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JP2023516538A - Ｕｃａｒｔ細胞を精製する方法及び応用 - Google Patents

Ｕｃａｒｔ細胞を精製する方法及び応用 Download PDF

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Abstract

ユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を精製する方法は、（ｉ）遺伝子編集技術により前記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞における１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣ遺伝子領域、及び１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍ遺伝子領域を破壊するステップと、（ｉｉ）次にＴＣＲα／βを標的するｍＲＮＡを遺伝子編集後のＣＡＲ－Ｔ細胞に導入するステップと、（ｉｉｉ）前述したように処理されたＣＡＲ－Ｔ細胞集団をインビトロで培養するステップとを含む。【選択図】なし

Description

本願は、Ｔ細胞を標的とする一過性に発現されたＣＡＲに関し、具体的には、腫瘍細胞を標的とする同種ＣＡＲ－Ｔ細胞を加えたインビトロ培養と遺伝子編集とを組み合わせる二重遺伝子ノックアウト技術に関し、培養過程においてＴＣＲα／βの標的を一過性に発現することができるｍＲＮＡを加えることにより、ＴＣＲα／β陰性が約９７％以上のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を得る。
悪性腫瘍は、身体の健康と生命を深刻に脅かす疾患になり、腫瘍の治癒は、常に人間の夢である。近年、腫瘍免疫療法は、広く注目されており、特に、ＣＡＲ－Ｔ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ）技術の出現のため、腫瘍の制御が画期的に発展している。ＣＡＲ－Ｔ技術は、１９８９年に初めて適用された。２０１２年にペンシルバニア大学のＣａｒｌ Ｊｕｎｅ教授がリードするチームは、Ｅｍｉｌｙ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄを治癒した。２０１７年にＦＤＡ腫瘍薬物専門家諮問委員会（ＯＤＡＣ）は、１０：０の圧倒的な投票結果として、ＮｏｖａｒｔｉｓＣＡＲ－Ｔ医薬ＣＴＬ０１９が十代後半のＢ細胞急性リンパ性白血病（ｒ／ｒＡｌｌ）を治療するために用いられることを承認するように推奨した。
一般的に、従来のＣＡＲ－Ｔ技術のＴ細胞は、主に患者自身に由来し、ＧＭＰ環境でＴ細胞をインビトロで単離し、活性化し、ＣＡＲを導入し、培養で増幅し、最後に品質制御を経て患者体内に再注入する。患者自身の条件の影響のため、採血に適しないか、又は採血してＴ細胞を単離した後に増幅しにくいという問題が現れる。患者の状態が重篤である場合、Ｔ細胞の単離からＣＡＲ－Ｔの再注入までのフロー全体の待ち時間も、自己再注入が直面する重大な問題である。これらの問題は、ＣＡＲ－Ｔ技術の広範な応用に制限をもたらし、そのため、現在のＣＡＲ－Ｔ細胞治療の重要な研究方向は、どのように健康なドナーのＴ細胞を用いて大量のＣＡＲ－Ｔ細胞を調製し、患者の臨床上の使用を満たすことである。この技術の確立は、ＣＡＲ－Ｔ療法のコストを大幅に低減し、均一に調製された細胞品質をよく保証することができ、且つ患者は、必要な時に、すぐにＣＡＲ－Ｔ細胞を得て治療することができる。また、同種ＣＡＲＴ治療もその不利点があり、例えば、ＧｖＨＤを引き起こしやすいが、従来技術で抗体精製技術的手段を利用するコストが高く、プロセスが複雑で、手間がかかる。したがって、新たな精製方法の確立は、差し迫っている。
本明細書全体では、数件の文書が引用されている。ここでの各文書（任意の学術論文又は要約、公開又は非公開の特許出願、登録特許、メーカーのプロトコール、使用説明書などを含む）は、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用される文書が実際に本発明の従来技術であることを認めない。
本願の技術的解決手段を実施して当技術分野に存在する上記問題を解決する。本願は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用してＣＡＲ－Ｔ細胞に対して二重遺伝子（ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ）ノックアウトを行い、そのノックアウト効率は、８０％以上に達する。しかしながら、依然として、約２０％の陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞発現は、ＧｖＨＤのＴＣＲα／βを引き起こすことができる。したがって、電気穿孔の送達プラットフォームを利用し、ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲをＣＡＲ－Ｔ細胞に一過性に導入し、精製のステップを省くことができるだけでなく、労力、物力及び財力を節約する。また、Ｔ細胞ＴＣＲα／βを標的とするターゲットに対し、本願は、初めて発表され、これは、遺伝子編集技術を確立して養子免疫と組み合わせて腫瘍及びウイルス性感染症（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）を治療するために方法を提供し、且つ関連疾患治療の研究に強固な技術基礎を定める。
したがって、本発明は、遺伝子編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用してＣＡＲ－Ｔ細胞に対して効率的なノックアウトを行い、それにより、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を取得し、また、電気穿孔伝達システムを利用してＴＣＲα／βの標的を発現することができるＣＡＲをＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＣＲα／β ＣＡＲを除く）に一過性にトランスフェクトし、この時に一過性にトランスフェクトされたＣＡＲは、ＴＣＲα／β陽性細胞集団を除去することができ、それにより、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を直接取得する方法を提供する。該方法は、従来の方法におけるＴＣＲα／β陽性細胞集団の除去を行うだけでなく、コストを節約し、手間も時間も節約する方法である。
具体的には、本願は、以下を提供する。
項１．ユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を精製する方法であって、該方法は、
（ｉ）遺伝子編集技術によって前記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＲＡＣゲノム領域及びＢ２Ｍゲノム領域を破壊するステップと、
（ｉｉ）次に、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを、ステップ（ｉ）の遺伝子編集後のＣＡＲ－Ｔ細胞に導入するステップとを含む、方法。
項２．ＴＣＲα／βを標的とする前記ｍＲＮＡを一過性トランスフェクションによりＣＡＲ－Ｔ細胞に導入するが、ゲノムに組み込まない、項１に記載の方法。
項３．前記方法で得られた細胞集団を、適切な時間、インビトロで培養して、ＴＣＲα／β陽性細胞を除去するステップをさらに含む、項１又は２に記載の方法。
項４．前記適切な時間は、４～８日間、好ましくは、５～７日間、最も好ましくは６日間である、項３に記載の方法。
項５．前記ＴＲＡＣゲノム領域は、ヒト１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのゲノム領域を含み、且つ前記Ｂ２Ｍゲノム領域は、ヒト１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのゲノム領域を含む、項１～４のいずれか１項に記載の方法。
項６．ＴＣＲα／βを標的とする前記ｍＲＮＡがコードするのは、抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖ分子であり、
抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖ分子の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ）に示すとおりであり、
抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖ分子の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）に示すとおりである、項１～５のいずれか１項に記載の方法。
項７．ｓｃＦｖ分子の軽鎖可変領域とｓｃＦｖ分子の重鎖可変領域とは、（Ｇ）ｎ（Ｓ）ｍを含むアミノ酸配列であるリンカーを介して連結され、ここで、ｎは１～２０の正の整数であり、ｍは１～１０の正の整数である、項６に記載の方法。
項８．前記リンカー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである、項７に記載の方法。
項９．ＴＣＲα／βを標的とする前記ｍＲＮＡがコードするアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡである、項１～８のいずれか１項に記載の方法。
項１０．前記ＴＲＡＣゲノム領域及びＢ２Ｍゲノム領域は、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼの遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術により破壊される、項１～９のいずれか１項に記載の方法。
項１１．前記遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である、項１０に記載の方法。
項１２．（ｉ）前記ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を該Ｔ細胞に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成し、及び／又は、
（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を該Ｔ細胞に導入して、前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を達成する、項１１に記載の方法。
項１３．（ｉ）前記ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～５から選択されるいずれか１つの配列を有し、
（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～１３から選択されるいずれか１つの配列を有する、項１２に記載の方法。
項１４．（ｉ）前記ＴＲＡＣゲノムをコードするｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするヌクレオチドをＴ細胞に共同又は別々に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成し、及び／又は、
（ｉｉ）前記Ｂ２ＭゲノムをコードするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドを該Ｔ細胞に共同又は別々に導入して、前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を達成する、項１３に記載の方法。
項１５．前記ｓｇＲＮＡは、化学修飾されている、項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
項１６．前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル類縁体修飾又はヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、項１５に記載の方法。
項１７．前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／又は３つの塩基及び／又は３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体修飾である、項１６に記載の方法。
項１８．前記ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を電気穿孔方式により該Ｔ細胞に導入する、項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
項１９．前記電気穿孔条件は、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓのいずれかから選択される、項１８に記載の方法。
項２０．前記ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍがそれぞれノックアウトされる効率は、９０％以上であり、同時にノックアウトされる効率は、７５％以上である、項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
項２１．前記方法で得られた細胞集団において、ＴＣＲ陰性細胞の比率が９８％又は９９％以上である、項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
項２２．精製されたユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞であって、
（ｉ）前記ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＲＡＣゲノム領域とＢ２Ｍゲノム領域は、遺伝子編集により破壊され、
（ｉｉ）該ＣＡＲ－Ｔ細胞には、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡが導入されている、ユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞。
項２３．ＴＣＲα／β、クラスＩＨＬＡタンパク質、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３から選択される１つ又は複数のタンパク質を低レベルで発現する、又は発現しない、項２２に記載のユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞。
項２４．項２２又は２３のいずれか１項に記載のユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を含む生物製品。
項２５．９８％又は９９％以上の前記ユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞がＴＣＲ陰性である、項２３に記載の生物製品。
項２６．被験者の疾患を治療するための医薬の製造における項２２又は２３のいずれか１項に記載のユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞又は項２４又は２５のいずれか１項に記載の生物製品の使用。
項２７．被験者の疾患を治療する方法であって、被験者に有効量の項２２又は２３に記載のユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞又は項２４又は２５に記載の生物製品を投与することを含む方法。
項２８．前記疾患は、腫瘍である、項２７に記載の方法。
項２９．前記腫瘍は、血液系腫瘍である、項２８に記載の方法。
項３０．前記腫瘍は、リンパ腫又は白血病である、項２９に記載の方法。
図１は、細胞の電気穿孔後の成長生存率の変化状況を示し、Ｔ細胞とＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存率が比較的よく、且つ培養時間の増加に伴って細胞の生存率が９０％以上に達するが、ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡは、２回目の電気穿孔後、その生存率が著しく低下し、培養時間の増加に伴ってその生存率が徐々に回復し、ＭＩＸ（ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ：ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡ １：１）細胞は、６日間に混合培養した後、その生存率も顕著に低下し、培養時間の増加につれて生存率が徐々に回復する。１４日間培養すると生存率がほぼ９０％以上に達する。 図２は、細胞の電気穿孔後の各群の成長状況を示し、Ｔ ｃｅｌｌの前期増殖速度が最も速く、１３日後に増殖速度が遅くなり、ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔの成長傾向がＴ ｃｅｌｌとほぼ同じであり、１４日まで培養し、その増殖速度がほぼ同じである。ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡは、編集されたＴ ｃｅｌｌを６日間培養して２回の電気穿孔を行い、その成長速度が比較的遅い。ＭＩＸは、６日間培養されたＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔと２回電気穿孔されたＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡを１：１で混合培養し、混合培養後にその増殖速度は、ＤＫＯ ＣＡＲ－ＴとＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡとの間にある。 図３は、ＴＣＲα／β－ＣＡＲを標的とするｍＲＮＡの導入後の、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を培養した表現型分析を示す。この結果から、ＴＣＲα／β－ＣＡＲを添加したＤＫＯ－Ｔ細胞は、培養後に、そのＴＣＲα／β陰性細胞の比率は、９９％以上である。 図４は、ＭＩＸ（ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ：ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡ１：１）を培養した後に、そのＴＣＲα／β陽性変化状況を示し、２日間混合培養し後に、そのＴＣＲα／β陰性細胞の比率は９９％以上である。 図５は、ＳＴＥＭＣＥＬＬを用いてＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ（ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ）がノックアウトされたＴ細胞をスクリーニングして精製した精製回収率を示し、図から分かるように回収率が低く、基本的に２０％～３０％である。 図６は、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ及びＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡ細胞殺傷機能の検証と結果の比較を示す。この実験では、Ｔ及びＣＡＲ－Ｔ及びＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡ細胞をエフェクター細胞とし、エフェクター対標的比（エフェクター細胞対標的細胞比）を１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２５：１としてインビトロ殺傷実験を行う。 図７は、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ及びＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡ細胞ＩＦＮ－γ因子の放出を示す。該実験で、Ｒａｊｉを標的細胞とし、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ及びＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡ細胞をエフェクター細胞とし、エフェクター対標的比を１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２５：１としてインビトロで共培養した後、１．２５：１で上清を取ってそのＩＦＮ－γを検出する。
以下、具体的な実施形態を参照して本願をさらに詳細に説明し、説明された実施例は、本発明をより完全に理解するためのものであり、且つ、本発明の範囲を完全に当業者に伝達することができるものである。
説明すべきものとして、明細書及び特許請求の範囲において特定の用語を用いて特定の部材を指す。当業者であれば、技術者は、異なる用語で同一の部材を呼ぶ可能性があると理解すべきである。本明細書及び特許請求の範囲は、用語の差異を部品を区別する方式とせず、部品の機能上の差異を区別基準とする。本明細書及び特許請求の範囲で言及される「含む」又は「含める」は、オープン用語であるため、「含むが、限定されない」と解釈されるべきである。明細書の後続の説明は、本発明を実施する好ましい実施形態であるが、前記説明は、一般的原理を説明する目的のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる。
本願の第１態様によれば、ユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を精製する方法が提供され、１つの具体的な実施形態では、該方法は、
（ｉ）遺伝子編集技術によって前記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＲＡＣゲノム領域及びＢ２Ｍゲノム領域を破壊するステップと、
（ｉｉ）次に、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを、ステップ（ｉ）の遺伝子編集後のＣＡＲ－Ｔ細胞に導入するステップとを含む。
「ＣＡＲ－Ｔ」は、「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」の略語であり、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞に標的細胞（例えば、腫瘍）抗原をＨＬＡ非依存的に認識する能力を付与するＣＡＲ－Ｔのコア部分であり、これは、ＣＡＲによって操作されたＴ細胞が、天然Ｔ細胞表面受容体ＴＣＲよりも広い標的を認識することを可能にする。いくつかの実施形態では、腫瘍を標的とするＣＡＲは、腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）結合ドメイン（例えば、一般的にはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインに由来するｓｃＦＶセグメント）、細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナルドメインを含むように設計される。標的抗原の選択は、ＣＡＲの特異性、有効性、及び遺伝子操作されたＴ細胞自体の安全性の両方にとって重要な決定因子である。
「ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞」は、特異的な標的細胞（例えば腫瘍）に関連するマークを標的とし細胞表面ＴＣＲ及びＭＨＣ機能を不活性化することができ、同種異系細胞治療に起因する免疫拒絶反応を低減することができるＣＡＲ－Ｔ細胞を指す。
自己細胞のＣＡＲ－Ｔによる治療は、血液を抽出して患者自身のＴリンパ球を単離して調製する必要があり、一方、患者自身の病状及びＴリンパ球の状態が異なり、ＣＡＲ－Ｔ調製過程の影響要因が多いため、規格化し製造することができず、安全性に影響を与え、他方、一部の患者自身のＴリンパ球が化学療法を経た後に活性及び数が不足であり、又は、腫瘍環境の影響を受けてＴリンパ球の活性及び増殖能力が制限され、このような細胞は、ＣＡＲ－Ｔを調製する難易度が大きく、治療の安全性及び有効性が影響を受け、又は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製過程において突発的な状況が発生したら、用意された細胞が患者にタイムリーに戻されないと、治療効果に影響を与え、さらに、自己Ｔリンパ球状態の影響を受けて一部の腫瘍患者は、自己のＣＡＲ－Ｔ細胞の養子治療を受けることができない。同種異系療法に使用可能なユニバーサルＣＡＲ－Ｔ又はユニバーサルＴリンパ球は、この状況において大きな利点を有する。
養子細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌμｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ、ＡＣＴ）、養子免疫療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、例えば、腫瘍養子免疫療法（ｔｕｍｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は、免疫細胞をインビトロで処理し、例えば、特異的な抗原を加え、免疫細胞が発現する分子を修飾するか又はサイトカインを利用してそれを刺激する等の方法で、高度に特異的な標的細胞（例えば腫瘍）のキラー免疫エフェクター細胞をスクリーニングして大量に増幅し、次に患者に戻し、標的細胞（例えば、腫瘍）を殺傷させる治療方法であり、受動免疫療法である。
本願では、Ｔ細胞は、健康なヒトに由来する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、癌患者などの患者、例えば、化学療法又は放射線療法前の癌患者に由来する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、臍帯血、骨髄、又は末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）などに由来する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、幹細胞、例えば、各分化段階にある造血幹細胞に由来する。本願に記載の調製方法は、例えば、ＰＢＭＣ又は幹細胞においてＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍをノックアウトし、対応する遺伝子操作されたＴ細胞をさらに培養、分化、及び／又は精製するために用いられてもよい。
本願における「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」は、ＣＤ３に結合してＴＣＲ－ＣＤ３複合体を形成する全てのＴ細胞表面の特徴的なマーカーである。ＴＣＲは、α、βという２本のペプチド鎖で構成され、各ペプチド鎖は、さらに、可変領域（Ｖ領域）、定常領域（Ｃ領域）、膜貫通領域、及び細胞質領域に分けることができる。ＴＣＲ分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、その抗原特異性は、Ｖ領域に存在し、Ｖ領域（Ｖα、Ｖβ）には、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３という３つの超可変領域があり、そのうち、ＣＤＲ３の変異が最も大きく、ＴＣＲの抗原結合特異性を直接決定する。ＴＣＲがＭＨＣ－抗原ペプチド複合体を認識すると、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子抗原結合溝の側壁を認識して結合し、ＣＤＲ３は、抗原ペプチドに直接結合される。ＴＣＲは、ＴＣＲ１及びＴＣＲ２という２種類に分けられ、ＴＣＲ１は、γ及びδという２本の鎖からなり、ＴＣＲ２は、α及びβという２本の鎖からなる。末梢血において、９０％～９５％のＴ細胞がＴＣＲ２を発現するが、いずれかのＴ細胞は、ＴＣＲ２及びＴＣＲ１のうち１つだけを発現する。
「β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）」は、細胞表面ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のβ鎖（軽鎖）部分であり、分子質量が１１８００で、９９個のアミノ酸からなる一本鎖ポリペプチドである。
本願の具体的な実施形態では、ＴＣＲα／βを標的とする前記コーディングヌクレオチドは、ｍＲＮＡであり、例えば、ＡＲＣＡキャップを含有するｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡを、電気穿孔の送達システムを用いてＣＡＲ－Ｔ細胞内に送達する。一過的に発現したＴＣＲα／βを標的とするタンパク質は、ＴＣＲα／β陽性の細胞を特異的に認識し、培養の過程でＴＣＲα／β陽性細胞を除去し、ＧｖＨＤの発生を回避する効果を達成することができる。
一過性トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、ｍＲＮＡを真核細胞に導入する手段の１つである。一過性トランスフェクションでは、組換えｍＲＮＡを、目的遺伝子の一時的な高レベルの発現を得るために、感染性が強い細胞株に導入する。トランスフェクトされたｍＲＮＡを宿主染色体に組み込む必要はない。一過性トランスフェクションで導入されたｍＲＮＡは、細胞中に遊離しているが、ゲノムに組み込まれず、安定的なトランスフェクションよりも短い時間でトランスフェクトされた細胞を取得することができ、より短い時間でより高い発現効率を得ることができる。一過的発現法は、操作が簡単で周期が短く、発現効率が高く、安全で高効率であり、遺伝子のスクリーニングを必要としないという多くの利点を有する。
「移植片対宿主反応（ＧｖＨＤ）」は、ドナーとレシピエントとの間に免疫遺伝学的差異が存在し、例えば、一方で、ドナー細胞、例えば、免疫学的に活性なドナーのＴリンパ球が、レシピエント患者に入ってある程度増殖した後に、レシピエント患者の正常細胞又は組織を標的と誤認して攻撃することによって生じる反応を意味する。他方で、同種異系細胞に対して、レシピエント内の正常な免疫系もまた、それらを除去し、「移植片対宿主反応（ＨＶＧＲ）」を生じさせる可能性がある。
ＨＶＧＲ及びＧＶＨＲ関連遺伝子は、ＴＣＲ、ＨＬＡ分子関連遺伝子を含み、これらの遺伝子が同時にノックアウトされたＴリンパ球を同種異系患者に再輸注する時に、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさないため、「ユニバーサルＴ細胞」と呼ぶことができる。例えば、単一のＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＣＲα鎖をコードする遺伝子とＴＣＲβをコードする２つのＴＲＢＣ遺伝子で形成された完全で機能的なＴＣＲ複合体であり、ＴＲＡＣのノックアウトは、ＴＣＲを不活性化することができるが、Ｂ２Ｍは、ＭＨＣＩ関連遺伝子である。この２つの遺伝子が同時にノックアウトされたＴリンパ球は、同種異系患者に戻される時に移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない。
１つの具体的な実施形態では、該方法は、ＴＣＲα／βが陽性発現した細胞集団を除去するために、得られた細胞集団を、適切な時間、インビトロで培養することをさらに含む。好ましい実施形態では、インビトロ培養の時間は、４～８日間、さらに好ましくは、５～７日間、最も好ましくは、６日間である。
１つの具体的な実施形態では、ＴＣＲα／βを標的とする前記ｍＲＮＡがコードするのは、抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖ分子である。「ｓｃＦｖ」は、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）を意味し、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、１５～２０アミノ酸の短ペプチド（ｌｉｎｋｅｒ、即ち、リンカー）を介して連結される抗体である。ｓｃＦｖ分子は、軽鎖可変領域、リンカー、及び重鎖可変領域からなるＣＡＲ分子の細胞外部分として理解され得る。
１つの具体的な実施形態では、抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖ分子の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ）に示すとおりであり、抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖ分子の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）に示すとおりである。
さらに、ｓｃＦｖ分子の軽鎖可変領域及びｓｃＦｖ分子の重鎖可変領域は、（Ｇ）ｎ（Ｓ）ｍを含むアミノ酸配列であるリンカーを介して連結され、ここで、ｎは１～２０の正の整数であり、ｍは１～１０の正の整数である。具体的には、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０であるが、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であってもよい。ここで、Ｇは、グリシンの略語であるが、Ｇｌｙと略記してもよい。ここで、Ｓは、セリンの略語であるが、Ｓｅｒと略記してもよい。
さらに、前記リンカー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示す配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
１つの具体的な実施形態では、ＴＣＲα／βを標的とする前記ｍＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す配列
Figure 2023516538000001
である。
本願の別の態様によれば、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法が提供され、遺伝子編集技術によって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞のうち、
（ｉ）１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域と、（ｉｉ）１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域とを破壊することを含む。
具体的な実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域、Ｂ２Ｍゲノム領域の両方は編集される。
１つの具体的な実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域及びＢ２Ｍゲノム領域は、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼの遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術により破壊される。
１つの更なる具体的な実施形態では、前記遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術である。
本願で説明したように、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」は、天然に存在するか又は人工的に設計された様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを含むが、それらに限定されない遺伝子編集技術である。天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）は、細菌及び古細菌が長期的進化過程で形成される適応免疫防御であり、侵入するウイルス及び外因性ＤＮＡに対抗するために使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の作用原理は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡ）が、塩基対合により、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）と結合してｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、この複合体が、ヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質を、ｃｒＲＮＡとペアリングする配列の標的部位で二本鎖領域ＤＮＡを切断するように誘導する。ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを人工的に設計することにより、Ｃａｓ９のＤＮＡに対する部位特異的な切断に十分なガイド作用を果たすｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を改良し形成することができる。ＲＮＡ誘導型のｄｓＤＮＡ結合タンパク質として、Ｃａｓ９エフェクターヌクレアーゼは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質を共局在化することができ、それによって、巨大な改変能力を有する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス１、クラス２又はクラス３のＣａｓタンパク質を使用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、Ｃａｓ９を使用する。他の適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＷＯ２０１４０６５５９６、ＷＯ２０１４０１８４２３、ＵＳ８６９７３５９に記載のシステム及び方法を含むが、それらに限定されない。
１つの具体的な実施形態では、本願は、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、遺伝子編集技術によって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞のうち、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～５から選択されたいずれかの配列に相補的なＴＲＡＣゲノム標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：６～１３から選択されるいずれかの配列に相補的なＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列とを破壊することを含む。そのうち、前記ＴＲＡＣゲノム領域及びＢ２Ｍゲノム領域は、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼの遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術により破壊される。
１つの具体的な実施形態では、本願は、遺伝子編集されたＴ細胞を調製する方法を提供し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって、前記Ｔ細胞のうち、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列に相補的なＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の配列に相補的なＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列とを破壊する。
１つの具体的な実施形態では、本願は、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって、前記Ｔ細胞のうち、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列に相補的なＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の配列に相補的なＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列と、を破壊する。
１つの具体的な実施形態では、本願は、遺伝子編集されたＴ細胞を調製する方法を提供し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞のうち、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列に相補的なＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の配列に相補的なＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列とを、破壊する。
さらに、１つの具体的な実施形態では、本願は、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）前記ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を該Ｔ細胞に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成し、及び／又は、
（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を該Ｔ細胞に導入して、前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を達成する。
１つの具体的な実施形態では、該方法は、前記ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を前記Ｔ細胞に共同又は別々に導入することを含む。
本願で、「ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」、又は、「単一ガイドＲＮＡ」、「合成ガイドＲＮＡ」又は「ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され得る。本願のｓｇＲＮＡは、標的配列を標的とするガイド配列（ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。
１つの具体的な実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＴＣＲ２のα鎖及び／又はβ鎖の定常領域のコード遺伝子を標的とし、それによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞表面ＴＣＲの構造を破壊し、該分子に機能を失わせる。
１つの具体的な実施形態では、ｓｇＲＮＡは、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のコード遺伝子を標的とし、例えば、Ｂ２Ｍタンパク質をコードする遺伝子の最初のエクソン領域を標的とし、それによって、Ｂ２Ｍの構造を破壊し、分子に機能を失わせる。
さらに、１つの具体的な実施形態では、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、該方法は、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～５から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域に対する編集を達成するステップと、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：６～１３から選択されたのいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して前記Ｂ２Ｍゲノム領域に対する編集を達成するステップとを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、前記ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を前記Ｔ細胞に共同又は別々に導入することを含む。
本願の１つの具体的な実施形態では、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、該方法は、（ｉ）ＴＲＡＣ－ｓｇ３ ｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成するステップと、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ－ｓｇ２ ｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を達成するステップとを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、前記ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を前記Ｔ細胞に共同又は別々に導入することを含む。
本願の１つの具体的な実施形態では、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、該方法は、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２又は３の配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成するステップと、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７～１１から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を達成する。いくつかの実施形態では、該方法は、Ｃａｓ９又はそのコードヌクレオチドをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態では、上記ｓｇＲＮＡは、化学修飾されている。例えば、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／又はヌクレオチド間３’チオにより修飾されている。いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／又は３つの塩基及び／又は３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体修飾である。
一般に、ｓｇＲＮＡのうちのガイド配列は、標的配列にハイブリダイズして、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的配列の配列と特異的に結合するようにガイドするために、標的ポリヌクレオチド配列に十分に相補的な任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントする場合、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％又はそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｉ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、 ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎから取得することができる）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔから取得することができる）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイド配列の長さは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５又はそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列の長さは、約７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２又はより少ないヌクレオチドの長さである。ガイド配列がＣＲ１ＳＰＲ複合体を標的配列の配列と特異的に結合するようにガイドする能力は、任意の適切な測定方法で評価することができる。例えば、対応する標的配列を有する宿主細胞に、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの成分（試験対象のガイド配列を含む）を提供することができ、これは、例えばＣＲＩＳＰＲ配列成分をコードするベクターによりトランスフェクションしてから、標的配列内の優先的切断を評価することによって行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体（試験対象のガイド配列及びガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含む）の成分を提供し、標的配列における試験及び対照ガイド配列の結合又は切断率を比較することによって、試験管内で評価することができる。上記測定及び評価は、当業者に公知の他の測定方法を用いて行うこともできる。
１つの具体的な実施形態では、電気穿孔方法で前記ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を前記Ｔ細胞に共導入する。
具体的には、ＴＲＡＣを標的とする前記ｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／又はＣａｓ９をコードするヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を該Ｔ細胞に電気穿孔によって導入する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣを標的とする前記ｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドは、Ｔ細胞に電気穿孔によって共同に導入する。
具体的には、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドは、ｍＲＮＡであり、例えば、ＡＲＣＡキャップを含有するｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターにある。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドは、同じベクターにある。
いくつかの具体的な実施形態では、前記電気穿孔条件は、１５０～２５０Ｖ、０．５－２ｍｓ；１８０－２５０Ｖ、０．５－２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；２５０Ｖ、０．５ｍｓから選択されるいずれかである。
本願のいくつかの実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡは、ＣＡＲ－Ｔ細胞に同時に導入される。具体的な実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡとは、ＣＡＲ－Ｔ細胞に同時に導入される場合、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡとの間の量は、近似又は同じであってよい。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡは、任意の適切な順序で１つずつＣＡＲ－Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドは、同時にＣＡＲ－Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドは、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡの前にＣＡＲ－Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド又はＣａｓ９タンパク質を含む。
さらに、本願は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、ここで、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～５から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成し、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：６～１３から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域の編集を達成する。
いくつかの実施形態では、本願は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成し、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域の編集を達成する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成し、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域の編集を達成する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成し、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域の編集を達成する。
いくつかの実施形態では、該ＣＡＲ－Ｔ細胞にＴＲＡＣを標的とする前記ｓｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡとを同時に導入する。いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＢ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを含む）は、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／又はヌクレオチド間３’チオで修飾されているものである。いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ）の５’末端の最初の１つ、２つ、及び／又は３つの塩基及び／又は３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体修飾である。
いくつかの実施形態では、上記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを含む）を、電気穿孔方式（エレクトロポレーション法）により前記ＣＡＲ－Ｔ細胞に導入する。いくつかの実施形態では、上記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）と共に、電気穿孔方式によって該ＣＡＲ－Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記電気穿孔条件は、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；２５０Ｖ、０．５ｍｓから選択されるいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞からＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの発現量が低いＣＡＲ－Ｔ細胞をスクリーニングすることをさらに含む。例えば、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞における前記ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの発現量は、遺伝子編集されていないＣＡＲ－Ｔ細胞の発現量の２／１０である。
いくつかの実施形態では、前記ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍがそれぞれノックアウトされる効率は９０％以上であり、また、ノックアウトされる効率は、７５％以上である。さらに、二重遺伝子の同時ノックアウト効率は、８０％以上である。従来技術に比べ、本発明のＴ細胞遺伝子のノックアウト方法は、効率的な遺伝子ノックアウト効率を取得する。
「ノックアウト効率」は、遺伝子レベルで、遺伝子ノックアウトを生じるＩＮＤＥＬの効率で表され、又は、細胞レベルで、前記遺伝子ノックアウトによる該遺伝子発現タンパク質の消失又は有意に減少する細胞のパーセントとして表すことができる。本発明で、「ノックアウト効率」とは、後者に基づいて算出されるノックアウト効率を意味する。当業者であれば、高いノックアウト効率は、標的細胞の収率を向上させ、製造コスト及び治療コストを低減することができると理解することができる。本願で使用される「Ｉｎｄｅｌ」は、全称が挿入／欠失、即ち、挿入及び欠失変異と呼ばれる。
本願に係る方法では、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞には、ＴＣＲα／β抗体を発現するｍＲＮＡを導入し、２４～４８ｈの発現期間の後に、それは、ＴＣＲα／β陽性のＴ細胞を特異的に認識し除去し、培養の過程で高純度の二重遺伝子（ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ）がノックアウトされたＣＡＲ－Ｔ細胞を達成することができる。前記方法で得られた細胞集団において、ＴＣＲ陰性細胞の比率は、９８％又は９９％以上である。該方法は、製造時間とコストを節約するだけでなく、労力と物力コストも節約する。
本願の別の態様は、さらに、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法に関し、該方法は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はそのコードヌクレオチドを、活性化されたＴ細胞に導入するステップを含む。
いくつかの実施形態で、前記方法は、さらに、Ｃａｓ９又はそのコードヌクレオチドを活性化されたＴ細胞に導入するステップ、
（ｉｉ）１４番染色体の２３０１６４４８位～２３０１６４９０位を標的とするＴＲＡＣゲノムを含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域を破壊するステップ、及び／又は
（ｉｉｉ）１５番染色体の４５００３７４５位～４５００３７８８位を標的とするＢ２Ｍゲノム領域を含むｓｇＲＮＡを該Ｔ細胞に導入し、前記Ｂ２Ｍゲノム領域を破壊するステップ、及び
（ｉｖ）ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡ、即ち、
Figure 2023516538000002
（ただし、下線部は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）配列である）を遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入し、ＴＣＲα／β陽性の細胞を除去することにより、最終産物であるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得るステップを含む。
いくつかの実施形態では、前記ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のコードヌクレオチドをヒトＴ細胞のゲノムに導入してＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するステップを含み、
前記方法は、さらに、ＣＡＳ９又はそのコードヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含むステップ、及び
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～５から選択されるいずれかを含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成するステップ、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：６～１３から選択されるいずれかを含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域の編集を達成するステップ、及び
（ｉｖ）ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入し、ＴＣＲα／β陽性の細胞を除去することにより、最終産物であるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得るステップとを含む。
いくつかの実施形態では、前記ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のコードヌクレオチドをヒトＴ細胞のゲノムに導入するステップを含み、
前記方法は、さらに、ＣＡＳ９又はそのコードヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含むステップ、及び
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成するステップ、及び／又は
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡをＣＡＲ－Ｔ細胞に導入して１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域の編集を達成するステップ、及び
（ｉｖ）ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入し、ＴＣＲα／β陽性の細胞を除去することにより、最終産物であるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得るステップとを含む。
いくつかの実施形態では、前記ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のコードヌクレオチドをヒトＴ細胞のゲノムに導入するステップを含み、
前記方法は、さらに、Ｃａｓ９又はそのコードヌクレオチドをＴ細胞に導入するステップ、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成するステップ、
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域の編集を達成するステップ、及び
（ｉｖ）ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入し、ＴＣＲα／β陽性の細胞を除去することにより、最終産物であるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得るステップとを含む。
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のコードヌクレオチドをＴ細胞のゲノムに導入するステップを含み、
前記方法は、さらに、ＣＡＳ９又はそのコードヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含むステップ、及び
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成するステップ、
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域の編集を達成するステップ、及び
（ｉｖ）ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入し、ＴＣＲα／β陽性の細胞を除去することにより、最終産物であるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得るステップとを含む。
いくつかの実施形態では、活性化されたＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のコードヌクレオチドを導入する。上記ＣＡＲ－ＴにＴＲＡＣを標的とする前記ｓｇＲＮＡとＢ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを同時に導入する。いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＢ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを含む）は、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／又はヌクレオチド間３’チオで修飾されているものである。いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ）の５’末端の最初の１つ、２つ、及び／又は３つの塩基及び／又は３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体修飾である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲのコードヌクレオチドを、Ｔ細胞を活性化するためにＴ細胞ゲノムに導入する。
いくつかの実施形態では、上記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを含む）を、電気穿孔方式により前記ＣＡＲ－Ｔ細胞に導入する。いくつかの実施形態では、上記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）と共に、電気穿孔方式によって該Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記電気穿孔条件は、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１８０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；２５０Ｖ、０．５ｍｓから選択されるいずれかひとつを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入し、ＴＣＲα／β陽性の細胞を除去する。
一態様では、本発明は、上記方法によって調製されたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞に関する。
一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する上記遺伝子操作されたＴ細胞を含むＣＡＲ－Ｔ細胞に関する。
一態様では、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞に関し、そのうち、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞において、
（ｉ）１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのＴＲＡＣゲノム領域が編集され、
（ｉｉ）１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのＢ２Ｍゲノム領域が編集された。
本発明の以上の内容に言及したＴＲＡＣゲノム領域、Ｂ２Ｍゲノム領域の位置情報は、データベースにおけるＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）における前記遺伝子の野生型配列位置情報を参照して決定した。当業者であれば、他のデータベースを参照して上記ゲノム領域の対応する位置情報を得る方法を知っている。
一態様では、本発明は、また、上記遺伝子操作されたＴ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む組成物（例えば、医薬組合せ）、キット、及び医療物品に関する。
一態様では、本発明は、有効量の上記ＣＡＲ－Ｔ細胞を被験者に投与することを含む、被験者の疾患を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、前記疾患は、腫瘍である。いくつかの実施形態では、前記腫瘍は、血液系腫瘍である。いくつかの実施形態では、前記腫瘍は、リンパ腫又は白血病である。
一態様では、本発明は、遺伝子編集されたＴ細胞及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞を精製して９９％のＴＣＲα／β陰性のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得る方法に関する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲα／βを標的とし、ＴＣＲα／β陽性細胞を除去する効果を有する前記ｍＲＮＡが翻訳された後に発現するタンパク質配列は、ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ；ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡであり、
リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
一態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～１３のいずれかを含むｓｇＲＮＡ又はそのベクターに関する。いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、化学修飾されているものであり、前記化学修飾は、例えば、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／又はヌクレオチド間３’チオ修飾である。いくつかの実施形態では、化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／又は３つの塩基及び／又は３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体修飾である。
いくつかの実施形態では、本発明のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞のＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子は、ノックアウトされる。
いくつかの具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（即ち、ＴＲＡＣ）遺伝子はノックアウトされる。Ｂ２Ｍのコード領域は、ノックアウトされる。
いくつかの具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（即ち、ＴＲＡＣ）遺伝子はノックアウトされる。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＴＣＲα鎖定常コード領域の遺伝子は、前記細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ ２、３、４、６分子の１つ（表１）及びＣａｓ９分子によりノックアウトされる。好ましくは、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域の遺伝子は、細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ ２及びＣａｓ９分子又はＴＲＡＣ－ｓｇ ３及びＣａｓ９分子によりノックアウトされる。
Figure 2023516538000003
他の具体的な実施形態では、前記ＨＬＡの定常コード領域のＢ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされている。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＢ２Ｍ定常コード領域の遺伝子は、前記細胞に導入されたＢ２Ｍ－ｓｇ １～８分子の１つ（表１）及びＣａｓ９分子によりノックアウトされ、好ましくは、前記Ｂ２Ｍの定常コード領域の遺伝子は、細胞に導入されたＢ２Ｍ－ｓｇ ２又はＢ２Ｍ－ｓｇ ６分子及びＣａｓ９分子によりノックアウトされる。
他の具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（即ち、ＴＲＡＣ）遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされる。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子は、前記細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ３及びＢ２Ｍ－ｓｇ２分子（表１）及び９分子によりノックアウトされる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を効率的に編集する方法を提供し、前記方法は、
ＣＡＲ－Ｔ細胞にｓｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子を導入するステップを含み、
いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子は、ＴＣＲ由来のα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子の定常コード領域の遺伝子標的領域に相補的な標的ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列を認識してＣａｓ９分子を標的部位を切断するように誘導することができる、ノックアウトされる遺伝子の標的領域に相補的な標的ドメインを含む核酸配列のセグメントを指し、これは、対応する部位の効率的な（ノックアウト効率８５％超）ノックアウトを達成することができる。
いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子が含む標的ドメインの配列は、表１のうちの１つに示すとおりである。
いくつかの好ましい実施形態では、前記標的ドメインの配列は、Ｔ２、Ｂ３に示すとおりである。
いくつかの好ましい実施形態では、電気穿孔技術により前記ｓｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードするｍＲＮＡを前記ＣＡＲ－Ｔ細胞に導入する。
いくつかの具体的な実施形態では、上記方法で使用されるＴ細胞は、健康なヒト、例えば、健康な成人末梢血、又は自然分娩で出産された健康なヒトの臍帯血に由来する。
いくつかの実施形態では、本発明の第３態様は、特異的に修飾された、高い編集効率を有するｓｇＲＮＡ配列（表１）を提供する。
いくつかの具体的な実施形態では、化学的方法でｓｇＲＮＡを合成及び修飾し、ｓｇＲＮＡが一般的なインビトロ転写（ＩＶＴ）によって得られるｓｇＲＮＡよりも安定で、高い編集効率を有するようにする。好ましくは、電気穿孔方法でＣＡＲ－Ｔ細胞を１回電気穿孔し、化学的に合成され修飾されたｓｇＲＮＡ遺伝子による編集効率は、一般的なＩＶＴで取得されたｓｇＲＮＡの１０倍以上である。
いくつかの実施形態では、一般的なインビトロ転写（ＩＶＴ）方法でＴＣＲα／βの標的を発現するｍＲＮＡを得て、電気穿孔送達方法でそれを遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に送達する。時間の経過と共に成長し、収穫した時にＴＣＲα／β陰性のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得る。
いくつかの実施形態では、疾患（例えば、腫瘍）を治療するための医薬の調製のための、本発明に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の使用が提供される。
いくつかの具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子、ＨＬＡの定常コード領域のＢ２Ｍ遺伝子である。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＴＣＲα鎖定常コード領域の遺伝子が前記細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ ２分子、本発明のＢ２Ｍ定常コード領域の遺伝子が前記細胞に導入されたＢ２Ｍ－ｓｇ６分子及びＣａｓ９分子、好ましくは、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域の遺伝子は細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ２、Ｂ２Ｍ定常コード領域の遺伝子は、細胞に導入されたＢ２Ｍ－ｓｇ６及びＣａｓ９分子によりノックアウトされる。
本願の別の態様によれば、ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞）を調製する方法は提供される。いくつかの実施形態では、該方法は、ＣＡＲ又はそのコードヌクレオチド又はベクターを、本発明に記載のいずれかの遺伝子操作されたＴ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）に導入するステップを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法は提供され、該方法は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はそのコード核酸を該Ｔ細胞へ導入するステップ、及び
（ｉｉ）１４番染色体の２３０１６４４８位～２３０１６４９０位を標的とするＴＲＡＣゲノムを含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域を破壊するステップ、
（ｉｉｉ）１５番染色体の４５００３７４５位～４５００３７８８位を標的とするＢ２Ｍゲノム領域を含むｓｇＲＮＡを該Ｔ細胞に導入し、前記Ｂ２Ｍゲノム領域を破壊するステップ、及び
（ｉｖ）２番染色体の２４２８００９３６位から２４２８００９７８位を標的とするＰＤ－１ゲノム領域、又は２番染色体の２４２７９５００９位から２４２７９５０５１位を標的とするＰＤ－１のゲノム領域を含むｓｇＲＮＡを該Ｔ細胞に導入して前記Ｂ２Ｍのゲノム領域を破壊するステップ、
（ｖ）ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入し、ＴＣＲα／β陽性の細胞を除去することにより、最終産物であるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得るステップとを含む。
ＣＡＲ又はそのコード核酸及びＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡとＣＡＲ又はそのコードヌクレオチドは、任意の適切な順序でＴ細胞に導入することができるが、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡは、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入されなければならず、それによって最終産物であるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡとＣＡＲ又はそのコードヌクレオチドは、該Ｔ細胞に同時に導入され、次に、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ又はそれをコードするヌクレオチドは、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡよりも前に該Ｔ細胞に導入され、次に、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ又はそれをコードするヌクレオチドは、既に遺伝子編集されたＴ細胞に導入され、該Ｔ細胞のＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍゲノム領域は、編集によって破壊される。いくつかの実施形態では、該方法は、さらに、Ｃａｓ９又はそれをコードするヌクレオチドを前記ｓｇＲＮＡと共に該Ｔ細胞に導入し、次に、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現されるＣＡＲは、癌化細胞を標的とするＴＣＲα／β以外の任意のＣＡＲであってもよく、さらに殺傷作用を果たす。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞で発現されるＣＡＲは、順序で接続されたシグナルペプチド、細胞外結合領域、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナルドメインを含む。本明細書で使用される用語「シグナルペプチド」は、新たに合成されたタンパク質の分泌経路への移動をガイドする短い（例えば、長さが５～３０アミノ酸の）ペプチド鎖を指す。本発明では、ヒトの体内の様々なタンパク質のシグナルペプチド、例えば、体内で分泌されるサイトカインタンパク質、白血球分化抗原（ＣＤ分子）のシグナルペプチドを使用することができる。
いくつかの実施形態では、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８シグナルペプチドであり、例えば、そのアミノ酸配列は、特許出願ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１に示すとおりである。
いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、様々な異なる抗体又は抗原受容体のヒンジ領域、特にＣＤ分子のヒンジ領域を使用することができる。１つの具体的な実施形態では、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８又はＣＤ２８などのタンパク質のヒンジ領域から選択することができる。前記ＣＤ８又はＣＤ２８は、Ｔ細胞表面の天然マーカーである。
本発明では、様々なヒト体内タンパク質の膜貫通領域、特に様々な異なる抗原受容体の膜貫通領域を使用することができる。好ましく使用される膜貫通領域は、ＣＤ分子の膜貫通領域である。いくつかの実施形態では、前記膜貫通領域は、ＣＤ８タンパク質の膜貫通領域から選択される。
いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８ａヒンジ領域（ＣＤ８－ｈｉｎｇｅ）であり、そのアミノ酸配列は、特許出願ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１に示すとおりである。
前記「細胞外結合領域」は、標的抗原を特異的に認識する領域を含むことを指す。いくつかの実施形態では、該細胞外結合領域は、標的腫瘍細胞表面抗原を特異的に認識する領域を含む。例えば、この領域は、ｓｃＦｖ又は他の抗体の抗原結合断片であってもよい。本明細書で使用される用語「ｓｃＦｖ」は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して接続された重鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＶＬ）の組換えタンパク質を指し、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）は、この２つのドメインを関係付けし、最終的に抗原結合部位を形成する。ｓｃＦｖは、一般的に、ヌクレオチド鎖によってコードされるアミノ酸配列である。上記ｓｃＦｖは、さらに、その誘導体を含んでもよい。
本発明で使用されるＣＡＲ及びその各ドメインは、アミノ酸欠失、挿入、置換、付加、及び／又は組換え、及び／又は他の修飾方法などの当技術分野で公知の従来技術を個々に、又は組み合わせて使用することによって、さらに修飾される。抗体のアミノ酸配列に基づいてそのＤＮＡ配列にこのような修飾を導入する方法は当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ分子クローニング：実験マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．）。前記修飾は、好ましくは、核酸レベルで行われる。
本明細書で使用される用語「特異的に認識」は、本発明の抗原認識領域が、標的抗原以外の任意のポリペプチドと交差反応しない、又は実質的に交差反応しないことを指す。その特異性の程度は、免疫ブロット、免疫アフィニティクロマトグラフィー、フローサイトメトリー解析などを含むが、これらに限定されない免疫学的技法で決定される。
いくつかの実施形態では、前記細胞外結合領域は、ＴＣＲα／β標的以外のものを特異的に認識する抗原結合領域である。
本発明では、前記細胞内シグナルドメインは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）タンパク質の細胞内シグナルドメインである。ＣＤ３分子は、５つのサブユニットからなり、そのうち、ＣＤ３ζサブユニット（ＣＤ３ｚｅｔａとも呼ばれ、ζと略称される）は、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体における重要なシグナル変換領域である３つのＩＴＡＭモチーフを含有する。ＦｃεＲＩ ｙは、主にマスト細胞及び好塩基球の表面に分布し、それは、ＣＤ３ζと構造的、分布的及び機能的に類似した１つのＩＴＡＭモチーフを含有する。また、前述したように、ＣＤ１３７は共刺激シグナル分子であり、それぞれのリガンドと結合した後にその細胞内シグナルセグメントで発生する共刺激作用は、Ｔ細胞の持続的な増殖を引き起こし、且つＴ細胞がＩＬ－２及びＩＦＮ－γなどのサイトカインを分泌するレベルを向上させることができ、同時にＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの生存周期及び抗腫瘍効果を向上させる。
本発明において、インビトロで転写（ＩＶＴ）された、ＴＣＲα／βを標的とし、それを表現するためのｍＲＮＡ配列は、電気穿孔によりそれを遺伝子編集後のＣＡＲ－Ｔ細胞に送達され、インビボ翻訳により、ＴＣＲα／βを標的とするタンパク質を発現し、一過性トランスフェクションであるため、該タンパク質は、４－５日しか存在できず、それがＴＣＲα／βＴ細胞を除去する機能を発揮した後に消失する。最終的に得られた製品が純粋なユニバーサルＣＡＲ－Ｔであることを確保する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ単独で生成されるシグナルは、天然Ｔ細胞を完全に活性化するには不十分であるため、ＴＣＲにより抗原依存性一次活性化を開始する配列（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）、及び抗原非依存的に作用して共刺激シグナルを提供する配列（共刺激ドメイン）を必要とする。一次シグナル伝達ドメインは、刺激性方法又は阻害性方法でＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性方法で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）と呼ばれるシグナル伝達モチーフを含有し得る。本発明におけるＩＴＡＭを含有する一次細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ３ζである。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭドメインを含み、例えば、天然ＩＴＡＭドメインと比較して活性が変化した（例えば、増加又は減少した）変異ＩＴＡＭドメイン、又は切断型（truncated）ＩＴＡＭの一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＴＣＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な反応に必要な、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。本発明の共刺激分子領域は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、前記方法は、以下を含む。
１）前記Ｔ細胞にＣＡＲ分子を導入する。
いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列を認識してＣａｓ９分子を標的部位を切断するように誘導することができる、ノックアウトされる遺伝子の標的領域に相補的な標的化ドメインを含む核酸配列のセグメントを指し、これは、対応する部位の効率的な（ノックアウト効率８５％超）ノックアウトを達成することができる。
２）ＣＡＲ－Ｔ細胞にｓｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子を導入する。
いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子は、ＴＣＲ由来のα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子、ＨＬＡ定常コード領域Ｂ２Ｍ遺伝子、及びＰＤ－１の定常コード領域の遺伝子標的領域に相補的な標的ドメインを含む。
３）ＣＡＲ－Ｔ細胞にＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡ分子を導入する。
いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡ分子は、細胞内でタンパク質に翻訳され、細胞膜で表現され、ＴＣＲα／β陽性Ｔ細胞を除去するように作用することができるインビトロ転写分子である。
いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ９分子は、ｓｇＲＮＡの誘導下で標的部位を切断することができるＣａｓ９ｍＲＮＡを指す。
いくつかの具体的な実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子が含む標的ドメインの配列は、表１のうちの１つに示すとおりである。
いくつかの好ましい実施形態では、前記標的ドメインの配列は、Ｔ２、Ｂ３に示すとおりである（表１）。
いくつかの好ましい実施形態では、電気穿孔技術により前記ｓｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードするｍＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入する。
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲ分子を、例えば、レンチウイルストランスフェクション技術により前記Ｔ細胞に導入する。
いくつかの具体的な実施形態では、健康なヒト末梢血又は臍帯血由来のＴ細胞を単離及び／又は活性化するステップを含む。好ましくは、前記方法は、上記ステップ２）の後にユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を選別するステップをさらに含み、上記ステップ３）を行った後に得られたＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞に対して機能的検証を行う。
いくつかの実施形態では、本発明は、疾患（例えば、腫瘍）を治療するための医薬の調製のための、上記ＣＡＲ－Ｔ細胞の使用を提供する。
本発明は、一態様において、本明細書に記載の有効量のＣＡＲ－Ｔ細胞を被験者に投与することを含む、被験者の疾患を治療する方法を提供する。本発明の前記治療方法は、いくつかの前記方法は、癌及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、該疾患は、リンパ腫又は白血病などの血液系腫瘍を含む腫瘍である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲα／β抗原以外の癌細胞標的を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、被験者から得られたものではない。例えば、前記Ｔ細胞は、健康なドナーに由来し得る。
本発明に関連するＣＡＲ－Ｔ細胞は、それを必要とする被験者に、細胞成分を含む医薬製剤を投与する従来の使用経路、例えば、静脈内注入経路によって投与することができる。投与量は、被験者の病状及び一般的な健康状態に基づいて具体的に決定され得る。
本願では、Ｔ細胞の供給源にも関する。増幅及び遺伝子改変の前に、被験者からＴ細胞の供給源を得る。用語「被験者」は、免疫応答を引き起こすことができる生体生物（例えば、哺乳動物）を含むことを意図する。被験者の例は、ヒトを含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む様々な供給源から得ることができる。本発明のＴ細胞は、また、各分化段階の造血幹細胞に由来し得る。造血幹細胞は、定方向分化培養条件下でＴ細胞に分化される。本発明のある態様では、当技術分野で入手可能な様々なＴ細胞株を使用することができる。
本発明のある態様では、Ｔ細胞は、当業者に公知の様々な技術を使用することができ、例えば、ＦｉｃｏｌｌＴＭは、被験者から収集された血液から単離することができる。アフェレーシス（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）により個体の循環血液から細胞を得ることもできる。アフェレーシス産物は、一般的には、Ｔ細胞、単核細胞、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含むリンパ球を含有する。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿部分を除去し、細胞をその後の処理ステップのために適切な緩衝液又は媒体に入れることができる。
赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配遠心分離又は向流遠心パンニによって単核細胞を枯渇させることにより、末梢血リンパ球からＴ細胞を単離することができる。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの特定のＴ細胞サブセットは、陽性又は陰性選択技術によってさらに単離することができる。例えば、一態様では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）結合ビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ Ｍ－４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔと共に、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間でインキュベートして単離する。腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離することができる。
本願の一態様では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡも提供される。前記ｓｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～２２から選択されるいずれかのヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、化学修飾されている。
本願は、ｓｇＲＮＡ組成物、キット又は製品をさらに含み、それは、本発明が関連するｓｇＲＮＡ又はそのベクターを含む。いくつかの実施形態では、該キットは、ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～５から選択されたいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡ、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：６～１３から選択されたいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡ、及び／又は（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１５～２２から選択されたいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、該キットは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３配列を含むｓｇＲＮＡ、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６配列を含むｓｇＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７配列を含むｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、該キットは、Ｃａｓ６をコードする核酸又はそのベクターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、化学修飾されている。
いくつかの実施形態では、本発明のＴ細胞遺伝子操作方法は、化学修飾されたｓｇＲＮＡを使用する。本発明者らが用いた化学修飾されたｓｇＲＮＡが以下の２つの利点を有すると考えられる。第一は、ｓｇＲＮＡが一本鎖形態のＲＮＡであるため、その半減期が非常に短く、細胞に入った後、迅速に分解される（最も長い場合は、１２時間を超えない）が、Ｃａｓ９タンパク質がｓｇＲＮＡと結合して遺伝子編集作用を発揮するために、少なくとも４８ｈｒｓを必要とする。そのため、化学修飾されたｓｇＲＮＡを用いて、細胞に入った後、安定的に発現し、Ｃａｓ９タンパク質と結合した後、ゲノムを効率的に遺伝子編集してＩｎｄｅｌｓを生成することができる。第二は、未修飾のｓｇＲＮＡが細胞膜に浸透する能力が低く、細胞又は組織に効果的に入って対応する機能を発揮することができない。しかしながら、化学修飾されたｓｇＲＮＡが細胞膜に浸透する能力は、一般に増強される。本発明においては、ｓｇＲＮＡの安定性（半減期の延長）を向上させ、細胞膜に入る能力を向上させることができれば、当技術分野で一般的に使用される化学修飾方法を用いることができる。実施例で使用される具体的な化学修飾に加えて、他の修飾方法、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ＧＦ１、Ｄａｍｈａ ＭＪ．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ａｕｇ ２４、１９（８）：９３７－５４、及びＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｅｎｈａｎｃｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｓｅｐ、３３（９）：９８５－９８９文献に報告された化学修飾方法を含む。
本発明は、化学修飾されたｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードする遺伝子を共に電気穿孔によりＴ細胞に導入し、効率的な遺伝子編集効率（例えば、Ｉｎｄｅｌｓ％で表示する）を達成し、そのうちｓｇＲＮＡの化学修飾は、本発明における重要な要素の１つである。実施例におけるデータは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと共に電気穿孔により導入されたのが化学修飾されていないｓｇＲＮＡであると、そのＩｎｄｅｌｓ効率が化学修飾されるｓｇＲＮＡを電気穿孔する時に達成されるＩｎｄｅｌｓ効率よりも遥かに低いことを示す。
以下、具体的な実施例により本発明の内容を説明する。理解すべきものとして、前記具体的な実施形態は、説明するためのものであり、本発明の内容が具体的な実施例に限定されることを意味しない。
本明細書全体では、数件の文書が引用されている。本明細書の各文書（任意の学術論文又は要約、公開又は非公開の特許出願、登録特許、メーカーのプロトコール、使用説明書などを含む）は、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用される文書が実際に本発明の従来技術であることを認めない。
以下、具体的な実施形態を参照しながら本願の内容を説明するが、本願の範囲は、これに限定されない。
特に説明がない限り、以下の実施形態において使用される試薬及び機器は、当技術分野における一般的な試薬及び機器であり、購入することができる。使用された方法は、いずれも一般的な実験方法であり、当業者は、実施例の内容に基づいて前記形態を疑いなく実施して対応する結果を得ることができる。
実施例１：ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製と増幅
サイトカインを利用して選別されたＴ細胞を活性化した後、Ｔ細胞培地で細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。２４ｈ後にＣＡＲ（細胞外領域ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）、リンク領域（Ｌｉｎｋｅｒ）、ＣＤ８ ａｌｐｈａヒンジ領域（ＣＤ８ ａｌｐｈａ ｈｉｎｇｅ）、ＣＤ８膜貫通領域（ＣＤ８ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｅｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、４－１１ＢＢシグナル領域（４－１１ＢＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及びＣＤ３ ｚｅｔａを含み、具体的な構造は、ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１を参照し、具体的な配列は、表２に示すとおりである）のウイルスをＭＯＩ＝４でＴ細胞に感染させ、７２ｈ後に細胞の状態を観察し、細胞懸濁液を収集し、３００ｇで７ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＤＰＢＳ溶液（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、品番： １９２４２９４）で２回洗浄した後、細胞密度を、電気穿孔試薬培地を用いて、２．５×１０７細胞／ｍＬに調整した。
Figure 2023516538000004
ＨＩＳＣＲＩＢＥ ＴＭ Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（ｗｉｔｈ Ｔａｉｌｉｎｇ）（メーカー：ＮＥＢ、品番：ｃａｔ＃Ｅ２０６０Ｓ）により調製されたＣａｓ９ ｍＲＮＡ及び合成されたｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣ配列を標的とするｓｇＲＮＡ：ＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＵＣＡ、Ｂ２Ｍ配列を標的とするｓｇＲＮＡ：ＧＡＧＵＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＵＡ）を使用し、Ｔ細胞とＲＮＡを混合し、その最終濃度を１００μＬあたり、２．５×１０６個の細胞と８μｇのＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ とｓｇＲＮＡをそれぞれ４μｇ）を含有する最終濃度とした後、電気穿孔装置ＢＴＸ Ａｇｉｌｅ ｐμｌｓｅ ＭＡＸを利用してＲＮＡを細胞に導入した後に培養した。５日目まで培養する時、ＨＩＳＣＲＩＢＥ ＴＭ Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（ｗｉｔｈ Ｔａｉｌｉｎｇ）（メーカー：ＮＥＢ、品番：ｃａｔ＃Ｅ２０６０Ｓ）で調製されたＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡ
Figure 2023516538000005
（ここで、下線部は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）配列である）をＣＡＲ－Ｔ細胞と混合し、その最終濃度を２００μｌあたりに２×１０７個の細胞を含有し、次に電気穿孔装置ＢＴＸ Ａｇｉｌｅ ｐμｌｓｅ ＭＡＸを用いてＲＮＡを細胞に導入した後、該細胞と該ｍＲＮＡが電気穿孔されていない細胞を１：２の細胞数で混合培養した。毎日に細胞の成長状況を観察し、一日おきに細胞をカウントして補液を行った。図１に示すように、細胞が増幅培養過程における生存率を監視し、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを添加した後、後期の細胞生存率が低く、細胞がＴＣＲα／β陽性のＴ細胞を自己殺傷させることができるためであるが、培養時間の増加に伴い、細胞生存率は、他の２群に比べて明らかな差がなかった。図２は、細胞が１４日培養された増幅倍数を示した。ＣＡＲを添加した細胞が自己殺傷するため、増殖倍率は他の対照群よりも低かった。
図３は、ＴＣＲα／β－ＣＡＲを標的とするｍＲＮＡの導入後の、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を培養した表現型分析を示した。この結果から、ＴＣＲα／β－ＣＡＲを添加したＤＫＯ－Ｔ細胞は、培養後に、そのＴＣＲα／β陰性細胞の比率は、９９％以上であった。
図４は、ＭＩＸ（ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ：ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡ １：１）を培養した後に、そのＴＣＲα／β陽性変化状況を示し、２日混合培養し後に、そのＴＣＲα／β陰性細胞の比率は９９％以上であった。
図５は、ＳＴＥＭＣＥＬＬを用いてＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ（ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ）がノックアウトされたＴ細胞をスクリーニングして精製した精製回収率を示し、図から分かるようにその回収率が低く、実質的に２０％～３０％であった。
本実施例では、ＴＣＲ陽性率は１％であり、ＴＣＲ及びＢ２Ｍ ＤＫＯのＴ細胞陽性率は＜１％であった。
実施例２：ユニバーサルＣＡＲ－Ｔの機能検証
実施例１で得られたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞（すなわちエフェクター細胞）のＢ細胞型急性リンパ芽球性白血病細胞に対する殺傷作用を観察した。
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔの特異的腫瘍細胞に対するインビトロ殺傷作用
本発明の実験ステップは、以下のとおりであった。
第１ステップ：標的細胞の標識
ＣＥＬＬ ＴＲＡＣＥＴＭ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、品番：１８８８５６９）を使用して標的細胞を標識した（ヒトバーキットリンパ腫細胞Ｒａｊｉ、Ｋ５６２、全ての細胞がＡＴＣＣに由来する）。
１、Ｃｅｌｌ ＴｒａｃｅＴＭ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎを二重蒸留水で１ｍｍｏｌの溶液に希釈し、
２、１×１０６個の標的細胞４００ｇを５分間遠心分離した後に上清を除去し、
３、Ｃｅｌｌ ＴｒａｃｅＴＭ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ溶液を１μｌ加え、暗所下で３７℃で２０ｍｉｎインキュベートし、
４、細胞をＴ細胞培地に添加し、３７℃で５ｍｉｎインキュベートし、
５、４００ｇを５分間遠心分離した後に上清を除去し、標識を完了した。
第２ステップ：エフェクター細胞による標的細胞の殺傷検出
標識された標的細胞をＲ１６４０＋１０％ＦＢＳ培養液で２×１０５細胞／ｍＬの密度で再懸濁し、５００μＬ取って４８ウェルプレートに加えた。適当なエフェクター対標的比（２．５：１、１．２５：１、０．６：１）で、５００μＬのエフェクター細胞をウェルごとに加え、また、Ｔ細胞と健常ヒト臍帯血ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｔ細胞が２日目まで培養された時に、ＣＡＲをパッケージングしたレンチウイルス（ＣＡＲの構造は、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、リンク領域（Ｌｉｎｋｅｒ）、ＣＤ８ ａｌｐｈａヒンジ領域（ＣＤ８ ａｌｐｈａ ｈｉｎｇｅ）、ＣＤ８膜貫通領域（ＣＤ８ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、４－１１ＢＢシングル領域（４－１１ＢＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及びＣＤ３ ｚｅｔａで構成される）をＭＯＩ＝２－１０の比率で加え、その配列は、前記のとおりであり、調製されたＣＡＲ－Ｔを対照とする）を対照細胞とし、各群に３つの並行があり、単独な標的細胞群を設計し、その死亡率を検出し、３７℃、５％のＣＯ２で１２－１６ｈ培養し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞ペレットを取り、１５０μｌ のＤＰＢＳ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、品番：１９２４２９４）を再懸濁した。ＰＩ（メーカー：Ｓｉｇｍａ、品番：Ｐ４１７０）で染色した後、フローサイトメータを用いて標的細胞の死亡率を検出し、結果は、図６に示すとおりであり、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、他のＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて標的細胞の特異的殺傷作用において基本的に一致し、効果は、いずれもＴ細胞より優れた。また、非特異的な標的細胞に対する殺傷機能は、ほとんどなかった。
第３ステップ：サイトカインの放出に対するＥＬＩＳＡの検出
標識された標的細胞を、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳで２×１０５個／ｍＬの密度で再懸濁し、５００μＬを４８ウェルプレートに加えた。適切なエフェクター対標的比（１０：１）に応じて各ウェルに、５００μＬのエフェクター細胞を加え、また、Ｔ細胞及び健康なヒト臍帯血のＣＡＲ－Ｔを対照細胞とし、各群は３つの並行があり、単独な標的細胞群を設計し、３７℃、５％のＣＯ２で１２～１６ｈ培養し、各ウェルに培養上清を１００μｌを取り、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して沈殿を除去し、上清を取った後にＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸＴＭ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２／ＩＦＮ－ｇａｍａ（メーカー：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番がそれぞれ、４３１８０７、４３０１０８）キットを利用してサイトカインの放出を検出した。
具体的な実験ステップは、以下のとおりである。
１、標準品を希釈した。
２、ウェルあたりに３００μｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（（１×）でプレートを４回洗浄し、ウェルあたりに５０μｌのＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを加えた。
３、サンプルをウェル当たりに５０μｌ加えた。
４、２００ｒｐｍで２ｈ振盪しインキュベートした。
５、３００μｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１×）でプレートを４回洗浄し、ウェルあたりにＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌ加え、２００ｒｐｍで１ｈ振盪しインキュベートした。
６、３００μｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１×）でプレートを４回洗浄し、ウェルあたりにＳｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ Ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌ添加し、２００ｒｐｍで３０ｍｉｎ振盪しインキュベートした。
７、３００μｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１×）でプレートを５回洗浄し、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆを加え、暗所下で２０ｍｉｎインキュベートした。
８、ウェルあたりにＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌ加えた。
９、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍと５７０ｎｍでの吸光度値を読み取った。
得られた結果は図７に示すとおりであり、該実験で、Ｒａｊｉを標的細胞とし、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ及びＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ＋ｍＲＮＡ細胞をエフェクター細胞とし、エフェクター対標的比が１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２５：１でインビトロで共培養した後、１．２５：１で上清を取ってそのＩＦＮ－γを検出した。それから分かるように、ユニバーサルＣＡＲ－ＴのＲａｊｉ細胞に対する殺傷能力は、一般的なＣＡＲ－Ｔ殺傷能力とほぼ一致するか、又は一般的なＣＡＲ－Ｔの殺傷能力よりも僅かに良く、特に、ＴＣＲｎｅｇ ＣＡＲ－Ｔ ＩＦＮ－ｒの放出量は、一般的なＣＡＲ－Ｔよりも遥かに高く、いずれもＫ ５６２に対する殺傷能力が低く、したがって、サイトカインの放出量が比較的少なかった。これは、ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒの現象を示さないＣＡＲの標的化の特異性を示した。
以上は、本願の好適な実施例に過ぎず、本願をいかなる形で限定するものではない。当業者は、いずれも、上記に開示された技術内容を利用して同等に変化した等価実施例に変更又は修正することができる。しかしながら、本願の技術的解決手段の内容から逸脱しない限り、本願の技術的実質に基づいて以上の実施例に対して行われたいかなる簡単な修正、同等変化及び変形は、依然として本願の技術的解決手段の保護範囲に属する。
配列表
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ配列
ｇａｃａａｇａａｇｕａｃａｇｃａｕｃｇｇｃｃｕｇｇａｃａｕｃｇｇｃａｃｃａａｃｕｃｕｇｕｇｇｇｃｕｇｇｇｃｃｇｕｇａｕｃａｃｃｇａｃｇａｇｕａｃａａｇｇｕｇｃｃｃａｇｃａａｇａａａｕｕｃａａｇｇｕｇｃｕｇｇｇｃａａｃａｃｃｇａｃｃｇｇｃａｃａｇｃａｕｃａａｇａａｇａａｃｃｕｇａｕｃｇｇａｇｃｃｃｕｇｃｕｇｕｕｃｇａｃａｇｃｇｇｃｇａａａｃａｇｃｃｇａｇｇｃｃａｃｃｃｇｇｃｕｇａａｇａｇａａｃｃｇｃｃａｇａａｇａａｇａｕａｃａｃｃａｇａｃｇｇａａｇａａｃｃｇｇａｕｃｕｇｃｕａｕｃｕｇｃａａｇａｇａｕｃｕｕｃａｇｃａａｃｇａｇａｕｇｇｃｃａａｇｇｕｇｇａｃｇａｃａｇｃｕｕｃｕｕｃｃａｃａｇａｃｕｇｇａａｇａｇｕｃｃｕｕｃｃｕｇｇｕｇｇａａｇａｇｇａｕａａｇａａｇｃａｃｇａｇｃｇｇｃａｃｃｃｃａｕｃｕｕｃｇｇｃａａｃａｕｃｇｕｇｇａｃｇａｇｇｕｇｇｃｃｕａｃｃａｃｇａｇａａｇｕａｃｃｃｃａｃｃａｕｃｕａｃｃａｃｃｕｇａｇａａａｇａａａｃｕｇｇｕｇｇａｃａｇｃａｃｃｇａｃａａｇｇｃｃｇａｃｃｕｇｃｇｇｃｕｇａｕｃｕａｕｃｕｇｇｃｃｃｕｇｇｃｃｃａｃａｕｇａｕｃａａｇｕｕｃｃｇｇｇｇｃｃａｃｕｕｃｃｕｇａｕｃｇａｇｇｇｃｇａｃｃｕｇａａｃｃｃｃｇａｃａａｃａｇｃｇａｃｇｕｇｇａｃａａｇｃｕｇｕｕｃａｕｃｃａｇｃｕｇｇｕｇｃａｇａｃｃｕａｃａａｃｃａｇｃｕｇｕｕｃｇａｇｇａａａａｃｃｃｃａｕｃａａｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｕｇｇａｃｇｃｃａａｇｇｃｃａｕｃｃｕｇｕｃｕｇｃｃａｇａｃｕｇａｇｃａａｇａｇｃａｇａｃｇｇｃｕｇｇａａａａｕｃｕｇａｕｃｇｃｃｃａｇｃｕｇｃｃｃｇｇｃｇａｇａａｇａａｇａａｕｇｇｃｃｕｇｕｕｃｇｇｃａａｃｃｕｇａｕｕｇｃｃｃｕｇａｇｃｃｕｇｇｇｃｃｕｇａｃｃｃｃｃａａｃｕｕｃａａｇａｇｃａａｃｕｕｃｇａｃｃｕｇｇｃｃｇａｇｇａｕｇｃｃａａａｃｕｇｃａｇｃｕｇａｇｃａａｇｇａｃａｃｃｕａｃｇａｃｇａｃｇａｃｃｕｇｇａｃａａｃｃｕｇｃｕｇｇｃｃｃａｇａｕｃｇｇｃｇａｃｃａｇｕａｃｇｃｃｇａｃｃｕｇｕｕｕｃｕｇｇｃｃｇｃｃａａｇａａｃｃｕｇｕｃｃｇａｃｇｃｃａｕｃｃｕｇｃｕｇａｇｃｇａｃａｕｃｃｕｇａｇａｇｕｇａａｃａｃｃｇａｇａｕｃａｃｃａａｇｇｃｃｃｃｃｃｕｇａｇｃｇｃｃｕｃｕａｕｇａｕｃａａｇａｇａｕａｃｇａｃｇａｇｃａｃｃａｃｃａｇｇａｃｃｕｇａｃｃｃｕｇｃｕｇａａａｇｃｕｃｕｃｇｕｇｃｇｇｃａｇｃａｇｃｕｇｃｃｕｇａｇａａｇｕａｃａａａｇａｇａｕｕｕｕｃｕｕｃｇａｃｃａｇａｇｃａａｇａａｃｇｇｃｕａｃｇｃｃｇｇｃｕａｃａｕｕｇａｃｇｇｃｇｇａｇｃｃａｇｃｃａｇｇａａｇａｇｕｕｃｕａｃａａｇｕｕｃａｕｃａａｇｃｃｃａｕｃｃｕｇｇａａａａｇａｕｇｇａｃｇｇｃａｃｃｇａｇｇａａｃｕｇｃｕｃｇｕｇａａｇｃｕｇａａｃａｇａｇａｇｇａｃｃｕｇｃｕｇｃｇｇａａｇｃａｇｃｇｇａｃｃｕｕｃｇａｃａａｃｇｇｃａｇｃａｕｃｃｃｃｃａｃｃａｇａｕｃｃａｃｃｕｇｇｇａｇａｇｃｕｇｃａｃｇｃｃａｕｕｃｕｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｇａａｇａｕｕｕｕｕａｃｃｃａｕｕｃｃｕｇａａｇｇａｃａａｃｃｇｇｇａａａａｇａｕｃｇａｇａａｇａｕｃｃｕｇａｃｃｕｕｃｃｇｃａｕｃｃｃｃｕａｃｕａｃｇｕｇｇｇｃｃｃｕｃｕｇｇｃｃａｇｇｇｇａａａｃａｇｃａｇａｕｕｃｇｃｃｕｇｇａｕｇａｃｃａｇａａａｇａｇｃｇａｇｇａａａｃｃａｕｃａｃｃｃｃｃｕｇｇａａｃｕｕｃｇａｇｇａａｇｕｇｇｕｇｇａｃａａｇｇｇｃｇｃｕｕｃｃｇｃｃｃａｇａｇｃｕｕｃａｕｃｇａｇｃｇｇａｕｇａｃｃａａｃｕｕｃｇａｕａａｇａａｃｃｕｇｃｃｃａａｃｇａｇａａｇｇｕｇｃｕｇｃｃｃａａｇｃａｃａｇｃｃｕｇｃｕｇｕａｃｇａｇｕａｃｕｕｃａｃｃｇｕｇｕａｕａａｃｇａｇｃｕｇａｃｃａａａｇｕｇａａａｕａｃｇｕｇａｃｃｇａｇｇｇａａｕｇａｇａａａｇｃｃｃｇｃｃｕｕｃｃｕｇａｇｃｇｇｃｇａｇｃａｇａａａａａｇｇｃｃａｕｃｇｕｇｇａｃｃｕｇｃｕｇｕｕｃａａｇａｃｃａａｃｃｇｇａａａｇｕｇａｃｃｇｕｇａａｇｃａｇｃｕｇａａａｇａｇｇａｃｕａｃｕｕｃａａｇａａａａｕｃｇａｇｕｇｃｕｕｃｇａｃｕｃｃｇｕｇｇａａａｕｃｕｃｃｇｇｃｇｕｇｇａａｇａｕｃｇｇｕｕｃａａｃｇｃｃｕｃｃｃｕｇｇｇｃａｃａｕａｃｃａｃｇａｕｃｕｇｃｕｇａａａａｕｕａｕｃａａｇｇａｃａａｇｇａｃｕｕｃｃｕｇｇａｃａａｕｇａｇｇａａａａｃｇａｇｇａｃａｕｕｃｕｇｇａａｇａｕａｕｃｇｕｇｃｕｇａｃｃｃｕｇａｃａｃｕｇｕｕｕｇａｇｇａｃａｇａｇａｇａｕｇａｕｃｇａｇｇａａｃｇｇｃｕｇａａａａｃｃｕａｕｇｃｃｃａｃｃｕｇｕｕｃｇａｃｇａｃａａａｇｕｇａｕｇａａｇｃａｇｃｕｇａａｇｃｇｇｃｇｇａｇａｕａｃａｃｃｇｇｃｕｇｇｇｇｃａｇｇｃｕｇａｇｃｃｇｇａａｇｃｕｇａｕｃａａｃｇｇｃａｕｃｃｇｇｇａｃａａｇｃａｇｕｃｃｇｇｃａａｇａｃａａｕｃｃｕｇｇａｕｕｕｃｃｕｇａａｇｕｃｃｇａｃｇｇｃｕｕｃｇｃｃａａｃａｇａａａｃｕｕｃａｕｇｃａｇｃｕｇａｕｃｃａｃｇａｃｇａｃａｇｃｃｕｇａｃｃｕｕｕａａａｇａｇｇａｃａｕｃｃａｇａａａｇｃｃｃａｇｇｕｇｕｃｃｇｇｃｃａｇｇｇｃｇａｕａｇｃｃｕｇｃａｃｇａｇｃａｃａｕｕｇｃｃａａｕｃｕｇｇｃｃｇｇｃａｇｃｃｃｃｇｃｃａｕｕａａｇａａｇｇｇｃａｕｃｃｕｇｃａｇａｃａｇｕｇａａｇｇｕｇｇｕｇｇａｃｇａｇｃｕｃｇｕｇａａａｇｕｇａｕｇｇｇｃｃｇｇｃａｃａａｇｃｃｃｇａｇａａｃａｕｃｇｕｇａｕｃｇａａａｕｇｇｃｃａｇａｇａｇａａｃｃａｇａｃｃａｃｃｃａｇａａｇｇｇａｃａｇａａｇａａｃａｇｃｃｇｃｇａｇａｇａａｕｇａａｇｃｇｇａｕｃｇａａｇａｇｇｇｃａｕｃａａａｇａｇｃｕｇｇｇｃａｇｃｃａｇａｕｃｃｕｇａａａｇａａｃａｃｃｃｃｇｕｇｇａａａａｃａｃｃｃａｇｃｕｇｃａｇａａｃｇａｇａａｇｃｕｇｕａｃｃｕｇｕａｃｕａｃｃｕｇｃａｇａａｕｇｇｇｃｇｇｇａｕａｕｇｕａｃｇｕｇｇａｃｃａｇｇａａｃｕｇｇａｃａｕｃａａｃｃｇｇｃｕｇｕｃｃｇａｃｕａｃｇａｕｇｕｇｇａｃｃａｕａｕｃｇｕｇｃｃｕｃａｇａｇｃｕｕｕｃｕｇａａｇｇａｃｇａｃｕｃｃａｕｃｇａｃａａｃａａｇｇｕｇｃｕｇａｃｃａｇａａｇｃｇａｃａａｇａａｃｃｇｇｇｇｃａａｇａｇｃｇａｃａａｃｇｕｇｃｃｃｕｃｃｇａａｇａｇｇｕｃｇｕｇａａｇａａｇａｕｇａａｇａａｃｕａｃｕｇｇｃｇｇｃａｇｃｕｇｃｕｇａａｃｇｃｃａａｇｃｕｇａｕｕａｃｃｃａｇａｇａａａｇｕｕｃｇａｃａａｕｃｕｇａｃｃａａｇｇｃｃｇａｇａｇａｇｇｃｇｇｃｃｕｇａｇｃｇａａｃｕｇｇａｕａａｇｇｃｃｇｇｃｕｕｃａｕｃａａｇａｇａｃａｇｃｕｇｇｕｇｇａａａｃｃｃｇｇｃａｇａｕｃａｃａａａｇｃａｃｇｕｇｇｃａｃａｇａｕｃｃｕｇｇａｃｕｃｃｃｇｇａｕｇａａｃａｃｕａａｇｕａｃｇａｃｇａｇａａｕｇａｃａａｇｃｕｇａｕｃｃｇｇｇａａｇｕｇａａａｇｕｇａｕｃａｃｃｃｕｇａａｇｕｃｃａａｇｃｕｇｇｕｇｕｃｃｇａｕｕｕｃｃｇｇａａｇｇａｕｕｕｃｃａｇｕｕｕｕａｃａａａｇｕｇｃｇｃｇａｇａｕｃａａｃａａｃｕａｃｃａｃｃａｃｇｃｃｃａｃｇａｃｇｃｃｕａｃｃｕｇａａｃｇｃｃｇｕｃｇｕｇｇｇａａｃｃｇｃｃｃｕｇａｕｃａａａａａｇｕａｃｃｃｕａａｇｃｕｇｇａａａｇｃｇａｇｕｕｃｇｕｇｕａｃｇｇｃｇａｃｕａｃａａｇｇｕｇｕａｃｇａｃｇｕｇｃｇｇａａｇａｕｇａｕｃｇｃｃａａｇａｇｃｇａｇｃａｇｇａａａｕｃｇｇｃａａｇｇｃｕａｃｃｇｃｃａａｇｕａｃｕｕｃｕｕｃｕａｃａｇｃａａｃａｕｃａｕｇａａｃｕｕｕｕｕｃａａｇａｃｃｇａｇａｕｕａｃｃｃｕｇｇｃｃａａｃｇｇｃｇａｇａｕｃｃｇｇａａｇｃｇｇｃｃｕｃｕｇａｕｃｇａｇａｃａａａｃｇｇｃｇａａａｃｃｇｇｇｇａｇａｕｃｇｕｇｕｇｇｇａｕａａｇｇｇｃｃｇｇｇａｕｕｕｕｇｃｃａｃｃｇｕｇｃｇｇａａａｇｕｇｃｕｇａｇｃａｕｇｃｃｃｃａａｇｕｇａａｕａｕｃｇｕｇａａａａａｇａｃｃｇａｇｇｕｇｃａｇａｃａｇｇｃｇｇｃｕｕｃａｇｃａａａｇａｇｕｃｕａｕｃｃｕｇｃｃｃａａｇａｇｇａａｃａｇｃｇａｕａａｇｃｕｇａｕｃｇｃｃａｇａａａｇａａｇｇａｃｕｇｇｇａｃｃｃｕａａｇａａｇｕａｃｇｇｃｇｇｃｕｕｃｇａｃａｇｃｃｃｃａｃｃｇｕｇｇｃｃｕａｕｕｃｕｇｕｇｃｕｇｇｕｇｇｕｇｇｃｃａａａｇｕｇｇａａａａｇｇｇｃａａｇｕｃｃａａｇａａａｃｕｇａａｇａｇｕｇｕｇａａａｇａｇｃｕｇｃｕｇｇｇｇａｕｃａｃｃａｕｃａｕｇｇａａａｇａａｇｃａｇｃｕｕｃｇａｇａａｇａａｕｃｃｃａｕｃｇａｃｕｕｕｃｕｇｇａａｇｃｃａａｇｇｇｃｕａｃａａａｇａａｇｕｇａａａａａｇｇａｃｃｕｇａｕｃａｕｃａａｇｃｕｇｃｃｕａａｇｕａｃｕｃｃｃｕｇｕｕｃｇａｇｃｕｇｇａａａａｃｇｇｃｃｇｇａａｇａｇａａｕｇｃｕｇｇｃｃｕｃｕｇｃｃｇｇｃｇａａｃｕｇｃａｇａａｇｇｇａａａｃｇａａｃｕｇｇｃｃｃｕｇｃｃｃｕｃｃａａａｕａｕｇｕｇａａｃｕｕｃｃｕｇｕａｃｃｕｇｇｃｃａｇｃｃａｃｕａｕｇａｇａａｇｃｕｇａａｇｇｇｃｕｃｃｃｃｃｇａｇｇａｕａａｕｇａｇｃａｇａａａｃａｇｃｕｇｕｕｕｇｕｇｇａａｃａｇｃａｃａａｇｃａｃｕａｃｃｕｇｇａｃｇａｇａｕｃａｕｃｇａｇｃａｇａｕｃａｇｃｇａｇｕｕｃｕｃｃａａｇａｇａｇｕｇａｕｃｃｕｇｇｃｃｇａｃｇｃｕａａｕｃｕｇｇａｃａａａｇｕｇｃｕｇｕｃｃｇｃｃｕａｃａａｃａａｇｃａｃｃｇｇｇａｕａａｇｃｃｃａｕｃａｇａｇａｇｃａｇｇｃｃｇａｇａａｕａｕｃａｕｃｃａｃｃｕｇｕｕｕａｃｃｃｕｇａｃｃａａｕｃｕｇｇｇａｇｃｃｃｃｕｇｃｃｇｃｃｕｕｃａａｇｕａｃｕｕｕｇａｃａｃｃａｃｃａｕｃｇａｃｃｇｇａａｇａｇｇｕａｃａｃｃａｇｃａｃｃａａａｇａｇｇｕｇｃｕｇｇａｃｇｃｃａｃｃｃｕｇａｕｃｃａｃｃａｇａｇｃａｕｃａｃｃｇｇｃｃｕｇｕａｃｇａｇａｃａｃｇｇａｕｃｇａｃｃｕｇｕｃｕｃａｇｃｕｇｇｇａｇｇｃｇａｃ
ＴＲＡＣ－ｓｇ ２（Ｔ２）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
ｇｃｕｇｇｕａｃａｃｇｇｃａｇｇｇｕｃａ
ＴＲＡＣ－ｓｇ ３（Ｔ３）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
ｃｕｃｕｃａｇｃｕｇｇｕａｃａｃｇｇｃａ
ＴＲＡＣ－ｓｇ ４（Ｔ４）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
ａｕｕｕｇｕｕｕｇａｇａａｕｃａａａａｕ
ＴＲＡＣ－ｓｇ ６（Ｔ６）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
ｕｃｕｃｕｃａｇｃｕｇｇｕａｃａｃｇｇｃ
Ｂ２Ｍ－ｓｇ １（Ｂ１）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
ａｃｕｃｕｃｕｃｕｕｕｃｕｇｇｃｃｕｇｇ
Ｂ２Ｍ－ｓｇ ２（Ｂ２）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
ｇａｇｕａｇｃｇｃｇａｇｃａｃａｇｃｕａ
Ｂ２Ｍ－ｓｇ ３（Ｂ３）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
ｃｇｃｇａｇｃａｃａｇｃｕａａｇｇｃｃａ
Ｂ２Ｍ－ｓｇ ４（Ｂ４）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
ｕｃａｃｇｕｃａｕｃｃａｇｃａｇａｇａａ
Ｂ２Ｍ－ｓｇ ５（Ｂ５）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
ｇｃｕａｃｕｃｕｃｕｃｕｕｕｃｕｇｇｃｃ
Ｂ２Ｍ－ｓｇ ６（Ｂ６）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
ｕｕｕｇａｃｕｕｕｃｃａｕｕｃｕｃｕｇｃ
Ｂ２Ｍ－ｓｇ ７（Ｂ７）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
ｃｇｕｇａｇｕａａａｃｃｕｇａａｕｃｕｕ
Ｂ２Ｍ－ｓｇ８（Ｂ８）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
ｃｕｃｇｃｇｃｕａｃｕｃｕｃｕｃｕｕｕｃ
抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖのアミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
Figure 2023516538000006
ここで、下線部は、リンカー（すなわち、リンカー）配列である。
ＣＤ８ ａｌｐｈａヒンジ領域のヌクレオチド配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
ａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｇｃｇａｃｃａｃｃａａｃａｃｃｇｇｃｇｃｃｃａｃｃａｔｃｇｃｇｔｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃｃａｇａｇｇｃｇｔｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｇｇｇｇｇｃｇｃａｇｔｇｃａｃａｃｇａｇｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｔｇａｔ
ＣＤ８膜貫通領域のヌクレオチド配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
ａｔｃｔａｃａｔｃｔｇｇｇｃｇｃｃｃｔｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｃｔｇｇｔｔａｔｃａｃｃｃｔｔｔａｃｔｇｃ
４－１１ＢＢシグナル領域のヌクレオチド配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７
ａａａｃｇｇｇｇｃａｇａａａｇａａａｃｔｃｃｔｇｔａｔａｔａｔｔｃａａａｃａａｃｃａｔｔｔａｔｇａｇａｃｃａｇｔａｃａａａｃｔａｃｔｃａａｇａｇｇａａｇａｔｇｇｃｔｇｔａｇｃｔｇｃｃｇａｔｔｔｃｃａｇａａｇａａｇａａｇａａｇｇａｇｇａｔｇｔｇａａｃｔｇ
ＣＤ３ ｚｅｔａのヌクレオチド配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８
ａｇａｇｔｇａａｇｔｔｃａｇｃａｇｇａｇｃｇｃａｇａｃｇｃｃｃｃｃｇｃｇｔａｃａａｇｃａｇｇｇｃｃａｇａａｃｃａｇｃｔｃｔａｔａａｃｇａｇｃｔｃａａｔｃｔａｇｇａｃｇａａｇａｇａｇｇａｇｔａｃｇａｔｇｔｔｔｔｇｇａｃａａｇａｇａｃｇｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａｔｇｇｇｇｇｇａａａｇｃｃｇａｇａａｇｇａａｇａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｃａａｔｇａａｃｔｇｃａｇａａａｇａｔａａｇａｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔａｃａｇｔｇａｇａｔｔｇｇｇａｔｇａａａｇｇｃｇａｇｃｇｃｃｇｇａｇｇｇｇｃａａｇｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｃｃｔｔｔａｃｃａｇｇｇｔｃｔｃａｇｔａｃａｇｃｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃｇａｃｇｃｃｃｔｔｃａｃａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔｃｇｃ
抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖの軽鎖可変領域のアミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを連結するリンカーのアミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
ＣＤ１９軽鎖コードＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２
Ｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃａｃａｇａｃｔａｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔｃｔｃｔｇｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｃｃａｔｃａｇｔｔｇｃａｇｇｇｃａａｇｔｃａｇｇａｃａｔｔａｇｔａａａｔａｔｔｔａａａｔｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇａｔｇｇａａｃｔｇｔｔａａａｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｃｃａｔａｃａｔｃａａｇａｔｔａｃａｃｔｃａｇｇａｇｔｃｃｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇａａｃａｇａｔｔａｔｔｃｔｃｔｃａｃｃａｔｔａｇｃａａｃｃｔｇｇａｇｃａａｇａａｇａｔａｔｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔｔｔｔｇｃｃａａｃａｇｇｇｔａａｔａｃｇｃｔｔｃｃｇｔａｃａｃｇｔｔｃｇｇａｇｇｇｇｇｇａｃｃａａｇｃｔｇｇａｇａｔｃａｃａ
リンク領域コードＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３
ｇｇｔｇｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃｇｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇｇｔｃｇｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｔｃｔ
ＣＤ１９重鎖コードＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４
Ｇａｇｇｔｇａａａｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃａｇｇａｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃｃｃｔｃａｃａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｇｔｃａｃａｔｇｃａｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｇｇｔｃｔｃａｔｔａｃｃｃｇａｃｔａｔｇｇｔｇｔａａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｃｃｔｃｃａｃｇａａａｇｇｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｔａａｔａｔｇｇｇｇｔａｇｔｇａａａｃｃａｃａｔａｃｔａｔａａｔｔｃａｇｃｔｃｔｃａａａｔｃｃａｇａｃｔｇａｃｃａｔｃａｔｃａａｇｇａｃａａｃｔｃｃａａｇａｇｃｃａａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａａａｔｇａａｃａｇｔｃｔｇｃａａａｃｔｇａｔｇａｃａｃａｇｃｃａｔｔｔａｃｔａｃｔｇｔｇｃｃａａａｃａｔｔａｔｔａｃｔａｃｇｇｔｇｇｔａｇｃｔａｔｇｃｔａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇａａｃｃｔｃａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａ
一態様では、本発明は、遺伝子編集されたＴ細胞及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞を精製して９９％のＴＣＲα／β陰性のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得る方法に関する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲα／βを標的とし、ＴＣＲα／β陽性細胞を除去する効果を有する前記ｍＲＮＡが翻訳された後に発現するタンパク質配列は、ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）；ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０）であり、
リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）である。
ＨＩＳＣＲＩＢＥ ＴＭ Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（ｗｉｔｈ Ｔａｉｌｉｎｇ）（メーカー：ＮＥＢ、品番：ｃａｔ＃Ｅ２０６０Ｓ）により調製されたＣａｓ９ ｍＲＮＡ及び合成されたｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣ配列を標的とするｓｇＲＮＡ：ＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＵＣＡ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、Ｂ２Ｍ配列を標的とするｓｇＲＮＡ：ＧＡＧＵＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＵＡ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）を使用し、Ｔ細胞とＲＮＡを混合し、その最終濃度を１００μＬあたり、２．５×１０６個の細胞と８μｇのＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ とｓｇＲＮＡをそれぞれ４μｇ）を含有する最終濃度とした後、電気穿孔装置ＢＴＸ Ａｇｉｌｅ ｐμｌｓｅ ＭＡＸを利用してＲＮＡを細胞に導入した後に培養した。５日目まで培養する時、ＨＩＳＣＲＩＢＥ ＴＭ Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（ｗｉｔｈ Ｔａｉｌｉｎｇ）（メーカー：ＮＥＢ、品番：ｃａｔ＃Ｅ２０６０Ｓ）で調製されたＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ここで、下線部は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）配列である）をＣＡＲ－Ｔ細胞と混合し、その最終濃度を２００μｌあたりに２×１０７個の細胞を含有し、次に電気穿孔装置ＢＴＸ Ａｇｉｌｅ ｐμｌｓｅ ＭＡＸを用いてＲＮＡを細胞に導入した後、該細胞と該ｍＲＮＡが電気穿孔されていない細胞を１：２の細胞数で混合培養した。毎日に細胞の成長状況を観察し、一日おきに細胞をカウントして補液を行った。図１に示すように、細胞が増幅培養過程における生存率を監視し、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを添加した後、後期の細胞生存率が低く、細胞がＴＣＲα／β陽性のＴ細胞を自己殺傷させることができるためであるが、培養時間の増加に伴い、細胞生存率は、他の２群に比べて明らかな差がなかった。図２は、細胞が１４日培養された増幅倍数を示した。ＣＡＲを添加した細胞が自己殺傷するため、増殖倍率は他の対照群よりも低かった。

Claims (30)

  1. ユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を精製する方法であって、
    （ｉ）遺伝子編集技術によって前記ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＲＡＣゲノム領域及びＢ２Ｍゲノム領域を破壊するステップと、
    （ｉｉ）次に、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを、ステップ（ｉ）の遺伝子編集後のＣＡＲ－Ｔ細胞に導入するステップとを含む、ことを特徴とする方法。
  2. 前記ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡを一過性トランスフェクションによりＣＡＲ－Ｔ細胞に導入する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法で得られた細胞集団を、適切な時間、インビトロで培養して、ＴＣＲα／β陽性細胞を除去するステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記適切な時間は、４～８日間、好ましくは、５～７日間、最も好ましくは６日間である、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＴＲＡＣゲノム領域は、ヒト１４番染色体の２３０１６４４８位から２３０１６４９０位までのゲノム領域を含み、且つ前記Ｂ２Ｍゲノム領域は、ヒト１５番染色体の４５００３７４５位から４５００３７８８位までのゲノム領域を含む、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡにコードされるのは、抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖ分子であり、
    抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖ分子の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ）に示すとおりであり、
    抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖ分子の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）に示すとおりである、ことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. ｓｃＦｖ分子の軽鎖可変領域とｓｃＦｖ分子の重鎖可変領域とは、（Ｇ）ｎ（Ｓ）ｍを含むアミノ酸配列であるリンカーを介して連結され、ここで、ｎは１～２０の正の整数であり、ｍは１～１０の正の整数である、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 前記リンカー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡにコードされるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡである、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ＴＲＡＣゲノム領域及びＢ２Ｍゲノム領域は、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼの遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術により破壊される、ことを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  12. （ｉ）前記ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を該Ｔ細胞に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成し、及び／又は、
    （ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を該Ｔ細胞に導入して、前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を達成する、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  13. （ｉ）前記ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～５から選択されるいずれか１つの配列を有し、
    （ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～１３から選択されるいずれか１つの配列を有する、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. （ｉ）前記ＴＲＡＣゲノムをコードするｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするヌクレオチドをＴ細胞に共同又は別々に導入して前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を達成し、及び／又は、
    （ｉｉ）前記Ｂ２ＭゲノムをコードするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドを該Ｔ細胞に共同又は別々に導入して、前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を達成する、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ｓｇＲＮＡは、化学修飾されている、ことを特徴とする請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル類縁体修飾又はヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. 前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／又は３つの塩基及び／又は３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体修飾である、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ｓｇＲＮＡを、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列とともに電気穿孔方式により該Ｔ細胞に導入する、ことを特徴とする請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記電気穿孔条件は、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓのいずれかから選択される、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍがそれぞれノックアウトされる効率は、９０％以上であり、同時にノックアウトされる効率は、７５％以上である、ことを特徴とする請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記方法で得られた細胞集団において、ＴＣＲ陰性細胞の比率が全ＣＡＲ－Ｔ細胞の９８％又は９９％以上を占める、ことを特徴とする請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 精製されたユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞であって、
    （ｉ）前記ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＲＡＣゲノム領域とＢ２Ｍゲノム領域は、遺伝子編集により破壊されており、
    （ｉｉ）該ＣＡＲ－Ｔ細胞には、ＴＣＲα／βを標的とするｍＲＮＡが導入されている、ことを特徴とするユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞。
  23. ＴＣＲα／β、クラスＩＨＬＡタンパク質、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３から選択される１つ又は複数のタンパク質が、低レベルで発現され、又は発現されていない、ことを特徴とする請求項２２に記載のユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞。
  24. 請求項２２又は２３のいずれか１項に記載のユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を含む生物製品。
  25. ９８％又は９９％以上の前記ユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞がＴＣＲ陰性である、ことを特徴とする請求項２３に記載の生物製品。
  26. 被験者の疾患を治療するための医薬の製造における請求項２２又は２３のいずれか１項に記載のユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞又は請求項２４又は２５のいずれか１項に記載の生物製品の使用。
  27. 被験者の疾患を治療する方法であって、被験者に有効量の請求項２２又は２３に記載のユニバーサルヒトＣＡＲ－Ｔ細胞又は請求項２４又は２５に記載の生物製品を投与することを含む方法。
  28. 前記疾患は、腫瘍である、ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  29. 前記腫瘍は、血液系腫瘍である、ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
  30. 前記腫瘍は、リンパ腫又は白血病である、ことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
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