JP2022524044A

JP2022524044A - 微生物のプール型ゲノム編集

Info

Publication number: JP2022524044A
Application number: JP2021552868A
Authority: JP
Inventors: スティーブンブラスコウスキー，; ルズアレオサクレト，サラダ; キャメロンコーツ，; アーロンミラー，; シャロンネイドマニー，; メリッサネットワル，; ケダールパテル，; ショーンシィジカ，; フィリップウェイマン，; ソロモンヘンリーストーンブルーム，; コリンスコットマクスウェル，; エリザベスローレンマイヤー，
Original assignee: ZYMERGEN INC.
Current assignee: ZYMERGEN INC.
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2022-04-27
Also published as: CA3129869A1; CN113710802A; KR20210137009A; WO2020185584A1

Abstract

本発明は、微生物宿主細胞のゲノムを１つまたは複数ラウンドの形質転換で編集するための方法に関する。本方法は、少なくとも１ラウンドの形質転換後に機能的対抗選択の使用を必要としない、プール型および／または反復方式での微生物宿主細胞のゲノムへの遺伝子編集の導入を可能にする。本方法を使用して、微生物宿主細胞のゲノム内に遺伝子編集を迅速にスタッキングすることができる。本方法を行うための組成物およびキットも開示される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年３月８日に出願した米国仮出願第６２／８１６，０３５号の優先権の利益を主張するものであり、前記仮出願は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野

本開示は、部位指向型ゲノム編集法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）の使用による微生物宿主細胞のプール型編集のための組成物および方法に関する。プール型編集方法は、編集ラウンドの少なくとも１ラウンドが、対抗選択可能なマーカーの活性発現および利用を必要とすることなく行われるような、連続する編集ラウンドの反復プロセスで行うことができる。開示される方法および組成物は、所望の宿主細胞または生物のゲノム内の複数の遺伝子座にわたっての多様な遺伝子編集の生成ならびに複数の遺伝子編集のスタッキングに有用であり得る。

代謝工学は、エタノール、高級アルコール、脂肪酸、アミノ酸、シキミ酸前駆体、テルペノイド、ポリケチド、および１，４－ブタンジオールのポリマー前駆体をはじめとする、工業的に適切なバイオ燃料または生化学物質を産生するように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉなどの微生物宿主細胞を改変するために、幅広く適用されている。多くの場合、工業的に最適化された株は、そのような工業的に適切な製品を生産するために多くのゲノム改変、例えば、挿入、欠失、および調節改変などを必要とする。そのような多数のゲノム編集標的は、時間を節約する逐次的操作またはマルチプレックス操作を行なうために効率的ツールを必要とする。

Ｅ．ｃｏｌｉの染色体ＤＮＡを操作するためにＲａｃプロファージ系または３つのバクテリオファージλ Ｒｅｄタンパク質Ｅｘｏ、ベータおよびＧａｍのどちらかを使用するファージリコンビナーゼ媒介相同組換え（リコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ））を利用するいくつかの手法があるが、これらの手法は、骨が折れるものであり得ること、時間がかかり得ること、および／または多くの場合１％未満という変異誘発効率を特徴とし得ることを考えると、ハイスループット適用には理想的でないことが多い。最近、ファージリコンビナーゼ媒介相同組換えとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の両方を利用する手法が、ＪｉａｎｇＷらにより紹介された（Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｅｄｉｔｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｓｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３Ｍａｒ；３１（３）：２３３－９を参照されたい）。手短に述べると、Ｊｉａｎｇおよび共同研究者の方法では、改変される株は、まず、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびλ Ｒｅｄ機構を発現するように遺伝子操作され、その後、この株は、（ｉ）改変される染色体領域とアニールし、Ｃａｓ９による部位特異的ＤＮＡ切断を促進するガイドＲＮＡをコードするプラスミド（ｐＣＲＩＳＰＲ）と、（ｉｉ）λ Ｒｅｄ媒介組換えによる二本鎖切断の修復を促進する、切断された末端に部分的に相同なドナーＤＮＡ（ＰＣＲにより誘導されたまたは化学合成された）とで、共形質転換され、それによって所望の変異が導入される。Ｊｉａｎｇおよび共同研究者の戦略は、６５％ほどもの高い変異効率を報告したが、この方法は、やはり時間がかかり、この手順を通して導入されるプラスミドを宿主細胞から有効にキュアリングするために対抗選択可能なマーカーの存在および使用を必要とする。
以上のことから、広範な微生物宿主において利用することができる効率的かつ迅速かつ対費用効果の高い方法で微生物宿主細胞に多様な遺伝子編集を導入し、遺伝子編集を反復的にスタッキングするための新しい方法が、当技術分野において必要とされている。本明細書で提供される組成物および方法は、微生物宿主細胞を代謝的に操作するための現行法に伴う上述の欠点に対処する。

Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｅｄｉｔｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｓｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３Ｍａｒ；３１（３）：２３３－９

一態様では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、ａ．）微生物宿主細胞の基礎集団を編集プラスミドの第１のプールと組み合わせるステップであって、第１のプール内の各々の編集プラスミドが、少なくとも１つの修復断片を含み、編集プラスミドの第１のプールが、少なくとも２つの異なる修復断片を含み、第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子をさらに含み、各々の修復断片が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；ｂ．）ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの第１のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；およびｃ．）ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法が、本明細書で提供される。一部の場合には、方法は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｄ）をさらに含む。一部の場合には、異なる編集プラスミドを個々の微生物宿主細胞に導入し、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、少なくとも２つの異なる修復断片は、同じプラスミド上に存在する。一部の場合には、少なくとも２つの異なる修復断片は、異なるプラスミド上に存在する。一部の場合には、異なる編集プラスミドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる修復断片を含み、それによって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、ゲノム編集を有さない個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、１つのゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、ゲノム編集を有さない個々の細胞、１つのゲノム編集を有する個々の細胞、および複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む。一部の場合には、方法は、追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドは、ｄ．）ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；ｅ．）編集プラスミドの追加のプールをステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集プラスミドの追加のプールが、少なくとも１つまたは２つの異なる修復断片を含み、各々の修復断片が、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；ｆ．）ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの追加のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；およびｇ．）ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドは、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプールからの選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、抗生物質対抗選択、化学的対抗選択、または温度に基づく対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、各々の修復断片は、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している複数の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、方法は、ステップ（ｃ）で選択されたコロニーの遺伝子型を判定するステップをさらに含む。一部の場合には、方法は、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地で増殖した微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含む。一部の場合には、１）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない、または２）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、編集プラスミドの第１のおよび追加のプール内の各々の編集プラスミドは、微生物宿主細胞と前に組み合わせられた編集プラスミドの他のまたは追加のプール各々の中の各々の編集プラスミドと比較して、同一の複製起点または同じクラスの複製起点を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む。一部の場合には、編集プラスミドの第１のまたは追加のプールは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の異なる編集プラスミドを含む。一部の場合には、編集プラスミドの第１のまたは追加のプール内の各々の編集プラスミドは、同じ選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、選択マーカー遺伝子は、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の場合には、追加の１または複数ラウンドの編集で導入される修復断片は、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含み、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う。一部の場合には、追加の１または複数ラウンドの編集で導入されるｇＲＮＡは、異なる遺伝子座（単数または複数）を標的にし、前の編集ラウンドとは異なる抗生物質選択マーカー遺伝子を伴う。一部の場合には、方法は、ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）は、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、最終修復断片は、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは最終遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列は、相同アーム間にあり、相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、最終遺伝子座（単数または複数）は、前に編集されたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むか、または前に編集されたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含み、最終プラスミドは、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を含む。一部の場合には、方法は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡを導入するステップをさらに含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、１つまたは複数の異種組換え系からのタンパク質のセットを含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、ラムダレッド組換え系、ＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質のセット；ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せを含む。一部の場合には、ラムダレッド組換え系からのタンパク質のセットは、ベータタンパク質、ｇａｍタンパク質およびｅｘｏタンパク質を含む。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、ステップ（ａ）の前に異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて微生物宿主細胞に導入される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子の微生物宿主細胞のゲノムへの組込みに起因して、微生物宿主細胞により安定的に発現される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、構成的に発現される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、必要に応じて、異種組換え系遺伝子は、オペロン内に存在する。一部の場合には、誘導性プロモーターは、試薬の添加、代謝物もしくは試薬の枯渇により、または温度の変化により誘導可能である。一部の場合には、試薬は、アラビノース、イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびテトラサイクリンからなる群から選択される。一部の場合には、微生物宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。一部の場合には、導入するステップは、微生物宿主細胞を形質転換することを含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、真核細胞である。一部の場合には、微生物宿主細胞は、酵母細胞である。一部の場合には、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の場合には、微生物宿主細胞は、糸状真菌である。一部の場合には、糸状真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである。一部の場合には、微生物宿主細胞は、原核細胞である。一部の場合には、原核生物宿主細胞は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。

別の態様では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、ａ．）微生物宿主細胞の基礎集団を編集プラスミドの第１のプールと組み合わせるステップであって、第１のプール内の各々の編集プラスミドが、少なくとも１つの修復断片を含み、編集プラスミドの第１のプールが、少なくとも２つの異なる修復断片を含み、編集プラスミドの第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子をさらに含み、微生物宿主細胞が、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または１つもしくは複数の部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、編集プラスミドの第１のプールとともに微生物宿主細胞に導入され、１つまたは複数の部位特異的制限酵素が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座を標的にし、各々の修復断片が、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の標的にされる１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；ｂ．）ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの第１のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；およびｃ．）ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法が、本明細書で提供される。一部の場合には、＿＿は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｄ）をさらに含む。一部の場合には、異なる編集プラスミドを個々の微生物宿主細胞に導入し、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、異なる編集構築物を個々の微生物宿主細胞の亜集団に導入し、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、少なくとも２つの異なる修復断片は、同じプラスミド上に存在する。一部の場合には、少なくとも２つの異なる修復断片は、異なるプラスミド上に存在する。一部の場合には、異なる編集プラスミドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる修復断片を含み、それによって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、ゲノム編集を有さない個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、１つのゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、ゲノム編集を有さない個々の細胞、１つのゲノム編集を有する個々の細胞、および複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む。一部の場合には、方法は、追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドは、ｄ．）ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；ｅ．）編集プラスミドの追加のプールをステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集プラスミドの追加のプールが、少なくとも１つまたは２つの異なる修復断片を含み、微生物宿主細胞が、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つもしくは複数の標的遺伝子座を標的にする編集プラスミドの追加のプールとともに微生物宿主細胞に導入され、各々の修復断片が、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の標的にされる１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；ｆ．）ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの追加のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；およびｇ．ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドは、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプールからの選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、抗生物質対抗選択、化学的対抗選択、または温度に基づく対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、各々の修復断片は、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している複数の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、方法は、ステップ（ｃ）で選択されたコロニーの遺伝子型を判定するステップをさらに含む。一部の場合には、方法は、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地で増殖した微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含む。一部の場合には、１）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない、または２）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、編集プラスミドの第１のおよび追加のプール内の各々の編集プラスミドは、微生物宿主細胞と前に組み合わせられた編集プラスミドの他のまたは追加のプール各々の中の各々の編集プラスミドと比較して、同一の複製起点または同じクラスの複製起点を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む。一部の場合には、編集プラスミドの第１のまたは追加のプールは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の異なる編集プラスミドを含む。一部の場合には、編集プラスミドの第１のまたは追加のプール内の各々の編集プラスミドは、同じ選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、選択マーカー遺伝子は、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する。一部の場合には、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択される。一部の場合には、部位特異的制限酵素の各々は、プラスミド上にコードされるか、ゲノム内にコードされるか、ＲＮＡから翻訳されるか、または細胞にタンパク質として導入される。一部の場合には、遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の場合には、追加の１または複数ラウンドの編集で導入される修復断片は、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含み、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う。一部の場合には、追加の１または複数ラウンドの編集で導入されるｇＲＮＡは、異なる遺伝子座（単数または複数）を標的にし、前の編集ラウンドとは異なる抗生物質選択マーカー遺伝子を伴う。一部の場合には、方法は、ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）は、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、最終修復断片は、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは最終遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列は、相同アーム間にあり、相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、最終遺伝子座（単数または複数）は、前に編集されたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むか、または前に編集されたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含み、最終プラスミドは、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を含み、微生物宿主細胞は、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にする最終プラスミドとともに微生物宿主細胞に導入される。一部の場合には、方法は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡを導入するステップをさらに含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、１つまたは複数の異種組換え系からのタンパク質のセットを含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、ラムダレッド組換え系、ＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質のセット；ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せを含む。一部の場合には、ラムダレッド組換え系からのタンパク質のセットは、ベータタンパク質、ｇａｍタンパク質およびｅｘｏタンパク質を含

む。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、ステップ（ａ）の前に異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて微生物宿主細胞に導入される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子の微生物宿主細胞のゲノムへの組込みに起因して、微生物宿主細胞により安定的に発現される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、構成的に発現される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、必要に応じて、異種組換え系遺伝子は、オペロン内に存在する。一部の場合には、誘導性プロモーターは、試薬の添加、代謝物もしくは試薬の枯渇により、または温度の変化により誘導可能である。一部の場合には、試薬は、アラビノース、イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびテトラサイクリンからなる群から選択される。一部の場合には、微生物宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。一部の場合には、導入するステップは、微生物宿主細胞を形質転換することを含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、真核細胞である。一部の場合には、微生物宿主細胞は、酵母細胞である。一部の場合には、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の場合には、微生物宿主細胞は、糸状真菌である。一部の場合には、糸状真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである。一部の場合には、微生物宿主細胞は、原核細胞である。一部の場合には、原核生物宿主細胞は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。

さらに他の態様では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、ａ．微生物宿主細胞の基礎集団を、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールと組み合わせるステップであって、編集構築物の第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、微生物宿主細胞が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むか、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、編集構築物の第１のプールとともに微生物宿主細胞に導入され、編集構築物の第１のプールが、ｉ．同じ標的遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；ｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している同じ１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；またはｉｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；ｂ．ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールを導入するステップであって、編集構築物の第１のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；およびｃ．ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法が、本明細書で提供される。一部の場合には、方法は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｄ）をさらに含む。一部の場合には、異なる編集プラスミドを個々の微生物宿主細胞に導入し、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、異なる編集構築物を個々の微生物宿主細胞の亜集団に導入し、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、少なくとも２つの異なる修復断片は、同じプラスミド上に存在する。一部の場合には、少なくとも２つの異なる修復断片は、異なるプラスミド上に存在する。一部の場合には、編集構築物の第１のプールは、１つまたは複数の線状断片をさらに含む。一部の場合には、編集構築物の第１のプールは、２つまたはそれより多くの異なる線状断片をさらに含む。一部の場合には、編集構築物の第１のプールは、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドを含む。一部の場合には、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、修復断片は、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、ｇＲＮＡおよび修復断片は、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡは、同じ編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するための修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡは、２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するための修復断片は、２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡおよび修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、全ての遺伝子座を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡおよび修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の線状断片上に存在する。一部の場合には、修復断片は、１つまたは複数の線状断片上に存在する。一部の場合には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つまたは複数の線状断片上にコードされる。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる線状断片は、異なる修復断片を含む。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる線状断片は、異なるｇＲＮＡを含む。一部の場合には、線状断片は、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡとして提供される。一部の場合には、線状断片は、末端改変を有する。一部の場合には、末端改変は、線状断片の５’および／または３’末端に適用される。一部の場合、この場合の改変は、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核酸塩基からなる群から選択されるが、これらに限定されない。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドは、１つの異なる修復断片または複数の異なる修復断片を含む。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドは、１つの異なるｇＲＮＡまたは複数の異なるｇＲＮＡを含む。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドは、１つの異なる修復断片および１つの異なるｇＲＮＡ、または複数の異なる修復断片および複数の異なるｇＲＮＡを含む。一部の場合には、異なる編集構築物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、ゲノム編集を有さない個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、１つのゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、ゲノム編集を有さない個々の細胞、１つのゲノム編集を有する個々の細胞、および複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む。一部の場合には、方法は、追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドは、ｄ．ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；ｅ．１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールを、ステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集構築物の追加のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールを導入するステップであって、編集構築物の追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；およびｇ．ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドは、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプールからの選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、抗生物質対抗選択、化学的対抗選択、または温度に基づく対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、各々の修復断片は、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している複数の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、ステップ（ｂ）または（ｆ）で導入されるｇＲＮＡは、標的遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、ステップ（ｆ）で導入されるｇＲＮＡは、前の編集ラウンドで標的にされたいずれの遺伝子座（単数または複数）とも異なる遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片は、異なる標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは異なる標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、ステップ（ｆ）で導入されるｇＲＮＡは、前の編集ラウンドで標的にされた同じ遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の異なる編集構築物を導入することを含み、異なる編集構築物は、前の編集ラウンドで導入されたｇＲＮＡおよび／または修復断片とは異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含み、それによって、

微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、１つまたは複数の異なる編集構築物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なる遺伝子座と相補的な配列を含む異なるｇＲＮＡを含み、異なる遺伝子座（単数または複数）は、いずれの前に標的にされた遺伝子座（単数または複数）とも異なる。一部の場合には、１つまたは複数の異なる編集構築物は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む異なる修復断片を含む。一部の場合には、方法は、ステップ（ｃ）で選択されたコロニーの遺伝子型を判定するステップをさらに含む。一部の場合には、方法は、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地で増殖した微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含む。一部の場合には、１）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない、または２）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、編集プラスミドの第１のおよび追加のプール内の各々の編集プラスミドは、微生物宿主細胞と前に組み合わせられた編集プラスミドの他のまたは追加のプール各々の中の各々の編集プラスミドと比較して、同一の複製起点または同じクラスの複製起点を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む。一部の場合には、編集プラスミドの第１のまたは追加のプールは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の異なる編集プラスミドを含む。一部の場合には、編集プラスミドの第１のまたは追加のプール内の各々の編集プラスミドは、同じ選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、選択マーカー遺伝子は、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する。一部の場合には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１、またはこれらのホモログ、オルソログもしくはパラログから選択される。一部の場合には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、プラスミド上にコードされるか、ゲノム内にコードされるか、ＲＮＡから翻訳されるか、または細胞にタンパク質として導入される。一部の場合には、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一部の場合には、ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。一部の場合には、遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の場合には、追加の１または複数ラウンドの編集で導入される修復断片は、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含み、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う。一部の場合には、追加の１または複数ラウンドの編集で導入されるｇＲＮＡは、異なる遺伝子座（単数または複数）を標的にし、前の編集ラウンドとは異なる抗生物質選択マーカー遺伝子を伴う。一部の場合には、方法は、ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）は、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終ｇＲＮＡおよび最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、最終ｇＲＮＡは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、最終遺伝子座（単数または複数）は、微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むか、または微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含み、最終修復断片は、最終遺伝子座（単数または複数）内の１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列は、相同アーム間にあり、相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、最終プラスミド、最終ｇＲＮＡおよび／または最終修復断片は、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を伴う。一部の場合には、方法は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡを導入するステップをさらに含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、１つまたは複数の異種組換え系からのタンパク質のセットを含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、ラムダレッド組換え系、ＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質のセット；ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せを含む。一部の場合には、ラムダレッド組換え系からのタンパク質のセットは、ベータタンパク質、ｇａｍタンパク質およびｅｘｏタンパク質を含む。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、ステップ（ａ）の前に異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて微生物宿主細胞に導入される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子の微生物宿主細胞のゲノムへの組込みに起因して、微生物宿主細胞により安定的に発現される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、構成的に発現される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、必要に応じて、異種組換え系遺伝子は、オペロン内に存在する。一部の場合には、誘導性プロモーターは、試薬の添加、代謝物もしくは試薬の枯渇により、または温度の変化により誘導可能である。一部の場合には、試薬は、アラビノース、イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびテトラサイクリンからなる群から選択される。一部の場合には、微生物宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。一部の場合には、導入するステップは、微生物宿主細胞を形質転換することを含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、真核細胞である。一部の場合には、微生物宿主細胞は、酵母細胞である。一部の場合には、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の場合には、微生物宿主細胞は、糸状真菌である。一部の場合には、糸状真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである。一部の場合には、微生物宿主細胞は、原核細胞である。一部の場合には、原核生物宿主細胞は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。

さらに別の態様では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、ａ．）微生物宿主細胞の基礎集団を、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールと組み合わせるステップであって、編集構築物の第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の第１のプールが、ｉ．同じ標的遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；ｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している同じ１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；またはｉｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；ｂ．）ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールとを導入するステップであって、編集構築物の第１のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；およびｃ．）ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法が、本明細書で提供される。一部の場合には、方法は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｄ）をさらに含む。一部の場合には、異なる編集構築物を個々の微生物宿主細胞の亜集団に導入し、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、少なくとも２つの異なる修復断片は、同じプラスミド上に存在する。一部の場合には、少なくとも２つの異なる修復断片は、異なるプラスミド上に存在する。一部の場合には、編集構築物の第１のプールは、１つまたは複数の線状断片をさらに含む。一部の場合には、編集構築物の第１のプールは、２つまたはそれより多くの異なる線状断片をさらに含む。一部の場合には、編集構築物の第１のプールは、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドを含む。一部の場合には、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、修復断片は、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つまたは複数の編集プラスミド上にコードされる。一部の場合には、ｇＲＮＡおよび修復断片は、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、各々の編集を生じさせるために必要なＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡおよび修復断片の配列は、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡは、同じ編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するための修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡは、２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するための修復断片は、２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡおよび修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、全ての遺伝子座を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡおよび修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在する。一部の場合には、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の線状断片上に存在する。一部の場合には、修復断片は、１つまたは複数の線状断片上に存在する。一部の場合には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つまたは複数の線状断片上にコードされる。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる線状断片は、異なる修復断片を含む。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる線状断片は、異なるｇＲＮＡを含む。一部の場合には、線状断片は、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡとして提供される。一部の場合には、線状断片は、末端改変を有する。一部の場合には、末端改変は、線状断片の５’および／または３’末端に適用される。一部の場合、この場合の改変は、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核酸塩基からなる群から選択されるが、これらに限定されない。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドは、１つの異なる修復断片または複数の異なる修復断片を含む。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドは、１つの異なるｇＲＮＡまたは複数の異なるｇＲＮＡを含む。一部の場合には、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドは、１つの異なる修復断片および１つの異なるｇＲＮＡ、または複数の異なる修復断片および複数の異なるｇＲＮＡを含む。一部の場合には、異なる編集構築物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、ゲノム編集を有さない個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、１つのゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、ゲノム編集を有さない個々の細胞、１つのゲノム編集を有する個々の細胞、および複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む。一部の場合には、方法は、追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドは、ｄ．ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；ｅ．１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールを、ステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集構築物の追加のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の追加プールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールとを導入するステップであって、編集構築物の追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；およびｄ．ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドは、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプールからの選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、抗生物質対抗選択、化学的対抗選択、または温度に基づく対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、各々の修復断片は、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している複数の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、ステップ（ｂ）または（ｆ）で導入されるｇＲＮＡは、標的遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、ステップ（ｆ）で導入されるｇＲＮＡは、前の編集ラウンドで標的にされたいずれの遺伝子座（単数または複数）とも異なる遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片は、異なる遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは異なる遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、ステップ（ｆ）で導入されるｇＲＮＡは、前の編集ラウンドで標的にされた同じ遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む。一部の場合には、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の異なる編集構築物を導入することを含み、異なる編集構築物は、前の編集ラウンドで導入されたｇＲＮＡおよび／または修復断片とは異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含み、それによって、微生物

宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一部の場合には、１つまたは複数の異なる編集構築物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なる遺伝子座と相補的な配列を含む異なるｇＲＮＡを含み、異なる遺伝子座（単数または複数）は、いずれの前に標的にされた遺伝子座（単数または複数）とも異なる。一部の場合には、１つまたは複数の異なる編集構築物は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む異なる修復断片を含む。一部の場合には、＿＿は、ステップ（ｃ）で選択されたコロニーの遺伝子型を判定するステップをさらに含む。一部の場合には、方法は、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地で増殖した微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含む。一部の場合には、１）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない、または２）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。一部の場合には、編集プラスミドの第１のおよび追加のプール内の各々の編集プラスミドは、微生物宿主細胞と前に組み合わせられた編集プラスミドの他のまたは追加のプール各々の中の各々の編集プラスミドと比較して、同一の複製起点または同じクラスの複製起点を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一部の場合には、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む。一部の場合には、編集プラスミドの第１のまたは追加のプールは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の異なる編集プラスミドを含む。一部の場合には、編集プラスミドの第１のまたは追加のプール内の各々の編集プラスミドは、同じ選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、選択マーカー遺伝子は、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子を含む。一部の場合には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する。一部の場合には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１、またはこれらのホモログ、オルソログもしくはパラログから選択される。一部の場合には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、プラスミド上にコードされるか、ゲノム内にコードされるか、ＲＮＡから翻訳されるか、または細胞にタンパク質として導入される。一部の場合には、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一部の場合には、ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。一部の場合には、遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の場合には、追加の１または複数ラウンドの編集で導入される修復断片は、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含み、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う。一部の場合には、追加の１または複数ラウンドの編集で導入されるｇＲＮＡは、異なる遺伝子座（単数または複数）を標的にし、前の編集ラウンドとは異なる抗生物質選択マーカー遺伝子を伴う。一部の場合には、方法は、ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）は、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終ｇＲＮＡおよび最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、最終ｇＲＮＡは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、最終遺伝子座（単数または複数）は、微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座を含むか、または微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座を含み、最終修復断片は、最終遺伝子座（単数または複数）内の１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列は、相同アーム間にあり、相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、最終プラスミド、最終ｇＲＮＡおよび／または最終修復断片は、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を伴う。一部の場合には、方法は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡを導入するステップをさらに含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、１つまたは複数の異種組換え系からのタンパク質のセットを含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、ラムダレッド組換え系、ＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質のセット；ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せを含む。一部の場合には、ラムダレッド組換え系からのタンパク質のセットは、ベータタンパク質、ｇａｍタンパク質およびｅｘｏタンパク質を含む。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、ステップ（ａ）の前に異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて微生物宿主細胞に導入される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子の微生物宿主細胞のゲノムへの組込みに起因して、微生物宿主細胞により安定的に発現される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、構成的に発現される。一部の場合には、異種組換え系からのタンパク質のセットは、誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、必要に応じて、異種組換え系遺伝子は、オペロン内に存在する。一部の場合には、誘導性プロモーターは、試薬の添加、代謝物もしくは試薬の枯渇により、または温度の変化により誘導可能である。一部の場合には、試薬は、アラビノース、イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびテトラサイクリンからなる群から選択される。一部の場合には、導入するステップは、微生物宿主細胞を形質転換することを含む。一部の場合には、微生物宿主細胞は、真核細胞である。一部の場合には、微生物宿主細胞は、酵母細胞である。一部の場合には、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の場合には、微生物宿主細胞は、糸状真菌である。一部の場合には、糸状真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである。一部の場合には、微生物宿主細胞は、原核細胞である。一部の場合には、原核生物宿主細胞は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。

図１は、本明細書で提供され、実施例１で詳述されるような、反復ゲノム編集の実施形態についてのワークフロー概略図を描示する。

図２は、形質転換の関数としての選択可能なマーカーの喪失を説明する。

図３は、反復編集形質転換の編集効率を例証する。形質転換１（すなわち、１＿ｃａｄＡ）によってＷ３１１０（４６の複製をスクリーニングした）において１８％編集効率が得られた。形質転換２（２＿ｍａｅＡ）によってＷ３１１０（６の複製をスクリーニングした）において１００％編集効率が得られた。形質転換３（３＿ｍａｅＢ）によってＷ３１１０（１６の複製をスクリーニングした）において７５％編集効率が得られた。^＊ｃａｄＡ欠失は、潜在的に毒性であると考えられ、それ故、より低い編集効率に至る（このことが様々な条件での複数の実験で観察された）。

図４は、反復スタッキングのラウンド３の後のＥ．ｃｏｌｉコロニーについてスクリーニングするコロニーＰＣＲ反応を例証する。野生型バンドサイズは、形質転換編集１および２について灰色で重ねられている。上のパネル－ｃａｄＡ：ＷＴ＝１８２６ｂｐ、ｃａｄＡ欠失＝９３３ｂｐ、中央パネル－ｍａｅＡ：ＷＴ＝２２５６ｂｐ、ｍａｅＡ欠失＝８８１ｂｐ、下のパネル－ｍａｅＢ：ＷＴ＝２５９０ｂｐ、ｍａｅＢ欠失＝１０４７ｂｐ。

図５Ａ～５Ｄは、すでに存在するプラスミドを第２のプラスミドについての形質転換および選択によって株から排除する例を説明する。図５Ａは、抗生物質耐性マーカー（ａｂＲ１）を有するプラスミドを含有する細胞が、同じ複製起点（丸）と異なる抗生物質選択マーカー（ａｂＲ２）とを有する第２のプラスミドで形質転換されることを示す。図５Ｂは、第２のプラスミドを含有する形質転換体についての選択が、第２のマーカーについての抗生物質を含有する培地への播種により行なわれ、その結果、両方のプラスミドを含有する細胞が得られることを示す。図５Ｃは、第２のプラスミドについての選択下での増殖により、第１のプラスミドが喪失する結果となることを示す。図５Ｄは、必要に応じた最終ステップが、プラスミドのない最終株を得るために、能動的対抗選択によるかまたは抗生物質選択からの解放によるかのどちらかによる第２のプラスミドの喪失を含むことを示す。

図６は、プール型ＣＲＩＳＰＲ編集に供されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体のコロニーＰＣＲスクリーニングの結果を描示する。

図７は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に導入されたｓｇＲＮＡ／修復プラスミドプールの組成を説明する。

図８は、図７で説明されたｓｇＲＮＡ／修復プラスミドプールで形質転換されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ形質転換体の組成を説明する。

図９は、本明細書で提供され、実施例６で詳述されるような、反復およびプール型反復ＣＲＩＳＰＲゲノム編集の実施形態についてのワークフロー概略図を描示する。

図１０Ａ～１０Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９相同組換え修復を使用するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるプールされたゲノム編集を説明する。図１０Ａは、Ｃａｓ９発現遺伝子と抗生物質（すなわち、ノーセオトリシン）耐性マーカー遺伝子とをコードするプラスミド骨格、Ｃａｓ９発現プラスミドへの組込みのための相同性を有するｓｇＲＮＡ発現カセット、およびｓｇＲＮＡの標的にされるゲノム遺伝子座についての複数の編集ペイロードという、三（３）クラスの線状ＤＮＡ分子を導入することにより行なわれる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介形質転換を描示する。図１０Ｂは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノム内の六（６）つの遺伝子座のうちの１つを標的にするｓｇＲＮＡの標的にされる六（６）つの可能性のあるゲノム遺伝子座（すなわち、ＡＲＩ１遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨ６遺伝子、ＥＣＭ１３遺伝子、ＭＣＨ５遺伝子またはＰＲＢ１遺伝子）の各々に挿入するための３ペイロードのプールを導入する六（６）つの形質転換実験からの遺伝子型決定データを示す。各実験において、プールされたゲノム編集後に複数の遺伝子型が回収された。同上。

図１１Ａ～１１Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９相同組換え修復を使用するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける反復ゲノム編集を説明する。図１１Ａは、迅速な反復形質転換プロセスを描示する：標準的な形質転換プロセス後に抗生物質培地で形質転換体が選択される。コロニーがプールとして培養され、次いで、抗生物質マーカー２を含有する代替プラスミド骨格で２回目の形質転換が行われ、抗生物質２を含有する固形培地で形質転換体が選択される。このプロセスが抗生物質３を用いて反復されて、３つの編集を有する株が産生される。図１１Ｂは、次の３つの線状ＤＮＡ分子での形質転換により行なわれる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介形質転換を示す：Ｃａｓ９発現遺伝子と３つの抗生物質マーカーのうちの１つとをコードするプラスミド骨格；Ｃａｓ９発現プラスミドへの組込みのための相同性を有するｓｇＲＮＡ発現カセット；およびｓｇＲＮＡの標的にされるゲノム遺伝子座のための修復鋳型。図１１Ｃは、旧来の形質転換後に迅速に反復される形質転換により導入された２つのゲノム編集の遺伝子型決定からの結果を示す。遺伝子型決定された２８のコロニーのうちの１７．８％が、両方の反復編集を含有した。同上。

図１２Ａは、プールされたプラスミド反復スタッキング（ＰＰＩＳ）を実施するためのプロセスを説明し、図１２Ｂ～１２Ｃは、ＰＰＩＳ法でＣＲＩＳＰＲ媒介相同組換え修復を使用する４ラウンドにわたる１ラウンド当たり４つのユニークな編集（４ラウンドのうちの１ラウンドでは編集が行なわれず、可能性のある遺伝子型の数から除外された）の適用後にＥ．ｃｏｌｉにおいて可能性のある遺伝子型１２５のうちの１１、すなわち約９％が獲得されたことを示す。同上。同上。

図１３Ａは、プールされた親反復スタッキング（ＰＰＡＩＳ）を実施するためのプロセスを説明し、図１３Ｂ～１３Ｃは、ＰＰＡＩＳ法でＣＲＩＳＰＲ媒介相同組換え修復を使用する４ラウンドにわたる１ラウンド当たり４つのユニークな編集（４ラウンドのうちの１ラウンドでは編集が行なわれず、可能性のある遺伝子型の数から除外された）の適用後にＥ．ｃｏｌｉにおいて可能性のある遺伝子型１２５のうちの２６、すなわち約２１％が獲得されたことを示す。同上。同上。

図１４Ａは、受動的対抗選択での単一反復スタッキングのためのプロセスを説明する。図１４Ｂは、ラウンド３の形質転換後のカナマイシンに対する株の感受性を示す。図１４Ｃ～１４Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ媒介相同組換え修復を使用する４ラウンドにわたっての４つのユニークな編集（４ラウンドのうちの１ラウンドでは編集が行なわれず、可能性のある遺伝子型の数から除外された）の適用後にＥ．ｃｏｌｉにおいて可能性のある遺伝子型３２のうちの７、すなわち約２２％が獲得されたことを示す。同上。

図１５は、実施例７に記載の相同組換え（ＨＲ）により媒介されるプールされた株ビルド（ｓｔｒａｉｎｂｕｉｌｄ）に供されたＥ．ｃｏｌｉのＰＣＲスクリーニングおよび次世代シークエンシング（ＮＧＳ）の結果を描示する。

定義
以下の用語は、当業者により十分に理解されると考えられるが、以下の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために示される。

本明細書で使用される場合、用語「ａ」または「ａｎ」は、その実体の１つまたは複数を指すことができ、すなわち、複数の指示対象を指すことができる。しかるが故に、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つまたは複数」および「少なくとも１」は、本明細書では互換的に使用され得る。加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素（ａｎｅｌｅｍｅｎｔ）」への言及は、文脈上、要素のうちの１つおよび１つだけが存在することが明確に求められる場合を除き、要素のうちの１つより多くが存在する可能性を除外しない。

文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語およびその語尾変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、限定されない包括的な意味に、すなわち、「含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔｎｏｔｌｉｍｉｔｅｄｔｏ）」と、解釈されるものとする。

本明細書を通して「一実施形態（ｏｎｅｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「ある実施形態（ａｎｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれる可能性があることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な箇所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、全てが必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない可能性がある。明確にするために別々の実施形態の文脈で説明される本開示のある特定の特徴が単一の実施形態で組み合わせて提供されることもあることが理解される。逆に、簡略して表現するために単一の実施形態の文脈で説明される本開示の様々な特徴が、別々に提供されることもあり、または任意の好適な部分的組合せで提供されることもある。

本明細書で使用される場合、用語「細胞性生物」、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、広く解釈されたい。これらの用語は、互換的に使用され、細菌および古細菌という２つの原核生物ドメイン、ならびにある特定の真核性真菌および原生生物を、これらに限定されないが含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示中に存在するリスト／表および図の「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「細胞性生物」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」に言及する。この特徴描写は、本明細書で提供される同定された分類学上の属ばかりでなく、同定された分類学上の種、ならびに本明細書で提供される任意の生物の様々な新規のおよび新たに同定または設計された株も指すことができる。

本明細書で使用される場合、用語「原核生物」は、当技術分野において認知されており、核も他の細胞小器官も含有しない細胞を指す。原核生物は、一般に、細菌および古細菌という２つのドメインの一方に分類される。古細菌ドメインの生物と細菌ドメインの生物との決定的な相違は、１６ＳリボソームＲＮＡにおけるヌクレオチド塩基配列の根本的相違に基づく。

本明細書で使用される場合、用語「古細菌」は、典型的に、通常でない環境に見られ、リボソームタンパク質の数および細胞壁中のムラミン酸の欠如をはじめとするいくつかの基準により原核生物の残部と区別される、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物のカテゴリー分類を指す。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａという２つの系統発生学的に明確に異なる群からなる。それらの生理学に基づいて、古細菌は、メタン菌（メタンを産生する原核生物）、高度好塩菌（非常に高い塩（ＮａＣｌ）濃度で生存する原核生物）、および高度（超）好熱菌（非常に高温で生存する原核生物）という３つのタイプにまとめることができる。古細菌を細菌と区別する古細菌の統一特徴（すなわち、細胞壁にムレインなし、エステル連結された膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、それらをそれらの特定の生息場所に順応させる固有の構造的または生化学的特質を示す。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主としてなり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン菌および高度好塩菌を含む。

本明細書で使用される場合、「細菌」または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指すことができる。細菌は、次のような少なくとも１１の明確に異なる群を含む：（１）グラム陽性（グラム＋）菌［これには、（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）、（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）という、２つの主要な亜門がある］；（２）プロテオバクテリア、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性菌（最も「多く見られる」グラム陰性菌）；（３）シアノバクテリア、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータおよび近縁種；（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線耐性小球菌および近縁種；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ好熱菌。

本明細書で使用される場合、「真核生物」は、細胞が、膜内に封入された核および他の小器官を含有する、任意の生物である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。真核細胞を原核細胞（上述の細菌および古細菌）と区別する明確な特徴は、それらが、膜結合小器官を有すること、特に、遺伝物質を含有し、核膜により封入されている、核を有することである。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書では互換的に使用され、本明細書で提供される反復遺伝子編集方法により遺伝子改変された宿主細胞を指すことができる。したがって、これらの用語は、それが由来した天然に存在する生物と比較して遺伝子変更、改変または操作され、その結果、（例えば、遺伝子改変が微生物のコード核酸配列に影響を与えた場合に）変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型を示す、宿主細胞（例えば、細菌など）を含む。一部の実施形態では、この用語が問題の特定の組換え宿主細胞ばかりでなく、そのような宿主細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことは理解される。

本明細書で使用される場合、用語「野生型微生物」または「野生型宿主細胞」は、自然界に存在する細胞、すなわち、遺伝子改変されていない細胞を記述し得る。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子操作された」は、宿主細胞のゲノムに対する（例えば、核酸の挿入、欠失、変異または置換による）任意の操作を指すことができる。

本明細書で使用される場合、用語「対照」または「対照宿主細胞」は、遺伝子改変または実験的処置の効果を決定するための適切な比較宿主細胞を指すことができる。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を識別する遺伝子改変を除いて、遺伝子改変された宿主細胞と遺伝学的に同一である。一部の実施形態では、本開示は、対照宿主細胞としての親株の使用を教示する。他の実施形態では、宿主細胞は、処置宿主細胞において試験される特定のプロモーターまたはＳＮＰを欠いている、遺伝学的に同一の細胞であることもある。

本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子」は、その対立遺伝子の全てが少なくとも１つの形質または特性に関係する、遺伝子の１つまたは複数の代替形態のいずれかを意味することができる。二倍体細胞では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子が、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数の遺伝子座（ｌｏｃｉ））は、天然ゲノム配列に対する編集が所望される任意の部位を意味することができる。一実施形態では、前記用語は、例えば遺伝子または遺伝子マーカーが見出される、染色体上の特定の位置（単数もしくは複数）または部位を意味することができる。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に連鎖している」は、育種中に高い率で共遺伝され、したがって、交雑によって分離することが困難である、２つまたはそれより多くの形質を指すことができる。

「組換え」または「組換え事象」は、本明細書で使用される場合、染色体交差または独立遺伝を指すことができる。

本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、個体の遺伝子構造（すなわち、遺伝子型）と環境との相互作用の結果として生じる、個々の細胞、細胞培養物、生物、または生物群の観察可能な特性を指すことができる。

本明細書で使用される場合、核酸配列またはタンパク質配列を記述するときの用語「キメラ（の）」または「組換え型（の）」は、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドもしくは２つの異種ポリペプチドを連結させて単一の高分子にする、または少なくとも１つの天然核酸もしくはタンパク質配列の１つもしくは複数のエレメントを再配列する、核酸またはタンパク質配列を指すことができる。例えば、用語「組換え型（の）」は、例えば、化学合成によって、または核酸の単離されたセグメントの遺伝子操作技法による操作によって、配列のそうしなければ分離されている２つのセグメントを人工的に組み合わせたものを指すことができる。

本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、自然界に存在することが知られていない、または天然に存在しない、ヌクレオチド配列である。一般に、そのような合成ヌクレオチド配列は、任意の他の天然に存在するヌクレオチド配列と比較されたとき、少なくとも１つのヌクレオチドの相違を含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのどちらかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、またはそれらのアナログを指すことができる。この用語は、分子の一次構造を指すことができ、したがって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。この用語は、改変された核酸、例えば、メチル化されたおよび／またはキャップされた核酸、改変塩基、骨格改変およびこれらに類するものを含有する核酸も含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指すことができる。したがって、遺伝子は、それらの発現に必要とされるコード配列および／または調節配列を、これらに限定されないが含むことができる。遺伝子は、例えば、他のタンパク質についての認識配列を形成する、発現されないＤＮＡセグメントも含むことができる。遺伝子は、目的の供給源からクローニングすることまたは既知もしくは予測配列情報から合成することを含めて、様々な供給源から得ることができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「相同（の）」または「ホモログ」または「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」または「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」は、当技術分野において公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有する類縁配列を指すことができ、この類縁配列は、配列同一性の程度に基づいて決定される。

用語「相同性」、「相同（の）」、「実質的に同様の」および「実質的に相当する」は、本明細書では互換的に使用され得る。前記用語は、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介するまたはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響を与えない、核酸断片を指すことができる。これらの用語は、結果として生じる核酸断片の機能特性を最初の非改変断片と比較して大幅に変更しない、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの、本開示の核酸断片の改変も指すことができる。したがって、当業者には理解されるように、本開示は特定の例示的配列を超えるものを包含すると解釈される。これらの用語は、ある種、亜種、品種、栽培品種または株において見出される遺伝子と、別の種、亜種、品種、栽培品種または株における対応するまたは同等の遺伝子との関係を記述する。本開示の目的のために、相同配列が比較される。

「相同配列」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的に関連すると考えられる、信じられている、または機能的に関連することが公知である。機能的関連は、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能を含むがこれらに限定されない、いくつかの方法のうちのいずれか１つで示すことができる。好ましくは、（ａ）と（ｂ）の両方が示される。アミノ酸または核酸配列間の配列相同性は、共通の祖先によって定義することができる。核酸の２つのセグメントは、種分化事象（オルソログ）または複製事象（パラログ）のどちらかのために共通の祖先を有することがある。アミノ酸または核酸配列間の相同性は、それらの配列類似性から推測することができ、したがって、アミノ酸または核酸配列は、前記アミノ酸または核酸配列が有意な類似性を共有する場合、相同であると言われる。有意な類似性は、２配列が共通祖先からの分岐進化によって関連することの強力な証拠であり得る。複数配列のアラインメントを使用して、相同領域を発見することができる。相同性は、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ７．７１８，Ｔａｂｌｅ７．７１で論じられているものなどの、当技術分野において容易に利用可能なソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。一部のアラインメントプログラムは、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＬｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮＰｌｕｓ（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄＥｄｕｃａｔｉｏｎａｌＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）およびＡｌｉｇｎＸ（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。

本明細書で使用される場合、用語「内在性」または「内在性遺伝子」は、それが宿主細胞ゲノム内に自然に見られる位置に、天然に存在する遺伝子を指すことができる。本開示に関して、内在性遺伝子に異種プロモーターを作動可能に連結させることは、既存の遺伝子が自然に存在する位置において、その遺伝子の前に異種プロモーター配列を遺伝的に挿入することを意味する。本明細書に記載の内在性遺伝子は、本開示の方法のいずれかに従って変異した天然に存在する遺伝子の対立遺伝子を含むことができる。

本明細書で使用される場合、用語「外来性」は、用語「異種」と互換的に使用され得、その天然供給源以外の何らかの供給源に由来する物質を指す。例えば、用語「外来性タンパク質」または「外来性遺伝子」は、非天然供給源または非天然位置からのタンパク質または遺伝子であって、生物システムに人工的に供給されたタンパク質または遺伝子を指す。

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、例えば、当技術分野において十分理解されているようなヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を指す。例えば、変異は、サイレント置換、付加または欠失を生じさせる変更を含み得るが、コードされたタンパク質の特性も活性も変更せず、タンパク質が作製される方法も変更しない。あるいは、変異は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更し得る、そしてタンパク質の特性または活性を変更する結果となり得る、非同義置換または変化であることもある。

本明細書で使用される場合、用語「タンパク質改変」は、例えば、当技術分野において十分に理解されているようなアミノ酸置換、アミノ酸改変、欠失および／または挿入を指すことができる。

本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部分」または「断片」という用語は、そのような配列の最小サイズ特性を有する部分を意味することもあり、または完全長分子を含むそれ以下の、完全長分子の任意のより大きい断片を意味することもある。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードし得る。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、本明細書に記載されるように、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１つについての一部分を単離することおよび活性を評価することによって、調製することができる。同様に、ポリペプチドの一部分は、最大で完全長ポリペプチドに達する、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得る。使用される部分の長さは、特定の適用に依存することになる。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の一部分は、１２ヌクレオチドほどの長さしかないことがあり、一部の実施形態では、それは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの一部分は、４アミノ酸ほどの長さしかないことがある。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの一部分は、一般に、４アミノ酸より長いであろう。

バリアントポリヌクレオチドは、変異誘発および組換え誘導手順、例えばＤＮＡシャフリング、によって得られる配列も包含することができる。そのようなＤＮＡシャフリングのための戦略は、当技術分野において公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）ＰＮＡＳ９１：１０７４７－１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９－３９１；Ｃｒａｍｅｒｉｅｔａｌ．（１９９７）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６－４３８；Ｍｏｏｒｅｅｔａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６－３４７；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．（１９９７）ＰＮＡＳ９４：４５０４－４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉｅｔａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１：２８８－２９１；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照されたい。

本明細書で開示されるＰＣＲ増幅のために、目的の任意の生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからの対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計するための方法およびＰＣＲクローニングのための方法は、当技術分野において一般に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３^ｒｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）において開示されている。Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）；ＩｎｎｉｓａｎｄＧｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓａｎｄＧｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＭａｎｕａｌ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）も参照されたい。公知のＰＣＲ法としては、対合プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマーを使用する方法、１つより多くのＤＮＡセグメントを同時に増幅するために対合プライマーの複数のセットを使用するマルチプレックス法、およびこれらに類する方法が挙げられるが、それらに限定されない。

用語「プライマー」は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡポリメラーゼを結合させる増幅標的にアニールすることができ、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれたとき、すなわち、ヌクレオチドおよび重合用の薬剤（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の存在下、好適な温度およびｐＨで、ＤＮＡ合成の開始点としての役割を果たすことができる、オリゴヌクレオチドを指すことができる。（増幅）プライマーは、増幅の最大効率のために一本鎖状であることがある。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることもある。プライマーは、重合用の薬剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含量）をはじめとする多くの因子に依存することになる。一対の二方向プライマーは、ＤＮＡ増幅の技術分野で、例えばＰＣＲ増幅で、一般に使用されるような、１つのフォワードおよび１つのリバースプライマーからなる。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すことができる。一部の実施形態では、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であることができ、プロモーターの生得的なエレメントであることもあり、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであることもある。プロモーターは、それらの全体が天然の遺伝子に由来することもあり、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されることもあり、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含むこともある。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることは、当業者には理解される。例えば、プロモーターを使用して、構成的である形でまたは内因性もしくは外因性刺激に応答する形で遺伝子の発現レベルを変化させることができる。多くの場合、調節配列の正確な境界は完全に定義されていないので、一部の変形形態のＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有することもあると、さらに認識される。

本明細書で使用される場合、句「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書では互換的に使用され得る。組換え構築物は、核酸断片の人工的組合せ、例えば、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含むことができる。例えば、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むこともあり、または同じ供給源に由来するが自然界で見られるものとは異なる形で配列されている調節配列およびコード配列を含むこともある。そのような構築物は、それだけで使用されることもあり、またはベクターとともに使用されることもある。ベクターが使用される場合には、ベクターの選択は、当業者には周知であるように、宿主細胞を形質転換させるために使用されることになる方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞をうまく形質転換させる、選択するおよび増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントを十分承知している。異なる独立した形質転換事象が、異なる発現レベルおよびパターンをもたらすことになること（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：２４１１－２４１８：ＤｅＡｌｍｅｉｄａｅｔａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２１８：７８－８６）、したがって、所望の発現レベルおよびパターンを提示する系統を得るために複数の事象をスクリーニングしなければならないことも、当業者には分かるであろう。そのようなスクリーニングは、数ある中でも特に、直接シークエンシング、ＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析、タンパク質発現の免疫ブロット解析、または表現型分析によって遂行され得る。ベクターは、自律複製する、または宿主細胞の染色体に組み込むことができる、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体およびこれらに類するものであることがある。ベクターは、自律複製性でない、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡとＲＮＡの両方で構成されているポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲート型ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲート型ＤＮＡもしくはＲＮＡ、リポソームコンジュゲート型ＤＮＡ、またはこれらに類するものであることもある。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。

「作動可能に連結された」または「機能的に連結された」は、本開示による任意の機能的遺伝子エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、デグロン、溶解性タグなど）とさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの逐次的な配置を意味することができる。一部の場合には、逐次的な配置は、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらすことができる。一部の場合には、逐次的な配置は、前記さらなるポリヌクレオチドの翻訳をもたらすことができる。機能的遺伝子エレメントは、さらなるオリゴまたはポリヌクレオチドの上流に存在することもあり、または下流に存在することもある。一例では、「作動可能に連結された」または「機能的に連結された」は、プロモーターが、前記プロモーターに近接しているまたはその下流もしくは３’側にある遺伝子の転写を制御することを意味することがある。別の例では、「作動可能に連結された」または「機能的に連結された」は、ターミネーターが、前記ターミネーターに近接しているまたはその上流もしくは５’側にある遺伝子の転写の終結を制御することを意味することがある。

用語「目的の産物」または「生体分子」は、本明細書で使用される場合、供給原料からの微生物により産生される任意の産物を指すことができる。一部の場合には、目的の産物は、小分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝物であり得る。一次代謝物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタミン酸塩、リシン、トレオニン、トリプトファンおよび他のアミノ酸、ビタミン、多糖類などであり得る。二次代謝物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制薬、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物または生体分子はまた、微生物により産生される任意の細胞内成分、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、およびその他諸々を含む微生物酵素であり得る。細胞内成分としては、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども挙げることができる。

本明細書で使用される場合、用語「ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー」または「ライブラリー」は、本開示による遺伝子摂動の収集物を指すことができる。一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、ｉ）データベースもしくは他のコンピュータファイル内の配列情報の収集物、ｉｉ）上述の一連の遺伝子エレメントを含む遺伝子構築物の収集物、またはｉｉｉ）前記遺伝子エレメントを含む宿主細胞株として顕在化し得る。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、個々のエレメントの収集物（例えば、ＰＲＯスワップライブラリーのためのプロモーターの収集物、ＳＴＯＰスワップライブラリーのためのターミネーターの収集物、ＳＯＬＵＢＩＬＩＴＹＴＡＧスワップライブラリーのためのタンパク質溶解性タグの収集物、またはＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮＴＡＧスワップライブラリーのためのタンパク質分解タグの収集物）を指すことがある。他の実施形態では、本開示のライブラリーは、プロモーター：遺伝子、遺伝子：ターミネーターまたはさらにはプロモーター：遺伝子：ターミネーターの組合せなどの、遺伝子エレメントの組合せを指すこともある。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、プロモーター、ターミネーター、タンパク質溶解性タグおよび／またはタンパク質分解タグの組合せを指すこともある。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、宿主生物においてライブラリーの各メンバーを適用する効果に関連するメタデータをさらに含む。例えば、ライブラリーは、本明細書で使用される場合、プロモーター：：遺伝子配列の組合せの収集物を、特定の種における１つまたは複数の表現型に対するこれらの組合せによって得られる効果とともに含むことができ、したがって、将来のプロモータースワップにおける前記組合せの使用の将来の予測値を向上させることができる。

本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＰ」は、核内低分子多型を指す。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰは、広く解釈されるべきであり、一塩基多型、配列挿入、欠失、反転、および他の配列置換を含む。本明細書で使用される場合、用語「非同義」または「非同義ＳＮＰ」は、宿主細胞タンパク質のコード変化につながる突然変異を指すことができる。

ゲノム操作の「ハイスループット（ＨＴＰ）」方法は、多数の実験または条件を評価することを可能にする少なくとも１台の機器、例えば、前記方法の少なくとも１ステップを実行するための自動化機器（例えば、液体ハンドラーまたはプレートハンドラー機）の利用を含み得る。

用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドを包含することができ、任意の長さの核酸を指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであることもあり、またはＲＮＡであることもある。ポリヌクレオチドは、別段の規定がない限り、一本鎖（ｓｓ）のものであってもよく、または二本鎖（ｄｓ）のものであってもよい。ポリヌクレオチドは、合成のものであること、例えば、ＤＮＡ合成装置で合成されることもあり、または天然に存在すること、例えば、天然供給源から抽出されることもあり、またはクローニングもしくは増幅された材料から誘導されることもある。本明細書で言及されるポリヌクレオチドは、改変塩基またはヌクレオチドを含有することができる。

用語「プール」は、本明細書で使用される場合、少なくとも２ポリヌクレオチドの収集物を指すことができる。ポリヌクレオチドのプールは、複数の異なるポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、プール内のポリヌクレオチドのセットは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、または少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００もしくはそれより多くのポリヌクレオチドを含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「アセンブルすること」は、より長いポリヌクレオチドを作製するために２つまたはそれより多くの、４つまたはそれより多くの、６つまたはそれより多くの、８つまたはそれより多くの、１０またはそれより多くの、１２またはそれより多くの、１５またはそれより多くのポリヌクレオチド、例えば、４つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを別のものとつなぎ合わせる反応を指すことができる。

本明細書で使用される場合、用語「好適な反応条件下でインキュベートすること」は、反応を、所望の結果、すなわちポリヌクレオチドのアセンブリー、を達成するために好適な温度に、好適な時間、維持することを指すことができる。本方法で使用される酵素および試薬に好適な反応条件は、公知（例えば、本明細書中の実施例に記載の通り）であり、したがって、本方法に好適な反応条件を容易に決定することができる。これらの反応条件は、使用される酵素に依存して（例えば、それらの最適な温度などに依存して）変わり得る。

本明細書で使用される場合、用語「つなぎ合わせること」は、２配列間の共有結合性連結の生成を指すことができる。

本明細書で使用される場合、用語「組成物」は、列挙されているものに加えて他の試薬、例えば、グリセロール、塩、ｄＮＴＰなどを含有し得る、試薬の組合せを指すことができる。組成物は、任意の形態、例えば、水性形態または凍結乾燥形態であり得、任意の状態（例えば、凍結または液体形態）であり得る。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、操作されたベクターが宿主細胞において複製され得るように断片またはＤＮＡアセンブリーを組み込むことができる好適なＤＮＡである。線状化ベクターは、環状ベクターの制限エンドヌクレアーゼ消化によりまたはＰＣＲにより作出することができる。断片および／または線状化ベクターの濃度は、ゲル電気泳動または他の手段により決定することができる。

本明細書で使用される場合、用語「インテグロン」は、可動遺伝子エレメント、または核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）に組み込まれた遺伝子エレメントであって、外来性遺伝子、Ｇｉｌｌｉｎｇｓ，ＭｉｃｈａｅｌＲ， ”Ｉｎｔｅｇｒｏｎｓ：Ｐａｓｔ，Ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄＦｕｔｕｒｅ” ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗ，Ｊｕｎｅ２０１４Ｖｏｌ．７８：２，ｐｐ．２５７－２７７（この内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなインテグロンインテグラーゼ（Ｉｎｔｌ）とインテグロン関連組換え部位（ａｔｔｌ）とインテグロン関連プロモーター（Ｐｃ）とをコードする遺伝子、を含む遺伝子カセットを構成するまたは含有する遺伝子エレメントを指すことができる。

大要
１つまたは複数の遺伝子改変微生物株の生成に使用するための組成物およびキットが本明細書で提供される。１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するために微生物宿主細胞のゲノムを編集するための方法も本明細書で提供される。方法は、微生物宿主細胞のゲノム内への複数の遺伝子編集のプール型方式での導入および／またはスタッキングに有用であり得る。そのゲノム内への複数の遺伝子編集の導入および／またはスタッキングを助長するために、微生物宿主細胞は、部位特異的制限酵素および／または１つもしくは複数の組換え系を含むことができ、複数の遺伝子編集からの各々の遺伝子編集は、微生物宿主細胞における核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）内に存在する遺伝子座と相同である配列をその５’および３’末端両方に含むことができる。本明細書で提供される方法は、修復またはドナー核酸、例えば、線状核酸断片（一本鎖状または二本鎖状）を用いて遺伝子編集を微生物宿主細胞に導入することを必要とし得る。本明細書に記載される編集方法を実際はプールすることができ、これは、微生物の集団において複数の異なる編集を生じさせるための成分が編集ラウンドごとに混合またはプールされることを意味する。ラウンドのうちの少なくとも１ラウンドが、機能的対抗選択（例えば、抗生物質対抗選択、化学的対抗選択、または温度対抗選択）の使用を必要としないような、１または複数ラウンドの編集（例えば、形質転換および選択）を、本明細書に記載される編集方法に利用することができる。一実施形態では、修復またはドナー核酸は、同じまたは別のプラスミド上に存在し、各々の編集ラウンドで導入され、先行するおよび／または後続のラウンドの形質転換および選択で導入されるプラスミド上に存在する選択可能なマーカー遺伝子とは異なる選択可能なマーカー遺伝子を含む。さらに、各々のラウンドの形質転換および選択で導入されるプラスミドは、この方法を通して導入される各々の他のプラスミドと同一である複製起点を含むことができる。あるラウンドの形質転換で導入されたプラスミドの微生物宿主細胞からのキュアリングまたは除去を、選択圧をかける試薬を含む培地で進行中のラウンドの対抗選択可能なマーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞を増殖させることによって、助長することができる。微生物宿主細胞のゲノムを反復的または非反復的に編集するための本明細書で提供される方法で使用するための組成物およびキットも、本明細書で提供される。遺伝子編集は、挿入（例えば、１つもしくは少数のヌクレオチドの小規模な挿入から複数の遺伝子の経路挿入に及ぶ）、欠失（例えば、１つもしくは少数のヌクレオチドの小規模な欠失から複数の遺伝子の経路欠失に及ぶ）、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。本明細書で提供される方法における各々のラウンドの形質転換は、微生物宿主細胞における遺伝子エレメント（例えば、ゲノムまたはプラスミド）内の単一の遺伝子座に単一の遺伝子編集を導入することができ、または微生物宿主細胞における遺伝子エレメント（例えば、ゲノムまたはプラスミド）によって複数の遺伝子座に複数の遺伝子編集を導入することができる。本明細書で提供される方法、組成物およびキットで使用するための微生物宿主細胞は、原核細胞であることもあり、または真核細胞であることもある。

一実施形態では、微生物宿主細胞ゲノムを編集するための方法であって、（ａ）第１の修復断片と選択マーカー遺伝子とを含む第１のプラスミドを微生物宿主細胞に導入するステップであって、第１の修復断片が、微生物宿主細胞のゲノム内の第１の遺伝子座内のまたは第１の遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列により隔てられた相同アームを含み、相同アームが、微生物宿主細胞のゲノム内の第１の遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含む、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；および（ｃ）ステップ（ｂ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含む方法が、本明細書で提供される。一実施形態では、編集方法は、微生物宿主細胞への遺伝子編集の単一ラウンドの導入を含む。一実施形態では、方法は、反復的であり、ステップ（ｄ）をさらに含み、このステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞においてステップ（ａ）～（ｃ）を追加の１または複数ラウンド反復することを含み、追加の１または複数ラウンドの各々は、追加の修復断片を含む追加のプラスミドを導入することを含み、追加の修復断片は、微生物宿主細胞のゲノム内の遺伝子座内のまたは遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列により隔てられた相同アームを含み、相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含み、追加のプラスミドは、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含み、それによって微生物宿主細胞ゲノムを反復的に編集する。追加の１または複数ラウンドは、微生物宿主細胞に遺伝子編集を導入するステップの少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ラウンドであり得る。一実施形態では、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、１つおきの編集ラウンド後にしか行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、最終編集ラウンド後にしか行われない。対抗選択は、微生物宿主細胞による抗生物質対抗選択可能なマーカー遺伝子、化学的対抗選択可能なマーカー遺伝子または温度感受性対抗選択可能なマーカー遺伝子の発現によるものであり得る。選択マーカー遺伝子は、例えば、本明細書で提供される抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子などの、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座は、第１の遺伝子座であることもあり、または第１の遺伝子座とは別のもしくは異なる遺伝子座であることもある。追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座は、この反復方法の別のラウンドからの遺伝子座と同じ遺伝子座であることもある。追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座は、この反復方法の別のラウンドからの遺伝子座のような別のまたは異なる遺伝子座であることもある。

一実施形態では、各々の修復断片（すなわち、第１のおよび／または追加の修復断片）は、前の修復断片からの遺伝子編集の１つまたは複数と同じ遺伝子編集の配列を含むことができる。したがって、同じ遺伝子編集の配列を、方法の各々のラウンド（第１のおよび／または追加のラウンド）において各々の遺伝子座に導入することができる。一実施形態では、各々の修復断片（すなわち、第１のおよび／または追加の修復断片）は、前の修復断片からの遺伝子編集の１つまたは複数のような異なる遺伝子編集の配列を含むことができる。したがって、異なる遺伝子編集の配列を、方法の各々のラウンド（第１のおよび／または追加のラウンド）において各々の遺伝子座に導入することができる。一実施形態では、複数の異なる第１の修復断片が導入される。複数の異なる第１の修復断片は、異なる遺伝子座内のまたは異なる遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列を含むことができる。一実施形態では、複数の異なる追加の修復断片が導入される。複数の追加の修復断片のうちの修復断片の各々は、異なる遺伝子座内のまたは異なる遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列を含むことができる。一実施形態では、方法の各々のラウンドにおいて各々の異なる遺伝子座に導入される遺伝子編集は、同じ遺伝子編集である。一実施形態では、方法の各々のラウンドにおいて各々の異なる遺伝子座に導入される遺伝子編集は、異なる遺伝子編集である。遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。

一実施形態では、方法は、ステップ（ａ）～（ｃ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含むステップ（ｅ）をさらに含む。最終修復断片は、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座内のまたは最終遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列により隔てられた相同アームを、相同アームが、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含むように、含むことができる。最終遺伝子座は、前に編集されたいずれの遺伝子座とも異なる遺伝子座であり得る。最終プラスミドは、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を含むことができる。一実施形態では、対抗選択は、最終ラウンド後に行なわれる。一実施形態では、方法は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なまたは相同のガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意のそのようなエンドヌクレアーゼであり得る。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。

一実施形態では、微生物宿主細胞ゲノムを編集するための方法であって、（ａ）第１の修復断片と選択マーカー遺伝子とを含む第１のプラスミドを微生物宿主細胞に導入するステップであって、微生物宿主細胞が、部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする配列が、第１のプラスミドとともに微生物宿主細胞に導入され、部位特異的制限酵素が、微生物宿主細胞のゲノム内の第１の遺伝子座を標的にし（例えば、または第１の遺伝子座に結合し）、第１の修復断片が、第１の遺伝子座内のまたは第１の遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列により隔てられた相同アームを含み、相同アームが、微生物宿主細胞のゲノム内の第１の遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含む、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；および（ｃ）ステップ（ｂ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含むまたは必要とする方法が、本明細書で提供される。一実施形態では、編集方法は、微生物宿主細胞への遺伝子編集の配列の単一ラウンドの導入を含む。一実施形態では、方法は、反復的であり、ステップ（ｄ）をさらに含み、このステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞においてステップ（ａ）～（ｃ）を追加の１または複数ラウンド反復することを含みまたは必要とし、追加の１または複数ラウンドの各々は、追加の修復断片を含む追加のプラスミドを導入することを含み、追加の修復断片は、微生物宿主細胞のゲノム内の遺伝子座内のまたは遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列により隔てられた相同アームを含み、相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含み、追加のプラスミドは、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含み、微生物宿主細胞は、部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする配列が、微生物宿主細胞のゲノム内の第１の遺伝子座もしくは別の遺伝子座を標的にする追加のプラスミドとともに微生物宿主細胞に導入され、それによって微生物宿主細胞ゲノムを反復的に編集する。追加の１または複数ラウンドは、微生物宿主細胞に遺伝子編集を導入するステップの少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ラウンドであり得る。一実施形態では、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、１つおきの編集ラウンド後にしか行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、最終編集ラウンド後にしか行われない。対抗選択は、微生物宿主細胞による抗生物質対抗選択可能なマーカー遺伝子、化学的対抗選択可能なマーカー遺伝子または温度感受性対抗選択可能なマーカー遺伝子の発現によるものであり得る。選択マーカー遺伝子は、例えば、本明細書で提供される任意の抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子などの、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。一実施形態では、ステップ（ａ）の部位特異的酵素は、微生物宿主細胞のゲノム内の第１の遺伝子座にある配列を切断する。一実施形態では、ステップ（ｄ）の部位特異的制限酵素は、微生物宿主細胞のゲノム内の追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座にある配列を切断する。追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座は、第１の遺伝子座であることもあり、または第１の遺伝子座とは別のもしくは異なる遺伝子座であることもある。追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座は、この反復方法の別のラウンドからの遺伝子座と同じ遺伝子座であることもある。追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座は、この反復方法の別のラウンドからの遺伝子座のような別のまたは異なる遺伝子座であることもある。本明細書で提供される編集方法の各々のラウンド（例えば、第１のおよび／または追加のラウンド）で導入される遺伝子編集の配列を含む修復断片の各々は、微生物宿主細胞における部位特異的制限酵素の標的にされる遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含むことができる。編集方法の各々のラウンド（例えば、第１のおよび／または追加のラウンド）で導入される修復断片上に存在する遺伝子編集の各々は、微生物宿主細胞における部位特異的制限酵素の標的にされる遺伝子座と相同の配列と隣接していることもある。微生物宿主細胞における部位特異的制限酵素の標的にされる遺伝子座と相補的なまたは相同の配列は、修復断片または遺伝子編集の各々の５’および３’末端両方に存在することができ、このような配列を相同アームと呼ぶことができる。一実施形態では、各々の修復断片（すなわち、第１のおよび／または追加の修復断片）は、前の修復断片上に存在する遺伝子編集の１つまたは複数と同じ遺伝子編集の配列を含むことができる。したがって、同じ遺伝子編集の配列を、方法の各々のラウンド（第１のおよび／または追加のラウンド）において各々の遺伝子座に導入することができる。一実施形態では、各々の修復断片（すなわち、第１のおよび／または追加の修復断片）は、前の修復断片上に存在する遺伝子編集の１つまたは複数のような異なる遺伝子編集の配列を含むことができる。したがって、異なる遺伝子編集の配列を、方法の各々のラウンド（第１のおよび／または追加のラウンド）において各々の遺伝子座に導入することができる。一実施形態では、複数の異なる第１の修復断片が導入される。複数の異なる第１の修復断片は、異なる遺伝子座内のまたは異なる遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列を含むことができる。一実施形態では、複数の異なる追加の修復断片が導入される。複数の追加の修復断片は、異なる遺伝子座内のまたは異なる遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列を含むことができる。一実施形態では、方法の各々のラウンドにおいて各々の異なる遺伝子座に導入される遺伝子編集は、同じ遺伝子編集である。一実施形態では、方法の各々のラウンドにおいて各々の異なる遺伝子座に導入される遺伝子編集は、異なる遺伝子編集である。この実施形態に付け加えて、微生物宿主細胞における部位特異的制限酵素は、１つまたは複数の反復ラウンドにおいて各々の異なる遺伝子座にある配列を切断することができる。遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。

一実施形態では、方法は、ステップ（ａ）～（ｃ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含むステップ（ｅ）をさらに含む。最終修復断片は、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座内のまたは最終遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列を含むことができる。最終遺伝子座は、前に編集されたいずれの遺伝子座とも異なる遺伝子座であり得る。最終プラスミドは、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を含むことができる。微生物宿主細胞は、部位特異的制限酵素を含むことができ、または部位特異的制限酵素をコードする配列を、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座を標的にする最終プラスミドとともに微生物宿主細胞に導入することができる。最終修復断片は、最終遺伝子座または部位特異的制限酵素により切断される遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含む相同アームを含むことができる。一実施形態では、方法は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なまたは相同のガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意のそのようなエンドヌクレアーゼであり得る。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。

一実施形態では、上述の反復編集方法は、実際はプールされ、これは、微生物の集団において複数の編集を生じさせるための成分が編集ラウンドごとに混合またはプールされることを意味する。この実施形態に付け加えて、各々のラウンドまたは形質転換は、２つまたはそれより多くの修復断片を含むプールを付加させることを含むことができる。各々の修復断片は、２つまたはそれより多くの修復断片のうちの各々他の修復断片と異なる遺伝子座を標的にすることができる。各々の修復断片は、２つまたはそれより多くの修復断片のうちの各々の他の修復断片と異なる遺伝子編集の配列を含むことができる。上述の反復編集方法の各々のラウンドまたは形質転換は、ラウンドまたは形質転換ごとに少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の修復断片を含むプールを付加させることができる。本明細書で提供される場合、２つまたはそれより多くの修復断片の各々は、プラスミド上に存在することができ、このような修復断片を編集プラスミドと呼ぶことができる。２つまたはそれより多くの修復断片の各々は、同じプラスミド上に存在することもある。２つまたはそれより多くの修復断片の各々は、異なるプラスミド上に存在することもある。一実施形態では、各々のラウンドまたは形質転換で付加される２つまたはそれより多くの修復断片の各々は、本明細書で提供されるような２つまたはそれより多くの遺伝子編集の配列を含むことができる。異なるｇＲＮＡ／修復断片対は、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００の異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含むことができ、それによって、微生物宿主細胞の編集された集団において少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００の異なる遺伝子改変微生物株を生じさせることができる。修復断片上の遺伝子編集の各々の配列は、本明細書で提供されるような挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集または多重編集からなる群から選択することができる。

一実施形態では、相同組換えを排他的に利用する１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法が、本明細書で提供される。相同組換えは、前記１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するために使用される微生物宿主細胞に本来備わっていることもあり、または使用される微生物宿主細胞に対して異種であることもある。方法は、（ａ）微生物宿主細胞の基礎集団を編集プラスミドの第１のプールと組み合わせるステップであって、プール内の各々の編集プラスミドが、少なくとも１つの修復断片を含み、編集プラスミドのプールが、少なくとも２つの異なる修復断片を含み、プール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子をさらに含み、各々の修復断片が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含む、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドのプールからのプラスミドを導入するステップ；および（ｃ）ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含むことができ、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する。一実施形態では、ステップ（ｂ）は、異なる編集プラスミドを個々の微生物宿主細胞の亜集団に導入することを必要とし、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する。異なる編集プラスミドは、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の異なる修復断片を含むことができ、それによって、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の異なる遺伝子改変微生物株を生成することができる。少なくとも２つの異なる修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在することがある。少なくとも２つの異なる修復断片は、異なる編集ラスミド上に存在することもある。１つまたは複数の遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。選択マーカー遺伝子は、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。

一実施形態では、相同組換えを排他的に使用して１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための上述の方法は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｄ）をさらに含む。ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）で導入された編集プラスミドのプールからのプラスミドの排除を助長することができる。一実施形態では、方法は、ステップ（ｅ）をさらに含み、このステップ（ｅ）は、編集プラスミドの追加のプールをステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせることを含み、編集プラスミドの追加のプールは、少なくとも１つまたは２つの異なる修復断片を含み、各々の修復断片は、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含む相同アームを含み、各々の修復断片は、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列は、相同アーム間にある。一実施形態では、方法は、ステップ（ｆ）をさらに含み、このステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に編集プラスミドの追加のプールからのプラスミドを導入することを含む。一実施形態では、方法は、ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ（ｇ）をさらに含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する。

１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための上述の方法は、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプール内に存在する選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含むような、追加の１または複数ラウンドの編集でステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップを含む、反復プロセスであり得る。追加の１または複数ラウンドは、少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ラウンドであり得る。一実施形態では、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、１つおきの編集ラウンド後にしか行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、最終編集ラウンド後にしか行われない。対抗選択は、微生物宿主細胞による抗生物質対抗選択可能なマーカー遺伝子、化学的対抗選択可能なマーカー遺伝子または温度感受性対抗選択可能なマーカー遺伝子の発現によるものであり得る。追加の１または複数ラウンドの編集で導入される修復断片は、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含むことができ、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う。１つまたは複数の遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。

一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法は、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含む、ステップ（ｈ）をさらに含む。最終修復断片は、微生物宿主細胞の核酸（例えば、ゲノムまたはプラスミド）内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは最終遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含むことができる。１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列は、相同アーム間にあり、これらの相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含む。最終遺伝子座（単数または複数）は、前に編集されたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むこともあり、または前に編集されたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含むこともある。最終プラスミドは、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を含むことができる。一実施形態では、方法は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なまたは相同のガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意のそのようなエンドヌクレアーゼであり得る。

一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、（ａ）微生物宿主細胞の基礎集団を編集プラスミドの第１のプールと組み合わせるステップであって、プール内の各々の編集プラスミドが、少なくとも１つの修復断片を含み、編集プラスミドのプールが、少なくとも２つの異なる修復断片を含み、編集プラスミドのプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子をさらに含み、微生物宿主細胞が、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、編集プラスミドの第１のプールとともに微生物宿主細胞に導入され、１つまたは複数の部位特異的制限酵素各々が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座を標的にし、各々の修復断片が、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の標的にされる１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座内のまたは標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含む、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドのプールからのプラスミドを導入するステップ；および（ｃ）ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法が、本明細書で提供される。一実施形態では、ステップ（ｂ）は、異なる編集プラスミドを個々の微生物宿主細胞の亜集団に導入することを必要とし、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する。異なる編集プラスミドは、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の異なる修復断片を含むことができ、それによって、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の異なる遺伝子改変微生物株を生成することができる。少なくとも２つの異なる修復断片は、同じプラスミド上に存在することもあり、または異なるプラスミド上に存在することもある。一実施形態では、修復断片の各々は、部位特異的制限酵素の標的にされる遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含む。一実施形態では、１つもしくは複数の遺伝子編集の各々の配列、または修復断片の各々は、微生物宿主細胞内に存在するまたは微生物宿主細胞に導入された部位特異的制限酵素の標的にされる遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含む。微生物宿主細胞内に存在するまたは微生物宿主細胞に導入された部位特異的制限酵素の標的にされる遺伝子座と相補的なまたは相同の配列は、修復断片の各々または１つもしくは複数の遺伝子編集の各々の５’末端と３’末端の両方に存在することができ、このような配列を相同アームと呼ぶことができ、したがって、５’末端の相同アームを左相同アームと呼ぶことができ、その一方で、３’末端の相同アームを右相同アームと呼ぶことができる。一実施形態では、微生物宿主細胞内に存在するまたは微生物宿主細胞に導入された部位特異的制限酵素は、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する。１つまたは複数の遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。

一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｄ）をさらに含む。ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）で導入された編集プラスミドのプールからのプラスミドの排除を助長することができる。一実施形態では、方法は、ステップ（ｅ）をさらに含み、このステップ（ｅ）は、編集プラスミドの追加のプールをステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせることを含み、編集プラスミドの追加のプールは、少なくとも１つまたは２つの異なる修復断片を含み、微生物宿主細胞は、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つもしくは複数の標的遺伝子座を標的にする編集プラスミドの追加のプールとともに微生物宿主細胞に導入され、各々の修復断片は、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含む。一実施形態では、方法は、ステップ（ｆ）をさらに含み、このステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に編集プラスミドの追加のプールからのプラスミドを導入することを含む。一実施形態では、方法は、ステップ（ｇ）をさらに含み、このステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する。

部位特異的制限酵素を利用して１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための上述の方法は、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプール上に存在する選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含むような、追加の１または複数ラウンドの編集でステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップを含む、反復プロセスであり得る。追加の１または複数ラウンドは、少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ラウンドであり得る。一実施形態では、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、１つおきの編集ラウンド後にしか行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、最終編集ラウンド後にしか行われない。対抗選択は、微生物宿主細胞による抗生物質対抗選択可能なマーカー遺伝子、化学的対抗選択可能なマーカー遺伝子または温度感受性対抗選択可能なマーカー遺伝子の発現によるものであり得る。一実施形態では、微生物宿主細胞内に存在するまたは微生物宿主細胞に導入された部位特異的制限酵素は、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する。追加の１または複数ラウンドの編集で導入される修復断片は、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含むことができ、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う。１つまたは複数の遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。

一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法は、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含む、ステップ（ｈ）をさらに含む。最終修復断片は、微生物宿主細胞の核酸（例えば、ゲノムまたはプラスミド）内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは最終遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含むことができる。１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列は、相同アーム間にあることができ、これらの相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含むことができる。前記最終遺伝子座（単数または複数）は、前に編集されたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むこともあり、または前に編集されたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含むこともある。最終プラスミドは、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を伴うことができる。微生物宿主細胞は、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にする最終プラスミドとともに微生物宿主細胞に導入される。一実施形態では、方法は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なまたは相同のガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意のそのようなエンドヌクレアーゼであり得る。

本明細書で提供される方法のいずれかの任意のステップで使用するための部位特異的制限酵素は、当技術分野において公知の任意の部位特異的制限酵素であり得る。部位特異的制限酵素は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択することができる。一実施形態では、部位特異的制限酵素は、プラスミド上にコードされる。一実施形態では、部位特異的制限酵素は、インテグロン上にコードされる。一実施形態では、部位特異的制限酵素は、ゲノム内にコードされる。一実施形態では、部位特異的制限酵素は、ＲＮＡから翻訳される。一実施形態では、部位特異的制限酵素は、細胞にタンパク質として導入される。一実施形態では、部位特異的制限酵素は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型、Ｖ型またはＶＩ型ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１およびＭＡＤ７、またはこれらのホモログ、オルソログ、突然変異体、バリアントもしくは改変バージョンから選択される。

一実施形態では、上述の方法は、実際はマルチプレックスであり、これは、複数の遺伝子編集をラウンドごとに単一微生物の核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）に導入することができることを意味する。この実施形態に付け加えて、各々の修復断片は、微生物宿主細胞における核酸（例えば、ゲノムまたはプラスミド）内の１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している複数の遺伝子編集の配列を含む。各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含むことができる。修復断片上の各々の遺伝子編集の配列は、本明細書で提供されるような挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集または多重編集からなる群から選択することができる。本明細書で提供される場合、修復断片の各々は、プラスミド上に存在することができる。１つまたは複数の修復断片を含むプラスミドを編集プラスミドと呼ぶことができる。

別の実施形態では、微生物宿主細胞ゲノムを編集するための方法であって、（ａ）第１のプラスミド、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および第１の修復断片を微生物宿主細胞に導入するステップであって、ｇＲＮＡが、微生物宿主細胞のゲノム内の第１の遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含み、第１の修復断片が、第１の遺伝子座内のまたは第１の遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列により隔てられた相同アームを含み、第１のプラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ｇＲＮＡおよび修復断片の少なくとも一方または両方とを含み、微生物宿主細胞が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むか、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、第１のプラスミドとともに宿主細胞に導入される、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含む方法が、本明細書で提供される。一実施形態では、編集方法は、微生物宿主細胞への遺伝子編集の単一ラウンドの導入を含む。一実施形態では、方法は、反復的であり、ステップ（ｄ）をさらに含み、このステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞においてステップ（ａ）～（ｃ）を追加の１または複数ラウンド反復することを含みまたは必要とし、追加の１または複数ラウンドの各々は、追加のプラスミド、追加のｇＲＮＡおよび追加の修復断片を導入することを含み、追加のｇＲＮＡは、微生物宿主細胞のゲノム内の遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含み、追加の修復断片は、微生物宿主細胞のゲノム内の遺伝子座内のまたは遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列により隔てられた相同アームを含み、相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含み、追加のプラスミドは、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含み、追加のプラスミドは、追加のｇＲＮＡおよび追加の修復断片の少なくとも一方または両方を含み、それによって微生物宿主細胞ゲノムを反復的に編集する。追加の１または複数ラウンドは、微生物宿主細胞に遺伝子編集を導入するステップの少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ラウンドであり得る。一実施形態では、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、１つおきの編集ラウンド後にしか行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、最終編集ラウンド後にしか行われない。対抗選択は、微生物宿主細胞による抗生物質対抗選択可能なマーカー遺伝子、化学的対抗選択可能なマーカー遺伝子または温度感受性対抗選択可能なマーカー遺伝子の発現によるものであり得る。選択マーカー遺伝子は、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。一実施形態では、ステップ（ａ）のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞のゲノム内の第１の遺伝子座にある配列を切断する。ステップ（ｄ）のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞のゲノム内の追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座にある配列を切断する。追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座は、第１の遺伝子座であることもあり、または第１の遺伝子座とは別のもしくは異なる遺伝子座であることもある。追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座は、この反復方法の別のラウンドからの遺伝子座と同じ遺伝子座であることもある。追加の１または複数ラウンドの各々において標的にされる遺伝子座は、この反復方法の別のラウンドからの遺伝子座のような別のまたは異なる遺伝子座であることもある。

一実施形態では、第１のプラスミドは、第１のｇＲＮＡおよび第１の修復断片を含み、追加のプラスミドの各々は、追加のｇＲＮＡおよび追加の修復断片を含む。一実施形態では、第１のｇＲＮＡは、線状断片として提供される。一実施形態では、各々の追加のｇＲＮＡは、線状断片として提供される。一実施形態では、第１のｇＲＮＡおよび各々の追加のｇＲＮＡは、線状断片として提供される。一実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一実施形態では、各々の追加のｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一実施形態では、第１のｇＲＮＡと各々の追加のｇＲＮＡの両方が、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一実施形態では、第１のｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一実施形態では、各々の追加のｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一実施形態では、第１のｇＲＮＡと各々の追加のｇＲＮＡの両方が、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。追加の編集ラウンドで導入されるｇＲＮＡは、前の編集ラウンドとは異なる遺伝子座（単数または複数）を標的にすることができる。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞のゲノム内の上述の編集方法の各々のラウンドにおいてｇＲＮＡの標的にされる各々の遺伝子座にある配列を切断することができる。

本明細書で提供される方法の連続ラウンドで導入される修復断片またはその中に存在する遺伝子編集の各々は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼにより切断された標的遺伝子座内の、標的遺伝子座にある、または標的遺伝子座に近接している配列と、相補的なまたは相同の配列を含むことができる。標的遺伝子座と相補的なまたは相同の配列は、修復断片またはその中に存在する遺伝子編集の配列の各々の５’および３’末端の両方に存在することができ、このような配列を相同アームと呼ぶことができる。一実施形態では、第１の修復断片は、線状断片として提供される。一実施形態では、各々の追加の修復断片は、線状断片として提供される。一実施形態では、第１の修復断片と各々の追加の修復断片の両方は、線状断片として提供される。一実施形態では、第１の修復断片は、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡとして提供される。一実施形態では、各々の追加の修復断片は、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡとして提供される。一実施形態では、第１の修復断片と各々の追加の修復断片の両方は、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡとして提供される。線状断片は、１つまたは複数の末端改変を有することができる。末端改変を線状断片の５’および／または３’末端に適用することができる。末端改変は、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核塩基からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。各々の修復断片（すなわち、第１のおよび／または追加の修復断片）は、前の修復断片上に存在する遺伝子編集の１つまたは複数と同じ遺伝子編集の配列を含むことがある。各々の修復断片（すなわち、第１のおよび／または追加の修復断片）は、前の修復断片上に存在する遺伝子編集の１つまたは複数のような異なる遺伝子編集の配列を含むこともある。一実施形態では、複数の異なる第１の修復断片が導入される。複数の異なる第１の修復断片のうちの異なる第１の修復断片の各々は、異なる遺伝子座内のまたは異なる遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列を含むことができる。一実施形態では、複数の異なる追加の修復断片が導入される。複数の追加の修復断片のうちの各々の修復断片は、異なる遺伝子座内のまたは異なる遺伝子座に近接している遺伝子編集の配列を含むことができる。一実施形態では、方法の各々のラウンドにおいて各々の異なる遺伝子座に導入される遺伝子編集は、同じ遺伝子編集である。一実施形態では、方法の各々のラウンドにおいて各々の異なる遺伝子座に導入される遺伝子編集は、異なる遺伝子編集である。遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。

一実施形態では、方法は、ステップ（ｅ）をさらに含み、このステップ（ｅ）は、ステップ（ａ）～（ｃ）を反復するステップの最終ラウンドで最終プラスミド、最終ｇＲＮＡおよび最終修復断片を導入することを含む。最終ｇＲＮＡは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含むことができる。最終遺伝子座は、微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれの遺伝子座とも異なる遺伝子座であり得る。最終修復断片は、最終遺伝子座内の遺伝子編集の配列により隔てられた相同アームを含むことができる。相同アームは、最終遺伝子座に隣接する配列と相補的または相同である配列を含むことができる。最終ｇＲＮＡおよび／または最終修復断片は、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を伴うこともある。最終プラスミドは、最終ｇＲＮＡおよび最終修復断片の少なくとも一方または両方を含むことができる。一実施形態では、最終ｇＲＮＡは、線状断片として提供される。一実施形態では、最終ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一実施形態では、最終ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一実施形態では、方法は、ステップ（ｆ）をさらに含み、このステップ（ｆ）は、ＣＲＩＳＰＲによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なまたは相同のガイド配列を含むｇＲＮＡを導入することを含む。一実施形態では、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なまたは相同のガイド配列を含むｇＲＮＡは、線状断片として提供される。一実施形態では、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なまたは相同のガイド配列を含むｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一実施形態では、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なまたは相同のガイド配列を含むｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。

一実施形態では、上述の反復編集方法は、実際はプールされ、これは、微生物の集団において複数の編集を生じさせるための成分が編集ラウンドごとに混合またはプールされることを意味する。この実施形態に付け加えて、上述の反復編集方法の各々のラウンドまたは形質転換は、２つまたはそれより多くのｇＲＮＡ／修復断片対を付加させるステップを含むことができる。一部の場合には、各々のｇＲＮＡ／修復断片対は、２つまたはそれより多くのｇＲＮＡ／修復断片対のうちの他のｇＲＮＡ／修復断片対各々と異なる遺伝子座を標的にすることができる。他の場合には、各々のｇＲＮＡ／修復断片対は、２つまたはそれより多くのｇＲＮＡ／修復断片対うちの他のｇＲＮＡ／修復断片対各々と異なる編集を生じさせることができる。上述の反復編集方法の各々のラウンドまたは形質転換は、ラウンドまたは形質転換ごとに少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００のｇＲＮＡ／修復断片対を付加させることができる。本明細書で提供される場合、２つまたはそれより多くのｇＲＮＡ／修復断片対の各々は、プラスミド上に存在することができる。各々のｇＲＮＡ／修復断片対において、ｇＲＮＡまたは修復断片の一方または両方は、線状断片であり得る。線状断片は、１つまたは複数の末端改変を有することができる。末端改変を線状断片の５’および／または３’末端に適用することができる。末端改変は、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核塩基からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。各々のｇＲＮＡ／修復断片対において、ｇＲＮＡまたは修復断片の一方または両方は、プラスミド上に存在することができる。一実施形態では、各々のラウンドまたは形質転換で付加される２つまたはそれより多くのｇＲＮＡ／修復断片対における各々の修復断片は、２つまたはそれより多くの遺伝子編集の配列を含むことができ、その結果、本明細書で提供されるように２つまたはそれより多くの遺伝子編集の各々がｇＲＮＡと対合される。異なるｇＲＮＡ／修復断片対は、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００の異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含むことができ、それによって、微生物宿主細胞の編集された集団において少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００の異なる遺伝子改変微生物株を生じさせることができる。修復断片上に存在する遺伝子編集の各々の配列は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集または多重編集からなる群から選択することができる。ｇＲＮＡの各々は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、ｇＲＮＡの各々は、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。

一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、（ａ）微生物宿主細胞の基礎集団を、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールと組み合わせるステップであって、編集構築物のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の第１のプールが、（ｉ）同じ標的遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のもしくは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；（ｉｉ）少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している同じ１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；または（ｉｉｉ）少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の編集プラスミドを含む１つまたは複数の編集構築物を導入するステップであって、編集構築物が、（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；および（ｃ）ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法が、本明細書で提供される。一実施形態では、異なる編集構築物をステップ（ｂ）で個々の微生物宿主細胞の亜集団に導入し、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する。異なる編集構築物は、少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００の異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含むことができ、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００の異なる遺伝子改変微生物株を生じさせることができる。一実施形態では、微生物宿主細胞の基礎集団は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。一実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞の基礎集団に導入される。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを１つまたは複数の編集プラスミド上にコードすることができ、それによって、１つまたは複数の編集プラスミドの導入時に微生物宿主細胞に導入することができる。一実施形態では、各々の編集を生じさせるために必要なＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡおよび修復断片の配列は、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。微生物宿主細胞の基礎集団内に存在するまたは基礎集団に導入されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断することができる。少なくとも２つの異なる修復断片は、同じプラスミド上に存在することもあり、または異なるプラスミド上に存在することもある。一実施形態では、修復断片の各々は、微生物宿主細胞の基礎集団内に存在するまたは基礎集団に導入されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの標的にされる遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含む。一実施形態では、修復断片の各々の１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列は、微生物宿主細胞の基礎集団内に存在するまたは基礎集団に導入されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの標的にされる遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含む。微生物宿主細胞の基礎集団内に存在するまたは基礎集団に導入されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの標的にされる遺伝子座と相補的なまたは相同の配列は、修復断片の各々または１つもしくは複数の遺伝子編集の各々の５’末端と３’末端の両方に存在することができ、このような配列を相同アームと呼ぶことができ、したがって、５’末端の相同アームを左相同アームと呼ぶことができ、その一方で、３’末端の相同アームを右相同アームと呼ぶことができる。選択マーカー遺伝子は、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。一実施形態では、微生物宿主細胞の基礎集団内に存在するまたは基礎集団に導入されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する。１つまたは複数の遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。

一実施形態では、編集構築物の第１のプールは、１つまたは複数の線状断片をさらに含む。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の線状断片の各々の線状断片上に存在することができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の線状断片のうちの少なくとも１つの線状断片上に存在することができる。修復断片は、１つまたは複数の線状断片の各々の線状断片上に存在することができる。修復断片は、１つまたは複数の線状断片のうちの少なくとも１つの線状断片上に存在することができる。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを１つまたは複数の線状断片の各々の上にコードすることができる。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを１つまたは複数の線状断片のうちの少なくとも１つの上にコードすることができる。線状断片は、異なる線状構築物であることがある。一実施形態では、編集構築物の第１のプールは、２つまたはそれより多くの異なる線状断片をさらに含む。２つまたはそれより多くの異なる線状断片の各々は、異なる修復断片を含むことができる。２つまたはそれより多くの異なる線状断片のうちの少なくとも１つは、異なる修復断片を含むことができる。一実施形態では、２つまたはそれより多くの異なる線状断片は、異なるｇＲＮＡを含む。２つまたはそれより多くの異なる線状断片の各々は、異なるｇＲＮＡを含むことができる。２つまたはそれより多くの異なる線状断片のうちの少なくとも１つは、異なるｇＲＮＡを含むことができる。線状断片は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であることもあり、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）であることもある。本明細書で提供される方法で使用するための線状断片は、１つまたは複数の末端改変を有することができる。末端改変を線状断片の５’および／または３’末端に適用することができる。末端改変は、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核塩基からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。ｇＲＮＡの各々は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、ｇＲＮＡの各々は、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。

一実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。一実施形態では、修復断片は、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。一実施形態では、ｇＲＮＡおよび修復断片は、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する。同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡは、同じ編集プラスミド上に存在することができる。同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するための修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在することができる。同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡおよび修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在することができる。全ての遺伝子座を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡおよび修復断片は、同じ編集プラスミド上に存在することができる。ｇＲＮＡの各々は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、ｇＲＮＡの各々は、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。

一実施形態では、編集構築物の第１のプールは、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドを含む。一実施形態では、異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するためｇＲＮＡは、２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する。２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドは、１つの異なるｇＲＮＡを含むこともあり、または複数の異なるｇＲＮＡを含むこともある。一実施形態では、異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するため修復断片は、２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する。２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドは、１つの異なる修復断片を含むこともあり、または複数の異なる修復断片を含むこともある。ｇＲＮＡの各々は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、ｇＲＮＡの各々は、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。一実施形態では、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドは、１つの異なる修復断片および１つの異なるｇＲＮＡ、または複数の異なる修復断片および複数の異なるｇＲＮＡを含む。

一実施形態では、ｇＲＮＡを利用する１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための上述の方法は、ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｄ）をさらに含む。ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）で導入された編集プラスミドの排除を助長することができる。一実施形態では、方法は、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールを、ステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせることを含む、ステップ（ｅ）をさらに含む。編集構築物の追加のプール内の各々の編集プラスミドは、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含むことができ、編集構築物の追加のプールは、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む。一実施形態では、方法は、ステップ（ｆ）をさらに含み、このステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の編集プラスミドを含む１つまたは複数の編集構築物を導入することを含み、編集構築物は、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む。一実施形態では、方法は、ステップ（ｇ）をさらに含み、このステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する。一実施形態では、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドは、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプール上に存在する選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む。ステップ（ｆ）で導入されるｇＲＮＡは、標的遺伝子座（単数または複数）と相補的なまたは相同の配列を含むことができ、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含むことができる。

ｇＲＮＡを利用する１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための上述の方法は、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプール上に存在する選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含むような、追加の１または複数ラウンドの編集でステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップを含む、反復プロセスであり得る。追加の１または複数ラウンドは、少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ラウンドであり得る。一実施形態では、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行われない。別の実施形態では、対抗選択は、いずれかの編集ラウンド後に行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、１つおきの編集ラウンド後にしか行われない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、最終編集ラウンド後にしか行われない。対抗選択は、微生物宿主細胞による抗生物質対抗選択可能なマーカー遺伝子、化学的対抗選択可能なマーカー遺伝子または温度感受性対抗選択可能なマーカー遺伝子の発現によるものであり得る。一実施形態では、微生物宿主細胞内に存在するまたは微生物宿主細胞に導入されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する。追加の１または複数ラウンドの編集で導入される修復断片は、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含むことができ、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う。１つまたは複数の遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。ステップ（ｆ）で導入されるｇＲＮＡは、前の編集ラウンドで標的にされたいずれの遺伝子座（単数または複数）とも異なる遺伝子座（単数または複数）と相補的なまたは相同の配列を含むことができ、各々の修復断片は、異なる遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは異なる遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含むことができる。ステップ（ｆ）で導入されるｇＲＮＡは、前の編集ラウンドで標的にされた同じ遺伝子座（単数または複数）と相補的なまたは相同の配列を含むことができ、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含むことができる。一実施形態では、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に１つまたは複数の異なる編集構築物を導入することを含み、異なる編集構築物は、前の編集ラウンドで導入されたｇＲＮＡおよび／または修復断片とは異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の異なる遺伝子改変微生物株を生成する。一実施形態では、追加の１または複数ラウンドの編集で導入されるｇＲＮＡは、異なる遺伝子座（単数または複数）を標的にし、前の編集ラウンドとは異なる抗生物質選択マーカー遺伝子を伴う。１つまたは複数の異なる編集構築物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なる遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含む異なるｇＲＮＡを含むことができ、異なる遺伝子座（単数または複数）は、いずれの前に標的にされた遺伝子座（単数または複数）とも異なる。１つまたは複数の異なる編集構築物は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含む、異なる修復断片を含むことができる。編集プラスミドの第１のおよび追加のプール内の各々の編集プラスミドは、微生物宿主細胞と前に組み合わせられた編集プラスミドの他のまたは追加のプール各々の中の各々の編集プラスミドと比較して、同一の複製起点または同じクラスの複製起点を含むことができる。編集プラスミドの第１のまたは追加のプール内の各々の編集プラスミドは、同じ選択マーカー遺伝子を含むことができる。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の選択マーカー遺伝子であり得る。一実施形態では、選択マーカー遺伝子は、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子を含む。ｇＲＮＡの各々は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、ｇＲＮＡの各々は、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集、および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。

追加の１または複数ラウンドの編集で導入される修復断片は、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含むことができ、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う。追加の１または複数ラウンドの編集で導入されるｇＲＮＡは、異なる遺伝子座（単数または複数）を標的にすることができ、前の編集ラウンドとは異なる抗生物質選択マーカー遺伝子を伴う。

一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法は、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終プラスミド、最終ｇＲＮＡおよび最終修復断片を導入することを含む、ステップ（ｈ）をさらに含む。最終ｇＲＮＡは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）と相補的なまたは相同の配列を含むことができる。最終遺伝子座（単数または複数）は、微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むこともあり、または微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含むこともある。最終修復断片は、最終遺伝子座（単数または複数）内の１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含むことができる。１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列は、相同アーム間にあることができ、これらの相同アームは、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相補的なまたは相同の配列を含むことができる。最終プラスミド、最終ｇＲＮＡおよび／または最終修復断片は、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を伴うことができる。一実施形態では、方法は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なまたは相同のガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意のそのようなエンドヌクレアーゼであり得る。最終ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、最終ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。

一実施形態では、ｇＲＮＡを利用する上述の方法は、実際はマルチプレックスであり、これは、複数の遺伝子編集を編集ラウンドごとに単一微生物のゲノムに導入することができることを意味する。この実施形態に付け加えて、各々のラウンドまたは形質転換で導入される修復断片は、複数の遺伝子編集の配列を含み、複数の遺伝子編集の各々は、ｇＲＮＡと対合される。別の実施形態では、少なくとも２つまたはそれより多くの異なる遺伝子座を標的にするｇＲＮＡが導入され、その結果、各々のｇＲＮＡが、同じ修復断片または異なる修復断片のどちらかと対合される。一実施形態では、マルチプレックス編集のための修復断片および／または対合ｇＲＮＡは、線状断片として存在する。線状断片は、１つまたは複数の末端改変を有することができる。末端改変を線状断片の５’および／または３’末端に適用することができる。末端改変は、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核塩基からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。一実施形態では、マルチプレックス編集のための修復断片および／または対合ｇＲＮＡは、プラスミド上に存在する。一実施形態では、マルチプレックス編集のための修復断片および対合ｇＲＮＡは、同じプラスミド上に各々存在する。一実施形態では、マルチプレックス編集のための修復断片および対合ｇＲＮＡは、対合ｇＲＮＡのうちの各々の対合ｇＲＮＡが、対合ｇＲＮＡのうちの各々の他の対合ｇＲＮＡと比べて同じまたは異なるプラスミド上に存在するように、異なるプラスミド上に各々存在する。各々のラウンドまたは形質転換で導入される修復断片は、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含むことができ、各々の遺伝子編集をｇＲＮＡと対合させることができる。上述の反復編集方法の各々のラウンドまたは形質転換で導入されるｇＲＮＡは、少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の異なる遺伝子座を標的にすることができ、各々のｇＲＮＡを修復断片と対合させることができる。一実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかで導入されるｇＲＮＡは、標的遺伝子座（単数または複数）と相補的なまたは相同の配列を含み、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含む。一実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかで導入されるｇＲＮＡは、前の編集ラウンドで標的にされたいずれの遺伝子座（単数または複数）とも異なる遺伝子座（単数または複数）と相補的なまたは相同の配列を含み、各々の修復断片は、異なる遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは異なる遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含む。一実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかで導入されるｇＲＮＡは、前の編集ラウンドで標的にされた同じ遺伝子座（単数または複数）と相補的なまたは相同の配列を含み、各々の修復断片は、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の遺伝子編集の配列を含む。上述の反復編集方法の各々のラウンドまたは形質転換で導入される異なるｇＲＮＡは、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の異なる遺伝子座を標的にすることができ、各々のｇＲＮＡを修復断片と対合させることができる。修復断片上に存在する遺伝子編集の各々の配列は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集または多重編集からなる群から選択することができる。ｇＲＮＡの各々は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、ｇＲＮＡの各々は、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。

一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための本明細書で提供される方法のいずれかで使用するための編集プラスミドの第１のまたは追加のプールは、複数の異なる編集プラスミドを含むことができる。複数の異なる編集プラスミドは、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の異なる編集プラスミドであり得る。編集プラスミドの第１のまたは追加のプール内の各々の編集プラスミドは、同じ選択マーカー遺伝子を含むことができる。

本明細書で提供される場合の１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法は、ゼロ、１つまたは複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む微生物宿主細胞の第１の、第２のまたは追加の編集された集団を生成することができる。複数のゲノム編集は、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集であり得る。一実施形態では、微生物宿主細胞の第１の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一実施形態では、微生物宿主細胞の第２の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。一実施形態では、微生物宿主細胞の各々の追加の編集された集団は、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む。

一実施形態では、本明細書で提供されるいずれかの方法で使用するためのＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、プラスミド上にコードされる。プラスミドは、本明細書で提供される方法のいずれかで使用するための編集プラスミドであり得る。一実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、インテグロン上にコードされる。一実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内にコードされる。一実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＲＮＡから翻訳される。一実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、細胞にタンパク質として導入される。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型、Ｖ型またはＶＩ型ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１およびＭＡＤ７、またはこれらのホモログ、オルソログ、突然変異体、バリアントもしくは改変バージョンから選択される。

一実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかに使用するための微生物宿主細胞は、１つまたは複数の組換え系からのタンパク質のセットをさらに含むことができる。組換え系は、ラムダレッド組換え系；ＲｅｃＥＴ組換え系；Ｒｅｄ／ＥＴ組換え系；ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せから選択することができる。一実施形態では、タンパク質のセットは、ラムダレッド組換え系からのものであり、ベータタンパク質、ｇａｍタンパク質およびｅｘｏタンパク質を含む。一実施形態では、組換え系からのタンパク質のセットは、本明細書で提供される方法のいずれかにおけるステップ（ａ）の前に、例えば、組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子を含む１つまたは複数のプラスミドまたはインテグロンによって、核酸として微生物宿主細胞に導入される。別の実施形態では、組換え系からのタンパク質のセットは、異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子の微生物宿主細胞のゲノムへの組込みに起因して、微生物宿主細胞により安定的に発現される。別の実施形態では、組換え系からのタンパク質のセットは、異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子の微生物宿主細胞のゲノムへの組込みに起因して、微生物宿主細胞により構成的に発現される。一実施形態では、組換え系からのタンパク質のセットは、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたオペロン内に存在する。誘導性プロモーターは、試薬もしくは代謝物の添加もしくは枯渇によりまたは温度の変化により誘導可能である、当技術分野において公知の任意のプロモーターであり得る。試薬は、アラビノース、イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびテトラサイクリンからなる群から選択することができる。本明細書で提供される方法および組成物において使用するための誘導性プロモーターの例としては、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターおよびアラビノース誘導性ｐＢＡＤプロモーターを挙げることができる。一実施形態では、組換え系からのタンパク質のセットは、抑制性プロモーターに作動可能に連結されたオペロン内に存在する。抑制性プロモーターは、試薬の除去により誘導可能である、当技術分野において公知の任意のプロモーターであり得る。本明細書で提供される方法および組成物において使用するための抑制性プロモーターの例としては、ｔｒｐプロモーターを挙げることができ、試薬はトリプトファンであり得る。１つまたは複数の組換え系は、微生物宿主細胞に対して異種であり得る。

一実施形態では、微生物宿主細胞ゲノムを（例えば、シングルプレックス、マルチプレックスまたはプール型方式で）編集するための本明細書で提供される方法のいずれかは、特異的選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で微生物宿主細胞を増殖させた後、微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含む。微生物宿主細胞ゲノムを（例えば、シングルプレックス、マルチプレックスまたはプール型方式で）編集するための本明細書で提供される方法は、複数の選択ステップを利用する方法では選択ステップ間に微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、微生物宿主細胞ゲノムを反復的に編集するための本明細書で提供される方法は、全ての編集ラウンド間に微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかは、微生物宿主細胞に導入された特異的選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で微生物宿主細胞を増殖させた後、微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、本明細書で提供される方法は、最終ステップ、例えば最終編集ステップ、の後に微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、微生物宿主細胞ゲノムを反復的に編集するための本明細書で提供される方法は、少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００編集ラウンドを経て最終編集ラウンド後にのみ微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含むことができる。遺伝子型判定を行って、所望の改変の存在を確認することができる。遺伝子型判定は、コロニーＰＣＲ、制限消化、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、レポーター遺伝子もしくは抗生物質の存在／非存在の検出、または当分野における他の標準的な方法により行うことができる。遺伝子編集をシークエンシングによって、例えば、当技術分野において公知の任意の次世代シークエンシング法で、確認することもできる。

別の実施形態では、微生物宿主細胞からすでに存在するプラスミドを排除するための方法であって、（ａ）第１の選択マーカー遺伝子を含む第１のプラスミドを微生物宿主細胞に導入するステップ、および（ｂ）ステップ（ａ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対して選択的な培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップを含み、すでに存在するプラスミドと導入される第１のプラスミドが同一の複製起点を含むことによって、すでに存在するプラスミドが微生物宿主細胞から排除され、対抗選択が、すでに存在するプラスミドの排除を助長するために行なわれない、方法が、本明細書で提供される。対抗選択は、微生物宿主細胞による抗生物質対抗選択可能なマーカー遺伝子、化学的対抗選択可能なマーカー遺伝子または温度感受性対抗選択可能なマーカー遺伝子の発現によるものであり得る。一実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対して選択的ではない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｃ）をさらに含む。なおさらなる実施形態では、方法は、ステップ（ａ）～（ｃ）を１または複数ラウンド反復するステップをさらに含む。１または複数ラウンドの各々は、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む追加のプラスミドを導入することを含むことができ、すでに存在するプラスミドおよび追加で導入されるプラスミドは、同一の複製起点を含む。すでに存在するプラスミドは、天然プラスミドであることもあり、または異種プラスミドであることもある。一実施形態では、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行なわれない。別の実施形態では、対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行なわれるとは限らない。別の実施形態では、対抗選択は、いずれの編集ラウンド後にも行なわれない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、１つおきの編集ラウンド後にしか行なわれない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、最終編集ラウンド後にしか行なわれない。選択マーカー遺伝子は、本明細書で提供される抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子などの、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。

さらに別の実施形態では、微生物宿主細胞から前に導入されたプラスミドを反復的に排除するための方法であって、（ａ）第１の選択マーカー遺伝子を含む第１のプラスミドを微生物宿主細胞に導入するステップ；（ｂ）ステップ（ａ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対して選択的な培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対して選択的ではない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；および（ｄ）ステップ（ａ）～（ｃ）を１または複数ラウンド反復するステップであって、１または複数ラウンドの各々が、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む追加のプラスミドを導入することを含む、ステップを含み、第１のおよび追加のプラスミドが、微生物宿主細胞に前に導入された他の第１または追加のプラスミド各々と同一の複製起点を含むことによって、前に導入された第１のまたは追加のプラスミドが微生物宿主細胞から反復的に排除され、対抗選択が、すでに存在するプラスミドの排除を助長するために行なわれない、方法が、本明細書で提供される。対抗選択は、微生物宿主細胞による抗生物質対抗選択可能なマーカー遺伝子、化学的対抗選択可能なマーカー遺伝子または温度感受性対抗選択可能なマーカー遺伝子の発現によるものであり得る。一実施形態では、対抗選択は、少なくとも１ラウンドの編集後に行なわれない。別の実施形態では、対抗選択は、全ての編集ラウンド後に行なわれるとは限らない。別の実施形態では、対抗選択は、いずれの編集ラウンド後にも行なわれない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、１つおきの編集ラウンド後にしか行なわれない。さらに別の実施形態では、対抗選択は、最終編集ラウンド後にしか行なわれない。選択マーカー遺伝子は、本明細書で提供される抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子などの、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。

一実施形態では、微生物宿主細胞からプラスミドを排除するための本明細書で提供される方法は、各ステップ間に微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含む。一実施形態では、微生物宿主細胞ゲノムからプラスミドを排除するための本明細書で提供される方法は、選択ステップ間に微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、微生物宿主細胞ゲノムからプラスミドを排除するための本明細書で提供される方法は、最終ステップ後に微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含むことができる。遺伝子型判定を行って、所望の改変の存在を確認することができる。遺伝子型判定は、コロニーＰＣＲ、制限消化、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、レポーター遺伝子もしくは抗生物質の存在／非存在の検出、または当分野における他の標準的な方法により行うことができる。遺伝子編集をシークエンシングによって、例えば、当技術分野において公知の任意の次世代シークエンシング法で、確認することもできる。

一実施形態では、本明細書で提供されるいずれの方法の導入ステップも、微生物宿主を形質転換することを含む。微生物宿主細胞の形質転換は、例えばプラスミドなどの核酸を微生物宿主細胞に導入して形質転換を生じさせるためのまたは導入するための当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の方法を使用して行うことができる。一部の場合には、微生物宿主細胞に導入される核酸の一部または全てを、１つまたは複数のプラスミドの一部として導入することができる。他の場合には、微生物宿主細胞に導入される核酸の一部または全てを、例えば一本鎖または二本鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む、線状断片として導入することができる。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれかに使用するための線状断片として存在するいずれの核酸も、線状断片が一本鎖状であるか二本鎖状であるかを問わず、１つまたは複数の末端改変を有することができる。末端改変を線状断片の５’および／または３’末端に適用することができる。末端改変は、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核塩基からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。

一実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかに利用される微生物宿主細胞は、真核細胞である。真核微生物宿主細胞は、本明細書で提供される任意の真核微生物宿主細胞であり得る。一実施形態では、真菌微生物宿主細胞は、酵母細胞または糸状菌細胞である。酵母細胞は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の酵母細胞であり得る。糸状菌細胞は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の糸状菌細胞であり得る。

別の実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかに利用される微生物宿主細胞は、原核細胞である。原核微生物宿主細胞は、本明細書で提供される任意の原核微生物宿主細胞であり得る。一実施形態では、原核微生物宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。Ｅ．ｃｏｌｉ株は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の株であり得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、腸毒性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、腸出血性Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、尿路病原性Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）、ベロ毒素産生Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１０４：Ｈ４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１２１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１０４：Ｈ２１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮＣ１０１から選択することができる。一実施形態では、原核微生物宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種またはその株である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の種であり得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ株は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の株であり得る。一実施形態では、原核微生物宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種またはその株である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の種であり得る。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の株であり得る。

本開示を通して説明されるように、本明細書で提供される方法に利用されるプラスミドは、選択可能なマーカー遺伝子または選択マーカー遺伝子を含むことができる。本明細書で使用される選択可能なマーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質耐性マーカー、異化マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカーまたはこれらの組合せであり得る。一実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子または選択マーカー遺伝子は、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子である。抗生物質選択マーカー遺伝子は、当技術分野において公知の任意の抗生物質選択マーカー遺伝子であり得る。本明細書で提供される方法に利用されるプラスミドのいずれかに使用される抗生物質選択マーカー遺伝子は、微生物宿主細胞に基づいて選択することができる。例えば、原核生物宿主細胞の場合、抗生物質選択マーカー遺伝子は、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ゼオシン、スペクチノマイシン／ストレプトマイシンに対する耐性を付与する、当技術分野において公知の任意の遺伝子であり得る。真核生物宿主細胞の場合、抗生物質選択マーカー遺伝子は、ブレオマイシン、フレオマイシン、ジェネテシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシンに対する耐性を付与する、当技術分野において公知の任意の遺伝子であり得る。栄養要求性選択マーカー遺伝子は、特定の微生物宿主細胞に対する当技術分野において公知の任意の栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。原核細胞のための本明細書で提供される方法に利用されるプラスミドのいずれかに使用される栄養要求性選択マーカー遺伝子は、公知のアミノ酸栄養要求性マーカーから選択することができる。原核細胞のための本明細書で提供される方法に利用されるプラスミドのいずれかに使用される栄養要求性選択マーカー遺伝子は、酵母ＵＲＡ３、ＬＹＳ２、ＬＥＵ２、ＴＲＩ１、ＨＩＳ３、ＭＥＴ１５およびＡＤＥ２またはこれらのホモログもしくはオルソログから選択することができる。

本開示を通して説明されるように、本明細書で提供される方法に利用されるプラスミドは、対抗選択可能なマーカー遺伝子または対抗選択マーカー遺伝子をさらに含むことができる。対抗選択可能なマーカー遺伝子は、産生細胞を死滅させる毒性遺伝子産物を発現する、「デス遺伝子」とも呼ばれることが多い、遺伝子であり得る。本明細書で提供される方法および組成物に使用するための対抗選択可能なマーカー遺伝子は、当技術分野において公知の任意の「デス遺伝子」であり得る。一実施形態では、対抗選択可能なマーカー遺伝子または対抗選択マーカー遺伝子は、抗生物質マーカー遺伝子、化学的マーカー遺伝子、または温度感受性マーカー遺伝子である。本明細書で提供される方法に利用されるプラスミドのいずれかに使用される対抗選択可能なマーカー遺伝子は、微生物宿主細胞に基づいて選択することができる。例えば、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の場合、対抗選択可能なマーカー遺伝子は、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｇａｔａ－１、またはｃｃｄＢから選択することができ、これらの機能は、（Ｒｅｙｒａｔｅｔａｌ．１９９８ ”ＣｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔａｂｌｅＭａｒｋｅｒｓ：ＵｎｔａｐｐｅｄＴｏｏｌｓｆｏｒＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．” ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．６６（９）：４０１１－４０１７）に記載されている。真核生物宿主細胞の場合、対抗選択可能なマーカー遺伝子は、酵母ＬＹＳ２、ＴＲＰ１、ＭＥＴ１５、ＵＲＡ３、ＵＲＡ４＋およびチミジンキナーゼまたはこれらのホモログもしくはオルソログから選択することができる。

本開示を通して説明されるように、本明細書で提供される方法における任意のラウンドの形質転換および選択に利用されるプラスミドは、各々、同一の複製起点を含むことができる。本明細書で提供される方法における遺伝子編集を導入するステップの任意のラウンドで利用されるプラスミドの各々により共有される複製起点は、当技術分野において公知の任意の複製起点であり得る。本明細書で提供される方法に利用されるプラスミドのいずれかに使用される複製起点は、微生物宿主細胞に基づいて選択することができる。一実施形態では、微生物宿主細胞は、原核生物宿主細胞であり、任意の編集ラウンド中に導入されるプラスミド間で共有される複製起点は、特定の原核生物宿主細胞生物についての当技術分野において公知の任意の複製起点である。一実施形態では、微生物宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ株であり、任意の編集ラウンド中に導入されるプラスミド間で共有される複製起点は、ｏｒｉＲ、ｃｏｌＥ１、ｐ１５Ａ、ｐＵＣ、ｐＳＣ１０１またはＲ６Ｋである。一実施形態では、微生物宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株であり、連続編集ラウンド中に導入されるプラスミド間で共有される複製起点は、ｐＥ１９４、ｐＢＡＡ１またはｐＵＢ１１０である。一部の実施形態では、Ｒ６Ｋ複製起点は、ｐｉｒタンパク質の存在を条件とする。すなわち、一部の実施形態では、Ｒ６Ｋ複製起点を含む本開示のベクターは、ｐｉｒ遺伝子を含む宿主細胞でのみ増幅されることになる。一実施形態では、微生物宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株であり、任意の編集ラウンド中に導入されるプラスミド間で共有される複製起点は、ｏｒｉＲ、ＣＡＳＥ１またはＣＧ１である。

本明細書で提供される方法で使用するための組成物も、本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するための組成物は、修復断片のプールを含む。一実施形態では、プールは、複数の単一修復断片を含む。一実施形態では、プールは、プール内の少なくとも１つの修復断片が、複数の修復断片のうちの他の修復断片各々に存在する各々の他の遺伝子編集とは異なる遺伝子編集を含むような、複数の修復断片を含む。プール内に存在する複数の修復断片は、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の異なる修復断片であり得る。一実施形態では、複数の修復断片のうちの少なくとも１つの修復断片は、プール内の各々の他の修復断片の標的にされる遺伝子座とは異なる、微生物宿主細胞内の核酸（例えば、ゲノムまたはプラスミド）内の遺伝子座を標的にすることができる。一実施形態では、複数の修復断片のうちの各々の修復断片は、プール内の各々の他の修復断片の標的にされる遺伝子座とは異なる、微生物宿主細胞内の核酸（例えば、ゲノムまたはプラスミド）内の遺伝子座を標的にすることができる。一実施形態では、本明細書で提供される組成物中に存在するプール内の各々の修復断片は、１つの遺伝子編集の配列を含む。一実施形態では、本明細書で提供される組成物中に存在するプール内の各々の修復断片は、複数の遺伝子編集の配列を含む。各々の修復断片は、少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含むことができる。修復断片上に存在する各々の遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集または多重編集からなる群から選択することができる。遺伝子編集は、プロモーター、デグロン、ターミネーター、タンパク質溶解性タグまたは分解タグであり得る。

本明細書で提供される組成物中に存在するプール内の各々の修復断片は、核酸の線状断片として存在することができる。核酸の線状断片は、一本鎖状であってもよく、または二本鎖状であってもよい。線状断片は、１つまたは複数の末端改変を有することができる。末端改変を線状断片の５’および／または３’末端に適用することができる。末端改変は、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核塩基からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。

一実施形態では、本明細書で提供される組成物中に存在するプール内の各々の修復断片は、プラスミドまたはインテグロン内に存在することができる。一実施形態では、本明細書で提供される組成物中に存在するプール内の各々の修復断片は、プール内の各々の他の修復断片と異なるプラスミドまたはインテグロン内に存在することができる。一実施形態では、修復断片は、プラスミドに備えられている。一実施形態では、修復断片を含む各々のプラスミドは、１つまたは複数の複製起点をさらに含む。各々のプラスミド内の１つまたは複数の複製起点は、同一であり得る。一実施形態では、プラスミドは、プラスミドのクローニング中に使用される微生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドの維持を助長する第１の複製起点、および本明細書で提供される遺伝子編集方法のうちの１つに利用される微生物宿主細胞（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるプラスミドの維持を助長する第２の複製起点を含む。

一実施形態では、各々の修復断片、または修復断片を含む核酸（例えば、プラスミド）は、選択マーカーおよび／または対抗選択マーカーをコードする配列をさらに含むことができる。本明細書における使用のための選択マーカー遺伝子および／または対抗選択マーカー遺伝子は、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質耐性マーカー、異化マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカーまたはこれらの組合せであり得る。一実施形態では、選択マーカー遺伝子および／または対抗選択マーカー遺伝子は、抗生物質マーカー遺伝子、化学的マーカー遺伝子、または温度感受性マーカー遺伝子である。抗生物質選択マーカー遺伝子は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の抗生物質選択マーカー遺伝子であり得る。本明細書で提供される方法に利用されるプラスミドのいずれかに使用される抗生物質選択マーカー遺伝子は、微生物宿主細胞に基づいて選択することができる。一実施形態では、本明細書で提供される場合の組成物における、各々の修復断片、または修復断片を含む核酸（例えば、プラスミド）は、各々の他の修復断片と同じ選択マーカー遺伝子を含むか、または修復断片を含む各々の他の核酸（例えば、プラスミド）と同じ選択マーカー遺伝子を含む。

修復断片の各々または修復断片内に存在する１つもしくは複数の遺伝子編集の各々は、微生物宿主細胞内の核酸（例えば、ゲノムおよび／またはプラスミド）内に存在する遺伝子座と相同の配列を含むことができる。核酸（例えば、ゲノムおよび／またはプラスミド）内に存在する遺伝子座位と相同の配列は、修復断片もしくは遺伝子編集の上流もしくは５’に、および／または修復断片もしくは遺伝子編集の下流もしくは３’に、位置することがある。修復断片または遺伝子編集の上流または５’に位置する核酸（例えば、ゲノムおよび／またはプラスミド）内に存在する遺伝子座と相同の配列を左相同アームと呼ぶことができ、その一方で、修復断片または遺伝子編集の下流または３’にある核酸（例えば、ゲノムおよび／またはプラスミド）内に存在する遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を右相同アームと呼ぶことができる。

一実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するための組成物は、編集プラスミドのプールを含む。編集プラスミドのプールは、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の異なる編集プラスミドを含むことができる。プール内の編集プラスミドの各々は、１つまたは複数の修復断片を含むことができる。各々の編集プラスミド中に存在する１つまたは複数の修復断片は、少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の遺伝子編集の配列を含むことができる。修復断片上に存在する各々の遺伝子編集は、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集または多重編集からなる群から選択することができる。遺伝子編集は、プロモーター、デグロン、ターミネーター、タンパク質溶解性タグまたは分解タグであり得る。

一実施形態では、本明細書で提供される場合の組成物中の編集プラスミドのプール内の各々の編集プラスミドは、選択マーカー遺伝子を含む。一実施形態では、本明細書で提供される場合の組成物中の編集プラスミドのプール内の各々の編集プラスミドは、同じ選択マーカー遺伝子を含む。一実施形態では、本明細書で提供される場合の組成物中の編集プラスミドのプール内の各々の編集プラスミドは、対抗選択マーカー遺伝子を含む。編集プラスミド内の選択マーカー遺伝子および／または対抗選択マーカー遺伝子は、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質耐性マーカー、異化マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカーまたはこれらの組合せであり得る。一実施形態では、選択マーカー遺伝子および／または対抗選択マーカー遺伝子は、抗生物質マーカー遺伝子、化学的マーカー遺伝子、または温度感受性マーカー遺伝子である。抗生物質選択マーカー遺伝子は、当技術分野において公知のおよび／または本明細書で提供される任意の抗生物質選択マーカー遺伝子であり得る。本明細書で提供される方法に利用されるプラスミドのいずれかに使用される抗生物質選択マーカー遺伝子は、微生物宿主細胞に基づいて選択することができる。

一実施形態では、プール内の各々の編集プラスミドは、１つまたは複数の複製起点をさらに含む。各々の編集プラスミド中の１つまたは複数の複製起点は、同一であり得る。一実施形態では、プラスミドは、プラスミドのクローニング中に使用される微生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドの維持を助長する第１の複製起点、および本明細書で提供される遺伝子編集方法のうちの１つに利用される微生物宿主細胞（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるプラスミドの維持を助長する第２の複製起点を含む。

一実施形態では、編集プラスミド中の各々の修復断片、または編集プラスミド中の各々の修復断片内に存在する１つもしくは複数の遺伝子編集は、微生物宿主細胞内の核酸（例えば、ゲノムおよび／またはプラスミド）内に存在する遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含むことができる。核酸（例えば、ゲノムおよび／またはプラスミド）内に存在する遺伝子座と相補的なまたは相同の配列は、修復断片上に存在する、遺伝子編集の上流もしくは５’におよび／または遺伝子編集の下流もしくは３’に位置することがある。遺伝子編集の上流または５’に位置する核酸（例えば、ゲノムおよび／またはプラスミド）内に存在する遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を左相同アームと呼ぶことができ、その一方で、遺伝子編集の下流または３’にある核酸（例えば、ゲノムおよび／またはプラスミド）内に存在する遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を右相同アームと呼ぶことができる。

一実施形態では、編集プラスミド中の各々の修復断片、または編集プラスミド中の各々の修復断片内に存在する１つもしくは複数の遺伝子編集は、プール内の各々の他の編集プラスミド中の各々の他の修復断片の標的にされるまたはプール内の各々の他の編集プラスミド中の各々の他の修復断片内に存在する１つまたは複数の遺伝子編集の標的にされる遺伝子座とは異なる、微生物宿主細胞内の遺伝子エレメント（例えば、ゲノムまたはプラスミド）内の遺伝子座を標的にする、左および右相同アームを含むことができる。一実施形態では、編集プラスミド中の各々の修復断片、または編集プラスミド中の各々の修復断片内に存在する１つもしくは複数の遺伝子編集は、プール内の各々の他の編集プラスミド中の他のもしくは少なくとも１つの修復断片各々の標的にされるまたはプール内の各々の他の編集プラスミド中の各々の他の修復断片内に存在する１つもしくは複数の遺伝子編集の標的にされる遺伝子座と同じである、微生物宿主細胞内の核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）内の遺伝子座を標的にする、左および右相同アームを含むことができる。

本明細書で提供される任意の組成物は、修復断片内に存在する各々の遺伝子編集と対合しているガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含むことができる。本明細書で提供される任意の組成物中に存在する各々のｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、本明細書で提供される任意の組成物中に存在する各々のｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される。本明細書で提供される場合の修復断片内に存在する遺伝子編集と対合しているｇＲＮＡは、核酸（例えば、ゲノムまたはプラスミド）内の遺伝子座を標的にすることができ、これは、遺伝子編集、または前記遺伝子編集を含む修復断片が、それと相補的なまたは相同の配列を含み、前記遺伝子座の切断を助長することができるためである。本明細書で提供される場合の修復断片上に存在する遺伝子編集と対合しているｇＲＮＡは、前記遺伝子編集と比べて同じプラスミド（例えば、編集プラスミド）上に存在することもあり、または異なるプラスミド（例えば、編集プラスミド）上に存在することもある。異なるまたは別のプラスミド上に存在する場合、ｇＲＮＡを含むプラスミドは、対合している遺伝子編集を含むプラスミドとまたは対合している遺伝子編集を含む修復断片を含むプラスミドと同じ選択マーカー遺伝子および／または対抗選択マーカー遺伝子をさらに含むことができる。異なるまたは別のプラスミド上に存在する場合、ｇＲＮＡを含むプラスミドは、対合している伝子編集を含むプラスミドとまたは対合している遺伝子編集を含む修復断片を含むプラスミドと同じ複製起点をさらに含むことができる。本明細書で提供される場合の修復断片上に存在する遺伝子編集と対合しているｇＲＮＡは、前記遺伝子編集と比べて同じ線状断片（一本鎖状もしくは二本鎖状）上に存在することもあり、または異なる線状断片（一本鎖状もしくは二本鎖状）上に存在することもある。一実施形態では、本明細書で提供される組成物中のプラスミド（例えば、編集プラスミド）または編集構築物は、１つのｇＲＮＡを含むか、または複数の異なるｇＲＮＡを含み、したがって、各々のｇＲＮＡが、組成物中に同じく存在する修復断片上に存在する遺伝子編集と対合している。複数の異なるｇＲＮＡは、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００１００の異なるｇＲＮＡであり得る。前記プラスミド（例えば、編集プラスミド）または編集構築物上の各々のｇＲＮＡと対合している遺伝子編集も、前記プラスミド（例えば、編集プラスミド）または編集構築物上に存在することがある。一実施形態では、本明細書で提供される組成物中に存在する線状断片（一本鎖状または二本鎖状）は、１つのｇＲＮＡを含むか、または複数の異なるｇＲＮＡを含み、したがって、各々のｇＲＮＡは、組成物中に同じく存在する修復断片上に存在する遺伝子編集と対合している。複数の異なるｇＲＮＡは、少なくとも、多くともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００の異なるｇＲＮＡであり得る。前記線状断片（一本鎖状または二本鎖状）上の各々のｇＲＮＡと対合している遺伝子編集も、前記線状断片（一本鎖状または二本鎖状）上に存在することがある。

一実施形態では、本明細書で提供される場合の組成物は、１つまたは複数の部位特異的エンドヌクレアーゼを含む微生物宿主細胞をさらに含むことができる。１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、当技術分野において公知の任意の部位特異的制限酵素であり得る。１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択することができる。一実施形態では、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、微生物宿主細胞またはその基準株に、核酸（例えば、プラスミドまたはインテグロン）を用いて導入される。一実施形態では、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、プラスミド上にコードされ、微生物宿主細胞またはその基準株に導入される。１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々を、本明細書で提供されるような１つまたは複数の編集プラスミド上にコードすることができる。一実施形態では、１つまたは複数の部位特異的制限酵素、１つまたは複数のｇＲＮＡおよび１つまたは複数の修復断片の各々の配列は、本明細書で提供されるような１つまたは複数の編集プラスミド上に存在することができる。一実施形態では、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、インテグロン上にコードされ、微生物宿主細胞またはその基準株に導入される。一実施形態では、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、ゲノム内にコードされる。一実施形態では、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、ＲＮＡから翻訳される。一実施形態では、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、細胞にタンパク質として導入される。

一実施形態では、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型、Ｖ型またはＶＩ型ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１およびＭＡＤ７、またはこれらのホモログ、オルソログ、突然変異体、バリアントもしくは改変バージョンから選択される。一実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞またはその基準株に、核酸（例えば、プラスミドまたはインテグロン）を用いて導入される。一実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、インテグロン上にコードされ、微生物宿主細胞またはその基準株に導入される。一実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、プラスミド上にコードされ、微生物宿主細胞またはその基準株に導入される。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、本明細書で提供されるような１つまたは複数の編集プラスミド上にコードすることができる。一実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、１つまたは複数のｇＲＮＡおよび１つまたは複数の修復断片の配列は、本明細書で提供されるような１つまたは複数の編集プラスミド上に存在することができる。

一実施形態では、提供される組成物のいずれかに使用するための微生物宿主細胞は、１つまたは複数の組換え系からのタンパク質のセットをさらに含むことができる。組換え系は、ラムダレッド組換え系；ＲｅｃＥＴ組換え系；Ｒｅｄ／ＥＴ組換え系；ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せから選択することができる。一実施形態では、タンパク質のセットは、ラムダレッド組換え系からのものであり、ベータタンパク質、ｇａｍタンパク質およびｅｘｏタンパク質を含む。一実施形態では、組換え系からのタンパク質のセットは、本明細書で提供される方法のいずれかにおけるステップ（ａ）の前に、例えば、組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子を含む１つまたは複数のプラスミドまたはインテグロンによって、核酸として微生物宿主細胞に導入される。別の実施形態では、組換え系からのタンパク質のセットは、異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子の微生物宿主細胞のゲノムへの組込みに起因して、微生物宿主細胞により安定的におよび／または構成的に発現される。一実施形態では、組換え系からのタンパク質のセットは、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたオペロン内に存在する。誘導性プロモーターは、試薬の添加もしくは＿＿によりまたは温度の変化により誘導可能である、当技術分野において公知の任意のプロモーターであり得る。試薬は、アラビノース、イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびテトラサイクリンからなる群から選択することができる。本明細書で提供される方法および組成物において使用するための誘導性プロモーターの例としては、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターおよびアラビノース誘導性ｐＢＡＤプロモーターを挙げることができる。一実施形態では、組換え系からのタンパク質のセットは、抑制性プロモーターに作動可能に連結されたオペロン内に存在する。抑制性プロモーターは、試薬の除去により誘導可能である、当技術分野において公知の任意のプロモーターであり得る。本明細書で提供される方法および組成物において使用するための抑制性プロモーターの例としては、ｔｒｐプロモーターを挙げることができ、試薬はトリプトファンであり得る。１つまたは複数の組換え系は、微生物宿主細胞に対して異種であり得る。
応用

本明細書で提供される組成物および方法には、例えば、目的の所望の産物の合成のための微生物宿主細胞内の経路の設計、またはその遺伝子産物が所望の産物の合成もしくは発現に関与する１つもしくは複数の配列の最適化を可能にする、多種多様な応用があり得る。本明細書で提供される組成物および編集方法は、遺伝子の最適化配列もしくはその発現を生じさせために、または遺伝子によりコードされるタンパク質の１つもしくは複数の機能的ドメインもしくはモチーフを組み合わせるために、使用することもできる。遺伝子は、生化学的経路または代謝経路の一部であることがある。生化学的経路または代謝経路は、目的の所望の産物を産生することができる。

目的の所望の産物は、細胞培養、真核細胞もしくは原核細胞発現系においてまたはトランスジェニック動物もしくは植物においてアセンブルされ得る任意の分子であり得る。本明細書で提供される方法およびそれらに使用される組成物は、遺伝子および／または代謝経路が変更された微生物宿主細胞またはそれらのライブラリーを生成するために使用することができる。本明細書で提供される方法およびそれらに使用される組成物は、目的の産物を産生するおよび／または目的の産物に関する所望の特性を有する微生物宿主細胞またはそれらのライブラリーを生成するために使用することができる。所望の特性は、目的の所望の産物の高い産生レベル、目的の産物の機能性強化、または機能性低下（それが有利である場合）であり得る。本明細書で提供される方法のいずれかにおける追加のステップは、結果として得られる微生物宿主細胞またはそのライブラリーを目的の所望の特性または産物の存在についてスクリーニングすることを必要とし得る。そのようなスクリーニングをハイスループット法により行うことができ、このハイスループット法は、本明細書で提供されるようなロボットによる／自動化された方法であり得る。

このように、本明細書で提供される編集方法は、目的の所望の産物を産生するために微生物宿主細胞を産生または操作するための多種多様な状況に利用することができる。一部の場合には、目的の産物は、小分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝物であり得る。一次代謝物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタミン酸塩、リシン、トレオニン、トリプトファンおよび他のアミノ酸、ビタミン、多糖類などであり得る。二次代謝物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制薬、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物または生体分子はまた、宿主細胞により産生される任意の細胞内成分、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、およびその他諸々を含む、微生物酵素であり得る。細胞内成分はまた、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなどを含み得る。目的の産物は、目的のタンパク質を指すこともある。

組換え系
本明細書で提供される一態様では、微生物宿主細胞の核酸（例えば、ゲノム、コスミドまたはプラスミド）を編集するためのまたは微生物宿主細胞から株を生成するための本明細書で提供される方法は、微生物宿主細胞における相同組換え系の使用を必要とし得る。相同組換え系は、宿主細胞に本来備わっていることもあり、または細胞宿主に導入されることもある。相同組換え系のための遺伝子を、プラスミドを用いて導入することができ、線状ＤＮＡ断片を用いて導入することができ、ＲＮＡもしくはＲＮＡのセットとして導入し、ＲＮＡもしくはＲＮＡのセットから翻訳することができ、またはタンパク質もしくはタンパク質のセットとして導入することができる。

一実施形態では、本明細書で提供される方法での相同組換え（例えば、天然相同組換え）の使用は、マルチラウンド法の各々のラウンドでプラスミドのプールを利用し得る。プール内の各々のプラスミドは、核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）内の領域と相同の配列（例えば、左および右相同アーム）を、左および右相同アームが、設計された遺伝子編集（例えば、プロモーターもしくは他の配列挿入、置換、ＳＮＰ、ターミネーター、デグロン、タグの配列、分解シグナルまたは欠失の配列）により隔てられるように、含むことができる。プール内のプラスミドの各々についての他の特徴としては、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、本明細書で提供されるような栄養要求性選択マーカー遺伝子または抗生物質選択マーカー遺伝子）、対抗選択可能なマーカー遺伝子（単数または複数）（例えば、スクロースおよび４－クロロ－フェニルアラニンそれぞれの存在下で毒性を付与する、ＳａｃＢまたはＰｈｅＳ）、および複製起点（例えば、Ｒ６Ｋ）を挙げることができる。反復編集方法の各々のラウンドで利用されるプラスミドのプールからの各々のプラスミドは、同じ複製起点を有することができる。反復編集方法の１ラウンドで利用されるプラスミドのプールからの各々のプラスミドは、編集方法の各々の他のラウンドで利用されるプラスミドのプールからの各々のプラスミドと同じ複製起点を有することができる。

相同アームと遺伝子編集の配列とを含む各々のプラスミドを生成すると、それらを定義された比（例えば、等モル）で混合またはプールし、本明細書で提供される方法のいずれか（例えば、電気穿孔による形質転換、コンジュゲーションなど）を使用して微生物宿主細胞に導入することができる。一実施形態では、本明細書で提供される方法の各々のラウンドは、プラスミドの２つまたはそれより多くのプールを含む。各々のラウンドがプラスミドの２つまたはそれより多くのプールを含む実施形態では、プールを定義された（例えば、等モル）比で混合することができる。

形質転換後、得られた形質転換体を回復させることができる。回復条件（例えば、時間および温度）は、プールされたライブラリー内の偏りを生じさせる（例えば、編集方法で使用され得る一部の編集された株が他の編集されたまたは編集されない株よりも高もしくは低頻度になり得るおよび／または速くもしくは遅く増殖し得る）確率を最小にするまたは減少させるように選択することができる。

回収後、本明細書で提供される方法の各々のラウンドにおいて得られた形質転換体を培地に播種して、特定のラウンドで利用された選択可能なマーカー遺伝子を発現する形質転換体を選択することができる。核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）内の標的遺伝子座を有する相同アームを含むプラスミドの組換えが、プラスミド上に存在しかつ設計された遺伝子編集に隣接する相同アームの標的にされる２つの相同部位のうちの一方で起こり得る。

選択培地でコロニーとして増殖した、得られた形質転換体を、次いで、選択培地から擦り取り、希釈し、第２のタイプの選択培地（例えば、対抗選択可能な培地）に播種することができる。このステップによって、標的にされた遺伝子座を有する核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）が左または右相同アームのどちらかでの第２の組換え事象を経た細胞（および次いでコロニー）の誘導および選択が可能になり得る。第２の組換え事象が第１の組換え事象と同じ相同アームで起こった場合、出発株が再作出され得る。第２の組換え事象が、第２の組換え部位で起こった場合、得られる形質転換体は、所望の遺伝子編集を含み得る。したがって、対抗選択培地で増殖するコロニーの集団は、未編集の株と、特定の編集ラウンドで導入されたプラスミドプールに含まれる編集のうちの１つを各々が含有する編集された株の混合物とを、両方とも含む。

本明細書で提供されるように、マルチラウンド反復編集方法の特定のラウンドで導入されるプラスミドのプールの除去を、その特定のラウンドでの形質転換体により発現される選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地で形質転換体を増殖させることにより助長することができる。

本明細書で提供されるように、本明細書で提供されるような相同組換えを利用する方法により生成される形質転換体または株における所望の遺伝子編集の、確認および／または同定を、選択および／または対抗選択後に前記形質転換体または株の遺伝子型を判定することにより果たすことができる。遺伝子型判定は、本明細書で提供されるようなＰＣＲおよび／または次世代シークエンシングを使用して行うことができる。
ループイン／ループアウト

一部の実施形態では、本開示は、宿主生物からのＤＮＡの選択された領域のルーピングアウト方法を教示する。ルーピングアウト方法は、Ｎａｋａｓｈｉｍａｅｔａｌ．２０１４ ”ＢａｃｔｅｒｉａｌＣｅｌｌｕｌａｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｂｙＧｅｎｏｍｅＥｄｉｔｉｎｇａｎｄＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ．” Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１５（２），２７７３－２７９３に記載されている通りであり得る。ルーピングアウト欠失技法は、当技術分野で公知であり、（Ｔｅａｒｅｔａｌ．２０１４ ”ＥｘｃｉｓｉｏｎｏｆＵｎｓｔａｂｌｅＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＧｅｎｅ－ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｎｖｅｒｔｅｄＲｅｐｅａｔｓＭｅｄｉａｔｅｓＳｃａｒ－ＦｒｅｅＧｅｎｅＤｅｌｅｔｉｏｎｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．” Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７５：１８５８－１８６７）に記載されている。本明細書で提供される方法で使用されるルーピングアウト方法は、一回交差相同組換えを使用して行うことができる。一実施形態では、選択された領域のルーピングアウトは、一回交差相同組換の使用を必要とし得る。

一実施形態では、本明細書で提供される組成物、方法またはキットは、相同アーム（例えば、左／右相同アーム）とそれらの間に位置する遺伝子編集の配列とを含む修復断片であって、前記修復断片が、ループアウトベクターとしての機能を果たすことができるプラスミド上に各々位置するような、修復断片を含むまたは利用する。一実施形態では、一回交差相同組換えは、相同アームおよびそれらの間に位置する遺伝子編集の配列を含む修復断片を含むループアウトベクターと、宿主細胞ゲノムとの間で、前記ベクターをループインするために使用される。ループアウトベクター内の遺伝子編集の配列は、既存の宿主配列のダイレクトリピートまたは宿主配列のすぐ近くに導入されるダイレクトリピートである配列を用いて、ルーピングおよび欠失に選出されたＤＮＡの領域にダイレクトリピートが隣接するように設計することができる。挿入したら、ループアウトプラスミドまたはベクターを含有する細胞を選択領域の欠失について対抗選択することができる。

本明細書で提供される一態様では、微生物宿主細胞の核酸（例えば、ゲノム、コスミドまたはプラスミド）を編集するための本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の組み換え系からのタンパク質のセットの使用を必要とし得る。前記組換え系は、微生物宿主細胞に内在することもあり、または異種的に導入されることもある。１つまたは複数の異種組換え系のタンパク質のセットを核酸として（例えば、プラスミド、線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはインテグロンとして）導入し、宿主細胞のゲノムに組み込むこと、または染色体外エレメントから安定的に発現させることができる。１つまたは複数の異種組換え系のタンパク質のセットをＲＮＡとして導入することができ、それを宿主細胞は翻訳することができる。１つまたは複数の異種組換え系のタンパク質のセットを宿主細胞にタンパク質として導入することができる。１つまたは複数の組換え系のタンパク質のセットは、ラムダレッド組換え系；ＲｅｃＥＴ組換え系；Ｒｅｄ／ＥＴ組換え系；ラムダレッド組換え系、ＲｅｃＥＴ組換え系もしくはＲｅｄ／ＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せからのものであってもよい。組換え方法および／またはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質のセットは、参照により本明細書に組み込まれる、ＺｈａｎｇＹ．，ＢｕｃｈｈｏｌｚＦ．，ＭｕｙｒｅｒｓＪ．Ｐ．Ｐ．ａｎｄＳｔｅｗａｒｔＡ．Ｆ． ”ＡｎｅｗｌｏｇｉｃｆｏｒＤＮＡｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ．” ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ２０（１９９８）１２３－１２８；Ｍｕｙｒｅｒｓ，Ｊ．Ｐ．Ｐ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｔｅｓｔａ，Ｇ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ． ”ＲａｐｉｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｂｙＥＴ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．” ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２７（１９９９）１５５５－１５５７；ＺｈａｎｇＹ．，ＭｕｙｒｅｒｓＪ．Ｐ．Ｐ．，ＴｅｓｔａＧ．ａｎｄＳｔｅｗａｒｔＡ．Ｆ． ”ＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇｂｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ．” ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８（２０００）１３１４－１３１７およびＭｕｙｒｅｒｓＪＰｅｔａｌ．， ”Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－－ｎｅｗｏｐｔｉｏｎｓｆｏｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇＤＮＡ” ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ．２００１Ｍａｙ；２６（５）：３２５－３１に記載されているようなもののいずれかであり得る。Ｒｅｄ／ＥＴ組換え系からのタンパク質のセットは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｖｅｒｏ－Ｍｕｌｌｅｒ，Ａｄｏｌｆｏｅｔａｌ． ”ＡｓｓｉｓｔｅｄｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｓｅｒｔｉｏｎｂｙＲｅｄ／ＥＴ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＡＬＦＩＲＥ）－－ａｎａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ” Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈｖｏｌ．３５，１０（２００７）：ｅ７８に記載されているようなもののいずれかであり得る。

本明細書で提供されるように、本明細書で提供される方法を使用して個々にまたはプールとして導入され得る遺伝子編集は、制御エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、溶解性タグ、分解タグもしくはデグロン）、遺伝子の改変形態（例えば、所望のＳＮＰを有する遺伝子）、アンチセンス核酸、および／または代謝経路もしくは生化学的経路の一部である１つもしくは複数の遺伝子を含むことができる。一実施形態では、改変は、例えば単一の遺伝子または複数の遺伝子を不活性化するために、１つまたは複数の欠失を必要とする。一実施形態では、改変は、宿主細胞の遺伝子編集を必要とする。遺伝子編集は、宿主細胞のゲノム、および／または宿主細胞内に存在する別の遺伝子エレメント、例えばプラスミドもしくはコスミドなど、を編集することを必要とし得る。

ラムダＲＥＤ媒介組換え
本明細書で提供される一態様では、微生物宿主細胞の核酸（例えば、ゲノム、コスミドまたはプラスミド）を編集するための本明細書で提供される方法は、ラムダレッド媒介組換え系からのタンパク質のセットの使用を必要とし得る。本明細書で提供される方法のいずれにおけるラムダレッド媒介相同組換えの使用も、ＤａｔｓｅｎｋｏａｎｄＷａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳＵＳＡ９７：６６４０－６６４５（２０００）により記載されたようなものであり得、この参考文献の内容は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ラムダレッド組換え系からのタンパク質のセットは、ｅｘｏ、ベータもしくはｇａｍタンパク質またはこれらの任意の組合せを含むことができる。ｇａｍは、内在性ＲｅｃＢＣＤおよびＳｂｃＣＤヌクレアーゼ両方が、微生物宿主細胞に導入された線状ＤＮＡを消化するのを防止することができ、その一方で、ｅｘｏは、５’末端から開始して線状ｄｓＤＮＡを分解して可能性のある２つの産物（すなわち、一本鎖３’オーバーハングを有する部分的ｄｓＤＮＡ二重鎖、または相補鎖全体が分解されたｓｓＤＮＡ）を生成することができる、５’→３’ｄｓＤＮＡ依存性エキソヌクレアーゼであり、ベータは、Ｅｘｏにより作出されるｓｓＤＮＡを保護し、細胞内での相補的ｓｓＤＮＡ標的へのそのアニーリングを促進することができる。ベータ発現は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるｂｌｏｇ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｌａｍｂｄａ－ｒｅｄ－ａ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ－ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ－ｆｏｒ－ｇｅｎｅｔｉｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇに記載されているように、ｓｓＤＮＡオリゴ基質を用いるラムダレッドに基づく組換えに必要とされ得る。

一実施形態では、本明細書で提供される編集方法は、ラムダレッド組換え遺伝子をすでに安定的に発現している微生物宿主細胞、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれるｂｌｏｇ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｌａｍｂｄａ－ｒｅｄ－ａ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ－ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ－ｆｏｒ－ｇｅｎｅｔｉｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇに記載されているＤＹ３８０株において実行される。ラムダレッド組換え系の成分を含み、本明細書で提供される方法のいずれかに利用され得る、他の菌株は、Ｔｈｏｍａｓｏｎｅｔａｌ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎＢａｃｔｅｒｉａＵｓｉｎｇＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．１０６：Ｖ：１．１６：１．１６．１－１．１６．３９）およびＳｈａｒａｎｅｔａｌ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＡＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ＢａｓｅｄＭｅｔｈｏｄｏｆＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２００９；４（２）：２０６－２２３）において見つけることができ、これらの参考文献の各々についての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で提供される場合、ラムダレッド組換え系のタンパク質のセットを、本明細書で提供される編集方法のいずれかの実行の前に微生物宿主細胞に導入することができる。ラムダレッド組換え系のタンパク質の各々についての遺伝子を、核酸を（例えば、プラスミド、線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ミニλ、ラムダレッドプロファージまたはインテグロンとして）用いて導入し、宿主細胞のゲノムに組み込むこと、または染色体外エレメントから発現させることができる。一部の場合には、ラムダレッド組換え系の成分（すなわち、ｅｘｏ、ベータ、ｇａｍ、またはこれらの組合せ）の各々をＲＮＡとして導入することができ、それを宿主細胞は翻訳することができる。一部の場合には、ラムダレッド組換え系の成分（すなわち、ｅｘｏ、ベータ、ｇａｍ、またはこれらの組合せ）の各々を宿主細胞にタンパク質として導入することができる。

一実施形態では、ラムダレッド組換え系のタンパク質のセットの遺伝子がプラスミドに導入される。プラスミド上のラムダレッド組換え系のタンパク質のセットは、例えば内在性ファージｐＬプロモーターなどのプロモーターの制御下にあり得る。一実施形態では、プラスミド上のラムダレッド組換え系のタンパク質のセットは、誘導性プロモーターの制御下にある。誘導性プロモーターは、試薬の添加もしくは枯渇によりまたは温度の変化により誘導可能であり得る。一実施形態では、プラスミド上のラムダレッド組換え系のタンパク質のセットは、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターまたはアラビノース誘導性ｐＢＡＤプロモーターなどの、誘導性プロモーターの制御下にある。ラムダレッド組換え系のタンパク質のセットの遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーター、アラビノース誘導性ｐＢＡＤプロモーターおよび内在性ファージｐＬプロモーターにそれぞれ関連するｌａｃＩ、ａｒａＣまたはｃＩ８５７リプレッサーなどの、特定のプロモーターに関連するリプレッサーを発現することもできる。

一実施形態では、ラムダレッド組換え系のタンパク質のセットの遺伝子は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるｂｌｏｇ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｌａｍｂｄａ－ｒｅｄ－ａ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ－ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ－ｆｏｒ－ｇｅｎｅｔｉｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇに記載されているように、微生物宿主細胞に導入されたときゲノムに組み込まれる、ファージＤＮＡの欠陥のある非複製性の環状片である、ミニλを用いて導入される。

一実施形態では、ラムダレッド組換え系のタンパク質のセットの遺伝子は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるｂｌｏｇ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｌａｍｂｄａ－ｒｅｄ－ａ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ－ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ－ｆｏｒ－ｇｅｎｅｔｉｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇに記載されているものなどの、微生物宿主細胞へのラムダレッド組換え系の安定した組込みを可能にすることができるラムダレッドプロファージを用いて導入される。

一実施形態では、ラムダレッド組換え系からのタンパク質のセットを含む微生物宿主ゲノムを編集するための本明細書で提供される方法のいずれも、修復断片を単独利用するか、または修復断片をｇＲＮＡと対で、修復断片および／または対合ｇＲＮＡの各々がＤＮＡの線状断片として存在するように、利用する。ＤＮＡの線状断片は、ｓｓＤＮＡであることもあり、またはｄｓＤＮＡであることもある。修復断片および／またはｇＲＮＡを含む線状断片は、選択可能なマーカー遺伝子および／または対抗選択可能なマーカー遺伝子をさらに含むことができる。ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ線状断片のどちらかの使用は、修復断片またはｇＲＮＡのサイズまたは長さに依存し得る。例えば、修復断片が約２０ヌクレオチドより大きい遺伝子編集（例えば、挿入または欠失）を含む場合にはｄｓＤＮＡ線状断片を利用することができ、その一方で、修復断片が約２０ヌクレオチド未満である遺伝子編集（例えば、挿入または欠失）を含む場合にはｓｓＤＮＡ線状断片を利用することができる。

本明細書で提供される場合、修復断片、または修復断片上に存在する遺伝子編集は、微生物宿主細胞内に存在する核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）内の遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含む相同アームを含むことができる。修復断片上に存在するまたは遺伝子編集に隣接する相同アームは、各々、長さ１～５ヌクレオチドの間、５～１０ヌクレオチドの間、１０～２０ヌクレオチドの間、２０～３０ヌクレオチドの間、３０～４０ヌクレオチドの間、４０～５０ヌクレオチドの間、５０～６０ヌクレオチドの間、６０～７０ヌクレオチドの間、７０～８０ヌクレオチドの間、８０～９０ヌクレオチドの間、９０～１００ヌクレオチドの間、１００～１２５ヌクレオチドの間、１２５～１５０ヌクレオチドの間、１５０～１７５ヌクレオチドの間または１７５～２００ヌクレオチドの間であり得、これらの終点を含む。修復断片上に存在するまたは遺伝子編集に隣接する相同アームは、長さが少なくとも、多くともまたは正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ヌクレオチドであり得る。

ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集
本明細書で提供される一態様では、微生物宿主細胞の核酸（例えば、ゲノム、コスミドまたはプラスミド）を反復的に編集するための本明細書で提供される方法は、ＣＲＩＳＰＲの使用を必要とし得る。本明細書で提供される場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、方法の実行の前に微生物宿主細胞に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、核酸として（例えば、プラスミド、線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはインテグロンとして）導入し、宿主細胞のゲノムに組み込むこと、または染色体外エレメントから発現させることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをＲＮＡとして導入することができ、それを宿主細胞は翻訳することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを宿主細胞にタンパク質として導入することができる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、プラスミドおよびファージ内に存在するもなどの外来遺伝子エレメントに対する耐性を付与する、ならびにある種の獲得免疫を提供する、原核細胞免疫系である。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ）の略語であり、ｃａｓは、ＣＲＩＳＰＲ関連系（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｙｓｔｅｍ）の略語であり、ＣＲＩＳＰＲ複合体に関連する小さいｃａｓ遺伝子を指す。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、クラス１またはクラス２系のどちらかとして最も広く特徴付けられている。これら２つの系の主な識別特徴は、Ｃａｓ－エフェクターモジュールの性質である。クラス１系は、干渉を媒介するために複合体の状態の複数のＣａｓタンパク質のアセンブリー（「カスケード複合体」と呼ばれる）を必要とし、その一方で、クラス２系は、干渉を媒介するために大きい単一のＣａｓ酵素を使用する。クラス１およびクラス２系の各々は、特異的Ｃａｓタンパク質の存在に基づいて複数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ型にさらに分けられる。例えば、クラス１系は、次の３つの型に分けられる：Ｃａｓ３タンパク質を含有するＩ型系；Ｃａｓ１０タンパク質を含有するＩＩＩ型系；およびＣａｓ８様タンパク質であるＣｓｆ１タンパク質を含有する推定ＩＶ型系。クラス２系は、一般に、クラス１系より稀であり、次の３つの型にさらに分けられる：Ｃａｓ９タンパク質を含有するＩＩ型系；Ｃａｓ１２ａタンパク質（旧称Ｃｐｆ１、本明細書ではＣｐｆ１と呼ばれる）、Ｃａｓ１２ｂ（旧称Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（旧称Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（旧称ＣａｓＹ）およびＣａｓ１２ｅ（旧称ＣａｓＸ）を含有するＶ型系；ならびにＣａｓ１３ａ（旧称Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂおよびＣａｓ１３ｃを含有するＶＩ型系。Ｐｙｚｏｃｈａｅｔａｌ．，ＡＣＳＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３（２），ｐｇｓ．３４７－３５６。一実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、クラス２系である。一実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＩＩ型、Ｖ型またはＶＩ型クラス２系である。一実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃおよびＭＡＤ７、またはこれらのホモログ、オルソログもしくはパラログから選択される成分を含む。一実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｃｐｆ１またはそのホモログ、オルソログもしくはパラログを含む。一実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＭＡＤ７またはそのホモログ、オルソログもしくはパラログを含む。

本明細書で開示される方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ系は、本明細書ではＣａｓエフェクタータンパク質と呼ばれる１つまたは複数の核酸（例えば、ＲＮＡ）誘導型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼを含む、Ｃａｓエフェクターモジュールを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含むことができる。Ｃａｓエフェクタータンパク質は、一本鎖または二本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸）を標的にすることができ、二本鎖または一本鎖切断を生じさせることができる。一部の実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、野生型または天然に存在するＣａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、親Ｃａｓタンパク質と比較して１つまたは複数の特性が変更されたＣａｓタンパク質を生成するために１つまたは複数の変異、挿入または欠失がＷＴまたは天然に存在するＣａｓタンパク質（例えば、親Ｃａｓタンパク質）に加えられている、変異体Ｃａｓタンパク質である。

一部の事例では、Ｃａｓタンパク質は、野生型（ＷＴ）ヌクレアーゼである。本開示での使用に好適なＣａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃ２ｃｌ、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆｌ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１００、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＭＡＤ１－２０、ＳｍＣｓｍ１、これらのホモログ、これらのオルソログ、これらのバリアント、これらの変異体、またはこれらの改変バージョンが挙げられる。好適な核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋａｎｄｌｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｄｏｒｅａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒを含むがこれらに限定されない属からの生物からのものであり得る。このような属の生物の種は、他の点では本明細書で論じられる通りであり得る。

好適な核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ファーミキューテス門、アクチノバクテリア門、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、およびテネリクテス門を含むがこれらに限定されない門からの生物からのものであり得る。好適な核酸誘導型ヌクレアーゼは、エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、バシラス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）、アクチノバクテリア綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス綱（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フラボバクテリウム綱（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベータプロテオバクテリア綱（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デルタプロテオバクテリア綱（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、イプシロンプロテオバクテリア綱（Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ綱（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、およびモリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）を含むがこれらに限定されない綱からの生物からのものであり得る。好適な核酸誘導型ヌクレアーゼは、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、アクチノミセス目；（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、バクテロイデス目（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）、フラボバクテリウム目（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、ロドスピリルム目（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、バークホルデリア目（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ）、ナイセリア目（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）、レジオネラ目（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）、ナウティリア目（Ｎａｕｔｉｌｉａｌｅｓ）、カンピロバクター目（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、スピロヘータ目（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ）、マイコプラズマ目（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、およびチオスリックス目（Ｔｈｉｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）を含むがこれらに限定されない目からの生物からのものであり得る。好適な核酸誘導型ヌクレアーゼは、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、エンテロコッカス科（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ロイコノストック科（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、スタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ユーバクテリウム科（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、フラボバクテリウム科（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クリオモルファス科（Ｃｒｙｏｍｏｏｒｐｈａｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｏｄｏｂｉａｃｅａｅ）、ロドスピリルム科（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、アセトバクター科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、サテレラ科（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、レジオネラ科（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、ナウティリア科（Ｎａｕｔｉｌｉａｃｅａｅ）、カンピロバクター科（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、スピロヘータ科（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ）、マイコプラズマ科（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）、およびフランシセラ科（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｃｅａｅ）を含むがこれらに限定されない科からの生物からのものであり得る。

本開示の方法、系および組成物における使用に好適な他の核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）としては、これらに限定されないが、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａｓｐ．ＸＳ５、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａｔｅｒｍｉｔｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓａｌｖｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、ＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＯＥ１、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａｂｒｅｖｉｓＡＴＣＣ１９１８８、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓｊｏｎｅｓｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ口腔分類群２７４、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎａｄａｉ血清型亜型Ｌｙｍｅｓｔｒ．１０、Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．結晶構造（５Ｂ４３）Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ；Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓｌ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａａｌｂｅｎｓｉｓ、ＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＭＣ２０１７１、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、ＰｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、ＰａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、ＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＭＡ２０２０、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎａｄａｉ、ＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｄｉｓｉｅｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｍａｃａｃａｅ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＣＡＧ：２９０、Ｋａｎｄｌｅｒｉａｖｉｔｕｌｉｎａ、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍＫＡ００２７４、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ３－２、Ｄｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、ＣｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｃａｔｕｓＧＤ／７、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｃｏｌｕｍｂａｅＤＳＭ７３７４、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＥＦＢ－Ｎ１、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｒｓｍｏｌｄｅｎｓｉｓ、およびＦｉｌｉｆａｃｔｏｒａｌｏｃｉｓＡＴＣＣ３５８９６などの、生物に由来するものが挙げられる。米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、同第８，７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８９５，３０８号、同第８，９０６，６１６号、同第８，９３２，８１４号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９９３，２３３号、同第８，９９９，６４１号、同第９，８２２，３７２号、同第９，８４０，７１３号、米国特許出願第１３／８４２，８５９号（ＵＳ２０１４／００６８７９７Ａ１）、９，２６０，７２３、９，０２３，６４９、９，８３４，７９１、９，６３７，７３９、米国特許出願第１４／６８３，４４３（ＵＳ２０１５／０２４０２６１Ａ１）、米国特許出願第１４／７４３，７６４号（ＵＳ２０１５／０２９１９６１Ａ１）、９，７９０，４９０、９，６８８，９７２、９，５８０，７０１、９，７４５，５６２、９，８１６，０８１、９，６７７，０９０、９，７３８，６８７、米国特許出願第１５／６３２，２２２号（ＵＳ２０１７／０３６９８７９Ａ１）、米国特許出願第１５／６３１，９８９号、米国特許出願第１５／６３２，００１号、および米国特許第９，８９６，６９６号を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、次の活性のうちの１つまたは複数を含む：

ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の単鎖を切断する能力；

二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を生じさせる能力；

エンドヌクレアーゼ活性；

エキソヌクレアーゼ活性；および／または

ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のヘリックス構造を巻き戻す能力。

本開示の態様では、用語「ガイド核酸」は、１）標的配列とハイブリダイズすることができるガイド配列（本明細書では「標的化セグメント」と呼ばれる）、および２）本明細書に記載の核酸誘導型ヌクレアーゼと（単独でにせよ、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子と組み合わせてにせよ）相互作用することができる足場配列（本明細書では「足場セグメント」と呼ばれる）を含む、ポリヌクレオチドを指す。ガイド核酸は、ＤＮＡであることもある。ガイド核酸は、ＲＮＡであることもある。ガイド核酸は、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含むことができる。ガイド核酸は、改変された天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。ガイド核酸がＲＮＡを含む場合、ＲＮＡガイド核酸は、本明細書で提供される方法および組成物を使用して生成される、プラスミド、線状構築物などの、ポリヌクレオチド分子上のＤＮＡ配列によりコードされ得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるガイド核酸は、ＲＮＡガイド核酸（「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」）であり、標的化セグメントおよび足場セグメントを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの足場セグメントは、１つのＲＮＡ分子に含まれ、標的化セグメントは、もう１つの別のＲＮＡ分子に含まれる。そのような実施形態は、本明細書では「二重分子ｇＲＮＡ」または「２分子ｇＲＮＡ」または「デュアルｇＲＮＡ」と呼ばれる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子であり、本明細書では「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。用語「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、包括的であり、２分子ガイドＲＮＡとｓｇＲＮＡの両方を指す。

ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的核酸配列中の配列と相補的または相同であるヌクレオチド配列を含む。標的核酸配列は、ゲノムまたはプラスミドなどの遺伝子エレメント中の遺伝子座であり得る。しかるが故に、ｇＲＮＡの標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）によって配列特異的に標的核酸と相互作用し、標的化セグメントのヌクレオチド配列によって、ｇＲＮＡが結合することになる標的ＤＮＡ内の位置が決まる。ガイド配列とその対応する標的配列との相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはそれより大きい、または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％より大きい、もしくはそれより大きい。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド、もしくはそれより大きい、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、７５ヌクレオチドより大きい、もしくはそれより大きい。一部の実施形態では、ガイド配列は、長さ約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０ヌクレオチド未満である。態様では、ガイド配列は、長さ１０～３０ヌクレオチドである。ガイド配列は、長さ１５～２０ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さ１５ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さ１６ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さ１７ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さ１８ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さ１９ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さ２０ヌクレオチドであり得る。

ガイドＲＮＡの足場セグメントは、１つまたは複数のＣａｓエフェクタータンパク質と相互作用して、リボ核タンパク質複合体（本明細書ではＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰまたはＲＮＰ－複合体と呼ばれる）を形成する。ガイドＲＮＡは、結合しているポリペプチドを、上記標的化セグメントによって標的核酸配列内の特定のヌクレオチド配列に方向付ける。ガイドＲＮＡの足場セグメントは、ヌクレオチドの２つのストレッチを含み、これらは、互いに相補的であり、二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成する。足場配列内の配列であって、標的化可能なヌクレアーゼ複合体の形成を促進するのに十分な配列は、二次構造の形成に関与する１つまたは２つの配列領域などの、足場配列内の２つの配列領域の長さに沿って、ある程度の相補性を有し得る。一部の場合には、１つまたは２つの配列領域は、同じポリヌクレオチド上に含まれるまたは存在する。一部の場合には、１つまたは２つの配列領域は、別個のポリヌクレオチド上に含まれるまたは存在する。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、１配列領域内または２配列領域内どちらかにおける自己相補性などの二次構造をさらに説明することができる。一部の実施形態では、１つまたは２つの配列領域間の、これら２配列の短い方の長さに沿っての相補性度は、最適にアラインメントされたとき、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはそれより高い、または約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％より大きい、もしくはそれより高い。一部の実施形態では、２つの配列領域の少なくとも一方は、長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０ヌクレオチド、もしくはそれより大きい、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０ヌクレオチドより大きい、もしくはそれより大きい。

対象ｇＲＮＡの足場配列は、二次構造を含むことができる。二次構造は、偽ノット領域またはステム－ループ構造を含むことができる。一部の例では、ガイド核酸と核酸誘導型ヌクレアーゼの適合性は、少なくともある程度は、ガイドＲＮＡの二次構造領域内のまたは二次構造領域に近接している配列により決定される。一部の場合には、核酸誘導型ヌクレアーゼへのガイド核酸の結合動態は、足場配列内の二次構造により、ある程度、決定される。一部の場合には、核酸誘導型ヌクレアーゼへのガイド核酸の結合動態は、足場配列を伴う核酸配列により、ある程度、決定される。

ｇＲＮＡ－Ｃａｓエフェクタータンパク質の組合せと適合する足場配列は、天然Ｃａｓヌクレアーゼ遺伝子座に近接している配列を走査することにより見つけることができる。言い換えると、天然Ｃａｓヌクレアーゼは、対応する適合性ガイド核酸または足場配列に近接している範囲内のゲノム上にコードされ得る。

核酸誘導型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ内在性宿主内には見られないガイド核酸に適合し得る。そのような直交性ガイド核酸は、経験的試験により決定することができる。直交性ガイド核酸は、異なる細菌種に由来することもあり、または合成のものであることもあり、または天然に存在しないように別様に操作されたものであることもある。共通の核酸誘導型ヌクレアーゼに適合する直交性ガイド核酸は、１つまたは複数の共通の特徴を含むことができる。共通の特徴は、偽ノット領域外の配列を含むことがある。共通の特徴は、偽ノット領域を含むこともある。共通の特徴は、一次配列を含むこともあり、または二次構造を含むこともある。

ガイド配列が標的配列と相補的または相同になるようにガイド配列を変更することによってガイド配列と標的配列の間のハイブリダイゼーションを可能にすることにより、所望の標的配列を標的にするようにガイド核酸を操作することができる。操作されたガイド配列を有するガイド核酸を、操作されたガイド核酸と呼ぶことができる。操作されたガイド核酸は、多くの場合、天然に存在せず、自然界に見られない。

一実施形態では、本明細書で提供される任意の方法の各々のラウンドで導入される本明細書で提供されるような１つまたは複数の遺伝子編集を含む修復断片は、ドナーＤＮＡとしての機能を果たし、各々の修復断片上の各々遺伝子編集は、ｇＲＮＡと対合される。各々のｇＲＮＡは、宿主細胞内の遺伝子エレメント（例えば、染色体またはプラスミド）内の遺伝子座にある特異的配列を標的にする配列を含むことができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用する遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ法では、ドナーＤＮＡ配列をその対合ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と組み合わせて使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的遺伝子内の鎖切断をもたらすことがあり、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用することによりその鎖切断を修復することができる。本明細書で提供される方法および組成物を使用して生成されるドナーＤＮＡ配列で宿主細胞を同時形質転換することにより、ＨＤＲ媒介修復を助長することができる。ドナーＤＮＡ配列は、所望の遺伝子摂動（例えば、欠失、挿入（例えば、プロモーター、ターミネーター、可溶性もしくは分解タグ）、および／または一塩基多型）を含むことができ、ｇＲＮＡの標的にされる配列または遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含む標的化配列または相同アームも含むことができる。この実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、１つまたは複数のｇＲＮＡにより指定される標的遺伝子を切断する。次いで、ドナーＤＮＡ配列を相同組換え機構の鋳型として使用して、所望の遺伝子摂動を宿主細胞に組み込むことができる。ドナーＤＮＡは、一本鎖状であることもあり、二本鎖状であることもあり、または二本鎖プラスミドであることもある。ドナーＤＮＡは、再切断を防止するために、ＰＡＭ配列を欠いていることもあり、またはスクランブルされた、変更されたもしくは非機能的なＰＡＭを含むこともある。一部の場合には、ドナーＤＮＡは、機能的なまたは変更されていないＰＡＭ部位を含有することもある。ドナーＤＮＡ内の（相同領域と隣接もしている）突然変異または編集された配列は、突然変異がゲノムに組み込まれた後のＣＲＩＳＰＲ－複合体による再切断を防止する。一部の実施形態では、相同組換えは、宿主細胞に内在するまたは異種的に導入されたどちらかの１つまたは複数の組換え系からのタンパク質のセットの使用または発現によって助長される。
宿主細胞

宿主細胞の核酸（例えば、ゲノムまたはプラスミド）を、前記宿主細胞の所望の形質または表現型（例えば、本明細書で提供されるような目的の産物の産生）を生成または産生するように編集するための、本明細書で提供されるキット、組成物および方法は、任意の生物に適用可能であり得、そこで所望の形質または表現型を遺伝子突然変異体の集団において同定することができる。生物は、微生物であることもあり、または高等真核生物であることもある。

したがって、本明細書で使用される場合、用語「微生物」を広く解釈すべきである。この用語は、これらに限定されないが、細菌および古細菌という２つの原核生物ドメイン、ならびにある特定の真核性真菌および原生生物を含む。しかし、ある特定の態様では、昆虫、植物および動物などの「高等」真核生物を、本明細書で教示される方法に利用することができる。

好適な宿主細胞としては、細菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。１つの説明に役立つ実施形態では、好適な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株またはＢａｃｉｌｌｕｓ株を含む。

本開示の他の好適な宿主生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物を含む。一部の実施形態では、好ましいＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株／種は、寄託された基準株がＤＳＭ４４５４９であるＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、寄託された基準株がＡＴＣＣ１３０３２であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、および寄託された基準株がＡＴＣＣ６８７１であるＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓを含む。一部の実施形態では、本開示の好ましい宿主は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。

Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の、好適な宿主株は、特に、公知の野生型株：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１５８０６、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１３８７０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａＡＴＣＣ１７９６５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓＦＥＲＭＢＰ－１５３９、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＡＴＣＣ１４０６７、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍＡＴＣＣ１３８６９、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍＡＴＣＣ１４０２０；ならびにこれらから調製される、Ｌアミノ酸生産変異体、または株、例えば、Ｌ－リシン生産株：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＦＥＲＭ－Ｐ１７０９、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＦＥＲＭ－Ｐ１７０８、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍＦＥＲＭ－Ｐ１７１２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＦＥＲＭ－Ｐ６４６３、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＦＥＲＭ－Ｐ６４６４、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＤＭ５８－１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＤＧ５２－５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＤＳＭ５７１４、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＤＳＭ１２８６６である。

用語「Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ」は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに対しても使用されてきた。Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ種の一部の代表、例えば、ＦＥＲＭＢＰ－１５３９株などは、先行技術分野ではＣ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓとも呼ばれている。

一部の実施形態では、本開示の微生物宿主細胞は、真核細胞である。好適な真核生物宿主細胞は、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、動物細胞、および植物細胞を含むが、これらに限定されない。好適な真菌宿主細胞は、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉを含むが、これらに限定されない。ある特定の好ましい真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状菌細胞を含む。好適な糸状菌宿主細胞は、例えば、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の任意の糸状形態を含む。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈｅｔａｌ．，ＩｎＡｉｎｓｗｏｒｔｈａｎｄＢｉｓｂｙ’ｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＴｈｅＦｕｎｇｉ，８^ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫを参照されたい）。糸状菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖で構成されている細胞壁を有する栄養菌糸体を特徴とする。糸状菌宿主細胞は、形態学的に酵母とは明確に異なる。

ある特定の例示的な、しかし非限定的な実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物の細胞であり得る。一実施形態では、糸状菌は、Ａ．ｎｉｇｅｒ群のＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉからなる群より選択される。好ましい実施形態では、糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである。

一実施形態では、糸状菌は、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｏｅｔｉｄｕｓＡＣＭ３９９６（＝ＦＲＲ３５５８）、ＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａＧｕｙ－１１またはＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍＲＰ７８から選択される生産株である。別の実施形態では、糸状菌は、当技術分野において公知のＡ．ｎｉｇｅｒ生産株である。本明細書で提供される方法で使用するためのＡ．ｎｉｇｅｒ生産株の例としては、Ａ．ｎｉｇｅｒＡＴＣＣ１１４１４、ＡＴＣＣ１０１５、ＡＣＭ４９９２（＝ＡＴＣＣ９１４２）、ＡＣＭ４９９３（＝ＡＴＣＣ１０５７７）、ＡＣＭ４９９４（＝ＡＴＣＣ１２８４６）、ＡＴＣＣ２６５５０、ＡＴＣＣ１１４１４、Ｎ４０２、ＣＢＳ５１３．８８またはＮＲＲＬ３（ＡＴＣＣ９０２９、ＣＢＳ１２０．４９）を挙げることができる。

好適な酵母宿主細胞は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａを含むことができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。

ある特定の実施形態では、微生物宿主細胞は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）などの、藻類である。

他の実施形態では、微生物宿主細胞は、原核細胞である。好適な原核細胞は、グラム陽性、グラム陰性、およびグラム不定性細菌細胞を含む。微生物宿主細胞は、これらに限定されないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓの、種または株であり得る。

一部の実施形態では、微生物宿主株は、工業用菌株である。多くの工業用菌株が公知であり、本明細書に記載される方法および組成物に好適である。

一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｒｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のものである。特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含むがこれらに限定されない、工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉＥ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびこれらに類するものである。

一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ種のものであり、腸毒性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）、ベロ毒素産生Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１０４：Ｈ４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１２１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１０４：Ｈ２１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ１、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮＣ１０１を含み得る。一部の実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作方法のための微生物宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、およびＥ．ｃｏｌｉＣから選択される。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作方法のための微生物宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉＮＣＴＣ１２７５７株、ＮＣＴＣ１２７７９株、ＮＣＴＣ１２７９０株、ＮＣＴＣ１２７９６株、ＮＣＴＣ１２８１１株、ＡＴＣＣ１１２２９株、ＡＴＣＣ２５９２２株、ＡＴＣＣ８７３９株、ＤＳＭ３００８３株、ＢＣ５８４９株、ＢＣ８２６５株、ＢＣ８２６７株、ＢＣ８２６８株、ＢＣ８２７０株、ＢＣ８２７１株、ＢＣ８２７２株、ＢＣ８２７３株、ＢＣ８２７６株、ＢＣ８２７７株、ＢＣ８２７８株、ＢＣ８２７９株、ＢＣ８３１２株、ＢＣ８３１７株、ＢＣ８３１９株、ＢＣ８３２０株、ＢＣ８３２１株、ＢＣ８３２２株、ＢＣ８３２６株、ＢＣ８３２７株、ＢＣ８３３１株、ＢＣ８３３５株、ＢＣ８３３８株、ＢＣ８３４１株、ＢＣ８３４４株、ＢＣ８３４５株、ＢＣ８３４６株、ＢＣ８３４７株、ＢＣ８３４８株、ＢＣ８８６３株、およびＢＣ８８６４株から選択される。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作方法のための微生物宿主細胞は、ベロ細胞毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＶＴＥＣ）、例えば、ＢＣ４７３４（Ｏ２６：Ｈ１１）株、ＢＣ４７３５（Ｏ１５７：Ｈ－）株、ＢＣ４７３６株、ＢＣ４７３７（ｎ．ｄ．）株、ＢＣ４７３８（Ｏ１５７：Ｈ７）株、ＢＣ４９４５（Ｏ２６：Ｈ－）株、ＢＣ４９４６（Ｏ１５７：Ｈ７）株、ＢＣ４９４７（Ｏ１１１：Ｈ－）株、ＢＣ４９４８（Ｏ１５７：Ｈ）株、ＢＣ４９４９（Ｏ５）株、ＢＣ５５７９（Ｏ１５７：Ｈ７）株、ＢＣ５５８０（Ｏ１５７：Ｈ７）株、ＢＣ５５８２（Ｏ３：Ｈ）株、ＢＣ５６４３（Ｏ２：Ｈ５）株、ＢＣ５６４４（Ｏ１２８）株、ＢＣ５６４５（Ｏ５５：Ｈ－）株、ＢＣ５６４６（Ｏ６９：Ｈ－）株、ＢＣ５６４７（Ｏ１０１：Ｈ９）株、ＢＣ５６４８（Ｏ１０３：Ｈ２）株、ＢＣ５８５０（Ｏ２２：Ｈ８）株、ＢＣ５８５１（Ｏ５５：Ｈ－）株、ＢＣ５８５２（Ｏ４８：Ｈ２１）株、ＢＣ５８５３（Ｏ２６：Ｈ１１）株、ＢＣ５８５４（Ｏ１５７：Ｈ７）株、ＢＣ５８５５（Ｏ１５７：Ｈ－）株、ＢＣ５８５６（Ｏ２６：Ｈ－）株、ＢＣ５８５７（Ｏ１０３：Ｈ２）株、ＢＣ５８５８（Ｏ２６：Ｈ１１）株、ＢＣ７８３２株、ＢＣ７８３３（Ｏ未処理型：Ｈ－）株、ＢＣ７８３４（ＯＮＴ：Ｈ－）株、ＢＣ７８３５（Ｏ１０３：Ｈ２）株、ＢＣ７８３６（Ｏ５７：Ｈ－）株、ＢＣ７８３７（ＯＮＴ：Ｈ－）株、ＢＣ７８３８株、ＢＣ７８３９（Ｏ１２８：Ｈ２）株、ＢＣ７８４０（Ｏ１５７：Ｈ－）株、ＢＣ７８４１（Ｏ２３：Ｈ－）株、ＢＣ７８４２（Ｏ１５７：Ｈ－）株、ＢＣ７８４３株、ＢＣ７８４４（Ｏ１５７：Ｈ－）株、ＢＣ７８４５（Ｏ１０３：Ｈ２）株、ＢＣ７８４６（Ｏ２６：Ｈ１１）株、ＢＣ７８４７（Ｏ１４５：Ｈ－）株、ＢＣ７８４８（Ｏ１５７：Ｈ－）株、ＢＣ７８４９（Ｏ１５６：Ｈ４７）株、ＢＣ７８５０株、ＢＣ７８５１（Ｏ１５７：Ｈ－）株、ＢＣ７８５２（Ｏ１５７：Ｈ－）株、ＢＣ７８５３（Ｏ５：Ｈ－）株、ＢＣ７８５４（Ｏ１５７：Ｈ７）株、ＢＣ７８５５（Ｏ１５７：Ｈ７）株、ＢＣ７８５６（Ｏ２６：Ｈ－）株、ＢＣ７８５７株、ＢＣ７８５８株、ＢＣ７８５９（ＯＮＴ：Ｈ－）株、ＢＣ７８６０（Ｏ１２９：Ｈ－）株、ＢＣ７８６１株、ＢＣ７８６２（Ｏ１０３：Ｈ２）株、ＢＣ７８６３株、ＢＣ７８６４（Ｏ未処理型：Ｈ－）株、ＢＣ７８６５株、ＢＣ７８６６（Ｏ２６：Ｈ－）株、ＢＣ７８６７（Ｏ未処理型：Ｈ－）株、ＢＣ７８６８株、ＢＣ７８６９（ＯＮＴ：Ｈ－）株、ＢＣ７８７０（Ｏ１１３：Ｈ－）株、ＢＣ７８７１（ＯＮＴ：Ｈ－）株、ＢＣ７８７２（ＯＮＴ：Ｈ－）株、ＢＣ７８７３株、ＢＣ７８７４（Ｏ未処理型：Ｈ－）株、ＢＣ７８７５（Ｏ１５７：Ｈ－）株、ＢＣ７８７６（Ｏ１１１：Ｈ－）株、ＢＣ７８７７（Ｏ１４６：Ｈ２１）株、ＢＣ７８７８（Ｏ１４５：Ｈ－）株、ＢＣ７８７９（Ｏ２２：Ｈ８）株、ＢＣ７８８０（Ｏ未処理型：Ｈ－）株、ＢＣ７８８１（Ｏ１４５：Ｈ－）株、ＢＣ８２７５（Ｏ１５７：Ｈ７）株、ＢＣ８３１８（Ｏ５５：Ｋ－：Ｈ－）株、ＢＣ８３２５（Ｏ１５７：Ｈ７）株、およびＢＣ８３３２（ＯＮＴ）株、ＢＣ８３３３株である。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作方法のための微生物宿主細胞は、腸侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、例えば、ＢＣ８２４６（Ｏ１５２：Ｋ－：Ｈ－）株、ＢＣ８２４７（Ｏ１２４：Ｋ（７２）：Ｈ３）株、ＢＣ８２４８（Ｏ１２４）株、ＢＣ８２４９（Ｏ１１２）株、ＢＣ８２５０（Ｏ１３６：Ｋ（７８）：Ｈ－）株、ＢＣ８２５１（Ｏ１２４：Ｈ－）株、ＢＣ８２５２（Ｏ１４４：Ｋ－：Ｈ－）株、ＢＣ８２５３（Ｏ１４３：Ｋ：Ｈ－）株、ＢＣ８２５４（Ｏ１４３）株、ＢＣ８２５５（Ｏ１１２）株、ＢＣ８２５６（Ｏ２８ａ．ｅ）株、ＢＣ８２５７（Ｏ１２４：Ｈ－）株、ＢＣ８２５８（Ｏ１４３）株、ＢＣ８２５９（Ｏ１６７：Ｋ－：Ｈ５）株、ＢＣ８２６０（Ｏ１２８ａ．ｃ．：Ｈ３５）株、ＢＣ８２６１（Ｏ１６４）株、ＢＣ８２６２（Ｏ１６４：Ｋ－：Ｈ－）株、ＢＣ８２６３（Ｏ１６４）株、およびＢＣ８２６４（Ｏ１２４）株である。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作方法のための微生物宿主細胞は、腸毒性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、例えば、ＢＣ５５８１（Ｏ７８：Ｈ１１）株、ＢＣ５５８３（Ｏ２：Ｋ１）株、ＢＣ８２２１（Ｏ１１８）株、ＢＣ８２２２（Ｏ１４８：Ｈ－）株、ＢＣ８２２３（Ｏ１１１）株、ＢＣ８２２４（Ｏ１１０：Ｈ－）株、ＢＣ８２２５（Ｏ１４８）株、ＢＣ８２２６（Ｏ１１８）株、ＢＣ８２２７（Ｏ２５：Ｈ４２）株、ＢＣ８２２９（Ｏ６）株、ＢＣ８２３１（Ｏ１５３：Ｈ４５）株、ＢＣ８２３２（Ｏ９）株、ＢＣ８２３３（Ｏ１４８）株、ＢＣ８２３４（Ｏ１２８）株、ＢＣ８２３５（Ｏ１１８）株、ＢＣ８２３７（Ｏ１１１）株、ＢＣ８２３８（Ｏ１１０：Ｈ１７）株、ＢＣ８２４０（Ｏ１４８）株、ＢＣ８２４１（Ｏ６Ｈ１６）株、ＢＣ８２４３（Ｏ１５３）株、ＢＣ８２４４（Ｏ１５：Ｈ－）株、ＢＣ８２４５（Ｏ２０）株、ＢＣ８２６９（Ｏ１２５ａ．ｃ：Ｈ－）株、ＢＣ８３１３（Ｏ６：Ｈ６）株、ＢＣ８３１５（Ｏ１５３：Ｈ－）株、ＢＣ８３２９株、ＢＣ８３３４（Ｏ１１８：Ｈ１２）株、およびＢＣ８３３９株である。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作方法のための微生物宿主細胞は、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、例えば、ＢＣ７５６７（Ｏ８６）株、ＢＣ７５６８（Ｏ１２８）株、ＢＣ７５７１（Ｏ１１４）株、ＢＣ７５７２（Ｏ１１９）株、ＢＣ７５７３（Ｏ１２５）株、ＢＣ７５７４（Ｏ１２４）株、ＢＣ７５７６（Ｏ１２７ａ）株、ＢＣ７５７７（Ｏ１２６）株、ＢＣ７５７８（Ｏ１４２）株、ＢＣ７５７９（Ｏ２６）株、ＢＣ７５８０（ＯＫ２６）株、ＢＣ７５８１（Ｏ１４２）株、ＢＣ７５８２（Ｏ５５）株、ＢＣ７５８３（Ｏ１５８）株、ＢＣ７５８４（Ｏ－）株、ＢＣ７５８５（Ｏ－）株、ＢＣ７５８６（Ｏ－）株、ＢＣ８３３０株、ＢＣ８５５０（Ｏ２６）株、ＢＣ８５５１（Ｏ５５）株、ＢＣ８５５２（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５５３（Ｏ２６）株、ＢＣ８５５４（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５５５（Ｏ８６）株、ＢＣ８５５６（Ｏ１２８）株、ＢＣ８５５７（ＯＫ２６）株、ＢＣ８５５８（Ｏ５５）株、ＢＣ８５６０（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５６１（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５６２（Ｏ１１４）株、ＢＣ８５６３（Ｏ８６）株、ＢＣ８５６４（Ｏ１２８）株、ＢＣ８５６５（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５６６（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５６７（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５６８（Ｏ１１１）株、ＢＣ８５６９（Ｏ１２８）株、ＢＣ８５７０（Ｏ１１４）株、ＢＣ８５７１（Ｏ１２８）株、ＢＣ８５７２（Ｏ１２８）株、ＢＣ８５７３（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５７４（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５７５（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５７６（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５７７（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５７８（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５８１（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５８３（Ｏ１２８）株、ＢＣ８５８４（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５８５（Ｏ１２８）株、ＢＣ８５８６（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５８８（Ｏ２６）株、ＢＣ８５８９（Ｏ８６）株、ＢＣ８５９０（Ｏ１２７）株、ＢＣ８５９１（Ｏ１２８）株、ＢＣ８５９２（Ｏ１１４）株、ＢＣ８５９３（Ｏ１１４）株、ＢＣ８５９４（Ｏ１１４）株、ＢＣ８５９５（Ｏ１２５）株、ＢＣ８５９６（Ｏ１５８）株、ＢＣ８５９７（Ｏ２６）株、ＢＣ８５９８（Ｏ２６）株、ＢＣ８５９９（Ｏ１５８）株、ＢＣ８６０５（Ｏ１５８）株、ＢＣ８６０６（Ｏ１５８）株、ＢＣ８６０７（Ｏ１５８）株、ＢＣ８６０８（Ｏ１２８）株、ＢＣ８６０９（Ｏ５５）株、ＢＣ８６１０（Ｏ１１４）株、ＢＣ８６１５（Ｏ１５８）株、ＢＣ８６１６（Ｏ１２８）株、ＢＣ８６１７（Ｏ２６）株、ＢＣ８６１８（Ｏ８６）株、ＢＣ８６１９株、ＢＣ８６２０株、ＢＣ８６２１株、ＢＣ８６２２株、ＢＣ８６２３株、ＢＣ８６２４（Ｏ１５８）株、およびＢＣ８６２５（Ｏ１５８）株である。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作方法のための微生物宿主細胞は、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｂｏｙｄｉｉ、およびＳｈｉｇｅｌｌａｓｏｎｎｅｉをはじめとする、Ｓｈｉｇｅｌｌａ生物である。

一部の実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するための細菌宿主細胞は、当技術分野において公知の、ならびに／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｗａｋｏｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ａｋｉｂａｉ、Ｂ．ｍａｎｎａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ａｌｖｅｉ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓから選択される、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種の任意の株または亜種である。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作方法のための微生物宿主細胞は、好アルカリ性Ｂａｃｉｌｌｕｓ株、例えば、Ｏ－４（＝ＪＣＭ９１３７＝ＤＳＭ２５１４）株、Ｎ－１（＝ＪＣＭ９１４０＝ＤＳＭ２５２１）株、１７－１（＝ＪＣＭ９１４２＝ＤＳＭ２５２４）株、２７－１（＝ＪＣＭ９１４４＝ＤＳＭ２５２０）株、１３（＝ＪＣＭ９１４５＝ＤＳＭ２５２３）株、Ｋ－１２－５（＝ＪＣＭ９１４９）株、２０２－１（＝ＪＣＭ９１５１）株、Ｃ－１１（＝ＪＣＭ９１５２＝ＤＳＭ１６７３１）株、Ｄ－６（＝ＪＣＭ９１５４）株、２ｂ－２（＝ＪＣＭ９１５５）株、Ｎ－４Ｔ（＝ＪＣＭ９１５６＝ＤＳＭ２５２２）株、１１３９Ｔ（＝ＪＣＭ９１５７＝ＡＴＣＣ４３２２６）株、ＩＣ（＝ＪＣＭ９１５８）株、ＫＸ－６（＝ＪＣＭ９１５９）株、Ｈ－１６７（＝ＪＣＭ９１６０）株、１９９（＝ＪＣＭ９１６３）株、Ｃ－３（＝ＪＣＭ９１６４）株、Ｓ－２（＝ＪＣＭ９１６６）株、ＡＭ－００１（＝ＪＣＭ１０５９６＝ＤＳＭ１６１３０）株および８－１（＝ＪＣＭ１０５９８）株である。

様々な実施形態では、原核生物株と真核生物株の両方を含む、本開示の実施に使用され得る株は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、有限会社ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎａｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）、オランダ微生物保存センター（ＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕＶｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）、および米国農業研究局特許培養株保存機関（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＰａｔｅｎｔＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北部研究センター（ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）（ＮＲＲＬ）などの、いくつかの培養株保存機関から公共的に容易に入手できる。

宿主細胞の形質転換
一部の実施形態では、本開示の方法に利用される構築物は、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはＴｉ媒介遺伝子移入を含む、様々な技法のいずれかを使用して、微生物宿主細胞に導入することができる。特定の方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，１９８６ ”ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”）。他の形質転換方法は、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔を含む。例えば、Ｇｉｅｔｚｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２７：６９－７４（１９９２）；Ｉｔｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．１５３：１６３－１６８（１９８３）；およびＢｅｃｋｅｒａｎｄＧｕａｒｅｎｔｅ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９４：１８２－１８７（１９９１）を参照されたい。一部の実施形態では、形質転換宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
自動化

一実施形態では、本明細書で提供されるキット、組成物および方法は、微生物宿主細胞の遺伝子操作のためにハイスループット（ＨＴＰ）法に組み込まれる。別の実施形態では、本明細書で提供される方法を、ＰＣＴ／ＵＳ１８／３６３６０、ＰＣＴ／ＵＳ１８／３６３３３またはＷＯ２０１７／１００３７７（これらの各々は、あらゆる目的で、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている一式のＨＴＰ分子ツールセットの一部である分子ツールの１つまたは複数を使用して実行して、所望の形質または表現型を有する遺伝子操作された微生物宿主細胞を作出することができる。微生物宿主細胞のゲノムを反復的に編集するための本明細書で提供される方法を使用して生成され得るライブラリーの例としては、プロモーターラダー、ターミネーターラダー、可溶性タグラダー、または分解タグラダーを挙げることができるが、これらに限定されない。本明細書で提供される方法を適応させることができるハイスループットゲノム操作法の例としては、ＰＣＴ／ＵＳ１８／３６３６０、ＰＣＴ／ＵＳ１８／３６３３３またはＷＯ２０１７／１００３７７に記載されているようなプロモータースワッピング、ターミネーター（ストップ）スワッピング、可溶性タグスワッピング、分解タグスワッピングまたはＳＮＰスワッピングを挙げることができるが、これらに限定されない。ハイスループット法は、自動化することができ、ならびに／またはロボット工学および液体処理プラットフォーム（例えば、当技術分野において公知のプレートロボット工学プラットフォームおよび液体処理機）を利用することができる。ハイスループット法は、例えばマイクロタイタープレートなどの、マルチウェルプレートを利用することができる。

一部の実施形態では、本開示の自動化方法は、ロボットシステムを含む。本明細書で概要が示されるシステムは、一般に、９６または３８４ウェルマイクロタイタープレートの使用に関するが、当業者には理解されるように、任意の数の、異なるプレートまたは構成を使用することができる。加えて、本明細書で概要が示されるステップのいずれかまたは全てを自動化することができ、したがって、例えば、システムを完全にまたは部分的に自動化することができる。本明細書で提供される方法および組成物に適合するロボットシステムは、ＰＣＴ／ＵＳ１８／３６３６０、ＰＣＴ／ＵＳ１８／３６３３３またはＷＯ２０１７／１００３７７に記載されているものであり得る。

キット
上記の、プラスミドの編集もしくはプラスミドの微生物宿主細胞から排除またはそれに由来するライブラリーの生成のための方法を実施するためのキットも、本開示により提供される。キットは、前記方法を行うために必要な試薬（例えば、修復断片および／またはｇＲＮＡを含むプラスミド；基準微生物宿主細胞）の全てを含有する混合物を含むことができる。一実施形態では、対象キットは、（ｉ）１つまたは複数の遺伝子編集を含む第１の修復断片と選択マーカー遺伝子とを含む第１のプラスミドのプール、（ｉｉ）プラスミドの各々の追加のプールが、１つまたは複数の追加の遺伝子編集の配列を含む追加の修復断片と、前のプラスミドに導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子とを含むような、プラスミドの１つまたは複数の追加のプール、および（ｉｉｉ）必要に応じて、微生物宿主細胞を、含有し得る。第１の修復断片および／または各々の追加の断片は、１つまたは複数の遺伝子編集に隣接する相同アームをさらに含むことができる。各々の修復断片（第１のおよび／または各々の追加の修復断片）上の相同アームは、微生物宿主細胞内の核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）内の遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含むことができる。各々の修復断片（第１のおよび／または追加の修復断片）上に存在する相同アームは、各々の他の修復断片上の相同アームと同じ遺伝子座を標的にすることができる。各々の修復断片（第１のおよび／または追加の修復断片）上に存在する相同アームは、各々の他の修復断片上の相同アームのような異なる遺伝子座を標的にすることができる。各々の修復断片（第１のおよび／または追加の修復断片）上に存在する相同アームは、別の修復断片上の相同アームの１つまたは複数と同じ遺伝子座を標的にすることができる。

一実施形態では、対象キットは、（ｉ）１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含む第１の修復断片と選択マーカー遺伝子とのプール、（ｉｉ）第１の修復断片上に存在する１つまたは複数の遺伝子編集の各々と対合しているガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｉｉｉ）各々の追加の修復断片が１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含むような１つまたは複数の追加の修復断片、および前の修復断片に導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子、（ｉｖ）各々の追加の修復断片上に見られる各々の追加の遺伝子編集ごとの追加のｇＲＮＡ、および（ｖ）必要に応じて、微生物宿主細胞を、含有し得る。一実施形態では、各々の修復断片およびその対合ｇＲＮＡは、同じプラスミド上に存在する。一実施形態では、各々の修復断片およびその対合ｇＲＮＡは、別個のプラスミド上に存在する。一実施形態では、各々の修復断片およびその対合ｇＲＮＡは、核酸の同じ線状断片上に存在する。一実施形態では、各々の修復断片およびその対合ｇＲＮＡは、核酸の別個の線状断片上に存在する。各々の第１の修復断片および／または各々の追加の断片は、１つまたは複数の遺伝子編集に隣接する相同アームをさらに含むことができる。各々の修復断片（第１のおよび／または各々の追加の修復断片）上の相同アームは、微生物宿主細胞内の核酸（例えば、ゲノム、プラスミドなど）内の遺伝子座と相補的なまたは相同の配列を含むことができる。各々の修復断片（第１のおよび／または追加の修復断片）上に存在する相同アームは、各々の他の修復断片上の相同アームと同じ遺伝子座を標的にすることができる。各々の修復断片（第１のおよび／または追加の修復断片）上に存在する相同アームは、各々の他の修復断片上の相同アームのような異なる遺伝子座を標的にすることができる。各々の修復断片（第１のおよび／または追加の修復断片）上に存在する相同アームは、別の修復断片上の相同アームの１つまたは複数と同じ遺伝子座を標的にすることができる。

一部の場合には、キットは、編集された微生物宿主細胞の遺伝子型決定のための試薬（例えば、コロニーＰＣＲおよび／または制限断片分析のための試薬）および／または表現型試験のための試薬をさらに含む。

一実施形態では、本明細書で提供されるキットは、異種組換え系を微生物宿主細胞に導入するための、異種組換え系のタンパク質のセットをコードする核酸を（例えば、プラスミド、線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはインテグロンとして）さらに含む。一実施形態では、本明細書で提供されるキットは、異種組換え系を微生物宿主細胞に導入するために異種組換え系のタンパク質のセットをさらに含む。異種組換え系は、ラムダレッド組換え系；ＲｅｃＥＴ組換え系；Ｒｅｄ／ＥＴ組換え系；ラムダレッド組換え系、Ｒｅｄ／ＥＴ組換え系もしくはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せから選択することができる。

別の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、部位特異的制限酵素を微生物宿主細胞に導入するための、１つまたは複数の部位特異的制限酵素をコードする核酸を（例えば、プラスミド、線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはインテグロンとして）さらに含む。一実施形態では、本明細書で提供されるキットは、１つまたは複数の部位特異的制限酵素を微生物宿主細胞に導入するために１つまたは複数の部位特異的制限酵素をさらに含む。１つまたは複数の部位特異的制限酵素は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択することができる。一実施形態では、１つまたは複数の部位特異的エンドヌクレアーゼは、微生物宿主細胞のゲノム内の第１の遺伝子座および／または別の遺伝子座にある配列を切断する、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１およびＭＡＤ７、またはこれらのホモログ、オルソログもしくはパラログから選択することができる。

キットの構成要素が１つの容器内に兼備されることもあり、または各々の構成要素がその独自の容器内に存在することもある。例えば、キットの構成要素は、単一の反応管内にまたは１つもしくは複数の異なる反応管に兼備されることがある。

上述の構成要素に加えて、対象キットは、対象方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための使用説明書をさらに含む。対象方法を実施するための使用説明書は、一般に、好適な記録媒体に記録される。例えば、使用説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷されることもある。しかるが故に、使用説明書は、キット内に添付文書として存在することもあり、キットまたはその構成要素の容器のラベル表示に（すなわち、包装または分包に付随して）存在することなどもある。他の実施形態では、実際の使用説明書は、キット内に存在せず、リモートソースから、例えばインターネット経由で、使用説明書を入手する手段が提供される。この実施形態の一例は、使用説明書を見ることができるおよび／または使用説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。

本発明を、以下の実施例を参照することによりさらに例証する。しかし、上記の実施形態同様、これらの実施例が説明に役立つものであり、これらの実施例をいかなる点においても本発明の範囲を制限すると見なすべきでないことに、留意すべきである。
（実施例１）
対抗選択マーカーの使用を編集ラウンドごとに必要としないＣＲＩＳＰＲによる微生物宿主細胞ゲノムの反復編集のための方法についての原理証明。
目的

本実施例は、編集の各ラウンドにおいて対抗選択可能なマーカーの使用を必要とすることなく微生物宿主細胞のゲノム内に複数のゲノム編集をスタッキングするためのＣＲＩＳＰＲ媒介方法の使用を記載する。本実施例で利用する方法の一般的なワークフローは、図１に示すものであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびラムダレッド組換え機構を含む微生物宿主株（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ株）における３ラウンドの連続ゲノム編集の各々において３つの別個のゲノム遺伝子座のうちの１つに遺伝子編集を導入することを必要とした。３つの別個のゲノム遺伝子座の各々についての遺伝子編集は、選択可能なマーカー遺伝子（すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＫａｎＲ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈｌｏｒＲ）またはテトラサイクリン排出トランスポーター（ＴｅｔＲ））も含む別個の構築物上に各々存在し、構築物の各々を微生物宿主株に１つずつ導入した。第１ラウンドで、ＫａｎＲプラスミドを微生物宿主細胞に導入して形質転換を生じさせ、形質転換体をカナマイシン含有培地（Ｋａｎ）での増殖によって選択した。次いで、抗生物質耐性形質転換体をプレートから別々に採取し（サブセットの遺伝子型を決定し）、ＫａｎＲプラスミドを選択しない培地中で一晩培養し、第２ラウンドの形質転換に備えた。第２ラウンドの形質転換では、ＣｈｌｏｒＲプラスミドを、第１ラウンドからの選択された形質転換体に導入して形質転換を生じさせ、クロラムフェニコール含有培地（ＣＭＰ）での増殖によって選択した。第２ラウンドからの選択された形質転換体におけるＴｅｔＲプラスミドの第３ラウンドのために同じサイクルを行なった。ＴｅｔＲプラスミドの形質転換後、対抗選択のラウンドを必要に応じて適用して、細胞の集団内の任意の残存プラスミドを能動的に排除してもよい（例えば、図１および９の「２」）。図１および９に示すように、対抗選択は、受動的または能動的のどちらかであった。ラウンド１と２の間およびラウンド２と３の間の受動的対抗選択（図１および９の「１」）は、抗生物質選択（すなわち、非選択的培地での増殖）からの形質転換体の放出により媒介された。抗生物質選択圧の非存在下では、プラスミドは複製機構（すなわち、タンパク質）について競合し、その結果、細胞から失われることになる。ラウンド３の後の能動的対抗選択（図１および９の「２」）は、ｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミド中に存在するｓａｃＢまたはｐｈｅＳなどのマーカーの使用により媒介され得る。
材料および方法

天然Ｃａｓ９プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓ９遺伝子と、アラビノース誘導性プロモーターに作動可能に連結されたオペロン内のラムダレッド組換え系からのタンパク質のセット（すなわち、ベータ、ｇａｍおよびｅｘｏ）とを含む、Ｃａｓ９／ラムダレッドプラスミドを、当技術分野において公知のクローニング方法を使用して構築した。次いで、Ｃａｓ９／ラムダレッドプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株に導入して形質転換を生じさせた。

図１に示す反復ＣＲＩＳＰＲ編集ワークフローを実行し、その有効性を試験するために、３セットのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドを構築した。第１のセットのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミド（すなわち、ＫａｎＲプラスミド）は、Ｅ．ｃｏｌｉ株内のｃａｄＡ遺伝子を標的にするｐＲプロモーターの制御下にあるｓｇＲＮＡカセットと、ｃａｄＡ遺伝子の８９３ｂｐ欠失を導入するための欠失カセットと、形質転換に成功したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞にカナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子と、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における維持のための複製起点とを有した。第２のセットのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミド（すなわち、ＣｈｌｏｒＲプラスミド）は、Ｅ．ｃｏｌｉ株内のｍａｅＡ遺伝子を標的にするｐＲプロモーターの制御下にあるｓｇＲＮＡカセットと、ｍａｅＡ遺伝子の１３７５ｂｐ欠失を導入するための欠失カセットと、形質転換に成功したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞にクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）耐性を付与するためのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子と、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における維持のための第１のセットのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドと同じ複製起点とを有した。第３のセットのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミド（すなわち、ｔｅｔＲプラスミド）は、Ｅ．ｃｏｌｉ株内のｍａｅＢ遺伝子を標的にするｐＲプロモーターの制御下にあるｓｇＲＮＡカセットと、ｍａｅＢ遺伝子の１５４３ｂｐ欠失を導入するための欠失カセットと、形質転換に成功したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞にテトラサイクリン耐性を付与するためのテトラサイクリン排出トランスポーター遺伝子と、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における維持のための第１および第２のセットのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドと同じ複製起点とを有した。ｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドの全てのセットは、スクロース含有増殖培地での対抗選択を可能にするためのｓａｃＢ遺伝子も有した。

３セットのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドの各々の調製後、カルベニシリンに対する耐性を付与するためのベータ－ラクタマーゼ遺伝子を有する、Ｃａｓ９／ラムダレッドプラスミドを含有する基準Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０株にＫａｎＲプラスミドに導入して形質転換を生じさせ、得られたラウンド１形質転換体を、カナマイシンおよびカルベニシリン含有増殖プレートでの増殖によって選択した。選択培地プレートの各々での増殖は、典型的には一晩である、個々のコロニーが採取可能になるまでの期間の増殖であった。次いで、いくつかのＫａｎおよびＣｌｉｎ耐性コロニーを、所望の編集の遺伝子型判定のために採取し、選択培地上にパッチしてＫａｎＲ、ＣｌｉｎＲまたはＴｅｔＲプラスミドの存在を判定し、カルベニシリンを含有する培地中で一晩増殖させてＣａｓ９／ラムダレッドプラスミドのみを選択した（図２を参照されたい）。ラウンド１形質転換体から得られた一晩培養物からコンピテント細胞を作製し、Ｃａｓ９／ラムダレッドプラスミドとＫａｎＲプラスミドとを含有する得られたコンピテントなラウンド１形質転換体をＣｈｌｏｒＲプラスミドで形質転換し、ラウンド２形質転換体をクロラムフェニコールおよびカルベニシリン含有プレートでの増殖により選択した。次いで、いくつかのＣｈｌｏｒおよびＣｌｉｎ耐性コロニーを、所望の編集の遺伝子型判定のために採取し、選択培地上にパッチしてＫａｎＲ、ＣｌｉｎＲまたはＴｅｔＲプラスミドの存在を判定し、カルベニシリンを含有する培地中で一晩増殖させてＣａｓ９／ラムダレッドプラスミドのみを選択した（図２を参照されたい）。ラウンド２形質転換体から得られた一晩培養物からコンピテント細胞を作製し、Ｃａｓ９／ラムダレッドプラスミドとＣｈｌｏｒＲプラスミドとを含有する得られたコンピテントなラウンド２形質転換体（サブセットはＫａｎＲプラスミドも含有し得る）をＴｅｔＲプラスミドで形質転換した。テトラサイクリンおよびカルベニシリン含有プレートでの増殖によってラウンド３形質転換体を選択した。いくつかのＴｅｔＲおよびＣｌｉｎ耐性コロニーを採取し、ラウンド１、２および３からの編集について遺伝子型判定し（図４を参照されたい）、選択培地上にパッチしてＫａｎＲ、ＣｌｉｎＲまたはＴｅｔＲプラスミドの存在を判定した（図２を参照されたい）。改変Ｅ．ｃｏｌｉ株が、プロトコール中に導入された遺伝子編集の各々を含み、前に導入されたｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドの全てを欠いている場合、適切な量の対抗選択剤（例えば、５％スクロース；図１および９を参照されたい）を含有する培地中でコロニーを一晩増殖させることができることに留意されたい。
結果

本実施例の目的の１つは、第１の選択可能なマーカーを含有するプラスミドが、第２の選択可能なマーカーを含有するプラスミドの導入および選択によって、前記第１の選択可能なマーカーを含有するプラスミドを保有する微生物宿主細胞から排除または除去されることになるかどうかを試験することであった。このいわゆる「受動的」対抗選択プロセスにおける、第２の選択可能なマーカーを含有するプラスミドの導入および選択による、第１の選択可能なマーカーを含有するプラスミドの喪失は、第１の選択可能なマーカーを含有するプラスミドの選択の欠如、およびＤＮＡ複製機構についての競合に起因して起こると仮定した。図２に示すように、前に導入された選択可能なマーカーを含有するプラスミドの宿主細胞からの喪失は、実際には起こった。詳細には、図２は、異なる抗生物質選択マーカーと同一の複製起点を含有する新たなプラスミドでの形質転換によるプラスミド排除の例を示した。このことは、細胞が、ｔｅｔＲプラスミドを強く発現したが、前の形質転換で導入されたＣｈｌｏｒＲプラスミドとＫａｎＲプラスミドの両方の明らかに失った、図２の右手側の一番下の横列におけるペトリ皿の写真に、特に示されている。

微生物宿主株に導入されたプラスミドは、新たな形質転換および選択の各々によって漸進的失われた（図２を参照されたい）が、宿主細胞に各々のプラスミドによって導入された遺伝子編集（ｃａｄＡ、ｍａｅＡおよびｍａｅＢ遺伝子の欠失）は、図４における３ラウンドの形質転換後のＥ．ｃｏｌｉコロニーからのコロニーＰＣＲ反応に関するゲル泳動の画像から分かるように、明らかに有効であった。詳細には、図４は、本明細書に記載するｓｇＲＮＡ修復断片プラスミドのセットでの３ラウンドの連続形質転換後の個々のコロニーにおけるｃａｄＡ、ｍａｅＡおよびｍａｅＢ欠失の存在を示した。編集効率は、図３に示すように連続形質転換ラウンド間で異なったが、この可変編集効率は、標的にされる遺伝子座および／またはそれに導入される遺伝子編集と相関関係があり得ることに留意されたい。例えば、ｃａｄＡ欠失は毒性であることがあり、このことが、このラウンドの形質転換のより低い編集効率の原因となり得る。

全体として、ここで提示する結果は、微生物宿主細胞内への遺伝子編集の反復スタッキングを、本開示を通して提供するように、編集の各ラウンドにおいて対抗選択可能なマーカーの活発な発現および利用を必要とすることなく行なうことができることを明確に実証した。
（実施例２）
微生物宿主株に前に導入されたプラスミドを排除するための方法の原理証明。
目的

本実施例は、第１のプラスミドがもはや存在しない最終株を得ることを目的とした微生物株内に存在する前記第１のプラスミドの除去であって、それによって前記第１のプラスミドを前記微生物株から有効にキュアリングする除去を記載する。
材料および方法

図５Ａ～５Ｄに示すように、第１のプラスミドが微生物株内にもはや存在しない最終株を得るために、第１のプラスミドと同じ複製起点と、抗生物質選択マーカーと、必要に応じた対抗選択可能なマーカーとを含有する第２のプラスミドを株に導入して形質転換を生じさせる（図５Ａ）。第２のプラスミドを取り込んだ形質転換体を、選択培地に播種することにより選択する（図５Ｂ）。得られた株を、第２のプラスミドを維持するための選択下で増殖させると、すでに存在する第１のプラスミドが失われることになる（図５Ｃ）。次いで、この第２のプラスミドを、プラスミドに対する抗生物質選択からの解放および／または必要に応じた対抗選択可能なマーカーの能動的対抗選択により喪失させ、その結果、第１、第２、または任意の追加のプラスミドがない最終株を得ることができる（図５Ｄ）。第１のプラスミドが、微生物株に、例えば、本明細書で提供するおよび／もしくは当技術分野において公知であるような遺伝子編集方法の過程などで、前に導入されたプラスミドであることもあり、または微生物株に本来備わっているプラスミドであることもあることに留意されたい。
（実施例３）
多重化方式での反復編集のための方法の原理証明。
目的

本実施例は、遺伝子編集の各ラウンドにおいて対抗選択可能なマーカーの使用を必要とすることなく微生物宿主細胞のゲノム内に複数のゲノム編集をスタッキングすることを目的として一連の連続する遺伝子編集ラウンドの各々のラウンドにおいて１つより多くの編集を微生物宿主細胞またはそれに由来する形質転換体に付与するために、実施例１で記載した反復編集方法を拡大するための、ＣＲＩＳＰＲ媒介方法の使用を記載する。本実施例での手法は、各々の導入されるプラスミドが、＞１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）／修復断片対を含有することを除いて、実施例１におよび本開示を通して他の箇所に記載するものと同様である。
材料および方法

本実施例で使用する微生物細胞は、実施例１で生成および使用した同じＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株である。

異なる３セットの編集プラスミドをＥ．ｃｏｌｉにおける反復マルチプレックス編集のために調製する。同じプラスミド骨格をセットごとに使用する。宿主細胞のゲノムに編集ラウンドごとに２つの異なる編集を導入することを目的として、ラウンドごとに導入される編集が前の編集ラウンドで導入された編集と異なる編集を３ラウンド行なう。各々の編集プラスミドは、２つの異なるｓｇＲＮＡ／修復断片対を含有する。全ての編集プラスミドは、同じ複製起点を含有し、編集プラスミドの異なるセット各々は、異なる抗生物質マーカーを含有する（本実施例では、プラスミドセット１＝ＫａｎＲ、プラスミドセット２＝ＣｈｌｏｒＲ、プラスミドセット３＝ＴｅｔＲ）。したがって、ＫａｎＲ、ＣｈｌｏｒＲおよびＴｅｔＲプラスミドの各々は、異なる複数のｓｇＲＮＡ／修復断片対を含有する。

第１の編集ラウンドについては、上の実施例１に記載のＣｌｉｎＲＣａｓ９／ラムダレッドプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０基礎株にＫａｎＲプラスミド（セット１）を導入して形質転換を生じさせる。形質転換体を、カナマイシンおよびカルベニシリンに対する選択性のある培地に播種することにより選択する。いくつかのＫａｎおよびＣｌｉｎ耐性コロニーを遺伝子型決定のために採取し、カルベニシリンを含有する培地中で一晩増殖させてＣａｓ９／ラムダレッドプラスミドのみを選択する。ラウンド１形質転換体から得られた一晩培養物からコンピテント細胞を作製し、Ｃａｓ９／ラムダレッドプラスミドとＫａｎＲプラスミドとを含有する得られたコンピテントなラウンド１形質転換体をＣｈｌｏｒＲプラスミド（セット２）で形質転換する。ラウンド２形質転換体をクロラムフェニコールおよびカルベニシリン含有プレートでの増殖によって選択する。いくつかのＣｈｌｏｒＲおよびＣｌｉｎ耐性コロニーを遺伝子型決定（ＣｈｌｏＲ編集とＫａｎＲ編集の両方の遺伝子型決定）のために採取し、カルベニシリンを含有する培地中で一晩増殖させてＣａｓ９／ラムダレッドプラスミドのみを選択する。ラウンド２形質転換体から得られた一晩培養物からコンピテント細胞を作製し、Ｃａｓ９／ラムダレッドプラスミドとＣｈｌｏｒＲプラスミドとを含有する得られたコンピテントなラウンド２形質転換体（サブセットはＫａｎＲプラスミドも含有し得る）をＴｅｔＲプラスミド（セット３）で形質転換する。テトラサイクリンおよびカルベニシリン含有プレートでの増殖によってラウンド３形質転換体を選択する。いくつかのテトラサイクリン耐性コロニーを遺伝子型決定（ＴｅｔＲ、ＣｈｌｏＲおよびＫａｎＲ編集の遺伝子型決定）のために採取し、カルベニシリンを含有する培地中で一晩増殖させてＣａｓ９／ラムダレッドプラスミドのみを選択する。対抗選択のラウンドを必要に応じて適用して、細胞の集団内の任意の残存プラスミドを能動的に排除してもよい（例えば、図１および９の「２」）。例えば、一部の場合には、最後の編集ラウンド後にカルベニシリンのみを含有する培地中で細胞を増殖させるのではなく、適切な量の対抗選択剤（例えば、５％スクロース）も含有する培地中で細胞を一晩増殖させて、ｓｇＲＮＡ／修復断片対を含有する導入されたプラスミドの全てを欠いている株を生成する。得られる細胞集団は、複数の異なる遺伝子編集、典型的には、本実施例では１細胞当たり６つの異なる編集、を有する個々の細胞を含み、これらの異なる編集は、編集ラウンドごとに、プラスミドセットごとに存在する異なるｓｇＲＮＡ／修復断片対の一部または全てに相当する。
（実施例４）
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプール型ＣＲＩＳＰＲ媒介編集の原理証明。
目的

本実施例は、編集の組合せ（すなわち、生物多様性）を含むＥ．ｃｏｌｉの混合集団を作出するためにＥ．ｃｏｌｉ宿主株のゲノムを編集するためのプール型ＣＲＩＳＰＲ媒介方法の使用を記載する。本実施例では、ＣＲＩＳＰＲ媒介編集を使用して、複数のゲノム遺伝子座にわたって遺伝子編集の様々な組合せを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞の集団を生成することができるかどうかを判定するために、複数のゲノム遺伝子座のうちの１つに可能性のある複数の遺伝子編集のうちの１つを各々が含む修復断片の混合物を含有するプールを、Ｅ．ｃｏｌｉ基準株に導入した。
材料および方法

本実施例で使用する微生物細胞は、実施例１で生成および使用した同じＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株であった。

加えて、上で生成したＥ．ｃｏｌｉ基準株にプールとして導入するためのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドの収集物を調製した。各々のプラスミドは、（１）カセットにコードされたｓｇＲＮＡの構成的発現を助長するｐＲプロモーターに作動可能に連結させた３つのゲノム遺伝子座（すなわち、ｃａｄＡ、ｍａｅＡまたはｍａｅＢ）のうちの１つを標的にするｓｇＲＮＡを含むｓｇＲＮＡカセット；（２）３つの遺伝子座のうちの１つのための望ましい遺伝子編集を含む修復断片であって、その遺伝子座のための適切なｓｇＲＮＡに対応する修復断片（９つの修復断片（すなわち、ｃａｄＡにおける３つの異なる欠失：５００ｂｐ欠失、８９０ｂｐ欠失および１５００ｂｐ欠失；ｍａｅＡにおける３つの異なる欠失：１０００ｂｐ欠失、１３００ｂｐ欠失および１５００ｂｐ欠失）のうちの１つ）；（３）任意の必要とするクローニングステップ中に使用するための、ならびに上で生成した基準株へのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドの導入後にＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を選択するための、カナマイシンに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子；（４）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド維持のためのｃｏｌＥ１複製起点；および（５）Ｅ．ｃｏｌｉのためのｓａｃＢ対抗選択マーカーを含んだ。調製後、９つのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドを同じ比率で混合して、上で生成したＥ．ｃｏｌｉ基準株への導入のためのプールを生成した。

上記試薬の調製後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９とラムダレッド組換え機構とを含有するＥ．ｃｏｌｉ基準株を、各々が互いに同じ比率の９つのｓｇＲＮＡ／修復プラスミドのプールで形質転換した。上述の通り、９つのｓｇＲＮＡ／修復プラスミドの各々は、３つのｓｇＲＮＡ（すなわち、３つの遺伝子座をこの実験では標的にした：ｃａｄＡ、ｍａｅＡ、またはｍａｅＢ）のうちの１つ、および９つの修復断片（すなわち、ｃａｄＡにおける３つの異なる欠失：５００ｂｐ欠失、８９０ｂｐ欠失および１５００ｂｐ欠失；ｍａｅＡにおける３つの異なる欠失：１０００ｂｐ欠失、１３００ｂｐ欠失および１５００ｂｐ欠失）のうちの１つを含有した。形質転換反応を１８℃または３０℃のどちらかでインキュベートし、１時間（１８℃と３０℃の両方での培養）後または３時間（３０℃での培養）後のどちらかに回収し、カナマイシンを含有する培地に播種した。コロニーを採取し、コロニーＰＣＲにより成功した編集のスクリーニングおよび遺伝子型判定を行った。
結果

図６は、採取したコロニーにおいて試験した３つの異なる条件（増殖温度／回復時間）について観察された編集を描示する。これらの条件のうちの２つ（３０℃－１時間回復、および３０℃－３時間回復）で、９つの意図した編集のうちの４つが同定された。最後の条件（１８℃－１時間回復）では、９つの意図した編集のうちの５つが同定された。全体としては、図６に描示する結果は、プール型ＣＲＩＳＰＲ媒介編集を使用して、複数のゲノム遺伝子座にわたって遺伝子編集の特異的組合せを含有するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞の集団を生成することができることを実証する。
（実施例５）
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるプール型ＣＲＩＳＰＲ媒介編集の原理証明。
目的

本実施例は、編集の組合せ（すなわち、生物多様性）を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの混合集団を作出するためにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主株のゲノムを編集するためのプール型ＣＲＩＳＰＲ媒介方法の使用を記載する。本実施例では、ＣＲＩＳＰＲ媒介編集を使用して、複数のゲノム遺伝子座にわたって遺伝子編集の様々な組合せを含有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の集団を生成することができるかどうかを判定するために、複数のゲノム遺伝子座のうちの１つに可能性のある複数の遺伝子編集のうちの１つを各々が含む修復断片とｇＲＮＡの混合物を含有するプールを、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ基準株に導入した。
材料および方法

本実施例での実験を行うために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞のゲノム内での構成的発現を助長するプロモーター（例えば、Ｐｔｒｃ）に作動可能に連結させたＣａｓ９ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込むことにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ基準株を生成した。異種組換え系をコードするタンパク質または遺伝子のセットもＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ基準株に導入することができる。異種組換えタンパク質のセットをコードする遺伝子をオペロン内に発現させ、プラスミド内に含有され得るまたはゲノムに組み込むことができる誘導性プロモーターによって誘導することができる。

加えて、上で生成したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ基準株にプールとして導入するためのｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドの収集物を調製した。各々のプラスミドは、（１）カセットにコードされたｓｇＲＮＡの構成的発現を助長するプロモーター（例えば、Ｐｃｇ２６１３）に作動可能に連結させたいくつかのゲノム遺伝子座のうちの１つを標的にするｓｇＲＮＡを含むｓｇＲＮＡカセット；（２）いくつかの遺伝子座のうちの１つのための望ましい遺伝子編集（ＰＲＯＳＷＡＰＳのためのプロモーター、またはデグロン）を含む修復断片；（３）ｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドの調製中にＥ．ｃｏｌｉにおけるクローニングステップで使用するための、およびｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドの導入後にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ形質転換体を選択するための、適切な選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）；（４）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド維持のための適切な複製起点（例えば、ｃｏｌＥ１またはｐ１５Ａ）；および（５）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるプラスミド維持のための適切な複製起点（例えば、ＣＡＳＥ１またはＣＧ１）を含んだ。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのための適切な対抗選択マーカー（例えば、ｓａｃＢ、ｐｈｅＳなど）もｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドに含めることができる。調製後、ｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドを同じ比率で混合して、上で生成したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ基準株への導入のためのプールを生成した。図７に示すように、１７の異なるｓｇＲＮＡ／修復断片プラスミドプールを調製した。各々のプールは、３～１７の間のプラスミドを含有し、所与のプール内の全てのプラスミドは、ＰＲＯＳＷＡＰのためのプロモーター、またはデグロンのどちらかである、同じタイプの編集を含有していた。所与のプール内の全てのプラスミドは、異なる遺伝子座を標的にする。図７に示すように、１７のプールを３００ｎｇ（図の右側）および９００ｎｇ（図の左側）で含めた。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入して形質転換を生じさせる前に、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを全てのプラスミドプールから調製し、得られた配列読み取りデータを使用して、図７に示すように各々のプールに存在する編集プラスミドの比率を同定した。図７中、各々の円グラフはプールを表し、各々の色は、所与のプール内のユニークなｓｇＲＮＡ／修復プラスミドを表し、「円グラフの扇形」のサイズは、所与のプール内の読み取りデータ（すなわち、プラスミド）の数に比例することに留意されたい。

上記試薬の調製後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ基準株を、図７に示す１７のプールのうちの１つの３００ｎｇ（図の右側）または９００ｎｇ（図の左側）を用いて形質転換した。形質転換は、３０Ｃで３時間後に回復し、カナマイシンを含有する培地にそれらを播種した。形質転換体のコロニーを採取し、編集を次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により評定した。ＮＧＳスクリーニング手順は、意図した標的遺伝子座を同定するために、採取したコロニーに含有されるｓｇＲＮＡ／修復プラスミドのＰＣＲ増幅およびその後のＮＧＳシークエンシングを必要とした。次に、この同定情報を使用して、標的遺伝子座プライマーを各々の採取したコロニーと対応させた。標的遺伝子座プライマーを、ｓｇＲＮＡ／修復プラスミド中に存在する相同アームの外側にアニールするように設計した。次に、各々のコロニーからの標的遺伝子座を増幅し、各々のアンプリコンのタグメンテーションライブラリーを構築し、各々のアンプリコンのタグメンテ－ションライブラリーをシークエンシングして、各々の遺伝子座への意図した編集の組込みが成功したかどうかを判定した。
結果

図８に示すように、単一プールから回収した個々の編集の最大数は８であった。図８中、各々の色は、異なる編集成功を表し、黒色と白色の縞模様は、不確定のシークエンシングデータを表し、白色は、野生型を示し、黒色は、プロセス失敗を示す。全体としては、図８に描示する結果は、プール型ＣＲＩＳＰＲ媒介編集を使用して、複数のゲノム遺伝子座にわたって遺伝子編集の特異的組合せを含有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞の集団を生成することができることを実証する。さらに、実施例４と５の総合結果は、プール型ＣＲＩＳＰＲ編集を一般に原核生物に使用することができることを実証する。
（実施例６）
プール型方式での反復編集のための方法の原理証明
目的

本実施例は、編集の組合せ（すなわち、生物多様性）の収集物を作出するために、実施例１および３に記載した反復編集方法を拡大するための、ＣＲＩＳＰＲ媒介方法の使用を記載する。これを遂行するために、実施例１および３に記載した反復編集方法ならびに実施例４～５に記載したプール型編集方法を、各々の形質転換または形質転換のラウンドが１つより多くのまたは１つを超える編集プラスミドの導入から構成されるように拡大することができる。

材料および方法
本実施例に記載するプールされた反復編集方法も、実施例１で生成および使用した同じＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株で行なうことができる。

本実施例のプールされた反復編集方法を実行するために、セットごとの各々の編集プラスミが、同じ遺伝子座を標的にする１つのｓｇＲＮＡ／修復断片対（実施例１に記載の基礎反復編集）または複数の遺伝子座を標的にする２つもしくはそれより多くの異なるｓｇＲＮＡ／修復断片対（実施例３に記載のマルチプレックス反復編集）を含むような、編集プラスミドのプールを、編集ラウンド中に各々のセットに使用するような方法で、上の実施例１および３に記載の反復編集を行なう。本実施例の実施形態を図９（「コンビナトリアル変異スタッキング」）に、本明細書に記載するプールされない実施形態（「単一変異スタッキング」）と比較して示す。各々の形質転換後、コロニーをプレートから収集し、組み合わせる－次いで、このコロニーの収集物からコンピテント細胞を調製する。第２の編集ラウンドでは、編集プラスミドの別のプール（ラウンド１とは異なる選択マーカーを含有する）の形質転換を行ない、形質転換体を選択する。ラウンド２からの形質転換体をプレートから収集し、組み合わせ、次いで、コンピテント細胞を調製し、第３の編集プールの形質転換に使用する。ｎラウンドのプールされた形質転換の完了後、個々のコロニーの遺伝子型を決定し、前記コロニーを目的の表現型について試験することができる。形質転換の完了後、対抗選択のラウンドを必要に応じて適用して、細胞の集団内の任意の残存プラスミドを能動的に排除してもよい（例えば、図１および９の「２」）。得られる細胞集団は、細胞ごとに異なる単一の遺伝子編集または複数の異なる遺伝子編集を有する亜集団を含むことになり、これらの異なる編集は、任意の編集ラウンドごとに、プラスミドセットごとに存在する異なるｓｇＲＮＡ／修復断片対の一部に相当する。
（実施例７）
Ｅ．ｃｏｌｉにおける相同組換え（ＨＲ）により媒介されるプール型株ビルドのための方法の原理証明
目的

本実施例は、編集された微生物の一群を作出するための天然の相同組換えの使用を詳述する。本実施例では、各々のプラスミドは、ゲノム内の領域との配列相同性（例えば、左および右相同アーム）を有する。左および右相同アームは、設計した編集（例えば、プロモーターまたは他の配列挿入、置換もしくは欠失）により隔てられている。プラスミドの他の特徴としては、正の選択可能なマーカー（例えば、カナマイシン耐性カセット）、対抗選択可能なマーカー（単数または複数）（例えば、スクロースおよび４－クロロ－フェニルアラニンそれぞれの存在下で毒性を付与する、ＳａｃＢまたはＰｈｅＳ）、およびＲ６Ｋ複製起点が挙げられる。
材料および方法

プールされた株ビルドを使用する株の構築は、一般に、２部からなる。第１に、可能性のある多くの編集のうちの１つを生じさせることができるプラスミドのプールを作製すること、およびそれらをレシピエント微生物に単回で導入して形質転換を生じさせることによる、編集された株のライブラリーの生成。第２に、もしあれば、編集された遺伝子座（単数または複数）の同定。
編集された株のライブラリーの生成

１０プラスミド／プールの６つの異なるプールを各々のプラスミドが等モル量で存在するように調製した。各々のプラスミドは、１ｋｂ相同アームと隣接しているものを付加させるためのプロモーター配列を含有した。プラスミドのこれらのプールをＥ．ｃｏｌｉ株に電気穿孔で導入し、１～３時間、３７℃で、リッチ培地で回復させ、標準的なＥ．ｃｏｌｉ培養方法を使用して単一組換え事象を有するシングルコロニーを選択した。プール型ライブラリー内の偏りを生じさせる（例えば、一部の編集された株が他の編集されたまたは未編集の株よりも高もしくは低頻度になり得るおよび／または速くもしくは遅く増殖し得る）確率を最小にしつつ電気穿孔からの形質転換体の回復を確実にするために、形質転換後の回復時間（すなわち、３７℃で１～３時間）を使用したことに留意されたい。さらに、得られた形質転換体を、プラスミド内に存在しかつ設計した編集に隣接する２つの相同部位のうちの一方でプラスミドと染色体の組換えが起こった形質転換体の選択のために、培地に播種した。

寒天培地を擦り取り、併せたコロニー生物量を液体培地に再浮遊させることにより、単一組換え事象を有するコロニーを一緒にプールした。擦り取りながらおおよそ１００コロニーを一緒にプールして、１０プラスミドの各々のプールから得られるコロニーの多様性を維持した。２５％グリセロールと５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンとを含有するＬｙｓｏｇｅｎｙブロス培地にこれらのコロニーを再浮遊させ、－８０℃で６０分間凍結させ、室温で解凍し、撹拌しながら３０分間、３７℃でインキュベートした。次いで、細胞浮遊液を希釈し、スクロースおよび４－クロロフェニルアラニンを含有する培地（対抗選択可能な培地）に複数の希釈物を播種して、対抗選択遺伝子ｓａｃＢおよびｐｈｅＳにより媒介される第２の組換え事象の発生を誘導し、選択した。プレートを３０℃で２４～３６時間インキュベートした。このことによって、染色体が左または右相同アームのどちらかにおける第２の組換え事象を経た細胞（および次いでコロニー）の誘導および選択が可能になった。第２の組換え事象が第１の組換え事象と同じ相同アームで起こった場合、出発株が再現される。第２の組換え事象が第２の組換え部位で起こった場合、得られた株は、意図した編集を含有していた。したがって、対抗選択培地で増殖するコロニーの集団は、未編集の株も、最初のプラスミドプールに含まれていた編集のうちの１つを各々が含有する編集された株の混合物も含む。
編集された遺伝子座の同定

ゲノムの設計した編集を含有するかまたは元の親遺伝子型を含有する、第２の組換え事象からの得られたコロニーを採取し、液体培地中で一晩、３７℃で増殖させた。編集された遺伝子座を当技術分野において公知のＰＣＲおよび／または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法により同定した。

スクロースおよび４－クロロフェニルアラニン培地で増殖した９６のコロニーのスクリーニング後、細胞に導入した元の１０プラスミドの、その１０プラスミドによってビルドされた、平均４０％～５０％のユニークな編集を、プールされたプラスミド形質転換ごとに回収することができた（図１５を参照されたい）。
（実施例８）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換え修復を使用するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるプール型ゲノム編集の使用
目的

本実施例は、編集されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の一群を作出するための自然相同組換えの使用を詳述する。本実施例では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞に挿入される各々のペイロードは、ゲノム内の領域と配列相同性（例えば、左および右相同アーム）を有する。左および右相同アームは、設計した編集（例えば、欠失）により隔てられている。
材料および方法

プールされたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ビルドを使用する株の構築は、一般に、２部からなった。第１に、ゲノム遺伝子座において三（３）つの可能性のある編集のうちの１つを生じさせることができるプラスミドのプールを作製すること、およびそれらをレシピエントＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞に単回で導入して形質転換を生じさせることによる、編集された株のライブラリーの生成。第２に、特定の遺伝子座に存在する編集の同定。全体としては、このプロセスは、標的にした各々の遺伝子座に三（３）つの明確に異なるペイロードのうちの１つを挿入する過程でＣａｓ９媒介相同組換えを使用して宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を形質転換することを必要とした（図１０Ａを参照されたい）。

宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に存在する抗生物質（すなわち、ノーセオトリシン）耐性マーカー遺伝子をコードする抗生物質選択可能なＣＥＮ．ＡＲＳプラスミドからＣａｓ９を発現させた。六（６）つのゲノム遺伝子座（すなわち、ＡＲＩ１遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨ６遺伝子、ＥＣＭ１３遺伝子、ＭＣＨ５遺伝子またはＰＲＢ１遺伝子）のうちの１つを標的にするスペーサーを含有するｓｇＲＮＡ発現構築物を、宿主細胞に存在するＣａｓ９発現プラスミドへの相同組換えによる組込みのための相同アームを有する線状ＤＮＡ分子として、六（６）つの別個の形質転換の各々（すなわち、１遺伝子座当たり１つの形質転換）において提供した。ＰＣＲを使用して、ペイロードを所望の遺伝子座に標的化する４５ｂｐ相同アームを付加させ、対応するｓｇＲＮＡの標的にされる配列を欠失させ、特定の編集ペイロードで置換することにより、遺伝子座ごとに三（３）つの編集ペイロードをＤＮＡの線状断片として生成した。三（３）つの編集ペイロードは、（１）５’から３’への方向で構成的プロモーターに作動可能に連結させた赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）（ＲＦＰ＿Ｆと名付けた）、（２）３’から５’への方向で構成的プロモーターに作動可能に連結させたＲＦＰ（ＲＦＰ＿Ｒと名付けた）、または（３）５’から３’への方向で構成的プロモーターに作動可能に連結させたＲＦＰおよび５’から３’への方向で異なる構成的プロモーターに作動可能に連結させた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＲＦＰ＿ＧＦＰと名付けた）であった。六（６）つの標的ゲノム遺伝子座の各々について、線状化Ｃａｓ９発現プラスミド、線状ｓｇＲＮＡ発現カセット、および三（３）つのペイロードアンプリコンの等モルプールを化学的形質転換プロセスによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入して形質転換を生じさせ、ノーセオトリシンを含有する培地で形質転換体を選択した。この化学的形質転換プロセスは、Ｇｉｅｔｚ，ｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｙｅａｓｔｂｙｌｉｔｈｉｕｍａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄｃａｒｒｉｅｒＤＮＡ／ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｍｅｔｈｏｄ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３５０（２００１），８７－９６に記載されているような、酢酸リチウム／一本鎖担体ＤＮＡ／ポリエチレングリコール法の使用を必要とした。

各々の形質転換後、コロニーを培養し、当技術分野において公知のＰＣＲおよび／または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法を使用してそれらの遺伝子型を決定した。
結果および結論

図１０Ｂに示すように、各々の形質転換後に試験したコロニー間で、３つ全てのペイロードが検出された。このプロセスは、ペイロードのプールをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集に使用して新しいＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を効率的かつ安価に生成することができることを実証した。
（実施例９）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換え修復を使用するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける反復ゲノム編集の使用
目的

本実施例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞のゲノムを反復的に編集して編集されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の一群を作出するための天然の相同組換えの使用を詳述する。本実施例では、新しい編集ペイロードを導入する各々の連続形質転換ラウンドでＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞に挿入される各々の編集ペイロードは、ゲノム内の領域との配列相同性（例えば、左および右相同アーム）を有する。左および右相同アームは、設計した編集（例えば、欠失）により隔てられている。
材料および方法

材料および方法
プールされたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ビルドを使用する株の構築は、一般に、２部からなった。第１に、ゲノム遺伝子座において三（３）つの可能性のある編集のうちの１つを生じさせることができるプラスミドのプールを作製すること、それらをレシピエントＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞に単回で導入して形質転換を生じさせること、そしてその後、このプロセスを追加の２編集ラウンドにわたって反復することによる、編集された株のライブラリーの生成であって、各々の追加のラウンドが異なる遺伝子座を標的にし、ゲノム遺伝子座の三（３）つの可能性のある編集のうちの１つが特定の追加のラウンドで標的にされる、編集された株のライブラリーの生成。第２に、特定の遺伝子座に存在する編集の同定。全体としては、このプロセスは、図１０Ａに示すように、標的にした各々の遺伝子座に三（３）つの明確に異なるペイロードのうちの１つを挿入する過程でＣａｓ９媒介相同組換えを使用して宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を形質転換すること、しかし、図１１Ａに示すように、このプロセスを追加の２ラウンドにわたって反復することを必要とした。

三（３）ラウンドの形質転換のラウンドごとに、Ｃａｓ９が、宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に存在する三（３）つの抗生物質選択可能なＣＥＮ．ＡＲＳプラスミドのうちの１つから発現された。各々のラウンドの形質転換は、３つの異なる抗生物質選択可能なマーカー遺伝子のうちの１つをコードするＣＥＮ．ＡＲＳプラスミドを使用し、したがって、各々のラウンドは、各々の他のラウンドの形質転換と異なる抗生物質選択可能なマーカー（すなわち、図１１Ａにおけるノーセオトリシン（抗生物質１）、ジェネテシン（Ｇ４１８）（抗生物質２）またはハイグロマイシン（抗生物質３））を有するＣＥＮ．ＡＲＳプラスミドを使用した。各々のラウンドの形質転換において、各々の他のラウンドの形質転換で標的にしたゲノム遺伝子座とは異なるゲノム遺伝子座を標的にするスペーサーを含有するｓｇＲＮＡ発現構築物を、宿主細胞に存在するＣａｓ９発現プラスミドへの相同組換えによる組込みのために、相同アームを有する線状ＤＮＡ分子として提供した。ＰＣＲを使用して、特定のラウンドの形質転換に所望される遺伝子座にペイロードを標的化する４５ｂｐ相同アームを付加させ、対応するｓｇＲＮＡの標的にされる配列を欠失させ、特定の編集ペイロードで置換することにより、三（３）つの可能性のある編集のうちの一（１）つの編集ペイロードを、線状断片として、特定のラウンドの形質転換で標的にされる遺伝子座のために生成した。各々のラウンドの形質転換は、三（３）つの可能性のあるペイロードのうちの別個の一（１）つを導入した。三（３）つの可能性のある編集ペイロードは、（１）５’から３’への方向で構成的プロモーターに作動可能に連結させた赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）（ＲＦＰ＿Ｆと名付けた）、（２）３’から５’への方向で構成的プロモーターに作動可能に連結させたＲＦＰ（ＲＦＰ＿Ｒと名付けた）、または（３）５’から３’への方向で構成的プロモーターに作動可能に連結させたＲＦＰおよび５’から３’への方向で異なる構成的プロモーターに作動可能に連結させた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＲＦＰ＿ＧＦＰと名付けた）であった。

図１１Ｂに示すように、形質転換のラウンドごとに、線状化Ｃａｓ９発現プラスミド、線状ｓｇＲＮＡ発現カセットおよび特定の編集ペイロードを、実施例８で利用した化学的形質転換プロセスによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入して形質転換を生じさせ、特定のラウンドの形質転換のための適切な抗生物質（すなわち、抗生物質１、２または３）を含有する培地で形質転換体を選択した。第１の形質転換は、硫酸ノーセオトリシン（抗生物質１）選択を使用して行ない、第２の形質転換は、ジェネテシンＧ４１８（抗生物質２）選択を使用して行ない、第３の形質転換は、ハイグロマイシン（抗生物質３）選択を使用して行なった。第１の抗生物質（抗生物質１）を用いる最初のラウンドの形質転換および選択の後、コロニーを液体中で２時間培養し、コンピテントにし、次いで、第２の編集ラウンドでｓｇＲＮＡカセット／編集ペイロードの第２のセットを使用して形質転換した。第２の編集ラウンドからの形質転換体を、第２の抗生物質（抗生物質２）を使用して固形培地で選択し、次いで、液体中で培養し、コンピテントにし、３回目はｓｇＲＮＡ／編集ペイロードの第３のセットで形質転換し、第３の抗生物質（抗生物質３）を使用して選択した。第３の編集ラウンド後、コロニーを培養し、当技術分野において公知のＰＣＲおよび／または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法を使用してそれらの遺伝子型を決定した。
結果および結論

図１１Ｃに示すように、旧来の形質転換後に形質転換の迅速な反復により導入した２つのゲノム編集の遺伝子型決定は、遺伝子型決定した２８コロニーの１７．８％が、反復した編集の両方を含有することを示した。このプロセスは、反復プロセスで導入されたペイロードをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集に使用して新しいＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を効率的かつ安価に生成することができることを実証した。
（実施例１０）
プール型プラスミド反復スタッキング（ＰＰＩＳ）の原理証明
目的

本実施例は、編集ラウンドごとに単一プールされた形質転換から多くの遺伝子型を生成するためのプールされたプラスミド反復スタッキング（ＰＰＩＳ）の使用を詳述する。個々にプラスミドの形質転換を行なうのではなく、本実施例では、４プラスミドのプールを宿主細胞に導入して形質転換を生じさせ、プラスミドを排除し、そしてその後、プールし、主培養物への接種に使用した。次いで、主培養物を、４プラスミドのプールを使用するプロセスの反復に供した（図１２Ａを参照されたい）。

材料および方法
全体としては、プールされたプラスミド反復スタッキング（ＰＰＩＳ）のために、編集ペイロードを含有する複数のプラスミド（ｐＥＤＩＴプラスミド）を混合し、複数の編集ラウンドにおいてＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を含む培養物の形質転換に使用した（図１２Ａを参照されたい）。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の形質転換の前に、ｐＣＵＴ２．２プラスミドを前記宿主細胞に導入した。ｐＣＵＴ２．２プラスミドは、Ｃａｓ９と、リコンビニアリング機構と、カルベニシリン耐性カセットと、温度感受性複製起点とを含有する、複製型プラスミドである。ｐＣＵＴ２．２プラスミドのＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞への導入後、編集ペイロードを各々が含有する４プラスミドのプールを混合し、ｐＣＵＴ２．２プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に、四（４）つの独立した逐次的なラウンドの各々の形質転換で導入した。各々の逐次的なラウンドの形質転換で導入された４プラスミドのプールは、四（４）つのｐＥＤＩＴプラスミドを含有し、各々のｐＥＤＩＴプラスミドは、相同アームを有する編集ペイロードと、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞内の特定の遺伝子座を標的にする対応するｓｇＲＮＡとを含んでいた。各々のラウンドの形質転換後、特定のラウンドの形質転換で導入されたｐＥＤＩＴプラスミドを、そのラウンドの形質転換体から排除し（すなわち、能動的対抗選択またはその代わりに受動的対抗選択（すなわち、非選択培地での増殖）を使用する）、次いで、排除された形質転換体をプールし、その後、主培養物への接種材料として使用し、次いで、その主培養物を次の逐次的な編集ラウンドに供した。最終編集ラウンド後、ｐＣＵＴ２．２プラスミドを、その温度感受性複製起点を使用して排除した。

より具体的には、以下の方法を使用してＰＰＩＳプロセスを実施した：
（１）コンピテント細胞調製のための培養：

種：基本編集株を５ｍＬのＬＢＣｌｉｎ１００に接種した。３０℃、１６０ｒｐｍで一晩、振盪した。

主培養物：種培養物のＯＤ６００を測定し、約０．０４の出発ＯＤ６００（基本編集株の倍加時間に依存する）で１００ｍＬのＬＢＣｌｉｎ１００を接種した。１８℃、１６０ｒｐｍで約１６時間、振盪した。（目標は、培養物が、翌朝、リコンビニアリング機構を誘導する前に、約０．３のＯＤ６００になることであった）。

翌朝、ＯＤ６００が約０．３であった場合、主培養物を０．２アラビノースで誘導した（リコンビニアリング機構の発現をｐＢＡＤにより駆動した）。ＯＤ６００が０．４～０．６に達するまで（１～２時間）、培養物を３０℃、１６０ｒｐｍで振盪した。
（２）コンピテント細胞調製：

培養物を氷上で１５分間、冷却した。コンピテント細胞調製全体を通して細胞を氷上で（または４℃で）保持した。

４℃、４０００×ｇで１０分間、遠心分離した。５０ｍＬの冷１０％グリセロールに細胞を再浮遊させ、５０ｍＬのコニカルに移し、４℃、３５００×ｇで１０分間、回転させた。デカントし、さらに２回洗浄し、合計３回洗浄した。最後の洗浄後、液体をデカントし、５０ｍＬコニカルの底に残存する少量の１０％グリセロールに細胞ペレットを再浮遊させた。

コンピテント細胞を１：５０（９８０ｕＬの１０％グリセロール＋２０ｕＬの細胞）希釈し、ＯＤ６００を測定した。コンピテント細胞のＯＤ６００を冷１０％グリセロールで調整して約５０～７５の最終ＯＤ６００にした。
（３）形質転換

５０ｕＬのコンピテント細胞と１００ｎｇのプラスミドを混合し（プールされたプラスミドについては、合計１００ｎｇ、すなわち、１００ｎｇ／プラスミド数＝ｎｇ毎プラスミド、を添加した）、１ｍＭキュベットに移し、Ｅ．ｃｏｌｉ設定を使用して電気穿孔した。本実施例では、４つの遺伝子編集のうちの１つが別のプラスミド上に存在し、したがって４つのプラスミドが各々の編集ラウンドで混合され、形質転換を生じさせるような、４つのユニークな遺伝子編集を使用した。

ＮＥＢ回復培地（７５０ｕＬ）に直ちに再浮遊させた。

３時間、３０℃、１０００ｒｐｍで振盪することにより回復させた。

非分割ＬＢＣｌｉｎ１００Ｋａｎ５０Ｑトレーに９００ｕＬ（１：５００希釈）を播種した。ＷｈｉｓｐｅｒＦｌｏｗキャビネット内で１時間、乾燥させた。Ｑトレーを３０℃で１～２日間（コロニーが採取可能になるまで）インキュベートした。
（４）ｐＥＤＩＴ排除

ｎ個のコロニー（ｎ＝４×可能性のある遺伝子型）を３００ｕＬＬＢＣｌｉｎ１００Ｋａｎ５０９６ＭＷＰまたは１２０ｕＬＬＢＣｌｉｎ１００Ｋａｎ５０３８４ＤＷＰに採取した。３０℃、１６０ｒｐｍで一晩、振盪した。

ＬＢＣｌｉｎ１００Ｋａｎ５０培養物が飽和したら、（等体積の培養物と５０％グリセロールを混合して）保存し、３ｕＬを３００ｕＬＬＢＣｌｉｎ１００＋１０％スクロース９６ＭＷＰに、または２ｕＬを１２０ｕＬＬＢＣｌｉｎ１００３８４ＤＷＰにスタンピングして、ｐＥＤＩＴを排除した（ｓａｃＢでの能動的対抗選択）。３０℃、１６０ｒｐｍで一晩、振盪した。

ＬＢＣｌｉｎ１００Ｓｕｃ１０培養物が飽和したら、同じ編集プールを有する培養物をプールし、１０～５に希釈した。

９００ｕＬの希釈された培養物を非分割ＬＢＣｌｉｎ１００Ｑトレーに播種した。ＷｈｉｓｐｅｒＦｌｏｗキャビネット内で１時間、乾燥させた。Ｑトレーを３０℃で１～２日間（コロニーが採取可能になるまで）インキュベートした。

Ｑトレーの１ウェル当たり１コロニーを３０ｕＬの滅菌水に採取した。コロニーを再浮遊させ、３ｕＬを３００ｕＬＬＢＣｌｉｎ１００および３００ｕＬＬＢＣｌｉｎ１００Ｋａｎ５０９６ＭＷＰに、または２ｕＬを１２０ｕＬＬＢＣｌｉｎ１００および１２０ｕＬＬＢＣｌｉｎ１００Ｋａｎ５０３８４ＤＷＰにスタンピングした。３０℃、１６０ｒｐｍで一晩、振盪した。

ＬＢＣｌｉｎ１００培養物が飽和したら、ＬＢＣｌｉｎ１００プレートとＬＢＣｌｉｎ１００Ｋａｎ５０プレートの両方のＯＤ６００を測定して、ｐＥＤＩＴを排除しなかった培養物についてチェックした。ＬＢＣｌｉｎ１００Ｋａｎ５０で増殖した培養物は、ｐＥＤＩＴを排除しなかったため、後続の編集ラウンドに進めなかった。

ｐＥＤＩＴを排除した、すなわち、ＬＢＣｌｉｎ１００で増殖したがＬＢＣｌｉｎ１００Ｋａｎ５０では増殖しなかった、培養物を（等体積の培養物と５０％グリセロールを混合して）保存した。

ｐＥＤＩＴを排除した培養物（種）をプールした。プールした種培養物のＯＤ６００を測定し、約０．０４の出発ＯＤ６００（基本編集株の倍加時間に依存する）で１００ｍＬのＬＢＣｌｉｎ１００を接種した。
（５）株ＱＣ

ステップ１～４を反復することにより、ｎラウンドの編集を行なった。本実施例では、４ラウンドの編集を行なった。

最終編集ラウンド（すなわち、ラウンド４）後、５ｕＬの培養物の２０ｕＬＴＥへのスタンピングおよび９８℃で１０分間のインキュベーションにより、ｐＥＤＩＴ排除培養物（ウェルをプールしなかった）のボイルプレップを作製した。

７ｕＬの滅菌水を３８４ウェルＰＣＲＦｒａｍｅｓｔａｒプレートにスタンピングし、アンプリコンＮＧＳプライマー（ｉ５／ｉ７アダプターを含有する）を添加した。

プライマーが入っている３８４ウェルＰＣＲＦｒａｍｅｓｔａｒプレートに、ＧＣ緩衝液とともに３ｕＬのボイルプレップおよび１０ｕＬのＮＥＢＯｎｅＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔＭａｓｔｅｒＭｉｘをスタンピングした。総反応体積は２０ｕＬであった。

ＧＣ緩衝液条件で標準ＮＥＢＯｎｅＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔＭａｓｔｅｒＭｉｘを用いてＰＣＲを実行した。

マッピングされたアンプリコンプレートをアンプリコンＮＧＳのためにＧｅｎｏｍｉｃｓａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｒｅに渡した。

試料に対するｋｍｅｒ検索を行なって、編集が起こったかどうかを評価した。
（６）ｐＣＵＴ２．２排除

３ｕＬのＬＢＣｌｉｎ培養物（ｐＥＤＩＴ排除後）を１ｍＬＬＢ９６ＤＷＰにスタンピングした。４２℃、１０００ｒｐｍで１７～２０時間、振盪した。

ＯＤ６００を測定し、ＬＢで１０～４から１０～７までの希釈を行ない、１５０ｕＬをＬＢおよびＬＢＣｌｉｎ分割Ｑトレーに播種した。

ＬＢおよびＬＢＣｌｉｎＱトレーを３０℃で２０～２２時間インキュベートした。

ｐＣＵＴ２．２排除（固形培地）についてスクリーニングした：ＬＢで増殖したがＬＢＣｌｉｎでは増殖しなかったＱトレーウェルは、ｐＣＵＴ２．２排除を示した。

ＬＢで増殖したがＬＢＣｌｉｎでは増殖しなかったＱトレーウェルからのｎ個のコロニーを３００ｕＬの水に採取した。コロニーを再浮遊させ、５ｕＬを３００ｕＬＬＢおよびＬＢＣｌｉｎ９６ＭＷＰにスタンピングした。

ｐＣＵＴ２．２排除（液体培地）を確認した：ＬＢで増殖したがＬＢＣｌｉｎでは増殖しなかったウェルは、ｐＣＵＴ２．２の排除成功を示した。

ｐＣＵＴ２．２を排除した培養物を（７５ｕＬの培養物を７５ｕＬの５０％グリセロールに混ぜ入れて）保存した。
結果および結論

理論的には、ＣＲＩＳＰＲを使用する四（４）ラウンドのＰＰＩＳの１ラウンド当たり四（４）つのユニークな編集は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて６２５の可能性のある遺伝子型を生じさせることができる。図１２Ｂ～１２Ｃに示すように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可能性のある遺伝子型１２５のうちの１１、または約９％を獲得した（４ラウンドのうちの１ラウンドで編集が起こらず、可能性のある遺伝子型の数からそれを除外した）。これは、ＣＲＩＳＰＲを使用するＰＰＩＳが、複数のゲノム遺伝子座にわたって複数の遺伝子編集を導入するために有効な方法であり得ることを示す。
（実施例１１）
プール型親反復スタッキング（ＰＰＡＩＳ）の原理証明
目的

本実施例は、プラスミドを別個のＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞培養物に個々に導入して形質転換を生じさせることにより、多くの遺伝子型を生成し、形質転換／編集の偏りを最小にするための、プールされた親反復スタッキング（ＰＰＡＩＳ）の使用を詳述する。
材料および方法

全体としては、プールされた親反復スタッキング（ＰＰＡＩＳ）については、プールされたプラスミド反復スタッキング（ＰＰＩＳ）のようにプラスミドのプールを宿主細胞の培養物に導入して形質転換を生じさせるのではなく、ｐＥＤＩＴプラスミドのプールを宿主細胞の別個の培養物に個々に導入して形質転換を生じさせ、ｐＥＤＩＴプラスミドを別個の培養物各々から排除し、排除された株全てをプールし（種）、主培養物への接種に使用し、次いで、その主培養物を別個の培養物に分割した。次の編集ラウンドで、このプロセスを、前の編集ラウンドからの主培養物を分割することにより生じさせた別個の培養物にプラスミドの四（４）つのプールを個々に導入して形質転換を生じさせることにより、反復した（図１３Ａを参照されたい）。実施例８で使用したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、編集ラウンドを開始する前に前記宿主細胞に導入されたｐＣＵＴ２．２プラスミドを含んでいた。実施例８におけるｐＥＤＩＴプラスミドのように、各々のｐＥＤＩＴプラスミドは、相同アームを有する編集ペイロードと、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞内の特定の遺伝子座を標的にする対応するｓｇＲＮＡとを含んでいた。同じく実施例８と同様に、各々のラウンドの形質転換後に、特定のラウンドの形質転換で導入されたｐＥＤＩＴプラスミドを、そのラウンドの形質転換体から排除し（すなわち、能動的対抗選択またはその代わりに受動的対抗選択（すなわち、非選択培地での増殖）を使用する）、最終編集ラウンド後、ｐＣＵＴ２．２を、その温度感受性複製起点を使用して排除した。

より具体的には、ＰＰＡＩＳプロセスを以下のように実施した：
（１）コンピテント細胞調製のための培養：

主培養物：種培養物のＯＤ６００を測定し、約０．０４の出発ＯＤ６００（基準編集株の倍化時間に依存する）で１００ｍＬのＬＢＣｌｉｎ１００を接種した。１８℃、１６０ｒｐｍで約１６時間、振盪した。（目標は、培養物が、翌朝、リコンビニアリング機構を誘導する前に、約０．３のＯＤ６００になることであった）。

５０ｕＬのコンピテント細胞と１００ｎｇのプラスミドを混合し、１ｍＭキュベットに移し、Ｅ．ｃｏｌｉ設定を使用して電気穿孔した。本実施例では、４つの遺伝子編集のうちの１つが別のプラスミド上に存在し、四（４）つのプラスミドの各々をＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に個々に導入して形質転換を生じさせるような、４つのユニークな遺伝子編集を使用した。

ＮＥＢ回復培地（７５０ｕＬ）に直ちに再浮遊させた。

ＬＢＣｌｉｎ１００Ｓｕｃ１０培養物が飽和したら、同じ編集を有する培養物をプールし、１０～５に希釈した。

７ｕＬの滅菌水を３８４ウェルＰＣＲＦｒａｍｅｓｔａｒプレートにスタンピングし、アンプリコンＮＧＳプライマー（ｉ５／ｉ７アダプターを含有する）をヒットピックした。

ヒットピックしたプライマーが入っている３８４ウェルＰＣＲＦｒａｍｅｓｔａｒプレートに、ＧＣ緩衝液とともに３ｕＬのボイルプレップおよび１０ｕＬのＮＥＢＯｎｅＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔＭａｓｔｅｒＭｉｘをスタンピングした。総反応体積は２０ｕＬであった。

３ｕＬのＬＢＣｌｉｎ培養物（ｐＥＤＩＴ排除後）を１ｍＬＬＢ９６ＤＷＰにスタンピングした。４２℃、１０００ｒｐｍで１７～２０時間、振盪する。

理論的には、ＣＲＩＳＰＲを使用して四（４）ラウンドのＰＰＡＩＳの１ラウンド当たり四（４）つのユニークな編集は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて６２５の可能性のある遺伝子型を生じさせることができる。図１３Ｂ～１３Ｃに示すように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可能性のある遺伝子型１２５のうちの２６、または約２１％を獲得した（４ラウンドのうちの１ラウンドで編集が起こらず、可能性のある遺伝子型の数からそれを除外した）。これは、ＣＲＩＳＰＲを使用するＰＰＡＩＳが、複数のゲノム遺伝子座にわたって複数の遺伝子編集を導入するために有効な方法であり得ることを示す。
（実施例１２）
受動的対抗選択を用いる単一反復編集のための方法の原理証明
目的

本実施例は、実施例１に記載した反復編集方法を使用するためのＣＲＩＳＰＲ媒介方法の使用を記載するが、第４ラウンドの形質転換が、第１ラウンドの形質転換で使用したのと同じ選択可能なマーカーを有する編集プラスミドを使用する、４ラウンドの形質転換を含む。目的は、受動的対抗選択が、前に導入された編集プラスミドの排除に有効であること、したがって、同じ選択可能なマーカーをその後のゲノム編集ラウンドで再利用することができることを確認することであった。全体としては、能動的対抗選択と比較して受動的対抗選択の使用を、編集サイクルの時間を短縮するために使用することができる。
材料および方法

本実施例に記載する反復編集方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において、本質的には図２および１４Ａに示すよう行なったが、同じ遺伝子座を標的にする１つのｓｇＲＮＡ／修復断片対とカナマイシン（ｋａｎ）選択可能なマーカー遺伝子とを含む４つ１セットの編集プラスミドを第１ラウンドの形質転換でＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に個々に導入して形質転換を生じさせた。形質転換体をカナマイシン含有培地で増殖させ、個々のコロニーを採取し、非選択培地中で一晩増殖させ、プールし（種）、本質的には実施例９（培養物の各々のプールを単一ｐＥＤＩＴプラスミドから得た）で説明したように主培養物に接種するために使用した。ラウンド２では、同じ遺伝子座（これは、第１ラウンドの形質転換からの編集プラスミドとは異なる遺伝子座である）を標的にする１つのｓｇＲＮＡ／修復断片対と、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒ）選択可能なマーカー遺伝子とを含む４つ１セットの編集プラスミドを用いて主培養物を形質転換した。形質転換体をＣｈｌｏｒ含有培地で増殖させ、個々のコロニーを採取し、非選択培地中で一晩増殖させ、プールし（種）、新たな主培養物への接種に使用し、この新たな主培養物を第３ラウンドの形質転換に供した。ラウンド３では、同じ遺伝子座（これは、第１および第２ラウンドの形質転換からの編集プラスミドとは異なる遺伝子座である）を標的にする１つのｓｇＲＮＡ／修復断片対と、テトラサイクリン（ｔｅｔ）選択可能なマーカー遺伝子とを含む４つ１セットの編集プラスミドを用いて、ラウンド２からの主培養物を形質転換した。形質転換体をＴｅｔ含有培地で増殖させ、個々のコロニーを採取し、非選択培地中で一晩増殖させ、プールし（種）、新たな主培養物への接種に使用し、この新たな主培養物を第４ラウンドの形質転換に供した。ラウンド４では、同じ遺伝子座（これは、第１、第２および第３ラウンドの形質転換からの編集プラスミドとは異なる遺伝子座である）を標的にする１つのｓｇＲＮＡ／修復断片対と、Ｋａｎ選択可能なマーカー遺伝子とを含む４つ１セットの編集プラスミドを用いて、ラウンド３からの主培養物を形質転換した。形質転換体をＫａｎ含有培地で増殖させ、個々のコロニーを非選択培地中で一晩増殖させ、スクロース含有培地に移してｐＥＤＩＴを排除し、ｐＥＤＩＴを排除した株の遺伝子型を、当技術分野において公知の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法を使用して決定した。
結果および結論

図１４Ｂに示すように、ラウンド３の形質転換後に産生された株は、カナマイシンに対して感受性であった。これは、ラウンド１からのカナマイシン耐性遺伝子含有プラスミドが排除されたことを示す。さらに、図１４Ｃ～１４Ｄは、本実施例の反復編集方法により産生された株が、所望の遺伝子編集の一部または全てを実際に有することを示した。図１４Ｃ～１４Ｄは、本実施例に記載した４ラウンドの形質転換を用いる１ラウンド当たり４つのユニークな編集の導入によってＥ．ｃｏｌｉに導入することができる可能性のある遺伝子型３２のうちの７、約２２％（４ラウンドのうちの１ラウンドでは編集が行なわれず、可能性のある遺伝子型の数からそれを除外した）を獲得したことを示した。したがって、２ラウンドの受動的対抗選択は、前に少なくとも２ラウンドで使用した選択可能なマーカー遺伝子の使用の適用に十分なものであった。このプロセスは、反復プロセスで導入されたペイロードをＥ．ｃｏｌｉにおいてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集に使用して新しいＥ．ｃｏｌｉ株を効率的かつ安価に生成することができることを実証した。

本開示の番号付き実施形態

本開示により企図される他の主題を以下の番号付き実施形態で示す。

１）１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、
ａ．微生物宿主細胞の基礎集団を編集プラスミドの第１のプールと組み合わせるステップであって、第１のプール内の各々の編集プラスミドが、少なくとも１つの修復断片を含み、編集プラスミドの第１のプールが、少なくとも２つの異なる修復断片を含み、第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子をさらに含み、各々の修復断片が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；
ｂ．ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの第１のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；および
ｃ．ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法。

２）１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、
ａ．微生物宿主細胞の基礎集団を編集プラスミドの第１のプールと組み合わせるステップであって、第１のプール内の各々の編集プラスミドが、少なくとも１つの修復断片を含み、編集プラスミドの第１のプールが、少なくとも２つの異なる修復断片を含み、編集プラスミドの第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子をさらに含み、微生物宿主細胞が、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または１つもしくは複数の部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、編集プラスミドの第１のプールとともに微生物宿主細胞に導入され、１つまたは複数の部位特異的制限酵素が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座を標的にし、各々の修復断片が、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の標的にされる１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；
ｂ．ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの第１のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；および
ｃ．ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法。

３）１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、
ａ．微生物宿主細胞の基礎集団を、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールと組み合わせるステップであって、編集構築物の第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、微生物宿主細胞が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むか、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、編集構築物の第１のプールとともに微生物宿主細胞に導入され、編集構築物の第１のプールが、
ｉ．同じ標的遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；
ｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している同じ１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；または
ｉｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片
を含む、ステップ；
ｂ．ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールを導入するステップであって、編集構築物の第１のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；および
ｃ．ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法。

４）１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、
ａ．微生物宿主細胞の基礎集団を、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールと組み合わせるステップであって、編集構築物の第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の第１のプールが、
ｉ．同じ標的遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；
ｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している同じ１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；または
ｉｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、標的遺伝子座内のもしくは標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片
を含む、ステップ；
ｂ．ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールとを導入するステップであって、編集構築物の第１のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；および
ｃ．ステップ（ｂ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法。

５）ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｄ）をさらに含む、実施形態１から４のいずれか１つの方法。

６）異なる編集プラスミドを個々の微生物宿主細胞に導入し、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する、実施形態１（ｂ）または実施形態２（ｂ）の方法。

７）異なる編集構築物を個々の微生物宿主細胞の亜集団に導入し、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する、実施形態３（ｂ）または実施形態４（ｂ）の方法。

８）少なくとも２つの異なる修復断片が、同じプラスミド上に存在する、実施形態１から４のいずれか１つの方法。

９）少なくとも２つの異なる修復断片が、異なるプラスミド上に存在する、実施形態１から４のいずれか１つの方法。

１０）編集構築物の第１のプールが、１つまたは複数の線状断片をさらに含む、実施形態３または実施形態４の方法。

１１）編集構築物の第１のプールが、２つまたはそれより多くの異なる線状断片をさらに含む、実施形態３または実施形態４の方法。

１２）編集構築物の第１のプールが、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドを含む、実施形態３または実施形態４の方法。

１３）ｇＲＮＡが、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する、実施形態３または実施形態４の方法。

１４）修復断片が、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する、実施形態３または実施形態４の方法。

１５）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つまたは複数の編集プラスミド上にコードされる、実施形態４の方法。

１６）ｇＲＮＡおよび修復断片が、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する、実施形態３または実施形態４の方法。

１７）各々の編集を生じさせるために必要なＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡおよび修復断片の配列が、１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する、実施形態４の方法。

１８）同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡが、同じ編集プラスミド上に存在する、実施形態３または実施形態４の方法。

１９）同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するための修復断片が、同じ編集プラスミド上に存在する、実施形態３または実施形態４の方法。

２０）異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡが、２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する、実施形態１２の方法。

２１）異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するための修復断片が、２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する、実施形態１２の方法。

２２）同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡおよび修復断片が、同じ編集プラスミド上に存在する、実施形態３または実施形態４の方法。

２３）全ての遺伝子座を標的にするおよび編集するためのｇＲＮＡおよび修復断片が、同じ編集プラスミド上に存在する、実施形態３または実施形態４の方法。

２４）ｇＲＮＡが、１つまたは複数の線状断片上に存在する、実施形態１０の方法。

２５）修復断片が、１つまたは複数の線状断片上に存在する、実施形態１０の方法。

２６）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つまたは複数の線状断片上にコードされる、実施形態１０の方法。

２７）２つまたはそれより多くの異なる線状断片が、異なる修復断片を含む、実施形態１１の方法。

２８）２つまたはそれより多くの異なる線状断片が、異なるｇＲＮＡを含む、実施形態１１の方法。

２９）線状断片が、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡとして提供される、実施形態１０、１１、または２４～２８のいずれか１つの方法。

３０）線状断片が、末端改変を有する、実施形態２９の方法。

３１）末端改変が、線状断片の５’および／または３’末端に適用される、実施形態３０の方法。

３２）改変の位置が、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核酸塩基からなる群から選択されるが、これらに限定されない、実施形態３１の方法。

３３）２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドが、１つの異なる修復断片または複数の異なる修復断片を含む、実施形態１２の方法。

３４）２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドが、１つの異なるｇＲＮＡまたは複数の異なるｇＲＮＡを含む、実施形態１２の方法。

３５）２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドが、１つの異なる修復断片および１つの異なるｇＲＮＡ、または複数の異なる修復断片および複数の異なるｇＲＮＡを含む、実施形態１２の方法。

３６）異なる編集プラスミドが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる修復断片を含み、それによって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる遺伝子改変微生物株を生成する、実施形態６の方法。

３７）異なる編集構築物が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含み、それによって、微生物宿主細胞の第１の編集された集団において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる遺伝子改変微生物株を生成する、実施形態７の方法。

３８）微生物宿主細胞の第１の編集された集団が、ゲノム編集を有さない個々の細胞を含む、実施形態１から４、６から７、または３６から３７のいずれか１つの方法。

３９）微生物宿主細胞の第１の編集された集団が、１つのゲノム編集を有する個々の細胞を含む、実施形態１から４、６から７、または３６から３７のいずれか１つの方法。

４０）微生物宿主細胞の第１の編集された集団が、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む、実施形態１から４、６から７、または３６から３７のいずれか１つの方法。

４１）微生物宿主細胞の第１の編集された集団が、ゲノム編集を有さない個々の細胞、１つのゲノム編集を有する個々の細胞、および複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む、実施形態１から４、６から７、または３６から３７のいずれか１つの方法。

４２）微生物宿主細胞の第１の編集された集団が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む、実施形態１から４、６から７、または３６から３７のいずれか１つの方法。

４３）追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドが、
ｄ．ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；
ｅ．編集プラスミドの追加のプールをステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集プラスミドの追加のプールが、少なくとも１つまたは２つの異なる修復断片を含み、各々の修復断片が、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；
ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの追加のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；および
ｇ．ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプールからの選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む、実施形態１の方法。

４４）追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドが、
ｄ．ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；
ｅ．編集プラスミドの追加のプールをステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集プラスミドの追加のプールが、少なくとも１つまたは２つの異なる修復断片を含み、微生物宿主細胞が、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つもしくは複数の標的遺伝子座を標的にする編集プラスミドの追加のプールとともに微生物宿主細胞に導入され、各々の修復断片が、１つまたは複数の部位特異的制限酵素の標的にされる１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；
ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの追加のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；および
ｇ．ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプールからの選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む、実施形態２の方法。

４５）追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドが、
ｄ．ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；
ｅ．１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールを、ステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集構築物の追加のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；
ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールを導入するステップであって、編集構築物の追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；および
ｇ．ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプールからの選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む、実施形態３の方法。

４６）追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドが、
ｄ．ステップ（ｃ）で単離された微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；
ｅ．１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールを、ステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集構築物の追加のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；
ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールとを導入するステップであって、編集構築物の追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；および
ｇ．ステップ（ｆ）からの微生物宿主細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、編集プラスミドの追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの第１のまたは前に組み合わせられたプールからの選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む、実施形態４の方法。

４７）対抗選択が、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない、実施形態４３から４６のいずれか１つの方法。

４８）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択、または温度に基づく対抗選択が、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない、実施形態４３から４６のいずれか１つの方法。

４９）各々の修復断片が、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している複数の遺伝子編集の配列を含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法。

５０）各々の修復断片が、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法。

５１）ステップ（ｂ）または（ｆ）で導入されるｇＲＮＡが、標的遺伝子座（単数もしくは複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片が、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む、実施形態３から４および４５から４６のいずれか１つの方法。

５２）ステップ（ｆ）で導入されるｇＲＮＡが、前の編集ラウンドで標的にされたいずれの遺伝子座（単数または複数）とも異なる遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片が、異なる遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは異なる遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む、実施形態４５または実施形態４６の方法。

５３）ステップ（ｆ）で導入されるｇＲＮＡが、前の編集ラウンドで標的にされた同じ遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片が、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む、実施形態４５または実施形態４６の方法。

５４）ステップ（ｆ）が、ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の異なる編集構築物を導入することを含み、異なる編集構築物が、前の編集ラウンドで導入されたｇＲＮＡおよび／または修復断片とは異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含み、それによって、微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の異なる遺伝子改変微生物株を生成する、実施形態４５または実施形態４６の方法。

５５）１つまたは複数の異なる編集構築物が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なる遺伝子座と相補的な配列を含む異なるｇＲＮＡを含み、異なる遺伝子座（単数または複数）が、いずれの前に標的にされた遺伝子座（単数または複数）とも異なる、実施形態５４の方法。

５６）１つまたは複数の異なる編集構築物が、標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む異なる修復断片を含む、実施形態５４の方法。

５７）ステップ（ｃ）で選択されたコロニーの遺伝子型を判定するステップをさらに含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法。

５８）選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地で増殖した微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含む、実施形態４３から４６のいずれか１つの方法。

５９）１）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択が、全ての編集ラウンド後に行われない、または２）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択が、いずれかの編集ラウンド後に行われない、実施形態４３から４６のいずれか１つの方法。

６０）編集プラスミドの第１のおよび追加のプール内の各々の編集プラスミドが、微生物宿主細胞と前に組み合わせられた編集プラスミドの他のまたは追加のプール各々の中の各々の編集プラスミドと比較して、同一の複製起点または同じクラスの複製起点を含む、実施形態４３から４６のいずれか１つの方法。

６１）微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団が、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む、実施形態４３から４６のいずれか１つの方法。

６２）微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む、実施形態４３から４６のいずれか１つの方法。

６３）編集プラスミドの第１のまたは追加のプールが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の異なる編集プラスミドを含む、実施形態１から４、または４３から４６のいずれか１つの方法。

６４）編集プラスミドの第１のまたは追加のプール内の各々の編集プラスミドが、同じ選択マーカー遺伝子を含む、実施形態１から４、または４３から４６のいずれか１つの方法。

６５）選択マーカー遺伝子が、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子を含む、実施形態１から４、または４３から４６のいずれか１つの方法。

６６）１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々が、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する、実施形態２または実施形態４４の方法。

６７）１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々が、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択される、実施形態２または実施形態４４の方法。

６８）部位特異的制限酵素の各々が、プラスミド上にコードされるか、ゲノム内にコードされるか、ＲＮＡから翻訳されるか、または細胞にタンパク質として導入される、実施形態２または実施形態４４の方法。

６９）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する、実施形態３から４、または４５から４６のいずれか１つの方法。

７０）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１、またはこれらのホモログ、オルソログもしくはパラログから選択される、実施形態３から４、または４５から４６のいずれか１つの方法。

７１）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、プラスミド上にコードされるか、ゲノム内にコードされるか、ＲＮＡから翻訳されるか、または細胞にタンパク質として導入される、実施形態３から４、または４５から４６のいずれか１つの方法。

７２）ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、実施形態３から５、７から４２、または４５から４６のいずれか１つの方法。

７３）ｇＲＮＡが、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される、実施形態３から５、７から４２、または４５から４６のいずれか１つの方法。

７４）遺伝子編集が、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、上記の実施形態のいずれか１つの方法。

７５）追加の１または複数ラウンドの編集で導入される修復断片が、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含み、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う、実施形態４３から４６のいずれか１つの方法。

７６）追加の１または複数ラウンドの編集で導入されるｇＲＮＡが、異なる遺伝子座（単数または複数）を標的にし、前の編集ラウンドとは異なる抗生物質選択マーカー遺伝子を伴う、実施形態４３から４６のいずれか１つの方法。

７７）ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）が、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、最終修復断片が、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは最終遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、最終遺伝子座（単数または複数）が、前に編集されたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むか、または前に編集されたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含み、最終プラスミドが、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を含む、実施形態４３の方法。

７８）ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）が、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、最終修復断片が、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは最終遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、最終遺伝子座（単数または複数）が、前に編集されたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むか、または前に編集されたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含み、最終プラスミドが、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を含み、微生物宿主細胞が、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にする最終プラスミドとともに微生物宿主細胞に導入される、実施形態４４の方法。

７９）ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）が、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終ｇＲＮＡおよび最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、最終ｇＲＮＡが、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、最終遺伝子座（単数または複数）が、微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むか、または微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含み、最終修復断片が、最終遺伝子座（単数または複数）内の１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、相同アームが、微生物宿主細胞のゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、最終プラスミド、最終ｇＲＮＡおよび／または最終修復断片が、前のラウンドの選択で導入された選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を伴う、実施形態４５または実施形態４６の方法。

８０）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる最終ラウンド後の最終修復断片の除去を助長するために、最終修復断片上に存在するまたは最終修復断片に付随する配列と相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡを導入するステップをさらに含む、実施形態７７から７９のいずれか１つの方法。

８１）微生物宿主細胞が、１つまたは複数の異種組換え系からのタンパク質のセットを含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法。

８２）微生物宿主細胞が、ラムダレッド組換え系、ＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質のセット；ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せを含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法。

８３）ラムダレッド組換え系からのタンパク質のセットが、ベータタンパク質、ｇａｍタンパク質およびｅｘｏタンパク質を含む、実施形態８２の方法。

８４）異種組換え系からのタンパク質のセットが、ステップ（ａ）の前に異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて微生物宿主細胞に導入される、実施形態８１から８３のいずれか１つの方法。

８５）異種組換え系からのタンパク質のセットが、異種組換え系からのタンパク質のセットをコードする遺伝子の微生物宿主細胞のゲノムへの組込みに起因して、微生物宿主細胞により安定的に発現される、実施形態８１から８４のいずれか１つの方法。

８６）異種組換え系からのタンパク質のセットが、構成的に発現される、実施形態８１から８５のいずれか１つの方法。

８７）異種組換え系からのタンパク質のセットが、誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、必要に応じて、異種組換え系遺伝子がオペロン内に存在する、実施形態８１から８６のいずれか１つの方法。

８８）誘導性プロモーターが、試薬の添加、代謝物もしくは試薬の枯渇により、または温度の変化により、誘導可能である、実施形態８７の方法。

８９）試薬が、アラビノース、イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびテトラサイクリンからなる群から選択される、実施形態８８の方法。

９０）導入するステップが、微生物宿主細胞を形質転換することを含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法。

９１）微生物宿主細胞が、真核細胞である、上記の実施形態のいずれか１つの方法。

９２）微生物宿主細胞が、酵母細胞である、実施形態９１の方法。

９３）酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、実施形態９２の方法。

９４）微生物宿主細胞が、糸状真菌である、実施形態９１の方法。

９５）糸状真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである、実施形態９４の方法。

９６）微生物宿主細胞が、原核細胞である、実施形態１から９０のいずれか１つの方法。

９７）原核生物宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、実施形態９６の方法。

９８）原核生物宿主細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、実施形態９６の方法。
＊＊＊＊＊＊＊

上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を得ることができる。本明細書で言及するおよび／または出願データシートに収載する米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公表文献の全ては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。必要に応じて様々な特許、出願および公表文献の概念を利用するために実施形態の態様を修飾して、なおさらなる実施形態を得ることができる。

上記の詳細な説明に照らして、これらおよび他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、下記の特許請求の範囲において使用する用語は、本明細書および本特許請求の範囲において開示する特定の実施形態に本特許請求の範囲を限定するように解釈すべきでなく、当該特許請求の範囲に権利がある均等物の全範囲とともに全ての可能な実施形態を含むように解釈すべきである。したがって、本特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
参照による組み込み

本明細書に引用する全ての参考文献、論文、公表文献、特許、特許公開および特許出願は、それら全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。しかし、本明細書に引用するいずれの参考文献、論文、公表文献、特許、特許公開および特許出願についての言及も、それらが有効な先行技術であることまたは世界のいずれかの国における共通一般知識の一部をなすことの是認でも、いかなる形の提言でもなく、そのようなことの是認とも、いかなる形の提言とも解釈すべきでない。

Claims

１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、
ａ．微生物宿主細胞の基礎集団を編集プラスミドの第１のプールと組み合わせるステップであって、前記第１のプール内の各々の編集プラスミドが、少なくとも１つの修復断片を含み、編集プラスミドの前記第１のプールが、少なくとも２つの異なる修復断片を含み、前記第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子をさらに含み、各々の修復断片が、前記微生物宿主細胞のゲノム内の１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の前記１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；
ｂ．ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの前記第１のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；および
ｃ．ステップ（ｂ）からの前記微生物宿主細胞を、前記選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の第１の編集された集団において前記１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法。
１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、
ａ．微生物宿主細胞の基礎集団を編集プラスミドの第１のプールと組み合わせるステップであって、前記第１のプール内の各々の編集プラスミドが、少なくとも１つの修復断片を含み、編集プラスミドの前記第１のプールが、少なくとも２つの異なる修復断片を含み、編集プラスミドの前記第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子をさらに含み、前記微生物宿主細胞が、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または１つもしくは複数の部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、編集プラスミドの前記第１のプールとともに前記微生物宿主細胞に導入され、前記１つまたは複数の部位特異的制限酵素が、前記微生物宿主細胞のゲノム内の１つまたは複数の標的遺伝子座を標的にし、各々の修復断片が、前記１つまたは複数の部位特異的制限酵素の標的にされる１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、微生物宿主の前記ゲノム内の前記１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；
ｂ．ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの前記第１のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；および
ｃ．ステップ（ｂ）からの前記微生物宿主細胞を、前記選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の第１の編集された集団において前記１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法。
１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、
ａ．微生物宿主細胞の基礎集団を、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールと組み合わせるステップであって、編集構築物の前記第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、前記微生物宿主細胞が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むか、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、編集構築物の前記第１のプールとともに前記微生物宿主細胞に導入され、編集構築物の前記第１のプールが、
ｉ．同じ標的遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、前記標的遺伝子座内のもしくは前記標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、微生物宿主のゲノム内の前記標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；
ｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、前記標的遺伝子座内のもしくは前記標的遺伝子座に近接している同じ１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、前記微生物宿主の前記ゲノム内の前記標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；または
ｉｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、前記標的遺伝子座内のもしくは前記標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、前記微生物宿主の前記ゲノム内の前記標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片
を含む、ステップ；
ｂ．ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、前記１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の前記第１のプールを導入するステップであって、編集構築物の前記第１のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；および
ｃ．ステップ（ｂ）からの前記微生物宿主細胞を、前記選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の第１の編集された集団において前記１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法。
１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成するための方法であって、
ａ．微生物宿主細胞の基礎集団を、１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の第１のプールと組み合わせるステップであって、編集構築物の前記第１のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の前記第１のプールが、
ｉ．同じ標的遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、前記標的遺伝子座内のもしくは前記標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、微生物宿主のゲノム内の前記標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；
ｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、前記標的遺伝子座内のもしくは前記標的遺伝子座に近接している同じ１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、前記微生物宿主の前記ゲノム内の前記標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片；または
ｉｉｉ．少なくとも２つの異なる標的遺伝子座を標的にするｇＲＮＡ、および少なくとも２つの異なる修復断片であって、各々の修復断片が、前記標的遺伝子座内のもしくは前記標的遺伝子座に近接している１つもしくは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、前記微生物宿主の前記ゲノム内の前記標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ｇＲＮＡおよび修復断片
を含む、ステップ；
ｂ．ステップ（ａ）からの個々の微生物宿主細胞に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと、前記１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の前記第１のプールとを導入するステップであって、編集構築物の前記第１のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；および
ｃ．ステップ（ｂ）からの前記微生物宿主細胞を、前記選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の第１の編集された集団において前記１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成する、方法。
ステップ（ｃ）で単離された前記微生物宿主細胞を、前記選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離することを含む、ステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
異なる編集プラスミドを個々の微生物宿主細胞に導入し、それによって、前記微生物宿主細胞の前記第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する、請求項１（ｂ）または請求項２（ｂ）に記載の方法。
異なる編集構築物を前記個々の微生物宿主細胞の亜集団に導入し、それによって、前記微生物宿主細胞の前記第１の編集された集団において２つまたはそれより多くの異なる遺伝子改変微生物株を生成する、請求項３（ｂ）または請求項４（ｂ）に記載の方法。
前記少なくとも２つの異なる修復断片が、同じプラスミド上に存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも２つの異なる修復断片が、異なるプラスミド上に存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
編集構築物の前記第１のプールが、１つまたは複数の線状断片をさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
編集構築物の前記第１のプールが、２つまたはそれより多くの異なる線状断片をさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
編集構築物の前記第１のプールが、２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドを含む、請求項３または４に記載の方法。
前記ｇＲＮＡが、前記１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する、請求項３または４に記載の方法。
前記修復断片が、前記１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する、請求項３または４に記載の方法。
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記１つまたは複数の編集プラスミド上にコードされる、請求項４に記載の方法。
前記ｇＲＮＡおよび前記修復断片が、前記１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する、請求項３または４に記載の方法。
各々の編集を生じさせるために必要な前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、前記ｇＲＮＡおよび前記修復断片の配列が、前記１つまたは複数の編集プラスミド上に存在する、請求項４に記載の方法。
同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するための前記ｇＲＮＡが、同じ編集プラスミド上に存在する、請求項３または４に記載の方法。
同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するための前記修復断片が、同じ編集プラスミド上に存在する、請求項３または４に記載の方法。
異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するための前記ｇＲＮＡが、前記２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する、請求項１２に記載の方法。
異なる遺伝子座を標的にするおよび編集するための前記修復断片が、前記２つまたはそれより多く異なる編集プラスミド上に存在する、請求項１２に記載の方法。
同じ遺伝子座（単数または複数）を標的にするおよび編集するための前記ｇＲＮＡおよび前記修復断片が、同じ編集プラスミド上に存在する、請求項３または４に記載の方法。
全ての遺伝子座を標的にするおよび編集するための前記ｇＲＮＡおよび前記修復断片が、同じ編集プラスミド上に存在する、請求項３または４に記載の方法。
前記ｇＲＮＡが、前記１つまたは複数の線状断片上に存在する、請求項１０に記載の方法。
前記修復断片が、前記１つまたは複数の線状断片上に存在する、請求項１０に記載の方法。
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記１つまたは複数の線状断片上にコードされる、請求項１０に記載の方法。
前記２つまたはそれより多くの異なる線状断片が、異なる修復断片を含む、請求項１１に記載の方法。
前記２つまたはそれより多くの異なる線状断片が、異なるｇＲＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
前記線状断片が、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡとして提供される、請求項１０、１１、または２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
前記線状断片が、末端改変を有する、請求項２９に記載の方法。
前記末端改変が、前記線状断片の５’および／または３’末端に適用される、請求項３０に記載の方法。
改変の位置が、リン酸化末端、ホスホロチオエート連結塩基、ヘアピン、逆方向塩基、塩基改変、２’Ｏ－メチル塩基、ロックド核塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、およびホスホロチオエート化ロックド核酸塩基からなる群から選択されるが、これらに限定されない、請求項３１に記載の方法。
前記２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドが、１つの異なる修復断片または複数の異なる修復断片を含む、請求項１２に記載の方法。
前記２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドが、１つの異なるｇＲＮＡまたは複数の異なるｇＲＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
前記２つまたはそれより多くの異なる編集プラスミドが、１つの異なる修復断片および１つの異なるｇＲＮＡ、または複数の異なる修復断片および複数の異なるｇＲＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
前記異なる編集プラスミドが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる修復断片を含み、それによって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる遺伝子改変微生物株を生成する、請求項６に記載の方法。
前記異なる編集構築物が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の前記第１の編集された集団において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の異なる遺伝子改変微生物株を生成する、請求項７に記載の方法。
前記微生物宿主細胞の前記第１の編集された集団が、ゲノム編集を有さない個々の細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物宿主細胞の前記第１の編集された集団が、１つのゲノム編集を有する個々の細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物宿主細胞の前記第１の編集された集団が、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物宿主細胞の前記第１の編集された集団が、ゲノム編集を有さない個々の細胞、１つのゲノム編集を有する個々の細胞、および複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物宿主細胞の前記第１の編集された集団が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドが、
ｄ．ステップ（ｃ）で単離された前記微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；
ｅ．編集プラスミドの追加のプールをステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集プラスミドの前記追加のプールが、少なくとも１つまたは２つの異なる修復断片を含み、各々の修復断片が、１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、微生物宿主の前記ゲノム内の前記１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；
ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの前記追加のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；および
ｇ．ステップ（ｆ）からの前記微生物宿主細胞を、前記選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において前記１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、
編集プラスミドの前記追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの前記第１のまたは前に組み合わせられたプールからの前記選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドが、
ｄ．ステップ（ｃ）で単離された前記微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；
ｅ．編集プラスミドの追加のプールをステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集プラスミドの前記追加のプールが、少なくとも１つまたは２つの異なる修復断片を含み、前記微生物宿主細胞が、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の１つもしくは複数の標的遺伝子座を標的にする編集プラスミドの前記追加のプールとともに前記微生物宿主細胞に導入され、各々の修復断片が、前記１つまたは複数の部位特異的制限酵素の標的にされる１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記１つまたは複数の遺伝子編集の各々の配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、前記微生物宿主の前記ゲノム内の前記１つまたは複数の標的遺伝子座からの標的遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含む、ステップ；
ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、編集プラスミドの前記追加のプールからのプラスミド（単数または複数）を導入するステップ；および
ｇ．ステップ（ｆ）からの前記微生物宿主細胞を、前記選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において前記１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、
編集プラスミドの前記追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの前記第１のまたは前に組み合わせられたプールからの前記選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む、請求項２に記載の方法。
追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドが、
ｄ．ステップ（ｃ）で単離された前記微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；
ｅ．１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールを、ステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集構築物の前記追加のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の前記追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；
ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、前記１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の前記追加のプールを導入するステップであって、編集構築物の前記追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；および
ｇ．ステップ（ｆ）からの前記微生物宿主細胞を、前記選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において前記１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、
編集プラスミドの前記追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの前記第１のまたは前に組み合わせられたプールからの前記選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む、請求項３に記載の方法。
追加の１または複数ラウンドの編集をさらに含み、各々の追加のラウンドが、
ｄ．ステップ（ｃ）で単離された前記微生物宿主細胞を、抗生物質選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ；
ｅ．１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の追加のプールを、ステップ（ｄ）で単離された微生物宿主細胞と組み合わせるステップであって、編集構築物の前記追加のプール内の各々の編集プラスミドが、選択マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および修復断片の一方または両方とを含み、編集構築物の前記追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；
ｆ．ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと、前記１つまたは複数の編集プラスミドを含む編集構築物の前記追加のプールとを導入するステップであって、編集構築物の前記追加のプールが、ステップ（ａ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のｇＲＮＡおよび修復断片を含む、ステップ；および
ｇ．ステップ（ｆ）からの前記微生物宿主細胞を、前記選択マーカー遺伝子を発現する微生物宿主細胞に対する選択性のある培地中で増殖させ、それから得られた培養物から微生物宿主細胞を単離するステップ
を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の第２のまたは追加の編集された集団において前記１つまたは複数の遺伝子改変微生物株を生成し、
編集プラスミドの前記追加のプール内の各々の編集プラスミドが、編集プラスミドの前記第１のまたは前に組み合わせられたプールからの前記選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子を含む、請求項４に記載の方法。
対抗選択が、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
抗生物質対抗選択、化学的対抗選択、または温度に基づく対抗選択が、少なくとも１ラウンドの編集後に行われないか、全ての編集ラウンド後に行われないか、またはいずれかの編集ラウンド後に行われない、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
各々の修復断片が、前記１つもしくは複数の標的遺伝子座内のまたは前記１つもしくは複数の標的遺伝子座に近接している複数の遺伝子編集の配列を含む、請求項１から４または４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
各々の修復断片が、前記標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは前記標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む、請求項１から４または４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｂ）または（ｆ）で導入される前記ｇＲＮＡが、前記標的遺伝子座（単数もしくは複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片が、前記標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは前記標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む、請求項３から４または４５から４６のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｆ）で導入される前記ｇＲＮＡが、前の編集ラウンドで標的にされたいずれの遺伝子座（単数または複数）とも異なる遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片が、前記異なる遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは前記異なる遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む、請求項４５または４６に記載の方法。
ステップ（ｆ）で導入される前記ｇＲＮＡが、前の編集ラウンドで標的にされた同じ遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、各々の修復断片が、前記標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは前記標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む、請求項４５または４６に記載の方法。
ステップ（ｆ）が、ステップ（ｅ）からの個々の微生物宿主細胞に、１つまたは複数の異なる編集構築物を導入することを含み、前記異なる編集構築物が、前の編集ラウンドで導入された前記ｇＲＮＡおよび／または修復断片とは異なるｇＲＮＡおよび／または修復断片を含み、それによって、前記微生物宿主細胞の前記第２のまたは追加の編集された集団において１つまたは複数の異なる遺伝子改変微生物株を生成する、請求項４５または４６に記載の方法。
前記１つまたは複数の異なる編集構築物が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なる遺伝子座と相補的な配列を含む異なるｇＲＮＡを含み、前記異なる遺伝子座（単数または複数）が、いずれの前に標的にされた遺伝子座（単数または複数）とも異なる、請求項５４に記載の方法。
前記１つまたは複数の異なる編集構築物が、前記標的遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは前記標的遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している遺伝子編集の配列であって、前の編集ラウンドで導入された遺伝子編集とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０の遺伝子編集の配列を含む異なる修復断片を含む、請求項５４に記載の方法。
ステップ（ｃ）で選択されたコロニーの遺伝子型を判定するステップをさらに含む、請求項１から４または４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記選択マーカー遺伝子に対する選択性のない培地で増殖した微生物宿主細胞の遺伝子型を判定するステップをさらに含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
１）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択が、全ての編集ラウンド後に行われない、または２）抗生物質対抗選択、化学的対抗選択または温度に基づく対抗選択が、いずれかの編集ラウンド後に行われない、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
編集プラスミドの前記第１のおよび前記追加のプール内の各々の編集プラスミドが、前記微生物宿主細胞と前に組み合わせられた編集プラスミドの他のまたは追加のプール各々の中の各々の編集プラスミドと比較して、同一の複製起点または同じクラスの複製起点を含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物宿主細胞の前記第２のまたは追加の編集された集団が、複数のゲノム編集を有する個々の細胞を含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物宿主細胞の前記第２のまたは追加の編集された集団が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００のゲノム編集を含む個々の細胞を含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
編集プラスミドの前記第１のまたは追加のプールが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の異なる編集プラスミドを含む、請求項１から４、または４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
編集プラスミドの前記第１のまたは追加のプール内の各々の編集プラスミドが、同じ選択マーカー遺伝子を含む、請求項１から４、または４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記選択マーカー遺伝子が、抗生物質選択マーカー遺伝子または栄養要求性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１から４、または４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々が、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の前記１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する、請求項２または４４に記載の方法。
前記１つまたは複数の部位特異的制限酵素の各々が、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択される、請求項２または４４に記載の方法。
前記部位特異的制限酵素の各々が、プラスミド上にコードされるか、ゲノム内にコードされるか、ＲＮＡから翻訳されるか、または前記細胞にタンパク質として導入される、請求項２または４４に記載の方法。
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の前記１つまたは複数の標的遺伝子座にある配列を切断する、請求項３から４、または４５から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１、またはこれらのホモログ、オルソログもしくはパラログから選択される、請求項３から４、または４５から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、プラスミド上にコードされるか、前記ゲノム内にコードされるか、ＲＮＡから翻訳されるか、または前記細胞にタンパク質として導入される、請求項３から４、または４５から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、請求項３から４、または４５から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記ｇＲＮＡが、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成される、請求項３から４、または４５から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記遺伝子編集が、挿入、欠失、一塩基多型、ゲノムシャフリング、大規模欠失、ゲノム編集、プラスミド編集および多重編集、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
追加の１または複数ラウンドの編集で導入される前記修復断片が、１つまたは複数の遺伝子編集の異なる配列を含み、前の編集ラウンドとは異なる選択マーカー遺伝子を伴う、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
追加の１または複数ラウンドの編集で導入される前記ｇＲＮＡが、異なる遺伝子座（単数または複数）を標的にし、前の編集ラウンドとは異なる抗生物質選択マーカー遺伝子を伴う、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）が、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、前記最終修復断片が、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは最終遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記１つまたは複数の遺伝子編集の各々の前記配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の前記最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、前記最終遺伝子座（単数または複数）が、前に編集されたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むか、または前に編集されたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含み、前記最終プラスミドが、前のラウンドの選択で導入された前記選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を含む、請求項４３に記載の方法。
ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）が、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、前記最終修復断片が、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の最終遺伝子座（単数もしくは複数）内のまたは最終遺伝子座（単数もしくは複数）に近接している１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記１つまたは複数の遺伝子編集の各々の前記配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の前記最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、前記最終遺伝子座（単数または複数）が、前に編集されたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むか、または前に編集されたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含み、前記最終プラスミドが、前のラウンドの選択で導入された前記選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を含み、前記微生物宿主細胞が、１つもしくは複数の部位特異的制限酵素を含むか、または部位特異的制限酵素をコードする１つもしくは複数の配列が、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の前記最終遺伝子座（単数もしくは複数）を標的にする前記最終プラスミドとともに前記微生物宿主細胞に導入される、請求項４４に記載の方法。
ステップ（ｈ）をさらに含み、ステップ（ｈ）が、ステップ（ｄ）～（ｇ）を反復するステップの最終ラウンドで最終ｇＲＮＡおよび最終修復断片を含む最終プラスミドを導入することを含み、前記最終ｇＲＮＡが、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の最終遺伝子座（単数または複数）と相補的な配列を含み、前記最終遺伝子座（単数または複数）が、前記微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれかの遺伝子座（単数もしくは複数）と同じ遺伝子座（単数もしくは複数）を含むか、または前記微生物宿主細胞に前に導入されたｇＲＮＡの標的にされたいずれの遺伝子座（単数もしくは複数）とも異なる遺伝子座（単数もしくは複数）を含み、前記最終修復断片が、前記最終遺伝子座（単数または複数）内の１つまたは複数の遺伝子編集の配列を含み、前記１つまたは複数の遺伝子編集の各々の前記配列が、相同アーム間にあり、前記相同アームが、前記微生物宿主細胞の前記ゲノム内の前記最終遺伝子座（単数または複数）からの遺伝子座に隣接する配列と相同の配列を含み、前記最終プラスミド、前記最終ｇＲＮＡおよび／または前記最終修復断片が、前のラウンドの選択で導入された前記選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子の配列を伴う、請求項４５または４６に記載の方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記最終ラウンド後の前記最終修復断片の除去を助長するために、前記最終修復断片上に存在するまたは前記最終修復断片に付随する配列と相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡを導入するステップをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
前記微生物宿主細胞が、１つまたは複数の異種組換え系からのタンパク質のセットを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物宿主細胞が、ラムダレッド組換え系、ＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質のセット；ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ；またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記ラムダレッド組換え系からのタンパク質の前記セットが、ベータタンパク質、ｇａｍタンパク質およびｅｘｏタンパク質を含む、請求項８２に記載の方法。
前記異種組換え系からのタンパク質の前記セットが、ステップ（ａ）の前に前記異種組換え系からのタンパク質の前記セットをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて前記微生物宿主細胞に導入される、請求項８１に記載の方法。
前記異種組換え系からのタンパク質の前記セットが、前記異種組換え系からのタンパク質の前記セットをコードする遺伝子の前記微生物宿主細胞のゲノムへの組込みに起因して、前記微生物宿主細胞により安定的に発現される、請求項８１に記載の方法。
前記異種組換え系からのタンパク質の前記セットが、構成的に発現される、請求項８１に記載の方法。
前記異種組換え系からのタンパク質の前記セットが、誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、必要に応じて、異種組換え系遺伝子がオペロン内に存在する、請求項８１に記載の方法。
前記誘導性プロモーターが、試薬の添加、代謝物もしくは試薬の枯渇により、または温度の変化により、誘導され得る、請求項８７に記載の方法。
前記試薬が、アラビノース、イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびテトラサイクリンからなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
前記導入するステップが、前記微生物宿主細胞を形質転換することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物宿主細胞が、真核細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物宿主細胞が、酵母細胞である、請求項９１に記載の方法。
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項９２に記載の方法。
前記微生物宿主細胞が、糸状真菌である、請求項９１に記載の方法。
前記糸状真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである、請求項９４に記載の方法。
前記微生物宿主細胞が、原核細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
原核生物宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項９６に記載の方法。
原核生物宿主細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項９６に記載の方法。