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JP2022548320A - アポリポタンパク質ｂ（ａｐｏｂ）遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法 - Google Patents

アポリポタンパク質ｂ（ａｐｏｂ）遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法 Download PDF

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オメガ セラピューティクス， インコーポレイテッド
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Abstract

本発明は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）遺伝子の発現を、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とすることによってモジュレートする（例えば、発現を増強するまたは低減させる）ための作用剤および組成物、ならびに、ＡＰＯＢ関連障害、例えば高コレステロール血症を処置するための、その使用方法を提供する。ＡＰＯＢ遺伝子は、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば哺乳動物体細胞、例えばマウスまたはヒト体細胞などに存在するものであり得る。本発明は、ＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートするため、またはＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートすることが有益であろう対象、例えば、ＡＰＯＢ関連疾患に罹患しているもしくは罹患しやすい対象を処置するために、本発明の作用剤および組成物を使用する方法も提供する。

Description

関連出願との相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１９年９月２３日出願の米国仮出願第６２／９０４，３２５号に対する優先権の利益を主張するものである。
発明の背景
高脂血症は、血液中の任意のまたは全ての脂質またはリポタンパク質のレベルの異常な上昇である。高脂血症の１つである高コレステロール血症は高コレステロールとも称され、血液中に高レベルのコレステロールが存在していることである。高コレステロール血症などの高脂血症は、食事、肥満、遺伝性（遺伝子）疾患（例えば、家族性高コレステロール血症におけるＬＤＬ受容体の変異など）、または２型糖尿病および甲状腺機能低下症などの他の疾患の存在の結果であり得る。
アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）は、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬ粒子の主要なアポリポタンパク質であり、コレステロールを含む脂質を、脂質粒子内で体内を全ての組織内の全ての細胞に輸送することを担う。ＡｐｏＢは前記粒子の主要な組織化タンパク質構成成分であり、これらの粒子の形成に重要である。特に、ＬＤＬ粒子のＡｐｏＢは、全身の種々の細胞におけるＬＤＬ受容体のリガンドとして作用する。ＡｐｏＢの過剰発現試験により、ＡｐｏＢのレベルの上昇により、低βリポ蛋白血症、正常トリグリセリド性低βリポ蛋白血症（ｎｏｒｍｏｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉｃ ｈｙｐｏｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）、および高コレステロール血症、血漿コレステロールに影響を及ぼす疾患が引き起こされる可能性があることが示唆される。
高コレステロール血症自体は無症候性であるが、長期にわたる血清コレステロールの上昇はアテローム性動脈硬化症に至る恐れがあり、これは、そのうちに進行性狭窄症またはさらには関与する動脈の完全閉塞に至る恐れがある。さらに、より小さなプラークが破裂し、血餅の形成が引き起こされ、血流が妨害され、その結果、例えば、心筋梗塞および／または脳卒中が生じる恐れがある。
成人における総血中コレステロールおよびＬＤＬを低下させるための推奨される食事上の措置は、トランス脂肪を回避し、飽和脂肪を多価不飽和脂肪で置き換えることである。しかし、コレステロールが非常に多い（例えば、高コレステロール血症）対象では、食事の改変では所望のＬＤＬの低下には実現に十分でないことも多く、脂質を減少させる薬物適用が通常必要とされる。しかし、多くの対象は脂質を減少させる薬物適用に対する有害反応を有する。
したがって、高コレステロール血症などのＡｐｏＢ関連疾患を処置する組成物および方法が当技術分野において必要とされている。
発明の概要
本発明は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）遺伝子の発現を、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とすることによってモジュレートする（例えば、発現を増強するまたは低減させる）ための作用剤および組成物を提供する。ＡＰＯＢ遺伝子は、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば哺乳動物体細胞、例えばマウスまたはヒト体細胞などに存在するものであり得る。本発明は、ＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートするため、またはＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートすることが有益であろう対象、例えば、ＡＰＯＢ関連疾患に罹患しているもしくは罹患しやすい対象を処置するために、本発明の作用剤および組成物を使用する方法も提供する。
したがって、一態様では、本発明は、部位特異的アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏｌｉｐｏｒｐｏｔｅｉｎ Ｂ）（ＡＰＯＢ）遮断剤を提供する。遮断剤は、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含む。一実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分はポリマー分子を含む。別の実施形態では、ポリマー分子はポリアミドを含む。さらに別の実施形態では、ポリマー分子はポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、発現制御領域はＡＰＯＢ関連アンカー配列を含む。別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連アンカー配列はＣＣＣＴＣ結合性因子（ＣＴＣＦ）結合性モチーフを含む。さらに別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連ＣＴＣＦ結合性モチーフはＡＰＯＢ ＣＴＣＦ部位３のヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態では、発現制御領域はＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続を含む。別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続は１つまたは複数の転写制御エレメントを接続の内側に含む。さらに別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続は１つまたは複数の転写制御エレメントを接続の外側に含む。
さらに別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連アンカー配列は転写制御エレメントに対して約３００ｋｂ以内に位置する。別の実施形態では、アンカー配列は転写制御エレメントに対して１０ｋｂ以内に位置する。
さらに別の実施形態では、発現制御領域はＡＰＯＢ特異的転写制御エレメントを含む。別の実施形態では、転写制御エレメントはＡＰＯＢプロモーターを含む。さらに別の実施形態では、転写制御エレメントは転写エンハンサーを含む。さらに別の実施形態では、転写制御エレメントは転写リプレッサーを含む。
一実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤は表２のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列全体に対して少なくとも８５％のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤はＡＰＯＢ発現制御領域に特異的に結合するジンクフィンガーポリペプチド（ＺＮＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む。
さらに別の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤はヌクレオチド修飾を含む。
さらに別の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤はペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
一態様では、本発明は、任意の態様および種々の実施形態の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を含むベクターを提供する。一実施形態では、ベクターはウイルス発現ベクターである。
別の態様では、本発明は、任意の態様および種々の実施形態の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤またはベクター（ｖａｃｔｏｒ）を含む細胞を提供する。
一実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤は組成物中に存在する。別の実施形態では、組成物は医薬組成物を含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は脂質製剤を含む。さらに別の実施形態では、脂質製剤は１つまたは複数のカチオン性脂質、１つまたは複数の非カチオン性脂質、１つまたは複数のコレステロールに基づく脂質、または１つまたは複数のＰＥＧ修飾された脂質、または前記のいずれかの組合せを含む。一実施形態では、医薬組成物は脂質ナノ粒子を含む。
一態様では、本発明は、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を提供する。遮断剤はＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分とエフェクター分子とを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。一実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分はＡＰＯＢ発現制御領域に特異的に結合するジンクフィンガーポリペプチド（ＺＮＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、エフェクター分子はポリペプチドをコードする核酸分子を含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質はペプチド核酸融合物を含む。
一実施形態では、エフェクターはヌクレアーゼ、物理的遮断因子、エピジェネティック動員因子、およびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子、および前記のいずれかの組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、エフェクターはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドまたはＣａｓポリペプチドをコードする核酸分子を含む。さらに別の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドである。さらに別の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤はヒトエキソヌクレアーゼ１（ｈＥＸＯ１）の触媒として活性なドメインをさらに含む。一実施形態では、エピジェネティック動員因子は転写エンハンサーまたは転写リプレッサーを含む。別の実施形態では、エピジェネティックＣｐＧ修飾因子はＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン修飾剤、またはヒストン脱アセチル化酵素を含む。
一実施形態では、エフェクター分子はジンクフィンガーポリペプチドを含む。別の実施形態では、エフェクター分子は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドを含む。
一態様では、本発明は、ベクターを提供する。ベクターは本発明の態様および種々の実施形態のいずれかの部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤をコードする核酸分子を含む。一実施形態では、ベクターはウイルス発現ベクターである。
別の態様では、本発明は、本発明の任意の態様および種々の実施形態の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤またはベクターを含む細胞を提供する。
一実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤は組成物中に存在する。別の実施形態では、組成物は医薬組成物を含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は脂質製剤を含む。さらに別の実施形態では、脂質製剤は１つまたは複数のカチオン性脂質、１つまたは複数の非カチオン性脂質、１つまたは複数のコレステロールに基づく脂質、または１つまたは複数のＰＥＧ修飾された脂質、または前記のいずれかの組合せを含む。一実施形態では、医薬組成物は脂質ナノ粒子を含む。
一態様では、本発明は、細胞におけるアポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）の発現をモジュレートする方法を提供する。当該方法は、細胞を、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分およびエフェクター分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤と接触させるステップを含み、それにより、細胞におけるＡＰＯＢの発現をモジュレートする。一実施形態では、発現のモジュレーションは細胞におけるＡＰＯＢの発現の増強である。別の実施形態では、発現のモジュレーションは細胞におけるＡＰＯＢの発現の低減である。さらに別の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分はポリマー分子を含む。さらに別の実施形態では、ポリマー分子はポリアミドを含む。一実施形態では、ポリマー分子はポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、発現制御領域はＡＰＯＢ関連アンカー配列を含む。別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連アンカー配列はＣＣＣＴＣ結合性因子（ＣＴＣＦ）結合性モチーフを含む。なお別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連ＣＴＣＦ結合性モチーフはＡＰＯＢ ＣＴＣＦ部位３のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、発現制御領域はＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続を含む。別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続は１つまたは複数の転写制御エレメントを接続の内側に含む。さらに別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続は１つまたは複数の転写制御エレメントを接続の外側に含む。
一実施形態では、アンカー配列は転写制御エレメントに対して約３００ｋｂ以内に位置する。別の実施形態では、アンカー配列は転写制御エレメントに対して１０ｋｂ以内に位置する。
別の実施形態では、発現制御領域はＡＰＯＢ特異的転写エレメントを含む。一実施形態では、転写エレメントはＡＰＯＢプロモーターを含む。別の実施形態では、転写制御エレメントは転写エンハンサーを含む。さらに別の実施形態では、転写制御エレメントは転写リプレッサーを含む。
さらに別の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤は表２のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列全体に対して少なくとも８５％のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
さらに別の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤はＡＰＯＢ発現制御領域に特異的に結合するジンクフィンガーポリペプチド（ＺＮＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤はヌクレオチド修飾を含む。
別の実施形態では、ポリマー分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
さらに別の実施形態では、エフェクター分子はポリペプチドを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ＡＰＯＢ発現調節領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分とエフェクター分子とを含む融合タンパク質を含む。別の実施形態では、融合タンパク質はペプチド核酸融合分子を含む。
さらに別の実施形態では、エフェクターはヌクレアーゼ、物理的遮断因子、エピジェネティック動員因子、およびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子、および前記のいずれかの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、エフェクターはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドまたはＣａｓポリペプチドをコードする核酸分子を含む。別の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドである。さらに別の実施形態では、エフェクター分子はヒトエキソヌクレアーゼ１（ｈＥＸＯ１）の触媒として活性なドメインをさらに含む。さらに別の実施形態では、エピジェネティック動員因子は転写エンハンサーまたは転写リプレッサーを含む。一実施形態では、エピジェネティックＣｐＧ修飾因子はＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン修飾剤、またはヒストン脱アセチル化酵素を含む。
一実施形態では、エフェクター分子はジンクフィンガーポリペプチドを含む。別の実施形態では、エフェクター分子は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドを含む。
別の実施形態では、融合タンパク質は酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドおよびエピジェネティック動員因子ポリペプチドを含む。一実施形態では、融合タンパク質は酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドおよびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子ポリペプチドを含む。
一実施形態では、部位特異的遮断剤、エフェクター、または部位特異的遮断剤とエフェクターの両方がベクター内に存在する。別の実施形態では、部位特異的遮断剤とエフェクターは同じベクター内に存在する。さらに別の実施形態では、部位特異的遮断剤とエフェクターは異なるベクター内に存在する。さらに別の実施形態では、ベクターはウイルス発現ベクターである。
別の実施形態では、部位特異的遮断剤、エフェクター、または部位特異的遮断剤とエフェクターの両方が組成物中に存在する。一実施形態では、部位特異的遮断剤とエフェクターは同じ組成物中に存在する。別の実施形態では、部位特異的遮断剤とエフェクターは異なる組成物中に存在する。さらに別の実施形態では、組成物は医薬組成物を含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は脂質製剤を含む。一実施形態では、脂質製剤は１つまたは複数のカチオン性脂質、１つまたは複数の非カチオン性脂質、１つまたは複数のコレステロールに基づく脂質、または１つまたは複数のＰＥＧ修飾された脂質、または前記のいずれかの組合せを含む。別の実施形態では、医薬組成物は脂質ナノ粒子を含む。
一態様では、細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は体細胞である。別の実施形態では、哺乳動物細胞は初代細胞である。
一実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。別の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで実施される。さらに別の実施形態では、接触させるステップは、ｅｘ ｖｉｖｏで実施される。さらに別の実施形態では、方法は、細胞を対象に投与するステップをさらに含む。一実施形態では、細胞は対象内に存在する。別の実施形態では、対象は、ＡＰＯＢ関連疾患を有する。さらに別の実施形態では、ＡＰＯＢ関連疾患は、高脂血症、高コレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症、インスリンに対する免疫応答に関連しないインスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧症、内皮細胞機能障害、心疾患、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
一態様では、本発明は、ＡＰＯＢ関連疾患を有する対象を処置するための方法であって、対象に、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分およびエフェクター分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を治療有効量で投与するステップを含み、それにより、対象を処置する、方法を提供する。一実施形態では、ＡＰＯＢ関連疾患は高コレステロール血症であり、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤は対象におけるＡＰＯＢの発現を低減するものである。別の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤およびエフェクター分子は、対象に併せて投与される。さらに別の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤およびエフェクター分子は、対象に逐次的に投与される。さらに別の実施形態では、エフェクター分子は、対象に、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤の投与の前に投与される。一実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤は、対象に、エフェクター分子の投与の前に投与される。
図１は、ＡＰＯＢ遺伝子の上流領域およびコード領域の一部ならびにＡＰＯＢ遺伝子の種々の調節エレメントの位置、例えばＣＴＣＦ部位３を示すＡＰＯＢゲノム近傍を示す。
図２は、ＡＰＯＢ遺伝子のＣＴＣＦ部位３の場所および本明細書に記載のガイドＲＮＡの相対的な位置を概略的に示す。
図３Ａは、Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定した、ＰＭＨ細胞における、示されている部位特異的標的化成分およびＣａｓ９を含むエフェクター分子を含むＡＰＯＢ遮断剤を示されている濃度で細胞と接触させた７２時間後の編集のパーセンテージを示すグラフである。
図３Ｂは、図３Ａに記載されているＴ７Ｅ１アッセイの結果を示す電気泳動ゲルの画像である。陰性結果、すなわち、ゲル上にＤＮＡバンドが存在しないことにより、対応する細胞のゲノムＤＮＡがＣａｓ９によって破壊されたことが示される。
図３Ｃは、ＰＭＨ細胞における、示されている部位特異的標的化成分（すなわち、ｓｇＲＮＡ）およびＣａｓ９を含むエフェクター分子を含むＡＰＯＢ遮断剤を示されている濃度で細胞と接触させた７２時間後の生産的編集のパーセンテージを示すグラフである。「生産的編集」は、ＡｐｏＢ発現制御領域の機能的変化、例えば、ＣＴＣＦ３部位のＤＮＡトポロジカル立体配置、例えばループを形成する能力の喪失をもたらすＣａｓ９誘導ゲノム編集を指す。
図３Ｄは、ＰＭＨ細胞における、示されている部位特異的標的化成分およびＣａｓ９を含むエフェクター分子を含むＡＰＯＢ遮断剤を示されている濃度で細胞と接触させた７２時間後の生産的編集の比を示すグラフである。
図４Ａ～４Ｄは、部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分（すなわち、ｓｇＲＮＡ）とＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せにより、ＡＰＯＢ ｍＲＮＡレベルが低下したことを実証するグラフである。２種のｓｇＲＮＡ、ＧＤ－２６９１１およびＧＤ－２６９１２では、５μｇ／ｍｌの濃度のｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せでＡｐｏＢ発現が５０％よりも大きく低減した。グラフは、示されているｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９を含むエフェクターを細胞と接触させた７２時間後のＡＰＯＢ ｍＲＮＡレベルを示す。結果は３連の実験からのものである。ＡＰＯＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｐｏＢ）のレベルはＮＴＸ対照に対するものである。ｓｇＲＮＡ処理群におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルを非標的化ガイドＲＮＡ製剤（ＧＤ－２３１５０群）（非標的対照）に対してグラフ化する。ＮＴＸ ＣＴＬは無処理群を示し、ＮＴＸ ＣＴＬにおけるＡｐｏＢレベルはベースラインＰＭＨを示す。ＧＤ－２３１５０群は、非標的化ｓｇＲＮＡを含有するＬＮＰで処理したＰＭＨを示す。ｓｉＲＮＡ群は、ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰで処理した群を示す。相対的なＡｐｏＢレベルをＬＮＰ処理における全ＲＮＡ濃度（すなわち、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せ）に対してグラフ化した。ＮＴＸ ＣＴＬ：無処理対照；ＮＴＣ：非標的対照。 図４Ａおよび４Ｂは、ＮＴＣと比較した相対的なＡＰＯＢ ｍＲＮＡレベルを示す。図４Ａは、ウェル内の結果を示すグラフである。試料のそれぞれのウェル内でのアクチンに対する個々のＡＰＯＢの結果を使用してデルタサイクル閾値（ｄＣＴ値）を算出した。図４Ｂは、プレート間にわたる結果を示すグラフである。各希釈点での全ての試料におけるアクチンの平均に対する個々のＡＰＯＢの結果を使用してｄＣＴ値を算出した。 図４Ｃおよび４Ｄは、正規化されたｍＲＮＡインプットを用いたＮＴＣと比較した相対的なＡＰＯＢ ｍＲＮＡレベルを示す。ＰＭＨ試料からの群にわたって同量の全ＲＮＡをｑＰＣＲ解析に使用した。図４Ｃは、ウェル内の結果を示すグラフである。試料のそれぞれのウェル内でのアクチンに対する個々のＡＰＯＢの結果を使用してｄＣＴ値を算出した。図４Ｄは、プレート間にわたる結果を示すグラフである。全ての試料におけるアクチンの平均に対する個々のＡＰＯＢの結果を使用してｄＣＴ値を算出した。
同上。
同上。 同上。
図４Ｅおよび４Ｆは、示されているｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せをトランスフェクトした細胞におけるＡＰＯＢ ｍＲＮＡレベルを示す。図４Ｅおよび４Ｆでは、５μｇ／ｍｌの全ＲＮＡ、すなわち、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せを細胞にトランスフェクトした。さらに、ＡＰＯＢ遺伝子のエクソンを標的とするｓｇＲＮＡ、ＧＤ－２７７２３を陽性対照として使用し、一方、無関係の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ、ＧＤ－２３１４９を陰性対照として使用した。
図５Ａおよび５Ｂは、ＡｐｏＢタンパク質の発現レベルを示すグラフである。図５Ａは、示されているｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せをトランスフェクトした培養細胞の上清中のＡｐｏＢのタンパク質濃度を示す。図５Ｂは、示されているｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せによって誘導されたタンパク質レベルの低下のパーセンテージを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）遺伝子の発現を、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とすることによってモジュレートする（例えば、発現を増強するまたは低減させる）ための作用剤および組成物を提供する。ＡＰＯＢ遺伝子は、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば哺乳動物体細胞、例えばマウスまたはヒト体細胞などに存在するものであり得る。本発明は、ＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートするため、またはＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートすることが有益であろう対象、例えば、ＡＰＯＢ関連疾患に罹患しているまたは罹患しやすい対象を処置するために、本発明の作用剤および組成物を使用する方法も提供する。
本発明の作用剤は、本明細書では、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤と称され、下の第ＩＩ節に記載されている。
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解することができるように、最初に特定の用語を定義する。さらに、パラメータの値または値の範囲が記載されている場合は常に、値および記載されている値の中間の範囲も本発明の一部であることが意図されていることに留意するべきである。
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、本明細書では、１つ、または１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）のその冠詞の文法上の目的語を指すように使用される。例として、「１つの（ａｎ）エレメント」は、１つのエレメントまたは１つよりも多くのエレメント、例えば複数のエレメントを意味する。
「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、本明細書では、「を含むがこれだけに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」という句を意味するように使用され、それと互換的に使用される。「または（ｏｒ）」という用語は、本明細書では、文脈によりそうでないことが明らかでない限り、「および／または」という用語を意味するように使用され、それと互換的に使用される。
「約」という用語は、本明細書では、当技術分野における典型的な許容範囲内に入ることを意味するように使用される。例えば、「約」は、平均から約２標準偏差と理解することができる。ある特定の実施形態では、約は±１０％を意味する。ある特定の実施形態では、約は±５％を意味する。約が数の一続きまたは範囲の前にある場合、「約」はその一続きまたは範囲内の数のそれぞれを変更し得る（ｃａｎ ｍｏｄｉｆｙ）ことが理解される。
数または数の一続きの前の「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語の隣の数、および、文脈から明らかになる通り論理的に含まれ得るその後の数または整数の全てを包含するものと理解される。例えば、核酸分子内のヌクレオチドの数は整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチドの核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、または２１ヌクレオチドが示されている特性を有することを意味する。少なくともが数の一続きまたは範囲の前にある場合、「少なくとも」はその一続きまたは範囲内の数のそれぞれを変更し得ることが理解される。
本明細書で使用される場合、「以下（ｎｏ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）」または「未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）」は、その句の隣の値、および、文脈から論理的である場合、ゼロまでの論理的なより小さい値または整数と理解される。「以下（ｎｏ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）」が数の一続きまたは範囲の前にある場合、「以下（ｎｏ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）」はその一続きまたは範囲内の数のそれぞれを変更し得ることが理解される。
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全程度もしくは度合いまたはほぼ全程度もしくは度合いを示す定性的な状態を指す。生物学的現象および化学的現象は、たとえあったとしても、完了することおよび／もしくは完全に進行すること、あるいは絶対的結果を達成するまたは回避することが、めったにないことが当業者には理解されよう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書の一部の実施形態では、多くの生物学的現象および化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「アポリポタンパク質Ｂ」または「ＡＰＯＢ」という用語は、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬ粒子の周知のアポリポタンパク質をコードする遺伝子を指す。コードされるタンパク質は前記粒子の主要な組織化タンパク質構成成分であり、これらの粒子の形成のために重要である。ＬＤＬ粒子のＡＰＯＢは全身の種々の細胞におけるＬＤＬ受容体のリガンドとしても作用する。高レベルのＡＰＯＢは心疾患に関連する。低βリポ蛋白血症は、ＡＰＯＢ遺伝子、ＡＰＯＢの変異によって引き起こされ得る遺伝障害である。遺伝子ＡＰＯＢ１００の変異では代謝障害である高コレステロール血症の遺伝性（常染色体優性）形態である家族性高コレステロール血症も引き起こされ得る。アポリポタンパク質Ｂの過剰産生の結果、肝臓における脂質誘導性小胞体ストレスおよびインスリン抵抗性が生じ得る。ＡＰＯＢのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は公知であり、例えば、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００９６９３、ＸＭ＿００１０００６４６、ＸＭ＿００１００００６５９、ＸＭ＿００１０００６６７、ＸＭ＿１３７９５５、ＸＭ＿８９４９８１、ＸＭ－９０６７５９、ＮＰ＿０３３８２３．２、ＸＰ＿００１０００６４６、ＸＰ＿００１０００６５９、ＸＰ＿００１０００６６７、ＸＰ＿１３７９５５、ＸＰ＿９０００７４、ＸＰ＿９１１８５２、ＮＭ＿０００３８４．３、ＮＰ＿０００３７５．３に見いだすことができる。ＡＰＯＢの内因性プロモーターおよびＡＰＯＢコード配列を含む、ヒトにおける２番染色体またはマウスにおける１２番染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列も公知であり、マウス－ｍｍ１０ ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ：ｃｈｒ１２：７９６８１１０－８０２３１５０、ヒト－ｈｇ１９ ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ：ｃｈｒ２：２１１６０３３３－２１３３０９１０に見いだすことができる。
「部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤」という用語は、本明細書で使用される場合、標的ＡＰＯＢ発現制御領域に特異的に結合し、例えば、ＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートする任意の作用剤を指す。本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤は、「部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分」を含み得る。
本明細書で使用される場合、「部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分」という用語は、ＡＰＯＢ発現制御領域、例えば、ＡＰＯＢ遺伝子の転写制御領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくはリプレッサー；またはＡＰＯＢ関連アンカー配列、例えば、ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続内にあるものなどに特異的に結合する成分を指す。例示的な「部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分」としては、これだけに限定されないが、ポリアミド、核酸分子、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡ、ポリペプチド、タンパク質核酸分子、および融合タンパク質が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、結合が生じる環境において、可能性のある結合パートナーを識別できることを指す。一部の実施形態では、他の潜在的な遮断剤が存在する場合に１つの特定の標的と相互作用する、例えば優先的に相互作用する遮断剤は、それが相互作用する標的（すなわち、発現制御領域）に「特異的に結合する」といえる。一部の実施形態では、遮断剤とその標的の会合の度合いを検出または決定することによって特異的結合を評価する。一部の実施形態では、遮断剤－標的複合体の解離の度合いを検出または決定することによって特異的結合を評価する。一部の実施形態では、遮断剤の、その標的と別の実体との間の代替的相互作用と競合する能力を検出または決定することによって特異的結合を評価する。一部の実施形態では、そのような検出または決定を様々な濃度にわたって実施することによって特異的結合を評価する。
本明細書で使用される場合、「発現制御領域」または「発現制御ドメイン」という用語は、細胞内の標的遺伝子の発現をモジュレートする、ゲノムＤＮＡ内に存在する領域またはドメインを指す。発現制御領域に関連する機能性は、例えば、標的遺伝子の発現を刺激する転写因子を動員することまたは動員を遮断することにより、標的遺伝子の発現に直接影響を及ぼし得る。発現制御領域に関連する機能性は、例えば、エピジェネティック修飾を導入することにより、または標的遺伝子の発現をモジュレートする染色体トポロジーの変化を誘導するエピジェネティック修飾を導入する他の因子を動員することにより、標的遺伝子の発現に間接的に影響を及ぼし得る。発現制御領域は、遺伝子のタンパク質コード配列の上流および／または下流であり得、例えば、転写制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー；ならびにアンカー配列、およびアンカー配列媒介性接続を含む。
「転写制御エレメント」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子の転写を制御する核酸配列を指す。転写制御エレメントとしては、例えば、アンカー配列、アンカー配列媒介性接続、プロモーター、転写エンハンサー、および転写リプレッサーが挙げられる。
プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＤＮＡの領域であり、一般に、遺伝子の転写開始部位の５’末端の上流に位置する。
「転写エンハンサー」は遺伝子転写を増加させるものである。「転写サイレンサー」または「転写リプレッサー」は遺伝子転写を低減するものである。強化配列およびサイレンシング配列は、約５０～３５００塩基対の長さであり得、最大約１メガ塩基離れた遺伝子転写に影響を及ぼし得る。
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、機能を有するタンパク質などの分子をコードするヌクレオチドの配列を指す。遺伝子は、転写される配列（例えば、３’ＵＴＲ）、転写されない配列（例えば、プロモーター）、翻訳される配列（例えば、エクソン）、および翻訳されない配列（例えば、イントロン）を含有する。
本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」という用語は、発現のモジュレーション、例えば、増大または低減の標的とされるＡＰＯＢ遺伝子を意味する。一部の実施形態では、ＡＰＯＢ標的遺伝子は標的とされるゲノム複合体の一部（例えば、そのゲノム配列の少なくとも一部を標的ゲノム複合体の一部として、例えばアンカー配列媒介性接続の内側に有するＡＰＯＢ遺伝子）であり、ゲノム複合体は本明細書に記載の１つまたは複数の部位特異的遮断剤の標的とされる。一部の実施形態では、モジュレーションは、標的遺伝子の発現の阻害を含む。一部の実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子またはＡＰＯＢ遺伝子に作動可能に連結した転写制御エレメントを本明細書に記載の１つまたは複数の部位特異的遮断剤と接触させることにより、ＡＰＯＢ遺伝子をモジュレートする。一部の実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子を細胞、例えば、対象（例えば、ＡＰＯＢ関連疾患を有する対象）内の細胞において異常に発現（例えば、過剰発現）させる。一部の実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子を細胞、例えば、対象（例えば、ＡＰＯＢ関連疾患を有する対象）内の細胞において異常に発現（例えば、過少発現）させる。
「アンカー配列」という用語は、本明細書で使用される場合、アンカー配列媒介性接続、例えば複合体が形成されるように十分に結合する核形成剤（ｎｕｃｌｅａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって認識される核酸配列を指す。一部の実施形態では、アンカー配列は１つまたは複数のＣＴＣＦ結合性モチーフを含む。一部の実施形態では、アンカー配列は遺伝子コード領域内には位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は遺伝子間領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列はエンハンサー内にもプロモーター内にも位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は任意の転写開始部位から少なくとも４００ｂｐ、少なくとも４５０ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも５５０ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも６５０ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８５０ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも９５０ｂｐ、または少なくとも１ｋｂ離れたところに位置する。一部の実施形態では、アンカー配列はゲノム刷り込み、単一対立遺伝子発現、および／または単一対立遺伝子エピジェネティックマークに関連しない領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は内因性の核形成ポリペプチド（例えば、ＣＴＣＦ）に結合すること、第２のアンカー配列と相互作用してアンカー配列媒介性接続を形成すること、またはアンカー配列媒介性接続の外側にあるエンハンサーに対して遮断することから選択される１つまたは複数の機能を有する。本発明の一部の実施形態では、特定のアンカー配列（１つまたは複数）を特異的に標的とし、他のアンカー配列（例えば、異なる状況にある核形成剤（例えば、ＣＴＣＦ）結合性モチーフを含有し得る配列）は標的としないようにできる技術が提供される；そのような標的とされるアンカー配列は「標的アンカー配列」と称することができる。一部の実施形態では、標的アンカー配列の配列および／または活性をモジュレートし、一方、他の標的とされるアンカー配列と同じ系（例えば、同じ細胞および／または一部の実施形態では、同じ核酸分子、例えば同じ染色体）に存在し得る１つまたは複数の他のアンカー配列の配列および／または活性はモジュレートしない。一部の実施形態では、アンカー配列は核形成ポリペプチド結合性モチーフを含む、または核形成ポリペプチド結合性モチーフである。一部の実施形態では、アンカー配列は核形成ポリペプチド結合性モチーフに隣接している。
「アンカー配列媒介性接続」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ内の少なくとも２つのアンカー配列と、アンカー配列に結合して、アンカー配列間の空間的近傍および機能的連結を可能にする核形成ポリペプチドなどの１つもしくは複数のポリペプチド、もしくは１つもしくは複数のタンパク質および／または核酸実体（例えばＲＮＡもしくはＤＮＡなど）との物理的な相互作用または結合によって生じ、かつ／または維持されるＤＮＡ構造、一部の場合では、複合体を指す。
本明細書で使用される場合、「ゲノム複合体」という用語は、１つまたは複数の染色体上の互いから間隔があいている２つのゲノム配列エレメントを、複数のタンパク質および／または他の構成成分（ゲノム配列エレメントを潜在的に含む）の間およびその中での相互作用を介して一緒にする複合体である。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、複合体の１つまたは複数のタンパク質構成成分が結合するアンカー配列である。一部の実施形態では、ゲノム複合体は、アンカー配列媒介性接続を含み得る。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、ＣＴＣＦ結合性モチーフ、プロモーターおよび／またはエンハンサーであり得る、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、プロモーターおよび／または調節領域（例えば、エンハンサー）のうちの少なくとも一方または両方を含む。一部の実施形態では、複合体の形成は、ゲノム配列エレメント（複数可）において、および／またはタンパク質構成成分の１つまたは複数がゲノム配列エレメント（複数可）と結合することによってその核が形成される。当業者には理解される通り、一部の実施形態では、複合体の形成を介したゲノム部位の共局在（例えば、接続）により、ゲノム配列エレメント（複数可）またはその付近、一部の実施形態ではそれらの間を含むところでＤＮＡトポロジーが変更される。一部の実施形態では、ゲノム複合体はアンカー配列媒介性接続を含み、アンカー配列媒介性接続は１つまたは複数のループを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、例えばＣＴＣＦおよび／またはコヒーシンなどの核形成ポリペプチドによって核が形成される。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、例えば、ＣＴＣＦ、コヒーシン、非コードＲＮＡ（例えば、ｅＲＮＡ）、転写機構タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、１つまたは複数の転写因子、例えば、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨなどからなる群から選択されるもの）、転写調節因子（例えば、メディエーター、Ｐ３００、エンハンサー結合性タンパク質、リプレッサー結合性タンパク質、ヒストン修飾因子など）などのうちの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、１つまたは複数のポリペプチドである構成成分および／または１つまたは複数の核酸である構成成分（例えば、１つまたは複数のＲＮＡである構成成分）を含み、これらは、一部の実施形態では、互いにおよび／または１つもしくは複数のゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモーター配列、調節配列（例えば、エンハンサー配列））と相互作用して、複合体が形成されない場合にひと続きのゲノムＤＮＡが採用しないトポロジカル立体配置（例えばループ）にひと続きのゲノムＤＮＡを制約し得る。
「エフェクター分子」は、本明細書で使用される場合、酵素活性、遺伝子発現、アンカー配列媒介性接続または細胞シグナル伝達などの生物活性を調節することができる分子を指す。例示的なエフェクターは以下の第ＩＩ節に記載されており、また、一部の実施形態では、それらとして、例えば、ヌクレアーゼ、物理的遮断因子、エピジェネティック動員因子、例えば、転写エンハンサーまたは転写リプレッサー、およびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子、例えば、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン修飾剤、またはヒストン脱アセチル化酵素、ならびに前記のいずれかの組合せが挙げられる。
ＩＩ．本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤
本発明は、本発明の一態様ではＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を提供する。別の態様では、本発明の部位特異的遮断剤は、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分およびエフェクター分子を含む。当業者には理解されるように、そのような遮断剤は、部位特異的であり、したがって、例えば細胞内のＡＰＯＢ発現制御領域（例えば、１つまたは複数の転写制御エレメントおよび／または１つまたは複数の標的アンカー配列）に特異的に結合し、標的とされない発現制御領域（例えば、同じ細胞内の）には結合しない。
本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤は、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む。部位特異的標的化成分によって標的とされる発現制御領域は、例えば、転写制御エレメント、またはアンカー媒介性接続内のアンカー配列などのアンカー配列であり得る。
したがって、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤により、遺伝子、すなわちＡＰＯＢの発現を、例えば、内因性プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサーからの遺伝子の発現をモジュレートすることによってモジュレートすることができる、制御領域のメチル化を変更することができる、少なくとも１つのアンカー配列を変更することができる；少なくとも１つの接続核形成分子結合部位（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｎｕｃｌｅａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を、例えば、接続核形成分子に対する結合親和性を変更することによって変更することができる；ＣＴＣＦ結合性モチーフなどの少なくとも１つの共通のヌクレオチド配列の配向を、例えば、ＣＴＣＦ結合性モチーフなどの少なくとも１つのアンカー配列内の置換、付加または欠失によって変更することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的遮断剤および組成物は、細胞における発現をモジュレートするために、１つまたは複数のＡＰＯＢ特異的転写制御エレメントを含む発現制御領域を標的とする。標的とすることができるＡＰＯＢ特異的転写制御エレメントとしては、ＡＰＯＢ特異的プロモーター、ＡＰＯＢ特異的エンハンサー、ＡＰＯＢ特異的リプレッサー、およびＡＰＯＢ関連アンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ部位が挙げられる。一実施形態では、ＡＰＯＢ関連ＣＴＣＦ部位は、肝臓の細胞における発現を調節するもの、例えば、ＣＴＣＦ部位３である。ＡＰＯＢ ＣＴＣＦ部位３のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ９６１５１に見いだすことができる。
例えば、部位特異的遮断剤は、部位特異的標的化成分、例えば、核酸分子、例えばＡＰＯＢ内因性ＣＴＣＦ部位、例えばＣＴＣＦ部位３を標的とするガイドＲＮＡなど、および、エフェクター分子、例えば、内因性プロモーターからの標的遺伝子の発現をモジュレート、例えば、増強または抑止して遺伝子発現をモジュレートする転写エンハンサーまたは転写リプレッサーを含むエフェクター分子などを含み得る。
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的遮断剤および組成物は、２次元クロマチン構造を変更するために、１つまたは複数のＡＰＯＢ関連アンカー配列を含む、例えば、アンカー配列媒介性接続内に第１のＡＰＯＢ関連アンカー配列および第２のＡＰＯＢ関連アンカー配列を含む発現制御領域を標的とする（例えば、例えばＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡにおけるアンカー配列媒介性接続を改変することにより、細胞、例えば対象内の細胞における発現をモジュレートするためにアンカー配列媒介性接続）。
一態様では、本発明は、アンカー配列媒介性接続内に１つまたは複数のＡＰＯＢ関連アンカー配列を含むＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を含む。遮断剤は、特定のアンカー配列媒介性接続に結合、例えば、特異的に結合して、アンカー配列媒介性接続、例えば、接続核形成分子が結合した２つまたはそれよりも多くのＤＮＡ遺伝子座の物理的な相互作用を有するアンカー配列媒介性接続のトポロジーを変更する。
アンカー配列媒介性接続の形成により、転写制御エレメントがＡＰＯＢ遺伝子と相互作用するように強制され得る、または転写制御エレメントの活性が空間的に制約され得る。したがって、アンカー配列媒介性接続を変更することにより、モジュレートされるＡＰＯＢ遺伝子のコード配列を変更せずにＡＰＯＢ発現をモジュレートすることが可能になる。
一部の実施形態では、本発明の部位特異的遮断剤および組成物により、アンカー配列媒介性接続に関連するＡＰＯＢ遺伝子の発現を、１つまたは複数のアンカー配列と接続核形成分子の間に物理的に干渉することによってモジュレートする。例えば、ＤＮＡ結合性小分子（例えば、副溝もしくは主溝結合物質）、ペプチド（例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、新規もしくは修飾されたペプチド）、タンパク質（例えば、ＣＴＣＦ、ＣＴＣＦ結合性および／もしくは凝集結合親和性が損なわれた修飾されたＣＴＣＦ）、または核酸（例えば、ｓｓＤＮＡ、修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロックド核酸、架橋型核酸、ポリアミド、および／または三重鎖形成性オリゴヌクレオチド）により、接続核形成分子が１つまたは複数のアンカー配列と相互作用することを物理的に妨げて、ＡＰＯＢ遺伝子発現をモジュレートすることができる。
一部の実施形態では、本発明の部位特異的遮断剤および組成物により、アンカー配列媒介性接続に関連するＡＰＯＢ遺伝子の発現を、アンカー配列の修飾、例えばエピジェネティック修飾、例えばヒストンタンパク質の修飾、またはゲノム編集（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ）の改変によってモジュレートする。例えば、ＡＰＯＢ遺伝子を含むアンカー配列媒介性接続に関連する１つまたは複数のアンカー配列をゲノム編集、例えばＣａｓ９媒介性ゲノム編集の標的とすることができる。
一部の実施形態では、本発明の部位特異的遮断剤および組成物により、アンカー配列媒介性接続に関連するＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートする、例えば、転写を活性化または抑止する、例えば、クロマチンまたはゲノム編集に対するエピジェネティック変化を誘導する。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、１つまたは複数のアンカー配列、ＡＰＯＢ遺伝子、および強化エレメントまたはサイレンシングエレメントなどの１つまたは複数の転写制御エレメントを含む。一部の実施形態では、転写制御エレメントはアンカー配列媒介性接続の内部に存在する、部分的にアンカー配列媒介性接続の内部に存在する、またはアンカー配列媒介性接続の外側に存在する。
一実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、染色体内ループなどのループを含む。ある特定の実施形態では、アンカー配列媒介性接続は複数のループを有する。１つまたは複数のループは、第１のアンカー配列、核酸配列、転写制御エレメント、および第２のアンカー配列を含み得る。別の実施形態では、少なくとも１つのループは、順番に、第１のアンカー配列、転写制御エレメント、および第２のアンカー配列；または第１のアンカー配列、核酸配列、および第２のアンカー配列を含む。さらに別の実施形態では、核酸配列および転写制御エレメントのいずれか一方または両方がループの内部または外側に位置する。さらに別の実施形態では、ループの１つまたは複数が転写制御エレメントを含む。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、ＧＣボックス、またはＣＡＰ部位を含む。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続は複数のループを含み、アンカー配列媒介性接続は、ループの１つまたは複数にアンカー配列、核酸配列、および転写制御エレメントのうちの少なくとも１つを含む。
一態様では、本発明の部位特異的遮断剤および組成物により、アンカー配列媒介性接続に標的化変更を導入して、アンカー配列に結合する遮断剤で核酸配列の発現をモジュレートすることができる。一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続内の１つまたは複数のヌクレオチドを置換、付加または欠失のための標的とすることによってアンカー配列媒介性接続を変更する。
一部の実施形態では、発現、例えば転写を、活性化ループを含めることまたは抑止性ループを除外することによって活性化する。そのような実施形態の１つでは、アンカー配列媒介性接続は、核酸配列、例えばＡＰＯＢをコードする核酸などの転写を増加させる転写制御配列を含む。別のそのような実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、核酸配列、例えばＡＰＯＢをコードする核酸などの発現、例えば転写を低減する転写制御エレメントを除外する。
一部の実施形態では、発現、例えば転写を、抑止性ループを含めることまたは活性化ループを除外することによって抑止する。その実施形態の１つでは、アンカー配列媒介性接続は、核酸配列、例えばＡＰＯＢをコードする核酸配列などの発現、例えば転写を低減する転写制御エレメントを含む。別のそのような実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、核酸配列、例えばＡＰＯＢをコードする核酸などの転写を増加させる転写制御配列を除外する。
各アンカー配列媒介性接続は、１つまたは複数、例えば複数のアンカー配列を含む。アンカー配列を操作または変更して、天然に存在するループを中断するまたは新しいループを形成する（例えば、外因性ループを形成するもしくは外因性もしくは変更されたアンカー配列を有する天然に存在しないループを形成する）ことができる。そのような変更により、ＡＰＯＢ遺伝子の全部または一部を含有するＤＮＡの２次元構造を変化させることによって、例えば、それにより、ＡＰＯＢ遺伝子の転写制御エレメント（例えば、強化配列およびサイレンシング／抑止性配列）と相互作用する能力をモジュレートすることによって、ＡＰＯＢ遺伝子発現をモジュレートする。一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続のアンカー配列内の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失によってクロマチン構造を改変する。
アンカー配列は互いに連続していなくてよい。連続していないアンカー配列を用いる実施形態では、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列は約５００ｂｐ～約５００Ｍｂ、約７５０ｂｐ～約２００Ｍｂ、約１ｋｂ～約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ～約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ～約１Ｍｂ、約１００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約５００ｋｂ、または約１７５ｋｂ～約５００ｋｂ離れ得る。一部の実施形態では、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列は約５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、またはこれらの間の任意のサイズだけ離れている。
一実施形態では、アンカー配列は共通のヌクレオチド配列、例えば、ＣＴＣＦ結合性モチーフ：Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号１）を含み、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドである。
ＣＴＣＦ結合性モチーフは、逆の配向、例えば、（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号２）であってもよい。
一実施形態では、アンカー配列は配列番号１または配列番号２または配列番号１または配列番号２のいずれかと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、少なくとも第１のアンカー配列および第２のアンカー配列を含む。第１のアンカー配列および第２のアンカー配列はそれぞれが共通のヌクレオチド配列を含み得る、例えば、それぞれがＣＴＣＦ結合性モチーフを含む。一部の実施形態では、第１のアンカー配列および第２のアンカー配列は異なる配列を含む、例えば、第１のアンカー配列はＣＴＣＦ結合性モチーフを含み、第２のアンカー配列はＣＴＣＦ結合性モチーフ以外のアンカー配列を含む。一部の実施形態では、各アンカー配列が共通のヌクレオチド配列および共通のヌクレオチド配列の一端または両端の１つまたは複数の隣接ヌクレオチドを含む。
接続を形成し得る２つのＣＴＣＦ結合性モチーフ（例えば、連続したまたは連続していないＣＴＣＦ結合性モチーフ）は、ゲノム内に任意の配向、例えば、５’→３’（左タンデム、例えば、配列番号１を含む２つのＣＴＣＦ結合性モチーフ）もしくは３’→５’（右タンデム、例えば、２つのＣＴＣＦ結合性モチーフが配列番号２を含む）のいずれかの同じ配向（タンデム）で、または、一方のＣＴＣＦ結合性モチーフが配列番号１を含み、他方が配列番号２を含む、収束配向で存在し得る。ＣＴＣＦＢＳＤＢ ２．０：Ｄａｔａｂａｓｅ Ｆｏｒ ＣＴＣＦ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ ：／／ｉｎｓｕｌａｔｏｒｄｂ．ｕｔｈｓｃ．ｅｄｕ／）を使用して、標的遺伝子、例えばＡＰＯＢに関連するＣＴＣＦ結合性モチーフを同定することができる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの共通のヌクレオチド配列、例えば、接続核形成分子結合部位の配向を変化させることによってアンカー配列媒介性接続を変更する。
一部の実施形態では、アンカー配列は接続核形成分子結合部位、例えばＣＴＣＦ結合性モチーフを含み、本発明の部位特異的遮断剤により、少なくとも１つの接続核形成分子結合部位の変更、例えば、接続核形成分子に対する結合親和性の変更が導入される。
一部の実施形態では、外因性アンカー配列を導入することによってアンカー配列媒介性接続を変更する。天然に存在しないアンカー配列または外因性アンカー配列の付加により、例えば、核酸配列の転写を変更する天然に存在しないループの形成が誘導されることによって天然に存在するアンカー配列媒介性接続が形成されるまたは中断される。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、１つのＡＰＯＢ遺伝子、および１つまたは複数、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはＡＰＯＢ遺伝子以外の他の遺伝子を含む。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、１つまたは複数の、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くの転写制御エレメントと関連する。一部の実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子は転写制御エレメントの１つまたは複数と連続していない。ＡＰＯＢ遺伝子が転写制御エレメントと連続していない一部の実施形態では、前記遺伝子は、１つまたは複数の転写制御エレメントから約１００ｂｐ～約５００Ｍｂ、約５００ｂｐ～約２００Ｍｂ、約１ｋｂ～約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ～約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ～約１Ｍｂ、約１００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約５００ｋｂ、または約１７５ｋｂ～約５００ｋｂ離れ得る。一部の実施形態では、前記遺伝子は転写制御エレメントから約１００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、またはこれらの間の任意のサイズだけ離れている。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続を変更することによって遺伝子発現をどのようにモジュレートするかの決定、例えば、部位特異的標的化成分の選択に、アンカー配列媒介性接続の型が役立ち得る。例えば、一部の型のアンカー配列媒介性接続はアンカー配列媒介性接続内に１つまたは複数の転写制御エレメントを含む。そのようなアンカー配列媒介性接続を、アンカー配列媒介性接続の形成を中断すること、例えば、１つまたは複数のアンカー配列を変更することによって中断することにより、アンカー配列媒介性接続内のＡＰＯＢ遺伝子の転写が低減する可能性がある。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続に付随する１つまたは複数の転写制御エレメントによってＡＰＯＢ遺伝子の発現を調節する、モジュレートする、または発現に影響を及ぼす。一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、ＡＰＯＢ遺伝子および１つまたは複数の転写制御エレメントを含む。例えば、ＡＰＯＢ遺伝子および１つまたは複数の転写制御配列は、少なくとも部分的に、アンカー配列媒介性接続内、例えば、１型アンカー配列媒介性接続内に位置する。アンカー配列媒介性接続は「１型、ＥＰ亜型」とも称され得る。一部の実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子は定義された発現の状態を有する、例えば、そのネイティブな状態にある、例えば、病的な状態にある。例えば、ＡＰＯＢ遺伝子は高レベルの発現を有し得る。アンカー配列媒介性接続を中断することにより、ＡＰＯＢ遺伝子の発現を低減すること、例えば、アンカー配列媒介性接続内の以前は転写に対して開かれていたＤＮＡのコンフォメーションの変化によって転写を低減すること、例えば、ＡＰＯＢ遺伝子と強化配列（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間に追加の距離を作り出すＤＮＡのコンフォメーションの変化によって転写を低減することができる。一実施形態では、関連するＡＰＯＢ遺伝子および１つまたは複数の転写制御配列、例えば、強化配列の両方がアンカー配列媒介性接続の内側に存在する。アンカー配列媒介性接続の中断により、ＡＰＯＢ遺伝子の発現が低減する。一実施形態では、アンカー配列媒介性接続に関連するＡＰＯＢ遺伝子には、少なくとも部分的にアンカー配列媒介性接続の内側に存在する１つまたは複数の転写制御エレメントがアクセス可能である。
一部の実施形態では、関連するが、アンカー配列媒介性接続に起因してアクセス不可能な１つまたは複数の転写制御エレメントによってＡＰＯＢ遺伝子の発現を調節する、モジュレートする、または発現に影響を及ぼす。例えば、ＡＰＯＢ遺伝子に関連するアンカー配列媒介性接続により、１つまたは複数の転写制御エレメントのＡＰＯＢ遺伝子の発現を調節する、モジュレートする、または発現に影響を及ぼす能力が中断される。転写制御配列はＡＰＯＢ遺伝子から分離されていてよい、例えば、ＡＰＯＢ遺伝子とは逆の側面に、少なくとも部分的に、例えばアンカー配列媒介性接続の内側または外側に存在する、例えば、ＡＰＯＢ遺伝子は、アンカー配列媒介性接続の近傍にあることに起因して、転写制御エレメントにアクセス不可能である。一部の実施形態では、１つまたは複数の強化配列はアンカー配列媒介性接続、例えば２型アンカー配列媒介性接続によってＡＰＯＢ遺伝子から分離されている。
一部の実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子はアンカー配列媒介性接続に起因して１つまたは複数の転写制御エレメントにアクセス不可能であり、アンカー配列媒介性接続の中断により、転写制御エレメントによりＡＰＯＢ遺伝子の発現を調節する、モジュレートする、または発現に影響を及ぼすことが可能になる。一実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子はアンカー配列媒介性接続の内側および外側にあり、１つまたは複数の転写制御エレメントにアクセス不可能である。アンカー配列媒介性接続の中断により、転写制御エレメントのアクセスが増大して、ＡＰＯＢ遺伝子の発現が調節される、モジュレートされる、または発現が影響を受ける、例えば、転写制御エレメントによりＡＰＯＢ遺伝子の発現が増大する。一実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子はアンカー配列媒介性接続の内側にあり、少なくとも部分的にアンカー配列媒介性接続の外側に存在する１つまたは複数の転写制御エレメントにアクセス不可能である。アンカー配列媒介性接続の中断により、ＡＰＯＢ遺伝子の発現が増大する。一実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子は少なくとも部分的にアンカー配列媒介性接続の外側にあり、アンカー配列媒介性接続の内側に存在する１つまたは複数の転写制御エレメントにアクセス不可能である。アンカー配列媒介性接続の中断によりＡＰＯＢ遺伝子の発現が増大する。
Ａ．ＡＰＯＢ部位特異的標的化成分
本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分は、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とし、ポリマーまたはポリマー分子、例えば、ポリアミド（すなわち、アミド結合によって連結したリピート単位の分子、例えば、ポリペプチド）、ヌクレオチドのポリマー（例えば、ガイドＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはペプチドもしくはポリペプチドなどのアミノ酸のポリマー、例えば、融合タンパク質などを含み得る。適切な部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分、組成物、およびそのような作用剤および組成物の使用方法は下に、およびその内容全体が明白に参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／０４９０７３号に記載されている。
一実施形態では、本発明の部位特異的遮断剤は、ガイドＲＮＡ（もしくはｇＲＮＡ）などの核酸分子またはガイドＲＮＡおよびエフェクターもしくはその断片もしくはエフェクターもしくはその断片をコードする核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む。
別の実施形態では、本発明の部位特異的遮断剤は、ＡＰＯＢ発現制御領域を特異的に標的にしてＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートするように操作されたものであるジンクフィンガーポリペプチド（ＺＮＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片などのポリペプチドをコードする核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む。
別の実施形態では、本発明の部位特異的遮断剤は、ＰＮＡ、例えば、エフェクターポリペプチドまたはその断片と連結した核酸ｇＲＮＡなどのポリヌクレオチドを含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む。
別の実施形態では、本発明の部位特異的遮断剤は、Ｃａｓポリペプチドと、例えば、エピジェネティック動員因子またはエピジェネティックＣｐＧ修飾因子とを含む融合タンパク質をコードする核酸分子などの融合分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む。
さらに別の実施形態では、本発明の部位特異的遮断剤は、Ｃａｓポリペプチドと、例えば、エピジェネティック動員因子またはエピジェネティックＣｐＧ修飾因子とを含む融合タンパク質などの融合分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む。
本明細書で使用される場合、その最も広範な意味で、「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチド鎖であるかまたはオリゴヌクレオチド鎖に組み入れることができる任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ポリヌクレオチド鎖であるかまたはポリヌクレオチド鎖にリン酸ジエステル連結を介して組み入れることができる化合物および／または物質である。文脈から明らかになる通り、一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す；一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」はＲＮＡであるかまたはＲＮＡを含む；一部の実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるかまたはＤＮＡを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、ロックド核酸分子およびデオキシ核酸分子を含む「ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）」である。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の天然の核酸残基であるか、それを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の核酸類似体であるか、それを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、核酸類似体は、リン酸ジエステル骨格を利用しないという点で核酸とは異なる。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか、またはそれからなり、ペプチド核酸は、当技術分野で公知であり、骨格内にリン酸ジエステル結合の代わりにペプチド結合を有するものであり、本発明の範囲内に入るとみなされる。その代わりにまたはそれに加えて、一部の実施形態では、核酸は、リン酸ジエステル結合ではなく、１つまたは複数のホスホロチオエートおよび／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト連結を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であるか、それを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、挿入塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｂａｓｅ）、およびこれらの組合せ）であるか、それを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、核酸は、天然の核酸におけるものと比較して修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を１つまたは複数含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は１つまたは複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸を、天然の供給源からの単離、相補的な鋳型に基づく重合による酵素的合成（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）、組換え細胞または系における再生、および化学合成のうちの１つまたは複数によって調製する。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００またはそれよりも多くの残基の長さである。一部の実施形態では、核酸は、部分的にまたは全体として一本鎖である；一部の実施形態では、核酸は、部分的にまたは全体として二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有するか、またはポリペプチドをコードする配列の相補物である。一部の実施形態では、核酸は酵素活性を有する。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって、またはペプチド結合以外の手段によって共有結合で連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に対する制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によってまたはペプチド結合以外の手段によって互いに接合した２つまたはそれよりも多くのアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、当技術分野において一般に例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短い鎖と、当技術分野において一般にタンパク質と称される長い鎖の両方を指し、多くの型が存在する。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、キメラまたは「融合タンパク質」であるかまたはそれを含み得る。本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種の第２のポリペプチド（すなわち、第１のタンパク質以外のポリペプチド）と作動可能に連結した第１のタンパク質の全部または一部（好ましくは生物活性のある部分）を含む。融合タンパク質の範囲内で、「作動可能に連結した」という用語は、第１のタンパク質またはそのセグメントと異種ポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すことが意図されている。異種ポリペプチドを第１のタンパク質またはセグメントのアミノ末端またはカルボキシル末端と融合することができる。
「ポリアミド」は、アミド結合によって連結したリピート単位を有するポリマー分子である。天然に存在するポリアミドの例はタンパク質である。一部の実施形態では、ポリアミドはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
「ペプチド核酸」（「ＰＮＡ」）は、ＰＮＡ内の１つまたは複数のアミノ酸単位がペプチド骨格と同様のアミド含有骨格、例えば、アミノエチル－グリシンを有し、アミノ酸側鎖の代わりに核酸側鎖を有する分子である。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は相補ＤＮＡおよびＲＮＡとそれらのオリゴヌクレオチド対応物よりも高い親和性でハイブリダイズすることが分かっている。ＰＮＡはこの特質により核酸側鎖と安定なハイブリッドになるだけでなく、同時に、中性骨格および疎水性側鎖によりポリペプチド内に疎水性単位がもたらされる。核酸側鎖としては、これだけに限定されないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルなどのプリン側鎖またはピリミジン側鎖が挙げられる。一実施形態では、核酸側鎖は本明細書に記載のヌクレオシド類似体を含む。
一実施形態では、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分はポリアミドを含む。本発明の作用剤および組成物への使用に適したポリアミドは当技術分野で公知である。
一実施形態では、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分はポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列はＡＰＯＢ遺伝子またはＡＰＯＢ発現産物をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ＡＰＯＢコード配列もＡＰＯＢ発現産物も含まない。例えば、一部の実施形態では、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分は、標的発現制御領域、例えばプロモーターまたはアンカー配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的アンカー配列の相補物であるか、または、標的配列の相補物と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を有する。
本発明のポリヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたデオキシヌクレオチド、修飾されたリボヌクレオチド（例えば、骨格連結、糖分子、および／または核酸塩基を変更する修飾などの化学修飾）、ならびに人工的な核酸を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドとしては、これだけに限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋型核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、修飾されたＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＰｖＮＡ、ｒＰｖＮＡ、修飾されたＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、約２～約５０００ｎｔ、約１０～約１００ｎｔ、約５０～約１５０ｎｔ、約１００～約２００ｎｔ、約１５０～約２５０ｎｔ、約２００～約３００ｎｔ、約２５０～約３５０ｎｔ、約３００～約５００ｎｔ、約１０～約１０００ｎｔ、約５０～約１０００ｎｔ、約１００～約１０００ｎｔ、約１０００～約２０００ｎｔ、約２０００～約３０００ｎｔ、約３０００～約４０００ｎｔ、約４０００～約５０００ｎｔ、またはこれらの間の任意の範囲の長さを有する。
本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオシド、例えば、プリンまたはピリミジン、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のヌクレオシド類似体を含む。ヌクレオシド類似体としては、これだけに限定されないが、ヌクレオシド類似体、例えば、５－フルオロウラシル；５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、４－メメチルベンズイミダゾール、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ジヒドロウリジン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｂｅｔａ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリン、３－ニトロピロール、イノシン、チオウリジン、キューオシン、ワイオシン、ジアミノプリン、イソグアニン、イソシトシン、ジアミノピリミジン、２，４－ジフルオロトルエン、イソキノリン、ピロロ［２，３－］ピリジン、およびプリン側鎖またはピリミジン側鎖と塩基対合し得る任意の他のものが挙げられる。
一部の実施形態では、ＡＰＯＢ発現制御領域を特異的に標的にしてＡＰＯＢ遺伝子の発現をモジュレートするように操作されたものであるジンクフィンガーポリペプチド（ＺＮＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分。
ＡＰＯＢ発現制御領域などの目的のＤＮＡ標的領域に特異的に結合するそのようなジンクフィンガーポリヌクレオチドの設計および調製は当技術分野において周知である。例えば、ジンクフィンガー（ＺＮＦ）タンパク質は、ヌクレオチドのトリプレットに特異的に結合するＤＮＡ結合性モチーフを含有する。したがって、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を設計および調製するために、それぞれが特定の３塩基対のＤＮＡ配列を認識し得る別々のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを組み合わせて、９塩基対から１８塩基対までにわたる長さの標的部位を認識する３フィンガーアレイ、４フィンガーアレイ、５フィンガーアレイ、または６フィンガーアレイを生成することを含むモジュラーアセンブリプロセスを使用することができる。別の適切な方法は、最大６つの個々のジンクフィンガーを有するＺＮＦポリヌクレオチドを生成するための２フィンガーモジュールを含み得る。例えば、Ｓｈｕｋｌａ ＶＫ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ． ４５９ （７２４５） ２００９： ４３７－４１； Ｄｒｅｉｅｒ Ｂ， ｅｔ ａｌ．， ＪＢＣ． ２８０ （４２） ２００５： ３５５８８－９７； Ｄｒｅｉｅｒ Ｂ， ｅｔ ａｌ， ＪＢＣ ２７６ （３１） ２００１： ２９４６６－７８； Ｂａｅ ＫＨ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２１ （３） ２００３： ２７５－８０を参照されたい。
一部の実施形態では、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分は、ＡｐｏＢ発現制御領域を特異的に標的にして、ＡｐｏＢ遺伝子の発現をモジュレートするように操作されたものであるジンクフィンガーのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）またはその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明における使用に適した、ヌクレオチドトリプレットに結合するジンクフィンガーをコードする例示的なアミノ酸配列を以下の表１に提示する（例えば、Ｇｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｔｈｅ Ａｄｖｅｎｔ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照されたい）。
Figure 2022548320000002
Figure 2022548320000003
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、Ｎ末端領域およびＣ末端領域を含み、間に、標的ＤＮＡ配列に結合する「フィンガー」を有する。Ｎ末端領域は、一般に７アミノ酸長である。Ｃ末端領域は一般に６アミノ酸長である。したがって、Ｎ末端領域は一般にＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号）のアミノ酸配列を含む。「Ｘ」は任意のアミノ酸であり得る。一部の実施形態では、Ｎ末端領域は例示的なアミノ酸配列ＬＥＰＧＥＫＰ（配列番号）を含む。「Ｘ」は任意のアミノ酸であり得る。Ｃ末端領域は一般にＸ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０（配列番号）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｃ末端領域は例示的なアミノ酸配列ＴＧＫＫＴＳ（配列番号）を含む。
ＤＮＡ結合ドメイン内の各フィンガーは、フィンガーのＮ末端に位置するＮ末端骨格とフィンガーのＣ末端に位置するＣ末端骨格に挟まれている。フィンガーのＮ末端骨格は一般に１１アミノ酸長であり、２つの保存的システイン（Ｃ）が３位および６位の位置にある。したがって、フィンガーのＮ末端骨格は一般にＸ８Ｘ９ＣＸ１０Ｘ１１ＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６（配列番号）のアミノ酸配列を含む。「Ｘ」は任意のアミノ酸であり得る。フィンガーのＣ末端骨格は一般に５アミノ酸長であり、２つの保存的ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｎｅ）（Ｈ）が１位および５位に位置する。したがって、フィンガーのＣ末端骨格は一般にＨＸ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｈ（配列番号）のアミノ酸配列を含む。「Ｘ」は任意のアミノ酸であり得る。一部の実施形態では、Ｎ末端骨格は例示的なアミノ酸配列ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ（配列番号６１）を含み、Ｃ末端骨格は例示的なアミノ酸配列ＨＱＲＴＨ（配列番号６２）を含む。２つの「フィンガー」はリンカーを通じて連結している。リンカーは、一般に５アミノ酸長であり、Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４（配列番号）のアミノ酸配列を含む。「Ｘ」は任意のアミノ酸であり得る。ある特定の実施形態では、リンカーは例示的なアミノ酸配列ＴＧＥＫＰ（配列番号６３）を含む。したがって、部位特異的ＡｐｏＢ部位特異的遮断剤のジンクフィンガーは以下の構造：（Ｎ末端骨格－フィンガー－Ｃ末端骨格－リンカー）ｎを有し、部位特異的ＡｐｏＢ部位特異的遮断剤のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは以下の構造：［Ｎ末端領域（Ｎ末端骨格－フィンガー－Ｃ末端骨格－リンカー）ｎ－Ｃ末端領域］を有する。「Ｎ」は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが結合する、したがってＡｐｏＢ部位特異的遮断剤が結合するヌクレオチドのトリプレットの数を表す。
４つのヌクレオチドトリプレットに対する「フィンガー」アミノ酸配列が分かっていないが、そのようなトリプレットが目的の標的領域内で同定された場合、この問題を回避するために２つの「リンカースパン配列」－リンカースパン１およびリンカースパン２－が有用である。リンカースパン１は、トリプレットに対する「フィンガー」アミノ酸配列が利用不可能な場合に１塩基対をスキップするために使用される。リンカースパン２は、トリプレットに対する「フィンガー」アミノ酸配列が利用不可能な場合に２塩基対をスキップするために使用される。リンカースパン１は一般に１２アミノ酸長である。リンカースパン２は一般に１６アミノ酸長である。したがって、リンカースパン１は一般にＸ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２（配列番号）のアミノ酸配列を含む。リンカースパン２は一般にＸ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（配列番号）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカースパン１は、ＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱ（配列番号）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、リンカースパン２はＴＰＮＰＨＲＲＴＤＰＳＨＫＰＦＱ（配列番号）のアミノ酸配列を含む。リンカースパン１および／またはリンカースパン２を使用する場合、フィンガー－リンカースパン１／スパン２－フィンガーは、以下の構造を含む：Ｎ末端骨格－フィンガー－Ｃ末端骨格－リンカースパン１／スパン２－Ｎ末端骨格－フィンガー－Ｃ末端骨格－リンカー。同様に、ＡＰＯＢ発現制御領域などの目的のＤＮＡ標的領域に特異的に結合するそのようなＴＡＬＥポリペプチドの設計および調製は当技術分野において周知である。例えば、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、繰り返される高度に保存された３３～３４アミノ酸配列を含有し、１２番目および１３番目のアミノ酸は多岐にわたる。これらの２つの位置は反復可変二残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）と称され、高度に可変性であり、特定のヌクレオチド認識との強力な相関を示す。アミノ酸配列とＤＮＡ認識のこの直接的な関連性により、適当なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組合せを選択することによって特定のＤＮＡ結合ドメインを操作することが可能になっている。例えば、Ｂｏｃｈ Ｊ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２９ （２） ２０１１： １３５－６； Ｂｏｃｈ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３２６ （５９５９） ２００９： １５０９－１２； Ｍｏｓｃｏｕ ＭＪ ＆ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ ＡＪ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３２６ （５９５９） ２００９： １５０１を参照されたい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分は、ガイドＲＮＡ（もしくはｇＲＮＡ）またはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。ｇＲＮＡは、例えば、エフェクターをＡＰＯＢ発現制御エレメントに方向づけるために必要な、例えば、ＡＰＯＢ発現制御エレメントを含むゲノム標的配列を標的とする約２０ヌクレオチドの部位特異的配列を含み得る「足場」配列を含む短い合成ＲＮＡ分子である。
一般に、ガイドＲＮＡ配列は、約１７ヌクレオチドから約２４ヌクレオチドの間（例えば、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、または２１ヌクレオチド）の長さを有し、標的配列と相補的になるように設計される。有効なガイドＲＮＡの設計に使用するためのカスタムｇＲＮＡ生成装置およびアルゴリズムが市販されている。遺伝子編集はまた、天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣する、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合のため）および少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼを編集のために標的とした配列にガイドするため）の両方を含有する操作された（合成）単一ＲＮＡ分子であるキメラ「単一ガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を使用しても実現されている。化学修飾されたｓｇＮＡもゲノム編集において有効であることが実証されている；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ９８５－９９１を参照されたい。
ポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡを含む例示的な部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を下の表２に提示する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表２のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列全体と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む。
表２の配列は修飾されたもの（または修飾されていないもの）として記載されているが、本発明の（ｔｈｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ） 、例えば部位特異的遮断剤に包含される核酸分子は、修飾されてないかまたは表２に記載されているものと違うように修飾されている表２に記載の配列のうちのいずれか１つも含み得ることが理解されよう。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡを含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分は、アンカー配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、アンカー配列はＣＴＣＦ結合性モチーフまたはコンセンサス配列：Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号１）を含み、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドである。ＣＴＣＦ結合性モチーフまたはコンセンサス配列はまた、逆の配向、例えば、（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号２）であり得る。一部の実施形態では、核酸配列は、ＣＴＣＦ結合性モチーフまたはコンセンサス配列と相補的な配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、アンカー配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的なヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＴＣＦ結合性モチーフまたはコンセンサス配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡ、およびアンカー配列と相補的な配列またはアンカー配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む配列からなる群から選択される。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分はＲＮＡｉ分子である。ＲＮＡｉ分子は、一般には１５～５０塩基対（例えば、約１８～２５塩基対）を含有し、細胞内で発現される標的遺伝子内のコード配列と同一の（相補的な）またはほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡまたはＲＮＡ様構造を含む。ＲＮＡｉ分子としては、これだけに限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロ二重鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）、およびダイサー基質が挙げられる（米国特許第８，０８４，５９９号、同第８，３４９，８０９号、および同第８，５１３，２０７号）。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、例えば接続核形成分子をコードする遺伝子の発現を阻害するための組成物を含む。
ＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子の全てまたは断片と実質的に相補的な、または完全に相補的な配列を含む。ＲＮＡｉ分子は、特定の遺伝子の新しく生成される核内ＲＮＡ転写物が転写のために成熟化してｍＲＮＡになることを妨げるために、イントロンとエクソンの境界において配列を補完し得る。特定の遺伝子と相補的なＲＮＡｉ分子はその遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし、その翻訳を妨げ得る。アンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその誘導体もしくはハイブリッドであり得る。そのような誘導体分子の例としては、これだけに限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）またはリボ核酸グアニジン（Ｒ Ｇ）などのホスホロチオエートに基づく分子が挙げられる。
ＲＮＡｉ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された「すぐに使える」ＲＮＡとして、または、転写されるとＲＮＡｉ分子を生じる、細胞にトランスフェクトされるアンチセンス遺伝子として細胞に提供することができる。ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイズした分子のＲＮＡｓｅ Ｈによる分解および／または翻訳複合体の形成の阻害がもたらされる。どちらによっても、元の遺伝子の産物の産生ができなくなる。
目的の転写物とハイブリダイズするＲＮＡｉ分子の長さは、およそ１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれよりも多くのヌクレオチドであるべきである。アンチセンス配列の標的とされる転写物との同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５であるべきである。
ＲＮＡｉ分子は、突出、すなわち、一般には対合していない、通常は本明細書において定義されているセンス鎖とアンチセンス鎖の対のコア配列によって形成される２重ヘリックス構造には直接関与しない、突出したヌクレオチドも含み得る。ＲＮＡｉ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれに独立に存在する約１～５塩基の３’突出および／または５’突出を含有し得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が３’突出および５’突出を含有する。一実施形態では、１つの鎖の１つまたは複数の３’突出ヌクレオチドと他の鎖の１つまたは複数の５’突出ヌクレオチドが塩基対合する。別の実施形態では、一方の鎖の塩基の１つまたは複数の３’突出ヌクレオチドは他方の鎖の１つまたは複数の５’突出ヌクレオチドと対合しない。ＲＮＡｉ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖は同じ数のヌクレオチド塩基を含む場合もあり、同じ数のヌクレオチド塩基を含まない場合もある。アンチセンス鎖とセンス鎖は２重鎖を形成し得、５’末端だけが平滑末端を有するか、３’末端だけが平滑末端を有するか、５’末端と３’末端の両方が平滑末端を有するか、または５’末端も３’末端も平滑末端ではない。別の実施形態では、突出内のヌクレオチドの１つまたは複数は、チオホスフェート、ホスホロチオエート、デオキシヌクレオチド逆位（３’－３’連結）ヌクレオチドを含有する、または修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドである。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、標的ｍＲＮＡの約１５～約２５個の連続したヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ配列はジヌクレオチドＡＡで始まり、約３０～７０％（約５０～６０％、約４０～６０％、または約４５％～５５％）のＧＣ含量を含み、例えば標準のＢＬＡＳＴ検索によって決定して、それが導入される哺乳動物のゲノム内の標的以外のいかなるヌクレオチド配列に対しても高いパーセンテージ同一性を有さない。
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子のプロセシング経路の中間体に似ている（Ｂａｒｔｅｌ， Ｃｅｌｌ １１６： ２８１－２９７， ２００４）。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡはｍｉＲＮＡとして機能し得る、または逆も同様に、ｍｉＲＮＡはｓｉＲＮＡとして機能し得る（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ９： １３２７－１３３３， ２００２；Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７： ４３８－４４２， ２００３）。マイクロＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様に、ＲＩＳＣを使用して標的遺伝子をダウンレギュレートするが、ｓｉＲＮＡとは異なり、大多数の動物ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡを切断しない。その代わりに、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制またはポリＡ除去およびｍＲＮＡ分解を通じてタンパク質アウトプットを減少させる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３： ４０３４－４０３９， ２００６）。公知のｍｉＲＮＡ結合部位はｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ内にある；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からヌクレオチド２～８に対してほぼ完全な相補性を有する部位を標的にしているようである（Ｒａｊｅｗｓｋｙ， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３８ Ｓｕｐｐｌ： Ｓ８－１３， ２００６； Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ４３３： ７６９－７７３， ２００５）。この領域はシード領域として公知である。ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡは互換的であるので、外因性ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡに対するシード相補性でｍＲＮＡをダウンレギュレートする（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３ ： １９９－２０４， ２００６）。３’ＵＴＲ内の複数の標的部位により、より強力なダウンレギュレーションが生じる（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７： ４３８－４４２， ２００３）。
公知のｍｉＲＮＡ配列の一覧は、とりわけ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｒｍ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、およびＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの研究組織によって維持されているデータベースに見いだすことができる。公知の有効なｓｉＲＮＡ配列および同類の結合部位は関連性のある文献にも十分に示されている。ＲＮＡｉ分子は当技術分野で公知の技術によって容易に設計され、生成される。さらに、有効かつ特異的な配列モチーフを発見する見込みを増大させるコンピューターツールが存在する（Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ． ２００６， Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ． ２００４， Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ． ２００３， Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ． ２００３， Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ． ２００４， Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ． ２００４， Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ． ２００４）。
ＲＮＡｉ分子は遺伝子にコードされるＲＮＡの発現をモジュレートする。複数の遺伝子が互いにある程度の配列相同性を共有し得るので、一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子を、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的とするように設計することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、異なる遺伝子標的の間で共有される配列または特定の遺伝子標的に特有の配列に対する相補性を有する配列を含有し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子を、いくつかの遺伝子の間で相同性を有し、それにより、遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライスバリアント、変異体遺伝子など）を標的とするＲＮＡ配列の保存された領域を標的とするように設計することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子を、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に特有の配列を標的とするように設計することができる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、接続核形成分子、例えばＣＴＣＦ、コヒーシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質関連因子３（ＴＡＦ３）、ＺＮＦ１４３、もしくはアンカー配列媒介性接続の形成を促進する別のポリペプチド、またはエピジェネティック修飾剤、例えば、これだけに限定されないが、ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ）、ＤＮＡの脱メチル化（例えば、ＴＥＴファミリー酵素は、５－メチルシトシンの５－ヒドロキシメチルシトシンおよびより高次の酸化誘導体への酸化を触媒する）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３）、サーチュイン１、２、３、４、５、６、もしくは７、リシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）、ヒストン－リシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、真性染色質ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ゼステホモログ２（ＥＺＨ２）のエンハンサー、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、タンパク質－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）などを含む、翻訳後修飾に関与する酵素内の配列を標的とする。一実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、タンパク質脱アセチル化酵素、例えば、サーチュイン１、２、３、４、５、６、または７を標的とする。一実施形態では、本発明は、接続核形成分子、例えばＣＴＣＦを標的とするＲＮＡｉを含む組成物を含む。
一部の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分はペプチドまたはタンパク質成分（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｉｅｔｙ）を含む。一部の実施形態では、部位特異的遮断剤は融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、エフェクターはｃａペプチドまたはタンパク質成分である。ペプチドまたはタンパク質成分としては、これだけに限定されないが、細胞外受容体などの受容体に結合するペプチドリガンド、抗体断片、または標的化アプタマー、神経ペプチド、ホルモンペプチド、ペプチド薬物、毒性ペプチド、ウイルスまたは微生物ペプチド、合成ペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストペプチドを挙げることができる。
例示的なペプチドまたはタンパク質としては、ＤＮＡ結合性タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ構成成分タンパク質、接続核形成分子、ドミナントネガティブな接続核形成分子、エピジェネティック修飾剤、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、ペプチドは、ヌクレアーゼ、物理的遮断因子、エピジェネティック動員因子、およびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子、ならびに前記のいずれかの断片および組合せを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ、ロイシンジッパー、Ｚｎ－フィンガー、ＴＡＴＡボックス結合性タンパク質、転写因子などのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む。
ペプチドまたはタンパク質は、直鎖または分岐型であり得る。ペプチドまたはタンパク質成分は、約５～約２００アミノ酸、約１５～約１５０アミノ酸、約２０～約１２５アミノ酸、約２５～約１００アミノ酸、またはこれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
上記の通り、一部の実施形態では、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分は融合タンパク質を含む。
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分およびエフェクター分子を含む。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質はエフェクター分子を含む。含まれる例示的なエフェクター分子は下に記載されており、一部の実施形態では、例えば、ヌクレアーゼ、物理的遮断因子、エピジェネティック動員因子、例えば、転写エンハンサーまたは転写リプレッサー、およびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子、例えば、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン修飾剤、またはヒストン脱アセチル化酵素、および前記のいずれかの組合せが挙げられる。
例えば、部位特異的標的化成分は、ｇＲＮＡ、およびエフェクター、例えば、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、例えば、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えばＣａｓ９ Ｄ１０Ａ）、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、もしくはＣ２Ｃ３、またはそのようなヌクレアーゼをコードする核酸を含み得る。ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（複数可）の選択は、標的とされる変異がヌクレオチドの欠失であるか、置換であるか、または付加であるか、例えば、標的とされる配列に対するヌクレオチドの欠失であるか、置換であるか、または付加であるかによって決定される。触媒として不活性なエンドヌクレアーゼ、例えば不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、例えばＤ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）と（１つまたは複数の）エフェクタードメインの全部または一部（例えば、生物学的に活性な部分）が繋がった融合物により、１つまたは複数のＲＮＡ配列（例えば、これだけに制限されないが、本明細書に記載のジンクフィンガーアレイ、ｓｇＲＮＡ、ＴＡＬアレイ、ペプチド核酸を含むＤＮＡ認識エレメント）によって組成物を特定のＤＮＡ部位にガイドして、１つまたは複数の標的核酸配列の活性および／または発現をモジュレートする（例えば、ＤＮＡ配列をメチル化または脱メチル化する）ためにポリペプチドと連結することができるキメラタンパク質が作り出される。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドまたはその断片（例えばＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片）およびエピジェネティック動員因子またはエピジェネティックＣｐＧ修飾因子を含むエフェクター分子を含み得る。
一実施形態では、適切なＣａｓポリペプチドは、酵素的に不活性なＣａｓポリペプチド、例えば「不活性型Ｃａｓポリペプチド」または「ｄＣａｓ」ポリペプチドである。
本明細書に記載の方法および組成物に適応可能な例示的なＣａｓポリペプチドは下に記載されている。当技術分野で公知の方法を使用して、Ｃａｓポリペプチドを本明細書に記載の種々の作用剤および／または分子のいずれかと融合することができる；そのように得られる融合分子は、種々の開示される方法に有用であり得る。
一態様では、本発明は、ＤＮＡに作用するドメイン、例えばエフェクター（例えば、ヌクレアーゼドメイン、例えばＣａｓ９ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９ドメイン；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、デアミナーゼ）を含むタンパク質と、タンパク質を部位特異的標的配列にターゲティングする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの組合せを含む組成物であって、ヒト細胞において、標的遺伝子の発現を変更するために有効である、組成物を含む。一部の実施形態では、酵素ドメインはＣａｓ９またはｄＣａｓ９である。一部の実施形態では、タンパク質は２つの酵素ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９ドメインとメチラーゼドメインまたはデメチラーゼドメインを含む。
一態様では、本発明は、転写制御エレメント（例えば、ヌクレアーゼドメイン、例えばＣａｓ９ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９ドメイン；転写エンハンサー；転写リプレッサー）を含むドメイン、例えばエフェクターを含むタンパク質と、前記タンパク質を部位特異的標的配列にターゲティングする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの組合せを含む組成物であって、ヒト細胞において、標的遺伝子の発現を変更するために有効である、組成物を含む。一部の実施形態では、酵素ドメインはＣａｓ９またはｄＣａｓ９である。一部の実施形態では、タンパク質は、２つの酵素ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９ドメインと転写エンハンサードメインまたは転写リプレッサードメインを含む。
本明細書で使用される場合、「エフェクタードメインの生物学的に活性な部分」は、エフェクタードメインの機能を維持する部分である（例えば、完全に、部分的に、最小に）（例えば、「最小」または「コア」ドメイン）。
本明細書に記載のキメラタンパク質は、リンカー、例えばアミノ酸リンカーも含み得る。一部の態様では、リンカーは、２つまたはそれよりも多くのアミノ酸、例えば、１つまたは複数のＧＳ配列を含む。一部の態様では、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）と２つまたはそれよりも多くのエフェクタードメイン（例えば、ＤＮＡメチラーゼまたはＤＮＡの脱メチル化において役割を有する酵素またはタンパク質アセチルトランスフェラーゼまたは脱アセチル化酵素のもの）の融合物は、前記ドメイン間に散在するリンカー（例えば、ＧＳリンカー）を１つまたは複数含む。一部の態様では、ｄＣａｓ９を２～５つのエフェクタードメインと散在するリンカーを用いて融合する。
一部の実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分は、接続核形成分子、接続核形成分子をコードする核酸、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続は、第１のアンカー配列と結合した第１の接続核形成分子、連続していない第２のアンカー配列と結合した第２の接続核形成分子、および第１の接続核形成分子と第２の接続核形成分子の会合によって媒介される。一部の実施形態では、接続核形成分子により、例えば競合的結合により、内因性の接続核形成分子とその結合部位の結合を中断することができる。
接続核形成分子は、例えば、ＣＴＣＦ、コヒーシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質関連因子３（ＴＡＦ３）、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、またはアンカー配列媒介性接続の形成を促進する別のポリペプチドであり得る。接続核形成分子は、内因性ポリペプチドまたは他のタンパク質、例えば転写因子、例えば自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ）、別の因子、例えばＸ－不活化特異的転写物（ＸＩＳＴ）、または目的の特定のＤＮＡ配列を認識するように、例えば、配列認識のためのジンクフィンガー、ロイシンジッパーまたはｂＨＬＨドメインを有するように操作された、操作されたポリペプチドであり得る。接続核形成分子により、アンカー配列媒介性接続の内部またはその周囲におけるＤＮＡ相互作用をモジュレートすることができる。例えば、接続核形成分子は、アンカー配列媒介性接続の形成または撹乱を変更する他の因子をアンカー配列に動員し得る。
接続核形成分子はまた、ホモ二量体形成またはヘテロ二量体形成のための二量体形成ドメインも有し得る。１つまたは複数の接続核形成分子、例えば、内因性のものおよび操作されたものは、相互作用してアンカー配列媒介性接続を形成し得る。一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続を安定化するために、接続核形成分子を、安定化ドメイン、例えば、凝集相互作用ドメインをさらに含むように操作する。一部の実施形態では、接続核形成分子を、標的配列を結合するように操作する、例えば、標的配列との結合親和性をモジュレートする。一部の実施形態では、アンカー配列媒介性接続内のアンカー配列に対する選択された結合親和性を有する接続核形成分子を選択するかまたは操作する。接続核形成分子およびそれらの対応するアンカー配列は、ＣＴＣＦに不活化変異を有する細胞および染色体コンフォメーション捕捉または３Ｃに基づく方法、例えば、Ｈｉ－Ｃまたはハイスループット配列決定を使用して、トポロジカルに関連するドメイン、例えば、ＣＴＣＦの非存在下での遠位ＤＮＡ領域または遺伝子座の間のトポロジカル相互作用を調査することによって同定することができる。長距離ＤＮＡ相互作用も同定することができる。追加の解析は、コヒーシン、ＹＹ１またはＵＳＦ１、ＺＮＦ１４３結合モチーフなどのベイトを使用したＣｈｌＡ－ＰＥＴ解析、およびベイトと関連する複合体を同定するためのＭＳを含み得る。
Ｂ．エフェクター分子
本発明の組成物および方法に使用するためのエフェクター分子としては、生物活性をモジュレートする、例えば、酵素活性、遺伝子発現、細胞シグナル伝達、および細胞または器官の機能を増大または低減するものが挙げられる。本発明の好ましいエフェクター分子は、ヌクレアーゼ、物理的遮断因子、エピジェネティック動員因子、例えば、転写エンハンサーまたは転写リプレッサー、およびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子、例えば、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン修飾剤、またはヒストン脱アセチル化酵素、および前記のいずれかの組合せである。
追加のエフェクター活性は、転写または翻訳などの調節因子の活性をモジュレートするための結合性調節タンパク質も含み得る。エフェクター分子は、本明細書に記載の活性化因子または阻害剤（または「負のエフェクター」）機能も含み得る。別の例では、エフェクター分子は受容体への基質の結合を阻害し得、その活性化を阻害し得る、例えば、ナルトレキソンおよびナロキソンはオピオイド受容体に、それらを活性化することなく結合し、受容体のオピオイドと結合する能力を遮断する。エフェクター分子はまた、タンパク質の安定性／分解および／または転写物の安定性／分解もモジュレートし得る。例えば、ポリペプチド補因子であるユビキチンによりタンパク質に分解の印をつけることにより、タンパク質を分解の標的とすることができる。別の例では、エフェクター分子は酵素の活性部位を遮断することによって酵素活性を阻害する。例えば、メトトレキサートは、ジヒドロ葉酸レダクターゼに天然の基質よりも１０００倍大きく密接に結合する、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの補酵素であるテトラヒドロ葉酸の構造類似体であり、ヌクレオチド塩基合成を阻害する。
一部の実施形態では、エフェクター分子は化学物質、例えば、シトシン（Ｃ）またはアデニン（Ａ）をモジュレートする化学物質（例えば、亜硫酸水素Ｎａ、亜硫酸水素アンモニウム）である。一部の実施形態では、エフェクター分子は酵素活性を有する（メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）、デアミナーゼ）。一部の実施形態では、エフェクター分子はアンカー配列媒介性接続の形成またはＲＮＡポリメラーゼとプロモーターの結合を立体的に妨げる。
エフェクター活性を有するエフェクター分子は、本明細書に記載のＰＫ／ＰＤが低い小分子、ペプチド、融合タンパク質、核酸、ナノ粒子、アプタマー、または薬剤（ｐｈａｒｍａｃｏａｇｅｎｔ）のうちのいずれか１つであり得る。
一部の実施形態では、エフェクター分子は阻害剤または「負のエフェクター分子」である。アンカー配列媒介性接続の形成をモジュレートする負のエフェクター分子に関しては、一部の実施形態では、負のエフェクター分子は、負のエフェクター分子が存在すると、存在しない場合と比較して内因性の核形成ポリペプチドの二量体化が減少することを特徴とする。例えば、一部の実施形態では、負のエフェクター分子は、内因性の核形成ポリペプチドの二量体形成ドメインまたはその二量体形成部分のバリアントであるかまたはそれを含む。
例えば、ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブエフェクター、例えば、アンカー配列（例えば、ＣＴＣＦ結合性モチーフ）を認識し、それに結合するが、不活性（例えば、変異した）二量体形成ドメイン、例えば、機能的なアンカー配列媒介性接続を形成することができない二量体形成ドメインを有するタンパク質を使用することにより、アンカー配列媒介性接続を変更する（例えば、中断する）。例えば、ＣＴＣＦのジンクフィンガードメインを、特定のアンカー配列に結合するように変更することができる一方で（隣接核酸を認識するジンクフィンガーを付加することによって）、操作されたＣＴＣＦと内因性形態のＣＴＣＦの相互作用が妨げられるようにホモ二量体化ドメインを変更する。
一部の実施形態では、エフェクター分子は標的アンカー配列媒介性接続内のアンカー配列に対して選択された結合親和性を有する合成の接続核形成分子を含む（結合親和性は、標的アンカー配列と関連する内因性の接続核形成分子の親和性よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより高いまたは低いものであり得る。合成の接続核形成分子は、内因性の接続核形成分子に対して３０～９０％、３０～８５％、３０～８０％、３０～７０％、５０～８０％、５０～９０％のアミノ酸配列同一性を有し得る）。接続核形成分子は、例えば競合的結合を通じて、内因性の接続核形成分子とそのアンカー配列の結合を中断させ得る。一部のさらなる実施形態では、接続核形成分子を、アンカー配列媒介性接続内の新規のアンカー配列に結合するように操作する。
一部の実施形態では、ドミナントネガティブエフェクター分子は、特定のＤＮＡ配列を認識するドメイン（例えば、配列特異性を付与する配列に挟まれた、アンカー配列、ＣＴＣＦアンカー配列）、およびアンカリング配列の付近に立体的存在をもたらす第２のドメインを有する。第２のドメインは、ドミナントネガティブな接続核形成分子またはその断片、接続核形成分子配列認識に干渉するポリペプチド（例えば、ペプチド／核酸またはＰＮＡのアミノ酸骨格）、立体的干渉を付与する小分子とライゲーションした核酸配列、またはＤＮＡ認識エレメントと立体的遮断物の任意の他の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、エフェクター分子はエピジェネティック修飾剤である。本明細書に記載の方法および組成物に有用なエピジェネティック修飾剤としては、例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化、およびＲＮＡ関連サイレンシングに影響を及ぼす作用剤が挙げられる。一部の実施形態では、エフェクターはエピジェネティック酵素（例えば、エピジェネティックマーク、例えばアセチル化および／またはメチル化を生成または除去する酵素）を配列特異的に標的とする。例示的なエピジェネティックエフェクターは、例えば転写制御エレメントまたはアンカー配列を含む発現制御領域を、部位特異的標的化成分を含む部位特異的遮断剤によって標的とし得る。
一部の実施形態では、エフェクター分子は遺伝子編集系の１つまたは複数の構成成分を含む。遺伝子編集系の構成成分は、遺伝子編集を含むがこれだけに限定されない種々の状況において使用することができるものである。例えば、そのような構成成分を使用して、ＡＰＯＢ配列を物理的に改変する、遺伝子改変する、および／またはエピジェネティック的に改変する作用剤を標的とすることができる。
例示的な遺伝子編集系としては、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターに基づくヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲに基づく方法は、例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３１．７ （２０１３）： ３９７－４０５に記載されている；遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ法は、例えば、Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ： Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ． ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ２０１６ Ｊｕｌｙ ３０ ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］； Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｖｏｌ． ５７， Ｎｏ． ３， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４， ｐｐ． １１５－１２４；に記載されている。
ＣＲＩＳＰＲ系は、初めは細菌および古細菌において発見された適応性の防御系である。ＣＲＩＳＰＲ系では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼまたは「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼと称されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）が外来ＤＮＡを切断するために使用される。典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ配列を標的とする配列特異的な非コード「ガイドＲＮＡ」により、エンドヌクレアーゼが標的ヌクレオチド配列（例えば、配列が編集されるゲノム内の部位）に方向づけられる。３つのクラス（Ｉ～ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が同定されている。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系では、単一のＣａｓエンドヌクレアーゼ（複数のＣａｓタンパク質ではなく）が使用される。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系の１つは、Ｃａｓ９などのＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）を含む。ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応する、一般には約２０ヌクレオチドのＲＮＡ配列である「ガイドＲＮＡ」を含有する。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合して部分的に二本鎖の構造を形成する領域も含有し、当該領域がＲＮａｓｅ ＩＩＩによって切断され、それにより、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが生じる。次いで、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドによりＣａｓ９エンドヌクレアーゼが標的ＤＮＡ配列を認識し、切断するように方向づけられる。標的ＤＮＡ配列は、一般に、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに特異的である「プロトスペーサー隣接モチーフ」（「ＰＡＭ」）に隣接していなければならない；しかし、ＰＡＭ配列は所与のゲノム全体を通して出現する。種々の原核生物種から同定されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは特有のＰＡＭ配列要件を有する；ＰＡＭ配列の例としては、５’－ＮＧＧ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、５’－ＮＮＡＧＡＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１）、５’－ＮＧＧＮＧ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ３）、および５’－ＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）が挙げられる。一部のエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼはＧに富むＰＡＭ部位、例えば５’－ＮＧＧに関連し、ＰＡＭ部位の３ヌクレオチド上流（５’側）の場所において標的ＤＮＡの平滑末端切断を行う。別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ９よりも小さいＶ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含む；例としては、ＡｓＣｐｆ１（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来）およびＬｂＣｐｆ１（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイはｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる；言い換えれば、Ｃｐｆ１系では、標的ＤＮＡ配列を切断するためにＣｐｆ１ヌクレアーゼおよびｃｒＲＮＡのみが必要である。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼはＴに富むＰＡＭ部位、例えば５’－ＴＴＮと関連する。Ｃｐｆ１は５’－ＣＴＡ ＰＡＭモチーフも認識する。Ｃｐｆ１は、４ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドの５’突出を伴うオフセットまたは互い違いの二本鎖切断を導入することによって標的ＤＮＡを切断する、例えば、コード鎖のＰＡＭ部位の１８ヌクレオチド下流（３’側）および相補鎖のＰＡＭ部位の２３ヌクレオチド下流に位置する５ヌクレオチドのオフセットまたは互い違いの切断で標的ＤＮＡを切断する；そのようなオフセット切断の結果生じる５ヌクレオチド突出により、平滑末端切断ＤＮＡにおける挿入によるよりも相同組換えによるＤＮＡ挿入による正確なゲノム編集が可能になる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｃｅｌｌ， １６３： ７５９－７７１を参照されたい。
種々のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子またはタンパク質を本発明に使用することができ、Ｃａｓタンパク質の選択は方法の特定の条件に依存する。
Ｃａｓタンパク質の特定の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、ＣａｓｌＯ、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、またはＣ２Ｃ３を含むクラスＩＩ系が挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質は種々の原核生物種のいずれに由来するものであってもよい。一部の実施形態では、特定のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するように、特定のＣａｓタンパク質、例えば、特定のＣａｓ９タンパク質を選択する。一部の実施形態では、部位特異的標的化成分は、ポリペプチド、例えば酵素、例えばＣａｓ９を標的とする配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質を細菌または古細菌から得ることもでき、公知の方法を使用して合成することもできる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はグラム陽性菌またはグラム陰性菌に由来し得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｃｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、またはＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒに由来するものであってよい。一部の実施形態では、例えば、同じ、同様のまたは異なるＰＡＭモチーフを含む部位の認識および改変を可能にするために、２つもしくはそれよりも多くの異なるＣａｓタンパク質または２つもしくはそれよりも多くのＣａｓタンパク質をコードする核酸を細胞、接合子、胚、または動物に導入することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼが不活化されるように改変されたもの、例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９、および転写活性化因子またはリプレッサー、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌの共サブユニット、ＶＰ６４、ｐ６５の活性化ドメイン、ＫＲＡＢ、またはＳＩＤ４Ｘを動員するように改変されたもの、エピジェネティック修飾を誘導するように改変されたもの、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよびＤＮＡの脱メチル化において役割を有する酵素（例えば、ＴＥＴファミリー酵素は、５－メチルシトシンの５－ヒドロキシメチルシトシンおよびより高次の酸化誘導体への酸化を触媒する）である。
遺伝子編集のために、ＣＲＩＳＰＲアレイを、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ配列を含有するように設計することができる；例えば、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９：８１９－８２３； Ｒａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ８：２２８１－２３０８を参照されたい。Ｃａｓ９ではＤＮＡ切断を生じさせるために少なくとも約１６または１７ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列が必要であり、Ｃｐｆ１に関しては検出可能なＤＮＡ切断を実現するために少なくとも約１６ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列が必要である。
野生型Ｃａｓ９はｇＲＮＡにより標的とされる特定のＤＮＡ配列における二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせるが、機能性が改変されたいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが利用可能であり、例えば、Ｃａｓ９の「ニッカーゼ」バージョンは一本鎖切断のみを生じさせ、触媒として不活性なＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は標的ＤＮＡをカットしないが、立体的障害によって転写に干渉する。ｄＣａｓ９を異種エフェクターとさらに融合して、標的遺伝子の発現を抑止する（ＣＲＩＳＰＲｉ）または活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ）ことができる。例えば、Ｃａｓ９を転写サイレンサー（例えば、ＫＲＡＢドメイン）または転写活性化因子（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合物）と融合することができる。Ｆｏｋ１ヌクレアーゼと融合した触媒として不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）（「ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ」）を使用して、２つのｇＲＮＡと相同な標的配列においてＤＳＢを生じさせることができる。例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ａｄｄｇｅｎｅ、７５ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔ．、Ｓｕｉｔｅ ５５０Ａ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ ０２１３９； ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ）に開示されており、公的に入手可能な多数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを参照されたい。それぞれが別々のガイドＲＮＡによって方向づけられる２つの別々の二本鎖切断を導入する「２重ニッカーゼ」Ｃａｓ９が、より正確なゲノム編集を実現するものとしてＲａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｃｅｌｌ， １５４： １３８０－１３８９に記載されている。
真核生物の遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ技術は、米国特許出願公開第２０１６／０１３８００８Ａ１号およびＵＳ２０１５／０３４４９１２Ａ１、ならびに米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９９９，６４１号、同第８，９９３，２３３号、同第８，８９５，３０８号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８８９，４１８号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，９３２，８１４号、同第８，７９５，９６５号、および同第８，９０６，６１６号に開示されている。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび対応するガイドＲＮＡおよびＰＡＭ部位は米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３ Ａ１号に開示されている。
一部の実施形態では、エフェクターは本明細書で前記のＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数の構成成分を含む。
一部の実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切なエフェクターとしては、例えば、ヌクレアーゼ、物理的遮断因子、エピジェネティック動員因子、例えば、転写エンハンサーまたは転写リプレッサー、およびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子、例えば、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン修飾剤、またはヒストン脱アセチル化酵素、および前記のいずれかの組合せが挙げられる。
例示的なエフェクターとしては、ユビキチン、ユビキチンリガーゼ阻害剤のような二環式ペプチド、転写因子、ＤＮＡおよびタンパク質修飾酵素、例えば、トポイソメラーゼ、トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＭＴファミリー（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ）などのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、タンパク質－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）、デアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢ ＥＣ、ＵＧ１）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、ゼステホモログ２（ＥＺＨ２）のエンハンサー、ＰＲＭＴ１、ヒストン－リシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、真性染色質ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、およびＧ９ａ）、ヒストン脱アセチル化酵素（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３）、ＤＮＡの脱メチル化において役割を有する酵素（例えば、ＴＥＴファミリー酵素は、５－メチルシトシンの５－ヒドロキシメチルシトシンおよびより高次の酸化誘導体への酸化を触媒する）、ＫＤＭＩＡおよびリシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）などのタンパク質デメチラーゼ、ＤＨＸ９などのヘリカーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、脱アセチル化酵素（例えば、サーチュイン１、２、３、４、５、６、または７）、キナーゼ、ホスファターゼ、臭化エチジウム、ｓｙｂｒグリーン、およびプロフラビンなどのＤＮＡ挿入剤、ペプチド模倣体様フェニルアラニンアルギニル－ナフチルアミドまたはキノリン誘導体、核受容体活性化因子および阻害剤などの排出ポンプ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、リソソーム蓄積症に関与するものなどの酵素の競合阻害剤、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、ＫＲＡＢドメイン、ＶＰ６４ドメイン、ｐ３００ドメイン（例えば、ｐ３００コアドメイン）、ＭｅＣＰ２ドメイン、ＭＱ１ドメイン、ＤＮＭＴ３ａ－３Ｌドメイン、ＴＥＴ１ドメイン、および／またはＴＥＴ２ドメインなどのタンパク質由来の特定のドメイン、タンパク質合成阻害剤、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、これらの１つまたは複数の融合物（例えば、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ、ｄＣａｓ９－ＡＰＯＢ ＥＣ、ｄＣａｓ９－ＵＧｌ、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＣａｓ９－ｐ３００コア、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ｄＣａｓ９－ＭＱ１、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ－３Ｌ、およびｄＣａｓ９－ＴＥＴ１／ＴＥＴ２）が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切なヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドまたは酵素的に活性なその一部を含む。一実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドまたは酵素的に活性なその一部は、ヒトエキソヌクレアーゼ１（ｈＥＸＯ１）の触媒として活性なドメイン、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および／またはＲＮａｓｅ Ｈ活性をさらに含む。他の実施形態では、適切なヌクレアーゼは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。さらに他の実施形態では、適切なヌクレアーゼはジンクフィンガータンパク質を含む。
ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書で使用される場合、広範なものであり、別のＴＡＬＥＮの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語は、また、共に働いて同じ部位のＤＮＡを切断する操作されたＴＡＬＥＮの対の一方のメンバーまたは両方のメンバーを指すようにも使用される。共に働くＴＡＬＥＮは、左側ＴＡＬＥＮおよび右側ＴＡＬＥＮと称される場合があり、これはＤＮＡの掌性に言及するものである。全てその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／９６５，５９０；ＵＳＳＮ１３／４２６，９９１（ＵＳ８，４５０，４７１）；ＵＳＳＮ１３／４２７，０４０（ＵＳ８，４４０，４３１）；ＵＳＳＮ１３／４２７，１３７（ＵＳ８，４４０，４３２）；およびＵＳＳＮ１３／７３８，３８１を参照されたい。
ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌によって分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸は例外として高度に保存された３３～３４アミノ酸の配列を含有する。これらの２つの場所は高度に可変性であり（反復可変二残基（ＲＶＤ））、特定のヌクレオチド認識との強力な相関を示す。アミノ酸配列とＤＮＡ認識のこの単純な関連性により、適当なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組合せを選択することによって特定のＤＮＡ結合ドメインを操作することが可能になっている。
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの末端由来の非特異的ＤＮＡ切断ドメインを使用して、酵母アッセイにおいて活性なハイブリッドヌクレアーゼを構築することができる。これらの試薬は、植物細胞および動物細胞においても活性である。最初のＴＡＬＥＮ試験では、野生型ＦｏｋＩ切断ドメインを使用したが、一部のその後のＴＡＬＥＮ試験では、切断特異性および切断活性が改善されるように設計された変異を有するＦｏｋＩ切断ドメインバリアントも使用した。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、標的ゲノム内の部位に対する特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を適当な配向および間隔で必要とする。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインの間のアミノ酸残基の数および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基の数はどちらも高レベルの活性の実現に関するパラメータである。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインの間のアミノ酸残基の数は、複数のＴＡＬエフェクターリピート配列とＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインの間にスペーサー（スペーサー配列とは別個のもの）を導入することによって改変することができる。スペーサー配列は、１２ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間であり得る。
アミノ酸配列とＴＡＬＥＮ結合ドメインによるＤＮＡ認識との間の関連性により、設計可能なタンパク質が可能になる。この場合、ＴＡＬＥ結合ドメイン内で反復配列の不適当なアニーリングが見いだされるので、人工的な遺伝子合成には問題がある。これの解決法の１つは、公的に入手可能なソフトウェアプログラム（ＤＮＡＷｏｒｋｓ）を使用して、二段階ＰＣＲ；オリゴヌクレオチドアセンブリ、その後、全遺伝子増幅でのアセンブリに適したオリゴヌクレオチドの算出を行うことである。操作されたＴＡＬＥ構築物を生成するためのいくつかのモジュラーアセンブリスキームも報告されている。どちらの方法も、ジンクフィンガーＤＮＡ認識ドメインを生成するためのモジュラーアセンブリ方法と概念的に同様のＤＮＡ結合ドメインを操作するための系統的手法をもたらすものである。
ＴＡＬＥＮ遺伝子がアセンブリされたら、それらをプラスミドに挿入する；次いで、プラスミドを使用して標的細胞にトランスフェクトし、そこで遺伝子産物が発現し、核内に進入してゲノムにアクセスする。ＴＡＬＥＮを使用して、細胞が修復機構で応答する二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによってゲノムを編集することができる。このように、ＴＡＬＥＮを、例えば、疾患を引き起こすゲノム内の変異を補正するために使用することができる。
本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーポリペプチド」または「ジンクフィンガータンパク質」は、ジンクフィンガーとして公知の金属により安定化されたドメインによってＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質に配列特異的に結合するタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ切断ドメインおよびＤＮＡ結合性ジンクフィンガードメインを有するヌクレアーゼである。ジンクフィンガーポリペプチドは、エンドヌクレアーゼの非特異的ＤＮＡ切断ドメインと部位特異的ＤＮＡ結合性ジンクフィンガードメインを融合することによって作製することができる。そのようなヌクレアーゼは、遺伝子編集のための強力なツールであり、ゲノムＤＮＡ内に二本鎖切断（ＤＳＢ）を部位特異的に誘導するためにアセンブリすることができる。ＺＦＮにより、ＤＮＡ修復の間の特定の遺伝子破壊が可能になり、標的とする遺伝子を変異原性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって中断すること、または、密接に関連するＤＮＡ鋳型が供給される場合には相同組換え（ＨＲ）によって改変することができる。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの非特異的ＤＮＡ切断ドメインと部位特異的ＤＮＡ結合性ジンクフィンガードメインを融合することによって作製されたキメラ酵素である。ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）の柔軟な性質に起因して、ゲノムＤＮＡ内に二本鎖切断（ＤＳＢ）を部位特異的に誘導するＺＦＮをアセンブルすることができる。ＺＦＮにより、ＤＮＡ修復の間の特定の遺伝子破壊が可能になり、標的とする遺伝子を変異原性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって中断すること、または、密接に関連するＤＮＡ鋳型が供給される場合には相同組換え（ＨＲ）によって改変することができる。
一部の実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切な物理的遮断因子は、ｇＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、または転写制御エレメントまたはアンカリング配列を立体的に遮断する三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（発現制御単位を標的とし得る）を含む。ｇＲＮＡは特定のＤＮＡ配列を認識し、例えば接続核形成分子配列に干渉して、立体的遮断物として作用する配列をさらに含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡを、立体的存在として作用する１つまたは複数のペプチド、例えばＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と組み合わせる。他の実施形態では、物理的遮断因子は、酵素的に不活性なＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片（例えば、ｄＣａｓ９）を含む。
一実施形態では、エピジェネティック動員因子により、標的遺伝子の転写を活性化させるまたは増強する。一部の実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切なエピジェネティック動員因子は、ＶＰ６４ドメインまたはｐ３００コアドメインを含む。
一実施形態では、エピジェネティック動員因子により、標的遺伝子の転写をサイレンシングするまたは抑止する。一部の実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切なエピジェネティック動員因子は、ＫＲＡＢドメイン、またはＭｅＣＰ２ドメインを含む。
一実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切なエピジェネティック動員因子は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合物、ｄＣａｓ９－ｐ３００コア融合物、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合物、またはｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２融合物を含む。
本明細書で使用される場合、「ＶＰ６４」は、グリシン－セリン（ＧＳ）リンカーで接続したＶＰ１６（単純ヘルペスウイルスタンパク質１６、アミノ酸４３７～４４７＊：ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ）の４つのタンデムなコピーで構成される転写活性化因子である。一実施形態では、ＶＰ６４は、Ｃ末端に転写因子ｐ６５およびＲｔａをさらに含む。
本明細書で使用される場合、「ｐ３００コアドメイン」は、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００の触媒コアを指す。
本明細書で使用される場合、「ＫＲＡＢ」は、ヒトジンクフィンガータンパク質に基づく転写因子（ＫＲＡＢジンクフィンガータンパク質）内に存在するクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）転写抑止ドメインを指す。
本明細書で使用される場合、「ＭｅＣｐ２」は、例えば、メチル化ＤＮＡを含むプロモーターに結合することによって転写を抑止するメチルＣｐＧ結合性タンパク質２を指す。
一実施形態では、エピジェネティックＣｐＧ修飾因子によりＤＮＡをメチル化し、転写を不活化するまたは抑止する。一部の実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切なエピジェネティックＣｐＧ修飾因子は、ＭＱ１ドメインまたはＤＮＭＴ３ａ－３Ｌドメインを含む。
一実施形態では、エピジェネティックＣｐＧ修飾因子によりＤＮＡを脱メチル化し、転写を活性化するまたは刺激する。一部の実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切なエピジェネティック動員因子は、ＴＥＴ１またはＴＥＴ２ドメインを含む。
本明細書で使用される場合、「ＭＱ１」は、原核生物ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＭＴ３ａ－３Ｌ」は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであるＤｎｍｔ３ａと、触媒として不活性であるがＤｎｍｔ３ａの触媒ドメインと直接相互作用するＤｎｍｔ３Ｌの融合物を指す。
本明細書で使用される場合、「ＴＥＴ１」は、ＴＥＴ１遺伝子によってコードされるＴＥＴファミリーの酵素のメンバーである「１０－１１転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ１」を指す。ＴＥＴ１は、哺乳動物における活性なＤＮＡの脱メチル化の最初のステップである、修飾されたＤＮＡ塩基５－メチルシトシン（５－ｍＣ）の５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ）への、鉄およびアルファ－ケトグルタル酸依存的な５－ｍＣの酸化による変換を触媒するジオキシゲナーゼである。シトシン塩基のＣ５位におけるメチル化は、転写調節において重要な役割を果たす哺乳動物ゲノムのエピジェネティック修飾である。ＤＮＡの脱メチル化におけるその役割に加えて、クロマチン調節においてより一般的な役割を果たす。転写的に活性な遺伝子およびポリコームにより抑止された遺伝子の両方のプロモーターのＣｐＧに富む配列に優先的に結合する。活性な遺伝子のＣｐＧに富む転写開始部位へのＯ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＯＧＴの動員に関与し、それにより、ＯＧＴによるヒストンＨ２Ｂ ＧｌｃＮＡｃ化を促進する。例示的なＴＥＴ１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０３０６２５．３、ＮＰ＿０８５１２８．２に見いだすことができる。
本明細書で使用される場合、「ＴＥＴ２」は、ＴＥＴ１遺伝子によってコードされるＴＥＴファミリーの酵素のメンバーである「１０－１１転座２（ＴＥＴ２）」を指す。ＴＥＴ１と同様に、ＴＥＴ２は、修飾されたゲノム塩基５－メチルシトシン（５ｍＣ）の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）への変換を触媒するジオキシゲナーゼであり、活性なＤＮＡの脱メチル化において重要な役割を果たす。ＴＥＴ２はＣｐＧモチーフ内の５－ヒドロキシメチルシトシンを優先。ＴＥＴ２はまた、その後の５ｈｍＣの５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）への変換、および５ｆＣの５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）への変換も媒介する。５ｍＣの５ｈｍＣ、５ｆＣおよび５ｃａＣへの変換は、おそらくシトシン脱メチル化の第１のステップを構成する。シトシン塩基のＣ５位におけるメチル化は、転写調節において重要な役割を果たす哺乳動物ゲノムのエピジェネティック修飾である。ＤＮＡの脱メチル化におけるその役割に加えて、活性な遺伝子のＣｐＧに富む転写開始部位へのＯ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＯＧＴの動員にも関与し、それにより、ＯＧＴによるヒストンＨ２Ｂ ＧｌｃＮＡｃ化を促進する。例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１１２７２０８．２、ＮＰ＿００１１２０６８０．１に見いだすことができる。
一部の実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切なエピジェネティック動員因子は、ＭＱ１ドメイン、ＤＮＭＴ３ａ－３Ｌ、ＴＥＴ１またはＴＥＴ２ドメインを含む。一実施形態では、本発明の作用剤、組成物、および方法に使用するための適切なエピジェネティック動員因子は、ｄＣａｓ９－ＭＱ１融合物、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ－３Ｌ融合物、またはｄＣａｓ９－ＴＥＴ１融合物またはｄＣａｓｅ９－ＴＥＴ２融合物を含む。
ＩＩＩ．本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤および本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を含む組成物の送達
本発明の遮断剤の、細胞、例えばヒト対象（例えば、ＡｐｏＢ関連障害、例えば硬変症を有する対象などの、それを必要とする対象）などの対象内の細胞への送達は、いくつかの異なるやり方で実現することができる。例えば、細胞に本発明の遮断剤をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで接触させることによって送達を実施することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ送達は、遮断剤を含む脂質組成物などの組成物を対象に投与することによって直接実施することができる。あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏ送達を、遮断剤をコードし、その発現を方向づける１つまたは複数のベクターを投与することによって間接的に実施することができる。これらの代替を下でさらに考察する。
一部の実施形態では、遮断剤は、融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、融合タンパク質は、ＡＰＯＢ発現制御領域を特異的に標的とし、それに結合する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ポリペプチドまたはジンクフィンガー（ＺＮＦ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片をコードするポリヌクレオチドなどの部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分と、ＶＰＲなどのエフェクター分子とを含む。
他の実施形態では、遮断剤は、ガイドＲＮＡおよびエフェクター分子をコードするｍＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡとｍＲＮＡの比は、約１００：１～約１：１００（ｗｔ：ｗｔ）であり得る。
一般に、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を送達する任意の方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏ）を本発明の遮断剤との使用に適応させることができる（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｋｈｔａｒ Ｓ． ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．， （１９９２） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２ （５） ： １３９－１４４およびＷＯ９４／０２５９５を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏ送達に関しては、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤の送達のために考慮すべき因子としては、例えば、遮断剤の生物学的安定性、非特異的影響の防止、および標的組織内への遮断剤の蓄積が挙げられる。遮断剤の非特異的影響は、局部投与によって、例えば、組織に直接注射するかもしくは埋め込むこと、または遮断剤を含む組成物を局所に投与することによって最小化することができる。処置部位への局部投与により、遮断剤の局部濃度が最大になり、そうでなければ遮断剤によって害される恐れがあるかまたは遮断剤が分解される恐れがある、全身組織への遮断剤の曝露が制限され、投与される遮断剤の総用量を少なくすることが可能になる。
ＡＰＯＢ関連疾患などの疾患を処置するために部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を全身性に投与することに関しては、遮断剤、例えば、核酸分子を含む部位特異的標的化成分を含む遮断剤を改変すること、あるいは薬物送達システムを使用して送達することができる；どちらの方法も、核酸分子を含む部位特異的標的化成分がｉｎ ｖｉｖｏでエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって迅速に分解されることを防ぐように作用する。核酸分子を含む部位特異的標的化成分を含む遮断剤または医薬担体の改変により、遮断剤を標的組織にターゲティングすることおよび望ましくないオフターゲットの影響を回避することも可能になる。例えば、本発明の遮断剤を、細胞内取り込みを増強し、分解を防ぐために、コレステロールなどの親油基への化学的なコンジュゲーションによって改変することができる。
あるいは、本発明の遮断剤を、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達することができる。正に荷電したカチオン性送達系では、遮断剤（例えば、負に荷電した分子）の結合が容易になり、また、負に荷電した細胞膜における相互作用も増強されて、細胞による遮断剤の効率的な取り込みが可能になる。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーを、遮断剤と結合させること、または遮断剤を包む小胞もしくはミセルを形成するように誘導することができる（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ． ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９ （２） ： １０７－１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成により、さらに、全身性に投与された場合の遮断剤の分解が防止される。カチオン性複合体を作製し、投与するための方法は十分に当業者の能力の範囲内に入る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｏｒｅｎｓｅｎ， ＤＲ．， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ ３２７： ７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ， ＵＮ． ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ９： １２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ， ＡＳ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｊ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ． ２５： １９７－２０５を参照されたい）。本発明の遮断剤の全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， ＤＲ．， ｅｔ ａｌ （２００３）， ｓｕｐｒａ；Ｖｅｒｍａ， ＵＮ． ｅｔ ａｌ．， （２００３）， ｓｕｐｒａ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， ＴＳ． ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１： １１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ， ＰＹ． ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２： ３２１－３２８； Ｐａｌ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｉｎｔ Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ２６： １０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ． ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ； Ａｉｇｎｅｒ， Ａ． （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ， Ｓ． （２００６） Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ． ３： ４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ， ＤＡ． ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ３５： ６１－６７； Ｙｏｏ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １６： １７９９－１８０４）が挙げられる。一部の実施形態では、全身投与のために、遮断剤（例えば、ｇＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）をシクロデキストリンとの複合体にする。シクロデキストリンを投与するための方法およびシクロデキストリンを含む医薬組成物は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２７，６０５号に見いだすことができる。
本発明の遮断剤を投与に適した医薬組成物に組み入れることができる。そのような組成物は、一般には、１つまたは複数の種の遮断剤および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という語は、医薬投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および作用剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、の組成物へのそれらの使用が意図されている。補足的な活性化合物を組成物に組み入れることもできる。
本発明の医薬組成物は、局部的処置が望まれるかまたは全身処置が望まれるかに応じて、および処置される領域に応じて、いくつかのやり方で投与することができる。投与は、局所（点眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮）、経口、または非経口であり得る。非経口投与は、点滴静注、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、または髄腔内もしくは脳室内投与を含む。
投与の経路および部位は、部位特異的標的化成分を含む遮断剤の特定の場所への送達またはターゲティングが増強されるように選択することができる。例えば、肝細胞を標的とするためには、静脈内注射を使用することができる。肺細胞は遮断剤をエアロゾル形態で投与することによって標的とすることができる。空腸細胞は肛門への投与によって標的とすることができる。
局所投与用の製剤としては、経皮吸収パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤（ｌｉｑｕｉｄ）、および散剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であり得るまたは望ましい。コーティングされたコンドーム、手袋なども有用であり得る。
経口投与用の組成物としては、散剤または顆粒剤、水中懸濁剤または液剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、シロップ剤、エリキシル剤または非水性媒体、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、またはトローチ剤が挙げられる。錠剤の場合では、使用することができる担体として、ラクトース、クエン酸ナトリウムおよびリン酸の塩が挙げられる。デンプン、ならびにステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤などの種々の崩壊剤が錠剤に一般に使用される。カプセル剤形態での経口投与に関しては、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量のポリエチレングリコールである。経口使用のために水性懸濁剤が必要な場合には、核酸組成物を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせることができる。所望であれば、ある特定の甘味剤または香味剤を添加することができる。
静脈内投与用の組成物は、バッファー、希釈剤、および他の適切な添加剤も含有し得る滅菌水性液剤を含み得る。
非経口投与用の製剤は、バッファー、希釈剤、および他の適切な添加剤も含有し得る滅菌水性液剤を含み得る。静脈内使用に関しては、調製物を等張にするように溶質の総濃度を制御することができる。
一実施形態では、本発明の遮断剤組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとしてまたは拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡的、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻腔内、尿道、または眼である。投与は、対象によって、または別の人、例えば、健康管理提供者によってもたらされる。組成物は、正確に測られた用量で、または正確に測られた用量を送達するディスペンサー中に入れて提供することができる。選択される送達方式を下でより詳細に考察する。
ある特定の実施形態では、本発明の遮断剤はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドであり、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。
Ａ．本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を含む組成物
本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を、（１）安定性を増大させるため；（２）細胞トランスフェクションを増加させるため；（３）持続放出もしくは遅延放出（例えば、デポ製剤からの）を可能にするため；（４）体内分布を変更するため（例えば、遮断剤を特定の組織もしくは細胞型にターゲティングするため）；（５）コードされるタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳を増加させるため；および／または（６）コードされるタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの放出プロファイルを変更するために、１つまたは複数の賦形剤を使用して医薬組成物などの組成物へと製剤化することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクルなどの従来の賦形剤に加えて、本発明の組成物に使用するための分散または懸濁補助剤、表面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤として、限定することなく、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、核酸分子、修飾された核酸分子、またはＲＮＡをトランスフェクトした細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物およびこれらの組合せを挙げることができる。したがって、本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の賦形剤を、それぞれ、一緒になって遮断剤の安定性を増大させる、遮断剤による細胞トランスフェクションを増加させる、修飾された核酸またはｍＲＮＡにコードされるタンパク質の発現を増加させる、および／または遮断剤の放出プロファイルを変更する量で含み得る。さらに、本発明の遮断剤は、自己組織化核酸ナノ粒子を使用して製剤化することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００３８６１２Ａ１号を参照されたい）。
ｉ．リピドイド
リピドイドの合成は、広範囲にわたって記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、核酸分子を含む、例えば、修飾された核酸分子またはｍＲＮＡを含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤などの本発明の遮断剤の送達に特に適する（全てそれらの全体が本明細書に組み込まれるＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２０１０ ２１： １４４８－１４５４； Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． ２０１０ ２６７： ９－２１； Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８ ２６： ５６１－５６９； Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１ ０ １０７： １８６４－１８６９； Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１１１０８： １２９９６－３００１を参照されたい）。
例えば、リピドイドは、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子、一本鎖核酸分子、修飾された核酸分子または修飾されたｍＲＮＡを有効に送達するために使用されている（例えば、米国特許公開第２０１６／００３８６１２Ａ１号を参照されたい）。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソームまたは粒子を調製し、したがって、核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分の有効な送達をもたらすことができ、これは、リピドイド製剤を例えば局部投与および／または全身投与によって投与した後のコードされるタンパク質の産生によって判断される。リピドイド複合体は、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路または皮下経路を含むがこれだけに限定されない種々の手段によって投与することができる。
例えば核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分のｉｎ ｖｉｖｏ送達は、製剤の組成、粒子ＰＥＧ化の性質、負荷の度合い、ポリヌクレオチドと脂質の比、および、これだけに限定されないが、粒子サイズなどの生物物理的パラメータを含むがこれだけに限定されない多くのパラメータの影響を受け得る（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００９ １７： ８７２－８７９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長の小さな変化により、ｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性に対する有意な影響が生じ得る。ペンタ［３－（１－ラウリルアミノプロピオニルＩ）］－トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ－５ＬＡＰ；別名９８ＮＩ２－５、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＭｕｒｕｇａｉａｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４０１： ６１ （２０１０）を参照されたい）、Ｃ１２－２００（誘導体およびバリアントを含む）、およびＭＤ１を含むがこれだけに限定されない、異なるリピドイドを用いた製剤を使用することができる。
一実施形態では、例えば核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を、リピドイドを用いて、肝臓の細胞を標的とするための全身静脈内投与用に製剤化する。例えば、核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤、および４２％９８ＮＩ２－５、４８％コレステロール、および１０％ＰＥＧ－脂質のモル組成の脂質を含み、総脂質と核酸分子の最終的な重量比が約７．５：１であり、ＰＥＧ脂質上のアルキル鎖長がＣ１４であり、平均粒子サイズが大まかに５０～６０ｎｍである最終的な最適化された静脈内製剤では、肝臓に対して９０％を超える製剤の分布がもたらされ得る（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００９ １７： ８７２－８７９を参照されたい）。別の例では、Ｃ１２－２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧのモル比が５０／１０／３８．５／１．５であり、総脂質と核酸分子の重量比が７：１であり、平均粒子サイズが８０ｎｍである、Ｃ１２－２００リピドイド（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／１２９７０９号を参照されたい）を使用した静脈内製剤を使用して、核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を肝細胞に送達することができる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＬｏｖｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１０ １０７： １８６４－１８６９を参照されたい）。別の実施形態では、ＭＤ１リピドイドを含有する製剤を使用して、核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤をｉｎ ｖｉｖｏで肝細胞に有効に送達することができる。筋肉内または皮下経路用の最適化されたリピドイド製剤の特徴は標的細胞型および製剤の細胞外マトリックスを通じて血流中に拡散する能力に応じて有意に変動し得る。有効な肝細胞への送達のためには、内皮窓のサイズに起因して、１５０ｎｍ未満の粒子サイズが所望であり得るが（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００９ １７： ８７２－８７９を参照されたい）、内皮細胞、骨髄性細胞、および筋肉細胞を含むがこれだけに限定されない他の細胞型に製剤を送達するためのリピドイドにより製剤化された核酸分子の使用は同様にサイズが限定されない場合がある。骨髄性細胞および内皮などの他の肝細胞ではない細胞にｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８２６： ５６１－５６９； Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１１ ２９： １００５－１０１ ０；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． Ａｄｖ． Ｆｕｎｃｔ． Ｍａｔｅｒ． ２００９ １９ ： ３１１２－３１１８； ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｕｄａｈ Ｆｏｌｋｍａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ． Ｏｃｔ． ８－９， ２０１０を参照されたい）。単球などの骨髄性細胞への送達に関して、リピドイド製剤は同様の構成成分のモル比を有し得る。肝細胞、骨髄性細胞、筋肉細胞などを含むがこれだけに限定されない異なる細胞型への送達のために製剤を最適化するために、異なる比のリピドイドならびにジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ－ＤＭＧを含むがこれだけに限定されない他の構成成分を使用することができる。例えば、構成成分モル比としては、これだけに限定されないが、５０％ＣＩ２－２００、１０％ジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％コレステロール、および１．５％ＰＥＧ－ＤＭＧを挙げることができる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＬｅｕｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１１ ２９： １００５－１０１ ０を参照されたい）。細胞（例えば、これだけに限定されないが、脂肪細胞および筋肉細胞など）への皮下送達、皮内送達または筋肉内送達のいずれかによる局部送達のためのリピドイド製剤の使用では、全身送達のために所望の製剤の構成成分の全てが必要であるとは限らない場合があり、したがって、リピドイドおよび本明細書に記載の例えば核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む含む遮断剤のみを含む場合がある。
細胞トランスフェクションを増加させることおよび／または含有されるコードされるタンパク質の翻訳を増加させることによって製剤の有効性を改善するために、異なるリピドイドの組合せを使用することができる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２０１１， １９： １６８８－１６９４を参照されたい）。
一実施形態では、アルクラミン（ａｌｋｌａｍｉｎｅ）のアクリレートへの共役付加によってリピドイドを調製することができる。非限定的な例として、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１４／０２８４８７号に記載されている方法によってリピドイドを調製することができる。一実施形態では、リピドイドは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１４／０２８４８７号に記載されている式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）または式（Ｖ）を有する化合物を含み得る。一実施形態では、リピドイドは生分解性であり得る。
ｉｉ．リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
本発明の遮断剤を、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。一実施形態では、本発明の医薬組成物はリポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層で構成され、栄養分および医薬製剤を投与するための送達ビヒクルとして使用することができる人工的に調製された小胞である。リポソームは、これだけに限定されないが、直径が数百ナノメートルであり得、狭い水性区画で区切られた一連の同心二重層を含有し得る多重膜小胞（ＭＬＶ）、直径が５０ｎｍよりも小さいものであり得る小型単細胞小胞（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＳＵＶ）、および直径が５０ｎｍから５００ｎｍの間であり得る大型単層小胞（ＬＵＶ）などの、サイズが異なるものであり得る。リポソーム設計としては、これだけに限定されないが、健康でない組織へのリポソームの付着を改善するため、またはこれだけに限定されないがエンドサイトーシスなどのイベントを活性化するためのオプソニンまたはリガンドを挙げることができる。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために低ｐＨまたは高ｐＨを含有し得る。リポソームの形成は、これだけに限定されないが、封入された医薬製剤およびリポソーム成分などの物理化学的特徴、脂質小胞を分散させる媒体の性質、封入された物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および／または送達に伴う任意の追加のプロセス、最適化サイズ、意図された適用のための小胞の多分散性および貯蔵寿命、ならびにバッチ間の再現性および安全かつ効率的なリポソーム製品の大規模生産の可能性に依存し得る。
非限定的な例として、合成膜小胞などのリポソームを、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１７７６３８号、同第２０１３／０１７７６３７号、同第２０１３／０１７７６３６号、同第２０１／３０１７７６３５号、同第２０１３／０１７７６３４号、同第２０１３／０１７７６３３号、同第２０１３／０１８３３７５号、同第２０１３／０１８３３７３号、同第２０１３／０１８３３７２号および同第２０１６／００３８６１２号）ならびにＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている方法、器具およびデバイスによって調製することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物としては、限定することなく、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈ．）のＤｉＬａ２リポソーム、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、およびＭＣ３から形成されたものなどのリポソーム（ＵＳ２０１００３２４１２０；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ならびにこれだけに限定されないが、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ、Ｐａ．）のＤＯＸＩＬ（登録商標）などの、小分子薬物を送達することができるリポソームを挙げることができる。一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物としては、限定することなく、以前に記載されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるオリゴヌクレオチド送達に適することが示されている安定化されたプラスミド－脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化された核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成により形成されたものなどのリポソームを挙げることができる（それぞれの内容全体が本明細書に組み込まれるＷｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． １９９９ ６： ２７１－２８１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． １９９９６： １４３８－１４４７；Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２００５ ２２： ３６２－３７２；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ ２： １００２－１００７；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ． ２００６ ４４１： １１１－１１４；Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ． ２００５ １０７ ：２７６－２８７；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２０１０ ２８： １７２－１７６；Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００９ １１９： ６６１－６７３；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００８ １９： １２５－１３２；米国特許出願公開第２０１３／０１２２１０４号、同第２０１３／０３０３５８７号、および同第２０１６／００３８６１２号を参照されたい）。Ｗｈｅｅｌｅｒらによる当初の製造方法は界面活性剤透析法であり、これが後にＪｅｆｆｓらによって改善され、自発性小胞形成法と称されている。本発明のリポソーム製剤は、部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤に加えて３～４つの脂質構成成分で構成されたものであり得る。例として、本発明のリポソームは、これだけに限定されないが、Ｊｅｆｆｓらにより記載されている通り、５５％コレステロール、２０％ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１０％ＰＥＧ－ＳＤＳＧ、および１５％１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有し得る。別の例として、本発明のリポソーム製剤は、これだけに限定されないが、Ｈｅｙｅｓらにより記載されている通り、４８％コレステロール、２０％ＤＳＰＣ、２％ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、および３０％カチオン性脂質を含有し得、ここで、カチオン性脂質は、１，２－ジステアリルオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、または１，２－ジリノレニルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。一部の実施形態では、リポソーム製剤は、約２５．０％コレステロール～約４０．０％コレステロール、約３０．０％コレステロール～約４５．０％コレステロール、約３５．０％コレステロール～約５０．０％コレステロールおよび／または約４８．５％コレステロール～約６０％コレステロールを含み得る。別の実施形態では、本発明の製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％および４３．５％からなる群から選択されるパーセンテージのコレステロールを含み得る。一部の実施形態では、本発明のリポソーム製剤は、約５．０％～約１０．０％ＤＳＰＣおよび／または約７．０％～約１５．０％ＤＳＰＣを含み得る。
一実施形態では、医薬組成物は、本発明の遮断剤を送達するために形成することができるリポソームを含み得る。部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤をリポソームで被包することができ、かつ／または、それを、リポソームで被包され得る水性コア中に含ませ得る（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１２／０３１０４６号、同第ＷＯ２０１２／０３１０４３号、同第ＷＯ２０１２／０３０９０１号および同第ＷＯ２０１２／００６３７８号ならびに米国特許出願公開第２０１３／０１８９３５１号、同第２０１３／０１９５９６９号および同第２０１／３０２０２６８４号を参照されたい）。
別の実施形態では、本発明において使用するためのリポソームは、標的化送達用に製剤化されたものであり得る。非限定的な例として、リポソームは、肝臓への標的化送達用に製剤化されたものであり得る。そのようなリポソームとしては、これだけに限定されないが、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１９５９６７号に記載されているリポソームを挙げることができる。
一実施形態では、リポソームおよび遮断剤を含む製剤を筋肉内投与、皮内投与、または静脈内投与することができる。
別の実施形態では、本発明の脂質製剤は、少なくとも１つのカチオン性脂質、トランスフェクションを増強する脂質、および、少なくとも１つの、脂質部分に連結した親水性頭部基を含有する脂質を含み得る（国際特許公開第ＷＯ２０１１０７６８０７号および米国特許出願公開第２０１１０２００５８２号；それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、本発明の脂質製剤は、官能化された脂質二重層間に架橋を有し得る脂質小胞である（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１７７７２４号を参照されたい）。
一実施形態では、遮断剤を含む製剤は、少なくとも１つの脂質を含み得る脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。脂質は、これだけに限定されないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８ＮＩ２－５、ＣＩ２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質およびアミノアルコール脂質から選択することができる。別の態様では、脂質は、これだけに限定されないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡおよびアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であり得る。アミノアルコールカチオン性脂質は、米国特許出願公開第２０１３／０１５０６２５号に記載されている脂質であり得、かつ／または、そこに記載されている方法によって作製することができる。
一実施形態では、カチオン性脂質は、これだけに限定されないが、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、同第ＷＯ２０１１／１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１／１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１／０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１／０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２／０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、同第ＷＯ２０１２／０４４６３８号、同第ＷＯ２０１０／０８０７２４号、同第ＷＯ２０１０／２１８６５号、同第ＷＯ２００８／１０３２７６号、同第ＷＯ２０１３／０８６３７３号およびＷＯ２０１３／０８６３５４号、米国特許第７，８９３，３０２号、同第７，４０４，９６９号、同第８，２８３，３３３号、同第８，４６６，１２２号および８，５６９，２５６号、ならびに米国特許出願公開第２０１０／００３６１１５号、同第２０１２／０２０２８７１号、同第２０１３／００６４８９４号、同第２０１３／０１２９７８５号、同第２０１３／０１５０６２５号、同第２０１３／０１７８５４１号、同第２０１３／０２２５８３６号および同第２０１４／００３９０３２号に記載されているカチオン性脂質から選択することができる。別の実施形態では、カチオン性脂質は、これだけに限定されないが、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、同第ＷＯ０１１１／５３１２０号、同第ＷＯ２０１１／１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１／０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１／０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２／０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、同第ＷＯ２０１２／０４４６３８号および同第ＷＯ２０１３／１１６１２６号または米国特許出願公開第２０１３／０１７８５４１号および同第２０１３／０２２５８３６号に記載されている式Ａから選択することができる。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、これだけに限定されないが、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１０３２７６号の式ＣＬＩ－ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号の式ＣＬＩＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩＣＬＸＸＸＸＩＩおよび米国特許出願公開第２０１０／００３６１１５号の式Ｉ～ＶＩ、米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号の式Ｉから選択することができる。
一実施形態では、カチオン性脂質を当技術分野で公知の方法によって、および／または、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、同第ＷＯ２０１１／１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１／１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１／０９０９６５号：同第ＷＯ２０１１／０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２／０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、同第ＷＯ２０１２／０４４６３８号、同第ＷＯ２０１０／０８０７２４号、同第ＷＯ２０１０／２１８６５号、同第ＷＯ２０１３／１２６８０３号、同第ＷＯ２０１３／０８６３７３号、および同第ＷＯ２０１３／０８６３５４号に記載されている通り合成することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の遮断剤の製剤化および／または送達に使用することができる脂質は、切断可能な脂質であり得る。非限定的な例として、切断可能な脂質および／または切断可能な脂質を含む医薬組成物としては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１２／１７０８８９号に記載されているものが挙げられる。別の非限定的な例として、切断可能な脂質は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１２／１７０８８９号に記載されているＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４および／またはＨＧＴ４００５であり得る。
一実施形態では、本明細書に記載の遮断剤の製剤化および／または送達に使用することができるポリマーとしては、これだけに限定されないが、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、ポリ（エチレンイミン）ビスカルバメート（ＰＥＩＣ）、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ヒスチジン修飾ＰＬＬ、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｈｄｏｎｅ））（ＰＶＰ）、ポリ（プロピレンイミン（ｐｒｏｐｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（ＰＰＩ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミドエチレンイミン）（ＳＳ－ＰＡＥＩ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、ポリ（β－アミノエステル）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（ｐｒｏｉｎｅ）エステル）（ＰＨＰ）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（α－［４－アミノブチル］－Ｌ－グリコール酸（ＰＡＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジニウムブロミド）、ポリ（ホスファゼン）（ＰＰＺ）、ポリ（リン酸エステル）（ＰＰＥ）、ポリ（ホスホラミデート）（ＰＰＡ）、ポリ（Ｎ－２－ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）（ｐＨＰＭＡ）、ポリ（２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（２－アミノエチルプロピレンホスフェート）ＰＰＥ＿ＥＡ）、キトサン、ガラクトシル化キトサン、Ｎ－ドデシル化キトサン、ヒストン、コラーゲンおよびデキストラン－スペルミンを挙げることができる。一実施形態では、ポリマーは、これだけに限定されないが、ＰＥＧなどの不活性ポリマーであり得る。一実施形態では、ポリマーは、これだけに限定されないが、ＰＥＩ、ＰＬＬ、ＴＥＴＡ、ポリ（アリルアミン）、ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジニウムブロミド）、ｐＨＰＭＡおよびｐＤＭＡＥＭＡなどのカチオン性ポリマーであり得る。一実施形態では、ポリマーは、これだけに限定されないが、ＤＳＰ、ＤＴＢＰおよびＰＥＩＣなどの生分解性ＰＥｌであり得る。一実施形態では、ポリマーは、これだけに限定されないが、ヒスチン修飾ＰＬＬ ＳＳＰＡＥＩ、ポリ（β－アミノエステル）、ＰＨＰ、ＰＡＧＡ、ＰＬＧＡ、ＰＰＺ、ＰＰＥ、ＰＰＡおよびＰＰＥ－ＥＡなど生分解性であり得る。
一実施形態では、本発明のＬＮＰ製剤を、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／１２７２５５号または同第ＷＯ２００８／１０３２７６号に記載されている方法に従って調製することができる。非限定的な例として、部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／１２７２５５号および／または同第ＷＯ２００８／１０３２７６号に記載されている通りＬＮＰ製剤に被包することができる。別の非限定的な例として、本明細書に記載の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２０７８４５号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／００８３３４号に記載されている通り、非経口経路によって送達されるナノ粒子として製剤化することができる。
一実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤を筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｙ）投与することができる。ＬＮＰ製剤は、これだけに限定されないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡおよびＣ１２－２００などの本明細書に記載のカチオン性脂質を含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載の遮断剤を含む本明細書に記載のＬＮＰ製剤を皮内投与することができる。ＬＮＰ製剤は、これだけに限定されないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡおよびＣ１２－２００などの本明細書に記載のカチオン性脂質を含み得る。
ナノ粒子製剤は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６００３８６１２Ａ１号に記載されているリン酸コンジュゲート、ポリマーコンジュゲート、ナノ粒子の送達を増強するコンジュゲートなどのコンジュゲートを含み得る。
一実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１００３２４１２０号に記載されているＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含む。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ１０７２３６９２Ｂ２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２００１７２４７２Ａ１号、同第ＵＳ２０２００１６３８７８Ａ１号、同第ＵＳ２０２０００４６８３８Ａ１号、同第ＵＳ２０１９０３５９５５６Ａ１号、同第ＵＳ２０１９０３１４５２４Ａ１号、同第ＵＳ２０１９０２７４９６８Ａ１号、同第ＵＳ２０１９００２２２４７Ａ１号、同第ＵＳ２０１８０３０３９２５Ａ１号、同第ＵＳ２０１８０１８５５１６Ａ１号、同第ＵＳ２０１６０３１７６７６Ａ１号、国際特許公開第ＷＯ２０２００１４６８０５Ａ１号、同第ＷＯ２０２００８１９３８Ａ１号、同第ＷＯ２０１９０８９８２８Ａ１号、同第ＷＯ２０１９０３６０３０Ａ１号、同第ＷＯ２０１９０３６０２８Ａ１号、同第ＷＯ２０１９０３６００８Ａ１号、同第ＷＯ２０１８２００９４３Ａ１号、同第ＷＯ２０１８１９１７１９Ａ１号、同第ＷＯ２０１８１０７０２６Ａ１号、同第ＷＯ２０１８０８１４８０Ａ１号（Ａｃｕｉｔａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）に記載されている脂質化合物、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体、または脂質ナノ粒子製剤を含む。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．により、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ９１３９５５４Ｂ２、ＵＳ９０５１５６７Ｂ２、ＵＳ８８８３２０３Ｂ２、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０１１７１２５Ａ１号において記載されているアミノ脂質、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体、または脂質ナノ粒子製剤を含む。特定の一実施例では、ＵＳ９１３９５５４Ｂ２に記載されている化合物はＤＬｉｎ－ｋＣ２－ＤＭＡである。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、Ａｒｂｕｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏｒｐ．により、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ１０５６１７３２Ｂ２、ＵＳ９９３８２３６Ｂ２、ＵＳ９６８７５５０Ｂ２、米国特許出願公開第ＵＳ２０１９０２４０３５４Ａ１号、同第ＵＳ２０１７００２７６５８Ａ１号、ＷＯ２０２００９７４９３Ａ１、ＷＯ２０２００９７５２０Ａ１、ＷＯ２０２００９７５４０Ａ１、ＷＯ２０２００９７５４８Ａ１において記載されているアミノ脂質、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体、または脂質ナノ粒子製剤を含む。
脂質ナノ粒子を操作して、脂質ナノ粒子が粘膜関門を透過することができるように粒子の表面特性を変更することができる。粘液は、例えば、これだけに限定されないが、口腔（例えば、頬および食道の膜ならびに扁桃組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、鼻、咽頭、気管および気管支の膜）、生殖器（例えば、膣、子宮頸部および尿道の膜）などの粘膜組織に位置する。広範な薬物に対するより高い薬物被包効率および持続的送達をもたらす能力のために好ましい１０～２００ｎｍよりも大きなナノ粒子は、粘膜関門を通って迅速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は絶え間なく分泌され、排出、廃棄または消化され、再利用され、したがって、捕捉されている粒子の大多数が数秒以内または数時間以内に粘膜組織（ｍｕｃｏｓｌａ ｔｉｓｓｕｅ）から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で高密度にコーティングされた大きなポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ～５００ｎｍ）は同じ粒子が水中で拡散するよりもわずか４～６倍低く、粘液を通じて拡散した（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ２００７ １０４（５）： １４８２－４８７；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ． Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ２００９６１ （２）： １５８－１７１；それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ナノ粒子の輸送は、光退色後の蛍光の回復（ＦＲＡＰ）および高分解能多粒子追跡（ＭＰＴ）を含むがこれだけに限定されない、透過速度および／または蛍光顕微鏡技法を使用して決定することができる。非限定的な例として、粘膜関門を透過することができる組成物を、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４１，６７０号または国際特許公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に記載されている通り作製することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を、これだけに限定することなく、リポプレックス、例えば、Ｓｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）のＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系および他のｓｉＲＮＡｌｉｐｏｐｌｅｘ技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）のＳＴＥＭＦＥＣＦＭ、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンに基づく核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｃｉｄｓ）の標的化送達および非標的化送達として製剤化する（Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００８ ６８： ９７８８－９７９８；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０： ７６－７８；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３： １２２２－１２３４；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６１３： １３６０－１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰｕｌｍＰｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２０１０２３： ３３４－３４４；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０： ２８６－２９３；Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２００９ ３２： ４９８－５０７；Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｎｎｏｔｈｅｒ． ２００８ ３１： １８０－１８８；Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． ４： １２８５－１２９４；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１１ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３４： １－１５；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５， ２３： ７０９－７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００７ ６； １０４： ４０９５－４１００；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００８ １９： １２５－１３２；全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、そのような製剤はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球を含むがこれだけに限定されない異なる細胞型に受動的にまたは能動的に向けられるように構築されるかまたは組成が変更され得る（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１０ １８： １３５７－１３６４；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ ２３： ７０９－７１７；Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎｌｎｖｅｓｔ． ２００９ １１９： ６６１－６７３；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０： ２８６－２９３；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６１３： １２２２－１２３４；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３： １３６０－１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２０１０ ２３： ３３４－３４４；Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２０１１ １９： ２１８６－２２００；Ｆｅｎｓｋｅ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｓ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２００８５： ２５－４４；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８ ３１９： ６２７－６３０；Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１１ １８： １１２７－１１３３；全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。製剤の肝細胞への受動的ターゲティングの１つの例として、アポリポタンパク質Ｅに結合し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるこれらの製剤の肝細胞への結合および取り込みを促進することが示されている、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡに基づく脂質ナノ粒子製剤が挙げられる（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１０ １８： １３５７－１３６４；その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。製剤を、これらに限定されないが、フォレート、トランスフェリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａＩＮＡｃ）、および抗体を標的とした手法によって例示される異なるリガンドを表面上に発現させることによって選択的にターゲティングすることもできる（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１１ ８： １９７－２０６；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ， Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ． ２０１１１６： １３８８－１４１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ ＢｉｏＩ． ２０１０ ２７： ２８６－２９８；Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． ２００８ ２５： １－６１；Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ２０１１ １２： ２７０８－２７１４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２００８ ５： ３０９－３１９；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１０ １８： １３５７－１３６４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ ＢｉｏＩ． ２０１２ ８２０： １０５－１１６；Ｂｅｎ－Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１２ ７５７： ４９７－５０７；Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０： ６３－６８；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００７ １０４： ４０９５－４１００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ ＢｉｏＩ． ２０１１ ７２１： ３３９－３５３；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１０ １８： ２０２８－２０３７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ ２３： ７０９－７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８ ３１９： ６２７－６３０；Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１１ １８： １１２７－１１３３；全てその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、本発明の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を固体脂質ナノ粒子として製剤化することができる。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０ｎｍから１０００ｎｍの間の球状であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤および／または乳化剤を用いて安定化することができる固体脂質コアマトリックスを有する。さらなる実施形態では、前記脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質－ポリマーナノ粒子であり得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｎａｎｏ， ２００８， ２ （８）， ｐｐ １６９６－１７０２を参照されたい）。非限定的な例として、ＳＬＮは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１０５１０１号に記載されているＳＬＮであり得る。別の非限定的な例として、ＳＬＮを、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１０５１０１号に記載されている方法またはプロセスによって作製することができる。
リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子により、核酸分子による細胞トランスフェクションを増加させること；および／またはコードされるタンパク質（例えば、本発明のエフェクター）の翻訳を増加させることができるので、これらの製剤を使用して、例えば核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤の有効性を改善して、タンパク質産生を指示することができる。そのような例の１つは、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にする脂質被包の使用を伴う（Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００７ １５： ７１３－７２０；その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子により、例えば核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤の安定性を増大させることもできる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００３８６１２号に記載されている。
一実施形態では、部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を制御放出および／または標的化送達用に製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「制御放出」は、治療転帰をもたらすための特定の放出パターンに従った医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。一実施形態では、本明細書に記載の部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を、制御放出および／または標的化送達のための本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知の送達用作用剤で被包することができる。本明細書で使用される場合、「被包する」という用語は、封入すること、囲むことまたは包むことを意味する。それが本発明の化合物の製剤化に関する場合、被包は、実質的なもの、完全なものまたは部分的なものであり得る。「実質的に被包された」という用語は、本発明の医薬組成物または遮断剤の少なくとも５０％よりも多く、少なくとも６０％よりも多く、少なくとも７０％よりも多く、少なくとも８０％よりも多く、少なくとも８５％よりも多く、少なくとも９０％よりも多く、少なくとも９５％よりも多く、少なくとも９６％よりも多く、少なくとも９７％よりも多く、少なくとも９８％よりも多く、少なくとも９９％よりも多く、少なくとも９９．９％よりも多く、少なくとも９９．９％よりも多く、または９９．９９９％よりも多くが送達用作用剤中に封入されていてよい、囲まれていてよいまたは包まれていてよいことを意味する。「部分的な被包」または「部分的に被包されている」とは、本発明の医薬組成物または遮断剤の１０未満、１０未満、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満またはそれ未満が送達用作用剤中に封入されていてよい、囲まれていてよいまたは包まれていてよいことを意味する。有利に、被包は、本発明の医薬組成物または化合物のエスケープまたは活性を蛍光および／または電子顕微鏡写真を使用して測定することによって決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物または遮断剤の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または９９．９９％よりも多くが送達用作用剤に被包される。
一実施形態では、本明細書に記載されるように含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を治療用ナノ粒子（例えば、ＢＩＮＤ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからの治療用ナノ粒子）で被包することができる。治療用ナノ粒子は、これだけに限定されないが、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００５７４０号、同第ＷＯ２０１０／０３０７６３号、同第ＷＯ２０１０／００５７２１号、同第ＷＯ２０１０／００５７２３号、同第ＷＯ２０１２／０５４９２３号、米国特許出願公開第２２０１／１０２６２４９１号、同第２０１０／０１０４６４５号、同第２０１０／００８７３３７号、同第２０１０／００６８２８５号、同第２０１１／０２７４７５９号、同第２０１０／００６８２８６号、同第２０１２／０２８８５４１号、同第２０１３／０１２３３５１号、同第２０１３／０２３０５６７号、同第２０１３／０２３６５００号、同第２０１３／０３０２４３３号、同第２０１３／０３０２４３２号、同第１０１３／０２８０３３９号および同第２０１３／０２５１７５７号、および米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、同第８，３１８，２１１号、同第８，６２３，４１７号、同第８，６１７，６０８号、同第８，６１３，９５４号、同第８，６１３，９５１号、同第８，６０９，１４２号、同第８，６０３，５３４号および同第８，５６３，０４１号などの本明細書に記載のおよび当技術分野で公知の方法によって製剤化することができる。別の実施形態では、治療用ポリマーナノ粒子を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１４０７９０号に記載されている方法によって調製することができる。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２３６５００号（Ｂｉｎｄ）に記載されている通り、約４～約２５重量パーセントの遮断剤、および、約１０～約９９重量パーセントの、ポリ（乳酸）を含むジブロックポリ（乳酸）－ポリ（エチレン）グリコール共重合体を含み得る。別の非限定的な例として、ナノ粒子は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２８０３３９号（Ｂｉｎｄ）および同第２０１０２５１７５７号ならびに米国特許第８，６５２，５２８号に記載されている通り、約０．２～約３５重量パーセントの遮断剤、および、約１０～約９９重量パーセントの、ジブロックポリ（乳酸）－ポリ（エチレン）グリコール共重合体を含み得る。
一実施形態では、治療用ナノ粒子として製剤化された遮断剤を筋肉内投与、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｍｒａｌｌｙ）投与、または静脈内投与することができる。
一実施形態では、ＡＣＣＵＲＩＮＳ（商標）ナノ粒子として製剤化された遮断剤を筋肉内投与、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｍｒａｌｌｙ）投与、または静脈内投与することができる。
一実施形態では、遮断剤は、これだけに限定されないが、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００３０３５１号および同第２０１１／０２９４７１７号に記載されているナノ粒子などの、ガラス転移温度が高い治療用ナノ粒子として送達することができる。
一実施形態では、治療用ナノ粒子を持続放出用に製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に従う医薬組成物または化合物を指す。期間としては、これだけに限定されないが、数時間、数日間、数週間、数カ月間および数年間を挙げることができる。非限定的な例として、持続放出ナノ粒子は、本発明のポリマーおよび遮断剤を含み得る（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１００７５０７２号および米国特許出願公開第２０１０／０２１６８０４号、同第２０１１／０２１７３７７号、同第２０１２／０２０１８５９号、同第２０１３／０２４３８４８号および同第２０１３／０２４３８２７号を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の遮断剤を合成ナノ担体で被包すること、それと連結すること、および／またはそれと会合させることができる。合成ナノ担体としては、これだけに限定されないが、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００５７４０号、同第ＷＯ２０１０／０３０７６３号、同第ＷＯ２０１２／１３５０１号、同第ＷＯ２０１２／１４９２５２号、同第ＷＯ２０１２１４９２５５号、同第ＷＯ２０１２１４９２５９号、同第ＷＯ２０１２１４９２６５号、同第ＷＯ２０１２１４９２６８号、同第ＷＯ２０１２１４９２８２号、同第ＷＯ２０１２１４９３０１号、同第ＷＯ２０１２１４９３９３号、同第ＷＯ２０１２１４９４０５号、同第ＷＯ２０１２１４９４１１号および同第ＷＯ２０１２１４９４５４号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号、同第２０１００１０４６４５号、同第２０１０００８７３３７号、同第２０１２０２４４２２２号およびＵＳ２０１３０２３６５３３、ならびに米国特許第８，６５２，４８７号に記載されているものが挙げられる。合成ナノ担体は、当技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載の方法を使用して製剤化することができる。非限定的な例として、合成ナノ担体を、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号および同第ＷＯ２０１２１３５０１号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号、同第２０１００１０４６４５号、同第２０１０００８７３３７号および同第２０１２０２４４２２２号に記載されている方法によって製剤化することができる。別の実施形態では、合成ナノ担体製剤を、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１０７２２１８号および米国特許第８，２１１，４７３号に記載されている方法によって凍結乾燥することができる。さらに別の実施形態では、合成ナノ担体を含むがこれだけに限定されない本発明の製剤を、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０２３０５６８号に記載されている方法によって凍結乾燥または再構成することができる。
一実施形態では、遮断剤を含む合成ナノ担体を筋肉内投与、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｍｒａｌｌｙ）投与、または静脈内投与することができる。
一部の実施形態では、遮断剤を、より小さなＬＮＰを使用して送達用に製剤化することができる。そのような粒子は、０．１μｍ未満から最大１０００μｍまで、例えば、これだけに限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５μｍ未満、２０μｍ未満、２５μｍ未満、３０μｍ未満、３５μｍ未満、４０μｍ未満、５０μｍ未満、５５μｍ未満、６０μｍ未満、６５μｍ未満、７０μｍ未満、７５μｍ未満、８０μｍ未満、８５μｍ未満、９０μｍ未満、９５μｍ未満、１００μｍ未満、１２５μｍ未満、１５０μｍ未満、１７５μｍ未満、２００μｍ未満、２２５μｍ未満、２５０μｍ未満、２７５μｍ未満、３００μｍ未満、３２５μｍ未満、３５０μｍ未満、３７５μｍ未満、４００μｍ未満、４２５μｍ未満、４５０μｍ未満、４７５μｍ未満、５００μｍ未満、５２５μｍ未満、５５０μｍ未満、５７５μｍ未満、６００μｍ未満、６２５μｍ未満、６５０μｍ未満、６７５μｍ未満、７００μｍ未満、７２５μｍ未満、７５０μｍ未満、７７５μｍ未満、８００μｍ未満、８２５μｍ未満、８５０μｍ未満、８７５μｍ未満、９００μｍ未満、９２５μｍ未満、９５０μｍ未満、９７５μｍ未満の直径を含み得る。
別の実施形態では、遮断剤を、約１ｎｍから約１００ｎｍまで、約１ｎｍから約１０ｎｍまで、約１ｎｍから約２０ｎｍまで、約１ｎｍから約３０ｎｍまで、約１ｎｍから約４０ｎｍまで、約１ｎｍから約５０ｎｍまで、約１ｎｍから約６０ｎｍまで、約１ｎｍから約７０ｎｍまで、約１ｎｍから約８０ｎｍまで、約１ｎｍから約９０ｎｍまで、約５ｎｍから約１００ｎｍまで（ｆｒｏｍ ａｂｏｕｔ ５ ｎｍ ｔｏ ａｂｏｕｔ ｆｒｏｍ １００ ｎｍ）、約５ｎｍから約１０ｎｍまで、約５ｎｍから約２０ｎｍまで、約５ｎｍから約３０ｎｍまで、約５ｎｍから約４０ｎｍまで、約５ｎｍから約５０ｎｍまで、約５ｎｍから約６０ｎｍまで、約５ｎｍから約７０ｎｍまで、約５ｎｍから約８０ｎｍまで、約５ｎｍから約９０ｎｍまで、約１０ｎｍから約５０ｎｍまで、約２０ｎｍから約５０ｎｍまで、約３０ｎｍから約５０ｎｍまで、約４０ｎｍから約５０ｎｍまで、約２０ｎｍから約６０ｎｍまで、約３０ｎｍから約６０ｎｍまで、約４０ｎｍから約６０ｎｍまで、約２０ｎｍから約７０ｎｍまで、約３０ｎｍから約７０ｎｍまで、約４０ｎｍから約７０ｎｍまで、約５０ｎｍから約７０ｎｍまで、約６０ｎｍから約７０ｎｍまで、約２０ｎｍから約８０ｎｍまで、約３０ｎｍから約８０ｎｍまで、約４０ｎｍから約８０ｎｍまで、約５０ｎｍから約８０ｎｍまで、約６０ｎｍから約８０ｎｍまで、約２０ｎｍから約９０ｎｍまで、約３０ｎｍから約９０ｎｍまで、約４０ｎｍから約９０ｎｍまで、約５０ｎｍから約９０ｎｍまで、約６０ｎｍから約９０ｎｍまでおよび／または約７０ｎｍから約９０ｎｍまでの直径を含み得るより小さなＬＮＰを使用して送達用に製剤化することができる。
一実施形態では、遮断剤をより小さなＬＮＰとして製剤化し、筋肉内投与、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｍｒａｌｌｙ）投与、または静脈内投与することができる。
一実施形態では、遮断剤を、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号または米国特許第８，４４０，６１４号に記載されている薬物被包マイクロスフェアを使用して送達用に製剤化することができる。別の態様では、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質（ＡＰＰＬ）は、本発明の遮断剤を細胞に送達することにおいて有用である（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号を参照されたい）。
一態様では、脂質ナノ粒子は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１３０５９９２２号に記載されている、限界サイズの脂質ナノ粒子であり得る。限界サイズの脂質ナノ粒子は、水性コアまたは疎水性コアを取り囲む脂質二重層を含み得る；脂質二重層は、これだけに限定されないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド、Ｃ８～Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、および１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン（Ｉ－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏＩｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＰＯＰＣ）などのリン脂質を含み得る。別の態様では、限界サイズの脂質ナノ粒子は、これだけに限定されないが、ＤＬＰＥＰＥＧ、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＣ－ＰＥＧおよびＤＳＰＥ－ＰＥＧなどのポリエチレングリコール－脂質を含み得る。
一実施形態では、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１３０６３５３０号に記載されている送達方法を使用して、本発明の遮断剤を特定の場所に、送達する、局在化させる、かつ／または集めることができる。非限定的な例として、対象に遮断剤を送達する前、それと同時にまたはその後に、対象に空のポリマー粒子を投与することができる。空のポリマー粒子は対象と接触すると体積が変化し、対象の特定の場所で留まる、包埋される、固定されるまたは封入される。
一実施形態では、遮断剤を活性物質放出系（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１０２５４５号を参照されたい）として製剤化することができる。活性物質放出系は、１）触媒として活性な核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド阻害剤鎖と結合した少なくとも１つのナノ粒子、および、２）治療的に活性な物質（例えば、本発明の遮断剤）と結合した少なくとも１つの基質分子と結合した化合物を含み得、触媒として活性な核酸による基質分子の切断により、治療的に活性な物質が放出される。
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、これだけに限定されないが、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３０９０６０１号に記載されているものなどの水溶性ナノ粒子であり得る。ナノ粒子は、良好な水溶性を示すために緻密な双性イオンリガンドを有する無機ナノ粒子であり得る。ナノ粒子は小さな流体力学的直径（ＨＤ）、時間、ｐＨ、および塩度に対する安定性、ならびに低レベルの非特異的タンパク質結合も有し得る。
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、これだけに限定されないが、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号（Ｂｉｎｄ）、同第２０１３０２５１８１７号（Ｂｉｎｄ）、同第２０１３２５１８１６号（Ｂｉｎｄ）および同第２０１３０２５１７６６号（Ｂｉｎｄ）に記載されているものなどのステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。ステルスナノ粒子は、ジブロック共重合体および化学療法剤を含み得る。これらのステルスナノ粒子は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号、同第２０１３０２５１８１７号、同第２０１３２５１８１６号および同第２０１３０２５１７６６号に記載されている方法によって作製することができる。非限定的な例として、ステルスナノ粒子は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号、同第２０１３０２５１８１７号、同第２０１３２５１８１６号および同第２０１３０２５１７６６号に記載されているナノ粒子などの、がん細胞を標的とするものであり得る。
一実施形態では、本発明の遮断剤を含むステルスナノ粒子を筋肉内投与、皮内投与、または静脈内投与することができる。
一実施形態では、本発明の遮断剤を、これだけに限定されないが、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３００１７２２３号に記載されている脂質ナノ粒子などの複数のカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子として製剤化し、かつ／または送達することができる。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、第１のカチオン性脂質および第２のカチオン性脂質を含み得る。別の非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＤＬｉｎ－ＭＣ２－ＤＭＡおよびＤＬｉｎＭＣ４－ＤＭＡを含み得る。さらに別の非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよびＣＩ２－２００を含み得る。一実施形態では、複数のカチオン性脂質を含むＬＮＰ製剤（例えば、これだけに限定されないが、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１３００１７２２３号に記載されているもの）を筋肉内投与、皮内投与、または静脈内投与することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の遮断剤を、カチオン性脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよび中性脂質ＤＯＰＥを含む脂質ナノ粒子として製剤化し、かつ／または送達することができる。脂質ナノ粒子は、ＰＥＧに基づく脂質およびコレステロールまたは抗酸化剤も含み得る。ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよびＤＯＰＥおよび遮断剤を含むこれらの脂質ナノ粒子製剤を筋肉内投与、皮内投与、または静脈内投与することができる。
一実施形態では、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよびＤＯＰＥを含む脂質ナノ粒子は、これだけに限定されないが、ペンタエリスリトールＰＥＧエステルテトラスクシンイミジルおよびペンタエリスリトールＰＥＧエーテルテトラ－チオール、ＰＥＧｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＳＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎグリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＰＧ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＳＡ（１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミンとカップリングしたＰＥＧ）、ＰＥＧ－ＤＭＡ（１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミンとカップリングしたＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＮＡ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＳＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、ＰＥＧ－ＤＰＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ ２０００および本明細書に記載のものおよび／または当技術分野で公知のものなどのＰＥＧ脂質を含み得る。
一実施形態では、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよびＤＯＰＥを含む脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質を０．５％から約３．０％まで、約１．０％から約３．５％まで、約１．５％から約４．０％まで、約２．０％から約４．５％まで、約２．５％から約５．０％までおよび／または約３．０％から約６．０％までの脂質モル比で含み得る。
一実施形態では、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよびＤＯＰＥを含む脂質ナノ粒子は、２５．０％コレステロール～約５０．０％コレステロール、約３０．０％コレステロール～約４５．０％コレステロール、約３５．０％コレステロール～約５０．０％コレステロールおよび／または約４８．５％コレステロール～約６０％コレステロールを含み得る。一実施形態では、製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％、４３．５％および４８．５％からなる群から選択されるパーセンテージのコレステロールを含み得る。
一実施形態では、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよびＤＯＰＥを含む脂質ナノ粒子は、２５．０％抗酸化剤～約５０．０％抗酸化剤、約３０．０％抗酸化剤～約４５．０％抗酸化剤、約３５．０％抗酸化剤～約５０．０％抗酸化剤および／または約４８．５％抗酸化剤～約６０％抗酸化剤を含み得る。一実施形態では、製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％、４３．５％および４８．５％からなる群から選択されるパーセンテージの抗酸化剤を含み得る。
本発明の遮断剤は、天然および／または合成ポリマーを使用して製剤化することができる。送達のために使用することができるポリマーの非限定的な例としては、これだけに限定されないが、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）およびＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆ．）製剤、これだけに限定することなく、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）などのＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、ＤＭＲＩＩＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）のＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆ．）のシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｓａｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆ．）、ならびに、これだけに限定されないが、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）などのｐＨ応答性共ブロックポリマーが挙げられる。
ポリマー製剤により、遮断剤の持続放出または遅延放出を可能にすることができる（例えば、筋肉内注射後、皮内注射後または皮下注射後）。遮断剤の放出プロファイルの変更の結果、例えば、コードされるタンパク質の長期間にわたる翻訳がもたらされ得る。ポリマー製剤を使用して遮断剤の安定性を増大させることもできる。例えば、修飾されたｍＲＮＡ以外の核酸を分解から保護するために生分解性ポリマーが以前に使用されており、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるペイロードの持続放出がもたらされることが示されている（Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００７ １０４： １２９８２－１２８８７；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２０１０ ７： １４３３－１４４６；Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ２０１０ Ｏｃｔ． １；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃ Ｃｈｅｒｎ Ｒｅｓ． ２０１２ Ｊａｎ． １３；Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２０１２ ３３： ２３０１－２３０９；Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ２０１１ １２： ２７０８－２７１４；Ｓｉｎｇｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ． ２０１１ ２： １３３－１４７；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｎｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００８ １９： １２５－１３２；Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００８ １６： １１３１－１１３８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２０１１ ８： １４５５－１４６８；Ｄａｖｉｓ， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２００９ ６： ６５９－６６８；Ｄａｖｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ ２０１ ０４６４： １０６７－１０７０；それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、医薬組成物は持続放出製剤であり得る。さらなる実施形態では、持続放出製剤は皮下送達用のものであり得る。持続放出製剤としては、これだけに限定されないが、ＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． Ａｌａｃｈｕａ、Ｆｌａ．）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．）、外科用シーラント、例えば、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃ ｏｎ Ｉｎｃ． Ｃｏｒｎｅｌｉａ、Ｇａ．）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ．）、ＰＥＧに基づくシーラント、およびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ．）を挙げることができる。
Ｂ．ベクターにコードされる本発明の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤
例えば核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現させることができる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ， Ａ， ｅｔ ａｌ．， ＴＩＧ． （１９９６）， １２： ５－１０；ＷＯ００／２２１１３、ＷＯ００／２２１１４、およびＵＳ６，０５４，２９９を参照されたい）。一部の実施形態では、発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞型に応じて持続する（数カ月間またはそれよりも長く）。これらの導入遺伝子は、直鎖状構築物、環状プラスミド、または、組込み型もしくは非組込み型ベクターであり得るウイルスベクターとして導入することができる。導入遺伝子を、染色体外プラスミドとして遺伝されることが可能になるように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２： １２９２）。遮断剤の異なる構成成分、例えば、ｇＲＮＡとエフェクターは、別々の発現ベクターに位置していてよく、それらを標的細胞に共導入する（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）ことができる。あるいは、個々の構成成分をそれぞれ、どちらも同じ発現プラスミドに位置するプロモーターによって転写させることもできる。
遮断剤を発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与による、患者から外植した標的細胞に投与し、その後、標的細胞を患者に再導入することによる、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によるなどの全身性のものであり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載のタンパク質、例えばエフェクターをコードする核酸を、ベクター、例えばウイルスベクターに組み入れる。
核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤の個々の鎖または複数の鎖を発現ベクター内のプロモーターから転写させることができる。例えばｄｓＲＮＡを生成するために２つの別々の鎖を発現させる場合、２つの別々の発現ベクターを標的細胞に共導入することができる（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）。あるいは、核酸分子の個々の鎖をそれぞれ、どちらも同じ発現プラスミド上にあるプロモーターによって転写することができる。一実施形態では、核酸分子を、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合した逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現させ、したがって、核酸分子はステム・ループ構造を有する。
発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞と適合する、好ましくは脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載の遮断剤を発現させるための組換え構築物を生成することができる。
遮断剤の組換え発現のための構築物には、一般に、標的細胞における遮断剤の発現を確実にするために、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどが必要である。
天然核酸または合成核酸の発現は、一般には、目的の核酸をコードする核酸をプロモーターなどの調節領域と作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み入れることによって実現される。ベクターは、真核生物における複製および組込みに適したものであり得る。
核酸分子への作動可能な連結に適したプロモーターなどの調節領域は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結することができ、任意の種に由来するものであってよい。任意の型のプロモーターを核酸配列に作動可能に連結することができる。プロモーターの例としては、限定することなく、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、および特定の刺激に対して応答性または不応答性のプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）が挙げられる。追加のプロモーターエレメント、例えば強化配列は、転写開始の頻度を調節する。一般には、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターが開始部位の下流にも機能的なエレメントを含有することが最近示された。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、したがって、エレメントが互いに対して逆になるかまたは移動した場合にもプロモーター機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が減退し始める前にプロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐに増大させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために協同的に機能する場合もあり、独立に機能する場合もある。
適切なプロモーターの１つの例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それと機能的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１ａ（ＥＦ－１ａ）である。しかし、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、例えば、これだけに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含むがこれだけに限定されない他の構成的プロモーター配列を使用することもできる。
さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として意図されている。誘導性プロモーターの使用により、当該プロモーターと機能的に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望まれる場合にオンにすること、または発現が望まれない場合には発現をオフにすることができる分子スイッチがもたらされる。誘導性プロモーターの例としては、これだけに限定されないが、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
核酸構築物に有用であり得る追加の調節領域としては、これだけに限定されないが、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、配列内リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、またはイントロンが挙げられる。そのような調節領域は必要でない場合もあるが、そのような調節領域により、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率などに影響を及ぼすことによって発現を増大させることができる。そのような調節領域を細胞（複数可）における核酸の最適な発現を得るために所望の通り核酸構築物に含めることができる。しかし、時には、そのような追加のエレメントなしで十分な発現を得ることができる。
導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクトしようとまたは感染させようとした細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含有し得る。他の態様では、選択マーカーに別のＤＮＡ片を載せ、共トランスフェクション手順に使用することができる。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方を適当な転写制御配列で挟んで、宿主細胞における発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子などが挙げられる。選択マーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。そのようなマーカーは、培養物中の安定な形質転換体の選択に有用である。他の選択マーカーとしては、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質などの蛍光ポリペプチドが挙げられる。
シグナルペプチドを含めることもでき、コードされるポリペプチドが細胞の特定の場所（例えば、細胞表面）に向けられるように使用することができる。
潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、および転写制御配列の機能性を評価するために、レポーター遺伝子を使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント供給源には存在しないかまたはレシピエント供給源によって発現されず、かつ、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって発現が顕在化するポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイする。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９： ７９－８２）。適切な発現系は周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、商業的に入手することもできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物をプロモーターとして同定する。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子と連結し、作用剤をプロモーターにより駆動される転写をモジュレートする能力について評価するために使用することができる。
ベクターおよび構築物に関して考慮すべき他の態様は当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む遮断剤を含む。
本明細書に記載の方法および組成物に利用することができるウイルスベクター系としては、これだけに限定されないが、（ａ）アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）；（ｂ）レンチウイルスベクター（組込みコンピテントまたは組込み欠損レンチウイルスベクターを含む）、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれだけに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックス、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えば、カナリアポックスまたは鶏痘などのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。種々のベクターが細胞のゲノムに組み入れられるようになる、または細胞のゲノムに組み入れられるようにはならない。構築物は、所望であればトランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター（例えばＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクター）に組み入れることができる。例えば、そのそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号を参照されたい。
アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのレトロウイルスならびにレンチウイルスに由来するものを含むベクターは、導入遺伝子の長期間の安定な組込みおよび娘細胞での繁殖を可能にするので、長期にわたる遺伝子移入を実現するために適したツールである。ベクターの例としては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが挙げられる。発現ベクターはウイルスベクターの形で細胞に提供することができる。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、種々のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。
一実施形態では、本発明において使用するための適切なウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクターなどのアデノ随伴ウイルスベクターである。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損かつ非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく遺伝子送達系である。ベクターは全て、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ １４５ｂｐ末端逆位反復配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組込みに起因した効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達がこのベクター系の重要な特色である（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５１： ９１１７ １７０２－３ （１９９８）， Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９： ７４８－５５ （１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含めたＡＡＶ血清型を本発明に従って使用することができる。
複製欠陥組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は高力価で産生することができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。大多数のアデノウイルスベクターは、Ａｄ Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、および／またはＥ３遺伝子が導入遺伝子に置き換わるように操作される；その後、複製欠損ベクターを、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞において繁殖させる。Ａｄベクターにより、肝臓、腎臓および筋肉に見いだされるものなどの非分裂性の分化細胞を含めた複数の型の組織をｉｎ ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは大きな運搬能を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を伴うものであった（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７： １０８３－９ （１９９８））。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４： １ ５－１０ （１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９： ７ １０８３－１０８９ （１９９８）；Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２： ２０５－１８ （１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ５９７－６１３ （１９９７）；Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ５０７－５１３ （１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７： １０８３－１０８９ （１９９８）が挙げられる。
宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するためにパッケージング細胞を使用する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞株によって生成される。前記ベクターは、一般には、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（該当する場合）に必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。失われたウイルスの機能はパッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは、一般には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要なＡＡＶゲノム由来の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含有するがＩＴＲ配列を欠く細胞株にウイルスＤＮＡをパッケージングする。細胞株にアデノウイルスもヘルパーとして感染させる。ヘルパーウイルスによりＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現が促進される。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠くので有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも高い感受性をもつ加熱処理によって減少させることができる。
ＩＶ．本発明の方法
本発明は、細胞におけるアポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）の発現をモジュレートするための、本明細書に記載の作用剤および組成物の使用方法も提供する。当該方法は、細胞を、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分およびエフェクター分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤と接触させるステップを含み、それにより、細胞におけるＡＰＯＢの発現をモジュレートする。部位特異的遮断剤、エフェクター、または部位特異的遮断剤とエフェクターの両方が上記の組成物などの組成物中に存在し得る。一部の実施形態では、部位特異的遮断剤とエフェクターは、同じ組成物中に存在する。他の実施形態では、部位特異的遮断剤とエフェクターは、異なる組成物中に存在する。
例えば、部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤と接触させなかった細胞と比較して、ＡＰＯＢの発現が増強または低減し得る。遺伝子発現のモジュレーションを当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。例えば、発現のモジュレーションを、例えば細胞、複数の細胞、および／または組織試料における遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを当業者にとって常套的な方法、例えば、ノーザンブロット法、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して決定することによって；遺伝子のタンパク質レベルをウエスタンブロッティング、免疫学的技法などの当業者にとって常套的な方法を使用して決定することによって、決定することができる。
「低下／低減／減少（ｒｅｄｕｃｅｄ）」という用語は、対象におけるＡＰＯＢ遺伝子発現またはＡＰＯＢタンパク質産生のレベル、または疾患マーカーもしくは症状に関しては、そのようなレベルの統計的に有意な低下を指す。低下／低減／減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）は、例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または検出方法の検出レベルを下回るものであり得る。ある特定の実施形態では、標的の発現が正常化する、すなわち、そのような障害を有さない個体に対して正常な範囲内として許容されるレベルに向かってまたはそのレベルまで低下する。本明細書で使用される場合、対象において「より低い」とは、対象の細胞における遺伝子発現またはタンパク質産生の低下が、対象の全ての細胞または組織における発現の低下を必要とするものではないことを指し得る。例えば、本明細書で使用される場合、対象における低下は、対象の肝臓における遺伝子発現またはタンパク質産生の低下を含み得る。
「低下／低減／減少（ｒｅｄｕｃｅｄ）」という用語は、疾患または状態の症状の正常化との関連でも使用され得る、すなわち、ＡＰＯＢ関連疾患に罹患していない正常な対象におけるレベルに向かうまたはそのレベルまでのＡＰＯＢ関連疾患に罹患している対象におけるレベルの間の差異が減少する。本明細書で使用される場合、疾患が症状に関して値の上昇と関連する場合、「正常」は正常の上限とみなされる。疾患が症状に関して値の低下と関連する場合、「正常」は正常の下限とみなされる。
「増強」という用語は、対象におけるＡＰＯＢ遺伝子発現またはＡＰＯＢタンパク質産生のレベル、または疾患マーカーもしくは症状に関しては、そのようなレベルの統計的に有意な上昇を指す。上昇は、例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または検出方法の検出レベルを上回るものであり得る。ある特定の実施形態では、標的の発現が正常化する、すなわち、そのような障害を有さない個体に対して正常な範囲内として許容されるレベルに向かってまたはそのレベルまで上昇する。本明細書で使用される場合、対象において「より高い」とは、対象の細胞における遺伝子発現またはタンパク質産生の上昇が、対象の全ての細胞または組織における発現の上昇を必要とするものではないことを指し得る。例えば、本明細書で使用される場合、対象における上昇は、対象の肝臓における遺伝子発現またはタンパク質産生の上昇を含み得る。
「増強」という用語は、疾患または状態の症状の正常化との関連でも使用され得る、すなわち、ＡＰＯＢ関連疾患に罹患していない正常な対象におけるレベルに向かうまたはそのレベルまでのＡＰＯＢ関連疾患に罹患している対象におけるレベルの間の差異が増大する。本明細書で使用される場合、疾患が症状に関して値の上昇と関連する場合、「正常」は正常の上限とみなされる。疾患が症状に関して値の低下と関連する場合、「正常」は正常の下限とみなされる。
一部の実施形態では、本発明の方法における使用に適した細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は体細胞である。一部の実施形態では、細胞は初代細胞である。例えば、一部の実施形態では、細胞は哺乳動物体細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は初代細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は非胚細胞である。
接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち、細胞が対象内に存在し得る）、またはｅｘ ｖｉｖｏで実施することができる。一部の実施形態では、細胞を接触させるステップをｅｘ ｖｉｖｏで実施し、当該方法は、接触させるステップの前に、細胞（例えば、哺乳動物細胞）を対象から取り出すステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、接触させるステップの後に、（ｂ）細胞（例えば、哺乳動物細胞）を対象に投与するステップをさらに含む。
本発明のｉｎ ｖｉｖｏ方法は、対象に本発明の作用剤または組成物を投与することを含み得る。
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、生物体、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、またはイヌ）を指す。一部の実施形態では、ヒト対象は、成人対象、青年対象、または小児対象である。一部の実施形態では、対象は疾患または状態を有していた。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害または状態、例えば、本明細書に提示されている通り処置することができる疾患、障害または状態に罹患している。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態にかかりやすい；一部の実施形態では、かかりやすい対象は、疾患、障害または状態の素因があるおよび／またはそれが発生するリスクの増大を示している（参照対象または集団における観察される平均リスクと比較して）。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状を示している。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の特定の症状（例えば、疾患の臨床像）も特徴も示していない。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態のいかなる症状も特徴も示していない。一部の実施形態では、対象は患者である。一部の実施形態では、対象は、診断および／または治療が施行されるおよび／または施行されている個体である。
本発明の方法が有益であろう対象としては、「ＡＰＯＢ関連疾患」を有する対象または「ＡＰＯＢ関連疾患」のリスクがある対象が挙げられる。
したがって、本発明は、それを必要とする対象を処置する方法をさらに提供する。本発明の処置方法は、本発明の作用剤または組成物を、対象、例えば、ＡＰＯＢ関連疾患を有する対象などの、ＡＰＯＢ発現のモジュレーションが有益であろう対象に、治療有効量で投与することを含む。
さらに、本発明は、ＡＰＯＢ関連疾患を有する対象などの、ＡＰＯＢ発現のモジュレーションが有益であろう対象における少なくとも１つの症状を、対象に本発明の作用剤または組成物を予防有効量で投与することによって防止する方法を提供する。
「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、ＡＰＯＢ関連疾患を有する対象を処置するために患者に投与した場合に、疾患の処置をもたらすため（例えば、既存の疾患または疾患またはその関連する共存症の１つまたは複数の症状を減弱させる、好転させる、または維持することによって）に十分である、作用剤または組成物の量を含むものとする。「治療有効量」は、作用剤または組成物、投与の仕方、疾患およびその重症度、ならびに処置を受ける患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ＡＰＯＢ遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスのステージ、もしあれば先行する処置または併用処置の型、および他の個々の特徴に応じて変動し得る。
「予防有効量」は、本明細書で使用される場合、ＡＰＯＢ関連疾患の症状をまだ経験してもいないし示してもいないが、ＡＰＯＢ関連疾患の素因を有し得る対象に投与した場合に、疾患または疾患の１つまたは複数の症状の発生または増悪を臨床的に有意な期間にわたって防止するまたは遅延させるために十分である作用剤または組成物の量を含むものとする。「予防有効量」は、作用剤または組成物、投与の仕方、疾患のリスクの度合い、ならびに処置を受ける患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば先行する処置または併用処置の型、および他の個々の特徴に応じて変動し得る。
本明細書で使用される場合、「防止」または「防止すること」は、ＡＰＯＢ遺伝子の発現またはＡＰＯＢタンパク質の産生の低減が有益であろう疾患、障害または状態に関して使用される場合、対象においてそのような疾患、障害、または状態に関連する症状、例えば、ＡＰＯＢ遺伝子発現またはＡＰＯＢ活性の徴候または症状が発生する尤度の低下を指す。
「治療有効量」または「予防有効量」は、任意の処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比でいくらかの所望の局部効果または全身性効果を生じる作用剤または組成物の量も含む。本発明の方法に使用する作用剤および組成物は、そのような処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比を生じさせるのに十分な量で投与することができる。一部の実施形態では、治療有効量または予防有効量を単回用量で投与する（ｔｉｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）；一部の実施形態では、治療有効量または予防有効量を送達するためには複数の単位用量が必要である。
本明細書で使用される場合、「症状が低減する」という句は、特定の疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状の大きさ（例えば、強度、重症度など）および／または頻度が低減する場合に使用することができる。一部の実施形態では、特定の症状の発症の遅延は、その症状の頻度の減少の一形態とみなされる。
処置を受ける対象がヒトなどの哺乳動物である場合、組成物を、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内、および髄腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、直腸、および局所（頬側および舌下を含む）投与を含めた経口経路、腹腔内経路、または非経口経路を含むがこれだけに限定されない当技術分野で公知の任意の手段によって投与することができる。ある特定の実施形態では、組成物を静脈内注入または静脈内注射によって投与する。ある特定の実施形態では、組成物を皮下注射によって投与する。
本明細書で使用される場合、「ＡＰＯＢ関連疾患」という用語は、ＡＰＯＢ遺伝子発現またはＡＰＯＢタンパク質産生によって引き起こされる、またはそれに関連する疾患または障害である。「ＡＰＯＢ関連疾患」という用語は、ＡＰＯＢ遺伝子発現、複製、またはタンパク質活性の低下が有益であろう疾患、障害または状態を含む。ＡＰＯＢ関連疾患の非限定的な例としては、例えば、脂質異常症（例えば、高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症）、血糖制御の障害（例えば、インスリンに対する免疫応答に関連しないインスリン抵抗性、２型糖尿病）、心血管疾患（例えば、高血圧症、内皮細胞機能障害）、メタボリックシンドローム、脂質沈着の疾患または機能障害（例えば、脂肪細胞機能障害、内臓脂肪沈着、肥満）、尿酸上昇の疾患（例えば、高尿酸血症、痛風）、および糖分を過剰に欲することなどの摂食障害が挙げられる。種々の疾患または状態の徴候および症状に関するさらなる詳細は本明細書に提示されており、また、当技術分野で周知である。
ＡＰＯＢ関連疾患または障害を有する患者における本発明の方法に従った作用剤または組成物の投与により、ＡＰＯＢ関連疾患または障害の重症度、徴候、症状、またはマーカーの低減をもたらすことができる。この文脈での「低下／低減／減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」は、そのようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下（絶対的な低下、または対象における上昇したレベルと正常なレベルの差異の減少）は、例えば、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または使用するアッセイの検出レベルを下回るまでであり得る。
本発明の方法に従った作用剤または組成物の投与により、標的遺伝子の発現を安定にまたは一過性にモジュレートすることができる。一部の実施形態では、発現のモジュレーションは少なくとも約１時間～約３０日間、または少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、またはより長い期間またはこれらの間の任意の時間にわたって持続する。一部の他の実施形態では、発現のモジュレーションは、約３０分～約７日間以下、または約１時間以下、約２時間以下、約３時間以下、約４時間以下、約５時間以下、約６時間以下、約７時間以下、約８時間以下、約９時間以下、約１０時間以下、約１１時間以下、約１２時間以下、約１３時間以下、約１４時間以下、約１５時間以下、約１６時間以下、約１７時間以下、約１８時間以下、約１９時間以下、約２０時間以下、約２１時間以下、約２２時間以下、約２４時間以下、約３６時間以下、約４８時間以下、約６０時間以下、約７２時間以下、約４日間以下、約５日間以下、約６日間以下、約７日間以下、またはこれらの間の任意の時間にわたって持続する。
作用剤または組成物を対象に１回投与することができる、あるいは、ある期間にわたって複数回の投与を実施することができる。例えば、１回の処置の間にまたはある期間にわたって２回、３回、４回、５回、またはそれよりも多くの投与を対象に対して行うことができる。一部の実施形態では、処置レジメンの通りに１回の処置の間にまたはある期間にわたって６回、８回、１０回、１２回、１５回または２０回またはそれよりも多くの投与を対象に対して行うことができる。
一部の実施形態では、投与を、必要に応じて、例えば、疾患、障害または状態に関連する症状が持続する限り行うことができる。一部の実施形態では、対象の残りの生涯にわたって反復投与が必要になり得る。処置期間は変動し得、例えば、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、６カ月間、１年間、またはより長い期間であり得る。
疾患の処置または防止の有効性は、例えば、疾患の増悪、疾患の寛解、症状の重症度、疼痛の低減、生活の質、処置効果を持続させるために必要な薬物適用の用量、疾患マーカーのレベル、または処置されるまたは防止の標的とされる所与の疾患に適した任意の他の測定可能なパラメータを測定することによって評価することができる。そのようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組合せを測定することによって処置または防止の有効性をモニタリングすることは十分に当業者の能力の範囲内に入る。本明細書で考察されている通り、測定される特定のパラメータは、対象が罹患しているＡＰＯＢ関連疾患に依存する。
後の読み取りと最初の読み取りを比較することにより、処置が有効であるかどうかの指標が医師にもたらされる。そのようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組合せを測定することによって処置または防止の有効性をモニタリングすることは十分に当業者の能力の範囲内に入る。作用剤または組成物の投与に関して、ＡＰＯＢ関連障害「に対して有効」とは、臨床的に適当な様式での投与により、少なくとも統計的に有意な割合の患者に有益な効果、例えば、症状の改善、治癒、疾患の低減、寿命の延長、生活の質の改善、またはＡＰＯＢ関連障害の処置に詳しい医師によって有益であると一般に認められる他の効果がもたらされることを示す。
処置効果または防止効果は、病状の１つまたは複数のパラメータの統計的に有意な改善が存在する場合に、またはそうでなければ予測されるであろう症状の悪化も発生も起こらないことによって明らかである。例として、測定可能な疾患のパラメータの少なくとも１０％、および好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれよりも大きな好都合な変化により、有効な処置が示され得る。所与の作用剤または組成物の有効性は、当技術分野で公知の所与の疾患の実験動物モデルを使用して判断することもできる。実験動物モデルを使用する場合、処置の有効性は、マーカーまたは症状の統計的に有意な低減が観察される場合に証明される。
あるいは、有効性を、臨床的に許容される疾患重症度に関する悪性度分類尺度に基づいて診断の分野の当業者によって決定されるとおり疾患の重症度の低下によって測定することができる。例えば適当な尺度を使用して測定される疾患の重症度の低下をもたらす任意の有益な変化は、本明細書に記載の作用剤または組成物を使用した処置が十分であることを表す。
本明細書で使用される場合、「処置すること」または「処置」という用語は、ＡＰＯＢ遺伝子発現またはＡＰＯＢタンパク質産生に関連する１つまたは複数の徴候または症状の緩和または好転を含むがこれだけに限定されない、有益なまたは所望の結果を指す。「処置」は、処置を行わない場合に予測される生存と比較して生存が長くなることも意味する。
次に、本発明を以下の実施例によって説明する。しかし、本明細書の任意の箇所でのこれらおよび他の実施例の使用は単に例示的なものであり、決して本発明または任意の例示された形態の範囲および意味を限定するものではない。本発明は、本明細書に記載の特定の好ましい実施形態のいずれにも限定されない。本発明の多くの改変および変形が当業者には明らかになり得、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。図面を含めた本出願全体を通して引用されている全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
（実施例１）
材料および方法
ここに記載する材料および方法を実施例２～４で使用する。
初代マウス肝細胞培養および処置
初代雌マウス（ＣＤ－１）凍結保存肝細胞（ＰＭＨ）をＧｉｂｃｏから購入した（Ｌｏｔ＃：７７０）。特別に配合された解凍用培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）、ＣＭ７５００）中で細胞を解凍した。ＰＭＨを６０ｇで６分間遠心分離し、デカントによって上清を廃棄した。ＰＭＨペレットを特別に配合された肝細胞プレーティング培地（５％ウシ胎仔血清、１μＭのデキサメタゾン、１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、４μｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）および１５ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したウイリアムズＥ培地）に再懸濁させた。トリパンブルー染色を用いて生ＰＭＨを計数し、細胞を、ラット尾部Ｉ型コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートに生ＰＭＨ３０，０００個／ウェルの濃度で播種した。５％ＣＯ２の湿度制御インキュベーター中、３７℃で４時間にわたってＰＭＨをウェルに付着させた。その後、培地（ｔｈｅ ｈｅ ｍｅｄｉｕｍ）を肝細胞インキュベーション培地（０．１μＭのデキサメタゾン、１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１％ＩＴＳ＋、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）および１５ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したウイリアムズＥ培地）に置き換えた。細胞を、処理前に、湿度制御インキュベーター中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。
処理のために、ウェル中のＰＭＨ培地を、ＬＮＰ製剤を種々の濃度の全ＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せ）で含有する肝細胞インキュベーション培地に置き換えた。２０μｇ／ｍｌの全ＲＮＡから開始する各濃度を３連でアッセイした。簡単に述べると、ＬＮＰを、別の９６ウェルプレート中、インキュベーション培地中に必要な濃度に希釈した。ＬＮＰを、プレート中、インキュベーション培地を使用して２倍に段階希釈した。次いで、ＬＮＰを含有する培地１００μｌを調製プレートからＰＭＨプレートに移した。細胞を、製剤と一緒に７２時間にわたって連続的にインキュベートした。処理時間の最後に、ウェル中の培地をＡｐｏＢ ＥＬＩＳＡのために採取し、ＰＭＨをＰＢＳで３回洗浄して細胞片および培地を取り除いた。ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＭＨからゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを抽出し、試料をさらに処理した。
（実施例２）
ＡＰＯＢ発現制御領域の編集
本実施例では、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分、すなわち、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）＝、およびＣａｓ９を含むエフェクターを含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を用いたＡＰＯＢ発現制御領域の編集を記載する。いかなる理論にも縛られることを望まずに、標的化成分によりエフェクターが標的部位にガイドされ、Ｃａｓ９を含むエフェクターにより、ゲノムＤＮＡがＡＰＯＢ遺伝子発現制御領域において切断されると仮定した。Ｃａｓ９誘導切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復では種々の異なる変異が残され、配列決定または他の方法によって検出することができる。したがって、部位特異的遮断剤により、ゲノムＤＮＡが標的発現制御領域で編集される。編集の一部は生産的である、すなわち、これらの編集（すなわち、変異）は発現調節配列の機能を中断する、例えば、ＣＴＣＦ部位によって媒介されるトポロジカル立体配置（例えばループ）の形成を中断するものである。
ガイドＲＮＡを、ＡＰＯＢ遺伝子のＣＴＣＦアンカー部位３（転写開始部位の付近）を含む転写制御領域を部位特異的に標的とするように設計し（例えば、図１および２を参照されたい）、オリゴヌクレオチド合成のための標準の方法に従って合成した。単一ガイドＲＮＡのヌクレオチド配列を表２に提示する。
細胞培養およびトランスフェクションを実施例１に記載の通り行った。
個々のｓｇＲＮＡ（図２を参照されたい）およびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを使用してＬＮＰ製剤を調製した。ＬＮＰ製剤を細胞に全ＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の最終濃度２０．００μｇ／ｍｌ、１０．００μｇ／ｍｌ、５．００μｇ／ｍｌ、２．５０μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、または０．６３０μｇ／ｍｌで添加した。７２時間後に実験を終了した。細胞培養物の上清をタンパク質アッセイのために採取した。下流のｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡ精製のために細胞を溶解させた。非標的ｓｇＲＮＡ、ＧＤ－２３１５０を陰性対照として使用した。ＧＤ－２３１５０は以下の配列を有する：ＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ
ＡＰＯＢ発現制御領域の編集をＴ７Ｅ１アッセイおよび配列決定に基づくアッセイを使用して分析した。周知のプロトコールに従ってアッセイを実施した。簡単に述べると、ＰＭＨ由来のゲノムＤＮＡ（上記）を、ＣＴＣＦ部位３領域に対するプライマーを使用して増幅し、アンプリコン配列決定（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって配列決定した。使用したプライマーは以下の配列を有する：
フォワード：ＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＡＴＴ
リバース：ＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＡＡＧＴＧＴ
フォワードアダプター配列：ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ
リバースアダプター配列：ＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ
野生型アンプリコン、すなわち、Ｃａｓ９による編集によって生成した変異を含有しないアンプリコンは以下に示される配列を有する：
ＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＡＴＴＴＡＣＴＣＴＡＣＣＣＴＡＧＧＧＧＴＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴＴＴＧＣＣＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＧＣＡＧＡＧＣＧＣＴＡＧＧＡＴＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＡＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＴＡＡＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＡＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＡＣＧＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＴＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧ
ＰＣＲ産物を精製し、Ｔ７エンドヌクレアーゼ消化またはアンプリコン配列決定に供した。Ｔ７エンドヌクレアーゼは、標的部位におけるＣａｓ９誘導切断のＮＨＥＪ修復によって生成される変異によって引き起こされたミスマッチの位置で二本鎖ＤＮＡを切断する。
図３Ａ～３Ｄに示されている通り、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９の組合せにより、ＡＰＯＢ遺伝子の発現制御領域が編集された。図３Ａ～３Ｄの実験の材料および方法は実施例１に記載されているものとはわずかに異なるものであった。簡単に述べると、ＰＭＨ細胞の解凍後、トリパンブルー染色を用いて生ＰＭＨを計数し、細胞を、ラット尾部Ｉ型コラーゲンをコーティングした２４ウェルプレートに生ＰＭＨ１８０，０００個／ウェルの濃度で播種した。５％ＣＯ２の湿度制御インキュベーター中、３７℃で４時間にわたってＰＭＨをウェルに付着させた。次いで、培地を肝細胞インキュベーション培地（０．１μＭのデキサメタゾン、１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１％ＩＴＳ＋、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）および１５ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したウイリアムズＥ培地）に置き換えた。細胞を、処理を行う前に、湿度制御インキュベーター中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。
処理のために、ウェル中のＰＭＨ培地を、本明細書の他の箇所で説明されている結果に基づいて５μｇ／ｍｌの全ＲＮＡ濃度のＬＮＰ製剤を含有する肝細胞インキュベーション培地に置き換えた。ＰＭＨ処理を３連で行った。簡単に述べると、ＬＮＰを、別の２４ウェルプレート中、インキュベーション培地中に必要な濃度に希釈した。ＰＭＨプレートのウェルから培地を採取した。次いで、ＬＮＰを含有する培地５００μｌを調製プレートからＰＭＨプレートに移した。細胞を、製剤と一緒に２４時間インキュベートした。次いで、ＡｐｏＢ ＥＬＩＳＡのためにウェルから培地を採取し、ＬＮＰを伴わない新鮮なインキュベーション培地を細胞に添加した。４８時間後および９６時間後（それぞれ処理の７２時間後および１２０時間後に対応する）、ウェル中の培地を採取し、ＰＭＨをＰＢＳで３回洗浄して細胞片および培地を取り除いた。次いで、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＭＨからゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを抽出し、試料をさらに処理した。ＰＣＲプライマーおよび予測される野生型アンプリコン配列は上記と同じであった。
図３Ａおよび３Ｂに示されている通り、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せにより、ＡＰＯＢ遺伝子の発現制御領域が編集された。図３Ａは、Ｔ７Ｅ１アッセイによって決定された、５μｇ／ｍｌの濃度の示されているｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡについての発現制御領域のＣａｓ９誘導編集のパーセンテージを示す。図３Ｂは、代表的な電気泳動ゲル画像であり、Ｔ７エンドヌクレアーゼによって切断可能なＰＣＲ産物がゲル上に存在しないことが示されている。
図３Ｃおよび３Ｄに示されている通り、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９の組合せにより、ＡＰＯＢ遺伝子の発現制御領域が編集された。図３Ｃは、５μｇ／ｍｌの濃度の、示されているｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡによる発現制御領域のＣａｓ９誘導生産的編集のパーセンテージを示す。図３Ｄは、示されているｓｇＲＮＡによる生産的編集の比を示す。
（実施例３）
ＡＰＯＢ発現のモジュレーション－ｍＲＮＡ
本実施例では、ＡＰＯＢ ｍＲＮＡレベルの低下によって測定される、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分、すなわちｓｇＲＮＡ、およびＣａｓ９を含むエフェクターを含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を使用したＡＰＯＢ発現の抑止を記載する。
実施例１に記載の通り、細胞を培養し、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした。ＡＰＯＢ特異的ｓｉＲＮＡを陽性対照として使用し、細胞培養物に０．６３ｎｇ／ｍｌで添加した。ｓｉＲＮＡは以下の配列を有する。
Figure 2022548320000004
ＰＭＨ処理由来のＡｐｏＢ ｍＲＮＡを、処理細胞から得たＲＮＡ抽出物を使用したｑＰＣＲによって分析した。相対的なＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルを算出するためのハウスキーピング陽性対照としてβ－アクチンを使用した。
予備試験において、全体的な細胞の健康の指標として処理がβ－アクチンレベルに負の影響を及ぼさないことを決定するために処理群の全ての濃度からのデータを使用した（データは示していない）。これらの結果に従って、５μｇ／ｍｌを超える全ＲＮＡ濃度（すなわち、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せ）はハウスキーピング遺伝子レベルに負の影響を及ぼし、したがって細胞ストレスを引き起こすと考えられることが決定され、さらなる分析から排除した。
したがって、図４Ａ～４Ｄは、予備試験に基づいて安全であるとして許容される全ＲＮＡ濃度内の処理群の相対的なＡｐｏＢレベルを示す。図４Ａ～４Ｄに示されている通り、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せにより、ｍＲＮＡレベルの低下によって測定された通り、培養されたＰＭＨにおけるＡＰＯＢ遺伝子の発現が低減した。図４Ａ～４Ｄは、ある特定の部位特異的ＡＰＯＢ標的成分（ＧＤ－２６９１１およびＧＤ－２６９１２）とＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せにより、５μｇ／ｍｌの全ＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せ）の濃度でＡｐｏＢ発現の５０％を超える低減がもたらされたことを示すグラフである。グラフは、細胞を示されているｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９を含むエフェクターと接触させた７２時間後のＡＰＯＢ ｍＲＮＡレベルを示す。結果は３連の実験からのものである。ＡＰＯＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｐｏＢ）のレベルはＮＴＸ対照に対するものである。ＮＴＸ対照に関しては、培養細胞にＬＮＰのみをトランスフェクトした、すなわち、ＬＮＰ製剤はＲＮＡを含有しないものであった。
図４Ａおよび４Ｂは、相対的なＡＰＯＢ ｍＲＮＡレベルを示す。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルを非標的化ガイドＲＮＡ製剤（ＧＤ－２３１５０群）に対してグラフ化した。図４Ａは、ウェル内の結果を示すグラフである。試料のそれぞれのウェル内のアクチンに対する個々のＡＰＯＢの結果を使用してデルタサイクル閾値（ｄＣＴ値）が算出された（ｗｅｒｅｗａｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）。図４Ｂは、プレート間にわたる結果を示すグラフである。各希釈点での全ての試料におけるアクチンの平均に対する個々のＡＰＯＢの結果を使用してｄＣＴ値を算出した。
図４Ｃおよび４Ｄは、正規化されたｍＲＮＡインプットを用いたＮＴＣと比較した相対的なＡＰＯＢ ｍＲＮＡレベルを示す。図４Ｃは、ウェル内の結果を示すグラフである。試料のそれぞれのウェル内でのアクチンに対する個々のＡＰＯＢの結果を使用してｄＣＴ値を算出した。図４Ｄは、プレート間にわたる結果を示すグラフである。全ての試料中のアクチンの平均に対する個々のＡＰＯＢの結果を使用してｄＣＴ値を算出した。
図４Ｅおよび４Ｆにより、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分、すなわちｓｇＲＮＡ、およびＣａｓ９を含むエフェクターを含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を用いたＡＰＯＢ発現のダウンレギュレーションがさらに確認される。図４Ｅおよび４Ｆでは、５μｇ／ｍｌの全ＲＮＡ、すなわち、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せを細胞にトランスフェクトした。さらに、ＡＰＯＢ遺伝子のエクソンを標的とするｓｇＲＮＡ、ＧＤ－２７７２３を陽性対照として使用し、一方、異なる無関係の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ、ＧＤ－２３１４９を陰性対照として使用した。ＧＤ－２７７２３およびＧＤ２３１４９は以下の配列を有する：
Figure 2022548320000005
図４Ｅおよび４Ｆに示されている通り、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９を含むエフェクターの組合せにより、ＡＰＯＢのｍＲＮＡレベルが特異的に低下した。ＰＭＨ細胞においてＡＰＯＢ特異的ｓｇＲＮＡによりＡＰＯＢのｍＲＮＡレベルが低下したが、無関係の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡではＡＰＯＢの発現をダウンレギュレートすることはできなかった。
（実施例４）
ＡＰＯＢ発現のモジュレーション－タンパク質
本実施例では、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分、すなわちｓｇＲＮＡ、およびＣａｓ９を含むエフェクターを含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を使用した、ＡＰＯＢタンパク質レベルの低下によって測定されるＡＰＯＢ発現の抑止を記載する。
わずかな改変を伴って実施例１に記載の通り細胞を培養し、部位特異的ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを用いて処理した。５μｇ／ｍｌの全ＲＮＡ、すなわち、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞培養物からの上清を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、上清中のＡＰＯＢタンパク質の濃度を決定した。
図５Ａおよび５Ｂに示されている通り、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９の組合せにより、タンパク質レベルの低下によって測定された通り、培養したＰＭＨにおけるＡＰＯＢ遺伝子の発現が低減した。図５Ａは、培養細胞の上清中のＡｐｏＢタンパク質の濃度を示す。図５Ｂは、示されているｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組合せを使用した低減のパーセンテージを示す。
Figure 2022548320000006
Figure 2022548320000007

Claims (110)

  1. ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分を含む部位特異的アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）遮断剤。
  2. 前記部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分が、ポリマー分子を含む、請求項１に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  3. 前記ポリマー分子が、ポリアミドを含む、請求項２に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  4. 前記ポリマー分子が、ポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  5. 前記発現制御領域が、ＡＰＯＢ関連アンカー配列を含む、請求項１に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  6. 前記ＡＰＯＢ関連アンカー配列が、ＣＣＣＴＣ結合性因子（ＣＴＣＦ）結合性モチーフを含む、請求項５に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  7. 前記ＡＰＯＢ関連ＣＴＣＦ結合性モチーフが、ＡＰＯＢ ＣＴＣＦ部位３のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  8. 前記発現制御領域が、ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続を含む、請求項５から７までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  9. 前記ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続が、１つまたは複数の転写制御エレメントを前記接続の内側に含む、請求項８に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  10. 前記ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続が、１つまたは複数の転写制御エレメントを前記接続の外側に含む、請求項８に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  11. 前記ＡＰＯＢ関連アンカー配列が、前記転写制御エレメントに対して約３００ｋｂ以内に位置する、請求項８から１０までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  12. 前記アンカー配列が、前記転写制御エレメントに対して１０ｋｂ以内に位置する、請求項１１に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  13. 前記発現制御領域が、ＡＰＯＢ特異的転写制御エレメントを含む、請求項１に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  14. 前記転写制御エレメントが、ＡＰＯＢプロモーターを含む、請求項１３に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  15. 前記転写制御エレメントが、転写エンハンサーを含む、請求項１３に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  16. 前記転写制御エレメントが、転写リプレッサーを含む、請求項１３に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  17. 表２のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列全体に対して少なくとも８５％のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  18. 前記ＡＰＯＢ発現制御領域に特異的に結合するジンクフィンガーポリペプチド（ＺＮＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  19. ヌクレオチド修飾を含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  20. ポリマー分子が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む、請求項１に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  21. 請求項１から１９までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を含むベクター。
  22. ウイルス発現ベクターである、請求項２１に記載のベクター。
  23. 請求項１から２０までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤または請求項２１または２２に記載のベクターを含む細胞。
  24. 組成物中に存在する、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  25. 前記組成物が、医薬組成物を含む、請求項２４に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  26. 前記医薬組成物が、脂質製剤を含む、請求項２５に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  27. 前記脂質製剤が、１つまたは複数のカチオン性脂質、１つまたは複数の非カチオン性脂質、１つまたは複数のコレステロールに基づく脂質、または１つまたは複数のＰＥＧ修飾された脂質、または前記のいずれかの組合せを含む、請求項２６に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  28. 前記医薬組成物が、脂質ナノ粒子を含む、請求項２６に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  29. ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分とエフェクター分子とを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  30. 前記部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分が、前記ＡＰＯＢ発現制御領域に特異的に結合するジンクフィンガーポリペプチド（ＺＮＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  31. 前記エフェクター分子が、ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、請求項２９に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  32. 前記融合タンパク質が、ペプチド核酸融合物を含む、請求項２９に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  33. 前記エフェクターが、ヌクレアーゼ、物理的遮断因子、エピジェネティック動員因子、およびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子、および前記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項２９から３２までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  34. 前記エフェクターが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  35. 前記Ｃａｓポリペプチドが、酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドである、請求項３１に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  36. ヒトエキソヌクレアーゼ１（ｈＥＸＯ１）の触媒として活性なドメインをさらに含む、請求項３１に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  37. 前記エピジェネティック動員因子が、転写エンハンサーまたは転写リプレッサーを含む、請求項３３に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  38. 前記エピジェネティックＣｐＧ修飾因子が、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン修飾剤、またはヒストン脱アセチル化酵素を含む、請求項３３に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  39. 前記エフェクター分子が、ジンクフィンガーポリペプチドを含む、請求項２９から３３までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  40. 前記エフェクター分子が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドを含む、請求項２９から３３までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  41. 請求項２９から４０までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤をコードする核酸分子を含むベクター。
  42. ウイルス発現ベクターである、請求項４１に記載のベクター。
  43. 請求項２９から４０までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤または請求項４１または４２に記載のベクターを含む細胞。
  44. 組成物中に存在する、請求項２９から４０までのいずれか一項に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  45. 前記組成物が、医薬組成物を含む、請求項４４に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  46. 前記医薬組成物が、脂質製剤を含む、請求項４５に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  47. 前記脂質製剤が、１つまたは複数のカチオン性脂質、１つまたは複数の非カチオン性脂質、１つまたは複数のコレステロールに基づく脂質、または１つまたは複数のＰＥＧ修飾された脂質、または前記のいずれかの組合せを含む、請求項４６に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  48. 前記医薬組成物が、脂質ナノ粒子を含む、請求項４６に記載の部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤。
  49. 細胞におけるアポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）の発現をモジュレートする方法であって、前記細胞を、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分およびエフェクター分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤と接触させるステップを含み、それにより、前記細胞におけるＡＰＯＢの発現をモジュレートする、方法。
  50. 前記発現のモジュレーションが、前記細胞におけるＡＰＯＢの発現の増強である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記発現のモジュレーションが、前記細胞におけるＡＰＯＢの発現の低減である、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分が、ポリマー分子を含む、請求項４９に記載の方法。
  53. 前記ポリマー分子が、ポリアミドを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ポリマー分子が、ポリヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記発現制御領域が、ＡＰＯＢ関連アンカー配列を含む、請求項５２に記載の方法。
  56. 前記ＡＰＯＢ関連アンカー配列が、ＣＣＣＴＣ結合性因子（ＣＴＣＦ）結合性モチーフを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ＡＰＯＢ関連ＣＴＣＦ結合性モチーフが、ＡＰＯＢ ＣＴＣＦ部位３のヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記発現制御領域が、ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続を含む、請求項５５から５７までのいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続が、１つまたは複数の転写制御エレメントを前記接続の内側に含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ＡＰＯＢ関連アンカー配列媒介性接続が、１つまたは複数の転写制御エレメントを前記接続の外側に含む、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記アンカー配列が、前記転写制御エレメントに対して約３００ｋｂ以内に位置する、請求項５４から６０までのいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記アンカー配列が、前記転写制御エレメントに対して１０ｋｂ以内に位置する、請求項５７に記載の方法。
  63. 前記発現制御領域が、ＡＰＯＢ特異的転写エレメントを含む、請求項４９に記載の方法。
  64. 前記転写エレメントが、ＡＰＯＢプロモーターを含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記転写制御エレメントが、転写エンハンサーを含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記転写制御エレメントが、転写リプレッサーを含む、請求項６４に記載の方法。
  67. 前記部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤が、表２のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列全体に対して少なくとも８５％のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４９から６６までのいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤が、前記ＡＰＯＢ発現制御領域に特異的に結合するジンクフィンガーポリペプチド（ＺＮＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４９に記載の方法。
  69. 前記部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤が、ヌクレオチド修飾を含む、請求項４９から６８までのいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記ポリマー分子が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む、請求項４９に記載の方法。
  71. 前記エフェクター分子が、ポリペプチドを含む、請求項４９に記載の方法。
  72. 前記ポリペプチドが、ＡＰＯＢ発現調節領域を標的とする前記部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分と前記エフェクター分子とを含む融合タンパク質を含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記融合タンパク質が、ペプチド核酸融合分子を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記エフェクターが、ヌクレアーゼ、物理的遮断因子、エピジェネティック動員因子、およびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子、および前記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  75. 前記エフェクターが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードする核酸分子を含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記Ｃａｓポリペプチドが、酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドである、請求項７５に記載の方法。
  77. ヒトエキソヌクレアーゼ１（ｈＥＸＯ１）の触媒として活性なドメインをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記エピジェネティック動員因子が、転写エンハンサーまたは転写リプレッサーを含む、請求項７４に記載の方法。
  79. 前記エピジェネティックＣｐＧ修飾因子が、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン修飾剤、またはヒストン脱アセチル化酵素を含む、請求項７４に記載の方法。
  80. 前記エフェクター分子が、ジンクフィンガーポリペプチドを含む、請求項７１から７４までのいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記エフェクター分子が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドを含む、請求項７１から７４までのいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記融合タンパク質が、酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドおよびエピジェネティック動員因子ポリペプチドを含む、請求項７２に記載の方法。
  83. 前記融合タンパク質が、酵素的にＣａｓポリペプチドおよびエピジェネティックＣｐＧ修飾因子ポリペプチドを含む、請求項７２に記載の方法。
  84. 前記部位特異的遮断剤、前記エフェクター、または前記部位特異的遮断剤と前記エフェクターの両方が、ベクター内に存在する、請求項４９から８３までのいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記部位特異的遮断剤と前記エフェクターが、同じベクター内に存在する、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記部位特異的遮断剤と前記エフェクターが、異なるベクター内に存在する、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記ベクターが、ウイルス発現ベクターである、請求項８４から８６までのいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記部位特異的遮断剤、前記エフェクター、または前記部位特異的遮断剤と前記エフェクターの両方が、組成物中に存在する、請求項４９から８３までのいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記部位特異的遮断剤と前記エフェクターが、同じ組成物中に存在する、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記部位特異的遮断剤と前記エフェクターが、異なる組成物中に存在する、請求項８８に記載の方法。
  91. 前記組成物が、医薬組成物を含む、請求項８８から９０までのいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記医薬組成物が、脂質製剤を含む、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記脂質製剤が、１つまたは複数のカチオン性脂質、１つまたは複数の非カチオン性脂質、１つまたは複数のコレステロールに基づく脂質、または１つまたは複数のＰＥＧ修飾された脂質、または前記のいずれかの組合せを含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記医薬組成物が、脂質ナノ粒子を含む、請求項９２に記載の方法。
  95. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４９に記載の方法。
  96. 前記哺乳動物細胞が、体細胞である、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記哺乳動物細胞が、初代細胞である、請求項９５に記載の方法。
  98. 前記接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請求項４９に記載の方法。
  99. 前記接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｖｏで実施される、請求項４９に記載の方法。
  100. 前記接触させるステップが、ｅｘ ｖｉｖｏで実施される、請求項４９に記載の方法。
  101. 前記細胞を対象に投与するステップをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記細胞が、対象内に存在する、請求項４９に記載の方法。
  103. 前記対象が、ＡＰＯＢ関連疾患を有する、請求項１０１または１０２に記載の方法。
  104. 前記ＡＰＯＢ関連疾患が、高脂血症、高コレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症、インスリンに対する免疫応答に関連しないインスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧症、内皮細胞機能障害、心疾患、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
  105. ＡＰＯＢ関連疾患を有する対象を処置するための方法であって、前記対象に、ＡＰＯＢ発現制御領域を標的とする部位特異的ＡＰＯＢ標的化成分およびエフェクター分子を含む部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤を治療有効量で投与するステップを含み、それにより、前記対象を処置する、方法。
  106. 前記ＡＰＯＢ関連疾患が、高コレステロール血症であり、前記部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤が、前記対象におけるＡＰＯＢの発現を低減するものである、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤および前記エフェクター分子が、前記対象に併せて投与される、請求項１０５または１０６に記載の方法。
  108. 前記部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤および前記エフェクター分子が、前記対象に逐次的に投与される、請求項１０５または１０６に記載の方法。
  109. 前記エフェクター分子が、前記対象に、前記部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤の投与の前に投与される、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記部位特異的ＡＰＯＢ遮断剤が、前記対象に、前記エフェクター分子の投与の前に投与される、請求項１０８に記載の方法。
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