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JP2023513502A - コロナウイルスワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、コロナウイルス（好ましくは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）への感染または当該感染に関連する障害（好ましくは、ＣＯＶＩＤ－１９）の、治療または予防における使用に好適な核酸に向けられている。また、本発明は、組成物、ポリペプチドおよびワクチンに向けられている。好ましくは、組成物およびワクチンは、１つ以上の上述の核酸配列を含んでいる。好ましくは、核酸配列は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と関連付けられている。また、本発明は、上述の核酸、組成物、ポリペプチド、組合せ、ワクチンおよびキットの第一医薬用途および第二医薬用途、ならびにコロナウイルス感染症（好ましくは、コロナウイルス感染症）の治療方法もしくは予防方法に向けられている。

Description

発明の詳細な説明
〔諸言〕
本発明は、とりわけ、コロナウイルス（好ましくは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）への感染または当該感染に関連する障害（好ましくは、ＣＯＶＩＤ－１９）の、治療または予防における使用に好適な核酸に向けられている。また、本発明は、組成物、ポリペプチドおよびワクチンにも向けられている。好ましくは、組成物およびワクチンは、１つ以上の上述の核酸配列を含んでいる。好ましくは、核酸配列は、ポリマー性キャリア、ポリカチオン性のタンパク質もしくはペプチド、または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と関連付けられている。また、本発明は、上述の核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチンおよびキットの第一医薬用途および第二医薬用途、ならびにコロナウイルス感染症（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染）の治療方法または予防方法にも向けられている。
コロナウイルスは、エンベロープを有しているプラス鎖１本鎖のＲＮＡウイルスで、コロナウイルス科に属している。
代表的なコロナウイルスは、哺乳類、鳥類、魚類などの種々の脊椎動物において、様々な疾患の原因となる。
コロナウイルスは、遺伝的に非常に変化しやすい。また、個々のウイルス種は、種の障壁を超えて、複数の種の宿主に感染できる。このような宿主の乗換えの結果、ヒトに対して感染性のあらうＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）および中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）が生まれた。２０１９年末から２０２０年始にかけて中華人民共和国の都市・武漢で始まったコロナウイルスの流行は、当時は未知のコロナウイルスが原因とされた。このウイルスは、当初はｎＣｏＶ－２０１９または武漢ヒトコロナウイルス（ＷＨＣＶ）と呼ばれ、後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２という正式名が与えられた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス感染による典型的な症状（ＣＯＶＩＤ－１９疾患（Coronavirus disease 2019）とも称される）の例には、発熱、咳嗽、呼吸困難、肺炎、胃腸の症状（下痢など）がある。重症疾患では呼吸不全に至り、人工換気および集中治療室での治療が必要になる。２０２０年１月３０日、世界保健機関（ＷＨＯ）は、この新規なコロナウイルスのアウトブレイクに対して、世界的な保健に対する緊急事態を宣言した。３月１１日には、ＷＨＯはＣＯＶＩＤ－１９がパンデミックであることを宣言した。そして、このコロナウイルス疾患には、世界中の１１０を超える国および地域で１１．８万を例超える症例があり、さらに世界中へと拡大する持続的なリスクがあると指摘した。２０２０年３月末までに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染は８０．０万例超の確定症例を数え、世界中のほぼ全ての国に拡大し、４０万人を超えるＣＯＶＩＤ－１９関連死を引き起こした。
現在のところ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染および／またはＣＯＶＩＤ－１９疾患に対するワクチンまたは特定の治療は、存在しない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が診断された患者は、個々人の症状および臨床状態に基づいた補助的な治療が受けられるに過ぎない。重大な世界的パンデミックのリスクが大きいため、安全かつ効果的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を治療または予防することに対する喫緊の需要がある。特に、死亡率が高いことが判明している高齢者を守るためには、ワクチンが必要である。
核酸系（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）ワクチンの接種は、新興ウイルスに対する新規なワクチンにとって有望な技術である。遺伝的に改変した核酸をヒト被験体に投与できる。トランスフェクトされた細胞は、コードされている抗原（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡによって与えられる抗原、とりわけｍＲＮＡによって与えられる抗原）を、直接に産生するようになる。その結果、防御性の免疫反応が生じる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染症に対する広汎かつ長期的な防御におけるウイルス特異的なメモリーＴ細胞の中心的な役割が、これまでに解明されている（例えば、Channappanavar, Rudragouda, et al. "Virus-specific memory CD8 T cells provide substantial protection from lethal severe acute respiratory syndrome coronavirus infection." Journal of virology 88.19 (2014): 11034-11044を参照）。例えば、ウイルス特異的なＣＤ８Ｔ細胞は、病原体クリアランスおよびウイルスの攻撃後における防御の媒介に必要である。したがって、効果的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、強力な機能性の液性免疫応答を誘導するのみならず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を誘導せねばならない。
したがって、本発明に内在する課題は、コロナウイルス感染症（とりわけＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染）に対する核酸系ワクチンを提供することである。本発明のさらなる課題は、冷凍状態以外での保存および輸送ができ、迅速かつ大規模なコロナウイルスワクチン生産ができる、効果的なコロナウイルスワクチンを提供することである。
特許請求の範囲においてさらに定義され、また本明細書に内在するように、上述の課題は、とりわけ、本発明が提供する核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）によって解決される。この核酸は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている、１つ以上のコーディング配列を有している。
さらに、望ましくは、上述の核酸または当該核酸を含んでいる組成物／ワクチンなどは、下記の有利な特徴のうち、少なくともいくつかを満たしている。
・注射／ワクチン接種した箇所（筋肉など）において核酸が翻訳される。
・少ない用量およびレジメンにて、コードされているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質に対する抗原特異的な免疫応答を非常に効果的に誘導する。
・乳児および／または新生児や高齢者（とりわけ高齢者）に対するワクチン接種に好適である。
・組成物／ワクチンを筋肉内投与することに好適である。
・コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）に特異的かつ機能性の液性免疫応答を誘導する。
・コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）に対する広汎かつ機能性のＴ細胞応答を誘導する。
・コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）に特異的なＢ細胞記憶を誘導する。
・ウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）を効果的に中和できる機能性の抗体を誘導する。
・新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を効果的に中和できる機能性の抗体を誘導する。
・粘膜のＩｇＡ抗体を誘導して、ＩｇＡによる粘膜免疫を誘導する。
・バランスのとれたＢ細胞応答およびＴ細胞応答を誘導する。
・コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその新興変異株など）の感染に対する防御性免疫を誘導する。
・コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）に対する免疫防御を急速に発足させる。
・コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）に対して誘導される免疫応答が長命である。
・ワクチン接種または免疫病理学的効果に起因して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を促進しない。
・核酸系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンによって抗体依存性増強（ＡＤＥ）が引き起こされない。
・ワクチンの適用後に、ワクチン接種における望ましくない高反応原性を引き起こすような、過剰な全身性のサイトカイン反応またはケモカイン反応を引き起こさない。
・ワクチンの忍容性が高く、副作用がなく、無毒である。
・核酸系ワクチンに特徴的な安定性の利点がある。
・コロナウイルスワクチン生産が迅速であり、応用でき、簡潔であり、大規模化できる。
・１回または２回のワクチン接種で充分な防御が得られるような、ワクチン接種レジメンの利点がある。
・組成物／ワクチンを少量投与するだけで充分な防御が得られるような、ワクチン接種レジメンの利点がある。
〔定義〕
明確性および可読性を高めるために、下記の定義を与える。これらの定義において言及されている任意の技術的特徴は、本発明の実施形態のそれぞれおよび全てに適用して読み込める。これらの実施形態に関連して、さらなる定義および説明が具体的に提供されることがある。
数に関連する百分率は、個々の物事の総数に対する相対値として理解すべきである。他の例においては、文脈上明らかに異なる場合を除いて、百分率を重量の百分率（重量％）と理解すべきである。
約：用語「約」は、決定因子または値が同一（１００％同じ）である必要がないときに用いる。したがって、「約」が意味しているのは、決定因子または値に０．１％～２０％の変位があることである。この変位は、好ましくは０．１％～１０％であり、特に０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％である。当業者が理解するであろうところによると、例えばパラメータまたは決定因子は、当該パラメータを決定する方法によって僅かに異なりうる。例えば、本明細書において、「約１０００ヌクレオチド」という長さなどの決定因子または値が定義されているとき、その長さには、０．１％～２０％の変位があってもよい。この変位は、好ましくは０．１％～１０％であり、特に０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％である。したがって、この具体例から当業者が理解するであろうところによると、長さの変位は、１～２００ヌクレオチドである。この変位は、好ましくは１～２００ヌクレオチドであり、特に５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチド、２００ヌクレオチドである。
適応免疫応答：本明細書において、用語「適応免疫応答」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、免疫系（適応免疫系）の抗原特異的反応である。抗原特異性によって、病原体または病原体に感染している細胞に特異的な、調整された反応が可能になる。通常、このような調整された反応を体内において実現できるようにしているのは、メモリー細胞（Ｂ細胞）である。本発明に関連して、抗原は、コロナウイルスに由来する１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質コードしている核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）により与えられる。好ましくは、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）である。
抗原：本明細書において、用語「抗原」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、免疫系（好ましくは適応免疫系）によって認識される物質である。また、この物質は、抗原特異的な免疫応答を誘導できる。抗原特異的な免疫応答の例としては、適応免疫応答の一部としての抗体および／または抗原特異的Ｔ細胞の形成が挙げられる。通常、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示されるペプチドまたはタンパク質でありうるか、またはその一部でありうる。また、１つ以上のエピトープを有しているペプチドまたはタンパク質の断片、バリアントおよび誘導体も、本発明に関連しては、抗原であると理解される。ペプチドまたはタンパク質の例としては、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９））のスパイクタンパク質（Ｓ）に由来するものが挙げられる。本発明に関連して、抗原は、本明細書において特定されている所与の核酸の翻訳産物であってもよい。
抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質：用語「抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質」または「免疫原性ペプチドまたは免疫原性タンパク質」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、（抗原性または免疫原性の）タンパク質に由来するペプチド、タンパク質である。このペプチド、タンパク質は、体内の適応免疫系を刺激して、適応免疫応答をもたらす。したがって、抗原性／免疫原性のペプチドまたはタンパク質は、１つ以上のエピトープ（本節で定義の通り）を有しているか、またはそれが由来するタンパク質（本節で定義の通り）の抗原（本節で定義の通り）を有している。このタンパク質の例としては、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９））のスパイクタンパク質（Ｓ）が挙げられる。
カチオン性：特定の文脈から異なる意味であることが明らかであるときを除いて、用語「カチオン性」とは、それぞれの構造が正に帯電していることを意味する。正に帯電しているのは、永続的であってもよいし、一時的であってもよい。一時的である場合は、ｐＨなどの特定の条件に反応して正に帯電する。したがって、用語「カチオン性」には、「永続的にカチオン性」および「カチオン化可能」の双方が含まれる。
カチオン化可能：本明細書において、用語「カチオン化可能」とは、化合物、基または原子が、低ｐＨ環境においては正に帯電し、高ｐＨ環境においては正に帯電しないことを意味する。また、ｐＨを決定できない非水性環境においては、カチオン化可能な化合物、基または原子は、水素イオン濃度が高いときには正に帯電し、水素イオン濃度または活性が低いときには正に帯電しない。帯電の有無が変化するｐＨまたは水素イオン濃度は、カチオン化可能またはポリカチオン化可能な化合物の個々の特性に応じて（とりわけ、カチオン化可能な基または原子のｐＫａに応じて）変化する。稀釈された水性環境において、正に帯電しているカチオン化可能な化合物、基または原子の割合は、いわゆるHenderson-Hasselbalchの式によって推定できる。この式は、当業者にとって周知である。例えば、いくつかの実施形態において、化合物または部分がカチオン化可能であるならば、ｐＨが約１～９のときに正に帯電する。正に帯電するｐＨは、好ましくは４～９、５～８または６～８であり、より好ましくは９未満、８未満または７未満であり、最も好ましくは生理学的なｐＨである。生理学的なｐＨとは、例えば約７．３～７．４であり、生理的条件下のことであり、特にin vivoにおける細胞の生理的塩条件下のことである。他の実施形態において、好ましくは、カチオン化可能な化合物または部分は、生理的なｐＨ（約７．０～７．４など）においては主として中性であるが、低ｐＨにおいては正に帯電する。いくつかの実施形態において、カチオン化可能な化合物または部分のｐＫａは、好ましくは約５～約７である。
コーディング配列／コーディング領域：本明細書において、用語「コーディング配列」または「コーディング領域」およびその略称である「ｃｄｓ」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、ペプチドまたはタンパク質に翻訳されうる複数個のヌクレオチドのトリプレットの配列である。本発明に関連して、コーディング配列は、３で割り切れる数のヌクレオチドからなるＤＮＡ配列であってもよく、好ましくはＲＮＡ配列である。コーディング配列は、開始コドンから始まり、好ましくは停止コドンで終わる。
～に由来する：本明細書において、用語「～に由来する」を核酸に関連して使用するとき（すなわち、（他の）核酸に由来する核酸と称するとき）、この用語が意味しているのは、（他の）核酸に由来する核酸である。この核酸と当該核酸が由来する核酸との配列同一性は、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。当業者であれば理解するように、通常、配列同一性は、同じ種類の核酸（ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）との間で計算する。したがって、理解されるであろうところによると、「ＤＮＡがＲＮＡに由来する」または「ＲＮＡがＤＮＡに由来する」ならば、最初の工程として、ＲＮＡ配列を対応するＤＮＡ配列に変換する（特に、配列中のウラシル（Ｕ）をチミジン（Ｔ）に置換する）。あるいは、その逆に、ＤＮＡ配列を対応するＲＮＡ配列に変換する（特に、配列中のＴをＵに置換する）。次に、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の配列同一性を決定する。好ましくは、「核酸に由来する核酸」とは、当該核酸が由来する核酸と比べて改変された核酸のことも表す。この例としては、ＲＮＡ安定性を増加させる改変や、タンパク質産生を長期化および／または増加させる改変が挙げられる。アミノ酸配列（抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質など）に関連して、用語「～に由来する」とは、（他の）アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を意味する。このアミノ酸配列と当該アミノ酸配列が由来するアミノ酸配列との配列同一性は、例えば、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
エピトープ：本明細書において、用語「エピトープ（本技術分野では「抗原決定因子」とも称される）」とは、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープである。Ｔ細胞エピトープ（または、抗原性ペプチドもしくは抗原性タンパク質の部分）は、好ましくは約６～約２０アミノ酸またはそれ以上の長さの断片を有している。例えば、ＭＨＣクラスＩ分子が修飾し提示する断片の長さは、好ましくは、約８～約１０アミノ酸である（例えば、８アミノ酸、９アミノ酸または１０アミノ酸。あるいはさらに、１１アミノ酸または１２アミノ酸）。また、ＭＨＣクラスＩＩ分子が修飾して維持する断片の長さは、好ましくは、約１３～約２０アミノ酸またはそれ以上である。通常、これらの断片は、ペプチド断片およびＭＨＣ分子からなる複合体の状態で、Ｔ細胞に認識される。つまり、通常、断片は、その本来の形態で認識されるわけではない。Ｂ細胞エピトープとは、通常、（本来の形態の）タンパク質またはペプチド抗原の外面に位置している断片である。この断片の長さは、好ましくは５～１５アミノ酸であり、より好ましくは５～１２アミノ酸であり、より一層好ましくは６～９アミノ酸である。この断片は、その本来の形態において、抗体により認識されることができる。さらに、このようなタンパク質またはペプチドのエピトープは、本明細書に記載されている当該タンパク質またはペプチドのバリアントのいずれかから選択されれもよい。これに関連して、エピトープは、構造的または不連続なエピトープであってもよい。このようなエピトープは、本明細書に記載のタンパク質またはペプチドの複数のセグメントから構成されている。これらのセグメントは、本明細書に記載のタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列において不連続であるが、共に三次元構造を形成している。あるいは、エピトープは、１本のポリペプチド鎖から構成される、連続または線形のエピトープであってもよい。
断片：本明細書において、核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）またはアミノ酸配列との関連で用いるとき、用語「断片」とは、通常、核酸配列またはアミノ酸配列などの完全長配列の短縮された部分でありうる。したがって、通常、断片は、対応する完全長配列と同種の配列からなる。好ましくは、本発明に関連して、配列の断片は、対象（ヌクレオチドまたはアミノ酸など）の連続した部分から構成されている。配列の断片は、当該断片が由来する分子における対象の、連続した部分と対応している。連続した部分は、当該断片が由来する分子全体（完全長分子）の４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上に当たる。断片が由来する分子の例としては、コロナウイルススパイクタンパク質（Ｓ）が挙げられ、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）由来のものが挙げられる。本明細書において、タンパク質またはペプチドとの関連で用いるとき、用語「断片」とは、通常、本明細書に記載のタンパク質またはペプチドの配列を含みうる。つまり、アミノ酸配列について、元のタンパク質のアミノ酸配列と比較すると、Ｎ末端および／またはＣ末端が短縮されている。したがって、このような短縮は、アミノ酸レベルで生じることもあるし、対応する核酸レベルで生じることもある。このような本明細書に記載の断片に対する配列同一性は、好ましくは、本明細書に記載のタンパク質またはペプチドの全体を参照したものでありうる（あるいは、当該タンパク質またはペプチドをコードしている核酸分子の全体を参照したものでありうる）。タンパク質またはペプチドの断片は、当該タンパク質またはペプチドのエピトープの１つ以上を有していてもよい。
異種：本明細書において、核酸配列またはアミノ酸配列に関連して用いるとき、用語「異種」または「異種配列」とは、他の遺伝子、他のアレルまたは他の種もしくはウイルスなどに由来する配列であると理解すべき配列（ＲＮＡ、ＤＮＡ、アミノ酸など）を表す。２つの配列が同じ遺伝子またはアレルに由来しないならば、通常、当該２つの配列は異種であると理解される。すなわち、異種配列が同じ生物またはウイルスに由来していたとしても、これらは、自然界では、同じ核酸またはタンパク質に存在していない。
液性免疫応答：用語「液性免疫」または「液性免疫応答」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が表そうと意図しているのは、例えば、Ｂ細胞によって媒介される抗体産生であって、任意構成で、抗体産生に伴う附随的なプロセスも表される。通常、液性免疫応答は、Ｔｈ２の活性化およびサイトカイン産生、胚中心の形成およびアイソタイプスイッチ、親和性成熟およびメモリー細胞の生成などによって特徴づけられうる。液性免疫とは、抗体のエフェクター機能のことも表す。エフェクター昨日の例としては、病原体および毒素の中和、古典的補体活性化、オプソニンによるファゴサイトーシスおよび病原体駆除の促進が挙げられる。
（配列の）同一性：本明細書において、核酸配列またはアミノ酸配列との関連で用いられるとき、用語「同一性」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、２つの配列が同一である割合である。２つの配列（例えば本明細書に記載の核酸配列またはアミノ酸配列（ａａ配列）であり、好ましくは本明細書に記載の核酸配列によってコードされているａａ配列または当該ａａ配列自体）が同一である割合を決定するためには、配列をアラインメントしてから相互に比較する。それゆえ、例えば、第１配列におけるある位置と、第２配列における対応する位置とを比較してもよい。第１配列におけるある位置と第２配列における対応する位置とが同じ残基であるときは、当該位置において２つの配列は同一である。残基が異なるときは、当該位置において２つの配列は異なっている。第２配列が第１配列に対して挿入を生じているときは、第１配列にギャップを挿入してからさらにアラインメントしてもよい。第２配列が第１配列に対して欠失を生じているときは、第２配列にギャップを挿入してからさらにアラインメントしてもよい。２つの配列が同一である割合とは、同一であった位置の数を位置の総数で除した関数である。位置の総数には、一方の配列にのみ存在する位置の数も含める。２つの配列が同一である割合は、アルゴリズムにより決定してもよい。このようなアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴプログラムに組込まれているアルゴリズムが挙げられる。
免疫原、免疫原性：用語「免疫原」または「免疫原性」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が表そうと意図しているのは、例えば、免疫応答を刺激／誘導する化合物である。好ましくは、免疫原は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。本発明の意味における免疫原とは、所与の核酸の翻訳産物である。この核酸は、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）のスパイクタンパク質（Ｓ）に由来する１つ以上の抗原性ペプチド・タンパク質をコードしている、１つ以上のコーディング配列を有している。通常、免疫原は、適応免疫応答を誘導する。
免疫応答：用語「免疫応答」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的な反応（いわゆる特異的応答または適応免疫応答）、先天免疫系の非特異的な反応（いわゆる非特異的応答または先天免疫応答）、またはこれらの組合せである。
免疫系：用語「免疫系」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、生物を感染から防護できる生物のシステムである。病原体が生物の物理的障壁を突破して当該生物に侵入すると、先天免疫系により、迅速かつ非特異的な応答が生じる。この先天性の応答を病原体が回避したとき、脊椎動物には第二層の防御である適応免疫系が存在する。免疫系は、感染の際に応答を適応させて、病原体の認識を向上させる。この向上した応答は、免疫記憶として、病原体が駆除された後にも維持される。免疫記憶があるために、適応免疫系は、同じ病原体と出会うたびに迅速かつ強力な攻撃ができるようになる。したがって、免疫系には、先天免疫系および適応免疫系が含まれる。これらの免疫系はいずれも、通常は、いわゆる液性成分および細胞成分を有している。
先天免疫系：用語「先天免疫系（非特異的免疫系とも）」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、他の生物への感染から非特異的な様式で宿主を防護する細胞および機構が典型的に含まれているシステムである。つまり、この先天性システムにおける細胞は、一般的方法で病原体を認識して応答するのであって、適応免疫系のように長期的または防御性の免疫を宿主に与えることはしない。先天免疫系は、パターン認識受容体のリガンドによって活性化されることがある。パターン認識受容体の例としては、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＯＤ様受容体またはＲＩＧ－Ｉ様受容体が挙げられる。
リピドイド化合物：リピドイド化合物（単にリピドイドとも称する）は、脂質様の化合物である。すなわち、脂質に類似した物理的性質を有している両親媒性化合物である。本発明に関連して、用語「脂質」には、リピドイド化合物も含まれると見做す。
永続的にカチオン性：本明細書において、用語「永続的にカチオン性」は、当業者によって認識・理解される。この用語が意味するのは、例えば、任意のｐＨまたは水素イオン活性の環境において、化合物、基または原子が正に帯電していることである。通常、正電荷は、第四級窒素原子が存在する結果として生じる。化合物が、このような正電荷を複数個有している場合には、「永続的にポリカチオン性」と称してもよい。
安定化させたＲＮＡ：用語「安定化させたＲＮＡ」とは、修飾されていないＲＮＡと比較して、より分解されにくいように修飾されているＲＮＡを表す。分解の例としては、環境要因または酵素による消化（エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる分解など）が挙げられる。好ましくは、本発明に関連して、安定化させたＲＮＡは、細胞において安定化している。細胞の例としては原核細胞または真核細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞（ヒト細胞など）である。例えば、安定化させたＲＮＡを含んでいる組成物を保存するために、細胞外（緩衝液中など）において安定化効果を発揮させてもよい。
Ｔ細胞応答：本明細書において、用語「細胞性免疫」「細胞性免疫応答」または「細胞性Ｔ細胞応答」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が表そうと意図しているのは、例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化であり、また、抗原に反応した種々のサイトカインの放出である。より一般的な用語において、細胞性免疫は、抗体には基づかず、免疫系の細胞の活性化に基づいている。典型的には、細胞性免疫応答は、例えば、細胞におけるアポトーシスを誘導できる抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球や、表面に外来抗原のエピトープを提示している樹状細胞などの特定の免疫細胞または他の細胞の活性化によって特徴づけられることがある。
（配列の）バリアント：本明細書において、核酸配列との関連で用いられるとき、用語「バリアント」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、他の核酸配列に由来する核酸配列のバリアントである。例えば、核酸配列のバリアントは、当該バリアントが由来する核酸配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加および／または置換を有していてもよい。核酸配列のバリアントは、当該バリアントが由来する核酸配列に対して、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上同一であってもよい。由来する配列の機能のうち、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上をバリアントが有しているならば、当該バリアントは機能性バリアントである。核酸配列のバリアントのヌクレオチド同一性は、当該核酸配列のうち１０ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、３０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、７５ヌクレオチド以上または１００ヌクレオチド以上にわたって、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
本明細書において、タンパク質またはペプチドとの関連で用いられるとき、用語「バリアント」が表そうと意図しているのは、例えば、１つ以上の変異／置換（１つ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失）においてオリジナル配列と異なっているアミノ酸配列を有している、タンパク質またはペプチドのバリアントである。好ましくは、断片および／またはバリアントは、同じまたは同等の特異的な抗原特性を有している（免疫原性バリアント、抗原性バリアント）。挿入および置換が生じうるのは、とりわけ、三次元構造を変化させたり結合領域に影響を及ぼしたりしない配列中の位置である。挿入または欠失による三次元構造の変化は、例えば、ＣＤスペクトル（円偏光二色性スペクトル）を利用して容易に決定できる。タンパク質またはペプチドのバリアントのアミノ酸同一性は、当該タンパク質またはペプチドの１０アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、３０アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、７５アミノ酸以上または１００アミノ酸以上にわたって、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。好ましくは、タンパク質のバリアントには、当該タンパク質の機能性バリアントが含まれている。本発明に関連して、タンパク質の機能性バリアントとは、に由来するタンパク質と実質的に同じ免疫原性を発揮するか、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の免疫原性を発揮するバリアントである。
〔発明の概要〕
本発明は、本発明者らの次のような驚くべき知見に基づいている。すなわち、核酸（ＲＮＡなど）のコーディング配列から得られる、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（旧称：ｎＣｏＶ－２０１９）に由来する１つ以上のペプチドまたはタンパク質は、ヒト細胞中で効果的に発現できるという知見である（実施例２ａ、２ｂおよび２ｃ）。さらに驚くべきことには、このような核酸（ＲＮＡなど）を含んでいる組成物を投与すると、コロナウイルス（特に、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する抗原特異的な免疫応答が誘導される（実施例を参照）。
さらに予期せぬことには、本発明者らが示すところによると、本発明のコーディングＲＮＡによれば、高レベルの機能性抗体が誘導される。この抗体は、高いウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）およびＴ細胞応答を示す。ワクチンにより、二重陽性であるＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導される（例えば、実施例７、１０を参照）。また、ワクチンにより、ハムスターおよび非ヒト霊長類は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の攻撃感染から防御された（実施例９、１５を参照）。したがって、これらの知見が示すところによると、本発明のコーディングＲＮＡまたは組成物／ワクチンは、ワクチン（ヒト被験体におけるワクチンなど）としての使用に好適である。
これらの知見は、核酸系コロナウイルスワクチンの供給における基礎である。
第１の態様において、本発明は、コロナウイルスワクチン（好ましくは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン）用の核酸を提供する。核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。コーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。あるいは、コーディング配列は、その免疫原性断片または免疫原性バリアントをコードしている。
第２の態様において、本発明は、組成物（好ましくは、免疫原性組成物）を提供する。組成物は、第１の態様の１つ以上の核酸を含んでいる。好適には、組成物は、１つ以上の脂質と複合化、カプセル化または関連している１つ以上の核酸（例えば、１つ以上のコーディングＲＮＡ）を含んでおり、これにより、脂質ナノ粒子を形成していてもよい。
第３の態様において、本発明は、コロナウイルスワクチン用の抗原性ポリペプチドを提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組成物またはワクチン用である。
第４の態様において、本発明は、コロナウイルスワクチン（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン）を提供する。ワクチンは、第１の態様の１つ以上の核酸、第２の態様の組成物、または第３の態様の１つ以上のポリペプチドを含んでいる。
第５の態様において、本発明は、キットまたはパーツのキットを提供する。キットまたはパーツのキットは、第１の態様の１つ以上の核酸、第２の態様の１つ以上の組成物、第３の態様の１つ以上のポリペプチド、および第４の態様の１つ以上のワクチンのうち、１つ以上を備えている。
第６の態様において、本発明は、２つ以上の分離した要素を含んでいる組合せを提供する。２つ以上の分離した要素は、第１の態様の２つの核酸、第２の態様の２つ以上の組成物、第３の態様の２つ以上のポリペプチド、および第４の態様の２つ以上のワクチンのうち、１つ以上から選択される。
本発明のさらなる態様は、被験体におけるコロナウイルス感染症（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染）の治療方法または予防方法に関する。また、核酸、組成物、ワクチンの第一医薬用途および第二医薬用途にも関する。さらに、上述の核酸、組成物またはワクチンの製造方法にも関する。
〔発明の詳細な説明〕
本出願においては、電子様式の配列表（ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５）を共に提出している。この配列表は、本明細書の一部を構成する。配列表に含まれている情報は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。本明細書において、配列番号に言及している箇所では、配列表において同じ識別子を有している、対応する核酸配列またはアミノ酸配列（ａａ配列）について言及している。多くの配列に関して、配列表には、追加の詳細情報を記載している。例えば、特定の構造上の特徴、配列最適化、GenBank（NCBI）またはGISAID（epi）の識別子、コード能力に関する追加情報を記載している。特に、このような情報は、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５配列表においては、＜２２３＞の欄に記載する。したがって、＜２２３＞の欄に記載の情報は、その全体が明示的に、本明細書に含まれる。また、これらの情報は、発明の基礎を成す本明細書の不可欠な部分として理解せねばならない。
［コロナウイルスワクチン用の核酸］
第１の態様において、本発明は、コロナウイルスワクチンに好適な核酸に関する。
留意すべきことには、本発明の第１の態様（本発明の核酸）に関連して記載されている特定の特徴および実施形態は、第２の態様（本発明の組成物）、第３の態様（本発明のポリペプチド）、第４の態様（本発明のワクチン）、第５の態様（本発明のキットまたはパーツのキット）またはさらなる態様（医療用途および治療方法など）に対しても、同様に適用できる。
コロナウイルスは、アルファコロナウイルス属、ベータコロナウイルス属、デルタコロナウイルス属、ガンマコロナウイルス属および未分類のコロナウイルスに分類される。コロナウイルスは、遺伝的に非常に変化しやすい。また、個々のウイルス種は、種の障壁を超えて、複数の種の宿主に感染できる。ヒトコロナウイルスの例としては、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（以前の名称は「武漢ヒトコロナウイルス」または「ｎＣｏＶ－２０１９」）が挙げられる。したがって、核酸は、コロナウイルスに対するワクチンにとって好適である。好ましくは、ヒトに対する病原体であるコロナウイルスに対するワクチンにとって好適である。最も好ましくは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）に対するワクチンにとって好適である。
用語「核酸」または「核酸分子」は、当業者によって認識・理解される。好ましくは、本明細書において、用語「核酸」または「核酸分子」は、ＤＮＡ（分子）またはＲＮＡ（分子）を表す。好ましくは、この用語は、用語「ポリヌクレオチド」と同義語として用いられる。好ましくは、核酸または核酸分子は、ヌクレオチドモノマーを含んでいるか、またはそれからなるポリマーである。このポリマーでは、ヌクレオチドモノマーが、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合している。用語「核酸分子」には、修飾された核酸分子も含まれる。修飾された核酸分子の例としては、塩基を修飾されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、糖を修飾されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、骨格を修飾されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が挙げられる（本明細書において定義する通り）。
第１の態様の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）は、核酸系組成物またはワクチンの基礎となりうる。一般的に、タンパク質系ワクチンまたは弱毒化生ワクチンは、製造コストが高く、発展途上国における使用では最善策ではない。また、タンパク質系ワクチンまたは弱毒化生ワクチンは、長期間の開発期間が必要であり、パンデミックウイルスのアウトブレイク（２０１９／２０２０年のコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアウトブレイクなど）に対する迅速な反応には適していない。これとは対照的に、本発明に係る核酸系ワクチンは、迅速かつ低コストな製造が可能である。したがって、従来のワクチンと比較すると、本発明の核酸系ワクチンは、顕著に廉価かつ迅速に製造できる。この点は、とりわけ発展途上国における使用において、非常に有利である。本発明の核酸系ワクチンのさらなる利点は、タンパク質系ワクチンまたはペプチド系ワクチンよりも温度安定性が高い点にある。ただし、ポリペプチド系ワクチンもまた、本発明の範囲に内在している（例えば、第３の態様を参照）。
用語「核酸配列」「ＤＮＡ配列」「ＲＮＡ配列」は、当業者によって認識され理解される。これらの用語は、例えば、特定かつ固有な一連のヌクレオチドの順番を表す。
第１の態様の好適な実施形態において、核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。コーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスに由来する、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。あるいは、コーディング配列は、その免疫原性断片または免疫原性バリアントをコードしている。
用語「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質」とは、次の(i)または(ii)のように理解すべきである。(i)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスからの抗原であって、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（またはその断片）のアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのタンパク質（またはその断片）と同一である。(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する抗原であって、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（またはその断片）のアミノ酸配列は、対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのタンパク質（またはその断片）と同一ではない。
したがって、第１の態様の好適な実施形態において、核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。コーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスのものであるか、またはそれに由来する、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。あるいは、コーディング配列は、その免疫原性断片または免疫原性バリアントをコードしている。
用語「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスのものであるか、またはそれに由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質」とは、次の(i)または(ii)のように理解すべきである。(i)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスからの抗原であって、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（またはその断片）のアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのタンパク質（またはその断片）の配列と同一である。(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する抗原であって、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（またはその断片）のアミノ酸配列は、対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのタンパク質（またはその断片）の配列と同一ではない。
好適な実施形態において、核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。コーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスのものであるか、またはそれに由来する、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。あるいは、コーディング配列は、その免疫原性断片または免疫原性バリアントをコードしている。ここで、核酸は、１つ以上の異種の非翻訳領域（ＵＴＲ）を有している。
用語「非翻訳領域」「ＵＴＲ」または「ＵＴＲ要素」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語は、例えば、通常はコーディング配列の５’または３’に位置している核酸分子の部分を表すことを意図している。ＵＴＲは、タンパク質へと翻訳されない。ＵＴＲは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）の部分であってもよい。ＵＴＲは、遺伝子発現を制御する要素を含んでいてもよい（調節要素とも称する）。調節要素は、リボソームの結合部位、ｍｉＲＮＡの結合部位などであってもよい。
本明細書においては、用語「ヒトコロナウイルス２０１９」「武漢ヒトコロナウイルス（ＷＨＣＶ）」「ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス」「ｎＣｏＶ－２０１９」「武漢海鮮食品市場肺炎ウイルス」「武漢コロナウイルス」「ＷＨＣＶコロナウイルス」「ＨＣｏＶ－１９」「ＳＡＲＳ２」「ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス」「ｈＣｏｖ－１９」「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」または「コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、本発明において交換可能に使用することがある。これらの用語は、新型のパンデミックを引き起こしたコロナウイルスに関連している。このコロナウイルスは、２０１９年末～２０２０年始に、中華人民共和国の都市・武漢に現れ、疾患ＣＯＶＩＤ－１９の原因となる。ＷＨＯによると、このウイルスは「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」と正式に命名され、これに伴う疾患は「ＣＯＶＩＤ－１９」と正式に命名された（２０２０年２月）。
ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルス科に属しており、特にオルトコロナウイルスに属しており、より具体的にはベータコロナウイルス属に属している。例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスとしては、下記リストＡおよびリストＢに記載の単離株が挙げられる（ただし、これらには限定されない）。
リストＡ：例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの単離株（EPI/GISAID）
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例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスは、GenBankアクセッション番号によって与えられる遺伝情報によっても、定義・特定できる。アクセッション番号を下記のリストＢに示す。
リストＢ：種々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離株のGenBankアクセッション番号
NC_045512、LC528232、LC528233、LC529905、MN908947、MN938384、MN938385、MN938386、MN938387、MN938388、MN938389、MN938390、MN970003、MN970004、MN975262、MN975263、MN975264、MN975265、MN975266、MN975267、MN975268、MN985325、MN988668、MN988669、MN994467、MN994468、MN996527、MN996528、MN996529、MN996530、MN996531、MN997409、MT007544、MT012098、MT019529、MT019530、MT019531、MT019532、MT019533、MT020880、MT020881、MT027062、MT027063、MT027064、MT039873、MT039887、MT039888、MT039890、MT044257、MT044258、MT049951、MT050493、MT066156、MT066175、MT066176、MT072688、MT093571、MT093631、MT106052、MT106053、MT106054、MT118835、MT121215、MT123290、MT123291、MT123292、MT123293、MT126808、MT135041、MT135042、MT135043、MT135044、MT152824、MT159705、MT159706、MT159707、MT159708、MT159709、MT159710、MT159711、MT159712、MT159713、MT159714、MT159715、MT159716、MT159717、MT159718、MT159719、MT159720、MT159721、MT159722、MT163716、MT163717、MT163718、MT163719、MT163720、MT163721、MT184907、MT184908、MT184909、MT184910、MT184911、MT184912、MT184913、MT188339、MT188340、MT188341、MT192759、MT192765、MT192772 or MT192773
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのNCBI Taxonomy ID（NCBI:txidまたはtaxID）は、２６９７０４９である。
用語「ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルスの抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質」または「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質」は、上記に定義したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスのものであるか、またはそれに由来する任意のペプチドまたはタンパク質に関する。また、当該ペプチドまたはタンパク質の断片、バリアントまたはその誘導体（好ましくは、免疫原性断片または免疫原性バリアント）にも関する。
用語「免疫原性断片」または「免疫原性バリアント」とは、被験体における免疫応答を惹起できるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスの抗原に対応している、任意の断片／バリアントであると理解せねばならない。好ましくは、第１の態様の核酸を筋肉内投与または皮内投与した結果として、コードされているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原（ペプチドまたはタンパク質）が、被験体において発現するようになる。
本明細書において、用語「発現」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのペプチドまたはタンパク質の産生を表す。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのペプチドまたはタンパク質は、第１の態様の核酸のコーディング配列から提供されるものである。例えば、「ＲＮＡの発現」とは、当該ＲＮＡをポリペプチドに翻訳することによる、タンパク質の産生を表す（ＲＮＡを細胞または被験体に投与した後における産生など）。産生されるタンパク質は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのものであるか、またはそれに由来するペプチドまたはタンパク質である。「ＤＮＡの発現」とは、ＤＮＡをＲＮＡへと転写し、それに続きポリペプチドへの翻訳することによる、タンパク質の産生を表す（ＤＮＡを細胞または被験体に投与した後における産生など）。産生されるタンパク質は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのものであるか、またはそれに由来するペプチドまたはタンパク質である。本明細書において、用語「発現」および用語「産生」は、互換可能に用いられることがある。また、好ましくは、用語「発現」は、核酸を細胞または生物に投与した際における、特定のペプチドまたはタンパク質の産生に関する。実施形態において、核酸はワクチンに好適であり、好ましくはコロナウイルスワクチンに好適である。好適な実施形態において、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスワクチンに好適である。
本発明に関連して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのものであるか、またはそれに由来する任意のタンパク質を利用してもよいし、適切にコーディング配列または第１の態様の核酸によってコードさせてもよい。本発明の基礎を成す範囲に含まれるものとして、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、合成により改変したまたは人工のコロナウイルスのペプチドまたはタンパク質を含んでいてもよいし、それからなっていてもよい。用語「合成により改変したコロナウイルスのペプチドまたはタンパク質」または用語「人工のコロナウイルスのペプチドまたはタンパク質」とは、天然には存在しないタンパク質に関する。それゆえ、人工のコロナウイルスのペプチドまたはタンパク質または合成により改変したコロナウイルスのペプチドまたはタンパク質は、天然のコロナウイルスのペプチドまたはタンパク質と比較して、例えば、１つ以上のアミノ酸が異なっていることがあるし、追加の異種のペプチド要素またはタンパク質要素を有していることがあるし、Ｎ末端またはＣ末端が延長または短縮されていることがある。
好適な実施形態において、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの１つ以上の抗原性ペプチドもしくは抗原性タンパク質またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントをコードしている、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、構造タンパク質、アクセサリータンパク質、レプリカーゼタンパク質、またはこれらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来する１つ以上のペプチドまたはタンパク質を含んでいる。
好適な実施形態において、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、構造タンパク質であるか、またはそれに由来する１つ以上のペプチドまたはタンパク質を含んでいる。構造タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、またはこれらのいずれかの免疫原性断片もしくはバリアントから選択される。
特に好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントを含んでいるか、またはそれからなる。
スパイクタンパク質とは、典型的なタイプＩのウイルス性融合タンパク質である。スパイクタンパク質は、ウイルスの表面に三量体で存在している。それぞれの単量体は、ヘッド（Ｓ１）およびステム（Ｓ２）からなる。個々の前駆体Ｓポリペプチドは、ホモ三量体を形成し、ゴルジ装置でグリコシル化されるとともに、シグナルペプチドを除去される。そして、細胞内のプロテアーゼで切断されて、分離したＳ１ポリペプチド鎖およびＳ２ポリペプチド鎖となる。ホモ三量体において、Ｓ１およびＳ２はＳ１／Ｓ２プロトマーとして会合しており、ヘテロ二量体の三量体となっている。スパイク糖タンパク質のＳ１ドメインには、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が含まれる。ＲＢＤは、アンギオテンシン変換酵素２受容体と結合し（その可能性が高いと考えられている）、ウイルスと宿主細胞との融合を媒介する。最初にＮ末端ドメインが標的細胞と接触し、２個のサブドメインがこれに続く。これらのドメインは、いずれも、中和抗体に対する感受性がある。Ｓ２ドメインは、６本の螺旋状の束の融合コアからなるＳ２ドメインは、宿主のエンドソーム膜との膜融合に関与している。Ｓ２ドメインも、中和の標的となる。Ｓ２サブユニットは、典型的には糖タンパク質と融合している２個の７回反復配列（ＨＲ１およびＨＲ２）および中央螺旋、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内テールドメインを有している。
本発明の核酸によって与えられる好適な抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質の配列を、表１の第Ａ列および第Ｂ列の第１行～第４１行に示す。これらの好適な抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質の配列に関する追加情報を、ＳＴ２５配列表の＜２２３＞の欄にも記載する。
以下では、本発明の核酸によって与えられる好適な抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質の配列について、詳細に説明する。
好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、配列番号１～１１１、２７４～１１６６３、１３１７６～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２～２２７５８、２２９１７、２２９２３、２２９２９～２２９６４、２６９３８、２６９３９のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第１行～第４１行を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
留意すべきことには、スパイクタンパク質（Ｓ）に含まれているアミノ酸残基（ａａ残基）およびその位置について言及するとき、使用されている任意の数は、配列番号１に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスの単離株EPI_ISL_402128（BetaCoV_Wuhan_WIV05_2019_EPI_ISL_402128）の対応するスパイクタンパク質（Ｓ）における、アミノ酸残基の位置に関する（別途記載のある場合を除く）。本開示において、個々のアミノ酸の位置は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの単離株EPI_ISL_402128（配列番号１）のスパイクタンパク質（Ｓ）における位置を例示的に示している。当業者であれば、当然に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のEPI_ISL_402128（配列番号１）に関して例示した本明細書の開示を、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの単離株における他の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質に応用できる。このような単離株の例としては、EPI_ISL_404227、EPI_ISL_403963、EPI_ISL_403962、EPI_ISL_403931、EPI_ISL_403930、EPI_ISL_403929、EPI_ISL_402130、EPI_ISL_402129、EPI_ISL_402128、EPI_ISL_402126、EPI_ISL_402125、EPI_ISL_402124、EPI_ISL_402123、EPI_ISL_402120、EPI_ISL_402119が挙げられる（ただし、これらには限定されない）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のさらなる単離株については、リストＡ、リストＢおよび／または表２５を参照。
タンパク質のアノテーションは、配列番号１をレファレンスタンパク質として実施する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのレファレンスタンパク質の完全長スパイクタンパク質（Ｓ）の大きさは１２７３アミノ酸残基であり、以下の要素が含まれている。
・分泌性シグナルペプチド：ａａ１～ａａ１５（配列番号２８を参照）
・スパイクタンパク質断片Ｓ１：ａａ１～６８１（配列番号２７を参照）
・受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）：ａａ３１９～ａａ５４１（配列番号１３２４３を参照）
・中和臨界ドメイン（ＣＮＤ）：ａａ３２９～ａａ５２９（配列番号１３３１０を参照）
・スパイクタンパク質断片Ｓ２：ａａ６８２～ａａ１２７３（配列番号３０を参照）
・膜貫通ドメイン（ＴＭ）：ａａ１２１２～ａａ１２７３（配列番号４９を参照）
・膜貫通ドメイン（ＴＭｆｌｅｘ）：ａａ１１４８～ａａ１２７３（配列番号１３１７６を参照）
留意すべきことには、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の単離株に由来するスパイクタンパク質では、天然に生じるアミノ酸レベルの変異がある（例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の単離株は、リストＡおよびリストＢを参照）。本発明に関連して、このようなアミノ酸の変異を、本明細書に記載のスパイクタンパク質に由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質に適用してもよい。
したがって、本発明に関連して、好適な抗原として本明細書に記載され意図されているスパイクタンパク質は、下記のうち１つ以上のアミノ酸変異を有していてもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
・Ｄ６１４ＧまたはＧ６１４Ｄ
・Ｈ４９ＹまたはＹ４９Ｈ
・Ｖ３６７ＦまたはＦ３６７Ｖ
・Ｐ１２６３ＬまたはＬ１２６３Ｐ
・Ｖ４８３ＡまたはＡ４８３Ｖ
・Ｓ９３９ＦまたはＦ９３９Ｓ
・Ｓ９４３ＰまたはＰ９４３Ｓ
・Ｌ５ＦまたはＦ５Ｌ
・Ｌ８ＶまたはＶ８Ｌ
・Ｓ９４０ＦまたはＦ９４０Ｓ
・Ｃ１２５４ＦまたはＦ１２５４Ｃ
・Ｑ２３９ＫまたはＫ２３９Ｑ
・Ｍ１５３ＴまたはＴ１５３Ｍ
・Ｖ１０４０ＦまたはＦ１０４０Ｖ
・Ａ８４５ＳまたはＳ８４５Ａ
・Ｙ１４５ＨまたはＨ１４５Ｙ
・Ａ８３１ＶまたはＶ８３１Ａ
・Ｍ１２２９ＩまたはＩ１２２９Ｍ
・Ｈ６９またはＨ６９ｄｅｌ（アミノ酸欠失）
・Ｖ７０またはＨ７０ｄｅｌ（アミノ酸欠失）
・Ｈ６９＿Ｖ７０またはＨ６９ｄｅｌおよびＨ７０ｄｅｌ（アミノ酸欠失）
・Ａ２２２ＶまたはＶ２２２Ａ
・Ｙ４５３ＦまたはＦ４５３Ｙ
・Ｓ４７７ＮまたはＮ４７７Ｓ
・Ｉ６９２ＶまたはＶ６９２Ｉ
・Ｒ４０３ＫまたはＫ４０３Ｒ
・Ｋ４１７ＮまたはＮ４１７Ｋ
・Ｎ４３７ＳまたはＳ４３７Ｎ
・Ｎ４３９ＫまたはＫ４３９Ｎ
・Ｖ４４５ＡまたはＡ４４５Ｖ
・Ｖ４４５ＩまたはＩ４４５Ｖ
・Ｖ４４５ＦまたはＦ４４５Ｖ
・Ｇ４４６ＶまたはＶ４４６Ｇ
・Ｇ４４６ＳまたはＳ４４６Ｇ
・Ｇ４４６ＡまたはＡ４４６Ｇ
・Ｌ４５５ＦまたはＦ４５５Ｌ
・Ｆ４５６ＬまたはＬ４５６Ｆ
・Ｋ４５８ＮまたはＮ４５８Ｋ
・Ａ４７５ＶまたはＶ４７５Ａ
・Ｇ４７６ＳまたはＳ４７６Ｇ
・Ｇ４７６ＡまたはＡ４７６Ｇ
・Ｓ４７７ＩまたはＩ４７７Ｓ
・Ｓ４７７ＲまたはＲ４７７Ｓ
・Ｓ４７７ＧまたはＧ４７７Ｓ
・Ｓ４７７ＴまたはＴ４７７Ｓ
・Ｔ４７８ＩまたはＩ４７８Ｔ
・Ｔ４７８ＫまたはＫ４７８Ｔ
・Ｔ４７８ＲまたはＲ４７８Ｔ
・Ｔ４７８ＡまたはＡ４７８Ｔ
・Ｅ４８４ＱまたはＱ４８４Ｅ
・Ｅ４８４ＫまたはＫ４８４Ｅ
・Ｅ４８４ＡまたはＡ４８４Ｅ
・Ｅ４８４ＤまたはＤ４８４Ｅ
・Ｇ４８５ＲまたはＲ４８５Ｇ
・Ｇ４８５ＳまたはＳ４８５Ｇ
・Ｆ４８６ＬまたはＬ４８６Ｆ
・Ｎ４８７ＩまたはＩ４８７Ｎ
・Ｙ４８９ＨまたはＨ４８９Ｙ
・Ｆ４９０ＳまたはＳ４９０Ｆ
・Ｆ４９０ＬまたはＬ４９０Ｆ
・Ｑ４９３ＬまたはＬ４９３Ｑ
・Ｑ４９３ＫまたはＫ４９３Ｑ
・Ｓ４９４ＰまたはＰ４９４Ｓ
・Ｓ４９４ＬまたはＬ４９４Ｓ
・Ｐ４９９ＬまたはＬ４９９Ｐ
・Ｔ５００ＩまたはＩ５００Ｔ
・Ｎ５０１ＹまたはＹ５０１Ｎ
・Ｎ５０１ＴまたはＴ５０１Ｎ
・Ｎ５０１ＳまたはＳ５０１Ｎ
・Ｖ５０３ＦまたはＦ５０３Ｖ
・Ｖ５０３ＩまたはＩ５０３Ｖ
・Ｇ５０４ＤまたはＤ５０４Ｇ
・Ｙ５０５ＷまたはＷ５０５Ｙ
・Ｑ５０６ＫまたはＫ５０６Ｑ
・Ｑ５０６ＨまたはＨ５０６Ｑ
・Ｙ１４４またはＹ１４４ｄｅｌ（アミノ酸欠失）
・Ａ５７０ＤまたはＤ５７０Ａ
・Ｐ６８１ＨまたはＨ６８１Ｐ
・Ｔ７１６ＩまたはＩ７１６Ｔ
・Ｓ９８２ＡまたはＡ９８２Ｓ
・Ｄ１１１８ＨまたはＨ１１１８Ｄ
・Ｌ１８ＦまたはＦ１８Ｌ
・Ｄ８０ＡまたはＡ８０Ｄ
・Ｄ２１５ＧまたはＧ２１５Ｄ
・Ｌ２４２またはＬ２４２ｄｅｌ（アミノ酸欠失）
・Ａ２４３またはＡ２４３ｄｅｌ（アミノ酸欠失）
・Ｌ２４４またはＬ２４４ｄｅｌ（アミノ酸欠失）
・Ｌ２４２＿Ａ２４３＿Ｌ２４４またはＬ２４２ｄｅｌ、Ａ２４３ｄｅｌおよびＬ２４４ｄｅｌ（アミノ酸欠失）
・Ｒ２４６ＩまたはＩ２４６Ｒ
・Ａ７０１ＶまたはＶ７０１Ａ
・Ｔ２０ＮまたはＮ２０Ｔ
・Ｐ２６ＳまたはＳ２６Ｐ
・Ｄ１３８ＹまたはＹ１３８Ｄ
・Ｒ１９０ＳまたはＳ１９０Ｒ
・Ｈ６５５ＹまたはＹ６５５Ｈ
・Ｔ１０２７ＩまたはＩ１０２７Ｔ
・Ｓ１３ＩまたはＩ１３Ｓ
・Ｗ１５２ＣまたはＣ１５２Ｗ
・Ｌ４５２ＲまたはＲ４５２Ｌ
・Ｒ３４６ＴまたはＴ３４６Ｒ
・Ｐ３８４ＬまたはＬ３８４Ｐ
・Ｌ４５２ＭまたはＭ４５２Ｌ
・Ｆ４５６ＡまたはＡ４５６Ｆ
・Ｆ４５６ＫまたはＫ４５６Ｆ
・Ｆ４５６ＶまたはＶ４５６Ｆ
・Ｅ４８４ＰまたはＰ４８４Ｅ
・Ｋ４１７ＴまたはＴ４１７Ｋ
・Ｇ４４７ＶまたはＶ４４７Ｇ
・Ｌ４５２ＱまたはＱ４５２Ｌ
・Ａ４７５ＳまたはＳ４７５Ａ
・Ｆ４８６ＩまたはＩ４８６Ｆ
・Ｆ４９０ＹまたはＹ４９０Ｆ
・Ｑ４９３ＲまたはＲ４９３Ｑ
・Ｓ４９４ＡまたはＡ４９４Ｓ
・Ｐ４９９ＨまたはＨ４９９Ｐ
・Ｐ４９９ＳまたはＳ４９９Ｐ
・Ｇ５０２ＶまたはＶ５０２Ｇ
・Ｔ７４８ＫまたはＫ７４８Ｔ
・Ａ５２２ＳまたはＳ５２２Ａ
・Ｖ１１７６ＦまたはＦ１１７６Ｖ
下記のアミノ酸変異は、特に好ましい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
・Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ
・Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２ｄｅｌ、Ａ２４３ｄｅｌ、Ｌ２４４ｄｅｌ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖ
・Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、およびＤ６１４Ｇ
・Ｅ４８４ＫおよびＤ６１４Ｇ
・Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、およびＴ１０２７Ｉ
・Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、Ｌ４５２Ｒ、およびＤ６１４Ｇ
・ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｉ６９２ＶおよびＭ１２２９Ｉ
・Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４ＰまたはＥ４８４Ｑ
・Ｇ４４６Ｖ
・Ｇ４８５Ｒ
いくつかの実施形態においては、スパイクタンパク質（Ｓ）の断片が、本発明の核酸によってコードされていてもよい。この断片は、Ｎ末端が短縮されていてもよく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの完全長レファレンスタンパク質（配列番号１）よりも、ａａ１から最大でａａ１００までのＮ末端のアミノ酸を欠失していてもよい。あるいは、この断片は、Ｃ末端が短縮されていてもよく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの完全長レファレンスタンパク質（配列番号１）よりも、ａａ５３１から最大でａａ１２７３までのＣ末端のアミノ酸を欠失していてもよい。このようなスパイクタンパク質（Ｓ）の断片は、アミノ酸の置換（後述）をさらに有していてもよいし、１つ以上の異種のペプチド要素またはタンパク質要素（後述）をさらに有していてもよい。好適な実施形態において、スパイクタンパク質（Ｓ）の断片は、Ｃ末端が短縮されており、Ｃ末端の膜貫通ドメインを有していない（すなわち、ａａ１２１２～ａａ１２７３またはａａ１１４８～ａａ１２７３を欠失している）。
他の実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）を含んでいるか、またはそれからなり、当該スパイクタンパク質（Ｓ）は、膜貫通ドメイン（ＴＭ；アミノ酸位置：ａａ１２１２～ａａ１２７３）を有していないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来するものである。実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）を含んでいるか、またはそれからなり、当該スパイクタンパク質（Ｓ）は、膜貫通ドメインの伸長部位（ＴＭｆｌｅｘ；アミノ酸位置：ａａ１１４８～ａａ１２７３）を有していないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来するものである。理論に拘束される意図はないが、本明細書に記載の膜貫通ドメイン（ＴＭまたはＴＭｆｌｅｘ）を有していないスパイクタンパク質（Ｓ）は、コロナウイルスワクチンにとって好適である。なぜならば、タンパク質が可溶性であると考えられ、細胞膜に固定されないからである。タンパク質が可溶性であると、（翻訳されたときに）高濃度で被験体に投与でき、免疫応答が向上する。
理論に拘束される意図はないが、ＲＢＤドメイン（ａａ３１９～ａａ５４１）およびＣＮＤドメイン（ａａ２９～ａａ５２９）は、免疫原性にとって重要である。これらの領域はいずれも、スパイクタンパク質のＳ１断片に位置している。したがって、本発明に関連して好適であることには、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質のＳ１断片を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、その免疫原性断片または免疫原性バリアントである。好適には、Ｓ１断片は、上述のＲＢＤドメインおよび／またはＣＮＤドメインを少なくとも含んでいてもよい。
好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ；ａａ３１９～ａａ５４１）を含んでいるか、またはそれからなる。このＲＢＤは、スパイクタンパク質断片を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、ＲＢＤは、その免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
さらに好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、短縮されている受容体結合ドメイン（ｔｒｕｎｃＲＢＤ；ａａ３３４～ａａ５２８）を含んでいるか、またはそれからなる。このＲＢＤは、スパイクタンパク質断片を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、ＲＢＤは、その免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
このようなスパイクタンパク質（Ｓ）の断片（ＲＢＤ；ａａ３１９～ａａ５４１またはｔｒｕｎｃＲＢＤ；ａａ３３４～ａａ５２８）は、アミノ酸の置換（後述）をさらに有していてもよいし、１つ以上の異種のペプチド要素またはタンパク質要素（後述）をさらに有していてもよい。
特に好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）を含んでいるか、またはそれからなる。スパイクタンパク質（Ｓ）は、スパイクタンパク質断片Ｓ１を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、スパイクタンパク質（Ｓ）は、その免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
したがって、好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（スパイクタンパク質断片Ｓ１を含んでいるか、またはそれからなる）は、配列番号１～２７、２９、３１～４８、５８～１１１、２７４～１３４５、１４８０～１５４６、１６１４～１１６６３、１３３７７～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。これらのアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第１行～６行、第９行、第１１行～第４１行を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質断片Ｓ１を含んでおり、スパイクタンパク質断片Ｓ２（ａａ６８２～ａａ１２７３）のうち、７０％以上、８０％以上、９０％以上、好ましくは１００％を含んでいない。この実施形態の利点は、Ｓ１断片が有している中和エピトープが、Ｓ１およびＳ２を含んでいる完全長タンパク質に附随する潜在的な問題点の制約を受けない点にある。
したがって、好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（スパイクタンパク質断片Ｓ１から実質的になる）は、配列番号２７、１２７９～１３４５、２９、１４８０～１５４６、１３２４３～１３３０９、２２７３３～２２７３６、２６９３８、２６９３９のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第６行および第９行）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
理論に拘束される意図はないが、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質がスパイクタンパク質断片Ｓ１およびスパイクタンパク質断片Ｓ２（少なくともＳ２の断片）を含んでいるか、またはそれからなることは、好適でありうる。これは、免疫原性のスパイクタンパク質の形成が促進される場合があるからである。
したがって、特に好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）を含んでいるか、またはそれからなる。このスパイクタンパク質（Ｓ）は、スパイクタンパク質断片Ｓ１またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントと、スパイクタンパク質断片Ｓ２またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントとを含んでいるか、またはそれからなる。
好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質断片Ｓ１およびスパイクタンパク質断片Ｓ２を含んでいるか、またはそれからなる。さらに、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、配列番号１～２６、３１～４８、５８～１１１、２７４～１２７８、１６１４～１１６６３、１３３７７～１３５１０、１３５２１～１４１７７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうち、いずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいる。あるいは、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第１行、第５行、第１１行～第３５行、第３８行を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
特に好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、完全長スパイクタンパク質を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
用語「完全長スパイクタンパク質」とは、実質的に完全なスパイクタンパク質に対応するアミノ酸配列を有しているスパイクタンパク質（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来するもの）であると理解すべきである。したがって、完全長スパイクタンパク質は、ａａ１～ａａ１２７３を含んでいてもよい（レファレンスタンパク質：配列番号１）。それゆえ、完全長スパイクタンパク質は、通常、分泌性シグナルペプチド、スパイクタンパク質断片Ｓ１、スパイクタンパク質断片Ｓ２、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、中和臨界ドメイン（ＣＮＤ）および膜貫通ドメインを含んでいてもよい。特筆すべきことには、特定のアミノ酸の置換（例えば、Ｓタンパク質をpre-fusion構造安定化させるもの）を有しているバリアントや、天然のアミノ酸欠失を有しているバリアントも、用語「完全長スパイクタンパク質」の範疇に含まれる。
したがって、好適な実施形態において、コードされている１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、完全長のＳタンパク質である。完全長のＳタンパク質は、配列番号１～９、２７４～３４０、２２７３７、２２７３９、２２７４１、２２７４３、２２７４５、２２７４７、２２７４９、２２７５１、２２７５３、２２７５５、２２７５７、２２９２９～２２９４６のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、完全長のＳタンパク質は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第１行を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
特に好適な実施形態において、第１の態様の核酸によって与えられるスパイクタンパク質（Ｓ）は、設計または適応により、pre-fusion立体配座で安定した抗原となっている。コロナウイルスワクチンとの関連で用いられるとき、pre-fusion立体配座は特に有利である。これは、中和抗体にとっての潜在的なエピトープのうちいくつかは、タンパク質のpre-fusion立体配座でなければ利用できないためである。また、タンパク質をpre-fusion立体配座に保つことには、疾患増悪および／または抗体依存性増強（ＡＤＥ）などの免疫病理効果を避ける目的もある。
好適な実施形態においては、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質をコードしている核酸（あるいは、組成物またはワクチン）を被験体に投与することにより、スパイクタンパク質に対する中和抗体を誘導させ、疾患を増悪させる抗体を誘導させない。とりわけ、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質をコードしている核酸（あるいは、組成物またはワクチン）を被験体に投与することにより、疾患増悪および／または抗体依存性増強（ＡＤＥ）などの免疫病理効果が誘導されない。
しｈたがって、好適な実施形態において、本発明の核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのものであるか、またはそれに由来する１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）であるか、またはそれに由来する。スパイクタンパク質（Ｓ）は、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）である。好適には、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質は、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有している。
本明細書において、用語「pre-fusion立体配座」とは、コロナウイルスのＳタンパク質の細胞外ドメインに導入される構造立体配座に関する。この立体配座は、分泌系で修飾を受けて成熟コロナウイルスＳタンパク質になった後の立体配座であり、融合を誘導するイベントが発生してコロナウイルスＳがpost-fusion立体配座に変化する前の立体配座である。
本明細書に記載の「pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）」は、コロナウイルスＳ配列の本来の形態と比較して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入を有している。これにより、本来の形態のコロナウイルスＳ配列によって形成されるコロナウイルスＳの細胞外ドメイン三量体と比較して、pre-fusion立体配座に維持される時間が増加する。１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入によるpre-fusion立体配座への安定化は、例えば、エネルギー論的な安定化であってもよいし（pre-fusion立体配座のエネルギーの方がオープンなpost-fusion立体配座よりも低くするなど）、反応速度論的な安定化であってもよい（pre-fusion立体配座からpost-fusion立体配座への遷移確率を下げるなど）。さらに、コロナウイルスＳの細胞外ドメイン三量体をpre-fusion立体配座に安定化させることにより、本来の形態のコロナウイルスＳ配列よりも変性耐性を上昇させられる。
したがって、好適な実施形態において、スパイクタンパク質は、Ｓタンパク質をpre-fusion立体配座に安定させる１つ以上のアミノ酸の置換を有している。このような置換の例としては、Ｓタンパク質の膜遠位部（Ｎ末端領域など）をpre-fusion立体配座に安定化させる置換が挙げられる。
Ｋ９８６および／またはＶ９８７の位置にある１つ以上のアミノ酸を、スパイクタンパク質をpre-fusion立体配座に安定化させるアミノ酸に置換することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのスパイクタンパク質を安定化させてもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
特に好適な実施形態においては、pre-fusion構造安定化変異において、Ｋ９８６の位置のアミノ酸が置換されている（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。Ｋ９８６のアミノ酸の置換は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、ＧまたはＰから選択される。好ましくは、Ｋ９８６のアミノ酸は、Ｐに置換されている。さらなる好適な実施形態においては、pre-fusion構造安定化変異において、Ｋ９８６の位置のアミノ酸が置換されている（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。Ｖ９８７のアミノ酸の置換は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、ＧまたはＰから選択される。好ましくは、Ｖ９８７のアミノ酸は、Ｐに置換されている。
好適には、Ｋ９８６およびＶ９８７の位置にある２個のアミノ酸を、スパイクタンパク質をpre-fusion立体配座に安定化させるアミノ酸に置換することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのスパイクタンパク質を安定化させてもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
好適な実施形態においては、pre-fusion構造安定化変異において、Ｋ９８６およびＶ９８７の位置にあるアミノ酸が置換されている（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。Ｋ９８６および／またはＶ９８７のアミノ酸の置換は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、ＧまたはＰから選択される。
好ましくは、スパイクタンパク質のＫ９８６残基およびＶ９８７残基を、２個のプロリンにより置換することにより、pre-fusion立体配座に安定化させる（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
したがって、好適な実施形態において、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有している。１つ以上のpre-fusion構造安定化変異においては、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐにアミノ酸が置換されている（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
したがって、上述した任意のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号または配列番号１～９、２７４～３４０、２２７３７、２２７３９、２２７４１、２２７４３、２２７４５、２２７４７、２２７４９、２２７５１、２２７５３、２２７５５、２２７５７、２２９２９～２２９４６から選択される任意のタンパク質、その断片もしくはバリアントを、当業者は選択し、アミノ酸変異を導入してもよい。好ましくは、アミノ酸の置換は、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐである（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
好適な実施形態において、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異は、pre-fusion状態をさらに安定化させるcavity-filling変異を有している。この変異／アミノ酸の置換は、Ｔ８８７ＷＮ；Ａ１０２０Ｗ；Ｔ８８７ＷＮおよびＡ１０２０Ｗ；Ｐ１０６９Ｆを含む群から選択される（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
用語「cavity-filling変異」または「cavity-fillingアミノ酸置換」とは、タンパク質のタンパク質コア（コロナウイルスＳタンパク質の細胞外ドメインなど）にある空隙を埋めるアミノ酸の置換に関する。空隙とは、折り畳まれたタンパク質にある実質的な空白部分であり、ここにはアミノ酸またはアミノ酸の側鎖が存在しない。いくつかの実施形態においては、cavity-fillingアミノ酸置換を導入して、コロナウイルスＳの細胞外ドメインコアのpre-fusion立体配座にある空隙を埋める。この空隙は、post-fusion立体配座に変化した後には失われる（体積が減少するなどする）。
いくつかの実施形態においては、Ｆ８１７Ｐ；Ａ８９２Ｐ；Ａ８９９ＰおよびＡ９４２Ｐのアミノ酸の置換のうち１つ以上と、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換とを組合せてもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
好適な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのスパイクタンパク質は、次のアミノ酸の置換のうち１つ以上を有している（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
・Ｆ８１７Ｐ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ａ８９２Ｐ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ａ８９９Ｐ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ａ９４２Ｐ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
特に好適な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのスパイクタンパク質は、次のアミノ酸の置換を有している（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
・Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｈｅｘ）
したがって、上述の任意のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号または配列番号１～９、２７４～３４０、２２７３７、２２７３９、２２７４１、２２７４３、２２７４５、２２７４７、２２７４９、２２７５１、２２７５３、２２７５５、２２７５７、２２９２９～２２９４６から選択される任意のタンパク質、その断片もしくはバリアントを、当業者は選択して、アミノ酸変異を導入してもよい。好適には、アミノ酸の置換は、次のうちから選択される：Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ。あるいは、アミノ酸の置換は、次のうちから選択される：Ｆ８１７Ｐ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ａ８９２Ｐ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ａ８９９Ｐ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ。アミノ酸位置は配列番号１を基準とする。
特に好適な実施形態において、Ｔ８８７Ｗ；Ａ１０２０Ｗ；Ｔ８８７ＷおよびＡ１０２０Ｗ；Ｐ１０６９Ｆのアミノ酸の置換のうち１つ以上と、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ置換とを組合せてもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
他の特に好適な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのスパイクタンパク質は、次のうち１つ以上のアミノ酸の置換を有している（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
・Ｔ８８７Ｗ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ａ１０２０Ｗ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｔ８８７ＷおよびＡ１０２０Ｗ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｐ１０６９Ｆ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
したがって、上述の任意のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号または配列番号１～９、２７４～３４０、２２７３７、２２７３９、２２７４１、２２７４３、２２７４５、２２７４７、２２７４９、２２７５１、２２７５３、２２７５５、２２７５７、２２９２９～２２９４６から選択される任意のタンパク質、その断片もしくはバリアントを、当業者は選択して、アミノ酸変異を導入してもよい。好適には、アミノ酸の置換は、次のうちから選択される：Ｔ８８７Ｗ；Ａ１０２０Ｗ；Ｔ８８７ＷおよびＡ１０２０Ｗ；Ｐ１０６９Ｆ。あるいは、アミノ酸の置換は、次のうちから選択される：Ｔ８８７Ｗ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ａ１０２０Ｗ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｔ８８７Ｗ、Ａ１０２０Ｗ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｐ１０６９Ｆ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ。アミノ酸位置は配列番号１を基準とする。
好適な実施形態において、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異は、pre-fusion状態をさらに安定化させる変異型プロトン化部位を有している。この変異／アミノ酸の置換は、次のうちから選択される：Ｈ１０４８ＱおよびＨ１０６４Ｎ；Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ；Ｈ１０４８Ｑ、Ｈ１０６４Ｎ、Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
いくつかの実施形態においては、Ｈ１０４８ＱおよびＨ１０６４Ｎ；Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ；Ｈ１０４８Ｑ、Ｈ１０６４Ｎ、Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎのアミノ酸の置換のうち１つ以上と、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換とを組合せてもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
特に好適な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのスパイクタンパク質は、次のアミノ酸の置換のうち１つ以上を有している（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
・Ｈ１０４８ＱおよびＨ１０６４Ｎ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｈ１０４８Ｑ、Ｈ１０６４Ｎ、Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
したがって、上述の任意のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号または配列番号１～９、２７４～３４０、２２７３７、２２７３９、２２７４１、２２７４３、２２７４５、２２７４７、２２７４９、２２７５１、２２７５３、２２７５５、２２７５７、２２９２９～２２９４６から選択される任意のタンパク質、その断片もしくはバリアントを、当業者は選択して、アミノ酸変異を導入してもよい。好適には、アミノ酸の置換は、次のうちから選択される：Ｈ１０４８ＱおよびＨ１０６４Ｎ；Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ；Ｈ１０４８Ｑ、Ｈ１０６４Ｎ、Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ。あるいは、アミノ酸の置換は、次のうちから選択される：Ｈ１０４８Ｑ、Ｈ１０６４Ｎ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｈ１０８３Ｎ、Ｈ１１０１Ｎ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｈ１０４８Ｑ、Ｈ１０６４Ｎ、Ｈ１０８３Ｎ、Ｈ１１０１Ｎ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ。アミノ酸位置は配列番号１を基準とする。
好適な実施形態において、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異は、人工の分子内ジスルフィド結合を有している。人工の分子内ジスルフィド結合を導入して、Ｓタンパク質の膜遠位部（Ｎ末端領域など）を、pre-fusion立体配座にさらに安定化できる。すなわち、pre-fusion特異的な１つ以上の抗体に特異的に結合立体配座にさらに安定化したり、Ｓタンパク質のpost-fusion立体配座には存在せずpre-fusion立体配座に存在する好適な抗原性を示せたりできる。
好適な実施形態においては、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異により、人工の分子内ジスルフィド結合が形成される。１つ以上の人工の分子内ジスルフィド結合は、下記を含む群から選択される２つ以上のアミノ酸の置換により形成される：Ｉ７１２Ｃ、Ｉ７１４Ｃ、Ｐ７１５Ｃ、Ｔ８７４Ｃ、Ｇ８８９Ｃ、Ａ８９０Ｃ、Ｉ９０９Ｃ、Ｎ９１４Ｃ、Ｑ９６５Ｃ、Ｆ９７０Ｃ、Ａ９７２Ｃ、Ｒ９９５Ｃ、Ｇ９９９Ｃ、Ｓ１００３Ｃ、Ｌ１０３４Ｃ、Ｖ１０４０Ｃ、Ｙ１０４７Ｃ、Ｓ１０５５Ｃ、Ｐ１０６９Ｃ、Ｔ１０７７Ｃ、１１１０Ｃ、Ｓ１１２３Ｃ（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
好適な実施形態においては、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異により、人工の分子内ジスルフィド結合が形成される。１つ以上の人工の分子内ジスルフィド結合は、次のうち１つ以上のアミノ酸の置換により形成される：Ｉ７１２ＣおよびＴ１０７７Ｃ；Ｉ７１４ＣおよびＹ１１１０Ｃ；Ｐ７１５ＣおよびＰ１０６９Ｃ；Ｇ８８９ＣおよびＬ１０３４Ｃ；Ｉ９０９ＣおよびＹ１０４７Ｃ；Ｑ９６５ＣおよびＳ１００３Ｃ；Ｆ９７０ＣおよびＧ９９９Ｃ；Ａ９７２ＣおよびＲ９９５Ｃ；Ａ８９０ＣおよびＶ１０４０Ｃ；Ｔ８７４ＣおよびＳ１０５５Ｃ；Ｎ９１４ＣおよびＳ１１２３Ｃ（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
さらなる実施形態において、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異には、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の異なる人工の分子内ジスルフィド結合が含まれている。これらの人工の分子内ジスルフィド結合は、いずれも、下記から選択されるアミノ酸の置換であってもよい：Ｉ７１２ＣおよびＴ１０７７Ｃ；Ｉ７１４ＣおよびＹ１１１０Ｃ；Ｐ７１５ＣおよびＰ１０６９Ｃ；Ｇ８８９ＣおよびＬ１０３４Ｃ；Ｉ９０９ＣおよびＹ１０４７Ｃ；Ｑ９６５ＣおよびＳ１００３Ｃ；Ｆ９７０ＣおよびＧ９９９Ｃ；Ａ９７２ＣおよびＲ９９５Ｃ；Ａ８９０ＣおよびＶ１０４０Ｃ；Ｔ８７４ＣおよびＳ１０５５Ｃ；Ｎ９１４ＣおよびＳ１１２３Ｃ（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
さらなる実施形態においては、Ｉ７１２ＣおよびＴ１０７７Ｃ；Ｉ７１４ＣおよびＹ１１１０Ｃ；Ｐ７１５ＣおよびＰ１０６９Ｃ；Ｇ８８９ＣおよびＬ１０３４Ｃ；Ｉ９０９ＣおよびＹ１０４７Ｃ；Ｑ９６５ＣおよびＳ１００３Ｃ；Ｆ９７０ＣおよびＧ９９９Ｃ；Ａ９７２ＣおよびＲ９９５Ｃ；Ａ８９０ＣおよびＶ１０４０Ｃ；Ｔ８７４ＣおよびＳ１０５５Ｃ；Ｎ９１４ＣおよびＳ１１２３Ｃのアミノ酸の置換のうち１つ以上（好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）と、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換とを組合せてもよい。例えば、pre-fusionに安定化させたＳタンパク質は、２個の異なる人工の分子内ジスルフィド結合（Ｉ７１２ＣおよびＴ１０７７Ｃ；Ｐ７１５ＣおよびＰ１０６９Ｃなど）に加えて、さらにＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換を有していてもよい。アミノ酸位置は配列番号１を基準とする。
特に好適な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのスパイクタンパク質は、下記のアミノ酸置換のうち１つ以上を有している（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
・Ｉ７１２ＣおよびＴ１０７７Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｉ７１４ＣおよびＹ１１１０Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｐ７１５ＣおよびＰ１０６９Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｇ８８９ＣおよびＬ１０３４Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｉ９０９ＣおよびＹ１０４７Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｑ９６５ＣおよびＳ１００３Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｆ９７０ＣおよびＧ９９９Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ａ９７２ＣおよびＲ９９５Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ａ８９０ＣおよびＶ１０４０Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｔ８７４ＣおよびＳ１０５５Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
・Ｎ９１４ＣおよびＳ１１２３Ｃ；Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ
したがって、上述の任意のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号または配列番号１～９、２７４～３４０、２２７３７、２２７３９、２２７４１、２２７４３、２２７４５、２２７４７、２２７４９、２２７５１、２２７５３、２２７５５、２２７５７、２２９２９～２２９４６から選択される任意のタンパク質、その断片もしくはバリアントを、当業者は選択して、アミノ酸変異を導入してもよい。好適には、アミノ酸の置換は、次のうちから選択される：Ｉ７１２ＣおよびＴ１０７７Ｃ；Ｉ７１４ＣおよびＹ１１１０Ｃ；Ｐ７１５ＣおよびＰ１０６９Ｃ；Ｇ８８９ＣおよびＬ１０３４Ｃ；Ｉ９０９ＣおよびＹ１０４７Ｃ；Ｑ９６５ＣおよびＳ１００３Ｃ；Ｆ９７０ＣおよびＧ９９９Ｃ；Ａ９７２ＣおよびＲ９９５Ｃ；Ａ８９０ＣおよびＶ１０４０Ｃ；Ｔ８７４ＣおよびＳ１０５５Ｃ；Ｎ９１４ＣおよびＳ１１２３Ｃ。あるいは、アミノ酸の置換は、次のうちから選択される：Ｉ７１２Ｃ、Ｔ１０７７Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｉ７１４Ｃ、Ｙ１１１０Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｐ７１５Ｃ、Ｐ１０６９Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｇ８８９Ｃ、Ｌ１０３４Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｉ９０９Ｃ、Ｙ１０４７Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｑ９６５Ｃ、Ｓ１００３Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｆ９７０Ｃ、Ｇ９９９Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ａ９７２Ｃ、Ｒ９９５Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ａ８９０Ｃ、Ｖ１０４０Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｔ８７４Ｃ、Ｓ１０５５Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；Ｎ９１４Ｃ、Ｓ１１２３Ｃ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ。アミノ酸位置は配列番号１を基準とする。
強調すべきことには、本発明に関連して、任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのスパイクタンパク質は、上述の変異（レファレンスタンパク質である配列番号１を対象に例示されている）を有することにより、pre-fusion立体配座に安定化されていてもよい。
したがって、好適な実施形態において、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、配列番号１０～２６、４０～４８、８５～１１１、３４１～１２７８、１６８１～２６１８、２６８６～３６２３、３６９１～４６２８、４６９６～５６３３、５７０１～６６３８、６７０６～７６４３、７７１１～８６４８、８７１６～９６５３、９７２１～１０６５８、１０７２６～１１６６３、１３３７７～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２、２２７３８、２２７４０、２２７４２、２２７４４、２２７４６、２２７４８、２２７５０、２２７５２、２２７５４、２２７５６、２２７５８、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第２行～第５行、第１２行～第１５行、第１７行～第２０行、第２２行～第２５行、第２７行～第３０行、第３２行～第３５行、第３８行を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
特に好適な実施形態において、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、配列番号１０～２６、３４１～４０７、６０９～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３８、２２７４０、２２７４２、２２７４４、２２７４６、２２７４８、２２７５０、２２７５２、２２７５４、２２７５６、２２７５８、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第２行および第５を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
より好適な実施形態において、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、配列番号１０～１８、３４１～４０７、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第２行を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
さらにより好適な実施形態において、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、配列番号２２９６０、２２９６１、２２９６３のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
より一層好適な実施形態において、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、配列番号１０または３４１のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。あるいは、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
種々の好適な実施形態によれば、本発明の核酸は、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質と、それに加えて１つ以上の異種のペプチド要素またはタンパク質要素とをコードしている。
好適には、１つ以上の異種のペプチド要素またはタンパク質要素は、コードされている本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質の分泌を促進または向上させてもよい（例えば、分泌シグナル配列によって）。あるいは、コードされている本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質の原形質膜への固着を促進または向上させてもよい（例えば、膜貫通要素によって）。あるいは、抗原複合体の形成を促進または向上させてもよい（例えば、多量体化ドメインまたは抗原クラスター化要素によって）。あるいは、ウイルス様粒子の形成を促進または向上させてもよい（ＶＬＰ形成配列）。さらに、第１の態様の核酸は、ペプチドリンカー要素、自己切断ペプチド、免疫アジュバント配列または樹状細胞標的化配列をさらにコードしていてもよい。
好適な多量体化ドメインは、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１１１６～１１６７またはこれらの配列の断片もしくはバリアントであるアミノ酸配列のうちから選択されてもよい。好適な膜貫通要素は、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１２２８～１３４３またはこれらの配列の断片もしくはバリアントであるアミノ酸配列のうちから選択されてもよい。好適なＶＬＰ形成配列は、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１１６８～１２２７またはこれらの配列の断片もしくはバリアントであるアミノ酸配列のうちから選択されてもよい。好適なペプチドリンカーは、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１５０９～１５６５またはこれらの配列の断片もしくはバリアントであるアミノ酸配列のうちから選択されてもよい。好適な自己切断ペプチドは、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１４３４～１５０８またはこれらの配列の断片もしくはバリアントであるアミノ酸配列のうちから選択されてもよい。好適な免疫アジュバント配列は、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１３６０～１４２１またはこれらの配列の断片もしくはバリアントであるアミノ酸配列のうちから選択されてもよい。好適な樹状細胞（ＤＣ）標的化配列は、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１３４４～１３５９またはこれらの配列の断片もしくはバリアントであるアミノ酸配列のうちから選択されてもよい。好適な分泌性シグナルペプチドは、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１～１１１５、１７２８またはこれらの配列の断片もしくはバリアントであるアミノ酸配列のうちから選択されてもよい。
好適な実施形態において、１つ以上のコーディング配列は、シグナルペプチド、リンカーペプチド、ヘルパーエピトープ、抗原クラスター化要素、三量体化要素もしくは多量体化要素、膜貫通要素またはＶＬＰ形成配列から選択される１つ以上の異種のペプチド要素またはタンパク質要素をさらにコードしている。
好適な実施形態において、本発明の核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する１つ以上の抗原性タンパク質と、それに加えて１つ以上の異種の三量体化要素、抗原クラスター化要素またはＶＬＰ形成配列とをコードしている。
（抗原クラスター化要素または多量体化要素）
好適な実施形態において、抗原クラスター化要素は、フェリチン要素、ルマジンシンターゼ要素、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはエンカプスリンから選択してもよい。（好ましくはpre-fusion構造にて）安定にクラスター化されたスパイクタンパク質を発現させることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を大きく幅広いものにできる。
ルマジンシンターゼ（Lumazine、ＬＳ、LumSynth）は、粒子形成特性を有する酵素である。この酵素は、様々な生物に存在し、リボフラビン生合成に関与している。
特に好適な実施形態においては、ルマジンシンターゼを用いて、抗原のクラスター化を促進させる。これによって、コードされている本発明のコロナウイルス抗原の免疫応答を促進または向上させてもよい。
特に好適な実施形態において、抗原クラスター化要素（多量体化要素）は、ルマジンシンターゼであるか、またはそれに由来する。好ましくは、抗原クラスター化ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１２のアミノ酸配列、その断片またはバリアントのうちいずれかと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
フェリチンは、細胞内における鉄の貯蓄を主な機能とするタンパク質である。ほとんど全ての生物がフェリチンを産生している。フェリチンは２４個のサブユニットから構成され、各サブユニットは４本のαヘリックの束から構成されており、八面体対称の四次構造に自己集合する。ナノ粒子に自己集合する特性は、抗原を運び、曝露させるのに適している。
特に好適な実施形態においては、フェリチンを用いて、抗原のクラスター化を促進させる。これにより、コードされているコロナウイルス抗原（好ましくはスパイクタンパク質）の免疫応答を促進できる。
特に好適な実施形態において、抗原クラスター化要素（多量体化要素）は、フェリチンであるか、またはそれに由来する。好ましくは、抗原クラスター化ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１３のアミノ酸配列、その断片またはバリアントのうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
いくつかの実施形態において、抗原クラスター化ドメインは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。ＨＢｓＡｇは、球状の粒子を形成している。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の配列断片の追加は、コロナウイルスに対する核酸系のワクチンの免疫応答を向上させるために特に有効でありうる。
特に好適な実施形態においては、ＨＢｓＡｇを用いて、抗原クラスター化を促進させる。これにより、コードされているコロナウイルス抗原（好ましくは、本明細書に記載のスパイクタンパク質）の免疫応答を促進できる。
いくつかの実施形態において、抗原クラスター化要素は、エンカプスリン要素である。エンカプスリン配列の追加は、コロナウイルスに対する核酸系のワクチンの免疫応答を向上させるために特に有効でありうる。特に好適な実施形態においては、エンカプスリンを用いて、抗原クラスター化を促進させる。これにより、コードされているコロナウイルス抗原（好ましくは、本明細書に記載のスパイクタンパク質）の免疫応答を促進できる。
エンカプスリンは、好熱性細菌のThermotoga maritimaから単離されたタンパク質である。エンカプスリン要素は、抗原を自己集合させ、抗原（ナノ）粒子を形成させる要素として使用できる。エンカプスリンは、それぞれ３１ｋＤａの大きさの同一のモノマーの６０コピーから形成されている。各モノマーは、薄い二十面体のＴ＝１対称ケージ構造であり、内径は２０ｎｍ、外径は２４ｎｍである。
いくつかの実施形態において、核酸のコーディング配列は、異種の抗原クラスター化要素をさらにコードしている。特に好ましく好適には、異種の抗原クラスター化要素は融合タンパク質を産生する。この融合タンパク質は、抗原クラスター化要素と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質とを含んでいる。好適には、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（好ましくはスパイクタンパク質）は、Ｃ末端の膜貫通ドメイン（ＴＭ）を欠失している（ａａ１２１２～ａａ１２７３を欠失している）。あるいは、Ｃ末端の膜貫通ドメインの一部（ＴＭｆｌｅｘ）を欠失している（例えば、ａａ１１４８～ａａ１２７３を欠失している）。
したがって、配列番号１～２６、２７４～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である任意のアミノ酸配列を改変して、ａａ１２１２～ａａ１２７３に位置する内在性膜貫通ドメイン（ＴＭ）を除去してもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。このように、本発明に関して、Ｃ末端短縮タンパク質として使用できる。さらに、配列番号１～２６、２７４～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である任意のアミノ酸配列を改変して、ａａ１１４８～ａａ１２７３に位置する内在性膜貫通ドメインの一部（ＴＭｆｌｅｘ）を除去してもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。このように、本発明に関して、Ｃ末端短縮タンパク質として使用できる。Ｃ末端の膜貫通ドメイン（ＴＭまたはＴＭｆｌｅｘ）を欠失している好適なスパイクタンパク質は、配列番号３１～３９、１６１４～３６２３、１３３７７～１３５１０から選択されてもよい。
他の実施形態において、核酸のコーディング配列が上述の異種の抗原クラスター化要素をさらにコードしているとき、特に好ましく好適には、融合タンパク質を産生する。この融合タンパク質は、抗原クラスター化要素と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質断片Ｓ１に由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（Ｓ２、ＴＭおよび／またはＴＭｆｌｅｘを欠失している）とを含んでいる。さらに、好適には、リンカー要素（例えば、配列番号１１５、１３１４８、１３１５２のリンカー）を用いて、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質から異種の抗原クラスター化要素を分離する。
好適な実施形態において、異種の抗原クラスター化要素を含む１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。異種の抗原クラスター化要素は、配列番号５８～７５、８５～１０２、３６２４～５６３３、７６４４～９６５３、１３５８８～１３７２１、１３８５６～１３９８９、２２７３３、２２７３５、２２７３６のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列である。あるいは、異種の抗原クラスター化要素は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第１６行および第２５行を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
さらなる好適な多量体化要素は、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１１１６～１１６７に記載のアミノ酸配列群、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントから選択されてもよい。ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１１１６～１１６７は、参照により本明細書に組込まれる。
（三量体化元素）
好適な実施形態において、三量体化要素は、フォールドン要素から選択されてもよい。好適な実施形態において、フォールドン要素は、フィブリチンフォールドン要素である。（好ましくはpre-fusion構造にて）安定している三量体スパイクタンパク質を発現させることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を大きく幅広いものにできる。
特に好適な実施形態においては、フィブリチンフォールドン要素を用いて、抗原の三量体化を促進させる。これにより、コードされているコロナウイルス抗原（好ましくはスパイクタンパク質）の免疫応答を促進できる。好ましくは、フォールドン要素は、バクテリオファージのものであるか、またはそれに由来する。好ましくは、フォールドン要素は、バクテリオファージＴ４のものであるか、またはそれに由来する。最も好ましくは、フォールドン要素は、バクテリオファージＴ４のフィブリチンであるか、またはそれに由来する。
特に好適な実施形態において、三量体化要素は、フォールドンであるか、またはそれに由来する。好ましくは、三量体化要素のアミノ酸配列は、配列番号１１４のアミノ酸配列、その断片またはバリアントのうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
他の実施形態において、核酸のコーディング配列が異種の三量体化要素をさらにコードしているとき、特に好ましく好適には、融合タンパク質を産生する。この融合タンパク質は、三量体化要素と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質とを含んでいる。好適には、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するスパイクタンパク質）は、Ｃ末端の膜貫通ドメインを欠失している（ａａ１２１２～ａａ１２７３を欠失している）。あるいは、Ｃ末端の膜貫通ドメインの一部（ＴＭｆｌｅｘ）を欠失している（例えば、ａａ１１４８～ａａ１２７３を欠失している）。
したがって、配列番号１～２６、２７４～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である任意のアミノ酸配列を改変して、ａａ１２１２～ａａ１２７３に位置する内在性膜貫通要素を欠失させてもよい。このように、本発明に関して、Ｃ末端短縮タンパク質として使用できる。さらに、配列番号１～２６、２７４～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である任意のアミノ酸配列はを改変して、ａａ１１４８～ａａ１２７３に位置する内在性膜貫通ドメインの一部（ＴＭｆｌｅｘ）を除去してもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。このように、本発明に関して、Ｃ末端短縮タンパク質として使用できる。Ｃ末端の膜貫通ドメイン（ＴＭまたはＴＭｆｌｅｘ）を欠失している好適なスパイクタンパク質は、配列番号３１～３９、１６１４～３６２３、１３３７７～１３５１０から選択されてもよい。
他の実施形態において、核酸のコーディング配列が上述の異種の三量体化要素をさらにコードしているとき、特に好ましく好適には、融合タンパク質を産生する。この融合タンパク質は、三量体化要素と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質断片Ｓ１に由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（Ｓ２、ＴＭおよび／またはＴＭｆｌｅｘを欠失している）を含んでいる。さらに、好適には、リンカー要素（例えば、配列番号１１５、１３１４８、１３１５２に記載のリンカー）を持強いて、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質から異種の抗原クラスター化要素を分離してもよい。
好適な実施形態において、異種の三量体化要素を含む１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。アミノ酸配列は、配列番号７６～８４、１０３～１１１、５６３４～６６３８、９６５４～１０６５８、１３７２２～１３７８８、１３９９０～１４０５６、２２７３４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列である。あるいは、アミノ酸配列は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第２６行、第３０行および第４１行）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
さらなる好適な三量体化要素は、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１１１６～１１６７のアミノ酸配列群、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントから選択されてもよい。ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１１１６～１１６７は、参照により本明細書に組込まれる。
（ＶＬＰ形成要素）
好適な実施形態においては、ＶＬＰ形成配列を選択し、本明細書に記載のコロナウイルス抗原と融合させてもよい。ＶＬＰ形態にて安定しているクラスター化したスパイクタンパク質を発現させることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を大きく幅広いものにできる。ＶＬＰは、感染性ウイルスを構造的に模倣して、強力な細胞性免疫応答および液性免疫応答を誘導できる。
好適なＶＬＰ形成配列は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、ＨＩＶ－１ Ｇａｇタンパク質またはウッドチャック肝炎コア抗原要素（ＷｈｃＡｇ）に由来する要素から選択されてもよい。
特に好適な実施形態において、１つ以上のＶＬＰ形成配列は、ウッドチャック肝炎コア抗原要素（ＷｈｃＡｇ）である。ＷｈｃＡｇ要素を用いて、ＶＬＰの形成を促進させる。これにより、コードされているコロナウイルス抗原（好ましくはスパイクタンパク質）の免疫応答を促進できる。
特に好適な実施形態において、ＶＬＰ形成配列は、フォールドンであるか、またはそれに由来する。好ましくは、ＶＬＰ形成配列のアミノ酸配列は、配列番号１３１７１のアミノ酸配列、その断片またはバリアントのうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらなる実施形態において、核酸のコーディング配列が異種のＶＬＰ形成配列をさらにコードしているとき、特に好ましく好適には、融合タンパク質を産生する。融合タンパク質は、ＶＬＰ形成配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するスパイクタンパク質）とを含んでいる。抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、Ｃ末端の膜貫通ドメインを欠失している（ａａ１２１２～ａａ１２７３を欠失している）。あるいは、Ｃ末端の膜貫通ドメインの一部（ＴＭｆｌｅｘ）を欠失してい（例えば、ａａ１１４８～ａａ１２７３を欠失している）。
したがって、配列番号１～２６、２７４～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である任意のアミノ酸配列を改変して、ａａ１２１２～ａａ１２７３に位置する内在性膜貫通要素を欠失させてもよい。このように、本発明に関して、Ｃ末端短縮タンパク質として使用できる。さらに、配列番号１～２６、２７４～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４いずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である任意のアミノ酸配列を改変して、ａａ１１４８～ａａ１２７３に位置する内在性膜貫通ドメインの一部（ＴＭｆｌｅｘ）を除去してもよい（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。このように、本発明に関して、Ｃ末端短縮タンパク質として使用できる。Ｃ末端の膜貫通ドメイン（ＴＭまたはＴＭｆｌｅｘ）を欠失している好適なスパイクタンパク質は、配列番号３１～３９、１６１４～３６２３、１３３７７～１３５１０から選択されてもよい。
他の実施形態において、核酸のコーディング配列が上述の異種のＶＬＰ形成配列をさらにコードしているとき、特に好ましく好適には、融合タンパク質を産生する。融合タンパク質は、ＶＬＰ形成配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質断片Ｓ１に由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（Ｓ２、ＴＭおよび／またはＴＭｆｌｅｘを欠失している）とを含んでいる。さらに、好適には、リンカー要素（例えば配列番号１１５、１３１４８、１３１５２のリンカー）を用いて、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質から異種の抗原クラスター化要素を分離する。
好適な実施形態において、異種のＶＬＰ形成配列を含む１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。アミノ酸配列は、配列番号６６３９～７６４３、１０６５９～１１６６３、１３７８９～１３８５５、１４０５７～１４１２３のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である１つ以上のアミノ酸配列である。あるいは、アミノ酸配列は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第３１行および第３５行）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
これに関連して、さらなる好適なＶＬＰ形成配列は、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１１６８～１２２７のアミノ酸配列群、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントから選択されてもよい。ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１１６８～１２２７は、参照により本明細書に組込まれる。
（異種の分泌性シグナルペプチド）
いくつかの実施形態において、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、異種のシグナルペプチドを含んでいる。異種のシグナルペプチドを用いて、コードされているコロナウイルス抗原の分泌性を向上できる。
好適な分泌性シグナルペプチドは、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１～１１１５、１７２８のアミノ酸配列群、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントから選択されてもよい。ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１～１１１５、１７２８は、参照により本明細書に組込まれる。
核酸のコーディング配列が異種の分泌性シグナルペプチドをさらにコードしている実施形態において、特に好ましく好適には、融合タンパク質を産生する。融合タンパク質は、異種の分泌性シグナルペプチドと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質を含んでいる。好適には、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するスパイクタンパク質）は、Ｎ末端の内在性分泌性シグナルペプチドを欠失している（ａａ１～ａａ１５を欠失している）。したがって、配列番号１～２６、２７４～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である任意のアミノ酸配列を改変して、ａａ１～ａａ１５に位置する内在性分泌性シグナルペプチドを欠失させてもよい。このように、本発明に関して、Ｎ末端短縮タンパク質として使用できる。
下記のリスト１では、上述した好適ななＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス抗原性ペプチドおよびタンパク質を、（命名法、タンパク質要素などについて）詳細に特定する。
リスト１：例示的な好適な本発明のタンパク質設計
・ａａ１～ａａ１２７３を含んでいる完全長スパイクタンパク質（Ｓ）
→配列番号１、２７４などを参照
・ａａ１～ａａ１２７３を含んでおり、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換を有している安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ）
→配列番号１０、３４１などを参照
・ａａ１～ａａ１２７３を含んでおり、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換を有している安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ）
→配列番号２２９６１などを参照
・ａａ１～ａａ１２７３を含んでおり、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換を有している安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ）
→配列番号２２９６０などを参照
・ａａ１～ａａ１２７３を含んでおり、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９ＰおよびＡ９４２Ｐのプロリン置換を有している安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｈｅｘ）
→配列番号２２７３２などを参照
・ａａ１～ａａ１２７３を含んでおり、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換とcavity-filling変異（Ｔ８８７Ｗ、Ａ１０２０Ｗ）とを有している安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｃａｖ）
→配列番号４０８などを参照
・ａａ１～ａａ１２７３を含んでおり、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換とcavity-filling変異（Ｐ１０６９Ｆ）とを有している安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｃａｖ）
→配列番号４７５などを参照
・ａａ１～ａａ１２７３を含んでおり、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換とcavity-filling変異（Ｈ１０４８Ｑ、Ｈ１０６４Ｎ、Ｈ１０８３Ｎ、Ｈ１１０１Ｎ）とを有している安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｐｒｏｔ）
→配列番号５４２などを参照
・ａａ１～ａａ１２７３を含んでおり、人工のジスルフィド結合であるＩ７１２ＣおよびＴ１０７７Ｃを有している安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ｄｉｓｕｌ）
→配列番号１９、６０９などを参照
・ａａ１～ａａ１２１１を含んでおり、膜貫通ドメインを有していないＳ（Ｓ＿ｗｏＴＭ）
→配列番号３１、１６１４などを参照
・ａａ１～ａａ１１４７含んでおり、膜貫通ドメイン屈曲部を有していないＳ
→配列番号２６１９などを参照
Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換を有しているＳ＿ｗｏＴＭ（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭ）
→配列番号４０、１６８１などを参照
Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換を有しているＳ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ）
→配列番号２６８６などを参照
・ａａ１～ａａ６８１を含んでいるスパイクタンパク質断片Ｓ１（Ｓ１）
→配列番号２７、１２７９などを参照
・ルマジンシンターゼを有しているＳ＿ｗｏＴＭ
→配列番号５８、３６２４などを参照
・ルマジンシンターゼを有しているＳ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ
→配列番号７６４４などを参照
・ルマジンシンターゼを有しているＳ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭ
→配列番号８５、３６９１などを参照
・ルマジンシンターゼを有しているＳ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ
→配列番号７７１１などを参照
・フェリチン要素を有しているＳ＿ｗｏＴＭ
→配列番号６７、４６２９などを参照
・フェリチン要素を有しているＳ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ
→配列番号８６４９などを参照
・フェリチン要素を有しているＳ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭ
→配列番号９４、４６９６などを参照
・フェリチン要素を有しているＳ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ
→配列番号８７１６などを参照
・フォールドン要素を有しているＳ＿ｗｏＴＭ
→配列番号７６、５６３４などを参照
・フォールドン要素を有しているＳ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ
→配列番号９６５４などを参照
・フォールドン要素を有しているＳ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭ
→配列番号１０３、５７０１などを参照
・フォールドン要素を有しているＳ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ
→配列番号９７２１などを参照
・ＶＬＰ配列（ＷｈｃＡｇ）を有しているＳ＿ｗｏＴＭ
→配列番号６６３９などを参照
・ＶＬＰ配列（ＷｈｃＡｇ）を有しているＳ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ
配列番号１０６５９などを参照
ＶＬＰ配列（ＷｈｃＡｇ）を有しているＳ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭ
→配列番号６７０６などを参照
・ＶＬＰ配列（ＷｈｃＡｇ）を構成するＳ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ＿ｗｏＴＭｆｌｅｘ
→配列番号１０７２６などを参照
フォールドン要素を有しているｔｒｕｎｃＲＢＤ
→配列番号２２７３４などを参照
・ルマジンシンターゼ（Ｃ末端）を有しているｔｒｕｎｃＲＢＤ
→配列番号２２７３５などを参照
・ルマジンシンターゼ（Ｎ末端）を有しているｔｒｕｎｃＲＢＤ
→配列番号２２７３６などを参照
・フェリチン要素を有しているｔｒｕｎｃＲＢＤ：
→例えば配列番号２２７３３を参照
※リスト１におけるアミノ酸位置は、配列番号１を基準とする。
第１の態様の特に好適な実施形態において、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。アミノ酸配列は、配列番号１０、２１、２２、２５、２７、２７４、３４１、４０８、４７５、５４２、７４３、８１０、１０１１、１１４５、１２１２、１２７９、８７１６、１０７２６、２２７３２～２２７５８、２２９２９～２２９４２、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、アミノ酸配列は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
上述したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する好ましい抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質を、表１に示す（第１行～第４１行）。表中、第１行～第４１行の各行は、好適なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスコンストラクトに対応する。表１のＡ列には、好適な抗原コンストラクトに関する簡単な説明を記載する。表１のＢ列には、各抗原コンストラクトのタンパク質（アミノ酸）の配列番号を記載する。表１のＣ列には、野生型の対応する核酸コーディング配列の配列番号を記載する。表１のＤ列には、Ｇ／Ｃを最適化した対応する核酸コーディング配列（ｏｐｔ１，ｇｃ）の配列番号を記載する。表１のＥ列には、ヒトのコドン使用頻度に適合させた対応する核酸コーディング配列（ｏｐｔ３，ｈｕｍａｎ）の配列番号を記載する。表１のＦ列にはＧ／Ｃ含有率を改変した対応する核酸コーディング配列（ｏｐｔ１０，ｇｃ ｍｏｄ）の配列番号を記載する。コーディング配列の詳細な説明については（好適なコーディング配列）のパラグラフを参照。
とりわけ、本発明の詳細な説明には、本出願のＳＴ２５配列表の＜２２３＞の欄に記載の情報が明示的に敵に含まれる。表１のコーディング配列（例えば、表１のコーディング配列を有しているｍＲＮＡ配列）を含んでいる好ましい核酸コンストラクトを、表３ａおよび表３ｂに示す。
Figure 2023513502000001
Figure 2023513502000002
Figure 2023513502000003
（好適なコーディング配列）
好適な実施形態によれば、本発明の核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスに由来する１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質（好ましくは上述のもの）またはその断片およびバリアントをコードしている、１つ以上のコーディング配列を有している。これに関して、本明細書に記載の１つ以上の抗原性タンパク質をコードしているコーディング配列またはその断片およびバリアントは、いずれも好適なコーディング配列として理解できる。それゆえ、本発明の核酸に含まれうる。
好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている１つ以上のコーディング配列を有していてもよいし、それからなっていてもよい。好ましくは、コーディング配列は、配列番号１～１１１、２７４～１１６６３、１３１７６～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２～２２７５８、２２９１７、２２９２３、２２９２９～２２９６４、２６９３８、２６９３９、またはその断片もしくはバリアントのうちいずれか１つをコードしている。理解すべきことには、核酸レベルにおいては、配列番号１～１１１、２７４～１１６６３、１３１７６～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２～２２７５８、２２９１７、２２９２３、２２９２９～２２９６４、２６９３８、２６９３９、またはその断片もしくはバリアントのうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であるアミノ酸配列をコードしている、任意の配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）を選択できる。したがって、これらの配列は、本発明の好適なコーディング配列として理解できる。上記のアミノ酸配列に関する追加情報を、表１（第Ａ列および第Ｂ列の第１行～第４１行を参照）、表３ａ、表３ｂおよびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、コーディング配列を有している。上記コーティング配列は１つ以上の核酸配列を含んでいる。核酸配列は、配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１３１４７、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１７７、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３１８４、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７に記載の配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。上記の核酸配列に関する追加情報を、表１（Ｃ列～Ｆ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）、表３ａ、表３ｂおよびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
あるいは、第１の態様の核酸は、コーディング配列を有している。コーティング配列は、１つ以上の核酸配列を含んでいる。核酸配列は、配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１３１４７、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１７７、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３１８４、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７に記載の配列（各配列における全てのウラシル（Ｕ）は、チミジン（Ｔ）によって置換されている）と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。上記の核酸配列に関する追加情報を、表１（Ｃ列～Ｆ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）、表３ａ、表３ｂおよびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、コーディング配列を有している。コーティング配列は、１つ以上の核酸配列を含んでいる。核酸配列は、配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４に記載の配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。上記の核酸配列に関する追加情報を表１（Ｃ列～Ｆ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）、表３ａ、表３ｂおよびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
あるいは、第１の態様の核酸は、コーディング配列を有している。コーティング配列は、１つ以上の核酸配列を含んでいる。核酸配列は、配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４（各配列における全てのウラシル（Ｕ）は、チミジン（Ｔ）によって置換されている）に記載の配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。上記の核酸配列に関する追加情報を、表１（Ｃ列～Ｆ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）、表３ａ、表３ｂおよびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、人工核酸である（人工ＤＮＡ、人工ＲＮＡなど）。
本明細書において、用語「人工核酸」が表そうと意図しているのは、天然には存在しない核酸である。つまり、人工核酸とは、非天然の核酸分子であると理解できる。これらの核酸分子が非天然であるのは、それ自体の配列のためであってもよいし（Ｇ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列、ＵＴＲなど）、他の修飾のためであってもよい（ヌクレオチドの構造の修飾など）。通常は、遺伝子工学によって人工核酸を設計・作製して、対応する所望の人工配列のヌクレオチドとする。これに関連して、人工核酸は、天然に存在しない配列（野生型配列／天然に存在する配列と１個以上のヌクレオチドが異なる配列）となりうる。用語「人工核酸」は、単一分子のみを意味するのではなく、実質的に同一である核酸分子の集合をも意味する理解される。したがって、人工核酸は、実質的に同一である複数の核酸分子に関連していてもよい。本明細書において、用語「人工核酸」は、人工ＤＮＡ（または、好ましくは人工ＲＮＡ）に関連していてもよい。
好適な実施形態において、第１の態様の核酸（好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ）は、改変および／または安定化させた核酸である。好ましくは、第１の態様の核酸は、改変および／または安定化させた人工核酸である。
したがって、好適な実施形態によれば、本発明の核酸は、「安定化させた人工核酸」または「安定化させたコーディング核酸」として提供されうる。これは、in vivoにおける分解耐性が向上している核酸であってもよいし、in vivoにおける安定性が向上している核酸であってもよいし、in vivoにおける翻訳性が向上している核酸であってもよい。以下では、上記に関連する特定の好適な修飾／適合について説明する。これは、核酸の安定化に適した修飾／適合である。好ましくは、本発明の核酸は、「安定化させたＲＮＡ」「安定化させたコーディングＲＮＡ」「安定化させたＤＮＡ」または「安定化させたコーディングＤＮＡ」として提供されうる。
このような安定化、本明細書に記載の乾燥核酸（乾燥ＤＮＡまたは乾燥ＲＮＡなど）および／または精製核酸（精製ＤＮＡまたは精製ＲＮＡなど）によって達成できる。その代わりにまたはそれに加えて、このような安定化は、例えば、本発明の核酸の骨格をリン酸修飾することによっても達成できる。本発明に関連して、骨格の修飾とは、核酸に含まれているヌクレオチドのリン酸骨格が化学的に改変されている修飾のことである。これに関連して、好適に使用できるヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート改変されたリン酸骨格を有している。好ましくは、リン酸骨格に含まれているリン酸酸素の１つ以上は、硫黄原子に置換されている。安定化させた核酸（好ましくは安定化させたＲＮＡ）の例としては、非イオン性リン酸アナログが挙げられる。非イオン性リン酸アナログの例としては、帯電しているリン酸酸素がアルキルまたはアリール基で置換されているアルキルホスホネートおよびアリールホスホネート、帯電している酸素残基がアルキル化した状態で残存しているホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルが挙げられる。このような骨格修飾には、典型的には、メチルホスホネート、ホスホラミデートおよびホスホロチオエートからなる群からの修飾が含まれる（ただし、これらには限定されない）。その例としては、シチジン－５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）が挙げられる。
本発明の核酸を安定化できる好適な改変について、以下に説明する。
好適な実施形態において、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）は、コドンを改変したコーディング配列の１つ以上を有している。
好適な実施形態において、核酸のコーディング配列の１つ以上は、コドンを改変したコーディング配列である。好ましくは、コドンを改変したコーディング配列の１つ以上によってコードされているアミノ酸配列は、対応する野生型コーディング配列または参照コーディング配列によってコードされているアミノ酸配列と変化していない。
用語「コドンを改変したコーディング配列」とは、対応する野生型コーディング配列または参照コーディング配列と比較して、１つ以上のコドン（１個のアミノ酸をコードしているヌクレオチドのトリプレット）が異なっているコーディング配列に関する。好適には、本発明に関連して、コドンを改変したコーディング配列は、in vivoにおける分解耐性が向上していてもよいし、in vivoにおける安定性が向上していてもよいし、in vivoにおける翻訳性が向上していてもよい。最も広義におけるコドン改変では、遺伝暗号の縮重を利用する。すなわち、複数のコドンが同じアミノ酸をコードしており、それらが互換可能に用いられる場合において（表２を参照）、コーディング配列を最適化／改変して、上述したようにin vivoに適用する。
用語「参照コーディング配列」とは、コーディング配列に関する。このコーディング配列は、改変および／または最適化され前の元々の配列である。
好適な実施形態において、核酸の１つ以上のコーディング配列は、コドンを改変したコーディング配列である。コドンを改変したコーディング配列は、Ｃを最大化したコーディング配列、ＣＡＩを最大化したコーディング配列、ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列、Ｇ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列、Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列、またはこれらの任意の組合せから選択される。
哺乳動物の宿主細胞にトランスフェクトしたときに、コドンを改変したコーディング配列を有している核酸は、１２～１８時間または１８時間超（例えば時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間時間または７２時間超）にわたって安定であり、哺乳動物の宿主細胞（筋細胞など）によって発現させられる。
哺乳動物の宿主細胞にトランスフェクトしたときに、コドンを改変したコーディング配列を有している核酸は、タンパク質に翻訳される。翻訳されるタンパク質の量は、天然に生じるタンパク質の量または哺乳動物性の宿主細胞に野生型コーディング配列または参照コーディング配列をトランスフェクトしたときに得られるタンパク質の量と比較して、同等以上である。好ましくは、翻訳されるたんぱく質の量は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、１００％以上または２００％以上多い。
好適な実施形態においては、本発明の核酸を改変して、１つ以上のコーディング配列のＣ含有率を、対応する野生型コーディング配列または参照コーディング配列のＣ含有率と比べて、向上（好ましくは最大化）させてもよい。このような配列を、本明細書では、「Ｃを最大化したコーディング配列」と称する。好ましくは、核酸のＣを最大化したコーディング配列によってコードされているアミノ酸配列は、野生型コーディング配列または参照コーディング配列によってコードされているアミノ酸配列と比べて変化していない。Ｃを最大化した核酸配列は、好適にはＷＯ２０１５／０６２７３８に記載の改変方法により作製できる。これに関連して、ＷＯ２０１５／０６２７３８の開示は、参照により本明細書に含まれる。
好適な実施形態においては、核酸を改変して、対応する野生型コーディング配列または参照コーディング配列のＧ／Ｃ含有率と比較して、１つ以上のコーディング配列のＧ／Ｃ含有率を最適化してもよい。このような配列を、本明細書では、「Ｇ／Ｃ含有率を最適化したコーディング配列」と称する。これに関連して、「最適化」とは、好ましくは、実質的に最大限までＧ／Ｃ含有率を向上させたコーディング配列を表す。好ましくは、核酸のＧ／Ｃ含有率を最適化したコーディング配列によってコードされているアミノ酸配列は、野生型コーディング配列または参照コーディング配列によってコードされているアミノ酸配列と比較して、変化していない。Ｇ／Ｃ含有率を最適化した核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、ＷＯ２００２／０９８４４３に記載の方法により作製できる。これに関連して、ＷＯ２００２／０９８４４３の開示は、その全体が本発明に組込まれる。本明細書を通して（配列表の＜２２３＞の欄を含む）、Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列を、略称「ｏｐｔ１」または「ｇｃ」によって示す。
好適な実施形態においては、核酸を改変して、１つ以上のコーディング配列中のコドンを、ヒトにおけるコドンの使用頻度に適合させてもよい。このような配列を、本明細書では、「ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列」と称する。同じアミノ酸をコードしているコドンであっても、ヒトにおいては、登場頻度が異なっている。したがって、好ましくは、核酸のコーディング配列を改変して、同じアミノ酸をコードしているコドンの頻度を、ヒトにおけるコドンの使用に従って天然に生じるコドンの頻度に適合させる。例えば、アミノ酸Ａｌａについては、コドン「ＧＣＣ」の使用頻度が０．４０となり、コドン「ＧＣＴ」の使用頻度が０．２８となり、コドン「ＧＣＡ」の使用頻度が０．２２となり、コドン「ＧＣＧ」の使用頻度が０．１０となるように、野生型コーディング配列または参照コーディング配列を適合させることが好ましい（表２参照）。このように、Ａｌａについて例示されている手順を、核酸のコーディング配列によってコードされている各アミノ酸に適用して、ヒトにおけるコドンの使用に適合させた配列を得る。本明細書を通して（配列表の＜２２３＞の欄を含む）、ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列を、略称「ｏｐｔ３」または「ｈｕｍａｎ」によって示す。
Figure 2023513502000004
実施形態においては、本発明の核酸を改変して１つ以上のコーディング配列のＧ／Ｃ含有率が、対応する野生型コーディング配列または参照コーディング配列のＧ／Ｃ含有率と比較して変化するようにしてもよい。このような配列を、本明細書では、「Ｇ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列」と称する。これに関連して、用語「Ｇ／Ｃを最適化した」または「Ｇ／Ｃ含有率を改変した」とは、対応する野生型コーディング配列または参照コーディング配列と比較して、グアノシンヌクレオチドおよび／またはシトシンヌクレオチドの数が改変されている（好ましくは増加している）核酸に関する。このような数の増加は、アデノシンヌクレオチドまたはチミジンヌクレオチドを含んでいるコドンを、グアノシンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチドを含んでいるコドンによって置換することで達成できる。有利には、Ｇ／Ｃ含有率が向上している核酸配列は、Ａ／Ｕ含有率が向上している配列よりも安定であるか、または発現性が向上している。好ましくは、核酸のＧ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列によってコードされているアミノ酸配列は、野生型配列または参照配列によってコードされているアミノ酸配列と比較して、変化していない。好ましくは、核酸のコーディング配列のＧ／Ｃ含有率は、対応する野生型または基準核酸配列のコーディング配列のＧ／Ｃ含有率よりも、１０％以上、２０％以上、３０％以上、好ましくは４０％以上増加している。本明細書では、Ｇ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列を、「ｏｐｔ １０」または「ｇｃ ｍｏｄ」と称する。
実施形態においては、核酸を改変して、１つ以上のコーディング配列のコドン適合指数（ＣＡＩ）を増加（好ましくは最大化）させてもよい。このような配列を、本明細書では、「ＣＡＩを最大化したコーディング配列」と称する。好ましくは、野生型核酸配列または参照核酸配列に含まれているヒトなどにおいては比較的稀である全てのコドンを、ヒトなどにおいて一般的であるコドンに置換する。このとき、頻度の高いコドンと、比較的稀なコドンとは、同じアミノ酸をコードしている。好適には、コードされているタンパク質の各アミノ酸について、最も頻度の高いコドンを使用する（表２を参照。頻度の高いヒトのコドンにはアスタリスクを付した）。好適には、核酸は１つ以上のコーディング配列を有しており、１つ以上のコーディング配列のコドン適合指数（ＣＡＩ）は、０．５以上、０．８以上、０．９以上または０．９５以上である。最も好ましくは、１つ以上のコーディング配列のコドン適合指数（ＣＡＩ）は１である（ＣＡＩ＝１）。例えば、アミノ酸Ａｌａの場合は、ヒトにおいて最も頻度の高いコドン「ＧＣＣ」がＡｌａのために常に使用されるように、野生型コーディング配列または参照コーディング配列を適合してもよい。このように、Ａｌａについて例示される手順を、核酸のコーディング配列によってコードされている各アミノ酸に適用すれば、ＣＡＩを最大化したコーディング配列を得る。
特に好適な実施形態において、核酸の１つ以上コーディング配列は、コドンを改変したコーディング配列である。コドンを改変したコーディング配列は、Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列、ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列、またはＧ／Ｃを改変したコーディング配列が選択される。
好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、コドンを改変した核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。コドンを改変した核酸配列は、配列番号１３６～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１７３１～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３１８４、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択されるコドンを改変した核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、コドンを改変した核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。上述の好適な核酸配列がコードしているものに関する追加情報は、配列表にも記載がある。特に、＜２２３＞の欄に詳細が記載されている。第１の態様の好適なコーディング配列を、表１に示す。上記の核酸配列に関する追加情報を、表１（Ｄ列～Ｆ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）、表３ａ、表３ｂおよびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
あるいは、第１の態様の核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、コドンを改変した核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。コドンを改変した核酸配列は、配列番号１３６～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１７３１～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３１８４、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７に記載の配列（各配列における全てのウラシル（Ｕ）は、チミジン（Ｔ）によって置換されている）と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、コドンを改変した核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。上記の核酸配列に関する追加情報を表１（Ｄ列～Ｆ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）、表３ａ、表３ｂおよびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
特に好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列を含んでいるか、またはそれからなる。Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列は、配列番号１３６～１３８、１４０、１４１、１４８、１４９、１５２、１５５、１５６、１５９、１６２、１６３、１６６、１６９、１７０、１７３、１１７３１～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１１９６６、１２２７１～１２４７２、１２７４３～１２９４４、１３５１４、１３５１５、１４１２４～１４１３２、１４１４２～１４１５０、１４１６０～１４１６８、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３０４０、２３０７７～２３１４８、２３１８９～２３２６０、２３２９７～２３３６８、２３４０９～２３４８０、２３５１７～２３５８８、２３６２９～２３７００、２３７３７～２３８０８、２３８４９～２３９２０、２３９５７～２４０２８、２４０６９～２４１４０、２４１７７～２４２４８、２４２８９～２４３６０、２４３９７～２４４６８、２４５０９～２４５８０、２４６１７～２４６８８、２４７２９～２４８００、２４８３７～２４９０８、２４９４９～２５０２０、２５０５７～２５１２８、２５１６９～２５２４０、２５２７７～２５３４８、２５３８９～２５４６０、２５４９７～２５５６８、２５６０９～２５６８０、２５７１７～２５７８８、２５８２９～２５９００、２５９３７～２６００８、２６０４９～２６１２０、２６１５７～２６２２８、２６２６９～２６３４０、２６３７７～２６４４８、２６４８９～２６５６０、２６５９７～２６６６８、２６７０９～２６７８０、２６８１７～２６８８８、２６９２５～２６９３７からなる群より選択されるコドンを改変した核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。上述の好適な核酸配列がコードしているものに関する追加情報は、配列表にも記載がある。特に、＜２２３＞の欄に詳細が記載されている。第１の態様の好適なコーディング配列を、表１に示す。上記の核酸配列に関する追加情報を、表１（Ｄ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）、表３ａ、表３ｂおよびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
特に好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列を含んでいるか、またはそれからなる。ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列は、配列番号１４２、１４３、１４５、１５０、１５３、１５７、１６０、１６４、１６７、１７１、１７４、１１９６７～１２０３３、１２４７３～１２５３９、１２９４５～１３０１１からなる群より選択されるコドンを改変した核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。上述の好適な核酸配列がコードしているものに関する追加情報は、配列表にも記載がある。特に、＜２２３＞の欄に詳細が記載されている。第１の態様の好適なコーディング配列を、表１に示す。上記の核酸配列に関する追加情報を、表１（Ｅ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）、表３ａおよびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
特に好適な実施形態において、第一の態様の核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列を含んでいるか、またはそれからなる。Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列は、配列番号１４６、１４７、１５１、１５４、１５８、１６１、１６５、１６８、１７２、１７５、１２０３４～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１２５４０～１２６７５、１３０１２～１３１４７、１３５１９、１３５２０、１４１３３～１４１４１、１４１５１～１４１５９、１４１６９～１４１７７、２３０４１～２３０７６、２３１４９～２３１８４、２３２６１～２３２９６、２３３６９～２３４０４、２３４８１～２３５１６、２３５８９～２３６２４、２３７０１～２３７３６、２３８０９～２３８４４、２３９２１～２３９５６、２４０２９～２４０６４、２４１４１～２４１７６、２４２４９～２４２８４、２４３６１～２４３９６、２４４６９～２４５０４、２４５８１～２４６１６、２４６８９～２４７２４、２４８０１～２４８３６、２４９０９～２４９４４、２５０２１～２５０５６、２５１２９～２５１６４、２５２４１～２５２７６、２５３４９～２５３８４、２５４６１～２５４９６、２５５６９～２５６０４、２５６８１～２５７１６、２５７８９～２５８２４、２５９０１～２５９３６、２６００９～２６０４４、２６１２１～２６１５６、２６２２９～２６２６４、２６３４１～２６３７６、２６４４９～２６４８４、２６５６１～２６５９６、２６６６９～２６７０４、２６７８１～２６８１６、２６８８９～２６９２４からなる群より選択されるコドンを改変した核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。上述の好適な核酸配列がコードしているものに関する追加情報は、配列表にも記載がある。特に、＜２２３＞の欄に詳細が記載されている。第１の態様の好適なコーディング配列を、表１に示す。上記の核酸配列に関する追加情報を、表１（Ｆ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
さらにより好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列を含んでいるか、またはそれからなる。Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列は、配列番号１３６～１３８、１４２、１４３、１４６、１４７、１１７３１、１１７９８～１１８０１、１１８０４、１１８０５、１１８０８、１１８１０～１１８１２、１１９２３、１１９５３、１２０３５、１２０４９、２２７５９～２２７８５、２２９６５～２２９８２、２３０７７～２３０９４、２３１４９からなる群より選択されるコドンを改変した核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列これらのいずれかの配列の断片またバリアントである。上述の好適な核酸配列がコードしているものに関する追加情報は、配列表にも記載がある。特に、＜２２３＞の欄に詳細が記載されている。第１の態様の好適なコーディング配列を、表１に示す。上記の核酸配列に関する追加情報を、表１（Ｆ列の第１行～第７行、第９行、第１１行～第４１行を参照）およびＳＴ２５配列表における各配列の配列番号の＜２２３＞の欄にも記載する。
特に好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原をコードしており、Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列を含んでいるか、またはそれからなる。Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列は、配列番号１３７に記載のコドンを改変した核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列は、その断片またはバリアントである。
さらに特に好適な実施形態において、第１の態様の核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原をコードしており、Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列を含んでいるか、またはそれからなる。Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列は、配列番号２３０９０、２３０９１、２３０９３、２３０９４に記載のコドンを改変した核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、Ｇ／Ｃを改変したコーディング配列は、その断片またはバリアントである。
さらなる実施形態において、第１の態様の核酸は、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原をコードしているコーディング配列を含んでいるか、またはそれからなる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原をコードしているコーディング配列は、配列番号２３１１３、２３１６７に記載のコドンを改変した核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原をコードしているコーディング配列は、その断片またはバリアントである。
（ＵＴＲ）
好適な実施形態において、本発明の核酸は、タンパク質をコードしている領域（コーディング配列またはｃｄｓ）と、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲとを有している。とりわけ、ＵＴＲは、調節配列要素を含んでいることがある。調節配列要素は、核酸（ＲＮＡなど）の代謝、安定性および局在化を決定する。さらに、ＵＴＲは、翻訳を促進する配列要素を有していてもよい。核酸配列（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の医学への応用において、核酸を１つ以上のペプチドまたはタンパク質へと翻訳することは、治療効果にとって非常に重要である。３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲの特定の組合せによれば、これらが作動可能に連結されているコーディング配列がコードしている、本発明のペプチドまたはタンパク質の発現を促進できる。ＵＴＲの組合せを有している核酸分子を被験体に投与（好ましくは筋肉内投与）した後には、有利には、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質を迅速かつ一過性に発現させるしたがって、本明細書に記載の特定の組合せの３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲを有している核酸は、ワクチンとしての投与に特に好適である。特に、被験体への筋肉内投与、真皮内投与または表皮内投与に適している。
好適には、本発明の核酸は、１つ以上の異種の５’ＵＴＲおよび／または１つ以上の異種の３’ＵＴＲを有している。異種の５’ＵＴＲまたは異種の３’ＵＴＲは、天然に存在する遺伝子に由来していてもよいし、合成により改変したものであってもよい。好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、１つ以上の（異種の）３’ＵＴＲおよび／または１つ以上の（異種の）５’ＵＴＲと作動可能に連結されている、本明細書に記載の１つ以上のコーディング配列を有しており、
好適な実施形態において、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）は、１つ以上の異種の３’ＵＴＲを有している。
用語「３’非翻訳領域」「３’ＵＴＲ」または「３’ＵＴＲ要素」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が表そうと意図しているのは、例えば、コーディング配列の３’側（すなわち下流）に位置しており、タンパク質に翻訳されない核酸分子の一部である。３’ＵＴＲは、コーディング配列と末端ポリ（Ａ）配列（任意構成）との間に位置している、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）の一部であってもよい。３’ＵＴＲは、遺伝子発現を制御するための要素（調節要素とも称される）を有していてもよい。このような調節要素の例としては、リボソーム結合部位、ｍｉＲＮＡ結合部位が挙げられる。
好ましくは、核酸は、３’ＵＴＲを有している。３’ＵＴＲは、ＲＮＡの半減期の延長に関する遺伝子（安定なＲＮＡを提供する遺伝子）から誘導できる。
いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、１つ以上のポリアデニル化シグナル、核酸の細胞内における位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、または１つ以上のｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ結合部位を有している。
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）とは、１９～２５ヌクレオチド長の非コーディングＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、遺伝子発現を下方制御する。この下方制御は、核酸分子の安定性を低下させるか、または翻訳を阻害することによって行われる。例えば、マイクロＲＮＡは、ＲＮＡを調節し、これによってタンパク質の発現を調節することが知られている。タンパク質の発現の調節は、例えば、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、心臓（ｍｉＲ－ｌｄ、ｍｉＲ－１４９）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）において行われる。ＲＮＡは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列またはマイクロＲＮＡ種を有していてもよい。このような配列は、例えば、任意の高値のマイクロＲＮＡに対応している（ＵＳ２００５／０２６１２１８およびＵＳ２００５／００５９００５に開示されているものなど）。
したがって、上述のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ結合部位を、３’ＵＴＲから除去したり３’ＵＴＲに導入したりすることにより、所望の細胞型または組織（筋細胞など）における核酸（ＲＮＡなど）の発現を調節できる。
好適な実施形態において、核酸は、１つ以上の異種の３’ＵＴＲを有している。１つ以上の異種の３’ＵＴＲは、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、αグロビン（ｍｕａｇとも表す）、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１およびＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいる。あるいは、１つ以上の異種の３’ＵＴＲは、これらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片またはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる。好ましくは、核酸配列は、配列番号２５３～２６８、２２９０２～２２９０５、２２８９２～２２８９５に記載の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの断片またはバリアントである。これに関連して特に好ましい核酸配列は、ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１（とりわけ、ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１のクレーム９）に由来するものであってよい。ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１のクレーム９に対応する３’ＵＴＲ配列（ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１の配列番号２３～３４またはその断片もしくは変異など）は、参照として本明細書に組込まれる。
特に好適な実施形態において、核酸は、αグロビン遺伝子に由来する３’ＵＴＲを有している。αグロビン遺伝子（ｍｕａｇ）に由来する３’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいてもよいし、それからなっていてもよい。核酸配列は、配列番号２６７、２６８、２２８９６～２２９０１、２２９０６～２２９１１と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらの断片またはバリアントである。
さらなる実施形態において、核酸は、ＲＰＳ９遺伝子に由来する３’ＵＴＲを有している。ＲＰＳ９遺伝子に由来する３’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいてもよいし、それからなっていてもよい。核酸配列は、配列番号２６３、２６４、２２８９４、２２８９５、２２９０４、２２９０５と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、それらの断片またはバリアントである。
好適な実施形態において、核酸は、ＰＳＭＢ３遺伝子に由来する３’ＵＴＲを有している。ＰＳＭＢ３遺伝子に由来する３’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいてもよいし、それからなっていてもよい。核酸配列は、配列番号２５３、２５４、２２８９２、２２８９３、２２９０２、２２９０３と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、それらの断片またはバリアントである。
他の実施形態において、核酸は、３’ＵＴＲを有している。３’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２２８７６～２２８９１と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、それらの断片またはバリアントである。
他の実施形態において、核酸は、ＷＯ２０１６／１０７８７７に記載の３’ＵＴＲを有している。３’ＵＴＲ配列に関するＷＯ２０１６／１０７８７７の開示は、参照により本明細書に組込まれる。好適な３’ＵＴＲは、ＷＯ２０１６／１０７８７７の配列番号１～２４、４９～３１８、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントである。他の実施形態において、核酸は、ＷＯ２０１７／０３６５８０に記載の３’ＵＴＲを有している。３’ＵＴＲ配列に関するＷＯ２０１７／０３６５８０の開示は、参照により本明細書に組込まれる。好適な３’ＵＴＲは、ＷＯ２０１７／０３６５８０の配列番号１５２～２０４、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントである。他の実施形態において核酸は、ＷＯ２０１６／０２２９１４に記載の３’ＵＴＲを有している。３’ＵＴＲ配列に関するＷＯ２０１６／０２２９１４の開示は、参照により本明細書に組込まれる。特に好ましい３’ＵＴＲは、ＷＯ２０１６／０２２９１４の配列番号２０～３６に記載の核酸配列、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントである。
好適な実施形態において、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）は、１つ以上の異種の５’ＵＴＲを有している。
用語「５’非翻訳領域」「５’ＵＴＲ」または「５’ＵＴＲ要素」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が表そうと意図しているのは、例えば、コーディング配列の５’側（すなわち上流）に位置しており、タンパク質に翻訳されない核酸分子の一部である。５’ＵＴＲは、コーディング配列の５’側に位置する核酸の一部であってもよい。通常、５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり、コーディング配列の開始コドンの前で終わる。５’ＵＴＲは、遺伝子発現を制御するための要素（調節要素とも称される）を有していてもよい。このような調節要素の例としては、リボソーム結合部位、ｍｉＲＮＡ結合部位が挙げられる。５’ＵＴＲは、転写後修飾されていてもよい。転写後修飾は、例えば、酵素的に行われてもよいし、５’キャップ構造の追加により行われてもよい（後述するｍＲＮＡなど）。
好ましくは、核酸は、５’ＵＴＲを有している。５’ＵＴＲは、ＲＮＡの半減期の延長に関する遺伝子（安定なＲＮＡを提供する遺伝子）から誘導できる。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、細胞内におけるＲＮＡの位置もしくは安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位の１つ以上、または１つ以上のｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ結合部位を有している（上述の通り）。
したがって、上述のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ結合部位を、５’ＵＴＲから除去したり５’ＵＴＲに導入したりすることにより、所望の細胞型または組織（筋細胞など）における核酸（ＲＮＡなど）の発現を調節できる。
好適な実施形態において、核酸は、１つ以上の異種の５’ＵＴＲを有している。１つ以上の異種の５’ＵＴＲは、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４ＢおよびＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいる。あるいは、１つ以上の異種の５’ＵＴＲは、これらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片またはバリアントである。核酸配列は、配列番号２３１～２５２、２２８７０～２２８７５と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である核酸配列である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの断片またはバリアントである。これに関連して、特に好ましい核酸配列は、ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１（とりわけ、ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１のクレーム９）からから選択されてもよい。ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１のクレーム９に対応する５’ＵＴＲ配列（ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１の配列番号１～２０またはその断片もしくはバリアントなど）は、参考として本明細書に組込まれる。
好適な実施形態において、核酸は、ＲＰＬ３１遺伝子に由来する５’ＵＴＲを有している。ＲＰＬ３１遺伝子に由来する５’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２４３、２４４、２２８７２、２２８７３と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、その断片またはバリアントである。
他の実施形態において、核酸は、ＳＬＣ７Ａ３遺伝子に由来する５’ＵＴＲを有している。ＳＬＣ７Ａ３遺伝子に由来する５’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２４５、２４６、２２８７４、２２８７５と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、その断片またはバリアントである。
特に好適な実施形態において、核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する５’ＵＴＲを有している。ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する５’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２３１、２３２、２２８７０、２２８７１と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、その断片またはバリアントである。
他の実施形態において、核酸は、５’ＵＴＲを有している。５’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２２８４８～２２８６９と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、その断片またはバリアントである。
他の実施形態において、核酸は、ＷＯ２０１３／１４３７００に記載の５’ＵＴＲを有している。５’ＵＴＲ配列に関連するＷＯ２０１３／１４３７００の開示は、参照により本明細書に組込まれる。特に好ましい５’ＵＴＲは、ＷＯ２０１３／１４３７００の配列番号１～１３６３、１３９５、１４２１、１４２２に由来する核酸配列、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントである。他の実施形態において、核酸は、ＷＯ２０１６／１０７８７７に記載の５’ＵＴＲを有している。５’ＵＴＲ配列に関するＷＯ２０１６／１０７８７７の開示は、参照により本明細書に組込まれる。特に好ましい５’ＵＴＲは、ＷＯ２０１６／１０７８７７の配列番号２５～３０、３１９～３８２に記載の核酸配列、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントである。他の実施形態において、核酸は、ＷＯ２０１７／０３６５８０に記載の５’ＵＴＲを有している。５’ＵＴＲ配列に関連するＷＯ２０１７／０３６５８０の開示は、参照により本明細書に組込まれる。特に好ましい５’ＵＴＲは、ＷＯ２０１７／０３６５８０の配列番号１～１５１に記載の核酸配列、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントである。他の実施形態において、核酸は、ＷＯ２０１６／０２２９１４に記載の５’ＵＴＲを有している。５’ＵＴＲ配列に関するＷＯ２０１６／０２２９１４の開示は、参照により本明細書に組込まれる。特に好ましい５’ＵＴＲは、ＷＯ２０１６／０２２９１４の配列番号３～１９に記載の核酸配列、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントである。
好適には、好適な実施形態において、核酸は、本明細書に記載の１つ以上の抗原性タンパク質（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスに由来する）をコードしている、本明細書に記載の１つ以上のコーディング配列を有している。コーディング配列は、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲと作動可能に連結されている。３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲは、下記の５’ＵＴＲ／３’ＵＴＲの組合せ（「ＵＴＲ設計」とも称する）から選択される。
ａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）
ａ－２（ＮＤＵＦＡ４／ＰＳＭＢ３）
ａ－３（ＳＬＣ７Ａ３／ＰＳＭＢ３）
ａ－４（ＮＯＳＩＰ／ＰＳＭＢ３）
ａ－５（ＭＰ６８／ＰＳＭＢ３）
ｂ－１（ＵＢＱＬＮ２／ＲＰＳ９）
ｂ－２（ＡＳＡＨ１／ＲＰＳ９）
ｂ－３（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＲＰＳ９）
ｂ－４（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＡＳＰ１）
ｂ－５（ＮＯＳＩＰ／ＣＯＸ６Ｂ１）
ｃ－１（ＮＤＵＦＡ４／ＲＰＳ９）
ｃ－２（ＮＯＳＩＰ／ＮＤＵＦＡ１）
ｃ－３（ＮＤＵＦＡ４／ＣＯＸ６Ｂ１）
ｃ－４（ＮＤＵＦＡ４／ＮＤＵＦＡ１）
ｃ－５（ＡＴＰ５Ａ１／ＰＳＭＢ３）
ｄ－１（Ｒｐｌ３１／ＰＳＭＢ３）
ｄ－２（ＡＴＰ５Ａ１／ＣＡＳＰ１）
ｄ－３（ＳＬＣ７Ａ３／ＧＮＡＳ）
ｄ－４（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＮＤＵＦＡ１）
ｄ－５（Ｓｌｃ７ａ３／Ｎｄｕｆａ１）
ｅ－１（ＴＵＢＢ４Ｂ／ＲＰＳ９）
ｅ－２（ＲＰＬ３１／ＲＰＳ９）
ｅ－３（ＭＰ６８／ＲＰＳ９）
ｅ－４（ＮＯＳＩＰ／ＲＰＳ９）
ｅ－５（ＡＴＰ５Ａ１／ＲＰＳ９）
ｅ－６（ＡＴＰ５Ａ１／ＣＯＸ６Ｂ１）
ｆ－１（ＡＴＰ５Ａ１／ＧＮＡＳ）
ｆ－２（ＡＴＰ５Ａ１／ＮＤＵＦＡ１）
ｆ－３（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＯＸ６Ｂ１）
ｆ－４（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＧＮＡＳ）
ｆ－５（ＭＰ６８／ＣＯＸ６Ｂ１）
ｇ－１（ＭＰ６８／ＮＤＵＦＡ１）
ｇ－２（ＮＤＵＦＡ４／ＣＡＳＰ１）
ｇ－３（ＮＤＵＦＡ４／ＧＮＡＳ）
ｇ－４（ＮＯＳＩＰ／ＣＡＳＰ１）
ｇ－５（ＲＰＬ３１／ＣＡＳＰ１）
ｈ－１（ＲＰＬ３１／ＣＯＸ６Ｂ１）
ｈ－２（ＲＰＬ３１／ＧＮＡＳ）
ｈ－３（ＲＰＬ３１／ＮＤＵＦＡ１）
ｈ－４（Ｓｌｃ７ａ３／ＣＡＳＰ１）
ｈ－５（ＳＬＣ７Ａ３／ＣＯＸ６Ｂ１）
ｉ－１（ＳＬＣ７Ａ３／ＲＰＳ９）
ｉ－２（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７）
ｉ－２（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７）
ｉ－３（αグロビン遺伝子）
特に好適な態様において、核酸は、本明細書に記載の１つ以上のコーディング配列を有している。コーディング配列は、１つ以上の抗原性タンパク質（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスに由来する）をコードしている。コーディング配列は、ＨＳＤ１７Ｂ４の５’ＵＴＲおよびＰＳＭＢ３の３’ＵＴＲに作動可能に連結されている（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３、ＵＴＲ設計：ａ－１）。
本発明者らが示したところによると、この実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答の誘導に特に有益である。これに関連して、１回のワクチン接種で既に充分なウイルス中和抗体価が得られたことが示されている。
さらに好適な態様において、核酸は、本明細書に記載の１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、本明細書に記載の１つ以上の抗原性タンパク質（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスに由来する）をコードしている。コーディング配列は、ＳＬＣ７Ａ３の５’ＵＴＲおよびＰＳＭＢ３の３’ＵＴＲに作動可能に連結されている（ＳＬＣ７Ａ３／ＰＳＭＢ３、ＵＴＲ設計：ａ－３）。
さらに好適な実施形態において、核酸は、本明細書に記載の１つ以上のコーディング配列を有している。つ以上のコーディング配列は、本明細書に記載の１つ以上の抗原性タンパク質（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスに由来する）をコードしている。コーディング配列は、ＲＰＬ３１の５’ＵＴＲおよびＲＰＳ９の３’ＵＴＲに作動可能に連結されている（ＲＰＬ３１／ＲＰＳ９、ＵＴＲ設計：ｅ－２）。
特に好適な実施形態において、核酸は、本明細書に記載の１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、本明細書に記載の１つ以上の抗原性タンパク質（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスに由来する）をコードしている。コーディング配列は、αグロビン（ｍｕａｇ）の３’ＵＴＲ（－／ｍｕａｇ）に作動可能に連結されている（ＵＴＲ設計：ｉ－３））。
いくつかの実施形態において、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）は、モノシストロン、バイシストロンまたはマルチシストロンでありうる。
用語「モノシストロン」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、１個のコーディング配列のみを有している核酸である。本明細書において、用語「バイシストロン」または「マルチシストロン」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が表そうと意図しているのは、例えば、２個のコーディング配列を有している核酸（バイシストロン）またはそれ以上のコーディング配列を有している核酸（マルチシストロン）である。
好適な態様において、第１の態様の核酸は、モノシストロンである。
他の実施形態において、核酸は、モノシストロンである。核酸のコーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する、２つ以上の異なる抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。したがって、コーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質を、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上およびそれ以上コードしていてもよい。抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、アミノ酸リンカー配列で連結されていてもよいし、連結されていなくてもよい。リンカー配列は、剛性リンカー、可撓性リンカー、切断性リンカー、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。本明細書においては、このようなコンストラクトを、「多抗原コンストラクト」と称する。
さらなる実施形態において、核酸は、バイシストロンまたはマルチシストロンであってもよい。核酸は、２つ以上のコーディング配列を有している。２つ以上のコーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する、２つ以上の異なった抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。したがって、バイシストロンまたはマルチシストロンの核酸に含まれているコーディング配列は、本明細書に記載の区別可能な抗原性タンパク質もしくは抗原性ペプチド、その免疫原性断片または免疫原性バリアントをコードするのに好適である。好ましくは、バイシストロンコンストラクトまたはマルチシストロンコンストラクトに含まれているコーディング配列は、１つ以上のＩＲＥＳ配列（内部リボソーム進入部位配列）によって分断されている。したがって、「２つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている」ととの表現は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの異なる単離株の（好ましくは異なる）抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質を、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上またはそれ以上コードしているバイシストロン核酸またはマルチシストロン核酸を意味していてもよい（ただし、これらには限定されない）。あるいは、バイシストロン核酸またはマルチシストロン核酸は、例えば、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する（好ましくは異なる）抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質を、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上またはそれ以上コードしていてもよい。これに関連して、好適なＩＲＥＳ配列は、ＷＯ２０１７／０８１０８２の配列番号１５６６～１６６２に記載の核酸配列群、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントから選択されてもよい。これに関連して、ＩＲＥＳ配列に関するＷＯ２０１７／０８１０８２の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
本発明に関連して理解すべきことには、コーディング配列の特定の組合せは、モノシストロン、バイシストロンおよびマルチシストロンのＤＮＡコンストラクト、ＲＮＡコンストラクトおよび／または多抗原コンストラクトの任意の組合せによって達成できる。これにより、本明細書に記載の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質を複数個コードしている核酸群が得られる。
好適な実施形態において、核酸のリボソーム結合部位の周囲におけるＡ／Ｕ（Ａ／Ｔ）の含有率は、野生型核酸または参照核酸のリボソーム結合部位の周囲におけるＡ／Ｕ（Ａ／Ｔ）含有率と比較して、増加していてもよい。この改変（リボソーム結合部位の周囲におけるＡ／Ｕ（Ａ／Ｔ）含有率の増加）により、例えば、核酸（ＲＮＡなど）へのリボソーム結合効率が向上する。リボソーム結合部位へのリボソームの結合効率が向上すると、核酸を効率的に翻訳できる。
したがって、特に好適な実施形態において、核酸は、Kozak配列とも称するリボソーム結合部位を有している。リボソーム結合部位は、配列番号１８０、１８１、２２８４５～２２８４７のうちいずれか１つと同一であるか、または８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上同一である。あるいは、リボソーム結合部位は、その断片またはバリアントである。
好適な実施形態において、本発明の核酸は、１つ以上のポリ（Ｎ）配列を有している。１つ以上のポリ（Ｎ）配列の例としては、１つ以上のポリ（Ａ）配列、１つ以上のポリ（Ｕ）配列、１つ以上のポリ（Ｃ）配列、またはこれらの組合せが挙げられる。
好適な実施形態において、本発明の核酸（好ましくはＲＮＡ）は、１つ以上のポリ（Ａ）配列を有している。
本明細書において、用語「ポリ（Ａ）配列」「ポリ（Ａ）テール」または「３’ポリ（Ａ）テール」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が意図しているのは、例えば、通常は直鎖ＲＮＡ（または環状ＲＮＡ）の３’末端に位置している、最大で約１０００におよびアデノシンヌクレオチドの配列である。好ましくは、ポリ（Ａ）配列は、実質的にホモポリマーである。例えば、１００個のアデノシンヌクレオチドのポリ（Ａ）配列の長さは、実質的に１００ヌクレオチドである。他の実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、アデノシンヌクレオチドとは異なる１つ以上のヌクレオチドによって中断されてもよい。例えば、１００個のアデノシンヌクレオチドのポリ（Ａ）配列の長さは、１００ヌクレオチド超であってもよい。この場合、１００個のアデノシンヌクレオチドに加えて、アデノシンヌクレオチドとは異なる１個以上のヌクレオチド（または一連のヌクレオチド）を含んでいる。理解すべきことには、本明細書に記載の「ポリ（Ａ）配列」は、典型的にはＲＮＡに関連するが、本発明に関連して、この用語は、ＤＮＡ分子に含まれている対応する配列（ポリ（Ｔ）配列など）にも同様に関連している。
ポリ（Ａ）配列に含まれているアデノシンヌクレオチドは、約１０～約５００個、約１０～約２００個、約４０～約２００個または約４０～約１５０個であってもよい。好適には、ポリ（Ａ）配列の長さは、約１０個以上、約５０個以上、約６４個以上、約７５個以上、約１００個以上、約２００個以上、約３００個以上、約４００個以上または約５００個以上のアデノシンヌクレオチドであってもよい。
好適な態様において、核酸は、１つ以上のポリ（Ａ）配列を有している。１つ以上のポリ（Ａ）配列は、約３０～約２００個のアデノシンヌクレオチドを含んでいる。特に好適な実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、約６４個のアデノシンヌクレオチドを含んでいる（Ａ６４）。他の特に好適な実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、約１００個のアデノシンヌクレオチドを含んでいる（Ａ１００）。他の実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、約１５０個のアデノシンヌクレオチドを含んでいる。
さらなる実施形態において、核酸は、１つ以上のポリ（Ａ）配列を有している。１つ以上のポリ（Ａ）配列は、約１００個のアデノシンヌクレオチドを含んでいる。ポリ（Ａ）配列は、アデノシン以外のヌクレオチドによって中断されている。好ましくは１０個のアデノシン以外のヌクレオチドによって中断されている（Ａ３０－Ｎ１０－Ａ７０）。
本明細書に記載のポリ（Ａ）配列は、核酸の３’末端に直接位置していてもよい。好ましくは、ＲＮＡの３’末端に直接位置していてもよい。
好適な実施形態において、３’末端のヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の３’末端における最後のヌクレオチド）は、１つ以上のポリ（Ａ）配列の３’末端のＡヌクレオチドである。用語「３’末端に直接位置している」とは、厳密に３’末端に位置すると理解せねばならない。つまり、核酸の３’末端は、Ａヌクレオチドで終結するポリ（Ａ）配列からなっている。
本発明者らが示したところによると、この実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答の誘導に特に有益である。これに関連して、１回のワクチン接種で既に充分なウイルス中和抗体価が得られたことが示されている。
特に好適な実施形態において、核酸配列（好ましくはＲＮＡ）は、ポリ（Ａ）配列を有している。ポリ（Ａ）配列は、７０個以上のアデノシンヌクレオチドを含んでいる。３’末端のヌクレオチドは、アデノシンヌクレオチドである。
これに関連して、末端をアデノシンヌクレオチドとすることにより、ＲＮＡワクチンによるＩＦＮ－αの誘導が低減されることが示されている。この事実は特に重要である。なぜならば、ＩＦＮ－αの誘導は、ワクチン接種した被験体における、発熱の発生の主要因であると考えられており、この発熱は当然回避すべきであるためである。
核酸がＲＮＡである実施形態において、核酸のポリ（Ａ）配列は、好ましくは、in vitroにおけるＲＮＡ転写において、ＤＮＡテンプレートから得られる。他の実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、必ずしもＤＮＡテンプレートから転写される必要はなく、化学合成の一般的方法によってin vitroで得られる。他の実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、（in vitroにおけるＲＮＡの転写後における）ＲＮＡの酵素的ポリアデニル化によって生じる。この場合、市販のポリアデニル化キットおよび対応する本技術分野で周知のプロトコルを使用する。あるいは、ポリ（Ａ）配列は、固定化ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて生じる。この場合、例えば、ＷＯ２０１６／１７４２７１に記載の方法および手段を用いる。
核酸は、酵素的ポリアデニル化によって得られるポリ（Ａ）配列を有していてもよい。核酸分子の大部分は、約１００個（＋／－２０個）～約５００個（＋／－５０個）のアデノシンヌクレオチドを含んでいる。好ましくは約２５０個（＋／－２０個）のアデノシンヌクレオチドを含んでいる。
他の実施形態において、核酸は、テンプレートＤＮＡに由来するポリ（Ａ）配列を有していてもよい。核酸は、酵素的ポリアデニル化によって生じる１つ以上のさらなるポリ（Ａ）配列をさらに含んでいてもよい。例えば、ＷＯ２０１６／０９１３９１を参照。
さらなる実施形態において、核酸は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを有している。
他の実施形態において、核酸は、１つ以上のポリ（Ｃ）配列を有していてもよい。
本明細書において、用語「ポリ（Ｃ）シークエンス」とは、最大で約２００個のシトシンヌクレオチドの配列を意図している。好適な実施形態において、ポリ（Ｃ）配列に含まれているシトシンヌクレオチドは、約１０個～約２００個、約１０個～約１００個、約２０個～約７０個、約２０個～約６０個または約１０個～約４０個である。特に好適な実施形態において、ポリ（Ｃ）配列は、約３０個のシトシンヌクレオチドを含んでいる。
好適な実施形態において、核酸は、１つ以上のヒストンステムループ（ｈＳＬ）を有している。
用語「ヒストンステムループ（配列表などにおいてはｈＳＬと略記する）」表そうと意図しているのは、主としてヒストンｍＲＮＡに見られ、ステムループ二次構造を形成している核酸配列である。
ヒストンステムループ配列／構造は、好適には、ＷＯ２０１２／０１９７８０に開示されているヒストンステムループ配列から選択されてもよい。この文献のヒストンステムループ配列／ヒストンステムループ構造に関する開示は、参照により本明細書に組込まれる。本発明において使用できるヒストンステムループ配列は、好ましくは、ＷＯ２０１２／０１９７８０の式（Ｉ）または（ＩＩ）に由来していてもよい。さらに好適な実施形態によれば、核酸は、ＷＯ２０１２／０１９７８０に記載の具体的な式（Ｉａ）または（ＩＩａ）の１つ以上に由来する１つ以上のヒストンステムループ配列を有していてもよい。
好適な実施形態において、本発明の核酸は、１つ以上のヒストンステムループを有している。ヒストンステムループ（ｈＳＬ）は、核酸配列を含むか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１７８または１７９と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、その断片またはバリアントである。
他の実施形態において、第１の態様のＲＮＡは、本明細書に記載のヒストンステムループを有していない。
いくつかの実施形態において（とりわけ、ＲＮＡに関する実施形態において）、核酸は、３’末端配列要素を有している。３’末端配列要素は、ポリ（Ａ）配列と、任意構成でヒストンステムループ配列とを含んでいる。したがって、本発明の核酸は、１つ以上の３’末端配列要素を有している。１つ以上の３’末端配列要素は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１８２～２３０、２２９１２、２２９１３と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、その断片またはバリアントである。
好適な実施形態において（とりわけ、ＲＮＡに関する実施形態において）、核酸は、３’末端配列要素を有している。３’末端配列要素は、ポリ（Ａ）配列と、任意構成でヒストンステムループ配列とを含んでいる。したがって、本発明の核酸は、１つ以上の３’末端配列要素を有している。３’末端配列要素は、核酸配列を含むか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１８２、１８７、１８９、１９２、１９９、２０７と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、その断片またはバリアントである。
種々の実施形態において（とりわけ、ＲＮＡに関する実施形態において）、核酸は、配列番号１７６、１７７、２２８４０～２２８４４に記載の５’末端配列要素、そのまたはその断片もしくはバリアントを有している。このような５’末端配列要素は、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの結合部位を含んでいる。さらに、５’末端開始配列の最初のヌクレオチドは、好ましくは、２’－Ｏ－メチル化されている（２’－Ｏ－メチル化グアノシンまたは２’－Ｏ－メチル化アデノシンなど）。
好ましくは、第１の態様の核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）に含まれているヌクレオチドは、通常、約５０～約２００００個、約５００～約１００００個、または約１０００～約１００００個である。好ましくは、約１０００～約５０００個である。より一層好ましくは、約２０００～約５０００個である。
いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
種々の実施形態において、ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡまたは直鎖コーディングＤＮＡのコンストラクトである。ＤＮＡは、本明細書に記載の核酸要素を含んでいるか、またはそれからなる（コーディング配列、ＵＴＲ、ポリ（Ａ／Ｔ）、ポリアデニル化シグナル、プロモーターなど）。
好適な態様において、核酸は、ＤＮＡ発現ベクターである。このようなＤＮＡ発現ベクターは、細菌性プラスミド、アデノウイルス、ポックスウイルス、パラポックスウイルス（オルフウイルス）、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、レンチウイルス、ラムダファージ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、Listeria sp.およびSalmonella sp.からなる群より選択されてもよい。
好適には、ＤＮＡは、プロモーターをさらに有していてもよい。プロモーターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原コーディング配列と作動可能に連結されている。抗原コーディング配列に作動可能に連結されているプロモーターの例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター（ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなど）、Moloneyウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ前初期プロモーターなど）、Epstein Barrウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、Rous肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。プロモーターは、ヒト遺伝子由来のプロモーターであってもよい（ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンまたはヒトメタロチオネインなど）。プロモーターは、組織特異的なプロモーターであってもよい（（天然または合成の）筋肉特異的プロモーター、皮膚特異的プロモーターなど）。このようなプロモーターの例は、ＵＳ２００４０１７５７２７に開示されている。好適な実施形態において、ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０またはｐｒｏｖａｘである。あるいは、ベクターは、コロナウイルス抗原をコードしているＤＮＡを発現させら、細胞に配列を翻訳させて免疫系に認識される抗原を生じさせることができる、他の任意の発現ベクターである。
さらに好適なプラスミドＤＮＡを作成して、細胞株にコードされているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原を効率的に産生させてもよい。例えば昆虫細胞株においては、ＷＯ２００９／１５０２２２Ａ２に記載の、クレーム１～３３に定義されるベクターなどを使用できる。ＷＯ２００９／１５０２２２Ａ２のクレーム１～３３は、参照により本明細書に組込まれる。
他の実施形態において、第１の態様の核酸は、アデノウイルス系ベクターである。このようなアデノウイルス系ベクターは、本明細書に記載の１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている、１つ以上のコーディング配列を有していてもよい。
本発明に関連して、任意の適切なアデノウイルス系ベクターを使用できる（ＷＯ２００５／０７１０９３またはＷＯＷＯ２００６／０４８２１５に記載のものなど）。好適には、使用されるアデノウイルス系ベクターは、サルアデノウイルスである。これにより、ヒトに対する一般的な既存抗体（ＡｄＨｕ５など）による、ワクチン接種後における免疫応答の減衰を回避する。好適なサルアデノウイルスベクターの例としては、ＡｄＣｈ６３（ＷＯ２００５／０７１０９３）またはＡｄＣｈ６８(Cohen et al J. Gen Virol 2002 83:151)が挙げられる。しかし、他のベクターを使用してもよい。好適には、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域を欠損している。これにより、ヒト細胞における複製能を欠損させる。アデノウイルスの他の領域（Ｅ３およびＥ４など）を欠損させてもよい。
さらなる実施形態において、第１の態様の核酸は、オルフウイルス系ベクターである。このようなアデノウイルス系ベクターは、本明細書に記載の１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている、１つ以上のコーディング配列を有していてもよい。
本発明の特に好適な実施形態において、本発明の核酸は、ＲＮＡである。
好ましくは、ＲＮＡに含まれているヌクレオチドは、通常は、約５０～約２００００個、約５００～約１００００個または約１０００～約１００００個である。好ましくは、約１０００～約５０００個である。より一層好ましくは、約２０００～約５０００個である。
好適な実施形態によれば、核酸は、ＲＮＡ（好ましくはコーディングＲＮＡ）である。
好適な実施形態において、コーディングＲＮＡは、ｍＲＮＡ、（コーディング）自己複製ＲＮＡ、（コーディング）環状ＲＮＡ、（コーディング）ウイルスＲＮＡまたは（コーディング）レプリコンＲＮＡから選択されてもよい。
他の実施形態において、コーディングＲＮＡは、環状ＲＮＡである。本明細書において、「環状ＲＮＡ」または「ｃｉｒｃＲＮＡ」とは、本明細書に記載の１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている、環状ポリヌクレオチドコンストラクトであると理解せねばならない。好ましくは、このようなｃｉｒｃＲＮＡは、１本鎖ＲＮＡ分子である。好適な実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上のコーディング配列を有している。１つ以上のコーディング配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する１つ以上の抗原性タンパク質、その免疫原性断片または免疫原性バリアントをコードしている。
さらなる実施形態において、コーディングＲＮＡは、レプリコンＲＮＡである。用語「レプリコンＲＮＡ」は、当業者によって認識・理解される。この用語が意図しているのは、例えば、最適化された自己複製ＲＮＡである。このようなコンストラクトの例としては、アルファウイルスなどに由来するレプリカーゼ要素（ＳＦＶ、ＳＩＮ、ＶＥＥまたはＲＲＶなど）、所定の核酸（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしているコーディング配列）による構造ウイルスタンパク質の置換体が挙げられる。あるいは、レプリカーゼは、独立したコーディングＲＮＡまたはコーディングＤＮＡのコンストラクトとして提供されてもよい。レプリカーゼの下流には、レプリコンＲＮＡの複製を制御するサブゲノムプロモーターがあってもよい。
特に好適な実施形態において、１つ以上の核酸は、レプリコンＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡではない。
特に好適な態様において、本発明の核酸は、ｍＲＮＡである。
好ましくは、ｍＲＮＡは、レプリカーゼ要素（レプリカーゼをコードしている核酸など）を有していない。
用語「ＲＮＡ」および「ｍＲＮＡ」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が意図しているのは、例えば、リボ核酸分子（ヌクレオチドからなるポリマー）である。これらのヌクレオチドは、通常は、アデノシン一リン酸モノマー、ウリジン一リン酸モノマー、グアノシン一リン酸モノマーおよびシチジン一リン酸モノマーであり、いわゆる骨格に沿って互いに連結されている。骨格は、隣接する第１モノマーの糖（リボース）と、第２モノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成されている。モノマーの特異的な連続をＲＮＡ配列と呼ぶ。ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）が提供するヌクレオチドコーディング配列は、特定のペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に翻訳されうる。
本発明に関連して、コーディングＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原性タンパク質をコードしている１つ以上のコーディング配列を提供してもよい。１つ以上のコーディング配列は、投与後に（例えば、ヒト被験体などへの被験体への投与後に）、（機能性の）抗原に翻訳される。
したがって、コーディングＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、ワクチン（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン）に好適である。
好適には、コーディングＲＮＡは、５’キャップ構造の付加によって改変されていてもよい。好ましくは、５’キャップ構造、（被験体への投与後に）コーディングＲＮＡを安定化させたり、コードされている抗原の発現を促進したり、先天免疫系の刺激を減少させたりする。５’キャップ構造は、核酸が直鎖コーディングＲＮＡ（直鎖ｍＲＮＡなど）または直鎖コードレプリコンＲＮＡである実施形態において特に重要である。
したがって、好適な実施形態において、ＲＮＡ（特にコーディングＲＮＡ）は、５’キャップ構造を有している。好ましくは、ＲＮＡは、ｃａｐ０構造、ｃａｐ１構造、ｃａｐ２構造、改変ｃａｐ０構造または改変ｃａｐ１構造を有している。
本明細書において、用語「５’キャップ構造」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の５’末端に位置している、５’修飾ヌクレオチド（特にグアニンヌクレオチド）である。好ましくは、５’キャップ構造は、５’－５’三リン酸結合を介してＲＮＡと連結している。
本発明に関連して好適な５’キャップ構造の例としては、ｃａｐ０（ｍ７ＧｐｐｐＮなどの第１の核酸塩基のメチル化）、ｃａｐ１（ｍ７ＧｐｐｐＮに隣接するヌクレオチドのリボースの追加メチル化）、ｃａｐ２（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第２のヌクレオチドのリボースの追加メチル化）、ｃａｐ３（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第３のヌクレオチドのリボースの追加メチル化）、ｃａｐ４（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第４のヌクレオチドのリボースの追加メチル化）、ＡＲＣＡ（抗リバースキャップアナログ）、改変ＡＲＣＡ（ホスホチオエート改変ＡＲＣＡなど）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオログアノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソグアノシン、２－アミノグアノシン、ＬＮＡ－グアノシンおよび２－アジドグアノシンが挙げられる。
５’キャップ（ｃａｐ０またはｃａｐ１）構造は、化学的なＲＮＡ合成において形成させてもよいし、キャップアナログを用いたin vitroにおけるＲＮＡの転写において形成させてもよい（共転写キャッピング）。
本明細書において、用語「キャップアナログ」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、キャップ機能を有している非重合性のジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドである。キャップ機能とは、核酸分子の５’末端に組込んだときに、翻訳または局在化を容易にしたり、核酸分子（特にＲＮＡ分子）の劣化を防止したりする機能である。非重合性とは、キャップアナログが５’末端にのみ組込まれることを意味する。これは、５’三リン酸を有していないので、テンプレート依存性ポリメラーゼ（特にテンプレート依存性ＲＮＡポリメラーゼ）によって３’方向に伸長できないためである。キャップアナログの例としては、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップアナログ（ＧｐｐｐＧなど）；ジメチル化キャップアナログ（ｍ２，７ＧｐｐｐＧなど）、トリメチル化キャップアナログ（ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧなど）、ジメチル化対称キャップアナログ（ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇなど）、または抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ；ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧおよびそれらの四リン酸誘導体など）からなる群より選択される化学構造が挙げられる（ただし、これらには限定されない）。さらなるキャップアナログも公開されている（ＷＯ２００８／０１６４７３、ＷＯ２００８／１５７６８８、ＷＯ２００９／１４９２５３、ＷＯＷＯ２０１１／０１５３４７、およびＷＯ２０１３／０５９４７５）。これに関連して、さらなる好適なキャップアナログは、ＷＯ２０１７／０６６７９３、ＷＯ２０１７／０６６７８１、ＷＯ２０１７／０６６７９１、ＷＯ２０１７／０６６７８９、ＷＯ２０１７／０５３２９７、ＷＯ２０１７／０６６７８２、ＷＯ２０１８／０７５８２７、およびＷＯ２０１７／０６６７９７に開示されている。ャップアナログに言及している開示は、参照により本明細書に組込まれる。
いくつかの実施形態においては、ＷＯ２０１７／０５３２９７、ＷＯ２０１７／０６６７９３、ＷＯ２０１７／０６６７８１、ＷＯ２０１７／０６６７９１、ＷＯ２０１７／０６６７８９、ＷＯ２０１７／０６６７８２、ＷＯ２０１８／０７５８２７およびＷＯ２０１７／０６６７９７に開示されているトリヌクレオチドキャップアナログを用いて、改変ｃａｐ１構造を作製する。特に、ＷＯ２０１７／０５３２９７のクレーム１～５に開示されている構造から誘導される任意のキャップ構造を適宜使用して、改変ｃａｐ１構造を共転写的に作製できる。さらに、ＷＯ２０１８／０７５８２７のクレーム１または２１に記載の構造から誘導される任意のキャップ構造を適宜使用して、改変ｃａｐ１構造を共転写的に作製できる。
好適な実施形態において、（コーディング）ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、ｃａｐ１構造を有している。
好適な実施形態においては、本明細書に記載のin vitroにおけるＲＮＡの転写反応において、本明細書に記載のトリヌクレオチドキャップアナログを用いて、５’キャップ構造を共転写的に好適に付加できる。
好適な実施形態において、本発明のコーディングＲＮＡのｃａｐ１構造は、トリヌクレオチドキャップアナログであるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧまたはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧを用いた共転写キャッピングによって形成される。これに関連する好ましいｃａｐ１アナログは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧである。
他の好適な実施形態において、本発明のＲＮＡのｃａｐ１構造は、トリヌクレオチドキャップアナログである３’ＯＭｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧを用いた共転写キャッピングによって形成される。
他の実施形態において、本発明のＲＮＡのｃａｐ０構造は、キャップアナログである３’ＯＭｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを用いた共転写キャッピングによって形成される。
他の実施形態において、５’キャップ構造は、キャッピング酵素を用いた酵素的キャッピングによって形成され、ｃａｐ０構造、ｃａｐ１構造またはｃａｐ２構造を生じさせる。キャッピング酵素の例としては、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および／またはキャップ依存性２’－Ｏメチルトランスフェラーゼが挙げられる。ＷＯ２０１６／１９３２２６に開示されている方法および手段を利用して、固定化キャッピング酵素および／またはキャップ依存性２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて５’キャップ構造（ｃａｐ０またはｃａｐ１）を付加してもよい。
好適な実施形態において、キャッピングアッセイにより測定したときに、ＲＮＡ（種）の約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％がｃａｐ１構造を有している。好適な実施形態において、キャッピングアッセイにより測定したときに、ＲＮＡ（種）の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満がｃａｐ１構造を有していない。他の好適な実施形態において、キャッピングアッセイにより測定したときに、ＲＮＡ（種）の約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％がｃａｐ０構造を有している。好適な実施形態において、キャッピングアッセイにより測定したときに、ＲＮＡ（種）の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満がｃａｐ０構造を有していない。
用語「ＲＮＡ種」は、単一分子のみを意味するのではなく、実質的に同一のＲＮＡ分子の集合も含まれると理解される。したがって、本発明は、実質的に同一の複数の（コーディング）ＲＮＡ分子に関するものでありうる。
ｃａｐ０構造またはｃａｐ１構造の有無を決定するために、ＷＯ２０１５／１０１４１６に開示されているキャッピングアッセイ（特に、ＷＯ２０１５／１０１４１６のクレーム２７～４６に記載のキャッピングアッセイ）を利用できる。ＲＮＡのｃａｐ０構造またはｃａｐ１構造の存在／非存在を決定するために利用できる他のキャッピングアッセイは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６６７、ＷＯ２０１４／１５２６７３およびＷＯ２０１４／１５２６５９に開示されている。
好適な実施形態において、ＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）キャップ構造を有している。この実施形態において、コーディングＲＮＡは、５’末端ｍ７Ｇキャップと、ｍ７ＧｐｐｐＮに隣接しているヌクレオチドのリボースの追加のメチル化（この場合は２’－Ｏ－メチル化アデノシン）とを有している。好ましくは、キャッピングアッセイにより測定したときに、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％のＲＮＡ（種）がｃａｐ１構造を有している。
他の好適な実施形態において、ＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）キャップ構造を有している。この実施形態において、コーディングＲＮＡは、５’末端ｍ７Ｇキャップと、隣接するヌクレオチドのリボースの追加のメチル化（この場合は２’－Ｏ－メチル化グアノシン）とを有している。好ましくは、キャッピングアッセイにより測定したときに、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％のコーディングＲＮＡ（種）がｃａｐ１構造を有している。
したがって、ＲＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列の最初のヌクレオチド（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ構造の下流のヌクレオチド）は、２’－Ｏ－メチル化グアノシンまたは２’－Ｏ－メチル化アデノシンであってもよい。
いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡは、改変ＲＮＡである。改変には、糖または塩基の修飾に加えて、骨格の修飾も含まれる。
改変ＲＮＡは、ヌクレオチドアナログ／修飾を有していてもよい（骨格、糖または塩基の修飾など）。本発明に関連して、骨格の修飾とは、ＲＮＡのヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に改変されている修飾である。本発明に関連して、糖の修飾とは、ＲＮＡのヌクレオチドの糖の化学修飾である。本発明に関連して、塩基の修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。これに関連して、ヌクレオチドアナログまたは修飾は、好ましくは、転写および／または翻訳に利用できるヌクレオチドアナログから選択される。
特に好適な実施形態において、本明細書に記載の改変ＲＮＡに含まれていてもよいヌクレオチドアナログ／改変は、好ましくは下記から選択される：２－アミノ－６－クロロプリンリボシド－５’－三リン酸、２－アミノプリン－リボシド－５’－三リン酸、２－アミノアデノシン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－三リン酸、２－チオシチジン－５’－三リン酸、２－チオウリジン－５’－三リン酸、２’－フルオロチミジン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチル－イノシン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルシチジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルウリジン－５’－三リン酸、５－ブロモシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモウリジン－５’－三リン酸、５－ブロモ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、５－ヨードシチジン－５’－三リン酸、５－ヨード－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－ヨードウリジン－５’－三リン酸、５－ヨード－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、５－プロピニル－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－プロピニル－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、６－アザシチジン－５’－三リン酸、６－アザウリジン－５’－三リン酸、６－クロロプリンリボシド－５’－三リン酸、７－デアザアデノシン－５’－三リン酸、７－デアザグアノシン－５’－三リン酸、８－アザアデノシン－５’－三リン酸、８－アジドアデノシン－５’－三リン酸、ベンゾイミダゾール－リボシド－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｏ６－メチルグアノシン－５’－三リン酸、シュードウリジン－５’－三リン酸またはプロマイシン－５’－三リン酸、キサントシン－５’－三リン酸。特に好ましくは、塩基修飾に用いられるヌクレオチドは、下記からなる群より選択される：５－メチルシチジン－５’－三リン酸、７－デアザグアノシン－５’－三リン酸、５－ブロモシチジン－５’－三リン酸，シュードウリジン－５’－三リン酸、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、２－アミノプリン、２、６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン，２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ウイオシン、ウィブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－ウリジン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－シュードウリジン、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、α－チオ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、α－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、５－メチル－ウリジン、ピロロ－シチジン、イノシン、α－チオ－グアノシン、６－メチル－グアノシン、５－メチル－シチジン、８－オキソ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、シュード－イソ－シチジン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシン。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、下記から選択される：シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、５－メチルウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジン。
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のコーディング配列に含まれているウラシルの１００％が化学修飾を有している。好ましくは、ウラシルの５位が化学修飾されている。
本発明に関連して特に好ましいのは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メチルシトシンおよび５－メトキシウリジンである。
しかし、いくつかの実施形態において、実施形態のポリヌクレオチド分子には、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）で置換されている位置がない。さらなる態様において、実施形態のポリヌクレオチド分子はに、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メチルシトシンおよび５－メトキシウリジンで置換されている位置がない。さらなる態様において、実施形態のポリヌクレオチド分子は、Ｇヌクレオチド、Ｃヌクレオチド、ＡヌクレオチドおよびＵヌクレオチドのみからなるコーディング配列を有している。
シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メチルシトシンおよび／または５－メトキシウリジンなどの修飾ヌクレオチドをＲＮＡのコーディング配列に含ませることは、有利である場合がある。これは、（コーディングＲＮＡまたはワクチンの投与時における）望ましくない先天免疫応答を調節または（場合によっては）減少させられるためである。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原性タンパク質をコードしている１つ以上のコーディング配列を有している。コーディング配列は、シュードウリジン（ψ）およびＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）から選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでいる。好ましくは、全てのウラシルヌクレオチドが、シュードウリジン（ψ）ヌクレオチドおよび／またはＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）ヌクレオチドで置換されている。
好適な実施形態において、ＲＮＡには、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）で置換されている位置がない。さらなる実施形態において、ＲＮＡには、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メチルシトシンおよび５－メトキシウリジンで置換されている位置がない。
好適な実施形態において、ＲＮＡは、Ｇヌクレオチド、Ｃヌクレオチド、ＡヌクレオチドおよびＵヌクレオチドのみからなる。それゆえ、ＲＮＡは、修飾ヌクレオチドを含んでいない（キャップアナログを除く）。
（コロナウイルスワクチンに適した核酸（好ましくはｍＲＮＡ）コンストラクト）
種々の実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、好ましくは５’から３’方向に下記の要素を有している。
（Ａ）５’キャップ構造（好ましくは本明細書に記載のもの）
（Ｂ）５’末端開始要素（好ましくは本明細書に記載のもの）
（Ｃ）任意構成の５’ＵＴＲ（好ましくは本明細書に記載のもの）
（Ｄ）リボソーム結合部位（好ましくは本明細書に記載のもの）
（Ｅ）１つ以上のコーディング配列（好ましくは本明細書に記載のもの）
（Ｆ）３’ＵＴＲ（好ましくは本明細書に記載のもの）
（Ｇ）任意構成のポリ（Ａ）配列（好ましくは本明細書に記載のもの）
（Ｈ）任意構成のポリ（Ｃ）配列（好ましくは本明細書に記載のもの）
（Ｉ）任意構成のヒストンステムループ（好ましくは本明細書に記載のもの）
（Ｊ）任意構成の３’末端配列要素（好ましくは本明細書に記載のもの）
好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、好ましくは５’から３’方向に下記の要素を有している。
（Ａ）ｍ７Ｇ（５’）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）から選択される、５’キャップ構造
（Ｂ）配列番号１７６、１７７、その断片またはバリアントから選択される、５’末端開始要素
（Ｃ）任意構成で、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する５’ＵＴＲ
（Ｄ）配列番号１８０、１８１、２２８４５～２２８４７、その断片またはバリアントから選択されるリボソーム結合部位
（Ｅ）配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４、その断片またはバリアントから選択される１つ以上のコーディング配列
（Ｆ）ＰＳＭＢ３遺伝子またはαグロビン遺伝子（ｍｕａｇ）の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ
（Ｇ）任意構成で、約３０～約５００個のアデノシンを含んでいるポリ（Ａ）配列
（Ｈ）任意構成で、約１０～約１００個のシトシンを含んでいるポリ（Ｃ）配列
（Ｉ）任意構成で、配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ
（Ｊ）任意構成で、配列番号１８２～２３０から選択される３’末端配列要素
特に好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を有している。
（Ａ）本明細書に記載のｃａｐ１構造
（Ｂ）配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４、その断片またはバリアントから選択されるコーディング配列
（Ｃ）本明細書に記載のｍｕａｇ遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２６７、２６８、２２８９６～２２９０１、２２９０６～２２９１１に記載のもの）
（Ｄ）約６４個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列
（Ｅ）約１０～約１００個のシトシンを含んでいるポリ（Ｃ）配列
（Ｆ）配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ
好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を有している。
（Ａ）本明細書に記載のｃａｐ１構造
（Ｂ）本明細書に記載のＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する５’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２３１または２３２に記載のもの）
（Ｃ）配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４、その断片またはバリアントから選択されるコーディング配列
（Ｄ）本明細書に記載のＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２５３または２５４に記載のもの）
（Ｅ）約６４個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列
（Ｆ）任意構成で、約１０～約１００個のシトシンを含んでいるポリ（Ｃ）配列
（Ｇ）配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ
（Ｈ）任意構成で、配列番号１８２～２３０の３’末端配列要素
特に好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を有している。
（Ａ）本明細書に記載のｃａｐ１構造
（Ｂ）本明細書に記載のＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する５’ＵＴＲ、（好ましくは、配列番号２３１または２３２に記載のもの）
（Ｃ）配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４、その断片またはバリアントから選択されるコーディング配列
（Ｄ）本明細書に記載のＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２５３または２５４のもの）
（Ｅ）配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ
（Ｆ）約１００個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列（好ましくは、３’末端に相当する）
さらに好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を有している。
（Ａ）本明細書に記載のｃａｐ１構造
（Ｂ）本明細書に記載のＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する５’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２３１または２３２に記載のもの）
（Ｃ）配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４、その断片またはバリアントから選択されるコーディング配列
（Ｄ）本明細書に記載のＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは配列番号２５３または２５４に記載のもの）
（Ｆ）約１００個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列（好ましくは、３’末端に相当する）
さらに好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を有している。
（Ａ）本明細書に記載のｃａｐ１構造
（Ｂ）本明細書に記載のＳＬＣ７Ａ３遺伝子に由来する５’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２４５または２４６に記載のもの）
（Ｃ）配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４、その断片またはバリアントから選択されるコーディング配列
（Ｄ）本明細書に記載のＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２５３または２５４に記載のもの）
（Ｅ）任意構成で、配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ
（Ｆ）約１００個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列（好ましくは、３’末端に相当する）
さらに好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を有している。
（Ａ）本明細書に記載のｃａｐ１構造
（Ｂ）本明細書に記載のＲＰＬ３１遺伝子に由来する５’ＵＴＲ（好ましくは配列番号２４３または２４３に記載のもの）
（Ｃ）配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４、その断片またはバリアントから選択されるコーディング配列
（Ｄ）本明細書に記載のＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２６３または２６４に記載のもの）
（Ｅ）任意構成で、配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ
（Ｆ）約１００個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列（好ましくは、３’末端に相当する）
本発明の好ましい核酸配列（好ましくはｍＲＮＡ配列）を表３ａに示す。表３ａにおいて、各行は、特に好適な本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コンストラクトを表す（表１と対応）。表３ａのＡ列には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コンストラクトの説明を記載する。Ｂ列には、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コンストラクトのアミノ酸配列の配列番号を記載する。各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コンストラクトをコードしているコーディング配列に対応する配列番号は、表１に記載している。追加情報は、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄に記載している。
Ｃ列およびＤ列には、対応する核酸（好ましくはコーディングＲＮＡ配列、特に好ましくはコーディング配列を有しているｍＲＮＡ配列）を記載する。Ｃ列には、本明細書に記載のＵＴＲの組合せ「ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３」を有している核酸配列を記載する。Ｄ列には、本明細書に記載のαグロビンの３’ＵＴＲを有している核酸配列を記載する。
Figure 2023513502000005
Figure 2023513502000006
Figure 2023513502000007
さらに好ましい核酸配列（好ましくは本発明のｍＲＮＡ配列）を表３ｂに示す。表３ｂにおいて、各列は、本発明の特に好適なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）コンストラクトを表す（表１および表３ａと対応）。Ｂ列には、表１および表３ａの第１行の全長スパイクタンパク質（Ｓ）を記載する。Ｃ列には、表１および表３ａの第２行と比較した安定化させたスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ＿ＰＰ）を記載する。
第１行には、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コンストラクトのアミノ酸配列の配列番号を記載する。各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コンストラクトをコードしているコーディング配列に対応する配列番号は、表１に記載している。追加情報は、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄に記載している。
第２行～第１６行には、対応する核酸（好ましくはコーディングＲＮＡ配列、特に好ましくはコーディング配列を有しているｍＲＮＡ配列）を記載する。各行には、ＵＴＲの組合せおよび好適な３’末端を有している核酸配列を記載する。
Figure 2023513502000008
好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。各核酸配列に関する追加情報を、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄、表３ａ（特にＣ列およびＤ列を参照）および表３ｂ（特に第２行～第１６行を参照）にも記載している。
特に好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１６２～１７５、１２６７６～１３１４７、１４１６０～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。各核酸配列に関する追加情報を、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄、表３ａ（特にＤ列を参照）および表３ｂ（第２行）にも記載している。
特に好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１６１、１２２０４～１２６７５、１４１４２～１４１５９、２２７８６～２２８１２、２３４０９～２３６２４、２４７２９～２４９４４からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。各核酸配列に関する追加情報を、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄、表３ａ（特にＣ列を参照）および表３ｂ（第３行および第７行を参照）に記載している。
特に好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４９～１５４、１５６～１６１、１６３～１６８、１７０～１７５、１２３３８、１２３５２、１２５４１、１２５５５、１２８１０、１２８２４、１３０１３、１３０２７、２２７８６、２２７９２、２２７９４、２２７９６、２２７９８、２２８００、２２８０２、２２８０４、２２８０６、２２８０８、２２８１０、２２８１２、２２８１３、２２８１９、２２８２１、２２８２３、２２８２５、２２８２７、２２８２９、２２８３１、２２８３３、２２８３５、２２８３７、２２８３９、２３５１７～２３６２４、２３２９７～２３４０４、２４８３７～２４９４４からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。各核酸配列に関する追加情報を、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄、表３ａ（Ｃ列およびＤ列、第２行および第６行を参照）および表３ｂ（Ｃ列を参照）に記載している。
さらにより好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４９、１５６、１２３３８、１５０、１５７、１５１、１５８、１２５４１、１６３、１７０、１２８１０、１６４、１７１、１６５、１７２、１３０１３、１２３４２～１２３５１、１２５４５～１２５５４、１２８１４～１２８２３、１３０１７～１３０２６、１４１３３からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。各核酸配列に関する追加情報を、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄、表３ａおよび表３ｂに記載している。
さらにより好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４９、１５０、１５１、１６３、１６４、１６５からなる群より選択される。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。各核酸配列に関する追加情報を、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄および表３（Ｃ列およびＤ列、第２行を参照）に記載している。
特に好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１６３の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらなる特に好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４９の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらなる特に好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２４８３７の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらに好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２３３１１、２３５３１、２４８５１の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらに好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２３３１０、２３５３０、２４８５０の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらに好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２３３１３、２３５３３、２４８５３、２３３１４、２３５３４、２４８５４の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらなる実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２６６３３の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらなる実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２６９０７の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらに好適な実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。ＲＮＡ配列は、本明細書に記載のＣａｐ１構造を有している。各核酸配列に関する追加情報を、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄、表３ａおよび表３ｂに記載している。
さらなる実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。ＲＮＡ配列において、１つ以上のウラシルヌクレオチド（好ましくは全てのウラシルヌクレオチド）は、シュードウリジン（ψ）ヌクレオチドおよび／またはＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）ヌクレオチドに置換されている。各核酸配列に関する追加情報を、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄、表３ａおよび表３ｂに記載している。
さらなる実施形態において、核酸（好ましくはＲＮＡ）は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。ＲＮＡ配列は、本明細書に記載のｃａｐ１構造を有している。ＲＮＡ配列において、１つ以上のウラシルヌクレオチド（好ましくは全てのウラシルヌクレオチド）は、シュードウリジン（ψ）ヌクレオチドおよび／またはＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）ヌクレオチドに置換されている。各核酸配列に関する追加情報を、配列表の各配列番号の＜２２３＞の欄、表３ａおよび表３ｂに記載している。
明細書を通じて記載している通り、好適なアミノ酸配列または核酸配列（コーディング配列、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列）に関する追加情報を、配列表から導出してもよい。特に、下記に説明するように＜２２３＞の欄に詳細が記載されている。
特定の実施形態において、本発明の核酸はＲＮＡである。ＲＮＡは、本技術分野で周知の方法によって作製できる。このような方法の例としては、化学合成（固相ＲＮＡ合成など）、in vitroにおける方法（in vitroにおけるＲＮＡ転写反応など）が挙げられる。したがって、好適な実施形態において、ＲＮＡは、in vitroにおけるＲＮＡ転写によって得られる。
したがって、好適な実施形態において、本発明の核酸は、好ましくはin vitroにおいて転写されたＲＮＡである。
用語「in vitroにおけるＲＮＡの転写」または「in vitroにおける転写」は、無細胞系（in vitro）でＲＮＡを合成するプロセスに関する。適切なＤＮＡテンプレートをＤＮＡ依存的にin vitroにおいて転写して、ＲＮＡを得てもよい。本発明に係るＤＮＡテンプレートは、直鎖化したプラスミドＤＮＡテンプレートまたはＰＣＲで増幅したＤＮＡテンプレートである。in vitroにおけるＲＮＡの転写を制御するためのプロモーターは、任意のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための、任意のプロモーターであってよい。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。本発明の好適な実施形態においては、ＤＮＡテンプレートを適当な制限酵素で直鎖化した後、in vitroにおいてＲＮＡを転写する。
in vitroにおけるＲＮＡの転写に使用される試薬には、通常、次のものが含まれる：
・バクテリオファージがコードしているＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６またはＳｙｎ５）などのＲＮＡポリメラーゼに対する結合親和性が高いプロモーター配列を有している、ＤＮＡテンプレート（直鎖化されたプラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ産物）
・４種類の塩基（アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシル）に対するリボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）
・任意構成で、本明細書に記載のキャップアナログ
・任意構成で、本明細書に記載の修飾ヌクレオチド
・ＤＮＡテンプレートに含まれているプロモーター配列に結合可能な、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼなど）
・任意構成で、潜在的に混入する任意のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を不活性化するためのリボヌクレアーゼ阻害剤
・任意構成で、ピロホスフェート（in vitroにおけるＲＮＡの転写を阻害しうる）を分解するためのピロホスファターゼ
・ポリメラーゼの補因子であるＭｇ２＋イオンを供給するＭｇＣｌ２
・好適なｐＨ値を維持するためのバッファ（ＴＲＩＳまたはＨＥＰＥＳ）であって、最適濃度の酸化防止剤（ＤＴＴなど）および／またはポリアミン（スペルミジンなど）を含んでいてもよいバッファ（例えば、ＷＯ２０１７／１０９１６１に開示されているＴＲＩＳ－クエン酸塩を含んでいるバッファ系）
好適な実施形態において、本発明のＲＮＡのｃａｐ１構造は、トリヌクレオチドキャップアナログであるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧまたはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧを用いた共転写キャッピングによって形成される。本発明のコーディングＲＮＡの作製において好適に使用できる好ましいｃａｐ１アナログは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧである。
特に好適な実施形態において、本発明のＲＮＡのキャップ１構造は、トリヌクレオチドキャップアナログである３’ＯＭｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧを用いた共転写キャッピングによって形成される。
他の実施形態において、本発明のＲＮＡのキャップ０構造は、キャップアナログである３’ＯＭｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを用いた共転写キャッピングによって形成される。
さらなる実施形態において、in vitroにおけるＲＮＡの転写において使用されるヌクレオチド混合物は、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。これに関連して、好ましい修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、５－メチルシトシンおよび５－メトキシウリジンから選択されてもよい。特定の実施形態において、ヌクレオチド混合物中のウラシルヌクレオチドは、シュードウリジン（Ψ）および／またはＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）によって（部分的または完全に）置換されており、これにより改変ＲＮＡを得る。
好適な実施形態において、in vitroにおけるＲＮＡの転写において使用されるヌクレオチド混合物は、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドを含んでいない。好適な実施形態において、in vitroにおけるＲＮＡの転写において使用されるヌクレオチド混合物は、Ｇヌクレオチド、Ｃヌクレオチド、ＡヌクレオチドおよびＵヌクレオチドと、任意構成で本明細書に記載のキャップアナログとのみを含んでいる。
好適な実施形態においては、in vitroにおけるＲＮＡの転写反応に使用されるヌクレオチド混合物（すなわち、混合物中の各ヌクレオチドの画分）を、好ましくは、所与のＲＮＡ配列について最適化してもよい（ＷＯ２０１５／１８８９３３を参照）。
これに関連して、in vitroにおける転写は、配列最適化されているヌクレオチド混合物および任意構成でキャップアナログの存在下で行われる。好ましくは、配列最適化されているヌクレオチド混合物は、化学修飾ヌクレオチドを含んでいない。
これに関連して、配列最適化されているヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、所与の配列のＲＮＡ分子をin vitroにおいて転写反応させるためのヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の混合物であって、４種類のヌクレオシド三リン酸であるＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを含んでいる。配列最適化されているヌクレオシド三リン酸の混合物中の４種類のヌクレオシド三リン酸のそれぞれの画分は、ＲＮＡ分子に含まれている各ヌクレオチドの画分に対応している。ＲＮＡ分子にリボヌクレオチドが存在しないならば、対応するヌクレオシド三リン酸は、配列最適化されているヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の混合物にも含まれていない。
本明細書に記載の２つ以上の異なるＲＮＡを作製する必要がある実施形態において（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の異なるＲＮＡを作製する必要がある実施形態（第２の態様を参照）において）は、ＷＯ２０１７／１０９１３４に記載の手順が好適に使用できる。
核酸系ワクチンの生産に関連して、ＧＭＰグレードの核酸（ＧＭＰグレードのＲＮＡまたはＤＮＡなど）の提供が必要となることがある。ＧＭＰグレードのＲＮＡまたはＤＮＡは、規制当局によって承認された製造プロセスによって製造できる。したがって、特に好適な実施形態においては、現行の製造管理・品質管理基準（ＧＭＰ）に基づいてＲＮＡを製造する、好ましくは、ＷＯ２０１６／１８０４３０に従って、ＤＮＡおよびＲＮＡレベルで種々の品質管理工程を実施する。好適な実施形態において、本発明のＲＮＡは、ＧＭＰグレードのＲＮＡ（特にＧＭＰグレードのｍＲＮＡ）である。したがって、ワクチン用のＲＮＡは、好ましくはＧＭＰグレードのＲＮＡである。
好ましくは、得られたＲＮＡ産物を精製する。精製には、PureMessenger (R)（CureVac, Tuebingen, Germany；ＷＯ２００８／０７７５９２に従うＲＰ－ＨＰＬＣ）、タンジェンシャルフロー濾過（ＷＯ２０１６／１９３２０６に記載の通り）および／またはオリゴｄ（Ｔ）精製（ＷＯ２０１６／１８０４３０を参照）を使用する。
好ましくは、本発明に係るＲＮＡを、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）で精製する。好ましくは、ＲＰ－ＨＰＬＣには、微多孔質スチレン／ジビニルベンゼンカラム（例えば、粒径：３０μｍ、細孔径：４０００Å）を用いる。また、分子量カットオフが約１００ｋＤａであるセルロース系膜を備えているフィルタカセットを用いてさらに精製する。
これに関連して、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製したＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製していないＲＮＡよりも、２本鎖ＲＮＡ副生成物の生成が約５％、約１０％または約２０％少ない。
あるいは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製した精製ＲＮＡは、オリゴｄＴ精製、沈澱、濾過および／または陰イオン交換クロマトグラフィによって精製したＲＮＡと比べて、２本鎖ＲＮＡ副生成物が約５％、約１０％または約２０％少ない。
さらに好適な実施形態においては、核酸（好ましくはＲＮＡ）を凍結乾燥させる（例えば、ＷＯ２０１６／１６５８３１またはＷＯ２０１１／０６９５８６に従って）。これにより、本明細書に記載のＲＮＡまたはＤＮＡなどの温度安定性乾燥核酸（粉末）を得る。本発明の核酸（特にＲＮＡ）を、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥によって乾燥させて（例えば、ＷＯ２０１６／１８４５７５またはＷＯ２０１６／１８４５７６に従って）、本明細書に記載の温度安定性ＲＮＡ（粉末）を得てもよい。したがって、核酸（特にＲＮＡ）の製造および精製に関連して、ＷＯ２０１７／１０９１６１、ＷＯ２０１５／１８８９３３、ＷＯ２０１６／１８０４３０、ＷＯ２００８／０７７５９２、ＷＯ２０１６／１９３２０６、ＷＯ２０１６／１６５８３１、ＷＯ２０１１／０６９５８６、ＷＯ２０１６／１８４５７５、およびＷＯ２０１６／１８４５７６の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
したがって、好適な実施形態において、核酸は、乾燥核酸（特に乾燥ＲＮＡ）である。
本明細書において、用語「乾燥ＲＮＡ」とは、上述の通り、温度安定性乾燥ＲＮＡ（粉末）を得るための、凍結乾燥、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥させたＲＮＡであると理解せねばならない。
好適な実施形態において、本発明の核酸は、精製核酸（特に精製ＲＮＡ）である。
本明細書において、用語「精製された核酸」とは、特定の精製工程後において出発物質よりも高い純度を有している核酸であると理解せねばならない。精製された核酸中に実質的に存在しない典型的な不純物の例としては、ペプチドもしくはタンパク質、スペルミジン、ＢＳＡ、不完全核酸配列、核酸断片、遊離ヌクレオチド、細菌性不純物、または精製手法に由来する不純物が挙げられる。したがって、この点に関して、核酸の純度は、できるだけ１００％に近いことが望ましい。また、核酸の純度は、完全長の核酸の量ができるだけ１００％に近いことが望ましい。したがって、本明細書において、精製核酸の純度は、７５％超、８０％超、８５％超である。とりわけ、精製核酸の純度は、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超である。最も好ましくは、精製核酸の純度は、９９％以上である。例えば、ＨＰＬＣ分析によって純度を決定してもよい。上述の割合は、標的核酸のピークの面積と、副生成物を表す全てのピークの合計面積との比率に対応している。あるいは、例えば、アガロースゲル電気泳動分析またはキャピラリーゲル電気泳動分析によって純度を決定してもよい。
好適な実施形態において、本発明の核酸は、精製ＲＮＡである。
本明細書において、用語「精製ＲＮＡ」または「精製ｍＲＮＡ」は、特定の精製工程（ＨＰＬＣ、ＴＦＦ、オリゴｄ（Ｔ）精製、沈澱工程など）後において、出発物質（in vitroで転写されたＲＮＡなど）よりも純度が高いＲＮＡであると理解せねばならない。精製ＲＮＡに実質的に含まれていない典型的な不純物の例としては、ペプチドもしくはタンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ、ピロホスファターゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどの、ＤＮＡ依存的なＲＮＡのin vitroにおける転写に由来する酵素）、スペルミジン、ＢＳＡ、不完全ＲＮＡ配列、ＲＮＡ断片（短い２本鎖ＲＮＡ断片、不完全配列など）、遊離ヌクレオチド（修飾ヌクレオチド、従来のＮＴＰ、キャップアナログ）、テンプレートＤＮＡの断片、バッファ成分（ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ＭｇＣｌ２）が挙げられる。発酵手法などに由来しうる他の潜在的な不純物の例としては、細菌性不純物（バイオバーデン、細菌ＤＮＡ）、または精製手法に由来する不純物（有機溶媒など）が挙げられる。したがって、この点に関して、ＲＮＡの純度は、できるだけ１００％に近いことが望ましい。また、ＲＮＡ純度は、完全長のＲＮＡ転写産物の量ができるだけ１００％に近いことが望ましい。したがって、本明細書において、精製ＲＮＡの純度は、７５％超、８０％超、８５％超である。とりわけ、精製ＲＮＡの純度は、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超である。最も好ましくは、精製ＲＮＡの純度は、９９％以上である。例えば、ＨＰＬＣ分析によって純度を決定してもよい。上述の割合は、標的ＲＮＡのピークの面積と、副生成物を表す全てのピークの合計面積との比率に対応している。あるいは、例えば、アガロースゲル電気泳動分析またはキャピラリーゲル電気泳動分析によって純度を決定してもよい。
核酸がＲＮＡである特に好適な実施形態において、ＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製されいる。精製ＲＮＡからは、２本鎖ＲＮＡ、キャップされていないＲＮＡおよび／またはＲＮＡ断片が除去されている。
in vitroにおいてＲＮＡを転写する際などに副生成物として２本鎖ＲＮＡが形成されると、先天免疫応答（特にＩＦＮ－α）を誘導することがある。ＩＦＮ－αは、ワクチン接種した被験体において発熱を誘導する主な要因である。これは、もちろん望ましくない副作用である。（ドットブロット、血清学的特異的電子顕微鏡（ＳＳＥＭ）またはＥＬＩＳＡなどによる）ｄｓＲＮＡの免疫ブロットのための現行の技術を利用して、核酸の混合物からｄｓＲＮＡ種を検出し、サイジングする。
好適には、本発明のＲＮＡは、本明細書に記載の通りにＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製されている。これにより、ｄｓＲＮＡの量を減少させる。
好適な実施形態において、本発明のＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦで精製していないＲＮＡと比べて、２本鎖ＲＮＡ副生成物が約５％、約１０％または約２０％少ない。
好適な実施形態において、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦで精製した本発明のＲＮＡは、オリゴｄＴ精製、沈澱、濾過および／またはＡＥＸで精製したＲＮＡと比べて、２本鎖ＲＮＡ副生成物が約５％、約１０％または約２０％少ない。
理解すべきことには、本明細書に記載の「乾燥ＲＮＡ」「精製ＲＮＡ」または「ＧＭＰグレードＲＮＡ」は、安定性に優れており（in vitro、in vivo）、有効性が向上していてもよい（in vivoにおけるｍＲＮＡの翻訳性の向上など）。したがって、これらは、医療用途（ワクチンなど）に特に適している。
本明細書に記載の共転写キャッピングの後（および、本明細書に記載の精製の後）に得られたＲＮＡのキャッピングの程度は、ＷＯ２０１５／１０１４１６（特に、ＷＯ２０１５／１０１４１６のクレーム２７～４６）に記載のキャッピングアッセイを利用して決定できる。あるいは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６６７に記載のキャッピングアッセイが利用できる。
実施形態においては、in vitroにおいてＲＮＡを転写するための自動化装置を使用して、本発明の核酸を作製および精製してもよい。このような装置は、組成物またはワクチンの製造にも使用できる（態様２および３を参照）。好ましくは、ＷＯ２０２０００２５９８に記載の装置（特に、ＷＯ２０２０００２５９８のクレーム１～５９および／または６８～７６（ｂおよび図１～１８））に記載の装置が好適に使用できる。
好ましくは、本明細書に記載の方法を、下記に詳述するＲＮＡ組成物またはワクチンの製造方法に応用してもよい。
［組成物、医薬組成物］
第２の態様は、第１の態様の１つ以上の核酸を含んでいる組成物に関する。
注目すべきことには、第２の態様の組成物に関する実施形態は、同様に、第４の態様のワクチンの好適な実施形態としても読まれ、理解されうる。また、第４の態様のワクチンに関する実施形態は、同様に、（第１の態様の核酸を含んでいる）第２の態様の組成物の好適な実施形態として読まれ、理解されうる。さらに、第１の態様（本発明の核酸）に関連して記載されている特徴および実施形態は、第２の態様の組成物の好適な実施形態として読まれ、理解されねばならない。
好適な実施形態において、組成物は、第１の態様に係る１つ以上の核酸を含んでいる。核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（かつてのｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルス、またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来する、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。
好適な実施形態において、組成物は、第１の態様に係る１つ以上の核酸を含んでいる。１つ以上の核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス、またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来する、１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。好ましくは、組成物を筋肉内投与または皮内投与する。
好ましくは、組成物を筋肉内投与または皮内投与することにより、被験体において、コードされているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原コンストラクトが発現するようになる。核酸がＲＮＡである実施形態においては、組成物を投与ことにより、被験体において、ＲＮＡが翻訳され、コードされているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原が産生されるようになる。核酸がＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ、アデノウイルスＤＮＡなど）である実施形態においては、組成物を投与することにより、被験体において、ＤＮＡがＲＮＡへ転写され、次にＲＮＡがコードされているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス抗原へと翻訳されるようになる。
好ましくは、第２の態様の組成物は、ワクチンに好適である。特に、第２の態様の組成物は、コロナウイルスワクチン（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）ワクチン）に好適である。
本発明に関連して、「組成物」とは、任意の種類の組成物を表す。組成物には、特定のが含まれていてもよい。特定の成分の例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのものであるか、またはそれに由来する１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）が挙げられる。核酸は、ポリマー性キャリアまたはＬＮＰなどと関連付けられている。任意構成で、組成物は、さらなる成分とも関連付けられている（通常は、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と関連付けられている）。組成物は、乾燥組成物（粉末または顆粒など）であってもよいし、固形単位（凍結乾燥形態など）であってもよい。あるいは、組成物は液体の形態であり、各構成成分は独立に溶解または分散（懸濁または乳化など）している状態で含まれていてもよい。
第２の態様の好適な実施形態において、組成物は、第１の態様の１つ以上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでいる。好ましくはＲＮＡを含んでいる。組成物は、任意構成で、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。
第２の態様の実施形態において、組成物は、第１の態様の１つ以上の核酸を含んでおり、好ましくはプラスミドＤＮＡ、アデノウイルスＤＮＡを含んでいる。組成物は、任意構成で、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。
第２の態様の好適な実施形態において、組成物は、１つ以上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡを含んでいる。核酸は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１３１４７、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１７７、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３１８４、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。組成物は、任意構成で、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。
第２の態様の特に好適な実施形態において、組成物は、１つ以上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡを含んでいる。核酸は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。組成物は、任意構成で、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。
最も好ましくは、組成物は、１つ以上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡを含んでいる。核酸は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１６３の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
最も好ましくは、組成物は、１つ以上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡを含んでいる。核酸は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４９の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらに特に好適な実施形態において、組成物は、１つ以上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡを含んでいる。核酸は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２４８３７、２３３１１、２３５３１、２３３１０、２３５３０、２３３１３、２３５３３の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
さらなる実施形態において、組成物は、１つ以上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡを含んでいる。核酸は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号２６６３３、２６９０７の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
第２の態様の特に好適な実施形態において、組成物は、１つ以上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡを含んでいる。核酸は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４９～１５１、１６３～１６５、２４８３７、２３３１１、２３５３１、２４８５１、２３３１０、２３５３０、２３３１３、２３５３３からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。組成物は、任意構成で、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。
本明細書において、用語「薬学的に許容可能なキャリア」または「薬学的に許容可能な賦形剤」には、好ましくは、投与のための組成物の液体基剤または非液体基剤が含まれる。液体の形態で組成物を提供するとき、キャリアは、水（発熱物質を含んでいない水）、等張な生理食塩水または緩衝（水溶）液（リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）であってもよい。水（または、好ましくはバッファ、より好ましくは水性バッファ）を使用してもよい。この水には、ナトリウム塩（好ましくは５０ｍＭ以上のナトリウム塩）、カルシウム塩（好ましくは０．０１ｍＭ以上のカルシウム塩）、および任意構成でカリウム塩（好ましくは３ｍＭ以上のカリウム塩）が含まれている。好適な実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩および任意構成のカリウム塩は、そのハロゲン化物（塩化物、ヨウ化物、臭化物など）、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩または硫酸塩などの形態で存在していてもよい。ナトリウム塩の例としては、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４が挙げられる。任意構成であるカリウム塩の例としては、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４が挙げられり。カルシウム塩の例としては、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２が挙げられる。
さらに、上述のカチオンの有機アニオンがバッファ中に存在していてもよい。したがって、実施形態において、核酸組成物は、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいてもよい。１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を利用して、例えば、安定性を向上させたり、細胞へのトランスフェクションを促進したり、持続または延長を可能にしたり、コードされているコロナウイルスのタンパク質のin vivoにおける翻訳を促進したり、コードされているコロナウイルスタンパク質のin vivoにおける放出プロファイルを変化させたりする。伝統的な賦形剤（任意および全ての溶媒、分散媒、稀釈剤または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤など）に加えて、本発明の賦形剤には、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア－シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドでトランスフェクトした細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびこれらの組合せが含まれる（ただし、これらには限定されない）。同様に、実施形態において、被験体への投与に好適な、１つ以上の適合性の固体もしくは液体の充填材、稀釈剤またはカプセル化合物を使用してもよい。本明細書において、用語「適合性」とは、組成物の構成成分と１つ以上の核酸（任意構成で複数の核酸）とを混合できることを意味する。この混合は、典型的な使用条件（筋肉内投与または皮内投与など）において、組成物の生物活性または薬学効果を実質的に低下させる相互作用が起こらない様式で行われる。治療する被験体への投与に適した組成物とするために、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤は、純度を充分に高く、かつ毒性を充分に低くせねばならない。薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤として使用できる化合物の例としては、糖（ラクトース、グルコース、トレハロース、マンノースおよびスクロースなど）；デンプン（トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンなど）；デキストロース；セルロースおよびその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど）；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；獣脂；固体滑剤（ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど）；硫酸カルシウム；植物油（落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオ属植物由来の油など）；ポリオール（ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど）；アルギン酸が挙げられる。
１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤は、好ましくは、組成物の筋肉内または皮内への送達／投与に好適であるように選択されてもよい。したがって、組成物は、好ましくは医薬組成物であり、好適には筋肉内投与用の組成物である。
組成物（好ましくは医薬組成物）の投与が意図される被験体には、ヒトおよび／または他の霊長類；哺乳動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウスおよび／またはラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む）；鳥類（家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／または七面鳥などの商業的に関連する鳥類を含む）が挙げられる（ただし、これらには限定されない）。
本発明の医薬組成物は、好適には、滅菌されていてもよいし、発熱物質を含んでいなくてもよい。
（本発明の多価組成物）
実施形態において、本明細書に記載の組成物（多価組成物など）は、核酸種（例えば、本発明の第１の態様に関連して記載されているＲＮＡ種など）を、複数または２つ以上含んでいてもよい。好ましくは、本明細書に記載の組成物は、第１の態様に関連して記載されている２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の異なる核酸を含んでいてもよい。
実施形態において、組成物（多価組成物など）は、第１の態様に関連して記載されている２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の異なる核酸種を含んでいてもよい。それぞれの核酸種は、同じコロナウイルスに由来する１つ以上の抗原性ペプチドもしくは抗原性タンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードしている。特に、上述の（遺伝的に）同じであるコロナウイルスは（実質的に）同じレパートリーのタンパク質またはペプチドを発現し、全てのタンパク質またはペプチドは（実質的に）同じアミノ酸配列を有している。特に、上述の（遺伝的に）同じであるコロナウイルスは実質的に同じタンパク質、ペプチドまたはポリタンパク質を発現し、好ましくは、これらのタンパク質、ペプチドまたはポリタンパク質はアミノ酸配列が同じである。
実施形態において、組成物（多価組成物など）は、第１の態様に関連して記載されている２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の異なる核酸種を含んでいてもよい。それぞれの核酸種は、遺伝的に異なるコロナウイルス（異なるコロナウイルスの単離株など）に由来する１つ以上のペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードしている。本明細書において、用語「異なる」または「異なるコロナウイルス」とは、２種類以上のコロナウイルス（異なるコロナウイルスの単離株など）の間の違いであると理解せねばならない。この違いは、異なるコロナウイルスのゲノムに現れる。特に、上述の（遺伝的に）異なるコロナウイルスは１つ以上の異なるタンパク質、ペプチドまたはポリタンパク質を発現していてもよく、１つ以上の異なるタンパク質、ペプチドまたはポリタンパク質は１つ以上のアミノ酸において異なっている。
好適な実施形態において、多価組成物の複数または２つ以上の核酸配列は、異なるスパイクタンパク質（好ましくはpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質）をコードしている。
これに関連して、異なるスパイクタンパク質またはpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質は、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスバリアント／単離株に由来することが特に好ましい。スパイクタンパク質は、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、またはＣＡＬ．２０Ｃに由来することが特に好ましい。
これに関連して、異なるスパイクタンパク質またはpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質は、下記(i)～(v)のうち１つ以上のスパイクタンパク質におけるアミノ酸変異を有していることがさらに好ましい。
(i)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｉ６９２ＶおよびＭ１２２９Ｉ
(ii)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、ｄｅｌＹ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ
(iii)Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、ｄｅｌＬ２４２、ｄｅｌＡ２４３、ｄｅｌＬ２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖ
(iv)Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５ＹおよびＴ１０２７Ｉ
(v)Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、Ｌ４５２Ｒ、およびＤ６１４Ｇ
実施形態において、組成物（多価組成物など）は、２個、３個、４個または５個の核酸種（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡ種を含んでいる。核酸種は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１３１４７、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１７７、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３１８４、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。組成物は、任意構成で、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。２個、３個、４個または５個の核酸種のそれぞれは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの異なる抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。
したがって、実施形態において、組成物（多価組成物など）は、２個の核酸種（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡ種を含んでいる。核酸種は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。組成物は、任意構成で、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。２個の核酸種のそれぞれは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの異なる抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。
実施形態において、組成物（多価組成物など）は、３個の核酸種（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含んでおり、好ましくはＲＮＡ種を含んでいる。核酸は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。組成物は、任意構成で、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。２個、３個、４つまたは５個の核酸種のそれぞれは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの異なる抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。
多価組成物の特に好適な実施形態を、下記に示す。
好ましくは、多価組成物に含まれている２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の異なる核酸種は、それぞれ、（第１の態様に記載の）異なるpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質をコードしている。好ましくは、スパイクタンパク質のＫ９８６残基およびＶ９８７残基を、２個のプロリンにより置換することにより、pre-fusion立体配座に安定化させる（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。したがって、好適な実施形態において、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、それぞれ、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有している。１つ以上のpre-fusion構造安定化変異においては、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐのアミノ酸置換が生じている（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
したがって、多価組成物に含まれている２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の異なる核酸種は、それぞれ、異なるpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質をコードしている。２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の安定化させたスパイクタンパク質は、配列番号１０～２６、３４１～４０７、６０９～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３８、２２７４０、２２７４２、２２７４４、２２７４６、２２７４８、２２７５０、２２７５２、２２７５４、２２７５６、２２７５８、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であるアミノ酸配列から選択される。あるいは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の安定化させたスパイクタンパク質は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
好適な実施形態において、多価組成物は、コーディング配列を有している１つの核酸種を含んでいる。コーディング配列は、アミノ酸配列をコードしている。アミノ酸配列は、配列番号１０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。多価組成物はさらに、下記から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上のさらなるＲＮＡ種を含んでいる。
(i)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、アミノ酸配列をコードしている。アミノ酸配列は、配列番号２２９６１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(ii)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、アミノ酸配列をコードしている。アミノ酸配列は、配列番号２２９６０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iii)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、アミノ酸配列をコードしている。アミノ酸配列は、配列番号２２９６３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iv)コーディング配列を有している１つの核酸種コーディング配列は、アミノ酸配列をコードしている。アミノ酸配列は、配列番号２２９４１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(v)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、アミノ酸配列をコードしている。アミノ酸配列は、配列番号２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
好適な実施形態において、多価組成物は、コーディング配列を有している２つ以上の核酸種を含んでいる。コーディング配列は、アミノ酸配列をコードしている。アミノ酸配列は、配列番号１０、２２９６１、２２９６０、２２９６３、２２９４１、２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
好ましくは、多価組成物に含まれている２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の異なる核酸種は、核酸コーディング配列を有している。核酸コーディング配列は、異なるpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質をそれぞれコードしている。２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の核酸コーディング配列は、配列番号１３６～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１７３１～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の核酸コーディング配列は、これらのいずれかの断片またはバリアントである。
好適な実施形態において、多価組成物は、コーディング配列を有している１つの核酸種を含んでいる。コーディング配列は、配列番号１３７のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。多価組成物はさらに、下記から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上のさらなるＲＮＡ種を含んでいる。
(i)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２３０９１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(ii)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２３０９０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iii)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２３０９３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iv)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２２９９９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(v)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２３０９４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
好ましくは、多価組成物に含まれている２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の異なる核酸種は、核酸コーディング配列を有している。核酸コーディング配列は、それぞれ、異なるpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質をコードしている。２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の核酸コーディング配列は、配列番号１４９～１５１、１６３～１６５、１２３３８、１２５４１、１２８１０～１２８１３、１２９０１、１２９３１、１３０１３、２２７９２、２２７９４、２２７９６、２２７９８、２２８０２、２２８０４、２２８０６、２２８１０、２２８１３、２２８１９、２２８２１、２２８２３、２２８２５、２２８２７、２２８２９、２２８３１、２２８３３、２２８３５、２２８３７、２２８３９、２３２９７～２３３１４、２３３６９、２３５１７～２３５２０、２３５２３～２３５２５、２３５２７、２３５２９、２３５３０、２３５８９、２３７３７、２３９５７、２４３９７、２４８３７、２５０５７、２５２７７、２５７１７、２６９２５～２６９３７のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはさらにそれ以上の核酸コーディング配列は、これらのいずれかの断片またはバリアントである。
好適な実施形態において、多価組成物は、ＲＮＡ種を含んでいるか、またはそれからなる。ＲＮＡ配列は、配列番号１６３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。多価組成物はさらに、下記から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上のさらなるＲＮＡ種を含んでいる。
(i)ＲＮＡ配列を含んでいるか、またはそれからなる１つのＲＮＡ種。ＲＮＡ配列は、配列番号２３３１１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(ii)コーディング配列を有している１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３３１０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iii)コーディング配列を有している１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３３１３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iv)コーディング配列を有している１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３２１９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(v)コーディング配列を有している１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３３１４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
上記の態様において、好ましくは、ｍＲＮＡ種のそれぞれは、Ｃａｐ１構造を有している。任意構成で、ｍＲＮＡ種のそれぞれは、修飾ヌクレオチドを含んでいない。
好適な実施形態において、多価組成物は、ＲＮＡ種を含んでいる。ＲＮＡ種は、ＲＮＡ配列を含んでいるか、またはそれからなる。ＲＮＡ配列は、配列番号１４９または２４８３７のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
多価組成物はさらに、下記から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上のさらなるＲＮＡ種を含んでいる。
(i)ＲＮＡ配列を含んでいるか、またはそれからなる１つのＲＮＡ種。ＲＮＡ配列は、配列番号２３５３１または２４８５１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(ii)コーディング配列を有している１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３５３０または２４８５０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iii)コーディング配列を有している１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３５３３または２４８５３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iv)コーディング配列を有している１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３４３９または２４７５９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(v)コーディング配列を有している１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３５３４または２４８５４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
上記の態様において、好ましくは、ｍＲＮＡ種のそれぞれはＣａｐ１構造を有している。任意構成で、ｍＲＮＡ種のそれぞれは、修飾ヌクレオチドを含んでいない。
さらに好適な実施形態において、多価組成物は、２つ以上のＲＮＡ種を含んでいる。２つ以上のＲＮＡ種は、配列番号１４９または２４８３７、２３５３１または２４８５１、２３５３０または２４８５０、２３５３３または２４８５３、２３４３９または２４７５９または２３５３４または２４８５４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
実施形態において、多価組成物に含まれているＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸（好ましくはＲＮＡ種）は、別々に製剤化されていてもよい（下記に特定される製剤）。好適な実施形態において、多価組成物に含まれているＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸（好ましくはＲＮＡ種）は、別々に共製剤化されていてもよい（下記に特定される製剤）。
（複合化）
第２の態様の好適な実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、さらなる化合物と複合化または関連付けられている。これにより、製剤化された組成物が得られる。これに関連して、製剤は、トランスフェクション試薬としての機能を有していてもよい。これに関連して、製剤は、核酸の分解を阻害する機能を有していてもよい。
第２の態様の好適な実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）および任意構成である１つ以上のさらなる核酸は、１つ以上のカチオン性化合物またはポリカチオン性化合物と、複合化もしくは関連付けられているか、または少なくとも部分的に複合化もしくは関連付けられている。好ましくは、カチオン性化合物またはポリカチオン性化合物は、カチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー、カチオン性もしくはポリカチオン性多糖、カチオン性もしくはポリカチオン性脂質、カチオン性もしくはポリカチオン性タンパク質、カチオン性もしくはポリカチオン性ペプチド、またはこれらの任意の組合せである。
本明細書において、用語「カチオン性化合物またはポリカチオン性化合物」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、正に帯電している帯電している分子である。この分子は、ｐＨが約１～９、約３～８、約４～８、約５～８のときに正に帯電している。より好ましくは、この分子は、ｐＨが約６～８のときに正に帯電している。より一層好ましくは、この分子は、ｐＨが約７～８のときに正に帯電している。最も好ましくは、この分子は、生理学的なｐＨ（例えば約７．２～約７．５）のときに正に帯電している。したがって、カチオン性成分（カチオン性ペプチド、カチオン性タンパク質、カチオン性ポリマー、カチオン性多糖、カチオン性脂質など）は、生理的条件において正に帯電する任意の正に帯電している化合物またはポリマーでありうる。「カチオン性またはポリカチオン性のペプチドまたはタンパク質」には、１つ以上の正に帯電しているアミノ酸または２つ以上の正に帯電しているアミノ酸が含まれていてもよい。このようなアミノ酸は、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＯｒｎから選択される。したがって、「ポリカチオン性」成分も、所与の条件において２つ以上の正電荷を有しているものの範囲に含まれる。
これに関連して、特に好ましいカチオン性化合物またはポリカチオン性化合物は、下記のカチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはその断片の群から選択されてもよい：プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンもしくはスペルミジン、または他のカチオン性ペプチドもしくはカチオン性タンパク質。他のカチオン性ペプチドまたはカチオン性タンパク質の例としては、ポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチドまたはＶＰ２２アナログペプチド、ＨＳＶ ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡまたはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リシンリッチペプチド、ＭＰＧペプチド、Ｐｅｐ－１、Ｌ－オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブホリン２、Ｂａｃ７１５－２４、Ｓｙｎ（Ｂ）、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、ヒストンが挙げられる。より好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸（例えばコーディングＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ）は、１つ以上のポリカチオンと複合化している。好ましくは、１つ以上のポリカチオンは、プロタミンまたはオリゴフェクタミンである。最も好ましくは、１つ以上のポリカチオンは、プロタミンと複合化している。
好適な実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなど１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、プロタミンと複合化している。
トランスフェクション試薬または複合化試薬として使用できるさらに好ましいカチオン性化合物またはポリカチオン性化合物の例としては、カチオン性多糖（キトサン、ポリブレンなど）；カチオン性脂質、（ＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ジ－Ｃ１４－アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ、ＤＩＭＲＩ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－６－１４、ＣＬＩＰ１、ＣＬＩＰ６、ＣＬＩＰ９、オリゴフェクタミンなど）；カチオン性もしくはポリカチオン性ポリマーが挙げられる。カチオン性もしくはポリカチオン性ポリマーの例としては、修飾ポリアミノ酸（βアミノ酸ポリマー、逆ポリアミドなど）；修飾ポリエチレン（ＰＶＰなど）；修飾アクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡなど）；修飾アミドアミン（ｐＡＭＡＭなど）；修飾ポリβアミノエステル（ＰＢＡＥ）（ジアミン末端修飾１，４－ブタンジオールジアクリレート－ｃｏ－５－アミノ－１－ペンタノールポリマーなど）；デンドリマー（ポリプロピルアミンデンドリマー、ｐＡＭＡＭ系デンドリマーなど）；ポリイミン（ＰＥＩ、ポリ（プロピレンイミン）など）；ポリアリルアミン；糖骨格系ポリマー（シクロデキストラン系ポリマー、デキストラン系ポリマーなど）；シラン骨格系ポリマー（ＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳコポリマーなど）；１つ以上のカチオン性ブロック（上述のカチオン性ポリマーから選択されるものなど）と１つ以上の親水性もしくは疎水性ブロック（ポリエチレングリコールなど）の組合せからなるブロックポリマーが挙げられる。
これに関連して、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、カチオン性化合物もしくはポリカチオン性化合物および／またはポリマー性キャリアと、複合化または少なくとも部分的に複合化している。好ましくは、１つ以上の核酸は、カチオン性タンパク質またはカチオン性ペプチドと複合化または少なくとも部分的に複合化している。これに関連して、ＷＯ２０１０／０３７５３９およびＷＯ２０１２／１１３５１３の開示は、参照により本明細書に組込まれる。「部分的に」とは、核酸の一部のみがカチオン性化合物と複合化しており、残りの核酸は複合化されていない形態（遊離形態）であることを意味する。
実施形態において、組成物は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）を含んでいる。１つ以上の核酸は、１つ以上のカチオン性化合物またはポリカチオン性化合物（好ましくはプロタミン）と複合化している。組成物は、１つ以上の遊離核酸（複合化していない核酸）をさらに含んでいる。
これに関連して、特に好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、プロタミンと複合化しているか、または少なくとも部分的に複合化している。好ましくは、核酸（特に、プロタミンと複合化しているＲＮＡのＲＮＡ）と、遊離ＲＮＡとのモル比は、約０．００１：１～約１：０．００１から選択されれもよい（この範囲には、約１：１も含まれる）。好適には、プロタミン－トレハロース溶液にＲＮＡサンプルを加えることによって、プロタミンと複合化させて、複合化しているＲＮＡを得る。このとき、ＲＮＡ：プロタミンの重量比（ｗ／ｗ）は、２：１である。
複合化に使用できるさらに好ましいカチオン性またはポリカチオン性のタンパク質またはペプチドを、ＷＯ２００９／０３０４８１またはＷＯ２０１１／０２６６４１の式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘから誘導してもよい。これに関連するＷＯ２００９／０３０４８１またはＷＯ２０１１／０２６６４１の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
好適な実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上のカチオン性もしくはポリカチオン性のタンパク質もしくはペプチド（好ましくは配列番号２６９～２７３から選択される）、またはそれらの任意の組合せと複合化しているか、または少なくとも部分的に複合化している。
種々の実施形態によれば、本発明の組成物は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは、第１の態様の文脈に記載の１つ以上のＲＮＡ）と、ポリマー性キャリアとを含んでいる。
本明細書において、用語「ポリマー性キャリア」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、他の化合物（積荷核酸など）の輸送および／または複合化を促進する化合物である。ポリマー性キャリアは、通常ポリマーから形成されているキャリアである。ポリマー性キャリアは、共有結合または非共有結合の相互作用によって、積荷（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）と関連付けられていてもよい。ポリマーは、コポリマーのように異なるサブユニットを有していてもよい。
これに関連して、好適なポリマー性キャリアの例としては、次のものが挙げられる：は例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＥＧ化ＰＬＬおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、ポリ（エチレンイミン）ビスカルバメート（ＰＥＩＣ）、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ヒスチジン修飾ＰＬＬ、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（プロピレンイミン（ＰＰＩ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミドエチレンイミン）（ＳＳ－ＰＡＥＩ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、ポリ（β－アミノエステル）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）（ＰＨＰ）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（α－［４－アミノブチル］－Ｌ－グリコール酸（ＰＡＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジニウムブロミド）、ポリ（ホスファゼン）（ＰＰＺ）、ポリ（ホスホエステル）（ＰＰＥ）、ポリ（ホスホルアミデート）（ＰＰＡ）、ポリ（Ｎ－２－ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）（ｐＨＰＭＡ）、ポリ（２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（２－アミノエチルプロピレンホスフェート）ＰＰＥ＿ＥＡ）、ガラクトシル化キトサン、Ｎ－ドデシル化キトサン、ヒストン、コラーゲン、デキストラン－スペルミンが挙げられる。一実施形態において、ポリマーは、不活性ポリマーであってもよい（ＰＥＧなどであるが、これらには限定されない）。一実施形態において、ポリマーは、カチオン性ポリマーであってもよい（ＰＥＩ、ＰＬＬ、ＴＥＴＡ、ポリ（アリルアミン）、ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジニウムブロミド）、ｐＨＰＭＡ、ｐＤＭＡＥＭＡなどであるが、これらには限定されない）。一実施形態において、ポリマーは、生分解性ＰＥＩであってもよい（ＤＳＰ、ＤＴＢＰ、ＰＥＩＣなどであるが、これらには限定されない）。一実施形態において、ポリマーは、生分解性であってもよい（ヒスチン修飾ＰＬＬ、ＳＳ－ＰＡＥＩ、ポリ（β－アミノエステル）、ＰＨＰ、ＰＡＧＡ、ＰＬＧＡ、ＰＰＺ、ＰＰＥ、ＰＰＡおよびＰＰＥ－ＥＡなどであるが、これらには限定されない）。
好適なポリマー性キャリアは、ジスルフィド架橋されているカチオン性化合物によって形成されているポリマー性キャリアであってもよい。ジスルフィド架橋されているカチオン性化合物は、互いに同じであっても異なっていてもよい。ポリマー性キャリアは、さらなる成分を含んでいてもよい。本発明に従って使用されるポリマー性キャリアは、カチオン性ペプチド、タンパク質またはポリマーと、任意構成である本明細書に記載のさらなる成分との混合物であってもよい。さらなる成分は、ジスルフィド結合によって（－ＳＨ基を介して）架橋されていてもよい。
これに関連して、ＷＯ２０１２／０１３３２６の式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ（Ｃｙｓ）ｙ｝および式Ｃｙｓ，｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝Ｃｙｓ２に従うポリマー性キャリアが好ましい。これに関連するＷＯ２０１２／０１３３２６の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）を複合化するために使用されるポリマー性キャリアは、ＷＯ２０１１／０２６６４１に開示されている（Ｌ－Ｐ１－Ｓ－［Ｓ－Ｐ２－Ｓ］ｎ－Ｓ－Ｐ３－Ｌ）に従うポリマー性キャリア分子から誘導されてもよい。これに関連するＷＯ２０１１／０２６６４１の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
実施形態において、ポリマー性キャリア化合物は、次のペプチド要素から形成されているか、それを含んでいるか、またはそれからなる：ＣｙｓＡｒｇ１２Ｃｙｓ（配列番号２６９）、ＣｙｓＡｒｇ１２（配列番号２７０）またはＴｒｐＡｒｇ１２Ｃｙｓ（配列番号２７１）。特に好適な実施形態において、ポリマー性キャリア化合物は、（Ｒ１２Ｃ）－（Ｒ１２Ｃ）二量体、（ＷＲ１２Ｃ）－（ＷＲ１２Ｃ）二量体、または（ＣＲ１２）－（ＣＲ１２Ｃ）－（ＣＲ１２）三量体からなる。このとき、二量体の個々のペプチド要素（ＷＲ１２Ｃなど）または三量体の個々のペプチド要素（ＣＲ１２など）は、－ＳＨ基を介して連結されている。
第２の態様の好適な実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、ポリエチレングリコール／ペプチドポリマーと複合化または関連付けられている。ポリエチレングリコール／ペプチドポリマーの例としては、HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH（ペプチドモノマーとしての配列番号２７２）、HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)4-S-PEG5000-OH（ペプチドモノマーとしての配列番号２７２）、HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)7-S-PEG5000-OH（ペプチドモノマーとしての配列番号２７３）、HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH（ペプチドモノマーの配列番号２７３）が挙げられる。
他の実施形態において、組成物は、１つ以上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含
んでおり。１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、ポリマー性キャリアと、任意構成である１つ以上の脂質成分と複合化または関連付けられている。１つ以上の脂質成分は、ＷＯ２０１７／２１２００８Ａ１、ＷＯ２０１７／２１２００６Ａ１、ＷＯ２０１７／２１２００７Ａ１、およびＷＯ２０１７／２１２００９Ａ１に開示されている。これに関連して、ＷＯ２０１７／２１２００８Ａ１、ＷＯ２０１７／２１２００６Ａ１、ＷＯ２０１７／２１２００７Ａ１およびＷＯ２０１７／２１２００９Ａ１の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
特に好適な実施形態において、（第１成分および／または第２成分の）ポリマー性キャリアは、ペプチドポリマー（好ましくは上述のポリエチレングリコール／ペプチドポリマー）および脂質成分（好ましくはリピドイド成分）である。
リピドイド（またはリピドイト）とは、脂質様化合物である。すなわち、脂質に類似した物性を有している両親媒性化合物である。好ましくは、リピドイドは、２つ以上のカチオン性窒素原子および２つ以上の親油性尾部を有している化合物である。従来型の多くのカチオン性脂質とは異なり、リピドイドは、加水分解性連結基（特に、加水分解性のエステル基、アミド基またはカルバメート基を含んでいる連結基）を有していない場合がある。リピドイドのカチオン性窒素原子は、カチオン化可能であってもよいし、永続的にカチオン性であってもよいし、両方のタイプのカチオン性窒素が化合物中に存在していてもよい。本発明に関連して、脂質という用語には、リピドイドも含まれると解される。
本発明のいくつかの実施形態において、リピドイドは、ＰＥＧ部分を含んでいてもよい。
好適な実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、ポリマー性キャリア（好ましくは上述のポリエチレングリコール／ペプチドポリマー）およびリピドイド成分と、複合化または関連付けられている。
好適には、リピドイドは、カチオン性である。すなわち、リピドイドは、カチオン化可能であるか、または永続的にカチオン性である。一実施形態において、リピドイドは、カチオン化可能である。すなわち、１つ以上のカチオン化可能な窒素原子を含んでおり、永続的にカチオン性の窒素原子を含んでいない。他の実施形態において、リピドイドのカチオン性窒素原子のうちの１つ以上は、永続的にカチオン性である。任意構成で、リピドイドは、永続的にカチオン性の窒素原子を、２個、３個または４個以上含んでいる。
好適な実施形態において、リピドイド成分は、次のうちから選択されるいずれか１つであってもよい：ＷＯ２０１７／２１２００９Ａ１の第５０～５４ページの表に記載のリピドイド、当該表に記載の特定のリピドイド。これらに関連する特定の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
好適な態様において、リピドイド成分は、次のうちから選択される１つ以上であってもよい：３－Ｃ１２－ＯＨ、３－Ｃ１２－ＯＨ－ｃａｔ、３－Ｃ１２－ａｍｉｄｅ、３－Ｃ１２－、３－Ｃ１２－ａｍｉｄｅ ｄｉｍｅｔｈｙｌ、ＲｅｖＰＥＧ（１０）－３－Ｃ１２－ＯＨ、ＲｅｖＰＥＧ（１０）－ＤＬｉｎ－ｐＡｂｅｎｚｏｉｃ、３Ｃ１２ａｍｉｄｅ－ＴＭＡｃａｔ、３Ｃ１２ａｍｉｄｅ－ＤＭＡ、３Ｃ１２ａｍｉｄｅ－ＮＨ２、３Ｃ１２ａｍｉｄｅ－ＯＨ、３Ｃ１２Ｅｓｔｅｒ－ＯＨ、３Ｃ１２Ｅｓｔｅｒ－ａｍｉｎ、３Ｃ１２Ｅｓｔｅｒ－ＤＭＡ、２Ｃ１２Ａｍｉｄ－ＤＭＡ、３Ｃ１２－ｌｉｎ－ａｍｉｄ－ＤＭＡ、２Ｃ１２－ｓｐｅｒｍ－ａｍｉｄ－ＤＭＡ（ＷＯ２０１７／２１２００９Ａ１の表（第５０～５４頁）を参照）。３－Ｃ１２－ＯＨまたは３－Ｃ１２－ＯＨ－ｃａｔが特に好ましい。
好適な実施形態において、ポリエチレングリコール／ペプチドポリマーは、上述のリピドイド（３－Ｃ１２－ＯＨまたは３－Ｃ１２－ＯＨ－ｃａｔなど）を含んでいる。このようなポリエチレングリコール／ペプチドポリマーを用いて、１つ以上の核酸を複合化する。これにより、Ｎ／Ｐ比が約０．１～約２０、約０．２～約１５、約２～約１５または約２～約１２である複合体を形成する。Ｎ／Ｐ比は、カチオン性ペプチドまたはカチオン性ポリマーの塩基性基の窒素原子の、核酸のリン酸基に対するモル比と定義する。これに関連して、ＷＯ２０１７／２１２００９Ａ１の開示（特に、ＷＯ２０１７／２１２００９Ａ１のクレーム１～１０およびそれに関連する特定の開示）は、参照により本明細書に組込まれる。
さらに好適なリピドイドは、ＷＯ２０１０／０５３５７２に由来するしていてもよい。特に、ＷＯ２０１０／０５３５７２のクレーム１～２９７から誘導できるなリピドイドを、本発明に関連して使用してもよい（例えば、本明細書に記載のペプチドポリマーに組込んだり、（後述する）脂質ナノ粒子に組込んだりする）。したがって、ＷＯ２０１０／０５３５７２のクレーム１～２９７およびそれに関連する特定の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
（ＬＮＰへのカプセル化／複合化）
第２の態様の好適な実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）および任意構成である１つ以上のさらなる核酸は、１つ以上の脂質（カチオン性脂質および／または中性脂質など）と、複合化されていたり、カプセル化されていたり、部分的にカプセル化されていたり、関連付けられていたりする。これにより、脂質系キャリア（リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームなど）を形成する。
リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームに組込まれている核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）は、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームの内部空間である、脂質層／膜の内部に完全にまたは部分的に位置していてもよい。あるいは、脂質層／膜の外表面において関連付けられていてもよい。リポソーム／ＬＮＰへの核酸の組込みのことを、本明細書においては、「カプセル化」とも称する。このとき、核酸（ＲＮＡなど）は、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームの内部空間に完全に組込まれている。核酸をリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームに組込む目的は、核酸（好ましくはＲＮＡ）を環境から防護するためである。この環境には、核酸および／または系を分解する酵素、化学物質または条件が含まれている場合がある。あるいは、この環境には、核酸を迅速に排泄させる受容体が含まれている場合がある。さらに、核酸（好ましくはＲＮＡ）をリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームに組込むことにより、核酸の取込みが促進されることがある。それゆえ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｎＣｏＶ－２０１９）の抗原性タンパク質をコードしている核酸（ＲＮＡなど）の治療効果を向上できる。したがって、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）をリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームに組込むことは、筋肉内投与および／または皮内投与用などのコロナウイルスワクチン（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンなど）にとって特に好適である可能性がある。
これに関連して、用語「複合化している」または「関連付けられている」は、核酸と１つ以上の脂質との実質的に安定な組合せを表す。この組合せは、より大きな複合体またはアセンブリへの組合せであり、共有結合を伴わない。
用語「脂質ナノ粒子」は、「ＬＮＰ」とも称され、特定の形態に限定さない。脂質ナノ粒子には、カチオン性脂質（および、任意構成であるさらなる脂質）と、核酸（ＲＮＡなど）とを組合せて生じる、任意の形態が含まれる。この組合せは、例えば、水性環境および／または水の存在下で行う。リポソーム、脂質複合体、リポプレックスなどは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の範囲に含まれる。
リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームの大きさは、様々であってよい。例えば、マルチラメラベシクル（ＭＬＶ）は、直径数百ｎｍに及ぶことがあり、狭い水性区画によって分離された一連の同心状の二重層を有していてもよい。小さなユニセルベシクル（ＳＵＶ）の直径は、５０ｎｍ未満でありうる。大きなユニラメラベシクル（ＬＵＶ）の直径は、５０～５００ｎｍありうる。ただし、これらには限定されない。
本発明のＬＮＰは、１つ以上の二重層膜によって外部媒体から隔離された内部水性空間を有している微小なベシクルとして、好適に特徴付けられる。ＬＮＰの二重層膜は、通常、両親媒性分子（合成または天然の脂質など）によって形成される。両親媒性分子は、空間的に分離された親水性ドメインおよび疎水性ドメインを有している。リポソームの二重層膜は、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤（ポリメロソーム、ニオソームなど）によっても形成できる。本発明に関連して、ＬＮＰは、通常、１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）を標的組織へと輸送するのに利用される。
したがって、第２の態様の好適な実施形態において、１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これによって脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成する。好ましくは、ＬＮＰは、筋肉内投与および／または皮内投与に特に適している。ＬＮＰは、通常、カチオン性脂質および１つ以上の賦形剤を含んでいる。１つ以上の賦形剤は、中性脂質、帯電脂質、ステロイドおよびポリマー複合化脂質（ＰＥＧ化された脂質など）から選択される。核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡなど）は、ＬＮＰの脂質部分の中にカプセル化されていてもよい。あるいは、ＬＮＰの脂質部分の一部または全部によって包囲された水性空間の中にカプセル化されてもよい。核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡなど）またはその一部を、ＬＮＰと関連付け、複合化させてもよい。ＬＮＰは、核酸が付着している粒子を形成できる任意の脂質を含んでいてもよい。あるいは、ＬＮＰは、１つ以上の核酸をカプセル化する任意の脂質を含んでいてもよい。好ましくは、核酸を含んでいるＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上の安定化脂質とを含む。安定化脂質には、中性脂質およびＰＥＧ化脂質が含まれる。
好ましくは、ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでいる。
(i)１つ以上のカチオン性脂質
(ii)１つ以上の中性脂質
(iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ（好ましくはコレステロール）
(iv)１つ以上のポリマー複合化脂質（好ましくはＰＥＧ脂質）
上記の態様において、(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ポリマー複合化脂質が０．５～１５％である。
ＬＮＰのカチオン性脂質は、カチオン化可能であってもよい。すなわち、脂質に含まれているイオン化可能な基のｐＫ未満にｐＨが低下するとプロトン化し、より高いｐＨでは徐々に電気的に中性になってもよい。ｐＫ未満のｐＨにおいては、脂質を、負に帯電している核酸と関連付けることができる。特定の実施形態において、カチオン性脂質は、両性イオン脂質を含んでおり、ｐＨが低下すると正に帯電する。
このような脂質の例としては、次のものが挙げられる（ただし、これらには限定されない）：ＤＳＤＭＡ、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）（Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩とも称する）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ｃｋｋ－Ｅ１２、ｃｋｋ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－ｙ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、９８Ｎ１２－５、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＭＤＭＡ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）ＨＧＴ４００３、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、ＡＬＮＹ－１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン））、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｃ１２－２００）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ＮＣ９８－５（４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ）、３－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＭＣ３エーテル）、４－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルブタン－１－アミン（ＭＣ４エーテル）、LIPOFECTIN(R)（市販のカチオン性リポソームで、ＤＯＴＭＡおよび１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含んでいる；GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.）、LIPOFECTAMINE(R)（市販のカチオン性リポソームで、Ｎ－（１－（２，３ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）および（ＤＯＰＥ）を含んでいる；GIBCO/BRL）、TRANSFECTAM(R)（市販のカチオン性脂質で、エタノール中にジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含んでいる；Promega Corp., Madison, Wis.）、上記の任意の組合せ。本発明の組成物および方法における使用にさらに好適なカチオン性脂質としては、ＷＯ２０１０／０５３５７２に記載のもの（特に、段落００２２５に記載のＣＩ２－２００）、ＷＯ２０１２／１７０９３０に記載のものが挙げられる。これら両文献は、参照により本明細書に組込まれる。さらなる例として、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴＳ００１、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ５００２が挙げられる（ＵＳ２０１５０１４００７０Ａ１を参照）。
実施形態において、カチオン性脂質は、アミノ脂質であってもよい。
代表的なアミノ脂質としては、次のものが挙げられる（ただし、これらには限定されない）：１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－ｔｒｉメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ＭＣ３（ＵＳ２０１００３２４１２０）。
実施形態において、カチオン性脂質は、アミノアルコールリピドイドであってもよい。
本発明に使用できるアミノアルコールリピドイドは、ＵＳ８，４５０，２９８（この文献は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる）に記載の方法によって調製できる。好適な（イオン化可能である）脂質は、表１、２および３に記載の化合物、ならびにＷＯ２０１７／０７５５３１Ａ１（この文献は、参照により本明細書に組込まれる）のクレーム１～２４に記載の化合物であってもよい。
他の実施形態において、好適な脂質は、ＷＯ２０１５／０７４０８５Ａ１に開示されている化合物（ＡＴＸ－００１～ＡＴＸ－０３２またはクレーム１～２６に記載の化合物）が挙げられる。ＵＳ６１／９０５，７２４、ＵＳ１５／６１４，４９９、ＵＳ９，５９３，０７７およびＵＳ９，５６７，２９６は、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
他の実施形態において、好適なカチオン性脂質は、ＷＯ２０１７／１１７５３０Ａ１に開示されている化合物（脂質１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはクレームに記載の化合物）でありってもよい。この文献は、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
好適な実施形態において、イオン化可能な脂質またはカチオン性脂質は、ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１に開示されている脂質から選択されてもよい（ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩに由来する脂質、またはＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１のクレーム１～１２に記載の脂質）。ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の開示は、その全体が参照により本明細書に組込まれる。これに関連して、本発明においては、ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の表７に開示されている脂質（例えば、式Ｉ－１～Ｉ－４１に由来する脂質）およびＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の表８に開示されている脂質（例えば、式ＩＩ－１～ＩＩ－３６に由来する脂質）を好適に使用できる。したがって、ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の式Ｉ－１～式Ｉ－４１および式ＩＩ－１～式ＩＩ－３６、ならびにそれらに関連する特定の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
好適な実施形態において、カチオン性脂質は、ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の式ＩＩＩに由来していてもよい。したがって、ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の式ＩＩＩ、およびそれに関連する特定の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
特に好適な実施形態において、組成物に含まれているＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これによりＬＮＰを形成している。ＬＮＰに含まれているカチオン性脂質は、ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の表９の構造ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－３６から選択される。したがって、ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の式ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－３６、およびそれに関連する特定の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
第２の態様の特に好適な実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これによりＬＮＰを形成している。ＬＮＰは、式ＩＩＩ－３のカチオン性脂質を含んでいる。
Figure 2023513502000009
本明細書で好適に使用される式ＩＩＩ－３の脂質の化学名は、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）である。この脂質は、ＡＬＣ－０３１５とも称する。
特定の実施形態において、本明細書に記載のカチオン性脂質（より好ましくはカチオン性脂質化合物ＩＩＩ－３）のＬＮＰにおける含有率は、ＬＮＰの全脂質含有量に対して、約３０～約９５ｍｏｌ％である。２種類以上のカチオン性脂質がＬＮＰ内に含まれている場合、カチオン性脂質の組合せに対して上記の割合が適用される。
実施形態において、カチオン性脂質のＬＮＰにおける含有率は、約３０～約７０ｍｏｌ％である。一実施形態において、カチオン性脂質のＬＮＰにおける含有率は、約４０～約６０ｍｏｌ％である（例えば、約４０ｍｏｌ％、約４１ｍｏｌ％、約４２ｍｏｌ％、約４３ｍｏｌ％、約４４ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約４６ｍｏｌ％、約４７ｍｏｌ％、約４８ｍｏｌ％、約４９ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約５１ｍｏｌ％、約５２ｍｏｌ％、約５３ｍｏｌ％、約５４ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％、約５６ｍｏｌ％、約５７ｍｏｌ％、約５８ｍｏｌ％、約５９ｍｏｌ％または約６０ｍｏｌ％である）。実施形態において、カチオン性脂質のＬＮＰにおける含有率は、約４７～約４８ｍｏｌ％である（約４７．０ｍｏｌ％、約４７．１ｍｏｌ％、約４７．２ｍｏｌ％、約４７．３ｍｏｌ％、約４７．４ｍｏｌ％、約４７．５ｍｏｌ％、約４７．６ｍｏｌ％、約４７．７ｍｏｌ％、約４７．８ｍｏｌ％、約４７．９ｍｏｌ％、約５０．０ｍｏｌ％など）。特に好ましくは、カチオン性脂質のＬＮＰにおける含有率は、４７．７ｍｏｌ％である。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰに存在する全脂質におけるカチオン性脂質の含有率は、約２０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％もしくは約４５～約６５ｍｏｌ％、または、約２０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％、約６０ｍｏｌ％、約６５ｍｏｌ％もしくは約７０ｍｏｌ％である。さらなる実施形態において、ＬＮＰに含まれているカチオン性脂質は、モル基準で、約２５％～約７５％である（例えば、モル基準で、約２０～約７０％、約３５～約６５％、約４５～約６５％、約６０％、約５７．５％、約５７．１％、約５０％または約４０％）。このとき、脂質ナノ粒子に含まれている脂質の総モル数を１００％とする。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質の核酸（コーディングＲＮＡまたはコーディングＤＮＡなど）に対する比率は、約３～約１５である（例えば、約５～約１３または約７～約１１）。
他の好適な（カチオン性またはイオン化可能である）脂質は、ＷＯ２００９／０８６５５８、ＷＯ２００９／１２７０６０、ＷＯ２０１０／０４８５３６、ＷＯ２０１０／０５４４０６、ＷＯ２０１０／０８８５３７、ＷＯ２０１０／１２９７０９、ＷＯ２０１１／１５３４９３、ＷＯ２０１３／０６３４６８、ＵＳ２０１１／０２５６１７５、ＵＳ２０１２／０１２８７６０、ＵＳ２０１２／００２７８０３、ＵＳ８，１５８，６０１、ＷＯ２０１６／１１８７２４、ＷＯ２０１６／１１８７２５、ＷＯ２０１７／０７０６１３、ＷＯ２０１７／０７０６２０、ＷＯ２０１７／０９９８２３、ＷＯ２０１２／０４０１８４、ＷＯ２０１１／１５３１２０、ＷＯ２０１１／１４９７３３、ＷＯ２０１１／０９０９６５、ＷＯ２０１１／０４３９１３、ＷＯ２０１１／０２２４６０、ＷＯ２０１２／０６１２５９、ＷＯ２０１２／０５４３６５、ＷＯ２０１２／０４４６３８、ＷＯ２０１０／０８０７２４、ＷＯ２０１０／２１８６５、ＷＯ２００８／１０３２７６、ＷＯ２０１３／０８６３７３、ＷＯ２０１３／０８６３５４、ＵＳ７，８９３，３０２、ＵＳ７，４０４，９６９、ＵＳ８，２８３，３３３、ＵＳ８，４６６，１２２、ＵＳ８，５６９，２５６、ＵＳ１０／００３６１１５、ＵＳ２０１２／０２０２８７１、ＵＳ２０１３／００６４８９４、ＵＳ２０１３／０１２９７８５、ＵＳ２０１３／０１５０６２５、ＵＳ２０１３／０１７８５４１、ＵＳ２０１３／０２２５８３６、ＵＳ２０１４／００３９０３２およびＷＯ２０１７／１１２８６５に開示されている。これに関連して、ＷＯ２００９／０８６５５８、ＷＯ２００９／１２７０６０、ＷＯ２０１０／０４８５３６、ＷＯ２０１０／０５４４０６、ＷＯ２０１０／０８８５３７、ＷＯ２０１０／１２９７０９、ＷＯ２０１１／１５３４９３、ＷＯ２０１３／０６３４６８、ＵＳ２０１１／０２５６１７５、ＵＳ２０１２／０１２８７６０、ＵＳ２０１２／００２７８０３、ＵＳ８，１５８，６０１、ＷＯ２０１６／１１８７２４、ＷＯ２０１６／１１８７２５、ＷＯ２０１７／０７０６１３、ＷＯ２０１７／０７０６２０、ＷＯ２０１７／０９９８２３、ＷＯ２０１２／０４０１８４、ＷＯ２０１１／１５３１２０、ＷＯ２０１１／１４９７３３、ＷＯ２０１１／０９０９６５、ＷＯ２０１１／０４３９１３、ＷＯ２０１１／０２２４６０、ＷＯ２０１２／０６１２５９、ＷＯ２０１２／０５４３６５、ＷＯ２０１２／０４４６３８、ＷＯ２０１０／０８０７２４、ＷＯ２０１０／２１８６５、ＷＯ２００８／１０３２７６、ＷＯ２０１３／０８６３７３、ＷＯ２０１３／０８６３５４、ＵＳ７，８９３，３０２、ＵＳ７，４０４，９６９、ＵＳ８，２８３，３３３、ＵＳ８，４６６，１２２、ＵＳ８，５６９，２５６、ＵＳ２０１０／００３６１１５、ＵＳ２０１２／０２０２８７１、ＵＳ２０１３／００６４８９４、ＵＳ２０１３／０１２９７８５、ＵＳ２０１３／０１５０６２５、ＵＳ２０１３／０１７８５４１、ＵＳ２０１３／０２２５８３６、ＵＳ２０１４／００３９０３２およびＷＯ２０１７／１１２８６５の開示は、ＬＮＰに適した（カチオン性）脂質に特に関連して、参照により本明細書に組込まれる。
実施形態において、本明細書に記載のアミノ脂質またはカチオン性脂質は、１つ以上のプロトン化可能または脱プロトン化可能な基を有している。これにより、脂質は、生理学的なｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下のｐＨにおいて正に帯電し、第２のｐＨ（好ましくは生理学的なｐＨ以上）において電気的に中性である。当然に理解すべきことには、ｐＨの関数であるプロトンの付加または除去は、平衡プロセスである。そのため、脂質が帯電しているまたは中性であるとの言明は、優勢な種の性質を表しているのであって、全ての脂質が帯電しているまたは中性である必要性はない。２個以上のプロトン化可能または脱プロトン化可能な基を有する脂質、または両性イオンである脂質も除外されず、本発明に関連して同様に好適でありうる。いくつかの実施形態において、プロトン化可能な脂質が有しているプロトン化可能な基のｐＫａは、約４～約１１ｐＫａである（例えば、約５～約７ｐＫａ）。
ＬＮＰは、本明細書に記載の２種類以上の（異なる）カチオン性脂質を含んでいてもよい。カチオン性脂質は、様々な有利な特性に寄与するように選択してもよい。例えば、特性が異なるカチオン性脂質をＬＮＰに使用できる（アミンのｐＫａ、化学的安定性、循環中の半減期、組織中の半減期、組織中の正味の蓄積、毒性など）。特に、混合物であるＬＮＰの特性が個々の脂質のみからなるＬＮＰの特性よりも望ましくなるように、カチオン性脂質を選択してもよい。
永続的にカチオン性の脂質またはリピドイドの量は、積荷の核酸の量を考慮して選択できる。一実施形態において、これらの量は、ナノ粒子または組成物のＮ／Ｐ比が約０．１～約２０になるように選択される。これに関連して、Ｎ／Ｐ比とは、脂質またはリピドイドの塩基性窒素含有基の窒素原子（Ｎ）の、積荷である核酸のリン酸基（Ｐ）に対するモル比と定義する。例えば、１μｇのＲＮＡが通常は約３ｎｍｏｌのリン酸残基を含んでいることに基づいて、Ｎ／Ｐ比を計算できる（ＲＮＡが塩基の統計的分布に従っている場合）。脂質またはリピドイドのＮの値は、分子量および永続的にカチオン性の基（および、存在するならばカチオン化可能な基）に基づいて計算できる。
in vivoにおけるＬＮＰの特性および挙動は、ＬＮＰ表面を親水性ポリマーコーティングすることによって改変できる（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）。これにより、立体構造を安定化させる。さらに、ＬＮＰの表面または連結しているＰＥＧ鎖の末端にリガンドを連結すれば（例えば、ＰＥＧ化脂質またはＰＥＧ化コレステロールを介して）、ＬＮＰを特異的な標的化に利用できる。リガンドの例としては、抗体、ペプチド、炭水化物が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ポリマー複合化脂質を含んでいる。用語「ポリマー複合化脂質」とは、脂質部分およびポリマー部分の両方を有している分子を表す。ポリマー複合化脂質の例としては、ＰＥＧ化脂質が挙げられる。用語「ＰＥＧ化脂質」とは、脂質部分およびポリエチレングリコール部分の両方を有している分子を表す。ＰＥＧ化脂質は、本技術分野で周知であり、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧ）などが含まれる。
本明細書に記載のポリマー複合化脂質（ＰＥＧ脂質など）は、低凝集性脂質の機能を果たしてもよい。
特定の実施形態において、ＬＮＰは安定化脂質を含んでおり、安定化脂質はポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ化脂質）である。好適なポリエチレングリコール脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０など）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられる。代表的なポリエチレングリコール脂質の例としては、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、ＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧがが挙げられる。一実施形態において、ポリエチレングリコール脂質は、Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。好適な実施形態において、ポリエチレングリコール脂質は、ＰＥＧ－２０００－ＤＭＧである。一実施形態において、ポリエチレングリコール脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧである。他の実施形態において、ＬＮＰは、ＰＥＧ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）（１ｇ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）；ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）；ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）；ＰＥＧ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）；または、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバメート、２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートなど）を含んでいる。
好適な実施形態において、ＰＥＧ化脂質は、好ましくはＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の式（ＩＶ）に由来する。したがって、ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の式（ＩＶ）に由来するＰＥＧ化脂質、およびそれに関連する開示は、参照により本明細書に組込まれる。
特に好適な実施形態において、組成物に含まれている１つ以上の核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、ＬＮＰを形成している。ＬＮＰは、ＰＥＧ化脂質を含んでいる。ＰＥＧ脂質は、好ましくは、ＷＯ２０１８／０７８０５３Ａ１の式（ＩＶａ）に由来する。したがって、２０１８／０７８０５３Ａ１の式（ＩＶａ）に由来するＰＥＧ化脂質、およびそれに関連する開示は、参照により本明細書に組込まれる。
特に好適な実施形態において、１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これによって脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している。ＬＮＰは、ＰＥＧ化脂質／ＰＥＧ脂質を含んでいる。好ましくは、ＰＥＧ脂質は、式（ＩＶａ）の物質である。
Figure 2023513502000010
式（ＩＶａ）中、ｎの平均値は、３０～６０である（約３０±２、約３２±２、約３４±２、約３６±２、約３８±２、約４０±２、約４２±２、約４４±２、約４６±２、約４８±２、約５０±２、約５２±２、約５４±２、約５６±２、約５８±２または約６０±２など）最も好適な実施形態において、ｎは、約４９である。さらに好適な態様において、ＰＥＧ脂質は式（ＩＶａ）の物質であり、ＰＥＧ脂質の平均分子量が約２０００ｇ／ｍｏｌ～約３０００ｇ／ｍｏｌまたは約２３００ｇ／ｍｏｌ～約２７００ｇ／ｍｏｌ（より一層好ましくは約２５００ｇ／ｍｏｌ）となるように整数ｎを選択する。
本明細書において好適に使用される式ＩＶａの脂質の化学名は、２［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドである。ＡＬＣ－０１５９とも称する。
これに関連して好適なＰＥＧ脂質のさらなる例は、ＵＳ２０１５／０３７６１１５Ａ１およびＷＯ２０１５／１９９９５２に記載されている。いずれの文献も、参照によりその全体が組込まれる。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰに含まれているＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、ＬＮＰに含まれている脂質の総モル数を基準として、約３ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％または約１ｍｏｌ％未満である。さらなる実施形態において、ＬＮＰに含まれているＰＥＧ修飾脂質は、モル基準で、約０．１％～約２０％である（ＬＮＰに含まれている脂質の総モル数を１００％とする）。例えば、ＰＥＧ修飾脂質の含有率は、モル基準で、約０．５～約１０％、約０．５～約５％、約１０％、約５％、約３．５％、約３％、約２．５％、約２％、約１．５％、約１％、約０．５％または約０．３％である。好適な実施形態において、ＬＮＰはに含まれているＰＥＧ修飾脂質は、モル基準で、約１．０％～約２．０％である（ＬＮＰに含まれている脂質の総モル数を１００％とする）。例えば、ＰＥＧ修飾脂質の含有率は、モル基準で、
例えば、１．２～約１．９％、約１．２～約１．８％、約１．３～約１．８％、約１．４～約１．８％、約１．５～約１．８％、約１．６～約１．８％である。特に、ＰＥＧ修飾脂質の含有率は、モル基準で、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％である。最も好ましくは、ＰＥＧ修飾脂質の含有率は、モル基準で、１．７％である。種々の実施形態において、カチオン性脂質のＰＥＧ化脂質に対するモル比は、（約１００：１）～（約２５：１）である。
好適な実施形態において、ＬＮＰは、、粒子の形成中または製造工程において粒子の形成を安定化させる、１つ以上の追加の脂質を含んでいてもよい。このような追加の脂質の例としては、中性脂質および／または１つ以上のステロイドもしくはステロイドアナログが挙げられる。
第２の態様の好適な実施形態において、１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これによって脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している。ＬＮＰは、１つ以上の中性脂質および／または１つ以上のステロイドもしくはステロイドアナログを含んでいる。
好適な安定化脂質の例としては、中性脂質およびアニオン性脂質が挙げられる。用語「中性脂質」とは、生理学的なｐＨにおいて帯電していない、両性イオンの注成形体である脂質種のうち、いずれか一つを表す。代表的な中性脂質の例としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドが挙げられる。
第２の態様の実施形態において、ＬＮＰは、１つ以上の中性脂質を含んでいる。中性脂質は、下記を含む群から選択される：ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）、またはこれらの混合物。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質を含んでいる。種々の実施形態において、カチオン性脂質の中性脂質に対するモル比は、（約２：１）～（約８：１）である。
好適な実施形態において、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。カチオン性脂質のＤＳＰＣに対するモル比は、（約２：１）～（約８：１）であってもよい。
好適な実施形態において、ステロイドは、コレステロールである。カチオン性脂質のコレステロールに対するモル比は、（約２：１）～（約１：１）であってもよい。いくつかの実施形態において、コレステロールは、ＰＥＧ化されていてもよい。
ステロールは、脂質粒子のうち、約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％または約２５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を占めていてもよい。一実施形態において、脂質粒子に含まれているステロールの含有率は、脂質粒子に含まれている全脂質の、約１０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％0または約６０ｍｏｌ％である。他の実施形態において、ＬＮＰに含まれているステロールは、モル基準で、約５％～約５０％である（脂質ナノ粒子に含まれている脂質の総モル数を１００％とする）。例えば、ＬＮＰに含まれているステロールは、モル基準で、約１５％～約４５％、約２０％～約４０％、約４８％、約４０％、約３８．５％、約３５％、約３４．４％、約３１．５％または約３１％である。
好ましくは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、下記を含んでいる。
（ａ）１つ以上の核酸（好ましくは第１の態様の１つ以上のＲＮＡ）
（ｂ）カチオン性脂質
（ｃ）凝集緩和剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質など）
（ｄ）任意構成で、非カチオン性脂質（中性脂質など）
（ｅ）任意構成で、ステロール
いくつかの実施形態において、（上述の）カチオン性脂質、（上述の）非カチオン性脂質、（上述の）コレステロールおよび／または（上述の）ＰＥＧ修飾脂質は、様々な相対モル比で組合せてよい。例えば、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比率は、約（３０～６０）：（２０～３５）：（２０～３０）：（１～１５）であってもよい。あるいは、この比率は、約４０：３０：２５：５、約５０：２５：２０：５、約５０：２７：２０：３、約４０：３０：２０：１０、約４０：３２：２０：８、約４０：３２：２５：３、約４０：３３：２５：２、約５０：２５：２０：５、約５０：２０：２５：５、約５０：２７：２０：３、約４０：３０：２０：１０、約４０：３０：２５：５、約４０：３２：２０：８、約４０：３２：２５：３または約４０：３３：２５：２であってもよい。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質と、１つ以上の核酸（好ましくは本明細書に記載の１つ以上のＲＮＡ）と、中性脂質と、ステロイドと、ＰＥＧ化脂質とを、含んでいる。好適な実施形態において、式（ＩＩＩ）の脂質は脂質化合物ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロイドはコレステロールであり、ＰＥＧ化脂質は式（ＩＶａ）の化合物（ＡＬＣ－０１５９）である。
第２の態様の好適な実施形態において、ＬＮＰは、実質的に下記からなる。
(i)１つ以上のカチオン性脂質
(ii)中性脂質
(iii)ステロール（コレステロールなど）
(iv)ＰＥＧ脂質（ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ｃＤＭＡなど）
上記の態様において、上記成分のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％、中性脂質が約５～２５％、ステロールが約２５～５５％、ＰＥＧ脂質が約０．５～１５％である。
特に好適な実施形態において、１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これによって脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
(i)本明細書に記載の１つ以上のカチオン性脂質（好ましくは式（ＩＩＩ）の脂質、より好ましくは脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５））
(ii)本明細書に記載の１つ以上の中性脂質（好ましくは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；）
(iii)本明細書に記載の１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ（好ましくはコレステロール）
(iv)本明細書に記載のＰＥＧ脂質（例えばＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ｃＤＭＡ、好ましくは（式（ＩＶａ）であるか、またはそれに由来するＰＥＧ化脂質）
ＰＥＧ化脂質である、または式（ＩＶａ）（ＡＬＣ－０１５９）に由来する）。
特に好適な実施形態において、１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これによって脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している。ＬＮＰに含まれている上記(i)～(iv)の成分は、モル比で、カチオン性脂質が約２０～６０％、中性脂質が約５～２５％、ステロールが約２５～５５％、ＰＥＧ脂質が約０．５～１５％である。
好適な一実施形態において、脂質ナノ粒子は、式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質および／または式（ＩＶ）のＰＥＧ脂質を含んでいる。任意構成で、脂質ナノ粒子は、中性脂質（好ましくは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ））と、ステロイド（好ましくは、コレステロール）とをさらに含んでいる。任意構成で、カチオン性脂質のＤＳＰＣに対するモル比は、（約２：１）～（約８：１）である。任意構成で、カチオン性脂質のコレステロールに対するモル比は、（約２：１）～（約１：１）である。
特に好適な実施形態において、１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）を含んでいる第２の態様の組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含んでいる。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
・カチオン性脂質（好ましくは、脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５））
・ＤＳＰＣ
・コレステロール
・ＰＥＧ脂質（好ましくは式（ＩＶａ）においてｎ＝４９であるＰＥＧ脂質、より一層好ましくは式（ＩＶａ）においてｎ＝４５であるＰＥＧ脂質（ＡＬＣ－０１５９））
ＬＮＰにおける上記成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、４７．４：１０：４０．９：１．７である。ＬＮＰは、エタノール中にて可溶化されている。
最も好ましくは、第２の態様の組成物は、１つ以上の核酸（好ましくはＲＮＡ）を含んでいる。１つ以上の核酸は、配列番号１６３の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。１つ以上の核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されている。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
・カチオン性脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）
・ＤＳＰＣ
・コレステロール
・式（ＩＶａ）においてｎ＝４９またはｎ＝４５であるＰＥＧ脂質（ｎ＝４５の場合はＡＬＣ－０１５９）
ＬＮＰにおける上記成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、約４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、約４７．４：１０：４０．９：１．７である。この好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、化学修飾されていない。
他の最も好適な実施形態において、第２の態様の組成物は、１つ以上の核酸（好ましくはＲＮＡ）を含んでいる。１つ以上の核酸は、配列番号１４９の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。１つ以上の核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されている。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
・カチオン性脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）
・ＤＳＰＣ
・コレステロール
・式（ＩＶａ）においてｎ＝４９またはｎ＝４５であるＰＥＧ脂質（ｎ＝４５の場合はＡＬＣ－０１５９）
ＬＮＰにおける上記成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、約４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、約４７．４：１０：４０．９：１．７である。この好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、化学修飾されていない。
他の最も好適な実施形態において、第２の態様の組成物は、１つ以上の核酸（好ましくはＲＮＡ）を含んでいる。１つ以上の核酸は、配列番号２４８３７の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。１つ以上の核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されている。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
・カチオン性脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）
・ＤＳＰＣ
・コレステロール
・式（ＩＶａ）においてｎ＝４９またはｎ＝４５であるＰＥＧ脂質（ｎ＝４５の場合はＡＬＣ－０１５９）
ＬＮＰにおける上記成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、約４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、４７．４：１０：４０．９：１．７である。この好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、化学修飾されていない。
さらなる好適な実施形態において、第２の態様の組成物は、１つ以上の核酸（好ましくはＲＮＡ）を含んでいる。１つ以上の核酸は、配列番号２３３１１、２３５３１または２４８５１の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。１つ以上の核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されている。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
・カチオン性脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）
・ＤＳＰＣ
・コレステロール
・式（ＩＶａ）においてｎ＝４９またはｎ＝４５であるＰＥＧ脂質（ｎ＝４５の場合はＡＬＣ－０１５９）
ＬＮＰにおける上記成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、約４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、４７．４：１０：４０．９：１．７である。この好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、化学修飾されていない。
さらなる好適な実施形態において、第２の態様の組成物は、１つ以上の核酸（好ましくはＲＮＡ）を含んでいる。１つ以上の核酸は、配列番号２３３１０、２３５３０、２３３１３または２３５３３の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。１つ以上の核酸配列は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されている。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
・カチオン性脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）
・ＤＳＰＣ
・コレステロール
・式（ＩＶａ）においてｎ＝４９またはｎ＝４５であるＰＥＧ脂質（ｎ＝４５の場合はＡＬＣ－０１５９）
ＬＮＰにおける上記成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、約４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、約４７．４：１０：４０．９：１．７である。この好適な実施形態において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、化学修飾されていない。
組成物が上述の多価組成物である実施形態において、多価組成物に含まれているＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸種（好ましくはＲＮＡ種）は、別々に製剤化されていてもよい。好ましくは、核酸種は、別々のリポソームまたはＬＮＰの中に製剤化されている。好適には、多価組成物に含まれているＲＮＡ種は、別々のＬＮＰ中に製剤化されている。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
・カチオン性脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）
・ＤＳＰＣ
・コレステロール
・式（ＩＶａ）においてｎ＝４９またはｎ＝４５であるＰＥＧ脂質
ＬＮＰにおける上記成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、約４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、約４７．４：１０：４０．９：１．７である。好ましくは、多価組成物用の核酸種は、上述の通り選択される（「本発明の多価組成物」の節を参照）。
組成物が上述の多価組成物である実施形態において、多価組成物に含まれているＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸腫（好ましくはＲＮＡ種）は共製剤化されてもよい。好ましくは、核酸種は、リポソームまたはＬＮＰ中に共製剤化されている。好適には、多価組成物に含まれているＲＮＡ種は、ＬＮＰ中に共製剤化されている。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
・カチオン性脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）
・ＤＳＰＣ
・コレステロール
・式（ＩＶａ）においてｎ＝４９またはｎ＝４５であるＰＥＧ脂質
ＬＮＰにおける上記成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、約４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、約４７．４：１０：４０．９：１．７である。好ましくは、多価組成物用の核酸種は、上述の通り選択される（「本発明の多価組成物」の節を参照）。
脂質ナノ粒子に含まれている核酸の総量は、様々である。核酸の総量は、例えば、核酸の全脂質に対する重量比（ｗ／ｗ）によって定義される。本発明の一実施形態において、核酸（特にＲＮＡ）の全脂質に対する比率は、０．０６ｗ／ｗ未満であり、好ましくは０．０３ｗ／ｗ～０．０４ｗ／ｗである。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、３種類の脂質成分のみを含んでいる。これらの成分とは、イミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ）から構成される。
一実施形態において、組成物に含まれている脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ステロイド、中性脂質およびポリマー複合化脂質（好ましくはＰＥＧ化脂質）を含んでいる。好ましくは、ポリマー複合化脂質は、ＰＥＧ化脂質またはＰＥＧ脂質である。特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、COATSOME(R)SS-EC（旧称：SS-33/4PE-15；NOF Corporation, Tokyo, Japan）に類似したカチオン性脂質を含んでいる。このカチオン性脂質は、下記式により表される。
Figure 2023513502000011
以下に説明する通り、これらの脂質ナノ粒子を「ＧＮ０１」と称する。
さらに、特定の実施形態において、ＧＮ０１脂質ナノ粒子は、中性脂質を含んでいる。この中性脂質の構造は、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）に類似している。
Figure 2023513502000012
さらに、特定の実施形態において、ＧＮ０１脂質ナノ粒子は、ポリマー複合化脂質（好ましくはＰＥＧ化脂質）を含んでいる。このポリマー複合化脂質とは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）である。構造は下記の通りである。
Figure 2023513502000013
本技術分野で使用されている「ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００」は、１，２－ＤＭＧ ＰＥＧ２０００および１，３－ＤＭＧ ＰＥＧ２０００を約９７：３の比率で混合した混合物と考えられる。
したがって、好適な一実施形態に係るＧＮ０１脂質ナノ粒子（ＧＮ０１－ＬＮＰ）は、カチオン性脂質であるＳＳ－ＥＣ、中性脂質であるＤＰｈｙＰＥ、コレステロール、およびポリマー複合化脂質（ＰＥＧ化脂質）である１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含んでいる。
好適な実施形態において、ＧＮ０１－ＬＮＰは下記を含んでいる。
（ａ）カチオン性脂質であるＳＳ－ＥＣ（旧称：SS-33/4PE-15；NOF Corporation, Tokyo, Japan）を４５～６５ｍｏｌ％
（ｂ）コレステロールを２５～４５ｍｏｌ％
（ｃ）ＤＰｈｙＰＥを８～１２ｍｏｌ％
（ｄ）ＰＥＧ－ＤＭＧ ２０００を１～３ｍｏｌ％
上記の量は、ＧＮ０１脂質ナノ粒子に含まれている全ての脂質賦形剤の総モル量に対する相対値である。
さらなる好適な実施形態において、本明細書に記載のＧＮ０１脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％のカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％の中性脂質、２９．３ｍｏｌ％のステロイド、および１．７ｍｏｌ％のポリマー複合化脂質（好ましくはＰＥＧ化脂質）を含んでいる。最も好適な実施形態において、本明細書に記載のＧＮ０１脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％のカチオン性脂質であるＳＳ－ＥＣ、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、および１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含んでいる。
ＧＮ０１脂質ナノ粒子に含まれている核酸の量に対するカチオン性脂質の量を、重量比で表してもよい（ｍ／ｍなどと略記する）。例えば、ＧＮ０１脂質ナノ粒子に含まれている１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）の量は、ＲＮＡに対する脂質の重量比が、約２０～約６０または約１０～約５０を満たす量である。他の実施形態においては、カチオン性脂質の核酸またはＲＮＡに対する比率は、約３～約１５である（約５～約１３、約４～約８または約７～約１１など）。本発明の非常に好適な実施形態において、全脂質／ＲＮＡの質量比率は、約４０または４０である。つまり、約４０倍または４０倍の過剰量を配合して、ＲＮＡを確実にカプセル化させる。他の好ましいＲＮＡ／脂質比は、約１～約１０、約２～約５、約２～約４である。好ましくは、ＲＮＡ／脂質比は、約３である。
さらに、カチオン性脂質の量は積荷の核酸（ＲＮＡ化合物など）の量を考慮して選択してもよい。一実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、約１～約５０である。他の実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、約１～約２０、約１～約１０、約１～約５である。好適な一実施形態においては、ＧＮ０１脂質ナノ粒子または組成物のＮ／Ｐ比が約１０～約２０となるようにカチオン性脂質の量を選択する。さらに非常に好適な実施形態において、Ｎ／Ｐは１４である。つまり、モル数で１４倍の過剰量の正電荷を配合して、確実に核酸をカプセル化させる。
好適な実施形態において、ＧＮ０１脂質ナノ粒子は、下記を含んでいる。
・カチオン性脂質としてCOATSOME(R)SS-EC（旧称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５（実施例に記載の通り）；NOF Corporation, Tokyo, Japan）を５９ｍｏｌ％
・ステロイドとしてコレステロールを２９．３ｍｏｌ％
・中性脂質／リン脂質としてＤＰｈｙＰＥを１０ｍｏｌ％
・ポリマー複合化脂質としてＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を１．７ｍｏｌ％
ＤＰｈｙＰＥの使用に関連する本発明のさらなる利点として、尾部が嵩高であるために融合能が高く、これによってエンドソーム脂質と高レベルで融合できる点が挙げられる。ＧＮ０１に関して、Ｎ／Ｐ（脂質の核酸（ＲＮＡなど）に対するのモル比）は、好ましくは１４である。ＧＮ０１に関して、全脂質／ＲＮＡの質量比は、好ましくは４０（ｍ／ｍ）である。
他の実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これによって脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している。ＬＮＰは、下記を含んでいる。
(I)１つ以上のカチオン性脂質
(Ii)１つ以上の中性脂質
(Iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ
(Iiii)本明細書に記載の１つ以上のＰＥＧ脂質
上記の態様において、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（５０ｍｏｌ％）またはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（５０ｍｏｌ％）である。中性脂質は、ＤＳＰＣ（１０ｍｏｌ％）である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＯＭＧ（１．５ｍｏｌ％）である。構造脂質は、コレステロール（３８．５ｍｏｌ％）である。
他の実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）は、１つ以上の脂質と複合化しており、これによって脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している。ＬＮＰは、ＳＳ１５／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（またはＤＯＰＣ）／ＤＳＧ－５０００を、５０／３８．５／１０／１．５（ｍｏｌ％）の割合で含んでいる。
他の実施形態において、本発明の核酸は、リポソーム中に製剤化されている。このようなリポソームの例としては、ＷＯ２０１９／２２２４２４、ＷＯ２０１９／２２６９２５、ＷＯ２０１９／２３２０９５、ＷＯ２０１９／２３２０９７またはＷＯ２０１９／２３２２０８に記載のものが挙げられる。リポソームまたは脂質系キャリア分子に関するＷＯ２０１９／２２２４２４、ＷＯ２０１９／２２６９２５、ＷＯ２０１９／２３２０９５、ＷＯ２０１９／２３２０９７、またはＷＯ２０１９／２３２２０８の記載は、参照により本明細書に組込まれる。
種々の実施形態において、本発明の１つ以上の核酸を好適にカプセル化するＬＮＰの平均直径は、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約６０ｎｍ～約２００ｎｍ、約７０ｎｍ～約２００ｎｍ、約８０ｎｍ～２００ｎｍ、約９０ｎｍ～約２００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１９０ｎｍまたは約２００ｎｍである。ＬＮＰは、実質的に無毒である。本明細書においては、本技術分野で周知の通り、動的光散乱により測定されるＺ平均により平均直径を表してもよい。
種々の実施形態において、ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は、通常、０．１～０．５である。特定の実施形態において、ＰＤＩは、０．２未満である。通常、ＰＤＩは、動的光散乱によって測定する。
本発明の他の好適な実施形態において、脂質ナノ粒子の流体力学的直径は、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約６０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍまたは約６０ｎｍ～約１２０ｎｍである。
本発明の他の好適な実施形態において、脂質ナノ粒子の流体力学的直径は、、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約６０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍまたは約６０ｎｍ～約１２０ｎｍである。
２つ以上または複数（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個）の本発明の核酸種が組成物に含まれている実施形態において、２つ以上または複数（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個）の本発明の核酸種は、１つ以上の脂質と複合化している。これによって２つ以上または複数（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個）の異なるの核酸種を含んでいるＬＮＰを形成できる。
好適な実施形態によれば、脂質系キャリア（好ましくは、ＲＮＡをカプセル化または含有している）を、１つ以上の精製工程によって精製する。好ましくは、１つ以上のＴＦＦ工程、１つ以上の清澄化工程および／または１つ以上の濾過工程によって精製する。この精製により、特に、脂質製剤に従前使用されてきた、組成物に含まれているエタノールの量を減少させられる。
これに関連して、好ましくは、精製後の組成物に含まれているエタノールは、約５００ｐｐＭ未満であり、好ましくは５０ｐｐＭ未満であり、より好ましくは約５ｐｐＭ未満である。
実施形態においては、本明細書に記載のＬＮＰを凍結乾燥させてもよい。これにより、製剤および／または核酸（好ましくはＲＮＡ）の保存安定性を向上させる。実施形態においては、本明細書に記載のＬＮＰを噴霧乾燥させてもよい。これにより、製剤および／または核酸の保存安定性を向上させる。凍結乾燥用および／または噴霧乾燥用の凍結乾燥防止剤は、トレハロース、スクロース、マンノース、デキストランおよびイヌリンから選択されてもよい。好ましい凍結乾燥防止剤はスクロースであり、任意構成でさらなる凍結乾燥防止剤を含んでいる。さらに好ましい凍結乾燥防止剤はトレハロースであり、任意構成でさらなる凍結乾燥防止剤を含んでいる。
したがって、ＬＮＰを含んでいる組成物などの組成物を、凍結乾燥させる（例えば、ＷＯ２０１６／１６５８３１またはＷＯ２０１１／０６９５８６などに従う）。これにより、温度安定性である本明細書に記載のＲＮＡまたはＤＮＡなどの乾燥核酸（粉末）組成物を得る。ＬＮＰを含んでいる組成物などの組成物を、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥により乾燥させてもよい（ＷＯ２０１６／１８４５７５またはＷＯ２０１６／１８４５７６などに従う）。これにより、本明細書に記載の温度安定性組成物（粉末）を調製してもよい。
したがって、好適な実施形態において、組成物は、乾燥組成物である。
本明細書において、用語「乾燥組成物」は、上述の通り凍結乾燥、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥させた組成物であると理解せねばならない。これらにより、温度安定性の乾燥組成物（粉末）を得る。乾燥組成物の例としては、（上述した）ＬＮＰと複合化しているＲＮＡを含んでいる乾燥組成物が挙げられる。
さらなる実施形態によれば、第２の態様の組成物は、１つ以上のアジュバントを含んでいてもよい。
好適には、アジュバントを加えることにより、組成物の免疫促進特性が向上する。
本明細書において、用語「アジュバント」は、当業者によって認識・理解される。この用語が表そうと意図しているのは、例えば、他の薬剤の効果を変化させたり（向上させるなど）、組成物の投与および送達を好適に補助したりできる薬理的および／または免疫学的な薬剤である。用語「アジュバント」は、広汎なスペクトルの物質を表している。典型的には、これらの物質は、抗原の免疫原性を増大させられる。例えば、アジュバントは、先天免疫系によって認識されることがある。この場合、例えば、先天免疫応答（非特異的免疫応答）を誘導することがある。通常、アジュバントは、適応免疫応答を誘導しない。本発明に関連して、アジュバントは、核酸から得られる抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質の効果を向上させてもよい。これに関連して、１つ以上のアジュバントは、当業者に知られており、この実施形態（すなわち、被験体（ヒト被験体など）における免疫応答の誘導を補助すること）に好適である任意のアジュバントから選択されてもよい。
したがって、第２の態様の組成物は、１つ以上のアジュバントを含んでいてもよい。１つ以上のアジュバントは、ＷＯ２０１６／２０３０２５に開示されている任意のアジュバントから好適に選択できる。ＷＯ２０１６／２０３０２５のクレーム２～１７のいずれかに開示されているアジュバント（好ましくは、ＷＯ２０１６／２０３０２５のクレーム１７に開示されているアジュバント）が、特に好ましい。これらの特定の記載内容は、参照により本明細書に組込まれる。第２の態様の組成物または第４の態様のワクチンにおいては、アジュバントを好適に使用し、含有させられる。これにより、例えば、コードされているタンパク質に対する充分な免疫応答に必要とされる核酸の量を減らしたり、高齢者を処置／ワクチン接種するための組成物／ワクチンの有効性を向上させたりできる。コロナウイルス組成物またはワクチン（特に、第３の態様のポリペプチドを含んでいる組成物）との関連で用いられるとき、好適なアジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストアジュバント、ＣｐＧ１０１８ＴＭであってもよい。
第２の態様の組成物は、本明細書において特定されている構成成分に加えて、下記からなる群より選択される１つ以上のさらなる成分を含んでいてもよい：さらなる抗原（例えば、ペプチドまたはタンパク質（好ましくはコロナウイルスに由来するもの））またはさらなる抗原をコードしている核酸（好ましくは、ペプチドまたはタンパク質（好ましくはコロナウイルスに由来するもの）をコードしている）；さらなる免疫治療剤；１つ以上の補助物質（サイトカイン（モノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカインなど））；ヒトＴｏｌｌ様受容体に対する（リガンドとしての）結合親和性があるため免疫促進性であることが知られている、任意のさらなる化合物；および／または、アジュバント核酸（好ましくは免疫促進性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、例えばＣｐＧ－ＲＮＡ）。
実施形態において、ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアを含んでいる組成物は、液体として保存後に安定である。例えば、液体として約５℃にて保存後、２週間以上安定である。
いくつかの態様において、本明細書において「安定である」とは、保存後における種々の生理化学的パラメータの測定値が規定の範囲内である、ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアを含んでいる液体組成物を表す。ある実施形態においては、ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアを含んでいる液体組成物を種々のパラメータに従って分析して、安定性を評価する。好適な安定性パラメータの例としては、ＲＮＡ完全性、Ｚ平均粒子径、多分散指数（ＰＤＩ）、液体組成物に含まれている遊離ＲＮＡの量、ＲＮＡのカプセル化効率（脂質系キャリアに組込まれているＲＮＡの割合（％））、ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアの形状および形態、ｐＨ、重量オスモル濃度、濁度が挙げられる（ただし、これらには限定されない）。さらに、「安定である」とは、種々の機能的パラメータの測定値が保存後に規定の範囲内であるＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアを含んでいる液体組成物を表す。一実施形態においては、ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアを含んでいる液体組成物を分析して、液体組成物の効力を評価する。例えば、コードされているペプチドまたはタンパク質の発現、特異的抗体価の誘導、中和抗体価の誘導、Ｔ細胞の誘導、液体組成物の反応原性（先天免疫応答の誘導など）を評価する。
好適な実施形態において、用語「安定」は、ＲＮＡ完全性を表す。
種々の実施形態において、実施形態の組成物は、温度安定性の液体医薬組成物と定義する。組成物は、ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアを特定の濃度で含んでいる。これは、液体組成物に温度安定性を与える好適な特徴である場合がある。理論には拘束されないが、特定濃度のＲＮＡを液体として保存すると、組成物の温度安定性に有利な効果を奏することがある。
実施形態において、組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約１０μｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬである。実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約１００μｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬである。実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約１００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬである。実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約１００μｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬである。実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約２００μｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬである。実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約１００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬである。好適な実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約２００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬである。好適な実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約２００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬである。好適な実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約２００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬである。好適な実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約２００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬである。好適な実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、約２００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬである。
実施形態において、組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、例えば、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬである。好適な実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡの濃度は、１００μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは２００μｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは５００μｇ／ｍＬ以上である。
種々の実施形態において、医薬組成物に含まれているＲＮＡは、特定のＲＮＡ完全性を有している。このＲＮＡ完全制覇、液体組成物に温度安定性を与えるのに好適な特徴である場合がある。
用語「ＲＮＡ完全性」とは、一般的に、完全なＲＮＡ配列が液体組成物中に存在するかどうかを表す。ＲＮＡ完全性が低い原因は、とりわけ、ＲＮＡの分解、ＲＮＡの切断、不正確または不完全なＲＮＡの化学合成、不正確な塩基対、修飾ヌクレオチドの組込みまたは既に組込まれたヌクレオチドの修飾、キャッピングの欠如または不完全なキャッピング、ポリアデニル化の欠如もしくは不完全なポリアデニル化、in vitroにおける不完全なＲＮＡ転写が挙げられる。ＲＮＡは分解しやすい脆弱な分子である。例えば、温度、リボヌクレアーゼ、ｐＨ、または他の要因（求核攻撃、加水分解など）によって、ＲＮＡが分解されることがある。これが原因となって、ＲＮＡ完全性が低下し、結果としてＲＮＡの機能性も低下することがある。
当業者であれば、様々なクロマトグラフィ法または電気泳動法を選択して、ＲＮＡ完全性を決定できる。クロマトグラフィ法および電気泳動法は、本技術分野で周知である。クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣなど）を採用する場合は、クロマトグラムにおける完全長ＲＮＡのピーク面積（またはピーク下面積）の決定することにより、ＲＮＡ完全性を分析できる。ピーク面積は、検出器システムの信号を評価する任意の適切なソフトウェアによって決定できる。ピーク面積を決定するプロセスを、積分とも称する。完全長ＲＮＡを表すピーク面積は、通常、サンプルに含まれている全てのＲＮＡのピーク面積に関連して与えられる。ＲＮＡ完全性を、ＲＮＡ完全性（％）により表してもよい。
本発明の態様に関連して、（ＲＰ）ＨＰＬＣ分析によりＲＮＡ完全性を決定してもよい。典型的な手順は、次の通りである。ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアを含んでいる液体組成物の試験サンプルを、洗剤で処理してもよい（約２％のTriton X100など）。これにより、脂質系キャリアを解離させて、カプセル化されているＲＮＡを放出させられる。基本的には製造者の指示に従って好適な結合化合物（Agencourt AMPure XP beads（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）など）を使用し、放出させたＲＮＡを捕捉してもよい。ＲＮＡサンプルを調製したら、次に、（ＲＰ）ＨＰＬＣ分析を実施して、ＲＮＡ完全性を決定できる。通常、ＲＮＡ完全性を決定するためには、ＲＮＡサンプルを０．１ｇ／Ｌに稀釈してもよい。稀釈には、注射用水（ＷＦＩ）などを用いる。約１０μＬの稀釈したＲＮＡサンプルを、ＨＰＬＣカラム（一体型のポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）マトリクスなど）に注入してもよい。（ＲＰ）ＨＰＬＣ分析は、標準的な条件で実施してよい。このような条件の例としては、勾配１：バッファＡ（０．１ＭのＴＥＡＡ（ｐＨ７．０））、バッファＢ（２５％アセトニトリルを含む０．１ＭのＴＥＡＡ（ｐＨ７．０））が挙げられる。最初はバッファＢの割合を３０％とし、２分間でバッファＢの割合を３２％に増加させ、その後、１５分間かけてバッファＢの割合を５５％に増加させる。流速は１ｍＬ／分とする。ＨＰＬＣクロマトグラムの記録波長は、通常、２６０ｎｍである。得られたクロマトグラムは、ソフトウェアにより評価できる。本技術分野で周知の通り、相対ピーク面積は％で得られる。相対ピーク面積は、ＲＮＡ完全性が１００％であるＲＮＡの量を表す。通常、ＨＰＬＣに注入するＲＮＡの量は既知であるので、相対ピーク面積を分析することにより、ＲＮＡ完全性に関する情報が得られる。例えば、合計で１００ｎｇのＲＮＡを注入し、相対ピーク面積が１００ｎｇと決定されるならば、ＲＮＡ完全性は１００％である。例えば、相対ピーク面積が８０ｎｇに対応するならば、ＲＮＡ完全性は８０％である。したがって、本発明に関連して、ＲＮＡ完全性は、ＨＰＬＣ分析（好ましくはＲＰ－ＨＰＬＣ分析）により決定する。
特定の実施形態において、実施形態に係る医薬は、液体として、約５℃にて、約２週間から約１箇月間、約２箇月間、約３箇月間、約４箇月間、約５箇月間、約６箇月間または約１年間保存した後に安定である。例えば、ＲＮＡのうち約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上または約９５％以上は、液体として、約５℃以上にて、約２週間、約３週間、約１箇月間、約６週間、約２箇月間、約３箇月間、約４箇月間、約５箇月間、約６箇月間または約１年間保存した後に損傷していない。いくつかの態様において、実施形態に係る温度安定性の液体医薬は、液体として、約５℃にて、約２週間以上保存した後に、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上または約９５％以上のＲＮＡが損傷していない。さらなる態様において、実施形態に係る温度安定性の液体医薬は、液体として、約５℃にて、約１箇月間以上保存した後に、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上または約９５％以上のＲＮＡが損傷していない。特定の態様において、実施形態に係る温度安定性の液体医薬は、液体として、約５℃にて、約２週間から約１箇月間以上、約２箇月間以上、約３箇月間以上、約４箇月間以上、約５箇月間以上、約６箇月間以上または約１年間以上保存した後に、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上または約９５％以上のＲＮＡが損傷していない。いくつかの特定の態様において、実施形態に係る温度安定性の液体医薬は、液体として、約５℃にて、約２週間以上保存した後に、約８０％以上のＲＮＡが損傷していない。
特定の実施形態において、組成物に含まれているＲＮＡのＲＮＡ完全性は、約４０％～約１００％である。実施形態において、ＲＮＡのＲＮＡ完全性は、約５０％～約１００％である。実施形態において、ＲＮＡのＲＮＡ完全性は、約６０％～約１００％である。実施形態において、ＲＮＡのＲＮＡ完全性は、約７０％～約１００％である。実施形態において、ＲＮＡ完全性は、例えば、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％である。ＲＮＡは、ＨＰＬＣ分析（好ましくはＲＰ－ＨＰＬＣ分析）により好適に決定される。
好適な実施形態において、組成物に含まれているＲＮＡのＲＮＡ完全性は、約５０％以上であり、好ましくは約６０％以上であり、より好ましくは約７０％以上であり、最も好ましくは約８０％以上または約９０％以上である。ＲＮＡは、ＨＰＬＣ分析（好ましくはＲＰ－ＨＰＬＣ分析）により好適に決定される。
種々の実施形態において、医薬組成物の核酸（ＲＮＡなど）は、ある割合を超える遊離ＲＮＡを含んでいない。これは、液体組成物に温度安定性を与えるのに好適な特徴でありうる。理論に拘束される意図はないが、液体組成物に含まれている遊離ＲＮＡは、脂質系キャリア中にカプセル化されているＲＮＡよりも、分解されやすいことがある。
特定の態様において、実施形態の組成物は、ＲＮＡを含んでいる。これに関連して、用語「遊離ＲＮＡ」「非複合化ＲＮＡ」または「カプセル化されていないＲＮＡ」には、本明細書に記載の脂質系キャリア中にカプセル化されていないＲＮＡ分子が含まれる。液体組成物を製造する際において（例えば、脂質系キャリアにＲＮＡをカプセル化する際において）、遊離ＲＮＡは、汚染または不純物として表されることがある。カプセル化されていないＲＮＡまたは遊離ＲＮＡの大部分は、組成物に含まれている脂質系キャリアの不安定化の指標でもありうる（例えば、組成物を保存する際における不安定化の指標）。例えば、液体組成物中において検出可能な遊離ＲＮＡは、保存中に増加することがある。これは、組成物の温度安定性を決定する特徴として使用できる。
当業者であれば、様々な方法を選択して、液体組成物に含まれている遊離ＲＮＡである遊離核酸の量および／または割合を決定できる。液体組成物に含まれている遊離ＲＮＡは、クロマトグラフィ法（ＡＥＸ、ＳＥＣなど）によって決定してもよいし、組成物に含まれている遊離ＲＮＡに結合するプローブ（色素など）を使用して決定してもよい。本発明に関連して、遊離ＲＮＡまたはカプセル化されていないＲＮＡの量は、色素系アッセイにより決定してもよい。遊離ＲＮＡの量および／または割合を決定するために使用できる好適な色素の例としては、RiboGreen(R)、PicoGreen(R) dye、OliGreen(R) dye、QuantiFluor(R) RNA dye、Qubit(R) RNA dye、Quant-iT(TM) RNA dye、TOTO(R)-1 dye、YOYO(R)-1 dyeが挙げられる。このような色素は、遊離ＲＮＡとカプセル化されているＲＮＡとの識別に適している。規定量の遊離ＲＮＡまたはカプセル化されているＲＮＡからなるレファレンス標準を使用して、製造者の指示書が推奨する通りに、試薬と混合してもよい（RiboGreen(R)試薬（励起光：５００ｎｍ／発光：５２５ｎｍ）など）。通常、液体組成物の遊離ＲＮＡは、Quant-iT RiboGreen RNA試薬を使用して、製造者の指示に従って定量する。本発明に関連して、遊離ＲＮＡの割合は、通常、RiboGreenアッセイにより決定する。
実施形態において、組成物に含まれている遊離核酸（遊離ＲＮＡなど）は、約３０％～約０％である。実施形態において、液体組成物に含まれているのは、約２０％の遊離ＲＮＡ（および約８０％のカプセル化されているＲＮＡ）、約１５％の遊離ＲＮＡ（および約８５％のカプセル化されているＲＮＡ）、約１０％の遊離ＲＮＡ（および約９０％のカプセル化されているＲＮＡ）、または約５％の遊離ＲＮＡ（および約９５％のカプセル化されているＲＮＡ）である。好適な実施形態において、液体組成物に含まれている遊離ＲＮＡは、約２０％未満であり、好ましくは約１５％未満であり、より好ましくは約１０％未満であり、最も好ましくは約５％未満である。
ＲＮＡ核酸を含んでいる態様において、用語「カプセル化されているＲＮＡ」には、本明細書に記載の脂質系キャリアにカプセル化されているＲＮＡ分子が含まれる。本発明に関連して、カプセル化されているＲＮＡの割合は、通常、RiboGreenアッセイにより決定する。
したがって、実施形態において、液体組成物に含まれているＲＮＡのうち約７０％～約１００％は、脂質系キャリアにカプセル化されている。実施形態において、液体組成物に含まれているのは、約８０％のカプセル化されているＲＮＡ（および約２０％の遊離ＲＮＡ）、約８５％のカプセル化されているＲＮＡ（および約１５％の遊離ＲＮＡ）、約９０％のカプセル化されているＲＮＡ（および約１０％の遊離ＲＮＡ）、または約９５％のカプセル化されているＲＮＡ（および約５％の遊離ＲＮＡ）である。
好適な実施形態において、液体組成物中に含まれている核酸（ＲＮＡなど）のうちカプセル化されているものは８０％であり、好ましくは８５％であり、より好ましくは９０％であり、最も好ましくは９５％である。
種々の実施形態において、医薬組成物（特に、組成物に含まれているＲＮＡ）は、特定の量を超える２価のカチオンを含んでいない。これは、液体組成物に温度安定性を与えるのに好適な特徴でありうる。２価のカチオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｐｂ２＋などの２価の金属イオン）は、組成物を液体として保存している間に、脂質系キャリアにカプセル化されているＲＮＡを加水分解することがある。
いくつかの態様において、組成物に含まれているＲＮＡは、通常、（直鎖）ＤＮＡテンプレートをin vitroにおいてＲＮＡに転写すること（ＩＶＴ）によって作製できる。in vitroにおけるＲＮＡの転写に用いられる一般的なバッファは、ＲＮＡポリメラーゼの補因子として、多量のＭｇＣｌ２を含んでいる（例えば、５ｍＭ、１５ｍＭまたはそれ以上）。したがって、得られるin vitroにおいて転写されたＲＮＡは、汚染物質としてＭｇ２＋イオンを含んでいることがある。in vitroにおけるＲＮＡの転写の後、通常は、ＤＮＡｓｅによってＤＮＡテンプレートを除去する。ＤＮＡｓｅによる消化に用いられる一般的なバッファは、ＤＮＡｓｅの補因子として、大量のＣａＣｌ２を含んでいる（例えば、１ｍＭ、５ｍＭまたはそれ以上）。したがって、得られるin vitroにおいて転写されたＲＮＡは、汚染物質としてＣａ２＋を含んでいることがある。
通常は、種々のＲＮＡの精製工程を採用して（ＲＰ－ＨＰＬＣ、タンジェンシャルフロー濾過など）、種々の汚染物質（２価の金属イオンなど）を除去できる。好適には、本発明の脂質系キャリアによりカプセル化するＲＮＡは、精製することで２価の金属イオンが除去されている。
実施形態において、実施形態の組成物に含まれている２価のカチオンは、ＲＮＡ１ｇあたり、約１００ｎＭ未満であり、好ましくは約５０ｎＭ未満であり、より好ましくは約１０ｎＭ未満である。実施形態において、２価のカチオンは、Ｍｇ２＋および／またはＣａ２＋から選択される。実施形態において、液体組成物に含まれているＭｇ２＋は、ＲＮＡ１ｇあたり、約１００ｎＭ未満である。実施形態において、液体組成物に含まれているＣａ２＋は、ＲＮＡ１ｇあたり、約１００ｎＭ未満である。典型的には、イオンクロマトグラフィ（ＩＣ）および誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣ－ＩＣＰ－ＭＳ）を用いて、２価のカチオンを測定してもよい。
実施形態において、組成物に含まれるＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアが含んでいる２価のカチオンは、ＲＮＡ１ｇあたり、約１００ｎＭ未満であり、好ましくは約５０ｎＭ未満であり、より好ましくは約１０ｎＭ未満である。実施形態において、２価のカチオンは、Ｍｇ２＋および／またはＣａ２＋から選択される。実施形態において、ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアに含まれているＭｇ２＋は、ＲＮＡ１ｇあたり、約１００ｎＭ未満である。実施形態において、ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアに含まれているＣａ２＋は、ＲＮＡ１ｇあたり、約１００ｎＭ未満である。典型的には、イオンクロマトグラフィ（ＩＣ）および誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣ－ＩＣＰ－ＭＳ）を用いて、Ｍｇ２＋および／またはＣａ２＋を測定してもよい。
実施形態において、組成物に含まれているＲＮＡは、対イオンとしてＮａ＋を含んでいる。実施形態において、ＲＮＡに含まれているＮａ＋は、ＲＮＡ１ｇあたり、約１０μｇ～約１ｍｇである。実施形態において、ＲＮＡに含まれているＮａ＋は、ＲＮＡ１ｇあたり、約１００μｇ以上であり、好ましくは約２００μｇ以上である。典型的には、イオンクロマトグラフィ（ＩＣ）および誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣ－ＩＣＰ－ＭＳ）を用いて、Ｎａ＋を測定できる。
実施形態において、組成物は、１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の１つ以上のアンタゴニストを含んでいる。このようなアンタゴニストは、好ましくは本明細書に記載の脂質系キャリア中に共製剤化されていてもよい。
１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の好適なアンタゴニストは、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０７２５１６に開示されている。この開示の全体は、参照により本明細書に組込まれる。特に、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０７２５１６のクレーム１～９４のいずれかに記載の、１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の好適なアンタゴニストに関する開示が組込まれる。
好適な実施形態において、組成物は、１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の１つ以上のアンタゴニストを含んでいる。１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体は、Ｔｏｌｌ様受容体から選択される。好ましくは、Ｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８である。
実施形態において、１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の１つ以上のアンタゴニストは、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、核酸、ペプチド、タンパク質、小分子、脂質、これらのいずれかの断片、バリアントまたは誘導体から選択される。
好適な実施形態において、１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の１つ以上のアンタゴニストは、１本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくは１本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド）である。
実施形態において、１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体のアンタゴニストは、１本鎖オリゴヌクレオチドである。１本鎖オリゴヌクレオチドは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０７２５１６の配列番号８５～２１２からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片である。
好適な実施形態において、１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体のアンタゴニストは、１本鎖オリゴヌクレオチドである。１本鎖オリゴヌクレオチドは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０７２５１６の配列番号８５～８７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、核酸配列は、これらのいずれかの配列の断片である。
本発明に関連して、１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の特に好ましいアンタゴニストは、５’－ＧＡＧ ＣＧｍＧ ＣＣＡ－３’（ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０７２５１６の配列番号８５）またはその断片である。
実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の１つ以上のアンタゴニストの、１つ以上の核酸（好ましくは、本明細書に記載のＳＲＡＳ－ＣｏＶ－２の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしているＲＮＡ）に対する、モル比は、好適には、約１：１～約１００：１または約２０：１～約８０：１である。
実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の１つ以上のアンタゴニストの、１つ以上の核酸（好ましくは、本明細書に記載のＳＲＡＳ－ＣｏＶ－２の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしているＲＮＡ）に対する重量比は、好適には、約１：１～約１：３０または約１：２～約１：１０である。
［コロナウイルスワクチンのためのポリペプチド］
第３の態様において、本発明は、コロナウイルスワクチン（特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（旧称：ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルスワクチン）に好適な、抗原性ポリペプチドを提供する。好適な実施形態において、ポリペプチドは、第１の態様の核酸がコードしている任意のタンパク質またはその断片に由来する。好ましいポリペプチド設計を、リスト１に記載している。
好適な実施形態において、第３の態様の抗原性ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１～１１１、２７４～１１６６３、１３１７６～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２～２２７５８、２２９１７、２２９２３、２２９２９～２２９６４、２６９３８、２６９３９のアミノ酸配列のうち、いずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。あるいは、アミノ酸配列は、これらのいずれかの断片またはバリアントである。
第３の態様のポリペプチドは、（医薬）組成物に含まれていてもよい。（医薬）組成物は、薬学的に許容可能なキャリアまたは本明細書に記載の（特に、第２の態様に関連して記載されている）アジュバントを含んでいる。したがって、本発明は、抗原性ポリペプチドを含んでいる（医薬）組成物にも関する。
第３の態様のポリペプチドは、ワクチンに含まれていてもよい。ワクチンは、薬学的に許容可能なキャリアまたは本明細書に記載の（特に、第４の態様に関連して記載されている）アジュバントを含んでいる。したがって、本発明は、抗原性ポリペプチドを含んでいるワクチンにも関する（第４の態様を参照）。本明細書に記載のポリペプチドと組合せて使用できる好適なアジュバントは、サポニン系アジュバント（ステロイドまたはトリテルペノイドグリコシド）である。その例としては、マトリクス－Ｍアジュバントが挙げられる。
［ワクチン］
第４の態様において、本発明は、コロナウイルス（好ましくはＣＯＶＩＤ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（旧称：ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルス）に対するワクチンを提供する。
第４の態様の好適な実施形態において、ワクチンは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの第１の態様の１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）を含んでいる。あるいは、ワクチンは、第２の態様の組成物を含んでいる。
他の実施形態において、ワクチンは、第３の態様に記載の１つ以上のポリペプチドを含んでいる。
他の実施形態において、ワクチンは、第１の態様に記載の１つ以上のプラスミドＤＮＡまたはアデノウイルスＤＮＡを含んでいる。
注目すべきことには、第２の態様の組成物に関する実施形態は、同様に、第４の態様のワクチンの好適な実施形態としても読まれ、理解されうる。また、第４の態様のワクチンに関する実施形態は、同様に、（第１の態様の核酸を含んでいる）第２の態様の組成物の好適な実施形態として読まれ、理解されうる。さらに、第１の態様（本発明の核酸）に関連して記載されている特徴および実施形態は、第４の態様の組成物の好適な実施形態として読まれ、理解されねばならない。
用語「ワクチン」は、当業者によって認識・理解される。この用語が意図しているのは、例えば、１つ以上のエピトープまたは抗原（好ましくは免疫原）を与える、予防物質または治療物質である。本発明に関連して、抗原または抗原機能は、本発明の第１の態様の核酸（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしているコーディング配列を有している核酸）または第２の態様の組成物（第１の態様の１つ以上の核酸を含んでいる組成物）によって、好適に与えられる。他の実施形態において、抗原または抗原機能は、本発明の第３の態様のポリペプチドによって与えられる。
好適な実施形態において、ワクチン（または、第２の態様の組成物）は、適応免疫応答を誘導する。好ましくは、ワクチンは、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）に対する適応免疫応答を誘導する。
特に好適な実施形態において、ワクチン（または、第２の態様の組成物）は、ウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）を効果的に中和できる機能性の抗体を誘導する。
さらに好適な実施形態において、ワクチン（または、第２の態様の組成物）は、粘膜のＩｇＡ抗体を誘導することによって、ＩｇＡによる粘膜免疫を誘導する。
特に好適な実施形態において、ワクチン（または、第２の態様の組成物）は、ウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）を効果的に中和できる機能性の抗体を誘導する。
さらに特に好適な実施形態において、ワクチン（または、第２の態様の組成物）は、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）に対する広汎な機能性の細胞性Ｔ細胞応答を誘導する。
さらに特に好適な実施形態において、ワクチン（または、第２の態様の組成物）は、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）に対するバランスのとれたＢ細胞応答およびＴ細胞応答を誘導する。
好適な実施形態によれば、本明細書に記載のワクチンは、第２の態様に関連して記載されている薬学的に許容可能なキャリアと、任意構成である１つ以上のアジュバントとをさらに含んでいてもよい。
これに関連して、好適なアジュバントは、ＷＯ２０１６／２０３０２５のクレーム１７に開示されているアジュバントから選択されてもよい。
好適な態様において、ワクチンは１価ワクチンである。
用語「１価ワクチン(monovalent vaccine, univalent vaccine)」または「１価組成物(monovalent composition, univalent composition)」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が表そうと意図しているのは、例えば、病原体に由来する１種類の抗原または抗原コンストラクトのみを含んでいる、組成物またはワクチンである。したがって、このようなワクチンまたは組成物は、１つの核酸種のみを含んでいる。１つの核酸種は、１種類の抗原または抗原コンストラクトのみをコードしており、１種類の生物に由来する。用語「１価ワクチン」には、１つの価に対する免疫化が含まれる。本発明に関連して、１価のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスワクチンまたは組成物は、特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する１種類の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質のみをコードしている、１つ以上の核酸を含んでいてもよい。
実施形態において、ワクチンは、第１の態様に関連して記載されている複数または２つ以上の核酸種を含んでいる、多価ワクチンである。第２の態様に関連して開示されている多価組成物に関する実施形態は、同様に、多価ワクチンの好適な実施形態として読まれ、理解されうる。
用語「多価ワクチン(polyvalent vaccine, multivalent vaccine)」または「多価組成物(polyvalent composition, multivalent composition)」は、当業者によって認識・理解される。これらの用語が表そうと意図しているのは、例えば、２種類以上のウイルス（異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの単離株など）に由来する抗原を含んでいる組成物もしくはワクチン、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの異なる抗原もしくは抗原コンストラクトを含んでいる組成物もしくはワクチン、またはこれらの任意の組合せである。この用語が意味するところは、ワクチンまたは組成物が２つ以上の価を有していることである。本発明に関連して、多価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスワクチンは、いくつかの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス（異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの単離株など）に由来する抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている核酸配列、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する異なる抗原または抗原コンストラクトをコードしている核酸配列、またはこれらの組合せを含んでいる。
好適な実施形態において、多価または多価ワクチンは、第２の態様に記載の１つ以上の多価組成物を含んでいる。特に好ましくは、「本発明の多価組成物」の節に記載の多価組成物を含んでいる。
実施形態において、ワクチンは、第２の態様に記載の１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の１つ以上のアンタゴニストを含んでいる。
コロナウイルスワクチンは、通常、安全かつ有効量のＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸（好ましくは第１の態様のＲＮＡ）、第２の態様の組成物、または第３の態様のポリペプチドを含んでいる。本明細書において、「安全かつ有効量」とは、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染に関連する疾患または障害を優位に陽性に変化させるのに充分な、核酸または組成物の量を意味する。同時に、「安全かつ有効量」は、重篤な副作用を回避するために、充分に少ない。本発明の核酸、組成物またはワクチンに関して、「安全かつ有効量」という表現は、好ましくは、過剰またはダメージを与える免疫反応（先天免疫応答など）を起こさずに、コロナウイルスに対する適応免疫系を刺激するのに好適である、核酸、組成物またはワクチンの量を意味する。
上述の核酸、組成物またはワクチンの「安全かつ有効量」は、処置する特定の状態、処置する患者の年齢および身体状態、状態の重篤度、処置期間、附随する処置の性質、使用する特定の薬学的に許容可能なキャリアの性質、および同様の因子に関連して、当業者の知識および経験の範囲内で変化する。また、核酸、組成物またはワクチンの「安全かつ有効量」は、適用／送達経路（皮内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路）、適用装置（ジェット注射、針注射、マイクロニードルパッチ、エレクトロポレーション装置）、複合体／製剤（プロタミン複合体またはＬＮＰカプセル、ＤＮＡまたはＲＮＡ）などによっても変化する。さらに、核酸、組成物またはワクチンの「安全かつ有効量」は、処置される被験体の身体状態（乳児、妊娠者、女性、免疫無防備状態のヒト被験体など）によっても変化する。
コロナウイルスワクチンは、本発明に従って使用できる。その目的は、ヒトに対する医療目的または（哺乳動物、脊椎動物または鳥類の種に対する）獣医目的でありうる。
本明細書において、薬学的に許容可能なキャリアは、好ましくは、本発明のコロナウイルスワクチンの液体基剤または非液体基剤を含んでいる。本発明のワクチンを液体で提供する場合、キャリアは、水（通常は発熱物質を含んでいない水）、等張な生理食塩水または緩衝（水溶）液（リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）であってもよい。好ましくは、本発明に係るワクチンまたは組成物の液体基剤として、乳酸リンゲル溶液を使用する（ＷＯ２００６／１２２８２８に記載の通り）。好適な緩衝液に関するＷＯ２００６／１２２８２８開示は、参照により本明細書に組込まれる。ワクチンまたは組成物（特に、ＬＮＰを含んでいる組成物／ワクチン）の液体基剤として使用される他の好ましい溶液は、スクロースおよび／またはトレハロースを含んでいる。
本明細書に記載の薬学的に許容可能なキャリアの選択は、原則として、本発明による医薬組成物またはワクチンを投与する様式によって決定する。好ましくは、コロナウイルスワクチンを局所的に投与する。局所投与経路の例としては、局所への投与経路一般が挙げられる。より具体的な例としては、皮内注射、経皮注射、皮下注射、筋肉内注射、病巣内注射、頭蓋内注射、肺内注射、心内注射、気管内注射、舌下注射が挙げられる。より好ましくは、本発明に係る組成物またはワクチンは、皮内経路、皮下経路または筋肉内経路によって投与してもよい。好ましくは、注射（針無注射および／または針注射）によって投与してもよい。本発明に関連して好ましいのは、筋肉内注射である。したがって、組成物／ワクチンは、好ましくは、液体または固体の形態で製剤化されている。本発明に係るワクチンまたは組成物の投与すべき好適な量は、通常の実験によって決定できる（動物モデルを利用した実験など）。このようなモデルの例としては、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌおよび非ヒト霊長類のモデルが挙げられる（ただし、これらには限定されない）。注射のための好ましい単位用量形態は、水、生理食塩水、またはこれらの混合物の滅菌溶液を含んでいる。このような溶液のｐＨは、約７．４に調整せねばならない。
本明細書に記載の本発明のコロナウイルスワクチンまたは組成物は、上述の１つ以上の補助物質またはアジュバントを含んでいてもよい。これにより、免疫原性をさらに増加させられる。本発明の組成物／ワクチンに含まれている核酸と、補助物質との相乗作用は、好ましくは、このようにして達成される。任意構成で、補助物質は、本発明のワクチンまたは組成物と共に製剤化されていてもよいし、別々に製剤化されていてもよい。このような免疫原性増加物質または化合物は、別々に提供されされてもよく（本発明のワクチンまたは組成物と共に製剤化さていなくてもよく）、別々に投与してもよい。
コロナウイルスワクチンは、好ましくは、凍結乾燥形態または噴霧乾燥形態で提供される（第２の態様に記載の通り）。このような凍結乾燥ワクチンまたは噴霧乾燥ワクチンは、通常、トレハロースおよび／またはスクロースを含んでいる。そして、被験体への投与前に、好適な液体バッファで再構成する。いくつかの態様において、実施形態の凍結乾燥ワクチンは、ＬＮＰと複合体化している実施形態のｍＲＮＡを含んでいる。いくつかの実施形態において、凍結乾燥組成物の含水率は、約１０％未満である。例えば、凍結乾燥組成物の含水率は、約０．１％～約１０％、約０．１％～約７．５％または約０．５％～約７．５％である。好ましくは、凍結乾燥組成物の含水率は、約０．５％～約５．０％である。
好適な実施形態において、治療有効量の核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチンを被験体に投与することにより、被験体において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する中和抗体価が誘導される。
いくつかの実施形態において、中和抗体価は、１００ＮＵ／ｍＬ（中和ユニット／ミリリットル）以上、５００ＮＵ／ｍＬ以上または１０００ＮＵ／ｍＬ以上である。
いくつかの実施形態においては、核酸、組成物、ポリペプチドまたはワクチンの投与から約１時間～約７２時間後に、被験体において、検出可能なレベルのコロナウイルス抗原が産生される。
いくつかの実施形態においては、核酸、組成物、ポリペプチドまたはワクチンの投与から約１日後～約７２日後に、被験体の血清中における（コロナウイルスに対する）中和抗体価は、１００ＮＵ／ｍＬ以上、５００ＮＵ／ｍＬ以上または１０００ＮＵ／ｍＬ以上である。
いくつかの実施形態において、中和抗体価は、コロナウイルスへの感染を減少させるのに充分であり、ワクチン未接種の対照被験体の中和抗体価と比較して５０％以上である。あるいは、中和抗体価は、コロナウイルスへの感染を減少させるのに充分であり、弱毒化ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチンまたはタンパク質サブユニットウイルスワクチンでワクチン接種した被験体の中和抗体価と比較して５０％以上である。
いくつかの実施形態において、中和抗体価および／またはＴ細胞免疫応答は、ワクチン未接種の対照被験体の中和抗体価と比較して、無症候性ウイルス感染の割合を低下させるのに充分である。
いくつかの実施形態において、中和抗体価および／またはＴ細胞免疫応答は、被験体におけるウイルス潜伏を防ぐのに充分である。
いくつかの実施形態において、中和抗体価は、被験体の上皮細胞とのウイルスの融合を阻害するのに充分である。
いくつかの実施形態においては、１μｇ～１００μｇの核酸、組成物、ポリペプチドまたはワクチンを１回目に投与してから２０日間以内に、中和抗体価が誘導される。あるいは、１μｇ～１００μｇの核酸、組成物、ポリペプチドまたはワクチンを２回目に投与してから４０日間以内に、中和抗体価が誘導される。
好適な実施形態において、治療的有効量の核酸、組成物、ポリペプチドまたはワクチンを被験体に投与することにより、被験体において、コロナウイルスに対するＴ細胞免疫応答が誘導される。好適な実施形態において、Ｔ細胞免疫応答には、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答が含まれる。
［キットまたはパーツのキット、応用、医療用途、治療方法］
第５の態様において、本発明は、コロナウイルス感染症の治療または予防に好適な、キットまたはパーツのキットを提供する。好ましくは、キットまたはパーツのキットは、コロナウイルス感染症（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（旧称：ｎＣｏＶ－２０１９）コロナウイルス感染症）の治療または予防に好適である。
注目すべきことには、第１の態様の核酸、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチドおよび第４の態様のワクチンに関する実施形態は、同様に、本発明の第５の態様のキットまたはパーツのキットの好適な実施形態として読まれ、理解されうる。
好適な実施形態において、キットまたはパーツのキットは、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは第１の態様の１つ以上のＲＮＡ）、第２の態様の１つ以上の組成物、第３の態様の１つ以上のポリペプチドおよび／または第４の態様の１つ以上のワクチンを備えている。
実施形態において、キットまたはパーツのキットは、第１の態様で定義される１つ以上のＤＮＡ（１つ以上のプラスミドＤＮＡおよび／または１つ以上のアデノウイルスＤＮＡなど）を備えている。
実施形態において、キットまたはパーツのキットは、第３の態様に記載の１つ以上のポリペプチドを備えている。
さらに、キットまたはパーツのキットは、可溶化用の液体媒体および／または構成品の投与および用量に関する情報を与える技術説明書を備えていてもよい。
キットは、第２の態様の組成物および／または第４の態様のワクチンに関連して記載されている追加の構成をさらに備えていてもよい。
キットの技術説明書は、投与および用量、ならびに患者群に関する情報を含んでいてもよい。このようなキット（好ましくはパーツのキット）は、例えば、本明細書に記載の任意の用途または使用のために利用できる。好ましくは、第１の態様の核酸、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、または第４の態様のワクチンの使用のために利用する。同じく好ましくは、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）またはそれに関する障害によって引き起こされる感染または疾患の治療または予防に利用する。
好ましくは、核酸、組成物、ポリペプチドまたはワクチンは、異なるキットの部分において提供される。好ましくは、核酸、組成物、ポリペプチドまたはワクチンは、好ましくは凍結乾燥されている。
キットは、核酸、組成物、ポリペプチドまたはワクチンの可溶化用の媒体（緩衝液など）を、その一部としてさらに備えていてもよい。
好適な実施形態において、本明細書に記載のキットまたはパーツのキットは、乳酸リンゲル溶液を備えている。
好適な実施形態において、本明細書に記載のキットまたはパーツのキットは、組成物／ワクチンを投与するための多用量容器を備えている。
上述のキットは、いずれも、本明細書に記載の治療または予防において使用してもよい。より好ましくは、上述キットのいずれかをワクチンとして使用してもよい。好ましくは、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）によって引き起こされる感染症に対するワクチンとして使用してもよい。
好適な態様において、キットまたはパーツのキットは、下記の要素を備えている。
（ａ）本明細書に記載の組成物またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを格納している、１つ以上の容器またはバイアル。組成物またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンにおける核酸（好ましくはＲＮＡ）の濃度は、約１００μｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約１００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬである（約２７０μｇ／ｍＬなど）。
（ｂ）無菌の稀釈バッファ（好適にはＮａＣｌを含んでいるバッファ）を格納している、１つ以上の稀釈容器またはバイアル。任意構成で、防腐剤も格納されている。
（ｃ）保存容器から稀釈容器へと組成物またはワクチンを移動させるための、１つ以上の手段。
（ｄ）最終稀釈組成物またはワクチンを被験体に投与するための、１つ以上のシリンジ。好ましくは、ヒト被験体への筋肉内投与のために構成されている、１つ以上のシリンジ。最終稀釈組成物またはワクチンの核酸（好ましくはＲＮＡ）の濃度は、約１０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬであり、好ましくは約１０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬである（約２４μｇ／ｍＬなど）。
一実施形態において、キットまたはパーツのキットは、２つ以上のｍＲＮＡ系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組成物／ワクチンを備えている。好ましくは、下記の条件を満たしている。
－第１バイアルまたは第１容器の中に提供されている、本明細書に記載の１つ以上のワクチン。ワクチンは、１つ以上の核酸（好ましくはＲＮＡ）を含んでいる。１つ以上の核酸は、配列番号１６３、１４９または２４８３７の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。好ましくは、核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されている。ＬＮＰは、カチオン性脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）、ＤＳＰＣ、コレステロール、および式（ＩＶａ）においてｎ＝４９またはｎ＝４５であるＰＥＧ脂質（ｎ＝４５の場合はＡＬＣ－０１５９）を含んでいる。これらの成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、約４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、約４７．４：１０：４０．９：１．７である。好ましくは、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、化学修飾されていない。
－第１バイアルまたは第１容器の中に提供されている、本明細書に記載の１つ以上のさらなるワクチン。組成物／ワクチンは、１つ以上の核酸（好ましくはＲＮＡ）を含んでいる。核酸は、配列番号２３３１１、２３５３１、２４８５１、２３３１０、２３５３０、２４８５０、２３３１３、２３５３３、２４８５３、２３３１４、２３５３４または２４８５４の核酸配列とと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である好ましくは、核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されている。ＬＮＰは、カチオン性脂質ＩＩＩ－３（ＡＬＣ－０３１５）、ＤＳＰＣ、コレステロール、および式（ＩＶａ）においてｎ＝４９またはｎ＝４５であるＰＥＧ脂質（ｎ＝４５の場合はＡＬＣ－０１５９）を含んでいる。これらの成分のモル比（ｍｏｌ％）は、約５０：１０：３８．５：１．５である。好ましくは、約４７．５：１０：４０．８：１．７である。より好ましくは、約４７．４：１０：４０．９：１．７である。好ましくは、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、化学修飾されていない。
一実施形態において、キットまたはパーツのキットは、初回ワクチン接種用およびブースターワクチン接種用の、２種類の異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを備えている。これらの内訳は、下記の通りである。
－第１バイアルまたは第１容器の中に提供されている、本明細書に記載の１つ以上の初回ワクチン。ワクチンは、本明細書に記載のｍＲＮＡ系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンである。
－第１バイアルまたは第１容器の中に提供されている、本明細書に記載の１つ以上のブースターワクチン。組成物／ワクチンは、本明細書に記載のアデノウイルス系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンである。
一実施形態において、キットまたはパーツのキットは、初回ワクチン接種用およびブースターワクチン接種用の２種類の異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを備えている。これらの内訳は、下記の通りである。
－第１バイアルまたは第１容器の中に提供されている、本明細書に記載の１つ以上のブースターワクチン。ワクチンは、本明細書に記載のｍＲＮＡ系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンである。
－第１バイアルまたは第１容器の中に提供されている、本明細書に記載の１つ以上の初回ワクチン。組成物／ワクチンは、本明細書に記載のアデノウイルス系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンである。
［組合せ］
第６の態様は、第１の態様で定義される２つ以上の核酸配列の組合せ、第２の態様で定義される２つ以上の組成物、第３の態様で定義される２つ以上のポリペプチド、第４の態様で定義される２つ以上のワクチン、または第５の態様で定義される２つ以上のキットに関する。
本発明に関連して、用語「組合せ」とは、２つ以上の要素が組合わされて存在していることを意味する。好ましくは、２つ以上の要素は、第１の態様に記載の２つ以上の核酸配列、第２の態様の文脈に記載の２つ以上の組成物、第３の態様に記載の２つ以上のポリペプチド、第４の態様の文脈に記載の２つ以上のワクチン、または第５の態様に記載の２つ以上のキットである。組合せの要素は、分離した存在であってもよい。したがって、組合せの要素の投与は、同じまたは異なる時刻において、同じまたは異なる投与部位に行える。
注目すべきことには、第１の態様の核酸、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様のワクチン、または第５の態様のキットもしくはパーツのキットに関する実施形態は、同様に、第６の態様の組合せの要素に関する好適な実施形態として読まれ、理解されうる。
実施形態において、組合せは、本発明の第１の態様に関連して記載されている核酸種（ＲＮＡ種など）を複数または２つ以上含んでいてもよい。核酸種は、分離した要素として提供される。
好ましくは、本明細書に記載の組合せは、本発明の第１の態様で定義される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の異なる核酸（ＲＮＡ種など）；本発明の第２の態様で定義される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の異なる組成物；本発明の第３の態様で定義される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の異なるポリペプチド；本発明の第３の態様で定義される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の異なるワクチンを含んでいてもよい。核酸種、組成物、ポリペプチド、ワクチンは分離した要素として提供される。
実施形態において、組合せは、２個、３個、４個または５個の核酸種（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を、分離した要素として含んでいる。好ましくは、核酸種は、ＲＮＡ種である。核酸種は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１３１４７、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１７７、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３１８４、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。任意要素で、組合せは、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。２個、３個、４個または５個の核酸種のそれぞれは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの異なる抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。
したがって、実施形態において、組合せは、２個の核酸種（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を分離した要素として含んでいる。好ましくは、核酸種は、ＲＮＡ種である。核酸種は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７１４８からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。任意要素で、組合せは、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。２個の核酸種のそれぞれは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの異なる抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。
実施形態において、組合せは、３個の核酸種（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を分離した要素として含んでいる。好ましくは、核酸種は、ＲＮＡ種である。核酸種は、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなる。核酸配列は、配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。任意要素で、組合せは、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでいる。２個、３個、４個または５個の核酸種のそれぞれは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの異なる抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードしている。
組合せの特に好適な実施形態を下記に示す。組合せの各要素は、分離した存在として提供されている。
好ましくは、この組合せに含まれている、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはそれ以上の異なる核酸種、組成物、ワクチンは、それぞれ、異なるpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質（第１の態様に記載の通り）をコードしている。好ましくは、スパイクタンパク質のＫ９８６残基およびＶ９８７残基に、２個の連続するプロリン置換を導入することにより、pre-fusion立体配座を安定化させる（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。したがって、好適な実施形態において、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のpre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）は、それぞれ、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有している。１つ以上のpre-fusion構造安定化変異は、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐのアミノ酸置換を有している（アミノ酸位置は配列番号１を基準とする）。
したがって、組合せに含まれている２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはそれ以上の異なる核酸種、組成物、ワクチンは、それぞれ、異なるpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質をコードしている。２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の安定化させたスパイクタンパク質は、配列番号１０～２６、３４１～４０７、６０９～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３８、２２７４０、２２７４２、２２７４４、２２７４６、２２７４８、２２７５０、２２７５２、２２７５４、２２７５６、２２７５８、２２９４７～２２９６４１０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であるアミノ酸配列から選択される。あるいは、安定化させたスパイクタンパク質は、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントから選択される。
好適な実施形態において、組合せは、１つの核酸種、組成物、ワクチンを含んでいる。１つの核酸種、組成物、ワクチンは、コーディング配列を有している。コーディング配列は、配列番号１０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であるアミノ酸配列をコードしている。多価組成物は、２個以上、３個以上、４個以上のさらなるＲＮＡ種を含んでいる。ＲＮＡ種は、下記から選択される１つ以上である。
(i)アミノ酸配列をコードしているコーディング配列を有している、１つの核酸種。アミノ酸配列は、配列番号２２９６１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(ii)アミノ酸配列をコードしているコーディング配列を有している、１つの核酸種。アミノ酸配列は、配列番号２２９６０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iii)アミノ酸配列をコードしているコーディング配列を有している、１つの核酸種。アミノ酸配列は、配列番号２２９６３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iv)アミノ酸配列をコードしているコーディング配列を有している、１つの核酸種。アミノ酸配列は、配列番号２２９４１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(v)アミノ酸配列をコードしているコーディング配列を有している、１つの核酸種。アミノ酸配列は、配列番号２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
好ましくは、組合せに含まれている２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の異なる核酸種、組成物、ワクチンは、核酸コーディング配列を有している。核酸コーディング配列は、それぞれ、異なるpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質をコードしている。２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはそれ以上の核酸コーディング配列は、配列番号１３６～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１７３１～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１４１、２２７５９、２２７６４～２２７８５、２２９６９～２３１８４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である核酸配列から選択される。あるいは、核酸コーディング配列は、これらのいずれかの断片またはバリアントから選択される。
好適な実施形態において、組合せは、コーディング配列を有している１つの核酸種、組成物、ワクチンを含んでいる。コーディング配列は、配列番号１３７のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。多価組成物は、さらに、下記から選択される２個以上、３個以上、４個以上のさらなるＲＮＡ種を含んでいる。ＲＮＡ種は、下記から選択される１つ以上である。
(i)コーディング配列を有している、１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２３０９１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(ii)コーディング配列を有している、１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２３０９０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iii)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２３０９３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iv)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２２９９９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(v)コーディング配列を有している１つの核酸種。コーディング配列は、配列番号２３０９４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
好ましくは、組合せに含まれている２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはそれ以上の異なる核酸種、組成物、ワクチンは、核酸コーディング配列を有している。核酸コーディング配列は、それぞれ、異なるpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質をコードしている。２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上またはそれ以上の核酸コーディング配列は、配列番号１４９～１５１、１６３～１６５、１２３３８、１２５４１、１２８１０～１２８１３、１２９０１、１２９３１、１３０１３、２２７９２、２２７９４、２２７９６、２２７９８、２２８０２、２２８０４、２２８０６、２２８１０、２２８１３、２２８１９、２２８２１、２２８２３、２２８２５、２２８２７、２２８２９、２２８３１、２２８３３、２２８３５、２２８３７、２２８３９、２３２９７～２３３１４、２３３６９、２３５１７～２３５２０、２３５２３～２３５２５、２３５２７、２３５２９、２３５３０、２３５８９、２３７３７、２３９５７、２４３９７、２４８３７、２５０５７、２５２７７、２５７１７、２６９２５～２６９３７１４９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であるＲＮＡ配列から選択される。あるいは、核酸コーディング配列は、これらのいずれかの断片またはバリアントから選択される。
好適な実施形態において、組合せは、１つのＲＮＡ種、組成物、ワクチンを含んでいる。ＲＮＡ種、組成物、ワクチンは、ＲＮＡ配列を含んでいるか、またはそれからなる。ＲＮＡ配列は、配列番号１６３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。組合せは、２個以上、３個以上、４個以上のさらなるＲＮＡ種をさらに含んでいる。ＲＮＡ種は、下記から選択される１つ以上である。
(i)ＲＮＡ配列を含んでいるか、またはそれからなる、１つのＲＮＡ種。ＲＮＡ配列は、配列番号２３３１１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(ii)コーディング配列を有している、１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３３１０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iii)コーディング配列を有している、１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３３１３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iv)コーディング配列を有している、１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３２１９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(v)コーディング配列を有している、１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３３１４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
上記の態様において、好ましくは、ｍＲＮＡ種のそれぞれは、Ｃａｐ１構造を有している。任意構成で、ｍＲＮＡ種のそれぞれは、修飾ヌクレオチドを含んでいない。
好適な実施形態において、組合せは、ＲＮＡ種、組成物、ワクチンを含んでいる。ＲＮＡ種、組成物、ワクチンは、ＲＮＡ配列を含んでいるか、またはそれからなる。ＲＮＡ配列は、配列番号１４９または２４８３７のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。組合せは、２個以上、３個以上、４個以上のＲＮＡ種をさらに含んでいる。ＲＮＡ種は、下記から選択される１つ以上である。
(i)ＲＮＡ配列を含んでいるか、またはそれからなる、１つのＲＮＡ種。ＲＮＡ配列は、配列番号２３５３１または２４８５１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(ii)コーディング配列を有している、１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３５３０または２４８５０のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iii)コーディング配列を有している、１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３５３３または２４８５３Ｂのうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(iv)コーディング配列を有している、１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３４３９または２４７５９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
(v)コーディング配列を有している、１つのＲＮＡ種。コーディング配列は、配列番号２３５３４または２４８５４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である。
上記の態様において、好ましくは、ｍＲＮＡ種のそれぞれは、Ｃａｐ１構造を有している。任意構成で、ｍＲＮＡ種のそれぞれは、修飾ヌクレオチドを含んでいない。
特定の実施形態において、組合せに含まれている第１要素は、ウイルスベクターワクチン／組成物を含んでいる（例えば、ＡＤＺ１２２２またはＡｄ２６．ＣＯＶ－２．Ｓなどのアデノウイルスベクター系ワクチン）。組合せに含まれている第２要素は、本明細書に記載の核酸系のワクチン／組成物（好ましくは、ｍＲＮＡ系ワクチン）を含んでいる。
［第一医薬用途、第二医薬用途（および第三以降の医薬用途）］
さらなる態様は、提供されている核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、キットまたは組合せの、第一医薬用途に関する。
注目すべきことには、第１の態様の核酸、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様のワクチン、第５の態様のキットもしくはキットのパーツ、または組合せに関する実施形態は、同様に、本発明の医薬用途の好適な実施形態として読まれ、理解されうる。
したがって、本発明は、医薬としての使用のための第１の態様で定義されるＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくはＲＮＡ）、医薬としての使用のための第２の態様で定義される組成物、医薬としての使用のための第３の態様で定義されるポリペプチド、医薬としての使用のための第４の態様で定義されるワクチン、医薬としての使用のための第５の態様で定義されるキットまたはパーツのキット、および組合せを提供する。
本発明はさらに、核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、キットまたは組合せの、いくつかの適用および使用を提供する。
特に、核酸（好ましくはＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、キットまたは組合せは、ヒトに対する医療目的または獣医目的のために使用できる。好ましくは、ヒトに対する医療目的のために使用できる。
特に、核酸（好ましくはＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、キットもしくはパーツのキットまたは組合せは、ヒトに対する医療目的の医薬としての使用するものである。核酸（好ましくはＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツのキットは、幼い乳児、新生児、免疫不全レシピエント、妊娠者、授乳中の女性および高齢者に好適でありうる。特に、核酸（好ましくはＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツのキットは、ヒトに対する医療目的の医薬としての使用するものである。核酸（好ましくはＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツのキットは、高齢のヒト被験体に特に好適である。
核酸（好ましくはＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、キットまたは組合せは、ヒトに対する医療目的の医薬として使用するものである。ＲＮＡ、組成物、ワクチン、またはキットもしくはパーツのキットは、筋肉内注射または皮内注射に特に好適でありうる。
さらに他の態様において、本発明は、提供されている核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、キットまたは組合せの第二医薬用途に関する。
したがって、本発明は、下記を提供する。
・コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染または感染に関連する障害もしくは疾患（ＣＯＶＩＤ－１９など）の治療または予防のための、第１の態様に記載の１つ以上の核酸（好ましくはＲＮＡ）
・コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染または感染に関連する障害もしくは疾患（ＣＯＶＩＤ－１９など）の治療または予防のための、第２の態様に記載の組成物
・コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染または感染に関連する障害もしくは疾患（ＣＯＶＩＤ－１９など）の治療または予防のための、第３の態様に記載のポリペプチド
・コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染または感染に関連する障害もしくは疾患（ＣＯＶＩＤ－１９など）の治療または予防のための、第４の態様に記載のワクチン
・コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染または感染に関連する障害もしくは疾患（ＣＯＶＩＤ－１９など）の治療または予防のための、第５の態様に記載のキットまたはパーツのキット
・コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染または感染に関連する障害もしくは疾患（ＣＯＶＩＤ－１９など）の治療または予防のための、第６の態様に記載の組合せ
実施形態において、第１の態様の核酸（好ましくはＲＮＡ）、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様のワクチン、第５の態様のキットもしくはパーツのキット、または第６の態様の組合せは、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染の治療または予防における使用のためのものである。
特に、第１の態様の核酸（好ましくはＲＮＡ）、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様のワクチン、第５の態様のキットもしくはパーツのキット、または第６の態様の組合せは、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染の予防（曝露前予防または曝露後予防）方法および／または治療的処置の方法において使用できる。
特に、第１の態様の核酸（好ましくはＲＮＡ）、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様のワクチン、第５の態様のキットもしくはパーツのキット、または第６の態様の組合せは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスへの感染によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９疾患の予防（曝露前予防または曝露後予防）方法および／または治療的処置の方法において使用できる。
核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチンまたは組合せは、好ましくは、局所的に投与してもよい。特に、組成物、ポリペプチド、ワクチンまたは組合せは、皮内経路、皮下経路、鼻腔内経路、または筋肉内経路から投与してもよい。実施形態において、本発明の核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチンは、従来の針注射または無針ジェット注射によって投与してもよい。これに関連して、好ましいのは、筋肉内注射である。
プラスミドＤＮＡを使用し、組成物、ワクチンまたは組合せにプラスミドが含まれている実施形態においては、エレクトロポレーション装置を使用するエレクトロポレーションによって組成物／ワクチン／組合せを投与してもよい。エレクトロポレーション装置の例としては、皮内送達または筋肉内送達用のエレクトロポレーション装置が挙げられる。好適には、ＵＳ７２４５９６３Ｂ２に記載されている装置（特に、ＵＳ７２４５９６３Ｂ２のクレーム１～６８に記載の装置）を使用できる。
アデノウイルスＤＮＡを使用し、組成物、ワクチンまたは組合せにアデノウイルスＤＮＡが含まれている実施形態においては、鼻腔内投与によって組成物／ワクチン／組合せを投与してもよい。
実施形態において、本明細書に記載の組成物、ワクチンまたは組合せに含まれている核酸の量は、約１００ｎｇ～約５００μｇ、約１μｇ～約２００μｇ、約５μｇ～約１００μｇである。好ましくは、約１０μｇ～約５０μｇである。具体的には、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１５μｇ、約１６μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇまたは約１００μｇである。
いくつかの実施形態において、核酸を含んでいるワクチンまたは組成物は、被験体において抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量で製剤化されている。いくつかの実施形態において、核酸の有効量は、合計用量で、１μｇ～２００μｇ、１μｇ～１００μｇまたは５μｇ～１００μｇである。
核酸が脂質系キャリア（ＬＮＰなど）中に提供されている実施形態において、１回用量に含まれている本明細書に記載のＰＥＧ脂質の量は、約５０μｇ未満であり、好ましくは約４５μｇ未満であり、より好ましくは約４０μｇ未満である。
１回用量におけるＰＥＧ脂質の使用量を減らすことにより、副作用（アレルギーなど）のリスクを低減できる。
特に好適な実施形態において、１回用量に含まれるＰＥＧ脂質の量は、約３．５μｇ～約３５μｇである。
核酸が脂質系キャリア（ＬＮＰなど）中に提供されている実施形態において、１回用量に含まれる本明細書に記載のカチオン性脂質の量は、約４００μｇ未満であり、好ましくは約３５０μｇ未満であり、より好ましくは約３００μｇ未満である。
１回用量におけるカチオン性脂質の使用量を減らすことにより、副作用（発熱など）のリスクを低減できる。
特に好適な実施形態において、１回用量に含まれるカチオン性脂質の量は、約３０μｇ～約３００μｇである。
一実施形態において、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）に対して被験体を治療または予防するための免疫化プロトコルには、組成物またはワクチンの１つの１回用量が含まれる。
いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、１μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、２μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、３μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、４μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、５μｇの用量である。１回のワクチン接種で被験体に投与される６μｇ。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、７μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、８μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、９μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、１０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、１１μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、１２μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、１３μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、１４μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、１６μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、２０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、２５μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、３０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、４０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、５０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、１００μｇの用量である。いくつかの実施形態において、１回のワクチン接種で被験体に投与される有効量は、２００μｇの用量である。上記において、「用量」とは、本明細書に記載の核酸（好ましくはｍＲＮＡ）の有効量を表す。
好適な態様において、コロナウイルス感染症（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス感染症）を治療または予防するための免疫化プロトコルには、複数の１回用量または用量の組成物またはワクチンが含まれる。本明細書において、１回用量とは、初回／１回目の用量、２回目の用量または任意のさらなる用量を表す。好ましくは、２回目以降の用量は、免疫反応をブーストするために投与する。
いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、１μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、２μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、３μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、４μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、５μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、６μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、７μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、８μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、９μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、１０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、１１μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、１２μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、１３μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、１４μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、１６μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、２０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、２５μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、３０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、４０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、５０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、１００μｇの用量である。いくつかの実施形態において、２回の合計で被験体に投与される有効量は、２００μｇの用量である。上記における「用量」とは、本明細書に記載の核酸（好ましくはｍＲＮＡ）の有効量を表す。
好適な実施形態において、ワクチン／組成物／組合せは、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染に対して、被験体を免疫化する。免疫化される期間は、（本明細書に記載の投与から）１年間以上であり、好ましくは２年間以上である。好適な実施形態において、ワクチン／組成物／組合せは、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）に対して、被験体を免疫化する。その期間は、２年間超であり、より好ましくは３年間超であり、より一層好ましくは４年間超であり、より一層好ましくは５～１０年間である。
［治療方法および使用、診断方法および使用］
他の態様において、本発明は、障害を治療または予防する方法に関する。
注目すべきことには、第１の態様の核酸、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様のワクチン、第５の態様のキットもしくは部品のキット、第６の態様の組合せ、または医薬用途に関する実施形態は、同様に、本明細書に記載の治療方法の好適な実施形態として読まれ、理解されうる。さらに、本明細書に記載の治療方法に関連する特定の特徴および実施形態は、本発明の医薬用途にも適用できる。
疾患（特にコロナウイルス感染症）を予防（阻害）または治療することは、例えば、疾患（コロナウイルス感染症など）のリスクがある被験体において、疾患または状態の完全な発生を阻害することに関する。「治療」とは、疾患または病的状態の徴候または症状を、発症後に回復させる治療的介入を表す。疾患または病的状態に関して、「回復」との用語は、治療による観察可能な有益なあらゆる効果を表す。疾患を阻害することには、疾患のリスクを予防または低減することが含まれる（ウイルス感染の予防またはリスクの低減など）。有益な効果は、例えば、感受性のある被験体において疾患の臨床症状の開始を延期させること、疾患の一部または全部の臨床症状の重篤度を低減させること、疾患の進行を遅らせること、ウイルス負荷の減少、被験体の全体的な健康状態または幸福度を向上させること、または特定の疾患に特異的な他のパラメータによって立証できる。予防的治療とは、疾患を発症するリスクを低減させる目的で、疾患の徴候を示さないか、または初期徴候のみを示す被験体に施される治療である。
好適な実施形態において、本発明は、障害を治療または予防する方法に関する。この方法は、第１の態様の核酸、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様のワクチン、第５の態様のキットもしくはパーツのキット、または第６の態様の組合せのうち１つ以上を、それを必要とする被験体に適用または投与する工程を含む。
好適な実施形態において、障害は、コロナウイルスへの感染、またはその感染に関連する障害である。とりわけ、障害は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスへの感染、またはその感染に関連する障害（ＣＯＶＩＤ－１９など）である。
好適な実施形態において、本発明は、上述した障害を治療または予防する方法に関する。この方法は、第１の態様の核酸、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様のワクチン、第５の態様のキットもしくはパーツのキット、または第６の態様の組合せのうち１つ以上を、それを必要とする被験体に適用または投与する工程を含む。必要とする被験体は、好ましくは、哺乳動物被験体である。
特定の実施形態において、第１の態様の核酸、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様のワクチン、第５の態様のキットもしくはパーツのキット、または第６の態様の組合せのうち１つ以上を、それを必要とする被験体に適用または投与することにより疾患を治療または予防する方法は、被験体における疾患負荷を低減する方法としてさらに定義される。例えば、方法は、好ましくは、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の１つ以上の症状の重篤度および／または持続期間を減少させる。いくつかの態様において、方法は、入院、集中治療室への入室、酸素供給治療および／または人工呼吸器治療を被験体が必要とする確率を低下させる。さらなる態様において、方法は、発熱、呼吸困難、嗅覚の喪失および／または味覚の喪失を被験体が発症する確率を低下させる。好適な態様において、方法は、重症または中等症のＣＯＶＩＤ－１９疾患を被験体が発症する確率を減少させる。特定の態様において、実施形態の方法は、被験体が実施形態の組成物を投与された後、約２週間から１箇月間、２箇月間、３箇月間、４箇月間、５箇月間、６箇月間、１年間または２年間の間、被験体における重症または中等症のＣＯＶＩＤ－１９疾患を予防する。好適な態様において、実施形態の方法は、症候性ＣＯＶＩＤ－１９疾患を予防する。さらなる態様において、実施形態の方法は、被験体が実施形態の組成物を投与された後、約２週間から１箇月間、２箇月間、３箇月間、４箇月間、５箇月間、６箇月間、１年間または２年間の間、被験体における検出可能なレベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸を予防する。さらなる態様において、実施形態の方法は、被験体におけるコロナウイルスへの感染（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染など）に対する防御性免疫を提供するための方法と定義する。またさらなる態様において、実施形態の方法は、処置した被験体の８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上において、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患を予防する。またさらなる態様において、実施形態の方法は、処置した被験体の８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上において、第２免疫原性組成物またはそれ以降の免疫原性組成物の投与（ブースター投与など）から約２週間～約１年後の間、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患を予防する。またさらなる態様において、実施形態の方法は、処置した被験体の８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上において、第２組成物またはそれ以降の組成物を投与した後、約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間の間、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患を予防する。
さらなる態様において、実施形態の方法は、次の工程を含む。
(i)実施形態の組成物（ワクチン組成物など）を得る工程。この組成物は、凍結乾燥されている。
(ii)凍結乾燥組成物を薬学的に許容可能な液体キャリア中で可溶化させて、液体組成物を調製する工程。
(iii)有効量の液体組成物を被験体に投与する工程。
いくつかの態様において、凍結乾燥組成物の含水率は、約１０％未満である。例えば、凍結乾燥組成物は、好ましくは、約０．１％～約１０％、約０．５％～約７．５％または約０．５％～約５．０％の水を含んでいてもよい。
またさらなる態様において、実施形態の方法は、配列番号１６３と約９５％以上同一であるｍＲＮＡを含んでいるワクチン組成物を被験体に投与する工程を含む。ワクチン組成物は、例えば、ＬＮＰと複合体を形成している。
さらなる態様において、実施形態の方法は、配列番号１４９、２４８３７、２３３１１、２３５３１、２３３１０、２３５３０、２３３１３または２３５３３と約９５％以上同一であるｍＲＮＡを含んでいるワクチン組成物を被験体に投与する工程を含む。ワクチン組成物は、例えば、ＬＮＰと複合体を形成している。いくつかの態様において、このような方法は、約６箇月間以上にわたり、重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から被験体を防護するのに充分な免疫応答を被験体に提供する。例えば、いくつかの態様において、被験体は、約６箇月間から約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３年間、約４年間または約５年間の間、重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から防護される。したがって、いくつかの態様において、実施形態の方法は、長期にわたり（例えば６箇月超）重篤な疾患から被験体を防護する、１回用量のワクチン組成物を提供する。
本明細書において、重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患とは、下記のうち１つ以上を経験する被験体と定義する。
・重度の全身性疾患を示している安静時の臨床徴候（呼吸数≧：３０回／分以上、心拍数：１２５回／分以上、海抜０ｍの室内空気におけるＳｐＯ２：９３％以下、またはＰａＯ２／ＦＩＯ２：未満３００ｍｍＨｇ（高度に応じて調整））
・呼吸不全（高流量酸素、非侵襲的換気、人工換気またはＥＣＭＯが必要な状態と定義）
・ショックの証拠（ＳＢＰ：９０ｍｍＨｇ未満、ＤＢＰ：６０ｍｍＨｇ未満、または昇圧薬が必要）
・重大な腎機能障害、肝機能障害、神経機能障害
・ＩＣＵへの入室
・死亡
本明細書において、中等症のＣＯＶＩＤ－１９疾患とは、かきのうち１つ以上を経験する被験体と定義する。
・呼吸困難または息切れ
・呼吸数：２０回／分以上
・ＳｐＯ２異常であるが、依然として海抜０ｍの室内空気におけるＳｐＯ２：９３％超（高度に応じて調整）
・臨床的またはＸ線写真による下気道疾患の証拠
・放射線による深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の証拠
本明細書において、軽症のＣＯＶＩＤ－１９疾患とは、下記の全てを経験する被験体と定義する。
・症候がある。
・呼吸困難または息切れがない。
・低酸素血症ではない（高度に応じて調整）
・中等症または重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患の症例の定義を満していない。
特に好適な実施形態において、必要とする被験体は哺乳動物被験体であり、好ましくはヒト被験体である（新生児、妊娠者、免疫不全者および／または高齢者など）。いくつかの実施形態において、被験体は、６箇月～１００歳、６箇月～８０歳、１年～８０歳、１年～７０歳、２年～８０歳または２年～６０歳である。他の実施形態において、被験体は新生児または乳児であり、その年齢は、３歳以下、２歳以下、１．５歳以下、１年以下（１２箇月以下）、９箇月以下、６箇月または３箇月である。いくつかの他の実施形態において、被験体は高齢の被験体であり、５０歳以上、６０歳以上、６５歳以上または７０歳以上である。さらなる態様において、実施形態に係る処置のための被験体は、６１歳以上である。またさらなる態様において、被験体は、１８歳～６０歳である。
特定の実施形態において、実施形態による処置のための被験体は、妊娠している被験体である（妊娠しているヒトなど）。いくつかの態様において、被験体の妊娠歴は、約１箇月間超、２箇月間超、３箇月間超、４箇月間超、５箇月間超、６箇月間超、７箇月間超または８箇月間超である。
特に好適な態様において、ヒト被験体は、高齢のヒト被験体である。
特定の態様において、実施形態による処置のための被験体の遺伝的背景は、ネイティヴ・アメリカ系、アフリカ系、アジア系またはヨーロッパ系である。いくつかの態様において、被験体の遺伝的背景は、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上または約９０％以上がネイティヴ・アメリカ系、アフリカ系、アジア系またはヨーロッパ系である。。特定の態様において、被験体の遺伝的背景は、ネイティヴ・アメリカ系である。例えば、のネイティヴ・アメリカ系の遺伝的背景が、約１０％以上、約２５％以上または約５０％以上ある。さらなる態様において、被験体は、ネイティヴ・アメリカ系の遺伝的背景を有する高齢の被験体である（５５歳以上、６０歳以上、６５歳以上または７０歳以上など）。
さらなる態様において、実施形態による処置のための被験体は、疾患を患っているか、または免疫不全状態である。いくつかの態様において、被験体は、肝疾患、腎疾患、糖尿病、高血圧、心疾患または肺疾患を患っている。さらなる態様において、実施形態による処置のための被験体は、アレルギー反応の既往歴を有している（食品アレルギーである被験体など）。ある態様において、被験体は、過去にワクチンに対するアレルギー反応を示しhている（アナフィラキシー反応）。またさらなる態様において、方法による処置のための被験体は、検出可能な抗ＰＥＧ抗体を有している被験体である（血清中に検出可能な抗ＰＥＧ ＩｇＥを有しているなど）。
さらなる態様において、実施形態による処置のための被験体は、下記から選択される１つ以上の疾患を同時に患っている。
(i)慢性腎疾患：過去３～６箇月以内の血清クレアチニン測定値から腎機能を確認し、慢性腎疾患疫学共同研究（ＣＫＤ－ＥＰＩ）の方程式を用いて推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）に換算する。ｅＧＦＲが６０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２未満である症例を、腎機能障害と定義する。
－ｅＧＦＲが６０～８９ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２である症例を、軽度の慢性腎疾患と定義する。
－ｅＧＦＲが３１～５９ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２であり、治療法が安定しており、６箇月間以上にわたり良好に維持されている症例を、中等度慢性腎疾患と定義する（Clinical Practice Clinical Guidelines for Chronic Kidney Disease: Am J Kidney Dis, 2002より改変）。
(ii)ＣＯＰＤ（肺気腫および慢性気管支炎を含む）
－１秒量／努力肺活量（ＦＥＶ１／ＦＶＣ）が０．７未満かつＦＥＶ１が予測値の８０％以上である症例を、軽度のＣＯＰＤ（咳嗽または痰の産生は、伴っても伴わなくてもよい）と定義する。
－ＦＥＶ１／ＦＶＣが０．７未満かつＦＥＶ１が予測値の５０％以上８０％未満であり、治療が安定している症例を、中等度のＣＯＰＤ（咳嗽または痰の産生は、伴っても伴わなくてもよい）と定義する（GOLD Criteria for COPD severity）。
(iii)ボディマス指数（ＢＭＩ）が３２ｋｇ／ｍ２超である肥満（病的状態が極端な肥満も含む）。
(iv)下記を含む慢性心血管状態（心不全、冠動脈疾患、心筋症、動脈性高血圧）
－クラスＩ心不全：機能的または構造的心疾患がなく、将来心不全を発症するリスクが高い。
－クラスＩＩ心不全：身体活動が僅かに制限される心疾患を患っている被験体。安静時には快適である。
－通常の身体活動により、疲労、動悸、息切れまたは狭心痛が生じる。
－クラスＩＩＩ心不全：身体活動が著しく制限されるが、安静時には快適である。通常以下の活動により症状が現れる。
－心臓の構造的な障害。病期にかかわらず症状が現れない。
－軽度の左室収縮機能不全または左室拡張機能不全。通常は大きな臨床徴候が現れない。
－労作性呼吸困難、起坐呼吸または発作性夜間呼吸困難を伴う中等度の左室不全。New York Heart Association（ＮＹＨＡ）に従う。投薬により安定する（クラスＩＩ～ＩＩＩ））。
－代謝当量閾値（ＭＥＴ）が２以上のである中等度までの冠動脈疾患。投薬により安定している。（ＭＥＴは、安静時に消費される酸素量として定義され、体重１ｋｇ当たりのＯ２消費量３．５ｍＬ×時間（分）に等しい。ＭＥＴが４であれば、通常、飛行機の階段を登ったり丘を歩いたりでき、他の激しい活動にも参加できる。ＭＥＴが１であれば、自分自身をケアできるが、自分自身を維持できないことがあり、激しい活動に制約を受ける）
－非感染性および代謝性起源の心筋症。投薬により、ＭＥＴは２～３になっている。
－ステージ１またはステージ２の高血圧。投薬により、安定にコントロールされている。
(v)慢性ＨＩＶ感染症。投与前１２箇月以内に採取した血液サンプルにより、ウイルス血症がなく（５０コピー／ｍＬ未満）、ＣＤ４の数が３５０／ｍＬ超であり安定していることが確認されている。ウイルス負荷が５０コピー／ｍＬ超であっても、５０～３５０コピー／ｍＬの一過性の変化を伴う症例は許容される。
(vi)２型糖尿病。投薬によりコントロールされていてもよいし（ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）：５８ｍｍｏｌ／ｍｏｌ（７．４５％）未満）、コントロールされていなくてもよい（最近のＨｂＡ１ｃ：５８ｍｍｏｌ／ｍｏｌ（７．４５％）超）。（ＨｂＡ１ｃ（％）－２．１５）×１０．９２９＝ＨｂＡ１ｃ（ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）である。コントロールされていない糖尿病においては、ＨｂＡ１ｃの変動は１０％未満であり、糖尿病性ケトアシドーシスの既往歴または過去３箇月以内の重度の症候性低血糖のエピソードがない。
(vii)１年以内に腎移植を受けた被験体。投薬により６箇月間以上安定した状態であり、拒絶反応の危険性が低いと分類されている。
またさらなる態様において、実施形態による処置のための被験体は、過去６箇月間において、１４日を超える免疫抑制剤の処置を受けていない。いくつかの態様において、実施形態による処置のための被験体は、次の(i)および(ii)のうち１つ以上の条件を満たしている(i)投与前２８日以内に生ワクチンを接種されていない。(ii)投与前１４日以内に不活化ワクチンを接種されていない。さらなる態様において、実施形態による処置のための被験体は、下記のうち１つ以上の条件を満たしている。
－ウイルス学的にＣＯＶＩＤ－１９疾患が確認されていない。
－女性について、実施形態の組成物の投与前１箇月以内に、妊娠または授乳をしていない。
－実施形態の組成物の投与前２８日以内に、治験薬または未登録医薬品（ワクチンまたは医薬品など）により処置されていない。
－実施形態の組成物の投与前２８日以内（生ワクチンの場合）または１４日以内（不活化ワクチンの場合）に、認可ワクチンを接種されていない。
－過去（または同時）に、治験中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンまたは他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）ワクチンにより処置されていない。
－実施形態の組成物の投与前６箇月以内に、合計で１４日間を超えて、免疫抑制剤または他の免疫改変剤（コルチコステロイド、生物製剤、メトトレキサートなど）で処置されていない。
－既往歴および身体検査により、免疫抑制または免疫不全状態が医学的に診断されておらず、疑われていない（既往歴の例としては、既知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）への感染が挙げられる）。現時点で、癌（白血病、リンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫または全身性悪性腫瘍を含む）、慢性腎不全またはネフローゼ症候群、および、臓器移植または骨髄移植の施術の診断または処置を受けていない。
－血管性浮腫（遺伝性または特発性）の既往歴がない。あるいは、何らかのアナフィラキシー反応またはｐＩＭＤの既往歴がない。
－ＣＶｎＣｏＶワクチンに含まれている任意の成分に対するアレルギー歴がない。
－実施形態の組成物の投与前３箇月以内に、免疫グロブリンまたは何らかの血液製剤を投与されていない。
－重大な急性または慢性の医学的または精神医学的疾患を経験していない。
－重度および／またはコントロール不良の心血管疾患、胃腸疾患、肝疾患、腎疾患、呼吸器疾患、内分泌障害、ならびに神経および精神疾患を経験していない。
特定の態様において、実施形態の方法による処置のための被験体は、いかなる潜在的な免疫介在性疾患（ｐＩＭＤ）をも罹患していない。さらなる態様において、実施形態の処置方法は、処置した被験体において、ｐＩＭＤを全く誘導しない。本明細書において、ｐＩＭＤとは、次の疾患であると定義する：セリアック病；クローン病；潰瘍性大腸炎；潰瘍性直腸炎；自己免疫性胆管炎；自己免疫性肝炎；原発性胆汁性肝硬変；原発性硬化性胆管炎；アジソン病；自己免疫性甲状腺炎（橋本甲状腺炎を含む）；１型糖尿病；グレーヴズ病またはバセドウ病；抗合成酵素症候群；皮膚筋炎；若年性慢性関節炎（スチル病を含む）；混合性結合組織障害；リウマチ性多発筋痛；多発性筋炎；乾癬性関節障害；再発性多発軟骨炎；関節リウマチ；強皮症（びまん性全身型およびＣＲＥＳＴ症候群などを含む）；脊椎関節炎（強直性脊椎炎、反応性関節炎（ライター症候群）および未分化脊椎関節炎などを含む）；全身性エリテマトーデス；全身性強皮症；急性散在性脳脊髄炎（非感染性脳炎、脳脊髄炎、脊髄炎、脊髄神経根脊髄炎などの部位特異的な類似疾患も含む）；脳神経障害（麻痺／不全麻痺（ベル麻痺など）を含む）；ギラン－バレー症候群（ミラー－フィッシャー症候群および他の類似疾患を含む）；免疫媒介性末梢神経障害；パーソネイジ－ターナー症候群および神経叢障害（慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多巣性運動ニューロパチー、単クローン性免疫グロブリン血症を伴う多発ニューロパチーなどを含む）；多発性硬化症；ナルコレプシー；視神経炎；横断性脊髄炎；円形脱毛症；自己免疫性水疱性皮膚疾患（天疱瘡、類天疱瘡および疱疹状皮膚炎を含む）；皮膚エリテマトーデス；結節性紅斑；斑状強皮症；扁平苔癬；乾癬；スイート症候群；白斑；大血管の血管炎（高安動脈炎および側頭動脈炎などの巨細胞性動脈炎を含む）；中型および／または小型血管の血管炎（結節性多発動脈炎、川崎病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ－ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫性血管炎）、バージャー病（閉塞性血栓性血管炎）、壊死性血管炎および抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）陽性血管炎（型は不特定）、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、白血球破砕性血管炎などを含む）；抗リン脂質抗体症候群；自己免疫性溶血性貧血；自己免疫性糸球体腎炎（ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎およびメサンギウム増殖性糸球体腎炎を含む）；自己免疫性心筋炎／心筋症；自己免疫性血小板減少症；グッドパスチャー症候群；特発性肺線維症；悪性貧血；レイノー現象；サルコイドーシス；シェーグレン症候群；スティーブンス－ジョンソン症候群；ブドウ膜炎。
特定の態様において、実施形態のワクチン接種法は、特に関心のある有害事象（ＡＥＳＩ）を被験体に経験させない。本明細書において、特に関心のある有害事象とは、次のものであると定義する：上述のｐＩＭＤ；アナフィラキシー；血管炎；免疫化後の疾患増悪；小児における多系統炎症性症候群；急性呼吸器促迫症候群；ＣＯＶＩＤ－１９疾患；急性心傷害；微小血管障害；心不全および心原性ショック；ストレス性心筋症；冠動脈疾患；不整脈；心筋炎；心膜炎；血小板減少症；深部静脈血栓症；肺塞栓；脳血管発作；四肢虚血；出血性疾患；急性腎傷害；肝傷害；全身性痙攣；ギラン・バレー症候群；急性散在性脳脊髄炎；無嗅覚・味覚消失；髄膜脳炎；凍瘡様病変；単一臓器皮膚血管炎；多形紅斑；免疫化後の重篤な局所性／全身性有害事象。
特に、治療方法は、下記の工程を含んでもよい。
（ａ）第１の態様のＤＮＡまたはＲＮＡなどの１つ以上の核酸（好ましくは１つ以上のＲＮＡ）、第２の態様の１つ以上の組成物、第３の態様の１つ以上のポリペプチド、第４の態様の１つ以上のワクチン、または第５の態様のキットもしくはパーツのキットを提供する工程。
（ｂ）１回目の投与として、核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツのキットを被験体に適用または投与する工程。
（ｃ）任意構成で、２回目または３回目以降の投与として、核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツのキットを被験体に適用または投与する工程。好ましくは、１回目の投与後、３箇月後、４箇月後、５箇月後、６箇月後、７箇月後、８箇月後、９箇月後、１０箇月後、１１箇月後、１２箇月後に適用または投与する。
本明細書において、第１投与とは、最初／１回目の投与、２回目の投与、または３回目以降の任意の投与を表す。これらは、好ましくは、免疫反応をブーストするために投与する。特定の態様においては、ワクチン／組成物を、被験体に１回、２回、３回、４回またはそれ以上投与する。いくつかの態様においては、ワクチン／組成物を、少なくとも１回目および２回目に被験体に投与する（初回投与およびブースター投与など）。いくつかの態様においては、１回目の投与から１０日以上、１４日以上、２１日以上、２８日以上、３５日以上、４２日以上、４９日以上または５６日以上経過後に、２回目の投与を行う。いくつかの態様において、１回目の投与と２回目の投与との間の期間は、約７日間～約５６日間、約１４日間～約５６日間、約２１日間～約５６日間；たは約２８日間～約５６日間である。さらなる態様においては、ワクチン／組成物を、被験体に３回以上投与する。特定の態様において、ワクチン／組成物の各回の投与期間は、１０日以上、１４日以上、２１日以上、２８日以上、３５日以上、４２日以上、４９日以上または５６日以上である。
いくつかの態様において、実施形態による処置のための被験体は、過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているか、または少なくとも第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物により処置されている。くつかの態様において、被験体は、第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物を、１回、２回、３回またはそれ以上投与されていた。いくつかの態様において、被験体を処置するために使用される実施形態の組成物は、被験体を処置するために過去に使用された組成物とは異なる種類のワクチン組成物である。いくつかの態様において、被験体は、過去に、ｍＲＮＡワクチンで処置されている（ＢＮＴ１６２またはｍＲＮＡ－１２７３など）。さらなる態様において、被験体は、過去に、タンパク質サブユニットワクチンで処置されている（例えば、ＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３またはＣＯＶＡＸなどのスパイクタンパク質系ワクチン）。特定の好適な態様において、タンパク質サブユニットワクチン組成物は、アジュバントを含んでいる。さらなる態様において、被験体は、過去に、ウイルスベクターワクチンで処置されている（例えば、ＡＤＺ１２２２またはＡｄ２６．ＣＯＶ－２．Ｓなどのアデノウイルスベクター系ワクチン）。またさらなる態様において、被験体は、過去に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の不活化ウイルスワクチンで処置されている（ＣｏｒｏｎａＶａｃ、ＢＢＩＢＰ－ＣｏｒＶまたはＢＢＶ１５２など）。さらなる態様において、ワクチン組成物で過去に処置した被験体は、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を有している（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質またはＮタンパク質に結合する抗体など）。さらなる態様において、実施形態による処置のための被験体は、第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物による処置から、約３箇月間以上、約６箇月間以上、約９箇月間以上、約１年間以上、約１．５年間以上、約２年間以上または約３年間以上が経過している。またさらなる態様において、実施形態による処置のための被験体は、第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物による処置から、約３箇月間～２年間または約６箇月間～２年間経過している。いくつかの態様において、実施形態のさらなるワクチン組成物で処置した被験体のうち、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上は、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から防護される。例えば、さらなる組成物の投与から約２週間後～約１年後の期間、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上は、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から防護される。またさらなる態様において、実施形態のさらなるワクチン組成物を投与することにより、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上は、投与から約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間にわたり、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患を予防する。このような組合せワクチン接種戦略の例を以下に示す。
・１回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）～Ｔ１～２回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）～Ｔ２～３回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）
・１回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）～Ｔ１～２回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）～Ｔ２～３回目の投与（タンパク質サブユニットワクチン）
・１回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）～Ｔ１～２回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）～Ｔ２～３回目の投与（ウイルスベクターワクチン）
・１回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）～Ｔ１～２回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）～Ｔ２～３回目の投与（不活化ウイルスワクチン）
・１回目の投与（タンパク質サブユニットワクチン）～Ｔ１～２回目の投与（タンパク質サブユニットワクチン）～Ｔ２～３回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）
・１回目の投与（不活化ウイルスワクチン）～Ｔ１～２回目の投与（不活化ウイルスワクチン）～Ｔ２～３回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）
・１回目の投与（ウイルスベクターワクチン）～Ｔ１～２回目の投与（ウイルスベクターワクチン）～Ｔ２～３回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）
・１回目の投与（ウイルスベクターワクチン）～Ｔ２～２回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）
・１回目の投与（タンパク質サブユニットワクチン）～Ｔ２～２回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）
・１回目の投与（不活化ウイルスワクチン）～Ｔ２～２回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）
・１回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）～Ｔ２～２回目の投与（ｍＲＮＡワクチン）
例えば、期間１（Ｔ１）は、通常２～６週間であり、好ましくは３～４週間である。期間２（Ｔ２）は、場合によっては、約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または３年間である。
いくつかの態様において、実施形態の方法は、被験体に複数回用量のワクチン組成物を投与する工程を含む。さらなる態様においては、ブースター用のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物の反応原性を低下させる方法が提供される。いくつかの態様においては、初回ワクチン接種後に高レベルの反応原性を示す被験体に対して、初回ワクチン組成物とは異なるブースターワクチンを投与する。例えば、いくつかの態様において、初回ワクチンはＢＮＴ１６２またはｍＲＮＡ－１２７３であり、ブースターワクチン、実施形態のｍＲＮＡワクチン組成物である。いくつかの態様においては、高い反応原性を示す被験体のためのブースターワクチン組成物として、過去に投与したワクチン組成物よりもＰＥＧまたはＰＥＧ複合体濃度が低いものを選択する。いくつかの態様においては、高い反応原性を示す被験体のためのブースターワクチン組成物はとして、過去に投与したワクチン組成物よりもｍＲＮＡまたはＬＮＰの濃度が低いものを選択する。
特定の態様において、実施形態による処置のための被験体は、ブースターワクチンとしてワクチン組成物を投与され、かつ、コロナウイルスワクチン組成物を１つ以上投与することにより過去に処置されている。特定の態様において、ブースターワクチンで処置される被験体は、過去にワクチン組成物で処置されている。このワクチン組成物は、スパイクタンパク質抗原を含んでいるか、またはスパイクタンパク質抗原をコードしている核酸分子を含んでいる。いくつかの態様において、ブースターワクチンによる処置のために選択された被験体は、過去にワクチン組成物を投与されている。このワクチン組成物は、ブースターワクチンのスパイクタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質を含んでいるか、またはコードしている。特定の態様において、過去に投与されたワクチン組成物は、スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質など）を含んでいるか、またはコードしている。このスパイクタンパク質と、ブースターワクチン組成物とは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上または１０個以上のアミノ酸が異なっている。特定の態様において、ブースターワクチン組成物は、スパイクタンパク質をコードしているＲＮＡを含んでいる。このスパイクタンパク質と、過去に投与したワクチン組成物とは、約１個～約５０個、約３個～約３０個、約５個～約３０個または約１０個～約２５個のアミノ酸が異なっている。またさらなる態様において、ブースターワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なる２種類、３種類、４種類またはそれ以上の異なるスパイクタンパク質をコードしているＲＮＡを含んでいる。
さらなる態様において、実施形態の方法は、２つ以上のブースターワクチン組成物を被験体に投与する工程を含む。各ブースターワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なっている区別可能なスパイクタンパク質をコードしているＲＮＡを含んでいる。いくつかの態様においては、このような区別可能なブースターワクチン組成物を、実質的に同時に投与してもよいし、約１０分間以内、２０分間以内、３０分間以内、１時間以内または２時間以内で別々に投与してもよい。いくつかの態様においては、区別可能なブースターワクチン組成物を、同じ部位に投与する（被験体の同じ腕に筋肉内注射するなど）。さらなる態様においては、区別可能なブースターワクチン組成物を、異なる部位に投与する（異なる腕に筋肉内注射したり、一方または両方の腕と１つ以上の脚の筋肉に筋肉内注射したりするなど）。
特定の態様においては、被験体における抗体反応またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を促進する方法として、実施形態の方法をさらに定義する。いくつかの態様においては、被験体における中和抗体反応を促進する方法として、方法を定義する。さらなる態様においては、被験体における防御性免疫応答を促進する方法として、方法を定義する。またさらなる態様においては、被験体におけるＴＨ２指向性免疫応答を促進する方法として、方法を定義する。
さらなる態様においては、実施形態のワクチン／組成物／組合せの投与により、抗体反応が刺激される。この抗体反応により、被験体におけるコロナウイルス中和抗体を１とすると、約１０～約５００のコロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体が、被験体において産生される。例えば、投与により刺激される抗体反応によって、コロナウイルス中和抗体を１とすると、約２００以下のスパイクタンパク質に結合する抗体が産生されてもよい。さらなる態様において、投与により刺激される抗体反応によって、コロナウイルス中和抗体を１とすると、約１０～約３００、約２０～約３００、約２０～約２００、約３０～約１００、または約３０～約８０のコロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体が産生される。またさらなる態様においては、実施形態の組成物の投与により刺激される被験体における抗体反応によって、スパイクタンパク質に結合する抗体のコロナウイルス中和抗体に対する比率は、平均的な回復期患者（コロナウイルス感染症から回復した被験体由来の血清）の血清における比率と比べて、２０％、１５％、１０％または５％になる。
またさらなる態様において、実施形態のワクチン／組成物／組合せの投与により、抗体反応が刺激される。この抗体反応により、コロナウイルス中和抗体を１とすると、約１～約５００のコロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合する抗体が被験体において産生される。さらなる態様においては、投与により刺激される抗体反応によって、コロナウイルス中和抗体を１とすると、約５０以下のスパイクタンパク質のＲＢＤに結合する抗体が産生される。またさらなる態様においては、投与により刺激される抗体反応によって、コロナウイルス中和抗体を１とすると、約１～約２００、約２～約１００、約３～約２００、約５～約１００、約５～約５０または約５～約２０のスパイクタンパク質のＲＢＤに結合する抗体が産生される。またさらなる態様において、実施形態の組成物の投与により被験体において刺激される抗体反応によって、スパイクタンパク質のＲＢＤに結合する抗体のコロナウイルス中和抗体に対する比率は、平均的な回復期患者（コロナウイルス感染症から回復した被験体）の血清における比率と比べて、２０％、１５％、１０％または５％になる。
またさらなる態様においては、実施形態のワクチン／組成物／組合せの投与により、被験体において、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＴＮＦおよび／またはＩＬ－１βの増加を実質的に誘導しない。さらなる態様においては、実施形態のワクチン／組成物の投与により、被験体において、血清中のＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＴＮＦおよび／またはＩＬ－１βの増加を実質的に誘導しない。いくつかの態様においては、実施形態のワクチン／組成物の投与により、被験体の注射部位（筋肉内注射部位など）において、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＴＮＦおよび／またはＩＬ－１βの増加を実質的に誘導しない。
またさらなる態様において、実施形態の方法は、疾患を患っているヒト被験体に実施形態のワクチン／組成物を投与する工程を含む。特定の態様において、被験体は、心血管疾患、腎疾患、肺疾患または自己免疫疾患を患っている。いくつかの態様においては、実施形態のワクチン／組成物を、抗凝固療法を受けている被験体に投与する。
またさらなる態様において、実施形態のワクチン／組成物／組合せをヒト被験体に投与した際に、グレード３の局所的有害事象を経験する被験体は、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７．５％以下または５％以下である（下記表Ａを参照）。例えば、いくつかの態様において、組成物の１回目または２回目の投与後に、グレード３の局所的有害事象を経験する被験体は、１０％以下である。好適な態様において、ヒト被験体に実施形態の組成物を投与することにより、グレード２以上の局所的有害事象を経験する被験体は、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７．５％以下または５％以下である。例えば、いくつかの態様において、組成物の１回目または２回目の投与後に、グレード２以上の局所的有害事象を経験する被験体は、３０％以下である。いくつかの態様において、ヒト被験体に実施形態の組成物を投与することにより、注射部位においてグレード３の疼痛、発赤、腫脹および／または掻痒を経験する被験体は、１０％以下である。
さらなる態様において、ヒト被験体に実施形態のワクチン／組成物／組合せを投与する際に、グレード３の全身性有害事象を経験する被験体は、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下である（下記表Ｂを参照）。例えば、いくつかの態様において、組成物の１回目の投与後に、グレード３の全身性有害事象を経験する被験体は、２５％以下である。ある態様において、組成物の２回目の投与後にグレード３の全身性有害事象を経験する被験体は、４０％以下である。いくつかの態様において、ヒト被験体に実施形態の組成物を投与することによりグレード３の発熱、頭痛、疲労、悪寒、筋肉痛、関節痛、悪心および／または下痢を経験する被験体は、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下である。
Figure 2023513502000014
Figure 2023513502000015
さらなる態様によれば、本発明は、１つ以上のポリペプチドを発現させる方法を提供する。１つ以上のポリペプチドは、コロナウイルスに由来する１つ以上のペプチドまたはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントを含んでいる。好ましくは、この方法は、下記の工程を含む。
（ａ）第１の態様の１つ以上の核酸または第２の態様の１つ以上の組成物を提供する工程。
（ｂ）核酸または組成物を、発現系（細胞）、組織、生物に、適用または投与する工程。
（本発明の核酸によって提供される）ポリペプチドの発現に好適な細胞は、ショウジョウバエＳ２昆虫細胞株でありうる。
この発現方法は、実験室、研究、診断、ペプチドもしくはタンパク質の商業生産および／または治療の目的に利用できる。さらに、方法は、特定の疾患の処置に関連して実施できる。特定の疾患は、特に感染症であり、特にコロナウイルス感染症であり、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス感染症およびＣＯＶＩＤ－１９疾患である。
同様に、他の態様によれば、本発明は、核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツのキットの使用を提供する。好ましくは、この使用は、例えば、コードされているコロナウイルス抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質のを発現させるための、診断目的または治療目的の使用である。
特定の実施形態においては、核酸、ポリペプチド、組成物、ワクチン、組合せを、組織または生物に対して適用または投与したする。その後、例えば、誘導されたコロナウイルス抗体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに特異的な（モノクローナル）抗体など）を得る工程を設けてもよい。あるいは、産生されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのタンパク質コンストラクト（Ｓタンパク質）を得る工程を設けてもよい。
使用は、（診断用）実験室、研究、診断、ペプチド、タンパク質またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス抗体の商業生産および／または治療目的に利用できる。使用は、in vitro、in vivoまたはex vivoで実施できる。使用はさらに、特定疾患に関連して実施できる。特定疾患は、とりわけ、コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９など）または関連障害である。
さらなる態様によれば、本発明は、組成物またはワクチンの製造方法を提供する。この製造方法は、下記工程を含む。
（ａ）キャップアナログの存在下にて、ＤＮＡテンプレートを用いいてin vitroにおいてＲＮＡを転写転写する工程。これにより、キャップｍＲＮＡを得る。好ましくは、キャップｍＲＮＡの核酸配列は、表３ａおよび３ｂに記載のものである。
（ｂ）工程（ａ）で得られたキャップＲＮＡを精製する工程。ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＴＦＦ、オリゴ（ｄＴ）精製および／またはＡＥＸを用いる。好ましくは、ＲＰ－ＨＰＬＣを用いる。
（ｃ）工程（ｂ）で精製したキャップＲＮＡを含んでいる、第１液体組成物を提供する工程。
（ｄ）本明細書に記載の１つ以上のカチオン性脂質、本明細書に記載の中性脂質、本明細書に記載のステロイドまたはステロイドアナログ、および本明細書に記載のＰＥＧ脂質を含んでいる第２液体組成物を提供する工程。
（ｅ）第１液体組成物および第２液体組成物を１つ以上の混合手段に導入して、キャップＲＮＡを含んでいるＬＮＰを形成させる工程。
（ｆ）得られたキャップＲＮＡを含んでいるＬＮＰを精製する工程。
（ｇ）任意構成で、キャップＲＮＡを含んでいる精製ＬＮＰを凍結乾燥させる工程。
好ましくは、工程（ｅ）にける混合手段は、Ｔピースコネクタまたはマイクロ流体混合装置である。好ましくは、精製工程（ｆ）は、沈澱工程、透析工程、濾過工程、ＴＦＦ工程から選択される１つ以上の工程を含む。任意構成で、工程（ａ）または（ｂ）の後に、酵素的ポリアデニル化工程を設けてもよい。任意構成で、さらなる精製工程を設けて、残留ＤＮＡ、バッファ、小型ＲＮＡ副産物などを除去してもよい。任意構成で、in vitroにおけるＲＮＡの転写はキャップアナログの非存在下で行い、in vitroにおけるＲＮＡの転写の後に酵素的キャッピング工程を実施する。任意構成で、in vitroにおけるＲＮＡの転写を、本明細書に記載の１つ以上の修飾ヌクレオチドの存在下で実施する。
実施形態においては、工程（ａ）を、in vitroにおけるＲＮＡの転写のための自動化装置において実施する。好ましくは、好ましくは工程（ａ）～（ｃ）を、より好ましくは上記に概説した全ての工程（ａ）～（ｇ）を、自動化装置において実施する。このような装置は、組成物またはワクチンを産生するためにも使用できる（態様２および３を参照）。好ましくは、ＷＯ２０２０／００２５９８に記載されている装置（特に、ＷＯ２０２０／００２５９８のクレーム１～５９および／または６８～７６（および図１～１８）に記載の装置）を好適に使用できる。
〔好適な実施形態／項目の一覧〕
本発明の特に好適な実施形態（項目１～２７５）を、下記に示す。
＜項目一覧＞
［項目１］
１つ以上の抗原性ペプチドもしくは抗原性タンパク質、またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントをコードしている１つ以上のコーディング配列を有している核酸であって、
上記１つ以上の抗原性ペプチドもしくは抗原性タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのものであるか、または当該ウイルスに由来しており、
１つ以上の異種の非翻訳領域（ＵＴＲ）を有している、核酸。
［項目２］
ワクチンに好適である、項目１に記載の核酸。
［項目３］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のペプチドまたはタンパク質を含んでいるか、または当該ペプチドまたはタンパク質からなり、
上記１つ以上のペプチドまたはタンパク質は、構造タンパク質、アクセサリータンパク質、レプリカーゼタンパク質、またはこれらのいずれかの免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来する、
項目１または２に記載の核酸。
［項目４］
上記構造タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、またはこれらのいずれかの免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来する、項目３に記載の核酸。
［項目５］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来する、項目１～４のいずれか１項に記載の核酸。
［項目６］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、または当該アミノ酸配列からなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～５のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１～１１１、２７４～１１６６３、１３１７６～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２～２２７５８、２２９１７、２２９２３、２２９２９～２２９６４、２６９３８、２６９３９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目７］
上記スパイクタンパク質（Ｓ）は、スパイクタンパク質断片Ｓ１またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントを含んでいるか、またはそれからなる、項目４～６のいずれか１項に記載の核酸。
［項目８］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～６のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１～２７、２９、３１～４８、５８～１１１、２７４～１３４５、１４８０～１５４６、１６１４～１１６６３、１３３７７～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目９］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号２７、１２７９～１３４５、２９、１４８０～１５４６、１３２４３～１３３０９、２２７３３～２２７３６、２６９３８、２６９３９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目１０］
上記スパイクタンパク質（Ｓ）は、
スパイクタンパク質断片Ｓ１またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントと、
スパイクタンパク質断片Ｓ２またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントと、
を含んでいるか、またはそれからなる、項目４～９のいずれか１項に記載の核酸。
［項目１１］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～１０のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１～２６、３１～４８、５８～１１１、２７４～１２７８、１６１４～１１６６３、１３３７７～１３５１０、１３５２１～１４１７７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目１２］
上記スパイクタンパク質（Ｓ）は、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有している、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）である、項目４～１１のいずれか１項に記載の核酸。
［項目１３］
上記１つ以上のpre-fusion構造安定化変異には、下記のアミノ酸置換が含まれている、項目１２に記載の核酸：
Ｋ９８６Ｐ；および、
Ｖ９８７Ｐ。
［項目１４］
上記１つ以上のpre-fusion構造安定化変異には、cavity-filling変異が含まれている、項目１２または１３に記載の核酸。
［項目１５］
上記１つ以上のcavity-filling変異は、下記を含む群から選択される、項目１４に記載の核酸：
Ｔ８８７Ｗ；
Ａ１０２０Ｗ；
Ｔ８８７ＷおよびＡ１０２０Ｗ；または、
Ｐ１０６９Ｆ。
［項目１６］
上記１つ以上のpre-fusion構造安定化変異には、変異型プロトン化部位が含まれている、項目１２～１５のいずれか１項に記載の核酸。
［項目１７］
上記１つ以上の変異型プロトン化部位は、下記を含む群から選択される、項目１６に記載の核酸：
Ｈ１０４８ＱおよびＨ１０６４Ｎ；
Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ；または、
Ｈ１０４８Ｑ、Ｈ１０６４Ｎ、Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ。
［項目１８］
上記１つ以上のpre-fusion構造安定化変異により、１つ以上の人工の分子内ジスルフィド結合が形成される、項目１２～１７のいずれか１項に記載の核酸。
［項目１９］
上記１つ以上の人工の分子内ジスルフィド結合は、下記のアミノ酸置換により形成される、項目１８に記載の核酸：
Ｉ７１２ＣおよびＴ１０７７Ｃ；
Ｉ７１４ＣおよびＹ１１１０Ｃ；
Ｐ７１５ＣおよびＰ１０６９Ｃ；
Ｇ８８９ＣおよびＬ１０３４Ｃ；
Ｉ９０９ＣおよびＹ１０４７Ｃ；
Ｑ９６５ＣおよびＳ１００３Ｃ；
Ｆ９７０ＣおよびＧ９９９Ｃ；
Ａ９７２ＣおよびＲ９９５Ｃ；
Ａ８９０ＣおよびＶ１０４０Ｃ；
Ｔ８７４ＣおよびＳ１０５５Ｃ；または、
Ｎ９１４ＣおよびＳ１１２３Ｃ。
［項目２０］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～１９のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１０～２６、４０～４８、８５～１１１、３４１～１２７８、１６８１～２６１８、２６８６～３６２３、３６９１～４６２８、４６９６～５６３３、５７０１～６６３８、６７０６～７６４３、７７１１～８６４８、８７１６～９６５３、９７２１～１０６５８、１０７２６～１１６６３、１３３７７～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２、２２７３８、２２７４０、２２７４２、２２７４４、２２７４６、２２７４８、２２７５０、２２７５２、２２７５４、２２７５６、２２７５８、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目２１］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～２０のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１０～２６、３４１～４０７、６０９～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３８、２２７４０、２２７４２、２２７４４、２２７４６、２２７４８、２２７５０、２２７５２、２２７５４、２２７５６、２２７５８、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目２２］
上記１つ以上のコーディング配列は、１つ以上の異種のペプチド要素またはタンパク質要素をさらにコードしており、
上記異種のペプチド要素またはタンパク質要素は、シグナルペプチド、リンカー、ヘルパーエピトープ、抗原クラスター化要素、三量体化要素、膜貫通要素および／またはＶＬＰ形成配列から選択される、
項目１～２１のいずれか１項に記載の核酸。
［項目２３］
上記１つ以上の異種のペプチド要素またはタンパク質要素は、異種の抗原クラスター化要素、異種の三量体化要素および／またはＶＬＰ形成配列である、項目２２に記載の核酸。
［項目２４］
上記１つ以上の異種の抗原クラスター化要素は、フェリチン要素、ルマジンシンターゼ要素、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）またはエンカプスリンから選択される、項目２２または２３に記載の核酸。
［項目２５］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～２４のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号５８～７５、８５～１０２、３６２４～５６３３、７６４４～９６５３、１３５８８～１３７２１、１３８５６～１３９８９、２２７３３、２２７３５、２２７３６のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目２６］
上記１つ以上の異種の三量体化要素は、フォールドン要素であり、
好ましくは、フィブリチンフォールドン要素である、
項目２２または２３に記載の核酸。
［項目２７］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～２６のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号７６～８４、１０３～１１１、５６３４～６６３８、９６５４～１０６５８、１３７２２～１３７８８、１３９９０～１４０５６、２２７３４、２６９３８、２６９３９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目２８］
上記１つ以上のＶＬＰ形成配列は、ウッドチャック肝炎コア抗原要素（ＷｈｃＡＧ）である、項目２２または２３に記載の核酸。
［項目２９］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～２８のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号６６３９～７６４３、１０６５９～１１６６３、１３７８９～１３８５５、１４０５７～１４１２３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目３０］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～２９のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１、１０、２１、２２、２５、２７、２７４、３４１、４０８、４７５、５４２、７４３、８１０、１０１１、１１４５、１２１２、１２７９、８７１６、１０７２６、２２７３２～２２７５８、２２９２９～２２９４２、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目３１］
上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～３０のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１０、２２９６０、２２９６１もしくは２２９６３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目３２］
上記１つ以上のコーディング配列は、１つ以上の核酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～３１のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１３１４７、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１７７、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３１８４、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである。
［項目３３］
１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、Ｓタンパク質を含んでおり、
上記Ｓタンパク質は、
pre-fusion構造安定化変異であるＫ９８６Ｐ変異およびＶ９８７Ｐ変異を有しており、かつ、
配列番号１０と同一であるアミノ酸配列を含んでいるもしくは当該アミノ酸配列からなる、または、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである、
項目１～３２のいずれか１項に記載の核酸。
［項目３４］
上記１つ以上のコーディング配列は、コドンを改変したコーディング配列であり、
好ましくは、上記コドンを改変したコーディング配列の１つ以上によってコードされているアミノ酸配列は、対応する野生型コーディング配列または参照コーディング配列によってコードされているアミノ酸配列と比較して変化していない、
項目１～３３のいずれか１項に記載の核酸。
［項目３５］
上記コドンを改変したコーディング配列の１つ以上は、Ｃを最大化したコーディング配列、ＣＡＩを最大化したコーディング配列、ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列、Ｇ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列、Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列、またはこれらの任意の組合せから選択される、項目３４に記載の核酸。
［項目３６］
上記コドンを改変したコーディング配列の１つ以上は、Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列、ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列またはＧ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列である、項目３４または３５に記載の核酸。
［項目３７］
上記１つ以上のコーディング配列は、核酸配列を含んでいるＧ／Ｃを最適化したコーディング配列を有しているか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～３６のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１３６～１３８、１４０、１４１、１４８、１４９、１５２、１５５、１５６、１５９、１６２、１６３、１６６、１６９、１７０、１７３、１１７３１～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１１９６６、１２２７１～１２４７２、１２７４３～１２９４４、１３５１４、１３５１５、１４１２４～１４１３２、１４１４２～１４１５０、１４１６０～１４１６８、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３０４０、２３０７７～２３１４８、２３１８９～２３２６０、２３２９７～２３３６８、２３４０９～２３４８０、２３５１７～２３５８８、２３６２９～２３７００、２３７３７～２３８０８、２３８４９～２３９２０、２３９５７～２４０２８、２４０６９～２４１４０、２４１７７～２４２４８、２４２８９～２４３６０、２４３９７～２４４６８、２４５０９～２４５８０、２４６１７～２４６８８、２４７２９～２４８００、２４８３７～２４９０８、２４９４９～２５０２０、２５０５７～２５１２８、２５１６９～２５２４０、２５２７７～２５３４８、２５３８９～２５４６０、２５４９７～２５５６８、２５６０９～２５６８０、２５７１７～２５７８８、２５８２９～２５９００、２５９３７～２６００８、２６０４９～２６１２０、２６１５７～２６２２８、２６２６９～２６３４０、２６３７７～２６４４８、２６４８９～２６５６０、２６５９７～２６６６８、２６７０９～２６７８０、２６８１７～２６８８８、２６９２５～２６９３７のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである。
［項目３８］
上記１つ以上のコーディング配列は、核酸配列を含んでいるヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列を有しているか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～３７のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１４２、１４３、１４５、１５０、１５３、１５７、１６０、１６４、１６７、１７１、１７４、１１９６７～１２０３３、１２４７３～１２５３９、１２９４５～１３０１１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである。
［項目３９］
上記１つ以上のコーディング配列は、核酸配列を含んでいるＧ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列を有しているか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～３８のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１４６、１４７、１５１、１５４、１５８、１６１、１６５、１６８、１７２、１７５、１２０３４～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１２５４０～１２６７５、１３０１２～１３１４７、１３５１９、１３５２０、１４１３３～１４１４１、１４１５１～１４１５９、１４１６９～１４１７７、２３０４１～２３０７６、２３１４９～２３１８４、２３２６１～２３２９６、２３３６９～２３４０４、２３４８１～２３５１６、２３５８９～２３６２４、２３７０１～２３７３６、２３８０９～２３８４４、２３９２１～２３９５６、２４０２９～２４０６４、２４１４１～２４１７６、２４２４９～２４２８４、２４３６１～２４３９６、２４４６９～２４５０４、２４５８１～２４６１６、２４６８９～２４７２４、２４８０１～２４８３６、２４９０９～２４９４４、２５０２１～２５０５６、２５１２９～２５１６４、２５２４１～２５２７６、２５３４９～２５３８４、２５４６１～２５４９６、２５５６９～２５６０４、２５６８１～２５７１６、２５７８９～２５８２４、２５９０１～２５９３６、２６００９～２６０４４、２６１２１～２６１５６、２６２２９～２６２６４、２６３４１～２６３７６、２６４４９～２６４８４、２６５６１～２６５９６、２６６６９～２６７０４、２６７８１～２６８１６、２６８８９～２６９２４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。
［項目４０］
上記１つ以上のコーディング配列のＧ／Ｃ含有率は、約５０％以上、約５５％以上または約６０％以上であり、
好ましくは、約６３．９％である、
項目１～３９のいずれか１項に記載の核酸。
［項目４１］
上記１つ以上のコーディング配列は、Ｓタンパク質をコードしており、
上記Ｓタンパク質は、pre-fusion構造安定化変異であるＫ９８６Ｐ変異およびＶ９８７Ｐ変異を有しており、
上記コーディング配列は、核酸配列を含んでいるＧ／Ｃを最適化したコーディング配列を有しているか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、配列番号１３７、２３０９０、２３０９１、２３０９３、２３０９４、またはその断片もしくはバリアントを含んでいる、
項目１～４０のいずれか１項に記載の核酸。
［項目４２］
上記１つ以上の異種の非翻訳領域は、１つ以上の異種の５’ＵＴＲおよび／または１つ以上の異種の３’ＵＴＲから選択される、項目１～４１のいずれか１項に記載の核酸。
［項目４３］
上記１つ以上の異種の３’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目４２に記載の核酸：
(i)ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、αグロビン、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１およびＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’ＵＴＲに由来する；
(ii)(i)の遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片またはバリアントに由来する。
［項目４４］
上記１つ以上の異種の５’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目４２に記載の核酸：
(i)ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４ＢおよびＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’ＵＴＲに由来する；
(ii)(i)の遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片またはバリアントに由来する。
［項目４５］
上記１つ以上の異種の５’ＵＴＲおよび上記１つ以上の異種の３’ＵＴＲのＵＴＲ設計は、ａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）、ａ－３（ＳＬＣ７Ａ３／ＰＳＭＢ３）、ｅ－２（ＲＰＬ３１／ＲＰＳ９）およびｉ－３（－／ｍｕａｇ）から選択され、
特に好ましくは、ＵＴＲ設計は、ａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）およびｉ－３（－／ｍｕａｇ）である、
項目４２に記載の核酸。
［項目４６］
上記核酸は、１つ以上のポリ（Ａ）配列および／または１つ以上のポリ（Ｃ）配列を有しており、
好ましくは、上記ポリ（Ａ）配列は、３０～２００個のアデノシンヌクレオチドを含んでおり、
好ましくは、上記ポリ（Ｃ）配列は、１０～４０個のシトシンヌクレオチドを含んでいる、
項目１～４５のいずれか１項に記載の核酸。
［項目４７］
上記核酸は、１つ以上のヒストンステムループを有している、項目１～４６のいずれか１項に記載の核酸。
［項目４８］
上記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、項目１～４７のいずれか１項に記載の核酸。
［項目４９］
上記核酸は、コーディングＲＮＡである、項目１～４８のいずれか１項に記載の核酸。
［項目５０］
上記コーディングＲＮＡは、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡまたはレプリコンＲＮＡである、項目４９に記載の核酸。
［項目５１］
上記核酸（好ましくはコーディングＲＮＡ）は、ｍＲＮＡである、項目１～５０のいずれか１項に記載の核酸。
［項目５２］
上記ｍＲＮＡは、レプリコンＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡではない、項目５１に記載の核酸。
［項目５３］
上記ｍＲＮＡは、
３０～２００個のアデノシンヌクレオチドを含んでいる１つ以上のポリ（Ａ）配列を有しており、かつ、
３’末端のヌクレオチドがアデノシンである、
項目５１に記載の核酸。
［項目５４］
上記ＲＮＡ（好ましくはコーディングＲＮＡ）は、５’キャップ構造を有しており、
好ましくは、上記５’キャップ構造は、
項目４８～５１のいずれか１項に記載の核酸。ｍ７Ｇ構造、ｃａｐ０構造、ｃａｐ１構造、ｃａｐ２構造、改変ｃａｐ０構造または改変ｃａｐ１構造であり、
好ましくは、５’ｃａｐ１構造である、
項目４８～５１のいずれか１項に記載の核酸。
［項目５５］
上記核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を含んでいる、項目４８～５４のいずれか１項に記載の核酸：
（Ａ）５’ｃａｐ１構造；
（Ｂ）配列番号１３７のコーディング配列、またはその断片もしくはバリアント；
（Ｃ）αグロビン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２６７または２６８の３’ＵＴＲ）；
（Ｄ）約６４個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列；
（Ｅ）約３０個のＣヌクレオチドを含んでいるポリ（Ｃ）配列；
（Ｆ）配列番号１７８または１７９のヒストンステムループ。
［項目５６］
上記核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を含んでいる、項目４８～５４のいずれか１項に記載の核酸：
（Ａ）５’ｃａｐ１構造
（Ｂ）ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２３１または２３２の５’ＵＴＲ）；
（Ｃ）配列番号１３７のコーディング配列、またはその断片もしくはバリアント；
（Ｄ）ＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２５３または２５４の３’ＵＴＲ）；
（Ｅ）配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ；
（Ｆ）約１００個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列。
［項目５７］
３’末端のヌクレオチドがアデノシンである、項目５６に記載の核酸。
［項目５８］
上記核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を含んでいる、項目４８～５４のいずれか１項に記載の核酸：
（Ａ）５’ｃａｐ１構造；
（Ｂ）配列番号２３０９０もしくは２３０９１のコーディング配列、またはその断片もしくはバリアント
（Ｃ）αグロビン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２６７または２６８の３’ＵＴＲ）
（Ｄ）約６４個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列；
（Ｅ）約３０個のＣヌクレオチドを含んでいるポリ（Ｃ）配列；
（Ｆ）配列番号１７８または１７９のヒストンステムループ。
［項目５９］
上記核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を含んでいる、項目４８～５４のいずれか１項に記載の核酸：
（Ａ）５’ｃａｐ１構造；
（Ｂ）ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２３１または２３２の５’ＵＴＲ）；
（Ｃ）配列番号２３０９０もしくは２３０９１のコーディング配列、またはその断片もしくはバリアント
（Ｄ）ＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２５３または２５４の３’ＵＴＲ）
（Ｅ）配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ；
（Ｆ）約１００個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列。
［項目６０］
上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～５９のいずれか１項に記載の核酸：
配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７１４８からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである。
［項目６１］
上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしており、
(i)配列番号１４９、１５６、１２３３８、１５０、１５７、１５１、１５８、１２５４１、１６３、１７０、１２８１０、１６４、１７１、１６５、１７２、１３０１３、１２３４２～１２３５１、１２５４５～１２５５４、１２８１４～１２８２３、１３０１７～１３０２６、１４１３３からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである；
好ましくは、上記核酸配列は、下記(iii)または(iv)を満たしている、項目１～６０のいずれか１項に記載の核酸：
(iii)配列番号１４９、１５０、１５１、１６３、１６４、１６５から選択される；
(iv)(iii)のいずれかの配列の断片もしくはバリアントから選択される。
［項目６２］
上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～６１のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１６３から選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)の断片またはバリアントである。
［項目６３］
上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～６２のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号１４９から選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)の断片またはバリアントである。
［項目６４］
上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～６３のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号２４８３７から選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)の断片またはバリアントである。
［項目６５］
上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～６４のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号２３３１１、２３５３１、２４８５１からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)の断片またはバリアントである。
［項目６６］
上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～６５のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号２３３１０、２３５３０、２４８５０からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)の断片またはバリアントである。
［項目６７］
上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、項目１～６６のいずれか１項に記載の核酸：
(i)配列番号２３３１３、２３５３３、２４８５３、２３３１４、２３５３４、２４８５４からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)の断片またはバリアントである。
［項目６８］
上記核酸は、１－メチルシュードウリジン置換を有していないＲＮＡである、項目１～６７のいずれか１項に記載の核酸。
［項目６９］
上記核酸は、化学修飾ヌクレオチドを含んでいないＲＮＡである、項目１～６８のいずれか１項に記載の核酸。
［項目７０］
上記核酸は、in vitroにおいて転写されたＲＮＡであり、
in vitroにおけるＲＮＡの転写は、配列最適化されているヌクレオチド混合物およびキャップアナログの存在下で行われ、
好ましくは、上記配列最適化されているヌクレオチド混合物は、化学修飾ヌクレオチドを含んでいない、
項目１～６９のいずれか１項に記載の核酸。
［項目７１］
上記核酸は、精製ＲＮＡであり、
好ましくは、ＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製されている、
項目１～７０のいずれか１項に記載の核酸。
［項目７２］
上記核酸は、精製ＲＮＡであり、
上記精製ＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製されており、
上記精製ＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦにより精製していないＲＮＡと比べて、２本鎖ＲＮＡ副生成物が約５％、約１０％または約２０％少ない、
項目１～７１のいずれか１項に記載の核酸。
［項目７３］
上記核酸は、精製ＲＮＡであり、
上記精製ＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製されており、
上記精製ＲＮＡは、オリゴｄＴ精製、沈澱、濾過および／または陰イオン交換クロマトグラフィによって精製したＲＮＡと比べて、２本鎖ＲＮＡ副生成物が約５％、約１０％または約２０％少ない、
項目１～７２のいずれか１項に記載の核酸。
［項目７４］
項目１～７３のいずれか１項に記載の核酸の１つ以上を含んでいる組成物であって、
任意構成で、上記組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアを含んでいる、
組成物。
［項目７５］
上記組成物は、配列番号１４９、１６３、２４８３７、２３３１１、２３５３１、２３３１０、２３５３０、２３３１３もしくは２３５３３に記載のｍＲＮＡ、またはこれらのいずれかの配列の断片もしくはバリアントを含んでいる、項目７４に記載の組成物。
［項目７６］
上記組成物は、項目１～７３のいずれか１項に記載の核酸を複数または２つ以上含んでいる多価組成物である、項目７４に記載の組成物。
［項目７７］
上記多価組成物の複数または２つ以上の核酸配列は、異なるスパイクタンパク質をそれぞれコードしており、
好ましくは、上記スパイクタンパク質は、pre-fusion構造安定化スパイクタンパク質である、
項目７６に記載の組成物。
［項目７８］
上記異なるスパイクタンパク質またはpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの異なるバリアント／単離株に由来する、項目７７に記載の組成物。
［項目７９］
上記異なるスパイクタンパク質またはpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質は、少なくとも、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１またはＣＡＬ．２０Ｃに由来する、項目７８に記載の組成物。
［項目８０］
上記異なるスパイクタンパク質またはpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質は、下記(i)～(v)のうち１つ以上のＳタンパク質におけるアミノ酸変異を有している、項目７８に記載の組成物：
(i)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｉ６９２ＶおよびＭ１２２９Ｉ；
(ii)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、ｄｅｌＹ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ；
(iii)Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、ｄｅｌＬ２４２、ｄｅｌＡ２４３、ｄｅｌＬ２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖ；
(iv)Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５ＹおよびＴ１０２７Ｉ；
(v)Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、Ｌ４５２ＲおよびＤ６１４Ｇ。
［項目８１］
上記多価組成物は、２つ以上の核酸種を含んでおり、
上記核酸種は、配列番号１０、２２９６１、２２９６０、２２９６３、２２９４１、２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であるアミノ酸配列をコードしているコーディング配列を有している、
項目７６～７８のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８２］
上記多価組成物は、２つ以上のＲＮＡ種を含んでおり、
上記ＲＮＡ種は、配列番号１４９もしくは２４８３７、２３５３１もしくは２４８５１、２３５３０もしくは２４８５０、２３５３３もしくは２４８５３、２３４３９もしくは２４７５９、または２３５３４もしくは２４８５４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である、
項目７６～７８のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８３］
上記組成物は、ＲＮＡ完全性が７０％以上であるｍＲＮＡを含んでいる、項目７４～８０のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８４］
上記組成物は、キャッピング率が７０％以上であるｍＲＮＡを含んでおり、
好ましくは、キャッピング率が７０％以上、８０％以上または９０％以上であり、かつ、Ｃａｐ１構造を有しているｍＲＮＡ種を含んでいる、
項目７４～８３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８５］
上記１つ以上の核酸は、１つ以上のカチオン性化合物またはポリカチオン性化合物と複合化もしくは関連付けられているか、または少なくとも部分的に複合化もしくは関連付けられており、
好ましくは、上記カチオン性化合物またはポリカチオン性化合物は、カチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー、カチオン性もしくはポリカチオン性多糖、カチオン性もしくはポリカチオン性脂質、カチオン性もしくはポリカチオン性タンパク質、カチオン性もしくはポリカチオン性ペプチド、またはこれらの任意の組合せである、
項目７４～８４のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８６］
上記１つ以上の核酸は、１つ以上の脂質または脂質系キャリアと複合化または関連付けられており、これにより、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームを形成しており、
好ましくは、上記１つ以上の核酸をカプセル化している、
項目８５に記載の組成物。
［項目８７］
上記１つ以上の核酸は、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子を形成している、項目８５または８６に記載の組成物。
［項目８８］
上記ＬＮＰは、式ＩＩＩ－３に係るカチオン性脂質を含んでいる、項目８６または８７に記載の組成物。
Figure 2023513502000016
［項目８９］
上記ＬＮＰは、式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質を含んでいる、項目８６～８８のいずれか１項に記載の組成物：
Figure 2023513502000017
式中、
ｎの平均値は、３０～６０であり、
好ましくは、ｎの平均値は、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４であり、
最も好ましくは、ｎの平均値は、４９または４５である。
［項目９０］
上記ＬＮＰは、式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質を含んでいる、項目８６～８８のいずれか１項に記載の組成物：
Figure 2023513502000018
式中、ｎは、上記ＰＥＧ脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌとなるように選択される整数である。
［項目９１］
上記ＬＮＰは、１つ以上の中性脂質および／または１つ以上のステロイドもしくはステロイドアナログを含んでいる、項目８６～９０のいずれか１項に記載の組成物。
［項目９２］
上記中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、
好ましくは、上記カチオン性脂質のＤＳＰＣに対するモル比は、（約２：１）～（約８：１）である、
項目９１に記載の組成物。
［項目９３］
上記ステロイドは、コレステロールであり、
好ましくは、上記カチオン性脂質のコレステロールに対するモル比は、（約２：１）～（約１：１）である、
項目９１に記載の組成物。
［項目９４］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)１つ以上のカチオン性脂質、好ましくは式（ＩＩＩ）の脂質、より好ましくは脂質ＩＩＩ－３；
(ii)１つ以上の中性脂質、好ましくは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
(iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ、好ましくはコレステロール；
(iv)１つ以上のポリマー複合化脂質、好ましくは式（ＩＶａ）に由来するＰＥＧ脂質であってｎ＝４９のもの；
上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
項目８６～９３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目９５］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)１つ以上のカチオン性脂質、好ましくは式（ＩＩＩ）の脂質、より好ましくは脂質ＩＩＩ－３；
(ii)１つ以上の中性脂質、好ましくは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
(iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ、好ましくはコレステロール；
(iv)１つ以上のポリマー複合化脂質、好ましくは式（ＩＶａ）に由来するＰＥＧ脂質であってｎ＝４５のもの；
上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
項目８６～９３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目９６］
上記(i)～(iv)のモル比は、約５０：１０：３８．５：１．５であり、
好ましくは、４７．５：１０：４０．８：１．７であり、
より好ましくは、４７．４：１０：４０．９：１．７である、
項目９４または９５に記載の組成物。
［項目９７］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記組成物に含まれている遊離ＲＮＡ（複合化またはカプセル化されていないＲＮＡ）は、約２０％未満であり、
好ましくは、遊離ＲＮＡは、約１５％未満であり、
より好ましくは、遊離ＲＮＡは、約１０％未満である、
項目８７～９６のいずれか１項に記載の組成物。
［項目９８］
脂質の核酸に対する重量比は、（約１０：１）～（約６０：１）であり、
好ましくは、（約２０：１）～（約３０：１）であり、
例えば、約２５：１である、
項目８７～９７のいずれか１項に記載の組成物。
［項目９９］
上記核酸をカプセル化している上記ＬＮＰのＮ／Ｐ比は、約１～約１０であり、
好ましくは、約５～約７であり、
より好ましくは、約６である、
項目８７～９８のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１００］
上記組成物の多分散指数（ＰＤＩ）は、約０．４未満であり、
好ましくは、約０．３未満であり、
より好ましくは、約０．２未満であり、
最も好ましくは、約０．１未満である、
項目８７～９９のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１０１］
上記ＬＮＰのＺ平均粒子径は、約６０～約１２０ｎｍであり、
好ましくは、約１２０ｎｍ未満であり、
より好ましくは、約１００ｎｍ未満であり、
最も好ましくは約８０ｎｍ未満である、
項目８６～１００のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１０２］
上記ＬＮＰのうち、粒子径が約５００ｎｍ超であるＬＮＰは、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満である、項目８６～１０１のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１０３］
上記ＬＮＰのうち、粒子径が約２０ｎｍ未満であるＬＮＰは、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満である、項目８６～１０２のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１０４］
脂質系キャリアのうち球状であるものは、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上であり、
好ましくは、固体または部分的に固体のコアを有している、
項目８６～１０３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１０５］
上記組成物の濁度は、約１５０～約０．０ＦＮＵであり、
好ましくは、約５０ＦＮＵ以下であり、
より好ましくは、約２５ＦＮＵ以下である、
項目８６～１０４のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１０６］
濃度が約５０～約３００ｍＭの糖をさらに含んでおり、
好ましくは、濃度が約１５０ｍＭのスクロースを含んでいる、
項目７４～１０５のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１０７］
濃度が約１０～約２００ｍＭの塩をさらに含んでおり、
好ましくは、濃度が約７５ｍＭのＮａＣｌを含んでいる、
項目７４～１０６のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１０８］
濃度が１～約１００ｍＭの緩衝剤をさらに含んでおり、
好ましくは、濃度が約１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４を含んでいる、
項目７４～１０７のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１０９］
上記組成物のｐＨは、約７．０～８．０であり、
好ましくは、約７．４である、
項目７４～１０８のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１１０］
ＲＮＡをカプセル化している脂質ナノ粒子を含んでおり、
上記ＲＮＡは、pre-fusion構造安定化変異であるＫ９８６Ｐ変異およびＶ９８７Ｐ変異を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードしており、
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３のカチオン性脂質；
(ii)１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａのＰＥＧ脂質（ｎ＝４９）；
上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約４７．４％であり、ＤＳＰＣが約１０％であり、コレステロールが約４０．９であり、ＰＥＧ脂質が１．７％であり、
上記ＲＮＡは、配列番号１６３または１４９の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であり、
上記ＲＮＡは、化学修飾されておらず、
上記ＲＮＡは、５’ｃａｐ１構造を有しており、
上記ＲＮＡの完全性は、約７０％以上であり、
上記ＲＮＡをカプセル化している上記ＬＮＰのＮ／Ｐ比は、約６であり、
上記ＲＮＡをカプセル化している上記ＬＮＰのＺ平均粒子径は、約６０～約１２０ｎｍであり、
上記組成物に含まれている遊離ＲＮＡ（複合化またはカプセル化されていないＲＮＡ）は、約２０％未満であり、
任意構成で、上記組成物は、濃度が約１５０ｍＭのスクロース、濃度が約７５ｍＭのＮａＣｌ、濃度が約１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４をさらに含んでおり、
任意構成で、上記組成物のｐＨは、約７．４である、
項目８６～１０９のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１１１］
ＲＮＡをカプセル化している脂質ナノ粒子を含んでおり、
上記ＲＮＡは、pre-fusion構造安定化変異であるＫ９８６Ｐ変異およびＶ９８７Ｐ変異を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードしており、
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３のカチオン性脂質；
(ii)１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａのＰＥＧ脂質（ｎ＝４５）；
上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約４７．４％であり、ＤＳＰＣが１０％であり、コレステロールが４０．９であり、ＰＥＧ脂質が１．７％であり、
上記ＲＮＡは、配列番号１６３または１４９の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であり、
上記ＲＮＡは、化学修飾されておらず、
上記ＲＮＡは、５’ｃａｐ１構造を有しており、
上記ＲＮＡの完全性は、約７０％以上であり、
上記ＲＮＡをカプセル化している上記ＬＮＰのＮ／Ｐ比は、約６であり、
上記ＲＮＡをカプセル化している上記ＬＮＰのＺ平均粒子径は、約６０～約１２０ｎｍであり、
上記組成物に含まれている遊離ＲＮＡ（複合化していないＲＮＡ）は、約２０％未満であり、
任意構成で、上記組成物は、濃度が約１５０ｍＭのスクロース、濃度が約７５のＮａＣｌ、濃度が約１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４を含んでおり、
任意構成で、上記組成物のｐＨは、約７．４である、
項目８６～１０９のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１１２］
化学修飾されていないＲＮＡを含んでおり、
上記ＲＮＡは、配列番号１６３の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であり、
上記ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されており、
上記ＬＮＰにおいて、カチオン性脂質ＩＩＩ－３、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質のモル比は、約５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ％）であり、
好ましくは、４７．５：１０：４０．８：１．７（ｍｏｌ％）であり、
より好ましくは、４７．４：１０：４０．９：１．７（ｍｏｌ％）である、
項目８６～１１０のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１１３］
化学修飾されていないＲＮＡを含んでおり、
上記ＲＮＡは、配列番号１４９の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であり、
上記ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されており、
上記ＬＮＰにおいて、カチオン性脂質ＩＩＩ－３、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質のモル比は、約５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ％）であり、
好ましくは、４７．５：１０：４０．８：１．７（ｍｏｌ％）であり、
より好ましくは、４７．４：１０：４０．９：１．７（ｍｏｌ％）である、
項目８６～１１０のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１１４］
上記組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓ）をコードしているｍＲＮＡを含んでおり、
上記ｍＲＮＡは、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有しているpre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）である、
項目７４～１１２のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１１５］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をコードしている上記ｍＲＮＡは、配列番号１６３と９５％以上同一であるか、または配列番号１６３と同一のコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、項目１１４に記載の組成物。
［項目１１６］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)１つ以上の中性脂質；
(iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ；
(iv)１つ以上のＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
項目１１４に記載の組成物。
［項目１１７］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
項目１１４に記載の組成物。
［項目１１８］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、約４７．５：１０：４０．８：１．７である、
項目１１４に記載の組成物。
［項目１１９］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、４７．４：１０：４０．９：１．７である、
項目１１４に記載の組成物。
［項目１２０］
ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、項目１０７～１１８のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１２１］
上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成しており、
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、約４７．５：１０：４０．８：１．７であり、
ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、
項目１２０に記載の組成物。
［項目１２２］
上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成しており、
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、４７．４：１０：４０．９：１．７であり、
ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、
項目１２０に記載の組成物。
［項目１２３］
上記組成物は、凍結乾燥組成物である、項目７４～９９、１１０～１２２のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１２４］
上記凍結乾燥組成物の含水率は、約１０％未満である、項目１２３に記載の組成物。
［項目１２５］
上記凍結乾燥組成物の含水率は、約０．５％～５％である、項目１２４に記載の組成物。
［項目１２６］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記組成物は、液体として、約５℃にて、約２週間以上保存した後に安定である、
項目８６～１２２のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１２７］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記組成物は、液体として、約５℃にて、１箇月間以上保存した後に安定である、
項目１２６に記載の組成物。
［項目１２８］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記組成物は、液体として、約５℃にて、約２週間から約１箇月間、約２箇月間、約３箇月間、約４箇月間、約５箇月間、約６箇月間または約１年間保存した後に安定である、
項目１２６に記載の組成物。
［項目１２９］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
液体として、約５℃にて、約２週間以上保存した後に、上記ＲＮＡの７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が損傷していない、
項目１２６に記載の組成物。
［項目１３０］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
液体として、約５℃にて、１箇月間以上保存した後に、上記ＲＮＡの７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が損傷していない、
項目１２９に記載の組成物。
［項目１３１］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
液体として、約５℃にて、約２週間から約１箇月間、約２箇月間、約３箇月間、約４箇月間、約５箇月間、約６箇月間または約１年間保存した後に、上記ＲＮＡの７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が損傷していない、
項目１２６に記載の組成物。
［項目１３２］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
液体として、約５℃にて、約２週間保存した後に、上記ＲＮＡの８０％以上が損傷していない、
項目１２６に記載の組成物。
［項目１３３］
上記組成物は、低凝集性脂質を含んでいる、項目８６～１３２のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１３４］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記ＲＮＡの濃度は、約１０μｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬであり、
好ましくは、約１００μｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬである、
項目８６～１３３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１３５］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記ＲＮＡの濃度は、１００μｇ／ｍＬ以上であり、
より好ましくは、２００μｇ／ｍＬ以上であり、
最も好ましくは、５００μｇ／ｍＬ以上である、
項目８６～１３３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１３６］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記ＲＮＡのＲＮＡ完全性は、約５０％以上であり、
好ましくは、約６０％以上であり、
より好ましくは、約７０％以上であり、
最も好ましくは、約８０％以上である、
項目８６～１３５のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１３７］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記組成物に含まれている遊離ＲＮＡは、約２０％未満であり、
好ましくは、約１５％未満であり、
より好ましくは、約１０％未満である、
項目８６～１３６のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１３８］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記組成物に含まれている２価のカチオンは、ＲＮＡ１ｇあたり約１００ｎＭ未満であり、
好ましくは、ＲＮＡ１ｇあたり約５０ｎＭ未満であり、
より好ましくは、ＲＮＡ１ｇあたり約１０ｎＭ未満である、
項目８６～１３７のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１３９］
上記２価のカチオンは、Ｍｇ２＋および／またはＣａ２＋から選択される、項目１３８に記載の組成物。
［項目１４０］
上記脂質の濃度は、約２５０μｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬであり、
好ましくは、約２．５ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬである、
項目８６～１３９のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１４１］
上記脂質の濃度は、約２．５ｍｇ／ｍＬ以上であり、
好ましくは、５ｍｇ／ｍＬ以上であり、
より好ましくは、１２．５ｍｇ／ｍＬ以上である、
項目８６～１４０のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１４２］
上記低凝集性脂質の濃度は、約１７．５μｇ／ｍＬ～約１７．５ｍｇ／ｍＬであり、
好ましくは、約１７５μｇ／ｍＬ～約１．７５ｍｇ／ｍＬである、
項目１３３～１４２のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１４３］
上記低凝集性脂質の濃度は、約１７５μｇ／ｍＬ以上であり、
好ましくは、約３５０μｇ／ｍＬ以上であり、
より好ましくは、８７５μｇ／ｍＬ以上である、
項目１３３～１４２のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１４４］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記脂質の上記ＲＮＡに対する重量比は、（約１０：１）～（約６０：１）であり、
好ましくは、（約２０：１）～（約３０：１）であり、
より好ましくは、約２５：１である、
項目８６～１４３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１４５］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記脂質系キャリアの上記ＲＮＡに対するＮ／Ｐ比は、約１～約１０であり、
好ましくは、約５～約７であり、
より好ましくは、約６でる、
項目８６～１４４のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１４６］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記ＲＮＡをカプセル化している上記脂質系キャリアに含まれている低凝集性脂質のモル比は、約０．５％～１５％であり、
好ましくは、約１．０％～約２．５％であり、
より好ましくは、約１．７％である、
項目８６～１４３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１４７］
上記低凝集性脂質は、ポリマー複合化脂質（例えば、ＰＥＧ複合化脂質）である、項目１３３～１４３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１４８］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記ＲＮＡおよび当該ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアは、下記(i)～(iii)のうち１つ以上により精製されている、項目８６～１４７のいずれか１項に記載の組成物：
(i)１つ以上の精製工程（好ましくは、１つ以上のＴＦＦ工程）；
(ii)１つ以上の清澄化工程；
(iii)１つ以上の濾過工程。
［項目１４９］
上記組成物に含まれているエタノールは、約５００ｐｐｍ未満であり、
好ましくは、約５０ｐｐｍ未満であり、
より好ましくは、約５ｐｐｍ未満である、
項目８６～１４８のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５０］
上記組成物のオスモル濃度は、約２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ～約４５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであり、
好ましくは、約３３５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである、
項目８６～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５１］
上記組成物は、液体として、約２５℃にて保存した後、１週間以上安定であり、
好ましくは、２週間以上安定であり、
より好ましくは、３週間以上安定であり、
最も好ましくは、４週間以上安定である、
項目８６～１５０のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５２］
上記組成物は、液体として、約４０℃にて保存した後、１日以上安定であり、
好ましくは、２日以上安定であり、
より好ましくは、３日以上安定であり、
最も好ましくは、４日以上安定である、
項目８６～１５１のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５３］
液体として保存したときに、上記ＲＮＡの完全性の減少は、約３０％未満であり、
好ましくは、約２０％未満であり、
より好ましくは、約１０％未満である、
項目８６～１５２のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５４］
液体として保存したときに、遊離ＲＮＡの増加量は、１０％以下であり、
好ましくは、５％以下である、
項目８６～１５３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５５］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
液体として保存したときに、上記ＲＮＡをカプセル化している上記脂質系キャリアのＰＤＩの増加は、約０．２以下であり、
好ましくは、約０．１以下である、
項目８６～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５６］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
液体として保存したときに、上記ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアのＺ平均粒子径の増加は、２０％以下であり、
好ましくは、１０％以下である、
項目８６～１５５のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５７］
液体として保存したときに、上記組成物の濁度の増加は、２０％以下であり、
好ましくは、１０％以下である、
項目８６～１５６のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５８］
液体として保存したときに、ｐＨおよび／またはオスモル濃度の増加または減少は、２０％以下であり、
好ましくは、１０％以下である、
項目８６～１５７のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１５９］
液体として保存したときに、上記組成物の力価の減少は、約３０％未満であり、
好ましくは、約２０％未満であり、
より好ましくは、約１０％未満である、
項目８６～１５８のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１６０］
上記核酸は、ＲＮＡであり、
上記ＲＮＡは、精製ＲＮＡであり、
好ましくは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって精製されたＲＮＡである、
項目８６～１３３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１６１］
１つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の１つ以上のアンタゴニストをさらに含んでおり、
好ましくは、ＴＬＲ７受容体および／またはＴＬＲ８受容体の１つ以上のアンタゴニストを含んでいる、
項目７４～１６０のいずれか１項に記載の組成物。
［項目１６２］
ＴＬＲ７受容体および／またはＴＬＲ８受容体の上記１つ以上のアンタゴニストは、１本鎖オリゴヌクレオチドであり、
好ましくは、ｐ５’－ＧＡＧ ＣＧｍＧ ＣＣＡ－３’である、
項目１６１に記載の組成物。
［項目１６３］
１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質を含んでいる、ワクチン用のポリペプチドであって、
上記抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来しており、
好ましくは、上記抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質のアミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、ポリペプチド：
(i)配列番号１～１１１、２７４～１１６６３、１３１７６～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２～２２７５８、２２９１７、２２９２３、２２９２９～２２９６４、２６９３８、２６９３９のアミノ酸配列のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
(ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
［項目１６４］
下記(i)～(iii)のうち１つ以上を含んでいる、ワクチン：
(i)項目１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
(ii)項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
(iii)項目１６３に記載のポリペプチド。
［項目１６５］
上記ワクチンは、適応免疫応答を誘導し、
好ましくは、上記適応免疫応答は、コロナウイルスに対する防御性の適応免疫応答であり、
好ましくは、上記コロナウイルスは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、
項目１６４に記載のワクチン。
［項目１６６］
上記ワクチンは、下記(i)または(ii)を含んでいる多価ワクチンである、項目１６４または１６５に記載のワクチン：
(i)項目１～７３に記載のいずれか１項に記載の核酸のうち、複数または２つ以上；
(ii)項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物のうち、複数または２つ以上。
［項目１６７］
下記(i)～(iv)のうち１つ以上を備えている、キットまたはパーツのキットであって、
(i)項目１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
(ii)項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
(iii)項目１６３に記載のポリペプチド；
(iv)項目１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
任意構成で、可溶化用の液体媒体を備えており、
任意構成で、構成品の投与および用量に関する情報を与える技術説明書を備えている、
キットまたはパーツのキット。
［項目１６８］
医薬としての使用のための、下記(i)～(v)のいずれか：
(i)項目１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
(ii)項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
(iii)項目１６３に記載のポリペプチド；
(iv)項目１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
(v)項目１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
［項目１６９］
コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染または当該感染に関連する障害（好ましくはＣＯＶＩＤ－１９）の、治療または予防にするための、下記(i)～(v)のいずれか：
(i)項目１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
(ii)項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
(iii)項目１６３に記載のポリペプチド；
(iv)項目１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
(v)項目１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
［項目１７０］
障害を治療または予防方法であって、
上記方法は、それを必要とする被験体に、下記(i)～(v)のうち１つ以上を適用または投与する工程を含む、方法：
(i)項目１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
(ii)項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
(iii)項目１６３に記載のポリペプチド；
(iv)項目１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
(v)項目１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
［項目１７１］
上記障害は、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染であるか、または当該感染に関連する障害（好ましくはＣＯＶＩＤ－１９）である、項目１７０に記載の障害を治療または予防する方法。
［項目１７２］
上記被験体は、哺乳動物被験体であり、
好ましくは、ヒト被験体である、
項目１７０または１７１に記載の障害を治療または予防する方法。
［項目１７３］
上記ヒト被験体は、高齢のヒト被験体であり、
好ましくは、５０歳以上、６０歳以上、６５歳以上または７０歳以上である、
項目１７０～１７２のいずれか１項に記載の障害を治療または予防する方法。
［項目１７４］
上記ヒト被験体は、６１歳以上である、項目１７３に記載の障害を治療または予防する方法。
［項目１７５］
上記ヒト被験体は、１８～６０歳である、項目１７０～１７２のいずれか１項に記載の障害を治療または予防する方法。
［項目１７６］
上記被験体は、妊娠者である、項目１７０～１７２のいずれか１項に記載の障害を治療または予防する方法。
［項目１７７］
下記(i)または(ii)を満たしている、項目１７０～１７５のいずれか１項に記載の方法：
(i)上記組成物の１回目の投与の後、グレート３の全身性有害事象を経験する被験体は、２５％以下である；
(ii)上記組成物の１回目の投与の後、グレード２以上の局所性有害事象を経験する被験体は、３０％以下である。
［項目１７８］
上記組成物の２回目の投与の後、グレート３の全身性有害事象を経験する被験体は、４０％以下である、項目１７０～１７５のいずれか１項に記載の方法。
［項目１７９］
上記ヒト被験体は、新生児または乳児であり、
好ましくは、３歳以下、２歳以下、１．５歳以下、１歳以下（１２箇月以下）、９箇月以下、６箇月以下もしくは３箇月以下、または６箇月～２歳である、
項目１７０～１７２のいずれか１項に記載の障害を治療または予防する方法。
［項目１８０］
上記被験体の疾患負荷を低減する方法としてさらに定義される、項目１７０に記載の方法。
［項目１８１］
上記方法により、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の１つ以上の症状の重篤度が低減される、項目１８０に記載の方法。
［項目１８２］
上記方法により、上記被験体が、入院、集中治療室への入室、酸素供給治療および／または人工呼吸器治療を必要とするようになる確率が低減される、項目１８１に記載の方法。
［項目１８３］
上記方法により、上記被験体が、重症または中等症のＣＯＶＩＤ－１９疾患を発症する確率が低減される、項目１８１に記載の方法。
［項目１８４］
上記方法により、上記被験体は、約６箇月間以上、重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防される、項目１８１に記載の方法。
［項目１８５］
上記方法により、上記被験体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に曝露されたときに重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳタンパク質は、配列番号１と比較して、１つ以上のアミノ酸変異を有している、
項目１８４に記載の方法。
［項目１８６］
上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳタンパク質は、下記(i)～(v)のうち１つ以上のアミノ酸変異を有している、項目１８５に記載の方法：
(i)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｉ６９２ＶおよびＭ１２２９Ｉ；
(ii)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、ｄｅｌＹ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ；
(iii)Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、ｄｅｌＬ２４２、ｄｅｌＡ２４３、ｄｅｌＬ２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖ；
(iv)Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５ＹおよびＴ１０２７Ｉ；
(v)Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、Ｌ４５２ＲおよびＤ６１４Ｇ。
［項目１８７］
上記方法により、上記被験体が、発熱、呼吸困難、嗅覚の喪失および／または味覚の喪失を発症するようになる確率が低減される、
項目１８１に記載の方法。
［項目１８８］
上記方法により、上記被験体が、発熱、呼吸困難、嗅覚の喪失および／または味覚の喪失を発症するようになる確率が低減される、
項目１８１に記載の方法。
［項目１８９］
上記被験体は、疾患を罹患しているか、または免疫不全状態である、項目１７０に記載の方法。
［項目１９０］
上記被験体は、肝疾患、腎疾患、糖尿病、高血圧、心疾患、肺疾患、癌を罹患しているか、またはＨＩＶ陽性である、項目１８９に記載の方法。
［項目１９１］
上記被験体は、過去６箇月の間、１４日間超にわたり免疫抑制剤の治療を受けていない、項目１７０に記載の方法。
［項目１９２］
上記被験体は、下記(i)および／または(ii)を満たしている、項目１７０に記載の方法：
(i)上記投与の前２８日以上にわたり、生ワクチンを接種していない；
(ii)上記投与の前１４日以上にわたり、不活性化ワクチンを接種していない。
［項目１９３］
被験体における免疫応答を促進する方法であって、
上記方法は、少なくとも第１組成物を被験体に投与する工程を含み、
上記第１組成物は、下記(i)～(v)のうち１つ以上を含んでいる、方法：
(i)項目１～７３のいずれか１項に記載の核酸（好ましくはｍＲＮＡ）；
(ii)項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
(iii)項目１６３に記載のポリペプチド；
(iv)項目１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
(v)項目１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
［項目１９４］
上記被験体は、過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがある、項目１９３に記載の方法。
［項目１９５］
上記被験体は、過去に少なくとも第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物によって処置されたことがある、項目１９３に記載の方法。
［項目１９６］
上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、ｍＲＮＡワクチンであった、項目１９５に記載の方法。
［項目１９７］
上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、ＢＮＴ１６２またはｍＲＮＡ－１２７３であった、項目１９６に記載の方法。
［項目１９８］
上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、タンパク質サブユニットワクチンであった、項目１９５に記載の方法。
［項目１９９］
上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、ＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３またはＣＯＶＡＸであった、項目１９８に記載の方法。
［項目２００］
上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、アデノウイルスベクターワクチンであった、項目１９５に記載の方法。
［項目２０１］
上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、ＡＤＺ１２２２またはＡｄ２６．ＣＯＶ－２．Ｓであった、項目２００に記載の方法。
［項目２０２］
上記被験体からは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体が検出可能である、項目１９３～２０１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２０３］
上記被験体からは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に結合する抗体が検出可能である、項目２０２に記載の方法。
［項目２０４］
上記被験体からは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体が検出可能である、項目２０２に記載の方法。
［項目２０５］
患者が上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物を投与されたのは、約３箇月以上前、約６箇月以上前、約９箇月以上前、約１年以上前、約１．５年以上前、約２年以上前または３年以上前である、項目１９５－２０１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２０６］
患者が上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物を投与されたのは、約３箇月前～２年前または約６箇月前～２年前である、項目１９５～２０１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２０７］
上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防される、項目１９３～２０６のいずれか１項に記載の方法。
［項目２０８］
上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
その期間は、上記投与から、約２週間～約１年間にわたる、
項目２０７に記載の方法。
［項目２０９］
上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
その期間は、上記投与から、約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間にわたる、
項目２０７に記載の方法。
［項目２１０］
上記方法により、処置した被験体のうち５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、下記(i)および／または(ii)を満たす、項目１９３～２０９のいずれか１項に記載の方法：
(i)上記被験体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が予防される；
(ii)上記被験体からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播が予防される。
［項目２１１］
処置した被験体のうち５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、下記(i)および／または(ii)を満たす、項目２１０に記載の方法：
(i)上記投与から約２週間～約１年間にわたり、上記被験体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が予防される；
(ii)上記投与から約２週間～約１年間にわたり、上記被験体からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播が予防される。
［項目２１２］
上記方法により、処置した被験体のうち５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、下記(i)および／または(ii)を満たす、項目２１１に記載の方法：
(i)上記被験体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が予防され、その期間は、上記投与から、約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間にわたる；
(ii)上記被験体からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播が予防され、その期間は、上記投与から、約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間にわたる。
［項目２１３］
少なくとも第２組成物を上記被験体に投与する工程をさらに含み、
上記第２組成物は、下記(i)～(v)のうち１つ以上を含んでいる、項目１９３～２１２のいずれか１項に記載の方法：
(i)項目１～６１のいずれか１項に記載の核酸（好ましくはｍＲＮＡ）；
(ii)項目７４～１２８のいずれか１項に記載の組成物；
(iii)項目１６３に記載のポリペプチド；
(iv)項目１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
(v)項目１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
［項目２１４］
上記第１組成物の後に上記第２組成物を投与し、
その期間は、約７日以上後である、
項目２１３に記載の方法。
［項目２１５］
上記第１組成物の後に上記第２組成物を投与し、
その期間は、約１０日以上、約１４日以上、約２１日以上、約２８日以上、約３５日以上、約４２日以上、約４９日以上または約５６日以上後である、
項目２１４に記載の方法。
［項目２１６］
上記第１組成物の後に上記第２組成物を投与し、
その期間は、約７日間～約５６日後である、
項目２１３に記載の方法。
［項目２１７］
上記第１組成物の後に上記第２組成物を投与し、
その期間は、約１４日間～約５６日後、約２１日間～約５６日後または約２８日間～約５６日後である、
項目２１６に記載の方法。
［項目２１８］
少なくとも第３組成物を上記被験体に投与する工程をさらに含み、
上記第３組成物は、下記(i)～(v)のうち１つ以上を含んでいる、項目１９３～２１２のいずれか１項に記載の方法：
(i)項目１～６１のいずれか１項に記載の核酸；
(ii)項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
(iii)項目１６３に記載のポリペプチド；
(iv)項目１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
(v)項目１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
［項目２１９］
上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防される、項目２１３～２１８のいずれか１項に記載の方法。
［項目２２０］
上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
その期間は、上記第２組成物またはそれ以降の組成物の投与から、約２週間～約１年間にわたる、
項目２１９に記載の方法。
［項目２２１］
上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
その期間は、上記第２組成物またはそれ以降の組成物の投与から、約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間にわたる、
項目２１９に記載の方法。
［項目２２２］
上記被験体における抗体、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を促進する方法としてさらに定義される、項目１９３～２２１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２２３］
上記被験体における中和抗体反応を促進する方法としてさらに定義される、項目１９３～２２１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２２４］
上記方法は、抗体反応を促進し、
上記抗体反応による、上記被験体におけるコロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約１０～約５００である、
項目１９３～２２１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２２５］
上記方法は、抗体反応を促進し、
上記抗体反応による、スパイクタンパク質に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約２００以下である、
項目２２４に記載の方法。
［項目２２６］
上記方法は、抗体反応を促進し、
上記抗体反応による、コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約１０～約３００、約２０～約３００、約２０～約２００または約３０～約１００である、
項目２２４に記載の方法。
［項目２２７］
上記方法は、抗体反応を促進し、
上記抗体反応による、コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約３０～約８０である、
項目２２６に記載の方法。
［項目２２８］
上記方法は、抗体反応を促進し、
上記抗体反応による、上記被験体におけるコロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約１～約５００である、
項目２２３に記載の方法。
［項目２２９］
上記方法は、抗体反応を促進し、
上記抗体反応による、スパイクタンパク質のＲＢＤに結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約５０以下である、
項目２２８に記載の方法。
［項目２３０］
上記方法は、抗体反応を促進し、
上記抗体反応による、スパイクタンパク質のＲＢＤに結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約１～約２００、約２～約１００、約３～約２００、約５～約１００または約５～約５０である、
項目２２８に記載の方法。
［項目２３１］
上記方法は、抗体反応を促進し、
上記抗体反応による、コロナウイルスのスパイクタンパク質のＲＢＤに結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約５～約２０である、
項目２３０に記載の方法。
［項目２３２］
上記被験体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に過去に感染したことがある、項目２２２に記載の方法。
［項目２３３］
上記被験体における防御性の免疫応答を促進する方法としてさらに定義される、項目２２２に記載の方法。
［項目２３４］
上記被験体は、ヒト被験体である、項目１９３～２３３のいずれか１項に記載の方法。
［項目２３５］
上記被験体の年齢は、６箇月～１００歳、６箇月～８０歳、１歳～８０歳、１歳～７０歳、２歳～８０歳または２歳～６０歳である、項目２３４に記載の方法。
［項目２３６］
上記被験体は、新生児または乳児であり、
上記被験体の年齢は、３歳以下、２歳以下、１．５歳以下、１歳以下（１２箇月以下）、９箇月以下、６箇月以下もしくは３箇月以下、または６箇月～２歳である、
項目２３４に記載の方法。
［項目２３７］
上記被験体は、高齢の被験体であり、
上記被験体の年齢は、５０歳以上、６０歳以上、６５歳以上または７０歳以上である、
項目２３４に記載の方法。
［項目２３８］
上記被験体は、高齢の被験体であり、
上記被験体の年齢は、６０歳以上である、
項目２３７に記載の方法。
［項目２３９］
上記被験体は、ネイティヴ・アメリカ系、アフリカ系、アジア系またはヨーロッパ系の遺伝的背景を有している、項目２３４～２３８のいずれか１項に記載の方法。
［項目２４０］
上記被験体は、ネイティヴ・アメリカ系、アフリカ系、アジア系またはヨーロッパ系の遺伝的背景を有しており、
その遺伝的背景は、約１０％以上、約２５％以上または約５０％以上である、
項目２３８に記載の方法。
［項目２４１］
上記被験体は、ネイティヴ・アメリカ系の遺伝的背景を有している、項目２３８に記載の方法。
［項目２４２］
上記被験体は、ネイティヴ・アメリカ系の遺伝的背景を有しており、
その遺伝的背景は、約１０％以上、約２５％以上または約５０％以上である、
項目２３８に記載の方法。
［項目２４３］
上記方法は、上記被験体におけるＴｈ２サイトカインの増加を実質的に誘導せず、
好ましくは、上記Ｔｈ２サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＴＮＦおよび／またはＩＬ－１βである、
項目１９３～２４２のいずれか１項に記載の方法。
［項目２４４］
上記被験体におけるＴｈ１指向性免疫応答を誘導する方法としてさらに定義される、項目１９３～２４２のいずれか１項に記載の方法。
［項目２４５］
上記被験体は、抗凝固療法を受けている、項目１９３～２４４のいずれか１項に記載の方法。
［項目２４６］
上記組成物を筋肉内注射により投与する、項目１９３～２４５のいずれか１項に記載の方法。
［項目２４７］
上記組成物は、コロナウイルスのスパイクタンパク質（Ｓ）をコードしているｍＲＮＡを含んでおり、
上記スパイクタンパク質（Ｓ）は、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有しているpre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）である、
項目１９３～２４６のいずれか１項に記載の方法。
［項目２４８］
上記ｍＲＮＡは、配列番号１６３に対して９５％以上同一であるコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、
項目２４７に記載の方法。
［項目２４９］
上記ｍＲＮＡは、配列番号１６３と同一であるコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、項目２４８に記載の方法。
［項目２５０］
上記ｍＲＮＡは、配列番号１４９に対して９５％以上同一であるコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、項目２４７に記載の方法。
［項目２５１］
上記ｍＲＮＡは、配列番号１４９と同一であるコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、項目２４８に記載の方法。
［項目２５２］
上記組成物の１回用量により、上記被験体を重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から防御するために充分な免疫応答が得られ、
その期間は、約６箇月間以上にわたる、
項目２５０または２５１に記載の方法。
［項目２５３］
上記組成物の１回用量により、上記被験体を重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から防御するために充分な免疫応答が得られ、
その期間は、約６箇月間から約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３年間、約４年間または約５年間にわたる、
項目２５２に記載の方法。
［項目２５４］
上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、ＬＮＰを形成している、項目２４７～２４９のいずれか１項に記載の方法。
［項目２５５］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)１つ以上の中性脂質；
(iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ；
(iv)１つ以上のＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
項目２５４に記載の方法。
［項目２５６］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
項目２５５に記載の方法。
［項目２５７］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、約４７．５：１０：４０．８：１．７である、
項目２５６に記載の方法。
［項目２５８］
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、４７．４：１０：４０．９：１．７である、
項目２５６に記載の方法。
［項目２５９］
ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、項目２５４～２５８のいずれか１項に記載の方法。
［項目２６０］
上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成しており、
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、約４７．５：１０：４０．８：１．７であり、
ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、
項目２４９に記載の方法。
［項目２６１］
上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成しており、
上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
(i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
(ii)ＤＳＰＣ；
(iii)コレステロール；
(iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
上記(i)～(iv)のモル比は、４７．４：１０：４０．９：１．７であり、
ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、
項目２４９に記載の方法。
［項目２６２］
上記被験体に投与される組成物は、ｍＲＮＡを約２μｇ～約５０μｇ含んでいる、項目２４７～２６１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２６３］
上記被験体に投与する組成物は、ｍＲＮＡを約１０μｇ～約５０μｇ含んでいる、項目２６２に記載の方法。
［項目２６４］
上記被験体に投与する組成物は、ｍＲＮＡを約１０μｇ～約３０μｇ含んでいる、項目２６３に記載の方法。
［項目２６５］
上記被験体に投与する組成物は、ｍＲＮＡを約１２μｇ含んでいる、項目２６４に記載の方法。
［項目２６６］
上記投与により、上記組成物を投与した被験体の１００％にセロコンバージョンが発生する、項目２６４または２６５に記載の方法。
［項目２６７］
上記ヒト被験体は、６１歳以上である、項目１９３～２６６のいずれか１項に記載の方法。
［項目２６８］
上記ヒト被験体は、１８～６０歳である、項目１９３～２６６のいずれか１項に記載の方法。
［項目２６９］
上記ヒト被験体は、過去にワクチンアレルギーを起こしたことがある、項目１９３～２６８のいずれか１項に記載の方法。
［項目２７０］
上記被験体からは、抗ＰＥＧ抗体が検出可能である、項目１９３～２６９のいずれか１項に記載の方法。
［項目２７１］
下記(i)～(iii)を含む、項目１９３～２７０のいずれか１項に記載の方法：
(i)項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物を得る工程であって、当該組成物は凍結乾燥組成物である工程；
(ii)上記凍結乾燥組成物を薬学的に許容可能な液体キャリア中で可溶化させて、液体組成物を調製する工程；
(iii)上記液体組成物の有効量を、上記被験体に投与する工程。
［項目２７２］
項目７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物を安定化させる方法であって、
上記組成物を凍結乾燥させて、安定化組成物を調製する工程を含む、
方法。
［項目２７３］
上記安定化組成物の含水率は、約１０％未満である、項目２７２に記載の方法。
［項目２７４］
上記安定化組成物の含水率は、約０．５％～５．０％である、項目２７３に記載の方法。
［項目２７５］
項目２７２～２７４のいずれか１項に記載の方法によって調製される、安定化凍結乾燥組成物。
〔リストおよび表の簡単な説明〕
・リストＡ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの単離株の例
・リストＢ：様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の単離株のGenBankアクセッション番号
・リスト１：本発明の好適なタンパク質設計の例
・表Ａ：非自発的に記録される局所的有害事象のグレード
・表Ｂ：非自発的に記録される全身性有害事象のグレード
・表１：好適なコロナウイルスコンストラクト（アミノ酸配列および核酸コーディング配列）
・表２：ヒトにおけるコドンの使用表および各アミノ酸の頻度
・表３ａ：コロナウイルスワクチンに好適な核酸（好ましくはｍＲＮＡ）コンストラクト
・表３ｂ：コロナウイルスワクチンに好適な核酸（好ましくはｍＲＮＡ）コンストラクト
・表４：様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ抗原設計（実施例で使用するもの）をコードしているＲＮＡコンストラクト
・表Ａ：実施例における脂質系キャリアの組成
・表５：実施例２ａで使用したｍＲＮＡコンストラクトの概要
・表６：実施例２ｂで使用したｍＲＮＡコンストラクトの概要
・表７：実施例２ｃで使用したｍＲＮＡコンストラクトの概要
・表８：ワクチン接種レジメン（実施例３）
・表９：ワクチン接種レジメン（実施例４）
・表１０：ワクチン接種レジメン（実施例５）
・表１１：ワクチン接種レジメン（実施例６）
・表１２：ワクチン接種レジメン（実施例７）
・表１３：ワクチン接種レジメン（実施例８）
・表１４：ワクチン接種レジメン（実施例９）
・表１５：図１２Ｆに記載の組織病理分析の一覧
・表１６：ワクチン接種レジメン（実施例１１）
・表１７：ワクチン接種レジメン（実施例１２
・表１８：分析の各エンドポイントにおける主要集団および補助集団
・表１９：２段階の群逐次デザイン。中間解析は５６症例および１１１症例。最終解析は１８５症例。
・表２０：ワクチン接種レジメン（実施例１４）
・表２１：ワクチン接種レジメン（実施例１５）
・表２２：ワクチン接種レジメン（実施例１６）
・表２３：ワクチン接種レジメン（実施例１７）
・表２４：ワクチン接種レジメン（実施例１８）
・表２５：新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の単離株／バリアントの一覧（実施例１９）
〔図面の簡単な説明〕
本明細書の末尾を参照。
〔実施例〕
本発明の種々の実施形態および態様を表す特定の実施例を、下記に示す。しかし、本明細書に記載の特定の実施形態によって、本発明の範囲を限定してはならないない。下記の調製例および実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施できるようにするために与えられる。しかし、本発明の範囲は、例示されている実施形態によって限定されない。例示されている実施形態は、本発明の一態様の例示としてのみ意図されており、機能的に同等である方法も本発明の範囲に含まれている。実際に、本明細書に記載されているもの以外の本発明の様々な変更は、上述の記載、添付の図面および下記の実施例に基づけば、当業者にとって容易に理解される。このような変更は全て、添付の特許請求の範囲に含まれている。
［実施例１］
［実施例１：ＤＮＡおよびＲＮＡコンストラクト、組成物ならびにワクチンの調製］
本実施例において示すのは、本発明のＲＮＡを得る方法と、本発明の組成物またはワクチンを調製する方法である。
（１．１．ＤＮＡおよびＲＮＡコンストラクトの調製）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の様々なＳタンパク質設計をコードしているＤＮＡ配列を作製し、in vitroにおけるＲＮＡ転写反応に使用した。安定化および発現最適化のために、Ｇ／Ｃ最適化または修飾コーディング配列（ｃｄｓ ｏｐｔ１など）を導入して、野生型ＤＮＡ配列またはレファレンスコーディングＤＮＡ配列を改変することにより、このＤＮＡ配列を作製した。ｐＵＣに由来するＤＮＡベクターに配列を導入して、安定化させた３’ＵＴＲ配列および５’ＵＴＲ配列と組合せた。さらに、アデノシン配列（Ａ６４またはＡ１００など）、任意構成であるヒストンステムループ構造（ｈＳＬ構造）、および任意構成である３０シトシン配列（Ｃ３０など）とも組み合わせた（表４を参照。コロナウイルス抗原設計の概要については、リスト１または表１を参照）。
得られたプラスミドＤＮＡコンストラクトを形質転換させ、本技術分野で周知の一般的なプロトコルを用いて細菌中で増殖させた。プラスミドＤＮＡコンストラクトを抽出し、精製してから、in vitroにおけるＲＮＡ転写に使用した（１．２節を参照）。
あるいは、ＤＮＡプラスミドを、ＰＣＲで増幅させるテンプレートとして使用してもよい（１．３節を参照）。
（１．２．プラスミドＤＮＡテンプレートのin vitroにおけるＲＮＡ転写）
１．１節の通りに調製したＤＮＡプラスミドを、制限酵素により酵素的に直鎖化し、ＤＮＡ依存的なin vitroにおけるＲＮＡ転写に用いた。ＲＮＡ転写には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた。ＲＮＡ転写は、ヌクレオチド混合物（ＡＴＰ／ＧＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ）およびキャップアナログの存在下にて、好適なバッファ条件でおこなった。キャップアナログの例としては、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ）、または３’ＯＭｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ）が挙げられる。得られたＲＮＡコンストラクトを、ＲＰ－ＨＰＬＣ（PureMessenger(R), CureVac AG, Tuebingen, Germany；ＷＯ２００８／０７７５９２）を用いて精製し、in vitro実験およびin vivo実験に使用した。ＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲをにより作製してもよい。このようなＰＣＲテンプレートは、本明細書で説明する通り、ＲＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ依存的なin vitroにおけるＲＮＡ転写にも使用できる。
ウラシルの代わりにシュードウリジン、Ｎ（１）－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）を含んでいる修飾ヌクレオチド混合物の存在下にてin vitroにおけるＲＮＡ転写を行い、化学修飾されたｍＲＮＡを得た。得られたｍ１Ψ化学修飾ＲＮＡを、ＲＰ－ＨＰＬＣ（
PureMessenger(R), CureVac AG, Tuebingen, Germany；ＷＯ２００８／０７７５９２）を使用して精製し、さらなる実験に使用した（例えば、実施例１６または１７参照）。
（酵素キャッピングによるキャッピングＲＮＡの作製（想定実施例））
キャップアナログの非存在下にて、いくつかのＲＮＡコンストラクトをin vitroにおいて転写する。次に、本技術分野で一般的に知られているキャッピング酵素を用いて、酵素的にキャップ構造（ｃａｐ０またはｃａｐ１）を追加する。要約すると、キャッピングキットを用いてin vitroにおいて転写されたＲＮＡをキャッピングし、ｃａｐ０－ＲＮＡを得る。ｃａｐ０－ＲＮＡをキャップ特異的２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを用いてさらに修飾し、ｃａｐ１－ＲＮＡを得る。ｃａｐ１－ＲＮＡを、上述した方法などで精製し、さらなる実験に使用する。
現行の製造管理・品質管理基準に準拠して（例えば、ＷＯ２０１６／１８０４３０に準拠して）、ＤＮＡレベルおよびＲＮＡレベルの様々な品質管理工程を施し、臨床開発用ＲＮＡを製造する。
（本実施例のＲＮＡコンストラクト）
作製したＲＮＡ配列／コンストラクトを、コードされている抗原タンパク質およびＵＴＲ要素と併せて、表４に示す。別途記載のない限り、表４のＲＮＡ配列／コンストラクトは、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧの存在下にて、in vitroにおけるＲＮＡ転写により作製した。したがって、ＲＮＡ配列／コンストラクトは、５’Ｃａｐ１構造を有している。別途記載のない限り、表４のＲＮＡ配列／コンストラクトは、化学修飾ヌクレオチド（シュードウリジン（Ψ）またはＮ（１）－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）など）の非存在下にて作製した。
（１．３．ＰＣＲで増幅させたＤＮＡテンプレートのin vitroにおけるＲＮＡ転写（想定実施例））
１．１節の通りに調製した、ＰＣＲで増幅させたＤＮＡテンプレートの精製物を、ＤＮＡ依存性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてin vitroにおいて転写する。転写は、好適なバッファ条件にて、ヌクレオチド混合物（ＡＴＰ／ＧＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ）と、キャップアナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧまたは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）との存在下で行う。あるいは、ＰＣＲで増幅させたＤＮＡを、ＤＮＡ依存性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてin vitroにおいて転写する。転写は、好適なバッファ条件にて、修飾ヌクレオチド混合物（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）またはシュードウリジン（Ψ））と、キャップアナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧまたはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ）との存在下で行う。いくつかのＲＮＡコンストラクトについては、キャップアナログの非存在下にてin vitroにおいて転写する。そして、本分野で一般的に知られているキャッピング酵素を用いて、キャップ構造（ｃａｐ０またはｃａｐ１）を酵素的に追加する。得られたＲＮＡを、上述した方法などにより精製し、さらなる実験に使用する。得られたｍＲＮＡを、例えばＲＰ－ＨＰＬＣ（PureMessenger(R), CureVac AG, Tuebingen, Germany；ＷＯ２００８／０７７５９２）をにより精製し、in vitro実験およびin vivo実験に使用する。
Figure 2023513502000019
Figure 2023513502000020
Figure 2023513502000021
Figure 2023513502000022
Figure 2023513502000023
Figure 2023513502000024
Figure 2023513502000025
（１．４．ｍＲＮＡを製剤化したＬＮＰ組成物の調製）
カチオン性脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質およびコレステロールを用いて、ＬＮＰを調製した。マイクロ流体混合装置を用いて、脂質溶液（エタノール中）と、ＲＮＡ溶液（緩衝水溶液）とを混合した。得られたＬＮＰを、透析を介して炭化水素バッファ中で再緩衝化した。超遠心チューブを使用して、標的濃度まで濃縮した。in vitroまたはin vivoにおける実験で使用するまで、ＬＮＰに製剤化されているｍＲＮＡを－８０℃で保存した。
好ましくは、ＷＯ２０１５／１９９９５２、ＷＯ２０１７／００４１４３およびＷＯ２０１７／０７５５３１に記載の一般的な手順に従って、脂質ナノ粒子を調製および試験した（これらの開示は全て、参照により本明細書に組込まれる）。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で製剤化したｍＲＮＡを、イオン化可能なアミノ脂質（カチオン性脂質）、リン脂質、コレステロールおよびＰＥＧ化脂質を用いて調製した。ＬＮＰは、次のように調製した。式ＩＩＩ－３に係るカチオン性脂質（ＡＬＣ－０３１５）、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質（ＡＬＣ－０１５９）を、約４７．５：１０：４０．８：１．７のモル比で、エタノール中で可溶化させた（表Ａ参照）。化合物ＩＩＩ－３を含んでいる脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、ｍＲＮＡの全脂質に対する比率が０．０３～０．０４ｗ／ｗとなるように調製した（ｍＲＮＡの配列は表４参照）。簡潔に述べると、ｍＲＮＡを１０～５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４）中で、０．０５～０．２ｍｇ／ｍＬに稀釈した。シリンジポンプを使用して、エタノール性脂質溶液とｍＲＮＡ水溶液とを、約１：５～１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率にて、１５ｍＬ／分超の合計流速で混合した。次に、エタノールを除去し、透析により外部バッファをＰＢＳに置換した。最後に、孔径：０．２μｍの滅菌フィルタで脂質ナノ粒子を濾過した。脂質ナノ粒子の粒子径は、６０～９０ｎｍであった。この値は、Malvern Zetasizer Nano（Malvern, UK）を用いた準弾性光散乱によって測定した。
Figure 2023513502000026
（１．５．プロタミン複合化ｍＲＮＡ組成物の調製（想定実施例））
in vivoにおける免疫化実験で使用する前に、ＲＮＡコンストラクトをプロタミンと複合化させてある。ＲＮＡ製剤は、５０％の遊離ＲＮＡと、５０％のプロタミンと複合化しているＲＮＡとの混合物からなる。プロタミンと複合化しているＲＮＡにおいて、ＲＮＡとプロタミントの重量比は、２：１である。まず、ｍＲＮＡにプロタミン－乳酸リンゲル溶液を加えて、ｍＲＮＡをプロタミンと複合化させる。１０分間インキュベートした後、安定な複合体が形成されたら、遊離ｍＲＮＡを加える。乳酸リンゲル溶液で最終濃度を調整する。
（１．６．設計したｍＲＮＡコンストラクトの発現分析）
表４に示すｍＲＮＡコンストラクトについて、発現を試験した。試験には、本技術分野で一般的に知られているように、Rabbit Reticulocyte Lysate Systemを用いたin vitroにおける翻訳とともに、細胞培養および引続くウェスタンブロットでの検出か、あるいはＦＡＣＳ分析を利用した（さらなる詳細および例示的な結果については、実施例２を参照）。
［実施例２ａ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質（Ｓ、Ｓ＿ｓｔａｂ、Ｓ１）をコードしているｍＲＮＡコンストラクトの発現分析］
ｍＲＮＡコンストラクトのin vitroにおけるタンパク質発現を測定するために、製造者のプロトコルに従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質または断片（Ｓ、Ｓ＿ｓｔａｂ、Ｓ１）をコードしているコンストラクトと、Promega Rabbit Reticulocyte Lysate Systemの成分とを混合した。溶解物には、タンパク質合成に必要な細胞成分が含まれている（ｔＲＮＡ、リボソーム、アミノ酸、開始因子、伸長因子および終結因子）。ポジティヴ・コントロールとして、Lysate System KitのルシフェラーゼＲＮＡを使用した。翻訳結果を、ＳＤＳ－Ｐａｇｅおよびウェスタンブロット分析（ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジン抗体（１：２０００））によって分析した。試験したＲＮＡコンストラクトを表５に要約する。
Figure 2023513502000027
（結果）
図１に示すように、使用したｍＲＮＡコンストラクトから、検出可能なタンパク質が発現した。このタンパク質は、ｍＲＮＡ系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの前提条件において予想される大きさであった（ＳまたはＳ＿ｓｔａｂ：１４０ｋＤａ、Ｓ１：７５ｋＤａ）。
［実施例２ｂ：ＨｅＬａ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質（Ｓ、Ｓ＿ｓｔａｂ、Ｓ１）の発現およびＦＡＣＳによる分析］
ｍＲＮＡコンストラクトのin vitroにおけるタンパク質発現を測定するために、ＨｅＬａ細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質（Ｓ、Ｓ＿ｓｔａｂ、Ｓ１）をコードしているｍＲＮＡで一時的にトランスフェクトした。次に、適当な抗スパイクタンパク質抗体（マウスにおいて生じた）を使用して染色し、ＦＩＴＣ結合二次抗体で対比染色した。トランスフェクションの２４時間前に、６ウェルプレート中の細胞培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ－グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に、４００，０００細胞／ウェルの密度で、ＨｅＬａ細胞を播種した。Lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して、製剤化していない２μｇのｍＲＮＡでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。実施例１に従って調製したｍＲＮＡコンストラクト（表６に記載）を、実験に使用した。ネガティヴ・コントロール（注射用水）も、実験に使用した。トランスフェクションの２４時間後、ＨｅＬａ細胞を、適当な抗スパイクタンパク質抗体（マウスにおいて生じた；１：２５０）および抗マウスＦＩＴＣ標識二次抗体（１：５００）で染色した。抗スパイクタンパク質抗体は、ＳＡＲＳのＳに対して生じ、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のＳに対して交差反応性であるＳに特異的な抗体である。次に、FACS Divaソフトウェアを使用するBD FACS Canto IIにより、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によってＨｅＬａ細胞を分析した。FlowJoソフトウェアパッケージ（Tree Star,Inc.）を用いて、蛍光ＦＩＴＣシグナルを定量分析した。
Figure 2023513502000028
（結果）
図２に示すように、使用したｍＲＮＡコンストラクトにより、完全長のＳ（ＳおよびＳ＿ｓｔａｂ）については、細胞表面における検出可能な発現が見られた。Ｓ１断片は膜貫通ドメインを欠いているので、その発現は細胞表面では検出できない（図２）。
［実施例２ｃ：ウェスタンブロットを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質（Ｓ、Ｓ＿ｓｔａｂ、Ｓ１）の発現分析］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳの発現を分析するために、トランスフェクション試薬としてLipofectamineを使用して、製剤化していないｍＲＮＡでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞を、３００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。Lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して、２μｇの製剤化していないｍＲＮＡでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。実施例１に従って調製したｍＲＮＡコンストラクト（表７に記載）を、実験に使用した。ネガティヴ・コントロール（注射用水）も、実験に使用した。トランスフェクションの２４時間後、ＨｅＬａ細胞を、トリプシンを含まない／ＥＤＴＡバッファによって分離させて回収し、細胞溶解物を調製した。細胞溶解物に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを施し、続いてウェスタンブロット検出を施した。ウェスタンブロット分析では、抗スパイクタンパク質抗体（ＳＡＲＳのＳに対する抗体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳに対して交差反応性）を、適当な二次抗体と組合せて使用した。
Figure 2023513502000029
（結果）
細胞溶解物においては、分析した全てのｍＲＮＡについて発現が検出できた（図３）。完全長Ｓの予想サイズは、１４０ｋＤａである。約９０ｋＤＡおよび１８０ｋＤａの２つの主要バンドは、未処理のＳタンパク質（Ｓ０）のグリコシル化形態と、切断されたＳ２サブユニットとを反映していると見られる。Ｓ１は７０ｋＤａであり、グリコシル化されていると見られる。
［実施例３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質設計抗原（Ｓ、Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡによるマウスへのワクチン接種］
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡコンストラクトを調製する（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化する。その後、in vivoにおけるワクチン接種実験に使用する。
（免疫化）
ｍＲＮＡワクチン組成物を、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に筋肉内注射（ｉ．ｍ．）する。用量は、表５に示す通りである。ネガティヴ・コントロールとして、１群のマウスをバッファでワクチン接種する。第０日および第２１日に全ての動物をワクチン接種する。第２１日（１回目の接種後）および第４２日（２回目の接種後）に血液サンプルを採取し、抗体価を決定する。
Figure 2023513502000030
（ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価の決定）
コーティング用にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳタンパク質（細胞外ドメイン）を用いて、ＥＬＩＳＡを行う。血清の稀釈液を用いて、コーティングしたプレートをインキュベートする。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳに対して特異的な抗体の結合を検出する。検出には、ビオチン化アイソタイプ特異的抗マウス抗体と、これに引続きAmplexを基質とするストレプトアビジン－ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いる。エンドポイントにおける抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）の力価を、ワクチン接種後の第２１日および第４２日において、ＥＬＩＳＡによって測定する。
（スパイクタンパク質に特異的な免疫応答の検出）
Lipofectamineを用いて、スパイクタンパク質をコードしているｍＲＮＡの２μｇを、Ｈｅｌａ細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションの２０時間後に細胞を回収し、１ウェルあたり１×１０５で９６ウェルプレートに播種する。ワクチン接種したマウスの血清サンプル（１：５０に稀釈）と共に、細胞をインキュベートする。次に、ＦＩＴＣ複合化抗マウスＩｇＧ抗体と共に、細胞をインキュベートする。DIVAソフトウェアを使用するBD FACS Canto IIにより細胞を捕捉し、FlowJoによって分析する。
（細胞内サイトカイン染色）
本技術分野で周知の標準的なプロトコルに従って、ワクチン接種したマウスから脾細胞を単離する。簡潔に述べると、細胞ストレーナーを通して単離した脾臓を粉砕し、ＰＢＳ／１％ＦＢＳで洗浄し、赤血球を溶解させる。ＰＢＳ／１％ＦＢＳでの充分な洗浄工程の後、脾細胞を９６ウェルプレートに播種する（１ウェルあたり２×１０６細胞）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に特異的なペプチドエピトープの混合物（各ペプチド：５μｇ／ｍＬ）を用いて、３７℃にて６時間、細胞を刺激する。この刺激は、２．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（BD Biosciences）およびタンパク質輸送阻害剤の存在下にて行う。刺激後、細胞を洗浄する。次に、Cytofix/Cytoperm試薬（BD Biosciences）を使用して、製造者の説明書に従って、細胞内サイトカインを染色する。染色には、次の抗体を使用する：Ｔｈｙ１．２－ＦＩＴＣ（１：２００）、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｈ７（１：１００）、ＴＮＦ－ＰＥ（１：１００）、ＩＦＮγ－ＡＰＣ（１：１００）（eBioscience）、ＣＤ４－ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｖ４５０（１：２００）（BD Biosciences）。また、１：１００に稀釈したＦｃγ阻害剤と共にインキュベートする。Aqua Dye（Invitrogen）を使用して、生細胞／死細胞を区別する。Canto IIフローサイトメーター（Beckton Dickinson）を用いて、細胞を捕捉する。FlowJoソフトウェアパッケージ（Tree Star,Inc.）を使用して、フローサイトメトリーのデータを分析する。
（ウイルス中和抗体価の決定）
血清を採取し、ＣＰＥ（細胞変性効果）またはシュードタイプ化粒子に基づくアッセイによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体価（ＶＮＴ）を決定する。
［実施例４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原Ｓ１をコードしているｍＲＮＡを用いたマウスへのワクチン接種］
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡコンストラクトを調製する（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化する。その後、in vivoにおけるワクチン接種実験に使用する。
（免疫化）
ｍＲＮＡワクチン組成物を、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に筋肉内注射（ｉ．ｍ．）する。用量は、表６に示す通りである。ネガティヴ・コントロールとして、１群のマウスをバッファでワクチン接種する。第０日および第２１日に全ての動物をワクチン接種する。第２１日（１回目の接種後）および第４２日（２回目の接種後）に血液サンプルを採取して、抗体価を決定する。
Figure 2023513502000031
ＥＬＩＳＡを介した特異的な免疫応答の誘導、ＩＣＳおよびＶＮＴを、上述の通りに決定する（実施例３を参照）。
［実施例５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原設計（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡを用いたマウスのワクチン接種］
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化した。
（免疫化）
ｍＲＮＡワクチン組成物を、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。用量は、表１０に示す通りである。ネガティヴ・コントロールとして、１群のマウスをバッファでワクチン接種した。第０日に全ての動物をワクチン接種した。第２１日に血液サンプルを採取して、抗体価を決定した。
Figure 2023513502000032
（ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価の決定）
コーティング用にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳタンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。血清の稀釈液を用いて、コーティングしたプレートをインキュベートした。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳに対して特異的な抗体の結合を検出した。検出には、ビオチン化アイソタイプ特異的抗マウス抗体と、これに引続きAmplexを基質とするストレプトアビジン－ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いた。エンドポイントにおける抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）の力価を、１回の初回ワクチン接種後の第２１日において、ＥＬＩＳＡによって測定した。
（結果）
図４に示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡによるワクチン接種により、１回のワクチン接種後（第２１日）において、Ｓに特異的に結合する抗体の高い抗体価が誘導された。アジュバントした組換えＳタンパク質と比較すると、ｍＲＮＡワクチンによって誘導される抗体価は、ＩｇＧ１では同等であり、ＩｇＧ２ａでは高かった。
［実施例６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原設計をコードしているｍＲＮＡによるマウスへのワクチン接種］
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化した。
（免疫化）
ｍＲＮＡワクチン組成物を、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。用量は、表１１に示す通りである。ネガティヴ・コントロールとして、１群のマウスをバッファでワクチン接種する。第０日および第２１日に全ての動物をワクチン接種した。第２１日（１回目の接種後）および第４２日（２回目の接種後）に血液サンプルを採取して、抗体価を決定した。
Figure 2023513502000033
（ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価の決定）
コーティング用にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳタンパク質（細胞外ドメイン）を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。血清の稀釈液を用いて、コーティングしたプレートをインキュベートした。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳに対して特異的な抗体の結合を検出した。検出には、ビオチン化アイソタイプ特異的抗マウス抗体と、これに引続きAmplexを基質とするストレプトアビジン－ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いた。エンドポイントにおける抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）の力価を、１回の初回ワクチン接種後の第２１日および第４２日において、ＥＬＩＳＡによって測定した。
（ウイルス中和抗体価の決定）
血清を採取して、ＣＰＥ（細胞変性効果）により検出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体価（ＶＮＴ）を決定した。熱不活性化させた血清（５６℃、３０分間）の稀釈系列を、２組試験した。稀釈系列の開始稀釈度は１：１０であり、その後、１：２で連続的に稀釈した。１００ＴＣＩＤ５０の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（2019-nCov/Italy-INMI1株）と共に、３７℃にて１時間、血清の稀釈系列をインキュベートした。全てのプレートには、細胞および培地のみを含んでいる細胞コントロール専用の列（８ウェル）と、細胞およびウイルスのみを含んでいるウイルスコントロール専用の列とを設けた。１００μＬのウイルス－血清混合物を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ATCC, Cat.1586）のコンフルエントな層と共にインキュベートし、３７℃にて３日間インキュベートし、ＣＰＥの形成を顕微鏡でスコアリングした。これにより、感染性ウイルスを定量した。試行ごとに逆滴定を行って、使用しているウイルス溶液のＴＣＩＤ５０の正確な範囲を検証した。Reed & Muenchに記載の方法に従って、ＶＮ力価を計算した。中和が観察されなかった場合には（ＭＮｔ：１０未満）、任意の値である５を報告した。分析は、VisMederi srl（Siena, Italy）で行った。
（細胞内サイトカイン染色）
本技術分野で周知の標準的なプロトコルに従って、ワクチン接種したマウスから脾細胞を単離した。簡潔に述べると、細胞ストレーナーを通して単離した脾臓を粉砕し、ＰＢＳ／１％ＦＢＳで洗浄し、赤血球を溶解させた。ＰＢＳ／１％ＦＢＳでの充分な洗浄工程の後、脾細胞を９６ウェルプレートに播種した（１ウェルあたり２×１０６細胞）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に特異的なペプチドエピトープの混合物（各ペプチド：５μｇ／ｍＬ）を用いて、３７℃にて６時間、細胞を刺激した。この刺激は、２．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（BD Biosciences）およびタンパク質輸送阻害剤の存在下にて行う。刺激後、細胞を洗浄した。次に、Cytofix/Cytoperm試薬（BD Biosciences）を使用して、製造者の説明書に従って、細胞内サイトカインを染色した。染色には、次の抗体を使用した：Ｔｈｙ１．２－ＦＩＴＣ（１：２００）、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｈ７（１：１００）、ＴＮＦ－ＰＥ（１：１００）、ＩＦＮγ－ＡＰＣ（１：１００）（eBioscience）、ＣＤ４－ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｖ４５０（１：２００）（BD Biosciences）。また、１：１００に稀釈したＦｃγ阻害剤と共にインキュベートした。Aqua Dye（Invitrogen）を使用して、生細胞／死細胞を区別した。Canto IIフローサイトメーター（Beckton Dickinson）を用いて、細胞を捕捉した。FlowJoソフトウェアパッケージ（Tree Star,Inc.）を使用して、フローサイトメトリーのデータを分析した。
（結果）
図５Ａおよび図５Ｂに示すように、完全長のＳタンパク質および完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡによるワクチン接種によって、１回のワクチン接種後（第２１日）において、Ｓに特異的に結合する抗体の高い抗体価が誘導された（図５Ａ：ＩｇＧ１、図５Ｂ：ＩｇＧ２ａ）。２回目のワクチン接種後（第４２日）には、抗体価が上昇した。全てのｍＲＮＡ設計により、概ね同等の抗体価が誘導された。中でも、Ｃ群のマウスは、他の群と比較すると、第２１日において誘導されたＩｇＧ２ａ抗体レベルが低かった。図５Ｃに示すように、完全長のＳタンパク質および完全長の安定化させたＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡによるワクチン接種により、２回のワクチン接種後において、強固なレベルのウイルス中和抗体が誘導された。
図６に示すように、完全長のＳタンパク質および完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡによるワクチン接種により、ＩＦＮγ／ＴＮＦ二重陽性であるＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が誘導された。
［実施例７：様々なワクチン接種計画後におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物のin vivoにおける免疫原性］
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化した。
（免疫化）
ｍＲＮＡワクチン組成物を、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。用量は、表１２に示す通りである。Ｉ群は、アラムアジュバントしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質（Ｓ細胞外ドメイン）でワクチン接種した。具体的には、１．５μｇのタンパク質および５．６μＬのＡｌヒドロゲルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で緩衝したものでワクチン接種した。ネガティヴ・コントロールとして、１群のマウスをバッファ（０．９％ＮａＣｌ）でワクチン接種した。
動物は、第０日、第７日、第１４日または第２１日に、１回目のワクチン接種を受けた。全ての動物は、第２８日に、２回目のワクチン接種を受けた。第２８日および第３５日に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳに結合する抗体の存在を分析した。第２８日、第３５日および第４９日に、ウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）の存在を分析した。実験の第４９日に、ワクチン接種後におけるＴ細胞応答の誘導を評価した。この実験設定を選択したのは、特異的免疫応答が開始される時点を決定するためである。また、１回目の免疫化から２回目の免疫化まで、どのワクチン接種間隔によればマウスにおける免疫応答を最も高くできるかを確認するためでもある。
Figure 2023513502000034
（ＲＮＡに誘導される先天免疫応答の特性評価）
ＬＮＰ中に製剤化されているＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡ（Ａ群に例示される）、ポジティヴ・コントロール、またはバッファを投与した。投与から１４時間後に、眼窩後部の出血から血液サンプルを採取した。血清サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＬ－１３）を、BD FACS CANTO IIを用いたサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）によって評価した。血清を１：４に稀釈し、BD Bioscience mouse cytokine flex setを製造者のプロトコルに従って使用して、血清サイトカインレベルを決定した。
下記のflex setを使用した。
・Mouse IFN-γ Flex Set RUO (A4) (BD Bioscience, Cat.558296)
・Mouse Il-13 Flex Set RUO (B8) (BD Bioscience, Cat.558349)
・Mouse IL-1β Flex Set RUO (E5) (BD Bioscience, Cat.560232)
・Mouse Il-4 Flex Set RUO (A7) (BD Bioscience, Cat.558298)
・Mouse Il-5 Flex Set RUO (A6) (BD Bioscience, Cat.558302)
・Mouse IL-6 Flex Set RUO (B4) (BD Bioscience, Cat.558301)
・Mouse TNF Flex Set RUO (C8) (BD Bioscience, Cat.558299)
製造者の指示に従ってVeriKine-HS Mouse IFN-α Serum ELISA Kit (pbl, Cat. 42115-1)を用いて、ＩＦＮ－αを定量した。血清を１：１００に稀釈し、５０μＬの稀釈物を試験した。
（ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価の決定）
コーティング用にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳタンパク質（細胞外ドメイン）を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。血清の稀釈液を用いて、コーティングしたプレートをインキュベートした。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳに対して特異的な抗体の結合を検出した。検出には、ビオチン化アイソタイプ特異的抗マウス抗体と、これに引続きAmplexを基質とするストレプトアビジン－ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いた。
（ウイルス中和抗体価の決定）
血清を採取し、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを用いて、ＣＰＥ（細胞変性効果）により検出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体価（ＶＮＴ）を決定した。マウス血清のウイルス中和抗体価を分析するために、熱不活性化させた血清（５６℃、３０分間）の稀釈系列を、２組試験した。稀釈系列の開始稀釈度は１：１０であり、その後、１：２で連続的に稀釈した。１００ＴＣＩＤ５０の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（2019-nCov/Italy-INMI1株）と共に、３７℃にて１時間、血清の稀釈系列をインキュベートした。全てのプレートには、細胞および培地のみを含んでいる細胞コントロール専用の行（８ウェル）と、細胞およびウイルスのみを含んでいるウイルスコントロール専用の行とを設けた。１００μＬのウイルス－血清混合物を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ATCC, Cat.1586）のコンフルエントな層と共にインキュベートし、３７℃にて３日間インキュベートし、ＣＰＥの形成を顕微鏡でスコアリングした。これにより、感染性ウイルスを定量した。試行ごとに逆滴定を行って、使用しているウイルス溶液のＴＣＩＤ５０の正確な範囲を検証した。Reed & Muenchに記載の方法に従って、ＶＮ力価を計算した。中和が観察されなかった場合には（ＭＮｔ：１０未満）、任意の値である５を報告した。分析は、VisMederi srl（Siena, Italy）で行った。
（細胞内サイトカイン染色）
脾細胞を単離し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクに特異的なペプチドライブラリーで２４時間刺激した。次に、細胞表面において分化抗原群８（ＣＤ８）Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞を、細胞内においてＩＮＦ－γおよびＴＮＦを染色した。これにより、ワクチン特異的ペプチドによって特異的に活性化された、多機能性Ｔ細胞の誘導を評価した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共にインキュベートした細胞を、ネガティヴ・コントロールとした。Canto IIフローサイトメーター（Beckton Dickinson）を用いて、細胞を捕捉した。FlowJoソフトウェアパッケージ（Tree Star,Inc.）を用いて、フローサイトメトリーのデータを分析した。
（結果）
図７に示すように、サイトカイン分析が実証したところによると、ＬＮＰ中に製剤化されているＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡ（ＣＶｎＣｏＶ）を注射することにより、バランスのよい免疫応答が誘導された。免疫応答は、ＩＦＮγまたはＩＬ４、ＩＬ－５およびＩＬ－１３に関して偏りを示さなかった。これらの因子は、それぞれ、ＴＨ１およびＴＨ２応答を示した。低レベルの炎症誘導性サイトカインであるＩＬ－６、ＩＦＮ－αは、血清中において低レベルで検出されたが、ＴＮＦおよびＩＬ－１βは検出されなかった。
図８Ａに示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡであるＲ９５１５によるワクチン接種により、１回目のワクチン接種時において、迅速な免疫応答の開始が誘導された。ワクチン組成物を筋肉内に１回投与すると、注射から７日後において、結合抗体を充分に誘導できた。
図８Ｂに示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡによるワクチン接種により、コーディング配列の最適化とは無関係に、同等の抗体価が誘導された。結合抗体のレベルは、ワクチン接種から血清サンプリングまでの間隔が長いほど上昇した（図８Ａおよび図８Ｂ）。２回目の免疫化により、注射から１週間後（第３５日）において、全体的な結合抗体価を上昇させられた。１回目の免疫化から２回目の免疫化までの間隔が長い群では、第３５日において、結合抗体価のレベルが高かった。アジュバントした組換えスパイクタンパク質ワクチンは、同等レベルの結合ＩｇＧ１抗体を誘導したが、ＩｇＧ２ａの力価は全てのｍＲＮＡ群よりも統計的に有意に低かった（Ｉ群）。
図９Ａおよび図９Ｂに示すように、１回目のワクチン接種から２８日後には、低いが検出可能なレベルのＶＮＴが存在した（Ｄ群およびＨ群）。試験の第３５日および第４９日に分析した全ての群において、２回目の免疫化後には、ＶＮＴレベルが増加していた。結合抗体の増加に即して、ＶＮＴは経時的に増加し、１回目と２回目のワクチン接種の間隔が長い群でも増加した。
図１０に示すように、ワクチン接種した動物においては、多機能性のＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が大幅に増加した。
多機能性Ｔ細胞が強力に誘導されたのに加えて、結合性抗体（さらに重要なことには機能性抗体）も強力に誘導された。このことが示唆しているのは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をコードしているｍＲＮＡワクチンによって、マウスにおける強力な免疫応答が誘導されることである。
ワクチンによって、バランスのとれたＴｈ１／ＴＨ２プロファイルが誘導された。このことは、ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ２ａ抗体の誘導が同等のレベルであったことと、サイトカインプロファイルにＴＨ２バイアスの徴候が見られなかったこと（すなわち、ＩＬ４、ＩＬ５およびＩＬ－１３が誘導されたこと）により、示されている。
［実施例８：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原をコードしているｍＲＮＡによるラットへのワクチン接種］
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡを、ＬＮＰで製剤化した。その後、in vivoにおけるワクチン接種実験に使用した。
（免疫化）
ｍＲＮＡワクチン組成物を、ラットに筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。用量は、表１３に示す通りである。ネガティヴ・コントロールとして、１群のラットをバッファでワクチン接種した（Ａ群）。第０日および第２１日に、全ての動物をワクチン接種した。第２１日（１回目の接種後）および第４２日（２回目の接種後）に血液サンプルを採取して、抗体価を決定した。
Figure 2023513502000035
（ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価の決定）
コーティング用にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳタンパク質（細胞外ドメイン）を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。血清の稀釈液を用いて、コーティングしたプレートをインキュベートした。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳに対して特異的な抗体の結合を検出した。マウスにおけるＥＬＩＳＡで用いた二次ＨＲＰ抗体を使用せずに、標識化ＨＲＰ抗体を用いて直接検出した。ラットにおけるＥＬＩＳＡでは、シグナルを増幅させていないので、抗体価がより出る可能性がある。そのため、現在のところ、ラットにおける研究とマウスにおける研究との間で、ＥＬＩＳＡによる抗体価は比較できない。
（ウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）の決定）
ラットの血清サンプルのウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）を、実施例６においてマウス血清について上述した通りに分析した。
（結果）
図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、ＬＮＰ中に製剤化されている完全長の安定化させたＳタンパク質のｍＲＮＡでワクチン接種することにより、ラットにおける結合抗体価レベルは、用量依存的に上昇した。結合抗体価レベルの上昇は、第２１日に見られ、０．５μｇ、２μｇおよび１０μｇの用量において確認され、４０μｇおよび８０μｇの用量でワクチン接種された群においては飽和に達した。図１１Ｄおよび図１１Ｅは、１回目のワクチン接種後の第４２日における、結合抗体価レベルを示す。２回目のワクチン接種により、抗体価はさらに上昇した。
図１１Ｆおよび１１Ｇに示すように、ＬＮＰ中に製剤化されている完全長の安定化させたＳタンパク質のｍＲＮＡでワクチン接種することにより、ラットにおけるＶＮＴレベルは、用量依存的に上昇した。
［実施例９：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるハムスターの攻撃研究］
ＬＮＰ中に製剤化されているＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡ（ＣＶｎＣｏＶ）による防護の有効性を、シリアンハムスターにおいて検討した。このモデルは、軽度から中等度のヒト肺疾患病理を表しており、ヒト関連の免疫原性および病因の検討用として認められ、受け容れられているモデルの一つである（Munoz-Fontela et al, PMID 32967005）。ハムスターは野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染に対して感受性である。感染すると、高レベルでウイルスが複製され、ウイルスの標的器官に組織病理的変質が生じる。
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡを、ＬＮＰで製剤化した。その後、in vivoにおけるワクチン接種実験に使用した。
（免疫化および攻撃）
シリアンゴールデンハムスター（１群あたりｎ＝５、１１～１３週齢）に、ｍＲＮＡワクチン組成物を筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。用量は、表１４に示す通りである（例えば、Ｅ群およびＦ群を参照）。ネガティヴ・コントロールとして、１群のハムスターを処置せず、（バッファで）模擬感染させた（Ａ群）。また、他の群には、バッファコントロールとしてＮａＣｌを注射した。ポジティヴ・コントロールとして、第０日において、０．１用量あたり１０２ＴＣＩＤ５０（１ｍＬ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、Ｃ群に鼻腔内感染させた。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、BetaCoV/Munich/BavPat1/2020から単離されたもので、Ｄ６１４Ｇ置換を有している。さらなるポジティヴ・コントロールとして、５μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えスパイクタンパク質をＤ群に筋肉内注射した。スパイクタンパク質は、Ｓ１およびＳ２細胞外ドメインならびにＨｉｓタグを有しており（Sino Biological, Cat. 40589-V08B1）、Ａｌヒドロゲル（Brenntag）２％でアジュバントして投与した。第２８日（１回目の接種後）ならびに第４２日および第５６日（２回目の接種後）において、血液サンプルを採取して、抗体価を決定した。第５６日に、１用量あたり１０２ＴＣＩＤ５０（合計投与体積：０．１ｍＬ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により、鼻腔内から動物を攻撃した。攻撃後（ｐ．ｃ．）４日間にわたり動物を追跡し、実験の第６０日に安楽死させた。
Figure 2023513502000036
（抗体分析）
第２８日、第４２日および第５６日に血液サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡによって全ＩｇＧ抗体を決定した。１μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳタンパク質（細胞外ドメイン）により、３７℃にて４～５時間、プレートをコーティングした。プレートを、１０％ミルク中で一晩ブロッキングし、洗浄し、室温にて２時間血清と共にインキュベートした。検出のために、ビオチンヤギ抗ハムスター（シリアン）ＩｇＧ抗体（BioLegend, Cat: 405601）と共に、ハムスター血清をインキュベートした。次に、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（BD, Cat: 554066）と共に、ハムスター血清をインキュベートした。BioTek SynergyHTXプレートリーダーにおいて、特異的シグナルを検出した。検出条件は、励起光：５３０／２５、発光検出：５９０／３５および感度：４５であった。ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＧ抗体価の分析は、感染した動物（Ｃ群）に対しては行わなかった。
ハムスター血清サンプルのウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）を、熱不活性化（５６℃、３０分間）させたサンプルにおいて分析した。３系列の稀釈系列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（Ｄ６１４Ｇ変異を有している）と共に、３７℃にて１時間インキュベートした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの濃度は、１０２ＴＣＩＤ５０／ウェルとした。稀釈系列の開始稀釈度は１：１０であり、２倍稀釈系列とした。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞の単層培養物を含んでいる９６ウェルプレートにウイルス－血清混合物を移し、３７℃にて５日間インキュベートした。次に、プレートを、バイタリティマーカーＷＳＴ８を使用してスコア付けした。（１００％エンドポイントにおける）ＶＮ力価を、Reed & Muenchに記載の方法に従って計算した。
（気道におけるウイルス負荷）
攻撃後の咽頭スワブ、肺および鼻甲介組織に含まれている、検出可能なレベルの複製可能なウイルスを分析した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞の単層培養物を含んでいる９６ウェルプレートに４組の１０倍稀釈系列を移し、３７℃にて１時間インキュベートした。細胞単層を洗浄した後、３７℃にて５日間インキュベートした。次に、バイタリティマーカーＷＳＴ８を使用してプレートをスコア付けした。ウイルス力価（Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬまたは／ｇ）を、Spearman-Karberの方法により算出した。
（ハムスターにおける攻撃の組織病理学）
攻撃後４日目に採取した組織サンプルについて、組織病理分析を行った。１０％ホルマリンで切片を固定した後、パラフィンに包埋した。組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、組織検査を行った。組織病理評価スコアは、下記の通りである。
・肺胞隔炎の重篤度、気管支炎／細気管支炎の重篤度：０＝炎症細胞がない。１＝炎症細胞がほとんどない。２＝炎症細胞数が中程度にある。３＝炎症細胞が多数ある。
・肺胞隔炎の程度：０＝０％。１＝２５％未満。２＝２５～５０％。３＝５０％超。
・肺胞浮腫の有無、肺胞出血の有無、ＩＩ型肺胞上皮細胞過形成の有無：０＝なし。１＝あり。
・気管支周囲／血管周囲の肥厚の程度：０＝なし。１＝１～２細胞の厚み。２＝３～１０細胞の厚み。３＝１０細胞超の厚み。
（結果）
図１２Ａに示すように、ＣＶｎＣｏＶで２回のワクチン接種（２μｇまたは１０μｇの用量を４週間間隔で接種）したハムスターは、１回目のワクチン接種後において、Ｓに結合するＩｇＧ抗体を用量依存的に賛成した。Ｓに結合するＩｇＧ抗体は、２回目のワクチン接種後には増加した。１０μｇのＣＶｎＣｏＶでワクチン接種した動物において、エンドポイントの抗体価の中央値は、１回目接種後に１．６×１０５であり、第４２日において７．８×１０５のピークに達した。ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＧ抗体価の分析は、感染した動物（Ｃ群）に対しては行わなかった。
図１２Ｂに示すように、検出可能なレベルのＶＮＴが、１回目のワクチン接種後の第２８日に存在した。両方の用量群（Ｅ群とＦ群）において、２回目の免疫化後にＶＮＴレベルが上昇した。この分析は、研究の第４２日および第５６日に行った。このアッセイに用いたウイルスはＤ６１４Ｄ変異を有していたが、ＣＶｎＣｏＶによりコードされているＳ＿ｓｔａｂはこの変異を有していなかった。注目すべきことに、アラムアジュバントしたＳＥＣＤタンパク質を接種したコントロール群では、ＩｇＧ抗体が産生されたが、検出可能なレベルのＶＮＴは誘導されなかった。
２回目のワクチン接種から４週間後である第５６日に、Ｄ６１４Ｇ変異を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で全ての動物を攻撃した（１用量あたり１０２ＴＣＩＤ５０）。バッファコントロール動物において、第５６日から終了日である第６０日まで毎日採取した咽頭スワブからの複製可能なウイルスのレベルは、攻撃の２日後にピークのウイルス力価を示し（約１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、第６０日にはほぼ検出不可能なレベルに戻った。過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した動物は、実験期間を通じて陰性のままであった。ＣＶｎＣｏＶワクチン接種群のいずれの群も、咽頭スワブにおけるウイルスレベルが有意に低下した。１０μｇのＣＶｎＣｏＶによるワクチン接種により、ウイルスのピークは有意に減少し、延期された（攻撃の３日後に１０１．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのピーク）。この群の５匹の動物のうちの２匹以上は、試験期間を通して陰性のままであった（図１２Ｃを参照）。
鼻甲介におけるウイルスレベルは、それほど顕著ではないが、用量依存的にウイルス複製が減少することが分かった（図１２Ｄ）。重要なことに、１０μｇのＣＶｎＣｏＶでワクチン接種した動物は、肺において検出可能なウイルスレベルを示さなかった。このことは、ＣＶｎＣｏＶにより、下気道におけるウイルス複製から動物を防護できることを示している（図１２Ｅ）。
組織病理分析が実証したところによると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したバッファコントロール群では、肺胞損傷と、肺胞、気管支および気管の炎症とが発生していた。肺におけるウイルス複製からの防護と整合するように、１０μｇのＣＶｎＣｏＶで２回ワクチン接種することにより、組織病理的変質は有意に減少した。重要なことに、２μｇの用量では、結合抗体は誘導されるものの、ＶＮＴは低レベルにしか誘導されず、組織病理学スコアも増加しなかった。肺ホモジネートにおける差次的遺伝子発現の群間比較によると、バッファまたは模擬感染群と比較したときに、ｍＲＮＡ群におけるＩＬ－４またはＩＬ－５の誘導に有意な変化はなかった（データ省略）。それゆえ、本発明者らの結論としては、ブレークスルーウイルス複製が起こる条件下であったとしても、ＣＶｎＣｏＶは、ハムスターにおける疾患増悪（抗体依存性増強によるものなど）を誘導しない。提示されたデータが示すところによると、アラムアジュバントしたタンパク質ワクチンによるワクチン接種により、ハムスターにおいて、検出可能なレベルのＶＮＴは誘導されないが高レベルの結合抗体が誘導され、組織病理学スコアが増加する（図１２Ｆ、表１４）。
Figure 2023513502000037
強力な免疫応答と整合して、ＣＶｎＣｏＶは、ＳにＤ６１４Ｇ変異があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの攻撃からハムスターを防護した。このことは、ＣＶｎＣｏＶにより、最も広汎な形態のウイルスから防護できることを示している。これらの実験により示されたところによると、１０μｇのＣＶｎＣｏＶで２回ワクチン接種することにより、上気道におけるウイルス複製レベルが有意に減少し、動物の肺における検出可能な生ウイルスは存在しない。
［実施例１０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡワクチン組成物の臨床開発］
ｍＲＮＡワクチン組成物の安全性および免疫原性を実証するために、臨床試験（第１相、２ａ相）を開始した。第１相臨床試験では、ボランティアのヒトコホート（１８～６０歳）に対して、２回以上筋肉内注射した。例えば、第１日および第２９日おいて、本発明に係るＬＮＰ中に製剤化されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をコードしているｍＲＮＡを注射した（ｍＲＮＡはＲ９５１５（配列番号１６３）；製剤はＣＶｎＣｏＶ（実施例１．４に記載の通り））。注射するｍＲＮＡの用量は、２μｇ、４μｇ、８μｇ、１２μｇ、１６μｇまたは２０μｇであった。本発明に係るワクチン組成物の安全性プロファイルを評価するために、投与後の被験者をモニタリングした（バイタルサイン、ワクチン接種部位および全身の反応原性評価、血液分析）。ワクチン接種した被験者の血清において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、ウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴ細胞を測定することにより、免疫化の免疫原性を分析する。血液サンプルの採取は、第１日（ベースライン）、各回のワクチン接種後および長期追跡期間中に行う。
Figure 2023513502000038
第８日、第１５日、第２９日、第３６日、第４３日、第５７日、第１２０日、第２１１日および第３９３日において、下記を決定した。
（ａ）ＥＬＩＳＡで測定する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の抗体に対してセロコンバージョンが生じた被験者の割合。
試験前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない被験者または試験期間中であって利用可能なサンプルを採取する前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない被験者において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対する抗体価がベースラインよりも上昇することを、セロコンバージョンと定義する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ抗原に対するＥＬＩＳＡで測定する。
ベースラインにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して血清陽性であった被験者においては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対する抗体価がベースラインの２倍に上昇することを、セロコンバージョンと定義する。
（ｂ）ＥＬＩＳＡで測定する、個々人の血清中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に特異的な抗体のレベル。
（ｃ）ＥＬＩＳＡで測定する、血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対する抗体価の幾何平均（ＧＭＴ）。
試験前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない被験者または試験期間中であって利用可能なサンプルを採取する前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない被験者を対象とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ抗原に対するＥＬＩＳＡによって測定する。
（ｄ）活性アッセイで測定する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体に対してセロコンバージョンが生じた被験者の割合。
試験前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない被験者または試験期間中であって利用可能なサンプルを採取する前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない被験者において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体価がベースラインよりも上昇することを、セロコンバージョンと定義する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ抗原に対するＥＬＩＳＡで測定する。
ベースラインにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して血清陽性であった被験者においては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体価がベースラインの２倍に上昇することを、セロコンバージョンと定義する。
（ｅ）個々人の血清におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体レベル。
（ｆ）活性アッセイで測定する、血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体価のＧＭＴ。
試験前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない被験者または試験期間中であって利用可能なサンプルを採取する前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない被験者を対象とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ抗原に対するＥＬＩＳＡによって測定する。
（細胞性免疫応答）
第２９日、第３６日および第２１１日に、指定した施設の全被験者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において、以下を決定した。
（ａ）抗原刺激後における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクに特異的なＴ細胞応答の頻度および機能性。
（ｂ）細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を行い、Ｔｈ１応答およびＴｈ２マーカーの産生を検討する。
（ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクに特異的なＴ細胞応答について、検出可能な増加を示した被験者の割合。
（先天免疫応答）
第２日、第８日、第２９日、第３０日および第３６日において、全ての非盲検センチネル被験者について、下記を決定した。
（ａ）血清サイトカイン濃度。インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ＩＦＮ－γ、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）およびＩＦＮ－γ誘導タンパク質１０（ＩＰ１０）を含むが、これらには限定されない。
（ｂ）遺伝子発現のプロファイリング。
（感染の評価）
（ａ）逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により臨床的に測定される、ウイルス学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を示した被験者数は、試験期間を通じた各時点で決定した。
（ｂ）事前に規定していた時点における遡及的な血清学的検査により測定する、無症候性のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を示した被験者数を決定した。
（ウイルス中和）
細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づくマイクロ中和アッセイにより、誘導された抗体の中和活性を決定した。アッセイにより、ウイルス感染用量２５（ＭＮ ２５ ＴＣＩＤ５０／ウェル）による５０％ＣＰＥを確認した。アッセイには、野生型ウイルス株（SARS-CoV-2 2019 nCOV ITALY/INMI1）をＶＥＲＯ Ｅ６細胞株に感染させて用いた。アッセイは、９６ウェルプレートのフォーマットで行った。ヒト血清を１：２で稀釈して、稀釈系列を作製した。マイクロ中和抗体価とは、５０％以上の細胞がＣＰＥから防護されたサンプルのうち、最も稀釈度が高いサンプルの稀釈度の逆数である。２組の実験の幾何平均として報告した。
（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡアッセイにより抗体価を測定した。標的抗原としては、スパイクの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のいずれかを使用した。コーティングに使用する抗原組換えタンパク質は、真核細胞中で発現させた。ヒト血清を１：２で稀釈して、稀釈系列を作製した。抗体価とは、カットポイント超であるサンプルのうち、最も稀釈度が高いサンプルの稀釈度の逆数である。カットポイントは、ブランクプラスマトリクス効果と定義する。抗体価は、２組の実験の幾何平均として報告する。
（Ｔ細胞応答）
本臨床試験の探索的エンドポイントとして、細胞性免疫応答を評価した。この評価は、抗原刺激後におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクに特異的なＣＤ４＋Ｔｈ１および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の頻度および機能性を評価することにより行った。さらに、ワクチン接種後においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクに特異的なＴ細胞応答が検出可能な増加を示した被験者の割合を決定した。
フローサイトメトリーに基づく細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により、機能性Ｔ細胞応答を決定し、ex vivoで定量した。細胞内サイトカイン染色では、Ｔ細胞活性化マーカーおよびエフェクターサイトカイン（ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α）を染色した。染色は、範囲が重複しているスパイクペプチドプールにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクに特異的なＣＤ４＋Ｔｈ１および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激した後に行った。
（結果）
図１３Ａは、様々な用量コホートにおける、１回目の投与後および２回目の投与後の全身性有害事象を示す。
図１３Ｂは、様々な用量コホートにおける、１回目の投与後および２回目の投与後の局所性有害事象を示す。
図１３Ｃは、特定の全身性有害事象を示す（疲労、頭痛、筋肉痛、悪寒、関節痛、発熱、悪心、下痢など）。
図１３Ｄは、特定の局所性有害事象を示す（疼痛、掻痒、腫脹、発赤など）。
要約すると、ＣｖｎＣｏＶワクチンの安全性は良好であり、反応原性は許容できる程度であった。
図１３Ｅに示すように、第１日、第２９日、第３６日、第４３日および第５７日において、様々な用量コホートでスパイクタンパク質に特異的なＩｇＧ抗体が増加した。ワクチン接種した全被験者において、スパイクに特異的な抗体が良好に誘導された。１２μｇコホートの抗体レベルは、セロコンバージョン患者（ＨＣＳ）の抗体レベルと同じであった。図１３Ｅの表に、ワクチン接種した被験者のセロコンバージョン率を示す。ほとんどの場合、ワクチン接種した被験者の９０％超は、第４３日において、スパイクタンパク質に特異的な抗体がベースラインよりも２倍超増加していた。全ての用量群において、ワクチン接種した被験者の７０％以上は、スパイクタンパク質に特異的な抗体がベースラインよりも４倍超増加していた。１２μｇ群において、被験者の９０％超は、抗体が４倍超増加していた。
図１３Ｆに示すように、第１日、第３６日および第４３日において、様々な用量コホートでＲＢＤに特異的なＩｇＧ抗体が増加した。ワクチン接種した全被験者において、ＲＢＤに特異な抗体が良好に誘導された。１２μｇコホートの抗体レベルは、セロコンバージョン患者（ＨＣＳ）の抗体レベルと同じであった。図１３Ｆの表に、ワクチン接種した被験者のセロコンバージョン率を示す。ほとんどの場合、ワクチン接種した被験者の８０％超は、第４３日において、ＲＢＤに特異的な抗体がベースラインよりも２倍超増加していた。８μｇ群および１２μｇ群において、被験者の８０％超は、抗体が４倍超増加していた。
図１３Ｇに示すように、ウイルス中和抗体が増加した。全ての用量群において、ウイルス中和抗体価が良好に上昇した。上昇幅が最も大きい１２μｇの用量では、セロコンバージョン患者（ＨＣＳ）における中和抗体レベルと同じであった。図１３Ｇの表に、ワクチン接種した被験者のセロコンバージョン率を示す。全ての用量群において、ワクチン接種した被験者の７０％以上は、第４３日において、ウイルス中和抗体がベースラインよりも２倍超増加していた。８μｇおよび１２μｇの用量群において、ワクチン接種した被験者の７０％以上は、ウイルス中和抗体がベースラインよりも４倍超増加していた。１２μｇ群において、被験者の１００％は、ウイルス中和抗体が４倍超増加していた。
図１３Ｈに、スパイクタンパク質またはＲＢＤに結合する抗体のレベルの、中和抗体のレベルに対する比率を示す。重要なことに、ＣＶｎＣｏＶによって誘導される比率は、回復期の被験者とほぼ同じである。このことが意味しているのは、ＣＶｎＣｏＶによって誘導される抗体レベルが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和するのに充分であることである。
図１３Ｉに示すように、１回目の投与後（第２９日）および２回目の投与後（第３６日）において、スパイクタンパク質Ｓ１に対するＣＤ４＋Ｔ細胞が増加した。いずれの用量群（４μｇおよび８μｇ）でも、スパイクタンパク質Ｓ１に対するＣＤ４＋Ｔ細胞が良好に誘導された。
図１３Ｊに示すように、１回目の投与後（第２９日）および２回目の投与後（第３６日）において、スパイクタンパク質Ｓ２に対するＣＤ４＋Ｔ細胞が増加した。いずれの用量群（４μｇおよび８μｇ）でも、スパイクタンパク質Ｓに対するＣＤ４＋Ｔ細胞が良好に誘導され、回復期患者と同等であった。
図１３Ｋの上側に示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が血清陽性であった被験者に２μｇ（左）または４μｇ（右）のＣｖｎＣｏＶをワクチン接種すると、ウイルスの中和抗体価が上昇した。注目すべきことに、ウイルス中和抗体が既に産生されている血清陽性患者では、いずれの用量群でも、ウイルス中和抗体をさらに増加させることができた。
図１３Ｋの下側に示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が血清陽性であった被験者に２μｇ（左）または４μｇ（右）のＣｖｎＣｏＶをワクチン接種すると、ＲＢＤに特異的な抗体が増加した。注目すべきことに、ＲＢＤに特異的な抗体が既に産生されている血清陽性患者では、いずれの用量群でも、ＲＢＤに特異な抗体をさらに増加させることができた。
［実施例１１：ＬＮＰ中に製剤化されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原Ｓ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡによるマウスへのワクチン接種］
本実施例において示すのは、３’末端の代替形態（Ａ６４－Ｎ５－Ｃ３０－ｈＳＬ－Ｎ５またはｈＳＬ－Ａ１００）およびＵＴＲの組合せ（ｉ－３（－／ｍｕａｇ）またはａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３））を有しているｍＲＮＡを含んでいるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡワクチンが、マウスにおいて、強力な液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導することである。ｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しておりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡは、より強力な免疫応答を誘導した。このことは、結合抗体、中和抗体およびＣＤ８＋Ｔ細胞がより強力に誘導されることによって実証された。
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化した。
（免疫化）
表１６に記載の用量のｍＲＮＡワクチン組成物を、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢、ｎ＝８）に筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。ネガティヴ・コントロールとして、１群のマウスを、バッファでワクチン接種した。第０日および第２１日に全ての動物をワクチン接種した。第２１日（１回目の接種後）および第４２日（２回目の接種後）に血液サンプルを採取して、抗体価を決定した。第４２日に脾細胞を単離して、Ｔ細胞分析を行った。
Figure 2023513502000039
実施例６に記載の通りに、ＥＬＩＳＡを用いてＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価を決定した。同じく実施例６に記載の通りに、ＣＰＥ（細胞変性効果）によりウイルス中和抗体価を決定した。同じく実施例６に記載の通りに、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によりＴ細胞分析を行った。
（結果）
図１４Ａに示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡによるワクチン接種により、１回のワクチン接種後（第２１日）において、Ｓに特異的に結合する抗体（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）の抗体価が誘導された。２回目のワクチン接種後（第４２日）において、抗体価は上昇した。ｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡを含んでいるワクチン組成物を投与した群（Ｃ群）では、結合抗体が大きく増加した。このことは、エンドポイントにおけるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗体価により示される。
いずれのｍＲＮＡ設計においても、２回目のワクチン接種後（第４２日）には、概ね同等のウイルス中和抗体価が誘導された。Ｂ群のマウスと比較すると、Ｃ群のマウスでは、１回目のワクチン接種後である第２１日において既に、ＶＮＴレベルの急速な上昇が見られた（図１４Ｂに示す）。
図１４Ｃに示すように、３’末端の代替形態（Ａ６４－Ｎ５－Ｃ３０－ｈＳＬ－Ｎ５またはｈＳＬ－Ａ１００）およびＵＴＲの組合せ（ｉ－３（－／ｍｕａｇ）またはａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３））の両方を有しており、完全長の安定化させたＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡによるワクチン接種によって、２回のワクチン接種後において、抗原特異的でありＩＦＮγ／ＴＮＦ二重陽性であるＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルが大きく増加した。ｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しておりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡを含んでいるワクチン組成物を投与した群（Ｃ群）では、ＩＦＮγ／ＴＮＦが二重陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞が驚くほど大幅に増加した。
［実施例１２：ＬＮＰ中に製剤化されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原Ｓ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡによるラットへのワクチン接種］
本実施例において示すのは、本発明の３’末端の代替形態（ｈＳＬ－Ａ１００）およびＵＴＲの組合せ（ａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３））を有しているｍＲＮＡを含んでいるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡワクチンにより、ラットにおいて、強力な液性免疫応答が誘導されることである。
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化した。その後、in vivoにおけるワクチン接種実験に使用した。
（免疫化）
ｍＲＮＡワクチン組成物を、ラットに筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。用量は、表１７に示す通りである。ネガティヴ・コントロールとして、１群のラットをバッファでワクチン接種した（Ａ群）。第０日および第２１日に全ての動物をワクチン接種した。第２１日（１回目の接種後）および第４２日（２回目の接種後）に血液サンプルを採取して、抗体価を決定した。
Figure 2023513502000040
（ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価の決定）
コーティング用にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳタンパク質（受容体結合ドメインＳのＲＢＤ）を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。血清の稀釈液を用いて、コーティングしたプレートをインキュベートした。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳに対して特異的な抗体の結合を検出した。マウスにおけるＥＬＩＳＡで用いた二次ＨＲＰ抗体を使用せずに、標識化ＨＲＰ抗体を用いて直接検出した。ラットにおけるＥＬＩＳＡでは、シグナルを増幅させていないので、抗体価が低く出る可能性がある。そのため、現在のところ、ラットにおける研究とマウスにおける研究との間で、ＥＬＩＳＡによる抗体価は比較できない。
（ウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）の決定）
ラットの血清サンプルのウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）を、実施例６においてマウス血清について上述した通りに分析した。
（結果）
図１５Ａに示すように、代替非コーディング領域として３’末端ｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しており、ＬＮＰ中に製剤化されている、完全長の安定化させたＳタンパク質のｍＲＮＡでワクチン接種することにより、ラットにおける結合抗体価レベルは、強力かつ用量依存的に上昇した。結合抗体価レベルの上昇は、１回目のワクチン接種後の第２１日および２回目のワクチン接種後の第４２日に見られ、０．５μｇ、２μｇおよび８μｇの用量において確認された。２回目のワクチン接種により、抗体価はさらに上昇した。
図１５Ｂに示すように、本発明の代替非コーディング領域として３’末端ｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しており、ＬＮＰ中に製剤化されている、完全長の安定化させたＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡでワクチン接種することにより、ラットにおけるＶＮＴは、用量依存的かつ非常に高レベルに上昇した。非コーディング領域として３’末端Ａ６４－Ｎ５－Ｃ３０－ｈＳＬ－Ｎ５およびＵＴＲの組合せｉ－３（－／ｍｕａｇ）を有しているｍＲＮＡと比較すると、ＥＬＩＳＡ（結合抗体ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）およびＶＮＴにより示される液性免疫応答は、顕著に増加した（比較として、実施例８および図１１Ａ～Ｆを参照）。
［実施例１３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（ＣＶｎＣｏＶワクチン）の臨床開発］
１ ヒトワクチン接種の試験試験実施計画書
２ 概要
本試験は、１８歳以上の成人を対象とし、第２ｂ相／３相の有効性および安全性に関する主要な試験として設計されている。本試験では、ランダム化観察者盲検化プラセボ対照化設計を採用する。全世界の複数の施設で被験者を登録し、１：１の比率でランダム化し、２回投与スケジュールを受けさせる。一方の群は、ＣＶｎＣｏＶを１２μｇ（ｍＲＮＡ）の用量レベルで投与する。他方の群は、対照としてプラセボ（通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ））を投与する。
３ 延長
第３９３日のＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験終了後、被験者は、試験の１年間の延長期間に引続き参加する。ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験の同意時に、被験者は、１年間の延長期間に参加することに同意する。延長試験では、長期安全性（重篤な有害事象（重篤な有害事象））、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の持続性、およびＣＯＶＩＤ－１９症例の発生を評価する追加データを収集し、ワクチンの有効性（ＶＥ）の持続期間を評価する。
４ 試験目的、エンドポイントおよびエスティマンド
４．１ 目的
４．１．１ 主要目的
有効性の主要目的
・ウイルス学的に確認されたあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の予防における、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性を実証すること。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染の被験者を対象とする。
・ウイルス学的に確認された中等症から重症のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の予防における、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性を実証すること。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染の被験者を対象とする。
安全性の主要目的
・１８歳以上の被験者にＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールを施したときの安全性を評価すること。
４．１．２ 副次的目的
枢要な有効性の副次的目的
・ウイルス学的に確認された重症のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の予防における、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性を実証すること。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染の被験者を対象とする。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による無症候性感染の予防または軽減における、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性を実証すること。血清陰性の被験者を対象とする（ウイルスのＮタンパク質に対するセロコンバージョンによって決定する）。
その他の有効性の副次的目的
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染の被験者において、下記を評価すること。
・ウイルス学的に確認されたあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の予防における、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性。６１歳以上の被験者を対象とする。
・ウイルス学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の１回目の罹患の予防における、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性。症状の有無は問わない。
・ＣＯＶＩＤ－１９による疾患負荷（ＢｏＤ）の軽減における、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性。
・ウイルス学的に確認されたあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の予防における、ＣＶｎＣｏＶの１回目の投与後における有効性。
免疫原性の副次的目的
・ＣＶｎＣｏＶを１回および２回投与した後における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対する抗体反応を評価すること。第２ｂ相試験に参加する被験者のサブセットを対象とする。
・ＣＶｎＣｏＶを１回および２回投与した後における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和抗体反応を評価すること。第２ｂ相試験に参加する被験者のサブセットを対象とする。
安全性の副次的目的
・２回投与スケジュールにおいて、第２ｂ相試験に参加する１８歳以上の被験者投与したＣＶｎＣｏＶの反応原性および忍容性を評価すること。
４．１．３ 探索的目的
有効性の探索的目的
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染の被験者において、下記を検討すること。
・プラセボを投与された被験者と比較して、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールを受けた被験者は、ＣＯＶＩＤ－１９の症状の重篤度が軽度であるか否か。
・プラセボを投与された被験者と比較して、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールを受けた被験者は、ＣＯＶＩＤ－１９に起因する酸素供給の必要性が低下するか否か。
・プラセボを投与された被験者と比較して、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールを受けた被験者は、ＣＯＶＩＤ－１９に起因する人工換気の必要性が低下するか否か。
・プラセボを投与された被験者と比較して、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールを受けた被験者は、ＣＯＶＩＤ－１９に起因する入院が減少するか否か。
・プラセボを投与された被験者と比較して、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールを受けた被験者は、ＣＯＶＩＤ－１９による死亡率が低下するか否か。
・プラセボを投与された被験者と比較して、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールを受けた被験者は、全原因死亡率が低下するか否か。
・ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールによる細胞性免疫反応（ＣＭＩ反応）を検討すること。選択した施設において、最大で４００人までの被験者を対象とする。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染および既感染の被験者において、下記を検討すること。
・ウイルス学的に確認されたあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の予防における、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性。全被験者を対象とする。ベースラインにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の血清学的状態は問わない。
・ウイルス学的に確認されたあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の予防における、ＣＶｎＣｏＶの１回目の投与後における有効性。全被験者を対象とする。ベースラインにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の血清学的状態を問わない。
試験期間中にウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９への１回目の罹患が認められた被験者において、以下を検討すること。
・プラセボを投与された被験者と比較した、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールを受けた被験者における、ＣＯＶＩＤ－１９への２回目の罹患の発生。
４．２ エンドポイント
４．２．１ 主要エンドポイント
有効性の主要エンドポイント
・ウイルス学的に確認された（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応陽性（ＲＴ－ＰＣＲ陽性））、あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の発生。
・有効性の主要解析の症例定義を満たす、ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）、中等症から重症のＣＯＶＩＤ－１９への１回目の罹患の発生（本明細書で定義する中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患）
安全性の主要エンドポイント
・２回目の試験ワクチン接種後６箇月間に収集された、医学的に認められた有害事象の発生、程度および関連性。全被験者を対象とする。
・２回目の試験ワクチン接種後１年間に収集された、重篤な有害事象および特に関心のある有害事象の発生、程度および関連性。全被験者を対象とする。
・２回目の試験ワクチン接種から１年間における、致死的な重篤な有害事象の発生。全被験者を対象とする。
４．２．２ 副次的エンドポイント
枢要な有効性の副次的エンドポイント
・有効性の主要解析の症例定義を満たす、ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）重症のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の発生（本明細書で定義する重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患）。
・２回目の試験ワクチン接種後１５日間以上における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対するセロコンバージョンの発生。無症候性血清陰性の被験者を対象とする。
セロコンバージョンとは、試験の第２１１日および／または第３９３日において、被験者の血清中においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対する抗体が検出可能であることと定義する。ただし、被験者は、第１日（ベースライン）および第４３日（２回目のワクチン接種から１５日前の２回目の検査時点）に血清陰性である。
その他の有効性の副次的エンドポイント
・有効性の主要解析の症例定義を満たす、ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の発生。６１歳以上の被験者を対象とする。
・ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の発生。症候の有無を問わない。
被験者に症状が認められた場合、２回目の試験ワクチン接種から１５日以上経過してから症状の発生が認められねばならない。被験者に症候が認められない場合、２回目の試験ワクチン接種から１５日以上経過してからＲＴ－ＰＣＲ陽性検査を行わねばならない。
・ＢｏＤスコア。有効性の主要解析の症例定義を満たす、ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患に基づき計算する。
○ＢｏＤ＃１：疾患なし（感染なしまたは無症候性感染）＝０、軽症または中等症＝１、重度＝２
○ＢｏＤ＃２：疾患なし（感染なしまたは無症候性感染）＝０、入院を伴わない疾患＝１、入院を伴う疾患＝２、死亡＝３
・ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の発生。１回目の試験ワクチン接種後の任意の時点で症状が発生した症例を対象とする。
免疫原性の副次的エンドポイント（第２ｂ相免疫原性サブセット）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対する抗体反応
第１日、第２９日、第４３日、第５７日、第１２０日、第２１１日および第３９３日
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対する血清抗体。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対するセロコンバージョンの発生。
セロコンバージョンとは、被験者の血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対する抗体が検出可能であることと定義する。ただし、被験者は、ベースラインにおいて血清陰性であった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和抗体反応
第１日、第２９日、第４３日、第５７日、第１２０日、第２１１日および第３９３日
・ウイルス中和抗体アッセイにより測定した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する血清ウイルス中和抗体。
・ウイルス中和抗体アッセイにより測定した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するセロコンバージョンの発生。
セロコンバージョンとは、被験者の血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和抗体が検出可能であることと定義する。ただし、被験者は、ベースラインにおいて血清陰性であった。
安全性の副次的エンドポイント
・各回の試験ワクチン接種後７日以内における、非自発的に記録される局所性有害事象の発生、程度および持続期間。第２ｂ相試験の被験者を対象とする。
・各回の試験ワクチン接種後７日以内における、非自発的に記録される全身性有害事象の発生、程度および持続期間。第２ｂ相試験の被験者を対象とする。
・各回の試験ワクチン接種後２８日以内における、自発的に記録される有害事象の発生、程度および関連。第２ｂ相試験の被験者を対象とする。
・２回目の試験ワクチン接種後１年間における、ワクチン中止または試験中止に至った有害事象の発生。全被験者を対象とする。
４．２．３ 探索的エンドポイント
有効性の探索的なエンドポイント
・有効性の主要解析の症例定義を満たす、ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）ＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の重篤度評価。
２回目の試験ワクチン接種（完全ＶＥ）から１５日以上以降の時点、および１回目の試験ワクチン接種後の任意の時点で発生した場合、下記のエンドポイントを解析する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染の被験者における：
・ＣＯＶＩＤ－１９疾患による酸素供給の発生。
・ＣＯＶＩＤ－１９疾患による人工換気の発生。
・ＣＯＶＩＤ－１９疾患による入院の発生。
・ＣＯＶＩＤ－１９疾患による死亡の発生。
・何らかの原因による死亡の発生。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染および既感染の被験者における：
・ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の発生。全被験者を対象とする。ベースラインの血清学的状態を問わない。
有効性の主要解析の症例定義を満たす、ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患が認められた被験者において、下記のエンドポイントを解析する。
・ウイルス学的に確認された（ＲＴ－ＰＣＲ陽性）あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例の２回目の罹患の発生。
探索的免疫原性評価（第２ｂ相免疫原性サブセット）
第１日、第２９日、第４３日、第１２０日**および第２１１日**に、選択した施設の最大で４００までの被験者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、下記を評価する。
・Ｔｈ１応答およびＴｈ２マーカーの発現を調べるための細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）による、抗原刺激後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのＲＢＤに特異的なＴ細胞応答の頻度および機能。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのＲＢＤに特異的なＴ細胞応答が検出可能に増加した被験者の割合。
**第１２０日および第２１１日に採取したサンプルの検査は、第２９日および／または第４３日においてＴ細胞応答者に分類された被験者に対してのみ実施する。
４．３ エスティマンド
Figure 2023513502000041
Figure 2023513502000042
Figure 2023513502000043
Figure 2023513502000044
Figure 2023513502000045
５ 試験設計
５．１ 全体設計
ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験は、最初の第２ｂ相試験と、それに引き続く大規模な第３相有効性試験への移行との、二部構成で実施する。第２ｂ相および第３相はいずれも、ランダム化観察者盲検化プラセボ対照化試験として実施する。１８歳以上の被験者は、全世界の複数の施設で登録され、２回投与スケジュールを受ける。被験者のうち一群には、ＣＶｎＣｏＶを１２μｇ（ｍＲＮＡ）の用量レベルで投与する。被験者の他の群には、プラセボ（通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）））を投与する。両群の比率は、１：１である。試験の第２ｂ相部分および第３相部分は、いずれも、設計が一貫している（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９症例の確認および症例定義について）。そのため、第２ｂ相で生じたＣＯＶＩＤ－１９症例を第３相で生じた症例とともにプールして、ＶＥの主要解析を実施できる。被験者は、本試験の第２ｂ相部分および第３相部分の１年間の延長期間にも参加する。
第２ｂ相の設計および目的
第２ｂ相の目的は、第３相を開始する前に、ＣＶｎＣｏＶの安全性、反応原性および免疫原性をさらに特徴付けることである。
ＣＶｎＣｏＶの用量レベルは、第３相試験で選択される１２μｇである。この用量については、最初の第１相および第２ａ相試験における安全性および免疫原性のデータから情報が得られている。第２ｂ相は、１８～６０歳および６１歳以上の２種類の年齢層で実施する（これは、第３相試験対象集団について想定されている年齢範囲でもある）。
約４，０００人の被験者が登録され、１：１の比率にランダム化される。一方の群は、ＣＶｎＣｏＶを１２μｇ（ｍＲＮＡ）の用量レベルで２回投与される。他方の群は、プラセボを２回投与される。投与間隔は、２８日間である。登録された４，０００人の被験者のうち、約８００～１，０００人（２０～２５％）は、６１歳以上である。第２ｂ相は、観察者盲検化方式で実施する。これにより、安全性評価における潜在的な偏りを低減する。４，０００人という被験者のサンプルサイズは、第３相に入る前のＣＶｎＣｏＶの安全性、反応原性および免疫原性を特徴付ける、頑健で詳細なデータセットを生成することに基づいている。さらに、第２ｂ相で生成されたデータは、ＣＶｎＣｏＶの早期条件付き承認を支持するために提出される主要なデータセットである。
第２ｂ相では、ＣＶｎＣｏＶの２回接種スケジュールの安全性および反応原性を、次の有害事象の頻度および重篤度を測定することにより詳細に評価する：各回のワクチン接種後７日間における局所性および全身性の非自発的に記録される有害事象、各回のワクチン接種後２８日間における自発的に記録される有害事象、２回目の試験ワクチン接種後６箇月間における医学的に認められた有害事象、２回目の試験ワクチン接種後１年間における特に関心のある有害事象および重篤な有害事象。ＣＶｎＣｏＶの免疫原性は、被験者のサブセットにおいて、１回目および２回目の接種後に評価する（２種類の年齢層のそれぞれに最初に登録された６００人の被験者；免疫原性サブセットの被験者は合計１，２００人）。免疫原性の評価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体およびウイルス中和抗体を測定することによる。抗体の持続性は、本試験および延長試験において評価する。
第２ｂ相の被験者に生じたＣＯＶＩＤ－１９症例を収集し、第３相で生じた症例とともにプールして、全症例数を有効性の主要解析に用いる。さらに、ＤＳＭＢは、ＶＤＥの徴候についてＣＯＶＩＤ－１９症例を定期的に監視する。
第２ｂ相に参加した被験者については、試験期間中の無症候性のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の有無も評価する。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対する抗体の発現（セロコンバージョン）により決定する。これらのデータを第３相のデータと合わせて、ＣＶｎＣｏＶのワクチン接種により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による無症候性感染の予防または発症率の低下ができるかを判定する（枢要な有効性の副次的目的の一つ）。
第２ｂ相への２種類のターゲット年齢群の被験者登録の開始は、柔軟である。第１相試験および第２ａ相試験のデータの時期によっては、第２ｂ相試験への２種類の年齢群の登録をずらすことがある。最初は１８～６０歳の被験者から登録を開始し、その後６１歳以上の被験者の登録を開始する。後期第２ｂ相試験の被験者数の２０～２５％が高齢者群であることから、この段階的な登録開始が、第２ｂ相試験コホートの全体の登録に影響を及ぼすとは予想されない。
第２ｂ相データの早期の安全性検討は、ＤＳＭＢによって実施する（９．３．９．１節を参照）。安全性検討は、第２ｂ相に約１，０００人の被験者が登録され（２５％の被験者が登録。ＣＶｎＣｏＶの接種者：５００人、プラセボの接種者：５００人）、１回目の試験ワクチン接種後１週間以上にわたり安全性の追跡調査を行った時点で実施する。安全性プロファイルが許容可能と判断され、安全性または忍容性に問題がない場合には、第２ｂ相から中断することなく、第３相への被験者の登録を開始することが想定されている。ＤＳＭＢによる他の安全性審査は、約１，０００人の第２ｂ相被験者が２回目の試験ワクチン接種を受け、１週間以上にわたり安全性の追跡調査を行った時点で実施する。第２ｂ相被験者から得られた利用可能な１回目の投与時の安全性データについても、この時点で全て検討する。
第３相の設計および目的
第２ｂ／３相複合試験の主要目的は、あらゆる重篤度または中等症以上のＣＯＶＩＤ－１９症例の予防における、ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性を実証することである。第２ｂ相と同様に、第３相は、ランダム化観察者盲検化プラセボ対照化試験として実施する。第３相試験においては、１８歳以上の約３２，５００人の被験者が、全世界の複数の施設に登録され、２回投与スケジュールを受ける。被験者のうち一群には、ＣＶｎＣｏＶを１２μｇ（ｍＲＮＡ）の用量レベルで投与する。被験者の他の群には、プラセボ（通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）））を投与する。両群の比率は、１：１である（図２を参照）。第２ｂ相と同様に、第３相試験対象集団のうちの約２０～２５％を、６１歳以上の被験者とする（６，５００～８，１２５人）。第２ｂ相臨床試験および第３相臨床試験を合計した試験への全登録者数は、３６，５００人である。
被験者は、ＣＯＶＩＤ－１９の積極的サーベイランスを受ける。全ての施設訪問および電話連絡において、ＣＯＶＩＤ－１９と臨床的に一致する何らかの症状を伴う急性疾患を被験者が患っている場合、施設に連絡するように注意喚起される。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有することに対して「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した者は、追跡調査面接および評価のために、試験スタッフに連絡する。被験者がＣＯＶＩＤ－１９疾患の疑いがある場合、施設訪問または家庭訪問時に採取したサンプルによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の検査を受ける。被験者がＣＯＶＩＤ－１９であることが確認された場合、全被験者について、疾患が消失するまで追跡調査を行う。被験者が入院した場合、試験責任者および入院終了時に入手した退院サマリによって、被験者の経過の記録を続けねばならない。ＣＯＶＩＤ－１９への罹患の臨床症状および徴候、持続期間および重篤度、ならびに治療および転帰に関する情報は、試験スタッフが文書化し、電子症例報告書（ｅＣＲＦ）に記録する。ＣＯＶＩＤ－１９の解消後は、ＣＯＶＩＤ－１９を提示していない被験者と同様に、試験終了まで被験者を追跡し続ける。以前に疾患を患っている被験者における２回目のＣＯＶＩＤ－１９への罹患は、有効性の主要症例として数えない。ただし、ワクチン接種した被験者におけるＣＯＶＩＤ－１９の再発を評価する探索的目的のために数える。
パンデミックの状況下ではＣＯＶＩＤ－１９症例の発現率が不確実である。そのため、本試験は、あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９エンドポイントに基づく、症例主導試験として実施する。このエンドポイントには、２回の中間解析および最終解析が含まれる。これらはいずれも、各解析のための所定の症例数を達成することにより可能となる。上述したように、第２ｂ相で生じたＣＯＶＩＤ－１９症例は、第３相の症例とともにプールして、ＶＥの主要解析を行う。このように、第２ｂ相に参加する被験者は、ＶＥの主要解析のための総サンプルサイズに含まれている（Ｎ＝３６，５００）。
有効性の主要解析のためには、症例は下記の基準を満たしていなければならない（ここでは、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患を定義する）。
・ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例でなければならない。ウイルス学的に確認されるとは、臨床的に症候性のＣＯＶＩＤ－１９を患っている被験者において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＲＴ－ＰＣＲ検査が陽性となることであると定義する（９．２節を参照）。
・症状の発症は、２回目のワクチン接種後１５日間以上経過してからでなければならない。
・被験者は、登録時においてウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９の既往歴（除外基準１に基づく）がないか、または２回目の試験ワクチン接種後１５日間以内にウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例を発症していてはいけない。
・被験者は、試験開始時および第４３日にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染（Ｎタンパク質に対して血清陰性）が実証されていなければならない。
主要有効性症例は、裁定委員会によって確認されねばならない。
本試験では、ウイルス学的に確認されたあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例の主要エンドポイントについて、群逐次設計を利用した、高い有効性または高い無益性に関する２回の中間解析を行う。中間解析では、O'Brien and Fleming error spending functionを用いる。両側αが２．５％であり、最終解析における有効性の主要症例定義を満たすあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例が合計１８５例であり、試験の全体的な検出力が９０％であるとき、ＶＥが６０％であるならば、ＶＥが３０％超であることが実証される。これは、ＶＥの９７．５％信頼区間の下限値のマージンが３０％であることに基づく。主要症例定義を満たす５６／１１１症例（最終症例数の３０％／６０％）が集積した時点で、有効性または無益性の高さについて２回の中間解析を実施する。これらの点は２つの基準に基づいて選択された。一つは、高い有効性または無益性の決定を支持するための５６／１１１症例のロバスト性である。もう一つは、有効性が高い場合、試験期間を短縮し、より早期にワクチン利用できる可能性がある点である。
ウイルス学的に確認された中等症から重症のＣＯＶＩＤ－１９症例の主要エンドポイントに関して、両側αが２．５％であり、最終解析における有効性の主要症例定義を満たす中等症から重症のＣＯＶＩＤ－１９症例が合計６０症例であり、試験の全体的な検出力が９０％であるなとき、ＶＥが７０％であるならば、ＶＥは２０％超である。これは、ＶＥの９７．５％信頼区間の下限値のマージンが２０％であることに基づく。ＣＯＶＩＤ－１９症例の１／３が中等症から重症であると仮定すると、ＣＯＶＩＤ－１９症例が合計１８０症例である場合、６０の中等症から重症の症例が得られる。この主要エンドポイントについては、中間解析は行わない。
対照被験者におけるＣＯＶＩＤ－１９の発現率が１箇月あたり０．１５％（１．５例／１０００／１箇月）であり、ＶＥが６０％であり、試験における評価不能率が２０％（ベースラインにおいて血清陽性の登録者（既感染被験者）約５％を含む）であると仮定する。この場合、３箇月間にわたって登録された３６，５００人（ワクチン群は１８，２５０人）の被験者の追跡調査により、１回目のワクチン接種から約９箇月後において、あらゆる重篤度の１８５症例のＣＯＶＩＤ－１９症例が集積されることになる。
登録完了時またはその近傍において、ＤＳＭＢは、症例の発現率の盲検解除審査を実施する。実際の症例発生率が予想よりも低い場合、ＤＳＭＢは、サンプルサイズの増加を推奨することがある。必要に応じて、ＤＳＭＢは、試験の後期に他の盲検解除審査を実施し、サンプルサイズをさらにが調整することがある。試験におけるイベントは、後述のタイムラインに示す（１年間の延長試験については、下記で考察する）。
評価可能な被験者の追跡期間が両群で等しい場合、全１８５症例のうち６０症例以下がＣＶｎＣｏＶ群であれば、最終解析時に有効性が実証される（推定ＶＥ：５２．０％以上）。主要症例定義を満たす５６／１１１症例が集積した時点（試験開始から約５／６．５箇月後）において、高い有効性または無益性について、２回の中間解析を実施する。評価可能な被験者の追跡期間が両群等しい場合、５６／１１１症例のうち７／２９症例以下がＣＶｎＣｏＶ群であれば、早期に高い有効性が実証される（中間解析における推定ＶＥ：８５．７％／６４．６％以上）。逆に、２６／４１症例以上がＣＶｎＣｏＶ群であれば、無益性が結論づけられる（中間解析における推定ＶＥ：１３．３％／４１．４％以下）。中間解析の評価は、ＤＳＭＢが実施する。中間解析の結果は、試験チームまたは試験依頼者を盲検解除せずに報告する。
第２ｂ相と同様に、第３相に参加した被験者は、試験期間中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を評価する。これは、血清陰性の被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対する抗体の発現により決定する。
第３相の安全性目的は、ＣＶｎＣｏＶの安全性を実証する大規模安全性データベースを生成することである。第２ｂ相試験部分および第３相試験部分に参加した全被験者は、２回目のワクチン接種後６箇月間にわたって収集された医学的に認められた有害事象と、２回目のワクチン接種後１年間にわたって収集された特に関心のある有害事象および重篤な有害事象を有している。
中間解析時または最終解析時のいずれかにおけるＣＶｎＣｏＶの有効性の実証とは独立に、ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験は、試験終了時まで継続し、観察者の盲検化を維持する。試験終了時は、最後の被験者が第３９３日の最終訪問を終了した時点である（５．４節を参照）。この期間中、プラセボ対照化安全性データの収集およびＣＯＶＩＤ－１９症例の集積を継続する。
延長試験
第３９３日の試験終了後、被験者は、ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験の１年間（１２箇月間）の延長試験に引続き参加する。延長試験においては、施設レベルでの盲検性を維持し、安全性（重篤な有害事象）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の持続性、およびＣＯＶＩＤ－１９症例の発生に関するプラセボ対照化データを収集する。これにより、有効性の持続期間を評価する。ＣＶｎＣｏＶの承認が得られた時点で、延長試験を終了させることがある。この時点で、対照被験者に対しては、可及的速やかなＣＶｎＣｏＶのワクチン接種を提案することがある。有効なワクチンを各所に配備した時点で、延長研究を終了させることもある。延長試験を終了させる前には、ＤＳＭＢおよび試験責任者ならびに関連する規制当局と協議する。
５．２ 試験設計の科学的根拠
ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験は、最初の第２ｂ相試験と、引続く大規模な第３相有効性試験への移行との二部構成で実施する。試験の第２相部分および第３相部分はいずれも設計が一貫している。そのため、第２ｂ相で生じたＣＯＶＩＤ－１９症例を第３相で生じた症例とともにプールして、ＶＥの主要解析を実施できる。パンデミックの状況下では、第２相および第３相におけるＣＯＶＩＤ－１９症例を組合せて、有効性の転帰を迅速に得ることが正当化されると考えられる。
第２ｂ相および第３相は、ランダム化、観察者盲検化およびプラセボ対照化で行う。試験されているＣＶｎＣｏＶワクチンおよびプラセボには外観および提示の違いがあるため、試験は観察者盲検化方式で実施する必要がある。これは、試験の盲検化おいてに一般的に採用され、充分に受け入れられている方法である。ランダム化、観察者盲検化およびプラセボ対照化設計により、試験の安全性および有効性の転帰におけるバイアスリスクが減少する（７．３節をも参照）。
高齢者はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に最も影響を受け、重症疾患および死亡のリスクが高い。そのため、この集団におけるＣＶｎＣｏＶを検討することは、極めて重要である。このような理由から、６１歳以上の被験者を含める。
第２ｂ相における被験者のサンプルサイズは、４，０００人である。この値は、第３相に入る前のＣＶｎＣｏＶの安全性、反応原性および免疫原性を特徴付ける、頑健で詳細なデータセットを生成することに基づいている。さらに、第２ｂ相で生成されたデータは、ＣＶｎＣｏＶの早期条件付き承認を支持するために提出される主要なデータセットである。
第２ｂ相／第３相複合試験の被験者の合計サンプルサイズは、３６，５００人である。この値は、ＶＥが６０％であるときに、ＶＥが３０％超であることが実証されることに基づいている（これは、ＶＥの９７．５％信頼区間の下限値のマージンが３０％であることに基づく）。両側αが２．５％であり、ＣＯＶＩＤ－１９症例が合計１８５例であり、試験の全体的な検出力が９０％であるならば、ＶＥが３０％超であることが実証される。対照被験者におけるＣＯＶＩＤ－１９の発現率が１箇月あたり０．１５％であり、試験における評価不能率が２０％（ベースラインにおいて血清陽性の登録者（既感染被験者）約５％を含む）であると仮定する。この場合、３箇月間にわたって登録された３６，５００人（ワクチン群は１８，２５０人）の被験者の追跡調査により、１回目のワクチン接種から約９箇月後において、１８５症例のＣＯＶＩＤ－１９症例が集積されることになる。
有効性の主要解析に関して、ＣＯＶＩＤ－１９症例の確認は、ＣＶｎＣｏＶの２回目のワクチン接種から１５日以上経過した時点から開始する。この時点では、２回目の投与後において、免疫応答が成熟し完全な高さに到達しうる。したがって、この時点から開始する症例の確認は、ＣＯＶＩＤ－１９に対するＣＶｎＣｏＶの完全ＶＥの評価を表している。
第３相の安全性目的は、ＣＶｎＣｏＶの安全性を実証する大規模安全性データベースを生成することである。第２ｂ相試験部分および第３相試験部分に参加した全被験者は、２回目のワクチン接種後６箇月間にわたって収集された医学的に認められた有害事象と、２回目のワクチン接種後１年間にわたって収集された特に関心のある有害事象および重篤な有害事象を有している。そのため、安全性の追跡調査のために、各被験者は、約１３．５箇月間にわたり本試験に参加する。
ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９疾患の既往歴を有する個人は、本試験への参加者から除外する。しかし、本試験では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の既往歴または過去の検査所見があり、その大部分が無症候性であった可能性がある参加者を、スクリーニングまたは除外しない。実際には、感染前のワクチン接種前スクリーニングが行われる可能性は低い。過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染していた個人において、ワクチンの安全性およびＣＯＶＩＤ－１９の転帰を理解することが重要である。
５．３ 投与の妥当性
ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験のために、ＣＶｎＣＯＶの用量レベルは１２μｇ（ｍＲＮＡ）を選択した。この値は、ＣＶ－ＮＣＯＶ－００１試験およびＣＶ－ＮＣＯＶ－００２試験の安全性、忍容性および免疫原性の結果に基づいた。
５．４ 試験定義の終了
ランダム化された群に該当する全ての訪問、手順および検査を終えた時点で、被験者は試験を完了したと見做される。
最終被験者が第３９３日に最終訪問を完了したか、または試験を早期に中止した場合ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験の終了と定義する。
全被験者は、引続き１年間の延長試験に参加することが期待される。延長試験は、第７５７日の最終訪問が終了した時点を試験終了と定義する。
５．５ 安全のための停止／一時停止規則
５．５．１ 個々の被験者の停止規則
１回目の試験ワクチン接種後、下記のいずれかの事象が発生した場合、個々の被験者の中止規定に該当する。
・試験ワクチンとの関連性があると判断されたアレルギー反応／アナフィラキシー反応
・試験ワクチンとの関連性があると判断された全ての重篤な有害事象
これらの規定のいずれかを満たした場合、２回目のワクチン接種を受けてはならない。被験者は、安全性のための試験の終了まで引続き参加することを奨励される。
５．５．２ 試験の一時停止
安全性シグナルを原因とする試験の一時停止（登録およびワクチン接種の一時的な停止）の決定は、試験依頼者と協議の上、ＤＳＭＢの勧告に基づく（９．３．９．１節を参照）。ＤＳＭＢは、定期的に予定されたＤＳＭＢの会議で発表される蓄積された安全性データの審査の後か、または有害事象の継続的な検討の後に、安全上の問題のために試験の一時停止を推奨できる。有害事象には、予測できない重篤な副作用の疑い（ＳＵＳＡＲ）、試験ワクチンとの関連が判断された全ての重篤な有害事象、関心のある重篤な有害事象（特に関心のある有害事象など）、生命を脅かす全ての有害事象および死亡が含まれるが、これらに限定されるものではない。試験中、これらの事象は、定期的にＤＳＭＢによって監視される。選択された有害事象および安全性の審査手順は、ＤＳＭＢ憲章に詳細に記載されている。
被験者の安全性を継続的に確保するため、上述した有害事象の盲検化したリストを、ＤＳＭＢの委員長（または被指名人）が定期的に監視する。各審査について、委員長（または被指名人）は、一または複数の任意の事象が新しい安全性シグナルを構成するかどうかを決定する。もし構成しなければ、委員長は、安全上の問題がないことを研究チームに通知する。逆に、安全上の問題がある場合、委員長は一または複数の有害事象を盲検解除し、必要に応じて、事象のさらなる評価のためにアドホックＤＳＭＢ会議を開催することができる。
ＤＳＭＢは、試験ワクチンと有害事象との因果関係に関するベネフィット・リスク比および生物学的妥当性の評価に基づき、試験依頼者に対し、計画通りに試験を継続するか、試験の実施を変更するか、試験を中断するかのいずれかを勧告し、有害事象をさらに評価できるようにする。後者の場合、試験依頼者は、ＤＳＭＢと協議の上、試験を一時停止することを決定する。
ＤＳＭＢの役割および責任に関するさらなる議論は、ＤＳＭＢ憲章を参照。
６ 試験対象集団
登録基準は、明示的に理解できねばならない。なお、参加基準の１つ以上を満たさないおよび／または除外基準の１つ以上を満たす被験者が不注意に登録され接種を受けた場合、試験依頼者は、直ちに連絡をとらねばならない。
本試験では、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９疾患の既往歴がある個人は、試験から除外する。しかし、本試験では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の既往歴または過去の検査所見がある個人を、スクリーニングまたは除外しない。さらに、登録時において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している個人を除外するためのスクリーニングでは通常のＲＴ－ＰＣＲ検査を行わない。加えて、国家に特有のいかなる規則も遵守される。
６．１ 全被験者の参加基準
下記の基準を全て満たした場合に限り、被験者を本試験に登録する。
１． １８歳以上の男性または女性の被験者である。
２． 試験手順の開始前に、文書によるインフォームド・コンセントが提供されている。
３． 試験実施計画書の手順を遵守することが予測され、予定された最終訪問までの臨床追跡調査が可能である。
４． 妊娠する可能性がない女性である。定義は次の通り：外科的に不妊である（両側卵管結紮術、両側卵巣摘出術または子宮摘出術の既往歴）または閉経後である（スクリーニング前（第１日）の１２箇月間以上連続して無月経であり、他の医学的原因がない場合と定義する）。閉経後の状態を確認するため、試験責任者の裁量により、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レベルを測定することがある。
５． 妊娠する可能性がある女性であり、第１日および第２９日における各試験ワクチン接種前２４時間以内の尿妊娠検査（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ））が陰性。
６． 妊娠する可能性がある女性は、試験ワクチンの１回目の投与の２週間前から最終投与の３箇月後まで、効果が非常に高い避妊法を用いなければならない。以下の避妊方法は、一貫して正しく使用される場合には、高価が非常に高いと考えられる。
・排卵抑制剤（経口、膣内または経皮）を伴う複合型（エストロゲンおよびプロゲストゲンを含有する）ホルモン避妊法
・排卵抑制剤（経口、注射または埋入型）を伴うプロゲストゲン単独のホルモン避妊法
・子宮内装置（ＩＵＤ）
・子宮内ホルモン放出システム（ＩＵＳ）
・両側卵管閉塞
・精管切除されたパートナーまたは不妊パートナー
・性的禁欲（定期的な禁欲およびその解除は許容できない（暦日、排卵、症状体温および排卵後に基づく禁欲方法など））
６．２ 除外基準
下記の基準のいずれかに該当する場合、被験者は、本試験に登録させない。
１． ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９疾患の既往歴がある。
２． 女性の場合、妊娠または授乳中である。
３． １回目の試験ワクチンの投与前２８日以内に、治験薬または未登録医薬品（ワクチンまたは医薬品など）を使用した。あるいは、試験期間中に使用を予定している。
４． １回目の試験ワクチンの投与前２８日以内（生ワクチンの場合）または１４日以内（不活化ワクチンの場合）に、認可ワクチンを接種された。
５． 試験前において、治験中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンまたは他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）ワクチンを接種した。あるいは、試験中に接種を予定している。
６． 試験ワクチンの投与前６箇月以内に、投与前６箇月以内に、合計で１４日間を超えて、免疫抑制剤または他の免疫改変剤（コルチコステロイド、生物製剤、メトトレキサートを含むが、これらには限定されない）で処置された。あるいは、試験中に使用を予定している。コルチコステロイドの使用に関しては、プレドニゾンまたは等価物を、０．５ｍｇ／ｋｇ／日で１４日間以上処置されることを意味する。コルチコステロイドの吸入使用、局所使用または局所注入使用（関節の疼痛／炎症に対するものなど）は認められる。
７． 既往歴および身体検査により、免疫抑制または免疫不全状態が医学的に診断されているか、疑われている。既往歴の例としては、既知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）への感染が挙げられる。
現時点で、癌（白血病、リンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫または全身性悪性腫瘍を含む）、慢性腎不全またはネフローゼ症候群、および、臓器移植または骨髄移植の施術の診断または処置を受けている。
８． 血管性浮腫（遺伝性または特発性）の既往歴がある。あるいは、何らかのアナフィラキシー反応またはｐＩＭＤの既往歴がある。
９． ＣＶｎＣｏＶワクチンに含まれている任意の成分に対するアレルギー歴がある。
１０． 試験ワクチン接種前投与前３箇月以内に、免疫グロブリンまたは何らかの血液製剤を投与された。あるいは、試験中に投与を予定している。
１１． 重大な急性または慢性の医療疾患もしくは精神疾患を患っており、試験責任者の判断により試験に参加できない被験者である（試験に参加することでリスクが増大し被験者が試験の必要条件を満たせなくなるおそれがある場合、または被験者の評価に支障を来すおそれがある場合）。このような疾患には、重度および／またはコントロール不良の心血管疾患、胃腸疾患、肝疾患、腎疾患、呼吸器疾患、内分泌障害、神経学的疾患および精神医学的疾患が含まれる。しかし、コントロールされた症例および安定症例である被験者を試験に含めることができる。
１２． 血液凝固障害を患っている。あるいは、筋肉内注射または採血が禁忌である出血性疾患を患っている。
１３． 試験手順の不遵守が予期される。試験責任者が判断する。
６．３ ワクチン延期勧告
登録後、被験者は、試験ワクチンの投与の延期が正当化される臨床状況に遭遇する可能性がある。このような状況とは、下記の通りである。
・第１日または第２９日の試験ワクチン接種予定日から３日間以内に、臨床的に重要な（グレード２以上の）急性感染症または他の急性疾患（試験責任者の評価による）を示した被験者。あるいは、体温が３８．０℃以上（１００．４°Ｆ以上）である被験者。ＣＯＶＩＤ－１９疾患の可能性がある症状も含まれる。
○急性感染症またはその他の急性疾患がグレード１以下に回復するか、被験者の体温が３８．０℃未満（１００．４°Ｆ未満）に低下するまで、試験ワクチン接種を延期すべきである。疾患が消失した後、試験責任者の判断に基づき、被験者の試験ワクチン接種を再度予定することができる。
○軽度の疾患を患っている無熱性の被験者は、試験責任者の裁量により、ワクチン接種をすることができる。
・試験ワクチンの投与予定前または投与後２８日以内（生ワクチンの場合）または１４日以内（不活化ワクチンの場合）に、認可されたワクチンを投与されている。これらは推奨される期間であるため、これらの期間に整合するように試験ワクチン接種を再度予定することは、実用的な場合に限るべきである。
６．４ 適格性基準の不適合
試験責任者は、インフォームド・コンセントに署名した全被験者に説明せねばならない。被験者が適格でないことが判明した場合（全ての参加基準を満たしていないか、１つ以上の除外基準を満たしている場合）、試験責任者は、その旨を被験者の原資料に記録する。
７ 試験ワクチン
７．１ 試験のワクチン投与
７．１．１ 試験ワクチンの説明
ＣＶｎＣｏＶは、試験対象であるＬＮＰ製剤（RNActive(R) SARS-CoV-2ワクチン）である。ＩＭＰは、活性医薬成分、Ｗｓｍｐｖ－ＳＰをコードしているｍＲＮＡ、および４種類の脂質成分（コレステロール、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ＰＥＧ化脂質、およびカチオン性脂質）から構成される。この医薬は、１ｍｇ／ｍＬに濃縮したｍＲＮＡ製剤原料として供給される。
プラセボは、注射用の滅菌した通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）である。
７．１．２ 投与量および投与経路
７．１．２．１ ＣＶｎＣｏＶ
ＣＶｎＣｏＶに割付けられた被験者は、ＣＶｎＣｏＶを１２μｇ（ｍＲＮＡ）の用量レベルで、２８日間隔で２回の接種を受ける。
ＣＶｎＣｏＶの投与は、三角筋エリアに、筋肉内（ＩＭ）注入により行われねばならない。好ましくは、利き腕でない腕に投与する。ＣＶｎＣｏＶは、ＩＭ注射用に厳密に意図されており、皮下、皮内または静脈内に注入してはならない。薬局マニュアルに記載されている注射の指示書に従わねばならない。
７．１．２．２ プラセボ対照（通常の生理食塩水）
試験の対照群に割付けられた被験者は、生理食塩水プラセボ（通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ））を、２８日間隔で２回の接種を受ける。
生理食塩水プラセボの投与は、三角筋エリアで、ＩＭ注入によって行われねばならない。好ましくは利き腕でない腕に投与する。薬局マニュアルに記載されている注射の指示書に従わねばならない。
７．１．２．３ ワクチン接種に対する過敏反応
ＣＶｎＣｏＶは、ワクチンのいずれかの成分に対して過敏性であることが既知の被験者には、投与してはならない。
アナフィラキシー反応の理論上のリスクがあるため、アナフィラキシー反応の治療用の緊急器具（静脈内輸液、コルチコステロイド、Ｈ１阻害剤およびＨ２阻害剤、エピネフリン、心肺蘇生用の器具）が容易に利用可能な場合にのみ、試験ワクチンを投与せねばならない。全被験者は、治験薬投与後以上３０分間、これらの副作用の治療に関する訓練を受けた担当者の直接の監視下に置かねばならない。
試験ワクチンの投与後にアナフィラキシーまたは重度の過敏反応が生じた場合、それ以降の投与を行うべきではない（５．５．１節および８．１節を参照）。
７．２ 調製、取扱い、保存および説明責任
ＣＶｎＣｏＶおよび生理食塩水プラセボの調製、取扱い、保存および盲検化に関する詳細情報については、薬局マニュアルを参照。
７．２．１ ＣＶｎＣｏＶの調製
濃縮されたＣＶｎＣｏＶを、滅菌された通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、防腐剤を含む）稀釈剤で稀釈して、ＩＭ注射用の投与溶液を調製せねばならない。CureVac AGによって提供されるＩＭＰの取扱いマニュアルに従って、盲検化されていない資格のある薬剤師がＣＶｎＣｏＶを調製する。薬剤師は、ワクチン接種後に、他の試験機能を有さず、厳格な信頼度で処置の職務を維持する。
７．２．２ ＣＶｎＣｏＶ製品の保存および安定性
濃縮されたＣＶｎＣｏＶは、－６０℃未満で凍結できる施設に出荷される。
施設に到着後は、濃縮されたＣＶｎＣｏＶを、－６０℃未満で凍結保存すべきである。
７．２．３ プラセボ対照（通常の生理食塩水）
通常の生理食塩水プラセボ対照ワクチンは、製品特性概要に従って保存すべきである。
７．２．４ 説明責任
試験責任者の責任は、施設において受領、保存および分配された治験薬の適時かつ正確な記録が、適用される規則およびガイドラインに従った適切な様式に則って、確実に維持されるようにすることである。治験薬は、推奨される保存条件下で保存し、アクセスを制限して施錠せねばならない（薬局マニュアルを参照）。承認された職員は、試験施設において、試験実施計画書ならびに適用される規則およびガイドラインに従って、ワクチンを分配せねばならない。
ＩＭＰの説明責任および在庫記録は、試験施設において、最新の状態で保存せねばならない。在庫記録には、下記の情報が含まれる。
・CureVacから受領したＣＶｎＣｏＶの日付および量。
・固有の被験者識別子。
・各被験者に分配した試験ワクチンの日付および量。
・服用量を準備する者のイニシャル。
・ワクチンを投与する者のイニシャル。
これらの記録は、調査のために容易に利用可能でなければならず、規制調査のために常に開かれていなければならない。
７．３ ランダム化および盲検化
第２ｂ相および第３相では、いずれも、ランダム化、観察者盲検化およびプラセボ対照化を行う。試験対象であるＣＶｎＣｏＶワクチンとプラセボとは外観が異なるため、試験は、観察者盲検化方式で実施する必要がある。これは、盲検化のための充分に受け入れられた方法である。
７．３．１ ランダム化
１８歳以上の被験者は、全世界の複数の施設に登録し、ＣＶｎＣｏＶまたはプラセボのいずれかを投与される群に１：１の割合でランダム化される。ランダム化は中央で実施し、国および年齢群（１８～６０歳および６１歳以上）により層別化する。ランダム化スキームは、受託研究機関（ＣＲＯ）であるＰＲＡの独立統計グループによって作成され、維持される。被験者をオンラインで試験に登録し、対話型ウェブ応答システム（ＩＷＲＳ）を用いてランダム化する。人口統計学的基準および適格性基準をシステムに入力した後、試験に登録した各被験者には、それらの処置割付けが割付けられる。
７．３．２ 盲検化
被験者はランダム化され、観察者盲検化方式にてＣＶｎＣｏＶまたはプラセボを接種される（試験対象であるＣＶｎＣｏＶワクチンとプラセボの外観および提示が異なるため）。施設の薬剤師は盲検ではなく、被験者に投与される試験ワクチンを識別できる。しかし、ワクチン接種担当者、試験責任者および試験実施に関わる全ての施設職員には、試験ワクチンおよび被験者の処置割付けについて盲検化されている（試験には、安全性の追跡調査およびＣＯＶＩＤ－１９症例の確認が含まれる）。ワクチン接種担当者の盲検性を維持するために、薬剤師は、注射器に予め充填された試験ワクチンの用量をワクチン接種担当者に提供する。注射器にはラベルがあり、液体内容物が見えないように液体内容物を覆っている。試験の実施に直接関与するＣＲＯおよび試験依頼者の全職員も、盲検化する。ＣＲＯおよび試験依頼者には、その役割のために、試験期間中に盲検を解除せねばならない特定の個人がいる（薬剤部における試験ワクチンの管理に関する非盲検化監視、ＤＳＭＢを支援する非盲検化独立統計家、免疫原性データの段落（次段落を参照）など）。これらの盲検解除された個人を同定し、その責任を文書化する。
免疫原性の結果は、被験者の処置割付けを非盲検化することになるため、アッセイを実施する独立した検査機関は、その結果を厳格な信頼度で維持する。試験開始時に指名され、試験の実施とは無関係な盲検解除担当者は、免疫原性データを作成する際において、その品質を審査する責任を有する。盲検解除担当者は、結果を厳格な信頼度で維持する。盲検性を維持するために、免疫原性データは、試験の盲検解除後にのみ臨床データベースと統合される。
ＤＳＭＢ会議で審査された安全性データが盲検解除されるかどうかは、ＤＳＭＢ委員の裁量による。安全上の問題がある場合、ＤＳＭＢは、いつでも、個々の被験者または特定のデータセットの盲検解除を要求することができる。さらに、ＤＳＭＢは、ＶＤＥのシグナルについて、ワクチン群ごとにＣＯＶＩＤ－１９症例を定期的に監視する。中間解析でにおいて、ＤＳＭＢは、有効性または無益性についてＣＯＶＩＤ－１９症例をワクチン群ごとに審査し、結果を盲検下で試験依頼者に伝達する。
ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験の実施中に規制当局の承認のための文書を提出する場合（例えば、一方の中間解析で有効性が実証された場合）、盲検解除された提出チームが形成される。提出チームは、試験を実施するチームとは完全に独立している。提出チームには、試験依頼者およびＣＲＯに帰属する個人が含まれ、盲検化されていないチームに対する役割および責任が明確に定義されている。
７．３．３ 緊急盲検解除
個々の盲検解除は、被験者の臨床管理または福祉にとって試験ワクチンに関する知識が不可欠であり、被験者の安全性の理由に関する緊急事態にのみ行うべきである。このような場合の盲検解除は、理想的には試験依頼者と協議の上、試験責任者の判断に基づいて行う。
一般的に、試験ワクチンの特定は、いかなる重篤な有害事象／有害事象の臨床管理にも影響を及ぼすべきではない。試験責任者は、可能な限り、盲検解除前に試験依頼者に連絡を取り、緊急時の盲検解除の必要性について協議する。合意が形成されると、ＩＷＲＳを介して盲検解除が実行される。
盲検が解除された場合、日付、正確な時期および理由を、一次文書に完全に文書化せねばならない。試験責任者は、盲検下にある他の試験スタッフにＩＭＰの識別を知らせてはならない。
盲検解除され、中止の医学的理由がない場合、被験者は、試験を継続することができる。被験者が試験ワクチンを１回以上接種されている場合、試験依頼者と協議の上、２回目の接種を受けるか否かは試験責任者が判断する。被験者が試験を中止した場合には、試験終了まで被験者の安全性に関する追跡調査を継続するためにあらゆる努力を払うべきである。
７．４ ワクチンのコンプライアンス
試験責任者は、投与された全ての試験ワクチンを、被験者のｅＣＲＦページに記録せねばならない。
７．５ 誤用および過剰投与
誤用の定義：試験ワクチンが意図的かつ不適切に使用され、試験実施計画書の投与命令または承認された製品情報に従わない場合。
過剰投与の定義：試験実施計画書の投与指示または承認された製品情報に従って、最大推奨用量を超えて、投与ごとまたは累積的に試験ワクチンの量を投与すること。
現在の臨床および非臨床経験からは、毒性作用は予測されない。可能性のある局所反応（疼痛）または全身性有害事象（発熱、頭痛、疲労、悪寒、筋肉痛、関節痛、悪心／嘔吐および下痢）を、理学的処置、パラセタモールまたは非ステロイド性抗炎症剤で対症療法することがある。
７．６ 随伴治療およびワクチン
被験者のｅＣＲＦには、併用薬およびワクチンを記録せねばならない（投与理由を含む）。
７．６．１ 試験において許可されている医薬品／ワクチン
被験者は、被験者が経験する可能性のある進行中の状態を治療するために、解熱剤およびその他の鎮痛剤の使用が認められている。解熱剤（パラセタモールなど）または他の鎮痛剤を用いて、試験ワクチン接種に関連する任意の局所性および／または全身性反応を治療することができる。本試験では、潜在的なワクチン関連反応のために、パラセタモールの予防的服用も認められている。例えば、１回目の試験ワクチン接種後に被験者に副作用が認められた場合、２回目の試験ワクチン接種のためにパラセタモールを予防的に服用することができる。この場合、パラセタモール（用量：１ｇ以下）は、試験ワクチン接種後、就寝時、翌日の朝および就寝時に服用することができる。あるいは、５００ｍｇの用量のパラセタモールを、試験ワクチン接種後６時間ごとに３６時間まで服用してもよい。パラセタモールの用量および投与スケジュールについては、試験責任者と協議すべきである。
ワクチン関連反応の治療または予防のために投与されたパラセタモールは、試験的ワクチン接種に対する投与時期とともに、ｅＣＲＦに記録せねばならない。
６．２節に記載され、後述の７．６．２節に列挙されている禁止された薬物およびワクチン以外に、被験者の既存の病状の処置に必要な薬物が許容される。
７．６．２ 試験における使用禁止薬／ワクチン
・試験期間中、治験薬または未登録医薬品（ワクチンまたは医薬）の使用は禁止される。
・試験期間中、試験ワクチンの投与から２８日以内（生ワクチンの場合）または１４日以内（不活化ワクチンの場合）に、認可ワクチンを接種してはならない。
・試験期間中、他の治験中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンまたは他のコロナウイルスワクチンを接種してはならない。
・試験期間中、免疫抑制剤または他の免疫改変剤（コルチコステロイド、生物製剤、メトトレキサートを含むが、これらには限定されない）で処置されてはならない。コルチコステロイドの使用に関しては、プレドニゾンまたは等価物を、０．５ｍｇ／ｋｇ／日以上処置されることを意味する。コルチコステロイドの吸入使用、局所使用または局所注入使用（関節の疼痛／炎症に対するものなど）は許容される。
・試験期間中、免疫グロブリンまたは血液製剤を投与されてはならない。
７．７ 投与中止に至る処置
６．２節に除外基準として記載した処置を被験者が必要とし延期できない場合には、個々の症例を審査した後、試験データの完全性を確保するために中止が考慮される。被験者の安全性追跡調査を継続するために、試験終了時まであらゆる努力を払うべきである。
７．８ 試験終了後の処置
試験後のケアは行わない。
８ 中止／撤回基準
試験への参加は、厳密に自主的である。被験者は、いつでも、任意の理由で、試験を撤回する権利を有する。被験者の最善の利益または試験実施計画書からの逸脱の結果と考えられる場合、試験責任者は、さらなる試験ワクチンの投与および／または試験を被験者に撤回させる権利をする。
有害事象に起因する中止については、事象の転帰を記録するために、あらゆる努力を払うべきである。
試験ワクチンを１回以上接種された被験者は、安全性評価のために、試験の終了まで参加を継続することが奨励される。
８．１ 試験ワクチンの投与の中止
試験ワクチンのさらなる投与を中止した主要な理由を、下記のカテゴリに沿って、被験者のｅＣＲＦに記録する。
・被験者による同意の撤回。
可能であれば、撤回理由をｅＣＲＦに記録すべきである。
注：撤回の根本的な理由を特定するために、全ての試み行うべきである。可能であれば、主要かつ根本的な理由を記録すべきである（有害事象に起因する撤回は、「自発的撤回」のカテゴリに記録すべきではない）。
・有害事象（試験ワクチンの既知の副作用を含む）。
試験ワクチンまたは試験手順に関連する可能性のある有害事象に起因する中止の場合は、試験責任者の医学的判断に従い、被験者を追跡調査せねばならない。追跡調査は、状態が解消されるか、さらなる観察または検査が医学的に必要ないと試験責任者が判断するまで続行する。
・さらなる参加を禁止する、被験者の全体的な医学的状態の変化。
・妊娠（９．３．５節を参照）。
適切な避妊を要求されているにもかかわらず、試験期間中に妊娠者となった被験者には、さらなる試験ワクチンを接種しない。施設は、妊娠した被験者との連絡を維持し、可及的速やかに「試験妊娠報告書」を完成させねばならない。さらに、子供の誕生まで、または自然な妊娠の終了もしくは自発的な妊娠の終了まで、被験者を追跡調査すべきである。妊娠転帰情報が入手可能になった場合、同じ報告書に情報を記録すべきである。被験者は、ＩＭＰ中止として報告すべきであり、その理由（妊娠）を与えるべきである。
・試験依頼者による試験の終了（この場合、第３９３日の試験訪問の終了時に行う、最低限の安全性追跡調査を実施する）。
・試験実施計画書からの主要な逸脱。
・その他。
注：特定の理由を、ｅＣＲＦのspecifyの項目に記録すべきである。
８．２ 試験の撤回
下記のいずれかに該当する場合、被験者は、試験を撤回せねばならない。
・継続的な参加が、被験者の健康、安全または権利を危険にさらす。
・早期終了を必要とする有害事象を、被験者が経験している。早期終了の理由は、継続的な参加が被験者の健康に許容できないリスクが課されるか、または有害事象のために被験者に継続の意思がないためである。さらなる安全性または免疫原性の評価を行わない理由を文書化すべきである。
・被験者が施設に戻らず、被験者に連絡するための複数回の試み（３回以上の試み）が成功しなかった（追跡不能）。
・試験を撤回することを被験者が望んでいる。可能であれば、撤回の理由を記録すべきである。
撤回の根本的な理由を特定するために、全ての試み行うべきである。可能であれば、主要かつ根本的な理由を記録すべきである（有害事象に起因する撤回は、「自発的撤回」のカテゴリに記録すべきではない）。
参加を途中で終了し、かつ、１つ以上の試験ワクチンを接種された被験者はいずれも、試験訪問の終了時と同様の手順で対応する。ただし、この手順に被験者にとって許容できないリスクがあると判断される場合を除く。
中止または撤回した被験者を、置換しない。
８．３ 試験終了
試験依頼者は、任意の時点において試験を終了させる権利を保有する。試験終了の理由としては、下記が考えられる。
・中間解析の結果が、高いＶＥまたは無益性を示している可能性がある。
・安全性上の理由：本試験または関連するワクチンを用いた他の任意の試験における有害事象の発生率が、被験者の潜在的な健康リスクを示している。
・新しい科学知識が知られるようになり、試験の目的がもはや実現可能／妥当ではなくなる。
・合意された期間内に、施設が充分な被験者を募集できない可能性が高い。
・試験管理の要求に施設が応じない。
・試験実施計画書からの逸脱を繰返す。
・安全でないまたは非倫理的な慣行。
・管理上の決定。
試験終了の決定後、試験責任者は、試験依頼者が設定した期間内に全被験者に連絡せねばならない。全ての試験資料を収集し、可能な限り関連文書を完成させねばならない。
何らかの理由により、規制当局によって試験を終了させられることがある。あるいは、ＤＳＭＢによって推奨される場合に、試験を終了させることがある。あるいは、独立倫理委員会または試験審査委員会（ＩＥＣ／ＩＲＢ）によって、施設レベルで試験を終了させることがある。。試験依頼者は、試験実施計画書の遵守状況が悪いこと、または被験者の登録が不充分であることなどの理由により、個々の施設を途中で閉鎖できる。
８．４ 追跡不能
予定された試験訪問に戻らなかった被験者または予定された電話連絡で連絡できなかった被験者に連絡するために、全ての努力を払うべきである。３回以上の試行を行い、文書化すべきである。関連する重篤な有害事象または有害事象が消失する前に被験者が追跡不能となった場合、試験依頼者は、追跡安全性情報を収集するために、被験者との連絡をさらに試みることを検討することができる。
９ 試験の評価および手順
本節では、試験の評価および手順について説明する。
試験実施計画書に規定された施設訪問のための施設に訪問できない被験者（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する公衆衛生上の非常事態のため）に対しては、代替方法により安全性評価を実施することができる（電話連絡、バーチャル訪問、評価のための代替地）。
パンデミック状態での試験の実施にさらに柔軟性を持たせるために、家庭訪問を行い、安全性評価および手順（血液および生体試料の採取など）を実施することが許容される。公衆衛生上の緊急事態のような固有の状況において、施設訪問、電話連絡またはサンプル採取を試験実施計画書に定義されている期間内で実行できない場合は、その期間外にこれらの作業を実行することは許容できる。パンデミック状態において、試験実施計画書に定義されている施設訪問および電話連絡のための期間は、ガイダンスとして提供されている。この期間が厳密に遵守されていない場合でも、逸脱とは見なされない。
安全関連情報の効率的な収集のために、試験においては電子日記（ｅＤｉａｒｙ）を使用する。ただし、試験において、一部の被験者には紙の日記で代用することもある。
第２ｂ相への２種類のターゲット年齢群の被験者登録の開始は、柔軟である。第１相試験および第２ａ相試験のデータの時期によっては、第２ｂ相試験への２種類の年齢群の登録をずらすことがある。最初は１８～６０歳の被験者から登録を開始し、その後６１歳以上の被験者の登録を開始する。第２ｂ相試験の全被験者数の２０～２５％が高齢者群であることから、この段階的な登録開始が、第２ｂ相試験コホートの全体の登録に影響を及ぼすとは予想されない。
９．１ 試験の評価および手続のスケジュール
インフォームド・コンセントに署名することにより、被験者は、ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験および１年間の延長試験の両方に参加することに同意する。合計で、約２．１年間の参加である。
試験の評価および手順は、全被験者に適用される。この原則は、試験前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して血清陽性であることが知られていることとは独立に適用される。あるいは、この原則は、遡及的解析によるベースラインにおける血清学的状態とは独立に適用される。
第２ｂ相に参加する被験者には、体温を経口測定するための体温計と、局所注射部位反応の大きさを測定するための測定テープとが与えられる。非自発的に記録される有害事象を７日間にわたりｅＤｉａｒｙに入力する方法を、被験者に指導する。
試験実施中および被験者との相互作用中において、ＣＯＶＩＤ－１９の早期警告徴候が認められた者は、直ちに救急医療を受けさせるべきである。これらの徴候には、息切れ、胸部の持続的な疼痛または圧迫感、新たな錯乱、覚醒できないもしくは覚醒状態を保てない、または唇や顔が青味を帯びるなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
９．１．１ 第２ｂ相：免疫原性サブセット
第２ｂ相の免疫原性サブセットには、第２ｂ相の２種類の年齢群（１８～６０歳および６１歳以上）にそれぞれ登録された最初の６００人が含まれる。それゆえ、目標全登録数は、約１，２００人である。
９．１．１．１ 来院１：第１日－１回目の試験ワクチン接種
被験者の適格性を確立するための手順、ならびに人口統計学的情報および既往歴の記録は、試験ワクチンの投与前２１日以内のうちに実施することがある点に留意する（１日間以上に及ぶことがある点に留意する）。ただし、全ての情報が得られ、評価および手順が行える場合には、試験ワクチンの投与と同じ日に適格性を確立することができる。第１日の試験ワクチンの投与前に、全ての適格性基準を審査せねばならない。
ワクチン接種前手順
・署名されたインフォームド・コンセント書面を入手する。
－被験者が試験を開始する前であって、試験実施計画書に指示された何らかの手順を実施する前に、署名されたインフォームド・コンセントを取得せねばならない。
－インフォームド・コンセント書面に署名することにより、ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験および１年間の延長試験に合計約２年間参加することに、被験者は自発的に同意する。
・参加基準／除外基準（６．１節および６．２節を参照）、除外基準に記載されている禁止薬（６．２節を参照）を審査する。
・人口統計情報を記録する。
・既往歴を記録する。
・本試験への登録前６箇月以内に服用した場合に、併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・身長および体重を含む完全な身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。適格性を確立するための完全な身体検査を試験ワクチンの投与前２１日以内に実施している場合は、ワクチン接種日の試験ワクチンの投与前に症状指向の身体検査を実施すべきである。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・妊娠する可能性がある女性に対して、尿妊娠検査を行う。
・下記の検査のために、ワクチン接種前の血液サンプルを採取する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和活性（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体（約６ｍＬの血液）
・選択した施設の被験者から、ゲノムバイオマーカー用のワクチン接種前の血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
・選択した施設の被験者から、ＣＭＩ用のワクチン接種前の血液サンプルを採取する（約３２ｍＬの血液）。
ワクチン接種手順
・ワクチン接種の延期または中止の基準を審査する。ワクチン投与の延期または中止に至る基準の概要については、６．３節および８．１節を参照。延期する場合、ワクチン接種は、許容される期間内に行うべきである。延期または中止の理由を、被験者のチャートに記載すべきである。
・割付けられた被験者に応じて、試験ワクチンの用量を投与する。
ワクチン接種後手順
・ワクチン接種後３０分間以上にわたり被験者を施設で観察し、安全性を監視する。観察期間の終了時に、下記を行う。
－バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
－バイタルサインが正常範囲になるまで、またはワクチン接種前のレベルに戻るまで、被験者を退院させないでおくことができる。
－試験ワクチン接種後におけるあらゆる有害事象の発生を記録する。
・被験者に下記を指示する。
－非自発的に記録される有害事象の測定方法およびｅＤｉａｒｙの記入方法を、被験者に指導する。ワクチン接種日および引続く７日間に発生した非自発的に記録される局所性または全身性の有害事象を、被験者は記録せねばならない。また、ワクチン接種日および引続く２８日間に発生した自発的に記録される有害事象（他の全ての有害事象の発生）を、被験者は記録せねばならない。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの局所性または全身性の懸念される反応を経験した。あるいは、他の医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
注：症状のない被験者であっても、いくつかの理由で検査されている場合がある。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への既知の感染者との濃厚接触のため、または医療提供者に対する通常のスクリーニングの一環として。
９．１．１．２ 電話連絡：第２日（－０日／＋０日）
この電話連絡の目的は、被験者の一般的な健康状態について質問し、１回目の試験ワクチン接種から１日後における安全性を評価することである。
・電話連絡において下記を行う。
－新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには、非自発的に記録される有害事象、自発的に記録される有害事象、または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）が含まれる。
－併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
－何らかの局所性もしくは全身性の懸念される反応または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象など）を被験者が報告した場合は、電話連絡または試験責任者の判断に基づく予定外の施設訪問により、追跡調査を実施せねばならない。
・被験者に下記を指示する。
－非自発的に記録される有害事象および自発的に記録される有害事象（他の全ての有害事象の発生）をｅＤｉａｒｙに記録し続けるように、被験者に注意喚起する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの局所性または全身性の懸念される反応を経験した。あるいは、他の医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．１．３ 来院２：第２９日－２回目のワクチン接種（－３日／＋７日）
ワクチン接種前手順
・新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには、非自発的に記録される有害事象、自発的に記録される有害事象、または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）が含まれる。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・症状指向の身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・妊娠する可能性がある女性に対して、尿妊娠検査を行う。
・下記の検査のために、ワクチン接種前の血液サンプルを採取する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対する抗体の検査は、この時点では行わない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和活性（約６ｍＬの血液）
・選択した施設の被験者から、ゲノムバイオマーカー用のワクチン接種前の血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
・選択した施設の被験者から、ＣＭＩ用のワクチン接種前の血液サンプルを採取する（約３２ｍＬの血液）。
ワクチン接種手順
・ワクチン接種の延期または中止の基準を審査する。ワクチン投与の延期または中止に至る基準の概要については、６．３節および８．１節を参照。延期する場合、ワクチン接種は、許容される期間内に行うべきである。延期または中止の理由を、被験者のチャートに記載すべきである。
・割付けられた被験者に応じて、試験ワクチンの用量を投与する。
ワクチン接種後手順
・ワクチン接種後３０分間以上にわたり被験者を施設で観察し、安全性を監視する。観察期間の終了時に、下記を行う。
－バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
－バイタルサインが正常範囲になるまで、またはワクチン接種前のレベルに戻るまで、被験者を退院させないでおくことができる。
－試験ワクチン接種後におけるあらゆる有害事象の発生を記録する。
・被験者に下記を指示する。
－非自発的に記録される有害事象の測定方法およびｅＤｉａｒｙの記入方法を、被験者に再度指導する。ワクチン接種日および引続く７日間に発生した非自発的に記録される局所性または全身性の有害事象を、被験者は記録せねばならない。また、ワクチン接種日および引続く２８日間に発生した自発的に記録される有害事象（他の全ての有害事象の発生）を、被験者は記録せねばならない。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの局所性または全身性の懸念される反応を経験した。あるいは、他の医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．１．４ 電話連絡：３０日（－０日／＋０日）
この電話連絡の目的は、被験者の一般的な健康状態について質問し、２回目の試験ワクチン接種から１日後における安全性を評価することである。
評価および手順は、第２日の電話連絡と同一である。
９．１．１．５ 来院３：第４３日（－３日／＋３日）
・新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには、非自発的に記録される有害事象、自発的に記録される有害事象、または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）が含まれる。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・症状指向の身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・下記の検査のために、血液サンプルを採取する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和活性（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体（約６ｍＬの血液）
・選択した施設の被験者から、ゲノムバイオマーカー用の血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
・選択した施設の被験者から、ＣＭＩ用の血液サンプルを採取する（約３２ｍＬの血液）。
・被験者に下記を指示する。
－非自発的に記録される局所性および全身性の反応をｅＤｉａｒｙに記録する作業は完了した旨を、被験者に通知する。自発的に記録される有害事象（全ての有害事象）の記録は継続するように、被験者に注意喚起する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．１．６ 来院４：第５７日（－３日／＋７日）
・新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには自発的に記録される有害事象、または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）が含まれる。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・症状指向の身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・下記に関する免疫原性評価のために、血液サンプルを採取する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対する抗体の検査は、この時点では行わない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和活性（約６ｍＬの血液）
・被験者に下記を指示する。
－自発的に記録される有害事象を記録する作業は完了した旨を、被験者に通知する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．１．７ 来院５：第１２０日（－７日／＋７日）
・第５７日の施設訪問以降に新たに報告された全ての有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）を審査し、記録する。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・症状指向の身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・下記の検査のために、血液サンプルを採取する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対する抗体の検査は、この時点では行わない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和活性（約６ｍＬの血液）
・選択した施設の被験者から、ゲノムバイオマーカー用の血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
・選択した施設の被験者から、ＣＭＩ用の血液サンプルを採取する（約３２ｍＬの血液）。
・被験者に下記を指示する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．１．８ 来院６：第２１１日（－７日／＋７日）
下記を除いて、評価および手順は、第１２０日の来院５の際のものと同じである。
・下記に関する免疫原性評価のために、血液サンプルを採取する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和活性（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質）に結合する抗体（約６ｍＬの血液）
・選択した施設の被験者から、ゲノムバイオマーカー用の血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
９．１．１．９ 電話連絡：第３０２日（－７日／＋７日）
この電話連絡の目的は、被験者の一般的な健康状態について質問し、第２１１日の施設訪問以降における安全性を評価することである。
・電話連絡において下記を行う。
○第２１１日の施設訪問以降に新たに報告された有害事象（重篤な有害事象）を審査し、記録する。
○併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
○被験者が有害事象について電話連絡で報告した場合には、電話連絡または試験責任者の判断に基づく予定外の施設訪問のいずれかにより、追跡調査を行ねばならない。
・被験者に下記を指示する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．１．１０ 試験来院の終了：第３９３日（－０日／＋２１日）
最後の試験ワクチンの投与から１年後の第３９３日に、試験訪問を終了させる。可能であれば、この訪問には、試験においてワクチン接種を途中で中止した被験者を含めるべきである。下記の評価を実施すべきである。
・第３０２日の電話連絡以降に新たに報告された有害事象（重篤な有害事象）を審査し、記録する。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・身長および体重を含む完全な身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・下記の検査のために、血液サンプルを採取する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和活性（約６ｍＬの血液）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体（約６ｍＬの血液）
試験の主要部分が終了し、試験の延長部分が開始されることを被験者に通知する（９．１．４節を参照）。
９．１．２ 第２ｂ相：非免疫原性被験者
被験者を第２ｂ相の免疫原性サブセット（ｎ＝１，２００）に登録した後、１８歳以上の残りの２，８００人を第２ｂ相に登録する。
９．１．２．１ 来院１：第１日－１回目の試験ワクチン接種
被験者の適格性を確立するための手順、ならびに人口統計学的情報および既往歴の記録は、試験ワクチンの投与前２１日以内のうちに実施することがある点に留意する（１日間以上に及ぶことがある点に留意する）。ただし、全ての情報が得られ、評価および手順が行える場合には、試験ワクチンの投与と同じ日に適格性を確立することができる。第１日の試験ワクチンの投与前に、全ての適格性基準を審査せねばならない。
ワクチン接種前手順
・署名されたインフォームド・コンセント書面を入手する。
－被験者が試験を開始する前であって、試験実施計画書に指示された何らかの手順を実施する前に、署名されたインフォームド・コンセントを取得せねばならない（１２．４節を参照）。
－インフォームド・コンセント書面に署名することにより、ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験および１年間の延長試験に合計約２年間参加することに、被験者は自発的に同意する。
・参加基準／除外基準（６．１節および６．２節を参照）、除外基準に記載されている禁止薬（６．２節を参照）を審査する。
・人口統計情報を記録する。
・既往歴を記録する。
・本試験への登録前６箇月以内に服用した場合に、併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・身長および体重を含む完全な身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。適格性を確立するための完全な身体検査を試験ワクチンの投与前２１日以内に実施している場合は、ワクチン接種日の試験ワクチンの投与前に症状指向の身体検査を実施すべきである。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・妊娠する可能性がある女性に対して、尿妊娠検査を行う。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体の検査のために、ワクチン接種前の血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
ワクチン接種手順
・ワクチン接種の延期または中止の基準を審査する。ワクチン投与の延期または中止に至る基準の概要については、６．３節および８．１節を参照。延期する場合、ワクチン接種は、許容される期間内に行うべきである。延期または中止の理由を、被験者のチャートに記載すべきである。
・割付けられた被験者に応じて、試験ワクチンの用量を投与する。
ワクチン接種後手順
・ワクチン接種後３０分間以上にわたり被験者を施設で観察し、安全性を監視する。観察期間の終了時に、下記を行う。
－バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
－バイタルサインが正常範囲になるまで、またはワクチン接種前のレベルに戻るまで、被験者を退院させないでおくことができる。
－試験ワクチン接種後におけるあらゆる有害事象の発生を記録する。
・被験者に下記を指示する。
－非自発的に記録される有害事象の測定方法およびｅＤｉａｒｙの記入方法を、被験者に指導する。ワクチン接種日および引続く７日間に発生した非自発的に記録される局所性または全身性の有害事象を、被験者は記録せねばならない。また、ワクチン接種日および引続く２８日間に発生した自発的に記録される有害事象（他の全ての有害事象の発生）を、被験者は記録せねばならない。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの局所性または全身性の懸念される反応を経験した。あるいは、他の医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
注：症状のない被験者であっても、いくつかの理由で検査されている場合がある。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への既知の感染者との濃厚接触のため、または医療提供者に対する通常のスクリーニングの一環として。
９．１．２．２ 電話連絡：第２日（－０日／＋０日）
この電話連絡の目的は、被験者の一般的な健康状態について質問し、１回目の試験ワクチン接種から１日後における安全性を評価することである。
・電話連絡において下記を行う。
－新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには、非自発的に記録される有害事象、自発的に記録される有害事象、または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）が含まれる。
－併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
－何らかの局所性もしくは全身性の懸念される反応または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象など）を被験者が報告した場合は、電話連絡または試験責任者の判断に基づく予定外の施設訪問により、追跡調査を実施せねばならない。
・被験者に下記を指示する。
－非自発的に記録される有害事象および自発的に記録される有害事象（他の全ての有害事象の発生）をｅＤｉａｒｙに記録し続けるように、被験者に注意喚起する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの局所性または全身性の懸念される反応を経験した。あるいは、他の医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．２．３ 来院２：第２９日－２回目のワクチン接種（－３日／＋７日）
ワクチン接種前手順
・新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには、非自発的に記録される有害事象、自発的に記録される有害事象、または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）が含まれる。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・症状指向の身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・妊娠する可能性がある女性に対して、尿妊娠検査を行う。
ワクチン接種手順
・ワクチン接種の延期または中止の基準を審査する。ワクチン投与の延期または中止に至る基準の概要については、６．３節および８．１節を参照。延期する場合、ワクチン接種は、許容される期間内に行うべきである。延期または中止の理由を、被験者のチャートに記載すべきである。
・割付けられた被験者に応じて、試験ワクチンの用量を投与する。
ワクチン接種後手順
・ワクチン接種後３０分間以上にわたり被験者を施設で観察し、安全性を監視する。観察期間の終了時に、下記を行う。
－バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
－バイタルサインが正常範囲になるまで、またはワクチン接種前のレベルに戻るまで、被験者を退院させないでおくことができる。
－試験ワクチン接種後におけるあらゆる有害事象の発生を記録する。
・被験者に下記を指示する。
－非自発的に記録される有害事象の測定方法およびｅＤｉａｒｙの記入方法を、被験者に再度指導する。ワクチン接種日および引続く７日間に発生した非自発的に記録される局所性または全身性の有害事象を、被験者は記録せねばならない。また、ワクチン接種日および引続く２８日間に発生した自発的に記録される有害事象（他の全ての有害事象の発生）を、被験者は記録せねばならない。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの局所性または全身性の懸念される反応を経験した。あるいは、他の医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．２．４ 電話連絡：第３０日（０日／＋０日）
この電話連絡の目的は、被験者の一般的な健康状態について質問し、２回目の試験ワクチン接種から１日後における安全性を評価することである。
評価および手順は、第２日の電話連絡と同一である。
９．１．２．５ 来院３：第４３日（－３／＋３日）
・新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには、非自発的に記録される有害事象、自発的に記録される有害事象、または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）が含まれる。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・症状指向の身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体の検査のために、血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
・被験者に下記を指示する。
－非自発的に記録される局所性および全身性の反応をｅＤｉａｒｙに記録する作業は完了した旨を、被験者に通知する。自発的に記録される有害事象（全ての有害事象）の記録は継続するように、被験者に注意喚起する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．２．６ 電話連絡：第５７日（－３日／＋７日）
この電話連絡の目的は、被験者の一般的な健康状態について質問し、第４３日の施設訪問以降における安全性を評価することである。
・電話連絡において下記を行う。
－新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには、自発的に記録される有害事象、または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）が含まれる。
－併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
－何らかの局所性もしくは全身性の懸念される反応または他の有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象など）を被験者が報告した場合は、電話連絡または試験責任者の判断に基づく予定外の施設訪問により、追跡調査を実施せねばならない。
・被験者に下記を指示する。
－自発的に記録される有害事象を記録する作業は完了した旨を、被験者に通知する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．２．７ 来院４：第１２０日（－７日／＋７日）
・第５７日の電話連絡以降に新たに報告された有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）を審査し、記録する。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・症状指向の身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・被験者に下記を指示する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．２．８ 来院５：第２１１日（－７日／＋７日）
下記を除いて、評価および手順は、第１２０日の来院４の際のものと同じである。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体の検査のために、血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
９．１．２．９ 電話連絡：第３０２日（－７日／＋７日）
この電話連絡の目的は、被験者の一般的な健康状態について質問し、第２１１日の施設訪問以降における安全性を評価することである。
・電話連絡において下記を行う。
○第２１１日の施設訪問以降に新たに報告された有害事象（重篤な有害事象）を審査し、記録する。
○併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
○被験者が有害事象について電話連絡で報告した場合には、電話連絡または試験責任者の判断に基づく予定外の施設訪問のいずれかにより、追跡調査を行ねばならない。
・被験者に下記を指示する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．２．１０ 試験来院の終了：第３９３日（－０日／＋２１日）
最後の試験ワクチンの投与から１年後の第３９３日に、試験訪問を終了させる。可能であれば、この訪問には、試験においてワクチン接種を途中で中止した被験者を含めるべきである。下記の評価を実施すべきである。
・第３０２日の電話連絡以降に新たに報告された有害事象（重篤な有害事象）を審査し、記録する。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・身長および体重を含む完全な身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体の検査のために血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
試験の主要部分が終了し、試験の延長部分が開始されることを被験者に通知する（９．１．４節を参照）。
９．１．３ 第３相の被験者
１８歳以上の約３２，５００人の被験者が、第３相試験に登録される。
９．１．３．１ 来院１：第１日－１回目の試験ワクチン接種
被験者の適格性を確立するための手順、ならびに人口統計学的情報および既往歴の記録は、試験ワクチンの投与前２１日以内のうちに実施することがある点に留意する（１日間以上に及ぶことがある点に留意する）。ただし、全ての情報が得られ、評価および手順が行える場合には、試験ワクチンの投与と同じ日に適格性を確立することができる。第１日の試験ワクチンの投与前に、全ての適格性基準を審査せねばならない。
ワクチン接種前手順
・署名されたインフォームド・コンセント書面を入手する。
－被験者が試験を開始する前であって、試験実施計画書に指示された何らかの手順を実施する前に、署名されたインフォームド・コンセントを取得せねばならない。
－インフォームド・コンセント書面に署名することにより、ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験および１年間の延長試験に合計約２年間参加することに、被験者は自発的に同意する。
・参加基準／除外基準（６．１節および６．２節を参照）、除外基準に記載されている禁止薬（６．２節を参照）を審査する。
・人口統計情報を記録する。
・既往歴を記録する。
・本試験への登録前６箇月以内に服用した場合に、併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・身長および体重を含む完全な身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。適格性を確立するための完全な身体検査を試験ワクチンの投与前２１日以内に実施している場合は、ワクチン接種日の試験ワクチンの投与前に症状指向の身体検査を実施すべきである。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・妊娠する可能性がある女性に対して、尿妊娠検査を行う。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体の検査のために、ワクチン接種前に血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
ワクチン接種手順
・ワクチン接種の延期または中止の基準を審査する。ワクチン投与の延期または中止に至る基準の概要については、６．３節および８．１節を参照。延期する場合、ワクチン接種は、許容される期間内に行うべきである。延期または中止の理由を、被験者のチャートに記載すべきである。
・割付けられた被験者に応じて、試験ワクチンの用量を投与する。
ワクチン接種後手順
・ワクチン接種後３０分間以上にわたり被験者を施設で観察し、安全性を監視する。観察期間の終了時に、下記を行う。
－バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
－バイタルサインが正常範囲になるまで、またはワクチン接種前のレベルに戻るまで、被験者を退院させないでおくことができる。
－試験ワクチン接種後におけるあらゆる新たな有害事象の発生を記録する。
・被験者に下記を指示する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの局所性または全身性の懸念される反応を経験した。あるいは、他の医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
注：症状のない被験者であっても、いくつかの理由で検査されている場合がある。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への既知の感染者との濃厚接触のため、または医療提供者に対する通常のスクリーニングの一環として。
９．１．３．２ 来院２：第２９日 ２回目のワクチン接種（－３日／＋７日）
ワクチン接種前手順
・新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには、医学的に認められた有害事象および重篤な有害事象が含まれる。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・症状指向の身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・妊娠する可能性がある女性に対して、尿妊娠検査を行う。
ワクチン接種手順
・ワクチン接種の延期または中止の基準を審査する。ワクチン投与の延期または中止に至る基準の概要については、６．３節および８．１節を参照。延期する場合、ワクチン接種は、許容される期間内に行うべきである。延期または中止の理由を、被験者のチャートに記載すべきである。
・割付けられた被験者に応じて、試験ワクチンの用量を投与する。
ワクチン接種後手順
・ワクチン接種後３０分間以上にわたり被験者を施設で観察し、安全性を監視する。観察期間の終了時に、下記を行う。
－バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
－バイタルサインが正常範囲になるまで、またはワクチン接種前のレベルに戻るまで、被験者を退院させないでおくことができる。
－試験ワクチン接種後におけるあらゆる新たな有害事象の発生を記録する。
・被験者に下記を指示する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの局所性または全身性の懸念される反応を経験した。あるいは、他の医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．３．３ 来院３：第４３日（－３日／＋３日）
・新たに報告された全ての安全性データを審査し、記録する。安全性データには、医学的に認められた有害事象および重篤な有害事象が含まれる。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・症状指向の身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体の検査のために、血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）。
・被験者に下記を指示する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．３．４ 電話連絡：第５７日（－３日／＋７日）および第１２０日（－７日／＋７日）
この電話連絡の目的は、被験者の一般的な健康状態について質問し、最後の電話連絡または施設訪問以降における安全性を評価することである
・電話連絡において下記を行う。
－施設訪問または電話連絡以降に新たに報告された有害事象（医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象）を審査し、記録する。
－併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
－何らかの有害事象を被験者が電話で報告した場合は、電話連絡または試験責任者の判断に基づく予定外の施設訪問により、追跡調査を実施せねばならない。
・被験者に下記を指示する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．１．３．５ 来院４日：第２１１日（－７日／＋７日）
評価および手順は、第４３日の臨床訪問と同一である。
９．１．３．６ 電話連絡：第３０２日（－７日／＋７日）
この電話連絡の目的は、被験者の一般的な健康状態について質問し、第２１１日の最後の施設訪問以降における安全性を評価することである。
評価および手順は、第５７日および第１２０日の電話連絡と同一である。
最後の試験ワクチンの投与から１年後の第３９３日に、試験訪問を終了させる。可能であれば、この訪問には、試験においてワクチン接種を途中で中止した被験者を含めるべきである。下記の評価を実施すべきである。
・第３０２日の電話連絡以降に新たに報告された有害事象（重篤な有害事象）を審査し、記録する。
・併用薬およびワクチン接種を記録する。間欠的な状態に対して繰返し使用する医薬品を含む。
・身長および体重を含む完全な身体検査を実施する（９．３．７節を参照）。
・バイタルサインを測定する（体温、脈拍、血圧；９．３．７節を参照）。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体の検査のために、血液サンプルを採取する（約６ｍＬの血液）
試験の主要部分が終了し、試験の延長部分が開始されることを被験者に通知する（９．１．４節を参照）。
９．１．４ 延長試験（最長１年間）
・全被験者に対する一般的な指示
－主要試験の最終日（第３９３日）に、延長試験を開始することを被験者に通知する。試験期間は１年間を予定しているが、ＣＶｎＣｏＶが規制当局に承認され、プラセボ群の被験者にＣＶｎＣｏＶのワクチン接種を提案する場合には、試験を早期に終了させる可能性があることを説明する。他の有効なワクチンが地域的に配備された場合にも、試験を早期に終了させる可能性がある。
・免疫原性サブセットに参加した第２ｂ相の被験者に対する指示
－下記の評価および手順を実施することを被験者に通知する。
○血液サンプルを採取するために、３箇月ごとに施設に戻る（第４８４日、第５７５日、第６６５日および第７５７日）。この血液サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和抗体の長期持続性を評価するためのものである。
○長期有効性を評価するために、ＣＯＶＩＤ－１９症例を検出する。
○長期安全性を評価するために、特に関心のある有害事象および重篤な有害事象を収集する。
・第２ｂ相の非免疫原性被験者および第３相の被験者に対する指示
－以下の評価および手順を実施することを、被験者に通知する。
○３箇月ごとに電話連絡をする（第４８４日、第５７５日、第６６５日、第７５７日）。この電話連絡は、特に関心のある有害事象および重篤な有害事象を確実に収集して、長期安全性を評価するためのものである。
○長期有効性を評価するために、ＣＯＶＩＤ－１９症例を検出する。
－施設に電話連絡して、下記の事項を直ちに報告するように被験者に注意喚起する。
○何らかの懸念される医学的事象を経験した。
○身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う何らかの訪問。入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問など。理由は問わない。
○重篤な医学的事象を経験した、全般的な健康状態に変化があった、または医師により新たな医学的状態と診断された。これらは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず、報告すべきである。
－ＣＯＶＩＤ－１９を示唆する何らかの症状がある場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起する。さらに、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。「はい」と回答した被験者は、追跡調査の情報のために、試験スタッフから連絡を受ける（９．２．１節および９．５節を参照）。
－施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者に注意喚起せねばならない。検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
９．２ 有効性評価
９．２．１ ＣＯＶＩＤ－１９症例
ＣＯＶＩＤ－１９症例の確認は、試験の第２ｂ相部分および第３相部分のいずれでも、同一の方法で行われる。症例検出は、ＣＯＶＩＤ－１９疾患と一致する症状を標準化したリストから１つ以上の症状を報告した被験者の同定から始める。試験スタッフとの電話面接に基づき、ＣＯＶＩＤ－１９疾患が疑われる被験者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の検査を受ける。この検査は、試験スタッフが施設で実施する迅速抗原検査と、指定の中央検査機関で実施する分子に基づくＲＴ－ＰＣＲ検査とからなる。試験戦略は、９．５節に記載の通りである。被験者がＣＯＶＩＤ－１９であることが確認された場合、初発症状が軽症と見られる場合であっても、疾患が消失するまで被験者を追跡調査する。被験者が入院した場合、被験者の経過を引続き試験責任者が追跡調査し、入院終了時に医療／退院サマリを入手せねばならない。
９．２．１．１ 症例検出
９．２．１．１．１ ＣＯＶＩＤ－１９の定期的サーベイランス
全ての施設訪問および電話連絡の際に、下記のいずれかの症状＊が認められた場合には施設に連絡するように、被験者は注意喚起される。
○発熱または悪寒；呼吸困難または息切れ；味覚または嗅覚の新たな喪失；咳嗽；疲労；筋肉または身体の痛み；頭痛；咽頭痛；鬱血または鼻水；悪心または嘔吐；下痢
＊FDA Development and Licensure of Vaccines to Prevent COVID-19 guidance (US Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration (FDA). Guidance for Industry. Development and Licensure of Vaccines to Prevent COVID 19. 2020.ウェブにて閲覧可能（fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/development-and-licensure-vaccines-prevent-covid-19）。２０２０年１０月閲覧。参照により本明細書に組込まれる。
また、被験者は、週に２回までメッセージ連絡を受け、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか否かについて「はい」または「いいえ」で回答する。いずれの試験ワクチン接種においても、ワクチン接種後４日間は、メッセージの送付を開始しない。これにより、この期間に発生する可能性があるワクチン関連反応（発熱、悪寒、頭痛、倦怠感、筋肉痛など）と、潜在的なＣＯＶＩＤ－１９の症状とを混同しないようにする。
訪問時もしくは電話連絡時に症状を報告するか、またはメッセージ連絡で症状があることに「はい」と答えた被験者は、試験スタッフから連絡を受けて、電話面接による追跡調査を行う。（訓練を受けた）試験スタッフは、マニュアルに沿って面接を行い、被験者の医学的状態に関する情報を収集する。この医学的状態を利用して、被験者がＣＯＶＩＤ－１９に罹患している確率を決定する。被験者のＣＯＶＩＤ－１９疾患への罹患が疑われる場合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の検査を受ける（次節を参照）。疑いが低い場合は、引続き電話連絡を行い、被験者の疾患および症状が進行しているかどうかを評価する。併せて、ＣＯＶＩＤ－１９の疑いが、被験者を検査するのに充分なレベルに達しているかどうかも評価する。臨床的判断に基づいて、電話連絡を毎日行うことができる。全ての症候性被験者には、家庭で使用するための体温計および酸素飽和度モニタを提供する。試験スタッフは、１日あたり３～４回以上（または、症状を感じたときはいつでも）、口腔内体温および酸素飽和レベルを測定するように、被験者に指導する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の検査戦略を９．５節に示す。この検査は、２つの検査からなる。一つは、試験スタッフが施設で実施する迅速抗原検査である。もう一つは、指定の中央検査機関で実施する分子に基づくＲＴ－ＰＣＲ検査である。試験責任者ならびにその施設および試験スタッフに応じて、検査用の鼻咽頭スワブサンプルを、施設または家庭訪問のいずれかで採取する。施設への訪問または試験スタッフによる家庭訪問は、「疾患訪問」と見做し、ｅＣＲＦに記録する。
被験者がＲＴ－ＰＣＲ検査陽性によりウイルス学的にＣＯＶＩＤ－１９であることが確認されたら、初発症状が軽症と見られる場合であっても、疾患が消失するまで被験者を追跡する。被験者が入院した場合、被験者の経過を引続き試験責任者が追跡調査し、入院終了時に退院サマリを入手せねばならない。ＣＯＶＩＤ－１９への罹患の臨床症状および徴候、持続期間および重篤度、ならびに治療および転帰に関する情報は、試験スタッフが文書化し、ｅＣＲＦに記録する。以前に疾患を患っている被験者における２回目のＣＯＶＩＤ－１９への罹患は、有効性の主要症例として数えない。ただし、ワクチン接種した被験者におけるＣＯＶＩＤ－１９の２回目の罹患の発生を評価する探索的目的のために計数する。
被験者がＲＴ－ＰＣＲ検査によりウイルス学的に確認されていない場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に未感染の被験者と同様のＣＯＶＩＤ－１９疾患の定期的サーベイランスに戻る。ただし、他の検査によりＮタンパク質に対する血清陽性と判定された場合は除く。
９．２．１．１．２ ＣＯＶＩＤ－１９の非定期的サーベイランス（施設外での陽性試験）
施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者を注意喚起する。これは、検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。
被験者に症状が認められた場合、試験スタッフは、マニュアルに沿って面接を行い、被験者のＣＯＶＩＤ－１９の症状および医学的状態に関する情報を収集する。可及的速やかに被験者を再検査して、結果を確認すべきである。鼻咽頭スワブサンプルを試験依頼者が指定する中央検査機関に送付して、ＲＴ－ＰＣＲ検査を実施すべきである。ＲＴ－ＰＣＲ検査の結果は、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９の確定症例と見做される。被験者がＣＯＶＩＤ－１９に罹患していることが確認された場合は、被験者の疾患が消失するまで追跡調査を実施する（定期サーベイランスで検出された被験者に関して上述した通り）。
被験者がＲＴ－ＰＣＲ検査によりウイルス学的に確認されていない場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に未感染の被験者と同様のＣＯＶＩＤ－１９疾患の定期的サーベイランスに戻る。ただし、他の検査によりＮタンパク質に対する血清陽性と判定された場合は除く。
９．２．１．２ ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例の定義
ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例とは、臨床的に症候性（下記からなる１つ以上の症状；上述のスクリーニング症状と同じものである）のＣＯＶＩＤ－１９を患っている被験者において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＲＴ－ＰＣＲ検査が陽性となることであると定義する。
○発熱または悪寒；呼吸困難または息切れ；味覚または嗅覚の新たな喪失；咳嗽；疲労；筋肉または身体の痛み；頭痛；咽頭痛；鬱血または鼻水；悪心または嘔吐；下痢
この定義は、ウイルス学的に確認された臨床的に症候性のＣＯＶＩＤ－１９症例のうち、全ての重篤度を把握することを意図している。したがって、重篤度（軽症または重症）によって分類されるＣＯＶＩＤ－１９症例は、この症例のサブセットである。
９．２．１．３ 有効性の主要解析のためのＣＯＶＩＤ－１９症例定義
有効性の主要解析においては、症例は下記の基準を満たさねばならない。
・臨床的に症候性のＣＯＶＩＤ－１９を患っている被験者において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＲＴ－ＰＣＲ検査が陽性となることであると定義される、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例でなければならない（９．２．１．２節にて定義した通り）。
○有効性の主要解析では、ＣＯＶＩＤ－１９症例を、「あらゆる重篤度」または「中等症から重症」の重篤度に分類する。
・症状の発症は、２回目のワクチン接種から１５日以上経過してからでなければならない。
・被験者は、登録時において、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９疾患の既往歴を有していてはならない。あるいは、被験者は、２回目の試験ワクチン接種から１５日経過以前において、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例を発症していてはならない（詳細は、１０．２．３節を参照）。
・ベースラインおよび第４３日において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に未感染でなければならない。ベースラインおよび第４３日に採取した血液サンプルが、Ｎタンパク質に対して血清陰性であることと定義する。
主要有効性症例は、裁定委員会によって確認されねばならない。
第４３日は、２回目の投与から１４日後である。この時点で、２回目の投与の後、ＣＶｎＣｏＶに対する免疫応答が成熟し、完全な高さに到達しうる。したがって、１５日後以降から開始する症例の確認は、ＣＯＶＩＤ－１９に対するＣＶｎＣｏＶの完全ＶＥの評価を表している。
９．２．１．４ ＣＯＶＩＤ－１９症例の判定
臨床医の独立委員会を設置して、ＣＯＶＩＤ－１９症例を判定する。委員会は、被験者の処置割付けについて盲検化されている。試験のエンドポイントに合致する下記の質問について、委員が症例を判定する。
・症例は、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例であるか？（「ウイルス学的に確認された」とは、臨床的に症候性（９．２．１．２節にて列挙した症状の１つ以上）のＣＯＶＩＤ－１９を患っている被験者において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＲＴ－ＰＣＲ検査が陽性となることであると定義する）
○ＲＴ－ＰＣＲ検査は、CureVacが指定した中央検査機関で実施されたか？
・症例における症状の発症は、２回目のワクチン接種後１５日以上経過していたか？あるいは、症例のケル症状の発症は、２回目のワクチン接種から１５日経過する前であったか？
・被験者は、ベースラインおよび第４３日において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に未感染であったか？それとも、既感染であったか？（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対して血清陰性または血清陽性であることと定義する）
・被験者は、１８～６０歳であったか？それとも、６１歳以上であったか？
・被験者は、無症候性であったか？無症候性であった場合、ＲＴ－ＰＣＲ検査で陽性となったのは、２回目のワクチン接種後１５日以上経過後か？それとも、経過前か？
・提供された臨床定義に基づいて、軽症または重症のＣＯＶＩＤ－１９症例であったか。
・被験者は、酸素供給を必要としていたか？どのような種類の酸素供給を被験者は受けていたか？
・被験者は、入院したか？被験者は、集中治療室に入室したか？
・被験者は、死亡したか？ＣＯＶＩＤ－１９が原因で死亡したか？それとも、他の原因で死亡したか？
９．２．２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の無症候性症例
本試験では、無症候性のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染に対する積極的サーベイランスは行わない。施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査で陽性であった場合は、直ちに施設に連絡するように、被験者を注意喚起する。これは、検査時において症候性（ＣＯＶＩＤ－１９疾患）であったか無症候性であったかを問わない。症状のない被験者であっても、いくつかの理由で検査されている場合がある。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への既知の感染者との濃厚接触のため、または医療提供者に対する通常のスクリーニングの一環として。
被験者が無症候性である場合、試験スタッフは被験者に直ちに連絡を取り、被験者が報告したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性であった検査について情報を収集する。結果を確認するために、可及的速やかに被験者を再検査すべきである。鼻咽頭スワブサンプルを試験依頼者が指定する中央検査機関に送付して、ＲＴ－ＰＣＲ検査を実施すべきである。ＲＴ－ＰＣＲ検査の結果が陽性であったら、ウイルス学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の確定症例と見做される。
被験者のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が確認された場合、試験スタッフは、ＣＯＶＩＤ－１９の症状の発症に関して被験者を２週間以上追跡調査し、無症候性感染であることを確認する。被験者がＣＯＶＩＤ－１９を発症した場合、ＣＯＶＩＤ－１９症例として被験者を追跡調査する。被験者が無症候性であることが確認された場合、試験スタッフは情報を収集し、適切なｅＣＲＦページに文書化する。
被験者がＲＴ－ＰＣＲ検査によりウイルス学的に確認されていない場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に未感染の被験者と同様のＣＯＶＩＤ－１９疾患の定期的サーベイランスに戻る。ただし、他の検査によりＮタンパク質に対する血清陽性と判定された場合は除く。
９．３ 安全性評価
ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの安全性、反応原性および忍容性を、下記の通りに評価する。
９．３．１ 第２ｂ相の被験者に特有の安全性評価
・反応原性は、各ワクチン接種日および引続く７日間にわたって毎日評価する。評価は、非自発的に記録される局所性有害事象（注射部位の疼痛、発赤、腫脹および掻痒）および非自発的に記録される全身性有害事象（発熱、頭痛、疲労、悪寒、筋肉痛、関節痛、悪心／嘔吐および下痢）を、ｅＤｉａｒｙを用いて収集することにより行う。さらに、他の安全指標を収集する（体温など）。
・ｅＤｉａｒｙは、各ワクチン接種日および引続く２８日間において、自発的に記録される有害事象を収集するための被験者の記憶補助としても使用される。
９．３．２ 第２ｂ相および第３相の全被験者に対する安全性評価
・２回目の試験ワクチン接種後６箇月間において、医学的に認められた有害事象を収集する。
・２回目の試験ワクチン接種後１年間において、特に関心のある有害事象を収集する。監視すべき特に関心のある有害事象には、ｐＩＭＤ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの特に関心のある有害事象、およびワクチン接種に対する免疫応答に影響を及ぼしうる重篤でない併発性医学的状態が含まれる。
・２回目の試験ワクチン接種後１年間において、重篤な有害事象を収集する。
・２回目の試験ワクチン接種後１年間において、ワクチン中止または試験中止に至る有害事象を収集する。
※被験者が２回目の試験ワクチン接種を受けなかった場合、有害事象の追跡調査期間（６箇月または１年間）は、２回目のワクチン接種予定日である第２９日を基準として決定する。
・ｅＤｉａｒｙは、医学的に認められた有害事象、特に関心のある有害事象および重篤な有害事象を収集するための被験者の記憶補助として使用される。
９．３．３ １年間の延長試験における被験者の安全性評価
・延長試験では、特に関心のある有害事象および重篤な有害事象を、最大で１年間収集する。
・ｅＤｉａｒｙは、特に関心のある有害事象および重篤な有害事象を収集するための被験者の記憶補助として使用される。
９．３．４ 有害事象
有害事象／重篤な有害事象の定義；有害事象／重篤な有害事象／妊娠／過剰投与の記録、評価、追跡調査および報告の手順；ならびに、有害事象の程度および因果関係の評価。
ＣＯＶＩＤ－１９の疾患およびその合併症／後遺症は、試験の有効性エンドポイントと一致している。そのため、これらを有害事象として記録すべきではないことに留意することが重要である。これらのデータは、試験で発生したＣＯＶＩＤ－１９症例の疾患（予想された試験の転帰）について、関連するｅＣＲＦページに取り込まれる。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９の疾患およびその合併症／後遺症は、たとえその事象が重篤な有害事象の基準を満たしている可能性があっても、標準的な重篤な有害事象の迅速化プロセスに従って報告しない。
９．３．４．１ 非自発的に記録される有害事象
第２ｂ相試験の全被験者にｅＤｉａｒｙを配布し、ワクチン接種日および引続く７日間において、非自発的に記録される局所性有害事象（注射部位の疼痛、発赤、腫脹および掻痒）および非自発的に記録される全身性有害事象（発熱、頭痛、疲労、悪寒、筋肉痛、関節痛、悪心／嘔吐および下痢）を収集する。被験者には、体温を経口測定するための体温計と、局所注射部位反応の大きさを測定するための測定テープとが与えられる。非自発的に記録される有害事象を７日間にわたりｅＤｉａｒｙに入力する方法を、被験者に指導する。
非自発的に記録される有害事象は、「なし」「軽度」「中等度」および「重度」の強度スケールで評価する（上記の表Ａおよび表Ｂ）。定義上、非自発的に記録される局所性有害事象は全て、試験ワクチン接種との関連があると見做される。試験責任者は、非自発的に記録される全身性有害事象について、試験ワクチンと有害事象の発生との関係を評価し、有害事象の重篤度を評価する（表Ｂ）。
被験者に懸念があるまたは期間が長期にわたる場合には、試験責任者に対して、グレード３の非自発的に記録される有害事象を直ちに報告せねばならない。関連するグレード３の非自発的に記録される有害事象が１日以上にわたりｅＤｉａｒｙで報告された場合、被験者に質問し、有害事象の全期間をできるだけ正確に記載する。
９．３．４．２ 自発的に記録される有害事象および重篤な有害事象
ワクチン接種日および引続く２８日間において発生した自発的に記録される有害事象は、２回の試験ワクチン接種のそれぞれについて、第２ｂ相の被験者ごとに記録する。
第２ｂ相および第３相の全被験者について２回目の試験ワクチン接種後６箇月間、医学的に認められた有害事象を収集する。２回目の試験ワクチン接種後１年間、特に関心のある有害事象を収集する（９．３．４．３節を参照）。２回目の試験ワクチン接種後１年間、重篤な有害事象を収集する。延長試験においては、特に関心のある有害事象および重篤な有害事象を、さらに最大１年間継続して収集する。
医学的に認められた有害事象とは、身体検査またはワクチン接種のための通常の訪問ではない、医療を伴う訪問が含まれる有害事象であると定義する。医療を伴う訪問とは、入院のための訪問、救急治療室への訪問、または予定外の医療従事者（医師）への訪問などであり、理由は問わない。
有害事象（重篤な有害事象および非重篤な有害事象）の発生は、各訪問時に、皮脂構成の質問を被験者に対して行い評価する。被験者が訪問時または訪問間にｅＤｉａｒｙに記入することにより自発的に提出した有害事象、または、全試験期間中に観察、身体検査、臨床検査またはその他の評価により検出した有害事象を、ｅＣＲＦに記録する。は重篤な症状、自覚的な愁訴、または健康状態の客観的変化を伴う有害事象が認められた場合には、直ちに試験責任者または施設職員に報告するように、被験者に指導する。これは、事象と試験ワクチンとの間に認められた関連性にかかわらず報告する。
試験責任者は、試験ワクチンと、それぞれの有害事象／重篤な有害事象の発生との関係を評価する。
ワクチン接種に対する免疫応答に影響を及ぼす可能性のある非重篤な併発性の医学的状態も、試験期間を通じて収集する。
９．３．４．３ 特に関心のある有害事象
ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験においては、２回目の試験ワクチン接種後１年間、特に関心のある有害事象を収集する。延長試験では、さらに最大１年間、特に関心のある有害事象を収集する。下記の事象を、本試験において特に関心のある有害事象と見做す。
・上述の潜在的な免疫媒介疾患（ｐＩＭＤ）の免疫媒介性病因が疑われる有害事象。
セリアック病；クローン病；潰瘍性大腸炎；潰瘍性直腸炎；自己免疫性胆管炎；自己免疫性肝炎；原発性胆汁性肝硬変；原発性硬化性胆管炎；アジソン病；自己免疫性甲状腺炎（橋本甲状腺炎を含む）；１型糖尿病；グレーヴズ病またはバセドウ病；抗合成酵素症候群；皮膚筋炎；若年性慢性関節炎（スチル病を含む）；混合性結合組織障害；リウマチ性多発筋痛；多発性筋炎；乾癬性関節障害；再発性多発軟骨炎；関節リウマチ；強皮症（びまん性全身型およびＣＲＥＳＴ症候群などを含む）；脊椎関節炎（強直性脊椎炎、反応性関節炎（ライター症候群）および未分化脊椎関節炎などを含む）；全身性エリテマトーデス；全身性強皮症；急性散在性脳脊髄炎（非感染性脳炎、脳脊髄炎、脊髄炎、脊髄神経根脊髄炎などの部位特異的な類似疾患も含む）；脳神経障害（麻痺／不全麻痺（ベル麻痺など）を含む）；ギラン－バレー症候群（ミラー－フィッシャー症候群および他の類似疾患を含む）；免疫媒介性末梢神経障害；パーソネイジ－ターナー症候群および神経叢障害（慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多巣性運動ニューロパチー、単クローン性免疫グロブリン血症を伴う多発ニューロパチーなどを含む）；多発性硬化症；ナルコレプシー；視神経炎；横断性脊髄炎；円形脱毛症；自己免疫性水疱性皮膚疾患（天疱瘡、類天疱瘡および疱疹状皮膚炎を含む）；皮膚エリテマトーデス；結節性紅斑；斑状強皮症；扁平苔癬；乾癬；スイート症候群；白斑；大血管の血管炎（高安動脈炎および側頭動脈炎などの巨細胞性動脈炎を含む）；中型および／または小型血管の血管炎（結節性多発動脈炎、川崎病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ－ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫性血管炎）、バージャー病（閉塞性血栓性血管炎）、壊死性血管炎および抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）陽性血管炎（型は不特定）、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、白血球破砕性血管炎などを含む）；抗リン脂質抗体症候群；自己免疫性溶血性貧血；自己免疫性糸球体腎炎（ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎およびメサンギウム増殖性糸球体腎炎を含む）；自己免疫性心筋炎／心筋症；自己免疫性血小板減少症；グッドパスチャー症候群；特発性肺線維症；悪性貧血；レイノー現象；サルコイドーシス；シェーグレン症候群；スティーブンス－ジョンソン症候群；ブドウ膜炎
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの開発または標的疾患に関連するその他の有害事象には、下記がある。
アナフィラキシー；血管炎；免疫化後の疾患増悪；小児における多系統炎症性症候群；急性呼吸器促迫症候群；ＣＯＶＩＤ－１９疾患；急性心傷害；微小血管障害；心不全および心原性ショック；ストレス性心筋症；冠動脈疾患；不整脈；心筋炎；心膜炎；血小板減少症；深部静脈血栓症；肺塞栓；脳血管発作；四肢虚血；出血性疾患；急性腎傷害；肝傷害；全身性痙攣；ギラン・バレー症候群；急性散在性脳脊髄炎；無嗅覚・味覚消失；髄膜脳炎；凍瘡様病変；単一臓器皮膚血管炎；多形紅斑；免疫化後の重篤な局所性／全身性有害事象
・ワクチン接種に対する免疫応答に影響を及ぼす可能性のある非重篤な併発医学的状態にも、試験期間を通じて収集する。
９．３．５ 妊娠
妊娠は、本試験への登録の除外基準である。しかし、被験者が本試験に積極的に参加している際に妊娠する可能性がある。
９．３．６ 安全性の臨床検査評価
妊娠検査用の尿サンプルは、試験ワクチン接種の１日前に妊娠の可能性のある女性から採取し、適格性を確立させる。２回目のワクチン接種前である第２９日にも尿妊娠検査を実施し、引続き適格性を判定する。
９．３．７ バイタルサインおよび身体検査
第２ｂ相および第３相の全訪問時に、被験者を座位で５分間安静にさせた後、バイタルサイン（体温、収縮期／拡張期血圧および脈拍）を、標準化された方法で記録する。
第１日の初回訪問時および第３９３日の試験終了時に、ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験の全被験者に対して、完全な身体検査を実施する。完全な身体検査には、全身状態、眼／耳／鼻／咽頭、頭部／頸部／甲状腺、リンパ節領域、心血管系、肺／胸部、腹部および腎尿路生殖器系、四肢および神経学的検査、皮膚検査、体重および身長の測定を含が含まれる。他の全ての試験訪問時には、症状指向の身体検査を実施する。
９．３．８ 既往歴および手術歴
登録前に被験者に認められた全ての有意な所見および既存の状態は、ｅＣＲＦの関連する既往歴／現在の病状スクリーニングで報告せねばならない。
第１日において進行中であると特定された既往歴および手術歴ならびに随伴する医学的状態に関する情報を提供せねばならない。
９．３．９ 監視委員会
９．３．９．１ データおよび安全性監視委員会（ＤＳＭＢ）
独立したＤＳＭＢを招集して、次のことを行う。
(i)本試験（ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４）に参加した被験者の安全性を監督する。
(ii)試験の進行および実施を評価する。
(iii)試験の累積安全性データを審査する。
(iv)潜在的な安全上の問題がある有害事象を継続的審査する（５．５．２節を参照）。
(v)試験を継続するか、変更するか、または一時停止するかを試験依頼者に勧告する（５．５．２節を参照）。
ＤＳＭＢは、これらの責任を果たすために、定期的に予定された会議を開催する。会議の際に、ＤＳＭＢには、ＣＶｎＣｏＶの他の進行中の臨床試験で作成されている安全性データも通知する。５．５．２節に記載の通り、被験者の安全性を継続的に保証するために、潜在的な安全上の問題がある有害事象の一覧を、ＤＳＭＢの委員長（または被指名人）が定期的に監視する。７．３．２節に記載の通り、ＤＳＭＢは、試験中の任意の時点において、個々の被験者または特定のデータセットの盲検解除を要求することができる。
安全性データに加えて、ＤＳＭＢは、中間解析時または可能であれば試験期間中の他の時点において、有効性データを審査するよう求められる。この審査は、試験のリスク・ベネフィットを継続的に評価することを目的とする。リスク・ベネフィット分析の一環として、ＤＳＭＢは、ＶＤＥのシグナルについてＣＯＶＩＤ－１９症例を定期的に監視する。ＤＳＭＢは、必要に応じて、ＣＯＶＩＤ－１９症例の発現率の盲検解除審査を実施して、サンプルサイズの増加を推奨するよう依頼される。
ＤＳＭＢ憲章には、ＤＳＭＢの構成および目的、ＤＳＭＢ・ＣｕｒｅＶａｃ・ＣＲＯの責任、ＤＳＭＢ会議予定および実施、審査するデータセットが詳細に記載されている。憲章には、ＤＳＭＢの統計分析プラン（ＳＡＰ）が含まれる。
９．３．９．２ 裁定委員会
臨床医の独立委員会を設置して、主要エンドポイントを評価するためにＣＯＶＩＤ－１９症例を判定する。委員会は、被験者の処置割付けについて盲検化されている。９．２．１．４節に記載の質問について、委員が症例を判定する。会議の日程および症例の判定に対するアプローチは、憲章に定義されている。委員長は、アドホックな参加者として、ＤＳＭＢ会議に出席する。
９．４ 免疫原性評価
免疫原性の結果は、被験者の処置割付けを盲検解除することになる。そのため、アッセイを実施する試験機関は、その結果を厳格な信頼度で保持する。試験開始時に指名され、試験の実施とは独立な盲検解除担当者は、免疫原性データの質を定期的に審査する。盲検解除担当者は、厳格な信頼度で結果を維持する。
９．４．１ ＣＶｎＣｏＶワクチン接種に対する抗体反応（Ｓタンパク質のＲＢＤおよびウイルス中和抗体）
ＣＶｎＣｏＶワクチン接種に対する抗体反応は、本試験の第２ｂ相部分の免疫原性サブセットの被験者についてのみ評価する。延長試験においては、ワクチン接種後２年目における抗体の持続性を３箇月ごとに評価する。
ＣＶｎＣｏＶのワクチン接種により誘導される免疫応答を、２種類のアッセイにより評価する。
・イムノアッセイで測定する、血清中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに結合する抗体。
・機能活性アッセイで測定する、血清中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するウイルス中和抗体。
９．４．２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｎタンパク質）に対する抗体反応
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体反応は、上記に規定した時点において、試験の全部分および全被験者について評価する。抗体反応は、イムノアッセイにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質（ワクチンコンストラクトに含まれていないウイルス抗原）に結合する抗体を測定することにより行う。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の事前感染の決定するために、Ｎタンパク質に関する血清学的状態を下記の項目に使用する。
１． 試験登録時および第４３日において、被験者がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染に対して未感染であったか既感染であったかを、遡及的に判定すること。
ａ． 未感染の被験者におけるＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールの有効性を評価するためには、ベースラインおよび第４３日において、被験者はＮタンパク質に対して血清陰性でなければならない。
ｂ． 未感染の被験者におけるＣＶｎＣｏＶの１回目の投与後の有効性を評価するためには、ベースラインにおいて、被験者はＮタンパク質に対して血清陰性でなければならない。
２． ＣＶｎＣｏＶの２回投与スケジュールによるワクチン接種により、試験期間中において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を低減できるかどうかを判定すること。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染は、血清陰性の被験者における、Ｎタンパク質に対するセロコンバージョンによって決定されれる。１ａに記載の通り、これらの被験者は、ベースラインおよび第４３日において、Ｎタンパク質に対して血清陰性でなければならない。
９．４．３ ＣＯＶＩＤ－１９症例を発症した被験者におけるＣＶｎＣｏＶワクチン接種に対する抗体反応
試験中に発生したＣＯＶＩＤ－１９の全症例について、試験ワクチン接種に対する抗体反応を、被験者の血液サンプルから判定する。血液サンプルは、試験の第１日（ワクチン接種前のベースライン）、第４３日、第２１１日、および第３９３日に採取する。これらのアッセイは、免疫原性サブセットに属さない第２ｂ相部分の被験者および第３相の被験者に対してのみ実施する必要がある。第２ｂ相の免疫原性サブセットに属する被験者は、コホートの一部として、既にこれらのアッセイを実施されている。これらの結果を用いて、ＣｖｎＣｏＶワクチン接種により誘導される防御性免疫の相関を探索する。
９．４．４ 細胞性免疫
ＣＭＩは、４００人の被験者を対象として評価する（ＣＶｎＣｏＶ投与群：２００人、プラセボ投与群：２００人）。ＣＶｎＣｏＶ群およびプラセボ群は、いずれも、１８～６０歳の被験者が１００人、６１歳以上の被験者が１００人とする。この評価は、ヨーロッパのある臨床施設およびラテンアメリカの他の臨床施設にて実施することを意図している。各施設とも、約１００人のＣＶｎＣｏＶ群および約１００人のプラセボ群の被験者が参加する。
ＰＢＭＣにおいて、ベースラインと比較した、抗原刺激後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのＲＢＤに特異的なＴ細胞応答の頻度および機能性を測定する。例えば、Ｔｈ１応答およびＴｈ２マーカーの産生を調べるＩＣＳを用いて、ベースラインからのＴｈ１シフトがワクチン接種により誘導されるかどうかを検討する。さらなる高プロファイリングのＴ細胞免疫応答は、他の技術を用いて検討できる（ＥＬＩＳｐｏｔ、ＣｙＴＯＦ、ゲノムバイオマーカーの分析、または任意の他の確立されたアッセイなど）。ＣＭＩ評価は、第１日（ベースライン）、第２９日、第４３日、第１２０日および第２１１日に実施する。なお、第１２０日および第２１１日の検査は、第２９日および／または第４３日にＴ細胞応答者と判定された被験者に対してのみ実施する。
９．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の検査
９．５．１ ＣＯＶＩＤ－１９疾患のウイルス学的確認
試験期間中、ＣＯＶＩＤ－１９疾患への罹患が臨床的に疑われる被験者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの検査を受ける（下記の通り）。検査のためのサンプル採取は、試験スタッフによって、施設または家庭訪問で実施することもある。理想的には、症状の発症から５日以内にサンプルを採取すべきである。試験結果は、適切なｅＣＲＦページに記載する。
・ＣＯＶＩＤ－１９が臨床的に疑われる被験者は、施設で行う迅速抗原検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染の検査を実施し、結果を被験者に提供する。鼻咽頭スワブを用いて、迅速抗原検査のサンプルを採取する。
・迅速抗原検査の結果にかかわらず、同時に採取した鼻咽頭スワブサンプルを中央検査機関に送付し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＲＴ－ＰＣＲ検査を実施する。ＲＴ－ＰＣＲ検査の結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を確定させると見做す。被験者から採取できるサンプルが１つのみである場合には（可能性は低いが）、中央検査機関でＲＴ－ＰＣＲ法によりサンプルを検査すべきである。
○ＲＴ－ＰＣＲ検査が陰性であるが、被験者の接触履歴および臨床像からＣＯＶＩＤ－１９が依然として疑われる場合は、可及的速やかに他の鼻咽頭スワブサンプルを採取し、中央検査機関に送付して、ＲＴ－ＰＣＲ検査を実施すべきである。ＲＴ－ＰＣＲによる再検査の結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を確定させると見做される。
・全ての検査で陰性であった被験者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して未感染であると見做す。被験者が、迅速抗原検査では陽性でありＲＴ－ＰＣＲでは陰性である場合には（可能性は低いが）、ＲＴ－ＰＣＲによるウイルス学的確認が陽性でない限り、被験者は依然として未感染であると見做される。ただし、他の検査によりＮタンパク質に対する血清陽性と判定された場合は除く。
９．５．２ 施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染検査の陽性確認
施設外で実施したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染検査での陽性を報告した被験者の追跡調査については、９．２．１．１．２節および９．２．２節を参照。
施設外で実施されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染検査で陽性を報告した被験者（症候性または無症候性）は、検査の種類にかかわらず、可及的速やかに再検査し、結果を確認する。鼻咽頭スワブサンプルを中央検査機関に送付して、確認のためのＲＴ－ＰＣＲ検査をすべきである。中央検査機関での再検査の結果は確定的であると見做される。
１０ 統計的考察
１０．１ サンプルサイズの決定
１０．１．１ 有効性の主要目的
本試験は、イベント主導型臨床試験である。サンプルサイズおよび検出力の考察は、ＣＯＶＩＤ－１９症例の予防におけるＣＶｎＣｏＶの有効性を実証するための共通の主要目的に基づいている。ここで言うＣＯＶＩＤ－１９症例とは、主要症例定義を満たす、あらゆる重篤度または中等症から重症のウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例である。群逐次設計には、あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例を対象とする２回の中間解析が含まれる。中間解析では、有効性が高いか、無益性に達しているかを実証する。中間解析では、O’Brien and Fleming型のエラー支出関数（Lan et al.1983）を用いる。サンプルサイズは１つの割合（全症例におけるのＣＶｎＣｏＶ群の症例の割合）についての試験に基づいている。群逐次設計は、あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９エンドポイントに基づいている。これは、このエンドポイントを満たすためにはより多くの症例数が求められるためである。
２つの主要目的に対する第一種の過誤を制御するために、全体の両側αである５％を、２つの主要目的の間で等しく分割する。全体の両側αを２．５％とすると、最終解析において必要となるのは、合計１８５例のあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例（あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９の有効性の主要症例定義を満たしている）である。これにより、対立仮説におけるＶＥを６０％としたときに、９０％の検出力で、ＶＥが３０％超であることを実証する（ＶＥの信頼区間の下限値に基づく）。すなわち、ＣＶｎＣｏＶ群の症例の割合が０．４１１８未満であることを同じく実証する（対立仮説における割合を０．２８５７とした場合の信頼区間の上限値に基づく）。
全体の両側αを２．５％とすると、最終解析において必要となるのは、合計６０例の中等症から重症のＣＯＶＩＤ－１９症例（中等症または重症のＣＯＶＩＤ－１９の有効性の主要症例定義を満たしている）である。これにより、対立仮説におけるＶＥを７０％としたときに、９０％の検出力で、ＶＥが２０％超であることを実証する（ＶＥの信頼区間の下限値に基づく）。すなわち、ＣＶｎＣｏＶ群の症例の割合が０．４４４４未満であることを同じく実証する（対立仮説における割合を０．２３０８とした場合の信頼区間の上限値に基づく）。あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例の１／３が中等症から重症であれば、ＣＯＶＩＤ－１９症例の総数が１８０例であれば、６０例の中等症から重症の症例が得られる。このエンドポイントについては、中間解析は計画されていない。
５６／１１１症例が集積した時点において（症例の約３０％／６０％）、あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例の高い有効性または無益性について、２回の中間解析を実施する。
プラセボ被験者におけるＣＯＶＩＤ－１９の発現率が１箇月あたり０．１５％であり、全体の評価不能率が２０％（ＥＡＳおよび脱落した被験者に対応する）であり、ＶＥが６０％であると仮定する。この場合、約３箇月間にわたって登録された３６，５００人（ワクチン群は１８，２５０人）の被験者から、１回目のワクチン接種から約９箇月後において、１８５症例のあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例が集積されることになる。発症率が低い、登録期間が長い、または評価不能率もしくはＶＥが高い場合には、１８５例の取得および最終解析の時期を遅らせる。ＣＶｎＣｏＶ群またはプラセボ群のいずれかに、１：１の割合で被験者をランダム化し、国および年齢群（１８～６０歳および６１歳以上）により層別化する。
１０．１．２ 枢要な有効性の副次的目的
ウイルス学的に確認された重症のＣＯＶＩＤ－１９症例の予防を評価する枢要な有効性の副次的目的については、最終解析の際に、主要エンドポイントよりも少ない症例数を収集する。Verity et al. 2019による大規模データベース解析に基づくと、ＣＯＶＩＤ－１９症例の約２０％は臨床的に重症または致命的と定義できる。このうち後者は、集中治療を必要とする。
重症のＣＯＶＩＤ－１９が３７症例であるとき（１８５症例の２０％）、本試験は、９５％信頼区間の下限でＶＥが１０％超であることを、８８％の検出力で検出する（ＶＥは７０％とする）。重症例に対するＶＥが７５％である場合、検出力は９０％に増加する。ＨＥＲＡＬＤ ＣＶ－ＮＣＯＶ－００４試験では、評価可能な全被験者を１年間完全に追跡するので、２回目のワクチン接種後にＣＯＶＩＤ－１９症例数がさらに増えれば、重症疾患に対するＣＶｎＣｏＶの有効性評価がよりロバストになると期待される。この分析はＳＡＰに提示される。
次の枢要な有効性の副次的目的に関して、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症の４５％が無症候性であると仮定すると（Daniel et al. 2020）、評価可能な全被験者について、２回目のワクチン接種後に１年間の追跡調査を完了した後、約３００例の無症候性感染が予測される。この症例数では、本試験は、９５％信頼区間の下限でＶＥが０％超であることを、８０％の検出力で検出する（無症候性感染に対するＶＥを２８％とする）。
１０．２ 解析対象集団
安全性解析対象集団（ＳＡＳ）、安全性解析対象集団２（ＳＡＳ２）、非自発的に記録される有害事象の安全性解析集団（ＳＡＳｓｏｌ）において、実際に投与された群（処置群）について被験者を解析する。
有効性集団およびプロトコルごとの集団の処置の意図の原則に従い、被験者がランダム化された群の中で解析する（ランダム化して解析する）。
１０．２．１ 安全性解析集団（ＳＡＳ）
ＳＡＳには、第２ｂ相または第３相においてランダム化された全被験者が含まれる。この被験者は、ＣＶｎＣｏＶまたはプラセボを１回以上投与されている。
ＳＡＳは、全被験者から収集される安全性のエンドポイント（医学的に認められた有害事象、特に関心のある有害事象、試験の撤回または中止に至る有害事象、および重篤な有害事象）の主要集団である。ＳＡＳは、１回目の投与後の有効性評価の目的に関する主要集団でもある。
１０．２．２ 安全性解析集団２（ＳＡＳ２、ＳＡＳｓｏｌ）
非自発的に記録される有害事象および自発的に記録される有害事象は、第２ｂ相の被験者のみを対象として収集する。そのため、これらの解析は、第２ｂ相の被験者に限定する。
ＳＡＳ２集団には、ＳＡＳの全ての第２ｂ相被験者が含まれる。ＳＡＳ２集団は、自発的に記録される有害事象の解析に使用する。
ＳＡＳｓｏｌ集団には、ＳＡＳの全ての第２ｂ相被験者が含まれており、１つ以上の日記集には非自発的に記録される有害事象の発生の有無が記載されている。ＳＡＳｓｏｌ集団は、非自発的に記録される有害事象の解析に使用する。
１０．２．３ 有効性解析対象集団（ＥＡＳ）
ＥＡＳには、下記の条件を満たす第２ｂ相または第３相においてランダム化された全被験者が含まれる。
・処置割付けに従って、試験ワクチンの両方の接種を受けた（ＣＶｎＣｏＶまたはプラセボの２回接種）。
・試験開始前（除外基準１に基づく）または２回目のワクチン接種後１５日経過前に、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例を発症していない。
・２回目のワクチン接種から１５日経過前に試験を中止していない。
・ベースラインにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に未感染であった。ベースラインにおいて採取した血液サンプルがＮタンパク質に対して血清陰性であることに基づく。
ＥＡＳは、全ての有効性エンドポイントの主要解析対象集団とする。ただし、セロコンバージョンに関する枢要な有効性の副次的エンドポイントと、１回目の投与後における有効性を評価する有効性エンドポイントとを除く。
１０．２．４ セロコンバージョンに関する有効性解析対象集団（ＥＡＳＳ）
ＥＡＳＳ集団に含まれるのは、次の条件を満たしている、ＥＡＳの全被験者である。(i)ベースラインおよび第４３日において（すなわち、２回目のワクチン接種後１５日間が経過する前の全ての検査時点において）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対して血清陰性である。(ii)２回目のワクチン接種後１５日以上経過後（第２１１日または第３９３日）の、Ｎタンパク質に関する１つ以上の血清学的検査結果を解析利用できる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対するセロコンバージョンに関する枢要な有効性の副次的エンドポイント（無症候性感染）の主要解析は、この集団を対象に実施する。
１０．２．５ プロトコルごとの有効性集団（ＰＰＥ）
プロトコルごとの有効性集団には、試験開始時に全ての適格性基準を満たしており、ＳＡＰに規定される有効性転帰に影響を及ぼすような試験実施計画書からの重大な逸脱がないＥＡＳ被験者が含まれる。
ＰＰＥは、有効性エンドポイントに関する副次的集団とする。ただし、セロコンバージョンに関する枢要な有効性の副次的エンドポイントと、１回目の投与後における有効性を評価する有効性の副次的エンドポイントとを除く。
１０．２．６ プロトコルごとの免疫原性集団（ＰＰＩ）
ＰＰＩ集団には、免疫原性サブ集団（ＩＳ）に属する全ての第２ｂ相被験者が含まれる。すなわち、第２ｂ相（１８～６０歳および６１歳以上）の２種類の年齢群のそれぞれに登録した被験者のうち最初の６００人であって、下記の条件を満たす被験者が含まれる。
・処置割付けに従い、試験実施計画書に定義された期間内に、試験ワクチンの両方の接種を受けた
。
・ＳＡＰに規定される有効性転帰への影響が予想される試験実施計画書からの重大な逸脱がない
・提案されている免疫原性測定の一方または両方に干渉する可能性のある治療を受けていない（血液製剤、免疫グロブリン療法など）。
・２回目のワクチン接種から１４日後（第４３日）以降に採取された、解析に利用できる１つ以上の血液サンプルがある。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対する抗体反応およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和抗体については、ＰＰＩを主要解析集団とする。
ＰＰＥ／ＰＰＩから除外すべき被験者を特定し、試験の盲検解除前に開催される盲検データ審査会議で審査する。主な試験実施計画書からの逸脱を記載し、要約する。
表１８は、各エンドポイントの解析のために計画されている主要集団および副次的集団の要約である。他の解析集団を、ＳＡＰの中から定義してもよい。
Figure 2023513502000046
１０．３ 統計解析
１０．３．１ 一般的考察
５回の解析が計画されている。内訳は、２回の中間解析（５６／１１１症例に達した時点）、最終解析（１８５症例に達した時点）、１年間の追跡調査（第３９３日の訪問までの全データ）、および２年間の追跡調査（延長試験終了までの全データ）である。中間解析および最終解析のためのＳＡＰは、最新データベースが確定する前に、準備・最終化される。本書は、解析変数および解析方法の定義に関するさらなる詳細を提供し、これにより、全ての試験の目的および欠測データの取扱いに対処する。最終解析のために計画される全ての解析は、１年間の追跡調査および２年間の追跡解析のために再生成される。
１０．３．２ 人口統計学、既往歴、その他のベースライン特性
人口統計およびベースライン特性（年齢、性別、身長、体重など）、既往歴、ベースラインの免疫状態、ならびに記述統計量（定量データ）および分割表（定性データ）を用いる全ての安全性測定値についてデータを要約する。データの要約は、全体、ワクチン群ごと、ならびに年齢群およびワクチン群ごとに行う。
１０．３．３ 試験のワクチン投与
ＣＶｎＣｏＶまたは対照の投与を一覧表にし、実際にワクチン接種を受けた被験者数をワクチン群ごとに要約する。
１０．３．４ 併用薬およびワクチン接種
試験開始後の併用薬／ワクチン接種を、解剖学治療化学用語を用いて一覧表にし、要約する。要約は、全体およびワクチン群ごとに行う。
１０．３．５ 有効性の解析
１０．３．５．１ 有効性の主要エンドポイントの共解析
有効性の主要解析
有効性の主要解析では、プラセボを投与した被験者と比較したワクチン接種した被験者における、ＣＯＶＩＤ－１９のあらゆる症例および中等症から重症の症例の頻度（主要症例定義による）の減少率として定義するＶＥを計算する。信頼区間は厳密に９５％である。計算式は、下記の通りである。
ＶＥ＝１－ＲＲ＝１－（ＡＲＶ／ＡＲＰ）＝１－｛ｐ／ｒ（１－ｐ）｝
式中、
ＡＲＶ＝ワクチン接種群の攻撃率＝ｎｖ／Ｎｖ＝ＣＶｎＣｏＶ群のうち１回以上のＣＯＶＩＤ－１９への罹患を報告した被験者数／ＣＶｎＣｏＶ群の評価可能な被験者の追跡調査期間の合計（人月数）
ＡＲＰ＝プラセボ群における攻撃率＝ｎｐ／Ｎｐ＝プラセボ群のうち１回以上のＣＯＶＩＤ－１９への罹患を報告した被験者数／プラセボ群の評価可能な被験者の追跡調査期間の合計（人月数）
ＲＲ＝相対リスク＝ＡＲＶ／ＡＲＰ
ｐ＝全症例におけるＣＶｎＣｏＶ群に由来するＣＯＶＩＤ－１９症例（主要症例定義による）の割合＝ｎｖ／（ｎｖ＋ｎｐ）
ｒ＝ＣＶｎＣｏＶ群の評価可能被験者の追跡調査期間の合計のプラセボ群の評価可能被験者の追跡調査期間の合計に対する比率＝Ｎｖ／Ｎｐ
＊信頼区間のレベルは、逐次設計により多少は調整できる（１０．３．８節を参照）。
有効性の主要エンドポイントに関する統計仮説は、下記のとおりである。
・Ｈ０Ａ：ＶＥ≦３０％ vs. Ｈ１Ａ：ＶＥ＞３０％
かつ
・Ｈ０Ｓ：ＶＥ≦２０％ vs. Ｈ１Ｓ：ＶＥ＞２０％
Ａは、あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例と関連している。
Ｓは、中等症から重症のＣＯＶＩＤ－１９症例に関連している。
あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例について、ＶＥエンドポイントの両側９７．５％の信頼区間の厳密な下限値（ＬＬ）が３０％超であるならば、試験は成功である（信頼区間は、逐次設計を考慮して多少調整する）。あるいは、中等症から重症のＣＯＶＩＤ－１９症例について、ＶＥエンドポイントの両側９７．５％信頼区間の下限値（ＬＬ）が２０％超であるならば、試験は成功である。
あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例について、２回の中間解析および最終解析を、５６／１１１症例および１８５症例が報告されたのちに行うとする。このとき、最終解析の時点において考慮すべき片側αリスクは、O'Brien Fleming型エラー支出関数によると、０．０１２０９である。そして、最終解析において、１８５症例のうち６０症例以下がＣＶｎＣｏＶ群であれば、有効性が実証される（観測されるＶＥ：５２．０％以上）。中等症から重症のＣＯＶＩＤ－１９症例については、片側αリスクは０．０２５である。そして、最終解析において、６０症例のうち１７症例以下がＣＶｎＣｏＶ群であれば、有効性が実証される（観測されるＶＥ：６０．５％以上）。注意すべき点として、有効性を実証するための症例の分割に関するルールは、ｒ≠１であればわずかに異なる場合がある（追跡調査期間の合計が両群で異なる場合）。
感度解析
枢要な感度解析として、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９症例（主要症例定義による）の初発までの時間を解析する。
カプラン－マイヤー曲線によると、ＣＯＶＩＤ－１９を発症しない推定確率が示される。ログランク検定を実施する。
ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９の初発までの期間（症状発現日）は、２回目のワクチン接種から１５日後から起算とする。
ＣＯＶＩＤ－１９を発症しなかった被験者は、試験終了日または解析用のカットオフ日のいずれか早い方で打切る。
追加の感度解析には、ＳＡＰにおいて特定した関連するベースライン共変量で調整したＣｏｘ比例ハザード回帰モデルを含めることができる。
解析方法の詳細については、ＳＡＰで説明する。
１０．３．５．２ 枢要な有効性の副次的エンドポイントの解析
２つの有効性の副次的エンドポイントの統計検定は、条件付き階層的検定手順に従って実施する。この際、目的／エンドポイントの節に義されているた順序を採用する。したがって、下記のことが言える。
・重症例に対するＣＶｎＣｏＶの有効性は、有効性の主要目的の実証が成功した場合にのみ実証される。
・無症候性感染に関するＣＶｎＣｏＶの有効性は、有効性の主要目的および副次目的が重症例において実証に成功した場合にのみ実証される。
あるいは、これらのエンドポイントは、成功基準の検定をしない探索的エンドポイントとして解析する。
重症疾患および無症候性感染の予防における有効性を評価するために、有効性の主要エンドポイントについて実施した解析と同様の解析を実施する。重症疾患に関しては、ＶＥの厳密な両側９５％信頼区間のＬＬが１０％超である場合に、有効性が実証される。無症候性感染に関しては、ＶＥの厳密な両側９５％信頼区間のＬＬが０％超である場合に、有効性が実証される。
その他の有効性の副次的エンドポイントについては、有効性の主要エンドポイントと同様に解析する。ただし、これらのエンドポイントに対しては、正式な検定は実施しない。１回目の投与後の有効性については、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９の初発までの期間（症状発現日）は、初回ワクチン接種後から起算とする。ＢｏＤは、２種類の異なるスコアリングシステムを用いて解析する。いずれのＢｏＤスコアリングシステムも、重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患または重症疾患（入院または死亡として反映される）に対する有効性に重点を置いている。さらに、ＶＥおよび関連する信頼区間を、ＢｏＤカテゴリのそれぞれについて計算する。
１０．３．５．３ 有効性の探索的なエンドポイントの解析
全症例における中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９症例（主要症例定義による）の割合を、群ごとに要約する。
下記の被験者について、頻度および割合を群ごとに記載する。
・ＣＯＶＩＤ－１９が原因で酸素供給が必要となった。
・ＣＯＶＩＤ－１９が原因で人工換気が必要となった。
・ＣＯＶＩＤ－１９が原因で入院した。
・ＣＯＶＩＤ－１９が原因で死亡した。
・何らかの原因で死亡した。
この解析は、２回目の試験ワクチン接種後１５日以上経過してから発生した事象（完全ＶＥ）に対して実施する。また、１回目の試験ワクチン接種後の任意の時点で発生した事象に対しても実施する。
全被験者について、ウイルス学的に確認されたあらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例への１回目の罹患の予防におけるＶＥを評価する。この評価は、ベースラインにおける血清学的状態にかかわらず、２回目の試験ワクチン接種から１５日間以上後に発生した症例を対象とする。また、１回目の投与に発生した全症例も対象とする。
最後に、２回目のＣＯＶＩＤ－１９への罹患を経験した被験者の数および百分率を、群ごとに示す。
１０．３．６ 副次的および探索的免疫原性解析
免疫原性に関する正式な仮説は検証しない。免疫原性エンドポイントの記述統計量を、全体、ワクチン群ごと、ならびにワクチン群および年齢群ごとに示す。各回のワクチン接種後にデータを提示する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対する抗体レベルおよび中和抗体について、下記の解析を実施する。解析は、ベースラインにおける被験者の血清陰性または血清陽性を区別して、または区別せずに全体として実施する。
・各採血時点における力価の幾何平均（ＧＭＴ）を、９５％信頼区間とともに要約する。
・ベースライン後の各採血時点におけるベースラインからの倍率変化（ＦＣ）を各被験者について計算する。ＦＣの幾何平均（ＧＭＦＣ）を、９５％信頼区間と共に示す。
検出可能でない抗体は、ＧＭＴおよびＧＭＦＣを計算する目的における検出カットオフの半数値によって任意に置換えられる。
各回の解析ごとに、ベースラインにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が血清陰性であり、セロコンバージョンが認められた被験者の数および割合を要約する。ベースライン以降の各採血時点において、厳密な９５％信頼区間とともに示す。セロコンバージョンとは、血清中の抗体が検出可能であることと定義する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対する抗体およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和抗体について、セロコンバージョンが生じた被験者の割合を要約する。ワクチンによって誘導される免疫細胞集団の頻度を要約する。Ｔ細胞免疫応答のさらなる特徴付けは、他の技術を用いて行ってもよい（ＥＬＩＳｐｏｔ、ＣｙＴＯＦおよび／またはゲノムバイオマーカーの解析など）。
グラフを含むさらなる免疫原性解析を、適用可能なＳＡＰに記載する。
１０．３．７ 安全性解析
安全性データの正式な統計検定は、計画されていない。
記述的な安全性解析は、全体、ワクチン群ごと、ならびに年齢群およびワクチン群ごとに実施する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対する抗体レベルについて、ベースラインにおいて血清陰性または血清陽性であった被験者を対照に、下記の解析を実施する。解析は、ベースラインにおける血清状態を区別してまたは区別せずに行う。
非自発的に記録される有害事象
各回のワクチン接種後７日以内において、非自発的に記録される局所性または全身性の有害事象を経験した被験者の頻度および割合を、全体および頻度別に示す。ワクチン接種後７日以内に、同一の有害事象が２回以上発生した被験者については、最大の程度を計上する。非自発的に記録される全身性有害事象についても、試験ワクチン接種との関係性ごとに、同様の集計を行う。非自発的に記録される局所性有害事象は、定義上、試験ワクチンとの因果関係ありと見做す。発症までの期間（単位：日）および持続期間（単位：日）についても、非自発的に記録される局所性または全身性の有害事象のそれぞれについて要約する。各回のワクチン接種後７日間における１つ以上の局所性または全身性の非自発的に記録されるの発生を示す表も作成する。
自発的に記録される有害事象
自発的に記録される有害事象には、重篤な有害事象および特に関心のある有害事象が含まれる。自発的に記録される有害事象を、医薬規制用語集（ＭｅｄＤＲＡ）を利用して、器官別大分類（ＳＯＣ）および基本語（ＰＴ）ごとにコードする。
各回のワクチン接種後２８日以内において、自発的に記録される有害事象を報告した被験者の頻度および割合を、ＳＯＣレベルおよびＰＴレベルで集計する。
関連する自発的に記録される有害事象、グレード３以上の自発的に記録される有害事象、２回目の試験ワクチン接種後６箇月間に発生した医学的に認められた有害事象、重篤な有害事象、関連する重篤な有害事象、特に関心のある有害事象、関連する特に関心のある有害事象、試験の撤回または中止に至った有害事象、および２回目の試験ワクチン接種後１年間以内の死亡を転帰とする重篤な有害事象についても、同様の表を作成する。
１回のワクチン接種後２８日以内に１人の被験者に有害事象が複数回発現した場合は、重篤度の最大値およびワクチン群との最も強い関連性を計上する。
要約表では、１回目のワクチン接種後の有害事象のみを考慮する。１回目のワクチン接種前に発生した有害事象は、既往歴として記録する。
致死性および重篤な有害事象のデータの一覧表を、被験者ごとに作成する。
バイタルサイン（ベースラインからの変化を含む）は、各訪問時の記述統計量により要約し、一覧表を作成する。
１０．３．８ 中間解析
本試験では、盲検解除された独立の統計家が２回の中間解析を実施し、ＤＳＭＢが審査する。中間解析は、あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例（有効性の主要症例定義を満たしている）が５６／１１１症例観察された時点で行う。中間解析の目的は、有効性の主要エンドポイントに関する高い有効性または無益性を、早期の段階で評価することである。中間解析は、ＥＡＳ集団のみを対照に実施する。この時点で入手可能な安全性データについても説明する。
高い有効性または無益性の早期実証の解析のために、累積O'Brien Fleming型エラー支出関数（Lan et al.1983）を利用する。この関数により、特定の中間段階までに蓄積された情報に基づいて、中間解析のための高い有効性（α境界）および無益性（β境界）に関する統計的停止規則が与えられる。
中間段階では、主要目的の検定のｐ値がα境界よりも低い場合、ＣＶｎＣｏＶに対する高レベルの有効性が宣言される。逆に、ｐ値がβ境界よりも高い場合、無益性が実証される。
中間解析は、あらゆる重篤度のＣＯＶＩＤ－１９症例が５６／１１症例観察された時点で実施することが計画されている。下記表１９は、高い有効性または無益性を実証するための境界を示す。これらの境界は、累積誤差支出関数を使用した片側ｐ値から計算した。
Figure 2023513502000047
注目すべきことに、意思決定に使用される実際の境界は、各解析（中間解析および最終解析）において発生し報告された症例の正確な数に依存する。
意思決定プロセスの一部となる他の多くの因子が存在しているため、この境界の適用には、拘束力がない。
１０．３．９ 欠測データおよび中止
ワクチン接種の変数の解析は、有効な症例に基づいて行う。すなわち、欠測値については、直前データによる補完（ＬＯＣＦ）のような欠測値の補完を適用しない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対する抗体について、定量下限（ＬＬＯＱ）未満を記録した濃度の値は、０．５×ＬＬＯＱとして設定する。
いずれの解析においても欠測値の補完は行わない。ただし、ＳＡＰに規定されている有害事象および併用薬の欠測日の補完は除く。
現在のところ、脱落した被験者の置換えは予定していない。
［実施例１４：ＬＮＰ中に製剤化されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原Ｓ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡによるラットへのワクチン接種］
本実施例において示すのは、３’末端の代替形態（Ａ６４－Ｎ５－Ｃ３０－ｈＳＬ－Ｎ５またはｈＳＬ－Ａ１００）およびＵＴＲの組合せ（ｉ－３（－／ｍｕａｇ）またはａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３））を有しているｍＲＮＡを含んでいるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡワクチンによって、ラットにおける液性免疫応答および細胞性免疫応答が誘導されることである。ｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡは、強力かつ非常に迅速な免疫応答の誘導が見られ、１回目のワクチン接種後においてもに結合する抗体および中和抗体が強力に誘導された。
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調整した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４にしたがって、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化した。その後、in vivoにおけるワクチン接種実験に使用した。
（免疫化）
ｍＲＮＡワクチン組成物をラットに筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。用量は、表１８に示す通りである。ネガティヴ・コントロールとして、１群のラットをバッファでワクチン接種した（Ａ群）。第０日および第２１日に全ての動物をワクチン接種した。第１４日、第２１日（１回目の接種後）および第４２日（２回目の接種後）に血液サンプルを採取して、抗体価を決定した。
Figure 2023513502000048
（ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価の決定）
実施例１２に上述した通りに、ＥＬＩＳＡを行った。
（ウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）の決定）
ラットの血清サンプルのウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）を、実施例６においてマウス血清について上述した通りに分析した。
（結果）
図１６Ａに示すように、非コーディング領域として３’末端にｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しており、ＬＮＰ中に製剤化されている、完全長の安定化させたＳタンパク質のｍＲＮＡ（Ｒ９７０９）でワクチン接種することにより、ラットにおける結合抗体価レベルは、強力かつ用量依存的に上昇した（エンドポイントにおけるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗体価により示す）。結合抗体価レベルの上昇は、１回目のワクチン接種である第１４日および第２１日には既に見られ、０．５μｇ、２μｇ、８μｇ、２０μｇおよび４０μｇの用量において確認された。非コーディング領域として３’末端にＡ６４－Ｎ５－Ｃ３０－ｈＳＬ－Ｎ５およびＵＴＲの組合せｉ－３（－／ｍｕａｇ；）を有している、ＬＮＰ中に製剤化されている、完全長の安定化させたＳタンパク質のｍＲＮＡ（Ｒ９５１５、ＣＶｎＣｏｖ）でワクチン接種することにより、ラットにおける結合抗体価レベルは、用量依存的に上昇した（エンドポイントにおけるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗体価により示す）。結合抗体価レベルの情報は、１回目のワクチン接種である第１４日および第２１日には既に見られ、高用量（８μｇ、２０μｇおよび４０μｇ）において確認された。
図１６Ｂに示すように、非コーディング領域として３’末端にｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しており、ＬＮＰ中に製剤化されている、完全長の安定化させたＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡ（Ｒ９７０９）でワクチン接種することにより、ラットにおけるＶＮＴは、用量依存的かつ非常に高レベルに上昇した。ラットにおけるＶＮＴは、１回目のワクチン接種である第１４日に既に見られ、２μｇ以上の用量で確認された。
図１６Ｃに示すように、ＬＮＰ中に製剤化されている、完全長の安定化させたＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡワクチンでワクチン接種することにより、いずれのｍＲＮＡワクチンフォーマットにおいても、ＶＮＴが用量依存的に大幅に上昇した。ｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡのＶＮＴの方が、Ａ６４－Ｎ５－Ｃ３０－ｈＳＬ－Ｎ５およびＵＴＲの組合せｉ－３（－／ｍｕａｇ）を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡよりも、より大きく強力に中和抗体価が上昇し、その効果は２μｇの用量であっても見られた。ｍＲＮＡＲ９７０９を含んでいるワクチン組成物により上昇した中和抗体価は、２回目のワクチン接種によって、さらに顕著に上昇する可能性がある。
ワクチン組成物Ｒ９７０９は強力なので、１回用量の組成物またはワクチンであったとしても、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）から被験体を治療または予防するための免疫化プロトコルを補助できる。
［実施例１５：ＬＮＰ中に製剤化されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原Ｓ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡによる非ヒト霊長類へのワクチン接種および攻撃］
ＬＮＰ中に製剤化されているＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡ（ＣＶｎＣｏＶ）による防護の有効性を、アカゲザルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２攻撃モデルにおいて検討した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染すると、非ヒト霊長類は、軽症の臨床疾患を発症する。この疾患は、上気道および下気道の両方における高レベルのウイルス複製と、ウイルス性肺炎を示す病理的変質とを伴う（Munoz-Fontela et al., 2020）。結果が示すところによると、ＣＶｎＣｏＶは、非ヒト霊長類のin vivoモデルのＣＯＶＩＤ－１９に対する防護効果を与える。この防護効果は、鼻腔内（ＩＮ）経路および気管内（ＩＴ）経路を介した５×１０６ＰＦＵの攻撃に対するものである。防護エンドポイントには、肺病理に対する防護に加えて、ウイルス負荷の有意な減少も含まれる。
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡを、ＬＮＰで製剤化した。その後、in vivoにおけるワクチン接種実験に使用した。
（免疫化および攻撃）
１８匹のインド産アカゲザル（Macaca mulatta）を、６匹ずつの３群に分けた。各群は、オス３匹およびメス３匹（体重：４．５ｋｇ超、年齢：３～６歳）により構成される。ＬＮＰに製剤化されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原Ｓ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ（ＣＶｎＣｏＶ））の０．５μｇまたは８μｇで、動物をワクチン接種した。あるいは、攻撃前までワクチン未接種のままにした。２回目のワクチン接種から４週間後に、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により攻撃した（図１７Ａを参照）。動物の上腕二頭筋に、ｍＲＮＡワクチン組成物を筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した（体積：０．５ｍＬ、用量：表２１に示す通り）。ネガティヴ・コントロールとして、１群の非ヒト霊長類は、攻撃前に未処置／ワクチン未接種とした（Ａ群）。第０日、第１４日、第２８日（１回目のワクチン接種後）、第４２日および第５６日（２回目のワクチン接種後）、ならびに攻撃後の１日目、３日目、５日目、７日目に血液サンプルを採取して、抗体価を決定した。第５６日に、５．０×１０６ＰＦＵの用量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により、動物を鼻腔内から攻撃した。具体的には、気管支鏡を用いて気管の前竜骨部位に２ｍＬのウイルス調製物を塗布し、次に１ｍＬのウイルス調製物を鼻腔内に塗布した（鼻孔１つあたり０．５ｍＬ）。攻撃後（ｐ．ｃ．）６日間、７日間または８日間にわたり、各群の２匹の動物を追跡した。それぞれを、実験の第６２日、第６３日または第６３日に安楽死させた。
Figure 2023513502000049
（ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ）
三量体化または安定化させた完全長のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、Lake Pharma（#46328）から入手した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換え受容体結合ドメイン（３１９～５４１）であるMyc-Hisは、MassBiologicsによって開発され、親切にも提供を受けた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えスパイクおよびＲＢＤに特異的なＩｇＧ応答を、ＥＬＩＳＡにより決定した。高結合性の９６ウェルプレート（Nunc Maxisorp, 442404）を、スパイク三量体またはスパイクＲＢＤでコーティングした。スパイク三量体またはスパイクＲＢＤの濃度は、１×ＰＢＳ（Gibco）中において２μｇ／ｍＬであった。コーティングに用いた量は、１ウェルあたり５０μＬであった。プレートを、４℃にて一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の５％ウシ胎仔血清（FBS, Sigma, F9665）により、室温にて１時間ブロッキングした。ワクチン接種後に動物から採取した血清は、１／５０を開始稀釈度とし、さらに２倍稀釈を８回行って稀釈系列を作製した。攻撃後のサンプルは、０．５％Ｔｒｉｔｏｎにより不活性化させ、１／１００を開始稀釈度とし、さらに３倍稀釈を８回行って稀釈系列を作製した。稀釈系列の作製には、１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の１０％ＦＢＳを用いた。プレートを洗浄した後、５０μＬ／ウェルの血清稀釈液を抗原被覆プレートに２組ずつ注入し、室温にて２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ（Invitrogen, PA1-84631）と複合化させた抗サルＩｇＧを、１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の１０％ＦＢＳで稀釈し（１：１０，０００）、プレートに加えた（１００μＬ／ウェル）。次に、プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、１ｍｇ／ｍＬのＯ－フェニレンジアミン二塩酸塩溶液（Sigma P9187）を調製し、１ウェルあたり１００μＬを加えた。１ウェルあたり５０μＬの１Ｍ塩酸（Fisher Chemical, J/4320/15）で反応を停止させた。４９０ｎｍにおける吸光度を、Softmax（バージョン７．０）を用いるMolecular Devices versamaxプレートリーダーで読み取った。全ての試験サンプルの用量応答曲線を、Softmax Pro（バージョン７．０）の４ＰＬモデルでフィッティングした。ＯＤが０．５であるときのエンドポイント抗体価（吸光度応答が０．５であるときの血清の稀釈度の逆数と定義する）を、各曲線から補間した。結果が検出限界未満であった場合、免疫化後のサンプルについては測定値を２５とし、攻撃後のサンプルについては測定値を５０とした。吸光度が０．５に到達しなかったサンプルについては、曲線の外挿部分から抗体価を推定した。カットオフは、未感染の動物（第０日）から採取した血清の平均抗体価＋１標準偏差とした。カットオフは、各抗原について別々に計算した。
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のフォーカス減少中和試験）
熱不活性化した血清サンプル（５６℃、３０分間）により、ウイルス中和抗体価を測定した。９６ウェルのＶ底プレートにおいて、１ウェルあたり１００～２５０のフォーカスの濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Victoria/01/2020, Doherty Institute）を注入し、ウイルスのみのコントロールウェルとした。１×抗生物質／抗真菌薬を添加した１％ＦＣＳ ＭＥＭ（Gibco, 15240-062）と、１：２０～１：６４０（または、抗体レベルに依存してそれ以上の稀釈度）の稀釈系列にした血清とを、５０：５０で混合して、他のウェルに加えた。このプレートを、加湿ボックス内で３７℃にて１時間インキュベートして、血清サンプル中の抗体をウイルスに結合させた。次に、１００μＬの血清／ウイルス混合物を、ウイルス感受性Ｖｅｒｏ／Ｅ６単層を含んでいる９６ウェルプレートに移し、密封した加湿ボックス中で３７℃にて１時間さらにインキュベートした。吸着後、ウイルス／抗体混合物を除去し、１００μＬの１％ｗ／ｖ ＣＭＣを加えた完全培地を細胞の上から加えた。ボックスを再度密封し、３７℃にて２４時間インキュベートした。次に、１００μＬの２０％ホルマリン／ＰＢＳ溶液で固定した。プレートを一晩燻蒸してから免疫染色した。ＥＬＩＳＡ洗浄機（BioTek 405 TSUS）を使用して水で洗浄した後、０．３％過酸化水素を２０分間加えて、残存する内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。次に、一次抗体／検出用抗体であるウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤポリクローナル抗体（SinoBiologicals; 40592-T62）と共に、プレートを１時間インキュベートした。抗体は、ＰＢＳで１：２，０００に稀釈して用いた。洗浄後、二次抗体である抗ウサギＨＲＰ複合化抗体（Invitrogen; G-21234）と共に、プレートを１時間インキュベートした。抗体は、ＰＢＳで１：４，０００に稀釈して用いた。洗浄後、TrueBlue (TM) Peroxidase Substrate（KPL seracare; 5510-0030）を用いてフォーカスを可視化した。次に、プレートを水で洗浄し乾燥させた。ImmunoSpot S6 Ultra-V分析器（CTL）およびBioSpotソフトウェア（7.0.28.4 Professional; CTL）を使用して、フォーカスを計数した。SoftMax Pro（Molecular Devices;v7.0.3 GxP）で結果を分析した。要約すると、各血清稀釈液におけるＶＯＣの割合（フォーカスの減少割合）として計数データを表し、４パラメータロジスティック（４ＰＬ）曲線上にプロットした。ウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）は、ウイルスフォーカスの５０％を中和した血清の稀釈率として報告する。
あるいは、Ｄ６１４Ｇ変異を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを用いた実施例９において上述した通りに、ウイルス中和抗体価を測定した。
（ＥＬＩＳｐｏｔ）
Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare, USA）を使用する密度勾配遠心分離によって、ヘパリン化全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより、ＰＢＭＣ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴ細胞の頻度およびＩＦＮ－γ産生能を推定した。アッセイには、human/simian IFN-γ kit（MabTech, Nacka, Sweden）を用いた。１ウェルあたり２×１０５細胞の密度でアッセイした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のペプチドプールおよびスパイクタンパク質のメガプール（Mimotopes, Australia）で、細胞を一晩刺激した。ペプチド配列は、GenBank: MN908947.3に基づくものとした。１０個のペプチドプールを使用した。このプールには、１５アミノ酸のペプチド群が含まれており、ペプチド間では１１個のアミノ酸が重複していた。３つのメガプールを構成した。メガプール１（ＭＰ１）には、ペプチドプール１～３が含まれていた。メガプール２（ＭＰ２）には、ペプチドプール４～６が含まれていた。メガプール３（ＭＰ３）には、ペプチドプール７～１０が含まれていた。全てのペプチドの最終濃度は、各ペプチドあたり１．７μｇ／ｍＬであった。１００ｎｇ／ｍＬのホルボール１２－ミリステート（Sigma-Aldrich Dorset, UK）および１ｍｇ／ｍＬのイオノマイシン（CN Biosciences, Nottingham, UK）をポジティヴ・コントロールとして使用した。結果を計算して、１００万細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として報告した。全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドおよびメガプールを２組ずつアッセイし、培地のみのウェルを減算することにより、抗原特異的なＳＦＵを得た。ＣＴＬスキャナーおよびソフトウェア（CTL, Germany）を用いて、ＥＬＩＳｐｏｔプレートを分析した。GraphPad Prism（バージョン８．０．１）（GraphPad Software, USA）を用いてさらなる分析を行った。
（気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ））
生存中は、６ｍＬまたは１０ｍＬのＰＢＳによりＢＡＬ洗浄を行った。洗浄には、気管支鏡を、右肺の２番目の分岐部より上に挿入して使用した。死後は、２０ｍＬのＰＢＳによりＢＡＬ洗浄を行った。洗浄は、左一次気管支を結紮した後、右肺葉に対して行った。
（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）
鼻スワブ、咽頭スワブ、ＥＤＴＡ処理した全血、ＢＡＬおよび組織サンプル（脾臓、腎臓、肝臓、結腸、十二指腸、扁桃、気管および肺）からＲＮＡを単離した。ＣＫ２８硬組織ホモジナイジング２．０ｍＬチューブ（Bertin）および１％（ｖ／ｖ）β－メルカプトエタノールを加えた１ｍＬのＲＬＴバッファ（Qiagen）を用いて、RNAprotect（Qiagen）中の組織サンプルを、Precellys 24ホモジナイザーでホモジナイズした。組織ホモジネートをQIAshredderホモジナイザー（Qiagen）に通した。BioSprint (TM) 96 One-For-All vetキット（Qiagen）およびKingfisher Flexプラットフォームを製造者の指示に従って使用して、１７．５ｍｇに相当する体積の組織を抽出した。非組織サンプルは、サンプルをＡＶＬバッファ（Qiagen）に入れ、そして１００％エタノールを加えて不活性化させた。これらのサンプルの抽出は、BioSprint (TM) 96 One-For-All vetキット（Qiagen）およびKingfisher Flexプラットフォームを製造者の指示に従って使用して行った。
TaqPath (TM) 1-Step RT-qPCR Master Mix、ＣＧ（Applied Biosystems (TM)）、2019-nCoV CDC RUOキット（Integrated DNA Technologies）およびQuantStudio (TM) 7 Flex Real-Time PCR System（Applied Biosystems (TM)）を用いて、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を行った。ＰＣＲアンプリコンをin vitroにおいて転写されたＮ遺伝子断片のＲＮＡ標準に対して定量した。１０コピー／μＬの定量下限（ＬＬＯＱ）未満で検出された陽性サンプルには、５コピー／μＬの測定値を割り当てた。未検出のサンプルには、アッセイＬＬＯＤと同等の２．３コピー／μＬの測定値を割り当てた。鼻スワブ、咽頭スワブ、ＢＡＬおよび血液サンプルから抽出したサンプルについては、ＬＬＯＱ：１．２９×１０４コピー／ｍＬ、ＬＬＯＤ：２．９６×１０３コピー／ｍＬに相当する。組織サンプルについては、ＬＬＯＱ：５．７１×１０４コピー／ｇ、ＬＬＯＤ：１．３１×１０４コピー／ｇに相当する。
QuantStudio (TM) 7 Flex Real-Time PCR Systemにより、サブゲノムＲＴ－ｑＰＣＲを行った。この際、TaqMan (TM) Fast Virus 1-Step Master Mix（Thermo Fisher Scientific）と、フォワードプライマー（最終濃度：２５０ｎＭ）、プローブ（最終濃度：１２５ｎＭ）およびリバースプライマー（最終濃度：５００ｎＭ）とを用いた。ｓｇＥプライマーおよびプローブの配列は、2019-nCoV_sgE-forward：5' CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC 3'（配列番号２２７２９）、2019-nCoV_sgE-reverse：5' ATATTGCAGCAGTACGCACACA 3'（配列番号２２７３０）、2019-nCoV_sgE-probe：5' FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1 3'（配列番号２２７３１）であった。サイクル条件は、５０℃で１０分間→９５℃で２分間→９５℃で１０秒間→６０℃で３０秒間を４５サイクルとした。in vitroにおいて転写されたＲＮＡ標準に対して、ＲＴ－ｑＰＣＲアンプリコンを定量した。ＲＮＡ標準は、完全長のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ ＯＲＦ（アクセッション番号：NC_045512.2）の前に、ＵＴＲリーダー配列および推定Ｅ遺伝子転写調節配列を配置したものの転写産物であった。定量下限（ＬＬＯＱ）未満で検出された陽性サンプルには、５コピー／μＬの測定値を割り当てた。未検出サンプルには、検出下限（ＬＬＯＤ）と同等の０．９コピー／μＬ以下の測定値を割り当てた。鼻スワブ、咽頭スワブ、ＢＡＬおよび血液サンプルから抽出したサンプルについては、ＬＬＯＱ：１．２９×１０４コピー／ｍＬ、ＬＬＯＤ：１．１６×１０３コピー／ｍＬに相当する。組織サンプルについては、ＬＬＯＱ：５．７１×１０４コピー／ｇ、ＬＬＯＤ：５．１４×１０３コピー／ｇに相当する。
（組織病理学）
左肺前葉および後葉、気管、喉頭、縦隔リンパ節、扁桃、心臓、胸腺、膵臓、脾臓、肝臓、腎臓、十二指腸、結腸、脳、ワクチン接種部位（皮下組織およびその下の筋肉を含む皮膚）および流入リンパ節（左および右）の組織サンプルを、１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィンワックス中に包埋した。４μｍ厚の切片を切出し、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色した。処置および群の詳細について盲検化されている２名の獣医病理学者が、独立に、組織スライドをスキャンし検査した。
肺については、各左肺葉から３つの切片を、異なる位置からサンプリングした（主肺葉気管支の近位、内側および遠位）。スコアリングシステム（Salguero et al., 2020）を使用して、肺組織切片において観察される組織病理学的病変を客観的に評価した。各組織病理学的パラメータのスコアは、動物ごとに評価した６つの肺組織切片で観察されたスコアの平均として算出した。
さらに、RNAscope in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）技術を用いて、両肺葉におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを同定した。簡潔に述べると、組織を、過酸化水素で１０分間（室温）、target retrievalで１５分間（９８～１０１℃）、およびprotease plusで３０分間（４０℃）前処理した（全てAdvanced Cell Diagnostics）。Ｓタンパク質遺伝子を標的とするV-nCoV2019-Sプローブ（Advanced Cell Diagnostics）を、４０℃にて２時間、組織上でインキュベートした。シグナルの増幅は、RNAscope 2.5 HD red kit（Advanced Cell Diagnostics）を用いて、RNAscopeプロトコル（RNAscope 2.5 HD Detection Reagent-Red）に従って行った。各ＩＳＨランには、適切なコントロールを含めた。Nikon NIS-Arソフトウェアを用いてデジタル画像分析を行い、ウイルスＲＮＡについて陽性の肺切片の総面積を計算した。
（コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）放射線診断）
１６スライスのLightspeedＣＴスキャナー（General Electric Healthcare, Milwaukee, WI, USA）を腹臥位および仰臥位で使用して、鎮静状態の動物からＣＴスキャンを収集した。全ての軸方向走査は１２０ＫＶｐ、Ａｕｔｏ ｍＡ（範囲：１０～１２０）で行い、小さな走査視野を用いて取得した。回転速度は０．８ｓであった。画像を１１ｃｍの視野として表示した。
攻撃後の心臓／肺血管系、リンパ節および肺外組織の完全な検査を容易にするために、非イオン性ヨード造影剤であるNiopam 300（Bracco, Milan, Italy）を、２ｍＬ／ｋｇ体重で静脈内（ＩＶ）投与した。注入直後および注入中間点から９０秒後においてスキャンを収集した。
ＣＯＶＩＤ疾患の特徴である、すりガラス陰影（ＧＧＯ）、硬化、クレージー・ペービング、結節、小葉周囲硬化の有無（分布：上、中、下、中央２／３、末梢、気管支中心性）、および肺塞栓についてスキャン画像を評価した。肺病変の程度を推定し（２５％未満、２５～５０％、５１～７５％、７６～１００％）、ＣＯＶＩＤ疾患用に開発されたスコアリングシステムを用いて定量化した。
（結果）
Ｓタンパク質三量体または単離された受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のいずれかに対する結合抗体価の分析によると、８μｇをワクチン接種した動物において、１回目のワクチン接種後に、スパイクに特異的なＩｇＧ抗体価（図１７Ｂ）およびＲＢＤに特異的なＩｇＧ抗体価（図１７Ｃ）が、僅かに増加していた。２回目のワクチン接種後である第４２日には、ＩｇＧ抗体価がより大きく上昇した。Ｓに反応性の抗体は、１．６×１０３だけ、エンドポイント抗体価の中央値が有意な上昇を示した（図１７Ｂ）。ＲＢＤに反応性の抗体は、３．２×１０３だけ、エンドポイント抗体価の中央値が有意な上昇を示した（図１７Ｃ）。この群では、スパイクおよびＲＢＤに特異的なＩｇＧ抗体価の上昇が攻撃時に認められた。特に、終了時（試験の第６２日、第６３日および第６４日）に採取した血清では上昇が顕著であった。
予想通り、０．５μｇのＣＶｎＣｏＶ群（意図的に最適量以下を投与した群）またはワクチン未接種コントロール群においては、ワクチン接種期間に、スパイクまたはＲＢＤに特異的なＩｇＧ抗体の有意な上昇は見られなかった。しかし、攻撃後に０．５μｇのＣＶｎＣｏＶを接種した動物においては、各サンプリング時点において、スパイクおよびＲＢＤに特異的なＩｇＧ抗体価が僅かに増加していた（図１７Ｂおよび図１７Ｃ）。ワクチン未接種のコントロールにおいては、スパイクまたはＲＢＤに特異的なＩｇＧ抗体価の上昇は観察されなかった（図１７Ｂおよび図１７Ｃ）。
結合抗体の誘導と整合して、８μｇ群の２回目のワクチン接種後において、強固なレベルのウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）が検出された（図１７Ｄ）。ＶＮＴは、第４２日に抗体価の中央値が２．７×１０４となり、ピークに達した。中和抗体の抗体価は、実験の第６２日、第６３日および第６４日までは、攻撃時と比較して変化しなかった。０．５μｇ群およびワクチン未接種コントロール群の動物は、攻撃前も陰性のままであった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染により、０．５μｇ群およびワクチン未接種群のうちそれぞれ４／６匹および５／６匹において、抗体価のわずかな増加が誘導された。Ｄ６１４Ｇ変異を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対しても、同様の結果が得られた。
ＣＶｎＣｏＶが誘導する細胞応答を評価するために、異なる時点（ワクチン接種後および攻撃後）に単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をカバーするペプチドプールで刺激した。刺激された細胞のＩＦＮ－γ放出を、ＥＬＩＳｐｏｔにより測定した。ワクチン接種期間の合計プールに対する応答を分析したところ、８μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物において、１回目のワクチン接種から２週間後に、スパイクに特異的なＩＦＮ－γの増加が認められた。また、２回目のワクチン接種から２週間後には、より顕著であった（図１８Ａのパネル１）。１０個の個々のプール（それぞれ、Ｓタンパク質のうち約１４０アミノ酸長をカバーする）による刺激によると、８μｇのＣＶｎＣｏＶでのワクチン接種した際に、Ｓの完全長にわたるペプチドに対して反応性である細胞が誘導された（図１８Ａのパネル３）。
０．５μｇのＣＶｎＣｏＶまたはワクチン未接種動物では、ワクチン接種時における明確な反応は認められなかった（図１８Ａのパネル１、２および４）。ネガティヴ・コントロール群のメス動物の１匹では、実験を通して、ペプチドプール２（Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）の一部をカバーする）での刺激後に特に高いＩＦＮ－γ分泌が認められた。同じ動物について、第５６日、にペプチドプール３（ＮＴＤおよびＲＢＤの一部をカバーする）での刺激後に特に高いＩＦＮ－γ分泌が認められた（図１８Ａのパネル１および４）。
データが実証しているところによると、ＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物において、Ｓに特異的な細胞応答が強く誘導された。８μｇのＣＶｎＣｏＶでワクチン接種した動物では、１回目および２回目のワクチン接種後において、Ｓタンパク質の完全長をカバーしているペプチドに対する応答の増加が誘導された。これらのデータは、マウスにおける過去のデータと整合している。マウスにおいて実証されたところによると、ＣＶｎＣｏＶによって、Ｓに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答が高レベルで誘導される（例えば、実施例６、７）。強力なＴ細胞応答が生じていることは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンの有効性を支持している可能性が高い。最新のデータが実証したところによると、アカゲザルモデルにおいては、ＣＤ８＋Ｔがウイルス制御に寄与している（McMahan et al., 2020）。ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴ細胞応答は容易に検出可能であり、長期的な防御おける役割を果たしている可能性がある（Grifoni et al., 2020; Sekine et al., 2020; Ni et al., 2020）。
攻撃後の第６２日～第６４日には、全ての動物において、スパイクに特異的なＩＦＮ－γ応答の増加が検出された（図１８Ｂのパネル１～４）。注目すべきことに、８μｇのＣＶｎＣｏＶでワクチン接種した動物における細胞応答の増加は、他の群よりも顕著ではなかった。この結果は、これらの動物におけるウイルス複製レベルが低いことを示している可能性が高い（図１８Ｂのパネル３）。
攻撃感染時におけるウイルスＲＮＡのコピーの定量により実証されたところによると、８μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物においては、上気道におけるウイルス複製が減少した。重要なことに、このワクチン用量によれば、攻撃された動物の肺を防護できた。肺の防護は、２つの結果により実証された。一つは、ウイルスＲＮＡが検出されなかったことである。もう一つは、ワクチン未接種動物よりも攻撃感染時の病理的変質が軽減されていたことである。強力な免疫応答が見られ、上気道よりも下気道において強く防護されるという結果は、ハムスターにおける結果と整合している（実施例９）この結果は、非ヒト霊長類攻撃モデルにおいて他のｍＲＮＡ系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを用いた結果とも整合している（Corbett et al., 2020; Vogel et al., 2020）。
攻撃後の上気道および下気道における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在または全てのＲＮＡを、ｑＲＴ－ＰＣＲによりモニタリングした（図１９）。ワクチン未接種動物において、上気道におけるウイルス複製は、第５９日にピークに達した。ピークにおける鼻スワブの中央値は２．７×１０７ｃｐ／ｍＬに達し（図１９Ａ）、終了日である第６２日～第６４日まで検出された。０．５μｇのＣＶｎＣｏＶでワクチン接種した動物とワクチン未接種のコントロール動物とでは、鼻スワブにおけるウイルス複製に有意差は見られなかった。全般的に、８μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種により、上気道におけるウイルスＲＮＡのコピー数は最低値になった。第５９日には、鼻スワブ中の中央値が２．９×１０６ｃｐ／ｍＬになった。しかし、研究群間の差は、統計的に有意ではなかった。同様の結果が、咽頭スワブでも得られた（図２０Ａ）。
ｑＲＴ－ＰＣＲにより、ウイルス複製を示すサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を評価した追加の分析において、上気道におけるｓｇＲＮＡレベルは、全体的に低かった。値は第５９日にピークに達し、全ての動物で第６２日にベースラインに戻った。鼻スワブにおけるｓｇＲＮＡレベルは、ＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物において０．４×１０４ｃｐ／ｍＬであり、最低値であった。ワクチン未接種コントロール動物においては、３．７×１０４ｃｐ／ｍＬであった。８μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種群において、６匹のうち３匹の動物は、全時点において陰性であった。未接種群において、６匹のうち５匹の動物は、ウイルスのサブゲノムＲＮＡが検出可能なレベルであった（図１９Ｄ）。咽頭スワブの分析では、群間におけるサブゲノムＲＮＡに有意差はなく、全ての動物で中央値は定量下限未満であった（図２０Ｂ）。
生存中（第５９日）および死後（第６２日～第６４日）の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）サンプルを用いた下気道の平行分析が示すところによると、８μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種により、いずれの時点においても、全てのウイルスＲＮＡレベル有意に低下した（図１９Ｂ）。コントロール群における全ＲＮＡの中央値は、第５９日に４．３×１０６ｃｐ／ｍＬであり、第６２日～第６４日に１．１×１０５ｃｐ／ｍＬであった。８μｇのＣＶｎＣｏＶをワクチン接種した動物における抗体価の中央値は、第５９日に０．６×１０４ｃｐ／ｍＬであり、第６２日～第６４日に０．３×１０４ｃｐ／ｍＬであった。ＢＡＬ中のＲＮＡレベルは、概ね全ての動物で定量下限未満であった。第５９日において、８μｇのＣＶｎＣｏＶ群の１匹の動物ではＲＮＡが検出されたが、ＲＮＡ数がは少なかった。０．５μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物における全てのウイルスＲＮＡレベルは、コントロール群と同等であった。注目すべき点として、第５９日のＢＡＬ分析では、ワクチン未接種群のメス動物およびオス動物１匹のみの結果を記載している。残りの動物のＢＡＬサンプリング条件は最善ではなく、さらなる評価を妨げるため、この分析からは除外した。
剖検時に採取した肺組織の分析により、ＢＡＬサンプルで得られた結果が確認された。ワクチン未接種では、抗体価の中央値として２．９×１０８ｃｐ／ｇが検出された。しかし、８μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種群の全ての動物では、定量下限未満であった（図１９Ｃ）。０．５μｇのＣＶｎＣｏＶ群の動物とワクチン未接種群の動物との間に、統計上の有意差は認められなかった。
ワクチンの安全性に関して、０．５μｇまたは８μｇのＣＶｎＣｏＶの注射により、ワクチン接種に対する副作用は誘導されなかった。研究のワクチン接種期間において、群間の体重または体温の差は観察されなかった（データ省略）。この結果は、使用した用量での、アカゲザルにおけるワクチンの好ましい安全性プロファイルを支持している。さらに、本研究ではワクチンによる疾患増悪の徴候は見られなかった。
ＢＡＬおよび肺組織サンプルにおけるサブゲノムウイルスＲＮＡ分析では、同様の結果が得られた。ワクチン未接種動物および０．５μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物のＢＡＬおよび肺サンプルにおいては、第５９日および第６２日～第６４日のいずれでも、ウイルス複製を示すＲＮＡが検出された。８μｇのＣＶｎＣｏＶ群の全ての動物においては、この分析結果は陰性であった（図１９Ｅおよび図１９Ｆ）。
剖検時に採取したさらなる組織サンプルを評価したところ、気管および扁桃におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全てのＲＮＡシグナルは、０．５μｇのＣＶｎＣｏＶおよびワクチン未接種動物において、低いが検出可能であった。しかし、８μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物においては、陰性であった（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）。いずれの群においても、脾臓、十二指腸、結腸、肝臓または腎臓では、ウイルスＲＮＡが検出されなかった（図２０Ｅ～図２０Ｉ）。
剖検時に採取した肺サンプルの組織病理分析では、攻撃された動物の肺において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染と一致する病変が認められた（図２１）。簡潔に述べると、肺実質には多病巣性から融合性の肺炎領域が認められ、変質していない肺実質に取り囲まれていた。肺胞上皮細胞のネクローシスを伴う肺胞損傷は、変質領域における顕著な特徴であった。この領域内の肺胞腔はしばしば肥厚しており、損傷した肺胞壁には種々の炎症細胞が含まれていた（マクロファージ、リンパ球、生存している変性好中球、およびときに好酸球が含まれていた）。肺胞浮腫およびＩＩ型肺胞細胞の過形成も観察された。遠位細気管支および細気管支－肺胞接合部では、上皮細胞の変性および脱落が認められた。より大きな気道では、時折、部分的な呼吸上皮の上皮変性および脱落が観察された。少数の種々の炎症細胞が、気管支壁および細気管支壁に浸潤していた（好中球、リンパ系細胞、およびときに好酸球が含まれていた）。一部の気道の内腔には、変性細胞（主に好中球および上皮細胞）と混ざりあった粘液が見られた。実質内では、血管周囲および細気管支周囲の肥厚も観察され、大部分は浸潤を構成するリンパ系細胞であった。肺以外の組織では、特筆すべき変化は認められなかった。
ウイルスＲＮＡレベルの低下と整合して、組織病理スコアリングシステムを用いた肺サンプルの評価が示すところによると、０．５μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種群およびワクチン未接種群と比較して、ＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物の肺病変の重篤度は、有意に低下していた（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。
ウイルスＲＮＡは、肺胞上皮細胞および炎症細胞浸潤部において認められた（図２１）。in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって観察されたウイルスＲＮＡの量も、０．５μｇのＣＶｎＣｏＶおよびワクチン未接種と比較すると、８μｇのＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物において有意に減少した（図２２Ｃ）。
完全な肺においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染時に誘導される病理的変質を生存中に把握するために、攻撃前および第６１日（攻撃後）において、ＣＴスキャンを実施した。全体的に、疾患の外見上のレベルは比較的軽度であり、肺の２５％未満しか影響を受けていなかった。攻撃後、０．５μｇのＣＶｎＣｏＶ群では６匹のうち６匹から、ワクチン未接種コントロール群では６匹のうち５匹から、肺の異常が検出された。８μｇのＣＶｎＣｏＶでワクチン接種した動物では、６匹のうち３匹しか検出可能な変化を示さなかった。ＣＴスキャンにおける合計スコアの最低レベルは、８μｇのＣＶｎＣｏＶでワクチン接種した動物において見られた（図２２Ｄ）。注目すべきことに、この分析における最高スコアは、０．５μｇのＣＶｎＣｏＶ群において見られた。しかし、コントロール群との間に統計差は認められなかった。
攻撃後の臨床徴候の評価において疾患増悪の徴候は検出されず、組成物はアカゲザルにおいて高い免疫原性を示すことが分かった。群間において、攻撃後の体重および体温に明確な差はなく、発熱の徴候も認められなかった。ワクチンによる疾患増悪は、抗体によって引き起こされることがある（抗体依存性疾患増悪、ＡＤＥ；Lee et al., 2020において概説されている）。この点については、ネコココロナウイルスに関する既報がある（Olsen et al., 1992）。このような抗体には中和活性がなく、ウイルスの侵入を促進し、これにより、ウイルス複製が増加し疾患が増悪する。本実施例に示される結果は、ＣＶｎＣｏＶをワクチン接種した動物におけるウイルス複製の増加を示唆していない。重要なことに、気道または遠位器官（脾臓、十二指腸、結腸、肝臓、腎臓など）における複製の促進も、０．５μｇ群において検出されなかった。これらの動物は、攻撃感染時におけるＳ結合レベルは低いが、ＶＮＴレベルは検出されなかった。この条件は、ＡＤＥが潜在的に発生しうる条件である。
疾患増悪の他の原因として、ワクチン関連呼吸器疾患増悪（ＶＡＥＲＤ）が挙げられる
。ＶＡＥＲＤは、ＴＨ２に偏った免疫応答による炎症の増加と、非中和抗体の中和抗体に対する高い比率とを特徴とする（Graham, 2020; Lee et al., 2020; Smatti et al., 2018において概説されている）。ＣＶｎＣｏＶワクチン接種動物における肺の病理分析では、８μｇのＣＶｎＣｏＶによる防護能が示され、最適用量以下を投与した動物では炎症の増加および病理的変質の徴候は示されなかった。
以上の結果により、高度に関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のモデル系における、ＣＶｎＣｏＶの安全性、免疫原性および防護有効性に関する本発明者らの知見が拡張された。免疫原性、防護有効性および病理に関して、非ヒト霊長類における研究の全般的な結果は、ハムスターモデルの結果と同等であった（実施例９を参照）。この結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのモデル系としてのハムスターを支持している。したがって、ＣＶｎＣｏＶは、非ヒト霊長類のＣＯＶＩＤ－１９攻撃モデルにおいて、８μｇという低用量で非常に有効であった。さらに、いかなる疾患増悪の徴候も示さず、試験したいずれの用量においても安全であった。
類似した他の非ヒト霊長類研究においては、本発明の形態の３’末端（ｈＳＬ－Ａ１００）およびＵＴＲの組合せ（ａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３））を含んでいるＬＮＰ中に製剤化されているＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡ（Ｒ９７０９）を含んでいるワクチン組成物を分析し、ＣＶｎＣｏＶ（Ｒ９５１５）と比較する。
［実施例１６：ＬＮＰ中に製剤化されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原Ｓ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡによるマウスへのワクチン接種］
本実施例において示すのは、改良した非コーディング領域を有しているｍＲＮＡを含んでいるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡワクチンにより、強力な免疫応答が誘導されることである。いくつかの群のマウスに、化学修飾ヌクレオチド（Ｎ（１）－メチルシュードウリジン；ｍ１ψ）を含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物を接種した。１つの群のマウスに、代替キャップ（３’ＯＭＥクリーンキャップ）から作製したｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物を接種した。詳細を表２２に示す。
（ＬＮＰに製剤化されているｍＲＮＡワクチンの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化した。
（ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＶＣ）の免疫促進）
＜ヒトＰＭＶＣの調製＞
標準的なFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離により（Ficoll濃度：１．０７８ｇ／ｍＬ）、匿名のドナーの全血からヒト末梢血単核細胞（ＰＭＶＣ）を単離した。ＰＭＶＣをＰＢＳで洗浄して、ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させた。このＲＰＭＩ１６４０には、２０％熱不活性化ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｌ－グルタミンを添加した。細胞を計数した後、１ｍＬあたり５０００万細胞となるように、ウシ胎仔血清／１０％ＤＭＳＯに再懸濁して凍結させた。使用前に細胞を解凍した。
＜ＰＭＶＣの刺激＞
ＬＮＰに製剤化されているｍＲＮＡ（１０μｇ／ｍＬ）を用いて、ＰＭＶＣを刺激した（表２２、Ｂ行～Ｍ行）。細胞の密度は４×１０５であり、細胞の合計体積は２００μＬであり、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で湿潤化させておいた。背景刺激を定量するために、培地のみでＰＭＶＣをインキュベートした（表２２、Ａ行）。トランスフェクションから２４時間後に、上清を回収した。
＜サイトカインレベルの定量化＞
製造者の説明書に従ってIFNa ELISA（PBL）を用いて、ヒトＩＦＮ－αを定量した。ＰＭＶＣの上清は、１：２０または１：４０に稀釈し、稀釈液５０μＬに精製したバッファ５０μＬを加えてから用いた。
（免疫化）
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢、ｎ＝８）に、表２２に記載のｍＲＮＡワクチン組成物を筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。ネガティヴ・コントロールとして、一群のマウスは、バッファでワクチン接種した（Ａ群）。第０日および第２１日に全ての動物をワクチン接種した。第２１日（１回目の接種後）および第４２日（２回目の接種後）に血液サンプルを採取し、抗体価を決定した。第４２日に脾細胞を摘出して、Ｔ細胞を分析した。
Figure 2023513502000050
ＥＬＩＳＡにより、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価を決定した。実施例６に記載の通りに、ＣＰＥ（細胞変性効果）によりウイルス中和抗体価を決定した。実施例６に記載の通りに、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によりＴ細胞を分析した。
［結果］
図２３Ａに示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡにより、ヒトＰＭＶＣにおいて、様々なレベルでＩＦＮ－αが誘導された。ほとんどのコンストラクトにおいて、誘導されたＩＦＮ－αのレベルは中程度であった。しかし、ＬＮＰに製剤化されているｍＲＮＡであって化学修飾ヌクレオチドを含んでいるｍＲＮＡでは、ＩＦＮ－αが誘導されなかった。
改良した非コーディング領域を有する完全長の安定化させたＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡ（Ｓ＿ｓｔａｂ）でワクチン接種することにより、１回目のワクチン接種後である第２１日において既に、ウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）が高いレベルで上昇した（図２３Ｂを参照）。３’末端にｈＳＬ－Ａ１００またはＡ－１００を有しているｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物は、いずれも、迅速かつ大幅なＶＮＴの上昇を示した（Ｃ群～Ｇ群、Ｉ群～Ｍ群）。これらのコンストラクトにおいて、ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの３’末端に直接位置している。
化学修飾ヌクレオチドを導入することにより、同程度にＶＮＴが上昇した（Ｈ群、Ｉ群、Ｊ群、Ｍ群）。
２回目のワクチン接種後である第４２日において、多くのｍＲＮＡワクチンでは、ＶＮＴが大きく上昇したままであった。また、３’末端にＡ６４－Ｎ５－Ｃ３０－ｈＳＬ－Ｎ５を有しているｍＲＮＡを含んでいるワクチン組成物であるＣＶｎＣｏＶによっても、ＶＮＴが大幅に上昇した（Ｂ群、図２３Ｃを参照）。化学修飾ヌクレオチドを導入されているワクチン組成物では、ＶＮＴレベルの上昇幅は小さかった（ｍ１ψ、Ｈ群）。３’末端にｈＳＬ－Ａ１００またはＡ－１００を有しているｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物では、迅速かつ大幅なＶＮＴの上昇が見られた（Ｃ群～Ｇ群、Ｉ群～Ｍ群）。しかし、ｍ１ψを使用した群では、そのような上昇は見られなかった。これらのコンストラクトにおいて、ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの３’末端に直接位置している。
［実施例１７：ＬＮＰ中に製剤化されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原Ｓ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡによるマウスへのワクチン接種］
本実施例で示すのは、改良した非コーディング領域を有しているｍＲＮＡを含んでいるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡワクチンにより、強力な免疫応答が誘導されることである。この研究では、１回のワクチン接種のみのワクチン接種レジメンと、２回のワクチン接種のワクチン接種レジメンとを比較する。いくつかの群のマウスには、化学修飾ヌクレオチド（Ｎ（１）－メチルシュードウリジン；ｍ１ψ）を含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物を接種した。詳細を表２３に示す。
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製した（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化した。
（免疫化）
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢、ｎ＝８）に、表２３に記載のｍＲＮＡワクチン組成物を筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。ネガティヴ・コントロールとして、１つの群のマウスは、バッファでワクチン接種した（Ｋ群）。動物のワクチン接種の回数は、Ａ群～Ｅ群では第０日の１回のみ、Ｆ群～Ｊ群では第０日および第２１日の２回とした。第２１日および第４２日に血液サンプルを採取して、抗体価を決定した。第４２日に脾細胞を摘出して、Ｔ細胞を分析した。
Figure 2023513502000051
実施例６に記載の通りに、ＣＰＥ（細胞変性効果）によりウイルス中和抗体価を決定した。実施例６に記載の通りに、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によりＴ細胞を分析した。
（結果）
図２４Ａに示すように、１回目のみのワクチン接種後においてもＶＮＴは上昇した。これは、実施例１７に示した通りである。３’末端にｈＳＬ－Ａ１００またはＡ－１００を有しているｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物では、迅速かつ大幅なＶＮＴの上昇が見られた（Ａ群、Ｄ群、Ｅ群、Ｇ群、Ｉ群、Ｊ群）。これらのコンストラクトにおいて、ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの３’末端に直接位置している。
図２４Ｂが示すのは、第４２日における、１回目のみのワクチン接種後（Ａ群～Ｅ群）または２回目のワクチン接種後（Ｆ群～Ｊ群）のＶＮＴの上昇である。１回目のワクチン接種のみを行った群の中では、Ｒ９７０９を含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物が、ＶＮＴの上昇が最も大きかった（Ｂ群）。Ｒ９７０９を含んでいるワクチン組成物は強力なので、１回用量の組成物またはワクチンであったとしても、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）から被験体を治療または予防するための免疫化プロトコルを補助できる。
３’末端にｈＳＬ－Ａ１００またはＡ－１００を有しているｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物は、迅速かつ大幅なＶＮＴの上昇が見られた（Ａ群、Ｄ群、Ｅ群、Ｇ群、Ｉ群、Ｊ群）。これらのコンストラクトにおいて、ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの３’末端に直接位置している。
［実施例１８：Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染に対するｍＲＮＡワクチンの有効性］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染に対する感受性がないが、Ｋ１８プロモーターの下流にヒトＡＣＥ２受容体（ｈＡＣＥ２受容体）を発現するように遺伝子改変されているマウスモデルが開発されている。ｈＡＣＥ２受容体は、ウイルスが宿主細胞に侵入するために必要な受容体である。このモデルは、元々、ＳＡＲＳ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）の原因物質を特定するために開発された（MCCRAY, Paul B., et al. Lethal infection of K18-hACE2 mice infected with severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of virology, 2007, 81. Jg., Nr. 2, S. 813-821）。しかし、現在では、ＣＯＶＩＤ－１９に好適な小動物モデルとしても使用されている。ｈＡＣＥ２マウスついて従前知られていたところによると、このマウスには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する感受性がある。また、このマウスは、体重減少、肺病理およびヒトと類似した症状を伴う疾病経過を呈する（例えば、BAO, Linlin, et al. The pathogenicity of SARS-CoV-2 in hACE2 transgenic mice. Nature, 2020, 583. Jg., Nr. 7818, S. 830-833; YINDA, Claude Kwe, et al. K18-hACE2 mice develop respiratory disease resembling severe COVID-19. PLoS pathogens, 2021, 17. Jg., Nr. 1, S. e1009195; DE ALWIS, Ruklanthi M., et al. A Single Dose of Self-Transcribing and Replicating RNA Based SARS-CoV-2 Vaccine Produces Protective Adaptive Immunity In Mice. BioRxiv, 2020.を参照）。原則として、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染予防や、ウイルス負荷の減少を探索するワクチン研究に好適である。同時に、ＣＯＶＩＤ－１９に対するｍＲＮＡワクチンの防御効果の相関および原因を、よく確立された免疫学的手法（一般的にマウスモデルを利用できる手法）により探索するワクチン研究にも好適である。
本実施例において示すのは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡワクチンにより、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおける強力な液性免疫応答および細胞性免疫応答が誘導されることである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡワクチンにより、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの攻撃から防護される。このことは、例えば、感染した動物のウイルス負荷を測定することにより示される。あるいは、体重減少、肺病理および症状の疾患の進行を監視することでも示される。あるいは、組織病理および生存によっても示される。
（ｍＲＮＡワクチンを製剤化したＬＮＰの調製）
実施例１に記載の通りに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのｍＲＮＡコンストラクトを調製する（in vitroにおけるＲＮＡ転写）。実施例１．４に従って、ＨＰＬＣにより精製したｍＲＮＡをＬＮＰで製剤化する。その後、in vivoにおけるワクチン接種実験に使用する。
（免疫化および攻撃）
Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにｍＲＮＡワクチン組成物を筋肉内注射（ｉ．ｍ．）する。用量は、表２４に示す通りである。ネガティヴ・コントロールとして、１つの群をバッファでワクチン接種する。コントロールとして、１つの群では、２０μＬのホルマリンで不活性化させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（１０６ＰＦＵ）およびアラムアジュバントを筋肉内注射する。第０日および第２８日に、全ての動物をワクチン接種した。第０日、第２８日（１回目の接種後）および第５６日（２回目の接種後、攻撃前）に血液サンプルを採取して、抗体価を決定する。第５６日に、例えば１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって、鼻腔内から動物を攻撃する（攻撃１）。攻撃後４～１０日間にわたり、動物を追跡する。
Figure 2023513502000052
ＥＬＩＳＡにより、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体価を決定する。ＣＰＥ（細胞変性効果）に基づくマイクロ中和アッセイにより、ウイルス中和抗体価を決定する。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により、Ｔ細胞を分析する。これらは、実施例６に記載の通りに行う。
本実施例に記載のＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスの免疫化および攻撃を利用して、本発明のさらなるｍＲＮＡコンストラクトおよび組成物による防御の有効性を決定できる。さらに、変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルスバリアントまたは単離株（Ｂ．１．３５１など。表２５も参照）を利用することにより、本発明のｍＲＮＡワクチン組成物が、これらの変異したウイルスバリアントまたは単離株に対して有効であることを示せる。
［実施例１９：新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対するｍＲＮＡワクチンの中和活性］
２０人の第Ｉ相臨床試験被験者（年齢：１８～６０歳、男性および女性）から採取した血清の、新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株または単離株に対する中和活性を検討する。被験者は、２μｇ、４μｇ、８μｇまたは１２μｇのＣＶｎＣｏＶを２回用量接種されている（実施例１０の臨床研究概要を参照）。臨床研究の第３６日、第４３日または第５７日に血清サンプルを採取する。血清サンプルのウイルス中和抗体価（ＶＮＴ）は、１０～１２８０である（ＭＮ：２５ＴＣＩＤ５０）。サンプルには、ＶＮＴが低い群（１０～２０）と、ＶＮＴが高い群（４５２～１２８０）が含まれている。
ＶＮＴの分析は、例えば、実施例９においてハムスター血清の分析について記載の通りに行う。ただし、血清サンプルを新興のウイルスバリアントとともにインキュベートする。SARS-CoV-2/human/ITA/INMI1/2020株またはUVE/SARS-CoV-2/2020/FR/702株を、レファレンス（野生型株）として使用してもよい。分析用の新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株または単離株を、表２５に示す。さらなるバリアントが勃興することがあれば、当該バリアントを分析してもよい。
Figure 2023513502000053
組換えＶＳＶウイルスまたは組換えレンチウイルスを利用したシュードウイルス中和アッセイ（ＰｓＶＮアッセイ）によっても、中和を測定できる。このアッセイで使用するシュードウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が有するスパイク変異を有している。
ＥＬＩＳＡアッセイによって、結合抗体能を検討できる。例えば、実施例１０で上述した方法において、新興のウイルスバリアントの変異を有する組換えスパイクタンパク質をコーティングすればよい。
攻撃モデルによっても、ｍＲＮＡワクチンの有効性を検討できる例えば、実施例１７におけるｈＡＣＥマウス、実施例１５における非ヒト霊長類、実施例９におけるハムスターを、新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株によって攻撃感染させればよい。
図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質設計をコードしている様々なｍＲＮＡコンストラクトから、検出可能なタンパク質が発現したことを示す。in vitro翻訳システムを利用した。詳細は実施例２ａおよび表５を参照。 図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質設計をコードしている様々なｍＲＮＡコンストラクトが、哺乳動物細胞の細胞表面において発現していることを示す。ＦＡＣＳ分析を利用した。詳細は実施例２ｂおよび表６を参照。 図３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードしている様々なｍＲＮＡコンストラクトが、哺乳動物細胞において発現していることを示す。ウェスタンブロット分析を利用した。詳細は実施例２ｃおよび表７を参照。 図４は、完全長の安定化させたＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡワクチンでワクチン接種した群において、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａが顕著に応答したことを示す。図４が示すように、ＩｇＧ１の応答は、ｍＲＮＡワクチンとＳＡＲＳ－ＣｏＶの組換えＳタンパク質との間で同等であった。ＩｇＧ２ａの抗体価は、ｍＲＮＡワクチンの方がＳＡＲＳ－ＣｏＶの組換えＳタンパク質よりも高かった。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗体価を、ＥＬＩＳＡにより評価した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳタンパク質をコーティング試薬とした。実施例５に記載の通りに実験を行った。コンストラクトの詳細は表１０を参照。 図５が示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質および完全長の野生型Ｓタンパク質をコードしているｍＲＮＡワクチンでワクチン接種した群において、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａが顕著に応答した。図５Ａに示すように、ＩｇＧ１の応答は、双方の完全長Ｓタンパク質設計の間で同等であった。図５Ｂに示すように、ＩｇＧ２ａの抗体価は、双方の完全長Ｓタンパク質設計の間で同等であった。図５Ｃに示すように、第４２日において、ウイルスの中和抗体価は、双方の完全長Ｓタンパク質設計の間で高いか同等であった。実施例６に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表１１を参照。 図５－１を参照。 図６が示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質および完全長のＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡを製剤化したＬＮＰにより、マウスにおいて、細胞性免疫応答が誘導された（ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞の応答）。細胞内サイトカイン染色アッセイを利用した。Ａ群～Ｃ群は、完全長のＳタンパク質設計をコードしているｍＲＮＡを製剤化した様々なＬＮＰを投与した群である。Ｄ群は、ネガティヴ・コントロールである。ワクチン接種スキームは表１１を参照。詳細は実施例６を参照。 図７は、完全長のＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡを製剤化したＬＮＰでワクチン接種した後における先天免疫応答（Ａ群）を示す。点線は検出下限を示す。実施例７に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表１２を参照。 図８Ａに示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質をコードしているｍＲＮＡワクチンでワクチン接種した群において、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａが顕著に応答した。図８Ａに示すように、１回目のワクチン接種において、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの応答がいずれも高かった。Ａ群～Ｄ群は、完全長のＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡを製剤化したＬＮＰで１回ワクチン接種した群である。Ｉ群は、アジュバントした組換えスパイクタンパク質でワクチン接種した群である。Ｊ群は、ネガティヴ・コントロールである。実施例７に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表１２を参照。 図８Ｂに示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチンでワクチン接種した全ての群において、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａが顕著に応答した。図８Ｂの（Ａ）は、第２８日（１回目のワクチン接種の後）および第３５日（２回目のワクチン接種の後）におけるＩｇＧ１の応答である。図８Ｂの（Ｂ）は、第２８日（１回目のワクチン接種の後）および第３５日（２回目のワクチン接種の後）におけるＩｇＧ２ａの応答である。Ａ群～Ｈ群は、完全長のＳタンパク質のｍＲＮＡを製剤化したＬＮＰにより、様々な間隔でワクチン接種した群である。Ｉ群は、アジュバントした組換えスパイクタンパク質でワクチン接種した群である。Ｊ群は、ネガティヴ・コントロールである。実施例７に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表１２を参照。 完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチンでワクチン接種した全ての群において、ウイルスの中和抗体価（ＶＮＴ）が顕著に上昇した。図９Ａは、第２８日（１回目のワクチン接種後）および第３５日におけるＶＮＴである。図９Ｂは、第４９日（２回目のワクチン接種後）におけるＶＮＴである。Ａ群～Ｈ群は、完全長のＳタンパク質のｍＲＮＡを製剤化したＬＮＰにより、様々な間隔でワクチン接種した群である。Ｉ群は、アジュバントした組換えスパイクタンパク質でワクチン接種した群である。Ｊ群は、ネガティヴ・コントロールである。実施例７に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表１２を参照。 図９Ａを参照。 図１０に示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡを製剤化したＬＮＰにより、２回目のワクチン接種のマウスにおいて、細胞性免疫応答が誘導された（ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞の応答）。１回目および２回目のワクチン接種の間隔は、様々に異ならせた。細胞内サイトカイン染色アッセイを利用した。Ａ群～Ｈ群は、完全長のＳタンパク質のｍＲＮＡを製剤化したＬＮＰにより、様々な間隔でワクチン接種した群である。Ｉ群は、アジュバントした組換えスパイクタンパク質でワクチン接種した群である。Ｊ群は、ネガティヴ・コントロールである。実施例７に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表１２を参照。 図１１が示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチンにより、様々な用量でワクチン接種したラットの群において、抗体が顕著に応答した。図１１Ａが示すように、ＩｇＧ１の応答は、Ｃ群～Ｆ群において高かった。図１１Ｂに示すように、ＩｇＧ２ａの応答は、Ｄ群～Ｆ群において高かった。図１１Ｃに示すように、全ＩｇＧの応答は、Ｃ群～Ｅ群において高かった。Ｂ群～Ｆ群は、完全長のＳタンパク質のｍＲＮＡを製剤化したＬＮＰを、様々な用量で投与した群である。Ａ群は、ネガティヴ・コントロールである。図１１Ｄおよび図１１Ｅに示すように、２回目のワクチン接種後の第４２日には、全ての群において、ＩｇＧ１の抗体反応（図１１Ｄ）およびＩｇＧ２ａの抗体価（図１１Ｅ）がさらに上昇した。図１１Ｆおよび図１１Ｇに示すように、ＬＮＰ中に製剤化されている完全長の安定化させたＳタンパク質のｍＲＮＡでワクチン接種することにより、ラットにおいて、ＶＮＴレベルが用量依存的に誘導された。実施例８に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表１３を参照。 図１１ＡＢＣを参照。 図１１ＡＢＣを参照。 図１２に示すように、本発明の完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしている様々なｍＲＮＡワクチンでワクチン接種したハムスターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の攻撃から防護された。図１２Ａが示すように、ワクチン接種したＥ群およびＦ群では、全ＩｇＧ抗体が高くなった。図１２Ｂに示すように、１回目のワクチン接種後（第２８日）または２回目のワクチン接種後（第４２日および第５６日）においては、ＶＮＴが用量依存的に上昇した。図１２Ｃ～Ｅに、検出可能なレベルの複製競合ウイルスを示す。図１２Ｃは、第５６日～第６０日における咽頭スワブの結果である。図１２Ｄは、第６０日における鼻甲介の結果である。図１２Ｆは、第６０日における肺組織の結果である。各点は個々の動物を示す。バーは中央値を示す。Mann-Whitney検定により統計解析を施した。図１２Ｆに示すように、ワクチン接種したハムスターにおいては、攻撃感染から気道が防護され、ワクチンによる疾患の増悪の徴候は見られなかった。第６０日（攻撃感染から４日後）に、ホルマリン固定・パラフィン包埋した組織片を組織病理分析した。調査したパラメータの重篤度に応じて組織病理評価スコアを付与した。各点は個々の動物を示す。バーは中央値を示す。Mann-Whitney検定により統計解析を施した。実施例９に記載の通り実験を行った。詳細は表１４および表１５を参照。 図１２ＡＢを参照。 図１２ＡＢ参照。 図１２ＡＢを参照。 図１３は、健康なヒト被験体における第Ｉ相臨床試験の結果である。図１３Ａは、様々な用量コホートにおける、１回目の投与後および２回目の投与後の全身性有害事象を示す。図１３Ｂは、様々な用量コホートにおける、１回目の投与後および２回目の投与後の局所性有害事象を示す。図１３Ｃは、特定の全身性有害事象を示す（疲労、頭痛、筋肉痛、悪寒、関節痛、発熱、悪心、下痢など）。図１３Ｄは、特定の局所性有害事象を示す（疼痛、掻痒、腫脹、発赤など）。図１３Ｅに示すように、第１日、第２９日、第３６日、第４３日および第５７日において、様々な用量コホートでスパイクタンパク質に特異的なＩｇＧ抗体が増加した。図１３Ｅの表に、ワクチン接種した被験体のセロコンバージョン率を示す。図１３Ｆに示すように、第１日、第３６日および第４３日において、様々な用量コホートでＲＢＤに特異的なＩｇＧ抗体が増加した。図１３Ｆの表に、ワクチン接種した被験体のセロコンバージョン率を示す。図１３Ｇに示すように、ウイルス中和抗体が増加した。図１３Ｇの表に、ワクチン接種した被験体のセロコンバージョン率を示す。図１３に、中和抗体レベルに対する、スパイクタンパク質またはＲＢＤに結合する抗体レベルの比率を示す。図１３Ｉに示すように、１回目の投与後（第２９日）および２回目の投与後（第３６日）において、スパイクタンパク質Ｓ１に対するＣＤ４＋Ｔ細胞が増加した。図１３Ｊに示すように、１回目の投与後（第２９日）および２回目の投与後（第３６日）において、スパイクタンパク質Ｓ２に対するＣＤ４＋Ｔ細胞が増加した。図１３Ｋに示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が血清陽性であった被験体に２μｇまたは４μｇのＣｖｎＣｏＶをワクチン接種すると、ウイルスの中和抗体価が上昇し、ＲＢＤに特異的な抗体が増加した。 図１３Ａを参照。 図１３Ａを参照。 図１３Ａを参照。 図１３Ａを参照。 図１３Ａを参照。 図１３Ａを参照。 図１３Ａを参照。 図１３Ａを参照。 図１３Ａを参照。 図１３Ａを参照。 図１４に示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡでワクチン接種した後、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａが顕著に応答した。１回目のワクチン接種後（第２１日）よりも、２回目のワクチン接種後（第４２日）の方が増加の程度が大きかった（図１４Ａ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡであってｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しているｍＲＮＡを含んでいるワクチン組成物を投与した群（Ｃ群）は、結合抗体が大きく増加した。エンドポイントにおけるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗体価を示す。図１４ＢにＶＮＴの上昇を示す。１回目のワクチン接種後である第２１日において早くも、Ｂ群のマウスと比較すると、Ｃ群のマウスではＶＮＴレベルの急速な上昇が見られた。図１４Ｃに、Ｔ細胞免疫の増進を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ＿ｓｔａｂをコードしているｍＲＮＡであってｈＳＬ－Ａ１００およびＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しているｍＲＮＡを含んでいるワクチン組成物を投与した群（Ｃ群）では、ＩＦＮγ／ＴＮＦが二重陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞が驚くほど大きく増加した。 図１４ＡＢを参照。 図１５に示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチンでワクチン接種したラットの群において、様々な用量で抗体が顕著に応答した。このｍＲＮＡは、代替非コーディング領域として３’末端にｈＳＬ－Ａ１００を有しており、ＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しており、ＬＮＰ中に製剤化されていた。図１５Ａに示すように、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに結合する抗体が大幅に増加した。図１５Ｂに示すように、ＶＮＴは用量依存的に上昇した。実施例１２に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表１７を参照。 図１５Ａを参照。 図１６が示すように、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチンでワクチン接種したラットの群において、様々な用量で抗体が顕著に応答した。このｍＲＮＡは、種々の非コーディング領域を有しており、ＬＮＰ中に製剤化されていた。図１６Ａに示すように、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに結合する抗体は、大幅かつ用量依存的に増加した。図１６Ｂに示すように、１回目のワクチン接種後すぐにＶＮＴは用量依存的に急速に上昇した。このワクチン接種では、完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチンを接種した。このｍＲＮＡは、非コーディング領域として３’末端にｈＳＬ－Ａ１００を有しており、ＵＴＲの組合せａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）を有しており、ＬＮＰ中に製剤化されていた。図１６Ｃに示すように、２回目のワクチン接種後である第４２日において、ＶＮＴは上昇した。実施例１４に記載の通りに実験を行った。コンストラクトの詳細は表２０を参照。 図１６Ａを参照。 図１６Ａを参照。 図１７に示すように、ＣＶｎＣｏＶ（ＬＮＰ中に製剤化されている完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチン）により、非ヒト霊長類における液性応答が誘導される。図１７Ａは、実験設定の模式図である。第０日および第２８日において、アカゲザル（ｎ＝６；各群ともオス３匹、メス３匹）に、０．５μｇまたは８μｇのＣＶｎＣｏＶをＩＭでワクチン接種するか、あるいはワクチン未接種のままにした。第５６日において、全ての動物を、５．０×１０６ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で攻撃した。第６２日、第６３日および第６４日において、各群から２匹の動物を致死させた。三量体のスパイクタンパク質（図１７Ｂ）またはＲＢＤに特異的に結合するＩｇＧ抗体（図１７Ｃ）。様々な時点におけるエンドポイントの力価を示す（Ｃ）。また、様々な時点において、フォーカス減少中和試験により測定したウイルスの中和抗体も示す。全ての値を中央値および値域によって表す。点線は、ワクチン接種および攻撃感染を示す。ＲＢＤとは、受容体結合ドメインのことである。ＶＮＴとは、ウイルスの中和抗体価のことである。実施例１５に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表２１を参照。 図１８に示すように、ＣＶｎＣｏＶ（ＬＮＰ中に製剤化されている完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチン）により、非ヒト霊長類における細胞応答が誘導される。０．５μｇもしくは８μｇのＣＶｎＣｏＶでワクチン接種した動物または未処置の動物から様々な時点において単離したＰＢＭＣを、ex vivoにおいて、Ｓに特異的なペプチドプールで再刺激し、次にＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔで分析した。図１８Ａは、第５６日の攻撃感染前におけるＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔである。パネル１は、Ｓタンパク質の全体を網羅する１種類のペプチドプールで刺激した結果である。パネル２～４は、１０種類のプールでそれぞれ刺激した結果である（１０種類のプールを合せると、Ｓタンパク質の全体を網羅する）。図１８Ｂは、第６２日～第６４日に実験を終了させるまでのＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔである。パネル１は、３種類のメガプールで刺激した結果である。Ｓタンパク質の全体にわたり、応答が見られなかった。パネル２～４は、１０種類のプールでそれぞれ刺激した結果である（１０種類のプールを合せると、Ｓタンパク質の全体を網羅する）。ＳＦＵとは、スポット形成単位のことである。ＰＰとは、ペプチドプールのことである。実施例１５に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は、表２１を参照。 図１９が示すように、ＣＶｎＣｏＶ（ＬＮＰ中に製剤化されている完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチン）により、非ヒト霊長類は攻撃感染から防護される。ＲＴ－ｑＰＣＲにより、次のサンプルにおける全てのウイルスＲＮＡのコピー数を分析した：（図１９Ａ）攻撃後の様々な時点で採取した鼻スワブ；（図１９Ｂ）第５９日および終了日（第６２日～第６４日）に採取した生体ＢＡＬサンプル；（図１９Ｃ）第６２日～第６４日に採取した肺組織のホモジネート。また、ＲＴ－ｑＰＣＲにより、次のサンプルにおけるウイルス性のサブゲノムＲＮＡのコピー数を分析した：（図１９Ｄ）攻撃後の様々な時点で採取した鼻スワブ；（図１９Ｅ）第５９日および終了日（第６２日～第６４日）に採取した生体ＢＡＬサンプル；（図１９Ｃ）第６２日～第６４日に採取した肺組織のホモジネート。値を中央値および値域により表す。下側の点線は、ＬＬＯＤである。上側の点線は、ＬＬＯＱである。Kruskall-Wallis ANOVAの後でDunn検定を行い、群を比較した。ｐ値を示す。ＬＬＯＤとは、検出下限のことである。ＬＬＯＱとは、定量化下限のことである。ＲＴ－ｑＰＣＲとは、逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応のことである。実施例１５に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表２１を参照。 図２０が示すように、ＣＶｎＣｏＶ（ＬＮＰ中に製剤化されている完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチン）により、非ヒト霊長類は攻撃感染から防護された。（図２０Ａ）攻撃前の様々な時点で採取した咽頭スワブについて、全てのウイルスＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲにより分析した。（図２０Ｂ）攻撃前の様々な時点で採取した咽頭スワブについて、サブゲノムＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲにより分析した。次の組織をホモジナイズして、全てのウイルスＲＮＡのコピー数をＲＴ－ｑＰＣＲにより分析した：（図２０Ｃ）扁桃；（図２０Ｄ）気管；（図２０Ｅ）脾臓；（図２０Ｆ）十二指腸；（図２０Ｇ）結腸；（図２０Ｈ）肝臓；（図２９Ｉ）腎臓。ＲＴ－ｑＰＣＲとは、逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応のことである。ｓｇとは、サブゲノムのことである。実施例１５に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表２１を参照。 図２１は、例示的な切片であり、組織病理学（Ｈ＆Ｅ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のin situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を示す。図２１Ａ：肺胞腔内における肺胞のネクローシスおよび炎症性滲出液（＊）、ならびにＩＩ型肺胞上皮細胞の過形成（矢印）。図２１Ｂ：軽度の血管周囲の肥厚（矢印）。図２１Ｃ：肺胞腔内および肺胞中隔内への炎症細胞の浸潤（＊）、ならびにＩＩ型肺胞上皮細胞の過形成（矢印）。図２１Ｄ：炎症巣内の豊富な細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＩＳＨ染色（矢印）。図２１Ｅ：肺胞中隔内の１個の細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＩＳＨ染色（矢印）。図２１Ｆ：肺胞被覆内および肺胞中隔内におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をＩＳＨ染色した細胞の豊富な箇所（矢印）。バーは、１００μｍを表す。ＩＳＨとは、in situハイブリダイゼーションのことである。実施例１５に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表２１を参照。 図２２に示すように、８μｇのＣＶｎＣｏＶ（ＬＮＰ中に製剤化されている完全長の安定化させたＳタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）をコードしているｍＲＮＡワクチン）をワクチン接種することにより、ウイルスの攻撃による病理的変質から肺が防護された。図２２Ａは、全群の動物の肺の病理パラメータおよび平均スコアを示すヒートマップである。重篤度を０～４の尺度で表す。０は観察されない、１は最小限、２は軽度、３は中程度、４は顕著／重度である。図２２Ｂは、各動物の肺の組織病理パラメータの全ての累積スコアを示すグラフである。図２２Ｃは、全ての動物の肺組織切片における、ウイルスＲＮＡの存在を示す。肺切片のうちＩＳＨ染色（RNAScopeによるin situハイブリダイゼーション）で陽性であった面積の割合で表している。図２２Ｄは、ＣＴ放射線検査により検出された肺の病理の累積スコアである。箱ひげは、中央値および値域を表す。Kruskall-Wallis ANOVAの後で、Dunn検定を行い、群を比較した。ｐ値を示す。実施例１５に記載の通り実験を行った。コンストラクトの詳細は表２１を参照。 図２３Ａは、ｍＲＮＡワクチン組成物で刺激したときの、ヒトＰＭＶＣにおけるＩＦＮ－αの増加を示す。図２３Ｂおよび図２３Ｃは、１回目のみのワクチン接種後（第２１日）および２回目のワクチン接種後（第４２日）における、ＶＮＴの上昇を示す。３’末端にｈＳＬ－Ａ１００またはＡ－１００を有するｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物の全てにおいて、より大きく、迅速で、強力なＶＮＴの上昇が見られた（Ｃ群～Ｇ群、Ｉ群～Ｍ群）。これらのコンストラクトにおいて、ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの３’末端に位置していた。 図２４Ａは、１回目のみのワクチン接種後におけるＶＮＴの上昇を示す。３’末端にｈＳＬ－Ａ１００またはＡ－１００を有するｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物では、より大きく、迅速で、強力なＶＮＴの上昇が見られた。これらのコンストラクトにおいて、ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの３’末端に位置していた。図２４Ｂは、第４２日という遅い時点における、１回目のみのワクチン接種後（Ａ群～Ｅ群）および２回目のワクチン接種後（Ｆ群～Ｊ群）のＶＮＴの上昇を示す。１回目のワクチン接種のみを受けた群の中では、Ｒ９７０９を含んでいるｍＲＮＡワクチン組成物（Ｂ群）において、ＶＮＴの抗体価が最も高かった。

Claims (275)

  1. １つ以上の抗原性ペプチドもしくは抗原性タンパク質、またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントをコードしている１つ以上のコーディング配列を有している核酸であって、
    上記１つ以上の抗原性ペプチドもしくは抗原性タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのものであるか、または当該ウイルスに由来しており、
    １つ以上の異種の非翻訳領域（ＵＴＲ）を有している、核酸。
  2. ワクチンに好適である、請求項１に記載の核酸。
  3. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のペプチドまたはタンパク質を含んでいるか、または当該ペプチドまたはタンパク質からなり、
    上記１つ以上のペプチドまたはタンパク質は、構造タンパク質、アクセサリータンパク質、レプリカーゼタンパク質、またはこれらのいずれかの免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来する、
    請求項１または２に記載の核酸。
  4. 上記構造タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、またはこれらのいずれかの免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来する、請求項３に記載の核酸。
  5. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸。
  6. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、または当該アミノ酸配列からなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１～１１１、２７４～１１６６３、１３１７６～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２～２２７５８、２２９１７、２２９２３、２２９２９～２２９６４、２６９３８、２６９３９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  7. 上記スパイクタンパク質（Ｓ）は、スパイクタンパク質断片Ｓ１またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントを含んでいるか、またはそれからなる、請求項４～６のいずれか１項に記載の核酸。
  8. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１～２７、２９、３１～４８、５８～１１１、２７４～１３４５、１４８０～１５４６、１６１４～１１６６３、１３３７７～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  9. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号２７、１２７９～１３４５、２９、１４８０～１５４６、１３２４３～１３３０９、２２７３３～２２７３６、２６９３８、２６９３９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  10. 上記スパイクタンパク質（Ｓ）は、
    スパイクタンパク質断片Ｓ１またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントと、
    スパイクタンパク質断片Ｓ２またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントと、
    を含んでいるか、またはそれからなる、請求項４～９のいずれか１項に記載の核酸。
  11. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１～２６、３１～４８、５８～１１１、２７４～１２７８、１６１４～１１６６３、１３３７７～１３５１０、１３５２１～１４１７７、２２７３２、２２７３７～２２７５８、２２９２９～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  12. 上記スパイクタンパク質（Ｓ）は、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有している、pre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）である、請求項４～１１のいずれか１項に記載の核酸。
  13. 上記１つ以上のpre-fusion構造安定化変異には、下記のアミノ酸置換が含まれている、請求項１２に記載の核酸：
    Ｋ９８６Ｐ；および、
    Ｖ９８７Ｐ。
  14. 上記１つ以上のpre-fusion構造安定化変異には、cavity-filling変異が含まれている、請求項１２または１３に記載の核酸。
  15. 上記１つ以上のcavity-filling変異は、下記を含む群から選択される、請求項１４に記載の核酸：
    Ｔ８８７Ｗ；
    Ａ１０２０Ｗ；
    Ｔ８８７ＷおよびＡ１０２０Ｗ；または、
    Ｐ１０６９Ｆ。
  16. 上記１つ以上のpre-fusion構造安定化変異には、変異型プロトン化部位が含まれている、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の核酸。
  17. 上記１つ以上の変異型プロトン化部位は、下記を含む群から選択される、請求項１６に記載の核酸：
    Ｈ１０４８ＱおよびＨ１０６４Ｎ；
    Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ；または、
    Ｈ１０４８Ｑ、Ｈ１０６４Ｎ、Ｈ１０８３ＮおよびＨ１１０１Ｎ。
  18. 上記１つ以上のpre-fusion構造安定化変異により、１つ以上の人工の分子内ジスルフィド結合が形成される、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の核酸。
  19. 上記１つ以上の人工の分子内ジスルフィド結合は、下記のアミノ酸置換により形成される、請求項１８に記載の核酸：
    Ｉ７１２ＣおよびＴ１０７７Ｃ；
    Ｉ７１４ＣおよびＹ１１１０Ｃ；
    Ｐ７１５ＣおよびＰ１０６９Ｃ；
    Ｇ８８９ＣおよびＬ１０３４Ｃ；
    Ｉ９０９ＣおよびＹ１０４７Ｃ；
    Ｑ９６５ＣおよびＳ１００３Ｃ；
    Ｆ９７０ＣおよびＧ９９９Ｃ；
    Ａ９７２ＣおよびＲ９９５Ｃ；
    Ａ８９０ＣおよびＶ１０４０Ｃ；
    Ｔ８７４ＣおよびＳ１０５５Ｃ；または、
    Ｎ９１４ＣおよびＳ１１２３Ｃ。
  20. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～１９のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１０～２６、４０～４８、８５～１１１、３４１～１２７８、１６８１～２６１８、２６８６～３６２３、３６９１～４６２８、４６９６～５６３３、５７０１～６６３８、６７０６～７６４３、７７１１～８６４８、８７１６～９６５３、９７２１～１０６５８、１０７２６～１１６６３、１３３７７～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２、２２７３８、２２７４０、２２７４２、２２７４４、２２７４６、２２７４８、２２７５０、２２７５２、２２７５４、２２７５６、２２７５８、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  21. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～２０のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１０～２６、３４１～４０７、６０９～１２７８、１３５２１～１３５８７、２２７３８、２２７４０、２２７４２、２２７４４、２２７４６、２２７４８、２２７５０、２２７５２、２２７５４、２２７５６、２２７５８、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  22. 上記１つ以上のコーディング配列は、１つ以上の異種のペプチド要素またはタンパク質要素をさらにコードしており、
    上記異種のペプチド要素またはタンパク質要素は、シグナルペプチド、リンカー、ヘルパーエピトープ、抗原クラスター化要素、三量体化要素、膜貫通要素および／またはＶＬＰ形成配列から選択される、
    請求項１～２１のいずれか１項に記載の核酸。
  23. 上記１つ以上の異種のペプチド要素またはタンパク質要素は、異種の抗原クラスター化要素、異種の三量体化要素および／またはＶＬＰ形成配列である、請求項２２に記載の核酸。
  24. 上記１つ以上の異種の抗原クラスター化要素は、フェリチン要素、ルマジンシンターゼ要素、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）またはエンカプスリンから選択される、請求項２２または２３に記載の核酸。
  25. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～２４のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号５８～７５、８５～１０２、３６２４～５６３３、７６４４～９６５３、１３５８８～１３７２１、１３８５６～１３９８９、２２７３３、２２７３５、２２７３６のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  26. 上記１つ以上の異種の三量体化要素は、フォールドン要素であり、
    好ましくは、フィブリチンフォールドン要素である、
    請求項２２または２３に記載の核酸。
  27. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～２６のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号７６～８４、１０３～１１１、５６３４～６６３８、９６５４～１０６５８、１３７２２～１３７８８、１３９９０～１４０５６、２２７３４、２６９３８、２６９３９のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  28. 上記１つ以上のＶＬＰ形成配列は、ウッドチャック肝炎コア抗原要素（ＷｈｃＡＧ）である、請求項２２または２３に記載の核酸。
  29. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～２８のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号６６３９～７６４３、１０６５９～１１６６３、１３７８９～１３８５５、１４０５７～１４１２３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  30. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～２９のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１、１０、２１、２２、２５、２７、２７４、３４１、４０８、４７５、５４２、７４３、８１０、１０１１、１１４５、１２１２、１２７９、８７１６、１０７２６、２２７３２～２２７５８、２２９２９～２２９４２、２２９４７～２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  31. 上記１つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記アミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～３０のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１０、２２９６０、２２９６１もしくは２２９６３のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  32. 上記１つ以上のコーディング配列は、１つ以上の核酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～３１のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１１６～１３２、１３４～１３８、１４０～１４３、１４５～１７５、１１６６４～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１３１４７、１３５１４、１３５１５、１３５１９、１３５２０、１４１２４～１４１７７、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３１８４、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである。
  33. １つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、Ｓタンパク質を含んでおり、
    上記Ｓタンパク質は、
    pre-fusion構造安定化変異であるＫ９８６Ｐ変異およびＶ９８７Ｐ変異を有しており、かつ、
    配列番号１０と同一であるアミノ酸配列を含んでいるもしくは当該アミノ酸配列からなる、または、これらのいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである、
    請求項１～３２のいずれか１項に記載の核酸。
  34. 上記１つ以上のコーディング配列は、コドンを改変したコーディング配列であり、
    好ましくは、上記コドンを改変したコーディング配列の１つ以上によってコードされているアミノ酸配列は、対応する野生型コーディング配列または参照コーディング配列によってコードされているアミノ酸配列と比較して変化していない、
    請求項１～３３のいずれか１項に記載の核酸。
  35. 上記コドンを改変したコーディング配列の１つ以上は、Ｃを最大化したコーディング配列、ＣＡＩを最大化したコーディング配列、ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列、Ｇ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列、Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項３４に記載の核酸。
  36. 上記コドンを改変したコーディング配列の１つ以上は、Ｇ／Ｃを最適化したコーディング配列、ヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列またはＧ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列である、請求項３４または３５に記載の核酸。
  37. 上記１つ以上のコーディング配列は、核酸配列を含んでいるＧ／Ｃを最適化したコーディング配列を有しているか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～３６のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１３６～１３８、１４０、１４１、１４８、１４９、１５２、１５５、１５６、１５９、１６２、１６３、１６６、１６９、１７０、１７３、１１７３１～１１８１３、１１８１５、１１８１７～１１９６６、１２２７１～１２４７２、１２７４３～１２９４４、１３５１４、１３５１５、１４１２４～１４１３２、１４１４２～１４１５０、１４１６０～１４１６８、２２７５９、２２７６４～２２７８６、２２７９１～２２８１３、２２８１８～２２８３９、２２９６９～２３０４０、２３０７７～２３１４８、２３１８９～２３２６０、２３２９７～２３３６８、２３４０９～２３４８０、２３５１７～２３５８８、２３６２９～２３７００、２３７３７～２３８０８、２３８４９～２３９２０、２３９５７～２４０２８、２４０６９～２４１４０、２４１７７～２４２４８、２４２８９～２４３６０、２４３９７～２４４６８、２４５０９～２４５８０、２４６１７～２４６８８、２４７２９～２４８００、２４８３７～２４９０８、２４９４９～２５０２０、２５０５７～２５１２８、２５１６９～２５２４０、２５２７７～２５３４８、２５３８９～２５４６０、２５４９７～２５５６８、２５６０９～２５６８０、２５７１７～２５７８８、２５８２９～２５９００、２５９３７～２６００８、２６０４９～２６１２０、２６１５７～２６２２８、２６２６９～２６３４０、２６３７７～２６４４８、２６４８９～２６５６０、２６５９７～２６６６８、２６７０９～２６７８０、２６８１７～２６８８８、２６９２５～２６９３７のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである。
  38. 上記１つ以上のコーディング配列は、核酸配列を含んでいるヒトにおけるコドン使用に適合させたコーディング配列を有しているか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～３７のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１４２、１４３、１４５、１５０、１５３、１５７、１６０、１６４、１６７、１７１、１７４、１１９６７～１２０３３、１２４７３～１２５３９、１２９４５～１３０１１のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである。
  39. 上記１つ以上のコーディング配列は、核酸配列を含んでいるＧ／Ｃ含有率を改変したコーディング配列を有しているか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～３８のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１４６、１４７、１５１、１５４、１５８、１６１、１６５、１６８、１７２、１７５、１２０３４～１２０５０、１２０５２、１２０５４～１２２０３、１２５４０～１２６７５、１３０１２～１３１４７、１３５１９、１３５２０、１４１３３～１４１４１、１４１５１～１４１５９、１４１６９～１４１７７、２３０４１～２３０７６、２３１４９～２３１８４、２３２６１～２３２９６、２３３６９～２３４０４、２３４８１～２３５１６、２３５８９～２３６２４、２３７０１～２３７３６、２３８０９～２３８４４、２３９２１～２３９５６、２４０２９～２４０６４、２４１４１～２４１７６、２４２４９～２４２８４、２４３６１～２４３９６、２４４６９～２４５０４、２４５８１～２４６１６、２４６８９～２４７２４、２４８０１～２４８３６、２４９０９～２４９４４、２５０２１～２５０５６、２５１２９～２５１６４、２５２４１～２５２７６、２５３４９～２５３８４、２５４６１～２５４９６、２５５６９～２５６０４、２５６８１～２５７１６、２５７８９～２５８２４、２５９０１～２５９３６、２６００９～２６０４４、２６１２１～２６１５６、２６２２９～２６２６４、２６３４１～２６３７６、２６４４９～２６４８４、２６５６１～２６５９６、２６６６９～２６７０４、２６７８１～２６８１６、２６８８９～２６９２４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)これらのいずれかの配列の断片またはバリアントである。
  40. 上記１つ以上のコーディング配列のＧ／Ｃ含有率は、約５０％以上、約５５％以上または約６０％以上であり、
    好ましくは、約６３．９％である、
    請求項１～３９のいずれか１項に記載の核酸。
  41. 上記１つ以上のコーディング配列は、Ｓタンパク質をコードしており、
    上記Ｓタンパク質は、pre-fusion構造安定化変異であるＫ９８６Ｐ変異およびＶ９８７Ｐ変異を有しており、
    上記コーディング配列は、核酸配列を含んでいるＧ／Ｃを最適化したコーディング配列を有しているか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、配列番号１３７、２３０９０、２３０９１、２３０９３、２３０９４、またはその断片もしくはバリアントを含んでいる、
    請求項１～４０のいずれか１項に記載の核酸。
  42. 上記１つ以上の異種の非翻訳領域は、１つ以上の異種の５’ＵＴＲおよび／または１つ以上の異種の３’ＵＴＲから選択される、請求項１～４１のいずれか１項に記載の核酸。
  43. 上記１つ以上の異種の３’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項４２に記載の核酸：
    (i)ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、αグロビン、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１およびＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’ＵＴＲに由来する；
    (ii)(i)の遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片またはバリアントに由来する。
  44. 上記１つ以上の異種の５’ＵＴＲは、核酸配列を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項４２に記載の核酸：
    (i)ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４ＢおよびＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’ＵＴＲに由来する；
    (ii)(i)の遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片またはバリアントに由来する。
  45. 上記１つ以上の異種の５’ＵＴＲおよび上記１つ以上の異種の３’ＵＴＲのＵＴＲ設計は、ａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）、ａ－３（ＳＬＣ７Ａ３／ＰＳＭＢ３）、ｅ－２（ＲＰＬ３１／ＲＰＳ９）およびｉ－３（－／ｍｕａｇ）から選択され、
    特に好ましくは、ＵＴＲ設計は、ａ－１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）およびｉ－３（－／ｍｕａｇ）である、
    請求項４２に記載の核酸。
  46. 上記核酸は、１つ以上のポリ（Ａ）配列および／または１つ以上のポリ（Ｃ）配列を有しており、
    好ましくは、上記ポリ（Ａ）配列は、３０～２００個のアデノシンヌクレオチドを含んでおり、
    好ましくは、上記ポリ（Ｃ）配列は、１０～４０個のシトシンヌクレオチドを含んでいる、
    請求項１～４５のいずれか１項に記載の核酸。
  47. 上記核酸は、１つ以上のヒストンステムループを有している、請求項１～４６のいずれか１項に記載の核酸。
  48. 上記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１～４７のいずれか１項に記載の核酸。
  49. 上記核酸は、コーディングＲＮＡである、請求項１～４８のいずれか１項に記載の核酸。
  50. 上記コーディングＲＮＡは、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡまたはレプリコンＲＮＡである、請求項４９に記載の核酸。
  51. 上記核酸（好ましくはコーディングＲＮＡ）は、ｍＲＮＡである、請求項１～５０のいずれか１項に記載の核酸。
  52. 上記ｍＲＮＡは、レプリコンＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡではない、請求項５１に記載の核酸。
  53. 上記ｍＲＮＡは、
    ３０～２００個のアデノシンヌクレオチドを含んでいる１つ以上のポリ（Ａ）配列を有しており、かつ、
    ３’末端のヌクレオチドがアデノシンである、
    請求項５１に記載の核酸。
  54. 上記ＲＮＡ（好ましくはコーディングＲＮＡ）は、５’キャップ構造を有しており、
    好ましくは、上記５’キャップ構造は、
    請求項４８～５１のいずれか１項に記載の核酸。ｍ７Ｇ構造、ｃａｐ０構造、ｃａｐ１構造、ｃａｐ２構造、改変ｃａｐ０構造または改変ｃａｐ１構造であり、
    好ましくは、５’ｃａｐ１構造である、
    請求項４８～５１のいずれか１項に記載の核酸。
  55. 上記核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を含んでいる、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の核酸：
    （Ａ）５’ｃａｐ１構造；
    （Ｂ）配列番号１３７のコーディング配列、またはその断片もしくはバリアント；
    （Ｃ）αグロビン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２６７または２６８の３’ＵＴＲ）；
    （Ｄ）約６４個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列；
    （Ｅ）約３０個のＣヌクレオチドを含んでいるポリ（Ｃ）配列；
    （Ｆ）配列番号１７８または１７９のヒストンステムループ。
  56. 上記核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を含んでいる、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の核酸：
    （Ａ）５’ｃａｐ１構造
    （Ｂ）ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２３１または２３２の５’ＵＴＲ）；
    （Ｃ）配列番号１３７のコーディング配列、またはその断片もしくはバリアント；
    （Ｄ）ＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２５３または２５４の３’ＵＴＲ）；
    （Ｅ）配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ；
    （Ｆ）約１００個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列。
  57. ３’末端のヌクレオチドがアデノシンである、請求項５６に記載の核酸。
  58. 上記核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を含んでいる、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の核酸：
    （Ａ）５’ｃａｐ１構造；
    （Ｂ）配列番号２３０９０もしくは２３０９１のコーディング配列、またはその断片もしくはバリアント
    （Ｃ）αグロビン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２６７または２６８の３’ＵＴＲ）
    （Ｄ）約６４個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列；
    （Ｅ）約３０個のＣヌクレオチドを含んでいるポリ（Ｃ）配列；
    （Ｆ）配列番号１７８または１７９のヒストンステムループ。
  59. 上記核酸（好ましくはｍＲＮＡ）は、５’から３’方向に下記の要素を含んでいる、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の核酸：
    （Ａ）５’ｃａｐ１構造；
    （Ｂ）ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２３１または２３２の５’ＵＴＲ）；
    （Ｃ）配列番号２３０９０もしくは２３０９１のコーディング配列、またはその断片もしくはバリアント
    （Ｄ）ＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲ（好ましくは、配列番号２５３または２５４の３’ＵＴＲ）
    （Ｅ）配列番号１７８または１７９から選択されるヒストンステムループ；
    （Ｆ）約１００個のＡヌクレオチドを含んでいるポリ（Ａ）配列。
  60. 上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～５９のいずれか１項に記載の核酸：
    配列番号１４８～１７５、１２２０４～１３１４７、１４１４２～１４１７７、２２７８６～２２８３９、２３１８９～２３４０４、２３４０９～２３６２４、２３６２９～２３８４４、２３８４９～２４０６４、２４０６９～２４２８４、２４２８９～２４５０４、２４５０９～２４７２４、２４７２９～２４９４４、２４９４９～２５１６４、２５１６９～２５３８４、２５３８９～２５６０４、２５６０９～２５８２４、２５８２９～２６０４４、２６０４９～２６２６４、２６２６９～２６４８４、２６４８９～２６７０４、２６７０９～２６９３７１４８からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである。
  61. 上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしており、
    (i)配列番号１４９、１５６、１２３３８、１５０、１５７、１５１、１５８、１２５４１、１６３、１７０、１２８１０、１６４、１７１、１６５、１７２、１３０１３、１２３４２～１２３５１、１２５４５～１２５５４、１２８１４～１２８２３、１３０１７～１３０２６、１４１３３からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの配列の断片またはバリアントである；
    好ましくは、上記核酸配列は、下記(iii)または(iv)を満たしている、請求項１～６０のいずれか１項に記載の核酸：
    (iii)配列番号１４９、１５０、１５１、１６３、１６４、１６５から選択される；
    (iv)(iii)のいずれかの配列の断片もしくはバリアントから選択される。
  62. 上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～６１のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１６３から選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)の断片またはバリアントである。
  63. 上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～６２のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号１４９から選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)の断片またはバリアントである。
  64. 上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～６３のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号２４８３７から選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)の断片またはバリアントである。
  65. 上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～６４のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号２３３１１、２３５３１、２４８５１からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)の断片またはバリアントである。
  66. 上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～６５のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号２３３１０、２３５３０、２４８５０からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)の断片またはバリアントである。
  67. 上記核酸は、核酸配列（好ましくはＲＮＡ配列）を含んでいるか、またはそれからなり、
    上記核酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１～６６のいずれか１項に記載の核酸：
    (i)配列番号２３３１３、２３５３３、２４８５３、２３３１４、２３５３４、２４８５４からなる群より選択される核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)の断片またはバリアントである。
  68. 上記核酸は、１－メチルシュードウリジン置換を有していないＲＮＡである、請求項１～６７のいずれか１項に記載の核酸。
  69. 上記核酸は、化学修飾ヌクレオチドを含んでいないＲＮＡである、請求項１～６８のいずれか１項に記載の核酸。
  70. 上記核酸は、in vitroにおいて転写されたＲＮＡであり、
    in vitroにおけるＲＮＡの転写は、配列最適化されているヌクレオチド混合物およびキャップアナログの存在下で行われ、
    好ましくは、上記配列最適化されているヌクレオチド混合物は、化学修飾ヌクレオチドを含んでいない、
    請求項１～６９のいずれか１項に記載の核酸。
  71. 上記核酸は、精製ＲＮＡであり、
    好ましくは、ＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製されている、
    請求項１～７０のいずれか１項に記載の核酸。
  72. 上記核酸は、精製ＲＮＡであり、
    上記精製ＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製されており、
    上記精製ＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦにより精製していないＲＮＡと比べて、２本鎖ＲＮＡ副生成物が約５％、約１０％または約２０％少ない、
    請求項１～７１のいずれか１項に記載の核酸。
  73. 上記核酸は、精製ＲＮＡであり、
    上記精製ＲＮＡは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはＴＦＦによって精製されており、
    上記精製ＲＮＡは、オリゴｄＴ精製、沈澱、濾過および／または陰イオン交換クロマトグラフィによって精製したＲＮＡと比べて、２本鎖ＲＮＡ副生成物が約５％、約１０％または約２０％少ない、
    請求項１～７２のいずれか１項に記載の核酸。
  74. 請求項１～７３のいずれか１項に記載の核酸の１つ以上を含んでいる組成物であって、
    任意構成で、上記組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアを含んでいる、
    組成物。
  75. 上記組成物は、配列番号１４９、１６３、２４８３７、２３３１１、２３５３１、２３３１０、２３５３０、２３３１３もしくは２３５３３に記載のｍＲＮＡ、またはこれらのいずれかの配列の断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項７４に記載の組成物。
  76. 上記組成物は、請求項１～７３のいずれか１項に記載の核酸を複数または２つ以上含んでいる多価組成物である、請求項７４に記載の組成物。
  77. 上記多価組成物の複数または２つ以上の核酸配列は、異なるスパイクタンパク質をそれぞれコードしており、
    好ましくは、上記スパイクタンパク質は、pre-fusion構造安定化スパイクタンパク質である、
    請求項７６に記載の組成物。
  78. 上記異なるスパイクタンパク質またはpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの異なるバリアント／単離株に由来する、請求項７７に記載の組成物。
  79. 上記異なるスパイクタンパク質またはpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質は、少なくとも、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１またはＣＡＬ．２０Ｃに由来する、請求項７８に記載の組成物。
  80. 上記異なるスパイクタンパク質またはpre-fusion構造安定化スパイクタンパク質は、下記(i)～(v)のうち１つ以上のＳタンパク質におけるアミノ酸変異を有している、請求項７８に記載の組成物：
    (i)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｉ６９２ＶおよびＭ１２２９Ｉ；
    (ii)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、ｄｅｌＹ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ；
    (iii)Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、ｄｅｌＬ２４２、ｄｅｌＡ２４３、ｄｅｌＬ２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖ；
    (iv)Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５ＹおよびＴ１０２７Ｉ；
    (v)Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、Ｌ４５２ＲおよびＤ６１４Ｇ。
  81. 上記多価組成物は、２つ以上の核酸種を含んでおり、
    上記核酸種は、配列番号１０、２２９６１、２２９６０、２２９６３、２２９４１、２２９６４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であるアミノ酸配列をコードしているコーディング配列を有している、
    請求項７６～７８のいずれか１項に記載の組成物。
  82. 上記多価組成物は、２つ以上のＲＮＡ種を含んでおり、
    上記ＲＮＡ種は、配列番号１４９もしくは２４８３７、２３５３１もしくは２４８５１、２３５３０もしくは２４８５０、２３５３３もしくは２４８５３、２３４３９もしくは２４７５９、または２３５３４もしくは２４８５４のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である、
    請求項７６～７８のいずれか１項に記載の組成物。
  83. 上記組成物は、ＲＮＡ完全性が７０％以上であるｍＲＮＡを含んでいる、請求項７４～８０のいずれか１項に記載の組成物。
  84. 上記組成物は、キャッピング率が７０％以上であるｍＲＮＡを含んでおり、
    好ましくは、キャッピング率が７０％以上、８０％以上または９０％以上であり、かつ、Ｃａｐ１構造を有しているｍＲＮＡ種を含んでいる、
    請求項７４～８３のいずれか１項に記載の組成物。
  85. 上記１つ以上の核酸は、１つ以上のカチオン性化合物またはポリカチオン性化合物と複合化もしくは関連付けられているか、または少なくとも部分的に複合化もしくは関連付けられており、
    好ましくは、上記カチオン性化合物またはポリカチオン性化合物は、カチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー、カチオン性もしくはポリカチオン性多糖、カチオン性もしくはポリカチオン性脂質、カチオン性もしくはポリカチオン性タンパク質、カチオン性もしくはポリカチオン性ペプチド、またはこれらの任意の組合せである、
    請求項７４～８４のいずれか１項に記載の組成物。
  86. 上記１つ以上の核酸は、１つ以上の脂質または脂質系キャリアと複合化または関連付けられており、これにより、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックスおよび／またはナノリポソームを形成しており、
    好ましくは、上記１つ以上の核酸をカプセル化している、
    請求項８５に記載の組成物。
  87. 上記１つ以上の核酸は、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子を形成している、請求項８５または８６に記載の組成物。
  88. 上記ＬＮＰは、式ＩＩＩ－３に係るカチオン性脂質を含んでいる、請求項８６または８７に記載の組成物。
    Figure 2023513502000054
  89. 上記ＬＮＰは、式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質を含んでいる、請求項８６～８８のいずれか１項に記載の組成物：
    Figure 2023513502000055
     式中、
    ｎの平均値は、３０～６０であり、
    好ましくは、ｎの平均値は、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４であり、
    最も好ましくは、ｎの平均値は、４９または４５である。
  90. 上記ＬＮＰは、式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質を含んでいる、請求項８６～８８のいずれか１項に記載の組成物：
    Figure 2023513502000056
     式中、ｎは、上記ＰＥＧ脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌとなるように選択される整数である。
  91. 上記ＬＮＰは、１つ以上の中性脂質および／または１つ以上のステロイドもしくはステロイドアナログを含んでいる、請求項８６～９０のいずれか１項に記載の組成物。
  92. 上記中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、
    好ましくは、上記カチオン性脂質のＤＳＰＣに対するモル比は、（約２：１）～（約８：１）である、
    請求項９１に記載の組成物。
  93. 上記ステロイドは、コレステロールであり、
    好ましくは、上記カチオン性脂質のコレステロールに対するモル比は、（約２：１）～（約１：１）である、
    請求項９１に記載の組成物。
  94. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)１つ以上のカチオン性脂質、好ましくは式（ＩＩＩ）の脂質、より好ましくは脂質ＩＩＩ－３；
    (ii)１つ以上の中性脂質、好ましくは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
    (iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ、好ましくはコレステロール；
    (iv)１つ以上のポリマー複合化脂質、好ましくは式（ＩＶａ）に由来するＰＥＧ脂質であってｎ＝４９のもの；
    上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
    請求項８６～９３のいずれか１項に記載の組成物。
  95. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)１つ以上のカチオン性脂質、好ましくは式（ＩＩＩ）の脂質、より好ましくは脂質ＩＩＩ－３；
    (ii)１つ以上の中性脂質、好ましくは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
    (iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ、好ましくはコレステロール；
    (iv)１つ以上のポリマー複合化脂質、好ましくは式（ＩＶａ）に由来するＰＥＧ脂質であってｎ＝４５のもの；
    上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
    請求項８６～９３のいずれか１項に記載の組成物。
  96. 上記(i)～(iv)のモル比は、約５０：１０：３８．５：１．５であり、
    好ましくは、４７．５：１０：４０．８：１．７であり、
    より好ましくは、４７．４：１０：４０．９：１．７である、
    請求項９４または９５に記載の組成物。
  97. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記組成物に含まれている遊離ＲＮＡ（複合化またはカプセル化されていないＲＮＡ）は、約２０％未満であり、
    好ましくは、遊離ＲＮＡは、約１５％未満であり、
    より好ましくは、遊離ＲＮＡは、約１０％未満である、
    請求項８７～９６のいずれか１項に記載の組成物。
  98. 脂質の核酸に対する重量比は、（約１０：１）～（約６０：１）であり、
    好ましくは、（約２０：１）～（約３０：１）であり、
    例えば、約２５：１である、
    請求項８７～９７のいずれか１項に記載の組成物。
  99. 上記核酸をカプセル化している上記ＬＮＰのＮ／Ｐ比は、約１～約１０であり、
    好ましくは、約５～約７であり、
    より好ましくは、約６である、
    請求項８７～９８のいずれか１項に記載の組成物。
  100. 上記組成物の多分散指数（ＰＤＩ）は、約０．４未満であり、
    好ましくは、約０．３未満であり、
    より好ましくは、約０．２未満であり、
    最も好ましくは、約０．１未満である、
    請求項８７～９９のいずれか１項に記載の組成物。
  101. 上記ＬＮＰのＺ平均粒子径は、約６０～約１２０ｎｍであり、
    好ましくは、約１２０ｎｍ未満であり、
    より好ましくは、約１００ｎｍ未満であり、
    最も好ましくは約８０ｎｍ未満である、
    請求項８６～１００のいずれか１項に記載の組成物。
  102. 上記ＬＮＰのうち、粒子径が約５００ｎｍ超であるＬＮＰは、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満である、請求項８６～１０１のいずれか１項に記載の組成物。
  103. 上記ＬＮＰのうち、粒子径が約２０ｎｍ未満であるＬＮＰは、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満である、請求項８６～１０２のいずれか１項に記載の組成物。
  104. 脂質系キャリアのうち球状であるものは、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上であり、
    好ましくは、固体または部分的に固体のコアを有している、
    請求項８６～１０３のいずれか１項に記載の組成物。
  105. 上記組成物の濁度は、約１５０～約０．０ＦＮＵであり、
    好ましくは、約５０ＦＮＵ以下であり、
    より好ましくは、約２５ＦＮＵ以下である、
    請求項８６～１０４のいずれか１項に記載の組成物。
  106. 濃度が約５０～約３００ｍＭの糖をさらに含んでおり、
    好ましくは、濃度が約１５０ｍＭのスクロースを含んでいる、
    請求項７４～１０５のいずれか１項に記載の組成物。
  107. 濃度が約１０～約２００ｍＭの塩をさらに含んでおり、
    好ましくは、濃度が約７５ｍＭのＮａＣｌを含んでいる、
    請求項７４～１０６のいずれか１項に記載の組成物。
  108. 濃度が１～約１００ｍＭの緩衝剤をさらに含んでおり、
    好ましくは、濃度が約１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４を含んでいる、
    請求項７４～１０７のいずれか１項に記載の組成物。
  109. 上記組成物のｐＨは、約７．０～８．０であり、
    好ましくは、約７．４である、
    請求項７４～１０８のいずれか１項に記載の組成物。
  110. ＲＮＡをカプセル化している脂質ナノ粒子を含んでおり、
    上記ＲＮＡは、pre-fusion構造安定化変異であるＫ９８６Ｐ変異およびＶ９８７Ｐ変異を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードしており、
    上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３のカチオン性脂質；
    (ii)１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａのＰＥＧ脂質（ｎ＝４９）；
    上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約４７．４％であり、ＤＳＰＣが約１０％であり、コレステロールが約４０．９であり、ＰＥＧ脂質が１．７％であり、
    上記ＲＮＡは、配列番号１６３または１４９の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であり、
    上記ＲＮＡは、化学修飾されておらず、
    上記ＲＮＡは、５’ｃａｐ１構造を有しており、
    上記ＲＮＡの完全性は、約７０％以上であり、
    上記ＲＮＡをカプセル化している上記ＬＮＰのＮ／Ｐ比は、約６であり、
    上記ＲＮＡをカプセル化している上記ＬＮＰのＺ平均粒子径は、約６０～約１２０ｎｍであり、
    上記組成物に含まれている遊離ＲＮＡ（複合化またはカプセル化されていないＲＮＡ）は、約２０％未満であり、
    任意構成で、上記組成物は、濃度が約１５０ｍＭのスクロース、濃度が約７５ｍＭのＮａＣｌ、濃度が約１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４をさらに含んでおり、
    任意構成で、上記組成物のｐＨは、約７．４である、
    請求項８６～１０９のいずれか１項に記載の組成物。
  111. ＲＮＡをカプセル化している脂質ナノ粒子を含んでおり、
    上記ＲＮＡは、pre-fusion構造安定化変異であるＫ９８６Ｐ変異およびＶ９８７Ｐ変異を有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードしており、
    上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３のカチオン性脂質；
    (ii)１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａのＰＥＧ脂質（ｎ＝４５）；
    上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約４７．４％であり、ＤＳＰＣが１０％であり、コレステロールが４０．９であり、ＰＥＧ脂質が１．７％であり、
    上記ＲＮＡは、配列番号１６３または１４９の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であり、
    上記ＲＮＡは、化学修飾されておらず、
    上記ＲＮＡは、５’ｃａｐ１構造を有しており、
    上記ＲＮＡの完全性は、約７０％以上であり、
    上記ＲＮＡをカプセル化している上記ＬＮＰのＮ／Ｐ比は、約６であり、
    上記ＲＮＡをカプセル化している上記ＬＮＰのＺ平均粒子径は、約６０～約１２０ｎｍであり、
    上記組成物に含まれている遊離ＲＮＡ（複合化していないＲＮＡ）は、約２０％未満であり、
    任意構成で、上記組成物は、濃度が約１５０ｍＭのスクロース、濃度が約７５のＮａＣｌ、濃度が約１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４を含んでおり、
    任意構成で、上記組成物のｐＨは、約７．４である、
    請求項８６～１０９のいずれか１項に記載の組成物。
  112. 化学修飾されていないＲＮＡを含んでおり、
    上記ＲＮＡは、配列番号１６３の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であり、
    上記ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されており、
    上記ＬＮＰにおいて、カチオン性脂質ＩＩＩ－３、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質のモル比は、約５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ％）であり、
    好ましくは、４７．５：１０：４０．８：１．７（ｍｏｌ％）であり、
    より好ましくは、４７．４：１０：４０．９：１．７（ｍｏｌ％）である、
    請求項８６～１１０のいずれか１項に記載の組成物。
  113. 化学修飾されていないＲＮＡを含んでおり、
    上記ＲＮＡは、配列番号１４９の核酸配列と同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一であり、
    上記ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化されており、
    上記ＬＮＰにおいて、カチオン性脂質ＩＩＩ－３、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質のモル比は、約５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ％）であり、
    好ましくは、４７．５：１０：４０．８：１．７（ｍｏｌ％）であり、
    より好ましくは、４７．４：１０：４０．９：１．７（ｍｏｌ％）である、
    請求項８６～１１０のいずれか１項に記載の組成物。
  114. 上記組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓ）をコードしているｍＲＮＡを含んでおり、
    上記ｍＲＮＡは、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有しているpre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）である、
    請求項７４～１１２のいずれか１項に記載の組成物。
  115. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をコードしている上記ｍＲＮＡは、配列番号１６３と９５％以上同一であるか、または配列番号１６３と同一のコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、請求項１１４に記載の組成物。
  116. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)１つ以上の中性脂質；
    (iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ；
    (iv)１つ以上のＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
    請求項１１４に記載の組成物。
  117. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
    請求項１１４に記載の組成物。
  118. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、約４７．５：１０：４０．８：１．７である、
    請求項１１４に記載の組成物。
  119. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、４７．４：１０：４０．９：１．７である、
    請求項１１４に記載の組成物。
  120. ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、請求項１０７～１１８のいずれか１項に記載の組成物。
  121. 上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成しており、
    上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、約４７．５：１０：４０．８：１．７であり、
    ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、
    請求項１２０に記載の組成物。
  122. 上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成しており、
    上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、４７．４：１０：４０．９：１．７であり、
    ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、
    請求項１２０に記載の組成物。
  123. 上記組成物は、凍結乾燥組成物である、請求項７４～９９、１１０～１２２のいずれか１項に記載の組成物。
  124. 上記凍結乾燥組成物の含水率は、約１０％未満である、請求項１２３に記載の組成物。
  125. 上記凍結乾燥組成物の含水率は、約０．５％～５％である、請求項１２４に記載の組成物。
  126. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記組成物は、液体として、約５℃にて、約２週間以上保存した後に安定である、
    請求項８６～１２２のいずれか１項に記載の組成物。
  127. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記組成物は、液体として、約５℃にて、１箇月間以上保存した後に安定である、
    請求項１２６に記載の組成物。
  128. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記組成物は、液体として、約５℃にて、約２週間から約１箇月間、約２箇月間、約３箇月間、約４箇月間、約５箇月間、約６箇月間または約１年間保存した後に安定である、
    請求項１２６に記載の組成物。
  129. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    液体として、約５℃にて、約２週間以上保存した後に、上記ＲＮＡの７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が損傷していない、
    請求項１２６に記載の組成物。
  130. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    液体として、約５℃にて、１箇月間以上保存した後に、上記ＲＮＡの７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が損傷していない、
    請求項１２９に記載の組成物。
  131. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    液体として、約５℃にて、約２週間から約１箇月間、約２箇月間、約３箇月間、約４箇月間、約５箇月間、約６箇月間または約１年間保存した後に、上記ＲＮＡの７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が損傷していない、
    請求項１２６に記載の組成物。
  132. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    液体として、約５℃にて、約２週間保存した後に、上記ＲＮＡの８０％以上が損傷していない、
    請求項１２６に記載の組成物。
  133. 上記組成物は、低凝集性脂質を含んでいる、請求項８６～１３２のいずれか１項に記載の組成物。
  134. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記ＲＮＡの濃度は、約１０μｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬであり、
    好ましくは、約１００μｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬである、
    請求項８６～１３３のいずれか１項に記載の組成物。
  135. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記ＲＮＡの濃度は、１００μｇ／ｍＬ以上であり、
    より好ましくは、２００μｇ／ｍＬ以上であり、
    最も好ましくは、５００μｇ／ｍＬ以上である、
    請求項８６～１３３のいずれか１項に記載の組成物。
  136. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記ＲＮＡのＲＮＡ完全性は、約５０％以上であり、
    好ましくは、約６０％以上であり、
    より好ましくは、約７０％以上であり、
    最も好ましくは、約８０％以上である、
    請求項８６～１３５のいずれか１項に記載の組成物。
  137. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記組成物に含まれている遊離ＲＮＡは、約２０％未満であり、
    好ましくは、約１５％未満であり、
    より好ましくは、約１０％未満である、
    請求項８６～１３６のいずれか１項に記載の組成物。
  138. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記組成物に含まれている２価のカチオンは、ＲＮＡ１ｇあたり約１００ｎＭ未満であり、
    好ましくは、ＲＮＡ１ｇあたり約５０ｎＭ未満であり、
    より好ましくは、ＲＮＡ１ｇあたり約１０ｎＭ未満である、
    請求項８６～１３７のいずれか１項に記載の組成物。
  139. 上記２価のカチオンは、Ｍｇ２＋および／またはＣａ２＋から選択される、請求項１３８に記載の組成物。
  140. 上記脂質の濃度は、約２５０μｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬであり、
    好ましくは、約２．５ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬである、
    請求項８６～１３９のいずれか１項に記載の組成物。
  141. 上記脂質の濃度は、約２．５ｍｇ／ｍＬ以上であり、
    好ましくは、５ｍｇ／ｍＬ以上であり、
    より好ましくは、１２．５ｍｇ／ｍＬ以上である、
    請求項８６～１４０のいずれか１項に記載の組成物。
  142. 上記低凝集性脂質の濃度は、約１７．５μｇ／ｍＬ～約１７．５ｍｇ／ｍＬであり、
    好ましくは、約１７５μｇ／ｍＬ～約１．７５ｍｇ／ｍＬである、
    請求項１３３～１４２のいずれか１項に記載の組成物。
  143. 上記低凝集性脂質の濃度は、約１７５μｇ／ｍＬ以上であり、
    好ましくは、約３５０μｇ／ｍＬ以上であり、
    より好ましくは、８７５μｇ／ｍＬ以上である、
    請求項１３３～１４２のいずれか１項に記載の組成物。
  144. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記脂質の上記ＲＮＡに対する重量比は、（約１０：１）～（約６０：１）であり、
    好ましくは、（約２０：１）～（約３０：１）であり、
    より好ましくは、約２５：１である、
    請求項８６～１４３のいずれか１項に記載の組成物。
  145. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記脂質系キャリアの上記ＲＮＡに対するＮ／Ｐ比は、約１～約１０であり、
    好ましくは、約５～約７であり、
    より好ましくは、約６でる、
    請求項８６～１４４のいずれか１項に記載の組成物。
  146. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記ＲＮＡをカプセル化している上記脂質系キャリアに含まれている低凝集性脂質のモル比は、約０．５％～１５％であり、
    好ましくは、約１．０％～約２．５％であり、
    より好ましくは、約１．７％である、
    請求項８６～１４３のいずれか１項に記載の組成物。
  147. 上記低凝集性脂質は、ポリマー複合化脂質（例えば、ＰＥＧ複合化脂質）である、請求項１３３～１４３のいずれか１項に記載の組成物。
  148. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記ＲＮＡおよび当該ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアは、下記(i)～(iii)のうち１つ以上により精製されている、請求項８６～１４７のいずれか１項に記載の組成物：
    (i)１つ以上の精製工程（好ましくは、１つ以上のＴＦＦ工程）；
    (ii)１つ以上の清澄化工程；
    (iii)１つ以上の濾過工程。
  149. 上記組成物に含まれているエタノールは、約５００ｐｐｍ未満であり、
    好ましくは、約５０ｐｐｍ未満であり、
    より好ましくは、約５ｐｐｍ未満である、
    請求項８６～１４８のいずれか１項に記載の組成物。
  150. 上記組成物のオスモル濃度は、約２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ～約４５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであり、
    好ましくは、約３３５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである、
    請求項８６～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
  151. 上記組成物は、液体として、約２５℃にて保存した後、１週間以上安定であり、
    好ましくは、２週間以上安定であり、
    より好ましくは、３週間以上安定であり、
    最も好ましくは、４週間以上安定である、
    請求項８６～１５０のいずれか１項に記載の組成物。
  152. 上記組成物は、液体として、約４０℃にて保存した後、１日以上安定であり、
    好ましくは、２日以上安定であり、
    より好ましくは、３日以上安定であり、
    最も好ましくは、４日以上安定である、
    請求項８６～１５１のいずれか１項に記載の組成物。
  153. 液体として保存したときに、上記ＲＮＡの完全性の減少は、約３０％未満であり、
    好ましくは、約２０％未満であり、
    より好ましくは、約１０％未満である、
    請求項８６～１５２のいずれか１項に記載の組成物。
  154. 液体として保存したときに、遊離ＲＮＡの増加量は、１０％以下であり、
    好ましくは、５％以下である、
    請求項８６～１５３のいずれか１項に記載の組成物。
  155. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    液体として保存したときに、上記ＲＮＡをカプセル化している上記脂質系キャリアのＰＤＩの増加は、約０．２以下であり、
    好ましくは、約０．１以下である、
    請求項８６～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
  156. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    液体として保存したときに、上記ＲＮＡをカプセル化している脂質系キャリアのＺ平均粒子径の増加は、２０％以下であり、
    好ましくは、１０％以下である、
    請求項８６～１５５のいずれか１項に記載の組成物。
  157. 液体として保存したときに、上記組成物の濁度の増加は、２０％以下であり、
    好ましくは、１０％以下である、
    請求項８６～１５６のいずれか１項に記載の組成物。
  158. 液体として保存したときに、ｐＨおよび／またはオスモル濃度の増加または減少は、２０％以下であり、
    好ましくは、１０％以下である、
    請求項８６～１５７のいずれか１項に記載の組成物。
  159. 液体として保存したときに、上記組成物の力価の減少は、約３０％未満であり、
    好ましくは、約２０％未満であり、
    より好ましくは、約１０％未満である、
    請求項８６～１５８のいずれか１項に記載の組成物。
  160. 上記核酸は、ＲＮＡであり、
    上記ＲＮＡは、精製ＲＮＡであり、
    好ましくは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／またはタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって精製されたＲＮＡである、
    請求項８６～１３３のいずれか１項に記載の組成物。
  161. １つ以上のＲＮＡセンシングパターン認識受容体の１つ以上のアンタゴニストをさらに含んでおり、
    好ましくは、ＴＬＲ７受容体および／またはＴＬＲ８受容体の１つ以上のアンタゴニストを含んでいる、
    請求項７４～１６０のいずれか１項に記載の組成物。
  162. ＴＬＲ７受容体および／またはＴＬＲ８受容体の上記１つ以上のアンタゴニストは、１本鎖オリゴヌクレオチドであり、
    好ましくは、ｐ５’－ＧＡＧ ＣＧｍＧ ＣＣＡ－３’である、
    請求項１６１に記載の組成物。
  163. １つ以上の抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質を含んでいる、ワクチン用のポリペプチドであって、
    上記抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその免疫原性断片もしくは免疫原性バリアントであるか、またはそれに由来しており、
    好ましくは、上記抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質のアミノ酸配列は、下記(i)または(ii)を満たしている、ポリペプチド：
    (i)配列番号１～１１１、２７４～１１６６３、１３１７６～１３５１０、１３５２１～１４１２３、２２７３２～２２７５８、２２９１７、２２９２３、２２９２９～２２９６４、２６９３８、２６９３９のアミノ酸配列のうちいずれか１つと同一であるか、または７０％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上同一である；
    (ii)(i)のいずれかの免疫原性断片または免疫原性バリアントである。
  164. 下記(i)～(iii)のうち１つ以上を含んでいる、ワクチン：
    (i)請求項１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
    (ii)請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
    (iii)請求項１６３に記載のポリペプチド。
  165. 上記ワクチンは、適応免疫応答を誘導し、
    好ましくは、上記適応免疫応答は、コロナウイルスに対する防御性の適応免疫応答であり、
    好ましくは、上記コロナウイルスは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、
    請求項１６４に記載のワクチン。
  166. 上記ワクチンは、下記(i)または(ii)を含んでいる多価ワクチンである、請求項１６４または１６５に記載のワクチン：
    (i)請求項１～７３に記載のいずれか１項に記載の核酸のうち、複数または２つ以上；
    (ii)請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物のうち、複数または２つ以上。
  167. 下記(i)～(iv)のうち１つ以上を備えている、キットまたはパーツのキットであって、
    (i)請求項１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
    (ii)請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
    (iii)請求項１６３に記載のポリペプチド；
    (iv)請求項１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
    任意構成で、可溶化用の液体媒体を備えており、
    任意構成で、構成品の投与および用量に関する情報を与える技術説明書を備えている、
    キットまたはパーツのキット。
  168. 医薬としての使用のための、下記(i)～(v)のいずれか：
    (i)請求項１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
    (ii)請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
    (iii)請求項１６３に記載のポリペプチド；
    (iv)請求項１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
    (v)請求項１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
  169. コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染または当該感染に関連する障害（好ましくはＣＯＶＩＤ－１９）の、治療または予防にするための、下記(i)～(v)のいずれか：
    (i)請求項１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
    (ii)請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
    (iii)請求項１６３に記載のポリペプチド；
    (iv)請求項１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
    (v)請求項１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
  170. 障害を治療または予防方法であって、
    上記方法は、それを必要とする被験体に、下記(i)～(v)のうち１つ以上を適用または投与する工程を含む、方法：
    (i)請求項１～７３のいずれか１項に記載の核酸；
    (ii)請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
    (iii)請求項１６３に記載のポリペプチド；
    (iv)請求項１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
    (v)請求項１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
  171. 上記障害は、コロナウイルス（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）への感染であるか、または当該感染に関連する障害（好ましくはＣＯＶＩＤ－１９）である、請求項１７０に記載の障害を治療または予防する方法。
  172. 上記被験体は、哺乳動物被験体であり、
    好ましくは、ヒト被験体である、
    請求項１７０または１７１に記載の障害を治療または予防する方法。
  173. 上記ヒト被験体は、高齢のヒト被験体であり、
    好ましくは、５０歳以上、６０歳以上、６５歳以上または７０歳以上である、
    請求項１７０～１７２のいずれか１項に記載の障害を治療または予防する方法。
  174. 上記ヒト被験体は、６１歳以上である、請求項１７３に記載の障害を治療または予防する方法。
  175. 上記ヒト被験体は、１８～６０歳である、請求項１７０～１７２のいずれか１項に記載の障害を治療または予防する方法。
  176. 上記被験体は、妊娠者である、請求項１７０～１７２のいずれか１項に記載の障害を治療または予防する方法。
  177. 下記(i)または(ii)を満たしている、請求項１７０～１７５のいずれか１項に記載の方法：
    (i)上記組成物の１回目の投与の後、グレート３の全身性有害事象を経験する被験体は、２５％以下である；
    (ii)上記組成物の１回目の投与の後、グレード２以上の局所性有害事象を経験する被験体は、３０％以下である。
  178. 上記組成物の２回目の投与の後、グレート３の全身性有害事象を経験する被験体は、４０％以下である、請求項１７０～１７５のいずれか１項に記載の方法。
  179. 上記ヒト被験体は、新生児または乳児であり、
    好ましくは、３歳以下、２歳以下、１．５歳以下、１歳以下（１２箇月以下）、９箇月以下、６箇月以下もしくは３箇月以下、または６箇月～２歳である、
    請求項１７０～１７２のいずれか１項に記載の障害を治療または予防する方法。
  180. 上記被験体の疾患負荷を低減する方法としてさらに定義される、請求項１７０に記載の方法。
  181. 上記方法により、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の１つ以上の症状の重篤度が低減される、請求項１８０に記載の方法。
  182. 上記方法により、上記被験体が、入院、集中治療室への入室、酸素供給治療および／または人工呼吸器治療を必要とするようになる確率が低減される、請求項１８１に記載の方法。
  183. 上記方法により、上記被験体が、重症または中等症のＣＯＶＩＤ－１９疾患を発症する確率が低減される、請求項１８１に記載の方法。
  184. 上記方法により、上記被験体は、約６箇月間以上、重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防される、請求項１８１に記載の方法。
  185. 上記方法により、上記被験体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に曝露されたときに重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
    上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳタンパク質は、配列番号１と比較して、１つ以上のアミノ酸変異を有している、
    請求項１８４に記載の方法。
  186. 上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳタンパク質は、下記(i)～(v)のうち１つ以上のアミノ酸変異を有している、請求項１８５に記載の方法：
    (i)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｉ６９２ＶおよびＭ１２２９Ｉ；
    (ii)ｄｅｌＨ６９、ｄｅｌＶ７０、ｄｅｌＹ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ；
    (iii)Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、ｄｅｌＬ２４２、ｄｅｌＡ２４３、ｄｅｌＬ２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖ；
    (iv)Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５ＹおよびＴ１０２７Ｉ；
    (v)Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、Ｌ４５２ＲおよびＤ６１４Ｇ。
  187. 上記方法により、上記被験体が、発熱、呼吸困難、嗅覚の喪失および／または味覚の喪失を発症するようになる確率が低減される、
    請求項１８１に記載の方法。
  188. 上記方法により、上記被験体が、発熱、呼吸困難、嗅覚の喪失および／または味覚の喪失を発症するようになる確率が低減される、
    請求項１８１に記載の方法。
  189. 上記被験体は、疾患を罹患しているか、または免疫不全状態である、請求項１７０に記載の方法。
  190. 上記被験体は、肝疾患、腎疾患、糖尿病、高血圧、心疾患、肺疾患、癌を罹患しているか、またはＨＩＶ陽性である、請求項１８９に記載の方法。
  191. 上記被験体は、過去６箇月の間、１４日間超にわたり免疫抑制剤の治療を受けていない、請求項１７０に記載の方法。
  192. 上記被験体は、下記(i)および／または(ii)を満たしている、請求項１７０に記載の方法：
    (i)上記投与の前２８日以上にわたり、生ワクチンを接種していない；
    (ii)上記投与の前１４日以上にわたり、不活性化ワクチンを接種していない。
  193. 被験体における免疫応答を促進する方法であって、
    上記方法は、少なくとも第１組成物を被験体に投与する工程を含み、
    上記第１組成物は、下記(i)～(v)のうち１つ以上を含んでいる、方法：
    (i)請求項１～７３のいずれか１項に記載の核酸（好ましくはｍＲＮＡ）；
    (ii)請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
    (iii)請求項１６３に記載のポリペプチド；
    (iv)請求項１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
    (v)請求項１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
  194. 上記被験体は、過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがある、請求項１９３に記載の方法。
  195. 上記被験体は、過去に少なくとも第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物によって処置されたことがある、請求項１９３に記載の方法。
  196. 上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、ｍＲＮＡワクチンであった、請求項１９５に記載の方法。
  197. 上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、ＢＮＴ１６２またはｍＲＮＡ－１２７３であった、請求項１９６に記載の方法。
  198. 上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、タンパク質サブユニットワクチンであった、請求項１９５に記載の方法。
  199. 上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、ＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３またはＣＯＶＡＸであった、請求項１９８に記載の方法。
  200. 上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、アデノウイルスベクターワクチンであった、請求項１９５に記載の方法。
  201. 上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物は、ＡＤＺ１２２２またはＡｄ２６．ＣＯＶ－２．Ｓであった、請求項２００に記載の方法。
  202. 上記被験体からは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体が検出可能である、請求項１９３～２０１のいずれか１項に記載の方法。
  203. 上記被験体からは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に結合する抗体が検出可能である、請求項２０２に記載の方法。
  204. 上記被験体からは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体が検出可能である、請求項２０２に記載の方法。
  205. 患者が上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物を投与されたのは、約３箇月以上前、約６箇月以上前、約９箇月以上前、約１年以上前、約１．５年以上前、約２年以上前または３年以上前である、請求項１９５－２０１のいずれか１項に記載の方法。
  206. 患者が上記第１ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物を投与されたのは、約３箇月前～２年前または約６箇月前～２年前である、請求項１９５～２０１のいずれか１項に記載の方法。
  207. 上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防される、請求項１９３～２０６のいずれか１項に記載の方法。
  208. 上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
    その期間は、上記投与から、約２週間～約１年間にわたる、
    請求項２０７に記載の方法。
  209. 上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
    その期間は、上記投与から、約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間にわたる、
    請求項２０７に記載の方法。
  210. 上記方法により、処置した被験体のうち５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、下記(i)および／または(ii)を満たす、請求項１９３～２０９のいずれか１項に記載の方法：
    (i)上記被験体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が予防される；
    (ii)上記被験体からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播が予防される。
  211. 処置した被験体のうち５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、下記(i)および／または(ii)を満たす、請求項２１０に記載の方法：
    (i)上記投与から約２週間～約１年間にわたり、上記被験体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が予防される；
    (ii)上記投与から約２週間～約１年間にわたり、上記被験体からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播が予防される。
  212. 上記方法により、処置した被験体のうち５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、下記(i)および／または(ii)を満たす、請求項２１１に記載の方法：
    (i)上記被験体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が予防され、その期間は、上記投与から、約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間にわたる；
    (ii)上記被験体からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播が予防され、その期間は、上記投与から、約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間にわたる。
  213. 少なくとも第２組成物を上記被験体に投与する工程をさらに含み、
    上記第２組成物は、下記(i)～(v)のうち１つ以上を含んでいる、請求項１９３～２１２のいずれか１項に記載の方法：
    (i)請求項１～６１のいずれか１項に記載の核酸（好ましくはｍＲＮＡ）；
    (ii)請求項７４～１２８のいずれか１項に記載の組成物；
    (iii)請求項１６３に記載のポリペプチド；
    (iv)請求項１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
    (v)請求項１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
  214. 上記第１組成物の後に上記第２組成物を投与し、
    その期間は、約７日以上後である、
    請求項２１３に記載の方法。
  215. 上記第１組成物の後に上記第２組成物を投与し、
    その期間は、約１０日以上、約１４日以上、約２１日以上、約２８日以上、約３５日以上、約４２日以上、約４９日以上または約５６日以上後である、
    請求項２１４に記載の方法。
  216. 上記第１組成物の後に上記第２組成物を投与し、
    その期間は、約７日間～約５６日後である、
    請求項２１３に記載の方法。
  217. 上記第１組成物の後に上記第２組成物を投与し、
    その期間は、約１４日間～約５６日後、約２１日間～約５６日後または約２８日間～約５６日後である、
    請求項２１６に記載の方法。
  218. 少なくとも第３組成物を上記被験体に投与する工程をさらに含み、
    上記第３組成物は、下記(i)～(v)のうち１つ以上を含んでいる、請求項１９３～２１２のいずれか１項に記載の方法：
    (i)請求項１～６１のいずれか１項に記載の核酸；
    (ii)請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物；
    (iii)請求項１６３に記載のポリペプチド；
    (iv)請求項１６４～１６６のいずれか１項に記載のワクチン；
    (v)請求項１６７に記載のキットまたはパーツのキット。
  219. 上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防される、請求項２１３～２１８のいずれか１項に記載の方法。
  220. 上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
    その期間は、上記第２組成物またはそれ以降の組成物の投与から、約２週間～約１年間にわたる、
    請求項２１９に記載の方法。
  221. 上記方法により、処置した被験体のうち８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が、中等症および重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から予防され、
    その期間は、上記第２組成物またはそれ以降の組成物の投与から、約２週間から約３箇月間、約６箇月間、約９箇月間、約１年間、約１．５年間、約２年間または約３年間にわたる、
    請求項２１９に記載の方法。
  222. 上記被験体における抗体、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を促進する方法としてさらに定義される、請求項１９３～２２１のいずれか１項に記載の方法。
  223. 上記被験体における中和抗体反応を促進する方法としてさらに定義される、請求項１９３～２２１のいずれか１項に記載の方法。
  224. 上記方法は、抗体反応を促進し、
    上記抗体反応による、上記被験体におけるコロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約１０～約５００である、
    請求項１９３～２２１のいずれか１項に記載の方法。
  225. 上記方法は、抗体反応を促進し、
    上記抗体反応による、スパイクタンパク質に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約２００以下である、
    請求項２２４に記載の方法。
  226. 上記方法は、抗体反応を促進し、
    上記抗体反応による、コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約１０～約３００、約２０～約３００、約２０～約２００または約３０～約１００である、
    請求項２２４に記載の方法。
  227. 上記方法は、抗体反応を促進し、
    上記抗体反応による、コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約３０～約８０である、
    請求項２２６に記載の方法。
  228. 上記方法は、抗体反応を促進し、
    上記抗体反応による、上記被験体におけるコロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約１～約５００である、
    請求項２２３に記載の方法。
  229. 上記方法は、抗体反応を促進し、
    上記抗体反応による、スパイクタンパク質のＲＢＤに結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約５０以下である、
    請求項２２８に記載の方法。
  230. 上記方法は、抗体反応を促進し、
    上記抗体反応による、スパイクタンパク質のＲＢＤに結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約１～約２００、約２～約１００、約３～約２００、約５～約１００または約５～約５０である、
    請求項２２８に記載の方法。
  231. 上記方法は、抗体反応を促進し、
    上記抗体反応による、コロナウイルスのスパイクタンパク質のＲＢＤに結合する抗体の産生は、コロナウイルス中和抗体が１に対して約５～約２０である、
    請求項２３０に記載の方法。
  232. 上記被験体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に過去に感染したことがある、請求項２２２に記載の方法。
  233. 上記被験体における防御性の免疫応答を促進する方法としてさらに定義される、請求項２２２に記載の方法。
  234. 上記被験体は、ヒト被験体である、請求項１９３～２３３のいずれか１項に記載の方法。
  235. 上記被験体の年齢は、６箇月～１００歳、６箇月～８０歳、１歳～８０歳、１歳～７０歳、２歳～８０歳または２歳～６０歳である、請求項２３４に記載の方法。
  236. 上記被験体は、新生児または乳児であり、
    上記被験体の年齢は、３歳以下、２歳以下、１．５歳以下、１歳以下（１２箇月以下）、９箇月以下、６箇月以下もしくは３箇月以下、または６箇月～２歳である、
    請求項２３４に記載の方法。
  237. 上記被験体は、高齢の被験体であり、
    上記被験体の年齢は、５０歳以上、６０歳以上、６５歳以上または７０歳以上である、
    請求項２３４に記載の方法。
  238. 上記被験体は、高齢の被験体であり、
    上記被験体の年齢は、６０歳以上である、
    請求項２３７に記載の方法。
  239. 上記被験体は、ネイティヴ・アメリカ系、アフリカ系、アジア系またはヨーロッパ系の遺伝的背景を有している、請求項２３４～２３８のいずれか１項に記載の方法。
  240. 上記被験体は、ネイティヴ・アメリカ系、アフリカ系、アジア系またはヨーロッパ系の遺伝的背景を有しており、
    その遺伝的背景は、約１０％以上、約２５％以上または約５０％以上である、
    請求項２３８に記載の方法。
  241. 上記被験体は、ネイティヴ・アメリカ系の遺伝的背景を有している、請求項２３８に記載の方法。
  242. 上記被験体は、ネイティヴ・アメリカ系の遺伝的背景を有しており、
    その遺伝的背景は、約１０％以上、約２５％以上または約５０％以上である、
    請求項２３８に記載の方法。
  243. 上記方法は、上記被験体におけるＴｈ２サイトカインの増加を実質的に誘導せず、
    好ましくは、上記Ｔｈ２サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＴＮＦおよび／またはＩＬ－１βである、
    請求項１９３～２４２のいずれか１項に記載の方法。
  244. 上記被験体におけるＴｈ１指向性免疫応答を誘導する方法としてさらに定義される、請求項１９３～２４２のいずれか１項に記載の方法。
  245. 上記被験体は、抗凝固療法を受けている、請求項１９３～２４４のいずれか１項に記載の方法。
  246. 上記組成物を筋肉内注射により投与する、請求項１９３～２４５のいずれか１項に記載の方法。
  247. 上記組成物は、コロナウイルスのスパイクタンパク質（Ｓ）をコードしているｍＲＮＡを含んでおり、
    上記スパイクタンパク質（Ｓ）は、１つ以上のpre-fusion構造安定化変異を有しているpre-fusion構造で安定したスパイクタンパク質（Ｓ＿ｓｔａｂ）である、
    請求項１９３～２４６のいずれか１項に記載の方法。
  248. 上記ｍＲＮＡは、配列番号１６３に対して９５％以上同一であるコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、
    請求項２４７に記載の方法。
  249. 上記ｍＲＮＡは、配列番号１６３と同一であるコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、請求項２４８に記載の方法。
  250. 上記ｍＲＮＡは、配列番号１４９に対して９５％以上同一であるコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、請求項２４７に記載の方法。
  251. 上記ｍＲＮＡは、配列番号１４９と同一であるコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードしている、請求項２４８に記載の方法。
  252. 上記組成物の１回用量により、上記被験体を重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から防御するために充分な免疫応答が得られ、
    その期間は、約６箇月間以上にわたる、
    請求項２５０または２５１に記載の方法。
  253. 上記組成物の１回用量により、上記被験体を重症のＣＯＶＩＤ－１９疾患から防御するために充分な免疫応答が得られ、
    その期間は、約６箇月間から約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３年間、約４年間または約５年間にわたる、
    請求項２５２に記載の方法。
  254. 上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、ＬＮＰを形成している、請求項２４７～２４９のいずれか１項に記載の方法。
  255. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)１つ以上の中性脂質；
    (iii)１つ以上のステロイドまたはステロイドアナログ；
    (iv)１つ以上のＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
    請求項２５４に記載の方法。
  256. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、カチオン性脂質が約２０～６０％であり、中性脂質が５～２５％であり、ステロールが２５～５５％であり、ＰＥＧ脂質が０．５～１５％である、
    請求項２５５に記載の方法。
  257. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、約４７．５：１０：４０．８：１．７である、
    請求項２５６に記載の方法。
  258. 上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、４７．４：１０：４０．９：１．７である、
    請求項２５６に記載の方法。
  259. ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、請求項２５４～２５８のいずれか１項に記載の方法。
  260. 上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成しており、
    上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、約４７．５：１０：４０．８：１．７であり、
    ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、
    請求項２４９に記載の方法。
  261. 上記ｍＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化しており、これにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成しており、
    上記ＬＮＰは、下記(i)～(iv)を含んでおり、
    (i)式ＩＩＩ－３に係る１つ以上のカチオン性脂質；
    (ii)ＤＳＰＣ；
    (iii)コレステロール；
    (iv)式ＩＶａに係るＰＥＧ脂質；
    上記(i)～(iv)のモル比は、４７．４：１０：４０．９：１．７であり、
    ｍＲＮＡの全脂質に対する比率は、約０．０３～０．０４（ｗ／ｗ）である、
    請求項２４９に記載の方法。
  262. 上記被験体に投与される組成物は、ｍＲＮＡを約２μｇ～約５０μｇ含んでいる、請求項２４７～２６１のいずれか１項に記載の方法。
  263. 上記被験体に投与する組成物は、ｍＲＮＡを約１０μｇ～約５０μｇ含んでいる、請求項２６２に記載の方法。
  264. 上記被験体に投与する組成物は、ｍＲＮＡを約１０μｇ～約３０μｇ含んでいる、請求項２６３に記載の方法。
  265. 上記被験体に投与する組成物は、ｍＲＮＡを約１２μｇ含んでいる、請求項２６４に記載の方法。
  266. 上記投与により、上記組成物を投与した被験体の１００％にセロコンバージョンが発生する、請求項２６４または２６５に記載の方法。
  267. 上記ヒト被験体は、６１歳以上である、請求項１９３～２６６のいずれか１項に記載の方法。
  268. 上記ヒト被験体は、１８～６０歳である、請求項１９３～２６６のいずれか１項に記載の方法。
  269. 上記ヒト被験体は、過去にワクチンアレルギーを起こしたことがある、請求項１９３～２６８のいずれか１項に記載の方法。
  270. 上記被験体からは、抗ＰＥＧ抗体が検出可能である、請求項１９３～２６９のいずれか１項に記載の方法。
  271. 下記(i)～(iii)を含む、請求項１９３～２７０のいずれか１項に記載の方法：
    (i)請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物を得る工程であって、当該組成物は凍結乾燥組成物である工程；
    (ii)上記凍結乾燥組成物を薬学的に許容可能な液体キャリア中で可溶化させて、液体組成物を調製する工程；
    (iii)上記液体組成物の有効量を、上記被験体に投与する工程。
  272. 請求項７４～１６２のいずれか１項に記載の組成物を安定化させる方法であって、
    上記組成物を凍結乾燥させて、安定化組成物を調製する工程を含む、
    方法。
  273. 上記安定化組成物の含水率は、約１０％未満である、請求項２７２に記載の方法。
  274. 上記安定化組成物の含水率は、約０．５％～５．０％である、請求項２７３に記載の方法。
  275. 請求項２７２～２７４のいずれか１項に記載の方法によって調製される、安定化凍結乾燥組成物。
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