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JP2022118129A - 第ｖｉｉｉ因子キメラタンパク質及びその使用 - Google Patents

第ｖｉｉｉ因子キメラタンパク質及びその使用 Download PDF

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JP2022118129A
JP2022118129A JP2022098923A JP2022098923A JP2022118129A JP 2022118129 A JP2022118129 A JP 2022118129A JP 2022098923 A JP2022098923 A JP 2022098923A JP 2022098923 A JP2022098923 A JP 2022098923A JP 2022118129 A JP2022118129 A JP 2022118129A
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amino acid
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Abstract

【課題】あまり頻繁ではない投与で済む第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）製剤、すなわち、半減期の限界の１．５～２倍より長い半減期を有するＦＶＩＩＩ製剤を提供する。【解決手段】本発明は、（ｉ）第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域またはその一部に融合されたＦＶＩＩＩを含む第１のポリペプチドと（ｉｉ）中間のＸＴＥＮ配列によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）のＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質を含む第２のポリペプチドとを含むキメラタンパク質を提供し、ＸＴＥＮ配列は２８８未満のアミノ酸残基を含有し、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドに連結されるまたは会合する。特定の実施形態には、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、第２のポリペプチドにおけるＸＴＥＮ配列は１２～２８７アミノ酸の間の長さを有するアミノ酸配列から成る。【選択図】図１

Description

電子的に提出された配列表への言及
ＡＳＣＩＩテキストファイルにて電子的に提出された配列表（名称：２１５９＿４４１ＰＣ０２＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：８２３，５００バイト；作成日：２０１５年１月９日）の内容はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
血友病Ａは第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする遺伝子の欠損が原因で生じる出血性疾患であり、男児出生１０，０００人に１～２人が発症する。Ｇｒａｗら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．６（６）：４８８－５０１（２００５）．血友病Ａに罹った患者は精製したＦＶＩＩＩまたは組換えで製造されたＦＶＩＩＩの点滴によって治療することができる。しかしながら、市販のＦＶＩＩＩ製剤はすべて約８～１２時間の半減期を有することが知られており、患者への頻繁な静脈内投与を必要とする。Ｗｅｉｎｅｒ，Ｍ．Ａ．及びＣａｉｒｏ，Ｍ．Ｓ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｒｅｔｓ，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｔ．，１２．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００１；Ｌｉｌｌｉｃｒａｐ，Ｄ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２２，Ｓｕｐｐｌ．４：Ｓ２－８（２００８）を参照のこと。加えて、ＦＶＩＩＩの半減期を延長するために多数のアプローチが試みられている。たとえば、凝固因子の半減期を延長するための開発におけるアプローチには、ＰＥＧ化、糖ＰＥＧ化、及びアルブミンによる抱合が含まれる。Ｄｕｍｏｎｔら，Ｂｌｏｏｄ．１１９（１３）：３０２４－３０３０（２０１２年１月１３日オンラインで公開）を参照のこと。しかしながら、使用されたタンパク質工学にかかわらず、現在開発中の長時間作用型のＦＶＩＩＩ製剤は前臨床動物モデルにてたった約１．５～２時間の限定された半減期を有するにすぎないことが報告されている。上記を参照のこと。一貫した結果はヒトで実証されており、たとえば、ｒＦＶＩＩＩＦｃは血友病Ａの患者にてアドベイト（登録商標）と比べて約１．７倍まで半減期を改善することが報告された。上記参照。したがって、半減期の上昇は、軽微な改善にもかかわらず、他のＴ１／２律速因子の存在を示し得る。Ｌｉｕ，Ｔ．ら，２００７，ＩＳＴＨ ｍｅｅｔｉｎｇ，ａｂｓｔｒａｃｔ＃Ｐ－Ｍ－０３５；Ｈｅｎｒｉｋ，Ａ．ら，２０１１，ＩＳＴＨ ｍｅｅｔｉｎｇ，ａｂｓｔｒａｃｔ＃Ｐ＝ＭＯ－１８１；Ｌｉｕ，Ｔら，２０１１，ＩＳＴＨ ｍｅｅｔｉｎｇ ａｂｓｔｒａｃｔ＃Ｐ－ＷＥ－１３１を参照のこと。
血漿のフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）はおよそ１６時間（１３～１８時間の範囲）の半減期を有する。Ｇｏｕｄｅｍａｎｄ，Ｊら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５；３：２２１９－２７。ＶＷＦの半減期は、多数の因子：ＶＷＦにおけるグリコシル化のパターン、ＡＤＡＭＴＳ－１３（トロンボスポンジンモチーフを伴ったジスインテグリンとメタロプロテアーゼ－１３）、及び種々の突然変異によって影響を受け得る
血漿では、ＦＶＩＩＩの９５～９８％が完全長のＶＷＦとの堅い非共有結合の複合体で循環している。この複合体の形成は生体内でのＦＶＩＩＩの適当な血漿レベルの維持にとって重要である。Ｌｅｎｔｉｎｇら，Ｂｌｏｏｄ．９２（１１）：３９８３－９６（１９９８）；Ｌｅｎｔｉｎｇら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．５（７）：１３５３－６０（２００７）。完全長の野生型ＦＶＩＩＩは大部分が、重鎖（ＭＷ ２００ｋＤ）と軽鎖（ＭＷ ７３ｋＤ）を有するヘテロ二量体として存在する。重鎖の３７２位と７４０位及び軽鎖の１６８９位でのタンパク質分解によりＦＶＩＩＩが活性化されると、ＦＶＩＩＩに結合されたＶＷＦが活性化されたＦＶＩＩＩから取り外される。活性化されたＦＶ
ＩＩＩは活性化された第ＩＸ因子、カルシウム及びリン脂質と一緒に（「テナーゼ複合体」）第Ｘ因子の活性化を誘導し、大量のトロンビンを生成する。次いでトロンビンは次にフィブリノーゲンを切断して可溶性のフィブリン単量体を形成し、次いでそれは自然に重合して可溶性のフィブリンポリマーを形成する。トロンビンはまた第ＸＩＩＩ因子も活性化し、それはカルシウムと一緒に可溶性のフィブリンポリマーを架橋し、安定化するのに役立ち、架橋された（不溶性の）フィブリンを形成する。活性化されたＦＶＩＩＩはタンパク質分解によって循環から速やかにクリアランスされる。
頻繁な投与と投与スケジュールが原因で生じる不都合さとに起因して、あまり頻繁ではない投与で済むＦＶＩＩＩ製剤、すなわち、半減期の限界の１．５～２倍より長い半減期を有するＦＶＩＩＩ製剤を開発するニーズが依然として存在する。
Ｇｒａｗら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．６（６）：４８８－５０１（２００５） Ｄｕｍｏｎｔら，Ｂｌｏｏｄ．１１９（１３）：３０２４－３０３０ Ｇｏｕｄｅｍａｎｄ，Ｊら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５；３：２２１９－２７ Ｌｅｎｔｉｎｇら，Ｂｌｏｏｄ．９２（１１）：３９８３－９６（１９９８） Ｌｅｎｔｉｎｇら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．５（７）：１３５３－６０（２００７）
本発明は、（ｉ）第１の免疫グロブリン（「Ｉｇ」）定常領域またはその一部に融合された第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）を含む第１のポリペプチドと（ｉｉ）中間のＸＴＥＮ配列によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたフォンウィルブランド因子（「ＶＷＦ」）のＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質を含む第２のポリペプチドとを含むキメラタンパク質を提供し、その際、ＸＴＥＮ配列は２８８未満のアミノ酸残基を含有し、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドに連結されるまたは会合する。特定の実施形態には、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、第２のポリペプチドにおけるＸＴＥＮ配列は１２アミノ酸～２８７アミノ酸の間の長さを有するアミノ酸配列から成る。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、キメラタンパク質は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを含み、融合タンパク質の第２のポリペプチドが少なくとも２８８アミノ酸を含有するＸＴＥＮ配列を含む相当する融合タンパク質に比べて長い半減期を示す。一部の実施形態には、少なくとも２８８アミノ酸を含有するＸＴＥＮ配列ＡＥ２８８が含まれる。一部の実施形態では、ＡＥ２８８は配列番号８である。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、第２のポリペプチドのＸＴＥＮ配列は約３６、約４２、約７２、または約１４４のアミノ酸を含有する。一部の実施形態では、第２のポリペプチドのＸＴＥＮ配列はＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＧ４２、ＡＧ７２、またはＡＧ１４４から選択される。
一部の実施形態には本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、第２のポリペプチドのＸＴＥＮ配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列
番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；または配列番号６３から選択される。
特定の実施形態では、第１のポリペプチドはさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質を第１のＩｇ定常領域またはその一部と連結する第２のＸＴＥＮ配列を含む。開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、第１のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩタンパク質の中での１以上の挿入部位に挿入される第３のＸＴＥＮ配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドはさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質の中での１以上の挿入部位に挿入される第２のＸＴＥＮ配列を含む。特定の実施形態では、第１のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩタンパク質を第１のＩｇ定常領域またはその一部と連結する第３のＸＴＥＮ配列を含む。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、第２のＸＴＥＮ配列、第３のＸＴＥＮ配列、または第２と第３のＸＴＥＮ配列はそれぞれ独立してＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、及びＡＧ１４４から選択される。一部の実施形態では、第２のＸＴＥＮ配列、第３のＸＴＥＮ配列、または第２と第３のＸＴＥＮ配列はそれぞれ独立して配列番号８；配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１７；配列番号５４；配列番号１９；配列番号１６；配列番号１８；配列番号１５；配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；または配列番号６３から選択される。特定の実施形態では、第２のＸＴＥＮ配列、第３のＸＴＥＮ配列、または第２と第３双方のＸＴＥＮ配列はそれぞれ独立してＡＥ２８８またはＡＧ２８８である。一部の実施形態では、第２のポリペプチドにおけるＸＴＥＮ配列はリンカーによって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合される。特定の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。
一部の実施形態には本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、リンカーは、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ－２、グランザイム－Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７、及びＭＭＰ－２０から選択されるプロテアーゼによって切断可能である。一部の実施形態には、リンカーは因子ＩＩａ（トロンビン）によって切断可能である。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、リンカーは、ＲＲＲＲ（配列番号１０２）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０３）、ＲＲＲＲＳ（配列番号１０４）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号３）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５）、ＬＶＰＲＧ（配列番号６）、ＡＬＲＰＲ（配列番号７）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号１２１）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号１２２）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号１２３）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号１２４）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号１２５）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号１２６）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号１２７）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号１２８）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号１２９）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号１３０）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号１３１）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号１３２）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号１３３）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号１３４）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：１３５）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号１３６）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１３７）、ＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号１３８）、ＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号８８）、及びＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）から選択されるアミノ酸配列を含む１以上の切断部位を含む。一部の実施形
態では、リンカーはＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号１４６）を含む。特定の実施形態では、切断部位はＬＶＰＲＧ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、切断部位はＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、切断部位はＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）のアミノ酸配列を含み、切断部位はＦＶＩＩＩの完全長ａ２領域ではない。一部の実施形態では、切断部位は少なくともＩＥＰＲ（配列番号２００）を含むＦＶＩＩＩのａ２領域の断片を含む。他の実施形態では、切断部位は少なくとも配列ＩＥＰＲ（配列番号２００）を含むＦＶＩＩＩのａ２領域の断片を含み、切断部位は完全長ａ２領域ではない。特定の実施形態では、切断部位は本明細書で提供されるような、または当該技術で既知のようなトロンビン切断アッセイで切断可能である。
一部の実施形態には本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、第１のＩｇ定常領域またはその一部は第１のＦｃ領域を含み、及び／または第２のＩｇ定常領域またはその一部は第２のＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、第１のＩｇ定常領域またはその一部及び第２のＩｇ定常領域またはその一部はキメラタンパク質の半減期を延長する。一部の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはリンカーによって融合される。特定の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは処理可能なリンカーによって融合される。一部の実施形態では、第１のＩｇ定常領域またはその一部は第２のＩｇ定常領域またはその一部と会合する。特定の実施形態では、第１のＩｇ定常領域またはその一部は第２のＩｇ定常領域またはその一部と共有結合によって会合する。一部の実施形態では、共有結合はジスルフィド結合である。
開示されるのはまた、以下の式（ａ）～（ｈｈ）のそれぞれを含むキメラタンパク質である：
（ａ）ＦＶＩＩＩ－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｂ）ＦＶＩＩＩ－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２；
（ｃ）Ｆ１－ＦＶＩＩＩ：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｄ）Ｆ１－ＦＶＩＩＩ：Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２；
（ｅ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ２－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｆ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ２－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｇ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｈ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｉ）Ｆ１－Ｘ２－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｊ）Ｆ１－Ｘ２－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｋ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１；
（ｌ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ；
（ｍ）Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｎ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｏ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２；
（ｐ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｑ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ；
（ｒ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１；
（ｓ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１；
（ｔ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）；
（ｕ）Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｖ）Ｆ－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｗ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｘ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｙ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）；
（ｚ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１；
（ａａ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ２－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｘ２－Ｌ５－Ｆ１；
（ｂｂ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ２－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ；
（ｃｃ）Ｆ１－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ１－Ｖ；
（ｄｄ）Ｆ１－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ２－Ｌ２－Ｆ２；
（ｅｅ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ１；
（ｆｆ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｇｇ）Ｆ１－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ４－Ｘ２－Ｌ５－ＦＶＩＩＩ；又は
（ｈｈ）Ｆ１－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－Ｆ２；
式中、ＶはＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質であり、ＸまたはＸ１は２８８未満のアミノ酸を含有する第１のＸＴＥＮ配列であり、Ｘ２は第２のＸＴＥＮ配列であり、ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）はＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位に挿入された第２のＸＴＥＮ配列を有するＦＶＩＩＩタンパク質を含み、Ｆ１は第１のＩｇ定常領域またはその一部であり、Ｆ２は第２のＩｇ定常領域またはその一部であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５は任意のリンカーであり、（－）はペプチド結合であり、（：）は共有結合または非共有結合である。
一部の実施形態には本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、ＸまたはＸ１は１２アミノ酸～２８７アミノ酸の間の長さのアミノ酸配列から成る。
特定の実施形態では、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質はＸまたはＸ１がＡＥ２８８であることを除いて式を含む相当するキメラタンパク質に比べて長い半減期を示す。一部の実施形態では、ＡＥ２８８は配列番号８である。
一部の実施形態には本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、式におけるＸまたはＸ１は約３６、約４２、約７２、または約１４４のアミノ酸を含有する。特定の実施形態では、式におけるＸまたはＸ１はＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＧ４２、ＡＧ７２、またはＡＧ１４４から選択される。一部の実施形態では、式におけるＸまたはＸ１は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；または配列番号６３から選択される。特定の実施形態では、Ｘ２は、少なくとも約３６アミノ酸、少なくとも約４２アミノ酸、少なくとも約１４４アミノ酸、少なくとも約２８８アミノ酸、少なくとも約５７６アミノ酸、少なくとも約８６４アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｘ２はＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、及びＡＧ１４４から選択される。一部の実施形態では、Ｘ２は、配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１７；配列番号５４；配列番号１９；配列番号１６；配列番号１８；配列番号１５；配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；または配列番号：６３から選択される。特定の実施形態では、Ｘ２はＡＥ２８８またはＡＧ２８８である。
開示されるのはまた、ＸまたはＸ１及び／またはＸ２を含まないキメラタンパク質に比べて長い半減期を示すＸまたはＸ１及び／またはＸ２を含む、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質である。一部の実施形態では、Ｌ１及び／またはＬ２は切断可能なリンカーである。特定の実施形態では、Ｌ４及び／またはＬ５は切断可能なリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ－２、グランザイム－Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７、及びＭＭＰ－２０から選択されるプロテ
アーゼによって切断可能である。一部の実施形態には、リンカーは第ＩＩａ因子（トロンビン）によって切断可能である。
一部の実施形態には本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、リンカーは、ＲＲＲＲ（配列番号１０２）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０３）、ＲＲＲＲＳ（配列番号１０４）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号２）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号３）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５）、ＬＶＰＲＧ（配列番号６）、ＡＬＲＰＲ（配列番号７）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号１２１）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号１２２）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号１２３）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号１２４）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号１２５）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号１２６）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号１２７）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号１２８）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号１２９）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号１３０）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号１３１）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号１３２）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号１３３）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号１３４）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１３５）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号１３６）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１３７）、及びＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号１３８）から選択されるアミノ酸配列を含む１以上の切断可能な部位を含む。一部の実施形態では、リンカーはＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号１４６）を含む。特定の実施形態では、リンカーはＬＶＰＲＧ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーはＦＶＩＩＩのａ１領域、ＦＶＩＩＩのａ２領域、ＦＶＩＩＩのａ３領域またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態では、リンカーはＦＶＩＩＩのａ２領域の断片を含む。ａ２領域の断片は場合によっては配列ＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号８８）を含むことができる。さらに他の実施形態では、ＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）の配列を有する断片を含むＦＶＩＩＩのａ２領域のさらに小さな断片を使用することができる。特定の一実施形態では、リンカーはＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、リンカーはＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）のアミノ酸配列を含み、その際、リンカーはＦＶＩＩＩの完全長ａ２領域ではない。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、ＦＶＩＩＩのａ２領域は、ＩＳＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１０６）またはＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号８８）のいずれかに対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ａ１領域はＩＳＭＫＮＮＥＥＡＥＤＹＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶ（配列番号１０７）に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ａ３領域はＩＳＥＩＴＲＴＴＬＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲＳＦＱ（配列番号１０８）に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｆ１は第１のＦｃ領域を含み、及び／またはＦ２は第２のＦｃ領域を含む。
一部の実施形態には、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、Ｆ１及びＦ２を含むキメラタンパク質はＦ１及びＦ２を含まないキメラタンパク質に比べて長い半減期を示す。特定の実施形態では、Ｌ３は処理可能なリンカーである。一部の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は非共有結合によってＦＶＩＩＩタンパク質と会合する。一部の実施形態では、キメラタンパク質の半減期は、ＶＷＦタンパク質及び／またはＸＴＥＮ配列を含まないＦＶＩＩＩタンパク質に比べて、または野生型ＦＶＩＩＩに比べて延長される。特定の実施形態では、キメラタンパク質の半減期は、ＶＷＦタンパク質またはＸＴＥＮ配列を含まないＦＶＩＩＩタンパク質よりも、または野生型ＦＶＩＩＩよりも
少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長される。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、キメラタンパク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。一部の実施形態では、キメラタンパク質の半減期はＨｅｍＡマウスにて約４０時間である。特定の実施形態では、ＶＷＦタンパク質はＶＷＦクリアランス受容体に実質的に結合しない。一部の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は、１以上のプロテアーゼ切断からＦＶＩＩＩタンパク質を保護することができ、活性化からＦＶＩＩＩタンパク質を保護することができ、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖及び／または軽鎖を安定化することができ、または１以上のスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩタンパク質のクリアランスを防ぐことができる。
一部の実施形態には、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、ＶＷＦタンパク質はＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を遮蔽することまたは遮断することによって内在性のＶＷＦがＦＶＩＩＩタンパク質に結合するのを阻害するまたは妨ぐ。特定の実施形態では、ＶＷＦ結合部位はＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメイン、またはＡ３ドメイン及びＣ２ドメインの双方に位置する。一部の実施形態では、ＶＷＦ結合部位は配列番号６５のアミノ酸１６６９～１６８９及び２３０３～２３３２に相当するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩｇ定常領域またはその一部及び第２のＩｇ定常領域またはその一部は同一である、または異なっている。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも２つのＸＴＥＮ配列、少なくとも３つのＸＴＥＮ配列、少なくとも４つのＸＴＥＮ配列、少なくとも５つのＸＴＥＮ配列、または少なくとも６つのＸＴＥＮ配列に連結される、及び／またはそれらと共に挿入される。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａ１ドメイン、ａ１酸性領域、Ａ２ドメイン、ａ２酸性領域、Ｂドメイン、Ａ３ドメイン、ａ３酸性領域、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、それらの１以上の断片、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＦＶＩＩＩの１以上のドメインを含む。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、ＦＶＩＩＩタンパク質における１以上の挿入部位は、Ａ１ドメイン、ａ１酸性領域、Ａ２ドメイン、ａ２酸性領域、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＦＶＩＩＩの１以上のドメインの範囲内に、またはＡ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のドメインの間に、またはＡ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ド
メイン、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメインの間に位置付けられる。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質における１以上の挿入部位は、表７、表８、表９及び表１０におけるアミノ酸残基から成る群から選択される１以上のアミノ酸である。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位は、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応するアミノ酸７４５のすぐ下流に位置付けられる。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位は、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基１６５６及び残基１９００のすぐ下流に位置付けられる。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位は、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基２６、１６５６及び１９００のすぐ下流である。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位は、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基４０３及び７４５のすぐ下流である。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位は、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基７４５及び１９００のすぐ下流である。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位は、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基１８及び７４５のすぐ下流である。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は二重鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は単鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質はＢドメインまたはその一部を含む。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質はＳＱＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩである。
一部の実施形態には、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、単鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームは、完全長の成熟第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号６５）に対応する残基１６４８、残基１６４５、若しくは双方の残基、またはＳＱ ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（配列番号６７）の残基７５４、残基７５１、若しくは双方の残基に相当する残基にて少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態では、アミノ酸置換はアルギニン以外のアミノ酸である。一部の実施形態では、二重鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームは、ＦＶＩＩＩの重鎖を含む第１の鎖とＦＶＩＩＩの軽鎖を含む第２の鎖を含み、その際、重鎖と軽鎖は金属結合によって互いに会合する。特定の実施形態では、Ｄ’ドメインは配列番号２１のアミノ酸７６４～８６６に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｄ３ドメインは配列番号２１のアミノ酸８６７～１２４０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は単量体である。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、それは、少なくとも２つのＶＷＦタンパク質、少なくとも３つのＶＷＦタンパク質、少なくとも４つのＶＷＦタンパク質、少なくとも５つのＶＷＦタンパク質、または少なくとも６つのＶＷＦタンパク質を含む。特定の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は配列番号２１のアミノ酸７６４～１２４０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は配列番号２１のアミノ酸７６４～１２４０から本質的に成る、または成る。特定の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は配列番号２１の残基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と１１４２の双方に相当する残基で少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する。一部の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は配列番号２１の残基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と１１４２の双方に相当する残基について置換されるシステイン以外のアミノ酸を含有する。特定の実施形態では、ＶＷＦタンパク質はさらにＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、またはＤ１とＤ２のドメインを含む。
一部の実施形態には、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、ＶＷＦタンパク質はさらに、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイ
ン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１以上の断片、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＶＷＦドメインを含む。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、ＶＷＦタンパク質は、（１）ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメイン若しくはその断片、（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ’及びＤ３のドメイン若しくはその断片、（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ’及びＤ３のドメイン若しくはその断片、（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’及びＤ３のドメイン若しくはその断片、または（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’、Ｄ３及びＡ１のドメイン若しくはその断片から本質的に成る、またはそれから成る。
一部の実施形態には、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質が含まれ、その際、ＶＷＦタンパク質はさらに、ＶＷＦタンパク質に操作可能に連結されるＶＷＦまたはＦＶＩＩＩのシグナルペプチドを含む。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、リンカーの１以上は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００のアミノ酸残基の長さを有する。一部の実施形態では、リンカーの１以上は、約１～約２０００のアミノ酸残基の長さを有する。特定の実施形態では、リンカーの１以上はＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号９４）またはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１６４）の式を有し、その際、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から成る群から選択される正の整数である。特定の実施形態では、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１００）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１６５）である。一部の実施形態では、リンカーは、２０のアミノ酸、３５のアミノ酸、４８のアミノ酸、７３のアミノ酸または９５のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、切断可能なリンカーはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧ（配列番号１６６）である。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質はポリシアル化され、ＰＥＧ化され、またはＨＥＳ化される。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質であり、その際、第１のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ１６１（配列番号６９）、ＦＶＩＩＩ１６９（配列番号７０）、ＦＶＩＩＩ１７３（配列番号７２）、ＦＶＩＩＩ１９５（配列番号７３）、ＦＶＩＩＩ１９６（配列番号７４）、ＦＶＩＩＩ１９９（配列番号７５）、ＦＶＩＩＩ２０１（配列番号７６）、ＦＶＩＩＩ２０３（配列番号７７）、ＦＶＩＩＩ２０４（配列番号７８）、ＦＶＩＩＩ２０５（配列番号７９）、ＦＶＩＩＩ２６６（配列番号８０）、ＦＶＩＩＩ２６７（配列番号８１）、ＦＶＩＩＩ２６８（配列番号８２）、ＦＶＩＩＩ２６９（配列番号８３）、ＦＶＩＩＩ２７１（配列番号８４）、ＦＶＩＩＩ２７２（配列番号８５）、またはＦＶＩＩＩ２８２（配列番号１５９）に対して少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であることを含み、第２のポリペプチドはＶＷＦ０５７（配列番号１５２）またはＶＷＦ０５９（配列番号１９７）のいずれかに対して少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であることを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドはＦＶＩＩＩ１６９（配列番号７０）を含み、第２のポリペプチドはＶＷＦ０５７（配列番号１５２）を含む。他の実施形態では、第１のポリ
ペプチドはＦＶＩＩＩ１６９（配列番号７０）を含み、第２のポリペプチドはＶＷＦ０５９（配列番号１９７）を含む。さらに別の実施形態では、第１のポリペプチドはＦＶＩＩＩ１６９（配列番号７０）を含み、第２のポリペプチドはＶＷＦ０６２（配列番号１９９）を含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質はそれを必要とする対象からの出血を防ぐ及び／または止めるのに有効である。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットである。一部の実施形態では、本明細書で記載されるようなポリヌクレオチドはさらにＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖を含む。
一部の実施形態には、本明細書で記載されるようなポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットに操作可能に連結される１以上のプロモータとを含むベクターが含まれる。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるようなベクターはさらにＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖を含む追加のベクターを含む。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞である。特定の実施形態では、哺乳類細胞はＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞から選択される。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞、及び薬学上許容可能なキャリアを含む医薬組成物である。一部の実施形態では、キメラタンパク質は野生型ＦＶＩＩＩタンパク質に比べて延長された半減期を有する。特定の実施形態では、キメラタンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩよりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長される。
一部の実施形態には、本明細書で記載されるような組成物が含まれ、その際、キメラタンパク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。特定の実施形態では、キメラタンパク質の半減期は、ＨｅｍＡマウスにて約４０時間である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるような組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、クモ膜下投与、硬膜下投与、及び経口投与から成る群から選択される経路によって投与される。特定の実施形態では、非経口投与は静脈内投与または皮下投与である。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるような組成物を用いてそれを必要とする対象にて出血性疾患または出血性の状態を治療する。特定の実施形態では、出血性疾患または出血性の状態は、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、腸腰筋鞘におけ
る出血及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。一部の実施形態では、対象は手術を受けるように計画される。特定の実施形態では、治療は予防的なものである、または要求に応じたものである。
開示されるのはまた、キメラタンパク質の半減期を延長するまたは増やす方法であり、その際、該方法は、それを必要とする対象に、本明細書で記載されるような有効量のキメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物を加えることを含み、ＶＷＦタンパク質、ＸＴＥＮ配列、第１のＩｇ定常領域若しくはその一部、または第２のＩｇ定常領域若しくはその一部がキメラタンパク質の半減期を増す。
一部の実施形態には、本明細書で記載されるような有効量のキメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物を投与することを含むそれを必要とする対象にて出血性の疾患または障害を治療する方法が含まれ、その際、出血性の疾患または障害は、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、及び腸腰筋鞘から成る群から選択される。一部の実施形態では、対象は動物である。特定の実施形態では、動物はヒトである。一部の実施形態では、対象は血友病Ａを患っている。特定の実施形態では、治療は予防的なものである、または要求に応じたものである。一部の実施形態では、有効量は０．１μｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇである。
開示されるのはまた、本明細書で記載されるような方法であり、その際、本明細書で記載されるようなキメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、クモ膜下投与、硬膜下投与、及び経口投与から成る群から選択される経路によって投与される。特定の実施形態では、非経口投与は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与及び皮内投与から成る群から選択される。
一部の実施形態には、本明細書で記載されるようなポリヌクレオチドまたはベクターで１以上の宿主細胞に形質移入することと、該宿主細胞にてキメラタンパク質を発現させることとを含む、該キメラタンパク質を作製する方法が含まれる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるような方法はさらに、キメラタンパク質を単離することを含む。特定の実施形態では、キメラタンパク質は対象にて出血を止めること及び／または出血を予防することに有効である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
キメラタンパク質であって、（ｉ）第１の免疫グロブリン（「Ｉｇ」）定常領域またはその一部に融合された第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）タンパク質を含む第１のポリペプチドと、（ｉｉ）中間のＸＴＥＮ配列によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたフォンウィルブランド因子（「ＶＷＦ」）のＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質を含む第２のポリペプチドとを含み、その際前記ＸＴＥＮ配列が２８８未満のアミノ酸残基を含有し、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドに連結されるまたは会合される、前記キメラタンパク質。
（項目２）
第２のポリペプチドにおけるＸＴＥＮ配列が１２アミノ酸～２８７アミノ酸の間の長さを有するアミノ酸配列から成る項目１に記載のキメラタンパク質。
（項目３）
融合タンパク質の第２のポリペプチドが少なくとも２８８のアミノ酸を含有するＸＴＥＮ配列を含む第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む相当する前記融合タンパク質と比べて、キメラタンパク質が長い半減期を示す項目１または２に記載のキメラタンパク質。
（項目４）
少なくとも２８８のアミノ酸を含有するＸＴＥＮ配列がＡＥ２８８である項目３に記載のキメラタンパク質。
（項目５）
ＡＥ２８８が配列番号８である項目４に記載のキメラタンパク質。
（項目６）
第２のポリペプチドのＸＴＥＮ配列が約３６、約４２、約７２、または約１４４のアミノ酸を含有する項目１～５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７）
第２のポリペプチドのＸＴＥＮ配列が、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＧ４２、ＡＧ７２、またはＡＧ１４４から選択される項目６に記載のキメラタンパク質。
（項目８）
第２のポリペプチドのＸＴＥＮ配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；配列番号６３から選択される項目７に記載のキメラタンパク質。
（項目９）
第１のポリペプチドがさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質を第１のＩｇ定常領域またはその一部と連結する第２のＸＴＥＮ配列を含む項目１～８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０）
第１のポリペプチドがＦＶＩＩＩタンパク質内での１以上の挿入部位で挿入される第３のＸＴＥＮ配列を含む項目９に記載のキメラタンパク質。
（項目１１）
第１のポリペプチドがさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質内での１以上の挿入部位で挿入される第２のＸＴＥＮ配列を含む項目１～８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１２）
第１のポリペプチドがＦＶＩＩＩタンパク質を第１のＩｇ定常領域またはその一部と連結する第３のＸＴＥＮ配列を含む項目１１に記載のキメラタンパク質。
（項目１３）
第２のＸＴＥＮ配列、第３のＸＴＥＮ配列、または第２と第３のＸＴＥＮ配列がそれぞれ独立してＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、及びＡＧ１４４から選択される項目９～１２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１４）
第２のＸＴＥＮ配列、第３のＸＴＥＮ配列、または第２と第３のＸＴＥＮ配列がそれぞれ独立して配列番号８；配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１７；配列番号５４；配列番号１９；配列番号１６；配列番号１８；配列番号１５；配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；または配列番号６３から選択される項目１３に記載のキメラタンパク質。
（項目１５）
第２のＸＴＥＮ配列、第３のＸＴＥＮ配列、または第２と第３のＸＴＥＮ配列双方がそれぞれ独立してＡＥ２８８またはＡＧ２８８である項目１３または１４に記載のキメラタンパク質。
（項目１６）
第２のポリペプチドにおけるＸＴＥＮ配列が、リンカーによって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合される項目１～１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１７）
リンカーが切断可能なリンカーである項目１６に記載のキメラタンパク質。
（項目１８）
リンカーが、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ－２、グランザイム－Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７、及びＭＭＰ－２０から選択されるプロテアーゼによって切断可能である項目１７に記載のキメラタンパク質。
（項目１９）
リンカーが第ＩＩａ因子（トロンビン）によって切断可能である項目１８に記載のキメラタンパク質。
（項目２０）
リンカーが、ＲＲＲＲ（配列番号１０２）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０３）、ＲＲＲＲＳ（配列番号１０４）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号２）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号３）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５）、ＬＶＰＲＧ（配列番号６）、ＡＬＲＰＲ（配列番号７）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号１２１）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号１２２）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号１２３）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号１２４）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号１２５）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号１２６）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号１２７）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号１２８）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号１２９）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号１３０）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号１３１）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号１３２）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号１３３）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号１３４）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１３５）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号：１３６）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号：１３７）、及びＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号１３８）から選択されるアミノ酸配列を含む１以上の切断部位を含む項目１７に記載のキメラタンパク質。
（項目２１）
リンカーがＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号１４６）を含む項目１７に記載のキメラタンパク質。
（項目２２）
切断部位がＬＶＰＲＧ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む項目２０に記載のキメラタンパク質。
（項目２３）
第１のＩｇ定常領域またはその一部が第１のＦｃ領域を含み、及び／または第２のＩｇ定常領域またはその一部が第２のＦｃ領域を含む項目１～２２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２４）
第１のＩｇ定常領域またはその一部及び第２のＩｇ定常領域またはその一部がキメラタンパク質の半減期を延長する項目２３に記載のキメラタンパク質。
（項目２５）
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドがリンカーによって融合される項目１～２４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２６）
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドが処理可能なリンカーによって融合される項目２５に記載のキメラタンパク質。
（項目２７）
第１のＩｇ定常領域またはその一部が第２のＩｇ定常領域またはその一部に会合される項目１～２４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２８）
第１のＩｇ定常領域またはその一部が共有結合によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に会合される項目２７に記載のキメラタンパク質。
（項目２９）
共有結合がジスルフィド結合である項目２８に記載のキメラタンパク質。
（項目３０）
キメラタンパク質であって、以下の式（ａ）～（ｈｈ）：
（ａ）ＦＶＩＩＩ－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｂ）ＦＶＩＩＩ－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２；
（ｃ）Ｆ１－ＦＶＩＩＩ：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｄ）Ｆ１－ＦＶＩＩＩ：Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２；
（ｅ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ２－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｆ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ２－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｇ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｈ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｉ）Ｆ１－Ｘ２－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｊ）Ｆ１－Ｘ２－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｋ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１；
（ｌ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ；
（ｍ）Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｎ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｏ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２；
（ｐ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｑ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ；
（ｒ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１；
（ｓ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１；
（ｔ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）；
（ｕ）Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｖ）Ｆ－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｗ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｘ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｙ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）；
（ｚ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１；
（ａａ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ２－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｘ２－Ｌ５－Ｆ１；
（ｂｂ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ２－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ；
（ｃｃ）Ｆ１－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ１－Ｖ；
（ｄｄ）Ｆ１－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ２－Ｌ２－Ｆ２；
（ｅｅ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ１；
（ｆｆ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｇｇ）Ｆ１－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ４－Ｘ２－Ｌ５－ＦＶＩＩＩ；又は
（ｈｈ）Ｆ１－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－Ｆ２；
のそれぞれを含み、式中、ＶはＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質であり、ＸまたはＸ１は２８８未満のアミノ酸を含有する第１のＸＴＥＮ配列であり、Ｘ２は第２のＸＴＥＮ配列であり、ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）はＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位に挿入された第２のＸＴＥＮ配列を有するＦＶＩＩＩタンパク質を含み、Ｆ１は第１のＩｇ定常領域またはその一部であり、Ｆ２は第２のＩｇ定常領域またはその一部であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５は任意のリンカーであり、（－）はペプチド結合であり、（：）は共有結合または非共有結合である、前記キメラタンパク質。
（項目３１）
ＸまたはＸ１が１２アミノ酸～２８７アミノ酸の間の長さのアミノ酸配列から成る項目３０に記載のキメラタンパク質。
（項目３２）
ＸまたはＸ１がＡＥ２８８であることを除いて式を含む相当するキメラタンパク質に比
べて長い半減期を示す項目３０または３１に記載のキメラタンパク質。
（項目３３）
ＡＥ２８８が配列番号８である項目３２に記載のキメラタンパク質。
（項目３４）
式におけるＸまたはＸ１が約３６、約４２、約７２または約１４４のアミノ酸を含有する項目３０～３３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目３５）
式におけるＸまたはＸ１が、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＧ４２、ＡＧ７２、またはＡＧ１４４から選択される請求書３４に記載のキメラタンパク質。
（項目３６）
式におけるＸまたはＸ１が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；または配列番号６３から選択される請求書３４に記載のキメラタンパク質。
（項目３７）
Ｘ２が、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、少なくとも約２８８のアミノ酸、少なくとも約５７６のアミノ酸、または少なくとも約８６４のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を含む項目３０～３６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目３８）
Ｘ２が、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、及びＡＧ１４４から選択される項目３７に記載のキメラタンパク質。
（項目３９）
Ｘ２が、配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１７；配列番号５４；配列番号１９；配列番号１６；配列番号１８；配列番号１５；配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；または配列番号６３から選択される項目３７に記載のキメラタンパク質。
（項目４０）
Ｘ２がＡＥ２８８またはＡＧ２８８である項目３７に記載のキメラタンパク質。
（項目４１）
ＸまたはＸ１及び／またはＸ２を含むキメラタンパク質が、ＸまたはＸ１及び／またはＸ２を含まないキメラタンパク質に比べて長い半減期を示す項目３０～４０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４２）
Ｌ１及び／またはＬ２が切断可能なリンカーである項目３０～４１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４３）
Ｌ４及び／またはＬ５が切断可能なリンカーである項目３０～４１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４４）
リンカーが、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ－２、グランザイム－Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７、及びＭＭＰ－２０から選択されるプロテアーゼによって切断可能である項目４２または４３に記載のキメラタンパク質。
（項目４５）
リンカーが第ＩＩａ因子（トロンビン）によって切断可能である項目４２または４３に記載のキメラタンパク質。
（項目４６）
リンカーが、ＲＲＲＲ（配列番号１０２）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０３）、ＲＲＲＲＳ（配列番号１０４）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号３）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５）、ＬＶＰＲＧ（配列番号６）、ＡＬＲＰＲ（配列番号７）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号１２１）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号１２２）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号１２３）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号１２４）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号１２５）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号１２６）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号１２７）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号１２８）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号１２９）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号１３０）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号１３１）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号１３２）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号１３３）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号１３４）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１３５）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号：１３６）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号：１３７）、及びＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号１３８）から選択されるアミノ酸配列を含む１以上の切断部位を含む項目４２または４３に記載のキメラタンパク質。
（項目４７）
リンカーがＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号１４６）を含む項目４２または４３に記載のキメラタンパク質。
（項目４８）
リンカーがＬＶＰＲＧ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む項目４２または４３に記載のキメラタンパク質。
（項目４９）
リンカーが、ＦＶＩＩＩのａ１領域、ＦＶＩＩＩのａ２領域、ＦＶＩＩＩのａ３領域、またはそれらの任意の組み合わせを含む項目４２または４３に記載のキメラタンパク質。（項目５０）
ＦＶＩＩＩのａ２領域が、ＩＳＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１０６）に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む項目４９に記載のキメラタンパク質。
（項目５１）
ａ１領域が、ＩＳＭＫＮＮＥＥＡＥＤＹＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶ（配列番号１０７）に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む項目４９に記載のキメラタンパク質。
（項目５２）
ａ３領域が、ＩＳＥＩＴＲＴＴＬＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲＳＦＱ（配列番号１０８）に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む項目４９に記載のキメラタンパク質。
（項目５３）
Ｆ１が第１のＦｃ領域を含み、及び／またはＦ２が第２のＦｃ領域を含む項目３０～５２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５４）
Ｆ１及びＦ２を含むキメラタンパク質が、Ｆ１及びＦ２を含まないキメラタンパク質に比べて長い半減期を示す項目３０～５３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５５）
Ｌ３が処理可能なリンカーである項目３０～５４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５６）
ＶＷＦタンパク質が非共有結合によってＦＶＩＩＩタンパク質に会合する項目１～５５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５７）
ＶＷＦタンパク質及び／またはＸＴＥＮ配列を含まないＦＶＩＩＩタンパク質に比べて、または野生型ＦＶＩＩＩに比べて、キメラタンパク質の半減期が延長される項目１～５６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５８）
キメラタンパク質の半減期が、ＶＷＦタンパク質またはＸＴＥＮ配列を含まないＦＶＩＩＩタンパク質よりも、または野生型ＦＶＩＩＩよりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長される項目５７に記載のキメラタンパク質。
（項目５９）
キメラタンパク質の半減期が、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である項目５７に記載のキメラタンパク質。
（項目６０）
キメラタンパク質の半減期がＨｅｍＡマウスにて約４０時間である項目５７に記載のキメラタンパク質。
（項目６１）
ＶＷＦタンパク質が実質的にＶＷＦクリアランス受容体に結合しない項目１～６０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６２）
ＶＷＦタンパク質が、１以上のプロテアーゼ切断からＦＶＩＩＩタンパク質を保護することができ、活性化からＦＶＩＩＩタンパク質を保護することができ、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖及び／または軽鎖を安定化することができ、または１以上のスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩタンパク質のクリアランスを防ぐことができる項目１～６１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６３）
ＶＷＦタンパク質が、ＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を遮蔽するまたは遮断することによって内在性のＶＷＦがＦＶＩＩＩタンパク質に結合するのを阻害するまたは妨ぐ項目１～６２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６４）
ＶＷＦ結合部位がＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメインまたはＡ３ドメインとＣ２ドメイン双方に位置する項目６３に記載のキメラタンパク質。
（項目６５）
ＶＷＦ結合部位が、配列番号６５のアミノ酸１６６９～１６８９及び２３０３～２３３２に相当するアミノ酸配列を含む項目６３に記載のキメラタンパク質。
（項目６６）
第１のＩｇ定常領域またはその一部及び第２のＩｇ定常領域またはその一部が同一であるまたは異なる項目１～６５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６７）
ＦＶＩＩＩタンパク質が、少なくとも２つのＸＴＥＮ配列、少なくとも３つのＸＴＥＮ配列、少なくとも４つのＸＴＥＮ配列、少なくとも５つのＸＴＥＮ配列または少なくとも６つのＸＴＥＮ配列に連結される、及び／または挿入される項目１～６６のいずれか１項
に記載のキメラタンパク質。
（項目６８）
ＦＶＩＩＩタンパク質が、Ａ１ドメイン、ａ１酸性領域、Ａ２ドメイン、ａ２酸性領域、Ｂドメイン、Ａ３ドメイン、ａ３酸性領域、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、それらの１以上の断片、及びそれらの組み合わせから選択されるＦＶＩＩＩの１以上のドメインを含む項目１～６７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６９）
ＦＶＩＩＩタンパク質における１以上の挿入部位が、Ａ１ドメイン、ａ１酸性領域、Ａ２ドメイン、ａ２酸性領域、Ｂドメイン、ａ３酸性領域、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＦＶＩＩＩの１以上のドメインの範囲内に、またはＡ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のドメインの間に、またはＡ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメインに間に位置付けられる項目１０～６８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７０）
ＦＶＩＩＩタンパク質における１以上の挿入部位が、表７、表８、表９、及び表１０におけるアミノ酸残基から成る群から選択される１以上のアミノ酸である項目１０～６８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７１）
ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位が、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応するアミノ酸７４５のすぐ下流に位置する項目７０に記載のキメラタンパク質。（項目７２）
ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位が、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基１６５６及び残基１９００のすぐ下流に位置する項目１０～６８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７３）
ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位が、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基２６、１６５６及び１９００のすぐ下流である項目１０～６８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７４）
ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位が、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基４０３及び７４５のすぐ下流である項目１０～６８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７５）
ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位が、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基７４５及び１９００のすぐ下流である項目１０～６８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７６）
ＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位が、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号６５）に対応する残基１８及び７４５のすぐ下流である項目１０～６８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７７）
ＦＶＩＩＩタンパク質が二重鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである項目１～７６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７８）
ＦＶＩＩＩタンパク質が単鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである項目１～７６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７９）
ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメインまたはその一部を含む項目１～７８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８０）
ＦＶＩＩＩタンパク質がＳＱ Ｂドメインを欠失させたＦＶＩＩＩである項目７９に記載のキメラタンパク質。
（項目８１）
単鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームが、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番６５）に対応する残基１６４８、残基１６４５若しくは双方の残基に相当する残基にて、またはＳＱ ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（配列番号６７）の残基７５４、残基７５１若しくは双方の残基に相当する残基にて少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する項目７８または７９に記載のキメラタンパク質。
（項目８２）
アミノ酸置換がアルギニン以外のアミノ酸である項目８１に記載のキメラタンパク質。（項目８３）
二重鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームが、ＦＶＩＩＩの重鎖を含む第１の鎖とＦＶＩＩＩの軽鎖を含む第２の鎖とを含み、前記重鎖と前記軽鎖が金属結合で互いに会合する項目７７に記載のキメラタンパク質。
（項目８４）
Ｄ’ドメインが、配列番号２１のアミノ酸７６４～８６６に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列含む項目１～８３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８５）
Ｄ３ドメインが、配列番号２１のアミノ酸８６７～１２４０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列含む項目１～８４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８６）
ＶＷＦタンパク質が単量体である項目１～８５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８７）
少なくとも２つのＶＷＦタンパク質、少なくとも３つのＶＷＦタンパク質、少なくとも４つのＶＷＦタンパク質、少なくとも５つのＶＷＦタンパク質、または少なくとも６つのＶＷＦタンパク質を含む項目１～８６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８８）
ＶＷＦタンパク質が、配列番号２１のアミノ酸７６４～１２４０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む項目１～８７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８９）
ＶＷＦタンパク質が、配列番号２１のアミノ酸７６４～１２４０から本質的に成る、またはそれから成る項目８８に記載のキメラタンパク質。
（項目９０）
ＶＷＦタンパク質が、配列番号２１の残基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と１１４２の双方に相当する残基にて少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する項目１～８９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９１）
ＶＷＦタンパク質が、配列番号２１の残基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と１１４２の双方に相当する残基にて置換されるシステイン以外のアミノ酸を含有する項目１～８９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９２）
ＶＷＦタンパク質がさらに、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメインまたはＤ１とＤ２のドメインを含む項目１～９１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９３）
ＶＷＦタンパク質がさらに、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１以上の断片、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＶＷＦドメインを含む項目１～９２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９４）
ＶＷＦタンパク質が、（１）ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメイン若しくはその断片、（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ’及びＤ３のドメイン若しくはその断片、（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ’及びＤ３のドメイン若しくはその断片、（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’及びＤ３のドメイン若しくはその断片、または（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’、Ｄ３及びＡ１のドメイン若しくはその断片から本質的に成る、またはそれから成る項目１～９２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９５）
ＶＷＦタンパク質がさらに、ＶＷＦタンパク質に操作可能に連結されるＶＷＦまたはＦＶＩＩＩのシグナルペプチドを含む項目１～９４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９６）
リンカーの１以上が、少なくともおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００のアミノ酸残基の長さを有する項目１６～９５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９７）
リンカーの１以上が、およそ１～およそ２０００アミノ酸残基の長さを有する項目１６～９５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９８）
リンカーの１以上が、Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドを含む項目９６または９７に記載のキメラタンパク質。
（項目９９）
Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドが（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号９４）またはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１６４）の式を有し、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から成る群から選択される正の整数である項目９８に記載のキメラタンパク質。
（項目１００）
（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーが（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１００）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１６５）である項目９９に記載のキメラタンパク質。
（項目１０１）
リンカーが、２０アミノ酸、３５アミノ酸、４８アミノ酸、７３アミノ酸、または９５アミノ酸を含む項目１６～１００のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０２）
切断可能なリンカーがＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧ（配列番号１６６）である項目１７～２９及び４２～１０１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０３）
ポリシアル化、ＰＥＧ化またはＨＥＳ化される項目１～１０２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０４）
第１のポリペプチドが、ＦＶＩＩＩ１６１（配列番号６９）、ＦＶＩＩＩ１６９（配列番号７０）、ＦＶＩＩＩ１７３（配列番号７２）、ＦＶＩＩＩ１９５（配列番号７３）、ＦＶＩＩＩ１９６（配列番号７４）、ＦＶＩＩＩ１９９（配列番号７５）、ＦＶＩＩＩ２０１（配列番号７６）、ＦＶＩＩＩ２０３（配列番号７７）、ＦＶＩＩＩ２０４（配列番号７８）、ＦＶＩＩＩ２０５（配列番号７９）、ＦＶＩＩＩ２６６（配列番号８０）、ＦＶＩＩＩ２６７（配列番号８１）、ＦＶＩＩＩ２６８（配列番号８２）、ＦＶＩＩＩ２６９（配列番号８３）、ＦＶＩＩＩ２７１（配列番号８４）、ＦＶＩＩＩ２７２（配列番号８５）またはＦＶＩＩＩ２８２（配列番号１５９）に対して少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であるものを含み、第２のポリペプチドがＶＷＦ０５７（配列番号１５２）に対して少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であるものを含む項目１～２０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０５）
第１のポリペプチドがＦＶＩＩＩ１６９（配列番号７０）を含み、第２のポリペプチドがＶＷＦ０５７（配列番号１５２）を含む項目１０４に記載のキメラタンパク質。
（項目１０６）
キメラタンパク質が、それを必要とする対象からの出血を防ぐ及び／または止めるのに有効である項目１～１０５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０７）
項目１～１０６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
（項目１０８）
ＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖をさらに含む項目１０７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０９）
項目１０７または１０８に記載のポリヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのセットに操作可能に連結された１以上のプロモータとを含むベクター。
（項目１１０）
ＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖を含む追加のベクターをさらに含む項目１０９に記載のベクター。
（項目１１１）
項目１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド、または項目１０９または１１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目１１２）
哺乳類細胞である項目１１１に記載の宿主細胞。
（項目１１３）
哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞から選択される項目１１２に記載の宿主細胞。
（項目１１４）
項目１～１０６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１０７若しくは１０８に記載のポリヌクレオチド、項目１０９若しくは１１０に記載のベクター、または項目１１１～１１３のいずれか１項に記載の宿主細胞と、薬学上許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
（項目１１５）
野生型ＦＶＩＩＩタンパク質に比べてＦＶＩＩＩタンパク質が延長された半減期を有する項目１１４に記載の組成物。
（項目１１６）
キメラタンパク質の半減期が、野生型ＦＶＩＩＩよりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、
少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長される項目１１４または１１５に記載の組成物。
（項目１１７）
キメラタンパク質の半減期が、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である項目１１４または１１５に記載の組成物。
（項目１１８）
キメラタンパク質の半減期が、ＨｅｍＡマウスにて約４０時間である項目１１４または１１５に記載の組成物。
（項目１１９）
局所投与、眼内投与、非経口投与、クモ膜下投与、硬膜下投与、及び経口投与から成る群から選択される経路によって投与される項目１１４～１１８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１２０）
非経口投与が、静脈内投与または皮下投与である項目１１９に記載の組成物。
（項目１２１）
それを必要とする対象にて出血性の疾患または状態を治療するのに使用される項目１１４～１２０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１２２）
出血性の疾患または状態が、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、腸腰筋鞘における出血及びそれらの組み合わせから成る群から選択される項目１２１に記載の組成物。
（項目１２３）
対象は手術を受けることが予定されている項目１２１または１２２に記載の組成物。
（項目１２４）
治療が予防的なもの、または要求に応じたものである項目１１４～１２３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１２５）
キメラタンパク質の半減期の延長方法または増加方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、項目１～１０６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１０７若しくは１０８に記載のポリヌクレオチド、項目１０９若しくは１１０に記載のベクター、項目１１１～１１３のいずれか１項に記載の宿主細胞、または項目１１４～１２４に記載のいずれか１項に記載の組成物の有効量を加えることを含み、その際、ＶＷＦタンパク質、ＸＴＥＮ配列、第１のＩｇ定常領域またはその一部及び第２のＩｇ定常領域またはその一部がキメラタンパク質の半減期を増加させる、前記延長方法または増加方法。
（項目１２６）
それを必要とする対象における出血性の疾患または障害の治療方法であって、有効量の項目１～１０６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１０７若しくは１０８に記載のポリヌクレオチド、項目１０９若しくは１１０に記載のベクター、項目１１１～１１３のいずれか１項に記載の宿主細胞、または項目１１４～１２４のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含み、前記出血性の疾患または障害が、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出
血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、及び腸腰筋鞘における出血から成る群から選択される、前記治療方法。
（項目１２７）
対象が動物である項目１２５または１２６に記載の方法。
（項目１２８）
動物がヒトである項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
対象が血友病Ａを患っている項目１２７または１２８に記載の方法。
（項目１３０）
治療が予防的なものまたは要求に応じたものである項目１２６～１２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３１）
有効量が、約０．１μｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇである項目１２６～１３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３２）
局所投与、眼内投与、非経口投与、クモ膜下投与、硬膜下投与、及び経口投与から成る群から選択される経路によって、項目１～１０６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１０７若しくは１０８に記載のポリヌクレオチド、項目１０９若しくは１１０に記載のベクター、項目１１１～１１３のいずれか１項に記載の宿主細胞、または項目１１４～１２４のいずれか１項に記載の組成物を投与する項目１２５～１３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３３）
非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、及び皮内投与から成る群から選択される項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
キメラタンパク質の作製方法であって、項目１０７若しくは１０８に記載のポリヌクレオチドまたは項目１０９若しくは１１０に記載のベクターによって１以上の宿主細胞に形質移入することと、宿主細胞にてキメラタンパク質を発現させることとを含む、前記作製方法。
（項目１３５）
キメラタンパク質を単離することをさらに含む項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
キメラタンパク質が対象における出血を止める及び／または妨げることに有効である項目１２４～１３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３７）
リンカーが、ＦＶＩＩＩのａ２領域またはその断片を含む項目１９に記載のキメラタンパク質。
（項目１３８）
リンカーが、ＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号８８）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１３７に記載のキメラタンパク質。
（項目１３９）
リンカーが、アミノ酸配列ＩＥＰＲ（配列番号２００）またはＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）を含む項目１９に記載のキメラタンパク質。
（項目１４０）
リンカーがＦＶＩＩＩの完全長ａ２領域ではない項目１３８または１３９に記載のキメラタンパク質。
（項目１４１）
リンカーがＦＶＩＩＩのａ２領域の断片を含む項目４２または４３に記載のキメラタンパク質。
（項目１４２）
リンカーが、配列番号８８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、及び２００から選択されるアミノ酸配列を含む項目１４１に記載のキメラタンパク質。
（項目１４３）
リンカーがアミノ酸配列ＩＥＰＲ（配列番号２００）またはＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）を含む項目１４２に記載のキメラタンパク質。
（項目１４４）
リンカーがＦＶＩＩＩの完全長のａ２領域ではない項目１４１～１４３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１４５）
キメラタンパク質であって、
（ｉ）第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）タンパク質が２８８アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列を含む、第１の免疫グロブリン（「Ｉｇ」）定常領域またはその一部に融合された前記ＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１のポリペプチドと
（ｉｉ）中間の１４４アミノ酸のＸＴＥＮ配列によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたフォンウィルブランド因子（「ＶＷＦ」）のＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質を含む第２のポリペプチドとを含み、
第１のポリペプチドが第１及び第２の定常領域を介して第２のポリペプチドに連結されるまたは会合する、前記キメラタンパク質。
（項目１４６）
１４４アミノ酸のＸＴＥＮ配列と第２のＩｇ定常領域との間で切断可能なリンカーをさらに含む項目１４５に記載のキメラタンパク質。
（項目１４７）
切断可能なリンカーがトロンビンによって切断可能である項目１４６に記載のキメラタンパク質。
（項目１４８）
切断可能なリンカーがＩＥＰＲ（配列番号２００）またはＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）を含むアミノ酸配列を有する項目１４６または１４７に記載のキメラタンパク質。（項目１４９）
切断可能なリンカーがＩＥＰＲ（配列番号２００）またはＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）を含むアミノ酸配列を有し、前記リンカーがＦＶＩＩＩの完全長のａ２領域ではない項目１４６または１４７に記載のキメラタンパク質。
ＸＴＥＮがＦＶＩＩＩタンパク質内での挿入部位で挿入される、Ｆｃ領域に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質（Ａ１～Ａ２部分的または完全なＢ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２）を含む第１のポリペプチドと、Ｄ’Ｄ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質と２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮとトロンビン切断可能なリンカーと第２のＦｃ領域を含む第２のポリペプチドとを含むキメラタンパク質の模式図である。ＦＶＩＩＩタンパク質におけるＸＴＥＮの挿入及び／またはＶＷＦタンパク質への融合が、流体力学半径を増すことによって及び受容体が介在するクリアランスを阻止することによってキメラタンパク質の半減期を延長する。ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは内在性ＶＷＦとのＦＶＩＩＩの相互作用を阻止し、ＦＶＩＩＩタンパク質を安定化し、キメラタンパク質の半減期を延長する。ＦｃドメインはＤ’Ｄ３ドメインをＦＶＩＩＩタンパク質と共有結合させ、ＦｃＲｎ介在性のリサイクル経路を介してキメラタンパク質の半減期を延長することができる。トロンビン切断可能なリンカーは、ＦＶＩＩＩの活性化の際、Ｄ’Ｄ３ドメインの解放を可能にし、ＦＶＩＩＩとＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインとの間での正確な配置を保証する。 ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ：Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体について３つのプラスミド発現系を示す図である；第１のプラスミドはＸＴＥＮがＢドメインに挿入される単鎖ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃをコードするヌクレオチド配列を含み；第２のプラスミドはＸＴＥＮ配列が２８８未満のアミノ酸を含むＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃをコードするヌクレオチド配列を含み；第３のプラスミドはプロペプチドプロセッシング酵素であるＰＡＣＥをコードするヌクレオチド配列を含む。３つのプラスミドから３つのポリペプチドが発現されると、細胞内プロセッシングによってＤ’Ｄ３ドメインからＶＷＦのＤ１Ｄ２ドメインをプロセッシングすることができる。得られる複合体は、３つの産物、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ／Ｄ’Ｄ３ヘテロ二量体である第１の分子と副産物であるＤ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃのホモ二量体である第２の分子と別の副産物、すなわち、ＦＶＩＩＩ（ＸＴＥＮ）－Ｆｃである第３の分子を含有する。 ヘテロ二量体の半減期の延長に対するＸＴＥＮ挿入の追加の効果を示す図である。ＦＶＩＩＩ１６９はＦｃ領域に融合されたＢドメインを欠失したＦＶＩＩＩタンパク質を含み、その際、ＸＴＥＮ配列（たとえば、ＡＥ２８８）は成熟完全長ＦＶＩＩＩに対応するアミノ酸７４５にて挿入される。ＦＶＩＩＩ２０５はＦｃ領域に融合されたＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩタンパク質を含み、その際、ＸＴＥＮ配列（たとえば、ＡＥ１４４）は成熟完全長ＦＶＩＩＩに対応するアミノ酸１８にて挿入され、別のＸＴＥＮ配列（たとえば、ＡＥ２８８）は成熟完全長ＦＶＩＩＩに対応するアミノ酸７４５にて挿入される。ＶＷＦ０３１はトロンビン切断可能なリンカーによってＦｃ領域に融合されたＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインとを含む（ＸＴＥＮなし）。ＶＷＦ０３４はＡＥ２８８に融合されたＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメインとＦｃ領域とを含む。ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１（逆三角形）の半減期はＨｅｍＡマウスにて１６．７時間であり、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１（丸）の半減期はＨｅｍＡマウスにて２９．４時間であり、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４（四角）の半減期はＨｅｍマウスにて３１．１時間である。 ＡＥ１４４ＸＴＥＮは、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインとＦｃドメインとの間に挿入されるとＡＥ２８８ＸＴＥＮよりも良好な半減期の延長を付与することを示す図である。たとえば、ＶＷＦ１６９／ＶＷＦ０３４（四角）の半減期はＨｅｍＡマウスで３１．１時間である一方で、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７（丸）の半減期はＨｅｍＡマウスにて４２時間である。ＶＷＦ０５７はＡＥ１４４に融合されたＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインとＦｃ領域とを含む。 キメラタンパク質ヘテロ二量体の半減期の延長にＦｃドメインが必要であることを示す図である。ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１（丸）の半減期を、ＦｃＲｎ結合部位に変異を含有する（ＩＨＨ三連変異Ｆｃ）ので、ＦｃＲｎ経路を介してリサイクルすることができないＦＶＩＩＩ２６３／ＶＷＦ０５０（四角）とＨｅｍＡマウス内で比べると、ＦＶＩＩＩ２６３／ＶＷＦ０５０の半減期（２３時間）はＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１のそれ（２９．４時間）より短い。このことは半減期の延長にＦｃ領域が必要であることを示している。 ＨｅｍＡマウスの尾クリップモデルにおけるＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩ（ＳＱ ＢＤＤＦＶＩＩＩ）と比べたＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体の類似の急性期有効性を示す図である。マウスに７５ＩＵ／ｋｇを投与し、ａＰＴＴアッセイによって活性を測定した。ＳＱ ＢＤＤＦＶＩＩＩを丸で示す一方でＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４を四角で示し、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７を菱形で示し、溶媒を逆三角形で示す。ＦＶＩＩＩ１６９、ＶＷＦ０３４及びＶＷＦ０５７の詳細な構築物は本明細書の他のどこかで示す。 ３７．５ＩＵ／ｋｇの用量でＨｅｍＡマウスにてＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩ（ＳＱ ＢＤＤＦＶＩＩＩ）と比べたＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４の急性有効性を示す図であり、活性はａＰＴＴアッセイにょって測定した。各処理群におけるマウスの失血中央値（uＬ）を横線で示し、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける失血（uＬ）を白抜き三角形として示し、３７．５ＩＵ／ｋｇのｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩを投与した後の失血（μＬ）を白抜き丸として示し、３７．５ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４を投与した後の失血（uＬ）を白抜き四角として示し、溶媒の投与の後の失血（uＬ）を逆三角形として示す。 （Ａ，Ｂ）ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７ヘテロ二量体は尾静脈横断面出血モデルにおいてＨｅｍＡマウスにさらに長い保護を提供することを示す図である。（Ａ）尾損傷の７２時間前にｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７を投与されたマウス（四角）、尾損傷の４８時間前にＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩを投与されたマウス（菱形）、尾損傷の２４時間前にＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩを投与されたマウス（逆三角形）及び溶媒を投与されたマウス（丸）における再出血のデータを示す図である。活性はａＰＴＴアッセイによって測定した。Ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸は非出血の比率を示す。（Ｂ）図７Ａで示したマウスの４つのカテゴリーにおける相当する生存率を示す図である。尾損傷の７２時間前に１２ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７を投与されたマウスは、尾損傷の２４時間前にＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ処理を受けたマウスと比べて再出血での類似の保護及び類似の生存を示した。 （Ａ）損傷の２４時間前でのｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと比較した９６時間前にｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体を受け取ったマウスにおける匹敵する再出血データを示す図である。黒四角は損傷の２４時間前にＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４を受け取ったマウスにおける再出血データを示し、白抜き四角は損傷の９６時間前にＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４を受け取ったマウスにおける再出血データを示し、黒菱形は損傷の２４時間前にＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７を受け取ったマウスにおける再出血データを示し、白抜き菱形は損傷の９６時間前にＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７を受け取ったマウスにおける再出血データを示し、黒丸は損傷の２４時間前にｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩを受け取ったマウスにおける再出血データを示し、白抜き丸は損傷の４８時間前にｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩを受け取ったマウスにおける再出血データを示し、黒逆三角形は溶媒を受け取ったマウスにおける再出血データを示す。Ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸は非出血の比率を示す。（Ｂ）損傷の２４時間前でのｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと比較した９６時間前にｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体を受け取ったマウスにおける生存曲線を示す図である。Ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸は生存の比率を示す。記号は図８Ａと同じである。 代表的なＦＶＩＩＩ－ＶＷＦヘテロ二量体及びＦＶＩＩＩ１６９、ＦＶＩＩＩ２８６、ＶＷＦ０５７、ＶＷＦ０５９、及びＶＷＦ０６２の構築物の模式図を示す。たとえば、ＦＶＩＩＩ１６９構築物は、Ｆｃ領域に融合されたＲ１６４８Ａ置換を伴ったＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩタンパク質を含み、その際、ＸＴＥＮ配列（たとえば、ＡＥ２８８）は成熟完全長ＦＶＩＩＩ（Ａ１－ａ１－Ａ２－ａ２－２８８ＸＴＥＮ－ａ３－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２－Ｆｃ）に対応するアミノ酸７４５にて挿入される。ＦＶＩＩＩ２８６構築物は、Ｆｃ領域に融合されたＲ１６４８置換を伴ったＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩタンパク質を含み、その際、ＸＴＥＮ配列（たとえば、ＡＥ２８８）は、ＦＶＩＩＩとＦｃの間で追加のａ２領域を伴った成熟完全長ＦＶＩＩＩ（Ａ１－ａ１－Ａ２－ａ２－２８８ＸＴＥＮ－ａ３－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２－ａ２－Ｆｃ）に対応するアミノ酸７４５にて挿入される。ＶＷＦ０５７は、ＬＶＰＲＧトロンビン部位（「ＬＶＰＲＧ」；配列番号６）を含むＶＷＦリンカーとＧＳリンカー（「ＧＳ」）を介してＦｃ領域に連結されたＶＷＦタンパク質のＤ’Ｄ３ドメイン（Ｄ’Ｄ３ドメインにて２つのアミノ酸置換、すなわち、Ｃ３３６ＡとＣ３７９Ａを伴った）を含むＶＷＦ－Ｆｃ融合構築物であり、その際、ＸＴＥＮ配列（すなわち、ＡＥ１４４）はＤ’Ｄ３ドメインとＶＷＦリンカーの間に挿入される（Ｄ’Ｄ３－１４４ＸＴＥＮ－ＧＳ＋ＬＶＰＲＧ－Ｆｃ）。ＶＷＦ０５９は、ＶＷＦのリンカーとしてのＦＶＩＩＩの酸性領域２（ａ２）を介してＦｃ領域に連結されたＶＷＦタンパク質のＤ’Ｄ３ドメイン（Ｄ’Ｄ３ドメインにて２つのアミノ酸置換、すなわち、Ｃ３３６ＡとＣ３７９Ａを伴った）を含むＶＷＦ－Ｆｃ融合構築物であり、その際、ＸＴＥＮ配列（すなわち、ＡＥ１４４）はＤ’Ｄ３ドメインとＶＷＦリンカーの間に挿入される。ＶＷＦ０６２は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦタンパク質のＤ’Ｄ３ドメイン（Ｄ’Ｄ３ドメインにて２つのアミノ酸置換、すなわち、Ｃ３３６ＡとＣ３７９Ａを伴った）を含むＶＷＦ－Ｆｃ融合構築物であり、その際、ＸＴＥＮ配列（すなわち、ＡＥ１４４）はＤ’Ｄ３ドメインとＦｃ領域の間に挿入される（Ｄ’Ｄ３－１４４ＸＴＥＮ－Ｆｃ）。 ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロ二量体の構築物、たとえば、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９Ａ、及びＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０７３を表す模式図である。矢印は、トロンビン切断可能な部位を導入するために任意のリンカーが付加される部位を示す。ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７はＬＶＰＲＧ（配列番号６）を含むリンカーを有する。ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９はＦＶＩＩＩのａ２領域
Figure 2022118129000002
 を含むリンカーを有する。ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９Ａは切り詰められたＦＶＩＩＩのａ２領域
Figure 2022118129000003
 を含むリンカーを有する。ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０７３はＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）から成るＦＶＩＩＩのａ２領域の断片を含むＶＷＦ０７３構築物（配列番号１７５）内でリンカーを有する。
ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７及びＦＶＩＩＩ－Ｆｃ対照のトロンビン消化に続くＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像を示す。（Ａ）抗Ｄ３抗体（ＡＢ９６３４０）によるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの染色を示す。矢印は、切断されていない完全長のＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７である「ＬＣＦｃ：Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃ」及びトロンビンによる切断に続いて得られる断片である「Ｄ’Ｄ３－１４４ＸＴＥＮ」を強調する。（Ｂ）抗ＨＣ抗体（ＧＭＡ０１２）によるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの染色を示す。矢印は、ＦＶＩＩＩの重鎖（「ＨＣ」）及びＦＶＩＩＩのＡ２ドメインを強調する。（Ｃ）はパネル（Ａ）とパネル（Ｂ）の重ね合わせを示す。各パネルの上に示す時点で試料を回収した。矢印は関連するタンパク質を指す。 ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９のトロンビン消化に続くＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像を示す。（Ａ）抗Ｄ３抗体（ＡＢ９６３４０）によるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの染色を示す。矢印は、切断されていない完全長のＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９である「ＬＣＦｃ：Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃ」及びトロンビンによる切断に続いて得られる断片である「Ｄ’Ｄ３－１４４ＸＴＥＮ」を強調する。（Ｂ）抗ＨＣ抗体（ＧＭＡ０１２）によるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの染色を示す。矢印は、切断されていない完全長のＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９；トロンビンによる切断に続いて得られる断片であるＤ’Ｄ３－１４４ＸＴＥＮ－ａ３、及びＦＶＩＩＩのＡ２ドメインである「Ａ２」を強調する。（Ｃ）はパネル（Ａ）とパネル（Ｂ）の重ね合わせを示す。各パネルの上に示す時点で試料を回収した。 ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ対照で処理したＨｅｍＡマウス（四角）と比べたＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９で処理したＨｅｍＡマウス（丸）の急性有効性を示す図である。尾クリップに続いて失血値を測定した。ｐ＝０．９８８３
本発明は、２つのポリペプチドを含むキメラタンパク質を指向し、第１のポリペプチド
は第１のＩｇ定常領域に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質を含み、第２のポリペプチドはＸＴＥＮ配列によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＶＷＦタンパク質を含み、その際、該ＸＴＥＮ配列は２８８未満のアミノ酸を含有する。
Ｉ．定義
用語「ａ」または「ａｎ」の実体はその実体の１以上を指すことが言及されるべきである；たとえば、「ａヌクレオチド配列」は１以上のヌクレオチド配列を表すように理解される。そのようなものとして、「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上」及び「少なくとも１つの」は本明細書では相互変換可能に使用することができる。
さらに「及び／または」は本明細書で使用される場合、他を伴ってまたは他を伴わずに２つの特定された特徴または成分のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。従って、用語「及び／または」は本明細書で「Ａ及び／またはＢ」のような語句で使用されるとき、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」（単独）、「Ａ」（単独）と「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に、用語「及び／または」は「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」のような語句で使用されるとき、以下の態様：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；Ｃ（単独）のそれぞれを包含するように意図される。
態様が、述語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」によって本明細書で記載される場合はどんな場合も、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」及び／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」という点で記載される別の類似の態様も提供されることが理解される。
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて本開示が関連する当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。たとえば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，第２版，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ ｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，改訂，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞及び記号は国際単位系（ＳＩ）が許容した形態で示される。数値範囲は範囲を定義する数を含む。指示されない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシの配向で記述される。本明細書で提供される見出しは本開示の種々の態様の限定ではなく、それは全体としての明細書を参照して得られる。従って、直下で定義される用語はその全体で明細書を参照することによってさらに完全に定義される。
用語「約」は、およそ、大まかに、ほぼ、またはその領域でを意味するように本明細書で使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、それは、示される数値の上下の境界を拡大することによってその範囲を改変する。一般に、用語「約」は、たとえば、１０パーセントの上下（高いまたは低い）の分散によって言及される値の上下で数値を改変することができる。
用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は複数の核酸と同様に単一の核酸も包含し、単離された核酸分子または構築物、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド
は従来のホスホジエステル結合または従来ではない結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）にて見いだされるようなアミド結合）を含む。用語「核酸」はポリヌクレオチドに存在する任意の１以上の核酸断片、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドによって、ネイティブな環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。たとえば、ベクターに含有される第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは本発明の目的で単離されたと見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞にて維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液にて他のポリヌクレオチドから（部分的にまたは実質的に）精製された組換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子には本発明のポリヌクレオチドの生体内のまたは試験管内のＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明に係る単離されたポリヌクレオチドまたは核酸にはさらに、合成で製造されたそのような分子が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、たとえば、プロモータ、エンハンサ、リボソーム結合部位、または転写終結シグナルのような調節エレメントを含むことができる。
本明細書で使用されるとき、「コーディング領域」または「コーディング配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンから成るポリヌクレオチドの部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は通常、アミノ酸に翻訳されないけれども、それはコーディング領域の一部であると見なされてもよいが、隣接配列、たとえば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロン等はコーディング領域の一部ではない。コーディング領域の境界は通常、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドン及び得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。本発明の２以上のコーディング領域は、単一のポリヌクレオチド構築物、たとえば、単一のベクターに、または別々のポリヌクレオチド構築物、たとえば、別々の（異なる）ベクターに存在することができる。その結果、要するに、単一のベクターがたった１つのコーディング領域を含有することができ、または２以上のコーディング領域を含むことができ、たとえば、単一のベクターが以下で記載されるような結合ドメインＡ及び結合ドメインＢを別々にコードすることができるということになる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の結合ドメインをコードする核酸に融合されたまたは融合されていない非相同のコーディング領域をコードすることができる。非相同のコーディング領域には限定しないで、たとえば、分泌シグナルペプチドまたは非相同の機能的ドメインのような特定されたエレメントまたはモチーフが挙げられる。
哺乳類細胞によって分泌される特定のタンパク質は、成長しているタンパク質鎖が粗面小胞体を横切った搬出がいったん開始されると成熟タンパク質からは切断される分泌シグナルペプチドに会合する。当業者は、シグナルペプチドが一般にポリペプチドのＮ末端に融合され、完全なまたは「完全長」のポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌された形態または「成熟」形態を生じることを知っている。特定の実施形態では、それに操作可能に会合するポリペプチドの分泌を指図する能力を保持するネイティブなシグナルペプチドまたはその配列の機能的誘導体。或いは、異種の哺乳類のシグナルペプチド、たとえば、ヒトの組織プラスミノーゲン活性因子（ＴＰＡ）またはマウスのβ－グルクロニダーゼのシグナルペプチドまたはまたはそれらの機能的な誘導体を使用することができる。
用語「下流」はヌクレオチド配列を指す場合、核酸またはヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に対して３’に位置することを意味する。特定の実施形態では、下流のヌクレオチド配列は転写の出発点に続く配列に関係する。たとえば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。用語「下流」はポリペプチド配列を指す場合、アミノ酸またはアミノ酸挿入部位が参照アミノ酸のＣ末端に位置することを意味する。たとえば、成熟野生型ＦＶＩＩＩタンパク質に対応するアミノ酸７４５のすぐ下流の挿入部位は
、挿入部位が成熟野生型ＦＶＩＩＩタンパク質に対応するアミノ酸７４５とアミノ酸７４６の間であることを意味する。
用語「上流」は参照ヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、上流のヌクレオチド配列はコーディング領域または転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。たとえば、ほとんどのプロモータは転写の開始部位の上流に位置する。
本明細書で使用されるとき、用語「調節性領域」は、コーディング領域の上流（５’非コーディング配列）、コーディング領域の範囲内、またはコーディング領域の下流（３’非コーディング配列）に位置し、且つ会合するコーディング領域の転写、ＲＮＡプロセッシング、安定性または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節性領域には、プロモータ、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位及びステム／ループ構造が挙げられ得る。コーディング領域が真核細胞での発現を意図されるのであれば、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は普通、コーディング配列に対して３’に位置するであろう。
遺伝子産物、たとえば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１以上のコーディング領域に操作可能に会合させたプロモータ及び／または転写若しくは翻訳の制御エレメントを含むことができる。操作可能な会合では、遺伝子産物、たとえば、ポリペプチドのためのコーディング領域は、調節性領域の影響下または制御下で遺伝子産物の発現をセットするような方法で１以上の調節性領域と会合する。たとえば、プロモータ機能の誘導がコーディング領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じるのであれば、且つ、プロモータとコーディング領域の間での結合の性質が遺伝子産物の発現を指図するプロモータの能力を妨害しないまたは転写されるＤＮＡ鋳型の能力を妨害しないのであれば、コーディング領域とプロモータは「操作可能に会合する」。プロモータに加えた他の転写制御エレメント、たとえば、エンハンサ、オペレータ、リプレッサ及び転写終結シグナルも遺伝子産物の発現を指図するようにコーディング領域と操作可能に会合させることができる。
種々の転写制御領域が当業者に既知である。これらには限定しないで、サイトメガロウイルス由来のプロモータとエンハンサの断片（イントロンＡと併せた前初期プロモータ）、サルウイルス４０（初期プロモータ）及びレトロウイルス（たとえば、ラウス肉腫ウイルス）のような、しかし、これらに限定されない脊椎動物細胞で機能する転写制御領域が挙げられる。他の転写制御領域には、たとえば、アクチン、ヒートショックプロテイン、ウシ成長ホルモン、及びウサギβ－グロビンのような脊椎動物遺伝子由来のもの、と同様に真核細胞にて遺伝子発現を制御することが可能である他の配列が挙げられる。追加の好適な転写制御領域には、組織特異的なプロモータ及びエンハンサと同様にリンホカイン誘導性のプロモータ（たとえば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモータ）が挙げられる。
同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に既知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳の開始コドン及び終結コドン、及びピコルナウイルスに由来するエレメント（特に内部リボソーム侵入部位、またはＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「発現」は本明細書で使用されるとき、それによってポリヌクレオチドが遺伝子産物、たとえば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生じる過程を指す。それには、限定しないで、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または他の任意の
ＲＮＡ産物への転写、およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。発現は「遺伝子産物」を生じる。本明細書で使用されるとき、遺伝子産物は、核酸、たとえば、遺伝子の転写によって生じるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであることができる。本明細書で記載される遺伝子産物にはさらに、転写後修飾、たとえば、ポリアデニル化若しくはスプライシングを伴った核酸、または翻訳後修飾、たとえば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、若しくはタンパク質分解切断を伴ったポリペプチドが含まれる。
「ベクター」は、宿主細胞への核酸のクローニング及び／または宿主細胞への核酸の移動のための媒体を指す。ベクターは、連結された断片のレプリコンをもたらすように別の核酸断片が連結されてもよいレプリコンであってもよい。「レプリコン」は、生体内での複製の自律単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製可能である遺伝エレメント（たとえば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。用語「ベクター」には、試験管内で、生体外でまたは生体内で核酸を細胞内に導入するためのウイルス性及び非ウイルス性双方の媒体が含まれる。たとえば、プラスミド、修飾された真核細胞ウイルスまたは修飾された細菌ウイルスを含む多数のベクターが当該技術で既知であり、使用されている。ポリヌクレオチドの好適なベクターへの挿入は、相補性付着末端を有する選択されたベクターに適当なポリヌクレオチド断片をライゲーションすることによって達成することができる。
ベクターは、ベクターを取り込んでいる細胞の選択または特定を提供する選択可能なマーカーまたはレポーターをコードするように操作されてもよい。選択可能なマーカーまたはレポーターの発現によってベクターに含有される他のコーディング領域を取り込み、発現する宿主細胞の特定及び／または選択が可能になる。当該技術で既知であり、使用される選択可能なマーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミド等に耐性を提供する遺伝子；及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節性遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。当該技術で既知であり、使用されるレポーターの例には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等が挙げられる。選択可能なマーカーはレポーターであるとも見なされる。
用語「プラスミド」は、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、普通、環状二本鎖のＤＮＡ分子の形態である染色体外のエレメントである。そのようなエレメントは、任意の供給源に由来する、自律的に複製する配列、ゲノムが統合する配列、ファージまたはヌクレオチドの配列、線状、環状、または超らせん状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、多数のヌクレオチド配列は、適当な３’非翻訳配列と共に選択された遺伝子産物についてのプロモータ断片とＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に連結されているまたは組み換えられている。
使用することができる真核細胞のウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、及びポックスウイルス、たとえば、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ／タンパク質複合体、及びバイオポリマーが挙げられる。
「クローニングベクター」は、順次複製し、プラスミド、ファージまたはコスミドのように複製開始点を含み、連結された断片の複製をもたらすように別の核酸断片が連結され
てもよい核酸の単位長さである「レプリコン」を指す。特定のクローニングベクターは一方の細胞型、たとえば、細菌では複製が可能であり、他方、たとえば、真核細胞では発現が可能である。クローニングベクターは通常、当該核酸配列の挿入のためにベクター及び／または１以上の複数のクローニング部位を含む細胞の選択に使用することができる１以上の配列を含む。
用語「発現ベクター」は、宿主細胞への挿入に続いて挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計された媒体を指す。挿入された核酸配列は、上述のような調節性領域と操作可能な関係で配置される。
ベクターは、当該技術で周知の方法、たとえば、形質移入、エレクトロポレーション、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈澱、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体によって宿主細胞に導入される。
「培養」、「培養すること」及び「培養すること」は本明細書で使用されるとき、細胞の増殖または分裂を可能にするまたは生きている状態で細胞を維持するのを可能にする試験管内の条件下で細胞をインキュベートすることを意味する。「培養された細胞」は本明細書で使用されるとき、試験管内で増殖させる細胞を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は単一の「ポリペプチド」と同様に複数の「ポリペプチド」を包含するように意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸の任意の鎖（単数）または鎖（複数）を指し、特定の長さの産物を指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２以上のアミノ酸の鎖（単数）または鎖（複数）を指すのに使用されるその他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含められ、用語「ポリペプチド」はそれらの用語の代わりに、またはそれらの用語と相互変換可能に使用することができる。用語「ポリペプチド」はまた、限定しないでグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すようにも意図される。ポリペプチドは、天然の生物供給源に由来することができ、または組換え技法で製造することもできるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない。それは化学合成を含む方法で生成することができる。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体または誘導体はその自然環境にはないポリペプチドを指す。精製の特定のレベルは必要とされない。たとえば、単離されたポリペプチドは単にそのネイティブなまたは天然の環境から取り出すことができる。好適な技法によって分離され、分画され、部分的にまたは実質的に精製されているネイティブのまたは組換えのポリペプチドと同様に、宿主細胞にて発現される組換えで作出されたポリペプチド及びタンパク質は本発明の目的では単離されたと見なされる。
本発明に含められるのはまた、ポリペプチドの断片または変異体及びそれらの組み合わせである。用語「断片」または「変異体」は本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子を指す場合、参照ポリペプチドの特性（たとえば、ＦｃＲｎ結合ドメインまたはＦｃ変異体に対するＦｃＲｎ結合親和性、ＦＶＩＩＩ変異体についての凝固活性、またはＶＷＦ断片に対するＦＶＩＩＩ結合活性）の少なくとも幾つかを保持するポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、本明細書の他のどこかで議論される特異抗体断片に加えて、欠失断片と同様にタンパク質分解断片を含むが、天然に存在する完全長のポリペプチド（成熟ポリペプチド）を含まない。本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子の変
異体には上述のような断片が含まれ、及びアミノ酸の置換、欠失または挿入のために変化したアミノ酸配列を持つポリペプチドも含まれる。変異体は天然に存在することができる、または天然に存在することができない。天然に存在しない変異体は当該技術で既知の変異誘発法を用いて作出することができる。変異体ポリペプチドは保存的なまたは非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を含むことができる。
本明細書で使用される用語「ＶＷＦタンパク質（単数）」または「ＶＷＦタンパク質（複数）」は、ＦＶＩＩＩと相互作用し、且つ、完全長ＶＷＦによって通常ＦＶＩＩＩに提供される少なくとも１以上の特性、たとえば、ＦＶＩＩＩａへの早すぎる活性を防ぐこと、早すぎるタンパク質分解を防ぐこと、早すぎるクリアランスをもたらすリン脂質膜との会合を防ぐこと、裸のＦＶＩＩＩを結合することができるが、ＶＷＦが結合したＦＶＩＩＩを結合することができないＦＶＩＩＩクリアランス受容体への結合を防ぐこと、及び／またはＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖の相互作用を安定化することを保持するＶＷＦ断片を意味する。
「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術で定義されている。従って、ポリペプチドにおけるアミノ酸が同一の側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸で置き換えられるならば、置換は保存的であると見なされる。別の実施形態では、アミノ酸の鎖は、側鎖ファミリーのメンバーの順及び／または組成で異なる構造的に類似する鎖によって保存的に置き換えることができる。
当該技術で既知であるように、２つのポリペプチド間での「配列同一性」は一方のポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で議論される場合、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドに対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるかどうかは、たとえば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）のような、しかし、これに限定されない当該技術で既知の方法及びコンピュータプログラム／ソフトウエアを用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴはＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２－４８９（１９８１）のローカル相同性アルゴリズムを用いて２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見いだす。ＢＥＳＴＦＩＴまたは他の配列比較プログラムを用いて特定の配列が本発明に係る参照配列に対して、たとえば、９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメータは当然、同一性の比率が参照ポリペプチド配列の完全長にわたって算出され、参照配列におけるアミノ酸の総数の５％までの相同性でのギャップが許されるように設定される。
本明細書で使用されるとき、ＶＷＦ配列またはＦＶＩＩＩタンパク質配列における「に対応するアミノ酸」または「同等のアミノ酸」は、第１のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩの配列と第２のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩの配列との間の同一性または類似性を最大化するように配列比較によって特定される。第２のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩの配列における同等のアミ
ノ酸を特定するのに使用される数は第１のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩの配列における対応するアミノ酸を特定するのに使用される数に基づく。
本明細書で使用されるとき、用語「挿入部位」は、異種の部分を挿入することができる位置のすぐ上流である、ＦＶＩＩＩポリペプチド、またはその断片、変異体または誘導体における位置を指す。「挿入部位」は数として特定され、その数は挿入部位が相当する成熟ネイティブＦＶＩＩＩ（配列番号６５）におけるアミノ酸の番号であり、それは挿入の位置のすぐＮ末端側である。たとえば、語句「ａ３は配列番号６５のアミノ酸１６５６に相当する挿入部位でＸＴＥＮを含む」は、異種の部分が配列番号６５のアミノ酸１６５６とアミノ酸１６５７に相当する２つのアミノ酸の間に位置することを示す。
語句「アミノ酸のすぐ下流」は本明細書で使用されるとき、アミノ酸の末端カルボキシル基のすぐ隣の位置を指す。同様に、語句「アミノ酸のすぐ上流」はアミノ酸の末端アミン基のすぐ隣の位置を指す。従って、語句「挿入部位の２つのアミノ酸間」は本明細書で使用されるとき、ＸＴＥＮまたは他の任意のポリペプチドが２つの隣接するアミノ酸間に挿入される位置を指す。従って、語句「アミノ酸のすぐ下流に挿入される」及び「挿入部位の２つのアミノ酸間に挿入される」は「挿入部位で挿入される」と同義で使用される。
用語「挿入された」、「挿入される」、「に挿入された」または文法的に関連する用語は本明細書で使用されるとき、ネイティブな成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける類似の位置に比べたキメラポリペプチドにおけるＸＴＥＮの位置を指す。本明細書で使用されるとき、その用語はネイティブな成熟ヒトＦＶＩＩＩに比べた組換えＦＶＩＩＩポリペプチドの特徴を指すのであって、キメラポリペプチドが作製された方法または工程を示す、暗示するまたは推察するものではない。たとえば、本明細書で提供されるキメラポリペプチドを参照して、語句「ＸＴＥＮはＦＶＩＩＩポリペプチドの残基７４５のすぐ下流に挿入される」は、キメラポリペプチドがネイティブな成熟ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸７４５に相当するアミノ酸のすぐ下流で、たとえば、ネイティブな成熟ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸７４５と７４６に相当するアミノ酸によって結合されたＸＴＥＮを含むことを意味する。
「融合」タンパク質または「キメラ」タンパク質は、自然界では天然に結合することはない第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を含む。通常別のタンパク質に存在するアミノ酸配列を融合ポリペプチドで一緒にすることができ、または通常同じタンパク質に存在するアミノ酸配列を融合ポリペプチドにて、たとえば、本発明の第ＶＩＩＩ因子ドメインのＩｇＦｃドメインとの融合にて新しい配置に置くことができる。融合タンパク質は、たとえば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを創り、翻訳することによって創り出される。キメラタンパク質はさらに、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合によって第１のアミノ酸配列と会合する第２のアミノ酸配列を含むことができる。
本明細書で使用されるとき、用語「半減期」は特定のポリペプチドの生体内での生物学的な半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半分が動物の循環及び／または他の組織から消えるのに必要とされる時間によって表されてもよい。所与のポリペプチドのクリアランス曲線を時間の関数として構築する場合、曲線は普通、迅速なαフェーズと長いβフェーズを伴う二相性である。αフェーズは通常、脈管間隙内と脈管間隙外の間での投与されたＦｃポリペプチドの平衡を表し、部分的にはポリペプチドのサイズによって決定される。βフェーズは通常、脈管間隙内でのポリペプチドの異化を表す。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は単相性であるので、αフェーズを有さず、単一のβフェーズだけを有する。従って、特定の実施形態では、用語、半減期は本明細書で使用されるとき、βフェーズにおけるポリペプチドの半減期を指す。ヒトにおけるヒト抗体の典型的なβフェーズの半減期は２１日である。
用語「連結される」は本明細書で使用されるとき、それぞれ、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に共有結合で連結されるまたは非共有結合で連結される第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に直接連結することができ、または並置することができ、または代わりに、介在配列が第１の配列を第２の配列に共有結合することができる。用語「連結される」は、Ｃ末端またはＮ末端での第２のアミノ酸配列への第１のアミノ酸配列の融合を意味するだけでなく、第２のアミノ酸配列（またはそれぞれ第１のアミノ酸配列）における２つのアミノ酸への第１のアミノ酸配列（または第２のアミノ酸配列）全体の挿入も含む。一実施形態では、第１のアミノ酸配列はペプチド結合またはリンカーによって第２のアミノ酸配列に連結することができる。第１のヌクレオチド配列はホスホジエステル結合またはリンカーによって第２のヌクレオチド配列に連結することができる。リンカーは、ペプチドまたはポリペプチド（ポリペプチド鎖のための）またはヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖のための）または化学部分（ポリペプチド鎖及びポリヌクレオチド鎖の双方）であることができる。用語「リンカー」はハイフン（－）によっても示される。
本明細書で使用されるとき、用語「と会合する」は、第１のアミノ酸鎖と第２のアミノ酸鎖との間で形成される共有結合または非共有結合を指す。一実施形態では、用語「と会合する」は共有結合、非ペプチド結合または非共有結合を意味する。この会合はコロン、すなわち、（：）によって示すことができる。別の実施形態では、それはペプチド結合を除く共有結合を意味する。たとえば、アミノ酸システインは、第２のシステイン残基上のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＬ領域はジスルフィド結合によって会合し、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付け方式を用いて２３９と２４２（ＥＵ番号付け方式の２２６位と２２９位）に相当する位置で２つのジスルフィド結合によって会合する。共有結合の例には、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、ｐｉ結合、デルタ結合、グリコシジル結合、アグノスチック結合、屈曲結合、双極性結合、Ｐｉバックグランド、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、抱合、超抱合、芳香族性、ハプト数性、または反結合性が挙げられるが、これらに限定されない。非共有結合の非限定例には、イオン結合（たとえば、カチオン／ｐｉ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（たとえば、二水素結合、二水素錯体、低バリア水素結合、または対称性水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金原子間結合、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力または化学極性が挙げられる。
本明細書で使用される「単量体／二量体ハイブリッド」は、ジスルフィド結合によって互いに会合する第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質を指し、その際、第１の鎖は凝固因子、たとえば、第ＶＩＩＩ因子とＦｃ領域を含み、第２の鎖は凝固因子を含まずに第２のＦｃ領域を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。従って、単量体／二量体ハイブリッド構築物はたった１つの凝固因子を有する単量体態様と２つのＦｃ領域を有する二量体態様を含むハイブリッドである。
本明細書で使用されるとき、用語「切断部位」または「酵素切断部位」は、酵素によって認識される部位を指す。特定の酵素切断部位は、細胞内プロセッシング部位を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、そのような部位の切断が凝固形成の部位で生じるように凝固カスケードの間に活性化される酵素によって切断される酵素切断部位を有する。例となるそのような部位には、たとえば、トロンビン、第ＸＩａ因子または第Ｘａ因子によって認識されるものが挙げられる。例となるＦＸＩａの切断部位には、たとえば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１）及びＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号３）が挙げられる。例と
なるトロンビンの切断部位には、たとえば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５）、ＬＶＰＲＧ（配列番号６）、ＡＬＲＰＲ（配列番号７）、ＩＳＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１０６）、ＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号８８）、及びＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）が挙げられる。他の酵素切断部位は当該技術で既知であり、本明細書の他のどこかで記載されている。
本明細書で使用されるとき、用語「プロセッシング部位」または「細胞内プロセッシング部位」は、ポリペプチドの翻訳の後機能する酵素についての標的であるポリペプチドにおける酵素切断部位の種類を指す。一実施形態では、そのような酵素はゴルジ内腔からゴルジを横断した区画の輸送の間に機能する。細胞内のプロセッシング酵素は細胞からのタンパク質の分泌に先立ってポリペプチドを切断する。そのようなプロセッシング部位の例には、たとえば、エンドペプチダーゼのＰＡＣＥ／フーリン（ＰＡＣＥは対合した塩基性アミノ酸切断酵素についての頭字語である）によって標的とされるものが挙げられる。これらの酵素はゴルジ膜に局在し、配列モチーフＡｒｇ－［任意の残基］－（ＬｙｓまたはＡｒｇ）－Ａｒｇのカルボキシ末端側でタンパク質を切断する。本明細書で使用されるとき、酵素の「フーリン」ファミリーには、たとえば、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３としても知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としても知られる）、ＰＣＳＫ３（フーリンまたはＰＡＣＥとしても知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としても知られる）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５またはＰＣ６としても知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としても知られる）、またはＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳＰＣ７としても知られる）が挙げられる。他のプロセッシング部位は当該技術で既知である。
１を超えるプロセッシング部位または切断部位を含む構築物では、そのような部位は同一であってもよいし、または異なっていてもよいことが理解されるであろう。
用語「フーリン」はＥＣ番号３．４.２１．７５に相当する酵素である。フーリンは、
ＰＡＣＥ（対形成塩基性アミノ酸切断酵素）としても知られるサブチリシン様の前駆タンパク質転換酵素である。フーリンは不活性な前駆体タンパク質を生物学的に活性のあるタンパク質の変換するその区分を欠失させる。その細胞内輸送の間に、ＶＷＦのプロペプチドはフーリン酵素によって成熟ＶＷＦ分子から切断することができる。一部の実施形態では、フーリンはＶＷＦのＤ’Ｄ３からＤ１Ｄ２を切断する。他の実施形態では、フーリンをコードするヌクレオチド配列は、Ｄ１Ｄ２ドメインがフーリンによって細胞内で切り離しされ得るようにＶＷＦ断片をコードするヌクレオチド配列と一緒に発現させることができる。
１を超えるプロセッシング部位または切断部位を含む構築物では、そのような部位は同一であってもよいし、または異なっていてもよいことが理解されるであろう。
「処理可能なリンカー」は本明細書で使用されるとき、本明細書の他のどこかで記載される少なくとも１つの細胞内プロセッシング部位を含むリンカーを指す。
止血障害は本明細書で使用されるとき、フィブリン血栓を形成する能力の損傷によりまたはフィブリン血栓を形成できないために、自然にまたは外傷の結果として出血する傾向を特徴とする遺伝的に継承されたまたは後天性の状態を意味する。そのような障害の例には血友病が挙げられる。３つの主な形態は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子の欠損）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子の欠損、または「クリスマス病」）、及び血友病Ｃ（第ＸＩ因子の欠損、軽い出血傾向）である。他の止血障害には、たとえば、フォンウィルブランド病、第ＸＩ因子の欠損（ＰＴＡの欠損）、第ＸＩＩ因子の欠損、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子における欠陥または構造的異
常、ＧＰＩｂにおける欠陥若しくは欠損であるベルナール・スリエ症候群が挙げられる。ＶＷＦに対する受容体であるＧＰＩｂは欠陥があることがあり得、一次血栓形成（一次止血）の欠如及び高い出血傾向、及びＧｌａｎｚｍａｎ及びＮａｅｇｅｌｉの血小板無力症（Ｇｌａｎｚｍａｎの血小板無力症）をもたらし得る。肝不全（急性及び慢性型）では、肝臓による凝固因子の不十分な産生があり、これが出血のリスクを高め得る。
本発明のキメラ分子は予防的に使用することができる。本明細書で使用されるとき、用語「予防的な治療」は出血症状の出現に先立つ分子の投与を指す。一実施形態では、一般的な止血剤を必要とする対象は手術を受けているまたは受けようとしている。本発明のキメラタンパク質は予防剤として手術に先立ってまたは手術後に投与することができる。本発明のキメラタンパク質を手術中または手術後に投与して急性期出血症状の出現を制御することができる。手術には、肝臓移植、肝臓切除術、歯科処置または幹細胞移植を挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明のキメラタンパク質は要求に応じた治療でも使用される。用語「要求に応じた治療」は出血症状の出現の兆候に対応したまたは出血を起こし得る活動の前のキメラ分子の投与を指す。態様の１つでは、手術後のような出血が始まるときに、または手術前のような出血が予想されるときに要求に応じた治療が対象に与えられ得る。別の態様では、接触型スポーツのような出血のリスクを高める活動に先立って要求に応じた治療が与えられ得る。
本明細書で使用されるとき、用語「急性出血」は根底にある原因に関わりのない出血症状の出現を指す。たとえば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝的な出血性障害（たとえば、第ＶＩＩ因子の欠損）、血小板の障害、または凝固因子に対する抗体の発生による耐性を有してもよい。
治療する、治療、治療することは本明細書で使用されるとき、たとえば、疾患または状態の重症度の軽減；疾患経過の持続時間の低減；疾患または状態に関連する１以上の症状の改善；疾患または状態を必ずしも治癒させることなく疾患または状態の対象に有益な効果を提供すること、または疾患または状態に関連する１以上の症状の予防を指す。一実施形態では、用語「治療すること」または「治療」は、本発明のキメラタンパク質またはＶＷＦ断片を投与することによって対象にてＦＶＩＩＩのトラフ濃度を少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または２０ＩＵ／ｄＬで維持することを意味する。別の実施形態では、治療することまたは治療は、ＦＶＩＩＩのトラフ濃度を約１～約２０ＩＵ／ｄＬ、約２～約２０ＩＵ／ｄＬ、約３～約２０ＩＵ／ｄＬ、約４～約２０ＩＵ／ｄＬ、約５～約２０ＩＵ／ｄＬ、約６～約２０ＩＵ／ｄＬ、約７～約２０ＩＵ／ｄＬ、約８～約２０ＩＵ／ｄＬ、約９～約２０ＩＵ／ｄＬ、または約１０～約２０ＩＵ／ｄＬの間で維持することを意味する。疾患または状態の治療または治療することには、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を非血友病対象のＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％に匹敵するレベルで維持することも含まれ得る。治療に必要とされる最小限のトラフ濃度は１以上の既知の方法によって測定することができ、各人について調整（増減）することができる。
ＩＩ．キメラタンパク質
本発明は、ＦＶＩＩＩの半減期限定因子、すなわち、内在性のＶＷＦがＦＶＩＩＩタンパク質に会合するのを妨げるまたは阻害することによって、ＸＴＥＮ配列に融合されたＶ
ＷＦタンパク質を用いたキメラタンパク質の半減期を延長することを指向する。内在性のＶＷＦは非共有結合複合体でＦＶＩＩＩの約９５％～約９８％に会合する。内在性のＶＷＦはＦＶＩＩＩの半減期限定因子である一方で、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合した内在性のＶＷＦは様々な方法でＦＶＩＩＩを保護することも知られている。たとえば、完全長のＶＷＦ（約２５０ｋＤａを有する多量体としての）は、プロテアーゼ切断及びＦＶＩＩＩの活性化からＦＶＩＩＩを保護し、ＦＶＩＩＩの重鎖及び／または軽鎖を安定化し、且つスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩのクリアランスを防ぐことができる。しかし、同時に、内在性のＶＷＦは、飲作用を防ぐことによって及びＶＷＦクリアランス経路を介して系からＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体をクリアランスすることによってＦＶＩＩＩの半減期を限定する。理論に束縛されない一方で、内在性のＶＷＦは、半減期延長因子に融合されたキメラタンパク質の半減期が野生型ＦＶＩＩＩの半減期の約２倍より長くなるのを妨ぐ半減期限定因子であると考えられる。従って、本発明は、Ｄ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質（たとえば、ＶＷＦ断片）を用いて内在性のＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質との間の相互作用を妨げることまたは阻害すること、と同時にＩｇ定常領域またはその一部との組み合わせでＸＴＥＮ配列を用いることによって得られるＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を増やすことを指向する。特に、本発明は、さらに短いＸＴＥＮ配列（すなわち、２８８未満のアミノ酸を含有するＸＴＥＮ、すなわち、２８８アミノ酸よりも短いＸＴＥＮ）がキメラタンパク質の半減期を延長することにおいてさらに良好であることを示す。
一実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１のポリペプチドと、（ｉｉ）中間のＸＴＥＮ配列によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質を含む第２のポリペプチドを含むキメラタンパク質を指向し、その際、ＸＴＥＮ配列は２８８未満のアミノ酸残基を含有し、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドに連結され、または会合される。別の実施形態では、第２のポリペプチドにおけるＸＴＥＮ配列は１２アミノ酸～２８７アミノ酸の間の長さを有するアミノ酸配列から成る。他の実施形態では、キメラタンパク質は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む相当する融合タンパク質と比べて長い半減期を示し、その際、第２のポリペプチドは少なくとも２８８のアミノ酸、たとえば、ＡＥ２８８、たとえば、配列番号８を含有するＸＴＥＮ配列を含む。さらに他の実施形態では、第２のポリペプチドにおけるＸＴＥＮ配列は、少なくとも約３６、少なくとも約４２、少なくとも約７２、または少なくとも約１４４のアミノ酸、しかし、２８８未満のアミノ酸、たとえば、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４（ＡＥ１４４、ＡＥ１４４＿２Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ１４４＿４Ａ、ＡＥ１４４＿５Ａ、ＡＥ１４４＿６Ｂ）、ＡＧ４２、ＡＧ７２、またはＡＧ１４４（ＡＧ１４４、ＡＧ１４４＿Ａ、ＡＧ１４４＿Ｂ、ＡＧ１４４＿Ｃ、ＡＧ１４４＿Ｆ）、たとえば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；または配列番号６３を含有する。
本発明のキメラタンパク質はさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質を第１のＩｇ定常領域またはその一部と連結する第２のＸＴＥＮ配列を含むことができる。
特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１のポリペプチドと、（ｉｉ）中間の第１のＸＴＥＮ配列によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質を含む第２のポリペプチドを含むキメラタンパク質を指向し、その際、ＸＴＥＮ配列は２８８未満のアミノ酸残基を含有し、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドに連結され、または会合され、第１のポリペプチドはさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質内での１以上の挿入部位で挿入される、またはＦＶＩＩＩタンパク質及
び／または第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合される第２のＸＴＥＮ配列を含む。従って、一実施形態では、第２のＸＴＥＮ配列はＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位にて挿入される。別の実施形態では、第２のＸＴＥＮ配列はＦＶＩＩＩタンパク質またはＩｇ定常領域またはその一部に融合される。他の実施形態では、第２のＸＴＥＮ配列はＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位にて挿入され、第３のＸＴＥＮ配列はＦＶＩＩＩタンパク質及び／または第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合される。
第２及び／または第３のＸＴＥＮ配列は任意の長さのＸＴＥＮアミノ酸であることができる。たとえば、第２及び／または第３のＸＴＥＮ配列は、本明細書の他のどこかで開示され、たとえば、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、及びＡＧ１４４、たとえば、配列番号８；配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１７；配列番号５４；配列番号１９；配列番号１６；配列番号１８；配列番号１５；配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２または配列番号６３である。特定の実施形態では、第２及び／または第３のＸＴＥＮ配列はＡＥ２８８またはＡＧ２８８、たとえば、配列番号８または１９である。
特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）任意のＸＴＥＮ配列（Ｘ２）がＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位で挿入されるまたはＦＶＩＩＩタンパク質若しくは第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合される、任意のリンカーによって第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合されるＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１のポリペプチドと、（ｉｉ）ＶＷＦタンパク質と第２のＩｇ定常領域またはその一部との間のＸＴＥＮ配列（Ｘ１）によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質を含む第２のポリペプチドを含むキメラタンパク質を指向し、その際、ＸＴＥＮ配列（Ｘ１）は２８８未満のアミノ酸残基を含有し、リンカーによってＶＷＦタンパク質に融合され、且つ第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは会合する。一部の実施形態では、本発明は、（ｉ）任意のＸＴＥＮ配列（Ｘ２）がＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位で挿入されるまたはＦＶＩＩＩタンパク質若しくは第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合される、任意のリンカーによって第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合されるＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１のポリペプチドと、（ｉｉ）ＶＷＦタンパク質と第２のＩｇ定常領域またはその一部との間のＸＴＥＮ配列（Ｘ１）によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質を含む第２のポリペプチドとを含むキメラタンパク質を指向し、その際、ＸＴＥＮ配列（Ｘ１）は２８８未満のアミノ酸残基を含有し、リンカーによって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合され、且つ第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは会合する。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列（Ｘ１）をＶＷＦタンパク質または第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合するリンカーは切断可能なリンカーである。切断可能なリンカーの非限定例は本明細書の他のどこかで示される。特定の実施形態では、リンカーはトロンビン切断可能なリンカーである。
一部の実施形態では、キメラタンパク質は２つのポリペプチド鎖であり、第１の鎖は上述した第１のポリペプチドを含み、第２の鎖は上述した第２のポリペプチドを含む。たとえば、２つのポリペプチド鎖は、（ｉ）単鎖ＦＶＩＩＩタンパク質と、第１のＩｇ定常領域またはその一部と、ＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位で挿入されるまたはＦＶＩＩＩタンパク質もしくは第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合される任意のＸＴＥＮ配列とを含む第１の鎖と、（ｉｉ）中間のＸＴＥＮ配列（Ｘ１）によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されるＶＷＦタンパク質を含む第２の鎖とを含み、その際、ＸＴＥＮ配列（Ｘ１）は２８８未満のアミノ酸を含有する。
特定の実施形態では、キメラタンパク質は２つのポリペプチド鎖であり、第１の鎖はＦ
ＶＩＩＩタンパク質の重鎖を含み、且つ第２の鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖と、ＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位に挿入されるまたはＦＶＩＩＩタンパク質若しくは第１の定常領域またはその一部に融合される任意のＸＴＥＮ配列と、第１のＩｇ定常領域またはその一部と、任意のリンカー（たとえば、処理可能なリンカー）とＶＷＦタンパク質とＸＴＥＮ配列（Ｘ１）と第２の任意のリンカー（たとえば、切断可能なリンカー）と第２のＩｇ定常領域またはその一部とを含む。
他の実施形態では、キメラタンパク質は３つのポリペプチド鎖、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖を含む第１の鎖と、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖と第１のＩｇ定常領域またはその一部とＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖又は軽鎖の中での１以上の挿入部位で挿入されるまたはＦＶＩＩＩタンパク質若しくは第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合される任意のＸＴＥＮ配列とを含む第２の鎖と、（ｉｉｉ）中間のＸＴＥＮ配列（Ｘ１）によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されるＶＷＦタンパク質を含む第３の鎖であり、その際、第１の鎖と第２の鎖は非共有結合、たとえば、金属結合によって会合し、且つ第２の鎖と第３の鎖は共有結合、たとえば、ジスルフィド結合によって会合する。
さらに他の実施形態では、キメラタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、単鎖ＦＶＩＩＩタンパク質と、ＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位で挿入されるまたはＦＶＩＩＩタンパク質若しくは第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合される任意のＸＴＥＮ配列と、第１のＩｇ定常領域またはその一部と、任意のリンカー（たとえば、処理可能なリンカー）と、ＶＷＦタンパク質と、ＸＴＥＮ配列（Ｘ１）と、第２の任意のリンカー（たとえば、切断可能なリンカー）と、第２のＩｇ定常領域またはその一部とを含む単鎖である。
特定の実施形態では、キメラタンパク質は以下の式（ａ）～（ｈｈ）：
（ａ）ＦＶＩＩＩ－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｂ）ＦＶＩＩＩ－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２；
（ｃ）Ｆ１－ＦＶＩＩＩ：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｄ）Ｆ１－ＦＶＩＩＩ：Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２；
（ｅ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ２－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｆ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ２－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｇ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｈ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｉ）Ｆ１－Ｘ２－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｊ）Ｆ１－Ｘ２－Ｆ１：Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｋ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１；
（ｌ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ；
（ｍ）Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｎ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｏ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２；
（ｐ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ；
（ｑ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ；
（ｒ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１；
（ｓ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１；
（ｔ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）；
（ｕ）Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｖ）Ｆ－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｗ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ２；
（ｘ）ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｙ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）；
（ｚ）Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｌ４－Ｆ１；
（ａａ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ２－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｘ２－Ｌ５－Ｆ１；
（ｂｂ）Ｖ－Ｌ１－Ｘ２－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ；
（ｃｃ）Ｆ１－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ１－Ｖ；
（ｄｄ）Ｆ１－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ２－Ｌ２－Ｆ２；
（ｅｅ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｖ－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆ１；
（ｆｆ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｆ１－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ；
（ｇｇ）Ｆ１－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ４－Ｘ２－Ｌ５－ＦＶＩＩＩ；または
（ｈｈ）Ｆ１－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ５－Ｘ２－Ｌ４－Ｆ２；の１つを含み、
式中、ＶはＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質であり、ＸまたはＸ１は２８８未満のアミノ酸を含有する第１のＸＴＥＮ配列であり、Ｘ２は第２のＸＴＥＮ配列であり、ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含み、
ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）はＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位で挿入される第２のＸＴＥＮ配列を有するＦＶＩＩＩタンパク質を含み、
Ｆ１は第１のＩｇ定常領域またはその一部であり、
Ｆ２は第２のＩｇ定常領域またはその一部であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５は任意のリンカーであり、
（－）はペプチド結合であり、
（：）は共有結合または非共有結合である。
一実施形態では、ＸまたはＸ１は１２アミノ酸～２８７アミノ酸の間の長さを有するアミノ酸配列から成る。別の実施形態では、キメラタンパク質は式を含む相当する融合タンパク質と比べて長い半減期を示し、その際、ＸまたはＸ１はＡＥ２８８、たとえば、配列番号８である。
他の実施形態では、式におけるＸまたはＸ１は、少なくとも約３６、少なくとも約４２、少なくとも約７２、または少なくとも約１４４アミノ酸、しかし、２８８未満のアミノ酸、たとえば、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４（ＡＥ１４４、ＡＥ１４４＿２Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ１４４＿４Ａ、ＡＥ１４４＿５Ａ、ＡＥ１４４＿６Ｂ）、ＡＧ４２、ＡＧ７２、またはＡＧ１４４（ＡＧ１４４、ＡＧ１４４＿Ａ、ＡＧ１４４＿Ｂ、ＡＧ１４４＿Ｃ、ＡＧ１４４＿Ｆ）、たとえば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１４；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；または配列番号６３を含有する。
さらに他の実施形態では、Ｘ２は、少なくとも約３６アミノ酸、少なくとも４２アミノ酸、少なくとも１４４アミノ酸、少なくとも２８８アミノ酸、少なくとも５７６アミノ酸、または少なくとも８６４アミノ酸、たとえば、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、またはＡＧ１４４、たとえば、配列番号９；配列番号１０；配列番号１５；配列番号１６；配列番号８；配列番号１１；配列番号１７；配列番号１８、配列番号１９、または配列番号１４の長さを有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｘ２はＡＥ２８８またはＡＧ２８８、たとえば、配列番号８または１９である。
特定の実施形態では、ＸまたはＸ１及び／もしくはＸ２を含むキメラタンパク質はＸまたはＸ１及び／もしくはＸ２を含まないキメラタンパク質に比べて延長された半減期を有する。他の実施形態では、Ｌ１及び／またはＬ２は切断可能なリンカーである。さらに他の実施形態では、Ｌ４及び／またはＬ５は切断可能なリンカーである。
ＩＩ.Ａ．フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）タンパク質
ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとしても知られる）は血液血漿に存在する大きな多量体糖タンパク質であり、内皮（バイベル・パラーデ小体にて）、巨核球（血小板のα顆粒）及び内皮細胞下の結合組織にて構成的に産生される。塩基性ＶＷＦ単量体は２８１３のアミノ酸のタンパク質である。単量体はどれも皆、特定の機能を持つ多数の特定のドメイン、Ｄ’／Ｄ３ドメイン（第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂ受容体、ヘパリン及び／またはおそらくコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合する）、Ｃ１ドメイン（これが活性化されるとＲＧＤドメインが血小板のインテグリンαＩＩｂβ３に結合する）、タンパク質のＣ末端における「システインノット」ドメイン（ＶＷＦが血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子－β（ＴＧＦβ）及びβ－ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（βＨＣＧ）とともに共有する）を含有する。
一実施形態では、ＶＷＦタンパク質はＶＷＦ断片である。用語「ＶＷＦ断片」は本明細書で使用されるとき、内在性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を阻害することが可能であるＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含む機能的なＶＷＦ断片を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に結合する。別の実施形態では、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を遮断し、それによって内在性のＶＷＦとのＦＶＩＩＩタンパク質の相互作用を阻害する。ＶＷＦ断片には、ＶＷＦのこれらの活性を保持する誘導体、変異体、突然変異体または類似体が挙げられる。
ヒトＶＷＦについての２８１３単量体アミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋにて受入番号＿ＮＰ＿０００５４３．２＿として報告されている。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋにて受入番号＿ＮＭ＿０００５５２．３＿として報告されている。ヒトＶＷＦのヌクレオチド配列は配列番号２０として指定されている。配列番号２１は完全長ＶＷＦのアミノ酸配列である。ＶＷＦの各ドメインを表１にて列記する。
Figure 2022118129000004
Figure 2022118129000005
Figure 2022118129000006
Figure 2022118129000007
Figure 2022118129000008
Figure 2022118129000009
Figure 2022118129000010
Figure 2022118129000011
Figure 2022118129000012
Figure 2022118129000013
Figure 2022118129000014
Figure 2022118129000015
ＶＷＦタンパク質は本明細書で使用されるとき、ＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片であることができ、その際、ＶＷＦ断片は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合し、内在性ＶＷＦ（完全長ＶＷＦ）のＦＶＩＩＩへの結合を阻害する。Ｄ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片はさらにＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１以上の断片、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるＶＷＦドメインを含むことができる。一実施形態では、ＶＷＦ断片は、（１）ＶＷＦのＤ’及びＤ３ドメインまたはそれらの断片、（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ’及びＤ３ドメインまたはそれらの断片、（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ’及びＤ３ドメインまたはそれらの断片、（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’及びＤ３ドメインまたはそれらの断片、または（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’、Ｄ３及びＡ１ドメインまたはそれらの断片を含む、それから本質的に成る、または成る。本明細書で記載されるＶＷＦ断片はＶＷＦクリアランス受容体に結合する部位を含有しない。別の実施形
態では、本明細書で記載されるＶＷＦ断片は配列番号２１のアミノ酸７６４～１２７４ではない。本発明のＶＷＦ断片はＶＷＦ断片に連結されるまたは融合される任意の他の配列を含むことができる。たとえば、本明細書で記載されるＶＷＦ断片はさらにシグナルペプチドを含むことができる。
一実施形態では、Ｄ’ドメイン及びＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に結合するまたはそれと会合する。ＦＶＩＩＩタンパク質に結合するまたはそれと会合することによって、本発明のＶＷＦ断片はプロテアーゼ切断及びＦＶＩＩＩの活性化からＦＶＩＩＩを保護し、ＦＶＩＩＩの重鎖及び軽鎖を安定化し、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩのクリアランスを妨げる。別の実施形態では、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、または会合し、ＦＶＩＩＩタンパク質のリン脂質及び活性化されたタンパク質Ｃへの結合を阻止するまたは妨げる。内在性の完全長ＶＷＦによるＦＶＩＩＩタンパク質の結合を妨げるまたは阻害することによって本発明のＶＷＦ断片はＶＷＦクリアランス受容体によるＦＶＩＩＩのクリアランスを低下させるので、キメラタンパク質の半減期を延長する。したがって、キメラタンパク質の半減期の延長は、ＦＶＩＩＩタンパク質へのＶＷＦクリアランス受容体の結合部位を欠いているＶＷＦ断片との結合または会合、及びＶＷＦクリアランス受容体の結合部位を含有する内在性ＶＷＦからのＶＷＦ断片によるＦＶＩＩＩタンパク質の遮蔽または保護による。ＶＷＦ断片に結合したまたはそれによって保護されたＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩタンパク質の再利用を可能にすることもできる。完全長ＶＷＦ分子に含有されるＶＷＦクリアランス経路受容体結合部位を排除することによって、本発明のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロ二量体はＶＷＦクリアランス経路から遮蔽され、さらにＦＶＩＩＩの半減期を延長する。
一実施形態では、本発明で有用なＶＷＦタンパク質はＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含み、その際、Ｄ’ドメインは配列番号２１のアミノ酸７６４～８６６に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、その際ＶＷＦタンパク質は内在性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を妨げるまたは阻害する。別の実施形態では、ＶＷＦタンパク質はＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含み、その際、Ｄ３ドメインは配列番号２１のアミノ酸８６７～１２４０に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、その際ＶＷＦタンパク質は内在性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を妨げるまたは阻害する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＶＷＦタンパク質は、配列番号２１のアミノ酸７６４～１２４０に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、ＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含み、それらから本質的に成り、またはそれらから成り、その際、ＶＷＦタンパク質は内在性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を妨げるまたは阻害する。他の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は、配列番号２１のアミノ酸２３～１２４０に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ’及びＤ３のドメインを含み、それらから本質的に成り、またはそれらから成り、その際、ＶＷＦタンパク質は内在性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を妨げるまたは阻害する。さらに他の実施形態では、ＶＷＦタンパク質はさらに、それに操作可能に連結されたシグナルペプチドを含む。
一部の実施形態では、本発明で有用なＶＷＦタンパク質は、（１）Ｄ’Ｄ３ドメイン、Ｄ１Ｄ’Ｄ３ドメイン、Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインまたはＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインと、（２）約１０アミノ酸までの（たとえば、配列番号２１のアミノ酸７６４～１２４０から配列番号２１のアミノ酸７６４～１２５０までの任意の配列）、約１５アミノ酸までの（たとえば、配列番号２１のアミノ酸７６４～１２４０から配列番号２１のアミノ酸７６４～１２５５までの配列）、約２０アミノ酸までの（たとえば、配列番号２１のアミノ酸７６４
～１２４０から配列番号２１のアミノ酸７６４～１２６０までの配列）、約２５アミノ酸までの（たとえば、配列番号２１のアミノ酸７６４～１２４０から配列番号２１のアミノ酸７６４～１２６５までの配列）、または約３０アミノ酸までの（たとえば、配列番号２１のアミノ酸７６４～１２４０から配列番号２１のアミノ酸７６４～１２６０までの配列）追加のＶＷＦ配列とから本質的に成る、または成る。特定の実施形態では、Ｄ’ドメインとＤ３ドメインを含むまたはそれらから本質的に成るＶＷＦタンパク質は配列番号２１のアミノ酸７６４～１２７４でもないし、完全長の成熟ＶＷＦでもない。一部の実施形態では、Ｄ１Ｄ２ドメインはＤ’Ｄ３ドメインとトランスで発現される。一部の実施形態では、Ｄ１Ｄ２ドメインはＤ’Ｄ３ドメインとシスで発現される。
他の実施形態では、Ｄ１Ｄ２ドメインに連結されたＤ’Ｄ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質はさらに、細胞内の切断部位、たとえば、（ＰＡＣＥ（フーリン）またはＰＣ５による切断部位）を含み、発現の際、Ｄ’Ｄ３ドメインからのＤ１Ｄ２ドメインの切断を可能にする。細胞内の切断部位の非限定例は本明細書の他のどこかで開示されている。
さらに他の実施形態では、ＶＷＦタンパク質はＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含むが、（１）配列番号２１に対応するアミノ酸１２４１～２８１３、（２）配列番号２１に対応するアミノ酸１２７０～アミノ酸２８１３、（３）配列番号２１に対応するアミノ酸１２７１～アミノ酸２８１３、（４）配列番号２１に対応するアミノ酸１２７２～アミノ酸２８１３、（５）配列番号２１に対応するアミノ酸１２７３～アミノ酸２８１３、（６）配列番号２１に対応するアミノ酸１２７４～アミノ酸２８１３、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列を含まない。
さらに他の実施形態では、本発明のＶＷＦタンパク質はＤ’ドメイン、Ｄ３ドメイン及びＡ１ドメインに相当するアミノ酸配列を含む、それから本質的に成るまたはそれから成り、その際、該アミノ酸配列は配列番号２１のアミノ酸７６４～１４７９に対して少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、その際、ＶＷＦタンパク質は内在性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を妨げる。特定の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は配列番号２１のアミノ酸７６４～１２７４ではない。
一部の実施形態では、本発明のＶＷＦタンパク質はＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むが、（１）Ａ１ドメイン、（２）Ａ２ドメイン、（３）Ａ３ドメイン、（４）Ｄ４ドメイン、（５）Ｂ１ドメイン、（６）Ｂ２ドメイン、（７）Ｂ３ドメイン、（８）Ｃ１ドメイン、（９）Ｃ２ドメイン、（１０）ＣＫドメイン、（１１）ＣＫドメイン及びＣ２ドメイン、（１２）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、及びＣ１ドメイン、（１３）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、（１４）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、（１５）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、及びＢ１ドメイン、（１６）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、及びＤ４ドメイン、（１７）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、及びＡ３ドメイン、（１８）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ａ３ドメイン、及びＡ２ドメイン、（１９）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ａ３ドメイン、Ａ２ドメイン、及びＡ１ドメイン、並びに（２０）それらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つのＶＷＦドメインを含まない。
さらに他の実施形態では、ＶＷＦタンパク質はＤ’Ｄ３ドメインと１以上のドメインまたはモジュールを含む。そのようなドメインまたはモジュールの例には、その全体が参照
によって本明細書に組み入れられるＺｈｏｕｒら，Ｂｌｏｏｄ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ，Ａｐｒｉｌ，６，２０１２：ＤＯＩ，１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１２－０１－４０５１３４にて開示されたドメイン及びモジュールが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、ＶＷＦタンパク質はＤ’Ｄ３ドメインと、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４Ｎモジュール、ＶＷＤ４モジュール、Ｃ８－４モジュール、ＴＩＬ－４モジュール、Ｃ１モジュール、Ｃ２モジュール、Ｃ３モジュール、Ｃ４モジュール、Ｃ５モジュール、Ｃ５モジュール、Ｃ６モジュール、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される１以上のドメインまたはモジュールとを含むことができる。
さらに他の実施形態では、ＶＷＦタンパク質は異種部分に連結され、その際、該異種部分はＶＷＦタンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に連結され、またはＶＷＦタンパク質にて１以上のアミノ酸（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）のすぐ下流に挿入される。たとえば、ＶＷＦタンパク質における異種部分の挿入部位はＤ’ドメイン、Ｄ３ドメイン、またはその双方であることができる。異種部分は半減期延長因子であることができる。
特定の実施形態では、本発明で有用なＶＷＦタンパク質は、多量体、たとえば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、またはさらに高次の多量体を形成する。他の実施形態では、ＶＷＦタンパク質はたった１つのＶＷＦタンパク質を有する単量体である。一部の実施形態では、本発明のＶＷＦタンパク質は１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加または修飾を有することができる。一実施形態では、ＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦタンパク質がジスルフィド結合を形成できないように、または二量体若しくは多量体を形成できないようにアミノ酸の置換、欠失、付加または修飾を含むことができる。別の実施形態では、アミノ酸の置換はＤ’ドメインとＤ３ドメインの範囲内である。特定の実施形態では、本発明で有用なＶＷＦタンパク質は、配列番号２１に対応する残基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と１１４２双方に相当する残基で少なくとも１つのアミノ酸の置換を含有する。少なくとも１つのアミノ酸の置換は野生型のＶＷＦでは天然に存在しない任意のアミノ酸であることができる。たとえば、アミノ酸の置換は、システイン以外の任意のアミノ酸、たとえば、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニンまたはヒスチジンであることができる。別の例では、アミノ酸の置換は、ＶＷＦタンパク質が多量体を形成するのを妨げるまたは阻害する１以上のアミノ酸を有する。
特定の実施形態では、本明細書で有用なＶＷＦタンパク質はさらにＦＶＩＩＩとの相互作用を改善するように、たとえば、ＦＶＩＩＩに対する結合親和性を改善するように修飾され得る。非限定例として、ＶＷＦタンパク質は、配列番号２１のアミノ酸７６４に相当する残基でセリン残基を含み、配列番号２１のアミノ酸７７３に相当する残基でリジン残基を含む。残基７６４及び／または７７３はＶＷＦタンパク質のＦＶＩＩＩに対する結合親和性に寄与する。他の実施形態では、本発明で有用なＶＷＦタンパク質は、他の修飾を有することができ、たとえば、タンパク質をＰＥＧ化する、グリコシル化する、ＨＥＳ化するまたはポリシアル化することができる。
ＩＩ.Ｂ．ＸＴＥＮ配列
本明細書で使用されるとき、「ＸＴＥＮ配列」は、主として小さな親水性アミノ酸で構成される、天然に存在しない、実質的に非反復の配列を持つ延長した長さのポリペプチドを指し、該配列は生理的条件下で低次の二次構造若しくは三次構造を持つ、または二次構造若しくは三次構造を持たない。キメラタンパク質の相手として、ＸＴＥＮは、キャリアとして役立つことができ、ＶＷＦタンパク質または本発明のＦＶＩＩＩ配列に連結されてキメラタンパク質を創り出す場合、特定の望ましい薬物動態特性、物理化学的特性及び薬学特性を付与する。そのような望ましい特性には、高い薬物動態パラメータ及び溶解度特
性が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、「ＸＴＥＮ」は具体的には抗体または軽鎖若しくは重鎖の単鎖抗体若しくはＦｃ断片のような抗体断片を排除する。
本発明は、ＸＴＥＮ配列がＶＷＦタンパク質及び／または第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合される場合、長いＸＴＥＮ配列に比べて改善された半減期延長特性を提供する短いＸＴＥＮ配列を提供する。従って、ＶＷＦタンパク質及び／または第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＸＴＥＮ配列は長さ２８８未満のアミノ酸を含有し、すなわち、２８８アミノ酸よりも短い。一実施形態では、ＶＷＦタンパク質及び／または第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＸＴＥＮ配列は、１２アミノ酸～２８７アミノ酸の間の長さを有するアミノ酸配列から成る。別の実施形態では、ＶＷＦタンパク質及び／または第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＸＴＥＮ配列は少なくとも約３６アミノ酸、少なくとも約４２アミノ酸、少なくとも約７２アミノ酸、少なくとも約１４４アミノ酸、しかし、２８８未満のアミノ酸を含む。他の実施形態では、ＶＷＦタンパク質及び／または第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＸＴＥＮ配列は、ＡＥ３６、ＡＧ３６、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１４４、またはＡＧ１４４から選択される。一実施形態では、ＶＷＦタンパク質及び／または第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＸＴＥＮ配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列であり、その際、キメラタンパク質はＸＴＥＮ配列を含まないキメラタンパク質に比べて改善された半減期を示す。
本発明のキメラタンパク質はさらに追加の（第２、第３またはそれ以上）ＸＴＥＮ配列を含むことができる。追加のＸＴＥＮ配列はさらにＦＶＩＩＩタンパク質または第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合することができる。追加のＸＴＥＮ配列は任意の長さであることができる。たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質または第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合された追加のＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００より大きいアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定の実施形態では、追加のＸＴＥＮ配列は、約２０を超えて約３０００までのアミノ酸残基、約３０を超えて約２５００までの残基、約４０を超えて約２０００までの残基、約５０を超えて約１５００までの残基、約６０を超えて約１０００までの残基、約７０を超えて約９００までの残基、約８０を超えて約８００までの残基、約９０を超えて約７００までの残基、約１００を超えて約６００までの残基、約１１０を超えて約５００までの残基、または約１２０を超えて約４００までの残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。
ＸＴＥＮ配列（すなわち、ＶＷＦタンパク質及び／または第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＸＴＥＮ配列、またはＦＶＩＩＩタンパク質及び／または第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合された若しくはＦＶＩＩＩタンパク質内の１以上の挿入部位に挿入されたＸＴＥＮ配列）は、９～１４アミノ酸残基の１以上の配列モチーフまたは該配列モチーフに対して少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、その際、該モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から成る群から選択される４～６種類のアミノ酸を含む、それらから本質的に成るまたはそれらから成る。ＵＳ２０１０－０２３９５５４Ａ１を参照のこと。
一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、重複しない配列モチーフを含み、配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または約１００％が表２Ａから選択される単一のモチーフファミリーから選択される重複しない配列の複数の単位から成り、結果的にファミリー配列を生じる。本明細書で使用されるとき、「ファミリー」は、ＸＴＥＮが表２Ａにある単一モチーフのカテゴリー、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤ ＸＴＥＮのみから選択されるモチーフを有し、且つ、ファミリーモチーフに由来しないＸＴＥＮにおける任意の他のアミノ酸を選択して、たとえば、コードしているヌクレオチドによって制限部位を取り込ませる、切断配列を取り込ませる、またはＦＶＩＩＩ若しくはＶＷＦへの良好な結合を達成するのに必要な特性を達成することを意味する。ＸＴＥＮファミリーの一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーの重複しない配列モチーフの複数の単位を含み、得られるＸＴＥＮは上述の相同性の範囲を示す。他の実施形態では、ＸＴＥＮは表２Ａのモチーフファミリーの２以上に由来するモチーフ配列の複数の単位を含む。これらの配列を選択して、以下でさらに完全に記載される、電荷、親水性のような特性、二次構造の欠如、またはモチーフのアミノ酸組成によって付与される反復性の欠如を含む所望の物理的／化学的な特徴を達成する。この段落の上文で記載された実施形態では、本明細書で記載される方法を用いてＸＴＥＮに取り込まれたモチーフを選択し、組み立てて、約３６～約３０００アミノ酸残基のＸＴＥＮを達成することができる。
Figure 2022118129000016
Figure 2022118129000017
一部の実施形態では、本発明で使用されるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１９０８、及びＡＧ２００４から成る群から選択される配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ＵＳ２０１０－０２３９５５４Ａ１を参照のこと。
一実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２（配列番号９）、ＡＥ７２（配列番号１０）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号５５）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号５６）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号５７）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号５８）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号５９）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号６０）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号６１）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号６２）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号６３）、ＡＥ８６４（配列番号１５）、ＡＥ５７６（配列番号１６）、ＡＥ２８８（配列番号８）、ＡＥ２８８＿２（配列番号５４）、ＡＥ１４４（配列番号１１）、ＡＧ８６４（配列番号１７）、ＡＧ５７６（配列番号１８）、ＡＧ２８８（配列番号１９）、ＡＧ１４４（配列番号１４）及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。別の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２（配列番号９）、ＡＥ７２（配列番号１０）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号５５）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号５６
）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号５７）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号５８）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号５９）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号６０）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号６１）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号６２）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号６３）、ＡＥ８６４（配列番号１５）、ＡＥ５７６（配列番号１６）、ＡＥ２８８（配列番号８）、ＡＥ２８８＿２（配列番号５４）、ＡＥ１４４（配列番号１１）、ＡＧ８６４（配列番号１７）、ＡＧ５７６（配列番号１８）、ＡＧ２８８（配列番号１９）、ＡＧ１４４（配列番号１４）及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。具体的な実施形態では、ＸＴＥＮ配列はＡＥ２８８である。本発明の特定のＸＴＥＮ配列のアミノ酸配列は表２Ｂに示される。
Figure 2022118129000018
Figure 2022118129000019
Figure 2022118129000020
Figure 2022118129000021
Figure 2022118129000022
ＸＴＥＮ成分が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択されるアミノ酸の４、５または６種類から成るアミノ酸の１００％未満を有する、または表３の配列モチーフ若しくは表４及び１３～１７のＸＴＥＮ配列から成る配列の１００％未満を有するそれらの態様では、ＸＴＥＮのその他のアミノ酸残基は他の任意の１４の天然のＬ－アミノ酸から選択されるが、ＸＴＥＮ配列が少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％親水性アミノ酸を含有するように親水性アミノ酸から優先的に選択される。グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）ではないＸＴＥＮアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列全体にわたって散在する、配列モチーフ内にまたはその間に位置する、またはＸＴＥＮ配列の１以上の短いストレッチに集中して、たとえば、ＸＴＥＮとＦＶＩＩＩまたはＶＷＦとの間でリンカーを創り出す。ＸＴＥＮ成分がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）以外のアミノ酸を含むような場合では、得られる配列が一般に二次構造を欠く、たとえば、本明細書で開示される方法によって測定されるとき、２％を超えるαらせんまたは２％を超えるβシートを有さないように、アミノ酸の約２％未満または約１％未満は疎水性残基であることが好まれる。ＸＴＥＮの構築ではあまり好まれない疎水性残基には、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニンが挙げられる。さらに、以下のアミノ酸：システイン（ジスルフィドの形成及び酸化を回避するために）、メチオニン（酸化を回避するために）、アルギニン及びグルタミン（脱アミド化を回避するために）の５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満、又は１％未満を含有するように、または全く含有しないようにＸＴＥＮ配列を設計することができる。従って、一部の実施形態では、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）に加えて他のアミノ酸を含むＸＴＥＮ成分は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎのアルゴリズムによって測定されたときαらせん及びβシートに寄与する残基の５％未満を伴った配列を有し、且つＧＯＲアルゴリズムによって測定されたとき少なくとも９０％または少なくとも約９５％以上のランダムコイル形成を有する。
さらなる実施形態では、本発明で使用されるＸＴＥＮ配列は、本発明のキメラタンパク質の物理的なまたは化学的な特性、たとえば、薬物動態に影響を与える。本発明で使用されるＸＴＥＮ配列は、以下の有利な特性：構造的な柔軟性、高い水溶解性、程度の高いプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳類の受容体に対する低い結合、または大きな流体力学（またはストーク）半径の１以上を示すことができる。具体的な実施形態では、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたＸＴＥＮ配列は、たとえば、長い終末相半減期または広い曲線下面積（ＡＵＣ）のように薬物動態特性を高めるので、本明細書で開示されるキメラタンパク質は野生型ＦＶＩＩＩに比べて長い時間生体内に留まる。さらなる実施形態では、本発明で使用されるＸＴＥＮ配列は、長い終末相半減期または広い曲線下面積（ＡＵＣ）のように薬物動態特性を高めるので、ＦＶＩＩＩタンパク質は野生型ＦＶＩＩＩに比べて長い時間生体内に留まる。
本発明の一実施形態は、Ｆｃ領域に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質とＦｃ領域に融合されたＶＷＦタンパク質とを含むＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ融合タンパク質であり、その際、ＸＴＥＮ配列（たとえば、ＡＥ２８８）はＦＶＩＩＩ部分内に挿入され、２８８未満のアミ
ノ酸を有するＸＴＥＮ配列（たとえば、ＡＥ１４４）はＶＷＦ部分とＦｃ部分との間に挿入される。実施例にて記載されるように、ＶＷＦ部分とＦｃ部分との間での２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮの挿入は、ＶＷＦ部分とＦｃ部分との間での２８８のアミノ酸を有するＸＴＥＮの挿入よりもキメラタンパク質の薬物動態に対して大きな効果を有する。たとえば、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ融合タンパク質におけるＶＷＦ部分とＦｃ部分との間での２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列の挿入は、２８８のアミノ酸を有するＸＴＥＮに比べてキメラタンパク質の終末相半減期を増すことができる。一部の実施形態では、終末相半減期は、２８８のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列の挿入に比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％増加する。特定の一実施形態では、終末相半減期は、２８８のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列の挿入に比べて少なくとも約３５％増加する。２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列の挿入はキメラタンパク質のＡＵＣ値を高めることもできる。一部の実施形態では、ＡＵＣ値は、２８８のアミノ酸を有するＸＴＥＮの挿入に比べて少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％高められる。特定の一実施形態では、ＡＵＣは約２倍高められる。２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列の挿入はまた、キメラタンパク質のクリアランスを減らすこともできる。たとえば、クリアランスは２８８のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列の挿入に比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％または少なくとも約３０％減らすことができる。２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列の挿入は、２８８のアミノ酸を有するＸＴＥＮの挿入に比べて平均滞留時間（ＭＲＴ）を増やすことができ、及び／または定常状態での分布の見かけの容積（Ｖｓｓ）を減らすことができる。
種々の方法及びアッセイを用いてＸＴＥＮ配列を含むタンパク質の物理的／化学的な特性を測定することができる。そのような方法には、分析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＨＰＬＣ－逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折測定、及びＵＶ／可視光分光法が挙げられるが、これらに限定されない。追加の方法はＡｍａｕら，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ．４８，１－１３（２００６）にて開示されている。
本発明に従って使用することができるＸＴＥＮ配列の追加の例は、ＵＳ２０１０／０２３９５５４Ａ１、ＵＳ２０１０／０３２３９５６Ａ１、ＵＳ２０１１／００４６０６０Ａ１、ＵＳ２０１１／００４６０６１Ａ１、ＵＳ２０１１／００７７１９９Ａ１、またはＵＳ２０１１／０１７２１４６Ａ１、またはＷＯ２０１００９１１２２Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２、ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１、ＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２、またはＷＯ２０１３０１２２６１７Ａ１にて開示されている。
ＩＩ.Ｃ．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質
「ＦＶＩＩＩタンパク質」は本明細書で使用されるとき、特定されない限り、凝固における正常な役割で機能的なＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。用語、ＦＶＩＩＩタンパク質には、凝固経路における完全長野生型の第ＶＩＩＩ因子の機能を保持する、その機能的な断片、変異体、類似体または誘導体が含まれる。「ＦＶＩＩＩタンパク質」はＦＶＩＩＩポリペプチド（またはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと相互変換可能に使用される。ＦＶＩＩＩの機能の例には、凝固を活性化する能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、またはＣａ２＋とリン脂質の存在下で第ＩＸ因子とテナーゼ複合体を形成し、次いで第Ｘ因子を活性化された形態Ｘａに変換する能力が挙げられるが、これらに限定されない。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラットまたはマウスのＦＶＩＩＩタンパク質であることができる。加えて、ヒト由来のＦＶＩＩＩと他の種のＦＶＩＩＩの比較
によって、機能に必要とされる可能性がある保存された残基が特定されている（Ｃａｍｅｒｏｎら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７－２２（１９９８）；ＵＳ６，２５１，６３２）。
凝固系の機能を評価する多数の試験：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（ＩＮＲを測定するのにも使用される）、フィブリノーゲン試験（Ｃｌａｕｓｓ法によることが多い）、血小板計数、血小板機能試験（ＰＦＡ－１００によることが多い）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿が正常な血漿と混合されれば異常が是正するかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ－二量体、遺伝試験（たとえば、第Ｖ因子ライデン、プロトロンビン変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセルクサリヘビ蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、その他の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリ（ＴＥＭ（登録商標）、たとえば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））またはオイグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）が利用可能である。
ａＰＴＴ試験は、「固有の」（接触活性化経路とも言う）及び共通の凝固経路双方の有効性を測定する性能指標である。この試験を一般に使用して市販の組換え凝固因子、たとえば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固活性を測定する。外来性の経路を測定するプロトロンビン試験（ＰＴ）と併せてそれを使用する。
ＲＯＴＥＭ解析は、止血の全体的な動態：凝固時間、血餅形成、血餅安定性及び溶解に関する情報を提供する。トロンボエラストメトリにおける様々なパラメータは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線維素溶解、またはこれらの相互作用に影響を与える多数の因子に依存する。このアッセイは二次止血の全体像を提供することができる。
ＦＶＩＩＩのポリペプチド及びポリヌクレオチドの配列は、多数の機能的な断片、変異体及び修飾型と同様に既知である。ヒトのＦＶＩＩＩ配列（完全長）の例を以下に示す。
Figure 2022118129000023
Figure 2022118129000024
Figure 2022118129000025
Figure 2022118129000026
Figure 2022118129000027
ＦＶＩＩＩポリペプチドには、完全長ＦＶＩＩＩ、Ｎ末端でＭｅｔを外した完全長ＦＶＩＩＩ、成熟ＦＶＩＩＩ（シグナルペプチドを外した）、Ｎ末端で追加のＭｅｔを伴った成熟ＦＶＩＩＩ、及び／またはＢドメインを完全にまたは部分的に欠失させたＦＶＩＩＩが含まれる。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ変異体には、部分欠失または完全欠失いずれかのＢドメインの欠失が含まれる。
ネイティブのヒト成熟ＦＶＩＩＩの配列は配列番号６５として提示されている。ネイティブのＦＶＩＩＩタンパク質は以下の式：Ａ１－ａ１－Ａ２－ａ２－Ｂ－ａ３－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２を有し、式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３は構造的に関連する「Ａドメイン」であり、Ｂは「Ｂドメイン」であり、Ｃ１及びＣ２は構造的に関連する「Ｃドメイン」であり、ａ１、ａ２及びａ３は酸性スペーサー領域である。配列番号６５における一次アミノ酸配列の位置を参照して、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１ドメインはＡｌａ１からほぼＡｒｇ３３６まで伸び、ａ１スペーサー領域はほぼＭｅｔ３３７からほぼＶａｌ３７４まで伸び、Ａ２ドメインはほぼＡｌａ３７５からほぼＴｙｒ７１９まで伸び、ａ２スペーサー領域はほぼＧｌｕ７２０からほぼＡｒｇ７４０まで伸び、ＢドメインはほぼＳｅｒ７４１からほぼＡｒｇ１６４８まで伸び、ａ３スペーサー領域はほぼＧｌｕ１６４９からほぼＡｒｇ１６８９ま
で伸び、Ａ３ドメインはほぼＳｅｒ１６９０からほぼＬｅｕ２０２５まで伸び、Ｃ１ドメインはほぼＧｌｙ２０２６からほぼＡｓｎ２０７２まで伸び、Ｃ２ドメインはほぼＳｅｒ２０７３からほぼＴｙｒ２３３２まで伸びる。特定のタンパク質分解切断部位以外に、ＦＶＩＩＩのドメイン及び領域の間での境界の位置の指定は様々な文献参照で変化し得る。従って、本明細書で言及される境界は用語「ほぼ」の使用によって近似として指定される。
ヒトのＦＶＩＩＩ遺伝子は単離され、哺乳類細胞で発現されている（Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３４２－３４７（１９８４）；Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３２６－３３０（１９８４）；Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ｉ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０－３３７（１９８４）；Ｖｅｈａｒ，Ｇ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３７－３４２（１９８４）；ＷＯ８７／０４１８７；ＷＯ８８／０８０３５；ＷＯ８８／０３５５８；及びＵＳ４，７５７，００６））。ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列はＵＳ４，９６５，１９９で示されたようなｃＤＮＡから推定された。加えて、部分的にまたは完全にＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩはＵＳ４，９９４，３７１及びＵＳ４，８６８，１１２にて示されている。一部の実施形態では、ヒトＦＶＩＩＩのＢドメインはＵＳ５，００４，８０３にて示されたようにヒトの第Ｖ因子のＢドメインで置き換えられる。ヒトの第ＶＩＩＩ因子をコードするｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列はＵＳ２００５／０１００９９０のそれぞれ配列番号１及び２にて示されている。
ブタのＦＶＩＩＩ配列は、Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５９３９－５９４２（１９８６）にて公開されている。さらに、ブタ脾臓のｃＤＮＡライブラリに由来するＦＶＩＩＩ配列のＰＣＲ増幅から得られたブタの完全なｃＤＮＡ配列は、Ｈｅａｌｅｙ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｂｌｏｏｄ，８８：４２０９－４２１４（１９９６）にて報告されている。ドメインすべて、サブユニットすべて及び特定のアミノ酸配列の置換を有するハイブリッドのヒト／ブタＦＶＩＩＩは、Ｌｏｌｌａｒ及びＲｕｎｇｅによるＵＳ５，３６４，７７１にて、及びＷＯ９３／２００９３にて開示された。さらに最近、ブタＦＶＩＩＩのＡ１及びＡ２ドメインのヌクレオチド配列及び相当するアミノ酸配列、並びに対応するヒトのドメインについて置換されたブタのＡ１及び／またはＡ２ドメインを持つキメラＦＶＩＩＩはＷＯ９４／１１５０３にて報告された。ＵＳ５，８５９，２０４、Ｌｏｌｌａｒ，Ｊ．Ｓ．もブタｃＤＮＡ及び推定されたアミノ酸配列を開示している。ＵＳ６，４５８，５６３はＢドメインを欠失させたブタＦＶＩＩＩを開示している。
ＵＳ５，８５９，２０４、Ｌｏｌｌａｒ，Ｊ．Ｓ．は低下した抗原性及び低下した免疫反応性を有するＦＶＩＩＩの機能的な変異体を報告している。ＵＳ６，３７６，４６３、Ｌｏｌｌａｒ，Ｊ．Ｓ．は低下した免疫反応性を有するＦＶＩＩＩの変異体も報告している。ＳａｅｎｋｏらのＵＳ２００５／０１００９９０はＦＶＩＩＩのＡ２ドメインにおける機能的な変異を報告している。
一実施形態では、ＦＶＩＩＩ（またはキメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分）は、配列番号６７のアミノ酸１～１４３８または配列番号６５のアミノ酸１～２３３２（シグナル配列なしで）のＦＶＩＩＩアミノ酸配列または配列番号６４のアミノ酸１～１９及び配列番号６７の１～１４３８または配列番号６４のアミノ酸１～１９及び配列番号６５のアミノ酸１～２３３２（シグナル配列を伴った）のＦＶＩＩＩアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよく、その際、ＦＶＩＩＩは凝固活性を有し、たとえば、補因子として第ＩＸ因子を活性化し、第Ｘ因子を活性化された第Ｘ因子に変換する。ＦＶＩＩＩ（またはキメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分）は、配列番号６７のアミノ酸１～１４３８または配列番号６５のアミノ酸１～２３３２（シグナル配列を含まず）のＦＶＩＩ
Ｉアミノ酸配列と同一であってもよい。ＦＶＩＩＩはさらにシグナル配列を含んでもよい。
ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」は本明細書で使用されるとき、ヒト完全長ＦＶＩＩＩの内部アミノ酸配列同一性及びタンパク分解切断の部位、たとえば、残基Ｓｅｒ７４１～Ａｒｇ１６４８によって定義される当該技術で既知のＢドメインと同一である。ヒトの他のＦＶＩＩＩのドメインは、以下のアミノ酸残基：Ａ１，残基Ａｌａ１～Ａｒｇ３７２；Ａ２，残基Ｓｅｒ３７３～Ａｒｇ７４０；Ａ３，残基Ｓｅｒ１６９０～Ａｓｎ２０１９；Ｃ１，残基Ｌｙｓ２０２０～Ａｓｎ２１７２；Ｃ２，残基Ｓｅｒ２１７３～Ｔｙｒ２３３２によって定義される。Ａ３－Ｃ１－Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０～Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列である残基Ｇｌｕ１６４９～Ａｒｇ１６８９は普通、ａ３酸性領域と呼ばれる。ブタ、マウス及びイヌのＦＶＩＩＩについてＢドメインを含むドメインすべての境界の位置も当該技術で既知である。一実施形態では、ＦＶＩＩＩのＢドメインを欠失させる（「Ｂドメインを欠失させた第ＶＩＩＩ因子」または「ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩの例はＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組換えＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）であり、それは表５（ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ重鎖は二重下線を引き、Ｂドメインはイタリック体であり、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ軽鎖は標準文字である）における配列の第ＶＩＩＩ因子部分と同じ配列を有する。表６（配列番号６８）をコードするヌクレオチド配列を表６にて示す。
Figure 2022118129000028
Figure 2022118129000029
Figure 2022118129000030
Figure 2022118129000031
「Ｂドメインを欠失させたＦＶＩＩＩ」は、ＵＳ６，３１６，２２６、ＵＳ６，３４６，５１３、ＵＳ７，０４１，６３５、ＵＳ５，７８９，２０３、ＵＳ６，０６０，４４７、ＵＳ５，５９５，８８６、ＵＳ６，２２８，６２０、ＵＳ５，９７２，８８５、ＵＳ６，０４８，７２０、ＵＳ５，５４３，５０２、ＵＳ５，６１０，２７８、ＵＳ５，１７１，８４４、ＵＳ５，１１２，９５０、ＵＳ４，８６８，１１２、及びＵＳ６，４５８，５６３にて開示された完全なまたは部分的な欠失を有してもよい。一部の実施形態では、本発明のＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩの配列はＵＳ６，３１６，２２６（ＵＳ６，３４６，５１３も）の第４欄第４行～第５欄第２８行及び実施例１～５にて開示された欠失のいずれか１つを含む。別の実施形態では、Ｂドメインを欠失させた第ＶＩＩＩ因子は、Ｓ７４３／Ｑ１６３８ Ｂドメインを欠失させた第ＶＩＩＩ因子（ＳＱ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）（たとえば、アミノ酸７４４～アミノ酸１６３７の欠失を有する第ＶＩＩＩ因子、たとえば、配列番号６５のアミノ酸１～７４３及びアミノ酸１６３８～２３３２を有する、すなわち、配列番号６７を有する第ＶＩＩＩ因子）である。一部の実施形態では、本発明のＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩは、ＵＳ５，７８９，２０３（ＵＳ６，０６０，４４７、ＵＳ５，５９５，８８６及びＵＳ６，２２８，６２０も）の第２欄第２６～５１行及び実施例５～８にて開示された欠失を有する。一部の実施形態では、Ｂドメインを欠失させた第ＶＩＩＩ因子は、ＵＳ５，９７２，８８５の第１欄第２５行～第２欄第４０行；ＵＳ６，０４８，７２０の第６欄第１～２２行及び実施例１；ＵＳ５，５４３，５０２の第２欄第１７～４６行；ＵＳ５，１７１，８４４の第４欄第２２行～第５欄第３６行；ＵＳ５，１１２，９５０の第２欄第５５～６８行、図２及び実施例１；ＵＳ４，８６８，１１２の第２欄第２行～第１９欄第２１行及び表２；ＵＳ７，０４１，６３５の第２欄第１行～第３欄第１９行、第３欄第４０行～第４欄第６７行、第７欄第４３行～第８欄第２６行及び第１１欄第５行～第１３欄第３９行；またはＵＳ６，４５８，５６３の第４欄第２５～５３行にて記載された欠失を有する。一部の実施形態では、Ｂドメインを欠失させたＦＶＩＩＩはＢドメインのほとんどの欠失を有するが、ＷＯ９１／０９１２２にて開示されたように、一次翻訳産物の２つのポリペプチド鎖への生体内でのタンパク質分解プロセッシングに必須であるＢドメインのアミノ末端の配列を依然として含有する。一部の実
施形態では、Ｂドメインを欠失させたＦＶＩＩＩはアミノ酸７４７～１６３８の欠失によって、すなわち、Ｂドメインの実際完全な欠失によって構築される。Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８－７３２３（１９９０）。Ｂドメインを欠失させた第ＶＩＩＩ因子はまたＦＶＩＩＩのアミノ酸７７１～１６６６またはアミノ酸８６８～１５６２の欠失を含有してもよい。Ｍｅｕｌｉｅｎ，Ｐ．ら．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２（４）：３０１－６（１９８８）。本発明の一部である追加のＢドメインの欠失には、アミノ酸９８２～１５６２または７６０～１６３９（Ｔｏｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６），８３、５９３９－５９４２））、７９７～１５６２（Ｅａｔｏｎら．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８６），２５：８３４３－８３４７））、７４１～１６４６（Ｋａｕｆｍａｎ（ＷＯ８７／０４１８７））、７４７－１５６０（Ｓａｒｖｅｒら、ＤＮＡ，（１９８７），６：５５３－５６４））、７４１～１６４８（Ｐａｓｅｋ（ＰＣＴ８８／００８３１））、または８１６～１５９８または７４１～１６４８（Ｌａｇｎｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）Ｎｏ８２：１６－２５、ＥＰ２９５５９７））の欠失が挙げられる。他の実施形態では、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩには、１以上のＮ結合グリコシル化部位、たとえば、完全長ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸配列に対応する残基７５７、７８４、８２８、９００、９６３または任意で９４３を保持するＢドメインの断片を含有するＦＶＩＩＩポリペプチドが挙げられる。Ｂドメインの断片の例には、Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．ら，Ｂｌｏｏｄ，１０３（ａ）：３４１２－３４１９（２００４），Ｋａｓｕｄａ，Ａら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６：１３５２－１３５９（２００８），及びＰｉｐｅ，Ｓ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：２２３５－２２４２（２０１１）にて開示されたようなＢドメインの２２６アミノ酸または１６３アミノ酸が含まれる（すなわち、Ｂドメインの最初の２２６アミノ酸または１６３アミノ酸が保持される）。さらに他の実施形態では、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩはさらに、残基３０９で点突然変異（ＰｈｅからＳｅｒ）を含んでＢＤＤ－ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を改善する。Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．ら，Ｂｌｏｏｄ，１０３（ａ）：３４１２－３４１９（２００４）を参照のこと。さらに他の実施形態では、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩには、Ｂドメインの部分を含有するが、１以上のフーリン切断部位（たとえば、Ａｒｇ１３１３及びＡｒｇ１６４８）を含有しないＦＶＩＩＩポリペプチドが含まれる。Ｐｉｐｅ，Ｓ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：２２３５－２２４２（２０１１）を参照のこと。前述の欠失のそれぞれは任意のＦＶＩＩＩ配列にて行われてもよい。
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩは部分的なＢドメインを有する。一部の実施形態では、部分的なＢドメインを伴ったＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩ１９８である。ＦＶＩＩＩ１９８は部分的なＢドメインを含有する単鎖ＦＶＩＩＩＦｃ分子－２２６Ｎ６である。数２２６はＦＶＩＩＩのＢドメインのＮ末端２２６アミノ酸を表し、Ｎ６はＢドメインにおける６つのＮ－グリコシル化部位を表す。
一実施形態では、アミノ酸１６４８（完全長の第ＶＩＩＩ因子または配列番号６５における）でのアルギニン、アミノ酸７５４（Ｓ７４３／Ｑ１６３８Ｂドメインを欠失させた第ＶＩＩＩ因子または配列番号６７における）でのアルギニン、または相当するアルギニン残基（他の変異体における）の直後でＦＶＩＩＩが切断され、それによって重鎖及び軽鎖を生じる。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、金属イオンが介在する非共有結合によって連結されるまたは会合する重鎖及び軽鎖を含む。
他の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、アミノ酸１６４８（完全長の第ＦＶＩＩＩ因子または配列番号６５における）でのアルギニン、アミノ酸７５４（Ｓ７４３／Ｑ１６３８Ｂドメインを欠失させた第ＦＶＩＩＩ因子または配列番号６７における）でのアルギニン、または相当するアルギニン残基（他の変異体における）の直後で切断されていない単鎖ＦＶＩＩＩである。単鎖ＦＶＩＩＩは１以上のアミノ酸置換を含んでもよい。一実施形態では
、アミノ酸置換は、完全長の成熟第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号６５）の残基１６４８、残基１６４５またはその双方、またはＳＱ ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（配列番号６７）の残基７５４、残基７５１またはその双方にて存在する。アミノ酸置換は、アルギニン以外のアミノ酸、たとえば、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、オルニチン、ピロリジン、またはタウリンであることができる。
ＦＶＩＩＩはトロンビンによって切断され、次いでＦＶＩＩＩａとして活性化され、活性化された第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）の補因子として役立つことができる。そして活性化されたＦＩＸは活性化されたＦＶＩＩＩと一緒にＸａｓｅ複合体を形成し、第Ｘ因子を活性化された第Ｘ因子（ＦＸａ）に変換する。活性化については、ＦＶＩＩＩは、アミノ酸３７２、７４０及び１６８９（Ｂドメインを欠失させたＦＶＩＩＩ配列におけるアミノ酸３７２、７４０及び７９５に対応する）にて３つのアルギニン残基の後でトロンビンによって切断され、切断は５０ｋＤａのＡ１鎖と４３ｋＤａのＡ２鎖と７３ｋＤａのＡ３－Ｃ１－Ｃ２鎖を有するＦＶＩＩＩａを生成する。一実施形態では、本発明で有用なＦＶＩＩＩタンパク質は活性のないＦＶＩＩＩである。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は活性のあるＦＶＩＩＩである。
ＶＷＦタンパク質に連結されたまたは会合させたＦＶＩＩＩポリペプチドを有するタンパク質は、配列番号６５または６７に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むことができ、その際、配列は、ＦＶＩＩＩの凝固活性、たとえば、補因子としての第ＩＸ因子を活性化して第Ｘ因子を活性化された第Ｘ因子（ＦＸａ）に変換する活性を有する。
「ハイブリッド」または「キメラ」のポリペプチド及びタンパク質は本明細書で使用されるとき、第１のポリペプチド鎖、たとえば、２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列と第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＶＷＦタンパク質と、第２のポリペプチド鎖、たとえば、第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質の組み合わせを含み、それによってヘテロ二量体を形成する。一実施形態では、ハイブリッドにおける第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、たとえば、電荷／電荷のまたは疎水性の相互作用のようなタンパク質／タンパク質の相互作用を介して互いに会合する。別の実施形態では、第１のポリペプチドはＶＷＦタンパク質／ＸＴＥＮ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、第２のポリペプチドはＦＶＩＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含んで、ハイブリッドをヘテロ二量体にし、その際、ＸＴＥＮは２８８未満のアミノ酸を含有する。他の実施形態では、第１のポリペプチドはＶＷＦタンパク質／ＸＴＥＮ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、第２のポリペプチドはＦＶＩＩＩ（Ｘ）－Ｆｃ融合タンパク質を含んで、ハイブリッドをヘテロ二量体にし、その際、ＸＴＥＮは２８８未満のアミノ酸を含有する。第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、たとえば、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域の間でのジスルフィド結合のような共有結合を介して会合することができる。第１のポリペプチドと第２のポリペプチドはさらに、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の間での結合によって互いに会合することができる。
本発明で有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩの凝固活性に影響を与えない１以上の追加のＸＴＥＮ配列を有するＦＶＩＩＩを含むことができる。そのようなＸＴＥＮ配列はＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端若しくはＮ末端に融合することができ、またはＦＶＩＩＩタンパク質における１以上の２つのアミノ酸残基の間に挿入することができるが、挿入はＦＶＩＩＩの凝固活性またはＦＶＩＩＩの機能に影響を与えない。一実施形態では、
挿入はＦＶＩＩＩタンパク質の薬物動態特性（たとえば、半減期）を改善する。別の実施形態では、挿入は、複数の挿入、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の挿入であることができる。挿入部位の例には、表７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５に載せられた部位、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
１以上のＸＴＥＮ配列に連結されるＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩ（Ｘ２）またはＦＶＩＩＩ（ａ→ｂ）－Ｘ－ＦＶＩＩＩ（ｃ→ｄ）として表すことができ、その際、ＦＶＩＩＩ（ａ→ｂ）は、アミノ酸残基「ａ」からアミノ酸残基「ｂ」までのＦＶＩＩＩタンパク質の第１の部分を含み、それから本質的に成り、またはそれから成り；Ｘ２は１以上のＸＴＥＮ配列を含み、それから本質的に成り、またはそれから成り；ＦＶＩＩＩ（ｃ→ｄ）はアミノ酸残基「ｃ」からアミノ酸残基「ｄ」までのＦＶＩＩＩタンパク質の第２の部分を含み、それから本質的に成り、またはそれから成る。 「ａ」はＦＶＩＩＩタンパク質の第１の部分のＮ末端アミノ酸残基であり； 「ｂ」はＦＶＩＩＩタンパク質の第１の部分のＣ末端アミノ酸残基であるが、ＸＴＥＮ配列が挿入される挿入部位の２つのアミノ酸のＮ末端アミノ酸残基でもあり； 「ｃ」はＦＶＩＩＩタンパク質の第２の部分のＮ末端アミノ酸残基であるが、ＸＴＥＮ配列が挿入される挿入部位の２つのアミノ酸のＣ末端アミノ酸残基でもあり； 「ｄ」はＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端アミノ酸残基であり、及び その際、ＦＶＩＩＩタンパク質の第１の部分とＦＶＩＩＩタンパク質の第２の部分は互いに同一ではなく、ＦＶＩＩＩタンパク質がＦＶＩＩＩの凝固活性を有するようにともに十分な長さである。
一実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質の第１の部分とＦＶＩＩＩタンパク質の第２の部分は配列番号６５（完全長成熟ＦＶＩＩＩ配列）または配列番号６７（Ｂドメインを欠失させたＦＶＩＩＩ）の断片、たとえば、それぞれＮ末端部分及びＣ末端部分である。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質の第１の部分はＦＶＩＩＩタンパク質のＡ１ドメインとＡ２ドメインを含む。ＦＶＩＩＩタンパク質の第２の部分はＡ３ドメインとＣ１ドメインと、任意でＣ２ドメインとを含む。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質の第１の部分はＡ１ドメインとＡ２ドメインを含み、ＦＶＩＩＩタンパク質の第２の部分はＢドメインの一部と、Ａ３ドメインとＣ１ドメインと、任意でＣ２ドメインとを含む。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質の第１の部分はＦＶＩＩＩタンパク質のＡ１ドメインとＡ２ドメインと、ＦＶＩＩＩドメインのＢドメインの一部とを含み、ＦＶＩＩＩタンパク質の第２の部分はＡ３ドメインとＣ１ドメインと、任意でＣ２ドメインとを含む。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質の第１の部分はＦＶＩＩＩタンパク質のＡ１ドメインとＡ２ドメインと、Ｂドメインの第１の部分とを含む。ＦＶＩＩＩタンパク質の第２の部分は、Ｂドメインの第２の部分とＡ３ドメインとＣ１ドメインと、任意でＣ２ドメインとを含む。一部の実施形態では、２つのアミノ酸（「ｂ」及び「ｃ」）は、表７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４及び１５で示されるアミノ酸残基挿入部位の任意の１以上であることができる。たとえば、「ｂ」は１以上のＸＴＥＮ配列が挿入されるまたは連結される部位のすぐ上流のアミノ酸残基であることができ、「ｃ」は１以上のＸＴＥＮ配列が挿入されるまたは連結される部位のすぐ下流のアミノ酸残基であることができる。一部の実施形態では、「ａ」はＦＶＩＩＩタンパク質の最初の成熟アミノ酸配列であり、「ｄ」はＦＶＩＩＩタンパク質の最後のアミノ酸配列である。たとえば、ＦＶＩＩＩ（ａ→ｂ）は、配列番号６７（Ｂドメインを欠失させたＦＶＩＩＩのアミノ酸配列）または配列番号６５（完全長ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１～７４５に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列であることができ、ＦＶＩＩＩ（ｃ→ｄ）はそれぞれ配列番号６７のアミノ酸７４６～１４３８または配列番号６５のアミノ酸１６４１～２３３２であることができる。
一部の態様では、ＦＶＩＩＩタンパク質の挿入部位は、Ｎ末端、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ末端であるＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のドメイン、またはそれらの２以上の組み合わせ、またはＡ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、及びＡ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせであるＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメイン間に位置する。たとえば、ＸＴＥＮ配列が挿入され得る挿入部位は、Ｎ末端とＡ１ドメイン、Ｎ末端とＡ２ドメイン、Ｎ末端とＡ３ドメイン、Ｎ末端とＢドメイン、Ｎ末端とＣ１ドメイン、Ｎ末端とＣ２ドメイン、Ｎ末端とＣ末端、Ａ１とＡ２のドメイン、Ａ１とＡ３のドメイン、Ａ１とＢのドメイン、Ａ１とＣ１のドメイン、Ａ１とＣ２のドメイン、Ａ１ドメインとＣ末端、Ａ２とＡ３のドメイン、Ａ２とＢのドメイン、Ａ２とＣ１のドメイン、Ａ２とＣ２のドメイン、Ａ２ドメインとＣ末端、Ａ３とＢのドメイン、Ａ３とＣ１のドメイン、Ａ３とＣ２のドメイン、Ａ３ドメインとＣ末端、ＢとＣ１のドメイン、ＢとＣ２のドメイン、ＢドメインとＣ末端、Ｃ１とＣ２のドメイン、Ｃ１とＣ末端、Ｃ２ドメイン、及びＣ末端、及びそれらの２以上の組み合わせから成る群から選択される。挿入部位の非限定例は表７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４及び１５でリストにされている。
ＸＴＥＮ配列がＦＶＩＩＩタンパク質における１以上のアミノ酸（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）のすぐ下流に挿入される、またはＣ末端若しくはＮ末端に連結されるＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列への連結またはそれによる挿入の後、ＦＶＩＩＩの活性を保持する。挿入がＦＶＩＩＩの活性に影響を与えない（すなわち、ＦＶＩＩＩタンパク質が凝固特性を依然として保持する）ようにＸＴＥＮ配列はＦＶＩＩＩタンパク質に１回、１回を超えて、２回、３回、４回、５回または６回挿入することができる。
本発明で有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、任意のリンカーによってＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端若しくはＣ末端で１以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結することができ、または１以上の任意のリンカーによってＦＶＩＩＩタンパク質における１以上のアミノ酸（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）のすぐ下流に挿入される。一実施形態では、ＸＴＥＮ配列が挿入される２つのアミノ酸残基またはＸＴＥＮ配列が連結されるアミノ酸残基は、表７、表８、表９及び表１０における残基及びそれらの組み合わせから成る群から選択される配列番号６５（完全長の成熟ＦＶＩＩＩ）の２または１のアミノ酸残基に相当する。
他の実施形態では、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が本明細書で開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位またはそれらの組み合わせに挿入される。態様の１つでは、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が表７で開示された１以上のアミノ酸にて開示された１以上のＸＴＥＮ挿入部位に挿入される。
Figure 2022118129000032
Figure 2022118129000033
Figure 2022118129000034
Figure 2022118129000035
Figure 2022118129000036
一部の実施形態では、１以上のＸＴＥＮ配列が、配列番号６５に対応するアミノ酸３２、２２０、２２４、３３６、３３９、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５、または１９１０、またはそれらの組み合わせから上下の約６つのアミノ酸の範囲内に挿入される。
Figure 2022118129000037
他の実施形態では、１以上のＸＴＥＮ配列は、表９における１以上の挿入部位から成る群から選択されるヒトの完全長成熟ＦＶＩＩＩに対応する１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入される。
Figure 2022118129000038
さらに他の実施形態では、１以上のＸＴＥＮがＦＶＩＩＩのＢドメインに挿入される。一例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７４０と１６４０の間に挿入され、その際、アミノ酸７４０と１６４０の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。別の例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７４１と１６９０の間に挿入され、その際、アミノ酸７４０と１６９０の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。他の例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７４１と１６４８の間に挿入され、その際、アミノ酸７４１と１６４８の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。さらに他の例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７４３と１６３８の間に挿入され、その際、アミノ酸７４３と１６３８の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。さらに他の例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７４５と１６５６の間に挿入され、その際、アミノ酸７４５と１６５６の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。一部の例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７４５と１６５７の間に挿入され、その際、アミノ酸７４５と１６５７の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。特定の例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７４５と１６６７の間に挿入され、その際、アミノ酸７４５と１６６７の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。さらに他の例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７４５と１６８６の間に挿入され、その際、アミノ酸７４５と１６８６の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。一部の他の例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７４７と１６４２の間に挿入され、その際、アミノ酸７４７と１６４２の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。さらに他の例では、ＸＴＥＮは配列番号６５に対応するアミノ酸７５１と１６６７の間に挿入され、その際、アミノ酸７５１と１６６７の間のＦＶＩＩＩ配列は任意で存在しない。
一部の実施形態では、１以上のＸＴＥＮは、表１０におけるアミノ酸残基から成る群から選択される挿入部位のアミノ酸のすぐ下流の１以上のアミノ酸に挿入される。
Figure 2022118129000039
Figure 2022118129000040
一実施形態では、１以上のＸＴＥＮ挿入部位は、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上の表面に露出した柔軟なループ構造（たとえば、許容ループ）内に位置する。たとえば、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列を、組換えタンパク質の凝固促進活性または生体内にて若しくは試験管内で宿主細胞にて発現される組換えタンパク質の能力を排除することなく少なくとも１つのＸＴＥＮポリペプチドを挿入することができる少なくとも２つの「許容ループ」を含む各ＦＶＩＩＩの「Ａ」ドメインに挿入することができる。許容ループは、幾つかある特質の中で特に、高い表面露出または溶媒露出及び配座柔軟性を伴った少なくとも１つのＸＴＥＮ配列の挿入を可能にする領域である。Ａ１ドメインは許容ループ－１（Ａ１－
１）領域と許容ループ－２（Ａ１－２）領域を含み、Ａ２ドメインは許容ループ－１（Ａ２－１）領域と許容ループ－２（Ａ２－２）領域を含み、Ａ３ドメインは許容ループ－１（Ａ３－１）領域と許容ループ－２（Ａ３－２）領域を含む。
態様の１つでは、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインにおける第１の許容ループ（Ａ１－１）はβ鎖１とβ鎖２の間に位置し、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインにおける第２の許容ループ（Ａ１－２）はβ鎖１１とβ鎖１２の間に位置する。ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインにおける第１の許容ループ（Ａ２－１）はβ鎖２２とβ鎖２３の間に位置し、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインにおける第２の許容ループ（Ａ２－２）はβ鎖３２とβ鎖３３の間に位置する。ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインにおける第１の許容ループ（Ａ３－１）はβ鎖３８とβ鎖３９の間に位置し、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインにおける第２の許容ループ（Ａ３－２）はβ鎖４５とβ鎖４６の間に位置する。特定の態様では、Ａ１－１を含む表面に露出した柔軟なループ構造は、配列番号６５のおよそアミノ酸１５からおよそアミノ酸４５までの、たとえば、配列番号６５のおよそアミノ酸１８からおよそアミノ酸４１までのヒトのネイティブな成熟ＦＶＩＩＩの領域に相当する。他の態様では、Ａ１－２を含む表面に露出した柔軟なループ構造は、配列番号６５のおよそアミノ酸２０１からおよそアミノ酸２３２までの、たとえば、配列番号６５のおよそアミノ酸２１８からおよそアミノ酸２２９までのヒトのネイティブな成熟ＦＶＩＩＩの領域に相当する。さらに他の態様では、Ａ２－１を含む表面に露出した柔軟なループ構造は、配列番号６５のおよそアミノ酸３９５からおよそアミノ酸４２１までの、たとえば、配列番号６５のおよそアミノ酸３９７からおよそアミノ酸４１８までのヒトのネイティブな成熟ＦＶＩＩＩの領域に相当する。さらに他の実施形態では、Ａ２－２を含む表面に露出した柔軟なループ構造は、配列番号６５のおよそアミノ酸５７７からおよそアミノ酸６３５までの、たとえば、配列番号６５のおよそアミノ酸５９５からおよそアミノ酸６０７までのヒトのネイティブな成熟ＦＶＩＩＩの領域に相当する。特定の態様では、Ａ３－１を含む表面に露出した柔軟なループ構造は、配列番号６５のおよそアミノ酸１７０５からおよそアミノ酸１７３２までの、たとえば、配列番号６５のおよそアミノ酸１７１１からおよそアミノ酸１７２５までのヒトのネイティブな成熟ＦＶＩＩＩの領域に相当する。さらに他の態様では、Ａ３－２を含む表面に露出した柔軟なループ構造は、配列番号６５のおよそアミノ酸１８８４からおよそアミノ酸１９１７までの、たとえば、配列番号６５のおよそアミノ酸１８９９からおよそアミノ酸１９１１までのヒトのネイティブな成熟ＦＶＩＩＩの領域に相当する。
別の実施形態では、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が挿入される１以上のアミノ酸はａ３ドメイン、たとえば、完全長の成熟ＦＶＩＩＩポリペプチドに対応するアミノ酸１６４９～１６８９の範囲内に位置する。特定の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は配列番号６５（完全長の成熟ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１６５６とアミノ酸１６５７の間に挿入される。特定の実施形態では、配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されるＸＴＥＮ配列を含むＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、配列番号６５に対応するアミノ酸７４５からアミノ酸１６５６までの欠失を含む。
一部の実施形態では、１以上のＸＴＥＮ挿入についての１以上の挿入部位は、 （１）アミノ酸３、（２）アミノ酸１８、（３）アミノ酸２２、（４）アミノ酸２６、（５）アミノ酸３２、 （６）アミノ酸４０、（７）アミノ酸６０、（８）アミノ酸６５、（９）アミノ酸８１、（１０）アミノ酸１１６、（１１）アミノ酸１１９、（１２）アミノ酸１３０、（１３）アミノ酸１８８、（１４）アミノ酸２１１、（１５）アミノ酸２１６、（１６）アミノ酸２２０、（１７）アミノ酸２２４、（１８）アミノ酸２３０、（１９）アミノ酸３３３、（２０）アミノ酸３３６、（２１）アミノ酸３３９、（２２）アミノ酸３７５、（２３）アミノ酸３９９、（２４）アミノ酸４０３、（２５）アミノ酸４０９、（２６）アミノ酸４１６、（２６）アミノ酸４４２、（２８）アミノ酸４８７、（２９）アミノ酸４９０、（３０） アミノ酸４９４、（３１）アミノ酸５００、（３２）ア
ミノ酸５１８、（３３）アミノ酸５９９、（３４）アミノ酸６０３、（３５）アミノ酸７１３、（３６）アミノ酸７４５、（３７）アミノ酸１６５６、（３８）アミノ酸１７１１、（３９）アミノ酸１７２０、（４０）アミノ酸１７２５、（４１）アミノ酸１７４９、（４２）アミノ酸１７９６、（４３）アミノ酸１８０２、（４４）アミノ酸１８２７、（４５）アミノ酸１８６１、（４６）アミノ酸１８９６、（４７）アミノ酸１９００、（４８）アミノ酸１９０４、（４９）アミノ酸１９０５、（５０）アミノ酸１９１０、（５１）アミノ酸１９３７、（５２）アミノ酸２０１９、（５３）アミノ酸２０６８、（５４）アミノ酸２１１１、（５５）アミノ酸２１２０、（５６）アミノ酸２１７１、（５７）アミノ酸２１８８、（５８）アミノ酸２２２７、（５９）アミノ酸２２７７、及び
（６０）それらの２以上の組み合わせから成る群から選択される成熟完全長ＦＶＩＩＩに対応する１以上のアミノ酸のすぐ下流である。
一実施形態では、本発明で有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、２つのＸＴＥＮ配列、第１のＸＴＥＮ挿入部位に挿入される第１のＸＴＥＮ配列と第２のＸＴＥＮ挿入部位に挿入される第２のＸＴＥＮ配列とを含む。第１のＸＴＥＮ挿入部位及び第２のＸＴＥＮ挿入部位の非限定例は表１１に載せられている。
Figure 2022118129000041
Figure 2022118129000042
ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入されるまたは連結される２つのＸＴＥＮは同一であること
ができ、または異なることができる。一部の実施形態では、本発明で有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号６５に対応するアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入された第１のＸＴＥＮ配列と配列番号６５に対応するアミノ酸２３３２（Ｃ末端）のすぐ下流に挿入された第２のＸＴＥＮ配列とを含む。他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１８、２６、４０、１６５６または１７２０のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１８、２６または４０のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸５９９のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１８、２６、４０、３９９、４０３、１７２５、１７２０、１９００または２３３２のすぐ下流に挿入される。特定の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１８、２６または４０のすぐ下流に挿入される。一部の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１８、２６または４０のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸３９９のすぐ下流に挿入される。他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１８、２６または４０のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１８のすぐ下流に挿入される。特定の実施形態では、２つのＸＴＥＮ配列、配列番号６５に対応するアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入された第１のＸＴＥＮ配列と配列番号６５に対応するアミノ酸２３３２のすぐ下流に挿入された第２のＸＴＥＮ配列とを含み、ＦＶＩＩＩタンパク質は、その際、ＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、配列番号６５に対応するアミノ酸７４５から配列番号６５に対応するアミノ酸１６８５までの欠失；配列番号６５に対応するアミノ酸１６８０での変異若しくは置換、たとえば、Ｙ１６８０Ｆ；配列番号６５に対応するアミノ酸１６４８での変異若しくは置換、たとえば、Ｒ１６４８Ａ；または配列番号６５に対応するアミノ酸１６４８と配列番号６５に対応するアミノ酸１６８０での少なくとも２つの変異若しくは置換、たとえば、Ｒ１６４８ＡとＹ１６８０Ｆを有する。具体的な実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、２つのＸＴＥＮ配列、配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入された第１のＸＴＥＮ配列と配列番号６５に対応するアミノ酸２３３２のすぐ下流に挿入された第２のＸＴＥＮ配列とを含み、その際、ＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、配列番号６５に対応するアミノ酸７４５からアミノ酸１６５６の欠失を有する。
特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、３つのＸＴＥＮ配列、第１のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第１のＸＴＥＮ配列と、第２のＸＴＥＮ配列挿入部位に挿入された第２のＸＴＥＮ配列と、第３のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第３のＸＴＥＮ配列とを含む。第１のＸＴＥＮ配列、第２のＸＴＥＮ配列及び第３のＸＴＥＮ配列は同一であることができ、または異なることができる。第１、第２及び第３の挿入部位は、本明細書で開示される挿入部位のいずれか１つの群から選択することができる。一部の実施形態では、３つのＸＴＥＮ配列を含むＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、たとえば、配列番号６５に対応するアミノ酸１６４８での変異または置換、たとえば、Ｒ１６４８Ａを含むことができる。たとえば、第１、第２及び第３のＸＴＥＮ挿入部位の非限定例は表１２にてリストにされている。
Figure 2022118129000043
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、３つのＸＴＥＮ配列、配列番号６５に対応するアミノ酸２６のすぐ下流に挿入された第１のＸＴＥＮ配列と配列番号６５に対応するアミノ酸４０３の下流に挿入された第２のＸＴＥＮ配列と配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６、１７２０または１９００の下流に挿入された第３のＸＴＥＮ配列とを含む。他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸２６のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６の下流に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０または１９００の下流に挿入される。さらに他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸２６のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０の下流に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１９００の下流に挿入される。さらに他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６の下流に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０または１９００の下流に挿入される。他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸４０３または１６５６のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０の下流に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１９００の下流に挿入される。他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ
酸１８、２６、４０、３９９、４０３、１７１１、１７２０、１７２５、１９００、１９０５または１９１０のすぐ下流に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸７４５の下流に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸２３３２の下流に挿入される。
他の実施形態では、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は４つのＸＴＥＮ配列、第１の挿入部位に挿入された第１のＸＴＥＮ配列と第２の挿入部位に挿入された第２のＸＴＥＮ配列と第３の挿入部位に挿入された第３のＸＴＥＮ配列と第４の挿入部位に挿入された第４のＸＴＥＮ配列とを含む。第１、第２、第３及び第４のＸＴＥＮ配列は同一であることができ、異なることができ、またはそれらの組み合わせであることができる。一部の実施形態では、４つのＸＴＥＮ配列を含むＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、たとえば、配列番号６５に対応するアミノ酸１６４８での変異または置換、たとえば、Ｒ１６４８Ａを含むことができる。第１、第２、第３及び第４のＸＴＥＮ挿入部位の非限定例は表１３にてリストにされている。
Figure 2022118129000044
Figure 2022118129000045
Figure 2022118129000046
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は５つのＸＴＥＮ配列、第１の挿入部位に挿入された第１のＸＴＥＮ配列と第２の挿入部位に挿入された第２のＸＴＥＮ配列と第３のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第３のＸＴＥＮ配列と第４のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第４のＸＴＥＮ配列と第５のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第５のＸＴＥＮ配列とを
含む。第１、第２、第３、第４、第５のＸＴＥＮ配列は同一であることができ、異なることができ、またはそれらの組み合わせであることができる。第１、第２、第３、第４、及び第５の挿入部位の非限定例は表１４にてリストにされている。
Figure 2022118129000047
特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、６つのＸＴＥＮ配列、第１のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第１のＸＴＥＮ配列と第２のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第２のＸＴＥＮ配列と第３のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第３のＸＴＥＮ配列と第４のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第４のＸＴＥＮ配列と第５のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第５のＸＴＥＮ配列と第６のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第６のＸＴＥＮ配列とを含む。第１、第２、第３、第４、第５または第６のＸＴＥＮ配列は同一であることができ、異なることができ、またはそれらの組み合わせであることができる。６つのＸＴＥＮ挿入部位の例には、表１５にてリストにされた挿入部位が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2022118129000048
特定の例では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５（完全長の成熟ＦＶＩＩＩ）に対応するアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。別の例では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。一部の例では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。他の例では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。さらに他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。さらに他の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され
、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。特定の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１９００と１９０１の間に挿入される。一部の実施形態では、第１のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第２のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、第３のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入され、第４のＸＴＥＮ配列は配列番号６５に対応するアミノ酸１９００と１９０１の間に挿入される。
特定の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、完全長の第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７４５と７４６の間に、またはＢドメインを欠失させた第ＶＩＩＩ因子の相当する挿入部位に挿入される。
一部の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、２つのポリペプチド配列、ＦＶＩＩＩ－１６１（配列番号６９）、ＦＶＩＩＩ－１６９（配列番号７０）、ＦＶＩＩＩ－１７０（配列番号７１）、ＦＶＩＩＩ－１７３（配列番号７２）；ＦＶＩＩＩ－１９５（配列番号７３）；ＦＶＩＩＩ－１９６（配列番号７４）、ＦＶＩＩＩ１９９（配列番号７５）、ＦＶＩＩＩ－２０１（配列番号７６）；ＦＶＩＩＩ－２０３（配列番号７７）、ＦＶＩＩＩ－２０４（配列番号７８）、ＦＶＩＩＩ－２０５（配列番号７９）、ＦＶＩＩＩ－２６６（配列番号８０）、ＦＶＩＩＩ－２６７（配列番号８１）、ＦＶＩＩＩ－２６８（配列番号８２）、ＦＶＩＩＩ－２６９（配列番号８３）、ＦＶＩＩＩ－２７１（配列番号８４）またはＦＶＩＩＩ－２７２（配列番号８５）から選択される配列に対して少なくとも約８０％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド配列と、ＶＷＦ０３１（配列番号８６）、ＶＷＦ０３４（配列番号８７）またはＶＷＦ－０３６から選択される配列に対して少なくとも約８０％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド配列とを含む。
ＩＩ.Ｄ．Ｉｇ定常領域またはその一部
本発明のキメラタンパク質はまた、２つのＩｇ定常領域またはその一部、任意のリンカーによってＦＶＩＩＩタンパク質に融合された第１のＩｇ定常領域またはその一部と、２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列を介してＶＷＦタンパク質に融合された第２のＩｇ定常領域またはその一部も含む。Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＸＴＥＮ配列及びＶＷＦタンパク質との組み合わせでキメラタンパク質の薬物動態特性または薬物力学的特性を改善することができる。特定の実施形態では、Ｉｇ定常領域またはその一部は、Ｉｇ定常領域またはその一部に融合された分子の半減期を延長する。
Ｉｇ定常領域はＣＨ（定常重鎖）と示されたドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２等）で構成される。アイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）に応じて、定常領域は３または４のＣＨドメインで構成され得る。一部のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ）の定常領域はヒンジ領域も含有する。Ｊａｎｅｗａｙら．２００１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
本発明のキメラタンパク質を作製するためのＩｇ定常領域またはその一部は多数の異なる供給源から得られてもよい。一部の実施形態では、Ｉｇ定常領域またはその一部はヒトのＩｇに由来する。しかしながら、Ｉｇ定常領域またはその一部は、たとえば、齧歯類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（たとえば、チンパンジー、サル）の種を含む別の哺乳類のＩｇに由来してもよい。さらに、Ｉｇ定常領域
またはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含むＩｇクラス及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むＩｇアイソタイプに由来してもよい。一実施形態では、ヒトのアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
種々のＩｇ定常領域の遺伝子配列（たとえば、ヒトの定常領域の遺伝子配列）が公的にアクセスできる供託物の形態で利用可能である。特定のエフェクター機能を有する（またはエフェクター機能を欠いている）、または免疫原性を低下させる特定の修飾を持つ定常領域のドメイン配列を選択することができる。抗体または抗体をコードする遺伝子の多数の配列が公開されており、好適なＩｇ定常領域の配列（たとえば、ヒンジ、ＣＨ２及び／またはＣＨ３の配列またはその一部）は当該技術で認識された技法を用いてこれらの配列から導出することができる。前述の方法を用いて得られた遺伝物質を次いで変化させ、または合成して本発明のポリペプチドを得てもよい。本発明の範囲が定常領域のＤＮＡ配列の対立遺伝子、変異体及び突然変異を包含することがさらに十分に理解されるであろう。
たとえば、ポリメラーゼ鎖反応及び当該ドメインを増幅するように選択されるプライマーを用いてＩｇ定常領域またはその一部の配列をクローニングすることができる。抗体からＩｇ定常領域またはその一部の配列をクローニングするには、ハイブリドーマ、脾臓またはリンパ系細胞からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲによって抗体遺伝子を増幅することができる。ＰＣＲ増幅法は、ＵＳ４，６８３，１９５；ＵＳ４，６８３，２０２；ＵＳ４，８００，１５９；ＵＳ４，９６５，１８８；及びたとえば、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｈｏら．１９８９．Ｇｅｎｅ，７７：５１；Ｈｏｒｔｏｎら．１９９３．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０にて詳細に記載されている。コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開された重鎖及び軽鎖のＤＮＡ及びアミノ酸の配列に基づいたさらに特異的なプライマーによってＰＣＲを開始してもよい。上述のように、ＰＣＲも用いて抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離してもよい。この場合、コンセンサスプライマーまたは、たとえば、マウスの定常領域プローブのようなさらに大きな相同プローブによってライブラリをスクリーニングしてもよい。抗体遺伝子の増幅に好適な多数のプライマーセットが当該技術で既知である（たとえば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（Ｂｅｎｈａｒ及びＰａｓｔａｎ．１９９４．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：１５０９）；ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７３：３３）；抗体のリーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋら．１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０））。抗体配列のクローニングはさらに、参照によって本明細書に組み入れられる１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらのＵＳ５，６５８，５７０に記載されている。
本明細書で使用されるＩｇ定常領域は、ドメインすべてとヒンジ領域またはその一部を含むことができる。一実施形態では、Ｉｇ定常領域またはその一部はＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、ヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手とを含む。
本明細書で使用されるとき、「Ｆｃ領域」は、ネイティブなＩｇのＦｃ領域に相当する、すなわち、その２つの重鎖の各Ｆｃドメインの二量体会合によって形成されるようなポリペプチドの部分として定義される。ネイティブなＦｃ領域は別のＦｃ領域とホモ二量体を形成する。それに対して、用語「遺伝的に融合されたＦｃ領域」または「単鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）は単一のポリペプチド鎖の中で遺伝的に連結された（すなわち、単一の連続的な遺伝配列）Ｆｃドメインから構成される合成の二量体Ｆｃ領域を指す。
一実施形態では、「Ｆｃ領域」はパパイン切断部位（すなわち、ＩｇＧにおける残基２１６、重鎖定常領域の最初の残基を１１４であると見なして）のすぐ上流のヒンジ領域で開始して抗体のＣ末端で終了する単一Ｉｇ重鎖の部分を指す。従って、完全なＦｃドメインは少なくともヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む。
Ｉｇのアイソタイプに応じたＩｇ定常領域のＦｃ領域はＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４のドメインと同様にヒンジ領域を含むことができる。ＩｇのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、高い安定性、増加した血清半減期（Ｃａｐｏｎら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５）と同様に新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）のようなＦｃ受容体への結合（ＵＳ６，０８６，８７５；ＵＳ６，４８５，７２６；ＵＳ６，０３０，６１３；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３－０２３５５３６Ａ１）を含む幾つかの望ましい特性をキメラタンパク質に与え、それらはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
Ｉｇ定常領域またはその一部はＦｃＲｎの結合相手であることができる。ＦｃＲｎは成人の上皮組織で活性があり、腸管の内腔、肺気道、鼻表面、膣表面、結腸及び直腸の表面で発現される（ＵＳ６，４８５，７２６）。ＦｃＲｎの結合相手はＦｃＲｎに結合するＩｇの一部である。
ＦｃＲｎはヒトを含む幾つかの哺乳類の種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ及びマウスＦｃＲｎの配列が知られている（Ｓｔｏｒｙら．１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７）。ＦｃＲｎは相対的に低いｐＨでＩｇＧを結合し（しかし、他のＩｇクラス、たとえば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを結合しない）、内腔から漿膜の方向に細胞を横切ってＩｇＧを能動的に輸送し、次いで間質液で見いだされる相対的に高いｐＨでＩｇＧを解放する。それは、肺及び腸の上皮（Ｉｓｒａｅｌら．１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９２：６９）、腎近位尿細管上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら．２００２，Ａｍ．Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｆ３５８）、と同様に鼻上皮、膣表面及び胆道系表面を含む成人の上皮組織（ＵＳ６，４８５，７２６；ＵＳ６，０３０，６１３；ＵＳ６，０８６，８７５；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３－０２３５５３６Ａ１）で発現される。
本発明で有用なＦｃＲｎの結合相手は、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、及びＦｃＲｎ受容体の完全な結合領域を含む他の断片を含む、ＦｃＲｎ受容体が特異的に結合することができる分子を包含する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域はＸ線結晶学に基づいて記載されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら．１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３７２：３７９）。ＦｃＲｎとのＦｃの主な接触領域はＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの接合部の近傍である。Ｆｃ－ＦｃＲｎの接触はすべて単一Ｉｇ重鎖の中である。ＦｃＲｎの結合相手にはＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、及びＦｃＲｎ受容体の完全な結合領域を含むＩｇＧの他の断片が挙げられる。主要な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０～２５７、２７２、２８５、２８８、２９０～２９１、３０８～３１１、及び３１４並びにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５～３８７、４２８、及び４３３～４３６が含まれる。ＩｇまたはＩｇの断片、または領域のアミノ酸の番号付けに対する参照はすべてＫａｂａｔら．１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．に基づく。
ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手はＦｃＲｎによって上皮バリアを横切って効果的に行き来することができるので、所望の治療用分子を全身性に投与する非侵襲性の手段を提供する。さらに、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手を含む融合タンパク質はＦｃＲｎを発現している細胞によって細胞に取り込まれる。ただし、分解についてマークされる代わりに、これらの融合タンパク質は循環で再び再利用されるので、これ
らタンパク質の生体内での半減期を増加させる。特定の実施形態では、Ｉｇ定常領域の一部が、ジスルフィド結合または他の非特異的な相互作用を介して別のＦｃ領域または別のＦｃＲｎの結合相手と会合して二量体及びさらに高次の多量体を形成するＦｃ領域または別のＦｃＲｎの結合相手である。
２つのＦｃＲｎ受容体が単一のＦｃ分子を結合することができる。結晶学的データは、各ＦｃＲｎ分子がＦｃホモ二量体の単一のポリペプチドを結合することを示唆している。一実施形態では、ＦｃＲｎの結合相手、たとえば、ＩｇＧのＦｃ断片を生物学的に活性のある分子に連結することは、生物学的に活性のある分子を経口で、頬内で、舌下で、直腸に、膣内に、鼻に投与されるエアロゾルとして、または肺の経路を介して、又は眼の経路を介して送達する手段を提供する。別の実施形態では、キメラタンパク質は侵襲的に、たとえば、皮下に、静脈内に投与することができる。
ＦｃＲｎの結合相手の領域は、ＦｃＲｎ受容体が特異的に結合することができ、結果的にＦｃ領域のＦｃＲｎ受容体による能動的な輸送を伴う分子またはその一部である。特異的に結合することは、生理的な条件下で相対的に安定である複合体を形成する２つの分子を指す。特異的な結合は、普通、中程度から高い結合能を伴って低い親和性を有する非特異的な結合と区別して高い親和性と中程度から低い結合能を特徴とする。通常、親和性定数ＫＡが１０６Ｍ－１より高い、または１０８Ｍ－１より高い場合、結合は特異的であると見なされる。必要に応じて、結合条件を変化させることによって特異的な結合に実質的に影響を及ぼすことなく非特異的結合を減らすことができる。たとえば、分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（たとえば、血清アルブミン、乳カゼイン）の濃度等のような適当な結合条件は、日常の技法を用いて技量のある熟練者によって最適化され得る。
特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、それでもなお、Ｆｃ領域にＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合特性を付与するのに十分である１以上の短縮したＦｃ領域を含む。たとえば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の部分（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＩｇＧ１のおよそアミノ酸２８２～４３８から、ＥＵ番号付け（ＣＨ２ドメインのアミノ酸２４８、２５０～２５７、２７２、２８５、２８８、２９０～２９１、３０８～３１１、及び３１４並びにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５～３８７、４２８、及び４３３～４３６である一次接触部位と共に）を含む。従って、本発明のＦｃ領域はＦｃＲｎ結合部分を含んでもよい、またはそれから成ってもよい。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプの重鎖に由来してもよい。一実施形態では、ヒトのアイソタイプＩｇＧ１の抗体に由来するＦｃＲｎ結合部分が使用される。別の実施形態では、ヒトのアイソタイプＩｇＧ４の抗体に由来するＦｃＲｎ結合部分が使用される。
別の実施形態では、「Ｆｃ領域」には、Ｆｃドメインのアミノ酸配列またはＦｃドメインに由来するアミノ酸配列が挙げられる。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒンジ（たとえば、上部、中部及び／または下部のヒンジ領域）ドメイン（ＥＵ番号付けに従って抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸２１６～２３０）、ＣＨ２ドメイン（ＥＵ番号付けに従って抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸２３１～３４０）、ＣＨ３ドメイン（ＥＵ番号付けに従って抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸３４１～４３８）、ＣＨ４ドメイン、またはその変異体、一部または断片の少なくとも１つを含む。他の実施形態では、Ｆｃドメインは完全なＦｃ領域（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合されたヒンジドメイン（またはその一部）、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）に融合されたヒンジドメイン（またはその一部）、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合されたＣＨ２ドメイン（またはその一部）、ヒンジドメイン（またはその一部）とＣＨ３ドメイン（またはそ
の一部）の双方に融合されたＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む、から本質的に成る、または成る。さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は少なくともＣＨ２ドメインの一部（たとえば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部）を欠く。特定の実施形態では、Ｆｃ領域はＥＵ番号２２１～４４７に相当するアミノ酸を含むまたはそれらから成る。
本明細書でＦ、Ｆ１またはＦ２として示されるＦｃ領域は多数の異なる供給源から得てもよい。一実施形態では、ポリペプチドのＦｃ領域はヒトのＩｇに由来してもよい。しかしながら、Ｆｃ領域は、たとえば、齧歯類（たとえば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）または非ヒト霊長類（たとえば、チンパンジー、サル）の種を含む別の哺乳類種のＩｇに由来してもよい。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部のポリペプチドは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含むＩｇクラス並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むＩｇアイソタイプに由来してもよい。別の実施形態では、ヒトのアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
特定の実施形態では、Ｆｃ変異体は、当該野生型Ｆｃドメインを含むＦｃ領域によって付与される少なくとも１つのエフェクター機能における変化（たとえば、Ｆｃ受容体（たとえば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）または補体タンパク質（たとえば、Ｃ１ｑ）に結合する、または抗体依存性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、貪食作用または補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣＣ）を誘発するＦｃ領域の能力の改善または低減）を付与する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体は操作されたシステイン残基を提供する。
本発明のＦｃ領域は、エフェクター機能及び／またはＦｃＲ若しくはＦｃＲｎの結合にて変化（たとえば、向上または低減）を付与することが知られている当該技術で認識されたＦｃ変異体を採用してもよい。具体的には、本発明の結合分子には、たとえば、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み入れられる国際ＰＣＴ公開、ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０４／０４４８５９、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２及びＷＯ０６／０８５９６７Ａ２；米国特許公開ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３７７６５、ＵＳ２００７／０２３７７６６、ＵＳ２００７／０２３７７６７、ＵＳ２００７／０２４３１８８、ＵＳ２００７０２４８６０３、ＵＳ２００７０２８６８５９、ＵＳ２００８００５７０５６；またはＵＳ５，６４８，２６０；ＵＳ５，７３９，２７７；ＵＳ５，８３４，２５０；ＵＳ５，８６９，０４６；ＵＳ６，０９６，８７１；ＵＳ６，１２１，０２２；ＵＳ６，１９４，５５１；ＵＳ６，２４２，１９５；ＵＳ６，２７７，３７５；ＵＳ６，５２８，６２４；ＵＳ６，５３８，１２４；ＵＳ６，７３７，０５６；ＵＳ６，８２１，５０５；ＵＳ６，９９８，２５３；ＵＳ７，０８３，７８４；ＵＳ７，４０４，９５６，及びＵＳ７，３１７，０９１にて開示されたアミノ酸位置の１以上における変化（たとえば、置換）が含まれてもよい。一実施形態では、特定の変化（たとえば、当該技術で開示された１以上のアミノ酸の特定の置換）は開示されたアミノ酸位置の１以上で行われてもよい。別の実施形態では、開示されたアミノ酸位置の１以上での異なる変化（たとえば、開示されたアミノ酸位置の１以上での異なる置換）が行われてもよい。
たとえば、部位特異的変異誘発のような十分に認識された手段に従ってＩｇＧのＦｃ領
域またはＦｃＲｎの結合相手を修飾してＦｃＲｎが結合するであろう修飾されたＩｇＧまたはＦｃの断片またはそれらの部分を得ることができる。そのような修飾には、ＦｃＲｎの接触部位から離れた修飾と同様にＦｃＲｎへの結合を保護するまたは増強さえする接触部位内での修飾が挙げられる。たとえば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ（Ｆｃγ１）における以下の単一のアミノ酸残基：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ，Ｑ４３８Ａ，Ｋ４３９Ａ，Ｓ４４０Ａ，Ｓ４４４Ａ，及びＫ４４７Ａは、ＦｃＲｎに対するＦｃの結合親和性を有意に失うことなく置換されることができ、その際、Ｐ２３８Ａは２３８位でアラニンによって置換された野生型プロリンを表す。一例として、具体的な実施形態は高度に保存されたＮ－グリコシル化部位を取り外すＮ２９７Ａ変異を組み入れる。アラニンに加えて、上記で特定された位置にて野生型アミノ酸について他のアミノ酸が置換されてもよい。Ｆｃに変異を１つずつ導入してネイティブのＦｃとは区別される１００を超えるＦｃ領域を生じてもよい。さらに、これらの個々の変異の２、３またはそれ以上の組み合わせを一緒に導入して数百以上のＦｃ領域を生じてもよい。さらに、本発明の構築物のＦｃ領域の１つを変異させてもよく、構築物の他のＦｃ領域を全く変異させなくてもよく、またはそれら双方を変異させてもよいが、変異は異なる。
特定の上記変異はＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手に新しい官能性を付与してもよい。たとえば、一実施形態は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位を取り外すＮ２９７Ａを組み入れる。この変異の効果は、免疫原性を低下させ、それによってＦｃ領域の循環する半減期を向上させること、及びＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなく、Ｆｃ領域がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＩＩＩＡに結合できなくすることである。（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら．１９９５，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６０：８４７；Ｆｒｉｅｎｄら．１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６８：１６３２；Ｓｈｉｅｌｄｓら．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。上述の変異から生じる新しい官能性のさらなる例として、場合によっては、ＦｃＲｎに対する親和性は野生型のそれを超えて上昇し得る。この上昇した親和性は、上昇した「オン」速度、低下した「オフ」速度、または上昇した「オン」速度と低下した「オフ」速度双方を反映してもよい。ＦｃＲｎに対する上昇した親和性を付与すると考えられる変異の例には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａが挙げられるが、これらに限定されない（Ｓｈｉｅｌｄｓら．２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃγ受容体が低いヒンジ領域、一般にアミノ酸２３４～２３７の範囲内でＩｇＧ上の結合部位を認識すると思われる。従って、新しい官能性と潜在的に低下した免疫原性の別の例は、たとえば、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２３３～２３６「ＥＬＬＧ」をＩｇＧ２由来の相当するアミノ酸「ＰＶＡ」（アミノ酸１つ欠失）に置
き換えることによるこの領域の変異から生じてもよい。そのような変異が導入されていると、種々のエフェクター機能に介在するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩはＩｇＧ１に結合しないであろうことが示されている。Ｗａｒｄ及びＧｈｅｔｉｅ，１９９５，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２：７７並びにＡｒｍｏｕｒら．１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３。
一実施形態では、Ｉｇ定常領域またはその一部、たとえば、Ｆｃ領域は、配列ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（ＵＳ５，７３９，２７７の配列番号８９または配列番号３）を含み、且つ任意でさらにＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号９０）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号９１）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号９２）またはＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号９３）（またはそれぞれＵＳ５，７３９，２７７配列番号１１、１、２及び３１）から選択される配列を含むポリペプチドである。
別の実施形態では、免疫グロブリンの定常領域またはその一部は、別の免疫グロブリンの定常領域またはその一部と共に１以上のジスルフィド結合を形成するヒンジ領域またはその一部におけるアミノ酸配列を含む。免疫グロブリンの定常領域またはその一部によるジスルフィド結合は、内在性のＶＷＦがＶＷＦ断片を置き換えないように且つＦＶＩＩＩに結合しないようにＦＶＩＩＩを含む第１のポリペプチドとＶＷＦ断片を含む第２のポリペプチドとを一緒に配置する。従って、第１の免疫グロブリンの定常領域またはその一部と第２の免疫グロブリンの定常領域またはその一部との間でのジスルフィド結合は内在性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質との間の相互作用を妨害する。ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質との間の相互作用の阻害は、キメラタンパク質の半減期が２倍の限度を越えるのを可能にする。ヒンジ領域またはその一部はさらにＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の１以上のドメイン、その断片及びそれらの任意の組み合わせにさらに連結することができる。特定の実施形態では、免疫グロブリンの定常領域またはその一部はヒンジ領域とＣＨ２である。
特定の実施形態では、Ｉｇの定常領域またはその一部はヘミグリコシル化される。たとえば、２つのＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手を含むキメラタンパク質は、第１のグリコシル化されたＦｃ領域（たとえば、グリコシル化されたＣＨ２領域）またはＦｃＲｎの結合相手と、第２のグリコシル化されないＦｃ領域（たとえば、グリコシル化されないＣＨ２領域）またはＦｃＲｎの結合相手とを含有する。一実施形態では、リンカーはグリコシル化されたＦｃ領域とグリコシル化されないＦｃ領域との間に割り込んでもよい。別の実施形態では、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手は完全にグリコシル化され、すなわち、Ｆｃ領域のすべてがグリコシル化される。他の実施形態では、Ｆｃ領域はグリコシル化されない、すなわち、Ｆｃ分子のいずれもグリコシル化されない。
特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、Ｉｇの定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ変異体）に対するアミノ酸置換を含み、それは、Ｉｇ定常領域の抗原には無関係のエフェクター機能、特にタンパク質の循環する半減期を変化させる。
そのようなタンパク質は、これらの置換を欠くタンパク質と比べたとき、ＦｃＲｎへの上昇したまたは低下した結合を示すので、それぞれ血清にて上昇したまたは低下した半減期を示す。ＦｃＲｎに対して改善された親和性を持つＦｃ変異体は、長い血清半減期を有することが期待され、そのような分子は、たとえば、慢性の疾患または障害を治療するために投与されるポリペプチドの長い半減期が所望される場合、哺乳類を治療する方法にて有用な適用を有する（たとえば、ＵＳ７，３４８，００４、ＵＳ７，４０４，９５６及びＵＳ７，８６２，８２０を参照のこと）。対照的に、低下したＦｃＲｎの結合親和性を持つＦｃ変異体は短い半減期を有することが予想され、そのような分子も、たとえば、短縮された循環時間が有利であり得る哺乳類への投与について、たとえば、生体内での診断用画像化について、または長期間循環に存在する場合、出発ポリペプチドが毒性の副作用を
有する状況で有用である。低下したＦｃＲｎの結合親和性を持つＦｃ変異体はまた、胎盤を通過しそうにないので、妊娠女性における疾患または障害の治療で有用である。加えて、低下したＦｃＲｎの結合親和性が所望であり得る他の適用には、脳、腎臓及び／または肝臓への局在が所望である適用が挙げられる。例となる一実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、脈管構造からの腎臓糸球体の上皮を横切る輸送を低下させる。別の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、脳から脈管性間隙への脳血管関門（ＢＢＢ）を横切る輸送を低下させる。一実施形態では、変化したＦｃＲｎ結合を持つタンパク質は、Ｉｇ定常領域の「ＦｃＲｎ結合ループ」の中で１以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手（たとえば、１または２のＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手）を含む。ＦｃＲｎ結合ループは、野生型完全長のＦｃ領域のアミノ酸残基２８０～２９９（ＥＵ番号付けに従って）で構成される。他の実施形態では、変化したＦｃＲｎ結合親和性を有する本発明のキメラタンパク質におけるＩｇ定常領域またはその一部は、１５ÅのＦｃＲｎ「接触ゾーン」内で１以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手を含む。本明細書で使用されるとき、１５ÅのＦｃＲｎ「接触ゾーン」には、野生型完全長Ｆｃ部分の以下の位置：２４３～２６１、２７５～２８０、２８２～２９３、３０２～３１９、３３６～３４８、３６７、３６９、３７２～３８９、３９１、３９３、４０８、４２４、４２５～４４０（ＥＵ番号付け）での残基が挙げられる。他の実施形態では、変化したＦｃＲｎの結合親和性を有する本発明のＩｇ定常領域またはその一部は、以下のＥＵ位置：２５６、２７７～２８１、２８３～２８８、３０３～３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（たとえば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ）、及び４３８のいずれか１つに相当するアミノ酸位置での１以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手を含む。ＦｃＲｎの結合活性を変えた例となるアミノ酸置換は、参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ０５／０４７３２７にて開示されている。
本発明で使用されるＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手はまた、キメラタンパク質のグリコシル化を変化させる当該技術で認識されたアミノ酸置換も含んでもよい。たとえば、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたキメラタンパク質のＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手は、低下したグリコシル化（たとえば、Ｎ－又はＯ－結合グリコシル化）をもたらす変異を有するＦｃ領域を含んでもよく、または野生型Ｆｃ部分の変化した糖型（たとえば、フコースの少ないグリカンまたはフコースを含まないグリカン）を含んでもよい。
一実施形態では、本発明の処理されていないキメラタンパク質は、本明細書で記載されるＩｇの定常領域またはその一部から独立して選択されるその構成定常領域またはその一部の２以上を有する遺伝的に融合されたＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）を含んでもよい。一実施形態では、二量体Ｆｃ領域のＦｃ領域は同一である。別の実施形態では、Ｆｃ領域の少なくとも２つは異なる。たとえば、本発明のタンパク質のＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手は、同じ数のアミノ酸残基を含み、またはそれらは、１以上のアミノ酸残基（たとえば、およそ５アミノ酸残基（たとえば、１、２、３、４、または５のアミノ酸残基）、およそ１０残基、およそ１５残基、およそ２０残基、およそ３０残基、およそ４０残基、またはおよそ５０残基）の長さで異なってもよい。さらに他の実施形態では、本発明のタンパク質のＦｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手は、１以上のアミノ酸位置で異なってもよい。たとえば、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎの結合相手の少なくとも２つがおよそ５アミノ酸の位置（たとえば、１、２、３、４、または５のアミノ酸の位置）、およそ１０の位置、およそ１５の位置、およそ２０の位置、およそ３０の位置、およそ４０の位置、またはおよそ５０の位置）で異なってもよい。
ＩＩ.Ｅ．リンカー
本発明のキメラタンパク質はさらに１以上のリンカーを含む。リンカーの種類の１つは、切断可能なリンカーであり、それは、生体内で、たとえば、凝固の部位にて対象に投与されると種々のプロテアーゼによって切断され得る。一実施形態では、切断可能なリンカーは、部分の、たとえば、ＶＷＦタンパク質のＸＴＥＮ配列からの切断を可能にするので、凝固カスケードの部位でキメラタンパク質からの切断を可能にし、それによって活性化されたＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）がそのＦＶＩＩＩａ活性を有するのを可能にする。リンカーの別の種類は、処理可能なリンカーであり、それは細胞内切断部位を含有するので宿主細胞における細胞内プロセッシング酵素によって切断されることができ、ポリペプチドの好都合な発現及びキメラタンパク質の形成を可能にする。
キメラタンパク質における２つのタンパク質の間で１以上のリンカーが存在することができる。一実施形態では、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質と（ｉｉ）第１のＩｇの定常領域またはその一部とを含む第１のポリペプチドと、（ｉｉｉ）ＶＷＦタンパク質と（ｉｖ）リンカー（たとえば、切断可能なリンカー）と（ｖ）ＸＴＥＮ配列と（ｖｉ）第２のＩｇの定常領域またはその一部とを含む第２のポリペプチドを含む。別の実施形態では、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質と（ｉｉ）第１のＩｇの定常領域またはその一部とを含む第１のポリペプチドと、（ｉｉｉ）ＶＷＦタンパク質と（ｉｖ）ＸＴＥＮ配列と（ｖ）リンカー（たとえば、切断可能なリンカー）と（ｖｉ）第２のＩｇの定常領域またはその一部とを含む第２のポリペプチドを含む。他の実施形態では、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質と（ｉｉ）第１のＩｇの定常領域またはその一部とを含む第１のポリペプチドと、（ｉｉｉ）ＶＷＦタンパク質と（ｉｖ）第１のリンカー（たとえば、切断可能なリンカー）と（ｖ）ＸＴＥＮ配列と（ｖｉ）第２のリンカー（たとえば、切断可能なリンカー）と（ｖｉｉ）第２のＩｇの定常領域またはその一部とを含む第２のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドはさらに、リンカー、たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質と第１のＩｇ定常領域との間で切断可能なリンカーを含む。
特定の実施形態では、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質と（ｉｉ）第１のＩｇの定常領域またはその一部とを含む第１のポリペプチドと、（ｉｉｉ）リンカー（たとえば、切断可能なリンカー）と、（ｉｖ）ＶＷＦタンパク質と、（ｖ）ＸＴＥＮ配列と（ｖｉ）第２のＩｇの定常領域またはその一部とを含む単鎖を含む。他の実施形態では、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質と（ｉｉ）第１のＩｇの定常領域またはその一部と、（ｉｉｉ）第１のリンカー（たとえば、切断可能なリンカー）と（ｉｖ）ＶＷＦタンパク質と、（ｖ）第２のリンカー（たとえば、切断可能なリンカー）と（ｖｉ）ＸＴＥＮ配列と（ｖｉｉ）第２のＩｇの定常領域またはその一部とを含む単鎖を含む。処理可能なリンカーはキメラタンパク質が宿主細胞で発現された後、処理され得る；ので宿主細胞で産生されるキメラタンパク質は２または３のポリペプチド鎖を含む最終形態であることができる。
本発明で有用なリンカーは任意の有機分子を含むことができる。一実施形態では、リンカーはポリマー、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。別の実施形態では、リンカーはアミノ酸配列を含む。リンカーは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００のアミノ酸を含むことができる。リンカーは、１～５のアミノ酸、１～１０のアミノ酸、１～２０のアミノ酸、１０～５０のアミノ酸、５０～１００のアミノ酸、１００～２００のアミノ酸、２００～３００のアミノ酸、３００～４００のアミノ酸、４００～５００のアミノ酸、５００～６００のアミノ酸、６００～７００のアミノ酸、７００～８００のアミノ酸、８００～９００のアミノ酸、または９００～１０００
のアミノ酸を含むことができる。一実施形態では、リンカーはＸＴＥＮ配列を含む。ＸＴＥＮの追加の例は本発明に従って使用することができ、ＵＳ２０１０／０２３９５５４Ａ１、ＵＳ２０１０／０３２３９５６Ａ１、ＵＳ２０１１／００４６０６０Ａ１、ＵＳ２０１１／００４６０６１Ａ１、ＵＳ２０１１／００７７１９９Ａ１、またはＵＳ２０１１／０１７２１４６Ａ１、またはＷＯ２０１００９１１２２Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２、ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１、またはＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２にて開示されている。別の実施形態では、リンカーはＰＡＳ配列である。
一実施形態では、リンカーはポリマー、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。別の実施形態では、リンカーはアミノ酸配列である。リンカーは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００のアミノ酸を含むことができる。リンカーは、１～５のアミノ酸、１～１０のアミノ酸、１～２０のアミノ酸、１０～５０のアミノ酸、５０～１００のアミノ酸、１００～２００のアミノ酸、２００～３００のアミノ酸、３００～４００のアミノ酸、４００～５００のアミノ酸、５００～６００のアミノ酸、６００～７００のアミノ酸、７００～８００のアミノ酸、８００～９００のアミノ酸、または９００～１０００のアミノ酸を含むことができる。
リンカーの例は当該技術で周知である。一実施形態では、リンカーは配列Ｇｎを含む。リンカーは配列（ＧＡ）ｎを含むことができる。リンカーは配列（ＧＧＳ）ｎを含むことができる。その他の実施形態では、リンカーは配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０１）を含む。さらに他の実施形態では、リンカーは配列（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９５）を含む。これらの例では、ｎは１～１００の整数であってもよい。他の例では、ｎは１～２０、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０からの整数であってもよい。リンカーの例には、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号９６）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号９７）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９８）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号９９）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１００）が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーはＶＷＦタンパク質活性または第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を排除しないまたは低下させない。任意で、リンカーは、たとえば、立体障害の効果を低下させ、ＶＷＦタンパク質または第ＶＩＩＩ因子タンパク質をその標的結合部位にさらにアクセス可能にすることによって、ＶＷＦタンパク質活性または第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を向上させる。
一実施形態では、キメラタンパク質に有用なリンカーは１５～２５アミノ酸の長さである。別の実施形態では、キメラタンパク質に有用なリンカーは１５～２０アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、キメラタンパク質についてのリンカーは１０～２５アミノ酸の長さである。他の実施形態では、キメラタンパク質についてのリンカーは１５アミノ酸の長さである。さらに他の実施形態では、キメラタンパク質についてのリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９４）であり、その際、Ｇはグリシンを表し、Ｓはセリンを表し、ｎは１～２０からの整数である。
ＩＩ.Ｆ．切断部位
切断可能なリンカーは、別の分子から分子を１つ解放するために、化学的に（たとえば、エステル結合の加水分解）、酵素的に（たとえば、プロテアーゼ切断配列の組み入れ）、または光分解で（たとえば、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）のような発色団）切断されることが可能である部分を取り込むことができる。
一実施形態では、切断可能なリンカーはＮ末端またはＣ末端またはその双方で１以上の切断部位を含む。別の実施形態では、切断可能なリンカーは１以上の切断可能な部位から本質的に成るまたはそれらから成る。他の実施形態では、切断可能なリンカーは、本明細書で記載される異種のアミノ酸リンカー配列、またはポリマー及び１以上の切断可能な部位を含む。
特定の実施形態では、切断可能なリンカーは宿主細胞にて切断され得る１以上の切断部位（すなわち、細胞内プロセッシング部位）を含む。切断部位の非限定例には、ＲＲＲＲ（配列番号１０２）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０３）及びＲＲＲＲＳ（配列番号１０４）が挙げられる。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、ＦＶＩＩＩに由来するａ１領域と、ＦＶＩＩＩに由来するａ２領域と、ＦＶＩＩＩに由来するａ３領域と、Ｘ－Ｖ－Ｐ－Ｒ（配列番号１０５）を含むトロンビン切断可能部位と、ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフとを含み、その際、Ｘは脂肪族アミノ酸またはそれらの任意の組み合わせである。完全長のＦＶＩＩＩに対応するＧｌｕ７２０～Ａｒｇ７４０に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むａ２領域を含み、その際、ａ２領域はトロンビンによって切断されることが可能である。特定の実施形態では、本発明の切断可能なリンカーは、ＩＳＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１０６）を含むａ２領域を含む。他の実施形態では、本発明で有用な切断可能なリンカーは、完全長のＦＶＩＩＩに対応するＭｅｔ３３７～Ａｒｇ３７２に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むａ１領域を含み、その際、ａ１領域はトロンビンによって切断されることが可能である。特定の実施形態では、ａ１領域はＩＳＭＫＮＮＥＥＡＥＤＹＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶ（配列番号１０７）を含む。一部の実施形態では、本発明の切断可能なリンカーは、完全長のＦＶＩＩＩに対応するＧｌｕ１６４９～Ａｒｇ１６８９に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むａ３領域を含み、その際、ａ３領域はトロンビンによって切断されることが可能である。具体的な実施形態では、本発明の切断可能なリンカーはａ３領域を含み、ａ３領域はＩＳＥＩＴＲＴＴＬＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲＳＦＱ（配列番号１０８）を含む。
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、Ｘ－Ｖ－Ｐ－Ｒ（配列番号１０５）を含むトロンビン切断可能部位と、ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフとを含み、その際、ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフはＳ－Ｆ－Ｌ－Ｌ－Ｒ－Ｎ（配列番号１０９）を含む。ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフはさらにＰ、Ｐ－Ｎ、Ｐ－Ｎ－Ｄ、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ（配列番号１１０）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ（配列番号１１１）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｅ（配列番号１１２）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｅ－Ｐ（配列番号１１３）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｅ－Ｐ－Ｆ（配列番号１１４）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｅ－Ｐ－Ｆ－Ｗ（配列番号１１５）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｅ－Ｐ－Ｆ－Ｗ－Ｅ（配列番号１１６）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｅ－Ｐ－Ｆ－Ｗ－Ｅ－Ｄ（配列番号１１７）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｅ－Ｐ－Ｆ－Ｗ－Ｅ－Ｄ－Ｅ（配列番号１１８）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｅ－Ｐ－Ｆ－Ｗ－Ｅ－Ｄ－Ｅ－Ｅ（配列番号１１９）、Ｐ－Ｎ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｅ－Ｐ－Ｆ－Ｗ－Ｅ－Ｄ－Ｅ－Ｅ－Ｓ（配列番号１２０）またはそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸配列を含むことができる。一部の実施形態では、脂肪族アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンから選択される。
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、切断可能なリンカーを含むキメラタンパク
質が対象に投与された後、プロテアーゼによって切断される１以上の切断部位を含む。一実施形態では、切断部位は、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ－２、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７、及びＭＭＰ－２０から成る群から選択されるプロテアーゼによって切断される。別の実施形態では、切断部位は、ＦＸＩａ切断部位（たとえば、ＫＬＴＲ↓ＡＥＴ（配列番号１２１））、ＦＸＩａ切断部位（たとえば、ＤＦＴＲ↓ＶＶＧ（配列番号１２２））、ＦＸＩＩａ切断部位（たとえば、ＴＭＴＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号１２３））、カリクレイン切断部位（たとえば、ＳＰＦＲ↓ＳＴＧＧ（配列番号１２４））、ＦＶＩＩａ切断部位（たとえば、ＬＱＶＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号１２５））、ＦＩＸａ切断部位（たとえば、ＰＬＧＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号１２６））、ＦＸａ切断部位（たとえば、ＩＥＧＲ↓ＴＶＧＧ（配列番号：１２７））、ＦＩＩａ（トロンビン）切断部位（たとえば、ＬＴＰＲ↓ＳＬＬＶ（配列番号１２８））、エラスターゼ－２切断部位（たとえば、ＬＧＰＶ↓ＳＧＶＰ（配列番号１２９））、グランザイム－Ｂ切断（たとえば、ＶＡＧＤ↓ＳＬＥＥ（配列番号１３０））、ＭＭＰ－１２切断部位（たとえば、ＧＰＡＧ↓ＬＧＧＡ（配列番号１３１））、ＭＭＰ－１３切断部位（たとえば、ＧＰＡＧ↓ＬＲＧＡ（配列番号１３２））、ＭＭＰ－１７切断部位（たとえば、ＡＰＬＧ↓ＬＲＬＲ（配列番号１３３））、ＭＭＰ－２０切断部位（たとえば、ＰＡＬＰ↓ＬＶＡＱ（配列番号１３４））、ＴＥＶ切断部位（たとえば、ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ（配列番号１３５））、エンテロキナーゼ切断部位（たとえば、ＤＤＤＫ↓ＩＶＧＧ（配列番号１３６））、プロテアーゼ３Ｃ（ＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ（商標））切断部位（たとえば、ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ（配列番号１３７））、及びソルターゼＡ切断部位（たとえば、ＬＰＫＴ↓ＧＳＥＳ）（配列番号１３８）から成る群から選択される。特定の実施形態では、ＦＸＩａ切断部位には、たとえば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１）及びＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号３）が挙げられるが、これらに限定されない。トロンビンの切断部位の非限定例には、たとえば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５）、ＬＶＰＲＧ（配列番号６）、ＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号８８）またはＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）が挙げられ、及びＡＬＲＰＲ（配列番号７）（たとえば、ＡＬＲＰＲＶＶＧＧＡ（配列番号１４５））を含む、それから本質的に成る、またはそれから成る配列が挙げられる。
特定の実施形態では、切断部位は、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号１４６）である。別の実施形態では、切断部位は、ＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号８８）またはその断片を含む。特定の一実施形態では、切断部位はＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）を含む。別の実施形態では、切断部位はＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９５）を含み、その際、切断部位はＦＶＩＩＩの完全長ａ２領域ではない。さらに別の実施形態では、切断部位はＩＥＰＲ（配列番号２００）を含む。別の実施形態では、切断部位はＩＥＰＲ（配列番号２００）を含み、その際、切断部位はＦＶＩＩＩの完全長ａ２領域ではなく、またはＦＶＩＩＩの完全長ａ２領域を含まない。他の実施形態では、切断部位は、ＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号８８）、ＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１３９）、ＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４０）、ＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４１）、ＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４２）、ＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４３）、ＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４４）、ＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１７６）、ＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１７７）、ＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１７８）、ＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１７９）、ＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８０）、ＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲ
ＳＦＳ（配列番号１８１）、ＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８２）、ＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８３）、ＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８４）、ＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８５）、ＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８６）、ＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８７）、ＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８８）、ＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８９）、ＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９０）、ＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９１）、ＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９２）、ＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９３）、またはＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）を含む。他の実施形態では、切断部位は、ＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号８８）、ＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１３９）、ＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４０）、ＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４１）、ＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４２）、ＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４３）、ＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１４４）、ＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１７６）、ＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１７７）、ＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１７８）、ＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１７９）、ＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８０）、ＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８１）、ＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８２）、ＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８３）、ＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８４）、ＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８５）、ＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８６）、ＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８７）、ＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８８）、ＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１８９）、ＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９０）、ＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９１）、ＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９２）、ＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９３）、またはＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号１９４）を含み、その際、切断部位は完全長のＦＶＩＩＩａ２領域ではない。特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、本明細書で提供されるような、または当該技術で知られるようなトロンビン切断アッセイにおいて切断可能である。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明で提供されるのはまた、本発明のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は単一のポリヌクレオチド鎖によってコードすることができる。別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は２つの異なるポリヌクレオチド、すなわち、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列によってコードされる。別の実施形態では、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列は２つの異なるポリヌクレオチド（たとえば、異なるベクター）上にある。
本発明は、単一のポリペプチド鎖（たとえば、ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ１－Ｌ１－Ｖ）をコードするポリヌクレオチドを含み、その際、ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）は、ＸＴＥＮ配列が１以上の挿入部位に挿入され、Ｆ１が第１のＩｇ定常領域またはその一部、たとえば、第１のＦｃ領域を含み、Ｌ１が第１のリンカーを含み、ＶがＶＷＦタンパク質を含み、Ｘ１が長さ２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列を含み、Ｌ２が第２のリンカーを含み、Ｌ３が第３のリンカーを含み、Ｆ２が第２のＩｇ定常領域またはその一部、たとえば、第２のＦｃ領域を含むＦＶＩＩＩタンパク質を含む。本発明はまた、２つのポリヌクレオチド、第１のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と、
ＶＷＦタンパク質と長さ２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列と第２のＩｇ定常領域またはその一部を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む。一部の実施形態では、２つのポリペプチド鎖または３つのポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質は、単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされることができ、次いで２または３（以上）のポリペプチド鎖に処理され得る。さらに他の実施形態では、これらのポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質は２つまたは３つのポリヌクレオチド鎖によってコードされることができる。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドのセットはさらに、タンパク質転換酵素をコードする追加のヌクレオチド鎖（たとえば、キメラポリペプチドが単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされる第２のヌクレオチド鎖、またはキメラタンパク質が２つのポリヌクレオチド鎖によってコードされる第３のヌクレオチド鎖）を含む。タンパク質転換酵素は、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン５型（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン７型（ＰＣＳＫ７またはＰＣ５）、酵母Ｋｅｘ２、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン３型（ＰＡＣＥまたはＰＣＳＫ３）、及び２以上のそれらの組み合わせから成る群から選択することができる。一部の実施形態では、タンパク質転換酵素はＰＡＣＥ、ＰＣ５またはＰＣ７である。具体的な実施形態では、タンパク質転換酵素はＰＣ５またはＰＣ７である。ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６８を参照のこと。
本明細書で使用されるとき、発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入される際、挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製及び翻訳に必要なエレメントを含有する核酸構築物を指す。発現ベクターには、プラスミド、ファージミド、ウイルス及びそれらの誘導体が挙げられる。
本発明の発現ベクターは、本明細書で記載されるキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むであろう。一実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と第１のＩｇ定常領域とを含む第１のポリペプチド、ＶＷＦタンパク質と２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列と第２のＩｇ定常領域またはその一部とを含む第２のポリペプチド、またはその双方のための１以上のコーディング配列は発現制御配列に操作可能に連結される。本明細書で使用されるとき、２つの核酸配列は各成分の核酸配列がその官能性を保持するのを可能にするような方法で共有結合される場合、それらは操作可能に連結される。コーディング配列と遺伝子発現制御配列は、遺伝子発現制御配列の影響下または制御下にコーディング配列の発現または転写及び／または翻訳を置くような方法で共有結合される場合、それらは操作可能に連結されると言われる。５’遺伝子発現配列でのプロモータの導入がコーディング配列の転写を生じるのであれば、且つ、２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト変異の導入を生じない、（２）コーディング配列の転写を指図するプロモータ領域の能力を妨害しない、または（３）タンパク質に翻訳する相当するＲＮＡ転写物の能力を妨害しないのであれば、２つのＤＮＡ配列は操作可能に連結されると言われる。従って、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように遺伝子発現配列がコーディング核酸配列の転写に影響を与えることが可能であったならば、遺伝子発現配列はそのコーディング核酸配列に操作可能に連結される。
遺伝子発現制御配列は本明細書で使用されるとき、それが操作可能に連結されるコーディング核酸の効率的な転写及び翻訳を促進する、たとえば、プロモータ配列またはプロモータ／エンハンサの組み合わせのような調節性のヌクレオチド配列である。遺伝子発現制御配列は、たとえば、哺乳類またはウイルスのプロモータ、たとえば、構成的なまたは誘導性のプロモータであってもよい。構成的な哺乳類のプロモータには、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼのためのプロモータ、βアクチンのプロモータ、及び他の構成的な
プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞にて構成的に機能する例となるウイルスのプロモータには、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルのウイルス（たとえば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、及び他のレトロウイルスに由来するプロモータ、及び単純性ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのプロモータが挙げられる。他の構成的なプロモータは当業者に既知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモータには誘導性のプロモータも挙げられる。誘導性のプロモータは誘導剤の存在下で発現される。たとえば、メタロチオネインのプロモータを誘導して特定の金属イオンの存在下で転写及び翻訳を促進する。他の誘導性のプロモータは当業者に既知である。
一般に、遺伝子発現制御配列は、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する５’非転写配列及び５’非翻訳配列、たとえば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等を必要に応じて含むべきである。特に、そのような５’非転写配列は、操作可能に連結されたコーディング核酸の転写制御のためのプロモータ配列を含むプロモータ領域を含むであろう。遺伝子発現配列は任意で所望のようにエンハンサ配列または上流アクチベータ配列を含む。
ウイルスベクターには、以下のウイルス：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ関連ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプステイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスに由来する核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術で周知の他のベクターを容易に採用することができる。特定のウイルスベクターは、非必須の遺伝子が当該遺伝子で置き換えられている非細胞変性の真核ウイルスに基づく。非細胞変性のウイルスにはレトロウイルスが挙げられ、その生活環には、ゲノムのウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写とそれに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みが関与する。レトロウイルスはヒトの遺伝子療法試験のために認可されている。最も有用なのは、複製欠損している（すなわち、所望のタンパク質の合成を指図できるが、感染性粒子を製造することができない）それらのレトロウイルスである。そのような遺伝的に変化させたレトロウイルスの発現ベクターは生体内での遺伝子の効率の高い導入について一般的な有用性を有する。複製欠損のレトロウイルスを作製する標準的なプロトコール（外来性の遺伝材料のプラスミドへの組み入れ、パッケージ細胞株のプラスミドによる形質移入、パッケージ細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、及びウイルス粒子による標的細胞の感染を含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）にて提供されている。
一実施形態では、ウイルスは二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノ関連ウイルスである。アデノ関連ウイルスは複製欠損であるように操作することができ、広い範囲の細胞型及び種を感染させることができる。それはさらに、たとえば、熱安定性及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系列の細胞での高い形質導入頻度；重複感染阻害の欠如のような利点を有するので、複数シリーズの形質導入が可能である。報告によれば、アデノ関連ウイルスは部位特異的な方法でヒトの細胞ＤＮＡに組み込むことができ、それによって挿入変異の可能性及びレトロウイルス感染の挿入遺伝子発現の特徴の変動性を出来るだけ小さくする。加えて、野生型のアデノ関連ウイルスの感染が選択圧の非存在下で組織培養にて１００継代を超えて続けられているということは、アデノ関連ウイルスのゲノムの組み込み
が相対的に安定な事象であることを示している。アデノ関連ウイルスは染色体外の方法でも機能することができる。
他のベクターにはプラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当該技術で広範に記載されており、当業者に周知である。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。ここ数年、プラスミドベクターは、それらが宿主ゲノム内で複製できず、宿主ゲノムに組み込まれないので生体内で細胞に遺伝子を送達するのに特に有利であることが見いだされている。しかしながら、宿主細胞に適合するプロモータを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で操作可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。業者から市販されている一部の一般的に使用されるプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、種々のｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、種々のｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。具体的なプラスミドの追加の例には、すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）に由来するｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ７９０２０；ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、カタログ番号Ｖ８７０２０；ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ、カタログ番号Ｖ８６３２０；及びｐＢｕｄＣＥ４．１、カタログ番号Ｖ５３２２０が挙げられる。他のプラスミドは当業者に周知である。さらに、標準の分子生物学の技法を用いてプラスミドを特注で設計してＤＮＡの特定の断片を取り除いてもよく及び／または加えてもよい。
本発明のタンパク質を産生するのに使用されてもよい昆虫の発現系の１つでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて外来性の遺伝子を発現させる。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞で増殖する。コーディング配列をウイルスの非必須領域（たとえば、多面体遺伝子）にクローニングし、ＡＣＮＰＶプロモータ（たとえば、多面体プロモータ）の制御下に置く。コーディング配列の上手くいった挿入は、多面体遺伝子の不活化と非閉塞性の組換えウイルス（すなわち、多面体遺伝子によるそのためにコードされたタンパク質様のコートを欠くウイルス）の産生を生じるであろう。次いでこれらの組換えウイルスを用い、挿入された遺伝子が発現されるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞を感染させる（たとえば、Ｓｍｉｔｈら．（１９８３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４；ＵＳ４，２１５，０５１を参照のこと。）。この発現系のさらなる例は、Ａｕｓｕｂｅｌら．，編．（１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにて見いだされ得る。
本発明のタンパク質を発現させるのに使用することができる他の系は「ＧＳ発現系」とも呼ばれるグルタミン合成酵素遺伝子発現系である（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＰＬＣ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ ＵＫ）。この発現系はＵＳ５，９８１，２１６にて詳細に記載されている。
哺乳類の宿主細胞では、多数のウイルスに基づく発現系が利用されてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、コーディング配列はアデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、たとえば、後期プロモータ及び三部リーダー配列にライゲーションされてもよい。次いで試験管内または生体内の組換えによってこのキメラ遺伝子をアデノウイルスのゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染させた宿主にて生存でき、ペプチドを発現させることができる組換えウイルスを生じるであろう。たとえば、Ｌｏｇａｎ及びＳｈｅｎｋ（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ.８１：３６５５）を参照のこと
。或いは、ワクシニア７．５Ｋプロモータが使用されてもよい。たとえば、Ｍａｃｋｅｔ
ｔら．（１９８２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７９：７４１５；Ｍａｃｋｅｔｔら．（１９８４），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７；Ｐａｎｉｃａｌｉら．（１９８２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７９：４９２７を参照のこと。
製造の効率を高めるために、酵素切断部位によって分離される本発明のタンパク質の複数の単位をコードするようにポリヌクレオチドを設計することができる。ポリペプチドの単位を回収するために得られたポリペプチドを（たとえば、適当な酵素による処理によって）切断することができる。これは単一のプロモータによって動かされるポリペプチドの収率を高めることができる。適当なウイルス発現系で使用されると、ｍＲＮＡによってコードされた各ポリペプチドの翻訳は、たとえば、リボソーム内部侵入部位ＩＲＥＳによって転写物にて内部に向けられる。従って、ポリシストロン性の構築物は、単一の大きなポリシストロン性のｍＲＮＡの転写を指図し、その後、それは複数の個々のポリペプチドの翻訳を指図する。このアプローチはポリタンパク質の産生及び酵素的プロセッシングを排除し、単一のプロモータによって動かされるポリペプチドの収率を有意に高め得る。
形質転換で使用されるベクターは普通、形質転換体を特定するのに使用される選択可能なマーカーを含有するであろう。細菌の系では、これには、たとえば、アンピシリンまたはカナマイシンのような抗生剤の耐性遺伝子を挙げることができる。培養された哺乳類細胞で使用するための選択可能なマーカーには、たとえば、ネオマイシン、ハイグロマイシン及びメソトレキセートのような薬剤に耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択可能なマーカーは、増幅可能な選択可能なマーカーであってもよい。増幅可能な選択可能なマーカーの１つはジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子である。Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｃ.
Ｃ.ら．（１９８３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８０：２４９
５－９．選択可能なマーカーはＴｈｉｌｌｙ，（１９８６），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓ．にて概説されており、選択可能なマーカーの選択は当業者のレベルの十分に範囲内である。
選択可能なマーカーは、当該遺伝子のように同時に別々のプラスミドで細胞に導入されてもよく、またはそれらは同じプラスミドで導入されてもよい。同じプラスミドならば、選択可能なマーカー及び当該遺伝子は異なるプロモータまたは同一プロモータの制御下にあってもよく、後者の配置は２シストロン性のメッセージを生じる。この種の構築物は当該技術で既知である（たとえば、ＵＳ４，７１３，３３９）。
発現ベクターは、組換えで作出されたタンパク質の容易な精製を可能にするタグをコードすることができる。例には、タグを付けた融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコーディング領域とインフレームで、発現されるタンパク質のコーディング配列がベクターにライゲーションされるベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら．（１９８３），ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１）が挙げられるが、これらに限定されず；ｐＧＥＸベクターを用いてグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを伴った本発明のタンパク質を発現させてもよい。これらのタンパク質は普通可溶性であり、グルタチオン／アガロースビーズに吸着させ、その後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出することによって細胞から容易に精製することができる。ベクターは、精製後のタグの容易な取り外しのために切断部位（トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼまたはＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ ＰＲＯＴＥＡＳＥ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎ．Ｊ．））を含む。
次いで発現ベクター（単数）またはベクター（複数）が好適な標的細胞にて形質移入されるまたは同時形質移入され、それはポリペプチドを発現するであろう。当該技術で既知の形質移入法には、リン酸カルシウム沈澱（Ｗｉｇｌｅｒら．（１９７８），Ｃｅｌｌ，
１４：７２５）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら．（１９８２），ＥＭＢＯ
Ｊ．１：８４１）、及びリポソーム系試薬が挙げられるが、これらに限定されない。原核細胞及び真核細胞の双方を含む種々の宿主発現ベクター系を利用して本明細書で記載されるタンパク質を発現させてもよい。これらには、適当なコーディング配列を含有する組換えのバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換された細菌（たとえば、大腸菌）；適当なコーディング配列を含有する組換えの酵母または真菌の発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌のような微生物；適当なコーディング配列を含有する組換えのウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；適当なコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス）で感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳類細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ、ＨＫＢ１１、及びＢＨＫ細胞）を含む動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。本明細書で使用されるとき、真核細胞は明確な核を有する任意の動物細胞または植物細胞を指す。動物の真核細胞には、脊椎動物、たとえば、哺乳類の細胞、及び無脊椎動物、たとえば、昆虫の細胞が挙げられる。植物の真核細胞には限定しないで酵母細胞を挙げることができる。真核細胞は、原核細胞、たとえば、細菌とははっきりと異なる。
特定の実施形態では、真核細胞は哺乳類細胞である。哺乳類細胞は哺乳類に由来する任意の細胞である。哺乳類細胞には、哺乳類細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、哺乳類細胞はヒト細胞である。別の実施形態では、哺乳類細胞はＨＥＫ２９３細胞であり、それはヒト胚性腎臓細胞株である。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＲＬ－１５３３としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手可能であり、２９３－Ｈ細胞、カタログ番号１１６３１－０１７または２９３－Ｆ細胞、カタログ番号１１６２５－０１９としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。一部の実施形態では、哺乳類細胞は網膜に由来するヒト細胞株であるＰＥＲ.Ｃ６（登録商標）細胞である。Ｐ
ＥＲ.Ｃ６（登録商標）細胞はＣｒｕｃｅｌｌ（Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）から入手可能
である。他の実施形態では、哺乳類細胞はチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手可能である（たとえば、ＣＨＯ－Ｋ１；ＣＣＬ－６１）。さらに他の実施形態では、哺乳類細胞は幼若ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。ＢＨＫ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手可能である（たとえば、ＣＲＬ－１６３２）。一部の実施形態では、哺乳類細胞はＨＫＢ１１細胞であり、それはＨＥＫ２９３細胞とヒトＢ細胞株のハイブリッド細胞株である。Ｍｅｉら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（２）：１６５－７８（２００６）。
一実施形態では、ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆｃ融合コーディング配列、ＶＷＦタンパク質－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆｃコーディング配列、またはその双方と、選択可能なマーカー、たとえば、ゼオシン耐性とを含むプラスミドがキメラタンパク質の作出のためにＨＥＫ２９３細胞に形質移入される。
別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ－Ｆｃ融合コーディング配列、ＶＷＦタンパク質－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆｃコーディング配列、またはその双方と、選択可能なマーカー、たとえば、ゼオシン耐性とを含むプラスミドがキメラタンパク質の作出のためにＨＥＫ２９３細胞に形質移入される。
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆｃ融合コーディング配列と第１の選択可能なマーカー、たとえば、ゼオシン耐性遺伝子を含む第１のプラスミドと、ＶＷＦタンパク質－Ｌ１－Ｘ１－Ｌ２－Ｆｃコーディング配列と第２の選択可能なマーカー、たとえば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む第２のプラスミドと、タンパク質変換酵素のコーディング配列と第３の選択可能なマーカー、たとえば、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む第３のプラスミドとが、たとえば、キメラタンパク質を作出するために、ＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入される。第１と第２のプラスミドは、同じ量（すなわち、１：１のモル比）で導入することができ、または、それらは等しくない量で導入することができる。
さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ－Ｆｃ融合コーディング配列と第１の選択可能なマーカー、たとえば、ゼオシン耐性遺伝子とを含む第１のプラスミドと、ＶＷＦタンパク質／Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆｃコーディング配列と第２の選択可能なマーカー、たとえば、ネオマイシン耐性遺伝子とを含む第２のプラスミドと、タンパク質変換酵素コーディング配列と第３の選択可能なマーカー、たとえば、ハイグロマイシン耐性遺伝子とを含む第３のプラスミドとをキメラタンパク質の産生のためにＨＥＫ２９３細胞にて同時形質移入する。第１と第２のプラスミドは等量（すなわち、１：１のモル比）で導入することができ、またはそれらは等しくない量で導入することができる。
さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ（Ｘ２）－Ｆｃ融合コーディング配列と第１の選択可能なマーカー、たとえば、ゼオシン耐性遺伝子とを含む第１のプラスミドと、ＶＷＦタンパク質／Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｆｃコーディング配列と第２の選択可能なマーカー、たとえば、ネオマイシン耐性遺伝子とを含む第２のプラスミドと、タンパク質変換酵素コーディング配列と第３の選択可能なマーカー、たとえば、ハイグロマイシン耐性遺伝子とを含む第３のプラスミドとをキメラタンパク質の産生のためにＨＥＫ２９３細胞にて同時形質移入する。第１と第２のプラスミドは等量（すなわち、１：１のモル比）で導入することができ、またはそれらは等しくない量で導入することができる。
特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ（ＸＴＥＮを伴ったまたは伴わない）－Ｆ１－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖコーディング配列と第１の選択可能なマーカー、たとえば、ゼオシン耐性遺伝子とを含む第１のプラスミドと、タンパク質変換酵素コーディング配列と第２の選択可能なマーカー、たとえば、ハイグロマイシン耐性遺伝子とを含む第２のプラスミドとをキメラタンパク質の産生のためにＨＥＫ２９３細胞にて同時形質移入する。ＦＶＩＩＩ（Ｘ）－Ｆ１コーディング配列とＶ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ２コーディング配列とのためのプロモータは異なることができ、またはそれらは同一であることができる。
さらに他の実施形態では、形質移入される細胞は安定的に形質移入される。当業者に既知の従来の技法を用いてこれらの細胞を安定な細胞株として選択し、維持することができる。
本発明のＤＮＡ構築物のタンパク質を含有する宿主細胞は適当な増殖培地で増殖する。本明細書で使用されるとき、用語「適当な増殖培地」は細胞の増殖に必要とされる栄養を含有する培地を意味する。細胞の増殖に必要とされる栄養には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル及び増殖因子が挙げられる。任意で、培地は１以上の選択因子を含有することができる。任意で、培地は仔ウシ血清またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有することができる。一実施形態では、培地は実質的にＩｇＧを含有しない。増殖培地は一般に、たとえば、薬剤選抜によって、またはＤＮＡ構築物における選択可能なマーカーによって補完される若しくはＤＮＡ構築物とともに同時形質移入される必須栄養素の欠乏によって、ＤＮＡ構築物を含有する細胞を選抜するであろう。培養される哺乳類細胞は一般に市販の血清含有培地または無血清培地（たとえば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）にて増殖する。一実施形態では、培地はＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃ
ａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）である。別の実施形態では、培地はＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）である。使用される特定の細胞株に適した培地の選択は当業者のレベルの範囲内である。
キメラタンパク質の２つのポリペプチド鎖を同時発現させるために、双方の鎖の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する。本明細書で使用されるとき、培養することは少なくとも定限時、試験管内で生きている細胞を維持することを指す。維持することは生きている細胞の集団の増加を含むことができるが、それを含むことが必要ではない。たとえば、培養で維持される細胞は、集団で静止することができるが、依然として生きており、所望の生成物、たとえば、組換えタンパク質または組換え融合タンパク質を産生することが可能である。真核細胞を培養するのに好適な条件は当該技術で周知であり、それには、培養培地、培養補完物、温度、ｐＨ、酸素飽和等の適当な選択が含まれる。商業目的では、培養することには、振盪器フラスコ、ローラーボトル、中空繊維型バイオリアクター、撹拌タンク型バイオリアクター、エアリフト型バイオリアクター、波型バイオリアクター等を含む種々の型の規模拡大システムの使用が含まれ得る。
細胞培養条件を選択してＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩタンパク質との会合を可能にする。ＶＷＦ断片及び／またはＦＶＩＩＩタンパク質の発現を可能にする条件にはビタミンＫの供給源の存在が含まれる。たとえば、一実施形態では、安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞は４ｍＭのグルタミンで補完されたＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にて培養される。
態様の１つでは、本発明は、（ａ）キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に形質移入することと、（ｂ）キメラタンパク質を発現させるのに好適な、キメラタンパク質が発現される条件下で培養培地にて宿主細胞を培養することとを含む、本発明のキメラタンパク質を発現させ、作製し、または産生させる方法を指向する。
さらなる実施形態では、第１のＩｇ定常領域またはその一部に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質及び／またはＸＴＥＮ配列によって第２のＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＶＷＦタンパク質を含有するタンパク質産物が培地に分泌される。培地を細胞から分離し、濃縮し、濾過し、次いで２または３のアフィニティカラム、たとえば、プロテインＡカラム及び１または２の陰イオン交換カラムを通す。
特定の態様では、本発明は本明細書で記載される方法によって産生されるキメラタンパク質に関する。
試験管内の製造は、規模拡大が大量の所望の変化した本発明のポリペプチドを生じるのを可能にする。組織培養の条件下での哺乳類細胞の培養の技法は当該技術で既知であり、それには、たとえば、エアリフト型リアクター若しくは連続撹拌型リアクターにおける均質浮遊培養、または中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ若しくはセラミックカートリッジにおける固定化された若しくは捕捉された細胞培養が挙げられる。必要に応じて及び／または所望ならば、普通のクロマトグラフィ法、たとえば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、ＤＥＡＥセルロース上のクロマトグラフィまたはアフィニティクロマトグラフィによってポリペプチドの溶液を精製することができる。
ＩＶ．医薬組成物
本発明のキメラタンパク質を含有する組成物は好適な薬学上許容可能なキャリアを含有してもよい。たとえば、それらは、活性化合物を作用部位への送達のために設計された製
剤に処理するのを円滑にする賦形剤及び／または補助剤を含有してもよい。
ボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内、皮下または筋肉内）のために医薬組成物を製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形、たとえば、保存剤を加えたアンプルまたは複数回投与容器で提示され得る。組成物は、懸濁液、溶液、または油性媒体若しくは水性媒体におけるエマルジョンのような形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤及び／または分散剤のような製剤化剤を含有することができる。或いは、有効成分は、好適な媒体、たとえば、発熱物質を含まない水と共に構成するための粉末形態であることができる。
非経口投与に好適な製剤には、水溶性形態、たとえば、水溶性の塩での活性化合物の水溶液も挙げられる。加えて、適当な油性の注射用懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与してもよい。好適な親油性の溶媒または媒体には、脂肪油、たとえば、ゴマ油、または合成の脂肪酸エステル、たとえば、オレイン酸エチル若しくはトリグリセリドが挙げられる。水性の注射用懸濁液は、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及びデキストランを含む、懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。任意で、懸濁液は安定剤も含有してもよい。リポソームを用いて、細胞または間質腔への送達のために本発明の分子を被包することができる。例となる薬学上許容可能なキャリアは生理的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等である。一部の実施形態では、組成物は、等張剤、たとえば、糖類、たとえば、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、または塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、組成物は、たとえば、湿潤剤、または軽微な量の湿潤剤若しくは乳化剤のような補助物質、有効成分の保存可能期間または有効性を向上させる保存剤または緩衝液のような薬学上許容可能な物質を含む。
本発明の組成物は、たとえば、液体（たとえば、注射用及び点滴用の溶液）、分散液、懸濁液、半固形及び固形の剤形を含む種々の形態であってもよい。好まれる形態は投与の方法及び治療適用に左右される。
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高い薬剤濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。無菌の注射用溶液は、必要に応じて、１または組み合わせでの上記で列挙された成分と共に必要な量の有効成分を適当な溶媒に組み込むこと、その後濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、上記で列挙された基礎分散媒と必要とされる他の成分を含有する無菌媒体に有効成分を組み込むことによって調製される。無菌の注射用溶液のための無菌の粉末の場合、好まれる調製方法は、前もって無菌濾過した溶液から有効成分に加えて追加の所望の成分の粉末を得る真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合、必要とされる粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の延長された吸収は、吸収を遅らせる作用剤、たとえば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
徐放性の製剤または用具によって有効成分を製剤化することができる。そのような製剤及び用具の例には、インプラント、経皮貼付剤、及びマイクロカプセル化送達方式が挙げられる。生分解性で生体適合性のポリマー、たとえば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤及び用具の調製方法は当該技術で既知である。たとえば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ
，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
注射用のデポー製剤は、たとえば、ポリラクチド－ポリグリコリドのような生分解性ポリマーにて薬剤のマイクロカプセル化マトリクスを形成することによって作製することができる。薬剤のポリマーに対する比及び採用されるポリマーの性質に応じて、薬剤放出の速度を制御することができる。他の例となる生分解性ポリマーはポリオルソエステル及びポリ無水物である。注射用デポー製剤は、リポソームまたはマイクロエマルジョンに薬剤を捕捉させることによっても調製することができる。
補足の活性化合物を組成物に組み込むことができる。一実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、別の凝固因子、またはその変異体、断片、類似体または誘導体と共に製剤化される。たとえば、凝固因子には、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、フォンウィルブランド因子または組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）または上記のいずれかの活性化された形態が挙げられるが、これらに限定されない。止血剤の凝固因子には、抗線溶剤、たとえば、ε－アミノカプロン酸、トラネキサム酸も挙げることができる。
最適な所望の応答を提供するように投与計画を調整してもよい。たとえば、単回でボーラス投与してもよく、幾つかの分割した用量を、時間をかけて投与してもよく、または治療状況の要件によって示されるように用量を比例的に増減してもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために単位剤形で非経口組成物を製剤化することは有利である。たとえば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ
Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９８０）を参照のこと。
活性化合物に加えて、液状の剤形は、たとえば、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３－
ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステルのような不活性成分を含有してもよい。
好適な医薬品のキャリアの非限定例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにも記載されている。賦形剤の一部の例には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物はまたｐＨ緩衝化試薬、及び湿潤剤または乳化剤も含有することができる。
経口投与については、医薬組成物は従来の手段によって調製される錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。組成物は、液体、たとえば、シロップまたは懸濁液として調製することもできる。液体は、懸濁剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂肪）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性媒体（たとえば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画化植物油）、及び保存剤（たとえば、メチルまたはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を含むことができる。製剤はまた風味剤、着色剤及び甘味剤も含むことができる。或いは、組成物は水または別の好適な媒体と共に構成するための乾燥製品として提示され得る。
頬内投与については、組成物は従来のプロトコールに従って錠剤またはトローチ剤の形
態を取ってもよい。
吸入による投与については、本発明に従って使用するための化合物は、賦形剤を伴った若しくは伴わない霧状にしたエアロゾルの形態で、または任意で高圧ガス、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の好適な気体を伴った加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は計測した量を送達するための弁を提供することによって決定することができる。吸入具または吸入器で使用するための、たとえば、化合物とラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤の粉末ミックスを含有するゼラチンのカプセル及びカートリッジを製剤化することができる。
医薬組成物は、たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐薬基剤を含有する坐薬または停留浣腸として直腸投与のために製剤化することもできる。
一実施形態では、医薬組成物は、キメラタンパク質、該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、または該ベクターを含む宿主細胞と薬学上許容可能なキャリアとを含む。キメラタンパク質におけるＦＶＩＩＩタンパク質は野生型ＦＶＩＩＩタンパク質に比べて、またはＶＷＦ断片を含まない相当するＦＶＩＩＩタンパク質に比べて延長した半減期を有する。一実施形態では、キメラタンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩよりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長される。別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の半減期は少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
一部の実施形態では、組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、クモ膜下投与、硬膜下投与、及び経口投与から成る群から選択される経路によって投与される。非経口投与は静脈内投与または皮下投与であることができる。
他の実施形態では、組成物を用いてそれを必要とする対象にて出血性の疾患または状態を治療する。出血性の疾患または状態は、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、腸腰筋鞘における出血及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。さらに他の実施形態では、対象は手術を受けるように計画される。さらに他の実施形態では、治療は予防的なもの、または要求に応じたものである。
Ｖ．遺伝子治療
本発明のそのキメラタンパク質は、哺乳類、たとえば、ヒト対象にて生体内で産生させることができ、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、及び腸腰筋鞘におけ
る出血から成る群から選択される出血性の疾患または障害の治療に対して遺伝子治療のアプローチを使用することは治療上有益である。一実施形態では、出血性の疾患または障害は血友病である。別の実施形態では、出血性の疾患または障害は血友病Ａである。これには、好適な発現制御配列に操作可能に連結された好適なキメラタンパク質をコードする核酸の投与が関与する。特定の実施形態では、これらの配列はウイルスベクターに組み込まれる。そのような遺伝子治療に好適なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプステインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純性ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。ウイルスベクターは複製欠損のウイルスベクターであることができる。他の実施形態では、アデノウイルスベクターはそのＥ１遺伝子及びＥ３遺伝子にて欠失を有する。アデノウイルスベクターを使用する場合、哺乳類は選択可能なマーカーをコードする核酸に曝露されなくてもよい。他の実施形態では、配列は当業者に既知の非ウイルスベクターに組み込まれる。
ＶＩ．キメラタンパク質の使用方法
本発明は、本明細書で記載されるキメラタンパク質を用いてＦＶＩＩＩタンパク質への内在性のＶＷＦの結合を妨げるまたは阻害する方法を指向する。本発明はまた、ＸＴＥＮ及びＩｇ定常領域またはその一部に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質を有するキメラタンパク質を使用する方法を指向する。
本発明の態様の１つは、内在性のＶＷＦからＦＶＩＩＩ上のＶＷＦ結合部位を遮断するまたは遮蔽することによって内在性のＶＷＦとのＦＶＩＩＩの相互作用を妨げることまたは阻害すること、と同時に、半減期延長剤でもあることができるＩｇ定常領域またはその一部との組み合わせでＸＴＥＮ配列を用いてキメラタンパク質の半減期を延長することを指向する。一実施形態では、本発明は野生型ＦＶＩＩＩよりも長い半減期を有するＦＶＩＩＩタンパク質を構築する方法を指向する。方法にて有用なキメラタンパク質は本明細書で記載される１以上のキメラタンパク質を含む。
本発明の別の態様は、野生型ＦＶＩＩＩよりも長い半減期を有するＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質を、それを必要とする対象に投与する方法を含み、その際、該方法は、本明細書で記載されるキメラタンパク質を該対象に投与することを含む。
一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ配列とＩｇ定常領域またはその一部を用いて、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦタンパク質とを含むキメラタンパク質の半減期を改善する方法を指向し、それはＦＶＩＩＩタンパク質との内在性のＶＷＦの相互作用を妨げるまたは阻害する。ＸＴＥＮ配列に連結され（たとえば、ＦＶＩＩＩ（Ｘ））、次いでＸＴＥＮとＩｇ定常領域またはその一部に融合されたＶＷＦタンパク質に結合されたまたは会合させたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦのクリアランス経路から遮断されるまたは保護されるので、ＶＷＦタンパク質に結合されないＦＶＩＩＩタンパク質に比べて低下したクリアランスを有する。従って、遮蔽されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列とＶＷＦタンパク質との結合されないまたは会合されないＦＶＩＩＩタンパク質に比べて半減期の最大延長を有する。特定の実施形態では、ＶＷＦタンパク質に会合したまたはＶＷＦタンパク質によって保護された且つＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質はＶＷＦクリアランス受容体によってクリアランスされない。他の実施形態では、ＶＷＦタンパク質に会合したまたはＶＷＦタンパク質によって保護された且つＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦタンパク質に会合しないまたはＶＷＦタンパク質によって保護されない且つＸＴＥＮ配列に連結されないＦＶＩＩＩタンパク質よりも系からゆっくりクリアランスされる。
態様の１つでは、ＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質またはＸＴＥＮに連
結されたＶＷＦタンパク質に結合したまたは会合したＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質は、ＶＷＦタンパク質がＶＷＦクリアランス受容体結合部位を含有しないので循環からの低下したクリアランスを有する。ＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦクリアランス経路を介してＶＷＦタンパク質に結合したまたは会合したＦＶＩＩＩの系からのクリアランスを妨げるまたは阻害する。本発明にとって有用なＶＷＦタンパク質はまた、内在性ＶＷＦによって提供される少なくとも１以上のＶＷＦ様のＦＶＩＩＩ保護特性も提供する。特定の実施形態では、ＶＷＦタンパク質またはＸＴＥＮ配列は１以上のＦＶＩＩＩクリアランス受容体結合部位も覆い隠すことができ、それによってそれ自体のクリアランス経路によるＦＶＩＩＩのクリアランスを妨げる。
一部の実施形態では、ＶＷＦタンパク質またはＸＴＥＮ配列による内在性ＶＷＦへのＦＶＩＩＩタンパク質の結合の妨害または阻害は試験管内または生体内であることができる。
提供されるのはまた、それを必要とする対象に本明細書で記載されるキメラタンパク質を投与することを含むキメラタンパク質の半減期を増す方法である。完全長のＶＷＦに結合したまたは会合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は血漿にて約１２～１４時間である。循環中にＶＷＦがほとんどないＶＷＤ３型では、ＦＶＩＩＩの半減期はたったの６時間でしかなく、低下した濃度のＦＶＩＩＩのためにそのような患者では軽度から中程度の血友病Ａの症状を招く。本発明のＶＷＦ断片またはＸＴＥＮ配列に連結したまたは会合したキメラタンパク質の半減期は、完全長のＶＷＦに結合したまたは会合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期よりも少なくとも約１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、または４．０倍長く増すことができる。
一実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と第１のＩｇ定常領域またはその一部とを含む第１のポリペプチドと、ＶＷＦタンパク質と２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮとＩｇ定常領域またはその一部とを含む第２のポリペプチドとを含むキメラタンパク質は、ＸＴＥＮ配列または野生型ＦＶＩＩＩを含まない同じ第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む相当するキメラタンパク質よりも少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍長い半減期を示す。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と第１のＩｇ定常領域またはその一部とを含む第１のポリペプチドと、ＶＷＦタンパク質と２８８未満のアミノ酸を有するＸＴＥＮとＩｇ定常領域またはその一部とを含む第２のポリペプチドとを含むキメラタンパク質は、ＸＴＥＮ配列または野生型ＦＶＩＩＩを含まない同じ第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む相当するキメラタンパク質よりも約２～約５倍、約３～約１０倍、約５～約１５倍、約１０～約２０倍、約１５～約２５倍、約２０～約３０倍、約２５～約３５倍、約３０～約４０倍、約３５～約４５倍長い半減期を示す。具体的な実施形態では、本発明のキメラタンパク質の半減期は、ＦＶＩＩＩとＶＷＦの二重ノックアウトマウスにおける野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも少なくとも約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０倍長く、増える。
特定の実施形態では、キメラタンパク質はマウスにて約４０時間の半減期を示す。
一部の実施形態では、キメラタンパク質の半減期は内在性ＶＷＦに会合したＦＶＩＩＩの半減期よりも長い。他の実施形態では、キメラタンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩまたは内在性ＶＷＦと会合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期の少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．５倍、または５．０倍である。
一部の実施形態では、本発明の結果、キメラタンパク質の半減期は、ＶＷＦタンパク質を含まないＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩに比べて延長される。本発明のキメラタンパク質の半減期は、ＶＷＦタンパク質を含まないキメラタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長い。一実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも約１．５倍～約２０倍、約１．５倍～約１５倍、または約１．５倍～約１０倍長い。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦタンパク質を含まないＦＶＩＩＩタンパク質に比べて、約２倍～約１０倍、約２倍～約９倍、約２倍～約８倍、約２倍～約７倍、約２倍～約６倍、約２倍～約５倍、約２倍～約４倍、約２倍～約３倍、約２．５倍～約１０倍、約２．５倍～約９倍、約２．５倍～約８倍、約２．５倍～約７倍、約２．５倍～約６倍、約２．５倍～約５倍、約２．５倍～約４倍、約２．５倍～約３倍、約３倍～約１０倍、約３倍～約９倍、約３倍～約８倍、約３倍～約７倍、約３倍～約６倍、約３倍～約５倍、約３倍～約４倍、約４倍～約６倍、約５倍～約７倍、または約６倍～約８倍延長される。他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。さらに他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質の半減期は、約１５時間～約２週間、約１６時間～約１週間、約１７時間～約１週間、約１８時間～約１週間、約１９時間～約１週間、約２０時間～約１週間、約２１時間～約１週間、約２２時間～約１週間、約２３時間～約１週間、約２４時間～約１週間、約３６時間～約１週間、約４８時間～約１週間、約６０時間～約１週間、約２４時間～約６日間、約２４時間～約５日間、約２４時間～約４日間、約２４時間～約３日間、または約２４時間～約２日間である。
一部の実施形態では、対象当たりの本発明のキメラタンパク質の平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日間）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日間）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日間）、約８４時間、約９６時間（４日間）、約１０８時間、約１２０時間（５日間）、約６日間、約７日間（１週間）、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、または約１４日間である。
加えて、本発明は、有効量のキメラタンパク質を投与することを含む、出血性の疾患または障害を治療するまたは予防する方法を提供する。一実施形態では、出血性の疾患または障害は、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、及び腸腰筋鞘における出血から成る群から選択される。具体的な実施形態では、出血性の疾患または障害は血友病Ａである。
本発明によって調製される内在性のＶＷＦとのＦＶＩＩＩタンパク質の相互作用を妨げ
るまたは阻害する、本明細書で記載されるＶＷＦタンパク質との組み合わせでＸＴＥＮ配列とＩｇ定常領域またはその一部とを含むキメラタンパク質は、止血障害を有する対象を治療する方法及び一般的な止血剤を必要とする対象を治療する方法を含むが、これらに限定されない、当業者によって認識されるような多数の用途を有する。一実施形態では、本発明は、治療上有効な量のキメラタンパク質を投与することを含む、止血障害を有する対象を治療する方法に関する。
キメラタンパク質におけるＦＶＩＩＩタンパク質部分は、負に荷電したリン脂質表面で第ＩＸ因子に対する補因子として作用し、それによってＸａｓｅ複合体を形成することにより止血障害を治療するまたは予防する。活性化された凝固因子のリン脂質表面への結合は、この過程を血管損傷の部位に局在化させる。リン脂質表面では、第ＶＩＩＩａ因子が第ＩＸａ因子による第Ｘ因子の活性化の最大速度をおよそ２００，０００倍高め、トロンビン生成の大きな第２のバーストをもたらす。
本発明のキメラタンパク質を用いて止血障害を治療することができる。本発明のキメラタンパク質の投与によって治療されてもよい止血障害には、血友病Ａ、と同様に第ＶＩＩＩ因子に関連する欠損または構造的な異常が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、止血障害は血友病Ａである。
本発明のキメラタンパク質を予防的に用いて止血障害の対象を治療することができる。本発明のキメラタンパク質を用いて止血障害の対象における急性出血の症状の出現を治療することができる。別の実施形態では、止血障害は欠陥のある凝固因子、たとえば、フォンウィルブランド因子の結末であってもよい。一実施形態では、止血障害は遺伝性の障害である。別の実施形態では、止血障害は後天的な障害である。後天的な障害は根底にある二次的な疾患または状態の結果生じ得る。無関係な状態は、たとえば、癌、自己免疫疾患または妊娠であり得るが、これらに限定されない。後天的な障害は加齢からまたは根底にある二次的な障害を治療する薬物（たとえば、癌の化学療法）から生じることができる。
本発明はまた、先天的な止血障害を有していないが、たとえば、抗ＦＶＩＩＩ抗体の発生または手術によって結果的に止血障害を得てしまう二次的な疾患または状態を有する対象を治療する方法にも関する。従って、本発明は、本方法によって調製される治療上有効な量のキメラタンパク質を投与することを含む、一般的な止血剤を必要とする対象を治療する方法に関する。
本発明はまた、有効量の、本明細書で記載されるキメラタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む、ＦＶＩＩＩの免疫原性を減らす、またはＦＶＩＩＩに対する低い免疫原性を誘導する方法にも関する。
一実施形態では、一般的な止血剤を必要とする対象は手術を受けているまたは手術を受ける予定である。本発明のキメラタンパク質は予防的投薬計画として手術の前に、最中に、またはその後に投与することができる。本発明のキメラタンパク質を手術の前に、最中に、またはその後に投与して急性期出血症状の出現を制御することができる。
本発明のキメラタンパク質を用いて、止血障害を有していない急性期出血症状の出現を有する対象を治療することができる。急性期出血症状の出現は、重篤な外傷、たとえば、手術、交通事故、創傷、裂傷銃撃、または制御されない出血を生じる他の外傷性の事象の結果生じ得る。出血症状の出現の非限定例には、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、腸腰筋鞘における出血及びそれらの組み合わせが挙げられる。
予防的適用では、本発明のキメラタンパク質を含有する１以上の組成物またはそのカクテルをまだ疾患状態ではない患者に投与して、患者の抵抗性を高める、または疾患若しくは障害に関連する症状を軽減する。そのような量は「予防上有効な量」であると定義される。治療応用では、疾患の進行が低下するまたは終了するまで、且つ患者が疾患の症状の部分的なまたは完全な改善を示すまで、相対的に短い間隔で、相対的に高い投与量（たとえば、投与当たり約１～４００ｍｇ／ｋｇのポリペプチド、５～２５ｍｇの投与量は放射性免疫抱合体にさらに一般的に使用され、さらに高い用量が細胞毒素／薬剤修飾のポリペプチドに使用される）が必要とされることが多い。その後、予防的投薬計画が患者に投与され得る。
一部の実施形態では、本発明のキメラタンパク質または組成物は、要求に応じた治療に使用され、それには、出血症状の出現、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷（頭部の外傷）、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、腸腰筋鞘における出血についての治療が含まれる。対象は、外科的予防法、手術前後の管理、または手術のための治療を必要としてもよい。そのような手術には、たとえば、小手術、大手術、抜歯、扁桃切除、鼠径ヘルニア切開術、滑膜切除、全膝置換、開頭術、骨接合術、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸郭内手術、または関節置換手術が挙げられる。
一実施形態では、本発明のキメラタンパク質は静脈内に、皮下に、筋肉内に、または粘膜表面を介して、たとえば、経口で、舌下に、頬内に、鼻内に、直腸に、膣内に、または肺の経路を介して投与される。本発明のＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質とを含むキメラタンパク質は、出血の部位へのキメラタンパク質の徐放を可能にするバイオポリマー固形支持体に埋め込むことができ、若しくは連結することができ、または帯具／包帯に埋め込むことができる。キメラタンパク質の用量は対象及び使用される投与の特定の経路に応じて変化するであろう。投与量は０．１～１００，０００μｇ／体重ｋｇの範囲であることができる。一実施形態では、投薬範囲は０．１～１，０００μｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投薬範囲は０．１～５００μｇ／ｋｇである。タンパク質は連続的にまたは特定時限の間隔で投与することができる。試験管内のアッセイを用いて最適な用量範囲及び／または投与のスケジュールを決定してもよい。凝固因子の活性を測定する試験管内のアッセイ、たとえば、ＳＴＡ－ＣＬＯＴ ＶＩＩａ－ｒＴＦ凝固アッセイまたはＲＯＴＥＭ凝固アッセイは当該技術で既知である。さらに、有効な用量は、動物モデル、たとえば、血友病イヌから得られた用量反応曲線から外挿されてもよい（Ｍｏｕｎｔら．２００２，Ｂｌｏｏｄ，９９（８）：２６７０）。
今や本発明を詳細に記載してきたが、説明目的のみのために本明細書に含められ、本発明の限定であることは意図されない以下の実施例を参照して、本発明がさらに明瞭に理解されるであろう。本明細書で参照された特許、出版物及び論文はすべて参照によって明白に且つ具体的に本明細書に組み入れられる。
実施例全体を通して、特に言及されない限り、以下の材料及び方法が使用された。
材料及び方法
一般に、本発明の実践は、特に指示されない限り、化学、生物物理学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、たとえば、抗体技術）、の従来の技法、及び電気泳動における標準の技法を採用する。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ，Ｐｒ.（１９９６）；Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ，Ｐ.（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら，ＣＳ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
実施例１：ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体
本発明は、ＩｇＧのＦｃドメインを介してフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）タンパク質のＤ’Ｄ３ドメインに結合されるキメラＦＶＩＩＩ分子を生成することを指向する。結合されたＤ’Ｄ３ドメインは内在性のＶＷＦ多量体とのＦＶＩＩＩの相互作用を妨げる。キメラタンパク質の薬物動態を改善するために、この分子は他の半減期の延長技術を組み入れるためのプラットフォームとして役立つ。ＸＴＥＮ配列はＦＶＩＩＩのＢドメインに、及びＤ’Ｄ３とＦｃ領域の間に組み込まれてＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロ二量体の半減期を延ばした。
Ｄ’Ｄ３とＦｃの間でのトロンビン切断部位はトロンビンによるＦＶＩＩＩ分子の活性化の際、Ｄ’Ｄ３ドメインの解放を可能にする。
実施例２：ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－Ｆｃヘテロ二量体のプラスミド構築ＶＷＦ０３１におけるＶＷＦ０５０－ＩＨＨ三重変異のクローニング
ＦｃにおけるＩＨＨ三重変異はＦｃＲｎとの相互作用を妨げるので、ＦｃＲｎ経路によるＦｃ含有分子の再利用はない。Ｆｃにおける３つの変異は、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３５Ａである。
ＶＷＦ０５０は、ＲｓＲＩＩとＮｏｔ１の制限部位間でＩＨＨ三重変異を含有するＦｃ断片によってＶＷＦ０３１プラスミドのＦｃ領域を交換することによって生成した。ＶＷＦ０５７のクローニング―１４４ ＡＥ ＸＴＥＮ＋３５ａａトロンビン切断可能リンカーを伴ったＶＷＦ－Ｆｃをクローニング
オリゴ
ＥＳＣ１５５－ＶＷＦ０３４における１４４ ＡＥ ＸＴＥＮのためのオリゴ－逆行
ＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣ
ＥＳＣ１５６－ＶＷＦ０３４における１４４ ＡＥ ＸＴＥＮ－ＧＳリンカーのためのオリゴ－逆行
ＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣ
ＥＳＣ１５７－ＶＷＦ０３１における１４４ ＡＥ ＸＴＥＮのためのオリゴ－順行
ＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＴＡＴＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＧＧＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＣ
ＰＣＲを２回行ってトロンビン切断部位を伴った１４４ＡＥ－ＸＴＥＮ＋３５ａａＧＳリンカーを得た。
１４４－ＡＥ ＸＴＥＮコーディングＤＮＡを鋳型とし、ＥＳＣ１５７／ＥＳＣ１５５
のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を行った。この反応から得られた長さ約５５０ｂｐのＰＣＲ産物を第２のＰＣＲ反応の鋳型として用い、ＥＳＣ１５７／１５６のプライマー対を用いて増幅した。この反応は長さ約７００ｂｐの産物を生じた。次いでこの７００ｂｐのＰＣＲ産物とＶＷＦ０３４プラスミドをＥｃｏＲＶ－ＨＦとＲｓＲＩＩで消化した。消化から得たプラスミド主鎖。
次いでＶＷＦ０３４を用いて７００ｂｐのＰＣＲ産物をライゲーションした。
ＶＷＦ０３４でのＶＷＦ０５８－ＩＨＨ三重変異のクローニング
ＦｃにおけるＩＨＨ三重変異はＦｃＲｎとの相互作用を妨げるので、ＦｃＲｎ経路によるＦｃ含有分子の再利用はない。Ｆｃにおける３つの変異はＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３５Ａである。
ＲｓＲＩＩとＮｏｔ１の制限部位間でのＩＨＨ三重変異を含有するＦｃ断片とＶＷＦ０３４のＦｃ領域を交換することによってＶＷＦ０５８が生成された。
ＩＨＨ三重変異を伴うＦＶＩＩＩ－２６３－ＦＶＩＩＩ２０５のクローニング
ＦｃにおけるＩＨＨ三重変異はＦｃＲｎとの相互作用を妨げるので、ＦｃＲｎ経路によるＦｃ含有分子の再利用はない。Ｆｃにおける３つの変異はＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３５Ａである。
ＲｓＲＩＩとＮｏｔ１の制限部位間でＩＨＨ三重変異を含有するＦｃ断片によりＦＶＩＩＩ２０５プラスミドのＦｃ領域を交換することによってＦＶＩＩＩ２６３を生成した。
Ｂドメインにおける１４４ＡＥＸＴＥＮを伴ったＦＶＩＩＩ－２８２－ＦＶＩＩＩ－Ｆｃのクローニング
ＥＳＣ１５８－Ｂドメインにおける１４４ＡＥ－ＸＴＥＮのためのオリゴ－順行
ＡＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＧＧＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＴＧＧＧＴＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣ
ＥＳＣ１５９－Ｂドメインにおける１４４ＡＥ－ＸＴＥＮのためのオリゴ－逆行
ＧＧＴＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＴＣＧＡＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＣＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＣＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＴＧＧＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＧＴＡＧＧ
１４４－ＡＥ ＸＴＥＮコーディングＤＮＡを鋳型とし、ＥＳＣ１５８／ＥＳＣ１５９
のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を行った。この反応から長さ約５５０ｂｐのＰＣＲ産物が得られ、次いでＦＶＩＩＩ１６９プラスミドをＡｓｃＩとＣｌａ１で消化した。次いで消化したＦＶＩＩＩ１６９に由来するプラスミド主鎖を用いて、ＦＶＩＩＩ２８２を得るために５５０ｂｐのＰＣＲ産物をライゲーションした。
ＩＨＨ三重変異を伴ったＦＶＩＩＩ－２８３－ＦＶＩＩＩ１６９のクローニング
ＦｃにおけるＩＨＨ三重変異はＦｃＲｎとの相互作用を妨げるので、ＦｃＲｎ経路によるＦｃ含有分子の再利用はない。Ｆｃにおける３つの変異はＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３５Ａである。
ＲｓＲＩＩとＮｏｔ１の制限部位間でＩＨＨ三重変異を含有するＦｃ断片とＦＶＩＩＩ１６９プラスミドのＦｃ領域を交換することによってＦＶＩＩＩ２８３を生成した。
実施例３：ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃの産生
図２．ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃ構築物の発現を示す模式図。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３細胞にて３つのプラスミドの同時形質移入を行った。第１のプラスミドはＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃの発現を引き出し、第２のプラスミドはＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃを発現し、第３のプラスミドはＰＡＣＥ／フーリンの発現を引き出し、それはＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃからプロペプチド、すなわち、Ｄ１Ｄ２ドメインを酵素的に取り外すのに必要とされる。この３つのプラスミド発現系の産物には、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体と、Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃホモ二量体と、微量のＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘミ接合様の種が含まれる。
実施例４：ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体の精製
ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体を精製するために、タンジェンシャルフロー（ＴＦＦ）工程を用いて先ず馴化培地を１０倍に濃縮した。次いでアフィニティクロマトグラフィ、その後脱塩カラムを用いて濾液における生成物をさらに精製した。分子の純度はＨＰＬＣ／ＳＥＣによって許容可能であったが、さらにウエスタンブロットによって確認した。ＦＶＩＩＩ活性アッセイ（実施例５）及びＯＤ２８０測定によって測定したとき、分子の比活性はＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩに匹敵した。
実施例５：ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体の比活性
ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体の活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイ及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイによって測定した。ＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４及びｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７の発色比活性及びａＰＴＴ比活性を表１６に載せる。ＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩに比べて、我々はｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４及びｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７について匹敵する発色比活性及びａＰＴＴ比活性における６０％の低下を観察した。
Figure 2022118129000049
 ＦＶＩＩＩ発色アッセイ
ＤｉａＰｈａｒｍａからのＣＯＡＴＥＳＴ ＳＰ ＦＶＩＩＩキット（製品＃：Ｋ８２４０８６）を用いてＦＶＩＩＩ活性を測定したが、インキュベートはすべて振盪しながら３７℃のプレートヒーター上で行った。
血液凝固第ＶＩＩＩ因子についてのＷＨＯ第８回国際基準：０７／３５０にコードされたＣ、濃縮物をアッセイ基準として用い、基準の範囲は１００ｍＩＵ／ｍＬ～０．７８ｍ
ＩＵ／ｍＬだった。プールした通常のヒト血漿アッセイの対照及び試験試料（１×Ｃｏａｔｅｓｔ緩衝液で希釈した）を２連でＩｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ９６穴プレートに加えた（２５μＬ／ウェル）。各添加間に５分間のインキュベートを伴って、新しく調製したＩＸａ／ＦＸリン脂質ミックス（５０μＬ）と、２５μＬの２５ｍＭのＣａＣｌ２と５０μＬのＦＸａ基質を各ウェルに順に加えた。基質とのインキュベートの後、２５μＬの２０％酢酸を加えて呈色反応を止め、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸプラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）機器によってＯＤ４０５の吸光度を測定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウエア（バージョン５．２）によってデータを解析した。定量の最低レベル（ＬＬＯＱ）は７．８ｍＩＵ／ｍＬである。
ＦＶＩＩＩのａＰＴＴアッセイ
ＳｙｓｍｅｘＣＡ－１５００凝固アナライザにてＦＶＩＩＩのａＰＴＴアッセイを以下のように行った：先ず、ａＰＴＴ緩衝液（５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＨＳＡ、ｐＨ７.４）における手動で希釈した５０μＬの試料、基準及び対照を機器
によって反応キュベットに加え、その後、５０μＬのＦＶＩＩＩ－欠損の血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ，製品＃：０８００）を加えた。３７℃で１分間のインキュベートに続いて、５０μＬのａＰＴＴ試薬（Ａｃｔｉｎ（登録商標）ＦＳＬ活性化セファロプラスチン試薬－Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ，参照＃Ｂ４２１９－２）を反応混合物に加え、３７℃で４分間インキュベートした。その後、５０μＬの２０ｍＭのＣａＣｌ２（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ，参照＃ＯＲＦＯ３７）を加え、反応キュベットを直ちに４つの分光光度計のチャンネル位置の１つに移し、混合物における屈折光線の量を測定し、機器のソフトウエアのアルゴリズムによってそれを凝固の開始に変換した。報告された凝固時間は、ＣａＣｌ２の添加から凝固形成の開始までの時間の長さだった。ＷＨＯ第８回国際ＦＶＩＩＩ基準を１００ｍＩＵ／ｍＬから０．７８ｍＩＵ／ｍＬまでの範囲にａＰＴＴ緩衝液で希釈することによってアッセイ基準を生成した。ＭＳエクセルにてＸ軸としてのＦＶＩＩＩ活性（ｍＩＵ／ｍＬ）の対数（底１０）に対してＹ軸としての凝固時間（秒で）として検量線をプロットし、この検量線の線形回帰直線についての式を用いて個々の試料の活性を算出した。アッセイ性能に基づいて、定量の下限（ＬＬＯＱ）は７．８ｍＩＵ／ｍＬだった。
実施例６：ヘテロ二量体の半減期延長に対するＸＴＥＮ挿入の相加効果
半減期の延長のためにＸＴＥＮの挿入をヘテロ二量体に組み込んだ。図３におけるｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１によって実証されたように、ＦＶＩＩＩのＢドメインでの単一の２８８アミノ酸（ａａ）ＡＥ－ＸＴＥＮの挿入はＨｅｍＡマウスにて１６．７時間のヘテロ二量体の半減期を生じた。ヘテロ二量体の半減期をさらに改善するために、１４４ａａまたは２８８ａａの長さの第２のＸＴＥＮ挿入をそれぞれＦＶＩＩＩのＡ１ドメインにて、またはＤ’Ｄ３断片のすぐ下流でＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１に組み込み、ヘテロ二量体の変異体をＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１及びＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４と命名した。
２００ＩＵ／ｋｇ用量での試験分子の単回静脈内投与によってＦＶＩＩＩ欠損（ＨｅｍＡ）マウスにてｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１、ｒＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１及びｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４の半減期を評価した。図３にて示すような指定時点で血漿試料を回収し、ＦＶＩＩＩ発色アッセイによって試料のＦＶＩＩＩ活性を測定し、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ－Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いてＰＫのパラメータを算出し、表１７に載せた。
図３及び表１７に示すように、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインにて、またはＤ’Ｄ３の下流にて第２のＸＴＥＮ挿入を加えることはさらにヘテロ二量体の半減期をそれぞれ２９．４５または３１．１０時間に改善した。さらに、双方のＸＴＥＮ挿入からクリアランス及び
ＡＵＣにて２倍を超える改善も観察された。
Figure 2022118129000050
実施例７：Ｄ’Ｄ３とＦｃドメインの間に挿入されると１４４ａａＡＥ－ＸＴＥＮは２８８ａａＡＥ－ＸＴＥＮよりも良好な半減期の利益を付与される
Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃ鎖内でのＸＴＥＮ挿入の最適な長さを特定する試みにて別のヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７を構築し、ＸＴＥＮ挿入の長さを２８８ａａから１４４ａａに減らした。図４で示すように、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４に比べて、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７の半減期は３１時間から４２時間に増えた。ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７についても改善されたクリアランス及びＡＵＣが観察され、データを表１８に載せた。従って、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体のＤ’Ｄ３とＦｃドメインの間に挿入すると１４４ａａＡＥ－ＸＴＥＮはＡＥ－２８８ａａＸＴＥＮよりも最適である。
Figure 2022118129000051
実施例８：Ｆｃドメインはヘテロ二量体の半減期を延長する
ＦｃドメインはＦｃＲｎが介在する再利用経路を介してその融合タンパク質の半減期を延長する。ヘテロ二量体の半減期の延長に対するＦｃドメインの必要性を確認するために、野生型ＦｃドメインをｒＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１における三重変異体（Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ；ＩＨＨ）によって置き換えてｒＦＶＩＩＩ２６３／ＶＷＦ０５０を形成し、ｒＦＶＩＩＩ２６３／ＶＷＦ０５０について表面プラスモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイによってＦｃＲｎ結合の完全な排除を確認した。ＦＶＩＩＩ２６３／ＶＷＦ０５０の半減期をｒＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１と比べてＨｅｍＡマウスにて評価した。図５及び表１９にて示すようにｒＦＶＩＩＩ２６３／ＶＷＦ０５０について上昇したクリアランス速度と同様に低下した半減期及びＡＵＣが観察された。この結果はＦＶＩＩＩとＤ’Ｄ３の共有結合を確保することに加えて、ヘテロ二量体の半減期の改善にはＦｃドメインも必要であることを実証した。
Figure 2022118129000052
実施例９：ＨｅｍＡマウスの尾クリップ出血モデルにおけるＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体の急性期有効性
ＨｅｍＡマウスの尾クリップ出血モデルを用いて主要なヘテロ二量体の急性期有効性を評価した。
８～１２週齢のオスＨｅｍＡマウスを４つの処理群に無作為化し、それぞれＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７または媒体溶液の単回静脈内投与で処理した。ＦＶＩＩＩの発症時治療を模倣するために（正常なＦＶＩＩＩ血漿レベルの５０～１００％を再構築するために）、選択されたＦＶＩＩＩ処理用量はＦＶＩＩＩのａＰＴＴアッセイで測定したとき７５ＩＵ／ｋｇである。この用量レベルで、試験ＦＶＩＩＩ変異体はすべて投与の５分後、正常なマウス血漿ＦＶＩＩＩ活性の約７０％を再構築するであろう。
試験における各個々の動物の失血値を図６でプロットした。媒体処理動物に比べてＦＶＩＩＩ処理群すべてについて失血値の有意な低下が認められた。３つのＦＶＩＩＩ処理群の中で、失血の低下には統計的な有意差が見られなかったということは、ヘテロ二量体分子が要求に応じた治療についてＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと同様に潜在的に有効であり得ることを示唆している。
試験における各個々の動物の失血値を図６でプロットした。媒体処理動物に比べてＦＶＩＩＩ処理群すべてについて失血値の有意な低下が認められた。３つのＦＶＩＩＩ処理群の中で、失血の低下には統計的な有意差が見られなかったということは、ヘテロ二量体分子が要求に応じた治療についてＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと同様に潜在的に有効であり得ることを示唆している。
加えて、低用量（３７．５ＩＵ／ｋｇ）のｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４でＨｅｍＡマウスを処理し、結果を図６Ｂに示す。７５ＩＵ／ｋｇ用量と同様に、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４は尾クリップ損傷後のＨｅｍＡマウスに対してＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと類似の保護を提供したということは、分子がＨｅｍＡマウスにて正常な循環ＦＶＩＩＩレベルの約３５％で重篤な出血症状の出現を治療するのに依然として有効であったことを示している。
尾クリップの手順は以下のように実施した。手短には、尾損傷に先立って、５０ｍｇ／ｋｇのケタミン／０．５ｍｇ／ｋｇのデクスメデトミジンのカクテルでマウスを麻酔し、３７℃の加熱パッド上に置いて体温を維持した。次いでマウスの尾を３７℃の生理食塩水に１０分間浸して外側静脈を拡張させた。静脈の拡張の後、ＦＶＩＩＩ変異体または媒体溶液を、尾静脈を介して注射し、次いで投与の５分後、刃が真っすぐな＃１１外科用メスを用いて５ｍｍ離れた尾を切断した。流れた血液を１３ｍＬの３７℃生理食塩水の中に３０分間採取し、血液採取チューブの重量変化によって失血値を決定した：失血値＝（採取チューブの最終重量－開始重量＋０．１０）ｍＬ。ｔ検定（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検
定）及び一元ＡＮＯＶＡ（ＫＲＵＳＫＡＬ－Ｗａｌｌｉｓ検定、事後検定：Ｄｕｎｎｓ多重比較検定）を用いて統計的解析を行った。
実施例１０：ＨｅｍＡマウスの尾静脈横切開出血モデルにおけるＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体の予防的有効性
ＨｅｍＡマウスの尾静脈横切開（ＴＶＴ）モデルにてＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７の予防的有効性を調べた。ＴＶＴモデルはマウスの尾の外側静脈に損傷を導入することによって出血を誘導し、それは血友病出血障害の患者における自然発生的な出血症状の出現を模倣する。
８～１０週齢のオスＨｅｍＡマウスを４つの処理群に無作為化し、尾静脈損傷の７２時間前にＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７で、または損傷の２４時間若しくは４８時間前にＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩで処理した。媒体で処理した動物を陰性対照として使用した。損傷後２４時間以内での再出血または過剰な失血による安楽死の事象を図７にてプロットした。
図７にて示すように、損傷後限られた保護しか認められなかったＴＶＴの４８時間前にＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩで処理したマウスとは異なって、尾損傷の７２時間前にｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７の処理を受けたマウスが、ＴＶＴの２４時間前にＳＱ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ処理を受けたマウスに比べて再出血に対する類似する保護及び生存を有したということは、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７がＴＶＴモデルにおけるＨｅｍＡマウスに少なくとも３倍以上（たとえば、４倍）長い保護を提供できることを示している。従って、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７は現在のＦＶＩＩＩ予防法の治療回数を有意に減らし得る。
同様に、尾静脈損傷の２４時間前または９６時間前にＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体：ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４及びｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７でＨｅｍＡマウスを処理した。処理の再出血及び生存のデータを損傷の２４時間前または４８時間前のｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ及び媒体によるデータと比較した。尾静脈損傷の２４時間前にｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩで処理したマウスにおける再出血が媒体で処理したマウスに類似する一方で、損傷の２４時間前にヘテロ二量体で処理したマウスの再出血データは媒体処理群よりも有意に良好である。さらに、損傷の９６時間前にヘテロ二量体で処理したマウスの再出血データは損傷の２４時間前にｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ処理を受けたマウスに匹敵した。ＴＶＴ損傷の２４時間後での生存率に関しては、ｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩで処理したマウスの５０％未満の生存率とは対照的に、損傷の２４時間前にＦＶＩＩＩ分子を投与した場合、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体処理によって９０％超えるマウスがＴＶＴ損傷を切り抜けて生き残った。加えて、損傷の２４時間前にｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ処理を受けたマウスと比べた場合、尾静脈損傷の９６時間前にＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体で処理したマウスにおける生存は、良好であった（ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４の場合）、または匹敵した（ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７の場合）。双方の再出血及び生存のデータはｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ処理に比べてＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃヘテロ二量体処理の４倍の有効性の延長を示した。
ＨｅｍＡマウスの尾静脈横切開モデル
尾静脈横切開手順は以下のように実施した。５０ｍｇ／ｋｇのケタミンと０．１２５ｍｇ／ｋｇのデクスメデトミジンと０．１ｍｇ／ｋｇのブプレネックスを含有するカクテルでマウスを麻酔した。適切な麻酔の深さで、尾の直径がおよそ２．７ｍｍの領域にて真っすぐな刃の１１号の外科用刃でマウスの外側尾静脈を横切開した。流れる血液を温かい生理食塩水で洗い流し、傷の明瞭な観察を確保した。次いで次の２４時間、処理したマウス
を白紙の寝床で清潔なケージに単独で収容した。尾の再出血及びマウスの身体活動を観察し、尾損傷の１２時間後まで時間毎に記録した。瀕死のマウスを直ちに安楽死させ、尾の損傷の２４時間後、最終的な観察を行った。血友病患者における出血状況を模倣し、麻酔からの動物の完全な回復を確保するために、１ｍｇ／ｋｇのアチパメゾール溶液を与えて尾静脈横切開の開始時でのデクスメデトミジンの効果を反転させた。一晩の疼痛管理のための１２時間の観察期間の終了時に０．１ｍｇ／ｋｇのブプレネックスの追加用量を投与した。データ解析のために時間対再出血及び時間対安楽死の生存曲線を生成し、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を統計的評価に用いた。
実施例１１：ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９及び他の構築物の調製
ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ３１０のクローニング
Ｎ末端でＢａｍＨ１部位に隣接し、Ｃ末端でＣｌａ１部位に隣接する合成ＤＮＡ断片は商業的に作製された。この合成ＤＮＡを用いてｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ１６９構築物（配列番号１５５）におけるＢａｍＨ１からＣｌａ１までの領域を置き換えた。合成ＤＮＡとｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ１６９ＤＮＡの双方をＢａｍＨ１とＣｌａ１で二重消化し、消化した合成ＤＮＡを消化したｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ１６９に挿入してｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ３１０（配列番号１６８；表２０）を創り出した。
ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ３１２をクローニングすること
Ｎ末端でＢａｍＨ１部位に隣接し、Ｃ末端でＡｆｅ１部位に隣接する合成ＤＮＡ断片は商業的に作製された。この合成ＤＮＡを用いてｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ１６９構築物（配列番号１５５）におけるＢａｍＨ１からＡｆｅ１までの領域を置き換えた。合成ＤＮＡとｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ１６９ＤＮＡの双方をＢａｍＨ１とＡｆｅ１で二重消化し、消化した合成ＤＮＡを消化したｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ１６９に挿入してｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ３１２（配列番号１６９；表２０）を創り出した。ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ３１２Ａ（配列番号２；表２０）をｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ３１２から創り出してＦＶＩＩＩとＸＴＥＮの接合部でアミノ酸残基ＧＡＰをコードするＡｓｃＩ部位を取り除いた。
Figure 2022118129000053
Figure 2022118129000054
ｐＳＹＮ ＶＷＦ０５９及びＶＷＦ０７３をクローニングすること
Ｄ’Ｄ３－ＸＴＥＮとＦｃの間で異なるリンカー領域をコードする種々の合成ＤＮＡ断片を作製した。これらの合成ＤＮＡ断片をＮ末端でＡｓｃ１部位に及びＣ末端でＮｏｔ１部位に隣接させた。これらの合成ＤＮＡを用いてｐＳＹＮ ＶＷＦ０５７構築物（配列番号１５２）のＡｓｃ１からＮｏｔ１の領域を置き換えた。ｐＳＹＮ ＶＷＦ０５９構築物（表２１）はリンカー領域（配列番号１３）を含み、それはＦＶＩＩＩの酸性領域２（ａ２）全体を含む。この部位は、トロンビンによって切断されると報告され、ＦＶＩＩＩの活性化の際、Ｄ’Ｄ３ＸＴＥＮが放出される。ｐＳＹＮ ＶＷＦ０７３構築物（表２１）はＦＶＩＩＩの酸性領域２（ａ２）のトロンビン切断部位（すなわち、ＩＥＰＲＳＦＳ）（配列番号２３）のみを含有する。合成ＤＮＡ及びｐＳＹＮ ＶＷＦ０５７のＤＮＡ双方をＡｓｃ１及びＮｏｔ１によって二重消化した。消化した合成ＤＮＡを消化したｐＳＹＮ
ＶＷＦ０５７に挿入してｐＳＹＮ ＶＷＦ０５９及びｐＳＹＮ ＶＷＦ０７３を創り出した。ＥｃｏＲＶ制限部位を取り除くことによってｐＳＹＮ ＶＷＦ０５９からｐＳＹＮ
ＶＷＦ０５９Ａ構築物（表２１）を生成した。ＨＥＫ２９３細胞にてＦＶＩＩＩ１６９とＶＷＦ０５７またはＶＷＦ０５９とを同時発現させることによってＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７及びＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９のヘテロ二量体のタンパク質を生成した。
Figure 2022118129000055
実施例１２：ＦｃからのＤ’Ｄ３の放出を分析するためのＦＶＩＩＩヘテロ二量体のトロンビン消化
トロンビン消化実験にて２つのＦＶＩＩＩヘテロ二量体タンパク質を調べ、トロンビンによる切断の速度を検討した。この実験に用いた２つのヘテロ二量体はＦＶＩＩＩＦｃと併せたＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７ヘテロ二量体及びＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９ヘテロ二量体だった。ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７及びＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９のヘテロ二量体は上述されている。３つの消化反応：（ｉ）ＦＶＩＩＩＦｃ、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７（図１１）及び（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９（図１２）を行った。およそ２２：１のＦＶＩＩＩ：トロンビンのモル比で試験試料をヒトα－トロンビンで処理した。各反応は３７℃の水槽でインキュベートした。示した各時点（ｔ＝５、１５、３０、４５、６０分）にて、２２．５μＬの試料を取り出し、２２．５μＬの非還元２×ＳＤＳ負荷染料で反応を止め、３分間加熱した。次いで消化したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で流した。ＬＩＣＯＲシステムを用い、抗ＦＶＩＩＩ重鎖（ＧＭＡ０１２）及び抗ＶＷＦ－Ｄ３（Ａｂ９６３４０）抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
図１１に示すように、トロンビンへのＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７の曝露は、切断生成物であるＤ’Ｄ３－１４４ＸＴＥＮのレベルの上昇に相関してＤ’Ｄ３－ＸＴＥＮ－Ｆｃの検出レベルの緩慢な低下を生じた。切断されないＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７が１５分後残った。逆に図１２は、５分後に切断されないＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９がほとんど検出されないことによって明らかなように、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９はトロンビンによってさらに迅速に切断される。従って、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９はＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７に比べてトロンビンの活性化の際、ＦｃからのＤ’Ｄ３のさらに良好な解放を示した。
並行した実験を行って質量分析法（ＭＳ）を用いてトロンビンの切断を検討した。ＭＳ
によってＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９は再び、ＶＷＦ０５７に比べてＦｃからのＤ’Ｄ３のさらに良好な放出を示した。
実施例１３：ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９の生体内の評価
ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９の薬物動態プロファイル及び生体内の効能をさらに評価するために、１５０ＩＵ／ｋｇ用量での静脈内投与を介したＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９でＨｅｍＡマウスを処理した。注射の５分後、２４、４８、７２、９６及び１２０時間後に大静脈採血を介して血漿試料を採取した。ＦＶＩＩＩ発色アッセイによって血漿におけるＦＶＩＩＩ活性を測定し、Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いてＰＫパラメータを算出した。表２２にて示すように、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７と比較して観察されたＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９の類似のＰＫプロファイルは、ａ２トロンビン切断リンカーがヘテロ二量体のＰＫプロファイルに否定的な効果を有さないことを示している。
Figure 2022118129000056
野生型ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと比較してＨｅｍＡマウスの尾クリップモデル（実施例９に記載）にてＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９の急性期有効性を評価した。７５ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９またはＢＤＤ－ＦＶＩＩＩでＨｅｍＡマウスを処理し、各実験マウスの失血値を図１３にてプロットした。ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩに比べて、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９がＨｅｍＡマウスに対して同じ程度の保護（ｐ＝０．９８８３）を提供したということは、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９が生体内で完全に機能的であることを示している。
ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３－Ｆｃヘテロ二量体のプラスミド構築物
Figure 2022118129000057
Figure 2022118129000058
Figure 2022118129000059
Figure 2022118129000060
Figure 2022118129000061
Figure 2022118129000062
Figure 2022118129000063
Figure 2022118129000064
Figure 2022118129000065
Figure 2022118129000066
Figure 2022118129000067
Figure 2022118129000068
Figure 2022118129000069
Figure 2022118129000070
Figure 2022118129000071
Figure 2022118129000072
Figure 2022118129000073
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具体的な実施形態の前述の記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにしているので、過度な実験を行うことなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、当該技術の技量の範囲内の知識を適用することによって他の人々はそのような具体的な実施形態を容易に改変することができ、及び／または種々の応用に適用することができる。従って、
本明細書で提示されている教示及び指針に基づいて、そのような適用及び改変は開示されている実施形態の同等物の意味及び範囲の中にあることが意図される。本明細書での表現及び用語は説明目的のためのものであって、限定目的ではないので、本明細書の用語または表現は教示及び指針に鑑みて技量のある熟練者によって解釈されるべきであることが理解されるべきである。
本発明の他の実施形態は、本明細書で開示されている本明細書の検討事項及び本発明の実践から当業者に明らかであろう。本明細書及び実施例は例示のみと見なされることが意図され、本発明の真の範囲及び精神は以下のクレームによって示される。
本明細書で引用されている特許及び出版物はすべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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