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JP2023545502A - リポタンパク質（ａ）を阻害するためのｒｎａ組成物および方法 - Google Patents

リポタンパク質（ａ）を阻害するためのｒｎａ組成物および方法 Download PDF

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JP2023545502A
JP2023545502A JP2023522985A JP2023522985A JP2023545502A JP 2023545502 A JP2023545502 A JP 2023545502A JP 2023522985 A JP2023522985 A JP 2023522985A JP 2023522985 A JP2023522985 A JP 2023522985A JP 2023545502 A JP2023545502 A JP 2023545502A
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nos
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nucleotides
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ベルトラン・フロティーア
エティエンヌ・ギヨー
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アーミン・ホフマイスター
カースティン・ヤン－ホフマン
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Abstract

本開示は、ＬＰＡ ｍＲＮＡを標的とし、Ｌｐ（ａ）血漿レベルを調節するｄｓＲＮＡ、およびＬＰＡ遺伝子発現に関連する１つまたはそれ以上の状態を処置する方法に関する。

Description

配列表
基準として役立つ核酸配列が本明細書に開示されている。同じ配列を特許事項のために標準的な要件に従った形式の配列表に提示する。標準的な配列表といかなる配列の相違がある場合も、本明細書に記載されている配列が基準であるものとする。
発明の分野
本発明は、ＬＰＡ ｍＲＮＡを標的とし、Ｌｐ（ａ）血漿レベルを調節するｄｓＲＮＡ、ならびにＬＰＡ遺伝子発現に関連する１つまたはそれ以上の状態を処置する方法に関する。
リポタンパク質は、血漿中において脂質を輸送する際に重要な役割を果たす脂質タンパク質粒子である。これらの粒子は、アポＡ、アポＢ、アポＣ、およびアポＥなどのアポリポタンパク質（脂質と結合するタンパク質）が埋め込まれた単層のリン脂質およびコレステロール膜を有する。この膜が輸送される脂質をカプセル化する。脂質は水に溶解できないため、リポタンパク質が乳化剤として効果的に働く。
ヒトおよび旧世界ザルにおいてのみ見られるリポタンパク質（ａ）すなわちＬｐ（ａ）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子を含む。Ｌｐ（ａ）は、ジスルフィド結合によりＬＤＬ粒子の外側表面のアポＢ１００と連結される、特有のアポリポタンパク質であるアポリポタンパク質（ａ）［アポ（ａ）］の存在により他のリポタンパク質とは異なる（例えば、非特許文献１；非特許文献２を参照）。アポ（ａ）は、主に肝臓で発現し、不活性ペプチダーゼドメインを含む。アポ（ａ）は、高度に多型のＬＰＡ遺伝子によってコードされる。遺伝子中の多様な数のクリングル（Ｋ）ＩＶタイプ２リピートが、広い範囲のアポ（ａ）アイソフォームのサイズにつながる。ＬＰＡ遺伝子はプラスミノーゲン遺伝子（ＰＬＧ）から進化したものであり、この２つの遺伝子は、高度に一致する配列を有する（非特許文献１、上記）。
血漿Ｌｐ（ａ）レベルは、個々の間でほぼ１０００倍変動し、集団のおよそ２０～３０％が極めて高いＬｐ（ａ）レベル（およそ≧５０ｍｇ／ｄＬ）を有する。例えば、非特許文献３；非特許文献４を参照。高い血漿Ｌｐ（ａ）レベルおよび小さなアポ（ａ）アイソフォームサイズは、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、卒中、末梢動脈疾患、石灰化大動脈弁疾患、およびアテローム動脈硬化症を含む、心血管疾患のリスクの増加に関連する。
特許文献１および特許文献２はともに、細胞におけるＬＰＡの発現を阻害するための核酸について開示している。また、特許文献３は、アポリポタンパク質（ａ）発現を調節するための組成物および方法について開示している。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている高度に保存された制御機構において、遺伝子発現をブロックすることが示された。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ａｎｔｉｍｉＲ、およびａｎｔａｇｏｍｉＲなどの一本鎖オリゴヌクレオチドの作用機序とは異なる作用機構のようである。ＲＮＡ干渉技術において、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）と結合し、ここでは、一方の鎖（「パッセンジャー鎖」または「センス鎖」）が取り除かれ、残りの鎖（「ガイド鎖」または「アンチセンス鎖」）はＲＩＳＣと協働して、相補的なＲＮＡ（標的ＲＮＡ）と結合する。標的ＲＮＡは、結合を受けると、ＲＩＳＣ中のＲＮＡエンドヌクレアーゼアルゴノート（ＡＧＯ）によって切断された後、ＲＮＡエキソヌクレアーゼによってさらに分解される。ＲＮＡｉは、現在、異常なまたは望ましくない遺伝子の発現が原因となる障害を処置するための新しいクラスの治療用薬剤を開発するために使用されている。
ＷＯ２０１９／０９２２８３ ＷＯ２０２０／０９９４７６ ＷＯ２０１４／１７９６２５
ＫｒｏｎｅｎｂｅｒｇおよびＵｔｅｒｍａｎｎ、Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ、（２０１３年）２７３（１）：６～３０頁 Ｇｕｅｒｒａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、（２００５年）１１１：１４７１～９頁 Ｈｏｐｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ、（２０１３年）２７３（１）：２６０～８頁 Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ（２０１９年）１３（３）：３７４～９２頁
コレステロールおよび酸化リン脂質の輸送、ならびにリゾホスファチジン酸の提供におけるＬｐ（ａ）の重要性、ならびに高いＬｐ（ａ）およびアテローム動脈硬化症促進脂質に関連する疾患の罹患率のため、ＬＰＡ発現の阻害剤を特定すること、ならびにそのような阻害剤を効力および細胞傷害性などの望ましくない副作用に関して試験することが差し迫って必要とされている。
本開示は、ＬＰＡ遺伝子のＲＮＡ転写物上の標的配列を標的とすることによってヒトＬＰＡ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、ｄｓＲＮＡは、センス配列を含むセンス鎖、およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、標的配列は、配列番号１６３２のヌクレオチド２２０～２３８、２２３～２４１、３０２～３２０、１２３６～１２５４、２９４６～２９６４、２９５３～２９７１、２９５４～２９７２、２９５８～２９７６、２９５９～２９７７、４６３５～４６５３、４６３６～４６５４、４６３９～４６５７、４８４２～４８６０、４９８０～４９９８、４９８２～５０００、６３８５～６４０３、または６４７０～６４８８であり、センス配列は、標的配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１５～２５の連続するヌクレオチドの領域にわたり互いに相補的である。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、３０ヌクレオチド長を超えない。特定の実施形態において、標的配列は、配列番号１６３２のヌクレオチド２９５８～２９７６、４６３９～４６５７、または４９８２～５０００である。
最も好適な対象配列は、ヌクレオチド２９５８～２９７６、４６３９～４６５７および４９８２～５０００である。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡの一方または両方の鎖は、
Figure 2023545502000001
の構造を有する１つまたはそれ以上の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中：
－ Ｂは、複素環式核酸塩基であり、
－ Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分もしくは式（Ｉ）の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、
－ Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１もしくはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、式中、Ｒ１は、以下であり：
・ 場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基（式中、
Ｊは、ＯもしくはＳであり、
Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）、
・ 場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
・ 基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３（式中、
ｍは、０もしくは１を意味する整数であり、
ｐは、０から１０の範囲の整数であり、
Ｒ２は、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、もしくは－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、
Ｋは、ＯもしくはＳであり、
Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、
もしくはＲ３は、細胞標的化部分である）、
－ Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、独立して水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
－ Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈもしくは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である。
別の態様において、本開示は、本ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物、ならびにＬＰＡ発現を阻害すること、Ｌｐ（ａ）レベルを低下させること、またはＬｐ（ａ）関連状態を処置することを必要とするヒトにおいてＬＰＡ発現を阻害する、Ｌｐ（ａ）レベルを低下させる、またはＬｐ（ａ）関連状態を処置する際に使用するためのｄｓＲＮＡならびに医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ヒトは、脂質代謝障害もしくは心血管疾患（ＣＶＤ）を有するか、またはそれを有するリスクがある。さらに別の実施形態において、ヒトは、高コレステロール血症、脂質異常症、心筋梗塞、アテローム動脈硬化性心血管疾患、アテローム動脈硬化症、末梢動脈疾患、石灰化大動脈弁疾患、血栓症、もしくは卒中を有するか、またはそれを有するリスクがある。
ＬＰＡ ｓｉＲＮＡスクリーニング結果の相関性分析を示すグラフである。２９９個のＬＰＡ ｓｉＲＮＡを含むスクリーニングライブラリーを、２つの独立した実験でｐｍｉｒＧＬＯ－ＬＰＡデュアルルシフェラーゼレポータープラスミドを一過性にトランスフェクションされたＨｅｐ３Ｂ細胞において１ｎＭ（図１Ａ）または１０ｎＭ（図１Ｂ）で試験した。 ＬＰＡ ｓｉＲＮＡスクリーニング結果の相関性分析を示すグラフである。２９９個のＬＰＡ ｓｉＲＮＡを含むスクリーニングライブラリーを、２つの独立した実験でｐｍｉｒＧＬＯ－ＬＰＡデュアルルシフェラーゼレポータープラスミドを一過性にトランスフェクションされたＨｅｐ３Ｂ細胞において１ｎＭ（図１Ａ）または１０ｎＭ（図１Ｂ）で試験した。 １または１０ｎＭの３４個の選択された試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｅｐＧ２－ＬＰＡ細胞（ヒトＬＰＡ ｃＤＮＡコンストラクトを安定して過剰発現した）（図２Ａ）、初代トランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞（図２Ｂ）、または初代カニクイザル肝細胞（図２Ｃ）におけるＬＰＡ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して示される。エラーバーは、標準偏差を示す。ＬＶ２およびＬＶ３：ヒト、カニクイザル、またはげっ歯類ｍＲＮＡ転写物のいずれも標的としない陰性対照ｓｉＲＮＡ配列。ｓ８２６３およびｓ８２６４：ヒトＬＰＡツールｓｉＲＮＡである陽性対照（Ａｍｂｉｏｎ、現Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。 １または１０ｎＭの３４個の選択された試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｅｐＧ２－ＬＰＡ細胞（ヒトＬＰＡ ｃＤＮＡコンストラクトを安定して過剰発現した）（図２Ａ）、初代トランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞（図２Ｂ）、または初代カニクイザル肝細胞（図２Ｃ）におけるＬＰＡ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して示される。エラーバーは、標準偏差を示す。ＬＶ２およびＬＶ３：ヒト、カニクイザル、またはげっ歯類ｍＲＮＡ転写物のいずれも標的としない陰性対照ｓｉＲＮＡ配列。ｓ８２６３およびｓ８２６４：ヒトＬＰＡツールｓｉＲＮＡである陽性対照（Ａｍｂｉｏｎ、現Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。 １または１０ｎＭの３４個の選択された試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｅｐＧ２－ＬＰＡ細胞（ヒトＬＰＡ ｃＤＮＡコンストラクトを安定して過剰発現した）（図２Ａ）、初代トランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞（図２Ｂ）、または初代カニクイザル肝細胞（図２Ｃ）におけるＬＰＡ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して示される。エラーバーは、標準偏差を示す。ＬＶ２およびＬＶ３：ヒト、カニクイザル、またはげっ歯類ｍＲＮＡ転写物のいずれも標的としない陰性対照ｓｉＲＮＡ配列。ｓ８２６３およびｓ８２６４：ヒトＬＰＡツールｓｉＲＮＡである陽性対照（Ａｍｂｉｏｎ、現Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。 １または１０ｎＭの示した３４個の選択された試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｕＨ－７細胞（図３Ａ）、初代ヒト肝細胞（図３Ｂ）、または初代カニクイザル肝細胞（図３Ｃ）におけるプラスミノーゲン（ＰＬＧ）ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して示される。エラーバーは、標準偏差を示す。 １または１０ｎＭの示した３４個の選択された試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｕＨ－７細胞（図３Ａ）、初代ヒト肝細胞（図３Ｂ）、または初代カニクイザル肝細胞（図３Ｃ）におけるプラスミノーゲン（ＰＬＧ）ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して示される。エラーバーは、標準偏差を示す。 １または１０ｎＭの示した３４個の選択された試験ｓｉＲＮＡによる処理後のヒトＨｕＨ－７細胞（図３Ａ）、初代ヒト肝細胞（図３Ｂ）、または初代カニクイザル肝細胞（図３Ｃ）におけるプラスミノーゲン（ＰＬＧ）ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡの発現は、ＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ対照により処理された細胞と比較して示される。エラーバーは、標準偏差を示す。 ３４個の選択された試験ｓｉＲＮＡのヒトＨｅｐＧ２－ＬＰＡ細胞における細胞傷害効果を示すグラフである。生存率（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ）および毒性（ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）アッセイ）に関して分析される前に、細胞を５または５０ｎＭの示したｓｉＲＮＡで処理した。得られた読み取りの比を、ＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ対照に関する結果と比較して示す。エラーバーは、標準偏差を示す。「ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ」：ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｈｓ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）。 ＥＬＩＳＡアッセイによって求められる自然な取り込み条件下で示された濃度（０．１、１、または１０μＭ）の１７個の選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡで処理されたヒト肝細胞の上清に分泌されたＰＬＧタンパク質の相対量を示すグラフである。タンパク質発現は、１μＭのＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ対照で処理された細胞（破線）と比較して示される。エラーバーは、標準偏差を示す。 ヒトＨｅｐＧ２－ＬＰＡ細胞における細胞傷害性ｓｉＲＮＡの影響の分析を示すグラフである。生存率（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ）および毒性（ＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ）に関する分析の前に、細胞を５および５０ｎＭの示した１７個の選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡで処理した。得られた読み取りの比を、ＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ対照の結果（破線）と比較して示す。エラーバーは、標準偏差を示す。 ３人の異なるドナーから単離され、１００ｎＭの濃度の１７個の選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡまたは対照をトランスフェクションされたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の上清に放出されたインターフェロンα２ａ（ＩＦＮα２ａ）タンパク質の量を示すグラフである。タンパク質濃度をＥＬＩＳＡによって求めた。エラーバーは、標準偏差を示す。 ０日目に５ｍｇ／ｋｇの１７個の選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの単回投与により皮下処置されたアポ（ａ）トランスジェニックマウスの血清アポ（ａ）タンパク質レベルの相対量を示すグラフである。タンパク質発現は、ＰＢＳビヒクル対照で処置された動物と比較して示される。ヒトアポ（ａ）レベルは、ＥＬＩＳＡによって定量し、エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。 ５μＭの３つの選択されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡで処理された２人の異なるドナーの初代ヒト肝細胞のＲＮＡ－Ｓｅｑ全トランスクリプトーム分析を示すグラフのパネルである。ＬＶ２ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ非サイレンシング対照と比較した差次的にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる遺伝子の数を、フィルター基準、絶対倍率変化＞１．５およびＦＤＲ（偽発見率）＜０．０５を適用して示す。それぞれの比較において最もダウンレギュレートされた転写物であるＬＰＡを、破線の円によって示す。 図９－１の続き。 図９－２の続き。 選択された配列ｓｉＬＰＡ＃０３０７、ｓｉＬＰＡ＃０３１１、およびｓｉＬＰＡ＃０３１４に基づく最適化ライブラリーの１ｎＭおよび５ｎＭのｓｉＲＮＡで処理された、アポ（ａ）トランスジェニックマウスから単離された初代肝細胞におけるＬＶ２非サイレンシング対照に対して正規化された残存ＬＰＡ ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 ０日目に３ｍｇ／ｋｇの４１個の最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡおよびそれぞれの親分子の単回投与により皮下処置されたアポ（ａ）トランスジェニックマウスにおける血清アポ（ａ）レベルの相対量を示すグラフである。図１１Ａ～Ｃは、それぞれ親配列ｓｉＬＰＡ＃０３０７；ｓｉＬＰＡ＃０３１１、およびｓｉＬＰＡ＃０３１４に基づく最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡに関するデータを示す。タンパク質発現は、ＰＢＳビヒクル対照で処置された動物と比較して示される。ヒトアポ（ａ）レベルは、ＥＬＩＳＡによって定量し、エラーバーはＳＥＭを示す。 ０日目に３ｍｇ／ｋｇの４１個の最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡおよびそれぞれの親分子の単回投与により皮下処置されたアポ（ａ）トランスジェニックマウスにおける血清アポ（ａ）レベルの相対量を示すグラフである。図１１Ａ～Ｃは、それぞれ親配列ｓｉＬＰＡ＃０３０７；ｓｉＬＰＡ＃０３１１、およびｓｉＬＰＡ＃０３１４に基づく最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡに関するデータを示す。タンパク質発現は、ＰＢＳビヒクル対照で処置された動物と比較して示される。ヒトアポ（ａ）レベルは、ＥＬＩＳＡによって定量し、エラーバーはＳＥＭを示す。 ０日目に３ｍｇ／ｋｇの４１個の最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡおよびそれぞれの親分子の単回投与により皮下処置されたアポ（ａ）トランスジェニックマウスにおける血清アポ（ａ）レベルの相対量を示すグラフである。図１１Ａ～Ｃは、それぞれ親配列ｓｉＬＰＡ＃０３０７；ｓｉＬＰＡ＃０３１１、およびｓｉＬＰＡ＃０３１４に基づく最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡに関するデータを示す。タンパク質発現は、ＰＢＳビヒクル対照で処置された動物と比較して示される。ヒトアポ（ａ）レベルは、ＥＬＩＳＡによって定量し、エラーバーはＳＥＭを示す。 ３人の異なるドナーから単離され、１００ｎＭの濃度の４１個の最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡまたは対照をトランスフェクションされたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の上清に放出されたインターフェロンα２ａ（ＩＦＮα２ａ）タンパク質の量を示すグラフである。タンパク質濃度をＥＬＩＳＡによって求めた。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み条件下でそれぞれ１００ｎＭおよび１μＭの濃度の示した４１個の最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡおよびそれぞれの親リード分子で処理された初代カニクイザル肝細胞におけるＬＰＡ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡ発現は、ＬＶ２非標的化ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ対照で処理された細胞（破線）と比較して示される。エラーバーは、標準偏差を示す。 自然な取り込み条件下でそれぞれ１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１μＭの濃度の示した４１個の最適化されたＬＰＡ ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ試薬およびそれぞれの親リード分子で処理された初代ヒト肝細胞におけるＰＬＧ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍＲＮＡ発現は、ＬＶ２非標的化ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ対照で処理された細胞（破線）と比較して示される。エラーバーは、標準偏差を示す。
本開示は、ＬＰＡ遺伝子の発現を阻害する新規の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。核酸の他に、本ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの標的組織への送達を促進する標的化部分などの追加の部分を含む場合もある。ｄｓＲＮＡは、心血管疾患などの状態を処置するために使用することができる。別に明記されない限り、「アポ（ａ）」は、ヒトＬＰＡ遺伝子産物を指す。ヒトアポ（ａ）タンパク質の６４８９ヌクレオチド長のｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５７７．２（配列番号１６３２）として入手可能である。配列番号１６３２の５’末端に位置する最初の７５のヌクレオチドが欠如した、ヒトアポ（ａ）タンパク質の６４１４ヌクレオチド長のｍＲＮＡ配列もＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５７７．３（配列番号１６２７）として入手可能であり、そのポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００５５６８．２（配列番号１６２８）として入手可能である。特定の実施形態において、本開示は、カニクイザルアポ（ａ）を指す。カニクイザルアポ（ａ）タンパク質のｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＸＭ＿０１５４４８５１７（配列番号１６２９）として入手可能であり、そのポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＸＰ＿０１５３０４００３．１（配列番号１６３０）として入手可能である。
コンジュゲートされたＧａｌＮＡｃ部分を含むものなどの本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する場合がある：（ｉ）５０％マウス血清において少なくとも２４、２８、３２、４８、５２、５６、６０、７２、９６、または１６８時間の半減期を有する；（ｉｉ）ヒト初代ＰＭＢＣから分泌されるインターフェロンαの産生を増加させない；（ｉｉｉ）トランスジェニックマウス肝細胞または初代ヒトもしくはカニクイザル肝臓細胞においてヒトＬＰＡ ｍＲＮＡ発現の阻害に関して、例えば、１ｐＭから１００ｎＭのＩＣ５０値を有する；および（ｉｖ）ヒトＬＰＡを発現するＦＶＢ／Ｎマウスにおいてインビボでアポ（ａ）のタンパク質レベルを少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下させる。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートされたＧａｌＮＡｃ部分を含む本開示のｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの以下の特性を有する：（ｉ）５０％マウス血清において少なくとも２４時間の半減期を有する；（ｉｉ）ヒト初代ＰＭＢＣから分泌されるインターフェロンαの産生を増加させない、（ｉｉｉ）トランスジェニックマウス肝細胞または初代ヒトもしくはカニクイザル肝臓細胞においてヒトＬＰＡ ｍＲＮＡ発現の阻害に関して、例えば、１ｐＭから５０ｎＭのＩＣ５０値を有する；および（ｉｖ）ヒトＬＰＡを発現するＦＶＢ／Ｎマウスにおいてインビボでヒトアポ（ａ）のタンパク質レベルを少なくとも８０％低下させる。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、すべての上記の特性を有する。
本明細書に記載のｄｓＲＮＡ（「単離された」ｄｓＲＮＡ）が天然には存在しないことを当業者は理解するであろう。
Ｉ．二本鎖ＲＮＡ
本開示の特定の態様は、ＬＰＡ ｍＲＮＡを標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子に関する。本明細書中で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を有する二本鎖構造を含むオリゴリボヌクレオチド分子を指す。二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分である場合もあり、またはそれらは別個のＲＮＡ分子にある場合もある。２本の鎖が別個のＲＮＡ分子上にある場合、ｄｓＲＮＡ構造は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として機能することができる。２本の鎖が１つのより大きな分子の一部であり、第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端との間で連続したヌクレオチドの鎖によって連結されている場合、連結するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と言及され、ＲＮＡ分子は、「短ヘアピンＲＮＡ」、または「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる場合もある。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有する場合もある。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上（例えば、１、２もしくは３つ）のヌクレオチドのオーバーハングを含む場合もある。
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも１０塩基の、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態のヌクレオチドの高分子形態を指す。この用語は、一および二本鎖形態を含む。
「ｄｓＲＮＡ」は、天然に存在するリボヌクレオチド、および／またはその化学修飾アナログを含むことができる。本明細書中で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」は、リボース含有ヌクレオチドを有するものに限定されない。ｄｓＲＮＡは、本明細書において、その一部またはすべてのヌクレオチド中のリボース部分は、結果として生じた二本鎖分子がＲＮＡ干渉によって標的遺伝子の発現を阻害することができる限り、別の部分によって置換されている二本鎖ポリヌクレオチド分子を包含する。ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはその化学修飾アナログを含むこともできるが、６０％を超えない（例えば、５０％、４０％、３０％、２０％、もしくは１０％を超えない）。
本開示のｄｓＲＮＡは、センス配列を含むセンス鎖、およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして、二本鎖構造を形成する程、十分に相補的である。「アンチセンス配列」という用語は、実質的または完全に相補的で、生理的条件下で細胞において標的ＲＮＡ配列と結合する配列を指す。「標的配列」は、標的遺伝子、例えば、ＬＰＡ遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（例えば、一次ＲＮＡ転写物またはメッセンジャーＲＮＡ転写物）上のヌクレオチド配列を指す。「センス配列」という用語は、アンチセンス配列と実質的または完全に相補的な配列を指す。
本開示のＬＰＡ ｍＲＮＡ標的ｄｓＲＮＡは、センス配列を含むセンス鎖およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、センスおよびアンチセンス配列は、互いに実質的または完全に相補的である。別に指示がある場合を除いて、「相補的な」という用語は、本明細書においては、特定の条件、例えば、生理的条件下において、第２の連続するヌクレオチド配列を含む別のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する、第１の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの能力を指す。これは、第１または第２の連続するヌクレオチド配列の全長にわたり２つのポリヌクレオチドの塩基対合を含むことができ；この場合、２つのヌクレオチド配列は、互いに「完全に相補的である」と見なされる。例えば、ｄｓＲＮＡが２１ヌクレオチド長の第１のオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチド長の第２のオリゴヌクレオチドを含み、２つのオリゴヌクレオチドが２１の連続的な塩基対を形成する場合、２つのオリゴヌクレオチドは、互いに「完全に相補的である」と言及される。第１のポリヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチド配列と「実質的に相補的である」と言及される場合、２つの配列は、ハイブリダイゼーションの長さの８０％またはそれ以上（例えば、９０％またはそれ以上）にわたり互いに塩基対を作ることができ、ミスマッチ塩基対は２０％を超えない（例えば、１０％を超えない）（例えば、２０ヌクレオチドの二本鎖に対して、４つを超えないまたは２つを超えないミスマッチ塩基対）。２つのオリゴヌクレオチドが、１つまたはそれ以上の一本鎖オーバーハングと二本鎖を形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。２つの配列の相補性は、ワトソン・クリック塩基対および／または非ワトソン・クリック塩基対に基づく場合もある。本明細書中で使用される場合、ｍＲＮＡの「少なくとも一部と実質的に相補的である」ポリヌクレオチドは、目的とするｍＲＮＡ（例えば、ＬＰＡをコードするｍＲＮＡ）の連続的な部分と実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ標的ｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡであり、この場合、センスおよびアンチセンス鎖が互いに共有結合していない。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ標的ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、例えば、ヘアピンループ（ｓｈＲＮＡの場合など）により、またはヘアピンループ以外の手段によって（「共有結合性リンカー」と呼ばれる結合構造によってなど）互いに共有結合している。
Ｉ．１ 長さ
いくつかの実施形態において、（センス鎖中の）センス配列および（アンチセンス鎖中の）アンチセンス配列のそれぞれは、９～３０ヌクレオチド長である。例えば、各配列は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限および９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、各配列中のヌクレオチドの数は、１５～２５（すなわち、各配列において１５から２５ヌクレオチド）、１５～３０、１６～２９、１７～２８、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、または１９～２１が可能である。
いくつかの実施形態において、各配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長よりも大きい。いくつかの実施形態において、各配列は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、各配列は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス配列はそれぞれ、少なくとも１５であり、２５を超えないヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス配列はそれぞれ、少なくとも１９であり、２３を超えないヌクレオチド長である。例えば、配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ ｍＲＮＡ標的ｄｓＲＮＡは、同じ長さまたは異なる長さのセンスおよびアンチセンス鎖を有する。例えば、センス鎖は、アンチセンス鎖よりも１、２、３、４、５、６、または７ヌクレオチド長いこともある。あるいは、センス鎖は、アンチセンス鎖よりも１、２、３、４、５、６、または７ヌクレオチド短いこともある。
いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、９～３６ヌクレオチド長である。例えば、各鎖は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６の上限および９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、各鎖中のヌクレオチドの数は、１５～２５、１５～３０、１６～２９、１７～２８、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、または１９～２１が可能である。
いくつかの実施形態において、各鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長よりも大きい。いくつかの実施形態において、各鎖は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、各鎖は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖はそれぞれ、少なくとも１５であり、２５を超えないヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖はそれぞれ、少なくとも１９であり、２３を超えないヌクレオチド長である。例えば、鎖は、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、センス鎖は、任意の修飾ヌクレオチドを含む２１、２２、２３、または２４のヌクレオチドを有すことができるが、アンチセンス鎖は、任意の修飾ヌクレオチドを含む２１のヌクレオチドを有することができ；特定の実施形態において、センス鎖は、１７、１８、または１９のヌクレオチドを有するセンス配列を有することができるが、アンチセンス鎖は、１９のヌクレオチドを有するアンチセンス配列を有することができる。
Ｉ．２ オーバーハング
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、センスおよびアンチセンス鎖の一方または両方の３’末端、５’末端、または両末端に１つまたはそれ以上のオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のオーバーハングは、ｄｓＲＮＡの安定性および／または阻害活性を向上させる。
「オーバーハング」は、本明細書では、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の３’末端が第２の鎖の５’末端を超えて延びる場合、または逆の場合のｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する対になっていないヌクレオチドを指す。「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端に対になっていないヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、その全長にわたり二本鎖である、すなわち、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。ｄｓＲＮＡの３’末端および／または５’末端にコンジュゲートされた化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学的部分は、ｄｓＲＮＡがオーバーハングを有するか否かを判断する際にここでは考慮されない。
いくつかの実施形態において、オーバーハングは、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む。例えば、オーバーハングは、１、２、３、または４つのヌクレオチドを含むこともある。
いくつかの実施形態において、本開示のオーバーハングは、１つまたはそれ以上のヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、その天然に存在するもしくは化学修飾アナログ）を含む。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、１つもしくはそれ以上のチミンまたはその化学修飾アナログを含む。特定の実施形態において、オーバーハングは、１つまたはそれ以上のチミンを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に位置するオーバーハングおよびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に位置するオーバーハングおよびセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置するオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に位置するオーバーハングおよびアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に位置するオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に位置するオーバーハングおよびセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方の５’末端に位置するオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に位置するオーバーハングおよびアンチセンス鎖の５’末端にオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に位置するオーバーハングおよびセンス鎖の５’末端にオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つの平滑末端を有する。
いくつかの実施形態において、オーバーハングは、センス鎖がアンチセンス鎖よりも長いことの結果である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、アンチセンス鎖がセンス鎖よりも長いことの結果である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、ねじれた同じ長さのセンスおよびアンチセンス鎖の結果である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを生じる。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、標的ｍＲＮＡと相補的である。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は：
ａ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハング；および／または
ｂ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハング
をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ中のオーバーハングは、２または３つのヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、５’－ＣＣＡ－［センス配列］－ｉｎｖｄＴの配列を有するセンス鎖、および５’－［アンチセンス配列］－ｄＴｄＴ－３’の配列を有するアンチセンス鎖を含み、トリヌクレオチドＣＣＡは、修飾される場合もある（例えば、２’－Ｏ－メチル－Ｃおよび２’－Ｏ－メチル－Ａ）。
Ｉ．３ 標的およびｄｓＲＮＡ配列
本開示のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＬＰＡ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）中の１２～３０ヌクレオチド長の標的配列と実質的または完全に相補的なアンチセンス配列を含む。例えば、標的配列は、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限および１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９の独立して選択される下限を有するヌクレオチド長の任意の範囲が可能である。いくつかの実施形態において、標的配列中のヌクレオチドの数は、１５～２５、１５～３０、１６～２９、１７～２８、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、または１９～２１が可能である。
いくつかの実施形態において、標的配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長よりも大きい。いくつかの実施形態において、標的配列は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、標的配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、標的配列は、少なくとも１５であり、２５を超えないヌクレオチド長；例えば、少なくとも１９であり、２３を超えないヌクレオチド長、または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド長である。
標的配列は、ＬＰＡ ｍＲＮＡ転写物の５’非コード領域、コード領域、または３’非コード領域にあることもある。標的配列は、コードおよび非コード領域の接合部に位置する場合もある。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡアンチセンス鎖は、標的配列と１つまたはそれ以上のミスマッチ（例えば、１、２、３もしくは４つのミスマッチ）を有するアンチセンス配列を含む。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、ヒトＬＰＡ ｍＲＮＡ配列中の対応する部分と完全に相補的であり、カニクイザルＬＰＡ ｍＲＮＡ配列中の対応する部分と完全に相補的または実質的に相補的（例えば、少なくとも１つもしくは２つのミスマッチを含む）である。そのようなｄｓＲＮＡの利点の１つは、カニクイザルなどの非ヒト霊長類におけるｄｓＲＮＡの臨床前インビボ試験を可能にすることである。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡセンス鎖は、（例えば、ヒトまたはカニクイザルＬＰＡ ｍＲＮＡ中の）標的配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるセンス配列を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトＬＰＡ ｍＲＮＡ配列（配列番号１６３２）中の標的配列は、以下のヌクレオチドに、またはそのあたり（例えば、その３ヌクレオチド以内）に開始および終了ヌクレオチド位置を有する：それぞれ、２２０および２３８、２２３および２４１、３０２および３２０、１２３６および１２５４、２９４６および２９６４、２９５３および２９７１、２９５４および２９７２、２９５８および２９７６、２９５９および２９７７、４６３５および４６５３、４６３６および４６５４、４６３９および４６５７、４８４２および４８６０、４９８０および４９９８、４９８２および５０００、６３８５および６４０３、または６４７０および６４８８。特定の実施形態において、標的配列は、ヒトＬＰＡ ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド位置２９５８～２９７６、４６３９～４６５７、または４９８２～５０００に対応し、この場合、開始および終了位置は、番号をつけた位置の３ヌクレオチド以内で変動する場合もある。いくつかの実施形態において、標的配列は、表１にセンス配列として列挙されている配列、または列挙されている配列の少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％）のヌクレオチドを含む配列である。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、表１に示されるセンス配列を含むセンス鎖を含む。例えば、センス鎖は、配列番号４、７、１９、９０、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１６８、１６９、１７２、２００、２２１、２２３、２７９、および２９８から選択される配列、または上記の選択された配列由来の少なくとも１５、１６、１７、もしくは１８の連続するヌクレオチドを有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、表１に示されるアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号３０３、３０６、３１８、３８９、４０３、４０６、４０７、４０９、４１０、４６７、４６８、４７１、４９９、５２０、５２２、５７８、および５９７から選択される配列、または上記の選択された配列由来の少なくとも１５、１６、１７、もしくは１８の連続するヌクレオチドを有する配列を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号３０３、３０６、３１８、３８９、４０３、４０６、４０７、４０９、４１０、４６７、４６８、４７１、４９９、５２０、５２２、５７８、および５９７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるアンチセンス配列を含む。
特定の実施形態において、センス配列およびアンチセンス配列は、相補的であり、この場合、
ａ）センス配列は、配列番号４、７、１９、９０、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１６８、１６９、１７２、２００、２２１、２２３、２７９、および２９８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか；または
ｂ）アンチセンス配列は、配列番号３０３、３０６、３１８、３８９、４０３、４０６、４０７、４０９、４１０、４６７、４６８、４７１、４９９、５２０、５２２、５７８、および５９７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、表１に示されるセンス配列を含むセンス鎖および表１に示されるアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ、以下の配列を含む：
配列番号４および３０３；
配列番号７および３０６；
配列番号１９および３１８；
配列番号９０および３８９；
配列番号１０４および４０３；
配列番号１０７および４０６；
配列番号１０８および４０７；
配列番号１１０および４０９；
配列番号１１１および４１０；
配列番号１６８および４６７；
配列番号１６９および４６８；
配列番号１７２および４７１；
配列番号２００および４９９；
配列番号２２１および５２０；
配列番号２２３および５２２；
配列番号２７９および５７８；または
配列番号２９８および５９７。
特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ、以下の配列を含む：
配列番号１１０および４０９；
配列番号１７２および４７１；または
配列番号２２３および５２２。
いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号１１０、１７２、および２２３から選択される配列と完全に相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号１１０、１７２、および２２３から選択される配列と実質的に相補的であり、アンチセンス配列は、選択された配列に対して少なくとも１つのミスマッチ（例えば、１、２、３または４つのミスマッチ）を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ ｍＲＮＡ標的ｄｓＲＮＡのアンチセンス配列は、標的配列に対して１つまたはそれ以上のミスマッチを含む（例えば、一般集団における個体間の対立遺伝子の差のため）。例えば、アンチセンス配列は、標的配列に対して１つまたはそれ以上のミスマッチ（例えば、１、２、３または４つのミスマッチ）を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のミスマッチは、相補性の領域の中心に位置しない。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のミスマッチは、相補性の領域の５’および／または３’末端の５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチド以内に位置する。例えば、１９のヌクレオチドのアンチセンス配列を含むｄｓＲＮＡに関して、いくつかの実施形態では、アンチセンス配列は、それとＬＰＡ ｍＲＮＡ中のその標的配列の間の相補性の領域の中心の９ヌクレオチド以内にいかなるミスマッチも含まない。
下記表１は、例となるｓｉＲＮＡコンストラクト（ＣＮＳＴ）のセンスおよびアンチセンス配列を列挙する。ＮＭ＿００５５７７．２（配列番号１６３２）の開始（ＳＴ）および終了（ＥＤ）ヌクレオチド位置を示す。「ＳＥＱ」は、配列番号を指す。
Figure 2023545502000002
Figure 2023545502000003
Figure 2023545502000004
Figure 2023545502000005
Figure 2023545502000006
Figure 2023545502000007
Figure 2023545502000008
Ｉ．４ ヌクレオチド修飾
本開示のｄｓＲＮＡは、例えば、細胞取り込み、標的配列に対する親和性、阻害活性、および／または安定性を向上させるために１つまたはそれ以上の修飾を含むことができる。修飾としては、例えば、末端修飾、塩基修飾、糖修飾／置換、および骨格修飾を含む、当該技術分野において既知の任意の修飾を挙げることができる。末端修飾としては、例えば、５’末端修飾（例えば、リン酸化、コンジュゲーション、および反転結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ））ならびに３’末端修飾（例えば、コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、および反転結合）を挙げることができる。塩基修飾としては、例えば、安定化塩基、不安定化塩基もしくは広範なレパートリーのパートナーと塩基対を作る塩基による置換、塩基の除去（ヌクレオチドの脱塩基修飾）、またはコンジュゲートされた塩基を挙げることができる。糖修飾または置換としては、例えば、糖部分の２’もしくは４’位における修飾、または糖部分の置換を挙げることができる。骨格修飾としては、例えば、１つまたはそれ以上のホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、リン酸トリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、ならびにホスホルアミダートによる、例えば、リン酸ジエステル結合の修飾または置換を挙げることができる。
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、天然に存在するもしくは修飾ヌクレオチド、または代替置換部分を含む。修飾ヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドであり、本明細書において、「ヌクレオチドアナログ」とも呼ばれる。当業者は、ヌクレオチドのグアニン、シトシン、アデニン、ウラシル、またはチミンを、修飾ヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく他の部分によって置換することができることを理解するであろう。例えば、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を作ることができる。したがって、本開示のヌクレオチド配列中のウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本開示の実施形態として含まれる。修飾ヌクレオチドは、リボース部分が非リボース部分により置換されたヌクレオチドも可能である。
本開示のｄｓＲＮＡとしては、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、チオホスフェートおよびホスホロチオアートなどの代替ヌクレオチド間結合を含む修飾ヌクレオチド、リン酸トリエステル修飾ヌクレオチド、末端でコレステロール誘導体または親油性部分と連結された修飾ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１年）２５４：１４９７～５００頁を参照）、拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ）（ｃＥｔ）修飾ヌクレオチド、反転デオキシ修飾ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、反転ジデオキシ修飾ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｉｄｅｏｘｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドの脱塩基修飾、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノ修飾ヌクレオチド、ホスホルアミダート修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位に修飾を含む修飾ヌクレオチド、ならびに非天然塩基含有修飾ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、５’－ホスホロチオアートヌクレオチド、またはコレステロール誘導体、親油性もしくはその他の標的化部分と連結された末端ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドのヌクレオシド中への２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－Ｏ－プロピル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アミノアルキル、または２’－デオキシ－２’－フルオロ（すなわち、２’－フルオロ）基の組み込みにより、オリゴヌクレオチドに向上したハイブリダイゼーション特性および／または向上したヌクレアーゼ安定性を付与することができる。さらに、ホスホロチオアート骨格を含むオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡの１つまたはそれ以上の位置の隣接する２つのヌクレオチド間のホスホロチオアート結合）は、向上したヌクレアーゼ安定性を有する場合もある。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位などの修飾リボースを有するヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、この場合、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボヌクレオチド、２’－デオキシリボヌクレオチド、または２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、そのセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端に反転２’－デオキシリボヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよび１つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよび２つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（ＯＭｅ）および２つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチド（Ｆ）を交互のパターン、例えば、パターンＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅ－ＦまたはパターンＦ－ＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅで含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス配列およびアンチセンス配列は、交互の２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドおよび２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、それぞれ２’－Ｏ－メチルヌクレオチドである最大１０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、それぞれが２’－フルオロヌクレオチドである最大１０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’または３’末端に２つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のホスホロチオアート基を含む。いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上のホスホロチオアート基を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、いかなるホスホロチオアート基も含まない。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のリン酸トリエステル基を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上のリン酸トリエステル基を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、いかなるリン酸トリエステル基も含まない。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分内に、例えば、デオキシリボヌクレオシドオーバーハングを含む、デオキシリボヌクレオシドなどの修飾リボヌクレオシド、および１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオシドを含む。ただし、いかなる状況でも、「ｄｓＲＮＡ」という用語に二本鎖のＤＮＡ分子が包含されることは自明のことである。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上の本明細書に記載されている異なる修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、最大２つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大３つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大４つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大５つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大６つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大７つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大８つの連続的な修飾ヌクレオチド、最大９つの連続的な修飾ヌクレオチド、または最大１０個の連続的な修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、連続的な修飾ヌクレオチドは、同じ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、連続的な修飾ヌクレオチドは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上の異なる修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは：
ａ）センス鎖が、配列番号６０２、６０５、６１７、６８８、７０２、７０５、７０６、７０８、７０９、７６６、７６７、７７０、７９８、８１９、８２１、８７７、および８９６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか；または
ｂ）アンチセンス鎖が、配列番号９０１、９０４、９１６、９８７、１００１、１００４、１００５、１００７、１００８、１０６５、１０６６、１０６９、１０９７、１１１８、１１２０、１１７６、および１１９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む
ようにされる。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは：
ａ）センス鎖が、配列番号７０８、７７０、および８２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか；または
ｂ）アンチセンス鎖が、配列番号１００７、１０６９、および１１２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む
ようにされる。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
ａ）配列番号６０２および９０１；
ｂ）配列番号６０５および９０４；
ｃ）配列番号６１７および９１６；
ｄ）配列番号６８８および９８７；
ｅ）配列番号７０２および１００１；
ｆ）配列番号７０５および１００４；
ｇ）配列番号７０６および１００５；
ｈ）配列番号７０８および１００７；
ｉ）配列番号７０９および１００８；
ｊ）配列番号７６６および１０６５；
ｋ）配列番号７６７および１０６６；
ｌ）配列番号７７０および１０６９；
ｍ）配列番号７９８および１０９７；
ｎ）配列番号８１９および１１１８；
ｏ）配列番号８２１および１１２０；
ｐ）配列番号８７７および１１７６；または
ｑ）配列番号８９６および１１９５
のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
ａ）配列番号７０８および１００７；
ｂ）配列番号７７０および１０６９；または
ｃ）配列番号８２１および１１２０
のヌクレオチド配列を含む。
下記表２は、修飾ヌクレオチドを含む例となるｓｉＲＮＡコンストラクト（ＣＮＳＴ）の配列を列挙する。ＮＭ＿００５５７７．２（配列番号１６３２）の開始（ＳＴ）および終了（ＥＤ）ヌクレオチド位置を示す。略語は以下のとおりである：ＳＥＱ＝配列番号；ｘ（小文字のヌクレオチド）＝２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチド（本明細書中の別の場所ではｍＸとも示される）；Ｘｆ＝２’－Ｆヌクレオチド（本明細書中の別の場所ではｆＸとも示される）；ｄＸ＝ＤＮＡヌクレオチド；およびｉｎｖｄＸ＝反転ｄＸ。これらのコンストラクトにおいて、それらのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、（１）修飾２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチドおよび２’－Ｆヌクレオチド、（２）センス鎖ヌクレオチド配列の５’末端にｃ－ｃ－ａ、（３）センス鎖ヌクレオチド配列の３’末端にｉｎｖｄＴ、ならびに／または（４）アンチセンス鎖ヌクレオチド配列の３’末端にｄＴ－ｄＴを含むことを別にすれば、同じコンストラクト番号を有する表１のコンストラクトのセンスおよびアンチセンス配列と対応する。これらのコンストラクトにおいて、ヌクレオチドの塩基対は、いくつかの実施形態では、異なるように修飾することができ、例えば、塩基対の一方のヌクレオチドが２’－Ｏ－Ｍｅリボヌクレオチドであり、他方が２’－Ｆヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端に２つの２’－Ｆヌクレオチドを含む。
Figure 2023545502000009
Figure 2023545502000010
Figure 2023545502000011
Figure 2023545502000012
Figure 2023545502000013
Figure 2023545502000014
Figure 2023545502000015
Figure 2023545502000016
Figure 2023545502000017
Figure 2023545502000018
Figure 2023545502000019
Figure 2023545502000020
Figure 2023545502000021
Figure 2023545502000022
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、国際公開第２０１９／１７０７３１号に記載されている１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、その開示の全体を本明細書に組み入れる。そのような修飾ヌクレオチドにおいて、リボース環は、六員複素環によって置換されている。そのような修飾ヌクレオチドは、式（Ｉ）：
Figure 2023545502000023
の構造を有するか、または薬学的に許容されるその塩であり、式中：
－ Ｂは、複素環式核酸塩基であり；
－ Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドと連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分もしくは式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドと連結するヌクレオシド間連結基であり、
－ Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１もしくはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、式中、Ｒ１は、以下であり：
・ 場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基（式中、
Ｊは、ＯもしくはＳであり、
Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）、
・ 場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
・ 基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３（式中、
ｍは、０もしくは１を意味する整数であり、
ｐは、０から１０の範囲の整数であり、
Ｒ２は、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、もしくは－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、
Ｋは、ＯもしくはＳであり、
Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、もしくはＲ３は、細胞標的化部分である）、
－ Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、独立して水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
－ Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈもしくは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、ヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む、非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１である、Ｒ１は、シクロヘキシル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＲ１であり、Ｒ１は、フェニル基によって置換されたメチル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、場合により置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、Ｙは、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、メチルおよびペンタデシルを含む群から選択され、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、一般式（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩に関して定義されるのと同じ意味を有する。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｙは、
ａ）Ｒ１が、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、ＮＲ１；
ｂ）Ｒ１が、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基である、ＮＲ１；
ｃ）Ｒ１が、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基である、ＮＲ１；
ｄ）Ｒ１が、シクロヘキシル基である、ＮＲ１；
ｅ）Ｒ１が、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、ＮＲ１；
ｆ）Ｒ１が、フェニル基によって置換されたメチル基である、ＮＲ１；
ｇ）Ｒ１が、場合により、置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１；または
ｈ）Ｒ１が、メチルもしくはペンタデシルである、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１
である。
いくつかの実施形態において、Ｂは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリンおよび置換プリン、または薬学的に許容されるその塩を含む群から選択される。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ中のヌクレオシド間連結基は、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル－ホスホナートおよびホスホルアミダート骨格連結基、または薬学的に許容されるその塩からなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル－ホスホナートおよびホスホルアミダート骨格連結基、または薬学的に許容されるその塩からなる群から独立して選択される１つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基を含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２から１０個の式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む。特定の実施形態において、２から１０個の式（Ｉ）の化合物は、センス鎖上にある。
さらに別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の標的ヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、式（ＩＩ）：
Figure 2023545502000024
または薬学的に許容されるその塩であり、
式中、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、ＯＨであり、
Ａ４は、ＯＨまたはＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ５であり、式中、Ｒ５は、場合によりハロゲン原子によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、または薬学的に許容されるその塩である
式（Ｉ）のヌクレオチドを有する修飾ｓｉＲＮＡを生成するために使用することができる前駆体を下記表Ａに例示する。表Ａは、オリゴヌクレオチド合成のためのホスホラミダイトヌクレオチドアナログの例を示す。（２Ｓ，６Ｒ）ジアステレオマーシリーズにおいて、ヌクレオチド前駆体としてのホスホラミダイトは、「ｐｒｅ－ｌ」で略記され、ヌクレオチドアナログは、式（Ｉ）中の基Ｙを指定する核酸塩基および数が続く「ｌ」で略記される。両方の立体化学を区別するために、アナログ（２Ｒ，６Ｒ）－ジアステレオ異性体を、追加の「ｂ」で示す。標的ヌクレオチド前駆体、標的ヌクレオチドアナログおよび固相担体は、上記のとおり略記されるが、「ｌ」の代わりに「ｌｇ」を用いる。
Figure 2023545502000025
Figure 2023545502000026
Figure 2023545502000027
Figure 2023545502000028
Figure 2023545502000029
Figure 2023545502000030
Figure 2023545502000031
式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドを、ｄｓＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’、３’、または両末端に組み込むことができる。例として、１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、もしくは５つまたはそれ以上）の修飾ヌクレオチドを、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の５’末端に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）の修飾ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端に位置し、この場合、修飾ヌクレオチドは、アンチセンス配列とぴったりとは合わないが、場合により、アンチセンス鎖の対応する３’末端で等しい数またはそれより小さい数の相補的なヌクレオチドと対を形成する場合もある。特定の実施形態において、センス鎖は、５’末端に２から５つの式（Ｉ）の化合物を含み、および／または３’末端に１から３つの式（Ｉ）の化合物を含む。
いくつかの実施形態において、
ａ）センス鎖の５’末端にある２から５つの式（Ｉ）の化合物は、ｌｇＴ３を含み、場合により、３つの連続したｌｇＴ３ヌクレオチドを含み；および／または
ｂ）センス鎖の３’末端にある１から３つの式（Ｉ）の化合物は、ｌＴ４を含み、場合により、２つの連続したｌＴ４を含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１７、１８、または１９ヌクレオチド長のセンス配列を有するセンス鎖を含む場合もあり、この場合、３から５つの式（Ｉ）のヌクレオチド（例えば、式（Ｉ）の追加のヌクレオチドを伴い、もしくは伴わず３つの連続的なｌｇＴ３またはｌｇＴ７）がセンス配列の５’末端に配置され、センス鎖は２０、２１、または２２ヌクレオチド長になる。そのような実施形態において、センス鎖は、センス配列の３’末端に式（Ｉ）の２つの連続的なヌクレオチド（例えば、１Ｔ４またはｌＴ３）をさらに含み、センス鎖が２２、２３、または２４ヌクレオチド長になる場合もある。ｄｓＲＮＡは、１９ヌクレオチド長のアンチセンス配列を含む場合もあり、この場合、アンチセンス配列は、３’末端に２つの修飾ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＴ）とさらに連結され、アンチセンス鎖が２１ヌクレオチド長になることもある。さらに別の実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、天然に存在するヌクレオチド間結合（リン酸ジエステル結合）のみを含み、この場合、アンチセンス鎖は、場合により、天然に存在しないヌクレオチド間結合を含むこともある。例えば、アンチセンス鎖は、骨格中の５’および／もしくは３’末端付近または５’および／もしくは３’末端にホスホロチオアート結合を含む場合もある。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドの使用は、天然に存在しないヌクレオチド間結合の使用などの他のＲＮＡ修飾の必要性を回避し、それによりｄｓＲＮＡの化学合成を簡単にする。さらに、式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドは、（ＧａｌＮＡｃ自体を含む）ＧａｌＮＡｃ誘導体などの細胞へと標的化された部分を含むよう容易に生成することができ、そのようなヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡの送達効率を向上させる。さらに、例えば、センス鎖に式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの安定性および治療効力を著しく向上させることが示された。
下記表３は、表２に列挙されている選択されたｓｉＲＮＡコンストラクトから誘導される例となる修飾ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンストラクトの配列を列挙する。この表では、ｍＸ＝２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチド；ｆＸ＝２’－Ｆヌクレオチド；ｄＸ＝ＤＮＡヌクレオチド；ＰＯ＝リン酸ジエステル結合；ＰＳ＝ホスホロチオアート結合である。これらのコンストラクトにおいて、それらのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、（１）修飾２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチドおよび２’－Ｆヌクレオチド、（２）センス鎖配列の５’末端に３つのｌｇＴ３ヌクレオチド、ならびに（３）ホスホロチオアート結合を含むことを別にすれば、同じコンストラクト番号を有する表１のコンストラクトのセンスおよびアンチセンス配列と対応する。
Figure 2023545502000032
Figure 2023545502000033
Figure 2023545502000034
ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
ａ）配列番号１２３１および１４２９；
ｂ）配列番号１３０７および１５０５；
ｃ）配列番号１３０８および１５０６；
ｄ）配列番号１３２５および１５２３；
ｅ）配列番号１３２８および１５２６；または
ｆ）配列番号１３６９および１５６７
のヌクレオチド配列を含む。
下記表４は、表３に列挙されている選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンストラクトから誘導される最適化されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンストラクトの配列を列挙する。表４では、ｍＸ＝２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチド；ｆＸ＝２’－Ｆヌクレオチド；ｄＸ＝ＤＮＡヌクレオチド；ｌｘ＝ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド；ＰＯ＝リン酸ジエステル結合；およびＰＳ＝ホスホロチオアート結合である。これらのコンストラクトにおいて、それらのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、（１）修飾２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチドおよび２’－Ｆヌクレオチド、（２）センス鎖の５’末端に３つのｌｇＴ３ヌクレオチド、（３）センス鎖の３’末端に２つのｌＴ４ヌクレオチド、（４）センスおよび／もしくはアンチセンス鎖に１つもしくはそれ以上のＬＮＡヌクレオチド、ならびに／または（５）ホスホロチオアート結合を含むことを別にすれば、表１の対応するコンストラクトのセンスおよびアンチセンス配列と対応する。
Figure 2023545502000035
Figure 2023545502000036
Figure 2023545502000037
Figure 2023545502000038
Figure 2023545502000039
Figure 2023545502000040
Figure 2023545502000041
Figure 2023545502000042
Figure 2023545502000043
Figure 2023545502000044
Figure 2023545502000045
Figure 2023545502000046
Figure 2023545502000047
Figure 2023545502000048
Figure 2023545502000049
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Figure 2023545502000061
Figure 2023545502000062
Figure 2023545502000063
表２、３、および４に示される例となるｓｉＲＮＡはヌクレオチド修飾を含むが、同じ、または実質的に同じ配列であるが、異なる数、パターン、および／またはタイプの修飾を有するｓｉＲＮＡも考えられる。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、片方または両方の末端にヌクレオチド（もしくはその修飾型）が付加された表１に示されるセンス鎖を含む。例えば、ｄｓＲＮＡは、５’ＣＣＡおよび／または３’ｉｎｖｄＴが付加された表１に示されるセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、片方または両方の末端にヌクレオチド（もしくはその修飾型）が付加された表１に示されるアンチセンス鎖を含む。例えば、ｄｓＲＮＡは、３’ｄＴｄＴが付加された表１に示されるアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖に５’ＣＣＡおよび３’ｉｎｖｄＴが付加され、アンチセンス鎖に３’ｄＴｄＴが付加された、表１に示されるとおりのセンスおよびアンチセンス鎖の組を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖に５’ｌｇＴ３－ｌｇＴ３－ｌｇＴ３および３’ｌＴ４－ｌＴ４が付加された、表２に示されるとおりのセンスおよびアンチセンス鎖の組を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、配列において表１に示されるセンス配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるセンス配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、配列において表１に示されるアンチセンス配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアンチセンス配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、配列において表１に示されるセンスおよびアンチセンス配列それぞれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるセンスおよびアンチセンス配列を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表２に示される配列を有するセンスおよびアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表３および４に示される配列を有するセンスおよびアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表１～４のｄｓＲＮＡから選択される。
２つのヌクレオチド配列間の「同一性パーセンテージ」は、２つの最適にアライメントされた配列を比較することによって求められ、この場合、比較するための核酸配列は、２つの配列間の最適なアライメントのための参照配列と比較して、付加または欠失を有することがある。「同一性パーセンテージ」は、ヌクレオチド残基が２つの配列間、好ましくは、２つの完全な配列間で同一である位置の数を求め、同一の位置の数をアライメントウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることによって計算して、２つの配列間の同一性パーセンテージを得る。本明細書における目的で、２つのヌクレオチド配列間の「同一性パーセンテージ」を求めるとき、ヌクレオチドに対する修飾は考慮されない。例えば、５’－ｍＣ－ｆＵ－ｍＡ－ｆＧ－３’の配列は、５’－ＣＵＡＧ－３’の配列と１００％の配列同一性を有すると見なされる。
Ｉ．５ ｄｓＲＮＡコンジュゲート
本ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のリガンドまたは部分と共有結合的または非共有結合的に連結させることができる。そのようなリガンドおよび部分の例は、例えば、Ｊｅｏｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２００９年）２０：５～１４頁およびＳｅｂｅｓｔｙｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１５年）１２１８：１６３～８６頁に見出すことができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のリガンドとリンカーを介してコンジュゲートされる／結びつけられる。例えば、多価（例えば、二価、三価、または四価）の分岐リンカーを含む、当該技術分野において既知の任意のリンカーを使用することができる。リンカーは、切断可能または切断不可能な場合もある。リガンドをｄｓＲＮＡとコンジュゲートすることは、その分布を変え、その細胞の吸収および／もしくは特定の組織に対する標的化および／もしくは１つもしくはそれ以上の特定の細胞タイプ（例えば、肝臓細胞）による取り込みを増大させ、ならびに／またはｄｓＲＮＡの存続期間もしくは半減期を増大させることもある。いくつかの実施形態において、疎水性リガンドは、ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされ、細胞膜の直接的な浸透および／または細胞（例えば、肝臓細胞）を超えた取り込みを促進する。ＬＰＡ ｍＲＮＡ標的ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）に関して、標的組織は、肝臓の実質細胞（例えば、肝細胞）を含む、肝臓である場合もある。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、リンカーを伴い、または伴わずに１つまたはそれ以上のリガンドとコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、細胞標的リガンドとコンジュゲートされる。細胞標的リガンドは、ｄｓＲＮＡの標的細胞への送達を促進する分子部分を指し、これは、（ｉ）選択された標的受容体（例えば、標的タンパク質）を発現する細胞と結合するｄｓＲＮＡの特異度の増加；（ｉｉ）標的細胞によるｄｓＲＮＡの取り込みの増加；および（ｉｉｉ）例えば、輸送ベシクルから細胞質へのｓｉＲＮＡの移行を促進することによるｓｉＲＮＡの細胞内放出の増加など、それが標的細胞に入ったら適切に処理されるｄｓＲＮＡの能力の向上を包含する。リガンドは、例えば、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、ペプチド、脂質、炭水化物、アプタマー、または共リガンドに対して特異親和性を有する分子が可能である。
リガンドの特定の例としては、抗体または肝臓細胞上の特定の受容体と結合するその抗原結合フラグメント、チロトロピン、メラノトロピン、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、多価マンノース、多価フコース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、トランスフェリン、ビスホスホナート、ステロイド、胆汁酸、リポ多糖、組み換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、ポリアミノ酸、アルファヘリカルペプチド、ポリグルタマート、ポリアスパルタート、レクチン、および補因子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リガンドは、１つまたはそれ以上の色素、クロスリンカー、多環式芳香族炭化水素、ペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、酵素、ハプテン、輸送／吸収促進剤、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、もしくはイミダゾールクラスター）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＬＤＬである。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のコレステロール誘導体もしくは親油性部分、例えば、コレステロールもしくはコレステロール誘導体；コール酸；ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ（トコフェロール）、ビオチン、もしくはピリドキサール）；飽和および非飽和の両方を含む胆汁酸コンジュゲートもしくは脂肪酸コンジュゲート（例えば、ラウロイル（Ｃ１２）、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）およびドコサニル（Ｃ２２）、リトコール酸および／もしくはリトコール酸オレイルアミンコンジュゲート（リトコール酸オレイル（ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ－ｏｌｅｙｌ）、Ｃ４３））；ポリマー骨格もしくは足場（例えば、ＰＥＧ、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ラクチド・グリコリドコポリマー（ＰＬＧ）、流体力学的ポリマー（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ））；ステロイド（例えば、ジヒドロテストステロン）；テルペン（例えば、トリテルペン）；カチオン性脂質もしくはペプチド；ならびに／または脂質もしくは脂質ベースの分子と結合させられる。そのような脂質または脂質ベースの分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することができる。脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートの標的組織との結合を調節する（例えば、制御する）ために使用することができる。例えば、ＨＳＡとより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に導かれる可能性が低いため、体から除去される可能性が低い。
いくつかの実施形態において、細胞標的化部分またはリガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合させられる。結合は、１つまたはそれ以上のリンカー（例えば、２、３、４つまたはそれ以上のリンカー）を介する場合もある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているリンカーは、多価（例えば、二価、三価、または四価）の分岐リンカーである。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と二価の分岐リンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、３つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と三価の分岐リンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、３つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体とリンカーを用いて、または用いずに結合させられる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、４つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と４つの別々のリンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、４つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と四価の分岐リンカーを介して結合させられる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端と結合させられる。例となる、非限定的コンジュゲートおよびリンカーは、例えば、Ｂｉｅｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２００２年）１３（２）：２９５～３０２頁；Ｃｅｄｉｌｌｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１７年）２２（８）：Ｅ１３５６；Ｇｒｉｊａｌｖｏら、Ｇｅｎｅｓ（２０１８年）９（２）：Ｅ７４；Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１７年）６：１１６～３２頁；Ｎａｉｒら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．（２０１４年）１３６：１６９５８～６１頁；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２０１５年）２６：１４５１～５頁；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１８年）２８（３）：１０９～１８頁；ならびに米国特許第８，１０６，０２２号、同第９，１２７，２７６号、および同第８，９２７，７０５号に記載されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲーションは、当該技術分野において周知の方法によって容易に行うことができる（例えば、上の文書に記載されているとおり）。
いくつかの実施形態において、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であり、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされている。
ＩＩ． ｄｓＲＮＡを生成する方法
本開示のｄｓＲＮＡは、当該技術分野において既知の任意の方法によって合成することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、自動合成機の使用によって、（例えば、市販のインビトロＲＮＡ合成キットを使用した）インビトロ転写および精製によって、細胞（例えば、ｄｓＲＮＡをコードする発現カセット／ベクターを含む細胞）からの転写および精製などによって合成することができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、別々に合成された後、アニーリングされて、ｄｓＲＮＡを形成する。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドを含み、場合により、細胞標的化部分（例えば、ＧａｌＮＡｃ）とコンジュゲートされたｄｓＲＮＡは、国際公開第２０１９／１７０７３１号の開示に従って調製することができる。
リガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡおよび本開示の配列特異的な連結されたヌクレオシドを有するリガンド分子は、例えば、標準的なヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、または既に連結部分を有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド・ヌクレオチド、またはリガンド分子を既に有するヌクレオシドコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有する基本単位を利用した、適したポリヌクレオチド合成機における構築を含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって構築することができる。
本開示のリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡは、例えば、連結分子のｄｓＲＮＡへの結合から誘導されたものなどのペンダント反応性官能基を有するｄｓＲＮＡの使用を含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって合成することができる。いくつかの実施形態において、この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、任意のさまざまな保護基を有する合成されたリガンド、またはリガンドに結合した連結部分を有するリガンドと直接反応させることができる。いくつかの実施形態において、方法は、適切にリガンドとコンジュゲートされ、固相担体材料とさらに結合させることもできるヌクレオシドモノマーの使用によってリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡの合成を容易にする。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡの３’末端に結合したアラルキルリガンドを有するｄｓＲＮＡは、まずモノマー基本単位をコントロールドポアグラス担体と長鎖アミノアルキル基により共有結合させ；その後、ヌクレオチドを標準的な固相合成技術により固相担体と結合したモノマー基本単位に結合させることによって調製される。モノマー基本単位は、ヌクレオシドまたは固相合成に適合したその他の有機化合物が可能である。
いくつかの実施形態において、５’末端にアミノ基を有する本開示の官能化ヌクレオシド配列は、ポリヌクレオチド合成機を使用して調製され、その後、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応させられる。活性エステル誘導体は、当業者によく知られている。アミノ基と活性エステルの反応は、選択されたリガンドが連結基により５’位に結合したオリゴヌクレオチドを生成する。５’末端にあるアミノ基は、５’－ａｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６試薬を利用して作製することができる。いくつかの実施形態において、リガンド分子は、リガンド－ヌクレオシドホスホラミダイトの使用によってオリゴヌクレオチドと５’位においてコンジュゲートされ、この場合、リガンドは、５’－ヒドロキシ基に直接、またはリンカーを介して間接的に連結される。そのようなリガンド－ヌクレオシドホスホラミダイトは、一般に自動合成手順の終わりに使用されて、５’末端にリガンドを有するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドをもたらす。
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを合成するためにクリックケミストリーが使用される。例えば、Ａｓｔａｋｈｏｖａら、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ．（２０１８年）１５（８）：２８９２～９頁；Ｍｅｒｃｉｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２０１１年）２２（１）：１０８～１４頁を参照。
ＩＩＩ． ｄｓＲＮＡの組成物および送達
本開示の特定の態様は、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡを含む組成物（例えば、医薬組成物）に関する。いくつかの実施形態において、本組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、ＬＰＡ遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害を処置するのに有用である。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ遺伝子の発現に関連する疾患または障害は、高トリグリセライド血症などの脂質代謝障害および／または本明細書に記載されている任意のその他の状態である。本開示の組成物は、送達の様式に基づいて製剤化することができ、例えば、非経口投与による肝臓への送達のために製剤化された組成物を含む。
本ｄｓＲＮＡは、薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することができる。薬学的に許容される賦形剤は、液体または固体が可能であり、所望の容積、粘度、ならびにその他の関連する輸送および化学的特性をもたらすよう、計画される投与様式を念頭において選択することができる。例えば、水、生理食塩水、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えば、ラクトースおよびその他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、カルシウム塩（例えば、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、およびヒドロキシアパタイト）、ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を含む、任意の既知の薬学的に許容される賦形剤を使用することができる。
本ｄｓＲＮＡは、他の分子、分子構造体、または核酸の混合物と混合された、カプセル化された、コンジュゲートされた、または代わりに会合しているｄｓＲＮＡを含有する組成物（例えば、医薬組成物）に製剤化することができる。例えば、１つまたはそれ以上の本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを含む組成物は、他の脂質低下薬（例えば、スタチン）などの他の治療用薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、本組成物（例えば、医薬組成物）は、本明細書に記載される送達ビヒクルをさらに含む。
本開示のｄｓＲＮＡは、直接または間接的に送達することができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を対象に投与することによって直接送達される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、下に記載される１つまたはそれ以上のベクターを投与することによって間接的に送達される。
本開示のｄｓＲＮＡは、例えば、核酸分子を送達する方法をｄｓＲＮＡとの使用に適合させることを含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって（例えば、Ａｋｈｔａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９２年）２（５）：１３９～４４頁；国際公開第９４／０２５９５号を参照）、または当該技術分野において既知のさらなる方法により（例えば、Ｋａｎａｓｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１３年）１２：９６７～７７頁；ＷｉｔｔｒｕｐおよびＬｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１５年）１６：５４３～５２頁；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００９年）８：１２９～３８頁；Ｇａｒｙら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００７年）１２１（１－２）：６４～７３頁；Ｗａｎｇら、ＡＡＰＳ Ｊ．（２０１０年）１２（４）：４９２～５０３頁；Ｄｒａｚら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ（２０１４年）４（９）：８７２～９２頁；Ｗａｎら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ．（２０１３年）４（１）：７４～８３頁；ＥｒｄｍａｎｎおよびＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ（編）（２０１０年）“ＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＤＯＩ １０．１００７／９７８－３－６４２－１２１６８－５；ＸｕおよびＷａｎｇ、Ａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１５年）１０（１）：１～１２頁を参照）送達することができる。インビボ送達に関して、ｄｓＲＮＡは、組織部位に注射するか、または全身投与（例えば、吸入によるナノ粒子形態）することができる。インビボ送達は、ベータ・グルカン送達系を介して行うこともできる（例えば、Ｔｅｓｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１１年）４３６（２）：３５１～６２頁を参照）。細胞へのインビトロ導入としては、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当該技術分野において既知の方法が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを含む送達ビヒクルによって送達される。いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは、リポソーム、リポプレックス、複合体、またはナノ粒子である。
ＩＩＩ．１ リポソーム製剤
リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層または多重膜ベシクルである。いくつかの実施形態において、リポソームは、球状の二重膜または複数の二重膜中に配置された両親媒性脂質から構成されるベシクルである。水性部分は、送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合できるという利点をもつ。リポソームの利点としては、例えば、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性であり、生分解性であること；リポソームが広い範囲の水溶性および脂溶性薬物を含むことができること；ならびにリポソームがその内部区画にカプセル化された薬物を代謝および分解から保護することができることが挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８年、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２４５頁）。リポソーム製剤の調製において重要な考慮すべき事項は、リポソームの脂質表面電荷、ベシクルサイズおよび水様液の体積である。例えば、ｄｓＲＮＡを送達するために設計されたカチオン性リポソームおよび立体的に安定化されたリポソームを使用することができる。例えば、Ｐｏｄｅｓｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２００９年）４６４：３４３～５４頁；米国特許第５，６６５，７１０号を参照。
ＩＩＩ．２ 核酸・脂質粒子
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、例えば、以下に限定されない、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、またはＳＮＡＬＰなどの核酸・脂質粒子を形成する。本明細書中で使用される場合、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む、安定な核酸・脂質粒子を指す。本明細書中で使用される場合、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質ベシクル内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む核酸・脂質粒子を指す。核酸・脂質粒子、例えば、ＳＮＡＬＰは、一般にカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ・脂質コンジュゲート）を含む。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈（ｉ．ｖ．）注射後に長い循環存続期間を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用に有用である。ＳＰＬＰは、「ｐＳＰＬＰ」を含み、これらとしては、国際公開第００／０３６８３号に記載されているカプセル化された凝縮剤・核酸複合体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、核酸・脂質粒子中に存在するとき、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗力がある。核酸・脂質粒子およびそれらの製造の方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；および同第６，８１５，４３２号；ならびに国際公開第９６／４０９６４号に開示されている。
いくつかの実施形態において、核酸・脂質粒子は、カチオン性脂質を含む。当該技術分野において既知の任意のカチオン性脂質またはその混合物を使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸・脂質粒子は、非カチオン性脂質を含む。当該技術分野において既知の任意の非カチオン性脂質またはその混合物を使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸・脂質粒子は、（例えば、凝集を防ぐために）コンジュゲートされた脂質を含む。当該技術分野において既知の任意のコンジュゲートされた脂質を使用することができる。
ＩＩＩ．３ さらなる製剤
インビボでｄｓＲＮＡ分子を首尾よく送達するために検討する重要な要素としては、（１）送達分子の生物学的安定性、（２）非特異的効果の予防、および（３）標的組織における送達分子の蓄積が挙げられる。ｄｓＲＮＡの非特異的効果は、例えば、組織への直接注射もしくは挿入による局部投与によって、または調製物を局所投与することによって最小限にすることができる。疾患の処置のためのｄｓＲＮＡの全身投与では、ｄｓＲＮＡを、修飾するか、あるいは薬物送達系を使用して送達することができ；いずれの方法も、インビボにおけるエンドおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を妨げるよう働く。ＲＮＡの修飾または医薬賦形剤も、ｄｓＲＮＡ組成物の標的組織に対する標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することができる。上記のとおり、ｄｓＲＮＡ分子を、コレステロールなどの親油性基との化学的コンジュゲーションによって修飾して、細胞取り込みを増大させ、分解を防ぐことができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ナノ粒子（例えば、リン酸カルシウムナノ粒子）、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達系を使用して送達される。正の電荷をもつカチオン性送達系は、（負の電荷をもつ）ｄｓＲＮＡ分子の結合を促進し、負の電荷をもつ細胞膜における相互作用も増大させて、細胞によるｄｓＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｄｓＲＮＡと結合させるか、またはｄｓＲＮＡを入れるベシクルもしくはミセルを形成させることができる（例えば、Ｋｉｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００８年）１２９（２）：１０７～１６頁を参照）。ベシクルまたはミセルの形成は、全身投与されたときにｄｓＲＮＡの分解をさらに妨げる。カチオン性ｄｓＲＮＡ複合体を生成および投与する方法は、当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、全身投与のためのサイクロデキストリンと複合体を形成することができる。
ＩＩＩ．４ ベクターにコードされるｄｓＲＮＡ
本開示のｄｓＲＮＡは、標的細胞にｄｓＲＮＡをコードする組み換えベクター（ＤＮＡもしくはＲＮＡベクター）を導入することによって標的細胞に間接的に送達することができる。ｄｓＲＮＡは、細胞内のベクターから、例えば、ｓｈＲＮＡの形態で発現されることになり、ｓｈＲＮＡは、その後、ｓｉＲＮＡに細胞内でプロセシングされる。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、原核細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、真核細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、酵母菌細胞における発現に適合している。いくつかの実施形態において、ベクターは、脊椎動物細胞における発現に適合している。例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルスなど）、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス（例えば、オルソポックスまたはアビポック）など由来のベクターを含む、当該技術分野において既知のｄｓＲＮＡをコードすることが可能な任意の発現ベクターを使用することができる。ウイルスベクターまたはウイルス由来のベクターの指向性は、必要に応じて１つもしくはそれ以上の他のウイルスのエンベロープタンパク質もしくはその他の表面抗原でベクターをシュードタイプすることによって、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代わりに用いることによって改変することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、Ｍｏｋｏｌａウイルスなどの表面タンパク質でシュードタイプすることができる。ＡＡＶベクターは、異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するようベクターを操作することによって異なる細胞を標的とするように作製することができる。例えば、血清型２のゲノムに基づいて血清型２のカプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２のカプシド遺伝子を、血清型５のカプシド遺伝子によって置き換えて、ＡＡＶ２／５ベクターを生成することができる。異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、以前に示されている（例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（２００２年）７６：７９１～８０１頁を参照）。
組み換えベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現するためにベクターに核酸配列を挿入するための方法、および１つまたはそれ以上の目的の細胞にベクターを送達する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｄｏｍｂｕｒｇ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．（１９９５年）２：３０１～１０頁；Ｅｇｌｉｔｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８年）６：６０８～１４頁；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．（１９９０年）１：５～１４頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８年）３９２：２５～３０頁；Ｘｉａら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２年）２０：１００６～１０頁；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．（２００３年）３３：４０１～６頁；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（１９８７年）６１：３０９６～１０１頁；Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９６年）７０：５２０～３２頁；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９８９年）６３：３８２２～６頁；米国特許第５，２５２，４７９号および同第５，１３９，９４１号；ならびに国際公開第９４／１３７８８号および同第９３／２４６４１号を参照。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織におけるｄｓＲＮＡの発現に十分な調節エレメント（例えば、異種プロモーター、エンハンサーなど）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つまたはそれ以上の異種プロモーターと連結されたｄｓＲＮＡをコードする１つまたはそれ以上の配列を含む。例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む、ｄｓＲＮＡを発現することができる当該技術分野において既知の任意の異種プロモーターを使用することができる。１つまたはそれ以上の異種プロモーターは、誘導性プロモーター、抑制可能なプロモーター、調節可能なプロモーター、および／または組織特異的なプロモーターが可能である。さらなるプロモーターの選択は、当業者の能力の範囲内である。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、構成的発現をもたらすよう選択される。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、調節された／誘導可能な／抑制可能な発現をもたらすよう選択される。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、組織特異的な発現をもたらすよう選択される。いくつかの実施形態において、調節エレメントおよびｄｓＲＮＡをコードする配列は、転写単位を形成する。
本開示のｄｓＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅら、ＴＩＧ（１９９６年）１２：５～１０頁；国際公開第００／２２１１３号および同第００／２２１１４号；ならびに米国特許第６，０５４，２９９号を参照）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞タイプにより、一過性（およそ数時間から数週間）の場合も、または持続性（数週から数か月もしくはそれ以上）の場合もある。これらの導入遺伝子は、直線的なコンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、これは、組み込みもしくは非組み込みベクターが可能である。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして受け継がれるのを可能にするように構築される（Ｇａｓｓｍａｎｎら、ＰＮＡＳ（１９９５年）９２：１２９２頁）。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、別々の発現ベクターにコードされる。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）同じ標的細胞に共導入された２つの別々の発現ベクターにおいて発現される。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターにコードされる。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターに配置された別々のプロモーターから転写される。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターの同じプロモーターから転写される。いくつかの実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、ｄｓＲＮＡがステムおよびループ構造を有するよう、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆向き反復配列として同じプロモーターから転写される。
ＩＶ． ｄｓＲＮＡ療法
本開示の特定の態様は、対象（例えば、ヒトなどの霊長類対象）におけるＬＰＡ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、治療有効量の１つもしくはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡ、１つもしくはそれ以上の本開示のベクター、または１つもしくはそれ以上の本開示の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。本開示の特定の態様は、１つまたはそれ以上の本明細書に記載されている状態（例えば、アテローム動脈硬化症、末梢動脈疾患、大動脈弁石灰化、血栓症、もしくは卒中を含む心血管疾患（ＣＶＤ）などのＬｐ（ａ）関連状態）を処置および／または予防する方法であって、１つもしくはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡおよび／または１つもしくはそれ以上の本開示のベクターおよび／または１つもしくはそれ以上の本明細書に記載されているｄｓＲＮＡを含む１つもしくはそれ以上の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、対象におけるＬＰＡ発現のダウンレギュレートは、対象における本明細書に記載されている状態（例えば、ＣＶＤなどの高Ｌｐ（ａ）関連状態）の１つまたはそれ以上の症状を軽減する。
本開示の医薬組成物は、ＬＰＡ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡの適した用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ受け手の体重の範囲である。特定の実施形態において、適した用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ受け手の体重の範囲、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ受け手の体重の範囲である。治療有効量の医薬組成物による対象の処置は、１回の処置または一連の処置を含むことがある。
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」および「予防有効量」という用語は、ＬＰＡ発現が関係する病理学的過程の処置、予防、もしくは維持、またはＬＰＡ発現が関係する病理学的過程の明白な症状に治療上の利益をもたらす量を指す。
本明細書中で使用される場合、「Ｌｐ（ａ）関連状態」または「高Ｌｐ（ａ）関連状態」という用語は、Ｌｐ（ａ）の血漿中濃度を低下させることが有益なあらゆる状態を含むことが意図される。そのような状態は、例えば、Ｌｐ（ａ）の過剰な産生、疾患状態と関連する特定のアポ（ａ）アイソフォームの産生、Ｌｐ（ａ）レベルを増加させるＬＰＡ遺伝子変異、レベルの増加、もしくは分解および除去の低減につながる異常なアポ（ａ）切断、および／またはＬｐ（ａ）レベルを増加させるか、もしくは分解を低減するようなＬｐ（ａ）と、他のタンパク質もしくは他の内因性もしくは外因性物質（例えば、プラスミノーゲン受容体）との間の異常な相互作用によって引き起こされる場合もある。Ｌｐ（ａ）関連状態は、例えば、心血管疾患である場合もある。高いＬｐ（ａ）レベルに関連する状態は、生活習慣の変化および一般的なスタチン薬物に対する感受性が比較的低い場合もあるため、処置するのが困難である。本明細書中で定義されるとおりのＬｐ（ａ）関連状態は、脂血症（ｌｉｐｉｄｅｍｉａ）（例えば、高脂血症）、脂質異常症（例えば、アテローム性脂質異常症、糖尿病性脂質異常症、または混合型脂質異常症）、高リポタンパク血症、高アポベータリポタンパク質血症（ｈｙｐｅｒａｐｏｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢動脈疾患、メタボリックシンドローム、急性冠症候群、大動脈弁狭窄症、大動脈弁石灰化、大動脈弁逆流症、大動脈解離、網膜動脈閉塞症、脳血管疾患、腸間膜虚血、上腸間膜動脈閉塞、再狭窄、腎動脈狭窄症、アンギナ、脳血管アテローム動脈硬化症、脳血管疾患、および静脈血栓症から選択される場合もある。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、慢性心臓疾患（ＣＨＤ）などの心血管疾患（ＣＶＤ）またはＣＶＤに関連する任意の症状もしくは状態を有する対象を処置するために使用される。特定の実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、高コレステロール血症（例えば、スタチン抵抗性高コレステロール血症、およびヘテロ接合性もしくはホモ接合性家族性高コレステロール血症）、心筋梗塞（ＭＩ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、石灰化大動脈弁疾患（ＣＡＶＤ）、アテローム動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）、アテローム動脈硬化症、脂質異常症、血栓症、または卒中を有する患者を処置するために使用される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、以下から選択される１つまたはそれ以上の状態を有する対象を処置するために使用される：脂血症（例えば、高脂血症）、脂質異常症（例えば、アテローム性脂質異常症、糖尿病性脂質異常症、または混合型脂質異常症）、高リポタンパク血症、高アポベータリポタンパク質血症、冠動脈疾患、メタボリックシンドローム、急性冠症候群、大動脈弁狭窄症、大動脈弁石灰化、大動脈弁逆流症、大動脈解離、網膜動脈閉塞症、脳血管疾患、腸間膜虚血、上腸間膜動脈閉塞、再狭窄、腎動脈狭窄症、アンギナ、脳血管アテローム動脈硬化症、脳血管疾患、および静脈血栓症。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、体重を管理するため、または対象の脂肪量を減少させるために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、ヒトＬＰＡ遺伝子、またはヒトおよびカニクイザルＬＰＡ遺伝子の両方の発現を阻害する。治療前のレベルと比較して処置後に、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％、対象におけるＬＰＡ遺伝子の発現を阻害することができるか、または対象におけるＬｐ（ａ）レベルを低下させることができる。いくつかの実施形態において、治療前のレベルと比較して処置後に、少なくとも約２分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約１５分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約２５分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約７５分の１、または少なくとも約１００分の１に、ＬＰＡ遺伝子の発現を阻害するか、または対象におけるＬｐ（ａ）レベルを低下させることができる。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ遺伝子が、阻害されるか、またはＬｐ（ａ）レベルが、対象の肝臓において低減される。
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ遺伝子の発現は、約１２もしくはそれ以上、２４もしくはそれ以上、または３６もしくはそれ以上の時間、ｄｓＲＮＡによって低減される。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ遺伝子の発現は、長い時間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、もしくは６日間またはそれ以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、もしくは４週間またはそれ以上低減される。
本明細書中で使用される場合、ＬＰＡ遺伝子に言及する限りにおいて、「～の発現を阻害する」または「～の発現を阻害すること」という用語は、ＬＰＡ遺伝子の発現が阻害されるよう処理された第１の細胞または細胞群における、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較した場合のＬＰＡ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量の減少によってはっきりと示されるＬＰＡ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。そのような阻害は、例えば、ノーザン分析、インサイツハイブリダイゼーション、Ｂ－ＤＮＡ分析、発現プロファイリング、レポーターコンストラクトの転写、および当該技術分野において既知のその他の技術によって評価することができる。本明細書中で使用される場合、「阻害すること」という用語は、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「ダウンレギュレートすること」、「抑制すること」およびその他の類似の用語と同義に使用され、任意のレベルの阻害を含む。阻害の程度は、通常、（（（対照細胞中のｍＲＮＡ）－（処理細胞中のｍＲＮＡ））／（対照細胞中のｍＲＮＡ））×１００％に換算して表される。
あるいは、阻害の程度は、ＬＰＡ遺伝子転写と機能的に結びつけられるパラメーター、例えば、細胞中のＬＰＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の量（例えば、ウエスタン分析、レポータータンパク質の発現、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、もしくは当該技術分野において既知のその他の技術によって評価される）、または特定の表現型、例えば、アポトーシスを示す細胞の数の減少に換算して得ることができる。原則として、ＬＰＡ遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム操作によって、および任意の適切なアッセイによってのいずれかで標的を発現する任意の細胞において判断することができる。しかしながら、所与のｄｓＲＮＡがＬＰＡ遺伝子の発現をある一定の程度阻害するかどうか判断するために基準が必要とされ、したがって、本開示に包含される場合、下記の実施例において示されるアッセイは、そのような基準の役割を果たすものとする。
本明細書に記載されているｄｓＲＮＡまたは医薬組成物は、経口または静脈内、筋肉内、皮下、経肺、経皮、および気道（エアロゾル）投与を含む、非経口経路を含むが、それらに限定されない当該技術分野において既知の任意の手段によって投与することができる。一般に、高コレステロール血症または別のＣＶＤ状態を有する患者を処置する場合、ｄｓＲＮＡ分子は、非経口手段により全身投与される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび／または組成物は、皮下投与によって投与される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび／または組成物は、静脈内投与によって投与される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび／または組成物は、経肺投与によって投与される。
本明細書中で使用される場合、ＬＰＡ発現の文脈において、「処置する」「処置」などという用語は、標的遺伝子発現が関係する病理学的過程からの解放または軽減を指す。本開示の文脈において、本明細書において挙げられた任意の状態に関する限りにおいて、「処置する」、「処置」などという用語は、上記状態に関連する１つもしくはそれ以上の症状を軽減することまたは緩和することを指す。本明細書中で使用される場合、疾患、障害もしくは状態を「緩和する」ことは、疾患、障害、もしくは状態の症状の重症度および／または発生頻度を低減することを意味する。さらに、本明細書における「処置」に対する言及は、治療的、対症的および予防的処置に対する言及を含む。
本明細書中で使用される場合、状態に関する「予防する」または「～の進行を遅らせる」という用語（およびその文法的変形）は、例えば、状態を有するか、またはそれを発症するリスクがあることが疑われる個体における状態の予防的処置に関する。予防としては、以下に限定されるものではないが、状態の発症もしくは進行を予防することもしくは遅らせること、および／または疾患の１つもしくはそれ以上の症状を所望のレベルもしくは病理学的なレベル未満に維持することを挙げることができる。
当然のことながら、本開示のｄｓＲＮＡは、本明細書に記載されている処置に使用するためのものである場合もあり、本明細書に記載されている処置の方法に使用される場合もあり、および／または本明細書に記載されている処置のための薬剤の製造に使用するためのものである場合もある。
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、その他のｓｉＲＮＡ治療用薬剤、モノクローナル抗体、および小分子などの１つまたはそれ以上の追加の治療用薬剤と組み合わせて投与されて、患者の状態にｄｓＲＮＡの単独投与よりも大きな改善をもたらす。特定の実施形態において、追加の治療用薬剤は、抗炎症効果をもたらす。特定の実施形態において、追加の治療用薬剤は、脂質低下薬などの高トリグリセライド血症を処置する薬剤である。
いくつかの実施形態において、追加の薬剤は、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、スタチン）、ＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ８阻害剤、フィブラート、胆汁酸捕捉剤（ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ）、ナイアシン（ニコチン酸）、抗血小板薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（例えば、ロサルタンカリウム）、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロール調節物質、胆汁酸調節物質、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、オメガ－３脂肪酸（例えば、魚油もしくはアマニ油）、およびインスリンもしくはインスリンアナログのうちの１つまたはそれ以上が可能である。特定の例としては、アトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、エゼチミブ、ベザフィブラート、クロフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム、およびナイアシンが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡは、脂質低下、体重減少、食事の変更、および／または適度の運動などの別の治療的介入と組み合わせて投与することができる。
遺伝的素因が標的遺伝子関連疾患、例えば、高Ｌｐ（ａ）レベルの発症に影響を及ぼす。したがって、１つまたはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡによる処置を必要とする対象は、家族歴を得ること、または、例えば、１つもしくはそれ以上の遺伝子マーカーもしくはバリアント、特に、Ｌｐ（ａ）ＫＩＶ２多型に関してスクリーニングすることによって特定することができる。特定の実施形態において、１つまたはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡによる処置を必要とする対象は、任意のこれらの遺伝子または任意のその組み合わせにおけるバリアントに関してスクリーニングすることによって特定することができる。
医師、看護師、または家族などの健康管理の提供者は、本開示のｄｓＲＮＡを処方または投与前に家族歴を得ることできる。さらに、遺伝子型または表現型を決定するために試験を実施することができる。例えば、ｄｓＲＮＡが対象に投与される前に、ＬＰＡ遺伝子型および循環Ｌｐ（ａ）表現型を特定するために、対象からのサンプル、例えば、血液サンプルに対してＤＮＡ試験またはアポ（ａ）アイソフォーム分離試験を実施することができる。
Ｖ． キットおよび製造品
本開示の特定の態様は、高Ｌｐ（ａ）関連状態（例えば、末梢動脈疾患、アテローム動脈硬化症、もしくは大動脈弁石灰化）の処置および／もしくは予防に有用な１つもしくはそれ以上の本明細書に記載されているｄｓＲＮＡ、ベクター、もしくは組成物（例えば、医薬組成物）を含む製造品またはキットに関する。製造品またはキットは、容器と、容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書とをさらに含む場合もある。適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静注液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料から形成することができる。容器は、単独で、もしくは疾患を処置もしくは予防するのに有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌した入り口を有することもできる（例えば、容器は、皮下注射針が貫通可能な栓を有する静注液バッグもしくはバイアルが可能である）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡである。ラベルまたは添付文書は、組成物が高Ｌｐ（ａ）関連状態を処置するために使用されることを示す。いくつかの実施形態において、状態は、ＣＶＤおよび／または本明細書に記載されている別の状態である。さらに、製造品またはキットは、（ａ）中に入れられた本明細書に記載されているｄｓＲＮＡを含む組成物を有する第１の容器；および（ｂ）中に入れられた第２の治療用薬剤を含む組成物を有する第２の容器（例えば、本明細書に記載されている追加の薬剤）を含む。本開示のこの態様における製造品またはキットは、組成物が特定の疾患を処置するために使用することができることを示す添付文書をさらに含むことができる。あるいは、またはさらに、製造品またはキットは、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理的食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２の（または第３の）容器をさらに含むことができる。それは、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、注射針、およびシリンジを含む、商業的および／または使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。
本明細書において別に定義されていない限り、本開示に関連して使用される科学および技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有するものとする。例となる方法および材料を以下に示すが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料も本開示の実務または試験に使用することができる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先されることになる。
一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医薬および製薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、当該技術分野において周知のものであり、一般的に使用される。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に遂行されるとおり、または本明細書に記載されるとおり、製造業者の仕様書に従って実施される。
さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むものとし、複数の用語は、単数を含むものとする。本明細書および実施形態全体をとおして、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語または「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、指定される整数または整数の群を含むが、その他のいかなる他の整数または整数の群も排除しないことを意味することが理解されるであろう。
本明細書において言及されるすべての刊行物およびその他の参考文献の全体を参照によって組み入れる。多くの文献が本明細書中で引用されるが、この引例は、これらのいかなる文献も当該技術分野において通常の一般知識の一部を構成することを認めるものではない。
本開示がさらによく理解されるために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、説明のためのものに過ぎず、いかなる方法によっても本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
ｓｉＲＮＡ合成および精製
非標的化対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴ対照）を含む、ｓｉＲＮＡを、固相オリゴヌクレオチド合成を使用して作製した。
１５～６０％のＧ＋Ｃ含量を有する２９９個の１９塩基長のＬＰＡ ｓｉＲＮＡ配列を含むＬＰＡ ｓｉＲＮＡスクリーニングライブラリーを、オルソロガスなカニクイザルｍＲＮＡ配列（ＸＭ＿０１５４４８５１７）に対して最大１個のミスマッチを許容して、ヒトｍＲＮＡ転写物（ＮＭ＿００５５７７．２）と完全に一致するよう設計した。これらのＬＰＡ ｓｉＲＮＡ配列は、２’－Ｏ－メチルおよび２’－フルオロ修飾ヌクレオチドの固定パターンを含んでいた（表１）。すべてのセンスおよびアンチセンス鎖配列を、ヒトＲｅｆＳｅｑ ＲＮＡデータベースバージョン２０１６－０２－２３に対してコンピュータでプロファイル分析した。ヒト肝臓組織においてＦＰＫＭ＜０．５のＲＮＡ－Ｓｅｑ発現（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｂｏｄｙ Ａｔｌａｓ）を有するオフターゲット転写物は考慮しなかった。唯一の例外はＬＰＡＬ２偽遺伝子であり、オフターゲットヒットが許容された。ヒト肝臓において発現するあらゆる他の可能性のあるヒトオフターゲット転写物に対して＞２個のミスマッチを有するｓｉＲＮＡ配列を、ライブラリー設計のために使用した。
非標的化対照ｓｉＲＮＡ（「ＬＶ２」および「ＬＶ３」）を含む、コンジュゲートされていないＬＰＡ ｓｉＲＮＡを、２’－ＯＭｅもしくは２’－Ｆ修飾を有する市販のウリジンの５’－Ｏ－ＤＭＴ－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホラミダイトモノマー（ＳＡＦＣ）、４－Ｎ－アセチルシチジン（ＣＡｃ）、６－Ｎ－ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）および２－Ｎ－イソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）、ならびに固相担体５’－Ｏ－ＤＭＴ－チミジン－ＣＰＧおよび３’－Ｏ－ＤＭＴ－チミジン－ＣＰＧ（ｉｎｖｄＴ、Ｌｉｎｋ）を使用して固相合成および脱保護に関する標準的なプロトコルに従って、１μｍｏｌ（インビトロ）もしくは１０μｍｏｌ（インビボ）のスケールでＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ ＭｅｒＭａｄｅ １２合成機において合成した（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．（２００８年）１１：２０３～１６頁；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｒｇ Ｓｙｎｔｈ．（２００４年）１：２９３～３０７頁）。
ホスホラミダイト基本単位を、アセトニトリル中の０．１Ｍ溶液として使用し、５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール（アクチベーター４２、アセトニトリル中０．２５Ｍ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）により活性化した。ホスホラミダイトカップリングのために３００秒の反応時間を使用した。キャッピング試薬として、ＴＨＦ中の無水酢酸（ＣａｐＡ ｆｏｒ ＡＢＩ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴＨＦ中のＮ－メチルイミダゾール（ＣａｐＢ ｆｏｒ ＡＢＩ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。酸化試薬として、ＴＨＦ／ピリジン／水中のヨウ素（０．０２Ｍ；ＡＢＩ用オキシダイザー、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。ＤＭＴ－保護基の脱保護を、ＤＣＭ中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ脱保護、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して行った。固相担体からの最終的な切断および脱保護（アシル－およびシアノエチル－保護基）を、ＮＨ３（３２％水溶液／エタノール、ｖ／ｖ ３：１）により達成した。
粗製オリゴヌクレオチドを、ＩＥＸおよびＬＣ－ＭＳによって分析し、３０分の１０～６５％バッファーＢの直線グラジエントを使用したアニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）によって精製した。ＡＫＴＡ精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００セミ分取イオン交換カラム、８μｍ粒子、幅２２ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）。
バッファーＡ：１．５０ｌ Ｈ２Ｏ、２．１０７ｇ ＮａＣｌＯ４、４３８ｍｇ ＥＤＴＡ、１．８１８ｇ ＴＲＩＳ、５４０．５４ｇ 尿素、ｐＨ７．４。
バッファーＢ：１．５０ｌ Ｈ２Ｏ、１０５．３４ｇ ＮａＣｌＯ４、４３８ｍｇ ＥＤＴＡ、１．８１８ｇ ＴＲＩＳ、５４０．５４ｇ 尿素、ｐＨ７．４。
オリゴヌクレオチドの単離は、４倍容量のエタノールの添加により引き起こされる沈殿および－２０℃における保管によって達成した。
データの高い正確さを確保するために、すべての一本鎖をＨＰＬＣ精製して、＞８５％の純度にした。オリゴヌクレオチドの純度および正体を、それぞれ、イオン交換クロマトグラフィーおよびＬＣ－ＭＳによって確認した。
陽性対照ＬＰＡ ｓｉＲＮＡ ｓ８２６３およびｓ８２６４を、Ａｍｂｉｏｎ（現Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入した。
インビトロおよびインビボ実験のために、ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡの保存液（それぞれ、１００μＭおよび１０ｍｇ／ｍｌ）を、等モル量の相補的なセンスおよびアンチセンス鎖を１×ＰＢＳバッファー中で混合することによって調製した。その溶液を９０℃に１０分間加熱し、室温にゆっくりと冷まして、アニーリングプロセスを完了させた。ｓｉＲＮＡを、ＨＰＬＣによってさらに特徴づけ、使用まで凍結保存した。
ｓｉＲＮＡ配列
各ｓｉＲＮＡの配列、およびヌクレオチド修飾を含む配列を上記表１、２、３、および４に示す。
ヒトＬＰＡ発現の阻害のためのｓｉＲＮＡの特定
方法
細胞および組織培養
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％ ＲＨで増殖させ、１０％ ＦＢＳを加えたＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号３０－２００３（商標））中で培養した。
ヒトＨｕＨ－７細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％ ＲＨで増殖させ、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１１４００３５）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ８６３６）および１０％ ＦＢＳを加えたＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４１０９０）中で培養した。
ｐｍｉｒＧＬＯ－ＬＰＡデュアルルシフェラーゼレポータープラスミドを安定して過剰発現するＨｅｐＧ２細胞（以下参照）を３７℃、５％ ＣＯ２および９５％ ＲＨで増殖させ、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１１４００３５）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１０％ ＦＢＳおよび６００μｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（商標）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０１３１０３５）を加えたＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４１０９０）中で培養した。
ヒトＬＰＡ ｃＤＮＡコンストラクトを安定して過剰発現するＨｅｐＧ２細胞（Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（１９９３年）９０（２４）：１１６４３～７頁）を、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％ ＲＨで増殖させ、１０％ ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＢＥ１２－７１９Ｆ）中で培養した。
初代ヒト（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号Ｍ００９９５－Ｐ）およびカニクイザル（Ｐｒｉｍａｃｙｔ、カタログ番号ＣＨＣＰ－Ｉ－Ｔ）肝細胞を以下のとおり培養した：播種および解凍キット（Ｐｒｉｍａｃｙｔ、カタログ番号ＰＴＫ－１）を使用して、凍結保存細胞を解凍し、播種し、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％ ＲＨでインキュベートした。播種の６時間後、培地を１％ ＦＢＳを加えた維持培地（ＫａＬｙ－Ｃｅｌｌ、カタログ番号ＫＬＣ－ＭＭ）に変えた。
Ｓｅｇｌｅｎ， Ｐ．Ｏ．（１９７６年）：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｃｅｌｌｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３：２９～８３頁から適応させたプロトコルに基づく実験の前に、雌のアポ（ａ）トランスジェニックマウスの初代肝細胞（以下参照）を新たに単離した。単離した肝細胞の播種は、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％ ＲＨで２ｍＭのグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号２５０３０）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン・ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１５１４０）、１μｇ／ｍｌのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ１７５６）、１×ＩＴＳ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号４１４００）、および５％ ＦＢＳを加えたウィリアムＥ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号２２５５１）中で３～５時間行った。播種後、培地を１％ ＦＢＳの添加以外は播種培地と同一の培養培地に変えた。４８または７２時間のインキュベーション期間中、さらなる培地変更は行わなかった。
ｐｍｉｒＧＬＯデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ
ｓｉＲＮＡスクリーニングのために、完全長ヒトＬＰＡ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００５５７７．２）を、ホタルルシフェラーゼ／ＬＰＡ融合ｍＲＮＡを生成する市販のデュアルルシフェラーゼレポーターベースのｐｍｉｒＧＬＯスクリーニングプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１３３０）のマルチクローニング部位にサブクローニングした。一過性のプラスミドトランスフェクションのために、ｐｍｉｒＧＬＯ－ＬＰＡプラスミド４５μｇを、Ｔ２２５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、カタログ番号３５３１３８）中の１８ ｍｉｏ． Ｈｅｐ３Ｂ細胞にＦｕＧｅｎｅ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ファストフォワード（ｆａｓｔ－ｆｏｒｗａｒｄ）設定で１８時間トランスフェクションした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１３７７８１５０）を使用した３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－Ｂｉｏ ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）、カタログ番号７８１０９８）の各ウェル当たり５０００のプラスミドを予めトランスフェクションされたＨｅｐ３Ｂ細胞の１ｎＭおよび１０ｎＭのｓｉＲＮＡトランスフェクションをリバース設定で次の日に行い、細胞を４８時間インキュベートした。Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２９４０）を使用して、ｐｍｉｒＧＬＯプラスミドによってコードされる構成的に発現するウミシイタケルシフェラーゼのレベルに対して正規化されたホタルルシフェラーゼレベルを測定することによって、遺伝子ノックダウンを判断した。
ＩＣ５０測定
安定したＨｅｐＧ２細胞クローンにおけるｐｍｉｒＧＬＯ－ＬＰＡレポータープラスミドを用いたＩＣ５０実験のために、８０～９０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞およびＦｕＧｅｎｅ ＨＤトランスフェクション試薬を３．５：１の比（μｌ単位のＦｕＧｅｎｅ ＨＤ対μｇ単位のプラスミド）で使用して、コラーゲン－Ｉコーティング６ウェルプレート（ＢＤ、カタログ番号３５６４００）の各ウェル当たり２μｇのＣｌａ－Ｉ線状ｐｍｉｒＧＬＯ－ＬＰＡプラスミドをトランスフェクションした。ポリクローナル細胞を、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を培養培地に添加することによってコラーゲン－ＩコーティングＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５６４８５）中で増殖させ、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ生細胞イメージングシステム（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を使用してコラーゲン－Ｉコーティング３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４６６４）において単一細胞クローニングした。ＬＰＡ発現レベル（以下参照）ならびに相対的なホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ存在量に関してｑＰＣＲ分析によって単一細胞クローンを特徴づけた。
トランスフェクション試薬を用いたＩＣ５０測定のために、９６ウェルプレート中のコラーゲン－ＩコーティングヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における３０，０００の初代トランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞に、８倍希釈段階を使用して２５ｎＭから開始する０．１ｐＭまでの７つの濃度の示したＬＰＡ ｓｉＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを用いてファストフォワード設定で７２時間トランスフェクションした。各ｓｉＲＮＡに関する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＳＡＳ９．４ソフトウェアにおいて開発された反復適合手順を使用した非線形回帰によって求めた。ＲａｔｋｏｖｓｋｙおよびＲｅｅｄｙ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ（１９８６年）４２（３）：５７５～８２頁）による４パラメーターロジスティックモデルを使用して結果を得た。ＳＡＳソフトウェアにおいてＬｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを使用した非線形回帰によって補正を得た。
安定したＨｅｐＧ２－ｐｍｉｒＧＬＯ－ＬＰＡ細胞クローンを使用したＩＣ５０値を以下のとおり生成した：コラーゲン－Ｉコーティング３８４ウェルプレートの各ウェル当たり５０００細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸおよびＬＰＡ ｓｉＲＮＡ試薬を用いて４８時間、４倍希釈段階を使用して４０ｎＭ～０．６ｐＭの範囲の９つの濃度でリバーストランスフェクションした。
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＨｅｐＧ２－ＬＰＡおよびＨｕＨ－７細胞におけるノックダウン実験のために、それぞれコラーゲン－Ｉコーティング９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｂｉｏｃｏａｔ（商標）、カタログ番号３５６４０７）および非コーティング９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）、カタログ番号６５５１８０）に１７，０００および２５，０００細胞／ウェルを使用した。初代ヒト、カニクイザル、およびトランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞におけるノックダウン実験のために、コラーゲン－Ｉコーティング９６ウェルプレートに４０，０００～５０，０００細胞／ウェルを使用した。細胞に、リバース（ＨｅｐＧ２－ＬＰＡ）またはファストフォワード（初代肝細胞）トランスフェクション設定において製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を０．２μＬ／ウェル使用して１または１０ｎＭのＬＰＡ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、培地を変えずに４８～７２ｈインキュベートした。通常、試験サンプル毎にＮ＝４の技術的反復を行った。
ｍＲＮＡ発現分析
ｓｉＲＮＡトランスフェクションまたは自然なｓｉＲＮＡ取り込みの４８または７２時間後、細胞のＲＮＡを、手順中のＤＮアーゼステップを含む、製造業者のプロトコルに従ってＰｒｏｍｅｇａのＳＶ９６ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ｚ３５００）の使用によって回収した。
ｃＤＮＡ合成のために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（カタログ番号Ｎ８０８０２３４）を使用した。１２μＬの総体積で１０×ＲＴバッファー１．２μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）２．６４μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）２．４μＬ、ランダムヘキサマー（５０μＭ）０．６μＬ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１６（配列番号１６３１）（５０μＭ）０．６μＬ、ＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ／μＬ）０．２４μＬおよびＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ（商標）（５０Ｕ／μＬ）０．３μＬを使用して、ｃＤＮＡをＲＮＡ３０ｎｇから合成した。サンプルを、２５℃で１０分間および４２℃で６０分間インキュベートした。９５℃に５分間加熱することによって反応を停止させた。
ヒトおよびカニクイザルＬＰＡ ｍＲＮＡレベルを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号４３０５７１９）および以下のＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイを使用したｑＰＣＲによって定量した：
Figure 2023545502000064
ＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００システムにより以下のＰＣＲ条件下で２回の技術的反復で実施した：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル。一反応において標的遺伝子および並行反応において正規化のためのハウスキーピング遺伝子（ヒト／カニクイザルＲＰＬ３７Ａ）を検出するシンプレックスＰＣＲとしてＰＣＲを設定した。ＰＣＲ反応の最終体積は、１×ＰＣＲマスターミックス中の１２．５μＬであり；ＲＰＬ３７Ａプライマーを５０ｎＭの最終濃度で使用し、プローブを２００ｎＭの最終濃度で使用した。標的転写物の相対発現量を計算するためにΔΔＣｔ法を利用した。標的遺伝子発現のパーセンテージを、ＬＶ２またはＬＶ３非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照配列のレベルに基づく正規化によって計算した。
細胞傷害性測定
９６ウェル当たり２０，０００のＨｅｐＧ２－ＬＰＡ細胞の培養物の５ｎＭおよび５０ｎＭのｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に、各サンプル中の細胞生存率／毒性の比を求めることによって細胞傷害性を測定した。細胞生存率を、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）を使用した細胞内ＡＴＰ含有量の決定によって測定した。細胞毒性を、製造業者のプロトコルに従ってＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＬＴ０７－２１７）を使用して上清において測定した。ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｈｓ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号ＳＩ０４３８１０４８）、２５μＭのケトコナゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号４２０６００）および１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ９２８４）を陽性対照として使用した。
結果
図１Ａおよび１Ｂに示されるとおり、ｐｍｉｒＧＬＯ－ＬＰＡプラスミドを用いたＨｅｐ３Ｂ細胞の一過性トランスフェクションに続く、前記Ｈｅｐ３Ｂ細胞を用いた１または１０ｎＭのＬＰＡ ｓｉＲＮＡライブラリーのトランスフェクションは、Ｒ２＝０．７８（１ｎＭのＬＰＡ ｓｉＲＮＡ）およびＲ２＝０．７４（１０ｎＭのＬＰＡ ｓｉＲＮＡ）の相関係数で非常に相関性があった。図１Ａおよび１Ｂはまた、極めて強力なＬＰＡ ｓｉＲＮＡ試薬の特定を示す。ＬＰＡ ｓｉＲＮＡ配列の小さな割合のみが、＞７５％（１ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度）および＞８５％（１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度）のノックダウン活性を示した。ヒトＬＰＡ ｍＲＮＡ配列内の単一の１００％一致する部位のみを有する３４個の活性ＬＰＡ ｓｉＲＮＡ試薬を、インビトロアッセイを使用したさらなる特徴づけのために選択した。
２つの独立した実験からの３４個の選択されたＬＰＡ ｓｉＲＮＡのＩＣ５０およびＩｍａｘ値を表５に示す。
Figure 2023545502000065
３４個の選択されたｓｉＲＮＡを、ヒトＬＰＡ ｃＤＮＡコンストラクトを安定して過剰発現するＨｅｐＧ２－ＬＰＡ細胞におけるＬＰＡ ｍＲＮＡノックダウン活性に関してさらに評価した（図２Ａ）。ｃＤＮＡクローンは、ヒトＬＰＡ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００５５７７．２）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の最後の１９６ヌクレオチドがないため、この細胞株はｍＲＮＡノックダウン活性に関するすべてのＬＰＡ ｓｉＲＮＡの特徴づけには適していないと確認された（Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（１９９３年）９０（２４）：１１６４３～７頁）。したがって、３４個のＬＰＡ ｓｉＲＮＡ試薬を、初代トランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞（図２Ｂ）および初代カニクイザル肝細胞（図２Ｃ）におけるＬＰＡ ｍＲＮＡノックダウン活性に関してさらに調査した。
３４個の選択されたＬＰＡ ｓｉＲＮＡの特異度を、アポ（ａ）の最も近いタンパク質コードオルソログである、ヒトプラスミノーゲンのｍＲＮＡ発現レベルを抑制する能力を評価することによって評価した。ＬＰＡ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションされたヒトＨｕＨ－７細胞株（図３Ａ）ならびに初代ヒト（図３Ｂ）およびカニクイザル（図３Ｃ）肝細胞におけるＰＬＧ ｍＲＮＡレベルを求めた。
次に、３４個の選択されたＬＰＡ ｓｉＲＮＡをＨｅｐＧ２－ＬＰＡ過剰発現細胞にトランスフェクションし、同じ細胞培養ウェルの細胞生存率（細胞内ＡＴＰ含有量）および毒性（細胞外アデニル酸キナーゼレベル）を測定することによってオフターゲット効果に関してアッセイした（図４）。
その後、安定したＨｅｐＧ２細胞クローンにおいて両ｐｍｉｒＧＬＯ－ＬＰＡ実験でＩＣ５０＞１ｎＭまたはＩｍａｘ＜９０％を有するあまり強力でないｓｉＲＮＡ（表５を参照）を除去した。全部で１７個のＬＰＡ ｓｉＲＮＡを、初代トランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞におけるさらなるＩＣ５０実験のために選択した。ＩＣ５０およびＩｍａｘ値を表６に列挙する。
まとめると、これらの結果は、ヒト細胞におけるヒトおよびカニクイザルＬＰＡ ｍＲＮＡ発現の強力で特異的な阻害が可能なｓｉＲＮＡが特定されたことを強調する。
Figure 2023545502000066
ヒトおよびカニクイザルＬＰＡ発現の阻害に関して活性なＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡの特定
方法
非標的化対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴ対照）を含む、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを、ＷＯ２０１９／１７０７３１に記載されるとおり、示された配列に基づいて生成した（上の配列表を参照）。
細胞および組織培養
ヒト（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号Ｍ００９９５－Ｐ）およびカニクイザル（Ｐｒｉｍａｃｙｔ、カタログ番号ＣＨＣＰ－Ｉ－Ｔ）初代肝細胞を、実施例２において上で記載したとおりに培養した。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者の説明書に従ってヘパリンナトリウムでコーティングされたＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）チューブ（ＢＤ、カタログ番号３６２７８０）中に採取した健康な３人のドナーからの血液およそ１６ｍｌから単離した。
ヒトアポ（ａ）トランスジェニックマウスモデル
以下の実験に使用した雌マウスは、完全長ヒトＬＰＡ遺伝子を含むＹＡＣゲノム遺伝子座を保有していた［Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １９９５年９（４）：４２４～３１頁］。トランスジェニックモデル、系統ＦＶＢ／Ｎ－Ｔｇ（ＬＰＡ、ＬＰＡＬ２、ＰＬＧ）１Ｈｇｃ／Ｍｍｍｈは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＵＳＡからライセンス導入した。
アッセイ
ｍＲＮＡ発現分析を、実施例２において上で記載したとおりに実施した。
自然な取り込み条件下における初代ヒト、カニクイザルおよびトランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞のＩＣ５０測定のため、コラーゲン－Ｉコーティング９６ウェルプレートの７０，０００（ヒトおよびカニクイザル）または３０，０００（トランスジェニックアポ（ａ）マウス）細胞を、培地を変えずに、１０倍希釈段階を使用して１０μＭ～０．０１ｎＭ（ヒトおよびカニクイザル）または１μＭ～０．００１μＭ（トランスジェニックアポ（ａ）マウス）の範囲の濃度のｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートとともに７２時間インキュベートした。
細胞傷害性および細胞生存率を、実施例２において上で記載したとおりに測定した。
マウス血清中におけるｓｉＲＮＡの安定性
修飾ｓｉＲＮＡを、５０％マウス血清中でヌクレアーゼ安定性に関して試験した。１×ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０－０９４）中の２．５μＭのｓｉＲＮＡ １６０μｌおよびマウス血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ５９０５）１６０μｌを、３７℃で最大１６８ｈインキュベートした。各時点（０ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈおよび１６８ｈ）において、反応の２０μｌを採取し、停止液（Ｔｉｓｓｕｅ ＆ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号ＭＴＣ０９６Ｈ）、プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ２３０８）、水）で６５℃において３０分間クエンチした。Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅおよび２４８７ Ｄｕａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ＤｅｔｅｃｔｏｒにおけるＨＰＬＣ分析に先立って、ＲＮアーゼフリー水を各サンプルに添加した。その溶液を、ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００分析カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号０６３０００）を使用したＨＰＬＣによって分析した。
Figure 2023545502000067
ｓｉＲＮＡの両鎖に関する血清半減期を推定した。
アポ（ａ）ＥＬＩＳＡアッセイ
示された濃度のＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートで処理した初代トランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞の予め１：４希釈した上清の１００μｌを、供給業者のマニュアルに従ったＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＳＴＡ－３５９）によるアポ（ａ）タンパク質測定のために使用した。ＯＤ４５０測定を、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏ機器およびＴＥＣＡＮのＭａｇｅｌｌａｎソフトウェアモジュールを用いて行った。アポ（ａ）タンパク質発現のパーセンテージを、ＬＶ２非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照配列の平均レベルに基づく正規化によって計算した。
トランスジェニックアポ（ａ）マウス血清サンプルのアポ（ａ）測定のために、以下のとおり血液を抜いた：最大３０μｌの血清の生成のために、ＳａｒｓｔｅｄｔのＭｉｎｉｖｅｔｔｅ（登録商標）およびＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）（カタログ番号１７．２１１１．０５０および２０．１２８０）を使用して伏在静脈から血液を採取した。最大１００μｌの血清の生成のために、マイクロピペット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＢＲ７０９１０９）およびＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号２０．１２９１）を使用して後眼窩の血液を採取した。４℃、３５００×ｇでの１０分間の遠心分離に先立って、サンプルの凝固を室温で３０分間行った。アポ（ａ）ＥＬＩＳＡ測定のために血清サンプルを１：５，０００～１：２０，０００希釈した。
ＰＬＧ ＥＬＩＳＡアッセイ
示された濃度のＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートで処理した初代ヒト肝細胞の予め１：４希釈した上清の１００μｌを、供給業者のマニュアルに従ったＡｂｎｏｖａのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＫＡ３８９７）によるプラスミノーゲンタンパク質測定のために使用した。ＯＤ４５０測定を、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏ機器およびＴＥＣＡＮのＭａｇｅｌｌａｎソフトウェアモジュールを用いて行った。ＰＬＧタンパク質発現のパーセンテージを、ＬＶ２非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照配列の平均レベルに基づく正規化によって計算した。
ＩＦＮα測定
細胞培養上清２５μｌを使用し、供給業者のプロトコルに従ってＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの電気化学発光Ｕ－ＰＬＥＸアッセイ技術（カタログ番号Ｋ１５１ＶＨＫ）を利用することによって、ヒトＰＢＭＣの上清中のヒトＩＦＮα２ａおよび７つの他のサイトカインのタンパク質濃度を定量した。
ＲＮＡ－Ｓｅｑオフターゲット分析
ＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの可能性のあるオフターゲット活性に関して試験するために、初代ヒト肝細胞を使用することによってＲＮＡ－Ｓｅｑ分析を行った。このために、コラーゲン－Ｉコーティング２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４４０８）の各ウェル当たり、それぞれＮ＝２の技術的反復で２人の異なるドナーからの４００，０００の初代ヒト肝細胞を播いた。培地を変えずに、５μＭのＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートと一緒にインキュベーションを７２時間行った。各ウェル当たりＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９２１６）３５０μｌおよび－８０℃で１回の凍結融解サイクルを用いて細胞溶解を行った。＜２００ヌクレオチドの小分子ＲＮＡを含む全ＲＮＡの単離を、製造業者のプロトコルに従って任意のオンカラムＤＮアーゼ消化工程（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９２５４）を含むｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１７００４）を使用して行った。Ａｇｉｌｅｎｔの２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｎａｎｏアッセイ（カタログ番号５０６７－１５１１）を利用することによってＲＮＡサンプルの完全性を調べた。ＲＮＡ－ＳｅｑプロファイリングのためにＲＩＮ値＞８を有するＲＮＡサンプルが含まれた。
ＲＮＡサンプル４００ｎｇを、その後、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ＬＴ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐキット（ｗｉｔｈ Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ Ｇｏｌｄ）（カタログ番号ＲＳ－１２２－２３０１およびＲＳ－１２２－２３０２）を使用してＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーに変換した。得られたライブラリーを、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００／５５０ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ ｖ２キット（カタログ番号ＦＣ－４０４－２００２）を使用して各ライブラリー当たり約４５百万リードでＮｅｘｔＳｅｑ ５００機器におけるペアエンドシーケンス（２×７５ｂｐ）によって配列決定した。
ＲＮＡ－Ｓｅｑデータ分析パイプラインは、Ａｒｒａｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ｑｉａｇｅｎ）に基づく。簡単にいえば、未処理データＱＣを実施した後、フィルタリング工程を利用して、ｒＲＮＡと対応するリードならびに低い品質スコアを有するリードを除去した。ＯＳＡ４（Ｈｕら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１２年）２８（１４）：１９３３～４頁）（Ｏｍｉｃｓｏｆｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｅｒ、バージョン４）を使用してマッピングおよび定量を実施した。マッピングのために参照ヒトゲノムＢ３８を使用し、遺伝子または転写物をＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子モデルに基づいて定量した。ＤＥＳｅｑ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／３．２／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ＤＥＳｅｑ２．ｈｔｍｌ）およびＶｏｏｍ（Ｌａｗら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４年）１５：Ｒ２９）を用いて差次的に発現される転写物を特定した。可変多重度を考慮し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）補正（ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ、Ｊ Ｒｏｙ Ｓｔａｔｉｓｔ Ｓｏｃ．（１９９５年）Ｂ５７：２８９～３００頁）により偽発見率（ＦＤＲ）調整済みｐ値を計算した。
結果
実施例２に記載されているとおり強力なＬＰＡ ｓｉＲＮＡの特定後、本発明者らは、選択した分子がインビボにおける肝臓特異的なｓｉＲＮＡ送達に適したＧａｌＮＡｃコンジュゲートの文脈において活性を保持するかを実証することに着手した。本発明者らは、この活性が前臨床種であるカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）のさらなる肝細胞において持続するかどうかも評価した。このために、１７個の選択されたＬＰＡ ｓｉＲＮＡは、表３に示されるとおりそれぞれのｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端にある３個の連続した修飾ＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドとコンジュゲートされた。
初代ヒトおよびトランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞における自然な取り込み実験によるＩＣ５０測定の結果（表７）は、トランスフェクション条件の非存在下での両細胞種における強力なＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの特定を実証する。
興味深いことに、上記と同じだが、初代カニクイザル肝細胞を使用したＩＣ５０実験（表７）は、カニクイザルＬＰＡ ｍＲＮＡ配列に対するＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡのミスマッチの存在が、保持されるｓｉＲＮＡノックダウン活性に対してさまざまな影響を与えることを示している。したがって、カニクイザル種に対してミスマッチがあるヒトＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの活性は、それ自体は予測できなかったが、配列コンテキストに依存し、実験的に試験される必要がある。
Figure 2023545502000068
１７個の選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの特異度を、自然な取り込み条件下で初代ヒト肝細胞においてヒトプラスミノーゲンのｍＲＮＡ発現レベルを抑制する能力のＩＣ５０ベースの試験によって評価した。表８に示されるとおり、プラスミノーゲンｍＲＮＡ低減に対して明らかに効果があるいくつかの配列を特定した。タンパク質レベルに対する効果を確認するために、同じヒト肝細胞実験の３つのｓｉＲＮＡ濃度の細胞培養上清をプラスミノーゲンＥＬＩＳＡ読み出しに使用した（図５）。
Figure 2023545502000069
次に、潜在的に毒性のＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを除外するために、ＨｅｐＧ２－ＬＰＡ過剰発現細胞において細胞傷害アッセイを実施した（図６）。
１７個の選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡに対する自然免疫応答を、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションに応じて、健康な３人の異なるドナーから単離したヒト初代ＰＭＢＣから分泌されたインターフェロンα２ａの産生を調べることによってインビトロでヒト細胞において測定した。いかなる試験ＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡに関してもヒトＰＢＭＣにおける免疫刺激のサインは確認されなかった（図７）。
ＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを、５０％マウス血清中におけるインビトロでのヌクレアーゼ安定性に関しても、相対的安定性および半減期を求めることによって試験した（表９）。半減期は、約２４から約９６時間の間の範囲であった。
Figure 2023545502000070
最後に、１７個の選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを、マウスの肝臓組織からヒトアポ（ａ）タンパク質を分泌するトランスジェニックマウスモデルにおいてインビボで試験した（図８）。単回５ｍｇ／ｋｇ用量の選択した化合物の皮下投与後、標的タンパク質レベルが、ＰＢＳビヒクル対照で処置した動物と比較して６８％から９６％（ＫＤｍａｘ）の間で低下した。化合物により、処置後約７日目から約２５日目の間にレベルが、最大ノックダウンの５０％（ＫＤ５０）に戻った。
カニクイザル肝細胞において異種間活性が保持される、インビトロおよびインビボにおける高いオンターゲット活性を含み、ヒト肝細胞におけるプラスミノーゲンに対するオフターゲット活性を含まない３つのＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを選択した。ｓｉＬＰＡ＃０３０７、ｓｉＬＰＡ＃０３１１およびｓｉＬＰＡ＃０３１４の全体の特異度を、５μＭのＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡで７２時間処理した２人の異なるドナーの初代ヒト肝細胞を使用したＲＮＡ－Ｓｅｑ全トランスクリプトーム分析によって試験した。図９に示されるとおり、３つの選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの特異度を確認し、ＬＰＡが３つの分析のすべてで最もダウンレギュレートされた転写物であった。
要約すると、本発明者らは、関連するインビトロおよびインビボモデルにおいてヒトＬＰＡ ｍＲＮＡおよび翻訳されるアポ（ａ）タンパク質の発現を強力に低下させる強力で特異的な非免疫原性のＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの特定に成功したことを証明した。
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＰＡ ｓｉＲＮＡ配列のリード最適化
実施例３の結果に基づいて、選択されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの３つの親配列（ｓｉＬＰＡ＃０３０７、ｓｉＬＰＡ＃０３１１、およびｓｉＬＰＡ＃０３１４）を、各ｓｉＲＮＡ配列当たり６６個の異なる化学修飾を含む最適化作戦に使用した。得られた配列および修飾パターンを表４に示す。すべての実験は、上の実施例２および３に記載されているとおりに行った。
これらの最適化ライブラリーのインビトロ活性を、０．２ｎＭ、１ｎＭ、および５ｎＭの濃度のＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを使用して自然な取り込み条件下で新たに単離された雌のアポ（ａ）トランスジェニックマウスの初代肝細胞において試験した。図１０に示されるとおり、選択された配列ｓｉＬＰＡ＃０３０７およびｓｉＬＰＡ＃０３１１に基づく最適化ライブラリーは、リード配列ｓｉＬＰＡ＃０３１４と比較して高い全体的なインビトロ活性を示すことが確認された。
最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの向上した安定性機能を評価するために、最適化ライブラリーを５０％マウス血清中においてインビトロ半減期に関してアッセイした。表１０に示されるとおり、それぞれの親分子と比較して向上したヌクレアーゼ安定性を有する多くの修飾を特定した。
Figure 2023545502000071
Figure 2023545502000072
次に、３つの異なる親配列に基づいて１９８のうち全部で４１個の最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを、アポ（ａ）トランスジェニックマウスにおけるインビボ薬理学試験のために選択し、それぞれの親分子ｓｉＬＰＡ＃０３０７、ｓｉＬＰＡ＃０３１１およびｓｉＬＰＡ＃０３１４と比較した（図１１Ａ～Ｃ）。単回３ｍｇ／ｋｇ用量の選択された化合物の皮下投与後、標的タンパク質レベルは、ＰＢＳビヒクル対照で処置した動物と比較して５６％から９９％（ＫＤｍａｘ）の間で低下した。化合物により、処置後約８日目から約４２日目の間にレベルが最大ノックダウンの５０％（ＫＤ５０）に戻った。それぞれの親配列と比較した場合に、向上したインビボにおける薬理学プロファイル（ＫＤｍａｘおよびＫＤ５０）を有する多くの最適化された分子を特定した。
高度な最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの選択に向けて、さらなるインビトロ実験を行った。読み出しとして上清へのＩＦＮα２ａ分泌を使用してヒトＰＢＭＣアッセイにおいて免疫刺激の可能性を判断した（図１２）。いかなる試験ＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡに関してもヒトＰＢＭＣにおける免疫刺激のサインは確認されなかった。
４１個の選択された最適化ＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの異種間活性を、初代カニクイザル肝細胞において評価した（図１３）。興味深いことに、すべての試験配列修飾がマカク／カニクイザルｍＲＮＡに対して１個のミスマッチを共有するが、保持されるノックダウン能力は化合物間で大きく異なる。
４１個の選択された最適化ＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの相対的特異度に関して試験するために、自然な取り込み条件下で初代ヒト肝細胞を使用してヒトプラスミノーゲンのｍＲＮＡ発現レベルに対する効果を判断した（図１４）。ＰＬＧ発現レベルに対して弱い効果を有するほんの少数の分子を特定した。
最後に、いくつかの高度な最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬＰＡ＃０３１７、ｓｉＬＰＡ＃０３９３、ｓｉＬＰＡ＃０３９４、ｓｉＬＰＡ＃０４１１、ｓｉＬＰＡ＃０４１４、およびｓｉＬＰＡ＃０４５５）を、初代トランスジェニックアポ（ａ）マウス肝細胞を使用した自然な取り込み条件下でのＩＣ５０実験においてアッセイした（表１１）。
Figure 2023545502000073
まとめると、本発明者らは、著しく向上したインビトロおよびインビボにおける薬理学プロファイルを示す最適化されたＬＰＡ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの特定に成功したことを証明するデータを提示した。
ＬＰＡ配列
ヒトＬＰＡ ｍＲＮＡ配列 － ＮＭ００５７７．２。（配列番号１６３２）
1 aggtaccttt ggggctggct ttctcaagga agcccagctc cctgtgattg agaatgaagt
61 gtgcaatcgc tatgactggg attgggacac actttctggg cactgctggc cagtcccaaa
121 atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagc agcacctgag
181 caaagccatg tggtccagga ttgctaccat ggtgatggac agagttatcg aggcacgtac
241 tccaccactg tcacaggaag gacctgccaa gcttggtcat ctatgacacc acatcaacat
301 aataggacca cagaaaacta cccaaatgct ggcttgatca tgaactactg caggaatcca
361 gatgctgtgg cagctcctta ttgttatacg agggatcccg gtgtcaggtg ggagtactgc
421 aacctgacgc aatgctcaga cgcagaaggg actgccgtcg cgcctccgac tgttaccccg
481 gttccaagcc tagaggctcc ttccgaacaa gcaccgactg agcaaaggcc tggggtgcag
541 gagtgctacc atggtaatgg acagagttat cgaggcacat actccaccac tgtcacagga
601 agaacctgcc aagcttggtc atctatgaca ccacactcgc atagtcggac cccagaatac
661 tacccaaatg ctggcttgat catgaactac tgcaggaatc cagatgctgt ggcagctcct
721 tattgttata cgagggatcc cggtgtcagg tgggagtact gcaacctgac gcaatgctca
781 gacgcagaag ggactgccgt cgcgcctccg actgttaccc cggttccaag cctagaggct
841 ccttccgaac aagcaccgac tgagcaaagg cctggggtgc aggagtgcta ccatggtaat
901 ggacagagtt atcgaggcac atactccacc actgtcacag gaagaacctg ccaagcttgg
961 tcatctatga caccacactc gcatagtcgg accccagaat actacccaaa tgctggcttg
1021 atcatgaact actgcaggaa tccagatgct gtggcagctc cttattgtta tacgagggat
1081 cccggtgtca ggtgggagta ctgcaacctg acgcaatgct cagacgcaga agggactgcc
1141 gtcgcgcctc cgactgttac cccggttcca agcctagagg ctccttccga acaagcaccg
1201 actgagcaga ggcctggggt gcaggagtgc taccacggta atggacagag ttatcgaggc
1261 acatactcca ccactgtcac tggaagaacc tgccaagctt ggtcatctat gacaccacac
1321 tcgcatagtc ggaccccaga atactaccca aatgctggct tgatcatgaa ctactgcagg
1381 aatccagatg ctgtggcagc tccttattgt tatacgaggg atcccggtgt caggtgggag
1441 tactgcaacc tgacgcaatg ctcagacgca gaagggactg ccgtcgcgcc tccgactgtt
1501 accccggttc caagcctaga ggctccttcc gaacaagcac cgactgagca aaggcctggg
1561 gtgcaggagt gctaccatgg taatggacag agttatcgag gcacatactc caccactgtc
1621 acaggaagaa cctgccaagc ttggtcatct atgacaccac actcgcatag tcggacccca
1681 gaatactacc caaatgctgg cttgatcatg aactactgca ggaatccaga tgctgtggca
1741 gctccttatt gttatacgag ggatcccggt gtcaggtggg agtactgcaa cctgacgcaa
1801 tgctcagacg cagaagggac tgccgtcgcg cctccgactg ttaccccggt tccaagccta
1861 gaggctcctt ccgaacaagc accgactgag caaaggcctg gggtgcagga gtgctaccat
1921 ggtaatggac agagttatcg aggcacatac tccaccactg tcacaggaag aacctgccaa
1981 gcttggtcat ctatgacacc acactcgcat agtcggaccc cagaatacta cccaaatgct
2041 ggcttgatca tgaactactg caggaatcca gatgctgtgg cagctcctta ttgttatacg
2101 agggatcccg gtgtcaggtg ggagtactgc aacctgacgc aatgctcaga cgcagaaggg
2161 actgccgtcg cgcctccgac tgttaccccg gttccaagcc tagaggctcc ttccgaacaa
2221 gcaccgactg agcaaaggcc tggggtgcag gagtgctacc atggtaatgg acagagttat
2281 cgaggcacat actccaccac tgtcacagga agaacctgcc aagcttggtc atctatgaca
2341 ccacactcgc atagtcggac cccagaatac tacccaaatg ctggcttgat catgaactac
2401 tgcaggaatc cagatgctgt ggcagctcct tattgttata cgagggatcc cggtgtcagg
2461 tgggagtact gcaacctgac gcaatgctca gacgcagaag ggactgccgt cgcgcctccg
2521 actgttaccc cggttccaag cctagaggct ccttccgaac aagcaccgac tgagcagagg
2581 cctggggtgc aggagtgcta ccacggtaat ggacagagtt atcgaggcac atactccacc
2641 actgtcactg gaagaacctg ccaagcttgg tcatctatga caccacactc gcatagtcgg
2701 accccagaat actacccaaa tgctggcttg atcatgaact actgcaggaa tccagatcct
2761 gtggcagccc cttattgtta tacgagggat cccagtgtca ggtgggagta ctgcaacctg
2821 acacaatgct cagacgcaga agggactgcc gtcgcgcctc caactattac cccgattcca
2881 agcctagagg ctccttctga acaagcacca actgagcaaa ggcctggggt gcaggagtgc
2941 taccacggaa atggacagag ttatcaaggc acatacttca ttactgtcac aggaagaacc
3001 tgccaagctt ggtcatctat gacaccacac tcgcatagtc ggaccccagc atactaccca
3061 aatgctggct tgatcaagaa ctactgccga aatccagatc ctgtggcagc cccttggtgt
3121 tatacaacag atcccagtgt caggtgggag tactgcaacc tgacacgatg ctcagatgca
3181 gaatggactg ccttcgtccc tccgaatgtt attctggctc caagcctaga ggcttttttt
3241 gaacaagcac tgactgagga aacccccggg gtacaggact gctactacca ttatggacag
3301 agttaccgag gcacatactc caccactgtc acaggaagaa cttgccaagc ttggtcatct
3361 atgacaccac accagcatag tcggacccca gaaaactacc caaatgctgg cctgaccagg
3421 aactactgca ggaatccaga tgctgagatt cgcccttggt gttacaccat ggatcccagt
3481 gtcaggtggg agtactgcaa cctgacacaa tgcctggtga cagaatcaag tgtccttgca
3541 actctcacgg tggtcccaga tccaagcaca gaggcttctt ctgaagaagc accaacggag
3601 caaagccccg gggtccagga ttgctaccat ggtgatggac agagttatcg aggctcattc
3661 tctaccactg tcacaggaag gacatgtcag tcttggtcct ctatgacacc acactggcat
3721 cagaggacaa cagaatatta tccaaatggt ggcctgacca ggaactactg caggaatcca
3781 gatgctgaga ttagtccttg gtgttatacc atggatccca atgtcagatg ggagtactgc
3841 aacctgacac aatgtccagt gacagaatca agtgtccttg cgacgtccac ggctgtttct
3901 gaacaagcac caacggagca aagccccaca gtccaggact gctaccatgg tgatggacag
3961 agttatcgag gctcattctc caccactgtt acaggaagga catgtcagtc ttggtcctct
4021 atgacaccac actggcatca gagaaccaca gaatactacc caaatggtgg cctgaccagg
4081 aactactgca ggaatccaga tgctgagatt cgcccttggt gttataccat ggatcccagt
4141 gtcagatggg agtactgcaa cctgacgcaa tgtccagtga tggaatcaac tctcctcaca
4201 actcccacgg tggtcccagt tccaagcaca gagcttcctt ctgaagaagc accaactgaa
4261 aacagcactg gggtccagga ctgctaccga ggtgatggac agagttatcg aggcacactc
4321 tccaccacta tcacaggaag aacatgtcag tcttggtcgt ctatgacacc acattggcat
4381 cggaggatcc cattatacta tccaaatgct ggcctgacca ggaactactg caggaatcca
4441 gatgctgaga ttcgcccttg gtgttacacc atggatccca gtgtcaggtg ggagtactgc
4501 aacctgacac gatgtccagt gacagaatcg agtgtcctca caactcccac agtggccccg
4561 gttccaagca cagaggctcc ttctgaacaa gcaccacctg agaaaagccc tgtggtccag
4621 gattgctacc atggtgatgg acggagttat cgaggcatat cctccaccac tgtcacagga
4681 aggacctgtc aatcttggtc atctatgata ccacactggc atcagaggac cccagaaaac
4741 tacccaaatg ctggcctgac cgagaactac tgcaggaatc cagattctgg gaaacaaccc
4801 tggtgttaca caaccgatcc gtgtgtgagg tgggagtact gcaatctgac acaatgctca
4861 gaaacagaat caggtgtcct agagactccc actgttgttc cagttccaag catggaggct
4921 cattctgaag cagcaccaac tgagcaaacc cctgtggtcc ggcagtgcta ccatggtaat
4981 ggccagagtt atcgaggcac attctccacc actgtcacag gaaggacatg tcaatcttgg
5041 tcatccatga caccacaccg gcatcagagg accccagaaa actacccaaa tgatggcctg
5101 acaatgaact actgcaggaa tccagatgcc gatacaggcc cttggtgttt taccatggac
5161 cccagcatca ggtgggagta ctgcaacctg acgcgatgct cagacacaga agggactgtg
5221 gtcgctcctc cgactgtcat ccaggttcca agcctagggc ctccttctga acaagactgt
5281 atgtttggga atgggaaagg ataccggggc aagaaggcaa ccactgttac tgggacgcca
5341 tgccaggaat gggctgccca ggagccccat agacacagca cgttcattcc agggacaaat
5401 aaatgggcag gtctggaaaa aaattactgc cgtaaccctg atggtgacat caatggtccc
5461 tggtgctaca caatgaatcc aagaaaactt tttgactact gtgatatccc tctctgtgca
5521 tcctcttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagcatt
5581 gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct cagaacaagg
5641 tttggaaagc acttctgtgg aggcacctta atatccccag agtgggtgct gactgctgct
5701 cactgcttga agaagtcctc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa
5761 gaagtgaacc tcgaatctca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc
5821 acacaagcag atattgcctt gctaaagcta agcaggcctg ccgtcatcac tgacaaagta
5881 atgccagctt gtctgccatc cccagactac atggtcaccg ccaggactga atgttacatc
5941 actggctggg gagaaaccca aggtaccttt gggactggcc ttctcaagga agcccagctc
6001 cttgttattg agaatgaagt gtgcaatcac tataagtata tttgtgctga gcatttggcc
6061 agaggcactg acagttgcca gggtgacagt ggagggcctc tggtttgctt cgagaaggac
6121 aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct
6181 ggtgtctatg ctcgtgtttc aaggtttgtt acttggattg agggaatgat gagaaataat
6241 taattggacg ggagacagag tgaagcatca acctacttag aagctgaaac gtgggtaagg
6301 atttagcatg ctggaaataa tagacagcaa tcaaacgaag acactgttcc cagctaccag
6361 ctatgccaaa ccttggcatt tttggtattt ttgtgtataa gcttttaagg tctgactgac
6421 aaattctgta ttaaggtgtc atagctatga catttgttaa aaataaactc tgcacttatt
6481 ttgatttga
ヒトＬＰＡ ｍＲＮＡ配列 － ＮＭ００５５７７．３（配列番号１６２７）
1 ctgggattgg gacacacttt ctgggcactg ctggccagtc ccaaaatgga acataaggaa
61 gtggttcttc tacttctttt atttctgaaa tcagcagcac ctgagcaaag ccatgtggtc
121 caggattgct accatggtga tggacagagt tatcgaggca cgtactccac cactgtcaca
181 ggaaggacct gccaagcttg gtcatctatg acaccacatc aacataatag gaccacagaa
241 aactacccaa atgctggctt gatcatgaac tactgcagga atccagatgc tgtggcagct
301 ccttattgtt atacgaggga tcccggtgtc aggtgggagt actgcaacct gacgcaatgc
361 tcagacgcag aagggactgc cgtcgcgcct ccgactgtta ccccggttcc aagcctagag
421 gctccttccg aacaagcacc gactgagcaa aggcctgggg tgcaggagtg ctaccatggt
481 aatggacaga gttatcgagg cacatactcc accactgtca caggaagaac ctgccaagct
541 tggtcatcta tgacaccaca ctcgcatagt cggaccccag aatactaccc aaatgctggc
601 ttgatcatga actactgcag gaatccagat gctgtggcag ctccttattg ttatacgagg
661 gatcccggtg tcaggtggga gtactgcaac ctgacgcaat gctcagacgc agaagggact
721 gccgtcgcgc ctccgactgt taccccggtt ccaagcctag aggctccttc cgaacaagca
781 ccgactgagc aaaggcctgg ggtgcaggag tgctaccatg gtaatggaca gagttatcga
841 ggcacatact ccaccactgt cacaggaaga acctgccaag cttggtcatc tatgacacca
901 cactcgcata gtcggacccc agaatactac ccaaatgctg gcttgatcat gaactactgc
961 aggaatccag atgctgtggc agctccttat tgttatacga gggatcccgg tgtcaggtgg
1021 gagtactgca acctgacgca atgctcagac gcagaaggga ctgccgtcgc gcctccgact
1081 gttaccccgg ttccaagcct agaggctcct tccgaacaag caccgactga gcagaggcct
1141 ggggtgcagg agtgctacca cggtaatgga cagagttatc gaggcacata ctccaccact
1201 gtcactggaa gaacctgcca agcttggtca tctatgacac cacactcgca tagtcggacc
1261 ccagaatact acccaaatgc tggcttgatc atgaactact gcaggaatcc agatgctgtg
1321 gcagctcctt attgttatac gagggatccc ggtgtcaggt gggagtactg caacctgacg
1381 caatgctcag acgcagaagg gactgccgtc gcgcctccga ctgttacccc ggttccaagc
1441 ctagaggctc cttccgaaca agcaccgact gagcaaaggc ctggggtgca ggagtgctac
1501 catggtaatg gacagagtta tcgaggcaca tactccacca ctgtcacagg aagaacctgc
1561 caagcttggt catctatgac accacactcg catagtcgga ccccagaata ctacccaaat
1621 gctggcttga tcatgaacta ctgcaggaat ccagatgctg tggcagctcc ttattgttat
1681 acgagggatc ccggtgtcag gtgggagtac tgcaacctga cgcaatgctc agacgcagaa
1741 gggactgccg tcgcgcctcc gactgttacc ccggttccaa gcctagaggc tccttccgaa
1801 caagcaccga ctgagcaaag gcctggggtg caggagtgct accatggtaa tggacagagt
1861 tatcgaggca catactccac cactgtcaca ggaagaacct gccaagcttg gtcatctatg
1921 acaccacact cgcatagtcg gaccccagaa tactacccaa atgctggctt gatcatgaac
1981 tactgcagga atccagatgc tgtggcagct ccttattgtt atacgaggga tcccggtgtc
2041 aggtgggagt actgcaacct gacgcaatgc tcagacgcag aagggactgc cgtcgcgcct
2101 ccgactgtta ccccggttcc aagcctagag gctccttccg aacaagcacc gactgagcaa
2161 aggcctgggg tgcaggagtg ctaccatggt aatggacaga gttatcgagg cacatactcc
2221 accactgtca caggaagaac ctgccaagct tggtcatcta tgacaccaca ctcgcatagt
2281 cggaccccag aatactaccc aaatgctggc ttgatcatga actactgcag gaatccagat
2341 gctgtggcag ctccttattg ttatacgagg gatcccggtg tcaggtggga gtactgcaac
2401 ctgacgcaat gctcagacgc agaagggact gccgtcgcgc ctccgactgt taccccggtt
2461 ccaagcctag aggctccttc cgaacaagca ccgactgagc agaggcctgg ggtgcaggag
2521 tgctaccacg gtaatggaca gagttatcga ggcacatact ccaccactgt cactggaaga
2581 acctgccaag cttggtcatc tatgacacca cactcgcata gtcggacccc agaatactac
2641 ccaaatgctg gcttgatcat gaactactgc aggaatccag atcctgtggc agccccttat
2701 tgttatacga gggatcccag tgtcaggtgg gagtactgca acctgacaca atgctcagac
2761 gcagaaggga ctgccgtcgc gcctccaact attaccccga ttccaagcct agaggctcct
2821 tctgaacaag caccaactga gcaaaggcct ggggtgcagg agtgctacca cggaaatgga
2881 cagagttatc aaggcacata cttcattact gtcacaggaa gaacctgcca agcttggtca
2941 tctatgacac cacactcgca tagtcggacc ccagcatact acccaaatgc tggcttgatc
3001 aagaactact gccgaaatcc agatcctgtg gcagcccctt ggtgttatac aacagatccc
3061 agtgtcaggt gggagtactg caacctgaca cgatgctcag atgcagaatg gactgccttc
3121 gtccctccga atgttattct ggctccaagc ctagaggctt tttttgaaca agcactgact
3181 gaggaaaccc ccggggtaca ggactgctac taccattatg gacagagtta ccgaggcaca
3241 tactccacca ctgtcacagg aagaacttgc caagcttggt catctatgac accacaccag
3301 catagtcgga ccccagaaaa ctacccaaat gctggcctga ccaggaacta ctgcaggaat
3361 ccagatgctg agattcgccc ttggtgttac accatggatc ccagtgtcag gtgggagtac
3421 tgcaacctga cacaatgcct ggtgacagaa tcaagtgtcc ttgcaactct cacggtggtc
3481 ccagatccaa gcacagaggc ttcttctgaa gaagcaccaa cggagcaaag ccccggggtc
3541 caggattgct accatggtga tggacagagt tatcgaggct cattctctac cactgtcaca
3601 ggaaggacat gtcagtcttg gtcctctatg acaccacact ggcatcagag gacaacagaa
3661 tattatccaa atggtggcct gaccaggaac tactgcagga atccagatgc tgagattagt
3721 ccttggtgtt ataccatgga tcccaatgtc agatgggagt actgcaacct gacacaatgt
3781 ccagtgacag aatcaagtgt ccttgcgacg tccacggctg tttctgaaca agcaccaacg
3841 gagcaaagcc ccacagtcca ggactgctac catggtgatg gacagagtta tcgaggctca
3901 ttctccacca ctgttacagg aaggacatgt cagtcttggt cctctatgac accacactgg
3961 catcagagaa ccacagaata ctacccaaat ggtggcctga ccaggaacta ctgcaggaat
4021 ccagatgctg agattcgccc ttggtgttat accatggatc ccagtgtcag atgggagtac
4081 tgcaacctga cgcaatgtcc agtgatggaa tcaactctcc tcacaactcc cacggtggtc
4141 ccagttccaa gcacagagct tccttctgaa gaagcaccaa ctgaaaacag cactggggtc
4201 caggactgct accgaggtga tggacagagt tatcgaggca cactctccac cactatcaca
4261 ggaagaacat gtcagtcttg gtcgtctatg acaccacatt ggcatcggag gatcccatta
4321 tactatccaa atgctggcct gaccaggaac tactgcagga atccagatgc tgagattcgc
4381 ccttggtgtt acaccatgga tcccagtgtc aggtgggagt actgcaacct gacacgatgt
4441 ccagtgacag aatcgagtgt cctcacaact cccacagtgg ccccggttcc aagcacagag
4501 gctccttctg aacaagcacc acctgagaaa agccctgtgg tccaggattg ctaccatggt
4561 gatggacgga gttatcgagg catatcctcc accactgtca caggaaggac ctgtcaatct
4621 tggtcatcta tgataccaca ctggcatcag aggaccccag aaaactaccc aaatgctggc
4681 ctgaccgaga actactgcag gaatccagat tctgggaaac aaccctggtg ttacacaacc
4741 gatccgtgtg tgaggtggga gtactgcaat ctgacacaat gctcagaaac agaatcaggt
4801 gtcctagaga ctcccactgt tgttccagtt ccaagcatgg aggctcattc tgaagcagca
4861 ccaactgagc aaacccctgt ggtccggcag tgctaccatg gtaatggcca gagttatcga
4921 ggcacattct ccaccactgt cacaggaagg acatgtcaat cttggtcatc catgacacca
4981 caccggcatc agaggacccc agaaaactac ccaaatgatg gcctgacaat gaactactgc
5041 aggaatccag atgccgatac aggcccttgg tgttttacca tggaccccag catcaggtgg
5101 gagtactgca acctgacgcg atgctcagac acagaaggga ctgtggtcgc tcctccgact
5161 gtcatccagg ttccaagcct agggcctcct tctgaacaag actgtatgtt tgggaatggg
5221 aaaggatacc ggggcaagaa ggcaaccact gttactggga cgccatgcca ggaatgggct
5281 gcccaggagc cccatagaca cagcacgttc attccaggga caaataaatg ggcaggtctg
5341 gaaaaaaatt actgccgtaa ccctgatggt gacatcaatg gtccctggtg ctacacaatg
5401 aatccaagaa aactttttga ctactgtgat atccctctct gtgcatcctc ttcatttgat
5461 tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa tgtcctggaa gcattgtagg ggggtgtgtg
5521 gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc agtctcagaa caaggtttgg aaagcacttc
5581 tgtggaggca ccttaatatc cccagagtgg gtgctgactg ctgctcactg cttgaagaag
5641 tcctcaaggc cttcatccta caaggtcatc ctgggtgcac accaagaagt gaacctcgaa
5701 tctcatgttc aggaaataga agtgtctagg ctgttcttgg agcccacaca agcagatatt
5761 gccttgctaa agctaagcag gcctgccgtc atcactgaca aagtaatgcc agcttgtctg
5821 ccatccccag actacatggt caccgccagg actgaatgtt acatcactgg ctggggagaa
5881 acccaaggta cctttgggac tggccttctc aaggaagccc agctccttgt tattgagaat
5941 gaagtgtgca atcactataa gtatatttgt gctgagcatt tggccagagg cactgacagt
6001 tgccagggtg acagtggagg gcctctggtt tgcttcgaga aggacaaata cattttacaa
6061 ggagtcactt cttggggtct tggctgtgca cgccccaata agcctggtgt ctatgctcgt
6121 gtttcaaggt ttgttacttg gattgaggga atgatgagaa ataattaatt ggacgggaga
6181 cagagtgaag catcaaccta cttagaagct gaaacgtggg taaggattta gcatgctgga
6241 aataatagac agcaatcaaa cgaagacact gttcccagct accagctatg ccaaaccttg
6301 gcatttttgg tatttttgtg tataagcttt taaggtctga ctgacaaatt ctgtattaag
6361 gtgtcatagc tatgacattt gttaaaaata aactctgcac ttattttgat ttga
ヒトＬＰＡポリペプチド配列（配列番号１６２８）
MEHKEVVLLLLLFLKSAAPEQSHVVQDCYHGDGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHNRTTENYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDPVAAPYCYTRDPSVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTITPIPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYQGTYFITVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPAYYPNAGLIKNYCRNPDPVAAPWCYTTDPSVRWEYCNLTRCSDAEWTAFVPPNVILAPSLEAFFEQALTEETPGVQDCYYHYGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHSRTPENYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCLVTESSVLATLTVVPDPSTEASSEEAPTEQSPGVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGGLTRNYCRNPDAEISPWCYTMDPNVRWEYCNLTQCPVTESSVLATSTAVSEQAPTEQSPTVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCPVMESTLLTTPTVVPVPSTELPSEEAPTENSTGVQDCYRGDGQSYRGTLSTTITGRTCQSWSSMTPHWHRRIPLYYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTRCPVTESSVLTTPTVAPVPSTEAPSEQAPPEKSPVVQDCYHGDGRSYRGISSTTVTGRTCQSWSSMIPHWHQRTPENYPNAGLTENYCRNPDSGKQPWCYTTDPCVRWEYCNLTQCSETESGVLETPTVVPVPSMEAHSEAAPTEQTPVVRQCYHGNGQSYRGTFSTTVTGRTCQSWSSMTPHRHQRTPENYPNDGLTMNYCRNPDADTGPWCFTMDPSIRWEYCNLTRCSDTEGTVVAPPTVIQVPSLGPPSEQDCMFGNGKGYRGKKATTVTGTPCQEWAAQEPHRHSTFIPGTNKWAGLEKNYCRNPDGDINGPWCYTMNPRKLFDYCDIPLCASSSFDCGKPQVEPKKCPGSIVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGKHFCGGTLISPEWVLTAAHCLKKSSRPSSYKVILGAHQEVNLESHVQEIEVSRLFLEPTQADIALLKLSRPAVITDKVMPACLPSPDYMVTARTECYITGWGETQGTFGTGLLKEAQLLVIENEVCNHYKYICAEHLARGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYARVSRFVTWIEGMMRNN
カニクイザルＬＰＡ ｍＲＮＡ配列（配列番号１６２９）
1 gatgctgcat acttaatgtc gaaaggttgc ttcatccaag agcctggagt tttcagagac
61 actgtcctga aactatgtcc tgaaactatg tcattgaaac tgaaacattg tcctgaagct
121 ggtattgggc aataccagcg cctgcaggca acagctcgga tgcacttaag atttaaatat
181 tacccacaga agttctggct tgtctgggaa aaccttttgc taaacagaag agcaacattt
241 tttttttttt cttttctgga atttgtaaac agcatttatt ctcagcctta ccttccaaac
301 gttgcacttg gaacattgct gggccccgtg gaaacagaag cgaacgtcag ccaggccggc
361 agggggcggc agaccccaca cttcgccggg cgccctcacc tccctgggag ggagtgtgca
421 gctgccaaaa tcttcggcgg ggttcagtcc aagcgacttc agccagcaga tggtcattct
481 cctgtgaccg tgtgtactac agactgtttc aaaaccgggc aggcaattaa caatgggaat
541 tctgccatca tcgctgacaa agtcatccca gtttgtctgc catccccaaa ttatgtggtc
601 gccaaccaga ctgaatgtta tgtcactggc tggggagaaa cccaagcact acctgagcaa
661 agccatgtgg tccaggattg ctaccatggt gatggacaga gttatcaagg cacatcctcc
721 accactgtca caggaaggac ctgccaagct tggtcatcta tggaaccaca tcagcataat
781 agaaccacag aaaactaccc aaatgctggc ttgatcagga actactgcag gaatccagat
841 cctgtggcag ccccttattg ttatacgatg gatcccaatg tcaggtggga gtactgcaac
901 ctgacacaat gctcagacgc agaagggact gccgtcgcac ctccgaatgt caccccggtt
961 ccaagcctag aggctccttc cgaacaagca ccgactgagc aaaggcctgg ggtgcaggag
1021 tgctaccacg gtaatggaca gagttatcga ggcacatact tcaccactgt gacaggaaga
1081 acctgccaag cttggtcatc tatgacaccg cactctcata gtcggacccc ggaaaactac
1141 ccaaatggtg gcttgatcag gaactactgc aggaatccag atcctgtggc agccccttat
1201 tgttatacca tggatcccaa tgtcaggtgg gagtactgca acctgacaca atgctcagac
1261 gcagaaggga ttgccgtcac acctctgact gttaccccgg ttccaagcct agaggctcct
1321 tccaagcaag caccaactga gcaaaggcct ggtgtccagg agtgctacca cggtaatgga
1381 cagagttatc gaggcacata cttcaccact gtgacaggaa gaacctgcca agcttggtca
1441 tctatgacac cacattctca tagtcgtacc ccagaaaact acccaaatgg tggcttgatc
1501 aggaactact gcaggaatcc agatcctgtg gcagcccctt attgttatac catggatccc
1561 aatgtcaggt gggagtactg caacctgaca caatgctcag acgcagaagg gactgccgtc
1621 gcacctccga ctgtcacccc ggttccaagc ctagaggctc cttccgaaca agcaccgact
1681 gagcaaaggc ctggggtgca ggagtgctac cacggtaatg gacagagtta tcgaggcaca
1741 tacttcacca ctgtgacagg aagaacctgc caagcttggt catctatgac accgcactct
1801 catagtcgga ccccggaaaa ctacccaaat ggtggcttga tcaggaacta ctgcaggaat
1861 ccagatcctg tggcagcccc ttattgttat accatggatc ccaatgtcag gtgggagtac
1921 tgcaacctga cacaatgctc agacgcagaa gggactgccg tcgcacctcc gaatgtcacc
1981 ccggttccaa gcctagaggc tccttctgag caagcaccaa ctgagcaaag gcttggggtg
2041 caggagtgct accacggtaa tggacagagt tatcgaggca catacttcac cactgtgaca
2101 ggaagaacct gccaagcttg gtcatctatg acaccacact ctcatagtcg gaccccagaa
2161 aactacccaa atgctggctt ggtcaagaac tactgccgaa atccagatcc tgtggcagcc
2221 ccttggtgtt atacaacgga tcccagtgtc aggtgggagt actgcaacct gacacgatgc
2281 tcagatgcag aagggactgc tgttgtgcct ccaaatatta ttccggttcc aagcctagag
2341 gcttttcttg aacaagaacc gactgaggaa acccccgggg tacaggagtg ctactaccat
2401 tatggacaga gttatagagg cacatactcc accactgtta caggaagaac ttgccaagct
2461 tggtcatcta tgacaccaca ccagcatagt cggaccccaa aaaactatcc aaatgctggc
2521 ctgaccagga actactgcag gaatccagat gctgagattc gcccttggtg ttataccatg
2581 gatcccagtg tcaggtggga gtactgcaac ctgacacaat gtctggtgac agaatcaagt
2641 gtccttgaaa ctctcacagt ggtcccagat ccaagcacac aggcttcttc tgaagaagca
2701 ccaacggagc aaagtcccga ggtccaggac tgctaccatg gtgatggaca gagttatcga
2761 ggctcattct ccaccactgt cacaggaagg acatgtcagt cttggtcctc tatgacacca
2821 cactggcatc agaggacaac agaatattat ccagatggtg gcctgaccag gaactactgc
2881 aggaatccag atgctgagat tcgcccttgg tgttatacca tggatcccag tgtcaggtgg
2941 gagtactgca acctgacaca atgtccagtg acagaatcaa gtgtcctcgc aacgtccatg
3001 gctgtttctg aacaagcacc aatggagcaa agccccgggg tccaggactg ctaccatggt
3061 gatggacaga gttatcgagg ttcattctcc accactgtca caggaaggac atgtcagtct
3121 tggtcctcta tgacaccaca ctggcatcag aggaccatag aatactaccc aaatggtggc
3181 ctgaccaaga actactgcag gaatccagat gctgagattc gcccttggtg ttataccatg
3241 gatcccagag tcagatggga gtactgcaac ctgacacaat gtgtggtgat ggaatcaagt
3301 gtccttgcaa ctcccatggt ggtcccagtt ccaagcagag aggttccttc tgaagaagca
3361 ccaactgaaa acagccctgg ggtccaggac tgctaccaag gtgatggaca gagttatcga
3421 ggcacattct ccaccactat cacaggaaga acatgtcagt cttggttgtc tatgacacca
3481 catcggcatc ggaggatccc attacgctat ccaaatgctg gcctgaccag gaactattgc
3541 agaaatccag atgctgagat tcgcccttgg tgttacacca tggatcccag tgtcaggtgg
3601 gagtactgca acctgacaca atgtccagtg acagaatcaa gtgtcctcac aactcccacg
3661 gtggtcccgg ttccaagcac agaggctcct tctgaacaag caccacctga gaaaagccct
3721 gtggtccagg attgctacca tggtgatgga cagagttatc gaggcacatc ctccaccact
3781 gtcacaggaa ggaactgtca gtcttggtca tctatgatac cacactggca tcagaggacc
3841 ccagaaaact acccaaatgc tggcctgacc aggaactact gcaggaatcc agattctggg
3901 aaacaaccct ggtgttacac gactgatcca tgtgtgaggt gggagtactg caacctgaca
3961 caatgctcag aaacagaatc aggtgtccta gagactccca ctgttgttcc ggttccaagc
4021 atggaagctc attctgaagc agcaccaact gagcaaactc ctgtggtcca gcagtgctac
4081 catggtaatg gacagagtta tcgaggcaca ttctccacca ctgtcacagg aaggacatgt
4141 caatcttggt catccatgac accacaccag cataagagga ccccggaaaa ccacccaaat
4201 gatgacttga caatgaacta ctgcaggaat ccagatgctg acacaggccc ttggtgtttt
4261 accatggacc ccagcgtcag gcgggagtac tgcaacctga cgcgatgctc agacacagaa
4321 gggactgtgg tcacacctcc gactgttatc ccggttccaa gcctagaggc tccttctgaa
4381 caagcatcct cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccaaagaa atgtcctgga
4441 agcattgtag gtgggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga
4501 acaaggtttg gaaagcactt ctgtggaggc accttaatat ccccagagtg ggtgctgact
4561 gctgcttgct gcttggagac gttctcaagg ccttccttct acaaggtcat cctgggtgca
4621 caccaagaag tgaatctcga atctcacgtt caagaaatag aagtgtctag gttgttcttg
4681 gagcccatag gagcagatat tgccttgcta aagctaagca ggcctgccat catcactgac
4741 aaagtaatcc cagcctgtct gccgtctcca aattacgtga tcaccgtctg gactgaatgt
4801 tacatcactg gctggggaga aacccaaggt acctttgggg ctggccttct caaggaagcc
4861 cagcttcatg tgattgagaa tacagtgtgc aatcactacg agtttctgaa tggaagagtc
4921 aaatccaccg agctctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagatg ccagggtgac
4981 agtggagggc ctgtggtttg cttcgacaag gacaaataca ttttacgagg aataacttct
5041 tggggtcctg gctgtgcatg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaagcttt
5101 gtcacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaattga acaagagaca gagtgaagca
5161 ttgactcacc tagaggctag aatgggggta gggatttagc acgctggaaa taacggacag
5221 taatcaaacg aagacactgt ccccagctac caactatgcc aaacctcagc atttttggta
5281 ttattgtgta taagcttttc ccgtctgact gctgggttct ccaataaggt gacatagcta
5341 tgccatttgt taaaaataaa ctctgtactt attttgattt gagtaaa
カニクイザルＬＰＡポリペプチド配列（配列番号１６３０）
MSKGCFIQEPGVFRDTVLKLCPETMSLKLKHCPEAGIGQYQRLQATARMHLRFKYYPQKFWLVWENLLLNRRATFFFFSFLEFVNSIYSQPYLPNVALGTLLGPVETEANVSQAGRGRQTPHFAGRPHLPGRECAAAKIFGGVQSKRLQPADGHSPVTVCTTDCFKTGQAINNGNSAIIADKVIPVCLPSPNYVVANQTECYVTGWGETQALPEQSHVVQDCYHGDGQSYQGTSSTTVTGRTCQAWSSMEPHQHNRTTENYPNAGLIRNYCRNPDPVAAPYCYTMDPNVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPNVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYFTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPENYPNGGLIRNYCRNPDPVAAPYCYTMDPNVRWEYCNLTQCSDAEGIAVTPLTVTPVPSLEAPSKQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYFTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPENYPNGGLIRNYCRNPDPVAAPYCYTMDPNVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYFTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPENYPNGGLIRNYCRNPDPVAAPYCYTMDPNVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPNVTPVPSLEAPSEQAPTEQRLGVQECYHGNGQSYRGTYFTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPENYPNAGLVKNYCRNPDPVAAPWCYTTDPSVRWEYCNLTRCSDAEGTAVVPPNIIPVPSLEAFLEQEPTEETPGVQECYYHYGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHSRTPKNYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCLVTESSVLETLTVVPDPSTQASSEEAPTEQSPEVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPDGGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCPVTESSVLATSMAVSEQAPMEQSPGVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTIEYYPNGGLTKNYCRNPDAEIRPWCYTMDPRVRWEYCNLTQCVVMESSVLATPMVVPVPSREVPSEEAPTENSPGVQDCYQGDGQSYRGTFSTTITGRTCQSWLSMTPHRHRRIPLRYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCPVTESSVLTTPTVVPVPSTEAPSEQAPPEKSPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTVTGRNCQSWSSMIPHWHQRTPENYPNAGLTRNYCRNPDSGKQPWCYTTDPCVRWEYCNLTQCSETESGVLETPTVVPVPSMEAHSEAAPTEQTPVVQQCYHGNGQSYRGTFSTTVTGRTCQSWSSMTPHQHKRTPENHPNDDLTMNYCRNPDADTGPWCFTMDPSVRREYCNLTRCSDTEGTVVTPPTVIPVPSLEAPSEQASSSFDCGKPQVEPKKCPGSIVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGKHFCGGTLISPEWVLTAACCLETFSRPSFYKVILGAHQEVNLESHVQEIEVSRLFLEPIGADIALLKLSRPAIITDKVIPACLPSPNYVITVWTECYITGWGETQGTFGAGLLKEAQLHVIENTVCNHYEFLNGRVKSTELCAGHLAGGTDRCQGDSGGPVVCFDKDKYILRGITSWGPGCACPNKPGVYVRVSSFVTWIEGVMRNN

Claims (39)

  1. ヒトＬＰＡ遺伝子のＲＮＡ転写物上の標的配列を標的とすることによってＬＰＡ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ｄｓＲＮＡは、センス配列を含むセンス鎖、およびアンチセンス配列を含むアンチセンス鎖を含み、標的配列は、配列番号１６３２のヌクレオチド２９５８～２９７６、４６３９～４６５７、４８９２～５０００、２２０～２３８、２２３～２４１、３０２～３２０、１２３６～１２５４、２９４６～２９６４、２９５３～２９７１、２９５４～２９７２、２９５９～２９７７、４６３５～４６５３、４６３６～４６５４、４８４２～４８６０、４９８０～４９９８、６３８５～６４０３、または６４７０～６４８８であり、センス配列は、標的配列と少なくとも９０％同一である、ｄｓＲＮＡ。
  2. センス鎖およびアンチセンス鎖は、１５～２５の連続するヌクレオチドの領域にわたり互いに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  3. センス鎖およびアンチセンス鎖は、３０ヌクレオチド長を超えない、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ。
  4. 標的配列は、配列番号１６３２のヌクレオチド２９５８～２９７６、４６３９～４６５７、または４９８２～５０００である、請求項１～３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  5. ｄｓＲＮＡは、配列番号３０３、３０６、３１８、３８９、４０３、４０６、４０７、４０９、４１０、４６７、４６８、４７１、４９９、５２０、５２２、５７８、および５９７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるアンチセンス配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. センス配列およびアンチセンス配列は、相補的であり、
    ａ）センス配列は、配列番号４、７、１９、９０、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１６８、１６９、１７２、２００、２２１、２２３、２７９、および２９８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか；または
    ｂ）アンチセンス配列は、配列番号３０３、３０６、３１８、３８９、４０３、４０６、４０７、４０９、４１０、４６７、４６８、４７１、４９９、５２０、５２２、５７８、および５９７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
    請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
    ａ）配列番号４および３０３；
    ｂ）配列番号７および３０６；
    ｃ）配列番号１９および３１８；
    ｄ）配列番号９０および３８９；
    ｅ）配列番号１０４および４０３；
    ｆ）配列番号１０７および４０６；
    ｇ）配列番号１０８および４０７；
    ｈ）配列番号１１０および４０９；
    ｉ）配列番号１１１および４１０；
    ｊ）配列番号１６８および４６７；
    ｋ）配列番号１６９および４６８；
    ｌ）配列番号１７２および４７１；
    ｍ）配列番号２００および４９９；
    ｎ）配列番号２２１および５２０；
    ｏ）配列番号２２３および５２２；
    ｐ）配列番号２７９および５７８；または
    ｑ）配列番号２９８および５９７
    のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
  8. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
    ａ）配列番号１１０および４０９；
    ｂ）配列番号１７２および４７１；または
    ｃ）配列番号２２３および５２２
    のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ。
  9. ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、該１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボヌクレオチド、２’－デオキシリボヌクレオチド、または２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドである、請求項１～８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  10. ｄｓＲＮＡは、そのセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端に反転２’－デオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  11. センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、
    ａ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハング；および／または
    ｂ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハング
    をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  12. ｄｓＲＮＡ中のオーバーハングは、２または３つのヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ。
  13. ｄｓＲＮＡ中のオーバーハングは、１つまたはそれ以上のチミンを含む、請求項１１または１２に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. センス配列およびアンチセンス配列は、交互の２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドおよび２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチドを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  15. ａ）センス鎖は、配列番号６０２、６０５、６１７、６８８、７０２、７０５、７０６、７０８、７０９、７６６、７６７、７７０、７９８、８１９、８２１、８７７、および８９６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；または
    ｂ）アンチセンス鎖は、配列番号９０１、９０４、９１６、９８７、１００１、１００４、１００５、１００７、１００８、１０６５、１０６６、１０６９、１０９７、１１１８、１１２０、１１７６、および１１９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
    請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  16. ａ）センス鎖が、配列番号７０８、７７０、および８２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか；または
    ｂ）アンチセンス鎖が、配列番号１００７、１０６９、および１１２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載のｄｓＲＮＡ。
  17. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
    ａ）配列番号６０２および９０１；
    ｂ）配列番号６０５および９０４；
    ｃ）配列番号６１７および９１６；
    ｄ）配列番号６８８および９８７；
    ｅ）配列番号７０２および１００１；
    ｆ）配列番号７０５および１００４；
    ｇ）配列番号７０６および１００５；
    ｈ）配列番号７０８および１００７；
    ｉ）配列番号７０９および１００８；
    ｊ）配列番号７６６および１０６５；
    ｋ）配列番号７６７および１０６６；
    ｌ）配列番号７７０および１０６９；
    ｍ）配列番号７９８および１０９７；
    ｎ）配列番号８１９および１１１８；
    ｏ）配列番号８２１および１１２０；
    ｐ）配列番号８７７および１１７６；または
    ｑ）配列番号８９６および１１９５
    のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ。
  18. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
    ａ）配列番号７０８および１００７；
    ｂ）配列番号７７０および１０６９；または
    ｃ）配列番号８２１および１１２０
    のヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
  19. ｄｓＲＮＡは、リンカーを用いて、または用いずに１つまたはそれ以上のリガンドとコンジュゲートされている、請求項１～１８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  20. リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であり、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされている、請求項１９に記載のｄｓＲＮＡ。
  21. ｄｓＲＮＡは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１～２０のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  22. ｄｓＲＮＡの一方または両方の鎖は、１つまたはそれ以上の、
    Figure 2023545502000074
     の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中：
    － Ｂは、複素環式核酸塩基であり、
    － Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分もしくは式（Ｉ）の化合物を前記鎖と連結するヌクレオシド間連結基であり、
    － Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１もしくはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、式中、Ｒ１は、以下であり：
    ・ 場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基（式中、
    Ｊは、ＯもしくはＳであり、
    Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）、
    ・ 場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
    ・ 基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３（式中
    ｍは、０もしくは１を意味する整数であり、
    ｐは、０から１０の範囲の整数であり、
    Ｒ２は、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、もしくは－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、
    Ｋは、ＯもしくはＳであり、
    Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくそれ以上の基によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
    Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）ヘテロ環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、もしくは
    Ｒ３は、細胞標的化部分である）、
    － Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、独立して水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
    － Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈもしくは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である、
    請求項１～２１のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  23. １つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｙは、
    ａ）Ｒ１が、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、ＮＲ１；
    ｂ）Ｒ１が、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基である、ＮＲ１；
    ｃ）Ｒ１が、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つもしくはそれ以上の基によって置換された（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基である、ＮＲ１；
    ｄ）Ｒ１が、シクロヘキシル基である、ＮＲ１；
    ｅ）Ｒ１が、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基によって置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、ＮＲ１；
    ｆ）Ｒ１が、フェニル基によって置換されたメチル基である、ＮＲ１；
    ｇ）Ｒ１が、場合により置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基である、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１；または
    ｈ）Ｒ１が、メチルまたはペンタデシルである、Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１
    である、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ。
  24. １つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中、Ｂは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリンおよび置換プリンからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載のｄｓＲＮＡ。
  25. Ｒ３は、式（ＩＩ）：
    Figure 2023545502000075
     または薬学的に許容されるその塩であり、
    式中、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、ＯＨであり、
    Ａ４は、ＯＨまたはＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ５であり、式中、Ｒ５は、場合によりハロゲン原子によって置換された（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である、請求項２２～２４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  26. Ｒ３は、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、または薬学的に許容されるその塩である、請求項２２～２５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  27. 表Ａの１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む、請求項２２～２６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  28. ２から１０個の式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項２２～２７のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  29. ２から１０個の式（Ｉ）の化合物は、センス鎖上にある、請求項２８に記載のｄｓＲＮＡ。
  30. センス鎖は、５’末端に２から５つの式（Ｉ）の化合物を含み、および／または３’末端に１から３つの式（Ｉ）の化合物を含む、請求項２２～２９のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  31. ａ）センス鎖の５’末端にある２から５つの式（Ｉ）の化合物は、ｌｇＴ３を含み、場合により、３つの連続したｌｇＴ３ヌクレオチドを含む；および／または
    ｂ）センス鎖の３’末端にある１から３つの式（Ｉ）の化合物は、ｌＴ４を含み、場合により、２つの連続したｌＴ４を含む、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ。
  32. リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル－ホスホナートおよびホスホルアミダート骨格連結基、または薬学的に許容されるその塩からなる群から独立して選択される１つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基を含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  33. 表１～４のｄｓＲＮＡから選択される、請求項１～３２のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  34. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、
    ａ）配列番号１２３１および１４２９；
    ｂ）配列番号１３０７および１５０５；
    ｃ）配列番号１３０８および１５０６；
    ｄ）配列番号１３２５および１５２３；
    ｅ）配列番号１３２８および１５２６；または
    ｆ）配列番号１３６９および１５６７
    のヌクレオチド配列を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  35. 請求項１～３４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  36. ＬＰＡ発現を阻害すること、Ｌｐ（ａ）レベルを低下させること、またはＬｐ（ａ）関連状態を処置することを必要とするヒトにおいてＬＰＡ発現を阻害する、Ｌｐ（ａ）レベルを低下させる、またはＬｐ（ａ）関連状態を処置する際に使用するための、請求項１～３４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡまたは請求項３５に記載の組成物。
  37. ヒトは、脂質代謝障害もしくは心血管疾患（ＣＶＤ）を有するか、またはそれを有するリスクがある、請求項３６に記載の使用するためのｄｓＲＮＡまたは組成物。
  38. ヒトは、高コレステロール血症、脂質異常症、心筋梗塞、アテローム動脈硬化性心血管疾患、アテローム動脈硬化症、末梢動脈疾患、石灰化大動脈弁疾患、血栓症、もしくは卒中を有するか、またはそれを有するリスクがある、請求項３６に記載の使用するためのｄｓＲＮＡまたは組成物。
  39. １つまたはそれ以上のＬｐ（ａ）関連状態を処置および／または予防する方法であって、請求項１～３４のいずれか１項に記載の１つもしくはそれ以上のｄｓＲＮＡ、および／または請求項３５に記載の１つもしくはそれ以上の医薬組成物を投与することを含む方法。
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