JP2022535063A

JP2022535063A - 免疫原性血清型３５ｂ肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲート及びそれを作成するためのコンジュゲーションプロセス

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Publication number: JP2022535063A
Application number: JP2021571698A
Authority: JP
Inventors: ヘ，ジアン; マクヒュー，パトリック; フィリップス，キャサリン・エム; サンティアゴ－ミランダ，アドリアナ・エヌ
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2022-08-04
Also published as: EP3980055A1; EP3980055A4; WO2020247299A1; CN114025790A; AU2020286360A1; BR112021024393A8; KR20220017996A; BR112021024393A2; MX2021014710A; US20220233674A1; CA3142692A1

Abstract

本発明は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３５Ｂからの莢膜多糖類の担体タンパク質へのコンジュゲーションに関連するプロセスの改善を提供する。開示されているプロセスによって調製された血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質コンジュゲートは、とりわけ、従来技術の方法によって作製された同様のコンジュゲートよりも免疫原性が高い。本発明のプロセスを使用して調製された肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質コンジュゲートは、多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物の中に含ませることができる。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３５Ｂからの莢膜多糖類の担体タンパク質へのコンジュゲーションに関連するプロセスの改善を提供する。開示されているプロセスによって調製された血清型３５Ｂ多糖類－担体タンパク質コンジュゲートは、とりわけ、従来技術の方法によって作製された同様のコンジュゲートよりも免疫原性が高い。本発明のプロセスを使用して調製された肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類－担体タンパク質コンジュゲートは、多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物の中に含ませることができる。

被包性細菌の一例である肺炎レンサ球菌は、世界的に深刻な疾患の重要な原因である。１９９７年、疾病予防管理センター（ＣＤＣ）は、米国内で、毎年、３，０００例の肺炎球菌性髄膜炎、５０，０００例の肺炎球菌性菌血症、７，０００，０００例の肺炎球菌性中耳炎及び５００，０００例の肺炎球菌性肺炎があると推定した。「ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲＭｏｒｂＭｏｒｔａｌＷｋｌｙＲｅｐ１９９７，４６（ＲＲ－８）：１－１３」を参照されたい。さらに、これらの疾患の合併症は重大である可能性があり、いくつかの研究では、肺炎球菌性髄膜炎による最大で８％の死亡率と２５％の神経学的後遺症を報告している。「Ａｒｄｉｔｉｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ１０２：１０８７－９７」を参照されたい。

長年にわたって認可されてきた多価肺炎球菌多糖類ワクチンは、成人、特に高齢者及び高リスクの成人における、肺炎球菌性疾患の予防において非常に貴重であることが分かっている。しかしながら、乳児及び幼児は、非コンジュゲート肺炎球菌多糖類への反応が不充分である。細菌の多糖類は、Ｔ細胞非依存性の免疫原であり、乳児においては反応が弱くしか誘発されないか又は全く誘発されない。細菌多糖免疫原の担体タンパク質への化学的コンジュゲーションは、乳児において、免疫応答をＴ細胞依存性に変換させる。ジフテリアトキソイド（ＤＴｘ、ＤＴの化学的に無毒化されたバージョン）及びＣＲＭ１９７は、それらのアミノ酸配列中にＴ細胞刺激エピトープが存在していることに起因して、細菌多糖免疫原のための担体タンパク質として記載されている。

当時、幼児及び乳児において侵襲性肺炎球菌性疾患を引き起こす最も頻繁に分離された７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、及び、２３Ｆ）を含んでいる肺炎球菌コンジュゲートワクチン、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）は、２０００年２月に米国で最初に認可された。米国内でＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）が広く使用された後、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）内に存在している血清型によって、小児の侵襲性肺炎球菌性疾患が著しく低減した。「ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲＭｏｒｂＭｏｒｔａｌＷｋｌｙＲｅｐ２００５，５４（３６）：８９３－７」を参照されたい。しかしながら、世界の特定の地域ではＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）による血清型の範囲に限界があり、及び、米国内では特定の新しい血清型に関するいくつかの証拠が存在している（例えば、１９Ａなど）。「Ｏ’Ｂｒｉｅｎｅｔａｌ．，２００４，ＡｍＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ１５９：６３４－４４」、「Ｗｈｉｔｎｅｙｅｔａｌ．，２００３，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３４８：１７３７－４６」、「Ｋｙａｗｅｔａｌ．，２００６，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３５４：１４５５－６３」、「Ｈｉｃｋｓｅｔａｌ．，２００７，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１９６：１３４６－５４」、「Ｔｒａｏｒｅｅｔａｌ．，２００９，ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓ４８：Ｓ１８１－Ｓ１８９」を参照されたい。

Ｐｒｅｖｎａｒ１３（登録商標）は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆを含んでいる１３価の肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートワクチンである。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００６／０２２８３８０Ａ１、「Ｐｒｙｍｕｌａｅｔａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ３６７：７４０－４８」及び「Ｋｉｅｎｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＳａｆｅｔｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃＮｏｎ－ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙｏｆ１３－ｖａｌｅｎｔＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌＣｏｎｊｕｇａｔｅＶａｃｃｉｎｅＣｏｍｐａｒｅｄｔｏ７－ｖａｌｅｎｔＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌＣｏｎｊｕｇａｔｅＶａｃｃｉｎｅＧｉｖｅｎａｓａ４－ＤｏｓｅＳｅｒｉｅｓｉｎＨｅａｌｔｈｙＩｎｆａｎｔｓａｎｄＴｏｄｄｌｅｒｓ，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄａｔｔｈｅ４８^ｔｈＡｎｎｕａｌＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ４６^ｔｈＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２５－２８，２００８」を参照されたい。さらにまた、「Ｄａｇａｎｅｔａｌ．，１９９８，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．６６：２０９３－２０９８」及び「Ｆａｔｔｏｍ，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ１７：１２６」も参照されたい。しかしながら、世界の特定の地域ではＰｒｅｖｎａｒ１３（登録商標）による血清型の範囲に限界があり、及び、米国内では特定の新しい血清型に関するいくつかの証拠が存在している（例えば、血清型３５Ｂ）。「Ｏ’Ｂｒｉｅｎｅｔａｌ．，２００４，ＡｍＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ１５９：６３４－４４」、「Ｗｈｉｔｎｅｙｅｔａｌ．，２００３，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３４８：１７３７－４６」、「Ｋｙａｗｅｔａｌ．，２００６，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３５４：１４５５－６３」、「Ｈｉｃｋｓｅｔａｌ．，２００７，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１９６：１３４６－５４」、「Ｔｒａｏｒｅｅｔａｌ．，２００９，ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓ４８：Ｓ１８１－Ｓ１８９」、「Ｏｌａｒｔｅｅｔａｌ．，２０１７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５５：７２４－７３４」を参照されたい。

米国特許出願公開第ＵＳ２００６／０２２８３８０Ａ１

ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲＭｏｒｂＭｏｒｔａｌＷｋｌｙＲｅｐ１９９７，４６（ＲＲ－８）：１－１３Ａｒｄｉｔｉｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ１０２：１０８７－９７ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲＭｏｒｂＭｏｒｔａｌＷｋｌｙＲｅｐ２００５，５４（３６）：８９３－７Ｏ’Ｂｒｉｅｎｅｔａｌ．，２００４，ＡｍＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ１５９：６３４－４４Ｗｈｉｔｎｅｙｅｔａｌ．，２００３，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３４８：１７３７－４６Ｋｙａｗｅｔａｌ．，２００６，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３５４：１４５５－６３Ｈｉｃｋｓｅｔａｌ．，２００７，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１９６：１３４６－５４Ｔｒａｏｒｅｅｔａｌ．，２００９，ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓ４８：Ｓ１８１－Ｓ１８９Ｐｒｙｍｕｌａｅｔａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ３６７：７４０－４８Ｋｉｅｎｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＳａｆｅｔｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃＮｏｎ－ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙｏｆ１３－ｖａｌｅｎｔＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌＣｏｎｊｕｇａｔｅＶａｃｃｉｎｅＣｏｍｐａｒｅｄｔｏ７－ｖａｌｅｎｔＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌＣｏｎｊｕｇａｔｅＶａｃｃｉｎｅＧｉｖｅｎａｓａ４－ＤｏｓｅＳｅｒｉｅｓｉｎＨｅａｌｔｈｙＩｎｆａｎｔｓａｎｄＴｏｄｄｌｅｒｓ，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄａｔｔｈｅ４８ｔｈＡｎｎｕａｌＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ４６ｔｈＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２５－２８，２００８Ｄａｇａｎｅｔａｌ．，１９９８，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．６６：２０９３－２０９８Ｆａｔｔｏｍ，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ１７：１２６Ｏｌａｒｔｅｅｔａｌ．，２０１７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５５：７２４－７３４

現在の多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、そのワクチン内に存在している血清型に関連する肺炎球菌性疾患の発生率を低減させるのに効果的であった。しかしながら、上記で述べたように、該ワクチン内に存在しない血清型を発現する肺炎球菌の有病率は増加している。新たな血清型に関するプロセス条件は、コンジュゲーション効率に関して各血清型について確認されるべきである。特定の血清型（これは、血清型３５Ｂを包含する）は、その独特の構造のために、特有の課題を提示する。従って、免疫原性血清型３５Ｂ多糖類－担体タンパク質コンジュゲート及びそれを作成するための改善されたプロセスが求められている。

本発明は、免疫原性血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲート及びそれを調製するためのプロセスを提供する。

一実施形態では、本発明は、１，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを提供する。

別の実施形態では、本発明は、１，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを提供し、ここで、該コンジュゲートは、３ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質～９ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質のリシン消費を含んでいる。

別の実施形態では、本発明は、１，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを提供し、ここで、該コンジュゲートは、４ｍｏｌ／ｍｏｌ担体タンパク質～８ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質のリシン消費を含んでいる。

一実施形態では、本発明は、１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを提供する。

別の実施形態では、本発明は、１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを提供し、ここで、該コンジュゲートは、３ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質～９ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質のリシン消費を含んでいる。

別の実施形態では、本発明は、１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを提供し、ここで、該コンジュゲートは、４ｍｏｌ／ｍｏｌ担体タンパク質～８ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質のリシン消費を含んでいる。

別の実施形態では、本発明は、上記コンジュゲートを含んでいる組成物を提供し、ここで、該組成物は、さらに、総多糖類量の３０％未満の遊離多糖類及び総タンパク質量の３０％未満の遊離タンパク質を含んでいる。

別の実施形態では、本発明は、上記コンジュゲートを含んでいる組成物を提供し、ここで、該組成物は、さらに、総多糖類量の２０％未満の遊離多糖類及び総タンパク質量の２０％未満の遊離タンパク質を含んでいる。

上記コンジュゲートの別の態様において、該血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートのタンパク質は、ＣＲＭ１９７である。

上記組成物の別の態様において、該多糖類－タンパク質コンジュゲートのタンパク質は、ＣＲＭ１９７である。

一実施形態では、本発明は、上記血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを作成するためのプロセスも提供し、ここで、該プロセスは、該多糖類を活性化させることを含んでおり、ここで、該活性化は、多糖類反復単位１モルあたり０．０１～０．１モルの過ヨウ素酸塩の範囲内の過ヨウ素酸塩を使用する。別の実施形態では、過ヨウ素酸塩の該範囲は、多糖類反復単位１モルあたり０．０３～０．０６モルの過ヨウ素酸塩である。

別の実施形態では、本発明は、上記免疫原性血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを作成するためのプロセスを提供し、ここで、該プロセスは、該多糖類を該タンパク質にコンジュケートさせることを含んでおり、ここで、該コンジュゲーションは、２２℃～３８℃のコンジュゲーション温度で実施する。別の実施形態では、該コンジュゲーション温度は、３２℃～３６℃である。

別の実施形態では、本発明は、上記血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを調製するためのプロセスを提供し、ここで、該プロセスは、（ｉ）該多糖類を活性化させること（ここで、該活性化は、多糖類反復単位１モルあたり０．０１～０．１モルの過ヨウ素酸塩の範囲内の過ヨウ素酸塩を使用する）、及び、（ｉｉ）該多糖類を該タンパク質にコンジュゲートさせること（ここで、該コンジュゲーションは、２２℃～３８℃のコンジュゲーション温度で実施する）、を含んでいる。

別の実施形態では、本発明は、プロセスを提供し、ここで、該多糖類の活性化は、多糖類反復単位１モルあたり０．０３～０．０６モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムの範囲内の過ヨウ素酸塩を使用する。

別の実施形態では、本発明は、プロセスを提供し、ここで、該コンジュゲーション温度は、３２℃～３６℃である。

別の実施形態では、本発明は、多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供し、ここで、該組成物は、上記コンジュゲートの実施形態において提供されている血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを含んでいる。

別の実施形態では、本発明は、上記血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを調製するプロセスを提供し、ここで、該多糖類は、非プロトン性溶媒の中で該タンパク質にコンジュゲートさせる。さらなる実施形態では、該非プロトン性溶媒は、ＤＭＳＯである。別の実施形態では、該ＤＭＳＯ溶媒は、１．２％（ｖ／ｖ）未満の水を含んでいる。別の実施形態では、該ＤＭＳＯ溶媒は、０．６％（ｖ／ｖ）未満の水を含んでいる。別の実施形態では、該ＤＭＳＯ溶媒は、０．３％（ｖ／ｖ）未満の水を含んでいる。

別の実施形態では、本発明は、上記血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを調製するためのプロセスを提供し、ここで、該多糖類の該タンパク質へのコンジュゲーションは、塩化ナトリウムの存在下で実施する。さらなる実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は、約５～１５ｍＭである。

８種類の異なる製剤からの３５Ｂ－ＣＲＭ１９７ワクチンの免疫原性、（Ａ）抗ＰｎＰｓ３５ＢＩｇＧ力価（Ｂ）抗３５ＢＯＰＡ力価。エラーバーは、ＧＭＴの９５％信頼区間を表している。

肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ莢膜多糖類は、多糖鎖の骨格内に活性化部位を含んでいる複合分子である。過ヨウ素酸塩による活性化中に、非環式トリオールが酸化されて反応性アルデヒドになるので、多糖類の主鎖が開裂される。これにより、反応性アルデヒドの数が増えるにつれて多糖類のＭｗが減少し、有効な活性化範囲が制限される。活性化中に生成される末端アルデヒドは、担体タンパク質との多糖体架橋の程度をさらに制限し、それによって低Ｍｗコンジュゲートをもたらす。

この構造の複雑さのために、血清型３５Ｂ多糖類をコンジュゲートさせる努力は、従来の活性化及びコンジュゲーションプロセスを利用する場合、限られた成功しか収められていない。例えば、他の肺炎レンサ球菌血清型からの多糖類に使用される標準的な範囲の過ヨウ素酸塩で血清型３５Ｂ多糖類を活性化させると、小さすぎるコンジュゲートになる。さらに、コンジュゲーション反応において使用される典型的なＰｓ：Ｐｒ（多糖類と担体タンパク質の比率）、多糖類濃度、担体タンパク質濃度及び温度範囲は、低いコンジュゲートＭｗ、低いリシン消費量並びに高い遊離Ｐｓ及び担体タンパク質などの不充分なコンジュゲート属性をもたらした。

免疫原性血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質コンジュゲートを生成させる活性化段階に関して、過ヨウ素酸塩の好ましい範囲が確認された。好ましい過ヨウ素酸塩範囲未満で活性化させた場合、所望のサイズを有する多糖類－タンパク質コンジュゲートが得られたが、コンジュゲーションに利用可能なアルデヒドを欠いているため、低リシン消費、高遊離タンパク質及び高遊離多糖類などの不充分なコンジュゲート属性がもたらされた。好ましい過ヨウ素酸塩範囲を超えて活性化させた場合、活性化反応中の多糖類サイズの減少の程度に起因して、免疫原性である可能性が低い低Ｍｗコンジュゲートが生じた。

さらに、肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類が該コンジュゲーション反応中における水分含有量に対して感受性であること、及び、該コンジュゲーション反応が阻害され得ることが確認された。水は、タンパク質と多糖類の凝集を促進することによって、血清型３５Ｂ多糖類コンジュゲーション反応を妨害する。有機コンジュゲーション反応では、塩や還元剤などの追加の成分を反応に加えるときに水を導入することができる。本明細書中に提示されている本発明は、弱い還元剤を排除すること及び前凍結乾燥製剤中に塩化ナトリウムを含ませることによる、コンジュゲーション反応中における水分含有量を低減させる方法を提供する。さらに、タンパク質及び多糖類の前凍結乾燥製剤を共凍結乾燥製剤の中に一緒に組み込ませた。これにより、多糖類とタンパク質の混合がなくなり、溶解直後にコンジュゲーションが初期化され、及び、空気中の水分の吸収が低減し、さらに、当該反応中の含水量が制限される。

改善されたコンジュゲート属性を有する免疫原性血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質コンジュゲートを生成する、肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類コンジュゲーション反応に関する好ましい温度範囲が特定された。この好ましい範囲より低い温度でのコンジュゲーションでは、反応速度の低下により、コンジュゲート属性が不充分な（特に、遊離Ｐｓが多い）小さなコンジュゲートが生じた。当該コンジュゲーション反応に関して好ましい温度範囲を超える温度では、タンパク質の安定性が不充分になり、そして、タンパク質が凝集する可能性があった。

本明細書中で使用されている場合、用語「担体タンパク質」は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＴＴ（破傷風トキソイド）又はＣＲＭ１９７を示している。「担体タンパク質」は「タンパク質」とも称される。好ましい実施形態では、「担体タンパク質」は、ＣＲＭ１９７を意味する。

本明細書中で使用されている場合、用語「遊離タンパク質」は、当該組成物中に存在しているが、多糖類に共有結合はしていないタンパク質を意味する。用語「複合タンパク質（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｐｒｏｔａｉｎ）」は、多糖類に共有結合しているタンパク質を意味する。用語「総タンパク質」は、遊離タンパク質及び複合タンパク質を含包含する、当該組成物中に存在する全てのタンパク質を意味する。

本明細書中で使用されている場合、用語「多糖類」（Ｐｓ）は、肺炎レンサ球菌莢膜多糖類を示している。用語「遊離多糖類」は、当該組成物中に存在しているが、担体タンパク質に共有結合はしていない多糖類を意味する。用語「複合多糖類（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」は、タンパク質に共有結合している多糖類を意味する。用語「全多糖類」は、遊離多糖類及び複合多糖類を包含する、当該組成物中に存在する全ての多糖類を意味する。

本明細書中で使用されている場合、「過ヨウ素酸塩」には、過ヨウ素酸塩及び過ヨウ素酸の両方が包含される。この用語には、さらに、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４－）及びオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６－）の両方も包含され、並びに、過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム及び過ヨウ素酸カリウム）も包含される。好ましい実施形態では、「過ヨウ素酸塩」は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを示している。

本明細書中で使用されている場合、用語「Ｍｗ」は、重量平均分子量を示しており、そして、典型的には、Ｄａ又はｋＤａで表される。Ｍｗは、大きな分子が小さな分子よりも多くのポリマーサンプル総質量をふくんでいることを考慮に入れている。Ｍｗは、静的光散乱、小角中性子散乱、Ｘ線散乱及び沈降速度などの技術で測定することができる。

本明細書中で使用されている場合、用語「Ｍｎ」は、数平均分子量を示しており、そして、典型的には、Ｄａ又はｋＤａで表される。Ｍｎは、サンプルの総重量をサンプル内の分子数で除して計算され、そして、ゲル浸透クロマトグラフィー、（マルク－ホウインクの式）による粘度測定、束一的方法（例えば、蒸気圧浸透圧測定）、末端基定量又はプロトンＮＭＲなどの技術で測定することができる。Ｍｗ／Ｍｎは、多分散性を反映している。

本明細書中で使用されている場合、用語「Ｐｓ：Ｐｒ」は、多糖類－タンパク質コンジュゲート内の多糖類とタンパク質の質量対質量比を示している。Ｐｓ：Ｐｒは、コンジュゲーション反応に装入された多糖類とタンパク質の質量によって直接影響される。Ｐｓ：Ｐｒは、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイで測定することができる。本発明の一実施形態では、血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質コンジュゲートに関するＰｓ：Ｐｒ比は、０．５～２．０の範囲内にある。

本明細書中で使用されている場合、本発明の免疫原性組成物及び／又は多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンと一緒に使用される場合の用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、アジュバント及び賦形剤などの他の任意の成分（抗原混合物に関する用語「からなる」の制限に従う）を包含することを示している。多価多糖類－タンパク質コンジュゲート混合物と一緒に使用される場合の用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」は、それらの特定の肺炎レンサ球菌多糖類タンパク質コンジュゲートを有しているが、異なる血清型からの他の肺炎レンサ球菌多糖類タンパク質コンジュゲートは有していない混合物を示している。

本明細書中で使用されている場合、用語「活性化段階」は、血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類上の隣接するジオールを酸化剤と反応させて反応性アルデヒドを形成させるプロセスを示している。

本明細書中で使用されている場合、用語「コンジュゲーション段階」は、血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類上の反応性アルデヒドを担体タンパク質上のリシン基に還元的アミノ化を使用してコンジュゲートさせるプロセスを示している。

別途明記されていない限り、本明細書中に記載されている全ての範囲は、記載されている下限と上限を含んでいる。

定義及び略語
本明細書及び添付されている特許請求の範囲の全体をとおして使用されているように、以下の略語が適用される：

多価肺炎球菌多糖類コンジュゲートワクチンを作成するための一般的な方法
莢膜多糖類
細菌莢膜多糖類、特に抗原として使用されてきた細菌莢膜多糖類は、本発明において使用するのに適しており、そして、免疫原性及び／又は抗原性多糖類を識別するための方法によって容易に確認することができる。肺炎レンサ球菌由来の細菌莢膜多糖類の例は、以下の血清型である：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０（２０Ａ及び２０Ｂ）、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ、３５Ｆ又は３８。

多糖類は、既知技術によって精製することができる。本発明は、天然源から精製された多糖類に限定されないが、多糖類は、全合成又は部分合成などの他の方法によって得ることができる。肺炎レンサ球菌由来の莢膜多糖類は、当業者には既知の標準的な技術によって調製することができる。例えば、多糖類は、既知方法によって、細菌から分離することが可能であり、及び、ある程度サイジングすることができる（例えば、欧州特許番号ＥＰ４９７５２４及びＥＰ４９７５２５を参照されたい）；そして、好ましくは、ホモジナイザーを使用して達成されるマイクロ流動化によって、又は、化学的加水分解によって、分離及びサイジングすることができる。各多糖血清型に対応する肺炎レンサ球菌株は、ダイズベースの培地で増殖させることができる。次いで、個々の多糖類は、遠心分離、沈澱及び限外濾過などの標準的な段階をとおして精製することができる。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２８６８３８号及び米国特許第５，８４７，１１２号を参照されたい。多糖類は、粘度を下げるために、及び／又は、濾過性とその後のコンジュゲートされた製品のロット間の一貫性を改善するために、サイジングすることが可能である。

精製された多糖類は、標準的な技術を使用して、化学的に活性化させて担体タンパク質と反応することが可能な官能性を導入することができる。多糖類の化学的活性化及びその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、第４，６７３，５７４号及び第４，９０２，５０６号に記載されている方法によって達成される。簡潔に言えば、肺炎球菌多糖類を過ヨウ素酸塩ベースの酸化剤（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム又は過ヨウ素酸）と反応させ、それによって、隣接するヒドロキシル基の酸化的開裂をもたらして反応性アルデヒド基を生成させる。過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、メタ過ヨウ素酸ナトリウムなど）の適切なモル当量には、０．０５～０．５モル当量（過ヨウ素酸塩と多糖の反復単位のモル比）又は０．１～０．５モル当量が包含される。過ヨウ素酸塩の反応は、過ヨウ素酸ナトリウムへの反応性ヒドロキシル基の接触性を制御するジオールのコンフォメーション（例えば、非環式ジオール、シスジオール、トランスジオール）に応じて、３０分から２４時間まで変化させることができる。

用語「過ヨウ素酸塩（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）」には、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方が包含される；この用語には、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ^４－）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ^６－）の両方も包含され、そして、過ヨウ素酸塩のさまざまな塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム及び過ヨウ素酸カリウム）が包含される。莢膜多糖類は、メタ過ヨウ素酸塩の存在下で、又は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）の存在下で、酸化され得る。さらに、莢膜多糖類は、オルト過ヨウ素酸塩の存在下で、又は、過ヨウ素酸の存在下で、酸化され得る。

精製された多糖類も、リンカーに連結させることができる。各莢膜多糖は、活性化されるか又はリンカーに連結されたら、担体タンパク質に別々にコンジュゲートさせて、複合多糖を形成させることができる。多糖類コンジュゲートは、既知カップリング技術によって調製することができる。

多糖をリンカーにカップリングさせて、リンカーの遊離末端がエステル基である多糖－リンカー中間体を形成させることができる。従って、当該リンカーは、少なくとも１つの末端がエステル基であるリンカーである。もう一方の末端は、多糖と反応して多糖－リンカー中間体を形成できるように選択される。

多糖類は、その多糖内の第一級アミン基を使用してリンカーにカップリングさせることが可能である。この場合、該リンカーは、典型的には、両方の末端にエステル基を有している。これにより、求核アシル置換反応によって該エステル基の１方を多糖類の第一級アミン基と反応させることでカップリングを行うことが可能になる。該反応によって、多糖がアミド結合を介してリンカーにカップリングしている多糖－リンカー中間体が生じる。従って、該リンカーは、多糖類内の第一級アミン基と反応するための第１のエステル基及び担体分子内の第一級アミン基と反応するための第二のエステル基を提供する二官能性リンカーである。典型的なリンカーは、アジピン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）である。

該カップリングは、間接的に実施することも可能であり、即ち、リンカーにカップリングさせる前に多糖類を誘導体化するために使用される追加のリンカーを用いて行うことも可能である。

多糖類は、その多糖の還元末端にあるカルボニル基を使用して、追加のリンカーにカップリングさせることができる。このカップリングは、以下の２つの段階を含んでいる：（ａ１）カルボニル基を追加のリンカーと反応させる段階；及び、（ａ２）該追加のリンカーの遊離末端を前記リンカーと反応させる段階。これらの実施形態では、該追加のリンカーは、典型的には、両方の末端に第一級アミン基を有しており、それにより、該第一級アミン基の１方を還元的アミノ化によって多糖内のカルボニル基と反応させることで、段階（ａ１）を実施することが可能になる。該多糖類内のカルボニル基と反応し得る第一級アミン基を使用する。ヒドラジド基又はヒドロキシルアミノ基が適している。同一の第一級アミン基は、典型的には、多糖（Ｐｓ）－Ｐｓカップリングの可能性を可能にする追加のリンカーの両方の末端に存在する。該反応は、当該多糖類がＣ－Ｎ結合を介して追加のリンカーにカップリングされる多糖－追加のリンカー中間体をもたらす。

多糖類は、その多糖内の異なる基（特に、カルボキシル基）を使用して、追加のリンカーにカップリングさせることができる。このカップリングは、以下の２つの段階を含んでいる：（ａ１）当該基を追加のリンカーと反応させる段階；及び、（ａ２）該追加のリンカーの遊離末端を前記リンカーと反応させる段階。この場合、該追加のリンカーは、典型的には、両方の末端に第一級アミン基を有しており、それにより、該第一級アミン基の１方をＥＤＡＣ活性化によって多糖内のカルボキシル基と反応させることで、段階（ａ１）を実施することが可能になる。該多糖類内のＥＤＡＣ活性化されたカルボキシル基と反応し得る第一級アミン基を使用する。ヒドラジド基が適している。同一の第一級アミン基は、典型的には、追加のリンカーの両方の末端に存在する。該反応は、当該多糖類がアミド結合を介して追加のリンカーにカップリングされる多糖－追加のリンカー中間体をもたらす。

担体タンパク質
本発明の特定の実施形態では、ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用する。ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素の無毒性変異体（即ち、トキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸及び酵母エキスベースの培地内で増殖させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）Ｃ７株（β１９７）の培養物から分離することができる。さらに、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載されている方法に従って組換え的に調製することができる。典型的には、ＣＲＭ１９７は、限外濾過と硫酸アンモニウム沈澱とイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって精製される。一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、ＰｆｅｎｅｘＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ^ＴＭ（ＰｆｅｎｅｘＩｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）において調製される。

別の適切な担体タンパク質としては、さらなる不活性化細菌毒素、例えば、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＴＴ（破傷風トキソイド）又はＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０８３２５１号に記載されている）、Ｅ．ｃｏｌｉＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉＳＴ、及び、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のエキソトキシンＡなどがある。細菌外膜タンパク質、例えば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン類、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ；国際出願特許公開第ＷＯ０２／０９１９９８号を参照されたい）、肺炎球菌表面アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、グループＡ若しくはグループＢのストレプトコッカスに由来するＣ５ａペプチダーゼ、又は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏｅｔａｌ．，１９９５，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ６３；２７０６－１３）〔これは、何らかの方法で無毒化されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（国際特許出願公開第ＷＯ０４／０８１５１５号を参照されたい）又はｄＰＬＹ－ｆｏｒｍｏｌを包含する〕、ＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、及び、Ｐｈｔタンパク質の融合物、例えば、ＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物）（国際特許出願公開第ＷＯ０１／９８３３４号及び第ＷＯ０３／５４００７号を参照されたい）なども使用することもできる。別のタンパク質、例えば、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（Ｎ．メニンギチジス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ；例えば、欧州特許第ＥＰ０５９４６１０Ｂ号を参照されたい）又はそれらの免疫学的に機能的な同等物、合成ペプチド（欧州特許第ＥＰ０３７８８８１号及び第ＥＰ０４２７３４７号を参照されたい）、熱ショックタンパク質（国際特許出願公開第ＷＯ９３／１７７１２号及び第ＷＯ９４／０３２０８号を参照されたい）、百日咳タンパク質（国際特許出願公開第ＷＯ９８／５８６６８号及び欧州特許第ＥＰ０４７１１７７号を参照されたい）、サイトカイン類、リンホカイン類、成長因子又はホルモン類（国際特許出願公開第ＷＯ９１／０１１４６号を参照されたい）、さまざまな病原体に由来する抗原からの複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含んでいる人工タンパク質（「Ｆａｌｕｇｉｅｔａｌ．，２００１，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ３１：３８１６－３８２４」を参照されたい）、例えば、Ｎ１９タンパク質（「Ｂａｒａｌｄｏｉｅｔａｌ．，２００４，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ７２：４８８４－７」を参照されたい）、鉄取り込みタンパク質（国際特許出願公開第ＷＯ０１／７２３３７号を参照されたい）、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素Ａ若しくは毒素Ｂ（国際特許公開第ＷＯ００／６１７６１号を参照されたい）、及び、フラジェリン（「Ｂｅｎ－Ｙｅｄｉｄｉａｅｔａｌ．，１９９８，ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ６４：９」を参照されたい）なども、担体タンパク質として使用することができる。

多価ワクチンを使用する場合、第２の担体は、多価ワクチン中の１以上の抗原に対して使用することができる。該第２の担体タンパク質は、好ましくは、無毒性で無反応原性（ｎｏｎ－ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）であり且つ充分な量及び純度で入手可能なタンパク質である。該第２の担体タンパク質を、さらに、抗原（例えば、肺炎レンサ球菌多糖類）とコンジュゲーション又は結合させて、抗原の免疫原性を増強させる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に従うべきである。第１の担体タンパク質にコンジュゲートしていない各莢膜多糖類は、同じ第２の担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる（例えば、各莢膜多糖分子は、単一の担体タンパク質にコンジュゲートしている）。第１の担体タンパク質にコンジュゲートしていない莢膜多糖は、２以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる（各莢膜多糖分子は、単一の担体タンパク質にコンジュゲートしている）。そのような実施形態では、同じ血清型の各莢膜多糖は、典型的には、同じ担体タンパク質にコンジュゲートさせる。別のＤＴ変異体、例えば、以下のものを、第２の担体タンパク質として使用することができる：ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａｅｔａｌ．，１９７３，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２１８：３８３８－３８４４）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３及びＣＲＭ１０７、並びに、Ｎｉｃｈｏｌｌｓ及びＹｏｕｌｅが「ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴｏｘｉｎｓ，Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ，ＭａｅｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ，１９９２」の中で記載した別の変異体；Ｇｌｕ－１４８の欠失又はＡｓｐ、Ｇｌｎ若しくはＳｅｒへの突然変異、及び／又は、Ａｌａ１５８の欠失若しくはＧｌｙへの突然変異、並びに、米国特許第４，７０９，０１７号若しくは米国特許第４，９５０，７４０号に開示されている別の突然変異；少なくとも１以上の残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０及び／若しくはＬｙｓ５３４の突然変異、並びに、米国特許第５，９１７，０１７号若しくは米国特許第６，４５５，６７３号に開示されている別の突然変異；又は、米国特許第５，８４３，７１１号に開示されているフラグメント。

還元的アミノ化によるコンジュゲーション
多糖の担体タンパク質への共有結合は、多糖上のアミン反応性部分をタンパク質の第一級アミン基（主に、リシン残基）に直接カップリングさせる還元的アミノ化を介して実施することができる。よく知られているように、還元的アミノ化反応は、２段階の機構を介して進行する。第１に、分子１のアルデヒド基（Ｒ－ＣＨＯ）を分子２の第一級アミン基（Ｒ’－ＮＨ２）と反応させて、式Ｒ－ＣＨ＝Ｎ－Ｒ’で表されるシッフ塩基中間体を形成させる。第２の段階では、該シッフ塩基を還元して、式Ｒ－ＣＨ２－ＮＨ－Ｒ’で表されるアミノ化合物を形成させる。多くの還元剤を利用することができるが、殆どの場合、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）などの選択性の高い還元剤を使用する。これは、そのような試薬が、シッフ塩基のイミン官能基のみを特異的に還元するからである。

全ての多糖類は鎖の末端にアルデヒド官能基（末端アルデヒド官能基）を有しているので、多糖類の還元的アミノ化を含んでいるコンジュゲーション法は、極めて一般的に適用可能であり、そして、反復単位内に別のアルデヒド官能基（鎖内アルデヒド官能基）が存在しない場合、そのような方法では、多糖分子が担体タンパク質の単一分子にカップリングしているコンジュゲートを得ることが可能になる。

典型的な還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどのシアノ水素化ホウ素塩である。通常使用されるイミン選択的還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムであるが、シアノ水素化ホウ素カリウムを包含する別のシアノ水素化ホウ素塩を使用することも可能である。シアノ水素化ホウ素ナトリウム試薬ロット中の出発シアン化物レベルとコンジュゲーション反応における残留シアン化物の違いにより、コンジュゲーション性能に一貫性がなくなる可能性があり、その結果、コンジュゲーションサイズ及びコンジュゲートＰｓ対ＣＲＭ１９７比などの製品属性が変動し得る。最終反応生成物中の遊離シアン化物レベルを制御及び／又は低減することにより、コンジュゲーションの可変性を低減させることができる。

多糖類上の残留未反応アルデヒドは、場合により、水素化ホウ素ナトリウムなどの強還元剤を添加することで還元する。一般的に、強還元剤の使用が好ましい。しかしながら、一部の多糖類では、この段階を回避することが好ましい。例えば、肺炎レンサ球菌血清型５には、強還元剤と容易に反応し得るケトン基が含まれている。この場合、多糖類の抗原構造を保護するために還元段階を回避することが好ましい。

コンジュゲーションに続いて、当業者によく知られている任意の技術（これは、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、限外濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー及び深層濾過を包含する）の１以上によって、多糖－タンパク質コンジュゲートを精製して、過剰のコンジュゲーション試薬並びに残留遊離タンパク質及び遊離多糖を除去する。例えば、米国特許第６，１４６，９０２号を参照されたい。一実施形態では、該精製段階は、限外濾過による。

一実施形態では、本発明は、５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ又は１０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ又は１，０００ｋＤａ～９，０００ｋＤａ又は１，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａ又は１，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａ又は１，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する。好ましくは、本発明は、１，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する。さらに、好ましくは、本発明は、１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する。

一実施形態では、本発明は、上記コンジュゲートの実施形態に記載されているように、血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを作製するためのプロセスを提供し、ここで、該プロセスは、該多糖類を活性化させることを含み、ここで、該活性化は、多糖類反復単位１モルあたり０．０１～０．１モルの過ヨウ素酸塩の範囲内の過ヨウ素酸塩を使用する。別の実施形態では、過ヨウ素酸塩の該範囲は、多糖類反復単位１モルあたり０．０３～０．０６モルの過ヨウ素酸塩である。

別の実施形態では、本発明は、上記コンジュゲートの実施形態に記載されているように、免疫原性血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを作製するためのプロセスを提供し、ここで、該プロセスは、該多糖類を該タンパク質にコンジュゲートさせることを含んでおり、ここで、該コンジュゲーションは、２２℃～３８℃のコンジュゲーション温度で実施する。別の実施形態では、該コンジュゲーション温度は、３２℃～３６℃である。

別の実施形態では、本発明は、上記コンジュゲートの実施形態に記載されているように、血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを調製するためのプロセスを提供し、ここで、該プロセスは、該多糖類を活性化させること（ここで、該活性化は、多糖類反復単位１モルあたり０．０１～０．１モルの過ヨウ素酸塩の範囲内の過ヨウ素酸塩を使用する）及び該多糖類を該タンパク質にコンジュゲートさせること（ここで、該コンジュゲーションは、２２℃～３８℃のコンジュゲーション温度で実施する）を含んでいる。

本発明の一実施形態では、該コンジュゲーション反応において非プロトン性溶媒を使用する。本発明の別の実施形態では、該コンジュゲーション反応において、非プロトン性溶媒としてＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を使用する。

別の実施形態では、コンジュゲーションは、塩化ナトリウムを含んでいるＤＭＳＯ溶媒の中で実施する。別の実施形態では、塩化ナトリウム濃度は、約１ｍＭ～５０ｍＭである。別の実施形態では、塩化ナトリウム濃度は、約５ｍＭ～１５ｍＭである。

別の実施形態では、コンジュゲーションは、１．２％未満の水（ｖ／ｖ）を含んでいるＤＭＳＯ溶媒中で実施する。別の実施形態では、該コンジュゲーションは、０．６％未満の水（ｖ／ｖ）を含んでいるＤＭＳＯ溶媒中で実施する。別の実施形態では、該コンジュゲーションは、０．３％未満の水（ｖ／ｖ）を含んでいるＤＭＳＯ溶媒中で実施する。

一実施形態では、該コンジュゲーションは、０．０１～０．１の範囲内の反復単位あたりのアルデヒドを有する活性化多糖類を使用して、ＤＭＳＯ溶媒中で実施する。別の実施形態では、該コンジュゲーションは、０．０３～０．０６の範囲内の反復単位あたりのアルデヒドを有する活性化多糖類を使用して、ＤＭＳＯ溶媒中で実施する。

一実施形態では、該コンジュゲーションは、３０～２００ＫＤａの範囲内の分子量を有する活性化多糖類を使用して、ＤＭＳＯ溶媒中で実施する。別の実施形態では、該コンジュゲーションは、４０～１００ＫＤａの範囲内の分子量を有する活性化多糖類を使用して、ＤＭＳＯ溶媒中で実施する。

別の実施形態では、該コンジュゲーション反応は、過ヨウ素酸塩による活性化を介して作製されたサイズが縮小された多糖類を用いて実施する。

多価多糖類－タンパク質コンジュゲートワクチン
特定の実施形態では、該免疫原性組成物は、１以上の担体タンパク質にコンジュゲートした１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０（２０Ａ又は２０Ｂ）、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ、３５Ｆ又は３８の少なくとも１から選択される肺炎レンサ球菌血清型に由来する莢膜多糖類を含有することができる。好ましくは、特定の血清型に由来する糖類は、２以上の担体タンパク質にはコンジュゲートしない。

個々の複合糖質を精製した後、それらを配合して、本発明の免疫原性組成物を製剤する。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別々のプロセスによって調製し、そして、単一の剤形にバルク製剤される。

医薬品／ワクチン組成物
本発明は、さらに、上記で記載した多糖類血清型組み合わせのいずれかを薬学的に許容される担体及びアジュバントと一緒に含んでいる、又は、本質的にそれらからなる、又は、それらからなる、組成物（これは、医薬組成物、免疫原性組成物及びワクチン組成物を包含する）を提供する。該組成物は、２から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５までの異なる多糖類－タンパク質コンジュゲートを含むことができるか、又は、本質的にそれらからなることができるか、又は、それらからなることができ、ここで、該コンジュゲートのそれぞれは、第１の担体タンパク質又は第２の担体タンパク質のいずれかにコンジュゲートした異なる莢膜多糖類を含んでおり、並びに、ここで、肺炎レンサ球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０（２０Ａ又は２０Ｂ）、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ、３５Ｆ又は３８の少なくとも１種に由来する莢膜多糖類がＣＲＭ１９７にコンジュゲートしている。

一実施形態では、本発明は、上記コンジュゲートの実施形態で提供されている血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを含んでいる多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する。

多糖類－タンパク質コンジュゲートの製剤化は、当技術分野で認められている方法を使用して達成することができる。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートは、生理学的に許容されるビヒクルを用いて製剤して、当該組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例としては、限定するものではないが、水、緩衝生理食塩水、ポリオール類（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びデキストロース溶液などを挙げることができる。

好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含んでいるＬ－ヒスチジン緩衝液の中で製剤する。

本明細書中で定義される場合、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強するのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与された場合に免疫原性が弱い（例えば、抗体力価若しくは細胞性免疫応答を誘発しないか又は弱い抗体力価若しくは細胞性免疫応答を誘発する）抗原に対する免疫応答を増強することができ、抗原に対する抗体力価を増加させることができ、及び／又は、個体における免疫応答を達成するのに効果的な抗原の用量を低下させる。従って、アジュバントは、多くの場合、免疫応答を高めるために与えられ、そして、当業者にはよく知られている。該組成物の有効性を増強するための適切なアジュバントとしては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；
（２）水中油型エマルション製剤（ムラミルペプチド（下記で定義される）又は細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫賦活剤の存在下又は非存在下）、例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際特許出願公開第ＷＯ９０／１４８３７号）〔これは、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．５％Ｓｐａｎ８５を含んでおり（場合により、さまざまな量のＭＴＰ－ＰＥを含んでいる）、マイクロフルイダイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を用いてサブミクロン粒子に製剤されている〕；（ｂ）ＳＡＦ〔これは、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１及びｔｈｒ－ＭＤＰを含んでおり、サブミクロンエマルションにマイクロフルイダイズされているか、又は、ボルテックスされて大粒径のエマルションを生成している〕；（ｃ）Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）〔これは、２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０を含んでおり、並びに、３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ^ＴＭ）（米国特許第４，９１２，０９４号に記載されている）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１種類以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ））を含んでいる〕；及び、（ｄ）ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ；
（３）サポニンアジュバント〔例えば、ＱｕｉｌＡ若しくはＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号を参照されたい）を使用し得るか、又は、該アジュバントから生成させた粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（コレステロールとサポニンとリン脂質と両親媒性タンパク質の組合せによって形成された免疫賦活性複合体）、及び、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（これは、ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するがタンパク質を含んでいない）〕；
（４）細菌リポ多糖、合成脂質Ａ類似体〔例えば、アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、又は、その誘導体若しくは類似体（これらは、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、及び、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている）；そのようなＡＧＰの一例は、２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ｝－ｂ－Ｄ－グルコピラノシドである（これは、５２９としても知られており（以前は、ＲＣ５２９として知られていた）、水性形態として又は安定なエマルションとして製剤される〕；
（５）合成ポリヌクレオチド〔例えば、ＣｐＧモチーフ（１以上）を含んでいるオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）〕；
（６）サイトカイン〔例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７－１及びＢ７－２など〕；及び、
（７）補体〔例えば、補体成分Ｃ３ｄの三量体〕。

別の実施形態では、該アジュバントは、上記アジュバントの２種類、３種類又はそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ及びＱＳ２１も含有している水中油型エマルション）である。

ムラミルペプチドとしては、限定するものではないが、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）などを挙げることができる。

特定の実施形態では、該アジュバントは、アルミニウム塩である。該アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン沈殿ワクチン又はミョウバン吸着ワクチンであり得る。アルミニウム塩アジュバントは、当技術分野でよく知られており、そして、例えば、「Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄＤ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）」及び「Ｎｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍｓａｌｔｓ．ＲｅｓｅａｒｃｈｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４３：４８９－４９３）」に記載されている。該アルミニウム塩としては、限定するものではないが、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、アルヒドロゲル、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウム（リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ））、非晶質アルミナ、三水和アルミナ又はトリヒドロキシアルミニウムなどを挙げることができる。

ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムを１：１の容積比で混合してヒドロキシリン酸アルミニウムを沈澱させることによって製造する。混合プロセス後、その物質を高剪断ミキサーを用いてサイズ低下させて、単分散粒子サイズ分布を達成する。次いで、その生成物を生理食塩水に対してダイアフィルトレートし、滅菌（蒸気滅菌又は高圧滅菌）する。

市販されているＡｌ（ＯＨ）_３（例えば、「Ｄｅｎｍａｒｋ／ＡｃｃｕｒａｔｅＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ」のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ又はＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用してタンパク質を吸着させることができる。タンパク質の吸着は、別の実施形態では、そのタンパク質のｐＩ（等電ｐＨ）及び媒体のｐＨに依存する。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩが高いタンパク質よりも強力に正荷電アルミニウムイオンに吸着する。アルミニウム塩は、２～３週間の期間にわたってゆっくり放出される抗原の貯蔵部を構築し得る、マクロファージの非特異的活性化及び補体活性化に関与し得る、及び／又は、先天性免疫機構を刺激し得る（おそらく、尿酸の刺激をとおして）。例えば、「Ｌａｍｂｒｅｃｈｔｅｔａｌ．，２００９，ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ２１：２３」を参照されたい。

一価のバルク水性コンジュゲートは、典型的には、一緒に混合し、及び、６Ｂを除く全ての血清型に関して目標の８μｇ／ｍＬまで希釈し、６Ｂは目標の１６μｇ／ｍＬまで希釈する。希釈したら、そのバッチを濾過滅菌し、そして、等体積のリン酸アルミニウムアジュバントを無菌的に加えて、目標の最終アルミニウム濃度２５０μｇ／ｍＬとする。アジュバントが添加され、製剤されたバッチは、使い捨ての０．５ｍＬ／用量のバイアルに入れる。

特定の実施形態では、該アジュバントは、ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特に、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧＯＤＮ）である。別の実施形態では、該アジュバントは、ＯＤＮ１８２６であり、これは、「ＣｏｌｅｙＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＧｒｏｕｐ」から取得可能である。

「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」及び類似した用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含んでいる長さが６－５０ヌクレオチドのヌクレオチド分子を示している。例えば、「Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ２１：４２９７」を参照されたい。別の実施形態では、該用語の当技術分野で認められている任意の他の定義が意図される。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドには、任意の合成ヌクレオシド間結合、修飾塩基及び／又は修飾糖を用いて修飾されたオリゴヌクレオチドが包含される。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドを使用する方法は、当技術分野でよく知られており、そして、例えば、「Ｓｕｒｅｔａｌ．，１９９９，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４－９３」、「Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，２００６，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＭｅｄ．１２７：１３９－５８」及び「Ｙａｓｕｄａｅｔａｌ．，２００６，ＣｒｉｔＲｅｖＴｈｅｒＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ．２３：８９－１１０」に記載されている。

投与／投与量
本発明の組成物及び製剤は、当該ワクチンを全身経路又は粘膜経路を介して投与することによって、感染（例えば、肺炎球菌感染）を受けやすいヒトを保護又は治療するために使用することができる。一実施形態では、本発明は、肺炎レンサ球菌莢膜多糖類コンジュゲートに対する免疫応答を誘発させる方法を提供し、ここで、該方法は、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物をヒトに投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、肺炎球菌感染症に対してヒトに予防接種する方法を提供し、ここで、該方法は、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物をヒトに投与する段階を含む。

特定のワクチンに関する成分の最適量は、対象者における適切な免疫応答を観察することを含む標準的な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態では、ヒトへのワクチン接種に関する投与量は、動物試験からヒトデータへの外挿によって決定される。別の実施形態では、投与量は、経験的に決定される。

本発明の組成物の「有効量」は、その後のチャレンジに際して、微生物（例えば、肺炎レンサ球菌）の感染性の可能性又は重症度を有意に低減させる抗体を誘発させるのに必要とされる用量を示している。

本発明の方法は、微生物（例えば、肺炎レンサ球菌）によって引き起こされる主要な臨床症候群（これは、侵襲性感染症（髄膜炎、肺炎及び菌血症）と非侵襲性感染症（急性中耳炎及び副鼻腔炎）の両方を包含する）の予防及び／又は低減のために使用することができる。

本発明の組成物の投与は、以下のもののうちの１以上を包含し得る：筋肉内経路、腹腔内経路、皮内経路若しくは皮下経路を介した注射；又は、経口／食事性、気道若しくは尿生殖路への粘膜投与を介したもの。一実施形態では、肺炎又は中耳炎を治療するために鼻腔内投与が使用される（肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより有効に抑制することができ、それによって、感染をその初期段階で減弱させることができることによる）。

各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、重大な有害効果を伴うことなく免疫保護応答を誘発させる量として選択することができる。そのような量は、肺炎球菌の血清型に応じてさまざまであり得る。一般に、多糖ベースコンジュゲートの場合、各用量は、０．１～１００μｇの各多糖、特に、０．１～１０μｇ、より特に、１～５μｇの各多糖を含んでいる。例えば、各用量は、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００若しくは７５０ｎｇ、又は、１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００μｇを含むことができる。

一実施形態では、アルミニウム塩の用量は、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００若しくは７００μｇ、又は、１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇ、又は、それ以上である。さらに別の実施形態では、上記で記載したアルミニウム塩の用量は、組換えタンパク質１μｇ当たりのものである。

本明細書の方法のいずれかによれば、及び、一実施形態では、該対象者はヒトである。特定の実施形態では、該ヒト患者は、乳児（１歳未満）、よちよち歩きの子供（約１２～２４ヶ月）又は幼児（約２～５歳）である。別の実施形態では、該ヒト患者は、高齢患者（＞６５歳）である。本発明の組成物は、さらに、年長児、青年及び成人（例えば、年齢１８～４５歳又は１８～６５歳）での使用にも適している。

本発明の方法の一実施形態では、本発明の組成物は、単回接種として投与される。別の実施形態では、該ワクチンは、２回、３回又は４回又はそれ以上、充分に間隔をあけて投与される。例えば、該組成物は、１、２、３、４、５若しくは６ヶ月間隔で、又は、それらの任意の組合せの間隔で投与され得る。免疫化スケジュールは、肺炎球菌ワクチン用に指定されたスケジュールに従うことができる。例えば、肺炎レンサ球菌によって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児及びよちよち歩きの子供に関する日常的なスケジュールは、２、４、６及び１２～１５ヶ月齢のときである。従って、好ましい実施形態では、該組成物は、年齢が２、４、６及び１２～１５ヶ月齢で一連の４回の用量で投与される。

本明細書の組成物には、さらに、肺炎レンサ球菌に由来する１種以上のタンパク質も含ませることができる。含ませるのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際特許出願公開第ＷＯ０２／０８３８５５号及びＷＯ０２／０５３７６１号において特定されるものなどがある。

製剤
本発明の組成物は、当業者に知られている１以上の方法（例えば、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内）で、対象者に投与することができ、そして、それに応じて製剤することができる。

一実施形態では、本発明の組成物は、液体調製物の表皮注射、筋肉内注射、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射又は呼吸内粘膜注射によって、投与される。注射のための液体製剤としては、溶液剤などがある。

本発明の組成物は、単回用量バイアル、複数用量バイアル又は充填済注射器として製剤することができる。

別の実施形態では、本発明の組成物は、経口投与され、従って、経口投与に適した形態に、即ち、固体又は液体の調製物として、製剤される。固体経口製剤としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、粒剤、ペレット剤などがある。液体経口製剤としては、溶液剤、懸濁液剤、分散液剤、エマルション剤、油剤などがある。

液体製剤用の薬学的に許容される担体は、水性若しくは非水性の溶液、懸濁液、エマルション又は油である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性の溶液、エマルション又は懸濁液（例えば、生理食塩水及び緩衝媒体）などがある。油の例は、動物、植物又は合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、又は、ミルク若しくは卵に由来する脂質である。

該医薬組成物は、等張性、低張性又は高張性であることができる。しかしながら、多くの場合、注入又は注射用の医薬組成物は、投与されるとき本質的に等張性であることが好ましい。従って、貯蔵のためには、該医薬組成物は、好ましくは、等張性又は高張性であることができる。該医薬組成物が貯蔵のために高張性である場合、投与前に等張性溶液となるように希釈することができる。

等張剤は、塩のようなイオン性等張剤又は炭水化物のような非イオン性等張剤であることができる。イオン性等張剤の例としては、限定するものではないが、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）及び塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）などを挙げることができる。非イオン性等張剤の例としては、限定するものではないが、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールなどを挙げることができる。

さらにまた、少なくとも１種類の薬学的に許容される添加剤は緩衝剤であることが好ましい。目的によっては、例えば、該医薬組成物が注入又は注射用である場合には、多くの場合、その組成物は緩衝剤（ここで、該緩衝剤は、溶液を４～１０（例えば、５～９、例えば、６～８）の範囲内のｐＨに緩衝することができる）を含んでいることが望ましい。

該緩衝剤は、例えば、ＴＲＩＳ緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、グルタミン酸塩緩衝剤、乳酸塩緩衝剤、マレイン酸塩緩衝剤、酒石酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、グリシン酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、グリシン緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤及びトリエタノールアミン緩衝剤からなる群から選択することができる。

該緩衝剤は、さらに、例えば、特に、該医薬製剤が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためＵＳＰ適合緩衝剤から選択することもできる。例えば、該緩衝剤は、以下のものからなる群から選択することができる：一塩基酸、例えば、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸及び乳酸；二塩基酸、例えば、アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸及び酒石酸；多塩基酸、例えば、クエン酸及びリン酸；並びに、塩基、例えば、アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン及びＴＲＩＳ。

非経口用ビヒクル（皮下注射用、静脈内注射用、動脈内注射用又は筋肉内注射用）としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液及び不揮発性油などがある。静脈内用ビヒクルとしては、体液補給液及び栄養補給液、電解質補給液（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などがある。その例は、界面活性剤及び他の薬学的に許容されるアジュバントが添加されている又は添加されていない、無菌液体、例えば、水及び油などである。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、グリコール（例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）が、好ましい液体担体、特に、注射用溶液に関して好ましい液体担体である。油の例は、動物、植物又は合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、又は、ミルク若しくは卵に由来する脂質である。

本発明の製剤は、さらに、界面活性剤を含有することができる。好ましい界面活性剤としては、限定するものではないが、以下のものなどがある：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的に、Ｔｗｅｅｎと称される）；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸ^ＴＭの商品名で販売されている）、例えば、直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール（これは、反復するエトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数がさまざまであることができ、ここで、オクトキシノール－９（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、又は、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール及びオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；及び、ソルビタンエステル（一般的に、ＳＰＡＮとして知られている）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）及びソルビタンモノラウレート。

界面活性剤の好ましい量（重量％）は、以下のとおりである：ポリオキシエチレンソルビタンエステル類（例えば、ＰＳ８０）０．０１～１％、特に、約０．１％；オクチル－又はノニルフェノキシポリオキシエタノール類（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、又は、Ｔｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤）０．００１～０．１％、特に、０．００５～０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル類（例えば、ラウレス９）０．１～２０％、好ましくは、０．１～１０％、特に、０．１～１％又は約０．５％。

該製剤は、さらに、ｐＨ緩衝生理食塩水溶液も含んでいる。該緩衝剤は、例えば、ＴＲＩＳ緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、グルタミン酸塩緩衝剤、乳酸塩緩衝剤、マレイン酸塩緩衝剤、酒石酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、グリシン酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、グリシン緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝剤、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）緩衝剤、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝剤及びトリエタノールアミン緩衝剤からなる群から選択することができる。該緩衝剤は、溶液を４～１０、５．２～７．５又は５．８～７．０の範囲内のｐＨに緩衝する能力を有している。本発明の特定の態様において、該緩衝剤は、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩又はクエン酸塩からなる群から選択される。該緩衝剤は、さらに、例えば、特に、該医薬製剤が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためＵＳＰ適合緩衝剤から選択することもできる。緩衝液の濃度は、１ｍＭ～５０ｍＭ又は５ｍＭ～５０ｍＭの範囲である。特定の態様において、該緩衝剤は、最終濃度５ｍＭ～５０ｍＭのヒスチジンであるか、又は、最終濃度１ｍＭ～１０ｍＭのコハク酸塩である。特定の態様において、該ヒスチジンは、最終濃度２０ｍＭ±２ｍＭである。

該生理食塩水溶液（即ち、ＮａＣｌを含んでいる溶液）が好ましいが、製剤に適している別の塩としては、限定するものではないが、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ及びＭｇＣｌ_２及びそれらの組み合わせなどがある。非イオン性等張剤（これは、限定するものではないが、ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール及びグリセリンを包含する）を塩の代わりに用いることもできる。適切な塩の範囲としては、限定するものではないが、２５ｍＭ～５００ｍＭ又は４０ｍＭ～１７０ｍＭなどがある。一態様において、該生理食塩水は、場合により２０ｍＭ～１７０ｍＭの濃度で存在していてもよい、ＮａＣｌである。

好ましい実施形態では、該製剤は、塩化ナトリウムと一緒にＬ－ヒスチジン緩衝剤を含んでいる。

別の実施形態では、該医薬組成物は、制御放出系で送達される。例えば、該薬剤は、静脈内注入、経皮貼付剤、リポソーム又は他の投与方法を用いて投与することができる。別の実施形態では、ポリマー物質を、例えば、ミクロスフィア又はインプラントにおいて使用する。

本発明の組成物には、肺炎レンサ球菌由来の１以上のタンパク質も含ませることができる。含ませるに適している肺炎レンサ球菌タンパク質の例としては、国際特許出願公開第ＷＯ０２／０８３８５５号及び第ＷＯ０２／０５３７６１号において特定されるものなどがある。

分析方法
ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイを用いるコンジュゲートの分子量及び濃度分析
コンジュゲートサンプルを注入し、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって分離する。検出は、一連の紫外線（ＵＶ）検出器、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器及び屈折率（ＲＩ）検出器によって行う。タンパク質濃度は、減衰係数を用いてＵＶ２８０からを計算する。多糖濃度は、ｍＬ／ｇで報告される溶質濃度における変化による溶液の屈折率の変化であるｄｎ／ｄｃ係数を用いて、ＲＩシグナル（タンパク質及び多糖の両方による寄与）から解析する。サンプルの平均分子量は、測定された濃度及びサンプルピーク全体の光散乱データを用いて、Ａｓｔｒａソフトウェア（ＷｙａｔｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳａｎｔａＢａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって計算する。多分散分子については、多くの形態の分子量平均値がある。例えば、数平均分子量Ｍｎ、重量平均分子量Ｍｗ、及び、ｚ－平均分子量Ｍｚ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１５，２０：１０３１３－１０３４１）。指定されていない限り、用語「分子量」は、本明細書を通して使用されている場合、重量平均分子量である。

多糖類と担体タンパク質の間の共有結合の数の尺度としてのコンジュゲートされたタンパク質におけるリシン消費の測定
ＷａｔｅｒｓＡｃｃＱ－Ｔａｇアミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて、コンジュゲートサンプル中のコンジュゲーションの程度を測定する。Ｅｌｄｅｘワークステーションでの気相酸加水分解を用いてサンプルを加水分解して、担体タンパク質をそれらの成分であるアミノ酸に分解する。その遊離アミノ酸を、６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いて誘導体化する。次いで、その誘導体化サンプルを、Ｃ１８カラムでのＵＶ検出を含むＵＰＬＣを用いて分析する。平均タンパク質濃度は、リシン以外の代表的なアミノ酸を用いて得られる。コンジュゲーション中のリシン消費（即ち、リシン損失）は、該コンジュゲート中のリシンの平均測定量と出発タンパク質中のリシンの推測量の間の差によって求める。

遊離多糖類試験
当該コンジュゲートサンプル中の遊離多糖類（即ち、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしていない多糖類）は、最初に遊離タンパク質及びコンジュゲートをデオキシコール酸塩（ＤＯＣ）及び塩酸を用いて沈澱させることによって測定する。次いで、沈澱物を濾去し、その濾液を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩによって遊離多糖類濃度に関して分析する。遊離多糖類は、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩによって測定される総多糖類の割合（％）として計算する。

遊離タンパク質試験
当該コンジュゲートサンプル中の遊離多糖類、多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲート及び遊離ＣＲＭ１９７を、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）モードでのキャピラリー電気泳動によって分離させる。簡潔に言えば、サンプルを、２５ｍＭホウ酸塩、１００ｍＭＳＤＳ、ｐＨ９．３を含んでいるＭＥＫＣランニング緩衝液と混合させ、予め調整しておいたベア溶融シリカキャピラリー（ｂａｒｅ－ｆｕｓｅｄｓｉｌｉｃａｃａｐｉｌｌａｒｙ）で分離する。分離を２００ｎｍでモニタリングし、遊離ＣＲＭ１９７を、ＣＲＭ１９７標準曲線を用いて定量する。遊離タンパク質の結果を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩ手順によって求めた総タンパク質含有量の割合（％）として報告する。

多糖類活性化度アッセイ
コンジュゲーションは、活性化されたアルデヒドと担体タンパク質の主にリシン残基との間の還元的アミノ化によって起こる。多糖類反復単位１モルあたりのアルデヒドのモル数としての活性化のレベルは、該コンジュゲーション反応を制御するために重要である。

このアッセイでは、多糖類を、ｐＨ４．０で２．５ｍｇ／ｍＬのチオセミカルバジド（ＴＳＣ）を用いて誘導体化して、発色団を導入する（血清型１、５、９Ｖに関する活性化多糖類の誘導体化では１．２５ｍｇ／ｍＬのＴＳＣを使用する）。該誘導体化反応が進行してプラトーに到達した。実際の時間は、各血清型の反応速度に応じて異なる。次いで、ＴＳＣ－Ｐｓを、高性能サイズ排除クロマトグラフィーによって、ＴＳＣ及び他の低分子量成分から分離させる。シグナルは、２６６ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出する。活性化アルデヒドのレベルは、Ｍｏｎｏ－ＴＳＣの標準曲線注入に対して、又は、所定の減衰係数を直接使用して、計算する。Ｍｏｎｏ－ＴＳＣは、単糖の合成されたチオセミカルバゾン誘導体である。次いで、アルデヒドレベルを、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイによって測定されたＰｓ濃度を使用して、反復単位１モルあたりのアルデヒドのモル数（Ａｌｄ／ＲＵ）として変換する。

添付の明細書を参照して本発明のさまざまな実施形態について説明してきたが、本発明は詳述した実施形態に限定されないこと、及び、当業者は添付の特許請求の範囲において定義されている本発明の範囲又は精神から逸脱することなくさまざまな変更及び修正を実施し得ることは、理解されるべきである。

以下の実施例によって本発明を例証するが、本発明はそれら実施例によって限定されるものではない。

実施例１
肺炎レンサ球菌３５Ｂ莢膜多糖類の調製
発酵
肺炎球菌を培養する方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、「Ｃｈａｓｅ，１９６７，ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１：５２」を参照されたい。肺炎球菌莢膜多糖類を調製する方法も、当技術分野においてよく知られている。例えば、欧州特許第ＥＰ０４９７５２４Ｂ１号を参照されたい。下記に記載されているプロセスは、概して、欧州特許第ＥＰ０４９７５２４Ｂ１号に記載の方法に従っており、そして、一般に、特異的に修飾されている場合を除き、全ての肺炎球菌血清型に適用可能である。

肺炎球菌血清型３５Ｂの分離株を、「ＭｅｒｃｋＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」から入手した。必要な場合は、特異的抗血清を用いるＱｕｅｌｌｉｎｇ反応に基づいて、サブタイプを識別することができる。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号を参照されたい。得られた分離株を、ヘミンを含まず、大豆ペプトン、酵母エキス及びグルコースを含んでいる動物成分非含有培地からなる寒天プレートで２段階で連続的に平板培養することで、さらにクローン的に分離した。各血清型についてのクローン分離株を、大豆ペプトン、酵母エキス、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、グルコース及びグリセロールを含んでいる動物成分非含有培地を用いる液体培養でさらに増殖させて、プレマスターセルバンクを調製した。

肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂの生成は、細胞増殖及びバッチ製造発酵とそれに続く化学的不活性化とその後の下流精製で構成されていた。解凍させたセルバンクバイアルを、大豆ペプトン又は大豆ペプトン限外濾過液、酵母エキス又は酵母エキス限外濾過液、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム及びグルコースを含んでいる滅菌済み動物成分非含有増殖培地を含んでいる振盪フラスコ又は培養瓶を用いて増殖させた。細胞増殖培養物を密閉した振盪フラスコ又は瓶の中で増殖させて、温度及び撹拌制御下にガス交換を最小にした。６００ｎｍでの光学密度によって測定される特定の培養物密度を達成した後、細胞増殖培養物の一部を、大豆ペプトン又は大豆ペプトン限外濾過液、酵母エキス又は酵母エキス限外濾過液、塩化ナトリウム、リン酸カリウム及びグルコースを含んでいる滅菌済み動物成分非含有増殖培地を含んでいる製造発酵槽に移した。温度、ｐＨ、圧力及び撹拌を制御した。スパージングを使用しなかったので、空気流オーバーレイも制御した。

グルコースがほぼ枯渇した時、化学不活性化剤であるフェノールを加えることで、バッチ発酵を終了させた。純粋なフェノールを０．８～１．２％の最終濃度まで加えて、細胞を不活性化させ、細胞壁から莢膜多糖を遊離させた。一次不活性化は発酵槽内で指定された時間にわたって行い、その際に温度及び撹拌の継続を制御する。一次不活性化後、バッチを別の容器に移し、そこで、それを、不活性化を完了させるために、追加の指定された時間にわたり、制御された温度及び撹拌下に保持した。不活性化の完了は、微生物プレーティング技術又はフェノール濃度及び指定時間の検証のいずれかによって確認した。次いで、不活性化したブロスを精製した。

Ｐｓの精製
肺炎球菌多糖類の精製は、数回の遠心分離、深層濾過、濃縮／ダイアフィルトレーション操作及び沈澱段階で構成されていた。全ての手順は、別途示されていない限り、室温で実施した。

肺炎レンサ球菌の発酵槽培養物からの不活性化ブロスを、カチオン性ポリマー（例えば、ＢＰＡ－１０００、Ｐｅｔｒｏｌｉｔｅ「Ｔｒｅｔｏｌｉｔｅ」及び「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ８１６０」及びポリ（エチレンイミン）、「ＭｉｌｌｉｐｏｒｅｐＤＡＤＭＡＣ」）で凝集させた。該カチオン性ポリマーは、不純物のタンパク質、核酸及び細胞残骸に結合した。凝集段階及び熟成期間後、凝集された固体を遠心分離及び複数回の深層濾過段階によって除去した。不純物を除いたブロスを濃縮し、１００ｋＤａ～５００ｋＤａＭＷＣＯ（分子量カットオフ）フィルターを用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ_２緩衝剤及びリン酸ナトリウム緩衝剤を用いて行った。ダイアフィルトレーションによって、残留している核酸及びタンパク質が除去された。

さらに、酢酸ナトリウムとフェノールの中で該多糖類を変性アルコール及び／又はイソプロパノールを用いて再沈澱させることによって、不純物除去を行った。フェノール沈澱段階に際して、リン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液中の酢酸ナトリウム及びフェノール（液化フェノール類又は固体フェノール類）を、ダイアフィルトレーションした保持液に加えた。次いで、多糖のアルコール分別を、２段階で行った。第１の段階では、低パーセントアルコールを調製物に加えて、細胞残骸及び他の望ましくない不純物を沈澱させたが、粗製多糖は溶液中に残った。不純物を、深層濾過段階によって除去した。次いで、追加のイソプロパノール又は変性アルコールをバッチに加えることによって、多糖を溶液から回収した。沈澱した多糖ペレットを、遠心分離によって回収し、摩砕し、粉末として乾燥させ、－７０℃で冷凍貯蔵した。

実施例２
肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類の活性化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解させ、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓ溶液の粘度を低減させた。均質化圧力及びホモジナイザーを通過する回数を、１００バール／５パスに制御した。均質化された多糖類を濃縮し、５ｋＤａＮＭＷＣＯタンジェンシャルフロー限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。

多糖類溶液を酢酸ナトリウム緩衝液を用いて２２℃及びｐＨ５に調整した。多糖類の活性化は、１００ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加することによって開始させた。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖活性化の目標レベル（多糖反復単位１モルあたりのアルデヒドのモル数）を達成するために、多糖反復単位１モルあたり０．０１、０．０３、０．０５、０．０７、０．０９又は０．１１モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムであった。該酸化反応は、２２℃で１時間進行した。活性化された多糖類は、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対して約４℃で透析し、続いて、５ｋＤａＮＭＷＣＯ透析カセットを使用して合計３日間蒸留水で透析した。

表１に示されているように、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを活性化反応に加える場合、肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖鎖のサイズが小さくなり、同時に、反復単位あたりのアルデヒド数が増加する。メタ過ヨウ素酸ナトリウムのモル当量（反応に装入される）が増加すると、３５Ｂ多糖のサイズが低減し、反復単位あたりの反応性アルデヒドの数が増加する。これは、活性化が多糖の主鎖を非環式トリオール部位で開裂していることを示唆している。

実施例３
肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類のＣＲＭ１９７へのコンジュゲーション
多糖類の活性化
多糖類は、実施例２に記載されているようにして、活性化及び精製した。

多糖類のＣＲＭ１９７へのコンジュゲーション
精製ＣＲＭ１９７（これは、以前に記載されているように（ＷＯ２０１２／１７３８７６Ａ１）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）において発現させることで得られた）を、５ｋＤａＮＭＷＣＯタンジェンシャルフロー限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。

活性化された多糖類は、５％ｗ／ｖのショ糖濃度を用いて６ｍｇＰｓ／ｍＬで凍結乾燥させるために製剤した。ＣＲＭ１９７は、１％ｗ／ｖのショ糖濃度を用いて６ｍｇＰｒ／ｍＬで凍結乾燥させるために製剤した。

製剤されたＰｓ及びＣＲＭ１９７の溶液を、個別に凍結乾燥させた。凍結乾燥したＰｓ及びＣＲＭ１９７材料を、等容積のＤＭＳＯに個別に再溶解させた。塩を含んでいるアームでは、溶解したＰｓに１０ｍＭ塩化ナトリウムの濃度まで塩化ナトリウムをスパイクした。多糖類とＣＲＭ１９７の溶液を混合させて、多糖類の濃度を６ｇＰｓ／Ｌ（アーム１～６）又は７．５ｇＰｓ／Ｌ（アーム７～１２）とし、多糖類とＣＲＭ１９７の質量比を３にした。コンジュゲーションは、３４℃で３時間続いた。

水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応に続いて、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モルあたり２モル）を加え、３４℃で１時間インキュベートした。そのバッチを、約４℃で、約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムで希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を加えてｐＨを中和した。そのバッチを、３００ｋＤａＮＭＷＣＯ透析カセットを使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０に対して約４℃で３日間透析した。

表２に示されているように、反復単位あたりの反応性アルデヒドの数及び肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖鎖のサイズ（これらは、活性化段階中に装入される過ヨウ素酸塩の量によって制御される）は、３５Ｂコンジュゲートの属性に直接影響する。酸化された３５Ｂ多糖類のサイズが大きくなると、反復単位あたりの反応性アルデヒドの数が低減する。従って、反復単位あたりのアルデヒドが少ない酸化３５Ｂ多糖分子は、大きなサイズの３５Ｂコンジュゲートをもたらすが、（１）リシン消費量が低減し、（２）遊離多糖の割合（％）が増大し、及び、（３）遊離タンパク質の割合（％）が増大する。他方、反復単位あたりのアルデヒドの数が増加した酸化３５Ｂ多糖分子は、より小さな多糖サイズを有し、サイズが１０００ｋＤ未満の３５Ｂコンジュゲートをもたらす。

透析は、限外濾過などのフルスケール精製方法と比較して、遊離タンパク質及び遊離多糖の除去にはあまり効果的ではないことに留意されたい（限外濾過を使用して精製されたコンジュゲートの例については、表８を参照されたい）。表２中の遊離多糖と遊離タンパク質の値は、多糖の活性化レベルに関連して、コンジュゲーション効率の傾向を示すために使用される。

実施例４
肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質コンジュゲートの属性に対する温度の影響
多糖類の活性化
精製された肺炎球菌血清型３５Ｂ莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解させ、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖類を濃縮し、５ｋＤａＮＭＷＣＯタンジェンシャルフロー限外濾過膜を使用して、水に対してダイアフィルトレーションした。

次いで、その多糖類溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液を用いて２２℃及びｐＨ５に調整した。多糖類の活性化は、１０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して開始させた。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖活性化の目標レベル（多糖反復単位１モルあたりのアルデヒドのモル数）を達成するために、多糖反復単位１モルあたり０．０４７モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムであった。該酸化反応は、２２℃で１時間進行した。

活性化された生成物を、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、続いて、５ｋＤａＮＭＷＣＯタンジェンシャルフロー限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。

活性化された多糖類は、５％ｗ／ｖのショ糖濃度及び１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度を用いて６ｍｇＰｓ／ｍＬで凍結乾燥させるために製剤した。ＣＲＭ１９７は、１％ｗ／ｖのショ糖濃度を用いて６ｍｇＰｒ／ｍＬで凍結乾燥させるために製剤した。

製剤されたＰｓ及びＣＲＭ１９７の溶液を、個別に凍結乾燥させた。凍結乾燥したＰｓ及びＣＲＭ１９７材料を、等容積のＤＭＳＯに個別に再溶解させた。その多糖類とＣＲＭ１９７の溶液を混合させて、多糖類の濃度を６ｇＰｓ／Ｌとし、多糖類とＣＲＭ１９７の質量比を３にした。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モルあたり１モル）を添加し、そのコンジュゲーション反応は、２８℃、３０℃、３４℃又は３８℃で３時間進行した。

水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応に続いて、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モルあたり２モル）を加え、コンジュゲーションと同じ温度で１時間インキュベートした。そのバッチを、約４℃で、約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムで希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を加えてｐＨを中和した。そのバッチを、３００ｋＤａＭＷＣＯ透析カセットを使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の中の１０ｍＭヒスチジンに対して２～８℃で３日間透析した。

表３に示されているように、該コンジュゲーション反応中に使用される温度は、肺炎レンサ球菌３５Ｂ多糖類／ＣＲＭ１９７コンジュゲートの属性に影響する。コンジュゲーション温度が２２℃から３８℃に上昇すると、該３５Ｂコンジュゲートでは、遊離多糖画分が減少する。これは、コンジュゲーションがこの範囲内の高温でより効果的であることを示唆している。

実施例５
肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質コンジュゲートの属性に対する水分濃度の影響
肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類のＣＲＭ１９７へのコンジュゲーションは、ＤＭＳＯなどの有機溶媒の中で行う。有機環境中でも、他の成分が加えられると、水がコンジュゲーション反応に導入される可能性がある（例えば、還元剤におけるスパイキング、又は、ＤＭＳＯは吸湿性であるため時間の経過とともに）。肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質（ＣＲＭ１９７）コンジュゲートの属性に対する水分含有量の影響について、コンジュゲーションの開始時に蒸留水にスパイクすることによって調べた。

多糖類の活性化
精製された肺炎球菌血清型３５Ｂ莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解させ、０．４５ミクロンで濾過した。濾過された溶解した多糖類を濃縮し、５ｋＤａＮＭＷＣＯタンジェンシャルフロー限外濾過膜を使用して、水に対してダイアフィルトレーションした。

次いで、その多糖類溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液を用いて２２℃及びｐＨ５に調整した。多糖類の活性化は、１０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して開始させた。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖活性化の目標レベル（多糖反復単位１モルあたりのアルデヒドのモル数）を達成するために、多糖反復単位１モルあたり０．０４７モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムであった。該酸化反応は、２２℃で２時間進行した。

製剤されたＰｓ及びＣＲＭ１９７の溶液を、個別に凍結乾燥させた。凍結乾燥したＰｓ及びＣＲＭ１９７材料を、等容積のＤＭＳＯに個別に再溶解させた。その多糖類とＣＲＭ１９７の溶液を混合させて、多糖類の濃度を６ｇＰｓ／Ｌとし、多糖類とＣＲＭ１９７の質量比を３にした。そのコンジュゲーション反応に目標の割合（％）になるまで直ぐに水をスパイクした。該質量比は、得られたコンジュゲート中の多糖類とＣＲＭ１９７の比率を制御するために選択した。該コンジュゲーション反応は、３４℃で３時間進行した。

水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応に続いて、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モルあたり２モル）を加え、３４℃で１時間インキュベートした。そのバッチを、約４℃で、約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムで希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を加えてｐＨを中和した。そのバッチを、３００ｋＤａＭＷＣＯ透析カセットを使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の中の１０ｍＭヒスチジンに対して２～８℃で３日間透析した。

表４に示されているように、遊離多糖類及び遊離タンパク質は、コンジュゲーション反応における含水率の増加とともに増大する。これは、おそらく、高濃度の水でタンパク質が凝集することに起因しており、従って、効果的なコンジュゲーションのためには、コンジュゲーション反応中の水分含有量を最小限に抑えるように注意する必要がある。

実施例６
凍結乾燥製剤中の塩化ナトリウムを含んでいる肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質コンジュゲートの調製
コンジュゲートの属性を改善するために、コンジュゲーション反応の中に塩類をスパイクすることができるが、それは、コンジュゲーション反応の中に水も導入する。水は、上記実施例５において示されているように、タンパク質と多糖類の凝集を促進することにより、血清型３５Ｂ多糖コンジュゲーション反応を妨害する。該コンジュゲーション反応中の水分含有量は、凍結乾燥前の製剤に塩化ナトリウムを含ませることによって最小限に抑えられた。コンジュゲーション反応中の水分含有量の低減は、サイズが増大し、リシン損失が増加し並びに遊離タンパク質及び遊離多糖が低減したコンジュゲートをもたらした。

活性化された多糖類は、５％ｗ／ｖのショ糖濃度を用いて６ｍｇＰｓ／ｍＬで凍結乾燥させるために製剤した。種々のレベルの塩化ナトリウムを、表５中に記載されている特定のアームに関して、Ｐｓ－ＰｒｅＬｙｏの中にスパイクした。ＣＲＭ１９７は、１％ｗ／ｖのショ糖濃度を用いて６ｍｇＰｒ／ｍＬで凍結乾燥させるために製剤した。

製剤されたＰｓ及びＣＲＭ１９７の溶液を、個別に凍結乾燥させた。凍結乾燥したＰｓ及びＣＲＭ１９７材料を、等容積のＤＭＳＯに個別に再溶解させた。その多糖類とＣＲＭ１９７の溶液を混合させて、多糖類の濃度を６ｇＰｓ／Ｌとし、多糖類とＣＲＭ１９７の質量比を３にし、及び、塩化ナトリウムの濃度を０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ又は１５ｍＭとした。表５に記載されているように、塩化ナトリウムの添加は、Ｐｓｐｒｅ－ｌｙｏを介して、又は、Ｐｓ溶解後に水溶液としてＰｓ－ＤＭＳＯにスパイクすることによって、実施した。コンジュゲーション反応は３４℃で３時間進行した。

表５に示されているように、水性塩化ナトリウムをコンジュゲーション反応にスパイクすることで（アーム２～４）、塩化ナトリウムを含んでいないコンジュゲート（アーム１）と同様のコンジュゲート属性が得られる。逆に、凍結乾燥前の反応に塩化ナトリウムを加えると（アーム５～７）、塩化ナトリウムがない状態と比較して、Ｍｗが増大し且つ遊離Ｐｓが低減したコンジュゲートが生成される。

実施例７
マウス試験のための肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類－タンパク質コンジュゲートの調製
以下に記載されているように、肺炎レンサ球菌血清型３５Ｂ多糖類を溶解させ、化学的に活性化し、及び、限外濾過によって緩衝液を交換した。活性化された多糖類及び精製されたＣＲＭ１９７を、個別に、凍結乾燥させ、ＤＭＳＯに再溶解させた。次いで、再溶解した多糖類とＣＲＭ１９７の溶液を合し、コンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、限外濾過で精製した後、最後に０．２ミクロンで濾過した。所望の属性を有するコンジュゲートを生成させるために、各段階内におけるいくつかのプロセスパラメータ（例えば、ｐＨ、温度、濃度、及び、時間）を制御した。

多糖類の活性化
精製された肺炎球菌血清型３５Ｂ莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解させ、０．４５ミクロンで濾過した。適切な場合には、溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓ溶液の粘度を低減させた。均質化圧力及びホモジナイザーを通過する回数を制御して、多糖類の粘度を低減させた。多糖類を濃縮し、５ｋＤａＮＭＷＣＯタンジェンシャルフロー限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。

次いで、その多糖類溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液を用いて２２℃及びｐＨ５に調整した。多糖類の活性化は、１０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して開始させた。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖活性化の目標レベル（多糖反復単位１モルあたりのアルデヒドのモル数）を達成するために、多糖反復単位１モルあたり０．０３８モル又は０．０４７モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムであった。該酸化反応は、２２℃で１～２時間進行した。

活性化された多糖類は、５％ｗ／ｖのショ糖濃度を使用し及びグループ６については塩化ナトリウムを用いて６ｍｇＰｓ／ｍＬで凍結乾燥させるために製剤した。ＣＲＭ１９７は、１％ｗ／ｖのショ糖濃度を用いて６ｍｇＰｒ／ｍＬで凍結乾燥させるために製剤した。

製剤されたＰｓ及びＣＲＭ１９７の溶液を、個別に凍結乾燥させた。凍結乾燥したＰｓ及びＣＲＭ１９７材料を、等容積のＤＭＳＯに個別に再溶解させた。グループ３、４及び８では、Ｐｓ－ＤＭＳＯ溶液に塩化ナトリウムをスパイクした。その多糖類とＣＲＭ１９７の溶液を混合させて、多糖類の濃度を６ｇＰｓ／Ｌとし、多糖類とＣＲＭ１９７の装入質量比を１．５、２．２又は３．０にした。該コンジュゲーション反応は、３４℃で３～６時間進行した。コンジュゲーションパラメータは、表６中に要約されている。

水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応に続いて、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モルあたり２モル）を加え、３４℃で１時間インキュベートした。そのバッチを、約４℃で、約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムで希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を加えてｐＨを中和した。そのバッチを濃縮し、３００ｋＤａＮＭＷＣＯタンジェンシャルフロー限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の中の１０ｍＭヒスチジンに対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。

最終濾過及び製品貯蔵
保持液バッチを０．５／０．２ミクロンで濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の中の追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分配し、－６０℃以下で凍結させた。結果として得られたコンジュゲートの属性が表７に要約されている。

実施例８
マウス試験のための肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤
上記実施例に記載されている種々のプロセスを利用して調製した個々の３５Ｂ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤に使用した。

該一価の医薬品は、肺炎球菌多糖類３５Ｂ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを使用して調製し、目標４．０μｇ／ｍＬの肺炎球菌多糖抗原で、２０ｍＭヒスチジンｐＨ５．８及び１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％ｗ／ｖポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）の中で製剤する。マウス試験のグループ７及び８の場合は、該製剤は、アジュバントとしてリン酸アルミニウムの形態にある２５０μｇ［Ａｌ］／ｍＬを使用して調製する。

個々の肺炎球菌多糖抗原の目標濃度を得るために必要なバルクコンジュゲートの必要量は、バッチ容積と個々のバルク多糖濃度の濃度に基づいて計算した。個々のコンジュゲートをヒスチジンと塩化ナトリウムとＰＳ－２０の溶液に添加して、２倍のコンジュゲートブレンドを生成した。その２倍コンジュゲートブレンドを含んでいる製剤容器を磁気撹拌バーを使用して混合し、次いで、別の容器内に滅菌濾過する。その滅菌濾過した２倍コンジュゲートブレンドを、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含んでいる別の容器に加えることで、又は、生理食塩水で希釈することで、所望の多糖類、賦形剤及びＡＰＡ（必要な場合）の濃度を達成する。次いで、該製剤をガラス製バイアル又は注射器に充填し、２～８℃で貯蔵する。

実施例９
３５Ｂ－ＣＲＭ１９７ワクチンの免疫原性に対するコンジュゲート／製剤プロセスの影響
若い雌のＣＤ１マウス（６～８週齢、ｎ＝５／グループ）を、０日目、１４日目及び２８日目に、上記で製剤した３５Ｂ－ＣＲＭ１９７ワクチン０．１ｍＬを用いて免疫化した。３５Ｂ－ＣＲＭ１９７ワクチンは、免疫化ごとに、ＡＰＡアジュバントを加えずに（グループ１～６）又は２５μｇのＡＰＡを加えて（グループ７及び８）、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた３５Ｂ多糖類０．４μｇで投与した（表７及び８）。試験開始前（免疫前）及び３５日目（投与３後、ＰＤ３）に血清を収集した。訓練を受けた動物管理スタッフが、疾患又は苦痛の何らかの兆候に関して、少なくとも毎日マウスを観察した。マウス体内の当該ワクチン製剤は、ワクチン関連の有害事象が認められなかったので、安全であり、耐容性が高いと見なされた。全ての動物実験は、「ＧｕｉｄｅｆｏｒＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ」の推奨基準に厳密に従って実施した。当該マウス実験プロトコルは、「Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．」の「ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ」によって承認された。

マウス血清は、抗ＰｎＰｓ３５ＢＩｇＧ力価に関しては、以前に記載されたＥＬＩＳＡ（ＣｈｅｎＺ．Ｆ．ｅｔａｌ，ＢＭＣＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅ，２０１８，１８：６１３）を使用して評価し、並びに、抗３５Ｂ機能性抗体に関しては、以前に記載されたプロトコル（ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕ）に基づくオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）及び所有者である「ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｌａｂａｍａ（ＵＡＢ）ＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ」によって使用が許可されたＯｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェアによって評価した（Ｂｕｒｔｏｎ，ＲＬ，ＮａｈｍＭＨ，ＣｌｉｎＶａｃｃｉｎｅＩｍｍｕｎｏｌ２００６，１３：１００４－９；Ｂｕｒｔｏｎ，ＲＬ，ＮａｈｍＭＨ，ＣｌｉｎＶａｃｃｉｎｅＩｍｍｕｎｏｌ２０１２，１９：８３５－４１）。免疫前の血清は、プールとしてアッセイし、ＰＤ３血清は、個別にアッセイした。

免疫前血清については、１：２００希釈で検出可能な抗３５ＢＩｇＧは存在しなかった（データは示していない）。しかしながら、ＩｇＧ力価は全てのワクチン製剤についてＰＤ３で増加した（図１Ａ）。該データは、さらにまた、異なるコンジュゲーション／製剤プロセスが３５Ｂ多糖－ＣＲＭ１９７ワクチンの免疫原性に有意な影響を及ぼしたことを示している。ＡＰＡアジュバントを加えることで、アジュバントなしのワクチンと比較してＩｇＧ力価が増大する（グループ７対グループ１／グループ８対グループ４）。コンジュゲート反応に５ｍＭのＮａＣｌを加えた場合も、３５Ｂ－ＣＲＭ１９７ワクチンのＩｇＧ力価が増大した（グループ６対グループ５）。抗３５ＢＯＰＡ力価は、ＩｇＧ力価において見られたのと同じ傾向に従った（図１Ｂ）。

表７に示すような範囲にわたる属性を有する血清型３５Ｂ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、免疫原性を示すことが分かった。

Claims

１，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲート。
前記コンジュゲートが、３ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質～９ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質のリシン消費を含んでいる、請求項１に記載のコンジュゲート。
前記コンジュゲートが、４ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質～８ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質のリシン消費を含んでいる、請求項１に記載のコンジュゲート。
請求項２又は３のコンジュゲートを含んでいる組成物であって、該組成物が、さらに、総多糖類量の３０％未満の遊離多糖類及び総タンパク質量の３０％未満の遊離タンパク質を含んでいる、前記組成物。
請求項２又は３のコンジュゲートを含んでいる組成物であって、該組成物が、さらに、総多糖類量の２０％未満の遊離多糖類及び総タンパク質量の２０％未満の遊離タンパク質を含んでいる、前記組成物。
前記タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１～３に記載のコンジュゲート。
前記多糖類－タンパク質コンジュゲートのタンパク質成分がＣＲＭ１９７である、請求項４又は５に記載の組成物。
請求項１～３のコンジュゲートを作成するためのプロセスであって、前記多糖類を活性化させることを含んでおり、ここで、該活性化は、多糖類反復単位１モルあたり０．０１～０．１モルの過ヨウ素酸塩の範囲内の過ヨウ素酸塩を使用する、前記プロセス。
過ヨウ素酸塩の前記範囲が、多糖類反復単位１モルあたり０．０３～０．０６モルの過ヨウ素酸塩である、請求項８に記載のプロセス。
前記過ヨウ素酸塩が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項８又は９に記載のプロセス。
前記過ヨウ素酸塩が、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項８又は９に記載のプロセス。
請求項１～３のコンジュゲートを作成するためのプロセスであって、前記多糖類を前記タンパク質にコンジュケートさせることを含んでおり、ここで、該コンジュゲーションは２２℃～３８℃のコンジュゲーション温度で実施する、前記プロセス。
前記コンジュゲーション温度が３２℃～３６℃である、請求項１２に記載のプロセス。
請求項１～３のコンジュゲートを作成するためのプロセスであって、前記多糖類を活性化させること（ここで、該活性化は、多糖類反復単位１モルあたり０．０１～０．１モルの過ヨウ素酸塩の範囲内の過ヨウ素酸塩を使用する）、及び、該多糖類を前記タンパク質にコンジュゲートさせること（ここで、該コンジュゲーションは、２２℃～３８℃のコンジュゲーション温度で実施する）、を含んでいる、前記プロセス。
請求項１～３のコンジュゲートを作成するためのプロセスであって、前記多糖類を活性化させること（ここで、該活性化は、多糖類反復単位１モルあたり０．０３～０．０６モルの過ヨウ素酸塩の範囲内の過ヨウ素酸塩を使用する）、及び、該多糖類を前記タンパク質にコンジュゲートさせること（ここで、該コンジュゲーションは、３２℃～３６℃のコンジュゲーション温度で実施する）、を含んでいる、前記プロセス。
前記コンジュゲーションを非プロトン性溶媒の中で実施する、請求項１４又は１５に記載のプロセス。
前記非プロトン性溶媒がＤＭＳＯである、請求項１６に記載のプロセス。
前記コンジュゲーションを塩化ナトリウムの存在下で実施する、請求項１６又は１７に記載のプロセス。
塩化ナトリウムの濃度が５～１５ｍＭである、請求項１８に記載のプロセス。
前記溶媒が、１．２％（ｖ／ｖ）未満の水を含んでいる、請求項１６～１９のいずれかに記載のプロセス。
前記溶媒が、０．６％（ｖ／ｖ）未満の水を含んでいる、請求項２０に記載のプロセス。
前記溶媒が、０．３％（ｖ／ｖ）未満の水を含んでいる、請求項２１に記載のプロセス。
前記コンジュゲーションを、０．０１～０．１の範囲内の反復単位あたりのアルデヒドを含んでいる活性化多糖類を使用して実施する、請求項１２～２２のいずれかに記載のプロセス。
反復単位あたりのアルデヒドが、０．０３～０．０６の範囲内である、請求項２３に記載のプロセス。
前記コンジュゲーションを、３０～２００ＫＤａの範囲内の分子量を有する活性化多糖類を使用して実施する、請求項１２～２４のいずれかに記載のプロセス。
前記活性化多糖類の分子量範囲が４０～１００ＫＤａである、請求項２５に記載のプロセス。
免疫原性多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であって、請求項８～２６のいずれかに記載のプロセスで調製された血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを含んでいる、前記免疫原性多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物。
免疫原性多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であって、請求項１～３の血清型３５Ｂ肺炎レンサ球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを含んでいる、前記免疫原性多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物。