JP2022071327A - Cell fixing solution and manufacturing method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、形態学的評価及び遺伝子解析に用いるための細胞固定液並びにその製造方法に関する。 The present invention relates to a cell fixative for use in morphological evaluation and gene analysis, and a method for producing the same.
細胞診検査における検体の固定方法及び標本の作製方法は多種多様であり、一般的に世界中で広く用いられている方法の一つに、液状化検体細胞診（Ｌｉｑｕｉｄ－Ｂａｓｅｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ：ＬＢＣ、以下「ＬＢＣ」と略記することがある）が存在する。ＬＢＣはその取扱いが簡易であることから、婦人科、非婦人科のあらゆる領域で用いられている。ＬＢＣの標本作製原理として、ブラシ等で採取した細胞を各種市販の細胞固定液中に浮遊させ、重力による細胞沈下及び荷電による重力沈降静電接着法と、フィルター状に細胞を集め、逆転写する吸引吸着転写法が知られている。このＬＢＣに用いるための固定液は各種メーカーから販売されており、標本の作製方法や試薬の組成や特徴が異なっている。ＬＢＣを行うメリットとして、ＬＢＣは形態学的評価のみならず、標本作成後の微量な残留検体からもＤＮＡ抽出が可能であるため遺伝子検査を行うことができる点が挙げられる。しかしながら、ＬＢＣからのＤＮＡ抽出については推奨条件が確立されておらず、９５％アルコールによる固定や後述するホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）に比べて、固定時間が経過するとともにＤＮＡ断片化が起きて、収集量が減少する場合があった。一方、病理検査において遺伝子解析を行う際には、ホルマリン固定パラフィン包埋切材料（ＦＦＰＥ）からＤＮＡを抽出する方法が推奨されている。しかしながら、手術において十分な組織量が採取できない場合があった。 There are various methods for fixing specimens and preparing specimens in cytopathology tests, and one of the methods widely used all over the world is liquid-based cytology (LBC). (Sometimes abbreviated as "LBC") exists. Since LBC is easy to handle, it is used in all fields of gynecology and non-gynecology. As the principle of preparing LBC specimens, cells collected with a brush or the like are suspended in various commercially available cell fixation solutions, and the cells are settled by gravity and settled by gravity by charge. The suction adsorption transfer method is known. The fixing liquids for use in this LBC are sold by various manufacturers, and the methods for preparing specimens and the compositions and characteristics of reagents are different. One of the merits of performing LBC is that LBC can perform genetic testing not only for morphological evaluation but also for DNA extraction from a small amount of residual sample after sample preparation. However, the recommended conditions for DNA extraction from LBC have not been established, and compared to fixation with 95% alcohol or formalin-fixed paraffin-embedded section (FFPE) described later, DNA fragmentation occurs as the fixation time elapses. Therefore, the amount of collection may decrease. On the other hand, when performing gene analysis in a pathological test, a method of extracting DNA from a formalin-fixed paraffin-embedded material (FFPE) is recommended. However, there were cases where a sufficient amount of tissue could not be collected during surgery.
特許文献１には、生物組織の断片に対し顕微鏡観察を行うための組織固定液であって、メタノールもしくはエタノールのような１種類以上のアルカノールの溶剤成分を溶剤１Ｌあたりほぼ２００～８００ｍＬの総濃度で含んで構成される組織固定液が記載されている。具体的には、エタノールを固定液１Ｌあたり４００ｍＬ、エチレングリコールを固定液１Ｌあたり３００ｍＬ、酢酸を固定液１Ｌあたり１０ｍＬ、塩化亜鉛を固定液１Ｌあたり５．８ｇ、及び水を固定液１Ｌあたり２９０ｍＬ配合した固定液が記載されている。そして、この固定液で処理された組織断片は、一般的な染色剤を用いて顕微鏡で観察するのに適した外観を示すとされている。しかしながら、特許文献１に記載の組織固定液を用いて形態学的評価ができたとしても、当該細胞固定液中で長期間保存した場合の核酸の保存性が必ずしも良好ではなく正確な遺伝子解析が困難であった。 Patent Document 1 describes a tissue fixative for microscopic observation of biological tissue fragments, which contains a solvent component of one or more alkanols, such as methanol or ethanol, at a total concentration of approximately 200-800 mL per liter of solvent. A tissue fixative composed of is described. Specifically, ethanol is mixed with 400 mL per 1 L of fixative, ethylene glycol is mixed with 300 mL per 1 L of fixative, acetic acid is mixed with 10 mL per 1 L of fixative, zinc chloride is mixed with 5.8 g per 1 L of fixative, and water is mixed with 290 mL per 1 L of fixative. The fixative is listed. The tissue fragment treated with this fixative is said to exhibit an appearance suitable for observation under a microscope using a common stain. However, even if morphological evaluation can be performed using the tissue fixative described in Patent Document 1, the storage stability of nucleic acid when stored in the cell fixative for a long period of time is not always good, and accurate gene analysis can be performed. It was difficult.
また、特許文献２には、細胞学的染料；界面活性剤；緩衝剤；有機溶媒；エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングルコール及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される薬剤からなる細胞固定液が記載されており、具体的には、約０．５ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／ＬのアズールＢ；約０．５ｍＬ／Ｌ～約２．０ｍＬ／Ｌのポリソルベート２０；約５ｍＬ／Ｌ～約５０ｍＬ／Ｌのエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリプロピレングリコール；約０．１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／ＬのＨＥＰＥＳナトリウム塩；およびメタノールを含み得る細胞固定液が記載されている。これによれば、検査中の標本のコントラストを改善する、検査用標本の自動調製のための細胞固定液を提供できるとされている。しかしながら、特許文献２に記載の細胞固定液では、当該細胞固定液中で長期間保存した場合に、形態学的評価に適した細胞形態を保持できず、核酸の保存性も必ずしも良好ではなく正確な遺伝子解析が困難であった。 Further, Patent Document 2 describes cell fixation consisting of a cytological dye; a surfactant; a buffer; an organic solvent; an agent selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol and any combination thereof. Liquids are described, specifically about 0.5 g / L to about 5.0 g / L of Azul B; about 0.5 mL / L to about 2.0 mL / L of polysolvate 20; about 5 mL / L. ~ About 50 mL / L of ethylene glycol, propylene glycol or polypropylene glycol; about 0.1 g / L to about 10 g / L of HEPES sodium salt; and a cell fixation solution that may contain methanol are described. According to this, it is said that it is possible to provide a cell fixation solution for automatic preparation of a specimen for examination, which improves the contrast of the specimen during examination. However, the cell fixative described in Patent Document 2 cannot retain the cell morphology suitable for morphological evaluation when stored in the cell fixative for a long period of time, and the nucleic acid storage stability is not always good and accurate. It was difficult to analyze the gene.
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、細胞固定液で長期間保存した場合であっても、形態学的評価に適した細胞形態を保持することができるとともに、核酸の保存性に優れていることから正確な遺伝子解析が可能となる細胞固定液を提供することを目的とするものである。 The present invention has been made to solve the above problems, and can maintain a cell morphology suitable for morphological evaluation even when stored in a cell fixative for a long period of time, and can preserve nucleic acids. It is an object of the present invention to provide a cell fixative which is excellent in sex and enables accurate gene analysis.
上記課題は、（ａ）３～２０ｖ／ｖ％のメタノール及び／又は５～３０ｖ／ｖ％のエタノールと、（ｂ）５～３０ｖ／ｖ％のイソプロパノールと、（ｃ）２１～３９ｖ／ｖ％のプロピレングリコールと、（ｄ）０．５～１０ｖ／ｖ％のホルマリンと、（ｅ）１０～６８ｖ／ｖ％の水とを含むことを特徴とする細胞固定液を提供することによって解決される。 The above tasks are (a) 3 to 20 v / v% methanol and / or 5 to 30 v / v% ethanol, (b) 5 to 30 v / v% isopropanol, and (c) 21 to 39 v / v%. It is solved by providing a cell fixation solution characterized by containing (d) 0.5 to 10 v / v% formalin and (e) 10 to 68 v / v% water. ..
このとき、エチレングリコールを含まない細胞固定液であることが好適な実施態様であり、前記（ａ）において、メタノール及びエタノールの両方を含むことが好適な実施態様である。 At this time, it is a preferable embodiment that the cell fixative does not contain ethylene glycol, and in the above (a), it is a preferable embodiment that both methanol and ethanol are contained.
また、上記課題は、前記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む混合液を調製した後に、前記（ｃ）を添加することを特徴とする細胞固定液の製造方法を提供することによっても解決される。 Further, the above-mentioned subject is a method for producing a cell-fixed solution, which comprises adding the above-mentioned (c) after preparing a mixed solution containing the above-mentioned (a), (b), (d) and (e). It is also solved by providing.
本発明により、細胞固定液で長期間保存した場合であっても、形態学的評価に適した細胞形態を保持することができるとともに、核酸の保存性に優れていることから正確な遺伝子解析が可能となる細胞固定液を提供することができる。当該細胞固定液を用いることにより、検体採取時と同等の細胞形態と核酸の保持が可能であるため、再検査の診断用として有用性が高いものとなる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, even when stored in a cell fixative for a long period of time, it is possible to maintain a cell morphology suitable for morphological evaluation, and since the nucleic acid is excellent in storage stability, accurate gene analysis can be performed. A possible cell fixative can be provided. By using the cell fixative, it is possible to retain the same cell morphology and nucleic acid as at the time of sample collection, so that it is highly useful for diagnosis of re-examination.
本発明の細胞固定液は、（ａ）３～２０ｖ／ｖ％のメタノール及び／又は５～３０ｖ／ｖ％のエタノールと、（ｂ）５～３０ｖ／ｖ％のイソプロパノールと、（ｃ）２１～３９ｖ／ｖ％のプロピレングリコールと、（ｄ）０．５～１０ｖ／ｖ％のホルマリンと、（ｅ）１０～６８ｖ／ｖ％の水とを含むことを特徴とするものである。なお、ｖ／ｖ％は、体積パーセントを意味するものである。 The cell fixative of the present invention comprises (a) 3-20 v / v% methanol and / or 5-30 v / v% ethanol, (b) 5-30 v / v% isopropanol, and (c) 21-. It is characterized by containing 39 v / v% propylene glycol, (d) 0.5 to 10 v / v% formalin, and (e) 10 to 68 v / v% water. In addition, v / v% means volume percent.
後述する実施例における細胞形態の観察結果及び核酸の保存性評価結果から分かるように、プロピレングリコールの含有量が特定範囲にない細胞固定液を用いてＪｕｒｋａｔ培養細胞を１か月間固定した場合、細胞質と核が膨化し、細胞質の辺縁が不明瞭になる等、細胞形態の観察に適しておらず、また、核酸の保存性も良好ではなかったことを本発明者らは確認している。これに対し、本発明の細胞固定液を用いてＪｕｒｋａｔ培養細胞を１か月間固定した場合、形態学的評価に適した細胞形態を保持することができ、かつ核酸の保存性にも優れていることが本発明者らの検討により明らかとなった。したがって、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）で規定された細胞固定液であることが重要であり、長期間保存した場合であっても１つの細胞固定液で形態学的評価と遺伝子解析の両方の検査を正確に行うことができる。このことは本発明者らにより初めて確認されたものである。 As can be seen from the observation results of cell morphology and the evaluation results of nucleic acid storage in Examples described later, when Jurkat cultured cells are fixed for one month using a cell fixative having a propylene glycol content not in a specific range, the cytoplasm The present inventors have confirmed that it is not suitable for observing cell morphology, such as swelling of the nucleus and obscuring the edge of the cytoplasm, and that the storage stability of nucleic acid is not good. On the other hand, when the Jurkat cultured cells are fixed for one month using the cell fixative of the present invention, the cell morphology suitable for morphological evaluation can be maintained and the nucleic acid storage stability is also excellent. It became clear by the examination of the present inventors. Therefore, it is important that the cell fixation solution is defined by the above (a), (b), (c), (d) and (e), and one cell fixation even when stored for a long period of time. Both morphological evaluation and genetic analysis can be performed accurately in liquid. This was first confirmed by the present inventors.
本発明の細胞固定液は、（ａ）３～２０ｖ／ｖ％のメタノール及び／又は５～３０ｖ／ｖ％のエタノールを含むものである。前記（ａ）を満たすことにより、長期間保存した場合であっても形態学的評価に適した細胞形態の保持が可能となる利点を有する。細胞質と核の辺縁が明瞭となり、核内構造の観察が容易となる観点から、前記（ａ）において、メタノール及びエタノールの両方を所定量含む細胞固定液であることが好適な実施態様である。メタノールの含有量が３ｖ／ｖ％未満の場合、細胞形態の保持が困難となる。メタノールの含有量は、５ｖ／ｖ％以上であることが好ましく、８ｖ／ｖ％以上であることがより好ましい。一方、メタノールの含有量が２０ｖ／ｖ％を超える場合、核が濃染し細胞形態の観察に適しておらず、核酸の保存性が良好ではないため、遺伝子解析に適していない。メタノールの含有量は、１８ｖ／ｖ％以下であることが好ましく、１５ｖ／ｖ％以下であることがより好ましく、１２ｖ／ｖ％以下であることがさらに好ましい。また、エタノールの含有量が５ｖ／ｖ％未満の場合も、細胞形態の保持が困難となる。エタノールの含有量は、８ｖ／ｖ％以上であることが好ましく、１２ｖ／ｖ％以上であることがより好ましく、１４ｖ／ｖ％以上であることがさらに好ましく、１８ｖ／ｖ％以上であることが特に好ましい。一方、エタノールの含有量が３０ｖ／ｖ％を超える場合、核内が淡染し細胞形態の観察に適していない。また、核酸の保存性が良好ではないため、遺伝子解析に適していない。エタノールの含有量は、２８ｖ／ｖ％以下であることが好ましく、２６ｖ／ｖ％以下であることがより好ましく、２４ｖ／ｖ％以下であることがさらに好ましい。 The cell fixative of the present invention comprises (a) 3-20 v / v% methanol and / or 5-30 v / v% ethanol. By satisfying the above (a), there is an advantage that the cell morphology suitable for morphological evaluation can be maintained even when stored for a long period of time. In the above (a), a cell fixation solution containing a predetermined amount of both methanol and ethanol is a preferred embodiment from the viewpoint of clarifying the margin between the cytoplasm and the nucleus and facilitating the observation of the intranuclear structure. .. When the content of methanol is less than 3v / v%, it becomes difficult to maintain the cell morphology. The content of methanol is preferably 5 v / v% or more, more preferably 8 v / v% or more. On the other hand, when the content of methanol exceeds 20 v / v%, the nucleus is deeply stained and not suitable for observation of cell morphology, and the storage stability of nucleic acid is not good, so that it is not suitable for gene analysis. The content of methanol is preferably 18 v / v% or less, more preferably 15 v / v% or less, and even more preferably 12 v / v% or less. Further, when the ethanol content is less than 5 v / v%, it becomes difficult to maintain the cell morphology. The content of ethanol is preferably 8 v / v% or more, more preferably 12 v / v% or more, further preferably 14 v / v% or more, and more preferably 18 v / v% or more. Especially preferable. On the other hand, when the ethanol content exceeds 30 v / v%, the inside of the nucleus is lightly stained and it is not suitable for observing the cell morphology. In addition, it is not suitable for gene analysis because the storage stability of nucleic acid is not good. The ethanol content is preferably 28 v / v% or less, more preferably 26 v / v% or less, and even more preferably 24 v / v% or less.
本発明の細胞固定液は、（ｂ）５～３０ｖ／ｖ％のイソプロパノールを含むものである。前記（ｂ）を満たすことにより、長期間保存した場合であっても細胞形態を観察した際の細胞質と核の辺縁が明瞭となる利点を有する。イソプロパノールの含有量が５ｖ／ｖ％未満の場合、核が濃染し細胞形態の観察に適していない。イソプロパノールの含有量は、８ｖ／ｖ％以上であることが好ましく、１０ｖ／ｖ％以上であることがより好ましく、１２ｖ／ｖ％以上であることがさらに好ましく、１６ｖ／ｖ％以上であることが特に好ましい。一方、イソプロパノールの含有量が３０ｖ／ｖ％を超える場合、核が膨化し、細胞形態の観察に適していない。イソプロパノールの含有量は、２８ｖ／ｖ％以下であることが好ましく、２６ｖ／ｖ％以下であることがより好ましく、２４ｖ／ｖ％以下であることがさらに好ましい。 The cell fixation solution of the present invention contains (b) 5 to 30 v / v% isopropanol. By satisfying the above (b), there is an advantage that the cytoplasm and the margin of the nucleus become clear when observing the cell morphology even when stored for a long period of time. When the content of isopropanol is less than 5v / v%, the nucleus is deeply stained and it is not suitable for observing the cell morphology. The content of isopropanol is preferably 8 v / v% or more, more preferably 10 v / v% or more, further preferably 12 v / v% or more, and more preferably 16 v / v% or more. Especially preferable. On the other hand, when the content of isopropanol exceeds 30 v / v%, the nucleus swells and is not suitable for observing the cell morphology. The content of isopropanol is preferably 28 v / v% or less, more preferably 26 v / v% or less, and even more preferably 24 v / v% or less.
本発明の細胞固定液は、（ｃ）２１～３９ｖ／ｖ％のプロピレングリコールを含むものである。前記（ｃ）を満たすことにより、長期間保存した場合であっても形態学的評価に適した細胞形態を保持することができ、かつ核酸の保存性にも優れる利点を有する。プロピレングリコールの含有量が２１ｖ／ｖ％未満の場合、細胞質の辺縁が不明瞭になる等、細胞形態の観察に適しておらず、核酸の保存性も良好ではない。プロピレングリコールの含有量は、２２ｖ／ｖ％以上であることが好ましく、２４ｖ／ｖ％以上であることがより好ましく、２６ｖ／ｖ％以上であることがさらに好ましく、２８ｖ／ｖ％以上であることが特に好ましい。一方、プロピレングリコールの含有量が３９ｖ／ｖ％を超える場合、細胞質の辺縁が不明瞭になる等、細胞形態の観察に適していない。プロピレングリコールの含有量は、３８ｖ／ｖ％以下であることが好ましく、３６ｖ／ｖ％以下であることがより好ましく、３４ｖ／ｖ％以下であることがさらに好ましい。 The cell fixation solution of the present invention contains (c) 21 to 39 v / v% propylene glycol. By satisfying the above (c), it is possible to maintain a cell morphology suitable for morphological evaluation even when stored for a long period of time, and it has an advantage of excellent storage stability of nucleic acid. When the content of propylene glycol is less than 21 v / v%, it is not suitable for observing the cell morphology, such as the margin of the cytoplasm becoming unclear, and the storage stability of the nucleic acid is not good. The content of propylene glycol is preferably 22 v / v% or more, more preferably 24 v / v% or more, further preferably 26 v / v% or more, and 28 v / v% or more. Is particularly preferable. On the other hand, when the content of propylene glycol exceeds 39 v / v%, it is not suitable for observing the cell morphology because the margin of the cytoplasm becomes unclear. The content of propylene glycol is preferably 38 v / v% or less, more preferably 36 v / v% or less, and even more preferably 34 v / v% or less.
本発明の細胞固定液は、（ｄ）０．５～１０ｖ／ｖ％のホルマリンを含むものである。前記（ｄ）を満たすことにより、核酸の保存性に優れ、正確な遺伝子解析が可能となる利点を有する。ホルマリンの含有量が０．５ｖ／ｖ％未満の場合、核酸の保存性が良好ではない。ホルマリンの含有量は、０．６ｖ／ｖ％以上であることが好ましく、０．８ｖ／ｖ％以上であることがより好ましい。一方、ホルマリンの含有量が１０ｖ／ｖ％を超える場合、核酸の保存性が良好ではなく、遺伝子解析に適していない。ホルマリンの含有量は、８ｖ／ｖ％以下であることが好ましく、６ｖ／ｖ％以下であることがより好ましく、４ｖ／ｖ％以下であることがさらに好ましく、２ｖ／ｖ％以下であることが特に好ましい。 The cell fixative of the present invention contains (d) 0.5-10 v / v% formalin. By satisfying the above (d), there is an advantage that the nucleic acid has excellent storage stability and accurate gene analysis becomes possible. When the formalin content is less than 0.5 v / v%, the nucleic acid storage stability is not good. The formalin content is preferably 0.6 v / v% or more, more preferably 0.8 v / v% or more. On the other hand, when the content of formalin exceeds 10 v / v%, the storage stability of nucleic acid is not good and it is not suitable for gene analysis. The formalin content is preferably 8v / v% or less, more preferably 6v / v% or less, still more preferably 4v / v% or less, and preferably 2v / v% or less. Especially preferable.
本発明の細胞固定液は、（ｅ）１０～６８ｖ／ｖ％の水を含むものである。用いられる水としては、蒸留水、イオン交換水等が挙げられ、滅菌水であってもよい。水の含有量が１０ｖ／ｖ％未満の場合、細胞が縮む場合がある。水の含有量は、１２ｖ／ｖ％以上であることが好ましく、１５ｖ／ｖ％以上であることがより好ましく、１８ｖ／ｖ％以上であることがさらに好ましく、２２ｖ／ｖ％以上であることが特に好ましい。一方、水の含有量が６８ｖ／ｖ％を超える場合、細胞が膨化し、細胞形態の観察に適していない。水の含有量は、６５ｖ／ｖ％以下であることが好ましく、５５ｖ／ｖ％以下であることがより好ましく、４５ｖ／ｖ％以下であることがさらに好ましく、４０ｖ／ｖ％以下であることが特に好ましい。 The cell fixation solution of the present invention contains (e) 10 to 68 v / v% water. Examples of the water used include distilled water, ion-exchanged water and the like, and may be sterile water. If the water content is less than 10 v / v%, the cells may shrink. The water content is preferably 12 v / v% or more, more preferably 15 v / v% or more, further preferably 18 v / v% or more, and preferably 22 v / v% or more. Especially preferable. On the other hand, when the water content exceeds 68 v / v%, the cells swell and are not suitable for observing the cell morphology. The water content is preferably 65 v / v% or less, more preferably 55 v / v% or less, further preferably 45 v / v% or less, and more preferably 40 v / v% or less. Especially preferable.
後述する実施例において、エチレングリコールを所定量含む市販の細胞固定液を用いてＪｕｒｋａｔ培養細胞を１か月間固定した場合、細胞質の辺縁が不明瞭になる等、細胞形態の観察に適しておらず、また、核酸の保存性も良好ではなかったことを本発明者らは確認している。かかる観点から、エチレングリコールを含まない細胞固定液であることが本発明の好適な実施態様である。なお、「エチレングリコールを含まない」とは、本発明の効果を阻害しない範囲でエチレングリコールが微量含まれることを許容し、前記微量とは、通常、１ｖ／ｖ％未満であり、好適には０．５ｖ／ｖ％未満である。 In the examples described later, when Jurkat cultured cells are fixed for 1 month using a commercially available cell fixation solution containing a predetermined amount of ethylene glycol, the edges of the cytoplasm become unclear, and the cells are suitable for observation of cell morphology. Moreover, the present inventors have confirmed that the storage stability of the nucleic acid was not good. From this point of view, a cell fixation solution containing no ethylene glycol is a preferred embodiment of the present invention. In addition, "without ethylene glycol" allows a trace amount of ethylene glycol to be contained within a range that does not impair the effect of the present invention, and the said trace amount is usually less than 1v / v%, and is preferable. It is less than 0.5 v / v%.
上記説明したように、本発明は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）で規定された細胞固定液であるが、本発明の効果を阻害しない範囲であれば、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）以外の他の成分が含まれていても構わない。他の成分の含有量は、通常、１ｖ／ｖ％未満であり、好適には０．５ｖ／ｖ％未満である。かかる観点から、本発明は、実質的に前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のみからなる細胞固定液であることが好適な実施態様であり、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のみからなる細胞固定液であることがより好適な実施態様である。 As described above, the present invention is the cell fixation solution defined in the above (a), (b), (c), (d) and (e), but as long as the effect of the present invention is not impaired. For example, other components other than the above (a), (b), (c), (d) and (e) may be contained. The content of the other components is usually less than 1 v / v%, preferably less than 0.5 v / v%. From this point of view, it is a preferred embodiment that the present invention is a cell fixation solution substantially consisting of only the above (a), (b), (c), (d) and (e). A more preferred embodiment is a cell fixation solution comprising only a), (b), (c), (d) and (e).
本発明の細胞固定液の製造方法としては特に限定されず、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を任意の順番で添加して混合液を調製することができる。しかしながら、プロピレングリコールの粘度が高く、単に前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を添加して混合液を調製すると、再現性良く細胞固定液を得ることができないおそれがある。かかる観点から、前記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む混合液を調製した後に、前記（ｃ）を添加する細胞固定液の製造方法であることが好適な実施態様である。 The method for producing the cell fixation solution of the present invention is not particularly limited, and the above-mentioned (a), (b), (c), (d) and (e) are added in any order to prepare a mixed solution. Can be done. However, the viscosity of propylene glycol is high, and a mixed solution can be obtained with good reproducibility by simply adding the above (a), (b), (c), (d) and (e) to prepare a mixed solution. It may not be possible. From this point of view, a preferred embodiment is a method for producing a cell fixation solution in which the (c) is added after preparing the mixed solution containing the (a), (b), (d) and (e). Is.
上述のようにして得られる本発明の細胞固定液は、長期間保存した場合であっても１つの細胞固定液で形態学的評価と遺伝子解析の両方の検査を正確に行うことができる。検体採取時と同等の細胞形態と核酸の保持が可能であるため、長期間保存後の再検査診断用として好適に用いることができる。 The cell fixative of the present invention obtained as described above can accurately perform both morphological evaluation and genetic analysis with one cell fixative even when stored for a long period of time. Since it is possible to retain the same cell morphology and nucleic acid as at the time of sample collection, it can be suitably used for re-examination diagnosis after long-term storage.
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。以下のパパニコロウ染色標本は、システム生物顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製「ＢＸ５０」）により形態観察を行った。また、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒによりフラグメント解析を行った。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The following Papanicolaou-stained specimens were morphologically observed with a system biological microscope (“BX50” manufactured by OLYMPUS). Fragment analysis was also performed using Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer.
（Ａ）細胞固定液の検討
［試料］
Ｊｕｒｋａｔ培養細胞を用いた。
(A) Examination of cell fixation solution [Sample]
Jurkat cultured cells were used.
［細胞固定液の調製］
（１）細胞固定液I
細胞固定液全量に対して、それぞれ２０ｖ／ｖ％エタノール、１０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して１０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液Iを得た。
[Preparation of cell fixation solution]
(1) Cell fixation solution I
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 20 v / v% ethanol, 10 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formarin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 10 v / v%, cell fixative I was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（２）細胞固定液II
細胞固定液全量に対して、それぞれ５ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、１５ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して１０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IIを得た。
(2) Cell fixation solution II
A mixed solution containing water was prepared so that the total amount of the cell fixation solution was 5 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 15 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene was added to this mixed solution. Glycol was added so as to be 10 v / v% with respect to the total amount of the cell-fixed solution, and then the mixture was sufficiently inverted and mixed to obtain the cell-fixed solution II.
（３）細胞固定液III
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して１０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IIIを得た。
(3) Cell fixation solution III
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 10 v / v%, cell fixative III was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（４）細胞固定液IV
細胞固定液全量に対して、それぞれ２０ｖ／ｖ％エタノール、１０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して２０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IVを得た。
(4) Cell fixation solution IV
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 20 v / v% ethanol, 10 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formarin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 20 v / v%, cell fixative IV was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（５）細胞固定液V
細胞固定液全量に対して、それぞれ５ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、１５ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して２０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液Vを得た。
(5) Cell fixation liquid V
A mixed solution containing water was prepared so that the total amount of the cell fixation solution was 5 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 15 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene was added to this mixed solution. Glycol was added so as to be 20 v / v% with respect to the total amount of the cell-fixed solution, and then sufficiently inverted and mixed to obtain the cell-fixed solution V.
（６）細胞固定液VI
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して２０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液VIを得た。
(6) Cell fixation solution VI
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 20 v / v%, cell fixative VI was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（７）細胞固定液VII
細胞固定液全量に対して、それぞれ２０ｖ／ｖ％エタノール、１０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して３０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液VIIを得た。
(7) Cell fixation solution VII
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 20 v / v% ethanol, 10 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formarin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 30 v / v%, cell fixative VII was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（８）細胞固定液VIII
細胞固定液全量に対して、それぞれ５ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、１５ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して３０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液VIIIを得た。
(8) Cell fixation solution VIII
A mixed solution containing water was prepared so that the total amount of the cell fixation solution was 5 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 15 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene was added to this mixed solution. Glycol was added so as to be 30 v / v% with respect to the total amount of the cell-fixed solution, and then the mixture was sufficiently inverted and mixed to obtain the cell-fixed solution VIII.
（９）細胞固定液IX
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して３０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IXを得た。上記（１）～（９）の細胞固定液の組成を表１にまとめて示す。
(9) Cell fixation solution IX
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 30 v / v%, cell fixative IX was obtained by sufficient inversion and miscibility. The compositions of the cell fixation solutions (1) to (9) above are summarized in Table 1.
［固定処理］
上記（１）～（９）のそれぞれの細胞固定液１０ｍｌに対し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．０×１０６個添加した。１か月間４℃で固定後、細胞固定液を１ｍｌ遠心管に採り、２０００ｒｐｍで５分遠心処理した。上清を除去したのち生理食塩水を２ｍｌ添加し十分に攪拌し、セットしたチャンバー内に添加後、１０分間静置した。余分な細胞固定液を破棄し、９５％エタノールで１日固定を行った後、通常のパパニコロウ染色を行って標本を得た。
[Fixed processing]
1.0 × 10 6 Jurkat cells were added to 10 ml of each of the cell fixation solutions (1) to (9) above. After fixing at 4 ° C. for 1 month, the cell fixation solution was collected in a 1 ml centrifuge tube and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, 2 ml of physiological saline was added, the mixture was sufficiently stirred, and the mixture was added into the set chamber and allowed to stand for 10 minutes. Excess cell fixative was discarded, and after fixing with 95% ethanol for 1 day, normal Papanicolaou stain was performed to obtain a specimen.
［細胞形態の観察］
得られたパパニコロウ染色標本の写真を図１に示す。図１（１）は上記（１）細胞固定液Iを用いた場合、図１（２）は上記（２）細胞固定液IIを用いた場合、図１（３）は上記（３）細胞固定液IIIを用いた場合、図１（４）は上記（４）細胞固定液IVを用いた場合、図１（５）は上記（５）細胞固定液Vを用いた場合、図１（６）は上記（６）細胞固定液VIを用いた場合、図１（７）は上記（７）細胞固定液VIIを用いた場合、図１（８）は上記（８）細胞固定液VIIIを用いた場合、図１（９）は上記（９）細胞固定液IXを用いた場合にそれぞれ対応する。図１（１）～（６）では、細胞質及び核が膨化し形態観察には適さなかった。図１（７）では、やや核が淡いが、細胞質の辺縁が明瞭であった。図１（８）では、細胞質及び核の辺縁が明瞭であり、核クロマチンの様子も明瞭であったが、軽度の細胞崩壊が確認された。図１（９）では、細胞質及び核の辺縁が明瞭であり、核クロマチンの様子も明瞭であり、細胞崩壊はあまり見られなかった。
[Observation of cell morphology]
A photograph of the obtained Papanicolaou-stained specimen is shown in FIG. 1 (1) shows the above (1) cell fixation solution I, FIG. 1 (2) shows the above (2) cell fixation solution II, and FIG. 1 (3) shows the above (3) cell fixation. When liquid III is used, FIG. 1 (4) shows the above (4) cell fixing solution IV, and FIG. 1 (5) shows the above (5) cell fixing solution V, FIG. 1 (6). When the above (6) cell fixation solution VI was used, FIG. 1 (7) used the above (7) cell fixation solution VII, and FIG. 1 (8) used the above (8) cell fixation solution VIII. In this case, FIG. 1 (9) corresponds to the case where the above-mentioned (9) cell fixation solution IX is used. In FIGS. 1 (1) to 1 (6), the cytoplasm and nucleus swelled and were not suitable for morphological observation. In FIG. 1 (7), the nucleus was slightly pale, but the cytoplasmic margin was clear. In FIG. 1 (8), the cytoplasm and the margin of the nucleus were clear, and the state of nuclear chromatin was also clear, but mild cell disruption was confirmed. In FIG. 1 (9), the cytoplasm and the margin of the nucleus were clear, the state of nuclear chromatin was also clear, and cell disruption was not so much observed.
（Ｂ）プロピレングリコール含有量の検討（１）
［試料］
Ｊｕｒｋａｔ培養細胞を用いた。
(B) Examination of Propylene Glycol Content (1)
[sample]
Jurkat cultured cells were used.
［細胞固定液の調製］
（１）細胞固定液I
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して３０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液Iを得た。
[Preparation of cell fixation solution]
(1) Cell fixation solution I
A mixed solution containing water was prepared so that the total amount of the cell fixation solution was 10 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene was added to this mixed solution. Glycol was added so as to be 30 v / v% with respect to the total amount of the cell-fixed solution, and then sufficiently inverted and mixed to obtain the cell-fixed solution I.
（２）細胞固定液II
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して３０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IIを得た。
(2) Cell fixation solution II
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 30 v / v%, cell fixative II was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（３）細胞固定液III
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して４０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IIIを得た。
(3) Cell fixation solution III
A mixed solution containing water was prepared so that the total amount of the cell fixation solution was 10 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene was added to this mixed solution. Glycol was added so as to be 40 v / v% with respect to the total amount of the cell-fixed solution, and then the mixture was sufficiently inverted and mixed to obtain the cell-fixed solution III.
（４）細胞固定液IV
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して４０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IVを得た。
(4) Cell fixation solution IV
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 40 v / v%, cell fixative IV was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（５）細胞固定液V
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して５０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液Vを得た。
(5) Cell fixation liquid V
A mixed solution containing water was prepared so that the total amount of the cell fixation solution was 10 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene was added to this mixed solution. Glycol was added so as to be 50 v / v% with respect to the total amount of the cell-fixed solution, and then sufficiently inverted and mixed to obtain the cell-fixed solution V.
（６）細胞固定液VI
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して５０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液VIを得た。上記（１）～（６）の細胞固定液の組成を表２にまとめて示す。
(6) Cell fixation solution VI
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 50 v / v%, cell fixative VI was obtained by sufficient inversion and miscibility. The compositions of the cell fixation solutions (1) to (6) above are summarized in Table 2.
［固定処理］
上記（１）～（６）のそれぞれの細胞固定液１０ｍｌに対し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．０×１０６個添加した。１か月間４℃で固定後、細胞固定液を１ｍｌ遠心管に採り、２０００ｒｐｍで５分遠心処理した。上清を除去したのち生理食塩水を２ｍｌ添加し十分に攪拌し、セットしたチャンバー内に添加後、１０分間静置した。余分な細胞固定液を破棄し、９５％エタノールで１日固定を行った後、通常のパパニコロウ染色を行って標本を得た。
[Fixed processing]
1.0 × 10 6 Jurkat cells were added to 10 ml of each of the cell fixation solutions (1) to (6) above. After fixing at 4 ° C. for 1 month, the cell fixation solution was collected in a 1 ml centrifuge tube and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, 2 ml of physiological saline was added, the mixture was sufficiently stirred, and the mixture was added into the set chamber and allowed to stand for 10 minutes. Excess cell fixative was discarded, and after fixing with 95% ethanol for 1 day, normal Papanicolaou stain was performed to obtain a specimen.
［細胞形態の観察］
得られたパパニコロウ染色標本の写真を図２に示す。図２（１）は上記（１）細胞固定液Iを用いた場合、図２（２）は上記（２）細胞固定液IIを用いた場合、図２（３）は上記（３）細胞固定液IIIを用いた場合、図２（４）は上記（４）細胞固定液IVを用いた場合、図２（５）は上記（５）細胞固定液Vを用いた場合、図２（６）は上記（６）細胞固定液VIを用いた場合にそれぞれ対応する。図２（１）では、細胞質及び核の辺縁が明瞭であり、核内構造の観察も可能であった。一部細胞質の辺縁にほつれが見られた。図２（２）では、図２（１）と同様に細胞質及び核の辺縁が明瞭であるが、図１（１）に比べ一部核が濃染し観察しにくく、細胞質の辺縁にほつれが見られた。図２（３）及び（４）では、核の辺縁が一部不明瞭であり、細胞質の辺縁が不明瞭であった。また、核が濃染していた。図（５）及び（６）では、細胞質の辺縁が不明瞭であり、核が濃染していた。
[Observation of cell morphology]
A photograph of the obtained Papanicolaou-stained specimen is shown in FIG. 2 (1) shows the above (1) cell fixation solution I, FIG. 2 (2) shows the above (2) cell fixation solution II, and FIG. 2 (3) shows the above (3) cell fixation. When liquid III is used, FIG. 2 (4) shows the above (4) cell fixing solution IV, and FIG. 2 (5) shows the above (5) cell fixing solution V. FIG. 2 (6). (6) Corresponds to the case where the cell fixation solution VI is used. In FIG. 2 (1), the cytoplasm and the margin of the nucleus were clear, and the intranuclear structure could be observed. Fraying was seen on the margin of some cytoplasms. In FIG. 2 (2), the cytoplasmic and nuclear margins are clear as in FIG. 2 (1), but compared to FIG. 1 (1), some nuclei are deeply stained and difficult to observe, and the cytoplasmic margins are visible. Fraying was seen. In FIGS. 2 (3) and 2 (4), the margin of the nucleus was partially unclear, and the margin of the cytoplasm was unclear. In addition, the nucleus was deeply dyed. In FIGS. (5) and (6), the edges of the cytoplasm were unclear and the nuclei were deeply stained.
（Ｃ）エチレングリコールとプロピレングリコールとの比較
［試料］
Ｊｕｒｋａｔ培養細胞を用いた。
(C) Comparison of ethylene glycol and propylene glycol [Sample]
Jurkat cultured cells were used.
［細胞固定液の調製］
（１）市販の細胞固定液Ａ
組成としては、細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１５～２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリン、５～１０ｖ／ｖ％エチレングリコールを含有。
[Preparation of cell fixation solution]
(1) Commercially available cell fixation solution A
The composition contains 10 v / v% methanol, 15-20 v / v% isopropanol, 1 v / v% formalin, and 5-10 v / v% ethylene glycol with respect to the total amount of the cell fixative.
（２）細胞固定液I
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して１０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液Iを得た。
(2) Cell fixation solution I
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 10 v / v%, cell fixative I was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（３）細胞固定液II
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して２０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IIを得た。
(3) Cell fixation solution II
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 20 v / v%, cell fixative II was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（４）細胞固定液III
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して３０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IIIを得た。上記（１）～（４）の細胞固定液の組成を表３にまとめて示す。
(4) Cell fixation solution III
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the total amount of the cell fixative. After addition to 30 v / v%, cell fixative III was obtained by sufficient inversion and miscibility. The compositions of the cell fixation solutions (1) to (4) above are summarized in Table 3.
［固定処理］
上記（１）～（４）のそれぞれの細胞固定液１０ｍｌに対し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．０×１０６個添加した。１か月間４℃で固定後、細胞固定液を１ｍｌ遠心管に採り、２０００ｒｐｍで５分遠心処理した。上清を除去したのち生理食塩水を２ｍｌ添加し十分に攪拌し、セットしたチャンバー内に添加後、１０分間静置した。余分な細胞固定液を破棄し、９５％エタノールで１日固定を行った後、通常のパパニコロウ染色を行って標本を得た。
[Fixed processing]
1.0 × 10 6 Jurkat cells were added to 10 ml of each of the cell fixation solutions (1) to (4) above. After fixing at 4 ° C. for 1 month, the cell fixation solution was collected in a 1 ml centrifuge tube and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, 2 ml of physiological saline was added, the mixture was sufficiently stirred, and the mixture was added into the set chamber and allowed to stand for 10 minutes. Excess cell fixative was discarded, and after fixing with 95% ethanol for 1 day, normal Papanicolaou stain was performed to obtain a specimen.
［細胞形態の観察］
得られたパパニコロウ染色標本の写真を図３に示す。図３（１）は上記（１）市販の細胞固定液Ａを用いた場合、図３（２）は上記（２）細胞固定液Iを用いた場合、図３（３）は上記（３）細胞固定液IIを用いた場合、図３（４）は上記（４）細胞固定液IIIを用いた場合にそれぞれ対応する。図３（１）では、細胞質及び核の辺縁がやや不明瞭であった。図３（２）及び（３）では、細胞質及び核が膨化し形態観察には適さなかった。図３（４）では、一部の細胞質の辺縁がやや不明瞭であるが、核の辺縁が明瞭であり、核内構造の観察も可能であった。エチレングリコールが含まれる細胞固定液よりも、プロピレングリコールを一定量含む細胞固定液の方が形態観察において有用であることが分かる。
[Observation of cell morphology]
A photograph of the obtained Papanicolaou-stained specimen is shown in FIG. 3 (1) shows the above (1) when the commercially available cell fixing solution A is used, FIG. 3 (2) shows the above (2) using the cell fixing solution I, and FIG. 3 (3) shows the above (3). When the cell fixation solution II is used, FIG. 3 (4) corresponds to the case where the above (4) cell fixation solution III is used, respectively. In FIG. 3 (1), the cytoplasm and the margin of the nucleus were slightly unclear. In FIGS. 3 (2) and 3 (3), the cytoplasm and nucleus swelled and were not suitable for morphological observation. In FIG. 3 (4), the margin of a part of the cytoplasm is a little unclear, but the margin of the nucleus is clear, and the intranuclear structure can be observed. It can be seen that a fixative containing a certain amount of propylene glycol is more useful in morphological observation than a fixative containing ethylene glycol.
（Ｄ）プロピレングリコール含有量の検討（２）
［試料］
Ｊｕｒｋａｔ培養細胞を用いた。
(D) Examination of propylene glycol content (2)
[sample]
Jurkat cultured cells were used.
［細胞固定液の調製］
（１）細胞固定液IV
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して３０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液IVを得た。
[Preparation of cell fixation solution]
(1) Cell fixation solution IV
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene in this mixed solution. Glyco was added so as to be 30 v / v% with respect to the total amount of the cell fixative, and then sufficiently inverted and mixed to obtain the cell fixative IV.
（２）細胞固定液V
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して２０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液Vを得た。
(2) Cell fixation liquid V
A mixed solution containing water was prepared so that the total amount of the cell fixation solution was 10 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene was added to this mixed solution. Glycol was added so as to be 20 v / v% with respect to the total amount of the cell-fixed solution, and then sufficiently inverted and mixed to obtain the cell-fixed solution V.
（３）細胞固定液VI
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して１０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液VIを得た。上記（１）～（３）の細胞固定液の組成を表４にまとめて示す。
(3) Cell fixation solution VI
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene in this mixed solution. Glyco was added so as to be 10 v / v% with respect to the total amount of the cell fixative, and then sufficiently inverted and mixed to obtain a cell fixative VI. The compositions of the cell fixation solutions (1) to (3) above are summarized in Table 4.
［固定処理］
上記（１）～（３）のそれぞれの細胞固定液１０ｍｌに対し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．０×１０６個添加した。１か月間４℃で固定後、細胞固定液を１ｍｌ遠心管に採り、２０００ｒｐｍで５分遠心処理した。上清を除去したのち生理食塩水を２ｍｌ添加し十分に攪拌し、セットしたチャンバー内に添加後、１０分間静置した。余分な細胞固定液を破棄し、９５％エタノールで１日固定を行った後、通常のパパニコロウ染色を行って標本を得た。
[Fixed processing]
1.0 × 10 6 Jurkat cells were added to 10 ml of each of the cell fixation solutions (1) to (3) above. After fixing at 4 ° C. for 1 month, the cell fixation solution was collected in a 1 ml centrifuge tube and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, 2 ml of physiological saline was added, the mixture was sufficiently stirred, and the mixture was added into the set chamber and allowed to stand for 10 minutes. Excess cell fixative was discarded, and after fixing with 95% ethanol for 1 day, normal Papanicolaou stain was performed to obtain a specimen.
［細胞形態の観察］
得られたパパニコロウ染色標本の写真を図４に示す。図４（１）は上記（１）細胞固定液IVを用いた場合、図４（２）は上記（２）細胞固定液Vを用いた場合、図４（３）は上記（３）細胞固定液VIを用いた場合にそれぞれ対応する。図４（１）では、細胞質及び核の辺縁が明瞭であり、核内構造の観察も可能であった。図４（２）では、細胞質の辺縁が不明瞭であり、形態観察には適さなかった。図４（３）では、細胞質の辺縁が不明瞭であり、核が濃染し、形態観察には適さなかった。
[Observation of cell morphology]
A photograph of the obtained Papanicolaou-stained specimen is shown in FIG. 4 (1) shows the above (1) cell fixation solution IV, FIG. 4 (2) shows the above (2) cell fixation solution V, and FIG. 4 (3) shows the above (3) cell fixation. Corresponds to each case when liquid VI is used. In FIG. 4 (1), the cytoplasm and the margin of the nucleus were clear, and the intranuclear structure could be observed. In FIG. 4 (2), the margin of the cytoplasm was unclear, and it was not suitable for morphological observation. In FIG. 4 (3), the margin of the cytoplasm was unclear, the nucleus was deeply stained, and it was not suitable for morphological observation.
（Ｅ）市販の細胞固定液との比較（１）
［試料］
Ｊｕｒｋａｔ培養細胞を用いた。
(E) Comparison with commercially available cell fixation solution (1)
[sample]
Jurkat cultured cells were used.
［細胞固定液の調製］
（１）細胞固定液Ｉ
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１０ｖ／ｖ％エタノール、２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して３０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液Iを得た。
[Preparation of cell fixation solution]
(1) Cell fixation solution I
A mixed solution containing water was prepared so that the total amount of the cell fixation solution was 10 v / v% methanol, 10 v / v% ethanol, 20 v / v% isopropanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and propylene was added to this mixed solution. Glycol was added so as to be 30 v / v% with respect to the total amount of the cell-fixed solution, and then sufficiently inverted and mixed to obtain the cell-fixed solution I.
（２）市販の細胞固定液Ａ
組成としては、細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１５～２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリン、５～１０ｖ／ｖ％エチレングリコールを含有。
(2) Commercially available cell fixation solution A
The composition contains 10 v / v% methanol, 15-20 v / v% isopropanol, 1 v / v% formalin, and 5-10 v / v% ethylene glycol with respect to the total amount of the cell fixative.
（３）市販の細胞固定液Ｂ
組成としては、細胞固定液全量に対して、それぞれ２～１０ｖ／ｖ％メタノール、３０～５０ｖ／ｖ％エタノールを含有。
(3) Commercially available cell fixation solution B
The composition contains 2 to 10 v / v% methanol and 30 to 50 v / v% ethanol, respectively, with respect to the total amount of the cell fixative.
（４）市販の細胞固定液Ｃ
組成としては、細胞固定液全量に対して、それぞれ１～２ｖ／ｖ％メタノール、１８～３０ｖ／ｖ％エタノール、１～１．８ｖ／ｖ％イソプロパノールを含有。上記（１）～（４）の細胞固定液の組成を表５にまとめて示す。
(4) Commercially available cell fixation solution C
The composition contains 1 to 2 v / v% methanol, 18 to 30 v / v% ethanol, and 1 to 1.8 v / v% isopropanol with respect to the total amount of the cell fixative. The compositions of the cell fixation solutions (1) to (4) above are summarized in Table 5.
［固定処理］
上記（１）～（４）のそれぞれの細胞固定液１０ｍｌに対し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．０×１０６個添加した。１か月間４℃で固定後、細胞固定液を１ｍｌ遠心管に採り、２０００ｒｐｍで５分遠心処理した。上清を除去したのち生理食塩水を２ｍｌ添加し十分に攪拌し、セットしたチャンバー内に添加後、１０分間静置した。余分な細胞固定液を破棄し、９５％エタノールで１日固定を行った後、通常のパパニコロウ染色を行って標本を得た。
[Fixed processing]
1.0 × 10 6 Jurkat cells were added to 10 ml of each of the cell fixation solutions (1) to (4) above. After fixing at 4 ° C. for 1 month, the cell fixation solution was collected in a 1 ml centrifuge tube and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, 2 ml of physiological saline was added, the mixture was sufficiently stirred, and the mixture was added into the set chamber and allowed to stand for 10 minutes. Excess cell fixative was discarded, and after fixing with 95% ethanol for 1 day, normal Papanicolaou stain was performed to obtain a specimen.
［細胞形態の観察］
得られたパパニコロウ染色標本の写真を図５に示す。図５（１）は上記（１）細胞固定液Iを用いた場合、図５（２）は上記（２）市販の細胞固定液Ａを用いた場合、図５（３）は上記（３）市販の細胞固定液Ｂを用いた場合、図５（４）は上記（４）市販の細胞固定液Ｃを用いた場合、図５（５）は比較用として未固定の細胞を用いた場合にそれぞれ対応する。図５（１）では、細胞質の辺縁がやや不明瞭の細胞もあるが、核の辺縁は明瞭でクロマチン構造も観察しやすいことが分かる。図５（２）では、細胞質及び核の辺縁がやや不明瞭であった。図５（３）では、細胞が小型化し、核が濃染し、細胞崩壊が確認された。図５（４）では、核の辺縁は明瞭であるが、細胞質内に空胞が多数観察された。上記（１）～（４）のそれぞれの細胞固定液を比較した結果、上記（１）細胞固定液Iを用いた場合が最も形態観察に適していた。以上のことより、市販の細胞固定液と比べて本発明の細胞固定液は、１か月固定した場合においても検体採取時と同等の形態学的評価を行うことができる。
[Observation of cell morphology]
A photograph of the obtained Papanicolaou-stained specimen is shown in FIG. 5 (1) shows the above (1) when the cell fixing solution I is used, FIG. 5 (2) shows the above (2) using the commercially available cell fixing solution A, and FIG. 5 (3) shows the above (3). When the commercially available cell fixation solution B is used, FIG. 5 (4) shows the above (4) when the commercially available cell fixation solution C is used, and FIG. 5 (5) shows the case where unfixed cells are used for comparison. Correspond to each. In FIG. 5 (1), it can be seen that the edge of the cytoplasm is slightly unclear in some cells, but the edge of the nucleus is clear and the chromatin structure is easy to observe. In FIG. 5 (2), the cytoplasm and the margin of the nucleus were slightly unclear. In FIG. 5 (3), the cells were downsized, the nuclei were deeply stained, and cell disruption was confirmed. In FIG. 5 (4), the margin of the nucleus was clear, but many vacuoles were observed in the cytoplasm. As a result of comparing each of the above (1) to (4) cell fixatives, the case of using the above (1) cell fixative I was most suitable for morphological observation. From the above, the cell fixative of the present invention can perform the same morphological evaluation as at the time of sample collection even when fixed for one month as compared with the commercially available cell fixative.
（Ｆ）市販の細胞固定液との比較（２）
［試料］
Ｊｕｒｋａｔ培養細胞を用いた。
(F) Comparison with commercially available cell fixation solution (2)
[sample]
Jurkat cultured cells were used.
［細胞固定液の調製］
（１）細胞固定液Ｉ
細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、３０ｖ／ｖ％エタノール、１ｖ／ｖ％ホルマリンとなるように水を含む混合液を調製し、この混合液にプロピレングリコールを細胞固定液全量に対して１０ｖ／ｖ％となるように添加後、十分に転倒混和を行うことにより細胞固定液Iを得た。
[Preparation of cell fixation solution]
(1) Cell fixation solution I
Prepare a mixed solution containing water so that the total amount of the cell fixative is 10 v / v% methanol, 30 v / v% ethanol, and 1 v / v% formalin, respectively, and add propylene glycol to the mixed solution to make the total amount of the cell fixative. After addition to 10 v / v%, cell fixative I was obtained by sufficient inversion and miscibility.
（２）市販の細胞固定液Ａ
組成としては、細胞固定液全量に対して、それぞれ１０ｖ／ｖ％メタノール、１５～２０ｖ／ｖ％イソプロパノール、１ｖ／ｖ％ホルマリン、５～１０ｖ／ｖ％エチレングリコールを含有。
(2) Commercially available cell fixation solution A
The composition contains 10 v / v% methanol, 15-20 v / v% isopropanol, 1 v / v% formalin, and 5-10 v / v% ethylene glycol with respect to the total amount of the cell fixative.
（３）市販の細胞固定液Ｂ
組成としては、細胞固定液全量に対して、それぞれ２～１０ｖ／ｖ％メタノール、３０～５０ｖ／ｖ％エタノールを含有。
(3) Commercially available cell fixation solution B
The composition contains 2 to 10 v / v% methanol and 30 to 50 v / v% ethanol, respectively, with respect to the total amount of the cell fixative.
（４）市販の細胞固定液Ｃ
組成としては、細胞固定液全量に対して、それぞれ１～２ｖ／ｖ％メタノール、１８～３０ｖ／ｖ％エタノール、１～１．８ｖ／ｖ％イソプロパノールを含有。上記（１）～（４）の細胞固定液の組成を表６にまとめて示す。
(4) Commercially available cell fixation solution C
The composition contains 1 to 2 v / v% methanol, 18 to 30 v / v% ethanol, and 1 to 1.8 v / v% isopropanol with respect to the total amount of the cell fixative. The compositions of the cell fixation solutions (1) to (4) above are summarized in Table 6.
［固定処理］
上記（１）～（４）のそれぞれの細胞固定液１０ｍｌに対し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．０×１０６個添加した。１か月間４℃で固定後、細胞固定液を１ｍｌ遠心管に採り、２０００ｒｐｍで５分遠心処理した。上清を除去したのち生理食塩水を２ｍｌ添加し十分に攪拌し、セットしたチャンバー内に添加後、１０分間静置した。余分な細胞固定液を破棄し、９５％エタノールで１日固定を行った後、通常のパパニコロウ染色を行って標本を得た。
[Fixed processing]
1.0 × 10 6 Jurkat cells were added to 10 ml of each of the cell fixation solutions (1) to (4) above. After fixing at 4 ° C. for 1 month, the cell fixation solution was collected in a 1 ml centrifuge tube and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, 2 ml of physiological saline was added, the mixture was sufficiently stirred, and the mixture was added into the set chamber and allowed to stand for 10 minutes. Excess cell fixative was discarded, and after fixing with 95% ethanol for 1 day, normal Papanicolaou stain was performed to obtain a specimen.
［細胞形態の観察］
得られたパパニコロウ染色標本の写真を図６に示す。図６（１）は上記（１）細胞固定液Iを用いた場合、図６（２）は上記（２）市販の細胞固定液Ａを用いた場合、図６（３）は上記（３）市販の細胞固定液Ｂを用いた場合、図６（４）は上記（４）市販の細胞固定液Ｃを用いた場合にそれぞれ対応する。図６（１）では、細胞質の辺縁が明瞭であるが、核が濃染していた。また、細胞の凝集が多数確認された。図６（２）では、細胞質の辺縁がやや不明瞭であった。図６（３）では、細胞質の辺縁が不明瞭であり、核の辺縁は明瞭であったが濃染していた。図６（４）では、細胞質の辺縁が不明瞭であり、一部細胞形態の崩壊が観察された。上記（１）～（４）のそれぞれの細胞固定液を比較した結果、イソプロパノールを含まず、プロピレングリコールの含有量が１０ｖ／ｖ％である上記（１）の細胞固定液Iで細胞集塊が観察され、この４つの細胞固定液の中では市販の細胞固定液Ａを用いた場合が最も形態観察に適している結果となった。
[Observation of cell morphology]
A photograph of the obtained Papanicolaou-stained specimen is shown in FIG. 6 (1) shows the above (1) when the cell fixing solution I is used, FIG. 6 (2) shows the above (2) using the commercially available cell fixing solution A, and FIG. 6 (3) shows the above (3). When the commercially available cell fixation solution B is used, FIG. 6 (4) corresponds to the case where the above-mentioned (4) commercially available cell fixation solution C is used, respectively. In FIG. 6 (1), the edge of the cytoplasm was clear, but the nucleus was deeply stained. In addition, a large number of cell aggregations were confirmed. In FIG. 6 (2), the margin of the cytoplasm was slightly unclear. In FIG. 6 (3), the edge of the cytoplasm was unclear, and the edge of the nucleus was clear but deeply stained. In FIG. 6 (4), the margin of the cytoplasm was unclear, and some cell morphology was observed to be disrupted. As a result of comparing each of the cell fixatives (1) to (4) above, the cell clumps were formed in the cell fixative I of the above (1) which did not contain isopropanol and had a propylene glycol content of 10 v / v%. Of these four cell fixatives, the case of using a commercially available cell fixative A was the most suitable for morphological observation.
（Ｇ）核酸の保存性評価
［試料］
「（Ｃ）市販の細胞固定液との比較（１）」におけるＪｕｒｋａｔ培養細胞と同じものを用いた。
(G) Nucleic acid storage stability evaluation [sample]
The same cells as the Jurkat cultured cells in "(C) Comparison with commercially available cell fixation solution (1)" were used.
［ＤＮＡ抽出］
「（Ｃ）市販の細胞固定液との比較（１）」における上記（１）～（４）の細胞固定液中でそれぞれリンパ節を振って細胞を落とし、細胞浮遊液とした。これら細胞浮遊液を混和したのち、浮遊液２ｍｌから細胞を回収し、これらの細胞に滅菌ＰＢＳを２００μｌ添加し、３０００ｒｐｍで５分間遠心した。その後、上清を除去し、再び、滅菌ＰＢＳを２００μｌ添加し、３０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を除去し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてＤＮＡ抽出を行った。
[DNA extraction]
In "(C) Comparison with commercially available cell fixation solution (1)", the lymph nodes were shaken in the cell fixation solutions (1) to (4) above to drop the cells to obtain a cell suspension. After mixing these cell suspensions, cells were collected from 2 ml of the suspension, 200 μl of sterile PBS was added to these cells, and the cells were centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. Then, the supernatant was removed, 200 μl of sterile PBS was added again, centrifugation was performed at 3000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and DNA extraction was performed with QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN).
［ＰＣＲ条件］
ＰＣＲ条件やｐｒｉｍｅｒ設定は、JJM van Dongenらによる報告（JJM van Dongen et al., Leukemia, 2003, 17, p.2257-2317）を参考にした。ＰＣＲ試薬は、TaqMan（登録商標） Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を使用した。ＰＣＲ条件としては、９５℃ ７分で熱変性後、９５℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ３０秒のＰＣＲを３５サイクル行い、７２℃ １０分で伸長反応を行った。
[PCR conditions]
The PCR conditions and primer settings were based on the report by JJM van Dongen et al. (JJM van Dongen et al., Leukemia, 2003, 17, p.2257-2317). The PCR reagent used was TaqMan® Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific). As PCR conditions, after heat denaturation at 95 ° C. for 7 minutes, PCR was performed at 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds for 35 cycles, and an extension reaction was performed at 72 ° C. for 10 minutes.
［ｐｒｉｍｅｒ］
ｐｒｉｍｅｒはＴＣＲＧを増幅するための設定であり、５’末端に蛍光ＦＡＭ標識、あるいは蛍光ＨＥＸ標識されたＴｕｂｅ Ａを用いた。ＰＣＲ増幅産物のサイズは１４５～２５５ｂｐである。ｐｒｉｍｅｒ配列は以下の通りである。
（１）Ｔｕｂｅ Ａ
VgIF：5’-GGAAGGCCCCACAGCRTCTT-3’（配列番号１）
Vg10：5’-AGCATGGGTAAGACAAGCAA-3’（配列番号２）
Jg1.1/2.1：3’-CGAGTATCATTGAAGCGGACCATT-5’（配列番号３）
Jg1.3/2.3：3’-GAGAAACCGTCACCTTGTTGTG-5’（配列番号４）
[Primer]
The primer was set to amplify TCRG, and a fluorescent FAM-labeled or fluorescent HEX-labeled Tube A was used at the 5'end. The size of the PCR amplification product is 145 to 255 bp. The primer sequence is as follows.
(1) Tube A
VgIF: 5'-GGAAGGCCCCACAGCRTCTT-3' (SEQ ID NO: 1)
Vg10: 5'-AGCATGGGTAAGACAAGCAA-3' (SEQ ID NO: 2)
Jg1.1 / 2.1: 3'-CGAGTATCATTGAAGCGGACCATT-5' (SEQ ID NO: 3)
Jg1.3 / 2.3: 3'-GAGAAACCGTCACCTTGTTGTG-5'(SEQ ID NO: 4)
［フラグメント解析］
得られたＰＣＲ増幅産物のフラグメント解析波形を図７に示す。図７（１）は「（Ｅ）市販の細胞固定液との比較（１）」における上記（１）細胞固定液Iを用いた場合、図７（２）は「（Ｅ）市販の細胞固定液との比較（１）」における上記（２）市販の細胞固定液Ａを用いた場合、図７（３）は「（Ｅ）市販の細胞固定液との比較（１）」における上記（３）市販の細胞固定液Ｂを用いた場合、図７（４）は「（Ｅ）市販の細胞固定液との比較（１）」における上記（４）市販の細胞固定液Ｃを用いた場合、図７（５）は比較用として未固定の細胞を用いた場合にそれぞれ対応する。フラグメント解析の結果、すべての細胞固定液から、未固定である試料と同様の２１１ｂｐ付近にフラグメント波形が得られた。波形の高さを比較すると、図７（１）の本発明の細胞固定液Iを用いた場合は３３８８、図７（２）の市販の細胞固定液Ａを用いた場合は３０１８、図７（３）の市販の細胞固定液Ｂを用いた場合は２２４４、図７（４）の市販の細胞固定液Ｃを用いた場合は２３４８、図７（５）の未固定の試料の場合は３５７２となった。未固定の試料を用いた場合が最もピークが高く、続いて本発明の上記（１）細胞固定液Iを用いた場合のピークが高い結果となった。以上のことより、市販の細胞固定液に比べて本発明の細胞固定液は、１か月固定した場合においてＰＣＲによる遺伝子解析が可能であり、核酸の保存性に優れていることが分かる。
[Fragment analysis]
The fragment analysis waveform of the obtained PCR amplification product is shown in FIG. FIG. 7 (1) shows "(E) Comparison with commercially available cell fixation solution (1)" when the above (1) cell fixation solution I is used, and FIG. 7 (2) shows "(E) commercially available cell fixation". When the above-mentioned (2) commercially available cell fixing solution A in "Comparison with liquid (1)" is used, FIG. 7 (3) shows the above (3) in "(E) Comparison with commercially available cell fixing solution (1)". ) When the commercially available cell fixation solution B is used, FIG. 7 (4) shows the above (4) when the commercially available cell fixation solution C in "(E) Comparison with the commercially available cell fixation solution (1)" is used. FIG. 7 (5) corresponds to the case where unfixed cells are used for comparison. As a result of fragment analysis, fragment waveforms were obtained in the vicinity of 211 bp similar to the unfixed sample from all the cell fixation solutions. Comparing the heights of the waveforms, 3388 when the cell fixation solution I of the present invention in FIG. 7 (1) was used, 3018 when the commercially available cell fixation solution A in FIG. 7 (2) was used, and FIG. 7 (FIG. 7). 2244 when the commercially available cell fixation solution B of 3) was used, 2348 when the commercially available cell fixation solution C of FIG. 7 (4) was used, and 3572 when the unfixed sample of FIG. 7 (5) was used. became. The peak was highest when an unfixed sample was used, followed by a high peak when the above-mentioned (1) cell fixation solution I of the present invention was used. From the above, it can be seen that the cell fixative of the present invention can be genetically analyzed by PCR when fixed for one month as compared with the commercially available cell fixative, and has excellent nucleic acid storage stability.
Claims (4)
（ｂ）５～３０ｖ／ｖ％のイソプロパノールと、
（ｃ）２１～３９ｖ／ｖ％のプロピレングリコールと、
（ｄ）０．５～１０ｖ／ｖ％のホルマリンと、
（ｅ）１０～６８ｖ／ｖ％の水
とを含むことを特徴とする細胞固定液。 (A) With 3 to 20 v / v% methanol and / or 5 to 30 v / v% ethanol,
(B) With 5 to 30 v / v% isopropanol,
(C) 21-39v / v% propylene glycol and
(D) Formalin of 0.5 to 10 v / v% and
(E) A cell fixation solution comprising 10 to 68 v / v% of water.
The cell fixation according to any one of claims 1 to 3, wherein a mixed solution containing the above (a), (b), (d) and (e) is prepared, and then the above (c) is added. Liquid manufacturing method.
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