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JP2023021958A - 腫瘍標的化アゴニストｃｄ２８抗原結合分子 - Google Patents

腫瘍標的化アゴニストｃｄ２８抗原結合分子 Download PDF

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JP2023021958A
JP2023021958A JP2022149635A JP2022149635A JP2023021958A JP 2023021958 A JP2023021958 A JP 2023021958A JP 2022149635 A JP2022149635 A JP 2022149635A JP 2022149635 A JP2022149635 A JP 2022149635A JP 2023021958 A JP2023021958 A JP 2023021958A
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Georges Guy
トーマス ホーファー，
Hofer Thomas
ラルフ ホッセ，
Hosse Ralf
クリスティアン クライン，
Klein Christian
エッケハルト メスナー，
Ekkehard Moessner
ヨハネス サム，
Sam Johannes
パブロ ウマーニャ，
Umana Pablo
ジェニー トスカ トム，
Tosca THOM Jenny
シュテファン ガサー，
Gasser Stephan
ジャン－バティスト ピエール ヴァリエ，
Pierre VALLIER Jean-Baptiste
タニヤ ファウチ，
Fauti Tanja
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

【課題】Ｔ細胞二重特異性抗体（TCB）との相乗効果を示し、ＴＣＢシグナルの存在下での厳密な腫瘍標的依存性のためにＣＤ２８結合一価を必要とする新規な腫瘍標的化アゴニストＣＤ２８分子を提供する。【解決手段】ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする腫瘍標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、それらの製造方法、これらの分子を含有する薬学的組成物、及びがんの処置における免疫調節剤としてのそれらの使用に関する。
がん免疫療法は、メラノーマ、非小細胞肺がん及び腎細胞癌などのがん型において劇的かつ持続的な応答をもたらし得る、ますます有効な治療選択肢になりつつある。これは主に、抗ＰＤ－１（例えば、Ｍｅｒｃｋのキイトルーダ；ＢＭＳのオプジーボ）、抗ＣＴＬＡ－４（例えば、ＢＭＳのヤーボイ）及び抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、Ｒｏｃｈｅのテセントリク）を含むいくつかの免疫チェックポイント遮断の成功によって推進される。これらの薬剤は、多くのがん型の標準治療として、又は併用療法の骨格として役立つ可能性が高いが、患者のごく一部（２５％未満）がそのような療法から利益を得るにすぎない。更に、様々ながん（前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肉腫、非トリプルネガティブ乳がんなど）は、これらの免疫調節物質に対する一次耐性を示す。いくつかの報告は、既存の抗腫瘍Ｔ細胞の非存在が一部の患者の不応答又は不十分な応答に寄与することを示している。要約すると、既存の免疫療法の印象的な抗がん効果にもかかわらず、大きながん患者集団に対処すること、並びに新規な腫瘍特異的Ｔ細胞応答を誘導及び増強することを目的とする治療法を開発することに対する明確な医学的必要性が存在する。
ＣＤ２８は、重要なシグナル伝達モチーフ（Ｃａｒｒｅｎｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，２００２）を含有する単一の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに結合した対Ｖセット免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインを特徴とする共刺激分子のサブファミリーの確立メンバーである。サブファミリーの他のメンバーとしては、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤ１Ｈ、ＴＩＧＩＴ及びＢＴＬＡ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｆｌｉｅｓ，２０１３）が挙げられる。ＣＤ２８発現はＴ細胞に限定され、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４を発現するものを含む、全てのナイーブ及び抗原経験サブセットの大部分で一般的である。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４は高度に相同であり、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ及び腫瘍細胞上に発現される同じＢ７分子ＣＤ８０及びＣＤ８６への結合について競合する（Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。リガンドのＢ７ファミリーに対するＣＴＬＡ－４のより高い親和性は、ＣＴＬＡ－４がリガンド結合についてＣＤ２８を打ち負かすこと、及びエフェクターＴ細胞応答を抑制することを可能にする（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。対照的に、ＰＤ－１は、ＣＤ２８の細胞質ドメインを部分的に脱リン酸化することによってＣＤ２８シグナル伝達を阻害することが示された（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。プロフェッショナル抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０又はＣＤ８６によるＣＤ２８のライゲーションは、ナイーブＴ細胞の機能的デノボプライミング、その後のクローン増殖、サイトカイン産生、標的細胞溶解、及び長寿命メモリーの形成に厳密に必要とされる。ＣＤ２８リガンドの結合はまた、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、及び４－１ＢＢなどの誘導性共刺激受容体の発現を促進する（Ａｃｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，２００３に概説）。ＣＤ２８のライゲーション時に、ジスルフィド結合ホモ二量体、膜近位ＹＭＮＭモチーフ及び遠位ＰＹＡＰモチーフは、いくつかのキナーゼ及びアダプタータンパク質と複合体を形成することが示されている（Ｂｏｏｍｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２０１０）。これらのモチーフは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１及びＮＦκＢファミリー転写因子のＣＤ２８依存的活性化によって媒介されるＩＬ２転写の誘導に重要である（Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）（Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。しかしながら、リン酸化及びユビキチン化のための更なる十分に特徴付けられていない部位が、ＣＤ２８の細胞質ドメイン内に見出される。（Ｅｓｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）によって概説されるように、ＣＤ２８によって開始される経路は、従来のＴ細胞の増殖及びエフェクター機能の促進において重要な役割を有する。ＣＤ２８ライゲーションはまた、制御性Ｔ細胞の抗炎症機能を促進する。ＣＤ２８は、Ｔ細胞受容体からのシグナルを部分的に増強することによってＴ細胞を共刺激するが、固有のシグナル伝達事象を媒介することも示された（Ａｃｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，２００３；Ｂｏｏｍｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２０１０；Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＣＤ２８によって特異的に引き起こされるシグナルは、下流タンパク質のリン酸化及び他の翻訳後修飾（例えば、ＰＩ３Ｋ媒介性リン酸化）、転写変化（例えば、Ｂｃｌ－ｘＬ発現）、エピジェネティック変化（例えばＩＬ－２プロモーター）、細胞骨格リモデリング（例えば、微小管形成中心の配向）及び解糖速度の変化（例えば、解糖流量）を含む、Ｔ細胞機能の多くの重要な側面を制御する。ＣＤ２８欠損マウスは、感染性病原体、同種移植片抗原、移植片対宿主病、接触過敏症及び喘息に対する応答が低下している（Ａｃｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，２００３）。ＣＤ２８媒介性共刺激の欠如は、インビトロ及びインビボでのＴ細胞増殖の減少、胚中心形成及び免疫グロブリンアイソタイプクラスの切り替えの重度の阻害、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞分化の減少並びにＴｈ２型サイトカインの発現をもたらす。ＣＤ４依存性細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答も影響を受ける。重要なことに、ＣＤ２８欠損ナイーブＴ細胞は、特により低い抗原濃度で増殖応答の低下を示した。文献の増加は、Ｔ細胞上のＣＤ２８を係合させることが抗腫瘍能を有するという考えを裏付けている。最近の証拠は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害剤の抗がん効果がＣＤ２８に依存することを実証している（Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１遮断の治療効果を調査する臨床研究は、進行したメラノーマ及び他のがんを有する患者において非常に有望な結果を示している。更に、細胞内ＴＣＲシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚ）及び細胞内共刺激ドメイン（ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢドメイン）に融合した細胞外抗原認識ドメインを含む人工キメラＴ細胞受容体を発現する遺伝子操作されたＴ細胞の注入は、Ｂ細胞がん及び他のがんにおける高い応答率及び持続性を示した。
ＣＤ２８アゴニスト抗体を、（ｉ）ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体及び（ｉｉ）ＣＤ２８従来のアゴニスト抗体の２つのカテゴリーに分けることができる。通常、ナイーブＴ細胞の活性化には、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ、シグナル１）の関与とＣＤ２８による共刺激シグナル伝達（シグナル２）の両方が必要である。ＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＣＤ２８ＳＡ）は、明白なＴ細胞受容体関与なしにＴ細胞を自律的に活性化することができるＣＤ２８特異的モノクローナル抗体である（Ｈｕｅｎｉｇ，２０１２）。齧歯類では、ＣＤ２８ＳＡは、従来の制御性Ｔ細胞を活性化する。ＣＤ２８ＳＡ抗体は、自己免疫、炎症及び移植の複数のモデルにおいて治療上有効である。しかしながら、ヒトＣＤ２８ＳＡ抗体ＴＧＮ１４１２の第Ｉ相研究は、２００６年に生命を脅かすサイトカインストームをもたらした。追跡調査は、毒性が、前臨床動物モデルのヒトＴ細胞及びＴ細胞のＣＤ２８応答性の違いによる投薬誤差によって引き起こされたことを示唆している。ＴＧＮ１４１２は現在、ＲＡ患者及び転移性又は切除不能な進行性固形悪性腫瘍を有する患者における非盲検多施設用量漸増試験で再評価されている。ＣＤ２８の従来のアゴニスト抗体、例えばクローン９．３は、ＣＤ２８天然リガンドを模倣し、Ｔ細胞受容体シグナルの存在下でのみＴ細胞活性化を増強することができる（シグナル１）。公開された見識は、抗体の結合エピトープが、アゴニスト抗体がスーパーアゴニストであるか従来のアゴニストであるかに大きな影響を及ぼすことを示している（Ｂｅｙｅｒｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，２００５）。スーパーアゴニストＴＧＮ１４１２はＣＤ２８の側方モチーフに結合するが、従来のアゴニスト分子９．３はリガンド結合エピトープの近くに結合する。異なる結合エピトープの結果として、スーパーアゴニスト抗体及び従来のアゴニスト抗体は、Ｔ細胞の表面上にＣＤ２８分子の線状複合体を形成する能力が異なる。正確には、ＴＧＮ１４１２はＣＤ２８の線形アレイを効率的に形成することができ、これはおそらくＴ細胞活性化の閾値を超えるのに十分な凝集したシグナル伝達成分をもたらす。一方、従来のアゴニスト９．３は、構造が直鎖状ではない複合体をもたらす。９．３クローンに基づく従来のアゴニスト結合因子を変換する試みは、メラノーマ関連プロテオグリカン及びＣＤ２８に対する組換え二重特異性一本鎖抗体を使用して以前に発表されている（Ｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００９）。報告された二重特異性一本鎖抗体は、多量体コンストラクトを形成する二重特異性一本鎖抗体の固有の傾向に基づいて、従来のＣＤ２８アゴニスト結合因子９．３の使用にもかかわらず、「超アゴニスト」活性を発揮することが報告された。
限界量の抗ＣＤ３二重特異性抗体、すなわちＣＥＡ－ＴＣＢなどのＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）を作動性抗ＣＤ２８分子と組み合わせると、より良好なＴ細胞活性化が達成されることが分かった。ＣＤ２８が様々な腫瘍適応症（Ｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔｉｒｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）においてＴ細胞上のベースラインで発現され、ＣＤ２８シグナル伝達の活性化がＴ細胞受容体シグナルを増強することを考えると、ＴＣＢ分子と腫瘍標的化ＣＤ２８分子との組み合わせは相乗的に作用して強力で長期持続性の抗腫瘍応答を誘導すると予想される。したがって、本発明者らは、本明細書において、ＴＣＢとの相乗効果を示し、ＴＣＢシグナルの存在下での厳密な腫瘍標的依存性のためにＣＤ２８結合一価を必要とする新規な腫瘍標的化アゴニストＣＤ２８分子を記載する。
固形腫瘍の免疫療法
固形腫瘍の処置は進行中の課題であり、ここ数年にわたってほとんど進歩は見られていない。典型的には、処置は、手術と化学療法及び／又は放射線療法との併用である。ごく少数の新たな処置が最近開発されているが、固形腫瘍に罹患している患者の生存率を高め、その生活の質を改善するために、更なる改善が依然として必要とされている。固形腫瘍は、１つの腫瘍特異的抗原を発現することは稀である。ほとんどの固形腫瘍では、腫瘍上に濃縮されているが、正常組織上でも非常に低レベルで発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を見出すことがより一般的である。ＴＡＡは、好ましくは、固形腫瘍細胞の表面又は腫瘍間質の細胞上に提示される。これは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２を含む、固形腫瘍のための多くの頻繁に標的化されるＴＡＡの場合である。更なるＴＡＡとしては、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＴＰＢＧ（５Ｔ４）、メソテリン、ＭＵＣ１及びＰＳＭＡが挙げられる。したがって、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、主に腫瘍表面又は腫瘍微小環境に向けられ、全身活性化が回避され得る間に腫瘍の近傍のＴ細胞を特異的に活性化する。
Ｂ細胞悪性腫瘍に対するＣＤ２８アゴニズムを標的とする理由
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、米国及び欧州におけるがん死の主因の１つである。濾胞性リンパ腫（ＦＬ）は、その経過が緩徐であり、進行速度が遅く、生存期間の中央値は８～１０年であり、進行した臨床段階の患者は、通常、治癒することができない。同様に、毎年２％～３％の患者において、ＦＬの表現型は、疾患の経過における重大な事象であり、リンパ腫関連死亡率の増加に関連する、侵襲性大細胞リンパ腫に転換する可能性がある。マントル細胞リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）はより侵攻性であり、未処置の場合、生存率の中央値はわずか６ヶ月である。無増悪生存期間を延長した免疫療法の著しい進歩にもかかわらず、低悪性度ＮＨＬサブタイプ及び侵襲性ＮＨＬサブタイプの両方を有する多くの患者の治癒的転帰の欠如は、依然として満たされていない医学的必要性を残している。過去数年の間に、特に抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるリツキシマブ（リツキサン（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））を強力な細胞傷害性化学療法レジメンに追加することにより、ＤＬＢＣＬにおける有意な長期生存が観察されている。しかしながら、以前に未処置のＤＬＢＣＬのための従来の処置は治癒的であることを意図しているにもかかわらず、患者の大部分は最終的に再発するであろう。同様に、進行したＦＬは、現在のＳｏＣではほとんど治癒しないままであり、再発の繰り返し及び徐々に寛解が短くなることを特徴とする。現在、多くの新世代モノクローナル抗体は、ＮＨＬ患者の転帰を更に改善し、リツキシマブ耐性の機構を克服するための評価の異なる前臨床及び臨床段階にある。自己幹細胞支持又は同種異系幹細胞移植を伴う高用量化学療法は、再発性／難治性（ｒ／ｒ）ＤＬＢＣＬを有する患者のごく一部（１０％）に対して治癒的選択肢を提供し、実質的な処置関連死亡率を伴う。現在開発中のＮＨＬの処置のための他のアプローチには、ベネトクラックス及びＢＥＴ阻害剤のような分子標的化合物が含まれる。最近承認された新規薬剤には、レナリドミド、イデラリシブ及びコパンリシブが含まれる。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、ｒ／ｒ Ｂ－ＮＨＬの侵襲的な形態の処置に承認されているが、この療法は限られた状況でのみ利用可能であり、致死的な神経学的事象及びサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に関連し得る。細胞傷害性細胞の溶解を悪性Ｂ細胞に向け直す二重特異性抗体コンストラクトは現在開発中であり、ＮＨＬに対する非常に有望な有効性を示している。無化学療法処置は、ＮＨＬの将来のために想定されており、おそらく二重特異性抗体又はキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）に基づくであろう。免疫療法と組み合わせてＢ細胞表面抗原に対して標的化されたＣＤ２８アゴニストは、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者の生活の質を損なうことなく、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者の生存率及び／又は治癒率を高める。
Ｂ細胞悪性腫瘍の標的としてのＢ細胞表面抗原
Ｂ細胞悪性腫瘍に関連するＴＡＡは、Ｂ細胞表面抗原である。ヒトＣＤ１９抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する９５ＫＤａ膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１９は、単一の膜貫通ドメイン、細胞質Ｃ末端及び細胞外Ｎ末端を有するＩ型膜貫通タンパク質として分類される。正常細胞では、それはＢリンパ球系統において最も遍在的に発現されるタンパク質である。ＣＤ１９発現は、新生物形質転換を受けたＢ系統細胞において維持され、したがって、ＣＤ１９は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びフローサイトメトリーを使用した白血病及びリンパ腫の診断において有用であり、ＣＤ２０抗原も同様である。Ｂ系統白血病及びリンパ腫はＣＤ１９発現を失うことはまれであり、多能性幹細胞では発現されないため、免疫毒素を含む様々な免疫療法剤の標的となっている。ＣＤ７９は、ＣＤ７９ａ（Ｉｇα、ｍｂ－１）及びＣＤ７９ｂ（Ｉｇβ、Ｂ２９）を含有する共有結合ヘテロ二量体からなる、Ｂ細胞受容体のシグナル伝達構成要素である。ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂはそれぞれ、ＣＤ３又は活性化Ｆｃγ受容体などの他のシグナル伝達タンパク質と同様に、細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメイン、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）ドメインを含有する。したがって、ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）のシグナル伝達サブユニットを構成する膜貫通タンパク質である。ＣＤ７９ｂは、Ｂ細胞上に排他的に発現される３９ＫＤａのタンパク質であり、ＣＤ７９ａと協働して、ＢＣＲの下流のシグナル伝達カスケードを開始させ、ＢＣＲ複合体の内部移行、エンドソームへのその移行、及び抗原提示をもたらす。Ｂ細胞において、抗原誘導性ＢＣＲクラスター形成は、ＳｒｃキナーゼによるＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂのＩＴＡＭのチロシンリン酸化を引き起こす。これは、最も注目すべきＳＹＫ及びＢＬＮＫを含む、ＢＣＲシグナル伝達カスケードに属する一連のエフェクター分子の動員及び活性化をもたらす。更に下流では、ＰＬＣｇ２、Ｂｔｋ及びＥＲＫの動員は、カルシウム流動を促進し、Ｂ細胞を活性化し、次いで、Ｂ細胞は、それらの増殖及びメモリー細胞又はエフェクター細胞への分化を駆動する更なる共活性化シグナルを受け取る準備ができている。この過程の間、Ｂ細胞は堅牢なＡＰＣになり、免疫応答の結果及び質に影響を及ぼし得るサイトカインを放出する。ＣＤ７９サブユニットは、ＢＣＲシグナル伝達における役割に加えて、小胞体から細胞表面への膜結合Ｉｇの輸送及び提示にも不可欠である。ＮＨＬ上でのＣＤ７９ｂの平均表面発現は、正常なＢ細胞上でのそれと同様であるが、範囲がより大きい。ＣＤ７９ｂの発現を考慮すると、特に慢性処置のために、患者に投与した場合に抗原性を最小限にするか又は全く生じないＣＤ７９ｂ抗原に対する治療用抗体を産生することが有益である。
限界量の抗ＣＤ３二重特異性抗体、すなわち、例えばＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体などのＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）をアゴニスト抗ＣＤ２８分子と組み合わせると、より良好なＴ細胞活性化が達成されることが見出された。ＣＤ２８が様々な腫瘍適応症（Ｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔｉｒｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）においてＴ細胞上のベースラインで発現され、ＣＤ２８シグナル伝達の活性化がＴ細胞受容体シグナルを増強することを考えると、Ｔ細胞二重特異性抗体とＢ細胞表面抗原を標的とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子との組み合わせは、強力かつ長期持続性の抗腫瘍応答を誘導するために相乗的に作用すると予想される。したがって、本発明者らは、本明細書において、ＴＣＢとの相乗効果を示し、ＴＣＢシグナルの存在下での厳密な腫瘍標的依存性のためにＣＤ２８結合の一価性を必要とする、Ｂ細胞表面抗原を標的とする新規な二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を記載する。
多発性骨髄腫における免疫療法
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、ＥＵ及び米国で毎年約７５，０００人の新しい患者に罹患しており、依然として満たされていない医学的必要性が高い、最も一般的な血液悪性腫瘍の１つである。多発性骨髄腫は、非機能性モノクローナル免疫グロブリンを分泌する最終分化形質細胞を特徴とする。短期的には、レナリドミド及びポマリドミドなどの免疫調節薬、並びにカルフィルゾミブ又はボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤は、多発性骨髄腫の第一選択療法の骨格のままであり得る（Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ，２０１６）。しかしながら、これらの薬物は、疾患腫瘍細胞、例えば疾患形質細胞（ＰＣ）を特異的に標的としない。多発性骨髄腫において形質細胞を選択的に枯渇させるための努力がなされてきた。形質細胞を特異的にマークする表面タンパク質の欠如は、多発性骨髄腫のための抗体又は細胞療法の開発を妨げてきた。これまでのところ、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８）及びエロツズマブ（抗ＣＤ３１９）を含む成功した生物製剤の事例はほとんどなく、両方の抗原が造血系及び免疫エフェクター細胞を含む他の正常組織でも発現され、その長期臨床使用を制限する可能性があるという警告がある。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）中の膜貫通糖タンパク質であるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、全ての患者ＭＭ細胞において有意に高いレベルで発現されるが、正常形質細胞を除く他の正常組織では発現されない。ＢＣＭＡ－キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、プロテアソーム阻害剤及び免疫調節剤を含む少なくとも３つの以前の処置を受けたＲＲＭＭ患者において有意な臨床活性を既に示している。抗ＢＣＭＡ抗体－薬物抱合体を含む更なるモダリティはまた、抗ＣＤ３８抗体、プロテアソーム阻害剤、及び免疫調節剤（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，２０１８）を含む少なくとも３つの先行治療に失敗した患者において有意な臨床応答を達成した。例えば、ＢＣＭＡ又はＣＤ３８を標的とする治療の１つの課題は、ＭＭ患者の血清中の高レベルの可溶性ＢＣＭＡ又はＣＤ３８の存在にあり、これは患者の活性薬物の量を減少させ得る。代替法は、健康なドナー由来の形質細胞に対して多発性骨髄腫における形質細胞によって差次的に発現され、可溶性形態を有しない、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）などの新たな標的であり得る。ＧＰＲＣ５Ｄは、多発性骨髄腫患者の予後及び腫瘍量に関連することが報告されている（Ａｔａｍａｎｉｕｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１２；ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＧＰＲＣ５Ｄは、一般的に男性において、及びがん特異的に男性において、リガンドが知られておらず、生物学がほとんど知られていないオーファン受容体である。染色体１２ｐ１３．３にマッピングされるＧＰＲＣ５Ｄコード遺伝子は、３つのエクソンを含み、約９．６ｋｂに及ぶ（Ｂｒａｕｎｅｒ－Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００１）。大きな第１のエクソンは、７回膜貫通ドメインをコードする。ＧＰＲＣ５Ｄは、動物の毛包のケラチン形成に関与することが示されているＧａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２０１６，ａｎｄ Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００４）。国際公開第２０１８／０１７７８６号Ａ２は、ＧＰＲＣ５Ｄ特異的抗体又は抗原結合断片を開示している。
多発性骨髄腫における疾患形質細胞に対するＣＤ２８アゴニズムを標的とする理由
多発性骨髄腫におけるＣＤ２８アゴニズムは、免疫性のそれぞれのＭＭ形質細胞に対して異なる生物学的機能を発揮し得る。ＣＤ２８を介したＴ細胞の共活性化は、抗腫瘍応答を駆動すると予想されるが、ＭＭ細胞に対するＣＤ２８アゴニズムは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＦｏｘＯ３ａ及びＢｉｍｍの調節を介して生存促進シグナル伝達を媒介し、これは、多発性骨髄腫において化学療法抵抗性を誘導すると記載されている（Ｍｕｒｒａｙ Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，２０１４）。新たに診断された多発性骨髄腫形質細胞上のＣＤ２８の過剰発現は、より悪い臨床転帰と相関すると記載されている（Ｂａｈｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）。しかしながら、ＣＤ２８活性化は骨髄腫細胞の生存を増強するが、その活性化は骨髄腫細胞増殖を阻害する。Ｔ細胞のＴ細胞二重特異的活性化などの強い免疫細胞媒介性応答の存在下でＣＤ２８をアゴナイズすることにより、効率的な抗腫瘍応答を更に高めることができる。本発明者らは、本明細書において、ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原に特異的に結合する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。特に、Ｔ細胞上に発現されるＢＣＭＡ、ＣＤ３８及びＧＰＲＣ５Ｄから選択されるＴＡＡを標的とする本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子並びにＣＤ２８は、単剤として、又はヒトＭＭ細胞表面抗原を標的とするＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）などの他の薬剤と組み合わせて、多発性骨髄腫を処置する効力を有する。
本発明は、多量体を形成することを必要とせずに腫瘍依存性Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅を達成する腫瘍標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を記載する。本発明の二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子は、ＣＤ２８への一価結合、及び腫瘍関連抗原（例えば、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９又はＧＰＲＣ５Ｄ）に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むことを特徴とする。更に、それらは、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを持つ。それにより、Ｆｃ受容体媒介性架橋が抑止され、腫瘍特異的活性化が、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインのその抗原への結合による架橋によって達成される。
したがって、本発明は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。
一態様では、ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、以下に定義する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。一態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。
一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３６の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３９の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）と、
を含む、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号３６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号４１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更には、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、本明細書において先に規定される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の特定の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｖ）配列番号５０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）と、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１３３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１３４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。特に、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
別の態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｅ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｆ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｇ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｈ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｊ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特に、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ａ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む。一態様では、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくはＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号５１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、（ｉｖ）配列番号５１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号５２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号５２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。より具体的には、ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号５２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）を含む。
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号５２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）と、（ｉｖ）配列番号５２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号５２９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）及び配列番号５３０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。より具体的には、ＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）及び配列番号５３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）を含む。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）と、（ｉｖ）配列番号５３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号５３７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）及び配列番号５３８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）及び配列番号５３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）を含む。
更に、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＢＰＧ）と、（ｉｖ）配列番号５４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＢＰＧ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号５４５のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＢＰＧ）及び配列番号５４６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＢＰＧ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。より具体的には、ＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＢＰＧ）及び配列番号５４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＢＰＧ）を含む。
更なる態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定した会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ及びＧＰＲＣ５Ｄからなる群から選択される多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原。
したがって、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ａ）（ｉ）配列番号５６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）と、（ｉｖ）配列番号５６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）、又は（ｂ）（ｉ）配列番号５７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）と、（ｉｖ）配列番号５８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）を含む、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５６９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）を含む。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）と、（ｉｖ）配列番号５５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５５３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）及び配列番号５５４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）及び配列番号５５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）を含む。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）と、（ｉｖ）配列番号５５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５５９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）及び配列番号５６０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）及び配列番号５６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）を含む。
更なる態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定した会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、Ｂ細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ３７からなる群から選択される。
したがって、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ａ）（ｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、（ｉｖ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）（ｉ）配列番号４１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、（ｉｖ）配列番号４１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号４１２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号４２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４２１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号４１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）と、（ｉｖ）配列番号４２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）及び配列番号４２９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号４２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）及び配列番号４２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）を含む。
更なる態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＦａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である、本明細書において先に定義した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、Ｆｃドメインサブユニットの１つのＮ末端に融合されている、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２及び第３のＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されている、本明細書に開示される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能なＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＶＨドメイン及びＶＬドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、そのＣ末端において、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＶＨドメイン及びＶＬドメインの一方が、ペプチドリンカーを介して第１のＦｃドメインサブユニットのＣ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＶＨドメイン及びＶＬドメインの他方が、ペプチドリンカーを介して第２のＦｃドメインサブユニットのＣ末端に融合される、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
本発明の別の態様によれば、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする１つ以上の単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は更に、１つ以上のベクター、特に、本発明の単離ポリヌクレオチド（複数可）を含む発現ベクター（複数可）、単離ポリヌクレオチド（複数可）又は本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の製造方法が提供される。必要に応じて、この方法はまた、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を回収することを含む。本発明は、本発明の方法により作製した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子もまた包含する。
本発明は更に、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、がんの処置に用いるためのものである。
二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子及び本発明の薬学的組成物を使用する方法も本発明に包含される。一態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は薬学的組成物を提供する。一態様では、（ａ）細胞活性化の増強又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能の増強に使用するための、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、疾患の処置に使用するための本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。具体的な態様では、疾患は、がんである。別の態様では、がんにおける処置で使用するための本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は薬学的組成物が提供され、該二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される。更なる態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はがんの処置において使用するための薬学的組成物が提供され、ここで、その二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与される。更に別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はがんの処置に使用するための薬学的組成物が提供され、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与される。
疾患を処置するための医薬の製造における本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の使用、並びに個体における疾患を処置する方法であって、前記個体に、治療有効量の本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を投与することを含む、方法も提供される。具体的な態様では、疾患は、がんである。一態様では、個体における（ａ）細胞活性化を増強するか又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能を増強する方法であって、本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を当該個体に投与することを含む、方法が提供される。別の態様では、疾患を処置するための医薬の製造における本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の使用であって、該処置が化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法に使用するための他の薬剤との同時投与を含む、使用が提供される。更なる態様では、個体における疾患を処置する方法であって、治療有効量の本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を当該個体に投与することを含み、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤との同時投与を含む、方法が提供される。更なる態様では、個体における疾患を処置する方法であって、当該個体に、治療有効量の本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を投与することを含み、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を同時投与することを含む、方法が提供される。別の態様では、個体における疾患を処置する方法であって、当該個体に、治療有効量の本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を投与することを含み、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体を同時投与することを含む、方法が提供される。個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該個体に、有効量の、本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法も提供される。上の態様のいずれかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。
図１Ａ～図１Ｌには、記載される分子の概略図が示されている。図１Ａは、そのｈｕＩｇＧ４アイソフォーム（ＴＧＮ１４１２）中のＣＤ２８アゴニスト抗体ＣＤ２８（ＳＡ）を示す。図１Ｂは、ｈｕ ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ アイソタイプ（「Ｆｃサイレント」）としてのＣＤ２８（ＳＡ）アゴニスト抗体を示す。１＋１フォーマット、１＋２フォーマット、２＋２フォーマット及び１＋４フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子をそれぞれ図１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ及び１Ｆに示す。１＋２フォーマット、２＋２フォーマット及び１＋１フォーマットの二重特異性ＣＥＡ－ＣＤ２８抗原結合分子をそれぞれ図１Ｇ、１Ｈ及び１Ｊに示す。図１Ｉは、一価ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡアイソタイプ（「Ｆｃサイレント」）としてのＣＤ２８アゴニスト抗体変異体の概略図を示す。図１Ｋは、ＦＡＰ抗原結合ドメインが、それぞれがＦｃドメインサブユニットの１つのＣ末端に融合されるＶＨドメイン及びＶＬドメインとして提示される、１＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子を示す。図１Ｌは、ＣＤ２８抗原結合ドメインが、そのＣ末端において「二価」ＦＡＰ抗体の重鎖のうちの１つのＮ末端に融合されるクロスＦａｂとして表される、２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子を例示する。図１Ｍは、ＣＤ２８抗原結合ドメインが、そのＣ末端において、ＦＡＰに結合するＦａｂ断片のＮ末端に融合されるクロスＦａｂとして表される、１＋１フォーマットの別の二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子を示す。図１Ｎ は、ＣＤ２８抗原結合ドメインが、軽鎖及び重鎖の両方のＣ末端においてｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ Ｆｃノブ鎖上の抗ＦＡＰ抗原結合ドメインの軽鎖及び重鎖の両方のＮ末端に融合されたＦａｂとして表され、抗ＣＥＡ クロスＦａｂ断片がｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ Ｆｃホール鎖の一部である、１＋１＋１フォーマットの三重特異的ＦＡＰ－ＣＥＡ－ＣＤ２８抗原結合分子を示す。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅは、細胞上のヒトＣＤ２８又はヒトＦＡＰに対するＣＤ２８アゴニスト抗体及びＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子の結合に関する。図２Ａにおけるｈｕ ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡアイソタイプｔｉヒトＣＤ２８に対するＩｇＧ４アイソフォーム中のＣＤ２８（ＳＡ）の結合、並びに細胞上のヒトＣＤ２８（図２Ｂ）及びヒトＦＡＰ（図２Ｃ）に対する異なるＦＡＰ－ＣＤ２８分子の結合が示されている。ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）又はヒトＦＡＰを発現する３Ｔ３細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８））に対する異なるＣＤ２８アゴニスト抗体又は抗ＤＰ４７標的化分子の結合の蛍光強度中央値をフローサイトメトリーによって評価した。ＳＥＭによる技術的三連が示されている。ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ＳＡ）抗原結合分子（実施例１に記載の分子Ｄ、Ｅ及びＦ）の比較を図２Ｄ（ヒトＣＤ２８への結合）及び図２Ｅ（ヒトＦＡＰへの結合）に示す。図２Ｆ及び２Ｇは、種々のフォーマットのＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子と、ＣＤ２８及びＦＡＰに対する一価結合との結合をそれぞれ示す。ＦＡＰ－ＣＤ２８ ＣＴＦ １＋１（Ｐ１ＡＥ２２３６、分子Ｉ）、ＦＡＰ－ＣＤ２８ １＋１（Ｐ１ＡＤ４４９２、分子Ｃ）、ＦＡＰ－ＣＤ２８ Ｈ２Ｔ １＋１（Ｐ１ＡＥ２０２１、分子Ｈ）、並びに参照としての２つの化合物ＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋２（Ｐ１ＡＤ９０１１、分子Ｅ）及びＤＰ４７についての曲線が示される。フローサイトメトリーによって評価される、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）（図２Ｆ）又はヒトＦＡＰを発現する３Ｔ３細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８））（図２Ｇ）に対するＦＡＰ－ＣＤ２８抗体又は抗ＤＰ４７抗体（陰性対照）の結合の蛍光強度中央値を示す。ＳＥＭによる技術的三連を示す。図２Ｈ及び２Ｉは、ＦＡＰ－ＣＤ２８ ２＋１（Ｐ１ＡＥ５２３１、分子Ｇ）のＣＤ２８及びＦＡＰへの結合をそれぞれ示す。 ＣＤ２８（ＳＡ）の可変ドメイン及びその変異体のアラインメントを図３Ａ～３Ｄに示す。システイン５０を除去し、得られた抗ＣＤ２８結合因子の親和性を異なる程度に低下させるためのＣＤ２８（ＳＡ）ＶＨドメイン及びその変異体のアラインメントを図３Ａ及び３Ｂに示す。注目すべきことに、ＶＨ変異体ｉ及びｊでは、ＣＤ２８（ＳＡ）のＣＤＲをＩＧＨＶ１－２フレームワークからＩＧＨＶ３－２３フレームワークにグラフトした（図３Ｂ）。図３Ｃ及び３Ｄには、得られた抗ＣＤ２８結合因子の親和性を異なる程度に低下させるためのＣＤ２８（ＳＡ）ＶＬドメイン及びその変異体のアラインメントを示す。変異体ｔでは、ＣＤＲをトラスツズマブ（ハーセプチン）ＶＬ配列のフレームワーク配列にグラフトした。 図４Ａ～４Ｃでは、細胞上のヒトＣＤ２８に対する上清からの単一特異性の一価ＩｇＧフォーマットにおける親和性低下ＣＤ２８アゴニスト抗体変異体の結合を示す。陰性対照（抗ＤＰ４７）及び元のＴＧＮ１４１２と比較した、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）への結合の蛍光強度中央値をフローサイトメトリーによって評価した。変異体１～１０の結合曲線を図４Ａに示し、変異体１１～２２の結合曲線図４Ｂに示し、変異体２３～３１の結合曲線を図４Ｃに示す。ＳＤを有する技術的複製を示す。図４Ｄ及び４Ｅには、細胞上のヒトＣＤ２８に対する、選択された親和性低下ＣＤ２８アゴニスト抗体変異体を有するｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ １＋１フォーマットにおけるＦＡＰ標的二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗体変異体の結合を示す。変異体８、１１、１２、１５、１６及び１７を有する二重特異性１＋１コンストラクトの結合曲線を図４Ｄに示し、変異体１９、２３、２５、２７及び２９を有する二重特異性１＋１コンストラクトの結合曲線を図４Ｅに示す。選択された結合因子を、１＋１の二重特異性ＦＡＰ標的化フォーマットでの産生のための親和性に基づいて選択した。図４Ｆ及び４Ｇでは、ヒトＦＡＰに対するｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ １＋１フォーマットにおける同じＦＡＰ標的二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗体変異体の結合を示す。ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）又はヒトＦＡＰを発現する３Ｔ３細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８））への結合の、陰性対照（抗ＤＰ４７）及びＴＧＮ１４１２（分子Ａ）と比較した、フローサイトメトリーによって評価される蛍光強度の中央値が提供される。ＳＥＭによる技術的三連を示す。ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ １＋１フォーマットにおける選択されたＦＡＰ標的二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗体変異体のインビトロ効力を図４Ｈ、４Ｉ及び４Ｊに例示する。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、限界濃度のＭＣＳＰ－ＴＣＢ（５ｐＭ、Ｐ１ＡＤ２１８９）及び指示されるＣＤ２８変異体結合因子を含むＦＡＰ－ＣＤ２８コンストラクトの漸増濃度の存在下で、ＭＣＳＰ発現及びＦＡＰ発現のＭＶ３メラノーマ細胞と５日間インキュベートした。図４Ｈでは、フローサイトメトリーによって評価した、ＣＤ８ Ｔ細胞のＴ細胞増殖の尺度としてのＣＦＳＥ希釈を示す。エラーバーはＳＥＭを示し、グラフは２人のドナーからの代表的な結果の技術的三連を示す。図４Ｉには、親ＴＧＮ１４１２クローン（ＣＤ２８（ＳＡ））の％としての（ａ）の曲線下面積による効力に対するＣＤ２８結合因子変異体のＫＤ（ｎＭ）の相関を示す。図４Ｊには、９０時間での標的細胞死滅を示す。 図５Ａ～５Ｄは、高密度（ＨＤ）前培養及びＣＤ２８（ＳＡ）の作用様式の確立を示す。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を高密度（ＨＤ）で２日間前培養するか、又はＰＢＭＣ単離から新たに使用し、漸増濃度のＣＤ２８（ＳＡ）で刺激した。ＣＤ２８（ＳＡ）（分子Ａ、Ｐ１ＡＥ１９７５）で５日間刺激した後のＴ細胞増殖（図５Ａ）及び刺激の２日後のサイトカイン分泌（図５Ｂ）の代用としてのＣＦＳＥ希釈を示す。図５Ｃは、フローサイトメトリーによって評価した、ＨＤ ＰＢＭＣ前培養の２日前及び２日後のＰＢＭＣ単球及びＢ細胞におけるＦｃγＲＩＩｂ発現の割合を示す。図５Ｄ：ＨＤ前培養ＰＢＭＣを、ＦｃγＲＩＩｂブロッキング抗体又はアイソタイプコントロールの存在下又は非存在下でＣＤ２８（ＳＡ）と５日間共培養し、ＣＤ４ Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈率をフローサイトメトリーによって評価した。グラフは、少なくとも６人のドナー（図５Ａ、５Ｂ）及び２人のドナー（図５Ｃ、５Ｄ）の代表であり、それぞれ独立した実験で評価される。グラフは、技術的三連を示す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定によって統計分析を行った。＊＊＊＝ｐ＜０．００１ＣＤ２８（ＳＡ）ＩｇＧ４のスーパーアゴニズムは、ＦｃγＲＩＩｂへの架橋に依存する。 図６Ａ及び６Ｂでは、元のＦｃ野生型ＩｇＧ４ ＣＤ２８（ＳＡ）（Ｐ１ＡＥ１９７５）又はＰ３２９Ｇ－ＬＡＬＡ変異を持つＣＤ２８（ＳＡ）（Ｐ１ＡＤ９２８９）のいずれかで５日間刺激した後のＴ細胞増殖、すなわちＣＤ４Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈が示されている。Ｔ細胞を高密度で２日間前培養した。グラフは、少なくとも３つの独立した実験を表す。技術的三連を示す。Ｆｃサイレンシングは、ＴＧＮ１４１２におけるスーパーアゴニズムを消失させる。腫瘍標的化部分をＦｃサイレンシングＴＧＮ１４１２に付加すると、スーパーアゴニズムが回復し、スーパーアゴニズムはその後、腫瘍標的の存在に依存する。 図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ及び７Ｄには、異なるフォーマット（２＋２及び１＋２）でのＦＡＰ標的化ＣＤ２８アゴニストと、スーパーアゴニスト（ＣＤ２８（ＳＡ））結合因子及び従来のアゴニスト結合因子（９．３、ＣＤ２８（ＣＡ））との比較を示す。従来のＣＤ２８アゴニスト結合因子を有するＦＡＰ標的化ＣＤ２８アゴニストは、スーパーアゴニストとして機能しない。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、スーパーアゴニスト結合因子（ＳＡ、図７Ａ）又は従来のアゴニスト結合因子（９．３、図７Ｂ）を有する漸増濃度のＦＡＰ－ＣＤ２８フォーマットの存在下で、３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞（ＦＡＰが存在する）と５日間共培養した。Ｔ細胞増殖が示される。次いで、ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、スーパーアゴニスト結合因子（ＳＡ、図７Ｃ）又は従来のアゴニスト結合因子（９．３、図７Ｄ）を含む漸増濃度のＦＡＰ－ＣＤ２８フォーマットの存在下で、３Ｔ３ ＷＴ細胞（ＦＡＰ非存在）とも５日間共培養した。刺激後５日目にフローサイトメトリーによって評価した、ＣＤ８ Ｔ細胞のＴ細胞増殖の尺度としてのＣＦＳＥ希釈を示す。グラフは、３つの独立した実験における３人のドナーからの累積データを示す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。同じ実験設定において、サイトカインもまた、共培養の２日後に上清から測定した。値を図７Ｅに示す。ＦＡＰ発現ＲＦＰ－ＭＶ３メラノーマ細胞の死滅を誘導する、スーパーアゴニストＣＤ２８（ＳＡ）結合因子又は従来のアゴニスト結合因子（ＣＤ２８（ＣＡ））のどちらかによる様々なフォーマットのＦＡＰ－ＣＤ２８の能力を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ技術を使用する生細胞イメージングによって９０時間にわたって評価した。ＦＡＰ－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ４６４５）を含む全ての分子を１０ｎＭで使用した。 図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、それぞれ技術的三連を有する３人のドナーからの代表的な結果を示す。図８Ｄは、３回の独立した実験からの３人のドナーのｔ＝９０時間での曲線下面積（ＡＵＣ）として表される累積結果を示す。ボックスは２５～７５パーセンタイルを表示し、ひげは最小から最大までを表示する。統計分析は、対の一元配置ＡＮＯＶＡによって実施した。＊＊＊：ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意性なし。 様々な形式のＣＥＡ標的化ＣＤ２８アゴニストとスーパーアゴニスト結合因子及び従来のアゴニスト結合因子との比較を図９Ａ及び９Ｂに示す。スーパーアゴニストＣＤ２８（ＳＡ）結合因子又は従来のアゴニスト結合因子ＣＤ２８（ＣＡ））のいずれかを用いた様々なフォーマットのＣＥＡ－ＣＤ２８がＣＥＡ発現ＲＦＰ＋ＭＫＮ４５胃がん細胞の死滅を誘導する能力を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ技術を用いた生細胞イメージングによって９０時間にわたって評価した。ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ５２９９）を含む全ての分子を１０ｎＭで使用した。図９Ａは、技術的三連を有する１人のドナーからの代表的な結果を示す。図９Ｂは、１回の実験における１人のドナーのｔ＝９０時間での曲線下面積（ＡＵＣ）として表される技術的三連の統計分析を示す。ボックスは２５～７５パーセンタイルを表示し、ひげは最小から最大までを表示する。統計分析は、対の一元配置ＡＮＯＶＡによって実施した。＊＊＊＝ｐ＜０．００１従来のＣＤ２８アゴニスト結合因子を有するＣＥＡ標的ＣＤ２８アゴニストは、スーパーアゴニスト性に挙動しないことが示されている。 図１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃには、一価のスーパーアゴニスト性結合因子を有する標的ＣＤ２８アゴニストは機能的にスーパーアゴニスト性ではないことを示す。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、漸増濃度の二価のＣＤ２８結合因子を有するＦＡＰ－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＤ９０１１、黒丸）又はＣＤ２８結合因子について一価のＦＡＰ－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＤ４４９２、白丸）の存在下、３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞と５日間共培養した。図１０Ａでは、ＣＤ８ Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈を示す。更に、Ｔ細胞の活性化を、フローサイトメトリーによる活性化マーカーＣＤ６９（図１０Ｂ）及びＣＤ２５（図１０Ｃ）の検出によって評価した。ＣＤ６９染色及びＣＤ２５染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を刺激の５日後に示す。１人のドナーからの技術的三連が示され、エラーバーはＳＥＭを示す。ＴＧＮ１４１２様スーパーアゴニズムは多価ＣＤ２８結合を必要とすることが示されている。 図１１Ａ及び１１Ｂは、Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）と組み合わせた場合、ＴＣＢ媒介エフェクター機能が、同程度の効力を有するＦＡＰ標的アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の一価及び二価のＣＤ２８結合によって支持されるが、ＣＤ２８結合因子の一価性は、ＴＣＢの存在下でＣＤ２８アゴニストの腫瘍標的依存性を維持するために必要であることを示す。図１１Ａでは、ＦＡＰの存在のために、ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、組み合わせた限界濃度のＭＣＳＰ－ＴＣＢ（５ｐＭ、Ｐ１ＡＤ２１８９）及び漸増濃度（０～１０ｎＭの範囲）のＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）の存在下、それぞれＣＤ２８への二価又は一価の結合と共に、ＭＣＳＰ発現及びＦＡＰ発現のＭＶ３メラノーマ細胞と９０時間インキュベーションした。ＩｎｃｕＣｙｔｅ技術を用いた生細胞イメージングによって評価した９０時間での標的細胞死滅を示す。図１１Ｂでは、ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、それぞれ二価又は一価のＣＤ２８結合を有するＦＡＰ－ＣＤ２８と組み合わせて、及び漸増濃度（０～１０ｎＭの範囲）のＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ（１０ ｐＭ、Ｐ１ＡＤ５２９９）の存在下で、ＦＡＰ陰性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５胃がん細胞（ＦＡＰ非存在）と９０時間共培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅによって評価した９０時間での標的細胞死滅を示す。データは、経時的なＭＫＮ４５標的細胞の死滅を示し、１つの実験における１つのドナーから、技術的三連、エラーバーはＳＥＭを示す。 図１２Ａ及び１２Ｂには、ＣＤ２８への二価結合を有するＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）は、Ｔ細胞の二重特異性と組み合わされたとき、ＦＡＰ依存性を失うことを示す。図１２Ａには、ＴＣＢは存在しない。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、漸増濃度のＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）２＋１の存在下において、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５及び３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ（「ＦＡＰ存在」条件、黒丸）又は３Ｔ３－ＷＴ（「ＦＡＰ非存在」条件、白丸）とそれぞれ共培養した。ＴＣＢとの組み合わせを図１２Ｂに示す。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、それぞれＣＥＡ発現ＭＫＮ４５及び３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ（「ＦＡＰ存在」条件、黒丸）又は３Ｔ３－ＷＴ（「ＦＡＰ非存在」条件、白丸）と、限界濃度のＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ（１０ｐＭ、Ｐ１ＡＤ５２９９）及び漸増濃度のＦＡＰ－ＣＤ２８ ２＋１ ＳＡの存在下で共培養した。刺激の５日後のＣＤ８ Ｔ細胞増殖が示されている。データは、２人のドナーを用いた２回の独立した実験の代表である。１人のドナーからの結果を示し、データ点は技術的三連を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。 図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは、異なるフォーマットでＣＤ２８に一価結合するＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）抗原結合分子の機能性を示す。分子ＣはＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）古典的１＋１フォーマット（Ｐ１ＡＤ４４９２）であり、分子ＨはＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋１「ヘッドトゥーテイル」（Ｈ２Ｔ）フォーマットＰ１ＡＥ２０２１）であり、分子ＩはＦＡＰ結合因子のＣ末端融合を有するＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋１フォーマット（Ｐ１ＡＥ２２３６）であり、分子ＧはＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）２＋１フォーマット（Ｐ１ＡＤ５２３１）である。参照として、二価ＣＤ２８抗原結合分子（Ｐ１ＡＤ９０１１）を使用した。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、限定的な濃度のＭＣＳＰ－ＴＣＢ（５ｐＭ、Ｐ１ＡＤ２１８９）及び漸増濃度（範囲０～１０ｎＭ）の所与のフォーマットのＦＡＰ－ＣＤ２８の存在下で、ＭＣＳＰ発現及びＦＡＰ発現のＭＶ３メラノーマ細胞とインキュベーションした。フローサイトメトリーによって評価した、５日後のＣＤ８ Ｔ細胞（図１３Ａ）及びＣＤ４ Ｔ細胞（図１３Ｂ）のＴ細胞増殖の尺度としてのＣＦＳＥ希釈を示す。図１３Ｃ：５ｐＭ ＭＣＳＰ－ＴＣＢと様々なフォーマットのＦＡＰ－ＣＤ２８の濃度の増加との組み合わせと比較して、５ｐＭ ＭＣＳＰ－ＴＣＢ単独の存在下で８４時間にわたってＭＶ３細胞を死滅させることを示す。ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムを使用した生細胞イメージングによって死滅を評価した。全ての分子がＴＣＢ媒介エフェクター機能を支持することができた。グラフは、３つの独立した実験及び４人のドナーからの累積データを示す。 １０ ｐＭ ＭＣＳＰ－ＴＣＢ；Ｅ：Ｔ ２０；統計：二元配置ＡＮＯＶＡ。星印は、ＴＣＢ単独よりもアドオンが有意である最低濃度を示す：＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１。エラーバーは、ＳＥＭを示す。 ＴＣＢと組み合わせたＣＥＡ－ＣＤ２８ １＋１フォーマットの標的細胞死滅を図１４に示す。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、２ｎＭのＣＥＡ－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＥ３１２７）又は非標的ＣＤ２８（Ｐ１ＡＤ８９４４）と組み合わせた限界濃度のＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ（１０ｐＭ、Ｐ１ＡＤ５２９９）の存在下で、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５胃がん細胞と９０時間共培養した。データは、１つの実験における１人のドナーからの経時的なＭＫＮ４５標的細胞の死滅を示す。ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムを使用した生細胞イメージングによって死滅を評価した。組み合わせのみが標的細胞の死滅をもたらし、所与の濃度では分子単独では死滅を誘導しないことが示されている。ＣＥＡ－ＣＤ２８はＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢと相乗作用する。 図１５では、ＣＥＡ－ＣＤ２８がＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢを増強し、ＴＣＢのＣＥＡ発現の閾値を低下させてＴ細胞活性化を誘導することを示す。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、異なるＣＥＡ発現レベルを有する標的細胞株の存在下で、漸増濃度のＣＥＡ－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ４６４６）又はＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ５２９９）及び固定濃度のＣＥＡ－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＥ３１２７）のいずれかとインキュベートした：（ｉ）ＭＫＮ４５（高発現、約４０００００のＣＥＡ結合部位／細胞）、（ｉｉ）Ｌｏｖｏ（中程度の発現、およそ６００００のＣＥＡ結合部位／細胞）、（ｉｉｉ）ＨＴ－２９（低発現、約６０００のＣＥＡ結合部位／細胞）。Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーによるＴ細胞活性化の代用として評価した。 細胞上のＣＤ２８に対する二重特異性ＣＥＡ標的化一価１＋１フォーマットの選択された親和性低減ＣＤ２８結結合因子変異体の結合を図１６に示す。ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）に対するＣＥＡ－ＣＤ２８抗体又は抗ＤＰ４７抗体（陰性対照）の結合の蛍光強度中央値をフローサイトメトリーによって評価した。ＳＥＭによる技術的三連を示す。 図１７Ａ、１７Ｂ及び１７Ｃは、二重特異性ＣＥＡ標的化一価１＋１フォーマットにおける選択された親和性低減ＣＤ２８結合因子変異体の官能性を示す。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、ＣＤ２８結合因子変異体を含む２ｎＭのＣＥＡ－ＣＤ２８ １＋１分子と組み合わせて、限界濃度のＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ（１０ｐＭ、Ｐ１ＡＤ５２９９）の存在下でＣＥＡ発現ＭＫＮ４５胃がん細胞と共培養した。ＣＤ８ Ｔ細胞増殖（図１７Ａ）及びＣＤ４ Ｔ細胞増殖（図１７Ｂ）を、共培養の５日後にフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ希釈によって評価した。標的細胞の死滅を９０時間のインキュベーション後に評価した（図１７Ｃ）。データは、１つの実験における１人のドナーからの経時的なＭＫＮ４５標的細胞の死滅を示す。全ての分子は、ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ媒介エフェクター機能を支持することができる。 図１８は、親マウスＡ５Ｂ７抗体の結合と比較した、ヒト化ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異体のＭＫＮ－４５への結合を示す。抗体は、蛍光標識した二次抗体で検出し、フローサイトメトリーにより蛍光を測定した。 図１９Ａ～１９Ｃは、ファージディスプレイキャンペーンにおいて抗原として使用されたＣＥＡＣＡＭ５タンパク質の異なるドメインを提示する組換えタンパク質の概略図である。図１９Ａは、４つのＩｇ様ドメインＮ、Ａ１、Ｂ及びＡ２からなるコンストラクトＮＡＢＡ－ａｖｉ－Ｈｉｓを示す。図１９Ｂは、コンストラクトＮ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓを示し、図１９Ｃは、コンストラクトＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓを示す。 図２０Ａ及び２０Ｂは、ヒト化ＣＥＡ抗体Ａ５Ｈ１ＥＬ１ＤのＶＨ配列及びＶＬ配列をそれぞれ示し、ランダム化された位置はＸでマークされている。 親和性成熟ライブラリのファージベクターの概略図を図２１Ａ（ＣＤＲＨ１／Ｈ２親和性成熟ライブラリ）、図２１Ｂ（ＣＤＲＬ１／Ｈ２親和性成熟ライブラリ）及び図２１Ｃ（ＣＤＲＨ３／ＣＤＲＬ３増幅ライブラリ）に示す。 図２２Ａ及び２２Ｂは、親和性成熟ヒト化ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）抗体変異体のＶＨアミノ酸配列（図２２Ａ）及びＶＬアミノ酸配列（図２２Ｂ）のアラインメントを示す。 図２３Ａ～２３Ｄには、実施例１１に記載される二重特異性ＣＥＡ／ＣＤ２８抗原結合分子の概略図を示す。図２３Ａは、１＋１フォーマットの二重特異性ＣＥＡ－ＣＤ２８抗原結合分子を示し、ＣＥＡ抗原結合ドメインはクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として提示され、ＣＤ２８抗原結合ドメインを有するＦａｂ断片には、軽鎖の正しい対合を支持するために荷電修飾が存在する。Ｆｃドメインは、ホール修飾へのノブ及びＦｃγ受容体への結合を無効にするためのＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する。図２３Ｂでは、ＣＤ２８抗原結合ドメインはクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として表され、ＣＥＡ抗原結合ドメインを担持するＦａｂ断片は荷電修飾を含む。図２３Ｃは、ＣＤ２８抗原結合ドメインがクロスＦａｂとして表され、ＣＥＡ抗原結合ドメインを有する２つのＦａｂ断片が重鎖（ヘッドトゥーテイル）を介して互いに融合されている、２＋１フォーマットの二重特異性ＣＥＡ－ＣＤ２８抗原結合分子を示す。図２３Ｄは、ＣＤ２８抗原結合ドメインが、そのＣ末端において「二価」ＣＥＡ抗体の重鎖のうちの１つのＮ末端に融合されるクロスＦａｂとして表される、２＋１フォーマットの二重特異性ＣＥＡ－ＣＤ２８抗原結合分子を例示する（「古典的」フォーマット）。 図２４では、親和性成熟抗ＣＥＡクローンＰ００２．１３９が、ＣＥＡ発現ＭＶ３細胞上のＣＥＡＣＡＭ５への結合の改善を示すことを示す。親和性成熟抗ＣＥＡクローンＰ００２．１３９又は親Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄクローンのいずれかを有するＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗体の結合を示す。ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現するように遺伝子操作されたＭＶ３細胞へのＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗体又は抗ＤＰ４７抗体（陰性対照）の結合の蛍光強度中央値をフローサイトメトリーによって評価した。ＳＥＭによる技術的複製を示す。グラフは、３つの独立した実験の代表である。 図２５Ａ及び２５Ｂには、親和性成熟抗ＣＥＡクローンＰ００２．１３９がＩＬ－２レポーターアッセイにおいて改善された機能性を示すことを示す。親和性成熟クローンＰ００２．１３９又は親クローンＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄのいずれかを保有するＭＫＮ４５細胞、ＩＬ－２レポーター細胞と５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ－ＣＤ２８との６時間の同時インキュベーション後の発光読み出しを示す。図２５Ａは、用量応答を示す。点線は、ＣＥＡ－ＴＣＢ単独によって達成される発光を示す。図２５Ｂには、図２５Ａに示すデータから計算された曲線下面積値を示す。ＳＥＭによる技術的複製を提供する。グラフは、３つの独立した実験の代表である。 図２６は、ヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片におけるＣＥＡ ＴＣＢと組み合わせた二重特異性ＣＥＡ－ＣＤ２８抗体（異なるＣＥＡクローンの比較）による有効性研究の研究計画を示す図である。計画及び種々の処置群を示す。 図２７Ａ～２７Ｅは、ヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片におけるＣＥＡ－ＣＤ２８及びＣＥＡ ＴＣＢの組み合わせを用いた有効性試験の結果を示す。４つの処置群についての個々のマウスにおける平均腫瘍体積（図２７Ａ）又は腫瘍増殖をｙ軸にプロットして示す（図２７Ｂ～２７Ｅ）。図２７Ｂは、ビヒクル群の各個々のマウスの腫瘍増殖を示し、図２７Ｃは、ＣＥＡ ＴＣＢ単独で処置したマウスの腫瘍増殖を示し、図２７Ｄは、ＣＥＡ ＴＣＢ及びＣＥＡ（Ｔ８４．６６）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）で処置したマウスの腫瘍増殖を示し、図２７Ｅは、ＣＥＡ ＴＣＢ及びＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）で処置したマウスの腫瘍増殖を示す。両方の二重特異性ＣＥＡ－ＣＤ２８抗体の存在下でＴＣＢ媒介性腫瘍退縮が増加していることが分かる。 図２８は、ヒト化マウスにおけるＢＸＰＣ３異種移植片におけるＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢと組み合わせた二重特異性ＣＥＡ－ＣＤ２８抗体（異なるＣＤ２８クローンの比較）による有効性研究の研究計画を示す図である。計画及び種々の処置群を示す。 図２９は、全ての処置群についての腫瘍増殖速度論（平均、＋ＳＥＭ）を示し、各処置群の対応するＴＧＩ値を表３３に示す（実施例１３．２）。 エクスビボＩｍｍｕｎｏ－ＰＤデータを図３０Ａ～３０Ｄに示す。図３０Ａは、各処置アームの染色された腫瘍単一細胞懸濁液の代表的なドットプロット（ＣＤ４５に対するＣＤ３及びＣＤ８に対するＣＤ４）を示す。ＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞浸潤の概要を、それぞれ図３０Ｂ（ＣＤ３）、図３０Ｃ（ＣＤ８）及び図３０Ｄ（ＣＤ４）に示す。 図３１は、ヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片におけるＣＥＡ ＴＣＢと組み合わせた二重特異性ＣＥＡ－ＣＤ２８抗体（ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８））による有効性試験の研究計画を示す。計画及び種々の処置群を示す。 図３２は、全ての処置群についての腫瘍増殖速度論（平均、＋ＳＥＭ）を示し、各処置群の対応するＴＧＩ値を以下の表３５（実施例１３．３）に示す。 エクスビボＩｍｍｕｎｏ－ＰＤデータを図３３Ａ及び３３Ｂに示す。図３３Ａは、各処置アームの染色された腫瘍単一細胞懸濁液の代表的なドットプロットを示す。ＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤の概要を図３３Ｂに示す。 図３４Ａ～３４Ｄには、実施例１４に記載される二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子の概略図を示す。図３４Ａは、１＋１フォーマットの二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８抗原結合分子を示し、ＣＤ２８抗原結合ドメインはクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として提示され、ＥｐＣＡＭ抗原結合ドメインを有するＦａｂ断片には、軽鎖の正しい対合を支持するために荷電修飾が存在する。Ｆｃドメインは、ホール修飾へのノブ及びＦｃγ受容体への結合を無効にするためのＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する。図３４Ｂには、ＣＤ２８抗原結合ドメインを有するＦａｂは荷電修飾を含み、ＨＥＲ３抗原結合ドメインを有するＦａｂはクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として表される。図３４Ｃは、ＣＤ２８抗原結合ドメインを有するＦａｂ分子が荷電修飾を含み、ＣＤ３０抗原結合ドメインを有するＦａｂがクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として表される、１＋１フォーマットの二重特異性ＣＤ３０－ＣＤ２８抗原結合分子を示す。図３４Ｄは、ＣＤ２８抗原結合ドメインを有するＦａｂ分子が荷電修飾を含み、ＴＰＢＧ（５Ｔ４）抗原結合ドメインを有するＦａｂがクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として表される、１＋１フォーマットの二重特異性ＴＰＢＧ－ＣＤ２８抗原結合分子を示す。 図３５Ａ～３５Ｃは、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子の機能的特性評価に関する。図３５Ａには、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（分子１４Ａ）が、フローサイトメトリーによって評価される、ＣＤ２８を発現するＣＨＯ－ｋ１細胞上のヒトＣＤ２８に結合することを示す。フローサイトメトリーによって評価したＨＴ２９細胞上のＥｐＣＡＭへの結合を図３５Ｂに示す。抗ＤＰ４７は、抗体化合物の細胞への非特異的結合に対する陰性対照としての役割を果たした。ドットは、技術的複製の手段を表す。図３５Ｃには、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＥ９０５１）がＩＬ－２レポーターアッセイにおいて抗ＣＤ３刺激に対するＴ細胞応答を増強することを示す。最適以下の濃度の抗ＣＤ３ ＩｇＧ（１０ｎＭ）及び漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８の存在下でのＨＴ－２９との６時間の共インキュベーション後の発光読み出しによって測定したＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。ドットは、技術的複製の手段を表す。 図３６Ａ～３６Ｃは、ＨＥＲ３－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子の機能的特性評価に関する。図３６Ａには、ＨＥＲ３－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＦ０１５１）が、フローサイトメトリーによって評価される、ＣＤ２８を発現するＣＨＯ－ｋ１細胞上のヒトＣＤ２８に結合することを示す。フローサイトメトリーによって評価した、Ｔ－４７Ｄ細胞上のＨＥＲ３に対するＨＥＲ３－ＣＤ２８の結合を図３６Ｂに示す。抗ＤＰ４７は、抗体化合物の細胞への非特異的結合に対する陰性対照としての役割を果たした。ドットは、技術的複製の手段である。図３６Ｃには、ＨＥＲ３－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＦ０１５１）がＩＬ－２レポーターアッセイにおいて抗ＣＤ３刺激に対するＴ細胞応答を増強することを示す。最適以下の濃度の抗ＣＤ３ ＩｇＧクローンＯＫＴ３（１０ｎＭ）及び漸増濃度のＨＥＲ３－ＣＤ２８の存在下でのＴ－４７Ｄ細胞との６時間の共インキュベーション後の発光読み出しによって測定したＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。ドットは、技術的複製の手段を表す。 図３７Ａ～３７Ｃには、実施例１６に記載される多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原を標的とする二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子の概略図を示す。図３７Ａは、１＋１フォーマットの二重特異性ＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＤ２８抗原結合分子を示し、ＣＤ２８抗原結合ドメインはクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として提示され、ＣＰＲＣ５Ｄ抗原結合ドメインを有するＦａｂ断片には、軽鎖の正しい対合を支持するために荷電修飾が存在する。Ｆｃドメインは、ホール修飾へのノブ及びＦｃγ受容体への結合を無効にするためのＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する。図３７Ｂには、ＣＤ２８抗原結合ドメインを有するＦａｂは荷電修飾を含み、ＣＤ３８抗原結合ドメインを有するＦａｂはクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として表される。図３７Ｃは、ＣＤ２８抗原結合ドメインを有するＦａｂ分子をクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として表し、ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを有するＦａｂが荷電修飾を含む、１＋１フォーマットの二重特異性ＢＣＭＡ－ＣＤ２８抗原結合分子を示す。図３７Ｄは、２＋１フォーマットの抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ）を例示し、ＧＰＣＲ５Ｄ抗原結合ドメインを有するＦａｂ分子は荷電修飾を含み、ＣＤ３抗原結合ドメインを有するＦａｂはクロスＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ交換）として表される。 図３８Ａ～３８Ｆは、ＣＤ２８及び多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子の細胞（実施例１７．１）への結合に関する。ＣＨＯ ｈｕＣＤ２８ ｃｌ４５細胞上のヒトＣＤ２８（図３８Ａ及び３８Ｅ）、ＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞上のヒトＣＤ３８（図３８Ｂ）、ＩＭ－９細胞上のヒトＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原、図３８Ｃ）及び示されている細胞株上に発現されたＣＨＯ ｈｕＧＰＲＣ５Ｄ Ｌ２細胞上のヒトＧＰＲＣ５Ｄ（図３８Ｄ及び３８Ｆ）のいずれかに対する二重特異性抗原結合分子の結合を示す。ＳＤを有する二連からの相対蛍光中央値（ＭＦＩ）を示す。結合のＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍによって計算し、表３８に含めた。 ＩＬ－２レポーターアッセイで評価したＣＤ２８及び多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子のＴ細胞活性化を図３９Ａ～３９Ｆに示す。発光によって決定した、５時間及び２２時間のインキュベーション後のＩＬ２レポーター細胞アッセイを示す。ＩＬ２レポーターエフェクター及びＧＰＲＣ５Ｄ発現標的細胞を、５：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）でインキュベートした。ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを１ｎＭの固定最終アッセイ濃度で添加し、示されたＭＭ標的ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子を示されたように滴定した。代表的な用量反応曲線を、ＣＤ３８－ＣＤ２８については図３９Ａ（５時間のインキュベーション後）及び図３９Ｂ（２２時間後）、ＢＣＭＡ－ＣＤ２８については図３９Ｃ（５時間後）及び図３９Ｄ（２２時間後）、並びにＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＤ２８については図３９Ｅ（５時間後）及び図３９Ｆ（２２時間のインキュベーション後）に示す。 図４０Ａ～４０Ｃは、０．２ｎＭの指定のＣＤ２８二重特異性分子ＣＤ３８－ＣＤ２８（図４０Ａ）、ＢＣＭＡ－ＣＤ２８（図４０Ｂ）及びＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＤ２８（図４０Ｃ）の存在下でのＧＰＲＣ５Ｄ発現ＭＭ細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９のＴ細胞媒介溶解のブーストを示す。ヒトｐａｎ Ｔ細胞とＭＭ腫瘍標的細胞とを最終Ｅ：Ｔ比１：１で２２時間共インキュベートした後、溶解を決定した。ＳＤを有する技術的複製を示す。腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値及び曲線下面積をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍによって計算し、表３９に示す。 図４１Ａは、実施例１８に記載される１＋１フォーマットの二重特異性ＣＤ１９－ＣＤ２８抗原結合分子の概略図を示し、ＣＤ１９抗原結合ドメインを含むＦａｂでは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが互いに交換され（ＶＨ／ＶＬクロスＦａｂ）、ＣＤ２８抗原結合ドメインを含むＦａｂでは、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸が交換されて（電荷変異体）、軽鎖とのより良好な対合が可能になる。図４１Ｂは、ＣＤ１９抗原結合ドメインがＣＤ７９ｂ抗原結合ドメイン（抗ＣＤ７９ｂ クロスＦａｂ）によって置き換えられている対応する分子を示す。 図４２は、コンストラクトＣＤ７９ｂ（ｈｕＭＡ７９ｂ．ｖ ２８）－ＣＤ２８（ｖ１５）１＋１におけるＣＤ７９ｂ（ポラツズマブ）の動態パラメータ及び熱力学パラメータの決定に関する。可溶性組換えＣＤ７９ｂ－Ｈｉｓを抗ペンタ－Ｈｉｓ抗体を介してＣＭ５チップ上に捕捉し、二重特異性ＣＤ７９ｂ（ｈｕＭＡ７９ｂ．ｖ２８）－ＣＤ２８（ｖ１５）１＋１を分析物として使用した。平滑線は、１：１相互作用モードへのデータの大域的適合を表す。 図４３Ａには、異なるレベルのＣＤ１９を発現する４つの異なるＢ細胞株に対するＣＤ１９－ＣＤ２８変異体１５（Ｐ１ＡＥ９０４０）の結合の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す。結合をフローサイトメトリーによって評価した。ＳＥＭによる技術的複製を示す。図４３Ｂには、４つの異なるＢ細胞株（ＭＦＩ）のＣＤ１９のＦＡＣＳ染色を示す。 細胞上のヒトＣＤ１９及びＣＤ２８に対する様々なＣＤ２８親和性を有するＣＤ１９－ＣＤ２８の結合を図４４Ａ及び４４Ｂに示す。ＣＨＯｋ１－ＣＤ２８細胞への結合（図４４Ａ）及びＮａｌｍ６ Ｂ細胞上のＣＤ１９への結合（図４４Ｂ）の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す。ドットは、ＳＥＭによる技術的複製を表す。対応するＥＣ５０値を実施例２０の表４２（ＣＨＯｋ１－ＣＤ２８）及び表４３（Ｎａｌｍ６）に示す。結合をフローサイトメトリーによって評価した。 図４５Ａ～４５Ｄでは、ＣＤ１９－ＣＤ２８ｖ１５が、異なるＢ細胞株の存在下でＩＬ－２レポーターアッセイにおいてＣＤ２０－ＴＣＢを増強することが示されている。最適以下の濃度のＣＤ２０－ＴＣＢ及び漸増濃度のＣＤ１９－ＣＤ２８ｖ１５の存在下での異なるＢ細胞株との６時間の共インキュベーション後の発光読み出し（ＬＵＭ）によって測定したＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。ドットは、ＳＥＭによる技術的複製を表す。最適以下のＣＤ２０－ＴＣＢ濃度は標的細胞株によって異なる：Ｎａｌｍ６については１０ｎＭ、ＲＣＫ８、ＷＳＵ ＤＬＣＬ２及びＺ１３８については０．０５ｎＭ。 図４６は、様々なＣＤ２８親和性を有するＣＤ１９－ＣＤ２８がＣＤ２０－ＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化を増強することを示す。最適以下の濃度のＣＤ２０－ＴＣＢ（１０ｎＭ）及び漸増濃度のＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ１５の存在下でのＮａｌｍ６ Ｂ細胞との６時間の共インキュベーション後の発光読み出し（ＬＵＭ）によって測定したＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。ドットは、ＳＥＭによる技術的複製を表す。ＣＤ２０発現標的細胞（Ｎａｌｍ６）（Ｅ：Ｔ比５：１）及びＣＤ１９－ＣＤ２８と共培養した後のＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の活性化状態を、ＣＤ２０－ＴＣＢの非存在下又は存在下で評価した。 ＴＣＲシグナルの非存在下又は存在下におけるＣＤ１９－ＣＤ２８の活性を図４７に示す。Ｎａｌｍ ６細胞との共インキュベーションの４８時間後のＰＢＭＣ由来ＣＤ４ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示し、１０ｎＭ ＣＤ２０－ＴＣＢの存在下又は非存在下でのＣＤ１９－ＣＤ２８ｖ１５の濃度を増加させる。ドットは、ＳＥＭによる技術的三連を表す。 図４８Ａ～４８Ｄでは、ＣＤ１９－ＣＤ２８単独ではＰＢＭＣにおいてサイトカイン分泌を誘導しないことが例示されている。ＣＤ２０－ＴＣＢの存在下又は非存在下でＣＤ１９－ＣＤ２８分子と共培養した４８時間後の全ＰＢＭＣにおけるサイトカイン放出を示す。バーは、技術的三連の平均＋ＳＥＭを表す。データは２人のドナーの代表である。サイトカイン分泌をＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １７ ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙによって評価した。ＩＦＮγ（図４８Ａ）、ＩＬ－２（図４８Ｂ）、ＩＬ－１０（図４８Ｃ）及びＴＮＦ（図４８Ｄ）を示す。 図４９Ａ及び４９Ｂでは、ＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８に関する機能データが、Ｚ１３８ Ｂ細胞の存在下でのＩＬ－２レポーターアッセイにおいてＣＤ２０－ＴＣＢを増強することを示す。図４９Ａに、Ｚ１３８ Ｂ細胞上のＣＤ７９ｂへの結合の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す。図４９Ｂでは、ＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８がＺ１３８ Ｂ細胞の存在下でＩＬ－２レポーターアッセイにおいてＣＤ２０－ＴＣＢを増強することが示される。最適以下の濃度のＣＤ２０－ＴＣＢ及び漸増濃度のＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８の存在下での異なるＢ細胞株との６時間の共インキュベーション後の発光読み出し（ＬＵＭ）によって測定したＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。ドットは、ＳＥＭによる技術的複製を表す。 図５０は、ヒト化マウスにおけるＮＡＬＭ６異種移植片における二重特異性ＣＤ１９－ＣＤ２８抗体（２つの異なるＣＤ２８クローンの比較）を用いた有効性研究の研究計画を示す。計画及び種々の処置群を示す。 図５１Ａ～５１Ｄは、ヒト化マウスにおけるＮＡＬＭ６異種移植片におけるＣＤ１９－ＣＤ２８による有効性試験の結果を示す。３つの処置群についての個々のマウスにおける平均腫瘍体積（図５１Ａ）又は腫瘍増殖をｙ軸にプロットして示す（図５１Ｂ～５１Ｄ）。図５１Ｂは、ビヒクル群の個々のマウスの腫瘍増殖を示し、図５１Ｃは、ＣＤ１９－ＣＤ２８で処置したマウス（変異体１５）の図であり、図５１Ｄは、ＣＤ１９－ＣＤ２８で処置したマウス（変異体８）の図である。単剤としてのＣＤ１９－ＣＤ２８（変異体８）は、ＣＤ１９－ＣＤ２８（変異体１５）と比較してより強い腫瘍増殖阻害を誘導したことが分かる。
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数系で使用される用語は、単数形も含む。
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することが可能である。特定の態様では、抗原結合ドメインは、標的部位、例えば、特定の種類の腫瘍細胞、又は抗原決定基を有する腫瘍間質に結合する構成要素（例えばＣＤ２８抗体）を指令することができる。標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びその断片を含む。更に、標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照されたい）を含む。
抗原結合分子、すなわち抗体又はその断片に関して、「標的細胞抗原に結合する抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、抗原の一部又は全部に相補的である領域を含む分子の一部を指す。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により、提供されることができる。具体的には、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の態様では、「腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」は、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片であってもよい。別の態様では、「腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」は、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片であってもよい。本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどに関する「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、各タイプの部分が２つ以上存在する場合の区別の便宜のために使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、部分の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞表面抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な部分」という用語は、Ｂ細胞表面の抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することが可能である。特定の態様では、抗原結合ドメインは、それが結合している実体（例えば、ＣＤ２８アゴニスト）を標的部位、例えばＢ細胞上に向けることができる。Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びその断片を含む。更に、Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照されたい）を含む。
「多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原に特異的に結合可能な部分」という用語は、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞上の抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合ドメインは、それが結合している実体（例えば、ＣＤ２８アゴニスト）を標的部位、例えばＭＭ細胞上に向けることができる。多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインとしては、本明細書中で更に定義される抗体及びその断片が挙げられる。更に、Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照されたい）を含む。
本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する突然変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能な変異体抗体は除く。このような変異体は、一般的に、少量存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体の調製と比べて、モノクローナル抗体の調製における各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。
「単一特異性」抗体という用語は、本明細書で使用される場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。しかしながら、二重特異性抗原結合分子は、更なる抗原決定基に結合する更なる抗原結合部位も含み得る。特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞又は同じ細胞上に発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。したがって、本発明による「二重特異性」という用語は、三重特異性分子、例えばＣＤ２８抗体及び２つの異なる標的細胞抗原に向けられた２つの抗原結合ドメインを含む二重特異性分子も含み得る。
本出願の中で用いられる「－価」という用語は、１つの異なる抗原決定基に対して特異的である抗原結合分子内で、１つの異なる抗原決定基に対して特異的な結合部位が特定の数、存在することを意味する。そのため、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗原結合分子においてそれぞれ、特定の抗原決定基に対して特異的な、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを意味する。本発明の特定の態様では、本発明に従った二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができ、このことは、これらが、上記抗原決定基に対して１つのみの結合部位を有することを意味する。又は、これらは特定の抗原決定基に対して二価若しくは四価であることができ、このことは、これらが、上記抗原決定基に対してそれぞれ、２つの結合部位、若しくは４つの結合部位を有することを意味する。
「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「天然抗体」とは、様々な構造を有する、天然に発生する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、ネイティブＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、これらのいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプへ更に分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに分けられてもよい。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎら、「Ｎａｔ Ｍｅｄ」第９巻、第１２９～１３４頁（２００３年）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、第２６９～３１５頁（１９９４年）を参照されたく、また、国際公開第９３／１６１８５号並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合ドメインを含む抗体断片であり、例えば、ＥＰ ４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツウォルサム）例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」という用語は、軽鎖（ＣＬ）の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを含む、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。
「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであって、ここで、該抗体ドメイン及び該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する：（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ。ここで、上記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。上記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。更に、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「クロスオーバー一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する。（ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ。ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、また上記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。更に、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて連結された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを、又はその逆で接続することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。これに加え、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、全長抗体の抗原結合特性を与える。
「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されてきた。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５（２００９）ａｎｄ Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様では、スキャフォールド抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体β－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子も、エビボディとして知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７号Ｂ１）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２）、３１－４５（２００１）を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性βシート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７－３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７号Ｂ１及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのプロテインＡに由来する足場である。ドメインは、約５８アミノ酸の３つのラセン形の束からなる。ライブラリは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５－４６２及び欧州特許出願公開第１６４１８１８号Ａ１を参照されたい。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸のネイティブドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ－ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）、１５５６－１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）、９０９－９１７（２００７年６月）を参照されたい。トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４、２４０６６－２４０７３（１９９９）を参照。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の接着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαらせんとβターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のαらせん及びβターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９－５０３（２００３）、ＰＮＡＳ １００（４）、１７００－１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５－１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号Ａ１を参照。一本鎖ドメイン抗体は、一本の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。更に、単一ドメイン抗体という用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来ＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。ベータ－サンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５－４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号Ｂ１を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細について、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３－７９７（２００５）を参照されたい。ミクロボディは、３～４のシステイン架橋を含む、２５～５０アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。
「抗原結合ドメイン」という用語は、ある抗原の一部又は全てに特異的に結合し、ある抗原の一部又は全てに対して相補的な抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。本発明の抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブ形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「全長」の未処理のタンパク質、及び細胞の処理から得られるタンパク質の任意の形態を包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別できることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られた他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７、３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８、２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。
「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する特異的結合親和性を指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含むことができる。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「腫瘍関連抗原」又はＴＡＡは、本明細書で使用する場合、標的細胞、例えばがん細胞、腫瘍間質の細胞、悪性Ｂリンパ球又はメラノーマ細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。ある特定の態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一態様では、ＴＡＡは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ｐ９５ＨＥＲ２、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ３、ＣＤ３０又はＴＰＢＧ（５Ｔ４）、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ及びＧＰＲＣ５Ｄからなる群から選択される。特定の一態様では、ＴＡＡは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２からなる群から選択される。別の特定の態様では、ＴＡＡは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ３、ＣＤ３０又はＴＰＢＧ（５Ｔ４）からなる群から選択される。特定の一態様では、腫瘍関連抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。一態様では、ＴＡＡは、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ３７、特にＣＤ１９及びＣＤ７９ｂからなる群から選択されるＢ細胞表面抗原である。一態様では、ＴＡＡは、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ及びＧＰＲＣ５Ｄからなる群から選択される多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原である。
プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ ３．４．２１）としても知られている、「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＦＡＰを意味する。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＦＡＰ、及び細胞におけるプロセシングから生じるＦＡＰの任意の形態を包含する。この用語は、ＦＡＰの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合可能である。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号２）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２にて示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０まで伸びている。Ｈｉｓタグ化したヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号１３５に示されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号１３６）、又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１まで伸びている。配列番号１３７は、Ｈｉｓタグ化されたマウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。配列番号１３８は、Ｈｉｓタグ化されたカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、抗本発明のＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている、「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＥＡを意味する。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号３）に示されている。ＣＥＡは長らく、腫瘍関連抗原として識別されている（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１２１：４３９－４６２，１９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ Ｎ．Ｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２０：２１９７－２２０７，２００２）。元は、胎児組織のみで発現するタンパク質として分類されていたＣＥＡは現在、いくつかの健常な成人組織にて同定されている。これらの組織は主に、胃腸、呼吸、及び泌尿器管の細胞、並びに、結腸、子宮頸、汗腺、及び前立腺の細胞を含む、元々上皮に存在する（Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，９（２－３）：１４５－５３，１９８８；Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２（８）：２３２９－２３３３９，１９９２）。上皮由来の腫瘍、及びこれらの転移物は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含有する。ＣＥＡ自身が存在することは、がん性細胞への形質転換を意味するものではないものの、ＣＥＡが分布していることを示している。健常な組織において、ＣＥＡは一般的に、細胞の先端面にて発現し（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９（２）：６７－８１（１９９９））、血流にて抗体に接近できなくなる。健常な組織とは対照的に、ＣＥＡは、がん性細胞の全面にわたって発現する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９（２）：６７－８１（１９９９））。発現パターンのこの変化により、ＣＥＡが、がん性細胞内で抗体結合をしやすくなる。更に、ＣＥＡの発現は、がん性細胞にて増加する。更に、ＣＥＡの発現が増加することにより、細胞間の接着性が増加し、転移につながり得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｊ．，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，３０（ａ Ｓｕｐｐｌ．８）：３０－６，２００３）。様々な腫瘍構成要素におけるＣＥＡ発現の有症率は一般的に、非常に高い。公開されたデータに一致して、組織試料にて実施した自身の分析により、その高い有症率が確認され、結腸癌（ＣＲＣ）において約９５％、膵がんにおいて９０％、胃がんにおいて８０％、非小細胞肺がん（ＨＥＲ３と同時発現するＮＳＣＬＣ）において６０％、及び乳がんにおいて４０％であり、小細胞肺がん及びグリア芽腫においては低い発現が確認された。
ＣＥＡは速やかに細胞表面から切断され、腫瘍から直接、又は、リンパ系を介してのいずれかにより、血流に入る。この性質から、血清ＣＥＡの濃度は、がん診断のための臨床マーカー、及びがん、特に結腸直腸がんの再発のためのスクリーニングとして使用されてきた（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ Ｄ Ｍ．，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒｓ，７：１８３－１８８，１９９２；Ｃｈａｕ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２２：１４２０－１４２９，２００４；Ｆｌａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；１２（２３）：６９８５－６９８８，２００６）。
「上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物が供給源の任意の天然ＥｐＣＡＭを指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＥｐＣＡＭ、及び細胞におけるプロセシングから生じるＥｐＣＡＭの任意の形態を包含する。この用語はまた、ＥｐＣＡＭの天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＥｐＣＡＭに特異的に結合可能である。ヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ１６４２２（バージョン１６７、配列番号６８）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２３４５．２に示されている。マウスＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９９ＪＷ５（バージョン１１１、配列番号７５）又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２５５８．２に示されている。腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）、１７－１Ａ及びＣＤ３２６としても知られる、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、上皮起源のがんにおいて及びがん幹細胞によって頻繁に過剰発現されるＩ型約４０ｋＤａ膜貫通糖タンパク質であり、したがって、治療及び診断のための重要な関心対象の分子である。細胞外ドメインＥｐＣＡＭを切断して、可溶性細胞外ドメイン分子ＥｐＥＸ及び細胞内分子ＥｐＩＣＤを得ることができる。ＥｐＩＣＤは、他のタンパク質と会合して、細胞増殖を促進する遺伝子の発現を上方制御する核複合体を形成することが示されている。ＥｐＣＡＭはまた、上皮から間葉細胞への移行（ＥＭＴ）に関与し得、大きな転移の形成に寄与し得る。
「ＣＤ３０」又は「ＴＮＦＲＳＦ８」は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。これは、とりわけ、未分化大細胞リンパ腫及びホジキンリンパ腫を含む特定の造血性悪性腫瘍において特徴的に発現される。正常リンパ系細胞及び悪性リンパ系細胞の両方におけるＣＤ３０の可変的な発現は、ＣＤ３０上方制御の病因、抗アポトーシス機構を介したリンパ球形成へのその寄与、及び細胞生存に対するその効果を理解することに研究努力を集中させてきた。特定の腫瘍型に対するＣＤ３０の制限を考えると、これの論理的拡張は、治療標的としてそれを利用しようと試みることであった。ＣＤ３０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する１２０ｋＤ膜貫通糖タンパク質受容体であり、細胞内、膜貫通及び細胞外ドメインを有し、ヒトＣＤ３０のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２８９０８（配列番号４７２）に示されている。
「ＴＰＢＧ」という用語は、「５Ｔ４」とも呼ばれる栄養芽細胞糖タンパク質を指す。ＴＢＰＧは、細胞接着に関与するロイシンリッチ膜貫通糖タンパク質である。成人では、このタンパク質は多くの腫瘍細胞で高度に発現され、多くのがんにおける臨床転帰不良に関連する。この用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＴＰＢＧを指す。ヒトＴＰＢＧのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１３６４１（配列番号４７３）に示されている。
「ＦｏｌＲ１」という用語は、葉酸受容体アルファを指し、いくつかのがんにおける潜在的な予後及び治療標的として同定されている。この用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＦｏｌＲ１を指す。ヒトＦｏｌＲ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１５３２８（配列番号１３９）に示され、マウスＦｏｌＲ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３５８４６（配列番号１４０）のアミノ酸配列を有し、カニクイザルＦｏｌＲ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｇ７ＰＲ１４（配列番号１４１）に示されるアミノ酸配列を有する。ＦｏｌＲ１は、細胞の原形質膜上に発現されるＮ－グリコシル化タンパク質である。ＦｏｌＲ１は、葉酸及びいくつかの還元型葉酸誘導体に対して高い親和性を有し、生理学的葉酸塩である５－メチルテトラヒドロ葉酸塩の細胞内部への送達を媒介する。ＦＯＬＲ １は、卵巣がんの大部分、並びに多くの子宮がん、子宮内膜がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん及び乳がんで過剰発現されるが、正常組織でのＦＯＬＲ１の発現は、腎臓近位尿細管、肺の肺胞肺細胞、膀胱がん、精巣がん、脈絡叢及び甲状腺の上皮細胞の頂端膜に制限されるため、ＦＯＬＲ１指向性がん治療の望ましい標的である。最近の研究では、ＦｏｌＲ１発現がトリプルネガティブ乳がんにおいて特に高いことが同定されている（Ｎｅｃｅｌａ ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ２０１５，１０（３），ｅ０１２７１３３）。
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られている、「メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＭＣＳＰを意味する。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号１４２）に示されている。ＭＣＳＰは、Ｎ結合型２８０ ｋＤａ糖タンパク質成分及び細胞膜上に発現される４５０ ｋＤａコンドロイチン硫酸プロテオグリカン成分からなる高グリコシル化内在性膜コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８３，２２５：３７０－３８）。ＭＣＳＰは、多くの正常細胞及び形質転換細胞においてより広く分布している。特に、ＭＣＳＰは表皮のほとんど全ての基底細胞に見られる。ＭＣＳＰは、メラノーマ細胞において差次的に発現され、分析された良性母斑及びメラノーマ病変部の９０％超において発現されることが見出された。ＭＣＳＰはまた、基底細胞癌、神経堤起源の様々な腫瘍を含む非色素細胞起源の腫瘍、及び乳癌において発現されることが見出されている。
原型がん遺伝子ｃ－ＥｒｂＢ－１又は受容体チロシン－プロテインキナーゼｅｒｂＢ－１という名も付いている、「上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＥＧＦＲを意味する。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号１４３）に示されている。がん原遺伝子「ＨＥＲ２」（ヒト上皮増殖因子受容体２）は、ヒト上皮増殖因子受容体に関連し、ある程度相同であるタンパク質チロシンキナーゼ（ｐ１８５ＨＥＲ２）をコードする。ＨＥＲ２は、この分野ではｃ－ｅｒｂＢ－２としても知られており、ラットホモログ、ｎｅｕと呼ばれることもある。ＨＥＲ２の増幅及び／又は過剰発現は、複数のヒト悪性腫瘍に関連し、ヒト乳がん及び卵巣がんの２５～３０％の進行に一体的に関与していると思われる。更に、増幅の程度は、観察された患者生存期間の中央値と逆相関している（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７－７１２（１９８９））。ヒトＨＥＲ２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２６（バージョン２３０、配列番号１４４）に示されている。本明細書で使用される場合、「ｐ９５ＨＥＲ２」という用語は、「６１１－ＣＴＦ」又は「１００～１１５ ｋＤａ ｐ９５ＨＥＲ２」としても知られるＨＥＲ２受容体タンパク質のカルボキシ末端断片（ＣＴＦ）を指す。ｐ９５ＨＥＲ２断片は、全長ＨＥＲ２分子のコドン位置６１１（Ａｎｉｄｏ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ ２５；３２３４－４４（２００６））でのＨＥＲ２ ｍＲＮＡの翻訳開始によって細胞内で生成される。これは１００～１１５ｋＤａの分子量を有し、細胞膜で発現され、そこで分子間ジスルフィド結合によって維持されるホモ二量体を形成することができる（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２９，３３１９－３１（２００９））。ヒトｐ９５ＨＥＲ２の例示的な配列は、配列番号１４５において与えられる。
「ＨＥＲ３」又は「ＥｒｂＢ３」（ヒト上皮成長因子受容体３）は、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼファミリーの他のメンバーと同様に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインからなる。細胞外ドメインは、４つのサブドメイン（Ｉ～ＩＶ）を含む。サブドメインＩ及びＩＩＩはロイシンリッチであり、主にリガンド結合に関与する。サブドメインＩＩ及びＩＶはシステインリッチであり、ジスルフィド結合の形成を通じてタンパク質の立体配座及び安定性に寄与する可能性が最も高い。サブドメインＩＩはまた、二量体形成に必要な二量体化ループを含む。細胞質ドメインは、膜近傍セグメント、キナーゼドメイン及びＣ末端ドメインを含む。ＥｒｂＢ３の過剰発現、構成的活性化、又は突然変異のみが発がん性であるという証拠は見出されていないが、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＥＲＢＢ３－ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ－ｐｍｉｄ８６３２００８－１８ＥｒｂＢ２と最も決定的に関係するヘテロ二量体化パートナーとしてのタンパク質は、成長、増殖、化学療法抵抗性、並びに浸潤及び転移の促進に関与する。ＥｒｂＢ３は、多数のがんにおける標的治療耐性に関連する。ヒトＨＥＲ３のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２１８６０（バージョン２２４、配列番号４７１）に示されている。
本明細書で使用される場合「Ｂ細胞表面抗原」は、Ｂリンパ球、特に悪性Ｂリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す（その場合、抗原は「悪性Ｂ細胞表面抗原」とも呼ばれる）。いくつかのＢ細胞表面抗原は、血液悪性新生物の免疫療法に関して興味深い。一態様では、Ｂ細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ３７からなる群から選択される。
「ＣＤ１９」という用語は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ－１２としても知られている、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９を意味し、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号４３４）に示されている。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないヒトＣＤ１９、並びに本明細書に掲載する抗体がそれに結合する限り、細胞におけるプロセシングから生じる任意の形態のヒトＣＤ１９を包含する。ＣＤ１９は、プレＢ細胞、初期発生のＢ細胞（すなわち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への最終分化を通した成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞を含むがこれらに限定されない、ヒトＢ細胞の表面上に発現される構造的に異なる細胞表面受容体である。ＣＤ１９は、ほとんどのプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及びいくつかのヌル急性リンパ芽球性白血病によって発現される。形質細胞上のＣＤ１９の発現は、それが多発性骨髄腫などの分化Ｂ細胞腫瘍上に発現され得ることを更に示唆する。したがって、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病及び／又は急性リンパ芽球性白血病の処置における免疫療法の標的である。
「ＣＤ７９ｂ」は、Ｉｇ－β又はＢ細胞特異的糖タンパク質Ｂ２９としても公知のＢ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質β鎖を指し、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＣＤ７９ｂを含む。ヒトＣＤ７９ｂのアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ４０２５９（バージョン１８０、配列番号４３５）に示されている。ＣＤ７９ｂは、Ｂ細胞上に排他的に発現される３９ＫＤａのタンパク質であり、ＣＤ７９ａと協働して、ＢＣＲの下流のシグナル伝達カスケードを開始させ、ＢＣＲ複合体の内部移行、エンドソームへのその移行、及び抗原提示をもたらす。ＣＤ７９（サブユニットＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂから構成される）は、Ｂ細胞受容体のヘテロ二量体シグナル伝達成分であり、成熟Ｂ細胞リンパ腫において遍在的に発現され、免疫グロブリンμの発現前に最も早く拘束されたＢ細胞前駆細胞によって細胞表面に配置される。「ＣＤ７９ｂ」という用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＤ７９ｂ、並びに細胞内のプロセシングから得られるＣＤ７９ｂの任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ７９ｂの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「ＣＤ２０」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ－１６としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号４３６）に示されている。ＣＤ２０は、プレＢリンパ球及び成熟Ｂリンパ球上に発現される約３５ ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。対応するヒト遺伝子は、ＭＳ４Ａ１としても知られる膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１である。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似のイントロン／エクソンスプライス境界によって特徴付けられ、造血細胞及び非リンパ組織の間で固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の形質細胞への発達及び分化において役割を果たすＢリンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中で１１ｑ１２に局在している。この遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする２つの転写バリアントをもたらす。「ＣＤ２０」という用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＤ２０、並びに細胞内のプロセシングから得られるＣＤ２０の任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ２０の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「ＣＤ２２」は、Ｂリンパ球細胞接着分子又はＳＩＧＬＥＣ２としても知られているＢ細胞受容体ＣＤ２２を指し、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＣＤ２２を含む。ヒトＣＤ２２のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０２７３（バージョン２０９、配列番号４３７）に示されている。ＣＤ２２は、レクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーに属する分子であり、成熟Ｂ細胞の表面に見られ、一部の未成熟Ｂ細胞にはあまり見られない。したがって、ＣＤ２２は、１３０～１５０ｋＤａのＢ細胞制限細胞表面ホスホグリコタンパク質であり、Ｂリンパ球抗原受容体（ＢＣＲ）媒介シグナル、並びにＢＣＲ非依存性シグナルの生成を調節することができる。「ＣＤ２２」という用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＤ２２、並びに細胞内のプロセシングから得られるＣＤ２２の任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ２２の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「ＣＤ３７」は、テトラスパニン－２６（Ｔｓｐａｎ－２６）としても公知の白血球抗原ＣＤ３７を指し、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ３７を含む。ヒトＣＤ３７のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ１１０４９（バージョン１６２、配列番号４３８）に示されている。ＣＤ３７発現は免疫系の細胞に限定され、成熟Ｂ細胞上で最も豊富であり、Ｔ細胞及び骨髄細胞上ではより低い発現が見られる。糖タンパク質ＣＤ３７は、膜貫通４スーパーファミリーのメンバーであり、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を制御する。「ＣＤ３７」という用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＤ３７、並びに細胞内のプロセシングから得られるＣＤ３７の任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ３７の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
本明細書で使用される場合、「多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原」は、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。いくつかのＭＭ細胞表面抗原は、多発性骨髄腫の免疫療法に関して興味深い。一態様では、ＭＭ細胞表面抗原は、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ及びＧＰＲＣ５Ｄからなる群から選択される。
分化抗原群３８又は環状ＡＤＰリボース加水分解酵素としても知られる「ＣＤ３８」という用語は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｂリンパ球及びナチュラルキラー細胞を含む多くの免疫細胞（白血球）の表面に見られる糖タンパク質である。ＣＤ３８はまた、細胞接着、シグナル伝達及びカルシウムシグナル伝達においても機能する。正常条件下では、ＣＤ３８は、骨髄細胞及びリンパ系細胞並びにいくつかの非造血組織において比較的低レベルで発現される。対照的に、正常な形質細胞及び多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞は、高レベルのＣＤ３８発現を有し、これにより、ＣＤ３８は、ＭＭにおいて細胞表面分子を標的化するための興味深い標的となる。本明細書で使用されるＣＤ３８は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のＣＤ３８タンパク質を指す。ヒトＣＤ３８のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ２８９０７（配列番号４７４）に示されている。
「ＢＣＭＡ」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳ１７）とも呼ばれるＢ細胞成熟抗原を指し、シグナルペプチドを有さず、システインリッチ細胞外ドメインを含有するＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは、全ての患者ＭＭ細胞において有意に高いレベルで発現されるが、正常形質細胞を除く他の正常組織では発現されない。ＢＣＭＡは、２つの関連するＴＮＦＲスーパーファミリーＢ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）並びに膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びシクロフィリンリガンドインターアクター（ＴＡＣＩ）と共に、Ｂ細胞の増殖及び生存、並びに形質細胞への成熟及び分化を決定的に調節する。これらの３つの機能的に関連する受容体は、それらの同族リガンドであるＢＡＦＦ及び／又はＡＰＲＩＬに結合することによって、発生の異なる段階におけるＢ細胞の長期生存を支援する。本明細書で使用される場合、ＢＣＭＡは、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のＢＣＭＡタンパク質を指す。ヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ０２２２３（配列番号４７５）に示される。
「ＧＰＲＣ５Ｄ」という用語は、ＲＮＡシーケンシングを使用して多発性骨髄腫の形質細胞から同定された標的である、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤを指す。ＧＰＲＣ５Ｄは、多発性骨髄腫患者の予後不良及び腫瘍量に関連することが報告されている。ＧＰＲＣ５Ｄは、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のＧＰＲＣ５Ｄタンパク質を指す。ヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ酸配列をＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９ＮＺＤ１（配列番号４７６）に示す。
「ＣＤ２８」（分化クラスター２８、Ｔｐ４４）という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のＣＤ２８タンパク質を指す。ＣＤ２８はＴ細胞上で発現され、Ｔ細胞の活性化及び生存に必要な共刺激シグナルを提供する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８によるＴ細胞刺激は、様々なインターロイキンの産生のための強力なシグナルを提供することができる。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質の受容体であり、ナイーブＴ細胞上に構成的に発現される唯一のＢ７受容体である。ヒトＣＤ２８のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ１０７４７（配列番号１）に示されている。
「アゴニスト抗体」とは、所与の受容体に対するアゴニスト機能を含む抗体を指す。一般に、アゴニストリガンド（因子）が受容体に結合すると、受容体タンパク質の三次構造が変化し、受容体が活性化される（受容体が膜タンパク質である場合、細胞増殖シグナルなどは、通常、形質導入される）。受容体が二量体形成型である場合、アゴニスト抗体は受容体を適切な距離及び角度で二量体化することができ、したがってリガンドと同様に作用する。適切な抗受容体抗体は、リガンドによって行われる受容体の二量体化を模倣することができ、したがって、アゴニスト抗体になり得る。
「ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子」又は「ＣＤ２８従来のアゴニスト抗原結合分子」は、Ｔ細胞受容体シグナル（「シグナル２」）の存在下でＴ細胞活性化を増強する役割においてＣＤ２８天然リガンド（ＣＤ８０又はＣＤ８６）を模倣する抗原結合分子である。Ｔ細胞は、完全に活性化されるために２つのシグナルを必要とする。生理学的条件下では、「シグナル１」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子と抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のペプチド／主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）複合体との相互作用から生じ、「シグナル２」は共刺激受容体、例えばＣＤ２８の係合によって提供される。ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子は、Ｔ細胞を共刺激することができる（シグナル２）。ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子はまた、ＴＣＲ複合体に対する特異性を有する分子と組み合わせてＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を誘導することができるが、ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子は、ＴＣＲの更なる刺激なしにＴ細胞を完全に活性化することができない。しかしながら、ＣＤ２８特異的抗原結合分子のサブクラス、いわゆるＣＤ２８スーパーアゴニスト抗原結合分子が存在する。「ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗原結合分子」は、ＴＣＲを更に刺激することなくＴ細胞を完全に活性化することができるＣＤ２８抗原結合分子である。ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗原結合分子は、事前のＴ細胞活性化なしにＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を誘導することができる（シグナル１）。
「可変ドメイン」又は「可変領域」という用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版 Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，第９１頁（２００７）を参照。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分な場合がある。
本明細書で使用する場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗原結合可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。一般的に、抗原結合ドメインは、６個のＣＤＲを含み、ＶＨに３個（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、ＶＬに３個（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１年））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名に従い決定することができることを理解するであろう。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．はまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のナンバリングシステムも定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体を超える実験データに頼ることなく、「Ｋａｂａｔナンバリング」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，’’Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ’’（１９８３）に記載されるナンバリングシステムを指す。特に明記されない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングに関する言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う。
本明細書で使用される場合、抗原結合分子（例えば、抗体）に関連して「親和性成熟」という用語は、参照抗原結合分子に由来する、例えば突然変異によって、参照抗体と同じ抗原に結合する、好ましくは同じエピトープに結合する抗原結合分子を指し、参照抗原結合分子よりも抗原に対して高い親和性を有する。親和性成熟は、一般に、抗原結合分子の１つ以上のＣＤＲ中の１以上のアミノ酸残基の改変を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、初期参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、概して、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中において以下の配列で現れる。ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは、異なる供給源又は種に由来する。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５種類の主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に修飾されるか、又は変更されているものである。
「ヒト」抗体とは、ヒト若しくはヒト細胞により作製した、又はヒト抗体レパートリ若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用した、非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、詳細には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
「ＣＨ１ドメイン」という用語は、おおよそＥＵ位置１１８からＥＵ位置２１５まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）。一態様では、ＣＨ１ドメインは、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＫＶ（配列番号４７７）のアミノ酸配列を有する。通常、ＥＰＫＳＣ（配列番号４８０）のアミノ酸配列を有するセグメントは、続いてＣＨ１ドメインをヒンジ領域に連結する。
「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを結合する抗体重鎖ポリペプチドの一部（例えば、ＫａｂａｔのＥＵナンバーシステムにより、約２１６の位置から約２３０の位置まで、又は約２２６の位置から約２３０の位置まで）を表す。他のＩｇＧサブクラスのヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることによって決定することができる。ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は、一般に、２５個までのアミノ酸残基を含み、柔軟であり、関連する標的結合部位が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、上部、中央、及び下部ヒンジドメイン（例えば、Ｒｏｕｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８）４０８３を参照されたい）の３つのドメインに細分することができる。
一態様では、ヒンジ領域は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号４８１）を有し、ＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域は、アミノ酸配列ＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号４８２）を有し、ＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＣＰＸＣＰ（配列番号４８３）を有し、ＸはＳ又はＰのいずれかである。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインとを含む。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約ＥＵ位置２３１のアミノ酸残基から約ＥＵ位置３４０のアミノ酸残基（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）まで延在する。一態様では、ＣＨ２ドメインは、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰ ＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧ ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ ＲＥＥＱＥＳＴＹＲＷ ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ ＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥ ＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号４７８）のアミノ酸配列を有する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対になっていないという点でユニークである。むしろ、インタクトネイティブＦｃ領域の２つのＣＨ２ドメインの間には、２つのＮ－ｌｉｎｋｅｄ分岐炭水化物鎖が介在している。炭水化物は、ドメインとドメインのペアリングの代わりを提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１９８５）１６１－２０６．一実施形態では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに接続している。本発明のＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであってもよい。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインのＣ末端側の残基のストレッチを含み、およそＥＵ位置３４１からＥＵ位置４４６まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）。一態様では、ＣＨ３ドメインは、ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫ ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧ（配列番号４７９）のアミノ酸配列を有する。本発明のＣＨ３領域は、ネイティブ配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「突起部」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）。そのような変異体ＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起部と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な実施形態では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、それにより、ダイマーを更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子変異体及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有する変異体を含むことが意図される。例えば、１種以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失されていてもよい。そのような変異体は、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０（１９９０）を参照）。
「野生型Ｆｃドメイン」という用語は、自然界で見出されるＦｃドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。野生型ヒトＦｃドメインには、天然ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域及び天然ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域並びにその天然起源の変異体が含まれる。野生型Ｆｃ領域は、配列番号４８４（ＩｇＧ１、白人型アロタイプ）、配列番号４８５（ＩｇＧ１、アフロアメリカン型アロタイプ）、配列番号４８６（ＩｇＧ２）、配列番号４８７（ＩｇＧ３）及び配列番号４８８（ＩｇＧ４）に示される。
「変異体（ヒト）Ｆｃドメイン」という用語は、少なくとも１つの「アミノ酸変異」によって「野生型」（ヒト）Ｆｃドメインアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を示す。一態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸変異、例えば約１～約１０個のアミノ酸変異、一態様では天然Ｆｃ領域中に約１～約５個のアミノ酸変異を有する。一態様では、（変異体）Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と少なくとも約９５％の相同性を有する。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる。Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化。
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞における専用の細胞表面受容体である、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により媒介されることができる。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる、抗体で覆われた病原体の除去、並びに、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による、赤血球、及び対応する抗体で覆われた他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１－５２４を参照されたい）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性により定義される：ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えばＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７－４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４（１９９４）２５－３４；ｄｅ Ｈａａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０－３４１；及びＧｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１－２４８に記載されている。
ＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃ領域に対する受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエータの放出、並びに、免疫複合体のクリアランス及び抗体産生の制御を含む、多種多様のエフェクター機能を誘発する。ヒトにおいて、３クラスのＦｃγＲが特性決定されており、これらは以下のとおりである。
－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、単量体ＩｇＧに高い親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球にて発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）の少なくとも１つにおける、Ｆｃ領域内での修飾によって、ＦｃγＲＩへの結合が低下する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された、位置２３３～２３６におけるＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０３倍低下させ、抗体により感作される赤血球に対するヒト単核細胞応答を取り除いた（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３－２６２４）。
－ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化ＩｇＧに中程度から低度の親和性で結合し、幅広く発現する。受容体は、２つのサブタイプ：ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは主に、死滅に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）にて発見され、死滅プロセスを活性化可能であるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスで役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球で発見されている。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、免疫グロブリン産生、及び、例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプ切り替えを更に抑制する機能を有するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介されるように、ファゴサイトーシスを阻害する役割を果たす。好酸球及び肥満細胞上において、Ｂ形態は、ＩｇＥの、その個別の受容体への結合による、これらの細胞の活性化の抑制を補助し得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）の１つにおいて突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
－ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）はＩｇＧに、中程度～低度の親和性で結合し、２つの種類として存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡはＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上で発見されており、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上に高度に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）の１つにおいて突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
Ｆｃ受容体に対する、ヒトＩｇＧ１上での結合部位のマッピング、上述した突然変異部位、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４に記載されている。
「ＡＤＣＣ又は「抗体依存性細胞傷害性」という用語は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「減少したＡＤＣＣ」という用語は、上記で定義されたＡＤＣＣの機構による、標的細胞を取り囲む培地中の所与の濃度の抗体で所与の時間に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構による、所与の時間に所与の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの減少は、同じ標準的な産生、精製、製剤化及び保存方法（当業者に知られている）を使用して、同じ種類の宿主細胞によって産生される同じ抗体によって媒介されるが、操作されていないＡＤＣＣと比較している。例えば、そのＦｃドメインを含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下である、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００６／０８２５１５号又はＰＣＴ出願国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照）。例えば、ＡＤＣＣを媒介する初期工程を誘発する抗体の能力は、ＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡ又は（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）ＮＫ細胞を組み換えにより発現する細胞といった、Ｆｃγ受容体を発現する細胞への、抗体の結合を測定することにより調査される。具体的には、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合が測定される。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体として、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照）。
「外部ドメイン」は、細胞外空間（すなわち、標的細胞の外側の空間）に伸長する膜タンパク質のドメインである。外部ドメインは、通常、シグナル伝達をもたらす表面との接触を開始するタンパク質の部分である。
「ペプチドリンカー」という用語は、１種以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。好適な、非免疫原性リンカーペプチドは例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般に、１～５、典型的には２～４、特に２の数字であり、すなわち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１４８）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１４９）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１５０）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１５１）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１５２）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１５３）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１５４）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１５５）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１５６）、ＧＧＳＧ（配列番号１５７）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１５８）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１５９）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１６０）もまた含む。特に目的のペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号１４６）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４７）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１５１）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１５２）である。
「アミノ酸」という用語は、本明細書中で使用される場合、アラニン（三文字表記：ａｌａ、一文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の群を示す。
「融合した」又は「接続した」とは、構成要素（例えば、上記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及び外部ドメイン）がペプチド結合によって直接又は１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていることを意味する。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大パーセントの配列同一性を達成するために配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮しないで、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるのに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性（％）の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作であり、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９）に提出されて、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルされてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルするべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変動しない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に採用されている状況においては、（あるいは所与のアミノ酸配列Ｂに対する、配列Ｂとの、又は配列Ｂに対向するある特定のアミノ酸配列同一％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａとして購入することができる）所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、配列Ｂとの、又は配列Ｂに対向するアミノ酸配列同一％は、次のように計算される。割合Ｘ／Ｙの１００倍（Ｘは、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡからＢの％アミノ酸配列同一性は、ＢからＡの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるであろう。特に明記されない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載されているように得られる。
特定の実施形態では、本明細書において提供する、ＣＤ２８抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が想到される。例えば、ＣＤ２８抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ＣＤ２８抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせは、最終コンストラクトが、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終コンストラクトに到達するように行うことができる。置換による突然変異生成のための目的部位として、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｂに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照しつつ、以下に更に記載される。アミノ酸置換は、目的の分子及び所望の活性（例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの向上）についてスクリーニングされた産物に導入されていてもよい。
Figure 2023021958000001
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
「アミノ酸配列変異体」という用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的に、更なる研究のために選択され、得られた変異体（複数可）は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改良）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているだろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用い、簡便に生成されてもよい。簡単に言うと、１つ以上のＨＶＲ残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされた変異体抗原結合分子である。特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中に作られてもよい。変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又は更に、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。変異体は、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。挿入の例としては、ＣＤ２８抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合を有するＣＤ２８抗原結合分子が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書において提供するＣＤ２８抗原結合分子が改変され、抗体がグリコシル化される程度が増加又は低下される。１つ以上のグリコシル化部位が作製される、又は取り除かれるように、アミノ酸配列を改変することにより、分子のグリコシル化変異体を便利に入手することができる。アゴニストＩＣＯＳ結合分子がＦｃドメインを含む場合において、Ｆｃドメインに付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する変異体を作製するために行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有するアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよく、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。本発明のＣＤ２８抗原結合分子の更なる変異体は、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に接続した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものを含む。このような変異体は、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有していてもよく、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。Ｆｃ領域に接続したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。このような抗体変異体は、改良されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載される。
一定の実施形態では、本発明のＣＤ２８抗原結合分子のシステイン操作変異体、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換された「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定的な実施形態では、置換された残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基は、抗体の接近可能な部位に位置しており、これを使用し、抗体を他の部分（例えば、薬物部分又はリンカー－薬物部分）に対して抱合させ、免疫抱合体を作製してもよい。特定の実施形態では、以下の残基のうちの任意の１つ以上がシステインで置換されていてもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作製されてもよい。
ある特定の態様では、本明細書中に提供されるＣＤ２８抗原結合分子は、当該分野で公知であり、容易に入手可能である更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体。ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため、製造上の利点があるかもしれない。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は、様々であってもよく、１つより多いポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が規定の条件下で使用されるかなどを含む限定事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質性部分との抱合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２００５）１１６００－１１６０５）。放射線は、任意の波長を有していてもよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。別の態様では、本明細書において提供するＣＤ２８抗原結合分子の免疫抱合体を得ることができる。「免疫抱合体」は、限定されないが、細胞毒性薬剤を含め、１つ以上の異種分子に抱合される抗体である。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びホスフェート基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、上記塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書では、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、及び一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。更に、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例として、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び／又はインビボで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。このようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を増強するために化学的に修飾することができ、その結果、ｍＲＮＡを対象に注射して、インビボで抗体を生成することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３：８１５－８１７、又は欧州特許第２ １０１ ８２３号Ｂ１を参照されたい）。
「単離」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種性宿主細胞において維持された組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）、ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々ポリヌクレオチド分子を含有する細胞において含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロでの本発明のＲＮＡ転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成によって産生されるこのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの調節要素であってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり５個までの点突然変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列に対して同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、もしくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列内の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列内へと挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位置もしくは３’末端位置で、又は、それらの末端位置の間の、参照配列内の残基間で個々のもしくは参照配列内での１つ以上の連続した基においてかのいずれかに点在しているどこかで起こってもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を用いて、従来通りに決定することができる。
「発現カセット」という用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片へと組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列、及びプロモーターを含む。特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞中で作用可能に会合した特異的遺伝子の発現を導入及び誘導するのに使用されるＤＮＡ分子を意味する。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。いったん発現ベクターが標的細胞内に入ると、リボ核酸分子又は遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞の転写機構及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は同じ意味で用いられ、外因性核酸が導入された細胞を意味し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数に関わらず、初代の形質転換された細胞、及び初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一でなくてもよいが、変異を含んでいてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する突然変異体の後代は、本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
ある薬剤（例えば、薬学的組成物）の「治療有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。治療有効量の作用剤は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
「薬学的組成物」という用語は、そこに含有される有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容可能な賦形剤」は、薬学的組成物中の成分であって、有効成分以外であり、対象にとって毒性ではない成分を指す。薬学的に許容可能な賦形剤として、限定されないが、緩衝液、安定剤、又は防腐剤が挙げられる。
「パッケージ添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、そのような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む。
本明細書で使用される場合、「処置」（及びその文法的な変形語、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体において本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用して、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。
本明細書で述べる「併用処置」又は「同時投与」という用語は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる場合）及び別個の投与を包含し、その場合、本明細書で報告する抗体の投与は、１つ以上の追加の治療剤、好ましくは１つ以上の抗体の投与の前、同時に及び／又は後に起こり得る。
「Ｂ細胞増殖性障害」とは、患者のＢ細胞の数が健常対象のＢ細胞の数と比較して増加している疾患、特にＢ細胞の数の増加が疾患の原因又は特徴である疾患を意味する。
「血液がん」という用語は、典型的には調節されていない細胞増殖／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、又はそれを説明する。したがって、本明細書で使用されるがんという用語は、癌、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病などの増殖性疾患を指す。特に、がんという用語は、Ｂ細胞増殖性障害を指す。一態様では、がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群から選択される。
「がん」という用語は、典型的には調節されていない細胞増殖／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、又はそれを説明する。したがって、本明細書で使用されるがんという用語は、癌、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病などの増殖性疾患を指す。特に「がん」という用語は、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、肺胞細胞性肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、消化器がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、頸部の癌、膣の癌、陰門の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫尿道のがん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫（上述のいずれかのがんの難治性態様を含む）、又は上述のがんの１つ以上の組合せを含む。一態様では、がんは固形腫瘍である。別の態様では、がんは血液がん、特に白血病、最も特に急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性などの、特に有利な特性を有する新規の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。新規の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能（Ｆｃサイレント）を低下させ、したがってＦｃ受容体を介した非特異的架橋が回避される、１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。代わりに、それらは、腫瘍部位で架橋を引き起こす線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。したがって、腫瘍特異的Ｔ細胞活性化が達成される。
ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が本明細書において提供される。
一態様では、ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる、及び／又はエフェクター機能を低下させるもしくは消失させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。一態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。一態様では、安定な会合が可能な第一及び第二のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、第一のサブユニットが配列番号１７６のアミノ酸配列を含み、第二のサブユニットが配列番号１７７のアミノ酸配列を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２０の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号３６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）と、
を含む、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号３６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号４１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更には、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、本明細書において先に規定される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｅ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｇ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｈ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｊ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ、又は
（ｋ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号４８９のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４９０のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号４９１のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４９２のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４９３のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号４９４のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号４９５のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４９６のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号４９７のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４９８のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４９９のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号５００のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５０１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５０２のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号５０３のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５０４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５０５のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号５０６のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更なる態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む抗原結合ドメインと比較して、低いアフィニティーでＣＤ２８に結合する、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。親和性は、ＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞への結合としてフローサイトメトリーによって測定される。一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む抗原結合ドメインと比較して、低下したアフィニティーでＣＤ２８に結合し、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む。一態様では、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む抗原結合ドメインと比較して、低い親和性でＣＤ２８に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む。
特定の一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の特定の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
ＣＥＡ標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｖ）配列番号５０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結結合分子が提供される。
特定の一態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む。
特に、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１３３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１３４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。一態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
別の態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１８７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。一態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
別の態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５１３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５１４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。一態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
別の態様では、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｅ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｆ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｇ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｈ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｊ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特に、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
ＦＡＰ標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特に、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む。一態様では、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくは、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
ＥｐＣＡＭ標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号５１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、（ｉｖ）配列番号５１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号５２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくは、ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号５２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）、及び配列番号５２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）を含む。
ＨＥＲ３標的二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＨｅｒ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号５２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）と、（ｉｖ）配列番号５２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５２９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）及び配列番号５３０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくは、ＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）及び配列番号５３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）を含む。
ＣＤ３０標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）と、（ｉｖ）配列番号５３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５３７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）及び配列番号５３８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくは、ＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）及び配列番号５３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）を含む。
ＴＢＰＧ（５Ｔ４）標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＴＢＰＧ（５Ｔ４）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＢＰＧ）と、（ｉｖ）配列番号５４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＢＰＧ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５４５のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＢＰＧ）及び配列番号５４６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＢＰＧ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくは、ＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＢＰＧ）及び配列番号５４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＢＰＧ）を含む。
ＭＭ標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
本発明はまた、多発性骨髄腫の処置において特に有用である新規な二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。分子は、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原発現細胞の存在下で架橋を引き起こすＭＭ細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能（Ｆｃサイレント）に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む。したがって、Ｆｃ受容体を介した非特異的架橋が回避され、ＭＭ細胞表面抗原発現細胞の存在下での特異的Ｔ細胞活性化が達成される。
したがって、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が本明細書において提供される。一態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする。更なる態様では、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原への一価結合を特徴とする。
一態様では、ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる、及び／又はエフェクター機能を低下させるもしくは消失させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。一態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。
一態様では、ＭＭ細胞表面抗原がＣＤ３８、ＢＣＭＡ及びＧＰＲＣ５Ｄからなる群から選択される、本明細書において先に定義した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）と、（ｉｖ）配列番号５５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５５３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）及び配列番号５５４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくは、ＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）及び配列番号５５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）を含む。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）と、（ｉｖ）配列番号５５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５６１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）及び配列番号５６２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくは、ＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）及び配列番号５６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）を含む。
ＧＰＲＣ５Ｄ標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）と、（ｉｖ）配列番号５６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５６９、配列番号５７１、配列番号５７２及び配列番号５７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）と、配列番号５７０、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７及び配列番号５７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５６９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくは、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）を含む。
別の態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）と、（ｉｖ）配列番号５８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９及び配列番号５９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）と、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４及び配列番号５９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号５６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）、又は
（ｂ）配列番号５７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）、又は
（ｃ）配列番号５６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）、又は
（ｄ）配列番号５８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）、又は
（ｅ）配列番号５８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５９２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
ＣＤ２８に結合するための一価及び腫瘍関連抗原に結合するための一価の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（１＋１フォーマット）
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号８７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号８８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｍ）が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｃ）が提供される。
更なる態様では、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、Ｆｃドメインサブユニットの１つのＮ末端に融合されている、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と、配列番号７５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｈ）が提供される。
更なる態様では、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能なＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＶＨドメイン及びＶＬドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、そのＣ末端において、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＶＨドメイン及びＶＬドメインの一方が、ペプチドリンカーを介して第１のＦｃドメインサブユニットのＣ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＶＨドメイン及びＶＬドメインの他方が、ペプチドリンカーを介して第２のＦｃドメインサブユニットのＣ末端に融合される、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１５１及び配列番号１５２から選択されるアミノ酸配列を含む。より詳しくは、ペプチドリンカーは、配列番号１５２を含む。
特定の一態様では、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｉ）が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉ）配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉｉ）配列番号５１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、配列番号３５２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１１Ａ）が提供される。一態様では、配列番号３５２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１１Ｂ）が提供される。一態様では、配列番号３５２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１１Ｃ）が提供される。一態様では、配列番号３５２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１１Ｄ）が提供される。一態様では、配列番号３７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１１Ｉ）が提供される。一態様では、配列番号３７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１１Ｊ）が提供される。一態様では、配列番号３７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１１Ｋ）が提供される。一態様では、配列番号３７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１１Ｌ）が提供される。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３７６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｒ）。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３７６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｓ）。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３７６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｔ）。
特定の一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３７６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｓ）。別の一態様では、配列番号３５２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１１Ｂ）が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉ）配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉｉ）配列番号５１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３６１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３６３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｅ）。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３６１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３６５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｆ）。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３６１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３６７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｇ）。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３６１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３６３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｈ）。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３７２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３６３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｍ）。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３７２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３６７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｎ）。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３７２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３６５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１１Ｏ）。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号５２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）を含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号５２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）を含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３６７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３９０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３９１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１４Ａ）。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＨＥＲ３に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）及び配列番号５３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）を含む、ＨＥＲ３に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３９２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３９３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１４Ｂ）。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＨＥＲ３に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）及び配列番号５３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）を含む、ＨＥＲ３に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ３０に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）及び配列番号５３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）を含む、ＣＤ３０に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３９４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３９５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１４Ｃ）。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ３０に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）及び配列番号５３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）を含む、ＣＤ３０に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＴＰＢＧに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＰＢＧ）及び配列番号５４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＰＢＧ）を含む、ＴＰＢＧに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１４Ｄ）。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＴＰＢＧに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＰＢＧ）及び配列番号５４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＰＢＧ）を含む、ＴＰＢＧに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ３８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）及び配列番号５５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）を含む、ＣＤ３８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号４００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１６Ｃ）。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ３８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）及び配列番号５５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）を含む、ＣＤ３８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＢＣＭＡに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）及び配列番号５６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）を含む、ＢＣＭＡに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＢＣＭＡに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）及び及び配列番号５６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）を含む、ＢＣＭＡに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３６７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号４０２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１６Ｄ）。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３６５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３９８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３９９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１６Ｂ）。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）配列番号５６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号３６７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３６６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３９８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３９９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む（分子１６Ａ）。
ＣＤ２８に結合するための一価及び腫瘍関連抗原に結合するための二価の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（１＋２フォーマット）
別の態様では、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２及び第３のＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されている、本明細書に開示される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、２本の軽鎖を含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、各々が配列番号７８のアミノ酸配列を含み、１本の軽鎖は配列番号７７のアミノ酸配列を含み、第１の重鎖は配列番号７５のアミノ酸配列を含み、第２の重鎖は配列番号７６のアミノ酸配列を含む（分子Ｇ）。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合可能な断片に特異的に結合可能な第２及び第３のＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉ）配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｉｉｉ）配列番号５１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、
を含む、Ｆａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、２本の軽鎖を含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、各々が配列番号３６１のアミノ酸配列を含み、１本の軽鎖は配列番号３６８のアミノ酸配列を含み、第１の重鎖は配列番号３６２のアミノ酸配列を含み、第２の重鎖は配列番号３７３のアミノ酸配列を含む（分子１１Ｐ）。
特定の一態様では、２本の軽鎖を含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、各々が配列番号３６１のアミノ酸配列を含み、１本の軽鎖は配列番号３６８のアミノ酸配列を含み、第１の重鎖は配列番号３６０のアミノ酸配列を含み、第２の重鎖は配列番号３７４のアミノ酸配列を含む（分子１１Ｑ）。
ＦＡＰ及びＣＥＡ標的化アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）第１の腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、第２の腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な１つの抗原結合ドメインを更に含むことを特徴とする、Ｆｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子も本明細書において提供される。
特定の一態様では、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメイン及びＦＡＰに特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、ＣＤ２８への一価結合を有する三重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号８８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号８７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３８９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｙ）が提供される。
Ｂ細胞表面抗原標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性などの、特に有利な特性を有する新規の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。新規の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能（Ｆｃサイレント）を低下させ、したがってＦｃ受容体を介した非特異的架橋が回避される、１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。代わりに、それらは、ＣＤ１９又はＣＤ７９ｂ発現Ｂ細胞の存在下で架橋を引き起こすＣＤ１９又はＣＤ７９ｂなどのＢ細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。したがって、ＣＤ１９又はＣＤ７９ｂ発現Ｂ細胞の存在下での特異的Ｔ細胞活性化が達成される。
ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が本明細書において提供される。一態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする。更なる態様では、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｂ細胞表面抗原への一価結合を特徴とする。
一態様では、ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる、及び／又はエフェクター機能を低下させるもしくは消失させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。一態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。
一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２０の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号３６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）と、
を含む、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、本明細書において先に規定される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２９のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３２のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、本明細書において先に規定される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号３６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号４１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更なる態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを含む。特定の一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の特定の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。更なる態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。更に別の特定の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ａ）（ｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、（ｉｖ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）（ｉ）配列番号４１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、（ｉｖ）配列番号４１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含む、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。詳しくは、ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号４１２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号４２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４２１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。特定の一態様では、ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号４１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
別の態様では、Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）と、（ｉｖ）配列番号４２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号４２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）及び配列番号４２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）とを含む。一態様では、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号４２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）及び配列番号４２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）を含む。
更なる態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＦａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である、本明細書において先に定義した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一特定態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインはＦａｂ断片であり、Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインはクロスＦａｂ断片である。
ＣＤ２８に結合するための一価及びＢ細胞表面抗原に結合するための一価の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（１＋１フォーマット）
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｉｉ）配列番号４２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号４３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１８Ａ）が提供される。
特定の一態様では、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号４３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１８Ｂ）が提供される。
別の一態様では、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号４３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１８Ｃ）が提供される。
更なる一態様では、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号４３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１８Ｄ）が提供される。
更に別の態様では、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号４３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１８Ｅ）が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、クロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｉｉ）配列番号４２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、
を含む、１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）配列番号４２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）及び配列番号４２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）を含む、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号４３２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４３３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子１８Ｆ）が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片であって、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｂ）配列番号４２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）及び配列番号４２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）を含む、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
ＣＤ２８に結合するための一価及びＢ細胞表面抗原に結合するための二価の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（１＋２フォーマット）
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｂ細胞表面抗原への二価結合を特徴とする。
別の態様では、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な第２及び第３のＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されている、本明細書に開示される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を下げるＦｃドメイン改変
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。一方、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。
したがって、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティーの低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。一態様では、ＦｃはＦｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の低下、樹状細胞の成熟の低下、又は減少したＴ細胞プライミング。
特定の態様では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域変異体を作製する。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
一特定態様では、本発明は、Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体に対する、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗原結合分子を提供する。一態様では、本発明は、Ｆｃ領域が１つ以上のアミノ酸置換を含み、抗体によって誘導されるＡＤＣＣが、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣの０～２０％に減少する抗体を提供する。
一態様では、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵナンバリング）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＥＵナンバリング）及び／又は３２９（ＥＵナンバリング）の位置にアミノ酸置換を含む。より詳しくは、ＩｇＧ重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）を有するＦｃドメインを含む、本発明による抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異をいう。アミノ酸置換の「Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、国際特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載され、そのような変異型Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定する方法も記載されている。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上が置換されたものも含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ突然変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位の２つ以上での置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティーの低下と、エフェクター機能の低下を示す。取り具体的な態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔナンバリング）。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵナンバリング）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は改変によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的変異導入法、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。又は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野において既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載される。又は、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
いくつかの態様では、相補性構成要素に対する（特定的にはＣ１ｑに対する）Ｆｃドメインの結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが低減されたエフェクター機能を有するように操作されるいくつかの態様では、当該低減されたエフェクター機能は、低減されたＣＤＣを含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを判断することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２、１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３、２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
特定の一態様では、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティーの低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び必要に応じてＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び必要に応じてＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より詳しくは、それは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン改変
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合部位を含み、そのため、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進させる改変を含む、ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一態様では、上記改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
具体的な態様では、上記改変は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」改変と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」改変とを含む。したがって、本発明は、（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含み、ノブからホールへの方法に従ってＦｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起部と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）。
なお更なる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ（２００１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電操縦効果に介在する改変を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。
本明細書に報告される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。１つの好ましい態様では、重鎖のＣ末端は短縮Ｃ末端末端Ｐである。１つの好ましい態様では、重鎖のＣ末端は短縮Ｃ末端末端ＰＧである。一態様では、本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含むＣＤ２８抗原結合分子は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。一態様では、本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含むＣＤ２８抗原結合分子は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
Ｆａｂドメイン内の改変
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかが、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って交換される、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。
１つの結合アームにドメインの置き換え／交換を伴う多特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ－ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ－ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１９１に記載される。これらの多特異性抗体は、明確に、第１の抗原に対する軽鎖と、第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチにより生じる副産物を減らす（このようなドメインの置き換えがない手法と比較した場合）。
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換えられている、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。
別の態様では、正しい対合を更に改善するために、（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含み、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、種々の荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの改変は、クロスしているか、又はクロスしていないＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、ＣＬドメインの１つにおいて、位置１２３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換されており、位置１２４（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、位置１４７（ＥＵナンバリング）、及び位置２１３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。特定の一態様では、ＣＤ２８に特異的に結合可能なＦａｂ断片のＣＬドメインでは、位置１２３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）によって置換されており、位置１２４のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）によって置換されており、ＣＤ２８に特異的に結合可能なＦａｂ断片のＣＨ１ドメインでは、位置１４７のアミノ酸（ＥＵナンバリング）及び位置２１３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする１つ以上の単離ポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子全体をコードする。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、例えば、固体ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上記のような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。本発明の一態様では、本発明の１種以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片（即ちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び／又は他の転写若しくは翻訳調節要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば、単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１種以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。更に、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体、若しくはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ以上の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力卯を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。追加の適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから切断されることを知っている。特定の実施形態では、ネイティブシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分裂を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。又は、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製（例えばヒスチジンタグ）を容易にするために、又は二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の標識化を補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
本発明の更なる態様では、本発明の１種以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、以下で形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。このような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などが挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて（特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションに）使用することができる、多数のバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６、５９（１９７７）に記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３、２４３－２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）に記載される）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を組み換えて、他方の免疫グロブリン鎖を発現して、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンとなるようにすることができる。
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で、本明細書で提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法が提供される。
特定の態様では、抗原結合分子の一部を形成する、標的細胞抗原（例えば、Ｆａｂ断片）に特異的に結合可能な部分は、少なくとも、抗原に結合能を有する免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成し得、それらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，’’Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ’’，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい。）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい）。
免疫グロブリンの任意の動物種を本発明で使用することができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトへの使用を意図したものである場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ形態の免疫グロブリンを使用してもよい。免疫グロブリンのヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合アフィニティー又は抗体機能を維持するのに重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域に接合すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフト接合すること、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを翻訳するが、表面残基を置き換えることによって、これらとヒト様部分とを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びこれを製造する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に記載され、更に、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１，６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３），１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフト接合を記載する）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド付き選択」手法を記載する）に記載される。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に記載される。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し得、そのヒトモノクローナル抗体に由来し得る（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（１９８７年ニューヨークのＭａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリ（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４－６２８（１９９１）を参照されたい）から選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって作製され得る。ファージは、典型的には、抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとしてディスプレイする。
特定の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例を参照されたい）又は米国特許第２００４／０１３２０６６号に開示される方法に従って、結合親和性が増強されるように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明の抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の手法、例えば表面プラズモン共鳴技法（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施形態では、そのような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば、線状エピトープ又は立体配座エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）’’Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’’，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定された抗原は、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合する能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化抗原を、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化された抗原に関連する標識の量を測定する。固定された抗原に関連する標識の量が対照試料と比較して試験試料で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
本明細書に記載のとおりに調製される本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明らかである。親和性クロマトグラフィー精製のために、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗原結合分子を親和性クロマトグラフィー精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧの親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例にて本質的に記載しているように、抗原結合分子を単離することができる。ＣＤ２８抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。例えば、実施例にて記載のとおりに発現するＣＤ２８抗原結合分子は、還元型、及び非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより示されるように、インタクトであり、適切にアセンブルしたことが示された。
アッセイ
本明細書において提供する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の物理的／化学的性質、及び／又は生物活性を、当該技術分野において公知の様々なアッセイにより識別、スクリーニング、又は特性決定することができる。
１．親和性アッセイ
対応する標的に対する本明細書で提供される抗原結合分子の親和性は、Ｐｒｏｔｅｏｎ機器（Ｂｉｏ－ｒａｄ）などの標準的な機器、及び組換え発現によって得られ得るものなどの受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施例に記載の方法に従って決定することができる。標的細胞抗原に対するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の親和性はまた、Ｐｒｏｔｅｏｎ機器（Ｂｉｏ－ｒａｄ）などの標準的な機器を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができ、受容体又は標的タンパク質などは組換え発現によって得ることができる。結合アフィニティーを測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態は、実施例４に記載される。一態様によれば、ＫＤは、Ｐｒｏｔｅｏｎ（登録商標）装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
２．結合アッセイ及び他のアッセイ
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子の、対応する受容体を発現する細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、ヒトＣＤ２８（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を発現するＣＨＯ細胞を結合アッセイに使用する。
更なる態様では、標的細胞抗原、例えばＦＡＰ又はＣＥＡ、ＣＤ１９又はＣＤ７９ｂを発現するがん細胞株を使用して、標的細胞抗原への二重特異性抗原結合分子の結合を実証した。
３．活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有するＣＤ２８抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性としては、例えば、実施例６に記載の方法で測定したＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌、又は実施例７で測定した腫瘍細胞死滅を挙げることができる。かかる生物活性をインビボ及び／又はインビトロで有する抗体も提供される。
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提示される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書において提供する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、及び、例えば後述する少なくとも１種の追加の治療剤を含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤に溶解又は分散した、治療的有効量の１種以上の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的又は薬理学的に許容可能な」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。少なくとも１種の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、及び必要に応じて追加の有効成分を含有する薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０により例示されているように、本開示の見地から当業者に既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」としては、当業者には知られているであろうが、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張性剤、塩類、安定化剤及びこれらの組み合わせが挙げられる。
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、又は腹腔内注射により投与されるように設計されているものが挙げられる。注射のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水バッファー中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。あるいは、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は使用前に、好適なビヒクル、例えば発熱性物質除去水と共に構成するための、粉末形態であることができる。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の融合タンパク質を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌フィルタにかけた液体媒体から有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇのタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、バッファー、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど）を含んでいてもよい。必要に応じて、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。更に、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成型物品の形態である。具体的な実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。本発明の例示的な薬学的に許容可能な賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１種以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と合わせる。例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。上述した組成物に加えて、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することも可能である。このような長く作用する製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、１種以上の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を薬学的に使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸などの無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。本発明の組成物は、処置される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。かかる有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。インビボ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。
治療方法及び組成物
本明細書において提供する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかを、単独で又は組み合わせて、治療方法にて使用することができる。
一態様では、医薬として使用するための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。更なる態様では、がんの処置に使用するための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の態様では、処置の方法において使用するための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本明細書において、がんを有する個体の処置方法であって、有効量の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を個体に投与することを含む、方法で使用するための、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。そのような一実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
一態様では、Ｂ細胞増殖性障害の処置に使用するための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。特定の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群から選択されるＢ細胞増殖性障害の処置における使用のためのものである。１つの特定の態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。特定の態様では、処置の方法において使用するための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本明細書において、がんを有する個体の処置方法であって、有効量の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を個体に投与することを含む、方法で使用するための、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、Ｂ細胞増殖障害、特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群から選択されるＢ細胞増殖障害を有する個体を処置する方法であって、有効量の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を個体に投与することを含む、方法において使用するための、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。そのような一実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様では、がん免疫療法に使用するための本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の実施形態では、がん免疫療法の方法において使用するための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。上記の態様のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
更なる態様では、本明細書において、医薬の製造又は調製における、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の使用のために提供される。一実施形態では、医薬は、がんの処置のためのものである。更なる態様では、医薬は、がんを処置する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、方法における使用のためのものである。そのような一つの態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つの更なる治療剤、例えば、以下に記載されるものを個体に投与することを更に含む。別の態様では、医薬は、Ｂ細胞増殖性障害の処置のためのものである。更なる態様では、医薬は、がん又はＢ細胞増殖性障害を処置する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、方法における使用のためのものである。
更なる態様では、本明細書では、がんを処置するための方法を提供する。一態様では、本方法は、がんを有する個体に有効量の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を投与する工程を含む。そのような一つの態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つの更なる治療剤、以下に記載されるものを個体に投与することを更に含む。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。
更なる態様では、例えば上記の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書に掲載する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかを含む医薬製剤を本明細書において提供する。一態様では、医薬製剤は、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容可能な担体とを含む。別の態様では、医薬製剤は、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１つの更なる治療剤とを含む。
本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて治療に使用することができる。例えば、本明細書中に記載されるような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、少なくとも１つの更なる治療剤と同時投与され得る。
上述したそのような併用療法は、併用投与（ここでは、２つ以上の治療剤が同一又は別個の製剤中に含まれる）及び別個の投与を包含し、この場合、本明細書に報告される抗体の投与は、追加の治療剤又は薬剤の投与に先立って、同時に、及び／又はそれに続いて、行われ得る。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の投与、及び追加の治療剤の投与は互いに、約１ヶ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。
本明細書に報告される抗原結合分子（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所処置のために所望される場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与することができる。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与などがある。投薬は、任意の適切な経路によるもの、例えば、一部には、投与が一時的であるか慢性的であるかに依存して、注射によって、例えば、静脈又は皮下への注射によるものであってもよい。限定されないが、種々の時間点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与、パルス注入を含む種々の投薬計画が本明細書で想定される。
本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、良好な医療行為と一致した様式で、製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき要因としては、処置される特定の疾患、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、必ずしもではないが、必要に応じて、問題の障害を予防又は処置するために同時に使用する１つ以上の作用物質と共に、製剤化される。このような他剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患の種類又は処置など、上述した他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されている投与量と同じ投与量で、又は本明細書に記載されている投与量の約１～９９％、又は経験的／臨床的に適切であると判断される任意の投与量で、及び任意の投与経路で使用される。
疾患の予防又は処置のため、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の適切な投薬量は（単独で又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるとき）、治療対象の疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療法、患者の病歴、抗体への反応、並びに主治医の裁量によって決定されることになる。二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、一度に、又は一連の処置にまたがり、患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じ、例えば、１回又は複数回の個別投与、又は連続点滴に関わらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、患者への投与への最初の候補投与量となることができる。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、処置は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。最初の多めの投与量、それに続く１回又は複数回の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
他の薬剤及び処置
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、１種以上の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗原結合分子は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与されてもよい。「治療剤」という用語は、このような処置が必要な個体において、症状又は疾患を処置するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような更なる治療剤は、処置される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、更なる治療剤は、別の抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。特定の態様では、更なる治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤若しくは細胞増殖抑制、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。
したがって、提供されるのは、がんの処置に使用するための本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はそれらを含む薬学的組成物であり、二重特異性抗原結合分子が、がん免疫療法に使用するための化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される、二重特異性抗原結合分子である。
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。有効量のこのような他の薬剤は、使用される融合タンパク質の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は通常、本明細書に記載される同一用量及び投与経路、若しくは本明細書で記載される１～９９％の用量、又は実験的／臨床的に適切と測定される任意の用量及び任意の経路で使用される。上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の組成物に含まれる場合）、及び別個の投与を含み、その場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与は、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に、起こり得る。
更なる態様では、提供されるのは、がんの処置に使用するための、本明細書で上述した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であり、二重特異性抗原結合分子は、別の免疫調節剤と組み合わせて投与される。「免疫調節剤」という用語は、免疫系に影響を与えるモノクローナル抗体を含む任意の物質を指す。本発明の分子は、免疫調節剤と見なすことができる。免疫調節剤は、がんの処置のための抗腫瘍剤として使用することができる。一態様では、免疫調節剤には、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ）、ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブ）、ＯＸ－４０抗体、４－１ＢＢ抗体及びＧＩＴＲ抗体が挙げられる。上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、二重特異性抗原結合分子の投与は、更なる治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行われてもよい。
Ｔ細胞二重特異性抗体との組合せ
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与され得る。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。特定の一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
一態様では、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ ＨＥＲ２からなる群から選択される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）への特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与するのに適している。別の特定の態様では、ＴＡＡは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ３、ＣＤ３０又はＴＰＢＧ（５Ｔ４）からなる群から選択される。
特定の態様では、組合せにおける使用のための抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４３９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４４０のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号４４１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４４２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４４３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４４４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４４５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４４６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
別の態様では、組合せにおける使用のための抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号５９６のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５９７のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号５９８のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号５９９のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号６００のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号６０１のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号６０２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号６０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号６０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
別の態様では、組合せにおける使用のための抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６０４のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号６０５のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号６０６のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号６０７のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号６０８のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号６０９のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号６１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号６１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号６１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
特定の一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１６１の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１６２の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１６３の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号１６４の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１６１のポリペプチド配列、配列番号１６２のポリペプチド配列、配列番号１６３のポリペプチド配列及び配列番号１６４のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
別の特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１６５の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１６６の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１６７の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号１６８の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１６５のポリペプチド配列、配列番号１６６のポリペプチド配列、配列番号１６７のポリペプチド配列及び配列番号１６８のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
特定の二重特異性抗体は、ＰＣＴ出願国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１に更に記載されている。更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体はまた、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（商標））を含み得る。更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、国際公開第２００７／０７１４２６号又は国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載される二重特異性抗体である。
別の態様では、Ｂ細胞表面抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメインを含む本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与され得る。一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面抗原に特異的であり、特に抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
本明細書で使用される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体である。したがって、本明細書で使用される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。
特定の態様では、組合せにおける使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４３９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４４０のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号４４１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４４２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４４３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４４４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４４５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４４６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は完全長抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒトＩｇＧクラスの抗体、特にヒトＩｇＧ１クラスの抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、抗体断片、特にＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子、より具体的にはＦａｂ分子である。特定の態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置き換えられる）クロスオーバーＦａｂ分子である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体はヒト化抗体である。
別の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４４７のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４４８のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号４４９のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号４５０のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４５１のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４５２のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４５３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号４５４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号４５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。
別の特定の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４４７のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４４８のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号４４９のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号４５０のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４５１のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４５２のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４５３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号４５４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号４５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、第３の抗原結合ドメインを含む。
更なる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されたクロスＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、従来のＦａｂ分子である。
別の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は二重特異性抗体であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
複数のＦａｂ分子はＦｃドメインに、又は互いに、直接、又は、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含む、１個以上のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーを介して、融合することができる。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であり、本明細書に説明される。一態様では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１４７）である。別の好適なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１５２）を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子が、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介し、更なるペプチドリンカーを伴い、又は伴わずに融合してもよい。更なる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。
特定の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４５５の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号４５６の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号４５７の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号４５８の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号４５５のポリペプチド配列、配列番号４５６のポリペプチド配列、配列番号４５７のポリペプチド配列及び配列番号４５８のポリペプチド配列を含む（ＣＤ２０ ＴＣＢ）。
特定の二重特異性抗体は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１６／０２０３０９号Ａ１又は国際公開第２０１５／０９５３９２号Ａ１に記載されている。更なる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はまた、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））を含み得る。更なる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はＸｍＡｂ（登録商標）１３６７６である。別の態様では、二重特異性抗体はＲＥＧＮ１９７９である。別の態様では、二重特異性抗体はＦＢＴＡ０５（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ）である。
本発明の別の態様では、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、がんを処置するため又はがんの進行を遅延させるための方法において使用するためのものであり、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用され、更に、それらはＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する作用物質と組み合わせられる。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ－１結合アンタゴニストである。特に、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体である。
別の態様では、ＭＭ細胞表面抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメインを含む本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与され得る。一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＭＭ細胞表面抗原に特異的であり、特に抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
特定の一態様では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３９８の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号３９９の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号４０４の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号４０５の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の態様では、二重特異性抗体は、配列番号３９８のポリペプチド配列、配列番号３９９のポリペプチド配列、配列番号４０４のポリペプチド配列及び配列番号４０５のポリペプチド配列を含む（ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む組み合わせ製品が提供される。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。特定の一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。更なる態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤との組合せ
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤、例えばＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ－１結合アンタゴニスト、特に抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与され得る。
一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＣＤ２７４又はＢ７－Ｈ１としても知られている「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＰＤ－Ｌ１（特に、「ヒトＰＤ－Ｌ１」）を意味する。完全ヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号４５９）に示されている。「ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－Ｌ１とその結合パートナーのうちのいずれか１つ以上、例えば、ＰＤ－１、Ｂ７－１との相互作用に起因するシグナル伝達を低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する分子を指す。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、ＰＤ－Ｌ１の結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１及び／又はＢ７－１への結合を阻害する。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合断片、免疫アデシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１、Ｂ７－１などの１つ以上の結合パートナーとの相互作用に起因するシグナル伝達を減少、遮断、阻害、侵害、又は妨害する他の分子を含む。一態様では、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、機能不全Ｔ細胞をより機能不全に陥らないように（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強するように）するために、ＰＤ－Ｌ１を介してシグナル伝達を媒介するＴリンパ球上に発現された細胞表面タンパク質によって媒介される、又はそれを介して媒介される負の共刺激シグナルを減少させる。特に、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体」、又は「アゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１」という用語は、１．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様ではは、１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性で、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイを用いて測定される。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びＭＤＸ－１１０５からなる群から選択される。具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＭＤＸ－１１０５である。更に別の具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。なお更なる態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。より詳しくは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号４６０の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号４６１の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。、、別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号４６２の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号４６３の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
ＣＤ２７９、ＰＤ１又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる「ＰＤ－１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＰＤ－Ｌ１、特にＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１５１１６（配列番号４６４）に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＤ－１を指す。「ＰＤ－１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ２への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方への結合を阻害する。特に、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。「抗ＰＤ－１抗体」、又は「ヒトＰＤ－１に結合する抗体」、又は「ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体」、又は「アゴニスト抗ＰＤ－１」という用語は、１．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では、１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性で、ヒトＰＤ１抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイを用いて測定される。一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－１抗体である。具体的な態様では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ－０１１（ピディリズマブ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ－１０８からなる群から、特にペンブロリズマブ及びニボルマブから選択される。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号４６５の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ－１）及び配列番号４６６の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ－１）を含む抗ＰＤ－１抗体である。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号４６７の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ－１）及び配列番号４６８の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ－１）を含む抗ＰＤ－１抗体である。
別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤、例えばＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ－１結合アンタゴニスト、特に抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体とを含む組み合わせ製品が提供される。
上述したそのような併用療法は、併用投与（ここでは、２つ以上の治療剤が同一又は別個の製剤中に含まれる）及び別個の投与を包含し、この場合、治療剤の投与は、追加の治療剤又は薬剤の投与に先立って、同時に、及び／又はそれに続いて、行われ得る。一実施形態では、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに約１か月以内、又は約１、２、３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に発生する。
製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル若しくはパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液バッグなどが挙げられる。容器を、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から作ることができる。容器は、組成物をそれ自身で、又は症状を処置し、予防し、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を処置するために使用されることを示す。更に、製造物品は、（ａ）製造物品中に含有され、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器、及び（ｂ）製造物品中に含有され、更なる細胞毒性又は別の治療剤を含む組成物を含む第２の容器を含んでよい。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物が特定の症状を処置するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、又は加えて、製造物品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
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ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に提供されている。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義したようなＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））によるナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、参照される。
以下のナンバリングされた項は、本発明の態様を記載する。
１．ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２．ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、項１に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３．ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む、項１又は２に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２０の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号３６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）と、
を含む、項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
５．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
６．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
７．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
８．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、項１～４又は７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
９．腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１０．ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１１．ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１３３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１３４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１２．腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１３．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、
を含む、項１～８又は１２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１４．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
を含む、項１～８又は１２又は１３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１５．ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、項１～８又は１２から１４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１６．ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインがＦａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である、項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１７．（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１８．（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、Ｆｃドメインサブユニットの１つのＮ末端に融合されている、項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１９．（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２及び第３のＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されている、項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２０．（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能なＦａｂ断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＶＨドメイン及びＶＬドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、そのＣ末端において、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＶＨドメイン及びＶＬドメインの一方が、ペプチドリンカーを介して第１のＦｃドメインサブユニットのＣ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なＶＨドメイン及びＶＬドメインの他方が、ペプチドリンカーを介して第２のＦｃドメインサブユニットのＣ末端に融合される、項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２１．項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする、ポリヌクレオチド。
２２．項２１に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
２３．項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の製造方法であって、二重特異性抗原結合分子の発現に好適な条件下にて、請求項２２に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
２４．項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
２５．がんの処置に使用するための、項２４に記載の薬学的組成物。
２６．医薬として使用するための、項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項２４に記載の薬学的組成物。
２７．がんの処置に使用するための、項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項２４に記載の薬学的組成物。
２８．二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、化学療法剤、放射線療法、及び／又はがん免疫治療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの処置に使用するための、項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２９．がんの処置に使用するための医薬の製造における、項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項２４に記載の薬学的組成物の使用。
３０．個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該個体に、有効量の、項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は項２４に記載の薬学的組成物を投与し、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
３１．個体に、治療有効量の、項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項２４に記載の薬学的組成物を投与することを含む、がんの処置方法。
３２．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３３．ＣＤ２８への一価結合を特徴とする、項３２の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３４．Ｂ細胞表面抗原への一価結合を更に特徴とする、項３２の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３５．前記ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む、項３２～３４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３６．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２０の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉｉ）配列番号３６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、項３２～３５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３７．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、項３２～３６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３８．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、項３２～３７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３９．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、項３２～３６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４０．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、
を含む、項３２～３６又は３９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４１．ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、項３２～３６又は３９又は４０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、
４２．Ｂ細胞表面抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ３７からなる群から選択される、項３２～４１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４３．Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、項３２～４２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４４．ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、（ｉｖ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号４１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、（ｉｖ）配列番号４１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）と、
を含む、項３２～４３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４５．ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４１２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）配列番号４２０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４２１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、
を含む、項３２～４４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４６．ＣＤ１９に特異的に結合能可能な抗原結合ドメインが、配列番号４１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、項３２～４５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４７．Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、項３２～４３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４８．ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）と、（ｉｖ）配列番号４２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）とを含む、項３２～４３又は４７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４９．ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９８％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）及び配列番号４２９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９８％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）を含む、項３２～４３又は４７又は４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
５０．（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含む、項３２～４９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
５１．（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、Ｆｃドメインサブユニットの１つのＮ末端に融合されている、項３２～４９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
５２．（ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｂ細胞表面抗原に特異的に結合可能な第２及び第３のＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
を含み、
ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されている、項３２～４９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
５３．項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
５４．項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする、ポリヌクレオチド。
５５．項５４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
５６．項５５に記載のベクター又は項５４に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
５７．項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の製造方法であって、二重特異性抗原結合分子の発現に好適な条件下にて、項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
５８．医薬として使用するための、項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項５３に記載の薬学的組成物。
５９．がんの処置に使用するための、項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項５３に記載の薬学的組成物。
６０．二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、化学療法剤、放射線療法、及び／又はがん免疫治療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて使用するためのものである、がんの処置に使用するための、項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
６０．二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用するためのものである、がんの処置に使用するための、項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
６１．二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用するためのものである、がんの処置に使用するための、項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
６２．二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて使用するためのものである、がんの処置に使用するための、項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
６３．がんの処置に使用するための医薬の製造における、項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項５３に記載の薬学的組成物の使用。
６４．個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該個体に、有効量の、項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は項５３に記載の薬学的組成物を投与し、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
６５．個体に、治療有効量の、項３２～５２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項５３に記載の薬学的組成物を投与することを含む、がんの処置方法。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に与えた一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２に示されている。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子の合成
必要な場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用してＰＣＲにより生成したか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（レーゲンスブルク、ドイツ）又はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州、米国）で合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．及びＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編集）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように使用した。
タンパク質精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶離は、ｐＨ ２．８で達成され、その後、試料を即時中和した。凝集したタンパク質は、ＰＢＳ中での、又は２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体フラクションをプールし、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し（必要な場合）、凍結させ、－２０℃又は－８０℃で保存した。試料の一部を、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析による特性決定のために提供した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書により使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ ６．４）、及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加）又はＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニングバッファーを使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ ７．５）におけるＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準物質として供した。
質量分析法
この章は、その正しいアセンブリに重点をおいて、ＶＨ／ＶＬ置き換え（ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂ）を有する多重特異性抗体の特性決定を記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化したインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂ及び脱グリコシル化した／消化したプラスミン、又は脱グリコシル化した／制限されたＬｙｓＣ消化したＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した。
ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂｓを、リン酸バッファー又はＴｒｉｓバッファー中、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで、３７℃で１７時間までの時間、Ｎ－グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。プラスミン又は制限されたＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、１００μｇの脱グリコシル化したＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを用い、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ８）中、それぞれ、室温で１２０時間、また、３７℃で４０分間行った。質量分析の前に、試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって決定された。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用い、それぞれの抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合アフィニティーの決定。
それぞれの抗原に対する、生成した抗体の結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用い、表面プラズモン共鳴によって観察された。簡潔には、親和性測定のために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ １０９－００５－０９８抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合を、ＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐｈ７．４）、２５℃（又は代替的に３７℃）中で測定する。抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内精製）を溶液中に様々な濃度で添加した。８０秒～３分の抗原注入により会合を測定し、チップ表面をＨＢＳ緩衝液で３～１０分間洗浄して解離を測定し、１：１ラングミュア結合モデルを用いてＫＤ値を推定した。システム固有のベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル低減のために、試料曲線から陰性対照データ（例えば、緩衝曲線）を差し引く。それぞれのＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを、センサーグラムの分析及びアフィニティーデータの計算に使用する。
実施例１
ＣＤ２８及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成及び産生
１．１ ＣＤ２８及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
抗原のクローニング：
ヒトＣＤ２８（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１０７４７）の細胞外ドメイン（成熟タンパク質のアミノ酸１から１３４）をコードするＤＮＡ断片を、溶解性及び精製タグとしての役割を果たすｈｕｍ ＩｇＧ１ Ｆｃ断片をコードする断片の上流の２つの異なる哺乳動物レシピエントベクターにインフレームで挿入した。発現ベクターの１つはＦｃ領域に「ホール」変異を含み、もう１つは「ノブ」変異、並びにＢｉｒ Ａビオチンリガーゼとの同時発現中に特異的ビオチン化を可能にするＣ末端ａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号３８７）を含んでいた。また、両Ｆｃ断片はＰＧ－ＬＡＬＡ変異を含んでいた。Ｆｃノブ鎖のＣ末端に一価ビオチン化アビタグを有する二量体ＣＤ２８－Ｆｃコンストラクトを得るために、両方のベクターを、ＢｉｒＡビオチンリガーゼをコードするプラスミドと組み合わせて同時トランスフェクトした。
ＦＡＰクローン４Ｂ９、ＣＥＡ結合因子並びにＣＤ２８クローンＳＡ及びｍＡｂ ９．３の可変ドメインを、種々の腫瘍標的化ＣＤ２８コンストラクトの作製のために使用した。ＦＡＰクローン４Ｂ９の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号Ａ２に開示されており、参照により本明細書に組み込まれている。分子に使用されるＣＥＡクローンは国際公開第２００７／０７１４２２号に記載されており、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＬを有するＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体（ＳＡ）は国際公開第２００６／０５０９４９号に記載されている。抗体ｍＡｂ ９．３の説明は、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２，１６９，１１１９－１１２５に見出すことができる。それぞれの発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。得られた分子の概略説明を図１Ａ～図１Ｍに示す。示される場合、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異（ＰＧ－ＬＡＬＡ）を、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。非対称二重特異性抗体の作製のために、Ｆｃ断片は、重鎖の誤対合を回避するために「ノブ」又は「ホール」突然変異のいずれかを含有した。二重及び多重特異性抗体コンストラクトにおける軽鎖の誤対合を回避するために、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／Ｃカッパドメインの交換を１つの結合部分に導入した（クロスＦａｂ技術）。別の結合部分において、電荷をＣＨ１ドメイン及びＣカッパドメインに導入した。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図１Ａ～図１Ｍに示す：
分子Ａ：ＣＤ２８（ＳＡ）（ｈｕ ＩｇＧ４）、ＴＧＮ１４１２、ヒトＩｇＧ４アイソタイプにおけるＣＤ２８（ＳＡ）抗体（図１Ａ）は、配列番号６２及び配列番号６３（Ｐ１ＡＥ１９７５）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｂ：ＣＤ２８（ＳＡ）（ＰＧ－ＬＡＬＡ）、ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡアイソタイプにおけるＣＤ２８（ＳＡ）抗体（図１Ｂ）は、配列番号６２及び配列番号６４（Ｐ１ＡＤ９２８９）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｃ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋１フォーマット、配列番号６５、６６、６７及び６８（Ｐ１ＡＤ４４９２）のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＦＡＰ（４Ｂ９）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図１Ｃ）。
分子Ｄ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋４フォーマット、二重特異性四価抗ＣＤ２８（ＳＡ）及び一価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡコンストラクト。ＦＡＰクローン４Ｂ９のＶＨドメイン及びＶＬドメインを、Ｆｃドメインのそれぞれの鎖のＣ末端に融合した（ＶＨ：ノブ鎖、ＶＬホール鎖）（図１Ｆ）。分子は、配列番号６２、６９及び７０（Ｐ１ＡＤ９０１８）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｅ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋２フォーマット、二重特異性二価抗ＣＤ２８（ＳＡ）及び一価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡコンストラクト。ＦＡＰクローン４Ｂ９のＶＨドメイン及びＶＬドメインを、Ｆｃドメインのそれぞれの鎖のＣ末端に融合した（ＶＨ：ノブ鎖、ＶＬ：ホール鎖）（図１Ｄ）。分子は、配列番号６２、７１及び７２（Ｐ１ＡＤ９０１１）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｆ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ＳＡ）２＋２、二重特異性の二価の抗ＣＤ２８（ＳＡ）及び二価の抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト、抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片中の荷電修飾、Ｆｃ断片のＣ末端へのＣＨ１／Ｃカッパ交換を伴う抗ＦＡＰ クロスＦａｂ断片のＶＨ融合（図１Ｅ）。分子は、配列番号６５、７３及び７４（Ｐ１ＡＤ４４９３）のアミノ酸配列 を含む。
分子Ｇ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ＳＡ）２＋１、二重特異性一価抗ＣＤ２８（ＳＡ）及び二価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト、「古典的配向」、抗ＣＤ２８クロスＦａｂ断片中のＶＨ／ＶＬ交換、抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片中の荷電修飾（図１Ｌ）。分子は、配列番号７５、７６、７７、及び７８（Ｐ１ＡＤ５２３１）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｈ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ＳＡ）Ｃ－０１、１＋１二重特異性一価抗ＣＤ２８（ＳＡ）及び一価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子、「ヘッドトゥーテイル」、抗ＣＤ２８ クロスＦａｂ断片中のＶＨ／ＶＬ交換、抗ＦＡＰ結合因子中の荷電修飾（図１Ｍ）。分子は、配列番号７５、７７、７８及び７９（Ｐ１ＡＥ２０２１）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｉ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ＳＡ）Ｃ－０４、１＋１二重特異性二価抗ＣＤ２８（ＳＡ）及び一価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡコンストラクト。ＦＡＰ結合因子４Ｂ９のＶＨドメイン及びＶＬドメインを、Ｆｃ断片（ＶＨ：ノブ鎖、ＶＬ：ホール鎖）のそれぞれの鎖のＣ末端に融合した（図１Ｋ）。分子は、配列番号６２、７２及び８０（Ｐ１ＡＥ２２３６）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｊ：ＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ）２＋２、二重特異性の二価の抗ＣＤ２８（ＳＡ）及び二価の抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト、抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片中の荷電修飾、Ｆｃ断片のＣ末端へのＣＨ１／Ｃカッパ交換を伴う抗ＣＥＡ クロスＦａｂ断片のＶＨ融合（図１Ｈ）．。分子は、配列番号６５、８１及び８２（Ｐ１ＡＥ１１９５）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｋ：ＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋２、二重特異性二価抗ＣＤ２８（ＳＡ）及び一価抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡコンストラクト。ＣＥＡ結合因子のＶＨドメイン及びＶＬドメインをＦｃ断片のそれぞれの鎖のＣ末端に融合した（ＶＨ：ノブ鎖、ＶＬ：ホール鎖）（図１Ｇ）。分子は、配列番号６２、８３及び８４（Ｐ１ＡＥ１１９４）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｌ：一価ＩｇＧ ＣＤ２８（ＳＡ）、一価抗ＣＤ２８（ＳＡ）ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡコンストラクトであって、ＣＤ２８重鎖は、Ｆｃ（ノブ）断片と組み合わせて「ホール」Ｆｃ鎖として発現される（図１Ｉ）。分子は、配列番号６５、８５及び８６（Ｐ１ＡＤ８９４４）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｍ：ＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋１フォーマット、配列番号６５、６６、８７及び８８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ クロスＦａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡクロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ３１２７）（図１Ｊ）。
分子Ｎ：ｍａｂ ９．３（ＰＧ－ＬＡＬＡ）、ヒトＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡアイソタイプ中のｍＡｂ９．３クローン（図１Ｂのとおり）。分子は、配列番号８９及び９０（Ｐ１ＡＤ５１４２）の アミノ酸配列を含む。
分子Ｏ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）Ｃ－０３、ｍＡｂ９．３ Ｆａｂ断片（ノブ）における荷電修飾及び抗ＦＡＰ断片（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト（図１Ｃのとおり）。分子は、配列番号６７、６８、９１及び９２（Ｐ１ＡＥ２２３８）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｐ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）１＋４、二重特異性四価抗ＣＤ２８ ｍＡｂ９．３及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡコンストラクト。ＦＡＰ結合因子のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、Ｆｃ断片のそれぞれの鎖のＣ末端に融合される（ＶＨ：ノブ鎖、ＶＬ：ホール鎖）（図１Ｆのとおり）。分子は、配列番号８９、９３及び９４（Ｐ１ＡＤ８９６９）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｑ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）１＋２、二重特異性二価抗ＣＤ２８ ｍＡｂ９．３及び一価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ コンストラクト。ＦＡＰ結合因子のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、Ｆｃ断片のそれぞれの鎖のＣ末端に融合された（ＶＨ：ノブ鎖、ＶＬ：ホール鎖）（図１Ｄのとおり）。分子は、配列番号８９、９５及び９６（Ｐ１ＡＤ８９６２）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｒ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）２＋２、二重特異性の二価の抗ＣＤ２８ ｍＡｂ９．３及び二価の抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト、抗ｍＡｂ９．３ＦＡＰ断片中の荷電修飾、Ｆｃ断片のＣ末端へのＣＨ１／Ｃカッパ クロスＦａｂ交換を伴う抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片のＶＨ融合（図１Ｅのとおり）．。分子は、配列番号９７、９８及び９９（Ｐ１ＡＤ８９６８）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｓ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）２＋１、二重特異性一価抗ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）及び二価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト、「古典的配向」、抗ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）クロスＦａｂ断片中のＶＨ／ＶＬ交換、抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片中の荷電修飾（図１Ｌのとおり）。分子は、配列番号７６、７７、１００及び１０１（Ｐ１ＡＤ５５６０）の アミノ酸配列を含む。
分子Ｔ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）Ｃ－０２、二重特異性一価抗ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）及び一価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト、「ヘッドトゥーテイル」、抗ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）クロスＦａｂ断片中のＶＨ／ＶＬ交換、抗ＦＡＰ断片中の荷電修飾（図１Ｍのとおり）。分子は、配列番号７８、７９、１００及び１０１（Ｐ１ＡＥ２０２２）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｕ：ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）Ｃ－０５、二重特異性一価抗ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）及び一価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ コンストラクト。ＦＡＰ結合因子４Ｂ９のＶＨドメイン及びＶＬドメインを、Ｆｃ断片（ＶＨ：Ｆｃノブ鎖、ＶＬ：Ｆｃホール鎖）のそれぞれの鎖のＣ末端に融合した（図１Ｋのとおり）。分子は、配列番号８０、８９及び９６（Ｐ１ＡＥ２２３７）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｖ：ＣＥＡ－ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）２＋２、二重特異性の二価の抗ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）及び二価の抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト、抗ｍＡｂ９．３Ｆａｂ断片中の荷電修飾、Ｆｃ断片のＣ末端へのＣＨ１／Ｃカッパ交換を伴う抗ＣＥＡ クロスＦａｂ断片のＶＨ融合（図１Ｈのとおり）。分子は、配列番号８２、８９及び１０２（Ｐ１ＡＥ１１９３）の アミノ酸配列を含む。
分子Ｗ：ＣＥＡ－ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）１＋２、二重特異性二価抗ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）及び一価抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡコンストラクト。ＣＥＡ結合因子のＶＨドメイン及びＶＬドメインをＦｃ断片のそれぞれの鎖のＣ末端に融合した（ＶＨ：ノブ鎖、ＶＬ：ホール鎖）（図１Ｇのとおり）。分子は、配列番号８９、１０３及び１０４（Ｐ１ＡＥ１１９２）のアミノ酸配列を含む。
分子Ｘ：一価ＩｇＧ ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）、ＣＤ２８重鎖は、Ｆｃ（ノブ）断片と組み合わせて「ホール」Ｆｃ鎖として発現される（図１Ｉのとおり）。分子は、配列番号８６、１０５及び１０６（（Ｐ１ＡＤ８９３８）のアミノ酸配列を含む。
更に、三重特異性分子を調製した：
分子Ｙ、ＦＡＰ（４Ｂ９）－ＣＤ２８（ＴＧＮ１４１２）－ＣＥＡ １＋１＋１、三重特異性一価抗ＣＤ２８（ＴＧＮ１４１２）、一価抗ＦＡＰ及び一価抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡクロスＦａｂコンストラクト、抗ＣＥＡ クロスＦａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換、抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片（ノブ）及び抗ＣＤ２８断片（ノブ）中の荷電修飾（図１Ｎのとおり）。分子は、配列番号８７、８８、３８８及び３８９（Ｐ１ＡＥ４０６４）のアミノ酸配列を含む。
１．２ ＣＤ２８及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の産生
上記の分子の発現は、キメラＭＰＳＶプロモーター又はＣＭＶプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
コンストラクトＣ～Ｗの産生のために、懸濁状態で成長するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンを使用してそれぞれの発現ベクターで同時トランスフェクトした。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩを添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合して、振蕩フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、編者：Ｗｅｉｃｈａｎｇ Ｚｈｏｕ，Ａｎｎｅ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ）。トランスフェクションの１日後、サプリメント（フィード）を添加した（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、編者：Ｗｅｉｃｈａｎｇ Ｚｈｏｕ，Ａｎｎｅ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ）。細胞上清を遠心分離及びその後、フィルタにかけ（０．２μｍフィルタ）によって７日後に回収し、標準的な方法によって精製した。
従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、（元は、ＡＴＣＣより受託し、Ｅｖｉｔｒｉａにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した）懸濁適応性ＣＨＯ Ｋ１細胞を用い、Ｅｖｉｔｒｉａにより、コンストラクトＡ、Ｂ及びＸを調製した。産生のために、Ｅｖｉｔｒｉａは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）、並びに、専有のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により上清を回収し、標準的な方法により精製した。
１．３ ＣＤ２８及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ ３．０で達成され、続いて試料をすぐに中和した。タンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
１．４ ＣＤ２８及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗体又は三重特異性抗体の分析データ
精製されたコンストラクトのタンパク質濃度は、Ｐａｃｅ、ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、４、２４１１－１４２３に従って、アミノ酸配列に基づいて計算される質量吸光係数を用い、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定された。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表１に示す。
Figure 2023021958000037
実施例２
ＣＤ２８及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の二重特異性抗体の結合及び動態解析
２．１ ＦＡＰ発現細胞又はＣＥＡ発現細胞及びＣＤ２８発現細胞に対する、ＣＤ２８及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性抗体の結合
二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８分子の結合を、３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞（クローン１９）を発現するヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を使用して試験した。この細胞株を、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択のもとでｈｕＦＡＰを発現するための発現ベクターｐＥＴＲ４９２１によるマウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８）のトランスフェクションによって作製した。ヒトＣＤ２８への結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞（胃がん細胞株、ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ ４０９）を用いて、ヒトＣＥＡＣＡＭ５への結合を試験した。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率について確認し、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に２．５Ｅ５／ｍｌで再懸濁した。５×１０４個の細胞を、漸増濃度のＦＡＰ標的化ＣＤ２８コンストラクト（１ｐＭ～１００ｎＭ）と共に４℃で２時間、丸底９６ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＥ抱合体化ヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）と共に４℃で更に６０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、遠心分離し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗ＤＰ４７ ＩｇＧを陰性対照として含めた。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ，ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて結合曲線を得た。
ＦＡＰ－ＣＤ２８分子は、濃度依存的様式で細胞上のヒトＦＡＰとヒトＣＤ２８の両方に結合することができた（所定の実施例については図２Ｂ及び図２Ｃ）。予想されたように、抗ＤＰ４７ ＩｇＧでは結合が検出されず、このことは、結合の検出が、それぞれの標的化部分による特異的なＣＤ２８結合及びＦＡＰ結合に起因することを示している。
ＣＥＡ－ＣＤ２８分子はまた、細胞上のヒトＣＥＡ及びヒトＣＤ２８の両方に結合することができた。
２．２ ＣＤ２８及びＣＥＡを標的とする二重特異性抗体又は三重特異性抗体の速度論的分析
抗ＣＥＡ（Ｍｅｄｉ－５６５）及び抗ＣＤ２８を含む二重特異性又は三重特異性抗体の両方の結合部分の親和性（ＫＤ）を、ビオチン化ｈｕＣＤ２８－Ｆｃ抗原及びニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化されたビオチン化Ｈｕ Ｎ（Ａ２－Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓを用いてＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して２５℃でＳＰＲによって測定した。
ＣＥＡのエピトープ（Ｍｅｄｉ－５６５）を含むＣＥＡＣＡＭ５ベースの抗原を生成するために、２つのＣＥＡＣＡＭ１及び２つのＣＥＡＣＡＭ５ Ｉｇドメインからなるキメラタンパク質を生成した。ＣＥＡＣＡＭ１の配列に基づいて、ＣＥＡＣＡＭ１の第２及び第３のドメインをＣＥＡＣＡＭ５ドメインＡ２及びＢ２で置き換えた。Ｃ末端のａｖｉタグ及びＨｉｓタグを部位特異的ビオチン化及び精製のために融合した。得られたタンパク質をＨｕ Ｎ（Ａ２－Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ（配列番号１６９）と命名した。
組換え抗原（リガンド）の固定：抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いでさまざまな接触時間で３０μｌ／分で注入して、垂直方向で約４００、８００及び１６００の応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成した。分析物の注入：ワンショット速度論測定のため、注入方向を水平方向に変え、精製された二重特異性ＣＥＡ標的化抗ＣＤ２８二重特異性抗体の二倍希釈系列（５０～３．１２５ｎＭの様々な濃度範囲）を、１５０秒の会合時間及び４５０秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って５０μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。１つの抗ＣＤ２８抗原結合ドメイン及び１つの抗ＣＥＡ抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体（分子Ｍ）の計算されたＫＤ値は、それぞれの単一特異性コンストラクトの測定値と一致する。動力学的及び熱力学的データを下表２に要約する。
Figure 2023021958000038
実施例３
ホットスポットを欠き、親和性が低下したＣＤ２８（ＳＡ）変異体の作製及び特性評価
３．１ 不対システイン残基、トリプトファン残基、脱アミド部位の除去及び親和性低下ＣＤ２８（ＳＡ）変異体の生成
発明者らの詳細な結合因子の特性評価の一部として、ＣＤ２８（ＳＡ）可変ドメイン配列の計算分析を行った。この分析により、ＶＨのＣＤＲ２領域の不対システイン（位置５０、Ｋａｂａｔナンバリング）、ＶＨのＣＤＲ３のトリプトファン残基（位置１００ａ、Ｋａｂａｔナンバリング）及びＶＬのＣＤＲ１（位置３２、Ｋａｂａｔナンバリング）、並びにＶＨのＣＤＲ２の潜在的なアスパラギン脱アミド部位（位置５６、Ｋａｂａｔナンバリング）が明らかになった。トリプトファンの酸化はかなり遅いプロセスであり、還元化合物を添加することによって防止することができるが、抗体可変ドメイン中の不対システインの存在は重要な可能性がある。遊離システインは反応性であり、他のタンパク質又は細胞もしくは培地の成分の他の不対システインと安定な結合を形成することができる。結果として、これは、潜在的に免疫原性であり、したがって患者にリスクをもたらし得る未知の修飾を有する不均一で不安定な生成物をもたらし得る。更に、アスパラギンの脱アミド化並びに結果として生じるイソアスパラギン酸及びスクシンイミドの形成は、インビトロ安定性及びインビボ生物学的機能の両方に影響を及ぼし得る。親マウス結合因子５．１１Ａの結晶構造分析により、Ｃ５０はヒトＣＤ２８への結合に関与せず、したがってＣＤ２８に対する親和性に影響を与えることなくセリンなどの類似のアミノ酸で置換できることが明らかになった（表６、変異体２９）。しかしながら、位置５０のトリプトファン残基及びアスパラギンの両方は、結合界面に近いか又はそれに関与し、したがって、類似のアミノ酸による置換は、結合親和性の低下をもたらし得る。この実施例では、本発明者らは、以下の理由のために、ヒトＣＤ２８に対するＣＤ２８（ＳＡ）の親和性を低下させることを特に目的とした：ＣＤ２８（ＳＡ）の親和性は１～２ｎＭの範囲内であり、結合半減期は約３２分である。この強い親和性は、患者に静脈内注射した場合、血液及びリンパ組織などの大量のＣＤ２８発現細胞を含有する組織においてシンク効果をもたらし得る。結果として、標的化成分（複数可）ＦＡＰ及び／又はＣＥＡを介した化合物の部位特異的標的化が低下し得、コンストラクトの有効性が低下し得る。そのような効果を最小限に抑えるために、いくつかのＶＨ及びＶＬ変異体を生成して、親和性を種々の程度に低下させた（（図３Ａ及び図３Ｃ）。潜在的な安定性ホットスポットを表す前述の位置に加えて、ヒトＣＤ２８への結合に直接的又は間接的に関与する更なる残基は、元のマウス生殖系列アミノ酸又は類似のアミノ酸のいずれかによって置き換えられた。更に、ＣＤ２８（ＳＡ）ＶＬ及びＶＨの両方のＣＤＲも、トラスツズマブのそれぞれのフレームワーク配列にグラフトした（図３Ｂ及び３Ｄ）。次いで、ＶＨ及びＶＬ変異体のいくつかの組み合わせを一価の１アーム抗ＣＤ２８ ＩｇＧ様コンストラクトとして発現させ、結合をＳＰＲによって特徴付けた。
３．２ ＳＰＲによる還元型１アーム抗ＣＤ２８変異体の解離速度定数（ｋｏｆｆ）の分析
第１の工程で抗ＣＤ２８結合因子変異体を特徴付けるために、全ての結合因子を一価の１アームＩｇＧ様コンストラクトとして発現させた（図４Ａ）。このフォーマットを、１：１モデルにおいてＣＤ２８への結合を特徴付けるために選択した。ＨＥＫ細胞へのトランスフェクションの５日後、上清を回収し、発現したコンストラクトの力価を決定した。
抗ＣＤ２８結合因子変異体の解離速度を、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化されたビオチン化ｈｕＣＤ２８－Ｆｃ抗原を用いて２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。組換え抗原（リガンド）の固定化のために、ｈｕＣＤ２８－ＦｃをＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０からなるＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で１００～５００ｎＭの範囲の濃度に希釈し、次いで、様々な接触時間で２５μｌ／分で注射した。これにより、垂直方向で１０００～３０００応答単位（ＲＵ）の間の固定化レベルが得られた。
ワンショット反応速度測定では、注入方向を水平方向に変更した。産生された上清の力価に基づいて、一価の１アームＩｇＧをＰＢＳＴで希釈して、１００ｎＭ～６．２５ｎＭの範囲の２倍希釈系列を得た。注入は、１２０秒の会合時間及び３００秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って５０μｌ／分で同時に行った。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。結合相互作用は、精製及び生化学的特徴付けなしで上清からの一価の１アームＩｇＧを用いて測定されたので、タンパク質：タンパク質相互作用のオフレートのみを更なる結論のために使用した。解離センサーグラムを適合させることによって、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１対１ラングミュア結合モデルを使用して、解離速度を計算した。全てのクローンの解離速度定数（ｋｏｆｆ）値を表３に要約する。産生された変異体の比較により、ｋｏｆｆ値が親配列と比較して最大３０倍減少することが明らかになった。
Figure 2023021958000039
Figure 2023021958000040
ヒトＣＤ２８に対する結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。この結合アッセイは、以下の実施例４に記載されている。図４Ａ～図４Ｃから分かるように、一価の１アームＩｇＧ様ＣＤ２８変異体コンストラクトは、結合の違いを示した。
３．３ 二重特異性ＦＡＰ標的化抗ＣＤ２８親和性変異体の調製及び速度論的分析
オフレート分析及びＣＤ２８発現細胞に対する結合研究に基づいて、異なる結合強度を有する抗ＣＤ２８ ＶＨ及びＶＬ変異体のいくつかの組合せを選択し、ＦＡＰ標的化二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子として発現させた（配列番号の組み合わせについては表４を参照されたい。）。１＋１フォーマットで得られたコンストラクト（図４Ｂ）を精製し、生化学的分析を行った（表５）。
Figure 2023021958000041
Figure 2023021958000042
作製した二重特異性抗原結合分子のＣＤ２８に対する親和性（ＫＤ）は、ニュートラアビジン捕捉によりＮＬＣチップ上にビオチン化ｈｕＣＤ２８－Ｆｃ抗原を固定化したＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて、２５℃でＳＰＲにより測定した。組換え抗原（リガンド）の固定：抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いでさまざまな接触時間で３０μｌ／分で注入して、垂直方向で約２００、４００又は８００の応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成した。分析物の注入：ワンショット速度論測定のため、注入方向を水平方向に変え、精製された二重特異性ＦＡＰ標的化抗ＣＤ２８親和性変異体の二倍希釈系列（５０～３．１２５ｎＭの様々な濃度範囲）を、１５０秒の会合時間及び４５０秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って５０μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。分析されたクローンにより、広い範囲（１～２５ｎＭ）のＫＤ値が明らかになった。動力学的及び熱力学的データを表６に要約する。
Figure 2023021958000043
実施例４
ＣＤ２８発現細胞及びＦＡＰ発現細胞に対する一価ＣＤ２８アゴニスト性ＩｇＧ及びＦＡＰ標的化ＣＤ２８アゴニスト性抗体の結合
ヒトＣＤ２８への結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率について確認し、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に２．５ｘ１０５／ｍｌで再懸濁した。５ｘ１０４個の細胞を、漸増濃度のＣＤ２８結合因子（１ｐＭ～１００ｎＭ）と共に４℃で２時間、丸底９６ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＥ抱合体化ヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）と共に４℃で更に６０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、遠心分離し、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗ＤＰ４７ ＩｇＧを陰性対照として含めた。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ，ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ６を用いて結合曲線を得た。
一価の１アーム型ＩｇＧ様ＣＤ２８変異体コンストラクトは、図４Ａ～図４Ｃから分かるように、結合における違いを示した。更に、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞に対する１＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ標的化抗ＣＤ２８抗体の結合を決定した。選択されたＣＤ２８変異体を有する種々の１＋１コンストラクトのＫＤ値を以下の表７又は図４Ｄ及び４Ｅの対応するグラフに示す。
Figure 2023021958000044
ＦＡＰ発現３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞（クローン１９）に対する１＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ標的化抗ＣＤ２８抗体の結合もまた、実施例２．１に記載されるように求められ、図４Ｆ及び図４Ｇの対応するグラフに示される。
実施例５
ＣＤ２８発現細胞へのＣＥＡ標的ＣＤ２８アゴニスト抗体の結合
ヒトＣＤ２８への結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞を用いて試験した（結合を、実施例４に記載されるようにＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ，ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ６を用いて結合曲線を得た。選択されたＣＤ２８変異体を有する種々の１＋１コンストラクトの結合曲線を図１６に示す。
実施例６
ＣＤ２８及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とするインビトロ機能的特性評価
初代ヒトＰＢＭＣを用いていくつかの細胞ベースのインビトロアッセイを実施して、Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体によって提供されるＴＣＲシグナルの存在下及び非存在下におけるＣＤ２８（ＳＡ）及び二重特異性ＦＡＰ標的化ＣＤ２８抗原結合分子の活性を評価した。フローサイトメトリー、サイトカインＥＬＩＳＡ及び生細胞イメージングによって決定されるＴ細胞増殖、サイトカイン分泌及び腫瘍細胞死滅を読み取りとして得た。
１．元のスーパーアゴニストＣＤ２８（ＳＡ）ＩｇＧ４の活性を、ＣＤ２８媒介スーパーアゴニズムに対する末梢血由来Ｔ細胞の応答性を回復させるために以前に記載された高密度前培養系を使用して評価した（Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
２．ＴＣＲシグナルの非存在下での標的化ＣＤ２８分子の機能性を、初代ヒトＰＢＭＣ共培養アッセイにおいて評価し、ＦＡＰ又はＣＥＡ標的化ＣＤ２８分子を、Ｔ細胞上のヒトＣＤ２８及びヒトＦＡＰへの同時結合によって架橋し、３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞（ヒトＦＡＰを安定的に過剰発現するように改変される親細胞株ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－９２）もしくはＭＣＳＰ及びＦＡＰを発現するＭＶ３メラノーマ細胞、又はＣＥＡを発現するＭＫＮ４５胃がん細胞のいずれかでそれぞれ発現させた。
３．ＴＣＲシグナルの存在下でのＦＡＰ標的化ＣＤ２８分子の機能性を、Ｔ細胞上のＣＤ３、及びＭＫＮ４５胃がん細胞上のヒトＣＥＡ、Ｌｏｖｏ結腸がん細胞、ＨＴ－２９結腸がん細胞、又はＭＶ３メラノーマ細胞上に発現されるＭＣＳＰのいずれかへの同時結合によって架橋されたＴＣＢ分子の更なる存在を伴って、上記のように評価した。
ＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、バフィーコート（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｚｕｅｒｉｃｈ）から得たヘパリン処理した血液の濃縮リンパ球調製物から密度勾配遠心分離によって調製した。２５ｍｌの血液（ＰＢＳで１：２に希釈）を１５ｍｌのｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８５１）の上に重層し、室温で２５分間、８４５×ｇでブレーキなしで遠心分離した。ＰＢＭＣ含有界面を、１０ｍｌピペットを用いて５０ｍｌチューブに回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、６１１×ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３０４×ｇで５分間遠心分離した。洗浄工程を繰り返し、１７１×ｇで遠心分離した。細胞をＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ（５％ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、ＮＥＡＡ、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有）に再懸濁し、それぞれのアッセイプロトコルに従って更なる機能分析のために処理した。
ＰＢＭＣの高密度前培養及びＣＤ２８スーパーアゴニストＣＤ２８（ＳＡ）によるＴ細胞活性化のインビトロ評価
ＴＧＮ１４１２媒介ＣＤ２８スーパーアゴニズムに対するヒトＴ細胞の応答性を回復させるために、ＰＢＭＣを高密度（ＨＤ）で前培養し（Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１１）、その後、ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体の影響を評価した。簡潔に言えば、ＰＢＭＣを完全培地（ＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ、５％ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、ＮＥＡＡ、５０ｕＭ ２－メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン）中で１Ｅ７細胞／ｍｌに調整し、２４ウェルプレート中で１．５ｍｌ／ウェルで３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。次いで、細胞を再採取し、完全培地で洗浄し、５５０×ｇで５分間遠心分離し、機能的特性評価に必要な所望の細胞密度に調整した。Ｔ細胞増殖を評価するために、ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、ＣＦＳＥ希釈を刺激の５日後にＴ細胞増殖の代用として測定した。簡潔に言えば、細胞をＰＢＳ中２×１０７／ｍｌに調整し、２．５μＭ ＣＦＳＥ増殖色素（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６５－０８５０－８４）で３７℃、５％ＣＯ２で６分間標識した。細胞を完全培地中で１回洗浄し、続いてＰＢＳ中で２回洗浄した。ＴＧＮ１４１２による刺激のために、ＰＢＭＣを完全培地中で２×１０６／ｍｌに調整し、１×１０５細胞を平底９６ウェルプレートの各ウェルに分配し、漸増濃度のＴＧＮ１４１２（０．０００２ｎＭ～１０ｎＭ、三連）で刺激した。ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、細胞を５５０×ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、細胞を５５０×ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。ＣＤ８（ＢＶ７１１抗ヒトＣＤ８ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３０１０４４）、ＣＤ４（ＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３４４６１２）についての表面染色を供給業者の指示に従って実施した。次いで、細胞を１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。サイトカイン分泌を、培養上清からのサイトカインＥＬＩＳＡ（ｈｕＴＮＦα、ＤｕｏＳｅｔ＃ＤＹ２１０－０５及びｈｕＩＦＮγ、ＤｕｏＳｅｔ＃ＤＹ２８５－０５）又はサイトカイン多重（ヒトサイトカイン１７プレックスアッセイ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃Ｍ５００００３１ＹＶ）分析によって活性化後５日目に測定した。
ＴＣＢシグナルの非存在下及び存在下における二重特異性ＦＡＰ標的化ＣＤ２８抗原結合分子によるＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌のインビトロ評価
Ｐａｎ Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、製造業者の指示に従ってＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＭＡＣＳによってＰＢＭＣから単離した。
ＴＣＢの非存在下における二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子によるＴ細胞活性化を測定するために、ＣＦＳＥ標識されたｐａｎ Ｔ細胞を、３×１０４／ウェルの３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ又はＦＡＰ発現を欠く親３Ｔ３細胞（３Ｔ３－ＷＴ）と共培養し、前日に平底９６ウェルプレートに播種した。二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子を漸増濃度（０．０００２ｎＭ～１０ｎＭ、三連）で加えた。
ＴＣＢシグナルの存在下でＴ細胞増殖を測定するために、ＣＦＳＥ標識されたｐａｎ Ｔ細胞を３×１０４／ウェルのＦＡＰ及びＭＣＳＰ発現ＭＶ３細胞とインキュベーションし、漸増濃度の二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子（０．０００２ｎＭ～１０ｎＭ、三連）、及び固定濃度のＭＣＳＰ－ＴＣＢ（５ｐＭ、Ｐ１ＡＤ２１８９）で前日に平底９６ウェルプレートに播種した。。対照として、ＴＣＢのみを含むウェルを含めた。
ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーによって評価し、サイトカイン分泌を、培養上清からのサイトカインＥＬＩＳＡ（ｈｕＴＮＦα、ＤｕｏＳｅｔ＃ＤＹ２１０－０５及びｈｕＩＦＮγ、ＤｕｏＳｅｔ＃ＤＹ２８５－０５）又はサイトカイン多重（ヒトサイトカイン１７プレックスアッセイ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃Ｍ５００００３１ＹＶ）分析によって活性化後５日目に測定した。
この実験で使用される抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＭＣＳＰ－ＴＣＢ）の調製は、国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１に記載される。
ＣＤ２８（ＳＡ）のスーパーアゴニズムはＦｃγＲＩＩｂ架橋を必要とする
ＰＢＭＣの高密度前培養はＣＤ２８（ＳＡ）スーパーアゴニズムを回復させる
ＣＤ２８（ＳＡ）の作用機序を理解するために、本発明者らは、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞がＴＧＮ１４１２媒介ＣＤ２８スーパーアゴニズム（Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）に応答する能力を回復させるための以前に記載されたプロトコルとしてＰＢＭＣの高密度（ＨＤ）前培養を検証した。図５Ａ及び５Ｂに示されるように、ＣＤ２８（ＳＡ）ＩｇＧ４（Ｐ１ＡＥ１９７５）は、ＨＤ前培養に供されたＰＢＭＣにおいてのみ刺激の５日後に濃度依存的様式でＰＢＭＣ Ｔ細胞増殖（図５Ａ）及びサイトカイン産生（図５Ｂ）を誘導するが、新鮮なＰＢＭＣは無応答のままであった。発明者らは、インビトロ（Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）でＣＤ２８（ＳＡ）に対するＴ細胞の応答性を回復させるための以前に公開されたプロトコルを発明者らの手で再現することができると結論付けた。
ＣＤ２８（ＳＡ）スーパーアゴニスト活性はＦｃγＲＩＩｂを介した架橋を必要とする－ＦｃγＲＩＩｂの遮断はＣＤ２８（ＳＡ）機能性を消失させる
以前に公開された文献は、ＴＧＮ１４１２が潜在的にＦｃγＲＩＩｂ架橋に依存することを示している。ＰＢＭＣのＨＤ前培養とＣＤ２８（ＳＡ）機能性のＦｃ依存性との関連性を理解するために、ＨＤ前培養の前後にフローサイトメトリーによってＰＢＭＣ上のＦｃγＲＩＩｂの発現レベルを評価した。図５Ｃに示すように、ＦｃγＲＩＩｂ発現は新鮮なＰＢＭＣ単球には存在せず、一方、単球の９６．８％がＨＤ前培養の２日後にＦｃγＲＩＩｂを発現した。その後のＴ細胞増殖アッセイにおけるＦｃγＲＩＩｂの抗体媒介遮断は、培養５日後に測定されたＣＤ２８（ＳＡ）での刺激時にＴ細胞増殖を完全に無効にした（図５Ｄ）。別のアプローチでは、Ｐ３２９Ｇ－ＬＡＬＡ変異（ＣＤ２８（ＳＡ）ＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ：Ｐ１ＡＤ９２８９）を有するＣＤ２８（ＳＡ）のＦｃサイレンシング変異体は、スーパーアゴニスト機能を示さなかった（図 ６Ａ）。これらのデータは、ＣＤ２８（ＳＡ）媒介ＣＤ２８スーパーアゴニズムがＦｃγＲＩＩｂを介した架橋に依存することを確認する。
ＦＡＰ標的化のための腫瘍標的化部分をＦｃ－サイレントＣＤ２８（ＳＡ）に加えることにより、スーパーアゴニズムが回復し、スーパーアゴニズムはその後、腫瘍標的の存在に依存する。
ＴＧＮ１４１２によるＣＤ２８スーパーアゴニズムがＦｃγＲＩＩｂ架橋に依存することを考えると、本発明者らは、（ｉ）ＦｃサイレンシングＰ３２９Ｇ－ＬＡＬＡ変異及び（ｉｉ）表面発現腫瘍抗原に架橋する標的化部分の導入によって、ＦｃＲ依存性が腫瘍に再指向され得ると仮定した。この仮説を試験するために、ＦＡＰ標的化部分を、ＦｃサイレンシングされたＴＧＮ１４１２（ＦＡＰ－ＣＤ２８ １＋２ ＳＡ：Ｐ１ＡＤ９０１１）にＣ末端融合物として加えた。ＦｃＲ架橋はこのアプローチに必要とされなかったので、ＰＢＭＣをＨＤ前培養に供しなかった。代わりに、新鮮なＰＢＭＣを、漸増濃度のＦＡＰ－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＤ９０１１）の存在下で５日間、３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ又は３Ｔ３－ＷＴと共培養し、Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーによるＣＦＳＥ希釈によって評価した。図６Ｂに示されるように、ＦＡＰ結合部分の導入は、もっぱらＦＡＰの存在下でのＴ細胞増殖を可能にした。本発明者らは、スーパーアゴニズムが、Ｆｃサイレンシング及び腫瘍標的化部分の付加によって腫瘍抗原に対して選択的に標的化され得ると結論づけた。
従来のＣＤ２８アゴニスト抗体（クローン９．３）は、腫瘍標的化二重特異性フォーマットにおいてスーパーアゴニスト的に挙動しない
２つのタイプのＣＤ２８アゴニスト抗体が文献に報告されており、ＴＧＮ１４１２などのスーパーアゴニストＣＤ２８抗体は、ＴＣＲによって提供される更なるシグナルを必要とせずにＴ細胞を自律的に活性化することができる。これらの抗体は、Ｔ細胞機能を増強するためにＴＣＲシグナルの存在に厳密に依存する天然のＣＤ２８アゴニストリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６の機能性を超えるので、スーパーアゴニストと呼ばれる。ＴＧＮ１４１２などのスーパーアゴニスト抗体とは対照的に、クローンｍａｂ ９．３などの従来のアゴニスト抗体はＴ細胞を自律的に活性化することができないが、天然のＣＤ２８リガンドと同様に、Ｔ細胞活性を増強するために追加のＴＣＲシグナルを必要とする。ＣＤ２８アゴニストを腫瘍抗原に標的化する効果をより詳細に評価するために、本発明者らは、更なるＦＡＰ－ＣＤ２８分子を作製した：（ｉ）２つのＣＤ２８結合部分（ＴＧＮ１４１２）及び２つのＦＡＰ結合部分＝２＋２ ＳＡフォーマット（Ｐ１ＡＤ４４９３）を有するスーパーアゴニスト（ＳＡ）分子、（ｉｉ）２つのＣＤ２８結合部分（クローン９．３）及び１つ又は２つのＦＡＰ結合部分をそれぞれ有する従来のアゴニスト（ＣＡ）：２＋２ ＣＡ（Ｐ１ＡＤ８９６８）、１＋２ ＣＡ（Ｐ１ＡＤ８９６２）．新鮮なＰＢＭＣを、増大する濃度のＦＡＰ標的化分子の存在下において５日間、３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ又は３Ｔ３－ＷＴと共培養し、Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーによるＣＦＳＥ希釈によって評価した。図７Ａ～７Ｄに示されるように、スーパーアゴニスト結合因子のみがＴ細胞を活性化することができた。更に、記載されるスーパーアゴニストコンストラクトによるＴ細胞活性化は、ＦＡＰの非存在下におけるＴ細胞活性化の非存在によって実証されるように（図７Ｄ）、ＦＡＰの存在に厳密に依存する（図７Ｂ）。これらのデータと一致して、サイトカイン分泌もまた、スーパーアゴニストＣＤ２８（ＳＡ）抗体を有するコンストラクトについてのみ観察されたが、従来のアゴニスト９．３抗体については観察されなかった（図７Ｅ）。本発明者らは、スーパーアゴニストＣＤ２８抗体のみが、二重特異性腫瘍標的化抗体フォーマットにおいて自律的Ｔ細胞活性化を誘発するが、従来の９．３結合因子と同じフォーマットはスーパーアゴニストではないと結論付けた。
実施例７
ＴＣＢの非存在下又は存在下での腫瘍標的化ＣＤ２８分子による腫瘍細胞死滅のインビトロ評価
二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８又はＣＥＡ－ＣＤ２８抗原結合分子が腫瘍細胞死滅を達成するか又はＴＣＢ媒介性腫瘍細胞死滅を支持する能力を評価するために、精製されたｐａｎ Ｔ細胞はエフェクター細胞としての役割を果たし、ＲＦＰ発現ＭＶ３細胞及びＭＫＮ４５細胞はそれぞれ腫瘍標的としての役割を果たした。
ＭＶ３腫瘍細胞の死滅を評価するために、前日に播種した５０００個のＭＶ３標的細胞を、５ｐＭ ＭＣＳＰ－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ２１８９）単独の存在下又は１０ｎＭ二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子との組合せの下で、平底９６ウェルプレート（Ｅ：Ｔ ２０：１）において１×１０５ｐａｎ Ｔ細胞／ウェルで共培養した。ＭＶ３腫瘍細胞の死滅を評価するために、前日に播種した５０００個のＭＶ３標的細胞を、２ｎＭのＦＡＰ－ＣＤ２８の存在下、平底９６ウェルプレート（Ｅ：Ｔ ２０：１）において１×１０５ ｐａｎ Ｔ細胞／ウェルで共培養した。ＭＫＮ４５腫瘍細胞の死滅を評価するために、前日に播種した５０００個のＭＫＮ４５を、２ｎＭ ＣＥＡ－ＣＤ２８の存在下、平底９６ウェルプレート中、ウェルあたり１×１０５個のｐａｎ Ｔ細胞と共培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステム（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、３時間毎にウェルあたり４つの画像をキャプチャして、標的細胞の死滅を９０時間にわたって監視した。経時的な画像あたりのＲＦＰ＋物体数（ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭソフトウェア、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを介して評価）は、標的細胞死の代用として機能した。抗体媒介性標的細胞死滅を、エフェクターＴ細胞単独の存在下で標的細胞の数を経時的にモニタリングすることによって自発的な標的細胞死と区別した（＝ベースライン対照）。死滅は１００－ｘとして計算され、ｘはベースライン対照に対する％標的である。スチューデントのｔ検定を使用して統計分析を行い、経時的な％死滅の曲線下面積（ＡＵＣ）を比較した。
ＦＡＰ－ＣＤ２８は、１＋２形式で標的細胞死滅を誘導するが、従来のＣＤ２８アゴニスト結合因子ではなく、スーパーアゴニストＣＤ２８結合因子のみで誘導する。
ＦＡＰ－ＣＤ２８分子が腫瘍細胞死滅を誘導する能力を評価した。図８Ａ～８Ｄに示されるように、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞をＦＡＰ－ＣＤ２８の存在下において９０時間にわたってＦＡＰ発現ＭＶ３メラノーマ細胞と共培養することにより、１＋２フォーマット（Ｐ１ＡＤ９０１１）でのＦＡＰ ＣＤ２８（ＳＡ）のみによるＭＶ３細胞の死滅がもたらされ、また、ＦＡＰ標的化ＴＣＢ（７）によって達成される死滅の誘導に匹敵した。２＋２フォーマットのＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）（Ｐ１ＡＤ４４９３）、同様にまた、従来のＣＤ２８アゴニスト性９．３抗体（Ｐ１ＡＤ８９６８及びＰ１ＡＤ８９６２）を用いたＦＡＰ－ＣＤ２８では死滅は全く認められなかった。本発明者らは、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌に加えて、スーパーアゴニスト結合因子を含む１＋２フォーマットのＦＡＰ－ＣＤ２８もまた、ＴＣＢに匹敵する標的細胞死滅を誘発し得ると結論付ける。
ＣＥＡ－ＣＤ２８は、１＋２及び２＋２形式で標的細胞死滅を誘導するが、従来のＣＤ２８アゴニスト抗体ではなく、スーパーアゴニスト抗体でのみ誘導する。
別のアプローチでは、本発明者らは、２＋２ ＳＡ（Ｐ１ＡＥ１１９５）、１＋２ ＳＡ（Ｐ１ＡＥ１１９４）、２＋２ ＣＡ（Ｐ１ＡＥ１１９３）、及び２＋１ ＣＡ（Ｐ１ＡＥ１１９２）フォーマットのＣＥＡ標的ＣＤ２８アゴニスト分子を使用して、標的細胞死滅を誘導する能力を評価した。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、上記フォーマットのＣＥＡ－ＣＤ２８の存在下でＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞と９０時間共培養した。スーパーアゴニストＣＤ２８結合因子を含む両フォーマットは、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞の死滅を誘導することができた（図９Ａ及び９Ｂ）。本発明者らは、ＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）２＋２とＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ）２＋２のそれぞれの標的細胞を死滅させる能力との間の不一致が、ＭＫＮ４５細胞対ＭＶ３細胞における標的発現レベルの不一致の範囲内にあると推測する。正確には、社内データでは、ＭＶ３細胞のＦＡＰ発現レベルがＭＫＮ４５細胞のＣＥＡ発現レベルよりも１０倍低いことが確認された。したがって、ＭＶ３細胞では、腫瘍標的結合部位が制限的であるかもしれず、ＭＶ３細胞の死滅には、ＣＤ２８に対するＦＡＰの効率的な占有が必要であり、これは、２＋２（すなわち、２つのＣＤ２８結合部位の架橋に必要な２つのＦＡＰ結合部位）と比較して１＋２フォーマット（すなわち、１つのＦＡＰ結合部位が２つのＣＤ２８結合部位を架橋する）において有利である。
ＴＧＮ１４１２結合因子によるＣＤ２８スーパーアゴニズムはＣＤ２８結合因子多価性に依存する－一価結合因子はスーパーアゴニスト性ではない
ＣＤ２８スーパーアゴニズムの性質を更に調べるために、本発明者らは、一価のＣＤ２８ ＴＧＮ１４１２結合因子が腫瘍標的化二重特異性フォーマットにおいてスーパーアゴニスト性の挙動を示すかどうかを評価した。ＰＢＭＣ Ｔ細胞を３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞と共培養し、漸増濃度の、ＣＤ２８二価を有するＦＡＰ－ＣＤ２８ １＋２ ＳＡ（Ｐ１ＡＤ９０１１）及びＣＤ２８一価を有するＦＡＰ－ＣＤ２８ １＋１ ＳＡ（Ｐ１ＡＤ４４９２）とインキュベーションした。図１０Ａに示されるように、一価のＣＤ２８結合を有するＦＡＰ－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＤ４４９２）は、ＣＤ２８二価コンストラクト（Ｐ１ＡＤ９０１１）とは対照的に、Ｔ細胞増殖を誘導することができなかった。一貫して、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御は、ＣＤ２８二価でのみ観察された（それぞれ、図１０Ｂ、１０Ｃ）。結論として、ＴＧＮ１４１２媒介性スーパーアゴニズムは、Ｆｃ受容体を介した架橋に依存するだけでなく、ＣＤ２８結合因子多価性も必要とする。
結論として、ＣＤ２８スーパーアゴニズムは、Ｆｃサイレンシング及び腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインの導入によって腫瘍抗原に特異的に標的化され得ることが確立され得る。更に、腫瘍標的化二重特異性抗体は、それらがＣＤ２８（ＳＡ）ベースの結合因子を含む場合にのみスーパーアゴニスト性であり、それらが従来のアゴニスト性結合因子を含む場合にはスーパーアゴニスト性ではない（クローン９．３）。更に、スーパーアゴニズムは、ＣＤ２８（ＳＡ）結合因子の多価性を必要とし、二重特異性コンストラクトにおける一価のＣＤ２８（ＳＡ）結合は、スーパーアゴニストＴ細胞活性化を抑止する。
ＦＡＰ－ＣＤ２８は、ＴＣＢ媒介性の標的細胞死滅を支持し、腫瘍標的依存性を持続させるためにＣＤ２８結合因子の一価性を必要とする
ＣＤ２８シグナル伝達は、Ｔ細胞受容体媒介Ｔ細胞応答を増強することが十分に説明されている。したがって、Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）は、ＣＤ２８アゴニズムの有望な組み合わせパートナーである。標的ＣＤ２８アゴニズムとＴＣＢとの組み合わせにより、本発明者らは、ＴＣＢ媒介エフェクター機能を増強し、効率的なＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化のためのＣＥＡ発現の閾値を低下させ、生存合図を提供し、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ４を介したＴ細胞抑制に対する耐性を支持することを想定している。
標的ＣＤ２８アゴニストがＴＣＢを増強することができるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋２（Ｐ１ＡＤ９０１１）及びＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋１（Ｐ１ＡＤ４４９２）がＴＣＢ媒介性の標的細胞死滅を支援する能力を評価した。漸増濃度のＦＡＰ－ＣＤ２８及び固定された限界濃度のＭＣＳＰ－ＴＣＢ（５ｐＭ）の存在下で５日間、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞をＭＣＳＰ－及びＦＡＰを共発現するＭＶ３細胞と共培養することにより、ＦＡＰ－ＣＤ２８の濃度依存的様式でＭＶ３標的細胞の増大した死滅がもたらされた（図１１Ａ）。しかしながら、刺激の５日後のＣＥＡ発現ＦＡＰ陰性ＭＫＮ４５腫瘍細胞の存在下におけるＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ媒介性標的細胞死滅の濃度依存的増加によって実証されるように（図１１Ｂ）、ＴＣＢの存在はＣＤ２８二価フォーマットＰ１ＡＤ９０１１）におけるＦＡＰ－ＣＤ２８のＦＡＰ依存性を無効にし、一方、ＦＡＰ依存性はＣＤ８一価フォーマット（Ｐ１ＡＤ４４９２）において維持された。
別のアプローチでは、本発明者らは、ＦＡＰ－ＣＤ２８ １＋２ ＳＡ（Ｐ１ＡＤ９０１１）によって誘導されるＴ細胞増殖を、ＴＣＢの存在下又は非存在下において、また、ＦＡＰの存在下又は非存在下においてそれぞれ評価した。図１２Ａ及び前の実施例に示されるように、ＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）２＋１は、ＴＣＢの非存在下におけるＴ細胞活性化のためのＦＡＰの存在に厳密に依存する。しかしながら、ＴＣＢの存在下では、図１２Ｂに示されるように、ＦＡＰ－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋２は、ＦＡＰの非存在下においてさえ、Ｔ細胞活性化の増強を誘導する。
本発明者らは、ＴＣＢ誘導ＴＣＲシグナルが、ＴＣＲシグナル伝達成分の十分なプレクラスタリングを潜在的にもたらし、したがって、共刺激を誘発するのに十分な二価ＣＤ２８分子によるＴ細胞上のＣＤ２８受容体の表面架橋をもたらすと仮定する。本発明者らは、ＴＣＢ組み合わせアプローチでは、標的ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子の腫瘍－標的依存性を維持するためにＣＤ２８結合因子の一価性が厳密に必要であると結論する。
種々の一価ＦＡＰ－ＣＤ２８フォーマットの比較により、古典的な１＋１フォーマットについて最も高い効力を有する一連の種々の機能的ＦＡＰ－ＣＤ２８フォーマットが明らかにされる。
ＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化を増強するその能力に対するＦＡＰ－ＣＤ２８の特異的抗体フォーマットの影響を評価するために、一価のＣＤ２８結合を有するＦＡＰ－ＣＤ２８抗原結合分子の種々のフォーマットを作製し、図１Ｃ、１Ｋ、１Ｌ及び１Ｍに示す。ＣＤ２８二価を有するＦＡＰ－ＣＤ２８ １＋２を参照として使用した。これらのフォーマットの機能性を評価するために、ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、漸増濃度のＦＡＰ－ＣＤ２８フォーマット及び固定された限界濃度のＭＣＳＰ－ＴＣＢ（５ｐＭ）の存在下で５日間、ＭＣＳＰ－及びＦＡＰを共発現するＭＶ３細胞と共にインキュベートした。全てのフォーマットは、ＣＤ８ Ｔ細胞増殖（図１３Ａ）、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖（図１３Ｂ）及び標的細胞死滅（図１３Ｃ）を有意に増加させることができた。注目すべきことに、分子Ｃ（Ｐ１ＡＤ４４９２）の効力は最も高く、二価ＣＤ２８参照フォーマット１＋２ ＳＡ（Ｐ１ＡＤ９０１１）の効力に匹敵した。全ての分子のＣＤ２８及びＦＡＰに対する結合をそれぞれ図２Ｆ及び２Ｇに示す。
実施例８
腫瘍標的化ＣＤ２８分子とＣＥＡ標的化ＴＣＢの組み合わせの腫瘍細胞死滅のインビトロ評価
Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製
ＴＣＢ分子を、国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１又は国際公開第２０１６／０７９０７６号Ａ１に記載される方法に従って調製した。この実験で使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢ又はＣＥＡ ＴＣＢ）の調製は、国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１の実施例３に記載される。ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢは、「２＋１ ＩｇＧ クロスＦａｂ」抗体であり、２つの異なる重鎖と、２つの異なる軽鎖とで構成される。２つの異なる重鎖のアセンブリを促進するために、ＣＨ３ドメイン中の点変異（「ホールにノブを入れる」）を導入した。２つの異なる軽鎖の正しいアセンブリを促進するために、ＣＤ３結合ＦａｂにおけるＶＨドメインとＶＬドメインの交換を行った。２＋１は、その分子が、ＣＥＡに特異的な２つの抗原結合ドメインと、ＣＤ３に特異的な１つの抗原結合ドメインを有することを意味する。ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢは、同じフォーマットを有するが、別のＣＥＡ結合因子を含み、軽鎖の正しい対形成を補助するために、ＣＤ３結合因子のＣＨドメイン及びＣＬドメインに点変異を含む。ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢは、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３及び配列番号１６４のアミノ酸配列を含む。ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ ＴＣＢは、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。
ＣＥＡ－ＣＤ２８は、標的細胞の死滅においてＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢと相乗作用する
代替的なアプローチでは、本発明者らは、ＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋１二重特異性抗原結合分子（分子Ｍ、Ｐ１ＡＥ３１２７）を生成し、ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ媒介標的細胞滅を増強するその能力を評価した。この目的のために、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５結腸直腸がん細胞を、最適以下のＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ（１０ｎＭ）の存在下又は非存在下でＰＢＭＣ Ｔ細胞及びＣＥＡ－ＣＤ２８（分子Ｍ、Ｐ１ＡＥ３１２７）又は非標的一価ＣＤ２８（分子Ｌ、Ｐ１ＡＤ８９４４）と共培養し、ＭＫＮ４５細胞死滅を経時的に評価した。図１４に示すように、ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢとＣＥＡ－ＣＤ２８の組み合わせのみが標的細胞死滅をもたらしたが、化合物単独では標的細胞死滅を達成せず、相乗効果を示した。更に、ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢと組み合わせた非標的ＣＤ２８も死滅を誘導せず、架橋及びそれによる腫瘍標的への持続的依存に対する一価ＣＤ２８アゴニストの必要性をもう一度強調した。
ＣＥＡ－ＣＤ２８はＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢを増強し、ＴＣＢがＴ細胞を活性化するためのがん細胞上のＣＥＡ発現閾値を低下させる
ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢは、Ｔ細胞活性化及び標的細胞死滅のために、標的細胞上で一定の発現レベルのＣＥＡを必要とする。本発明者らは、ＣＥＡ－ＣＤ２８がＴＣＢのＣＥＡ発現閾値を低下させて効率的な標的細胞死滅を誘導できるかどうかを評価した。この目的のために、様々なＣＥＡ発現レベルを有する標的細胞株の存在下で、ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、漸増濃度のＣＥＡ－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ４６４６）又はＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ５２９９）及び固定濃度のＣＥＡ－ＣＤ２８（分子Ｍ、Ｐ１ＡＥ３１２７）のいずれかと共にインキュベートした：（ｉ）ＭＫＮ４５（高発現、約４０００００のＣＥＡ結合部位／細胞）、（ｉｉ）Ｌｏｖｏ（中程度の発現、およそ６００００のＣＥＡ結合部位／細胞）、（ｉｉｉ）ＨＴ－２９（低発現、約６０００のＣＥＡ結合部位／細胞）。Ｔ細胞増殖をＴ細胞活性化の代用として測定した。図１５に示すように、ＣＥＡ－ＣＤ２８は、ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢの効力を有意に増加させることができた。最も注目すべきことに、ＴＣＢは低ＣＥＡ発現ＨＴ－２９細胞のみではＴ細胞活性化を達成しなかったが、ＣＥＡ－ＣＤ２８の添加はＴＣＢの活性を強く増強した。本発明者らは、ＣＥＡ－ＣＤ２がＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢを増強し、ＴＣＢがＴ細胞を活性化するためのがん細胞上のＣＥＡ発現閾値を低下させると結論づける。
実施例９
ＣＤ２８（ＳＡ）の親和性低減変異体のインビトロ機能的特性評価
元のＣＤ２８（ＳＡ）結合因子（ＴＧＮ１４１２）について、ＫＤ＝１ｎＭの親和性を決定した。このような高親和性結合因子は、特にＣＤ２８の場合のように標的が末梢血で高度に発現される場合、末梢シンク効果を受けるリスクを有する。（ｉ）末梢性シンク効果を低下させ、（ｉｉ）Ｔ細胞に対する二重特異性腫瘍標的化ＣＤ２８抗体の腫瘍外結合を通して末梢性Ｔ細胞活性化のリスクを低下させるために、本発明者らは、ＣＤＲに点変異を導入することによって親和性が低下した一連の３１個のＣＤ２８結合因子を作製した（実施例３を参照されたい）。図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃは、上清からのＣＤ２８単一特異的一価ＩｇＧのＣＨＯ細胞上のＣＤ２８への結合を示し、点変異の添加が様々な結合特性を有する広範囲の結合因子を生成したことを確認する。これらのデータに基づいて、１１個の候補の最終リストを更なる特徴付けのためにＦＡＰ－ＣＤ２８二重特異性フォーマット（実施例４、表６を参照されたい）への変換のために選択した。結合アッセイにより、細胞上のＦＡＰに対する正の結合（図４Ｆ及び図４Ｇ）、同様にまた、選択された変異体のＣＤ２８に対する正の結合及び変化する結合（図４Ｄ及び４Ｅ）が確認された。
親和性低下ＣＤ２８結合因子変異体は、ＦＡＰ－ＣＤ２８二重特異性フォーマットにおいてインビトロで機能的である
親和性が低下したＣＤ２８結合因子変異体が依然として機能的であり、ＴＣＢ媒介エフェクター機能を支持することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、ＴＣＢの組み合わせにおけるＴ細胞増殖を評価した。この目的のために、ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、漸増濃度のＦＡＰ－ＣＤ２８及び固定された限界濃度のＭＣＳＰ－ＴＣＢ（５ｐＭ）の存在下で５日間、ＭＣＳＰ－及びＦＡＰを共発現するＭＶ３細胞と共培養した。図４Ｈに示すように、ＣＤ２８結合因子の全ての変異体は機能的であり、濃度依存的にＴＣＢ媒介Ｔ細胞増殖を増加させることができた。注目すべきことに、最も低い親和性変異体８（Ｐ１ＡＥ３１３１）は、親ＣＤ２８クローンと比較して親和性の約２０倍の減少を示すが、その効力の約８６％を回復する（図４Ｉ）。これらの知見と一致して、全ての変異体は、ＭＶ３標的細胞のＴＣＢ媒介性死滅を更に増強することができた（図４Ｊ）。対応するＥＣ５０値を、下表８に示す。
Figure 2023021958000045
これらの結果に基づいて、インビトロでの更なる特性評価及びインビボでの試験のために変異体８（最も低い親和性、２３ｎＭ）、１５（中間親和性：７．１ｎＭ）及び２９（除去されたホットスポット、ほとんど親和性低下なし、ＫＤ＝１．１ｎＭ）を選択し、有効性及び腫瘍への改善された生体内分布によって判断した。
親和性低下ＣＤ２８結合因子変異体は、ＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性フォーマットにおいてインビトロで機能的である
別のアプローチでは、本発明者らは、３つの選択された変異体８、１５及び２９をＣＥＡ標的二重特異性フォーマットに変換し、ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化及び標的細胞死滅を増強する能力を評価した。これらの分子のＣＤ２８への結合を図１６に示す。機能性を評価するために、ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５標的細胞の存在下で、漸増濃度のＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ及び固定濃度のＣＥＡ－ＣＤ２８変異体と共にインキュベートした。図１７Ａ、１７Ｂ及び１７Ｃに示されるように、全ての変異体は、５日後にＴＣＢ媒介ＣＤ８ Ｔ細胞増殖を増強することができ（図１７Ａ）、５日後にＣＤ４ Ｔ細胞増殖を増強することができ（図１７Ｂ）、９０時間で細胞を死滅させることを標的とすることができた（図１７Ｃ）。対応するＥＣ５０値を以下の表９に要約する。
Figure 2023021958000046
実施例１０
新規抗ＣＥＡ抗体の作製及び作製
１０．１ 抗ＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変異体の作製
１０．１．１ 方法論
抗ＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７は例えば、Ｍ．Ｊ．Ｂａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９７，２９（２），１６１－１７１により開示されており、その構造は、タンパク質構造データベースＰＤＢ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ，Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，２８，２３５－２４２）においてＰＤＢ ＩＤ：１ＣＬＯとして見つけることができる。このエントリーは、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。抗ＣＥＡ結合因子Ａ５Ｂ７のヒト化の間に、好適なヒトアクセプターフレームワークを識別するために、高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを検索し、このフレームワークのＣＤＲをグラフトし、復帰突然変異が予想可能なものを評価することによる、古典的なアプローチを利用した。より明示的には、親抗体に対する、識別したフレームワークの各アミノ酸の違いの、結合因子に対する構造的完全性の影響を判断し、適切な場合はいつでも、親配列に対する逆突然変異を導入した。構造評価は、親抗体と、Ｂｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，バージョン４．５を使用して実装した、社内で抗体構造相同性モデリングツールにより作製したそのヒト化バージョンとの両方のＦｖ領域相同性モデルに基いた。
１０．１．２ アクセプターフレームワークの選択及びその適合
アクセプターフレームワークを、下表１０に記載のとおりに選択した。
Figure 2023021958000047
 重鎖に関しては、ヒトＪエレメント生殖細胞系ＩＧＪＨ６、及び、軽鎖に関しては、カッパＪエレメントＩＧＫＪ２に類似した配列から、ポストＣＤＲ３フレームワーク領域を適合させた。
構造の考察に基づき、親結合因子における、ヒトアクセプターフレームワークからアミノ酸への復帰突然変異を、重鎖の位置９３及び９４に導入した。
１０．１．３ 得られるヒト化ＣＥＡ抗体のＶＨ及びＶＬ領域
ヒト化ＣＥＡ抗体の得られたＶＨドメインは、下表１１に見いだすことができ、ヒト化ＣＥＡ抗体の得られたＶＬドメインは、下表１２に列挙されている。
Figure 2023021958000048
重鎖に関して、最初の変異体３－２３Ａ５－１は、結合アッセイにおいて好適であることが発見され（しかし、親マウス抗体よりわずかに低い結合を示した）、更なる修飾のための起点として選択した。ＩＧＨＶ３－１５に基づく変異体は、ヒト化変異体３－２３Ａ５－１と比較して、低い結合活性を示した。
親キメラ抗体の完全な結合活性を復元するために、変異体３－２３Ａ５－１Ａ、３－２３Ａ５－１Ｃ、及び３－２３Ａ５－１Ｄを作製した。ＣＤＲ－Ｈ２の長さがヒトアクセプター配列に適合可能であるか否か、変異体３－２３Ａ５－１を試験したが、このコンストラクトは完全に結合活性を失っていた。推定では、アミド分解ホットスポットはＣＤＲ－Ｈ２（Ａｓｎ５３－Ｇｌｙ５４）に存在したため、このモチーフをＡｓｎ５３－Ａｌａ５４に変更した。可能性のある別のホットスポットＡｓｎ７３－Ｓｅｒ７４を、Ｌｙｓ７３－Ｓｅｒ７４に復帰突然変異させた。このように、変異体３－２３Ａ５－１Ｅを作製した。
Figure 2023021958000049
ヒトＩＧＫＶ３－１１アクセプターフレームワークに基づき、軽鎖をヒト化した。連続したＡ５－Ｌ１からＡ５－Ｌ４において、変異体Ａ５－Ｌ１は良好な結合活性を示す（しかし、親抗体をわずかに下回る）ことが分かった。ＣＤＲ－Ｌ１（変異体Ａ５－Ｌ２；Ｋａｂａｔ位置３０及び３１）の部分的なヒト化により、結合が完全に失われる。同様に、ＣＤＲ－Ｈ２（変異体Ａ５－Ｌ３；Ｋａｂａｔ位置５０～５６）のヒト化によってもまた、結合が完全に失われる。位置９０（変異体Ａ５－Ｌ４）は、結合特性に対する著しい寄与を示す。この位置におけるヒスチジンは、結合に重要である。したがって、変異体Ａ５－Ｌ１を更なる修飾のために選択した。
連続したＡ５－Ｌ１Ａ～Ａ５－Ｌ１Ｄは、親キメラ抗体の完全な結合能力を復元するために、どの復帰突然変異が必要であるかの問いを解決した。Ｋａｂａｔ位置１、２、全体フレームワーク２、並びにＫａｂａｔ位置７１における復帰突然変異は、どのような更なる結合活性も添加しないことを、変異体Ａ５－Ｌ１Ａは示した。変異体Ａ５－Ｌ１Ｂ、及びＡ５－Ｌ１Ｃは、これらの位置のサブセットを解決し、そのサブセットは結合特性を変化させないことを確認する。Ｋａｂａｔ位置４６及び４７において復帰突然変異を有する変異体Ａ５－Ｌ１Ｄは、最良の結合活性を示した。
１０．１．４ ヒト化Ａ５Ｂ７抗体の選択
ＶＨ及びＶＬの新規のヒト化変異体に基づき、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載の方法に従い、新規のＣＥＡ抗体を、エフェクターサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ）を有するｈｕＩｇＧ１抗体として発現させてＦｃγ受容体への結合をなくし、ＭＫＮ４５細胞上で発現したＣＥＡへの結合を試験し、それぞれの親マウスＡ５Ｂ７抗体と比較した。
Figure 2023021958000050
ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４０９）は、ＣＥＡを発現するヒトの胃腺癌細胞株である。細胞を、高度ＲＰＭＩ＋２％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘで培養した。ＭＫＮ－４５細胞の生存能を確認し、細胞を再懸濁し、１Ｍｉｏ細胞／ｍＬの密度に調節した。１００μＬのこの細胞懸濁液（０．１Ｍｉｏ細胞を含有）を、９６ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを４分間４００×ｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次に、４０μＬの希釈抗体又はＦＡＣＳ緩衝液を細胞に添加し、３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２０μＬの希釈した二次ＰＥ抗ヒトＦｃ特異性二次抗体（１０９－１１６－１７０，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に加えた。細胞を更に３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％ ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
図１８に、ヒト化Ａ５Ｂ７変異体の結合曲線を示す。試験した結合因子は全て、ＭＫＮ４５細胞に結合することができたが、結合能力は、親Ａ５Ｂ７抗体と比較してわずかに低下した。クローンＰ１ＡＥ２１６７は、試験した全ての変異体に最良の結合を有したので、更なる開発のために選択した。
１０．１．５表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用した、マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変異体のＦａｂ断片の、ヒトＣＥＡに対する親和性の測定
マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変異体のＦａｂ断片の、ヒトＣＥＡに対する親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００機器を用いる表面プラズモン共鳴により評価した。ＣＭ５チップ上で、ヒトＣＥＡ（ｈｕ Ｎ（Ａ２－Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ Ｂ）を、フローセル２上での３０秒間の、約１００ＲＵに対する標準的なアミンカップリングにより、４０ｎＭの濃度で不動態化した。マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変異体のＦａｂ断片を、１２０秒の接触時間、２５０又は１０００秒の解離時間、及び３０μＬ／分の流速に対して、５００～０．６５６ｎＭの範囲の３倍希釈で、分析物としてその後注入した。ヒトＣＥＡ（ｈｕ Ｎ（Ａ２－Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ Ｂ）の濃度における再生は、２パルスの、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ ｐＨ ２．０（６０秒間）により達成された。不動態化フローセル１、及び分析物のゼロ濃度に対して、データを二重参照した。分析物の前記を、単純な１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。ヒトＣＥＡ（Ａ２ドメイン）に対する親和性定数［ＫＤ］を、下表１４に要約する。
Figure 2023021958000051
マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変異体は、親マウス抗体よりも低い親和性を有する。Ｐ１ＡＥ２１６７（ＶＨ変異体３－２３Ａ５－１Ａを有する重鎖、及びＶＬ変異体Ａ５－Ｌ１Ｄを有するＣカッパ軽鎖）に由来するＦａｂ断片Ｐ１ＡＥ４１３８を、最終のヒト化変異体として選択した。更に、アミド分解部位を取り除くために、Ｋａｂａｔ位置５４における、グリシンからアラニンへの変異（Ｇ５４Ａ）をＶＨドメインに導入し、ＶＬ変異体３－２３Ａ５－１Ｅをもたらした。最終のヒト化抗体（ＶＨ変異体３－２３Ａ５－１Ｅを有する重鎖、及びＶＬ変異体Ａ５－Ｌ１Ｄを有するＣカッパ軽鎖）の名前を、Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ又はｈｕＡ５Ｂ７とした。
１０．２ Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ由来の親和性成熟抗ＣＥＡ抗体の作製
１０．２．１ファージディスプレイキャンペーンのための抗原の調製、精製及び特性評価
マウス抗体Ａ５Ｂ７及びそのヒト化誘導体Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄは、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）のＡ２ドメインに、それぞれ約０．８及び約２．５ｎＭの親和性で結合する。ファージディスプレイによるＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄの親和性成熟変異体の生成のために、３つの異なる組換え可溶性抗原を生成した。各タンパク質は、部位特異的ビオチン化のためのＣ末端ａｖｉタグ及び精製のためのｈｉｓタグを含んでいた：第１のタンパク質は、４つのＩｇ様ドメインＮ、Ａ１、Ｂ、Ａ２（ＮＡＢＡ－ａｖｉ－Ｈｉｓ、配列番号２３８、表１５）からなるＣＥＡＣＡＭ１の細胞外部分からなっていた。第２のタンパク質は、２つのＣＥＡＣＡＭ５及び２つのＣＥＡＣＡＭ１ Ｉｇドメインからなるキメラタンパク質であった。ＣＥＡＣＡＭ１の４つのドメインの配列に基づいて、ＣＥＡＣＡＭ１の第２及び第３のドメインをコードするＤＮＡ（Ａ１及びＢドメイン）を、ＣＥＡＣＡＭ５のＡ２及びＢ２ドメインをコードするＤＮＡ（Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ、配列番号２３９、表１５）で置き換えた。第３のタンパク質は、１つのＣＥＡＣＡＭ５及び３つのＣＥＡＣＡＭ１ Ｉｇドメインからなるキメラタンパク質であった。ＣＥＡＣＡＭ１の４つのドメインの配列に基づいて、ＣＥＡＣＡＭ１の第３のドメイン（Ｂドメイン）をコードするＤＮＡを、ＣＥＡＣＡＭ５のＢ２ドメイン（ＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ、配列番号２４０、表１５）をコードするＤＮＡで置き換えた。３つのコンストラクトの概略説明を図１９Ａ、１９Ｂ及び１９Ｃに示す。
Figure 2023021958000052
各プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過性トランスフェクトし、ＥＢＶ由来タンパク質ＥＢＮＡ（ＨＥＫ ＥＢＮＡ）を安定して発現させた。ビオチンリガーゼＢｉｒＡをコードする同時に共トランスフェクトされたプラスミドが、ｉｎ ｖｉｖｏでのａｖｉタグ特異的なビオチン化を可能にした。タンパク質を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）とその後のゲル濾過を使用した標準プロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養上清から精製した。単量体タンパク質画分をプールし、濃縮し（必要に応じて）、凍結し、－８０℃で保存した。試料の一部を、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析による特性決定のために提供した。
１０．２．２ 親和性成熟Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ由来抗体の選択
抗体Ａ５Ｂ７のヒト化は、ＳＰＲによって測定したＣＥＡに対する親和性の約３～４倍の低下をもたらした。Ａ５Ｂ７に対する親和性は約０．８ｎＭであったが、Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄについては約２．５ｎＭの親和性が測定された。異なるＣＥＡ発現レベルを有する細胞株を用いたＦＡＣＳ実験により、この知見が確認された。ヒト化クローンＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄの親和性を改善するために、３つの異なる親和性成熟ライブラリを作製し、ファージディスプレイによる親和性が改善されたクローンの選択に使用した。
１０．２．２．１ Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ親和性成熟ライブラリの作製
親和性成熟Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ由来抗体の作製を、標準的なプロトコル（Ｓｉｌａｃｃｉ ｅｔ ａｌ，２００５）を使用してファージディスプレイによって行った。第１の工程では、ヒト化親クローンＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ（配列番号１８６及び１８７のアミノ酸配列）のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列をファージミドにクローニングし、次いでこれをランダム化のための鋳型として使用した。次の工程では、ファージディスプレイによる好ましいクローンの選択のために３つのライブラリを作製した。成熟ライブラリ１及び２を、重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２又は軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のいずれかにランダム化した。第３の成熟化ライブラリを、重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ３領域においてランダム化した。それぞれのＣＤＲ領域におけるランダム化された位置を図２０Ａ及び２０Ｂに示す。重鎖のＣＤＲ１及び２においてランダム化された成熟ライブラリ１を作製するために、「重複伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって２つの断片を構築し、ファージベクターにクローニングした（図２１Ａ）。以下のプライマーの組合せを使用して、ライブラリ断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号２４３、表１６）及びＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ＿Ｈ１＿ｒｅｖ＿ＴＮ（配列番号２４１、表１６）及び断片２（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ＿Ｈ２＿ｆｏｒ＿ＴＮ（配列番号２４２、表７）及びＨＣＤＲ３－ｒｅｖ－ｃｏｎｓｔａｎｔ（配列番号２４４、表１６）。
Figure 2023021958000053
重鎖のＣＤＲ１及び２においてランダム化された成熟ライブラリ２を作製するために、「重複伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって２つの断片を構築し、ファージベクターにクローニングした（図２１Ｂ）。以下のプライマーの組合せを使用して、ライブラリ断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号：２４３、表１７）及びＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ＿Ｌ１＿ｒｅｖ＿ＴＮ（配列番号：断片２４５、表１７）及び断片２（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ＿Ｌ２＿ｆｏｒ＿ＴＮ（配列番号：２４６、表１７）及びＨＣＤＲ３－ｒｅｖ－ｃｏｎｓｔａｎｔ（配列番号：２４４、表１７）。
Figure 2023021958000054
重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３においてランダム化された成熟ライブラリ３を作製するために、「重複伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって２つの断片を構築し、ファージベクターにクローニングした（図２１Ｃ）。以下のプライマーの組合せを使用して、ライブラリ断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号：２４３、表１８）及びＬＣＤＲ３－ｒｅｖ－ｃｏｎｓｔａｎｔ（配列番号：２４９、表１８）及び断片２（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ＿Ｌ３＿ｆｏｒ＿ＴＮ（配列番号：２４７、表１８）及びＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ＿Ｈ３＿ｒｅｖ＿ＴＮ（配列番号：２４８、表１８）。
Figure 2023021958000055
各ライブラリの断片のアセンブリのために、等モル量の各断片を使用し、それぞれの外側プライマーで増幅した。ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３にランダム化した第３のライブラリの断片のアセンブリのために、プライマーＬＭＢ３（配列番号２４３、表１８）をプライマー「ＨＣＤＲ３増幅」（配列番号２５０、表１８）と組み合わせて使用した。このプライマーを、ＶＨのＣ末端をＫｐｎＩ部位を含む配列で伸長するために使用した。十分な量の完全長ランダム化断片の組立て後、それらを同様に処理した受容体ファージミドベクターと共にＮｃｏＩ／ＫｐｎＩで消化した。３倍モル過剰のライブラリインサートを２０μｇのファージミドベクターと連結した。精製したライゲーションを２０回の形質転換に使用し、約０．７×１０９から２×１０９の形質転換体を得た。Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ親和性成熟ライブラリを示すファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製して選択に使用した。
１０．２．２．２ 親和性成熟Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ由来クローンの選択
親和性成熟クローンの選択のために、３つ全てのライブラリを用いたファージディスプレイ選択を、組換え可溶性抗原を用いて行った。パニングラウンドを、以下のパターンに従って溶液中で行った：１．２００ｎＭビオチン化ＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ及びＮＡＢＡ－ａｖｉ－ｈｉｓと０．５時間インキュベートすることによる非特異的ファージミド粒子の前除去、２．５．４×１０７ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを１０分間添加することによるビオチン化ＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ、ＮＡＢＡ－ａｖｉ－ｈｉｓ及び結合ファージミド粒子の捕捉、３．更なる選択のための上清からの非結合ファージミド粒子の単離、４．総体積１ｍｌでの２０ｎＭビオチン化Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓへのファージミド粒子の０．５時間の結合、５．ビオチン化Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓタンパク質の捕捉、及び５．４×１０７ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの添加による特異的に結合したファージ粒子の１０分間の捕捉、６．５×１ｍｌ ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×１ｍｌ ＰＢＳを使用したビーズの洗浄、７．１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡの添加によるファージ粒子の１０分間の溶出、及び５００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ７．４ファージを添加することによる中和、８．指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌の感染、９．ヘルパーＶＣＳＭ１３による感染、及び１０．続くファージミド粒子（その後の選択ラウンドで使用する）のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。減少する抗原濃度（２０×１０－９Ｍ、１０×１０－９Ｍ、及び２×１０－９Ｍ）を使用して３回にわたって選択を行った。第３ラウンドでは、ストレプトアビジンビーズを２０×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。
特異的結合因子を、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定した：ウェルあたり１００μｌの１０ｎＭビオチン化Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓタンパク質又は４０ｎＭビオチン化ＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓタンパク質のいずれかをニュートラビジンプレート上にコーティングした。Ｆａｂを含む細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用して結合ＦａｂをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。ＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓタンパク質上ではなく、組換えＮ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓタンパク質上でＥＬＩＳＡ陽性であったクローンを、ＳＰＲによって更に試験した。
１０．２．２．３ ＳＰＲによる親和性成熟Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ由来変異体の同定
ＥＬＩＳＡ陽性クローンを更に特性評価するために、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６装置を使用して表面プラズモン共鳴によってオフレートを測定し、結果を親ヒト化クローンＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄと比較した。
この実験のために、約２０００、１０００及び５００ ＲＵのビオチン化Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓを、ストレプトアビジン被覆ＮＬＣチップを垂直配向で使用して３つのチャネルに固定化した。非特異的結合の対照として、２０００ＲＵのビオチン化ＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓタンパク質をチャネル４に固定化した。同定されたＥＬＩＳＡ陽性クローンのオフレート分析のために、注入方向を水平配向に変更した。注射前に、各Ｆａｂ含有細菌上清をフィルタにかけ、ＰＢＳで３倍希釈した。会合時間は１００μｌ／分で１００秒であり、解離時間は６００秒又は１２００秒のいずれかであった。Ｆａｂ断片を含まない細菌上清を参照に使用した。再生を、５０μｌ／分（垂直配向）で３５秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ １．５で行った。
解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。最も遅い解離速度定数を有するＦａｂを発現するクローンを同定し、候補を挙げた。以下に列挙したクローンを、同じ条件下で追加のＳＰＲ実験で再評価した。このとき、各注射中に、４つの親和性成熟クローンを親クローンＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄと並行して直接比較した。Ｆａｂ断片を含まない細菌上清を参照に使用した。Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ上でＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄよりも遅い解離速度を示し、ＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓに結合しなかったクローンを選択し、対応するファージミドの可変ドメインを配列決定した。最良のクローンの測定された解離速度を表１９に示し、それぞれの可変ドメインの配列を表２０に列挙する。
Figure 2023021958000056
Figure 2023021958000057
Figure 2023021958000058
１０．２．２．４ 親和性成熟Ａ５Ｈ１ＥＬ１ＤクローンのＦａｂ精製
親和性成熟クローンを更に特性評価するために、動態パラメータの正確な分析のためにそれぞれのＦａｂ断片を精製した。各クローンについて、５００ｍｌの培養物に、対応するファージミドを有する細菌を接種し、６００ｎｍで測定した光学密度（ＯＤ６００）が０．９の１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。その後、培養物を２５℃で一晩インキュベートし、遠心分離により回収した。再懸濁したペレットを２５ｍｌのＰＰＢ緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ショ糖）で２０分間インキュベートした後、細菌を再度遠心分離し、上清を回収した。このインキュベーション工程を、２５ｍｌの５ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液で１回繰り返した。両方のインキュベーション工程の上清をプールし、フィルタにかけ、ＩＭＡＣカラム（Ｈｉｓ ｇｒａｖｉｔｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。続いて、カラムを４０ｍｌの洗浄緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ ７．４）で洗浄した。溶出後（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ ７．４）、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して溶出液を再緩衝化した。精製タンパク質の収量は３００～５００μｇ／Ｌの範囲であった。
１０．２．２．５ 精製された親和性成熟Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ Ｆａｂ断片のＳＰＲ分析
精製されたＦａｂ断片の親和性（ＫＤ）を、先に記載されたものと同じ設定を使用して、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６装置を使用する表面プラズモン共鳴によって測定した。
約２０００、１０００、５００、及び２５０ ＲＵのビオチン化Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓを、ストレプトアビジン被覆ＮＬＣチップの４つのチャネルに垂直配向で固定化した。非特異的結合の対照として、２０００ＲＵのビオチン化ＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓタンパク質をチャネル５に固定化した。精製クローンの親和性（ＫＤ）を決定するために、注射方向を水平配向に変更した。２倍希釈系列の精製Ｆａｂ断片（１００ｎＭ～３ｎＭの様々な濃度範囲）を、１００秒の会合時間及び１２００秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って１００μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。再生を、５０μｌ／分（垂直配向）で３５秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ １．５で行った。
会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。動力学的及び熱力学的データを表２１に列挙する。
Figure 2023021958000059
１０．２．２．６ 親和性成熟クローンのＣＤＲ位置の組み合わせ
ＣＥＡに対する親和性を更に増加させる試みにおいて、いくつかの以前に同定された親和性成熟結合因子のＣＤＲ位置を互いに組み合わせた。これには、ＣＤＲ内の特定の位置だけでなく、異なる結合因子からのＣＤＲの組み合わせも含まれる。全てのクローン、ファージディスプレイ由来クローン及びコンビナトリアルクローンのアラインメントを図２２Ａ及び２２Ｂに示す。全ての重鎖及び軽鎖のＣＤＲをそれぞれ表２２及び２３に列挙する。ＶＨドメイン及びＶＬドメインを表２０に要約する。
Figure 2023021958000060
Figure 2023021958000061
１０．３ 親和性成熟Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ由来二重特異性抗体の作製及び特性評価
１０．３．１ 二重特異性抗体のクローニング、作製及び精製
全てのクローンの可変ドメインを合成し、ノブ・イントゥ・ホール変異及びＰＧ－ＬＡＬＡ変異と組み合わせたｃｒｏｓｓｍａｂ技術に基づいて二重特異性１＋１ ＩｇＧ分子をコードするプラスミドにクローニングした。第２の結合部分はＣＤ２８に特異的であった。最終分子の概略説明を図１Ｊに示す。得られた分子は、表２４に列挙された配列から構成される。親和性成熟結合因子（配列番号３２３～３４８）のＶＬ及びＶＨ配列を発現する全ての鎖の組み合わせを、ＣＤ２８に特異的な２本の鎖（配列番号３４９及び３５０）と組み合わせた。
従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、（元は、ＡＴＣＣより受託し、Ｅｖｉｔｒｉａにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した）懸濁適応性ＣＨＯ Ｋ１細胞を用い、Ｅｖｉｔｒｉａにより、得られたコンストラクトを調製した。産生のために、Ｅｖｉｔｒｉａは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）、並びに、専有のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ ３．０で達成され、続いて試料をすぐに中和した。タンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
Figure 2023021958000062
Figure 2023021958000063
Figure 2023021958000064
Figure 2023021958000065
１０．３．２ ＳＰＲによる選択された抗体の親和性決定
親抗体Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ及びその親和性成熟誘導体の親和性（ＫＤ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて２５℃でＳＰＲによって測定した。
約２０００、１０００、５００、及び２５０ ＲＵのビオチン化Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ を、ストレプトアビジン被覆ＮＬＣチップの４つのチャネルに垂直配向で固定化した。非特異的結合の対照として、２０００ＲＵのビオチン化ＮＡ（Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓタンパク質をチャネル５に固定化した。精製二重特異性コンストラクトの親和性（ＫＤ）を決定するために、注射方向を水平配向に変更した。精製二重特異性ＩｇＧの２倍希釈系列（２５～１．５６ｎＭの様々な濃度範囲）を、１８０秒の会合時間及び１２００秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って１００μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。再生を、５０ｕｌ／分（垂直配向）で２０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ １．５で行った。
会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。全ての動力学的及び熱力学的データを表２５に列挙する。ファージディスプレイ選択によって同定された親和性成熟クローンについて、より高い親和性（より低いＫＤ値）が観察された。更に、交換されたＣＤＲ及びＣＤＲ位置との組み合わせを試験した。いくつかの組み合わせ（例えば、クローン「Ｐ００５．１０３－ｃｏｍｂｏ２」及び「Ｐ００５．１０２－ｃｏｍｂｏ１」）は、非常に遅い解離速度、結果として非常に高い親和性をもたらしたが、２つのコンビナトリアルクローン（クローンＰ００６．０３８－ｃｏｍｂｏ１」及び「Ｐ００６．０３８－ｃｏｍｂｏ２」）では親和性が有意に低下した。
Figure 2023021958000066
実施例１１
ＣＤ２８及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする更なる二重特異性抗原結合分子の作製
１１．１ 二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。得られた分子の概略説明を図２３に示す。Ｆｃドメインにおいて、国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異（ＰＧ－ＬＡＬＡ）を、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Ｆｃ断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）又は「ホール」変異（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異）のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／Ｃカッパドメインの交換を１つの結合部分に導入した（クロスＦａｂ技術）。国際特許出願の国際公開第２０１５／１５０４４７号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をＣＨ１ドメイン及びＣカッパドメインに導入した。抗ＣＥＡクローンＴ８４．６６の生成及び調製は、国際公開第２０１６／０７５２７８号Ａ２に記載されている。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図２３Ａ～２３Ｄに示す：
分子１１Ａ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋１フォーマット、配列番号３５１、３５２、３５３及び３５４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ４７７３）（図２３Ａ）。
分子１１Ｂ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）１＋１フォーマット、配列番号３５１、３５２、３５５及び３５６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ４７７４）（図２３Ａ）。
分子１１Ｃ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３５１、３５２、３５７及び３５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ４７７５）（図２３Ａ）。
分子１１Ｄ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２９）１＋１フォーマット、配列番号３５１、３５２、３５９及び３５４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２９）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ４７７６）（図２３Ａ）。
分子１１Ｅ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋１フォーマット、ＣＤ２８（ＳＡ）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換及び配列番号３６０、３６１、３６２及び３６３（Ｐ１ＡＥ４７７７）のアミノ酸配列を含むＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図２３Ｂ）。
分子１１Ｆ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（変異体８）１＋１フォーマット、ＣＤ２８（変異体８）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換及び配列番号３６０、３６１、３６４及び３６５（Ｐ１ＡＥ４７８０）のアミノ酸配列を含むＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図２３Ｂ）。
分子１１Ｇ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（変異体１５）１＋１フォーマット、ＣＤ２８（変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換及び配列番号３６０、３６１、３６６及び３６７（Ｐ１ＡＥ４７９１）のアミノ酸配列を含むＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図２３Ｂ）。
分子１１Ｈ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（変異体２９）１＋１フォーマット、ＣＤ２８（変異体２９）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換及び配列番号３６０、３６１、３６８及び３６３（Ｐ１ＡＥ４７９３）のアミノ酸配列を含むＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図２３Ｂ）。
分子１１Ｉ：ＣＥＡ（Ｔ８４．６６）－ＣＤ２８（ＳＡ）１＋１フォーマット、配列番号３６９、３７０、３５３及び３５４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ）Ｆａｂフラグメント（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ｔ８４．６６）Ｆａｂフラグメント（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ＰＧ－ＬＡＬＡクロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ６４８８）（図２３Ａ）。
分子１１Ｊ：ＣＥＡ（Ｔ８４．６６）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２９）１＋１フォーマット、配列番号３６９、３７０、３５９及び３５４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２９）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ｔ．８４．６６）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ６４９５）（図２３Ａ）。
分子１１Ｋ：ＣＥＡ（Ｔ８４．６６）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３６９、３７０、３５７及び３５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ｔ８４．６６）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ６５５７）（図２３Ａ）。
分子１１Ｌ：ＣＥＡ（Ｔ８４．６６）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）１＋１フォーマット、配列番号３６９、３７０、３５５及び３５６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ｔ８４．６６）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ６５５６）（図２３Ａ）。
分子１１Ｍ：ＣＥＡ（Ｔ８４．６６）－ＣＤ２８（変異体２９）１＋１フォーマット、ＣＤ２８（変異体２９）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換及び配列番号３７１、３７２、３６８及び３６３（Ｐ１ＡＥ９６０５）のアミノ酸配列を含むＣＥＡ（Ｔ８４．６６）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図２３Ｂ）。
分子１１Ｎ：ＣＥＡ（Ｔ８４．６６）－ＣＤ２８（変異体８）１＋１フォーマット、ＣＤ２８（変異体８）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換及び配列番号３７１、３７２、３６６及び３６７（Ｐ１ＡＥ９６０６）のアミノ酸配列を含むＣＥＡ（Ｔ８４．６６）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図２３Ｂ）。
分子１１Ｏ：ＣＥＡ（Ｔ８４．６６）－ＣＤ２８（変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３７１、３７２、３６４及び３６５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）中のＶＨ／ＶＬ交換及びＣＥＡ（Ｔ８４．６６）Ｆａｂ断片（ホール）中の荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ９６０７）（図２３Ｂ）。
分子１１Ｐ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（ＳＡ－変異体２９）２＋１、二重特異性一価抗ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２９）及び二価抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト、頭部と尾部が互いに融合した両方の抗ＣＥＡ Ｆａｂ断片における荷電修飾（ホール）、抗ＣＤ２８クロスＦａｂ断片におけるＶＨ／ＶＬ交換（ノブ）（図２３）。分子は、配列番号３６８、３６２、３６１及び３７３（Ｐ１ＡＥ６９２４）のアミノ酸配列を含む。
分子１１Ｑ：ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２９）２＋１、二重特異性一価抗ＣＤ２８（ＳＡ）及び二価抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂコンストラクト、「古典的配向」、抗ＣＤ２８クロスＦａｂ断片におけるＶＨ／ＶＬ交換、両方の抗ＣＥＡ ＦＡＰ Ｆａｂ断片における荷電修飾（図２３Ｄ）。分子は、配列番号３６８、３７４、３６１及び３６０（Ｐ１ＡＥ６９２５）のアミノ酸配列を含む。
分子１１Ｒ：ＣＥＡ（Ｐ００２．１３９）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３７５、３７６、３５７及び３５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ｐ００２．１３９）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＥ８３７１）（図２３Ａ）。
分子１１Ｓ：ＣＥＡ（Ｐ００２．１３９）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）１＋１フォーマット、配列番号３７５、３７６、３５５及び３５６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ｐ００２．１３９）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＦ１１１５）（図２３Ａ）。
分子１１Ｔ：ＣＥＡ（Ｐ００２．１３９）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１１）１＋１フォーマット、配列番号３７５、３７６、３５５及び３５４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１１）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＣＥＡ（Ｐ００２．１３９）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＦ１１１６）（図２３Ａ）。
比較のため、以下の抗ＣＤ２８抗体変異体を作製した：
分子１１Ｕ：ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）（ＰＧ－ＬＡＬＡ）、ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡアイソタイプ（図１Ｂ）におけるＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）抗体は、配列番号３７７及び配列番号３７８のアミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＥ７０３５）。
分子１１Ｖ：ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１１）（ＰＧ－ＬＡＬＡ）、ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡアイソタイプ（図１Ｂ）におけるＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１１）抗体は、配列番号３７９及び配列番号３８０のアミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＥ７０３６）。
分子１１Ｗ：ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）（ＰＧ－ＬＡＬＡ）、ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡアイソタイプ（図１Ｂ）におけるＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）抗体は、配列番号３８１及び配列番号３８２のアミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＥ７０３７）。
分子１１Ｘ：ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２７）（ＰＧ－ＬＡＬＡ）、ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡアイソタイプ（図１Ｂ）におけるＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２７）抗体は、配列番号３８３及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＥ７０３８）。
分子１１Ｙ：ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２９）（ＰＧ－ＬＡＬＡ）、ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡアイソタイプ（図１Ｂ）におけるＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２９）抗体は、配列番号３８５及び配列番号３８６のアミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＥ７０３９）。
１１．２ 分子の製造
上記の分子の発現は、キメラＭＰＳＶプロモーター又はＣＭＶプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
分子１１Ａ～１１Ｄ及び１１Ｉ～１１Ｔの産生のために、懸濁状態で成長するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンを使用してそれぞれの発現ベクターで同時トランスフェクトした。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩを添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合して、振蕩フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、編者：Ｗｅｉｃｈａｎｇ Ｚｈｏｕ，Ａｎｎｅ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ）。トランスフェクションの１日後、サプリメント（フィード）を添加した（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、編者：Ｗｅｉｃｈａｎｇ Ｚｈｏｕ，Ａｎｎｅ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ）。細胞上清を遠心分離及びその後、フィルタにかけ（０．２μｍフィルタ）によって７日後に回収し、標準的な方法によって精製した。
従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、（元は、ＡＴＣＣより受託し、Ｅｖｉｔｒｉａにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した）懸濁適応性ＣＨＯ Ｋ１細胞を用い、Ｅｖｉｔｒｉａにより、分子１１Ｕ、１１Ｖ、１１Ｗ、１１Ｘ及び１１Ｙを調製した。産生のために、Ｅｖｉｔｒｉａは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）、並びに、専有のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により上清を回収し、標準的な方法により精製した。分子１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ及び１１Ｈを、それらの標準的な方法及びプロトコルに従ってＰｒｏｔｅｒｏｓによって生成及び精製した。
１１．３ 分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ ３．０で達成され、続いて試料をすぐにｐＨ 中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（物品番号：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
１１．４ ＣＤ２８及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の分析データ
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表２６に示す。
Figure 2023021958000067
Figure 2023021958000068
１１．５ ＳＰＲによるＣＤ２８及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の結合解析
抗ＣＥＡ抗体Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ及び抗ＣＤ２８結合因子変異体８、１１及び２９並びに元の結合因子ＣＤ２８（ＳＡ）を有する分子１０Ａ～１０ＤのＣＤ２８に対する親和性（ＫＤ）を、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６装置を使用して表面プラズモン共鳴によって測定した。組換え抗原（リガンド）の固定化のために、ｈｕＣＤ２８－ＦｃをＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１００～５００ｎＭの範囲の濃度に希釈し、次いで、様々な接触時間で２５μｌ／分で注射した。これにより、垂直方向で５００～３０００応答単位（ＲＵ）の間の固定化レベルが得られた。
精製分子の親和性（ＫＤ）を決定するために、注射方向を水平配向に変更した。２倍希釈系列の精製コンストラクト（１００～６．２５ｎＭの様々な濃度範囲）を、１５０秒の会合時間及び４００秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って１００μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。再生を、５０μｌ／分（垂直配向）で３５秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ １．５で行った。会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。動力学的及び熱力学的データを表２７に列挙する。
Figure 2023021958000069
１１．６ 抗ＣＤ２８ ＩｇＧ変異体及び選択された１＋１二重特異性ＣＥＡ標的化抗ＣＤ２８抗原結合分子の生化学的特性評価
それらの生化学的及び生物物理学的特性を特性評価し、比較するために、以下の分子を詳細に分析した：ＣＥＡ標的化抗ＣＤ２８二重特異性変異体分子１０Ａ～１０Ｄ及び抗ＣＤ２８ ＩｇＧ変異体分子１０Ｕ～１０Ｙ。結果を表２７及び２８に要約する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
見かけの疎水性は、２０μｇの試料を２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ ７．０で平衡化したＨＩＣ－Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ）カラムに注入することにより決定した。溶出は、０～１００％の緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０）の直線勾配で６０分以内に行った。保持時間を、既知の疎水性を有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、０～０．３５の相対保持時間を示す。
熱安定性
試料を、２０ｍＭ ヒスチジン／ヒスチジンクロリド、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ ６．０で１ｍｇ／ｍＬの濃度にて調製し、０．４μｍフィルタプレートで遠心分離して光学３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。流体力学的半径を、試料を２５℃から８０℃まで０．０５℃／分の速度で加熱しながら、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（ワイアット）で動的光散乱法によって繰り返し測定した。
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー
Ｃｙｍｅｒ，Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ２０１７，９（１７），ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１５５／ｂｉｏ－２０１７－０１０９に記載されているように、ＦｃＲｎを発現させ、精製し、ビオチン化した。カップリングのために、調製した受容体をストレプトアビジン－セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加えた。得られたＦｃＲｎ－セファロースマトリックスをカラムハウジングに充填した。カラムを２０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリン）－エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ５．５（溶離液Ａ）で０．５ｍｌ／分の流速で平衡化した。３０μｇの抗体試料を溶離液Ａで１：１の容量比で希釈し、ＦｃＲｎカラムにアプライした。カラムを５カラム容量の溶離液Ａで洗浄し、続いて２０～１００％の直線勾配で３５カラム容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．８（溶離液Ｂ）で溶出した。分析を２５℃のカラムオーブンを用いて行った。溶出プロファイルを、２８０ｎｍでの吸光度の連続測定によって監視した。保持時間を、既知のアフィニティーを有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、０～１の相対保持時間を示す。
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
ヘパリン親和性を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）で平衡化したＴＳＫｇｅｌヘパリン－５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ）カラムに３０～５０μｇの試料を注入することによって決定した。溶出は、３７分以内に０から１００％の緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４ｍＭ）の直線勾配で行った。保持時間を、既知のアフィニティーを有するタンパク質標準と比較した。
試験した配列変異体はいずれも、全ての基準を満たし、試験した全ての生物物理学的及び生化学的特性に関して互いに有意に異ならない（表２８及び２９）。
Figure 2023021958000070
Figure 2023021958000071
実施例１２
ＣＤ２８及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
１２．１ ＣＥＡ発現ＭＶ３細胞上のＣＥＡＣＡＭ５への結合
Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄの親和性成熟がＣＥＡＣＡＭ５への結合の改善をもたらしたかどうかを評価するために、ＣＥＡを発現するように遺伝子改変されたＭＶ３細胞に対するＦＡＣＳ結合アッセイを行った。図２４に示すように、親和性成熟抗ＣＥＡクローンＰ００２．１３９を有するＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗体（分子１１Ｒ、Ｐ１ＡＥ８３７１）ＥＣ５０＝４．１ｎＭ）は、Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄクローン（分子１１Ｃ、Ｐ１ＡＥ４７７５）（ＥＣ５０＝２０．４ｎＭ）よりもＣＥＡＣＡＭ５に対して優れた結合を示した。
１２．２ ＣＥＡ標的化ＴＣＢと組み合わせたＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗体のインビトロ機能性を分析するためのＩＬ－２レポーターアッセイ
ＩＬ－２レポーター細胞（Ｊ１６３１，Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＩＬ－２プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞である。ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞エフェクター機能を増強するＣＥＡ標的化ＣＤ２８アゴニストの能力を評価するために、１００００個のＭＫＮ４５細胞／ウェルを、固定濃度のＣＥＡ－ＴＣＢ（５ｎＭ）及び濃度範囲のＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗体（１４ｐＭ～１０ｎＭ）と共に１０５個のＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ比１０：１）と共にインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、製造業者の指示に従って、ＯｎｅＧｌｏ（Ｅ６１２０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光を評価した。プレートをＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒによって読み取った。
親和性成熟抗ＣＥＡクローンＰ００２．１３９（分子１１Ｒ、Ｐ１ＡＥ８３７１）又はクローンＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ（分子１１Ｃ、Ｐ１ＡＥ４７７５）のいずれかを担持するＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗体の機能性を、ＣＥＡ－ＴＣＢ（５ｎＭ）と組み合わせてＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞の存在下でＩＬ－２レポーター細胞アッセイを用いて評価した。図２５Ａ及び２５Ｂに示すように、親和性成熟クローンＰ００２．１３９の改善された親和性は、クローンＡ５Ｈ１ＥＬ１Ｄと比較して、共刺激能力においてより高い効力に変換された。
実施例１３
ＣＥＡ ＴＣＢと組み合わせた、ＣＤ２８及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビボ機能的特性評価
１３．１ ヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片におけるＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせた異なるＣＥＡ抗原結合ドメインを有するＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子を用いた有効性試験
本明細書に記載の有効性試験は、完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍退縮に関して、ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子のＣＥＡ－クローン依存的効力を理解することを目的とした。
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は、ＡＴＣＣから最初に得られ、増殖後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。インビトロ継代１２を９７％の生存率で皮下注射に使用した。５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１×１０６個のＭＫＮ４５細胞）を、２２Ｇ～３０Ｇの針で麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（ＺＨ２２５－１７）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌性ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から１４～１６週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトＴ細胞の頻度に従って、異なる処置群に無作為に分けられた。その時点で、記載されているように（図２６、０日目）マウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３（１３日目）に達したときに化合物又はヒスチジン緩衝液（ビヒクル）で処理した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌ当たり適切な量の化合物を得るために、原液（表３０）を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。
Figure 2023021958000072
ＣＥＡ－ＣＤ２８及びＣＥＡ－ＴＣＢとの併用療法（群Ｃ及びＤ、図２６）のために、二重特異性分子を同時に注射した。ノギスを用いて腫瘍増殖を週２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
インビボ効力の測定値としての腫瘍増殖阻害値を、以下のようにＲｏｃｈｅ内部統計プログラムを用いて計算した：
Figure 2023021958000073
試験は３９日目に終了した。図２７Ａは、腫瘍増殖速度論（平均、＋ＳＥＭ）並びに群及びマウスあたりの個々の腫瘍増殖速度論を示す（図２７Ｂ～２７Ｅ）。本明細書に記載されるようにＣＥＡ－ＴＣＢは、単剤として、腫瘍増殖阻害をほとんど誘導しなかった。しかしながら、両方のＣＥＡ－ＣＤ２８分子との組み合わせは、改善された腫瘍増殖阻害を示した。特に、ＣＥＡに対する親和性がより低い結合因子（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）を含むＣＥＡ－ＴＣＢとＣＥＡ－ＣＤ２８との組み合わせは、優れた腫瘍増殖退縮をもたらした。表３１に示すように、ＣＥＡ－ＴＣＢとＣＥＡ－ＣＤ２８（ｈｕＡ５Ｂ７）との組み合わせ群について、最も高いＴＧＩ値（ＴＧＩ：１１６％）を計算し、最も強い抗腫瘍効果を示した。ＴＧＩは腫瘍増殖阻害を意味し、ＴＧＩ＞１００は腫瘍退縮を意味し、ＴＧＩ＝１００を腫瘍静止（ｔｕｍｏｒ ｓｔａｓｉｓ）と定義する。
Figure 2023021958000074
１３．２ ヒト化マウスにおけるＢＸＰＣ３異種移植片におけるＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ及び抗ＰＤＬ１抗体と組み合わせた３つの異なるＣＤ２８抗原結合ドメインを有するＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子を用いた有効性試験
この有効性研究は、完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍退縮及びＩｍｍｕｎｏＰＤパターンに関して、ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ及び抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わせたＣＥＡ－ＣＤ２８分子のＣＤ２８抗原結合ドメインの親和性の影響を理解することを目的とした。本研究では、３つの異なる親和性変異体を試験した（変異体８＜変異体１５＜変異体２９）。
ヒトＢＸＰＣ３細胞（ヒト膵臓がん細胞株）は、元々、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）から得られ、増殖後、Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｅｌｌ ｂａｎｋに寄託された。ＢＸＰＣ３細胞を、１％Ｇｌｕｔａｍａｘと共に１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）を含有するＲＰＭＩ中で培養した。細胞を３７°Ｃ、水飽和雰囲気、５％ＣＯ２で培養した。インビトロ継代２０を、９５％を超える生存率で皮下注射に使用した。５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１×１０６個のＢＸＰＣ３細胞）を、２２Ｇ～３０Ｇの針で麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（ＺＨ２２５－１７）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌性ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から１４～１６週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスを、そのヒトＴ細胞の頻度に従って、異なる処置群Ａ～Ｆに無作為に分けた。その時点で、図２８記載されているようにマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３（２０日目）に達したときに化合物又はヒスチジン緩衝液（ビヒクル）で処理した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌ当たり適切な量の化合物を得るために、原液（表３２）を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。
Figure 2023021958000075
終了時（５２日目）に、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出し、秤量し、その後のＦＡＣＳ分析のためにコラゲナーゼＶ及びＤＮＡｓｅによる酵素消化によって単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞を、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４について染色し、ＦＡＣＳ ＢＤＦｏｒｔｅｓｓａで分析した。
図２９は、全ての処置群についての腫瘍増殖速度論（平均、＋ＳＥＭ）を示し、各処置群の対応するＴＧＩ値を以下の表３３に示す。本明細書に記載されるように、ＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢ単独療法並びにａ－ＰＤ－Ｌ１との組み合わせは、腫瘍増殖阻害をほとんど誘導しなかった。ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢとａ－ＰＤ－Ｌ１との組み合わせへのＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）の添加のみが腫瘍増殖阻害の増加をもたらした（ＴＧＩ：７５％）。変異体１５も変異体２９も抗腫瘍効果を増加させなかった。興味深いことに、試験終了時に屠殺した動物由来の腫瘍のＩｍｍｕｎｏ－ＰＤデータ（図３０Ａ～Ｄ）は、ＣＥＡ－ＣＤ２８変異体８によって誘導される更なる腫瘍増殖阻害も腫瘍内Ｔ細胞頻度の増加によって反映されることを明らかにした。図３０Ａは、各処置アームの染色された腫瘍単一細胞懸濁液の代表的なドットプロットを示す。ＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞浸潤の概要をそれぞれ図３０Ｂ、図３０Ｃ及び３０Ｄに示す。腫瘍におけるＴ細胞浸潤に関して、ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢのみ又はａ－ＰＤ－Ｌ１との組み合わせと比較して、ＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）又はＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体２９）で処置した群において統計的差異は観察されなかった。最も強いＩｍｍｕｎｏＰＤ効果は、ＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）で検出されている。
Figure 2023021958000076
１３．３ ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片におけるＣＥＡ ＴＣＢと組み合わせたＣＥＡ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子による有効性試験
本明細書に記載の有効性試験は、完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍退縮及びＩｍｍｕｎｏＰＤパターンに関して、第２のヒト異種移植モデルにおいてＣＥＡ－ＴＣＢとＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）との組み合わせを試験することを目的とした。
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は、ＡＴＣＣから最初に得られ、増殖後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。インビトロ継代１２を＞９５％の生存率で皮下注射に使用した。５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１×１０６個のＭＫＮ４５細胞）を、２２Ｇ～３０Ｇの針で麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（ＺＨ２２５－１７）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌性ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から１４～１６週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトＴ細胞の頻度に従って、異なる処置群に無作為に分けられた。その時点で、図３１に記載されるようにマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３（１３日目）に達したときに分子又はヒスチジン緩衝液（ビヒクル）で処理した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌ当たり適切な量の化合物を得るために、原液（表３４）を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。
Figure 2023021958000077
併用療法（群Ｃ、図３１）のために、コンストラクトを同時に注射した。ノギスを用いて腫瘍増殖を週２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
インビボ効力の測定値としての腫瘍増殖阻害値を、先の実施例１２．１に記載されるようにＲｏｃｈｅ内部統計プログラムを用いて計算した。
終了時（４８日目）に、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出し、秤量し、その後のＦＡＣＳ分析のためにコラゲナーゼＶ及びＤＮＡｓｅによる酵素消化によって単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞を、ヒトＣＤ４５及びＣＤ３について染色し、ＦＡＣＳ ＢＤＦｏｒｔｅｓｓａで分析した。
図３２は、全ての処置群についての腫瘍増殖速度論（平均、＋ＳＥＭ）を示し、各処置群の対応するＴＧＩ値を以下の表３５に示す。本明細書に記載されるように、ＣＥＡ－ＴＣＢ単独療法は、８４％のＴＧＩ値で腫瘍増殖阻害を誘導した。しかしながら、ＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）との併用処置は、優れた腫瘍増殖阻害をもたらした（ＴＧＩ：１０１％）。更に、試験終了時に屠殺した動物由来の腫瘍のＩｍｍｕｎｏ－ＰＤデータ（図３）は、ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＣＥＡ－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）によって誘導される強力な腫瘍増殖阻害も腫瘍内Ｔ細胞頻度の増加によって反映されることを明らかにした。図３３Ａは、各処置アームの染色された腫瘍単一細胞懸濁液の代表的なドットプロットを示す。ＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤の概要を図３３Ｂに示す。
Figure 2023021958000078
実施例１４
ＣＤ２８及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＨＥＲ３、ＣＤ３０又は栄養膜細胞糖タンパク質（ＴＰＢＧ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成及び産生
１４．１ ＣＤ２８及びＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ３、ＣＤ３０又はＴＰＢＧを標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃドメインにおいて、国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異（ＰＧ－ＬＡＬＡ）を、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Ｆｃ断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）又は「ホール」変異（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異）のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／Ｃカッパドメインの交換を１つの結合部分に導入した（クロスＦａｂ技術）。国際特許出願の国際公開第２０１５／１５０４４７号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をＣＨ１ドメイン及びＣカッパドメインに導入した。
抗ＥｐＣＡＭ抗体ＭＴ２０１（アデカツムマブ）の作製及び調製は、米国特許第７，６３２，９２５号Ｂ２に記載されている。抗ＨＥＲ３抗体（ルムレツズマブ）の産生は、国際公開第２０１１／０７６６８３号Ａ１に記載されている。抗ＣＤ３０抗体ブレンツキシマブは、国際公開第０２／３４６６１号Ａ２に開示されている。抗ＴＰＢＧ抗体、例えばＦＡＢ０９１の作製及び調製は、国際公開第２０１７／０７２２０７号Ａ１に記載されている。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図３４Ａ～図３４Ｄに示す：
分子１４Ａ：ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３６６、３６７、３９０及び３９１（Ｐ１ＡＥ９０５１）のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図３４Ａ）。
分子１４Ｂ：ＨＥＲ３（ルムレツズマブ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３５７、３５８、３９２及び３９３（Ｐ１ＡＦ０１５１）のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及び抗ＨＥＲ３ Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を有する二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図３４Ｂ）。
分子１４Ｃ：ＣＤ３０（ブレンツキシマブ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３５７、３５８、３９４及び３９５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及び抗ＣＤ３０ Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＦ１７５１）（図３４Ｃ）。
分子１４Ｄ：ＴＰＢＧ（ＦＡＢ０９１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３５７、３５８、３９６及び３９７のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及び抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＦ１７５２）（図３４Ｄ）。
１４．２ 分子の製造
上記の分子の発現は、キメラＭＰＳＶプロモーター又はＣＭＶプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞、又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離にかけて、培地を、予め暖めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号１０７４３０２９）に交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、補充液（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充液（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を添加した。７日後に、遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
１４．３ 分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ ３．０で達成され、続いて試料をすぐにｐＨ 中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（物品番号：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
１４．４ 二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子の分析データ
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表３６に示す。
Figure 2023021958000079
実施例１５
ＣＤ２８及びＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ３、ＣＤ３０又はＴＰＢＧを標的とする二重特異性抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
１５．１ ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８のＥｐＣＡＭ及びＣＤ２８発現細胞への結合
中間親和性ＣＤ２８クローン変異体１５（Ｐ１ＡＥ９０５１）を担持するＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（分子１４Ａ）のＥｐＣＡＭへの結合を、ＨＴ－２９細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ－３８）を用いて試験し、ヒトＣＤ２８への結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に０．５ Ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁した。５Ｅ４個の細胞を、漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８コンストラクト（１０ｐＭ～５００ｎＭ）と共に４℃で１時間、丸底９６ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＥ抱合体化ヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）と共に４℃で更に３０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離し、１：１００００に希釈したＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０２３６２７６００１）を含む８５ｕｌ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗ＤＰ４７ ＩｇＧを陰性対照として含めた。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ，ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を用いて結合曲線を得た。
インビトロ細胞結合アッセイにより、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＥ９０５１）二重特異性アゴニスト抗体が、ＨＴ－２９細胞上のヒトＣＤ２８（図３５Ａ）及びヒトＥｐＣＡＭ（図３５Ｂ）に濃度依存的様式で結合することが確認される。予想されたように、抗ＤＰ４７ ＩｇＧでは結合が検出されず、このことは、結合の検出が、それぞれの標的化部分による特異的なＣＤ２８結合及びＥｐＣＡＭ結合に起因することを示している。
１５．２ ＩＬ－２レポーターアッセイに基づくＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８分子のインビトロ機能的特性評価
ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（分子１４Ａ）が抗ＣＤ３媒介Ｔ細胞活性化を支援する能力を評価するために、ＩＬ－２レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１６５１）はエフェクター細胞（ＩＬ－２プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）としての役割を果たし、ＨＴ－２９は腫瘍標的としての役割を果たした。１Ｅ４腫瘍標的細胞を、１０ｎＭの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１６－００３７－８５）単独の存在下又は濃度を増加させるＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８コンストラクト（２４ｐＭ～１００ｎＭ）と組み合わせた存在下、５Ｅ４ ＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ ５：１）と共に、白色平底９６ウェルプレート中、３７°Ｃで６時間インキュベートした。測定の前に、プレートを室温で１５分間インキュベートし、次いで、１００μｌの基質（ＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１２０）を細胞に添加した。暗所での室温での１０分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを用いて発光（カウント／秒）を測定した。
一定の最適以下の抗ＣＤ３刺激と組み合わせたＴ細胞活性化を評価した。この目的のために、ＩＬ－２レポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＥ９０５１）及び固定された限界濃度の抗ＣＤ３ ＩｇＧクローンＯＫＴ３（１０ｎＭ）の存在下において、ＥｐＣＡＭ発現ＨＴ２９細胞と６時間共培養した。図３５Ｃに示されるように、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８は、濃度依存的様式で最適以下のＣＤ３刺激に曝露されたＴ細胞におけるＩＬ－２産生の増加によって判断されるように、Ｔ細胞活性化を増強することができた。
１５．３ ＨＥＲ３－及びＣＤ２８発現細胞へのＨＥＲ３－ＣＤ２８の結合
ＨＥＲ３に対する中間親和性ＣＤ２８クローン変異体１５（Ｐ１ＡＦ０１５１）を有するＨＥＲ３－ＣＤ２８（分子１４Ｂ）の結合を、Ｔ－４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ－１３３）を用いて試験し、ヒトＣＤ２８に対する結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に０．５ Ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁した。５Ｅ４個の細胞を、漸増濃度のＨＥＲ３－ＣＤ２８コンストラクト（１０ｐＭ～５００ｎＭ）と共に４℃で１時間、丸底９６ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＥ抱合体化ヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）と共に４℃で更に３０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離し、１：１００００に希釈したＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０２３６２７６００１）を含む８５ｕｌ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗ＤＰ４７ ＩｇＧを陰性対照として含めた。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ，ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を用いて結合曲線を得た。
ＦＡＣＳ分析
Ｔ－４７Ｄの表面におけるＨＥＲ３の相対レベルを評価するために、２Ｅ５細胞を４８０×ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。ＨＥＲ３（ＡＰＣ抗ヒト、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３２４７０８）の表面染色を、供給業者の指示に従って実施した。細胞を１５０ｕｌ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄し、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。
インビトロ細胞結合アッセイにより、ＨＥＲ３－ＣＤ２８（分子１４Ｂ）二重特異性アゴニスト抗体が、細胞上のヒトＣＤ２８（図３６Ａ）及びヒトＨＥＲ３（図３６Ｂ）に濃度依存的様式で結合することが確認される。予想されたように、抗ＤＰ４７ ＩｇＧでは結合が検出されず、このことは、結合の検出が、それぞれの標的化部分による特異的なＣＤ２８結合及びＨＥＲ３結合に起因することを示している。
１５．４ ＩＬ－２レポーターアッセイに基づくＨＥＲ３－ＣＤ２８分子のインビトロ機能的特性評価
ＨＥＲ３－ＣＤ２８（分子１４Ｂ）が抗ＣＤ３媒介Ｔ細胞活性化を支援する能力を評価するために、ＩＬ－２レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１６５１）はエフェクター細胞（ＩＬ－２プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）としての役割を果たし、Ｔ－４７Ｄは腫瘍標的としての役割を果たした。１Ｅ４腫瘍標的細胞を、１０ｎＭの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１６－００３７－８５）単独の存在下又は濃度を増加させるＨＥＲ３－ＣＤ２８コンストラクト（２４ｐＭ～１００ｎＭ）と組み合わせた存在下、５Ｅ４ ＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ ５：１）と共に、白色平底９６ウェルプレート中、３７°Ｃで６時間インキュベートした。測定の前に、プレートを室温で１５分間インキュベートし、次いで、１００ｕｌの基質（ＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１２０）を細胞に添加した。暗所での室温での１０分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを用いて発光（カウント／秒）を測定した。
一定の最適以下の抗ＣＤ３刺激と組み合わせたＴ細胞活性化を評価した。この目的のために、ＩＬ－２レポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、漸増濃度のＨＥＲ３－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＦ０１５１）及び固定された限界濃度の抗ＣＤ３ ＩｇＧクローンＯＫＴ３（１０ｎＭ）の存在下において、ＥｐＣＡＭ発現ＨＴ２９細胞と６時間共培養した。図３６Ｃに示されるように、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化、すなわち。濃度依存的様式で最適以下のＣＤ３刺激に曝露されたＴ細胞におけるＩＬ－２産生の増加を増強することができた。
１５．５ ＰＢＭＣアッセイにおけるＴＰＢＧ－ＣＤ２８及びＣＤ３０－ＣＤ２８アゴニスト抗体のインビトロ機能的特性評価
抗ＣＤ３刺激によって媒介されるＴ細胞活性化を増強するＴＰＢＧ（５Ｔ４）－ＣＤ２８（分子１４Ｄ）及びＣＤ３０－ＣＤ２８（分子１４Ｃ）の能力を、エフェクター細胞としての健常ドナー由来の初代ＰＢＭＣ Ｔ細胞、並びにＪＩＭＴ－１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＮＣＩ－Ｎ８７及びＣａｌｕ－１細胞などの５Ｔ４発現標的細胞、又はＫＡＲＰＡＳ－２９９などのＣＤ３０発現標的細胞をそれぞれ用いて評価することになる。そのようなアッセイでは、１Ｅ４腫瘍標的細胞を、丸底９６ウェルプレート中、３７℃で５日間、最適以下の濃度の抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１６－００３７－８５、クローンＯＫＴ３）単独の存在下、又は漸増濃度のＣＤ２８アゴニストコンストラクト（２４ｐＭ～１００ｎＭ）と組み合わせて、１Ｅ５（Ｅ：Ｔ １０：１）と共にインキュベートする。ＣＤ２８標的分子の機能性をフローサイトメトリーによって評価し、Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９）及びＴ細胞増殖（ＣＦＳＥ希釈）を測定する。
実施例１６
ＣＤ２８及び多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子の作製
１６．１ ＣＤ２８及び多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃドメインにおいて、国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異（ＰＧ－ＬＡＬＡ）を、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Ｆｃ断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）又は「ホール」変異（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異）のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／Ｃカッパドメインの交換を１つの結合部分に導入した（クロスＦａｂ技術）。国際特許出願の国際公開第２０１５／１５０４４７号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をＣＨ１ドメイン及びＣカッパドメインに導入した。
抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体５Ｅ１１は、国際公開第２０１９／１５４８９０号Ａ１に記載されているクローン５Ｅ１１のヒト化バージョンである。抗ＣＤ３８抗体、例えば、ダラツムマブは、国際公開第２００６／９９８７５号Ａ１に開示されている。抗ＢＣＭＡ抗体の生成及び調製は、国際公開第２０１６／１６６６２９号Ａ１に記載されている。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図３７Ａ～図３７Ｃに示す：
分子１６Ａ：ＧＰＲＣ５Ｄ（５Ｅ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３６６、３６７、３９８及び３９９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換及びＧＰＲＣ５Ｄ（５Ｅ１１）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＦ１２７２）（図３７Ａ）。
分子１６Ｂ：ＧＰＲＣ５Ｄ（５Ｅ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体８）１＋１フォーマット、配列番号３６４、３６５、３９８及び３９９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）中の荷電修飾及びＧＰＲＣ５Ｄ（５Ｅ１１）Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を有する二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（Ｐ１ＡＦ２９５４）（図３７Ａ）。
分子１６Ｃ：ＣＤ３８（ダラツムマブ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１フォーマット、配列番号３５７、３５８、４００及び４０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ中の荷電修飾及び抗ＣＤ３８ Ｆａｂ断片（ホール）中のＶＨ／ＶＬ交換を有する二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図３７Ｂ）（Ｐ１ＡＥ９０３８）。
分子１６Ｄ：抗ＢＣＭＡ－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１ フォーマット、配列番号３６６、３６７、４０２及び４０３のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換及び抗ＢＣＭＡ Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図３４Ａ）（Ｐ１ＡＥ９０５３）。
１６．２ 分子の製造
上記の分子の発現は、キメラＭＰＳＶプロモーター又はＣＭＶプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞、又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離にかけて、培地を、予め暖めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号１０７４３０２９）に交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、補充液（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充液（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を添加した。７日後に、遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
あるいは、従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、（元は、ＡＴＣＣより受託し、Ｅｖｉｔｒｉａにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した）懸濁適応性ＣＨＯ Ｋ１細胞を用い、Ｅｖｉｔｒｉａにより、本明細書で記載される抗体及び二重特異性抗体を調製した。産生のために、Ｅｖｉｔｒｉａは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）、並びに、専有のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
１６．３ 分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ ３．０で達成され、続いて試料をすぐにｐＨ 中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（物品番号：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
１６．４ 二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子の分析データ
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。分子の精製パラメータの概要を表３７に示す。
Figure 2023021958000080
実施例１７
ＣＤ２８及び多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
１７．１ 指定の標的を過剰発現する、ＣＤ２８及び多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子の細胞への結合
ＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８又はＣＤ２８への結合を測定するために、本発明者らは、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ又はヒトＣＤ２８のいずれかを安定に過剰発現するように形質導入された報告された多発性骨髄腫細胞株（Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓ；Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００７，４６（３），２２６－３８）又はＣＨＯ形質移入体に対してＦＡＣＳベースの結合アッセイを行い、ＩＭ－９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１５９）を使用してＢＣＭＡへの結合を評価し、ＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ６９９）を使用してＣＤ３８への結合を評価し、ＣＨＯ－ｈＧＰＲＣ５Ｄ細胞を使用してＧＰＲＣ５Ｄへの結合を評価し、ＣＨＯ－ｈＣＤ２８細胞を使用してＣＤ２８への結合を評価した。
ＩＭ－９及びＯＣＩ－Ｌｙ１８を製造者の説明書に従って培養し、安定なＣＨＯトランスフェクタント（親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を、１０％ＦＣＳを補充したＦ－１２Ｋ中で培養した。簡潔には、懸濁細胞を回収し、計数し、生存率について確認した。接着性ＣＨＯ細胞を、細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して剥離し、計数し、生存率について確認した。その後の工程をいずれも４℃で行った。
細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清；１％０．５ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ ８；０．２５％ＮａＮ３アジ化ナトリウム）、１ Ｍｉｏ細胞／ｍｌでＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。０．１ Ｍｉｏ細胞を丸底９６ウェルプレートのウェルあたりに播種し、もう一度ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、上清を廃棄した。細胞を５０ｕｌ／ウェルの総体積で染色し、表示のＣＤ２８二重特異性分子（０．０７～３００ｎＭ）の濃度を４℃で３０分間増加させた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、予め希釈した二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，ＦｃγＦｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－５４６－００８、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈、それぞれ１０９－６０６－００８ ＰＥ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、指示のとおりＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈）を含む、１ウェル当たり合計２５ｕｌで４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａを備えたＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて結合曲線及びＥＣ５０値を得た。
図３８Ａ～図３８Ｆは、全ての二重特異性ＣＤ２８分子が、ヒトＣＤ２８（Ａ）とそれぞれの第２の標的、すなわちヒトＣＤ３８、ヒトＢＣＭＡ又はヒトＧＰＲＣ５Ｄとの両方に濃度依存的に結合することができることを示す。簡潔には、ＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＤ２８分子は、ヒトＣＤ２８への結合について最も低いＥＣ５０を有するが（表３７）、他の２つのＣＤ２８二重特異性分子と比較してより低い最大結合に達する。
ＣＤ３８及びＢＣＭＡ標的ＣＤ２８分子の両方が、それぞれＣＤ３８及びＢＣＭＡに対する濃度依存的結合を示し、評価した濃度範囲で飽和に達する（ＥＣ ５０結合値を表３８に要約する）。対照的に、ＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＤ２８分子は濃度依存的に結合しているが、同じ濃度範囲では飽和に達しず、これらの分子に含まれるＣＤ３８又はＢＣＭＡ結合因子に対してＧＰＲＣ５Ｄの親和性が低いことを示している。
Figure 2023021958000081
１７．２ ＩＬ－２レポーターアッセイに基づくインビトロ機能的特性評価（Ｔ細胞活性化の機能的特性評価）
ＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化を支持するＣＤ３８－ＣＤ２８、ＢＣＭＡ－ＣＤ２８及びＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子の能力を評価するために、ＩＬ－２レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１６５１）をエフェクター細胞（ＩＬ－２プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）として使用し、また腫瘍標的として、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ並びにＧＰＲＣ５Ｄに陽性であるＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を使用した。
簡潔には、５×１０３個の腫瘍標的細胞を、白色平底３８４ウェルプレート（３５３９８８ Ｆａｌｃｏｎ（商標）３８４－Ｗｅｌｌ Ｆｌａｔ－Ｂｏｔｔｏｍ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）中で、１ｎＭのＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ単独又は漸増濃度のＣＤ２８二重特異性分子（１２．２～５０ｎＭ）と組み合わせた存在下、２．５×１０４個のＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ ５：１）と共に、３７℃で５時間、それぞれ２２時間インキュベートした。測定の前に、プレートを室温で１５分間インキュベートし、次いで、２０ｕｌの基質（ＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１２０）を細胞に添加した。暗所での室温での１０分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを用いて発光（カウント／秒）を測定した。
図３９Ａ～３９Ｆに示されるように、いずれのＭＭ標的化ＣＤ２８分子も、ＴＣＢシグナルの非存在下でＩＬ２ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞活性化を誘導しない（明るい灰色の線、図３９Ａ～９Ｆ）。予想されるように、これらのＩＬ－２レポーター細胞では、１ｎＭ ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢの存在下でのレポーター細胞活性化の有意な誘導も、初期時点（５時間）でも後期時点（２２時間後）でもなかった。
しかしながら、全てのＭＭ標的化分子は、１ｎＭ ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの存在下でＩＬ－２レポーター細胞の有意な濃度依存的及び時間依存的活性化を誘導することができる。ＣＤ３８－ＣＤ２８及びＢＣＭＡ－ＣＤ２８分子は、５時間後に既にＩＬ２レポーター細胞活性化を誘導することができるが（図３９Ａ及び３９Ｃ）、ＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＤ２８は、評価された後の時点（２２時間、図３９Ｆ）でのみ同様の最大活性レベルに達し、異なる活性速度論を示す。
実験に使用した抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ、図３７Ｄ）は、実施例８及び国際公開第２０１６／０７９０７６号Ａ１に記載されているＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢと同様に調製した。ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢは、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４０４及び配列番号４０５のアミノ酸配列を含む。
１７．３ 多発性骨髄腫細胞株のＴ細胞媒介性溶解
ＣＤ３８－ＣＤ２８、ＢＣＭＡ－ＣＤ２８及びＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＤ２８が多発性骨髄腫細胞株のＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ媒介溶解を促進する能力を評価するために、１．５×１０５個のヒトｐａｎ Ｔエフェクター細胞を、３×１０４個のＮＣＩ－Ｈ９２９標的細胞と共に、１：１の最終Ｅ：Ｔ比で約２２時間インキュベートした。製造業者の指示に従ってＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用して、ＭＡＣＳによってＰＢＭＣからＰａｎ Ｔ細胞を単離した。ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢを漸増濃度（０．０６４ｐＭ～１ｎＭ）で添加し、異なるＭＭ標的二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子を０．２ｎＭの固定濃度で添加した。腫瘍細胞溶解を以下のように評価した：アッセイプレートを５分間遠心分離し、ウェルあたり５０ｕｌの上清を新しい９６平底ウェルプレートに移した。正規化のために、標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の最終濃度での標的細胞のインキュベーションによって誘導した。最小溶解（＝０％）は、エフェクター細胞と同時インキュベートされたが、二重特異性コンストラクト又はＴＣＢを含まない標的細胞を指す。３７℃、５％ＣＯ２で約２２時間の一晩のインキュベーション後、上清へのアポトーシス／壊死標的細胞のＬＤＨ放出を、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃１１ ６４４ ７９３ ００１）を使用して、製造業者の指示に従って測定した。
図４０ａ～図４０Ｃに示すように、ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢは、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞の濃度依存的溶解を誘導する。評価した３つ全てのＭＭ標的二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子は、０．２ｎＭの固定濃度で投与した場合、ＴＣＢ単剤療法と比較して有効性を有意に増強することができる。更に、いずれのＭＭ標的二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子も、ＴＣＢの非存在下で腫瘍細胞溶解を誘導しておらず、これは、ＭＭ標的分子のＴＣＢシグナルへの依存性を支持する。
表３９は、ＥＣ５０値、並びに図４０Ａ～４０Ｃに示すデータから導出された曲線下面積を要約する。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して計算した。
Figure 2023021958000082
実施例１８
ＣＤ２８及びＣＤ１９又はＣＤ７９ｂを標的とする二重特異性抗原結合分子の作製及び作製
１８．１ ＣＤ２８及びＣＤ１９又はＣＤ７９ｂを標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
ＣＤ１９抗体の作製及び調製は、国際公開第２０１７／５５５４１号Ａ１又は国際公開第２０１７／５５３２８号Ａ１に開示されている。特に、ＣＤ１９クローン２Ｂ１１は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／５５３２８号Ａ１に記載されている。本明細書で使用されるＣＤ７９ｂクローンｈｕＭＡ ７９ｂ．ｖ２８（ポラツズマブに対応する）は、国際公開第２００９／０１２２６８号Ａに記載されている。それぞれの発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。得られた分子の概略説明をそれぞれ図４１Ａ及び４１Ｂに示す。Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異（ＰＧ－ＬＡＬＡ）を、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。非対称二重特異性抗体の作製のために、Ｆｃ断片は、重鎖の誤対合を回避するために「ノブ」又は「ホール」突然変異のいずれかを含有した。二重及び多重特異性抗体コンストラクトにおける軽鎖の誤対合を回避するために、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／Ｃカッパドメインの交換を１つの結合部分に導入した（クロスＦａｂ技術）。別の結合部分において、電荷をＣＨ１ドメイン及びＣカッパドメインに導入した。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図４１Ａ及び４１Ｂに示す：
分子１８Ａ：ＣＤ１９（８Ｂ８－２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿ｖ２９）１＋１、ＣＤ２８ ｖ２９ Ｆａｂ（ノブ）における電荷修飾及びＣＤ１９（２Ｂ１１）Ｆａｂ（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図４１Ａ）。分子は、配列番号１１８及び４３０の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号６５及び４３１の軽鎖アミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＥ８００２）。
分子１８Ｂ：ＣＤ１９（８Ｂ８－２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿ｖ１５）１＋１、ＣＤ２８ ｖ１５ Ｆａｂ（ノブ）における電荷修飾及びＣＤ１９（２Ｂ１１）Ｆａｂ（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図４１Ａ）。分子は、配列番号１１６及び４３０の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号１２１及び４３１の軽鎖アミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＥ９０４０）。
分子１８Ｃ：ＣＤ１９（８Ｂ８－２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿ｖ８）１＋１、ＣＤ２８ ｖ８ Ｆａｂ（ノブ）における電荷修飾及びＣＤ１９（２Ｂ１１）Ｆａｂ（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性 ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図４１Ａ）。分子は、配列番号１１４及び４３０の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号１２２及び４３１の軽鎖アミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＦ０１７５）。
分子Ｄ：ＣＤ１９（８Ｂ８－２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿ｖ１１）１＋１、ＣＤ２８ ｖ１１ Ｆａｂ（ノブ）における電荷修飾及びＣＤ１９（２Ｂ１１）Ｆａｂ（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ分子（図２Ｂ）。分子は、配列番号１１４及び４３０の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号６５及び４３１の軽鎖アミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＦ０３７７）。
分子Ｅ：ＣＤ１９（８Ｂ８－２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿ｖ２７）１＋１、ＣＤ２８ ｖ２７ Ｆａｂ（ノブ）における電荷修飾及びＣＤ１９（２Ｂ１１）Ｆａｂ（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ クロスＦａｂ ｂ分子（図２Ｂ）。分子は、配列番号１１８及び４３０の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号１２３及び４３１の軽鎖アミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＦ０３７８）。
分子Ｆ：ＣＤ７９ｂ（ｈｕＭＡ７９ｂ．ｖ２８）－ＣＤ２８（ＳＡ＿ｖ１５）１＋１、ＣＤ２８ ｖ１５ Ｆａｂ（ノブ）における電荷修飾及びＣＤ７９ｂ（ｈｕＭＡ７９ｂ．ｖ２８）Ｆａｂ（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を伴う二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡクロスＦａｂ（図２Ｃ）。分子は、配列番号１１６及び４３２の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号１２１及び４３３の軽鎖アミノ酸配列を含む（Ｐ１ＡＥ９０３９）。
１８．２ ＣＤ２８及びＣＤ１９又はＣＤ７９ｂを標的とする二重特異性抗原結合分子の作製
上記の分子の発現は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
全てのコンストラクトの産生のために、懸濁状態で成長するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンを使用してそれぞれの発現ベクターで一過性に同時トランスフェクトした。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩを添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合して、振蕩フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、編者：Ｗｅｉｃｈａｎｇ Ｚｈｏｕ，Ａｎｎｅ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ）。トランスフェクションの１日後、サプリメント（フィード）を添加した（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、編者：Ｗｅｉｃｈａｎｇ Ｚｈｏｕ，Ａｎｎｅ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ）。細胞上清を遠心分離及びその後、フィルタにかけ（０．２μｍフィルタ）によって７日後に回収し、標準的な方法によって精製した。
１８．３ ＣＤ２８及びＣＤ１９又はＣＤ７９ｂを標的とする二重特異性抗原結合分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ ３．０で達成され、続いて試料をすぐにｐＨ 中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（物品番号：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
１８．４ ＣＤ２８及びＣＤ１９又はＣＤ７９ｂを標的とする二重特異性抗体又は三重特異性抗体の分析データ
精製されたコンストラクトのタンパク質濃度は、Ｐａｃｅ、ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、４、２４１１－１４２３に従って、アミノ酸配列に基づいて計算される質量吸光係数を用い、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定された。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表４０に示す。
Figure 2023021958000083
実施例１９
ＣＤ２８及びＣＤ１９又はＣＤ７９ｂを標的とする二重特異性抗原結合分子の結合及び速度論的分析
１９．１ ＣＤ７９ｂを標的とする二重特異性抗原結合分子の速度論的分析
組換えＣＤ７９ｂ－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＃２９７５０－Ｈ０８Ｈ）に対するｈｕＭＡ７９ｂ．ｖ２８の親和性（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を使用する表面プラズモン共鳴によってＳＰＲによって測定した。ＣＤ７９ｂ－Ｈｉｓの捕捉のために、抗ペンタＨＩＳ抗体をアミンカップリングによってＣＭ５チップのフローセルにカップリングさせた。約５０００単位の固定化レベルを使用した。次いで、ＣＤ７９ｂ－Ｈｉｓを１ｎＭの濃度に希釈し、１０μｌ／分の流速で１０秒間抗ペンタＨＩＳ抗体によって捕捉した。
精製分子Ｆ（ＣＤ７９ｂ（ｈｕＭＡ７９ｂ．ｖ２８）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１）の親和性（ＫＤ）を決定するために、精製された抗原結合分子の二倍希釈系列（１２５ｎＭと０．４９ｎＭとの間の様々な濃度範囲）を３０μｌ／分で、１８０秒の会合時間及び４００秒の解離時間で注入した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ標準緩衝液ＢＲ－１００６－６９ １：１０希釈）を参照のために注入した。再生を、１０ｍＭグリシンｐＨ ２．１を用いて２×６０秒間行った。会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した（図４２）。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算した。結果を表４１に示す。分子Ｆ（ＣＤ７９ｂ（ｈｕＭＡ７９ｂ．ｖ２８）－ＣＤ２８（ＳＡ＿変異体１５）１＋１）のＣＤ７９ｂ－Ｈｉｓに対する親和性は７６ｎＭである。
Figure 2023021958000084
１９．２ ＣＤ２８を標的とする二重特異性抗原結合分子の速度論的分析
作製した二重特異性抗原結合分子のＣＤ２８に対する親和性（ＫＤ）を、ニュートラアビジン捕捉によりＮＬＣチップ上にビオチン化ｈｕＣＤ２８－Ｆｃ抗原を固定化したＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、２５℃でＳＰＲにより測定した。組換え抗原（リガンド）の固定：抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いでさまざまな接触時間で３０μｌ／分で注入して、垂直方向で約２００、４００又は８００の応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成した。分析物の注入：ワンショット速度論測定のため、注入方向を水平方向に変え、精製された二重特異性ＣＤ１９標的化抗ＣＤ２８親和性変異体の二倍希釈系列（５０～３．１２５ｎＭの様々な濃度範囲）を、１５０秒の会合時間及び４５０秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って５０μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。分析されたクローンにより、広い範囲（１～５０ｎＭ）のＫＤ値が明らかになった。
実施例２０
ＣＤ２８発現細胞及びＣＤ１９又はＣＤ７９ｂ発現細胞への二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子の結合
ヒトＣＤ２８への結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率について確認し、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に２．５ｘ１０５／ｍｌで再懸濁した。５ｘ１０４個の細胞を、漸増濃度のＣＤ２８結合因子（１ｐＭ～１００ｎＭ）と共に４℃で２時間、丸底９６ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＥ抱合体化ヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）と共に４℃で更に６０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、遠心分離し、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗ＤＰ４７ ＩｇＧを陰性対照として含めた。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ，ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ６を用いて結合曲線を得た。
図４Ａ～図４Ｃから分かるように、一価の１アームＩｇＧ様ＣＤ２８変異体コンストラクトは、結合の違いを示した。
ＣＤ１９及びＣＤ７９ｂへの結合を、異なるレベルのＣＤ１９及びＣＤ７９ｂを発現するＢ細胞株を使用して試験した：Ｎａｌｍ６（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ１２８）、ＲＣＫ８（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ５６１）、ＷＳＵＤＬＣＣ２（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ５７５）及びＺ１３８（レスター大学Ｍ．Ｄｙｅｒからの贈り物）。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に０．５ Ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁した。５Ｅ４個の細胞を、漸増濃度のＣＤ１９－ＣＤ２８（又はＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８）コンストラクト（１０ｐＭ～５００ｎＭ）と共に４℃で１時間、丸底９６ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＥ抱合体化ヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）と共に４℃で更に３０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離し、１：１００００に希釈したＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０２３６２７６００１）を含む８５ｕｌ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗ＤＰ４７ ＩｇＧを陰性対照として含めた。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ、ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を用いて結合曲線を得た。異なるＢ細胞株に対するＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ１５の結合の比較を図４３Ａ及び４３Ｂに示す。
ＦＡＣＳ分析
Ｂ細胞株（Ｎａｌｍ６，ＲＣＫ８，ＷＳＵ ＤＬＣＬ２及びＺ１３８）の表面におけるＣＤ１９の相対レベルを評価するために、細胞を、Ｈｕｍａｎ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ、カタログ番号５６４２２０）を使用する染色の前にＦｃブロックし、次いで、２×１０５個の細胞を４８０×ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。ＣＤ１９（ＢＶ６５０抗ヒト、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３０２２３８）の表面染色を、供給業者の指示に従って実施した。細胞を１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄し、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。
インビトロ細胞結合アッセイにより、全てのＣＤ１９－ＣＤ２８アゴニスト抗体が、濃度依存的様式で細胞上のヒトＣＤ１９及びヒトＣＤ２８に結合することが確認された（図４４Ａ及び４４Ｂ）。予想されたように、抗ＤＰ４７ ＩｇＧでは結合が検出されず、このことは、結合の検出が、それぞれの標的化部分による特異的なＣＤ２８結合及びＣＤ１９結合に起因することを示している。ＣＤ２８への結合についてのＥＣ５０値を表４２に示し、ＣＤ１９への結合についてのＥＣ５０値を表４３に示す。
Figure 2023021958000085
Figure 2023021958000086
実施例２１
ＣＤ１９又はＣＤ７９ｂを標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
初代ヒトＰＢＭＣを用いていくつかの細胞ベースのインビトロアッセイを実施して、Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体によって提供されるＴＣＲシグナルの存在下及び非存在下におけるＣＤ２８（ＳＡ）及び二重特異性ＣＤ１９又はＣＤ７９ｂ標的化ＣＤ２８抗原結合分子の活性を評価した。フローサイトメトリー、サイトカインＥＬＩＳＡ及び生細胞イメージングによって決定されるＴ細胞増殖、サイトカイン分泌及び腫瘍細胞死滅を読み取りとして得た。
ＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、バフィーコート（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｚｕｅｒｉｃｈ）から得たヘパリン処理した血液の濃縮リンパ球調製物から密度勾配遠心分離によって調製した。２５ｍｌの血液（ＰＢＳで１：２に希釈）を１５ｍｌのｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８５１）の上に重層し、室温で２５分間、８４５×ｇでブレーキなしで遠心分離した。ＰＢＭＣ含有界面を、１０ｍｌピペットを用いて５０ｍｌチューブに回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、６１１×ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３０４×ｇで５分間遠心分離した。洗浄工程を繰り返し、１７１×ｇで遠心分離した。細胞をＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ（５％ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、ＮＥＡＡ、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有）に再懸濁し、それぞれのアッセイプロトコルに従って更なる機能分析のために処理した。
ＩＬ－２レポーターアッセイに基づくＣＤ１９－ＣＤ２８及びＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８分子のインビトロ機能的特性評価
ＣＤ１９－ＣＤ２８及びＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８がＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化を支援する能力を評価するために、ＩＬ－２レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１６５１）はエフェクター細胞（ＩＬ－２プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）と手の役割を果たし、Ｎａｌｍ６、ＲＣＫ８、ＷＳＵ ＤＬＣＬ２及びＺ１３８は腫瘍標的としての役割を果たした。２×１０４個の腫瘍標的細胞を、白色平底９６ウェルプレート中、３７°Ｃで６時間、１０５個のＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ ５：１）と共に、最適以下のＣＤ２０－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ４０７１）濃度（Ｎａｌｍ６については１０ｎＭ、又はＲＣＫ８、ＷＳＵ ＤＬＣＬ２及びＺ１３８については０．０５ｎＭ）単独の存在下、又は漸増濃度のＣＤ１９－ＣＤ２８（又はＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８）コンストラクト（０．２ｐＭ～１０ｎＭ）と組み合わせてインキュベートした。測定の前に、プレートを室温で１５分間インキュベートし、次いで、１００ｕｌの基質（ＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１２０）を細胞に添加した。暗所での室温での１０分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを用いて発光（カウント／秒）を測定した。
ＰＢＭＣ単離Ｔ細胞活性化に基づくＣＤ１９－ＣＤ２８のインビトロ機能的特性評価
ＣＤ１９－ＣＤ２８がＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化を支援する能力を評価するために、ｐａｎ Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、製造業者の指示に従ってＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用してＭＡＣＳによってＰＢＭＣから単離し、Ｎａｌｍ６、ＲＣＫ８、ＷＳＵ ＤＬＣＬ２及びＺ１３８を腫瘍標的とした。２×１０４個の腫瘍標的細胞を、平底９６ウェルプレート中、３７°Ｃで４８時間、１０５個のｐａｎ Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ ５：１）と共に、最適以下のＣＤ２０－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ４０７１）濃度（Ｎａｌｍ６については１０ｎＭ、又はＲＣＫ８、ＷＳＵ ＤＬＣＬ２及びＺ１３８については０．０５ｎＭ）単独の存在下、又は漸増濃度のＣＤ１９－ＣＤ２８コンストラクト（０．２ｐＭ～１０ｎＭ）と組み合わせてインキュベートした。Ｔ細胞活性化をフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、細胞を４８０×ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。ＣＤ８（ＢＶ４２１抗ヒト、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３０１０３６）、ＣＤ４（ＰＥ－Ｃｙ７抗ヒト、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３４４６１１）、ＣＤ２５（ＢＶ６０５抗ヒト、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３０２６３２）、ＣＤ６９（ＰＥ抗ヒト、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３１０９０６）についての表面染色を、供給業者の指示に従って実施した。細胞を１５０ｕｌ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄し、１５０ｕｌ／ウェルのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して分析した。
サイトカイン放出アッセイ
ＴＣＲシグナル伝達の存在下でサイトカイン放出をトリガーするＣＤ１９－ＣＤ２８の能力を評価するために、５×１０５個のＰＢＭＣをＵ底９６ウェルプレート中で３７℃で４８時間、ＣＤ１９－ＣＤ２８（１ｎＭ）及び最適以下のＣＤ２０－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ４０７１）濃度（０．４ｐＭ）の存在下でインキュベートした。ＴＣＲシグナル伝達の非存在下でサイトカイン放出をトリガーするＣＤ１９－ＣＤ２８の能力を評価するために、５×１０５個のＰＢＭＣをＵ底９６ウェルプレート中で、漸増濃度のＣＤ１９－ＣＤ２８コンストラクト（０．０８ｎＭ～１００ｎＭ）の存在下、３７℃で４８時間インキュベートした。サイトカイン放出を、マルチプレックスアッセイによって評価した。供給者の指示に従って、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １７－ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ番号ｍ５００００３１ｙｖ）を用いて、５０μｌ／ウェルの上清を、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ）、ＭＩＰ－１β及びＴＮＦ－α分泌についてスクリーニングした。
ＣＤ１９－ＣＤ２８は、様々なＢ細胞株においてＣＤ２０－ＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化を増強する
ＣＤ２０－ＴＣＢ媒介エフェクター機能を増強するＣＤ１９－ＣＤ２８抗体の能力を評価するために、ＴＣＢ併用におけるＴ細胞活性化を評価した。この目的のために、ＩＬ－２レポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、漸増濃度のＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ１５（Ｐ１ＡＥ９０４０）及び固定した限界濃度のＣＤ２０－ＴＣＢ（Ｐ１ＡＤ４０７１）の存在下で６時間、４つの異なるＣＤ１９発現細胞株（Ｎａｌｍ６、ＷＳＵ ＤＬＣＬ２、Ｚ１３８、ＲＣＫ８）と共培養した。ＣＤ２０ ＴＣＢは、国際公開第２０１６／０２０３０９号Ａ１の実施例１に記載されているような２＋１フォーマットの抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。図４５Ａ～４５Ｄに示されるように、ＣＤ１９－ＣＤ２８は、４つ全てのＢ細胞株の存在下で濃度依存的にＣＤ２０－ＴＣＢ媒介エフェクター機能を増加させる。
親和性低下ＣＤ２８結合因子変異体は、ＣＤ１９－ＣＤ２８二重特異性フォーマットにおいてインビトロで機能的である
元のＣＤ２８（ＳＡ）クローンは、ＫＤ＝１ｎＭの親和性を有する。抗親和性抗体クローンは、特にＣＤ２８の場合のように標的が末梢血で高度に発現される場合、末梢シンク効果を受けるリスクを有する。（ｉ）末梢シンク効果を低下させ、（ｉｉ）ｔａｒｇ．ＣＤ２８アゴニストのＴ細胞への腫瘍外結合を介して末梢Ｔ細胞活性化のリスクを低下させるために、本発明者らは、ＣＤＲに点変異を導入することによって親和性が低下した一連の３１個のＣＤ２８クローンを作製した（実施例１．１を参照されたい）。候補クローンを前述のように選択した。異なるＣＤ２８親和性を有する５つの分子をＣＤ１９標的二重特異性フォーマットで作製した：ＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ８（Ｐ１ＡＦ０１７５）、ＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ１１（Ｐ１ＡＦ０３７７）、ＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ１５（Ｐ１ＡＥ９０４０）、ＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ２７（Ｐ１ＡＦ０３７８）及びＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ２９（Ｐ１ＡＥ８００２）。図４４Ａ及び４４Ｂは、全ての生成されたＣＤ１９－ＣＤ２８分子がヒトＣＤ１９並びにＣＤ２８に結合し、結合強度が結合因子親和性と相関することを示す。
親和性が低下したＣＤ２８クローン変異体が機能的であり、ＴＣＢ媒介エフェクター機能を支持することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、ＴＣＢの組み合わせにおけるＴ細胞活性化を評価した。この目的のために、ＩＬ－２レポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、漸増濃度のＣＤ１９－ＣＤ２８及び固定した限界濃度のＣＤ２０－ＴＣＢの存在下で６時間、ＣＤ１９発現Ｎａｌｍ６細胞と共培養した。図４６に示すように、ＣＤ２８結合因子の全ての変異体は機能的であり、濃度依存的にＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化を増加させることができた。Ｐａｎ Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、製造業者の指示に従ってＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＭＡＣＳによってＰＢＭＣから単離した。
ＣＤ１９－ＣＤ２８は、ＴＣＲシグナルの非存在下でＰＢＭＣ Ｔ細胞を活性化しない
ＣＤ１９－ＣＤ２８コンストラクトがＣＤ２０－ＴＣＢによって提供されるものなどのＴＣＲシグナルなしで不活性であることを確認するために、本発明者らは、ＣＤ２０－ＴＣＢの非存在下又は存在下でＣＤ２０発現標的細胞（Ｎａｌｍ６）及びＣＤ１９－ＣＤ２８と共培養した後のＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の活性化状態を評価した。図４７に示されるように、ＣＤ１９－ＣＤ２８は、ＰＢＭＣ Ｔ細胞におけるＣＤ２０－ＴＣＢ媒介のＣＤ６９発現を用量依存的様式で増強するが、ＴＣＢの非存在下では、ＣＤ１９－ＣＤ２８は、高濃度（１００ｎＭ）でさえ、Ｔ細胞活性化をもたらさない。この知見は、ＣＤ２０－ＴＣＢの存在下又は非存在下でＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ８又はＣＤ１９－ＣＤ２８ ｖ１５と同時インキュベートした後、ＣＤ１９－ＣＤ２８がＰＢＭＣ由来Ｔ細胞においてサイトカイン放出をもたらさなかったという本発明者らの観察によって確認される（図４８Ａ～４８Ｄ）。結論として、これらのデータは、ＣＤ１９－ＣＤ２８がスーパーアゴニスト抗体ではなく、Ｔ細胞活性化を増強するためにＴＣＲシグナル、すなわちＴＣＢによって提供されるＴＣＲシグナルを必要とすることを確認する。
ＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８はＣＤ２０－ＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化を増強する
ＣＤ１９標的ＣＤ２８アゴニスト抗体に加えて、本発明者らはまた、ＣＤ７９ｂ標的ＣＤ２８抗体を生成して、ＣＤ２０－ＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化を増強するそれらの能力を評価した。このために、ＣＤ７９ｂ陽性Ｂ細胞株Ｚ１３８を使用した。図４９Ａに示されるように、ＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８はＺ１３８に結合する。更に、ＣＤ７９ｂ－ＣＤ２８は、０．０５ｎＭ ＣＤ２０－ＴＣＢの存在下でＺ１３８と共にインキュベートした場合、ＩＬ－２ Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＤ２０－ＴＣＢ媒介性ＩＬ－２産生を増強することができた（図４９Ｂ）。
実施例２２
ＣＤ２８及びＣＤ１９を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビボ機能的特性評価
ヒト化マウスにおけるＮＡＬＭ６異種移植片における異なるＣＤ２８変異体を有するＣＤ１９－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子を用いた有効性試験
本明細書に記載の有効性試験は、完全ヒト化ＮＳＧマウスのＣＤ１９陽性ヒトリンパ腫モデルにおいて、ＣＤ１９－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子中のどのＣＤ２８変異体が単剤療法においてより強い腫瘍増殖阻害をもたらすかを評価することを目的とした。
ヒトＮＡＬＭ６細胞（Ｂ細胞前駆体白血病）は、ＡＴＣＣから最初に得られ、増殖後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％ＦＣＳ及び１×Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ中で培養した。細胞を３７°Ｃ、水飽和雰囲気、５％ＣＯ２で培養した。５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１×１０６個のＮＡＬＭ６細胞）を、２２Ｇ～３０Ｇの針で麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（ＺＨ２２５－１７）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌性ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から１４～１６週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトＴ細胞の頻度に従って、異なる処置群に無作為に分けられた。その時点で、記載されているように（図５０）マウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ３（１８日目）に達したときに化合物又はヒスチジン緩衝液（ビヒクル）で処理した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌ当たり適切な量の化合物を得るために、原液（表４４）を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。
Figure 2023021958000087
ノギスを用いて腫瘍増殖を週２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
試験は５３日目に終了した。図５１Ａは、腫瘍増殖速度論（平均、＋ＳＥＭ）を示し、図５１Ｂ～５１Ｄは、群及びマウスごとの個々の腫瘍増殖速度論を示す。本明細書に記載されるように、単剤としてのＣＤ１９－ＣＤ２８変異体８は、ＣＤ１９－ＣＤ２８変異体１５と比較してより強い腫瘍増殖阻害を誘導した。ビヒクル動物は、皮下腫瘍細胞注射による転移の形成のために早期に屠殺しなければならなかった。ヒト化マウスにおける単剤治療効果は、マウス系におけるアロ反応性ヒトＴ細胞のブーストによって説明することができ、これはネオ抗原認識の代用と見なすことができる。
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Ｇａｏ Ｙ．，Ｗａｎｇ Ｘ．，Ｙａｎ Ｈ．，Ｚｅｎｇ Ｊ．，Ｍａ Ｓ．，Ｎｉｕ Ｙ．，Ｚｈｏｕ Ｇ．，Ｊｉａｎｇ Ｙ．，Ｃｈｅｎ Ｙ．（２０１６）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｅｔａｌ Ｓｋｉｎ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｋｅｙ Ｇｅｎｅｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｈａｉｒ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｃａｓｈｍｅｒｅ Ｇｏａｔｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（３），ｅ０１５１１１８．
Ｈｕｉ，Ｅ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｊ．，Ｚｈｕ，Ｊ．，Ｓｕ，Ｘ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｌｌｗｅｂｅｒ，Ｈ．Ａ．，Ｓａｓｍａｌ，Ｄ．Ｋ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．，ａｎｄ Ｖａｌｅ，Ｒ．Ｄ．（２０１７）．Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ２８ ｉｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ＰＤ－１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５，１４２８－１４３３．
Ｈｕｎｉｇ，Ｔ．（２０１２）．Ｔｈｅ ｓｔｏｒｍ ｈａｓ ｃｌｅａｒｅｄ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＣＤ２８ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ＴＧＮ１４１２ ｔｒｉａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２，３１７－３１８．
Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，Ｎａｍｂｕ Ｔ．ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｔ．（２００４）．Ｔｈｅ ＲＡＩＧ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ，ＧＰＲＣ５Ｄ，ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈａｒｄ－ｋｅｒａｔｉｎｉｚｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２２（３），５６５－７３．
Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．，Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（１９８７）．Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ２８ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７，４４７２－４４８１．
Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ，Ａ．Ｏ．，Ｗｉｅｌａｎｄ，Ａ．，Ｎａｓｔｉ，Ｔ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ，Ｂ．Ｔ．，Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃ．Ｚ．，Ｋｏｅｎｉｇ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＰＤ－１－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｓ ＣＤ２８－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５，１４２３－１４２７．
Ｌａｖｉｎ，Ｙ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．，Ｌｅａｄｅｒ，Ａ．，Ａｍｉｒ，Ｅ．Ｄ．，Ｅｌｅｆａｎｔ，Ｎ．，Ｂｉｇｅｎｗａｌｄ，Ｃ．，Ｒｅｍａｒｋ，Ｒ．，Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｒ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｄ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｉｎ Ｅａｒｌｙ Ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ Ｐａｉｒｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｃｅｌｌ １６９，７５０－７６５ ｅ７１７．
Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｌａｒｋ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．（１９９０）．Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ２８ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ７／ＢＢ－１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７，５０３１－５０３５．
Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．ａｎｄ Ｓ．Ｖ．Ｒａｊｋｕｍａｒ（２０１６）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅａｌｉｔｙ．Ｌａｎｃｅｔ，３８８（１００４０）：ｐ．１１１－１１３．
Ｍｕｒｒａｙ Ｍ．Ｅ．，Ｇａｖｉｌｅ Ｃ．Ｍ．，Ｎａｉｒ Ｊ．Ｒ．，Ｋｏｏｒｅｌｌａ Ｃ．，Ｃａｒｌｓｏｎ Ｌ．Ｍ．，Ｂｕａｃ Ｄ．，Ｕｔｌｅｙ Ａ．，Ｃｈｅｓｉ Ｍ．，Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ Ｐ．Ｌ．，Ｂｏｉｓｅ Ｌ．Ｈ．，Ｌｅｅ Ｋ．Ｐ．（２０１４）．ＣＤ２８－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ １２３（２４），３７７０－３７７９．
Ｒｏｅｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｂｅｒｒ，Ｓ．，Ａｖｏｔａ，Ｅ．，Ｎａ，Ｓ．Ｙ．，Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｍ．，ｔｅｎ Ｂｅｒｇｅ，Ｉ．，Ｅｉｎｓｅｌｅ，Ｈ．，ａｎｄ Ｈｕｎｉｇ，Ｔ．（２０１１）．Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ＰＢＭＣｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ＣＤ２８ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ＴＧＮ１４１２．Ｂｌｏｏｄ １１８，６７７２－６７８２．
Ｔａｉ，Ｘ．，Ｖａｎ Ｌａｅｔｈｅｍ，Ｆ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．，ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．（２００７）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ＣＴＬＡ－４－／－ｍｉｃｅ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ２８ ｍｏｔｉｆ ｔｈａｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４，１３７５６－１３７６１．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｔ．，Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｋｕｎｋｅｌ，Ｓ．Ｌ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．，Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｇ．，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．（１９８９）．ＣＤ２８ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ／ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８６，１３３３－１３３７．
Ｔｉｒｏｓｈ，Ｉ．，Ｉｚａｒ，Ｂ．，Ｐｒａｋａｄａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｍ．Ｈ．，２ｎｄ，Ｔｒｅａｃｙ，Ｄ．，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ，Ｊ．Ｊ．，Ｒｏｔｅｍ，Ａ．，Ｒｏｄｍａｎ，Ｃ．，Ｌｉａｎ，Ｃ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２，１８９－１９６．
Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｙｏｏ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｕｏ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｇｕｏ，Ｘ．，Ｋａｎｇ，Ｂ．，Ｈｕ，Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １６９，１３４２－１３５６ ｅ１３１６．

Claims (63)

  1. ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
    （ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
    （ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
    （ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
    を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  2. 前記ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む、請求項１に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  3. 前記ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号３６の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号３９の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
    （ｉｉ）配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２５のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）と、
    を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  4. 前記ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  5. 前記ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）と、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  6. 前記ＣＤ２８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｅ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｇ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｈ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｊ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｋ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
    を含む、請求項１～３又は５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８結合分子。
  7. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ｐ９５ＨＥＲ２、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＨＥＲ３、ＣＤ３０、ＴＰＢＧ（５Ｔ４）、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ及びＧＰＲＣ５Ｄからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  8. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  9. 前記ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）；又は
    （ｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）；又は
    （ｉｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、
    （ｉｖ）配列番号５０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）と、
    を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  10. 前記ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  11. 前記ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｂ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｃ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｄ）配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｅ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｆ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｇ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｈ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｉ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｊ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
    を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  12. 前記ＣＥＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項１～９又は１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  13. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  14. 前記ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
    （ａ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
    （ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、
    を含む、請求項１～７又は１３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  15. 前記ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１～７又は１３又は１４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  16. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  17. 前記ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、（ｉｖ）配列番号５１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）と、を含む、含む、請求項１～７又は１６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  18. 前記ＥｐＣＡＭに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号５２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）を含む、請求項１～７又は１６又は１７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  19. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  20. 前記ＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）と、（ｉｖ）配列番号５２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）と、を含む、請求項１～７又は１９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  21. 前記ＨＥＲ３に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＥＲ３）及び配列番号５３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＥＲ３）を含む、請求項１～７又は１９又は２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  22. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  23. 前記ＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）と、（ｉｖ）配列番号５３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）と、を含む、請求項１～７又は２２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  24. 前記ＣＤ３０に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３０）及び配列番号５３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３０）を含む、請求項１～７又は２２又は２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  25. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  26. 前記ＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＢＰＧ）と、（ｉｖ）配列番号５４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＢＰＧ）と、を含む、請求項１～７又は２５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  27. 前記ＴＢＰＧに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＴＢＰＧ）及び配列番号５４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＴＢＰＧ）を含む、請求項１～７又は２５又は２６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  28. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ及びＧＰＲＣ５Ｄからなる群から選択される多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞表面抗原である、請求項１～７のいずれか一項記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  29. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７又は２８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  30. 前記ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
    （ａ）（ｉ）配列番号５６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）と、（ｉｖ）配列番号５６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）、又は
    （ｂ）（ｉ）配列番号５７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号５８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）と、（ｉｖ）配列番号５８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）と、
    を含む、請求項１～７又は２８又は２９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  31. 前記ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＧＰＲＣ５Ｄ）及び配列番号５７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＧＰＲＣ５Ｄ）を含む、請求項１～７又は２８～３０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  32. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７又は２８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  33. 前記ＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）と、（ｉｖ）配列番号５５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）と、を含む、請求項１～７又は２８又は３２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  34. 前記ＣＤ３８に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３８）及び配列番号５５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３８）を含む、請求項１～７又は２８又は３２又は３３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  35. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７又は２８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  36. 前記ＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）と、（ｉｖ）配列番号５５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）と、を含む、請求項１～７又は２８又は３５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  37. 前記ＢＣＭＡに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号５６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＢＣＭＡ）及び配列番号５６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＢＣＭＡ）を含む、請求項１～７又は２８又は３５又は３６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  38. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ３７からなる群から選択されるＢ細胞表面抗原である、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  39. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７又は３８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  40. 前記ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
    （ａ）（ｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、（ｉｖ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
    （ｂ）（ｉ）配列番号４１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、（ｉｖ）配列番号４１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）と、
    を含む、請求項１～７又は３８又は３９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  41. 前記ＣＤ１９に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号４１２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号４２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４２１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、請求項１～７又は３８又は３９又は４０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  42. 前記ＣＤ１９に特異的に結合能可能な抗原結合ドメインが、配列番号４１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、請求項１～７又は３８又は４１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  43. 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項１～７又は３８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  44. 前記ＣＤ７９ｂに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）と、（ｉｖ）配列番号４２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）と、を含む、請求項１～７又は３８又は４３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  45. 前記ＣＤ７９ｂに結合能可能な抗原結合ドメインが、配列番号４２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ７９ｂ）及び配列番号４２９のアミノ酸配列を含む軽鎖変領域（ＶＬＣＤ７９ｂ）を含む、請求項１～７又は３８又は４３又は４４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  46. （ａ）ＣＤ２８に特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と、
    （ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な１つのクロスＦａｂ断片と、
    （ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
    を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  47. （ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
    （ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片と、
    （ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
    を含み、
    前記ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、Ｆｃドメインサブユニットの１つのＮ末端に融合されている、
    請求項１～４５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  48. （ａ）ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片と、
    （ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片及び第３のＦａｂ断片と、
    （ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
    を含み、
    前記ＣＤ２８に特異的に結合可能な第１のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、次いで、そのＣ末端において、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第３のＦａｂ断片が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されている、
    請求項１～４５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  49. 請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする１つ以上の単離されたポリヌクレオチド。
  50. 請求項４９に記載のポリヌクレオチド（複数可）を含む、１つ以上のベクター、特に、発現ベクター。
  51. 請求項４９に記載のポリヌクレオチド（複数可）又は請求項５０に記載のベクター（複数可）を含む宿主細胞。
  52. 二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を製造する方法であって、ａ）請求項５１記載の宿主細胞を、前記二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及びｂ）必要に応じて、前記二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を回収する工程を含む、方法。
  53. 請求項５２記載の方法によって製造される、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  54. 請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
  55. がんの処置で使用するための、請求項５４に記載の薬学的組成物。
  56. 医薬として使用するための、請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は請求項５４に記載の薬学的組成物。
  57. （ａ）Ｔ細胞活性化又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能を増強するのに使用するための、請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  58. がんの処置に使用するための、請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  59. 前記二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、化学療法剤、放射線治療、及び／又はがん免疫治療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて投与するためのものである、がんの処置に使用するための、請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  60. 前記二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与されるためのものである、がんの処置に使用するための、請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  61. 前記二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与されるためのものである、がんの処置に使用するための、請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  62. がんの処置のための医薬の製造における、請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は請求項５４に記載の薬学的組成物の使用。
  63. 個体における腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、前記個体に有効量の、請求項１～４８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は請求項２４に記載の薬学的組成物を投与し、前記腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
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