JP2022504472A - Ｈｅｒ２結合四量体ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、四量体ポリペプチドに関し、前記四量体ポリペプチドは第１のＶＬ抗原結合ドメイン及び第１のＣＬ定常ドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、第１のＶＨ抗原結合ドメイン、第１のＣＨ１定常ドメイン、第１のＣＨ２定常ドメイン及び第１のＣＨ３定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、第１のドメイン間アミノ酸リンカーにより前記第１のＶＬ抗原結合ドメイン又は前記第１のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結されるＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに結合する第１のリガンドと、第２のＶＬ抗原結合ドメイン及び第２のＣＬ定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖と、第２のＶＨ抗原結合ドメイン、第２のＣＨ１定常ドメイン、第２のＣＨ２定常ドメイン及び第２のＣＨ３定常ドメインを含む第４のポリペプチド鎖と、第２のドメイン間アミノ酸リンカーにより前記第２のＶＬ抗原結合ドメイン又は前記第２のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結されるＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに結合する第３のリガンドと、を含み、ＶＬ抗原結合ドメイン及びＶＨ抗原結合ドメインは共にＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに結合する第２のリガンド及び第４のリガンドを構成する。本発明は、更に四量体ポリペプチドの悪性腫瘍性疾患の予防又は治療方法における応用、単離された核酸及びポリペプチド発現用の宿主細胞並びにポリペプチドの取得方法に関する。

Description

本発明は、２つのＨＥＲ２エピトープＤ１に対する結合部位及び２つのＨＥＲ２エピトープＤ４に対する結合部位を有する四量体ポリペプチドに関する。

受容体型チロシンキナーゼのＨＥＲファミリーのメンバーは、細胞の成長、分化、遊走及び生存にとって重要な媒体である。受容体ファミリーは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５＜ｎｅｕ＞）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含む４つの異なるメンバーを含む。ＥＧＦＲファミリーのメンバーは、密接に関連した一本鎖モジュラー糖タンパク質であり、細胞外リガンド結合領域、単一膜貫通ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼを有し、その後に下流シグナルタンパク質のドッキングに重要な特定のリン酸化部位が続く。

ＨＥＲ受容体ファミリーの細胞外領域は、受容体の二量体化に重要な２つの相同リガンド結合ドメイン（ドメイン１及び３）及び２つのシステインリッチドメイン（ドメイン２及び４）を含む。リガンドがない場合、ＨＥＲ受容体は、通常、ドメイン２と４の密接な相互作用を特徴とする「テザー」構造として知られている不活性モノマーとして存在する。リガンドが細胞外ドメインに結合することによって、立体配座再配列が引き起こされ、二量体化ドメイン２及び４が露出する。従って、成長因子のＨＥＲ受容体への結合によって、受容体の二量体化を可能にする立体配座の変化が誘導される。細胞外受容体が二量体化した後、膜貫通ヘリックスは、細胞内キナーゼドメインが互いにトランス自己リン酸化することを可能にするように、活性立体配座に切り替える。このリン酸化によって、特定の下流シグナル伝達タンパク質の動員を可能にする。

上皮成長因子受容体１（ＥＧＦＲ）は、原因としてヒト悪性腫瘍に関与している。特に、乳癌、膀胱癌、肺癌、頭部癌、頸部癌、胃癌及び神経膠芽腫でＥＧＦＲの発現の増加が観察された。

ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２又はＮｅｕとしても知られ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ． Ｐ０４６２６）は、１２３３個のアミノ酸からなり、構造的にはＥＧＦＲに類似し、４つのサブドメイン１～４からなる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、膜近傍ドメイン、細胞内細胞質チロシンキナーゼ及び調節性Ｃ末端領域を有する。しかしながら、ＨＥＲ２の細胞外領域の構造は、重要な面で他のＥＧＦ受容体と異なる。他のＥＧＦ受容体では、非活性化状態で、ドメイン２がドメイン４に結合する。ドメイン１及び３に結合する際に、活性化成長因子（リガンド）は、ＥｒｂＢ二量体パートナーと相互作用するように二量体化アームがドメイン２から伸びることを可能にする立体配座を選択して安定的にする。一方、ＨＥＲ２は、他の受容体メンバーのリガンド活性化状態に似ている固定的立体配座を有する。即ち、ドメイン２～４の相互作用がなく、ドメイン２における二量体化ループが持続的に露出する。ＨＥＲ２は、他のＥｒｂＢファミリーメンバーと共にヘテロ二量体複合体を形成することにより活性化され、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３リガンドによって間接調節される。ＨＥＲ２は、他の３つのＥｒｂＢ受容体にとって好ましいヘテロ二量体化パートナーであり、リガンド－受容体複合体の解離速度を遅くすることにより、他のＥｒｂＢ受容体のリガンドに対する親和性を補強し、よって、ＨＥＲ２はシグナル伝達を補強して延長する。

細胞表面のＨＥＲ２が過剰であると、複数の組織からの上皮細胞の形質転換が引き起こされる。ｎｅｕ遺伝子のヒトホモログ（ＨＥＲ２としても知られている）の増幅は、乳癌及び卵巣癌で観察され、予後不良に関連している（ＵＳ４，９６８，６０３）。ＨＥＲ２の過剰発現は、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、甲状腺癌、膵臓癌及び膀胱癌を含む他の癌でも観察された。

ＨＥＲ２を標的とする抗体
Ｄｒｅｂｉｎと同僚は、ＵＳ６，７３３，７５２に開示されているラットｎｅｕ遺伝子産物ｐ１８５＜ｎｅｕ＞に対する抗体を提案した。

Ｈｕｄｚｉａｋら（１９８９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３），１１６５－１１７２）は、ヒト乳房腫瘍細胞株ＳｋＢｒ－３により特徴付けられるＨＥＲ２抗体グループの生成について説明した。細胞増殖アッセイを使用し、４Ｄ５と呼ばれる抗体によって最大限の阻害が得られた。更に、抗体４Ｄ５がＨＥＲ２過剰発現乳房腫瘍細胞株をＴＮＦ－［α］の細胞毒性効果に敏感にすることが見出され、ＵＳ５，６７７，１７１をも参照する。マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化形態（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ又はハーセプチン；ＵＳ５，８２１，３３７）は、以前に広範な抗癌療法を受けたＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌患者に対して臨床的に有効である。ハーセプチンは、化学療法と組み合わせてＨＥＲ２陽性転移性胃（胃部）癌患者に使用されることが承認された。

ハーセプチンは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する、及び／又はＨＥＲ２遺伝子が増幅する早期及び転移性乳癌患者に対する治療に広く用いられている。ハーセプチン／トラスツズマブによる乳癌患者の治療は、例えばＨＥＲ２陽性疾患の患者に推奨され、且つ、現在、日常的に行われており、ＵＳ２００２／００６４７８５、ＵＳ２００３／０１７０２３４Ａ１、ＵＳ２００３／０１３４３４４及びＵＳ２００３／０１４７８８４を参照する。従って、従来技術では、高いＨＥＲ２タンパク質発現量（例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）によってＨＥＲ２（３＋）として定義される）に基づくトラスツズマブ／ハーセプチン療法に対する乳癌患者の適格性に注目している。免疫組織化学的方法によって乳房組織生検や乳房組織切片などの患者から得られたサンプル、又は転移性部位に由来する組織において高いＨＥＲ２（タンパク質）発現量を検出した場合（例えば、ＨＥＲ２（＋＋＋）又はＨＥＲ２遺伝子増幅（例えば、ＨＥＲ２遺伝子コピー数が腫瘍細胞あたりに４コピーのＨＥＲ２遺伝子よりも高い）又はその両方）、乳癌にＨＥＲ２陽性疾患が存在すると定義する。遺伝子レベルでＨＥＲ２の過剰発現及び増幅を検出するために頻繁に使用されている方法の１つは、ＵＳ２００３／０１５２９８７にも記載されている蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である。

ヒト化抗体であるペルツズマブは、ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）として知られている最初の新しいクラスの薬剤である。ペルツズマブは、その二量体化ドメインでＨＥＲ２に結合することにより、活性ヘテロ二量体受容体複合体を形成する能力を阻害し、最終的に細胞の成長と分裂を引き起こす下流シグナルカスケードを遮断する。ペルツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン２に対するものである。ＨＥＲ２のドメイン４に結合することによって作用するトラスツズマブと比べれば、ペルツズマブは、対応する活性化リガンドの存在下で、ＨＥＲ２とＨＥＲ３及びＥＧＦＲ受容体ファミリーの他のメンバーとの二量体化を阻害するＨＥＲ二量体化阻害剤である。ペルツズマブは、複合体形成を遮断することで、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のリガンドによって活性化された成長刺激効果及び細胞生存シグナルを阻止する。ペルツズマブは、Ｐｅｒｊｅｔａという名前で、以前に抗ＨＥＲ２療法又は転移性疾患に対する化学療法を受けたことのないＨＥＲ２陽性転移性乳癌患者のためにトラスツズマブ及びドセタキセルと併用して治療することに用いられると、ＦＤＡによって承認された。ペルツズマブは、ヒトＩｇＧ１（［κ］）フレームワーク配列に基づく完全ヒト化組換えモノクローナル抗体である。ペルツズマブ及びそれによる療法の対象患者の選択に関する特許公報は、ＵＳ２００６００７３１４３Ａ１、ＵＳ２００３００８６９２４、ＵＳ２００４００１３６６７Ａ１及びＵＳ２００４０１０６１６１Ａ１を含む。

トラスツズマブについて、化学療法のみの場合に比べて、化学療法と併用する場合は、例えば生存期間の延長の面で臨床的有用性を示したことが分かったが、殆どのＨＥＲ２陽性乳癌患者は非応答者であることが発見された（ハーセプチンと化学療法を併用した場合、全体の応答率が４５％であり、化学療法のみの場合、２９％である）。

従って、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体療法は、例えばＨＥＲ２を過剰発現する転移性乳癌に対して改良治療を提供できることを示したが、まだ相当な改良余地がある。

ＨＥＲ２を標的とする非抗体足場
最近、代替の標的タンパク質が提案され、ヒト免疫グロブリン由来の抗体フラグメント及び抗体由来の構築物とフォーマットに比べて、分子構造がより多様であり、ヘテロ二量体及び多量体アセンブリを作製することによってより多くの分子フォーマットを可能にし、新しい生物学的機能をもたらす。このような標的タンパク質はたくさん記載されている（（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，２３，１２５７－１２６８）で総説された）。このような標的タンパク質の非限定的な例として、ラクダ抗体、タンパク質Ａドメインに由来するタンパク質足場（「アルファボディ」と呼ばれ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ）、テンダミスタット（αアミラーゼ阻害剤、ストレプトマイセス・テンダエからの７４個のアミノ酸のβシートタンパク質）、フィブロネクチン、リポカリン（「Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ」，Ｐｉｅｒｉｓ）、Ｔ細胞受容体、アンキリン（「ＤＡＲＰｉｎｓ」と呼ばれる設計アンキリンリピートタンパク質，Ｕｎｉｖ．Ｚｕｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ；ＵＳ２０１２０１４２６１１を参照）、いくつかの受容体のＡドメイン（「Ａｖｉｍｅｒｓ」，Ａｖｉｄｉａ）及びＰＤＺドメイン、フィブロネクチンドメイン（ＦＮ３）（「Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ」，Ａｄｎｅｘｕｓ）、コンセンサスフィブロネクチンドメイン（「Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ」，Ｃｅｎｔｙｒｅｘ／Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ユビキチン（「Ａｆｆｉｌｉｎｓ」，ＳＣＩＬタンパク質）及びノッチン（Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎｅ，２０１２， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２２３－２５１及びその中に引用された参考文献）が挙げられる。

これらのタンパク質から、多量体及び多特異性アセンブリを構築することができる（Ｃａｒａｖｅｌｌａ ａｎｄ Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ，２０１０，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４，５２０－５２８；Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９２，３８９－４０７；Ｌｏｆｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２，８４３－８４８，Ｂｏｅｒｓｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，８４９－８５７）。これら及び他のペプチドドメインを抗体に融合して、所謂Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（Ｚｙｎｇｅｎｉａ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を作製することも可能である。

これらの異なる固有特性を有する足場の共通点としては、当業者に公知の選択技術を使用することによって、特異的エピトープに結合するようにすることができる（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．）。

例えば、ＨＥＲ２の異なるドメインのそれぞれは、ドメイン１及びドメイン４の場合に証明されたように、バキュロウイルス発現システムを利用して昆虫細胞で個別に発現可能である（Ｆｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，９９７－１００１）。それにより、選択されたバインダーが対象ドメインに向けられることが保証される。次に、ＨＥＲ２ドメインは、前述したようにビオチン化され（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（４６），３５１６７－７５）、ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズ、或はストレプトアビジン又はニュートラアビジンをコートしたマイクロタイタープレートに固定化されることができる（Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８２，１２１１－１２２７；Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９，１０１５－１０２８．）。そのように固定化されたＨＥＲ２ドメインは、ファージディスプレイフォーマット又はリボソームディスプレイフォーマットの多様なタンパク質ライブラリーの標的として役割を果たすことができる。多種多様な異なる抗体ライブラリーが既に公開され（Ｍｏｎｄｏｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．１３，１１１７－１１２９）、結合抗体の選択技術は、当業者に公知のものである。ファージディスプレイは、抗体フラグメント（Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、又は単一ドメイン抗体）（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，２３（９），１１０５－１１１６）及びジスルフィド結合を含む他の足場に適するフォーマットであるが、ジスルフィド結合を含まない足場にも適用可能である（例えば、Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３８２，１２１１－１２２７）（Ｒｅｎｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｈｉｍｉａ．，６５（１１），８４３－５，Ｓｋｅｒｒａ Ａ．，２００７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．， １８（４）， ２９５－３０４）。同様に、リボソームディスプレイは、抗体フラグメント（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，１２８７－１２９２）及び他の足場に適用可能である（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４，２６９－２７９；Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６９，１０１５－２８．）。３つ目の強力な技術は、酵母ディスプレイである（Ｐｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１１（２），１２７－１３４）。この場合、対象結合タンパク質のライブラリーは、酵母の表面にディスプレイされ、ＨＥＲ２のドメインのそれぞれは、蛍光色素で直接標識されるか、抗Ｈｉｓタッグ抗体でそのＨｉｓタグが検出され、抗Ｈｉｓタッグ抗体は、また二次抗体で検出される。このような方法は、当業者に公知のものである（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３２８，４３０－４４）。

エンジニアリングの別の可能性は、二重特異性又はそれ以上の多価結合分子を作製するためにこれらのバインダーを接続することである。このような接続は、遺伝的にこれらの結合分子の２つ以上を融合することによって、又は化学的に別々に発現される分子を架橋することによって、又は二量体化ドメインを追加することによって（それぞれの又はその任意の組み合わせの独立した従属請求項を含む）、実現可能である（例えば、Ｓｔｅｆａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，４１３，８２６－８４３；Ｂｏｅｒｓｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６，４１２７３－４１２８５を参照）。

二重特異性抗ＨＥＲ２ラクダ科抗体構築物（二重特異性ナノボディ）は、ＵＳ２０１１００５９０９０に示されている。この文献は、ペルツズマブとの競合で定義される細胞外ドメイン２及びトラスツズマブとの競合で定義されるドメイン４で同時にＨＥＲ２を標的とする二重特異性分子に関する。この分子は、ＳｋＢｒ３細胞株を使用した生体外細胞培養モデルで直接比較した結果、トラスツズマブ（ハーセプチン）よりも強い抗増殖活性を示すと述べられている。

既知のＨＥＲ２特異的リガンドが一切存在しないため、現在のＨＥＲ２標的戦略は、相互作用表面に結合して受容体の二量体化を遮断することを目的としている。現在のＨＥＲ２受容体の二量体化に関する知見は、殆どＥＧＦＲホモ二量体のリガンド結合型結晶構造に基づいており、当該結晶構造は、全てのＥＧＦ受容体ファミリーメンバーの活性モードとして広く認められている（Ｇａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，７６３－７７３）。２つのＥＧＦＲ分子は、背面同士の相互作用を示す。この発見を、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲファミリーの他のメンバーとの可能性のある相互作用へと展開すると、１つの相互作用界面は、ＨＥＲ２の細胞外部分のドメイン２に存在する。ペルツズマブは、ドメイン２に結合し、この界面で受容体の相互作用を確実に遮断することが知られている。他の知られている相互作用は、ＨＥＲ２の細胞外部分のドメイン４に存在する。この相互作用界面はトラスツズマブによって遮断されることが考えられている。しかし、ペルツズマブとトラスツズマブとの２つの抗体は、同時に使用されたとしても、全てのＨＥＲ２相互作用を完全に遮断することができない。細胞外部分とＨＥＲ２のキナーゼドメインの相互作用は、ペルツズマブやトラスツズマブに遮断された状態でも一部の残留相互作用が可能であるように連結されていると考えられ、これは結晶構造データに合致する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，５４３２－５４４３）。２つのエピトープ（ペルツズマブ及びトラスツズマブ）に同時に結合する上記二重特異性リガンド（ＵＳ２０１１／００５９０９０）によれば、細胞培養モデルでの細胞の成長は約５０％減少するが、トラスツズマブによる効果では、約４０％減少する。しかしながら、トラスツズマブとペルツズマブの混合物で処理することによっても、同じ効果を実現することができる。

特許出願ＷＯ２０１４／０６０３６５には、ＨＥＲ２細胞外ドメイン１（Ｄ１エピトープ）に結合する第１のポリペプチドリガンド及びＨＥＲ２細胞外ドメイン４（Ｄ４エピトープ）に結合する第２のポリペプチドリガンドを含み、第１のポリペプチドリガンドと第２のポリペプチドリガンドがリンカーによって分離している二重特異性ＨＥＲ２標的薬剤が記載されている。これらのバイパラトピック結合剤のうち活性の最も高いものは、主に分子間結合モードで２つの分離しているＨＥＲ２分子に結合する。それにより、これらのバイパラトピック二価結合剤は、これらのパラトープ及び好ましくは短いペプチドリンカーによって、１つのＨＥＲ２のＨＥＲ２＿ＥＣＤ１と他のＨＥＲ２分子のＨＥＲ２＿ＥＣＤ４を架橋し、分子内結合よりも分子間結合に一層寄与する。バイパラトピック結合剤の二価結合モードは、細胞表面でＨＥＲ２受容体の重合を誘導するため、生産的なＨＥＲ２／ＨＥＲ３又はＨＥＲ２／ＥＧＦＲヘテロ二量体又はＨＥＲ２／ＨＥＲ２ホモ二量体を形成することができない（Ｔａｍａｓｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。そのため、ＨＥＲ２過剰発現癌細胞においてＨＥＲ２及びＨＥＲ３リン酸化が阻害され、続いて、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３受容体からの増殖と抗アポトーシスシグナル伝達を停止させ、最終的にアポトーシスによって細胞死が誘導される。しかしながら、これらのバイパラトピック結合剤は、ＨＥＲ２受容体の総発現量に影響しない（Ｔａｍａｓｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＨＥＲ２受容体の総発現は、依然として比較的に高く、ＨＥＲ２受容体の不完全な不活性化を引き起こす可能性がある。更に、これらの構築物は、全身適用に必要な所望の薬物動態特性を示していない。血流中の長い血清半減期やＦｃＲｎ受容体への結合によるタンパク質リサイクルメカニズムのような所望の機能は、これらの構築物では実現されていない。更に、これらのバイパラトピック構築物は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）や抗体依存－細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）のような抗体エフェクター機能を利用していない。これらのエフェクター機能は、バイパラトピック結合剤の生体内での抗腫瘍活性を更に高めることに寄与することができる。最後に、これらのバイパラトピック結合剤は、Ｔ細胞エピトープを回避するように更に改変されていないため、潜在的に免疫応答を誘導する傾向がある。これによって、免疫能の正常な患者の反復投与後の忍容性と血清値が大幅に低減する可能性がある。

更に、ＨＥＲ２のＤ４とＤ２エピトープに結合するトラスツズマブと３９Ｓ抗体可変配列の融合体を含む四価バイパラトピックＨＥＲ２標的抗体薬物複合体が記載されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２９，１１７－１２９）。この複合体は、ＭｅｄｉｍｍｕｎｅによってＭＥＤＩ４２７６という名前で商品化され、第１／２相臨床試験（ＮＣＴ０２５７６５４８）でテストされた。しかしながら、ツブリシン毒性ペイロードを融合していないアーム無し形態のバイパラトピックＩｇＧ融合構築物は、癌細胞増殖の阻害を誘導するには十分ではない。逆に、このＩｇＧ融合分子の非複合形態は、ＨＥＲ２過剰発現癌細胞モデルにおいて高濃度で癌細胞増殖の活性化を誘導する。これは、シグナル伝達能力を有するＨＥＲ２ホモ二量体及びヘテロ二量体の形成を増やすようにＨＥＲ２＿ＥＣＤ２及びＨＥＲ２＿ＥＣＤ４に結合することによって引き起こされる可能性がある。一方、この四価バイパラトピックＨＥＲ２標的抗体の非複合ＩｇＧ融合タンパク質形態は、ＨＥＲ２受容体発現のダウンレギュレーションを誘導することができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２９，１１７－１２９）。纏めていえば、四価ｓｃＦｖ＿４Ｄ５－ＩｇＧ＿３９Ｓ融合タンパク質は、ＨＥＲ２発現をダウンレギュレートするが、ＨＥＲ２シグナル伝達に対する阻害を示しておらず、その代わりに特定のＨＥＲ２過剰発現モデルで癌細胞増殖の活性化を招く。これは、ＨＥＲ２のダウンレギュレーションと癌細胞の成長に対する阻害が簡単に関連しているわけではないことも示している。明らかに、ＨＥＲ２標的薬剤のＨＥＲ２依存性シグナル伝達経路に対する阻害は、臨床応用に必須のものである。例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン）は、ＨＥＲ３のシグナル伝達を確かに遮断し、ＰＩ３Ｋ経路活性化突然変異のないＨＥＲ２過剰発現癌において細胞増殖を確かに大幅に減少している。

上記した従来技術に基づき、本発明の目的は、従来技術の上記欠点を鑑みて改善されたＨＥＲ２標的薬剤を提供するための手段及び方法を提供し、特に、ＨＥＲ２標的薬剤に結合する他の小分子毒素がない場合、改善されたＨＥＲ２シグナル伝達阻害、発現ダウンレギュレーション、重合及びクラスタリング、受容体拡散の阻害、分解及び／又はリサイクルの阻害を示すＨＥＲ２標的薬剤を提供することである。この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。

本発明は、四量体ポリペプチドに関し、
ＮからＣの方向に第１のＶＬ抗原結合ドメイン及び第１のＣＬ定常ドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、
ＮからＣの方向に第１のＶＨ抗原結合ドメイン、第１のＣＨ１定常ドメイン、第１のＣＨ２定常ドメイン及び第１のＣＨ３定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、
ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに特異的に結合する第１のリガンドであって、第１のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第１のドメイン間アミノ酸リンカーにより第１のＶＬ抗原結合ドメインのＮ末端に連結され、あるいは、第２のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第１のドメイン間アミノ酸リンカーにより第１のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結される、第１のリガンドと、
第１のポリペプチド鎖の第１のＶＬ抗原結合ドメイン及び第２のポリペプチド鎖の第１のＶＨ抗原結合ドメインが一緒になって構成する、ＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに特異的に結合する第２のリガンド、特にＦａｂドメインと、
ＮからＣの方向に第２のＶＬ抗原結合ドメイン及び第２のＣＬ定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖と、
ＮからＣの方向に第２のＶＨ抗原結合ドメイン、第２のＣＨ１定常ドメイン、第２のＣＨ２定常ドメイン及び第２のＣＨ３定常ドメインを含む第４のポリペプチド鎖と、
ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに特異的に結合する第３のリガンドであって、第３のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第２のドメイン間アミノ酸リンカーにより第２のＶＬ抗原結合ドメインのＮ末端に連結され、あるいは、第４のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第２のドメイン間アミノ酸リンカーにより第２のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結される、第３のリガンドと、
第３のポリペプチド鎖の第２のＶＬ抗原結合ドメイン及び第４のポリペプチド鎖の第２のＶＨ抗原結合ドメインが一緒になって構成する、ＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに特異的に結合する第４のリガンド、特にＦａｂドメインと、を含むか、又はそれらからなる。

従って、本発明による四量体ポリペプチドは、２倍の２つの異なるＨＥＲ２結合パラトープを含み、つまり、四価である。当該ポリペプチドは、単一の分子でＤ１とＤ４という２つの異なるＨＥＲ２エピトープへの結合部位を含むため、バイパラトピックである。

驚くべきことに、当該ポリペプチドは、従来の抗体及び二価バイパラトピックポリペプチド（合わせて２つの結合パラトープからなる）に比べて、優れたＨＥＲ２不活性化を示し、細胞の成長と増殖、アポトーシス及び他の形態の細胞死、ＨＥＲ２内在化及びＨＥＲ２リサイクル阻害、ＨＥＲ２発現ダウンレギュレーション及びＨＥＲ２分解、ＨＥＲ２架橋、ＨＥＲ２二量体化の阻害及びＨＥＲ２受容体表面移動度の低下にも効果がある。更に、分子サイズの増加によって腎臓濾過が除外され、ＦｃＲｎにより媒介されるリサイクルによって薬物動態特性が増やされる。最後に、Ｆｃ部分が存在するため、抗体依存－細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が発生する場合もある。最後に、全ての配列がヒト抗体の配列であるため、構築物は非免疫原性配列からなる。纏めていえば、本発明による四量体ポリペプチドは、ＨＥＲ２発現癌の全身療法の有望な候補である。

別の実施形態において、本発明は、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩、及び少なくとも１つの医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤のうちの少なくとも１つを含む医薬組成物に関する。

本発明は、更に、四量体ポリペプチドの悪性腫瘍性疾患の予防又は治療方法における応用、ポリペプチドをコードする単離された核酸、ポリペプチドを産生するための宿主細胞、及びポリペプチドの取得方法に関する。

バイパラトピック抗ＨＥＲ２結合剤のスキームを示す。 バイパラトピック抗ＨＥＲ２結合剤の更なるスキームを示す。 ＣＨＯ細胞において構築物４４１の軽鎖と重鎖を共発現するためのプラスミドのベクターマップ（二重発現カセットを有するＰｙｍｅｘ１０に基づくベクター［ＣＭＶ ＧＯＩ ｐｏｌｙＡ］）を示す。 ＣＨＯ細胞において構築物４７Ｃ２の軽鎖と重鎖を共発現するためのプラスミドのベクターマップ（二重発現カセットを有するＰｙｍｅｘ１０に基づくベクター［ＣＭＶ ＧＯＩ ｐｏｌｙＡ］）を示す。 ＣＨＯ細胞において構築物８４１を発現するためのプラスミドのベクターマップを示す。 タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーからの構築物４４１の溶出プロファイルを示す。 カチオン交換クロマトグラフィーからの構築物４４１の溶出プロファイルを示す。 サイズ排除クロマトグラフィーからの構築物４４１の溶出プロファイルを示す。 構築物４４１の精製からの画分のクーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 構築物４４１（ｓｃＦＶ－ＩｇＧ）の発現中におけるＣＨＯの生死判別試験を示す。示された時間でＣＨＯ細胞における構築物４４１の発現最適化を行った。細胞をＭＩｒｕｓからのＣＨＯｇｒｏ培地（ＭＩＲ ６２６０）で培養し、更にそれぞれ遊離システイン（還元型）（２）、グルタチオン（３）、ウシ胎児血清（４）、又は全ての添加剤（５）を加えた。ＣＨＯ細胞をＣＡＳＹセルカウンター（Ｓｃｈａｒｆｅ Ｓｙｓｔｅｍ）で分析した。 示された時間後にＣＨＯ細胞の培地に分泌された構築物４４１発現のウェスタンブロットを示す。細胞をＭＩｒｕｓからのＣＨＯｇｒｏ培地（ＭＩＲ６２６０）で培養し（１）、更にそれぞれ遊離システイン（還元型）（２）、グルタチオン（３）、ウシ胎児血清（４）、又は全ての添加剤（５）を加えた。アセトン沈殿により培地からタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ ＰＡＧＥバッファーに再溶解させた。タンパク質を４～１２％の勾配ゲルで分離し、Ｏｄｙｓｓｅｙシステム（ＬＩ－ＣＯＲ）でウェスタンブロットを分析した。精製された無傷の全長構築物４４１は、対照（Ａ）として示され、１７０ｋＤａのマーカーを超える。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の分子量マーカーであるＰａｇｅ ｒｕｌｅｒは赤で示される。 ４日間処理した後のＢＴ４７４細胞を用いた細胞増殖アッセイ（ＸＴＴ）を示す。トラスツズマブ（ＴＺＢ）、バイパラトピックＤＡＲＰｉｎ（６Ｌ１Ｇ）、及びバイパラトピック構築物の異なる融合変異体が示される。ＬＦ ＩｇＧ ＨＬ（構築物４４１のネズミ親）、ＨＦ ＩｇＧ ＨＬ（構築物２４１のネズミ親）は、バイパラトピックＤＡＲＰｉｎ ６Ｌ１Ｇに比べて同様な抗増殖活性を示し、トラスツズマブ（ＴＺＢ）より優れている。ＨＦ ＩｇＧ ＬＨ（ネズミ変異体、配列なし）及びＬＦ ＩｇＧ ＬＨ（ネズミ配列、配列なし）は、バイパラトピックＤＡＲＰｉｎに比べて低下した抗増殖活性及びより高いＩＣ５０濃度を示す。 リンカーの長さの影響をテストするために４日間処理した後のＢＴ４７４細胞を用いた細胞増殖アッセイ（ＸＴＴ）を示す。バイパラトピックＤＡＲＰｉｎ（６Ｌ１Ｇ）とバイパラトピック構築物（４４１のネズミ親構築物）の異なる融合リンカー変異体とを比較する。２－ＡＡリンカー（ＧＳ）は、最も高い抗増殖活性を示す。４－ＡＡ、７－ＡＡ及び１２－ＡＡリンカーは同様な活性を示す。２２－ＡＡリンカー変異体は低下した活性を示す。 ４日間処理した後のＢＴ４７４細胞を用いた細胞増殖アッセイ（ＸＴＴ）を示す。バイパラトピックＤＡＲＰｉｎ（６Ｇ； ６Ｌ１Ｇ）、バイパラトピック構築物４４１（４４１）、バイパラトピック構築物４１１（ヒト化κ１ ＶＨ１）及びバイパラトピック構築物４４３（ヒト化κ４ ＶＨ３）が示される。４４３が低下した活性を示した以外、他の全てが同様なプラトーレベルの抗増殖活性を示す。 ＴＺＢ ｓｃＦｖに融合した場合、異なるヒト化形態のＡ２１ ＩｇＧで４日間処理した後のＢＴ４７４細胞を用いた細胞増殖アッセイ（ＸＴＴ）を示す。ヒト化の戦略は前述した通りである。異なる変異体は、ヒト化κ１ ＶＨ３又はヒト化κ１ ＶＨコア移植組織を使用する。 ４日間処理した後のＢＴ４７４細胞を用いたＸＴＴ細胞増殖アッセイを示す。四価ＩｇＧ（ＨＦ ＩｇＧ ＨＬ及びＬＦ ＩｇＧ ＨＬネズミ）と二価Ｆａｂ融合体（ＨＦ Ｆａｂ ＨＬ及びＬＦ Ｆａｂ ＨＬネズミ）とを比較する。全ての構築物は同様なプラトー値とＩＣ５０値を示す。 ４日間処理した後のＳＫＢＲ３細胞を用いたＸＴＴ細胞増殖アッセイを示す。バイパラトピックＤＡＲＰｉｎ（６Ｇ）、バイパラトピック構築物（４４１ ｔｆ）、トラスツズマブ（ＴＺＢ）が示される。 ４日間処理した後のＣＡＬＵ－３細胞を用いた細胞増殖アッセイ（ＸＴＴ）を示す。バイパラトピックＤＡＲＰｉｎ（６Ｇ）、バイパラトピック構築物（構築物４４１（４４１ｔｆ））、トラスツズマブ（ＴＺＢ）が示される。 ４日間処理した後のＢＴ４７４細胞を用いた細胞増殖アッセイ（ＸＴＴ）を示し、ドメイン１結合ユニットの効果をテストする。Ａ２１（構築物４４１ｔｆ）又は７Ｃ２融合体を有するバイパラトピック構築物は、異なるＩＣ５０及びプラトーレベルを示す。 ４日間処理した後のＢＴ４７４細胞を用いた細胞増殖アッセイ（ＸＴＴ）を示し、ドメイン１結合ユニットの効果をテストする。Ａ２１（構築物４４１）又は３９Ｓ（３９ｓ ＨＦ ＩｇＧ ＨＬ）を含むバイパラトピック構築物が示される。 ４日間処理した後のＨＣＣ１４１９細胞を用いたＸＴＴ細胞増殖アッセイを示す。バイパラトピックＤＡＲＰｉｎ（６Ｇ； ６Ｌ１Ｇ）、バイパラトピック構築物４４１（４４１ｔｆ）及び二価ＬＦ－ｏａＦａｂＦｃ（Ａ２１－ＴＺＢ－４ｏａ）が示される。４４１及び６Ｇは、４日後に細胞増殖に対して同様な阻害を示す。４４１に比べて、ＬＦ－ｏａＦａｂＦｃは、細胞増殖に対する阻害が少々低下する。 ４日間処理した後のＢＴ４７４及びＨＣＣ１４１９細胞を用いたＸＴＴ細胞増殖アッセイを示す。全てヒトに由来するものである。 ４日間処理した後のＢＴ４７４及びＨＣＣ１４１９細胞を用いたＸＴＴ細胞増殖アッセイを示す。全てヒトに由来するものである。 ａ）４日間処理した後のＢＴ４７４（左）及びＨＣＣ１４１９（右）細胞を用いたＸＴＴ細胞増殖アッセイの上部パネル、及び４日間処理した後のＢＴ４７４（左）及びＨＣＣ１４１９（右）細胞を用いたＸＴＴ細胞増殖アッセイ（より高い親和性を有する変異体（ＮＧＳ及びＧＧＧ））の下部パネル、ｂ）ＮＧＳの新しい発現を用いて繰り返して行った実験を示す。 ４日間処理した後のＢＴ４７４（左）及びＨＣＣ１４１９（右）細胞を用いたＸＴＴ細胞増殖アッセイを示す。 ＨＣＣ１４１９細胞を３Ｄスフェロイドに成長させたＸＴＴ細胞増殖アッセイを示す。 示された薬剤（ネズミ）により２４時間後処理（ＢＴ４７４）を行った後のウェスタンブロットを示す。 ３日間処理した後のＢＴ４７４細胞におけるアポトーシスの誘導の上部パネルを示す。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性細胞の平均数を４回繰り返してから決定し、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒによりカウントし、スチューデントのｔ検定により分析した。トラスツズマブ（ＴＺＢ）に比べて、バイパラトピック構築物（４４１，４４１ｔｆ）は、明らかにより多くの細胞死を誘導した。４４１とバイパラトピックＤＡＲＰｉｎ（６Ｌ１Ｇ）は、同様なレベルの細胞死を示す。また、３日間処理した後のＢＴ４７４細胞におけるアポトーシスの誘導の下部パネルを示す。アネキシンＶ陽性細胞の平均数を３～４回繰り返してから決定し、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒによりカウントし、スチューデントのｔ検定で分析した。トラスツズマブ（ＴＺＢ）に比べて、バイパラトピック構築物４４１は、明らかにより多くのアポトーシスを誘導した。構築物４４１と６Ｌ１Ｇは同様なレベルのアポトーシスを示す。 示された薬剤で３日間処理した後のＢＴ４７４細胞の画像を示す。 Ａｌｅｘａ６４７標識トラスツズマブ（ＴＺＢ）、バイパラトピック構築物４４１及びバイパラトピック片腕構築物ｏａＬＦ及びｏａＨＦを、１００ｎＭの濃度で３００万のＢＴ４７４細胞と共にＮａＮ３（０．１％）及びＢＳＡ（１％）を含む３ｍｌのＰＢＳにおいて４℃で１時間インキュベートした結果を示す。結合前に、内在化を遮断するために、０．１％のＮａＮ３で１％のＢＳＡを含むＰＢＳにおいてＢＴ４７４細胞を前処理したことに留意されない。その後、ＣｙＦｌｏｗ Ｓｐａｃｅ機器（Ｐａｒｔｅｃ）により細胞を分析した。全ての結合剤は、ＨＥＲ２陽性ＢＴ４７４細胞の表面への特異的な結合を示す。 １００ ｎＭの示された薬剤で処理した後の細胞死の誘導を示す。処理時点の２４時間前にＢＴ４７４、Ｎ８７、ＨＣＣ１４１９及びＳＫＢＲ３細胞を９６黒色クリアウェルの顕微鏡プレート（Ｎｕｎｃ）に接種し、３日間連続して処理し、全細胞をＨＯＥＣＨＳＴ－３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）で膜透過性の死細胞を染色した。細胞をＬｉｏｎｈｅａｒｔ ＦＸ自動顕微鏡（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により分析し、Ｇｅｎ５ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によりヨウ化プロピジウム及びＨＯＥＣＨＳＴ－３３３４２陽性細胞の数を定量した。ヨウ化プロピジウムとＨＯＥＣＨＳＴ－３３３４２陽性細胞の比率は、生物学的反復を３回行ってから計算され、平均値及びＳＤは、対応する棒グラフに示される。トラスツズマブ（ＴＺＢ）又はトラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ（ＴＺＢ＋ＰＺＢ）に比べて、ＨＥＲ２のドメイン１及び４に結合するバイパラトピック結合剤（６Ｌ１Ｇ、４４１、８４１、ＬＦｏａ、２４１、６４１、ＨＦｏａ、７Ｃ２ＬＦ）は、ＨＥＲ２陽性癌細胞でより多くの死細胞を持続的に誘導する。 ＮＳＧマウスの血清における構築物４４１の半減期を示す。サンドイッチＥＬＩＳＡ法により先に４４１を注射（３ｍｇ／ｋｇ）したマウスの採取された血清を分析した。４４１は約４．３時間のアルファ相を示し、引き続き４５時間以上のベータ相を示した。 ＳＣＩＤベージュマウス内のＮ８７異種移植片に対する４４１の生体内活性を示す。Ｎ８７腫瘍のサイズが１５０ｍｍ３に達した後、マウスに４４１（１０ｍｇ／ｋｇ）を４週間に８回注射して処理する。未処理のマウス及びＴＺＢ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はｈｕＡ２１Ｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスに比べて、４４１は、腫瘍のサイズを明らかに減少する。 トラスツズマブ（ＴＺＢ）、ｈｕＡ２１Ｇ（Ａ２１）、それらの組み合わせ又は４４１で２時間処理した後のＢＴ－４７４細胞、及び対照とされる未処理（抗ヒト一次抗体を加えるか、又は加えない）の細胞の代表的な顕微鏡画像を示す。２－（４－アミジノフェニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボキシミドアミド（ＤＡＰＩ）で核を染色し、ヤギ由来の抗ヒトＦｃ抗体で抗体を検出し、抗ＬＡＭＰ１抗体でリソソームコンパートメントを検出した。 構築物４４１及び８４１、ｈＡ２１Ｇ、トラスツズマブ（ＴＺＢ）、トラスツズマブとｈＡ２１Ｇの組み合わせ（ＴＺＢ＋ｈＡ２１Ｇ）、ペルツズマブ（ＰＺＢ）、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ（ＴＺＢ＋ＰＺＢ）、及びＨＳＰ９０阻害剤であるゲルダナマイシン（ＧＡ）の経時的処理及び後続の表面タンパク質内在化及び分解アッセイの結果を示す。

発明の具体的説明

用語及び定義
別途定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）の当業者が普通に認識しているものと同じ意味を有する。標準的な技術は、分子的、遺伝的、生化学的方法（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．を参照）及び化学的方法に適用される。

本明細書の文脈における「ある主題はある対象を含む」という用語は、当該主題が当該対象からなり、つまり、「含む」という用語が「からなる」と同義である個別の実施形態を含む。他の個別の実施形態において、対象は、主題に含まれるいくつかの異なるもののうちの１つである。

本明細書の文脈におけるリガンドという用語は、標的、特にＨＥＲ２に結合するポリペプチドの領域に関する。

本明細書の文脈におけるドメイン間アミノ酸リンカーという用語は、第１のポリペプチドドメインのＣ末端を第２のポリペプチドドメインのＮ末端に共有結合させるポリペプチドリンカーに関する。

本明細書の文脈におけるエピトープという用語は、抗体が結合する抗原分子の領域に関する。

本明細書の文脈におけるＦａｂドメインという用語は、Ｃ末端でＣＬドメインに（共有結合）連結されるＶＬドメインからなる第１の鎖と、Ｃ末端でＣＨ１ドメインに（共有結合）連結されるＶＨドメインからなる第２の鎖とを含み、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインがジスルフィド結合によって連結される抗体分子に関する。

本明細書の文脈におけるＶＬ抗原結合ドメインという用語は、抗体の軽鎖、特に免疫グロブリンＧ軽鎖の可変ドメインに関する。

本明細書の文脈におけるＶＨ抗原結合ドメインという用語は、抗体の重鎖、特に免疫グロブリンＧ重鎖の可変ドメインに関する。

本明細書の文脈におけるＣＬ定常ドメインという用語は、抗体の軽鎖、特に免疫グロブリンＧ軽鎖の定常ドメインに関する。

本明細書の文脈におけるＣＨ１定常ドメインという用語は、抗体の重鎖、特に免疫グロブリンＧ重鎖の第１の定常ドメインに関する。

本明細書の文脈におけるＣＨ２定常ドメインという用語は、抗体の重鎖、特に免疫グロブリンＧ重鎖の第２の定常ドメインに関する。

本明細書の文脈におけるＣＨ３定常ドメインという用語は、抗体の重鎖、特に免疫グロブリンＧ重鎖の第３の定常ドメインに関する。

本明細書の文脈における一本鎖可変フラグメントという用語は、ポリペプチドリンカー（ｓｃＦｖリンカー鎖）によりＶＬ抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ軽鎖とも称される）に共有結合するＶＨ抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ重鎖とも称される）に関する。

本明細書において、陽性という用語は、マーカーの発現の文脈で用いられる場合、蛍光標識抗体により測定された抗原の発現を指し、標識の「陽性」と言われる構造（例えば、細胞）上における蛍光は、同一の標的に特異的に結合していないアイソタイプ適合蛍光標識抗体で染色した場合に比べて、蛍光強度の中央値が少なくとも３０％高く（≧３０％）、特に≧５０％又は≧８０％である。マーカーのこのような表現は、マーカーの名前の後に続く上付き文字の「プラス」（^＋）で示され、例えばＣＤ４^＋である。

本明細書において、陰性という用語は、マーカーの発現の文脈で用いられる場合、蛍光標識抗体により測定された抗原の発現を指し、蛍光強度の中央値は、同一のターゲットに特異的に結合していないアイソタイプ適合抗体の蛍光強度の中央値よりも３０％未満高く、特に１５％未満高い。マーカーのこのような表現は、マーカーの名前の後に続く上付き文字のマイナス（^－）で示され、例えばＣＤ１２７^－である。

マーカーの高発現について、例えば、ＣＤ２５の高発現とは、ＦＡＣＳによって検出された明らかに区別可能な細胞集団におけるマーカーの発現量が、細胞あたりにより低い蛍光強度によって特徴付けられる他の集団に比べて、細胞あたりに最も高い蛍光強度を示すことを指す。高表現は、マーカーの名前の後に続く上付き文字の「ｈｉｇｈ」又は「ｈｉ」で示され、例えばＣＤ２５^ｈｉｇｈである。「高く発現される」という用語は、同じ特徴を指す。

マーカーの低発現について、例えば、ＣＤ２５の低発現とは、ＦＡＣＳによって検出された明らかに区別可能な細胞集団におけるマーカーの発現量が、細胞あたりにより高い蛍光強度によって特徴付けられる他の集団に比べて、細胞あたりに最も低い蛍光強度を示すことを指す。低発現は、マーカーの名前の後に続く上付き文字の「ｌｏｗ」又は「ｌｏ」で示され、例えばＣＤ２５^ｌｏｗである。「低く発現される」という用語は、同じ特徴を指す。

マーカーの発現は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ又は多重分析などの技術によって測定することができる。

本明細書の文脈におけるポリペプチドという用語は、アミノ酸がペプチド結合によって接続される線形鎖を形成する５０個以上のアミノ酸からなる分子に関する。ポリペプチドのアミノ酸配列は、（生理学的に発見された）タンパク質全体又はその断片のアミノ酸配列を表すことができる。本明細書において、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換可能に使用され、タンパク質及びそのフラグメントを含む。本明細書において、ポリペプチドは、アミノ酸残基配列として開示されている。

本明細書の文脈におけるペプチドという用語は、アミノ酸がペプチド結合によって接続される線形鎖を形成する、最大５０個のアミノ酸、特に８～３０個のアミノ酸、より特に８～１５個のアミノ酸からなる分子に関する。

アミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端まで提供される。配列位置の大文字は、１文字のコードのＬ－アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３^ｒｄ ｅｄ．ｐ．２１）。アミノ酸配列位置の小文字は、対応するＤ－又は（２Ｒ）－アミノ酸を指す。配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に左から右へ書かれている。標準名称法によると、アミノ酸残基配列は、アラニン（Ａｌａ，Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ，Ｖ）のように、３文字又は１文字のコードで命名される。Ｊは、ロイシン又はイソロイシンである。

遺伝子という用語は、転写・翻訳された後に特定のポリペプチド又はタンパク質をコード可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列は、関連する遺伝子のより大きな断片又は全長コード配列を同定するために用いられることができる。より大きなフラグメント配列の単離方法は、当業者に公知のものである。

遺伝子発現或は遺伝子産物という用語は、遺伝子が転写・翻訳される際に核酸（ＲＮＡ）又はアミノ酸（例えば、ペプチド又はポリペプチド）を生成するプロセス及びその産物を指す。

本明細書で使用されるように、発現は、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが引き続きペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。発現は、転写及び翻訳のレベルで、即ち、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物で測定されることができる。

本明細書に開示される配列と類似する又は相同である（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）配列も、本発明の一部である。いくつかの実施形態では、アミノ酸レベルで、配列同一性は、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上とすることができる。核酸レベルで、配列同一性は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上とすることができる。また、核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下（例えば、高度に厳密なハイブリダイゼーション条件下）でストランドの補体にハイブリダイズされる場合、実質的同一性が存在する。核酸は、全細胞、細胞溶解物、或は部分的に精製された、又は実質的に純粋な形態で存在してよい。

２つの配列間の「相同性」又は「配列同一性」又は「類似性」の計算（これらの用語は、本明細書で交換可能に使用される）は、以下のように実行される。最適に比較するために配列をアライメントする（例えば、比較するために、最適にアライメントするように第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の１つ又は両方にギャップを導入してもよく、非相同配列を無視してもよい）。具体的な実施形態において、比較するためにアライメントされた参照配列の長さは、当該参照配列の長さの少なくとも３０％、特に少なくとも４０％、より特に少なくとも５０％、更に特に少なくとも６０％、更に特に少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同じものによって占められている場合、分子はその位置で同一であるとする（本明細書で使用されるように、アミノ酸又は核酸の「相同性」はアミノ酸又は核酸の「同一性」に相当する）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最適にアライメントするために導入される必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列に共有される同一の位置の数の関数である。循環して関連するタンパク質の場合、同一性パーセントを計算するために必要な機能的に同等の残基の最適なアライメントを達成するために、パートナーのうちの１つの配列を適切に分割して２つのセクションにおいてアライメントする必要がある。

本明細書の文脈において、配列同一性及び配列同一性のパーセントという用語は、２つのアライメントされた配列を比較することにより決定された値を指す。比較用の配列アライメント方法は、当分野において公知のものである。比較用の配列アライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２，４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３のグローバルアライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５，２４４４の類似性検索方法、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化実装によって実施されることができ、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公開されている。

アミノ酸配列を比較するための１つの例は、以下のデフォルト設定を使用したＢＬＡＳＴＰアルゴリズムである：期待閾値（Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：１０、ワードサイズ（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）：３、クエリー範囲内の最大マッチ（Ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ）：０、マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップコスト（Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ）：存在（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）１１、伸長（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）１、組成調整（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ）：条件付き組成スコアマトリックス補正（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）。核酸配列を比較するための１つの例は、以下のデフォルト設定を使用したＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである：期待閾値（Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：１０、ワードサイズ（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）：２８、クエリー範囲内の最大マッチ（Ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ）：０、マッチ／ミスマッチスコア（Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ）：１．－２、ギャップコスト（Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ）：線形。特に説明しない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、タンパク質及び核酸の比較を行うためにそれぞれ上記デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴプログラム一式（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３－４１０）を使用して得られた値を指す。

本明細書の文脈において、抗体という用語は、全抗体を指し、免疫グロブリンタイプＧ（ＩｇＧ）、タイプＡ（ＩｇＡ）、タイプＤ（ＩｇＤ）、タイプＥ（ＩｇＥ）又はタイプＭ（ＩｇＭ）、任意の抗原結合フラグメント又はその一本鎖、及び関連する又はそれに由来する構築物を含むが、これらに限定されない。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）で構成される。重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略称する）及び軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣ_Ｌで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。同様に、この用語は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである所謂ナノボディ又は単一ドメイン抗体を包含する。

本明細書の文脈において、ヒト化抗体という用語は、最初に非ヒト種の免疫細胞によって産生され、そのタンパク質配列がヒトで自然に産生された抗体変異体との類似性を高めるように修飾された抗体を指す。本明細書で使用されるヒト化抗体という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に移植した抗体を含む。ヒトフレームワーク配列内、及び別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列内で、フレームワーク領域を別途修飾してもよい。

本明細書の文脈における抗体様分子という用語は、高い親和性（Ｋｄ≦１０Ｅ－８ ｍｏｌ／ｌ）で別の分子又は標的に特異的に結合可能な分子を指す。抗体様分子は、抗体の特異的結合と同じようにその標的に結合する。抗体様分子という用語は、設計アンキリンリピートタンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｚｕｒｉｃｈ）などのリピートタンパク質、高い特異性と高親和性の標的タンパク質結合を示す改変抗体模倣タンパク質を含む（ＵＳ２０１２／１４２６１１，ＵＳ２０１６／２５０３４１，ＵＳ２０１６／０７５７６７及びＵＳ２０１５／３６８３０２を参照し、その全てが参照により本明細書に組み込まれる）。抗体様分子という用語は、アルマジロリピートタンパク質に由来するポリペプチド、ロイシンリッチリピートタンパク質に由来するポリペプチド、及びテトラトリコペプチドリピートタンパク質に由来するポリペプチドを更に包含するが、これらに限定されない。

抗体様分子という用語は、以下のものに由来する特異的結合ポリペプチドを更に包含する。
・タンパク質Ａドメイン、
・フィブロネクチンドメインＦＮ３、
・コンセンサスフィブロネクチンドメイン、
・リポカリン（Ｓｋｅｒｒａ，２０００，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８２（１－２），３３７－５０を参照）、
・ジンクフィンガータンパク質に由来するポリペプチド（Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１１（７），８０３－８１３を参照）、
・Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）又はＳｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）、
・ＰＤＺドメイン、
・ガンマクリスタリン、
・ユビキチン、
・システインノットポリペプチド又はノッチン、
・シスタチン、
・Ｓａｃ７ｄ、
・三重ヘリックスコイルドコイル（アルファボディとしても知られている）、
・クニッツドメイン又はクニッツ型プロテアーゼ阻害剤、及び
・炭水化物結合モジュール３２－２。

タンパク質Ａドメインに由来するポリペプチドという用語は、プロテインＡの誘導体であって、免疫グロブリンのＦｃ領域及びＦａｂ領域に特異的に結合可能な分子を指す。

アルマジロリピートタンパク質という用語は、ヘアピン構造を形成する一対のアルファヘリックスにより特徴付けられる少なくとも１つのアルマジロリピートを含むポリペプチドを指す。

本明細書の文脈におけるヒト化ラクダ抗体という用語は、重鎖又は重鎖の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）のみからなり、そのアミノ酸配列がヒトで自然に産生された抗体との類似性を高めるように修飾されたため、ヒトに投与される場合、低下した免疫原性を示す抗体を指す。ラクダ抗体をヒト化する一般的な策略は、Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８４（５），３２７３－３２８４及びＵＳ２０１１／１６５６２１に示す通りである。

本明細書の文脈において、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域という用語は、細胞生物学及び免疫学の分野における公知の意味で使用され、ジスルフィド結合により共有結合されるＣ_Ｈ２ドメインとＣ_Ｈ３ドメインで構成される２つの同一の重鎖フラグメントを含む抗体画分を指す。

本発明の文脈における特異的結合という用語は、所定の親和性及び標的特異性でそれらの標的に結合するリガンドの特性を指す。このようなリガンドの親和性は、リガンドの解離定数で示される。特異的に反応するリガンドは、その標的に結合する時に≦１０^－７ｍｏｌ／Ｌの解離定数を有するが、解離定数は分子との相互作用において少なくとも３桁も高く、当該分子は、化学組成が全体的に標的に類似するが、三次元構造が異なる。

本明細書の文脈において、解離定数（ＫＤ）という用語は、化学及び物理学の分野における公知の意味で使用され、［殆ど２つの］異なる成分で構成される複合体がその構成成分に可逆的に解離する傾向を測定する平衡定数を指す。当該複合体は、例えば、抗体Ａｂと抗原Ａｇで構成される抗体－抗原複合体ＡｂＡｇであってよい。Ｋ_Ｄは、モル濃度［ｍｏｌ／ｌ］で表され、［Ａｇ］の結合部位の半分が占められている場合の［Ａｂ］の濃度に対応する。つまり、未結合の［Ａｂ］の濃度は、［ＡｂＡｇ］複合体の濃度に等しい。解離定数は、下記式に基づいて計算されることができる。

［Ａｂ］は抗体の濃度であり、［Ａｇ］は抗原の濃度であり、［ＡｂＡｇ］は、抗体抗原複合体の濃度である。

本明細書の文脈において、解離速度（Ｋｏｆｆ，［１／秒］）及び結合速度（Ｋｏｎ，［１／秒＊Ｍ］）という用語は、化学及び物理学の分野における公知の意味で使用され、抗体とその標的抗原との解離（Ｋｏｆｆ）又は会合（Ｋｏｎ）を測定する速度定数を指す。Ｋｏｆｆ及びＫｏｎは、当分野で既に確立された方法を利用して実験的に決定することができる。抗体のＫｏｆｆ及びＫｏｎを決定するための方法として、表面プラズモン共鳴を採用する。これは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）又はＰｒｏｔｅＯｎ（商標）システムなどのバイオセンサシステムにおける原理である。それらは、下記式を使用して解離定数ＫＤを決定するためにも用いられる。

本明細書で使用されるように、医薬組成物という用語は、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩、及び少なくとも１つの医薬的に許容される担体を指す。いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、局所、非経口又は注射可能な投与に適する形態で提供される。

本明細書で使用されるように、医薬的に許容される担体という用語は、当業者に公知のように、任意の溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、バインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料など及びそれらの組み合わせを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ＩＳＢＮ ０８５７１１０６２４を参照）。

本明細書で使用されるように、任意の疾患又は障害（例えば、癌）の治療という用語は、１つの実施形態において、疾患又は障害を改善する（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つを遅延するか、又は阻止するか、又は減少する）ことを指す。別の実施形態において、「治療」は、患者が識別できない可能性のあるものを含め、少なくとも１つの物理的パラメータを軽減又は改善することを指す。更に別の実施形態において、「治療」は、身体上（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学上（例えば、身体的パラメータの安定化）又はその両方の疾患又は障害を調節することを指す。以下に特に説明しない限り、疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、当分野における公知のものである。

本明細書の文脈において、二量体という用語は、２つのサブユニットからなるユニットを指す。

本明細書の文脈において、ホモ二量体という用語は、同一であるか、又は同類サブユニットの高度に類似するメンバーである２つのサブユニットで構成される二量体を指す。

本明細書の文脈において、アミノ酸リンカーという用語は、一本鎖ポリペプチドを生成するために２つのポリペプチドを接続するための可変長のポリペプチドを指す。本明細書で詳しく説明されている発明を実施するためのリンカーの例示的な実施形態は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０又は５０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド鎖である。アミノ酸リンカーの非限定的な例は、ポリペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３）である。

本発明の第１の側面は、四量体ポリペプチドに関する。

第１の側面の第１の代替案によれば、四量体ポリペプチドは、
・ＮからＣの方向に第１のＶＬ抗原結合ドメイン及び第１のＣＬ定常ドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、
・ＮからＣの方向に第１のＶＨ抗原結合ドメイン、第１のＣＨ１定常ドメイン、第１のＣＨ２定常ドメイン及び第１のＣＨ３定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、
・ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに特異的に結合する第１のリガンドであって、第１のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第１のドメイン間アミノ酸リンカーにより第１のＶＬ抗原結合ドメインのＮ末端に連結され、あるいは、第２のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第１のドメイン間アミノ酸リンカーにより第１のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結される、第１のリガンドと、
・第１のポリペプチド鎖の第１のＶＬ抗原結合ドメイン及び第２のポリペプチド鎖の第１のＶＨ抗原結合ドメインが一緒になって構成する、ＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに特異的に結合する第２のリガンド、特にＦａｂドメインと、
・ＮからＣの方向に第２のＶＬ抗原結合ドメイン及び第２のＣＬ定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖と、
・ＮからＣの方向に第２のＶＨ抗原結合ドメイン、第２のＣＨ１定常ドメイン、第２のＣＨ２定常ドメイン及び第２のＣＨ３定常ドメインを含む第４のポリペプチド鎖と、
・ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに特異的に結合する第３のリガンドであって、第３のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第２のドメイン間アミノ酸リンカーにより第２のＶＬ抗原結合ドメインのＮ末端に連結され、あるいは、第４のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第２のドメイン間アミノ酸リンカーにより第２のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結される、第３のリガンドと、
・第３のポリペプチド鎖の第２のＶＬ抗原結合ドメイン及び第４のポリペプチド鎖の第２のＶＨ抗原結合ドメインが一緒になって構成する、ＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに特異的に結合する第４のリガンド、特にＦａｂドメインと、を含むか、又はそれらからなる。

第１の側面の第２の代替案によれば、四量体ポリペプチドは、
・ＮからＣの方向に第１のＶＬ抗原結合ドメイン及び第１のＣＬ定常ドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、
・ＮからＣの方向に第１のＶＨ抗原結合ドメイン及び第１のＣＨ１定常ドメインを含み、特に第１のＣＨ２定常ドメインを更に含み、より特に第１のＣＨ２定常ドメインがそのＣ末端で欠損する第２のポリペプチド鎖と、
・ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに特異的に結合する第１のリガンドであって、第１のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第１のドメイン間アミノ酸リンカーにより第１のＶＬ抗原結合ドメインのＮ末端に連結され、あるいは、第２のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第１のドメイン間アミノ酸リンカーにより第１のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結される、第１のリガンドと、
・第１のポリペプチド鎖の第１のＶＬ抗原結合ドメイン及び第２のポリペプチド鎖の第１のＶＨ抗原結合ドメインが一緒になって構成する、ＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに特異的に結合する第２のリガンド、特にＦａｂドメインと、
・ＮからＣの方向に第２のＶＬ抗原結合ドメイン及び第２のＣＬ定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖と、
・ＮからＣの方向に第２のＶＨ抗原結合ドメイン及び第２のＣＨ１定常ドメインを含み、特に第２のＣＨ２定常ドメインを更に含み、より特に第２のＣＨ２定常ドメインがそのＣ末端で欠損する第４のポリペプチド鎖と、
・ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに特異的に結合する第３のリガンドであって、第３のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第２のドメイン間アミノ酸リンカーにより第２のＶＬ抗原結合ドメインのＮ末端に連結され、あるいは、第４のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第２のドメイン間アミノ酸リンカーにより第２のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結される、第３のリガンドと、
・第３のポリペプチド鎖の第２のＶＬ抗原結合ドメイン及び第４のポリペプチド鎖の第２のＶＨ抗原結合ドメインが一緒になって構成する、ＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに特異的に結合する第４のリガンド、特にＦａｂドメインと、を含むか、又はそれらからなる。

以下の全ての実施形態は、本発明の第１の側面の第１の代替案及び第２の代替案の両方と組み合わせることができる。

第１及び第３のポリペプチド鎖のＶＬ抗原結合ドメイン及びＣＬ定常ドメインは、免疫グロブリンＧ軽鎖のドメインであり、第２及び第４のポリペプチドのＶＨ抗原結合ドメイン及びＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３定常ドメインは、免疫グロブリンＧ重鎖のドメインである。言い換えれば、第１及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ免疫グロブリンＧ軽鎖を含み、第２及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ免疫グロブリンＧ重鎖を含む。本発明による四量体ポリペプチドの免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は、ＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに特異的に結合する第２及び第４のリガンドを形成する。

更に、ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに特異的に結合する第１及び第３のリガンドを含むポリペプチドは、ドメイン間アミノ酸リンカーにより免疫グロブリンＧ重鎖又は免疫グロブリンＧ軽鎖のＮ末端に融合され、よって、４つのＨＥＲ２結合部位を有する四量体ポリペプチドが形成され、４つのＨＥＲ２結合部位のうち、２つがＤ４エピトープに結合し、２つがＤ１エピトープに結合する。

驚くべきことに、本発明による四量体ポリペプチドは、従来の抗体及び二価バイパラトピックポリペプチド（合わせて２つの結合領域を有する）などの他の抗体様分子に比べて、優れたＨＥＲ２不活性化を示し、細胞増殖、アポトーシス、ＨＥＲ２内在化及びＨＥＲ２分解にも効果がある。従って、本発明による四量体ポリペプチドは、ＨＥＲ２発現癌の療法の有望な候補である。

理論に束縛されないように、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＬドメイン、特にＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、本発明の四量体ポリペプチドの更なる効果、特に細胞の成長と増殖の阻害、アポトーシス及び他の形態の細胞死の誘導、ＨＥＲ２内在化、ＨＥＲ２リサイクル阻害及びＨＥＲ２分解、ＨＥＲ２架橋、ＨＥＲ２表面移動度の低下、ＨＥＲ２発現ダウンレギュレーション、及び可変ドメインを特定の角度及び距離に位置決めすることによるＨＥＲ２二量体化及びシグナル伝達の阻害に寄与すると認められている。

いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖は、互いに７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖は、同一である。

いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖は、互いに７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖は、同一である。

いくつかの実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、第４のポリペプチド鎖と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖と第３のポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖は、互いに７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第１のポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖と第３のポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖は、同一である。

いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖は、第３のポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、第２のポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖と第４のポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖は、互いに７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第２のポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖と第４のポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖は、同一である。

いくつかの実施形態において、第２のポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖は、第４のポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、第１のリガンドと第３のリガンドは、互いに７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第１のリガンドと第３のリガンドは、同一である。

いくつかの実施形態において、第１のリガンドは、第３のリガンドと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

言い換えれば、第１のリガンは、第３のリガンドと実質的に同じである。

いくつかの実施形態において、第２のリガンドと第４のリガンドは、互いに７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第２のリガンドと第４のリガンドは、同一である。

いくつかの実施形態において、第２のリガンドは、第４のリガンドと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

言い換えれば、第２のリガンドは、第４のリガンドと実質的に同じである。

いくつかの実施形態において、第２のポリペプチド鎖の第１のＣＨ２定常ドメイン及び第１のＣＨ３定常ドメインは、第４のポリペプチド鎖の第２のＣＨ２定常ドメイン及び第２のＣＨ３定常ドメインと相互作用して、四量体ポリペプチドを形成する。特に、第２及び第４のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインは、二量体化される。特に、第１及び第２のポリペプチド鎖と第３及び第４のポリペプチド鎖との相互作用と組み合わせて、特に対応するＶＬ及びＶＨ抗原結合ドメインとＣＬ及びＣＨ１定常ドメインの二量体化によって、第１、第２、第３及び第４のポリペプチドの四量体が形成される。従って、多量体形成の面から、本発明の四量体ポリペプチドは、抗体に類似する。

いくつかの実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、第１のＣＨ１定常ドメインと第１のＣＨ２定常ドメインの間に第１のヒンジ領域を含み、第４のポリペプチド鎖は、第２のＣＨ１定常ドメインと第２のＣＨ２定常ドメインの間に第２のヒンジ領域を含み、第１のヒンジ領域及び第２のヒンジ領域は、特に少なくとも１つのジスルフィド結合により、より特に第１のジスルフィド結合及び第２のジスルフィド結合により、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖の間の複合体形成を媒介して、四量体ポリペプチドを形成する。ＣＨ１とＣＨ２定常ドメインの複合体形成は、ヒンジ領域によって、すなわち、抗体にある時と同じように、システイン残基間のジスルフィド結合の形成によって、発生可能である。

いくつかの実施形態において、第２のポリペプチド鎖のＣＨ２定常ドメイン及び／又はＣＨ３定常ドメインは、そのＣ末端で欠損する。

いくつかの実施形態において、第４のポリペプチド鎖のＣＨ２定常ドメイン及び／又はＣＨ３定常ドメインは、そのＣ末端で欠損する。

いくつかの実施形態において、第１のリガンドは、ｓｃＦｖ重鎖、ｓｃＦｖリンカー鎖及びｓｃＦｖ軽鎖を含む一本鎖可変フラグメントポリペプチド鎖を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ重鎖は、４Ｄ５のＶＨドメイン（特に配列番号８０）であり、ｓｃＦｖ軽鎖は、４Ｄ５のＶＬドメイン（特に配列番号８１）である。

いくつかの実施形態において、一本鎖可変フラグメントポリペプチド鎖は、ＮからＣの方向にｓｃＦｖ重鎖、ｓｃＦｖリンカー鎖及びｓｃＦｖ軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、一本鎖可変フラグメントポリペプチド鎖は、ＮからＣの方向にｓｃＦｖ軽鎖、ｓｃＦｖリンカー鎖及びｓｃＦｖ重鎖を含む。

言い換えれば、ｓｃＦｖ重鎖及びｓｃＦｖ軽鎖は、一本鎖可変フラグメントポリペプチド鎖において任意の方向で提供されてもよい。

いくつかの実施形態において、第３のリガンドは、ＮからＣの方向にｓｃＦｖ重鎖、ｓｃＦｖリンカー鎖及びｓｃＦｖ軽鎖を含む一本鎖可変フラグメントポリペプチド鎖を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ重鎖は、４Ｄ５のＶＨドメイン（特に配列番号８０）であり、ｓｃＦｖ軽鎖は、４Ｄ５のＶＬドメイン（特に配列番号８１）である。

いくつかの実施形態において、
・第１のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、最も特に、第１のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、
・第１のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、最も特に、第１のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態において、
・第１のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、
・第１のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態において、
・第３のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、最も特に、第３のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、
・第３のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、最も特に、第３のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態において、・第３のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、
・第３のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態において、
・第１のリガンド及び第３のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、それぞれ配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、最も特に、第１のリガンド及び第３のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、それぞれ配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、
・第１のリガンド及び第３のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、それぞれ配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、最も特に、第１のリガンド及び第３のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、それぞれ配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態において、
・第１のリガンド及び第３のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、それぞれ配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなり、
・第１のリガンド及び第３のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、それぞれ配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含むか、又はそれらからなる。

ｓｃＦｖ軽鎖及び重鎖は、完全に上記に定義されたペプチド配列からなってもよく、又はｓｃＦｖ軽鎖及び重鎖は、上記に定義されたペプチド配列を含んでもよく、ここで、ｓｃＦｖ軽鎖及び重鎖は他のペプチド配列を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、第１のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、抗体４Ｄ５のＶＬ抗原結合ドメインを含むか、又はそれからなり、第１のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、抗体４Ｄ５のＶＨ抗原結合ドメインを含むか、又はそれからなる。

いくつかの実施形態において、第３のリガンドのｓｃＦｖ軽鎖は、抗体４Ｄ５のＶＬ抗原結合ドメインを含むか、又はそれからなり、第３のリガンドのｓｃＦｖ重鎖は、抗体４Ｄ５のＶＨ抗原結合ドメインを含むか、又はそれからなる。

本明細書の文脈において、４Ｄ５という用語は、ヒト化モノクローナル抗体トラスツズマブを指し、ハーセプチンとしても知られ、本明細書で、ＨＥＲ２の膜近位ドメインＩＶに対する「ＴＺＢ」とも呼ばれる（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖリンカー鎖は、配列番号１６と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、ｓｃＦｖリンカー鎖は、ペプチド配列と同一の配列番号１６を含む。

いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖリンカー鎖は、配列番号１６と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含み、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含み、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含み、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第４のポリペプチド鎖は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含み、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含み、
・第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含み、
・第２のポリペプチド及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含む。

従って、第１、第２、第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨ抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩに特異的に結合するＡ２１（Ｈｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，７０，９３８－９４９）と呼ばれるｓｃＦｖフラグメントのＶＬ及びＶＨ抗原結合ドメインと実質的に同一であってもよい。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第１のポリペプチド鎖は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と同一のペプチド配列を含み、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第２のポリペプチド鎖は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と同一のペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含み、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第３のポリペプチド鎖は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と同一のペプチド配列を含み、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第４のポリペプチド鎖は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と同一のペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含み、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と同一のペプチド配列を含み、
・第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有するペプチド配列を含み、最も特に、第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と同一のペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含み、
・第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチド配列を含む。

従って、第１、第２、第３及び第４のポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は、ＨＥＲ２のドメインＩに特異的に結合する７Ｃ２（ＵＳ ７，３７１，３７６）と呼ばれるＥｒｂＢ２抗体の対応するドメインと実質的に同一のＩｇＧドメイン（ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３）を含んでもよい。

いくつかの具体的な実施形態において、本発明による四量体ポリペプチドは、本質的に２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を有する免疫グロブリンＧ型抗体（特に、ヒト又はヒト化モノクローナルＩｇＧ抗体）であり、抗原特異的可変重鎖及び軽鎖は共にＨｅｒ２のＤ１ドメインに特異的に反応するリガンド（第２及び第４のリガンド）を形成し、各軽鎖又は各重鎖は、Ｎ末端で連結されたポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、ｓｃＦｖリンカー鎖により連結された重鎖と軽鎖可変領域で構成されるｓｃＦｖポリペプチド鎖を含み、ｓｃＦｖポリペプチド鎖は、１～２０個のアミノ酸からなるドメイン間アミノ酸リンカーにより免疫グロブリン重鎖又は軽鎖のＮ末端に連結される。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号１と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１と同一であり、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号２と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２と同一である。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号１と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号２と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号１と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１と同一であり、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号２と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第４のポリペプチド鎖は、配列番号２と同一である。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号１と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号２と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、配列番号１と同一であり、
・第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号２と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、配列番号２と同一である。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
・第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号２と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

得られた四量体ポリペプチドは、（同一性のため）「４４１」と呼ばれる。この構築物において、抗体Ａ２１のＶＬ抗原結合ドメインを含む（第１及び第３のポリペプチド鎖の）ＩｇＧ軽鎖は、４Ｄ５（トラスツズマブ又はハーセプチン、ＨＥＲ２ Ｄ４バインダー）のＶＬ及びＶＨ抗原結合ドメインを含むｓｃＦｖフラグメントにＮ末端で融合され、且つ抗体Ａ２１のＶＨ抗原結合ドメインを含むＩｇＧ重鎖（第２及び第４のポリペプチド鎖）と組み合わせられる。Ａ２１のＶＬ及びＶＨ抗原結合ドメインは、共にＨＥＲ２ Ｄ１バインダーを構成する。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号３と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第１のポリペプチド鎖は、配列番号３と同一であり、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号４と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第２のポリペプチド鎖は、配列番号４と同一である。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号３と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号４と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号３と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第３のポリペプチド鎖は、配列番号３と同一であり、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号４と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第４のポリペプチド鎖は、配列番号４と同一である。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号３と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号４と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号３と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、配列番号３と同一であり、
・第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号４と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、配列番号４と同一である。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号３と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
・第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号４と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

得られた四量体ポリペプチドは、（同一性のため）「４７Ｃ２」と呼ばれる。この構築物において、抗体７Ｃ２のＶＬ抗原結合ドメインを含む（第１及び第３のポリペプチド鎖の）ＩｇＧ軽鎖は、４Ｄ５（トラスツズマブ又はハーセプチン、ＨＥＲ２ Ｄ４バインダー）のＶＬ及びＶＨ抗原結合ドメインを含むｓｃＦｖフラグメントにＮ末端で融合され、且つ抗体７Ｃ２のＶＨ抗原結合ドメインを含むＩｇＧ重鎖（第２及び第４のポリペプチド鎖）と組み合わせられる。７Ｃ２のＶＬ及びＶＨ抗原結合ドメインは、共にＨＥＲ２ Ｄ１バインダーを構成する。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号１１と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１１と同一であり、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号１２と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１２と同一である。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖は、配列番号１１と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
・第２のポリペプチド鎖は、配列番号１２と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１と同一であり、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号１２と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第４のポリペプチド鎖は、配列番号１２と同一である。

いくつかの実施形態において、
・第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
・第４のポリペプチド鎖は、配列番号１２と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１１と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１と同一であり、
・第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１２と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性を有し、最も特に、第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、配列番号１２と同一である。

いくつかの実施形態において、
・第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１１と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
・第２のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号１２と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

得られた四量体ポリペプチドは、（同一性のため）「２４１」と呼ばれる。この構築物において、抗体Ａ２１のＶＨ抗原結合ドメインを含む（第２及び第４のポリペプチド鎖の）ＩｇＧ重鎖は、４Ｄ５（トラスツズマブ又はハーセプチン、ＨＥＲ２ Ｄ４バインダー）のＶＬ及びＶＨ抗原結合ドメインを含むｓｃＦｖフラグメントにＮ末端で融合され、且つ抗体Ａ２１のＶＬ抗原結合ドメインを含むＩｇＧ 軽鎖（第１及び第３のポリペプチド鎖）と組み合わせられる。Ａ２１のＶＬ及びＶＨ抗原結合ドメインは、共にＨＥＲ２ Ｄ１バインダーを構成する。

いくつかの実施形態において、ＶＨ抗原結合ドメインは、Ａ２１のＶＨ抗原結合ドメイン（特に配列番号４０、４２、５１、５２又は７７）、及び７Ｃ２のＶＨ抗原結合ドメイン（特に配列番号７９）から選択され、ＶＬ抗原結合ドメインは、Ａ２１のＶＬ抗原結合ドメイン（特に配列番号３９、４１、５０又は７６）及び７Ｃ２のＶＬ抗原結合ドメイン（特に配列番号７８）から選択される。

いくつかの実施形態において、第１及び第３のポリペプチド鎖は、配列番号１、又は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する機能的に同等のペプチド配列と同一であり、第２及び第４のポリペプチド鎖は、配列番号２、又は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する機能的に同等のペプチド配列と同一である（配列同一性の場合、構築物４４１である）。

いくつかの実施形態において、第１及び第３のポリペプチド鎖は、配列番号３、又は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する機能的に同等のペプチド配列と同一であり、第２及び第４のポリペプチド鎖は、配列番号４ 、又は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する機能的に同等のペプチド配列と同一である（配列同一性の場合、構築物４７Ｃ２である）。

いくつかの実施形態において、第１及び第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１、又は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する機能的に同等のペプチド配列と同一であり、第２及び第４のポリペプチド鎖は、配列番号１２、又は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する機能的に同等のペプチド配列と同一である（配列同一性の場合、構築物２４１である）。

ドメイン間アミノ酸リンカーは、アミノ酸組成の面で制限されないが、本明細書で想定された具体的な実施形態において、リンカーの柔軟性に寄与することが示されるアミノ酸を選択する。本発明者らは、既に（ＧＧ_ｍＳ）及び（ＧＧ_ｍＴ）のリピートなどのＧ、Ｓ及び／又はＴ残基からなるリンカーが機能することを示し、ｍは１から３から選択され、リンカー全体の長さは、２０、２５、ひいては３０を超えない。１つ又は２つのアミノ酸の短いドメイン間リンカーが機能することが示された。第１及び第３のポリペプチドは、同じドメイン間アミノ酸リンカーを含んでもよく、又は異なるドメイン間アミノ酸リンカーを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、ドメイン間アミノ酸リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸からなる。

ドメイン間アミノ酸リンカーの長さ及び配列組成に関して、本発明者らによる結果から分かるように、構造予測のため、得られたタンパク質の溶解性を妨害しないと予想される、最大２５アミノ酸の同等の長さを有するリンカーが機能すると予想される。

前記実施形態のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて、ドメイン間アミノ酸リンカーは、アミノ酸Ｇ、Ａ、Ｊ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ及びＥを含むか、又はそれらからなり、特にドメイン間アミノ酸リンカーは、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ａ及びＴを含むか、又はそれらからなる。

具体的な実施形態において、ドメイン間アミノ酸リンカーは、（ＧＧΣ）_ｎであり、ｎは整数であり、ｎ≧４であり（特にｎは４、５、６、７又は８である）、ΣはＳ及びＴから選択される。

具体的な実施形態において、ドメイン間アミノ酸リンカーは、（ＧＧＳ）_ｎであり、ｎは整数であり、ｎ≧４である（特にｎは４、５、６、７又は８である）。

具体的な実施形態において、ドメイン間アミノ酸リンカーは、（ＧＧＴ）_ｎであり、ｎは整数であり、ｎ≧４である（特にｎは４、５、６、７又は８である）。

具体的な実施形態において、ドメイン間アミノ酸リンカーは、（ＧΣＧ）_ｎであり、ｎは整数であり、ｎ≧４であり（特にｎは４、５、６、７又は８である）、ΣはＳ及びＴから選択される。

具体的な実施形態において、ドメイン間アミノ酸リンカーは、（ΓΓΣ）_ｎであり、ｎは整数であり、ｎ≧４であり（特にｎは４、５、６、７又は８である）、各Γは、他のΓと独立してＡ、Ｇ及びＶから選択され、及びΣは、Ｓ及びＴから選択される。

リンカー配列を選択する際の重要な考慮点は、溶解性と柔軟性である。当業者は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６５，１３５７－１３６９ ａｎｄ Ｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１３１８３－１３１９２に例示されたように、本明細書の教示及びリンカー設計に利用可能な知識に基づいて、この配列の組成及び長さを容易に変えることができる。

いくつかの実施形態において、ドメイン間アミノ酸リンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_ｎにより特徴付けられ、ｎは１、２、３、４又は５である。

いくつかの実施形態において、ドメイン間アミノ酸リンカーは、配列番号１７、配列番号５５～配列番号６９及び配列番号８２～配列番号９１のうちの１つにより特徴付けられる配列を含むか、又はそのような配列である。

いくつかの実施形態において、ドメイン間アミノ酸リンカーは、配列番号１７、配列番号５５～配列番号６９及び配列番号８２～配列番号９１のうちの１つから選択されるペプチド配列、又は少なくとも７０％の配列同一性を有する機能的に同等のペプチド配列を含むか、又はそれらからなる。

本発明の第２の側面は、第１の側面によるポリペプチドのＨＥＲ２の発現に関連する悪性腫瘍性疾患の予防又は治療方法における応用（ＨＥＲ２陽性癌）に関する。

同様に、本発明の四量体ポリペプチドを含む、ＨＥＲ２の発現に関連する悪性腫瘍性疾患を予防又は治療するための剤形が提供される。

当業者であれば、具体的に言及された任意の薬物が、前記薬物の医薬的に許容される塩として存在可能であることが理解される。医薬的に許容される塩は、イオン型薬物及び逆帯電した対イオンを含む。医薬的に許容されるアニオン性塩形態の非限定的な例は、酢酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エンボン酸塩（ｅｍｂｏｎａｔｅ）、エストレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硫酸メチル、ムケート（ｍｕｃａｔｅ）、ナプシル酸塩（ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、サリチル酸塩、ジサリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド及び吉草酸塩を含む。医薬的に許容されるカチオン性塩形態の非限定的な例は、アルミニウム、ベンザチン、カルシウム、エチレンジアミン、リジン、マグネシウム、メグルミン、カリウム、プロカイン、ナトリウム、トロメタミン及び亜鉛を含む。

剤形は、経鼻、バッカル、直腸、経皮又は経口投与などの経腸投与に用いられてもよく、又は吸入型又は坐薬としてもよい。選択的に、皮下、静脈内、肝臓内又は筋肉内注射型などの非経口投与を使用してもよい。必要に応じて、医薬的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。

局所投与も、本発明の有利な用途の範囲内にある。Ｂｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗａｔｋｉｎｓｏｎ（Ｅｄｓ．），Ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ ２０１１，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０４７０４５０２９１）、及びＧｕｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｃｒａｆｔ： Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ（２^ｎｄ Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ２００２，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７０８６１０）、Ｏｓｂｏｒｎｅ ａｎｄ Ａｍａｎｎ（Ｅｄｓ．）：Ｔｏｐｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（１^ｓｔ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９；ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７８１８３５）の内容にて例示されたように、局所製剤を提供するための幅広い可能な処方は、当業者に公知のものである。

本発明の第３の側面は、本発明の第１の側面による四量体ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖の少なくとも１つをコードする単離された核酸に関する。特に、単離された核酸は、細菌又は真核生物の宿主細胞で発現されるようにプラスミドに含まれてもよい。第１、第２、第３及び第４のポリペプチドをコードする核酸配列は、同一のホストで共発現されるように、同一のプラスミド又は別体のプラスミド上で提供されてもよい。

本発明の第４の側面は、本発明の第１の側面による四量体ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖の少なくとも１つの産生に適合する宿主細胞に関する。特に、宿主細胞は、細菌細胞又は真核細胞である。より特に、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

いくつかの実施形態において、本発明の第１の側面によるポリペプチドの第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖の少なくとも１つを産生できるように、本発明の第３の側面による単離された核酸を含む。特に、第１、第２、第３及び第４のポリペプチドは、同一の細胞で共同産生されてもよく、又は別々に産生されて生体外で組み合わせられてもよい。

本発明の第５の側面は、本発明の第１の側面によるポリペプチドの取得方法に関し、本発明の第１の側面によるポリペプチドの第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖の少なくとも１つを産生するように、本発明の第４の側面による宿主細胞を培養することを含む。

医薬組成物及び投与
本発明の別の側面は、本発明の四量体ポリペプチド、又はその医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。更なる実施形態において、当該組成物は、本明細書に記載された少なくとも２つの医薬的に許容される担体を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、本発明の四量体ポリペプチドは、典型的には、薬物の投薬量を制御しやすく、患者に上品で取り扱いやすい製品を与えるように、医薬剤形に製剤化される。

本発明の四量体ポリペプチドの局所使用に関する本発明の実施形態において、医薬組成物は、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル又はエアロゾルなどにより送達されるスプレー可能な製剤などの局所投与に適する形で製剤化され、活性成分と、当業者に公知の可溶化剤、安定剤、張性強化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、バッファー及び防腐剤の１つ又は複数とを含む。

医薬組成物は、経口投与、非経口投与又は直腸投与のために製剤化されることができる。更に、本発明の医薬組成物は、固体形態（カプセル、錠剤、丸薬、顆粒剤、粉薬又は坐薬を含むが、これらに限定されない）、又は液体形態（溶液、懸濁剤又は乳剤を含むが、これらに限定されない）とすることができる。

本発明の化合物の投与計画は、特定の薬剤の薬力学的特性及びその投与モードと経路、受容者の種、年齢、性別、健康状態、身体疾患及び体重、症状の性質と程度、併用療法の種類、治療の頻度、投与経路、患者の腎機能と肝機能、並びに望ましい効果などの既知の要因に応じて変化する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、１日１回の用量で投与されてもよく、又は１日の総投与量を１日２、３、又は４回の分割量に分けて投与されてもよい。

本発明の医薬組成物には、滅菌などの通常の製薬工程を行うことができ、及び／又は通常の不活性希釈剤、平滑剤、又は緩衝剤、及び防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤やバッファーなどのアジュバントを含むことができる。それらは、通常の混合、造粒、溶解又は凍結乾燥プロセスのような標準プロセスによって製造されてよい。医薬組成物を調製するための多くの手順及び方法は、当分野における公知のものであり、例えば、Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，４ｔｈ Ｅｄ，２０１３（ＩＳＢＮ ８１２３９２２８９２）を参照する。

本発明は、更に特許請求の範囲として明確に述べられる下記の項目に関する。
項目１：ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに結合する第１のリガンド、ドメイン間アミノ酸リンカー及び第１の免疫グロブリンドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、
第２の免疫グロブリンドメインを含む第２のポリペプチド鎖であって、第１の免疫グロブリンドメイン及び第２の免疫グロブリンドメインが共にＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに結合する第２のリガンド、特にＦａｂドメインを構成する第２のポリペプチド鎖と、
ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに結合する第３のリガンド、ドメイン間アミノ酸リンカー及び第３の免疫グロブリンドメインを含む第３のポリペプチド鎖と、
第４の免疫グロブリンドメインを含む第４のポリペプチド鎖であって、第３の免疫グロブリンドメイン及び第４の免疫グロブリンドメインが共にＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに結合する第４のリガンド、特にＦａｂドメインを構成する第４のポリペプチド鎖と、を含むか、又はそれらからなる四量体ポリペプチド。
項目２：項目１に記載のポリペプチドにおいて、前記第１の免疫グロブリンドメインは、前記第３の免疫グロブリンドメインと実質的に同じであり、及び／又は前記第２の免疫グロブリンドメインは、前記第４の免疫グロブリンドメインと実質的に同じである。
項目３：項目１又は２に記載のポリペプチドにおいて、前記第１のリガンドは、前記第３のリガンドと実質的に同じである。
項目４：前記項目のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて、前記第１のリガンド及び／又は前記第３のリガンドは、ｓｃＦｖ重鎖、ｓｃＦｖリンカー鎖及びｓｃＦｖ軽鎖を含む一本鎖可変フラグメントポリペプチド鎖を含むか、又はそれからなる。
項目５：項目４に記載のポリペプチドにおいて、前記ｓｃＦｖ重鎖は、４Ｄ５のＶＨドメインであり、前記ｓｃＦｖ軽鎖は、４Ｄ５のＶＬドメインである。
項目６：項目１～５のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて、
－前記第１の免疫グロブリンドメインはＶＬドメインであり、前記第２の免疫グロブリンドメインはＶＨドメインであり、及び／又は前記第３の免疫グロブリンドメインはＶＬドメインであり、前記第４の免疫グロブリンドメインはＶＨドメインであり、又は
－前記第１の免疫グロブリンドメインはＶＨドメインであり、前記第２の免疫グロブリンドメインはＶＬドメインであり、及び／又は前記第３の免疫グロブリンドメインはＶＨドメインであり、前記第４の免疫グロブリンドメインはＶＬドメインである。
項目７：項目６に記載のポリペプチドにおいて、前記ＶＨドメインは、Ｃ末端でＣＨ１ドメインに連結される。
項目８：項目７に記載のポリペプチドにおいて、前記ＣＨ１ドメインは、Ｃ末端でＣＨ２ドメイン又はＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインに連結される。
項目９：項目６～８のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて、前記ＶＬドメインは、Ｃ末端でＣＬドメインに連結される。
項目１０：項目６～９のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて、前記ＶＨドメインは、Ａ２１のＶＨドメイン及び７Ｃ２のＶＨドメインから選択され、前記ＶＬドメインは、Ａ２１のＶＬドメイン及び７Ｃ２のＶＬドメインから選択される。
項目１１：前記項目のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて、前記ドメイン間アミノ酸リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸からなる。
項目１２：前記項目のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて、前記ドメイン間アミノ酸リンカーは、アミノ酸Ｇ、Ａ、Ｊ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ及びＥを含むか、又はそれらからなり、特に、前記ドメイン間アミノ酸リンカーは、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ａ及びＴを含むか、又はそれらからなる。
項目１３：前記項目のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて、前記ドメイン間アミノ酸リンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_ｎにより特徴付けられ、ｎは、１、２、３、４又は５である。
項目１４：前記項目のいずれか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ２ポリペプチドにおいて、前記ドメイン間アミノ酸リンカーは、配列番号１７、配列番号５５～配列番号６９及び配列番号８２～配列番号９１のいずれか１つにより特徴付けられる配列を含むか、又はそのような配列である。
項目１５：前記項目のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて、前記ドメイン間アミノ酸リンカーは、配列番号１７、配列番号５５～配列番号６９及び配列番号８２～配列番号９１のうちの１つから選択されるペプチド配列、又は少なくとも７０％の配列同一性を有する機能的に同等のペプチド配列を含むか、又はそれらからなる。
項目１６：前記項目のいずれか一項に記載のポリペプチドのＨｅｒ２の発現に関連する悪性腫瘍性疾患の予防又は治療方法における応用。

例えば、アイソタイプタンパク質又はコード配列、リガンドタイプ又は医学的適応症などの単一の分離可能な特徴の代替案は、本明細書において「実施形態」としてレイアウトされているが、本明細書に開示される本発明の別個の実施形態を形成するように、そのような代替案を自由に組み合わせることができることが理解される。従って、任意の検出可能なラベルの代替実施形態は、任意のリガンドの代替実施形態と組み合わせることができ、これらの組み合わせは、本明細書に記載された任意の医学的適応症又は診断方法と組み合わせることができる。

本発明について下記の例及び図面を通じて更に説明し、更なる実施形態及び利点が得られる。これらの例は、本発明を説明する旨であるが、その範囲を限定するものではない。

配列リスト：

実施例１：バイパラトピック抗ＨＥＲ２結合剤
本発明者らは、バイパラトピックＩｇＧ誘導体を生成した。Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ ＭＥＤＩ４２７６からの抗体薬物複合体（ＡＤＣ）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）のような他の利用可能なバイパラトピックＨＥＲ２標的抗体と比較すれば、これらのＩｇＧは、薬物が付着していない（Ｋａｓｔ ｅｔ ａｌ．，調製中）「裸の」結合タンパク質として、非常に強い抗腫瘍活性を示す。従って、これらの新規のバイパラトピック抗ＨＥＲ２ ＩｇＧは、単一の分子でトラスツズマブとペルツズマブの作用メカニズム、及びＨＥＲ２に対する小分子キナーゼ阻害剤の作用メカニズムを組み合わせたと認められている。更に、ＡＤＣがその毒素によって多くの健康な組織で作用できることに対し、バイパラトピック抗ＨＥＲ２ ＩｇＧは、ＨＥＲ２中毒細胞のみに作用できるため、その潜在的なオフターゲット効果が、Ｔ－ＤＭ１やＭＥＤＩ４２７６などのＡＤＣ融合体の効果より遥かに低いと予想される。よって、新しい併用療法の治療濃度域が開拓される。更に、ＨＥＲ２受容体の重合によるｐａｎ－ＥｒｂＢ阻害は、他の受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の代償性活性化を受動的に遮断する可能性がある。バイパラトピック抗ＨＥＲ２結合剤は、他のＲＴＫの活性化を遮断する可能性のあるシグナル伝達能力を有する複合体を誘導することなく、ＨＥＲ２増幅癌の細胞表面でのＨＥＲ２受容体の自由な横移動を干渉する。その結果、バイパラトピック抗ＨＥＲ２結合剤は、小分子阻害剤との強い相乗効果を示すことができ、当該小分子阻害剤は、最終的に治療から逃げるように働く代償性ＲＴＫの発現を誘導する傾向がある。従って、幅広いＨＥＲ２増幅癌では、バイパラトピック抗ＨＥＲ２ ＩｇＧは、小分子阻害剤と組み合わせることで強い抗腫瘍相乗効果を引き出す潜在能力が非常に高い。小分子阻害剤との相乗効果の潜在能力は、現在の単一特異性抗体又は抗体の組み合わせより優れている。

好ましいバイパラトピックＩｇＧ構築物の例示的なスキームは、図１及び２に示される。

バイパラトピックＩｇＧ構築物の調製及び生物活性に関するデータは、図３～２６に示される。

ＣＨＯ細胞においてバイパラトピックＩｇＧを産生するための実験計画
ベクターの設計
同時トランスフェクションのために、２つの発現カセット又は２つのベクターシステムを含むバイシストロニックプラスミドを構築する。プラスミドｐＹＭｅｘ１０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）の誘導体をバイシストロニック戦略に用いる。得られたプラスミド構築物において、多量体構築物のポリペプチド鎖のコード配列は、それぞれ各々のＣＭＶプロモーターにより制御され、例えばウシ成長ホルモン又はシミアンウイルス４０から得られたポリＡテールシグナルによって終わる（図３及び図４を参照）。ｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ）に由来するベクターを同時トランスフェクションに用いる。ここで、各々のポリペプチド鎖は、別々のプラスミドにあり、相同要素の組換えのリスクが低減され、更に収量を改善するようにトランスフェクション用プラスミドのモル比が調整可能になる。標準クローニング技術によって対象遺伝子の交換を行うことができる。得られた構築物の例は図５に示される。

ＣＨＯ－Ｓでの発現
ＴＰＰ６００バイオリアクタにおいて、指数関数的に成長するＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ）を、１ｍｌあたりに４００万の密度でＣＨＯｇｒｏ（Ｍｉｒｒｕｓ）に接種する。１ｍｌの培養物あたりに、３μｇの線状ポリエチレンイミン（ＭＷ２５，０００，ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）と１．２５μｇの高純度プラスミドＤＮＡを混合しながら添加する。最後に、最終濃度が１ｍＭになるように培養物にバルプロ酸を追加する。Ｋｕｈｎｅｒ ＩＳＦ１－Ｘシェーカーにおいて、３１℃又は３７℃、８％のＣＯ２、１８０ｒｐｍ、及び５０ｍｍの振幅で１２日間もタンパク質を発現する。

分子の精製
１４００ｒｐｍ及び４℃で３０分間遠心分離することによって発現培養物が得られる。上澄み液を０．２２μｍの濾過によって更に清澄し、ｐＨを７に調整する。全ての後続の精製ステップは４℃で実施される。上澄み液を、ＡＥＫＴＡ Ｐｕｒｅシステムで操作されてＰＢＳで平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ）に注ぐ。ＰＢＳで洗浄した後、結合したタンパク質を０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７５）で溶出する（図６のクロマトグラム）。対象画分を合わせ、バッファーを２０ｍＭのＢｉｓ／Ｔｒｉｓメタン、２０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．７５）に交換する。濾過後のタンパク質溶液をＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ（ＧＥ）カラムにロードし、１００％の２０ｍＭのＢｉｓ／Ｔｒｉｓメタン、１０００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．７５）になるように勾配で溶出する（図７を参照）。所望の画分を合わせ、必要に応じて、高純度を得るようにＳＥＣ（適切なサイズのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム，ＧＥ）で仕上げる（図８）。単量体画分を合わせ、濾過し、ＳＤＳＰＡＧＥで純度を分析する（図９）。最後に、純粋なタンパク質は、生化学及び細胞アッセイ、ならびに生体内研究に用いられる。

四価バイパラトピックＩｇＧのＨＥＲ２関連効果
当業者に公知の様々なアッセイで、四量体（四価及びバイパラトピック）ポリペプチド構築物４４１及び４７Ｃ２をテストし、且つ、四価ＩｇＧ融合体ＭＥＤＩ４２７６（毒素無し）、二量体二価バイパラトピックポリペプチド構築物８４１、８７Ｃ２及びそれらのＦｃ融合体、二価バイパラトピックＤＡＲＰｉｎ構築物６Ｌ１Ｇ（特許出願ＷＯ２０１４／０６０３６５Ａ１を参照）、単一のＩｇＧ（ＴＺＢ、ＰＺＢ、Ａ２１及び７Ｃ２）及びそれらの組み合わせと比較する。

生細胞ハイコンテント顕微鏡法、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色及び細胞計数を用いたＸＴＴ細胞生存率アッセイで、成長阻害をテストする。表１に示すように、構築物４４１、４７Ｃ２、８４１、８７Ｃ２、及び８４１と８７Ｃ２のＦｃ融合体、６Ｌ１Ｇ、及びＴＺＢとＡ２１の組み合わせによって、成長を完全に阻害するが、単一抗体及びＴＺＢとＰＺＢの組み合わせによって、部分的に阻害する。驚くべきことに、細胞傷害性薬剤が存在しない場合、抗体ＭＥＤＩ４２７６はＸＴＴ細胞の成長を刺激する。

アネキシンＶ及びＰＩ染色を用いた生細胞ハイコンテント顕微鏡法によって、又はＰＡＲＰ分裂を分析するためにウェスタンブロットにより細胞溶解物における分裂されたＰＡＲＰを検出することによって、構築物のアポトーシス／細胞死に対する効果を分析する。

構築物４４１、４７Ｃ２、８４１、８７Ｃ２及びそれらのＦｃ融合体、６Ｌ１Ｇは、アポトーシスに影響するが、ＭＥＤＩ４２７６、単一抗体は、アポトーシスに影響せず、ＴＺＢ及びＡ２１は、部分的に影響する。ＴＺＢ＋ＰＺＢの組み合わせは、非常に少数の細胞又は脆弱な細胞株でアポトーシスを誘導することができる。

「ロックダウン」とも呼ばれる細胞表面でのＨＥＲ２架橋は、光退色後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）及び単一細胞局在性顕微鏡法により測定される。ＦＲＡＰシグナルの減少は、細胞の移動度が低いことを示す。そのため、ポリペプチド構築物に応答して架橋する。

４４１、４７Ｃ２及び６Ｌ１Ｇは、受容体のロックダウンを招き、８４１、８７Ｃ２及びそれらのＦｃ融合体、ならびにＴＺＢ＋ＰＺＢ及びＴＺＢ＋Ａ２１という抗体の組み合わせに対して、一部の架橋効果を測定する。単一抗体は、架橋に対して効果がない。

更に、実施例２に詳しく記載されるように、表面タンパク質内在化及び分解アッセイ、共焦点顕微鏡法及びフローサイトメトリーにより、細胞へのＨＥＲ２の内在化を分析する。

四価バイパラトピック構築物４４１、４７Ｃ２及びＭＥＤＩ４２７６は、ＨＥＲ２内在化に対して強い効果を示したが、ＴＺＢ＋ＰＺＢ及びＴＺＢ＋Ａ２１の組み合わせでは、リサイクル阻害が検出された。他の構築物は効果を示しなかった。

総ＨＥＲ２の表面タンパク質内在化と分解アッセイ及びウェスタンブロット検出により、ＨＥＲ２分解をテストする。ここで、４４１及び４７Ｃ２によって、迅速で強い分解が起こされる。ＭＥＤＩ４２７６は、分解に対して効果があるが、４４１及び４７Ｃ２に比べて、それ程強くではない。それに対して、抗体の組み合わせは、遅い分解を招き、他の構築物は、効果がない。

表２は、上記した実験と同じ構築物を用いて実施したＨＥＲ２結合研究の結果を示す。フローサイトメトリーにより、更に、バイパラトピックＩｇＧ構築物とＨＥＲ２との複合体が形成された場合、サイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により、結合を決定する。

全ての構築物は、予想通りに細胞外ドメイン１、２、及び／又は４に結合した（表２を参照）。４４１、４７Ｃ２及びＴＺＢ＋Ａ２１の組み合わせは、極めて遅い解離速度を示し、他の構築物よりも遅い。

面白いことに、全てのバイパラトピック構築物は、１：１に近いＨＥＲ２結合化学量論をもたらす。単一抗体と抗体の組み合わせは、およそ１：２だけの化学量論をもたらす。

更に、ＮＳＧマウスへの静脈注射、及びＥＬＩＳＡによる血液サンプルにおけるバイパラトピックＩｇＧの時間分解検出により、構築物４４１の血清半減期をテストする。４４１の半減期を決定するために、３ｍｇ／ｋｇの精製構築物をＮＳＧマウスに静脈注射する。示された時点で、マウスから採血し、全血を凝固させ、遠心分離されたサンプルの上澄み液を収集することで血清が得られる。標準的捕捉ＥＬＩＳＡを使用して４４１の血清レベルを評価する（図３２）。マウスからの抗ヒトＦｃ抗体をマキシソーブプレート（ｍａｘｉｓｏｒｂ ｐｌａｔｅ）に直接塗る。結合４４１及び血清スパイク４４１の標準品は、アルカリホスファターゼに接合したヤギからの抗κ鎖抗体によって明らかになる。二相崩壊モデルによりデータをフィッティングした結果、得られた半減期は、４．３＋４５．３時間（α相とβ相）であると計算された。

驚くべきことに、四量体四価バイパラトピック構築物４４１及び４７Ｃ２は、ＨＥＲ２への優れた結合特性を有する他、細胞増殖を強く阻害し、アポトーシスにより細胞死を引き起こし、細胞表面でのＨＥＲ２の架橋を招き、強いＨＥＲ２内在化及び強いＨＥＲ２分解を引き起こす。４４１及び４７Ｃ２は、全てのカテゴリの他の構築物のいずれかよりも優れているか、スコアが同等である。

ＴＺＢ＋ＰＺＢ及びＴＺＢ＋Ａ２１は、総ＨＥＲ２の減少を招き（ＴＺＢ＋ＰＺＢの場合、非常に弱い）、これは、リサイクル阻害、即ちＨＥＲ２が事前の細胞内蓄積のない状態で分解するメカニズムによるものである（図３５を参照）。

構築物４４１の腫瘍成長に対する効果を決定するために、ＳＣＩＤベージュ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）マウスの右脇腹に、５０％のマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にある５００万個のＮ８７細胞を接種する。腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達した後、１０ｍｇ／ｋｇの４４１で３～４日間の間隔をあけてマウスを８回処理する。処理されたマウスは、４４１に応答して腫瘍量が減少する。ＴＺＢ（１０ｍｇ／ｋｇ）及びｈＡ２１Ｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスにおいて、成長停止が最初に見られ、対照マウス（図３３で「ＰＢＳ」と標識されている）の腫瘍は、妨害されずに発展し続けることを示した（図３３）。

実施例２：開示された分子４４１により補強されたＨＥＲ２の内在化、リソソーム輸送及び分解
ＢＴ－４７４及びＨＣＣ１４１９乳癌細胞を用いた顕微鏡検査
固定サンプルに顕微鏡検査を行うために、細胞を４・１０^４ｃｍ^－２の密度で完全培地のμスライド（Ｉｂｉｄｉ，ｃａｔ．ｎｏ．８０８２４）に接種する。翌日、対応する分子で細胞を処理する。２時間後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で細胞を一回洗浄し、ＤＰＢＳに溶解した４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドを添加し、室温で１０分間インキュベートすることで固定する。次に、ＰＢＳＢＡ＋Ｔ（１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、及び０．５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を追加したＤＰＢＳ）で細胞を２回洗浄する。その後、１：１５０（ｖ／ｖ）でＰＢＳＢＡ＋Ｔに溶解し、更に１００ｎｇ ｍｌ^－１の２－（４－アミジノフェニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボキシミドアミド（ＤＡＰＩ）を追加した抗ＬＡＭＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｄ４０１Ｓ）において、室温で細胞を３０分間インキュベートする。次に、ＰＢＳＢＡ＋Ｔで細胞を２回洗浄し、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１１００１）に接合する抗マウス抗体、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ－２１４４５）に接合してＰＢＳＢＡ＋Ｔに溶解したヤギ由来の抗ヒト抗体を添加し、室温で３０分間インキュベートする。次に、ＰＢＳＢＡ＋Ｔで細胞を２回洗浄し、ＤＰＢＳに溶解した４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドを添加して再度固定し、室温で１０分間インキュベートし、最後にＰＢＳＡで１回洗浄し、測定するまでに４℃でＰＢＳＡ（０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを追加したＤＰＢＳ）で保存する。ＳＰ５共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）に画像を形成する。画像から、２つの細胞株に対して、４４１のみがその急速な内在化を誘導することができ、リソソーム（ＬＡＭＰ１陽性）コンパートメントとの強い共局在性を示していることが分かる。

表面タンパク質の内在化と分解アッセイ
治療時のＨＥＲ２の内在化と分解を定量化するために、定量的な表面タンパク質の内在化と分解アッセイを実施した。簡潔に言えば、メーカーの説明書に基づいて、安定したＦｌｐ－Ｉｎ ＴＲＥｘ ＨＥＫ２９３細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｋ６５０００１）を生成し、誘導時にＨａｌｏＴａｇ－ＨＥＲ２受容体融合体を過剰発現することができる。アッセイについて、初回の処理時点の２日前に細胞を接種し、処理時点の１日前にドキシサイクリンを添加して安定した過剰発現を２４時間誘導する。細胞標識の時間を参照して、示された時点で処理物（１００ｎＭ）を添加する。

処理時間間隔が経った後、２段階法で細胞を標識する。第１の標識段階において、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０（ＨＴＬ－ＡＦ６６０，Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ８４７２）を含むＨａｌｏＴａｇリガンドを結合し、当該リガンドは、完全に細胞非透過性であるため、表面受容体のみを染色する。第２の段階において、テトラメチルローダミンを含む細胞透過性ＨａｌｏＴａｇリガンド（ＨＴＬ－ＴＭＲ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ８２５２）を、細胞内コンパートメントに存在する全ての受容体融合体を染色するために用いる。それにより、表面と内部受容体からのシグナルは、フローサイトメーターの別々のチャネルで検出される。従って、局在性に関する情報を得て、且つ、以下に説明される再スケーリング手順で定量的分布に関する情報を得ることができる。全ての受容体が表面に出現するため、市販の死細胞染色剤を使用して、透過性（死んだ）細胞を分析から除外する。ＬＳＲ ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）を使用して、２，０００～１０，０００個のセルの各チャネルでの蛍光強度を記録し、単一の非透過性細胞をゲーティングする。これらの集団の平均蛍光強度は、ＦｌｏｗＪｏ １０．４（ＦｌｏｗＪｏ）を使用して得られる。

データ処理
フローサイトメトリー機器のＡＦ６６０及びＴＭＲチャネルでの異なる検出効率を補正するために、データをスケーリングして、相対的存在量を算出する。そのために、第１の（ＨＴＬ－ＡＦ６６０標識）段階が省略された対照サンプル（ｕｔｒ．，ｓ．）が必要となる。このサンプルでは、全てのＨａｌｏＴａｇ分子は、その局在性を問わず、この「単一」（ｓ．）の標識手順でＨＴＬ－ＴＭＲと反応する。一重項非透過性細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、単一標識の未処理対照サンプル（ｕｔｒ．，ｓ．）の正規化及びバックグラウンド除去によって、サンプルのＴＭＲチャネルの正規化（特徴スケーリング）シグナルＳ_ＴＭＲを取得する。

ただし、ｕｔｒ．，ｕｎｌａｂ．は、未処理の非標識の対照を表す（自家蛍光のみを示す）。

細胞非透過性染料を用いた第１の表面標識段階は、完全な２段階（ダブル）の標識手順で実質的に充分である。従って、正規化された表面シグナルＳ_{ＡＦ６６０}は、次のように定義することができる。

サンプルのシグナルを二重標識対照（ｕｔｒ．，ｄ．）からの表面シグナルに関連付けることができ、且つ、ＨＴＬ－ＡＦ６６０が内部受容体にアクセスできないため、染色できず、別々の単一染色サンプルは不要である。

ΔＳ_ＴＭＲは、ＴＭＲチャネルでの単一標識手順とダブル標識手順の違いであり、第１の表面特異的段階で遮断された分子の数に正確に対応する。同じ二重標識実験のＡＦ６６０チャネルでの信号も、分子のこの数に直接関連する。

従って、補正因子Ｃ_Ａを定義することができ、当該補正因子によって、測定された強度Ｓ_{ＡＦ６６０}（ｕｔｒ．，ｄ．）（ＡＦ６６０チャネルに記録）をＳ_{ＡＦ６６０，スケーリング}（ｕｔｒ．，ｄ．）（ＴＭＲチャネルの縮尺で）に関連付ける。

単一標識及び二重標識の未処理細胞からのシグナルを使用して、Ｃ_Ａを次のように計算することができる。

単一標識の未処理細胞のＴＭＲシグナルがこの前に式Ｓ１によって１００％にスケーリングされたことを考慮し、処理されたサンプルに関して、ＡＦ６６０チャネルに記録された信号の補正は、次のように行うことができる。

続いて、Ｓ_ＴＭＲ（ｔｒｅ．，ｄ．）及びＳ_{ＡＦ６６０，スケーリング}（ｔｒｅ．，ｄ．）は、それぞれ内部タンパク質と表面タンパク質の存在量を表し、Ｓ_{ＡＦ６６０，スケーリング}（ｔｒｅ．，ｄ．）＋Ｓ_ＴＭＲ（ｔｒｅ．，ｄ．）の和は、二重標識の処理済みサンプルの総タンパク質の量を表し、常に未処理の対照サンプルに対するものである。

前述したデータスケーリングを実行し、ＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１７ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）、Ｒ３．５．１、Ｐｒｉｓｍ６．０７（ＧｒａｐｈＰａｄ）及びＥｘｃｅｌ２０１６（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）により結果をプロットする。結果を図３５に示す。全ての他の構築物に比べて、構築物４４１は５分間内で殆どＨＥＲ２の内在化を示した。

Claims (15)

1. （ａ）第１のＶＬ抗原結合ドメイン及び第１のＣＬ定常ドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、
   （ｂ）第１のＶＨ抗原結合ドメイン、第１のＣＨ１定常ドメイン、第１のＣＨ２定常ドメイン及び第１のＣＨ３定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、
   （ｃ）ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに特異的に結合する第１のリガンドであって、前記第１のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第１のドメイン間アミノ酸リンカーにより前記第１のＶＬ抗原結合ドメインのＮ末端に連結され、あるいは、前記第２のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第１のドメイン間アミノ酸リンカーにより前記第１のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結される、第１のリガンドと、
   （ｄ）第１のポリペプチド鎖の第１のＶＬ抗原結合ドメイン及び第２のポリペプチド鎖の第１のＶＨ抗原結合ドメインが一緒になって構成する、ＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに特異的に結合する第２のリガンド、特にＦａｂドメインと、
   （ｅ）第２のＶＬ抗原結合ドメイン及び第２のＣＬ定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖と、
   （ｆ）第２のＶＨ抗原結合ドメイン、第２のＣＨ１定常ドメイン、第２のＣＨ２定常ドメイン及び第２のＣＨ３定常ドメインを含む第４のポリペプチド鎖と、
   （ｇ）ＨＥＲ２ Ｄ４エピトープに特異的に結合する第３のリガンドであって、前記第３のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第２のドメイン間アミノ酸リンカーにより前記第２のＶＬ抗原結合ドメインのＮ末端に連結され、あるいは、前記第４のポリペプチド鎖に含まれ、かつ、第２のドメイン間アミノ酸リンカーにより前記第２のＶＨ抗原結合ドメインのＮ末端に連結される、第３のリガンドと、
   （ｈ）第３のポリペプチド鎖の第２のＶＬ抗原結合ドメイン及び第４のポリペプチド鎖の第２のＶＨ抗原結合ドメインが一緒になって構成する、ＨＥＲ２ Ｄ１エピトープに特異的に結合する第４のリガンド、特にＦａｂドメインと、
   を含むか、又はそれらからなる、四量体ポリペプチド。
2. 前記第１のポリペプチド鎖と前記第３のポリペプチド鎖、及び／又は前記第２のポリペプチド鎖と前記第４のポリペプチド鎖は、互いに７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられ、最も特に前記第１のポリペプチド鎖と前記第３のポリペプチド鎖、及び／又は前記第２のポリペプチド鎖と前記第４のポリペプチド鎖は同一であり、及び／又は、前記第１のリガンドと前記第３のリガンドは、互いに７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられ、最も特に前記第１のリガンドと前記第３のリガンドは同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記第２のポリペプチド鎖の前記第１のＣＨ２定常ドメイン及び前記第１のＣＨ３定常ドメインが、前記第４のポリペプチド鎖の前記第２のＣＨ２定常ドメイン及び前記第２のＣＨ３定常ドメインと相互作用し、特に共有結合することで、四量体ポリペプチドが形成される、請求項１又は２に記載の四量体ポリペプチド。
4. 前記第２のポリペプチド鎖が、前記第１のＣＨ１定常ドメインと前記第１のＣＨ２定常ドメインの間に第１のヒンジ領域を含み、前記第４のポリペプチド鎖が、前記第２のＣＨ１定常ドメインと前記第２のＣＨ２定常ドメインの間に第２のヒンジ領域を含み、前記第１のヒンジ領域及び前記第２のヒンジ領域が、特に少なくとも１つのジスルフィド結合により、前記第２のポリペプチド鎖と前記第４のポリペプチド鎖の間の複合体形成を媒介することで、四量体ポリペプチドが形成される、請求項１～３のいずれか一項に記載の四量体ポリペプチド。
5. 前記第１のリガンド及び／又は前記第３のリガンドが、ｓｃＦｖ重鎖、ｓｃＦｖリンカー鎖及びｓｃＦｖ軽鎖を含む一本鎖可変フラグメントポリペプチド鎖を含むか、又はそれらからなり、特に、
   （ａ）前記第１のリガンド及び／又は前記第３のリガンドの前記ｓｃＦｖ重鎖が、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられるペプチド配列を含み、最も特に、前記第１のリガンド及び／又は前記第３のリガンドの前記ｓｃＦｖ重鎖が、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４４、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号８０から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含み、
   （ｂ）前記第１のリガンド及び／又は前記第３のリガンドの前記ｓｃＦｖ軽鎖が、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられるペプチド配列を含み、最も特に、前記第１のリガンド及び／又は前記第３のリガンドの前記ｓｃＦｖ軽鎖が、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４３及び配列番号８１から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含む、
   請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
6. 前記ｓｃＦｖリンカー鎖が、配列番号１６と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられるペプチド配列を含み、最も特に、前記ｓｃＦｖリンカー鎖が、配列番号１６と同一のペプチド配列を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
7. （ａ）前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第３のポリペプチド鎖が、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられるペプチド配列を含み、最も特に、前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第３のポリペプチド鎖が、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号５０及び配列番号７６から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含み、
   （ｂ）前記第２のポリペプチド鎖及び／又は前記第４のポリペプチド鎖が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられるペプチド配列を含み、最も特に、前記第２のポリペプチド鎖及び／又は前記第４のポリペプチド鎖が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号７７から選択されるペプチド配列と同一のペプチド配列を含む、
   請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
8. （ａ）前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第３のポリペプチド鎖が、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられるペプチド配列を含み、最も特に、前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第３のポリペプチド鎖が、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号７８と同一のペプチド配列を含み、
   （ｂ）前記第２のポリペプチド鎖及び／又は前記第４のポリペプチド鎖が、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられるペプチド配列を含み、最も特に、前記第２のポリペプチド鎖及び／又は前記第４のポリペプチド鎖が、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号７９と同一のペプチド配列を含む、
   請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
9. （ａ）前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第３のポリペプチド鎖が、配列番号１と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられ、最も特に、前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第３のポリペプチド鎖が、配列番号１と同一であり、
   （ｂ）前記第２のポリペプチド鎖及び／又は前記第４のポリペプチド鎖が、配列番号２と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられ、最も特に、前記第２のポリペプチド鎖及び／又は前記第４のポリペプチド鎖が、配列番号２と同一である、
   請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
10. （ａ）前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第３のポリペプチド鎖が、配列番号３と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられ、最も特に、前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第３のポリペプチド鎖が、配列番号３と同一であり、
    （ｂ）前記第２のポリペプチド鎖及び／又は前記第４のポリペプチド鎖が、配列番号４と７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更に特に９５％以上の配列同一性により特徴付けられ、最も特に、前記第２のポリペプチド鎖及び／又は前記第４のポリペプチド鎖が、配列番号４と同一である、
    請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
11. 前記第１のドメイン間アミノ酸リンカー及び／又は前記第２のドメイン間アミノ酸リンカーが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸からなり、前記第１のドメイン間アミノ酸リンカー及び／又は前記第２のドメイン間アミノ酸リンカーが、アミノ酸Ｇ、Ａ、Ｊ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ及びＥを含むか、又はそれらからなり、特に、前記第１のドメイン間アミノ酸リンカー及び／又は前記第２のドメイン間アミノ酸リンカーが、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ａ及びＴを含むか、又はそれらからなり、特に、前記第１のドメイン間アミノ酸リンカー及び／又は前記第２のドメイン間アミノ酸リンカーが、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎにより特徴付けられ、ｎは、１、２、３、４又は５であり、あるいは、前記第１のドメイン間アミノ酸リンカー及び／又は前記第２のドメイン間アミノ酸リンカーが、配列番号１７、配列番号５５～配列番号６９及び配列番号８２～配列番号９１のいずれか１つから選択されるペプチド配列、又は少なくとも７０％の配列同一性により特徴付けられる機能的同等ペプチド配列を含むか、又はそれらからなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
12. ＨＥＲ２の発現に関連する悪性腫瘍性疾患の予防又は治療方法に用いるための、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
13. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチドの第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖の少なくとも１つをコードする、単離された核酸。
14. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチドの第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖の少なくとも１つの生成に適合する宿主細胞であって、特に、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチドの第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖の少なくとも１つを生成できるように、請求項１３に記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。
15. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを取得する方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチドの第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖の少なくとも１つを生成するように、請求項１４に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。

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