JP2022509193A - 生物学的製品を冷凍するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

外側断熱ハウジング内に配置された内側ハウジングを備える生物学的製品を保存するための装置は、内側ハウジングの壁は生物学的製品を受設するためのコンパートメントを画定し、該壁は、熱交換流体をコンパートメント内に流入するためのインレット壁と、熱交換流体をコンパートメント外へ流出するための反対側のアウトレット壁と、側壁と、ベースとを有し、該側壁およびベースはインレット壁をアウトレット壁へ接合し、インレット壁およびアウトレット壁はそれぞれ、動作中、内側ハウジングのコンパートメント内に受設された生物学的製品が熱交換流体によって熱を交換するべく熱交換流体中に浸漬されるように、当該装置を通じて連続する熱交換流体流を収容するための一連のアパーチャを含む、ことを特徴とする。

Description

本願発明は、生物学的製品を保存のために冷凍する方法および装置に関する。

体外で赤血球（ＲＢＣｓ）を保存する能力は長年、救命措置の実施に関係してきた。より近年においては、輸血医学における冷凍保存済みＲＢＣｓの使用が広く評価されてきた。ＲＢＣｓの冷凍保存中、ＲＢＣｓは徐々に劣化し、長期間保存されたＲＢＣｓ点滴は、術後感染症、入院の長期化および生存率の点で、悪い医学的結果に関連してきた。

保存済みＲＢＣｓの輸血に関する問題はいまだに残っており、限定的な輸血ストラテジーが現在でも好まれている。このことは、冷凍保存の関心の復活を生じさせた。超低温でのＲＢＣｓの保存は細胞代謝を停止させ、その後悪い医学的結果に関連する進行的細胞劣化を防止する。

最初、冷凍保存は、長期間の間生きた状態でＲＢＣｓを維持するための有効なアプローチとして出現した。しかし、冷凍保存ずみＲＢＣｓ（通常、冷凍ＲＢＣｓとして知られる）の医学的応用は、高価であること、時間がかかること、および保存方法の非効率性によって妨げられた。

冷凍保存されたＲＢＣｓの要件
現在、ＲＢＣｓは使用される保存液に応じて、しばしば最大５から６週間の間２から６℃で保存されている。一方、冷凍保存によれば、数年間ＲＢＣｓの保存が可能である。冷凍保存は現在、希少血液型を有するドナーからのＲＢＣｓの長期保存および軍隊配備用に有用なアプローチである。しかし、冷凍保存済みＲＢＣｓの備蓄は、ＲＢＣｓの需要が供給を上回る緊急または医学的状況においても利益がある。現在の方法を使った冷凍保存済みＲＢＣｓの保存可能期間は１０年までである。

国際的ガイドラインでは、ＲＢＣ冷凍保存ユニット内の溶血は許容レベル（すなわち、欧州で０．８％、米国で１％）以下に保持されなければならず、かつ、点滴されるＲＢＣｓの少なくとも７５％は点滴後にさらに２４時間循環しなければならないことを要求している。

しかし、当該ガイドラインは点滴後に機能するＲＢＣｓの能力を具体的に反映していない。

保存済みＲＢＣｓの品質
４℃での保存はＲＢＣｓの生物学的プロセスを遅くするが、細胞代謝はこれらの温度において完全に抑制されない。冷凍保存中、点滴後に機能するＲＢＣｓの能力を妥協させるさまざまな変化が観測された。これらの変化はＲＢＣ保存ユニット内での、減少した濃度の２，３－ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および膜シアル酸含有量を含む。他の変化は、細胞表面に対するホスファチジルセリン（ＰＳ）の転座、膜脂質およびたんぱく質への酸化障害、球状エキノサイトへの形状変化、膜小疱形成およびカリウムの蓄積、遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）、サイトカイン、生理活性脂質、および（凝血原）微小胞を含む。

ＲＢＣｓのレオロジー特性もまた、冷凍保存中に害される。冷凍されたＲＢＣｓは内皮細胞（ＥＣｓ）へ集合および付着する傾向の増加、および保存の２週目から変形能の減少を示す。これらの変化は、微小循環でのＲＢＣｓの適正な機能を妨げうる。

超低温でのＲＢＣｓの保存は、ＲＢＣｓの生物学的活性を停止させ、それにより長期間の間保存するのが可能になる。一般に、高濃度の冷凍保存添加物または急速冷凍のいずれかが細胞損傷を防止するのに必要である。遅い冷却速度では、細胞外氷生成が生じる。氷が生成されるに従い、非冷凍フラクションの溶質含有率がより高くなる。生成された浸透不均衡により、流体はＲＢＣから外へ移動し、細胞間脱水が生じる。一方、急速冷却において、ＲＢＣ細脂質は過冷却となり、細胞間氷生成が生じ、それはその後機械的ダメージを導く。

冷凍ダメージを最小化するために、冷凍保存添加剤は重要である。長年、ＲＢＣｓの冷凍保存用の異なる非浸透および浸透添加剤が調査されてきた。輸血前に解凍されたＲＢＣｓから除去することが要求されないことが提案されていたため、ヒドロキシエチルデンプンおよびポリビニルピロリドン、ならびにさまざまなグリコールおよび砂糖など非浸透添加剤は期待できると思われた。

逆に、浸透添加剤であるグリセリンは、超低温においてＲＢＣｓを保護する能力を有することが知られている。ＲＢＣｓを保護するのに必要なグリセリンの濃度は冷却速度および保存温度に依存する。グリセリンは、冷凍中に細胞の脱水および溶質効果を最小限にしつつ、氷生成の速度および範囲を遅くすることによって、ＲＢＣｓを保護する。

冷凍保存されるＲＢＣｓの要件
超低温の氷点下温度でのＲＢＣｓの保護により、長年の間の保存が可能になるが、一度解凍するとＲＢＣｓの保存可能期間は限定される。グリセリンから取り除かれたＲＢＣｓは一次的に、４８時間までの間ＳＡＧＭ（saline-adenine-glucose-mannitol）保存液内に保存されるか、または１４日までの間ＡＳ－３保存液内で保存される。冷凍保存されたＲＢＣｓは残留グリセロール含有量を１％以下に減少させるために、脱グリセリン処理する必要がある。また、ＲＢＣｓは、ＲＢＣユニット内での溶血が許容レベル（すなわち、欧州で０．８％、米国で１％）以下のままでなければならず、かつ脱グリセリン後のＲＢＣ解凍回復（すなわち、凍結－解凍－洗浄回復）は８０％を超えなければならないことを要求する上述した国際ガイドラインにさらされる。また、冷凍されたＲＢＣｓの少なくとも７５％は輸血後２４時間さらに循環しなければならない。

グリセロールを用いた冷凍方法
現在、グリセロールを用いてＲＢＣｓを保存するのに受け入れられた２つの冷凍方法が存在する。
１．ＲＢＣｓが、１４０℃以下の温度で、約２０％（ｗｔ／ｖоｌ）のグリセロールの最終濃度の低グリセロール法（ＬＧＭ）を使って液体窒素内で急速に冷凍される。
２．ＲＢＣｓが、－６５℃と－８０℃との間の温度で、約４０％（ｗｔ／ｖоｌ）のグリセロールの最終濃度のＲＢＣｓユニットの保存を許す、高グリセロール方法（ＨＧＭ）を使ってゆっくり冷凍される。

冷凍されたＲＢＣｓは、処理手順の間に発生する細胞損失のために効率がより低い。ＲＢＣｓがより広範囲は洗浄を要求するので、この細胞損失は、ＨＧＭ冷凍保存済みＲＢＣｓ（約１０～２０％）内でより顕著となる。しかし、ＬＧＭによるＲＢＣｓはより高い歩留まりであるが、一般にＨＧＭ冷凍保存済みＲＢＣｓは、冷凍中の温度の広範囲の変動を許容することができ、かつ、解凍後のステージ中に安定であると考えられている。また、ＨＭＧ冷凍保存済みＲＢＣｓは保存および移送条件を容易にする液体窒素を必要としない。結果として、現在、ＨＧＭが欧州および米国で最も応用可能なＲＢＣ冷凍保存方法である。

ＨＧＭの冷凍保存方法に関連する保存方法は、高グリセロール含有量および保存温度範囲のため細胞間脱水を生じさせる。本願発明の好適実施形態は、より低いグリセロール含有量を使い、それにより、冷凍保存されたＲＢＣｓの保存可能期間を延長しつつ、細胞間脱水および溶質効果を最小化することを追求する。

ここで使用される“生物学的製品”（または“生物学的材料”）は、完全に網羅していない以下の材料のリスト、すなわち、血液、血漿、血小板、白血球、または、その他の血液製品、細菌、バクテリア、菌類、または他の微生物、器官、精液、卵子、初乳、皮膚、リンパ液、ワクチン、幹細胞（例えば、骨髄、臍帯血、羊水等からの）、臍帯、骨髄、細菌細胞、腫瘍細胞、精液、ワクチン、および植物細胞を含む。

本願発明の第１の態様に従い、外側断熱ハウジング内に配置された内側ハウジングを備える生物学的製品を保存するための装置が与えられ、当該装置は、内側ハウジングの壁が生物学的製品を受設するためのコンパートメントを画定し、壁は、熱交換流体をコンパートメント内に流入するためのインレット壁と、熱交換流体をコンパートメント外へ流出するための反対側のアウトレット壁と、側壁と、ベースとを有し、側壁およびベースはインレット壁をアウトレット壁へ接合し、インレット壁およびアウトレット壁はそれぞれ、動作中、内側ハウジングのコンパートメント内に受設された生物学的製品が熱交換流体によって熱を交換するべく熱交換流体中に浸漬されるように、当該装置を通じて連続する熱交換流体流を収容するための一連のアパーチャを含む、ことを特徴とする。

本願発明の第２の態様に従い、保存の前に生物学的製品に添加すべき抗凍結剤の量を決定する方法が与えられ、当該方法は、
ａ．抗凍結剤の初期量を含む、保存すべき生物学的製品のおおよその幾何学的形状の全表面積を決定する工程であり、生物学的製品、抗凍結剤、および任意のパッケージングはサンプルを画定するところの工程と、
ｂ．サンプルの熱特性を推定する工程と、
ｃ．サンプルのおおよその幾何学的形状、サンプルの熱特性、装置の幾何学的形状、装置内でのサンプルの予め定められた位置、熱交換流体の予め定められたインレット温度、およびインレットからアウトレットへの熱交換流体の予め定められた温度の増加のいずれか一つ以上を含むフロー制約に基づいて、上記第１の態様の装置内で、サンプルに対して、計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．予め定められたサンプル表面の温度でサンプルのコアの平均温度降下速度を決定し、かつ、平均温度降下速度を得るべく熱交換流体流量を対応付ける工程と、
ｅ．工程（ｄ）で計算した流体流量が予め定められたポンプデューティー以下である装置のポンプデューティーに対応する場合、新しい初期量を画定するべく、初期量より少ない予め定められた量である抗凍結剤の量を選択し、工程（ｄ）で計算した流体流量が予め定められたポンプデューティーと等しいポンプデューティーに対応する場合、保存前に生物学的製品に添加すべき抗凍結剤の量として、抗凍結剤の初期量を選択する工程と、
ｆ．工程（ｄ）で計算した流体流量が予め定められたポンプデューティー以下であるポンプデューティーに対応する場合、工程（ｄ）で計算した流体流量が予め定められたポンプデューティーと等しいポンプデューティーに対応するまで、工程（ａ）から（ｅ）を繰り返す工程とを有する。

本願発明の第３の態様に従い、保存の前に生物学的製品に添加すべき抗凍結剤の量を決定する方法が与えられ、当該方法は、
ａ．抗凍結剤の初期量を含む、保存すべき生物学的製品のおおよその幾何学的形状の全表面積を決定する工程であり、生物学的製品、抗凍結剤、および任意のパッケージングはサンプルを画定するところの工程と、
ｂ．サンプルの熱特性を推定する工程と、
ｃ．サンプルのおおよその幾何学的形状、サンプルの熱特性、装置の幾何学的形状、装置内でのサンプルの予め定められた位置、およびインレットからアウトレットへの熱交換流体の予め定められた温度の増加のいずれか一つ以上を含むフロー制約に基づいて、上記第１の態様の装置内で、サンプルに対して、計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．予め定められたサンプル表面の温度でサンプルのコアの平均温度降下速度を決定し、かつ、平均温度降下速度を得るべく熱交換流体のインレット温度を対応付ける工程と、
ｅ．工程（ｄ）で決定した熱流体のインレット温度が、予め定められた蒸発器デューティー以下である装置の蒸発器デューティーに対応する場合、新しい初期量を画定するべく、初期量より少ない予め定められた量である抗凍結剤の量を選択し、工程（ｄ）で計算した流体流量が予め定められたポンプデューティーと等しいポンプデューティーに対応する場合、保存前に生物学的製品に添加すべき抗凍結剤の量として、抗凍結剤の初期量を選択する工程と、
ｆ．工程（ｄ）で計算した流体流量が予め定められた蒸発器デューティー以下である蒸発器デューティーに対応する場合、工程（ｄ）で計算した流体流量が予め定められたポンプデューティーと等しいポンプデューティーに対応するまで、工程（ａ）から（ｅ）を繰り返す工程とを有する。

本願発明の第４の態様に従い、生物学的製品を保存するために第１の態様の装置の使用が与えられる。

当該装置は、保存すべき関連生物学的製品を保持するよう設計されたトレイ、ラック、またはバスケットを有してよい。

本願発明の実施形態は、添付する図面を参照して、非限定的な例示としてのみ説明される。

図１は、生物学的製品の保存用のタンクの下方斜視図である。 図２は、生物学的製品の保存用のタンクの上方斜視図である。 図３は、さまざまな温度での血液の特定エンタルピーを示すグラフである。 図４は、さまざまな温度での血液の熱伝導率を示すグラフである。 図５は、血液の冷結保存バイアルを表す。 図６は、さまざまな時間間隔での血液の温度プロットを示す。 図７は、２５℃の熱交換流体インレット温度により、冷凍保存にさらされるポリプロピレン壁に囲まれた冷結保存バイアル内の血液の幾何学的インクリメントの温度／時間プロファイルを示す。 図８は、－５０℃の熱交換流体インレット温度により冷凍保存にさらされる血液の幾何学的インクリメントの温度／時間プロファイルを示す。 図９は、－７０℃の熱交換流体インレット温度により冷凍保存にさらされる血液の幾何学的インクリメントの温度／時間プロファイルを示す。 図１０は、－５０℃の熱交換流体インレット温度により冷凍保存にさらされる血液の幾何学的インクリメントの温度／時間プロファイルを示す。 図１１は、－５０℃の熱交換流体インレット温度により冷凍保存にさらされる血液の幾何学的インクリメントの温度／時間プロファイル、および冷結保存バイアルと０．２ｍ／ｓの熱交換流体との間の相対移動を示す。 図１２は、－５０℃の熱交換流体インレット温度により冷凍保存にさらされる血液の幾何学的インクリメントの温度／時間プロファイル、および冷結保存バイアルの水平方向を示す。 図１３は、異なる保存シナリオに対する溶血を示すグラフである。 図１４は、冷却システムの配管計装の図である。

図１および２は、生物学的製品（または生物学的材料）を保存するための浸漬槽１を示す。槽１は、ＡＳＴＭＡ２４０に適うスチールによって作成されている。槽１は、２つの熱交換流体インレット２および２つの熱交換流体アウトレット３を有し、該インレット２はインレット壁４上に配置され、該アウトレット３はアウトレット壁５上に配置されている。

図２は、槽１の外壁の内側に配置された内側ハウジング１０を示す。内側ハウジング１０は、インレット壁１４、アウトレット壁１５、およびベース１６を有し、それぞれは内側ハウジング１０への熱交換流体の流出入を許すアパーチャ１１を含む。アパーチャ１１は、インレット壁１４およびアウトレット壁１５上に１０個４列、ベース１６上に１０個１０列で設けられている。インレット壁１４およびベース１６上のアパーチャ１１は直径が１０ｍｍであり、アウトレット１５上のアパーチャ１１は直径が２０ｍｍである。インレット壁１４はインレット壁２の内側面１２から１００ｍｍ離隔されており、それによりボイド１３が与えられる。類似のボイドがアウトレット壁１５とストレット壁５の内側面との間に設けられる。

１００ｍｍのボイド間隔がさらにベースに設けられる。内側面１２はインレット壁２から５０ｍｍに配置されたスチールシート枠によって画定され、かつブラケットによって固定され、ポリウレタンフォーム断熱材が槽１の製造中にポンピングされるところのキャビティが与えられる。断熱材は、槽の天井から槽の壁下約５９５ｍｍまで槽の４つすべての壁に同様に与えられる。

直径３０ｍｍの穴２２の列が、各壁の底に沿ってベース７と槽の壁との間に約４５°の角度で配置されるストリップ２３に沿って設けられる。ストリップ２３は、槽構造体を補強するために設けられ、トレイまたはブラケットが内側ハウジング１０の壁またはベースに触るのを防止するようガイドするべく使用されてもよい。槽構造体を補強し、かつガイド機能を実行するほかの構造も可能であることが理解されよう。穴２２は、ストリップ２３の存在のために、槽の領域に蓄積する熱交換流体の停滞を減少させるのを補助する。

熱交換流体アウトレット３の下方に、槽１のアウトレット壁５を越えて伸長するよう方向付けられエルボ配管として形成されたドレイン６が槽１のベース７から設けられている。熱交換流体インレット２および熱交換流体アウトレット３は、８０ｍｍの直径を有する。

槽１はさらにスチールシート（図示せず）によって形成された蓋を有する。槽１のベース７は槽１の中心重量を支持する４つの中央レッグ部８を有し、ならびに、槽１のコーナーに配置されかつ槽壁の端部に形成された足１６を有する。切り抜き部９が槽のベース７のメンテナンス用のアクセスを与えるために槽壁の下側端部に設けられている。槽１は、高さが約１．１０５ｍであり、側面の一辺の長さが１．７０５ｍの正方形で構成されている。

使用の際、槽１は、－７０℃以上で凍らない熱交換流体によって満たされている。熱交換流体は、毎時１７立方メートルの体積流量で熱交換流体インレット２を介して槽１のキャビティ１３内へポンピングされる。熱交換流体がアパーチャ１１の制限領域を通じて強制されるに従い、キャビティ１３内の圧力が上昇し、それにより体積流量は減少するが内側ハウジング１０に進入する流体の速度は増加する。ある流体は内側ハウジング１０の下方を流れ、アウトレット壁５内の対向するキャビティまで強制され、ある流体は内側ハウジング１０のベース７に設けられたアパーチャ１１を通じて流れる。アパーチャ１１は槽のすべての部分への冷媒の分配を改善し、インレット領域から離れたところで生じやすいホットスポットの発生を最小化する。熱交換流体が槽１を連続して流れるに従い、熱は生物学的製品から除去され、槽１を離れる加熱済み熱交換流体はその後、当該熱交換流体を連続して冷却する冷却システムと交換される。熱交換流体自身は冷却システム内の冷媒によって熱交換される。

好適には、低レンジの熱交換流体が、非常に低温においても比較的低い粘性を有利に有する浸漬液用の槽に使用され、よってシステムのポンプ電力要求が減少する。以下の表（表１）は熱交換流体の熱特性のいくつかの具体例である。

上記各温度において、熱交換流体は非常に小さく、水より小さい密度を有する。有利に、槽の運転中になんらかの破損または漏水が生じた場合、破損または漏れた物質は槽の下側部分に沈みやすく、熱交換流体の実質的な損失なくその物質の排水を促進する。保存用に要求される低温において極端なポンプ電力を要求せずに十分に低い粘性を有することを条件に、任意の適切な熱交換流体が使用可能であることが理解されよう。熱交換流体は生物学的製品に対して安全であることが好ましい。

表２は、熱交換流体のさまざまな流量に対する、槽インレットとアウトレットとの間の温度を与え、２０ｋＷの熱が槽内の流体から抽出されると仮定している。表２から、インレットとアウトレットとの間で３℃の温度差が、約４ｋｇ／ｓの質量流量を使って達成可能であることがわかる。この温度差は要求される蒸発器デューティーおよび要求される製品の冷却に関して許容可能な温度上昇であるとみなされた。許容可能な温度上昇は、システムを経済的に妥当なものとするために一度に処理可能な製品の最大数に関するコストに対して均衡がとれなければならない。より大きい流量は、熱交換流体と消費物品との間の熱伝達を増加させる際に望ましいことがわかる。しかし、より大きい流量はまた、より高い熱抵抗を生じさせ、したがってより高いポンピング電力が必要となる。

本願発明者らは、生物学的製品の温度を急速に減少するために増加した流量の熱交換流体を使うことにより、生物学的製品は、冷凍プロセス中に通常生じる氷結晶形成によるダメージを最小限にしつつ、減少したレベルの抗凍結剤によって保存可能であることを見出した。

ＲＢＣｓおよび他の生物学的材料のガラス化を達成するための正しい温度および速度を決定する方法は、熱特性、表面積および製品負荷容積を増加させる計算に基づく。計算された熱伝達係数は、冷凍保存の生成を可能にする最終的な装置動作条件を知らせる。

一例において、冷凍保存バイアル中の０．５ｍｌの血液の冷凍が調査された。

図５は、内部容積が０．５ｍＬで、外径６ｍｍ、長さ２７．５ｍｍ、壁厚０．５ｍｍのポリプロピレンから作成された冷凍保存バイアルのＣＡＤモデルを示す。

血液で満たされた冷凍保存バイアル用の冷凍時間を計算するために、計算流体力学（ＣＦＤ）が使用された。ＣＦＤ解析に対して、冷凍保存バイアルはシミュレーションの開始時に均一な２℃の温度を有することが仮定されている。それは、マイナス２５℃、マイナス５０℃、およびマイナス７０℃のそれぞれの温度で熱交換流体内に浸漬された。その後、過渡的ＣＦＤが熱交換流体と冷凍保存バイアルの外部表面との間の熱交換を自動的に計算する。ＣＤＦはまた、冷凍保存バイアル（血液およびポリプロピレン）を通じた熱の伝導を計算する。

冷凍中の血液の移動は無視された。すなわち、血液は“ソリッド”であると仮定されている。血液の熱特性は、それが８５％の水分および１５％のたんぱく質からなるという仮定に基づいている。生物学的製品の熱特性は当業者に周知の方法を通じて得ることができるか、当業者に周知の熱特性テーブルで探すことができる。

図３および４は、血液に対して計算されるような特定のエンタルピーおよび熱伝導率をそれぞれ示す。熱伝導率はコペルマン法によって計算されている。

以下の表は、マイナス２５℃、マイナス５０℃、およびマイナス７０℃それぞれの熱伝達流体の温度に対するコアの冷却時間を与える。

表３のシナリオの各々に対応する温度／時間プロットは、図７から９に示されている。図６は、３０から１００秒の間で、１０秒間隔の熱伝達流体に対するマイナス５０℃の場合の温度プロットを示す。

図７を参照して、コア温度は時刻０ｓで約２℃から開始し、２２０ｓごとに約－２４℃の温度まで冷却され、毎分約７℃の全平均温度降下速度を生じさせる。しかし、約１２５ｓと１５０ｓとの間の時間ウインドウを観測すると、約１４℃のコア温度で急速な減少が生じ、その時間間隔にわたって毎分約３４℃の平均温度降下速度を生じさせる。

図８を参照して、コア温度は時刻０ｓで約２℃から開始し、１８０ｓごとに約－４９℃の温度で冷却され、毎分約１７℃の全平均温度降下速度を生じさせる。しかし、約６９ｓと７５ｓとの間の時間ウインドウを観測すると、約１４℃のコア温度で急速な減少が生じ、その時間間隔にわたって、毎分約１４０℃の平均温度降下速度を生じさせる。

図９を参照して、コア温度は時刻０ｓで約２℃から開始し、７７．５ｓごとに約－５０℃の温度まで冷却され、毎分約４０℃の全平均温度降下速度を生じさせる。しかし、約４９ｓと５２．５ｓとの間の時間ウインドウを観測すると、約１４℃のコア温度で急速な減少が生じ、その時間間隔にわたって、毎分約２４０℃の平均温度降下速度を生じさせる。

有利なことに、急速温度降下は約－２℃と－１５℃の間で生じてよく、それは、多くの生物学的製品の過冷却に対して重要な範囲となるべきと考えられる。上記した例において、急速温度降下のウインドウはこの温度範囲とほぼ一致する。

上記した例において、グラフの急勾配部分は温度変化のおおよその最大速度を決定するために視覚的に評価される。他のオプションは、データをモデリングしかつ導関数をプロットすることであり、それにより、製品の変化の最大瞬間速度が決定される。変化の要求される速度は、所与の時間間隔にわたって、少なくとも所与の降下速度以上であるとして規定されうる。例えば、温度降下速度は、２０ｓの間隔の間、毎分１００℃以上であることが必要であってよい。

以下の付加的なシナリオは、代替的シナリオの効果を調査するべく実行された。以下のすべての分析は、マイナス５０℃の熱伝達流体によって実行された。これらは、以下の効果を含む。
ａ．ポリプロピレン壁の効果：ポリプロピレンは、低い熱伝導率を有し、それゆえ血液から熱伝達流体へ流れる熱に対して高い抵抗を有する。この場合、ポリプロピレンはスチール壁と置換された。これは、より高い熱伝導材料および／またはより薄い壁厚を使った効果を示している。
ｂ．０．２ｍ／ｓで熱伝達流体を通じて水平方向に冷凍保存バイアルを移動する効果：冷凍保存バイアル（または熱伝達流体）の移動は、冷凍保存バイアル表面と熱伝達流体との間の熱伝達を強化する。
ｃ．冷凍保存バイアルを水平方向に方向付ける効果：冷凍処理中、冷凍保存バイアルは熱伝達流体へ熱を返す。熱い流体が増加し、それゆえ冷凍保存バイアルに隣接するより暖かい熱伝達流体が増加し、冷凍保存バイアル表面からの熱伝達を増加させる熱伝達流体の移動が作成される。冷凍保存バイアルを水平方向へ方向付けることは、表面伝熱の効果を有してよい。

以下のテーブルは、上述した代替シナリオに対する冷凍シナリオに対する冷凍時間を示す。表３に記述されるようなシナリオ２の結果は、参照を容易にするため繰り返されている。図１０から１２はそれぞれ対応する温度／時間プロファイルを示す。

これらの結果は、より高い熱伝導率／より小さい厚さの冷凍保存バイアル材料を使うことが有意な効果を有するということを示す。したがって熱伝達流体／冷凍保存バイアルの移動は表面伝熱を増加させ、冷凍時間の効果を生じさせる。冷凍保存バイアルを水平方向に方向付けることもまた正の効果を有する。

本冷凍保存方法にさらされた後、ＲＢＣｓの試験が実行された。

約３０ｍｌ（６×５ｍｌｓ）の血液が静脈穿刺により健康なボランティアから取得された。血液全体は４℃、１１００ｘｇで１２分間、遠心分離された。軟膜およびほとんどの血漿が除去されかつ破棄された。濃縮されたＲＢＣｓはその後リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）によって２回洗浄され、５０±１０％の最終ヘマトクリット（Ｈｃｔ）値までＰＢＳ内で再懸濁された。ＲＢＣ濃縮はその後、グリセロール化のために、５０ｍｌのプラスチックファルコンチューブへ移送された。

グリセロール化
ＲＢＣｓは２０％または４０％のグリセロールの最終濃度を得るために、室温でグリセロール化された。

６つの組み合わせが測定された（それぞれ３つ）。

約４０％（ｗｔ／ｖоｌ）グリセロールの最終濃縮を達成するべく、等しい量の標準５７％（ｗｔ／ｖоｌ）グリセロールがＲＢＣ濃縮に添加された。２５％（ｗｔ／ｖоｌ）のグリセロール混合物が、約２０％（ｗｔ／ｖоｌ）の最終濃度のグリセロールを達成するべく、ＲＢＣｓに５：１の比率で添加された。最終的な溶液は、冷凍保存にさらされ、解凍され、４℃で一晩保持された。コントロールＲＢＣ濃度（冷凍保存処理にさらされない）もまた４℃で一晩保持された。

デグリセロール化
ＲＢＣ濃縮は、穏やかなインバージョンにより、３０分間室温にて平衡状態にされた。懸濁液はその後、１１００ｘｇで１２分間遠心分離され、上澄みが廃棄された。ＲＢＣ懸濁液（０．５ｍｌｓ）は以下に示すような低下浸透圧のＮａＣｌ溶液によって繰り返し洗浄されることによりデグリセロール化された。
・室温で３分間温置された、８％（４０％グリセロールサンプルに対して１２％）ＮａＣｌの０．１２５ｍｌ
・室温で３分間温置された、０．９％ＮａＣｌの０．６２５ｍｌ
・室温で３分間温置された、０．９％ＮａＣｌの０．７５ｍｌ
・室温で３分間温置された、０．９％ＮａＣｌの４ｍｌ

懸濁液は１１００ｘｇで１２分間遠心分離され、上澄みが廃棄された。

溶血の評価
デグリセロール化セル（上述した）は２分間４℃でＰＢＳ内に保存され、その後溶血が測定された。セルは上澄みからＲＢＣを分離するために、２８６０ｘｇで１分間遠心分離された。上澄みは、プラスチックキュベット（１ｃｍ）へ移送され、遊離ヘモグロビンのフラクションが分光光度計で５４０ｎｍの吸収度を測定することにより判定された。

結果
各処置の生データが以下の表に与えられる。遊離ヘモグロビンの量は、溶解済みＲＢＣｓの量に相関する。両方の方法は低レベルの溶血を生じさせた。

図１３は、コントロールと比較した、上記シナリオの各々の溶血の量を示す。

結果は、４０％グリセロールが抗凍結剤として使用されたときに、ここで説明した冷凍保存手法がＲＢＣｓを劣化から保護したことを示す。試験した両方の温度（－２５℃および－５０℃）において、当該処理はコントロールより優れていた。システムおよび処理の最適化により、２０％グリセロールのケースがコントロールと少なくとも同等であることを示すと考えらえる。

要求される冷凍保存量の決定
保存システムの入力パラメータを変更する影響を調査することにより分析が実行された。これは、製品の幾何学的形状、製品の開始温度、パッケージングの特性、および利用するラッキングシステムの特定を含んでよい。当該方法は、生物学的製品を幾何学的インクリメント（例えば、ビンまたは試験チューブ用の円筒シェル）内に分割することを含む。これらのインクリメントのひとつ毎にエネルギー保存方程式が解かれる。すなわち、所与の時間ステップの間に、ある量のエネルギーがシェルから除去され、そのシェルの温度の降下が生じる。除去されたエネルギーの量は、隣接シェルの温度のフラクションであり、シェル間の熱流に対する抵抗である。これは、生物学的製品の熱特性を温度の関数として考慮することに関連する。

血液が２℃の開始温度、および、当業者に周知な方法を使って、識別、推定または計算可能な熱特性を有する固体塊として扱うことが可能であると仮定して分析が実行された。

製品の全表面積、槽内の製品の容積負荷、熱交換流体の予め選択されたインレット温度、熱交換流体の予め選択された許容可能なアウトレット温度（例えば、インレット温度より３℃高い）、製品（抗凍結剤を含む）およびパッケージングの熱特性、ならびに槽を通過する流体の予め選択された速度に基づいて、上述したように製品の温度降下速度がシミュレーション可能である。

時間の所与のスナップショット内の温度降下速度は、例えば、毎分９０℃以上であってよい。生成速度および温度降下が実際の見地から許容可能であれば（例えば、選択した温度での熱交換流体の粘性に基づいてポンプデューティーが許容可能であるか、または、蒸発器デューティーが要求された熱除去量に基づいて許容可能であれば）、より大きな温度降下速度が、製品内の抗凍結剤のより低い量とともに対応して選択可能である（保存が製品に対するダメージ無しで生じうるように）。新たに選択された温度降下速度、およびひいてはより大きい流体速度は、その後上述したように実際の見地から選択可能であるか否かを判定するべくシミュレーションされうる。

実際の最大の温度降下速度が決定されると（および対応する最低レベルの抗凍結剤が決定されると）、製品は、決定されたレベルまで抗凍結剤と混合され、かつ、決定された温度降下速度に基づいた保存にさらされる。抗凍結剤レベルおよび温度降下速度の各々に対して実際には、例えば１０％の安全率が使用されてもよい。

冷却システム
図１４は、熱交換流体を連続的に冷却する冷却システムの配管計装図である。冷却システムは、熱伝達流体と冷媒との間で熱を交換するための熱交換機を有し、それは、例えば、Ｒ４０４Ａであってよい。

Claims (22)

1. 外側断熱ハウジング内に配置された内側ハウジングを備える生物学的製品を保存するための装置であって、前記内側ハウジングの壁は生物学的製品を受設するためのコンパートメントを画定し、前記壁は、熱交換流体を前記コンパートメント内に流入するためのインレット壁と、熱交換流体を前記コンパートメント外へ流出するための反対側のアウトレット壁と、側壁と、ベースとを有し、前記側壁およびベースは前記インレット壁を前記アウトレット壁へ接合し、前記インレット壁および前記アウトレット壁はそれぞれ、動作中、前記内側ハウジングの前記コンパートメント内に受設された生物学的製品が前記熱交換流体によって熱を交換するべく前記熱交換流体中に浸漬されるように、前記装置を通じて連続する熱交換流体流を収容するための一連のアパーチャを含む、ことを特徴とする装置。
2. 前記ベースは一連のアパーチャを有する、請求項１に記載の装置。
3. 前記装置は、前記生物学的製品を保持するための前記コンパートメント内に受設可能な構造体を有し、前記構造体は一つ以上のトレイ、ラックおよびバスケットである、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
4. 前記構造体は、前記装置の蓋から吊り下げられている、ことを特徴とする請求項３に記載の装置。
5. 前記外側ハウジングは、
   前記内側ハウジングの前記インレット壁に対応するインレット側面であって、前記インレット側面と前記インレット壁との間にインレット空間を画定するインレット側面と、
   前記内側ハウジングの前記アウトレット壁に対応するアウトレット側面であって、前記アウトレット側面と前記アウトレット壁との間にアウトレット空間を画定するアウトレット側面と、
   を有し、
   前記インレット側面は、前記外側ハウジングの外側から前記インレット空間内へ連通する少なくともひとつのインレットを含み、前記アウトレット側面は、前記アウトレット空間から前記外側ハウジングの外側へ連通する少なくともひとつのアウトレットを含み、
   動作中、前記熱交換流体が、前記少なくともひとつのインレットを介して前記装置内に導入され、前記少なくともひとつのアウトレットを介して前記装置から除去される、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
6. 前記インレット空間および前記アウトレット空間は流体的に接続されている、ことを特徴とする請求項５に記載の装置。
7. 前記少なくともひとつのインレットおよび前記少なくともひとつのアウトレットは直径が８０ｍｍである、ことを特徴とする請求項５に記載の装置。
8. 使用中、前記装置は外部の冷却システムに結合され、それにより、前記熱交換流体は冷媒と熱交換する、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
9. 保存の前に生物学的製品に添加すべき抗凍結剤の量を決定する方法であって、
   ａ．抗凍結剤の初期量を含む、保存すべき前記生物学的製品のおおよその幾何学的形状の全表面積を決定する工程であり、前記生物学的製品、抗凍結剤、および任意のパッケージングはサンプルを画定するところの工程と、
   ｂ．前記サンプルの熱特性を推定する工程と、
   ｃ．前記サンプルのおおよその幾何学的形状、前記サンプルの熱特性、前記装置の幾何学的形状、前記装置内でのサンプルの予め定められた位置、熱交換流体の予め定められたインレット温度、およびインレットからアウトレットへの前記熱交換流体の予め定められた温度の増加のいずれか一つ以上を含むフロー制約に基づいて、請求項１に記載の装置内で、前記サンプルに対して、計算流体力学解析を実行する工程と、
   ｄ．予め定められたサンプル表面の温度で前記サンプルの前記コアの平均温度降下速度を決定し、かつ、前記平均温度降下速度を得るべく熱交換流体流量を対応付ける工程と、
   ｅ．工程（ｄ）で計算した前記流体流量が予め定められたポンプデューティー以下である前記装置のポンプデューティーに対応する場合、新しい初期量を画定するべく、前記初期量より少ない予め定められた量である抗凍結剤の量を選択し、工程（ｄ）で計算した前記流体流量が予め定められたポンプデューティーと等しいポンプデューティーに対応する場合、保存前に生物学的製品に添加すべき前記抗凍結剤の量として、抗凍結剤の前記初期量を選択する工程と、
   ｆ．工程（ｄ）で計算した前記流体流量が予め定められたポンプデューティー以下であるポンプデューティーに対応する場合、工程（ｄ）で計算した前記流体流量が予め定められたポンプデューティーと等しいポンプデューティーに対応するまで、工程（ａ）から（ｅ）を繰り返す工程と
   を備える方法。
10. 保存の前に生物学的製品に添加すべき抗凍結剤の量を決定する方法であって、
    ａ．抗凍結剤の初期量を含む、保存すべき前記生物学的製品のおおよその幾何学的形状の全表面積を決定する工程であり、前記生物学的製品、抗凍結剤、および任意のパッケージングはサンプルを画定するところの工程と、
    ｂ．前記サンプルの熱特性を推定する工程と、
    ｃ．前記サンプルのおおよその幾何学的形状、前記サンプルの熱特性、前記装置の幾何学的形状、前記装置内でのサンプルの予め定められた位置、およびインレットからアウトレットへの前記熱交換流体の予め定められた温度の増加のいずれか一つ以上を含むフロー制約に基づいて、請求項１に記載の装置内で、前記サンプルに対して、計算流体力学解析を実行する工程と、
    ｄ．予め定められたサンプル表面の温度で前記サンプルの前記コアの平均温度降下速度を決定し、かつ、前記平均温度降下速度を得るべく熱交換流体のインレット温度を対応付ける工程と、
    ｅ．工程（ｄ）で決定した熱流体の前記インレット温度が、予め定められた蒸発器デューティー以下である前記装置の蒸発器デューティーに対応する場合、新しい初期量を画定するべく、前記初期量より少ない予め定められた量である抗凍結剤の量を選択し、工程（ｄ）で計算した前記流体流量が予め定められたポンプデューティーと等しいポンプデューティーに対応する場合、保存前に生物学的製品に添加すべき前記抗凍結剤の量として、抗凍結剤の前記初期量を選択する工程と、
    ｆ．工程（ｄ）で計算した前記流体流量が予め定められた蒸発器デューティー以下である蒸発器デューティーに対応する場合、工程（ｄ）で計算した前記流体流量が予め定められたポンプデューティーと等しいポンプデューティーに対応するまで、工程（ａ）から（ｅ）を繰り返す工程と
    を備える方法。
11. 前記抗凍結剤の初期量は、前記サンプルのｗｔ／ｖоｌ％として与えられ、前記初期量より少ない予め定められた量である抗凍結剤の量を選択する前記工程は、前記初期量より約１％少ない抗凍結剤の量を選択する工程を含む、ことを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記抗凍結剤の初期量は、前記サンプルのｗｔ／ｗｔ％として与えられ、前記初期量より少ない予め定められた量である抗凍結剤の量を選択する前記工程は、前記初期量より約１％少ない抗凍結剤の量を選択する工程を含む、ことを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
13. 前記抗凍結剤の初期量は、前記サンプルのｖоｌ／ｖоｌ％として与えられ、前記初期量より少ない予め定められた量である抗凍結剤の量を選択する前記工程は、前記初期量より約１％少ない抗凍結剤の量を選択する工程を含む、ことを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
14. 生物学的製品を保存するための請求項１に記載の装置の使用。
15. 生物学的製品を保存するための請求項１に記載の装置の使用であって、前記生物学的製品は、約０％から約４０％ｗｔ／ｖоｌの抗凍結剤を含む、ことを特徴とする使用。
16. 生物学的製品を保存するための請求項１に記載の装置の使用であって、前記生物学的製品は、約４０％ｗｔ／ｖоｌの抗凍結剤を含む、ことを特徴とする使用。
17. 生物学的製品を保存するための請求項１に記載の装置の使用であって、前記生物学的製品は、約２０％ｗｔ／ｖоｌの抗凍結剤を含む、ことを特徴とする使用。
18. 生物学的製品を保存するための請求項１に記載の装置の使用であって、前記生物学的製品は、約０％ｗｔ／ｖоｌの抗凍結剤を含む、ことを特徴とする使用。
19. 請求項１に記載の装置を使用する方法であって、前記生物学的製品は請求項９から１３のいずれか一項に記載される方法によって決定された量の抗凍結剤を含む、ことを特徴とする方法。
20. 前記予め定められたポンプデューティーは、安全率を含む、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
21. 前記予め定められた蒸発器デューティーは、安全率を含む、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
22. 前記安全率は約１０％である、ことを特徴とする請求項２０または２１に記載の方法。
    

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