JP2022024035A

JP2022024035A - ５，１０－メチレン－（６ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩

Info

Publication number: JP2022024035A
Application number: JP2021183793A
Authority: JP
Inventors: モーザー・ルードルフ; Rudolf Moser; グレーン・ヴィオーラ; Groehn Viola; エッガー・トーマス; Thomas Egger; アマン・トーマス; Ammann Thomas
Original assignee: Merck et Cie
Current assignee: Merck et Cie
Priority date: 2013-08-14
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2022-02-08
Also published as: IL269170B; DK3033344T3; JP6764501B2; AU2014307872B2; EP2837631A1; MX2016001834A; PT3033344T; EP3287460B1; KR102410373B1; CN105452250A; NO3033344T3; LT3287460T; HUE037615T2; IL244069B; JP6617104B2; WO2015022407A1; LT3033344T; HK1217018A1; DK3287460T3; SG11201601016PA

Abstract

【課題】安定性の高い５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩を提供する。【解決手段】ｉ）５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩を水に溶解すること；ｉｉ）上記水を凍結すること；およびｉｉｉ）その後、凍結した水を真空下で除去すること、により得られる、凍結乾燥物。好ましくは、前記ステップｉ）において、緩衝剤、佐剤、別の治療剤、または界面活性剤などが添加された、凍結乾燥物による。【選択図】なし

Description

本発明は、好ましくは実質的に結晶質形態にある、５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩、ならびに、医薬組成物およびその治療、好ましくは化学療法における使用に向けられている。

還元されたホラートである、５，１０－メチレン－５，６，７，８－テトラヒドロホラート（５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ）は、固形腫瘍の治療において、その細胞増殖抑制剤としての有効性が知られており、好ましくはフッ化ピリミジン、例えば５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）と組み合わせて投与されてきた（Ｓｅｌｅｙ，Ｋ．Ｌ．ＩＤｒｕｇｓ４（１），９９，２００１（非特許文献１））。５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦは、塩基アナログであり５－ＦＵ代謝産物である５－ＦｄＵＭＰと一緒に、酵素チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を阻害することによって、その化学療法効果を達成する。ＴＳは、ＤＮＡ合成の必須のビルディングブロックであるデオキシチミジレート（ｄＴＭＰ）へのドオキシウリジレート（ｄＵＭＰ）の変換を触媒する。ＴＳの不活性化は、ＴＳ、５－ＦＵの代謝産物である前記の塩基アナログ５－ＦｄＵＭＰおよび５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ間での共有結合三元阻害複合体の形成により起こる。５－ＦＵの細胞障害性効果の強化は、５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの細胞内濃度を増加させ、その結果前記の三元複合体の安定性が増加することによって達成できる。これがＤＮＡ合成および修復の直接の阻害を引き起こし、最終的に細胞死および腫瘍増殖の遅延をもたらす。

しかしながら、５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦに付随する望ましくない特性が存在し、このことが現在、その薬学的な使用を制限している。医薬用途に受け入れられるためには、活性物質（例えば５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ）は、（ｉ）活性物質の物理化学的特性に著しい変化を示すことなく、許容可能な期間にわたる有効な保管が達成できるような、活性物質自体およびその医薬組成物の高い（化学的な、異性体の、結晶の）安定性、（ｉｉ）活性物質の高い（化学的な、異性体の、結晶の）純度、（ｉｉｉ）活性物質を適当な製剤等へ移すことが可能なような活性物質の取り扱いおよび加工の容易性、を含むいくつかの要件を満たす必要があることがよく知られている。

５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦはテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）およびホルムアルデヒドの付加生成物であり（例えば、Ｐｏｅ，Ｍ．ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８（２４），５５２７，１９７９（非特許文献２）；Ｋａｌｌｅｎ，Ｒ．Ｇ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８Ｂ，７０５，１９７１参照（非特許文献３））、その空気による酸化への極めて高い感受性ならびに潜在的に化学分解および／または加水分解に至る中性および／または酸性環境における不安定性が知られている（例えばＯｄｉｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１６（７），４４７，１９９８（非特許文献４）；Ｏｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２，４９２１，１９６０（非特許文献５）；Ｈａｗｋｅｓ，Ｊ．，ａｎｄＶｉｌｌｏｔａ，Ｒ．ＦｏｏｄＳｃｉ．Ｎｕｔｒ．２８，４３９，１９８９（非特許文献６）参照）。５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦを安定化するための試みには、例えば（ｉ）空気不含環境における固体製剤の再構成および５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの注入のための特別な技術的デバイスの使用による、大気中酸素の厳密な排除（例えばＯｄｉｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１６（７），４４７，１９９８（非特許文献７）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５６４，０５４（特許文献１）参照）；（ｉｉ）還元剤、例えばＬ（＋）－アスコルビン酸またはその塩、還元型ガンマ－グルタチオン、ベータ－メルカプトエタノール、チオグリセロール、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン等の、高い感受性の５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのための、特にＴＨＦのための酸化防止剤としての添加；（ｉｉｉ）シクロデキストリン包接化合物による安定化（例えばＥＰ０５７９９９６Ｂ１（特許文献２）参照）；（ｉｖ）ｐＨを塩基性の値に調節しながらのクエン酸塩の添加（例えばＥＰ１６４１４６０Ｂ１（特許文献３）参照）；または（ｖ）種々の塩、例えば硫酸塩の形成（例えばＥＰ０５３７４９２Ｂ１（特許文献４）参照）が含まれていた。

それにもかかわらず、高い（化学的な、異性体のおよび／または結晶の）純度を示し、および／または化合物としても医薬組成物に製剤化された際も両方とも高い安定性を有し、さらに効率的に製造、精製および単離でき、ならびに／あるいは操作性（例えば薬学的に許容可能な溶媒における許容可能な溶解性、流動性および粒径）および／または無視できるほどの分解または化合物の物理的および化学的特性の変化を伴う製剤化を受け入れることができ、好ましくは高いモルパーセントで製剤化できる（治療的有効用量を生じさせるために製剤化され投与されなければならない物質の量を最小化するために）、安定化された５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ化合物に対する大きな需要がなおも残されている。

Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５６４，０５４ＥＰ０５７９９９６Ｂ１ＥＰ１６４１４６０Ｂ１ＥＰ０５３７４９２Ｂ１

Ｓｅｌｅｙ，Ｋ．Ｌ．ＩＤｒｕｇｓ４（１），９９，２００１Ｐｏｅ，Ｍ．ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８（２４），５５２７，１９７９Ｋａｌｌｅｎ，Ｒ．Ｇ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８Ｂ，７０５，１９７１Ｏｄｉｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１６（７），４４７，１９９８Ｏｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２，４９２１，１９６０Ｈａｗｋｅｓ，Ｊ．，ａｎｄＶｉｌｌｏｔａ，Ｒ．ＦｏｏｄＳｃｉ．Ｎｕｔｒ．２８，４３９，１９８９Ｏｄｉｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１６（７），４４７，１９９８

さらに、これらの適当な特性を有する（公知の）化学化合物の安定な固体（多形）形態の存在は予期できない。このような固体形態の性質がどのようなものであり得るか、すなわち、それが塩、無水、水和または溶媒和形態であるか否かは予測できず、ましてや特定の多形体を単離し得る詳細な条件（例えば、結晶化条件および可変物、例えば溶媒、温度、ｐＨ等）も予期できない。そのようなパラメーターの選択および制御は、所望の固体形態を高い純度、安定性および加工可能性で得るために極めて重要である。これらは生成物の特性および性能ならびにそれらのさらなる用途に直接影響を及ぼす重要な因子である。多くの可変物（すなわち、溶液ｐＨ、温度、圧力、時間、溶液組成、添加剤のタイプおよび濃度）のどれが決定因子になるかを予測することは不可能である。

今回驚くべきことに、５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの（６Ｒ）－異性体［（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ］のそのヘミ硫酸塩（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅｓａｌｔ）への変換が、該化合物およびその医薬組成物に優れた安定性を付与し、それにより前述の欠点が克服されることが見出された。（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の有利な安定性特性は、この化合物の医薬用途における有効な使用を可能にする。

本発明は、第１の態様において、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（以後、本発明のヘミ硫酸塩または本発明の化合物とも呼ぶ）を対象とする。

好ましくは、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩は、化学的におよび／または異性体的におよび／または結晶的に純粋な形態にあり、より好ましくは、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩は、実質的に結晶質形態にある。

特定の実施態様において、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩は無水形態にあり、従って、好ましい実施態様において、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩は、結晶質の無水形態にある。

好ましくは、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩は、２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線）で表される４．７°、１７．９°および２３．３°の回折角２シータ（２θ）における１つまたは複数のＸ線パターンピーク位置を特徴とする結晶質形態にある。

特定の実施態様において、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩は、１６７２、１６５６、１６０３、１５５３、１４７４、１３０１、６３７、６２４および３６３ｃｍ^－１の波数（±２ｃｍ^－１で表される）におけるピークを含むＦＴ－ラマンスペクトルを付与することを特徴とする。

さらなる態様において、本発明は、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩および薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含み、任意選択的に少なくとも１種の追加的な治療剤（殺菌剤、抗生物質、抗ウイルス剤、防腐剤、抗腫瘍剤、抗癌性化合物、例えば化学療法薬、抗真菌薬、および／または抗炎症薬、またはヒトの使用に適した他の生物活性剤もしくは治療剤、特に抗癌性化合物、例えば化学療法薬、例えば５－ＦＵおよび誘導体、および抗葉酸薬、例えばメトトレキサート、ペメトレキセドを含むがこれらに限定はされない）をさらに含む、医薬組成物に向けられる。

さらなる態様において、本発明は、治療における、好ましくは癌化学療法における（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（またはその医薬組成物）の使用に向けられている。

図１：３００ｍＷの名目上のレーザー出力レベルおよび６４スキャンを用いて記録した、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（タイプ１）のラマンスペクトル図２（ａ）：反射モードで記録した（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（タイプ１）のＸ線粉末ディフラクトグラム；図２（ｂ）：透過モードで記録した（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（タイプ１）のＸ線粉末ディフラクトグラム；図２（ｃ）：透過モードで記録した（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（タイプ１）のＸ線回折パターン（上の曲線Ａ）と、反射モードで記録した同一化合物の記録（下の曲線Ｂ）との比較；図２（ｄ）：透過モードで記録した（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（タイプ１）のＸ線回折パターン（上の曲線Ａ）と、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの硫酸塩のＸ線回折パターン（下の曲線Ｂ）との比較。図３：（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（タイプ１）のＴＧ－ＦＴＩＲサーモグラム。「Ａ」は、（水の損失による）－０．５％の質量変化を示し、「Ｂ」は、（分解による）－１４．５３％の質量変化を示す図４：（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩のＤＳＣサーモグラム（タイプ１；ファーストスキャン：実線；セカンドスキャン（クエンチクーリング後）：点線）。

発明の詳細な説明
本発明は、第一の態様において、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（本発明の化合物または本発明のヘミ硫酸塩とも呼ぶ）に向けられる。１つの実施態様において、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩は、実質的に結晶質形態に、より詳細には、結晶質の無水形態にある。

ここで使用される場合に、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦは、その天然に存在する異性体形態（５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸、Ｎ－［４－［（６ａＲ）－３－アミノ－１，２，５，６，６ａ，７－ヘキサヒドロ－１－オキソイミダゾ［１，５－ｆ］プテリジン－８（９Ｈ）－イル］ベンゾイル］－Ｌ－グルタミン酸）にある５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ（プテリジン環のＣ６およびグルタミン酸部分のα－炭素におけるキラル中心が、それらの天然に存在する配置にある）を指す。従って、ここで使用する場合に、「異性体純度」、「立体異性体純度」という語句はそれぞれ、同一化合物の１種または複数の他の異性体を含み得る試料における、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの量を指す。ここで使用する場合に、「異性体的に純粋な」、「立体異性体的に純粋な」という語句はそれぞれ、約８０％より大きい、好ましくは約９０％より大きい、好ましくは約９５％より大きい、より好ましくは約９７％より大きい、さらに一層好ましくは約９９％またはそれ以上より大きい、最も好ましくは最大１００％の、所望の（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ異性体の異性体過剰を有する本発明化合物を意味し、ここで、残りは１種または複数種の他の異性体であってもよい。

ここで使用される場合に、「結晶質形態（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｆｏｒｍ）」（または「多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ）」または「結晶形（ｃｒｙｓｔａｌｆｏｒｍ）」）という語句は、構造単位の特定の規則正しい三次元配列からなる固体状態の形態を表す。従って、同一の化合物の異なる結晶質形態は、固体状態における分子の異なるパッキングから生じ、これは、異なる結晶対称性および／または単位胞パラメーターをもたらす。通常、異なる固体または結晶形は、１種または２種以上の異なる物理的および／または化学的特性、例えば異なる溶解プロファイル、異なる熱力学的および化学的安定性、異なる融点温度および／または異なるＸ線回折パターンを有し、従って、Ｘ線回折、赤外線（ＩＲ）分光法、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、ラマン分光法、固体ＮＭＲ、ならびに融点、密度、硬度、光学的および電気的特性、安定性および／または溶解プロファイル等により区別することができる。ほとんど規則正しくないかまたは規則正しくない三次元配列は通常、「非晶質」という語句によって記載される。

（本発明の）「結晶質化合物」という語句は、認識可能な量の本発明の化合物の結晶形（複数可）または多形（複数可）、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える量の本発明化合物の１種（または複数種）の結晶形（複数可）または多形（複数可）を含む、本発明の化合物の固体形態を表す。本発明の結晶質化合物の結晶性の量、程度および性質は、光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、Ｘ線粉末回折、固体ＮＭＲ分光法または偏光顕微鏡法を含む１つまたは複数の技術手段により測定することができる。

本明細書で使用される場合に、（本発明の）「ヘミ硫酸塩」という表現は、その全ての具体的な態様を含み、好ましくは、化学的におよび／または（立体）異性体的におよび／または結晶性の純粋な形態で提供される。１つの特定の実施態様において、それは、実質的に結晶質形態、より具体的には、結晶質の無水形態（以後、結晶質形態タイプ１とも呼ぶ）である。

本明細書で使用される場合に、「結晶純度」という語句は、試料中の化合物の特定の結晶質形態のパーセンテージを意味し、当該形態は、化合物の非晶質形態、化合物の１種または複数種の他の結晶質形態（化合物の上記特定の結晶質形態以外）またはそれらの混合物を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合に、「実質的に結晶質形態」という語句は、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の結晶純度、好ましくは約９７％の結晶純度、より好ましくは約９９％またはそれ以上の結晶純度、最も好ましくは約１００％の結晶純度を表す。結晶純度は、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）、赤外ラマン分光法および他のソリッドステート法により測定される。

本明細書で使用される場合に、「化学的純度］という語句は、試料中における特定の化合物のパーセンテージを意味する。本明細書で使用される場合に、「実質的な化学的純度」は、ＨＰＬＣにより測定した場合に、約８０％の化学的純度、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、より好ましくは約９７％、より好ましくは約９８％の化学的純度、最も好ましくは９９％または９９％より高いまたは最大１００％の化学的純度にある、本発明化合物を表す。化学的不純物には、未反応の出発物質（溶媒を含む）、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの分解生成物（例えばＴＨＦ）等が含まれ得る。

上記のように、本発明のヘミ硫酸塩の結晶質形態（およびその純度）は、ここで提供するデータによって示されるような、例えばＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）、赤外線ラマン分光法および他のソリッドステート法に関する、固有の固体状態の特徴により、同定でき、特徴付けることができ、そして他の塩の形態、例えば他の硫酸塩形態から区別することができる。

従って、特定の実施態様において、本発明は、以下を提供することを特徴とする、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの無水ヘミ硫酸塩の結晶質形態（以下、結晶質形態タイプ１とも呼ぶ）を提供する：
（ｉ）４．７°、１７．９°および２３．３°、好ましくは４．７°、１６．６°、１７．９°、１８．４°、１８．９°、２０．２°、２３．３°、２３．５°、２４．３°および２４．７°に算出された格子間隔（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線）で表される）を与えるＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターン；および／または
（ｉｉ）１６７２、１６５６、１６０３、１５５３、１４７４、１３０１、６３７、６２４および３６３の波数（±２ｃｍ^－１で表される）におけるピークを含むＦＴ－ラマンスペクトル、および／または
（ｉｉｉ）表３に従う１つまたは複数の吸収帯を有するＩＲスペクトル。

好ましい実施態様において、本発明のヘミ硫酸塩（タイプ１）は、４．７°、１６．６°、１７．９°、１８．４°、１８．９°、２０．２°、２３．３°、２３．５°、２４．３°および２４．７°、好ましくは４．７°、１７．９°および２３．３°における以下の１０個のＸＲＰＤピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線）で表される）のうちの少なくとも２つ、ならびに１６７２、１６５６、１６０３、１５５３、１４７４、１３０１、６３７、６２４および３６３の以下の９個のＦＴ－ラマンピーク（±２ｃｍ^－１で表される）のうちの少なくとも２つを特徴とする。

他の実施態様において、本発明の（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（タイプ１）は、図１に実質的に従うＦＴ－ラマンスペクトルおよび／または表１に報告されるピークおよび／または図２（ａ）に実質的に従うＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンおよび／または表２に報告されるピークを与える。

本発明の化合物は、本技術分野で公知の手順に従って測定されるような、Ｘ線粉末回折パターンにより、最も効率的に特徴付けされ、関連化合物から区別される（例えばＪ．Ｈａｌｅｂｌｉａｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６４：１２６９，１９７５；Ｊ．ＨａｌｅｂｌａｉｎａｎｄＷ．ＭｃＣｒｏｎｅ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５８：９１１，１９６９参照）。例において調製した（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩のＸ線回折パターンを、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの硫酸塩のＸ線回折パターンと比較して示す図２（ｄ）は、これらの２つの塩の示差的なパターンを明確に実証している。

ピークの相対強度は、試料調製技術、試料装填手順および特に使用される装置に応じて変わり得るが、本発明の化合物は、特定の多形に特徴的な示差的なピークおよびピーク位置によって（約±０．５°２シータ（２θ）、好ましくは±０．２°２シータ（２θ）（ＣｕＫα線）のピーク帰属における小さな変動で）同定することができる。

本発明の化合物は、非溶媒和の無水形態であり、これは、水を全く含有しない化合物および微量の水を含み得る化合物を含む。このような潜在的な残存の（非化学量論的な）含水量は、任意の水量であることができるが、通常、０重量％Ｈ_２Ｏ～３重量％Ｈ_２Ｏ、好ましくは０重量％Ｈ_２Ｏ～１重量％Ｈ_２Ｏの範囲である。

本発明のヘミ硫酸塩化合物は、固体形態、例えば粉末、凍結乾燥物の形態で、または液体として保管することができる。

特定の実施態様において、本発明の化合物は、好ましくは、（６Ｓ）－ＴＨＦのホルムアルデヒド水溶液を硫酸の水溶液（または酢酸および硫酸の水溶液）に添加し、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩の結晶化を起こさせることにより、製造される。この結晶化反応は、上昇させた温度で、例えば３５℃を超える温度で行われる。特に、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの結晶質ヘミ硫酸塩の製造の方法は、（ｉ）（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の溶液をホルムアルデヒド水溶液と反応させて溶液中の（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦを得る（公知の手順により）ステップ、（ｉｉ）得られた溶液中の（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦを、硫酸の水溶液に（または代替的に、酢酸および硫酸の水溶液に）、３５℃超、好ましくは３５℃～７０℃、より好ましくは４０℃～６０℃、最も好ましくは４０℃～５０℃の温度で添加し、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩の結晶化を生じさせるステップ、および（ｉｉｉ）得られた（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの結晶質ヘミ硫酸塩を、例えばろ過により、単離するステップを含む。

ステップ（ｉ）は、例に記載されるように公知の手順に従って実施することができる。

ステップ（ｉｉ）において、得られた透明な溶液を約４０～５０℃の温度で硫酸溶液（または酢酸および硫酸の水溶液）に添加することができ、所望の生成物の選択的な結晶化が可能となる。任意選択的に、添加が完了後、得られた反応混合物を約４０～５０℃の温度で最大５時間撹拌してもよく、引き続き、結晶化生成物をその後同一温度でろ過するか、または遠心分離し、任意選択的に水で洗浄し、乾燥する。

さらなる態様において、本発明は、患者に投与するための、本発明の（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦのヘミ硫酸塩（の治療的有効量）および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物（本発明の医薬組成物とも呼ぶ）に向けられている。本明細書において使用される場合に、「薬学的に許容可能な」という語句は、キャリアが動物、より特にはヒトにおける使用のために承認または許可されること、すなわち、宿主または患者にとって毒性ではないことを表す。さらに、好ましいキャリアは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない。「キャリア」という語句は、好ましい投与の特定のモードに必要な任意の補助材料を表し、例えば、溶媒（希釈剤）、添加剤または他の賦形剤（これらとともに本発明の化合物は投与される）を含む。通常使用される希釈剤薬学的キャリアには、滅菌液体、例えば水溶液および油（例えば、石油、動物、植物もしくは合成源）、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等が含まれる。通常使用される水性液体には、水、生理食塩水溶液、水性デキストロ―スおよびグリセロール溶液などが含まれる。適当な薬学的添加剤には、クエン酸、アスコルビン酸、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。任意選択的に、前記組成物は、賦形剤、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤または結合剤を含むことができる。適当な薬学的キャリアの例は、当技術分野において公知であり、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」ｂｙＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（１８ｔｈｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に記載されている。

任意選択的に、本発明の医薬組成物はさらに、少なくとも１種の追加的な治療剤を含むことができる。特定の実施態様において、前記の少なくとも１種の追加的治療剤は、殺菌剤、抗生物質、抗ウイルス剤、防腐剤、抗腫瘍剤、抗癌性化合物、例えば化学療法薬、抗真菌薬、および／または抗炎症薬、またはヒトの使用に適した他の生物活性剤もしくは治療剤、特に抗癌性化合物、例えば化学療法薬から選択することができる。抗がん剤、例えば化学療法剤には、特異的結合メンバー、タンパク質、核酸または核酸アナログ（例えば、限定はされないが、アンチセンス分子、リボザイムおよびｓｉＲＮＡ）、脂質、ステロイド、巨大分子、小分子または金属が含まれ得るがこれらに限定はされない。１種または複数の抗がん剤は、例えば以下の（これらに限定されない）１種または複数種の化学療法剤を含むことができる：核酸、特にフッ素化核酸（例えば、５－フルオロウラシルまたはそのアナログもしくはプロドラッグ、抗葉酸剤（例えば、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、ロメトレキソール）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、ゲムシタビン、テザシタビン）、５－ＦＵモジュレーター、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、カルムスチン）、核酸生合成阻害剤（例えば、マイトマイシン、アントラサイクリン（例えば、エピルビシン、ドキソルビシン）、白金誘導体（シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）、微小管破壊剤（例えば、パクリタキセル、デセタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン）、ホルモン遮断剤（例えば、タモキシフェン）、受容体型もしくは非受容体型チロシンキナーゼを含むがこれらに限定されないキナーゼの阻害剤（例えば、イレッサ、タルセバ、ＳＵ５４１６、ＰＴＫ７８７、グリベック）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、免疫調節剤（例えば、レバミゾール）、抗炎症薬、血管新生阻害剤、サイトカイン（例えば、インターロイキン、腫瘍壊死因子）、ならびにサイトカイン、ホルモン、またはサイトカインもしくはホルモンに関する受容体の活性を阻害する薬剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブまたは「アバスチン」）。抗癌剤はまた、モノクローナル抗体、例えばサイトカイン、ホルモンまたはホルモン受容体に結合するモノクローナル抗体（これらに限定はされない）（例えば、ＥＧＦもしくはＶＥＧＦ成長因子の活性化を遮断する抗体、例えば、アバスチン、エルビタックス、ハーセプチン）等を含み得る。

本発明の化合物またはその医薬組成物は、治療のために、特に癌化学療法において、すなわち、癌の治療のための方法において使用することができ、これは、治療的有効量の本発明のヘミ硫酸塩またはその医薬組成物を、そのような治療が必要な対象に投与することを含む。

従って、さらなる態様において、本発明はさらに、治療における、好ましくは化学療法における、すなわち、癌の治療における本発明のヘミ硫酸塩（またはその医薬組成物）の使用に向けられる。本発明により治療されるべき癌の例には、乳癌、食道癌、胃癌、胆嚢癌、胆管癌、大腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部癌および中皮腫癌が含まれるが、これらに限定はされない。

本発明の適当な医薬組成物は、経口、非経口または直腸投与のために適合させることができ、それ自身、錠剤、カプセル剤、経口用液体調製物、散剤、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射可能なもしくは注入可能な液剤もしくは懸濁剤、または坐剤の形態にあることができる。好ましくは、前記医薬組成物は、静脈内または筋肉内、皮下、動脈内のような非経口投与に適した形態にある。

非経口投与のために、液体の単位剤形は通常、水をベースとする液剤または油をベースとする懸濁剤（またはそれらの凍結乾燥物）を形成するために、本発明の化合物、任意選択でさらなる治療剤、および薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。化合物は、他の治療剤の存在、キャリアおよび使用濃度に応じて、キャリアに懸濁するかまたは溶解してもよい。非経口液剤のために、前記化合物を注射用に溶解し、ろ過滅菌した後に、適切なバイアルもしくはアンプルに充填して密閉することができる。任意選択的に、佐剤、例えば局所麻酔薬、保存剤および緩衝剤をベヒクルに溶解する。所望の場合、得られた溶液を、凍結乾燥に付すことができる（すなわち、前記組成物は、バイアルに充填した後に凍結し、真空下で水を除去することができる）。非経口懸濁剤のために、前記化合物をベヒクルに懸濁し（溶解するかわりに）、そして、好ましい滅菌は、滅菌ベヒクル（例えばバイアルまたはアンプル）における懸濁の前のエチレンオキシドへの曝露を含む。任意選択的に、化合物の均一な分布を促進するために、界面活性剤または湿潤剤を、前記組成物に含ませることができる。

経口投与のための錠剤およびカプセル剤は、単位投薬形態にあることができ、慣用の添加剤、例えば結合剤、増量剤、錠剤化滑剤、崩壊剤および許容可能な湿潤剤を含むことができる。錠剤は、通常の薬学的慣行においてよく知られた方法に従ってコーティングされていてもよい。

経口用液体調製物は、例えば水性もしくは油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であることができ、あるいは、使用前に水または他の適当なベヒクルを用いて再構成するための乾燥生成物の形態であることができる。このような液体調製物は、慣用の賦形剤、例えば懸濁剤、乳化剤、非水性ベヒクル（食用油を含むことができる）、保存剤および所望により慣用の香味料または着色剤を含むことができる。

本発明の医薬組成物が本発明の化合物および少なくとも１種のさらなる治療剤を含む併用療法の場合、活性な剤を、同一の医薬組成物の一部として投与することができ、または前記の少なくとも１種のさらなる治療剤を別々に、すなわち、別個の（およびおそらく異なる）医薬組成物として、任意選択的に異なる投与経路によって、同時にまたは順次に投与することができる。

本明細書において記載されるような治療において使用される活性薬剤、すなわち、本発明の化合物（および任意選択的に少なくとも１種のさらなる治療剤）の用量は、治療される対象の年齢および健康状態、治療される疾患の種類および重症度、投与の経路および頻度等を含む種々の因子に依存する。癌治療および化学療法の専門家は、単独でのまたは上記に定義されるような少なくとも１種のさらなる治療薬と組み合わせた本発明の化合物に関する治療的に有効な量および投薬計画を、毒性および有効性を評価するための公知のプロトコールに基づいて決定することができるであろう。

本明細書で使用される場合に「治療的に有効な量」という語句は、（ｉ）疾患の予防；および／または（ｉｉ）疾患の抑制（例えば病状および／または症候のさらなる進行の阻止）；および／または（ｉｉｉ）疾患の改善（例えば病状および／または症候からの回復）を含む、当業者によって求められている組織、系、動物、個体またはヒトにおける生物応答もしくは薬物応答を引き起こす活性化合物の量を指す。同様に、本明細書で使用される場合に「治療」という語句は、（ｉ）疾患の予防；および／または（ｉｉ）疾患の抑制（例えば病状および／または症候のさらなる進行の阻止）；および／または（ｉｉｉ）疾患の改善（例えば病状および／または症候からの回復）を指す。

医薬組成物は、好ましくは、投与方法に応じて、０．１％～９９重量％、好ましくは１０～６０重量％の活性薬剤（すなわち、任意選択で少なくとも１種のさらなる治療剤と組み合わされた本発明の化合物）を含むことができる。

癌治療において使用されるべき本発明化合物の典型的な用量範囲は、それぞれ１０ｍｇ／ｍ^２～１ｇ／ｍ^２、好ましくは５０ｍｇ／ｍ^２～５００ｍｇ／ｍ^２（結腸直腸癌治療に関して）、１０ｍｇ／ｍ^２～２００ｍｇ／ｍ^２（メトトレキサート療法に関して）、より好ましくは約１００ｍｇ／ｍ^２～２５０ｍｇ／ｍ^２（結腸直腸癌治療に関して）、それぞれ５０ｍｇ／ｍ^２～１５０ｍｇ／ｍ^２（メトトレキサート療法に関して）の範囲であることができる。

以下の例は、本発明の説明としての役割を果たすが、その範囲の限定を意図するものではない。

示差走査熱量測定（ＴｈｅｒｍａｌＡｎａｌｙｓｉｓＱ２０００）：閉じた（密封した）金のるつぼ；周囲条件下またはＮ_２環境における３分の平衡化後に充填された試料；１０Ｋ分－１の加熱速度；－５０℃～２５４℃領域。２回の加熱スキャンを実施した際、スキャンの間に試料を－５０℃に急速に冷却した。リストに挙げた転移温度は、ピーク極大および極小に対応し、開始温度には相当しない。

ＦＴ－ラマン分光法（ＢｒｕｋｅｒＲＦＳ１００；ＯＰＵＳ６．５ソフトウェアを用いる；ＯＰＵＳ７．０ソフトウェアで実施したオフラインデータ分析）：Ｎｄ：ＹＡＧ１０６４－ｎｍ励起；３００ｍＷ名目上レーザーパワー；Ｇｅ検出器；６４－２５６スキャン；３５００－１００ｃｍ^－１の分析に使用したスペクトル領域；２ｃｍ^－１分解能。

^１Ｈ－ＮＭＲ（ＢｒｕｋｅｒＤＰＸ３００）：３００．１３ＭＨｚのプロトン周波数、３０°励起パルスおよび１ｓの繰り返し時間（ｒｅｃｙｃｌｅｄｅｌａｙ）を使用して、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。１６回または２５６回のいずれかスキャンを積算し、重水素化ＤＭＳＯを溶媒として使用した。溶媒ピークを参照のために使用し、化学シフトをＴＭＳ尺度で報告する。

^１３ＣＮＭＲ（ＢｒｕｋｅｒＡＭＸ３００）：^１３ＣＮＭＲスペクトルを、５ｍｍＴＸＯプローブヘッドを備えたＢｒｕｋｅｒＡＭＸ３００ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて得た。ヘミ硫酸塩を０．１ＮＮａＯＤに溶解した。スペクトルを、３０３Ｋにおいて４０００スキャンおよび３２７６８データポイントのデジタル分解能で測定した。化学シフトを内部ＴＳＰ（（（３－トリメチルシリル）－２，２’，３，３’－テトラジュウテロプロピオン酸、ナトリウム塩））標準に対してｐｐｍで付与する。

粉末Ｘ線回折（ＢｒｕｋｅｒＤ８Ａｄｖａｎｃｅ）：銅Ｋα線、４０ｋＶ／４０ｍＡ、ＬｙｎｘＥｙｅ検出器、Ｂｒａｇｇ－Ｂｒｅｎｔａｎｏ反射型ジオメトリー、０．０２°２θステップサイズ、３７ｓのステップ時間、２．５－５０°の２θ範囲。粉末試料を、０．１－ｍｍまたは０．５－ｍｍの深さのケイ素単結晶試料ホルダーで測定した。平坦な表面を得るためにわずかな圧力を施す以外、試料を調製するのに特別な処理は用いなかった。全ての測定に周囲空気雰囲気を使用し、測定の間、試料を回転させた。反対のＸ線回折データに関する情報の不在は反射データとして示す。

粉末Ｘ線回折（ＳｔｏｅＳｔａｄｉＰ．）：銅Ｋα１線、４０ｋＶ／４０ｍＡ、Ｍｙｔｈｅｎ１Ｋ検出器、透過モード、湾曲Ｇｅモノクロメータ、０．０２°２θステップサイズ、６０ｓのステップ時間、ステップスキャンモードで１°２θの検出ステップで、１．５－５０．５°２θのスキャニング範囲。試料（１０～２０ｍｇの粉末）を２つのアセテート薄膜間で測定した。試料を調製するのに特別な処理は用いなかった。全ての測定に周囲空気雰囲気を使用し、測定の間、各試料を回転させた。

ＴＧ－ＦＴＩＲ（ＢｒｕｋｅｒＦＴ－ＩＲＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒＩＦＳ２８を備えたＮｅｔｚｓｃｈＴｈｅｒｍｏ－ＭｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅＴＧ２０９）：Ａｌるつぼ（微細孔を有する）；Ｎ_２雰囲気；１０Ｋ分^－１加熱速度；２５℃～３００℃範囲。

ＩＲ（ＦＴ－ＩＲＰａｒａｇｏｎ１０００）：ブロミドディスクにおいてプレスしたヘミ硫酸塩試料から、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＦｏｕｒｉｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍＩｎｆｒａｒｅｄＳｙｓｔｅｍにおいて、赤外線スペクトルを１００スキャンで記録した。

例１：（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ _２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の製造
７８．０ｇの蒸留水における（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸（１６ｍｍｏｌ，７．９３ｇ）の溶液を、Ｎ_２下、室温で、丸底フラスコに供給した。３２％ＮａＯＨ溶液を（ゆっくりと）添加することにより、この溶液のｐＨをｐＨ１１に調節した。溶液が透明になったらすぐに、１．００ＭＨＣｌ溶液を添加して、溶液のｐＨを２５℃で８．３に調節した。得られた透明溶液を約０℃に冷却し、当該温度においてそれは８．８のｐＨを示した。１ＭＨＣｌの添加により、ｐＨをｐＨ＝８．６に調節し、１．４４ｇの３６．８％ＨＣＨＯ溶液（１１０ｍｏｌ％）を一度に添加した。添加の完了後に溶液を０℃（氷浴）で１時間撹拌した。活性炭（０．２ｇ、ＮｏｒｉｔＣＥｘｔｒａ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、その後、吸引ろ過において冷間ろ過（ｃｏｌｄｆｉｌｔｅｒｅｄ）することにより透明溶液を得、これをさらなる精製なしでステップ（ｂ）に使用した。

（ｂ）５５ｍｌ１ＭＨ_２ＳＯ_４（０．０５５ｍｏｌ；３４４ｍｏｌ％）の混合物を、Ｎ_２下６０℃で丸底フラスコに供給した。この溶液に、ステップ（ａ）において得られたような溶液を１５分間にわたって滴加し、得られた反応混合物を５０℃で２時間撹拌した。その後、吸引ろ過において５０℃で反応混合物ををろ過し、室温で２５ｍｌの蒸留水を用いて２度洗浄し、３０℃かつ１０ｍｂａｒで１２時間（一晩）乾燥して、淡いグレーの結晶の形態の（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩（７．３６ｇ，８６％収率）を得た。得られた生成物は、ＨＰＬＣにより測定した場合に９８．４％の純度、９７．６％の異性体純度（６Ｒ－異性体）を有していた。ＸＲＰＤによる分析は、結晶形タイプ１を示した（完全な特性評価に関しては、例２および３を参照）。

例２：特性評価
（ａ）３００ｍＷの名目上レーザーパワーレベルおよび６４スキャンを用いて記録した（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩のＦＴラマンスペクトルを図１に示す。

（ｂ）透過モードで記録した対応の粉末Ｘ線ディフラクトグラムを図２に示す。

（ｃ）（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩のＴＧ－ＦＴＩＲサーモグラムを図３に示す。それは、Ｎ_２流下で実施した（酸化分解を防ぐため）。該試料は、約４０℃から２１０℃までに０．５重量％Ｈ_２Ｏの損失を示し、これは、（吸湿性または不完全な乾燥のいずれかによる）残留水である。分解は２１０℃超でのみ生じる。

（ｄ）（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩のＤＳＣサーモグラムを図４に示す。最初の加熱スキャン前に試料を窒素ガス流下で３分間平衡化し、その時間の間にその質量の０．６重量％が失われた。これは、ＴＧ－ＦＴＩＲサーモグラム（図３参照）で観察された含水量と一致し、この水が緩く結合していることが確認される。該試料を続いて閉じた金のるつぼ中で、１０Ｋ分^－１で２５４℃に加熱し、－５０℃にクエンチクーリングし、１０Ｋ分^－１で二度目の加熱を行った。最初の加熱スキャンにおける熱事象のみが約２４７．４℃で吸熱性であり（ΔＨ約６０．９Ｊｇ^－１）、これは溶融に起因する。この吸熱事象は、場合により発熱分解の開始と重複する。第２の加熱スキャンにおいて、Ｔｇ約１０４℃でガラス転移が観察され（ΔＣｐ＝０．３８Ｊｇ^－１Ｋ^－１）、これにより溶融が第１スキャンにおいて生じたことが確認される。２５０℃まで他の熱的事象は観察されなかった。

（ｅ）ＩＲスペクトルをプレスしたＫＢｒペレットで記録し、特徴的な吸収帯を表３に示す。

（ｆ）（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の^１ＨＮＭＲスペクトルをＤＭＳＯ－ｄ_６で記録し、化学シフト（ｄ）（ｐｐｍ）を表８に示す。

（ｇ）^１３ＣＮＭＲを０．１ＮＮａＯＤにおいて記録し、ＴＳＰに対する化学シフト（ｄ）（ｐｐｍ）を表９に示す。

（ｈ）光学顕微鏡法による（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の分析により、その結晶性を確認した。当該試料は、小さな複屈折粒子の集合体からなっていた。

例３：（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ _２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の安定性試験
（ａ）種々の溶媒および混合物における室温以外の温度での出発物質としての（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の懸濁液平衡を表１０にまとめる：

（ｂ）室温での８５％エタノールにおける安定性
（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩（３．０ｇ）を、室温で１００ｍｌの８５％ＥｔＯＨに分散させ、５時間撹拌し、その後ろ過し、３０℃および８ｍｂａｒで１２時間（一晩）乾燥した。ＸＲＰＤによる分析により、結晶形タイプ１に特徴的なＸ線パターンを変わらずに維持したことが示された。

（ｃ）高温／低圧での安定性
（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩（２．１７ｇ）を６５℃および８ｍｂａｒで２１時間、乾燥チャンバー内に置いた。ＸＲＰＤによる分析により、結晶形タイプ１に特徴的なＸ線パターンを変わらずに維持したことが示された。

（ｄ）（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩およびその医薬組成物の長期安定性
（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の長期安定性を測定するために、本発明の化合物を、空気中において２５℃で、そして６０％の相対湿度で保管した。残留している（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の含量を定期的な間隔でＨＰＬＣにより測定し、初期値と比較して求めた（％ｒｅｌ．）。結果を表１１に示す。

医薬組成物としての、より具体的には凍結乾燥物（例えば例５に従って製造されるような）としての（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の長期安定性を測定するために、凍結乾燥物を空気中において２５℃および６０％相対湿度で保管した。残留している（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の含量を定期的な間隔でＨＰＬＣにより測定し、初期値との比較により求めた（％ｒｅｌ．）。結果を表１２に示す。

^１）４５ヶ月に関する値

表１１および１２は、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩が、純粋な化合物として、および医薬組成物、例えば凍結乾燥物の形態で、室温でさえ長期間にわたって高度に安定であることを明確に示している。

例４：（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ _２－ＴＨＦ硫酸塩の比較安定性
本発明の化合物（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の長期安定性を、ＥＰ０５３７４９２Ｂ１に従って製造した（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦの硫酸塩の長期安定性と比較するために、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ硫酸塩の安定性データを、種々の温度および湿度において作成した。

（ａ）（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ硫酸塩の安定性
（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ硫酸塩を文献の手順（ＥＰ０５３７４９２Ｂ１）に従って製造し、－２０℃で１５か月保管した。その後、生成物の試料を５℃、それぞれ２５℃および６０％相対湿度、それぞれ４０℃および７５％相対湿度で保管した。試料に残留している（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ硫酸塩の含量を定期的な間隔でＨＰＬＣにより測定した。（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ硫酸塩の含量を、製造の時点での初期値と比較した（％ｒｅｌ．）。結果を表１３および１４に示す。

表１３および１４におけるデータと、例３に開示される（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の安定性データとの比較は、明確に以下を示している：
ｉ）（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ硫酸塩と比較した、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の安定性には顕著な差異がある、および
ｉｉ）（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩は、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ硫酸塩よりも、長い期間にわたって極めて安定であった。

（ｂ）分解生成物１０－ホルミル－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸の含有量
（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ硫酸塩を文献の手順（ＥＰ０５３７４９２Ｂ１）に従って製造し、－２０℃で１５か月保管した。その後、生成物の試料を５℃、それぞれ２５℃および６０％相対湿度、それぞれ４０℃および７５％相対湿度で保管した。１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸（主要な分解生成物）を、定期的な間隔でＨＰＣＬによって測定し、絶対値（％ｗ／ｗ）として開示した。結果を表１５～１６に示す。

例５：（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ _２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の医薬剤形
（ａ）静脈内適用に使用される再構成用凍結乾燥物
１８．４８０ｋｇの水に、４℃で、アルゴンを１時間にわたってスパージし、１．３８６ｋｇのＮａＯＨ２Ｍおよび９６８．９ｇのクエン酸ナトリウム三水和物を添加した。混合物を４℃でアルゴン下において、完全に溶解するまで撹拌した（ｐＨ１３．０）。その後、４７３．９ｇの（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩を、２１０ｇのアルゴンを用いて飽和した４℃の洗浄水下で添加した（ゆっくり溶解、ｐＨ６．５）。その後、ｐＨをＮａＯＨ２Ｍで９．３±０．１（１２１．８ｇ）に合わせた。４℃の２０３．６ｇアルゴン飽和水を添加した（溶液合計２１．８４４ｋｇ）。

その後、溶液を滅菌フィルターを通してろ過した。１０ｍｌの各バイアルに滅菌ろ過した５．２０１ｇ（５ｍｌ）の溶液を添加し、その後、－４５℃で凍結乾燥した。

注射前に、１０ｍｌの水（ＷＦＩ）を各バイアルに添加した（２９３ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ）。

（ｂ）実質的に中性のｐＨでの（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の凍結乾燥組成物の調製
以下の材料（ｍｇ／１００ｍｌ）および手順を、凍結乾燥組成物を得るために使用した：
材料（ｍｇ／１００ｍｌ）：
５．５３０ｇ（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩（５．０００ｇ（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦと当量）
６．０００ｇクエン酸、無水、粉末、ＵＳＰ
４．０００ｇアスコルビン酸、粒状、ＵＳＰ
ｐＨを調節するためのＮａＯＨ／ＨＣｌ
１００ｍｇ注射用水（ＷＦＩ）、ＵＳＰ適量まで
（ｉ）手順：フィルターを通した窒素ガスＮＦをＷＦＩに３０分間スパージ。
（ｉｉ）１００ｍｌプラスチック容器の風袋重量を記録。
（ｉｉｉ）クエン酸、アスコルビン酸および約９０ｇのＮ_２をスパージした水を計量。
（ｉｖ）混合して溶解。
（ｖ）１ＮＮａＯＨまたはＨＣＩでｐＨを７．０±０．１に調節。
（ｖｉ）該溶液を１０℃に冷却。
（ｖｉｉ）（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩を添加、混合して溶解。
（ｖｉｉｉ）ｐＨ（７．０±０．２）を記録。
（ｉｘ）１１０ｇの最終重量（または１００ｍｌ）までさらに水を添加。重量を記録。
（ｘ）該溶液をできるだけ冷却しながら、０．２ミクロンフィルターを通す。
（ｘｉ）該溶液をできるだけ冷却しながら、バイアルへ充填（バイアルあたり、２ｍｌまたは１００ｍｇの５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ）。
（ｘｉｉ）凍結乾燥。
（ｘｉｉｉ）ヘッドスペースにおける窒素とともにわずかに減圧下でバイアルを密封。
（ｘｉｖ）バイアルをクリンプ。

例６：前臨床／臨床結果
（ａ）ＩＣＨＳ９ガイダンスに従って実施した動物モデルにおける前臨床研究からの結果は、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩が、ラット（１００ｍｇ／ｋｇ／日）およびイヌ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）へ最も高い用量レベルで投与された際に安全であることを示す。さらに、臨床データは、最大２００ｍｇ／ｍ^２の用量で投与された（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩が患者にとって安全であることを示す。

（ｂ）大腸癌と診断された３２人の患者において実施された、無作為化単盲検第Ｉ／ＩＩ相試験（ＩＳＯ－ＣＣ－００２）において、レボロイコボリンと比較した、腫瘍組織、隣接する粘膜および血漿における（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の薬物動態および薬力学的特性を調べた。試験は、スウェーデンのエーテボリにおけるＳａｈｌｇｒｅｎｓｋａ大学病院において実施した。試験完了後のデータの解析により、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の投与が、レボロイコボリンの投与後に得られるよりも、大幅に大きい曝露およびピーク血漿濃度を与えることが示された。腫瘍および隣接の粘膜の両方において、メチレンテトラヒドロホラートおよびテトラヒドロホラートの濃度もまた、（６Ｒ）－５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦヘミ硫酸塩の投与後に、レボロイコボリンの投与後に得られるよりも非常に高かった。

なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩。
２．実質的に結晶質形態にある、上記１に記載のヘミ硫酸塩。
３．少なくとも８０％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、最も好ましくは９９％またはそれ以上の結晶純度を有する、上記１または２に記載のヘミ硫酸塩。
４．少なくとも８０％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、最も好ましくは９９％またはそれ以上の化学的純度を有する、上記１～３のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
５．無水形態にある、上記１～４のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
６．２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線、反射）で表される４．７°、１７．９°および２３．３°の回折角２θに１つまたは複数のＸ線パターンピーク位置を有する、上記１～５のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
７．２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線、反射）で表される４．７°、１６．６°、１７．９°、１８．４°、１８．９°、２０．２°、２３．３°、２３．５°、２４．３°および２４．７°の回折角２θに１つまたは複数のＸ線パターンピーク位置を有する、上記１～６のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
８．１６７２、１６５６、１６０３、１５５３、１４７４、１３０１、６３７、６２４および３６３の波数（±２ｃｍ ^－１で表される）に１つまたは複数のピークを含むＦＴ－ラマンスペクトルを有する、上記１～７のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
９．図１に実質的に従うＦＴ－ラマンスペクトルを有するおよび／または図２（ａ）もしくは２（ｂ）に実質的に従うＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを有する、上記１～８のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
１０．以下の４．７°、１６．６°、１７．９°、１８．４°、１８．９°、２０．２°、２３．３°、２３．５°、２４．３°および２４．７°における１０個のＸＲＰＤピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線）で表される）のうちの少なくとも２つ、ならびに以下の１６７２、１６５６、１６０３、１５５３、１４７４、１３０１、６３７、６２４および３６３の９個のＦＴ－ラマンピーク（±２ｃｍ ^－１で表される）のうちの少なくとも２つを有する、上記１～９のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
１１．４．７°、１７．９°および２３．３°における以下の３個のＸＲＰＤピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線）で表される）のうちの少なくとも２つ、ならびに１６７２、１６５６、１６０３、１５５３、１４７４、１３０１、６３７、６２４および３６３の以下の５個のＦＴ－ラマンピーク（±２ｃｍ ^－１で表される）のうちの少なくとも２つを有する、上記１～１０のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
１２．上記１～１１のいずれか１つに記載の５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩および任意選択的に薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
１３．錠剤、カプセル剤、経口用液体調製物、散剤、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射可能なもしくは注入可能な液剤もしくは懸濁剤、または坐剤、好ましくは凍結乾燥物の形態にある、上記１２に記載の医薬組成物。
１４．さらに少なくとも１種の追加的な治療剤を含む、上記１２または１３に記載の医薬組成物。
１５．経口、非経口または直腸投与のための医薬組成物である、上記１２～１４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１６．治療、好ましくは癌化学療法に使用するための、上記１～１１のいずれか１つに記載の５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩または上記１２～１５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１７．癌の治療のための方法であって、上記１～１１のいずれか１つに記載の５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩または上記１２～１５のいずれか１つに記載の医薬組成物を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む、方法。
以下の例は、本発明の説明としての役割を果たすが、その範囲の限定を意図するものではない。

Claims

５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩。
実質的に結晶質形態にある、請求項１に記載のヘミ硫酸塩。
少なくとも８０％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、最も好ましくは９９％またはそれ以上の結晶純度を有する、請求項１または２に記載のヘミ硫酸塩。
少なくとも８０％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、最も好ましくは９９％またはそれ以上の化学的純度を有する、請求項１～３のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
無水形態にある、請求項１～４のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線、反射）で表される４．７°、１７．９°および２３．３°の回折角２θに１つまたは複数のＸ線パターンピーク位置を有する、請求項１～５のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線、反射）で表される４．７°、１６．６°、１７．９°、１８．４°、１８．９°、２０．２°、２３．３°、２３．５°、２４．３°および２４．７°の回折角２θに１つまたは複数のＸ線パターンピーク位置を有する、請求項１～６のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
１６７２、１６５６、１６０３、１５５３、１４７４、１３０１、６３７、６２４および３６３の波数（±２ｃｍ^－１で表される）に１つまたは複数のピークを含むＦＴ－ラマンスペクトルを有する、請求項１～７のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
図１に実質的に従うＦＴ－ラマンスペクトルを有するおよび／または図２（ａ）もしくは２（ｂ）に実質的に従うＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを有する、請求項１～８のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
以下の４．７°、１６．６°、１７．９°、１８．４°、１８．９°、２０．２°、２３．３°、２３．５°、２４．３°および２４．７°における１０個のＸＲＰＤピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線）で表される）のうちの少なくとも２つ、ならびに以下の１６７２、１６５６、１６０３、１５５３、１４７４、１３０１、６３７、６２４および３６３の９個のＦＴ－ラマンピーク（±２ｃｍ^－１で表される）のうちの少なくとも２つを有する、請求項１～９のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
４．７°、１７．９°および２３．３°における以下の３個のＸＲＰＤピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα線）で表される）のうちの少なくとも２つ、ならびに１６７２、１６５６、１６０３、１５５３、１４７４、１３０１、６３７、６２４および３６３の以下の５個のＦＴ－ラマンピーク（±２ｃｍ^－１で表される）のうちの少なくとも２つを有する、請求項１～１０のいずれか１つに記載のヘミ硫酸塩。
請求項１～１１のいずれか１つに記載の５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩および任意選択的に薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
錠剤、カプセル剤、経口用液体調製物、散剤、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射可能なもしくは注入可能な液剤もしくは懸濁剤、または坐剤、好ましくは凍結乾燥物の形態にある、請求項１２に記載の医薬組成物。
さらに少なくとも１種の追加的な治療剤を含む、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
経口、非経口または直腸投与のための医薬組成物である、請求項１２～１４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
治療、好ましくは癌化学療法に使用するための、請求項１～１１のいずれか１つに記載の５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩または請求項１２～１５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
癌の治療のための方法であって、請求項１～１１のいずれか１つに記載の５，１０－メチレン－（６Ｒ）－テトラヒドロ葉酸のヘミ硫酸塩または請求項１２～１５のいずれか１つに記載の医薬組成物を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む、方法。