JP2022500072A - Ntsr1に特異的な抗体およびその使用 - Google Patents
Ntsr1に特異的な抗体およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
ニューロテンシン受容体1型(NTSR1)を特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメントが記載される。これらの抗NTSR1抗体およびその抗原結合フラグメント、例えば一本鎖Fv(scFv)は、正常細胞および腫瘍細胞におけるNTSR1のニューロテンシン媒介性活性化を阻害することが可能である。NTSR1陽性癌または特定の代謝疾患などのNTSR1活性に関連する疾患または状態の治療のための方法ならびに抗体およびその抗原結合フラグメントの使用もまた記載される。また、NTSR1の第2の細胞外ループの立体構造を模倣し、ニワトリなどの動物における抗NTSR1抗体の産生を誘導することが可能な環状ペプチドも記載される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2018年8月31日に出願された米国仮特許出願第62/725,451号の利益を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年8月31日に出願された米国仮特許出願第62/725,451号の利益を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は概して、特定の形態の癌などのNTSR1活性に関連する疾患または状態の治療を含む、様々な用途のための、例えば組換え抗体を使用したニューロテンシン受容体1型(NTSR1またはNTS1)の調節(modulation)の分野に関する。
NTSR1は、Gタンパク質共役受容体(GPCR)の大スーパーファミリーに属し、低血圧症、高血糖症、低体温症、痛覚抑制、ならびに腸運動性および分泌の調節(regulation)などのニューロテンシン(NTSまたはNT)の複数の機能を媒介することが示されている。NTSR1発現/過剰発現は、炎症性腸疾患と関連することが示されている(例えば、Gui et al.,World J.Gastroenterol.2013 Jul 28;19(28):4504−4510を参照。文献中には、NTSR1活性が統合失調症などの神経障害に関連するという証拠も存在する。
中枢神経系(CNS)および胃腸管におけるNTによるNTSR1関与の生理学的作用に加えて、NT媒介性NTSR1刺激が発癌において重要な役割を果たすという証拠が増えている。NTSR1の異常発現(例えば、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、および結腸癌)、増殖および生存効果を伴う腫瘍成長から、足場非依存性成長ならびに前移動性および前侵襲性効果を有する転移拡散までの癌進行の各段階における効果を伴う、多数のタイプの癌細胞および腫瘍におけるNT発癌作用が記載されている(例えば、Wu et al.,Front Endocrinol(Lausanne).2012;3:184を参照)。これらの効果は全て、細胞形質転換の初期段階中のNTSR1の異常または調節不全発現と関連し、いくつかのキナーゼおよびエフェクター、例えばPKC、MAPK、FAK、RHO−GTPase、RAS、およびScrの活性化の結果である(Younes et al.,Oncotarget.2014;5(18):8252−8269)。NTSR1発現は、乳癌、肺癌、および頭頸部扁平上皮細胞癌を含むいくつかの癌における予後不良の独立したマーカーであることが示されている(Younes et al.,2014、上記参照、Ouyang et al.,Mol Cancer.2015;14:21、Alifano et al.,Clin Cancer Res;16(17);4401−10)。
細胞内シグナル伝達におけるそれらの重要な役割、ならびに癌、感染、および炎症を含む様々な疾患に対するそれらの臨床的関連性のため、NTSR1などのGPCRは、最も魅力的な治療標的クラスの1つである。しかしながら、高い立体構造変動性、細胞外エピトープの小さい露出面積(抗体結合のためにアクセスできない場合がある)、ならびに好適なGPCR抗原および効率的な抗体スクリーニングツールの調製が困難なことは、有効な抗GPCR抗体の開発を妨げており、これは依然として課題である。実際、GPCR標的抗体は、これまで米国食品医薬品局および欧州医薬品庁によって承認されていない(Jo et al.,Exp Mol Med.2016 Feb;48(2):e207)。
したがって、抗NTRS1抗体などのNTSR1を特異的に標的とする薬剤の開発、ならびに予後不良のある特定の形態の癌を含むNTSR1活性に関連する疾患または状態の治療のための新規戦略の必要性がある。
本説明は、多くの文書を参照し、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、以下の項目1〜91を提供する。
1.ニューロテンシン受容体1型(NTSR1)の細胞外ループに位置する立体構造エピトープ(該細胞外ループがヒトNTSR1(配列番号80)の残基206〜234に対応する)に、好ましくは、ヒトニューロテンシン受容体1型(NTSR1)からのアミノ酸配列NRSADGQHAGGおよび/またはラットNTSR1からのアミノ酸配列NRSGDGTHPGGに位置する立体構造エピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
2.ヒトNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGGおよびラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGGに位置する立体構造エピトープに特異的に結合する、項目1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
3.ポリクローナル抗体である、項目1または2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
4.モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目1または2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
5.相補性決定領域(CDR)の以下の組み合わせ:配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)またはSGSGSSWHGYG(配列番号125)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1(CDR−L1)、配列FNDKRPS(配列番号10)またはDNTNRPS(配列番号126)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−L2、配列GSADSTGGI(配列番号11)またはGGYDSSTYAGI(配列番号127)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−L3、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)またはGFTFSSFNMI(配列番号128)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1(CDR−H1)、配列AQIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)またはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−H2、および配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)またはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−H3を含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
6.(i)CDR−L1が、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)もしくはSGSGSSWHGYG(配列番号125)と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−L2が、配列FNDKRPS(配列番号10)もしくはDNTNRPS(配列番号126)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−L3が、配列GSADSTGGI(配列番号11)もしくはGGYDSSTYAGI(配列番号127)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−H1が、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)もしくはGFTFSSFNMI(配列番号128)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−H2が、配列AQIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)もしくはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−H3が、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)もしくはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または(vii)(i)〜(vi)の任意の組み合わせである、項目5に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
7.(i)CDR−L1が、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)、SGGGSTDASSYYYG(配列番号19)、もしくはSGSGSSWHGYG(配列番号125)を含む、(ii)CDR−L2が、配列FNDKRPS(配列番号10)もしくはDNTNRPS(配列番号126)を含む、(iii)CDR−L3が、配列GSADSTGGI(配列番号11)もしくはGGYDSSTYAGI(配列番号127)を含む、(iv)CDR−H1が、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)、GFTFSSFNRF(配列番号15)、GFTVSSFNMF(配列番号16)、GFTFSSFNMC(配列番号17)、GFTFSSFNMV(配列番号18)、GFTFSGFNMF(配列番号20)、GFTFRSFNMF(配列番号21)、GFTFSRFNMF(配列番号23)、GVTFSSFNMF(配列番号24)、GFTFSSVNMF(配列番号25)、GFTFSSLNMF(配列番号26)、GFTFGSFNMF(配列番号27)、GFTFSSCNMF(配列番号28)、もしくはGFTFSSFNMI(配列番号128)を含む、(v)CDR−H2が、配列QIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)、QISDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号22)、QSIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号29)、QMIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号30)、QIIDGAGSRTADGAAVKG(配列番号31)、QIIEGAGSRTAYGAAVKG(配列番号32)、もしくはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)を含む、(vi)CDR−H3が、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)もしくはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)を含む、または(vii)(i)〜(vi)の任意の組み合わせである、項目6に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
8.(i)CDR−L1が、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)、SGGGSTDASSYYYG(配列番号19)、またはSGSGSSWHGYG(配列番号125)を含み、(ii)CDR−L2が、配列FNDKRPS(配列番号10)またはDNTNRPS(配列番号126)を含み、(iii)CDR−L3が、配列GSADSTGGI(配列番号11)またはGGYDSSTYAGI(配列番号127)を含み、(iv)CDR−H1が、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)、GFTFSSFNRF(配列番号15)、GFTVSSFNMF(配列番号16)、GFTFSSFNMC(配列番号17)、GFTFSSFNMV(配列番号18)、GFTFSGFNMF(配列番号20)、GFTFRSFNMF(配列番号21)、GFTFSRFNMF(配列番号23)、GVTFSSFNMF(配列番号24)、GFTFSSVNMF(配列番号25)、GFTFSSLNMF(配列番号26)、GFTFGSFNMF(配列番号27)、GFTFSSCNMF(配列番号28)、またはGFTFSSFNMI(配列番号128)を含み、(v)CDR−H2が、配列QIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)、QISDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号22)、QSIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号29)、QMIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号30)、QIIDGAGSRTADGAAVKG(配列番号31)、QIIEGAGSRTAYGAAVKG(配列番号32)、またはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)を含み、(vi)CDR−H3が、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)またはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
9.IgY抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目1〜8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
10.抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)もしくはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)1、(ii)配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)もしくはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR2、(iii)配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)もしくはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR3、(iv)配列FGAGTTLTVL(配列番号103)もしくはFGAGTTLTVL(配列番号134)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、項目9に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
11.(i)軽鎖FR1が、配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)もしくはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)を含む、(ii)軽鎖FR2が、配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)もしくはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)を含む、(iii)軽鎖FR3が、配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)もしくはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)を含む、(iv)軽鎖FR4が、配列FGAGTTLTVL(配列番号103)もしくはFGAGTTLTVL(配列番号134)を含む、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、項目10に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
12.(i)軽鎖FR1が、配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)またはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)を含み、(ii)軽鎖FR2が、配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)またはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)を含み、(iii)軽鎖FR3が、配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)またはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)を含み、(iv)軽鎖FR4が、配列FGAGTTLTVL(配列番号103)またはFGAGTTLTVL(配列番号134)を含む、項目10に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
13.抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)もしくはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKAS(配列番号135)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)もしくはWVRQTPGKGLEWV(配列番号136)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR2、(iii)配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)もしくはRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAK(配列番号137)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR3、(iv)配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)もしくはWGHGTEVIVSS(配列番号138)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、項目9〜12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
14.(i)重鎖FR1が、配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)もしくはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKAS(配列番号135)を含む、(ii)重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)もしくはWVRQTPGKGLEWV(配列番号136)を含む、(iii)重鎖FR3が、配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)を含む、(iv)重鎖FR4が、配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)を含む、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、項目13に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
15.(i)重鎖FR1が、配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)を含み、(ii)重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)を含み、(iii)重鎖FR3が、配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)またはRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAK(配列番号137)を含み、(iv)重鎖FR4が、配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)またはWGHGTEVIVSS(配列番号138)を含む、項目14に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
16.抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ALTQPTSVSANLGGTVEITCSGGGSTDAGSYYYGWFQQKSPGSAPVTVIYFNDKRPSDIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFCGSADSTGGIFGAGTTLTVL(配列番号108)またはALTQPSSVSANLGGTVKITCSGSGSSWHGYGWYQQKAPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFCGGYDSSTYAGIFGAGTTLTVL(配列番号139)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖(VL)を含む、項目9〜15のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
17.VLが、配列番号108または139の配列を含む、項目16に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
18.抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEFVAQIIDGAGSRTAYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCARGGHYWGGASIDAWGHGTEVIVSS(配列番号109)またはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKASGFTFSSFNMIWVRQTPGKGLEWVASICTGGSYTYYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAKSVDGVGWHAGQIDAWGHGTEVIVSS(配列番号140)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖(VH)を含む、項目9〜17のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
19.VHが、配列番号109または140の配列を含む、項目18に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
20.IgY抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化形態である、項目1〜8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
21.抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)1、(ii)配列WYQQKPGQAPVTVIYと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR2、(iii)配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR3、(iv)配列FGGGTKLTVLと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、項目20に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
22.(i)軽鎖FR1が、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCを含む、(ii)軽鎖FR2が、配列WYQQKPGQAPVTVIYを含む、(iii)軽鎖FR3が、配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCを含む、(iv)軽鎖FR4が、配列FGGGTKLTVLを含む、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、項目21に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
23.(i)軽鎖FR1が、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCを含み、(ii)軽鎖FR2が、配列WYQQKPGQAPVTVIYを含み、(iii)軽鎖FR3が、配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCを含み、(iv)軽鎖FR4が、配列FGGGTKLTVLを含む、項目22に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
24.抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEWVと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR2、(iii)配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR3、(iv)配列WGQGTLVTVSSと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、項目20〜23のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
25.(i)重鎖FR1が、配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASを含む、(ii)重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEWVを含む、(iii)重鎖FR3が、配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKを含む、(iv)重鎖FR4が、配列WGQGTLVTVSSを含む、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、項目24に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
26.(i)重鎖FR1が、配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASを含み、(ii)重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEWVを含み、(iii)重鎖FR3が、配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKを含み、(iv)重鎖FR4が、配列WGQGTLVTVSSを含む、項目25に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
27.抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGGSTDAGSYYYGWYQQKPGQAPVTVIYFNDKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGSADSTGGIFGGGTKLTVL(配列番号118)またはSSELTQPPAVSVALGQTVRITCSGSGSSWHGYGWYQQKPGQAPVTVIYDNTNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGGYDSSTYAGIFGGGTKLTVL(配列番号141)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖(VL)を含む、項目20〜26のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
28.VLが、配列番号118または141の配列を含む、項目27に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
29.抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEWVAQIIDGAGSRTAYGAAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGHYWGGASIDAWGQGTLVTVSS(配列番号119)またはEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFNMIWVRQAPGKGLEWVASICTGGSYTYYAPAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSVDGVGWHAGQIDAWGQGTLVTVSS(配列番号142)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖(VH)を含む、項目20〜28のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
30.VHが、配列番号119または141の配列を含む、項目29に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
31.抗体の抗原結合フラグメントである、項目1〜30のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
32.該抗原結合フラグメントが、軽鎖可変領域(VL)、重鎖可変領域(VH)、およびVLとVHとを接続するリンカーを含む一本鎖可変フラグメント(scFv)である、項目31に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
33.該リンカーが、約5〜約50個のアミノ酸を含むポリペプチドリンカーである、項目32に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
34.該ポリペプチドリンカーが、約15〜約20個のアミノ酸を含む、項目33に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
35.該ポリペプチドリンカーが、約18個のアミノ酸を含む、項目34に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
36.ポリペプチドリンカー中の残基の少なくとも25%がグリシン残基である、項目33〜35のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
37.該リンカーが、ペンタペプチド配列GGGGSを含む、項目33〜36のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
38.ポリペプチドリンカーが、配列GQSSRSSGGGGSSGGGGSを含む、項目37に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
39.該リンカーが、VHのN末端をVLのC末端と接続する、項目32〜38のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
40.抗体またはその抗原結合フラグメントが、少なくとも1つの定常ドメインまたはそのフラグメントを含む、項目1〜39のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
41.抗体の定常重鎖のフラグメント結晶性(Fc)フラグメントを含む、項目40に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
42.Fcフラグメントが、図8Gの太字の配列を含む、項目41に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
43.検出可能な標識または親和性タグにコンジュゲートされる、項目1〜42のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
44.項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸または核酸の組み合わせ。
45.項目44に記載の核酸または核酸の組み合わせを含むプラスミドまたはベクター。
46.項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞。
47.項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物。
48.担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、項目47に記載の組成物。
49.試料中または細胞上のNTSR1を検出する方法であって、細胞を、項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目47もしくは48に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
50.細胞内のNTSR1活性を阻害するための方法であって、細胞を、有効量の項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目47もしくは48に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
51.細胞内のニューロテンシンによるNTSR1の活性化を阻害する方法であって、細胞を、有効量の項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目47もしくは48に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
52.対象におけるNTSR1活性に関連する疾患または状態を治療するための方法であって、対象に、有効量の項目1〜43のいずれか一項に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目47もしくは48に記載の組成物を投与することを含む、方法。
53.該疾患または状態が炎症性腸疾患である、項目52に記載の方法。
54.該治療が、大腸炎関連腫瘍形成を発症するリスクを低減する、項目52または53に記載の方法。
55.該疾患または状態が代謝性疾患または状態である、項目52に記載の方法。
56.該疾患または状態が癌、好ましくは膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、肝臓癌、脳癌、子宮癌、皮膚癌、胃癌、または結腸直腸癌である、項目52に記載の方法。
57.該癌が原発性癌である、項目56に記載の方法。
58.該癌が転移性または続発性癌である、項目56に記載の方法。
59.該癌が難治性癌である、項目56〜58のいずれか一項に記載の方法。
60.該治療が、癌の悪性度および/または転移能を低減するためのものである、項目56〜59のいずれか一項に記載の方法。
61.該癌が、上皮成長因子受容体を発現または過剰発現する、項目56〜60のいずれか一項に記載の方法。
62.該上皮成長因子受容体が、構成的に活性化された上皮成長因子受容体である、項目61に記載の方法。
63.該抗体またはその抗原結合フラグメントが、Fcフラグメントを含むscFv(scFV−Fc)である、項目56〜62のいずれか一項に記載の方法。
64.対象に、有効量の追加の化学療法薬を投与することをさらに含む、項目56〜63のいずれか一項に記載の方法。
65.対象がヒト対象である、項目52〜64のいずれか一項に記載の方法。
66.以下の配列のドメインを含む環状ペプチドであって、
X1−X2−X3−N−R−S−A−D−G1−X4−H−X5−G2−G3
式中、
「−」は結合、好ましくはペプチド(アミド)結合であり、
X1はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
X2はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
X3はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
X4およびX5は任意のアミノ酸であり、
X3またはNのうちの1つは、G3への結合、好ましくはペプチド結合を介して付着し、それによって環状ペプチドを形成する、環状ペプチド、
あるいはその塩。
67.X1が存在する場合、システインである、項目66に記載の環状ペプチド。
68.X2が存在する場合、正荷電残基、好ましくはリジン(K)残基である、項目66または67に記載の環状ペプチド。
69.X3が存在する場合、正荷電残基である、項目66〜68のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
70.該正荷電残基が、リジン(K)またはオルニチンである、項目69に記載の環状ペプチド。
71.リジンまたはオルニチンのアミン基が、G3のカルボキシ末端とペプチド結合を形成する、項目70に記載の環状ペプチド。
72.X5がQまたはTである、項目66〜71のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
73.X5がQである、項目72に記載の環状ペプチド。
74.X5がTである、項目72に記載の環状ペプチド。
75.X6がAまたはPである、項目66〜74のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
76.X6がAである、項目75に記載の環状ペプチド。
77.X6がPである、項目75に記載の環状ペプチド。
78.担体タンパク質にコンジュゲートされる、項目66〜77のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
79.該担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)である、項目78に記載の環状ペプチド。
80.項目66〜79のいずれか一項に記載の環状ペプチドを含む組成物。
81.担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、項目80に記載の組成物。
82.ワクチンまたは免疫原性組成物である、項目80または81に記載の組成物。
83.該ワクチン組成物が、項目78または79に記載の環状ペプチドを含む、項目82に記載の組成物。
84.ワクチンアジュバントをさらに含む、項目82または83に記載の組成物。
85.ワクチンアジュバントがフロイントアジュバント(Freud’s adjuvant)である、項目84に記載の組成物。
86.動物におけるNTSR1に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための方法であって、該動物に、有効量の項目66〜79のいずれか一項に記載の環状ペプチドまたは項目80〜85のいずれか一項に記載の組成物を該動物に投与することを含む、方法。
87.動物において産生された抗体を採取することをさらに含む、項目86に記載の方法。
88.採取された抗体を精製することをさらに含む、項目87に記載の方法。
89.該精製が、該動物に投与されるペプチドを使用して、抗体を含む試料を親和性精製ステップに供することを含む、項目88に記載の方法。
90.該動物が、ニワトリ(雌鶏)である、項目86〜89のいずれか一項に記載の方法。
91.項目87に記載の該採取が該動物によって産生される卵からである、項目90に記載の方法。
1.ニューロテンシン受容体1型(NTSR1)の細胞外ループに位置する立体構造エピトープ(該細胞外ループがヒトNTSR1(配列番号80)の残基206〜234に対応する)に、好ましくは、ヒトニューロテンシン受容体1型(NTSR1)からのアミノ酸配列NRSADGQHAGGおよび/またはラットNTSR1からのアミノ酸配列NRSGDGTHPGGに位置する立体構造エピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
2.ヒトNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGGおよびラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGGに位置する立体構造エピトープに特異的に結合する、項目1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
3.ポリクローナル抗体である、項目1または2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
4.モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目1または2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
5.相補性決定領域(CDR)の以下の組み合わせ:配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)またはSGSGSSWHGYG(配列番号125)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1(CDR−L1)、配列FNDKRPS(配列番号10)またはDNTNRPS(配列番号126)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−L2、配列GSADSTGGI(配列番号11)またはGGYDSSTYAGI(配列番号127)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−L3、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)またはGFTFSSFNMI(配列番号128)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1(CDR−H1)、配列AQIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)またはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−H2、および配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)またはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−H3を含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
6.(i)CDR−L1が、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)もしくはSGSGSSWHGYG(配列番号125)と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−L2が、配列FNDKRPS(配列番号10)もしくはDNTNRPS(配列番号126)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−L3が、配列GSADSTGGI(配列番号11)もしくはGGYDSSTYAGI(配列番号127)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−H1が、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)もしくはGFTFSSFNMI(配列番号128)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−H2が、配列AQIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)もしくはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR−H3が、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)もしくはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または(vii)(i)〜(vi)の任意の組み合わせである、項目5に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
7.(i)CDR−L1が、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)、SGGGSTDASSYYYG(配列番号19)、もしくはSGSGSSWHGYG(配列番号125)を含む、(ii)CDR−L2が、配列FNDKRPS(配列番号10)もしくはDNTNRPS(配列番号126)を含む、(iii)CDR−L3が、配列GSADSTGGI(配列番号11)もしくはGGYDSSTYAGI(配列番号127)を含む、(iv)CDR−H1が、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)、GFTFSSFNRF(配列番号15)、GFTVSSFNMF(配列番号16)、GFTFSSFNMC(配列番号17)、GFTFSSFNMV(配列番号18)、GFTFSGFNMF(配列番号20)、GFTFRSFNMF(配列番号21)、GFTFSRFNMF(配列番号23)、GVTFSSFNMF(配列番号24)、GFTFSSVNMF(配列番号25)、GFTFSSLNMF(配列番号26)、GFTFGSFNMF(配列番号27)、GFTFSSCNMF(配列番号28)、もしくはGFTFSSFNMI(配列番号128)を含む、(v)CDR−H2が、配列QIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)、QISDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号22)、QSIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号29)、QMIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号30)、QIIDGAGSRTADGAAVKG(配列番号31)、QIIEGAGSRTAYGAAVKG(配列番号32)、もしくはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)を含む、(vi)CDR−H3が、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)もしくはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)を含む、または(vii)(i)〜(vi)の任意の組み合わせである、項目6に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
8.(i)CDR−L1が、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)、SGGGSTDASSYYYG(配列番号19)、またはSGSGSSWHGYG(配列番号125)を含み、(ii)CDR−L2が、配列FNDKRPS(配列番号10)またはDNTNRPS(配列番号126)を含み、(iii)CDR−L3が、配列GSADSTGGI(配列番号11)またはGGYDSSTYAGI(配列番号127)を含み、(iv)CDR−H1が、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)、GFTFSSFNRF(配列番号15)、GFTVSSFNMF(配列番号16)、GFTFSSFNMC(配列番号17)、GFTFSSFNMV(配列番号18)、GFTFSGFNMF(配列番号20)、GFTFRSFNMF(配列番号21)、GFTFSRFNMF(配列番号23)、GVTFSSFNMF(配列番号24)、GFTFSSVNMF(配列番号25)、GFTFSSLNMF(配列番号26)、GFTFGSFNMF(配列番号27)、GFTFSSCNMF(配列番号28)、またはGFTFSSFNMI(配列番号128)を含み、(v)CDR−H2が、配列QIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)、QISDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号22)、QSIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号29)、QMIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号30)、QIIDGAGSRTADGAAVKG(配列番号31)、QIIEGAGSRTAYGAAVKG(配列番号32)、またはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)を含み、(vi)CDR−H3が、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)またはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
9.IgY抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目1〜8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
10.抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)もしくはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)1、(ii)配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)もしくはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR2、(iii)配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)もしくはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR3、(iv)配列FGAGTTLTVL(配列番号103)もしくはFGAGTTLTVL(配列番号134)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、項目9に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
11.(i)軽鎖FR1が、配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)もしくはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)を含む、(ii)軽鎖FR2が、配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)もしくはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)を含む、(iii)軽鎖FR3が、配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)もしくはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)を含む、(iv)軽鎖FR4が、配列FGAGTTLTVL(配列番号103)もしくはFGAGTTLTVL(配列番号134)を含む、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、項目10に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
12.(i)軽鎖FR1が、配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)またはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)を含み、(ii)軽鎖FR2が、配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)またはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)を含み、(iii)軽鎖FR3が、配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)またはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)を含み、(iv)軽鎖FR4が、配列FGAGTTLTVL(配列番号103)またはFGAGTTLTVL(配列番号134)を含む、項目10に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
13.抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)もしくはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKAS(配列番号135)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)もしくはWVRQTPGKGLEWV(配列番号136)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR2、(iii)配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)もしくはRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAK(配列番号137)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR3、(iv)配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)もしくはWGHGTEVIVSS(配列番号138)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、項目9〜12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
14.(i)重鎖FR1が、配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)もしくはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKAS(配列番号135)を含む、(ii)重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)もしくはWVRQTPGKGLEWV(配列番号136)を含む、(iii)重鎖FR3が、配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)を含む、(iv)重鎖FR4が、配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)を含む、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、項目13に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
15.(i)重鎖FR1が、配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)を含み、(ii)重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)を含み、(iii)重鎖FR3が、配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)またはRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAK(配列番号137)を含み、(iv)重鎖FR4が、配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)またはWGHGTEVIVSS(配列番号138)を含む、項目14に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
16.抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ALTQPTSVSANLGGTVEITCSGGGSTDAGSYYYGWFQQKSPGSAPVTVIYFNDKRPSDIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFCGSADSTGGIFGAGTTLTVL(配列番号108)またはALTQPSSVSANLGGTVKITCSGSGSSWHGYGWYQQKAPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFCGGYDSSTYAGIFGAGTTLTVL(配列番号139)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖(VL)を含む、項目9〜15のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
17.VLが、配列番号108または139の配列を含む、項目16に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
18.抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEFVAQIIDGAGSRTAYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCARGGHYWGGASIDAWGHGTEVIVSS(配列番号109)またはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKASGFTFSSFNMIWVRQTPGKGLEWVASICTGGSYTYYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAKSVDGVGWHAGQIDAWGHGTEVIVSS(配列番号140)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖(VH)を含む、項目9〜17のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
19.VHが、配列番号109または140の配列を含む、項目18に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
20.IgY抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化形態である、項目1〜8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
21.抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)1、(ii)配列WYQQKPGQAPVTVIYと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR2、(iii)配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR3、(iv)配列FGGGTKLTVLと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、項目20に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
22.(i)軽鎖FR1が、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCを含む、(ii)軽鎖FR2が、配列WYQQKPGQAPVTVIYを含む、(iii)軽鎖FR3が、配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCを含む、(iv)軽鎖FR4が、配列FGGGTKLTVLを含む、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、項目21に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
23.(i)軽鎖FR1が、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCを含み、(ii)軽鎖FR2が、配列WYQQKPGQAPVTVIYを含み、(iii)軽鎖FR3が、配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCを含み、(iv)軽鎖FR4が、配列FGGGTKLTVLを含む、項目22に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
24.抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEWVと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR2、(iii)配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR3、(iv)配列WGQGTLVTVSSと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、項目20〜23のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
25.(i)重鎖FR1が、配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASを含む、(ii)重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEWVを含む、(iii)重鎖FR3が、配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKを含む、(iv)重鎖FR4が、配列WGQGTLVTVSSを含む、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、項目24に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
26.(i)重鎖FR1が、配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASを含み、(ii)重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEWVを含み、(iii)重鎖FR3が、配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKを含み、(iv)重鎖FR4が、配列WGQGTLVTVSSを含む、項目25に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
27.抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGGSTDAGSYYYGWYQQKPGQAPVTVIYFNDKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGSADSTGGIFGGGTKLTVL(配列番号118)またはSSELTQPPAVSVALGQTVRITCSGSGSSWHGYGWYQQKPGQAPVTVIYDNTNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGGYDSSTYAGIFGGGTKLTVL(配列番号141)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖(VL)を含む、項目20〜26のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
28.VLが、配列番号118または141の配列を含む、項目27に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
29.抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEWVAQIIDGAGSRTAYGAAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGHYWGGASIDAWGQGTLVTVSS(配列番号119)またはEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFNMIWVRQAPGKGLEWVASICTGGSYTYYAPAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSVDGVGWHAGQIDAWGQGTLVTVSS(配列番号142)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖(VH)を含む、項目20〜28のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
30.VHが、配列番号119または141の配列を含む、項目29に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
31.抗体の抗原結合フラグメントである、項目1〜30のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
32.該抗原結合フラグメントが、軽鎖可変領域(VL)、重鎖可変領域(VH)、およびVLとVHとを接続するリンカーを含む一本鎖可変フラグメント(scFv)である、項目31に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
33.該リンカーが、約5〜約50個のアミノ酸を含むポリペプチドリンカーである、項目32に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
34.該ポリペプチドリンカーが、約15〜約20個のアミノ酸を含む、項目33に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
35.該ポリペプチドリンカーが、約18個のアミノ酸を含む、項目34に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
36.ポリペプチドリンカー中の残基の少なくとも25%がグリシン残基である、項目33〜35のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
37.該リンカーが、ペンタペプチド配列GGGGSを含む、項目33〜36のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
38.ポリペプチドリンカーが、配列GQSSRSSGGGGSSGGGGSを含む、項目37に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
39.該リンカーが、VHのN末端をVLのC末端と接続する、項目32〜38のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
40.抗体またはその抗原結合フラグメントが、少なくとも1つの定常ドメインまたはそのフラグメントを含む、項目1〜39のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
41.抗体の定常重鎖のフラグメント結晶性(Fc)フラグメントを含む、項目40に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
42.Fcフラグメントが、図8Gの太字の配列を含む、項目41に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
43.検出可能な標識または親和性タグにコンジュゲートされる、項目1〜42のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
44.項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸または核酸の組み合わせ。
45.項目44に記載の核酸または核酸の組み合わせを含むプラスミドまたはベクター。
46.項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞。
47.項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物。
48.担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、項目47に記載の組成物。
49.試料中または細胞上のNTSR1を検出する方法であって、細胞を、項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目47もしくは48に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
50.細胞内のNTSR1活性を阻害するための方法であって、細胞を、有効量の項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目47もしくは48に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
51.細胞内のニューロテンシンによるNTSR1の活性化を阻害する方法であって、細胞を、有効量の項目1〜43のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目47もしくは48に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
52.対象におけるNTSR1活性に関連する疾患または状態を治療するための方法であって、対象に、有効量の項目1〜43のいずれか一項に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目47もしくは48に記載の組成物を投与することを含む、方法。
53.該疾患または状態が炎症性腸疾患である、項目52に記載の方法。
54.該治療が、大腸炎関連腫瘍形成を発症するリスクを低減する、項目52または53に記載の方法。
55.該疾患または状態が代謝性疾患または状態である、項目52に記載の方法。
56.該疾患または状態が癌、好ましくは膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、肝臓癌、脳癌、子宮癌、皮膚癌、胃癌、または結腸直腸癌である、項目52に記載の方法。
57.該癌が原発性癌である、項目56に記載の方法。
58.該癌が転移性または続発性癌である、項目56に記載の方法。
59.該癌が難治性癌である、項目56〜58のいずれか一項に記載の方法。
60.該治療が、癌の悪性度および/または転移能を低減するためのものである、項目56〜59のいずれか一項に記載の方法。
61.該癌が、上皮成長因子受容体を発現または過剰発現する、項目56〜60のいずれか一項に記載の方法。
62.該上皮成長因子受容体が、構成的に活性化された上皮成長因子受容体である、項目61に記載の方法。
63.該抗体またはその抗原結合フラグメントが、Fcフラグメントを含むscFv(scFV−Fc)である、項目56〜62のいずれか一項に記載の方法。
64.対象に、有効量の追加の化学療法薬を投与することをさらに含む、項目56〜63のいずれか一項に記載の方法。
65.対象がヒト対象である、項目52〜64のいずれか一項に記載の方法。
66.以下の配列のドメインを含む環状ペプチドであって、
X1−X2−X3−N−R−S−A−D−G1−X4−H−X5−G2−G3
式中、
「−」は結合、好ましくはペプチド(アミド)結合であり、
X1はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
X2はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
X3はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
X4およびX5は任意のアミノ酸であり、
X3またはNのうちの1つは、G3への結合、好ましくはペプチド結合を介して付着し、それによって環状ペプチドを形成する、環状ペプチド、
あるいはその塩。
67.X1が存在する場合、システインである、項目66に記載の環状ペプチド。
68.X2が存在する場合、正荷電残基、好ましくはリジン(K)残基である、項目66または67に記載の環状ペプチド。
69.X3が存在する場合、正荷電残基である、項目66〜68のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
70.該正荷電残基が、リジン(K)またはオルニチンである、項目69に記載の環状ペプチド。
71.リジンまたはオルニチンのアミン基が、G3のカルボキシ末端とペプチド結合を形成する、項目70に記載の環状ペプチド。
72.X5がQまたはTである、項目66〜71のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
73.X5がQである、項目72に記載の環状ペプチド。
74.X5がTである、項目72に記載の環状ペプチド。
75.X6がAまたはPである、項目66〜74のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
76.X6がAである、項目75に記載の環状ペプチド。
77.X6がPである、項目75に記載の環状ペプチド。
78.担体タンパク質にコンジュゲートされる、項目66〜77のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
79.該担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)である、項目78に記載の環状ペプチド。
80.項目66〜79のいずれか一項に記載の環状ペプチドを含む組成物。
81.担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、項目80に記載の組成物。
82.ワクチンまたは免疫原性組成物である、項目80または81に記載の組成物。
83.該ワクチン組成物が、項目78または79に記載の環状ペプチドを含む、項目82に記載の組成物。
84.ワクチンアジュバントをさらに含む、項目82または83に記載の組成物。
85.ワクチンアジュバントがフロイントアジュバント(Freud’s adjuvant)である、項目84に記載の組成物。
86.動物におけるNTSR1に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための方法であって、該動物に、有効量の項目66〜79のいずれか一項に記載の環状ペプチドまたは項目80〜85のいずれか一項に記載の組成物を該動物に投与することを含む、方法。
87.動物において産生された抗体を採取することをさらに含む、項目86に記載の方法。
88.採取された抗体を精製することをさらに含む、項目87に記載の方法。
89.該精製が、該動物に投与されるペプチドを使用して、抗体を含む試料を親和性精製ステップに供することを含む、項目88に記載の方法。
90.該動物が、ニワトリ(雌鶏)である、項目86〜89のいずれか一項に記載の方法。
91.項目87に記載の該採取が該動物によって産生される卵からである、項目90に記載の方法。
添付の図面を参照してほんの一例として与えられる本発明の特定の実施形態の以下の非限定的な説明を読むと、本発明の他の目的、利点、および特徴がより明らかになる。添付図面では、以下の事項が示される。
本明細書に記載の研究において、本発明者らは、様々な種(ヒトを含む)由来のNTS1受容体の第2の細胞外ループの立体構造を模倣する環状ペプチドを操作し、これを使用してニワトリを免疫化し、NTS1受容体を特異的に識別するIgY抗体を作った。これらの抗体は、NTS1受容体への結合についてNTと競合し、NT依存性環状AMP産生ならびにNT媒介性Gαqおよびβ−アレスチン−2シグナル伝達経路活性化を阻害することが示された。これらの抗体の組換え形態(scFvおよびscFv−Fc)も産生され、ヒトNTS1受容体を内因的に発現する癌細胞株におけるニューロテンシン媒介性Gαq活性化を阻害し、ADCCを誘発し、異なる起源からの癌患者由来の異種移植片に結合することが示された。
抗NTSR1抗体およびその抗原結合フラグメント
したがって、第1の態様において、本開示は、NTS1受容体(NTSR1)の細胞外ループ、好ましくはヒトNTSR1(図9A、配列番号80)の残基206〜234に対応するNTSR1の細胞外ループに位置するエピトープ(例えば、立体構造エピトープ)に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。この細胞外ループは、ラットNTSR1(図9B、配列番号81)における残基207〜235、およびマウスNTSR1(図9C、配列番号82)の残基206〜234によって定義される。別の態様において、本開示は、ニューロテンシンとNTSR1との間の相互作用を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、NTS2に結合しない。
したがって、第1の態様において、本開示は、NTS1受容体(NTSR1)の細胞外ループ、好ましくはヒトNTSR1(図9A、配列番号80)の残基206〜234に対応するNTSR1の細胞外ループに位置するエピトープ(例えば、立体構造エピトープ)に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。この細胞外ループは、ラットNTSR1(図9B、配列番号81)における残基207〜235、およびマウスNTSR1(図9C、配列番号82)の残基206〜234によって定義される。別の態様において、本開示は、ニューロテンシンとNTSR1との間の相互作用を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、NTS2に結合しない。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトNTS1受容体(NTSR1)由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGG(配列番号83)および/またはラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGG(配列番号84)に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGG(配列番号83)およびラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGG(配列番号84)に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHPGG(配列番号85)に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列NRSADGTHPGG(配列番号86)に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する。
本明細書で使用される「立体構造エピトープ」という用語は、タンパク質のネイティブな三次元構造に見られ、抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合することが可能な抗原決定基を指す。
本明細書で使用される「抗体またはその抗原結合フラグメント」という用語は、所望の抗原特異性/結合活性を示す限り、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、CDR移植抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントを含む任意のタイプの抗体/抗体フラグメントを指す。抗体フラグメントは、完全長抗体の一部分、概してその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFvフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子(例えば、一本鎖FV、scFV)、単一ドメイン抗体(例えば、ラクダ由来)、サメNAR単一ドメイン抗体、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体フラグメントはまた、VH領域(VH、VH−VH)、anticalin、PepBody、抗体T細胞エピトープ融合体(Troybody)、またはPeptibodyを含むがこれらに限定されない、CDRまたは抗原結合ドメインを含む結合部分を指すことができる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団からの抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は実質的に類似しており、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る考えられるバリアントを除いて、同じエピトープ(複数可)に結合し、そのようなバリアントは概して微量で存在している。そのようなモノクローナル抗体は典型的には、標的に結合する可変領域を含む抗体を含み、抗体は、複数の抗体からの抗体の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、複数のクローン、例えば、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えDNAクローンのプールからの特有のクローンの選択であり得る。選択された抗体は、例えば、標的に対する親和性を改善する、抗体をヒト化する、細胞培養におけるその産生を改善する、インビボでのその免疫原性を低減する、多重特異性抗体を作るなどのために、さらに改変され得、改変された可変領域配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には、他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。修飾語「モノクローナル(monoclonal)」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler et al.,Nature,256:495(1975)、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)、Hammerling et al.,:Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas 563−681,(Elsevier,N.Y.,1981))、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson et al.,Nature,352:624−628(1991)、Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581−597(1991)、Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299−310(2004)、Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073−1093(2004)、Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34):12467−12472(2004)、およびLee et al.J.Immunol.Methods 284(1−2):119−132(2004)を参照)、ならびにヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全部を有する動物からヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術(例えば、WO98/24893、WO96/34096、WO96/33735、およびWO91/10741、Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)、Jakobovits et al.,Nature,362:255−258(1993)、Bruggemann et al.,Year in Immune,7:33(1993)、米国特許第.5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,591,669号(全てGenPharm)、同第5,545,807号、WO97/17852、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、および同第5,661,016号、ならびにMarks et al.,Bio/Technology,10:779−783(1992)、Lonberg et al.,Nature,368:856−859(1994)、Morrison,Nature,368:812−813(1994)、Fishwild et al.,Nature Biotechnology,14:845−851(1996)、Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)、ならびにLonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65−93(1995)を参照)を含む、様々な技法によって作製され得る。本明細書に定義されるNTSR1からの立体構造エピトープに特異的に結合することが可能な抗体はまた、ファージディスプレイ技術を使用して産生され得る。次いで、本明細書に定義されるNTSR1からの立体構造エピトープに選択的に結合する抗体フラグメントが単離され得る。ファージディスプレイを介してそのような抗体を産生するための例示的な方法は、例えば、米国特許第6,225,447号に開示されている。
本明細書におけるモノクローナル抗体は具体的には、所望の生物活性を示す限り、軽鎖および/または重鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である一方で、鎖(複数可)の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である、「キメラ」または「組換え」抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントを含む(米国特許第4,816,567号、およびMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855(1984))。本明細書における目的のキメラ抗体としては、「ヒト化」抗体が挙げられる。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が抗体間で配列において大きく異なるという事実を指し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布していない。軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域(CDR)または超可変領域(HVR)と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。ネイティブ重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する3つのCDRによって接続される、主にβシート構造を採用する4つのFR領域を含む。各鎖のCDRは、FR領域によって近接して一緒に保持され、他方の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。N末端からC末端まで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、交互のFRおよびCDR:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。各領域へのアミノ酸の割り当ては、例えば、Kabat、Chothiaの定義(Al−Lazikani et al.,J Mol Biol.1997;273(4):927−48)、またはIMGT(Lefranc,M.−P.,Immunology Today,18,509(1997))に従って行われ得る。
「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。二本鎖Fv種において、この領域は、密接な非共有会合における1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Fv種において、1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二本鎖Fv種におけるものと類似の「二量体」構造で会合することができるように、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合され得る。この構造では、各可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH−VL二量体の表面上の抗原結合部位を画定する。集合的に、6つのCDRは、抗体に抗原結合特異性を付与することに関与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
「超可変領域」または「HVR」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は概して、「相補性決定領域」または「CDR」からのアミノ酸残基(Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))、および/または「超可変ループ」からの残基(Al−Lazikani et al.、上記参照)を含む。
「相補性決定領域」または「CDR」という用語は、本明細書で使用される場合、特定のリガンドと接触し、その特異性を決定する免疫学的受容体の一部を指す。免疫学的受容体のCDRは、受容体タンパク質の最も可変な部分であり、受容体にその多様性を与え、受容体の可変ドメインの遠位端の6つのループ上に担持され、3つのループは、受容体の2つの可変ドメインの各々に由来する。
本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」という用語は、Kabatら(上記参照)またはChothia(Al−Lazikani et al.、上記参照)によって定義されるように、単一種中の異なる免疫グロブリンの間で比較的保存されている免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の部分(すなわち、CDR以外)を指す。本明細書で使用される場合、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一であるフレームワーク領域である。
一実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリクローナル抗体である。
別の実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体である。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、相補性決定領域(CDR)の以下の組み合わせ:配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)またはSGSGSSWHGYG(配列番号125)と少なくとも70%、75%、80%、85%、または90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる軽鎖CDR1(CDR−L1)、配列FNDKRPS(配列番号10)またはDNTNRPS(配列番号126)と少なくとも70%、75%、80%、85%、または90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなるCDR−L2、配列GSADSTGGI(配列番号11)またはGGYDSSTYAGI(配列番号127)と少なくとも70%、75%、80%、85%、または90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなるCDR−L3、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)またはGFTFSSFNMI(配列番号128)と少なくとも70%、75%、80%、85%、または90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる重鎖CDR1(CDR−H1)、配列QIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)またはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)と少なくとも70%、75%、80%、85%、または90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなるCDR−H2、および配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)またはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)と少なくとも70%、75%、80%、85%、または90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなるCDR−H3を含む。
一実施形態において、上述のCDR配列内の1つまたは2つの残基が置換される。さらなる実施形態において、上述のCDR配列内の1つの残基が置換される。
一実施形態において、CDR−L1は以下の配列:SGGGSTDAXSYYYG(配列番号86)を含み、Xは任意のアミノ酸、好ましくはグリシンまたはセリンである。
一実施形態において、CDR−H1は以下の配列:GX1TX2X3X4X5NX6X7(配列番号87)を含み、X1〜X7は独立して、任意のアミノ酸である。一実施形態において、CDR−H1は以下の配列:GX1TFSSFNMF(配列番号88)を含み、X1は任意のアミノ酸、好ましくはバリンまたはフェニルアラニンである。一実施形態において、CDR−H1は以下の配列:GFTX2SSFNMF(配列番号89)を含み、X2は任意のアミノ酸、好ましくはバリンまたはフェニルアラニンである。一実施形態において、CDR−H1は以下の配列:GFTFX3SFNMF(配列番号90)を含み、X3は任意のアミノ酸、好ましくはセリン、アルギニン、またはグリシンである。一実施形態において、CDR−H1は以下の配列:GFTFSX4FNMF(配列番号91)を含み、X4は任意のアミノ酸、好ましくはセリン、アルギニン、またはグリシンである。一実施形態において、CDR−H1は以下の配列:GFTFSSX5NMF(配列番号92)を含み、X5は任意のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン、バリン、ロイシン、またはシステインである。一実施形態において、CDR−H1は以下の配列:GFTFSSFNX6F(配列番号93)を含み、X6は任意のアミノ酸、好ましくはメチオニンまたはアルギニンである。一実施形態において、CDR−H1は以下の配列:GFTFSSFNMX7(配列番号94)を含み、X7は任意のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン、バリン、またはシステインである。
一実施形態において、CDR−H2は以下の配列:QX8X9X10GAGSRTAX11GAAVKG(配列番号95)を含み、X8〜X11は独立して、任意のアミノ酸である。別の実施形態において、CDR−H2は、以下の配列:QX8IDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号96)を含み、X8は任意のアミノ酸、好ましくはイソロイシン、セリン、またはメチオニンである。別の実施形態において、CDR−H2は、以下の配列:QIX9DGAGSRTAYGAAVKG(配列番号97)を含み、X9は任意のアミノ酸、好ましくはイソロイシンまたはセリンである。別の実施形態において、CDR−H2は、以下の配列:QIIX10GAGSRTAYGAAVKG(配列番号98)を含み、X10は任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸である。別の実施形態において、CDR−H2は、以下の配列:QIIDGAGSRTAX11GAAVKG(配列番号99)を含み、X11は任意のアミノ酸、好ましくはチロシンまたはアスパラギン酸である。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、図8Aに示されるCDRのうちの1つ以上を含む。
さらなる実施形態において、(i)CDR−L1は、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)、SGGGSTDASSYYYG(配列番号19)、もしくはSGSGSSWHGYG(配列番号125)を含むもしくはそれからなる、(ii)CDR−L2は、配列FNDKRPS(配列番号10)もしくはDNTNRPS(配列番号126)を含むもしくはそれからなる、(iii)CDR−L3は、配列GSADSTGGI(配列番号11)もしくはGGYDSSTYAGI(配列番号127)を含むもしくはそれからなる、(iv)CDR−H1は、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)、GFTFSSFNRF(配列番号15)、GFTVSSFNMF(配列番号16)、GFTFSSFNMC(配列番号17)、GFTFSSFNMV(配列番号18)、GFTFSGFNMF(配列番号20)、GFTFRSFNMF(配列番号21)、GFTFSRFNMF(配列番号23)、GVTFSSFNMF(配列番号24)、GFTFSSVNMF(配列番号25)、GFTFSSLNMF(配列番号26)、GFTFGSFNMF(配列番号27)、GFTFSSCNMF(配列番号28)、もしくはGFTFSSFNMI(配列番号128)を含むもしくはそれからなる、(v)CDR−H2は、配列QIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)、QISDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号22)、QSIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号29)、QMIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号30)、QIIDGAGSRTADGAAVKG(配列番号31)、QIIEGAGSRTAYGAAVKG(配列番号32)、もしくはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)を含むもしくはそれからなる、(vi)CDR−H3は、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)もしくはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)を含むもしくはそれからなる、または(vii)(i)〜(vi)の任意の組み合わせである。
さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のCDRの組み合わせを含む:(i)配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)、SGGGSTDASSYYYG(配列番号19)、またはSGSGSSWHGYG(配列番号125)、好ましくはSGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)を含むまたはそれからなるCDR−L1、(ii)配列FNDKRPS(配列番号10)またはDNTNRPS(配列番号126)を含むまたはそれからなるCDR−L2、(iii)配列GSADSTGGI(配列番号11)またはGGYDSSTYAGI(配列番号127)を含むまたはそれからなるCDR−L3、(iv)配列GFTFSSFNMF(配列番号12)、GFTFSSFNRF(配列番号15)、GFTVSSFNMF(配列番号16)、GFTFSSFNMC(配列番号17)、GFTFSSFNMV(配列番号18)、GFTFSGFNMF(配列番号20)、GFTFRSFNMF(配列番号21)、GFTFSRFNMF(配列番号23)、GVTFSSFNMF(配列番号24)、GFTFSSVNMF(配列番号25)、GFTFSSLNMF(配列番号26)、GFTFGSFNMF(配列番号27)、GFTFSSCNMF(配列番号28)、またはGFTFSSFNMI(配列番号128)、好ましくはGFTFSSFNMF(配列番号12)を含むまたはそれからなるCDR−H1、(v)配列QIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)、QISDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号22)、QSIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号29)、QMIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号30)、QIIDGAGSRTADGAAVKG(配列番号31)、QIIEGAGSRTAYGAAVKG(配列番号32)、またはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)、好ましくはQIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)を含むまたはそれからなるCDR−H2、および(vi)配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)またはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)を含むまたはそれからなるCDR−H3。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む:(i)配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)もしくはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖FR1、(ii)配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)もしくはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖FR2、(iii)配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)もしくはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖FR3、(iv)配列FGAGTTLTVL(配列番号103)もしくはFGAGTTLTVL(配列番号134)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせ。一実施形態において、軽鎖FR1は、図8Bに示されるFR1アミノ酸配列のうちの1つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、軽鎖FR2は、図8Bに示されるFR2アミノ酸配列のうちの1つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、軽鎖FR3は、図8Bに示されるFR3アミノ酸配列のうちの1つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、軽鎖FR4は、図8Bに示されるFR4アミノ酸配列のうちの1つを含むまたはそれからなる。
さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む:(i)配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)もしくはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)を含むもしくはそれからなる軽鎖FR1、(ii)配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)もしくはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)を含むもしくはそれからなる軽鎖FR2、(iii)配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)もしくはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)を含むもしくはそれからなる軽鎖FR3、(iv)配列FGAGTTLTVL(配列番号103)もしくはFGAGTTLTVL(配列番号134)を含むもしくはそれからなる軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせ。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、特徴(i)〜(iv)を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む:(i)配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)もしくはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKAS(配列番号135)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)もしくはWVRQTPGKGLEWV(配列番号136)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖FR2、(iii)配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)もしくはRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAK(配列番号137)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖FR3、(iv)配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)もしくはWGHGTEVIVSS(配列番号138)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせ。一実施形態において、重鎖FR1は、図8Cに示されるFR1アミノ酸配列のうちの1つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、重鎖FR2は、図8Cに示されるFR2アミノ酸配列のうちの1つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、重鎖FR3は、図8Cに示されるFR3アミノ酸配列のうちの1つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、重鎖FR4は、図8Cに示されるFR4アミノ酸配列のうちの1つを含むまたはそれからなる。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む:(i)配列番号104もしくは135を含むもしくはそれからなる重鎖FR1、(ii)配列番号105もしくは136を含むもしくはそれからなる重鎖FR2、(iii)配列番号106もしくは137を含むもしくはそれからなる重鎖FR3、(iv)配列番号107もしくは138を含むもしくはそれからなる重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせ。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、特徴(i)〜(iv)を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列
(配列番号108)または
(配列番号139)と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む。一実施形態において、参照可変軽鎖配列に対する差は、上記の下線付きのFRのうちの1つ以上内にある。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号108または139の配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列
(配列番号109)または
(配列番号140)と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む。一実施形態において、参照可変重鎖配列に対する差は、上記の下線付きのFRのうちの1つ以上内にある。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号109または140の配列を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む。
本明細書に記載のCDRおよびFRの配列は、Chothiaの番号付けに基づいている(Al−Lazikani et al.,J Mol Biol.1997 Nov 7;273(4):927−48)。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、上述の抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化形態である。
別の態様において、本開示は、本明細書に開示されるCDRの組み合わせのいずれかを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、好ましくはキメラまたはヒト化抗体または抗原結合フラグメントに関する。
非ヒト(例えば、ニワトリ、げっ歯類)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域(例えば、CDR)由来の残基が、本明細書に定義されるCDRなどの所望の特異性、親和性、および能力を有するニワトリ、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域由来の残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFR残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。ヒト化抗体はまた、FRのうちの1つ以上からの残基がヒト免疫グロブリンの1つ以上のFRからの残基によって置き換えられる、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト(例えば、ニワトリ)免疫グロブリンに対応し得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト(例えば、ニワトリ)免疫グロブリンのものに対応し、FRの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた任意に、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、Jones et al.,Nature 321:522−525(1986)、Riechmann et al.,Nature 332:323−329(1988)、およびPresta,Curr.Opin.Struct.Biol.2:593−596(1992)を参照。
ヒトキメラ抗体およびヒトCDR移植抗体は、当該技術分野において既知の方法を使用して調製され得る。代表的な方法が以下に記載される。
(1)組換え抗体発現のためのベクターの構築。組換え抗体発現のためのベクターは、ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAが挿入された動物細胞の発現ベクターであり、ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAの各々を動物細胞の発現ベクターにクローニングすることによって構築される。ヒト抗体の定常領域(以下、C領域と称される)は、任意のヒト抗体のCHおよびCLであり得る。例としては、ヒト抗体のγ1サブクラスのCHおよびκクラスのCLなどが挙げられる。ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAとして、cDNAが一般的に使用され得、エクソンおよびイントロンからなる染色体DNAもまた使用され得る。動物細胞の発現ベクターとして、ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子がその中に挿入され、その中で発現され得る限り、任意の発現ベクターが使用され得る。その例としては、pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2−4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、pSE1UK1Sed1−3[Cytotechnol.,13,79(1993)]などが挙げられる。動物細胞の発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、SV40初期プロモーター[J.Biochem.,101,1307(1987)]、モロニーマウス白血病ウイルスLTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]、免疫グロブリンH鎖プロモーター[Cell,41,479(1985)]、エンハンサー[Cell,33,717(1983)]などが挙げられる。組換え抗体発現のためのベクターとして、抗体HおよびL鎖の両方が同一ベクター上に存在する組換え抗体発現のためのベクターのタイプ(タンデムタイプ)(J.Immunol.Methods,167,271(1994))が、組換え抗体発現のためのベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、ならびに動物細胞における抗体HおよびL鎖の発現レベルのバランスの観点から使用されてもよく、抗体HおよびL鎖が別個のベクター上に存在するタイプも使用され得る。組換え抗体発現のためのベクターのタンデムタイプの例としては、pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18(Hybridoma,17,559(1998))などが挙げられる。
(2)非ヒト動物由来の抗体のV領域をコードするcDNAの取得およびアミノ酸配列の分析。mRNAは、cDNAを合成するために非ヒト抗体(例えば、ニワトリ抗体)を産生するハイブリドーマ細胞から抽出される。合成されたcDNAは、ファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングされて、cDNAライブラリを調製する。VHまたはVLをコードするcDNAを含有する組換えファージまたは組換えプラスミドの各々は、プローブとして非ヒト抗体のC領域またはV領域をコードするDNAを使用してライブラリから単離される。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的の非ヒト抗体のVHおよびVLの塩基配列の完全長が決定され、VHおよびVLのアミノ酸配列の完全長がそれぞれ塩基配列から推定される。非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を調製するための非ヒト動物の例としては、ニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどが挙げられる。ハイブリドーマ細胞が産生され得る限り、任意の動物が使用され得る。全RNAは、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法(Methods in Enzymol.,154,3(1987))、またはRNA easy kit(Qiagen(登録商標)製)などのキットなどを使用して、ハイブリドーマ細胞から調製され得る。mRNAは、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))、Oligotex(商標)−dT30<Super>mRNA Purification Kit(Takara Bio製)などのキットを使用する方法などを使用して、全RNAから調製され得る。加えて、mRNAは、Fast Track(登録商標)mRNA単離キット(Invitrogen(登録商標)製)、QuickPrep(登録商標)mRNA Purification Kit(Pharmacia(登録商標)製)などのキットを使用して、ハイブリドーマ細胞から調製され得る。cDNAを合成し、cDNAライブラリを調製するための方法の例としては、既知の方法(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987−1997))、Super Script(登録商標)Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen(登録商標)製)、ZAP−cDNA Synthesis Kit(Stratagene(登録商標)製)などのキットを使用する方法が挙げられる。テンプレートとしてハイブリドーマ細胞から抽出されたmRNAを使用して合成されたcDNAが挿入される、cDNAライブラリを調製するためのベクターは、cDNAがそこに挿入され得る限り、任意のベクターであってもよい。その例としては、ZAP ExPress(Strategies,5,58(1992))、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene(登録商標)製)、λgt10およびλgt11(DNA Cloning:A Practical Approach,I,49(1985))、Lambda BlueMid(Clontech(登録商標)製)、λExCell,pT7T3−18U(Pharmacia(登録商標)製)、pcD2(Mol.Cell.Biol.,3,280(1983))、pUC18(Gene,33,103(1985))などが挙げられる。cDNAライブラリが導入、発現、および維持され得る限り、ファージまたはプラスミドベクターによって構築されたcDNAライブラリを導入するための任意のEscherichia coliが使用され得る。その例としては、XL1−Blue MRF(Strategies,5,81(1992))、C600(Genetics,39,440(1954))、Y1088およびY1090(Science,222:778(1983))、NM522(J.Mol.Biol.,166,1(1983))、K802(J.Mol.Biol.,16,118(1966))、JM105(Gene,38,275(1985))などが挙げられる。同位体または蛍光標識プローブを使用するコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーション法(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))は、cDNAライブラリから非ヒト抗体などのVHまたはVLをコードするcDNAクローンを選択するために使用され得る。また、VHまたはVLをコードするcDNAは、プライマーを調製し、mRNAまたはcDNAライブラリから調製したcDNAをテンプレートとして使用することによって、ポリメラーゼ連鎖反応を通して調製され得る。cDNAの塩基配列は、適切な制限酵素などで選択されたcDNAを消化し、フラグメントをpBluescript SK(−)などのプラスミドにクローニングし、通常使用される配列分析法を行うことによって決定され得る。例えば、配列分析法は、ジデオキシ法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977))などの反応後に、ABI PRISM3700(登録商標)(PE Biosystems(登録商標)製)またはA.L.F.DNA sequencer(Pharmacia(登録商標)製)などの自動ヌクレオチド配列決定分析装置を使用することによって実施される。得られたcDNAが分泌シグナル配列を含有する抗体のVHおよびVLの完全なアミノ酸配列をコードするかどうかは、決定されたヌクレオチド配列からVHおよびVLのアミノ酸配列の完全長を推定し、それらを既知の抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の完全長と比較することによって確認され得(A.L.F.DNA sequencer、US Dept.Health and Human Services(1991))、さらに、それらが属するサブグループが決定され得る。加えて、VHおよびVLの各CDRのアミノ酸配列は、それらを既知の抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列と比較することによって決定され得る。
(3)ヒトキメラ抗体発現のためのベクターの構築。非ヒト動物(例えば、ニワトリ)の抗体のVHおよびVLの各々をコードするcDNAは、上述の組換え抗体の発現のためのベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードする遺伝子の上流でクローニングされ、それによってヒトキメラ抗体発現のためのベクターを構築する。非ヒト動物の抗体のVHまたはVLをコードするcDNAの3’末端と、ヒト抗体のCHまたはCLの5’末端とをライゲーションするために、VHおよびVLをコードする各cDNAは、連結部分の塩基配列によってコードされる適切なアミノ酸をコードするように調製され、制限酵素の適切な認識配列を有するように設計される。VHおよびVLの調製されたcDNAは、それらの各々が上記(1)で言及されたヒトCDR移植抗体発現のためのベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードする遺伝子の上流で適切な形態で発現されるようにそれぞれクローニングされて、ヒトキメラ抗体発現のためのベクターを構築する。加えて、非ヒト動物抗体のVHまたはVLをコードするcDNAは、両端に適切な制限酵素の認識配列を有する合成DNAを使用してPCRによって増幅され、それらの各々は、組換え抗体発現のために上記(1)で得られたベクターにクローニングされる。
(4)ヒトCDR移植抗体のV領域をコードするcDNAの構築。非ヒト抗体のVHまたはVL中のCDR(例えば、本明細書に記載の抗体のCDR)のアミノ酸配列が移植される、非ヒト抗体のVHまたはVL中のFRのアミノ酸配列がそれぞれ選択される。FRの任意のアミノ酸配列は、それらがヒト由来である限り使用され得る。その例としては、Protein Data Bankなどのデータベースに登録されたヒト抗体のFRのアミノ酸配列、またはヒト抗体のFRのサブグループに共通のアミノ酸配列[A.L.F.DNA,US Dept.Health and Human Services(1991)]などが挙げられる。抗体の結合活性の減少を阻害するために、元の抗体のVHまたはVL中のFRのアミノ酸配列と高い相同性(少なくとも60%以上)を有するFRのアミノ酸配列が選択される。次いで、元の抗体のCDRのアミノ酸配列が、ヒト抗体のVHまたはVL中のFRの選択されたアミノ酸配列にそれぞれ移植されて、ヒトCDR移植抗体のVHまたはVLの各アミノ酸配列を設計する。設計されたアミノ酸配列は、抗体の遺伝子のヌクレオチド配列に見られるコドン使用の頻度を考慮することによってDNA配列に変換され、ヒトCDR移植抗体のVHまたはVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列が設計される。設計されたDNA配列に基づいて、約100ヌクレオチドの長さを有するいくつかの合成DNAが合成され、それらを使用してPCRが行われる。この場合、PCRの反応効率および合成され得るDNAの長さを考慮して、H鎖およびL鎖の各々当たり6個の合成DNAが設計されることが好ましい。さらに、ヒトCDR移植抗体のVHまたはVLをコードするcDNAは、両端上に存在する合成DNAの5’末端に適切な制限酵素の認識配列を導入することによって、(1)で構築されたヒトCDR移植抗体を発現するためのベクターに容易にクローニングされ得る。そうでなければ、設計されたDNA配列に基づいて、完全長H鎖および完全長L鎖の各々をコードする単一DNAとして合成DNAを使用して行われ得る。PCR後、増幅産物がpBluescript SK(−)などのプラスミドにクローニングされ、塩基配列は、(2)に記載の方法と同様の方法に従って決定されて、所望のヒトCDR移植抗体のVHまたはVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するプラスミドを得る。
(5)ヒトCDR移植抗体のV領域のアミノ酸配列の修飾。非ヒト抗体のVHおよびVL中のCDRのみをヒト抗体のVHおよびVLのFRに移植することによってヒトCDR移植抗体が産生される場合、その抗原結合活性が元の非ヒト抗体よりも低い場合があることが知られている[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。ヒトCDR移植抗体において、ヒト抗体のVHおよびVL中のFRのアミノ酸配列のうち、抗原への結合に直接関与するアミノ酸残基、CDR中のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の三次元構造を維持し、抗原への結合に間接的に関与するアミノ酸残基が識別され、元の非ヒト抗体中に見られるアミノ酸残基と置き換えられ、それによって減少した抗原結合活性を増加させ得る。FRにおける抗原結合活性に関与するアミノ酸残基を識別するために、抗体の三次元構造が構築され、X線結晶学、コンピュータモデリングなどによって分析され得る。加えて、抗原に対する十分な結合活性を有する修飾ヒトCDR移植抗体は、各抗体のいくつかの修飾抗体を産生し、それらの抗原結合活性を検査して改善された親和性を有するものを識別することによって得られ得る。ヒト抗体のVHおよびVL中のFRのアミノ酸配列の修飾は、(4)に記載のPCRに従って修飾のための様々な合成DNAを使用して達成され得る。PCRにより得られた増幅産物に関しては、所望の修飾が行われたかどうかを検査するために、(2)に記載の方法に従って塩基配列が決定される。
(6)ヒトCDR移植抗体発現のためにベクターの構築。ヒトCDR移植抗体発現のためのベクターは、構築された組換え抗体のVHまたはVLをコードする各cDNAを、(1)に記載の組換え抗体発現のためのベクター中のヒト抗体のCHまたはCLをコードする各遺伝子の上流にクローニングすることによって構築され得る。例えば、(4)および(5)のヒトCDR移植抗体のVHまたはVLの構築に使用される合成DNAのうち両端に位置付けられた合成DNAの5’末端に、適切な制限酵素の認識配列が導入され、(1)に記載のヒトCDR移植抗体発現のためのベクターにおけるヒト抗体のCHまたはCLをコードする各遺伝子の上流で適切な形態でそれらが発現されるようにクローニングが行われ得る。
(7)組換え抗体の一過性発現。組換え抗体は、様々なヒトCDR移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、(3)および(6)で得られた組換え抗体発現のためのベクターまたはその修飾発現ベクターを使用して一過性に発現され得る。宿主細胞が組換え抗体を発現することが可能である限り、任意の細胞が宿主細胞として使用され得る(例えば、CHO細胞、COS細胞)。例えば、COS−7細胞(ATCC CRL1651)が使用される。COS−7細胞への発現ベクターの導入は、DEAE−デキストラン法、リポフェクション法などを使用することによって実施される。発現ベクターの導入後、培養上清中の組換え抗体の発現レベルおよび抗原結合活性は、酵素免疫測定法などによって決定され得る。
(8)組換え抗体を安定して発現する形質転換体の取得および組換え抗体の調製。組換え抗体を安定して発現する形質転換体は、(3)および(6)で得られた組換え抗体発現のためのベクターを適切な宿主細胞に導入することによって得られ得る。宿主細胞への発現ベクターの導入は、エレクトロポレーションなどによって実施される。組換え抗体発現のためのベクターが導入される宿主細胞として、組換え抗体を産生することが可能である宿主細胞である限り、任意の細胞が使用され得る。その例としては、CHO−K1(ATCC CCL−61)、DUkXB11(ATCC CCL−9096)、Pro−5(ATCC CCL−1781)、CHO−S(Life Technologies(登録商標)、カタログ番号11619)、ラット骨髄腫細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(YB2/0とも呼ばれる)、マウス骨髄腫細胞NSO、マウス骨髄腫細胞SP2/0−Ag14(ATCC番号CRL1581)、マウスP3−X63−Ag8653細胞(ATCC番号CRL1580)、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損しているCHO細胞、レクチン抵抗性獲得Lec13、α1,6−フコシルトランスアファーゼ遺伝子が欠損しているCHO細胞、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC番号CRL1662)、CHO−3E7細胞(EBNA1の、切断されているが機能的な形態を発現する、米国特許第8,637,315号)などが挙げられる。発現ベクターの導入後、組換え抗体を安定して発現する形質転換体は、G418硫酸塩などの薬剤を含有する動物細胞培養用培地中でそれらを培養することによって選択される。動物細胞培養用培地の例としては、RPMI1640培地(Invitrogen(登録商標)製)、GIT培地(Nihon Pharmaceutical(登録商標)製)、EX−CELL301(登録商標)培地(JRH(登録商標)製)、IMDM培地(Invitrogen(登録商標)製)、ハイブリドーマ−SFM培地(Invitrogen(登録商標)製)、これらの培地にFBSなどの様々な添加剤を添加することによって得られた培地などが挙げられる。組換え抗体は、得られた形質転換体を培地中で培養することによって、培養上清中で産生および蓄積され得る。培養上清中の組換え抗体の発現レベルおよび抗原結合活性は、ELISAなどによって測定され得る。また、形質転換体において、組換え抗体の発現レベルは、DHFR増幅系などを使用することによって高められ得る。組換え抗体は、プロテインAカラムを使用することによって形質転換体の培養上清から精製され得る。加えて、組換え抗体は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過などのタンパク質精製方法を組み合わせることによって精製され得る。精製された組換え抗体または抗体分子のH鎖またはL鎖の全体としての分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティングなどによって決定される。
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む:(i)配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITC(配列番号110)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖FR1、(ii)配列WYQQKPGQAPVTVIY(配列番号111)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖FR2、(iii)配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYC(配列番号112)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖FR3、(iv)配列FGGGTKLTVL(配列番号113)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせ。
さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む:(i)配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITC(配列番号110)を含むもしくはそれからなる軽鎖FR1、(ii)配列WYQQKPGQAPVTVIY(配列番号111)を含むもしくはそれからなる軽鎖FR2、(iii)配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYC(配列番号112)を含むもしくはそれからなる軽鎖FR3、(iv)配列FGGGTKLTVL(配列番号113)を含むもしくはそれからなる軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせ。さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、特徴(i)〜(iv)を含む。
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む:(i)配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号114)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号115)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖FR2、(iii)配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(配列番号116)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖FR3、(iv)配列WGQGTLVTVSS(配列番号117)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせ。
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む:(i)配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号114)を含むもしくはそれからなる重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号115)を含むもしくはそれからなる重鎖FR2、(iii)配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(配列番号116)を含むもしくはそれからなる重鎖FR3、(iv)配列WGQGTLVTVSS(配列番号117)を含むもしくはそれからなる重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせ。さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、特徴(i)〜(iv)を含む。
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列
(配列番号118)と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む。
別の態様において、本開示は、配列
(配列番号118)と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
一実施形態において、参照可変軽鎖配列に対する差は、上記の下線付きのFRのうちの1つ以上内にある。さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGGSTDAGSYYYGWYQQKPGQAPVTVIYFNDKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGSADSTGGIFGGGTKLTVL(配列番号118)の配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む。
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列
(配列番号119)と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む。
別の態様において、本開示は、配列
(配列番号119)と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
一実施形態において、参照可変重鎖配列に対する差は、上記の下線付きのFRのうちの1つ以上内にある。さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列:EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEWVAQIIDGAGSRTAYGAAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGHYWGGASIDAWGQGTLVTVSS(配列番号119)を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む。
別の実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、一本鎖抗体、好ましくは一本鎖Fv(scFv)である。一実施形態において、scFvは、上述のCDR、FR、および/または可変領域を含み、軽鎖可変領域(VL)および重鎖可変領域(VH)は、リンカーを通して一緒に連結または接続される。リンカーは、VHのN末端をVLのC末端と接続し得るか、またはVLのN末端をVHのC末端と接続し得る。一実施形態において、リンカーは、VHのN末端をVLのC末端と接続する。
リンカーは、軽鎖および重鎖が抗原認識のための適切な立体構造を採用すること(すなわち、NTSR1からの上述の立体構造エピトープに結合する能力を維持すること)を可能にするために、好適な可撓性および安定性を有する、1つ以上のアミノ酸を有するポリペプチドリンカー、または別のタイプの化学リンカー(例えば、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、PEGなど)であってもよい。一実施形態において、リンカーは、ポリペプチドリンカーである。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも2、3、4、または5個のアミノ酸を含む。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、約100、90、80、70、60、もしくは50個のアミノ酸またはそれ以下を含む。さらなる実施形態において、ポリペプチドリンカーは、約5〜約50個のアミノ酸、例えば、約5〜約40個のアミノ酸または約7〜約30個のアミノ酸、例えば、約7〜約20または25個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態において、リンカーは、約15〜約20個のアミノ酸または約18〜20個のアミノ酸、好ましくは18個のアミノ酸を含む。ポリペプチドリンカーは、軽鎖および重鎖が抗原認識のための適切な立体構造を採用すること(すなわち、上述のNTSR1からの立体構造エピトープに結合する能力を維持すること)を可能にするために、好適な可撓性および安定性を有するように設計されている。scFvフラグメントに好適な可撓性ポリペプチドリンカー、より具体的には最小の球状性および最大の障害を有するリンカーを設計するための方法は、当該技術分野において既知である。これは、例えば、Globplot 2.3プログラムまたは任意の他の好適なツールを使用して達成され得る。配列は、推定凝集ホットスポット、局在化ドメイン、ならびに/または相互作用およびリン酸化モチーフを排除するためにさらに最適化され得る。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、グリシン残基が豊富であり、すなわち、リンカーの残基の少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%がグリシン残基である(リンカー可撓性に有利に働くことが知られている)。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、1つ以上のセリン(SerもしくはS)および/またはトレオニン残基(リンカー溶解性に有利に働くことが知られている)、好ましくはセリン残基を含む。別の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、ペンタペプチド配列GGGGS(またはG4SまたはGly4Ser)を含む。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも1つのアルギニン残基を含む。別の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも1つのグルタミン残基を含む。さらなる実施形態において、ポリペプチドリンカーは、配列GQSSRSS(配列番号120)を含む。さらなる実施形態において、ポリペプチドリンカーは、配列GQSSRSSGGGGSSGGGGS(配列番号121)を含むまたはそれからなる。
一実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも1つの定常ドメイン、例えば、軽鎖および/または重鎖の定常ドメイン、またはそのフラグメントを含む。さらなる実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体の定常重鎖のフラグメント結晶性(Fc)フラグメントを含む。Fcフラグメントは、2つまたは3つの定常ドメイン、例えば、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含んでもよい。Fc領域は、例えば、ヒトIgG1、ヒトIgG4、または最大10個のアミノ酸修飾を有するヒトIgG1もしくはIgG4のバリアントから得てもよい。一実施形態において、Fcフラグメントは、ヒト抗体、好ましくはIgG1などのヒトIgGのCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むまたはそれからなる。一実施形態において、Fcフラグメントは、図8Gの太字の配列(配列番号79の残基14〜233)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、Fcフラグメントは、図8Gの太字の配列を含むまたはそれからなる。
一実施形態において、抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメントは、上で定義したFcフラグメントなどのFcフラグメントを含むscFv(scFV−Fc)である。一実施形態において、scFv成分は、リンカー、例えば、ヒンジによってFcフラグメントに接続される。ヒンジは、抗体、例えば、ヒトIgG1またはIgG4ヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列PEPKSSDKTHTCP(配列番号79の残基1〜13)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列PEPKSSDKTHTCPを含むまたはそれからなる。
scFv−Fcの様々な特性を改善するために、ヒンジ領域およびFc領域に修飾が行われ得る。一実施形態において、天然に存在するヒトFc領域の1、2、3、4、5、または最大10個のアミノ酸が、ヒンジ領域の修飾に加えて修飾され得る。例えば、Fc領域は、scFv−Fcの血清半減期を延長させるように修飾され得る。IgGの半減期は、受容体FcRnへのそのpH依存的結合に依存する。内皮細胞の表面上で発現されるFcRnは、pH依存的にIgGに結合し、それを分解から保護する。例えば、CH2ドメインとCH3ドメインとの間の界面に位置する変異は、インビボでFcRnへの結合親和性を増加させ、IgG1の半減期を延長させることが示されている。そのような修飾は、例えば、Strohl WR.,2009.Curr Opin Biotechnol.20(6):685−91、およびVaccaro C.et al.,2005.Nat Biotechnol.23(10):1283−8で概説されている。
ヒンジおよび/またはFcフラグメントに対する他の修飾は、エフェクター機能を増加または低減させることができる。4つのヒトIgGアイソタイプは、活性化Fc−ガンマ(Fcγ)受容体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制性FcγRIIb受容体、および補体の第1の成分(C1q)に異なる親和性で結合し、異なるエフェクター機能をもたらす。IgGのFcγRまたはC1qへの結合は、例えば、IgGヒンジ領域およびCH2ドメイン内に位置する残基に依存する。これらの残基の単一または複数のアミノ酸置換は、FcγRまたはC1qとのIgG相互作用を調節することによってエフェクター機能に影響を及ぼし得る。他の置換がエフェクター機能に影響を与えることが知られている。これらの修飾は、例えば、Strohl 2009(上記参照)で概説されている。アミノ酸修飾を使用して、組換え抗体またはその抗原結合フラグメントの薬理学的機能を改善することもできる。例えば、アミノ酸修飾を使用して、補体活性化を増加させ、FcyRIIIA結合を増加させるもしくはFcyRIIIB結合を減少させることによって抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を増強し、かつ/またはFcRn結合を増加させることによって血清半減期を延長させることができる。そのようなアミノ酸修飾は、例えば、Beck et al.(2010)Nature 10:345−52で概説されている。
ヒトIgG1のヒンジおよび/またはFcフラグメントの代表的な修飾が表1に要約される(WO2016/141244から)。
1.Hinton et al.(2004)J.Biol.Chem.279(8):6213−16。2.Vaccaro et al.(2005)Nature Biotechnol.23(10):1283−88。3.Armour et al.(1999)Eur.J.Immunol.29(8):2613−24。4.Shields et al.(2001)J.Biol.Chem.276(9):6591−604。5.Idusogie et al.(2000)J.Immunol.164(8):4178−84。6.Idusogie et al.(2001)J.Immunol.166(4):2571−75。7.Lazar et al.(2006)Proc.Natl Acad.Sci.USA 103(11):4005−10。8.Ryan et al.(2007)Mol.Cancer Ther.6:3009−18。9.Datta−Mannan et al.(2007)Drug Metab.Dispos.35:86−94。10.Steurer et al.(1995)J.Immunol.155(3):1165−74。11.Richards et al.(2008)Mol.Cancer Ther.7(8):2517−27。
したがって、本明細書で使用される場合、「Fcフラグメント」という用語は、FcγRおよび/またはC1qに結合する能力を維持する抗体またはそのバリアント由来のネイティブFcフラグメント(例えば、ネイティブFcフラグメントと少なくとも60、65、70、75、80、85、90、または95%の配列同一性を有する)を指す。
抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントに対する考えられる修飾
本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載される保存的および非保存的変異のための技法およびガイドラインのいずれかを使用して行われ得る。変異は、ネイティブ配列抗体と比較してアミノ酸配列の変化をもたらす抗体をコードする1つ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であってもよい。任意に、この変異は、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントのドメインのうちの1つ以上において、少なくとも1個のアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換することによる。どのアミノ酸残基が、所望の活性に悪影響を及ぼすことなく挿入、置換、または欠失され得るかを決定する際のガイダンスは、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの配列を相同性の既知のタンパク質分子の配列と比較し、高相同性の領域で行われるアミノ酸配列変化の数を最小限に抑えることによって見出され得る。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、同様の構造的および/または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換える結果であり得、例えば、ロイシンのセリンでの置き換え、すなわち、保存的アミノ酸置き換えの結果であり得る。挿入または欠失は任意に、約1〜5個のアミノ酸の範囲内であり得る。許容される変異は、配列内のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行い、得られるバリアントを、完全長または成熟天然配列によって示される活性について試験することによって決定され得る。実施形態において、バリアントは、本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの配列と少なくとも50%、55%または60%、好ましくは少なくとも65、70、75、80、90、95、96、97、98、または99%の配列同一性を示し、本明細書に記載のNTSR1から立体構造エピトープに特異的に結合する能力を維持する。
本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載される保存的および非保存的変異のための技法およびガイドラインのいずれかを使用して行われ得る。変異は、ネイティブ配列抗体と比較してアミノ酸配列の変化をもたらす抗体をコードする1つ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であってもよい。任意に、この変異は、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントのドメインのうちの1つ以上において、少なくとも1個のアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換することによる。どのアミノ酸残基が、所望の活性に悪影響を及ぼすことなく挿入、置換、または欠失され得るかを決定する際のガイダンスは、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの配列を相同性の既知のタンパク質分子の配列と比較し、高相同性の領域で行われるアミノ酸配列変化の数を最小限に抑えることによって見出され得る。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、同様の構造的および/または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換える結果であり得、例えば、ロイシンのセリンでの置き換え、すなわち、保存的アミノ酸置き換えの結果であり得る。挿入または欠失は任意に、約1〜5個のアミノ酸の範囲内であり得る。許容される変異は、配列内のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行い、得られるバリアントを、完全長または成熟天然配列によって示される活性について試験することによって決定され得る。実施形態において、バリアントは、本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの配列と少なくとも50%、55%または60%、好ましくは少なくとも65、70、75、80、90、95、96、97、98、または99%の配列同一性を示し、本明細書に記載のNTSR1から立体構造エピトープに特異的に結合する能力を維持する。
「同一性」は、2つのポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、アライメントされた配列内の各位置を比較することによって決定され得る。同一性パーセントを決定する方法は、当該技術分野において既知であり、EMBOSS Needle、ClustalW、SIM、DIALIGNなどを含むいくつかのツールおよびプログラムが、アミノ酸配列をアライメントし、同一性パーセンテージを決定するために利用可能である。本明細書で使用される場合、特定の対象配列またはその指定された部分に対する所与の同一性パーセンテージは、BLOSUM置換マトリックス(Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915−9(1992))を類似性尺度として使用して、スミスウォーターマンアルゴリズム(Smith & Waterman,J.Mol.Biol.147:195−7(1981))によって生成される最大の配列同一性パーセントを達成するために配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、対象配列(またはその指定された部分)内のアミノ酸と同一の候補誘導体配列内のアミノ酸のパーセンテージとして定義され得る。
「同一性%値」は、同一性パーセントが報告されている配列長で割った一致する同一アミノ酸の数によって決定される。
「同一性%値」は、同一性パーセントが報告されている配列長で割った一致する同一アミノ酸の数によって決定される。
抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの共有結合修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合修飾としては、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの標的アミノ酸残基を、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの選択された側鎖またはN末端もしくはC末端残基と反応することが可能な有機誘導体化剤と反応させることが挙げられる。他の修飾としては、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の対応するグルタミルおよびアスパルチル残基のそれぞれへの脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79−86(1983))、N末端アミンのアセチル化、ならびに任意のC末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
本開示の範囲内に含まれる抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの他のタイプの共有結合修飾としては、抗体またはその抗原結合フラグメントのネイティブグリコシル化パターンを変更すること(Beck et al.,Curr.Pharm.Biotechnol.9:482−501,2008、Walsh,Drug Discov.Today 15:773−780,2010)、および米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号、同第4,791,192号、または同第4,179,337号に記載される方法で、抗体またはその抗原結合フラグメントを様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの1つに連結することが挙げられる。グリコシル化はまた、結果として生じる抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、scFv−FcのADCC活性を増加させるために、例えば、フコシル化を阻害することによって意図的に変更され得る。
一実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、1つ以上の部分で標識されるか、またはそれとコンジュゲートされる。抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、コエンザイム標識、化学発光標識、または放射性同位体標識などの1つ以上の標識で標識され得る。一実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識、例えば、蛍光部分(フルオロフォア)で標識される。有用な検出可能な標識としては、蛍光化合物(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、Alexa Fluor(登録商標)染料など)、放射性標識、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびタンパク質検出アッセイで一般的に使用される他のもの)、ストレプトアビジン/ビオチン、ならびにコロイド金、着色ガラス、またはプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)などの比色標識が挙げられる。化学発光化合物も使用され得る。そのような標識抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織染色などによって、例えば、インビボまたはインビトロでNTSR1および/またはNTSR1発現細胞を検出するのに有用であり得る。抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの検出および/または精製を容易にする検出可能または親和性タグにコンジュゲートされ得る。そのようなタグは、当該技術分野において周知である。検出可能または親和性タグの例としては、ポリヒスチジンタグ(Hisタグ)、ポリアルギニンタグ、ポリアスパラギン酸タグ、ポリシステインタグ、ポリフェニルアラニンタグ、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)タグ、マルトース結合タンパク質(MBP)タグ、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)タグ、ストレプトアビジン/ビオチンベースのタグ、HaloTag(登録商標)、Profinity eXact(登録商標)タグ、エピトープタグ(FLAG、血球凝集素(HA)、HSV、S/S1、c−myc、KT3、T7、V5、E2、およびGlu−Gluエピトープタグなど)、レポータータグ、例えば、β−ガラクトシダーゼ(β−gal)、アルカリホスファターゼ(AP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)タグが挙げられる(例えば、Kimple et al.,Curr Protoc Protein Sci.2013;73:Unit−9.9を参照)。
抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、1つ以上の治療薬または活性剤(例えば、薬物)にコンジュゲートされ得、したがって、治療薬(複数可)(例えば、抗腫瘍薬、あるいは疾患もしくは状態の治療または1つ以上の症状の緩和に有用な任意の他の薬剤)を腫瘍などの細胞または組織に送達するために治療的に使用され得る。抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントを別の部分(例えば、検出可能な部分、活性剤)にコンジュゲートするための当該技術分野において既知の任意の方法が用いられ得、Hunter et al.(1962)Nature,144:945、David et al.(1974)Biochemistry,13:1014、Pain et al.(1981)J.Immunol.Meth.,40:219、Nygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)、およびHermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diegoに記載される方法を含む。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の特徴のうちの1つ以上、すなわち、本明細書に記載の特徴の任意の組み合わせ/部分的組み合わせを有する、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸、細胞、および作製方法
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載の抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。単離された核酸は、例えば、合成DNA、非自然発生的mRNA、またはcDNAであり得る。例としては、本明細書に記載のVHおよびVLドメインをコードする核酸、ならびに/またはscFvもしくはscFv−Fcをコードする核酸が挙げられる。核酸は、プラスミド、ベクター、または転写もしくは発現カセット内に挿入され得る。当該技術分野において周知の従来の技法を使用して、本明細書に記載の抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸が作製され得、記載の発現された抗体または抗原結合フラグメントが試験され得る。
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載の抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。単離された核酸は、例えば、合成DNA、非自然発生的mRNA、またはcDNAであり得る。例としては、本明細書に記載のVHおよびVLドメインをコードする核酸、ならびに/またはscFvもしくはscFv−Fcをコードする核酸が挙げられる。核酸は、プラスミド、ベクター、または転写もしくは発現カセット内に挿入され得る。当該技術分野において周知の従来の技法を使用して、本明細書に記載の抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸が作製され得、記載の発現された抗体または抗原結合フラグメントが試験され得る。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメントを発現する細胞、例えば、組換え宿主細胞を提供する。抗体または抗原結合フラグメントを調製する方法は、抗体または抗原結合フラグメントを産生する条件下で宿主細胞においてコード核酸(複数可)を発現することと、抗体または抗原結合フラグメントを回収することとを含む。抗体または抗原結合フラグメントを回収するプロセスは、抗体または抗原結合フラグメントの単離および/または精製を含み得る。産生方法は、抗体または抗原結合フラグメントを、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも1つの追加の成分を含む組成物に製剤化することを含んでもよい。
「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)という用語は、本明細書で使用される場合、外因性DNAが導入された細胞を指すように意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫を指すように意図されることが理解されるべきである。ある特定の修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかにより後続世代において生じ得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではなくてもよいが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。好ましくは、宿主細胞は、生命界のいずれかから選択される原核細胞および真核細胞を含む。好ましい真核細胞としては、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられる。最も好ましくは、宿主細胞としては、原核細胞株E.Coli、哺乳動物細胞株CHO、HEK 293、およびCOS、昆虫細胞株Sf9、真菌細胞Saccharomyces cerevisiae、植物細胞、または藻類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、宿主細胞は免疫細胞である。本明細書に記載の抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメントは、CAR T細胞、CAR NK細胞などを産生するためのキメラ抗原受容体(CAR)として使用され得る。CARは、所望の抗原(例えば、NTSR1)に対する特異性を提供するリガンド結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を、T細胞またはNK細胞活性化ドメインなどの活性化細胞内ドメイン(またはシグナル伝達ドメイン(signal transducing domain))部分と組み合わせ、一次活性化シグナルを提供する。腫瘍細胞によって発現される分子に結合することが可能な抗体の抗原結合フラグメント、より具体的にはscFvは、一般にCARとして使用される。したがって、別の態様において、本開示は、本明細書に記載のscFvを発現する宿主細胞、好ましくはT細胞またはNK細胞などの免疫細胞を提供する。
本開示のCARはまた、膜に広がる膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、天然ポリペプチド由来であり得るか、または人工的に設計され得る。天然ポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質から得ることができる。例えば、T細胞受容体aもしくはβ鎖、CD28、CD3−エプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、またはGITRの膜貫通ドメインが使用され得る。人工的に設計された膜貫通ドメインは、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むポリペプチドである。合成膜貫通ドメインの各末端にフェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見られることが好ましい。好ましい実施形態において、膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性を与えるCD28またはCD8由来である。
CARで使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体関与後にシグナル伝達を開始するために協調して作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、抗原依存性一次活性化を開始するもの、および抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するものを含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ITAMの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼの結合部位として機能する様々な受容体の細胞質内尾部に見られる、十分に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明で使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、FcRエプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3エプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d由来のものが含まれ得る。
本開示のCARはまた、ヒトCD28、4−1BB(CD137)、ICOS−1、CD27、OX40(CD137)、DAP10、およびGITR(AITR)などの1つ以上の共刺激ドメインを含んでもよい。実施形態において、CARは第3世代であり、CD28および4−1BBなどの2つの共刺激ドメインを含む。
本開示のCARはまた、本明細書に記載の抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメント(例えば、scFv)のシグナルペプチドN末端を含んでもよく、CARがT細胞などの細胞内で発現されると、新生タンパク質が小胞体に、その後それが発現される細胞表面に向けられる。シグナルペプチドのコアは、単一アルファ−ヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長い伸長を含有し得る。シグナルペプチドは転座中にポリペプチドの適切なトポロジーを強化するのに役立つ、短い正荷電アミノ酸伸長から始まってもよい。シグナルペプチドの末端には、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸の伸長が存在する。シグナルペプチダーゼは、転座中または完了後のいずれかに切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼによって消化される。一例として、シグナルペプチドは、ヒトCD8もしくはGM−CSF、または1もしくは2個のアミノ酸変異を有するそのバリアントに由来し得るが、ただし、シグナルペプチドが依然として、CARの細胞表面発現を引き起こすように機能することを条件とする。
本開示のCARは、本明細書に記載の抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメント(例えば、scFv)を膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのヒンジとして、スペーサー配列を含み得る。可撓性スペーサーにより、結合ドメインが異なる方向に配向して、所望の抗原(例えば、NTSR1)へのその結合を可能にすることができる。スペーサー配列は、例えば、IgG1 Fc領域、IgG1ヒンジもしくはCD8ストーク、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
本明細書に記載の抗NTSR1抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸(複数可)を含む好適なベクターが選択または構築され得、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する。ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、ファージミド、アデノウイルス、AAV、レンチウイルスであってもよい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのDNAの導入、および遺伝子発現における核酸の操作のための技法およびプロトコルは、当該技術分野において周知である。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すように意図される。1つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のDNAセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。
ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自律複製が可能である(例えば、細菌複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と称される。一般に、組換えDNA技法において有用である発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)などの発現ベクターのそのような他の形態を含むように意図される。
そのような核酸を宿主細胞に導入することは、当該技術分野において周知の技法を使用して達成され得る。真核細胞については、好適な技法としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルスを使用した形質導入が挙げられる。細菌細胞については、好適な技法としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用したトランスフェクションが挙げられ得る。導入の後に、核酸からの発現を引き起こすこと、またはそれを可能にすること、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することが続いてもよい。一実施形態において、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム、例えば、染色体に組み込まれる。組み込みは、標準的な技法に従ってゲノムとの組換えを促進する配列を含むことによって促進され得る。
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌、酵母、ならびにトランスジェニック植物および動物が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウス黒色腫細胞、ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞、例えば、HEK293細胞、ヒト胎児網膜細胞、および多くの他のものが挙げられる。E.coliなどの原核細胞における抗体および抗体フラグメントの発現は、当該技術分野において十分に確立されている。概説については、例えば、Pliickthun Bio/Technology 9:545−551(1991)を参照。例えば、Andersen et al.(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13:117−23で概説されるように、真核細胞における発現もまた当業者に利用可能である。
抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物
別の態様において、本開示は、本明細書に定義される抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、上述の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントおよび担体または賦形剤、さらなる実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。そのような組成物は、好適な純度を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを、1つ以上の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することによって、薬学分野において周知の方法で調製されてもよい(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Loyd V Allen,Jr,2012,22nd edition,Pharmaceutical Press、Handbook of Pharmaceutical Excipients,Rowe et al.,2012,7th edition,Pharmaceutical Pressを参照)。担体/賦形剤は、任意の従来の投与経路、例えば、経口、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、点眼、脳室内、嚢内、脊髄内、髄腔内、硬膜外、大槽内、腹腔内、鼻腔内、または肺(例えば、エアロゾル)投与による、抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に好適であり得る。一実施形態において、担体/賦形剤は、静脈内または皮下経路による抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に適合される。一実施形態において、担体/賦形剤は、静脈内経路による抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に適合される。別の実施形態において、担体/賦形剤は、皮下経路による抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に適合される。
別の態様において、本開示は、本明細書に定義される抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、上述の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントおよび担体または賦形剤、さらなる実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。そのような組成物は、好適な純度を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを、1つ以上の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することによって、薬学分野において周知の方法で調製されてもよい(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Loyd V Allen,Jr,2012,22nd edition,Pharmaceutical Press、Handbook of Pharmaceutical Excipients,Rowe et al.,2012,7th edition,Pharmaceutical Pressを参照)。担体/賦形剤は、任意の従来の投与経路、例えば、経口、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、点眼、脳室内、嚢内、脊髄内、髄腔内、硬膜外、大槽内、腹腔内、鼻腔内、または肺(例えば、エアロゾル)投与による、抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に好適であり得る。一実施形態において、担体/賦形剤は、静脈内または皮下経路による抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に適合される。一実施形態において、担体/賦形剤は、静脈内経路による抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に適合される。別の実施形態において、担体/賦形剤は、皮下経路による抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に適合される。
「賦形剤」は、本明細書で使用される場合、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、活性成分(薬物)自体ではない任意の成分である。賦形剤としては、例えば、結合剤、潤滑剤、希釈剤、充填剤、増粘剤、崩壊剤、可塑剤、コーティング剤、バリア層製剤、潤滑剤、安定剤、放出遅延剤、および他の成分が挙げられる。「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用される場合、活性成分の生物活性の有効性を妨げず、対象に対して毒性がない、すなわち、対象に対して毒性がないタイプ賦形剤であり、かつ/または対象に対して毒性がない量で使用するためのものである、任意の賦形剤を指す。賦形剤は当該技術分野において周知であり、本系はこれらの点で限定されない。ある特定の実施形態において、剤形の1つ以上の製剤としては、例えば、限定するものではないが、1つ以上の結合剤(binder)(結合剤(binding agent))、増粘剤、界面活性剤、希釈剤、放出遅延剤、着色剤、香味剤、充填剤、崩壊剤/溶解促進剤、潤滑剤、可塑剤、シリカフローコンディショナー、流動促進剤、固化防止剤、抗粘着剤、安定剤、帯電防止剤、腫脹剤、およびそれらの任意の組み合わせを含む賦形剤が挙げられる。当業者が認識するように、単一の賦形剤は、一度に3つ以上の機能を果たすことができ、例えば、結合剤および増粘剤の両方として機能することができる。また、当業者が認識するように、これらの用語は必ずしも相互排他的ではない。一般的に使用される賦形剤の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール(マンニトール、ソルビトールなど)、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。薬学的に許容される物質の追加の例は、貯蔵寿命を延長させるまたは有効性を高める、湿潤剤または補助物質、例えば乳化剤、防腐剤、または緩衝液である。
組成物はまた、以下にさらに詳述されるように、標的疾患/状態の治療、または標的疾患/状態の症状(複数可)の管理のための1つ以上の追加の活性剤(例えば、鎮痛剤、制吐剤など)を含んでもよい。
抗NTSR1抗体およびその抗原結合フラグメント、またはそれらを含む組成物の使用
別の態様において、本開示は、細胞におけるNTSR1活性を阻害するための方法を提供し、方法は、細胞を有効量の本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物と接触させることを含む。本開示はまた、細胞におけるNTSR1活性を阻害するための、または細胞におけるNTSR1活性を阻害するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物の使用を提供する。一実施形態において、NTSR1活性は、NTSR1へのニューロテンシン(NT)の結合によって媒介される。一実施形態において、NTSR1活性は、NT媒介性Gαq活性化、すなわち、NTのNTSR1への結合によって誘導されるGαq経路の活性化を含む。
別の態様において、本開示は、細胞におけるNTSR1活性を阻害するための方法を提供し、方法は、細胞を有効量の本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物と接触させることを含む。本開示はまた、細胞におけるNTSR1活性を阻害するための、または細胞におけるNTSR1活性を阻害するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物の使用を提供する。一実施形態において、NTSR1活性は、NTSR1へのニューロテンシン(NT)の結合によって媒介される。一実施形態において、NTSR1活性は、NT媒介性Gαq活性化、すなわち、NTのNTSR1への結合によって誘導されるGαq経路の活性化を含む。
別の態様において、本開示は、細胞上のNTSR1へのニューロテンシン(NT)の結合を阻害するための方法を提供し、方法は、細胞(NTSR1発現細胞)を、有効量の本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物と接触させることを含む。本開示はまた、細胞上のNTSR1へのNTの結合を阻害するための、または細胞上のNTSR1へのNTの結合を阻害するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物の使用を提供する。一実施形態において、細胞は腫瘍または癌細胞である。一実施形態において、細胞は膵臓、前立腺、肺、乳房、肝臓、または結腸細胞である。別の実施形態において、細胞は膵臓または肝臓細胞である。
別の態様において、本開示は、対象におけるNTSR1活性に関連する疾患または状態(例えば、NTSR1活性の調節不全または異常)を治療するための方法を提供し、方法は、有効量の本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物を対象に投与することを含む。本開示はまた、対象におけるNTSR1活性に関連する疾患もしくは状態を治療するための、または対象におけるNTSR1活性に関連する疾患もしくは状態を治療するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物の使用を提供する。
NTSR1は、GPCRの大スーパーファミリーに属し、低血圧症、高血糖症、低体温症、痛覚抑制、ならびに腸運動性および分泌の調節などのNTの複数の機能を媒介することが示されている。
NTSR1発現/過剰発現は、炎症性腸疾患と関連することが示されている(例えば、Gui et al.,World J.Gastroenterol.2013 Jul 28;19(28):4504−4510を参照。したがって、一実施形態において、NTSR1活性に関連する疾患または状態は、炎症性腸疾患(IBD)、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎(UC)である。一実施形態において、治療は、腸粘膜炎症および/または急性結腸炎症を低減する。一実施形態において、治療は、大腸炎関連腫瘍形成を発生するリスクを予防または低減する。
疾患の重症度とも相関したより高い血漿pro−NTレベルがNAFLDを有する対象において検出されたため、NT/NTSR1系が、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)および非アルコール性脂肪肝炎(NASH)などの特定の代謝障害に関与するという証拠も存在する(Barchetta et al.,The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism,103(6):2253−2260)。より高い血漿pro−NTレベルはまた、インスリン抵抗性の特徴と関連付けられ、非肥満個体において後期に肥満を発症するリスクを倍増させた(Li J et al.,Nature.2016;533(7603):411−415)。全身投与されるNTは、高血糖および高グルカゴン血症効果を有することが知られている。これらの効果は、ヒスタミンH−1およびH−2受容体によって遮断されることがわかっており(Nagai K,Frohman LA.Diabetes.1978 27(5):577−82)、ヒスタミン放出がシグナル伝達経路に関与することを示唆する。ソマトスタチンの変化も報告された。NT欠損マウスは、高脂肪食誘発性肥満、インスリン抵抗性、および肝臓組織における脂質の蓄積に対してより耐性があることが示された(Jing L.,et al.Nature 533,411−415)。
したがって、一実施形態において、NTSR1活性に関連する疾患または状態は、肥満、インスリン抵抗性、グルコース抵抗性、2型糖尿病、NAFLD、またはNASHなどの心血管疾患または代謝疾患である。一実施形態において、NTSR1活性に関連する疾患または状態は、NAFLDまたはNASHである。
中枢神経系(CNS)および胃腸管におけるNTによるNTSR1関与の生理学的作用に加えて、NT媒介性NTSR1刺激が発癌において重要な役割を果たすという証拠が増えている。NTSR1の異常発現(例えば、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、および結腸癌)、増殖および生存効果を伴う腫瘍成長から、足場非依存性成長ならびに前移動性および前侵襲性効果を有する転移拡散までの癌進行の各段階における効果を伴う、多数のタイプの癌細胞および腫瘍におけるNT発癌作用が記載されている(例えば、Wu et al.,Front Endocrinol(Lausanne).2012;3:184、Moody et al.,Life Sci.2014;100(1):25−34、Wu et al.,Front Endocrinol 2013;3:1−9、Alfano et al.,Clin Cancer Res.2010;16:4401−4410、Dupouy et al.,PLoS ONE.2009;4:e4223、Shimizu et al.,Int J Cancer.2008;123:1816−1823、Moody et al.,Peptides.2001;22:109−115、Maoret et al.,Int J Cancer.1999;80:448−454を参照)。これらの効果は全て、細胞形質転換の初期段階中のNTSR1の異常または調節不全発現と関連し、いくつかのキナーゼおよびエフェクター、例えばPKC、MAPK、FAK、RHO−GTPase、RAS、およびScrの活性化の結果である。NTSR1発現は、乳癌、肺癌、および頭頸部扁平上皮細胞癌を含むいくつかの癌における予後不良の独立したマーカーであることが示されている。
別の態様において、本開示は、対象における癌(NTSR1陽性癌)を治療するための方法を提供し、方法は、有効量の本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物を対象に投与することを含む。本開示はまた、対象における癌(NTSR1陽性癌)を治療するための、または対象における癌(NTSR1陽性癌)を治療するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物の使用を提供する。
一実施形態において、上述の細胞は、NTSR1を発現する腫瘍または癌細胞である。一実施形態において、腫瘍または癌細胞はまた、NTを発現/分泌する。
一実施形態において、NTSR1発現腫瘍/癌は、心臓肉腫、肺癌、肺小細胞癌(SCLC)、非肺小細胞癌(NSCLC)、気管支原性癌(扁平上皮、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌)、肺胞腺癌(細気管支癌)、気管支腺腫、肉腫(例えば、ユーイング肉腫、カポジ肉腫)、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫;胃腸系の癌、例えば、食道(扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫)、腹部(癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫)、胃、膵臓(管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ)、小腸(腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫)、大腸(腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫);尿生殖器管の癌、例えば、腎臓癌(腺癌、ウィルムス腫瘍[腎芽腫]、リンパ腫、白血病)、膀胱および/または尿道癌(扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌)、前立腺癌(腺癌、肉腫)、精巣癌(精上皮腫、奇形腫、胎児性癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞腫、線維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫);肝臓癌、例えば、肝癌(肝細胞癌、HCC)、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、膵内分泌腫瘍(褐色細胞腫、インスリノーマ、血管作動性腸管ポリペプチド産生腫瘍、膵島細胞腫瘍、およびグルカゴノーマなど);骨癌、例えば、骨原性肉腫(骨肉腫)、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、悪性リンパ腫(細網細胞肉腫)、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫(骨軟骨性外骨症)、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、および巨細胞腫;神経系の癌、例えば、中枢神経系(CNS)の腫瘍、原発性CNSリンパ腫、頭蓋癌(骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎)、髄膜炎(髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症)、脳癌(星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫[松果体腫]、多形性膠芽細胞腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍)、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫);生殖器系の癌、例えば、婦人科癌、子宮癌(子宮内膜癌)、子宮頸癌(子宮頸癌腫、前腫瘍子宮頸部異形成)、卵巣癌(卵巣悪性腫瘍[漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌]、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫)、外陰癌(扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫)、膣癌(明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫(胎児性横紋筋肉腫)、卵管癌(癌腫);胎盤癌、陰茎癌、前立腺癌、精巣癌;血液系の癌、例えば、血液癌(急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群)、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫[悪性リンパ腫];口腔癌、例えば、口唇癌、舌癌、歯肉癌、口蓋癌、中咽頭癌、鼻咽頭癌、副鼻腔癌;皮膚癌、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、およびケロイド;副腎癌:神経芽細胞腫;ならびに結合組織および軟組織、後腹膜および腹膜を含む他の組織の癌、眼癌、眼内黒色腫、および付属器、乳癌(例えば、乳管癌)、頭部および/または頸部の癌(頭頸部扁平上皮癌)、肛門癌、甲状腺癌、副甲状腺癌;リンパ節の続発性および部位不明の悪性新生物、呼吸器系および消化器系の続発性新生物、ならびに他の部位の続発性悪性新生物である。
さらなる実施形態において、NTSR1発現腫瘍/癌は、膵臓癌(例えば、膵管腺癌)、前立腺癌(例えば、前立腺腺癌)、肺癌(例えば、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、胸膜中皮腫)、乳癌、甲状腺癌(甲状腺髄様癌)、肝臓癌(例えば、肝細胞癌、HCC)、脳癌(例えば、神経膠腫、膠芽細胞腫)、子宮癌(例えば、子宮内膜腺癌)、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌(例えば、皮膚黒色腫)、胃癌、または結腸直腸癌(例えば、結腸腺癌)である。一実施形態において、腫瘍または癌は、原発性腫瘍または癌である。別の実施形態において、腫瘍または癌は、転移性または続発性腫瘍または癌である。別の実施形態において、腫瘍または癌は、難治性腫瘍または癌である。一実施形態において、治療は、癌の悪性度および/または転移能を低減するためのものである。
一実施形態において、癌または腫瘍は、上皮成長因子受容体(例えば、EGFR/HER1、HER2、HER3、および/またはHER4)、例えば、上皮成長因子受容体の構成的に活性化された形態を発現または過剰発現する。
一実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、標的細胞上のNTSR1へのNTの結合を妨げ、かつ/または標的細胞内のNTSR1関連シグナル伝達経路のうちの1つ以上のNT媒介活性化を阻害する。
別の実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、補体依存性細胞傷害性(CDC)または抗体依存性細胞媒介性(または細胞性)細胞傷害性(ADCC)を通して、NTSR1発現細胞(例えば、NTSR1発現腫瘍/癌細胞)の死滅を誘導する。さらなる実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、NTSR1へのNTの結合に干渉し、かつ/または標的細胞内のNTSR1関連シグナル伝達経路のうちの1つ以上のNT媒介活性化を阻害し、CDCまたはADCCを通してNTSR1発現細胞の殺傷を誘導する。一実施形態において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、古典的補体経路の成分によって、および/または細胞傷害性免疫細胞(例えば、NK細胞マクロファージ、単球、または好酸球)によって認識されるドメイン、例えば、古典的補体経路の開始成分C1qによって、および/または細胞傷害性免疫細胞上に存在するFcガンマ受容体(例えば、フラグメント結晶性(Fc)部分)によって認識されるドメインを含み、CDCおよび/またはADCCを通してNTSR1発現細胞(例えば、NTSR1発現腫瘍/癌細胞)の殺傷を誘導する。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の生物学的、治療的、および/または予防的効果を達成するのに十分な量の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、細胞内のNTSR1活性の阻害/低減、または癌に関連する症状の予防もしくは減少をもたらす量を指す。対象に使用または投与される抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントの量は、例えば、疾患のタイプおよび重症度、ならびに個体の特徴、例えば、全般的な健康、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐性に依存する。また、疾患の程度、重症度、およびタイプにも依存する。当業者は、これらおよび他の因子に応じて適切な投与量を決定することができるであろう。抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、1つ以上の追加の治療用化合物と組み合わせて投与されてもよい。本明細書に記載の方法において、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌の1つ以上の兆候または症状を有する対象に投与され得る。例えば、「治療有効量」の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌の生理学的効果が少なくとも改善されるレベルを意味する。
本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物は、標的疾患/状態の治療(放射線療法、手術、ワクチンなど)のために、または標的疾患/状態の1つ以上の症状の管理(例えば、鎮痛剤、制吐剤など)のために、1つ以上の追加の活性剤または療法と組み合わせて使用され得る。一実施形態において、本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、1つ以上の化学療法薬、免疫療法、チェックポイント阻害剤、細胞ベースの療法等と組み合わせて使用される。本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントと組み合わせて使用するのに好適な化学療法薬の例としては、ビンカアルカロイド、微小管形成を妨げる薬剤(コルヒチンおよびその誘導体など)、抗血管新生薬、治療用抗体、EGFR標的化剤、チロシンキナーゼ標的化剤(チロシンキナーゼ阻害剤など)、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗薬(ヌクレオシド類似体など)、アルキル化剤、白金ベースの薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド(オールトランスレチノイン酸またはそれらの誘導体など);ゲルダナマイシンまたはその誘導体(17−AAGなど)、ならびに当該技術分野において認識される他の癌治療薬が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントと組み合わせて使用するための化学療法薬は、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン(duanorubicin)、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン(BCNU)、メチル−CCNU、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびそれらの誘導体、フェネステリン、タキサンおよびそれらの誘導体(例えば、タキソール、パクリタキセルおよびその誘導体、タキソテールおよびその誘導体など)、トポテカン(topetecan)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、nab−5404、nab−5800、nab−5801、イリノテカン、HKP、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、Herceptin(登録商標)、ビノレルビン、Doxil(登録商標)、カペシタビン、Alimta(登録商標)、Avastin(登録商標)、Velcade(登録商標)、Tarceva(登録商標)、Neulasta(登録商標)、ラパチニブ、ソラフェニブ、エルロチニブ、エルビタックス、それらの誘導体などのうちの1つ以上を含む。一実施形態において、本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物は、EGFRまたはチロシンキナーゼ標的化剤、例えば、EGFR阻害剤(RTK阻害剤)と組み合わせて使用される。本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物もまた、1つ以上の追加の治療用抗体または抗体フラグメント、例えば、腫瘍の治療に使用される治療用抗体または抗体フラグメントと組み合わせて使用され得る。
活性剤および/またはそれらを含む組成物の組み合わせは、任意の従来の剤形で(例えば、連続的に、同時に、異なる時間に)投与または同時投与され得る。本発明との関連における同時投与とは、改善された臨床転帰を達成するための協調的な治療の過程における2つ以上の治療薬の投与を指す。そのような同時投与はまた、同一の広がりを持ってもよく、すなわち、重複した期間中に行われ得る。例えば、第1の薬剤(例えば、本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメント)は、第2の活性薬剤(例えば、化学療法薬)が投与される前、それと同時、前および後、または後に患者に投与され得る。一実施形態において、薬剤は、単一組成物中で組み合わされ/製剤化され、したがって、同時に投与され得る。
一実施形態において、本明細書に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物は、目的の薬剤(例えば、化学療法薬、放射性核種、造影剤などの薬剤)をNTSR1発現細胞または組織に送達するための標的化剤または送達ビヒクルとして使用される。一実施形態において、目的の薬剤は、抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびヒトなどの温血動物を意味するとみなされる。一実施形態において、対象は哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
別の態様において、本開示は、試料中または細胞上のNTSR1の検出するための方法に関し、細胞を本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む。一実施形態において、方法は、抗体−NTSR1複合体を検出または定量化することをさらに含む。そのような方法は、試料中のNTSR1発現細胞を検出、定量化、および/または精製するために、例えば、上記の疾患または状態(例えば、NTSR1発現癌)などのNTSR1発現/活性の調節不全に関連する疾患または状態を診断するために有用であり得る。一実施形態において、本明細書に記載の抗NTSR1抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記のように検出可能な標識(例えば、造影剤)にコンジュゲートされる。
環状ペプチド
上述のように、本発明者らは、NTSR1の第2の細胞外ループの立体構造を模倣する環状ペプチドを操作し、これを使用してニワトリを免疫化し、NTSR1を特異的に識別する抗体を作った。
上述のように、本発明者らは、NTSR1の第2の細胞外ループの立体構造を模倣する環状ペプチドを操作し、これを使用してニワトリを免疫化し、NTSR1を特異的に識別する抗体を作った。
したがって、別の態様において、本開示は、以下の配列のドメインを含む環状ペプチドであって、
X1−X2−X3−N−R−S−A−D−G1−X4−H−X5−G2−G3
式中、
「−」は結合、好ましくはペプチド(アミド)結合であり、
X1はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、好ましくはシステイン(C)であるか、または存在せず、
X2はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、好ましくはリジンもしくはリジン類似体であるか、または存在せず、
X3はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、好ましくはアミンもしくはその類似体を含む側鎖を含むアミノ酸、より好ましくはリジン(K)であるか、または存在せず、
X4およびX5は任意のアミノ酸であり、
X3またはNのうちの1つは、G3への結合、好ましくはペプチド結合を介して付着し、それによって環状ペプチドを形成する、環状ペプチド、
あるいはその塩を提供する。
X1−X2−X3−N−R−S−A−D−G1−X4−H−X5−G2−G3
式中、
「−」は結合、好ましくはペプチド(アミド)結合であり、
X1はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、好ましくはシステイン(C)であるか、または存在せず、
X2はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、好ましくはリジンもしくはリジン類似体であるか、または存在せず、
X3はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、好ましくはアミンもしくはその類似体を含む側鎖を含むアミノ酸、より好ましくはリジン(K)であるか、または存在せず、
X4およびX5は任意のアミノ酸であり、
X3またはNのうちの1つは、G3への結合、好ましくはペプチド結合を介して付着し、それによって環状ペプチドを形成する、環状ペプチド、
あるいはその塩を提供する。
一実施形態において、X1およびX2は存在しない。別の実施形態において、X1およびX2は存在する。さらなる実施形態において、X1はシステイン(C)残基である。別のさらなる実施形態において、X2はリジン(K)残基である。
一実施形態において、X3は存在しない。別の実施形態において、X3は存在する。存在する場合、X3は、好ましくはリジンまたはオルニチン、好ましくはリジンである。さらなる実施形態において、X3のアミン基(例えば、リジンまたはオルニチン)は、G3のカルボキシ末端とペプチド結合を形成する。
一実施形態において、X5はQまたはTである。別の実施形態において、X5はQである。別の実施形態において、X5はTである。
一実施形態において、X6はAまたはPである。一実施形態において、X6はAである。別の実施形態において、X6はPである。
別の態様において、本発明は、式Iの環状ペプチドを提供し、
式中、
R1およびR2は独立して、任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体の側鎖であり、
R3は、置換または非置換C1〜C8アルキルである。
一実施形態において、R1は、アラニン(A)またはプロリン(P)の側鎖である。一実施形態において、R1はAの側鎖である。別の実施形態において、R1はPの側鎖である。
R1およびR2は独立して、任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体の側鎖であり、
R3は、置換または非置換C1〜C8アルキルである。
一実施形態において、R1は、アラニン(A)またはプロリン(P)の側鎖である。一実施形態において、R1はAの側鎖である。別の実施形態において、R1はPの側鎖である。
一実施形態において、R2は、グルタミン(Q)またはトレオニン(T)の側鎖である。一実施形態において、R2はQの側鎖である。別の実施形態において、R2はTの側鎖である。
一実施形態において、R3は、置換または非置換C1〜C6アルキル、好ましくは置換または非置換C1〜C4アルキルである。
一実施形態において、R3はR4置換基で置換され、R4は、環状ペプチドを部分/分子にコンジュゲートするためのリンカーである。
さらなる実施形態において、R4は、(CH2)m−NH(CO)−C(NR5R6)−(CH2)n−SHまたはNH(CO)−(CH2)m−NH(CO)−C(NR5R6)−(CH2)n−SHであり、式中、mおよびnは独立して、1〜6の整数であり、R5およびR6は独立して、HまたはC1〜C6アルキルである。一実施形態において、mは、3〜5、好ましくは4の整数である。一実施形態において、nは、1〜3、好ましくは1の整数である。一実施形態において、R5およびR6のうちの少なくとも1つはHであり、好ましくは、R5およびR6はHである。
「塩(複数可)」という用語は、本明細書で使用される場合、無機酸および/または有機酸で形成される酸性塩、ならびに無機塩基および/または有機塩基で形成される塩基性塩を示す。医薬組成物で使用される塩は、薬学的に許容される塩であるが、他の塩が本明細書に記載の環状ペプチドの産生に有用であり得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、親ペプチドの生物活性を保持し、かつ生物学的または別様に不適切ではないペプチドの塩を指す。
「アミノ酸」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチドの合成類似体を調製するためにペプチド化学において使用される、天然に存在するアミノ酸ならびに他のアミノ酸(例えば、天然に存在するアミノ酸、非自然発生的アミノ酸、核酸配列によってコードされていないアミノ酸など)のL異性体およびD異性体の両方を含む。天然に存在するアミノ酸の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンなどである。
他のアミノ酸としては、例えば、アミノ酸の非遺伝子的にコードされた形態、ならびにL−アミノ酸の保存的置換が挙げられる。天然に存在する非遺伝的にコードされたアミノ酸としては、例えば、ベータ−アラニン、3−アミノ−プロピオン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸、アルファ−アミノイソ酪酸(Aib)、4−アミノ−酪酸、N−メチルグリシン(サルコシン)、ヒドロキシプロリン、オルニチン(例えば、L−オルニチン)、シトルリン、t−ブチルアラニン、t−ブチルグリシン、N−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン(Nle)、ノルバリン、2−ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、3−ベンゾチエニルアラニン、4−クロロフェニルアラニン、2−フルオロフェニルアラニン、3−フルオロフェニルアラニン、4−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、1,2,3,4−テトラヒドロ−イソキノリン−3−カルボン酸、ベータ−2−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、L−ホモアルギニン(Hoarg)、N−アセチルリジン、2−アミノ酪酸、2−アミノ酪酸、2,4−ジアミノ酪酸(D−もしくはL−)、p−アミノフェニルアラニン、N−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン(HoSer)、システイン酸、エプシロン−アミノヘキサン酸、デルタ−アミノ吉草酸、または2,3−ジアミノ酪酸(D−もしくはL−)などが挙げられる。これらのアミノ酸は、生化学/ペプチド化学の分野において周知である。
上述の環状ペプチドは、全てのL−アミノ酸、全てのD−アミノ酸、またはL−アミノ酸とD−アミノ酸との混合物を含み得る。したがって、上述の式におけるアミノ酸を設計するための単一文字コードは、列挙したアミノ酸のL異性体およびD異性体の両方を包含する(キラル中心を有するものについて)。例えば、「N」という文字は、L−アスパラギンおよびD−アスパラギンを指す。
環状ペプチドを形成するために、X1、X2、X3、X4、またはRのうちの1つは、G3、X7、またはX8のうちの1つへの結合を介して付着する。結合/接続は、ペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端との間、アミノ末端とアミノ酸の側鎖との間、カルボキシ末端とアミノ酸の側鎖との間、またはアミノ酸の2つの側鎖間であり得る。2個のアミノ酸は、通常のペプチド結合(すなわち、1つの残基のアルファカルボキシルと別の非連続残基のアルファアミンとの間)、非アルファアミド結合、例えば、1つの残基の側鎖と別の残基のアルファカルボキシル基との間の結合、またはラクトン、エーテル、チオエーテル、もしくはジスルフィドなどの任意の他の化学的に安定した結合を含む、任意の好適な結合を通して結合または接続され得る。
実施形態において、上述の環状ペプチドは、上で定義したドメインに加えて、該ドメインのアミノ末端および/またはカルボキシ末端に共有結合した1つ以上のアミノ酸(天然または合成)を含んでもよい。一実施形態において、上述の環状ペプチドは、上で定義したドメインのN末端および/またはC末端に最大5個の追加のアミノ酸を含む。さらなる実施形態において、上述のGRF類似体は、上で定義したドメインのN末端および/またはC末端に最大5、4、3、2、または1個の追加のアミノ酸を含む。一実施形態において、上述のドメインまたは環状ペプチドは、約50個の残基またはそれ以下、好ましくは40、30、20、15、14、もしくは13個のアミノ酸またはそれ以下を含む。一実施形態において、上述のドメインまたは環状ペプチドは、約9または10〜約15個の残基、好ましくは約11〜約15個の残基、例えば12、13、または14個のアミノ酸を含む。一実施形態において、上述の環状ペプチドは、上で定義したドメインからなる。
一実施形態において、ペプチドのネイティブアミノ末端および/またはカルボキシ末端は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端修飾基を使用して修飾され得る。
「アミノ末端修飾基」という用語は、例えば、プロテアーゼ消化に対するその安定性および/または感受性を高めるために、環状ペプチドのネイティブNH2末端基を置き換えるかまたは修飾するために、ペプチド化学分野において一般的に使用される部分を指す。アミノ末端修飾基は、1〜8個の炭素の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基、またはアシル基(RA−CO−)(式中、RAは疎水性部分(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブタニル、イソ−プロピル、もしくはイソ−ブタニルなどのアルキル)である)、またはアロイル基(Ar−CO−)(式中、Arはアリール基である)であってもよい。アシル基は、C1〜C16またはC3〜C16アシル基(直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和)、例えば、飽和C1〜C6アシル基(直鎖または分枝鎖)または不飽和C3〜C6アシル基(直鎖または分枝鎖)、例えば、アセチル基(CH3−CO−、Ac)であってもよい。一実施形態において、ペプチドのアミノ末端がペプチドを環状にする結合を形成しない場合、環状ペプチドはネイティブNH2末端基を有する。
「カルボキシ末端修飾基」という用語は、例えば、プロテアーゼ消化に対するその安定性および/または感受性を高めるために、ペプチドのネイティブCO2H末端基を置き換えるかまたは修飾するために、ペプチド化学分野において一般的に使用される部分を指す。カルボキシ末端修飾基は、以下であってもよい。
・カルボキシル基に付着したヒドロキシルアミン基(NHOH)(−C(=O)−NHOH)、
・カルボキシル基に結合したアミン(−C(=O)−NRBRC)であって、アミンは一級、二級、もしくは三級アミンであり、好ましくはアミンは、好ましくは1〜10個の炭素の脂肪族アミンであり、例えばメチルアミン、イソ−ブチルアミン、イソ−バレリルアミンもしくはシクロヘキシルアミン、芳香族アミンもしくはアリールアルキルアミン、例えば、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シナミルアミン、もしくはフェニルエチルアミンであり、好ましくはアミンは−NH2である、
・ニトリル基(C≡N)、または
・ヒドロキシアルキル(すなわち、アルコール)、好ましくはCH2OH。
・カルボキシル基に付着したヒドロキシルアミン基(NHOH)(−C(=O)−NHOH)、
・カルボキシル基に結合したアミン(−C(=O)−NRBRC)であって、アミンは一級、二級、もしくは三級アミンであり、好ましくはアミンは、好ましくは1〜10個の炭素の脂肪族アミンであり、例えばメチルアミン、イソ−ブチルアミン、イソ−バレリルアミンもしくはシクロヘキシルアミン、芳香族アミンもしくはアリールアルキルアミン、例えば、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シナミルアミン、もしくはフェニルエチルアミンであり、好ましくはアミンは−NH2である、
・ニトリル基(C≡N)、または
・ヒドロキシアルキル(すなわち、アルコール)、好ましくはCH2OH。
一実施形態において、ペプチドのカルボキシル末端がペプチドを環状にする結合を形成しない場合、環状ペプチドはネイティブCO2H末端基を有する。
環状ペプチドは、ペプチド模倣体であってもよい。ペプチド模倣体は典型的には、そのペプチド等価物の極性、三次元サイズ、および官能性(生物活性)を保持することによって特徴付けられるが、ペプチド結合/連結のうちの1つ以上は、しばしばより安定した連結によって置き換えられている。一般に、アミド結合を置き換える結合(アミド結合代替物)は、アミド結合の特性の多くまたは全て、例えば、立体構造、立体的かさ高さ、静電特性、水素結合能などを保存する。典型的なペプチド結合の置き換えとしては、エステル、ポリアミンおよびその誘導体、ならびにアミノメチルおよびケトメチレンなどの置換アルカンおよびアルケンが挙げられる。例えば、上述のドメインまたは環状は、−CH2NH−、−CH2S−、−CH2−CH2−、−CH=CH−(シスもしくはトランス)、−CH2SO−、−CH(OH)CH2−、または−COCH2−などの連結によって置き換えられた1つ以上のペプチド連結を有し得る。そのようなペプチド模倣体は、そのペプチド等価物と比較してより大きい化学安定性、強化された生物学的/薬理学的特性(例えば、半減期、吸収、効力、効率など)、および/または低減された抗原性を有し得る。一実施形態において、環状ペプチドは、X1、X2、X3、X4またはRのうちの1つと、環を形成するG3、X7、またはX8のうちの1つとの間の結合を除いて、ネイティブペプチド結合のみを含み、すなわち、上記の式中の「−」で表される結合は、全てのペプチド結合である。
一実施形態において、環状ペプチドは、図1B〜図1Dのいずれか1つに示される構造を有する。さらなる実施形態において、環状ペプチドは、図1Dに示される構造を有する。
本明細書に記載の環状ペプチドは、プロテアーゼ抵抗性、血漿タンパク質結合、血漿半減期の延長、細胞内浸透などの追加の生物学的特性を環状ペプチドに付与する1つ以上の修飾をさらに含んでもよい。そのような修飾としては、例えば、脂肪酸(例えば、C6〜C18)などの環状ペプチド(例えば、上記の式IIの分子)への分子/部分の共有結合、アルブミンなどのタンパク質の付着(例えば、米国特許第7,268,113号を参照);糖/多糖(グリコシル化)、ビオチン化またはPEG化(例えば、米国特許第7,256,258号および同第6,528,485号を参照)が挙げられる。環状ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、およびオボアルブミン(OVA)などの担体タンパク質、ならびに/または多糖を含む、その免疫原性を高める分子にコンジュゲートされてもよい。一実施形態において、環状ペプチドは、担体タンパク質、好ましくはKLHにコンジュゲートされる。一実施形態において、担体タンパク質は、環状ペプチドへのジスルフィド結合を介して、すなわち、ペプチドのシステイン残基の硫黄を通してコンジュゲートされる。環状ペプチドの修飾の上記の説明は、アプローチの範囲も操作され得る考えられる修飾も限定するものではない。
環状ペプチドは、当該技術分野において周知の方法を使用して、例えば、固相合成ならびに従来の有機合成によって合成され得る。
環状ペプチドを含む組成物
別の態様において、本開示は、本明細書に定義される環状ペプチドを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、上述の環状ペプチド、および担体または賦形剤、さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントについて上述されるものなどの薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。そのような組成物は、抗体またはその抗原結合フラグメントについて上述されるように、薬学分野において周知の方法で調製され得る。
別の態様において、本開示は、本明細書に定義される環状ペプチドを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、上述の環状ペプチド、および担体または賦形剤、さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントについて上述されるものなどの薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。そのような組成物は、抗体またはその抗原結合フラグメントについて上述されるように、薬学分野において周知の方法で調製され得る。
一実施形態において、組成物は、免疫原性組成物またはワクチン組成物である。そのような組成物は、ワクチン分野において既知の任意の従来の経路によって、例えば、粘膜(例えば、眼内、鼻腔内、肺、経口、胃、腸管、直腸、膣、もしくは尿路)表面を介して、非経口(例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、もしくは腹腔内)経路を介して、または(例えば、パッチなどの経皮送達系を介した)局所投与を介して投与され得る。
一実施形態において、本明細書に定義される環状ペプチドを含む組成物は、ワクチンアジュバントをさらに含む。「ワクチンアジュバント」という用語は、抗原(例えば、本明細書で定義される環状ペプチド)などの免疫原に添加されると、混合物への曝露時に宿主における薬剤に対する免疫応答を非特異的に強化または増強する物質を指す。好適なワクチンアジュバントは当該技術分野において周知であり、例えば、(1)無機塩(アルミニウム塩、例えば、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウム、リン酸カルシウムゲル)、スクワレン、(2)油系アジュバント、例えば、油エマルションおよび界面活性剤系製剤、例えば、不完全もしくは完全フロイントアジュバント(Freud’s adjuvant)MF59(マイクロ流動化洗剤で安定化した水中油エマルション)、QS21(精製サポニン)、AS02[SBAS2](水中油エマルション+MPL+QS−21)、(3)微粒子アジュバント、例えば、ビロソーム(インフルエンザ血球凝集素を組み込んだ単層リポソームビヒクル)、AS04(MPLを含む[SBAS4]アルミニウム塩)、ISCOMS(サポニンおよび脂質の構造化複合体)、ポリラクチドコ−グリコリド(PLG)、(4)微生物誘導体(天然および合成)、例えば、モノホスホリルリピドA(MPL)、Detox(MPL+M.Phlei細胞壁骨格)、AGP[RC−529](合成アシル化単糖)、DC_Chol(リポソームに自己組織化することが可能なリポイド免疫刺激剤)、OM−174(リピドA誘導体)、CpGモチーフ(免疫刺激CpGモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド)、修飾LTおよびCT(非毒性アジュバント効果を与える遺伝子操作された細菌毒素)、完全フロイントアジュバント(Freud’s adjuvant)(不活性化および乾燥マイコバクテリウムを含む)(5)内因性ヒト免疫調節剤、例えば、hGM−CSFもしくはhIL−12(コードされたタンパク質もしくはプラスミドとして投与され得るサイトカイン)、Immudaptin(C3dタンデムアレイ)、ならびに/または(6)不活性ビヒクル、例えば、金粒子が挙げられる。
環状ペプチドまたはそれを含む組成物の使用
別の態様において、本開示は、動物におけるNTSR1(例えば、ヒトNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGG(配列番号83)および/またはラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGG(配列番号84)に位置する立体構造エピトープ)に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための方法を提供し、方法は、該動物に、有効量の本明細書に定義される環状ペプチドまたはそれを含む組成物を該動物に投与することを含む。別の態様において、本開示はまた、動物におけるNTSR1(例えば、ヒトNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGGおよび/またはラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGGに位置する立体構造エピトープ)に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための、本明細書で定義される環状ペプチドまたはそれを含む組成物の使用も提供する。本開示はまた、動物におけるNTSR1(例えば、ヒトNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGGおよび/またはラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGGに位置する立体構造エピトープ)に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための、本明細書で定義される環状ペプチドまたはそれを含む組成物も提供する。
別の態様において、本開示は、動物におけるNTSR1(例えば、ヒトNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGG(配列番号83)および/またはラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGG(配列番号84)に位置する立体構造エピトープ)に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための方法を提供し、方法は、該動物に、有効量の本明細書に定義される環状ペプチドまたはそれを含む組成物を該動物に投与することを含む。別の態様において、本開示はまた、動物におけるNTSR1(例えば、ヒトNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGGおよび/またはラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGGに位置する立体構造エピトープ)に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための、本明細書で定義される環状ペプチドまたはそれを含む組成物の使用も提供する。本開示はまた、動物におけるNTSR1(例えば、ヒトNTSR1由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGGおよび/またはラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGGに位置する立体構造エピトープ)に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための、本明細書で定義される環状ペプチドまたはそれを含む組成物も提供する。
一実施形態において、上述の方法または使用は、動物において産生された抗体を採取することをさらに含む。さらなる実施形態において、上述の方法または使用は、採取された抗体を精製することをさらに含む。
環状ペプチドまたはそれを含む組成物が投与される動物は、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ヤギ、またはニワトリなど、抗体の産生に従来使用されている任意の動物であってもよい。
一実施形態において、動物はニワトリ(雌鶏)である。ニワトリ(雌鶏)を動物宿主として使用する場合、動物において産生される抗体はIgY型であり、動物の卵から採取(および精製)される。卵から抗体を採取および精製するための方法は、当該技術分野において周知であり(例えば、M.NARAT,Food Technol.Biotechnol.41(3)259−267(2003)およびその中で引用される参考文献を参照)、代表的な方法が以下に記載される。
用語「a」および「an」および「the」、ならびに本発明を説明する文脈における(特に、以下の特許請求の範囲の文脈における)同様の指示対象の使用は、本明細書で別途記載のない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。
「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」、および「含有する(containing)」という用語は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語(すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する)として解釈されるべきである。
本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書に別途記載のない限り、範囲内に入る各別個の値を個々に参照する簡単な方法として機能することのみを意図し、各別個の値は、それがあたかも本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。範囲内の値の全てのサブセットもまた、それらがあたかも本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
本明細書に提供されるありとあらゆる実施例、または例示的な言語(例えば、「など」)の使用は、単に本発明をより良く例示することを意図するものであり、特に特許請求されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。
本明細書のいかなる言語も、いかなる特許請求されていない要素も本発明の実施に必須なものとして示していると解釈されるべきではない。
本明細書において、「約」という用語は、その通常の意味を有する。「約」という用語は、値が、その値を決定するために用いられるデバイスもしくは方法についての固有の誤差変動を含むことを示すためか、または列挙される値に近い値、例えば、列挙される値(または値の範囲)の10%もしくは5%以内の値を包含するために使用される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明を実施するためのモード(複数可)
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に例示される。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に例示される。
実施例1:材料および方法
ペプチド合成。2−クロロトリチルクロリド樹脂を、直鎖ペプチド(カルボン酸機能および遊離アミン機能を有し、他方の側鎖は保護されている)で回収した。樹脂を5mLのDMFに添加した。5当量のDEPBTおよび6当量のDIPEAを溶液に添加した。樹脂を16時間インキュベートし、DMFおよびDCMで洗浄した。次いで、樹脂を真空下で乾燥させた。反応収率についての品質管理の後、ペプチド切断を行い、分取HPLCによって大環状ペプチドの精製を実施した。
ペプチド合成。2−クロロトリチルクロリド樹脂を、直鎖ペプチド(カルボン酸機能および遊離アミン機能を有し、他方の側鎖は保護されている)で回収した。樹脂を5mLのDMFに添加した。5当量のDEPBTおよび6当量のDIPEAを溶液に添加した。樹脂を16時間インキュベートし、DMFおよびDCMで洗浄した。次いで、樹脂を真空下で乾燥させた。反応収率についての品質管理の後、ペプチド切断を行い、分取HPLCによって大環状ペプチドの精製を実施した。
ニワトリ免疫化およびIgY抽出。KLHコンジュゲートペプチド(Lin−ペプチド、3D−ペプチド−1、−2、および−3)の一次免疫化を完全フロイントアジュバント中で適用した一方で、以下のブースターを不完全フロイントアジュバント中に与えた。KLHコンジュゲートペプチドを筋肉内注射した。毎月の抗原ブーストによる3ヶ月の免疫化の後、全ての卵を抗原および採取時間に従ってプールした。卵黄を卵白から分離し、タンパク質を、いくつかの修飾を加えてすでに記載されているように抽出した(”Production and Application”R.Schade et al.2000,Springer−Verlag,Lab Manuals,ISBN 3−540−66679−6.”Isolation and Purification of Chicken Egg Yolk immunoglobulins:A review”)。抽出した全てのIgY(IgY−Lin、IgY−3D−1、IgY−3D−2、およびIgY−3D−3)を、アガロースビーズにコンジュゲートされた対応するペプチドを使用する免疫親和性精製の第2のステップのために処理した。
抗体配列決定。抗体の配列を次世代シーケンシング(NGS)によって決定し、サンガーシーケンシングによって確認した。
細胞および試薬。ヒト胎児腎臓(HEK)293Aおよび293T細胞を、37℃、5% CO2で10%ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で維持した。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)−K1細胞をAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手し、37℃、5% CO2で、FBS 10%、L−グルタミン、HEPES、および抗生物質を補充したDMEM/F12中で維持した。全ての細胞培養試薬は、HyClone(Thermo Scientific,Logan,UT,USA)からのものであった。
HEK293AおよびCHO−K1細胞をレンチウイルス系で形質転換して、ラットNTS1受容体を安定して発現した。HAタグ付きラットNTS1を発現するレンチウイルスベクターを生成するために、2HA−rNTS1コード配列を、カスタムプラスミド(p2HA−rNTS1)から以下のプライマー(順方向:5’−TGCATCTAGAGCCACCATGTACCCATACGA−3’(配列番号122)および逆方向:5’−TCACTGCAGAATTCCTAGTACAGGGTCTCC−3’(配列番号123))で増幅し、XbaIおよびEcoRI制限酵素(New England Biolab,Massachusetts,USA)を使用して、pCDH−MCS−Ef1−puro cDNAクローニングおよび発現ベクター(System Biosciences,Mountain View,CA,USA)にクローニングした。次いで、HEK293T細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンアミン(MW 25,000;Polysciences,Warrington,PA)を使用して、pCDHレンチベクター、pMD2.G(Didier Tronoからの贈答品、Addgeneプラスミド番号12259)およびpsPAX2(Didier Tronoからの贈答品、Addgeneプラスミド番号12260)で一過性に共トランスフェクトした。次いで、ウイルス粒子をトランスフェクションの48時間後に採取し、濾過し(0.45μM PVDFシリンジフィルタ、ThermoFisher Scientific,Massachusetts,USA)、HA−ratNTS1を安定して発現する細胞を生成するために使用した。pCDH−CMV−2HA−rNTS1−Ef1−puroを発現するHEKおよびCHO−K1細胞を、それぞれ0.5μg/mLおよび8μg/mLの濃度のピューロマイシンを使用して選択した。
ペプチドに対する酵素結合免疫吸着測定法。試験した全てのペプチド(Lin−ペプチド、3Dペプチド−1、3Dペプチド−2、および3Dペプチド−3)を、4℃で一晩、結合緩衝液(0.1M Na2HPO4、0.15M NaCl、10mM EDTA pH7.2)で、Well−Coated(商標)スルフヒドリル結合、8ウェルストリッププレート、クリア(G−Biosciences,MO 63132−1429,USA)内で、ウェル当たり3.5μmoleの濃度でプレートコーティングした。遮断するために、L−システイン(結合緩衝液中1μM)を各ウェルに、室温(RT)で1時間添加した。試験した抗体(IgY−Lin、IgY−3D−1、IgY−3D−2、およびIgY−3D−3)を、100ng/mLの最終濃度(PBS 0.25% Tween 20、0.3%ミルク)で希釈し、その対応する遊離ペプチドの増加する量(0.3nM〜10000nM)、または遊離Lin−ペプチド、3D−ペプチド−1、−2、もしくは−3のいずれかの固定濃度(10μM)と予めインキュベートした。全てのIgY−ペプチド混合物および対照(陽性対照としてIgYのみ、および陰性対照として二次抗体のみ)を各ペプチドコーティングウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。PBS 0.25% Tween(登録商標)20(PBST)での4回の洗浄を実施し、二次抗体(アルパカ抗ニワトリHRP、Immune Biosolutions,Sherbrooke,QC,CA)を室温で45分間添加した。PBSTでの4回の追加の洗浄後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)(Sigma−Aldrich,St−Louis,Missouri,USA)を添加し、反応をHCl 2Nで停止させる前に室温で15分間インキュベートした。450nmでの吸光度を、Tecan GENios(登録商標)プレートリーダー(Tecan Austria GmbH,Austria)で読み取った。
免疫蛍光顕微鏡検査法。HA−rNTS1を安定して発現するか、またはHAタグ付きのrNTS1、rNTS2、またはrAPJのいずれかを一過性に発現する120,000個のHEK293A細胞を、6ウェルプレート内の顕微鏡ガラスカバースリップ上に播種した。翌日、細胞をPBSで洗浄し、37℃の3.7%ホルムアルデヒド−PBS中で10分間固定し、PBS中で3回洗浄し、氷上で2分間、0.1% Triton X−100で透過処理した。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、室温で1時間PBS中の10%の正常ヤギ血清(NGS)で処理した。この飽和ステップに続いて、マウスモノクローナルHA−プローブ抗体(1:200、(F−7)sc7392、Santa Cruz Biotechnology,CA,USA)、および5μg/mLの各ニワトリポリクローナル抗NTS1(Lin、3D−1、3D−2、および3D−3)、またはPBS NGS 10%中1:10(IgY:ペプチド)の比率で抗体および対応するペプチドを含有する混合物と共に一晩インキュベートした。Alexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗ニワトリ抗体およびAlexa Fluor(商標)647コンジュゲートヤギ抗マウス抗体(各々を1:200希釈で使用)とインキュベートすることによって、蛍光染色を行った。細胞を、PBS中で4回洗浄した後、DAPI(ThermoFisher scientific,Massachusetts,USA)を有するProLong(登録商標)gold褪色防止用封入剤中でマウントした。共焦点Olympus IX81 FV1000 LSM顕微鏡およびFluoview(登録商標)FV10−ASW 3.1ビューアソフトウェアを使用して写真を生成した。撮像パラメータを、試料間で同一の値に設定した。条件毎にランダムに選択された5つの視野(FV10−ASW 3.1ビューアソフトウェア)のzスタック画像(視野毎に10スライス)に対して、共局在化および係数計算(ピアソンおよびオーバーラップ488/647)を実施した。
組織固定および免疫組織染色。成体雄ラットを5%イソフルランで麻酔し、リン酸緩衝液(0.1M)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で経心的に灌流した。脳を4℃で一晩凍結防止し(リン酸緩衝液0.1M、30%スクロース)、イソペンタン中で−40℃において1分間凍結させた。凍結ミクロトーム上で冠状切片を切断し、PBS中で採取して免疫染色を進めた。遊離浮遊脳切片をPBSで4回洗浄し、PBS−H2O2 3%で1時間インキュベートした。切片をPBSでさらに4回洗浄し、透過処理し、ブロッキング溶液(PBS、NGS 3%、およびtriton−X 0.3%)で1時間遮断した。希釈溶液(PBS、NGS 1%、およびTriton−X0.3%)中5μg/mLの濃度のニワトリ抗体(IgY−Lin、IgY−3D−1/2および3)で2時間のインキュベーションを行った。洗浄後、ヤギ抗ニワトリHRPコンジュゲート抗体を希釈溶液中に添加し(1:200)、1時間インキュベートし、再度洗浄した。溶液A(1:100)およびB(1:100)を希釈溶液中で希釈し、スライドに添加し、1時間インキュベートした。洗浄後、DAB溶液(PBS、ジアミノベンジジン0.05%、H2O2 0.015%)を3分間添加し、反応をPBSで停止させた。全てのステップを、撹拌下で室温において実施した。脳切片を乾燥させ、Permount(登録商標)Mounting Media(SP15−500、Fisher Scientific,NY,USA)でカバースリップした。10倍の倍率のLeica DM4000顕微鏡で画像を取得した。
ウエスタンブロット。HEK293A細胞を、等量(6μg)のHAタグ付きのrNTS1、rNTS2、rAPJ、または陰性対照としての空ベクターのいずれかで一過性にトランスフェクトした。全細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche,Bale,Switzerland)を補充した還元溶解緩衝液(280mM NaCl、50mM Tris、0.015g DTT、0.5% NP−40、pH8.0)、またはネイティブ溶解緩衝液(280mM NaCl、50mM Tris、0.5%デオキシコール酸ナトリウム(NaDOC)、1% n−ドデシルβ−D−マルトシド(DDM))中で溶解し、トランスフェクションの48時間後に30秒間超音波処理した。全細胞溶解物を、免疫沈降および/またはポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)のためにさらに処理した。後者に関して、溶解物を、変性/還元タンパク質試料緩衝液(60mM Tris−HCl pH6.8、10%グリセロール、0.002%ブロモフェノールブルー、2% SDS、2% 2−メルカプトエタノール)、またはネイティブタンパク質試料緩衝液(31.25mM Tris−HCl pH6.8、25%グリセロール、0.005%ブロモフェノールブルー)中で37℃において加熱した。タンパク質試料(ウェル当たり20μgの総タンパク質)を装填し、SDSまたはネイティブPAGEによって分解した。ニトロセルロース膜に移した後、ブロットを、1μg/mLの濃度の異なるニワトリ抗体(IgY−Lin、IgY−3D−1、IgY−3D−2、およびIgY−3D−3)、またはニワトリ抗HA抗体(1:1000、Immune Biosolutions Inc,Sherbrooke,QC,CA)、続いて二次抗体であるヤギ抗ニワトリHRP(1:5000、Immune Biosolutions Inc,Sherbrooke,QC,CA)でプローブした。ラットモノクローナル抗HA高親和性HRPコンジュゲート抗体(1:1000、Roche,Sigma−Aldrich,St−Louis,Missouri,USA)を使用して、選択性アッセイにおける全細胞溶解物のタンパク質発現レベルを検出した。全てのブロットを、化学発光検出系(Bio−Rad Clarity western ECL,Bio−Rad,Hercules,CA,USA)を使用して明らかにした。画像を、ソフトウェアImage Labバージョン5.0を使用してChemidoc(登録商標)MPに記録した。
免疫沈降。試験した全てのニワトリ抗体(IgY−Lin、IgY−3D−1、IgY−3D−2、IgY−3D−3、およびIgY抗HA)を、等価モル比でマレイミド磁気ビーズ(Immune Biosolution Inc.)にコンジュゲートした。抗体結合磁気ビーズ(10μL)を各試料(1mg/mLの全タンパク質において200μLの全細胞溶解物)、および空ベクターでトランスフェクトした細胞の溶解物、または質量分析の前のアッセイにおいて1:10の比率で予めインキュベートしたIgY−ペプチドの混合物を有する標的受容体を含有する試料からなる陰性対照に添加した。全ての試料をローテーター上で4℃において一晩インキュベートした。翌日、タンパク質−抗体−磁気ビーズ複合体をPBS Tween(登録商標)0.01%で4回洗浄した後、質量分析で試験した試料の場合は、TweenなしのPBSで4回洗浄した。免疫沈降タンパク質を溶出緩衝液(水酸化アンモニウム0.5M)で溶出し、上記のウエスタンブロットのために処理するか、または瞬間凍結させて、ストッパリングトレイ乾燥機(Labconco,Kansas City,MO,USA)を使用してさらに凍結乾燥させた(プログラム:−40℃(6時間)、−21℃(10時間)、20℃(4時間))。試料を2つのプラットフォームに送り、質量分析を評価した:PhenoSwitch(Sherbrooke,QC,CA)およびCHULの研究センターのプロテオミクスプラットフォーム(Laval University,QC,CA)。
質量分析およびタンパク質識別。タンパク質を、100μLの50mM Tris pH8+0.75M尿素中で再構成し、10mMのDTTで65℃において15分間還元し、暗所で室温において1時間、15mMのヨードアセトアミドでアルキル化した。トリプシン/LysC(1μg)を各試料に添加し、タンパク質を撹拌しながら37℃で一晩消化した。2%ギ酸の添加によって消化を停止させ、ペプチドを逆相SPEによって精製した。Phenoswitchおよびプロテオミクスプラットフォームのそれぞれによって、ABSciex TripleTOF 5600(ABSciex,Foster City,CA,USA)およびThermo Orbitrap(登録商標)Fusion Tribrid(Thermo Scientific,Logan,UT,USA)で、取得を実施した。Phenoswitchからのタンパク質識別を、TripleTof5600について予め設定された機器、特殊因子としてのシステインアルキル化としてのヨードアセトアミドを用いた、ProteinPilot V4.5ベータ(ABSciex)で実施した。(カスタムタンパク質配列を付加した)ラット(Rattus norvegicus)プロテオームに対する生物学的修飾に重点を置いて、偽発見率分析を用いた徹底した検索を実施した。タンパク質識別およびデータ分析については、全体的な偽発見率(FDR)を1%に設定し、局所的な偽発見率を5%に設定した。ニューロテンシン受容体1のペプチドが基本的な品質基準を満たしていることを確認するために、手動でレビューした。プロテオミクスプラットフォームは、Mascot(Matrix Science,London,UK;バージョン2.5.1)を使用して全てのMS/MS試料を分析した。Mascotは、消化酵素トリプシンを仮定して、CP_RattusNorvegicus_10116_CO_20161019データベース(バージョン不明、31602エントリ)を検索するように設定した。Mascotを、0,6Daのフラグメントイオン質量許容差および10PPMの親イオン許容差で検索した。システインのカルバミドメチルを、Mascotで固定修飾として指定した。アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド化ならびにメチオニンの酸化は、Mascotで可変修飾として指定した。Scaffold(バージョンScaffold_4.7.5、Proteome Software Inc.,Portland,OR)を使用して、MS/MSベースのペプチドおよびタンパク質識別を検証した。ペプチド識別を、それらが、Scaffold Local FDRアルゴリズムによって1%未満のFDRを達成する確率が99%を超えて確立され得る場合に認めた。タンパク質識別を、それらが、1%未満のFDRを達成する確率が99%を超えて確立され得、少なくとも1つの識別されたペプチドを含有した場合に認めた。
環状AMP産生測定。HA−rNTS1を安定して発現するCHO−K1細胞を使用して、HTRF技術(cAMP−Gs dynamic kit,Cisbio US,Bedford,MA,USA)に基づいて、この競合免疫アッセイを実施した。細胞(2000/ウェル)を、アルファ−プレート384 SW(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)中で、NT8−13(6nM(EC50)および10μM(ECmax)のみ、またはNT8−13(6nM)と各IgY(−Lin、−3D−1、−3D−2、および−3D−3)との混合物で30分間、37℃で刺激した。刺激を受けなかった細胞を陰性対照として使用した。試薬を製造業者のプロトコルに記載されるように添加した。蛍光を、Tecan GENiosプレートリーダー(Tecan Austria GmbH,Austria)を用いて620nmおよび665nmで測定した。
結合アッセイ。HAタグ付きラットNTS1(HA−rNTS1)を発現するHEK293細胞を、80%のコンフルエンシーに達したときに凍結させた。細胞を10mMのTris、1mMのEDTA pH7.5で皿から剥離し、4℃において5分間15,000gで遠心分離した。次いで、ペレットを結合緩衝液中に再懸濁した。HA−rNTS1受容体を発現する15μgの細胞膜を、濃度が増加するニワトリ抗体(IgY−Lin、IgY−3D−1、IgY−3D−2、およびIgY−3D−3)の存在下で、結合緩衝液(50mMのTris−HCl、pH7.5、0.2% BSA)中で45pMの125I−[Tyr3]−NT(2200Ci/mmol)と60分間25℃においてインキュベートすることによって、競合放射性リガンド結合実験を実施した。インキュベーション後、結合反応混合物をポリエチレンアミンコーティング96ウェルフィルタプレート(ガラス繊維フィルタGF/B、Millipore,Billerica,MA)中に移した。反応を濾過によって終了し、プレートを200μLの氷冷結合緩衝液で3回洗浄した。次いで、ガラスフィルタをγカウンタ(2470 Wizard2,PerkinElmer)でカウントした。非特異的結合を、10−5Mの非標識NT[8−13]の存在下で測定し、総結合の5%未満を表した。125I−[Tyr3]−NT特異的結合の半分を阻害する非標識リガンド濃度として、IC50値を競合曲線から決定した。
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)ベースのバイオセンサアッセイ。全てのBRETアッセイをDomain Therapeutics NA Inc(Montreal,QC,Canada)で実施した。実験を全て、HA−ラットNTS1受容体を一過性に発現するHEK293T細胞において実施し、上記のようにわずかな修正を伴い処理した(Rives et al.,Mol Pharmacol.,2018)。細胞を384ウェルプレートにプレートした。最初に、増加する量のNT 1−13(0.1pM〜0.1mM)、SR48692(0.1pM〜0.1mM)、およびニワトリ抗体:IgY−Lin、IgY−3D−1およびIgY−3D−3(0.02μM〜2μM)を用いて、トランスフェクションの48時間後に細胞を処理することによって、アゴニストモードを試験した。細胞をTyrode−HEPES緩衝液(Sigma、カタログ番号T2145−H9136)で洗浄し、室温で60分間の平衡期間にわたって続行した。次いで、e−Coelenterazine Prolume(登録商標)Purple(1.8μM、Methoxy e−CTZ;Nanolight,カタログ番号369)を各ウェルに添加し、第1の読み取り値をSynergy NEOプレートリーダー上で取得した。アンタゴニストモードについて、EC50のNT 1−13を以前のウェルに添加し、これをSR48692および抗体で処理し、10分のインキュベーション後に第2の読み取りを実施した。BRETシグナルを、ドナー放出に対するアクセプター放出の比率として計算した。
ヒト化および組換え抗体の調製。ヒト化フレームワークscFv配列を含有するgBlocksを、Integrated DNA Technologies,Inc.によって合成した。受け取り時に、gBlocksを10mM Tris pH8.0中に再懸濁し、Gibson Assembly法によってpTT5−Fcプラスミド中に導入した。組み立てられた生成物をDH5αコンピテント細胞に形質転換し、選択プレート上で一晩増殖した。コロニーをカウントし、コロニーPCRによって検証した。プラスミドを陽性クローンのためにMiniprepによって単離し、さらなる分析のためのサンガーシーケンシングのために送った。確認された陽性クローンを含有するプラスミドを増幅し、Maxiprepによって単離した。プラスミドをCHO−3E7中でトランスフェクトし、細胞を7日間維持した。培養培地を採取し、抗体を、プロテインAカラムを使用した親和性クロマトグラフィーによって単離した。
実施例2:ペプチドの説明ならびにペプチドに対する抗体選択性および親和性の評価
抗原決定基として機能した本研究のために選択されたペプチドは、アゴニスト結合結晶化ラットNTS1受容体の第2の細胞外ループの11アミノ酸配列に基づいている。4つの設計されたペプチド(Lin−ペプチド、3Dペプチド−1、−2、および−3)ならびにリンカーの構造および説明が図1A〜図1Dおよび図10に示される。4つのペプチドでの免疫化の後、ニワトリポリクローナル抗体(IgY)を抽出し、免疫精製して、4つの異なる抗体:IgY−Lin、IgY−3D−1、−2、および−3を生成した。以下に記載される全ての検証結果に基づいた、結果として生じる抗体交差反応性および機能特性は、図10に示される。
抗原決定基として機能した本研究のために選択されたペプチドは、アゴニスト結合結晶化ラットNTS1受容体の第2の細胞外ループの11アミノ酸配列に基づいている。4つの設計されたペプチド(Lin−ペプチド、3Dペプチド−1、−2、および−3)ならびにリンカーの構造および説明が図1A〜図1Dおよび図10に示される。4つのペプチドでの免疫化の後、ニワトリポリクローナル抗体(IgY)を抽出し、免疫精製して、4つの異なる抗体:IgY−Lin、IgY−3D−1、−2、および−3を生成した。以下に記載される全ての検証結果に基づいた、結果として生じる抗体交差反応性および機能特性は、図10に示される。
エピトープ結合有効性を検証するために、全ての抗体を、固定ペプチド上の酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)において試験した(図2A)。抗体を増加する量のその適合する遊離ペプチドと(例えば、IgY−LinをLin−ペプチドと)予めインキュベートして、固定ペプチド検出を遮断することによって、阻害曲線を生成した。遊離ペプチドを含まない抗体のみを含有する対照の450nmにおける吸光度測定を、100%の全検出に対して正規化し、全ての試料を、それらの対応する対照に対してパーセンテージで正規化した。固定ペプチドへの結合の50%を阻害するために、計算された濃度(IC50)は、約2.25nM(Lin)〜約7.81nM(3D−3)の範囲の4つの抗体について同等であった。
設計したペプチドに対する抗体の選択性を分析するために、示された抗体(図2B)を固定濃度(10μM)の各ペプチドと混合することによって競合アッセイを行った。対照は、遊離ペプチドを含まない抗体のみに対応した。全ての吸光度測定をパーセンテージに変換し、それぞれの対照に対して正規化した。得られた結果は、全ての抗体がそれらの適合するペプチドによって遮断されたことを示す。IgY−Linは、3つの3D−ペプチドによって部分的に遮断された(最大67%の遮断)。興味深いことに、IgY−3D−1は、その対応するペプチド(3Dペプチド−1)によってのみ効率的に遮断された。IgY−3D−2および−3は、類似の表現型を有し、全ての3D−ペプチドによって(3Dペプチド−1によってはより低い程度まで)遮断され、Lin−ペプチドによっては部分的にのみ遮断された(最大45%の遮断)。
実施例3:抗体の検証−ラットNTS1受容体の検出
抗体を、それらが産生されたエピトープを検出する能力について検証した。次のステップは、それらが完全タンパク質を検出することができたかどうかを決定することであった。HAタグ付きラットNTS1受容体を安定して発現する固定HEK293A細胞に対して免疫蛍光(IF)顕微鏡法を実施し、共局在化分析を実施し、HA(Alexa Fluor(商標)647)によって生成されたシグナル上の、ニワトリ抗体(Alexa Fluor(商標)488)によって生成されたシグナルに基づいて、オーバーラップ係数を計算した。図3Aのグラフは、条件毎にランダムに選択された5つの視野からの、複製とみなされる10個のzスタックスライス(0.5μm)の計算されたオーバーラップ係数(488/647)を示す。文献によると、0.5未満のオーバーラップ係数は、IgY−3D−2の場合のように有意な共局在化としてみなされない。
抗体を、それらが産生されたエピトープを検出する能力について検証した。次のステップは、それらが完全タンパク質を検出することができたかどうかを決定することであった。HAタグ付きラットNTS1受容体を安定して発現する固定HEK293A細胞に対して免疫蛍光(IF)顕微鏡法を実施し、共局在化分析を実施し、HA(Alexa Fluor(商標)647)によって生成されたシグナル上の、ニワトリ抗体(Alexa Fluor(商標)488)によって生成されたシグナルに基づいて、オーバーラップ係数を計算した。図3Aのグラフは、条件毎にランダムに選択された5つの視野からの、複製とみなされる10個のzスタックスライス(0.5μm)の計算されたオーバーラップ係数(488/647)を示す。文献によると、0.5未満のオーバーラップ係数は、IgY−3D−2の場合のように有意な共局在化としてみなされない。
内因性ラットNTS1受容体の検出を検証するために、免疫組織化学(IHC)をニワトリ抗体を用いてラット脳切片上で実施した。IgY−LinおよびIgY−3D−1で得られた結果が図3Bに示される。rNTS1受容体を高度に発現すると以前に記載された領域が示され、矢印はNTS1特異的シグナルを示している。IgY−3D−1およびIgY−3D−3は、IgY−Linで得られた非特異的シグナルを生成することなく、ラットNTS1受容体を効率的に検出していた。IgY−3D−2は、ラット脳内の受容体を検出することができなかった。
抗体とラットNTS1受容体との特異的相互作用の実証は、質量分析による識別によって確立された。最初に、ラットNTS1受容体を、HA−rNTS1を過剰発現するHEK293A細胞から、磁気ビーズにコンジュゲートされたニワトリ抗体(IgY−3D−1および−3)との免疫沈降(IP)によって単離した。使用した陰性対照は、IgYコンジュゲートビーズと、それらの適合するペプチドとの1:10の比率でのプレインキュベーションに対応した。免疫ブロットを抗HA−HRP抗体で明らかにした(図4A)。全ての試料を分析のために送り、rattus norvegicus由来のペプチドが明確に識別され、ラットNTS1受容体のC末端ドメインに対応した。識別されたペプチド配列およびそのイオンプロファイルが図4Bに示される。NTS1特異的抗体とNTS1受容体との間の相互作用は、図4Cのグラフによって示されるように、対応するペプチドとのプレインキュベーションによって有意に遮断された。
実施例4:種間のNTSR1保存および抗体選択性
免疫原が使用された第2の細胞外ループラットNTS1受容体のX線ベースのペプチド配列は、1個および2個のアミノ酸がマウスおよびヒトNTS1タンパク質配列のそれぞれと異なるため、種間で大部分は保存される(図5A)。このエピトープに対して作られたNTS1受容体抗体(IgY−3D−1およびIgY−3D−3)は、ヒトNTS1受容体を認識することが示され、マウス受容体を認識すると予想される。図5Bに示される結果は、ポリクローナルIgY−3D−3抗体が、変異体のいくつかに対して(ネイティブNTと比較して)より強い結合を有して、最も曝露されたものであると予測される、設計されたエピトープの5個のアミノ酸(D216、G217、T218、H219、およびP220)において変異(アラニン置換)したNTS1タンパク質に結合することを示す。IgY−3D−3抗体はまた、ネイティブNTと比較してより低いレベルではあるが、変異体上の放射性標識ニューロテンシン(NT)の置き換えを誘導することができた(図5C)。
免疫原が使用された第2の細胞外ループラットNTS1受容体のX線ベースのペプチド配列は、1個および2個のアミノ酸がマウスおよびヒトNTS1タンパク質配列のそれぞれと異なるため、種間で大部分は保存される(図5A)。このエピトープに対して作られたNTS1受容体抗体(IgY−3D−1およびIgY−3D−3)は、ヒトNTS1受容体を認識することが示され、マウス受容体を認識すると予想される。図5Bに示される結果は、ポリクローナルIgY−3D−3抗体が、変異体のいくつかに対して(ネイティブNTと比較して)より強い結合を有して、最も曝露されたものであると予測される、設計されたエピトープの5個のアミノ酸(D216、G217、T218、H219、およびP220)において変異(アラニン置換)したNTS1タンパク質に結合することを示す。IgY−3D−3抗体はまた、ネイティブNTと比較してより低いレベルではあるが、変異体上の放射性標識ニューロテンシン(NT)の置き換えを誘導することができた(図5C)。
標的選択性は、抗体の産生における決定因子であり、評価する必要があった。この問題に対処するために、全ての抗体を、他のクラスA GPCR:ニューロテンシン低親和性受容体2(rNTS2)およびアペリン受容体(rAPJ)(両方ともラット由来)を検出する能力について試験した。HAタグ付きrNTS1、rNTS2、rAPJ、または空ベクター対照のいずれかを過剰発現するHEK293A細胞を、ウエスタンブロット(図5D)およびネイティブ免疫沈降(図5E)のために処理した。これらの図に示される結果は、NTS1抗体IgY−3D−1およびIgY−3D−3がラットNTS1受容体のみを検出したことを示す。
実施例5:抗体の機能特性
NTS1受容体に対する化合物または抗体の機能特性を検証するためのロバストな技法は、抗体を用量反応的に添加することによって、その受容体に結合する放射性標識ニューロテンシン(125I−Tyr3−ニューロテンシン)の置き換えを測定することである(図6A)。IgY−3D−3は最も強力な抗体であり、低濃度(IC50=3.2μg/mL)でNTを効率的に置き換えることができた。IgY−3D−1およびIgY−Linは、IgY−3D−3と比較してより高い濃度(それぞれ36.5μg/mLおよび187μg/mL)で、ニューロテンシンの50%を置き換えることが示された。IgY−3D−2は、結合NTのレベルを有意に変化させなかった。
NTS1受容体に対する化合物または抗体の機能特性を検証するためのロバストな技法は、抗体を用量反応的に添加することによって、その受容体に結合する放射性標識ニューロテンシン(125I−Tyr3−ニューロテンシン)の置き換えを測定することである(図6A)。IgY−3D−3は最も強力な抗体であり、低濃度(IC50=3.2μg/mL)でNTを効率的に置き換えることができた。IgY−3D−1およびIgY−Linは、IgY−3D−3と比較してより高い濃度(それぞれ36.5μg/mLおよび187μg/mL)で、ニューロテンシンの50%を置き換えることが示された。IgY−3D−2は、結合NTのレベルを有意に変化させなかった。
ニューロテンシン結合後のNTS1受容体活性化は、複数のシグナル伝達経路を誘発し、最初に試験したものは、Gs結合NTS1活性化に応答する環状AMP(cAMP)の蓄積であった。産生されたcAMPの量を、ホモジニアス時間分解蛍光(HTRF)技術に基づくアッセイを用いて、ラットNTS1受容体を安定して発現するCHO−K1細胞内で計算した。細胞をNTで刺激し(EC50に対応する濃度で)、抗体とインキュベートして、cAMPの産生を遮断する能力を評価した(図6B)。IgY−3D−3抗体は、これらの条件下でNTによって誘導されるcAMPの産生を有意に阻害する唯一の抗体であった。
次いで、BRETベースのアッセイを使用して、HA−rNTS1を一過性に発現するHEK293細胞内で、NT刺激後のラットNTS1シグナル伝達活性プロファイルを決定し、試験した全てのシグナル伝達経路がグラフに示される(図6C)。Gαqおよびβアレスチン2は、NT刺激に対する良好な応答を引き起こし、その後、アゴニストモード(図6D、6E)およびアンタゴニストモード(図6F、6G)でニワトリ抗体(IgY−Lin、IgY−3D−1、およびIgY−3D−3)を用いた濃度応答アッセイにおいて試験した。いずれの抗体も、全ての試験されたシグナル伝達経路の活性化に有効であることが示されていない(アゴニストモード)。アンタゴニストモードでは、細胞をNT(EC50)で刺激し、抗体とインキュベートして、Gαqおよびβアレスチン2依存性シグナル伝達を遮断するそれらの能力を評価した。IgY−3D−3は、これらのシグナル伝達経路を遮断することができる唯一の抗体であった。既知のNTS1アンタゴニストSR48692を、陽性対照として使用した。
実施例6:NTSR1特異的組換え抗体および機能特性
3Dペプチド−3で免疫化したニワトリの遺伝物質を使用してファージディスプレイを実施し、scFvライブラリを生成し、関連配列を選択して、ニワトリHisタグ付きscFv(scFv 238)およびヒトIgG由来のFcフラグメントを有するニワトリscFv(scFv−Fc 238)を構築した。scFvのサイズ(約25kDa)を確認するウエスタンブロットを図7Aに示し、ニワトリ抗Hisおよび抗scFvの2つのHRPコンジュゲート抗体を用いて行った。ヒトIgG由来のFcフラグメントを有する第2のニワトリscFvも調製した(scFv−Fc 009、scFv 009の配列については図8Hを参照)。scFv 238はまた、HA−ヒトNTS1を安定して発現するHEK細胞を検出すること(図7B)、およびHCT116およびPANC−1膜調製物上で放射性標識ニューロテンシンを置き換えること(図7Cおよび図7D)ができた。図11Aおよび図11Bに示されるように、scFv−Fc 238およびscFv−Fc 009で同様の結果が得られた。
3Dペプチド−3で免疫化したニワトリの遺伝物質を使用してファージディスプレイを実施し、scFvライブラリを生成し、関連配列を選択して、ニワトリHisタグ付きscFv(scFv 238)およびヒトIgG由来のFcフラグメントを有するニワトリscFv(scFv−Fc 238)を構築した。scFvのサイズ(約25kDa)を確認するウエスタンブロットを図7Aに示し、ニワトリ抗Hisおよび抗scFvの2つのHRPコンジュゲート抗体を用いて行った。ヒトIgG由来のFcフラグメントを有する第2のニワトリscFvも調製した(scFv−Fc 009、scFv 009の配列については図8Hを参照)。scFv 238はまた、HA−ヒトNTS1を安定して発現するHEK細胞を検出すること(図7B)、およびHCT116およびPANC−1膜調製物上で放射性標識ニューロテンシンを置き換えること(図7Cおよび図7D)ができた。図11Aおよび図11Bに示されるように、scFv−Fc 238およびscFv−Fc 009で同様の結果が得られた。
組換え抗体の機能特性を試験するために、増加する量のscFv 238(図7E)およびscFv−Fc 238を使用して、Gq結合NTS1活性化に応答するイノシトールモノホスフェート(IP−One)の蓄積を、濃度応答アッセイにおいて測定した。ヒトNTS1受容体を内因的に発現する結腸直腸癌細胞であるHCT116細胞を、NT(10nM)で刺激し、組換え抗体とインキュベートした。scFv 238およびscFv−Fc 238の両方は、scFv 238およびscFv−Fc 238のそれぞれについて100ng/mLの濃度でのIP−One産生の完全(約%100)または約50%の阻害で、HCT116細胞内のNT誘導性IP−One産生を阻害することができた。ヒトNTS1受容体を発現するヒト膵臓癌細胞であるPANC−1細胞上のscFv 238(図7F)、ならびにscFv−Fc 238および別のscFv−Fc(scFv−Fc 009)(図11Cおよび図11D)で、同様の結果が得られた。scFv 238は、HCT116生細胞においてUDPではなくNT 1−13で、Gαq経路を活性化した後のIP−one産生を阻害することが示され、NTS1に対する抗体の特異性を確認した。
図11Eおよび図11Fに示される結果は、scFv−Fc 238が、HCT116およびPANC−1細胞に対するADCC応答を誘発する能力を有することを示す。したがって、腫瘍細胞内のNT媒介性シグナル伝達を遮断することに加えて、組換え抗体は、腫瘍細胞の死滅を誘導することができる。
図12A〜図12Cに示される結果は、scFv−Fc 238および/またはscFv−Fc 009が、安定してトランスフェクトされたHEK細胞(図12A)、ならびに膀胱癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、および膵臓癌異種移植片を含む異なる起源由来のいくつかの癌患者由来の異種移植片(図12B、図12C)上でのIHCによって、ヒトNTS1を検出することができることを示し、組換え抗体が任意の起源のNTS1発現腫瘍を標的にするのに有用であり得るという証拠を提供する。
本発明は、その特定の実施形態によって上で説明されているが、添付の特許請求の範囲に定義される主題の発明の精神および本質から逸脱することなく修正され得る。特許請求の範囲において、「含む(comprising)」という用語は、「含むがこれらに限定されない」という語句に実質的に等しいオープンエンドの用語として使用される。単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈上別途明確に指示されない限り、対応する複数の参照を含む。
Claims (91)
- ニューロテンシン受容体1型(NTSR1)の細胞外ループに位置する立体構造エピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記細胞外ループがヒトNTSR1(配列番号80)の残基206〜234に対応する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒトニューロテンシン受容体1型(NTSR1)由来のアミノ酸配列NRSADGQHAGG(配列番号83)および/またはラットNTSR1由来のアミノ酸配列NRSGDGTHPGG(配列番号84)に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ポリクローナル抗体である、請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 相補性決定領域(CDR)の以下の組み合わせ:配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)またはSGSGSSWHGYG(配列番号125)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1(CDR−L1)、配列FNDKRPS(配列番号10)またはDNTNRPS(配列番号126)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−L2、配列GSADSTGGI(配列番号11)またはGGYDSSTYAGI(配列番号127)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−L3、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)またはGFTFSSFNMI(配列番号128)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1(CDR−H1)、配列AQIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)またはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−H2、および配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)またはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR−H3を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記CDR−L1が、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)もしくはSGSGSSWHGYG(配列番号125)と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CDR−L2が、配列FNDKRPS(配列番号10)もしくはDNTNRPS(配列番号126)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CDR−L3が、配列GSADSTGGI(配列番号11)もしくはGGYDSSTYAGI(配列番号127)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CDR−H1が、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)もしくはGFTFSSFNMI(配列番号128)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CDR−H2が、配列AQIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)もしくはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記CDR−H3が、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)もしくはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または(vii)(i)〜(vi)の任意の組み合わせである、請求項5に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記CDR−L1が、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)、SGGGSTDASSYYYG(配列番号19)、もしくはSGSGSSWHGYG(配列番号125)を含み、(ii)前記CDR−L2が、配列FNDKRPS(配列番号10)もしくはDNTNRPS(配列番号126)を含み、(iii)前記CDR−L3が、配列GSADSTGGI(配列番号11)もしくはGGYDSSTYAGI(配列番号127)を含み、(iv)前記CDR−H1が、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)、GFTFSSFNRF(配列番号15)、GFTVSSFNMF(配列番号16)、GFTFSSFNMC(配列番号17)、GFTFSSFNMV(配列番号18)、GFTFSGFNMF(配列番号20)、GFTFRSFNMF(配列番号21)、GFTFSRFNMF(配列番号23)、GVTFSSFNMF(配列番号24)、GFTFSSVNMF(配列番号25)、GFTFSSLNMF(配列番号26)、GFTFGSFNMF(配列番号27)、GFTFSSCNMF(配列番号28)、もしくはGFTFSSFNMI(配列番号128)を含み、(v)前記CDR−H2が、配列QIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)、QISDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号22)、QSIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号29)、QMIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号30)、QIIDGAGSRTADGAAVKG(配列番号31)、QIIEGAGSRTAYGAAVKG(配列番号32)、もしくはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)を含み、(vi)前記CDR−H3が、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)もしくはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)を含み、または(vii)(i)〜(vi)の任意の組み合わせである、請求項6に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記CDR−L1が、配列SGGGSTDAGSYYYG(配列番号9)、SGGGSTDASSYYYG(配列番号19)、またはSGSGSSWHGYG(配列番号125)を含み、(ii)前記CDR−L2が、配列FNDKRPS(配列番号10)またはDNTNRPS(配列番号126)を含み、(iii)前記CDR−L3が、配列GSADSTGGI(配列番号11)またはGGYDSSTYAGI(配列番号127)を含み、(iv)前記CDR−H1が、配列GFTFSSFNMF(配列番号12)、GFTFSSFNRF(配列番号15)、GFTVSSFNMF(配列番号16)、GFTFSSFNMC(配列番号17)、GFTFSSFNMV(配列番号18)、GFTFSGFNMF(配列番号20)、GFTFRSFNMF(配列番号21)、GFTFSRFNMF(配列番号23)、GVTFSSFNMF(配列番号24)、GFTFSSVNMF(配列番号25)、GFTFSSLNMF(配列番号26)、GFTFGSFNMF(配列番号27)、GFTFSSCNMF(配列番号28)、またはGFTFSSFNMI(配列番号128)を含み、(v)前記CDR−H2が、配列QIIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号13)、QISDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号22)、QSIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号29)、QMIDGAGSRTAYGAAVKG(配列番号30)、QIIDGAGSRTADGAAVKG(配列番号31)、QIIEGAGSRTAYGAAVKG(配列番号32)、またはASICTGGSYTYYAPAVKG(配列番号129)を含み、(vi)前記CDR−H3が、配列GGHYWGGASIDA(配列番号14)またはSVDGVGWHAGQIDA(配列番号130)を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- IgY抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)もしくはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)1、(ii)配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)もしくはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR2、(iii)配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)もしくはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR3、(iv)配列FGAGTTLTVL(配列番号103)もしくはFGAGTTLTVL(配列番号134)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、請求項9に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記軽鎖FR1が、配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)もしくはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)を含み、(ii)前記軽鎖FR2が、配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)もしくはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)を含み、(iii)前記軽鎖FR3が、配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)もしくはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)を含み、(iv)前記軽鎖FR4が、配列FGAGTTLTVL(配列番号103)もしくはFGAGTTLTVL(配列番号134)を含み、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、請求項10に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記軽鎖FR1が、配列ALTQPTSVSANLGGTVEITC(配列番号100)またはALTQPSSVSANLGGTVKITC(配列番号131)を含み、(ii)前記軽鎖FR2が、配列WFQQKSPGSAPVTVIY(配列番号101)またはWYQQKAPGSAPVTVIY(配列番号132)を含み、(iii)前記軽鎖FR3が、配列DIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFC(配列番号102)またはNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFC(配列番号133)を含み、(iv)前記軽鎖FR4が、配列FGAGTTLTVL(配列番号103)またはFGAGTTLTVL(配列番号134)を含む、請求項10に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)もしくはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKAS(配列番号135)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)もしくはWVRQTPGKGLEWV(配列番号136)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR2、(iii)配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)もしくはRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAK(配列番号137)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR3、(iv)配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)もしくはWGHGTEVIVSS(配列番号138)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、請求項9〜12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記重鎖FR1が、配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)もしくはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKAS(配列番号135)を含み、(ii)前記重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)もしくはWVRQTPGKGLEWV(配列番号136)を含み、(iii)前記重鎖FR3が、配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)を含み、(iv)前記重鎖FR4が、配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)を含み、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、請求項13に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記重鎖FR1が、配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKAS(配列番号104)を含み、(ii)前記重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEFV(配列番号105)を含み、(iii)前記重鎖FR3が、配列RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAR(配列番号106)またはRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAK(配列番号137)を含み、(iv)前記重鎖FR4が、配列WGHGTEVIVSS(配列番号107)またはWGHGTEVIVSS(配列番号138)を含む、請求項14に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ALTQPTSVSANLGGTVEITCSGGGSTDAGSYYYGWFQQKSPGSAPVTVIYFNDKRPSDIPSRFSGSTSGSTNTLTITGVQADDEAVYFCGSADSTGGIFGAGTTLTVL(配列番号108)またはALTQPSSVSANLGGTVKITCSGSGSSWHGYGWYQQKAPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAEDEAVYFCGGYDSSTYAGIFGAGTTLTVL(配列番号139)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖(VL)を含む、請求項9〜15のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記VLが、配列番号108または配列番号139に記載される配列を含む、請求項16に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEFVAQIIDGAGSRTAYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCARGGHYWGGASIDAWGHGTEVIVSS(配列番号109)またはAVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKASGFTFSSFNMIWVRQTPGKGLEWVASICTGGSYTYYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAKSVDGVGWHAGQIDAWGHGTEVIVSS(配列番号140)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖(VH)を含む、請求項9〜17のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記VHが、配列番号109または配列番号140に記載される配列を含む、請求項18に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- IgY抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化形態である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITC(配列番号110)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)1、(ii)配列WYQQKPGQAPVTVIY(配列番号111)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR2、(iii)配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYC(配列番号112)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR3、(iv)配列FGGGTKLTVL(配列番号113)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、請求項20に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記軽鎖FR1が、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITC(配列番号110)を含み、(ii)前記軽鎖FR2が、配列WYQQKPGQAPVTVIY(配列番号111)を含み、(iii)前記軽鎖FR3が、配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYC(配列番号112)を含み、(iv)前記軽鎖FR4が、配列FGGGTKLTVL(配列番号113)を含み、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、請求項21に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記軽鎖FR1が、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITC(配列番号110)を含み、(ii)前記軽鎖FR2が、配列WYQQKPGQAPVTVIY(配列番号111)を含み、(iii)前記軽鎖FR3が、配列GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYC(配列番号112)を含み、(iv)前記軽鎖FR4が、配列FGGGTKLTVL(配列番号113)を含む、請求項22に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、(i)配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号114)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR1、(ii)配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号115)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR2、(iii)配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(配列番号116)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR3、(iv)配列WGQGTLVTVSS(配列番号117)と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖FR4、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせを含む、請求項20〜23のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記重鎖FR1が、配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号114)を含み、(ii)前記重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号115)を含み、(iii)前記重鎖FR3が、配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(配列番号116)を含み、(iv)前記重鎖FR4が、配列WGQGTLVTVSS(配列番号117)を含み、または(v)(i)〜(iv)の任意の組み合わせである、請求項24に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (i)前記重鎖FR1が、配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(配列番号114)を含み、(ii)前記重鎖FR2が、配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号115)を含み、(iii)前記重鎖FR3が、配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(配列番号116)を含み、(iv)前記重鎖FR4が、配列WGQGTLVTVSS(配列番号117)を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGGSTDAGSYYYGWYQQKPGQAPVTVIYFNDKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGSADSTGGIFGGGTKLTVL(配列番号118)またはSSELTQPPAVSVALGQTVRITCSGSGSSWHGYGWYQQKPGQAPVTVIYDNTNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGGYDSSTYAGIFGGGTKLTVL(配列番号141)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖(VL)を含む、請求項20〜26のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記VLが、配列番号118または配列番号141の配列を含む、請求項27に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEWVAQIIDGAGSRTAYGAAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGHYWGGASIDAWGQGTLVTVSS(配列番号119)またはEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFNMIWVRQAPGKGLEWVASICTGGSYTYYAPAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSVDGVGWHAGQIDAWGQGTLVTVSS(配列番号142)と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖(VH)を含む、請求項20〜28のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記VHが、配列番号119または配列番号142の配列を含む、請求項29に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 抗体の抗原結合フラグメントである、請求項1〜30のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗原結合フラグメントが、軽鎖可変領域(VL)、重鎖可変領域(VH)、および前記VLと前記VHとを接続するリンカーを含む一本鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項31に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記リンカーが、約5〜約50個のアミノ酸を含むポリペプチドリンカーである、請求項32に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記ポリペプチドリンカーが、約15〜約20個のアミノ酸を含む、請求項33に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記ポリペプチドリンカーが、約18個のアミノ酸を含む、請求項34に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記ポリペプチドリンカー中の残基の少なくとも25%がグリシン残基である、請求項33〜35のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記リンカーが、ペンタペプチド配列GGGGS(配列番号120)を含む、請求項33〜36のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記ポリペプチドリンカーが、配列GQSSRSSGGGGSSGGGGS(配列番号121)を含む、請求項37に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記リンカーが、前記VHのN末端を前記VLのC末端と接続する、請求項32〜38のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、少なくとも1つの定常ドメインまたはそのフラグメントをさらに含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 抗体の定常重鎖のフラグメント結晶性(Fc)フラグメントを含む、請求項40に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記Fcフラグメントが配列番号79の残基14〜233の配列を含む、請求項41に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記scFvを前記Fcフラグメントに接続するヒンジをさらに含む、請求項40または41に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記ヒンジが配列番号79の残基1〜13の配列を含む、請求項43に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 検出可能な標識または親和性タグにコンジュゲートされる、請求項1〜44のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸または核酸の組み合わせ。
- 請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞。
- 請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、組成物。
- 試料中または細胞上のNTSR1を検出する方法であって、前記細胞を、請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項もしくは48に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 細胞内のNTSR1活性を阻害するための方法であって、前記細胞を、有効量の請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項もしくは48に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 細胞内のニューロテンシンによるNTSR1の活性化を阻害する方法であって、前記細胞を、有効量の請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項もしくは48に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 対象におけるNTSR1活性に関連する疾患または状態を治療するための方法であって、前記対象に、有効量の請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗NTSR1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項もしくは48に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 前記疾患または状態が炎症性腸疾患である、請求項52に記載の方法。
- 前記治療が、大腸炎関連腫瘍形成を発症するリスクを低減する、請求項52または53に記載の方法。
- 前記疾患または状態が代謝性疾患または状態である、請求項52に記載の方法。
- 前記疾患または状態が癌、好ましくは膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、肝臓癌、脳癌、子宮癌、皮膚癌、胃癌、または結腸直腸癌である、請求項52に記載の方法。
- 前記癌が原発性癌である、請求項56に記載の方法。
- 前記癌が転移性または続発性癌である、請求項56に記載の方法。
- 前記癌が難治性癌である、請求項56〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記治療が、前記癌の悪性度および/または転移能を低減するためのものである、請求項56〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、上皮成長因子受容体を発現または過剰発現する、請求項56〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記上皮成長因子受容体が、構成的に活性化された上皮成長因子受容体である、請求項61に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Fcフラグメントを含むscFv(scFV−Fc)である、請求項56〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象に、有効量の追加の化学療法薬を投与することをさらに含む、請求項56〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒト対象である、請求項52〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の配列のドメインを含む環状ペプチドであって、
X1−X2−X3−N−R−S−A−D−G1−X4−H−X5−G2−G3
式中、
「−」は結合、好ましくはペプチド(アミド)結合であり、
X1はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
X2はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
X3はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
X4およびX5は任意のアミノ酸であり、
X3またはNのうちの1つは、G3への結合、好ましくはペプチド結合を介して付着し、それによって環状ペプチドを形成する、環状ペプチド、
あるいはその塩。 - X1が存在する場合、システインである、請求項66に記載の環状ペプチド。
- X2が存在する場合、正荷電残基、好ましくはリジン(K)残基である、請求項66または67に記載の環状ペプチド。
- X3が存在する場合、正荷電残基である、請求項66〜68のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
- 前記正荷電残基が、リジン(K)またはオルニチンである、請求項69に記載の環状ペプチド。
- 前記リジンまたはオルニチンのアミン基が、G3のカルボキシ末端とペプチド結合を形成する、請求項70に記載の環状ペプチド。
- X5がQまたはTである、請求項66〜71のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
- X5がQである、請求項72に記載の環状ペプチド。
- X5がTである、請求項72に記載の環状ペプチド。
- X6がAまたはPである、請求項66〜74のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
- X6がAである、請求項75に記載の環状ペプチド。
- X6がPである、請求項75に記載の環状ペプチド。
- 担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項66〜77のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
- 前記担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)である、請求項78に記載の環状ペプチド。
- 請求項66〜79のいずれか一項に記載の環状ペプチドを含む組成物。
- 担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項80に記載の組成物。
- ワクチンまたは免疫原性組成物である、請求項80または81に記載の組成物。
- 前記ワクチン組成物が、請求項78または79に記載の環状ペプチドを含む、請求項82に記載の組成物。
- ワクチンアジュバントをさらに含む、請求項82または83に記載の組成物。
- 前記ワクチンアジュバントがフロイントアジュバントである、請求項84に記載の組成物。
- 動物におけるNTSR1に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための方法であって、前記動物に、有効量の請求項66〜79のいずれか一項に記載の環状ペプチドまたは請求項80〜85のいずれか一項に記載の組成物を前記動物に投与することを含む、方法。
- 前記動物において産生された前記抗体を採取することをさらに含む、請求項86に記載の方法。
- 採取された前記抗体を精製することをさらに含む、請求項87に記載の方法。
- 前記精製が、前記動物に投与される前記ペプチドを使用して、前記抗体を含む試料を親和性精製ステップに供することを含む、請求項88に記載の方法。
- 前記動物が、ニワトリ(雌鶏)である、請求項86〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項87に記載の前記採取が前記動物によって産生される卵からである、請求項90に記載の方法。
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