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JP2023522925A - カラム方式の単一チューブｐｃｒ用核酸分離のためのバッファ組成物及びこの用途 - Google Patents

カラム方式の単一チューブｐｃｒ用核酸分離のためのバッファ組成物及びこの用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、核酸分離用バッファ組成物、これを含むメンブレンフィルターが装着された核酸分離用キット及び核酸分離方法に関するもので、前記核酸分離用バッファ組成物は、多様な素材のメンブレンフィルターとの適合性に優れ、多様なサンプルから核酸を優秀に分離することができ、特に、これを含む核酸分離用キットは、カラム方式の単一チューブＰＣＲが可能であり、これを活用した核酸分離方法は、別途の溶出過程なく核酸が固定されたメンブレンフィルターを直ちにＰＣＲに適用可能なことを確認したところ、本発明による核酸分離用組成物、キット及び分離方法は、現場における迅速な診断に有用に活用されることができる。

Description

本発明は、核酸を迅速かつ容易に分離するための核酸分離用バッファ組成物、これを含む核酸分離用キット及び核酸分離方法に関するもので、カラム方式の単一チューブ（ｏｎｅ－ｔｕｂｅ）ＰＣＲが可能な技術的特徴を保有する。
一般的に、各種の疾病の診断、遺伝子組換え植物の検査などを実施するために、検査目的に合う組織、血液、毛根、細胞、植物、菌株などのサンプルから核酸を精製する過程が先に行われる。
生物学的物質で迅速に核酸を分離する方法は、診断プロセスにおいて何よりも重要であるため、細胞溶解溶液内に含まれた様々な種類の物質から核酸のみを選択的に分離することができる効果的かつ再現性のある方法に対する多様な研究がなされてきた。
通常使用される核酸精製方法は、採取されたサンプルを溶解バッファ（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）内で一定時間培養して細胞壁及び細胞膜などを破壊した後、核酸を露出させるように溶解する前処理過程を実施し、上記破壊された不純物を除去する段階を含む。
さらに詳しくは、サンプルを溶解バッファに入れてインキューベートして前処理した後に核酸がバインディングされるメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）が備えられたスピンカラム（ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）に仕込む。前処理された核酸サンプルが仕込まれたカラムは、遠心分離と洗浄過程を交互に複数回実施してスピンカラム内部のメンブレンに核酸をバインディングさせる。前記核酸がバインディングされたメンブレンを利用して乾燥過程と共にＴＥバッファ（Ｔ ｔｅｎ Ｅ ｏｎｅ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ）、溶出バッファ（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）及び水などを利用した、メンブレンから核酸を分離する過程を行って純粋な核酸を分離する。
したがって、既存のカラムを利用した核酸分離方法は、前処理過程、遠心分離過程、洗浄過程、乾燥過程及び遺伝子分離過程を経ることにより、前処理バッファ、遠心分離装置（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、乾燥装置及び分離バッファのような多様な装置とマイクロピペット（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔｔｅ）等の道具が必要であり、サンプルを移動しながら各過程を実施するため、多くの時間と人力を要する。これと共に、核酸のメンブレンへのバインディングまたは不純物洗浄のための複数回の洗浄過程も、所要時間の増大に寄与している。また、これを通じて得た核酸をＰＣＲ反応に活用するためには、非常に少ない量のμｌ単位の核酸サンプルを特定の道具（マイクロピペット）を使用して得なければならないため、研究室ではない場所で核酸抽出とその後のＰＣＲ反応を行うには困難がある。
カラムを使用した核酸分離方法は、使用者の必要な上逹水準が非常に低く有用性が高いため、上記のような問題点を解決して活用可能な方案を設けることが非常に重要である。
一方、去る２０年間、人類は重症呼吸器症候群を起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ（Ｓｅ－ｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２００２－２００３））とＨ１Ｎ１新種インフルエンザ（２００９）のようなウイルス性伝染病を経験した。最近、２０１２年と２０１５年には、中東呼吸器症候群（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａ－ｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＥＲＳ）を起こすＭＥＲＳコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）がサウジアラビアと韓国で地域的に流行（ｅｐｉｄｅｍｉｃ）した。
さらに、２０１９年１２月３１日にＷＨＯ（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に初めて報告された新種コロナウイルス１９（２０１９ ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、２０１９－ｎＣｏＶ；ＣＯＶＩＤ－１９）が発生した。かかるウイルス性伝染病は、伝播速度が非常に速く、これによる患者が持続的に速く増加しており、非常に致命的な被害が発生している。
したがって、現場での速い診断が何よりも重要であるが、従来のカラムを利用した核酸分離技術は上記のような問題点を有しており、現場での活用度が落ちるため、これを改善した迅速かつ容易な核酸分離技術の開発が必要である。
本発明者らは、核酸を分離するための新規な核酸分離用バッファ組成物と、これを含むメンブレンフィルターが装着されたカラム方式の核酸分離用キットを製造し、これを利用して直ぐＰＣＲに適用する、単一チューブ（ｏｎｅ－ｔｕｂｅ）ＰＣＲまたは核酸が固定されたメンブレンフィルターを別途抽出してＰＣＲを行った時に多様なサンプルから核酸を迅速かつ正確に分離することができることを確認して、別途の遠心分離、洗浄過程及び乾燥過程などが不要な核酸分離技術を開発して本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、カラム方式の単一チューブＰＣＲに適用可能なワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用バッファ組成物を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、ワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用キットを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、サンプルから核酸を分離する方法を提供することにある。
本発明のさらにまた他の目的は、核酸の増幅方法を提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明は、エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及びＴｒｉｓ－ＨＣｌを含むワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用バッファ組成物を提供する。
また、上記の他の目的を達成するために、本発明は、本発明による核酸分離用バッファ組成物を含み、メンブレンフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｉｔｅｒ）が装着されたカラム（Ｃｏｌｕｍｎ）を含むワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用キットを提供する。
また、上記のまた他の目的を達成するために、本発明は、本発明による核酸分離用キットを利用してサンプルから核酸を分離する方法を提供する。
また、上記のさらに他の目的を達成するために、本発明は、本発明による方法で分離した核酸を鋳型としてＰＣＲを行う段階を含む核酸の増幅方法を提供する。
本発明による核酸分離用バッファ組成物、これを含むメンブレンフィルターが装着された核酸分離用キット及び核酸分離方法は、ワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）で多様なサンプルから核酸を迅速かつ正確に分離することができ、特に、別途の溶出過程なく核酸が固定されたメンブレンフィルターを含むカラムにＰＣＲ反応混合物（ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）を入れることで直ちにＰＣＲに適用することができる。既存のカラムを利用した核酸分離方法は、複雑な過程を通じて行われたため多様な装置と道具が必要であり、過度な時間、資本及び人力が必要であった。それだけでなく、分離した核酸が各段階を行うことにより、一部損失または汚染するおそれもある。これに対し、本発明による核酸分離用組成物、キット及び分離方法は、カラム方式基盤の単一チューブＰＣＲ方法に適用可能であるため、特別な装置が不要で、容易かつ迅速に核酸を分離可能なだけでなく、分離した核酸の損失または汚染のおそれが少なく、安価で提供されることができる。また、核酸が固定されたメンブレンフィルターをカラムから分離し別途のチューブに入れてＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲも行うことができるため、多様なＰＣＲ方法に適用可能で活用度が高いため、現場における迅速な診断に有用に活用することができる。
Ａは、本発明による核酸分離用バッファ組成物及びメンブレンフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）が装着された注射器を利用して、分離した核酸が固定されたメンブレンフィルターを直ちに適用してＰＣＲ（等温ＰＣＲ、一般ＰＣＲ、またはＲＴ－ＰＣＲを含む）を行う過程を示したイメージであり、Ｂは、前記核酸が固定されたメンブレンをカラムから分離して溶出溶液で核酸を抽出した後、これを利用してＰＣＲ（等温ＰＣＲ、一般ＰＣＲ、またはＲＴ－ＰＣＲを含む）を行う過程を示したイメージである。 本発明による核酸分離用バッファ組成物を利用して、溶出過程が除かれた、核酸が固定されたメンブレンフィルターをＰＣＲに直ちに適用した核酸分離方法において、ＳＤＳ及びＥｔＯＨの最適濃度を確認した図面である。 本発明の核酸分離用バッファ組成物と商業的メンブレンフィルター（Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）の適合性において、適合なメンブレンフィルターの気孔サイズを確認した図面である。 本発明の核酸分離用バッファ組成物とシリカメンブレンフィルター（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）の適合性を確認した図面である。 本発明の核酸分離用バッファ組成物とガラス繊維フィルター（ｇｌａｓｓ ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）の適合性を確認した図面である。 本発明の核酸分離用バッファ組成物及びガラス繊維フィルターが装着された注射器を利用して核酸を分離した後、前記ガラス繊維フィルターのｇＤＮＡ固定有無を確認した図面である。 本発明の核酸分離用バッファ組成物とガラス繊維フィルターの活用において、前記ガラス繊維フィルターのＰＣＲ反応に適合な最適のサイズを確認した図面である。 本発明による核酸分離用バッファ組成物を利用してワンステップで分離した核酸が固定されたガラス繊維フィルターを適用したＰＣＲにおいて、ｇＤＮＡ量による敏感度を確認した図面である。 本発明による核酸分離用バッファ組成物を利用してワンステップで分離した核酸が固定されたガラス繊維フィルターを適用したＰＣＲにおいて、核酸が分離する細胞数による敏感度を確認した図面である。 本発明による核酸分離用バッファ組成物を利用してワンステップで分離した核酸が固定されたガラス繊維フィルターを適用したＰＣＲにおいて、バクテリアｇＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）分離効率を確認した図面である。 本発明による核酸分離用バッファ組成物を利用してワンステップで分離した核酸が固定されたガラス繊維フィルターを適用したＰＣＲにおいて、ｐＨによるＲＮＡ分離効率を確認した図面である。 本発明による核酸分離用バッファ組成物を利用して、溶出過程が除かれた、核酸が固定されたガラス繊維フィルターを直ちに適用したＰＣＲにおいて、ｐＨによるＰＣＲ反応を確認した図面である。
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明は、エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及びＴｒｉｓ－ＨＣｌを含むワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用バッファ組成物を提供する。
本発明による核酸分離用バッファ組成物は、ワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）で核酸を分離し、カラム方式の単一チューブＰＣＲに適用して、単一チューブで核酸分離からＰＣＲ反応まで進行することに技術的特徴がある。本発明は、これを通じて既存のカラムを利用した核酸分離方法が有する多様な溶液が必要な複雑な分離方法、追加装備の必要性及び過度な時間、資源、人力浪費に対する問題点を解決することに目的がある。
特に、ｇＤＮＡ分離方法において、細胞溶解及びメンブレンフィルターとｇＤＮＡの結合のために、多量の塩（ＮａＣｌなど）及びＥｔＯＨが必要であるが、前記塩及びＥｔＯＨによってＰＣＲ結果が影響を受けるという問題が引き起こされることがある。したがって、本発明の核酸分離用バッファ組成物を利用してワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）で核酸を分離した後、前記分離した核酸が固定されたメンブレンフィルターを利用して直ちにＰＣＲを行う場合、溶出溶液を利用した精密な分離過程及び別途の洗浄過程がないため、メンブレンフィルターから溶け出す前記塩とＥｔＯＨがＰＣＲ結果に及ぶ影響を最小化することができる組成が非常に重要である。
本発明の一実施例において、本発明の組成物を活用したワンステップＤＮＡ分離において前記ＳＤＳ及びＥｔＯＨの最適化条件を確認してみたところ、５０％（ｖ／ｖ）以下のＥｔＯＨ及び１％（ｗ／ｖ）以下のＳＤＳが含まれた組成物が優秀に核酸が分離可能なことを確認した。
したがって、本発明のワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用バッファ組成物において、前記エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）は、１０％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、３０％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、３０％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）または４０％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）で含まれることができ、さらに好ましくは、２０％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）で含まれることができる。前記エタノールが５０％（ｖ／ｖ）を超える濃度で含まれる場合、一部のｇＤＮＡ分離はなされることができるが、バッファを常温で保管する時にＮａＣｌの結晶化が発生するという問題が引き起こされる。
さらに、前記ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）は、０．１％（ｗ／ｖ）～０．９％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）～０．８％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）～０．７％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）～０．６％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）～０．４％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）～０．３％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）～０．２％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）～０．９％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）～０．８％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）～０．７％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）～０．６％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）～０．４％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）～０．３％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）～０．９％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）～０．８％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）～０．７％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）～０．６％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）～０．４％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）～０．９％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）～０．８％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）～０．７％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）～０．６％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）～０．９％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）～０．８％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）～０．７％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）～０．６％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）～０．９％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）～０．８％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）～０．７％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）～０．９％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）～０．８％（ｗ／ｖ）、または０．８％（ｗ／ｖ）～０．９％（ｗ／ｖ）で含まれることができ、さらに好ましくは、０．１％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）で含まれることができる。
前記塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）は、０．１Ｍ～１Ｍ、０．１Ｍ～０．９Ｍ、０．１Ｍ～０．８Ｍ、０．１Ｍ～０．７Ｍ、０．１Ｍ～０．６Ｍ、０．１Ｍ～０．５Ｍ、０．１Ｍ～０．４Ｍ、０．１Ｍ～０．３Ｍ、０．１Ｍ～０．２Ｍ、０．２Ｍ～１Ｍ、０．２Ｍ～０．９Ｍ、０．２Ｍ～０．８Ｍ、０．２Ｍ～０．７Ｍ、０．２Ｍ～０．６Ｍ、０．２Ｍ～０．５Ｍ、０．２Ｍ～０．４Ｍ、０．２Ｍ～０．３Ｍ、０．３Ｍ～１Ｍ、０．３Ｍ～０．９Ｍ、０．３Ｍ～０．８Ｍ、０．３Ｍ～０．７Ｍ、０．３Ｍ～０．６Ｍ、０．３Ｍ～０．５Ｍ、０．３Ｍ～０．４Ｍ、０．４Ｍ～１Ｍ、０．４Ｍ～０．９Ｍ、０．４Ｍ～０．８Ｍ、０．４Ｍ～０．７Ｍ、０．４Ｍ～０．６Ｍ、０．４Ｍ～０．５Ｍ、０．５Ｍ～１Ｍ、０．５Ｍ～０．９Ｍ、０．５Ｍ～０．８Ｍ、０．５Ｍ～０．７Ｍ、０．５Ｍ～０．６Ｍ、０．６Ｍ～１Ｍ、０．６Ｍ～０．９Ｍ、０．６Ｍ～０．８Ｍ、０．６Ｍ～０．７Ｍ、０．７Ｍ～１Ｍ、０．７Ｍ～０．９Ｍ、０．７Ｍ～０．８Ｍ、０．８Ｍ～１Ｍ、０．８Ｍ～０．９Ｍまたは０．９Ｍ～１Ｍで含まれることができ、さらに好ましくは、０．５Ｍ～１Ｍで含まれることができる。
前記ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）は、１ｍＭ～１００ｍＭで含まれることができ、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、１ｍＭ～５０ｍＭで含まれることができる。
本発明のワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用バッファ組成物は、好ましい具体例として、２０％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）のエタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）、０．５Ｍ～１Ｍの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）、１ｍＭ～１００ｍＭのＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び１ｍＭ～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含むことができる。
また、好ましくは、前記バッファ組成物は、バッファ組成物１００重量部に対して、２０％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）のエタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）１～５重量部、０．１％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）１～５重量部、０．５Ｍ～１Ｍの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）２．５～１０重量部、１ｍＭ～１００ｍＭのＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）１～５重量部、及び１ｍＭ～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌが１～５重量部含まれることができ、さらに好ましくは、前記バッファ組成物は、バッファ組成物１００重量部に対して、２０％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）のエタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）２．５重量部、０．１％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）２．５重量部、０．５Ｍ～１Ｍの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）５重量部、１ｍＭ～１００ｍＭのＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）２．５重量部及び１ｍＭ～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌが２．５重量部含まれることができる。
本発明の一実施例では、より好ましい具体例として、５０％（ｖ／ｖ）のエタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）、０．２５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）、０．２５Ｍの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）、１２．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む水溶液を製造した。
本発明による核酸分離用バッファ組成物を利用してｇＤＮＡを分離する場合、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌはｐＨ８であることが好ましい。
さらに、本発明の一実施例によると、本発明による核酸分離用バッファ組成物を利用して総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を分離する場合、ｐＨ４～７で行うことが好ましいことを確認した。
したがって、本発明に核酸分離用バッファ組成物を利用して総ＲＮＡを分離する場合、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌのｐＨは、ｐＨ４～７であることが好ましい。
また、本発明は、本発明によるワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用バッファ組成物を含み、メンブレンフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｉｔｅｒ）が装着されたカラム（Ｃｏｌｕｍｎ）を含むワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用キットを提供する。
さらに、本発明のワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用キットは、カラムの上部に圧力をかけてメンブレンフィルターで溶液をろ過した後、ろ過液を下部で除去可能な形態で、より好ましくは、注射器形態であることができる。前記キットが注射器形態で製造される場合、遠心分離機などの別途の道具が不要であり、携帯用で現場で直ちに検出可能であるという長所を有する。
前記メンブレンフィルターは、ポリビニリデンフルオライド（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）、ナイロンフィルター（ｎｙｒｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）、セルロースニトリートフィルター（ｃｅｌｌｕｏｓｅ ｎｉｔｒａｔｅ ｆｉｌｔｅｒ）、紙フィルター（ｐａｐｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）、ガラス繊維フィルター（ｇｌａｓｓｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）及びシリカフィルター（ｓｉｌｉｃａ ｆｉｌｔｅｒ）からなる群より選択されたいずれか一つであることができ、下記の実施例において、本発明のワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用バッファ組成物と前記各メンブレンフィルターとの適合性に優れることを確認した。
本発明の一実施例で確認したものによると、本発明の核酸分離用バッファ組成物とＰＶＤＦ素材の商業的メンブレンフィルターを利用したＤＮＡ分離において、気孔サイズ０．１μｍフィルターが最も高いＤＮＡ分離効率を示したことを確認した。
一方、ＰＶＤＦメンブレン、シリカメンブレン及びガラス繊維メンブレンフィルターのような負電荷メンブレンフィルター（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）は、負電荷のｇＤＮＡを捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）するために、正電荷（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）の中間媒介として多量の塩（ｓａｌｔ）を必要とする（０．１～１ＭのＮａＣｌ）。したがって、別途の精製なくｇＤＮＡが捕捉されたガラス繊維フィルターにＰＣＲ反応混合物を添加した後にＰＣＲを行うと、前記ガラス繊維フィルターから溶け出したＮａＣｌによってＰＣＲ反応の阻害が引き起こされるおそれがあるため、本発明のまた他の実施例において、本発明の核酸分離用バッファ組成物との活用においてガラス繊維フィルターの最適なサイズを確認した。その結果、総ボリューム５０ｕｌ当たりガラス繊維フィルターは、２×２ｍｍ２サイズ以下が最適であることを確認した（０．２５ＭのＮａＣｌ基準）。
前記核酸は、ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＰＮＡ（ｐｅｎｔｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上であることができる。
さらに、本発明は、本発明による核酸分離用キットを利用してサンプルから核酸を分離する方法を提供する。
また、本発明は、本発明の核酸分離方法を通じて分離した核酸を鋳型としてＰＣＲを行う段階を含む核酸の増幅方法を提供する。
さらに詳しくは、上記方法は、サンプルを本発明による核酸分離用バッファに浸漬して溶解する段階と、常温で前記サンプルが溶解された溶液をインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する段階と、前記サンプルが溶解された溶液をメンブレンフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｉｔｅｒ）が装着されたカラムに移す段階と、前記カラムに圧力をかけてフィルターに核酸を固定しろ過液は除去する段階とで行われるか、サンプルを本発明による核酸分離用バッファに浸漬して溶解する段階と、常温で前記サンプルが溶解された溶液をインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する段階と、前記サンプルが溶解された溶液をメンブレンフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｉｔｅｒ）が装着されたカラムに移す段階と、前記カラムに圧力をかけてフィルターに核酸を固定しろ過液は除去する段階と、前記核酸が固定されたカラムに溶出溶液を入れてメンブレンフィルターを通過させる段階と、前記溶出溶液を得る段階とで行われることができる。
本発明による核酸の増幅方法において、鋳型となる核酸は、核酸が固定されたフィルターを直接的に利用するか、溶出溶液に含まれた形態で利用されることができる。
この時、前記核酸が固定されたフィルターを直接的に利用する場合、図１のＡ及びＢのように、核酸が固定されたフィルターが装着されたカラム自体にＰＣＲ反応混合物を直ちに添加してＰＣＲを行うか、核酸が固定されたフィルターを分離してこれを別途のチューブに移した後、ＰＣＲ反応混合物と反応させてＰＣＲを行うことができる。この時、核酸が固定されたフィルターは適切なサイズに切ることができる。
この時、前記ＰＣＲ反応は、分離された核酸を確認するための方法であって、その他に分離した核酸が確認可能な方法であれば、当分野に公知された如何なる方法でも適用可能である。好ましくは、重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）、逆転写重合酵素連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ－ＰＣＲ）及び等温増幅（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ＰＣＲであることができるが、これに制限されるものではない。
前記溶出溶液は、当分野に公知された溶出溶液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）であれば制限なく使用可能である。好ましくは、蒸留水、ＴＥバッファ（Ｔ ｔｅｎ Ｅ ｏｎｅ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ）及びこれらの混合物からなる群より選択されたいずれか一つであることができるが、これに制限されるものではない。さらに、上記当分野に公知された溶出溶液は、ＴＥバッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ））または溶出バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５～８．５）であることができるが、これに制限されるものではない。
本発明の核酸分離方法において、前記インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）は、細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させる過程で２分～１０分間行われることができ、より好ましくは、５分間行われることができる。
前記インキュベーションは、サンプルを１～５ｍｌの本発明による核酸分離用バッファに浸漬し振りながら混合した後に行われることができるが、これに制限されるものではない。
また、前記サンプルは、生物学的または非生物学的サンプルであることを特徴とする。
前記生物学的サンプルは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むサンプルとして、鼻腔吸引物（ｎａｓａｌ ａｓｐｉｒａｔｅ）、気管支吸引物（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｐｉｒａｔｅ）、気管分泌物（ｏｒｇａｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）、喀痰（ｓｐｕｔｕｍ）、涙（ｔｅａｒｓ）、唾（ｓａｌｉｖａ）、細胞（ｃｅｌｌ）、細胞分離物（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ）、全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、血漿（ｐｌａｓｍａ）、血清（ｓｅｒｕｍ）、粘液（ｍｕｃｕｓ）、鼻洗浄液（ｎａｓａｌ ｗａｓｈｅｓ）、小便（ｕｒｉｎｅ）、精液（ｓｅｍｅｎ）、腹腔洗浄液（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｗａｓｈｉｎｇｓ）、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、嚢腫液（ｃｙｓｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、脳脊樺膜液（ｍｅｎｉｎｇｅａｌ ｆｌｕｉｄ）、羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）、白血球層（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）、腺液（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、膵臓液（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、リンパ液（ｌｙｍｐｈ ｆｌｕｉｄ）、胸水（ｐｌｅｕｒａｌ ｆｌｕｉｄ）、乳頭吸引物（ｎｉｐｐｌｅ ａｓｐｉｒａｔｅ）、滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）、関節吸引物（ｊｏｉｎｔ ａｓｐｉｒａｔｅ）、及び脳脊樺液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）からなる群より選択されたいずれか一つ以上であることができるが、これに制限されるものではない。
さらに、前記非生物学的サンプルは、化学的に合成されたＰＮＡを含むことを特徴とする。
本発明の核酸分離用バッファ組成物、これを含むメンブレンフィルターが装着された核酸分離用キット及び核酸分離方法は、ワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）で多様なサンプルから核酸を優秀に分離することができ、特に別途の溶出過程なく核酸が固定されたメンブレンフィルターを直ちにＰＣＲに適用することができる技術的特徴がある。
これは、既存のカラムを利用した核酸分離方法が保有した過度な時間、資本及び人力の必要性、分離した核酸の損失または汚染発生の危険性などの問題点を優秀に改善したもので、核酸を迅速に分離して現場における迅速な診断に活用しようとする。
上述した本発明の内容は相互矛盾しない限り、互いに同一に適用され、当該技術分野の通常の技術者が適切な変更を加えて実施することも本発明の範疇に含まれる。
以下、本発明を実施例を通じて詳しく説明するが、本発明の範囲が下記の実施例のみに限定されるものではない。
実施例１．核酸分離用バッファ組成物の製造
本発明者らは、核酸分離のためのバッファ組成物の好ましい実施例として、バッファ組成物１００ｍｌを基準として２．５ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）のエタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）、２．５ｍｌの０．２５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）、５ｍｌの０．２５Ｍの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）、２．５ｍｌの１２．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び２．５ｍｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む水溶液を製造した。
一方、既存の核酸分離方法は、前処理過程、遠心分離過程、洗浄過程、乾燥過程及び遺伝子分離過程の複雑な過程を通じて行われる。このため、溶解バッファ（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）、結合バッファ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）、洗浄用バッファ、溶出バッファ（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）などが各段階別に必要であり、遠心分離機のような特別な装置も必要であり、過度な時間、資本及び人力が所要される。それだけでなく、分離した核酸が各段階を行うことにより、一部損失または汚染するおそれもある。さらに、追加的に分離した核酸を利用してＰＣＲを行うためには、分離したＤＮＡをマイクロピペット（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔｔｅ）とピペットチップ（ｐｉｐｅｔｔｅ ｔｉｐｓ）などを使用して１～５μｌ程度の極少量を採取する必要があるが、これは上記道具が具備されていない現場で行うには困難がある。一方、上記実施例１で製造した本発明の核酸分離用バッファ組成物は、全ての構成要素が一つで混合された組成物で、ワンステップ（ｏｎｅｓｔｅｐ）で核酸分離が可能で迅速に分離可能なだけでなく、分離した核酸の損失または汚染のおそれが少なく、さらに必要な装備がないため、現場でより容易かつ迅速にリアルタイムで検出可能である。
実施例２．核酸分離用バッファ組成物を利用した核酸分離方法
２－１．溶出過程が除かれた核酸分離方法
本発明の核酸分離方法において、核酸が固定されたフィルターを別途の溶出過程なく直ちにＰＣＲに適用して結果を直ちに確認することができる。
先ず、綿棒を利用してサンプルを採取し、上記実施例１で製造した２ｍｌの核酸分離用バッファ組成物に浸漬し振って混合した後、これを常温で５分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させた。
インキュベーションの終了後、前記溶液をメンブレンフィルターが装着された注射器に移した後、ゆっくりと圧力をかけて溶液をメンブレンフィルターで通過させて核酸を固定しろ過液を除去した。その後、前記核酸が固定されたメンブレンフィルターを利用してＰＣＲを行った。
さらに詳しくは、核酸が固定されたメンブレンフィルターを含む注射器にＰＣＲ反応混合物（２５μｌの２Ｘ ｉ－ＴａｑＴＭＰＣＲ ｍｉｘ、１μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌ正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）、１μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌ逆方向プライマー、２３μｌの蒸留水（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で、総ボリューム５０μｌ）を添加した。その後、ＰＣＲ反応させ、この時下記のようなＰＣＲ条件下で行った。初期変性（ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）：９４℃、２分、３０回（ｃｙｃｌｅ）（変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）：９４℃、２０秒；結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）：５５℃、１０秒；伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）：７２℃、３０秒；最終伸長（ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）：７２℃、５分）。
２－２．溶出過程が含まれた核酸分離方法
さらに、核酸が固定されたメンブレンフィルターを溶出溶液を利用して溶出した後、これをＰＣＲに適用することができる。
メンブレンフィルターに核酸を固定するまでの段階は、上記２－１の方法と同一に行った。ろ過液が除去された注射器に蒸留水を入れてメンブレンフィルターを通過させた後、これを得た。この時、蒸留水を入れる前に選択的に不純物をろ過するために１００％のＥｔＯＨで一度洗浄することができる。最終的に得た溶液からＤＮＡまたはＲＮＡを含むか否かを上記実施例２－１と同一の方法で確認した。
実施例３．ワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用バッファ組成物の最適条件の確認
ｇＤＮＡ分離において細胞溶解及びメンブレンフィルターにｇＤＮＡが結合するためには、多量の塩を必要とし、ＥｔＯＨも含有されるべきである。したがって、本発明による核酸分離用バッファ組成物を利用してワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）で核酸を分離した後、前記核酸が固定されたメンブレンフィルターを利用して直ちにＰＣＲを行う場合、前記塩とＥｔＯＨの影響を最小化することができる組成が非常に重要である。
これを確認するために、構成要素であるＳＤＳ（０．５％または１％）、Ｎａｃｌ（０．５Ｍまたは１Ｍ）、またはＥｔＯＨ（５０％または７０％）をそれぞれ含んだ核酸分離用バッファ組成物のＤＮＡ分離効率を確認し、その結果を図２に示した。この時、各実験群に合わせて上記実施例２－１または２－２の方法と同一に行い、メンブレンフィルターとしてはガラス繊維フィルター（ｇｌａｓｓ ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒｓ、ＧＦ／Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ ｃｏ）を使用し、２９３Ｔ細胞（ＳＶ４０大型Ｔ抗原の突然変異を発現するＨＥＫ２９３細胞株で派生したヒト細胞株）を１．７５×１０９で同一に使用した。分離したサンプル５μｌとダイ（ｄｙｅ）１μｌを混合して０．８％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）にローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）した後、ＧｅｌＤｏｃ（電気泳動イメージングシステム）を利用して結果を確認した。
図２において、１番ラインは、１００ｂｐラダー（ｌａｄｄｅｒ）であり、２番ラインは、陰性対照群（核酸を入れずＰＣＲを行った後、これをローディング）であり、３番ラインは、５μｌのＧＡＰＤＨに対するプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号１）、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＣＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ（配列番号２））のみをローディングした結果であり、４番ラインは、陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（商業的ｇＤＮＡ分離キット（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ－３０３２） ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離したｇＤＮＡ（１μｇ）をＰＣＲする）であり、５番ラインは、上記実施例２－１のように、サンプルと本発明による核酸分離用バッファが混合した混合物をメンブレンフィルターにろ過し、これをローディングした結果であり（ＡＢ（ａｔｔａｃｈ ａｎｄ ｂｉｎｄ） ｅｌｕｔｉｏｎと記載）、６番ラインは、上記実施例２－２のように、前記５番ラインにおいて、混合物がろ過されたメンブレンフィルターを蒸留水で溶出した後、前記蒸留水をローディングした結果であり（ＡＢ（ａｔｔａｃｈ ａｎｄ ｂｉｎｄ）と記載）（上記５番ライン及び６番ラインは、メンブレンフィルターのｇＤＮＡ結合有無を確認するための実験群）、７番ラインは、２ｍｌの上記実施例１のバッファ組成物を適用して上記実施例２－１のように行って得たものをローディングした結果であり（ＳＴ（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）と記載）、８番ラインは、２ｍｌの高濃度ＳＤＳ（１％、ＨＳ（Ｈｉｇｈ ＳＤＳ）と記載）を適用した結果であり、９番ラインは、２ｍｌの中濃度ＳＤＳ（０．５％、ＭＳ（Ｍｅｄｉｕｍ ＳＤＳ）と記載）を適用した結果であり、１０番ラインは、２ｍｌの高濃度ＮａＣｌ（１Ｍ、ＨＮ（Ｈｉｇｈ ＮａＣｌ）と記載）を適用した結果であり、１１番ラインは、２ｍｌの中濃度ＮａＣｌ（０．５Ｍ、ＭＮ（Ｍｅｄｉｕｍ ＮａＣｌ）と記載）を適用した結果であり、１２番ラインは、２ｍｌの高濃度ＥｔＯＨ（７０％、ＨＥ（Ｈｉｇｈ ＥｔＯＨ）と記載）を適用した結果であり、１３番ラインは、２ｍｌの中濃度ＥｔＯＨ（５０％、ＭＥ（Ｍｅｄｉｕｍ ＥｔＯＨ）と記載）を適用した結果である。
図２に示すように、メンブレンフィルターのｇＤＮＡの結合有無を確認した結果、５番ラインに対して６番ラインの発光が明らかであるため、メンブレンフィルターに核酸がよく結合しており（５番ライン参照）、蒸留水を利用してこれから核酸を優秀に分離可能（６番ライン参照）なことを確認することができた。
さらに、ＥｔＯＨは、５０％以下の場合のみに溶出過程なく直ちにメンブレンフィルターを適用したＰＣＲが行われることができた（１３番ライン参照）。またＳＤＳの場合、１％ＳＤＳを含む場合は、ＰＣＲが行われないことを確認した（８番ライン参照）。
したがって、本発明の核酸分離用バッファ組成物を利用して、溶出過程が除かれた、核酸が固定されたメンブレンフィルターを直ちに適用した核酸分離方法において、前記ＳＤＳは、１％以下で含まれることが好ましく、前記ＥｔＯＨは、５０％以下で含まれることが好ましいことを確認した。
実施例４．メンブレンフィルターによる核酸分離効率の確認
４－１．商業的メンブレンフィルター（Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）
多様な気孔サイズ（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）を有するＰＶＤＦ素材の商業的メンブレンフィルターのうち、本発明による核酸分離用バッファ組成物に適合なフィルターを確認した。
そこで、０．１μｍのＰＶＤＦフィルター、０．２２μｍのＰＶＤＦフィルター、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター、または紙フィルター（ｐａｐｅｒ ｆｉｌｔｅｒ（３Ｍ ｐａｐｅｒ ｆｉｌｔｅｒ））が装着された注射器及び本発明の核酸分離用バッファ（ＧＢ（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ））を利用した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（１．０×１０６）を５ｍｌの本発明による核酸分離用バッファを利用して溶解し、上記実施例２のうち２－１．と同一の方法でゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ、ｇＤＮＡ）を分離し、それぞれの分離効率を確認して図３に示した。各実験群の条件によって得たサンプル５μｌとダイ１μｌを混合し、０．８％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を利用して１００ｖで３０分間ローディングした。
図３において、１番ラインは、１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅｒ）であり、２番ラインは、ｇＤＮＡ対照群（商業的ｇＤＮＡ分離キット（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ－３０３２） ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離したｇＤＮＡ（１μｇ）をＰＣＲする）であり、３番（気孔サイズ０．１μｍフィルター）、５番（気孔サイズ０．２２μｍフィルター）、７番（気孔サイズ０．４５μｍ）及び９番ライン（ｐａｐｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）は、１００μｌの上記実施例２によって分離したｇＤＮＡ（１０μｇ）＋３００μｌの本発明による核酸分離用バッファを各メンブレンフィルターにろ過させた実験群（ろ過後、メンブレンに結合していない、核酸分離用バッファに残ったｇＤＮＡの量を確認するための実験群）であり、４番（気孔サイズ０．１μｍフィルター）、６番（気孔サイズ０．２２μｍフィルター）、８番（気孔サイズ０．４５μｍ）及び１０番ライン（ｐａｐｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）は、上記実施例２のうち２－２の方法において最終段階で４００μｌのＨ２Ｏで溶出して核酸を得た実験群である。この時、４番、６番、８番及び１０番ラインにおいて、不純物をろ過するために、メンブレンフィルターを４００μｌの１００％ＥｔＯＨで一度洗浄した。
図３から確認したように、４番ラインで明らかなバンドを確認することができた。したがって、多様な気孔サイズを有するＰＶＤＦ素材の商業的メンブレンフィルターにおいて、気孔サイズ０．１μｍのフィルターが最も高いＤＮＡ分離効率を示すことを確認した。一方、気孔サイズ０．４５μｍのフィルターの場合、ｇＤＮＡがメンブレンフィルターに結合されず、ろ過された溶液で相当量のｇＤＮＡを確認することができた。従って、ＰＶＤＦ素材のフィルターにおいて、気孔サイズ０．１μｍのフィルターが本発明の核酸分離用バッファ組成物と最も適合なことを確認した。
４－２．シリカメンブレンフィルター（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）
シリカメンブレンフィルターと本発明による核酸分離用バッファ組成物との適合性も評価した。
そこで、シリカフィルターが装着された注射を利用して実施例２のうち２－１．と同一の方法で２９３Ｔ細胞からゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ、ｇＤＮＡ）を分離し、それぞれの分離効率を確認して図４に示した。この時、溶出溶液の量によって溶出される核酸の量を確認した（シリカフィルターイールーション１～５（ｓｉｌｉｃａ ｆｉｌｔｅｒ ｅｌｕｔｉｏｎ １～５）と記載）。
図４において、１番ラインは、１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅｒ）であり、２番ラインは、陽性対照群（商業的ｇＤＮＡ分離キット（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ－３０３２） ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離したｇＤＮＡ（１μｇ）と本発明の核酸分離用バッファ４００μｌを混合した後、０．１μＭのＰＶＤＦメンブレンフィルターにろ過した後、前記メンブレンフィルターを２００μｌ蒸留水で溶出させた実験群）であり、３番ラインは、上記２番ラインの一度溶出されたメンブレンフィルターを再び２００μｌ蒸留水を使用して溶出させた実験群であり（溶出後にｇＤＮＡ残量がないことを確認するための実験群）、４番ラインは、１μｇのｇＤＮＡを含有した本発明の核酸分離用バッファをシリカメンブレンフィルターでろ過させた後、これを利用した実験群であり（シリカメンブレンフィルターにｇＤＮＡが結合したか否かを確認するための実験群）、５番ラインは、前記シリカメンブレンフィルターを５０μｌの蒸留水で溶出した実験群であり、６番ラインは、前記シリカメンブレンフィルターを５０μｌの蒸留水で２回繰り返し溶出した実験群であり、７番ラインは、前記シリカメンブレンフィルターを５０μｌ蒸留水で３回繰り返し溶出した実験群であり、８番ラインは、前記シリカメンブレンフィルターを５０μｌの蒸留水で４回繰り返し溶出した実験群であり、９番ラインは、前記シリカメンブレンフィルターを５０μｌ蒸留水で５回繰り返し溶出した実験群である。
したがって、図４に示すように、本発明の核酸分離用バッファ組成物とシリカメンブレンフィルターを利用した場合もｇＤＮＡ分離効率に優れることを確認した。特に、５番～９番ラインで明らかなバンドを確認することができ、これを参考としたところ、溶出溶液のボリュームは１００～２００μｌ程度が適正なことを確認した。
４－３．ガラス繊維フィルター（ｇｌａｓｓ ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）
１）適合性の確認
ガラス繊維フィルターと本発明による核酸分離用バッファ組成物との適合性も評価した。
そこで、ガラス繊維フィルターが装着された注射器を利用して上記実施例２のうち２－１．と同一の方法で２９３Ｔ細胞からゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ、ｇＤＮＡ）を分離し、それぞれの分離効率を確認して図５に示した。
図５において、１番ラインは、１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅｒ）であり、２番ラインは、陰性対照群として、ｇＤＮＡなしに２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物のみを入れた実験群であり、３番及び４番ラインは、１μｇのｇＤＮＡを含有した本発明の核酸分離用バッファをガラス繊維フィルターでろ過させた後、５０μｌの蒸留水で溶出した、同じ条件で２回繰り返した実験群であり、５番ラインは、前記ガラス繊維フィルターを１００μｌの蒸留水で溶出した実験群であり、６番ラインは、前記ガラス繊維フィルターを２００μｌの蒸留水で溶出した実験群である。
図５に示すように、ガラス繊維フィルターを使用した実験群である１番ライン～４番ラインが明らかなバンドを示すため、ｇＤＮＡが分離したことを確認した。したがって、本発明の核酸分離用バッファ組成物とガラス繊維フィルターを利用した場合も、ｇＤＮＡ分離効率に優れることを確認した。
さらに、ガラス繊維フィルターのｇＤＮＡ固定有無を目視で確認し図６に示した。このため、ガラス繊維フィルターにＥｔＢｒ（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を処理した後、ＵＶ下で発光を確認してガラス繊維フィルターのｇＤＮＡ固定有無を確認して図６に示した。
図６において、１番及び４番は、対照群として、ｇＤＮＡなしに２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物のみを入れた実験群であり、２番及び３番は、同じ条件で繰り返し行った実験群として、ＰＣＲを行っていない実験群であり、５番及び６番は、同じ条件で繰り返し行った実験群として、ＰＣＲを行った実験群である。
ｇＤＮＡが結合したガラス繊維メンブレンフィルターを溶出過程なくＵＶ相で確認した図６の結果、２番及び３番ラインで明らかなバンド発光が確認可能であるため、ガラス繊維メンブレンフィルターにｇＤＮＡがよく結合されていることを確認した。さらに、ガラス繊維メンブレンフィルターを利用した、溶出過程を除いて直ちにＰＣＲする場合において、ガラス繊維メンブレンフィルターのｇＤＮＡ残量を確認した結果、ＰＣＲをする前より若干減少することを確認した。これは、ＰＣＲ過程中に一部のｇＤＮＡがＰＣＲ反応混合物に溶けたことを示すと判断された。
したがって、本発明の核酸分離用バッファ組成物とガラス繊維メンブレンフィルターを利用した場合もｇＤＮＡ結合と分離効率に優れることを確認した。
２）最適のサイズ確認
一方、ＰＶＤＦメンブレン、シリカメンブレン及びガラス繊維メンブレンフィルターのような負電荷メンブレンフィルター（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）は、負電荷のｇＤＮＡを捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）するために正電荷（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）の中間媒介として多量の塩（ｓａｌｔ）を必要とする（０．１～１ＭのＮａＣｌ）。したがって、核酸を含んでいるガラス繊維フィルターは、ｇＤＮＡ結合媒介体である多量のＮａ＋を含有しているため、別途の精製なくＰＣＲを行うと、ＰＣＲ反応の阻害を引き起こし得る。これを防止するための最も効率的な方法は、ＰＣＲボリューム（ｖｏｌｕｍｅ）に比べてガラス繊維フィルターをできるだけ小さくしてＮａ＋による影響を最小化することである。しかし、小さ過ぎると、ガラス繊維メンブレンフィルターが装着されたカラム形態の核酸分離用キットを製作し難いという留意点がある。従って、本発明の核酸分離用バッファ組成物との活用においてガラス繊維フィルターの最適のサイズを確認した。
上記実施例２のうち２－１．と同一の方法で２９３Ｔ細胞からゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ、ｇＤＮＡ）を分離し、それぞれの分離効率を確認して図７に示した。
この時、ＰＣＲ生成物の確認のために０．８％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を使用し、１００ｖで３０分間ローディングした。さらに、ＰＣＲは、総５０μｌのボリュームで行い、サンプル５μｌとダイ（Ｄｙｅ）１μｌを混合してローディングした。
図７において、１番ラインは、１００ｂｐラダー（２μｌのラダー＋３μｌのＨ２Ｏ）であり、２番ラインは、陰性対照群としてｇＤＮＡなしに２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物のみを入れた実験群であり、３番ラインは、５μｌのＧＡＰＤＨに対するプライマー（正方向プライマー：ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号１）、逆方向プライマー：ＣＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ（配列番号２））のみをローディングした実験群であり、４番ラインは、陽性対照群（商業的ｇＤＮＡ分離キット（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ－３０３２） ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離したｇＤＮＡ（１μｇ）をＰＣＲする）であり、５番ラインは、１μｇのｇＤＮＡを含有した本発明の核酸分離用バッファをガラス繊維フィルターでろ過させた後、前記ろ過されたバッファをＰＣＲした実験群であり（６番ラインの対照群）、６番ラインは、１μｇのｇＤＮＡを含有した４００μｌの本発明の核酸分離用バッファをガラス繊維フィルターでろ過させ、これを１／８サイズ（４×４ｍｍ２）に切った後、ＰＣＲ反応を行った実験群であり、７番ラインは、１μｇのｇＤＮＡを含有した４００μｌの本発明の核酸分離用バッファをガラス繊維フィルターでろ過させ、前記ろ過されたバッファをＰＣＲした実験群であり（８番ラインの対照群）、８番ラインは、１μｇのｇＤＮＡを含有した４００μｌの本発明の核酸分離用バッファをガラス繊維フィルターでろ過させ、これを１／１６サイズ（２×２ｍｍ２）に切った後、ＰＣＲ反応を行った実験群である。
図７のように、総ボリューム５０μｌのＰＣＲ反応基準として、８番ラインで明らかなバンドが観察されるところ、２×２ｍｍ２サイズで（１／１６）成功的にＰＣＲが行われたことを確認した。一方、６番ラインのように、４×４ｍｍ２サイズ（１／８）ではＰＣＲが行われなかったことを確認した。したがって、総ボリューム５０ｕｌ当たりガラス繊維フィルターは、２×２ｍｍ２サイズ以下が最適であることを確認した（０．２５ＭのＮａＣｌ基準）。
実施例５．ワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離方法の核酸分離効率の確認
５－１．ｇＤＮＡ量による敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）確認
本発明の核酸分離用バッファ組成物を利用して、溶出過程が除かれた、核酸が固定されたメンブレンフィルターを直ちにＰＣＲに適用する核酸分離方法において、少量のｇＤＮＡもＰＣＲで検出可能であるかを確認した。ガラス繊維フィルターを利用する場合、ｇＤＮＡ量（μｇ（ｍｉｃｒｏｇｒａｍ）からｐｇ（ｐｉｃｏｇｒａｍ）単位）による敏感度を検証する必要がある。
このため、商業的ｇＤＮＡ分離キット（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ－３０３２） ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して２９３Ｔ細胞からＤＮＡを抽出した。抽出された総１２０μｇのｇＤＮＡを４００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物と混合した後、この１／１０である４０μｌを３６０μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物と混合し、前記混合した溶液の１／１０を本発明による核酸分離用バッファ組成物と再び希釈する、連続的希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を７回行った後、それぞれをガラス繊維フィルターを通じてろ過した。その後、前記フィルターを２×２ｍｍ２に切り、これをＰＣＲ反応混合物に入れてＰＣＲ増幅有無を確認した。
この時、０．１％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を使用し、１００ｖで３０分間ローディングした。さらに、ＰＣＲは、総５０μｌのボリュームで行い、サンプル５μｌとダイ（Ｄｙｅ）１μｌを混合してローディングした。
図８において、１番ラインは、１００ｂｐラダーであり、２番ラインは、陰性対照群として、ｇＤＮＡなしに２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物のみを入れた実験群であり、３番ラインは、５μｌのＧＡＰＤＨに対するプライマー（正方向プライマー：ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号１）、逆方向プライマー：ＣＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ（配列番号２））のみをローディングした実験群であり、４番ラインは、陽性対照群（商業的ｇＤＮＡ分離キット（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ－３０３２） ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離したｇＤＮＡ（１μｇ）をＰＣＲする）であり、５番ラインは、１２０μｇのｇＤＮＡをガラス繊維フィルターに固定させた後、これを２×２ｍｍ２サイズに切った後、ＰＣＲ反応混合物に入れてＰＣＲ増幅有無を確認した実験群であり、６番ラインは、１２μｇのｇＤＮＡのＰＣＲ結果であり、７番ラインは、１．２μｇのｇＤＮＡのＰＣＲ結果であり、８番ラインは、１２０ｎｇのｇＤＮＡのＰＣＲ結果であり、９番ラインは、１２ｎｇのｇＤＮＡのＰＣＲ結果であり、１０番ラインは、１．２ｎｇのｇＤＮＡのＰＣＲ結果であり、１１番ラインは、１２０ｐｇのｇＤＮＡのＰＣＲ結果であり、１２番ラインは、１２ｐｇのＤＮＡのＰＣＲ結果である。
図８に示すように、１２番ライン（１２ｐｇのｇＤＮＡ）でも明らかなバンドを確認することができるため、少量のｇＤＮＡにもＰＣＲ増幅が優秀になされることを確認した。
５－２．細胞数による敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の確認
本発明の核酸分離用バッファ組成物を利用して、溶出過程が除かれた、核酸が固定されたメンブレンフィルターを直ちにＰＣＲに適用する核酸分離方法において、少ない個数の細胞で得られたｇＤＮＡ量による敏感度を検証する必要がある。このため、ガラス繊維フィルターを利用する場合、１０万個の細胞から１００単位のｇＤＮＡ量による敏感度を確認した。
このため、１０万個の２９３Ｔ細胞を４００μｌの水に溶解させ、その中で２００μｌを採取して新しいチューブに移した後、２００μｌの水を添加して混合する方式で１／２ずつ連続希釈した（希釈後に各チューブのボリュームは２００μｌである）。本発明による核酸分離用バッファ組成物（ＧＢ、ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を利用して細胞を溶解させ、ガラス繊維フィルターを通じて溶出した後、２×２ｍｍ２サイズに切ったガラス繊維フィルターをＰＣＲ反応混合物に入れてＰＣＲ増幅有無を確認した。
この時、０．１％のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を使用し、１００ｖで３０分間ローディングした。さらに、ＰＣＲは、総５０μｌのボリュームで行い、サンプル５μｌとダイ（Ｄｙｅ）１μｌを混合してローディングした。
図９において、１番ラインは、１００ｂｐラダー（２μｌのラダー＋３μｌのＨ２Ｏ）であり、２番ラインは、ＧＡＰＤＨに対するプライマー（正方向プライマー：ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号１）、逆方向プライマー：ＣＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ（配列番号２））のみをローディングした実験群であり、３番ラインは、陽性対照群（商業的ｇＤＮＡ分離キット（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ－３０３２） ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離したｇＤＮＡ（１μｇ）をＰＣＲする）であり、４番ラインは、陰性対照群（ｇＤＮＡなしに２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物のみを入れた実験群、ＡＢ－ｃｏｎｔｒｏｌ）であり、５番ラインは、陽性対照群（１μｇのｑＤＮＡと本発明による核酸分離用バッファ組成物２００μｌ、ＡＢ＋ｃｏｎｔｒｏｌ）であり、６番ラインは、１００，０００個の細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、７番ラインは、５０，０００個の細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、８番ラインは、２５，０００個の細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、９番ラインは、１２，５００個の細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、１０番ラインは、６，２５０個の細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、１１番ラインは、３，１２５個の細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、１２番ラインは、１，５６３個の細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、１３番ラインは、７８１個の細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群である。
図９に示すように、７８１個の少ない細胞個数にもかかわらず、ｇＤＮＡで成功的にＰＣＲ増幅が行われることを確認した（１３番ライン参照）。
５－３．バクテリアｇＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａ ｇＤＮＡ）分離効率の確認
本発明の核酸分離用バッファ組成物を利用して、溶出過程が除かれた、核酸が固定されたメンブレンフィルターを直ちにＰＣＲに適用する核酸分離方法において、ガラス繊維フィルターを利用する場合、細胞壁（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ）を有しているバクテリアｇＤＮＡも分離可能であるか否かを確認した。
このため、１０９個のＥ．ｃｏｌｉ（大膓菌）細胞と４００μｌの本発明による核酸分離用バッファを混合して溶解させた後、その中で２００μｌを採取して新しいチューブに移し、２００μｌの本発明による核酸分離用バッファを添加して混合する方式で１／２ずつ連続希釈した（希釈後に各チューブのボリュームは２００μｌである）。これをガラス繊維フィルターを通じて溶出した後、２×２２サイズに切ったガラス繊維フィルターをＰＣＲ反応混合物に入れてＰＣＲ増幅有無を確認した。
バクテリアｇＤＮＡで増幅するために使用したプライマーは、ｕｉｄＡ遺伝子に対するプライマーであり、正方向プライマー（ｕｉｄＡ Ｕｐ）：ＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴ（配列番号３）、逆方向プライマー（ｕｉｄＡ Ｄｏｗｎ）：ＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧ（配列番号４））を使用した。さらに、使用したＰＣＲ反応混合物とＰＣＲ条件は、上記実施例に記載した通りである。
この時、０．１％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を使用し、１００ｖで３０分間ローディングした。さらに、ＰＣＲは、総５０μｌのボリュームで行い、サンプル５μｌとダイ（Ｄｙｅ）１μｌを混合してローディングした。
図１０において、１番ラインは、１００ｂｐラダーであり、２番ラインは、陰性対照群（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）であり、３番ラインは、５μｌのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子に対するプライマーのみをローディングした実験群であり、４番ラインは、陽性対照群（商業的ｇＤＮＡ分離キット（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ－３０３２） ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離したｇＤＮＡ（１μｇ）をＰＣＲする）であり、５番ラインは、１．７５×１０９細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、６番ラインは、１．７５×１０８個のＥ．ｃｏｌｉ細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、７番ラインは、１．７５×１０７個のＥ．ｃｏｌｉ細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、８番ラインは、１．７５×１０６個のＥ．ｃｏｌｉ細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、９番ラインは、１．７５×１０５個のＥ．ｃｏｌｉ細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、１０番ラインは、１．７５×１０４個のＥ．ｃｏｌｉ細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、１１番ラインは、１．７５×１０３個のＥ．ｃｏｌｉ細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群であり、１２番ラインは、１．７５×１０２個のＥ．ｃｏｌｉ細胞（２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物）実験群である。
図１０に示すように、１７５個程度の少ない個数のバクテリアｇＤＮＡでも成功的にＰＣＲ増幅が行われたことを確認した（１２番ライン参照）。
５－４．ｐＨによるＲＮＡ分離効率の確認
本発明の核酸分離用バッファ組成物を利用して、溶出過程なく核酸が固定されたメンブレンフィルターを利用した核酸分離方法において、細胞のｐＨによる総ＲＡＮ分離効率を確認した。
細胞から総ＲＮＡを分離するためには、ＤＮＡとは異なるｐＨの変化が必要であるため、多様なｐＨ変化下で本発明による核酸分離用バッファ組成物とガラス繊維フィルターを利用して、総ＲＮＡを分離しフィルターに固定した後、溶出して総ＲＮＡ分離有無を確認した。この時、細胞は２９３Ｔ細胞であり、１×１０６で同一に使用した。
上記細胞を２ｍｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物（ＧＢ、ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）２ｍｌと混合し、５分間インキュベーションして溶解させた。その後、ガラス繊維フィルターを通じて溶出してガラス繊維フィルターに総ＲＮＡを固定させ、蒸留水で溶出して総ＲＮＡ抽出有無を確認した。ｐＨによる総ＲＮＡ抽出効率を分析するために、ｐＨ４～ｐＨ８の２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを使用した。
この時、１％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を使用し、１００ｖで３０分間ローディングした。さらに、ＰＣＲは、総５０μｌのボリュームで行い、サンプル５μｌとダイ（Ｄｙｅ）１μｌを混合してローディングした。
図１１において、１番ラインは、１００ｂｐラダー（２μｌのラダー＋３μｌのＨ２Ｏ）であり、２番ラインは、陽性対照群（商業的総ＲＮＡ分離キット（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離した総ＲＮＡ（１μｇ））であり、３番ラインは、また他の対照群として、前記２番ラインのように商業的総ＲＮＡ分離キットを利用して得た総ＲＮＡ（１μｇ）を２ｍｌのｐＨ８の２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌが含まれた本発明の核酸分離用バッファ組成物で溶解させた実験群であり、４番ライン～８番ラインは、細胞をそれぞれｐＨ４～８の２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌが含まれた本発明の核酸分離用バッファ組成物で溶解した実験群である。
図１１に示すように、ｇＤＮＡに適合なｐＨであるｐＨ８では、総ＲＮＡ分離がよく行われなかったが、ｐＨ７以下では、総ＲＮＡがよく分離したことを確認した。したがって、本発明による核酸分離用バッファ組成物とガラス繊維フィルターを利用して、溶出過程なく核酸が固定されたメンブレンフィルターを利用した総ＲＮＡの分離方法において、ｐＨ４～７で行うことが好ましいことを確認した。
５－５．ｐＨによるＲＮＡ分離後にＰＣＲ効率の確認
本発明による核酸分離用バッファ組成物とガラス繊維フィルターを利用して、細胞から総ＲＮＡを分離してメンブレンフィルターに固定した後、総ＲＮＡが固定されたメンブレンをＰＣＲチューブに入れて直ちにＰＣＲ反応が可能であるかを確認した。
ＤＮＡと違ってＲＮＡを分離するためには、ＤＮＡとは異なるｐＨのｂｕｆｆｅｒ組成の変化が必要であるため、ｐＨによるｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出後にＰＣＲ反応に与える影響を分析するために、ｐＨ４～ｐＨ８の２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを使用した。多様なｐＨ変化下でこれを本発明による核酸分離用バッファ組成物２ｍｌを利用して１×１０６個の２９３Ｔ細胞を５分間インキュベーションして溶解させた。ガラス繊維フィルターを通じて溶出してガラス繊維フィルターにｔｏｔａｌ ＲＮＡを固定させ、２×２ｍｍ２サイズに切りＰＣＲ反応混合物に入れてＰＣＲ増幅有無を確認した。
この時、１％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を使用し、１００ｖで３０分間ローディングした。さらに、ＰＣＲは、総５０μｌのボリュームで行い、サンプル５μｌとダイ（Ｄｙｅ）１μｌを混合してローディングした。
図１２において、１番ラインは、１００ｂｐラダー（２μｌのラダー＋３μｌのＨ２Ｏ）であり、２番ラインは、陰性対照群として、２００μｌの本発明による核酸分離用バッファ組成物のみを入れた実験群であり、３番ラインは、５μｌのＧＡＰＤＨに対するプライマー（正方向プライマー：ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号１）、逆方向プライマー：ＣＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ（配列番号２））のみをローディングした結果であり、４番ラインは、陽性対照群（商業的総ＲＮＡ分離キット（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離した総ＲＮＡ（１μｇ））であり、５番ラインは、前記４番ラインのように商業的総ＲＮＡ分離キットを利用して得た総ＲＮＡ（１μｇ）を２ｍｌのｐＨ８の２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌが含まれた本発明の核酸分離用バッファ組成物で溶解させた実験群であり、６番ラインは、陽性対照群（商業的ｇＤＮＡ分離キット（ｇＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ－３０３２） ｏｆ Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用して分離したｇＤＮＡ（１μｇ）をＰＣＲする）であり、７番ラインは、前記６番ラインのように商業的ｇＤＮＡ分離キットを利用して得たｇＤＮＡ（１μｇ）を２ｍｌのｐＨ８の２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌが含まれた本発明の核酸分離用バッファ組成物で溶解させた実験群であり、８番ライン～１２番ラインは、細胞をそれぞれｐＨ４～８の２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌが含まれた本発明の核酸分離用バッファ組成物を利用して溶解した実験群である。
図１２に示すように、細胞をｐＨ４～７の２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌが含まれた、本発明の核酸分離用バッファ組成物で溶解した後、これをガラス繊維フィルターでろ過させ、直ちにＰＣＲチューブに入れてＰＣＲを行っても成功的に行われることを確認した。
総合的に本発明による核酸分離用バッファ組成物及びこれを含むメンブレンフィルターが装着された核酸分離用キットは、単一チューブ（ｏｎｅ－ｔｕｂｅ）でＰＣＲ反応まで行うことができ、ワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）で多様なサンプルから核酸を分離することができ、前記核酸分離用バッファ組成物は、多様な素材のメンブレンフィルターと適合性に優れることを確認した。さらに、これを適用した核酸分離方法において、別途の溶出過程なく核酸が固定されたメンブレンフィルターを直ちにＰＣＲに適用可能なことを確認したところ、本発明による核酸分離用組成物、キット及び分離方法は、現場における迅速な診断に有用に活用されることができる。

Claims (16)

  1. エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及びＴｒｉｓ－ＨＣｌを含むワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用バッファ組成物。
  2. 前記バッファ組成物は、２０％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）のエタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）、０．５Ｍ～１Ｍの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＮａＣｌ）、１ｍＭ～１００ｍＭのＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び１ｍＭ～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸分離用バッファ組成物。
  3. 請求項１または請求項２に記載の核酸分離用バッファ組成物を含み、メンブレンフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｉｔｅｒ）が装着されたカラム（Ｃｏｌｕｍｎ）を含むワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用キット。
  4. 前記メンブレンフィルターは、ポリビニリデンフルオライド（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）、ナイロンフィルター（ｎｙｒｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）、セルロースニトリートフィルター（ｃｅｌｌｕｏｓｅ ｎｉｔｒａｔｅ ｆｉｌｔｅｒ）、紙フィルター（ｐａｐｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）、ガラス繊維フィルター（ｇｌａｓｓｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）及びシリカフィルター（ｓｉｌｉｃａ ｆｉｌｔｅｒ）からなる群より選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項３に記載の核酸分離用キット。
  5. 前記キットは、注射器形態であることを特徴とする、請求項３に記載の核酸分離用キット。
  6. 前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡを含む群より選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項３に記載の核酸分離用キット。
  7. 請求項３に記載のワンステップ（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）核酸分離用キットを利用してサンプルから核酸を分離する方法。
  8. 前記方法は、下記の段階を含むことを特徴とする、請求項７に記載のサンプルから核酸を分離する方法。
    サンプルを請求項１または請求項２に記載の核酸分離用バッファに浸漬して溶解する段階；
    常温で前記サンプルが溶解された溶液をインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する段階；
    前記サンプルが溶解された溶液をメンブレンフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｉｔｅｒ）が装着されたカラムに移す段階；及び
    前記カラムに圧力をかけてフィルターに核酸を固定しろ過液は除去する段階。
  9. 前記方法は、下記の段階を含むことを特徴とする、請求項７に記載のサンプルから核酸を分離する方法。
    サンプルを請求項１または請求項２に記載の核酸分離用バッファに浸漬して溶解する段階；
    常温で前記サンプルが溶解された溶液をインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する段階；
    前記サンプルが溶解された溶液をメンブレンフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｉｔｅｒ）が装着されたカラムに移す段階；
    前記カラムに圧力をかけてフィルターに核酸を固定しろ過液は除去する段階；
    前記核酸が固定されたカラムに溶出溶液を入れてメンブレンフィルターを通過させる段階；及び
    前記溶出溶液を得る段階。
  10. 前記溶出溶液は、蒸留水、ＴＥバッファ（Ｔ ｔｅｎ Ｅ ｏｎｅ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ）及びこれらの混合物からなる群より選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項９に記載のサンプルから核酸を分離する方法。
  11. 前記インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）は、２分～１０分間行われることを特徴とする、請求項８に記載のサンプルから核酸を分離する方法。
  12. 前記サンプルは、生物学的または非生物学的サンプルであることを特徴とする、請求項７に記載のサンプルから核酸を分離する方法。
  13. 前記生物学的サンプルは、鼻腔吸引物（ｎａｓａｌ ａｓｐｉｒａｔｅ）、気管支吸引物（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｐｉｒａｔｅ）、気管分泌物（ｏｒｇａｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）、喀痰（ｓｐｕｔｕｍ）、涙（ｔｅａｒｓ）、唾（ｓａｌｉｖａ）、細胞（ｃｅｌｌ）、細胞分離物（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ）、全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、血漿（ｐｌａｓｍａ）、血清（ｓｅｒｕｍ）、粘液（ｍｕｃｕｓ）、鼻洗浄液（ｎａｓａｌ ｗａｓｈｅｓ）、小便（ｕｒｉｎｅ）、精液（ｓｅｍｅｎ）、腹腔洗浄液（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｗａｓｈｉｎｇｓ）、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、嚢腫液（ｃｙｓｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、脳脊樺膜液（ｍｅｎｉｎｇｅａｌ ｆｌｕｉｄ）、羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）、白血球層（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）、腺液（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、膵臓液（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、リンパ液（ｌｙｍｐｈ ｆｌｕｉｄ）、胸水（ｐｌｅｕｒａｌ ｆｌｕｉｄ）、乳頭吸引物（ｎｉｐｐｌｅ ａｓｐｉｒａｔｅ）、滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）、関節吸引物（ｊｏｉｎｔ ａｓｐｉｒａｔｅ）、及び脳脊樺液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）からなる群より選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１２に記載のサンプルから核酸を分離する方法。
  14. 前記非生物学的サンプルは、化学的に合成されたＰＮＡを含むことを特徴とする、請求項１２に記載のサンプルから核酸を分離する方法。
  15. 請求項７に記載の方法で分離した核酸を鋳型としてＰＣＲを行う段階を含む核酸の増幅方法。
  16. 前記ＰＣＲは、重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）、逆転写重合酵素連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ－ＰＣＲ）及び等温増幅（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ＰＣＲからなる群より選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１５に記載の核酸の増幅方法。

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