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JP2022153280A - Ｐｄ－１とｖｅｇｆを標的とした四価二重特異性抗体、その製造方法および用途 - Google Patents

Ｐｄ－１とｖｅｇｆを標的とした四価二重特異性抗体、その製造方法および用途 Download PDF

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JP2022153280A
JP2022153280A JP2022027366A JP2022027366A JP2022153280A JP 2022153280 A JP2022153280 A JP 2022153280A JP 2022027366 A JP2022027366 A JP 2022027366A JP 2022027366 A JP2022027366 A JP 2022027366A JP 2022153280 A JP2022153280 A JP 2022153280A
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fab
igg4
light chain
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JP2022027366A
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趙▲ジエ▼
Jie Zhao
黄浩旻
Haomin Huang
朱禎平
Zhenping Zhu
朱雲霞
Yunxia Zhu
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Original Assignee
Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
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Abstract

【課題】共通軽鎖に基づき且つ構造上対称性を有する四価二重特異性抗体及びその作製方法を提供する。【解決手段】ＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とした四価二重特異性抗体であって、四価二重特異性抗体は、２つのポリペプチド鎖及び４つの共通軽鎖を含み、ポリペプチド鎖及び共通軽鎖のアミノ酸配列は特定の配列で表される。前記二重特異性抗体は、モノクローナル抗体に匹敵する生体活性及び物理化学的特性を有し、又は、モノクローナル抗体に比べてより優れた生体活性及び物理化学的特性を有し、様々な炎症性疾患、がん、及び、他の疾患の治療に適用可能である。【選択図】なし

Description

本発明は、抗体工学の分野に属し、より具体的には、１類の四価二重特異性抗体、その製造方法および用途に関する。
二重特異性抗体とは、２つの抗原または２つの結合エピトープに同時に特異的に結合しうる抗体分子を指し、構造上の対称性から対称性および非対称性分子に分けられ、また、結合サイトの数から二価、三価、四価および多価分子に分けられる。
一本鎖抗体（以下、「ＳｃＦｖ」とも称する）は、重鎖可変領域（以下、「ＶＨ領域」とも称する）および軽鎖可変領域（以下、「ＶＬ領域」とも称する）で構成され、そのうちＶＨ領域とＶＬ領域が柔軟なペプチドリンカーを介して一体に連結される。ＳｃＦｖにおいて、構造ドメインはＶＨ領域－リンカー－ＶＬ領域又はＶＬ領域－リンカー－ＶＨ領域の順に配置され、ＶＨ領域とＶＬ領域をつなぐリンカーとして様々な分子が既に報告され、例えば短いアラニンリンカー、グリシンとセリンに富むリンカー、螺旋構造を呈するリンカー、並びに免疫グロブリンや免疫グロブリン以外に由来のリンカー分子などを利用することができる（Ａｈｍａｄ Ｚ Ａ，Ｙｅａｐ Ｓ Ｋ，Ａｌｉ Ａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，ｓｃＦｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２：９８０２５０）。ＳｃＦｖとは、抗体の最小結合部位を指し、１つのリンカーを用いて２つのＳｃＦｖをつなぐことで二重特異性抗体を作製することができる。二重抗体分子は二価であり、抗原ごとに１つの結合サイトを保有し、分子量が一般に言うと５０～６０ｋＤａの程度である。２つのＳｃＦｖフラグメントをタンデムに繋いだ場合、各ＳｃＦｖフラグメントが独立して折り畳んで各自それぞれの抗原結合サイトを形成する。タンデムに繋いだｓｃＦｖは二重特異性を呈し、現在、既にがんの免疫療法に広く使われ、Ｔ細胞が腫瘍細胞や腫瘍微小環境における腫瘍関連細胞をリターゲッティングするように用いられる。かような抗体形態は二重特異性Ｔ細胞誘導剤（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、以下では「ＢｉＴＥ」とも略称する）の分子基盤となり、ＢｉＴＥ分子として最初に販売認可を得られたのはブリナツモマブである（Ｈｕｅｈｌｓ Ａ Ｍ，Ｃｏｕｐｅｔ Ｔ Ａ，Ｓｅｎｔｍａｎ Ｃ Ｌ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，９３（３）：２９０－２９６）。
ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ，Ｄｂ）は、２つの鎖によって形成される二価分子であり、各鎖に同じ又は異なる抗体に由来する１つのＶＨおよびＶＬ構造ドメインを含む。ダイアボディにおいて、２つの可変構造ドメインは短いリンカー分子を介して連結され、このようなリンカー分子としては、通常、５つのアミノ酸残基で構成され、例えばＧＧＧＧＳが挙げられる。リンカー分子が鎖内組織化に必要とされる長さより明らかに短くなるため、２つのＳｃＦｖ鎖が頭尾方向に沿って二量体化することにより、分子量がタンデムに繋いだＳｃＦｖに相当し且つ緊密に組織化されたダイアボディ分子を形成する（Ｗｕ Ｃ．Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，２００９，２２（８）：４５３）。細胞内でダイアボディ分子の２つの異なる鎖を発現する際に可変構造ドメインのミスマッチングを惹起するおそれがあり、かつ２つの鎖が非共有結合によって連結されていないため、ダイアボディ分子に安定性の問題が残される（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ Ｓ Ｍ，Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ Ｇ，Ｂｒａｕｎａｇｅｌ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｏｍａｉｎ ｏｒｄｅｒ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，３３０（１）：９９－１１１）。
ダイアボディとヒトＦｃを融合することで免疫グロブリンに更に類似する分子を形成することができ、得られた抗体分子を「Ｄｉ－Ｄｉａｂｏｄｙ」と称する（Ｌｕ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｋｏｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩｇＧ－ｌｉｋｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，２８０（２０）：１９６６５－１９６７２）。また、２つのタンデムにつないだＳｃＦｖとヒトＦｃを融合することで免疫グロブリンに更に類似する分子を形成することができ、得られた抗体分子を「ＴａＦｖ－Ｆｃ」と称する（Ｃｈｅｎ Ｚ，Ｘｉｅ Ｗ，Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ Ｄ Ｏ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－ｌｉｋｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６，１７（２）：１３９－１５０）。
上述のＤｉ－ＤｉａｂｏｄｙおよびＴａＦｖ－Ｆｃ以外でも、構造対称性を呈する四価二重特異性抗体としては、下記幾つかの種類が挙げられるが、これらに限らない。
天然ＩｇＧの重鎖又は軽鎖のＮ末端又はＣ末端に、ペプチドリンカーを介してＳｃＦｖを付けることにより、ＩｇＧ－ＳｃＦｖ型の二重特異性抗体を形成することができる（Ｃｏｌｏｍａ Ｍ Ｊ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ Ｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５（２）：１５９）。
天然抗体の軽鎖および重鎖のＮ末端に、ペプチドリンカーを介して更に別の抗体のＶＬ およびＶＨ領域を付けることにより、ＤＶＤ－Ｉｇ型の二重特異性抗体を形成することができる（Ｗｕ Ｃ，Ｙｉｎｇ Ｈ，Ｇｒｉｎｎｅｌｌ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｂｙ ａ ｄｕａｌ－ｖａｒｉａｂｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２５（１１）：１２９０）。
ＣｒｏｓｓＭＡｂは、抗体のＦａｂアーム内にある機能ドメインの交差に基づく技術であり、ロシュ社によって確立された技術プラットフォームである。該技術は、同種由来の軽鎖と重鎖が正確に会合する問題を解決し、抗体を構築するときの成功率を更に高めた。現在、ＣｒｏｓｓＭＡｂに基づいて作製した数種の二重特異性抗体が既に報告されている（Ｋｌｅｉｎ Ｃ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｗ，Ｒｅｇｕｌａ Ｊ Ｔ．，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＣｒｏｓｓＭＡｂ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉ－ａｎｄ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｃ］／／ＭＡｂｓ．Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１６，８（６）：１０１０－１０２０）。
天然抗体の重鎖のＮ末端にペプチドリンカーを介して別の抗体の軽鎖を付け、そしてＶＨ＋ＣＨ１を独立した短鎖としてＮ末端に連結された軽鎖と会合させることにより、ＦＩＴ－ＩｇＧ型の二重特異性抗体を形成することができる（ＵＳ１０２６６６０８Ｂ２）。
ＩｇＧ－ＴＣＲは、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＣＲ）のα鎖及びβ鎖の定常領域を用いて重鎖のＣＨ１領域及び軽鎖のＣＬ領域をそれぞれ置き換えることで関連重鎖と軽鎖の会合効率を高めたものである（Ｗｕ Ｘ，Ｓｅｒｅｎｏ Ａ Ｊ，Ｈｕａｎｇ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ／ＴＣＲ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ－ｌｉｋｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｃ］／／ＭＡｂｓ．Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１５，７（２）：３６４－３７６）。ＷｕＸｉＢｏｄｙは、ＩｇＧ－ＴＣＲに基づき更に改良を行い、α鎖定常領域とβ鎖定常領域の間に人工ジスルフィド結合を設けることにより関連重鎖と軽鎖の会合効率、および二重特異性抗体分子の安定性を更に高めることに至った（ＷＯ２０１９／０５７１２２Ａ１）。
最近、四価二重特異性抗体の新たな作製方法も報告され、該方法によると、結晶構造に対する知見に基づきＦａｂの重鎖と軽鎖の界面に対して人工改造を行い、さらに直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）のＦａｂ界面を実験により選出し、該直交性Ｆａｂの重鎖と軽鎖同士は特異的に会合することができ、間違って野生型の重鎖および軽鎖と会合することはない（Ｌｅｗｉｓ Ｓ Ｍ，Ｗｕ Ｘ，Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｆａｂ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３２（２）：１９１； Ｗｕ Ｘ，Ｓｅｒｅｎｏ Ａ Ｊ，Ｈｕａｎｇ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｆａｂ－ｂａｓｅｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｓ ｗｉｔｈ ｒｏｂｕｓｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｃ］／／ＭＡｂｓ．Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１５，７（３）：４７０－４８２）。
なお、構造上対称性を示さない二重特異性抗体としては、さらに、以下に示す幾つかの構造が挙げられるが、これらに限らない。
杵臼構造（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ、以下では「ＫＩＨ」とも略称する）は、主に二重特異性抗体の２つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を促進する役割を果たす。杵臼構造の特徴として、二重特異性抗体を構成する１つの重鎖のＣＨ３領域に突然変異が起こることで突起状の「杵構造」を形成し、別の重鎖のＣＨ３領域に突然変異が起こることで溝槽状の「臼構造」を形成する。杵臼構造を利用することにより、２種類の異種抗体の重鎖同士が正確に会合させることができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ａ Ｍ，Ｚｈｕ Ｚ，Ｙｕａｎ Ｊ Ｑ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６（７）：６７７）。ＤｕｅｔＭａｂは、ＫＩＨ技術を利用して２つの異種重鎖のヘテロ二量体化を実現し、さらに、人工ジスルフィド結合を導入してＣＨ１とＣＬの間の天然ジスルフィド結合を置き換えることで関連重鎖と軽鎖の会合効率を高めることに至った（Ｍａｚｏｒ Ｙ，Ｏｇａｎｅｓｙａｎ Ｖ，Ｙａｎｇ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ｄｅｓｉｇｎ［Ｃ］／／ＭＡｂｓ．Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１５，７（２）：３７７－３８９）。
異種重鎖のヘテロ二量体化を促す別の方法としては、静電的ステアリング変異（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を利用する方法が挙げられる。該方法は、静電相互作用を示す帯電残基に基づいて確立され、いわばＣＨ３界面の電荷極性を選択的に変えることにより、帯電状態が一致するＦｃ構造ドメインが静電相互作用によってヘテロ二量体を形成し、静電反発作用によってホモ二量体化を抑制する方法である（ＵＳ１００１１８５８Ｂ２； Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｋ，Ｐｅｎｔｏｎｙ Ｍ，Ｓｈｅｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＩｇＧ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，２８５（２５）：１９６３７－１９６４６）。
共通軽鎖（Ｃｏｍｍｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ）も二重特異性抗体の構築によく用いられる手法である。共通軽鎖は、重鎖と軽鎖のミスマッチングによる副産物の生成を低減し、二重特異性抗体の収量を高めることができる（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ Ｅ．，Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｃ］／／ＭＡｂｓ．Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１７，９（２）：１８２－２１２）。共通軽鎖は実験探索により選出され、このときハイブリドーマ又はファージディスプレイ技術を利用するのが一般である。通常、Ａ抗体およびＢ抗体の抗体ライブラリに対してハイスループットでスクリーニングすることが求められ、このとき２つの抗体ライブラリの容量に対しても一定の要求がある（Ｓａｍｐｅｉ Ｚ，Ｉｇａｗａ Ｔ，Ｓｏｅｄａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃｏｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，２０１３，８（２）：ｅ５７４７９； ＵＳ９６５７１０２Ｂ２）。
二重特異性抗体は、１類の斬新な治療性抗体になりつつあり、様々な炎症性疾患、がんおよび他の疾患の治療に適用可能である。最近、二重特異性抗体の新規構成形態が数多く報告されているが、正確に会合する分子を得ることは二重特異性抗体を製造する際の主な技術難点でもある。上述の二重特異性抗体はいずれもミスマッチングの問題を抱え、間違って会合することにより１種または数種の副産物や凝集体が生成し、結果として目的とする二重特異性抗体の収量、純度および物理化学的安定性に影響を与え、さらに体内における二重特異性抗体の安全性及び有効性にも影響を与える。
本発明は、上記した従来の課題に鑑みてなされ、共通軽鎖の構造対称性に基づく四価二重特異性抗体およびその作製方法を提供する。通常、二重特異性抗体の重鎖と軽鎖の間にミスマッチングが発生することが多く見られるが、重鎖同士の間でも間違って会合することがあり、正確に会合する効率が高くなるにつれてミスマッチングが発生する可能性が低くなる。そこで、本発明では、共通軽鎖を利用して重鎖と軽鎖の間にミスマッチングが発生する問題を解決し、かつ抗体の重鎖可変領域ＶＨ－ＢとＣＨ１をつなぎ、ペプチドリンカーを介して別の抗体の重鎖可変領域ＶＨ－Ａを付け、さらに重鎖定常領域ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を付けることで１つの長い重鎖を構成した。この長い重鎖および共通軽鎖の遺伝子を同一の細胞内で発現するとき、長い重鎖がそれぞれ２つの共通軽鎖と会合し、このとき長い重鎖と会合する２つの軽鎖が同じであるため、長い重鎖と共通軽鎖の間にミスマッチングが発生する恐れがなく、また、長い重鎖同士がヘテロ二量体でなくホモ二量体を形成するため、長い重鎖同士に間違って会合することもない。本発明に係る四価二重特異性抗体は、Ｆｃ修飾を不要とし、簡易に製造でき、モノクローナル抗体に匹敵し、若しくはモノクローナル抗体を上回る生体活性および物理化学的特性を有する。
さらに、本発明者が上述の四価二重特異性抗体について鋭意検討を重ねた結果、驚くことにヒトＰＤ－１抗体であるｍＡｂ１－２５－Ｈｕ（以下、「６０９」とも略称する）が主に重鎖を介してＰＤ－１分子に結合し、軽鎖にはさほど依存しないことを見出した。この知見に基づくと、６０９の重鎖可変領域及び／又は重鎖と、他の標的を認識する抗体の重鎖可変領域及び／又は重鎖および軽鎖可変領域及び／又は軽鎖（すなわち、共通軽鎖）とを組み合わせることでＰＤ－１及び他の標的に結合しうる二重特異性抗体を作製することができ、こうした策略は本発明で言う四価二重特異性抗体に限らず、当分野で既知の他の共通軽鎖を含む二重特異性抗体の作製にも適用可能である。
したがって、本発明の第１の側面では、四価二重特異性抗体を提供する。
本発明の第２の側面では、前記四価二重特異性抗体をコードする単離されたヌクレオチドを提供する。
本発明の第３の側面では、前記ヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを提供する。
本発明の第４の側面では、前記発現ベクターを含んでなるホスト細胞を提供する。
本発明の第５の側面では、前記四価二重特異性抗体の製造方法を提供する。
本発明の第６の側面では、前記四価二重特異性抗体を含む薬物組成物を提供する。
本発明の第７の側面では、前記四価二重特異性抗体又は前記薬物組成物の、がん、炎症性疾患、自己免疫性疾患および他の病症を治療するための薬物の製造における用途を提供する。
本発明の第８の側面では、四価二重特異性抗体の作製方法を提供する。
本発明の第９の側面では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８３で表される二重特異性抗体を提供する。
本発明の第１０の側面では、アミノ酸配列が配列番号８３で表される重鎖可変領域の、二重特異性抗体の作製における用途を提供する。
上記目的を達成すべく、本発明は、以下の技術案で構成される。
本発明の第１の側面では、四価二重特異性抗体を提供し、該四価二重特異性抗体は、
Ｎ末端からＣ末端にまでＶＨ－Ｂ－ＣＨ１－ペプチドリンカー－ＶＨ－Ａ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む２つのポリペプチド鎖と、Ｎ末端からＣ末端にまでＶＬ－ＣＬを含む４つの共通軽鎖とを含み、
そのうち、前記ＶＨ－Ａは第１抗体の重鎖可変領域あり、ＶＨ－Ｂは第２抗体の重鎖可変領域であり、前記ＣＨ１は重鎖定常領域の第１構造ドメインであり、前記ＣＨ２は重鎖定常領域の第２構造ドメインであり、前記ＣＨ３は重鎖定常領域の第３構造ドメインであり、前記第１抗体は第１抗原に特異的に結合し、前記第２抗体は第２抗原に特異的に結合し、
前記ＶＬは軽鎖可変領域であり、前記ＣＬは軽鎖定常領域であり、前記ポリペプチド鎖のＶＨ－Ａ－ＣＨ１および前記ポリペプチド鎖のＶＨ－Ｂ－ＣＨ１はそれぞれ前記共通軽鎖のＶＬ－ＣＬと会合し、前記ＶＨ－Ａと前記ＶＬは第１抗原結合サイトを形成し、前記ＶＨ－Ｂと前記ＶＬは第２抗原結合サイトを形成する。
本発明に係る二重特異性抗体の構造は、図１に示された通りである。
本発明によれば、前記共通軽鎖は、以下の方法を用いてスクリーニングすることで得られ、
第１抗体および第２抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれ入れ替えることで第１抗体の重鎖と第２抗体の軽鎖の組み合わせ、及び第２抗体の重鎖と第１抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体を取得し、このとき、
ａ）第１抗体の重鎖と第２抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第１抗原に特異的に結合できると、第２抗体の軽鎖を共通軽鎖とし、
ｂ）第２抗体の重鎖と第１抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第２抗原に特異的に結合できると、第１抗体の軽鎖を共通軽鎖とし、
ｃ）第１抗体の重鎖と第２抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第１抗原に特異的に結合できず、かつ第２抗体の重鎖と第１抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第２抗原に特異的に結合できないと、第１抗体の軽鎖に復帰変異を導入することで第２抗体の重鎖と第１抗体の変異軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第２抗原に特異的に結合できるようにし、そして第１抗体の変異軽鎖を共通軽鎖とし、又は
ｄ）第１抗体の重鎖と第２抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第１抗原に特異的に結合できず、かつ第２抗体の重鎖と第１抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第２抗原に特異的に結合できないと、第２抗体の軽鎖に復帰変異を導入することで第１抗体の重鎖と第２抗体の変異軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第１抗原に特異的に結合できるようにし、そして第２抗体の変異軽鎖を共通軽鎖とする。
本発明の一好適な実施形態によれば、上記ａ）およびｂ）においてハイブリッド抗体が抗原に特異的に結合しうると、上記と同様にして軽鎖に復帰変異を導入することでハイブリッド抗体と抗原とが結合する際の親和性を更に高めることができる。したがって、前記共通軽鎖としては、さらに以下の方法を用いてスクリーニングすることで得られる。
第１抗体および第２抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれ入れ替えることで第１抗体の重鎖と第２抗体の軽鎖の組み合わせ、及び第２抗体の重鎖と第１抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体を取得し、このとき、
ａ’）第１抗体の重鎖と第２抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第１抗原に特異的に結合できると、第２抗体の軽鎖に復帰変異を導入することで、第１抗原に対する親和性からして第１抗体の重鎖と第２抗体の変異軽鎖を組み合わせたハイブリッド抗体が、第１抗体の重鎖と第２抗体の軽鎖を組み合わせたハイブリッド抗体を上回るようにし、そして第２抗体の変異軽鎖を共通軽鎖とし、
ｂ’）第２抗体の重鎖と第１抗体の軽鎖の組み合わせによって形成されたハイブリッド抗体が第２抗原に特異的に結合できると、第１抗体の軽鎖に復帰変異を導入することで、第２抗原に対する親和性からして第２抗体の重鎖と第１抗体の変異軽鎖を組み合わせたハイブリッド抗体が、第２抗体の重鎖と第１抗体の軽鎖を組み合わせたハイブリッド抗体を上回るようにし、そして第１抗体の変異軽鎖を共通軽鎖とする。
本発明によれば、前記ペプチドリンカーは、人工リンカーである。好ましくは、前記人工リンカーとしてはＧ、ＧＳ、ＳＧ、ＧＧＳ、ＧＳＧ、ＳＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＳ、ＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５０）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ、ＳＡＫＴＴＰ、ＲＡＤＡＡＰ、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ、ＡＤＡＡＰ、ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ、ＴＶＡＡＰ、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ、ＱＰＫＡＡＰ、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ、ＡＫＴＴＰＰ、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ、ＡＳＴＫＧＰ、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳおよびＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳなどからなる群より選ばれる任意の１種である。より好ましくは、前記人工リンカーとしては、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５０）である。
本発明によれば、前記ポリペプチド鎖においてＮ末端近傍のＣＨ１構造ドメインおよびＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、同じサブタイプ又は異なるサブタイプの重鎖定常領域に由来してもよく、例えばＩｇＧ１の重鎖定常領域、ＩｇＧ２の重鎖定常領域、ＩｇＧ３の重鎖定常領域およびＩｇＧ４の重鎖定常領域からなる群より選ばれる重鎖定常領域に由来し、好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の重鎖定常領域に由来し、前記ＩｇＧ４には、サイト変異としてＳ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング）を含むのが好ましい。
本発明によれば、前記ＣＬは、κ軽鎖の定常領域又はλ軽鎖の定常領域である。
本発明の一好適な実施形態において、前記第１抗原および前記第２抗原は、ＶＥＧＦ／ＰＤ－１、ＰＤ－１／ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β／ＰＤ－１、ＰＤ－１／ＴＧＦ－β、ＨＥＲ２／ＣＤ４７、ＣＤ４７／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＣＤ１３７、ＣＤ１３７／ＨＥＲ２、ＰＤ－１／ＣＤ１３７、ＣＤ１３７／ＰＤ－１、ＰＤ－１／ＣＤ４０、ＣＤ４０／ＰＤ－１、ＰＤ－１／ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ／ＰＤ－１、ＰＤ－１／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＰＤ－１、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４、ＣＴＬＡ－４／ＰＤ－１、ＰＤ－１／ＬＡＧ－３、及びＬＡＧ－３／ＰＤ－１からなる群より選ばれる何れか１種である。
本発明の一好適な実施形態において、前記ＶＨ－Ａ又は前記ＶＨ－Ｂは、配列番号８３で表される配列を有する。
本発明の一好適な実施形態において、前記ＶＨ－Ａ、前記ＶＨ－Ｂおよび前記ＶＬの配列は、配列番号１、１１、１５、配列番号１１、１、１５、配列番号２０、１１、１５、配列番号１１、２０、１５、配列番号２９、４１、４２、配列番号４１、２９、４２、配列番号３１、４１、４２、配列番号４１、３１、４２、配列番号５３、６１、５４、配列番号６１、５３、５４、配列番号５３、７７、５４、配列番号７７、５３、５４、配列番号８３、９１、９２、配列番号９１、８３、９２、配列番号８３、１０５、１０６、配列番号１０５、８３、１０６、配列番号８３、１１３、１１４、配列番号１１３、８３、１１４、配列番号８３、１１７、１１８、配列番号１１７、８３、１１８、配列番号８３、１１９、１２０、配列番号１１９、８３、１２０、配列番号８３、１２１、１２２、及び配列番号１２１、８３、１２２からなる群より選ばれる。
本発明の一好適な実施形態において、前記ポリペプチド鎖および前記共通軽鎖の配列は、配列番号１６、１３、配列番号１８、１３、配列番号２１、１３、配列番号４５、４３、配列番号４７、４３、配列番号４９、４３、配列番号５１、４３、配列番号６５、６３、配列番号６７、６３、配列番号７９、６３、配列番号８１、６３、配列番号９５、９３、配列番号９７、９３、配列番号１０９、１０７、配列番号１１１、１０７、配列番号１３１、１２３、配列番号１３３、１２５、配列番号１３５、１２７、配列番号１３７、１２７、配列番号１３９、１２７、配列番号１４１、１２７、配列番号１４３、１２９、及び配列番号１４５、１２９からなる群より選ばれる。
本発明の第２の側面では、前記四価二重特異性抗体をコードする単離されたヌクレオチドを提供する。
本発明の第３の側面では、前記ヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを提供する。
本発明の一好適な実施形態において、前記ヌクレオチドは、前記ポリペプチド鎖および前記共通軽鎖をコードし、前記ヌクレオチドは、配列番号１７、１４、配列番号１９、１４、配列番号２２、１４、配列番号４６、４４、配列番号４８、４４、配列番号５０、４４、配列番号５２、４４、配列番号６６、６４、配列番号６８、６４、配列番号８０、６４、配列番号８２、６４、配列番号９６、９４、配列番号９８、９４、配列番号１１０、１０８、配列番号１１２、１０８、配列番号１３２、１２４、配列番号１３４、１２６、配列番号１３６、１２８、配列番号１３８、１２８、配列番号１４０、１２８、配列番号１４２、１２８、配列番号１４４、１３０、及び配列番号１４６、１３０からなる群より選ばれる配列を有する。
本発明の第４の側面では、前記発現ベクターを含んでなるホスト細胞を提供する。
本発明の第５の側面では、前記四価二重特異性抗体の製造方法を提供し、該製造方法は、発現条件下で前記ホスト細胞を培養することにより、前記四価二重特異性抗体を発現するステップａと、前記ステップａで発現した四価二重特異性抗体を分離、精製するステップｂとを含む。
本発明の第６の側面では、前記四価二重特異性抗体および薬学的に許容可能な担体を含んでなる薬物組成物を提供する。
本発明の第７の側面では、前記四価二重特異性抗体又は前記薬物組成物の、がん及び炎症性疾患、自己免疫性疾患および他の疾患を治療するための薬物の製造における用途を提供する。さらに、本発明は、要治療の被験者に前記四価二重特異性抗体又は前記薬物組成物を投与することにより、がん及び炎症性疾患、自己免疫性疾患及び他の疾患を治療する方法を提供する。前記がんとしては、メラノーマ（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、淡明細胞型腎細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン難治性前立腺がん）、膵癌、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頚部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫および他の腫瘍性悪性疾患が挙げられるが、これらに特に制限されない。前記炎症性疾患、自己免疫性疾患および他の疾患としては、眼科、繊維化、喘息、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎などが挙げられるが、これらに特に制限されない。また、前記被験者については制限がないが、人を被験者とするのが一般である。
本発明の第８の側面では、四価二重特異性抗体の作製方法を提供し、該作製方法は、
第２抗原に特異的に結合する第２抗体の重鎖可変領域ＶＨ－Ｂと、重鎖定常領域の第１構造ドメインＣＨ１をつなぐステップＩ、
ペプチドリンカーを介して、ステップＩで得られた連結物を、第１抗原特異的に結合する第１抗体の重鎖可変領域ＶＨ－ＡにつなぐステップＩＩ、
ステップＩＩで得られた連結物と、重鎖定常領域ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とを繋いでポリペプチド鎖を形成するステップＩＩＩ、および
ステップＩＩＩで得られたポリペプチド鎖および共通軽鎖ＶＬ－ＣＬを、それぞれ発現ベクターに導入し、得られた発現ベクターを組み合せて発現することにより目的とする四価二重特異性抗体を取得するステップＩＶを含む。
そのうち、前記ＣＨ１は重鎖定常領域の第１構造ドメインであり、前記ＣＨ２は重鎖定常領域の第２構造ドメインであり、前記ＣＨ３は重鎖定常領域の第３構造ドメインであり、前記ＶＬは軽鎖可変領域であり、前記ＣＬは軽鎖定常領域であり、前記ＶＨ－Ａ－ＣＨ１および前記ＶＨ－Ｂ－ＣＨ１は、それぞれ前記ＶＬ－ＣＬと会合し、前記ＶＨ－Ａは、前記ＶＬと第１抗原結合サイトを形成し、前記ＶＨ－Ｂは、前記ＶＬと第２抗原結合サイトを形成する。
本発明の第９の側面では、二重特異性抗体を提供し、前記二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる重鎖可変領域及び少なくとも２つの共通軽鎖を含み、前記共通軽鎖は、同じ軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域が抗原結合サイトを形成し、前記重鎖可変領域は、配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む。
本発明の第１０の側面では、配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の、二重特異性抗体の作製における用途を提供し、前記二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる重鎖可変領域及び少なくとも２つの共通軽鎖を含み、前記共通軽鎖は、同じ軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域が抗原結合サイトを形成する。
本発明は、共通軽鎖に基づき且つ構造上対称性を有する四価二重特異性抗体及びその作製方法を提供する。本発明に係る二重特異性抗体は、モノクローナル抗体に匹敵する生体活性および物理化学的特性を有し、又はモノクローナル抗体に比べてより優れた生体活性および物理化学的特性を有し、様々な炎症性疾患、がん及び他の疾患の治療に適用可能である。
本発明の二重特異性抗体の構造概略図であり、そのうちＶＨ－Ａは第１抗体の重鎖可変領域を表し、ＶＨ－Ｂは第２抗体の重鎖可変領域を表し、ＶＬは共通軽鎖の軽鎖可変領域を表し、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、重鎖定常領域における３つの構造ドメインであり、ＣＬは、共通軽鎖の軽鎖定常領域であり、重鎖同士の間のジスルフィド結合および重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合は、それぞれ線分で表され、ポリペプチド鎖のＮ末端に近接するＣＨ１領域とＶＨ－Ａ領域の間の人工リンカーは線分で表され、ポリペプチド鎖のＣ末端に近接するＣＨ１領域とＣＨ２領域の間の線分は、抗体本来のリンカーおよびヒンジ領域（重鎖がヒトＩｇＧ４のサブタイプである場合、ヒンジ領域にはサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を表する。 図２Ａ～図２Ｂは、６０１、２０－Ｈｕ及びこれらのハイブリッド抗体のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図３Ａ～図３Ｂは、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ及び６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図４Ａ～図４Ｂは、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルである。 図５Ａ～図５Ｂは、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルである。 図６Ａ～図６Ｄは、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＣＥ－ＳＤＳスペクトルである。 図７Ａ～図７Ｂは、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＤＳＣスペクトルである。 ＶＥＧＦ生体活性に対する２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌの中和能力を測定したときの結果を示す図である。 図９Ａ～図９Ｂは、ＭＬＲ活性に対する２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌの亢進効果を示す図である。 ＰＤ－１及びＶＥＧＦ１６５両者に同時に結合するときの２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌの結合特性を示す図である。 ２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌの薬物動態学特性を示す図である。 ＰＤ－１及びＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体のマウス体内における抗腫瘍活性を示す図である。 図１３Ａ～図１３Ｂは、１Ｄ１１－Ｈｕ、１４－Ｈｕ及びこれらのハイブリッド抗体のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 ｍＡｂ１２７、１４－Ｈｕ及びこれらのハイブリッド抗体のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図１５Ａ～図１５Ｂは、１４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４、１Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４及び１２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図１６Ａ～図１６Ｂは、ＭＬＲ活性に対する１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４の亢進効果を示す図である。 ＴＧＦ－β１及びＰＤ－１両者に同時に結合するときの１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４の結合特性を示す図である。 ＰＤ－１及びＴＧＦ－ｂｅｔａを標的とする二重特異性抗体のマウス体内における抗腫瘍活性を示す図である。 図１９Ａ～図１９Ｂは、１９Ｈ６－Ｈｕ、Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ及びこれらのハイブリッド抗体のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図２０Ａ～図２０Ｂは、ＣＤ４７Ｂ－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－ＣＤ４７Ｂ－ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図２１Ａ～図２１Ｂは、１９Ｈ６－Ｈｕ、９４－Ｈｕ及びこれらのハイブリッド抗体のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図２２Ａ～図２２Ｂは、９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図２３Ａ～図２３Ｂは、６０９、Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ及びこれらのハイブリッド抗体のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図２４Ａ～図２４Ｂは、６０９－Ｆａｂ－１３７－ＩｇＧ４及び１３７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図２５Ａ～図２５Ｂは、６０９、Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ及びこれらのハイブリッド抗体のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図２６Ａ～図２６Ｂは、６０９－Ｆａｂ－４０－ＩｇＧ４及び４０－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 ６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用に対する６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣの阻害効果を示す図である。 混合リンパ球反応に対する６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣの亢進効果を示す図である。 フローサイトメトリー法を利用し、細胞表面のＰＤ－１に対する６０９、６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣの結合特性を測定するときの結果を示す図である。 ６０９の軽鎖可変領域をアラニンスキャニングにかけるときの結果を示す図である。 図３２Ａ～図３２Ｂは、６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図３３Ａ～図３３Ｂは、６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 図３４Ａ～図３４Ｂは、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体の機能活性を測定するときの結果を示す図である。 ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を測定するときの結果を示す図である。 ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体のラット体内における薬物動態学特性を示す図である。 ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体のマウス体内における抗腫瘍活性を示す図である。 図３９Ａ～図３９Ｂは、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４及び５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 ＰＤ－１及びＬＡＧ－３を標的とする二重特異性抗体が２種類の抗原に同時に結合するときの結合特性を示す図である。 ＰＤ－１及びＬＡＧ－３を標的とする二重特異性抗体の機能活性を測定するときの結果を示す図である。 ＰＤ－１及びＬＡＧ－３を標的とする二重特異性抗体のマウス体内における抗腫瘍活性を示す図である。 図４３Ａ～図４３Ｅは、ハイブリッド抗体の特異性を検証するときの結果を示す図である。 図４４Ａ～図４４Ｈは、６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４、６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４及び５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルである。 図４５Ａ～図４５Ｂは、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１及び６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルである。 図４６Ａ～図４６Ｄは、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１及び６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル及びＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルである。
本発明において、「抗体（Ａｂ）」及び「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）」とは、構造特徴が同じである約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ鎖）と２つの同じ重鎖（Ｈ鎖）で構成される。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合を介して重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンにおいて重鎖アイソタイプの間のジスルフィド結合数が異なる。重鎖および軽鎖は、それぞれ規則的な間隔を隔てて鎖内ジスルフィド結合を備え、各重鎖の一端に可変領域（ＶＨ領域）を有し、可変領域に続いて３つの構造ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる定常領域を有する。各軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ領域）を有し、他端に１つのＣＬ構造ドメインで構成される定常領域を有し、軽鎖の定常領域と重鎖の定常領域における第１構造ドメインＣＨ１が会合し、かつ軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域が会合する。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接に関与せず、例えば抗体依存性細胞介在性の細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下では「ＡＤＣＣ」とも略称する）に関与するなど、他の生体機能を示す。重鎖の定常領域は、サブタイプとしてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含み、軽鎖の定常領域は、サブタイプとしてκ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）定常領域を含む。抗体の重鎖と軽鎖は、重鎖のＣＨ１構造ドメインと軽鎖のＣＬ構造ドメインとの間の共有ジスルフィド結合を介して一体に連結され、２つの重鎖は、ヒンジ領域同士の間に形成された鎖間ジスルフィド結合を介して一体に連結される。
本発明において、「二重特異性抗体」とは、２つの抗原（標的）又は２つのエピトープを同時に認識して特異的に結合しうる抗体分子を指す。
本発明において、「モノクローナル抗体」とは、１類のほぼ均一な群から得られる抗体を指し、すなわち極一部に自然変異を形成する可能性がある以外、該群に含まれる単一抗体が同じであることを意味する。モノクローナル抗体は、１つの抗原サイトを高い特異性で認識して結合する。そして、通常のポリクローナル抗体製剤（これらのポリクローナル抗体製剤は、通常、異なる決定基を認識しうる複数の抗体を含む混合物である）と異なり、モノクローナル抗体は、抗原における単一決定基を認識して結合する。モノクローナル抗体は、上述の特異性に加え、ハイブリドーマを培養することで得られ且つ他の免疫グロブリンによって汚染されないという優勢がある。なお、本発明において「モノクローナル」とは、抗体の特性を指すものであり、ほぼ均一な抗体群から得られ、何らの特別な方法で作製されるものと解釈してはいけない。
本発明において、「Ｆａｂ」及び「Ｆｃ」とは、抗体をパパインで消化して得られた２つの完全に同じであるＦａｂフラグメント及び１つのＦｃフラグメントを指すものである。Ｆａｂフラグメントは、抗体重鎖のＶＨ領域及びＣＨ１構造ドメインと、軽鎖のＶＬ領域及びＣＬ構造ドメインとで構成される。Ｆｃフラグメントは、結晶性断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ，Ｆｃ）とも称され、抗体のＣＨ２構造ドメインとＣＨ３構造ドメインとで構成される。Ｆｃフラグメントは、抗原への結合活性を示さず、抗体とそのエフェクター分子又は細胞とが相互作用する部位である。
本発明において、「可変」とは、抗体可変領域の一部に配列差異が存在し、特定抗原に対する抗体の結合性や特異性を決定する構成である。また、可変度を決める配列は、抗体の可変領域全体に渡って均一に分布するわけでなく、軽鎖および重鎖の可変領域における相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）又は超可変領域における３つのフラグメントに集中して存在する。可変領域において保存性が比較的高い部分がフレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）であり、天然重鎖および軽鎖の可変領域にそれぞれ４つのＦＲ領域を含む。これらのＦＲ領域は、概ねβ－折り畳み構造を形成し、接続リングを構成する３つのＣＤＲによって互いに連結されるが、場合によっては部分的なβ－折り畳み構造を形成することもできる。各鎖におけるＣＤＲ領域は、ＦＲ領域を介して緊密に隣接し、かつ他鎖のＣＤＲ領域と共に抗体の抗原結合サイトを形成する［Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、第Ｉ巻第６４７～６６９頁（１９９１）］。
本発明において、「マウス由来の抗体」とは、ラット又はモウス由来の抗体を指し、中でもマウス由来の抗体が特に好ましい。
本本発明において、「ヒト化抗体」とは、ＣＤＲ領域がヒト以外の動物（例えば、マウス）の抗体に由来し、それ以外のフレームワーク領域や定常領域部分がヒト抗体に由来するものを指す。なお、結合親和性を維持する観点から、フレームワーク領域の残基を変更することも可能である。
本発明において、「特異的結合」及び「結合」とは、２つの分子が非ランダムで結合する反応を指し、例えば、抗体とその結合対象である抗原との間の反応を特定するものである。抗体は、通常、１×１０－７Ｍ未満の平衡解離定数（以下、「ＫＤ」とも称する）、例えば約１×１０－８Ｍ未満、より好ましくは１×１０－９Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１０Ｍ未満、１×１０－１１Ｍ未満又はそれ以下の平衡定数で抗原に結合する。本発明において、「ＫＤ」は、特定の抗体と抗原が相互作用する際の平衡解離定数であり、抗体と抗原の結合親和力を表わす。平衡解離定数が小さいほど抗体と抗原の結合が強く、すなわち抗体と抗原の結合親和力が高くなる。抗体と抗原の結合親和力は、例えば表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）を利用し、Ｂｉａｃｏｒｅ装置を用いて測定することができ、またはＥＬＩＳＡ法を利用して抗体と抗原が結合する際の相対親和力を測定することもできる。
本発明において、「（抗体）価」とは、抗体分子内に存在する抗原結合サイトの数を表わす用語である。本発明の二重特異性抗体は、４つの抗原結合サイトを有し、四価であることが好ましい。本発明において、抗原結合サイトとしては、重鎖可変領域（ＶＨ領域）および軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む。
本発明において、「結合エピトープ」とは、抗体が特異的に結合するペプチド決定基を指し、抗原内の抗体に特異的に結合しうる領域である。
本発明において、「ペプチドリンカー」とは、アミノ酸配列からなるペプチドを指す。本発明で言うペプチドリンカーは、天然ペプチドリンカー又は人工ペプチドリンカーであるが、人工ペプチドリンカーであることが好ましい。本発明のペプチドリンカーとしては、例えばＧ、ＧＳ、ＳＧ、ＧＧＳ、ＧＳＧ、ＳＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＳ、ＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５０）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ、ＳＡＫＴＴＰ、ＲＡＤＡＡＰ、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ、ＡＤＡＡＰ、ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ、ＴＶＡＡＰ、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ、ＱＰＫＡＡＰ、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ、ＡＫＴＴＰＰ、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ、ＡＳＴＫＧＰ、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ又はＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳなどが挙げられる。本発明で言うペプチドリンカーとしては、体内分解可能なペプチドリンカー、酵素（例えば、ＭＭＰ）感受性のリンカー、還元分解可能なジスルフィド結合を抱えるリンカー等であってもよく、このようなペプチドリンカーとしてはＳｔｅｆａｎ Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ編集の「Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ」を参照することができ、若しくは当分野でよく使われる任意の分解可能なリンカーを利用することもできる。これらの分解可能なリンカーは、体内において抗体分子の頭部にあるＦａｂの解離に適用可能であり、体内組織への浸透及び分布状況や、標的との結合を増強し、同時に潜在的な副作用を低減することができ、並びに２つの異なるＦａｂ領域の体内機能および半減期を改善することができる。最も好ましくは、本発明の人工リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５０）である。
本発明において、「共通軽鎖」とは、同じ軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含む軽鎖を指し、第１抗原に結合する第１抗体の重鎖と会合することにより第１抗原に特異的に結合する結合サイトを形成することができ、一方で第２抗原に結合する第２抗体の重鎖と会合することにより第２抗原に特異的に結合する結合サイトを形成することができる。さらに、共通軽鎖の軽鎖可変領域と第１抗体の重鎖可変領域とが第１抗原結合サイトを形成し、共通軽鎖の軽鎖可変領域と第２抗体の重鎖可変領域とが第２抗原結合サイトを形成する。
本発明において、発現ベクターについては特に制限がなく、例えばｐＴＴ５、ｐＳＥＣｔａｇ系、ｐＣＧＳ３系、ｐＣＤＮＡ系発現ベクターなど、並びに他の哺乳動物発現系に用いるベクターを使用することができ、これらの発現ベクターは、適切な転写調節配列や翻訳調節配列が連結された融合ＤＮＡ配列を含んでなる。
本発明において、使用可能なホスト細胞としては、上記発現ベクターを発現しうる細胞が挙げられ、例えば哺乳類動物や昆虫ホスト細胞培養系の真核細胞を利用して本発明の融合タンパク質を発現することができ、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＢＨＫ及びこれらに由来の変性細胞なども本発明に使用可能である。
本発明において、「薬物組成物」とは、本発明の四価二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な担体とからなる薬物製剤を指し、これらの薬物製剤は、安定な治療効果を発揮すると同時に本発明に係る四価二重特異性抗体のアミノ酸コア配列の構造完全性を維持することができ、さらに、タンパク質の多官能基を分解（例えば、凝集、脱アミノ化や酸化）から免れるようにすることができる。
以下、実施例におけるタンパク質の発現および精製方法を説明するが、本発明はこれらに特に制限されない。具体的には、外来遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に導入し、得られた発現ベクターを組み合わせ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を利用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に導入して抗体を発現させ、そしてＰｒｏｔｅｉｎ－Ａカラムで抗体を精製した。
以下、実施例における物理化学的特性の測定方法について説明を行う。
実施例のＥＬＩＳＡ検出は、以下のように行われた。つまり、組換えタンパク質を用いてそれぞれＥＬＩＳＡプレートを被覆し、１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸塩緩衝液）でＥＬＩＳＡプレートをブロッキング処理した。測定用抗体を段階的に希釈して濃度勾配を形成した後、上述の組換えタンパク質を被覆したＥＬＩＳＡプレートに移し、室温で３０分間インキュベートしてからプレートを洗い流した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識のヤギ抗ヒト抗体（Ｆｃ又はＦａｂ特異性であり、Ｓｉｇｍａ社製）を適宜希釈してプレートに加え、室温で３０分間インキュベートしてからプレートを洗い流した。各ウェルに３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（以下、「ＴＭＢ」とも称する）を基質とする着色液を１００μＬ加え、室温で１～５分間インキュベートした後、停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０プレートリーダーでＯＤ４５０値を測定し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析グラフを作成し、ＥＣ５０を算出した。
実施例の混合リンパ球反応（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下では「ＭＬＲ」とも称する）は、以下のように行われた。つまり、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてヒト血液から末梢血単核球（以下、「ＰＢＭＣ」とも称する）を分離し、接着法を利用してＰＢＭＣの単核球を分離した。そして、ＩＬ－４（２５ｎｇ／ｍＬ）に加えてＧＭ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を用いて単核球を樹状細胞に分化誘導し、７日後に上記誘導された細胞を消化して樹状細胞を回収した。上記と同様にして別のドナーの血液からもＰＢＭＣを分離し、ＭＡＣＳ磁気カラム及びＣＤ４マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製）を用いてＰＢＭＣからＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。上記誘導された樹状細胞（１０４個細胞／ウェル）とＣＤ４陽性Ｔ細胞（１０５個細胞／ウェル）を適切な割合で均一に混ぜ合わせ、９６ウェルプレートの各ウェルに１５０μＬずつ播種した。数時間後、９６ウェルプレートに段階的に希釈した抗体を５０μＬ加え、３７℃のインキュベーターにおいて３日間インキュベートした。上記実験において、細胞培養にはＡＩＭ－Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、マニュアルに記載の標準手順に従ってＩＬ－２及びＩＦＮ－γの分泌量を測定した。ＩＬ－２及びＩＦＮ－γの検出は、標準のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用し、かかるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で使われる抗体試薬はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のものであった。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０プレートリーダーでＯＤ４５０値を読み出し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析グラフを作成し、ＥＣ５０を算出した。
ＨＰＬＣ－ＳＥＣ解析は、以下の通りに行われた。抗体は、高分子量のタンパク質であり、かつ高度で複雑な二次構造および三次構造を有するため、翻訳後修飾、凝集や分解といった変化を抱え、化学特性や物理特性からして異質的なものである。そのため、分離技術を利用して二重特異性抗体を解析した場合、変性体、凝集体および切断断片がよく見られ、これらの存在は、抗体の安全性及び有効性に大きな損害をもたらし、抗体製造と保存時にも凝集体、切断断片、組織化が不完全な分子が生成しやすくなる。本発明では、高速液体クロマトグラフィー・サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＳＥＣ）を用い、モノマーに比べて分子量が大きい凝集体のピークの保持時間が短く、その一方で分解した断片（切断断片）および組織化が不完全な分子の分子量が小さく、関連ピークの保持時間が長くなるという原理に基づき、試料における不純物の量を検出した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣ解析に用いる装置としてはＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００であり、移動相としては２０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム母液を適宜取って、２０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムでＰＨ６．８±０．１に調整したものを使い、試料の注入量を２０μｇとした。カラムとしてはＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、カラム規格７．８×３００ｍｍ ５μｍのものを使い、流速０．５ｍＬ／１分間、溶出時間３０分間、カラム温度２５℃、試料チャンバー温度１０℃、検出波長２１４ｎｍの条件下で実験を行った。
ＨＰＬＣ－ＩＥＣ解析は、以下の通りに行われた。抗体は、例えばＮ－グリコシル化、Ｃ末端リシン残基の修飾、Ｎ末端グルタミン又はグルタミン酸の環化、アスパラギンの脱アミド化、アスパラギン酸の異性化およびアミノ酸残基の酸化など、翻訳後修飾によって表面電荷が直接又は間接的に変化して帯電電荷に異質性が生じ、なお、抗体の製造および保存時にも電荷変異体が生成しやすくなるため、その帯電電荷に基づき電荷変異体を分離、解析することができる。かかる電荷変異体は、イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）及び陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を用いて解析することができ、イオン交換クロマトグラフィーで解析する際に、主ピーク（ｍａｉｎ ピーク）に対する酸性種 （ａｃｉｄｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）及び塩基性種（ｂａｓｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）の保持時間を測定することで行われる。具体的には、酸性種は、ＣＥＸの主ピークより先又はＡＥＸの主ピークより後に溶出され、塩基性種は、ＣＥＸの主ピークより後又はＡＥＸの主ピークより先に溶出され、酸性種および塩基性種それぞれに対応するピークを酸性ピークおよび塩基性ピークと称する。本発明では、高速液体クロマトグラフィー・イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＩＥＣ）を用いて試料の帯電特性（すなわち、電荷均一性）を分析した。ＨＰＬＣ－ＩＥＣ解析装置はＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００を用い、カラムとしてはＴｈｅｒｍｏ ＰｒｏｐａｃＴＭ ＷＣＸ－１０、移動相Ａとして２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ６．３）、移動相Ｂとして２０ｍＭのＰＢ＋２００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．３）をそれぞれ用い、２種類の移動相については予め設定したプログラムに従って各自の割合を時系列に従って調整しつつ、流速１．０ｍＬ／１分間、カラム温度３０℃、試料チャンバー温度１０℃、試料の注入量２０μｇ、検出波長２１４ｎｍの条件下で実験を行った。
実施例では、キャピラリー電気泳動－ＳＤＳ（以下、「ＣＥ－ＳＤＳ」とも称する）法を利用して試料に含まれる切断断片の量や、組織化が不完全な分子の量を測定した。キャピラリー電気泳動は、非還元型および還元型に分けられ、非還元型のキャピラリー電気泳動に供される試料は、還元剤としてＤＴＴを用いて分子内のジスルフィド結合を破壊する必要がなく、還元型のキャピラリー電気泳動に供される試料は、ＤＴＴを用いて分子内のジスルフィド結合を破壊することが行われる。以下では、非還元型および還元型のＣＥ－ＳＤＳをそれぞれＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳと略称する場合がある。キャピラリー電気泳動装置は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製のＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂＴＭ ＰＡ８００ ｐｌｕｓを用い、キャピラリー電気泳動装置に２１４ｎｍのＵＶ検出器が搭載され、キャピラリーの型番としてはＢａｒｅ Ｆｕｓｅｄ－Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ、規格３０．７ｃｍ×５０μｍ、有効長２０．５ｃｍのものであり、関連試薬は何れもＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製のものであった。キャピラリー電気泳動は、キャピラリーおよび試料チャンバー温度２０±２℃、分離電圧１５ｋＶの条件下で行われた。
示差走査熱量測定法（以下、「ＤＳＣ」とも称する）は、制御可能な昇温又は降温プログラムに従って温度を変化させながらそれに伴う生体分子の熱量変化を測定することにより、生体試料の熱安定性を評価する方法である。その原理としては、昇温過程においてタンパク質が熱量を吸収することにより折り畳み構造が解けられ、このとき、試料チャンバーに温度差が生じ、かような温度差を補うエネルギーは検出装置で計測、記録することができる。そして、これらの熱量変化は検出スペクトルにおいてピーク状として表れ、タンパク質の折り畳み構造が解けるときのピーク温度値が、謂わばタンパク質の融解温度（以下、「Ｔｍ」とも称する）である。Ｔｍは、タンパク質の熱安定性を表わす１つの重要な指標であり、Ｔｍが高いほどタンパク質の安定性が高くなる。
本発明に係る配列情報を、下記表１に纏めて示す。
（表１）
配列番号 配列の名称
１ Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（６０１）の重鎖可変領域のアミノ酸配列
２ Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（６０１）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
３ マウス由来２０号抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
４ マウス由来２０号抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
５ マウス由来２０号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
６ マウス由来２０号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
７ マウス由来２０号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
８ マウス由来２０号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
９ マウス由来２０号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
１０ マウス由来２０号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
１１ ２０－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列
１２ ２０－Ｈｕの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
１３ ６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌのアミノ酸配列
１４ ６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌのヌクレオチド配列
１５ ６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
１６ ２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１７ ２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
１８ ６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１９ ６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
２０ Ｙ０３１３－１の重鎖可変領域のアミノ酸配列
２１ ２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
２２ ２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
２３ マウス由来１Ｄ１１号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
２４ マウス由来１Ｄ１１号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
２５ マウス由来１Ｄ１１号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
２６ マウス由来１Ｄ１１号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
２７ マウス由来１Ｄ１１号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
２８ マウス由来１Ｄ１１号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
２９ １Ｄ１１－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列
３０ １Ｄ１１－Ｈｕの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
３１ ｍＡｂ１２７の重鎖可変領域のアミノ酸配列
３２ ｍＡｂ１２７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
３３ マウス由来１４号抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
３４ マウス由来１４号抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
３５ マウス由来１４号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
３６ マウス由来１４号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
３７ マウス由来１４号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
３８ マウス由来１４号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
３９ マウス由来１４号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
４０ マウス由来１４号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
４１ １４－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列
４２ １４－Ｈｕの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
４３ １４－Ｈｕ－ＬＣのアミノ酸配列
４４ １４－Ｈｕ－ＬＣのヌクレオチド配列
４５ １４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
４６ １４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
４７ １Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
４８ １Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
４９ １４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
５０ １４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
５１ １２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
５２ １２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
５３ １９Ｈ６－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列
５４ １９Ｈ６－Ｈｕの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
５５ Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
５６ Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
５７ Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
５８ Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
５９ Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
６０ Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
６１ Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列
６２ Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
６３ １９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣのアミノ酸配列
６４ １９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣのヌクレオチド配列
６５ ＣＤ４７Ｂ－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１のアミノ酸配列
６６ ＣＤ４７Ｂ－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１のヌクレオチド配列
６７ １９Ｈ６－Ｆａｂ－ＣＤ４７Ｂ－ＩｇＧ１のアミノ酸配列
６８ １９Ｈ６－Ｆａｂ－ＣＤ４７Ｂ－ＩｇＧ１のヌクレオチド配列
６９ マウス由来９４号抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
７０ マウス由来９４号抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
７１ マウス由来９４号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
７２ マウス由来９４号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
７３ マウス由来９４号抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
７４ マウス由来９４号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
７５ マウス由来９４号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
７６ マウス由来９４号抗体の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
７７ ９４－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列
７８ ９４－Ｈｕの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
７９ ９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ のアミノ酸配列
８０ ９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ のヌクレオチド配列
８１ １９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのアミノ酸配列
８２ １９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのヌクレオチド配列
８３ ｍＡｂ１－２５－Ｈｕ（６０９）の重鎖可変領域のアミノ酸配列
８４ ｍＡｂ１－２５－Ｈｕ（６０９）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
８５ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
８６ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
８７ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
８８ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
８９ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
９０ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
９１ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列
９２ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
９３ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣのアミノ酸配列
９４ Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣのヌクレオチド配列
９５ ６０９－Ｆａｂ－１３７－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
９６ ６０９－Ｆａｂ－１３７－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
９７ １３７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
９８ １３７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
９９ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
１００ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
１０１ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
１０２ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列
１０３ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列
１０４ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列
１０５ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列
１０６ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
１０７ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣのアミノ酸配列
１０８ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣのヌクレオチド配列
１０９ ６０９－Ｆａｂ－４０－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１１０ ６０９－Ｆａｂ－４０－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
１１１ ４０－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１１２ ４０－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
１１３ Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列
１１４ Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
１１５ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列
１１６ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
１１７ Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列
１１８ Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
１１９ １０Ｄ１（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）の重鎖可変領域のアミノ酸配列
１２０ １０Ｄ１（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
１２１ ５Ｅ７－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列
１２２ ５Ｅ７－Ｈｕの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
１２３ Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣのアミノ酸配列
１２４ Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣのヌクレオチド配列
１２５ Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣのアミノ酸配列
１２６ Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣのヌクレオチド配列
１２７ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣのアミノ酸配列
１２８ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣのヌクレオチド配列
１２９ ５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣのアミノ酸配列
１３０ ５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣのヌクレオチド配列
１３１ ６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１３２ ６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
１３３ ６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１３４ ６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
１３５ ６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１のアミノ酸配列
１３６ ６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１のヌクレオチド配列
１３７ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１のアミノ酸配列
１３８ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１のヌクレオチド配列
１３９ ６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１４０ ６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
１４１ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１４２ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
１４３ ６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１４４ ６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
１４５ ５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のアミノ酸配列
１４６ ５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のヌクレオチド配列
１４７ ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列
１４８ ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）重鎖定常領域のアミノ酸配列
１４９ κ軽鎖定常領域のアミノ酸配列
１５０ リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）
１５１ 重鎖の第４フレームワーク領域（ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）
１５２ 軽鎖の第４フレームワーク領域（ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ）
１５３ 軽鎖の第４フレームワーク領域（ＦＧＧＧＴＫＶＥＬＫ）
以下、実施例や実験例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例や実験例に制限されない。以下においてベクターやプラスミドの作製方法、タンパク質をコードする遺伝子をベクターやプラスミドに導入する方法、プラスミドをホスト細胞に導入する方法など、従来周知の技法については詳細な説明を省略することがある。これらの技法は当業者が熟知し、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどの出版物に詳細な説明がある。
実施例１：ＰＤ－１及びＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体の作製
１．１）配列
ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、以下では「６０１」とも称する）抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列（配列番号１および配列番号２）は、文献資料（Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ－Ｂｅｕｚｅｌｉｎ Ｃ，Ｋａａｓ Ｑ，Ｗｅｈｂｉ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ-ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００７，６４（３）：２１０－２２５）に記載のものであった。上海生工バイオテック社に委託して上記可変領域をコードするＤＮＡを合成し、６０１の重鎖可変領域（６０１－ＶＨ領域）および軽鎖可変領域（６０１－ＶＬ領域）を、それぞれヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（配列番号１４７）およびヒトＫａｐｐａの軽鎖定常領域（配列番号１４９）と繋ぐことで６０１抗体の重鎖全長遺伝子および軽鎖全長遺伝子を構築し、それぞれ６０１－ＨＣおよび６０１－ＬＣと名づけた。
ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１の明細書実施例１～５に従い、最終的にはスクリーニング結果に基づきマウス由来のヒトＰＤ－１モノクローナル抗体２０号をリード抗体とし、かつその重鎖可変領域のヌクレオチド配列および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を取得してアミノ酸配列（配列番号３及び配列番号４）に変換した。
２０号抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列について解析を行い、ＫＡＢＡＴ法則に則って２０号抗体の重鎖および軽鎖の抗原相補性決定領域及びフレームワーク領域をそれぞれ確定した。２０号抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列としては、Ｈ－ＣＤＲ１がＮＹＤＭＳ（配列番号５）であり、Ｈ－ＣＤＲ２がＴＩＳＧＧＧＧＹＴＹＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号６）であり、Ｈ－ＣＤＲ３がＰＹＧＨＹＧＦＥＹ（配列番号７）であり、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列としては、Ｌ－ＣＤＲ１がＳＡＳＱＧＩＳＮＦＬＳ（配列番号８）であり、Ｌ－ＣＤＲ２がＹＴＳＳＬＨＳ（配列番号９）であり、Ｌ－ＣＤＲ３がＱＱＹＳＮＬＰＷＴ（配列番号１０）であった。
マウス由来２０号抗体の重鎖可変領域について、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／においてヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ３－２１＊０１を選んで重鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来２０号抗体の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ３－２１＊０１のフレーム領域に移植し、かつＨ－ＣＤＲ３の後ろにＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５１）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の配列を得た。同様にして、マウス由来２０号抗体の軽鎖可変領域についてもヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ１－３９＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来２０号抗体の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ１－３９＊０１のフレーム領域に移植し、かつＬ－ＣＤＲ３の後にＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５２）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の配列を得た。さらに、ＣＤＲ移植可変領域に基づき、一部のフレームワーク領域におけるアミノ酸サイトに復帰変異（復帰変異とは、ヒト由来フレームワーク領域の一部のアミノ酸を、マウス由来フレームワーク領域の同一位置のアミノ酸に変えることを意味し、復帰変異のサイトは、通常、抗体構造及び／又は親和力の維持に極めて重要である）を導入し、復帰変異を導入する際、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。
好ましくは、ＣＤＲ移植重鎖可変領域に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第２８位のＴをマウス由来のＶ、第４４位のＧをＲ、第９４位のＲをＳにそれぞれ変更し、また、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域については、第４３位のＡをＴ、第４４位のＰをＶ、第７１位のＦをＹにそれぞれ変更する。
上記復帰変異サイトを抱える重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域（配列番号１１及び配列番号１２）とし、上海生工バイオテック社に委託して上記ヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成した。得られたヒト化重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４（ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）定常領域（配列番号１４８）をつなぎ、ヒト化重鎖の全長遺伝子を得て２０－Ｈｕ－ＨＣと名づけ、また、ヒト化軽鎖の可変領域とヒトＫａｐｐａ鎖の定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、ヒト化軽鎖の全長遺伝子を得て２０－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。
上記抗体の重鎖および軽鎖遺伝子それぞれをｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、得られた重鎖および軽鎖の発現ベクターを合わせてＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入して抗体を発現した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ２９３発現培地において５日間培養してから上澄み液を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａカラムで抗体を精製し、２０－Ｈｕ－ＨＣと２０－Ｈｕ－ＬＣを組み合せた抗体を２０－Ｈｕと名づけた。
１．２）共通軽鎖の選定
２０－Ｈｕの軽鎖可変領域及び６０１の軽鎖可変領域について、ＢＬＡＳＴを利用してアミノ酸配列に対して対比解析を行った結果、両者の間で完全に一致したアミノ酸が８９％（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を占め、物理化学特性が類似したアミノ酸が９４％（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を占めることが確認できた。
６０１－ＨＣ及び６０１－ＬＣの遺伝子配列を、それぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入した。そして、２０－Ｈｕ－ＨＣ、２０－Ｈｕ－ＬＣ、６０１－ＨＣ及び６０１－ＬＣの発現ベクターを、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋２０－Ｈｕ－ＬＣ、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ及び６０１－ＨＣ＋２０－Ｈｕ－ＬＣの通りに組み合わせ、抗体を発現してから精製し、得られた抗体をそれぞれ２０－Ｈｕ、６０１、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ及び６０１－ＨＣ＋２０－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。つまり、６×Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１の細胞外領域ドメイン（ＰＤ－１の細胞外領域は、ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１に開示されたものである）を自ら調製し、この組換えタンパク質をＰＤ１－Ｈｉｓと標記した。また、６×Ｈｉｓタグ付きのヒトＶＥＧＦ１６５（配列はＮＣＢＩに由来し、寄託番号がＡＡＭ０３１０８である）を自ら調製し、この組換えタンパク質をＶＥＧＦ１６５－Ｈｉｓと標記した。ＰＤ１－ＨｉｓおよびＶＥＧＦ１６５－Ｈｉｓをそれぞれ用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は、それぞれ２０ｎｇ／ウェル及び１０ｎｇ／ウェルであった。
図２Ａに示すように、２０－Ｈｕ及び２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣは、ＰＤ１－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．２０６２ｎＭ及び０．９７４７ｎＭであった。一方、６０１及び６０１－ＨＣ＋２０－Ｈｕ－ＬＣは、ＰＤ１－Ｈｉｓに結合できず、ＥＣ５０を算出することができなかった。図２Ｂに示すように、６０１及び６０１－ＨＣ＋２０－Ｈｕ－ＬＣは、ＶＥＧＦ１６５－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．４６８１ｎＭ及び８．２１７ｎＭであり、２０－Ｈｕ及び２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣは、ＶＥＧＦ１６５－Ｈｉｓに結合することができなかった。
２０－Ｈｕに比べ、ＰＤ１－Ｈｉｓに対する２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣの相対親和力が顕著に低下し、６０１に比べ、ＶＥＧＦ１６５－Ｈｉｓに対する６０１－ＨＣ＋２０－Ｈｕ－ＬＣの相対親和力も顕著に低下した。ここで、ＰＤ１－Ｈｉｓに対する相対親和力を高めるため、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣに復帰変異を導入する模索試験が行われ、その結果、６０１軽鎖可変領域と２０－Ｈｕ軽鎖可変領域の間に１２個のアミノ酸残基が異なり、そのうちＫＡＢＡＴナンバリング第２８位、第３２位、第３４位、第４６位、第５０位、第７１位、第９３位及び第９４位のアミノ酸残基が抗体への親和力維持に極めて重要であると確認できた。また、６０１－ＬＣの上記位置にサイト変異を導入し、かかるアミノ酸残基を２０－Ｈｕ－ＬＣの該当位置のアミノ酸残基にそれぞれ変え、これらのサイト変異を抱える６０１－ＬＣをそれぞれ６０１－ＬＣ－Ｄ２８Ｇ、６０１－ＬＣ－Ｙ３２Ｆ、６０１－ＬＣ－Ｎ３４Ｓ、６０１－ＬＣ－Ｖ４６Ｌ、６０１－ＬＣ－Ｆ５０Ｙ、６０１－ＬＣ－Ｆ７１Ｙ、６０１－ＬＣ－Ｔ９３Ｎ及び６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌと標記した。
上記軽鎖の遺伝子配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、２０－Ｈｕ－ＨＣの発現ベクターと上記サイト変異を抱える６０１－ＬＣの発現ベクターをそれぞれ組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｄ２８Ｇ、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｙ３２Ｆ、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｎ３４Ｓ、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ４６Ｌ、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｆ５０Ｙ、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｆ７１Ｙ、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｔ９３Ｎ、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌと名づけた。上述のＥＬＩＳＡ法を利用して上記抗体のＰＤ－１に結合する相対親和力を測定し、対照物としては２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣを用いた。ＥＬＩＳＡ測定結果から、上記変異体および２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣのＥＣ５０がそれぞれ０．４８４９ｎＭ、０．４５６１ｎＭ、０．１７５１ｎＭ、０．５３３３ｎＭ、０．５２５５ｎＭ、１．０３４５ｎＭ、０．４８５９ｎＭ、０．３０７９ｎＭ及び０．６２５１ｎＭであることが確認された。２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣに比べ、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｎ３４Ｓ及び２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌは、ＰＤ－１に対してより高い相対親和力を示し、他の変異抗体は、相対親和力が２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣとほぼ同じであるか、若しくは２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣに比べて相対親和力が更に低下することが確認できた。
６０１－ＨＣの発現ベクターと上記サイト変異を抱える６０１－ＬＣの発現ベクターをそれぞれ組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｄ２８Ｇ、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｙ３２Ｆ、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｎ３４Ｓ、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ４６Ｌ、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｆ５０Ｙ、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｆ７１Ｙ、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｔ９３Ｎ、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌと名づけた。上述のＥＬＩＳＡ法を利用して上記抗体のＶＥＧＦ１６５に結合する相対親和力を測定し、対照物としては６０１を用いた。ＥＬＩＳＡ測定結果から、上記変異体及び６０１のＥＣ５０がそれぞれ０．１３２８ｎＭ、０．１２５４ｎＭ、０．２０８１ｎＭ、０．３２５６ｎＭ、０．１４００ｎＭ、０．１４８１ｎＭ、０．１２５９ｎＭ、０．１２４３ｎＭ及び０．１２９１ｎＭであると確認された。さらに、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｎ３４Ｓ及び６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ４６Ｌは、６０１に比べてＶＥＧＦ１６５に結合する相対親和力が顕著に低下し、他の変異抗体は、ＶＥＧＦ１６５に結合する相対親和力が６０１とほぼ同等のレベルであることが確認できた。
以上を纏めると、Ｖ９４Ｌ変異体は、６０１のＶＥＧＦ１６５に結合する相対親和力を低下させず、同時に２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣのＰＤ－１結合する相対親和力を増強することのできることが確認できた。このことから、６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌ（配列番号１３及び配列番号１４）を共通軽鎖として二重特異性抗体を作製することにした。
１．３）二重特異性抗体の作製
２０－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して６０１の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖遺伝子を作製して２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４（配列番号１６および配列番号１７）と名づけた。同様に、６０１の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して２０－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖遺伝子を作製して６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４（配列番号１８および配列番号１９）と名づけた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４の発現ベクター及び６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４の発現ベクターを、それぞれ６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌの発現ベクターと組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ及び６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌと名づけた。
１．４）ＥＬＩＳＡ法による相対親和力の測定
図に３Ａ示すように、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌ、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ及び６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、ＰＤ１－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．３３１４ｎＭ、０．４７６８ｎＭ及び１．７７２ｎＭであった。図３Ｂに示すように、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌ、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ及び６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、ＶＥＧＦ１６５－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０が０．０１８７２ｎＭ、０．０５８５９ｎＭ及び０．０３８８６ｎＭであった。また、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ及び６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、ＰＤ－１およびＶＥＧＦ両者に結合することができ、二重特異性抗体であることが実証された。
１．５）Ｂｉａｃｏｒｅ法による親和力の測定
上記抗体とＰＤ－１またはＶＥＧＦの親和力については、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置を用いて測定した。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置において、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ／Ｇが固定されたチップで各抗体を捕捉し、そして組換えタンパク質ＰＤ１－Ｈｉｓ又はＶＥＧＦ１６５－Ｈｉｓを注入して結合・解離グラフを取得し、チップ再生には６Ｍのグアニジン塩酸塩溶液を用いた。得られたデータをＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置専用の解析ソフトで解析し、結果を下記表２に纏めて示す。
Figure 2022153280000001
表２に示すように、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌおよび２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、ＰＤ－１に対する平衡解離定数（ＫＤ）で特に近接した数値を示し、ＫＤがそれぞれ１．５９Ｅ－０９および８．８５Ｅ－１０であった。また、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌおよび２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、ＶＥＧＦ１６５－Ｈｉｓに対する結合常数（Ｋｏｎ）および解離定数（Ｋｏｆｆ）がほぼ同じく、平衡解離定数（ＫＤ）もほぼ同じレベルであり、ＫＤがそれぞれ７．４６Ｅ－１２および９．２６Ｅ－１２であった。ここで、平衡解離定数（ＫＤ）と親和力は反比例の関係であった。
１．６）物理化学的特性の評価
１．６．１）ＨＰＬＣ－ＳＥＣ
図４Ａは、モノクローナル抗体６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４ＬのＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、スペクトルにおいてピーク１およびピーク２の両ピークが特に目立ち、各ピークの占有割合がそれぞれ０．７％および９９．３％であった。そのうちピーク１は、保持時間が主要ピークに当たるピーク２に比べて短く、凝集体によるものと考えられる。スペクトルからは、分解断片（切断断片）や組織化が不完全な分子を表わすピークが確認できなかった。図４Ｂは、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、スペクトルにおいてピーク１およびピーク２の両ピークが特に目立ち、各ピークの占有割合がそれぞれ０．７％、９９．３％であった。そのうちピーク１は、保持時間が主要ピークに当たるピーク２に比べて短く、凝集体によるものと考えられる。スペクトルからは、分解断片（切断断片）や組織化が不完全な分子を表わすピークが確認できなかった。
１．６．２）ＨＰＬＣ－ＩＥＣ
図５Ａ～図５Ｂは、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌ及び２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルであり、かかる主要ピークの占有割合がそれぞれ７９．３１％、８０．６４％であり、帯電特性からして２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌが６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌと同等であることが確認できた。
１．６．３）ＣＥ－ＳＤＳ
図６Ａ～図６Ｂは、それぞれ６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４ＬのＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルであり、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて、主要ピークに当たるピーク９の占有割合が９７．９０％であった。Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて、２つの主要ピークとしてピーク６（軽鎖に対応するピーク）及びピーク１２（重鎖に対応するピーク）の占有割合がそれぞれ３０．９２％、６５．２７％であり、両ピークの面積比が１：２．１であった。図６Ｃ～図６Ｄは、それぞれ２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルであり、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて、主要ピークであるピーク１３の占有割合が９６．７４％であった。Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて、２つの主要ピークとしてピーク３（軽鎖に対応するピーク）およびピーク１２（重鎖に対応するピーク）の占有割合がそれぞれ３８．４２％、５９．７４％であり、両ピークの面積比が２：３．１であった。６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌ及び２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、主要ピークの占有割合がＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて特に近接した数値を示し、軽鎖と重鎖のピーク面積比がＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいてが所期通りの数値を示した。
１．６．４）ＤＳＣ
図７Ａ～図７Ｂは、それぞれ６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌ及び２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＤＳＣスペクトルである。そのうち、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４ＬのＴｍＯｎｓｅｔおよびＴｍがそれぞれ６６．４６℃、７５．３７℃であり、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４ＬのＴｍＯｎｓｅｔおよびＴｍがそれぞれ６５．９２℃、７４．２８℃であった。この結果から、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、６０１－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌに非常に近似した熱安定性を有することが実証された。
１．７）改良型二重特異性抗体の作製
１．７．１）二重特異性抗体の作製
米国特許出願公開公報ＵＳ２００２００３２３１５Ａ１において、発明者らは、ファージディスプレイ技術を利用してベバシズマブの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を改良することにより、親和力および中和活性がより優れた重鎖可変領域のアミノ酸配列Ｙ０３１３－１（ＵＳ２００２００３２３１５Ａ１に記載の配列番号１１４、本発明では配列番号２０で表されるアミノ酸配列）を得た。
ここで、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌにおける６０１（ベバシズマブ）重鎖可変領域をＹ０３１３－１に置き換えた。具体的には、２０－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介してＹ０３１３－１の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖遺伝子を作製して２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４（配列番号２１および配列番号２２）と名づけた。
上記配列をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４の発現ベクターと６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌの発現ベクターを組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体を２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌと名づけた。
１．７．２）ＶＥＧＦ生体活性に対する中和能力評価
ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，ＨＵＶＥＣ）は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入し、臍帯静脈内皮細胞の完全培地（物品番号及び仕様規格Ｈ－００４／５００ｍＬ、ＡｌｌＣｅｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてＨＵＶＥＣ細胞を継代培養した。ＨＵＶＥＣ細胞が対数増殖期に増殖すると、パンクレアチンで消化し細胞を遊離させ、遠心、回収して細胞を完全培地で再懸濁した。そして、細胞を密度が８０００個細胞／ウェルとなるように９６ウェルの細胞培養プレートに播種し、２４時間後に９６ウェルプレート内の完全培地を基本培地（物品番号及び仕様規格Ｈ－００４Ｂ／５００ｍＬ、ＡｌｌＣｅｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に置き換え、このとき、基本培地量は１ウェル当たり１５０μＬであった。４００ｎｇ／ｍＬの組換えＶＥＧＦ１６５（物品番号ＶＥ５－Ｈ４２１０、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含む基本培地を用いて抗体を段階的に希釈することで濃度勾配を形成し、ＶＥＧＦ１６５と抗体の混合溶液を１ウェル当たり５０μＬの量で９６ウェルプレートに加え、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターにおいて３日間インキュベートした。３日後、各ウェルにＣＣＫ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）溶液を２０μＬ加え、インキュベーターにおいて引続き４時間インキュベートした。プレートリーダーでＯＤ４５０値を読み出し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析グラフを作成し、ＩＣ５０を算出した。
図８に示すように、６０１、２０－Ｆａｂ－６０１－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ、６０１－Ｆａｂ－２０－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ及び２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、何れもＶＥＧＦ１６５によって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖を効果的に抑制することができ、ＩＣ５０がそれぞれ４．４２２ｎＭ、９．０３９ｎＭ、３．８４ｎＭ及び１．６３２ｎＭであった。以上の結果から、ＶＥＧＦ１６５生体活性に対し、２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌが最も強い中和能力を示すことが確認できた。
１．７．３）ＭＬＲ亢進活性の評価
図９Ａ～図９Ｂに示すように、２０－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ（すなわち２０－Ｈｕ）、２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌ及び２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、何れもＭＬＲのＩＬ－２およびＩＦＮ－γ分泌を効果的に刺激することができ、ＭＬＲのＩＬ－２分泌を刺激するときのＥＣ５０がそれぞれ０．２５７１ｎＭ、０．３７０３ｎＭ及び０．７５５４ｎＭであり、ＭＬＲのＩＦＮ－γ分泌を刺激するときのＥＣ５０がそれぞれ０．１４２６ｎＭ、０．２４７ｎＭ及び１．０３６ｎＭであった。
１．７．４）ＰＤ－１とＶＥＧＦに対する二重特異性抗体の結合能力評価
ＶＥＧＦ１６５（物品番号ＶＥ５－Ｈ４２１０、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）でマイクロプレートを被覆し、１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴで測定用抗体を段階的に希釈して濃度勾配を形成し、上記マイクロプレートに入れて室温、約３０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗い流した。ビオチン化のヒトＰＤ－１細胞外領域ドメイン（物品番号１０３７７－Ｈ０８Ｈ－Ｂ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を２００ ｎｇ／ｍＬに希釈してからマイクロプレートに加え、室温、約３０分間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗い流した。ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（物品番号５５４０６６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１０００倍希釈してマイクロプレートに加え、室温、約３０分間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗い流した。ＴＭＢ着色液（１００μＬ／ウェル）を加え、室温で１～５分間インキュベートした後、停止液（５０μＬ／ウェル）を加えて着色反応を停止した。プレートリーダーでＯＤ４５０値を読み出し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析グラフを作成し、ＥＣ５０を算出した。
図１０に示すように、２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、ＶＥＧＦ１６５に加え、ヒトＰＤ－１にも効果的に結合することができ、ＥＣ５０が０．３２９３ｎＭであった。一方、６０１および２０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０１－ＬＣ－Ｖ９４Ｌは、ＰＤ－１とＶＥＧＦ１６５に同時に結合することができなかった。
１．７．５）ＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体のラット体内における薬物動態学評価
ＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット、浙江維通利華実験動物会社製）を用いて二重特異性抗体の薬物動態学を検討した。各組にラット４匹ずつ配分し、ラットの平均体重が約２００ｇであり、ラットに尾静脈注射（Ｉ．Ｖ．）にて１ｍｇの抗体を投与し、投与後の指定時点で眼窩から採血し、血液が自然凝固するまで待ってから遠心して血清を回収した
血清中における目的抗体の濃度は、以下の通りに測定した。つまり、二重特異性抗体に対応する２つの抗原（ＶＥＧＦ１６５は、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製であり、物品番号がＶＥ５－Ｈ４２１０であった。６×Ｈｉｓタグ付のヒトＰＤ－１細胞外領域ドメインは、上記１．２に記載のものを使用した）をそれぞれ用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートをブロッキング処理した。ラット血清を適宜希釈し、上記２つの抗原を被覆したＥＬＩＳＡプレートに加えて室温、１時間インキュベートした後、プレートを洗い流した。そして、ＨＲＰ標識のヤギ抗ヒト抗体（Ｆｃ特異的なものであり、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、該抗体は、種間交叉反応性を無くすために吸着処理が行われ、ラット抗体を認識しないものであった。室温、３０分間インキュベートしてからプレートを洗い流し、各ウェルにＴＭＢ基質とする着色液を１００μＬ加え、室温で１～５分間インキュベートした後、停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて反応を停止し、プレートリーダーでＯＤ４５０値を測定した。検量線を利用してＯＤ４５０を血清抗体濃度に換算し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析グラフを作成し、Ｐｈｏｅｎｉｘソフトを利用してラット体内における抗体薬物の半減期を算出した。
図１１に示すように、２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌは、ＰＤ－１を抗原とした場合に半減期が１６．９日であり、ＶＥＧＦ１６５を抗原とした場合に半減期が１７．３日であった。以上の結果から、２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌが良好な薬物動態学特性を有することが確認できた。
１．７．６）ＰＤ－１及びＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体のマウス体内における抗腫瘍効果
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いてＮＳＧマウスでヒト化免疫系を再構築し、さらに、該マウスを用いてヒト肺がん株ＮＣＩ－Ｈ４６０の皮下移植腫瘍モデルを作製した。該マウス腫瘍モデルは、ヒトＰＤ－１を発現するＴ細胞およびヒトＶＥＧＦを発現するヒト腫瘍細胞を兼ね備え、ＰＤ－１及びＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体の体内における抗腫瘍活性を評価することができる。具体的には、以下の通りにして実験を行った。体外で培養したヒト非小細胞肺がんＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１７７ＴＭ）を回収し、細胞懸濁液を濃度が１×１０８個細胞／ｍＬとなるように調整した後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、物品番号３５６２３４）と１：１の体積比で混ぜ合わせた。また、購入したＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、物品番号ＰＢ００５－Ｃ）を復活させ、ＰＢＳで再懸濁し、ＰＢＭＣ懸濁液を濃度が１×１０７個細胞／ｍＬとなるように調整した。上述の腫瘍細胞懸濁液とＰＢＭＣ懸濁液を１：１の体積比で混ぜ合わせ、混合液２００μＬを取って無菌条件下でＭ－ＮＳＧマウス（上海南方モデル生物研究センターにより入手）の背中右側皮下に接種した。接種後、即時に接種済みのマウスを体重に従ってランダムで幾つかの組に分け、各組にそれぞれ１０匹のマウスを配分した。マウスへの投与は、それぞれ対照組に生理食塩水、Ａｖａｓｔｉｎ組にＶＥＧＦ陽性対照物抗体であるＡｖａｓｔｉｎ（ロシュ製薬製）１０ｍｇ／ｋｇ、Ｏｐｄｉｖｏ組にＰＤ－１陽性対照物抗体であるＯｐｄｉｖｏ（ブリストル・マイヤーズスクイブ社製）１０ｍｇ／ｋｇ、２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ組に１６ｍｇ／ｋｇの２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌを注射することにより行われた。二重特異性抗体とモノクローナル抗体は分子量が異なるため、本実験では抗体を物質量に換算し、各抗体を同じ物質量で投与した。そして、上述の投与計画に従って週２回の頻度で合計１０回投与し、腫瘍体積については毎週２回測定した。最後に、各組の腫瘍生長状況を時系列に従って整理し、図１２に示すような生長グラフを作成した。
腫瘍抑制率は、［腫瘍抑制率＝（対照組の平均腫瘍体積－実験組の平均腫瘍体積）／対照組の平均腫瘍体積×１００％］に従って算出し、３１日目の実験終了時点でＡｖａｓｔｉｎ組、Ｏｐｄｉｖｏ組および２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ組の腫瘍抑制率がそれぞれ８４．５％、３５．８％、９６．６％であることが確認でき、かつＡｖａｓｔｉｎ組およびＯｐｄｉｖｏ組に比べ、２０－Ｆａｂ－０３１３－ＩｇＧ４－Ｖ９４Ｌ組においてより優れた腫瘍抑制効果が確認できた。
実施例２：ＰＤ－１およびＴＧＦ－Ｂｅｔａを標的とする二重特異性抗体の作製
２．１）配列
米国特許出願公開公報ＵＳ５５７１７１４Ａに、一連のＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）モノクローナル抗体が開示され、そのうちマウス由来のモノクローナル抗体１Ｄ１１．１６（以下、「１Ｄ１１」とも略称する）は、ＴＧＦ－β１およびＴＧＦ－β２両者に効果的に結合することができる。１Ｄ１１に対応するハイブリドーマは、既に寄託番号ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－９８４９ＴＭでアメリカ培養細胞系統保存機関に寄託保存し、また、マウス由来１Ｄ１１の配列は、米国特許出願公開公報ＵＳ２０１８０２４４７６３Ａ１に記載のものであった。
１Ｄ１１号抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列について解析を行い、ＫＡＢＡＴ法則に則って１Ｄ１１号抗体の重鎖および軽鎖の抗原相補性決定領域及びフレームワーク領域を確定した。１Ｄ１１号抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列としては、Ｈ－ＣＤＲ１がＴＹＷＭＮ（配列番号２３）であり、Ｈ－ＣＤＲ２がＱＩＦＰＡＳＧＳＴＮＹＮＥＭＦＥＧ（配列番号２４）であり、Ｈ－ＣＤＲ３がＧＤＧＮＹＡＬＤＡＭＤＹ（配列番号２５）であり、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列としては、Ｌ－ＣＤＲ１がＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨ（配列番号２６）であり、Ｌ－ＣＤＲ２がＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号２７）であり、Ｌ－ＣＤＲ３がＱＱＮＮＥＤＰＬＴ（配列番号２８）であった。
マウス由来１Ｄ１１号抗体の重鎖可変領域について、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／においてヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ１－４６＊０１を選んで重鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来１Ｄ１１号抗体の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ１－４６＊０１のフレーム領域に移植し、かつＨ－ＣＤＲ３の後ろにＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５１）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の配列を得た。同様に、マウス由来１Ｄ１１号抗体の軽鎖可変領域についてもヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ７－３＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来１Ｄ１１号抗体の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ７－３＊０１のフレーム領域に移植し、かつＬ－ＣＤＲ３の後ろにＦＧＧＧＴＫＶＥＬＫ（配列番号１５３）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の配列を得た。さらに、ＣＤＲ移植可変領域に基づき、一部のフレームワーク領域におけるアミノ酸サイトに復帰変異を導入した。復帰変異を導入する際、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。
好ましくは、ＣＤＲ移植重鎖可変領域に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、第２８位のＴをマウス由来のＩ、第３０位のＴをＩ、第４８位のＭをＩ、第６７位のＶをＡ、第６９位のＭをＬ、第７１位のＲをＶ、第７８位のＶをＡにそれぞれ変更し、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域については、第８１位のＮをＤに変更する。
上記ヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域（配列番号２９及び配列番号３０）について、上海生工バイオテック社に委託して上記可変領域をコードするＤＮＡを合成した。得られたヒト化重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４（ヒンジ領域に、サイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）の重鎖定常領域（配列番号１４８）をつなぎ、ヒト化重鎖の全長遺伝子を得て１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣと名づけ、また、ヒト化軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ軽鎖の定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、ヒト化軽鎖の全長遺伝子を得て１Ｄ１１－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。
上記抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を、それぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、抗体を発現して精製した。１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣと１Ｄ１１－Ｈｕ－ＬＣを組み合わせた抗体を１Ｄ１１－Ｈｕと標記した。
米国特許出願公開公報ＵＳ２０１００１３６０２１Ａ１に一連のＴＧＦ－β抗体が開示され、そのうちモノクローナル抗体ｍＡｂ１２．７（以下、「ｍＡｂ１２７」とも略称する）は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３に効果的に結合し且つ中和能力があるため、ＵＳ２０１００１３６０２１Ａ１に記載のｍＡｂ１２７の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列（配列番号３１及び配列番号３２）を用いて次の実験に行った。
上海生工バイオテック社に委託して上記可変領域をコードするＤＮＡを合成し、得られた重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４（ヒンジ領域に、サイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）の重鎖定常領域（配列番号１４８）をつなぎ、重鎖の全長遺伝子を得てとｍＡｂ１２７－ＨＣ名づけ、かつ軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ軽鎖定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、軽鎖の全長遺伝子を得てｍＡｂ１２７－ＬＣと名づけた。
ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１の明細書実施例１～５に従い、マウス由来の１４号モノクローナル抗体を選んでリード抗体とし、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列に基づいてアミノ酸配列（配列番号３３及び配列番号３４）を導き出した。
１４号抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域については、アミノ酸配列を解析し、ＫＡＢＡＴ法則に則って１４号抗体の重鎖および軽鎖の抗原相補性決定領域及びフレームワーク領域それぞれ確定した。１４号抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列としては、Ｈ－ＣＤＲ１がＧＹＴＭＮ（配列番号３５）であり、Ｈ－ＣＤＲ２がＬＩＮＰＹＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号３６）であり、Ｈ－ＣＤＲ３がＷＲＹＴＭＤＹ（配列番号３７）であり、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列としては、Ｌ－ＣＤＲ１がＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＮＳＦＭＮ（配列番号３８）であり、Ｌ－ＣＤＲ２がＦＡＳＮＬＥＳ（配列番号３９）であり、Ｌ－ＣＤＲ３がＱＱＮＮＥＡＰＰＴ（配列番号４０）であった。
マウス由来の１４号抗体の重鎖可変領域について、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／においてヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ１－４６＊０１を選んで重鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来１４号抗体の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ１－４６＊０１のフレーム領域に移植し、かつＨ－ＣＤＲ３の後ろにＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５１）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の配列を得た。同様に、マウス由来１４号抗体の軽鎖可変領域についてもヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ７－３＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来１４号抗体の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ７－３＊０１のフレーム領域に移植し、かつＬ－ＣＤＲ３の後ろにＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５２）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の配列を得た。ＣＤＲ移植可変領域に基づき、一部のフレームワーク領域におけるアミノ酸サイトに復帰変異を導入した。復帰変異を導入する際、アミノ酸配列についてＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。
好ましくは、ＣＤＲ移植重鎖可変領域に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第２８位のＴをマウス由来のＳ、第４８位のＭをＩ、第６７位のＶをＡ、第６９位のＭをＶ、第７１位のＲをＶ、第７３位のＴをＫ、第７８位のＶをＡにそれぞれ変更し、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域についてもＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第４６位のＬをＰ、第６８位のＧをＲ、第８１位のＮをＤにそれぞれ変更する。
上記変異サイトを抱える重鎖および軽鎖可変領域を、それぞれヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域（配列番号４１及び配列番号４２）と標記し、上海生工バイオテック社に委託して上記ヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成した。得られたヒト化重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４（ヒンジ領域に、サイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）重鎖定常領域（配列番号１４８）をつなぎ、ヒト化重鎖の全長遺伝子を得て１４－Ｈｕ－ＨＣと名づけ、また、ヒト化軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ軽鎖定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、ヒト化軽鎖の全長遺伝子を得て１４－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。
上記抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、抗体を発現して精製し、１４－Ｈｕ－ＨＣと１４－Ｈｕ－ＬＣを組み合わせた抗体を１４－Ｈｕと標記した。
２．２）共通軽鎖の選定
１４－Ｈｕの軽鎖可変領域及び１Ｄ１１－Ｈｕの軽鎖可変領域について、ＢＬＡＳＴを用いてアミノ酸配列に対して対比解析を行った結果、両者の間で完全に一致したアミノ酸が９２％（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を占め、かつ物理化学特性において類似したアミノ酸が９４％（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を占めることが確認できた。
１４－Ｈｕ－ＨＣ、１４－Ｈｕ－ＬＣ、１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣ及び１Ｄ１１－Ｈｕ－ＬＣの発現ベクターを、１４－Ｈｕ－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣ、１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣ＋１Ｄ１１－Ｈｕ－ＬＣ、１４－Ｈｕ－ＨＣ＋１Ｄ１１－Ｈｕ－ＬＣ及び１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣの通りに組み合わせ、抗体を発現してから精製した。得られた抗体をそれぞれ１４－Ｈｕ、１Ｄ１１－Ｈｕ、１４－Ｈｕ－ＨＣ＋１Ｄ１１－Ｈｕ－ＬＣ及び１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による検出は、以下の通りに行われた。つまり、６×Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１の細胞外領域ドメイン（ＰＤ－１細胞外領域は、ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１に記載されたものである）を自ら調製し、得られた組換えタンパク質をＰＤ１－Ｈｉｓと標記し、該ＰＤ１－ＨｉｓでＥＬＩＳＡプレート（２０ｎｇ／ウェル）被覆した。また、ＴＧＦ－β１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、このときの被覆濃度は、５ｎｇ／ウェルであった。
図１３Ａに示すように、１４－Ｈｕは、ＰＤ１－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０が０．３９２４ｎＭであり、一方で１Ｄ１１－Ｈｕ、１４－Ｈｕ－ＨＣ＋１Ｄ１１－Ｈｕ－ＬＣ及び１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣは、ＰＤ１－Ｈｉｓに結合することができなかった。また、図１３Ｂに示すように、１Ｄ１１－Ｈｕは、ＴＧＦ－β１に効果的に結合し、ＥＣ５０が０．０６６２４ｎＭであり、１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣもＴＧＦ－β１に結合することができ、ＥＣ５０が０．５２５５ｎＭであり、１４－Ｈｕ及び１４－Ｈｕ－ＨＣ＋１Ｄ１１－Ｈｕ－ＬＣは、ＴＧＦ－β１に結合することができなかった。これらの結果に鑑み、１４－Ｈｕ－ＬＣ（配列番号４３および配列番号４４）を選んで共通軽鎖とし、二重特異性抗体を作製することにした。
１４－Ｈｕ軽鎖可変領域およびｍＡｂ１２７軽鎖可変領域について、ＢＬＡＳＴを用いてアミノ酸配列に対して対比解析を行った結果、両者の間で完全に一致したアミノ酸が７５％（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を占め、かつ物理化学特性が類似したアミノ酸が８３％（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を占めることが確認できた。
１４－Ｈｕ－ＬＣ、ｍＡｂ１２７－ＨＣ及びｍＡｂ１２７－ＬＣの発現ベクターを、ｍＡｂ１２７－ＨＣ＋ｍＡｂ１２７－ＬＣ及びｍＡｂ１２７－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣの通りに組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれｍＡｂ１２７及びｍＡｂ１２７－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。
上述のＥＬＩＳＡ法を用い、ＴＧＦ－β１に対する１Ｄ１１－Ｈｕ、１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣ、ｍＡｂ１２７及びｍＡｂ１２７－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣの相対親和力を測定し、得られた測定データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析グラフを作成し、ＥＣ５０を算出した。
図１４に示すように、１Ｄ１１－Ｈｕ、ｍＡｂ１２７およびｍＡｂ１２７－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣは、何れもＴＧＦ－β１に効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１３３８ｎＭ、０．０４１３６ｎＭ及び０．０７１０５ｎＭであった。また、ｍＡｂ１２７及びｍＡｂ１２７－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣは、１Ｄ１１－Ｈｕに比べてＥＣ５０がより低く且つ結合シグナルがより強く、両者がＴＧＦ－β１に対してより優れた親和力を有することが確認できた。そのため、１４－Ｈｕ－ＬＣ（配列番号４３及び配列番号４４）を選んで共通軽鎖とし、二重特異性抗体を作製することにした。
２．３）二重特異性抗体の作製
１４－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して１Ｄ１１の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖遺伝子を作製し、１４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４（配列番号４５及び配列番号４６）と名づけた。同様に、１Ｄ１１の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して１４－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖遺伝子を作製し、１Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４（配列番号４７及び配列番号４８）と名づけた。
上記と同様にして、１４－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介してｍＡｂ１２７の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖遺伝子を作製し、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４（配列番号４９及び配列番号５０）と名づけた。また、ｍＡｂ１２７の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して１４－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖遺伝子を作製し、１２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４（配列番号５１及び配列番号５２）と名づけた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４に導入し、１４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４、１Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４及び１２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４の発現ベクターを、それぞれ１４－Ｈｕ－ＬＣの発現ベクターと組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ１４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４、１Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４及び１２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４と名づけた。
２．４）ＥＬＩＳＡ法による相対親和力の測定
図１５Ａに示すように、１４－Ｈｕ、１４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４、１Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４及び１２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４は、何れもＰＤ１－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．４３２１ｎＭ、０．４３６７ｎＭ、１．９９６ｎＭ、０．３８７３ｎＭ及び３．９５５ｎＭであった。そのうち１Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４及び１２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４は、１４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４及び１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４に比べてＰＤ１－Ｈｉｓに対する相対親和力が低下し、立体障害の影響が低下の原因であると考えられる。図１５Ｂに示すように、１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣ、ｍＡｂ１２７－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣ、１４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４、１Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４及び１２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４は、何れもＴＧＦ－β１に結合でき、ＥＣ５０がそれぞれ１．２６７ｎＭ、０．０８０３ｎＭ、０．６９８５ｎＭ、０．３６２８ｎＭ、０．１５２５ｎＭ及び０．１０８３ｎＭであった。そのうち、ｍＡｂ１２７－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣ、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４及び１２７－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４は、１Ｄ１１－Ｈｕ－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣ、１４－Ｆａｂ－１Ｄ１１－ＩｇＧ４及び１Ｄ１１－Ｆａｂ－１４－ＩｇＧ４に比べ、ＴＧＦ－β１に対する相対親和力が更に高くなることが確認できた。
２．５）ＭＬＲ亢進活性の評価
図１６Ａ～図１６Ｂに示すように、１４－Ｈｕ及び１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４は、何れもＭＬＲのＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌を効果的に刺激し、ＭＬＲのＩＬ－２分泌を刺激するときのＥＣ５０がそれぞれ０．１００８ｎＭ及び０．３１８５ｎＭであり、ＭＬＲのＩＦＮ－γ分泌を刺激するときのＥＣ５０がそれぞれ０．０４７１６ｎＭ及び０．５８７１ｎＭであった。なお、１４－Ｈｕに比べ、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４は、高濃度でＭＬＲのＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌を更に増強できることも実証された。
２．６）ＰＤ－１とＴＧＦ－Ｂｅｔａに対する二重特異性抗体の結合能力評価
ＴＧＦ－β１（物品番号１０８０４－ＨＮＡＣ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いてマイクロプレートを被覆し、１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴで測定用抗体を段階的に希釈して濃度勾配を形成した後、上記マイクロプレートに加えて室温、約３０分間インキュベートした。そして、上述の１．７．４と同様にして評価を行った。
図１７に示すように、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４は、ＴＧＦ－β１に結合した後にもヒトＰＤ－１に効果的に結合することができ、ＥＣ５０が０．２７８４ｎＭであった。一方、１４－Ｈｕ及びｍＡｂ１２７－ＨＣ＋１４－Ｈｕ－ＬＣは、ＰＤ－１及びＴＧＦ－β１に同時に結合することができなかった。
２．７）ＰＤ－１及びＴＧＦ－ｂｅｔａを標的とする二重特異性抗体のマウス体内における抗腫瘍効果
ヒトＰＤ－１トランスジェニックマウス（品種背景：Ｃ５７ＢＬ／６）及びＭＣ３８マウス大腸がん細胞株は、上海南方モデル生物研究センターから購入し、該トランスジェニックマウスにおいて、ヒト由来ＰＤ－１遺伝子の細胞外領域ドメインを用いてマウスの相同部分を置き換えた。本発明の二重特異性抗体は、該トランスジェニックマウスのＰＤ－１分子を認識すると同時に、マウス内在性のＴＧＦ－ｂｅｔａにも結合することができる。具体的には、ＭＣ３８細胞株を体外培養し、このときの培地としては１０％の血清を含むＤＭＥＭ（血清及び培地は、何れもＧｉｂｃｏ社製）を用いた。培養したＭＣ３８細胞を、ヒトＰＤ－１トランスジェニックマウスに１匹当たり２×１０６個細胞、皮下注射にて接種した。接種した腫瘍細胞が体積約１００ｍｍ３にまで生長すると、マウスをランダムで幾つかの組に分け、各組にマウス８匹ずつ配分した。各組のマウスについては、それぞれ対照組に生理食塩水、Ｋｅｙｔｒｕｄａ組（２つの投与組）にＰＤ－１陽性対照物抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａ（メルク社製）２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４組（２つの投与組）に３．２ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇの１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４を注射することにより投与を行った。二重特異性抗体とモノクローナル抗体は分子量が異なるため、本実験では抗体を物質量に換算し、各抗体を同じ物質量で投与した。そして、上述の投与計画に従って週２回の頻度で合計６回投与し、腫瘍体積については毎週２回測定した。最後に、各組の腫瘍生長状況を時系列に従って整理し、図１８に示すような生長グラフを作成した
腫瘍抑制率は、［腫瘍抑制率＝（対照組の平均腫瘍体積－実験組の平均腫瘍体積）／対照組の平均腫瘍体積×１００％］に従って算出し、２５日目の実験終了時点でＫｅｙｔｒｕｄａ組（２つの投与組）及び１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４組（２つの投与組）の腫瘍抑制率がそれぞれ７９．２％（２ｍｇ／ｋｇ）、７７．７％（１０ｍｇ／ｋｇ）、８５．１％（３．２ｍｇ／ｋｇ）及び１００％（１６ｍｇ／ｋｇ）であることが確認でき、かつＫｅｙｔｒｕｄａ組に比べ、１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４組においてより優れた腫瘍抑制効果が観察され、高投与量で１４－Ｆａｂ－１２７－ＩｇＧ４を投与した場合、全てのマウスにおいて腫瘍が完全に減退することが確認できた。
実施例３：ＨＥＲ－２及びＣＤ４７を標的とする二重特異性抗体の作製
３．１）配列
１９Ｈ６－Ｈｕは、ヒトＨＥＲ２を標的とするヒト化のモノクローナル抗体であり、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、ＷＯ２０２０／０２５０１３Ａ１に記載がある。本発明では、上記１９Ｈ６－Ｈｕのヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれ１９Ｈ６－Ｈｕ－ＶＨ及び１９Ｈ６－Ｈｕ－ＶＬ（配列番号５３及び配列番号５４）と標記した。
上海生工バイオテック社に委託し、上記１９Ｈ６－Ｈｕのヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成した。合成したヒト化重鎖可変領域とヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（配列番号１４７）をつなぎ、ヒト化重鎖の全長遺伝子を得て１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣと名づけ、また、ヒト化軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ鎖の定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、ヒト化軽鎖の全長遺伝子を得て１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣ及び１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣの遺伝子を、それぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、抗体を発現して精製し、得られた抗体を１９Ｈ６－Ｈｕと名づけた。
ＭＡＢＬ－２（以下、「Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ」と称する）は、ヒトＣＤ４７を標的とするマウス由来のモノクローナル抗体であり、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＵＳ２００３０１０８５４６Ａの明細書に記載の配列番号１２及び配列番号１０である。
Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して解析を行い、ＫＡＢＡＴ法則に従ってＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの重鎖および軽鎖の抗原相補性決定領域及びフレームワーク領域をそれぞれ確定した。Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列として、Ｈ－ＣＤＲ１がＮＨＶＩＨ（配列番号５５）であり、Ｈ－ＣＤＲ２がＹＩＹＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＤ（配列番号５６）であり、Ｈ－ＣＤＲ３がＧＧＹＹＴＹＤＤ（配列番号５７）であり、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列として、Ｌ－ＣＤＲ１がＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＫＴＹＬＨ（配列番号５８）であり、Ｌ－ＣＤＲ２がＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５９）であり、Ｌ－ＣＤＲ３がＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号６０）であった。
マウス由来Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの重鎖可変領域について、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／においてヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ１－４６＊０１を選んで重鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ１－４６＊０１のフレーム領域に移植し、かつＨ－ＣＤＲ３の後ろにＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５１）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の配列を得た。これと同様に、マウス由来Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの軽鎖可変領域についてもヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ２－３０＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂの軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ２－３０＊０１のフレーム領域に移植し、かつＬ－ＣＤＲ３の後ろにＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５２）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の配列を得た。ＣＤＲ移植可変領域に基づき、一部のフレームワーク領域におけるアミノ酸サイトに復帰変異を導入した。復帰変異を導入する際、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。
好ましくは、ＣＤＲ移植重鎖可変領域についてＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第３０位のＴをＡ、第６９位のＭをＬ、第７１位のＲをＳ、第７３位のＴをＫにそれぞれ変更し、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域についてもＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第３６位のＦをＹ、第４６位のＲをＬにそれぞれ変更する。
上記サイト変異を抱える重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域とし、Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＶＨ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＶＬ（配列番号６１及び配列番号６２）と標記した。
上海生工バイオテック社に委託し、上記ヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成した。合成したヒト化重鎖可変領域とヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（配列番号１４７）をつなぎ、ヒト化重鎖の全長遺伝子を得てＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＨＣと名づけ、また、ヒト化軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ鎖の定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、ヒト化軽鎖の全長遺伝子を得てＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＨＣ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＬＣの遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、抗体を発現して精製し、得られた抗体をＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕと名づけた。
３．２）共通軽鎖の選定
１９Ｈ６－Ｈｕ軽鎖可変領域について、ＢＬＡＳＴを利用してＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ軽鎖可変領域とアミノ酸配列解析を行ったところ、両者の間で完全に一致したアミノ酸が９６％（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を占め、物理化学特性において類似したアミノ酸が９９％（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を占めることが確認できた。
１９Ｈ６－Ｈｕ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を、１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＬＣ、及びＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣの通りに組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＬＣ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。つまり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＨｅｒ－２細胞外領域ドメインは、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製であり、物品番号がＨＥ２－Ｈ５２２５であり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＣＤ４７細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１２２８３－Ｈ０８Ｈであり、これらの２つの組換えタンパク質をそれぞれＨＥＲ２－ＥＣＤ－ＨｉｓおよびＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓと標記した。ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓをそれぞれ用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は、何れも１０ｎｇ／ウェルであった。
図１９Ａに示すように、１９Ｈ６－Ｈｕ及び１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＬＣは、何れもＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．０７７０１ｎＭ及び０．１３８８ｎＭであった。一方、Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣは、ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓに結合することができなかった。また、図１９Ｂに示すように、Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣは、何れもＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．０４２７６ｎＭ及び０．０５４１ｎＭであり、１９Ｈ６－Ｈｕ及び１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＬＣは、ＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓに結合することができなかった。これらの結果に鑑み、１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣ（配列番号６３及び配列番号６４）を選んで共通軽鎖とし、二重特異性抗体を作製することにした。
３．３）二重特異性抗体の作製
Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して１９Ｈ６－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製し、ＣＤ４７Ｂ－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１（配列番号６５及び配列番号６６）と名づけた。これと同様に、１９Ｈ６－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介してＡｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製し、１９Ｈ６－Ｆａｂ－ＣＤ４７Ｂ－ＩｇＧ１（配列番号６７及び配列番号６８）と名づけた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、さらに、ＣＤ４７Ｂ－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－ＣＤ４７Ｂ－ＩｇＧ１の発現ベクターを、それぞれ１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣの発現ベクターと組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれＣＤ４７Ｂ－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－ＣＤ４７Ｂ－ＩｇＧ１と名づけた（便宜上、ここでは重鎖名で抗体を命名する）。
３．４）ＥＬＩＳＡ法による相対親和力の測定
図２０Ａに示すように、１９Ｈ６－Ｈｕ、ＣＤ４７Ｂ－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－ＣＤ４７Ｂ－ＩｇＧ１は、何れもＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１２６２ｎＭ、０．１０５７ｎＭ及び０．１５４３ｎＭであり、かつ図２０Ｂに示すように、Ａｎｔｉ－ＣＤ４７Ｂ－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣ、ＣＤ４７Ｂ－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－ＣＤ４７Ｂ－ＩｇＧ１は、何れもＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．０６１６６ｎＭ、０．０７８１７ｎＭ及び０．１９４５ｎＭであった。これらの結果から、ＣＤ４７Ｂ－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－ＣＤ４７Ｂ－ＩｇＧ１がＨＥＲ－２およびＣＤ４７両者に効果的に結合することができ、二重特異性抗体であることが確認できた。
実施例４：ＨＥＲ－２及びＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体の作製
４．１）配列
１９Ｈ６－Ｈｕは、上記３．１で述べたように、ヒトＨＥＲ２を標的とするヒト化のモノクローナル抗体である。また、９４号抗体は、本発明者が自ら作製したマウス由来のヒトＣＤ１３７抗体であり、ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１の明細書実施例１～５に従って作製することができるが、マウスの免疫がヒトＣＤ１３７の組換えタンパク質で行われ、かつＥＬＩＳＡ法を利用し、ヒトＣＤ１３７の組換えタンパク質を用いてハイブリドーマ細胞をスクリーニングする点においてやや異なり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６９及び配列番号７０で表される。
９４号抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域については、アミノ酸配列解析を行い、ＫＡＢＡＴ法則に従って９４号抗体の重鎖および軽鎖の抗原相補性決定領域及びフレームワーク領域をそれぞれ確定した。９４号抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列として、Ｈ－ＣＤＲ１がＳＹＤＩＳ（配列番号７１）であり、Ｈ－ＣＤＲ２がＶＩＷＴＧＧＧＴＮＹＮＳＡＦＭＳ（配列番号７２）であり、Ｈ－ＣＤＲ３がＭＤＹ（配列番号７３）であり、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列として、Ｌ－ＣＤＲ１がＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７４）であり、Ｌ－ＣＤＲ２がＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号７５）であり、Ｌ－ＣＤＲ３がＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号７６）であった。
マウス由来９４号抗体の重鎖可変領域について、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／においてヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ４－５９＊０１を選んで重鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来９４号抗体の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ４－５９＊０１のフレーム領域に移植し、かつＨ－ＣＤＲ３の後ろにＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５１）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の配列を得た。同様に、マウス由来９４号抗体の軽鎖可変領域についてもヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ２－３０＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来９４号抗体の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ２－３０＊０１のフレーム領域に移植し、かつＬ－ＣＤＲ３の後ろにＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５２）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の配列を得た。ＣＤＲ移植可変領域に基づき、一部のフレームワーク領域におけるアミノ酸サイトに復帰変異を導入した。復帰変異を導入する際、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。
好ましくは、ＣＤＲ移植重鎖可変領域に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第２７位のＧをＦ、第２９位のＩをＬ、第４８位のＩをＬ、第７１位のＲをＳ、第７１位のＶをＫ、第７３位のＴをＮ、第７６位のＮをＳ、第７８位のＦをＶ、第９３位のＡをＶにそれぞれ変更し、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域に対してもＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第３６位のＦをＹ、第４６位のＲをＬ、第４８位のＩをＦ、第８７位のＹをＦにそれぞれ変更する。
上記サイト変異を抱える重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域とし、９４－Ｈｕ－ＶＨ及び９４－Ｈｕ－ＶＬ（配列番号７７及び配列番号７８）と標記した。
上海生工バイオテック社に委託し、上記ヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成した。合成したヒト化重鎖可変領域とヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（配列番号１４７）をつなぎ、ヒト化重鎖の全長遺伝子を得てと９４－Ｈｕ－ＨＣ名づけ、また、ヒト化軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ鎖の定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、ヒト化軽鎖の全長遺伝子を得て９４－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。９４－Ｈｕ－ＨＣ及び９４－Ｈｕ－ＬＣ遺伝子を、それぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、抗体を発現して精製し、得られた抗体を９４－Ｈｕと名づけた。
４．２）共通軽鎖の選定
１９Ｈ６－Ｈｕ軽鎖可変領域及び９４－Ｈｕ軽鎖可変領域について、ＢＬＡＳＴを利用してアミノ酸配列解析を行ったところ、両者の間で完全に一致したアミノ酸が９７％（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を占め、物理化学特性において類似したアミノ酸が９９％（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を占めることが確認できた。
１９Ｈ６－Ｈｕ及び９４－Ｈｕの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を、１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣ＋９４－Ｈｕ－ＬＣ及び９４－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣの通りに組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣ＋９４－Ｈｕ－ＬＣ及び９４－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。つまり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＨｅｒ－２細胞外領域ドメインは、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製であり、物品番号がＨＥ２－Ｈ５２２５であり、Ｆｃタグ付きのヒトＣＤ１３７細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１００４１－Ｈ０２Ｈであり、本発明では、これらの組換えタンパク質をそれぞれＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃと標記した。ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃをそれぞれ用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は、何れも１０ｎｇ／ウェルであった。
図２１Ａに示すように、１９Ｈ６－Ｈｕ及び１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣ＋９４－Ｈｕ－ＬＣは、何れもＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１２２２ｎＭ及び０．１３９１ｎＭであり、９４－Ｈｕ及び９４－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣは、ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓに結合することができなかった。また、図２１Ｂに示すように、９４－Ｈｕ及び９４－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣは、何れもＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．３９１３ｎＭ及び０．６３４ｎＭであり、１９Ｈ６－Ｈｕ及び１９Ｈ６－Ｈｕ－ＨＣ＋９４－Ｈｕ－ＬＣは、ＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃに結合することができなかった。これらの結果に鑑み、１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣ（配列番号６３及び配列番号６４）を選んで共通軽鎖とし、二重特異性抗体を作製することにした。また、９４－Ｈｕ－ＬＣを共通軽鎖として二重特異性抗体を作製することもでき、本発明ではこれらに特に制限されない。
４．３）二重特異性抗体の作製
９４－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して１９Ｈ６－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１と名づけた。これと同様に、１９Ｈ６－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して９４－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して１９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１と名づけた。
本発明では、上記二重抗体分子のＦｃフラグメントとＦｃγＲｓ（Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の相互作用を抑制し、かつ体内における潜在的な毒性を低減する観点から、Ｆｃフラグメントの第２３４位のロイシン及び第２３５位のロイシンを共にアラニンに変え、このような変異をＬＡＬＡと標記した（Ｗａｎｇ Ｘ，Ｍａｔｈｉｅｕ Ｍ，Ｂｒｅｚｓｋｉ Ｒ Ｊ．，ＩｇＧ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ ＆ ｃｅｌｌ，２０１８，９（１）：６３－７３；Ｈｏ Ｓ Ｋ，Ｘｕ Ｚ，Ｔｈａｋｕｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ Ｆｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ａｒｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＤ１３７ Ａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０２０，ｐｐ．１０４０-１０５１）。そして、上記ＬＡＬＡ変異を導入した二重抗体分子を、それぞれ９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（配列番号７９及び配列番号８０）及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（配列番号８１及び配列番号８２）と名付けた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、さらに、９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡの発現ベクターを、それぞれ１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣの発現ベクターと組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡと名づけた（便宜上、ここでは重鎖名で抗体を命名する）。
４．４）ＥＬＩＳＡ法による相対親和力の測定
図２２Ａに示すように、１９Ｈ６－Ｈｕ、９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡは、何れもＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１９３３ｎＭ、０．１５７９ｎＭ及び０．１２０１ｎＭであった。また、図２２Ｂに示すように、９４－Ｈｕ－ＨＣ＋１９Ｈ６－Ｈｕ－ＬＣ及び９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡは、何れもＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．６３４ｎＭ及び０．２４１１ｎＭであり、そのうち１９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡは、ＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃに対して結合が弱く、ＥＣ５０が２７．５６ｎＭであった。これらの結果から、９４－Ｆａｂ－１９Ｈ６－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ及び１９Ｈ６－Ｆａｂ－９４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡがＨＥＲ－２及びＣＤ１３７両者に共に結合することができ、つまり、二重特異性抗体であることが実証された。
実施例５：ＰＤ－１及びＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体の作製
５．１）配列
ｍＡｂ１－２５－Ｈｕ（以下、「６０９」とも略称する）は、ヒトＰＤ－１を標的とするヒト化モノクローナル抗体であり、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１に開示され、ヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域（配列番号８３及び配列番号８４）を、それぞれヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の重鎖定常領域（配列番号１４８）及びＫａｐｐａ軽鎖の定常領域（配列番号１４９）とつなぐことにより、ヒト化のｍＡｂ１－２５－Ｈｕモノクローナル抗体（６０９）の重鎖全長遺伝子および軽鎖全長遺伝子が得られた。
４Ｂ４－１－１（以下、「Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７」とも称する）は、ヒトＣＤ１３７を標的とするマウス由来のモノクローナル抗体であり、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＵＳ５９２８８９３の明細書に記載の配列番号１０及び配列番号１１であった。
Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列について解析を行い、ＫＡＢＡＴ法則に則ってＡｎｔｉ－ＣＤ１３７の重鎖および軽鎖の抗原相補性決定領域及びフレームワーク領域をそれぞれ確定した。Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列として、Ｈ－ＣＤＲ１がＳＹＷＭＨ（配列番号８５）であり、Ｈ－ＣＤＲ２がＥＩＮＰＧＮＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号８６）であり、Ｈ－ＣＤＲ３がＳＦＴＴＡＲＧＦＡＹ（配列番号８７）であり、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列として、Ｌ－ＣＤＲ１がＲＡＳＱＴＩＳＤＹＬＨ（配列番号８８）であり、Ｌ－ＣＤＲ２がＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号８９）であり、Ｌ－ＣＤＲ３がＱＤＧＨＳＦＰＰＴ（配列番号９０）であった。
マウス由来のＡｎｔｉ－ＣＤ１３７の重鎖可変領域については、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／においてヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ１－４６＊０１を選んで重鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来のＡｎｔｉ－ＣＤ１３７の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ１－４６＊０１のフレーム領域に移植し、かつＨ－ＣＤＲ３の後ろにＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５１）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の配列を得た。これと同様に、マウス由来のＡｎｔｉ－ＣＤ１３７の軽鎖可変領域についてもヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ６－２１＊０２を選んで軽鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来のＡｎｔｉ－ＣＤ１３７の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ６－２１＊０２のフレーム領域に移植し、かつＬ－ＣＤＲ３の後ろにＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５２）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の配列を得た。ＣＤＲ移植可変領域に基づき、一部のフレームワーク領域におけるアミノ酸サイトに復帰変異を導入した。復帰変異を導入する際、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。
好ましくは、ＣＤＲ移植重鎖可変領域に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第３０位のＴをＳ、第６９位のＭをＬ、第７１位のＲをＶ、第７３位のＴをＫにそれぞれ変更し、かつＣＤＲ移植軽鎖可変領域に対してもＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第４位のＬをＭ、第５８位のＶをＩ、第６９位のＴをＳにそれぞれ変更する。
上記サイト変異を抱える重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域とし、Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＶＨ及びＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＶＬ（配列番号９１及び配列番号９２）と名づけた。
上海生工バイオテック社に委託し、上記ヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成した。合成したヒト化の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の重鎖定常領域（配列番号１４８）をつなぎ、ヒト化重鎖の全長遺伝子を得てＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＨＣと名づけた。ヒト化の軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ鎖の定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、ヒト化軽鎖の全長遺伝子を得てＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＨＣ及びＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターにそれぞれ導入し、抗体を発現して精製し、得られた抗体をＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕと名づけた。
５．２）共通軽鎖の選定
６０９軽鎖可変領域について、ＢＬＡＳＴを利用してＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ軽鎖可変領域とアミノ酸配列解析を行ったところ、両者の間で完全に一致したアミノ酸が７３％（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を占め、物理化学特性において類似したアミノ酸が８８％（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を占めることが確認できた。
６０９及びＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣ及びＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＨＣ＋６０９－ＬＣの通りに組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣ及びＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＨＣ＋６０９－ＬＣと名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。つまり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１０３７７－Ｈ０８Ｈであり、Ｆｃタグ付きのヒトＣＤ１３７細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１００４１－Ｈ０２Ｈであった。本発明では、上記２つの組換えタンパク質をそれぞれＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃと標記し、ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃを用いてそれぞれＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は、何れも１０ｎｇ／ウェルであった。
図２３Ａに示すように、６０９及び６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣは、何れもＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１３５８ｎＭ及び０．２０６７ｎＭであり、Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ及びＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＨＣ＋６０９－ＬＣは、ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに結合することができなかった。また、図２３Ｂに示すように、Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕは、ＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃに効果的に結合し、ＥＣ５０が０．４６１ｎＭであり、６０９、６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣ及びＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＨＣ＋６０９－ＬＣは、ＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃに結合することができなかった。そのため、Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣ（配列番号９３及び配列番号９４）を共通軽鎖をとし、二重特異性抗体を作製することにした。
５．３）二重特異性抗体の作製
６０９の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介してＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して６０９－Ｆａｂ－１３７－ＩｇＧ４（配列番号９５及び配列番号９６）と名づけた。同様に、Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して６０９の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して１３７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４（配列番号９７及び配列番号９８）と名づけた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、さらに、６０９－Ｆａｂ－１３７－ＩｇＧ４及び１３７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４の発現ベクターを、それぞれＡｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣの発現ベクターと組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ６０９－Ｆａｂ－１３７－ＩｇＧ４及び１３７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４（便宜上、ここでは重鎖名で抗体を命名する）と名づけた。
５．４）ＥＬＩＳＡ法による相対親和力の測定
図２４Ａに示すように、６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ－ＬＣ、６０９－Ｆａｂ－１３７－ＩｇＧ４及び１３７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、何れもＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．２０６７ｎＭ、０．２２９３ｎＭ及び１．４１５ｎＭであった。また、図２４Ｂに示すように、Ａｎｔｉ－ＣＤ１３７－Ｈｕ、６０９－Ｆａｂ－１３７－ＩｇＧ４及び１３７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、何れもＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．４６１ｎＭ、０．３５７２ｎＭ及び０．２４２４ｎＭであった。このことから、６０９－Ｆａｂ－１３７－ＩｇＧ４及び１３７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、ＰＤ－１に加えてＣＤ１３７にも結合することができ、二重特異性抗体であることが確認できた。
実施例６：ＰＤ－１及びＣＤ４０を標的とする二重特異性抗体の作製
６．１）配列
６０９は、ヒトＰＤ－１を標的とするヒト化モノクローナル抗体であり、詳しくは上述の５．１を参照することができる。ＭＡｂ２．２２０（以下、「Ａｎｔｉ－ＣＤ４０」とも称する）は、ヒトＣＤ４０を標的とするマウス由来のモノクローナル抗体であり、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＵＳ６３１２６９３の明細書に記載の配列番号２及び配列番号１であった。
Ａｎｔｉ－ＣＤ４０抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して解析を行い、ＫＡＢＡＴ法則に従ってＡｎｔｉ－ＣＤ４０の重鎖および軽鎖の抗原相補性決定領域及びフレームワーク領域をそれぞれ確定した。Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列として、Ｈ－ＣＤＲ１がＴＴＧＭＱ（配列番号９９）であり、Ｈ－ＣＤＲ２がＷＩＮＴＨＳＧＶＰＫＹＶＥＤＦＫＧ（配列番号１００）であり、Ｈ－ＣＤＲ３がＳＧＮＧＮＹＤＬＡＹＦＡＹ（配列番号１０１）であり、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列として、Ｌ－ＣＤＲ１がＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号１０２）であり、Ｌ－ＣＤＲ２がＹＡＳＨＳＩＳ（配列番号１０３）であり、Ｌ－ＣＤＲ３がＱＨＧＨＳＦＰＷＴ（配列番号１０４）であった。
マウス由来Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の重鎖可変領域について、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／においてヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ７－４－１＊０２を選んで重鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ７－４－１＊０２のフレーム領域に移植し、かつＨ－ＣＤＲ３の後ろにＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５１）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の配列を得た。同様に、マウス由来Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の軽鎖可変領域についてもヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ３－１１＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲの移植テンプレートとし、マウス由来Ａｎｔｉ－ＣＤ４０の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ３－１１＊０１のフレーム領域に移植し、かつＬ－ＣＤＲ３の後ろにＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５２）を付けて第４フレームワーク領域とすることにより、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の配列を得た。ＣＤＲ移植可変領域に基づき、一部のフレームワーク領域におけるアミノ酸サイトに復帰変異を導入し、変異を導入する際、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。
好ましくは、ＣＤＲ移植重鎖の可変領域に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第２位のＶをＩ、第２８位のＴをＡ、第３９位のＱをＥ、第４８位のＭをＩ、第７６位のＳをＮ、第９３位のＡをＶにそれぞれ変更し、かつＣＤＲ移植軽鎖の可変領域に対してもＫＡＢＡＴ編集を行い、ＫＡＢＡＴナンバリング第４３位のＡをＳ、第４９位のＹをＫ、第６９位のＴをＳにそれぞれ変更する。
上記サイト変異を抱える重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域とし、Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＶＨ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＶＬ（配列番号１０５及び配列番号１０６）と名づけた。
上海生工バイオテック社に委託し、上記ヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成した。合成したヒト化重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の重鎖定常領域（配列番号１４８）をつなぎ、ヒト化重鎖の全長遺伝子を得たＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＨＣと名づけ、また、ヒト化軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ鎖の定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、ヒト化軽鎖の全長遺伝子を得たＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＨＣ遺伝子及びＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣ遺伝子を、それぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、抗体を発現して精製し、得られた抗体をＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕと名づけた。
６．２）共通軽鎖の選定
６０９軽鎖可変領域について、ＢＬＡＳＴを利用してＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ軽鎖可変領域とアミノ酸配列解析を行ったところ、両者の間で完全に一致したアミノ酸が９０％（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を占め、物理化学特性において類似したアミノ酸が９６％（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を占めることが確認できた。
６０９及びＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０９－ＬＣの通りに組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０９－ＬＣと名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。つまり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１０３７７－Ｈ０８Ｈであり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＣＤ４０細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１０７７４－Ｈ０８Ｈであった。本発明では、これら２つの組換えタンパク質をそれぞれＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＤ４０－ＥＣＤ－Ｈｉｓと標記し、ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＤ４０－ＥＣＤ－Ｈｉｓを用いてそれぞれＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は、何れも１０ｎｇ／ウェルであった。
図２５Ａに示すように、６０９及び６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣは、何れもＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１２６３ｎＭ及び０．１３８７ｎＭであり、Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０９－ＬＣは、ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに結合することができなかった。また、図２５Ｂに示すように、Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕは、ＣＤ４０－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０が０．１１０４ｎＭであり、６０９、６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣ及びＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＨＣ＋６０９－ＬＣは、何れもＣＤ４０－ＥＣＤ－Ｈｉｓに結合することができなかった。そのため、Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣ（配列番号１０７及び配列番号１０８）を共通軽鎖とし、二重特異性抗体を作製することにした。
６．３）二重特異性抗体の作製
６０９の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介してＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して６０９－Ｆａｂ－４０－ＩｇＧ４（配列番号１０９及び配列番号１１０）と名づけた。同様に、Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して６０９の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して４０－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４（配列番号１１１及び配列番号１１２）と名づけた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、さらに、６０９－Ｆａｂ－４０－ＩｇＧ４及び４０－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４の発現ベクターを、それぞれＡｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣの発現ベクターと組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ６０９－Ｆａｂ－４０－ＩｇＧ４及び４０－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４（便宜上、ここでは重鎖名で抗体を命名する）と名づけた。
６．４）ＥＬＩＳＡ法による相対親和力の測定
図２６Ａに示すように、６０９－ＨＣ＋Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ－ＬＣ、６０９－Ｆａｂ－４０－ＩｇＧ４及び４０－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、何れもＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１３８７ｎＭ、０．１７２３ｎＭ及び１．０１７ｎＭであり、また、図２６Ｂに示すように、Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－Ｈｕ、６０９－Ｆａｂ－４０－ＩｇＧ４及び４０－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、何れもＣＤ４０－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１１０４ｎＭ、０．１０４７ｎＭ及び０．０９５５６ｎＭであった。このことから、６０９－Ｆａｂ－４０－ＩｇＧ４及び４０－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、ＰＤ－１に加えてＣＤ４０にも結合することができ、二重特異性抗体であることが確認できた。
実施例７：ＰＤ－１及び他のタンパク質分子を標的とする二重特異性抗体の作製
７．１）配列
６０９は、ヒトＰＤ－１標的とするヒト化のモノクローナル抗体であり、詳しくは上述の５．１を参照することができる。一方、抗体製剤であるセツキシマブ、ベバシズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブなどの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１～２、および配列番号１１３～１１８）は、文献資料（Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ－Ｂｅｕｚｅｌｉｎ Ｃ，Ｋａａｓ Ｑ，Ｗｅｈｂｉ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ-ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００７，６４（３）：２１０－２２５）に既に報告されたものであった。また、１０Ｄ１（以下、「Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ」とも称する）は、ヒトＣＴＬＡ－４を標的とするモノクローナル抗体であり、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＵＳ２００２００８６０１４Ａ１の明細書に記載の配列番号１７および配列番号７（本発明では、配列番号１１９及び配列番号１２０）であった。
上海生工バイオテック社に委託し、上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成した。重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする配列を、それぞれヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（配列番号１４７）及びヒトＫａｐｐａ軽の鎖定常領域（配列番号１４９）とつなぐことで抗体の重鎖の全長遺伝子および軽鎖の全長遺伝子を作製した。上記抗体の重鎖遺伝子を、それぞれＣｅｔｕｘｉｍａｂ－ＨＣ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＨＣ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＨＣ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＨＣ及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＨＣと名づけ、上記抗体の軽鎖遺伝子をそれぞれＣｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣと名づけた。上記重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、名付けが対応する重鎖および軽鎖遺伝子を組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれＣｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ１及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１と名づけた。
５Ｅ７－Ｈｕは、ヒトＬＡＧ－３を標的とするヒト化抗体であり、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７６０２３の明細書に記載の配列番号２６および配列番号２８（本発明では、配列番号１２１及び配列番号１２２）であった。上海生工バイオテック社に委託し、上記ヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成した。合成したヒト化重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）重鎖定常領域（配列番号１４８）をつなぎ、ヒト化重鎖の全長遺伝子を得て５Ｅ７－Ｈｕ－ＨＣと名づけた。また、ヒト化の軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ鎖の定常領域（配列番号１４９）をつなぎ、ヒト化軽鎖の全長遺伝子を得て５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。５Ｅ７－Ｈｕ－ＨＣ遺伝子及び５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣ遺伝子を、それぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、抗体を発現して精製し、得られた抗体を新たに５Ｅ７－Ｈｕと名づけた。
７．２）共通軽鎖の選定
７．２．１）ハイブリッド抗体と抗原の結合親和力の測定
６０９の重鎖遺伝子と上記抗体の軽鎖遺伝子をそれぞれ組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣと名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。つまり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１０３７７－Ｈ０８Ｈであり、本発明では該組換えタンパク質をＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓと標記した。ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓを用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は、何れも１０ｎｇ／ウェルであった。図２７に示すように、Ｏｐｄｉｖｏ（ブリストル・マイヤーズスクイブ社製）、６０９、６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣは、何れもＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．２８８７ｎＭ、０．１１００ｎＭ、０．２４２４ｎＭ、０．１５３０ｎＭ、０．２２４４ｎＭ、０．１５４７ｎＭ及び０．１７０９ｎＭであった。一方、６０９－ＨＣ＋Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣは、ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに対して相対親和力が弱く、ＥＣ５０が０．７２１９ｎＭであった。このことから、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ（配列番号１２３及び配列番号１２４）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ（配列番号１２５及び配列番号１２６）、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ（配列番号１２７及び配列番号１２８）及び５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣ（配列番号１２９及び配列番号１３０）を共通軽鎖として関連の二重特異性抗体を作製することができる。このとき、同種対照物抗体としてＰＤ－１に結合しないヒトＩｇＧ４抗体を用いた。
７．２．２）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用に対するハイブリッド抗体の阻害効果評価
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用に対する抗体の阻害効果は、以下の通りに評価した。ヒトＦｃタグ付きのヒトＰＤ－１およびヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外領域ドメインは、ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１の明細書を参照しながら自ら調製し、これら２つの組換えタンパク質を、それぞれＰＤ１－ＥＣＤ－ｈＦｃ及びＰＤ－Ｌ１－ＥＣＤ－ｈＦｃと標記した。ビオチン化試薬であるビオチンｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ社製、物品番号／仕様規格Ｈ１７５９－１００ＭＧ）を、無水ＤＭＳＯを用いて濃度１００ｍＭの母液に調製し、ＰＤ－Ｌ１－ＥＣＤ－ｈＦｃは、分子量および溶液濃度に基づいて物質量濃度に換算した。ＰＤ－Ｌ１－ＥＣＤ－ｈＦｃ融合タンパク質の溶液を適宜取って、物質量を算出した後、それぞれビオチンｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルと１：２０の割合で均一に混ぜ合わせ、室温、１時間静置して標識を行った。透析を行い、紫外線分光法を利用してタンパク質の濃度を測定した。そして、ヒトＰＤ－１－ＥＣＤ－ｈＦｃを被覆用緩衝液で希釈して濃度が２μｇ／ｍＬになるようにし、ピペットで吸い取って９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ加え、室温で４時間インキュベートした。ＰＢＳＴで１回洗い流した後、各ウェルに１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴを２００μＬ加え、室温で２時間インキュベートすることによりブロッキング処理を行った。プレートを軽く叩いてブロッキング液を取り除き、次の処理に備えて４℃に一時保管した。９６ウェルプレートにおいて、ビオチン化のＰＤ－Ｌ１－ＥＣＤ－ｈＦｃを１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳＴ溶液で希釈して濃度が５００ｎｇ／ｍＬになるようにし、上記希釈済みのビオチン化融合タンパク質を用いてＰＤ－１抗体を段階的に希釈して濃度勾配を形成した。上記希釈済みの抗体とビオチン化融合タンパク質の混合溶液を、上記ヒトＰＤ－１－ＥＣＤ－ｈＦｃを被覆したＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗い流し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１０００の倍率に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えて室温、４５分間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗い流した。各ウェルにＴＭＢを基質とする着色液を１００μＬ加え、室温で１～５分間インキュベートした後、停止液を５０μＬ加えて着色反応を停止した。プレートリーダーを用いてＯＤ４５０値を読み出し、得られた測定データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析グラフを作成し、ＩＣ５０を算出した。
図２８に示すように、Ｏｐｄｉｖｏ、６０９、６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣは、何れもＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を効果的に阻害することができ、ＩＣ５０がそれぞれ０．０５７２９ｎＭ、０．１３０９ｎＭ、０．１１９９ｎＭ、０．１１９１ｎＭ、０．１１６２ｎＭ、０．０９８７６ｎＭ、０．１０５２ｎＭ及び０．１３１２ｎＭであった。このとき、同種対照物抗体としてＰＤ－１に結合しないヒトＩｇＧ４抗体を用いた。
７．２．３）混合リンパ球反応に対するハイブリッド抗体の亢進効果評価
さらに、混合リンパ球反応に対する上記抗体の亢進効果を測定した。図２９に示すように、６０９、６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣは、何れも混合リンパ球反応亢進させてＩＬ－２分泌を促すことができ、ＥＣ５０がそれぞれ０．０８６２３ｎＭ、０．２５１０ｎＭ、０．１２１１ｎＭ、０．５１７１ｎＭ、０．２０４０ｎＭ及び０．０９１０１ｎＭであった。一方、６０９－ＨＣ＋Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣは、混合リンパ球反応およびＩＬ－２分泌に対して刺激効果を示さなかった。この実験では、同種対照物抗体としてＰＤ－１に結合しないヒトＩｇＧ４抗体を用いた。
７．２．４）細胞表面ＰＤ－１に対するハイブリッド抗体の結合性能評価
フローサイトメトリー法を利用し、細胞表面ＰＤ－１に対するハイブリッド抗体の結合性能を評価した。ＰＤ－１を発現するＴＦ－１細胞株は、以下のように樹立した。具体的には、ヒトＰＤ－１の全長遺伝子配列として、ＵｎｉＰｒｏｔで登録番号Ｑ１５１１６の配列を用い、該遺伝子配列をレンチウイルス発現ベクターであるｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に導入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、物品番号Ｌ３０００００１）を用い、レンチウイルス用パッケージングベクター及び目的遺伝子を含むｐＬＶＸ－ＰｕｒｏをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、物品番号Ｒ７０００７）に導入し、４８時間インキュベートした。細胞培養液を遠心して上澄み液を回収し、０．４５μｍのフィルタメンブレンでろ過して細胞残骸を除去した。上記ウイルス粒子を含む上澄み液でＴＦ－１細胞（社製ＡＴＣＣ、物品番号ＣＲＬ－２００３ＴＭ）を感染し、４８時間後にピューロマイシンで細胞を処理し、スクリーニングによって目的遺伝子を安定に発現する細胞株を選出し、ＰＤ－１を安定に発現するＴＦ－１細胞株をＴＦ１－ＰＤ１と名づけた。
細胞に対する抗体の結合は、フローサイトメトリー法を利用して以下のように測定した。具体的には、ＴＦ１－ＰＤ１細胞を、９６ウェル丸底プレートに１ウェル当たり２０万個細胞接種し、遠心して上澄み液を捨て、段階的に希釈した抗体を加えて室温、約３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗い流し、遠心して上澄み液を捨て、適宜希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ －ＦＩＴＣ抗体（Ｆｃ特異的なものであり、Ｓｉｇｍａ社製、物品番号Ｆ９５１２）を各ウェルに加えて室温、約３０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗い流した。上澄み液を捨て、固定用緩衝液Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えて室温、５分間インキュベートすることにより細胞を固定した後、細胞をＰＢＳで２回洗い流し、最後に２００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁した。フローサイトメーターにおいてＦＩＴＣチャンネルの蛍光強度を測定し、フローサイトメーターに搭載のソフトを用いて測定データを処理してからＥｘｃｅｌデータに変換し、そしてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６でＥｘｃｅｌデータを処理して解析グラフを作成し、ＥＣ５０を算出した。
図３０に示すように、６０９、６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣは、何れも細胞表面のＰＤ－１に効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．３７６１ｎＭ、０．５７７ｎＭ、０．５１９３ｎＭ、０．４３０２ｎＭ、０．４７７３ｎＭ及び０．３８６４ｎＭであった。そのうち６０９－ＨＣ＋Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣは、他のハイブリッド抗体に比べ、ＴＦ１－ＰＤ１に対する結合が顕著に低下した。この実験では、同種対照物抗体としてＰＤ－１に結合しないヒトＩｇＧ４抗体を用いた。
７．２．５）６０９とＰＤ－１の結合に対する６０９軽鎖可変領域ＣＤＲの作用
以上の実験結果から、６０９の重鎖と別の抗体軽鎖を組み合わせたハイブリッド抗体もＰＤ－１分子に効果的に結合し、かつＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害し、および混合リンパ球反応や、細胞表面ＰＤ－１への結合を亢進できることが実証された。この実験では、アラニンスキャニング技術を利用し、６０９とＰＤ－１の結合に対する６０９軽鎖可変領域ＣＤＲの作用を評価した。具体的には、６０９軽鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸残基をそれぞれアラニン残基に変換し、このときＣＤＲ本来固有のアラニン残基については変換せずにそのまま残した。６０９重鎖を軽鎖変異体とそれぞれ組み合わせ、以上で説明した方法に従って抗体を発現して精製し、さらに、上述のＥＬＩＳＡ法を利用してＰＤ－１に対する抗体の相対親和力を測定した。測定結果を、下記表３に纏めて示す。表３において、６０９－ＨＣ＋６０９－ＬＣ－Ｒ２４ＡにおけるＲ２４Ａとは、第２４位のアルギニン残基をアラニン残基に変換したことを意味し、この実験でもアミノ酸残基の位置は、ＫＡＢＡＴナンバリングで表示される。
Figure 2022153280000002
図３１及び表４に示すように、アラニンスキャニングの実験結果から、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸残基をそれぞれアラニン残基に変換しても抗体とＰＤ－１の結合に対して明らかな影響を示さず、６０９が主に重鎖を利用してＰＤ－１分子に結合し、６０９とＰＤ－１の結合が６０９の軽鎖にさほど依存しないことが実証された。
７．３）ＰＤ－１及びＥＧＦＲを標的とする二重特異性抗体の作製
６０９の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介してＣｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ１の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４（配列番号１３１及び配列番号１３２）と名づけた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４の発現ベクターとＣｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣの発現ベクター組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体を６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４（便宜上、ここでは重鎖名で抗体を命名する）と名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１０３７７－Ｈ０８Ｈ）であり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＥＧＦＲ細胞外領域ドメインもＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１０００１－Ｈ０８Ｈであった。本発明では、これら２つの組換えタンパク質をＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＥＧＦＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓと標記し、ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＥＧＦＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓをそれぞれ用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は、それぞれ１０ｎｇ／ウェル及び２０ｎｇ／ウェルであった。
図３２Ａに示すように、６０９－ＨＣ＋Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＬＣ及び６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４は、何れもＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．７１７２ｎＭ及び０．２６１６ｎＭであった。また、図３２Ｂに示すように、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ１及び６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４は、何れもＥＧＦＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．０７６０９ｎＭ及び０．０９３２７ｎＭであった。この結果から、６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４は、ＰＤ－１に加えてＥＧＦＲにも結合することができ、二重特異性抗体であることが実証された。
７．４）ＰＤ－１及びＨＥＲ－２を標的とする二重特異性抗体の作製
６０９の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介してＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ１の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４（配列番号１３３及び配列番号１３４）と名づけた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４の発現ベクターとＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣの発現ベクターを組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体を６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４（便宜上、ここでは重鎖名で抗体を命名する）と名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１０３７７－Ｈ０８Ｈであり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＨｅｒ－２細胞外領域ドメインは、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製であり、物品番号がＨＥ２－Ｈ５２２５であった。本発明では、これら２つの組換えタンパク質をＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓと標記し、ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓをそれぞれ用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は、何れも１０ｎｇ／ウェルであった。
図３３Ａに示すように、６０９－ＨＣ＋Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＬＣ及び６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４は、何れもＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１４２２ｎＭ及び０．１１９６ｎＭであった。また、図３３Ｂに示すように、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ１及び６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４は、何れもＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．５３５２ｎＭ及び２．６１６ｎＭであった。この結果から、６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４は、ＰＤ－１に加えてＨＥＲ－２にも結合することができ、二重特異性抗体であることが実証された。
７．５）ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体の作製
７．５．１）二重特異性抗体の作製
６０９の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介してＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖遺伝子を作製して６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１（配列番号１３５及び配列番号１３６）と名づけた。同様に、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して６０９の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖遺伝子を作製してＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１（配列番号１３７及び配列番号１３８）と名づけた。
６０９の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介してＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４（配列番号１３９及び配列番号１４０）と名づけた。同様に、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して６０９の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製してＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４（配列番号１４１及び配列番号１４２）と名づけた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、さらに、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４の発現ベクターを、それぞれＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣの発現ベクターと組み合わせ、抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４（便宜上、ここでは重鎖名で抗体を命名する）と名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１０３７７－Ｈ０８Ｈ）、ヒトＦｃタグ付きのヒトＣＴＬＡ－４細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１１１５９－Ｈ３１Ｈ５であった。本発明では、これら２つの組換えタンパク質をＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＴＬＡ４－ＥＣＤ－Ｆｃと標記し、ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＴＬＡ４－ＥＣＤ－Ｆｃをそれぞれ用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は，何れも１０ｎｇ／ウェルであった。
図３４Ａに示すように、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、何れもＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．２３３７ｎＭ、０．１７３４ｎＭ、０．７９５４ｎＭ、０．２０７８ｎＭ及び０．９６４３ｎＭであった。また、図３４Ｂに示すように、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、何れもＣＴＬＡ４－ＥＣＤ－Ｆｃに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．８３５４ｎＭ、２．１２３ｎＭ、０．３３７６ｎＭ、２．６２６ｎＭ及び０．３９２ｎＭであった。これらの結果から、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、ＰＤ－１に加えてＣＴＬＡ－４にも結合することができ、二重特異性抗体であることが実証された。
７．５．２）ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体の生体活性評価
ＲＰＭＩ１６４０に１０％のウシ胎児血清、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１％のピルビン酸ナトリウム、１のＨＥＰＥＳ、０．１％の２－メルカプトエタノール、１％のペニシリン－ストレプトマイシン及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントを加えＲＰＭＩ１６４０完全培地を調製し、これらの試薬は、何れもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製であった。該ＲＰＭＩ１６４０完全培地を用い、新たに分離したＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、物品番号ＰＢ００５－Ｃ）を洗い流してから再懸濁し、さらに、スーパー抗原として一定量のブドウ球菌腸毒素Ｂ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ，ＳＥＢ）を加えた。該スーパー抗原は、アミノ酸配列がｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０１５５２に登録され、本発明者が大腸菌を使って自ら調製したものであった。９６ウェルの丸底細胞培養プレートに、ＰＢＭＣ細胞懸濁液を１ウェル当たり１５０μＬずつ、２０万個細胞の量で播種し、さらに、段階的に希釈した抗体を５０μＬ加えて３７℃のインキュベーターにおいて４日間インキュベートした。９６ウェルプレートから適量の上澄み液を取って、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用して標準操作マニュアルに従って上澄み液に含まれるＩＬ－２量を測定することでＩＬ－２の分泌量を検出した。また、この実験で使用するペアリング抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製であり、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０プレートリーダーを用いてＯＤ４５０値を測定し、得られた測定データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で処理して解析グラフを作成し、ＥＣ５０を算出した。
Figure 2022153280000003
図３５及び上記表４に示すように、６０９、６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１は、ＥＣ５０および活性数値（Ｔｏｐ値）が特に高く、これら３つの抗体が同等の生体活性を有することが確認できた。また、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体の生体活性は、高い順から６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１＞Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１＞６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４＞Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４であり、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１は、生体活性において明らかにモノクローナル抗体である６０９及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１、およびハイブリッド抗体である６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣを上回り、かつ生体活性が６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣとＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１を併用する場合と同等のレベルであることが確認できた。また、上記表５において、「６０９－ＨＣ＋Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＬＣ／Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１」とは、２つの抗体を１：１の物質量比で併用する場合を意味する。
７．５．３）ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性評価
抗体依存性細胞介在性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、ヒトＩｇＧ抗体が抱える普遍的な機能であり、ＡＤＣＣ活性は、抗体のサブタイプに緊密に関連する。ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４を標的とするＩｇＧ１サブタイプの二重特異性抗体は、ＰＤ－１を発現する細胞に対して潜在的な細胞毒性を示す可能性がある。そのため、新たに分離したＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、物品番号ＰＢ００５－Ｃ）をエフェクター細胞とし、かつＰＤ－１を発現するＴＦ－１細胞を標的細胞としてＡＤＣＣ活性を測定した。
図３６に示すように、ＩｇＧ４同種対照物抗体（すなわち、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４に結合しないモノクローナル抗体）は、ＡＤＣＣ活性を示さず、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１も明らかなＡＤＣＣ作用を示さなかった。その原因としては、ＴＦ１－ＰＤ１細胞がＣＴＬＡ－４を発現しないことが考えられる。６０９は、重鎖定常領域がＩｇＧ４サブタイプであり、ＡＤＣＣ活性が弱く、標的細胞の溶解が約１０％の程度に止まった。一方。６０９－ＩｇＧ１は、６０９の重鎖定常領域をＩｇＧ１サブタイプに入れ替えたため、やや強いＡＤＣＣ活性を示し、標的細胞の溶解は最高で約５０％の程度に達した。このことから、重鎖定常領域がＩｇＧ４サブタイプなのか、またはＩｇＧ１サブタイプなのかによってＡＤＣＣ活性に段差が生じ、ＩｇＧ１の場合、ＩｇＧ４に比べてより強いＡＤＣＣ活性を示すことが確認できた。また、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１は、６０９に類似したＡＤＣＣ活性を示し、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１は、６０９－ＩｇＧ１に類似したＡＤＣＣ活性を示した。６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１は、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１に比べてＡＤＣＣ活性が顕著に低下し、両者のＡＤＣＣ活性の差異は、二重特異性抗体の立体配置形態によるものと考えられる。
７．５．４）ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４と標的する二重特異性抗体のラット体内における薬物動態学評価
ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４と標的する二重特異性抗体のラット体内における薬物動態学特性は、ＥＬＩＳＡプレートを被覆する抗原として、上記７．５．１で調製したＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体に対応する２つの抗原ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＴＬＡ４－ＥＣＤ－Ｆｃを用いた以外、上述の１．７．５と同様にして評価を行った。
図３７に示すように、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１は、ＰＤ－１を抗原とした場合に半減期が１５．２日であり、ＣＴＬＡ－４を抗原とした場合に半減期が１４．６であった。この結果から、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１が良好な薬物動態学特性を有することが確認できた。
７．５．５）ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする二重特異性抗体のマウス体内における抗腫瘍効果
ヒトＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ダブルトランスジェニックマウス（品種背景：Ｃ５７ＢＬ／６）は、北京Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ社により購入し、ＭＣ３８マウス大腸がん細胞株は、広州ＪｅｎｎｉｏＢｉｏｔｅｃｈ社により購入した。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ダブルトランスジェニックマウスにおいて、ヒト由来のＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４遺伝子の細胞外領域部分でマウスの相同性部分を置き換えたため、本発明の二重特異性抗体は、該トランスジェニックマウスのＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を認識して結合することができる。実験は、以下の通りに行われた。１０％の血清を含むＤＭＥＭ培地を用い、体外においてＭＣ３８を培養し、このときの血清及び培地は、何れもＧｉｂｃｏ社製であった。培養によって増殖したＭＣ３８細胞を、ヒトＰＤ－１トランスジェニックマウスに１匹当たり２×１０６個細胞、皮下注射にて接種した。接種した腫瘍細胞が体積約１００ｍｍ３にまで生長すると、マウスをランダムで幾つかの組に分け、各組にマウス８匹ずつ配分した。各組のマウスへの投与は、対照組に生理食塩水、６０９組に１０ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１抗体である６０９、Ｙｅｒｖｏｙ組に１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ－４陽性対照物抗体であるＹｅｒｖｏｙ（ブリストル・マイヤーズスクイブ社製）、６０９＋Ｙｅｒｖｏｙ組に１０ｍｇ／ｋｇの６０９及び１０ｍｇ／ｋｇのＹｅｒｖｏｙ、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１組に１６ｍｇ／ｋｇの６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１をそれぞれ注射することにより行われた。二重特異性抗体とモノクローナル抗体は、分子量が異なるため、本実験では抗体を物質量に換算し、各抗体を同じ物質量で投与した。そして、上述の投与計画に従って週２回の頻度で合計４回投与し、腫瘍体積については毎週２回測定した。最後に、各組の腫瘍生長状況を時系列に従って整理し、図３８に示すような生長グラフを作成した。
腫瘍抑制率は、［腫瘍抑制率＝（対照組の平均腫瘍体積－実験組の平均腫瘍体積）／対照組の平均腫瘍体積×１００％］に従って算出し、１４日目の実験終了時点で６０９組、Ｙｅｒｖｏｙ組、６０９＋Ｙｅｒｖｏｙ組及び６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１組の腫瘍抑制率がそれぞれ４８．６％、７９．１％、８５．９％、９２．２％であった。また、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１は、６０９及びＹｅｒｖｏｙを単独投与する場合に比べて腫瘍生長をより効果的に抑制し、かつ６０９とＹｅｒｖｏｙを併用する場合と同等の抑制効果を示すことが確認できた。
７．６）ＰＤ－１及びＬＡＧ－３を標的とする二重特異性抗体の作製
７．６．１）二重特異性抗体の作製
６０９の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して５Ｅ７－Ｈｕの重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４（配列番号１４３及び配列番号１４４）と名づけた。同様に、５Ｅ７－Ｈｕの重鎖可変領域とヒトＩｇＧ４のＣＨ１構造ドメインをつなぎ、そして人工リンカーとしてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して６０９の重鎖可変領域を付け、最後にヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ヒンジ領域にサイト変異としてＳ２２８Ｐを含む）を付けることにより、２つの重鎖可変領域及び２つのＣＨ１構造ドメインを含む長い重鎖を作製して５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４（配列番号１４５及び配列番号１４６）と名づけた。
上記配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入し、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４及び５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４の発現ベクターを、それぞれ５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣの発現ベクターと組み合わせ、上述の方法を利用して抗体を発現して精製し、得られた抗体をそれぞれ６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４及び５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４（便宜上、ここでは重鎖名で抗体を命名する）と名づけた。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。Ｈｉｓタグ付きのヒトＰＤ－１細胞外領域ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１０３７７－Ｈ０８Ｈであり、Ｈｉｓタグ付きのヒトＬＡＧ－３細胞外領域ドメインもＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、物品番号が１６４９８－Ｈ０８Ｈであった。本発明では、これら２つの組換えタンパク質をＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＬＡＧ３－ＥＣＤ－Ｈｉｓと標記し、ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＬＡＧ３－ＥＣＤ－Ｈｉｓをそれぞれ用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、被覆濃度は、何れも１０ｎｇ／ウェルであった。
図３９Ａに示すように、６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣ、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４及び５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、何れもＰＤ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１５２３ｎＭ、０．１６１ｎＭ及び０．８１３８ｎＭであった。また、図３９Ｂに示すように、５Ｅ７－Ｈｕ、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４及び５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、何れもＬＡＧ３－ＥＣＤ－Ｈｉｓに効果的に結合し、ＥＣ５０がそれぞれ０．１４７２ｎＭ、０．２０８２ｎＭ及び０．１５２９ｎＭであった。この結果から、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４及び５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４は、ＰＤ－１に加えてＬＡＧ－３にも結合することができ、両者が何れも二重特異性抗体であることが実証された。
７．６．２）ＰＤ－１及びＬＡＧ－３に対する二重特異性抗体の結合能力評価
マイクロプレートは、ＬＡＧ３－ＥＣＤ－Ｈｉｓを用いて被覆し、測定用抗体は、１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴで段階的に希釈して濃度勾配を形成し、上記被覆済みのマイクロプレートに加えて室温で約３０分間インキュベートした。そして、上記１．７．４と同様にして実験を行った。
図４０に示すように、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４は、ＬＡＧ－３に結合した後でもヒトＰＤ－１に効果的に結合し、ＥＣ５０が０．５２９４ｎＭであった。一方、５Ｅ７－Ｈｕ及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣ両者は、何れもＰＤ－１及びＬＡＧ－３に同時に結合することができなかった。
７．６．３）ＰＤ－１及びＬＡＧ－３を標的とする二重特異性抗体の生体活性評価
本実験では、上記７．５．２に記載の方法に従ってＰＤ－１及びＬＡＧ－３を標的とする二重特異性抗体の生体活性を評価した。
Figure 2022153280000004
図４１及び表５に示すように、ＩＬ－２の分泌に対し、５Ｅ７－Ｈｕの刺激効果が特に弱かった。一方、６０９及び６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣは、ＥＣ５０及び実測値（Ｔｏｐ値）が同等のレベルにあり、両者が類似した生体活性を有することが確認できた。濃度が１ｎＭを越えるとき、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４は、モノクローナル抗体である５Ｅ７－Ｈｕ及び６０９、およびハイブリッド抗体である６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣに比べてＩＬ－２の分泌をより効果的に刺激し、かつ５Ｅ７－Ｈｕと６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣを併用する場合と類似した刺激効果を示した。また、表５において「５Ｅ７－Ｈｕ／６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣ」とは、５Ｅ７－Ｈｕと６０９－ＨＣ＋５Ｅ７－Ｈｕ－ＬＣを１：１の物質量比で併用する場合を意味する。
７．６．４）ＰＤ－１及びＬＡＧ－３を標的とする二重特異性抗体のマウス体内における抗腫瘍効果
ヒトＰＤ－１／ＬＡＧ－３ダブルトランスジェニックマウス（品種背景：Ｃ５７ＢＬ／６）は、北京Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ社により購入し、ＭＣ３８マウス大腸がん細胞株は、広州ＪｅｎｎｉｏＢｉｏｔｅｃｈ社により購入した。ＰＤ－１／ＬＡＧ－３ダブルトランスジェニックマウスにおいて、ヒト由来のＰＤ－１及びＬＡＧ－３遺伝子の細胞外領域部分でマウスの相同性部分を置き換えたため、本発明の二重特異性抗体は、該トランスジェニックマウスのＰＤ－１及びＬＡＧ－３を認識して結合することができる。実験は、以下の通りに行われた。１０％の血清を含むＤＭＥＭ培地を用い、体外においてＭＣ３８を培養し、このときの血清及び培地は、何れもＧｉｂｃｏ社製であった。培養によって増殖したＭＣ３８細胞を、ヒトＰＤ－１トランスジェニックマウスに１匹当たり２×１０６個細胞、皮下注射にて接種した。接種した腫瘍細胞が体積約１００ｍｍ３にまで生長すると、マウスをランダムで幾つかの組に分け、各組にマウス８匹ずつ配分した。各組のマウスへの投与は、対照組に生理食塩水、６０９組に２０ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１抗体である６０９、５Ｅ７－Ｈｕ組に２０ｍｇ／ｋｇのＬＡＧ－３抗体である５Ｅ７－Ｈｕ、６０９＋５Ｅ７－Ｈｕ組に２０ｍｇ／ｋｇの６０９および２０ｍｇ／ｋｇの５Ｅ７－Ｈｕ、および６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４組に３２ｍｇ／ｋｇの６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４をそれぞれ注射することにより行われた。二重特異性抗体とモノクローナル抗体は、分子量が異なるため、本実験では抗体を物質量に換算し、各抗体を同じ物質量で投与した。そして、上述の投与計画に従って週２回の頻度で合計４回投与し、腫瘍体積については毎週２回測定した。最後に、各組の腫瘍生長状況を時系列に従って整理し、図４２に示すような生長グラフを作成した。
腫瘍抑制率は、［腫瘍抑制率＝（対照組の平均腫瘍体積－実験組の平均腫瘍体積）／対照組の平均腫瘍体積×１００％］に従って算出し、１４日目の実験終了時点で６０９組、５Ｅ７－Ｈｕ組、６０９＋５Ｅ７－Ｈｕ組及び６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４組の腫瘍抑制率がそれぞれ７０．８％、１３．１％、７１．５％及び８２．８％であった。また、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４は、６０９や５Ｅ７－Ｈｕを単独投与する場合に比べて腫瘍生長をより効果的に抑制し、６０９と５Ｅ７－Ｈｕの併用は、６０９の単独投与に比べてより優れた抑制効果が見られなかった。これらの結果から、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４は、ＰＤ－１及びＬＡＧ－３を標的とする二重特異性抗体として相乗効果を奏することが確認できた。
７．７）ハイブリッド抗体の特異性に対する評価
ＥＬＩＳＡ法による測定は、以下のように行われた。上述の抗原ＥＧＦＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓ、ＶＥＧＦ１６５－Ｈｉｓ、ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓ、ＬＡＧ３－ＥＣＤ－Ｈｉｓ及びＣＴＬＡ４－ＥＣＤ－Ｆｃをそれぞれ用い、かつ上述の実験条件下でＥＬＩＳＡプレートを被覆し、６０９の重鎖と他の抗体の軽鎖を組み合せたハイブリッド抗体がこれらの標的を認識できるかどうかを確認した。本実験において、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ１、６０１、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ１、５Ｅ７－Ｈｕ及びＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１などの抗体は、由来が以上で説明した通りであり、各抗原に結合する陽性対照物抗体として用いた。そのうち、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ１は、可変領域が上記７．１で説明した通りであり、定常領域がＩｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１と同じく、他の抗体と同様にして作製したものであった。
図４３Ａ～図４３Ｅに示すように、６０９の重鎖と他の抗体の軽鎖を組み合せたハイブリッド抗体は、他の標的を認識できず、これらのハイブリッド抗体が良好な特異性を有することが確認できた。
７．８）ＨＰＬＣ－ＳＥＣ
図４４Ａは、６０９－Ｆａｂ－Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が９９．１３％であり、図４４Ｂは、６０９－Ｆａｂ－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が９９．２％であり、図４４Ｃは、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が９９．３％であり、図４４Ｄは、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ１のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が９９．２％であり、図４４Ｅは、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が９９．３％であり、図４４Ｆは、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が９９．１％であり、図４４Ｇは、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が９９．２％であり、かつ図４４Ｈは、５Ｅ７－Ｆａｂ－６０９－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が９９．０％であった。
７．９）ＨＰＬＣ－ＩＥＣ
図４５Ａは、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が８３．５２％であった。この結果から、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１が良好な電荷異質性を有することが確認できた。
図４５Ｂは、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルであり、主要ピークの占有割合が８５．４３％であった。この結果から、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４が良好な電荷異質性を有することが確認できた。
７．１０）ＣＥ－ＳＤＳ
図４６Ａ～図４６Ｂは、それぞれ６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルであり、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて、主要ピークに当たるピーク１３の占有割合が９７．０２％であり、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて、２つの主要ピークとしてピーク２（軽鎖に対応するピーク）及びピーク１２（長い重鎖に対応するピーク）の占有割合がそれぞれ３９．１４％、５９．１３％であり、両ピークの面積比が２：３．０であった。また、６０９－Ｆａｂ－Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１の軽鎖と長い重鎖のピーク面積比は、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて所期通りの数値を示した。
図４６Ｃ～図４６Ｄは、それぞれ６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ及びＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルであり、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて、主要ピークに当たるピーク１１の占有割合が９４．７３％であり、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて、２つの主要ピークとしてピーク７（軽鎖に対応するピーク）及びピーク１６（長い重鎖に対応するピーク）の占有割合がそれぞれ３８．３２％、５９．５８％であり、両ピークの面積比が２：３．１であった。また、６０９－Ｆａｂ－５Ｅ７－ＩｇＧ４の軽鎖と長い重鎖のピーク面積比は、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルにおいて所期通りの数値を示した。

Claims (9)

  1. ＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とした四価二重特異性抗体であって、
    前記四価二重特異性抗体は、２つのポリペプチド鎖及び４つの共通軽鎖を含み、
    前記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号２１で表され、前記共通軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１３で表されることを特徴とする、四価二重特異性抗体。
  2. 単離されたヌクレオチドであって、
    ＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とし、かつ２つのポリペプチド鎖及び４つの共通軽鎖を含む請求項１に記載の四価二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド。
  3. 前記ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２で表され、
    前記共通軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４で表される、請求項２に記載のヌクレオチド。
  4. 請求項２又は請求項３に記載のヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
  5. 請求項２又は請求項３に記載のヌクレオチド、又は請求項４に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
  6. 請求項１に記載のＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とした四価二重特異性抗体を含んでなることを特徴とする、薬物組成物。
  7. 請求項１に記載のＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とした四価二重特異性抗体又は請求項６に記載の薬物組成物の、がん、炎症性疾患および自己免疫性疾患を治療するための薬物の製造における用途。
  8. ＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とする前記四価二重特異性抗体又は前記薬物組成物は、がんの治療に用いられる、請求項７に記載の用途。
  9. 請求項１に記載のＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とした四価二重特異性抗体を製造する方法であって、
    請求項４に記載の発現ベクターを構築し、ホスト細胞に導入するステップａと、
    ステップａで得られた前記ホスト細胞を発現条件下で培養することにより、ＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とする前記四価二重特異性抗体を発現するステップｂと、
    ステップｂで発現したＰＤ－１とＶＥＧＦを標的とする前記四価二重特異性抗体を分離、精製するステップｃと
    を含むことを特徴とする、製造方法。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113563473A (zh) * 2020-04-29 2021-10-29 三生国健药业（上海）股份有限公司 四价双特异性抗体、其制备方法和用途
KR20240101664A (ko) * 2021-11-19 2024-07-02 메뤼스 엔.페. Pd-1 및 tgf-brii 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 결합 모이어티
US20240101718A1 (en) * 2022-09-28 2024-03-28 Incyte Corporation Anti-pd-1/lag-3 bispecific antibodies and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009131239A1 (ja) * 2008-04-25 2009-10-29 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 安定な多価抗体

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5571714A (en) 1988-12-22 1996-11-05 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies which bind both transforming growth factors β1 and β2 and methods of use
ATE226641T1 (de) 1995-04-08 2002-11-15 Lg Chemical Ltd Humaner 4-1bb spezifischer humaner antikörper und diesen produzierende zellinie
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
WO2000053634A1 (fr) 1999-03-10 2000-09-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fv monocatenaire induisant l'apoptose
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
IL151853A0 (en) * 2000-04-11 2003-04-10 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
EP3623473A1 (en) 2005-03-31 2020-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007044887A2 (en) * 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
ES2379194T3 (es) 2005-12-23 2012-04-23 Eli Lilly And Company Anticuerpos de unión a TGF-beta
AR091116A1 (es) * 2012-05-22 2015-01-14 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos biespecificos y sus metodos de uso
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
MX2015012059A (es) * 2013-03-15 2016-01-12 Merck Patent Gmbh Anticuerpos biespecificos tetravalentes.
US10465006B2 (en) * 2013-07-05 2019-11-05 Genmab A/S Humanized or chimeric CD3 antibodies
CN105612182B (zh) * 2013-10-11 2019-12-10 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性结构域交换共有可变轻链抗体
KR102056963B1 (ko) 2013-12-30 2019-12-17 에피맙 바이오테라퓨틱스 인코포레이티드 Fabs-인-탠덤 면역글로불린 및 이의 용도
KR20170087486A (ko) * 2014-11-20 2017-07-28 에프. 호프만-라 로슈 아게 일반 경쇄 및 이의 사용 방법
EA201791121A1 (ru) * 2014-11-20 2018-04-30 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Активирующие т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы против folri и cd3
CN105820251B (zh) * 2015-01-08 2019-10-15 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
US11447575B2 (en) * 2015-12-18 2022-09-20 Biogen Ma Inc. Bispecific antibody platform
EP3411068A4 (en) * 2016-02-02 2020-01-29 Kadmon Corporation, LLC BISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR PD-L1 AND KDR
WO2017186950A1 (en) * 2016-04-28 2017-11-02 Biomunex Pharmaceuticals Bispecific antibodies targeting egfr and her2
JP7274413B2 (ja) * 2016-09-23 2023-05-16 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ラムダ及びカッパ軽鎖を含む多重特異性抗体分子
JP7269167B2 (ja) * 2016-10-14 2023-05-08 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド モジュラー四価二重特異性抗体プラットフォーム
CA3048467A1 (en) * 2016-12-29 2018-07-05 Development Center For Biotechnology Klk6-mediated cns-specific antibody prodrug activation
TWI787230B (zh) 2017-01-20 2022-12-21 法商賽諾菲公司 抗ＴＧＦ-β抗體及其用途
CN108341871A (zh) 2017-01-24 2018-07-31 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用
KR101961871B1 (ko) * 2017-02-20 2019-07-17 주식회사 와이바이오로직스 신규 다중특이적 결합 단백질
MX2020000055A (es) * 2017-07-06 2020-08-06 Merus Nv Anticuerpos biespecificos antiproteina 1 de muerte celular programada (pd-1) -anti inmunoglobulina de celulas t y dominio de mucina que contiene -3 (tim-3).
EP3658193A1 (en) * 2017-07-24 2020-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd8 antibodies and uses thereof
CN109385445A (zh) * 2017-08-09 2019-02-26 北京睿诚海汇健康科技有限公司 植物作为宿主在表达贝伐抗体中的应用
MX2020003145A (es) 2017-09-22 2020-07-29 Wuxi Biologics Ireland Ltd Nuevos complejos de polipeptidos biespecificos.
JP2021502100A (ja) * 2017-11-08 2021-01-28 ゼンコア インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体
EP3720881A1 (en) * 2017-12-08 2020-10-14 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules and uses thereof
US20200354457A1 (en) * 2018-01-31 2020-11-12 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
US11827697B2 (en) * 2018-02-11 2023-11-28 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-PD-1/anti-VEGF natural antibody structure like heterodimeric form bispecific antibody and preparation thereof
SG11202009036YA (en) * 2018-03-30 2020-10-29 Merus Nv Multivalent antibody
US20210179734A1 (en) * 2018-04-17 2021-06-17 Invenra Inc. Trivalent trispecific antibody constructs
CN110790840A (zh) 2018-08-01 2020-02-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人her2的抗体、其制备方法和用途
CN110678484B (zh) * 2018-08-21 2022-12-27 天境生物科技(杭州)有限公司 抗pd-l1/抗lag3双特异性抗体及其用途
JP7177543B2 (ja) * 2018-08-21 2022-11-24 エービーエル バイオ インコーポレイテッド 抗ｐｄ－ｌ１／抗ｌａｇ３二重特異性抗体およびその使用
CN113226371A (zh) * 2018-12-28 2021-08-06 协和麒麟株式会社 与TfR结合的双特异性抗体
CN110272495A (zh) * 2019-06-11 2019-09-24 南京华岩生物技术有限公司 一种能结合两种抗原的双特异性结合的免疫球蛋白及其用途
CN110330566A (zh) * 2019-06-11 2019-10-15 南京华岩生物技术有限公司 一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白
MX2022000456A (es) * 2019-07-11 2022-04-18 Wuhan Yzy Biopharma Co Ltd Anticuerpos biespecificos simetricos tetravalentes.
CN110498857B (zh) * 2019-08-09 2022-09-09 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗vegf-抗pd1双特异性抗体
CN113563473A (zh) * 2020-04-29 2021-10-29 三生国健药业（上海）股份有限公司 四价双特异性抗体、其制备方法和用途
CN113754774A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗pd-l1和egfr的四价双特异性抗体
CN115154598A (zh) * 2021-04-06 2022-10-11 丹生医药技术(上海)有限公司 一种抗pd-1/vegf双特异性抗体液体制剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009131239A1 (ja) * 2008-04-25 2009-10-29 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 安定な多価抗体

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