JP2022527541A - 抗ｈｌａ－ｃ抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
抗ＨＬＡ－Ｃ６抗体及びその抗原結合フラグメントが記載される。当該抗体をコードしている核酸、当該抗体を含む組成物、並びに当該抗体を生成する方法、及び自己免疫疾患などの疾患を治療又は予防するために当該抗体を使用する方法についても記載される。【選択図】図１
Description
本発明は、モノクローナル抗ＨＬＡ－Ｃ抗体、抗体をコードする核酸及び発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞、並びに抗体を含む組成物に関する。抗体を作製する方法、及び乾癬を含む疾患を治療するために抗体を使用する方法も提供される。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「ＪＢＩ６０６５ＷＯＰＣＴ１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ」及び２０１９年３月２８日の作成日で、１２６ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ファイル名「ＪＢＩ６０６５ＷＯＰＣＴ１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ」及び２０１９年３月２８日の作成日で、１２６ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
自己免疫疾患は、２０人に１人が罹患していると推定されている（Ｈａｙｔｅｒ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｖ．１１（１０）：７５４－６５（２０１２））。自己免疫の根本原因は、自己抗原に反応する、調節不全のＴ細胞クローンの出現である。自己反応性Ｔ細胞により、サイトカイン駆動型フィードフォーワードループが開始され、炎症（例えば、白血球動員及び浮腫）を引き起こし、これが慢性化すると、組織破壊及び機能喪失につながる。特定のサイトカイン（例えば、抗ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１７）を中和する抗体は、フィードフォーワードループを中断し、炎症を最小限に抑えるために有用である（Ｗｏｌｆ ａｎｄ Ａｎｇ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．３７（２）：２８３－９９（２０１７）；Ｈｅｒ ａｎｄ Ｋａｖａｎａｕｇｈ，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１）：１９－２７（２０１６））。しかし、これらの薬剤は、疾患の初期の根本原因に対処していないため、慢性的な治療が必要となる。したがって、下流の炎症を標的とするのではなく、疾患の根本原因に対処するために、サイトカインではなく自己反応性Ｔ細胞の発達及び活性化を標的とする治療法が必要である。
根本原因に対処する改善された選択的アプローチは、自己抗原を認識する自己反応性Ｔ細胞の発達及び活性化をブロックする抗体を開発することである。Ｔ細胞は、α及びβ鎖からなる、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られているヘテロ二量体表面受容体によって抗原を認識する。α及びβ鎖遺伝子は、胸腺で広範囲の体細胞組換えを受ける。胸腺のＴ細胞発達時の組換えにより、個体内で発現するＴＣＲ遺伝子には非常に大きな多様性がもたらされる（Ｌａｙｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｇ．Ｂ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３７０（１６７５）：２０１４０２９１（２０１５））。各ＴＣＲは、異なる抗原認識機能を有する。抗原は、宿主の６つの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質のうちの１つによって結合して表示される短いペプチドである。具体的には、ヒトは、３つのクラスＩ ＭＨＣ遺伝子（すなわち、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ）及び３つのクラスＩＩ ＭＨＣ遺伝子（すなわち、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、又はＨＬＡ－ＤＱ）を発現する（Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３７（１－２）：１－８（２０１１））。ＭＨＣ遺伝子は、ゲノムで最も多型の遺伝子の１つであり、数百種類の異形態（タンパク質アイソフォーム）をコードする各ＭＨＣ遺伝子の対立遺伝子が、ヒト集団には１０００個を超えて存在する。各ＭＨＣ異形態は、独自のペプチド結合面を持ち、自己及び外来ペプチドの独自のレパートリーを結合する。成熟Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲは、自己ＭＨＣ異形態の１つに「制限」され、これは、Ｔ細胞が特異的なペプチドＭＨＣ複合体によってのみ活性化され得ることを意味する。
自己反応性Ｔ細胞によって認識される正確な自己ペプチドＭＨＣ複合体を判定するために、多くの研究努力がなされてきた。特定の自己ペプチドＭＨＣ複合体と同族のＴ細胞を検出することが可能であるが、大多数の患者で認識される自己ペプチドＭＨＣ複合体、又は疾患を引き起こすことが証明されている自己ペプチドＭＨＣ複合体を同定することはより困難である。更に、自己免疫疾患は、複数の自己ペプチドＭＨＣ複合体を認識する多くのＴ細胞クローンによって引き起こされる可能性がある。
自己ペプチドＭＨＣ複合体の同定は依然として不明瞭なままであるが、多くの自己免疫疾患が特定のＭＨＣ対立遺伝子との強い関連性を示すことから、問題となるＭＨＣの同定に関する重要な遺伝学的な手がかりを提供する（Ｍａｔｚａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８（１）：７６（２０１７）。各異形態は自己ペプチドの独自のレパートリーに結合するため、特定の対立遺伝子が特定の自己免疫疾患を持つ人で高度に濃縮される可能性があることは重要なことである。したがって、自己免疫疾患の遺伝的リスクは、組織特異的な自己ペプチドを表示する異形態の能力を反映していると考えられる。このことは、ＨＬＡ－ＤＱ１５によって結合されたＩＶ型コラーゲンペプチドをＴ細胞が認識するグッドパスチャー病に最もよく示されている（Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１４（１１）：２８０１－１２（２００３））。
ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２対立遺伝子の遺伝的性質は、乾癬と呼ばれる自己免疫疾患を発症する人の最も強い遺伝的決定因子である（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７８（５）：８２７－５１（２００６）；Ｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３０（５）：１２１３－２６（２０１０））。滴状乾癬を経験している人の大多数（約８０％）は、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２対立遺伝子を保有しており（Ａｓｕｍａｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２０（４）：６２７－３２（２００３））、一方、より一般的な尋常性乾癬の人では、約５０％がこの対立遺伝子を保有し、健康な対照者では約１０～１５％であるのと比較される。ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２対立遺伝子の１コピーは、ホモ接合体で２．５倍高い約１０％の生涯リスクを伴い（Ｇｕｄｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４８（２）：２３３－５（２００３））、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２陽性の人は、より早い年齢で、より重症の乾癬を発症する（Ｇｕｄｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２６（４）：７４０－５（２００６））。重要なことに、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２の人の乾癬のリスクは、ＥＲＡＰ１の触媒的に活性がより高い変異体（Ｓｔｒａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｇｅｎｅｔ．４２（１１）：９８５－９０（２０１０））、すなわち、クラスＩ ＭＨＣ負荷にペプチドをカスタマイズするために必要な主要なエンドペプチダーゼと、エピスタシスな関係にある。
乾癬を引き起こす自己ペプチドについては、文献上ではコンセンサスが得られていないが、いくつかの自己ペプチド／タンパク質が、患者の血液又は皮膚から単離されたＴ細胞を活性化することが示されている。現在までに、これらには、皮膚関連タンパク質であるケラチン－１７、ＬＬ３７、ＡＤＡＭＴＳＬ５、Ｍａｓｐｉｎ、及びペルオキシレドキシン－２又はペプチド誘導体が含まれる（Ｙｕｎｕｓｂａｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌ．８，ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ６０９８（２０１８）；Ｌａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：５６２１（２０１４）；Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１２（１３）：２２０３－１２（２０１５）；ａｎｄ Ｂｅｓｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４（９）：５３９２－４０２（２０１０））。ケラチン－１７、ＬＬ３７、及びＡＤＡＭＴＳＬ５に由来するペプチドは、ＨＬＡ－Ｃｗ６が結合する可能性のあるペプチドのレパートリーの一部であることが示されており、ＬＬ３７ペプチド結合ＨＬＡ－Ｃｗ６テトラマーは、乾癬患者の同族Ｔ細胞を同定するために使用されている。一方、ケラチン－１７及びペルオキシレドキシン－２ペプチドは、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２陽性の乾癬患者では、陰性の患者に比べて有意に高い頻度でＴ細胞を活性化する。乾癬病変ではクローン性Ｔ細胞増殖のエビデンスが報告されており、いくつかのクローンによって発現されるα及びβＴＣＲ遺伝子の配列が決定され、報告されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（５）：ｅ３７３３８（２０１２））。これらのＴＣＲの１つの同族ペプチドＭＨＣをデコンボリューションして判定した（Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１２（１３）：２２０３－１２（２０１５））。ＴＣＲはＨＬＡ－Ｃｗ６に制限されており、メラノサイト上のＨＬＡ－Ｃｗ６によって提示されるＡＤＡＭＴＳＬ５（５７－６５）が同族抗原であると考えられた。総じて、データは、乾癬の自己反応性Ｔ細胞に自己抗原を提示する際のＨＬＡ－Ｃｗ６の重要な役割を指摘している。
自己反応性Ｔ細胞の発達及び活性化をブロックするＨＬＡ－Ｃに対する抗体は、乾癬の根本的な問題に対処するのに有効であると考えられる。
全般的な一態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ｃ、任意にＨＬＡ－Ｃｗ６に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列：
ａ．それぞれ、配列番号３７、３８、３９、６４、６５、及び６６、
ｂ．それぞれ、配列番号４０、４１、４２、６７、６８、及び６９、
ｃ．それぞれ、配列番号４３、４４、４５、７０、７１、及び７２、
ｄ．それぞれ、配列番号４６、４７、４８、７３、７４、及び７５、
ｅ．それぞれ、配列番号４９、５０、５１、７６、７７、及び７８、
ｆ．それぞれ、配列番号５２、５３、５４、７９、８０、及び８１、
ｇ．それぞれ、配列番号５５、５６、５７、８２、８３、及び８４、
ｈ．それぞれ、配列番号５８、５９、６０、８５、８６、及び８７、又は
ｉ．それぞれ、配列番号６１、６２、６３、８８、８９、及び９０、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
ａ．それぞれ、配列番号３７、３８、３９、６４、６５、及び６６、
ｂ．それぞれ、配列番号４０、４１、４２、６７、６８、及び６９、
ｃ．それぞれ、配列番号４３、４４、４５、７０、７１、及び７２、
ｄ．それぞれ、配列番号４６、４７、４８、７３、７４、及び７５、
ｅ．それぞれ、配列番号４９、５０、５１、７６、７７、及び７８、
ｆ．それぞれ、配列番号５２、５３、５４、７９、８０、及び８１、
ｇ．それぞれ、配列番号５５、５６、５７、８２、８３、及び８４、
ｈ．それぞれ、配列番号５８、５９、６０、８５、８６、及び８７、又は
ｉ．それぞれ、配列番号６１、６２、６３、８８、８９、及び９０、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列：
ａ．それぞれ、配列番号９１、９２、９３、１１８、１１９、及び１２０、
ｂ．それぞれ、配列番号９４、９５、９６、１２１、１２２、及び１２３、
ｃ．それぞれ、配列番号９７、９８、９９、１２４、１２５、及び１２６、
ｄ．それぞれ、配列番号１００、１０１、１０２、１２７、１２８、及び１２９、
ｅ．それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、１３０、１３１、及び１３２、
ｆ．それぞれ、配列番号１０６、１０７、１０８、１３３、１３４、及び１３５、
ｇ．それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１３６、１３７、及び１３８、
ｈ．それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１３９、１４０、及び１４１、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１１５、１１６、１１７、１４２、１４３、及び１４４、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントも提供される。
ａ．それぞれ、配列番号９１、９２、９３、１１８、１１９、及び１２０、
ｂ．それぞれ、配列番号９４、９５、９６、１２１、１２２、及び１２３、
ｃ．それぞれ、配列番号９７、９８、９９、１２４、１２５、及び１２６、
ｄ．それぞれ、配列番号１００、１０１、１０２、１２７、１２８、及び１２９、
ｅ．それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、１３０、１３１、及び１３２、
ｆ．それぞれ、配列番号１０６、１０７、１０８、１３３、１３４、及び１３５、
ｇ．それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１３６、１３７、及び１３８、
ｈ．それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１３９、１４０、及び１４１、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１１５、１１６、１１７、１４２、１４３、及び１４４、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントも提供される。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列：
ａ．それぞれ、配列番号１４５、１４６、１４７、１７２、１７３、及び１７４、
ｂ．それぞれ、配列番号１４８、１４９、１５０、１７５、１７６、及び１７７、
ｃ．それぞれ、配列番号１５１、１５２、１５３、１７８、１７９、及び１８０、
ｄ．それぞれ、配列番号１５４、１５５、１５６、１８１、１８２、及び１８３、
ｅ．それぞれ、配列番号１５７、１５８、１５９、１８４、１８５、及び１８６、
ｆ．それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１８７、１８８、及び１８９、
ｇ．それぞれ、配列番号１６３、１６４、１６５、１９０、１９１、及び１９２、
ｈ．それぞれ、配列番号１６６、１６７、１６８、１９３、１９４、及び１９５、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１６９、１７０、１７１、１９６、１９７、及び１９８、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントも提供される。
ａ．それぞれ、配列番号１４５、１４６、１４７、１７２、１７３、及び１７４、
ｂ．それぞれ、配列番号１４８、１４９、１５０、１７５、１７６、及び１７７、
ｃ．それぞれ、配列番号１５１、１５２、１５３、１７８、１７９、及び１８０、
ｄ．それぞれ、配列番号１５４、１５５、１５６、１８１、１８２、及び１８３、
ｅ．それぞれ、配列番号１５７、１５８、１５９、１８４、１８５、及び１８６、
ｆ．それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１８７、１８８、及び１８９、
ｇ．それぞれ、配列番号１６３、１６４、１６５、１９０、１９１、及び１９２、
ｈ．それぞれ、配列番号１６６、１６７、１６８、１９３、１９４、及び１９５、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１６９、１７０、１７１、１９６、１９７、及び１９８、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントも提供される。
特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５若しくは１７と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、
ａ．配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｂ．配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｃ．配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｄ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｅ．配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｆ．配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｇ．配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｈ．配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、又は
ｉ．配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、を含む。
ａ．配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｂ．配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｃ．配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｄ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｅ．配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｆ．配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｇ．配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｈ．配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、又は
ｉ．配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、を含む。
特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラである。
特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトである又はヒト化されている。
特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体又は抗原結合は、ＨＬＡ－Ｃｗ６による抗原提示の結合及び阻害を介して、Ｔ細胞の発達及び活性化をブロックする。
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸も提供される。
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターも提供される。
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを含む宿主細胞も提供される。
特定の実施形態では、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物が提供される。
また、自己免疫疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法も提供される。本方法は、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む。自己免疫疾患は、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、及び乾癬性関節炎から選択することができるが、これらに限定されない。
また、本発明は、自己反応性Ｔ細胞の活性化の阻害を、それを必要とする対象において行う方法を提供する。本方法は、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含み、医薬組成物の投与により、対象における自己反応性Ｔ細胞の活性化が阻害される。
また、ＨＬＡ－Ｃ（例えば、ＨＬＡ－Ｃｗ６）発現細胞におけるペプチド結合ＨＬＡ－Ｃ（例えば、ＨＬＡ－Ｃｗ６）へのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の機能的結合を阻害する方法も提供される。本方法は、細胞を本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることを含み、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、ペプチド結合ＨＬＡ－Ｃに結合し、ＴＣＲの機能的結合を阻害する。特定の実施形態では、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる。特定の実施形態では、細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触させる。
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する方法も提供される。本方法は、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む細胞を、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する条件で培養することと、細胞又は培養物から抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することと、を含む。
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物を製造する方法も提供される。当該方法は、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを、医薬的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物を得ることを含む。
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した特定の実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、又は「含有する（containing）」あるいはこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の接続的な用語「及び／又は」は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用されるとき、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されることはないことを示す。
本明細書で使用するとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§ ２１１１．０３を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「被験体／対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
「同一」又は「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例、抗ＨＬＡ－Ｃ抗体及びそれをコードするポリヌクレオチド、ＨＬＡ－Ｃポリペプチド及びそれをコードするＨＬＡ－Ｃポリヌクレオチド）に関連して、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及びアラインメントした場合に同じであるか、又は特定のパーセントの同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。
ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア、常に＞０）及びＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用するとき、用語「阻害する（inhibit）」、「阻害する（inhibiting）」、及び「阻害（inhibition）」は、活性、応答、状態、疾患、又は他の生物学的パラメータを低下させることを意味する。これには、活性、応答、状態、又は疾患の完全なアブレーションが挙げられるが、これらに限定されない。また、これには、例えば、ネイティブレベル又は対照レベルと比較して、活性、応答、状態、又は疾患を１０％減少させることが含まれ得る。したがって、減少は、ネイティブレベル又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、又はこれらの間の任意の減少量であり得る。非限定的な例として、本発明の抗体は、ＨＬＡ－Ｃ（例えば、ＨＬＡ－Ｃｗ６）に結合することによって、自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害することができる。
抗体
本発明は、全般的に、単離抗ＨＬＡ－Ｃ抗体（例えば、ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体）、当該抗体をコードしている核酸及び発現ベクター、当該ベクターを含有する組換え細胞、並びに当該抗体を含む組成物に関する。抗体を作製する方法、及び自己免疫疾患（例えば、乾癬）を含む疾患を治療するために抗体を使用する方法も提供される。本発明の抗体は、１つ以上の望ましい機能的特性（ＨＬＡ－Ｃへの高親和性結合、ＨＬＡ－Ｃへの高い特異性、自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害する能力、ペプチド結合したＨＬＡ－Ｃｗ６へのＴＣＲの機能的結合を阻害する能力、及び自己免疫疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う能力を含むが、これらに限定されない）を有するものである。
本発明は、全般的に、単離抗ＨＬＡ－Ｃ抗体（例えば、ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体）、当該抗体をコードしている核酸及び発現ベクター、当該ベクターを含有する組換え細胞、並びに当該抗体を含む組成物に関する。抗体を作製する方法、及び自己免疫疾患（例えば、乾癬）を含む疾患を治療するために抗体を使用する方法も提供される。本発明の抗体は、１つ以上の望ましい機能的特性（ＨＬＡ－Ｃへの高親和性結合、ＨＬＡ－Ｃへの高い特異性、自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害する能力、ペプチド結合したＨＬＡ－Ｃｗ６へのＴＣＲの機能的結合を阻害する能力、及び自己免疫疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う能力を含むが、これらに限定されない）を有するものである。
全般的な態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ｃ（例えば、ＨＬＡ－Ｃｗ６）に特異的に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、広義で使用され、免疫グロブリン、又はモノクローナル又はポリクローナルである、ヒト、ヒト化、複合、及びキメラ抗体を含む抗体分子並びに抗体フラグメントを含む。全般的には、抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体の構造は、公知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。したがって、本発明の抗体は、５つの主要なクラス又は対応する下位クラスのいずれかのものであることができる。本発明の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であることが好ましい。脊椎動物種の抗体軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちκ及びλのうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、ラット又はヒト抗体由来の重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。重及び軽定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる抗原結合領域を含有し、これらのそれぞれは３つのドメイン（すなわち相補性決定領域１～３；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、あるいはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、あるいはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と称される。
本明細書で使用するとき、用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する単離抗体は、ＨＬＡ－Ｃｗ６に結合しない抗体を実質的に含まない）。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在する可能性のある自然発生変異を除いて同一である。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、又は組換えＤＮＡ法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウス又はラットから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合フラグメント」は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体又は親抗体フラグメントが結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖のＦｄフラグメントを含む。他の特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントはＦａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。
本明細書で使用するとき、用語「単鎖抗体」は、約１５～約２０個のアミノ酸の短いペプチドによって接続される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、この分野における従来の単鎖抗体を指す。本明細書で使用するとき、用語「単一ドメイン抗体」は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むか、又は重鎖可変領域のみを含む、この分野における従来の単一ドメイン抗体を指す。
本明細書で使用するとき、用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、又は当該技術分野において既知の任意の技術を用いて作製される、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、インタクトな若しくは完全長の抗体、そのフラグメント、並びに／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／若しくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
本明細書で使用するとき、用語「ヒト化抗体」とは、抗体の抗原結合特性が保持されるが、人体における抗原の抗原性が低下するように、改変により配列相同性をヒト抗体のそれに対して増加させた非ヒト抗体を意味する。
本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、多くの場合、所望の特異性、親和性、及び能力を有する１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方で定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、別の種の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する抗体の配列に対応する。
本明細書で使用するとき、用語「多重特異性抗体」は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、複数のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複しないか、又は実質的に重複しない。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（又は異なる多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、又は第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分枝、又は四重特異性抗体分子である。
本明細書で使用するとき、用語「二重特異性抗体」は、２つ以下のエピトープ又は２つ以下の抗原に結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（又は異なる多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントとを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントとを含む。ある実施形態では、第１のエピトープはＨＬＡ－Ｃｗ６上に位置し、第２のエピトープは他の自己免疫関連表面抗原上に位置する。
本明細書で使用するとき、用語「ＨＬＡ－Ｃｗ６」は、ＭＨＣクラスＩ重鎖受容体を指す。ＨＬＡ－Ｃｗ６は、ＨＬＡ－ＣクラスＩ重鎖受容体の血清型の１つである。ＨＬＡ－Ｃ受容体は、ＨＬＡ－Ｃ成熟遺伝子産物及びｂ２－ミクログロブリンからなるヘテロ二量体である。成熟Ｃ鎖は、細胞膜に固定されている。ＨＬＡ－Ｃは、ほとんど全ての細胞で発現しており、小ペプチドを免疫系に提示する働きをし、これは、小ペプチドが自己ペプチドであるか非自己ペプチドであるかを判定するように作用する。ＨＬＡ－Ｃは、クラスＩ－ＭＨＣ受容体である多数のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子をコードする、６番染色体上の遺伝子座である。ＨＬＡ－Ｃタンパク質の血清型としては、ＨＬＡ－Ｃｗ１、ＨＬＡ－Ｃｗ２、ＨＬＡ－Ｃｗ３、ＨＬＡ－Ｃｗ４、ＨＬＡ－Ｃｗ５、ＨＬＡ－Ｃｗ６、ＨＬＡ－Ｃｗ６、ＨＬＡ－Ｃｗ７、ＨＬＡ－Ｃｗ８、ＨＬＡ－Ｃｗ１２、ＨＬＡ－Ｃｗ１４、ＨＬＡ－Ｃｗ１５、ＨＬＡ－Ｃｗ１６、ＨＬＡ－Ｃｗ１７、及びＨＬＡ－Ｃｗ１８が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヒトＨＬＡ－Ｃｗ６の例示的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ２９９６３で表される。
本明細書で使用するとき、「ＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する」抗体とは、ＨＬＡ－Ｃｗ６、好ましくはヒトＨＬＡ－Ｃｗ６に、１×１０－７Ｍ以下、好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、又は１×１０－１０Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を指す。用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を用いて決定することができる。例えば、抗体のＫＤは、表面プラズモン共鳴を使用することによって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのバイオセンサーシステムを使用することなどによって、又はＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムなどのバイオレイヤーインターフェロメトリー技術を使用することによって、求めることができる。
抗体のＫＤの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性が高い。
特定の態様によれば、本発明は、以下のポリペプチド配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって：
ａ．それぞれ、配列番号３７、３８、３９、６４、６５、及び６６、
ｂ．それぞれ、配列番号４０、４１、４２、６７、６８、及び６９、
ｃ．それぞれ、配列番号４３、４４、４５、７０、７１、及び７２、
ｄ．それぞれ、配列番号４６、４７、４８、７３、７４、及び７５、
ｅ．それぞれ、配列番号４９、５０、５１、７６、７７、及び７８、
ｆ．それぞれ、配列番号５２、５３、５４、７９、８０、及び８１、
ｇ．それぞれ、配列番号５５、５６、５７、８２、８３、及び８４、
ｈ．それぞれ、配列番号５８、５９、６０、８５、８６、及び８７、又は
ｉ．それぞれ、配列番号６１、６２、６３、８８、８９、及び９０、
ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
ａ．それぞれ、配列番号３７、３８、３９、６４、６５、及び６６、
ｂ．それぞれ、配列番号４０、４１、４２、６７、６８、及び６９、
ｃ．それぞれ、配列番号４３、４４、４５、７０、７１、及び７２、
ｄ．それぞれ、配列番号４６、４７、４８、７３、７４、及び７５、
ｅ．それぞれ、配列番号４９、５０、５１、７６、７７、及び７８、
ｆ．それぞれ、配列番号５２、５３、５４、７９、８０、及び８１、
ｇ．それぞれ、配列番号５５、５６、５７、８２、８３、及び８４、
ｈ．それぞれ、配列番号５８、５９、６０、８５、８６、及び８７、又は
ｉ．それぞれ、配列番号６１、６２、６３、８８、８９、及び９０、
ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
別の特定の態様によれば、本発明は、以下のポリペプチド配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって：
ａ．それぞれ、配列番号９１、９２、９３、１１８、１１９、及び１２０、
ｂ．それぞれ、配列番号９４、９５、９６、１２１、１２２、及び１２３、
ｃ．それぞれ、配列番号９７、９８、９９、１２４、１２５、及び１２６、
ｄ．それぞれ、配列番号１００、１０１、１０２、１２７、１２８、及び１２９、
ｅ．それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、１３０、１３１、及び１３２、
ｆ．それぞれ、配列番号１０６、１０７、１０８、１３３、１３４、及び１３５、
ｇ．それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１３６、１３７、及び１３８、
ｈ．それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１３９、１４０、及び１４１、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１１５、１１６、１１７、１４２、１４３、及び１４４、
ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
ａ．それぞれ、配列番号９１、９２、９３、１１８、１１９、及び１２０、
ｂ．それぞれ、配列番号９４、９５、９６、１２１、１２２、及び１２３、
ｃ．それぞれ、配列番号９７、９８、９９、１２４、１２５、及び１２６、
ｄ．それぞれ、配列番号１００、１０１、１０２、１２７、１２８、及び１２９、
ｅ．それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、１３０、１３１、及び１３２、
ｆ．それぞれ、配列番号１０６、１０７、１０８、１３３、１３４、及び１３５、
ｇ．それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１３６、１３７、及び１３８、
ｈ．それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１３９、１４０、及び１４１、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１１５、１１６、１１７、１４２、１４３、及び１４４、
ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
別の特定の態様によれば、本発明は、以下のポリペプチド配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって：
ａ．それぞれ、配列番号１４５、１４６、１４７、１７２、１７３、及び１７４、
ｂ．それぞれ、配列番号１４８、１４９、１５０、１７５、１７６、及び１７７、
ｃ．それぞれ、配列番号１５１、１５２、１５３、１７８、１７９、及び１８０、
ｄ．それぞれ、配列番号１５４、１５５、１５６、１８１、１８２、及び１８３、
ｅ．それぞれ、配列番号１５７、１５８、１５９、１８４、１８５、及び１８６、
ｆ．それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１８７、１８８、及び１８９、
ｇ．それぞれ、配列番号１６３、１６４、１６５、１９０、１９１、及び１９２、
ｈ．それぞれ、配列番号１６６、１６７、１６８、１９３、１９４、及び１９５、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１６９、１７０、１７１、１９６、１９７、及び１９８、
ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
ａ．それぞれ、配列番号１４５、１４６、１４７、１７２、１７３、及び１７４、
ｂ．それぞれ、配列番号１４８、１４９、１５０、１７５、１７６、及び１７７、
ｃ．それぞれ、配列番号１５１、１５２、１５３、１７８、１７９、及び１８０、
ｄ．それぞれ、配列番号１５４、１５５、１５６、１８１、１８２、及び１８３、
ｅ．それぞれ、配列番号１５７、１５８、１５９、１８４、１８５、及び１８６、
ｆ．それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１８７、１８８、及び１８９、
ｇ．それぞれ、配列番号１６３、１６４、１６５、１９０、１９１、及び１９２、
ｈ．それぞれ、配列番号１６６、１６７、１６８、１９３、１９４、及び１９５、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１６９、１７０、１７１、１９６、１９７、及び１９８、
ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
別の特定の態様によれば、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５若しくは１７と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。好ましい一実施形態によれば、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
別の特定の態様によれば、本発明は、以下を含む、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する：
ａ．配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｂ．配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｃ．配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｄ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｅ．配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｆ．配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｇ．配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｈ．配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、又は
ｉ．配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域。
ａ．配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｂ．配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｃ．配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｄ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｅ．配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｆ．配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｇ．配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｈ．配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、又は
ｉ．配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号３７、３８、３９、６４、６５、及び６６のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号４０、４１、４２、６７、６８、及び６９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号４３、４４、４５、７０、７１、及び７２のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号４６、４７、４８、７３、７４、及び７５のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号４９、５０、５１、７６、７７、及び７８のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号５２、５３、５４、７９、８０、及び８１のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号５５、５６、５７、８２、８３、及び８４のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号５８、５９、６０、８５、８６、及び８７のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１５と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号６１、６２、６３、８８、８９、及び９０のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１８と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号９１、９２、９３、１１８、１１９、及び１２０のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号９４、９５、９６、１２１、１２２、及び１２３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号９７、９８、９９、１２４、１２５、及び１２６のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１００、１０１、１０２、１２７、１２８、及び１２９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、１３０、１３１、及び１３２のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１０６、１０７、１０８、１３３、１３４、及び１３５のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１３６、１３７、及び１３８のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１３９、１４０、及び１４１のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１５と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１１５、１１６、１１７、１４２、１４３、及び１４４のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１８と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１４５、１４６、１４７、１７２、１７３、及び１７４のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１４８、１４９、１５０、１７５、１７６、及び１７７のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１５１、１５２、１５３、１７８、１７９、及び１８０のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１５４、１５５、１５６、１８１、１８２、及び１８３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１５７、１５８、１５９、１８４、１８５、及び１８６のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１８７、１８８、及び１８９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１６３、１６４、１６５、１９０、１９１、及び１９２のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１６６、１６７、１６８、１９３、１９４、及び１９５のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１５と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号１６９、１７０、１７１、１９６、１９７、及び１９８のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１８と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
別の特定の態様によれば、本発明は、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、抗体又はその抗原結合フラグメントがキメラである。
別の特定の態様によれば、本発明は、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、抗体又はその抗原結合フラグメントがヒトである又はヒト化されている。
別の全般的な態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしている、単離核酸に関する。タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、タンパク質のコード配列を変える（例えば置換する、欠失する、挿入するなど）ことができることが、当業者には理解されよう。したがって、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしている核酸配列を変更できることが当業者には理解されるであろう。
別の全般的な態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしている単離核酸を含む、ベクターに関する。プラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターなどの、本開示の観点から当業者に公知の任意のベクターも使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモータ、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモータは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモータであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当技術分野において知られており、細胞内で抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するために、本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成を使用して、本発明の実施形態に従った組換え発現ベクターを生成することができる。
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸を含む宿主細胞に関する。本開示の観点から、当業者に知られている任意の宿主細胞を、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの組換え発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌ＴＧ１若しくはＢＬ２１細胞（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ抗体の発現の場合）、ＣＨＯ－ＤＧ４４若しくはＣＨＯ－Ｋ１細胞、又はＨＥＫ２９３細胞（例えば、完全長ＩｇＧ抗体の発現の場合）である。特定の実施形態によれば、組換え発現ベクターは、組換え核酸が効果的に発現するように宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる、化学的トランスフェクション、熱ショック、又はエレクトロポレーションなどの従来の方法によって宿主細胞に形質転換される。
別の全般的な態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する方法であって、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する条件で、当該モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしている核酸を含む細胞を培養することと、当該細胞又は細胞培養物から（例えば上清から）当該抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することと、を含む、方法に関する。発現した抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞から採取し、当該技術分野において公知の従来の技術に従って、そして、本明細書に記載のとおり精製することができる。
医薬組成物
別の全般的な態様では、本発明は、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。本明細書で使用するとき、用語「医薬組成物」は、医薬的に許容される担体と一緒に本発明の抗体を含む製造物を意味する。本発明の抗体及びそれを含む組成物は、本明細書で言及される治療用途のための医薬の製造においても有用である。
別の全般的な態様では、本発明は、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。本明細書で使用するとき、用語「医薬組成物」は、医薬的に許容される担体と一緒に本発明の抗体を含む製造物を意味する。本発明の抗体及びそれを含む組成物は、本明細書で言及される治療用途のための医薬の製造においても有用である。
本明細書で使用するとき、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファ、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野で周知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で使用するとき、用語「医薬的に許容される担体」は、本発明による組成物の効果にも本発明による組成物の生物活性にも干渉しない無毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮して、抗体の医薬組成物での使用に好適ないずれの医薬的に許容される担体も、本発明において使用することができる。
医薬的に許容される担体を有する医薬的活性成分の製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）及びそれ以降の任意の改訂版）にあるように、当該技術分野において既知である。追加成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張度調節剤、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。１つ以上の医薬的に許容される担体が、本発明の医薬組成物の製剤化において使用され得る。
本発明の一実施形態では、医薬組成物は液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ゲルなどを含んでいてよい。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０％ｗ／ｗの水、又は少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％ｗ／ｗの水を含む。
一実施形態では、医薬組成物は、例えば注射デバイス（例えば、注射器又は注入ポンプ）を介して注射することができる注射剤として製剤化され得る。注射は、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、硝子体内、又は静脈内に送達され得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、そのまま使用することができるか、又は医師若しくは患者が使用前に溶媒及び／若しくは希釈剤を加える、凍結乾燥又は噴霧乾燥組成物である。固体剤形としては、圧縮錠剤及び／又はコーティング錠剤などの錠剤、並びにカプセル剤（例えば、硬又は軟ゼラチンカプセル）を挙げることができる。医薬組成物はまた、例えば、サッシェ、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ、又は再構成用の粉末の形態であってもよい。
剤形は即時放出であってもよく、その場合、水溶性若しくは水分散性担体を含んでいてよく、又は剤形は遅延放出、持続放出、若しくは調節放出であってもよく、その場合、胃腸管若しくは皮下における剤形の溶解速度を制御する非水溶性ポリマーを含んでいてよい。
他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、頬内、又は舌下に送達され得る。
水性製剤のｐＨは、ｐＨ３～ｐＨ１０であり得る。本発明の一実施形態では、製剤のｐＨは約７．０～約９．５である。本発明の別の実施形態では、製剤のｐＨは約３．０～約７．０である。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は緩衝剤を含む。緩衝剤の非限定的な例としては、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、シトレート、リン酸一水素二ナトリウム、フマル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸塩、酒石酸、トリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、及びこれらの混合物が挙げられる。緩衝液は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な緩衝剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は防腐剤を含む。防腐剤の非限定的な例としては、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル４－ヒドロキシベンゾエート、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロルフェネシン、ｏ－クレゾール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、エチル４－ヒドロキシベンゾエート、イミド尿素、メチル４－ヒドロキシベンゾエート、フェノール、２－フェノキシエタノール、２－フェニルエタノール、プロピル４－ヒドロキシベンゾエート、デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な防腐剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、等張剤を含む。本実施形態の非限定的な例としては、塩（塩化ナトリウムなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、及びスレオニンなど）、アルジトール（グリセロール、１，２－プロパンジオールプロピレングリコールなど）、１，３－プロパンジオール、及び１，３－ブタンジオールなど）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）、並びにこれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例としては、糖が挙げられる。糖の非限定的な例は、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ－ＨＰＣＤ、可溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、単糖類、二糖類、若しくは多糖類、又は水溶性グルカンであり得る。等張剤の別の例は、糖アルコールであり、用語「糖アルコール」は、少なくとも１つの－ＯＨ基を有するＣ（４～８）炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定的な例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールが挙げられる。等張剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な等張剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物はキレート剤を含む。キレート剤の非限定的な例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、及びこれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なキレート剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含む。安定剤の非限定的な例としては、１つ以上の凝集阻害剤、１つ以上の酸化阻害剤、１つ以上の界面活性剤、及び／又は、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含み、当該安定剤は、カルボキシ－／ヒドロキシセルロース及びそれらの誘導体（ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、ＨＰＣ－Ｌ、及びＨＰＭＣなど）、シクロデキストリン、２－メチルチオエタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ３３５０など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、塩（塩化ナトリウムなど）、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール）、又はチオグリコール酸である。安定剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な安定剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の界面活性剤、好ましくは界面活性剤、少なくとも１つの界面活性剤、又は２つの異なる界面活性剤を含む。「界面活性剤」という用語は、水溶性（親水性）部分及び脂溶性（親油性）部分から構成される任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び／又は双性界面活性剤からなる群から選択され得る。界面活性剤は、個々に又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な界面活性剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、及び／又はベンズアミジン塩酸（ＨＣｌ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、個々に又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なプロテアーゼ阻害剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
別の全般的な態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物を製造する方法であって、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを医薬的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物を得ることを含む、方法に関する。
使用方法
別の全般的な態様では、本発明は、自己免疫疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法に関する。本方法は、ＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む。ＨＬＡ－Ｃｗ６モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、対象の細胞上でＨＬＡ－Ｃｗ６に結合することができる。抗ＨＬＡ－Ｃｗ６モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、細胞表面上のペプチド結合したＨＬＡ－Ｃｗ６に結合することにより、自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害することができ、及び／又は、ペプチド結合したＨＬＡ－Ｃｗ６のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への機能的結合を阻害することができる。抗ＨＬＡ－Ｃｗ６モノクローナル抗体は、例えば、対象の自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害することもできる別のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントと、二重特異性抗体を形成することができる。
別の全般的な態様では、本発明は、自己免疫疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法に関する。本方法は、ＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む。ＨＬＡ－Ｃｗ６モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、対象の細胞上でＨＬＡ－Ｃｗ６に結合することができる。抗ＨＬＡ－Ｃｗ６モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、細胞表面上のペプチド結合したＨＬＡ－Ｃｗ６に結合することにより、自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害することができ、及び／又は、ペプチド結合したＨＬＡ－Ｃｗ６のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への機能的結合を阻害することができる。抗ＨＬＡ－Ｃｗ６モノクローナル抗体は、例えば、対象の自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害することもできる別のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントと、二重特異性抗体を形成することができる。
ＨＬＡ－Ｃｗ６に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントの機能的活性は、当該技術分野において既知の方法により、そして本明細書に記載のとおり特性評価することができる。ＨＬＡ－Ｃｗ６に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを特性評価する方法としては、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、及びＯｃｔｅｔＲｅｄ分析を含む親和性及び特異性アッセイ；ＦＡＣＳによるＴ細胞上のＨＬＡ－Ｃｗ６に対する抗体の結合を検出する結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、ＨＬＡ－Ｃｗ６に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを特性評価する方法としては、以下に記載するものが挙げられる。
別の全般的な態様では、本発明は、自己免疫疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、ＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明の医薬組成物を当該対象に投与することを含む、方法に関する。自己免疫疾患は、例えば、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、及び乾癬性関節炎から選択することができるが、これらに限定されない。
本発明の実施形態によれば、医薬組成物は、治療有効量の抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。本明細書で使用するとき、用語「治療有効量」は、対象に所望の生物学的又は薬理的応答を惹起する活性成分又は構成成分の量を指す。治療有効量は、記載される目的に対して経験的かつ通常の方法で決定することができる。
抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体又はその抗原結合フラグメントに関して本明細書で使用するとき、治療有効量は、それを必要としている対象における免疫応答を調節する抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体又はその抗原結合フラグメントの量を意味する。
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を達成するのに十分な治療の量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害若しくは病態又はそれに関連する症状の重症度を軽減又は改善すること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の退縮を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進行又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療の予防又は治療効果を強化又は改善すること。
治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために最適に漸増される。
特定の実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、対象への想定される投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、静脈内投与、皮下投与、又は筋肉内投与に適した形で製剤化することができる。
本明細書で使用するとき、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」という用語は全て、自己免疫疾患又は障害（例えば、乾癬）に関連する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。用語「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」はまた、疾患、障害、又は病態を退縮させる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、自己免疫疾患（例えば、乾癬）などの疾患、障害、若しくは病態に関連する１つ以上の症状の緩和、進行若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。
特定の実施形態によれば、自己免疫疾患の治療又は予防に使用される組成物が提供される。自己免疫療法の場合、組成物は、化学療法、抗ＩＬ－２３ ｍＡｂ、抗ＴＮＦ－α ｍＡｂ、抗ＩＬ１７Ａ ｍＡｂ、他の自己免疫疾患薬、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又は標的療法を含むがこれらに限定されない別の治療と組み合わせて使用することができる。抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体を使用して、ＩＬ－２３、ＴＮＦ－α、ＩＬ１７Ａ、及び／又は他のＴ細胞表面抗原に対するパートナーｍＡｂとの二重特異性抗体を構築して、ＨＬＡ－Ｃｗ６及び特定のＴ細胞表面抗原の両方を発現する自己免疫疾患を治療することができる。
本明細書で使用するとき、用語「併用される」は、対象への２つ以上の治療薬の投与との関連において、複数の治療薬の使用を指す。用語「併用される」の使用は、治療薬を対象に投与する順序について限定しない。例えば、第１の治療薬（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
実施形態１は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列：
ａ．それぞれ、配列番号３７、３８、３９、６４、６５、及び６６、
ｂ．それぞれ、配列番号４０、４１、４２、６７、６８、及び６９、
ｃ．それぞれ、配列番号４３、４４、４５、７０、７１、及び７２、
ｄ．それぞれ、配列番号４６、４７、４８、７３、７４、及び７５、
ｅ．それぞれ、配列番号４９、５０、５１、７６、７７、及び７８、
ｆ．それぞれ、配列番号５２、５３、５４、７９、８０、及び８１、
ｇ．それぞれ、配列番号５５、５６、５７、８２、８３、及び８４、
ｈ．それぞれ、配列番号５８、５９、６０、８５、８６、及び８７、又は
ｉ．それぞれ、配列番号６１、６２、６３、８８、８９、及び９０、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
ａ．それぞれ、配列番号３７、３８、３９、６４、６５、及び６６、
ｂ．それぞれ、配列番号４０、４１、４２、６７、６８、及び６９、
ｃ．それぞれ、配列番号４３、４４、４５、７０、７１、及び７２、
ｄ．それぞれ、配列番号４６、４７、４８、７３、７４、及び７５、
ｅ．それぞれ、配列番号４９、５０、５１、７６、７７、及び７８、
ｆ．それぞれ、配列番号５２、５３、５４、７９、８０、及び８１、
ｇ．それぞれ、配列番号５５、５６、５７、８２、８３、及び８４、
ｈ．それぞれ、配列番号５８、５９、６０、８５、８６、及び８７、又は
ｉ．それぞれ、配列番号６１、６２、６３、８８、８９、及び９０、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態２は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列：
ａ．それぞれ、配列番号９１、９２、９３、１１８、１１９、及び１２０、
ｂ．それぞれ、配列番号９４、９５、９６、１２１、１２２、及び１２３、
ｃ．それぞれ、配列番号９７、９８、９９、１２４、１２５、及び１２６、
ｄ．それぞれ、配列番号１００、１０１、１０２、１２７、１２８、及び１２９、
ｅ．それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、１３０、１３１、及び１３２、
ｆ．それぞれ、配列番号１０６、１０７、１０８、１３３、１３４、及び１３５、
ｇ．それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１３６、１３７、及び１３８、
ｈ．それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１３９、１４０、及び１４１、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１１５、１１６、１１７、１４２、１４３、及び１４４、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
ａ．それぞれ、配列番号９１、９２、９３、１１８、１１９、及び１２０、
ｂ．それぞれ、配列番号９４、９５、９６、１２１、１２２、及び１２３、
ｃ．それぞれ、配列番号９７、９８、９９、１２４、１２５、及び１２６、
ｄ．それぞれ、配列番号１００、１０１、１０２、１２７、１２８、及び１２９、
ｅ．それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、１３０、１３１、及び１３２、
ｆ．それぞれ、配列番号１０６、１０７、１０８、１３３、１３４、及び１３５、
ｇ．それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１３６、１３７、及び１３８、
ｈ．それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１３９、１４０、及び１４１、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１１５、１１６、１１７、１４２、１４３、及び１４４、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態３は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列：
ａ．それぞれ、配列番号１４５、１４６、１４７、１７２、１７３、及び１７４、
ｂ．それぞれ、配列番号１４８、１４９、１５０、１７５、１７６、及び１７７、
ｃ．それぞれ、配列番号１５１、１５２、１５３、１７８、１７９、及び１８０、
ｄ．それぞれ、配列番号１５４、１５５、１５６、１８１、１８２、及び１８３、
ｅ．それぞれ、配列番号１５７、１５８、１５９、１８４、１８５、及び１８６、
ｆ．それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１８７、１８８、及び１８９、
ｇ．それぞれ、配列番号１６３、１６４、１６５、１９０、１９１、及び１９２、
ｈ．それぞれ、配列番号１６６、１６７、１６８、１９３、１９４、及び１９５、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１６９、１７０、１７１、１９６、１９７、及び１９８、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
ａ．それぞれ、配列番号１４５、１４６、１４７、１７２、１７３、及び１７４、
ｂ．それぞれ、配列番号１４８、１４９、１５０、１７５、１７６、及び１７７、
ｃ．それぞれ、配列番号１５１、１５２、１５３、１７８、１７９、及び１８０、
ｄ．それぞれ、配列番号１５４、１５５、１５６、１８１、１８２、及び１８３、
ｅ．それぞれ、配列番号１５７、１５８、１５９、１８４、１８５、及び１８６、
ｆ．それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１８７、１８８、及び１８９、
ｇ．それぞれ、配列番号１６３、１６４、１６５、１９０、１９１、及び１９２、
ｈ．それぞれ、配列番号１６６、１６７、１６８、１９３、１９４、及び１９５、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１６９、１７０、１７１、１９６、１９７、及び１９８、を含み、
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃ、好ましくはＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態４は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５若しくは１７と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態５は、実施形態１～４のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ａ．配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｂ．配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｃ．配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｄ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｅ．配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｆ．配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｇ．配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｈ．配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、又は
ｉ．配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
ａ．配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｂ．配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｃ．配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｄ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｅ．配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｆ．配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｇ．配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｈ．配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、又は
ｉ．配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態６は、実施形態１～５のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであり、抗体又はその抗原結合フラグメントはキメラである。
実施形態７は、実施形態１～６のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであり、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトである又はヒト化されている。
実施形態８は、実施形態１～８のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであり、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃｗ６による抗原提示の結合及び阻害を介して、Ｔ細胞の発達及び活性化をブロックする。
実施形態９は、実施形態１～８のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸である。
実施形態１０は、実施形態９に記載の単離核酸を含むベクターである。
実施形態１１は、実施形態１０に記載のベクターを含む宿主細胞である。
実施形態１２は、実施形態１～８のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。
実施形態１３は、自己免疫疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法であり、実施形態１２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
実施形態１４は、自己免疫疾患が、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、及び乾癬性関節炎からなる群から選択される、実施形態１３に記載の方法である。
実施形態１５は、自己反応性Ｔ細胞の活性化の阻害を、それを必要とする対象において行う方法であり、実施形態１２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
実施形態１６は、ＨＬＡ－Ｃｗ６発現細胞におけるペプチド結合ＨＬＡ－Ｃｗ６複合体へのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の機能的結合を阻害する方法であり、該方法は、実施形態１～８のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと細胞を接触させることを含み、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、ペプチド結合したＨＬＡ－Ｃｗ６に結合し、ＴＣＲのペプチド結合ＨＬＡ－Ｃｗ６複合体への機能的結合を阻害する。
実施形態１７は、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる、実施形態１６に記載の方法である。
実施形態１８は、細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触させる、実施形態１６に記載の方法である。
実施形態１９は、実施形態１～８のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する方法であり、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む細胞を、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する条件で培養することと、細胞又は培養物から抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することと、を含む。
実施形態２０は、実施形態１～８のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を製造する方法であり、モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを医薬的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む。
材料及び方法
使用するタンパク質の生成
ペプチドを有する組換えＨＬＡ－Ｃｗ６を、哺乳類及び細菌の両方の発現系で発現させた。カウンタースクリーニングのために、組換えＡ２ＰＷ２３（ｒｈＨＬＡ－Ａ２）（配列番号１９９）、ＭＨＧＷ２（ｒｈＨＬＡ－Ｇ５）（配列番号２００）及びＭ０１Ｗ６（β２－ミクログロブリン）（配列番号２０１）抗原を用いて、ＨＬＡ－Ｃｗ６に対して高い選択性を有する抗体を同定した。標的抗原を安定的に発現する細胞株を、標準的なクローニング、発現、及びクローン選択法を用いて生成した。
使用するタンパク質の生成
ペプチドを有する組換えＨＬＡ－Ｃｗ６を、哺乳類及び細菌の両方の発現系で発現させた。カウンタースクリーニングのために、組換えＡ２ＰＷ２３（ｒｈＨＬＡ－Ａ２）（配列番号１９９）、ＭＨＧＷ２（ｒｈＨＬＡ－Ｇ５）（配列番号２００）及びＭ０１Ｗ６（β２－ミクログロブリン）（配列番号２０１）抗原を用いて、ＨＬＡ－Ｃｗ６に対して高い選択性を有する抗体を同定した。標的抗原を安定的に発現する細胞株を、標準的なクローニング、発現、及びクローン選択法を用いて生成した。
ＯｍｎｉＲａｔ免疫操作からのハイブリドーマ上清のスクリーニング：組換え抗原（免疫原）に対するハイブリドーマ融合の一次スクリーニング。
９６－Ｗｅｌｌ Ｎｕｎｃ Ｆ９６ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）及びＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））抗原の１：１混合物を含む１μｇ／ｍＬ溶液（ＰＢＳ）５０μＬ／ウェルで、最低２．５時間コーティングした後、コーティング溶液を吸引した。プレートを２００μＬ／ウェルのブロッキング溶液（０．４％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で、４℃で３～４日間ブロッキングした。アッセイの日に、プレートを１Ｘ ＰＢＳＴで３×３００μＬ／ウェル洗浄し、対照サンプルを含む培養上清を５０μＬ／ウェル加え、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄し、５０μＬ／ウェルのヤギ抗ラットＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（１：１０Ｋに希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，＃１１２－０３６－０７１）の二次検出試薬を、ブロッキング緩衝液で調製して各ウェルに加えた。プレートをＲＴで３０分間インキュベートした後、上記のように洗浄した。各ウェルに５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，＃３４０２２）の基質溶液を加え、１０分間インキュベートした後、５０μＬ／ウェルの１Ｍ ＨＣｌ（停止溶液）（ＶＷＲ；Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，＃３００４．３２４－２．５Ｌ）を加えた。その後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーでプレートを読み取り、λ＝４５０ｎｍでの吸光度を記録した。
９６－Ｗｅｌｌ Ｎｕｎｃ Ｆ９６ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）及びＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））抗原の１：１混合物を含む１μｇ／ｍＬ溶液（ＰＢＳ）５０μＬ／ウェルで、最低２．５時間コーティングした後、コーティング溶液を吸引した。プレートを２００μＬ／ウェルのブロッキング溶液（０．４％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で、４℃で３～４日間ブロッキングした。アッセイの日に、プレートを１Ｘ ＰＢＳＴで３×３００μＬ／ウェル洗浄し、対照サンプルを含む培養上清を５０μＬ／ウェル加え、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄し、５０μＬ／ウェルのヤギ抗ラットＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（１：１０Ｋに希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，＃１１２－０３６－０７１）の二次検出試薬を、ブロッキング緩衝液で調製して各ウェルに加えた。プレートをＲＴで３０分間インキュベートした後、上記のように洗浄した。各ウェルに５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，＃３４０２２）の基質溶液を加え、１０分間インキュベートした後、５０μＬ／ウェルの１Ｍ ＨＣｌ（停止溶液）（ＶＷＲ；Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，＃３００４．３２４－２．５Ｌ）を加えた。その後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーでプレートを読み取り、λ＝４５０ｎｍでの吸光度を記録した。
組換え抗原に対するハイブリドーマ融合の確認及び選択性のスクリーニング
ハイブリドーマ融合の一次スクリーニングから生じるヒット（８８０）を、結合の選択性及び特異性を確認するために追加の抗原に対してスクリーニングした。
ハイブリドーマ融合の一次スクリーニングから生じるヒット（８８０）を、結合の選択性及び特異性を確認するために追加の抗原に対してスクリーニングした。
６セットの９６ウェルＮｕｎｃＦ９６ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを単一の抗原：（１）ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ ＡＲＦ（配列番号２１９））、（２）ＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）、（３）ＣＷ６Ｗ３６（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭＴＳＬ５）（配列番号２０４）、（４）Ａ２ＰＷ２３（ｒｈＨＬＡ－Ａ２）（配列番号１９９）、（５）ＭＨＧＷ２（ｒｈＨＬＡ－Ｇ５）（配列番号２００）、及び（６）Ｍ０１Ｗ６（β２－ミクログロブリン）（配列番号２０１）でコーティングした。５０μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬ抗原コーティング溶液（ＰＢＳ）を用いて４℃で一晩インキュベートした後、溶液を捨て、プレートを２５０μＬ／ウェルのブロッキング溶液（０．４％ＢＳＡ／ＰＢＳ）でＲＴにおいて３時間ブロッキングした。プレートを１Ｘ ＰＢＳＴで３００μＬ／ウェル×３回洗浄し、対照サンプルを含む培養上清を５０μＬ／ウェル加え、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液で調製した５０μＬ／ウェルのヤギ抗ラットＩｇＧＦｃ－ＨＲＰ（１：１０Ｋに希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１１２－０３６－０７１）二次検出試薬を各ウェルに加えた。プレートをＲＴで３０分間インキュベートした後、上記のように洗浄した。各ウェルにＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ＃３４０２２）基質溶液を５０μＬ／ウェル加え、１０分間インキュベートした後、５０μＬ／ウェルの１Ｍ ＨＣｌ（停止溶液）（ＶＷＲ＃３００４．３２４－２．５Ｌ）を加えた。その後、プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取り、λ＝４５０ｎｍでの吸光度を記録した。
ＨＬＡ－Ｃｗ６ハイブリドーマ出力ヒットの確認ＭＳＤ細胞結合スクリーニング。
ハイブリドーマ融合の一次スクリーニングから生じるヒット（８８０）を、結合の選択性及び特異性を確認するために追加の抗原に対してスクリーニングした。
ハイブリドーマ融合の一次スクリーニングから生じるヒット（８８０）を、結合の選択性及び特異性を確認するために追加の抗原に対してスクリーニングした。
ＨＬＡ－Ｃｗ６免疫化ＯｍｎｉＲａｔリンパ球とＦ０骨髄腫細胞との融合から得られた全てのクローンの上清を、抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体の存在について試験した。Ｋ５６２親細胞株、並びにｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）及びｒｈＨＬＡ－Ａ１（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ１）（配列番号２１２）を安定的に発現するＫ５６２細胞株に対して、結合を試験した。９６ウェルのＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄプレート（ＭＳＤ＃Ｌ１５ＸＢ）に細胞を６５０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２に設定したインキュベータで１時間インキュベートした。コーティング溶液を捨て、１５０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中２０％ＦＢＳ及び０．１８％ＮａＮ３）で、プレートをＲＴにて３０分間ブロッキングした。ブロッキング溶液を捨て、５０μＬ／ウェルの上清をアッセイプレートに加え、ＲＴで１時間インキュベートした後、３×３００μＬ／ウェルのＰＢＳでプレートを洗浄した。二次ＳｕｌｆｏＴａｇ標識抗ラットＩｇＧ検出抗体（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，＃Ｒ３２ＡＨ－１）を０．５ｍｇ／ｍＬの溶液として調製し、５０μＬ／ウェルでプレートに加え、ＲＴで１時間インキュベートした後、上記のようにプレートを洗浄した。その後、プレートに１Ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（界面活性剤を含まない）（ＭＳＤ＃Ｒ９２ＴＤ－１）を１５０μＬ加え、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒでプレートを読み取った。
組換え抗原に対する免疫化Ａｂｌｅｘｉｓマウスからの単一Ｂ細胞によって発現される抗体の一次スクリーニング。
培養した単一Ｂ細胞の上清を、３８４ウェルＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄアッセイプレート（ＭＳＤ＃Ｌ２１ＸＢ－４）を用いて、マウスＩｇＧの存在及び抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体の存在について試験した。３８４ウェルのＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄプレートを、１０μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１１５－００６－０７１）又はＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））でＲＴにて６時間コーティングした。コーティングしたプレートを７５μＬの１Ｘ ＰＢＳＴで洗浄し、６０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（０．４％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を全てのプレートに加えた。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、上記のようにプレートを洗浄し、単一のＢ細胞培養物から採取した１０μＬ／ウェルの上清を、ＲＴで２時間、プレート内でインキュベートした。プレートを洗浄し、１５μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬヤギＳｕｌｆｏＴａｇ抗マウス二次検出抗体（ＭＳＤ＃Ｒ３２ＡＣ－５）をアッセイプレートに加え、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３５μＬ／ウェルの１Ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（ＭＳＤ＃Ｒ９２ＴＣ－１）を加え、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００でプレートを読み取った。
培養した単一Ｂ細胞の上清を、３８４ウェルＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄアッセイプレート（ＭＳＤ＃Ｌ２１ＸＢ－４）を用いて、マウスＩｇＧの存在及び抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体の存在について試験した。３８４ウェルのＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄプレートを、１０μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１１５－００６－０７１）又はＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））でＲＴにて６時間コーティングした。コーティングしたプレートを７５μＬの１Ｘ ＰＢＳＴで洗浄し、６０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（０．４％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を全てのプレートに加えた。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、上記のようにプレートを洗浄し、単一のＢ細胞培養物から採取した１０μＬ／ウェルの上清を、ＲＴで２時間、プレート内でインキュベートした。プレートを洗浄し、１５μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬヤギＳｕｌｆｏＴａｇ抗マウス二次検出抗体（ＭＳＤ＃Ｒ３２ＡＣ－５）をアッセイプレートに加え、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３５μＬ／ウェルの１Ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（ＭＳＤ＃Ｒ９２ＴＣ－１）を加え、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００でプレートを読み取った。
細胞株に対する免疫化Ａｂｌｅｘｉｓマウスからの単一Ｂ細胞によって発現される抗体の一次スクリーニング。
培養した単一Ｂ細胞からの上清を、ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２１１）を安定的に発現するＫ５６２細胞株への選択的結合について試験したが、ｒｈＨＬＡ－Ａ１（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ１）（配列番号２１２）若しくはｒｈＨＬＡ－Ｂ７（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７）（配列番号２１３）を安定的に発現するＫ５６２細胞株への選択的結合、又はＫ５６２親細胞株への選択的結合については試験しなかった。Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ３８４ウェルＭＳＤプレート（ＭＳＤ＃Ｌ２１ＸＢ－４）を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベータ内で、１０μＬの容量で１．５時間、５０００個の細胞／ウェルでコーティングした。プレートをブロックするために、２０％ＦＢＳ／０．１８％ＮａＮ３／ＰＢＳ溶液を６０μＬ／ウェル加え、５％ＣＯ２を補充した３７℃のインキュベータでプレートを３０分間インキュベートした。ブロッキング溶液を捨て、単一のＢ細胞培養物から採取した１０μＬ／ウェルの上清を、プレート内でＲＴにて１．５時間インキュベートした。プレートを６０μＬ／ウェルの１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、１５μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬのヤギＳｕｌｆｏＴａｇ抗マウス二次検出抗体（ＭＳＤ＃Ｒ３２ＡＣ－５）をアッセイプレートに加え、ＲＴで３０分間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄し、１Ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（界面活性剤を含まない）（ＭＳＤ＃Ｒ９２ＴＤ－１）を３５μＬ／ウェル加え、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００でプレートを読み取った。
培養した単一Ｂ細胞からの上清を、ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２１１）を安定的に発現するＫ５６２細胞株への選択的結合について試験したが、ｒｈＨＬＡ－Ａ１（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ１）（配列番号２１２）若しくはｒｈＨＬＡ－Ｂ７（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７）（配列番号２１３）を安定的に発現するＫ５６２細胞株への選択的結合、又はＫ５６２親細胞株への選択的結合については試験しなかった。Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ３８４ウェルＭＳＤプレート（ＭＳＤ＃Ｌ２１ＸＢ－４）を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベータ内で、１０μＬの容量で１．５時間、５０００個の細胞／ウェルでコーティングした。プレートをブロックするために、２０％ＦＢＳ／０．１８％ＮａＮ３／ＰＢＳ溶液を６０μＬ／ウェル加え、５％ＣＯ２を補充した３７℃のインキュベータでプレートを３０分間インキュベートした。ブロッキング溶液を捨て、単一のＢ細胞培養物から採取した１０μＬ／ウェルの上清を、プレート内でＲＴにて１．５時間インキュベートした。プレートを６０μＬ／ウェルの１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、１５μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬのヤギＳｕｌｆｏＴａｇ抗マウス二次検出抗体（ＭＳＤ＃Ｒ３２ＡＣ－５）をアッセイプレートに加え、ＲＴで３０分間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄し、１Ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（界面活性剤を含まない）（ＭＳＤ＃Ｒ９２ＴＤ－１）を３５μＬ／ウェル加え、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００でプレートを読み取った。
一次モノクローナル抗体スクリーニング／カウンタースクリーニング。
Ｋ５６２親細胞株、並びにｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）及びｒｈＨＬＡ－Ｂ７（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７）（配列番号２１３）を安定的に発現するＫ５６２細胞株を、１２０００細胞／ウェルの密度で３８４ウェルのＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄアッセイプレート（ＭＳＤ＃Ｌ２１ＸＢ－４）に播種した。インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、プレートを吸引し、５０μＬのＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃３７５４２）を各ウェルに加え、更にＲＴで３０分間、プレートをインキュベートした。ブロッキング緩衝液を吸引し、調製した試験抗体２０μＬを適切なウェルに加え、プレートをＲＴで１時間更にインキュベートした。プレートを８０μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、各ウェルに１μｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏＴａｇ標識二次検出抗体溶液を２０μＬ／ウェル加えた。ＲＴで１時間インキュベートした後、プレートを８０μＬのＰＢＳで３回洗浄し、１Ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（界面活性剤を含まない）（ＭＳＤ＃Ｒ９２ＴＤ－１）を５０μＬ／ウェル加え、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒでプレートを読み取った。
Ｋ５６２親細胞株、並びにｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）及びｒｈＨＬＡ－Ｂ７（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７）（配列番号２１３）を安定的に発現するＫ５６２細胞株を、１２０００細胞／ウェルの密度で３８４ウェルのＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄアッセイプレート（ＭＳＤ＃Ｌ２１ＸＢ－４）に播種した。インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、プレートを吸引し、５０μＬのＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃３７５４２）を各ウェルに加え、更にＲＴで３０分間、プレートをインキュベートした。ブロッキング緩衝液を吸引し、調製した試験抗体２０μＬを適切なウェルに加え、プレートをＲＴで１時間更にインキュベートした。プレートを８０μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、各ウェルに１μｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏＴａｇ標識二次検出抗体溶液を２０μＬ／ウェル加えた。ＲＴで１時間インキュベートした後、プレートを８０μＬのＰＢＳで３回洗浄し、１Ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（界面活性剤を含まない）（ＭＳＤ＃Ｒ９２ＴＤ－１）を５０μＬ／ウェル加え、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒでプレートを読み取った。
Ｔ細胞株活性化アッセイ－ＩＬ－２放出の阻害
ＣＤ８（配列番号２１６及び配列番号２１７）及びＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５（配列番号２１４及び配列番号２１５）の両方を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローン（クローンＥ１１）（Ｊｕｒｋａｔ－ｒｈＣＤ８／ｒｈＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５）を、ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（ＬＣＬ．７２１．２２１－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）を安定的に発現するＬＣＬ．７２１．２２１クローンで刺激し、ＩＬ－２サイトカイン放出応答を誘導する。サイトカイン放出応答は、Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンからのＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＬＳ５応答の特異性により、ＬＣＬ．７２１．２２１－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６上のＡＤＡＭ－Ａｂｕペプチドの負荷に依存している。ＬＣＬ．７２１．２２１－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６に０．２ｍｇ／ｍＬのＡＤＡＭ－Ａｂｕ（配列番号２１８）ペプチドを、３７℃に設定し、５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベータ内で１時間負荷した。ペプチドを負荷したＬＣＬ．７２１．２２１－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６細胞を３８４ウェルのアッセイプレートに２０μＬ／ウェルでプレーティングし、２０μＬの４Ｘ試験抗体と３７℃に設定し、５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベータ内で１時間インキュベートした。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ｒｈＣＤ８＋／ｒｈＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５細胞を４０μＬ／ウェルでアッセイプレートに加え、３７℃に設定し、５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベータ内で１６～２０時間、アッセイプレートをインキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、２０μＬ／ウェルを採取し、３８４ウェルのＭＳＤ ＩＬ－２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅアッセイキット（ＭＳＤ＃Ｋ２１１ＡＨＢ－２）を用いて、製造元推奨のプロトコルで解析した。
ＣＤ８（配列番号２１６及び配列番号２１７）及びＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５（配列番号２１４及び配列番号２１５）の両方を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローン（クローンＥ１１）（Ｊｕｒｋａｔ－ｒｈＣＤ８／ｒｈＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５）を、ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（ＬＣＬ．７２１．２２１－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）を安定的に発現するＬＣＬ．７２１．２２１クローンで刺激し、ＩＬ－２サイトカイン放出応答を誘導する。サイトカイン放出応答は、Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンからのＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＬＳ５応答の特異性により、ＬＣＬ．７２１．２２１－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６上のＡＤＡＭ－Ａｂｕペプチドの負荷に依存している。ＬＣＬ．７２１．２２１－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６に０．２ｍｇ／ｍＬのＡＤＡＭ－Ａｂｕ（配列番号２１８）ペプチドを、３７℃に設定し、５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベータ内で１時間負荷した。ペプチドを負荷したＬＣＬ．７２１．２２１－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６細胞を３８４ウェルのアッセイプレートに２０μＬ／ウェルでプレーティングし、２０μＬの４Ｘ試験抗体と３７℃に設定し、５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベータ内で１時間インキュベートした。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ｒｈＣＤ８＋／ｒｈＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５細胞を４０μＬ／ウェルでアッセイプレートに加え、３７℃に設定し、５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベータ内で１６～２０時間、アッセイプレートをインキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、２０μＬ／ウェルを採取し、３８４ウェルのＭＳＤ ＩＬ－２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅアッセイキット（ＭＳＤ＃Ｋ２１１ＡＨＢ－２）を用いて、製造元推奨のプロトコルで解析した。
Ｔ細胞株活性化アッセイ－ＣＤ６９のアップレギュレーションの阻害
ＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＬＳ５（配列番号２１４及び配列番号２１５）を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローン（クローンＥ１１）（Ｊｕｒｋａｔ－ｒｈＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５）、及びＴＣＲ－ＴＲＡＴ（配列番号２２５及び配列番号２２６）を安定的に発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞クローン（クローンＣ５）（Ｊｕｒｋａｔ－ｒｈＴＣＲ－ＴＲＡＴ）を、ＨＬＡ－Ｃｗ６を安定的に発現しているＫ５６２細胞株（クローン１６）（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）で同族ペプチドの存在下で刺激し、フローサイトメトリーを用いてＣＤ６９のアップレギュレーションによって測定したところ、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローンを活性化した。９６ウェルのアッセイプレートに、Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６細胞（１００Ｋ細胞／ウェル）を５０μＬ加え、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）で調製した１００μｇ／ｍＬのＡＤＡＭ－Ａｂｕ（配列番号２１８）又はＴＲＡＴ（配列番号２２０）ペプチド溶液５０μＬと共に３７℃で１時間インキュベートした。その後、連続希釈した抗体を、９６ウェルアッセイプレート中のペプチドを負荷したＫ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６細胞に加え、３７℃で１時間インキュベートした。適切なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローンを、同族ペプチドを負荷したＫ５６２－ＨＬＡ－Ｃｗ６細胞を含むアッセイプレートに５０μＬ／ウェル（５０Ｋ細胞／ウェル）で加え、プレートを３７℃で１４～１５時間インキュベートした。処理期間が終了した後、細胞を９６ウェルの丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３７９９）に移し、プレートを１３００ＲＰＭで５分間、ＲＴで遠心分離した。上清を注意深く除去し、細胞ペレットを、ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，＃１３０－０５９－９０１）と、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（Ｇｈｏｓｔ Ｄｙｅ Ｒｅｄ，ＡＰＣ－Ｃｙ７，Ｔｏｎｂｏ＃１３－０８６５－Ｔ１００）色素とを含む溶液で、ＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，＃５５４６５７）において、５０μＬ／ウェルに再懸濁した。その後、プレートを暗所で５分間、氷上でインキュベートした。その後、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｃ３４５５４）及びＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９抗体（ｍＩｇＧ１、クローンＦＮ５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５６２８８３）を含む、ＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで調製した染色カクテルを５０μＬ／ウェル用いて、氷上で３０分、細胞をインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを各ウェルに加え、プレートを１３００ＲＰＭで５分間ＲＴにて遠心沈殿させた。上清を除去し、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁して、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターで取得した。データはＦｌｏｗＪｏ ｖ１０で解析した。
ＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＬＳ５（配列番号２１４及び配列番号２１５）を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローン（クローンＥ１１）（Ｊｕｒｋａｔ－ｒｈＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５）、及びＴＣＲ－ＴＲＡＴ（配列番号２２５及び配列番号２２６）を安定的に発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞クローン（クローンＣ５）（Ｊｕｒｋａｔ－ｒｈＴＣＲ－ＴＲＡＴ）を、ＨＬＡ－Ｃｗ６を安定的に発現しているＫ５６２細胞株（クローン１６）（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）で同族ペプチドの存在下で刺激し、フローサイトメトリーを用いてＣＤ６９のアップレギュレーションによって測定したところ、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローンを活性化した。９６ウェルのアッセイプレートに、Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６細胞（１００Ｋ細胞／ウェル）を５０μＬ加え、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）で調製した１００μｇ／ｍＬのＡＤＡＭ－Ａｂｕ（配列番号２１８）又はＴＲＡＴ（配列番号２２０）ペプチド溶液５０μＬと共に３７℃で１時間インキュベートした。その後、連続希釈した抗体を、９６ウェルアッセイプレート中のペプチドを負荷したＫ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６細胞に加え、３７℃で１時間インキュベートした。適切なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローンを、同族ペプチドを負荷したＫ５６２－ＨＬＡ－Ｃｗ６細胞を含むアッセイプレートに５０μＬ／ウェル（５０Ｋ細胞／ウェル）で加え、プレートを３７℃で１４～１５時間インキュベートした。処理期間が終了した後、細胞を９６ウェルの丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３７９９）に移し、プレートを１３００ＲＰＭで５分間、ＲＴで遠心分離した。上清を注意深く除去し、細胞ペレットを、ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，＃１３０－０５９－９０１）と、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（Ｇｈｏｓｔ Ｄｙｅ Ｒｅｄ，ＡＰＣ－Ｃｙ７，Ｔｏｎｂｏ＃１３－０８６５－Ｔ１００）色素とを含む溶液で、ＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，＃５５４６５７）において、５０μＬ／ウェルに再懸濁した。その後、プレートを暗所で５分間、氷上でインキュベートした。その後、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｃ３４５５４）及びＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９抗体（ｍＩｇＧ１、クローンＦＮ５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５６２８８３）を含む、ＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで調製した染色カクテルを５０μＬ／ウェル用いて、氷上で３０分、細胞をインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを各ウェルに加え、プレートを１３００ＲＰＭで５分間ＲＴにて遠心沈殿させた。上清を除去し、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁して、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターで取得した。データはＦｌｏｗＪｏ ｖ１０で解析した。
ＬＡＢＳｃｒｅｅｎアッセイ－対立遺伝子特異性スクリーニング
ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）アッセイにより、９７のＣｌａｓｓ Ｉ ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ）のパネルに対する抗体結合を、ビーズベースの蛍光フロー技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ １００；Ｌｕｍｉｎｅｘ；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて調査する。９６ウェルのアッセイプレートにおいて、５μＬのＬＡＢＳｃｒｅｅｎ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ＃ＬＳ１Ａ０４）ビーズを２０μＬの各試験抗体（１０μｇ／ｍＬ）と共に、ＲＴで暗所にて穏やかに振盪しながら３０分間インキュベートした。インキュベーション終了後、供給された１Ｘ洗浄緩衝液１５０μＬを各ウェルに加え、プレートを１３００×ｇで５分間、ＲＴで遠心分離した。洗浄溶液をフリックして除去し、プレートをもう１回洗浄した。１Ｘ ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ＃ＬＳＡＢ－２）溶液を調製し、１００μＬ／ウェルをアッセイプレートに加えた。プレートを穏やかに振盪しながらＲＴにて暗所で３０分間インキュベートした。その後、上記のようにビーズを２回洗浄した後、８０μＬ／ウェルの１Ｘ ＰＢＳを各ウェルに加えた。プレートをＬｕｍｉｎｅｘ １００機器で分析し、Ｆｕｓｉｏｎ ３．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）を用いてデータを解析した。
ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）アッセイにより、９７のＣｌａｓｓ Ｉ ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ）のパネルに対する抗体結合を、ビーズベースの蛍光フロー技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ １００；Ｌｕｍｉｎｅｘ；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて調査する。９６ウェルのアッセイプレートにおいて、５μＬのＬＡＢＳｃｒｅｅｎ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ＃ＬＳ１Ａ０４）ビーズを２０μＬの各試験抗体（１０μｇ／ｍＬ）と共に、ＲＴで暗所にて穏やかに振盪しながら３０分間インキュベートした。インキュベーション終了後、供給された１Ｘ洗浄緩衝液１５０μＬを各ウェルに加え、プレートを１３００×ｇで５分間、ＲＴで遠心分離した。洗浄溶液をフリックして除去し、プレートをもう１回洗浄した。１Ｘ ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ＃ＬＳＡＢ－２）溶液を調製し、１００μＬ／ウェルをアッセイプレートに加えた。プレートを穏やかに振盪しながらＲＴにて暗所で３０分間インキュベートした。その後、上記のようにビーズを２回洗浄した後、８０μＬ／ウェルの１Ｘ ＰＢＳを各ウェルに加えた。プレートをＬｕｍｉｎｅｘ １００機器で分析し、Ｆｕｓｉｏｎ ３．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）を用いてデータを解析した。
ＨＬＡ－Ｃｗ６抗原構築物に結合する抗ＨＬＡ－Ｃｗ６ｍＡｂの分析
複数のＨＬＡ－Ｃｗ６抗原への抗ＨＬＡ－Ｃｗ６ ｍＡｂの結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で、ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃１７６－５０１１）を用いて測定した。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９－００５－０９８））を標準的なアミンカップリングにより水平方向にチップにコンジュゲートさせ、続いて抗ＨＬＡ－Ｃｗ６ ｍＡｂ（「リガンド」）を垂直方向に捕捉した。抗ＨＬＡ－Ｃｗ６ ｍＡｂを、１００～２００応答単位のリガンド密度で捕捉した。各ＨＬＡ－Ｃｗ６抗原（「分析物」）への結合を、５つの抗原濃度（３倍の濃度系列で１．２３ｎＭまで希釈した１００ｎＭ）を捕捉したｍＡｂの上に水平方向に流すことにより、緩衝液（ＰＢＳＴ－リン酸緩衝生理食塩水、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０を補充、ｐＨ７）のみを含有する６番目の分析物チャネルを用いて測定した。全ての分析を、ＰＢＳＴ中、１００μＬ／ｍｉｎの流量で行い、会合時間は１８０秒、解離時間は９００秒であった。チップ表面の再生（捕捉されたリガンドの放出）は、０．８５％リン酸の２つの短いパルス（１００μＬ／ｍｉｎで１８秒の接触時間）によって達成された。「インタースポット」におけるブランクの表面応答（屈折率の変化及びチップ表面との非特異的な相互作用を補正するため）、及び緩衝液のブランク応答（時間の経過に伴うｍＡｂの解離に起因するあらゆるベースラインドリフトを補正するため）を差し引くことで、分析物の生データを二重に参照した。参照データを、１：１の単純なＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに全体的に適合させた。動態パラメータを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（バージョン３．１．０．６）を用いて、パラメータ（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、Ｒｍａｘ）の範囲及びタイプをそれぞれ「Ｇｒｏｕｐｅｄ」及び「Ｆｉｔｔｅｄ」に設定して、各ｍＡｂ／抗原の組み合わせ又は相互作用について計算した。
複数のＨＬＡ－Ｃｗ６抗原への抗ＨＬＡ－Ｃｗ６ ｍＡｂの結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で、ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃１７６－５０１１）を用いて測定した。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９－００５－０９８））を標準的なアミンカップリングにより水平方向にチップにコンジュゲートさせ、続いて抗ＨＬＡ－Ｃｗ６ ｍＡｂ（「リガンド」）を垂直方向に捕捉した。抗ＨＬＡ－Ｃｗ６ ｍＡｂを、１００～２００応答単位のリガンド密度で捕捉した。各ＨＬＡ－Ｃｗ６抗原（「分析物」）への結合を、５つの抗原濃度（３倍の濃度系列で１．２３ｎＭまで希釈した１００ｎＭ）を捕捉したｍＡｂの上に水平方向に流すことにより、緩衝液（ＰＢＳＴ－リン酸緩衝生理食塩水、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０を補充、ｐＨ７）のみを含有する６番目の分析物チャネルを用いて測定した。全ての分析を、ＰＢＳＴ中、１００μＬ／ｍｉｎの流量で行い、会合時間は１８０秒、解離時間は９００秒であった。チップ表面の再生（捕捉されたリガンドの放出）は、０．８５％リン酸の２つの短いパルス（１００μＬ／ｍｉｎで１８秒の接触時間）によって達成された。「インタースポット」におけるブランクの表面応答（屈折率の変化及びチップ表面との非特異的な相互作用を補正するため）、及び緩衝液のブランク応答（時間の経過に伴うｍＡｂの解離に起因するあらゆるベースラインドリフトを補正するため）を差し引くことで、分析物の生データを二重に参照した。参照データを、１：１の単純なＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに全体的に適合させた。動態パラメータを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（バージョン３．１．０．６）を用いて、パラメータ（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、Ｒｍａｘ）の範囲及びタイプをそれぞれ「Ｇｒｏｕｐｅｄ」及び「Ｆｉｔｔｅｄ」に設定して、各ｍＡｂ／抗原の組み合わせ又は相互作用について計算した。
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋによる組換えクラスＩ ＭＨＣ分子への結合の親和性測定。
アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ－１０００－５０）を用いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９－００５－０９８）を、チップ表面にカップリングすることによって、シリーズＳ ＣＭ４センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ－１００５－３４）を調製した。全ての動態測定のランニング緩衝液は、１Ｘ ＨＢＳＰ＋１００ μｇ／ｍＬのＢＳＡであり、全ての測定値は２５℃で得られた。７５～２２５ＲＵの試験抗体を固定化した後、３つの濃度（３．７～１００ｎＭ）の抗原を、６０μＬ／ｍｉｎの流量で接触時間６０秒、解離時間９００秒で注入することによって、単一サイクルの動態分析を行った。結果として得られたセンサーグラムを、１：１の動態モデルを用いて適合させ、全体のｋａ、ｋｄ、Ｒｍａｘ、ＲＩを０に設定した。
アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ－１０００－５０）を用いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９－００５－０９８）を、チップ表面にカップリングすることによって、シリーズＳ ＣＭ４センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ－１００５－３４）を調製した。全ての動態測定のランニング緩衝液は、１Ｘ ＨＢＳＰ＋１００ μｇ／ｍＬのＢＳＡであり、全ての測定値は２５℃で得られた。７５～２２５ＲＵの試験抗体を固定化した後、３つの濃度（３．７～１００ｎＭ）の抗原を、６０μＬ／ｍｉｎの流量で接触時間６０秒、解離時間９００秒で注入することによって、単一サイクルの動態分析を行った。結果として得られたセンサーグラムを、１：１の動態モデルを用いて適合させ、全体のｋａ、ｋｄ、Ｒｍａｘ、ＲＩを０に設定した。
エピトープビニング－表面プラズモン共鳴イメージング（ＳＰＲｉ）及び連続フローマイクロスポッター（ＣＦＭ）法
ＣＦＭ ２（Ｗａｓａｔｃｈ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ；Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、ＵＴ）を用いて、９６個のｍＡｂのマイクロアレイを作製した。これにより、９６ウェルマイクロプレートから４８個の７０μＬプラグのサンプルを流体マニホールドに引き出し、これによって、ＳＰＲ基質（Ｇ－ＣＯＯＨでコーティングされたプリズム、Ｓｓｅｎｓ，ＮＬ製）の表面上の４８個のマイクロフローセルのアレイに溶液を集中させ、該溶液を６０μＬ／分で前後に循環させる。ＭＥＳカップリング緩衝液ｐＨ４．５中３０μｇ／ｍＬの各ｍＡｂ１００μＬを用いて９６ウェルマイクロプレートを調製し、ＣＦＭのベイ２に負荷した。新たに混合した活性化試薬（合計５ｍＬのＭＥＳカップリング緩衝液ｐＨ４．５中０．４Ｍ ＥＤＣ １５０μＬ及び０．１Ｍスルホ－ＮＨＳ １５０μＬ）の第２のプレートをベイ１に負荷した。次いで、ＣＦＭをシステム緩衝液（ＰＢＳ＋０．０１％ Ｔ２０）でプライミングした。抗ＨＬＡ－ＤＲ４ ｍＡｂプレートには８９個のｍＡｂが含まれていた。ドッキング後、活性化試薬を表面上で７分間循環させ、続いてすぐに最初のｍＡｂセット（ｍＡｂプレートの上半分）を循環させ、１５分間循環させた。ドッキングを解除せずに、スポットをシステム緩衝液ですすいだ。ＣＦＭは一度に４８溶液をプリントするため、８９個のｍＡｂの完全なアレイを作製するには、表面に２回対処する必要がある。１回目のプリント後、ＣＦＭを一時停止して新しい活性化試薬を負荷し、７分間の活性化と１５分間のカップリングという同じサイクルを、ｍＡｂプレートの後半部分にも繰り返した。その後、プリントしたプリズムをＳＰＲｉリーダー（ＭＸ９６、ＩＢＩＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に負荷した。このリーダーは、単一のフローセルとオートサンプラーを使用しており、分析物ごとに８０μＬの注入を前後に繰り返すことでアレイに対応するように構成されている。負荷してから、１Ｍエタノールアミン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をチップ全体に１５分間注入して、過剰な反応性エステルをクエンチした。次いで、システム緩衝液でチップを洗浄し、チップ画像を用いて反応スポット（すなわち、９６リガンドアレイ）及び介在する参照スポット（反応スポット当たり２つのローカル参照スポット）を規定した。従来の（Ｓａｎｄｗｉｃｈ）ビニングでは、抗原とｍＡｂ分析物との両方を並行してフローセルに輸送し、再生を継続する前に互いの直後に注入する同時注入を用いた。抗原（ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））を３分間注入した後、２０μｇ／ｍＬのｍＡｂを更に３分間注入した後、表面を再生した。全てのＳＰＲｉ実験を、９６×９６アナライト・オン・リガンドフォーマットで実施した。
ＣＦＭ ２（Ｗａｓａｔｃｈ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ；Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、ＵＴ）を用いて、９６個のｍＡｂのマイクロアレイを作製した。これにより、９６ウェルマイクロプレートから４８個の７０μＬプラグのサンプルを流体マニホールドに引き出し、これによって、ＳＰＲ基質（Ｇ－ＣＯＯＨでコーティングされたプリズム、Ｓｓｅｎｓ，ＮＬ製）の表面上の４８個のマイクロフローセルのアレイに溶液を集中させ、該溶液を６０μＬ／分で前後に循環させる。ＭＥＳカップリング緩衝液ｐＨ４．５中３０μｇ／ｍＬの各ｍＡｂ１００μＬを用いて９６ウェルマイクロプレートを調製し、ＣＦＭのベイ２に負荷した。新たに混合した活性化試薬（合計５ｍＬのＭＥＳカップリング緩衝液ｐＨ４．５中０．４Ｍ ＥＤＣ １５０μＬ及び０．１Ｍスルホ－ＮＨＳ １５０μＬ）の第２のプレートをベイ１に負荷した。次いで、ＣＦＭをシステム緩衝液（ＰＢＳ＋０．０１％ Ｔ２０）でプライミングした。抗ＨＬＡ－ＤＲ４ ｍＡｂプレートには８９個のｍＡｂが含まれていた。ドッキング後、活性化試薬を表面上で７分間循環させ、続いてすぐに最初のｍＡｂセット（ｍＡｂプレートの上半分）を循環させ、１５分間循環させた。ドッキングを解除せずに、スポットをシステム緩衝液ですすいだ。ＣＦＭは一度に４８溶液をプリントするため、８９個のｍＡｂの完全なアレイを作製するには、表面に２回対処する必要がある。１回目のプリント後、ＣＦＭを一時停止して新しい活性化試薬を負荷し、７分間の活性化と１５分間のカップリングという同じサイクルを、ｍＡｂプレートの後半部分にも繰り返した。その後、プリントしたプリズムをＳＰＲｉリーダー（ＭＸ９６、ＩＢＩＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に負荷した。このリーダーは、単一のフローセルとオートサンプラーを使用しており、分析物ごとに８０μＬの注入を前後に繰り返すことでアレイに対応するように構成されている。負荷してから、１Ｍエタノールアミン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をチップ全体に１５分間注入して、過剰な反応性エステルをクエンチした。次いで、システム緩衝液でチップを洗浄し、チップ画像を用いて反応スポット（すなわち、９６リガンドアレイ）及び介在する参照スポット（反応スポット当たり２つのローカル参照スポット）を規定した。従来の（Ｓａｎｄｗｉｃｈ）ビニングでは、抗原とｍＡｂ分析物との両方を並行してフローセルに輸送し、再生を継続する前に互いの直後に注入する同時注入を用いた。抗原（ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））を３分間注入した後、２０μｇ／ｍＬのｍＡｂを更に３分間注入した後、表面を再生した。全てのＳＰＲｉ実験を、９６×９６アナライト・オン・リガンドフォーマットで実施した。
Ｈ／Ｄ交換試験を用いた抗ＨＬＡ－Ｃｗ６ ｍＡｂのエピトープマッピング。
ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化及びＬＣ－ＭＳ。１３０μＬの対照緩衝液（５０ｍＭホスフェート、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中の５μｇのＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））を、１３０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ ＴＣＥＰ緩衝液（最終的なｐＨは２．５であった）を加え、混合物を２０℃で３分間インキュベートすることによって変性させた。次いで、混合物を、パッキングしたペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ（ｗ／ｗ、１：１）カラム（２．１×３０ｍｍ）を用いて、オンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化に供した。得られたペプチドを、Ｑ ＥｘａｃｔｉｖｅＴＭ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）に接続されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣで構成されるＵＰＬＣ－ＭＳシステムを使用して分析した。ペプチドを、２～３２％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．２％ギ酸）の１６．５分の勾配で５０ｍｍ×１ｍｍのＣ８カラム上で分離した。溶媒Ａは、水中０．２％ギ酸であった。注入バルブ、及びペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩカラム、及びそれらに関連する接続チューブは、１６℃で維持された冷却ボックス内にあった。第２の切換バルブ、Ｃ８カラム、及びそれらに関連するステンレス鋼の接続チューブは、－６℃で維持された別の冷却循環ボックス内にあった。Ｗ６配列に対するＭＳ／ＭＳデータをＭａｓｃｏｔで検索することを通じて、ペプチド同定を行った。プリカーサー及びプロダクトイオンに対する質量許容差は、それぞれ７ｐｐｍ及び０．０２Ｄａであった。ＣＷ６Ｗ３では１００％の配列カバレッジが達成された。
ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化及びＬＣ－ＭＳ。１３０μＬの対照緩衝液（５０ｍＭホスフェート、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中の５μｇのＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））を、１３０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ ＴＣＥＰ緩衝液（最終的なｐＨは２．５であった）を加え、混合物を２０℃で３分間インキュベートすることによって変性させた。次いで、混合物を、パッキングしたペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ（ｗ／ｗ、１：１）カラム（２．１×３０ｍｍ）を用いて、オンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化に供した。得られたペプチドを、Ｑ ＥｘａｃｔｉｖｅＴＭ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）に接続されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣで構成されるＵＰＬＣ－ＭＳシステムを使用して分析した。ペプチドを、２～３２％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．２％ギ酸）の１６．５分の勾配で５０ｍｍ×１ｍｍのＣ８カラム上で分離した。溶媒Ａは、水中０．２％ギ酸であった。注入バルブ、及びペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩカラム、及びそれらに関連する接続チューブは、１６℃で維持された冷却ボックス内にあった。第２の切換バルブ、Ｃ８カラム、及びそれらに関連するステンレス鋼の接続チューブは、－６℃で維持された別の冷却循環ボックス内にあった。Ｗ６配列に対するＭＳ／ＭＳデータをＭａｓｃｏｔで検索することを通じて、ペプチド同定を行った。プリカーサー及びプロダクトイオンに対する質量許容差は、それぞれ７ｐｐｍ及び０．０２Ｄａであった。ＣＷ６Ｗ３では１００％の配列カバレッジが達成された。
水素重水素交換（ＨＤＸ）。１０μＬのＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））（５μｇ）、１０μＬのＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））＆ＣＷ６Ｂ１７５混合物、又は１０μＬのＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））＆ＣＷ６Ｂ１３０の混合物（５μｇ：１５μｇ）を、１２０μＬの重水標識緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＤ７．４）と共に、２０℃で０秒、６０秒、３００秒、１８００秒、又は７２００秒間インキュベートした。各時点での水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換を、２回で実施した。１３０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ ＴＣＥＰ緩衝液（最終的なｐＨは２．５であった）を加えることによって、交換をクエンチした。その後、クエンチしたサンプルを、上記に記載されるようにオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化及びＬＣ－ＭＳ分析に供した。質量スペクトルはＭＳのみのモードで記録した。未処理ＭＳデータを、Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータの分析のためのソフトウェア、ＨＤＸ ＷｏｒｋＢｅｎｃｈを使用して処理した（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２，２３（９），１５１２－１５２１）。重水素化ペプチドとその天然形態（ｔ０）との平均質量差を使用して、重水素レベルを算出した。
実施例１：抗体の生成
全てのリード候補抗体及びツール抗体を、２つの独立した免疫操作、すなわち、（１）ＯＭＴ ＯｍｎｉＲａｔ、及び（２）Ａｂｌｅｘｉｓマウスへの免疫から同定した。
全てのリード候補抗体及びツール抗体を、２つの独立した免疫操作、すなわち、（１）ＯＭＴ ＯｍｎｉＲａｔ、及び（２）Ａｂｌｅｘｉｓマウスへの免疫から同定した。
ＯｍｎｉＲａｔには、反復接種多重部位技術（Repetitive Immunizations Multiple Sites、ＲＩＭＳ）及び最終細胞免疫ブーストプロトコルに従って、週２回、合計１２回の免疫ブーストが行われた。組換えヒトＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））及びＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）タンパク質を使用して、ＨＬＡ－Ｃｗ６に対する抗体を生成した。最後のブーストとして、ＨＬＡ－Ｃｗ６を過剰発現させたＫ５６２細胞株を接種した。血清を採取し、ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６に対する循環ＩｇＧ特異的抗体を評価し、抗原をプレートに直接コーティングした固相ＥＬＩＳＡで力価を測定した。リンパ節を採取してＢリンパ球を融合させ、ハイブリドーマからの上清を標的抗原への結合についてスクリーニングした。
第２のアプローチでは、Ａｂｌｅｘｉｓマウスを３つの異なる方法、すなわち、腹腔内注射（ＩＰ）、３０日間のプロトコル、及びＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））とＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）との混合物を用いたＩＰ／ＲＩＭＳで免疫し、免疫プロトコルの期間中に合計８回の注射を行った。ｈＨＬＡ－Ｃｗ６を過剰発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）による最終ブーストは行わなかった。免疫プロトコルの最後に、ＡｕｔｏＭＡＣＳ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを用いてＴ細胞及びＩｇＭ＋Ｂ細胞を枯渇させることにより、脾細胞からＢ細胞を濃縮した。細胞の一部をハイブリドーマ生成のために融合させた。残りのＢ細胞を、ｂｔ－ＨＬＡ ＣＷ６抗原、抗マウスＩｇＧ（Ｆｃｙ特異的）－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、抗ヒトＫａｐｐａ－ＰＥ／Ｃｙ７で染色し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩにより選別した。単一の抗原特異的Ｂ細胞（ｍｓＦｃ、ｈｕＫａｐｐａ、及びＨＬＡ－ＣＷ６陽性）を、培地（Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ ＋ ２０％ Ｊｕｒｋａｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ ＋ ０．１μｇ／ｍＬのｍｓＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ）＋５μｇ／ｍＬのｍｓＣｐＧ ＯＤＮ１８２６＋２５ｎｇ／ｍＬのｍｓＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）＋１０ｎｇ／ｍＬのｍｓＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋１７ｎｇ／ｍＬのｍｓＩＬ－１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋１０μｇ／ｍＬのＬＰＳ ０２６：Ｂ６（Ｓｉｇｍａ）＋１μｇ／ｍＬのＰＷＭ（Ｓｉｇｍａ）＋１８００ ｉＭＥＦフィーダー細胞／ウェル）を含む３８４ウェル組織培養プレートに沈着させ、１ウェルあたり１個の細胞を沈着させた。選別された細胞を９０μＬの培地で４日間インキュベートし、培養上清をＭＳＤでスクリーニングして、ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））タンパク質に対するマウスＩｇＧ抗体の存在と、各種細胞株（親、ＨＬＡ－ＣＷ６、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ－過剰発現）の存在を確認した。
ＯＭＴハイブリドーマの上清を、複数の組換え抗原への結合について試験し、標準的なＥＬＩＳＡによってＨＬＡ－ＣＷ６に選択的な抗体を選択した。ＥＬＩＳＡプレートにコーティングされた６つの標的抗原は、（１）ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））、（２）ＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）、（３）ＣＷ６Ｗ３６（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭＴＳＬ５）（配列番号２０４）、（４）Ａ２ＰＷ２３（ｒｈＨＬＡ－Ａ２）（配列番号１９９）、（５）ＭＨＧＷ２（ｒｈＨＬＡ－Ｇ５）（配列番号２００）、及び（６）Ｍ０１Ｗ６（β２－ミクログロブリン（配列番号２０１））であった。更に、ＨＬＡ－Ｃｗ６（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）及びＨＬＡ－Ａ１（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ１）（配列番号２１２）を安定的に発現するＫ５６２細胞への結合、及び親Ｋ５６２細胞株への結合について、上清をＭＳＤ Ｃｅｌｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｏｒｍａｔでスクリーニングした。ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合し、ｒｈＨＬＡ－Ａ２、ｒｈＨＬＡ－Ｇ５、β２－ミクログロブリン、Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ２及び親Ｋ５６２細胞株には結合しなかったクローンをクローン化し、完全なヒトｈＩｇＧ１－シグマモノクローナル抗体として発現させた。
ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））でＭＳＤプレートをコーティングし、結合したマウスＩｇＧをＳｕｌｆｏＴａｇ抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出することにより、単一のＢ細胞からの上清をスクリーニングした。また、ヒトＨＬＡ－Ｃｗ６（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）、ＨＬＡ－Ａ１（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ１）（配列番号２１２）及びＨＬＡ－Ｂ７（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７）（配列番号２１３）を安定的に発現するＫ５６２細胞株への結合について、上清をスクリーニングし；非特異的バインダーを除外するために、親Ｋ５６２細胞を含めた。
ＨＬＡ－Ｃｗ６特異的バインダーとして同定された両抗体探索操作からの全ての抗体を、最初にクローン化し、ｈＩｇＧ１－シグマモノクローナル抗体として発現させた。Ｔａｒｇｅｔ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ基準を満たす抗体をクローン化し、ｈＩｇＧ４－ＰＡＡモノクローナル抗体として発現させた。
実施例２：抗体の特性評価
ハイブリドーマ融合クローンの上清、ＯＭＴ ＯｍｎｉＲａｔ免疫、Ａｂｌｅｘｉｓマウス免疫からのＢ細胞選別から、抗体を同定した。後述の特性評価実験から、エピトープ結合群、アンタゴニスト効力、結合選択性、及び親和性の異なる組み合わせ特性を有する、８つのアンタゴニスト及び１つの非アンタゴニストの抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体を表す９つの独自の抗体を同定した。以下の項では、９つの抗体全てについて、各ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価試験の結果を説明する。
ハイブリドーマ融合クローンの上清、ＯＭＴ ＯｍｎｉＲａｔ免疫、Ａｂｌｅｘｉｓマウス免疫からのＢ細胞選別から、抗体を同定した。後述の特性評価実験から、エピトープ結合群、アンタゴニスト効力、結合選択性、及び親和性の異なる組み合わせ特性を有する、８つのアンタゴニスト及び１つの非アンタゴニストの抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体を表す９つの独自の抗体を同定した。以下の項では、９つの抗体全てについて、各ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価試験の結果を説明する。
ＯＭＴハイブリドーマ融合からの上清の一次スクリーニング
ＯＭＴ ＯｍｎｉＲａｔの免疫から得られたハイブリドーマ上清を、２３２×９６ウェルＥＬＩＳＡで最初にスクリーニングし、免疫に使用した免疫原であるＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）及びＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））に結合する抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体を発現するクローンを同定した。一次スクリーニングでは、合計８８０件のヒットが同定された。ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６に対する選択性を有するハイブリドーマクローン上清を同定するために、複数の組換え抗原及びＨＬＡ－Ｉ分子を安定的に発現する複数の細胞株に対して確認ＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。確認スクリーニングにおける抗原は、（１）ｃｗ６ｗ３．ｅｃｏ．ｐｐ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））、（２）ＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）、（３）ＣＷ６Ｗ３６（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭＴＳＬ５）（配列番号２０４）、（４）Ａ２ＰＷ２３（ｒｈＨＬＡ－Ａ２）（配列番号１９９）、（５）ＭＨＧＷ２（ｒｈＨＬＡ－Ｇ５）（配列番号２００）、及び（６）Ｍ０１Ｗ６（ｒｈβ２－マクログロブリン）（配列番号２０１）であった。ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６を安定的に発現するＫ５６２細胞株（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）に対して確認細胞結合スクリーニングを行い、ｒｈＨＬＡ－Ａを安定的に発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ）（配列番号２１２）、及びＫ５６２親細胞株に対してカウンタースクリーニングを行った。これらのスクリーニングに基づき、合計２０８のハイブリドーマクローン上清がＨＬＡ－Ｃｗ６に対して選択的であった（表１）。
ＯＭＴ ＯｍｎｉＲａｔの免疫から得られたハイブリドーマ上清を、２３２×９６ウェルＥＬＩＳＡで最初にスクリーニングし、免疫に使用した免疫原であるＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）及びＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））に結合する抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体を発現するクローンを同定した。一次スクリーニングでは、合計８８０件のヒットが同定された。ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６に対する選択性を有するハイブリドーマクローン上清を同定するために、複数の組換え抗原及びＨＬＡ－Ｉ分子を安定的に発現する複数の細胞株に対して確認ＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。確認スクリーニングにおける抗原は、（１）ｃｗ６ｗ３．ｅｃｏ．ｐｐ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））、（２）ＣＷ６Ｗ３２（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ）（配列番号２０２）、（３）ＣＷ６Ｗ３６（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭＴＳＬ５）（配列番号２０４）、（４）Ａ２ＰＷ２３（ｒｈＨＬＡ－Ａ２）（配列番号１９９）、（５）ＭＨＧＷ２（ｒｈＨＬＡ－Ｇ５）（配列番号２００）、及び（６）Ｍ０１Ｗ６（ｒｈβ２－マクログロブリン）（配列番号２０１）であった。ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６を安定的に発現するＫ５６２細胞株（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）に対して確認細胞結合スクリーニングを行い、ｒｈＨＬＡ－Ａを安定的に発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ）（配列番号２１２）、及びＫ５６２親細胞株に対してカウンタースクリーニングを行った。これらのスクリーニングに基づき、合計２０８のハイブリドーマクローン上清がＨＬＡ－Ｃｗ６に対して選択的であった（表１）。
続いて、ＨＬＡ－Ｂ７を発現するＫ５６２細胞株（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７）（配列番号２１３）を含む２０８個の上清ヒットに対して、追加の一次細胞結合スクリーニングを行って、ハイブリドーマクローン上清パネルのＨＬＡ－Ｃｗ６に対する特異性を高めた。このスクリーニングから、４９個のハイブリドーマクローン上清は、Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２１１）に選択的に結合するが、Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７（配列番号２１３）又はＫ５６２親細胞株には結合しないことが確認された。
ＡｂｌｅｘｉｓマウスＢ細胞選別からの単一Ｂ細胞上清及び精製抗体の一次スクリーニング
Ａｂｌｅｘｉｓマウスの免疫操作で得られ、ＩｇＧの発現に対して陽性であり、ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））抗原への結合が陽性であった、２１６個の培養単一Ｂ細胞の上清をスクリーニングし、ＨＬＡ－Ｃｗ６（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）、ＨＬＡ－Ａ１（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ１）（配列番号２１２）、ＨＬＡ－Ｂ７（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７）（配列番号２１３）を安定的に発現するＫ５６２細胞、及び親Ｋ５６２細胞株との結合性を確認した。２１６個の選別されたクローンのうち、１１個のクローンが、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的な結合を示したが、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ａ、－ＨＬＡ－Ｂ、親細胞株には結合しなかった。これらのスクリーニングから同定された１１のヒットは、ヒトＩｇＧ４－ＰＡＡにクローン化され、更なる特性評価のために発現及び精製された。同定された１１個の上清ヒットのうち、９個がモノクローナル抗体として正常に発現及び精製された（表２）（Ａｂｌｅｘｉｓ Ｂ細胞から６個（ＣＷ６Ｂ２２８、ＣＷ６Ｂ２２９、ＣＷ６Ｂ２３０、ＣＷ６Ｂ２３３、ＣＷ６Ｂ２３７、ＣＷ６Ｂ２３８）、ＯＭＴハイブリドーマから３個（ＣＷ６Ｂ１３０、ＣＷ６Ｂ１７５、ＣＷ６Ｂ１８８））。抗体を配列決定して、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、並びに重鎖及び軽鎖相補性決定領域を同定した（表３～表６）。
Ａｂｌｅｘｉｓマウスの免疫操作で得られ、ＩｇＧの発現に対して陽性であり、ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））抗原への結合が陽性であった、２１６個の培養単一Ｂ細胞の上清をスクリーニングし、ＨＬＡ－Ｃｗ６（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６）（配列番号２１１）、ＨＬＡ－Ａ１（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ａ１）（配列番号２１２）、ＨＬＡ－Ｂ７（Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７）（配列番号２１３）を安定的に発現するＫ５６２細胞、及び親Ｋ５６２細胞株との結合性を確認した。２１６個の選別されたクローンのうち、１１個のクローンが、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的な結合を示したが、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ａ、－ＨＬＡ－Ｂ、親細胞株には結合しなかった。これらのスクリーニングから同定された１１のヒットは、ヒトＩｇＧ４－ＰＡＡにクローン化され、更なる特性評価のために発現及び精製された。同定された１１個の上清ヒットのうち、９個がモノクローナル抗体として正常に発現及び精製された（表２）（Ａｂｌｅｘｉｓ Ｂ細胞から６個（ＣＷ６Ｂ２２８、ＣＷ６Ｂ２２９、ＣＷ６Ｂ２３０、ＣＷ６Ｂ２３３、ＣＷ６Ｂ２３７、ＣＷ６Ｂ２３８）、ＯＭＴハイブリドーマから３個（ＣＷ６Ｂ１３０、ＣＷ６Ｂ１７５、ＣＷ６Ｂ１８８））。抗体を配列決定して、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、並びに重鎖及び軽鎖相補性決定領域を同定した（表３～表６）。
発現及び精製されたモノクローナル抗体を、ＭＳＤ細胞結合アッセイフォーマットを用いて、Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６細胞株には選択的に結合するが、Ｋ５６２－ｒｅｈＨＬＡ－Ｂ７又はＫ５６２親細胞株には結合しないことをスクリーニングした。合計７つのｍＡｂが、Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６細胞株に結合するが、Ｋ５６２－ｒｈＨＬＡ－Ｂ７又はＫ５６２親細胞株には結合しない、選択性の基準を満たした（表７）。
精製モノクローナル抗体（ＩＬ－２及びＣＤ６９）の機能的活性スクリーニング
ＯＭＴ ＯｍｎｉＲａｔハイブリドーマ及びＡｂｌｅｘｉｓ Ｂ細胞選別の一次スクリーニングで同定された精製抗体を、２つの別々であるが直交するアッセイにおける機能的活性、すなわち、（１）Ｔ細胞株におけるＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭＴＳＬ５－Ａｂｕ依存性のＩＬ－２放出の阻害、（２）Ｔ細胞株におけるＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭ－ＴＳＬ５及びＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ依存性ＣＤ６９アップレギュレーションの阻害について特性評価した。
ＯＭＴ ＯｍｎｉＲａｔハイブリドーマ及びＡｂｌｅｘｉｓ Ｂ細胞選別の一次スクリーニングで同定された精製抗体を、２つの別々であるが直交するアッセイにおける機能的活性、すなわち、（１）Ｔ細胞株におけるＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭＴＳＬ５－Ａｂｕ依存性のＩＬ－２放出の阻害、（２）Ｔ細胞株におけるＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭ－ＴＳＬ５及びＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ依存性ＣＤ６９アップレギュレーションの阻害について特性評価した。
ＩＬ－２阻害機能のスクリーニングを３つの抗体濃度で実施し、ＩＬ－２放出の阻害率（％）に基づいて抗体をランク付けした。簡潔に述べると、ＬＣＬ－７２１．２２１－ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６細胞（クローン２８）（配列番号２１１）に、ＡＤＡＭＴＳＬ５－Ａｂｕペプチド（配列番号２１８）を負荷し、ヒトＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５受容体（配列番号２１４及び配列番号２１５）を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローン（Ｊｕｒｋａｔ－ｒｈＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５）と共培養した（ＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭＴＳＬ５－Ａｂｕペプチドは同族リガンド）。アンタゴニストの抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体の非存在下で、又は陰性対照の存在下で、刺激されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローンは測定可能なＩＬ－２を分泌する。しかし、抗ＨＬＡ－Ｃｗ６アンタゴニスト抗体で共培養を処理することにより、ＩＬ－２の分泌が阻害され、アンタゴニスト活性についてＨＬＡ－Ｃｗ６特異的抗体をスクリーニングする方法が提供される。ＨＬＡ－Ｃｗ６特異的抗体のパネルから、７つの抗体が、陽性対照の抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体（ＣＷ６Ｂ１２３及びＣＷ６Ｂ１２４）に匹敵する、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株によるＨＬＡ－Ｃｗ６依存性のＩＬ－２放出に拮抗する良好な有効性を有している。また、アンタゴニスト活性を示さない、ＨＬＡ－Ｃに高い特異性を持つ抗体も、抗体パネルに含まれていた（表８）。
ＣＤ６９アップレギュレーションによって測定されるＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭ－Ａｂｕ及びＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ依存性Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞活性化の阻害を測定する直交機能バイオアッセイで、ＩＬ－２放出のブロッキングに良好な有効性を持つ７つの抗体を特性評価した。簡潔に述べると、ｒＨＬＡ－Ｃｗ６を安定的に発現するＫ５６２細胞に、ＡＤＡＭ－ａｂｕ、又はＴＲＡＴのペプチドを負荷し、抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体で処理し、ＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＬＳ５、又はＴＣＲ－ＴＲＡＴを安定的に発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株とそれぞれ共培養した。一晩インキュベートした後、ＣＤ６９発現のＨＬＡ－Ｃｗ６／ペプチド依存性アップレギュレーションをフローサイトメトリーでモニターした。ＩＬ－２阻害アッセイから得られた７つのアンタゴニスト抗体は全て、Ｊｕｒｋａｔ－ＴＣＲ－ＡＤＡＭＴＳＬ５（図１）及びＪｕｒｋａｔ－ＴＣＲ－ＴＲＡＴ（図２）のＴ細胞株におけるＣＤ６９アップレギュレーションの抗体濃度依存性のブロッキングを示す。ＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭ－Ａｂｕに対しては、ＣＷ６Ｂ１３０が最も高い効力を示し、ＣＷ６Ｂ２３７が最も低い効力を示した。ＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴに対しては、Ｃｗ６Ｂ２３７が最も高い効力を示した。
ＬＡＢＳＣＲＥＥＮ（登録商標）対立遺伝子特異性スクリーニング
精製した抗体をＬＡＢＳＣＲＥＥＮ（登録商標）アッセイで対立遺伝子特異性を解析した。ＬＡＢＳＣＲＥＥＮ（登録商標）アッセイは、ビーズベースの蛍光フロー技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ １００）を用いて、９７のＣｌａｓｓ Ｉ ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ）への定性的な抗体結合を評価するものである。データをＨＬＡ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ソフトウェア（バージョン４．０）を用いて解析し、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子に対する高い選択性を持つ抗体を選択して、その機能的活性、結合性、及び他の特性による更なる評価を行った。社内で生成された抗体のうち、ＣＷ６Ｂ２３７及びＣＷ６Ｂ２３８はＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子に対して最も高い特異性を示し、次にＣＷ６Ｂ１３０、ＣＷ６Ｂ１７５及びＣＷ６Ｂ１８８が続き、これらは全てＨＬＡ－Ｂ４６と交差反応性を示し、ＣＷ６Ｂ１３０及びＣＷ６Ｂ１７５はＨＬＡ－Ｂ７３に対して追加の交差反応性を示す。これらのＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子の配列を解析すると、ＨＬＡ－Ｂ７３はＨＬＡ－Ｃファミリーに密接に関連しており、一方、ＨＬＡ－Ｂ４６はＨＬＡ－Ｂファミリーに含まれていると考えられる。７６位のバリンは、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｂ４６、ＨＬＡ－Ｂ７３には保存されているが、他のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子には保存されていないことから、このバリンがこれらの抗体で観察される対立遺伝子特異性に関与していることを示唆している。残りの抗体は、少なくとも１０個を超える非ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子に対して（定性的に）交差反応性を示し、ＣＷ６Ｂ２３８は、試験した９７個のクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子の中で最も高い交差反応性を示す（図３Ａ～図３Ｃ、図４Ａ～図４Ｃ、図５Ａ～図５Ｃ、図６Ａ～図６Ｃ、図７Ａ～図７Ｃ、図８Ａ～図８Ｃ、図９Ａ～図９Ｃ、図１０Ａ～１０図Ｃ、図１１Ａ～図１１Ｃ、図１２Ａ～図１２Ｃ、及び図１３Ａ～図１３Ｃ）。
精製した抗体をＬＡＢＳＣＲＥＥＮ（登録商標）アッセイで対立遺伝子特異性を解析した。ＬＡＢＳＣＲＥＥＮ（登録商標）アッセイは、ビーズベースの蛍光フロー技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ １００）を用いて、９７のＣｌａｓｓ Ｉ ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ）への定性的な抗体結合を評価するものである。データをＨＬＡ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ソフトウェア（バージョン４．０）を用いて解析し、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子に対する高い選択性を持つ抗体を選択して、その機能的活性、結合性、及び他の特性による更なる評価を行った。社内で生成された抗体のうち、ＣＷ６Ｂ２３７及びＣＷ６Ｂ２３８はＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子に対して最も高い特異性を示し、次にＣＷ６Ｂ１３０、ＣＷ６Ｂ１７５及びＣＷ６Ｂ１８８が続き、これらは全てＨＬＡ－Ｂ４６と交差反応性を示し、ＣＷ６Ｂ１３０及びＣＷ６Ｂ１７５はＨＬＡ－Ｂ７３に対して追加の交差反応性を示す。これらのＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子の配列を解析すると、ＨＬＡ－Ｂ７３はＨＬＡ－Ｃファミリーに密接に関連しており、一方、ＨＬＡ－Ｂ４６はＨＬＡ－Ｂファミリーに含まれていると考えられる。７６位のバリンは、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｂ４６、ＨＬＡ－Ｂ７３には保存されているが、他のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子には保存されていないことから、このバリンがこれらの抗体で観察される対立遺伝子特異性に関与していることを示唆している。残りの抗体は、少なくとも１０個を超える非ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子に対して（定性的に）交差反応性を示し、ＣＷ６Ｂ２３８は、試験した９７個のクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子の中で最も高い交差反応性を示す（図３Ａ～図３Ｃ、図４Ａ～図４Ｃ、図５Ａ～図５Ｃ、図６Ａ～図６Ｃ、図７Ａ～図７Ｃ、図８Ａ～図８Ｃ、図９Ａ～図９Ｃ、図１０Ａ～１０図Ｃ、図１１Ａ～図１１Ｃ、図１２Ａ～図１２Ｃ、及び図１３Ａ～図１３Ｃ）。
ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子に対する特異性が最も高い抗体（ＣＷ６Ｂ２３７及びＣＷ６Ｂ２３８）は、良好なアンタゴニスト効能を示すが、最高の活性は示さない。最も高いアンタゴニスト効能を示すのはＣＷ６Ｂ１３０及びＣＷ６Ｂ１７５で、ＨＬＡ－Ｂ４６及びＨＬＡ－Ｂ７３に対して定性的に交差反応性を示している。ＣＷ６Ｂ１８８は、ＨＬＡ－Ｃの選択性が高いが、ＨＬＡ－Ｂ４６に結合し、Ｔ細胞活性化試験ではアンタゴニスト活性を有さない。
親和性測定（ＳＰＲ）
既に述べたように、ｒＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＲＦＮ（配列番号２０５）（リフォールドしたｒＨＬＡ－Ｃｗ６の酸性ペプチド、別名ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３）（配列番号２０３）、ｒＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ（一本鎖発現タンパク質中の塩基性ペプチド、別名ＣＷ６Ｗ３２）（配列番号２０２）、ｒＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭＴＳＬ５（一本鎖発現タンパク質中の酸性ペプチド、別名ＣＷ６Ｗ３６）（配列番号２０４）抗原に対して、ＰｒｏｔｅＯＮ ＸＰＲ３６システムを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって、抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体の親和性測定値を得た。抗体は、試験した３つの抗原に対して、異なる結合動態を示した（表９エラー！参照ソース見つからず。）。
既に述べたように、ｒＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＲＦＮ（配列番号２０５）（リフォールドしたｒＨＬＡ－Ｃｗ６の酸性ペプチド、別名ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３）（配列番号２０３）、ｒＨＬＡ－Ｃｗ６／ＴＲＡＴ（一本鎖発現タンパク質中の塩基性ペプチド、別名ＣＷ６Ｗ３２）（配列番号２０２）、ｒＨＬＡ－Ｃｗ６／ＡＤＡＭＴＳＬ５（一本鎖発現タンパク質中の酸性ペプチド、別名ＣＷ６Ｗ３６）（配列番号２０４）抗原に対して、ＰｒｏｔｅＯＮ ＸＰＲ３６システムを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって、抗ＨＬＡ－Ｃｗ６抗体の親和性測定値を得た。抗体は、試験した３つの抗原に対して、異なる結合動態を示した（表９エラー！参照ソース見つからず。）。
クラスＩ ＭＨＣ分子を区別する抗体の能力特性を更に評価にする。ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊７３：０１クラスＩ ＭＨＣ分子を表す１１の抗原に対する７つのアンタゴニスト抗体を用いて、これらのクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子に高頻度で関連して観察されたペプチドを表すペプチドを負荷して、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器でＳＰＲを行った（Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１３９４－１４０５，Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．４７：４７２－７）。
ＬＡＢＳｃｒｅｅｎアッセイの結果は、ＣＷ６Ｂ１３０及びＣＷ６Ｂ１７５がＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊７３：０１対立遺伝子に対して交差反応性を有することを示しているが、同族ペプチドを有する抗原を用いたＳＰＲデータは、これらの抗体がペプチドを負荷した抗原に不十分に結合することを示している（表１０）。
エピトープのビニング及びマッピング（ＩＢＩＳ及びＨＤＸ）
標的抗原（ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））上の抗ＨＬＡ－Ｃｗ６エピトープを、ＳＰＲｉ（ＳＰＲイメージング）及びＣＦＭ（連続フローマイクロ流体、又はマイクロスポッター）プリントを用いた従来の競合（サンドイッチフォーマット）実験によって決定し、ＩＢＩＳ法を用いて解析した。９４個の抗ＨＬＡ－Ｃ抗体のパネルを用いて同定されたビン群は全部で６つあり、同定された９個の抗体は３つの異なるエピトープ群に適合する。それらのうちの４つは、群３の陽性／参照対照抗体であるＣＷ６Ｂ１２３と一緒にビンに入れられ、４つを一緒に群４でビンに入れ、１つの抗体（ＣＷ６Ｂ２３７）を群６でビンに入れる（表１１）
標的抗原（ＣＷ６Ｗ３．ＥＣＯ．ＰＰ．００２／．００３（ｒｈＨＬＡ－Ｃｗ６（配列番号２０３）／ＡＲＦ（配列番号２１９））上の抗ＨＬＡ－Ｃｗ６エピトープを、ＳＰＲｉ（ＳＰＲイメージング）及びＣＦＭ（連続フローマイクロ流体、又はマイクロスポッター）プリントを用いた従来の競合（サンドイッチフォーマット）実験によって決定し、ＩＢＩＳ法を用いて解析した。９４個の抗ＨＬＡ－Ｃ抗体のパネルを用いて同定されたビン群は全部で６つあり、同定された９個の抗体は３つの異なるエピトープ群に適合する。それらのうちの４つは、群３の陽性／参照対照抗体であるＣＷ６Ｂ１２３と一緒にビンに入れられ、４つを一緒に群４でビンに入れ、１つの抗体（ＣＷ６Ｂ２３７）を群６でビンに入れる（表１１）
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
Claims (16)
- 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列：
ａ．それぞれ、配列番号３７、３８、３９、６４、６５、及び６６、
ｂ．それぞれ、配列番号４０、４１、４２、６７、６８、及び６９、
ｃ．それぞれ、配列番号４３、４４、４５、７０、７１、及び７２、
ｄ．それぞれ、配列番号４６、４７、４８、７３、７４、及び７５、
ｅ．それぞれ、配列番号４９、５０、５１、７６、７７、及び７８、
ｆ．それぞれ、配列番号５２、５３、５４、７９、８０、及び８１、
ｇ．それぞれ、配列番号５５、５６、５７、８２、８３、及び８４、
ｈ．それぞれ、配列番号５８、５９、６０、８５、８６、及び８７、又は
ｉ．それぞれ、配列番号６１、６２、６３、８８、８９、及び９０、を含み、
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃに結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列：
ａ．それぞれ、配列番号９１、９２、９３、１１８、１１９、及び１２０、
ｂ．それぞれ、配列番号９４、９５、９６、１２１、１２２、及び１２３、
ｃ．それぞれ、配列番号９７、９８、９９、１２４、１２５、及び１２６、
ｄ．それぞれ、配列番号１００、１０１、１０２、１２７、１２８、及び１２９、
ｅ．それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、１３０、１３１、及び１３２、
ｆ．それぞれ、配列番号１０６、１０７、１０８、１３３、１３４、及び１３５、
ｇ．それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１３６、１３７、及び１３８、
ｈ．それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１３９、１４０、及び１４１、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１１５、１１６、１１７、１４２、１４３、及び１４４、を含み、
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃｗ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列：
ａ．それぞれ、配列番号１４５、１４６、１４７、１７２、１７３、及び１７４、
ｂ．それぞれ、配列番号１４８、１４９、１５０、１７５、１７６、及び１７７、
ｃ．それぞれ、配列番号１５１、１５２、１５３、１７８、１７９、及び１８０、
ｄ．それぞれ、配列番号１５４、１５５、１５６、１８１、１８２、及び１８３、
ｅ．それぞれ、配列番号１５７、１５８、１５９、１８４、１８５、及び１８６、
ｆ．それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１８７、１８８、及び１８９、
ｇ．それぞれ、配列番号１６３、１６４、１６５、１９０、１９１、及び１９２、
ｈ．それぞれ、配列番号１６６、１６７、１６８、１９３、１９４、及び１９５、又は
ｉ．それぞれ、配列番号１６９、１７０、１７１、１９６、１９７、及び１９８、を含み、
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ－Ｃに結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５若しくは１７と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ａ．配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｂ．配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｃ．配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｄ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｅ．配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｆ．配列番号１１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｇ．配列番号１３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｈ．配列番号１５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、又は
ｉ．配列番号１７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがキメラである、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがヒトである又はヒト化されている、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＨＬＡ－Ｃｗ６による抗原提示の結合及び阻害を介して、Ｔ細胞の発達及び活性化をブロックする、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸。
- 請求項９に記載の単離核酸を含むベクター。
- 請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
- 自己免疫疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項１２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
- 前記自己免疫疾患が、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、及び乾癬性関節炎からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
- 請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する方法であって、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む細胞を、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する条件で培養することと、前記細胞又は培養物から前記抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することと、を含む、方法。
- 請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を製造する方法であって、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを医薬的に許容される担体と組み合わせて、前記医薬組成物を得ることを含む、方法。
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