈ１１－Ｆａｂ－ビオチンを２００ｎＭで注入した。これは、２Ｈ１１ Ｆａｂ：ＫＲａｓのモル比が１：２であることを表しており、弱い結合部位（すなわち２Ｈ１１ Ｆａｂが結合していないＫＲａｓ）と高親和性結合部位（すなわちＫＲａｓ－２Ｈ１１ Ｆａｂ複合体）の割合が効果的に等しくなる。化学量論的等価を得るのに十分なＦａｂ、又は過剰なＦａｂの共捕獲は、均質なＫＲａｓ－２Ｈ１１ Ｆａｂ複合体をもたらし、さらなる最適化に可能であった。
解析は上記に概説したように実施したが、１：１モデルは、２サイト部位結合モデル（異種リガンド）で置き換えられて、図９に示されるように、両サイトの動力学及び親和性を、単一サイクルの動力学曲線へのフィッティングから決定することができた。図９に示されるように、化合物の濃度を徐々に上昇させることで、二相性の用量依存的応答が得られた。２つの部位の擬一次モデルのデータへのフィッティングが行われ、高親和性部位について、６．６×１０５のｋｏｎ（１／Ｍｓ）、０．０２５（１／ｓ）のｋｏｆｆ、約４μＭのＫＤという相互作用定数が返された。フィッティングされたモデル曲線が実験的な応答サイクルにうまく重なることが観察できる。高親和性安定化ＳＷＩＩ部位に結合する化合物は、各注入の最後のより遅い解離位相極率から容易に同定され、これは、より安定な複合体を示している。親和性の低い非安定化ＳＷＩＩ部位への結合は、重なり合うように見えるが、速い解離を伴っている。予想されたように、より親和性の高い安定化ＳＷＩＩ ＫＲａｓへの結合は、低濃度で飽和し、一方で、非安定化低親和性部位への結合は、最も高い試験濃度１０μＭでも不飽和のままである。この解析は、選択された一連のＳＷＩＩ結合化合物について繰り返された。協同性因子は、安定化：非安定化ＳＷＩＩ結合のＫＤ 比として表され、図１０は、化合物の選択についての協同性因子をまとめたものである。
図８における各注入の開始時と終了時の曲率は、動態学的情報を含み、動態学的速度定数の定義に役立ち、各注入の中間のプラトー領域は、各用量における平衡応答を定義する。１：１の擬一次モデルがデータにフィッティングされ、会合速度定数、解離速度定数、及び親和性定数を得るために重ね合わせて示されている。
非共捕獲ＳＰＲでは、抗体は、試験される化合物に曝露する前に予め結合させることができ、濃度と接触時間の両方が、本明細書に記載される抗体が完全に飽和する（すなわち、結合しない標的が本質的に残らない）ように選択される場合、標的でコートされたセンシング表面上に注入することができる。しかしながら、この手法は欠点を有している。高い標的濃度では、フルサイズの抗体（１５０ｋＤａ）の化学量論的等価濃度（例えば、標的あたり１Ｆａｂアーム）を標的コートヒドロゲルにロードすることは不可能であった。このようなローディングの限界は、過密によって引き起こされるハイドロゲルの排除効果と、分子サイズの排除、等電点、静電気、ハイドロゲル鎖密度、及び標的密度の複雑な相互作用との結果である可能性がある。
スクリーニング及び化合物結合の特徴づけのためのバイオセンサーベースのアッセイは通常、完了まで実行するのに数時間以上を要し、この間に、抗体は、表面から連続的に流れるバッファー流へと自由に解離する。したがって、表面を再飽和させるために、抗体の定期的な注入が必要である。抗体ＫＲａｓ複合体が比較的短い半減期（例えば＜１５分）を有するとき、定期的な再飽和は現実的ではなく、せいぜいアッセイ中に占有率を大きく変動させる程度である。したがって、本明細書に記載される共捕獲技術は、相互作用及び化合物親和性の決定においてより効率的且つより優良である。

Claims (81)

  1. ヒトＫＲａｓに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＧＤＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）に、ＧＴＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＴＰ）よりも高い親和性で特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
  2. ヒトＫＲａｓに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＧＴＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＴＰ）に、ＧＤＰに結合したＫＲａｓ（ＫＲａｓ－ＧＤＰ）よりも高い親和性で特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
  3. ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である、請求項１又は請求項２に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  4. ＳＷＩＩポケットを開いて安定化する、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  5. ヒトＫＲａｓが、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＱ６１Ｈ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、及びＫＲａｓＧ１３Ｄからなる群から選択されたＫＲａｓ変異体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  6. ヒトＫＲａｓが、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、及びＫＲａｓＧ１３Ｄからなる群から選択されたＫＲａｓ変異体である、請求項５に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  7. ＫＲａｓ変異体がＫＲａｓＧ１２Ｃである、請求項６に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  8. ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰが、ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤でアルキル化されている、請求項７に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  9. ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７でアルキル化されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合するアルキル化コンフォメーション特異的ＫＲａｓ抗体である、請求項８に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  10. ＫＲａｓ変異タンパク質のＳＷＩＩポケットを安定化する、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  11. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＷＤＥＲＬＳＧＷＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＳＳＳＷＹＤＬＧＰＦＤＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  12. 軽鎖可変領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  13. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；
    （ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、及び配列番号９８からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つを含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  14. 軽鎖可変領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、及び配列番号１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つを含む、請求項１３に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  15. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（配列番号１）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＱＤＨＤＹＰＬＴ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＦＹＶＲＮＷＦＤＰ（配列番号６）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  16. 軽鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  17. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号１７）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１８）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＹＹＳＹＰＦＴ（配列番号１９）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＳＳＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＱＧＧＹＧＹＰＧＥＳＷＦＤＹ（配列番号２２）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  18. 軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  19. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号２５）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２６）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＳＹＳＰＰＷＴ（配列番号２７）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号２８）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＦＹＳＹＭＤＶ（配列番号３０）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  20. 軽鎖可変領域が、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  21. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号３３）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号３４）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号３５）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＷＷＳ（配列番号３６）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＹＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３７）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＲＴＩＬＴＧＹＹＧＦＤＹ（配列番号３８）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  22. 軽鎖可変領域が、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  23. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４１）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号４２）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＹＶ（配列番号４３）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号４４）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４５）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号４６）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  24. 軽鎖可変領域が、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  25. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（配列番号８１）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号８３）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号８４）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＦＧＰＹＡＦＤＶ（配列番号８６）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  26. 軽鎖可変領域が、配列番号８７のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号８８のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  27. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号４９）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号５０）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＴＷＤＳＳＬＴＧＷＶ（配列番号５１）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＩＳ（配列番号５２）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５３）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＦＷＳＧＹＰＧＧＬＦＤＶ（配列番号５４）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  28. 軽鎖可変領域が、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号５６のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  29. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号５７）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号５８）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＮＨＷＶ（配列番号５９）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６０）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６１）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＮＮＹＧＹＲＹＦＤＹ（配列番号６２）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  30. 軽鎖可変領域が、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号６４のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  31. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号６５）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号６６）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＴＤＮＨＬＷＶ（配列番号６７）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号６８）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６９）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＴＳＳＧＹＹＹＦＤＹ（配列番号７０）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  32. 軽鎖可変領域が、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号７２のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  33. （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号７３）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号７４）を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＴＷＤＮＳＬＳＶＷＶ（配列番号７５）を含むＣＤＲ－Ｌ３；並びに
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号７６）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７７）を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＫＧＩＶＧＷＧＦＦＧＭＤＶ（配列番号７８）を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  34. 軽鎖可変領域が、配列番号７９のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号８０のアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  35. ヒトＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＫＲａｓのアミノ酸Ｗ９９、Ｋ５、Ｌ６、Ｖ７、Ｓ３９、Ｄ５４、Ｌ５４、Ｙ７１、Ｔ７４、及び／又はＧ７５に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
  36. ヒトＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＫＲａｓのアミノ酸Ｗ９９、Ｋ５、Ｌ６、Ｖ７、Ｓ３９、Ｄ５４、Ｌ５４、Ｙ７１、Ｔ７４、及び／又はＧ７５に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
  37. 請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインをコードする１つ又は複数の単離された核酸。
  38. 請求項３７に記載の１つ又は複数の核酸を含むベクター。
  39. 請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
  40. 検出可能な標識にコンジュゲートしている、請求項１～３６のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  41. ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する抗体又はその断片を作製するための方法であって、抗体をコードするベクターの発現に適した条件下で請求項３６に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗体を回収することを含む方法。
  42. ＫＲａｓ－ＧｔＰに結合する抗体又はその断片を作製するための方法であって、抗体をコードするベクターの発現に適した条件下で請求項３６に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗体を回収することを含む方法。
  43. ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰよりも高い親和性でＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する抗体のスクリーニング方法であって、
    （ａ）抗体ライブラリーを
    ｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、
    ｉｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤でアルキル化されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ、及び
    ｉｉｉ）非加水分解性ＧＴＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃ
    と接触させること、並びに
    （ｂ）非加水分解性ＧＴＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃよりも高い親和性でアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰ及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰに結合する抗体を選択すること
    を含む方法。
  44. ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＤＰよりも高い親和性でＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰに結合する抗体のスクリーニング方法であって、
    （ａ）抗体ライブラリーを
    ｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰ、
    ｉｉ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤でアルキル化されたＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰ、及び
    ｉｉｉ）非加水分解性ＧＤＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃ
    と接触させること、並びに
    （ｂ）非加水分解性ＧＤＰアナログに結合したＫＲａｓＧ１２Ｃよりも高い親和性でアルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰ及び非アルキル化ＫＲａｓＧ１２Ｃ－ＧＴＰに結合する抗体を選択すること
    を含む方法。
  45. ライブラリーが合成ファージライブラリーである、請求項４３又は請求項４４に記載の方法。
  46. 生体試料を、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含む、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＤＰを検出するための方法。
  47. 生体試料を、ＫＲａｓ－ＧＴＰに結合する抗体と接触させることをさらに含み、ＫＲａｓ－ＧＤＰの量及びＫＲａｓ－ＧＴＰの量が決定される、請求項４６に記載の方法。
  48. 生体試料を、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含む、生体試料中のＫＲａｓ－ＧＴＰを検出するための方法。
  49. 生体試料を、ＫＲａｓ－ＧＤＰに結合する抗体と接触させることをさらに含み、ＫＲａｓ－ＧＴＰの量及びＫＲａｓ－ＧＤＰの量が決定される、請求項４６に記載の方法。
  50. 検出可能な標識にコンジュゲートした請求項１～３６のいずれか一項に記載のＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片と、前記抗体又はその抗原結合断片を検出するための説明書とを含むキット。
  51. 請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を、ＫＲａｓ変異体と接触させること、化合物をスクリーニングすること、及び抗体又はその抗原結合断片に結合したＫＲａｓ変異体に結合する化合物を同定することを含む、ＫＲａｓ変異体の阻害剤を取得する方法。
  52. 化合物が、ＳＷＩＩポケットにおいてＫＲａｓを共有結合的に修飾する分子を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 化合物が、ＳＷＩＩポケット内の少なくとも１つの残基をアルキル化する共有結合阻害剤を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 化合物が、ＳＷＩＩポケットにおいてＫＲａｓを非共有結合的に修飾する分子を含む、請求項５１に記載の方法。
  55. ＫＲａｓ変異体が、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈである、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 生体試料を、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させること、及びアルキル化ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む、ＫＲａｓのアルキル化を検出する方法。
  57. 検出が、ＫＲａｓＧ１２Ｃの検出を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である、請求項５６又は５７に記載の方法。
  59. 請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を哺乳動物に投与すること、及びアルキル化ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出することを含む、哺乳動物におけるＫＲａｓのアルキル化を検出する方法。
  60. ＫＲａｓ阻害剤で治療した患者におけるＫＲａｓのアルキル化を検出する方法であって：
    （ａ）患者から試料を取得すること；
    （ｂ）試料を、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させること；
    （ｃ）抗体又はその抗原結合断片によって結合されたＫＲａｓの量を測定すること
    を含む方法。
  61. ＫＲａｓ阻害剤が、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７である、請求項６０に記載の方法。
  62. 抗体又はその抗原結合断片によって結合されたＫＲａｓの量が、患者に投与するＫＲａｓ阻害剤の投与量を決定する、請求項６０又は６１に記載の方法。
  63. 検出が、ＫＲａｓＧ１２Ｃの検出を含む、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 哺乳動物がヒトである、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
  66. ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤で治療した対象におけるＫＲａｓＧ１２Ｃのアルキル化を検出する方法であって：
    （ａ）ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤による治療後の対象に、抗体１Ｅ５、２Ｈ１１、２Ａ３、３Ａ１２、１Ｆ４、４Ｇ１２、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７又はＡｂ８のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片を投与すること；及び
    （ｂ）アルキル化ＫＲａｓに結合した抗体又はその抗原結合断片を検出すること
    を含む方法。
  67. ＫＲａｓＧ１２Ｃ特異的共有結合阻害剤が、ＡＲＳ－１９５２、ＡＲＳ－８５３、ＡＲＳ－１６２０、ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ－５１０、ＧＤＣ－６０３６、ＡＲＳ－３２４８、ＬＹ３４９９４４６、ＬＹ３５３７９８２、又はＪＮＪ－７４６９９１５７である、請求項６６に記載の方法。
  68. 抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓアルキル化コンフォメーション特異的抗体である、請求項６７に記載の方法。
  69. ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんを治療する方法であって、そのようながんを有する患者に対し、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む方法。
  70. ＫＲａｓＧ１２Ｃ媒介性のがんが、ＮＳＣＬＣ、結腸がん、又は膵臓がんである、請求項６９に記載の方法。
  71. 請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む結晶化シャペロン。
  72. ＫＲａｓを結晶化するための方法あって、ＫＲａｓが、ＫＲａｓ阻害剤に結合してもよく、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をＫＲａｓと接触させること、及び複合体の結晶構造を解明することを含む方法。
  73. ＫＲａｓが、ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ＫＲａｓＧ１２Ｄ、ＫＲａｓＧ１２Ｖ、ＫＲａｓＧ１２Ｒ、ＫＲａｓＧ１３Ｄ、又はＫＲａｓＱ６１Ｈである、請求項７２に記載の方法。
  74. 化合物のＫＲａｓへの結合を測定するためのバイオセンシング表面であって：
    （ｉ）バイオセンシング表面が、ＫＲａｓタンパク質と、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片とがその中に共局在化しているヒドロゲルを含み；
    （ｉｉ）ＫＲａｓと、抗体又はその抗原結合断片とは、互いに係合して親和性複合体を形成するために、水素内で十分な自由度を有し；
    （ｉｉｉ）ＫＲａｓ及び抗体又はその抗原結合断片の局所濃度は、解離親和定数を少なくとも１０倍上回っており、その局所濃度が親和性複合体の形成を促進し；
    （ｉｖ）未結合ＫＲａｓタンパク質及び抗ＫＲａｓ抗体の割合が約５０％未満であり；
    （ｖ）ＫＲａｓ阻害剤化合物が、少なくとも５秒間、バイオセンシング表面上に注入され；
    （ｖｉ）抗ＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ阻害剤化合物の結合が、少なくとも１つのセンシングチャネル上で測定される、
    バイオセンシング表面。
  75. ヒドロゲルが、約１０ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～３００ｎｍ、１０～２５０ｎｍ、又は約１０～２００ｎｍの厚さである、請求項７４に記載のバイオセンシング表面。
  76. ＫＲａｓがビオチン化されている、請求項７４又は７５に記載のバイオセンシング表面。
  77. ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップに取り付けられている、請求項７４～７６のいずれか一項に記載のバイオセンシング表面。
  78. 抗ＫＲａｓ阻害剤の活性について化合物をスクリーニングする方法であって、ＫＲａｓへの化合物の結合を測定することを含み、ＫＲａｓが抗ＫＲａｓ抗体に結合しており、結合が、請求項７４～７７のいずれか一項に記載のバイオセンシング表面を使用して測定される、方法。
  79. ここに記載される抗ＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ変異タンパク質の結合を測定する方法であって：
    （ｉ）請求項７４～７７のいずれか一項に記載のバイオセンシング表面をＫＲａｓと接触させてＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を形成すること；
    （ｉｉ）ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させることであって、抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓタンパク質と比較して過剰モルである、ＫＲａｓに結合したバイオセンシング表面を、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させること；及び
    （ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴を使用してＫＲａｓに対する抗体又はその抗原結合断片の結合及び親和性を検出すること
    を含む方法。
  80. ここに記載される抗ＫＲａｓ抗体へのＫＲａｓ変異タンパク質の結合を測定する方法であって：
    （ｉ）請求項７４～７７のいずれか一項に記載のバイオセンシング表面を、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させて、抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面を形成すること；
    （ｉｉ）抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面をＫＲａｓと接触させることであって、抗体又はその抗原結合断片が、ＫＲａｓタンパク質と比較して過剰モルである、抗ＫＲａｓ抗体に結合したバイオセンシング表面をＫＲａｓと接触させること；及び
    （ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴を使用してＫＲａｓに対する抗体又はその抗原結合断片の結合及び親和性を検出すること
    を含む方法。
  81. ＫＲａｓタンパク質へのＫＲａｓ阻害剤の標的係合を測定する方法であって、
    （ａ）患者から試料を取得すること；
    （ｂ）試料を、ここに記載される抗ＫＲａｓ抗体又はその抗原結合断片と接触させること；及び
    （ｃ）抗ＫＲａｓ抗体によって結合されたＫＲａｓのレベルを測定すること
    を含む方法。
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