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JP2022046466A - 核酸ガイド化ヌクレアーゼをベースとした系を使用する核酸の捕捉 - Google Patents

核酸ガイド化ヌクレアーゼをベースとした系を使用する核酸の捕捉 Download PDF

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Abstract

【課題】核酸ガイド化ヌクレアーゼをベースとした系を使用する核酸の捕捉のための方法および組成物を提供する。【解決手段】目的の核酸配列の選択的捕捉を可能にする方法および組成物である。核酸は、DNA又はRNAを含有することができ、複合核酸試料を扱うのに特に有用である方法および組成物である。一態様では、標的核酸配列を捕捉する方法であって、(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップを含む方法である。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
この出願は、2015年8月19日に出願された米国仮出願第62/207,359号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
ゲノムの特異的領域の標的化配列決定は、特に臨床状況において、研究者の関心事であり続けている。遺伝病、がんおよび多くの研究プロジェクトの臨床診断は、配列決定の費用を低減しつつも標的化部位の広い適用範囲の配列決定を可能にするために、標的化配列決定に依存している。現在、この目的のために使用される主な方法は、1)ハイブリダイゼーションをベースとした濃縮、および2)多重PCRである。前者のアプローチでは、ライブラリーから目的の配列を「取り出す」ために、ビオチンで標識された短いオリゴヌクレオチドプローブが使用される。このプロセスは時間と費用がかかり、多くの実地の工程を必要とする可能性がある。さらに、結果として生じる生成物中に、一部の「標的外」の配列がしばしば残存することがある。多重PCRをベースとしたアプローチはより迅速かもしれないが、標的数が制限され、費用が高くなる可能性がある。容易であり、特異的であり、迅速であり、かつ安価である目的の核酸領域の効率的な捕捉のための方法が必要である。この必要性に対処する方法および組成物が、本明細書で提供される。
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、公報、文書、ウェブリンクおよび論文は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
目的の核酸配列の選択的捕捉を可能にする方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸は、DNAまたはRNAを含有することができる。本明細書で提供される方法および組成物は、複合核酸試料を扱うのに特に有用である。
一態様では、本発明は、標的核酸配列を捕捉する方法であって、(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップ;(b)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって一方の末端で第1または第2のアダプターにライゲートされ、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ;および(c)前記複数の核酸断片を第3のアダプターと接触させ、それによって、一方の末端で前記第1または第2のアダプターに、他方の末端で前記第3のアダプターにライゲートした複数の核酸断片を生成するステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがCRISPR/Cas系タンパク質である。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが非CRISPR/Cas系タンパク質である。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがCASクラスIタイプI、CASクラスIタイプIII、CASクラスIタイプIV、CASクラスIIタイプIIおよびCASクラスIIタイプVからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがCas9、Cpf1、Cas3、Cas8a-c、Cas10、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Csm2、Cm5、Csf1、C2c2およびNgAgoからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記gNAがgRNAである。一つの実施形態では、前記gNAがgDNAである。一つの実施形態では、複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的の前記標的化部位を切断し、それによって一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成する。一つの実施形態では、方法は、第1または第2および第3のアダプターに特異的なPCRを使用してステップ(c)の生成物を増幅するステップをさらに含む。一つの実施形態では、前記核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNAおよびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸が二本鎖DNAである。一つの実施形態では、前記核酸がゲノムDNAからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムDNAがヒトのものである。一つの実施形態では、前記核酸のアダプターにライゲートされる末端が20bpから5000bpの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される。一つの実施形態では、前記アダプターが20bpから100bpの長さである。一つの実施形態では、前記アダプターがプライマー結合部位を含む。一つの実施形態では、前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。一つの実施形態では、前記第1および第2のアダプターが同一である。一つの実施形態では、前記第1および第2のアダプターが異なる。一つの実施形態では、前記試料が配列決定ライブラリーを含む。
一態様では、本発明は、目的の標的化部位に標識ヌクレオチドを導入する方法であって、(a)複数の核酸断片を含む試料を提供するステップ;(b)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって目的の前記標的化部位で複数のニック入りの核酸断片を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸断片中の目的の標的化部位に相補的である、ステップ;および(c)前記複数のニック入りの核酸断片を、ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な酵素および標識ヌクレオチドと接触させ、それによって目的の前記標的化部位において標識ヌクレオチドを含む複数の核酸断片を生成するステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cm5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記gNAがgRNAである。一つの実施形態では、前記gNAがgDNAである。一つの実施形態では、前記核酸断片が、一本鎖DNA断片、二本鎖DNA断片、一本鎖RNA断片、二本鎖RNA断片およびDNA/RNAハイブリッド断片からなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核断片が二本鎖DNA断片である。一つの実施形態では、二本鎖DNA断片がゲノムDNAからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムDNAがヒトのものである。一つの実施形態では、前記核酸断片が20bpから5000bpの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。一つの実施形態では、前記標識ヌクレオチドがビオチン化ヌクレオチドである。一つの実施形態では、前記標識ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である。一つの実施形態では、方法は、ビオチン化ヌクレオチドを含む前記核酸断片をアビジンまたはストレプトアビジンと接触させ、それによって目的の前記標的化核酸部位を捕捉するステップをさらに含む。一つの実施形態では、ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、DNAポリメラーゼI、クレノウ断片、TAQポリメラーゼまたはBstDNAポリメラーゼである。一つの実施形態では、前記Cas9ニッカーゼが前記核酸断片の5’末端にニックを入れる。一つの実施形態では、前記核酸断片が20bpから5000bpの長さである。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。
一態様では、本発明は、目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップ;および(b)前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させるステップであって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されており、gRNAは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端に第3のアダプターを含む複数の核酸断片を生成するために、前記複合体に複数の第3のアダプターを負荷する、ステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、方法は、第1または第2および第3のアダプターに特異的なPCRを使用してステップ(b)の生成物を増幅するステップをさらに含む。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがCRISPR/Cas系タンパク質に由来する。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非CRISPR/Cas系タンパク質に由来する。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なCASクラスIタイプI、不活性なCASクラスIタイプIII、不活性なCASクラスIタイプIV、不活性なCASクラスIIタイプIIおよび不活性なCASクラスIIタイプVからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCm5、dCsf1、dC2C2およびdNgAgoからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記gNAがgRNAである。一つの実施形態では、前記gNAがgDNAである。一つの実施形態では、核酸配列がゲノムDNAからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムDNAがヒトのものである。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのN末端に融合されている。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのC末端に融合されている。一つの実施形態では、前記アダプターにライゲートされる核酸が20bpから5000bpである。一つの実施形態では、(b)の接触させるステップが標的化核酸配列への前記第2のアダプターの挿入を可能にする。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される。一つの実施形態では、前記アダプターが20bpから100bpの長さである。一つの実施形態では、前記アダプターがプライマー結合部位を含む。一つの実施形態では、前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。
一態様では、本発明は、目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は5’末端および3’末端で前記アダプターにライゲートされている、ステップ;(b)前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体に結合した、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ;および(c)前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって5’または3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸中の目的の標的化部位と目的外の標的化部位の両方に相補的である、ステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、(c)の接触させるステップが、ステップ(b)のCAS9-gRNA複合体に結合した、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の前記核酸を置換しない。一つの実施形態では、(d)の接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的外の前記標的化部位を切断し、それによって、5’または3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成する。一つの実施形態では、前記結合したCAS9-gRNA複合体を除去し、アダプターに特異的なPCRを使用して(b)の生成物を増幅するステップをさらに含む。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがCRISPR/Cas系タンパク質である。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非CRISPR/Cas系タンパク質である。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが不活性なCASクラスIタイプI、不活性なCASクラスIタイプIII、不活性なCASクラスIタイプIV、不活性なCASクラスIIタイプIIおよび不活性なCASクラスIIタイプVからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCm5、dCsf1、dC2C2、dCPF1およびdNgAgoからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記gNAがgRNAである。一つの実施形態では、前記gNAがgDNAである。一つの実施形態では、前記核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNAおよびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸が二本鎖DNAである。一つの実施形態では、前記核酸がゲノムDNAからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムDNAがヒトのものである。一つの実施形態では、前記5’末端および3’末端でアダプターにライゲートされた前記核酸が20bpから5000bpの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される。一つの実施形態では、前記アダプターが20bpから100bpの長さである。一つの実施形態では、前記アダプターがプライマー結合部位を含む。一つの実施形態では、前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。
一態様では、本発明は、目的の標的DNA配列を捕捉する方法であって、(a)複数の核酸配列を含む試料を提供するステップであって、前記核酸配列はメチル化ヌクレオチドを含み、前記核酸配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ;(b)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって前記核酸配列のサブセットで目的の複数のニック入りの部位を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸配列のサブセットの目的の標的化部位に相補的であり、そして前記標的核酸配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ;(c)前記試料をニック入りの部位でDNA合成を開始することが可能な酵素およびメチル化されていないヌクレオチドと接触させ、それによって、目的の前記標的化部位にメチル化されていないヌクレオチドを含む複数の核酸配列を生成するステップであって、前記核酸配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ;および(d)前記試料を、メチル化核酸を切断することが可能な酵素と接触させ、それによってメチル化核酸を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、メチル化核酸を含む複数の前記核酸断片は5’および3’末端のうち最大1つでアダプターにライゲートされている、ステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cm5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2c2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記gNAがgRNAである。一つの実施形態では、前記gNAがgDNAである。一つの実施形態では、前記DNAが二本鎖DNAである。一つの実施形態では、前記二本鎖DNAがゲノムDNAからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムDNAがヒトのものである。一つの実施形態では、前記DNA配列が20bpから5000bpの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全DNAの50%未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。一つの実施形態では、ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、DNAポリメラーゼI、クレノウ断片、TAQポリメラーゼまたはBstDNAポリメラーゼである。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記DNA配列の5’末端にニックを入れる。一つの実施形態では、メチル化DNAを切断することが可能な前記酵素がDpnIである。
一態様では、本発明は、目的の標的DNA配列を捕捉する方法であって、(a)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって目的の領域に隣接する部位で複数のニック入りのDNAを生成するステップであって、前記gNAが、前記DNA配列のサブセット中の目的の前記領域に隣接する目的の標的化部位に相補的である、ステップ;(b)65℃まで加熱して、近接するニックに二本鎖切断を起こすステップ;(c)これらの二本鎖切断を耐熱性のリガーゼと接触させ、それによってこれらの部位にのみアダプター配列のライゲーションを可能にするステップ;および(d)これらの3ステップを反復して、第2のアダプターを目的の前記領域の反対側に置き、こうして目的の前記領域の濃縮を可能にするステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、前記gNAがgRNAである。一つの実施形態では、前記gNAがgDNAである。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがCASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがCas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cm5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記DNAが二本鎖DNAである。一つの実施形態では、前記二本鎖DNAがゲノムDNAからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムDNAがヒトのものである。一つの実施形態では、前記DNA配列が20bpから5000bpの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全DNAの50%未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。一つの実施形態では、前記二本鎖切断を接触させることが可能な前記リガーゼが耐熱性の5’App DNA/RNAリガーゼまたはT4 RNAリガーゼである。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記DNA配列の5’末端にニックを入れる。一つの実施形態では、メチル化DNAを切断することができる酵素は、DpnIである。
一態様では、本発明は、目的の配列について試料を濃縮する方法であって、(a)目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を提供するステップであって、目的の前記配列は前記試料の50%未満を構成する、ステップ;および(b)複数の核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼ-gRNA複合体または複数の核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼ-gDNA複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記gRNAおよびgDNAは前記標的化配列に相補的であり、それによって前記標的化配列が切断される、ステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、方法は、目的の前記配列および枯渇のための前記標的化配列を前記試料から抽出するステップをさらに含む。一つの実施形態では、方法は、抽出される前記配列を断片化するステップをさらに含む。一つの実施形態では、切断される前記標的化配列がサイズ排除によって除去される。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか1つである。一つの実施形態では、前記試料が、枯渇のために標的化される宿主核酸配列および目的の非宿主核酸配列を含む。一つの実施形態では、前記非宿主核酸配列が微生物の核酸配列を含む。一つの実施形態では、前記微生物核酸配列が、細菌、ウイルスまたは真核寄生生物の核酸配列である。一つの実施形態では、前記gRNAおよびgDNAが、リボソームRNA配列、スプライシングされた転写物、スプライシングされていない転写物、イントロン、エクソンまたは非コードRNAに相補的である。一つの実施形態では、抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のRNAを含む。一つの実施形態では、抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のDNAを含む。一つの実施形態では、目的の前記配列が抽出される前記核酸の10%未満を構成する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼがC2c2を含む。一つの実施形態では、前記C2c2が触媒活性がない。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼがNgAgoを含む。一つの実施形態では、前記NgAgoが触媒活性がない。一つの実施形態では、前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される。
別の態様では、本発明は、試料を濃縮する方法であって、(a)宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を提供するステップ;(b)複数の核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼ-gRNA複合体または複数の核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼ-gDNA複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記gRNAおよびgDNAは前記宿主核酸の標的化部位に相補的である、ステップ、ならびに(c)非宿主核酸について前記試料を濃縮するステップを含む、方法。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼがC2c2を含む。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼが触媒活性がないC2c2を含む。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼがNgAgoを含む。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼが触媒活性がないNgAgoを含む。一つの実施形態では、前記宿主が、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、スナネズミ、トリ、マウスおよびラットからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記非宿主が原核生物である。一つの実施形態では、前記非宿主が、真核生物、ウイルス、細菌、真菌および原生動物からなる群より選択される。一つの実施形態では、アダプターにライゲートされた前記宿主核酸および非宿主核酸が50bpから1000bpの長さの範囲内である。一つの実施形態では、前記非宿主核酸が前記試料中の全核酸の50%未満を構成する。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか1つである。一つの実施形態では、ステップ(c)がステップ(b)の生成物をcDNAに逆転写することを含む。一つの実施形態では、ステップ(c)がサイズ排除によって前記宿主核酸を除去することを含む。一つの実施形態では、ステップ(c)がビオチンの使用によって前記宿主核酸を除去することを含む。一つの実施形態では、前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される。
別の態様では、本発明は、標識された触媒活性がない核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼタンパク質を使用して、RNA試料中の標的について濃縮するために、核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼを使用する方法を提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼタンパク質は血液RNA試料中のHIV RNAを標的にし、宿主RNAは洗い流される。一部の実施形態では、核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼは、C2c2である。
別の態様では、本発明は、核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物を提供する。一つの実施形態では、前記核酸はDNAを含む。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cm5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記gNAがgRNAである。一つの実施形態では、前記gNAがgDNAである。一つの実施形態では、前記核酸断片がDNAを含む。一つの実施形態では、前記核酸断片がRNAを含む。一つの実施形態では、前記ヌクレオチドがビオチンで標識される。一つの実施形態では、前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である。
別の態様では、本発明は、核酸断片および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体を含む組成物であって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されている、組成物を提供する。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なCASクラスIタイプI、不活性なCASクラスIタイプIII、不活性なCASクラスIタイプIV、不活性なCASクラスIIタイプIIおよび不活性なCASクラスIIタイプVからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCm5、dCsf1、dC2C2およびdNgAgoからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記gNAがgRNAである。一つの実施形態では、前記gNAがgDNAである。一つの実施形態では、前記核酸断片がDNAを含む。一つの実施形態では、前記核酸断片がRNAを含む。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのN末端に融合されている。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのC末端に融合されている。一つの実施形態では、組成物は、DNA断片およびdCas9-gRNA複合体を含み、dCas9はトランスポゾンに融合されている。
一態様では、本発明は、メチル化ヌクレオチドを含む核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体および非メチル化ヌクレオチドを含む組成物を提供する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cm5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記gNAがgRNAである。一つの実施形態では、前記gNAがgDNAである。一つの実施形態では、前記核酸断片がDNAを含む。一つの実施形態では、前記核酸断片がRNAを含む。一つの実施形態では、前記ヌクレオチドがビオチンで標識される。一つの実施形態では、前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である。一つの実施形態では、組成物は、メチル化ヌクレオチドを含むDNA断片、ニッカーゼであるCas9-gRNA複合体および非メチル化ヌクレオチドを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
標的核酸配列を捕捉する方法であって、
(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップ;
(b)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって一方の末端で第1または第2のアダプターにライゲートされ、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ;および
(c)前記複数の核酸断片を第3のアダプターと接触させ、それによって、一方の末端で前記第1または第2のアダプターに、他方の末端で前記第3のアダプターにライゲートした複数の核酸断片を生成するステップ
を含む、方法。
(項目2)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがCRISPR/Cas系タンパク質である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが非CRISPR/Cas系タンパク質である、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがCASクラスIタイプI、CASクラスIタイプIII、CASクラスIタイプIV、CASクラスIIタイプIIおよびCASクラスIIタイプVからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがCas9、Cpf1、Cas3、Cas8a-c、Cas10、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Csm2、Cmr5、Csf1、C2c2およびNgAgoからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記gNAがgRNAである、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記gNAがgDNAである、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的の前記標的化部位を切断し、それによって一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成する、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
第1または第2および第3のアダプターに特異的なPCRを使用してステップ(c)の生成物を増幅するステップをさらに含む、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNAおよびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記核酸が二本鎖DNAである、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記核酸がゲノムDNAからのものである、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目12に記載の方法。
(項目14)
アダプターにライゲートされる前記核酸が20bpから5000bpの長さである、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目1から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される、項目9に記載の方法。
(項目17)
前記アダプターが20bpから100bpの長さである、項目1から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記アダプターがプライマー結合部位を含む、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む、項目1から18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める、項目1から19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目1から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記第1および第2のアダプターが同一である、項目1から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記第1および第2のアダプターが異なる、項目1から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記試料が配列決定ライブラリーを含む、項目1から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
目的の標的化部位に標識ヌクレオチドを導入する方法であって、
(a)複数の核酸断片を含む試料を提供するステップ;
(b)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって目的の前記標的化部位で複数のニック入りの核酸断片を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸断片中の目的の標的化部位に相補的である、ステップ;および
(c)前記複数のニック入りの核酸断片を、ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な酵素および標識ヌクレオチドと接触させ、それによって目的の前記標的化部位において標識ヌクレオチドを含む複数の核酸断片を生成するステップ
を含む、方法。
(項目26)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cm5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼ、CPF1ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記gNAがgRNAである、項目25から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記gNAがgDNAである、項目25から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記核酸断片が、一本鎖DNA断片、二本鎖DNA断片、一本鎖RNA断片、二本鎖RNA断片およびDNA/RNAハイブリッド断片からなる群より選択される、項目25から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記核酸断片が二本鎖DNA断片である、項目30に記載の方法。
(項目32)
二本鎖DNA断片がゲノムDNAからのものである、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記核酸断片が20bpから5000bpの長さである、項目25から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目25から34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める、項目25から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目25から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記標識ヌクレオチドがビオチン化ヌクレオチドである、項目25から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記標識ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である、項目25から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
ビオチン化ヌクレオチドを含む前記核酸断片をアビジンまたはストレプトアビジンと接触させ、それによって目的の前記標的化部位を捕捉するステップをさらに含む、項目38に記載の方法。
(項目41)
ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、DNAポリメラーゼI、クレノウ断片、TAQポリメラーゼまたはBstDNAポリメラーゼである、項目25から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記核酸断片の5’末端にニックを入れる、項目25から41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記核酸断片が20bpから5000bpの長さである、項目25から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目25から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、
(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップ;および
(b)前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させるステップであって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されており、gRNAは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端に第3のアダプターを含む複数の核酸断片を生成するために、前記複合体に複数の第3のアダプターを負荷する、ステップ
を含む、方法。
(項目46)
第1または第2および第3のアダプターに特異的なPCRを使用してステップ(b)の生成物を増幅するステップをさらに含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがCRISPR/Cas系タンパク質に由来する、項目45に記載の方法。
(項目48)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非CRISPR/Cas系タンパク質に由来する、項目45に記載の方法。
(項目49)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なCASクラスIタイプI、不活性なCASクラスIタイプIII、不活性なCASクラスIタイプIV、不活性なCASクラスIIタイプIIおよび不活性なCASクラスIIタイプVからなる群より選択される、項目45に記載の方法。
(項目50)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCmr5、dCsf1、dC2C2およびdNgAgoからなる群より選択される、項目45に記載の方法。
(項目51)
前記gNAがgRNAである、項目45から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記gNAがgDNAである、項目45から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
核酸配列がゲノムDNAからのものである、項目45から52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのN末端に融合されている、項目45から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのC末端に融合されている、項目45から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
アダプターにライゲートされる前記核酸が20bpから5000bpの長さである、項目45から56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
(b)の接触させるステップが標的化核酸配列への前記第2のアダプターの挿入を可能にする、項目45から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目45から58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される、項目46に記載の方法。
(項目61)
前記アダプターが20bpから100bpの長さである、項目45から59のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記アダプターがプライマー結合部位を含む、項目45から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む、項目45から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める、項目45から63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目45から64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、
(a)アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は5’末端および3’末端で前記アダプターにライゲートされている、ステップ;
(b)前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体に結合した、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ;および
(c)前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって5’または3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸中の目的の標的化部位と目的外の標的化部位の両方に相補的である、ステップ
を含む、方法。
(項目67)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがCRISPR/Cas系タンパク質である、項目66に記載の方法。
(項目68)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非CRISPR/Cas系タンパク質である、項目66に記載の方法。
(項目69)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが不活性なCASクラスIタイプI、不活性なCASクラスIタイプIII、不活性なCASクラスIタイプIV、不活性なCASクラスIIタイプIIおよび不活性なCASクラスIIタイプVからなる群より選択される、項目66に記載の方法。
(項目70)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCm5、dCsf1、dC2C2、dCPF1およびdNgAgoからなる群より選択される、項目66に記載の方法。
(項目71)
前記gNAがgRNAである、項目66から70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
前記gNAがgDNAである、項目66から70のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
(c)の接触させるステップが、ステップ(b)の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体に結合した、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の前記核酸を置換しない、項目66から72のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
(d)の接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的外の前記標的化部位を切断し、それによって、5’または3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成する、項目66から73のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
前記結合した触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体を除去し、アダプターに特異的なPCRを使用して(b)の生成物を増幅するステップをさらに含む、項目66から74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
前記核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNAおよびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される、項目66から75のいずれか一項に記載の方法。
(項目77)
前記核酸が二本鎖DNAである、項目76に記載の方法。
(項目78)
前記核酸がゲノムDNAからのものである、項目66から77のいずれか一項に記載の方法。
(項目79)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目78に記載の方法。
(項目80)
前記5’末端および3’末端でアダプターにライゲートされた前記核酸が20bpから5000bpである、項目66から79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目66から80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される、項目75に記載の方法。
(項目83)
前記アダプターが20bpから100bpの長さである、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
前記アダプターがプライマー結合部位を含む、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の50%未満を占める、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目66から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目88)
目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、
(a)複数の核酸配列を含む試料を提供するステップであって、前記核酸配列はメチル化ヌクレオチドを含み、前記核酸配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ;
(b)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって前記核酸配列のサブセットで目的の複数のニック入りの部位を生成するステップであって、前記gNAは前記核酸配列のサブセットの目的の標的化部位に相補的であり、そして前記標的核酸配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ;
(c)前記試料をニック入りの部位でDNA合成を開始することが可能な酵素およびメチル化されていないヌクレオチドと接触させ、それによって、目的の前記標的化部位にメチル化されていないヌクレオチドを含む複数の核酸配列を生成するステップであって、前記核酸配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ;および
(d)前記試料を、メチル化核酸を切断することが可能な酵素と接触させ、それによってメチル化核酸を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、メチル化核酸を含む複数の前記核酸断片は5’および3’末端のうち最大1つでアダプターにライゲートされている、ステップ
を含む、方法。
(項目89)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目88に記載の方法。
(項目90)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cmr5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目88に記載の方法。
(項目91)
前記gNAがgRNAである、項目88に記載の方法。
(項目92)
前記gNAがgDNAである、項目88に記載の方法。
(項目93)
前記DNAが二本鎖DNAである、項目88から92のいずれか一項に記載の方法。
(項目94)
前記二本鎖DNAがゲノムDNAからのものである、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目94に記載の方法。
(項目96)
前記DNA配列が20bpから5000bpの長さである、項目88から95のいずれか一項に記載の方法。
(項目97)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目88から96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全DNAの50%未満を占める、項目88から97のいずれか一項に記載の方法。
(項目99)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目88から98のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、DNAポリメラーゼI、クレノウ断片、TAQポリメラーゼまたはBstDNAポリメラーゼである、項目88から99のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記DNA配列の5’末端にニックを入れる、項目88から100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
メチル化DNAを切断することが可能な前記酵素がDpnIである、項目88から101のいずれか一項に記載の方法。
(項目103)
目的の標的DNA配列を捕捉する方法であって、
(a)前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させ、それによって目的の領域に隣接する部位で複数のニック入りのDNAを生成するステップであって、前記gNAが、前記DNA配列のサブセット中の目的の前記領域に隣接する目的の標的化部位に相補的である、ステップ;
(b)前記試料を65℃まで加熱し、それによって、近接するニックに二本鎖切断を起こすステップ;
(c)前記二本鎖切断を耐熱性のリガーゼと接触させ、それによってこれらの部位にのみアダプター配列のライゲーションを可能にするステップ;および
(d)ステップa~cを反復して、第2のアダプターを目的の前記領域の反対側に置き、こうして目的の前記領域の濃縮を可能にするステップ
を含む、方法。
(項目104)
前記gNAがgRNAである、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記gNAがgDNAである、項目103に記載の方法。
(項目106)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがCASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目103から105のいずれか一項に記載の方法。
(項目107)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがCas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cmr5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目103から105のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記DNAが二本鎖DNAである、項目103に記載の方法。
(項目109)
前記二本鎖DNAがゲノムDNAからのものである、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記ゲノムDNAがヒトのものである、項目109に記載の方法。
(項目111)
前記DNA配列が20bpから5000bpの長さである、項目103から110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
目的の前記標的化部位が一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、項目103から111のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
目的の前記標的化部位が前記試料中の全DNAの50%未満を占める、項目103から112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、項目103から113のいずれか一項に記載の方法。
(項目115)
前記二本鎖切断を接触させることが可能な耐熱性の前記リガーゼが耐熱性の5’App
DNA/RNAリガーゼまたはT4 RNAリガーゼである、項目103から113のいずれか一項に記載の方法。
(項目116)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記DNA配列の5’末端にニックを入れる、項目103から115のいずれか一項に記載の方法。
(項目117)
目的の配列について試料を濃縮する方法であって、
(a)目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を提供するステップであって、目的の前記配列は前記試料の50%未満を構成する、ステップ;および
(b)複数の核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼ-gRNA複合体または複数の核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼ-gDNA複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記gRNAおよびgDNAは前記標的化配列に相補的であり、それによって前記標的化配列が切断される、ステップ
を含む、方法。
(項目118)
目的の前記配列および枯渇のための前記標的化配列を前記試料から抽出するステップをさらに含む、項目117に記載の方法。
(項目119)
抽出される前記配列を断片化するステップをさらに含む、項目118に記載の方法。
(項目120)
切断される前記標的化配列がサイズ排除によって除去される、項目117から119のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか1つである、項目117から120のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
前記試料が、枯渇のために標的化される宿主核酸配列および目的の非宿主核酸配列を含む、項目117から121のいずれか一項に記載の方法。
(項目123)
前記非宿主核酸配列が微生物の核酸配列を含む、項目122に記載の方法。
(項目124)
前記微生物核酸配列が、細菌、ウイルスまたは真核寄生生物の核酸配列である、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記gRNAおよびgDNAが、リボソームRNA配列、スプライシングされた転写物、スプライシングされていない転写物、イントロン、エクソンまたは非コードRNAに相補的である、項目117から124のいずれか一項に記載の方法。
(項目126)
抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のRNAを含む、項目118に記載の方法。
(項目127)
抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のDNAを含む、項目118に記載の方法。
(項目128)
目的の前記配列が抽出される前記核酸の10%未満を構成する、項目117から127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
前記核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼがC2c2を含む、項目117から128のいずれか一項に記載の方法。
(項目130)
前記C2c2が触媒活性がない、項目129に記載の方法。
(項目131)
前記核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼがNgAgoを含む、項目117から128のいずれか一項に記載の方法。
(項目132)
前記NgAgoが触媒活性がない、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される、項目117から132のいずれか一項に記載の方法。
(項目134)
試料を濃縮する方法であって、
(a)宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を提供するステップ;
(b)複数の核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼ-gRNA複合体または複数の核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼ-gDNA複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記gRNAおよびgDNAは前記宿主核酸の標的化部位に相補的である、ステップ、ならびに
(c)非宿主核酸について前記試料を濃縮するステップ
を含む、方法。
(項目135)
前記核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼがC2c2を含む、項目134に記載の方法。
(項目136)
前記核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼが触媒活性がないC2c2を含む、項目134に記載の方法。
(項目137)
前記核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼがNgAgoを含む、項目134に記載の方法。
(項目138)
前記核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼが触媒活性がないNgAgoを含む、項目134に記載の方法。
(項目139)
前記宿主が、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、スナネズミ、トリ、マウスおよびラットからなる群より選択される、項目134から138のいずれか一項に記載の方法。
(項目140)
前記非宿主が原核生物である、項目134から138のいずれか一項に記載の方法。
(項目141)
前記非宿主が、真核生物、ウイルス、細菌、真菌および原生動物からなる群より選択される、項目134から138のいずれか一項に記載の方法。
(項目142)
アダプターにライゲートされた前記宿主核酸および非宿主核酸が50bpから1000bpの範囲内である、項目134から141のいずれか一項に記載の方法。
(項目143)
前記非宿主核酸が前記試料中の全核酸の50%未満を構成する、項目134から142のいずれか一項に記載の方法。
(項目144)
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか1つである、項目134から143のいずれか一項に記載の方法。
(項目145)
ステップ(c)がステップ(b)の生成物をcDNAに逆転写することを含む、項目134から144のいずれか一項に記載の方法。
(項目146)
ステップ(c)がサイズ排除によって前記宿主核酸を除去することを含む、項目134から145のいずれか一項に記載の方法。
(項目147)
ステップ(c)がビオチンの使用によって前記宿主核酸を除去することを含む、項目134から145のいずれか一項に記載の方法。
(項目148)
前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される、項目134から147のいずれか一項に記載の方法。
(項目149)
核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物。
(項目150)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目149に記載の組成物。
(項目151)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cmr5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目149に記載の組成物。
(項目152)
前記gNAがgRNAである、項目149から151のいずれか一項に記載の組成物。
(項目153)
前記gNAがgDNAである、項目149から151のいずれか一項に記載の組成物。
(項目154)
前記核酸断片がDNAを含む、項目149から153のいずれか一項に記載の組成物。
(項目155)
前記核酸断片がRNAを含む、項目149から153のいずれか一項に記載の組成物。
(項目156)
前記ヌクレオチドがビオチンで標識される、項目149から155のいずれか一項に記載の組成物。
(項目157)
前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である、項目149から156のいずれか一項に記載の組成物。
(項目158)
核酸断片および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体を含む組成物であって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されている、組成物。
(項目159)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なCASクラスIタイプI、不活性なCASクラスIタイプIII、不活性なCASクラスIタイプIV、不活性なCASクラスIIタイプIIおよび不活性なCASクラスIIタイプVからなる群より選択される、項目158に記載の組成物。
(項目160)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCmr5、dCsf1、dC2C2およびdNgAgoからなる群より選択される、項目158に記載の組成物。
(項目161)
前記gNAがgRNAである、項目158、159または160のいずれか一項に記載の組成物。
(項目162)
前記gNAがgDNAである、項目158から161のいずれか一項に記載の組成物。
(項目163)
前記核酸断片がDNAを含む、項目158から162のいずれか一項に記載の組成物。
(項目164)
前記核酸断片がRNAを含む、項目158から163のいずれか一項に記載の組成物。
(項目165)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのN末端に融合されている、項目158から164のいずれか一項に記載の組成物。
(項目166)
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのC末端に融合されている、項目158から165のいずれか一項に記載の組成物。
(項目167)
メチル化ヌクレオチドを含む核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体および非メチル化ヌクレオチドを含む組成物。
(項目168)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、CASクラスIタイプIニッカーゼ、CASクラスIタイプIIIニッカーゼ、CASクラスIタイプIVニッカーゼ、CASクラスIIタイプIIニッカーゼおよびCASクラスIIタイプVニッカーゼからなる群より選択される、項目167に記載の組成物。
(項目169)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cmr5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼおよびNgAgoニッカーゼからなる群より選択される、項目167に記載の組成物。
(項目170)
前記gNAがgRNAである、項目167、168または169のいずれか一項に記載の組成物。
(項目171)
前記gNAがgDNAである、項目167から170のいずれか一項に記載の組成物。
(項目172)
前記核酸断片がDNAを含む、項目167から171のいずれか一項に記載の組成物。
(項目173)
前記核酸断片がRNAを含む、項目167から171のいずれか一項に記載の組成物。
(項目174)
前記ヌクレオチドがビオチンで標識される、項目167から173のいずれか一項に記載の組成物。
(項目175)
前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である、項目167から174のいずれか一項に記載の組成物。
図1は、ヒトゲノムDNAのライブラリーからの標的核酸の捕捉のための第1のプロトコールを図示する。
図2は、核酸混合物からの標的核酸(例えば、DNA)の捕捉のためのプロトコールをさらに図示する。標的核酸は核酸ガイド化ヌクレアーゼで切断され、その後、新たに利用可能な平滑末端にアダプターがライゲートされる。
図3は、Cas9切断と、続くアダプターのライゲーションが、標的DNAの特異的増幅を可能にすることを図示する。
図4は、増幅されたDNAの配列決定を行った後、アダプターのライゲーションがガイドRNAによって指定された位置だけで起こったことを図示する。
図5は、図1の方法が、いずれの所与のライブラリーにおいても過少に示されるDNAを効率的に増幅することを図示する。
図6は、捕捉のための第2のプロトコールを図示する:さらなる捕捉および精製を可能にする、標的核酸(例えば、DNA)を標識する核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼの使用。
図7は、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼの代わりとして制限ニッカーゼを使用する原理実験の証明を図示する。
図8は、図7に図示する実験(Cas9-ニッカーゼを使用する)のための、概ね50倍の試験DNAの濃縮を図示する。
図9は、捕捉のための第3のプロトコールを図示する:特異的SNPの濃縮を可能にする、ヒトゲノムライブラリーにアダプターを挿入するための触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-トランスポザーゼ融合物の使用。
図10は、捕捉のための第4のプロトコールを図示する:目的領域の濃縮を可能にする、核酸ガイド化ヌクレアーゼによる以降の断片化から標的化部位を保護するための不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼの使用。
図11は、捕捉のための第5のプロトコールを図示する:メチル化されていないDNAでメチル化DNAを置き換えることによって、任意の標的化領域、例えばSNPまたはSTRを、例えばヒトゲノムDNAから保護し、次に濃縮するための、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼの使用。
図12は、第5のプロトコールにおける試験DNAのメチル化が、それをDpnI媒介切断に感受性にすることを図示する。
図13は、捕捉のための第6のプロトコールを図示する:アダプターの3’一本鎖ライゲーションおよび以降の濃縮を可能にする、目的領域を正確に示す2つの二本鎖切断を導入するための、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼの使用。
定義
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、これ以降に定義される用語は、明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY、第2版、John Wiley and Sons、New York(1994年)およびHaleおよびMarkham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY、Harper Perennial、N.Y.(1991年)は、本明細書で使用される用語の多くの一般的意味を当業者に提供する。なお、明瞭性および参照の容易さのために、特定の用語が下で定義される。
数値範囲は、その範囲を規定する数を含む。
本明細書で使用する用語「試料」は、その限りではないが一般的に、1つまたは複数の目的分析物を含有する液状の材料または材料の混合物に関する。
本明細書で使用する用語「核酸試料」は、核酸を含有する試料を表す。本明細書で使用される核酸試料は、それらが配列を有する複数の異なる分子を含有するという点で、複合体であってもよい。哺乳動物からのゲノムDNAは、一種の複合試料である。複合試料は、10、10、10または10個より多くの異なる核酸分子を有することができる。DNA標的は、任意の供給源、例えばゲノムDNA、cDNAまたは人工DNA構築物を起源とすることができる。核酸を含有する任意の試料、例えば組織培養細胞から作製されるゲノムDNAまたは組織試料を、本明細書で用いることができる。
用語「ヌクレオチド」は、公知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、改変された他の複素環塩基も含有する部分を含むものである。そのような改変には、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、アルキル化されたリボースまたは他の複素環が含まれる。さらに、用語「ヌクレオチド」にはハプテンまたは蛍光標識を含有する部分が含まれ、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含有することができる。改変ヌクレオシドまたはヌクレオチドには、例えば、ヒドロキシル基の1つまたは複数がハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられるか、エーテル、アミンなどとして官能基化される、糖部分の改変も含まれる。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される、任意の長さ、例えば、約2塩基より大きい、約10塩基より大きい、約100塩基より大きい、約500塩基より大きい、1000塩基より大きい、最高約10,000またはそれより多くの塩基の核酸ポリマーを記載するために使用され、酵素的または合成的に生成することができ(例えば、米国特許第5,948,902号およびその中の引用文献に記載されるPNA)、それは2つの天然に存在する核酸のそれに類似した配列特異的方法で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン-クリック型塩基対形成相互作用に関与することができる。天然に存在するヌクレオチドには、グアニン、シトシン、アデニンおよびチミン(それぞれG、C、AおよびT)が含まれる。DNAおよびRNAはデオキシリボースおよびリボース糖骨格をそれぞれ有するが、PNAの骨格は、ペプチド結合によって連結されている反復するN-(2-アミノエチル)-グリシン単位で構成される。PNAでは、様々なプリンおよびピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。しばしばアクセス不可能なRNAと呼ばれるロックト核酸(LNA)は、改変RNAヌクレオチドである。LNAヌクレオチドのリボース部分は、2’酸素および4’炭素を接続する余分の橋で改変される。橋は3’-エンド(北(north))コンフォメーションでリボースを「ロック」し、それはA形二重鎖でしばしば見出される。所望のときはいつでも、LNAヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのDNAまたはRNA残基と混合していてもよい。用語「非構造化核酸」または「UNA」は、低い安定性で互いに結合する非天然ヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、非構造化核酸は、G’残基およびC’残基を含有することができ、ここで、これらの残基は、低い安定性で互いと塩基対を形成するが、天然に存在するCおよびGの残基とそれぞれ塩基対を形成する能力を保持する、GおよびCの天然に存在しない形、すなわち類似体に対応する。非構造化核酸は米国特許出願公開第20050233340号に記載され、それはUNAの開示のために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用するように、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの一本鎖多量体を表す。
特に明記しない限り、核酸は左から右に5’から3’の向きで記述される。アミノ酸配列は、左から右にそれぞれアミノからカルボキシの向きで記述される。
本明細書で使用するように、用語「切断する」は、二本鎖DNA分子の両方の鎖における2つの隣接したヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を切断し、それによってDNA分子において二本鎖切断をもたらす反応を指す。
本明細書で使用するように、用語「切断部位」は、二本鎖DNA分子が切断された部位を指す。
「核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体」は、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質とガイド核酸(gNA、例えばgRNAまたはgDNA)とを含む複合体を指す。例えば、「Cas9-gRNA複合体」は、Cas9タンパク質とガイドRNA(gRNA)とを含む複合体を指す。核酸ガイド化ヌクレアーゼは、野生型核酸ガイド化ヌクレアーゼ、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼを非限定的に含む、任意のタイプの核酸ガイド化ヌクレアーゼであってよい。
用語「核酸ガイド化ヌクレアーゼ関連ガイドNA」は、ガイド核酸(ガイドNA)を指す。核酸ガイド化ヌクレアーゼ関連ガイドNAは、単離された核酸として、または核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体、例えばCas9-gRNA複合体の一部として存在することができる。
用語「捕捉」および「濃縮」は、本明細書で互換的に使用され、目的の配列、目的の標的化部位、目的外の配列または目的外の標的化部位を含有する核酸領域を選択的に単離するプロセスを指す。
用語「ハイブリダイゼーション」は、当技術分野で公知のように、核酸鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合するプロセスを指す。その2つの配列が中等度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下でお互いと特異的にハイブリダイズするならば、核酸は参照核酸配列と「選択的にハイブリダイゼーションが可能である」と考えられる。中等度および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は公知である(例えば、Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Wiley & Sons1995年およびSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory
Manual、第3版、2001年、Cold Spring Harbor、N.Y.を参照)。高ストリンジェンシー条件の1つの例は、50%ホルムアミド、5×SSC、5×デンハルト液、0.5%SDSおよび100μg/mlの変性担体DNA中で約42℃でのハイブリダイゼーション、続いて、室温での2×SSCおよび0.5%SDSにおける2回の洗浄と42℃での0.1×SSCおよび0.5%SDSにおける2回の追加の洗浄を含む。
本明細書で使用する用語「二重鎖」または「二重鎖の(duplexed)」は、塩基対を形成した、すなわち一緒にハイブリダイズした2つの相補的ポリヌクレオチドを記載する。
本明細書で使用するように用語「増幅する」は、鋳型として標的核酸を使用して標的核酸の1つまたは複数のコピーを生成することを指す。
本明細書で使用するように、用語「ゲノム領域」は、ゲノム、例えば動物または植物のゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類または昆虫または植物のゲノムの領域を指す。ある特定の場合には、本明細書に記載される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、その配列は例えばNCBIのGenbankデータベースまたは他のデータベースに寄託される染色体領域を使用して設計することができる。
本明細書で使用するように、用語「ゲノム配列」は、ゲノムに存在する配列を指す。RNAはゲノムから転写されるので、この用語は、生物体の核ゲノムに存在する配列、ならびにそのようなゲノムから転写されるRNA(例えば、mRNA)のcDNAコピーに存在する配列を包含する。
本明細書で使用するように、用語「ゲノム断片」は、ゲノム、例えば動物または植物のゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類または昆虫または植物のゲノムの領域を指す。ゲノム断片は、染色体全体または染色体の断片であってもよい。ゲノム断片は、アダプターでライゲートされても(この場合、それは断片の片方もしくは両方の末端に、または分子の少なくとも5’末端にライゲートされたアダプターを有する)、またはアダプターでライゲートされなくてもよい。
ある特定の場合には、本明細書に記載される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、その配列は例えばNCBIのGenbankデータベースまたは他のデータベースに寄託される染色体領域を使用して設計することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、試験ゲノムを含有する試料を使用するアッセイにおいて用いることができ、ここで試験ゲノムはオリゴヌクレオチドのための結合部位を含有する。
本明細書で使用するように、用語「ライゲートする」は、第1のDNA分子の5’末端の末端ヌクレオチドと第2のDNA分子の3’末端の末端ヌクレオチドとの、酵素によって触媒される結合を指す。
2つの核酸が「相補的である」場合は、核酸のうち1つの各塩基は他の核酸の中の対応するヌクレオチドと塩基対を形成する。用語「相補的な」および「完全に相補的な」は、本明細書において同義的に使用される。
本明細書で使用するように、用語「分離する」は、2つのエレメントの(例えば、サイズまたは親和性等による)物理的分離、ならびに1つのエレメントが分解し、他はインタクトなまま残ることを指す。例えば、切断された標的化配列を含む核酸を分離するために、サイズ排除を用いることができる。
細胞では、DNAは通常二本鎖の形態で存在し、このように、本明細書において「トップ」および「ボトム」鎖と呼ばれる2つの相補的な核酸鎖を有する。ある特定の場合には、染色体領域の相補鎖は、「プラス」および「マイナス」鎖、「第1」および「第2」の鎖、「コード」および「非コード」鎖、「ワトソン」および「クリック」鎖または「センス」および「アンチセンス」鎖と呼ぶことができる。トップまたはボトム鎖への鎖の割り当ては恣意的であり、いかなる特定の配向、機能または構造も意味しない。それらが共有結合するまで、第1および第2の鎖は別個の分子である。記載の容易さのために、トップおよびボトム鎖が共有結合している二本鎖核酸の「トップ」および「ボトム」鎖は、「トップ」および「ボトム」鎖としてなお記載される。言い換えると、この開示のために、二本鎖DNAのトップおよびボトム鎖は分離された分子である必要はない。いくつかの例示的な哺乳動物の染色体領域(例えば、BAC、アセンブリー、染色体等)の第1の鎖のヌクレオチド配列が公知であり、例えば、NCBIのGenbankデータベースに見出すことができる。
本明細書で使用する用語「トップ鎖」は、核酸の両方の鎖でなく核酸のいずれかの鎖を指す。オリゴヌクレオチドまたはプライマーが「トップ鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは1つの鎖だけに結合し、他には結合しない。本明細書で使用する用語「ボトム鎖」は、「トップ鎖」に相補的である鎖を指す。オリゴヌクレオチドが「1本の鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは1本の鎖だけ、例えば第1または第2の鎖だけに結合し、他の鎖には結合しない。オリゴヌクレオチドが二本鎖DNAの両方の鎖に結合またはアニールする場合は、オリゴヌクレオチドは2つの領域を有することができ、第1の領域は二本鎖DNAのトップ鎖とハイブリダイズし、第2の領域は二本鎖DNAのボトム鎖とハイブリダイズする。
用語「二本鎖DNA分子」は、トップおよびボトム鎖が共有結合していない二本鎖DNA分子、ならびにトップおよびボトム鎖が共有結合している二本鎖DNA分子の両方を指す。二本鎖DNAのトップおよびボトム鎖は、ワトソン-クリック相互作用により互いと塩基対を形成する。
本明細書で使用するように、用語「変性する」は、適する変性条件に二重鎖を置くことによる、核酸二重鎖の塩基対の少なくとも一部の分離を指す。変性条件は、当技術分野で周知である。一実施形態では、核酸二重鎖を変性させるために、二重鎖を二重鎖のTより上の温度に曝露させ、それによって二重鎖の1本の鎖を他から解放することができる。ある特定の実施形態では、適する時間(例えば、少なくとも30秒から30分まで)、少なくとも90℃の温度にそれを曝露させることによって、核酸を変性させることができる。ある特定の実施形態では、二重鎖の塩基対を完全に分離するために、完全変性条件を使用することができる。他の実施形態では、二重鎖のある特定の部分の塩基対を分離するために(例えば、A-T塩基対が濃縮された領域は分離することができ、G-C塩基対が濃縮された領域は対を形成したままでいることができる)、部分的変性条件(例えば、完全変性条件より低い温度による)を使用することができる。核酸は、化学的に変性させることもできる(例えば、尿素またはNaOHを使用する)。
本明細書で使用するように、用語「遺伝子型決定」は、核酸配列の任意のタイプの分析を指し、配列決定、多型(SNP)分析および再配列を同定するための分析を含む。
本明細書で使用するように、用語「配列決定」は、ポリヌクレオチドの連続するヌクレオチドの同一性が得られる方法を指す。
用語「次世代配列決定」は、いわゆる並行化された合成による配列決定またはライゲーションによる配列決定プラットホーム、例えば、Illumina、Life TechnologiesおよびRoche等によって現在用いられるものを指す。次世代配列決定方法は、ナノポア配列決定方法または電子検出に基づく方法、例えば、Life Technologiesによって商品化されたIon Torrent技術を含むこともできる。
用語「相補的DNA」またはcDNAは、RNAの(ランダムヘキサマーまたはオリゴdTプライマーなどのプライマーを使用した)逆転写と、続くRNaseHによるRNAの消化およびDNAポリメラーゼによる合成による第2の鎖の合成によってRNA試料から生成された二本鎖DNA試料を指す。
用語「RNAプロモーターアダプター」は、バクテリオファージRNAポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージT3、T7、SP6などからのRNAポリメラーゼのためのプロモーターを含有するアダプターである。
用語の他の定義は、明細書全体で出現することがある。
本発明の例示的方法
本明細書に記載されるように、本発明は、核酸の捕捉のための例示的なプロトコールおよびこれらのプロトコールで使用するための組成物を提供する。例示的なプロトコールは、それぞれ図1、6、9、10、11および13で、ならびに実施例のセクションで例示される。全体で、様々な使用が企図される。このセクションで言及する特定の用語は、以降のセクションにおいてより詳細に記載される。
一実施形態では、本発明は、図1~5に提供される捕捉方法(プロトコール1として表される)を提供する。この実施形態では、この方法は標的核酸配列を捕捉するために使用される。図1に関しては、本方法は、抽出プロトコール101(例えば、DNA抽出プロトコール)に供されて、>99%の標的外の配列および<1%の標的配列を含む試料102をもたらす試料またはライブラリー100を提供するステップを含む。試料はライブラリー構築プロトコール103に供されて、配列決定指数化アダプター104を含む核酸ライブラリーをもたらし、アダプターにライゲートされた複数の核酸をもたらし、ここで、核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている。標的特異的ガイドNA(例えばgRNA)のライブラリーを生成するために、RNAポリメラーゼプロモーター111、特異的塩基対領域112(例えば、20塩基対領域)、および核酸ガイド化ヌクレアーゼ113のためのステムループ結合部位113を各々含む標的特異的gNA前駆体110のライブラリーをin vitro転写114に供し、標的特異的ガイドRNA115のライブラリーを得た。核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体のライブラリーを与えるために、標的特異的ガイドNAのライブラリーを、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質116と次に組み合わせた。核酸ガイド化ヌクレアーゼ-が対応する標的核酸配列を切断し、他の核酸を未切断のままにするために117、核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体を核酸ライブラリーと次に組み合わせた。第2のアダプター118を付加し、切断された核酸119の5’リン酸化平滑末端に特異的にライゲートした。これは、下流への適用、例えば、アダプターに特異的なPCR120を使用して、一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端に第3のアダプターを含む核酸断片を増幅することを可能にする。
プロトコール1の例示的描写では、図1に関して、この方法は標的核酸配列を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料またはライブラリーを提供するステップであって、核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップを含む。この後に、試料を複数のCas9-gRNA複合体と接触させ、ここで、gRNAは核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である。接触させるステップは目的の標的化部位を切断し、それによって、一方の末端で第1または第2のアダプターにライゲートされ、他方の末端にはアダプターなしの複数の核酸断片を生成する。このステップに続いて、結果として生じる複数の核酸断片を第3のアダプターにライゲートし、それによって、一方の末端で第1または第2のアダプターに、他方の末端で第3のアダプターにライゲートした複数の核酸断片を生成する。これは、下流への適用、例えば、アダプターに特異的なPCRを使用して、一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端に第3のアダプターを含む核酸断片を増幅することを可能にする。
一実施形態では、本発明は、図6~8に提供される捕捉方法(プロトコール2として表される)を提供する。この実施形態では、本方法は、目的の標的化部位に標識ヌクレオチドを導入するために使用される。本方法は、複数の二本鎖核酸断片601(例えば、二本鎖DNA)を含む試料を提供するステップ;試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体と接触させるステップを含む。ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ603は、標的特異的ガイドNA604によって誘導され、ここで、gNAは核酸断片中の目的の標的化部位に相補的であり、それによって目的の標的化部位で複数のニック入りの核酸断片を生成する。ニッカーゼは、標的配列605にニックを入れるために使用される。ニッカーゼ-核酸ガイド化ヌクレアーゼは、標的配列で切断する。単一鎖の切れ目(ニック)は、ニックの下流のDNAをビオチン標識DNA606で置き換えるために使用することができる、DNAポリメラーゼIのための基質である。
プロトコール2の例示的な描写では、図6に関し、本方法は、目的の標的化部位に標識ヌクレオチドを導入するために使用される。本方法は、複数の核酸断片を含む試料を提供するステップ;試料を複数のCas9ニッカーゼ-gRNA複合体と接触させるステップであって、gRNAは核酸断片中の目的の標的化部位に相補的であり、それによって目的の標的化部位で複数のニック入りの核酸断片を生成する、ステップ;続いて、複数のニック入りの核酸断片をニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な酵素および標識ヌクレオチドと接触させ、それによって目的の標的化部位において標識ヌクレオチドを含む複数の核酸断片を生成するステップを含む。
一実施形態では、本発明は、図9に提供される捕捉方法(プロトコール3として表される)を提供する。この実施形態では、本方法は目的の標的核酸配列901を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸902を含む試料を先ず提供するステップであって、核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップを含む。この後に、試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させるステップが続き、ここで、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼ903に融合し、gNA904は核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、ここで、一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端に第3のアダプターを含む複数の核酸断片906を生成するために、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNAトランスポザーゼ複合体に、複数の第3のアダプター905を負荷する。これらの断片は、アダプター配列を使用して次に増幅することができ907、次に配列決定をすることができる908。
プロトコール3の例示的描写では、図9に関して、本方法は目的の標的核酸配列を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を先ず提供するステップであって、核酸は一方の末端で第1のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第2のアダプターにライゲートされている、ステップを含む。この後に、試料を複数のdCas9-gRNA複合体と接触させ、ここで、dCas9はトランスポザーゼに融合されており、gRNAは核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、ここで、一方の末端に第1または第2のアダプターを含み、他方の末端に第3のアダプターを含む複数の核酸断片を生成するために、dCas9-gRNAトランスポザーゼ複合体に、複数の第3のアダプターを負荷する。
一実施形態では、本発明は、例えば図10に提供される捕捉方法(プロトコール4として表される)を提供する。この実施形態では、本方法は、目的の標的核酸配列1001を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸1002を含む試料を先ず提供するステップであって、核酸は5’末端および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップを含む。本方法は、試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体1003と接触させるステップを次に含み、ここで、gNA1004は核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、それによって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体1005に結合している、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を生成する。この後に、試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体1006と接触させるステップが続き、ここで、gNA1007は核酸の目的の標的化部位と目的外の標的化部位の両方に相補的であり、それによって、5’または3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片1008を生成する。この方法では、第2の接触ステップの場合、複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体と接触させるステップは、ステップ(b)の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体に結合した、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を置換しない。
プロトコール4の例示的描写では、図10に関して、本方法は目的の標的核酸配列を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を先ず提供するステップであって、核酸は5’末端および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップを含む。本方法は、試料を複数の不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体(例えば、dCas9-gRNA)と接触させるステップを次に含み、ここで、gNAは核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、それによって、不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体(例えば、dCAS9-gRNA複合体)に結合している、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を生成する。この後に、試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体(例えば、Cas9-gRNA複合体)と接触させるステップが続き、ここで、gNAは核酸の目的の標的化部位と目的外の標的化部位の両方に相補的であり、それによって、5’または3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成する。この方法では、第2の接触ステップで、複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体(例えば、Cas9-gRNA複合体)と接触させるステップは、ステップ(b)の不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体(例えば、dCAS9-gRNA複合体)に結合している、5’および3’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を置換しない。
一実施形態では、本発明は、例えば図11および図12に提供される捕捉方法(プロトコール5として表される)を提供する。この実施形態では、本方法は、目的の標的核酸配列1101を捕捉するために使用される。本方法は、複数の配列1102を含む試料を先ず提供するステップであって、配列はメチル化ヌクレオチド(例えば、Damメチルトランスフェラーゼで処理される)を含み、配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップを含む。本方法は、試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ-gNA複合体1103と先ず接触させるステップを次に含み、ここで、gNA1104は配列のサブセットの目的の標的化部位に相補的であり、それによって目的の標的化部位で複数のニック入りの核酸配列1105を生成し、核酸配列は、5’および3’末端でアダプターにライゲートされている。核酸がDNAである場合、単一鎖の切れ目(ニック)は、例えば、ニックの下流のDNAをメチル化されていないDNAで置き換える、DNAポリメラーゼIの基質であってよい。この後に、試料をニック部位でDNA合成を開始することが可能な酵素およびメチル化されていないヌクレオチドと次に接触させ、それによって、目的の標的化部位でメチル化されていないヌクレオチド1106を含む複数のDNAを生成することができ、ここで、DNA配列は、5’および3’末端でアダプターにライゲートされている。この後に、メチル化DNAを切断することが可能な酵素(例えば、DpnI)と試料を接触させ1107、それによってメチル化DNAを含む複数のDNA断片を生成し、ここで、メチル化DNAを含む複数のDNA断片は、5’および3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされている。残りのインタクトな核酸は増幅させて、配列決定をすることができる1108。図12は、例えば、このプロトコールによって実行された実験からの結果を示す。ゲル上の第1のカラムは1kbラダーを示し、第2のカラムはDamメチルトランスフェラーゼで処理し、次にDpnIで消化した試験DNAを示し、第3のカラムはDpnIで消化した試験DNAを示す。第2のカラムはDpnI消化DNAに対応するバンドを示し、第3のカラムは未切断の試験DNAに対応するバンドを示す。
プロトコール5の例示的描写では、図11~12に関して、本方法は目的の標的DNA配列を捕捉するために使用される。本方法は、複数のDNA配列を含む試料を先ず提供するステップであって、DNA配列はメチル化ヌクレオチドを含み、DNA配列は5’および3’末端でアダプターにライゲートされている、ステップを含む。本方法は、試料を複数のCas9ニッカーゼ-gRNA複合体と先ず接触させるステップを次に含み、ここで、gRNAはDNA配列のサブセットの目的の標的化部位に相補的であり、それによって目的の標的化部位で複数のニック入りのDNAを生成し、DNAは、5’および3’末端でアダプターにライゲートされている。この後に、試料をニック部位でDNA合成を開始することが可能な酵素およびメチル化されていないヌクレオチドと次に接触させ、それによって、目的の標的化部位でメチル化されていないヌクレオチドを含む複数のDNAを生成することが続き、ここで、DNA配列は、5’および3’末端でアダプターにライゲートされている。この後に、メチル化DNAを切断することが可能な酵素と試料を接触させ、それによってメチル化DNAを含む複数のDNA断片を生成し、ここで、メチル化DNAを含む複数のDNA断片は、5’および3’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされている。
一実施形態では、本発明は、図13に提供される捕捉方法(プロトコール6として表される)を提供する。この方法の目的は、例えば図13に表されるように、任意の供与源(例えば、ライブラリー1302、ゲノムまたはPCR)から核酸1301の領域を濃縮することである。核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ1303は、2つのガイドNA1304および1305を使用して近位部位に標的化され、各位置1306で核酸のニッキングをもたらすことができる。あるいは、アダプターは1つの側だけでライゲートし、次にフィルインされ、その後アダプターを反対側でライゲートすることができる。2つのニックが互いに近接していてもよい(例えば、10~15bp以内)。標的外の分子に、単一のニックを生成させてもよい。2つのニック部位が近接しているため、反応を例えば65℃に加熱すると1307、二本鎖切断が起こり、長い(例えば、10~15bp)3’オーバーハングをもたらすことができる。これらのオーバーハングは、一本鎖アダプターの部位特異的ライゲーション1308を可能にするために、耐熱性の一本鎖DNA/RNAリガーゼによって認識することができる。リガーゼは、例えば、長い3’オーバーハングだけを認識することができ、このように、アダプターが他の部位でライゲートされないことを確実にする。このプロセスは、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼおよび目的の領域の反対側を標的にするガイドNAを使用して繰り返し、その後第2の一本鎖アダプターを使用して上のようにライゲーションを続けることができる。2つのアダプターが目的の領域のいずれかの側にライゲートされると、領域を増幅させること、または直接的に配列決定をすることができる1309。
プロトコール6の例示的な描写では、図13に関して、本方法は、任意のDNA供与源(例えば、ライブラリー、ゲノムまたはPCR)からDNAの領域を濃縮することである。Cas9ニッカーゼは、2つのガイドRNAを使用して近位部位に標的化され、各位置でDNAのニッキングをもたらすことができる。あるいは、アダプターは1つの側だけでライゲートし、次にフィルインされ、その後アダプターを反対側でライゲートすることができる。2つのニックが互いに近くにあってよい(例えば、10~15bp以内)。標的外の分子に、単一のニックを生成することができる。2つのニック部位が近接するため、反応を例えば65℃に加熱したとき、二本鎖切断が起こり、長い(例えば、10~15bp)3’オーバーハングをもたらすことができる。これらのオーバーハングは、一本鎖アダプターの部位特異的ライゲーションを可能にするために、耐熱性の一本鎖DNA/RNAリガーゼ、例えば耐熱性の5’App DNA/RNAリガーゼによって認識することができる。リガーゼは、例えば、長い3’オーバーハングだけを認識することができ、このように、アダプターが他の部位でライゲートされないことを確実にする。このプロセスは、Cas9ニッカーゼおよび目的の領域の反対側を標的にするガイドRNAを使用して繰り返し、その後第2の一本鎖アダプターを使用して上のようにライゲーションを続けることができる。2つのアダプターが目的の領域のいずれかの側にライゲートされると、領域を増幅させること、または直接的に配列決定をすることができる。
一実施形態では、本明細書で、目的の配列について試料を濃縮する方法であって、(a)目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を提供するステップであって、目的の配列は試料の50%未満を構成するステップ;および(b)複数の核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼ-gRNA複合体または複数の核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼ-gDNA複合体と試料を接触させるステップであって、gRNAおよびgDNAは標的化配列に相補的である、ステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的化配列は、それによって切断される。一実施形態では、核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼは、C2c2である。一実施形態では、C2c2は触媒活性がない。一実施形態では、核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼは、NgAgo(Natronobacterium gregoryiからのアルゴノート)である。一実施形態では、NgAgoは触媒活性がない。
一実施形態では、本明細書で、試料を濃縮する方法であって、(a)宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を提供するステップ;(b)複数の核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼ-gRNA複合体または複数の核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼ-gDNA複合体と試料を接触させるステップであって、gNAは宿主核酸の標的化部位に相補的である、ステップ、ならびに(c)非宿主核酸について試料を濃縮するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼは、C2c2である。一実施形態では、C2c2は触媒活性がない。一実施形態では、核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼは、NgAgoである。一実施形態では、NgAgoは触媒活性がない。
核酸、試料
本発明の核酸(捕捉のために標的化される)は、任意のDNA、任意のRNA、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖DNA、二本鎖RNA、人工DNA、人工RNA、合成DNA、合成RNAおよびRNA/DNAハイブリッドであってよい。
本発明の核酸は、ゲノムの領域を含むゲノム断片、または全ゲノムそれ自体であってよい。一実施形態では、ゲノムはDNAゲノムである。別の実施形態では、ゲノムはRNAゲノムである。
本発明の核酸は、真核生物または原核生物の生物体から;哺乳動物の生物体または非哺乳動物の生物体から;動物または植物から;細菌またはウイルスから;動物寄生生物から;または病原体から得ることができる。
本発明の核酸は、任意の哺乳動物の生物体から得ることができる。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は畜産動物、例えばウマ、ヒツジ、ウシ、ブタまたはロバである。別の実施形態では、哺乳動物の生物体は、家庭用ペット、例えばネコ、イヌ、スナネズミ、マウス、ラットである。別の実施形態では、哺乳動物はサルの一種である。
本発明の核酸は、任意のトリまたは鳥類の生物体から得ることができる。鳥類の生物体には、ニワトリ、シチメンチョウ、カモおよびガチョウが限定されずに含まれる。
本発明の核酸は、植物から得ることができる。一実施形態では、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、バラ、ブドウ、コーヒー、果実、トマト、ジャガイモまたはワタである。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、細菌の種から得られる。一実施形態では、細菌は、結核を引き起こす細菌である。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、ウイルスから得られる。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、真菌類の種から得られる。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、藻類の種から得られる。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、任意の哺乳動物寄生生物から得られる。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、任意の哺乳動物寄生生物から得られる。一実施形態では、寄生生物は虫である。別の実施形態では、寄生生物は、マラリアを引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物は、リーシュマニア症を引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物はアメーバである。
一部の実施形態では、病原体は、非哺乳動物の病原体である(非哺乳動物生物体において病原性である)。
一実施形態では、本発明の核酸には、同じ試料中のgNAの標的である核酸およびgNAの標的でない核酸が含まれる。
一実施形態では、本発明の核酸には、同じ試料中のgRNAの標的である核酸およびgRNAの標的でない核酸が含まれる。
一実施形態では、本発明の核酸には、同じ試料中のgDNAの標的である核酸およびgDNAの標的でない核酸が含まれる。
一実施形態では、本発明の核酸には、試料からの標的核酸(gNAの標的)および目的の核酸(gNAによって標的化されない)が含まれる。
一実施形態では、本発明の核酸には、試料からの標的核酸(gRNAの標的)および目的の核酸(gRNAによって標的化されない)が含まれる。
一実施形態では、本発明の核酸には、試料からの標的核酸(gDNAの標的)および目的の核酸(gDNAによって標的化されない)が含まれる。
一実施形態では、標的DNA(gNA、gRNA、gDNAの標的)はヒト非ミトコンドリアDNA(例えば、ゲノムDNA)であってよく、目的の(捕捉のための)DNAはヒトミトコンドリアDNAであってよく、ヒトミトコンドリアDNAは、非ミトコンドリアヒトDNAを標的にすることによって濃縮される。
一実施形態では、捕捉される核酸は、ゲノムのマッピング不能領域であってよく;さらなる分析/配列決定/クローニングのために保持される核酸は、ゲノムのマッピング可能な領域であってよい。一実施形態では、捕捉されて除去される(captured out)核酸は、ゲノムのマッピング可能な領域であってよく;さらなる分析/配列決定/クローニングのために保持される核酸は、ゲノムのマッピング不能領域であってよい。マッピング不能領域の例には、テロメア、動原体またはマッピングするのがより困難である特徴を有する他のゲノム領域が含まれる。
一実施形態では、本発明の核酸は、生物学的試料から得られる。核酸が得られる生物学的試料には、限定されずに、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料が含まれる。生物学的試料には、歯、骨、指の爪などの法医学試料が含まれてよい。生物学的試料には、組織、組織生検材料、例えば切除された肺組織が含まれてよい。生物学的試料には、臨床試料が含まれてよく、それは臨床場面、例えば病院またはクリニックで得られる試料を指す。
一実施形態では、本発明の核酸は、環境試料から、例えば、水、土壌、空気または岩石から得られる。
一実施形態では、本発明の核酸は、法医学試料、例えば、犯行現場で個体から、証拠品から、死後に、継続中の調査などの一部として得られる試料から得られる。
一実施形態では、本発明の核酸は、ライブラリーで提供される。
本発明の核酸は、試料から提供または抽出されてよい。抽出は、実質的に全ての核酸配列を検体から抽出することができる。
本発明の方法は、捕捉される核酸対捕捉されない核酸を、99.999:0.001から0.001:99.999の間のいずれかの比で生成することができる。本発明の方法は、標的化核酸および目的の核酸を、99.999:0.001から0.001:99.999の間のいずれかの比で生成することができる。本発明の方法は、捕捉される核酸対保持/分析/配列決定される核酸を、99.999:0.001から0.001:99.999の間のいずれかの比で生成することができる。これらの実施形態では、比は99.999:0.001から0.001:99.999の間のいずれかと等しいかまたはその範囲のどこかに入り得、例えば、比は、99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95および1:99であってよい。
捕捉の後、増幅、配列決定などのために各抽出される核酸の長さをより管理可能な長さに低減するために、捕捉または保持される核配列を断片化することができる。
本明細書で提供されるように、出発核酸材料の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%を捕捉することができる。この捕捉は、10分以下、15分以下、20分以下、30分以下、45分以下、60分以下、75分以下、90分以下、105分以下、120分以下、150分以下、180分以下または240分以下で達成することができる。
一部の場合には、目的の標的化部位は、試料中の全DNAの90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満または10%未満を占める。
アダプター
本明細書で提供されるように、本明細書で提供される方法の実行を助けるために、本発明の核酸(核酸または核酸断片と互換的に呼ばれる)は、アダプターにライゲートされている。
アダプターにライゲートされる本発明の核酸は、サイズが20bpから5000bpの範囲内であってよい。例えば、アダプターにライゲートされる核酸は、少なくとも20、25、50、75、100、125、150、175、200、25、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500または5000bpであってよい。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、100bpである。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、200bpである。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、300bpである。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、400bpである。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、500bpである。
アダプターは、5’および3’末端で、核酸または核酸断片の各々の各末端にライゲートすることができる。他の実施形態では、アダプターは、断片の各々の1つの末端だけにライゲートすることができるか、または、他の場合には、後のステップでアダプターをライゲートすることができる。一例では、アダプターは、二本鎖DNA分子の両方の鎖にライゲーション可能な核酸である。様々な実施形態では、アダプターは、ヘアピンアダプター、例えば、それ自体で塩基対を形成して二本鎖のステムおよびループを有する構造を形成する1つの分子であってよく、ここで、分子の3’および5’末端は断片の二本鎖DNA分子の5’および3’末端にそれぞれライゲートする。あるいは、アダプターは、ユニバーサルアダプターとも呼ばれる、断片の1つの末端または両末端にライゲートされるYアダプターであってよい。あるいは、アダプターそれ自体は、お互いと塩基対を形成する2つの異なるオリゴヌクレオチド分子で構成されてよい。さらに、アダプターのライゲーション可能な末端は、制限酵素による切断によって作製されるオーバーハングに適合するように設計することができるか、または、それは平滑末端もしくは5’Tオーバーハングを有することができる。一般的に、アダプターは二本鎖ならびに一本鎖の分子を含むことができる。したがって、アダプターは、DNAまたはRNA、またはこれら2つの混合物であってよい。RNAを含有するアダプターは、RNアーゼ処理またはアルカリ加水分解によって切断可能であってよい。
アダプターは長さが10から100bpであってよいが、この範囲の外のアダプターは本発明から逸脱することなく使用可能である。具体的な実施形態では、アダプターは、少なくとも10bp、少なくとも15bp、少なくとも20bp、少なくとも25bp、少なくとも30bp、少なくとも35bp、少なくとも40bp、少なくとも45bp、少なくとも50bp、少なくとも55bp、少なくとも60bp、少なくとも65bp、少なくとも70bp、少なくとも75bp、少なくとも80bp、少なくとも85bp、少なくとも90bpまたは少なくとも95bpの長さである。
さらなる例では、捕捉される核酸配列は、1つまたは複数のDNA配列決定ライブラリーに由来することができる。アダプターは、次世代配列決定プラットホームのために、例えば、Illumina配列決定プラットホームまたはIonTorrentプラットホームの上での使用のために構成することができる。
アダプターは、目的の制限部位またはプライマー結合部位を含有することができる。
例示的なアダプターには、P5およびP7アダプターが含まれる。
ガイド核酸(gNA)
本明細書でガイド核酸(gNA)が提供され、ここで、gNAは、核酸中の、例えば宿主からのゲノムDNA中の標的化部位または目的の配列、または目的外の配列に相補的である(選択的である、ハイブリダイズすることができる)。gNAは、核酸ガイド化ヌクレアーゼを核酸の特異的部位に誘導する。
一部の実施形態では、gNAはガイドRNA(gRNA)である。他の実施形態では、gNAはガイドDNA(gDNA)である。一部の実施形態では、gNAはgRNAおよびgDNAの混合物を含む。
gNAが導かれる宿主は、動物、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、スナネズミ、トリ、マウスまたはラットであってよい。宿主は、植物であってよい。非宿主は、原核生物、真核生物、ウイルス、細菌、真菌および原生動物であってよい。
一実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化される核酸配列とハイブリダイズするように構成される、gNAの収集物を含むガイド核酸(gNA)ライブラリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化されない核酸配列とハイブリダイズするように構成される、gNAの収集物を含むガイドNAライブラリーを提供する。
一実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化される核酸配列とハイブリダイズするように構成される、gRNAの収集物を含むガイドRNAライブラリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化されない核酸配列とハイブリダイズするように構成される、gRNAの収集物を含むガイドRNAライブラリーを提供する。
一実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化される核酸配列とハイブリダイズするように構成される、gDNAの収集物を含むガイドDNAライブラリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化されない核酸配列とハイブリダイズするように構成される、gDNAの収集物を含むガイドDNAライブラリーを提供する。
一実施形態では、gNAは試料中の標的核酸に選択的であるが、試料からの目的の配列に選択的でない。
一実施形態では、gNAは、核酸配列を逐次的に捕捉するために使用される。
一部の実施形態では、gNAは、核酸ガイド化ヌクレアーゼが結合することができるProtospacer隣接モチーフ(PAM)配列がその後に続く、標的核酸配列に選択的である。一部の実施形態では、gNAの配列は、核酸ガイド化ヌクレアーゼのタイプによって決定される。様々な実施形態では、PAM配列は、核酸ガイド化ヌクレアーゼが由来する生物体の種によって異なる可能性があるので、gNAは、異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼタイプに調整することができる。
本発明のgNA(gRNAまたはgDNA)は、サイズが50~200塩基対の範囲内で異なることができる。例えば、本発明のgNAは、少なくとも50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp、90bp、95bp、100bp、110bp、120bp、125bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、175bp、180bp、190bpまたは195bpであってよい。具体的な実施形態では、gNAは、80bp、90bp、100bpまたは110bpである。一部の実施形態では、標的特異的gNAは、細菌種に由来する核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質(例えば、Cas9)が結合することができるProtospacer隣接モチーフまたは(PAM)配列が続く標的核酸中の所定部位に相補的であってよい塩基対配列を含む。具体的な実施形態では、標的核酸中の所定部位に相補的であるgNAの塩基対配列は、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45または50塩基対である。
本発明は、gNAライブラリー(例えば、gRNAライブラリーまたはgDNAライブラリー)も提供する。gNAライブラリーは、捕捉の標的である核酸配列、目的の核酸配列または目的外の核酸配列とハイブリダイズする(選択的である)ように構成される、いくつかの異なる種特異的ガイドNA(例えば、gRNAまたはgDNA)エレメントを各々含むことができる。各gNAは、標的特異的ガイド配列、および核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質に結合するように形成されるステムループ結合部位を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは複数の異なるガイドNAを含むことができ、各々は、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質が結合することができる適当なPAM配列が続く、標的化される核酸中の異なる所定部位に相補的である異なる15~30塩基対配列を有する。各ガイドNAについて、PAM配列は目的の核酸の所定のDNAまたはRNA標的配列に存在するが、対応する標的特異的ガイド配列に存在しない。
一般的に、本発明により、所定の標的配列および続く適当なPAM配列を有する目的のゲノム中の任意の核酸配列は、ガイドNAライブラリーにおいて提供され、核酸ガイド化ヌクレアーゼが結合する対応するガイドRNAがハイブリダイズすることができる。様々な実施形態では、PAM配列は、核酸ガイド化ヌクレアーゼが由来する細菌の種によって異なる可能性があるので、gNAライブラリーは、異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼタイプに調整することができる。しかし、一部のバリエーションでは、所定の標的配列の後にPAM配列が続かない。
gNA中の異なる標的特異的配列を生成することができる。これは、バクテリオファージRNAポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージT3、T7、SP6などからのRNAポリメラーゼのためのプロモーターを使用して実行することができる。したがって、各異なるT7 RNAポリメラーゼプロモーターは、異なる標的核酸配列とハイブリダイズするのに適する異なる標的特異的配列を提供する。アニーリングおよび以降のPCR反応で使用できるフォワードプライマーの非限定的例示的セットは、下で提供される表1に掲載される。
所望の捕捉結果に適するように、各異なるガイドNAエレメントの多数のコピーならびに多数の異なるガイドNAエレメントを含むように、gNAライブラリー(例えば、gRNAまたはgDNAライブラリー)を増幅することができる。所与のガイドNAライブラリー中の特異なガイドNAエレメントの数は、1つの特異なガイドNAエレメントから300,000,000個もの特異なガイドNAエレメントの範囲内であってよく、または、ヒトゲノム中の10塩基対につき概ね1つの特異なガイドNA配列であってよい。特異なgNA(例えば、gRNAまたはgDNA)の数は、少なくとも約101、102、103、104、105、106、107または108個の特異なgNAであってよい。特異なgNAの数は、特異な核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体(例えば、CRISPR/Cas系タンパク質-gRNA複合体)のその数をもたらすことができる。
理論に制約されることなく、gNAが約100%の効能を提示する場合、標的核酸の>95%の切断に到達するgNAの間の距離を計算することができる:これは、ライブラリーのサイズの分布を測定し、平均、Nおよび標準偏差SDを決定することによって計算することができる;ライブラリーの>95%についてN-2SD=最小サイズであり、>95%捕捉を確実にするためにこのサイズの断片につき1つのガイドNAがあることを確実にする。これは、ガイドNAの間の最大距離=ライブラリーサイズの平均-2x(ライブラリーサイズの標準偏差)と記載することもできる。
本発明の様々な実施形態では、gNAは、一塩基多型(SNP)、ショートタンデムリピート(STR)、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異および調節領域を限定されずに含む、目的の様々な標的化部位に特異的であってよい。
核酸ガイド化ヌクレアーゼ
試料からの核酸の捕捉のための組成物および方法が、本明細書で提供される。これらの組成物および方法は、核酸ガイド化ヌクレアーゼを利用する。本明細書で使用するように、「核酸ガイド化ヌクレアーゼ」は、DNA、RNAまたはDNA/RNAハイブリッドを切断し、特異性を付与するために1つまたは複数の核酸ガイド核酸(gNA)を使用する任意のエンドヌクレアーゼである。核酸ガイド化ヌクレアーゼには、CRISPR/Cas系タンパク質ならびに非CRISPR/Cas系タンパク質が含まれる。
本明細書で提供される核酸ガイド化ヌクレアーゼは、DNAによって誘導されるDNAエンドヌクレアーゼ;DNAによって誘導されるRNAエンドヌクレアーゼ;RNAによって誘導されるDNAエンドヌクレアーゼ;またはRNAによって誘導されるRNAエンドヌクレアーゼであってよい。
一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼである。
一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼである。
CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質には、CRISPR I型系、CRISPR II型系およびCRISPR III型系からのタンパク質が含まれる。
一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種からのものであってよい。
一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものである。
一部の実施形態では、CRIPR/Cas系タンパク質は、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、Streptococcus thermophiles、Treponema denticola、Francisella tularensis、Pasteurella multocida、Campylobacter jejuni、Campylobacter lari、Mycoplasma gallisepticum、Nitratifractor salsuginis、Parvibaculum lavamentivorans、Roseburia intestinalis、Neisseria cinerea、Gluconacetobacter diazotrophicus、Azospirillum、Sphaerochaeta globus、Flavobacterium columnare、Fluviicola taffensis、Bacteroides coprophilus、Mycoplasma mobile、Lactobacillus farciminis、Streptococcus pasteurianus、Lactobacillus johnsonii、Staphylococcus pseudintermedius、Filifactor alocis、Legionella
pneumophila、Suterella wadsworthensisまたはCorynebacter diphtheriaからのCRISPR/Cas系タンパク質からのものであるかそれに由来する。
一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質の例は、天然に存在するものまたは操作されたバージョンであってよい。
一部の実施形態では、天然に存在するCRISPR/Cas系タンパク質は、CASクラスIタイプI、IIIもしくはIV、またはCASクラスIIタイプIIもしくはVに属することができ、Cas9、Cas3、Cas8a-c、Cas10、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Csm2、Cmr5、Csf1、C2c2およびCpf1を含むことができる。
例示的な実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質は、Cas9を含む。
「CRISPR/Cas系タンパク質-gNA複合体」は、CRISPR/Cas系タンパク質およびガイドNA(例えば、gRNAまたはgDNA)を含む複合体を指す。gNAがgRNAである場合、gRNAは2つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する1つのRNA(「crRNA」)、およびcrRNAとハイブリダイズすることが可能である1つのRNA「tracrRNA」で構成することができる。あるいは、ガイドRNAは、crRNAおよびtracrRNA配列を含有する単一の分子(すなわち、gRNA)であってよい。
CRISPR/Cas系タンパク質は、野生型CRISPR/Cas系タンパク質と少なくとも60%同一(例えば、少なくとも70%、少なくとも80%または90%同一、少なくとも95%同一または少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一)であってよい。CRISPR/Cas系タンパク質は、野生型CRISPR/Cas系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち1つもしくは一部だけを有することができる。
用語「CRISPR/Cas系タンパク質関連ガイドNA」は、ガイドNAを指す。CRISPR/Cas系タンパク質関連ガイドNAは、単離されたNAとして、またはCRISPR/Cas系タンパク質-gNA複合体の一部として存在することができる。
Cas9
一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Cas9であるかまたはそれを含む。本発明のCas9は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものであってよい。
本明細書の実施形態において使用することができるCas9タンパク質の例は、F.A. Ran、L. Cong、W.X. Yan、D. A. Scott、J.S. Gootenberg、A.J. Kriz、B. Zetsche、O. Shalem、X. Wu、K.S. Makarova、E.V. Koonin、P.A. SharpおよびF. Zhang;「In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9」、Nature520巻、186~191頁(2015年4月9日)doi:10.1038/nature14299、に見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、Cas9は、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、Streptococcus thermophiles、Treponema denticola、Francisella tularensis、Pasteurella multocida、Campylobacter jejuni、Campylobacter lari、Mycoplasma gallisepticum、Nitratifractor salsuginis、Parvibaculum
lavamentivorans、Roseburia intestinalis、Neisseria cinerea、Gluconacetobacter diazotrophicus、Azospirillum、Sphaerochaeta globus、Flavobacterium columnare、Fluviicola
taffensis、Bacteroides coprophilus、Mycoplasma mobile、Lactobacillus farciminis、Streptococcus pasteurianus、Lactobacillus johnsonii、Staphylococcus pseudintermedius、Filifactor alocis、Legionella pneumophila、Suterella wadsworthensisまたはCorynebacter diphtheriaに由来するII型CRISPR系である。
一部の実施形態では、Cas9は、S.pyogenesに由来するII型CRISPR系であり、PAM配列は、標的特異的ガイド配列の3’末端に直に位置するNGGである。例示的な細菌種からのII型CRISPR系のPAM配列は、以下を含むこともできる:Streptococcus pyogenes(NGG)、Staph aureus(NNGRRT)、Neisseria meningitidis(NNNNGA
TT)、Streptococcus thermophilus(NNAGAA)およびTreponema denticola(NAAAAC)、これらは全て本発明から逸脱することなく使用可能である。
例示的な一実施形態では、Cas9配列は、例えば、細菌で発現させ、組換え6Hisタグ付きタンパク質を精製するために、PCRによって再増幅され、次にpET30(EMD biosciencesから)にクローニングされる、pX330プラスミド(Addgeneから入手可能)から得ることができる。
「Cas9-gNA複合体」は、Cas9タンパク質およびガイドNAを含む複合体を指す。Cas9タンパク質は、野生型Cas9タンパク質と、例えばStreptococcus pyogenesのCas9タンパク質と少なくとも60%同一(例えば、少なくとも70%、少なくとも80%、または90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一)であってよい。Cas9タンパク質は、野生型Cas9タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち1つもしくは一部だけを有することができる。
用語「Cas9関連ガイドNA」は、前記のようなガイドNAを指す。Cas9関連ガイドNAは、単離されて、またはCas9-gNA複合体の一部として存在することができる。
非CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、非CRISPR/Cas系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。
一部の実施形態では、非CRISPR/Cas系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種からのものであってよい。
一部の実施形態では、非CRISPR/Cas系タンパク質は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものである。
一部の実施形態では、非CRISPR/Cas系タンパク質は、Aquifex aeolicus、Thermus thermophilus、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、Streptococcus thermophiles、Treponema denticola、Francisella tularensis、Pasteurella multocida、Campylobacter jejuni、Campylobacter lari、Mycoplasma gallisepticum、Nitratifractor salsuginis、Parvibaculum lavamentivorans、Roseburia intestinalis、Neisseria cinerea、Gluconacetobacter diazotrophicus、Azospirillum、Sphaerochaeta globus、Flavobacterium columnare、Fluviicola taffensis、Bacteroides coprophilus、Mycoplasma mobile、Lactobacillus farciminis、Streptococcus pasteurianus、Lactobacillus johnsonii、Staphylococcus pseudintermedius、Filifactor alocis、Legionella
pneumophila、Suterella wadsworthensis、Natronobacterium gregoryiまたはCorynebacter diphtheriaからのものであるかまたはそれに由来する。
一部の実施形態では、非CRISPR/Cas系タンパク質は、天然に存在するものまたは操作されたバージョンであってよい。
一部の実施形態では、天然に存在する非CRISPR/Cas系タンパク質は、NgAgo(Natronobacterium gregoryiからのアルゴノート)である。
「非CRISPR/Cas系タンパク質-gNA複合体」は、非CRISPR/Cas系タンパク質およびガイドNA(例えば、gRNAまたはgDNA)を含む複合体を指す。gNAがgRNAである場合、gRNAは2つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する1つのRNA(「crRNA」)、およびcrRNAとハイブリダイズすることが可能である1つのRNA「tracrRNA」で構成することができる。あるいは、ガイドRNAは、crRNAおよびtracrRNA配列を含有する単一の分子(すなわち、gRNA)であってよい。
非CRISPR/Cas系タンパク質は、野生型非CRISPR/Cas系タンパク質と少なくとも60%同一(例えば、少なくとも70%、少なくとも80%、または90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一)であってよい。非CRISPR/Cas系タンパク質は、野生型非CRISPR/Cas系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち1つもしくは一部だけを有することができる。
用語「非CRISPR/Cas系タンパク質関連ガイドNA」は、ガイドNAを指す。非CRISPR/Cas系タンパク質関連ガイドNAは、単離されたNAとして、または非CRISPR/Cas系タンパク質-gNA複合体の一部として存在することができる。
触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは非CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ)が含まれる。用語「触媒活性がない」は、不活性化ヌクレアーゼ、例えば、不活性化HNHおよびRuvCヌクレアーゼを有する核酸ガイド化ヌクレアーゼを一般的に指す。そのようなタンパク質は任意の核酸中の標的部位に結合することができるが(標的部位はガイドNAによって決定される)、タンパク質は核酸を切断することもニックを入れることもできない。
したがって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、未結合の核酸および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼに結合した断片への混合物の分離を可能にする。不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼの使用は、例えば、図9および図10のプロトコール3および4においてそれぞれ表される。例示的な一実施形態では、dCas9/gRNA複合体はgRNA配列によって決定される標的に結合する。図10に描写されるように、dCas9結合はCas9による切断を阻止できるが、他の操作は進行する。
別の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、トランスポザーゼなどの別の酵素に融合させて、その酵素の活性を特異的部位に標的化させることができる。
一部の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、dCas9、dCpf1、dCas3、dCas8a-c、dCas10、dCse1、dCsy1、dCsn2、dCas4、dCsm2、dCm5、dCsf1、dC2C2またはdNgAgoである。
例示的な一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質は、dCas9である。
核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ(ニッカーゼ-核酸ガイド化ヌクレアーゼと互換的に呼ばれる)が含まれる。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、単一の不活性触媒ドメインを含有する、CRISPR/Cas系ニッカーゼまたは非CRISPR/Cas系ニッカーゼが含まれる。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Cas9ニッカーゼ、Cpf1ニッカーゼ、Cas3ニッカーゼ、Cas8a-cニッカーゼ、Cas10ニッカーゼ、Cse1ニッカーゼ、Csy1ニッカーゼ、Csn2ニッカーゼ、Cas4ニッカーゼ、Csm2ニッカーゼ、Cm5ニッカーゼ、Csf1ニッカーゼ、C2C2ニッカーゼまたはNgAgoニッカーゼである。
一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Cas9ニッカーゼである。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。1つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的DNAの1本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ガイドNAとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする2つのgNAに結合した核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、核酸において二本鎖切断を起こすことができる。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方の核酸ガイド化ヌクレアーゼ/gNA複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加させる。
例示的な実施形態では、Cas9ニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。用語「Cas9ニッカーゼ」は、単一の不活性触媒ドメイン、すなわち、RuvC-またはHNH-ドメインを含有する、Cas9タンパク質の改変バージョンを指す。1つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、Cas9ニッカーゼは、標的DNAの1本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ガイドRNAとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする2つのgRNAに結合したCas9ニッカーゼは、DNAにおいて二本鎖切断を起こす。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方のCas9/gRNA複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加することができる。
DNAの捕捉は、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼを使用して実行することができる。これは、図6および図11のプロトコール2および5においてそれぞれ図示される。例示的な一実施形態では、図6および11に描写されるように、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは二本鎖核酸の1本の鎖を切断し、二本鎖の領域はメチル化ヌクレオチドを含む。
解離可能および耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼが本明細書で提供される方法で使用される(耐熱性のCRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは耐熱性の非CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ)。そのような実施形態では、反応温度が上昇し、タンパク質の解離を誘導する。反応温度は低下し、さらなる切断された標的配列の生成を可能にする。一部の実施形態では、少なくとも75℃で少なくとも1分の間維持されるとき、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも50%の活性、少なくとも55%の活性、少なくとも60%の活性、少なくとも65%の活性、少なくとも70%の活性、少なくとも75%の活性、少なくとも80%の活性、少なくとも85%の活性、少なくとも90%の活性、少なくとも95%の活性、少なくとも96%の活性、少なくとも97%の活性、少なくとも98%の活性、少なくとも99%の活性または100%の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも75℃で、少なくとも80℃で、少なくとも85℃で、少なくとも90℃で、少なくとも91℃で、少なくとも92℃で、少なくとも93℃で、少なくとも94℃で、少なくとも95℃、96℃で、少なくとも97℃で、少なくとも98℃で、少なくとも99℃で、または少なくとも100℃で少なくとも1分の間維持されるとき、少なくとも50%の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも75℃で少なくとも1分、2分、3分、4分または5分の間維持されるとき、少なくとも50%の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、温度を上昇させ、25℃~50℃に低下させたとき、少なくとも50%の活性を維持する。一部の実施形態では、温度は、25℃に、30℃に、35℃に、40℃に、45℃に、または50℃に低下させられる。例示的な一実施形態では、耐熱性酵素は、95℃で1分間の後に少なくとも90%の活性を保持する。
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、耐熱性Cas9、耐熱性Cpf1、耐熱性Cas3、耐熱性Cas8a-c、耐熱性Cas10、耐熱性Cse1、耐熱性Csy1、耐熱性Csn2、耐熱性Cas4、耐熱性Csm2、耐熱性Cm5、耐熱性Csf1、耐熱性C2C2または耐熱性NgAgoである。
一部の実施形態では、耐熱性CRISPR/Cas系タンパク質は、耐熱性Cas9である。
耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、単離すること、例えば、高温菌Streptococcus thermophilusおよびPyrococcus furiosusのゲノムにおける配列相同性によって同定することができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼ遺伝子は、発現ベクターに次にクローニングすることができる。例示的な一実施形態では、耐熱性のCas9タンパク質は単離される。
別の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、非耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼのin vitro進化によって得ることができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼの配列は、その耐熱性を改善するために変異誘発させられ得る。
本発明の例示的組成物
一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼCas9-gRNA複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。そのような実施形態では、核酸はDNAを含むことができる。ヌクレオチドは、例えばビオチンで標識することができる。ヌクレオチドは、抗体-コンジュゲート対の一部であってよい。
一実施形態では、核酸断片および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体を含む組成物であって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されている、組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、DNA断片およびdCas9-gRNA複合体を含む組成物であって、dCas9はトランスポザーゼに融合されている、組成物が本明細書で提供される。
一実施形態では、メチル化ヌクレオチドを含む核酸断片、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ-gNA複合体、およびメチル化されていないヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、メチル化ヌクレオチドを含むDNA断片、ニッカーゼCas9-gRNA複合体およびメチル化されていないヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。
一実施形態では、核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼと複合体を形成したgDNAが本明細書で提供される。例示的な実施形態では、核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼは、NgAgoである。
一実施形態では、核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼと複合体を形成したgDNAが本明細書で提供される。
一実施形態では、核酸ガイド化DNAエンドヌクレアーゼと複合体を形成したgRNAが本明細書で提供される。
一実施形態では、核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼと複合体を形成したgRNAが本明細書で提供される。一実施形態では、核酸ガイド化RNAエンドヌクレアーゼは、C2c2を含む。
キットおよび製造品
本出願は、アダプター、gNA、gDNA、gRNA、gNAライブラリー、gRNAライブラリー、gDNAライブラリー、核酸ガイド化ヌクレアーゼ、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ、CRISPR/Cas系タンパク質、ニッカーゼCRISPR/Cas系タンパク質、触媒活性がないCRISPR/Cas系タンパク質、Cas9、dCas9、Cas9ニッカーゼ、メチル化ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、アビジン、ストレプトアビジン、ニック部位で核酸合成を開始することが可能な酵素、DNAポリメラーゼI、TAQポリメラーゼ、bstDNAポリメラーゼ、メチル化ヌクレオチドを切断することが可能な酵素、Dpn1酵素、およびDNAをメチル化することが可能な酵素、例えばDam/Dcm1メチルトランスフェラーゼ)を限定されずに含む、本明細書に記載される組成物のいずれか1つまたは複数を含むキットを提供する。
一実施形態では、キットはgNAの収集物またはライブラリーを含み、ここで、gNAはヒトゲノムDNA配列、例えば目的の特定の遺伝子(例えば、がん遺伝子)SNP、STRを標的にする。別の例示的実施形態では、キットはgNAの収集物またはライブラリーを含み、ここで、gNAはヒト以外の哺乳動物のDNA配列を標的にする。別の例示的実施形態では、キットはgNAの収集物またはライブラリーを含み、ここで、gNAはヒトのリボソームRNA配列を標的にする。別の例示的実施形態では、キットはgNAの収集物またはライブラリーを含み、ここで、gNAはヒトのミトコンドリアDNA配列を標的にする。
例示的一実施形態では、キットはgRNAの収集物またはライブラリーを含み、ここで、gRNAはヒトゲノムDNA配列、例えば目的の特定の遺伝子(例えば、がん遺伝子)SNP、STRを標的にする。別の例示的実施形態では、キットはgRNAの収集物またはライブラリーを含み、ここで、gRNAはヒト以外の哺乳動物のDNA配列を標的にする。別の例示的実施形態では、キットはgRNAの収集物またはライブラリーを含み、ここで、gRNAはヒトのリボソームRNA配列を標的にする。別の例示的実施形態では、キットはgRNAの収集物またはライブラリーを含み、ここで、gRNAはヒトのミトコンドリアDNA配列を標的にする。
本出願は、本明細書に記載されるキットのいずれか1つを含む製造品も提供する。製造品の例には、バイアル(密封バイアルを含む)が含まれる。
以下の実施例は例示目的のために含まれ、本発明の範囲を限定するものではない。
(実施例1:全ヒトゲノムDNAからのミトコンドリアDNAの捕捉(DNAの捕捉のためのプロトコール1))
概要
この方法の目的は、図1に表すように、ヒトゲノムDNAのライブラリーからミトコンドリアDNAを捕捉することであった。ヒト組織検体をDNA抽出プロトコールに供し、>99%のヒトDNAおよび<1%の標的配列を含むDNA試料をもたらした。DNA試料を配列決定ライブラリー構築プロトコールに供し、配列決定指数化アダプターを含む核酸ライブラリーをもたらした。標的特異的ガイドRNA(gRNA)のライブラリーを生成するために、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ヒト特異的20塩基対領域、およびCas9のためのステムループ結合部位を各々含む標的特異的gRNA前駆体のライブラリーをin vitro転写に供し、標的特異的ガイドRNAのライブラリーを得た。標的特異的ガイドRNAのライブラリーをCas9タンパク質と次に組み合わせ、Cas9-gRNA複合体のライブラリーを得た。Cas9が対応する標的DNA配列を切断し、他のDNAを未切断のままに残すように、Cas9-gRNA複合体を核酸ライブラリーと次に組み合わせた。第2のアダプターを付加し、切断されたDNAの5’リン酸化平滑末端に特異的にライゲートさせた。第1および第2のアダプターを使用して特異的に増幅するために、PCRを次に使用した。
ミトコンドリアDNAは、全ヒトゲノムDNAの概ね0.1~0.2%を構成する。Cas9によるDNAの正確な部位特異的切断および続くアダプターのライゲーションを試験するために、図2に関し、試験DNA(例えば、プラスミド)201を第1の位置202または第2の位置203でCas9により切断し、第1の生成物204または第2の生成物205を得た(例えば、図2を参照)。アダプターを、新たに利用可能な平滑DNA末端にライゲートした206。AUK-F/P7またはMB1OriR/P7のためにPCR増幅を実行し、反応ごとに2つの別個の生成物を得た。第1の位置が切断された場合、生成物は212であり、サイズは1.9kであった。第2の位置が切断された場合、生成物は359であり、サイズは1.75kであった。検証は、配列決定によって実行した。
結果は、Cas9切断と、続くアダプターのライゲーションが、標的DNAの特異的増幅を可能にすることを示した(例えば、図3を参照)。増幅されたDNAの配列決定は、アダプターのライゲーションがガイドRNAによって指定された位置だけで起こることを示した(例えば、図4を参照)。
次に、主にヒト核DNAを含有する混合物からミトコンドリアDNAを濃縮した。ミトコンドリアDNAに特異的である25個のガイドRNAを使用し、次にCas9で切断し、アダプターとライゲートし、その後増幅が続いた。図5からわかるように、2つ別個の反応はミトコンドリアDNAの増幅を可能にし、ガイドRNAのない反応はいかなるDNAも増幅せず、このように、この方法が任意の所与のライブラリーにおいて過少に示されるDNAを効率的に増幅することを示す。
DNAライブラリーの調製
平滑末端修復キット(NEB)を25℃で20分の間使用して、500ngの断片化ヒトゲノムDNAを末端修復することによって(dsDNAフラグメンターゼ、NEB、37℃で1時間処理した)、ヒトゲノムDNAライブラリーを生成した。次に、75℃で20分の間反応を熱不活性化させ、25℃に冷却し、次にT4 DNAリガーゼ(NEB)を使用して25℃で2時間、15ピコモルのP5/Mycアダプターにライゲートした。アダプターダイマー (adapter dimmer)は、NGSクリーンアップキット(Life Technologies)を使用して除去した。
Cas9の発現
Cas9開始コドンの直ぐ上流にヘキサヒスチジンタグを挿入するために、Cas9(S.pyogenesから)をpET30発現ベクター(EMD biosciences)にクローニングした。結果として生じたプラスミドをRosetta(DE3)BL21細菌株(EMD biosciences)に形質転換させ、培養物の光学密度(600nmのOD)が0.4に到達するまで、激しい通気により1LのLB培地で増殖させた。温度を25℃まで下げ、0.2mMのIPTGを加え、培養物をさらに4時間増殖させた。細胞を次に遠心分離(4℃で20分間の1,000×g)によって収集し、10ml結合緩衝液(20mMトリスpH8、0.5M NaCl、5mMイミダゾール、0.05%NP40)に再懸濁させ、超音波処理(30%パワーで7×10秒間のバースト、ソニファイアー250、Branson)によって溶解した。不溶性細胞残渣は、20分間の10,000×gによる遠心分離によって除去した。可溶タンパク質を含有する上清を次に0.4mlのNTAビーズ(Qiagen)と混合して、カラムにロードした。4mlの結合緩衝液でビーズを3回洗浄し、次に、250mMのイミダゾールを補充した結合緩衝液の3×0.5mlで溶出した。次に溶出した画分を30,000MWCOタンパク質濃縮器(Life Technologies)を使用して濃縮し、保存緩衝液(10mMトリスpH8、0.3M NaCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50%グリセロール)で緩衝液を交換し、SDS PAGEによって検証し、その後Colloidal Blue染色(Life Technologies)が続き、定量化し、次に後の使用のために-20℃で保存した。
変異体Cas9ニッカーゼ、S.pyogenesのCas9のD10A変異体は、上記のようにCas9を生成するのに使用される同じ手法を使用して生成し、精製することができる。
gRNA1およびgRNA2の調製
3つのオリゴヌクレオチドT7-ガイドRNA1および2(5’から3’方向に、GCCTCGAGCTAATACGACTCACTATAGGGATTTATACAGCACTTTAAおよびGCCTCGAGCTAATACGACTCACTATAGGGTCTTTTTGGTCCTCGAAGの配列)ならびにstlgR(配列、GT TTT AGA GCT AGA AAT AGC AAG TTA AAA TAA GGC TAG TCC GTT ATC AAC TTG AAA AAG TGG CAC CGA GTC GGT GCT TTT TTT GGA TCC GAT GC)を注文し、合成した(IDT)。stlgRオリゴヌクレオチド(300ピコモル)を、製造業者の説明書に従ってT4 PNK(New England Biolabs)を使用して逐次的に5’リン酸化し、次に5’アデニル化キット(New England Biolabs)を使用して5’アデニル化した。耐熱性の5’AppDNA/RNAリガーゼ(New England Biolabs)を65℃で1時間使用して、T7-ガイドRNAオリゴヌクレオチド(5ピコモル)および5’アデニル化stlgR(10ピコモル)を次にライゲートした。ライゲーション反応を90℃で5分間熱不活性化させ、次にプライマーForT7(配列GCC TCG AGC TAA TAC GAC TCA C)およびgRU(配列AAAAAAAGCACCGACTCGGTG)によるPCR(OneTaq、New England Biolabs、95℃で30秒、57℃で20秒、72℃で20秒の30サイクルを使用)で増幅した。PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してPCR生成物を精製し、アガロースゲル電気泳動および配列決定によって検証した。検証された生成物は、in vitro転写のための鋳型として次に使用した。
ガイドRNAライブラリーの調製
T7-ガイドRNAオリゴヌクレオチド(表1)および別のオリゴヌクレオチド、stlgR(配列、GT TTT AGA GCT AGA AAT AGC AAG TTA AAA TAA GGC TAG TCC GTT ATC AAC TTG AAA AAG TGG CAC CGA GTC GGT GCT TTT TTT GGA TCC GAT GC)を注文し、合成した(IDT)。
stlgRオリゴヌクレオチド(300ピコモル)を、製造業者の説明書に従ってT4
PNK(New England Biolabs)を使用して逐次的に5’リン酸化し、次に5’アデニル化キット(New England Biolabs)を使用して5’アデニル化した。耐熱性の5’AppDNA/RNAリガーゼ(New England Biolabs)を65℃で1時間使用して、T7-ガイドRNAオリゴヌクレオチド(5ピコモル)および5’アデニル化stlgR(10ピコモル)を次にライゲートした。ライゲーション反応を90℃で5分間熱不活性化させ、次にプライマーForT7(配列GCC TCG AGC TAA TAC GAC TCA C)およびgRU(配列AAAAAAAGCACCGACTCGGTG)によるPCR(OneTaq、New England Biolabs、95℃で30秒、57℃で20秒、72℃で20秒の30サイクルを使用)で増幅した。PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してPCR生成物を精製し、アガロースゲル電気泳動および配列決定によって検証した。検証された生成物は、in vitro転写のための鋳型として次に使用した。
Figure 2022046466000001
Figure 2022046466000002
in vitro転写
検証された生成物は、HiScribe T7転写キット(New England Biolabs)を使用したin vitro転写反応のための鋳型として次に使用した。製造業者の説明書に従って、500~1000ngの鋳型を37℃で終夜インキュベートした。ガイドライブラリーをガイドRNAに転写するために、以下のin vitro転写反応混合物を組み立てた:10μlの精製ライブラリー(約500ng)、6.5μlのH2O、2.25μlのATP、2.25μlのCTP、2.25μlのGTP、2.25μlのUTP、2.25μlの10×反応緩衝液(NEB)および2.25μlのT7 RNAポリメラーゼミックス。反応を37℃で24時間インキュベートし、次にRNAクリーンアップキット(Life Technologies)を使用して精製し、100μlのRNアーゼ不含水に溶出し、定量化し、使用時まで-20℃で保存した。
DNA特異的Cas9-媒介断片化
試験DNAを切断するために、試験ガイドRNA1および2を別々に使用した。ヒトゲノムDNAライブラリーからミトコンドリアDNAを切断し、濃縮するために、ガイドRNAシリーズ1および2を使用した。希釈したガイドRNA(1μl、2ピコモルと同等)を、3μlの10×Cas9反応緩衝液(NEB)、20μlのH2Oおよび1μlの組換えCas9酵素(NEB、1ピコモル/μl)と組み合わせた。以下の配列(5’-GGATTTATACAGCACTTTAA-3’)を標的にした対照ガイドRNAを使用した対照反応を、同じパラメーターを使用して別々に実行した。この配列は、ヒト染色体でもミトコンドリアDNAでも不在である。反応を37℃で15分間インキュベートし、次に5μlの希釈されたDNAライブラリー(50pg/μl)を補充し、37℃でのインキュベーションを90分間継続した。1:100の希釈でRNアーゼA(Thermo Fisher Scientific)を加えることによって反応を終了し、次に、PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してDNAを精製し、30μlの10mMトリス-Cl pH8で溶出した。次に反応を使用時まで-20℃で保存した。
アダプターのライゲーションおよびPCR分析
試験DNAのために、Cas9消化の後の反応を15ピコモルのP5/P7アダプターおよびT4 DNAリガーゼ(NEB)と、25℃で1時間インキュベートした。ライゲーションは、試験DNA-Fプライマー(配列ATGCCGCAGCACTTGG)およびP5プライマー(配列AATGATACGGCGACCACCGA)を使用したPCRのための鋳型として次に使用した。切断およびライゲーションが標的DNA配列で起こったことを示すために、試験DNA-Fプライマー(ElimBio)を使用して配列決定をしたアガロースゲル電気泳動によって、成功したPCR生成物を確認した。
古い末端でライゲートされたアダプターの排除
ミトコンドリアDNAの濃縮のために、Cas9消化の後、反応を15ピコモルのFlag5/P7アダプターおよびT4 DNAリガーゼ(NEB)と、25℃で1時間インキュベートした。例えば酵素処理を用いた、元のライブラリーからの旧P5およびP7アダプターの末端のアダプターのライゲーションを排除するために、複数の分子生物学的方法を用いることができる。P7(配列CAAGCAGAAGACGGCATACGA)およびP5プライマー(配列AATGATACGGCGACCACCGA)を使用したPCRのための鋳型として、反応を次に使用した。成功したPCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によって確認した。
(実施例2:DNA混合物から試験DNAを標識し、次に精製するための、Cas9ニッカーゼの使用(DNAの捕捉のためのプロトコール2))
概要
この方法の目的は、例えば図6に表されるように、ヒトゲノムDNAのライブラリーから目的の領域(例えば、SNP、STR等)を捕捉することであった。このプロトコールを適用するために、標的特異的ガイドRNAによって誘導されるニッキング酵素(NtAlwI(NEB))のための部位を含有する試験DNAを、この部位を含有しない別のDNAプールに1%または5%で混合した。ニッカーゼCas9は標的配列だけで切断し、DNAの1本の鎖を切断することしかしない。ニッカーゼは、標的配列にニックを入れるために使用した。単一鎖の切れ目(ニック)は、ニックの下流のDNAをビオチン標識DNAで置き換えるために使用することができる、DNAポリメラーゼIのための基質である。目的のビオチン化DNAを次に精製し、増幅し、配列決定をした。
ニッキングの標的部位(例えば、GGATC)703を含むDNAの混合物701およびそれを含まないDNAの混合物702を、NtAlwIを使用してニックを入れた704(例えば、図7を参照)。ニッカーゼ部位を有する目的のDNAと比較して、ニッカーゼ部位を有しないDNAは100倍過剰に存在した。単一鎖の切れ目(ニック)は、ニックの下流のDNAをビオチン標識DNAで置き換えるために使用される705、DNAポリメラーゼIのための基質である。目的のビオチン標識DNAを、ストレプトアビジン結合および洗浄706によって単離した。PCR増幅は特異的プライマー707で実行し、増幅された目的の領域708、および、例えば非特異的標識化または捕捉のために存在した、増幅された非標識配列709を得た。
2つの特異的PCR反応(1つは目的の領域を有する試験DNAのためであり、他は目的の領域のない他のDNAのためである)は、試験DNAが概ね50倍濃縮されたことを示した(例えば、図8を参照)。
Cas9ニッカーゼの発現および精製
変異体Cas9ニッカーゼ、S.pyogenesのCas9のD10A変異体は、上記のようにCas9を生成するのに使用される同じ手法を使用して生成し、精製することができる。
配列特異的Cas9ニッカーゼ媒介ニッキング
以下の配列5’-GGATTTATACAGCACTTTAA-3’を標的にする希釈されたガイドRNA(1μl、2ピコモルに同等)を、3μlの10×Cas9反応緩衝液(NEB)、20μlのH2Oおよび1μlの組換えCas9ニッカーゼ酵素(10ピコモル/μl)と組み合わせた。この標的配列は、標的DNA(全DNAの5%または1%を占める)の上にだけ存在する。反応を37℃で15分間インキュベートし、次に5μlの希釈されたDNA(全100ng)を補充し、37℃でのインキュベーションを90分間継続した。1:100の希釈でRNアーゼA(Thermo Fisher Scientific)を加えることによって反応を終了し、次に、PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してDNAを精製し、30μlの10mMトリス-Cl pH8で溶出した。次に使用時まで反応を-20℃で保存した。
ビオチンニックトランスレーション
ニック入りのDNAを、5’>3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ニックでDNA合成を開始することが可能であり、したがってそれがニック下流のヌクレオチドを標識ヌクレオチド(この手法の場合、ビオチン標識ヌクレオチド)で置き換えることを可能にする、E.coliのDNAポリメラーゼIとインキュベートした。ニック標識反応は、25℃で30分間、1単位のE.coliDNAポリメラーゼI(NEB)ならびに各々0.02mMのdCTP、dGTPおよびdTTP、0.01mMのdATPおよび0.01mMのビオチン-C14標識dATP(Life Technologies)を有する20μlのDNAポリメラーゼ緩衝液(NEB)で実行した。反応は、1mMのEDTAを加えることによって終了した。
ビオチン標識DNAの濃縮
ストレプトアビジンC1ビーズ(反応につき5μl、Life Technologies)を1mlの結合緩衝液(50mMのトリス-Cl pH8、1mMのEDTA、0.1%のTween20)に再懸濁させ、磁気ラックに結合させ、結合緩衝液で2回洗浄した。次にビーズを30μlの結合緩衝液に再懸濁させ、ニックトランスレーション反応と混合し、次に25℃で30分の間インキュベートした。ビーズは磁気ラックを使用して捕捉し、0.5ml結合緩衝液で4回、次に0.5mlの10mMトリス-Cl pH8で3回洗浄した。次にビーズを20μlの10mMトリス-Cl pH8に再懸濁させ、その後、試験DNAおよび他のDNAの割合を決定するためにPCRのための鋳型として使用した。
(実施例3:ヒトゲノムライブラリーにアダプターを挿入し、続いて特異的SNPを濃縮するための触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-トランスポザーゼ融合物の使用(DNAの捕捉のためのプロトコール3))
この例では、Cas9精製について記載されるように、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ-トランスポザーゼ融合タンパク質(例えば、dCas9-トランスポザーゼ融合タンパク質)は、E.coliから発現され、精製される。融合タンパク質はアダプター(Nextera)と、次に目的の領域(例えば、ヒトSNP)を標的にするガイドNA(例えば、gRNA)と複合体を形成する。次に、複合体をヒトゲノムDNAに付加する。目的の領域は触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼによって標的化され、トランスポザーゼ-アダプター複合体は目的の領域の近くに置かれ、アダプターの挿入を可能にする。次にヒトSNPをPCRによって増幅し、次にMiSeqを使用して配列決定をすることができ、このように、ヒトSNPをヒトゲノムDNAから濃縮することができる。
(実施例4:ミトコンドリアDNAを保護し、ヒトゲノムDNAライブラリーからの残りのヒト核DNAを消化するための、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼの使用(DNAの捕捉のためのプロトコール4))
臨床、法医学または環境試料からのP5/P7アダプターを含むヒトゲノムDNAライブラリーを得る。ある特定の領域(例えば、SNP)を濃縮するために、これらの領域を標的にするガイドRNAを作製し、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ(例えば、dCas9)とインキュベートし、次に37℃で20分の間ヒトゲノムDNAライブラリーに加える。次に、活性のある核酸ガイド化ヌクレアーゼ(例えば、Cas9)と複合体を形成したヒトゲノムを網羅するガイドNAのライブラリーを加える。触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、標的位置に結合したままであり、目的の領域(例えば、SNP)が切断されて、PCR増幅不能および配列決定不能になることから保護する。したがって、目的のDNAはインタクトなままであるが、全ての他のDNAは切断され、排除される。PCRクリーンアップキットを使用して反応から目的のDNAを回収し、PCR増幅し、MiSeqを使用して配列決定をする。
概念実証試験のために、全ヒトゲノムDNAライブラリーからミトコンドリアDNAを濃縮する。ミトコンドリア特異的ガイドRNAをdCas9に加え、次にライブラリーに加える。次に、Cas9と複合体を形成したランダムガイドRNAはアクセス不可能なものを除いて任意の配列を分解するが、その理由は、それらは既に結合したdCas9によって保護されているからである。これは、元の0.1~0.2%よりはるかに高いレベルへのミトコンドリアDNAの濃縮を可能にする。
(実施例5:メチル化DNAをメチル化されていないDNAで置き換えることによってヒトゲノムDNAからのSNPを保護し、次に濃縮するための、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ(例えば、Cas9ニッカーゼ)の使用(DNAの捕捉のためのプロトコール5))
概要
この方法の目的は、図11に表すように、ヒトゲノムDNAのライブラリーから目的の領域を捕捉することである。原理の証拠として、ニッキング酵素、NtBbvCI(NEB)のための部位を含有する試験DNAを、この部位を含有しない別のDNAプールに1%または5%で混合した。メチル基を全てのGATC配列に付加するために、全体の混合物をDamメチルトランスフェラーゼで次に処理した。試験DNAおよび他のDNAの両方は、それらの配列にGATCモチーフを含有する。次にNtBbvCIを使用して混合物にニックを入れ、次にDNAポリメラーゼIおよび非標識のヌクレオチド(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)とインキュベートし、次に75℃で20分の間熱不活性化した。次に、メチル化DNAだけを消化し、非メチル化または半メチル化DNAは消化しない、DpnIで混合物を消化した。図12は、試験DNAのメチル化が、それをDpnI媒介切断に感受性にすることを示す。
Cas9ニッカーゼの発現および精製
変異体Cas9ニッカーゼ、S.pyogenesのCas9のD10A変異体は、上記のようにCas9を生成するのに使用される同じ手法を使用して生成し、精製することができる。
配列特異的Cas9ニッカーゼ媒介ニッキング
以下の配列5’-GGATTTATACAGCACTTTAA-3’を標的にする希釈されたガイドRNA(1μl、2ピコモルに同等)を、3μlの10×Cas9反応緩衝液(NEB)、20μlのHOおよび1μlの組換えCas9ニッカーゼ酵素(10ピコモル/μl)と組み合わせた。この標的配列は、標的DNAの上にのみ存在する(全DNAの5%または1%を占める)。反応を37℃で15分間インキュベートし、次に5μlの希釈されたDNA(全100ng)を補充し、37℃でのインキュベーションを90分間継続した。1:100の希釈でRNアーゼA(Thermo Fisher Scientific)を加えることによって反応を終了し、次に、PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してDNAを精製し、30μlの10mMトリス-Cl pH8で溶出した。次に使用時まで反応を-20℃で保存した。
非標識DNAニックトランスレーション
ニック入りのDNAを、5’>3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ニックでDNA合成を開始することが可能であり、したがってそれがニック下流のヌクレオチドを標識ヌクレオチド(この手法の場合、ビオチン標識ヌクレオチド)で置き換えることを可能にする、E.coliのDNAポリメラーゼIとインキュベートした。ニック標識反応は、25℃で30分間、1単位のE.coli DNAポリメラーゼI(NEB)ならびに各々0.02mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを有する20μlのDNAポリメラーゼ緩衝液(NEB)で実行した。反応は、75℃で20分間の熱不活性化によって終了する。
DpnIによる消化
次に、反応をDpnI(NEB)と37℃で1時間インキュベートする。PCRクリーンアップキット(Life Technologies)を使用してDNAを回収し、次に試験DNA特異的プライマーを使用したPCRの鋳型として使用する。
(実施例6:目的の領域に隣接する長い3’オーバーハングを生成し、次にアダプターをこれらのオーバーハングにライゲートして標的DNAを濃縮するための、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ(例えば、Cas9ニッカーゼ)の使用(DNAの捕捉のためのプロトコール6))
この方法の目的は、例えば図13に表されるように、任意のDNA供与源(例えば、ライブラリー、ゲノムまたはPCR)からDNAの領域を濃縮するために使用することができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ(例えば、Cas9ニッカーゼ)は、2つのガイドNA(例えば、gRNA)を使用して近位部位に標的化され、各位置でDNAのニッキングをもたらすことができる。あるいは、アダプターは1つの側だけでライゲートし、次にフィルインされ、その後アダプターを反対側でライゲートすることができる。2つのニックが互いに近くにあってよい(例えば、10~15bp以内)。標的外の分子に、単一のニックを生成することができる。2つのニック部位が近接するため、反応を例えば65℃に加熱したときに二本鎖切断を起こし、長い(例えば、10~15bp)3’オーバーハングをもたらすことができる。これらのオーバーハングは、一本鎖アダプターの部位特異的ライゲーションを可能にするために、耐熱性の一本鎖DNA/RNAリガーゼ、例えば耐熱性の5’App DNA/RNAリガーゼによって認識することができる。リガーゼは、例えば、長い3’オーバーハングだけを認識することができ、このように、アダプターが他の部位でライゲートされないことを確実にする。このプロセスは、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼおよび目的の領域の反対側を標的にするガイドNAを使用して繰り返し、その後第2の一本鎖アダプターを使用して上のようにライゲーションを続けることができる。2つのアダプターが目的の領域のいずれかの側にライゲートされると、領域を増幅させること、または直接的に配列決定をすることができる。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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