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JP2022523360A - Ｍｅｔに結合する抗ｍｅｔ抗体および二特異性抗原結合分子を使用した眼癌の治療方法 - Google Patents

Ｍｅｔに結合する抗ｍｅｔ抗体および二特異性抗原結合分子を使用した眼癌の治療方法 Download PDF

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JP2022523360A JP2021549279A JP2021549279A JP2022523360A JP 2022523360 A JP2022523360 A JP 2022523360A JP 2021549279 A JP2021549279 A JP 2021549279A JP 2021549279 A JP2021549279 A JP 2021549279A JP 2022523360 A JP2022523360 A JP 2022523360A
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Abstract

本明細書において、ＭＥＴに結合する抗体または二特異性抗原結合分子、または当該抗体もしくは二特異性抗原結合分子を含む抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）を使用して、ブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌を治療する方法が提供される。二特異性抗原結合分子は、第一および第二の抗原結合ドメインを含み、当該第一および第二の抗原結合ドメインは、ヒトＭＥＴの細胞外ドメインの二つの異なるエピトープに結合する。ＡＤＣは、細胞障害剤、放射性核種、または他の部分に連結された、本明細書に提供される抗体または二特異性抗原結合分子を含む。抗体および二特異性抗原結合分子は、ヒトＭＥＴおよびそのリガンドのＨＧＦとの間の相互作用を遮断することができる。眼癌を有する対象、例えば、ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマを有する対象を、抗体、二特異性抗原結合分子、またはそのＡＤＣを当該対象に投与することにより治療することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－ＭｅｔまたはＭＥＴ）に特異的に結合し、ＭＥＴシグナル伝達を調節して、ブドウ膜メラノーマを含む眼癌を治療する抗体、二特異性抗体、およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体の抗体－薬剤結合体に関するものである。
配列表
配列表の公的な写しは、ＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書と同時に提出され、当該写しのファイル名は「１０５４８ＷＯ０１＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」であり、２０２０年２月２０日が作成日であり、サイズは約１４０キロバイトである。このＡＳＣＩＩフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ブドウ膜メラノーマは、成人において最も普遍的な眼内原発性悪性腫瘍であり、眼メラノーマの７９～８１％を占める。米国における発症率は１００万人当たり５人と推定され、一方でヨーロッパにおける発症率は緯度に依存し、北から南へと向かうにつれて発症率は減少して１００万人当たり２～８人と推定されている。ブドウ膜メラノーマは転移傾向が高く、長期予後は不良で、５０％を超える症例で死亡する。
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（別名、散乱因子［ＳＦ：ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ］）はヘテロ二量体のパラクライン増殖因子であり、ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ）と相互作用することによってその活性を発揮する。ＨＧＦＲは、ｃ－Ｍｅｔ癌遺伝子の産物であり、ＭＥＴとしても知られている。ＭＥＴは、ジスルフィド架橋を介して細胞外アルファ鎖に連結された膜貫通ベータ鎖からなる受容体チロシンキナーゼである。ＨＧＦがＭＥＴに結合すると、ＭＥＴのキナーゼ触媒活性が活性化され、ベータ鎖のＴｙｒ １２３４およびＴｙｒ １２３５のリン酸化と、それに続く下流シグナル伝達経路の活性化が生じる。
ＭＥＴ遺伝子が増幅した腫瘍細胞株は、増殖および生存をＭＥＴに高度に依存している。様々な一価のＭＥＴ遮断抗体が、様々な癌の治療に臨床開発されている（米国特許第５，６８６，２９２号、第５，６４６，０３６号、第６，０９９，８４１号、第７，４７６，７２４号、第９，２６０，５３１号、および第９，３２８，１７３号、ならびに米国特許出願公開２０１４／０３４９３１０および２００５／０２３３９６０を参照）。そうした抗体としては、オナルツズマブ（ＭｅｔＭａｂ：ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）やエミベツズマブ（ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）が挙げられる（Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９（１８）：５０６８－７８，２０１３、およびＲｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｃｔｏｂｅｒ １０，２０１６，ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１６－１４１８）。これら抗体の一部は、リガンド依存性のＭＥＴシグナル伝達を遮断するが、リガンド非依存性のＭＥＴ活性化の遮断にはあまり有効ではない。
ブドウ膜メラノーマ腫瘍は、Ｇ－タンパク質の変異（ＧＮＡＱおよびＧＮＡ１１）とｃ－Ｍｅｔの高発現を特徴とする。ブドウ膜メラノーマのｃ－Ｍｅｔの標的化は、細胞の浸潤と転移を阻害するが、腫瘍の増殖は抑制されない。局所的な腫瘍制御率や世界的な救命率は徐々に改善されているが、生存率は比較的未変化のままである。抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は過去数年で進歩しており、そのうちのいくつかはＦＤＡにより使用が承認されているが、ブドウ膜メラノーマに対して開発されたものはこれまでのところない。リガンド依存性とリガンド非依存性の両方のＭＥＴシグナル伝達を強力に遮断する、ブドウ膜メラノーマを含む眼癌の治療に使用するための抗癌剤の改善に対する重大なアンメットメディカルニーズが未だ存在している。
米国特許第５，６８６，２９２号明細書 米国特許第５，６４６，０３６号明細書 米国特許第６，０９９，８４１号明細書 米国特許第７，４７６，７２４号明細書 米国特許第９，２６０，５３１号明細書 米国特許第９，３２８，１７３号明細書 米国特許出願公開第２０１４／０３４９３１０号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２３３９６０号明細書
Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９（１８）：５０６８－７８，２０１３ Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｃｔｏｂｅｒ １０，２０１６，ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１６－１４１８
本明細書において、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌を治療する方法が提供される。当該方法は、抗体、抗体の抗原結合断片、二価一特異性抗体の組み合わせ、またはヒトｃ－Ｍｅｔ受容体タンパク質に結合する二特異性抗体（ＭＥＴ×ＭＥＴ）を用いた治療を含む。抗ＭＥＴ抗体およびその抗原結合部分は、非改変の形態で単独で使用されてもよく、または抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）の一部として、もしくは二特異性抗体の一部として含まれてもよい。抗体およびＡＤＣは特に、ＭＥＴを発現する腫瘍細胞の標的化に有用であり、したがって本明細書に開示される眼癌の治療方法において有用である。
他の実施形態は、後に続く詳細な説明の検討を行うことから明白となるであろう。
図１は、本明細書に開示される２７２個の例示的なＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体の構成要素を示すマトリクスである。マトリクスの番号付けされた各セルは、“Ｄ１”抗原結合ドメインと“Ｄ２”抗原結合ドメインを含む固有の二特異性抗体を確認するものであり、この場合において当該Ｄ１抗原結合ドメインは、Ｙ軸に沿って列記される対応する抗ＭＥＴ抗体の免疫グロブリン可変ドメイン（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア）またはＣＤＲを含み、当該Ｄ２抗原結合ドメインは、Ｘ軸に沿って列記される対応する抗ＭＥＴ抗体の免疫グロブリン可変ドメイン（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列）またはＣＤＲを含む。
図２は、ＳＲＥ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、抗体誘導型ＭＥＴ経路活性化、またはＨＧＦ誘導型経路活性化の抗体遮断を評価するために使用されたルシフェラーゼ系レポーターアッセイの概略である。
図３は、１リットル当たりの対数モルを単位とする抗体濃度の関数としてＳＲＥ－ルシフェラーゼ発現を表す相対光度単位（ＲＬＵ）を示す折れ線グラフである。黒四角（■）は、親二価一特異性抗体Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２を表し、黒三角（▲）は、親二価一特異性抗体Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２を表し、黒丸（●）は、一価抗体を表し、黒菱形（◆）は、アイソタイプ対照を表し、黒逆三角（▼）は、リガンド無しを表す。図３Ａは、ＨＧＦリガンドを伴わない抗体単独を示す。図３Ｂは、抗体＋ＨＧＦリガンドを示す。
図４は、１リットル当たりの対数モルを単位とする抗体濃度の関数としてＳＲＥ－ルシフェラーゼ発現を表す相対光度単位（ＲＬＵ）を示す折れ線グラフである。黒四角（■）は、抗ＭＥＴ一価抗体を表し、黒丸（●）は、ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体を表し、黒菱形（◆）は、親抗体Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２を表す。図４Ａは、ＨＧＦリガンドを伴わない抗体単独を示す。図４Ｂは、抗体＋ＨＧＦリガンドを示す。
図５は、ヒト二価一特異性抗ＭＥＴ抗体１～１８、対照抗体、および抗ＭＥＴ一価抗体を用いた処置の関数としてＭＥＴ増幅胃癌ＳＮＵ５細胞の相対的細胞増殖を示す棒グラフである。比較目的のために、抗体８（横座標）は、親抗体Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２であり、抗体１１（横座標）は、親抗体Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２である。
図６は、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体、対照抗体、および抗ＭＥＴ一価抗体を用いた処置の関数としてＭＥＴ増幅細胞の相対的細胞増殖を示す棒グラフを含む。図６Ａは、対照抗体、０．１、１、および１０μｇ／ｍＬの一価抗体、ならびに０．１、１、および１０μｇ／ｍＬのＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いた処置の関数としてのＳＮＵ５細胞の相対的増殖を示す。図６Ｂは、対照抗体、ならびに０．１、および１μｇ／ｍＬのＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いた処置の関数としてのＥＢＣ－１細胞の相対的増殖を示す。
図７は、対照抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いた処置後のＨｓ７４６Ｔ細胞から抽出されたｐＭＥＴ（リン酸化ＭＥＴ）、ＭＥＴ、ｐＥｒｋ（リン酸化Ｅｒｋ）、およびチューブリン（ローディング対照用）のイムノブロット（図７Ａ）、ならびに０、２、および６時間、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体で処置した後のＨｓ７４６Ｔ細胞におけるＭＥＴ（およびローディング対照としてのチューブリン）の発現（図７Ｂ）を示す。
図８は、対照抗体、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体、抗ＭＥＴ一特異性二価親抗体１、抗ＭＥＴ一特異性二価親抗体２、および親抗体１と親抗体２の組み合わせで処置した後のＨｓ７４６Ｔ細胞から抽出されたｐＭＥＴ、ＭＥＴ、ｐＥｒｋおよびチューブリン（ローディング対照用）のイムノブロットを示す。
図９は、対照抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体で２、６および１８時間処置した後のＨｓ７４６Ｔ細胞におけるＭＥＴ（およびローディング対照としてのチューブリン）の発現に関するイムノブロットを示す。
図１０は、対照抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いた処置後のＳＮＵ５細胞から抽出されたｐＭＥＴ、ＭＥＴ、ｐＥｒｋ、およびチューブリン（ローディング対照用）のイムノブロット（図１０Ａ）、ならびに対照抗体および抗ＭＥＴ一価抗体で処置した後のＳＮＵ５細胞におけるＭＥＴ（およびローディング対照としてのチューブリン）の発現（図１０Ｂ）を示す。
図１１は、対照抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体で処置した後のＥＢＣ－１細胞から抽出されたｐＭＥＴ、ＭＥＴ、ｐＥｒｋおよびチューブリン（ローディング対照用）のイムノブロットを示す。
図１２は、対照抗体（黒四角■）、ＭＥＴ一価抗体（黒丸●）、またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体（黒菱形◆）で処置された動物における、ＥＢＣ－１細胞移植後の日数の時間関数としての立方ミリメートル単位でのＥＢＣ－１腫瘍の体積の変化を示す線グラフである。
図１３は、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体、対照抗体、および抗ＭＥＴ一価抗体を用いた処置の関数としてＭＥＴ増幅細胞の相対的細胞増殖を示す棒グラフを含む。図１３Ａは、対照抗体、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ親一特異性抗体１、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ親一特異性抗体２、および親抗体１と親抗体２の組み合わせを用いた処置の関数としてのＨｓ７４６Ｔ細胞の相対的増殖を示す。図１３Ｂは、対照抗体、１、１０、および２５μｇ／ｍＬの一価抗体、ならびに１、１０、および２５μｇ／ｍＬのＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いた処置の関数としてのＨｓ７４６Ｔ細胞の相対的増殖を示す。
図１４は、対照抗体（Ｃ）、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体（ＭＭ）、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ親一特異性抗体１（Ｍ１）、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ親一特異性抗体２（Ｍ２）、および親抗体１と親抗体２の組み合わせ（Ｍ１Ｍ２）、ならびにＭＥＴアゴニストの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を用いた処置の関数としてのＮＣＩ－Ｈ５９６細胞の相対的増殖を示す棒グラフである。
図１５は、対照抗体（黒四角■）ＭＥＴ一価抗体（黒丸●）、またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体（黒菱形◆）で処置された動物における、Ｈｓ７４６Ｔ細胞移植後の日数の時間関数としての立方ミリメートル単位でのＨｓ７４６Ｔ腫瘍の体積の変化を示す線グラフである。
図１６Ａは、対照抗体（黒四角■）、１ｍｇ／ｍＬのＭＥＴ一価抗体（黒丸●）、１０ｍｇ／ｍＬのＭＥＴ一価抗体（白丸〇）、１ｍｇ／ｍＬのＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体（黒菱形◆）、または１０ｍｇ／ｍＬのＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体（白菱形◇）で処置された動物における、ＳＮＵ５細胞移植後の日数の時間関数としての立方ミリメートル単位でのＳＮＵ５腫瘍の体積の変化を示す線グラフである。
図１６Ｂは、対照抗体、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＭＥＴ一価抗体、および１０ｍｇ／ｋｇのＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体を用いた処置後に、マウス異種移植片モデルから採取されたＳＮＵ５腫瘍から抽出されたｐＭＥＴ、ＭＥＴ、およびチューブリン（ローディング対照）のイムノブロットである。
図１７は、対照抗体（黒四角■）、ＭＥＴ一価抗体（黒丸●）、またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体（黒菱形◆）で処置された動物における、Ｕ８７－ＭＧ細胞移植後の日数の時間関数としての立方ミリメートル単位でのＵ８７－ＭＧ腫瘍の体積の変化を示す線グラフである。
図１８は、対照抗体（黒四角■）、ＭＥＴ一価抗体（黒丸●）、またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体（白菱形◇）で処置された動物における、Ｕ１１８－ＭＧ細胞移植後の日数の時間関数としての立方ミリメートル単位でのＵ１１８－ＭＧ腫瘍の体積の変化を示す線グラフである。
図１９は、メイタンシノイド６（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ ６）の合成を示す概略図である。
図２０は、メイタンシノイド中間体１の合成を示す概略図である。
図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、および図２１Ｄは、メイタンシノイドＢ（黒三角▲）と結合したアイソタイプ抗体と比較した、メイタンシノイドＢ（黒丸●）に結合した二つの異なる濃度の二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体で処置された四つのｃ－Ｍｅｔ発現ブドウ膜メラノーマ細胞における、７日間の細胞生存率における変化を示す線グラフである。 同上。 同上。 同上。
図２２Ａおよび図２２Ｂは、メイタンシノイドＢ（０．３～１０ｎＭ）と結合された二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体（クロスハッチ模様の線）、またはメイタンシノイドＢと結合されたアイソタイプ抗体（黒四角■）で７日間にわたり処置されたときの、ｃ－Ｍｅｔ発現ＯＭＭ１．３細胞とｃ－Ｍｅｔ陰性ＯＣＭ３細胞を比較した、細胞生存率の変化を示す線グラフである。 同上。
図２３および図２４は、メイタンシノイドＢと結合されたアイソタイプ抗体と比較して、メイタンシノイドＢに結合された二つの異なる濃度（１．２５ｎＭ、図２３；２．５ｎＭ、図２４）の二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体で処置されたブドウ膜メラノーマ細胞の処置から得られたアポトーシス割合を示す棒グラフである。 同上。
図２５、図２６、および図２７は、メイタンシノイドＢと結合されたアイソタイプ抗体と比較した、メイタンシノイドＢと結合された二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体を用いた処置後の増殖相の各々における細胞分布を示すヒストグラム（側方散乱プロットが挿入）である。二つのｃ－Ｍｅｔ陽性細胞株であるＯＭＭ１．３（図２５）とＭｅｌ２０２（図２６）が検証され、ｃ－Ｍｅｔ陰性細胞株のＯＣＭ３と比較された（図２７）。 同上。 同上。
図２８は、いくつかのブドウ膜メラノーマ細胞株、ならびにｃ－Ｍｅｔを高度に発現することが知られている陽性対照の胃癌細胞株であるＳＮＵ－５、およびｃ－Ｍｅｔを発現する肺癌細胞株であるＡ５４９のｃ－Ｍｅｔ発現レベルを示すウェスタンブロットの画像である。
図２９は、メイタンシノイドＢと結合されたアイソタイプ抗体と比較された、メイタンシノイドＢと結合された二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体を用いた２４時間の処置後の三つのブドウ膜メラノーマ細胞株における、ＰＡＲＰ切断およびヒストンＨ３リン酸化を示すウェスタンブロットの画像である。
図３０は、メイタンシノイドＢと結合されたアイソタイプ抗体と比較された、メイタンシノイドＢと結合された二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体を用いた処置後のｃ－Ｍｅｔ陽性細胞株ＯＭＭ１．３における、ＰＡＲＰ切断、ｃ－Ｍｅｔタンパク質の発現、およびヒストンＨ３のリン酸化の時間依存性の誘導を、ｃ－Ｍｅｔ陰性細胞株のＯＣＭ３と比較して示すウェスタンブロットの画像である。
図３１は、メイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－プロパンアミジル－３－チオ－３－スクシンイミジル－Ｎ－メチルシクロヘキシル－４－トランス－カルボキシコハク酸塩の‘Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。スペクトルは、混合物に起因する共鳴により複雑化されることはなく、単一のジアステレオマーと一致し、当該単一ジアステレオマーは少なくとも９５％のジアステレオマー過剰状態にある。
図３２は、５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを化学的誘引物質として使用しながら、対照抗体、対照－ＡＤＣ、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ、およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ－ＡＤＣの用量を増加させて処置されたＯＭＭ１．３細胞における、細胞浸潤の阻害を示す画像を提供する。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ－ＡＤＣは、ピコモルの投与量で細胞浸潤を強力に阻害した。当該投与量では、細胞生存率は影響を受けない。
図３３は、メイタンシノイドＢと結合されたアイソタイプ抗体と比較された、メイタンシノイドＢと結合された二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体で処置されたブドウ膜メラノーマ細胞の細胞生存率の用量依存性の減少を示す。
本発明を説明する前に、本開示は、記述される特定の方法および実験条件に限定されず、そうした方法および条件は変化し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態を記述する目的でのみ使用されており、限定することは意図されないことも理解されたい。
別途規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本教示の属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙される数値に関して使用される場合、当該値が、列挙される値から１％以下まで変動し得ることを意味する。例えば本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、９９および１０１、ならびにその間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。
本明細書に記載したものと類似または均等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから記述する。本明細書において言及される全ての特許、特許出願、および非特許公開文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ＭＥＴタンパク質
「ＭＥＴ」、「ｃ－Ｍｅｔ」などの表現は、本明細書で使用される場合、（１）配列番号１４５に記載されるアミノ酸配列、および／もしくはアイソフォーム「ａ」の非プロセッシングプレプロタンパク質を表すＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１２７５００．２に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、（２）配列番号１４６に記載されるアミノ酸配列、および／もしくはアイソフォーム「ｂ」の非プロセッシングプレプロタンパク質を表すＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００２３６．２に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、（３）配列番号１４７に記載されるアミノ酸配列、および／もしくはアイソフォーム「ｃ」の非プロセッシングプレプロタンパク質を表すＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３１１３３０．１に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、ならびに／または（３）三つのアイソフォームすべてに共通する細胞質アルファサブユニット（配列番号１４８）、および膜貫通ベータサブユニット（アイソフォームａ、ｂおよびｃに対しそれぞれ配列番号１４９、１５０または１５１）、を含む成熟タンパク質、を含むヒト膜貫通受容体チロシンキナーゼを指す。「ＭＥＴ」という表現には、単量体および多量体のＭＥＴ分子の両方が含まれる。本明細書において使用される場合、「単量体ヒトＭＥＴ」という表現は、任意の多量体形成ドメインを含有していない、または保有していない、および別のＭＥＴ分子への直接的な物理的接続を伴わずに単一のＭＥＴ分子として通常の条件下に存在する、ＭＥＴタンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体ＭＥＴ分子は、本明細書において、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む「ｈＭＥＴ．ｍｍｈ」と呼称される分子である（例えば本明細書の実施例３を参照）。本明細書で使用される場合、「二量体ヒトＭＥＴ」という表現は、リンカー、共有結合、非共有結合を介して、または抗体Ｆｃドメインなどの多量体形成ドメインを介して、互いに接続された二個のＭＥＴ分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体ＭＥＴ分子は、本明細書において、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む「ｈＭＥＴ．ｍＦｃ」と呼称される分子である（例えば本明細書の実施例３を参照）。
本明細書における、タンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質断片への全ての参照は、非ヒト種からと明示的に指定されていない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図されている。したがって、「ＭＥＴ」という表現は、例えば「マウスＭＥＴ」、「サルＭＥＴ」など、非ヒト種由来であると特定されていない限り、ヒトＭＥＴを意味する。
本明細書において使用される場合、「細胞表面発現ＭＥＴ」という表現は、ＭＥＴタンパク質の少なくとも一部が、細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボにおいて細胞表面上に発現される、一つ以上のＭＥＴタンパク質、またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現ＭＥＴ」は、ＭＥＴタンパク質を通常に発現する細胞の表面上に発現されるＭＥＴタンパク質を含んでもよく、またはそれからなってもよい。あるいは、「細胞表面発現ＭＥＴ」は、通常はその表面上にヒトＭＥＴを発現しないが、人為的にその表面上にＭＥＴを発現するように操作された細胞の表面上で発現されるＭＥＴタンパク質を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
眼癌の治療方法
本明細書において、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌を治療する方法が提供される。一部の態様では、方法は、その必要のある対象に、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子（例えば、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲの配列のいずれかを含む抗ＭＥＴ、または本明細書の表５に記載されるＤ１構成要素およびＤ２構成要素のいずれかを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子、またはオナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、エミベツズマブ（ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、テリソツズマブ（ｔｅｌｉｓｏｔｕｚｕｍａｂ）、ＳＡＩＴ３０１、ＡＲＧＸ－１１１、Ｓｙｍ０１５、ＨｕＭａｘ－ｃＭｅｔ、およびＣＥ－３５５６２１からなる群から選択される抗ＭＥＴ抗体）を含む治療用組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、以下に詳述されるように、例えばメイタンシノイドなどの細胞障害性化合物に結合される。治療用組成物は、細胞障害剤に結合された抗ＭＥＴ ＡＤＣまたはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を含む、本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含んでもよい。
ブドウ膜メラノーマは、成人において最も普遍的な悪性原発性の眼内腫瘍である。これらの腫瘍は、脈絡膜、虹彩および毛様体に発生する可能性があり、虹彩または毛様体のメラノーマと呼ばれる場合もある。ブドウ膜メラノーマは高度に転移性である。他の眼癌としては、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫が挙げられ、後者は毛様体およびブドウ膜で発生する可能性がある。本明細書に開示される方法は、例えば眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌の治療に有用であることが予期される。一部の態様では、治療には、原発腫瘍からの浸潤および／もしくは転移を阻害または軽減することが含まれる。
抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子、ならびにその薬剤結合体は特に、ＭＥＴの発現、シグナル伝達もしくは活性に関連する、または介在される、またはＭＥＴとＨＧＦの間の相互作用の遮断により治療可能である、ならびに／または別手段によりＭＥＴの活性および／もしくはシグナル伝達を阻害することにより治療可能である、ならびに／または受容体内在化を促進することにより治療可能である、ならびに／または細胞表面受容体の数を減少させることにより治療可能である、任意の疾患もしくは障害の治療、予防および／または改善に有用である。特に抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子、ならびにその薬剤結合体は、ブドウ膜メラノーマの治療に有用である。治療には、対象においてブドウ膜メラノーマの腫瘍増殖を低下させること、および／またはブドウ膜メラノーマの退縮をもたらすことが含まれる。さらに治療には、ブドウ膜メラノーマ細胞の浸潤を阻害もしくは軽減すること、または原発腫瘍からのブドウ膜メラノーマの転移を阻害もしくは軽減することが含まれる。
例えば本開示の抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、ＭＥＴを発現する（または過剰発現する）ブドウ膜メラノーマ腫瘍の治療に有用である。例えば、抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、眼に生じる原発性および／または転移性の腫瘍を治療するために使用されてもよい。
したがって本明細書は、対象において、眼癌を治療する方法、眼癌の増殖を低下させる方法、眼癌の浸潤および／もしくは転移を阻害または軽減する方法、ならびに／または眼癌の退縮をもたらす方法を提供する。例えば本明細書は、対象において、ブドウ膜メラノーマを治療する方法、ブドウ膜メラノーマ腫瘍の増殖を低下させる方法、ブドウ膜メラノーマの浸潤および／もしくは転移を阻害または軽減する方法、ならびに／またはブドウ膜メラノーマの退縮をもたらす方法を提供する。一部の態様では、例えばブドウ膜メラノーマなどの眼癌は、ＭＥＴを発現する。一部の態様では、方法は、その必要のある対象に、二特異性抗原結合分子とサイトトキシンを含む抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）を投与することを含み、この場合において当該二特異性抗原結合分子は、第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）および第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）を含み、Ｄ１はヒトＭＥＴの第一のエピトープに特異的に結合し、Ｄ２はヒトＭＥＴの第二のエピトープに特異的に結合する。
さらに本明細書において、ブドウ膜メラノーマ細胞の増殖を阻害する方法、浸潤を阻害する方法、アポトーシスを誘導する方法、および／または生存率を減少させる方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、細胞と、二特異性抗原結合分子とサイトトキシンを含む抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）とを接触させることを含む。一部の実施形態では、二特異性抗原結合分子は、第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）を含み、この場合においてＤ１は、ヒトＭＥＴの第一のエピトープに特異的に結合し、Ｄ２は、ヒトＭＥＴの第二のエピトープに特異的に結合する。
さらに本明細書において、ブドウ膜メラノーマ細胞の有糸分裂停止を誘導する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、細胞と、二特異性抗原結合分子とサイトトキシンを含む抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）とを接触させることを含み、この場合において当該二特異性抗原結合分子は、第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）を含み、Ｄ１はヒトＭＥＴの第一のエピトープに特異的に結合し、Ｄ２はヒトＭＥＴの第二のエピトープに特異的に結合する。
また本明細書において、ｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍に罹患する対象において、眼癌を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、当該対象に、二特異性抗原結合分子を投与することを含み、当該分子は、第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）を含み、この場合においてＤ１は、ヒトＭＥＴの第一のエピトープに特異的に結合し、Ｄ２は、ヒトＭＥＴの第二のエピトープに特異的に結合する。一部の態様では、二特異性抗原結合分子は、サイトトキシンと結合されて、抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）を形成する。一部の態様では、サイトトキシンは、メイタンシノイドである。
二特異性抗原結合分子の様々な態様、およびサイトトキシンの様々な態様が、以下の段落に提供されているが、本明細書の別段においてより詳細に記述される。
一部の態様では、Ｄ１とＤ２は、ヒトＭＥＴへの結合に関し、互いに競合しない。一部の態様では、ヒトＭＥＴの第一のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４を含む。一部の態様では、ヒトＭＥＴの第二のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸３０５～３１５および４２１～４５５を含む。一部の態様では、ヒトＭＥＴの第一のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４を含み、ヒトＭＥＴの第二のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸３０５～３１５および４２１～４５５を含む。
一部の実施形態では、Ｄ１は、配列番号５８または配列番号１８のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１，ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む。一部の実施形態では、Ｄ２は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１，ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む。
一部の実施形態では、二特異性抗原結合分子は、配列番号５８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、二特異性抗原結合分子は、配列番号１８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のＤ１は、配列番号５８のアミノ酸配列または当該配列少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および配列番号１３８のアミノ酸配列または当該配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む。
一部の態様では、Ｄ１のＨＣＤＲ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４２のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣＤＲ３は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のＤ１は、配列番号５８のアミノ酸配列、または当該配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１３８のアミノ酸配列、または当該配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のＤ１は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のＤ２は、配列番号８２のアミノ酸配列または当該配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および配列番号１３８のアミノ酸配列または当該配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のＤ２のＨＣＤＲ１は、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号８６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号８８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のＤ２は、配列番号８２のアミノ酸配列、または当該配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１３８のアミノ酸配列、または当該配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のＤ２は、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、サイトトキシンは、バイオトキシン、化学療法剤、および放射性同位体からなる群から選択される。例えばサイトトキシンは、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、トメイマイシン（ｔｏｍａｙｍｙｃｉｎ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈ、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択されてもよい。一部の態様では、サイトトキシンは、リンカーを介して二特異性抗原結合分子に結合される。
サイトトキシンの例は、以下である：
Figure 2022523360000001
 式中、
Figure 2022523360000002
 は、リンカーへの結合である。一部の態様では、リンカーは、以下である：
Figure 2022523360000003
 式中、
Figure 2022523360000004
 で記される結合は、二特異性抗原結合分子への結合を表し、
Figure 2022523360000005
 で記される結合は、サイトトキシンへの結合を表す。
さらなるサイトトキシンの例は、以下である：
Figure 2022523360000006
 式中、
Figure 2022523360000007
 は、リンカーへの結合である。一部の態様では、リンカーは、以下である：
Figure 2022523360000008
 式中、
Figure 2022523360000009
 で記される結合は、二特異性抗原結合分子への結合を表し、
Figure 2022523360000010
 で記される結合は、サイトトキシンへの結合を表す。
本明細書に提供される方法は、眼癌または目の癌の治療に有用である。一部の実施形態では、眼癌は、ブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫からなる群から選択される。
本明細書に記載される治療方法において、抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子、ならびにその薬剤結合体は、単剤療法として（すなわち、唯一つの治療剤として）投与されてもよく、または一つ以上の追加的治療剤（その例は本明細書において別に記載されている）と組み合わされて投与されてもよい。
抗ＭＥＴ抗体およびその抗原結合断片
さらなる詳細において、および一つの態様によれば、本明細書に提供される方法に従い有用な抗ＭＥＴ抗体は、本明細書の表１および表２に列挙される。表１には、例示的な抗ＭＥＴ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列の識別子が記載されており、そこから本明細書に開示される二特異性抗原結合分子（本明細書において二特異性抗原結合タンパク質と相互交換可能に使用される）が誘導され得る。表２には、例示的な抗ＭＥＴ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列の識別子が記載されている。
また本明細書に提供される方法に従って、オナルツズマブ、エミベツズマブ、テリソツズマブ、ＳＡＩＴ３０１、ＡＲＧＸ－１１１、Ｓｙｍ０１５、ＨｕＭａｘ－ｃＭｅｔ、およびＣＥ－３５５６２１からなる群から選択される抗ＭＥＴ抗体も有用である。
また本明細書に提供される方法に従って、ＭＥＴに特異的に結合し、細胞中のＭＥＴのシグナル伝達経路をアゴナイズ（例えば活性化）する抗体またはその抗原結合断片も有益であり、ならびにＭＥＴシグナル伝達の活性化が有益である、または治療上有用である治療状況下における当該抗体の使用も有用である。そのようなアゴニスト性抗ＭＥＴ抗体の非限定的な例としては、本明細書において「Ｈ４Ｈ１４６３６Ｄ」と呼称される抗体、ならびに重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲ（配列番号２８、３０、３２、１４０、１４２、１４４）ならびに／またはその重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（配列番号２６／１３８）を含む抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。
本明細書において、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似した配列を含むＨＣＶＲを含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が有用である。
本明細書において、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が有用である。
本明細書において、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片が有用である。ある実施形態によれば、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される：配列番号２／１３８、１０／１３８、１８／１３８、２６／１３８、３４／１３８、４２／１３８、５０／１３８、５８／１３８、６６／１３８、７４／１３８、８２／１３８、９０／１３８、９８／１３８、１０６／１３８、１１４／１３８、１２２／１３８および１３０／１３８。
また、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ１とＬＣＤＲ１とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ１／ＬＣＤＲ１）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。ある実施形態によれば、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、ＨＣＤＲ１／ＬＣＤＲ１アミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される：配列番号４／１４０、１２／１４０、２０／１４０、２８／１４０、３６／１４０、４４／１４０、５２／１４０、６０／１４０、６８／１４０、７６／１４０、８４／１４０、９２／１４０、１００／１４０、１０８／１４０、１１６／１４０、１２４／１４０および１３２／１４０。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ２とＬＣＤＲ２とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ２／ＬＣＤＲ２）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。ある実施形態によれば、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ２／ＬＣＤＲ２アミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、ＨＣＤＲ２／ＬＣＤＲ２アミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される：配列番号６／１４２、１４／１４２、２２／１４２、３０／１４２、３８／１４２、４６／１４２、５４／１４２、６２／１４２、７０／１４２、７８／１４２、８６／１４２、９４／１４２、１０２／１４２、１１０／１４２、１１８／１４２、１２６／１４２および１３４／１４２。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。ある実施形態によれば、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される：配列番号８／１４４、１６／１４４、２４／１４４、３２／１４４、４０／１４４、４８／１４４、５６／１４４、６４／１４４、７２／１４４、８０／１４４、８８／１４４、９６／１４４、１０４／１４４、１１２／１４４、１２０／１４４、１２８／１４４および１３６／１４４。
本明細書において、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有される六個のＣＤＲ（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む、ＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。ある実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、以下からなる群から選択される：配列番号４－６－８－１４０－１４２－１４４、１２－１４－１６－１４０－１４２－１４４、２０－２２－２４－１４０－１４２－１４４、２８－３０－３２－１４０－１４２－１４４、３６－３８－４０－１４０－１４２－１４４、４４－４４－４８－１４０－１４２－１４４、５２－５４－５６－１４０－１４２－１４４、６０－６２－６４－１４０－１４２－１４４、６８－７０－７２－１４０－１４２－１４４、７６－７８－８０－１４０－１４２－１４４、８４－８６－８８－１４０－１４２－１４４、９２－９４－９６－１４０－１４２－１４４、１００－１０２－１０４－１４０－１４２－１４４、１０８－１１０－１１２－１４０－１４２－１４４、１１６－１１８－１２０－１４０－１４２－１４４、１２４－１２６－１２８－１４０－１４２－１４４、および１３２－１３４－１３６－１４０－１４２－１４４。
関連の実施形態では、ＭＥＴに特異的に結合し、本明細書に開示される方法において有用な抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかにより規定されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの中に含有される六個のＣＤＲ（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む。例えばＭＥＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、以下からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの中に含有されるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む：配列番号４－６－８－１４０－１４２－１４４、１２－１４－１６－１４０－１４２－１４４、２０－２２－２４－１４０－１４２－１４４、２８－３０－３２－１４０－１４２－１４４、３６－３８－４０－１４０－１４２－１４４、４４－４４－４８－１４０－１４２－１４４、５２－５４－５６－１４０－１４２－１４４、６０－６２－６４－１４０－１４２－１４４、６８－７０－７２－１４０－１４２－１４４、７６－７８－８０－１４０－１４２－１４４、８４－８６－８８－１４０－１４２－１４４、９２－９４－９６－１４０－１４２－１４４、１００－１０２－１０４－１４０－１４２－１４４、１０８－１１０－１１２－１４０－１４２－１４４、１１６－１１８－１２０－１４０－１４２－１４４、１２４－１２６－１２８－１４０－１４２－１４４、および１３２－１３４－１３６－１４０－１４２－１４４。
ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技法は当該技術分野で既知であり、本明細書に開示の特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な慣習としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般的な条件では、Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ手法との間の折衷物である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。パブリックデータベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
本明細書に提供される方法に従い、改変グリコシル化パターンを有する抗ＭＥＴ抗体も有用である。いくつかの実施形態では、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾、または抗体がオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損していることが有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の応用において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子
本発明者らは、ＭＥＴへのＨＧＦ結合を遮断する特定の一特異性抗ＭＥＴ抗原結合分子が、ＭＥＴシグナル伝達を強力に活性化する傾向があること（治療用分子にとって望ましくない結果）を観察した。しかしながら本発明者らは驚くべきことに、ＭＥＴタンパク質の細胞外ドメイン上の二つの異なるエピトープに同時に結合する二特異性抗原結合分子は、ＭＥＴへのリガンド結合を遮断しながら、ＭＥＴシグナル伝達のアゴニズムをほとんど引き起こさないことを発見した。さらに本発明者らは驚くべきことに、当該二特異性抗原結合分子は、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌の治療、および／または転移の阻害もしくは軽減に非常に適していることも発見した。
したがって本明細書に記載される方法に従い、第一の抗原結合ドメイン（本発明において「Ｄ１」とも称される）および第二の抗原結合ドメイン（本明細書において「Ｄ２」とも称される）を含む、二特異性抗原結合分子が有用である。当該二特異性抗原結合分子による二つの異なるＭＥＴエピトープの同時結合は、ＭＥＴシグナル伝達の活性化を最小限にしながら効果的にリガンド遮断を生じさせる。
ヒトＭＥＴの第一のエピトープに特異的に結合する第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と、ヒトＭＥＴの第二のエピトープに特異的に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）とを含む二特異性抗原結合分子は、本明細書において、「ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体」、「ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ」、または他の関連する用語として呼称され得る。一部の実施形態では、ヒトＭＥＴの第一のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４を含む。一部の実施形態では、ヒトＭＥＴの第二のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸３０５～３１５および４２１～４５５を含む。一部の実施形態では、ヒトＭＥＴの第一のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４を含み、ヒトＭＥＴの第二のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸３０５～３１５および４２１～４５５を含む。
ある実施形態では、ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体のＤ１ドメインおよびＤ２ドメインは、互いに非競合的である。ＭＥＴへの結合に対して、Ｄ１とＤ２の間の非競合とは、Ｄ１およびＤ２が誘導されたそれぞれの一特異性抗原結合タンパク質が、ヒトＭＥＴへの結合に対して互いに競合しないことを意味する。抗原結合タンパク質の競合アッセイの例は当分野で既知であり、その非限定的な例は本明細書の別段に記載される。
ある実施形態では、Ｄ１およびＤ２は、本明細書において別段に記載されるように、ＭＥＴ上の異なるエピトープ（例えば、ＭＥＴ上の非重複エピトープまたは部分重複エピトープ）に結合する。
ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、二つの異なる一特異性抗ＭＥＴ抗体の抗原結合ドメインを使用して構築されてもよい。例えば、モノクローナル性の一特異性抗ＭＥＴ抗体のコレクションを、当分野に公知の標準的な方法を使用して作製してもよい。そのように作製された個々の抗体を、ＭＥＴタンパク質に対する交差競合に関して、互いに対して一対で試験してもよい。二つの異なる抗ＭＥＴ抗体が同時にＭＥＴに結合することができる場合（すなわち、互いに競合しない場合）、当該第一の抗ＭＥＴ抗体由来の抗原結合ドメインと、当該第二の非競合抗ＭＥＴ抗体由来の抗原結合ドメインを、本開示に従う一つのＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体へと操作してもよい。
本発明によれば、二特異性抗原結合分子は、一つの多機能性ポリペプチドであってもよく、または互いに共有結合的にまたは非共有結合的に関連付けられた二つ以上のポリペプチドの多量体性の複合体であってもよい。本開示によって明らかとなるように、ＭＥＴの二つの異なる同一ではないエピトープに同時に結合する能力を有する抗原結合構築物はすべて、二特異性抗原結合分子と見なされる。本発明に開示される二特異性抗原結合分子またはそのバリアントはいずれも、当業者に公知であるように、標準的な分子生物学的手法（例えば、組み換えＤＮＡ法およびタンパク質発現技術）を使用して構築されてもよい。
抗原結合領域
本明細書に開示される方法において有用な二特異性抗原結合分子は、二つの異なる抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）を含む。本明細書において使用される場合、「抗原結合ドメイン」という表現は、対象の特定抗原（例えばヒトＭＥＴ）に特異的に結合することができる、あらゆるペプチド、ポリペプチド、核酸分子、足場型（ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｔｙｐｅ）分子、ペプチドディスプレイ分子（ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、またはポリペプチド含有構築物を意味する。「特異的に結合する」などの用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合領域が、５００ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる特定の抗原と複合体を形成し、一般的な試験条件下においてその他の無関係な抗原を結合しないことを意味する。「関連性のない抗原」とは、互いに９５％未満のアミノ酸相同性を有する、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。
本開示と関連して使用され得る抗原結合ドメインの例示的な分類には、抗体、抗体の抗原結合部分、特定の抗原と特異的に相互作用するペプチド（例えば、ペプチボディ）、特定の抗原と特異的に相互作用する受容体分子、特定の抗原に特異的に結合する受容体のリガンド結合部分を含むタンパク質、抗原結合足場（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ、ＨＥＡＴ反復タンパク質、ＡＲＭ反復タンパク質、テトラトリコペプチド反復タンパク質、および天然の反復タンパク質に基づく他の足場など［例えば、Ｂｏｅｒｓｍａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２０１１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９－８５７、および当該文献内に引用される参考文献を参照されたい］）、ならびにそれらのアプタマーまたは部分が含まれる。
二個の分子が互いに特異的に結合するかどうかを判定するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴法、および同様の方法が挙げられる。例えば、本開示に関連して使用される場合、抗原結合領域には、表面プラズモン共鳴アッセイにて測定さした場合、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約２ｐＭ未満、約１ｐＭ未満、約０．５ｐＭ未満、約０．２ｐＭ未満、約０．１ｐＭ未満、または約０．０５ｐＭ未満のＫＤを有する、特定の抗原（例えば、標的分子［Ｔ］もしくは内部移行エフェクタータンパク質［Ｅ］）またはその一部を結合するポリペプチドが含まれる。
「表面プラズモン共鳴法」という用語は、本明細書において使用される場合、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社内Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス部門、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて検出することにより、リアルタイムの相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
「ＫＤ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定のタンパク質－タンパク質相互作用（例えば、抗体－抗原相互作用）の平衡解離定数を意味する。本発明にて開示されるＫＤ値は、表面プラズモン共鳴アッセイによって２５℃で測定されたＫＤ値を指す。
上記に示されるように、「抗原結合ドメイン」（Ｄ１および／またはＤ２）は、抗体または抗体の抗原結合断片を含んでもよいか、またはこれらからなってもよい。「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗原（例えば、ヒトＭＥＴ）と特異的に結合する、または相互作用する少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あらゆる抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語には、四つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続した二つの重（Ｈ）鎖および二つの軽（Ｌ）鎖、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む、免疫グロブリン分子が包含される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、一つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。異なる実施形態では、本明細書に提供される抗体のＦＲ（またはその抗原結合部分）は、ヒトの生殖系列配列と同一であってもよく、または自然にもしくは人為的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、二つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
本明細書に提供される二特異性抗原結合分子のＤ１構成要素および／またはＤ２構成要素は、完全抗体分子（ｆｕｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の抗原結合断片を含んでいても、これらからなっていてもよい。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成するいずれか天然の、酵素処理により取得可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えばタンパク質消化、または抗体の可変ドメイン、および任意で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作と発現を含む遺伝子組み換え操作法などの任意の適切な標準的技術を使用して完全抗体分子から誘導されてもよい。そのようなＤＮＡは既知であり、かつ／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成され得る。ＤＮＡは化学的に、または分子生物学的技術を使用することにより配列解析され、および操作されてもよく、例えば、一つ以上の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切な構成へと配置させてもよく、またはコドンを導入してもよく、システイン残基を生成してもよく、修飾してもよく、アミノ酸を付加もしくは欠失させてもよい。
抗原結合断片の非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ 断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール式免疫薬剤（ＳＭＩＰ：ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作型分子も、本明細書において使用される場合、「抗原結合断片」という表現の内に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的に、少なくとも一つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってもよく、一般的に、一つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、または一つ以上のフレームワークとともにフレーム内にある、少なくとも一つのＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は、二量体であってもよく、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有してもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含有してもよい。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも一つの定常ドメインに共有結合された少なくとも一つの可変ドメインを含有してもよい。本開示の抗体の抗原結合断片内で見られ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な構成には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。上記の構成例のいずれかを含む、可変ドメインと定常ドメインの任意の構成において、可変ドメインと定常ドメインは互いに直接結合されてもよく、または完全もしくは部分的なヒンジまたはリンカー領域により結合されてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子における隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可動性または半可動性連鎖をもたらす、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなってもよい。さらに、抗原結合断片は、上記に列挙された可変領域および定常領域の構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（またはその他の多量体）を、互いに非共有結合で、および／または一つ以上の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインとの非共有結合で（例えば、ジスルフィド結合により）、含んでいてもよい。
本明細書に提供される方法において有用な二特異性抗原結合分子は、ヒト抗体および／もしくは遺伝子組み換えヒト抗体、またはその断片を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含む。しかしヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて、および特定のＣＤＲ３において、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコード化されていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な突然変異誘導により導入された変異、またはインビボでの体細胞突然変異により導入された変異）を含んでもよい。しかしながら「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されていない。
本明細書に提供される方法において有用な二特異性抗原結合分子は、組み換えヒト抗体またはその抗原結合断片を含んでもよく、またはそれからなるものであってもよい。「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え手段によって、調製される、発現される、生成される、または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞（以下で詳述する）にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリ（以下で詳述する）から単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照されたい）、または他のＤＮＡ配列へヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含むあらゆるその他の手段によって調製される、発現される、生成される、または単離される抗体などを含むことが意図される。その様な遺伝子組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。ある特定の実施形態では、しかしながら、その様な遺伝子組換えヒト抗体はインビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボでの体細胞の突然変異誘発）に供されるため、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、関連する配列である一方で、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー中には自然に存在し得ない。
二特異性抗体を作製する方法は当分野に公知であり、当該方法を使用して、本明細書に開示される二特異性抗原結合分子を構築してもよい。本開示に関して使用することのできる例示的な二特異性のフォーマットとしては、限定されないが例えば、ｓｃＦｖベースまたはダイアボディ二特異性のフォーマット（ｄｉａｂｏｄｙ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒｍａｔ）、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二特異性フォーマット（前述のフォーマットのレビューに関しては、例えばＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２、ｍＡｂｓ ４：６、１～１１、および当該文献内に引用される参考文献を参照のこと）が挙げられる。
本明細書に提供されるＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子に含まれ得る抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）の例としては、本明細書に開示される抗ＭＥＴ抗体のいずれかに由来する抗原結合ドメインが挙げられる。例えば、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含むＨＣＶＲを含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子が、本明細書に記載されるブドウ膜メラノーマの治療方法に有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子が、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子が、本明細書に提供される方法により有用である。ある実施形態によれば、有用なＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含むＤ１またはＤ２抗原結合ドメインを含む。
また、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。ある実施形態によれば、本開示は、表１に列挙された例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
また、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有される六個のＣＤＲ（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子も有用である。
また、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかにより規定されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの中に含有される六個のＣＤＲ（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子も有用である。
本明細書に提供される方法において有用なＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、表１の抗ＭＥＴ抗体のいずれかに由来するＤ１抗原結合ドメイン、および表１の任意の他の抗ＭＥＴ抗体に由来するＤ２抗原結合ドメインを含んでもよい。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体の非限定的な例を、図１に示す。図１は、２７２個の例示的なＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体の構成要素を示すマトリクスである。マトリクスの番号付けされた各セル（１～２７２までの番号）は、“Ｄ１”抗原結合ドメインと“Ｄ２”抗原結合ドメインを含む固有の二特異性抗体を確認するものであり、この場合において当該Ｄ１抗原結合ドメインは、Ｙ軸に沿って列記される対応する抗ＭＥＴ抗体の免疫グロブリン可変ドメイン（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア）またはＣＤＲを含み、当該Ｄ２抗原結合ドメインは、Ｘ軸に沿って列記される対応する抗ＭＥＴ抗体の免疫グロブリン可変ドメイン（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列）またはＣＤＲを含む。したがって例えば、当該マトリクスに示されるＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子の「番号１０」は、例示的な抗ＭＥＴ抗体のＨ４Ｈ１３２９０Ｐ２に由来するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲペアまたは６－ＣＤＲセットを含むＤ１抗原結合ドメインと、例示的な抗ＭＥＴ抗体のＨ４Ｈ１３３２１Ｐ２に由来するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲペアまたは６－ＣＤＲセットを含むＤ２抗原結合ドメインとを含む。本明細書に提供されるＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体の追加的な例を、本明細書の実施例４に記載する。
本明細書に提供される方法により有用なＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子の例は、Ｄ１抗原結合ドメインとＤ２抗原結合ドメインとを含み、この場合において当該Ｄ１抗原結合ドメインは、配列番号５８／１３８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア、または配列番号６０－６２－６４－１４０－１４２－１４４を含む重鎖および軽鎖のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含み、およびこの場合において当該Ｄ２抗原結合ドメインは、配列番号８２／１３８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア、または配列番号 ８４－８６－８８－１４０－１４２－１４４を含む重鎖および軽鎖のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む。これらの配列の特徴を有する例示的なＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、二特異性抗体の番号１２２とも呼称される、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄと指定される二特異性抗体であり、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２に由来するＤ１と、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２に由来するＤ２とを含む（本明細書の実施例４および表５を参照のこと）。
さらなる非限定的な例示として、本明細書において有用なＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、Ｄ１抗原結合ドメインとＤ２抗原結合ドメインとを含み、この場合において当該Ｄ１抗原結合ドメインは、配列番号１８／１３８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア、または配列番号２０－２２－２４－１４０－１４２－１４４を含む重鎖および軽鎖のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含み、およびこの場合において当該Ｄ２抗原結合ドメインは、配列番号８２／１３８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア、または配列番号 ８４－８６－８８－１４０－１４２－１４４を含む重鎖および軽鎖のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む。これらの配列の特徴を有する例示的なＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、二特異性抗体の番号４２とも呼称される、Ｈ４Ｈ１４６３５Ｄと指定される二特異性抗体であり、Ｈ４Ｈ１３２９５Ｐ２に由来するＤ１と、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２に由来するＤ２とを含む（本明細書の実施例４および表５を参照のこと）。
多量体形成成分
本発明に提供される方法に従い有用な二特異性抗原結合分子は、ある実施形態において、一つ以上の多量体形成構成要素を含んでもよい。多量体形成構成要素は、抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）間の会合を維持するように機能することができる。本明細書において使用される場合、「多量体形成構成要素」とは、同一のもしくは類似の構造または構成の第二の多量体形成構成要素と会合する能力を有する、任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体形成構成要素は、イムノグロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体形成構成要素の非限定的な例として、イムノグロブリンのＦｃ部分（例えば、以下のアイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプ群における任意のアロタイプから選択されるアイソタイプのＦｃドメイン）が挙げられる。特定の実施形態において、多量体形成構成要素は、Ｆｃ断片であり、または少なくとも一つのシステイン残基を含有する１～約２００のアミノ酸の長さのアミノ酸配列である。その他の実施形態において、多量体形成構成要素はシステイン残基であるか、または短システイン含有ペプチドである。その他の多量体形成ドメインとして、ロイシンジッパー、ヘリックス・ループ・モチーフ、またはコイルドコイル・モチーフを含むか、もしくはこれらからなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
ある実施形態において、二特異性抗原結合分子は、二つの多量体形成ドメインのＭ１とＭ２を含み、この場合においてＤ１はＭ１に結合され、Ｄ２はＭ２に結合され、Ｍ１およびＭ２の会合は、一つの二特異性抗原結合分子において、Ｄ１とＤ２の互いの物理的連結を促進する。特定の実施形態において、Ｍ１およびＭ２は互いに同一である。例えば、Ｍ１は特定のアミノ酸配列を有するＦｃドメインであってもよく、Ｍ２はＭ１と同一のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。あるいは、Ｍ１およびＭ２は一つ以上のアミノ酸位置において互いに異なっていてもよい。例えば、Ｍ１は、第一のイムノグロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインを含んでいてもよく、Ｍ２は第二のＩｇ ＣＨ３ドメインを含んでもよく、この場合において当該第一および第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは少なくとも一つのアミノ酸が互いに異なっており、この場合において少なくとも一つのアミノ酸の差異は、同一のＭ１およびＭ２配列を有する参照構築物と比べて、プロテインＡに対する標的化構築物の結合を減少させる。一実施形態において、Ｍ１のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡと結合し、Ｍ２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、例えばＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）など、プロテインＡ結合を減少させるか、または消滅させる変異を含有する。Ｍ２のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；Ｙ４３６ＦはＥＵによる）を含んでいてもよい。Ｍ２のＣＨ３にて見出され得るさらなる修飾として、以下を挙げることができる：Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの場合においては、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２ＩはＥＵによる）；ＩｇＧ２ Ｆｃドメインの場合においては、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２ＩはＥＵによる）；ならびに、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインの場合においては、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２ＩはＥＵによる）。
本明細書に提供される方法に従い有用な二特異性抗原結合分子は、「単離」されていてもよい。本明細書において使用される場合、「単離された二特異性抗原結合分子」とは、その天然環境の少なくとも一つの構成要素から特定され、および分離され、および／または回収された二特異性抗原結合分子を意味する。例えば、生物体の少なくとも一つの構成要素から、または当該抗体が生成された組織もしくは細胞から分離された、または取り出された二特異性抗体は、本開示に目的に対し、「単離された二特異性抗体」である。単離された二特異性抗原結合分子には、組み換え細胞内での原位置での分子も含む。単離された二特異性抗原結合分子は、少なくとも一つの精製工程または単離工程を受けた分子である。ある実施形態によれば、単離された二特異性抗原結合分子は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本明細書に提供される方法に従い有用な二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、当該抗原結合タンパク質または抗原結合ドメインが誘導された対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域ならびに／またはＣＤＲ領域において、一つ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含んでもよい。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認され得る。二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来し、この場合において一つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の一つ以上のアミノ酸は、当該抗体が由来する生殖細胞系列の配列の対応する残基に、または別のヒト生殖細胞系列の配列の対応する残基に、または対応する生殖細胞系列の残基の保存的アミノ酸置換に、変異を受けている（そのような配列変化を本明細書において集合的に「生殖細胞系列変異」と呼称する）。
当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から開始して、一つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む、多くの二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）を容易に作製することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のすべてが、抗体が由来する元の生殖系列配列に存在する残基へと戻し変異する。他の実施形態では、ある残基のみ、例えばＦＲ１の最初の８個のアミノ酸、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸の中に存在する変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３の中に存在する変異残基のみが、元の生殖系列配列に戻し変異する。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のうちの一つ以上が、異なる生殖系列配列（すなわち抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基に変異する。
さらに本明細書において有用な二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、フレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域の中に二つ以上の生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば特定の個々の残基は、特定の生殖細胞系列配列の対応する残基へと変異され、一方で元の生殖細胞系列配列とは異なる特定の他の残基は維持され、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基へと変異される。取得された時点で、一つ以上の生殖細胞系列変異を含有する二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、一つ以上の所望の特性に関して容易に検証されることができる。所望の特性としては例えば結合特異性の改善、結合アフィニティの増加、アンタゴニスト性もしくはアゴニスト性の生物学的特性の改善または強化（場合によっては）、免疫原性の低下などが挙げられる。この一般的な様式で取得された二特異性抗原結合分子またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、本明細書で有用であることが予期される。
バリアント
また、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗ＭＥＴ抗体および二特異性抗原結合分子も本明細書において有用である。当該態様に含まれる例示的なバリアントとしては、一つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントが挙げられる。例えば本開示は、本明細書において表１に記載されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下等の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する、抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を含む。
例示的なバリアントとしては、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかとの実質的な配列同一性を有するバリアントが挙げられる。アミノ酸配列の場合において本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、二つのアミノ酸配列が、例えばデフォルトのギャップ重み付けを使用したプログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列したとき、少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。特定の実施形態では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なっている。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能性特性を実質的に変化させない。二つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の百分率または相同性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に既知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖はシステインおよびメチオニンである、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有する任意の変化である。当該文献は参照により本明細書に援用される。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて、負ではない値を有する任意の変化である。
二つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。配列解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似性の測定値を用いて類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有しており、これらプログラムをデフォルトのパラメータで使用して、異なる生物種に由来する相同ポリペプチド、または野生型タンパク質とその変異体との間の相同ポリペプチドなどの非常に近縁なポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリと検索配列の間の最良重複の領域のアラインメントおよび配列同一性の百分率を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）、上記）。本明細書に提供される配列を、異なる生物体からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴであり、特にデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照のこと。各文献は、本明細書において参照により援用される。
ＦＣバリアントを含む抗ＭＥＴ抗体、およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子
本明細書に提供される特定の実施形態によると、本明細書において有用な抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質は、例えば中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を強化する、または減少させる一つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む。例えば、そのようなバリアントには、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質が含まれ、この場合において当該変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインのアフィニティを増加させる。そのような変異によって、動物に投与されたときの抗体の血清半減期が延長され得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）；２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）の修飾、または４２８位および／または４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）の修飾、または２５０位および／もしくは４２８位の修飾、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）と４３４位の修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆおよび／または３０８Ｐ）を含む。
したがって、以下からなる群から選択される変異の一つ以上のペアまたは群を含むＦｃドメインを含む、抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質が本明細書において有用である。２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異のあらゆる可能性のある組み合わせが、本開示の範囲内に予期される。
本明細書において有用な抗原結合分子の生物学的特徴
本明細書に提供される方法によれば、ブドウ膜メラノーマ細胞の増殖を阻害し、浸潤を阻害し、アポトーシスを引き起こし、および／または生存率を低下させる抗体およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体および抗原結合断片を含むＡＤＣが有用である。
また本明細書に提供される方法によれば、ブドウ膜メラノーマ細胞の細胞サイクルに影響を及ぼす抗体およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体およびその抗原結合断片を含むＡＤＣも有用である。一部の態様では、細胞は有糸分裂停止を受ける。一部の態様では、細胞はＳｕｂＧ１期に留まり、これは細胞がアポトーシスを受けていることを示す。
また本明細書に提供される方法によれば、ブドウ膜メラノーマ細胞にアポトーシスを引き起こす抗体およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体およびその抗原結合断片を含むＡＤＣも有用である。一部の態様では、ブドウ膜メラノーマ細胞は、ＰＡＲＰ切断を示す。一部の態様では、ブドウ膜メラノーマ細胞は、ヒストンＨ３のリン酸化を示す。
また本明細書に提供される方法によれば、高アフィニティで単量体ヒトＭＥＴに結合する抗体およびその抗原結合断片も有用である。例えば本発明は、例えば本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを使用するなど、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約２３０ｎＭ未満のＫＤで、単量体型ヒトＭＥＴ（例えば、ｈＭＥＴ．ｍｍｈ）に結合する抗ＭＥＴ抗体を含む。ある実施形態によると、例えば本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約２３０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ ｎＭ未満、または約３ｎＭ未満のＫＤで、３７℃で単量体ヒトＭＥＴに結合する抗ＭＥＴ抗体が提供される。
そのような抗体およびその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、２５℃または３７℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約１分を超える解離半減期（ｔ１／２）で単量体ヒトＭＥＴ（例えば、ｈＭＥＴ．ｍｍｈ）に結合する。そのような抗ＭＥＴ抗体は、例えば本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約１分を超える、約２分を超える、約４分を超える、約６分を超える、約８分を超える、約１０分を超える、約１２分を超える、約１４分を超える、約１６分を超える、約１８分を超える、または約２０分以上のｔ１／２で、３７℃で単量体ヒトＭＥＴに結合する。
そのような抗体およびその抗原結合断片は、高いアフィニティで二量体ヒトＭＥＴ（例えば、ｈＭＥＴ．ｍＦｃ）に結合する。例えば抗ＭＥＴ抗体は、例えば本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、２５℃または３７℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約３ｎＭ未満のＫＤで二量体ヒトＭＥＴに結合する。ある実施形態によると、抗ＭＥＴ抗体は、例えば本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．９ｎＭ未満、約０．８ｎＭ未満、約０．７ｎＭ未満、約０．６ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．４ｎＭ未満、約０．３ｎＭ未満、または約０．２５ｎＭ未満のＫＤで、３７℃で二量体ヒトＭＥＴに結合する。
そのような抗体およびその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、２５℃または３７℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約４分を超える解離半減期（ｔ１／２）で二量体ヒトＭＥＴ（例えば、ｈＭＥＴ．ｍＦｃ）に結合してもよい。ある実施形態によると、抗ＭＥＴ抗体は、例えば本明細書の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約４分を超える、約５分を超える、約１０分を超える、約２０分を超える、約３０分を超える、約４０分を超える、約５０分を超える、約６０分を超える、約７０分を超える、約８０分を超える、約９０分を超える、約１００分を超える、または約１０５分以上のｔ１／２で、３７℃で二量体ヒトＭＥＴに結合してもよい。
本明細書に提供される方法によると、例えば本明細書の実施例５に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、２５℃または３７℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約１０分を超える解離半減期（ｔ１／２）で二量体ヒトＭＥＴ（例えば、ｈＭＥＴ．ｍＦｃ）に結合するＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質も有用である。ある実施形態によると、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質は、例えば本明細書の実施例５に規定されるアッセイフォーマットまたは非常に類似したアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定したときに、約１０分を超える、約２０分を超える、約３０分を超える、約４０分を超える、約５０分を超える、約６０分を超える、約７０分を超える、約８０分を超える、約９０分を超える、約１００分を超える、約２００分を超える、約３００分を超える、約４００分を超える、約５００分を超える、約６００分を超える、約７００分を超える、約８００分を超える、約９００分を超える、約１０００分を超える、または約１１００分以上のｔ１／２で、３７℃で二量体ヒトＭＥＴに結合する。
または本明細書に提供される方法によると、抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質は、例えばインビトロのリガンド結合アッセイにおいて、ＨＧＦとＭＥＴの間の相互作用を遮断する。本明細書に提供されるある実施形態によると、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＭＥＴを発現する細胞へのＨＧＦ結合を遮断し、ＨＧＦシグナル伝達の非存在下で、ＭＥＴ活性化を最小限に誘導し、または全く誘導しない。例えば、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質は、細胞系ＭＥＴ活性レポーターアッセイにおいて、Ｄ１またはＤ２を単独で含有する一特異性抗体を使用した同等の活性レポーターアッセイにおいて観察されるＭＥＴアゴニスト活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＭＥＴアゴニスト活性の程度を呈する。
本開示に従い有用な抗体および抗原結合タンパク質は、前述の生物学的特徴のうちの一つ以上、またはその任意の組み合わせを保有してもよい。抗体の生物学的特徴の前述のリストは、包括的であることは意図されない。本明細書に提供される抗体のその他の生物学的特徴は、本明細書の実施例を含む本開示の検討から当業者に明らかであろう。
抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）
本明細書に提供される方法によれば、例えば細胞障害剤、化学療法薬、または放射性同位体などの治療部分と結合された抗ＭＥＴ抗体、またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質を含む抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）が有用である。
細胞傷害剤としては、細胞の成長、生存率、または増殖に対して有害な任意の剤が挙げられ、限定ではないが、チューブリン相互作用剤およびＤＮＡ損傷剤が挙げられる。本開示の当該態様に従い抗ＭＥＴ抗体に結合され得る適切な細胞障害剤および化学療法剤の例としては、例えば、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメタンスルホニルヒドラジド、１，８－ジヒドロキシ－ビシクロ［７．３．１］トリデカ－４，９－ジエン－２，６－ジイン－１３－オン、１－デヒドロテストステロン、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、９－アミノカンプトテシン、アクチノマイシンＤ、アマニチン、アミノプテリン、アングイジン、アントラサイクリン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、オーリスタチン、ブレオマイシン、ブスルファン、酪酸、カリケアミシン（例えば、カリケアミシンγ１）、カンプトテシン、カルミノマイシン、カルムスチン、セマドチン、シスプラチン、コルヒチン、コンブレタスタチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン、ジアセトキシペンチルドキソルビシン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオンン、ジソラゾール、ドラスタチン（例えば、ドラスタチン１０）、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エキノマイシン、エリュテロビン、エメチン、エポチロン、エスペラミシン、エストラムスチン、エチジウムブロマイド、エトポシド、フルオロウラシル、ゲルダナマイシン、グラミシジンＤ、グルココルチコイド、イリノテカン、キネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤、レプトマイシン、ロイロシン、リドカイン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メイタンシノイド、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトプテリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、ポドフィロトキシン、プロカイン、プロプラノロール、プテリジン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）、リゾキシン、ストレプトゾトシン、タリソマイシン（ｔａｌｌｙｓｏｍｙｃｉｎｓ）、タキソール、テノポシド、テトラカイン、チオエパクロラムブシル、トマイマイシン、トポテカン、チューブリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびそれらのいずれかの誘導体が挙げられる。ある実施形態によると、抗ＭＥＴ抗体に結合される細胞障害剤は、例えばＤＭ１またはＤＭ４などのメイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、またはドラスタチン誘導体である。ある実施形態によると、抗ＭＥＴ抗体に結合される細胞障害剤は、例えばＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、またはその誘導体などのオーリスタチンである。当分野に公知の他の細胞障害剤も本開示の範囲内にあることが予期され、例えばリシン、Ｃ．ディフィシル毒素、シュードモナス外毒素、リシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、サポニン、ヤマゴボウ毒素（すなわち、フィトラッカトキシンおよびフィトラッキゲニン）などのタンパク質毒素、および例えばＳａｐｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１３，１３８：４５２－４６９に記載されるものなどの他の毒素が挙げられる。
ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイド、例えばメイタンシンの誘導体である。好適なメイタンシノイドとしては、ＤＭ１、ＤＭ４、またはその誘導体、立体異性体、もしくはアイソトポログが挙げられる。好適なメイタンシノイドとしてはさらに限定されないが、ＷＯ２０１４／１４５０９０Ａ１、ＷＯ２０１５／０３１３９６Ａ１、ＵＳ２０１６／０３７５１４７Ａ１、およびＵＳ２０１７／０２０９５９１Ａ１に開示されるものが挙げられる。当該文献はその全体で参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の構造を有する：
Figure 2022523360000011
 式中、Ａは、任意で置換されるアリーレンまたはヘテロアリーレンである。
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の構造を有する：
Figure 2022523360000012
 式中、Ａは、任意で置換されるアリーレンまたはヘテロアリーレンである。
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の構造を有する：
Figure 2022523360000013
 式中、ｎは１～１２の整数であり、Ｒ１はアルキルである。
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下である：
Figure 2022523360000014
Figure 2022523360000015
Figure 2022523360000016
 。
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下である。
Figure 2022523360000017
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下である。
Figure 2022523360000018
また、本明細書に提供される方法によると、一つ以上の放射性核種に結合された抗ＭＥＴ抗体を含む抗体－放射性核種結合体（ＡＲＣ）も有用である。本開示の態様の場合において使用され得る放射性核種の例としては限定されないが、例えば、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２２７Ｔｈ、２２２Ｒｎ、２２３Ｒａ、２２４Ｒａ、および９０Ｙが挙げられる。
ある実施形態では、ＡＤＣは、リンカー分子を介して細胞障害剤（例えば上記に開示される細胞障害剤のいずれか）と結合された抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質を含む。リンカーは、本明細書に記載される抗体または抗原結合タンパク質を、例えば細胞障害剤などの治療部分と連結、接続、または結合させる任意の群または部分である。好適なリンカーは、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｌ．，Ｅｄ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１３；Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．，Ｅｄ．；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１３；Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．－Ｃ．，ａｎｄ Ｚａｒｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１５に見出される。これら文献の内容は、参照によりその全体で本明細書に援用される。概して、本明細書に記載の抗体結合体に適した結合手段のリンカーは、抗体の循環半減期を活用するのに充分に安定的であると同時に、当該結合体の抗原介在性の内在化の後に搭載物を放出することができるリンカーである。リンカーは、切断可能であっても、切断不可能であってもよい。切断可能なリンカーとしては、内在化後に例えば加水分解、還元または酵素反応を介した切断などの細胞内代謝により切断されるリンカーが挙げられる。切断不可能なリンカーとしては、内在化後の抗体のリソソーム分解を介して、付加された搭載物を放出するリンカーが挙げられる。好適なリンカーとしては限定されないが、酸不安定性リンカー、加水分解不安定性リンカー、酵素切断可能なリンカー、還元不安定性リンカー、自己犠牲（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）リンカー、および切断不可能なリンカーが挙げられる。適切なリンカーとしてはさらに限定されないが、ペプチド、グルクロニド、スクシンイミド－チオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位、ヒドラゾン、マル－カプロイル（ｍａｌ－ｃａｐｒｏｙｌ）単位、ジペプチド単位、バリン－シトルリン単位、およびパラ－アミノベンジル（ＰＡＢ）単位であるか、またはそれらを含むリンカーが挙げられる。
当分野で公知の任意のリンカー分子またはリンカー技術を使用して、本開示により有用なＡＤＣを作製または構築することができる。ある実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。他の実施形態によれば、リンカーは切断不可能なリンカーである。本開示の状況下で使用され得る例示的なリンカーとしては、例えば、ＭＣ（６－マレイミドカプロイル）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ－ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、ｖａｌ－ａｌａ（バリン－アラニン）、プロテアーゼ切断リンカー中のジペプチド部位、ａｌａ－ｐｈｅ（アラニン－フェニルアラニン）、プロテアーゼ切断リンカー中のジペプチド部位、ＰＡＢ（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタン酸塩）、ＳＭＣＣ（Ｎ－スクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１ カルボン酸塩）、ＳＩＡＢ（Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノ安息香酸塩）、ならびにそれらのバリアントおよび組み合わせを含む、またはそれらからなるリンカーが挙げられる。本開示の状況下で使用され得る追加の例示的リンカーは、例えば、ＵＳ７，７５４，６８１、およびＤｕｃｒｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１０，２１：５－１３、ならびにそれらに引用される参照文献中に提示されるものであり、それら文献の内容は、その全体で参照により本明細書に援用される。
ある実施形態では、リンカーは、生理学的条件下で安定である。ある実施形態では、リンカーは切断可能であり、例えば、酵素の存在下、または特定のｐＨ範囲もしくはｐＨ値で、少なくとも搭載物部分を放出することができる。一部の実施形態では、リンカーは、酵素切断可能な部分を含む。例示的な酵素切断可能な部分としては限定されないが、ペプチド結合、エステル結合、ヒドラゾン、およびジスルフィド結合が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、カテプシン切断可能なリンカーを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、切断不可能な部分を含む。
好適なリンカーとしてはさらに限定されないが、例えば抗体など一つの結合物質の二つのシステイン残基に化学的に結合されるリンカーが挙げられる。そのようなリンカーは、結合プロセスの結果として破壊される抗体のジスルフィド結合を模倣する役目を果たすことができる。
一部の実施形態では、リンカーは、一つ以上のアミノ酸を含む。好適なアミノ酸として、天然、非天然、標準、非標準、タンパク質を構成する、タンパク質を構成しない、およびＬ－またはＤ－α－アミノ酸が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、もしくはシトルリン、その誘導体、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、一つ以上のアミノ酸側鎖が、以下に記載される側鎖群に連結される。一部の実施形態では、リンカーは、バリンおよびシトルリンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、リシン、バリン、およびシトルリンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、リシン、バリン、およびアラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、バリンおよびアラニンを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、自己犠牲基を含む。自己犠牲基は、当業者に公知の任意のそのような基であり得る。特定の実施形態では、自己犠牲基は、ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）、またはその誘導体である。有用な誘導体としては、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）が挙げられる。当業者であれば、自己犠牲基が、搭載物からリンカーの残存原子を放出する化学反応を実行する能力を有することを認識するであろう。
一部の実施形態では、リンカーは、以下である：
Figure 2022523360000019
 式中、
Figure 2022523360000020
 は、抗体または抗原結合タンパク質への（例えばリシン残基を介した）結合であり、
Figure 2022523360000021
 は、細胞障害剤（例えば、ＤＭ１）への結合である。一部の実施形態では、リンカーは、以下である：
Figure 2022523360000022
 式中、
Figure 2022523360000023
 は、抗体または抗原結合タンパク質への（例えばリシン残基を介した）結合であり、
Figure 2022523360000024
 は、細胞障害剤（例えば、ＤＭ１）への結合である。ある実施形態では、リンカーは、以下である。
Figure 2022523360000025
ある実施形態では、リンカーは、以下である。
Figure 2022523360000026
一部の実施形態では、リンカーは、マレイミジルメチル－４－トランス－シクロヘキサンカルボキシコハク酸塩から誘導される。
Figure 2022523360000027
一部の実施形態では、リンカーは、以下である：
Figure 2022523360000028
 式中、
Figure 2022523360000029
 は、抗体または抗原結合タンパク質への（例えばリシン残基を介した）結合であり、
Figure 2022523360000030
 は、細胞障害剤（例えば、以下の式を有する化合物）への結合である。
Figure 2022523360000031
本開示の方法により有用な分子は、ＡＤＣを含み、ＡＤＣにおいて、リンカーが抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質を、当該抗体または抗原結合分子内の特定のアミノ酸での付加を介して薬剤またはサイトトキシンへと接続させる。当該態様の状況下で使用され得るアミノ酸付加の例は、例えば、リシン（例えば、ＵＳ５，２０８，０２０；ＵＳ２０１０／０１２９３１４；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００８，１９：３５８－３６１；ＷＯ２００５／０８９８０８；ＵＳ５，７１４，５８６；ＵＳ２０１３／０１０１５４６；およびＵＳ２０１２／０５８５５９２を参照のこと）、システイン（例えば、ＵＳ２００７／０２５８９８７；ＷＯ２０１３／０５５９９３；ＷＯ２０１３／０５５９９０；ＷＯ２０１３／０５３８７３；ＷＯ２０１３／０５３８７２；ＷＯ２０１１／１３０５９８；ＵＳ２０１３／０１０１５４６；およびＵＳ７，７５０，１１６を参照のこと）、セレノシステイン（例えば、ＷＯ２００８／１２２０３９；およびＨｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２００８，１０５：１２４５１－１２４５６を参照のこと）、ホルミルグリシン（例えば、Ｃａｒｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００７，３：３２１－３２２；Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２０１３，１１０：４６－５１、およびＲａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１２，１０：１０５２－１０６７を参照のこと）、非天然アミノ酸（例えば、ＷＯ ２０１３／０６８８７４およびＷＯ ２０１２／１６６５５９を参照のこと）、および酸性アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１２／０５９８２を参照のこと）である。またリンカーは、炭水化物（例えば、ＵＳ２００８／０３０５４９７、ＷＯ ２０１４／０６５６６１、およびＲｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ ＆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１３：１２７－１３０を参照のこと）およびジスルフィドリンカー（例えば、ＷＯ ２０１３／０８５９２５、ＷＯ ２０１０／０１０３２４、ＷＯ ２０１１／０１８６１１、およびＳｈａｕｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，２：３１２－３１３を参照のこと）への付加を介して抗原結合タンパク質に結合されてもよい。部位特異的な結合技術を採用して、抗体または抗原結合タンパク質の特定の残基へ直接結合させてもよい（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１６）３６（Ｓｕｐｐｌ １）：１００を参照のこと）。部位特異的な結合技術としては限定されないが、トランスグルタミナーゼを介したグルタミン結合が挙げられる（例えば、Ｓｃｈｉｂｌｉ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒ Ｅｄ．２０１０，４９，９９９５を参照のこと）。
ある実施形態によると、本明細書に提供される方法により有用なＡＤＣは、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１４５０９０に記載されるリンカー－薬剤組成物へ結合された抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質を含む（例えば、「化合物７」は、本明細書において「Ｍ００２６」とも呼称され、以下に記載される）。当該文献は、その全体で参照により本明細書に援用される。
Figure 2022523360000032
本明細書に提供される方法により、一特異性の抗ＭＥＴ抗体、およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を含む抗体－薬剤結合体も有用であり、ここで当該抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、細胞障害剤に結合される。ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイドである。ある実施形態では、メイタンシノイドは、以下の式を有する化合物である：
Figure 2022523360000033
 式中、ｎは１～１２の整数であり、Ｒ１はアルキルである。ある実施形態では、メイタンシノイドは、以下である：
Figure 2022523360000034
 。
ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイドであり、当該メイタンシノイドは、切断不可能なリンカーを介して抗体に共有結合される。ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイドであり、当該メイタンシノイドは、切断可能なリンカーを介して抗体に共有結合される。
一つの実施形態では、抗体は、以下に結合される。
Figure 2022523360000035
 式中、
Figure 2022523360000036
 は、抗体への結合である。
一つの実施形態では、抗体は、以下に結合される：
Figure 2022523360000037
 式中、
Figure 2022523360000038
 は、抗体への結合である。
一つの実施形態では、抗体は、以下に結合される：
Figure 2022523360000039
 式中、
Figure 2022523360000040
 は、抗体への結合である。
一つの実施形態では、抗体は、以下に結合される：
Figure 2022523360000041
 式中、
Figure 2022523360000042
 は、抗体への結合である。
一つの実施形態では、抗体は、以下の構造を有する化合物のジアステレオマーに結合される：
Figure 2022523360000043
 当該ジアステレオマーは、（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４Ｈｚ），６．７２（ｍ，１Ｈ），６．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４Ｈｚ），６．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５Ｈｚ，１１Ｈｚ），６．２５（ｓ，１Ｈ），５．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ，９Ｈｚ），５．４１（ｍ，１Ｈ），４．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），４．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），３．７２（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），３．３７（ｍ，４Ｈ），３．２７（ｍ，１Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），３．１６ －２．９９（ｍ，４Ｈ），２．８５（ｍ，７Ｈ），２．６２（ｍ，３Ｈ），２．３９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９Ｈｚ，１２Ｈｚ，４Ｈｚ），２．１８（ｂｒ ｍ，２Ｈ），１．７７（ｂｒ ｍ，３Ｈ），１．６６（ｓ，３Ｈ），１．６０－１．４７（ｍ，４Ｈ），１．３１（ｍ，６Ｈ），１．０５（ｍ，２Ｈ）、および０．８２（ｓ，３Ｈ）のデルタシフトにより特徴付けられる１Ｈ ＮＭＲを特徴とする。
一つの実施形態では、抗体は、以下の構造を有する化合物のジアステレオマーに結合される：
Figure 2022523360000044
 この場合において当該ジアステレオマーは、実質的に図３１に示される１Ｈ ＮＭＲを特徴とする。
一つの実施形態では、抗体は、以下の構造を有する化合物に結合される：
Figure 2022523360000045
 （Ｉ）；
以下を接触させる工程を含むプロセスにより調製される：
（ｉ）式ＩＩＩの化合物：
Figure 2022523360000046
 ＩＩＩ；
（ｉｉ）式ＩＶの化合物：
Figure 2022523360000047
 ＩＶ
（ｉｉｉ）シリカゲル、および
（ｉｖ）有機溶媒と水を含む希釈剤。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体、またはＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｐａｙは、細胞障害剤であり、
ｎは、１～１０の整数である。
一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号８２／１３８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内のＣＤＲを含む抗ＭＥＴ抗体である。一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号８２のＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１３８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む抗ＭＥＴ抗体である。
一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号５８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号１３８のＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号５８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号１３８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号１８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号１３８のＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号１８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。
一部の実施形態では、Ｌは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、Ｌは、切断不可能なリンカーである。一部の実施形態では、Ｌは、ジペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｌは、ＰＡＢ部分を含む。
一部の実施形態では、Ｌは、以下の構造を有する部分を含む。
Figure 2022523360000048
一部の実施形態では、Ｌは、以下の構造を有する部分を含む。
Figure 2022523360000049
一部の実施形態では、Ｌは、以下の構造を有する部分を含む。
Figure 2022523360000050
一部の実施形態では、Ｌは、以下の構造を有する部分を含む。
Figure 2022523360000051
一部の実施形態では、Ｐａｙは、メイタンシノイドである。
一部の実施形態では、Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000052
 式中、Ｒ１は、アルキルである。
一部の実施形態では、Ｐａｙは、以下である。
Figure 2022523360000053
一部の実施形態では、Ｐａｙは、以下である。
Figure 2022523360000054
一部の実施形態では、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000055
 式中、
Figure 2022523360000056
 は、抗体への結合である。
一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000057
 式中、
Figure 2022523360000058
 は、抗体への結合である。
一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000059
 式中、
Figure 2022523360000060
 は、抗体への結合である。
一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000061
 式中、
Figure 2022523360000062
 は、抗体への結合である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する。
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号８２のＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１３８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む抗ＭＥＴ抗体である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000063
 式中、
Figure 2022523360000064
 は、抗体への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する。
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号８２のＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１３８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む抗ＭＥＴ抗体である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000065
 式中、
Figure 2022523360000066
 は、抗体への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号８２のＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１３８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む抗ＭＥＴ抗体である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000067
 式中、
Figure 2022523360000068
 は、抗体への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号８２のＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１３８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む抗ＭＥＴ抗体である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000069
 式中、
Figure 2022523360000070
 は、抗体への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号５８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000071
 式中、
Figure 2022523360000072
 は、抗原結合タンパク質への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号５８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000073
 式中、
Figure 2022523360000074
 は、抗原結合タンパク質への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号５８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000075
 式中、
Figure 2022523360000076
 は、抗原結合タンパク質への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号５８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000077
 式中、
Figure 2022523360000078
 は、抗原結合タンパク質への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号１８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000079
 式中、
Figure 2022523360000080
 は、抗原結合タンパク質への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号１８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000081
 式中、
Figure 2022523360000082
 は、抗原結合タンパク質への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号１８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000083
 式中、
Figure 2022523360000084
 は、抗原結合タンパク質への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号１８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質である。
Ｌ－Ｐａｙは、以下である：
Figure 2022523360000085
 式中、
Figure 2022523360000086
 は、抗原結合タンパク質への結合であり、ｎは、２～５の整数である。
本明細書に有用な抗体薬剤結合体は、当分野の当業者に公知の結合条件を使用して調製することができる（例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００３，２１，７，７７８を参照のこと。当該文献はその全体で参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、抗ＭＥＴ抗体、またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質の抗体薬剤結合体は、本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質を、所望のリンカーおよび細胞障害剤を含む化合物と接触させることにより調製され、この場合において当該リンカーは、例えば当該抗体または抗原結合タンパク質の所望の残基で、当該抗体または抗原結合タンパク質と反応性である部分を保有する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法により有用な抗体薬剤結合体の調製のためのプロセスは、本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質を、以下の式Ａ１を有する化合物、および水性希釈剤を接触させることを含む：
Figure 2022523360000087
 Ａ１
一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、化学量論上、過剰に存在する。一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、化学量論上、５～６倍過剰に存在する。一部の実施形態では、水性希釈剤は、ＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、水性希釈剤は、ＤＭＡを含む。
一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、以下の式Ａ２またはＡ３の化合物である：
Figure 2022523360000088
一部の実施形態では、式Ａ２またはＡ３の化合物は、立体的に純粋である。一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、式Ａ２またはＡ３の化合物を含み、この場合においてＡ２またはＡ３の化合物は、５０％を超えるジアステレオマー過剰の状態で存在する。ある実施形態では、ジアステレオマーの過剰は、７０％を超える。ある実施形態では、ジアステレオマーの過剰は、９０％を超える。ある実施形態では、ジアステレオマーの過剰は、９５％を超える。
「ジアステレオマーの過剰」という用語は、組成物中の残りのジアステレオマーと比較した、所望の単一ジアステレオマーのモル割合間の差異を指す。ジアステレオマーの過剰は、以下のように計算される：（単一ジアステレオマーの量）－（他のジアステレオマーの量）／１。例えば、９０％の１、および１０％の２、３、４またはそれらの混合物を含有する組成物は、８０％のジアステレオマーの過剰を有する［（９０－１０）／１］。９５％の１、および５％の２、３、４またはそれらの混合物を含有する組成物は、９０％のジアステレオマーの過剰を有する［（９５－５）／１］。９９％の１、および１％の２、３、４またはそれらの混合物を含有する組成物は、９８％のジアステレオマーの過剰を有する［（９９－１）／１］。ジアステレオマーの過剰は、１、２、３、または４のうちのいずれか一つについて同様に計算することができる。
一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、以下の式（ａ）の化合物：
Figure 2022523360000089
 （ａ）
を、以下の式（ｂ）の化合物：
Figure 2022523360000090
 （ｂ）
と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させることにより調製される。一部の実施形態では、希釈剤は、有機溶媒と水を含有する。
また本明細書において、以下のプロセスによって調製される生成物が提供される：
（ｉ）式（ａ）の化合物：
Figure 2022523360000091
 （ａ）
を、以下の式（ｂ）の化合物：
Figure 2022523360000092
 （ｂ）
と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させ、中間体を合成させること、および
（ｉｉ）本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質を、当該中間体、および水性希釈剤と接触させること。
一部の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合タンパク質を、以下の式Ｂを有する化合物、および水性希釈剤と接触させることを含む、抗体－薬剤結合剤を調製するプロセスが提供される：
Figure 2022523360000093
 Ｂ
式中、ＬＧは、脱離基である。
一部の実施形態では、式Ｂの化合物は、化学量論上、過剰に存在する。一部の実施形態では、式Ｂの化合物は、化学量論上、５～６倍過剰に存在する。一部の実施形態では、水性希釈剤は、ＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、水性希釈剤は、ＤＭＡを含む。一部の実施形態では、－Ｃ（Ｏ）－ＬＧは、例えばＮＨＳまたはトリフルオロフェニルエステルなどのエステルである。
一部の実施形態では、式Ｂの化合物は、以下の式Ｂ１の化合物である。
Figure 2022523360000094
 Ｂ１
一部の実施形態では、式Ｂ１の化合物は、以下の式Ｃの化合物：
Figure 2022523360000095
 Ｃ
と、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ペプチドカップリング試薬、および有機希釈剤を接触させることにより調製される。好適なペプチドカップリング試薬としては、カルボン酸部分を活性化させる、すなわち反応性を与えて、求核試薬と反応させる試薬が挙げられる。ある実施形態では、ペプチドカップリング試薬は、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。一部の実施形態では、有機溶媒は、ジクロロメタンである。
一部の実施形態では、式Ｃの化合物は、以下の式Ｄの化合物：
Figure 2022523360000096
 Ｄ
と、アジピン酸、ペプチドカップリング剤、および有機溶媒を接触させることにより調製される。ある実施形態では、ペプチドカップリング剤は、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）である。ある実施形態では、有機溶媒は、ジクロロメタンを含む。化合物Ｄは、ＷＯ２０１４／１４５０９０に記載されるように調製することができる。
エピトープマッピングおよびその関連技術
抗体または抗原結合ドメインが結合するエピトープは、ＭＥＴタンパク質の３個以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上）のアミノ酸の単一連続配列からなる場合もある。あるいはその関連エピトープは、ＭＥＴの複数の非連続的アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなる場合もある。一部の実施形態では、エピトープは、ＭＥＴのリガンド結合ドメイン上に位置し、またはその付近に位置する。他の実施形態では、エピトープは、ＭＥＴのリガンド結合ドメインの外側に位置し、例えば抗体が当該エピトープに結合したときに、ＭＥＴへのＨＧＦ結合に干渉しないＭＥＴ表面上の位置にある。
本明細書において別段に記載されるように、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子の個々の抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）は互いに対して、別個の、または重複しない、または部分的に重複するエピトープに結合する場合がある。本明細書において使用される場合、「部分的に重複するエピトープ」とは、当分野で公知の任意のエピトープマッピング方法（例えば、Ｘ線結晶法、アラニンスキャン突然変異誘導法、水素／重水素交換法［ＨＤＸ］、ドメインスワッピング法など）により決定された場合、第一のエピトープと第二のエピトープが、５未満、４未満、３未満、またはたった一つの共通アミノ酸を共有することを意味する。Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインは、互いに非競合的であってもよい。例えばある実施形態では、特定のＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子のＤ１ドメインの、ＭＥＴ上のそのエピトープへの結合は、当該ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子のＤ２ドメインの、ＭＥＴ上のそのエピトープへの結合を阻害しない（または最小限にのみ阻害する）。Ｄ１構成要素とＤ２構成要素の各エピトープが、非重複（または最大でも部分的重複）であることによって、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、細胞表面上の一つのＭＥＴ分子に結合することができる。
当業者に公知の様々な技術を使用して、本明細書に有用な抗体および抗原結合ドメインが相互作用するＭＥＴ上のエピトープを決定することができる。特定の抗体または抗原結合ドメインのエピトープまたは結合ドメインを決定するために使用できる例示的な技術には、例えば、点変異突然誘導法（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘導法、アルギニンスキャニング突然変異誘導法など）、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３～４６３）、プロテアーゼ保護、およびペプチド切断分析が挙げられる。さらに、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、および化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体と相互作用するポリペプチド内のアミノ酸の特定に使用され得るもう一つの方法は、質量分析法により検出される水素／重水素交換法である。総称的な用語として、水素／重水素交換法は、対象タンパク質を重水素標識すること、次いで抗体を当該重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次にタンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体により保護された残基（重水素標識の状態を維持する）を除くすべての残基で水素－重水素交換を発生させる。抗体を解離させた後、標的タンパク質にプロテアーゼ切断と質量分析を行い、それにより重水素標識残基が明らかとなり、当該重水素標識残基が抗体が相互作用する特定のアミノ酸に相当する。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照のこと。Ｘ線結晶構造解析を使用して、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定することもできる。
本明細書に提供される方法により、本明細書に記載される特定の例示的な抗体または抗原結合ドメイン（例えば、本明細書の表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＭＥＴ抗体（二特異性抗体を含む）が有用である。同様に本明細書において、本明細書に記載される特定の例示的な抗体（例えば、本明細書の表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと、ＭＥＴへの結合に関して競合する抗ＭＥＴ抗体も提供される。一部の実施形態では、抗ＭＥＴ抗体が結合するヒトＭＥＴエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４、アミノ酸３０５～３１５、および／またはアミノ酸４２１～４５５を含む。一部の実施形態では、ヒトＭＥＴの第一のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４を含み、ヒトＭＥＴの第二のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸３０５～３１５および４２１～４５５を含む。
当分野に公知であり、本明細書において例証される日常的な方法を使用することにより、抗体が、参照抗ＭＥＴ抗体と同じエピトープに結合するか、または参照抗ＭＥＴ抗体と結合に関して競合するかを容易に決定することができる。例えば被験抗体が、本発明に提供される参照抗ＭＥＴ抗体と同じエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体を、ＭＥＴタンパク質に結合させる。次に、ＭＥＴ分子に結合する被験抗体の能力が評価される。参照抗ＭＥＴ抗体との飽和結合後に被験抗体がＭＥＴに結合することができた場合、当該被験抗体は参照抗ＭＥＴ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、参照抗ＭＥＴ抗体との飽和結合後に被験抗体がＭＥＴ分子に結合できない場合、当該被験抗体は、参照抗ＭＥＴ抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。追加の日常的な実験（例えば、ペプチド突然変異および結合分析）を実施して、観察された被験抗体の結合の欠落が実際に、参照抗体と同じエピトープに結合することが原因であるのか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠落の原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的な抗原結合アッセイを使用して実施することができる。ある実施形態によると、競合結合アッセイにおいて測定したとき、例えば１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍余剰のある抗体が、他の抗体の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、またはさらには９９％まで阻害する場合、二つの抗体は同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照のこと）。別の方法として、一個の抗体の結合を減少または除去する抗原中の本質的に全てのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合を減少または除去する場合、二個の抗体は同一エピトープに結合するとみなされる。一個の抗体の結合を減少または消去するアミノ酸変異のサブセットのみが、他の抗体の結合を減少または消去する場合、二個の抗体は「重複エピトープ」を有すると見なされる。
抗体が、参照抗ＭＥＴ抗体と結合に関して競合する（または結合に関して交差競合する）かどうかを決定するために、以下の二つの方向性で上述の結合技法が実施される：第一の方向性では、参照抗体は、飽和条件下でＭＥＴ分子に結合され、その後、ＭＥＴ分子への被験抗体の結合が評価される。第二の方向性では、被験抗体が、飽和条件下でＭＥＴ分子に結合され、その後、ＭＥＴ分子への参照抗体の結合が評価される。両方の方向性で、第一の（飽和）抗体のみがＭＥＴ分子に結合することができた場合、被験抗体と参照抗体は、ＭＥＴへの結合に関して競合すると結論付けられる。当分野の当業者によって理解されるように、参照抗体への結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しなくてよく、重複したエピトープまたは隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断する場合もある。
ヒト抗体の調製
本明細書に提供される方法により有用な抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、完全ヒト抗体であってもよい。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体の作製方法は、当分野に公知である。ヒトＭＥＴに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の状況下で任意のそうした公知の方法が使用され得る。
例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）法、または任意の他の類似した公知の方法を使用して完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、ヒト可変領域とマウス定常領域を有する、ヒトＭＥＴに対する高アフィニティキメラ抗体が最初に単離される。以下の実験セクションと同様に、抗体を、アフィニティ、リガンド遮断活性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付け、選択する。必要であれば、マウス定常領域と、所望のヒト定常領域、例えば野生型もしくは改変型のＩｇＧ１またはＩｇＧ４を置換して、完全ヒト抗ＭＥＴ抗体が作製される。選択された定常領域は、特定の用途に応じて変化する場合がある一方で、高アフィニティの抗原結合性および標的特異性の特徴は、可変領域中に存在する。ある例において、完全ヒト抗ＭＥＴ抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離される。
生物学的均等物
本明細書に提供される方法により有用な抗ＭＥＴ抗体および抗体断片は、記載される抗体のアミノ酸配列とは異なるが、ヒトＭＥＴに結合する能力を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較して一つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体の生物学的活性と本質的に均等である生物学的活性を呈する。同様に、本開示の抗ＭＥＴ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示される配列と比較して一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本開示の抗ＭＥＴ抗体または抗体断片と本質的に生物学的に均等である抗ＭＥＴ抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。そうしたバリアントなアミノ酸配列およびＤＮＡ配列の例は、上記に検討される。
二つの抗原結合タンパク質または抗体が、薬学的な均等物または薬学的な代替物であり、類似した実験条件下で、単回投与または複数回投与のいずれかで同モル投与量で投与されたときに、その吸収の速度および範囲が有意な差を示さない場合、それら二つの抗原結合タンパク質または抗体は生物学的に均等とみなされる。いくつかの抗体で、吸収の範囲は同等であるが、吸収の速度は同等ではなく、しかし吸収速度における当該差異が意図的であり、ラベリングに反映されており、例えば慢性的使用での有効身体薬物濃度の獲得に必須ではなく、試験された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないとみなされるために、それら抗体が生物学的に均等であるとみなされ得る場合、それら抗体は均等物、または薬学的代替物とみなされる。
一つの実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度および有効性において臨床的に意義のある差異が無ければ、生物学的に均等である。
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、参照製品と生物学的製品の間での一回以上の切り替えを行わない持続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含む有害作用のリスクの予想される上昇または有効性の減退が生じずに、患者がそのような切り替えを行うことができる場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、一つのまたは複数の使用条件について、一つのまたは複数の共通の作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
生物学的に均等であることは、インビボおよびインビトロの方法により実証されてもよい。生物学的に均等であることの測定方法としては例えば、（ａ）時間の関数として血液、血漿、血清または他の体液中で抗体またはその代謝物の濃度が測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、（ｂ）ヒトのインビボ生体利用効率データに相関し、その合理的な指標であるインビトロ検査、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的作用が時間関数として計測される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、および（ｄ）抗体の安全性、有効性または生体利用効率もしくは生物学的均等性を立証する、適切に管理された臨床試験が挙げられる。
本発明に提供される抗ＭＥＴ抗体の生物学的に均等なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基または配列を欠失させることによって構築されてもよい。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要な、または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失されてもよく、または他のアミノ酸で置換されてもよい。他の状況では、生物学的に均等の抗体には、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を消滅または除去する変異を含む、抗ＭＥＴ抗体バリアントを含んでもよい。
種選択性および種交差反応性
本開示は特定の実施形態によると、ヒトＭＥＴに結合するが、他の種に由来するＭＥＴには結合せず、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫および髄様上皮腫などの眼癌の治療に有用な抗ＭＥＴ抗体（および抗ＭＥＴ抗原結合ドメインを含む抗原結合分子）を提供する。本開示はさらに、ヒトＭＥＴ、および一種以上の非ヒト種に由来するＭＥＴに結合し、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫および髄様上皮腫などの眼癌の治療に有用な抗ＭＥＴ抗体（および抗ＭＥＴ抗原結合ドメインを含む抗原結合分子）も含む。例えば抗ＭＥＴ抗体および抗原結合分子は、ヒトＭＥＴに結合してもよく、そして場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのＭＥＴのうちの一つ以上に結合してもよく、または結合しなくてもよい。ある例示的実施形態によると、ヒトＭＥＴとカニクイザル（例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＭＥＴに特異的に結合する抗ＭＥＴ抗体および抗原結合分子が提供される。他の抗ＭＥＴ抗体および抗原結合分子は、ヒトＭＥＴに結合するが、カニクイザルＭＥＴには結合しないか、または弱く結合するのみである。
多特異性抗体
本明細書において別段に記載されるように、本開示によると、二つの異なる抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子が有用であり、この場合において第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）は、ＭＥＴ上の第一のエピトープに結合し、第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）は、ＭＥＴ上の第二のエピトープに結合する。ある実施形態では、Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインが結合するＭＥＴ上の第一および第二のエピトープは別個のものであり、または重複せず、または部分的に重複している。当該態様によれば、Ｄ１ドメインは、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかを含んでもよく、およびＤ２ドメインは、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれか他の配列を含んでもよい（Ｄ１ドメインの結合特異性が、Ｄ２ドメインの結合特異性とは異なっており、および／またはＤ１が取得された抗原結合タンパク質が、Ｄ２が取得された抗原結合タンパク質と、ＭＥＴへの結合に関して競合しない限りにおいて）。一部の実施形態では、抗ＭＥＴ抗体が結合するヒトＭＥＴエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４、アミノ酸３０５～３１５、および／またはアミノ酸４２１～４５５を含む。一部の実施形態では、ヒトＭＥＴの第一のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４を含み、ヒトＭＥＴの第二のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸３０５～３１５および４２１～４５５を含む。
別の態様によれば、従来的な二特異性抗体も、本明細書に有用な抗体として提供される。この場合において当該二特異性抗体の一方のアームは、ヒトＭＥＴ上のエピトープに結合し、当該二特異性抗体の他方のアームは、ＭＥＴ以外の第二の抗原に結合する。ＭＥＴ結合アームは、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかを含んでもよい。ある実施形態では、ＭＥＴ結合アームは、ヒトＭＥＴに結合し、ＭＥＴへのＨＧＦ結合を遮断する。他の実施形態では、ＭＥＴ結合アームは、ヒトＭＥＴに結合するが、ＭＥＴへのＨＧＦ結合は遮断しない。
本開示の状況下で使用され得る例示的な二特異性抗体のフォーマットは、第一の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインと第二のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み、この場合において当該第一および第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも一つのアミノ酸によって互いに異なり、そしてこの場合において、少なくとも一つのアミノ酸の差異は、アミノ酸の差異を欠く二特異性抗体と比較して、二特異性抗体のプロテインＡへの結合を低下させる。一つの実施形態では、第一のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、例えばＨ９５Ｒ（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）修飾などのプロテインＡ結合を減少または消失させる変異を含有する。第二のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含んでもよい。第二のＣＨ３内に存在し得るさらなる修飾としては以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合には、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合には、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合には、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）。上述の二特異性抗体のフォーマットの変形も、本開示の範囲内に予期される。
本開示の状況下で使用され得る他の例示的な二特異性のフォーマットとしては限定されないが、例えば、ｓｃＦｖベースまたはダイアボディの二特異性フォーマット（ｄｉａｂｏｄｙ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒｍａｔ）、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二特異性フォーマット（前述のフォーマットのレビューに関しては、例えばＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２、ｍＡｂｓ ４：６、１～１１、および当該文献内に引用される参考文献を参照のこと）が挙げられる。二特異性抗体はさらに、ペプチド／核酸結合を使用して構築されてもよい。例えば直交的な化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド結合体を作製し、次いでこれを規定の組成、結合価および構造を有する多量体性複合体へと自己アセンブリさせる。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照されたい）。
治療用製剤および投与
本明細書において、本明細書に記載される方法により有用な抗ＭＥＴ抗体、またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、適切な担体、賦形剤とともに、および輸送、送達、忍容性などの改善をもたらす他の剤とともに製剤化されてもよい。
一部の態様では、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を含む医薬組成物は、例えば、ブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、または髄様上皮腫などの眼癌を治療するための眼投与用に製剤化される。
本明細書において、患者に投与される抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子が、医薬製剤内に含有される方法が提供される。医薬製剤は、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を、例えば、薬学的に許容可能な担体などの少なくとも一つの不活性成分と共に含有し得る。他の剤を医薬組成物内に組み込んで、輸送、送達、忍容性などの改善を提供し得る。「薬学的に許容可能」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されるか、または米国薬局方に列記されるか、または動物で、より具体的にはヒトにおける使用に関して他の一般的に認識されている薬局方に列記されることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指し、これとともに抗体が投与される。数多くの適切な製剤が、すべての薬剤師に公知の以下の処方集に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストン、１９７５）の中の特にＢｌａｕｇ、Ｓｅｙｍｏｕｒによるチャプター８７。これらの製剤としては例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油および油中水の乳剤、乳剤カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固形混合物が挙げられる。前述の混合物のいずれも、本開示の方法の場合において適切であり得るが、ただし抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子が、当該製剤により不活化されないものとし、および当該製剤は、投与経路に関して生理学的に適合性があり、忍容性であるものとする。またＰｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８－３１１、および薬剤師に公知の賦形剤および担体に関連する追加情報について、当該文献中の引用文献も参照のこと。
本開示の場合において、注射による投与に有用な医薬製剤は、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を、従来から注射用に使用される滅菌水性媒体または油性媒体中で溶解、懸濁、または乳化することにより調製されてもよい。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースと他の補助剤を含有する等張液などがあり、それらを例えばアルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが採用されてもよく、それらを例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このようにして調製された注射液は、望ましい場合には適切なアンプル中に充填され得る。
投与様式
抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗原結合分子（または抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を含む医薬製剤）は、任意の公知の送達システムおよび／または投与方法により患者に投与されてもよい。ある実施形態では、抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、眼注射、眼内注射、硝子体内注射、または結膜下注射により患者に投与される。他の実施形態では、抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、例えば、抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を含有し、眼に直接適用することができる点眼剤または他の液体、ゲル、軟膏もしくは流体を介した局所投与により患者に投与することができる。他の可能性のある投与経路としては、例えば、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が挙げられる。
併用療法および製剤
本明細書において、一つ以上の追加の治療活性成分と組み合わされた、本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子のいずれかを含む組成物および治療用製剤が提供され、および当該組成物を、その必要のある対象に投与することを含む治療方法が提供される。
抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子は、以下からなる群から選択される一つ以上の追加の治療活性成分と組み合わされて共に製剤化されてもよく、および／または投与されてもよい：ＭＥＴアンタゴニスト（例えば、抗ＭＥＴ抗体［例えば、オナルツズマブ、エミベツズマブ、テリソツズマブ、ＳＡＩＴ３０１、ＡＲＧＸ－１１１、Ｓｙｍ０１５、ＨｕＭａｘ－ｃＭｅｔ、ＣＥ－３５５６２１、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ］、またはＭＥＴの低分子阻害剤）、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの低分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ］）、例えばＨｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４などの別のＥＧＦＲファミリーの一員のアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２［例えば、トラスツズマブ、またはＴ－ＤＭ１｛ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）｝］、抗ＥｒｂＢ３抗体もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体、またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４の活性に対する低分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ－ｒａｆ阻害剤（例えば、ヴェムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０）、ＰＤＧＦＲ－α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－α抗体）、ＰＤＧＦＲ－β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－β抗体、または例えばメシル酸イマチニブもしくはリンゴ酸スニチニブなどの低分子キナーゼ阻害剤）、ＰＤＧＦリガンド阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、または－Ｄの抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡなど）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ、例えば、ＵＳ ７，０８７，４１１を参照のこと（本明細書において「ＶＥＧＦ－阻害融合タンパク質」とも呼称される）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の低分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、またはパゾパニブ）、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１など、ＵＳ２００９／０１４２３５４に開示されている抗ＤＬＬ４抗体など）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐなど、ＵＳ ２０１１／００２７２８６に開示されている抗Ａｎｇ２抗体など）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＳＴＥＡＰ１またはＳＴＥＡＰ２のアンタゴニスト（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体または抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン［例えば、抗ＵＰＫ３Ａ］抗体）、ＭＵＣ１６アンタゴニスト（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体）、Ｔｎ抗原アンタゴニスト（例えば、抗Ｔｎ抗体）、ＣＬＥＣ１２Ａアンタゴニスト（例えば、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体）、ＴＮＦＲＳＦ１７アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ１７抗体）、ＬＧＲ５アンタゴニスト（例えば、抗ＬＧＲ５抗体）、一価ＣＤ２０アンタゴニスト（例えば、リツキシマブなどの一価抗ＣＤ２０抗体）、ＣＤ２０ ｘ ＣＤ３ 二特異性抗体、ＰＤ－１ブロッキング剤（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブなどの抗ＰＤ－１抗体）など。本明細書に提供される抗体と組み合わせて有益に投与され得る他の剤としては例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤およびサイトカイン阻害剤が挙げられ、例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８等のサイトカイン、またはそれらの各受容体に結合する低分子サイトカイン阻害剤および抗体が挙げられる。
例としては、例えば抗ＰＤ－１抗体などのＰＤ－１阻害剤を、本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体－薬剤結合体と組み合わせてもよい。標的患者集団には特に、ｃ－Ｍｅｔ変異を過剰発現する腫瘍を有する患者、例えばｃ－Ｍｅｔ発現ブドウ膜メラノーマまたはｃ－Ｍｅｔ発現非小細胞肺癌を有する患者が含まれる。
本明細書において、本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子のいずれかと、一つ以上の化学療法剤の組み合わせを含む組成物および治療用製剤が提供される。化学療法剤の例示としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補液（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社、ニュージャージー州プリンストン）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ社、フランス、アントニー）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；および上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモンの作用を制御する、または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）をはじめとする抗エストロゲン；例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。
抗ＭＥＴ抗体およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子はさらに、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、ＣＯＸ阻害剤、心臓保護剤、金属キレート剤、ＩＦＮ－ガンマ、および／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与されてもよく、および／または一緒に製剤化されてもよい。
例えば上記に列記される剤またはその誘導体のいずれかなどの追加の治療活性成分は、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子の投与の直前に、投与と同時に、または投与の後すぐに投与されてもよい（本開示の目的に対し、そうした投与レジメンは、追加の治療活性成分と「併用された」抗体の投与とみなされる）。本開示は、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子が、本明細書の別段に記載される追加の治療活性成分のうちの一つ以上と一緒に製剤化される医薬組成物を含む。
投与レジメン
ある実施形態によると、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子（または、抗ＭＥＴ抗体もしくはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子と、本明細書に言及される追加の治療活性剤のいずれかの組み合わせを含む医薬組成物）の複数投与量を、規定の時間経過で対象に投与してもよい。当該態様による方法は、本明細書に提供される抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子の複数投与量を対象に順次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「順次投与する」とは、抗体の各投与量が、例えば所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）をあけた異なる日など、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本開示は、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子の一つの初回投与量、次いで当該抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子の一つ以上の第二の投与量、および任意で次いで当該抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子の一つ以上の第三の投与量を、患者に順次投与することを含む方法を含む。
「初回投与量」、「第二の投与量」、および「第三の投与量」という用語は、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子の投与に関する時間的な順序を指す。したがって、「初回投与量」は、治療レジメンの開始時に投与される投与量である（また「基準投与量」とも呼称される）、「第二の投与量」は、初回投与量の後に投与される投与量であり、「第三の投与量」は、第二の投与量の後に投与される投与量である。初回投与量、第二の投与量、および第三の投与量はすべて、同じ量の抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を含有してもよいが、一般的に、投与頻度に関しては概して互いに異なり得る。しかしながらある実施形態では、初回投与量、第二の投与量、および／または第三の投与量に含有される抗体の量は、治療経過の間に（例えば適宜調整されて加減され）、互いに異なっている。ある実施形態では、二つ以上（例えば、２、３、４、または５）の投与量が、治療レジメンの開始時に負荷投与量」として投与され、その後に続く投与量は、より低い頻度ベースで投与される（例えば、「維持投与量」）。
抗体の診断用途
本開示の抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を使用して、例えば診断目的のためにサンプル中のＭＥＴもしくはＭＥＴ発現細胞を検出および／または測定してもよい。例えば、抗ＭＥＴ抗体またはその断片を使用して、ＭＥＴの異常発現（例えば過剰発現、過小発現、発現の欠如など）を特徴とする状態または疾患を診断してもよい。ＭＥＴに対する例示的な診断アッセイは、例えば患者から取得されたサンプルを、抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子と接触させることを含み、この場合において、当該抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識される。あるいは、標識されていない抗ＭＥＴ抗体またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗原結合分子を、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて、診断アプリケーションに使用することもできる。検出可能な標識またはレポーター分子は、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなどの放射性同位体、例えばフルオレセインもしくはローダミンなどの蛍光または化学発光部分、または例えばアルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であってもよい。サンプル中のＭＥＴを検出または測定するために使用され得る具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、およびイムノ－ＰＥＴ（例えば、８９Ｚｒ、６４Ｃｕなど）、および蛍光活性化細胞ソーティング法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本開示に従うＭＥＴ診断アッセイに使用され得るサンプルとしては、患者から取得可能な任意の組織サンプルまたは液体サンプル、特に眼または眼の空洞部分にある組織または液体が挙げられる。一般的に、健常な患者（例えば異常なＭＥＴのレベルまたは活性と関連した疾患または状態に罹患していない患者）から取得された特定のサンプル中のＭＥＴレベルを測定して、最初に基準または標準的なＭＥＴレベルを確立する。次いでＭＥＴの基準レベルを、ＭＥＴ関連の疾患または状態を有すると疑われる個体から得られたサンプルにおいて測定されたＭＥＴレベルと比較することができる。
以下の実施例は、当業者に、本明細書に提供される方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示と説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明であるとみなす範囲を限定することは意図されていない。使用した数字（例えば、量、温度など）に対する正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は考慮に入れるべきである。別段の示唆が無い限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧であるか、または大気圧に近い。
実施例１．抗ＭＥＴ抗体の作製
抗ＭＥＴ抗体は、ヒトＦｃに融合された組換えヒトＭＥＴ細胞外ドメインを含む免疫原を用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたマウスを免疫化することにより取得された（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号３５８－ＭＴ、ミネソタ州ミネアポリス）。免疫化に使用されたマウスは、「ユニバーサル軽鎖」を発現する。すなわち、当該マウスで生成された抗体は、異なる重鎖可変領域を有するが、本質的に同一の軽鎖可変ドメインを有している。
抗体の免疫反応は、ＭＥＴ特異的な免疫アッセイによりモニタリングされた。所望の免疫応答が得られたときに、脾細胞を採取し、マウスミエローマ細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成させた。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＭＥＴ特異的抗体を産生する細胞株を特定した。この技術を使用して、数種の抗ＭＥＴキメラ抗体（すなわちヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを保有する抗体）を得た。さらに、ＵＳ ２００７／０２８０９４５Ａ１号に記載されるように、いくつかの完全ヒト抗ＭＥＴ抗体を、ミエローマ細胞との融合をおこなわずに直接、抗原陽性Ｂ細胞から単離した。
本実施例の方法にしたがって作製された例示的な抗ＭＥＴ抗体、および当該抗体から構築された二特異性抗体の特定の生物学的特性を、以下に記載される実施例において詳細に説明する。
実施例２．重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
表１は、本明細書に記載される選択された抗ＭＥＴ抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、およびＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。（上述のように、実施例１で生成された全ての抗体は、同じ軽鎖可変領域を保有しており、それに伴い同じ軽鎖ＣＤＲ配列を保有している）。対応する核酸配列の識別子は、表２に記載される。
Figure 2022523360000097
Figure 2022523360000098
抗体は典型的には、以下の命名法にしたがって本明細書において言及される：表１および２に示されるように、Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ４Ｈ」）、その後に数値識別子（例えば、「１３２９０」、「１３２９１」、「１３２９５」など）、その後に「Ｐ２」接尾辞が続く。したがってこの命名法によると、抗体は本明細書において例えば「Ｈ４Ｈ１３２９０Ｐ２」、「Ｈ４Ｈ１３２９１Ｐ２」、「Ｈ４Ｈ１３２９５Ｐ２」などと呼称される場合もある。本明細書で使用される抗体の名称に対する接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域のアイソタイプを示す。特に「Ｈ４Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ４のＦｃを有する（抗体の名称において最初に「Ｈ」で示される場合、全ての可変領域が完全にヒトである）。当業者によって理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ４ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ１を有する抗体に変換することができる、など）。しかしいずれの場合でも、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）－これは、表１および２に示される数値識別子によって示されている－は変わらず同じであり、結合特性はＦｃドメインの性質に関わらず同一または実質的に類似していると予想される。
実施例３．ヒトモノクローナル抗ＭＥＴ（一特異性）抗体の表面プラズモン共鳴から導かれた結合アフィニティおよび速度定数
ヒト抗ＭＥＴ抗体の結合アフィニティおよび速度定数を、３７℃での表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００またはＴ－２００）により決定した。本実施例で検証された抗ＭＥＴ抗体は、二価の一特異性ＭＥＴ結合物質であった。ヒトＩｇＧ４として発現された抗体（「Ｈ４Ｈ」と指定）は、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体とのアミンカップリングを介して誘導体化されたＣＭ４またはＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面に捕捉された（ＧＥ社、ＢＲ－１００８－３９）。 様々な濃度の可溶性の単量体（ヒト（ｈ）Ｍｅｔ．ｍｍｈ；配列番号１５２、カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（ｍｆ）Ｍｅｔ．ｍｍｈ；配列番号１５４）または二量体（ｈＭｅｔ．ｍＦｃ；配列番号１５３）のＭＥＴタンパク質を、３０または５０μＬ／分の流速で抗ＭＥＴ抗体捕捉表面に注入した。捕捉モノクローナル抗体と、ｈＭＥＴ．ｍｍｈまたはｈＭＥＴ．ｍＦｃの結合は４または５分間モニタリングされ、ＨＢＳ－ＥＴ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）またはＰＢＳ－Ｐ（０．０１Ｍ リン酸ナトリウム ｐＨ ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）のランニング緩衝液中、ｈＭＥＴ．ｍｍｈまたはｈＭＥＴ．ｍＦｃの解離が１０分間モニタリングされた。
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサグラムを１：１結合モデルに適合させることによって、結合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）定数を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を以下のように速度定数から計算した：
Figure 2022523360000099
一特異性抗Ｍｅｔ抗体の単量体Ｍｅｔタンパク質および二量体Ｍｅｔタンパク質に対する結合速度パラメータを、以下の表３に示す。
Figure 2022523360000100
Figure 2022523360000101
表３に示されるように、いくつかの抗体は、ヒトおよびサルのＭＥＴタンパク質に対し、高いアフィニティの結合を呈した。
実施例４．抗Ｍｅｔ抗体は、Ｍｅｔ受容体上の異なるエピトープに結合する
二つの抗Ｍｅｔ抗体が、ＭＥＴ上のそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合することができるかを評価するために、ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州メンロパーク）上でリアルタイムの無標識バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して結合競合アッセイを実施した。
簡潔に述べると、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグとともに発現された約０．２５ｎＭのヒトＭＥＴ細胞外ドメイン（ｈＭｅｔ．ｍｍｈ）は、２０μｇ／ｍＬのｈＭＥＴ．ｍｍｈ溶液を含有するウェル内にバイオセンサーを５分間沈めることによって、抗ペンタＨｉｓ抗体被覆ＯＣＴＥＴ（登録商標）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．、＃１８－５０７９）上に最初に捕捉された。次に、抗原を捕獲したバイオセンサーを、５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ－１溶液を含有するウェル内に５分間沈めることによって、第一の抗ＭＥＴモノクローナル抗体（以後、ｍＡｂ－１と呼称される）で飽和させた。次に、バイオセンサーを、５０μｇ／ｍＬの第二の抗ＭＥＴモノクローナル抗体（以後、ｍＡｂ－２と呼称される）溶液を含有するウェル内に３分間沈めた。すべてのバイオセンサーを、実験の各工程の間にＯＣＴＥＴ（登録商標）ＨＥＰＥＳ－緩衝生理食塩水－ＥＤＴＡポリソルベート２０（ＨＢＳ－ＥＰ）緩衝液中で洗浄した。実験の経過中、リアルタイムの結合反応をモニタリングし、各工程の最後での結合反応を記録した。ｍＡｂ－１と予め複合体化された抗ＭＥＴに対するｍＡｂ－２結合の反応を比較し、様々な抗ＭＥＴモノクローナル抗体の競合／非競合の挙動を、５０％阻害閾値を使用して判定した。表４は、結合の順序とは関係なく両方向で競合する抗体の関係性を明示的に規定する。
Figure 2022523360000102
実施例５．ＭＥＴの異なるエピトープに特異的な二つの異なる抗原結合ドメインを有する二特異性抗体の構築
本実施例は、二つの異なる抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）を含む二特異性抗体の構築を記述する。Ｄ１およびＤ２は、異なる抗ＭＥＴ抗体に由来し、その結果、ＭＥＴ細胞外ドメイン上の異なるエピトープに結合する。
本実施例の二特異性抗体を構築するために使用された個々の抗ＭＥＴ抗原結合ドメインは、本明細書の実施例１～３に記載される様々な二価の一特異性抗ＭＥＴ抗体から誘導された。本明細書に記載されるすべての抗ＭＥＴ抗体は、同一（共通の）軽鎖（配列番号１３８の軽鎖可変領域［ＬＣＶＲ］のアミノ酸配列、および配列番号１４０、１４２および１４４の軽鎖ＣＤＲ［ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３］のアミノ酸配列を含む）を含む。さらに、本実施例に例証される全ての二特異性抗体は、例示的な抗ＭＥＴ抗体であるＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２に由来する「Ｄ２」アームを含有する。したがって、本実施例に記載される全ての二特異性抗体の抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）は両方とも、この共通軽鎖可変領域を含み、そして全てのＤ２結合アームは、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２由来の重鎖可変領域を含む。しかし、それら二特異性抗体は、そのＤ１重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）に関しては互いに異なっている。本実施例の二特異性抗体の構成要素を、表５に要約する。
Figure 2022523360000103
Figure 2022523360000104
実施例６．ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴヒト二特異性モノクローナル抗体の表面プラズモン共鳴から導かれた結合アフィニティおよび速度定数
本明細書の実施例４に従って構築されたＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体の結合アフィニティおよび速度定数を、３７℃での表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００または Ｔ－２００）により決定した。ヒトＩｇＧ４として発現された二特異性抗体（「Ｈ４Ｈ」と指定）を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体とのアミンカップリングを介して誘導体化されたＣＭ４またはＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面に捕捉した（ＧＥ社、ＢＲ－１００８－３９）。様々な濃度の可溶性の単量体ＭＥＴタンパク質（ｈＭｅｔ．ｍｍｈ、配列番号１５２）を、抗ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体が捕捉された表面上に、３０または５０μＬ／分の速度で注入した。捕捉二特異性抗体と分析物の結合は、４または５分間モニタリングされ、ＨＢＳ－ＥＴ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）またはＰＢＳ－Ｐ（０．０１Ｍ リン酸ナトリウム ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）のランニング緩衝液中、分析物の解離が１０分間モニタリングされた。
結合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）定数を実施例３に記載されるように決定した。
二特異性抗Ｍｅｔ抗体の単量体Ｍｅｔタンパク質（ｈＭＥＴ．ｍｍｈ）に対する結合速度パラメータを、以下の表６に示す。
Figure 2022523360000105
表６に示されるように、本明細書に記載の二特異性「ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ」抗体は、最大１１５５分を超えるＴ１／２値を示した。
表７に示されるように、二特異性抗体Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄの解離速度は、その親抗体のＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２およびＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２の各々の解離速度よりも有意に低い。
Figure 2022523360000106
実施例７：抗Ｍｅｔ抗体は、ＳＲＥ－ルシフェラーゼレポーターバイオアッセイにおいて、ＨＧＦ介在性のＭｅｔ活性化を遮断する
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）介在性のＭＥＴ活性化を遮断する抗ＭＥＴ抗体の能力を、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイで検証した。増殖因子のＨＧＦは、その受容体のｃ－Ｍｅｔ（ＭＥＴ）の細胞外ドメインに結合し、急速なホモ二量体化を誘発して、いくつかの下流シグナル伝達カスケードを活性化する。本実施例で検証された抗ＭＥＴ抗体は、ＭＥＴの二価一特異性結合物質、または抗ＭＥＴ「二特異性」物質であり、二特異性抗体の各アームは、ＭＥＴ上の異なる別個のエピトープに結合した。
操作された細胞系ルシフェラーゼレポーターアッセイ（図２）を使用して、ＭＥＴシグナル伝達を活性化する抗ＭＥＴ抗体の能力（図３、パネルＡ；表８、列３および４）、およびＭＥＴのリガンド介在性活性化を遮断する抗ＭＥＴ抗体の能力（図３、パネルＢ；表８、列１および２）を決定した。簡潔に述べると、ＣＩＧＮＡＬ（商標）Ｌｅｎｔｉ ＳＲＥ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ｌｕｃ）キット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ドイツ、ヒルデン）を使用して、ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ細胞を作製した。ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎）細胞は、ｃ－Ｍｅｔを内因性に発現するために選択された。ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ細胞は、血清応答因子（ＳＲＥ）依存性ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーターを安定的に組み込まれた（Ｄｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（２）：ｅ０１１７７７４，２０１５を参照）。ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、および１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養された。
次に、２．０ ｘ １０５ ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ細胞を、９６ウェルプレートにおいて、ルシフェラーゼアッセイ培地中に播種し、５％ ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートした。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の用量反応曲線は、連続希釈されたＨＧＦ（０．０１ｐＭ～１．０ｎＭ）を細胞に添加し、抗体の非存在下、３７℃で４～６時間インキュベーションした後のルシフェラーゼシグナルを記録することによって生成された。抗体阻害曲線を生成するために、連続希釈された抗ヒトＭＥＴ抗体（１．１ｐＭ～２００ｎＭ）を用いて、３７℃で１時間、細胞を予めインキュベートした。次いで、７３ｐＭまたは１００ｐＭの濃度のＨＧＦをさらに４～６時間添加して、その後にシグナルを記録した。それとは別に、リガンドの非存在下でｃ－Ｍｅｔを活性化する抗体の能力も評価した。
ルシフェラーゼ活性は、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用して検出し、放射光を、ＶｉｃｔｏｒまたはＥｎｖｉｓｉｏｎのルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、米国コネチカット州シェルトン）上で測定し、相対光度単位（ＲＬＵ）として表現した。ＥＣ５０／ＩＣ５０値は、１２点の応答曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式からＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭ（登録商標）を使用して決定した。ＨＧＦ遮断のパーセント、およびＭＥＴ活性化の倍率（ｍＡｂ単独）は、最大抗体用量に対して報告された。結果を表８に示す。
Figure 2022523360000107
 NT=未試験、ND=EC50/IC50は非シグモイド曲線であるため、または不完全遮断のために判定されず。
表８に要約されるように、抗体の大部分はＳＲＥレポーターの活性化を阻害し、ＩＣ５０値は＜２．０ｐＭ～約１．０ｎＭの範囲であった。例えば、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２およびＨ４Ｈ１３３０９Ｐ２などのいくつかの例示的な一特異性二価抗ＭＥＴ抗体は、ＳＲＥ－ｌｕｃ活性化の強力な阻害物質であり、それぞれ阻害割合は６７％と７７％であった。抗ＭＥＴ二特異性抗体（ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ）は、全体的に高いＳＲＥ－ｌｕｃ活性化の阻害を示した。例えば、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄは、９５％の阻害を示した。さらに、いくつかの遮断抗体は、リガンドの非存在下では弱く活性化し、活性化応答の倍率は基準レベルより０．８～１４．４の範囲であった。
また図３に示されるように、二価単一特異性抗体のＨ４１４１３３０６Ｐ２およびＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２はそれぞれ、ＨＧＦリガンドの非存在下でＭｅｔ経路を活性化し（パネルＡ）、またＭｅｔのＨＧＦ活性化も遮断した（パネルＢ）。
ＨＧＦ依存性およびＨＧＦ非依存性のＭＥＴ活性化に対する二特異性ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ抗体（例えば、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ の効果も、ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃシステムを使用して評価した。ＳＲＥ誘導型ルシフェラーゼ活性を、様々な濃度のＭＥＴ抗体Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ（ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体）、一価抗ＭＥＴ抗体、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ親抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２で処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において測定し、ＨＧＦ非依存性のＭＥＴアゴニズムのレベルを確認した。親抗ＭＥＴ一特異性二価抗体は、ＭＥＴアゴニスト活性を示したが、一価抗体もＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体もＭＥＴアゴニスト活性を示さなかった（図４、パネルＡ）。
ＳＲＥ誘導型ルシフェラーゼ活性を、様々な濃度のＭＥＴ抗体Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ（ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体）、一価抗ＭＥＴ抗体、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ親抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２で処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において測定し、ＨＧＦ依存性のＭＥＴアゴニズムの阻害または遮断のレベルを確認した。親抗ＭＥＴ一特異性二価抗体は、いくらかのＨＧＦ遮断活性を示したが、一価抗体とＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体の両方とも高いＨＧＦ遮断を示した（図４、パネルＢ）。
ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、ＨＧＦシグナル伝達を遮断し、低いＭＥＴアゴニスト活性を呈する。
実施例８：抗Ｍｅｔ抗体は、Ｍｅｔ増幅細胞の増殖を阻害する。
次に、選択された抗Ｍｅｔ抗体を、ＭＥＴ増幅ＳＮＵ５細胞の増殖を阻害する能力について試験した。簡潔に述べると、２．５×１０３個のヒト胃癌（ＳＮＵ５）細胞を、１．５ｐＭ～１００ｎＭの範囲の濃度の抗ＭＥＴ抗体の存在下で、完全増殖培地中に播種した。ＳＮＵ５完全増殖培地は、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、１０％ ＦＢＳ、およびペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを含有した。細胞を５日間インキュベートし、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、メーカーの説明書に従い、生細胞数を決定した。
表９に要約されるように、例えばＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２およびＨ４Ｈ１３３２５Ｐ２などのいくつかの抗ＭＥＴ抗体は、５０％を超えてＳＮＵ５の増殖を妨害し、全体的なＩＣ５０は、４４ｐＭ～７８０ｐＭの範囲であった。
図５は、様々な抗ＭＥＴ二価一特異性抗体（すなわち従来的な抗体）を用いて処理されたＳＮＵ５細胞の相対的な細胞増殖を示す。従来的なＭＥＴ抗体のサブセットは、ＳＮＵ５のＭＥＴ増幅胃癌細胞の増殖を阻害する（図５）。９６ウェルプレート中のＳＮＵ５細胞を、１０μｇ／ｍｌの各抗体で処理し、細胞の増殖は、ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）の減少により５日後に判定した。一価ＭＥＴ抗体（列２、図５）は、米国特許第７，８９２，５５０ Ｂ２号に記載される、ＭｅｔＭａｂの重鎖可変配列および軽鎖可変配列を使用して生成された。当該特許は、その全体で参照により本明細書に援用される。従来的な抗体である８は、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２であり、従来的な抗体である１１は、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２であり、これらを使用して、ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄが構築された。
別個の増殖アッセイにおいて、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体（すなわちＨ４Ｈ１４６３９Ｄ）の遮断活性を、ＳＮＵ５、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株のＥＢＣ－１の両方で評価した。ＥＢＣ－１も、Ｍｅｔ遺伝子の増幅を停止、ＭＥＴを過剰発現する（Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７（５）：２０８１－２０８８，２００７）。ＥＢＣ－１細胞の完全増殖培地は、ＭＥＭ Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｓａｌｔｓ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、およびＭＥＭ用の非必須アミノ酸を含有した。Ｈ４Ｈ１４３６９Ｄは、ＳＲＥ－ルシフェラーゼの読み取り値によると、ＭＥＴ活性において最大阻害割合を示した。現行の実験では、３．０×１０３個のＳＮＵ５細胞またはＥＢＣ－１細胞を、１５ｐＭ～１００ｎＭの範囲の濃度のＨ４Ｈ１４６３９Ｄの存在下で、完全増殖培地中に播種した。細胞を、５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートした。次いで細胞を４％ホルムアルデヒド中で固定し、３μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、核を標識した。ＩＭＡＧＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ ＸＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州サニーベール）上で画像を取得し、ＭＥＴＡＸＰＲＥＳＳ（登録商標）画像解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州サニーベール）により核の数を決定した。４０ｎＭのジギトニンで処理された細胞のバックグラウンドの核数を、全てのウェルから引き算し、生存率は未処理対照のパーセンテージ（生存率％）として表した。ＩＣ５０値は、１０点の応答曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式から決定された（ＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭ（登録商標））。ＩＣ５０値、および細胞殺傷率を表９に示す。
Figure 2022523360000108
 ND=IC50は非シグモイド曲線であるため、または不完全妨害のために判定されず。
以下の表１０に要約されるように、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄは、ＥＢＣ－１細胞およびＳＮＵ５細胞の増殖を、それぞれ３７％および４０％阻害し、ＩＣ５０は、０．８２ｎＭおよび０．３ｎＭであった。
Figure 2022523360000109
９６ウェルプレート中のＳＮＵ５細胞（胃）を、対照抗体、一価ＭＥＴ抗体、またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体を用いて、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬで処理した。ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）の減少により、細胞の増殖を５日後に判定した。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、対照抗体および一価抗体と比較して、ＳＮＵ５細胞の相対的な細胞増殖を有意に減少させた（図６、パネルＡ）。
同様に、ＥＢＣ－１細胞の増殖に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果を評価した。２，５００個のＥＢＣ－１細胞を９６ウェルプレートに播種し、１０％のＦＢＳを補充したダルベッコ培地中で培養した。細胞を、対照抗体またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体を用いて、０．１μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬで処理した。続いて５％ ＣＯ２で、３７℃でインキュベートした。５日後、相対的な細胞増殖は、指標色素のＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（登録商標）を、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、カリフォルニア州サニーベール）において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。結果を表１１および図６、パネルＢに示す。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ）は、対照抗体と比較して、ＥＢＣ－１細胞の相対的細胞増殖を有意に減少させた（図６、パネルＢ）。
二価単一特異性、およびＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二価の両方の抗ＭＥＴ抗体のいくつかが、ＳＲＥ－Ｌｕｃ活性化の強力な阻害物質であり、Ｍｅｔが増幅され、ＭＥＴを過剰発現する細胞株の増殖を阻害する。
Figure 2022523360000110
実施例９．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、ＮＣＩ－Ｈ５９６ ＮＳＣＬＣ細胞において、中程度で一過性のＭＥＴ経路活性を誘導する
ヒト肺腺扁平上皮癌細胞における、ＭＥＴ経路に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。
２５０，０００個のＮＣＩ－Ｈ５９６細胞を１２ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ培地中で培養した。細胞を、５０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）で、または１０μｇ／ｍｌのＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体 Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄで処理し、実験を二重に繰り返した。次いで細胞を３７℃で５％ ＣＯ２中でインキュベートした。 ０、２、６、または１８時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を正規化し、イムノブロット分析を実施した。ＭＥＴリン酸化およびＥＲＫリン酸化を、ＩｍａｇｅＪ画像処理プログラム（Ｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４３：Ｓ２５－Ｓ３０，２００７）を用いて定量した。チューブリンのローディング対照に対してリン酸化レベルを正規化し、対照処理に対する倍数変化として表した。結果を表１２に要約する。
Figure 2022523360000111
ＮＣＩ－Ｈ５９６細胞をＨＧＦで処理することにより、ＭＥＴとＥＲＫに強力な活性化を誘導し、２時間でピークに達して、１８時間持続した。中程度のＭＥＴおよびＥＲＫのリン酸化は、Ｈ４Ｈ１４６３６Ｄ二特異性抗体の処理で検出され、それぞれ１８時間または６時間までに基準レベルに戻った。
実施例１０．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、Ｈｓ７４６Ｔ胃癌細胞において、一特異性抗体よりも強力にＭＥＴ分解を誘導し、経路の活性を阻害する
ヒト胃癌細胞のＭＥＴ経路に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。２５０，０００個のＨｓ７４６Ｔヒト胃癌細胞（Ｈ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．６２（２）：２２５－２３０，１９７９）を１２ウェルプレートに播種し、１０％のＦＢＳを補充した改変ダルベッコ培地中で培養した。細胞を、（１）５μｇ／ｍｌのｈＦｃ対照分子、（２）５μｇ／ｍｌの親二価一特異性抗ＭＥＴ抗体のＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２、（３）５μｇ／ｍｌの親二価一特異性抗ＭＥＴ抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２、（４）２．５μｇ／ｍＬのＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２と２．５μｇ／ｍＬのＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２の組み合わせ、または（５）５μｇ／ｍｌのＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄ、を用いて処理した。次いで細胞を３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。 １８時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を正規化し、イムノブロット分析を実施した。ＭＥＴ発現、ＭＥＴリン酸化、およびＥＲＫリン酸化を、ＩｍａｇｅＪ画像処理プログラム（Ｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４３：Ｓ２５－Ｓ３０，２００７）を用いて定量した。結果を表１３および図７のパネルＡに要約する。当該図において、イムノブロットの生データを示す。図７のパネルＢは、１０μｇ／ｍｌのＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いて、０、２、または６時間、処理された細胞中のＭＥＴタンパク質発現を示す。Ｈｓ７４７Ｔ細胞における総ＭＥＴレベルは、ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体を用いた処理により経時的に低下した。ＭＥＴ増幅ヒト乳頭腺がんのＮＣＩ－Ｈ８２０細胞株（Ｂｅａｎ ｅｔ ａｌ．，“ＭＥＴ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｃｃｕｒｓ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｔ７９０Ｍ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＥＧＦＲ ｍｕｔａｎｔ ｌｕｎｇ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｇｅｔｆｉｔｎｉｂ ｏｒ ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ，” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００７ Ｄｅｃ ２６，１０４（５２）：２０９３２－２０９３７）に対しても同様の結果が得られた。
Figure 2022523360000112
二特異性抗体であるＨ４Ｈ１４６３９Ｄは、その親の従来抗体よりも強力にＭＥＴ分解を誘導した。ＭＥＴリン酸化とＥＲＫリン酸化は両方とも、親抗体、または親抗体の組み合わせよりも、Ｈ４Ｈ１４６３６Ｄを用いた処理によって効果的に阻害された。
Ｈｓ７４６Ｔ胃癌細胞を、対照抗体、ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄ、抗ＭＥＴ親抗体のＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２、抗ＭＥＴ親抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２、および親抗体１と２の組み合わせを用いて処理した。各抗体は１０μｇ／ｍｌで、または親抗体の組み合わせはそれぞれ５μｇ／ｍｌで１８時間処理した。ＭＥＴ発現（ＭＥＴ）、および経路活性化（ｐＭＥＴおよびｐＥｒｋ）を、指定抗体を用いた免疫ブロッティングにより判定した（図８）。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、Ｈｓ７４６Ｔ胃癌細胞において、その親抗体よりも効果的にＭＥＴ経路の活性化を阻害する。
実施例１１．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、ＮＣＩ－Ｈ５９６肺癌細胞において、一特異性抗体よりも強力にＭＥＴ分解を誘導する
ヒト肺腺扁平上皮癌細胞上の肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲまたはＭＥＴ）の発現レベルに対する、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体と、親二価一特異性抗ＭＥＴ抗体の効果を評価した。２５０，０００個のＮＣＩ－Ｈ５９６ヒト肺腺扁平上皮癌細胞を１２ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ培地中で培養した。細胞を、（１）５μｇ／ｍｌのｈＦｃ対照分子、（２）５μｇ／ｍｌの親二価一特異性抗ＭＥＴ抗体のＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２、（３）５μｇ／ｍｌの親二価一特異性抗ＭＥＴ抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２、（４）２．５μｇ／ｍＬのＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２と２．５μｇ／ｍＬのＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２の組み合わせ、または（５）５μｇ／ｍｌのＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄ、を用いて処理した。次いで細胞を３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。 １８時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を正規化し、イムノブロット分析を実施した。ＭＥＴ発現を、ＩｍａｇｅＪ画像処理プログラム（Ｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４３：Ｓ２５－Ｓ３０，２００７）を用いて定量した。結果を表１４に要約する。
Figure 2022523360000113
さらにＮＣＩ－Ｈ５９６（ＭＥＴのエクソン１４スキップ変異）肺癌細胞を、１０μｇ／ｍｌの対照抗体またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体で２、６、または１８時間、処理した。ＭＥＴ発現は、イムノブロット法により判定された（図９）。当該図から、処理時間が増すにつれ、ＭＥＴｘＭＥＴ二特異性抗体誘導性にＭＥＴが分解されることが示される。
二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３６Ｄは、ＮＣＩ－Ｈ５９６肺癌細胞において、その親の従来抗体よりも強力にＭＥＴ分解を誘発する。
実施例１２．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、ＳＮＵ５胃癌細胞において、一特異性抗体よりも強力にＭＥＴ分解を誘導し、経路の活性を阻害する
胃癌細胞上の肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲまたはＭＥＴ）の発現レベルに対する、二価一特異性抗ＭＥＴ抗体、およびいくつかのＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体の効果を評価した。ヒト胃癌ＳＮＵ５細胞を、２０％ ＦＢＳと、ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミンを含有するＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地中に播種した。播種から２４時間後、細胞を、対照ｈＦｃ、抗ＭＥＴ親二価一特異性抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２、またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体（Ｈ４Ｈ１４６３４Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６３５Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６３６Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６３７Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６３８Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６４０Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６４１Ｄ）を用いて１８時間処理した。次いで細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロッティングにより分析した。イムノブロットを、ＭＥＴおよびチューブリンに対してプローブした。ＭＥＴタンパク質の発現レベルを定量し、チューブリンローディング対照に対して正規化した。結果を表１５および図１０、パネルＢに示す。
Figure 2022523360000114
ＳＮＵ５癌細胞を、１０μｇ／ｍｌの対照抗体またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体または一価ＭＥＴ抗体を用いて１８時間、上述のように処理した。ＭＥＴ発現（図１０、パネルＡおよびＢ）、および経路活性化（すなわちｐＭＥＴおよびｐＥｒｋ、パネルＡ）を、指定抗体を用いた免疫ブロッティングにより判定した。イムノブロットを図１０に示す。
ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体を用いたＳＮＵ５細胞の処理によって、二価一特異性抗ＭＥＴ抗体（Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２）（図１０、パネルＢ）、一価ＭＥＴ抗体、または対照ｈＦｃを用いた処理よりも強力なＭＥＴの分解を誘導した。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いたＳＮＵ５細胞の処理によって、ＭＥＴ経路の下流エフェクターが阻害された。ＭＥＴ増幅非小細胞肺癌腺癌細胞株のＮＣＩ－Ｈ１９９３（Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．，“ＭＥＴ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｒ ＥＧＦＲ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅ ＭＥＴ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｓ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥＧＦＲ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，” Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００９ Ａｐｒ １５；１２４（８）：１７７８－１７８４）についても同様の結果が得られた。
実施例１３．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、ＥＢＣ－１細胞において、一特異性抗体よりも強力にＭＥＴ分解を誘導し、経路の活性を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害する
ＭＥＴ増幅ヒト肺扁平上皮細胞癌のＥＢＣ－１細胞（Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ＭＥＴ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｒｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ Ｍｅｔ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｍａｒ １；６７（５）：２０８１－８）を、対照抗体、または１０μｇ／ｍｌのＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いて１８時間、上述のように処理した。ＭＥＴ発現とＭＥＴ経路の活性化は、ｐＭＥＴおよびｐＥｒｋにより確定され、指定抗体を用いた免疫ブロッティングにより判定された。イムノブロットを図１１に示す。
ＭＥＴ遺伝子の増幅を担持するＥＢＣ－１細胞をＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体で処理することにより、対照抗体を用いた処理よりも強力なＭＥＴの分解を誘導した。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いたＥＢＣ－１細胞の処理によって、ＭＥＴ経路の下流エフェクターが阻害された。
別の実験において、５００万個のＥＢＣ－１細胞を、Ｃ．Ｂ．－１７ ＳＣＩＤマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に達した時点で、マウスを６群に無作為化し、２５ｍｇ／ｋｇの対照抗体、または２５ｍｇ／ｋｇのＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄを用いて週に２回処理した。腫瘍増殖は、移植後３０日間モニタリングされ、各実験群について腫瘍体積（ｍｍ３）が経時的に測定された。結果を表１６および図１２に示す。この結果から、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体が、ＥＢＣ－１腫瘍の増殖を有意に阻害することが示される。
Figure 2022523360000115
実施例１４．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、Ｈｓ７４６Ｔ胃癌細胞のインビトロ増殖を、一特異性抗体よりも強力に阻害する
ヒト胃癌細胞の増殖に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。２，５００個のＨｓ７４６Ｔヒト胃癌細胞（Ｈ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．６２（２）：２２５－２３０，１９７９）を９６ウェルプレートに播種し、１０％のＦＢＳを補充した改変ダルベッコ培地中で培養した。細胞は、（１）５μｇ／ｍｌの個々の二価一特異性抗ＭＥＴ抗体（Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２またはＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２）、（２）それぞれ２．５μｇ／ｍｌの二つの二価一特異性抗ＭＥＴ親抗体（Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２とＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２）の組み合わせ、または（３）５μｇ／ｍｌの、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２由来の一方の結合アームと、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２由来の他方の結合アームを含有する二特異性抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ）、を用いて処理された。次いで細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。 ５日後、相対的な細胞増殖は、指標色素のＡＬＡＭＡＲ ＢＬＵＥ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｍ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州サニーベール）において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。蛍光の増加は、細胞増殖と相関する。表１７は、対照（処理なし）Ｈｓ７４６Ｔ細胞の増殖に対して正規化された各抗体処理の相対的なＨｓ７４６Ｔ細胞の増殖を示す。二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄは、その親一特異性抗体の個々の、または組み合わせよりも強力にＨｓ７４６Ｔ細胞の増殖を阻害する。
Figure 2022523360000116
Ｈｓ７４６Ｔ胃癌細胞を、対照抗体、ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄ、抗ＭＥＴ親抗体のＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２、抗ＭＥＴ親抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２、および親抗体１と２の組み合わせを用いて処理した。各抗体は２μｇ／ｍｌであった。ＡＬＡＭＡＲ ＢＬＵＥ（登録商標）試薬の減少により、細胞の増殖を５日後に判定した（図１３、パネルＡ）。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、親抗体の単独または組み合わせよりも細胞増殖を阻害し、Ｈｓ７４６Ｔ胃癌細胞において、その親抗体よりも効果的にＭＥＴ経路の活性化を阻害した。
９６ウェルプレート中のＨｓ７４６Ｔ胃癌細胞を、２５μｇ／ｍＬの対照抗体、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、もしくは２５μｇ／ｍＬの一価ＭＥＴ抗体、または１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、もしくは２５μｇ／ｍＬＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体を用いて処理した。Ｈｓ７４６Ｔ胃癌細胞の増殖は、ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（登録商標）試薬の減少により５日後に判定した（図１３、パネルＢ）。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、ＭＥＴ増幅細胞の増殖を強力に阻害する。
実施例１５．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、インビトロでＮＣＩ－Ｈ５９６肺癌細胞の増殖を誘導しない
ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞（ＮＣＩ－Ｈ５９６）の増殖に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果をインビトロで評価した。１０，０００個のＮＣＩ－Ｈ５９６ 肺腺扁平上皮癌細胞（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８６（５）：３７８－３８３，１９９４）を、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した培地中、０．６６％アガーの層上で、９６ウェルプレートに播種した。細胞を、０．３％アガロースを含む、１％ ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞は、（１）５μｇ／ｍｌの個々の親二価一特異性抗ＭＥＴ抗体（Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２またはＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２）、（２）それぞれ２．５μｇ／ｍｌの二つの親二価一特異性抗ＭＥＴ抗体（Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２とＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２）の組み合わせ、（３）５μｇ／ｍｌの、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２由来の一方の結合アームと、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２由来の他方の結合アームを含有する二特異性抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ）、または（４）１００ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を用いて処理された。次いで細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。 ２週間後、相対的な細胞増殖は、指標色素のＡＬＡＭＡＲ ＢＬＵＥ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州サニーベール）において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。蛍光の増加は、細胞増殖と相関する。表１８および図１４は、対照（処理なし）のＮＣＩ－Ｈ５９６細胞の増殖に対して正規化された各抗体処理の相対的なＮＣＩ－Ｈ５９６細胞の増殖を示す。ＮＣＩ－Ｈ５９６肺癌細胞をＨＧＦで処理することにより、軟アガー中での増殖が強力に誘導された。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ（図１４のＭＭ）二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄは、対照処理細胞と比較して増殖を有意に変化させなかった。それぞれの親二価一特異性抗体のＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２（Ｍ１）またはＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２（Ｍ２）の個別で、または組み合わせ（Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２とＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２）（Ｍ１Ｍ２）で、中程度の細胞増殖が観察された。
Figure 2022523360000117
 実施例１６．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、ＳＮＵ５胃癌細胞のインビトロ増殖を、一特異性抗体よりも強力に阻害する
ヒト胃癌細胞の増殖に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。２，５００個のＳＮＵ５ヒト胃癌細胞（Ｋｕ ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３７（１）：１－１９，２００５）を、９６ウェルプレートに播種し、２０％のＦＢＳを補充したＩｓｃｏｖｅ’ｓ改変ダルベッコ培地中で培養した。細胞は、（１）５μｇ／ｍｌの個々の二価一特異性抗ＭＥＴ抗体（Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２またはＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２）、（２）それぞれ２．５μｇ／ｍｌの二つの二価一特異性抗ＭＥＴ抗体（Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２とＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２）の組み合わせ、または（３）５μｇ／ｍｌの、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２由来の一方の結合アームと、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２由来の他方の結合アームを含有する二特異性抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ）、を用いて処理された。次いで細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。 ５日後、相対的な細胞増殖は、指標色素のＡＬＡＭＡＲ ＢＬＵＥ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州サニーベール）において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。蛍光の増加は、細胞増殖と相関する。表１９は、対照（処理なし）ＳＮＵ５細胞の増殖に対して正規化された各抗体処理の相対的なＳＮＵ５細胞の増殖を示す。二特異性抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄは、その親一特異性抗体よりも強力にＳＮＵ５細胞の増殖を阻害する。
Figure 2022523360000118
実施例１７．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、Ｈｓ７４６Ｔ腫瘍異種移植片の退縮を誘導する
免疫不全マウスモデルにおける、ヒト胃癌腫瘍に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果を評価した。３００万個のＨｓ７４６Ｔヒト胃癌細胞を、ＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスの側腹に皮下移植した（Ｂａｎｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１）：４－９，１９８６）。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達した時点で、マウスを６群に無作為化し、２５ｍｇ／ｋｇの対照抗体、または２５ｍｇ／ｋｇのＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ）を用いて週に２回治療した。対照群に関して、移植から１６日間、対照治療腫瘍がプロトコールのサイズ限界に達するときまで腫瘍増殖をモニタリングした。Ｈ４Ｈ１４６３９治療群に関して、移植から３０日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体を用いた腫瘍の治療は、治療開始時と比較して２１日間にわたり、腫瘍サイズの退縮を誘導した。対照治療された腫瘍は、１６日間にわたり増殖し、約１２倍の平均体積の増加を示した（表２０）。経時的な腫瘍体積は、ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体によるＨｓ７４６Ｔ腫瘍退縮を示しており、これは図１５に示される。
Figure 2022523360000119
実施例１８．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、ＳＮＵ５腫瘍異種移植片の退縮を誘導する
免疫不全マウスモデルにおける、ヒト胃癌腫瘍に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果を評価した。１，０００万個のＳＮＵ５ヒト胃癌細胞を、ＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約５００ｍｍ３に達した時点で、マウスを５群に無作為化し、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、または１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇいずれかのＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ）を用いて週に２回治療した。移植後８１日間、対照治療腫瘍がプロトコールのサイズ限界に達するときまで腫瘍増殖がモニタリングされた。
１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＭＥＴ×ＭＥＴ抗体で治療されたマウスの腫瘍は、それぞれ約９５％または９８％の平均サイズ減少を示した。対照治療群の腫瘍は、治療開始から約１２倍の平均体積の増加を示した（表２１）。
Figure 2022523360000120
皮下移植されたＳＮＵ５腫瘍を、対照抗体、１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ一価ＭＥＴ抗体、または１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇのＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体で週に２回治療した。ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体で治療されたマウスにおいて、ＭＥＴ増幅ＳＮＵ５腫瘍の強力で持続的な退縮（すなわち腫瘍体積の減少）が経時的に観察された（図１６、パネルＡ）。試験終了時に腫瘍からタンパク質を抽出し、ＭＥＴ発現と、ＭＥＴリン酸化（ｐＭＥＴ発現）により示される経路活性化をイムノブロット法により判定した。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ治療マウス（腫瘍）は、対照と比較してＭＥＴおよびｐＭＥＴの発現の減少を示した（図１６、パネルＢ）。ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、ＭＥＴ増幅を担持する腫瘍の強力な阻害物質である。
実施例１９．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、Ｕ８７－ＭＧ腫瘍異種移植片の退縮を誘導する
免疫不全マウスモデルにおける、ヒトグリア芽腫腫瘍に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果を評価した。５００万個のＵ８７－ＭＧヒトグリア芽腫細胞（Ｖｏｒｄｅｒｍａｒｋ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｂｉｏｌ．５６（４）：１１８４－１１９３，２００３）を、ＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスの側腹に皮下移植した。Ｕ８７－ＭＧグリア芽腫異種移植片モデルは、オートクラインのＨＧＦシグナル伝達により誘導される。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達した時点で、マウスを６群に無作為化し、対照抗体またはＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ）を用いて治療した。各マウスには、週に二回、２５ｍｇ／ｋｇの抗体（対照またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ）が投与ｓれた。移植後２９日間、対照治療腫瘍がプロトコールのサイズ限界に達するときまで腫瘍増殖がモニタリングされた。
ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ抗体で治療されたマウスの腫瘍は、約３８％の平均サイズ減少を示したが、対照抗体で治療された腫瘍は、２９日間にわたり増殖し、約１９倍の平均体積の増加を示した（表２２）。経時的な腫瘍体積は、ＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体によるＵ８７－ＭＧ腫瘍退縮を示しており、これは図１７に示される。
Figure 2022523360000121
実施例２０．ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体は、Ｕ１１８－ＭＧ腫瘍異種移植片の増殖を阻害する
免疫不全マウスモデルにおける、ヒトグリア芽腫腫瘍に対するＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体の効果を評価した。Ｕ１１８－ＭＧグリア芽腫異種移植片モデルは、オートクラインのＨＧＦシグナル伝達により誘導される。５００万個のＵ１１８－ＭＧヒトグリア芽腫細胞（Ｏｌｏｐａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：２５２３－２５２９，１９９２）を、ＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達した時点で、マウスを６群に無作為化し、対照抗体またはＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ）を用いて治療した。各マウスには、週に二回、２５ｍｇ／ｋｇの抗体（対照またはＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ）が投与ｓれた。移植後７２日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
ＭＥＴ抗体は、７２日間にわたり腫瘍増殖を９９％阻害した（表２３）。
Figure 2022523360000122
別の実験では、マウスに皮下移植されたＵ１１８－ＭＧグリア芽腫腫瘍を、２５ｍｇ／ｋｇの対照抗体、一価ＭＥＴ抗体、またはＭＥＴ×ＭＥＴ二特異性抗体を用いて週に２回治療した。各実験群について、経時的に腫瘍体積（ｍｍ３）を測定した。結果を図１８に示す。この結果から、ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体が、Ｕ１１８－ＭＧ腫瘍の増殖を阻害することが示される。
実施例２１：メイタンシノイドの合成
メイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン－カルバミル－（ｐ－アミノ）ベンジル－シトルリン－バリン－アジポイル－コハク酸塩（図２０の化合物１）を、化合物２（図１９）から以下に記載されるように合成した。
メイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｆｍｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン（化合物３、図１９）。デス－アセチル－メイタンシン（化合物２、図１９、０．４３３ｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－Ａｌａ（０．４３４ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（０．７５７ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を乾燥したフラスコに計り取り、無水ＤＭＦ（９ｍＬ）に溶解させ、４－メチルモルホリン（０．３００ｍＬ、２．７３ｍｍｏｌ）で処理した。フラスコをゴム隔膜で密封し、アルゴンでパージして、反応物を周囲温度で攪拌した。３日後、混合物を蒸発させて油状物を得て、アセトニトリルおよび水に溶解させ、２７５ｇのＣ１８シリカカラム上のフラッシュクロマトグラフィー（２０分間で３０～９０％のアセトニトリル水溶液、両方の相で０．０５％酢酸）により精製した。生成画分の凍結乾燥により、白色固形物として表題化合物を得た。粗生成物を、８０ｇのシリカゲルカラム（１７分かけてＥｔＯＡｃ－５：５：１のＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製した。純粋な画分を一つにまとめ、蒸発させ、真空中で一晩乾燥させて、白色固形物として表題化合物を得た（０．４２４ｇ、６６％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ５１Ｈ６１ＣｌＮ４Ｏ１２の計算値９５６．４；実測値９５６．９（Ｍ＋Ｈ）、９７９．０（Ｍ＋Ｎａ），９３９．０（Ｍ－Ｈ２Ｏ＋Ｈ）。
Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－Ｎ－メチル－ベータ－アラニンコハク酸エステル（化合物４、図１９）。表題化合物を、当分野で公知の方法（Ｗｉｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００６，４９（１４），４４０１を参照）により、市販のＢｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－Ａｌａ－ＯＨから調製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．６２（ｂｍ，２Ｈ），２．８８（ｍ，９Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）。
メイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｂｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン（化合物５、図１９）。方法Ａ：上述の工程の生成物（化合物４、図１９、０．４５３ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）およびデス－アセチル－メイタンシン（化合物２、図１９、０．３０４ｇ、０．４６８ｍｍｏｌ）を、３：１のアセトニトリル：水（８ｍＬ）に溶解し、１ＭのＮａＨＣＯ３水溶液（０．５ｍＬ）で処理し、１８時間、周囲温度で攪拌した。ＴＬＣにより判定して反応が完了したら、その後ブラインで１０分間攪拌し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で三回抽出した。次いで一つにまとめた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮して真空中で乾燥させて金色のシロップを得て、２０ｇのシリカゲルカートリッジでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ中、１５分かけて０～１０％ ＭｅＯＨ）により精製し、白色固形物として表題化合物を得た（０．０８４ｇ、４３％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４１Ｈ５９ＣｌＮ４Ｏ１２の計算値８３４．４；実測値８３５．２（Ｍ＋Ｈ）、８５７．２（Ｍ＋Ｎａ），８１７．４（Ｍ－Ｈ２Ｏ＋Ｈ）。
方法Ｂ：Ｂｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－Ａｌａ－ＯＨ（０．２９４ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、ペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィン酸塩（ＦＤＰＰ、０．５５５ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）で処理し、反応物を周囲温度で３０分間攪拌した。次いで混合物を、デス－アセチル－メイタンシン（化合物２、図１９、０．４６２ｇ、０．７１１ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．２５０ｍＬ、１．４４ｍｍｏｌ）の無水ＤＮＦ（７ｍＬ）溶液を含有する大きなフラスコへと移し、ゴム隔膜でフラスコを密閉して、アルゴンでパージし、反応物を周囲温度で再び攪拌した。２４時間後、反応物を真空中で濃縮して油状物を得て、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、２ｍＬ）中に溶解し、４０ｇのシリカゲルカートリッジ（１５分かけてＥｔＯＡｃ－５：５：１のＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）上で精製して、淡黄色固形物として表題化合物を得た（０．４６８ｇ、７９％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４１Ｈ５９ＣｌＮ４Ｏ１２の計算値８３４．４；実測値８５７．２（Ｍ＋Ｎａ），８１７．２（Ｍ－Ｈ２Ｏ＋Ｈ）。
メイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン（化合物６、図１９）。方法Ａ：メイタンシン－Ｎ－Ｍｅ－Ｌ－Ａｌａ－Ｂｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－Ａｌａ（化合物５、図１９、０．４６４ｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸の３：１：１混合液（７ｍＬ）中に溶解し、フラスコをゴム隔膜で密封し、アルゴンでパージした。反応物を周囲温度で２４時間攪拌して、その後に蓋をして－２０℃で３日間保存した。粗反応混合物を周囲温度まで２時間加温し、真空中で短時間濃縮し、１００ｇの Ｃ１８ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄカラム（２５分かけて、２０％～８０％のアセトニトリル水溶液、両溶媒中、０．１％ＴＦＡ）で精製し、一つにまとめた純画分を周囲温度で部分的に蒸発させ、ドライアイス浴中で凍結し、凍結乾燥させて、淡黄色固形物として表題化合物を得た（０．２９５ｇ、６３％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ３６Ｈ５１ＣｌＮ４Ｏ１０の計算値７３４．３；実測値７３５．７（Ｍ＋Ｈ），１４７１．３（２Ｍ＋Ｈ）。
方法Ｂ：メイタンシン－Ｎ－Ｍｅ－Ｌ－Ａｌａ－Ｆｍｏｃ－ベータ－Ａｌａ（化合物３、図１９、０．４２２ｇ、０．４４１ｍｍｏｌ）５％ピペリジンのＤＭＦ溶液中に溶解し（６．００ｍＬ、３．０４ｍｍｏｌ）、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。３時間後、反応をＬＣＭＳにより完了させ、真空中で濃縮し、密封して、－２０℃で一晩保存した。粗生成物を周囲温度まで加温し、アセトニトリルおよび１０％酢酸水溶液（３ｍＬずつ）で処理し、２７５ｇのＣ１８シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（２０分かけて１０～９０％のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に０．０５％ 酢酸）により精製した。生成画分の凍結乾燥により、白色固形物として表題化合物を得た。固形物を無水ジエチルエーテルで三回粉末化し、濾過して、ＤＣＭを用いて固形物からフリットを洗い流し、濾液を蒸発させ、真空中で乾燥させて、白色固形物として表題化合物を得た（０．３１１ｇ、８９％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ３６Ｈ５１ＣｌＮ４Ｏ１０の計算値７３４．３；実測値７３５．０（Ｍ＋Ｈ）。
メイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン－カルバミル－（ｐ－アミノ）ベンジル－シトルリン－バリン－Ｆｍｏｃ（化合物７、図２０）。工程１：上述の工程の生成物（化合物６、図１９、０．３１０ｇ、０．３９０ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡＴ、０．１６４ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）、重炭酸ナトリウム（０．１３８ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）、およびＦｍｏｃ－バリン－シトルリン－（ｐ－アミノ）ベンジル－（ｐ－ニトロフェニル）炭酸塩（０．５９５ｇ、０．７７６ｍｍｏｌ、当分野に公知の方法により調製された。Ｇａｎｇｗａｒらの米国特許第７，７１４，０１６ Ｂ２号を参照のこと）を、無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。２４時間後、反応物を真空中でおよそ２～３ｍＬまで部分的に蒸発させ、１０％の酢酸水溶液および水（それぞれ約１ｍＬ）で処理し、アセトニトリル（約６ｍＬ）に溶解し、２７５ｇのＣ１８シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（２０分かけて、３０～９０％のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に０．０５％酢酸）により精製した。部分蒸発、凍結、および凍結乾燥により、白色固形物として表題化合物を得た（０．３６２ｇ、６８％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ７０Ｈ８８ＣｌＮ９Ｏ１７の計算値 １３６１．６；実測値 １３６２．１（Ｍ＋Ｈ），１３８４．１（Ｍ＋Ｎａ），１３４４．１（Ｍ－Ｈ２Ｏ＋Ｈ）。
工程２：上述の工程の生成物（０．３６０ｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）を５％ ピペリジンのＤＭＦ（７ｍＬ）溶液に溶解し、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。３時間後、反応物を真空中で蒸発させ、残留物を１０％の酢酸水溶液（２ｍＬ）で処理し、アセトニトリル（４ｍＬ）に溶解し、２７５ｇのＣ１８シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（２０分かけて、１０～７０％のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に０．０５％酢酸）により精製した。純画分を一つにまとめ、－２０℃で一晩保存し、真空中、２５～３０℃で部分的に蒸発させてドライアイス上で凍結させ、６日間凍結乾燥させて淡黄色固形物として表題化合物を得た（０．３０３ｇ、９５％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ１５Ｈ７８ＣｌＮ９Ｏ１５の計算値１１３９．５；実測値１１４０．１（Ｍ＋Ｈ），１１６２．０（Ｍ＋Ｎａ）。
メイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン－カルバミル－（ｐ－アミノ）ベンジル－シトルリン－バリン－アジピン酸（化合物８、図２０）。上述の工程の生成物（化合物７、図２０、０．２０５ｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）、アジピン酸（０．２５８ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）、および２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、０．２１５ｇ、０．８６９ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）および無水メタノール（５ｍＬ）に溶解し、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。２１時間後、反応物を真空中で蒸発させ、残留物を数ミリリットルのアセトニトリル／水に溶解し、１５０ｇのＣ１８シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（１７分かけて、２０～８０％のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に０．０５％酢酸）により精製した。純画分を１８時間、部分蒸発、凍結、および凍結乾燥することにより、白色固形物として表題化合物を得た（０．１４０ｇ、６５％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ６１Ｈ８６ＣｌＮ９Ｏ１８の計算値１２６７．６；実測値１２６８．９（Ｍ＋Ｈ），１２９０．９（Ｍ＋Ｎａ）。
メイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン－カルバミル－（ｐ－アミノ）ベンジル－シトルリン－バリン－アジポイル－コハク酸塩（化合物１、図２０）。上述の工程の生成物（化合物８、図２０、０．０６１ｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（０．０６３ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、およびＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ－ＨＣｌ、０．０７１ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（７ｍＬ）中に溶解し、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。５日後、反応物を真空中で蒸発させ、残留物を数ミリリットルのアセトニトリル／水に溶解し、１００ｇのＣ１８シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（１５分かけて、３０～９０％のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に０．０５％酢酸）により精製した。最も清浄化された生成物画分を１８時間、部分蒸発、凍結、および凍結乾燥することにより、白色固形物として表題化合物を得た（０．０４４ｇ、６７％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ６５Ｈ８９ＣｌＮ１０Ｏ２０の計算値１３６４．６；実測値１３６５．７（Ｍ＋Ｈ），１３８７．７（Ｍ＋Ｎａ），１３４７．７（Ｍ－Ｈ２Ｏ＋Ｈ）。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ７．５６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｍ，１Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３９（ｄｄ，Ｊ＝１５．１，１１．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３８－５．３２（ｍ，１Ｈ），５．０３（ｔ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８８（ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），４．７３（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ），４．６１（ｄｄ，Ｊ＝９．１，３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．６１（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５７（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４６（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．１７－３．０７（ｍ，５Ｈ），２．９７（ｄｄ，Ｊ＝１６．６，９．９Ｈｚ，１Ｈ），２．８８（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，３Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ），２．７７（ｓ，２Ｈ），２．６６（ｓ，２Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），２．５６（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），２．３２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．１５（ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，１Ｈ），２．１０（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），１．９２（ｓ，４Ｈ），１．７５（ｍ，５Ｈ），１．６１（ｓ，３Ｈ），１．５２（ｓ，３Ｈ），１．２７（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２２（ｄｔ，Ｊ＝１２．７，６．３Ｈｚ，６Ｈ），０．９５（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，７Ｈ），０．７８（ｓ，３Ｈ）。
ＤＭ１は、ＷＯ２０１５／０３１３９６（例えば、実施例２の段落［０１０６］）に記載される手順に基づいて、単一のジアステレオマーとして合成された。当該文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
実施例２２．抗体結合体および結合体の特徴解析
抗体結合体
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、および１０－１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＡ中、抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ、Ｈ４Ｈ１４６３５Ｄ、およびアイソタイプ対照；１０～２０ｍｇ／ｍｌ）を、実施例２１に記載されるように調製されたＳＭＣＣ－ＤＭ１ジアステレオマーの５～６倍過剰量（メイタンシノイドＡ）、またはメイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン－カルバミル－（ｐ－アミノ）ベンジル－シトルリン－バリン－アジポイル－コハク酸塩（化合物１、図２０）（メイタンシノイドＢ）の５～６倍過剰量と、周囲温度で２時間結合させた。結合体は、サイズ排除クロマトグラフィーまたは広域限外濾過により精製し、滅菌濾過した。タンパク質濃度は、ＵＶスペクトル分析によって決定された。使用された全ての結合体が９０％を超える単量体であったサイズ排除ＨＰＬＣが確立され、そして非結合リンカー搭載物が１％未満となったＲＰ－ＨＰＬＣが確立された。すべての結合抗体は、Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４ Ｏｃｔ １５；１０（２０）：７０６３－７０）に従い、リンカー搭載物の担持量に関してＵＶにより、および／または質量差により、結合と非結合を比較して分析された。搭載物と抗体の比率は、表２４に報告する。
Figure 2022523360000123
液体クロマトグラフィー－質量分析法による結合体の特徴解析
抗体上のリンカー－搭載物の担持量を判定するために、結合体を脱グリコシル化し、ＬＣ－ＭＳにより分析した。
このアッセイについて、５０μｇの結合体をミリＱ水で希釈し、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度とした。１０μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ溶液［ＰＮＧａｓｅ Ｆ溶液は、１５０μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆストック（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ番号Ｐ０７０４Ｌ）および８５０μＬのミリＱ水を加えて、よく混合することにより調製された］を希釈結合体溶液に加え、次いで３７℃で一晩インキュベートした。各サンプルの５μＬをＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｔ Ｇ２－Ｓｉ）上に注入し、２５分かけて０．１ｍＬ／分の勾配移動相 ２０～４０％で溶出させた（移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中、０．１％ ｖ／ｖ、移動相Ｂ：アセトニトリル中、０．１％ ｖ／ｖ ＦＡ）。ＬＣ分離は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ４カラム（１．０ Ｘ ５０ｍＭ、１．７μＭ）で８０℃で実施された。
質量分析スペクトルは、Ｍａｓｓｌｙｎｘソフトウェアを使用してデコンボリューションされ、薬剤と抗体の比率（ＤＡＲ）は、以下の方程式を使用して計算された：
１．分布ピーク強度（ＰＩ）による薬剤（Ｄｎ）の相対割合（％）：
Ｄｎ％＝ＰＩｎ／Σ（ＰＩ０＋ＰＩ１＋ＰＩ２……．＋ＰＩｉ）×１００
（ｎ＝０，１，２，３，…，ｉ）
２．平均ＤＡＲの計算：
ＤＡＲ＝Σ（１×Ｄ１％＋２×Ｄ２％＋３×Ｄ３％＋……＋ｉ×Ｄｉ％）
実施例２３．ヒトモノクローナル抗ＭＥＴ（一特異性および二特異性）抗体の表面プラズモン共鳴から導かれた結合アフィニティおよび速度定数
ＭＣＣ－ＤＭ１ジアステレオマー（メイタンシノイドＡ）、またはメイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン－カルバミル－（ｐ－アミノ）ベンジル－シトルリン－バリン－アジポイル－コハク酸塩（化合物１、図２０）（メイタンシノイドＢ）のいずれかと結合された抗ＭＥＴ抗体へのＭＥＴ結合に対する平衡解離定数（ＫＤ値）は、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００装置でのリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを使用して決定された。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、＃ ＢＲ－１００８－３９）とのアミンカップリングを行うことにより誘導体化して、ヒト定常領域を含み発現される抗ＭＥＴ ＡＤＣと親非改変抗体を捕捉した。Ｂｉａｃｏｒｅ結合実験は、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）－ＥＰランニング緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中で実施された。Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを発現するヒトＭＥＴ（ｈＭＥＴ－ｍｍｈ）が社内で調製された。ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で調製された、様々な濃度（３倍希釈）のｈＭＥＴ－ｍｍｈ（３０ｎＭ～１．１ｎＭの範囲）を、抗ＭＥＴ ＡＤＣまたは抗体捕捉表面上に４０μＬ／分の流量で注入した。ｈＭＥＴ－ｍｍｈと、捕捉ＡＤＣおよびモノクローナル抗体の各々への結合は、４分間モニタリングされた。続いて、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で６分間、ｈＭＥＴ－ｍｍｈの解離がモニタリングされた。抗ヒトＦｃ表面は２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４の短時間注入により再生された。すべての結合動態実験は、２５℃で実施された。
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサグラムを１：１結合モデルに適合させることによって、結合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）定数を決定した。すべてのセンサグラムは、対応する分析物のセンサグラムから緩衝液注入センサグラムのシグナルを差し引くことにより二重参照され、これにより捕捉表面から抗体が解離することにより生じるアーチファクトが除去される。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、反応速度定数から以下のように計算した：
Figure 2022523360000124
メイタンシノイドＡまたはメイタンシノイドＢが結合した抗ＭＥＴ一特異性抗体と抗ＭＥＴ二特異性抗体の結合速度パラメータを、以下の表２５に示す。いくつかの実験は二重で実施された。
Figure 2022523360000125
実施例２４：抗ＭＥＴ抗体薬剤結合体（ＡＤＣ）のインビトロでの有効性
本明細書に記載される抗ＭＥＴ抗体薬剤結合体（ＡＤＣ）の相対的な細胞殺傷の有効性を判定するために、様々なレベルの内因性ＭＥＴを発現する複数の細胞株に対し、細胞殺傷アッセイを実施した。ＥＢＣ－１（Ｒｉｋｅｎ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ；＃ＲＢＲＣ－ＲＣＢ１９６５）細胞株、ＭＫＮ－４５（ＪＣＲＢ；＃ＪＣＲＢ０２５４）細胞株、ＮＣＩ－Ｈ１９９３（ＡＴＣＣ；＃ＣＲＬ－５９０９）細胞株、およびＪ．ＲＴ３（ＡＴＣＣ；＃ＴＩＢ－１５３）細胞株は、ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳ＋１Ｘ ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン（Ｐ／Ｓ／Ｇ）中で維持された。ＳＮＵ－５（ＡＴＣＣ；＃ＣＲＬ－５９７３）細胞株は、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ＋ １０％ ＦＢＳ＋１Ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ中で維持された。Ｈｓ７４６ｔ（ＡＴＣＣ；＃ＨＴＢ－１３５）細胞株とＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ；＃ ００３０４１）細胞株は、ＤＭＥ＋１０％ ＦＢＳ＋１Ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ中で維持された。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ；＃ＨＴＢ－２６）細胞株は、Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５＋１０％ ＦＢＳ＋１Ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ＋１Ｘ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）中でＣＯ２を用いずに維持された。Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ；＃ ＨＴＢ－１４）細胞株は、ＭＥＭ Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｓａｌｔｓ＋１５％ ＦＢＳ＋１Ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ＋１Ｘ ＮＥＡＡ中で維持された。Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ；＃ＨＴＢ－１３３）細胞株は、ＲＰＭ１ １６４０ ＋ １０％ ＦＢＳ ＋ １Ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム ＋ １０ ｕｇ／ｍｌ ウシインスリン中で維持された。Ａ５４９（ＡＴＣＣ；＃ ＣＣＬ－１８５）細胞株は、Ｋａｉｇｈｎ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＨＡＭ’ｓ Ｆ－１２Ｋ）＋１０％ ＦＢＳ＋１Ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ中で維持された。
最初に、フローサイトメトリーにより細胞株パネルの全体にわたる、相対的な抗ＭＥＴ抗体の結合を、非結合のＨ４Ｈ１４６３５Ｄ抗体、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ抗体、およびＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２抗体を用いて評価した。簡潔に述べると、１×１０６個の細胞を、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中、氷上で３０分間、１０μｇ／ｍｌのＨ４Ｈ１４６３５Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２、またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）とともにインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後、細胞を、氷上で３０分間、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７結合抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、＃１０９－６０６－１７０）とともにインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液でさらに１回洗浄した後、サンプルを、Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、＃５５４６５５）を用いて固定し、ＦＡＣＳ緩衝液でろ過して、ｉＱｕｅフローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｉｃｙｔｅ社）でフローサイトメトリーを実施した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用して決定した。ＦＡＣＳ結合は、アイソタイプ対照のレベルを超えるＭＦＩ結合の倍率として表され、結果を表２６に要約する。三種の抗Ｍｅｔ抗体の相対的結合は各細胞株に対して同等であり、アイソタイプ対照の４４７倍～７倍の範囲であった。Ｔ４７Ｄ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＪ．ＲＴ３細胞に対しては、試験された３種の抗ＭＥＴ抗体のいずれの結合も検出されなかった。
抗ＭＥＴ ＡＤＣのインビトロでの細胞傷害性を測定するために、ＡＤＣを用いた３日間または６日間の処置後の核数を評価した。簡潔に述べると、細胞を、９６ウェルのコラーゲン被覆プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、ＶＷＲ、＃８２０５０－８１２）に、７５０～３０００細胞／ウェルで、完全増殖培地中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させた。細胞生存率曲線については、連続希釈されたＡＤＣ、非結合抗体、または遊離搭載物を、１００ｎＭ～０．０１ｎＭの範囲の最終濃度（毒素濃度に基づく）で細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３日間または６日間インキュベートした。続いて細胞を、４％ホルムアルデヒドで固定しながら、３μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ｈ３５７０）で処理した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ｍｉｃｒｏ ＸＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州サニーベール）上で画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ画像解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州サニーベール）により核数を決定した。４０ｎＭのジギトニンで処理された細胞のバックグラウンドの核数を、全てのウェルから引き算し、生存率は未処理対照のパーセンテージ（生存率％）として表した。ＩＣ５０値は、１０点の応答曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式から決定された（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。各用量応答性曲線に対する未処置条件も分析に含まれており、最小用量として表されている。ＩＣ５０値および細胞殺傷割合％を表２７および表２８に示す。
表２７に要約されるように、抗ＭＥＴ抗体－薬剤結合体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡは、Ｍｅｔ増幅されたＥＢＣ－１、ＳＮＵ－５、ＭＫＮ－４５、ＮＣＩ－Ｈ１９９３、およびＨｓ７４６ｔ細胞の状況下で、０．３５ｎＭ～０．９６ｎＭの範囲のＩＣ５０値で細胞生存率を特異的に減少させた。殺傷細胞の割合（最大殺傷の割合％）は、７３％～１００％の範囲であった。Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡはさらに、Ａ５４９細胞の８４％を特異的に殺傷し、ＩＣ５０値は１３．９１ｎＭであった。低発現細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＵ８７ＭＧ）、および非発現細胞株（Ｔ４７Ｄ、ＨＥＫ２９３、およびＪ．ＲＴ３）において、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡのＩＣ５０値は、３７ｎＭよりも高かった。類似の結合型アイソタイプ対照抗体は、すべての細胞株を殺傷し、ＩＣ５０値は３５ｎＭよりも高かった。ＤＭ１（ＭｅＳ－ＤＭ１）のメチルジスルフィド型は、全ての検証された細胞株を殺傷し、ＩＣ５０値は、０．０７ｎＭ～２．８６ｎＭの範囲であった。
別の実験では、三種の抗Ｍｅｔ抗体（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６３５Ｄ、およびＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２）をメイタンシノイドＡ搭載物またはメイタンシノイドＢ搭載物に結合させ、６日間の処理後にＥＢＣ－１、Ｈｓ７４６ｔ、Ａ５４９、Ｔ４７Ｄ細胞においてインビトロでの細胞傷害性を評価した。表２８に要約されるように、すべての抗Ｍｅｔ抗体－薬剤結合体は、Ｍｅｔ陽性細胞において強力かつ特異的に細胞生存率を低下させ、ＥＢＣ－１細胞でのＩＣ５０値は１０ｐＭ、Ｈｓ７４６ｔ細胞では０．８２ｎＭ、Ａ５４９細胞では３．５ｎＭもの低さであった。殺傷された細胞の割合は、ＥＢＣ－１細胞では９５％よりも高く、Ｈｓ７４６ｔ細胞では８６％よりも高く、そしてＡ５４９細胞では７２％よりも高かった。Ｔ４７Ｄ細胞（Ｍｅｔ陰性）は、抗Ｍｅｔ ＡＤＣによって特異的に殺傷されなかった。類似の結合型アイソタイプ対照抗体は、検証された全ての細胞株において細胞生存率を低下させ、ＩＣ５０値は、ＥＢＣ－１細胞では５ｎＭよりも高く、Ｈｓ７４６ｔ細胞では３３ｎＭよりも高く、Ａ５４９細胞とＴ４７Ｄ細胞では９０ｎＭよりも高かった。非結合型のＨ４Ｈ１４６３９Ｄは、ＥＢＣ－１細胞、Ｈｓ７４６ｔ細胞、およびＡ５４９細胞において細胞生存率を低下させたが、結合抗体よりも低い割合であった。非結合型のＨ４Ｈ１４６３５ＤおよびＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２は、検証された細胞株のいずれにおいても生存率にほとんど影響を与えず、または全く影響を与えなかった。ＤＭ１（ＭｅＳ－ＤＭ１）のメチルジスルフィド型は、全ての検証された細胞株を殺傷し、ＩＣ５０値は、０．１２ｎＭ～１．３９ｎＭの範囲であった。対照的に、Ｍ２４（メイタンシノイドＢから放出される搭載物）は、１００ｎＭよりも高いＩＣ５０で細胞を殺傷した。
Figure 2022523360000126
Figure 2022523360000127
Figure 2022523360000128
実施例２５ 胃癌細胞に対するインビボ有効性
３００万個のＨｓ７４６Ｔ胃癌細胞を、Ｃ．Ｂ．－１７ ＳＣＩＤマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に達した時点で、マウスを６群に無作為化し、対照抗体のＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢ、１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＡ、または３もしくは１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡまたはＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで治療した。すべての抗体を、週に１回の頻度で３回投与した。移植後３７日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
免疫不全マウスにおいて、ヒト腫瘍異種移植片の増殖に対するＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡまたはＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢの効果を評価し、その結果を表２９に示す。対照抗体のＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢまたはＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＡで治療された腫瘍は、２０日以内にプロトコールのサイズ限界に達するまで増殖した。Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡを３ｍｇ／ｋｇで治療された腫瘍は、２７日以内にプロトコールのサイズ限界に達するまで増殖した。実験期間中、３ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで治療された腫瘍の増殖は阻害された。１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡ、またはＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢを用いた腫瘍の治療は、治療開始時と比較して腫瘍サイズの退縮を誘導した。
Figure 2022523360000129
実施例２６：肺癌細胞に対するインビボ有効性
５００万個のＥＢＣ１肺癌細胞を、Ｃ．Ｂ．－１７ ＳＣＩＤマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約１７０ｍｍ３に達した時点で、マウスを６群に無作為化し、対照抗体のＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢを１５ｍｇ／ｋｇ、またはＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢを２．５、５、１０、もしくは１５ｍｇ／ｋｇで用いて治療した。抗体は、週に１回の頻度で２回投与した。移植後７３日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖に対するＨ４Ｈ１４６３９Ｄの効果を評価した。対照抗体のＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢで治療された腫瘍は、２４日以内にプロトコールのサイズ限界に達するまで増殖した（ＩＡＣＵＣプロトコールは、直径２ｃｍを超え、およそ１５００ｍｍ３の腫瘍を担持する動物の犠牲を要求する）。２．５、５、１０、または１５ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢを用いた腫瘍の治療は、治療開始時と比較して腫瘍サイズの退縮を誘導した。結果を表３０に示す。
Figure 2022523360000130
実施例２７：患者由来のＮＳＣＬＣ腫瘍に対するインビボ有効性
Ｍｅｔ発現ＮＳＣＬＣ ＣＴＧ－０１６５の患者由来腫瘍を、ｎｕ／ｎｕ Ｎｕｄｅマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に達した時点で、マウスを６群に無作為化し、対照抗体のＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢ、１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＡ、または３もしくは１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡまたはＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで治療した。すべての抗体を、週に１回の頻度で３回投与した。移植後６１日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
免疫不全マウスにおいて、ヒト腫瘍異種移植片の増殖に対するＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡまたはＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢの効果を評価した。対照抗体のＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＡまたはＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢで治療された腫瘍は、２７日以内にプロトコールのサイズ限界に達するまで増殖した。３ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡまたはＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで治療された腫瘍の増殖は、２７日間、阻害された。１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡ、またはＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢを用いた腫瘍の治療は、治療開始時と比較して腫瘍サイズの退縮を誘導した。データを表３１に提示する。
Figure 2022523360000131
実施例２８：水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換に基づいたエピトープマッピング。ヒトＭＥＴに結合する抗ＭＥＴ抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄのエピトープマッピング
ヒト肝細胞増殖因子受容体外部ドメイン（配列番号１５５：ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジン（．ｍｍｈ）タグとともに発現されるヒトＭｅｔアイソフォーム１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０８５８１。以下、ｈＭｅｔと呼称される）の、抗ＭＥＴ抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄが相互作用する特異的領域を決定するための実験を実施した。Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２およびＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２は二価－一特異性抗ＭＥＴ抗体であり、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄは、二つの重鎖とユニバーサル軽鎖を含む二特異性抗体であり、当該二つの重鎖はそれぞれＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２とＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２に由来するＭＥＴ上の異なるエピトープに結合する。（実施例５を参照）。
質量分析法（ＨＤＸ－ＭＳ）を用いた水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換エピトープマッピングを利用して、上述の抗体の結合エピトープを決定した。ＨＤＸの概要説明は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；およびＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ～２６５Ａに記載されている。
実験手順
ＨＤＸを介して、抗Ｍｅｔ抗体のＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２、およびＨ４Ｈ１４６３９ＤのｈＭＥＴ上の結合エピトープをマッピングするために、個々の抗体を、ＮＨＳ活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）に別々に共有結合させた。以下に記載されるように、「オン－抗原」および「オン－複合体」の二つの方法を利用して、抗ＭＥＴ抗体の結合エピトープを確認した。
「オン－抗原」実験の条件下では、ｈＭＥＴは、Ｄ２Ｏを用いて調製されたＰＢＳ中、５．０分間または１０．０分間の重水素化を受けた。重水素化抗原を、短時間のインキュベーションでＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２抗体またはＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２抗体に結合させ、次いで氷冷した低ｐＨのクエンチ緩衝液を用いてビーズから溶出させた。溶出したサンプルを、統合オンラインペプチド消化、トラップ、９．０分間の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離、およびＳｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ ＭＳデータ取得からなるＷａｔｅｒｓ Ｈ／ＤＸ－ＭＳシステムに手動でローディングした。
「オン－複合体」実験の条件下では、ｈＭＥＴは、最初にＨ４Ｈ１３３１２Ｐ２ビーズまたはＨ４Ｈ１３３０６Ｐ２ビーズに結合され、その後、Ｄ２Ｏを用いて調製されたＰＢＳ中でのインキュベーションを介して５．０分間または１０．０分間の重水素化を受けた。重水素化されたｈＭＥＴを溶出し、上述のようにＷａｔｅｒｓ Ｈ／ＤＸ－ＭＳシステムによって分析した。
ｈＭＥＴからのペプシン消化ペプチドを特定するために、非重水素化サンプルからのＬＣ－ＭＳＥデータを処理して、Ｗａｔｅｒｓ ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒ（ＰＬＧＳ）ソフトウェアを使用してヒトＭＥＴに対して探索した。特定されたペプチドをＤｙｎａｍＸ ３．０ソフトウェアにインポートし、以下の二つの基準によりフィルタリングした：１）１アミノ酸当たりの最小生成物が０．３である、２）複製ファイル閾値が３．０である。続いてＤｙｎａｍＸ ３．０ソフトウェアは、特定されたペプチドの重水素取り込みに関して、５分および１０分の両方の重水素時点での「オン－抗原」ならびに「オン－複合体」の間の差異を自動的に計算した。重水素取り込み計算の精度を確保するために、質量中心値の計算のためのＤｙｎａｍＸソフトウェアによりピックアップされた各ペプチドの個々の同位体ピークも手動で検証した。
概して、０．２を超える重水素化のデルタ値を、特異的結合エピトープ決定のカットオフ点として使用した。
結果
９．０分間のＬＣ－ＭＳＥデータ取得と併せて、Ｗａｔｅｒｓ Ｅｎｚｙｍａｔｅ（商標）ＢＥＨ Ｐｅｐｓｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（２．１ ｘ ３０ ｍｍ、５μｍ）を介したオンラインのペプシン消化を使用して、ヒトＭＥＴから合計で１６２個のペプシン消化ペプチドを再現性良く特定した。Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２抗体ビーズを使用したときに、「オン－抗原」と「オン－複合体」の両方の実験に対し、追跡可能な重水素取り込みがあった。これらのペプチドは、５５．７％の配列カバー率を表している。これらすべてのペプチドのうち、５個のペプチドのみが、抗原単独の重水素化（オン－抗原）と比較して、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２の結合時（オン－複合体）に、重水素化取り込みが有意に減少した。両実験条件下でのこれら五つのペプチドの質量中心値を、表３２に図示した。これらの五つのペプチドによってカバーされる１９２～２０４残基に対応する領域を、ＨＤＸデータに基づいて、Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２抗体の結合エピトープとして規定した。
Figure 2022523360000132
Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２抗体ビーズを使用して実施されたＨＤＸ実験については、ｈＭＥＴに由来する合計で９８個のペプシン消化ペプチドが再現性良く特定され、「オン－抗原」と「オン－複合体」の両方の実験中に追跡可能な重水素取り込みがあった。これらの９８個のペプチドは、５２．１％の配列カバー率を表している。これらすべてのペプチドのうち、１２個のペプチドが、抗原単独の重水素化（オン－抗原）と比較して、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２の結合時（オン－複合体）に、重水素化取り込みが有意に減少したことが観察された。両実験条件下でのこれら１２個のペプチドの質量中心値を、表３３に図示した。これらのペプチドによってカバーされる３０５－３１５残基および４２１－４５５残基に対応する領域を、ＨＤＸデータに基づいて、Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２抗体の結合エピトープとして規定した。
Figure 2022523360000133
二特異性抗Ｍｅｔ抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄの結合エピトープを決定するために、上記で概説した方法と同じ方法を使用した。この方法により決定されたｈＭＥＴ上のＨ４Ｈ１４６３９Ｄの結合エピトープは、親抗体で決定されたエピトープに対応する。
抗Ｍｅｔ抗体Ｈ４Ｈ１３３１２Ｐ２の結合エピトープ：ＡＡ １９２－２０４：配列番号１５５のＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦ（配列番号１５６）。
抗Ｍｅｔ抗体Ｈ４Ｈ１３３０６Ｐ２の結合エピトープ：ＡＡ ３０５－３１５：配列番号１５５のＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤ（配列番号１５７）、およびＡＡ ４２１－４５５：配列番号１５５のＦＩＫＧＤＬＴＩＡＮＬＧＴＳＥＧＲＦＭＱＶＶＶＳＲＳＧＰＳＴＰＨＶＮＦ（配列番号１５８）。
実施例２９：ブドウ膜メラノーマ細胞株における、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体ＡＤＣＣによる細胞増殖の阻害と細胞生存率
二つのメイタンシノイド搭載物のうちの一つに結合された二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄは、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡとＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢと指定された。これらをブドウ膜メラノーマ細胞株において試験し、当該細胞株のｃ－Ｍｅｔ発現と比較した細胞増殖と細胞生存率に対する効果を判定した。
第一の実験では、ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるＯＭＭ１．３、Ｍｅｌ２０２、Ｍｅｌ２７０、およびＭＰ６５を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中、１ウェル当たり１，０００細胞で９６ウェルプレートに一晩播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞を、０．０１ｎＭ～１００ｎＭでＲＥＧＮ１９４５、ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＡ、ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢ、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡ、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢの用量を増加させながら７日間処理した。７日後、Ｅｍａｘ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用した比色分析アッセイのＤｏｊｉｎｄｏ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８における、ＷＳＴ－８の低下を測定することにより、相対的な細胞生存率を決定した。
第二の実験では、ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるＯＭＭ１．３細胞、ならびにｃ－Ｍｅｔ陰性のＯＣＭ３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中、１ウェル当たり１，０００細胞で９６ウェルプレートに一晩播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞を、０．３１２５ｎＭ～１０ｎＭで、ＲＥＧＮ１９４５、ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢ、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢの用量を増加させながら処理した。７日後、Ｅｍａｘ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用した比色分析アッセイのＤｏｊｉｎｄｏ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８における、ＷＳＴ－８の低下を測定することにより、相対的な細胞生存率を決定した。
表３４～３８ならびに図２１および図２２において、メイタンシノイド搭載物に結合された二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢが、対照処理と比較して、ｃ－Ｍｅｔタンパク質を発現するブドウ膜メラノーマ細胞の生存率を低下させたことが示される。Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢは、ｃ－Ｍｅｔ陰性細胞株の生存率には影響を及ぼさなかった。図２１は、より低いＡＤＣ濃度での細胞の生存率への影響を対数尺度で示す。Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＡのデータも、図２１に示す。非結合型のＨ４Ｈ１４６３９Ｄ抗体は、ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマ細胞の生存率を有意には低下させなかった。このことから、これら細胞は、生存にためにＭｅｔシグナル伝達に依存していないことが示唆される。１３種の細胞株を、ＲＥＧＮ１９４５、ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢ、Ｈ４Ｈ１４６３９ＤおよびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢの用量を増加させながら用いて３日にわたり処理した第三の実験のデータを図３３に示す。Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢは、用量依存性にＭＥＴ発現ブドウ膜メラノーマ細胞株の生存率を低下させ、ＩＣ５０は１ｎＭ未満であった。
Figure 2022523360000134
Figure 2022523360000135
Figure 2022523360000136
Figure 2022523360000137
Figure 2022523360000138
実施例３０：ブドウ膜メラノーマ細胞において、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体ＡＤＣはアポトーシスを誘導する。
ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマ細胞株であるＯＭＭ１．３およびＭｅｌ２０２、ならびにｃ－Ｍｅｔ陰性のＯＣＭ３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中、１ウェル当たり８００，０００細胞で６０ｍｍ３プレートに一晩播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞を、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、または１０ｎＭのＲＥＧＮ１９４５（アイソタイプ対照抗体）、ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＡ、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、またはＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで４８時間処理した。次いで細胞をトリプシンで収集し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で３０分間固定し、４℃で一晩ＤＡＰＩで染色した。 細胞を顕微鏡スライド上に置き、Ｃｙｔｏｓｅａｌ ４０で密封した。アポトーシス細胞を、ＤＡＰＩ蛍光を励起するためのＵＶ光を伴う顕微鏡下で定量した。
メイタンシノイド搭載物に結合された二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体であるＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢは、対照処理およびｃ－Ｍｅｔ陰性細胞株（表４１を参照）と比較して、用量依存性にｃ－Ｍｅｔタンパク質を発現するブドウ膜メラノーマ細胞のアポトーシスを有意に誘導した（表３９および４０を参照）。図２３および２４も参照のこと。別の実験では、１０ｎＭのＭＥＴｘＭＥＴ－ＡＤＣで４８時間処理したとき、ｃ－Ｍｅｔ発現細胞株のＯＭＭ１．３およびＭｅｌ２０２において最大４０％までアポトーシスが誘導されたが、ＯＣＭ３では誘導されなかった（データは示さず）。細胞障害性化合物とｃ－Ｍｅｔ特異的抗体を結合させることにより、ブドウ膜メラノーマを選択的にアポトーシスの標的とすることができる。
Figure 2022523360000139
Figure 2022523360000140
Figure 2022523360000141
実施例３１：ブドウ膜メラノーマ細胞において、ＭＥＴ Ｘ ＭＥＴ二特異性抗体ＡＤＣは細胞サイクルを変化させる
ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマ細胞株であるＯＭＭ１．３およびＭｅｌ２０２、ならびにｃ－Ｍｅｔ陰性のＯＣＭ３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中、１ウェル当たり８００，０００細胞で６０ｍｍ３プレートに一晩播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞は、未処理で、または１０ｎＭのＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで１、３、６、２４、および４８時間処理した。次いで細胞をトリプシンで収集し、ＰＢＳで洗浄し、－２０℃で一晩、冷却７０％エタノールで固定した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ抗ＭＰＭ２抗体で２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と結合されたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の抗マウスＩｇＧ中でインキュベートし、再度ＰＢＳで洗浄した。次いで細胞を５００μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで染色し、４℃で一晩インキュベートした。次いで細胞をセルストレーナーに通し、その後、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターを通過させた。データは、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６を使用し、Ｄｅ Ｎｏｖｏソフトウェアによって分析された。
メイタンシノイド搭載物に結合された二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢは、６～２４時間の処理後、ＯＭＭ１．３細胞およびＭｅｌ２０２細胞（それぞれ図２５および２６）において有意に有糸分裂停止を誘導したが、ＯＣＭ３細胞では有糸分裂停止を誘導しなかった（図２７）。Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで処理されたｃ－Ｍｅｔ発現細胞において、２４～４８時間の間にＳｕｂＧ１集団の増加があった。このことから、アポトーシスの誘導が示唆されるが、ｃ－Ｍｅｔ陰性細胞においてはＳｕｂＧ１集団の増加は見られなかった。表４２～４４を参照のこと。細胞サイクル解析により、メイタンシノイド搭載物の導入により、ｃ－Ｍｅｔ発現細胞株であるＯＭＭ１．３とＭｅｌ２０２においてのみ有糸分裂停止とその結果としてのアポトーシスが誘導され、ｃ－Ｍｅｔ陰性のＯＣＭ３細胞株では誘導されなかったことが確認された。
Figure 2022523360000142
Figure 2022523360000143
Figure 2022523360000144
実施例３２：ブドウ膜メラノーマ細胞株におけるｃ－Ｍｅｔ発現
ウェスタンブロッティング解析を実施して、いくつかのブドウ膜メラノーマ細胞株ならびに胃癌細胞株および肺癌細胞株においてｃ－Ｍｅｔタンパク質発現レベルの差異を評価した。
胃癌細胞株のＳＮＵ－５、肺癌細胞株のＡ５４９、ならびにブドウ膜メラノーマ細胞株のＭｅｌ２９０、９２．１、ＯＭＭ１．３、ＯＭＭ１、Ｍｅｌ２８５、Ｍｅｌ２０２、Ｍｅｌ２７０、ＯＣＭ１Ａ、ＯＣＭ３、ＭＰ４１、ＭＰ６５、ＭＰ４６、およびＵＭ００４を含む、様々なレベルのｃ－Ｍｅｔ発現を有する細胞株を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中、１プレート当たり１，０００，０００細胞で、６０ｍｍ３プレートに播種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで細胞をトリプシンで収集し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。タンパク質溶解物を、２０ウェルのＮｏｖｅｘ ｍｉｄｉ ｇｅｌ ４－１２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上に流し、次いでＰＢＤＦ膜にトランスファーした。その後、膜を５％ノンファット粉乳中でブロッキングし、４℃の振とう機上で一晩、ｃ－Ｍｅｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）およびチューブリン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）に対する一次抗体でインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰと結合された適切な二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。ＥＣＬ ＨＲＰ基質を膜上に添加し、蛍光画像をＦｕｊｉｆｉｌｍ ＸＡ－２ カメラを使用して撮影した。
結果
ブドウ膜メラノーマ細胞株は、例えばＧＮＡＱまたはＧＮＡ１１など、Ｇタンパク質の変異が一般的に認識されているが、それらはさらに様々なｃ－Ｍｅｔ発現も呈する。図２８に示されるように、ブドウ膜メラノーマ細胞株の各々は、ＯＣＭ１Ａ細胞株およびＯＣＭ３細胞株を除き、ある程度のレベルでｃ－Ｍｅｔ受容体を発現するが、これらはＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異細胞である。ＳＮＵ－５は、ｃ－Ｍｅｔを高度に発現することが知られている陽性対照の胃癌細胞株であり、一方でＡ５４９は、ｃ－Ｍｅｔも発現する肺癌細胞株である。
実施例３３：ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体ＡＤＣは、ＰＡＲＰ切断およびヒストンＨ３のリン酸化を誘導する
ウェスタンブロット解析を実施して、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢを用いた処理後のいくつかのブドウ膜メラノーマ細胞株における、ｃ－Ｍｅｔタンパク質レベル、ＰＡＲＰ切断およびヒストンＨ３のリン酸化を評価した。
ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるＯＭＭ１．３細胞およびＭｅｌ２０２細胞、ならびにｃ－Ｍｅｔ陰性のＯＣＭ３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中、１ウェル当たり８００，０００細胞で６０ｍｍ３プレートに一晩播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞を、未処理で、または０．５ｎＭ～１０ｎＭで、ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢ、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢの用量を増加させながら２４時間処理した。次いで細胞をトリプシンで収集し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。タンパク質溶解物を、２０ウェルのＮｏｖｅｘ ｍｉｄｉ ｇｅｌ ４－１２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上に流し、次いでＰＢＤＦ膜にトランスファーした。その後、膜を５％ノンファット粉乳中でブロッキングし、４℃の振とう機上で一晩、ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、リン酸化ヒストン－Ｈ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、およびチューブリン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）に対する一次抗体でインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰと結合された適切な二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。ＥＣＬ ＨＲＰ基質を膜上に添加し、蛍光画像をＦｕｊｉｆｉｌｍ ＸＡ－２ カメラを使用して撮影した。
別の実験では、ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるＯＭＭ１．３細胞、ならびにｃ－Ｍｅｔ陰性のＯＣＭ３細胞株を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中、１ウェル当たり８００，０００細胞で６０ｍｍ３プレートに一晩播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。しかしながらこの実験では、細胞は、未処理で、または１０ｎＭのＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢ、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢを用いて、より長時間の２４時間、４８時間および７２時間で処理された。次いで細胞をトリプシンで収集し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。タンパク質溶解物を、２０ウェルのＮｏｖｅｘ ｍｉｄｉ ｇｅｌ ４－１２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上に流し、次いでＰＢＤＦ膜にトランスファーした。その後、膜を５％ノンファット粉乳中でブロッキングし、４℃の振とう機上で一晩、ｃ－Ｍｅｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、リン酸化ヒストン－Ｈ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、およびチューブリン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）に対する一次抗体でインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰと結合された適切な二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。ＥＣＬ ＨＲＰ基質を膜上に添加し、蛍光画像をＦｕｊｉｆｉｌｍ ＸＡ－２ カメラを使用して撮影した。
結果
図２９は、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢが、処置から２４時間後にＯＭＭ１．３細胞およびＭｅｌ２０２細胞においてＰＡＲＰ切断（アポトーシスのマーカー）を誘導することを示すウェスタンブロットの画像である。ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢとＨ４Ｈ１４６３９ＤのいずれもＰＡＲＰ切断を誘導しなかった。ｃ－Ｍｅｔ陽性細胞株とは異なり、ＯＣＭ３細胞は、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢ処理後でもＰＡＲＰ切断を呈さなかった。図２９はさらに、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで処理されたＯＭＭ１．３細胞およびＭｅｌ２０２細胞におけるヒストンＨ３リン酸化の有意な増加を、ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢおよびＨ４Ｈ１４６３９Ｄと比較して示しているが、ＯＣＭ３細胞では増加はなかった。ヒストンＨ３のリン酸化は有糸分裂中に誘導されるものであり、細胞におけるメイタンシノイド誘導性の有糸分裂停止の証拠である。図２９では、ヒストンＨ３のリン酸化は、ｃ－Ｍｅｔ発現細胞（ＯＭＭ１．３およびＭｅｌ２０２）にのみ見られ、ＯＣＭ３では見られなかった。これは、ｃ－Ｍｅｔ抗体により細胞内にメイタンシノイドが輸送された証拠である。このデータは、ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣの特異性と有効性をさらに実証する。
図３０は、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで処理されたＯＭＭ１．３細胞では、時間依存性のＰＡＲＰ切断の誘導があるが、ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢまたはＨ４Ｈ１４６３９Ｄで処理されたＯＭＭ１．３細胞では誘導がなかったことを示す、ウェスタンブロットの画像である。ＰＡＲＰタンパク質は、ＯＣＭ３細胞において、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢ処理で影響を受けなかった。さらに、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－Ｍ１１４で処置された場合、未処理およびＲＥＧＮ１９４５－Ｍ１１４と比較して、Ｍｅｔタンパク質の総発現量が減少しており、このことから、抗体またはＡＤＣで処理した後の受容体の内在化が示唆される。最後に、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢで処理されたＯＭＭ１．３細胞において、（ＲＥＧＮ１９４５－メイタンシノイドＢで処理された場合、またはＨ４Ｈ１４６３９Ｄで処理された場合と比較して）、ヒストンＨ３リン酸化の有意な増加があったが、やはりＯＣＭ３細胞では増加は観察されなかった。
結論として、例示的な二特異性抗ｃ－Ｍｅｔ抗体であるＨ４Ｈ１４６３９Ｄ抗体は、当該受容体を発現する細胞において、ｃ－Ｍｅｔを特異的に標的とする。この抗体をメイタンシノイドと結合させることにより（Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢ）、ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマ細胞株においてアポトーシスを特異的かつ強力に誘導することができる。
実施例３４：ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ二特異性抗体ＡＤＣは、ｃ－Ｍｅｔ発現ブドウ膜メラノーマ細胞の浸潤を阻害する
ｃ－Ｍｅｔを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるＯＭＭ１．３を、以下の処理を伴い、０．１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ中、１インサート当たり１２０，０００個の細胞で、２４ウェルプレートに配置されたマトリゲルインサートに一晩播種した：未処置対照、１２５ｐＭ、２５０ｐＭおよび５００ｐＭのＲ１９４５、Ｒ１９４５－メイタンシノイドＢ、Ｈ４Ｈ１４６３９ＤならびにＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢ。１０％ＦＢＳと５０ｎｇ／ｍｌのヒトＨＧＦを含有するＲＰＭＩを、化学的誘引物質としてウェル内に入れた。約２４時間後、マトリゲルの挿入側から非遊走性細胞で除去した。遊走細胞をメタノールで２分間固定し、１％のトルイジンで２分間染色した。次いでｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した。その後、乾燥したマトリゲルを顕微鏡スライド上に置き、Ｃｙｔｏｓｅａｌ ６０で密封した。Ｎｉｋｏｎ社のＴＥ－２０００－Ｕ顕微鏡を使用して画像を取得した。
結果
二特異性ｃ－Ｍｅｔ抗体のＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢは、対照処理（Ｒ１９４５およびＲ１９４５－メイタンシノイドＢ）と比較して、ｃ－Ｍｅｔタンパク質を発現するＯＭＭ１．３ブドウ膜メラノーマ細胞の浸潤を２５０ｐＭから阻害した。また、Ｈ４Ｈ１４６３９Ｄで処理された細胞においても、２５０ｐＭから細胞浸潤の有意な阻害が認められた。しかしながら細胞生存率は、この用量でのＨ４Ｈ１４６３９Ｄ－メイタンシノイドＢの結合型メイタンシノイド搭載物では影響を受けなかった。図３２を参照のこと。
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本発明の様々な改変が、本明細書に記載されるものに加えて、上記の記述および付随する図から、当業者に明らかとなるであろう。そのような改変も、添付される特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (41)

  1. 対象において、ブドウ膜メラノーマを治療する方法、ブドウ膜メラノーマの腫瘍増殖を低下させる方法、および／またはブドウ膜メラノーマの退縮を生じさせる方法であって、前記方法は、その必要のある対象に、二特異性抗原結合分子およびサイトトキシンを含む抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）を投与することを含み、前記二特異性抗原結合分子は、
    第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）、および
    第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）を含み、
    Ｄ１は、ヒトＭＥＴの第一のエピトープに特異的に結合し、および
    Ｄ２は、ヒトＭＥＴの第二のエピトープに特異的に結合する、方法。
  2. 前記ブドウ膜メラノーマが、ＭＥＴを発現する、請求項１に記載の方法。
  3. Ｄ１は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項１に記載の方法。
  4. Ｄ２は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号５８のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号８２のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項１に記載の方法。
  6. ヒトＭＥＴの前記第一のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４を含む、請求項１に記載の方法。
  7. ヒトＭＥＴの前記第二のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸３０５～３１５および４２１～４５５を含む、請求項１に記載の方法。
  8. ヒトＭＥＴの前記第一のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸１９２～２０４を含み、ヒトＭＥＴの前記第二のエピトープは、配列番号１５５のアミノ酸３０５～３１５および４２１～４５５を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記サイトトキシンは、バイオトキシン、化学療法剤、および放射性同位体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記サイトトキシンは、メイタンシノイド、オーリスタチン、トメイマイシン、デュオカルマイシン、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈ、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  11. 前記サイトトキシンが、リンカーを介して前記二特異性抗原結合分子に結合され、前記サイトトキシンが、
    Figure 2022523360000145
     であり、式中、
    Figure 2022523360000146
     は、リンカーへの結合である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記リンカーが、
    Figure 2022523360000147
     であり、式中、
    Figure 2022523360000148
     で記される結合は、前記二特異性抗原結合分子への結合を表し、
    Figure 2022523360000149
     で記される結合は、前記サイトトキシンへの結合を表す、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記サイトトキシンが、リンカーを介して前記二特異性抗原結合分子に結合され、前記サイトトキシンが、
    Figure 2022523360000150
     であり、式中、
    Figure 2022523360000151
     は、リンカーへの結合である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記リンカーが、
    Figure 2022523360000152
     であり、式中、
    Figure 2022523360000153
     で記される結合は、前記二特異性抗原結合分子への結合を表し、
    Figure 2022523360000154
     で記される結合は、前記サイトトキシンへの結合を表す、請求項１３に記載の方法。
  15. ブドウ膜メラノーマ細胞の増殖を阻害する方法、浸潤を阻害する方法、アポトーシスを生じさせる方法、および／または生存率を低下させる方法であって、前記細胞と、二特異性抗原結合分子およびサイトトキシンを含む抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）とを接触させることを含み、前記二特異性抗原結合分子は、
    第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）、および
    第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）を含み、
    Ｄ１は、ヒトＭＥＴの第一のエピトープに特異的に結合し、および
    Ｄ２は、ヒトＭＥＴの第二のエピトープに特異的に結合する、方法。
  16. Ｄ１は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. Ｄ２は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記サイトトキシンが、リンカーを介して前記二特異性抗原結合分子に結合され、前記サイトトキシンが、
    Figure 2022523360000155
     であり、式中、
    Figure 2022523360000156
     は、リンカーへの結合である、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記リンカーが、
    Figure 2022523360000157
     であり、式中、
    Figure 2022523360000158
     で記される結合は、前記二特異性抗原結合分子への結合を表し、
    Figure 2022523360000159
     で記される結合は、前記サイトトキシンへの結合を表す、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記サイトトキシンが、リンカーを介して前記二特異性抗原結合分子に結合され、前記サイトトキシンが、
    Figure 2022523360000160
     であり、式中、
    Figure 2022523360000161
     は、前記リンカーへの結合である、請求項１５に記載の方法。
  21. 前記リンカーが、
    Figure 2022523360000162
     であり、式中、
    Figure 2022523360000163
     で記される結合は、前記二特異性抗原結合分子への結合を表し、
    Figure 2022523360000164
     で記される結合は、前記サイトトキシンへの結合を表す、請求項２０に記載の方法。
  22. ブドウ膜メラノーマ細胞の有糸分裂停止を誘導する方法であって、前記細胞と、二特異性抗原結合分子およびサイトトキシンを含む抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）とをインビボで接触させることを含み、前記二特異性抗原結合分子は、
    第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）、および
    第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）を含み、
    Ｄ１は、ヒトＭＥＴの第一のエピトープに特異的に結合し、および
    Ｄ２は、ヒトＭＥＴの第二のエピトープに特異的に結合する、方法。
  23. Ｄ１は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. Ｄ２は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記サイトトキシンが、リンカーを介して前記二特異性抗原結合分子に結合され、前記サイトトキシンが、
    Figure 2022523360000165
     であり、式中、
    Figure 2022523360000166
     は、リンカーへの結合である、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記リンカーが、
    Figure 2022523360000167
     であり、式中、
    Figure 2022523360000168
     で記される結合は、前記二特異性抗原結合分子への結合を表し、
    Figure 2022523360000169
     で記される結合は、前記サイトトキシンへの結合を表す、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記サイトトキシンが、リンカーを介して前記二特異性抗原結合分子に結合され、前記サイトトキシンが、
    Figure 2022523360000170
     であり、式中、
    Figure 2022523360000171
     は、リンカーへの結合である、請求項２２に記載の方法。
  28. 前記リンカーが、
    Figure 2022523360000172
     であり、式中、
    Figure 2022523360000173
     で記される結合は、前記二特異性抗原結合分子への結合を表し、
    Figure 2022523360000174
     で記される結合は、前記サイトトキシンへの結合を表す、請求項２７に記載の方法。
  29. ｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍に罹患する対象において、眼癌を治療する方法または転移を阻害する方法であって、前記対象に、
    第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）、および
    第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）とを含む二特異性抗原結合分子を投与することを含み、
    Ｄ１は、ヒトＭＥＴの第一のエピトープに特異的に結合し、および
    Ｄ２は、ヒトＭＥＴの第二のエピトープに特異的に結合する、方法。
  30. 前記眼癌は、ブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記対象に、第二の抗癌治療剤を投与することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  32. Ｄ１とＤ２は、ヒトＭＥＴへの結合に関し、互いに競合しない、請求項２９に記載の方法。
  33. Ｄ１は、配列番号５８のアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および配列番号１３８のアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを宇組む、請求項２９に記載の方法。
  34. ＨＣＤＲ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４２のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣＤＲ３は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
  35. 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号５８のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１３８のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、とを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、とを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. Ｄ２は、配列番号８２のアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および配列番号１３８のアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを宇組む、請求項３６に記載の方法。
  38. ＨＣＤＲ１は、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号８６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号８８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４２のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣＤＲ３は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号８２のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１３８のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、とを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、とを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記二特異性抗原結合分子は、サイトトキシンと結合されて、抗体－薬剤結合体（ＡＤＣ）を形成し、前記サイトトキシンは、メイタンシノイドである、請求項２９に記載の方法。


JP2021549279A 2019-02-21 2020-02-20 Ｍｅｔに結合する抗ｍｅｔ抗体および二特異性抗原結合分子を使用した眼癌の治療方法 Pending JP2022523360A (ja)

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