JP2022046466A - 核酸ガイド化ヌクレアーゼをベースとした系を使用する核酸の捕捉 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2015年8月19日に出願された米国仮出願第62/207,359号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
標的核酸配列を捕捉する方法であって、
(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップ;
(b)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって一方の末端で第1または第2のアダプターにライゲートされ、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ;および
(c)前記複数の核酸断片を第3のアダプターと接触させ、それによって、一方の末端で前記第1または第2のアダプターに、他方の末端で前記第3のアダプターにライゲートした複数の核酸断片を生成するステップ
を含む、方法。
(項目2)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがCRISPR/Cas系タンパク質である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが非CRISPR/Cas系タンパク質である、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがCASクラスIタイプI、CASクラスIタイプIII、CASクラスIタイプIV、CASクラスIIタイプIIおよびCASクラスIIタイプVからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがCas9、Cpf1、Cas3、Cas8a-c、Cas10、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Csm2、Cmr5、Csf1、C2c2およびNgAgoからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記gNAがgRNAである、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記gNAがgDNAである、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的の前記標的化部位を切断し、それによって一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成する、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
第1または第2および第3のアダプターに特異的なPCRを使用してステップ(c)の生成物を増幅するステップをさらに含む、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNAおよびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記核酸が二本鎖DNAである、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記核酸がゲノムDNAからのものである、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目12に記載の方法。
(項目14)
アダプターにライゲートされる前記核酸が20bpから5000bpの長さである、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目1から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される、項目9に記載の方法。
(項目17)
前記アダプターが20bpから100bpの長さである、項目1から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記アダプターがプライマー結合部位を含む、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む、項目1から18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める、項目1から19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目1から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記第1および第2のアダプターが同一である、項目1から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記第1および第2のアダプターが異なる、項目1から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記試料が配列決定ライブラリーを含む、項目1から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
目的の標的化部位に標識ヌクレオチドを導入する方法であって、
(a)複数の核酸断片を含む試料を提供するステップ;
(b)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって目的の前記標的化部位で複数のニック入りの核酸断片を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸断片中の目的の標的化部位に相補的である、ステップ;および
(c)前記複数のニック入りの核酸断片を、ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な酵素および標識ヌクレオチドと接触させ、それによって目的の前記標的化部位において標識ヌクレオチドを含む複数の核酸断片を生成するステップ
を含む、方法。
(項目26)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cm5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼ、CPF1ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記gNAがgRNAである、項目25から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記gNAがgDNAである、項目25から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記核酸断片が、一本鎖DNA断片、二本鎖DNA断片、一本鎖RNA断片、二本鎖RNA断片およびDNA/RNAハイブリッド断片からなる群より選択される、項目25から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記核酸断片が二本鎖DNA断片である、項目30に記載の方法。
(項目32)
二本鎖DNA断片がゲノムDNAからのものである、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記核酸断片が20bpから5000bpの長さである、項目25から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目25から34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める、項目25から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目25から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記標識ヌクレオチドがビオチン化ヌクレオチドである、項目25から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記標識ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である、項目25から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
ビオチン化ヌクレオチドを含む前記核酸断片をアビジンまたはストレプトアビジンと接触させ、それによって目的の前記標的化部位を捕捉するステップをさらに含む、項目38に記載の方法。
(項目41)
ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、DNAポリメラーゼI、クレノウ断片、TAQポリメラーゼまたはBstDNAポリメラーゼである、項目25から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記核酸断片の5’末端にニックを入れる、項目25から41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記核酸断片が20bpから5000bpの長さである、項目25から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目25から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、
(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップ;および
(b)前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させるステップであって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されており、gRNAは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端に第3のアダプターを含む複数の核酸断片を生成するために、前記複合体に複数の第3のアダプターを負荷する、ステップ
を含む、方法。
(項目46)
第1または第2および第3のアダプターに特異的なPCRを使用してステップ(b)の生成物を増幅するステップをさらに含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがCRISPR/Cas系タンパク質に由来する、項目45に記載の方法。
(項目48)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非CRISPR/Cas系タンパク質に由来する、項目45に記載の方法。
(項目49)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なCASクラスIタイプI、不活性なCASクラスIタイプIII、不活性なCASクラスIタイプIV、不活性なCASクラスIIタイプIIおよび不活性なCASクラスIIタイプVからなる群より選択される、項目45に記載の方法。
(項目50)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCmr5、dCsf1、dC2C2およびdNgAgoからなる群より選択される、項目45に記載の方法。
(項目51)
前記gNAがgRNAである、項目45から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記gNAがgDNAである、項目45から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
核酸配列がゲノムDNAからのものである、項目45から52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのN末端に融合されている、項目45から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのC末端に融合されている、項目45から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
アダプターにライゲートされる前記核酸が20bpから5000bpの長さである、項目45から56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
(b)の接触させるステップが標的化核酸配列への前記第2のアダプターの挿入を可能にする、項目45から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目45から58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される、項目46に記載の方法。
(項目61)
前記アダプターが20bpから100bpの長さである、項目45から59のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記アダプターがプライマー結合部位を含む、項目45から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む、項目45から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める、項目45から63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目45から64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、
(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は5’末端および3’末端で前記アダプターにライゲートされている、ステップ;
(b)前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体に結合した、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ;および
(c)前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって5’または3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸中の目的の標的化部位と目的外の標的化部位の両方に相補的である、ステップ
を含む、方法。
(項目67)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがCRISPR/Cas系タンパク質である、項目66に記載の方法。
(項目68)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非CRISPR/Cas系タンパク質である、項目66に記載の方法。
(項目69)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが不活性なCASクラスIタイプI、不活性なCASクラスIタイプIII、不活性なCASクラスIタイプIV、不活性なCASクラスIIタイプIIおよび不活性なCASクラスIIタイプVからなる群より選択される、項目66に記載の方法。
(項目70)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCm5、dCsf1、dC2C2、dCPF1およびdNgAgoからなる群より選択される、項目66に記載の方法。
(項目71)
前記gNAがgRNAである、項目66から70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
前記gNAがgDNAである、項目66から70のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
(c)の接触させるステップが、ステップ(b)の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体に結合した、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の前記核酸を置換しない、項目66から72のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
(d)の接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的外の前記標的化部位を切断し、それによって、5’または3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成する、項目66から73のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
前記結合した触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体を除去し、アダプターに特異的なPCRを使用して(b)の生成物を増幅するステップをさらに含む、項目66から74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
前記核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNAおよびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される、項目66から75のいずれか一項に記載の方法。
(項目77)
前記核酸が二本鎖DNAである、項目76に記載の方法。
(項目78)
前記核酸がゲノムDNAからのものである、項目66から77のいずれか一項に記載の方法。
(項目79)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目78に記載の方法。
(項目80)
前記5’末端および3’末端でアダプターにライゲートされた前記核酸が20bpから5000bpである、項目66から79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目66から80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される、項目75に記載の方法。
(項目83)
前記アダプターが20bpから100bpの長さである、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
前記アダプターがプライマー結合部位を含む、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目88)
目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、
(a)複数の核酸配列を含む試料を提供するステップであって、前記核酸配列はメチル化ヌクレオチドを含み、前記核酸配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ;
(b)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって前記核酸配列のサブセットで目的の複数のニック入りの部位を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸配列のサブセットの目的の標的化部位に相補的であり、そして前記標的核酸配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ;
(c)前記試料をニック入りの部位でDNA合成を開始することが可能な酵素およびメチル化されていないヌクレオチドと接触させ、それによって、目的の前記標的化部位にメチル化されていないヌクレオチドを含む複数の核酸配列を生成するステップであって、前記核酸配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ;および
(d)前記試料を、メチル化核酸を切断することが可能な酵素と接触させ、それによってメチル化核酸を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、メチル化核酸を含む複数の前記核酸断片は5’および3’末端のうち最大1つでアダプターにライゲートされている、ステップ
を含む、方法。
(項目89)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目88に記載の方法。
(項目90)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cmr5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目88に記載の方法。
(項目91)
前記gNAがgRNAである、項目88に記載の方法。
(項目92)
前記gNAがgDNAである、項目88に記載の方法。
(項目93)
前記DNAが二本鎖DNAである、項目88から92のいずれか一項に記載の方法。
(項目94)
前記二本鎖DNAがゲノムDNAからのものである、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目94に記載の方法。
(項目96)
前記DNA配列が20bpから5000bpの長さである、項目88から95のいずれか一項に記載の方法。
(項目97)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目88から96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全DNAの50%未満を占める、項目88から97のいずれか一項に記載の方法。
(項目99)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目88から98のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、DNAポリメラーゼI、クレノウ断片、TAQポリメラーゼまたはBstDNAポリメラーゼである、項目88から99のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記DNA配列の5’末端にニックを入れる、項目88から100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
メチル化DNAを切断することが可能な前記酵素がDpnIである、項目88から101のいずれか一項に記載の方法。
(項目103)
目的の標的DNA配列を捕捉する方法であって、
(a)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって目的の領域に隣接する部位で複数のニック入りのDNAを生成するステップであって、前記gNAが、前記DNA配列のサブセット中の目的の前記領域に隣接する目的の標的化部位に相補的である、ステップ;
(b)前記試料を65℃まで加熱し、それによって、近接するニックに二本鎖切断を起こすステップ;
(c)前記二本鎖切断を耐熱性のリガーゼと接触させ、それによってこれらの部位にのみアダプター配列のライゲーションを可能にするステップ;および
(d)ステップa~cを反復して、第2のアダプターを目的の前記領域の反対側に置き、こうして目的の前記領域の濃縮を可能にするステップ
を含む、方法。
(項目104)
前記gNAがgRNAである、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記gNAがgDNAである、項目103に記載の方法。
(項目106)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがCASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目103から105のいずれか一項に記載の方法。
(項目107)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがCas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cmr5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目103から105のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記DNAが二本鎖DNAである、項目103に記載の方法。
(項目109)
前記二本鎖DNAがゲノムDNAからのものである、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目109に記載の方法。
(項目111)
前記DNA配列が20bpから5000bpの長さである、項目103から110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目103から111のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全DNAの50%未満を占める、項目103から112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目103から113のいずれか一項に記載の方法。
(項目115)
前記二本鎖切断を接触させることが可能な耐熱性の前記リガーゼが耐熱性の5’App
DNA/RNAリガーゼまたはT4 RNAリガーゼである、項目103から113のいずれか一項に記載の方法。
(項目116)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記DNA配列の5’末端にニックを入れる、項目103から115のいずれか一項に記載の方法。
(項目117)
目的の配列について試料を濃縮する方法であって、
(a)目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を提供するステップであって、目的の前記配列は前記試料の50%未満を構成する、ステップ;および
(b)複数の核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼ-gRNA複合体または複数の核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼ-gDNA複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記gRNAおよびgDNAは前記標的化配列に相補的であり、それによって前記標的化配列が切断される、ステップ
を含む、方法。
(項目118)
目的の前記配列および枯渇のための前記標的化配列を前記試料から抽出するステップをさらに含む、項目117に記載の方法。
(項目119)
抽出される前記配列を断片化するステップをさらに含む、項目118に記載の方法。
(項目120)
切断される前記標的化配列がサイズ排除によって除去される、項目117から119のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか1つである、項目117から120のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
前記試料が、枯渇のために標的化される宿主核酸配列および目的の非宿主核酸配列を含む、項目117から121のいずれか一項に記載の方法。
(項目123)
前記非宿主核酸配列が微生物の核酸配列を含む、項目122に記載の方法。
(項目124)
前記微生物核酸配列が、細菌、ウイルスまたは真核寄生生物の核酸配列である、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記gRNAおよびgDNAが、リボソームRNA配列、スプライシングされた転写物、スプライシングされていない転写物、イントロン、エクソンまたは非コードRNAに相補的である、項目117から124のいずれか一項に記載の方法。
(項目126)
抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のRNAを含む、項目118に記載の方法。
(項目127)
抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のDNAを含む、項目118に記載の方法。
(項目128)
目的の前記配列が抽出される前記核酸の10%未満を構成する、項目117から127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
前記核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼがC2c2を含む、項目117から128のいずれか一項に記載の方法。
(項目130)
前記C2c2が触媒活性がない、項目129に記載の方法。
(項目131)
前記核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼがNgAgoを含む、項目117から128のいずれか一項に記載の方法。
(項目132)
前記NgAgoが触媒活性がない、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される、項目117から132のいずれか一項に記載の方法。
(項目134)
試料を濃縮する方法であって、
(a)宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を提供するステップ;
(b)複数の核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼ-gRNA複合体または複数の核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼ-gDNA複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記gRNAおよびgDNAは前記宿主核酸の標的化部位に相補的である、ステップ、ならびに
(c)非宿主核酸について前記試料を濃縮するステップ
を含む、方法。
(項目135)
前記核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼがC2c2を含む、項目134に記載の方法。
(項目136)
前記核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼが触媒活性がないC2c2を含む、項目134に記載の方法。
(項目137)
前記核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼがNgAgoを含む、項目134に記載の方法。
(項目138)
前記核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼが触媒活性がないNgAgoを含む、項目134に記載の方法。
(項目139)
前記宿主が、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、スナネズミ、トリ、マウスおよびラットからなる群より選択される、項目134から138のいずれか一項に記載の方法。
(項目140)
前記非宿主が原核生物である、項目134から138のいずれか一項に記載の方法。
(項目141)
前記非宿主が、真核生物、ウイルス、細菌、真菌および原生動物からなる群より選択される、項目134から138のいずれか一項に記載の方法。
(項目142)
アダプターにライゲートされた前記宿主核酸および非宿主核酸が50bpから1000bpの範囲内である、項目134から141のいずれか一項に記載の方法。
(項目143)
前記非宿主核酸が前記試料中の全核酸の50%未満を構成する、項目134から142のいずれか一項に記載の方法。
(項目144)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか1つである、項目134から143のいずれか一項に記載の方法。
(項目145)
ステップ(c)がステップ(b)の生成物をcDNAに逆転写することを含む、項目134から144のいずれか一項に記載の方法。
(項目146)
ステップ(c)がサイズ排除によって前記宿主核酸を除去することを含む、項目134から145のいずれか一項に記載の方法。
(項目147)
ステップ(c)がビオチンの使用によって前記宿主核酸を除去することを含む、項目134から145のいずれか一項に記載の方法。
(項目148)
前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される、項目134から147のいずれか一項に記載の方法。
(項目149)
核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物。
(項目150)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目149に記載の組成物。
(項目151)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cmr5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目149に記載の組成物。
(項目152)
前記gNAがgRNAである、項目149から151のいずれか一項に記載の組成物。
(項目153)
前記gNAがgDNAである、項目149から151のいずれか一項に記載の組成物。
(項目154)
前記核酸断片がDNAを含む、項目149から153のいずれか一項に記載の組成物。
(項目155)
前記核酸断片がRNAを含む、項目149から153のいずれか一項に記載の組成物。
(項目156)
前記ヌクレオチドがビオチンで標識される、項目149から155のいずれか一項に記載の組成物。
(項目157)
前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である、項目149から156のいずれか一項に記載の組成物。
(項目158)
核酸断片および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体を含む組成物であって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されている、組成物。
(項目159)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なCASクラスIタイプI、不活性なCASクラスIタイプIII、不活性なCASクラスIタイプIV、不活性なCASクラスIIタイプIIおよび不活性なCASクラスIIタイプVからなる群より選択される、項目158に記載の組成物。
(項目160)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCmr5、dCsf1、dC2C2およびdNgAgoからなる群より選択される、項目158に記載の組成物。
(項目161)
前記gNAがgRNAである、項目158、159または160のいずれか一項に記載の組成物。
(項目162)
前記gNAがgDNAである、項目158から161のいずれか一項に記載の組成物。
(項目163)
前記核酸断片がDNAを含む、項目158から162のいずれか一項に記載の組成物。
(項目164)
前記核酸断片がRNAを含む、項目158から163のいずれか一項に記載の組成物。
(項目165)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのN末端に融合されている、項目158から164のいずれか一項に記載の組成物。
(項目166)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのC末端に融合されている、項目158から165のいずれか一項に記載の組成物。
(項目167)
メチル化ヌクレオチドを含む核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体および非メチル化ヌクレオチドを含む組成物。
(項目168)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目167に記載の組成物。
(項目169)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cmr5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目167に記載の組成物。
(項目170)
前記gNAがgRNAである、項目167、168または169のいずれか一項に記載の組成物。
(項目171)
前記gNAがgDNAである、項目167から170のいずれか一項に記載の組成物。
(項目172)
前記核酸断片がDNAを含む、項目167から171のいずれか一項に記載の組成物。
(項目173)
前記核酸断片がRNAを含む、項目167から171のいずれか一項に記載の組成物。
(項目174)
前記ヌクレオチドがビオチンで標識される、項目167から173のいずれか一項に記載の組成物。
(項目175)
前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である、項目167から174のいずれか一項に記載の組成物。
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
Manual、第3版、2001年、Cold Spring Harbor、N.Y.を参照)。高ストリンジェンシー条件の1つの例は、50%ホルムアミド、5×SSC、5×デンハルト液、0.5%SDSおよび100μg/mlの変性担体DNA中で約42℃でのハイブリダイゼーション、続いて、室温での2×SSCおよび0.5%SDSにおける2回の洗浄と42℃での0.1×SSCおよび0.5%SDSにおける2回の追加の洗浄を含む。
本明細書に記載されるように、本発明は、核酸の捕捉のための例示的なプロトコールおよびこれらのプロトコールで使用するための組成物を提供する。例示的なプロトコールは、それぞれ図1、6、9、10、11および13で、ならびに実施例のセクションで例示される。全体で、様々な使用が企図される。このセクションで言及する特定の用語は、以降のセクションにおいてより詳細に記載される。
本発明の核酸(捕捉のために標的化される)は、任意のDNA、任意のRNA、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖DNA、二本鎖RNA、人工DNA、人工RNA、合成DNA、合成RNAおよびRNA/DNAハイブリッドであってよい。
本明細書で提供されるように、本明細書で提供される方法の実行を助けるために、本発明の核酸(核酸または核酸断片と互換的に呼ばれる)は、アダプターにライゲートされている。
本明細書でガイド核酸(gNA)が提供され、ここで、gNAは、核酸中の、例えば宿主からのゲノムDNA中の標的化部位または目的の配列、または目的外の配列に相補的である(選択的である、ハイブリダイズすることができる)。gNAは、核酸ガイド化ヌクレアーゼを核酸の特異的部位に誘導する。
試料からの核酸の捕捉のための組成物および方法が、本明細書で提供される。これらの組成物および方法は、核酸ガイド化ヌクレアーゼを利用する。本明細書で使用するように、「核酸ガイド化ヌクレアーゼ」は、DNA、RNAまたはDNA/RNAハイブリッドを切断し、特異性を付与するために1つまたは複数の核酸ガイド核酸(gNA)を使用する任意のエンドヌクレアーゼである。核酸ガイド化ヌクレアーゼには、CRISPR/Cas系タンパク質ならびに非CRISPR/Cas系タンパク質が含まれる。
一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質には、CRISPR I型系、CRISPR II型系およびCRISPR III型系からのタンパク質が含まれる。
pneumophila、Suterella wadsworthensisまたはCorynebacter diphtheriaからのCRISPR/Cas系タンパク質からのものであるかそれに由来する。
一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Cas9であるかまたはそれを含む。本発明のCas9は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものであってよい。
lavamentivorans、Roseburia intestinalis、Neisseria cinerea、Gluconacetobacter diazotrophicus、Azospirillum、Sphaerochaeta globus、Flavobacterium columnare、Fluviicola
taffensis、Bacteroides coprophilus、Mycoplasma mobile、Lactobacillus farciminis、Streptococcus pasteurianus、Lactobacillus johnsonii、Staphylococcus pseudintermedius、Filifactor alocis、Legionella pneumophila、Suterella wadsworthensisまたはCorynebacter diphtheriaに由来するII型CRISPR系である。
TT)、Streptococcus thermophilus(NNAGAA)およびTreponema denticola(NAAAAC)、これらは全て本発明から逸脱することなく使用可能である。
一部の実施形態では、非CRISPR/Cas系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。
pneumophila、Suterella wadsworthensis、Natronobacterium gregoryiまたはCorynebacter diphtheriaからのものであるかまたはそれに由来する。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは非CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ)が含まれる。用語「触媒活性がない」は、不活性化ヌクレアーゼ、例えば、不活性化HNHおよびRuvCヌクレアーゼを有する核酸ガイド化ヌクレアーゼを一般的に指す。そのようなタンパク質は任意の核酸中の標的部位に結合することができるが(標的部位はガイドNAによって決定される)、タンパク質は核酸を切断することもニックを入れることもできない。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ(ニッカーゼ-核酸ガイド化ヌクレアーゼと互換的に呼ばれる)が含まれる。
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼが本明細書で提供される方法で使用される(耐熱性のCRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは耐熱性の非CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ)。そのような実施形態では、反応温度が上昇し、タンパク質の解離を誘導する。反応温度は低下し、さらなる切断された標的配列の生成を可能にする。一部の実施形態では、少なくとも75℃で少なくとも1分の間維持されるとき、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも50%の活性、少なくとも55%の活性、少なくとも60%の活性、少なくとも65%の活性、少なくとも70%の活性、少なくとも75%の活性、少なくとも80%の活性、少なくとも85%の活性、少なくとも90%の活性、少なくとも95%の活性、少なくとも96%の活性、少なくとも97%の活性、少なくとも98%の活性、少なくとも99%の活性または100%の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも75℃で、少なくとも80℃で、少なくとも85℃で、少なくとも90℃で、少なくとも91℃で、少なくとも92℃で、少なくとも93℃で、少なくとも94℃で、少なくとも95℃、96℃で、少なくとも97℃で、少なくとも98℃で、少なくとも99℃で、または少なくとも100℃で少なくとも1分の間維持されるとき、少なくとも50%の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも75℃で少なくとも1分、2分、3分、4分または5分の間維持されるとき、少なくとも50%の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、温度を上昇させ、25℃~50℃に低下させたとき、少なくとも50%の活性を維持する。一部の実施形態では、温度は、25℃に、30℃に、35℃に、40℃に、45℃に、または50℃に低下させられる。例示的な一実施形態では、耐熱性酵素は、95℃で1分間の後に少なくとも90%の活性を保持する。
一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼCas9-gRNA複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。そのような実施形態では、核酸はDNAを含むことができる。ヌクレオチドは、例えばビオチンで標識することができる。ヌクレオチドは、抗体-コンジュゲート対の一部であってよい。
本出願は、アダプター、gNA、gDNA、gRNA、gNAライブラリー、gRNAライブラリー、gDNAライブラリー、核酸ガイド化ヌクレアーゼ、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ、CRISPR/Cas系タンパク質、ニッカーゼCRISPR/Cas系タンパク質、触媒活性がないCRISPR/Cas系タンパク質、Cas9、dCas9、Cas9ニッカーゼ、メチル化ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、アビジン、ストレプトアビジン、ニック部位で核酸合成を開始することが可能な酵素、DNAポリメラーゼI、TAQポリメラーゼ、bstDNAポリメラーゼ、メチル化ヌクレオチドを切断することが可能な酵素、Dpn1酵素、およびDNAをメチル化することが可能な酵素、例えばDam/Dcm1メチルトランスフェラーゼ)を限定されずに含む、本明細書に記載される組成物のいずれか1つまたは複数を含むキットを提供する。
概要
この方法の目的は、図1に表すように、ヒトゲノムDNAのライブラリーからミトコンドリアDNAを捕捉することであった。ヒト組織検体をDNA抽出プロトコールに供し、>99%のヒトDNAおよび<1%の標的配列を含むDNA試料をもたらした。DNA試料を配列決定ライブラリー構築プロトコールに供し、配列決定指数化アダプターを含む核酸ライブラリーをもたらした。標的特異的ガイドRNA(gRNA)のライブラリーを生成するために、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ヒト特異的20塩基対領域、およびCas9のためのステムループ結合部位を各々含む標的特異的gRNA前駆体のライブラリーをin vitro転写に供し、標的特異的ガイドRNAのライブラリーを得た。標的特異的ガイドRNAのライブラリーをCas9タンパク質と次に組み合わせ、Cas9-gRNA複合体のライブラリーを得た。Cas9が対応する標的DNA配列を切断し、他のDNAを未切断のままに残すように、Cas9-gRNA複合体を核酸ライブラリーと次に組み合わせた。第2のアダプターを付加し、切断されたDNAの5’リン酸化平滑末端に特異的にライゲートさせた。第1および第2のアダプターを使用して特異的に増幅するために、PCRを次に使用した。
平滑末端修復キット(NEB)を25℃で20分の間使用して、500ngの断片化ヒトゲノムDNAを末端修復することによって(dsDNAフラグメンターゼ、NEB、37℃で1時間処理した)、ヒトゲノムDNAライブラリーを生成した。次に、75℃で20分の間反応を熱不活性化させ、25℃に冷却し、次にT4 DNAリガーゼ(NEB)を使用して25℃で2時間、15ピコモルのP5/Mycアダプターにライゲートした。アダプターダイマー (adapter dimmer)は、NGSクリーンアップキット(Life Technologies)を使用して除去した。
Cas9開始コドンの直ぐ上流にヘキサヒスチジンタグを挿入するために、Cas9(S.pyogenesから)をpET30発現ベクター(EMD biosciences)にクローニングした。結果として生じたプラスミドをRosetta(DE3)BL21細菌株(EMD biosciences)に形質転換させ、培養物の光学密度(600nmのOD)が0.4に到達するまで、激しい通気により1LのLB培地で増殖させた。温度を25℃まで下げ、0.2mMのIPTGを加え、培養物をさらに4時間増殖させた。細胞を次に遠心分離(4℃で20分間の1,000×g)によって収集し、10ml結合緩衝液(20mMトリスpH8、0.5M NaCl、5mMイミダゾール、0.05%NP40)に再懸濁させ、超音波処理(30%パワーで7×10秒間のバースト、ソニファイアー250、Branson)によって溶解した。不溶性細胞残渣は、20分間の10,000×gによる遠心分離によって除去した。可溶タンパク質を含有する上清を次に0.4mlのNTAビーズ(Qiagen)と混合して、カラムにロードした。4mlの結合緩衝液でビーズを3回洗浄し、次に、250mMのイミダゾールを補充した結合緩衝液の3×0.5mlで溶出した。次に溶出した画分を30,000MWCOタンパク質濃縮器(Life Technologies)を使用して濃縮し、保存緩衝液(10mMトリスpH8、0.3M NaCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50%グリセロール)で緩衝液を交換し、SDS PAGEによって検証し、その後Colloidal Blue染色(Life Technologies)が続き、定量化し、次に後の使用のために-20℃で保存した。
3つのオリゴヌクレオチドT7-ガイドRNA1および2(5’から3’方向に、GCCTCGAGCTAATACGACTCACTATAGGGATTTATACAGCACTTTAAおよびGCCTCGAGCTAATACGACTCACTATAGGGTCTTTTTGGTCCTCGAAGの配列)ならびにstlgR(配列、GT TTT AGA GCT AGA AAT AGC AAG TTA AAA TAA GGC TAG TCC GTT ATC AAC TTG AAA AAG TGG CAC CGA GTC GGT GCT TTT TTT GGA TCC GAT GC)を注文し、合成した(IDT)。stlgRオリゴヌクレオチド(300ピコモル)を、製造業者の説明書に従ってT4 PNK(New England Biolabs)を使用して逐次的に5’リン酸化し、次に5’アデニル化キット(New England Biolabs)を使用して5’アデニル化した。耐熱性の5’AppDNA/RNAリガーゼ(New England Biolabs)を65℃で1時間使用して、T7-ガイドRNAオリゴヌクレオチド(5ピコモル)および5’アデニル化stlgR(10ピコモル)を次にライゲートした。ライゲーション反応を90℃で5分間熱不活性化させ、次にプライマーForT7(配列GCC TCG AGC TAA TAC GAC TCA C)およびgRU(配列AAAAAAAGCACCGACTCGGTG)によるPCR(OneTaq、New England Biolabs、95℃で30秒、57℃で20秒、72℃で20秒の30サイクルを使用)で増幅した。PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してPCR生成物を精製し、アガロースゲル電気泳動および配列決定によって検証した。検証された生成物は、in vitro転写のための鋳型として次に使用した。
T7-ガイドRNAオリゴヌクレオチド(表1)および別のオリゴヌクレオチド、stlgR(配列、GT TTT AGA GCT AGA AAT AGC AAG TTA AAA TAA GGC TAG TCC GTT ATC AAC TTG AAA AAG TGG CAC CGA GTC GGT GCT TTT TTT GGA TCC GAT GC)を注文し、合成した(IDT)。
PNK(New England Biolabs)を使用して逐次的に5’リン酸化し、次に5’アデニル化キット(New England Biolabs)を使用して5’アデニル化した。耐熱性の5’AppDNA/RNAリガーゼ(New England Biolabs)を65℃で1時間使用して、T7-ガイドRNAオリゴヌクレオチド(5ピコモル)および5’アデニル化stlgR(10ピコモル)を次にライゲートした。ライゲーション反応を90℃で5分間熱不活性化させ、次にプライマーForT7(配列GCC TCG AGC TAA TAC GAC TCA C)およびgRU(配列AAAAAAAGCACCGACTCGGTG)によるPCR(OneTaq、New England Biolabs、95℃で30秒、57℃で20秒、72℃で20秒の30サイクルを使用)で増幅した。PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してPCR生成物を精製し、アガロースゲル電気泳動および配列決定によって検証した。検証された生成物は、in vitro転写のための鋳型として次に使用した。
検証された生成物は、HiScribe T7転写キット(New England Biolabs)を使用したin vitro転写反応のための鋳型として次に使用した。製造業者の説明書に従って、500~1000ngの鋳型を37℃で終夜インキュベートした。ガイドライブラリーをガイドRNAに転写するために、以下のin vitro転写反応混合物を組み立てた:10μlの精製ライブラリー(約500ng)、6.5μlのH2O、2.25μlのATP、2.25μlのCTP、2.25μlのGTP、2.25μlのUTP、2.25μlの10×反応緩衝液(NEB)および2.25μlのT7 RNAポリメラーゼミックス。反応を37℃で24時間インキュベートし、次にRNAクリーンアップキット(Life Technologies)を使用して精製し、100μlのRNアーゼ不含水に溶出し、定量化し、使用時まで-20℃で保存した。
試験DNAを切断するために、試験ガイドRNA1および2を別々に使用した。ヒトゲノムDNAライブラリーからミトコンドリアDNAを切断し、濃縮するために、ガイドRNAシリーズ1および2を使用した。希釈したガイドRNA(1μl、2ピコモルと同等)を、3μlの10×Cas9反応緩衝液(NEB)、20μlのH2Oおよび1μlの組換えCas9酵素(NEB、1ピコモル/μl)と組み合わせた。以下の配列(5’-GGATTTATACAGCACTTTAA-3’)を標的にした対照ガイドRNAを使用した対照反応を、同じパラメーターを使用して別々に実行した。この配列は、ヒト染色体でもミトコンドリアDNAでも不在である。反応を37℃で15分間インキュベートし、次に5μlの希釈されたDNAライブラリー(50pg/μl)を補充し、37℃でのインキュベーションを90分間継続した。1:100の希釈でRNアーゼA(Thermo Fisher Scientific)を加えることによって反応を終了し、次に、PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してDNAを精製し、30μlの10mMトリス-Cl pH8で溶出した。次に反応を使用時まで-20℃で保存した。
試験DNAのために、Cas9消化の後の反応を15ピコモルのP5/P7アダプターおよびT4 DNAリガーゼ(NEB)と、25℃で1時間インキュベートした。ライゲーションは、試験DNA-Fプライマー(配列ATGCCGCAGCACTTGG)およびP5プライマー(配列AATGATACGGCGACCACCGA)を使用したPCRのための鋳型として次に使用した。切断およびライゲーションが標的DNA配列で起こったことを示すために、試験DNA-Fプライマー(ElimBio)を使用して配列決定をしたアガロースゲル電気泳動によって、成功したPCR生成物を確認した。
ミトコンドリアDNAの濃縮のために、Cas9消化の後、反応を15ピコモルのFlag5/P7アダプターおよびT4 DNAリガーゼ(NEB)と、25℃で1時間インキュベートした。例えば酵素処理を用いた、元のライブラリーからの旧P5およびP7アダプターの末端のアダプターのライゲーションを排除するために、複数の分子生物学的方法を用いることができる。P7(配列CAAGCAGAAGACGGCATACGA)およびP5プライマー(配列AATGATACGGCGACCACCGA)を使用したPCRのための鋳型として、反応を次に使用した。成功したPCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によって確認した。
概要
この方法の目的は、例えば図6に表されるように、ヒトゲノムDNAのライブラリーから目的の領域(例えば、SNP、STR等)を捕捉することであった。このプロトコールを適用するために、標的特異的ガイドRNAによって誘導されるニッキング酵素(NtAlwI(NEB))のための部位を含有する試験DNAを、この部位を含有しない別のDNAプールに1%または5%で混合した。ニッカーゼCas9は標的配列だけで切断し、DNAの1本の鎖を切断することしかしない。ニッカーゼは、標的配列にニックを入れるために使用した。単一鎖の切れ目(ニック)は、ニックの下流のDNAをビオチン標識DNAで置き換えるために使用することができる、DNAポリメラーゼIのための基質である。目的のビオチン化DNAを次に精製し、増幅し、配列決定をした。
変異体Cas9ニッカーゼ、S.pyogenesのCas9のD10A変異体は、上記のようにCas9を生成するのに使用される同じ手法を使用して生成し、精製することができる。
以下の配列5’-GGATTTATACAGCACTTTAA-3’を標的にする希釈されたガイドRNA(1μl、2ピコモルに同等)を、3μlの10×Cas9反応緩衝液(NEB)、20μlのH2Oおよび1μlの組換えCas9ニッカーゼ酵素(10ピコモル/μl)と組み合わせた。この標的配列は、標的DNA(全DNAの5%または1%を占める)の上にだけ存在する。反応を37℃で15分間インキュベートし、次に5μlの希釈されたDNA(全100ng)を補充し、37℃でのインキュベーションを90分間継続した。1:100の希釈でRNアーゼA(Thermo Fisher Scientific)を加えることによって反応を終了し、次に、PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してDNAを精製し、30μlの10mMトリス-Cl pH8で溶出した。次に使用時まで反応を-20℃で保存した。
ニック入りのDNAを、5’>3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ニックでDNA合成を開始することが可能であり、したがってそれがニック下流のヌクレオチドを標識ヌクレオチド(この手法の場合、ビオチン標識ヌクレオチド)で置き換えることを可能にする、E.coliのDNAポリメラーゼIとインキュベートした。ニック標識反応は、25℃で30分間、1単位のE.coliDNAポリメラーゼI(NEB)ならびに各々0.02mMのdCTP、dGTPおよびdTTP、0.01mMのdATPおよび0.01mMのビオチン-C14標識dATP(Life Technologies)を有する20μlのDNAポリメラーゼ緩衝液(NEB)で実行した。反応は、1mMのEDTAを加えることによって終了した。
ストレプトアビジンC1ビーズ(反応につき5μl、Life Technologies)を1mlの結合緩衝液(50mMのトリス-Cl pH8、1mMのEDTA、0.1%のTween20)に再懸濁させ、磁気ラックに結合させ、結合緩衝液で2回洗浄した。次にビーズを30μlの結合緩衝液に再懸濁させ、ニックトランスレーション反応と混合し、次に25℃で30分の間インキュベートした。ビーズは磁気ラックを使用して捕捉し、0.5ml結合緩衝液で4回、次に0.5mlの10mMトリス-Cl pH8で3回洗浄した。次にビーズを20μlの10mMトリス-Cl pH8に再懸濁させ、その後、試験DNAおよび他のDNAの割合を決定するためにPCRのための鋳型として使用した。
この例では、Cas9精製について記載されるように、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-トランスポザーゼ融合タンパク質(例えば、dCas9-トランスポザーゼ融合タンパク質)は、E.coliから発現され、精製される。融合タンパク質はアダプター(Nextera)と、次に目的の領域(例えば、ヒトSNP)を標的にするガイドNA(例えば、gRNA)と複合体を形成する。次に、複合体をヒトゲノムDNAに付加する。目的の領域は触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼによって標的化され、トランスポザーゼ-アダプター複合体は目的の領域の近くに置かれ、アダプターの挿入を可能にする。次にヒトSNPをPCRによって増幅し、次にMiSeqを使用して配列決定をすることができ、このように、ヒトSNPをヒトゲノムDNAから濃縮することができる。
臨床、法医学または環境試料からのP5/P7アダプターを含むヒトゲノムDNAライブラリーを得る。ある特定の領域(例えば、SNP)を濃縮するために、これらの領域を標的にするガイドRNAを作製し、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ(例えば、dCas9)とインキュベートし、次に37℃で20分の間ヒトゲノムDNAライブラリーに加える。次に、活性のある核酸ガイド化ヌクレアーゼ(例えば、Cas9)と複合体を形成したヒトゲノムを網羅するガイドNAのライブラリーを加える。触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、標的位置に結合したままであり、目的の領域(例えば、SNP)が切断されて、PCR増幅不能および配列決定不能になることから保護する。したがって、目的のDNAはインタクトなままであるが、全ての他のDNAは切断され、排除される。PCRクリーンアップキットを使用して反応から目的のDNAを回収し、PCR増幅し、MiSeqを使用して配列決定をする。
概要
この方法の目的は、図11に表すように、ヒトゲノムDNAのライブラリーから目的の領域を捕捉することである。原理の証拠として、ニッキング酵素、NtBbvCI(NEB)のための部位を含有する試験DNAを、この部位を含有しない別のDNAプールに1%または5%で混合した。メチル基を全てのGATC配列に付加するために、全体の混合物をDamメチルトランスフェラーゼで次に処理した。試験DNAおよび他のDNAの両方は、それらの配列にGATCモチーフを含有する。次にNtBbvCIを使用して混合物にニックを入れ、次にDNAポリメラーゼIおよび非標識のヌクレオチド(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)とインキュベートし、次に75℃で20分の間熱不活性化した。次に、メチル化DNAだけを消化し、非メチル化または半メチル化DNAは消化しない、DpnIで混合物を消化した。図12は、試験DNAのメチル化が、それをDpnI媒介切断に感受性にすることを示す。
変異体Cas9ニッカーゼ、S.pyogenesのCas9のD10A変異体は、上記のようにCas9を生成するのに使用される同じ手法を使用して生成し、精製することができる。
以下の配列5’-GGATTTATACAGCACTTTAA-3’を標的にする希釈されたガイドRNA(1μl、2ピコモルに同等)を、3μlの10×Cas9反応緩衝液(NEB)、20μlのH2Oおよび1μlの組換えCas9ニッカーゼ酵素(10ピコモル/μl)と組み合わせた。この標的配列は、標的DNAの上にのみ存在する(全DNAの5%または1%を占める)。反応を37℃で15分間インキュベートし、次に5μlの希釈されたDNA(全100ng)を補充し、37℃でのインキュベーションを90分間継続した。1:100の希釈でRNアーゼA(Thermo Fisher Scientific)を加えることによって反応を終了し、次に、PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してDNAを精製し、30μlの10mMトリス-Cl pH8で溶出した。次に使用時まで反応を-20℃で保存した。
ニック入りのDNAを、5’>3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ニックでDNA合成を開始することが可能であり、したがってそれがニック下流のヌクレオチドを標識ヌクレオチド(この手法の場合、ビオチン標識ヌクレオチド)で置き換えることを可能にする、E.coliのDNAポリメラーゼIとインキュベートした。ニック標識反応は、25℃で30分間、1単位のE.coli DNAポリメラーゼI(NEB)ならびに各々0.02mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを有する20μlのDNAポリメラーゼ緩衝液(NEB)で実行した。反応は、75℃で20分間の熱不活性化によって終了する。
次に、反応をDpnI(NEB)と37℃で1時間インキュベートする。PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してDNAを回収し、次に試験DNA特異的プライマーを使用したPCRの鋳型として使用する。
この方法の目的は、例えば図13に表されるように、任意のDNA供与源(例えば、ライブラリー、ゲノムまたはPCR)からDNAの領域を濃縮するために使用することができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ(例えば、Cas9ニッカーゼ)は、2つのガイドNA(例えば、gRNA)を使用して近位部位に標的化され、各位置でDNAのニッキングをもたらすことができる。あるいは、アダプターは1つの側だけでライゲートし、次にフィルインされ、その後アダプターを反対側でライゲートすることができる。2つのニックが互いに近くにあってよい(例えば、10~15bp以内)。標的外の分子に、単一のニックを生成することができる。2つのニック部位が近接するため、反応を例えば65℃に加熱したときに二本鎖切断を起こし、長い(例えば、10~15bp)3’オーバーハングをもたらすことができる。これらのオーバーハングは、一本鎖アダプターの部位特異的ライゲーションを可能にするために、耐熱性の一本鎖DNA/RNAリガーゼ、例えば耐熱性の5’App DNA/RNAリガーゼによって認識することができる。リガーゼは、例えば、長い3’オーバーハングだけを認識することができ、このように、アダプターが他の部位でライゲートされないことを確実にする。このプロセスは、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼおよび目的の領域の反対側を標的にするガイドNAを使用して繰り返し、その後第2の一本鎖アダプターを使用して上のようにライゲーションを続けることができる。2つのアダプターが目的の領域のいずれかの側にライゲートされると、領域を増幅させること、または直接的に配列決定をすることができる。
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- 明細書に記載の発明。
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