[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP2022536370A - Ｐｄ－１に対する抗体およびその使用方法 - Google Patents

Ｐｄ－１に対する抗体およびその使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022536370A
JP2022536370A JP2021573797A JP2021573797A JP2022536370A JP 2022536370 A JP2022536370 A JP 2022536370A JP 2021573797 A JP2021573797 A JP 2021573797A JP 2021573797 A JP2021573797 A JP 2021573797A JP 2022536370 A JP2022536370 A JP 2022536370A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
amino acid
antibody
acid sequence
residues
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021573797A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020252471A5 (ja
Inventor
ウェイン エイ． マラスコ
マシュー チャン
クアン カレン チュー
Original Assignee
デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド filed Critical デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド
Publication of JP2022536370A publication Critical patent/JP2022536370A/ja
Publication of JPWO2020252471A5 publication Critical patent/JPWO2020252471A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明は、細胞表面受容体であるＰＤ－１（プログラム死１）に結合するヒトモノクローナル抗体に関する。抗体は、癌および慢性ウイルス感染症の治療に使用できる。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１９年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８６１，６４３号からの優先権の利益を主張する国際出願であり、その内容全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載され特許請求される本発明の日付の当業者に既知の最新技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示は、参照により本出願に組み込まれる。
本特許開示は、著作権保護の対象となる、材料を含む。著作権所有者は、米国特許商標局の特許ファイルまたは記録に表れているように、特許文書または特許開示のいずれかによってファクシミリ複製に異議はないが、それ以外では、何であれ全ての著作権を留保する。
発明の分野
本発明は、ＰＤ－１に対する抗体およびその使用方法に関する。
発明の背景
プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面膜タンパク質である。このタンパク質は、プロＢ細胞において発現され、それらの分化において役割を果たすと考えられている。ＣＤ２８ファミリーのメンバーであるＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球上で上方調節される。ＰＤ－１は、Ｂ７ファミリー中に２つの同定されたリガンド、ＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死－１リガンド１；表面抗原分類２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７相同体１（Ｂ７－Ｈ１）としても知られる）およびＰＤ－Ｌ２を有する。ＰＤ－Ｌ１は、４０ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１またはＢ７．１へのＰＤ－Ｌ１の結合は、リンパ節におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を減少させる阻害シグナルを伝達し、その補足として、ＰＤ－１はまた、遺伝子Ｂｃｌ－２のより低い調節によってさらに媒介されるアポトーシスを介して、リンパ節における外来抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を制御することができる。ＰＤ－Ｌ２発現はより制限される傾向があり、主に活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に見出されるが、造血系細胞（活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞およびマクロファージなど）および末梢非リンパ系組織（心臓、骨格、筋肉、胎盤、肺、腎臓および肝臓組織など）を含むＰＤ－Ｌ１発現はより広範である。ＰＤ－Ｌ１の広範な発現は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１媒介性末梢寛容の調節において有意な役割を示す。
本発明は、ＰＤ－１抗体組成物およびその使用方法を提供する。
本発明の１つの態様は、ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ－１）タンパク質に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。１つの実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、Ｇ－（Ｘ１）－ＴＦ－（Ｘ２Ｘ３）－Ｙ－（Ｘ４）（配列番号８１）、Ｇ－（Ｘ５）－ＴＦ－（Ｘ６Ｘ７Ｘ８）－Ａ（配列番号８２）、ＧＤＳＶＳＳＤＮＹＦ（配列番号４３）、またはＧＹＴＦＮＲＦＧ（配列番号５５）を含むＣＤＲ１；ＩＳＷＮＳＧＳＩ（配列番号１９）、ＩＹＰＤＤＳＤＴ（配列番号３３）、ＶＹＹＮＧＮＴ（配列番号４５）、ＴＮＰＹＮＧＮＴ（配列番号５７）、またはＩＳＹＤＧＳＮＫ（配列番号６９）を含むＣＤＲ２；ＡＳＤＹＧＤＫＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号２１）、ＡＦＷＧＡＳＧＡＰＶＮＧＦＤＩ（配列番号３５）、ＡＴＥＴＰＰＴＳＹＦＮＳＧＰＦＤＳ（配列番号４７）、ＡＲＶＶＡＶＮＧＭＤＶ（配列番号５９）、ＡＳＱＴＶＡＧＳＤＹ（配列番号７１）、またはＡＳＤＹＧＤＫＹＳＹＹＧＭＤＶ（配列番号７９）を含むＣＤＲ３；またはそれらのＣＤＲの組み合わせを含む。他の実施形態では、軽鎖は、ＳＳＮＩＧＳＮＴ（配列番号２４）、ＳＳＮＩＧＡＧＹＶ（配列番号３７）、ＳＮＮＶＧＡＨＧ（配列番号４９）、ＳＧＳＩＡＡＹＹ（配列番号６１）もしくはＮＩＧＳＫＳ（配列番号７３）を含むＣＤＲ１；（Ｘ９）－ＤＮ（配列番号８３）、（Ｘ１０）－ＮＮ（配列番号８４）もしくはＤＤＳ（配列番号７５）を含むＣＤＲ２；ＡＡＷＤＧＧＬＮＧＲＧＶ（配列番号２８）、ＡＡＷＤＤＳＬＮＡＰＶ（配列番号４１）、ＳＳＷＤＳＳＬＳＧＹＶ（配列番号５３）、ＱＳＹＤＳＳＮＬＷＶ（配列番号６５）もしくはＱＶＷＨＳＶＳＤＱＧＶ（配列番号７７）を含むＣＤＲ３；またはそれらのＣＤＲの組合せを含む。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載のＣＤＲを含む重鎖および軽鎖を含む。さらなる実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、完全ヒトであるか、またはヒト化されている。さらなる実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性である。さらなる実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、単鎖抗体である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも１．０×１０－９Ｍの結合親和性を有する。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ１、Ｘ４、Ｘ５、またはＸ８アミノ酸残基は、非極性アミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ１、Ｘ４、Ｘ５、またはＸ８アミノ酸残基は、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはアラニン（Ａ）である。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７またはＸ８アミノ酸残基は、極性アミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、またはＸ８アミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはトリプトファン（Ｗ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ１アミノ酸残基は、チロシン（Ｙ）またはフェニルアラニン（Ｆ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ２アミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、またはセリン（Ｓ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ３アミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、またはセリン（Ｓ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ４アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、またはトリプトファン（Ｗ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ５アミノ酸残基は、フェニルアラニン（Ｆ）、またはチロシン（Ｙ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ６アミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）、またはセリン（Ｓ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ７アミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）、またはセリン（Ｓ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ８アミノ酸残基は、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ９アミノ酸残基は、極性親水性アミノ酸残基である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ９アミノ酸残基は、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ１０アミノ酸残基は、極性親水性アミノ酸残基である。他の実施形態では、単離されたモノクローナルＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に由来するＣＤＲのＸ１０アミノ酸残基は、セリン（Ｓ）またはアルギニン（Ｒ）である。
本発明の１つの態様は、少なくとも１つの抗体を含む抗体組成物に関し、この少なくとも１つの抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲは、配列番号１のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９；または配列番号３のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９；または配列番号５のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１２１；または配列番号７のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１５；または配列番号９のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１４；または配列番号１２のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９（例えば、本明細書に記載のＨＬ－１４変異体）；または配列番号１３のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９（例えば、本明細書に記載のＨＬｋｉｎ－１変異体）；または配列番号１５のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９（例えば、本明細書に記載のｍｕｔ－３変異体）に見出される参照生殖系列ＣＤＲと同一であるが、重鎖ＣＤＲの少なくとも１つは、その参照ＣＤＲと比較して単一アミノ酸の置換が異なる。いくつかの実施形態では、軽鎖ＣＤＲは、配列番号２のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１６；または配列番号４のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１５；または配列番号６のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１５；または配列番号８のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１４；または配列番号１０のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１５；または配列番号１１のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１６（例えば、本明細書に記載のＨＬ－７変異体）に見出される参照生殖系列ＣＤＲと同一であるが、軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つは、その参照ＣＤＲと比較して単一アミノ酸置換が異なる。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、ＦＣＣ’鎖によって生成されるＰＤ－１面内のアミノ残基を含むエピトープに結合するが、配列番号ＸＸ中の非隣接アミノ酸を含むＰＤ－１のＣ’Ｄループと接触しない。
本発明の１つの態様は、ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ－１）タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片に関する。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む（例えば、本明細書に記載のＨＬ－７変異体）。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む（例えば、本明細書に記載されるＨＬ－１４変異体）。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号７８のアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号２１のアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む（例えば、本明細書に記載のＨＬｋｉｎ－１変異体）。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号７８のアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号２１のアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８０のアミノ酸を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む（例えば、本明細書に記載のＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ｍｕｔ２変異体）。１つの実施形態では、ＰＤ－１に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号７８のアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７９のアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８０のアミノ酸を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む（例えば、本明細書に記載のＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ＨＬ－１４ ｍｕｔ３変異体）。
本発明の１つの態様は、ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ－１）タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片に関する。１つの実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、配列番号１、３、５、７、９、１２、１３、および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２、４、６、８、１０、および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
他の実施形態において、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、以下を含む。
他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、以下を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、重鎖は、配列番号１と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号２と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、重鎖は、配列番号３と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号４と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、重鎖は、配列番号５と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号６と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、重鎖は、配列番号７と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号８と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、重鎖は、配列番号９と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１０と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、重鎖は、配列番号１と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１１と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、重鎖は、配列番号１２と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号２と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、重鎖は、配列番号１３と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号２と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、重鎖は、配列番号１３と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１１と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、重鎖は、配列番号１５と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１１と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。
本発明の１つの態様は、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する第１の抗体断片と、免疫細胞上の分子に対する特異性を有する第２の抗原結合断片とを含む、単離された二重特異性抗体に関する。１つの実施形態では、単離された二重特異性抗体は、本明細書に記載されるＰＤ－１タンパク質に対するヒト抗体の断片を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞上の分子は、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ１２２、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＬＡＧ－３、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ－４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、４－１ＢＢ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＨＥＶＭ、ＢＴＬＡ、またはＫＩＲを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する抗体断片は、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体を含む。他の実施形態では、免疫細胞上の分子に対して特異性を有する第２の抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃ断片を含む。
本発明の１つの態様は、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する第１の抗体断片、ならびに免疫細胞上の分子に対する特異性を有する第２および第３の抗原結合断片を含む、単離された多重特異性抗体に関する。１つの実施形態では、単離された多重特異性抗体は、本明細書に記載されるＰＤ－１タンパク質に対するヒト抗体の断片を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞上の分子は、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ１２２、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＬＡＧ－３、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ－４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、４－１ＢＢ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＨＥＶＭ、ＢＴＬＡ、またはＫＩＲを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する抗体断片は、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体を含む。他の実施形態では、免疫細胞上の分子に対して特異性を有する第２および第３の抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、Ｆｃ断片を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、免疫細胞上の分子に対して特異性を有する第４および／または第５の抗原結合断片をさらに含む。
本発明の１つの態様は、本明細書に記載されるヒトプログラム細胞死１（ＰＤ－１）タンパク質に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸に関する。本発明の１つの態様は、本明細書に記載されるヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片をコードする核酸に関する。本発明の１つの態様は、本明細書に記載の二重特異性抗体をコードする核酸に関する。本発明の１つの態様は、本明細書に記載の多重特異性抗体をコードする核酸に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸を含むベクターに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のベクターを含む細胞に関する。
本発明の１つの態様は、本明細書に記載のヒトＰＤ－１タンパク質に結合する抗体または断片、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む。他の実施形態では、治療剤は、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、またはサイトカインである。
本発明の１つの態様は、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する二重特異性抗体または断片、ならびに本明細書に記載される免疫細胞上の分子に特異性を有する第２の抗原結合断片、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む。他の実施形態では、治療剤は、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、またはサイトカインである。
本発明の１つの態様は、本明細書に記載される免疫細胞上の分子に対する特異性を有する第２、第３、第４または第５の抗原結合断片に加えて、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する二重特異性抗体または断片、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む。他の実施形態では、治療剤は、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、またはサイトカインである。
本発明の１つの態様は、本明細書に記載のＰＤ－１抗体または断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む単離された細胞に関する。本発明の１つの態様は、本明細書に記載の二重特異性抗体またはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む単離された細胞に関する。本発明の１つの態様は、本明細書に記載の多重特異性抗体またはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む単離された細胞に関する。
本発明の１つの態様は、本明細書に記載の医薬組成物；対象への医薬組成物の投与のための注射器、針、またはアプリケーター；および使用説明書を含むキットに関する。
本発明の１つの態様は、キメラ抗原受容体を含む操作された細胞に関し、このキメラ抗原受容体は、癌細胞の表面上の抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含み、抗原はＰＤ－１を含む。本発明の他の態様は、キメラ抗原受容体を含む操作された細胞に関し、このキメラ抗原受容体は、癌細胞の表面上の第１の抗原および第２の抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含み、第１の抗原はＰＤ－１を含み、第２の抗原は本明細書に記載の腫瘍特異的表面抗原を含む。１つの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、抗体またはその断片を含む。別の実施形態では、抗体は、表１～１１によるＶＨおよび／またはＶＬ、あるいは本明細書に記載の重鎖または軽鎖の任意の組み合わせを含む。１つの実施形態では、抗体は、表１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３、または本明細書に記載のＣＤＲの任意の組み合わせを含む。１つの実施形態では、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である。１つの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋ｐａｎＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。
本発明の１つの態様は、対象の癌を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＰＤ－１抗体を含む治療有効量の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の医薬組成物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＣＡＲ組成物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む。１つの実施形態では、癌はＰＤ－１を発現する。別の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌、黒色腫、卵巣癌、リンパ腫、または腎細胞癌を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、対象に化学療法剤を投与することをさらに含む。
本発明の他の目的および利点は、以下の記載から容易に明らかになるであろう。
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公報の写しは、特許庁に請求して必要な手数料を支払うことで得られる。
抗体発見のためのＰＭＰＬパニング戦略（例えば、本発明のＰＤ－１抗体）の概略図を示している。 図２は、抗ＰＤ－１抗体、Ｐ４－Ｂ３のＶＨおよびＶＬ配列の概略図である。 図２－１の説明を参照のこと。 図３は、ヒトＰＤ－１の３Ｄタンパク質構造の図であり、ヒトとカニクイザルＰＤ－１との間の差異が赤色で強調している。対応するアミノ酸配列を下に整列させる。高度の類似性がヒトとカニクイザルＰＤ－１との間で観察される。ニボルマブと結合するＰＤ－１の３Ｄタンパク質構造も示している。 図３－１の説明を参照のこと。 ヒトおよびカニクイザルＰＤ－１に対するＰ４－Ｂ３ミニボディの結合曲線を示すグラフである。 Ｐ４－Ｂ３の異なる型におけるオクテット結合曲線のグラフを示している。 ＰＤ－１抗体を使用したＰＤ－Ｌ１競合アッセイの結合曲線を示している。 ＩｇＧ ＥＬＩＳＡの結合曲線を示している。 図８は、抗ＰＤ１ ＩｇＧを用いて行ったＰＤ１ ＦＡＣＳについてのＦＡＣＳ分析プロットを示している。 図８－１の説明を参照のこと。 ＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイの概略図である。 図１０は、市販のＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイからの誘導曲線のグラフを示している。（Ａ）Ｐ４－Ｂ３のＩｇＧ１ 野生型モノマーバージョン対ｐｅｍｂｒｏおよびｎｉｖｏ。図に示されるように、Ｐ４－Ｂ３抗ＰＤ１抗体は、ｐｅｍｂｒｏおよびｎｉｖｏのシグナルの約１／２を達成している。 図１０は、市販のＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイからの誘導曲線のグラフを示している。（Ｂ）ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ構成のヘキサマー比較。ヘキサマー構成は、用量応答曲線において約２～３倍のシフトを示している。 図１０は、市販のＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイからの誘導曲線のグラフを示している。（Ｃ）ＩｇＧ４構築物（モノマーおよびヘキサマー）とｎｉｖｏとの直接比較。ここでは、図１０Ａおよび図１０Ｂと同様の傾向が観察される。市販の抗体はＰ４－Ｂ３より２倍強力であり、ヘキサマーはモノマーと比較して約２～３倍のシフトを有する。 ヒトＰＤ－１のリボン図の概略図である（Ｃｈｅｎｇ，Ｘ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）．ＪＢＣ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．４４８１２６を参照のこと）。ＰＤ－１は、逆平行Ｂ－サンドイッチである。逆平行Ｂサンドイッチが示されている。ＰＤ－１リボン図の前面シートは、Ｇ、Ｆ、Ｃ、Ｃ’を含み、ＰＤ－１リボン図の後面シートは、Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｄを含む。ＰＤ－１は、ストーク領域中にシステインを欠き、これによって、ＰＤ－１がホモ二量体化するのが妨げられる。 図１２は、ＰＤ－１とそのリガンドであるＰＤＬ－１またはＰＤＬ－２との相互作用を示すタンパク質構造の概略図である。Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＪＢＣ ２０１３；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１３２３８－０１６－０３３７－７；およびＹａｎ ｅｔ ａｌ，（２００８）ＰＮＡＳ，ＤＰＯ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０４４５３１０５を参照のこと。 図１２－１の説明を参照のこと。 図１３は、市販の抗体に結合するＰＤ－１のリボン図を示している。（Ａ）ＮｉｖｏはＦＧループに結合することでＰＤ－Ｌ１を遮断する。（Ｂ）Ｐｅｍｂｒｏは、ＣおよびＣ’鎖に結合することにより遮断する。Ｆｅｓｓａｓ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１７を参照のこと。 図１３－１の説明を参照のこと。 ヒト対マウスＰＤ－１のタンパク質モデルオーバーレイおよびアミノ酸配列比較である。ヒトおよびマウスＰＤ－１の類似性の程度：約６４％。Ｃｈｅｎｇ，Ｘ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）．ＪＢＣ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．４４８１２６．を参照のこと。 ヒト対マウスＰＤ－１のタンパク質モデルオーバーレイおよびアミノ酸配列比較である。アミノ酸残基Ｐ１１０（紫色）は、ＦＧループにねじれをもたらす。マウスＰＤ１において、この残基は、Ａｒｇ８３とＴｒｐ３９との疎水性相互作用に起因して、ＢＣループをＤＥループに向かわせる。ヒトＰＤ－１におけるアミノ酸残基Ｐ６３（青色）は、ループをＣ’鎖から離れさせ、可撓性の高いループを作製する。理論に束縛されることを望まないが、これらの２つの構造的差異は、ＰｅｍｂｒｏおよびＮｉｖｏのマウスＰＤ－１との交差反応性の欠如において役割を果たす。Ｃｈｅｎｇ，Ｘ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）．ＪＢＣ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．４４８１２６．を参照のこと。 マウスＰＤ－１へのＰ４－Ｂ３結合を示すグラフである。Ｐ４－Ｂ３は、マウスＰＤ－１に対して適度な親和性を有し、ＰｅｍｂｒｏおよびＮｉｖｏとは一線を画している。 ＦＡＣＳによるスクリーニングの前にディスプレイされた酵母ライブラリを差次的に標識するために使用することができる染色戦略の概略図である。Ｃｈｅｒｆ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，２０１５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．を参照のこと。 ＦＡＣＳ分析のプロットを示している。青色ゲートが陽性ヒットであり、緑色ゲートが陰性である標準的な染色選別を示している。青色ゲートは、ｘ＝ｙ軸に沿って上方にシフトしている。理論に束縛されることを望まないが、ＰＤ－１抗体クローンは、より高い親和性でＰＤ－１に結合する。 動的染色のＦＡＣＳ分析のプロットを示している。収集された細胞は青色のゲートにあり、対象の例は赤色の円内にある。より多くのサンプルが得られるように収集ゲートを広く維持した。 Ｐ４－Ｂ３変異体の結合曲線のグラフである。 Ｐ４－Ｂ３変異体の結合曲線のグラフである。 図２２は、Ｐ４－Ｂ３（抗ＰＤ１）生殖系列アラインメントの概略図であり、生成されたＰ４－Ｂ３変異体において変化したアミノ酸残基の図である。 図２２－１の説明を参照のこと。 図２２－１の説明を参照のこと。 異なるＰ４－Ｂ３変異体のオクテット結合曲線のグラフを示している。ＳＡセンサを２．５ｕｇ／ｍｌのビオチン化ＰＤ－１でコーティングした。 ＰＤ－１抗体（様々なＰ４－Ｂ３変異体）を使用するＰＤ－Ｌ１競合アッセイの結合曲線を示している。 生成されたＰ４－Ｂ３変異体において変化したアミノ酸残基の概略図である。 図２６は、抗ＰＤ１抗体クローンの生殖系列アラインメントの概略図である。これらの候補は、可溶性タンパク質パニング（ＰＤ１－ｈＦｃ）によって見出された。 図２６－１の説明を参照のこと。 図２６－１の説明を参照のこと。 図２６－１の説明を参照のこと。 オクテット結合曲線のグラフを示している。ＰＤ１とＰＤＬ１の両方がタグ付けされている。センサＨ４から分かるように、センサは、ＰＤＬ１を付加する前に飽和していなかった。さらなる配列決定により、ＰＤ１＃５が抗体ではないことが確認された。Ａ４：Ｒ＆Ｄ抗ＰＤ１（ＡＦ１０８６）；Ｂ４：ＰＤ１ ミニ３；Ｃ４：ＰＤ１ ミニ４；Ｄ４：ＰＤ１ ミニ５；Ｅ４：ＰＤ１ ミニ７；Ｆ４：ＰＤ１ ミニ１３；Ｇ４：ＴＩＧ１（対照ａｂ）＋ＰＤＬ１；Ｈ４：センサが飽和しているかどうかを見るため抗体＋ＰＤ１なし。 オクテット結合曲線のグラフを示している。センサＨ４から分かるように、ＰＤ１とＰＤＬ１の両方がタグ付けされている。センサは、ＰＤＬ１を付加する前に飽和していなかった。ＰＤ１およびＰＤＬ１を２．５ｕｇ／ｍｌで使用した。抗体は２ｕｇ／ｍｌで使用した。全てのサンプルを１ｘＰＢＳＴで希釈した。新規ＰＤ－１抗体をｓｃＦｖ－Ｆｃ型で使用し、ＮｉｖｏおよびＰｅｍｂｒｏは市販の調製物である。Ａ６：Ｎｉｖｏ；Ｂ６：Ｐｅｍｂｒｏ；Ｃ６：ＰＤ１＃３；Ｄ６：ＰＤ１＃４；Ｅ６：ＰＤ１＃５；Ｆ６：ＰＤ１＃７；Ｇ６：ＰＤ１＃１３；Ｈ６：ＴＩＧ１（－）。 オクテット結合曲線のグラフを示している。ＳＡセンサ、２．５ｕｇのｅｘｐｉ２９３発現可溶性ＰＤ１－ａｖｉをロードし、Ａｖｉｄｉｔｙ社のビオチン化キットを介してビオチン化した。ＰＤ１＃３は、高いオフ速度を示した。 図３０は、抗ＰＤ１抗体クローン、Ｐ４－Ｂ７の生殖系列アラインメントの概略図である。 図３０－１の説明を参照のこと。 Ｐ４－Ｂ７のヒトおよびカニクイザルＰＤ－１へのミニボディ結合曲線のグラフを示している。トランスフェクションの４８時間後にｅｘｐｉ２９３細胞を用いて曲線を作成した。ヒト変異体は、市販の抗体を介して発現レベルに正規化したが、カニクイザル変異体は正規化しなかった。カニクイザル変異体は、使用した市販の抗体がカニクイザルＰＤ＃１に結合することが報告されていないため、正規化しなかった。 Ｐ４－Ｂ７を使用するＩｇＧ ＥＬＩＳＡの結合曲線のグラフを示している。Ｐ４－Ｂ７は、反応速度が進行するのに適切でないほど右にシフトしている。上図、ＥＬＩＳＡプレートを１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＰＤ１で３７℃で２時間コーティングした。次にプレートを洗浄し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、抗体の３×段階希釈物を、６ｕｇ／ｍｌで開始して、２％ミルク－ＰＢＳＴ中の各ウェル（１００ｕｌ）に加えた。次いで、プレートを穏やかに振盪しながら室温でインキュベートし、ＰＢＳ－Ｔで６回洗浄し、二次抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（１：１５０ｋ、Ｂｅｔｈｙｌ）を加えた。プレートを再度、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ－Ｔで６回洗浄した。ＴＭＢ基質を加え、プレートを３０℃で１０分間インキュベートして、ＨＲＰ反応を加速させた。次いで、シグナルをＴＭＢ停止溶液でクエンチし、４５０ｎｍで読み取った。下図、得られたデータのプロトコルは、プレートを６ｕｇ／ｍｌで開始する抗原の３×段階希釈物でコーティングしたことを除いて、上のグラフで得られたデータのプロトコルと同じであった。次いで、抗体を１ｕｇ／ｍｌの一定濃度で全てのウェルに加えた。 市販のＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイからの誘導曲線のグラフを示している。 Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイ（Ｊ１２５０）の概略図を示している。Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイ（Ｊ１２５０）を、野生型ａＰＤ－１ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（Ｐ４－Ｂ３）ならびにランダム変異誘発酵母ライブラリから生成された変異体単一およびコンボ変異体を用いて行った。ニボルマブをベンチマーク対照として使用した。 Ｐ４－Ｂ３変異体Ｐｒｏｍｅｇａバイオアッセイ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ型バイオアッセイ）を示している。Ｎｉｖｏ（黒丸）は約６の誘導倍率に達し、これは本発明者らの以前の実験と同様である。単一変異体ＨＬｋｉｎ－１、ＨＬ－７およびコンボ変異体Ｍｕｔ＋２、Ｍｕｔ＋３は、Ｎｉｖｏと比較してより高いまたは等しいレベルのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断を示している。これはＥＣ５０値にも反映されており、Ｍｕｔ＋２はＮｉｖｏの約半分のＥＣ５０値を有する。Ｐ４－Ｂ３野生型はより低い遮断レベルを示し、Ｎｉｖｏより１．７５倍高いＥＣ５０値も有する。本発明者らのランダム変異誘発酵母ディスプレイライブラリーによって同定された点変異は、結合およびチェックポイント遮断能力に対して有意な効果を有するようである。このアッセイで使用した全てのＰ４－Ｂ３サンプルは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ型であった。ＮｉｖｏおよびＦ１０のみを完全ＩｇＧとして使用した。 Ｐ４－Ｂ３野生型／変異体ＩｇＧにおけるオクテット結合曲線を示している。ＳＡセンサをビオチン化ＰＤ－１でコーティングし、次いで、様々な濃度の抗ＰＤ１抗体に浸漬した。ベースライン後の第１の工程は抗体の結合を示し、第２の工程は解離を示している。この図から分かるように、Ｐ４－Ｂ３野生型は、迅速なオフ速度を有するが、変異体およびＰｅｍｂｒｏははるかに遅いオフ速度を有する。 マウスＰＤ－１（ｍＰＤ－１）とのＰ４－Ｂ３単一対コンボ変異体における結合曲線を示している（ｓｃＦｖ－Ｆｃ型）。 ｈＰＤ１とのＰ４－Ｂ３単一対コンボ変異体における結合曲線を示している（特に明記されていない限り、ｓｃＦｖ－Ｆｃ型）。 ｈＰＤ１とのＰ４－Ｂ３単一対コンボ変異体における結合曲線を示している（ｐｅｍｂｒｏ／ｎｉｖｏ／野生型ＩｇＧ１を除いてｓｃＦｖ－Ｆｃ型）。 生成されたＰ４－Ｂ３変異体において変化したアミノ酸残基の概略図である。 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイの概略図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、活性化の際に高レベルのＰＤ－１を発現する。ＤＣは、体内での自己寛容を改善するために高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現する。ＭＨＣミスマッチによるＴ細胞活性化は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害に起因して制限される。抗ＰＤ－１抗体の付加は、この阻害シグナルを除去し、Ｔ細胞活性化の増加をもたらす（サイトカイン放出によって測定される）。 図４２は、グラフの表題に示されるように、サイトカイン産生を示すＭＬＲアッセイのグラフを示している。 図４２－１の説明を参照のこと。 図４３は、グラフの表題に示されるように、サイトカイン産生を示すＭＬＲアッセイのグラフを示している。 図４３－１の説明を参照のこと。 図４４は、Ｐｅｍｂｒｏ対Ｐ４Ｂ３ｍｕｔ＋３ ＩｇＧ４におけるＭＬＲアッセイの統計データ表を示している。 図４４－１の説明を参照のこと。 図４５は、Ｐｅｍｂｒｏ対Ｐ４Ｂ３ｍｕｔ＋３ ＩｇＧ４におけるＭＬＲアッセイの統計データ表を示している。 図４５－１の説明を参照のこと。 図４６は、Ｐｅｍｂｒｏ対Ｐ４Ｂ３ｍｕｔ＋３ ＩｇＧ４におけるＭＬＲアッセイの統計データ表を示している。 図４６－１の説明を参照のこと。 図４７は、Ｐｅｍｂｒｏ対Ｐ４Ｂ３ｍｕｔ＋３ ＩｇＧ４におけるＭＬＲアッセイの統計データ表を示している。 図４７－１の説明を参照のこと。
発明の詳細な説明
略語および定義
１つ以上の実施形態の詳細な説明が本明細書に提供される。しかしながら、本発明が、様々な形式で具現化され得ることが、理解される。したがって、本明細書に開示された特定の詳細は、限定として解釈されるべきではなく、特許請求の範囲の根拠として、および当業者に本発明を任意の適切な方法で用いるように教示するための代表的な根拠として解釈されるべきである。
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。特許請求の範囲および／または明細書において「備える」という用語とともに使用されるときの「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つ以上」の意味とも一致する。
句「例えば」、「など」、「含む」などが本明細書で使用される場合は常に、他に明確に明記されない限り、句「限定することなく」が付随することが理解される。同様に、「一例」、「例示的」などは、非限定的であると理解される。
用語「実質的に」は、意図した目的に悪影響を与えない記述語からの逸脱を可能にする。記述用語は、単語「実質的に」が明確に列挙されていなくても、用語「実質的に」によって修正されることが理解される。
用語「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに「有している（ｈａｖｉｎｇ）」および「伴っている（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」（および同様に「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、および「伴う（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」）などは、交換可能に使用され、同じ意味を有している。具体的には、用語それぞれは、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の一般的な米国特許法の定義と一致して定義され、それ故、非限定用語（ｏｐｅｎ ｔｅｒｍ）の意味「少なくとも以下の（ａｔ ｌｅａｓｔ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）」であると解釈され、追加の特徴、限定、態様などを除外しないとも解釈される。したがって、例えば、「工程ａ、ｂ、およびｃを伴うプロセス」は、プロセスが少なくとも工程ａ、ｂおよびｃを含むことを意味している。用語「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」が使用される場合は常に、そのような解釈が文脈において無意味でない限り、「１以上」と理解される。
「約」という用語は、本明細書では、おおよそ、大まかに、およそ、またはその領域内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用される場合、それは、記載された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、用語「約」は、本明細書では、数値を、記載された値の上下に２０パーセントの変動（上下）で変更するために使用される。
ＰＤ－１
プログラムＴ細胞死１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞の表面上に見出される膜貫通タンパク質であり、これは、腫瘍細胞上のプログラムＴ細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に結合すると、Ｔ細胞活性の抑制およびＴ細胞媒介性細胞傷害の低減をもたらす。したがって、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は、免疫下方制御因子または免疫チェックポイント「オフスイッチ」である。ＰＤ－１阻害剤の例としては、ニボルマブ、（オプジーボ）（ＢＭＳ－９３６５５８）、ペムブロリズマブ（キイトルーダ）、ピジリズマブ、ＡＭＰ－２２４、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ－９３６５５９およびＭＳＢ００１０７１８Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。
免疫系は、病原体を排除するための有効な応答と、自己免疫疾患を予防するための耐性の維持との間のバランスを達成しなければならない。Ｔ細胞は、このバランスを維持するために中心的な役割を果たしており、それらの適切な調節は、主にＢ７－ＣＤ２８ファミリーの分子によって調整される。リガンドとして機能するＢ７ファミリーメンバーと、受容体として機能するＣＤ２８ファミリーメンバーとの間の相互作用は、Ｔ細胞応答を開始、増大および維持するだけでなく、適切な場合にＴ細胞応答を制限、終結および／または減弱する重要な負のシグナルにも寄与する重要な正のシグナルを提供する。ＰＤ－１はＣＤ２８ファミリーのメンバーである。
ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の結合は、Ｔ細胞応答の調節に対して顕著な効果を有する。具体的には、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用は、Ｔ細胞増殖、ならびにＴ細胞活性および免疫応答を仲介するエフェクターサイトカイン、例えばＩＬ－２およびＩＦＮ－γの産生を阻害する。この負の調節機能は、Ｔ細胞媒介性自己免疫および免疫病理を予防するために重要である。しかしながら、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸はまた、Ｔ細胞疲弊において役割を果たすことが示されており、それにより、負の調節機能は、宿主の損傷に対するＴ細胞応答を阻害する。Ｔ細胞の長期または慢性抗原刺激は、抗原特異的応答を阻害し、病原体の免疫回避をもたらす負の免疫学的フィードバック機構を誘導し得る。Ｔ細胞疲弊はまた、抗原特異的Ｔ細胞自体の進行性の物理的欠失をもたらし得る。ＰＤ－１のＴ細胞発現は、慢性抗原刺激中に上方制御され、ＰＤ－Ｌ１への結合により、ＣＤ４＋（Ｔヘルパー細胞）とＣＤ８＋（細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＴＬ）Ｔ細胞の両方におけるエフェクター機能の遮断をもたらすため、Ｔ細胞疲弊の誘導におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に関与する。
最近では、いくつかの慢性ウイルス感染および癌が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１媒介性Ｔ細胞疲弊を引き起こすことによってＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を特異的に利用する免疫回避戦略を開発したことが研究により示された。多くのヒト腫瘍細胞および腫瘍関連抗原提示細胞は、高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現し、これは、腫瘍がＴ細胞疲弊を誘導して抗腫瘍免疫応答を回避することを示唆している。例えば、慢性ＨＩＶ感染時には、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は機能的に損なわれ、サイトカインおよびエフェクター分子を産生する能力が低下し、増殖能力の低下を示す。研究は、ＰＤ－１がＨＩＶ感染個体のＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上で高度に発現されることを示しており、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断することが、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳ患者の治療のための治療可能性を有し得ることを示している。まとめると、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断する薬剤は、様々な癌、ＨＩＶ感染、および／またはＴ細胞疲弊に関連する他の疾患および状態のための新たな治療アプローチを提供するであろう。したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断または防止することができる薬剤が緊急に必要とされている。
ＰＤ－Ｌ１の過剰発現は、様々な癌で検出されている。例えば、乳癌では、ＰＤ－Ｌ１が過剰発現しており、高リスク予後因子と関連している。腎細胞癌において、ＰＤ－Ｌ１は上方調節されており、ＰＤ－１の発現の増加が腫瘍浸潤白血球においても見出されている。抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＰＤ－１抗体は、腎細胞癌についての第Ｉ相試験においていくらかの臨床的有効性を実証している。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合することができる治療剤は、腫瘍細胞を特異的に標的とするのに有用であり得る。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断することができる薬剤は、Ｔ細胞疲弊を誘導して抗腫瘍Ｔ細胞活性を回避する癌の治療にさらにより有用であり得る。そのような薬剤を単独でまたは他の抗癌治療薬と組み合わせて使用することにより、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する腫瘍細胞を効果的に標的とし、抗腫瘍Ｔ細胞活性を増加させ、それにより、標的腫瘍細胞に対する免疫応答を増強することができる。
ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１はまた、例えば、慢性感染による慢性抗原刺激後にＴ細胞によって上方制御され得る。慢性ＨＩＶ感染時には、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は機能的に損なわれ、サイトカインおよびエフェクター分子を産生する能力が低下し、増殖能力の低下を示す。ＰＤ－１は、ＨＩＶ感染個体のＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上で高度に発現される。したがって、この経路を遮断することにより、ＨＩＶペプチドによる刺激に応答してＨＩＶ特異的Ｔ細胞が増殖してサイトカインを産生する能力が増強され、それによってＨＩＶに対する免疫応答が増強され得る。他の慢性感染、例えば慢性ウイルス、細菌または寄生虫感染も、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ブロッキング剤の使用から利益を得ることができる。
本発明の態様は、ＰＤ－１に対して特異的な単離されたモノクローナル抗体を提供する。細胞、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関して、本明細書中で使用される場合、「単離された」という用語は、高分子の天然源中に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地、または化学的に合成される場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指すことができる。例えば、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、天然状態では見出されないであろう核酸断片を含み得る。「単離された」はまた、他の細胞タンパク質または組織から単離された細胞またはポリペプチドを指すこともある。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を含み得る。単離された抗体は、ＰＤ－１をライブラリ選択標的として使用することにより、常磁性プロテオリポソームを介した２７０億のヒト単鎖抗体（ｓｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリーの使用によって同定された。これらの抗体は、ＰＤ－Ｌ１、ペムブロリズマブおよびニボルマブ結合と競合し得るＰＤ－１に対する新規クラスのモノクローナル抗体を表す。さらに、本明細書で論じられるモノクローナルＰＤ－１抗体は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＰＤ－１タンパク質と交差反応する。本明細書で論じられるモノクローナルＰＤ－１抗体はまた、多重特異性抗体の構築において、またはＣＡＲ－Ｔ細胞のためのペイロードとして使用することもできる。
１０種の固有の組換えモノクローナルＰＤ－１抗体が本明細書に記載されている。これらには、Ｐ４－Ｂ３、Ｐ４－Ｂ７、ＰＤ１＃２、ＰＤ１＃３、ＰＤ１＃１３、Ｐ４－Ｂ３－ＨＬｋｉｎ１、Ｐ４－Ｂ３－ＨＬ－７、Ｐ４－Ｂ３－ＨＬ－１４、Ｐ４－Ｂ３ ＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ｍｕｔ２、およびＰ４－Ｂ３ ＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ＨＬ－１４ ｍｕｔ３が含まれる。ポリペプチド（抗体など）またはポリヌクレオチドに関する用語「組換え」は、天然に存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を指し、その非限定的な例は、通常は一緒に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることによって作製することができる。
本明細書で提供されるＶＨおよびＶＬ配列との組み合わせにおいて有用な例示的な野生型ＩｇＧ定常領域（表２を参照のこと）に加えて、モノクローナルＰＤ－１抗体の核酸およびアミノ酸配列を以下に提供する。
Figure 2022536370000002
（表１Ａ）Ａｂ Ｐ４－Ｂ３可変領域核酸配列
Figure 2022536370000003
（表１Ｂ）Ａｂ Ｐ４－Ｂ３可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000004
（表２Ａ）Ａｂ Ｐ４－Ｂ３定常領域核酸配列－野生型ＩｇＧモノマー
Figure 2022536370000005
（表２Ｂ）Ａｂ Ｐ４－Ｂ３定常領域アミノ酸配列－野生型ＩｇＧモノマー
Figure 2022536370000006
（表３Ａ）Ａｂ Ｐ４－Ｂ７可変領域核酸配列
Figure 2022536370000007
（表３Ｂ）Ａｂ Ｐ４－Ｂ７可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000008
（表４Ａ）ＰＤ１＃２可変領域核酸配列
Figure 2022536370000009
（表４Ｂ）Ａｂ ＰＤ１＃２可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000010
（表５Ａ）ＰＤ１＃３可変領域核酸配列
Figure 2022536370000011
（表５Ｂ）Ａｂ ＰＤ１＃３可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000012
（表６Ａ）Ａｂ ＰＤ１＃１３可変領域核酸配列
Figure 2022536370000013
（表６Ｂ）Ａｂ ＰＤ１＃１３可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000014
Figure 2022536370000015
（表７Ａ）Ａｂ Ｐ４－Ｂ３－ＨＬｋｉｎ１可変領域核酸配列
Figure 2022536370000016
（表７Ｂ）Ａｂ ＨＬＫｉｎ１可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000017
（表８Ａ）Ａｂ Ｐ４－Ｂ３－ＨＬ－７可変領域核酸配列
Figure 2022536370000018
（表８Ｂ）Ａｂ ＨＬ－７可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000019
（表９Ａ）Ａｂ Ｐ４－Ｂ３－ＨＬ－１４可変領域核酸配列
Figure 2022536370000020
（表９Ｂ）Ａｂ ＨＬ－１４可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000021
（表１０Ａ）Ａｂ ＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ｍｕｔ２可変領域核酸配列
Figure 2022536370000022
（表１０Ｂ）Ａｂ ＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ｍｕｔ２可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000023
（表１１Ａ）Ａｂ ＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ＨＬ－１４ ｍｕｔ３可変領域核酸配列
Figure 2022536370000024
（表１１Ｂ）Ａｂ ＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ＨＬ－１４ ｍｕｔ３可変領域アミノ酸配列
Figure 2022536370000025
ＰＤ－１抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列を以下の表１２Ａ～Ｂに示す。
（表１２Ａ）ＰＤ－１抗体の重鎖（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）
Figure 2022536370000026
（表１２Ｂ）ＰＤ－１抗体の軽鎖（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）
Figure 2022536370000027
ＰＤ－１抗体の重鎖および軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、以下の表１３Ａ～Ｂに示す。
（表１３Ａ）ＰＤ－１抗体の重鎖（ＶＨ）フレームワーク領域（ＦＲ）
Figure 2022536370000028
（表１３Ｂ）ＰＤ－１抗体の軽鎖（ＶＬ）フレームワーク領域（ＦＲ）
Figure 2022536370000029
本明細書に記載のＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１に結合する。１つの実施形態では、ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１に対して高い親和性および高い特異性を有する。いくつかの実施形態はまた、本明細書に記載の抗ＰＤ－１抗体のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して特定のパーセンテージの同一性または類似性を有する抗体を特徴とする。例えば、「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致する位置または相同な位置の数の関数である。例えば、抗体は、本明細書に記載の抗ＰＤ－１抗体のいずれか１つの特定の領域または全長と比較した場合に、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。例えば、抗体は、本明細書に記載される抗ＰＤ－１抗体のいずれか１つの特定の領域または全長と比較した場合、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の核酸同一性を有し得る。本発明の核酸およびタンパク質に対する配列同一性または類似性は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているような、当該技術分野で既知のソフトウェアプログラムを使用する、当該技術分野で既知の方法による配列比較および／またはアラインメントによって決定することができる。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２．０）、手動アラインメントまたは目視検査を利用して、本発明の核酸およびタンパク質についてのパーセント配列同一性または類似性を決定し得る。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することができ、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に結合されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、本明細書では「ポリペプチド」を指すことができ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用することができる。「ポリペプチド」はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことができる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術によって産生され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。これは、化学合成を含む任意の様式で生成され得る。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を改変、付加、欠失または置換する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、本明細書中で集合的に「保存的に改変された変異体」と呼ばれることを容易に認識している。いくつかの実施形態では、改変は、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。本明細書に開示される抗ＰＤ－１抗体のそのような保存的に修飾された変異体は、未修飾ＰＤ－１抗体と比較して、ＰＤ－１に対して増大した交差反応性を示し得る。
例えば、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。別の実施形態では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似したストリングで置き換えることができる。
抗体
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指すことができる。抗体は、抗体全体および任意の抗原結合断片またはその単鎖であり得る。例えば、「抗体」は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含み得る。非限定的な例としては、重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域もしくはその任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも１つの部分が挙げられる。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指すことができる。「特異的に結合する」または「免疫反応する」とは、抗体が所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドとは反応しない抗体を意味する。
本明細書中で使用される場合、「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、インタクトな抗体によって認識される同じ抗原と結合する。用語「抗体断片」としては、アプタマー（例えば、スピーゲル）、ミニボディ、およびダイアボディが挙げられる。用語「抗体断片」はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質を含み得る。本明細書に記載の抗体、抗原結合ポリペプチド、変異体、または誘導体としては、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、ミニボディ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリ、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体によって産生される断片が挙げられるが、これらに限定されない。
「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチド分子は、共有結合したＶＨ：ＶＬヘテロダイマーであり、ペプチドをコード化するリンカーによって結合された、ＶＨをコード化する遺伝子およびＶＬをコード化する遺伝子を含む遺伝子融合体から発現できる。（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８５（１６）：５８７９－５８８３を参照のこと）。いくつかの態様では、領域は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで結合されている。リンカーは、柔軟性のためにグリシン、ならびに溶解性のためにセリンまたはスレオニンが豊富であってよく、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と連結するか、またはその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。自然に凝集しているが化学的に分離された、軽鎖および重鎖ポリペプチド鎖を、抗体Ｖ領域から、抗原結合部位の構造と実質的に同様の三次元構造に折り畳まれるｓｃＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するための多くの方法が記載されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；第５，８９２，０１９号；第５，１３２，４０５号；および第４，９４６，７７８号を参照されたく、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。
多くの標的分子に対する再構成された抗体遺伝子の大きな供給源を提供するために、非常に大きなナイーブヒトｓｃＦｖライブラリが作製されておりかつ作製され得る。疾患特異的抗体を単離するために、感染性疾患を有する個体からより小さなライブラリを構築することができる。（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３３９－４３（１９９２）；Ｚｅｂｅｄｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３ １７５－７９（１９９２）を参照のこと）。
ヒトから得られる抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質が互いに異なる、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤの５クラスのいずれかに関連する。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの中にいくつかのサブクラス（例えば、γ１～γ４）があることを理解するであろう。特定のクラスは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などのサブクラスも有する。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは、十分に特徴付けられており、機能的特殊化を付与することが知られている。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は、典型的には、「Ｙ」構成でジスルフィド結合によって結合され、軽鎖は、「Ｙ」の口から始まり、可変領域を通って続く重鎖を囲む。本明細書に記載の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
軽鎖はカッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合され得る。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、２つの重鎖の「テール」部分は、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合している。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ構成フォーク状端部におけるＮ末端から各鎖の底部におけるＣ末端に及ぶ。
軽鎖と重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインは、抗原認識および特異性を決定する。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指すことができる。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間、およびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指すことができる。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間で互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ＣＤＲを含むＶＨおよびＶＬ領域、ならびにＰＤ－１抗体のフレームワーク（ＦＲ）を表１Ａ～表１５Ｂに示す。
各抗原結合ドメイン中に存在する６つのＣＤＲは、抗体が水性環境中でその三次元構成をとるため、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されたアミノ酸の短い非隣接配列である。抗原結合ドメイン中の残りのアミノ酸であるＦＲ領域は、分子間変動が少ないことを示している。フレームワーク領域は主にβシート構造をとり、ＣＤＲはループを形成してβシート構造に結合し、場合によってはその一部を形成する。フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的相互作用によってＣＤＲを正しい向きに配置する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を提供し、同族のエピトープへの抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、それぞれ、それらが以前に定義されているので、当業者によって重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定され得る（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１～９１７（１９８７）を参照のこと）。
当該技術分野において使用および／または受け入れられている用語の定義が２つ以上ある場合、本明細書で使用される用語の定義は、そうではないと明示的に述べられていない限り、全てのそのような意味を含むことが意図される。具体的な例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７年）によって記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ定義には、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書において定義および使用される用語の範囲内であることが意図される。上記の引用文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表に記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
Figure 2022536370000030
Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定義した。当業者は、配列自体以外のいかなる実験データにも依存することなく、任意の可変ドメイン配列にこの「Ｋａｂａｔナンバリング」システムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示されるナンバリングシステムを指す。
上記の表に加えて、Ｋａｂａｔ番号システムは、以下のようにＣＤＲ領域を記載する：ＣＤＲ－Ｈ１は、約アミノ酸３１（すなわち、最初のシステイン残基のおよそ９残基後）で始まり、およそ５～７個のアミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｈ２は、ＣＤＲ－Ｈ１の末端後の１５番目の残基で始まり、約１６～１９個のアミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリジン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｈ３は、ＣＤＲ－Ｈ２の末端後の約３３番目のアミノ酸残基で始まり、３～２５個のアミノ酸を含み、配列Ｗ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終わる（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）。ＣＤＲ－Ｌ１は、約２４番目の残基（すなわち、システイン残基に続く）で始まり、約１０～１７個の残基を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｌ２は、ＣＤＲ－Ｌ１の末端後の約１６番目の残基で始まり、約７個の残基を含む。ＣＤＲ－Ｌ３は、ＣＤＲ－Ｌ２の末端後の約３３番目の残基（すなわち、システイン残基に続く）で始まり、約７～１１個の残基を含み、配列ＦまたはＷ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終わる（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、またはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含むことができる。可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができる。例えば、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端ペプチドに対して産生され得る。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖の各々上の３つのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）によって定義される。１つの実施形態では、抗体は、配列番号ＸＸのアミノ酸配列を含むＰＤ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５００９；長さが２８８アミノ酸残基を有する）に向けられ得る。
Figure 2022536370000031
本明細書で使用される場合、「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプの非共有結合相互作用を指すことができる。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の平衡結合定数（ＫＤ）に関して表すことができ、ＫＤが小さいほど親和性が大きいことを表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を使用して定量化することができる。かかる方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを必要とし、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る。（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６－８７（１９９３）を参照のこと）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメーターの相殺を可能にし、平衡結合定数ＫＤに等しい。（一般に、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９－４７３を参照のこと）。本発明の抗体は、平衡結合定数（ＫＤ）が≦１μＭ、≦１０μＭ、≦１０ｎＭ、≦１０ｐＭ、または≦１００ｐＭ～約１ｐＭである場合に、ＰＤ－１エピトープに特異的に結合することができ、これは、放射性リガンド結合アッセイなどの動的アッセイ、またはＢＩＡｃｏｒｅもしくはＯｃｔｅｔ（ＢＬＩ）などの当業者に公知の同様のアッセイによって測定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－１２Ｍ～約１Ｅ－１１ＭのＫＤである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－１１Ｍ～約１Ｅ－１０ＭのＫＤである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－１０Ｍ～約１Ｅ－９ＭのＫＤである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－９Ｍ～約１Ｅ－８ＭのＫＤである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－８Ｍ～約１Ｅ－７ＭのＫＤである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－７Ｍ～約１Ｅ－６ＭのＫＤである。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－１２Ｍであるが、他の実施形態ではＫＤは約１Ｅ－１１Ｍである。いくつかの実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－１０Ｍであるが、他の実施形態ではＫＤは約１Ｅ－９Ｍである。いくつかの実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－８Ｍであるが、他の実施形態ではＫＤは約１Ｅ－７Ｍである。いくつかの実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－６Ｍであるが、他の実施形態ではＫＤは約１Ｅ－５Ｍである。いくつかの実施形態では、例えばＫＤは約３Ｅ－１１Ｍであるが、他の実施形態ではＫＤは約３Ｅ－１２Ｍである。いくつかの実施形態では、ＫＤは約６Ｅ－１１Ｍである。「特異的に結合する」または「特異性を有する」は、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、その結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のある程度の相補性を伴う抗体を指すことができる。例えば、抗体は、その抗原結合ドメインを介して、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易にそのエピトープに結合する場合、「特異的に結合する」と言われる。
例えば、ＰＤ－１抗体は一価または二価であってよく、単鎖または二本鎖を含む。機能的には、ＰＤ－１抗体の結合親和性は、１０－５Ｍ～１０－１２Ｍの範囲内である。例えば、ＰＤ－１抗体の結合親和性は、１０－６Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－５Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－６Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－１０Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－５Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－６Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－５Ｍ～１０－９Ｍ、１０－６Ｍ～１０－９Ｍ、１０－７Ｍ～１０－９Ｍ、１０－８Ｍ～１０－９Ｍ、１０－５Ｍ～１０－８Ｍ、１０－６Ｍ～１０－８Ｍ、１０－７Ｍ～１０－８Ｍ、１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、１０－６Ｍ～１０－７Ｍ、１０－５Ｍ～１０－６Ｍである。
本発明のＰＤ－１タンパク質またはその誘導体、断片、類似体、相同体またはオーソログは、これらのタンパク質成分、例えば配列番号Ｘを含むアミノ酸残基に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫原として利用することができる。プロテオリポソームに結合されたＰＤ－１タンパク質またはその誘導体、断片、類似体、相同体またはオーソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的にカップリングする抗体の生成において免疫原として利用することができる。
当業者は、過度の実験なしに、ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、前者が後者のＰＤ－１への結合を妨げるかどうかを確認することによって決定することが可能であることを認識するであろう。例えば、本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、試験されるヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場合、２つのモノクローナル抗体は、同じエピトープまたは密接に関連するエピトープに結合する可能性が高い。
ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するための別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を、それが通常反応性であるＰＤ－１タンパク質とプレインキュベートし、次いで試験されるヒトモノクローナル抗体を付加して、試験されるヒトモノクローナル抗体がＰＤ－１に結合するその能力において阻害されるかどうかを決定することである。試験されるヒトモノクローナル抗体が阻害される場合、おそらく、それは、本発明のモノクローナル抗体と同じ、または機能的に同等のエピトープ特異性を有する。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングはまた、ＰＤ－１を利用し、試験モノクローナル抗体がＰＤ－１を中和することができるかどうかを決定することによって実施することができる。
当該技術分野で既知の様々な手順を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、断片、類似体、相同体若しくはオーソログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生に使用することができる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ Ｅ，ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。
抗体は、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の技術によって精製することができる。続いて、または代わりに、求められる免疫グロブリンの標的である特異的抗原またはそのエピトープをカラム上に固定化して、免疫親和性クロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製することができる。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８（Ａｐｒｉｌ１７，２０００），ｐｐ．２５－２８）によって論じられている。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」または「Ｍａｂ」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、固有の軽鎖遺伝子産物および固有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子の集団を指すことができる。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、母集団の全ての分子で同一である。ＭＡｂは、それに対する独特の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって記載されているようなハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を通常、免疫剤で免疫して、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化され得る。
免疫剤は、タンパク質抗原、その断片またはその融合タンパク質を含むことができる。例えば、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血リンパ球を使用することができ、またはヒト以外の哺乳動物源が所望される場合、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用することができる。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９－１０３を参照されたい）。不死化細胞株は、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞であり得る。例えば、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
有用な不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるものである。例えば、不死化細胞株は、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手され得るマウス骨髄腫株であってもよい。ヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている。（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１－６３を参照のこと）。
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。例えば、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。さらに、モノクローナル抗体の治療的用途において、標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる。（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９－１０３を参照のこと）。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腹水としてインビボで増殖され得る。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地または腹水から単離または精製することができる。
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、次いで、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２－１３（１９９４）を参照のこと）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに対して置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換されて、キメラ二価抗体を作製し得る。
完全ヒト抗体は、例えば、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子である。かかる抗体は、「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。「ヒト化抗体」は、軽鎖および重鎖タンパク質配列が、ヒトにおいて産生される抗体変異体との類似性を増加させるように改変されている非ヒト種由来の抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を改変する（例えば、改善する）ために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野において周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５５８５０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと）。例えば、抗体の非ヒト部分（軽鎖、軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ）は、標的抗原に結合され得る。ヒト化モノクローナル抗体は、本明細書では「ヒトモノクローナル抗体」と呼ばれることもある。
抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ ２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたはリサーフェシング（ＥＰ５９２，１０６号；ＥＰ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２８（４／５）：４８９－４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７（６）：８０５－８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９６９－９７３（１９９４））、および鎖シャッフリング（参照によりその全体が組み込まれる米国特許第５，５６５，３３２号）などの、当該技術分野で既知の種々の技術を用いてヒト化することができる。「ヒト化」（リシェイプまたはＣＤＲ移植とも呼ばれる）は、異種源（一般にげっ歯類）由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を低下させ、ヒト免疫系の活性化を改善するために、当業者によって理解される十分に確立された技術である（例えば、Ｈｏｕ Ｓ，Ｌｉ Ｂ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｑｉａｎ Ｗ，Ｚｈａｎｇ Ｄ，Ｈｏｎｇ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｇｕｏ Ｙ（２００８年７月）．「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ３４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ」．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４４（１）：１１５－２０）を参照のこと）。
ヒトモノクローナル抗体（例えば、完全ヒト抗体およびヒト化抗体）は、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ ａｌ，１９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ４：７２を参照のこと）；およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ，１９８５「ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ」，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６を参照のこと）を使用することによって調製することができる。ヒトモノクローナル抗体を用いることができ、ヒトハイブリドーマを使用するか（Ｃｏｔｅ，ｅｔ ａｌ，１９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８０：２０２６－２０３０を参照のこと）またはインビトロでエプスタインバーウイルスでヒトＢ細胞を形質転換すること（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８５ 「ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ」，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６を参照のこと）によって産生することができる。
さらに、抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む他の技術を使用して産生することもできる。（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１（１９９１）を参照のこと）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。攻撃の際に、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子再構成、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む全ての点でヒトにおいて見られるものと非常に類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，７７９－７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８，８５６－８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２－１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４，８４５－５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５－９３（１９９５）に記載されている。
ヒト抗体はさらに、抗原による攻撃に応答して動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して産生することができる。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２号および米国特許第６，６７３，９８６号を参照のこと）。非ヒト宿主中の重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は無力化されており、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性遺伝子座が宿主のゲノムに挿入されている。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトＤＮＡ断片を含む酵母人工染色体を使用して組み込まれる。次いで、全ての所望の改変を提供する動物は、改変の完全な相補体よりも少ない相補体を含む中間トランスジェニック動物を交配することによって子孫として得られる。そのような非ヒト動物の非限定的な例はマウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５号およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）と呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体の調製物として、目的の免疫原での免疫化後に動物から直接的に得られ得るか、あるいは、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのような動物由来の不死化Ｂ細胞から得られ得る。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現させて、抗体を直接得ることができ、またはさらに改変して、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子などの抗体の類似体を得ることができる。したがって、そのような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することができる。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７３：６５－９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、およびそのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれているＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３号、ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと。さらに、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）などの企業は、上記と同様の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く、マウスとして例示される非ヒト宿主を産生する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。これは、胚性幹細胞中の少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失させて、遺伝子座の再構成を防止し、再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止すること（この欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的指向ベクターによってもたらされる）；ならびにその体細胞および生殖細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から産生すること、を含む方法によって得られ得る。
ヒト抗体などの目的の抗体を産生するための１つの方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示されている。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入すること、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入すること、および２つの細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成することを含む。ハイブリッド細胞は、重鎖と軽鎖を含む抗体を発現する。
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定するための方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択するための相関的方法が、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９号に開示されている。
目的の抗体は、上記の単鎖抗体をコードするＤＮＡ断片を含むベクターによっても発現させることができる。ベクターとしては、標的指向部分（例えば、細胞表面レセプターに対するリガンド）および核酸結合部分（例えば、ポリリシン）を有するＷＯ９３／６４７０１号に記載されるような化学的結合体、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含む融合タンパク質であるＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０号（ＷＯ９５／２２６１８号）に記載されるような融合タンパク質、プラスミド、ファージ、ウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは染色体性、非染色体性、または合成であってもよい。レトロウイルスベクターも使用されてよく、モロニーマウス白血病ウイルスが含まれる。ＤＮＡウイルスベクターも使用されてよく、オルソポックスまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクターが含まれる（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ，「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８７：１１４９（１９９０），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ（ｓｅｅ ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）ａｎｄ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ（ｓｅｅ Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照のこと）。
ポックスウイルスベクターは遺伝子を細胞質に導入する。アビポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、核酸を神経細胞に導入するために使用することができる。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約４ヶ月）よりも短期間（約２ヶ月）の発現をもたらし、アデノ随伴ウイルスはＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは、標的細胞および治療される状態に依存する。導入は、標準的な技術（例えば、感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換）によるものであり得る。遺伝子導入の様式の例としては、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰ０４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターが挙げられる。
ベクターを使用して、本質的に任意の所望の標的細胞を標的とすることができる。例えば、定位注入を使用して、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に方向付けることができる。さらに、粒子は、ミニポンプ注入システム（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して脳室内（ｉｃｖ）注入によって送達され得る。対流と呼ばれるバルクフローに基づく方法もまた、大きな分子を脳の広範な領域に送達するのに有効であることが証明されており、ベクターを標的細胞に送達するのに有用であり得る。（Ｂｏｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２０７６－２０８０（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２－３０５（１９９４）を参照のこと）。使用され得る他の方法としては、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、ならびに経口または他の公知の投与経路が挙げられる。
これらのベクターを使用して、様々な方法で使用することができる大量の抗体を発現させることができる。例えば、サンプル中のＰＤ－１の存在を検出するためである。抗体はまた、ＰＤ－１活性に結合し、破壊することを試みるために使用することができる。
本発明の抗原発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために技術を適合させ得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。加えて、方法は、タンパク質またはその誘導体、断片、類似体もしくは相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ効果的な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリの構築に方法を適合させ得る（例えば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ ａｌ，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５～１２８１を参照のこと）。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体断片は、（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成されるＦａｂ断片；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤による抗体分子の処理によって生成されるＦａｂ断片、ならびに（ｉｖ）Ｆｖ断片を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の技術によって産生することができる。
ヘテロ結合体抗体も本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合した抗体で構成されている。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を、望ましくない細胞へと標的指向させることができ（米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと）、ＨＩＶ感染の治療のためのものであり得る（ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／００３６０号；同第ＷＯ９２／２０３７３号を参照のこと）。抗体は、架橋剤を含むものを含む合成タンパク質化学における既知の方法を使用してインビトロで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的のための好適な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル－４－メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが挙げられる。
本発明の抗体は、例えば、癌の治療における抗体の有効性を高めるように、エフェクター機能に関して改変することができる。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成が可能になる。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力および／または増加した補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。（Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１７６：１１９１－１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８－２９２２（１９９２）を参照のこと）。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それによって増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を操作することができる。（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９－２３０（１９８９）を参照のこと）。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の抗原非依存性エフェクター機能、特に抗体の循環半減期を改変するアミノ酸置換を含むＦｃ変異体を含むことができる。そのような抗体は、これらの置換を欠く抗体と比較した場合、ＦｃＲｎへの結合の増加または減少を示し、したがって、血清中の半減期がそれぞれ増加または減少する。ＦｃＲｎに対する親和性が改善されたＦｃ変異体は、より長い血清半減期を有すると予想され、そのような分子は、例えば、慢性疾患または障害を治療するために、投与された抗体の長い半減期が望まれる哺乳動物を治療する方法において有用な用途を有する。それとは対照的に、減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃ変異体は、より短い休止期間を有することが予想され、そのような分子はまた、例えば、短縮された循環時間が有利であり得る哺乳動物への投与のために、例えば、インビボ画像診断において、または出発抗体が、長期間にわたって循環中に存在する場合に毒性副作用を有する状況において有用であり得る。減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃ変異体はまた、胎盤を通過する可能性が低いため、妊婦における疾患または障害の治療においても有用である。さらに、減少したＦｃＲｎ結合親和性が所望され得る他の用途としては、脳、腎臓、および／または肝臓への局在化が所望される用途が挙げられる。１つの実施形態では、Ｆｃ変異体含有抗体は、血管系から腎糸球体の上皮を通過する輸送の減少を示し得る。別の実施形態では、Ｆｃ変異体含有抗体は、脳から血管腔への血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送の減少を示し得る。１つの実施形態では、改変されたＦｃＲｎ結合を有する抗体は、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合ループは、アミノ酸残基２８０～２９９（ＥＵナンバリングによる）から構成される。ＦｃＲｎ結合活性が改変された例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ０５／０４７３２７号に開示されている。特定の例示的な実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、以下の置換：Ｖ２８４Ｅ、Ｈ２８５Ｅ、Ｎ２８６Ｄ、Ｋ２９０ＥおよびＳ３０４Ｄ（ＥＵナンバリング）のうちの１つ以上を有するＦｃドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＡｂの抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が改変されるように、ｍＡｂの定常領域に変異が導入される。例えば、変異は、ＣＨ２ドメイン内のＬＡＬＡ変異である。１つの実施形態では、抗体（例えば、ヒトｍＡｂまたは二重特異性Ａｂ）は、ＡＤＣＣ活性を低下させるヘテロ二量体ｍＡｂの１つのｓｃＦｖ単位上に変異を含む。別の実施形態では、ｍＡｂは、ＡＤＣＣ活性を完全に除去するヘテロ二量体ｍＡｂの両方の鎖上に変異を含む。例えば、ｍＡｂの一方または両方のｓｃＦｖ単位に導入される変異は、ＣＨ２ドメイン内のＬＡＬＡ変異である。可変ＡＤＣＣ活性を有するこれらのｍＡｂは、ｍＡｂが、ｍＡｂによって認識される１つの抗原を発現する細胞に対して最大の選択的殺傷を示すが、ｍＡｂによって認識される第２の抗原に対して最小の殺傷を示すように最適化することができる。
他の実施形態では、本明細書に記載される診断方法および治療方法において使用するための本発明の抗体は、グリコシル化を低減または排除するように改変することができる定常領域、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。例えば、本発明の抗体はまた、抗体のグリコシル化を改変させるアミノ酸置換を含むＦｃ変異体を含み得る。例えば、Ｆｃ変異体は、低減されたグリコシル化（例えば、ＮまたはＯ結合型グリコシル化）を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ変異体は、アミノ酸位置２９７（ＥＵナンバリング）に通常見出されるＮ結合型グリカンのグリコシル化の低減を含む。別の実施形態では、抗体は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含むＮ結合型グリコシル化モチーフの近傍またはその中にアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、抗体は、アミノ酸位置２２８または２９９（ＥＵナンバリング）にアミノ酸置換を有するＦｃ変異体を含む。より特定の実施形態では、抗体は、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａ変異（ＥＵナンバリング）を含むＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含む。
低減されたまたは改変されたグリコシル化を付与する例示的なアミノ酸置換は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ０５／０１８５７２号に記載されている。いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、グリコシル化を排除するように改変される。そのような抗体またはその断片は、「ａｇｌｙ」抗体またはその断片（例えば、「ａｇｌｙ」抗体）と呼ばれ得る。理論に束縛されることを望むものではないが、「ａｇｌｙ」抗体またはその断片は、インビボで改善された安全性および安定性プロファイルを有することができる。例示的なａｇｌｙ抗体またはその断片は、Ｆｃ－エフェクター機能を欠いているＩｇＧ４抗体の非グリコシル化Ｆｃ領域を含むため、ＰＤ－１を発現する正常な重要組織および細胞に対するＦｃ媒介性毒性の可能性を排除する。さらに他の実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、改変されたグリカンを含む。例えば、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７においてＮ－グリカン上のフコース残基の数が低減され、すなわち、脱フコシル化される。別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７においてＮ－グリカン上に改変された数のシアル酸残基を有し得る。
本発明はまた、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体）などの細胞毒性薬剤に結合された抗体を含むイムノ結合体を対象とする。
使用することができる酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。様々な放射性核種が、放射性結合体化抗体の産生のために利用可能である。非限定的な例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
抗体および細胞毒性薬剤の結合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベリン酸など）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トリメチレン２，６－ジイソシアナートなど）、およびビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための例示的なキレート剤である。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１１０２６号および米国特許第５，７３６，１３７号を参照のこと）。
当業者は、多種多様な可能な部分を、得られた抗体または本発明の他の分子に結合させることができることを理解している。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（ｅｄｓ），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照のこと。
カップリングは、抗体および他の部分がそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合する任意の化学反応によって達成することができる。この結合には、多くの化学的機構、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、および複合体形成が含まれる。１つの実施形態では、結合は共有結合である。共有結合は、存在する側鎖の直接縮合または外部架橋分子の組み込みのいずれかによって達成することができる。多くの二価または多価連結剤が、タンパク質分子（例えば、本発明の抗体）を他の分子にカップリングする際に有用である。例えば、代表的なカップリング剤としては、有機化合物（例えば、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミン）が挙げられる。このリストは、当該技術分野で既知の様々なクラスのカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の例示である。（Ｋｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５－２５４９（１９８４）；Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２：１８５－２１６（１９８２）；およびＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）を参照のこと）。リンカーの非限定的な例は、文献に記載されている。（例えば、例えば、ＭＢＳ（Ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載するＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４：２０１－２０８（１９８４）を参照のこと）。オリゴペプチドリンカーを介して抗体にカップリングされたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号も参照のこと。本発明の抗体とともに使用され得る有用なリンカーの非限定的な例としては、以下が挙げられる：（ｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノ－プロピル）カルボジイミドヒドロクロリド；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジル－ジチオ）－トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル－６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１６５－Ｇ）；および（ｖ）ＥＤＣに結合されたスルホ－ＮＨＳ（－ヒドロキシスルホ－スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２４５１０）が挙げられる。
本明細書に記載されるリンカーは、異なる属性を有する成分を含有し、従って、異なる物理化学的特性を有する結合体をもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳ－エステル含有リンカーは、スルホ－ＮＨＳエステルよりも可溶性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体障害ジスルフィド結合を含み、安定性が増加した結合体を形成することができる。ジスルフィド結合は、一般に、ジスルフィド結合がインビトロで切断され、利用可能な結合体が少なくなるため、他の結合よりも安定性が低い。特にスルホ－ＮＨＳは、カルボジイミドカップリングの安定性を高めることができる。カルボジイミドカップリング（ＥＤＣなど）は、スルホ－ＮＨＳと共に使用される場合、カルボジイミドカップリング反応のみよりも加水分解に対してより耐性であるエステルを形成する。
本明細書に開示される抗体は、免疫リポソームとして製剤化することもできる。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されているようなに記載されているような、当該技術分野で既知の方法によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
有用なリポソームの非限定的な例は、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、規定された孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを生成する。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６－２８８（１９８２）に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合することができる。
二重特異性抗体
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、２つの可変ドメインまたはｓｃＦｖユニットを含む抗体であり、結果として得られる抗体は２つの異なる抗原を認識する。本発明は、ＰＤ－１および第２の抗原を認識する二重特異性抗体を提供する。例示的な第２の抗原としては、腫瘍関連抗原（例えば、ＬＩＮＧＯ１）、サイトカイン、および細胞表面受容体が挙げられる。第２の抗原の非限定的な例としては、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４－１ＢＢ、ＴＩＭ３、ＯＸ－４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＥＶＭ（またはＢＴＬＡ）、ＣＤ４７、およびＣＤ７３が挙げられる。異なる型の二重特異性抗体も本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ１断片および第２の断片のそれぞれは、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体からそれぞれ独立して選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃ断片をさらに含む。本発明の二重特異性抗体は、本明細書に開示されるＰＤ－１抗体の重鎖および軽鎖の組合せまたはｓｃＦｖを含む。
本発明の二重特異性抗体は、当該技術分野で既知の方法を使用して構築することができる。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖ断片が、２つのｓｃＦｖ単位間の分子内会合を可能にして抗体を形成するのに十分な長さの長いリンカーポリペプチドによって連結されている、単一のポリペプチドである。他の実施形態では、二重特異性抗体は、共有結合または非共有結合によって結合された２つ以上のポリペプチドである。
別の実施形態では、二重特異性抗体は、「ノブ・イントゥ・ホール」法（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ７：６１７－６２１（１９９６））を使用して構築される。この方法では、２つの異なる可変ドメインのＩｇ重鎖が還元されて、重鎖－軽鎖対合を保持しながら重鎖対合が選択的に破壊される。２つの異なる抗原を認識する２つの重鎖－軽鎖ヘテロ二量体が混合されて、ＣＨ３ドメインの操作された「ノブ・イントゥ・ホール」を介して媒介されるヘテロライゲーション対合が促進される。
別の実施形態では、二重特異性抗体は、２つ以上の異なる抗体から重鎖－軽鎖二量体を交換してハイブリッド抗体を生成することによって構築することができ、第１の重－軽鎖二量体はＰＤ－１を認識し、第２の重－軽鎖二量体は第２の抗原を認識する。重鎖－軽鎖二量体の機構は、二重特異性分子としても機能するヒトＩｇＧ４の形成と同様である。ＩｇＧ重鎖の二量体化は、各重鎖のＣＨ３ドメインとジスルフィド架橋との対合などの分子内力によって促進される。ＣＨ３ドメインにおける特定のアミノ酸（Ｒ４０９）の存在は、二量体交換およびＩｇＧ４分子の構築を促進することが示されている。重鎖対合はまた、抗体のヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド架橋によってさらに安定化される。具体的には、ＩｇＧ４において、ヒンジ領域は、（配列Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓを含む安定なＩｇＧ１ヒンジ領域と比較して）アミノ酸配列Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓをアミノ酸２２６～２３０に含む。２２９位のセリンのこの配列の差異は、ＩｇＧ４がヒンジ領域において鎖内ジスルフィドを形成する傾向に関連している（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７：１５５４－１５５７およびＬａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８７：３２３８－３２４６）。
したがって、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－１または第２の抗原を認識する抗体のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９残基およびヒンジ領域中のＣｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ配列の導入によって作製することができ、その結果、重－軽鎖二量体が交換されて、ＰＤ－１を認識する１つの重－軽鎖二量体および第２の抗原を認識する第２の重－軽鎖二量体を有する抗体分子を生成する（ここで、第２の抗原は本明細書に開示される任意の抗原である）。公知のＩｇＧ４分子はまた、本明細書中に開示されるように、重鎖および軽鎖がＰＤ－１または第２の抗原を認識するように改変され得る。本発明の二重特異性抗体を構築するためのこの方法の使用は、ＩｇＧ４分子の固有の特徴に起因して有益であってよく、ここで、Ｆｃ領域は、免疫応答のエフェクター系（例えば、特定の白血球によって発現される補体およびＦｃレセプター）とほとんど相互作用しない点で、他のＩｇＧサブタイプと異なる。この特異的特性により、これらのＩｇＧ４ベースの二重特異性抗体は、抗体が標的に結合し、標的に関連するシグナル伝達経路を機能的に改変させる必要があるが、エフェクター活性を誘発しない治療用途において魅力的なものとなる。
いくつかの実施形態では、ｂｓＡｂの抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が改変されるように、ｂｓＡｂの定常領域に変異が導入される。例えば、変異は、ＣＨ２ドメイン内のＬＡＬＡ変異である。１つの態様では、ｂｓＡｂは、ＡＤＣＣ活性を低下させるヘテロ二量体ｂｓＡｂの１つのｓｃＦｖ単位上に変異を含む。別の態様では、ｂｓＡｂは、ＡＤＣＣ活性を完全に除去するヘテロ二量体ｂｓＡｂの両方の鎖上に変異を含む。例えば、ｂｓＡｂの一方または両方のｓｃＦｖ単位に導入される変異は、ＣＨ２ドメイン内のＬＡＬＡ変異である。可変ＡＤＣＣ活性を有するこれらｂｓＡｂは、ｂｓＡｂが、ｂｓＡｂによって認識される１つの抗原を発現する細胞に対して最大の選択的殺傷を示すが、ｂｓＡｂによって認識される第２の抗原に対して最小の殺傷を示すように最適化することができる。
本明細書に開示される二重特異性抗体は、慢性感染症、疾患、または医学的状態、例えば癌の治療において有用であり得る。
ＰＤ－１に対する抗体の使用
ＰＤ－１タンパク質またはその断片に特異的に結合する本発明の抗体は、ＰＤ－１関連疾患または障害の治療のために投与することができる。「ＰＤ－１関連疾患または障害」は、ＰＤ－１のレベルの上昇および／またはＰＤ－１が関与する細胞シグナル伝達経路の活性化が見られる、病状および／または病状に関連する症状が含まれる。例示的なＰＤ－１関連疾患または障害には、癌および感染性疾患など、Ｔ細胞が抑制される疾患が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、感染性疾患は、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、または逆転写ウイルスなどの微生物によって引き起こされ得る。ウイルスの非限定的な例としては、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタインバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、感染性疾患は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、原生動物、または真菌などの微生物によって引き起こされ得る。
疾患を引き起こす菌の非限定的な例としては、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ Ｑｕｉｎｔａｎａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリア・リカレンチス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・サンタロサイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓａｎｔａｒｏｓａｉ）、レプトスピラ・ウェイリイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｗｅｉｌｉｉ）、レプトスピラ・ノグチ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｎｏｇｕｃｈｉｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が挙げられる。
疾患を引き起こす原生動物の非限定的な例としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）（マラリア）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）（トキソプラズマ症）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）の種（リーシュマニア症）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）（アフリカ睡眠病）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）（シャーガス病）、およびランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（ジアルジア症）が挙げられる。
疾患を引き起こす真菌の非限定的な例としては、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、スタキボトリス・チャータルム（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）が挙げられる。
二重特異性、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全ヒト抗体を含む本発明の抗体は、治療剤として使用することができる。このような薬剤は、一般に、対象の癌を治療するため、ワクチンの効率を高めるため、または自然免疫応答を増強するために使用される。抗体調製物（例えば、その標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するもの）は、対象に投与され、一般に、標的との結合に起因する効果を有する。抗体の投与によって、ＰＤ－１タンパク質の活性が無効になるか、阻害されるか、または妨害され得る。
ＰＤ－１タンパク質またはその断片に特異的に結合する本発明の抗体は、医薬組成物の形態で癌の治療のために投与することができる。抗体を含む治療用医薬組成物の調製に関連する原理および考慮事項、ならびに成分の選択に関するガイダンスは、例えば、以下に提供されている：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ）．Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０００；Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
任意の特定の患者に対する具体的な用量および治療レジメンは、使用される特定の抗体、その変異体または誘導体、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事、ならびに投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、および治療される特定の疾患の重症度などの、様々な要因に依存する。医療介護者によるそのような要因の判断は、当業者の範囲内である。この量はまた、治療される個々の患者、投与経路、製剤の型、使用される化合物の特徴、疾患の重篤度、および所望の効果に依存する。使用される量は、当該技術分野で周知の薬理学的および薬物動態学的原理によって決定することができる。
本発明の抗体の治療有効量は、治療目的を達成するために必要な量であり得る。本明細書に記載されるように、これは、抗体とその標的抗原との間の結合相互作用であってよく、これは、特定の場合において、標的の機能を妨害する。投与されるのに必要な量はさらに、その特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存し、投与された抗体が、それが投与される他の対象の自由体積から枯渇する速度にも依存する。本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドの対象（例えば、患者）に投与される投薬量は、典型的には、患者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、患者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、または患者の体重の１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答に起因して、他の種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期を有する。したがって、ヒト抗体のより低い投薬量およびより少ない頻度の投与がしばしば可能である。さらに、本開示の抗体の投与の投薬量および頻度は、例えば、脂質化などの改変によって抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳内への）を増強することによって低減され得る。本発明の抗体または抗体断片の治療有効用量の一般的な範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）～約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり得る。一般的な投与頻度は、例えば、１日２回～１週間に１回の範囲であり得る。
抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成することができ、および／または組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９－７８９３（１９９３）を参照のこと）。製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な１つを超える活性化合物、例えば、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有することができる。あるいは、またはさらに、組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞毒性薬剤、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）、化学療法剤または増殖阻害剤など）を含み得る。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルション中に封入され得る。
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
徐放性調製物が調製され得る。持続放出調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸およびγエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン－酢酸ビニルおよび乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日間にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。
本発明による抗体は、サンプル中のＰＤ－１（またはそのタンパク質断片）の存在を検出するための薬剤として使用することができる。例えば、抗体は、検出可能な標識を含有することができる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ）２）が使用され得る。プローブまたは抗体に関して、「標識された」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（すなわち、物理的に結合する）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含し得る。間接標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。「生物学的サンプル」という用語は、対象から単離された組織、細胞、および体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および体液を含み得る。したがって、用語「生物学的サンプル」の使用に含まれるのは、血液ならびに、血清、血漿またはリンパなどの血液の画分または成分である。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボで生物学的サンプル中の被検体ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出するために使用され得る。例えば、被検体ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。被検体タンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。被検体ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。
イムノアッセイを実施するための手順は、例えば、「ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌ．４２，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（Ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，Ｅ．ＤｉａｍａｎｄｉｓおよびＴ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６；および「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に記載されている。さらに、被検体タンパク質を検出するためのインビボ技術は、標識された抗被検体タンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的な画像化技術によって検出され得る放射性マーカーで標識され得る。
ＰＤ－１タンパク質（またはその断片）に対する抗体は、ＰＤ－１タンパク質の局在化および／または定量化に関する当該技術分野で既知の方法において使用することができる（例えば、適切な生理学的サンプル内のＰＤ－１タンパク質のレベルの測定における使用、診断方法における使用、タンパク質の画像化における使用など）。所与の実施形態では、抗体由来抗原結合ドメインを含む、ＰＤ－１タンパク質、またはその誘導体、断片、類似体もしくは相同体に特異的な抗体は、薬理学的に活性な化合物（本明細書では「治療剤」と称される）として利用される。
ＰＤ－１タンパク質に特異的な本発明の抗体を使用して、免疫親和性、クロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術によってＰＤ－１ポリペプチドを単離することができる。ＰＤ－１タンパク質（またはその断片）に対する抗体は、例えば、所与の治療レジメンの効力を決定するために、臨床試験手順の一部として、組織中のタンパク質レベルを監視するために診断的に使用することができる。
抗体を検出可能な物質にカップリング（すなわち、物理的に結合）することにより、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられるが、これらに限定されない。好適な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としてはルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、または３Ｈが挙げられる。
本発明の抗体または薬剤（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにその誘導体、断片、類似体および相同体は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、抗体または薬剤および薬学的に許容される担体を含むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことができる。好適な担体は、参照により本明細書に組み込まれる、当該技術分野において標準的な参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の非限定的な例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび不揮発性油などの非水性ビヒクルも使用することができる。薬学的な活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。いずれかの従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化することができる。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）、および張性を調節するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作製されたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与用バイアル中に封入され得る。
注射可能な使用に適した医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。実施形態では、組成物は無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度に流体である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であってよく、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤としては、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含めることが有用であり得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって達成することができる。
無菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。例えば、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上記で列挙されるものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用液剤の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分の粉末と、その前に無菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物としては、不活性希釈剤または可食性担体が挙げられる。それらはゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための流体担体を使用して調製され得、ここで、流体担体中の化合物は、経口的に適用され、口内で転がして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料などの香味剤。
吸入による投与において、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与について、浸透させる障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与について、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与について、活性化合物は、当該技術分野で一般に知られる軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
化合物はまた、坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを用いて）または直腸送達のための停留浣腸の形態で調製することができる。
１つの実施形態では、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のような、身体からの迅速な排除に対して化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者に明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
経口または非経口組成物は、投与を容易にし、投与量を均一にするために、投与単位形態で処方することができる。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の治療のためにそのような活性化合物を配合する技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
医薬組成物は、投与説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
治療法
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療」という用語は、治療的処置と予防的または防止的手段の両方を指し、その目的は、癌の進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益なまたは望ましい臨床結果としては、検出可能か検出不可能かに関わらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」とは、治療を受けない場合に予想される生存率と比較して、生存期間を延長することを指す。治療を必要とするものとしては、既に状態または障害を有するもの、ならびに状態もしくは障害を有する傾向があるもの、または状態もしくは障害が予防されるべきものが挙げられる。
本発明は、癌（例えば、早期検出癌バイオマーカーがそのような対象において同定される場合）または他の細胞増殖関連疾患もしくは障害のリスクがある（またはそれらに感受性である）対象を治療する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。そのような疾患または障害としては、例えば、ＰＤ－１の異常な発現に関連する疾患または障害が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、これらの方法は、癌の症状を治療、予防、または緩和するために使用される。１つの実施形態では、本方法は、固形腫瘍の症状を治療、予防、または緩和するために使用される。本明細書の実施形態によって治療することができる他の腫瘍の非限定的な例としては、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌または胃癌が挙げられる。さらに、本発明の方法は、白血病およびリンパ腫などの血液癌を治療するために使用することができる。あるいは、これらの方法を使用して、転移した癌の症状を治療、予防、または緩和することができる。例えば、治療もしくは予防できる、または症状を緩和できる癌としては、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非小細胞肺癌、黒色腫、卵巣癌、リンパ腫、または腎細胞癌が挙げられる。治療もしくは予防することもできる、または症状を緩和することができる癌には、変異負荷が高く濾液中のＷＢＣを有する固形腫瘍が挙げられる。治療もしくは予防できる、または症状を緩和することができる癌としては、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸におけるシグナルが調節されている癌、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌または肺腺癌）、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、食道扁平上皮癌、鼻咽頭癌、およびＰＤ１／ＰＤＬ１軸が活性である液性腫瘍（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ））が挙げられる（これらに限定されない）癌が挙げられる（例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｐａｔｈｗａｙ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ，Ａｍ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２０２０；１０（３）：７２７－７４２を参照のこと）。
したがって、１つの態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ抗体または二重特異性抗体を対象に投与することにより、対象の癌または細胞増殖性疾患または障害の症状を予防、治療または緩和するための方法を提供する。例えば、抗ＰＤ－１抗体は、治療有効量で投与することができる。
癌または細胞増殖関連の疾患または障害のリスクがある対象には、癌の家族歴がある患者、または既知または疑われる癌の原因物質に曝露された対象が含まれ得る。予防薬の投与は、疾患が予防されるか、あるいはその進行が遅延されるように、癌の発現前に行うことができる。
別の態様では、腫瘍細胞の増殖は、細胞を本発明の抗ＰＤ－１抗体と接触させることによって阻害される。細胞は、ＰＤ－１を発現する任意の細胞であり得る。
本発明はさらに、慢性または急性のウイルス、細菌または寄生虫感染のリスクがある（または感受性がある）対象を治療する予防的および治療的方法の両方を提供する。本発明はまた、Ｔ細胞疲弊に関連する疾患もしくは障害または状態のリスク、またはＴ細胞疲弊を発症するリスクのある対象を治療する予防的および治療的方法の両方のための治療方法を提供する。本発明はまた、Ｔ細胞疲弊に関連する疾患もしくは障害または状態のリスク、またはＴ細胞疲弊を発症するリスクのある対象を治療する予防的および治療的方法の両方のための治療方法を提供する。このような疾患または障害としては、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、および慢性または急性の細菌、ウイルス、または寄生虫感染が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、他のそのような慢性感染としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、またはトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）によって引き起こされるものが挙げられる。他の急性感染としては、例えば、本明細書に記載されるようなグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、原生動物、または真菌などの微生物によって引き起こされるものが挙げられる。
抗原に対する免疫応答を増加または増強する方法も本発明に含まれる。免疫応答は、本発明のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ抗体、または二重特異性抗体を対象に投与することによって増加または増強される。免疫応答は、例えば、抗原特異的Ｔエフェクター機能を増強することによって増強される。抗原は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、細菌、寄生虫または腫瘍抗原である。免疫応答は、自然免疫応答である。自然免疫応答とは、感染の結果である免疫応答を意味する。感染は、慢性感染である。抗原に対する免疫応答の増加または増強は、当該技術分野で既知の多くの方法によって測定され得る。例えば、免疫応答は、Ｔ細胞活性、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、エフェクターサイトカインの産生、およびＴ細胞転写プロファイルのいずれか１つを測定することによって測定され得る。あるいは、免疫応答は、ワクチン接種によって誘導される応答である。
したがって、別の態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはｓｃＦｖ抗体およびワクチンを対象に投与することによってワクチン効率を高める方法を提供する。抗体およびワクチンは、逐次的にまたは同時に投与される。ワクチンは腫瘍ワクチン、細菌ワクチンまたはウイルスワクチンである。
組み合わせ方法
本明細書に記載される本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与することができる。本開示の組成物と共に投与され得る化学療法剤としては、限定されるわけではないが、抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗薬（例えば、フルオロウラシル、５－ＦＵ、メトトレキセート、フロクスウリジン、インターフェロンα－２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および６－チオグアニン）；細胞毒性薬剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シス－プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール二リン酸、クロロトリアニセン、およびテストトラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン、クロラムブシル、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイドおよび組合せ（例えば、ベタメタソンリン酸ナトリウム）；およびその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げられる。
さらなる実施形態では、本明細書に記載される本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて投与することができる。組成物と共に投与することができるサイトカインとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ－αが挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態では、本明細書に記載の組成物は、例えば、放射線療法などの他の治療または予防レジメンと組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、他の免疫療法剤と組み合わせて投与することができる。免疫療法剤の非限定的な例としては、シムツズマブ（ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アルツモマブ（ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アマツキシマブ（ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アルシツモマブ（ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、バビツキシマブ（ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブ（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、カンツズマブ（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、シタツズマブ（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブ（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ドロジツマブ（ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュシジツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エロツズマブ（ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファルレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、イブリツモマブ（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イノツズマブ（ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ラベツズマブ（ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、レキサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、リンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブ（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、マパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ミラツズマブ（ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モキセツモマブ（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナプツモマブ（ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ピンツモマブ（ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、リロツムマブ（ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サツモマブ（ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、タカツズマブ（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、チガツズマブ（ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ツコツズマブ（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベルツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ボルセツズマブ（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ＣＣ４９、および３Ｆ８が挙げられる。
本発明は、ＰＤ－１タンパク質の同じエピトープ、あるいは、ＰＤ－１タンパク質の２つの異なるエピトープに結合する２つの抗体を投与することによって、患者の癌を治療する方法を提供する。あるいは、癌は、ＰＤ－１に結合する第１の抗体およびＰＤ－１以外のタンパク質に結合する第２の抗体を投与することによって治療することができる。他の実施形態では、癌は、ＰＤ－１に結合し、かつＰＤ－１以外のタンパク質に結合する二重特異性抗体を投与することによって治療することができる。例えば、ＰＤ－１以外の他のタンパク質としては、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－２１、またはＩＬ－２１Ｒが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＰＤ－１以外の他のタンパク質は、腫瘍関連抗原であり；ＰＤ－１以外の他のタンパク質は、サイトカインであってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＰＤ－１抗体を単独で、またはＰＤ－１以外の別のタンパク質を認識する追加の抗体と組み合わせて、免疫応答を達成または増強することができる細胞とともに投与することを提供する。例えば、これらの細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、またはＰＢＭＣ中に見出される任意の細胞型、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得る。
さらに、本発明は、ＰＤ－１タンパク質に結合する抗体および抗新生物剤、例えば、小分子、成長因子、サイトカインまたはペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、ポリヌクレオチド、脂質由来メディエーター、低分子生体アミン、ホルモン、神経ペプチドおよびプロテアーゼなどの生体分子を含む他の治療剤の投与を提供する。小分子としては、無機分子および有機小分子が挙げられるが、これらに限定されない。好適な成長因子またはサイトカインとしては、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＮＦ－αが挙げられる。小分子ライブラリは、当該技術分野で既知である。（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，１２：１４５，１９９７を参照のこと）。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法などの細胞療法もまた、本明細書で提供される。ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、例えば、Ｔ細胞上でのＣＡＲの外因性発現によって患者のＴ細胞を、腫瘍細胞を殺傷するように向け直す。ＣＡＲは、抗体の抗原認識ドメインをＴ細胞受容体および共受容体の細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、膜貫通型融合タンパク質であり得る。本発明の抗ＰＤ－１抗体を分泌することができる（あるいは、分泌されるように本明細書に記載されるように抗ＰＤ－１抗体を発現するように操作される）好適な細胞を使用することができる。分泌される抗ＰＤ－１「ペイロード」は、例えば、ミニボディ、ＳｃＦｖ、ＩｇＧ分子、二重特異性融合分子、および本明細書に記載される他の抗体断片であり得る。
固形腫瘍は、ＣＡＲ－Ｔ療法に特有の課題を提供する。固形腫瘍におけるＣＡＲ－Ｔ有効性に対するいくつかの障壁としては、不均質な抗原発現、不十分な組織ホーミング、活性化、持続性、および免疫抑制腫瘍微小環境が挙げられる。血液癌とは異なり、腫瘍関連標的タンパク質は腫瘍と健常組織との間で過剰発現され、健常組織のオンターゲット／オフ腫瘍Ｔ細胞殺傷をもたらす。さらに、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫抑制は、腫瘍の殺傷に向けてＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を制限する。そのような接触または操作により、次いで、細胞は、治療を必要とする癌患者に導入され得る。癌患者は、本明細書中に開示されるようなタイプのいずれかの癌を有し得る。細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えば、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
本発明の態様において有用な例示的なＣＡＲおよびＣＡＲファクトリーとしては、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６７２２５号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２２２７２号に開示されているものが挙げられ、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、レンチウイルス系（形質導入による）、レトロウイルス系（トランスフェクション（電気穿孔法）による）、およびトランスポゾン系（ＰｉｇｇｙＢａｃによる）を使用して、当該技術分野で既知の方法に従って生成することができる。ＣＡＲ－Ｔの生成に使用することができるペイロードのプロモーターに有用なものとしては、例えば、構成的プロモーター（プロモーターは、ＥＦ１α、次いでＩＲＥＳまたは２ＡなどのＣＡＲ－Ｔと同じである）；誘導性プロモーター（プロモーターは、ＮＦＡＴ、ＩＬ－２ｐｒｏｍなどのＣＡＲ－Ｔのプロモーターとは異なる）；および遺伝子操作されたプロモーター（サイトカインのＰＤ－１遺伝子座「ノックイン」および／または内因性プロモーターの制御下にあるプロモーターなど）が挙げられる。１つの実施形態では、本明細書で論じられるＰＤ－１抗体は、多重特異性抗体の構築において、またはＣＡＲ－Ｔ細胞のペイロードとして使用することができる。例えば、１つの実施形態では、本明細書で論じられる抗ＰＤ－１抗体は、ＣＡＲＳの標的指向化のために（すなわち、標的指向部分として）使用することができる。１つの実施形態では、本明細書で論じられる抗ＰＤ－１抗体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって分泌されるペイロードとして使用することができる。別の実施形態では、本明細書で論じられる抗ＰＤ－１抗体は、標的指向部分として使用することができ、異なるエピトープを標的とする異なるＰＤ－１抗体をペイロードとして使用することができる。別の実施形態では、ペイロードは、免疫調節抗体ペイロードであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ組成物での使用において、本明細書に記載されるＰＤ－１抗体は、高親和性ＰＤ－１抗体ではない（例えば、抗体は、そのため、ＰＤ－１標的に強く結合しない）。例えば、本明細書に記載されるＰＤ－１抗体は、特定の癌（すなわち、卵巣癌においてはＭＳＬＮおよびＭＵＣ１）について選択された２つの標的指向部分（例えば、腫瘍関連表面抗原）と共に、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって分泌されるペイロードとして使用することができる。腫瘍関連表面抗原の非限定的な例としては、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１、ＭＳＬＮ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ２２、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ＲＥＴ１、ＲＥＴ２（ＡＳ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＴＡＧ－７２、ＰＡＰ、ｐ５３、Ｒａｓ、プロステイン、ＰＳＭＡ、サバイビン、９Ｄ７、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ、メソテリン、ベタイン－カテニン、ＴＧＦ－ベタインＲＩＩ、ＢＲＣＡ１／２、ＳＡＰ－１、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶ－Ｅ７が挙げられる（さらなる腫瘍関連表面抗原については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６７２２５号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２２２７２号もまた参照のこと）。
診断アッセイ
抗ＰＤ－１抗体は、例えば、所与の治療および／または予防レジメンの有効性を決定するための臨床試験手順の一部として、例えば、癌の発生または進行を監視するために診断的に使用することができる。
いくつかの態様では、診断目的のために、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、例えば、癌のリスクがあるかまたは癌に罹患している対象において癌細胞を検出するための方法を提供するように、検出可能な部分に結合される。
検出可能な部分は、抗体または断片に直接結合するか、または、例えば、蛍光二次抗体を使用することによって間接的に結合することができる。直接結合は、例えば、フルオロフォアの抗体もしくは抗体断片への標準的な化学的カップリングによって、または遺伝子操作を介して達成することができる。蛍光または生物発光タンパク質にカップリングされた抗体または抗体断片を含有するキメラまたは融合タンパク質を構築することができる。例えば、Ｃａｓａｄｅｉ，ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９０ Ｍａｒ；８７（６）：２０４７－５１）は、哺乳動物細胞においてエクオリンおよび抗体遺伝子の融合タンパク質を発現することができるベクター構築物を作製する方法を記載している。
本明細書で使用される場合、プローブまたは抗体に関して「標識された」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（すなわち、物理的に結合する）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含し得る。間接標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。「生物学的サンプル」という用語は、対象から単離された組織、細胞、および体液（生検など）、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および体液を含むことを意図している。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボで、生物学的サンプルにおいてＰＤ－１を発現する細胞を検出するために使用され得る。例えば、ＰＤ－１の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。さらに、ＰＤ－１を検出するためのインビボ技術は、標識された抗ＰＤ－１抗体を対象に導入することを含む。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的な画像化技術によって検出され得る放射性マーカーで標識され得る。
「標的化された」結合体、すなわち特定の部位または複数の部位で対象または動物内の結合体を局在化するように設計された分子または特徴である標的指向部分を含む結合体の場合、局所化は、対象内の結合された「局所化された」実体と、結合されていない「遊離した」実体の間の平衡が本質的に達成された状態を指すことができる。そのような平衡が達成される速度は、投与経路に依存する。例えば、静脈内注射によって投与される結合体は、注射の数分以内に局在化を達成し得る。一方、経口投与される結合体は、局在化を達成するのに数時間かかり得る。あるいは、局在化は、実体が投与された後の選択された期間における対象または動物内の実体の位置を単に指し得る。別の例として、局在化は、その部分が投与後に分布するようになる場合に達成される。
局在化を達成するための時間の合理的な推定は、当業者によって行われ得ることが理解される。さらに、時間の関数としての局在化の状態は、本発明の方法に従って、例えば光検出器デバイスを用いて、検出可能な部分（例えば、発光結合体）を画像化することによって追跡され得る。使用される「光検出器デバイス」は、妥当な時間量で哺乳動物内からの微弱な光の画像化を可能にし、そのようなデバイスからの信号を使用して画像を構築するのに十分に高い感度を有するべきである。
非常に明るい光生成部分を使用すること、および／または画像化される対象もしくは動物の表面付近に局在する光生成融合タンパク質を検出することが可能である場合、一対の「暗視」ゴーグルまたは標準的な高感度ビデオカメラ（例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ Ｔｕｂｅ（ＳＩＴ）カメラ（例えば、Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ））が使用され得る。しかしながら、より典型的には、より高感度な光検出方法が必要とされる。
極端に低い光レベルでは、単位面積あたりの光子束が非常に低くなり、画像化されているシーンが連続的に見えなくなる。代わりに、それは、時間的にも空間的にも互いに異なる個々の光子によって表される。モニタ上で見ると、そのような画像は、それぞれが単一の検出された光子を表す光のシンチレーション点として現れる。これらの検出された光子をデジタル画像プロセッサ内で経時的に蓄積することによって、画像を取得して構築することができる。各画像点における信号に強度値が割り当てられる従来のカメラとは対照的に、光子計数撮像では、信号の振幅は重要ではない。目的は、信号（光子）の存在を単純に検出し、経時的にその位置に関して信号の発生を計数することである。
以下で説明される少なくとも２つのタイプの光検出器デバイスは、個々の光子を検出し、画像プロセッサによって分析され得る信号を生成することができる。ノイズ低減光検出デバイスは、光子信号を増幅するのではなく、光子検出器のバックグラウンドノイズを低減することで感度を達成する。ノイズは、主に検出器アレイを冷却することによって低減される。このデバイスには、「背面薄化」冷却ＣＣＤカメラと呼ばれる電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラが含まれる。より高感度の機器において、冷却は、例えば、ＣＣＤアレイの温度を約－１２０℃にする液体窒素を使用して達成される。「裏薄化された」とは、光子が検出されるまでの経路長を減少させ、それによって量子効率を増加させる超薄型のバックプレートを指す。特に感度の高い裏薄化低温ＣＣＤカメラは、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．（Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚ．）から入手可能なシリーズ２００カメラである「ＴＥＣＨ ５１２」である。
「光子増幅デバイス」は、光子が検出画面に当たる前に光子を増幅する。このクラスには、マイクロチャネル増強装置などの増強装置を備えたＣＣＤカメラが含まれる。マイクロチャネル増強装置は、典型的には、カメラの検出画面に対して垂直であり、かつそれと同一の広がりを有するチャネルの金属アレイを含む。マイクロチャネルアレイは、画像化されるサンプル、対象、または動物とカメラの間に配置される。アレイのチャネルに入る光子の大部分は、出る前にチャネルの側面に接触する。アレイに電圧を印加すると、各光子の衝突から多くの電子が放出される。そのような衝突からの電子は、「ショットガン」パターンでそれらの起点チャネルを出て、カメラによって検出される。
増強マイクロチャネルアレイを直列に配置して、第１段階で発生した電子が第２段階で電子の増幅信号を生じるようにすることによって、さらに高い感度を達成することができる。しかし、感度の増加は空間分解能を犠牲にして達成され、それは増幅の各追加段階と共に減少する。例示的なマイクロチャネル増強装置に基づく単一光子検出デバイスは、Ｃ２４００シリーズであり、Ｈａｍａｍａｔｓｕから入手可能である。
画像プロセッサは、光子を計数する光検出器デバイスによって生成された信号を処理して、例えば、モニタ上に表示され得るか、またはビデオプリンタ上に印刷され得る画像を構築する。このような画像プロセッサは、典型的には、上述の高感度光子計数カメラを含むシステムの一部として販売されており、したがって、同じ供給源から入手可能である。画像プロセッサは、通常、ＩＢＭ互換ＰＣまたはＡｐｐｌｅ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）などのパーソナルコンピュータに接続され、購入した画像システムの一部として含まれてもよいし、含まれなくてもよい。画像がデジタルファイルの形態になると、様々な画像処理プログラム（例えば、「ＡＤＯＢＥ ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ」，Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって操作し、印刷することができる。
１つの実施形態では、生物学的サンプルは、試験対象由来のタンパク質分子を含む。１つの例示的な生物学的サンプルは、従来の手段によって対象から単離された末梢血白血球サンプルである。
本発明はまた、生物学的サンプル中のＰＤ－１またはＰＤ－１発現細胞の存在を検出するためのキットを包含する。例えば、キットは、生物学的サンプル中の癌または腫瘍細胞を検出することができる標識された化合物または薬剤（例えば、抗ＰＤ－１ ｓｃＦｖまたはモノクローナル抗体）；サンプル中のＰＤ－１の量を決定するための手段；およびサンプル中のＰＤ－１の量を標準と比較するための手段を含むことができる。標準は、いくつかの実施形態では、非癌細胞またはその細胞抽出物である。化合物または薬剤は、適切な容器に包装することができる。キットは、サンプル中の癌を検出するためにキットを使用するための説明書をさらに含むことができる。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していない。他の態様、利点、および変更は、添付の特許請求の範囲内である。
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載される。
実施例は、本発明のより完全な理解を促進するために以下に提供される。以下の実施例は、本発明を作製および実施する例示的な様式を例示する。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例に開示されている特定の実施形態に限定されず、代わりの方法を使用して同様の結果を得ることができるため、例示のみを目的としている。
実施例１－ＰＭＰＬパニング
本発明のＰＤ－１抗体（例えば、Ｐ４－Ｂ３およびＰ４－Ｂ７）を、ＰＭＰＬパニングによって見出した。簡潔に述べると、ＰＤ－１を、Ｃ末端Ｃ９タグ（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ）に遺伝子的に融合させて発現させた。Ｅｘｐｉ２９３細胞の一過的トランスフェクションを行い、その後溶解させた。溶解物を清澄化し、１Ｄ４（抗Ｃ９タグ）結合磁気ビーズを使用してＰＤ－１タンパク質を捕捉した。次いで、ビーズを脂質溶液中で透析し、これにより、細胞膜をシミュレートし、タンパク質の安定性を補助する脂質二重層をビーズの周囲に形成した。次いで、これらのビーズをパンニングに使用した。
実施例２－ミニボディ結合曲線
ミニボディ結合曲線を、トランスフェクトした細胞を用いて行った（図４を参照のこと）。ヒトまたはカニクイザルＰＤ１をトランスフェクトした細胞を使用して、Ｐ４－Ｂ３ミニボディの結合曲線を作成した。ヒト変異体は２回実施したが、陰性およびカニクイザルは１回実施した。トランスフェクションの４８時間後にＥｘｐｉ２９３細胞を用いて曲線を作成した。ヒト変異体曲線を、市販の抗体染色による発現レベルに基づいて正規化したが、カニクイザル変異体は正規化しなかった。カニクイザル変異体は、使用した市販の抗体がカニクイザルＰＤ－１に結合することが報告されていないため、正規化しなかった。
実施例３－Ｐ４－Ｂ３の異なる抗体型のオクテット結合曲線
ストレプトアビジンセンサに３ｕｇ／ｍｌのビオチン化ＰＤ－１をロードした。Ｐ４－Ｂ３の全ての型の最高濃度は５０ｎＭであり、３／４段階希釈を行った。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄソフトウェアを使用して動的計算を行い、図５に示す。ＥＭＥＡ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔ（ＥＭＥＡ／Ｈ／Ｃ／００３８２０／００００）によれば、ＰｅｍｂｒｏのＫＤは２．９Ｅ－１１ Ｍであると報告されており、これは、実験からＰｅｍｂｒｏについて得られた結果に匹敵する。
実施例４－ＰＤ－Ｌ１競合アッセイ
ＳＡセンサに３ｕｇ／ｍｌのＰＤ－１をロードし、次いで、様々な濃度（５０～０ｎＭ）のＰｅｍｂｒｏ（ＩｇＧ）またはＰ４－Ｂ３（ＩｇＧまたはミニボディ）のいずれかとインキュベートし、続いて５ｕｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１とインキュベートした。図６において、赤色の曲線は、抗体がロードされておらず、ＰＤ－１機能化センサに結合するＰＤ－Ｌ１の最大量を表す。図６に示されるように、Ｐ４－Ｂ３抗体は、ＰＤ－Ｌ１の付加によりわずかなシフトを有するが、ＰＤ－Ｌ１結合のかなりの部分を遮断するようである。曲線は、抗体のロード工程を含まず、代わりにＰＤ－Ｌ１結合工程のみを示している。元の抗体結合工程は、図５に詳述する。
実施例５－ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＰＤ１で３７℃で２時間コーティングした。次にプレートを洗浄し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７Ｃで１時間遮断した。ブロッキング溶液を除去し、抗体の３×段階希釈物を、６ｕｇ／ｍｌで開始して、２％ミルク－ＰＢＳＴ中の各ウェル（１００ｕｌ）に加えた。次いで、プレートを穏やかに振盪しながら室温でインキュベートし、ＰＢＳ－Ｔで６回洗浄し、二次抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（１：１５０ｋ、Ｂｅｔｈｙｌ）を加えた。プレートを再度、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ－Ｔで６回洗浄した。ＴＭＢ基質を加え、プレートを３０℃で１０分間インキュベートして、ＨＲＰ反応を促進させた。次いで、シグナルをＴＭＢ停止溶液でクエンチし、４５０ｎｍで読み取った。図７の上のグラフを参照のこと。
プレートを６ｕｇ／ｍｌで開始する抗原の３×段階希釈物でコーティングしたことを除いて、本明細書に記載されるものと同じプロトコルを図７の下のグラフに対して実行した。次いで、抗体を１ｕｇ／ｍｌの一定濃度で全てのウェルに加えた。
実施例６－抗ＰＤ１ ＩｇＧを用いたＰＤ１ ＦＡＣＳ
Ｔ細胞を、完全ＤＭＥＭ（２９３ＦＴ培地）中で５ｕｇ／ｍｌのＰＨＡを用いるか、または用いずに４８時間培養した。ペムブロリズマブおよびＰ４－Ｂ３抗体を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＡＰＣ（カタログ番号４０９３０６）で検出した。図８に示すように、Ｐ４－Ｂ３ ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブおよび対照抗ＰＤ１抗体の結合パターンと同様の結合パターンを示す。
実施例７－ＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイ
Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイ（Ｊ１２５０）を、本発明のＰＤ－１抗体（Ｐ４－Ｂ３）ならびに市販の抗体ペムブロリズマブおよびニボルマブを用いて実施した（図９）。
試験した構築物は、（ａ）ＩｇＧ１：野生型モノマー；（ｂ）ＬＡＬＡ：モノマー、ヘキサマー、および変異体３；（ｃ）ｓＩｇＧ４：モノマーおよびヘキサマー；対照：ｍＡｂ１１ ＬＡＬＡモノマーを含むものであった。
ｍＡｂ１１を除いて、全てのサンプルを３回行った。
誘導倍率：ＲＬＵ刺激／ＲＬＵ非刺激（Ａｂなし）（図１０）。
実施例８－抗ＰＤ－１交差反応性
多くの抗ＰＤ－１抗体は、マウスおよびヒトＰＤ－１と交差反応することができない（ＰｅｍｂｒｏおよびＮｉｖｏは交差反応性ではない）。Ｆｅｓｓａｓ，Ｐｅｔｒｏｓ ｅｔ ａｌ．「Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＤ－１－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ａｎｄ ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ」Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．４４，２（２０１７）：１３６－１４０．を参照のこと。また、Ｔａｎ ＪＢＬ，Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｃｈｅｎ Ｋ，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＬＳ－０１０（ＡＢ１２２）：「Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｈｕｍａｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ－Ｓｔａｇｅ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」 Ｐｏｓｔｅｒ，Ａｒｃｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと；Ｂｕｒｏｖａ，Ｅｌｅｎａ ｅｔ ａｌ．「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＲＥＧＮ２８１０ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＨｕｍａｎＰＤ－１Ｋｎｏｃｋ－Ｉｎ Ｍｉｃｅ」Ｌａｒｇｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１７を参照のこと。さらに、Ｌｉ，Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｔｏ ｂｏｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ１」ｍＡｂｓ ｖｏｌ．９，４（２０１７）：６２８－６３７を参照のこと。
本発明の抗体（例えば、Ｐ４－Ｂ３）は交差反応性である。
３Ｅ５を一過的にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３細胞を１００ｕｌのＭＡＣＳ緩衝液に懸濁し、各ウェルに添加した。次に、５０ｕｌの各抗体希釈液を細胞と混合し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１ｕｌ／ウェルの抗ヒトＦｃ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃４０９３０６）とインキュベートした。プレートを４℃で２５分間インキュベートし、サンプルを分析する前に３回洗浄した。
図１６に示されるように、Ｐ４－Ｂ３は、マウスＰＤ－１に対して適度な親和性を有し、ＰｅｍｂｒｏおよびＮｉｖｏとは一線を画している。
実施例９－親和性成熟
酵母ライブラリの生成
最初に、ｐＦａｒｂｅｒベクター（ファージディスプレイ）由来のＰ４－Ｂ３ ｓｃＦｖを切断し、ｐＣＴＣＯＮ２ベクター（酵母ディスプレイ）にペーストする。次いで、当該技術分野で実施される２つの方法に従ってライブラリを作製する：（１）細菌における消化／ライゲーションおよびインタクトなプラスミドの酵母への形質転換；ならびに（２）酵母中の相同組換えのための線状化ベクター＋ＰＣＲ断片。消化／ライゲーション法（本明細書中に記載される方法（１））は、ライブラリーサイズが非常に低くなり、ライゲーション／細菌の形質転換の効率が低くなり、酵母への形質転換の効率が非常に低くなった。しかしながら、相同組換え（本明細書中に記載される方法（２））は、約１０６～１０７個の変異体を有するライブラリを生じた。
エラープローン変異誘発
Ａｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩランダム変異誘発キットを使用した。このキットは、最初の鋳型ＤＮＡに基づいて変異率を変化させるように設計されている。
Figure 2022536370000032
外部プライマー（ｐＣＴＣＯＮ２ベクターと約５０～６０ｂｐ重複）：
（ａ）ｐＣＴＣＯＮ２－ＨＲ－Ｆｗｄ：
ＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＧＣＴＡＧＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧ
（ｂ）ｐＣＴＣＯＮ２－ＨＲ－Ｒｅｖ：
ＡＣＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣ
内部プライマー（重鎖または軽鎖断片と４５ｂｐ重複）：
（ａ）Ｇ４Ｓ－Ｆｗｄ：
ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣ
（ｂ）Ｇ４Ｓ－Ｒｅｖ：
ＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ
エラープローン変異誘発戦略
（ａ）外部プライマーを用いたｓｃＦｖ断片全体のＰＣＲ。この戦略は、リンカー領域における変異を可能にする（これは望ましくない）。（ｂ）外部プライマーおよびＧ４Ｓプライマーを別々に使用する重鎖および軽鎖のＰＣＲであって、３ピース相同組換えのための第３の重複点としてＧ４Ｓリンカーを使用する。この戦略は、変異からリンカーを保護するが、２ピースよりも効率が低い可能性がある３ピース相同組換えを必要とする。
両方の技術を様々な量の鋳型ＤＮＡで使用した。全ｓｃＦｖ ＰＣＲの鋳型は、Ｐ４－Ｂ３がクローニングされたｐＣＴＣＯＮ４ベクターである（約１／１０の鋳型が標的配列である）。重鎖／軽鎖の別々のＰＣＲの鋳型は、Ｐ４－Ｂ３ ＰＣＲ断片である（約１／２鋳型が標的配列である）。
使用した鋳型－全ｓｃＦｖのＰＣＲ：４ｕｇ、２ｕｇ、１ｕｇ、０．５ｕｇ；重鎖／軽鎖の別々のＰＣＲ：４５０ｎｇ、５０ｎｇ（各２回反応）。
＊ＰＣＲを３３サイクル実行して、ＤＮＡ収量を増加させた。
ライブラリの生成
Ｂｅｎａｔｕｉｌ ｅｔ ａｌ，「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１０Ａｐｒ；２３（４）：１５５－９．に記載されているプロトコルに従った。
一般的なプロトコル：ＥＢＹ１００酵母細胞を１００ｍｌのＹＰＤ培地にＯＤ６００＝０．３で接種し、ＯＤ６００＝１．６になるまで３０℃で約５～６時間増殖させた。細胞を遠心分離によって収集し、５０ｍｌの冷ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄し、５０ｍｌの冷エレクトロポレーション緩衝液（１Ｍソルビトール／１ｍＭ ＣａＣｌ２）で１回洗浄した。次いで、２０ｍｌの０．１Ｍ ＬｉＡｃ／１０ｍＭ ＤＴＴ中、３０℃で３０分間振盪することによって、細胞を馴化させた。細胞を回収し、５０ｍｌの冷エレクトロポレーション緩衝液で洗浄した。ペレット化した後、細胞を再懸濁して、２回の形質転換に適した最終容量１ｍｌとした。
全ｓｃＦｖ ＰＣＲ：４．８ｕｇのインサートが得られ、４ｕｇの線状化ベクター（ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ）と混合した。
Ｈ／Ｌ鎖 ＰＣＲ：４．１ｕｇのＨＣと３．５ｕｇのＬＣが得られ、３ｕｇの線状化ベクター（ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ）に減少した。
ベクターおよび所望の断片を混合し、次いでＥｔＯＨ沈殿させて体積を減少させた（５０ｕｌ未満）。４００ｕｌのエレクトロコンピテント酵母細胞を、Ｂｉｏｒａｄを２．５ｋＶおよび２５ｕＦで使用して形質転換した。細胞を１：１のＹＰＤ：１Ｍソルビトール中で１時間回収した後、細胞をスピンダウンし、ＳＤＣＡＡで洗浄し、各形質転換について２５０ｍｌのＳＤＣＡＡ中に再懸濁した。
力価：（ａ）全ｓｃＦｖライブラリ：約５．２Ｅ６メンバー；（ｂ）別々のＨ／Ｌ鎖：約５．８Ｅ６メンバー。
２継代後、コロニーを配列決定のために平板培養した（ライブラリ当たり９６コロニー）。全ｓｃＦｖライブラリ：５６／９６（５８．３３％）は、少なくとも１つの変異を有していた。別々のＨ／Ｌ鎖ライブラリ：４２／９６（４３．７５％）は、少なくとも１つの突然変異を有していた。
有効ライブラリーサイズ：（ａ）全ｓｃＦｖライブラリ：約２．９Ｅ６メンバー；（ｂ）別々のＨ／Ｌ鎖：約２．１Ｅ６メンバー。
ライブラリの選別戦略
２つの染色方法を使用した：（１）改善された結合を探す標準染色（ＦＡＣＳ分析中の右上四分円へのシフト）；および（２）改善されたオフ速度を探す動的戦略。
動的染色において、ライブラリをＫｄの１０倍の濃度の標識抗原で染色し、洗浄してから、容量を増やしてＫｄの１００倍の濃度の非標識抗原でインキュベートする。サンプルを大量にインキュベートすると、解離する抗原が酵母と再結合できなくなる。さらに、より高い濃度の非標識抗原を付加することは、遊離した任意の標識抗原が非標識抗原で置換されることを意味する。
動的染色において、染色時間は時定数（τ）に依存する。
τ＝（ｋｏｎ［Ａｇ］０＋ｋｏｆｆ）－１
式中、ｋｏｎ＝オン速度（Ｍ＾－１ｓ＾－１）；ｋｏｆｆ＝オフ速度（ｓ＾－１）；および［Ａｇ］０＝初期抗原濃度（Ｍ）である。
オクテット測定から、Ｐ４－Ｂ３ ｓｃｆｖは、ｋｏｎ＝６．８５Ｅ４、ｋｏｆｆ＝６．４５Ｅ－５、Ｋｄ＝９．４Ｅ１０を有する。
平衡結合の９５％での結合は３τであり、９９％での結合は５τである。
染色プロトコルは、Ｃｈｅｒｆ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１９：１５５－７５に従って実施した。
簡潔には、高親和性タンパク質変異体を、ＦＡＣＳによって酵母ディスプレイライブラリーから単離した。遺伝子ライブラリでの酵母細胞の形質転換および表面発現の誘導に続いて、２つの主要な戦略を使用して、スクリーニングの前にディスプレイされたライブラリを差次的に標識する：（１）平衡結合戦略（ここで、ライブラリは、最も高い親和性の変異体の予想されるＫＤ値よりも５～１０倍高いリガンド濃度でインキュベートして、密接な結合変異体がほぼ飽和し、より弱い親和性の変異体が平衡で部分的に標識される）、および（２）動的結合戦略（ここで、ライブラリは、平衡結合戦略について記載されるようにリガンドとともにインキュベートされるが、結合していないリガンドは、洗浄によって除去され、次いで、ライブラリは、１００倍過剰の非標識リガンドとともにインキュベートされるか、または解離したリガンドの再結合を防止するために十分に大量の緩衝液中でインキュベートされる。
この第２のインキュベーション工程中、過剰な非標識リガンドまたは大きなインキュベーション体積は、解離した標識リガンドが再結合するのを防止する。したがって、タンパク質は、それらの解離速度定数（ｋｏｆｆ）に基づいて区別され、最も遅いｋｏｆｆを有する変異体が、予め結合した標識リガンドの最大パーセンテージを保持する。蛍光標識された抗エピトープタグ抗体の添加により、結合による酵母表面発現レベルの正規化が可能になり、ＦＡＣＳによって最も親和性の高い変異体を単離できるようになる。酵母クローンの選別されたプールは、分析またはその後の選別のいずれかのために培養中に拡大することができ、またはこれらのクローンからのＤＮＡを単離し、変異誘発に供し、さらなるタンパク質進化のために酵母の新しいバッチを形質転換するために使用することができる。Ａｇａ１ｐ、Ａｇａ２ｐ、ＨＡおよびｃ－ｍｙｃエピトープタグ、ならびに図１７に示される検出抗体などの酵母ディスプレイプラットフォームの構成要素は、明確にするために省略される。
ライブラリ選別
ライブラリをＳｏｎｙ ＳＨ８００上で選別し、サンプル当たり約１０００個のクローンを回収した。結合が増加したクローンと減少したクローンについて、サンプルを選別した（重要な残基はマッピングされている）。選別された細胞を平板培養し、数ダースのみが増殖し、その全てを配列決定した。標準および動的染色を用いて別々のＨ／Ｌ鎖ライブラリに焦点を合わせた。
Figure 2022536370000033
選別した細胞をＳＤＣＡＡプレート上に播種し、３０℃で３日間インキュベートした。次にコロニーを採取し、新鮮なＳＤＣＡＡ培地中で増殖させ、配列決定して重要な変異を同定した。次に配列決定からの固有のクローンを新鮮なＳＧＣＡＡ中に接種し（ガラクトースによる誘導）、３６時間後にサンプルを染色して結合曲線を作成した。
ＥＢＹ１００酵母培養物を３０℃で１．５日間誘導した。１Ｅ６細胞を遠心沈降させ、ＰＢＳ中の様々な希釈度の抗原を含むウェルに入れた。プレートを振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、０．１ｕｇ／ｍｌのストレプトアビジン－ＡＰＣ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を各ウェルに付加した。プレートを振盪しながら室温で２５分間インキュベートし、次いで洗浄し、ＦＡＣＳキャリバーで読み取った。
クローン２、７、１０、１４は、Ｐ４－Ｂ３（抗ＰＤ１）のランダム変異誘発ライブラリに由来し、より高い結合について選別した（ｙ＝ｘ軸上にシフトさせた）。ＨＬクローンを、リンカー配列を介した相同組換えによって組換えられる前に、Ｈ鎖およびＬ鎖のエラープローンによって別々に生成した。ＨＬ 動的１は、ライブラリを１０×Ｋｄの標識抗原と共にインキュベートした後、元の染色体積の１０倍の１００倍過剰の非標識抗原と共に長時間インキュベートする、動的染色アプローチに由来した。Ｐ４－Ｂ３ 野生型は、この段階で陽性ではなかったが、ポップアップしたライブラリ中のクローンはわずかであった（図２０を参照のこと）。適切な濃度で実験を繰り返し、曲線を左にシフトさせたクローンのみを使用した（（図２１を参照のこと）。
同定されたがまだ特徴付けられていない他のクローン
Figure 2022536370000034
ｓｃＦｖ 陽性は、主により少ない量のｃＭｙｃを発現するが、より多い量のＰＤ－１を結合することによって、いくらか増加した結合を示したクローンである（いずれもｘ＝ｙ軸上で上方にシフトしなかった）。
ｓｃＦｖ 陰性は、野生型と比較して結合の減少を示したクローンである。
ミニボディベクターへのＨＬｋｉｎ１、ＨＬ－７、ＨＬ－１４のクローニングに加えて、２重（Ｍｕｔ＋２：ＨＬｋｉｎ１＋ＨＬ－７）および３重（Ｍｕｔ＋３：ＨＬｋｉｎ１＋ＨＬ－７＋ＨＬ－１４）組合せ変異体を作製して、相加的効果が観察されるかどうかを確認した（図２３および図２４を参照のこと）。
例えば、以下のＫＤが測定されている：
ＰＤ１＃３ 約１Ｅ－１０Ｍ
Ｐ４－Ｂ３ 野生型 約１Ｅ－９Ｍ
Ｍｕｔ＋２（ＨＬｋｉｎ１＋ＨＬ－７）約３Ｅ－１１Ｍ
Ｍｕｔ＋３（ＨＬｋｉｎ１＋ＨＬ－７＋ＨＬ－１４）約３Ｅ－１２Ｍ
ＨＬｋｉｎ－１ 約６Ｅ－１１Ｍ
実施例１０－ＩｇＧを用いたＰＤ１バイオアッセイ
Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＤ１－ＰＤＬ１バイオアッセイ（Ｊ１２５０）を、本発明のＰＤ－１抗体（例えば、Ｐ４－Ｂ３および本明細書に記載される変異体）ならびに市販の抗体ペムブロリズマブおよびニボルマブを用いて行った（図３３）。
Ｎｉｖｏ（緑色三角形）は、約５～６の誘導倍率に達し、これは以前の実験と同様である。ｓｃＦｖ－Ｆｃ実験において、Ｍｕｔ＋２、Ｍｕｔ＋３、ＨＬｋｉｎ－１およびＨＬ－７は全て、Ｎｉｖｏと比較して増加した誘導を示した。ＩｇＧに変換された場合、コンボ変異体（Ｍｕｔ＋２／Ｍｕｔ＋３）は、Ｎｉｖｏよりも良好に、かつＰｅｍｂｒｏと同等のレベルで機能し続け、一方、単一（ＨＬｋｉｎ－１／ＨＬ－７）は、わずかに減少した活性を示す。元のＰ４－Ｂ３ ＩｇＧは、全ての抗体のものより有意に低い。クローンｓｃＦｖ－６は、酵母ライブラリから得られた二重変異体であり、２つの軽鎖変異を有する。見られるように、これはＰ４－Ｂ３野生型に対する改善であるが、市販の抗体および他の変異体抗体よりも有意に悪い。
実施例１１－混合リンパ球反応（ＭＬＲ）プロトコル
ＣＤ１４＋単球を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ１４＋マイクロビーズを使用して単離した。細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｍｏ－ＤＣ培地（ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ４を含む予め調製した培地）中で培養した。細胞を５日間培養した後、ＴＮＦ－α（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ－１β（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（１μＭ）を付加し、細胞を２日間培養してＤＣを成熟させた。Ｔ細胞をＭＬＲ実験の日に単離した（ＣＤ４＋陰性選択キットＳｔｅｍＣｅｌｌ）。ＭＬＲにおいて、１ウェル当たり１００，０００個のＴ細胞および１０，０００個のＭｏＤＣ細胞を使用した。抗体を様々な濃度で添加し、培養物を５日間インキュベートした。
上清をＥＬＩＳＡスクリーニング（例えば、ＩＬ２およびＩＦＮγ）のために保存した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞をＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＰＤ１－ＰＥ、ＬＡＧ３－ＢＶ４２１、ＴＩＭ３－ＡＰＣＣｙ７で染色した。
ＭＬＲ Ｐｅｍｂｒｏ対Ｐ４－Ｂ３ｍｕｔ＋３ ＩｇＧ４。２つのＴ細胞ドナーおよび２つのＤＣドナーを使用した。図４２および４３のグラフの表題は、測定されたサイトカイン、Ｔ細胞ドナー、およびＤＣドナーを示す。ＩＬ２ Ｔ２ ＤＣＶ 未処理は、ＩＬ２アッセイ、Ｔ細胞ドナー２、ＤＣドナーＶに対応する。
ｓＩｇＧ４型のＰ４－Ｂ３ｍｕｔ＋３抗体を、ペムブロリズマブおよびＦ１０－ｓＩｇＧ４の市販の調製物（陰性対照）に対して試験した。図４２および４３に示されるように、Ｐ４－Ｂ３ｍｕｔ＋３またはペムブロリズマブのいずれかの付加は、Ｆ１０のものと比較してサイトカイン産生の有意な増加をもたらす。
同等物
当業者であれば、ルーチンの実験以上のものを使用せずに、本明細書に具体的に記載された特定の物質および手順に対する多数の同等物を認識するであろう、または確認できるであろう。そのような同等物は、本発明の範囲内であると考えられ、以下の請求項によってカバーされる。
[本発明1001]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ヒトプログラム細胞死1（ＰＤ－1）タンパク質に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
前記重鎖は、
Ｇ－（Ｘ 1 ）－ＴＦ－（Ｘ 2 Ｘ 3 ）－Ｙ－（Ｘ 4 ）（配列番号81）、Ｇ－（Ｘ 5 ）－ＴＦ－（Ｘ 6 Ｘ 7 Ｘ 8 ）－Ａ（配列番号82）、ＧＤＳＶＳＳＤＮＹＦ（配列番号43）、またはＧＹＴＦＮＲＦＧ（配列番号55）を含む、ＣＤＲ1、
ＩＳＷＮＳＧＳＩ（配列番号19）、ＩＹＰＤＤＳＤＴ（配列番号33）、ＶＹＹＮＧＮＴ（配列番号45）、ＴＮＰＹＮＧＮＴ（配列番号57）、またはＩＳＹＤＧＳＮＫ（配列番号69）を含む、ＣＤＲ2、
ＡＳＤＹＧＤＫＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号21）、ＡＦＷＧＡＳＧＡＰＶＮＧＦＤＩ（配列番号35）、ＡＴＥＴＰＰＴＳＹＦＮＳＧＰＦＤＳ（配列番号47）、ＡＲＶＶＡＶＮＧＭＤＶ（配列番号59）、ＡＳＱＴＶＡＧＳＤＹ（配列番号71）、またはＡＳＤＹＧＤＫＹＳＹＹＧＭＤＶ（配列番号79）を含む、ＣＤＲ3、
またはそれらのＣＤＲの組み合わせ
を含み、かつ
前記軽鎖は、
ＳＳＮＩＧＳＮＴ（配列番号24）、ＳＳＮＩＧＡＧＹＶ（配列番号37）、ＳＮＮＶＧＡＨＧ（配列番号49）、ＳＧＳＩＡＡＹＹ（配列番号61）、またはＮＩＧＳＫＳ（配列番号73）を含む、ＣＤＲ1、
（Ｘ 9 ）－ＤＮ（配列番号83）、（Ｘ 10 ）－ＮＮ（配列番号84）、またはＤＤＳ（配列番号75）を含む、ＣＤＲ2、
ＡＡＷＤＧＧＬＮＧＲＧＶ（配列番号28）、ＡＡＷＤＤＳＬＮＡＰＶ（配列番号41）、ＳＳＷＤＳＳＬＳＧＹＶ（配列番号53）、ＱＳＹＤＳＳＮＬＷＶ（配列番号65）、またはＱＶＷＨＳＶＳＤＱＧＶ（配列番号77）を含む、ＣＤＲ3、
またはそれらのＣＤＲの組み合わせ
を含む、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1002]
完全ヒトであるか、またはヒト化されている、本発明1001の抗体。
[本発明1003]
単一特異性、二重特異性、または多重特異性である、本発明1001の抗体。
[本発明1004]
単鎖抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1005]
少なくとも1．0×10 －6 Ｍの結合親和性を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1006]
重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはそれらの組み合わせをさらに含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1007]
Ｘ 1 、Ｘ 4 、Ｘ 5 、またはＸ 8 は、非極性アミノ酸残基である、本発明1001の抗体。
[本発明1008]
Ｘ 1 、Ｘ 4 、Ｘ 5 、またはＸ 8 は、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはアラニン（Ａ）である、本発明1007の抗体。
[本発明1009]
Ｘ 2 、Ｘ 3 、Ｘ 4 、Ｘ 6 、Ｘ 7 、またはＸ 8 は、極性アミノ酸残基である、本発明1001の抗体。
[本発明1010]
Ｘ 2 、Ｘ 3 、Ｘ 4 、Ｘ 6 、Ｘ 7 、またはＸ 8 は、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはトリプトファン（Ｗ）である、本発明1009の抗体。
[本発明1011]
Ｘ 1 は、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）である、本発明1001の抗体。
[本発明1012]
Ｘ 2 は、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）である、本発明1001の抗体。
[本発明1013]
Ｘ 3 は、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）である、本発明1001の抗体。
[本発明1014]
Ｘ 4 は、アラニン（Ａ）またはトリプトファン（Ｗ）である、本発明1001の抗体。
[本発明1015]
Ｘ 5 は、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）である、本発明1001の抗体。
[本発明1016]
Ｘ 6 は、アスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）である、本発明1001の抗体。
[本発明1017]
Ｘ 7 は、アスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）である、本発明1001の抗体。
[本発明1018]
Ｘ 8 は、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）である、本発明1001の抗体。
[本発明1019]
Ｘ 9 は、極性親水性アミノ酸残基である、本発明1001の抗体。
[本発明1020]
Ｘ 9 は、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）である、本発明1019の抗体。
[本発明1021]
Ｘ 10 は、極性親水性アミノ酸残基である、本発明1001の抗体。
[本発明1022]
Ｘ 10 は、セリン（Ｓ）またはアルギニン（Ｒ）である、本発明1021の抗体。
[本発明1023]
少なくとも1つの抗体を含む抗体組成物であって、前記少なくとも1つの抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖を含み、
前記重鎖のＣＤＲは、配列番号1のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～119；または配列番号3のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～119；または配列番号5のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～121；または配列番号7のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～115；または配列番号9のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～114；または配列番号12のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～119；または配列番号13のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～119；または配列番号15のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～119に見出される参照生殖系列ＣＤＲと同一であるが、前記重鎖ＣＤＲの少なくとも1つは、その参照ＣＤＲと比較して単一アミノ酸置換によって異なり、かつ
前記軽鎖のＣＤＲは、配列番号2のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～116；または配列番号4のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～115；または配列番号6のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～115；または配列番号8のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～114；または配列番号10のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～115；または配列番号11のＩＭＧＴナンバリングによる残基27～38、残基56～65、および残基105～116に見出される参照生殖系列ＣＤＲと同一であるが、前記軽鎖ＣＤＲの少なくとも1つは、その参照ＣＤＲと比較して単一アミノ酸置換によって異なり、かつ
前記抗体組成物は、ＦＣＣ’鎖によって生成されるＰＤ－1面内のアミノ残基を含むエピトープに結合するが、配列番号ＸＸ中の非隣接アミノ酸を含むＰＤ－1のＣ’Ｄループと接触しない、
抗体組成物。
[本発明1024]
ヒトプログラム細胞死1（ＰＤ－1）タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片であって、
（ａ）配列番号17のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号19のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号21のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号24のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号26のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号28のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3、または、
（ｂ）配列番号31のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号33のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号35のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号37のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号39のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号41のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3、または、
（ｃ）配列番号43のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号45のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号47のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号49のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号51のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号53のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3、または、
（ｄ）配列番号55のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号57のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号59のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号61のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号63のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号65のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3、または、
（ｅ）配列番号67のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号69のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号71のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号73のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号75のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号77のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3、または、
（ｆ）配列番号17のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号19のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号21のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号24のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号80のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号28のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3、または、
（ｇ）配列番号17のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号19のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号79のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号24のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号26のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号28のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3、または、
（ｈ）配列番号78のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号19のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号21のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号24のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号26のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号28のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3、または、
（ｉ）配列番号78のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号19のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号21のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号24のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号80のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号28のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3、または、
（ｊ）配列番号78のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ1、配列番号19のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ2、配列番号79のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ3、配列番号24のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ1、配列番号80のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ2、および配列番号28のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ3
を含む、単離された抗体またはその断片。
[本発明1025]
配列番号1、3、5、7、9、12、13、および15からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号2、4、6、8、10、および11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＰＤ－1タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片。
[本発明1026]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号1と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号2と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1027]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号3と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号4と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1028]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号5と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号6と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1029]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号7と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号8と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1030]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号9と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号10と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1031]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号1と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号11と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1032]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号12と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号2と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1033]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号13と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号2と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1034]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号13と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号11と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1035]
重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号15と約95％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号11と約95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1036]
本発明1001、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、または1035の断片と、免疫細胞上の分子に対する特異性を有する第2の抗原結合断片とを含む、単離された二重特異性抗体。
[本発明1037]
前記分子は、Ｂ7Ｈ3、Ｂ7Ｈ4、ＣＤ27、ＣＤ28、ＣＤ40、ＣＤ40Ｌ、ＣＤ47、ＣＤ122、ＣＴＬＡ－4、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＬＡＧ－3、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ－40、ＯＸ40Ｌ、ＰＤ－1、ＴＩＭ3、4－1ＢＢ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＨＥＶＭ、ＢＴＬＡ、およびＫＩＲからなる群から選択される、本発明1036の二重特異性抗体。
[本発明1038]
前記断片および第2の断片のそれぞれは、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体から独立して選択される、本発明1036の二重特異性抗体。
[本発明1039]
Ｆｃ断片をさらに含む、本発明1036の二重特異性抗体。
[本発明1040]
本発明1001～1035のいずれかの抗体をコードする、核酸。
[本発明1041]
本発明1036～1039のいずれかに記載二重特異性抗体をコードする、核酸。
[本発明1042]
本発明1001～1035のいずれかの抗体またはその断片、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
[本発明1043]
少なくとも1つの追加の治療剤をさらに含む、本発明1042の医薬組成物。
[本発明1044]
前記治療剤は、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、またはサイトカインである、本発明1043の医薬組成物。
[本発明1045]
本発明1036～1039のいずれかの二重特異性抗体、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
[本発明1046]
少なくとも1つの追加の治療剤をさらに含む、本発明1045の医薬組成物。
[本発明1047]
前記治療剤は、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、またはサイトカインである、本発明1046の医薬組成物。
[本発明1048]
本発明1001～1035のいずれかの抗体またはその断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
[本発明1049]
本発明1036～1039のいずれかの二重特異性抗体またはその断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
[本発明1050]
本発明1040または1041の核酸を含む、ベクター。
[本発明1051]
本発明1050のベクターを含む、細胞。
[本発明1052]
本発明1042または1045の少なくとも1つの抗体組成物、対象に少なくとも1つの抗体を投与するための注射器、針、またはアプリケーター、および使用説明書を含む、キット。
[本発明1053]
キメラ抗原受容体を含む操作された細胞であって、前記キメラ抗原受容体は、癌細胞の表面上の抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含み、前記抗原はＰＤ－1を含む、操作された細胞。
[本発明1054]
前記細胞外リガンド結合ドメインは、抗体またはその断片を含む、本発明1053の操作された細胞。
[本発明1055]
前記抗体は、表1～11によるＶＨおよび／またはＶＬ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1053の操作された細胞。
[本発明1056]
前記抗体は、表12のＣＤＲ1、ＣＤＲ2、および／またはＣＤＲ3、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1054の操作された細胞。
[本発明1057]
前記操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞を含む、本発明1053の操作された細胞。
[本発明1058]
前記Ｔ細胞は、ＣＤ4＋、ＣＤ8＋、ＣＤ3＋ｐａｎＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせである、本発明1057の操作された細胞。
[本発明1059]
対象における癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、本発明1001～1039のいずれかの抗体、本発明1042～1046のいずれかの医薬組成物、または本発明1053～1058のいずれかのＣＡＲ組成物を含む組成物を投与することを含む、方法。
[本発明1060]
前記癌はＰＤ－1を発現する、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記癌は、非小細胞肺癌、黒色腫、卵巣癌、リンパ腫、または腎細胞癌を含む、本発明1059の方法。
[本発明1062]
化学療法剤を対象に投与することをさらに含む、本発明1059の方法。
本発明の他の目的および利点は、以下の記載から容易に明らかになるであろう。
（表１０Ａ）Ａｂ ＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ｍｕｔ２可変領域核酸配列
Figure 2022536370000101
（表１１Ａ）Ａｂ ＨＬｋｉｎ－１ ＨＬ－７ ＨＬ－１４ ｍｕｔ３可変領域核酸配列
Figure 2022536370000102
（表１３Ａ）ＰＤ－１抗体の重鎖（ＶＨ）フレームワーク領域（ＦＲ）
Figure 2022536370000103
（表１３Ｂ）ＰＤ－１抗体の軽鎖（ＶＬ）フレームワーク領域（ＦＲ）
Figure 2022536370000104

Claims (62)

  1. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ－１）タンパク質に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
    前記重鎖は、
    Ｇ－（Ｘ１）－ＴＦ－（Ｘ２Ｘ３）－Ｙ－（Ｘ４）（配列番号８１）、Ｇ－（Ｘ５）－ＴＦ－（Ｘ６Ｘ７Ｘ８）－Ａ（配列番号８２）、ＧＤＳＶＳＳＤＮＹＦ（配列番号４３）、またはＧＹＴＦＮＲＦＧ（配列番号５５）を含む、ＣＤＲ１、
    ＩＳＷＮＳＧＳＩ（配列番号１９）、ＩＹＰＤＤＳＤＴ（配列番号３３）、ＶＹＹＮＧＮＴ（配列番号４５）、ＴＮＰＹＮＧＮＴ（配列番号５７）、またはＩＳＹＤＧＳＮＫ（配列番号６９）を含む、ＣＤＲ２、
    ＡＳＤＹＧＤＫＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号２１）、ＡＦＷＧＡＳＧＡＰＶＮＧＦＤＩ（配列番号３５）、ＡＴＥＴＰＰＴＳＹＦＮＳＧＰＦＤＳ（配列番号４７）、ＡＲＶＶＡＶＮＧＭＤＶ（配列番号５９）、ＡＳＱＴＶＡＧＳＤＹ（配列番号７１）、またはＡＳＤＹＧＤＫＹＳＹＹＧＭＤＶ（配列番号７９）を含む、ＣＤＲ３、
    またはそれらのＣＤＲの組み合わせ
    を含み、かつ
    前記軽鎖は、
    ＳＳＮＩＧＳＮＴ（配列番号２４）、ＳＳＮＩＧＡＧＹＶ（配列番号３７）、ＳＮＮＶＧＡＨＧ（配列番号４９）、ＳＧＳＩＡＡＹＹ（配列番号６１）、またはＮＩＧＳＫＳ（配列番号７３）を含む、ＣＤＲ１、
    （Ｘ９）－ＤＮ（配列番号８３）、（Ｘ１０）－ＮＮ（配列番号８４）、またはＤＤＳ（配列番号７５）を含む、ＣＤＲ２、
    ＡＡＷＤＧＧＬＮＧＲＧＶ（配列番号２８）、ＡＡＷＤＤＳＬＮＡＰＶ（配列番号４１）、ＳＳＷＤＳＳＬＳＧＹＶ（配列番号５３）、ＱＳＹＤＳＳＮＬＷＶ（配列番号６５）、またはＱＶＷＨＳＶＳＤＱＧＶ（配列番号７７）を含む、ＣＤＲ３、
    またはそれらのＣＤＲの組み合わせ
    を含む、
    単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  2. 完全ヒトであるか、またはヒト化されている、請求項１に記載の抗体。
  3. 単一特異性、二重特異性、または多重特異性である、請求項１に記載の抗体。
  4. 単鎖抗体である、請求項１に記載の抗体。
  5. 少なくとも１．０×１０－６Ｍの結合親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
  6. 重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の抗体または断片。
  7. Ｘ１、Ｘ４、Ｘ５、またはＸ８は、非極性アミノ酸残基である、請求項１に記載の抗体。
  8. Ｘ１、Ｘ４、Ｘ５、またはＸ８は、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはアラニン（Ａ）である、請求項７に記載の抗体。
  9. Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、またはＸ８は、極性アミノ酸残基である、請求項１に記載の抗体。
  10. Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、またはＸ８は、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはトリプトファン（Ｗ）である、請求項９に記載の抗体。
  11. Ｘ１は、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）である、請求項１に記載の抗体。
  12. Ｘ２は、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）である、請求項１に記載の抗体。
  13. Ｘ３は、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）である、請求項１に記載の抗体。
  14. Ｘ４は、アラニン（Ａ）またはトリプトファン（Ｗ）である、請求項１に記載の抗体。
  15. Ｘ５は、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）である、請求項１に記載の抗体。
  16. Ｘ６は、アスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）である、請求項１に記載の抗体。
  17. Ｘ７は、アスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）である、請求項１に記載の抗体。
  18. Ｘ８は、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）である、請求項１に記載の抗体。
  19. Ｘ９は、極性親水性アミノ酸残基である、請求項１に記載の抗体。
  20. Ｘ９は、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）である、請求項１９に記載の抗体。
  21. Ｘ１０は、極性親水性アミノ酸残基である、請求項１に記載の抗体。
  22. Ｘ１０は、セリン（Ｓ）またはアルギニン（Ｒ）である、請求項２１に記載の抗体。
  23. 少なくとも１つの抗体を含む抗体組成物であって、前記少なくとも１つの抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、
    前記重鎖のＣＤＲは、配列番号１のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９；または配列番号３のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９；または配列番号５のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１２１；または配列番号７のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１５；または配列番号９のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１４；または配列番号１２のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９；または配列番号１３のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９；または配列番号１５のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１９に見出される参照生殖系列ＣＤＲと同一であるが、前記重鎖ＣＤＲの少なくとも１つは、その参照ＣＤＲと比較して単一アミノ酸置換によって異なり、かつ
    前記軽鎖のＣＤＲは、配列番号２のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１６；または配列番号４のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１５；または配列番号６のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１５；または配列番号８のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１４；または配列番号１０のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１５；または配列番号１１のＩＭＧＴナンバリングによる残基２７～３８、残基５６～６５、および残基１０５～１１６に見出される参照生殖系列ＣＤＲと同一であるが、前記軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つは、その参照ＣＤＲと比較して単一アミノ酸置換によって異なり、かつ
    前記抗体組成物は、ＦＣＣ’鎖によって生成されるＰＤ－１面内のアミノ残基を含むエピトープに結合するが、配列番号ＸＸ中の非隣接アミノ酸を含むＰＤ－１のＣ’Ｄループと接触しない、
    抗体組成物。
  24. ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ－１）タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片であって、
    （ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、または、
    （ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、または、
    （ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、または、
    （ｄ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、または、
    （ｅ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、または、
    （ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、または、
    （ｇ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、または、
    （ｈ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、または、
    （ｉ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、または、
    （ｊ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３
    を含む、単離された抗体またはその断片。
  25. 配列番号１、３、５、７、９、１２、１３、および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２、４、６、８、１０、および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合する単離された抗体またはその断片。
  26. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号１と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号２と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  27. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号３と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号４と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  28. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号５と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号６と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  29. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号７と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号８と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  30. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号９と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号１０と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  31. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号１と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号１１と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  32. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号１２と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号２と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  33. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号１３と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号２と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  34. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号１３と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号１１と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  35. 重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＤ－１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記重鎖は、配列番号１５と約９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖は、配列番号１１と約９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  36. 請求項１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５に記載の断片と、免疫細胞上の分子に対する特異性を有する第２の抗原結合断片とを含む、単離された二重特異性抗体。
  37. 前記分子は、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ１２２、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＬＡＧ－３、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ－４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、４－１ＢＢ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＨＥＶＭ、ＢＴＬＡ、およびＫＩＲからなる群から選択される、請求項３６に記載の二重特異性抗体。
  38. 前記断片および第２の断片のそれぞれは、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体から独立して選択される、請求項３６に記載の二重特異性抗体。
  39. Ｆｃ断片をさらに含む、請求項３６に記載の二重特異性抗体。
  40. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の抗体をコードする、核酸。
  41. 請求項３６～３９のいずれか一項に記載二重特異性抗体をコードする、核酸。
  42. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
  43. 少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
  44. 前記治療剤は、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、またはサイトカインである、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 請求項３６～３９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
  46. 少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. 前記治療剤は、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、またはサイトカインである、請求項４６に記載の医薬組成物。
  48. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
  49. 請求項３６～３９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
  50. 請求項４０または４１に記載の核酸を含む、ベクター。
  51. 請求項５０に記載のベクターを含む、細胞。
  52. 請求項４２または４５に記載の少なくとも１つの抗体組成物、対象に少なくとも１つの抗体を投与するための注射器、針、またはアプリケーター、および使用説明書を含む、キット。
  53. キメラ抗原受容体を含む操作された細胞であって、前記キメラ抗原受容体は、癌細胞の表面上の抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含み、前記抗原はＰＤ－１を含む、操作された細胞。
  54. 前記細胞外リガンド結合ドメインは、抗体またはその断片を含む、請求項５３に記載の操作された細胞。
  55. 前記抗体は、表１～１１によるＶＨおよび／またはＶＬ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５３に記載の操作された細胞。
  56. 前記抗体は、表１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５４に記載の操作された細胞。
  57. 前記操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞を含む、請求項５３に記載の操作された細胞。
  58. 前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋ｐａｎＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５７に記載の操作された細胞。
  59. 対象における癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、請求項１～３９のいずれか一項に記載の抗体、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項５３～５８のいずれか一項に記載のＣＡＲ組成物を含む組成物を投与することを含む、方法。
  60. 前記癌はＰＤ－１を発現する、請求項５９記載の方法。
  61. 前記癌は、非小細胞肺癌、黒色腫、卵巣癌、リンパ腫、または腎細胞癌を含む、請求項５９に記載の方法。
  62. 化学療法剤を対象に投与することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
JP2021573797A 2019-06-14 2020-06-15 Ｐｄ－１に対する抗体およびその使用方法 Pending JP2022536370A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962861643P 2019-06-14 2019-06-14
US62/861,643 2019-06-14
PCT/US2020/037781 WO2020252471A1 (en) 2019-06-14 2020-06-15 Antibodies against pd-1 and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022536370A true JP2022536370A (ja) 2022-08-15
JPWO2020252471A5 JPWO2020252471A5 (ja) 2023-06-21

Family

ID=73781315

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021573797A Pending JP2022536370A (ja) 2019-06-14 2020-06-15 Ｐｄ－１に対する抗体およびその使用方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220275088A1 (ja)
EP (1) EP3982997A4 (ja)
JP (1) JP2022536370A (ja)
AU (1) AU2020290971A1 (ja)
CA (1) CA3141628A1 (ja)
WO (1) WO2020252471A1 (ja)

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2041177T3 (pl) * 2006-06-02 2012-09-28 Regeneron Pharma Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu receptorowi IL 6
WO2010041060A1 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 Medimmune Limited Targeted binding agents directed to heparanase and uses thereof 463
JO3182B1 (ar) * 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
EP2284193A1 (en) * 2009-08-10 2011-02-16 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody against S. aureus derived apha-toxin and its use in treating or preventing abscess formation
SG11201401791WA (en) * 2011-10-24 2014-08-28 Abbvie Inc Immunobinders directed against sclerostin
TWI681969B (zh) * 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
WO2017024515A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 Wuxi Biologics (Cayman) Inc. Novel anti-pd-1 antibodies
CN107949573B (zh) * 2015-09-01 2022-05-03 艾吉纳斯公司 抗-pd-1抗体及其使用方法
RU2656181C1 (ru) * 2016-07-13 2018-05-31 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Анти-pd-1-антитела, способ их получения и способ применения
JP2019531708A (ja) * 2016-08-12 2019-11-07 エックスフォー・ファーマシューティカルズ（オーストリア）ゲーエムべーハー クレブシエラ・ニューモニエｏ３特異的抗体
EP3609915A1 (en) * 2017-04-12 2020-02-19 Pfizer Inc Antibodies having conditional affinity and methods of use thereof
US20200354460A1 (en) * 2017-09-29 2020-11-12 Wuxi Biologics Ireland Limited. Bispecific antibodies against EGFR and PD-1
US20220047634A1 (en) * 2018-11-30 2022-02-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Chimeric antigen receptor factories and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA3141628A1 (en) 2020-12-17
EP3982997A1 (en) 2022-04-20
WO2020252471A1 (en) 2020-12-17
US20220275088A1 (en) 2022-09-01
AU2020290971A1 (en) 2021-12-23
EP3982997A4 (en) 2023-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102340832B1 (ko) 항 pd-1 항체 및 그의 용도
AU2018226425B2 (en) Human Monoclonal Anti-PD-L1 Antibodies and Methods of Use
JP6704954B2 (ja) 親和性成熟抗ｃｃｒ４ヒト化モノクローナル抗体および使用法
CN113286634A (zh) 对gucy2c特异性的抗体及其用途
KR20170062485A (ko) 글루코코티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체(gitr) 항체 및 이의 사용 방법
AU2024200994A1 (en) Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) antibodies and methods of use thereof
US20240254234A1 (en) PD-L1xCD28 BISPECIFIC ANTIBODIES FOR IMMUNE CHECKPOINT-DEPENDENT T CELL ACTIVATION
JP2022536913A (ja) Ｐｄ－１に対する抗体およびその使用方法
JP2023504271A (ja) Ｐｄ－ｌ１に対する抗体およびその使用方法
JP2022536370A (ja) Ｐｄ－１に対する抗体およびその使用方法
JP2024541476A (ja) Ｃｔｌａ－４に対する抗体及びその使用方法
KR20240123846A (ko) Ctla-4에 대한 항체 및 이의 사용 방법
WO2024039670A1 (en) Antibodies against cldn4 and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220603

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230613

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230613

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20230707

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240530

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240828

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240917