JP2021527798A - 非混和性の流体を有する微細加工液滴ディスペンサ - Google Patents

Abstract

マイクロ流体通路を開閉するように構成されたＭＥＭＳマイクロ流体バルブを含んでいてよい微細加工液滴ディスペンサ構造が記載されている。バルブの開閉により、ターゲット粒子およびビーズをサンプル流から分離することができ、これら２つの粒子を、基板の縁部に形成された単一の液滴内へと方向付けることができる。次いで液滴は、非混和性の流体のシース流内に入れられてよい。

Description

関連出願に関する相互参照
該当なし。

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
該当なし。

マイクロフィッシュ付録に関する記載
該当なし。

背景技術
本発明は、粒子と生物学的物質とを操作するためのシステム、およびこれらの粒子を含む液滴の形成に関する。

生物医学の研究者たちは、以前から、少量の流体サンプルを用いて作業する必要性、およびこれらの少量の体積内における混合物を一意的に識別する必要性を認識してきた。これらの属性により、多数の実験を並行して実行することができ、時間と、設備や試薬にかかる費用とが節約され、患者が大量のサンプルを作成する必要が低減される。

実際に、少量の緩衝液に懸濁された核酸およびタンパク質の小さな断片の分析は、分子生物学の重要な要素である。遺伝情報およびプロテオミクス情報を検出し、識別し、利用する能力により、繊細な特定の診断、および治療法の開発が可能となる。特に、少量の生物学的物質および分析物を明確に識別する必要がある。

殆どの遺伝的およびプロテオミクス的分析には、重要な分析物の検出のためにラベリングが必要である。このようなラベリングは、「バーコード化」と呼ぶこともでき、ラベルが一意であり、いくつかの特徴または識別子と相互に関連があることを示唆している。例えば、シークエンシング適用においては、合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）中に鋳型鎖に付加されたヌクレオチドは、通常、ラベリングされる、または成長鎖内に組み込まれたときにラベルを生成することが意図されている。ラベルの存在により、組み込まれたヌクレオチドの検出が可能となる。診断および治療の結果を改善するためには、効果的なラベリング技術が所望される。

同時に、マイクロ流体デバイスによる流体の流れの精密操作は、流体に基づく多くの技術に革命をもたらしている。小さな通路のネットワークは、少量の流体を精密操作するための柔軟なプラットフォームである。このようなマイクロ流体デバイスの有用性は、マイクロ流体ポンプおよびバルブ、界面動電ポンピング、誘電泳動ポンプ、またはエレクトロウェッティング駆動流のような実現技術に大きく依存している。完全なシステムへのこのようなモジュールの組み込みは、マイクロ流体デバイスを構築するための便利かつ頑強な方法を提供する。

しかしながら、事実上全てのマイクロ流体デバイスは、流体の流れの流動に基づいている。このことは、拡散および表面吸着の汚染作用ゆえに、効果的に使用できる試薬の最小体積に制限を設けている。最小体積のサイズが小さくなると、拡散が、反応物の分散へ導く混合のための主要なメカニズムとなる。この分野で発行された特許の数が増加していることから示唆されるように、これは、生物医学技術の大きく成長している分野である。

米国特許第９４４０２３２号明細書には、マイクロ流体構造と、流体および反応を操作するための方法とが記載されている。この構造および方法は、例えば液滴の形態の流体サンプルを、マイクロ流体ネットワーク内の所定の領域におけるキャリア流体（例えば、流体サンプルと非混和性であってよい油）中に配置するステップを含む。いくつかの実施形態では、液滴の配置は、液滴間の有意な物理的接触なしに、これら液滴がマイクロ流体ネットワーク内に（例えば、順次に）導入される順序で行うことができる。液滴間の接触が殆どないまたは全くないことにより、液滴間の合体は殆どないまたは全くない。したがって、いくつかの実施形態では、流体サンプルまたはキャリア流体において、液滴の合体を防ぐために界面活性剤は必要ない。

米国特許第９４１０１５１号明細書により、ハイスループットのスクリーニングアッセイおよびコンビナトリアルケミストリの実施のために有用なマイクロ流体デバイスおよび方法が提供される。この特許は、一意的にラベリングされた細胞、酵素、核酸等を含む水性のエマルジョンを提供し、この場合、エマルジョンはさらに、プライマ、ラベル、プローブ、およびその他の反応物を含む。油ベースのキャリア流体は、マイクロ流体デバイス上のエマルジョンライブラリを囲い込んでいる。このように、連続的な通路は、エマルジョンライブラリのプール、合体、混合、選別、検出等を達成するために、非混和性の流体の流動のために提供される。

米国特許第９３９９７９７号明細書は、液滴に基づくデジタルＰＣＲ、およびこれを使用してターゲット核酸を分析する方法に関する。所定の実施形態では、サンプルの核酸構造を決定するための方法が提供される。

米国特許第９１５０８５２号明細書には、バーコードライブラリと、そのバーコードライブラリを形成し、使用する方法とが開示されており、この方法は、各構造が一意のＮ量体と機能的Ｎ量体とを含む複数の核酸構造を獲得するステップと、各コンパートメントが、一意の構造の１つ以上のコピーを含むように、構造を、流体コンパートメントに分離するステップとを含んでいる。

これらの参照文献のいずれも、バーコード化されたアイテムを取り囲む流体の体積を制御し、液滴内に封入された粒子を選択するために、小さなマイクロメカニカルバルブ構造を使用してはいない。したがって、液滴を「オンデマンド」で作成することはできず、研究の対象である粒子を取り囲むために形成することはできない。

概要
したがって、本発明の課題は、ターゲット粒子を非ターゲット物質から分離することができ、ラベリングされたビーズを分離し、２つの粒子を単一の液滴内に組み合わせることができる微細加工システムを提供することである。ターゲット粒子およびビーズに加えて、液滴は、生理食塩水または緩衝流体のような第１の水性の流体を有していてよい。液滴は、第１の流体と非混和性の第２の流体の流れ内に分配されてよい。したがって、流体が、非混和性であって、液滴は接触または合体しないので、液滴は、個別の、良好に規定された単一のユニットとして、その完全性を維持することができる。

ターゲット粒子が、その外面に位置する抗原を有した、細胞のような生物学的物質である場合には、ターゲット粒子は、これらの抗原が、ビーズ上に位置する抗体と結合することにより、そのビーズに付着するようになってよい。ビーズはさらに、ビーズに取り付けられた複数の蛍光標識であってよい、識別蛍光特性によってラベリングされてよい。したがって、識別可能なラベリングされた蛍光ビーズに今や結合された各ターゲット細胞は、それ自体の識別のために本質的にバーコード化されてよい。これにより、粒子は全て識別可能かつ区別可能であるので、非混和性の流体に入れられた多数のこのような液滴において、多数の実験を実施することができるようになる。

したがって、マイクロ流体通路を開閉するように構成されたＭＥＭＳマイクロメカニカル流体バルブを含んでいてよい微細加工液滴ディスペンサ構造が記載されている。バルブの開閉により、ターゲット粒子および／またはビーズを流体サンプル流から分離することができ、これら２つの粒子を単一の液滴内へと方向付けることができる。次いで液滴は、非混和性の流体のシース内に入れられて、下流の収容部または出口へと送られてよい。

システムはさらに、マイクロ流体通路内を流れる、ターゲット粒子と非ターゲット物質とを含む流体サンプル流と、マイクロ流体通路内における問合せ領域とを有していてよい。問合せ領域内で、ターゲット粒子を非ターゲット物質から識別することができ、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブは、問合せ領域からの信号に反応して、ターゲット粒子を非ターゲット物質から分離し、ターゲット粒子を液滴内へと方向付けることができる。

システムは、複数の蛍光標識に取り付けられているビーズを使用してもよく、蛍光標識は、ビーズの識別を蛍光シグナルで明示し、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブは、ビーズを分離し、ビーズを液滴内に方向付けるように構成されており、ビーズとターゲット粒子とは、同じ液滴内に位置している。

以下の図面を参照し、様々な例としての詳細を説明する。
非混和性の流体を含む、微細加工液滴ディスペンサの実施形態を、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブの閉鎖位置で示す概略図である。 非混和性の流体を含む、微細加工液滴ディスペンサの実施形態を、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブの開放（選別）位置で示す概略図である。 微細加工ＭＥＭＳ流体バルブの開放時間に対する水滴サイズの関数的な依存性を示すグラフである。 油中に空の液滴を生成する非混和性の流体を含む、微細加工液滴ディスペンサの実施形態を示す概略図である。 粒子とビーズとの両方を含む液滴を生成する非混和性の流体を含む、微細加工液滴ディスペンサの実施形態を示す概略図である。 突き合わせ合流部における非混和性の流体を含む、微細加工液滴ディスペンサの実施形態を示す概略図である。 レーザ支援液滴合体が行われる、微細加工液滴ディスペンサの実施形態を示す概略図である。 可変の通路横断面を含む、微細加工液滴ディスペンサの実施形態を示す概略図である。

図面は必ずしも縮尺通りではなく、類似の符号は、類似の特徴を示すことを理解されたい。

詳細な説明
以下の説明は、新規の微細加工液滴ディスペンサシステムの複数の例示的な実施形態を提示する。以下の参照符号は、添付の図面において、以下の通りに参照するために使用される。

１１０ 微細加工ＭＥＭＳバルブ
１２０ 流体流入通路
１２２ 選別通路
１４０ 廃棄通路
１５０ ノズル
１７０ 問合せ領域
１４５ 非選別流
２００ 油
２２０ 油流入部１
２４０ 油流入部２
２６０ 出口路へと流れる油
３００ 油中の水滴
３１０ 水滴中のビーズ
３２０ 水滴中のターゲット粒子
４００ レーザヒータ
５００ 合併領域

このシステムは、液滴を非混和性の流体に分配する微細加工液滴ディスペンサを含んでいる。このシステムは、ターゲット粒子および非ターゲット物質を含み得る流体サンプル流に適用することができる。ターゲット粒子は、生物学的な性質のものであってよく、例えば、Ｔ細胞、腫瘍細胞、幹細胞のような生物学的細胞等である。非ターゲット物質は、例えば血漿、血小板、緩衝液、または栄養素であってよい。

微細加工ＭＥＭＳバルブは、例えば図１および図２に一般的に示された装置であってよい。この設計は単なる例であり、図１および図２に示したものの代わりに別種のＭＥＭＳバルブが使用されてもよいことを理解されたい。

以下で説明する図面では、同様の参照符号は、同様の構造を示すことを意図しており、この新規の装置の重要な特徴を明確に示すために、構造は、様々な詳細のレベルで図示されている。これらの図面は必ずしも、縮尺通りの構造を示しているわけではなく、「上」、「下」、「上方」、「下方」、「左」、および「右」のような方向指定は、任意の特定の向きで装置を構築でき、操作できるように、任意のものであることを理解されたい。特に、「選別」および「廃棄」の指定は、これらが単に粒子の異なる集団を示すものであり、どちらの集団が「ターゲット」または「選別」集団と呼ばれるかは任意であるため、入れ替え可能である。

図１は、静止（非作動）位置にある、新規の微細加工流体ＭＥＭＳ液滴ディスペンサデバイス１０の平面図である。ＭＥＭＳ液滴ディスペンサデバイス１０は、微細加工流体バルブまたは可動部材１１０、および複数の微細加工流体通路１２０，１２２，１４０を含んでいてよい。流体バルブ１１０と微細加工流体通路１２０，１２２，１４０とは、詳しく後述するように、ＭＥＭＳリソグラフィ加工技術を用いて、シリコン基板のような適切な基板に形成されてよい。製作基板は、製作平面を有していてよく、この平面内で、デバイスが形成され、可動部材１１０が動く。バルブ１１０の製作に関する詳細は、参照によりその全体が組み込まれる、２０１６年６月２１日に発行された米国特許第９３７２１４４号明細書（’１４４特許）に認めることができる。

流体サンプル流は、サンプル入口通路１２０を介して微細加工流体バルブ１１０へと導入することができる。サンプル流は、少なくとも１種の所望のターゲット粒子と、その他の望ましくない複数の非ターゲット物質とを含む粒子の混合物を含有し得る。粒子は、一般的には生理食塩水のような水性流体である流体中に懸濁されていてよい。この説明のために、この水性流体は、第１の流体であってよく、この第１の流体は、後述するように、第２の流体と非混和性であってよい。

ターゲット粒子は、例えば、生理食塩水のような緩衝液に懸濁されている、幹細胞、癌細胞、接合体、タンパク質、Ｔ細胞、バクテリア、血液の成分、ＤＮＡ断片のような生物学的物質であってよい。流体入口通路１２０は、バルブ１１０と同じ製作平面に形成されてよく、これにより流体の流れが実質的にこの平面内にある。バルブ１１０の動きも、この製作平面内にあってよい。所定の粒子の選別／保存または処分／廃棄の決定は、任意の数の識別信号に基づいていてよい。

１つの実施形態では、流体サンプル流は、レーザ問合せ領域であってよい、問合せ領域１７０を通過してよく、この場合、励起レーザが、ターゲット粒子に添加された蛍光標識を励起する。励起の結果として、蛍光標識は、蛍光放射を発し、この放射は、近くの検出器によって検出することができ、したがって、ターゲット粒子または細胞を識別することができる。ターゲット粒子または細胞が識別されると、微細加工ＭＥＭＳバルブを、後述するように操作することができ、図２に示したように、流れが、非選別（廃棄）通路１４５から、選別通路１２２へと方向付けられる。操作手段は、例えば電磁的であってよい。蛍光シグナルの分析、粒子の選別または廃棄の決定、およびバルブの操作は、マイクロプロセッサまたはコンピュータの制御により行われてよい。

いくつかの実施形態では、バルブ１１０の近くにある外部の電磁コイルおよびコアにエネルギを与えることにより操作が行われてよい。バルブ１１０は、外部の電磁コイルおよびコアによって生成される磁束の磁束密度が変化する領域内に引き込まれる、組み込まれた透磁性材料を含んでいてよい。他の実施形態では、静電および圧電を含む、他の操作機構が使用されてもよい。このようなバルブの構造および操作についてのさらなる詳細は、本明細書に組み込まれた’１４４特許に見出すことができる。

１つの例示的な実施形態では、粒子に添加され、照射レーザによって励起される蛍光標識に基づき、粒子により放射される蛍光シグナルに基づいて、決定が行われる。したがって、これらの蛍光標識は、識別子またはバーコードシステムであってよい。しかしながら、粒子の形態に基づいてよい散乱光または側方散乱光を含む、または粒子を、ターゲット粒子でありしたがって選別または保存するものか、非ターゲット粒子でありしたがって棄却するまたは他の方法で廃棄するものかを識別することができる任意の数の機械的、化学的、電気的、または電磁的作用を含む、他種の識別信号が想定されてもよい。

このシステムは、ラベル付きまたはバーコード付きのビーズを選別するために使用されてもよい。したがって、「ターゲット粒子」は、細胞および／またはラベル付きビーズであってよい。

バルブ１１０が図１に示された位置にあることによって、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブ１１０は、閉鎖位置で示されており、この場合、流体サンプル流、ターゲット粒子、および非ターゲット物質は、廃棄通路１４０へと直接流れる。したがって、流入流は妨げられることなく、出口オリフィスおよび通路１４０を通過し、この出口オリフィスおよび通路は、入口通路１２０の平面の外側にあってよい、したがってデバイス１０の製作平面の外側にあってよい。すなわち、この流れは、入口通路１２０から流出オリフィス１４０へと流れ、流出オリフィスからは、実質的に鉛直方向に、すなわち入口通路１２０に対して直交方向に流れる。この流出オリフィス１４０は、図１に示した紙面の平面に対して垂直であってよい平面外通路へと通じている。より一般的には、流出通路１４０は、入口通路１２０または選別通路１２２の平面、または可動部材１１０の製作平面に対して平行ではない。

流出オリフィス１４０は、製作基板に、または製作基板に接合されたカバー基板に形成された穴であってよい。さらにバルブ１１０は、流入流の流れを、次の図２につき記載したように選別流出流へと変向することのできる湾曲転換表面１１２を有していてよい。オリフィス１４０の輪郭は、入口通路１２０および選別通路１２２の全てではなく一部と重なるようなものであってよい。入口通路と重なり、上述したようなリリーフ領域を有する輪郭１４０を有していることにより、可動部材またはバルブ１１０が、非作動の廃棄位置にある場合に、流入流を廃棄オリフィス１４０へと直接流す経路が存在する。

図２は、微細加工ＭＥＭＳデバイス１０を備えた、非混和性の流体を含む、微細加工液滴ディスペンサの実施形態の概略図である。図２では、ＭＥＭＳデバイス１０は、開放（選別）位置にあるＭＥＭＳ流体バルブ１１０を含んでいてよい。この開放（選別）位置では、レーザ問合せ領域１７０で検出されたターゲット細胞５は、所定の量の懸濁（緩衝）液と共に選別通路１２２へと変向されてよい。

この位置では、可動部材またはバルブ１１０は、図２に示した位置を取るように上方に変向されている。転換表面１１２は、入口通路１２０の流れを選別流出通路１２２へと向ける選別輪郭である。選別流出通路１２２は、入口通路１２０と実質的に同じ平面に位置していてよく、これにより、選別通路１２２内の流れも、入口通路１２０内の流れと実質的に同じ平面にある。可動部材１１０の作動は、力発生装置（図示せず）からの力により生じ得る。いくつかの実施形態では、力発生装置は、電磁的であってよいが、力発生装置が、静電的、圧電的、または可動部材を第１の位置（図１）から第２の位置（図２）へと動かす力を可動部材１１０に加える幾つかのその他の手段であってもよいことを理解されたい。

より一般的には、図１および図２に示された、マイクロメカニカル粒子操作デバイスは、１つの製作基板の表面上に形成されてよく、マイクロメカニカル粒子操作デバイスは、微細加工可動部材１１０を有していてよく、可動部材１１０は、可動部材に加えられる力に反応して第１の位置から第２の位置へと動き、この動きは、実質的に前記表面に平行な平面内にあり、基板には流体サンプル入口通路１２０が形成されていて、少なくとも１つのターゲット粒子と非ターゲット物質とを含む流体がサンプル入口通路を貫流し、流体サンプル入口通路内の流れは、実質的に前記表面に平行であり、微細加工部材が流体を方向転換させる複数の流出通路１２２，１４０が設けられており、流出通路１４０のうちの少なくとも１つにおける流れは、前記平面に平行ではなく、少なくとも１つの流出通路１４０は、可動部材の動きの少なくとも一部にわたって可動部材１１０の少なくとも一部のすぐ下に位置している。

通路１２２は、「選別通路」と呼ばれていて、オリフィス１４０は、「廃棄オリフィス」と呼ばれているが、これらの用語は、一般性に欠けるものではなく、選別流が廃棄オリフィス１４０へと方向付けられ、廃棄流が通路１２２へと方向付けられるように交換することができることを理解されたい。同様に、「入口通路」１２０と「選別通路」１２２とを逆にすることもできる。３つの通路を指定するために使用される用語は任意であるが、入口流は、バルブ１１０によって、２つの別の方向のうちのいずれかに方向転換されてよく、これら２つの方向のうちの少なくとも１つは、その他２つとは同じ平面にない。「実質的に」という用語は、角度方向に関して使用される場合、すなわち、実質的に接線方向または実質的に鉛直方向、とは、関連する方向の１５度以内を意味すると理解されたい。例えば、所定の線に対して「実質的に直交する」とは、その線に対して約７５度〜約１０５度であることを意味すると理解されたい。

バルブが、図２の開放位置または選別位置にある場合、懸濁水性流体は、少なくとも１つの懸濁粒子を伴い、選別通路１２２内へと流れることができ、そこから製作基板の縁部へと到る。流体サンプル入口通路１２０内へと流れていた流体は、次いで、製作基板の縁部で液滴を形成することができる。または、生成された液滴が、選別チャンバ内に流れてそこに蓄積される場合もある。

液滴の形成を促進するためにこの領域では様々な構造を使用してよい。これらの構造は例えば、メニスカスフォースの強度または形状、濡れ角度、第１の流体液滴の表面張力に影響を与えることができる、またはこれらを操作することができる丸み付けられた角隅または鋭いエッジであってよい。これらの構造は一般に「ノズル」と呼ばれてよく、液滴が形成される領域に向いている。液滴が形成されるこのノズルの点で、付加的なマニホルドによって、非混和性の第２の流体が、水性の液滴へと供給されてよく、この流体内で水性の液滴が懸濁させられ、その概略的な輪郭と境界層とが維持される。

上述したように、バルブ１１０を、ターゲット細胞およびビーズの両者を選別するために使用することができる。レーザ誘起蛍光は、一方または両方の粒子を見分ける特徴であってよい。これらの粒子は、両方とも単一の液滴内に供給されてよい。これらの粒子は、生理食塩水のような水性の第１の流体内に懸濁されて、この流体によって取り囲まれてよい。したがって、液滴は、主としてこの第１の流体と、選択された粒子、ターゲット細胞および／またはビーズを含んでいてよい。ビーズは、「バーコード化」されてもよく、すなわち、識別マーカを有していてもよい。次いで液滴を、第２の流体源によって供給される非混和性の第２の流体によって取り囲むことができる。これらの特徴は、複数の実施形態につき、以下でさらに説明する。

したがって、微細加工通路内の流れにより、液滴は、非混和性の流体との交点に形成され得る。これらの液滴は、図１および図２に示されるように、脂質流体または油２００のような非混和性の第２の流体内に入れられてよい。油流入部２２０および油流入部２４０から、油２００を対称に投入することができる。非混和性の流体は、液滴間の分離を維持するために機能することができ、これによりこれら液滴は合併せずに、各液滴は通常、１つだけのターゲット粒子と１つだけのビーズを含む。油の流れは、選別出口路２６０を介して出て行くことができる。脂質流体は、石油性の脂質流体、または植物性の脂質流体、または動物性の脂質流体であってよい。

液滴形成のペース、品質、および速度は、主として、ＭＥＭＳバルブ１１０のダイナミクスによって制御されてよい。すなわち、液滴に含まれる流体の量、したがって液滴のサイズは、ＭＥＭＳバルブ１１０が、図２に示した開放または選別位置にある時間の長さの関数であってよい。バルブの開放時間に対する液滴のサイズの関数的な依存性は図３に示されている。図３からわかるように、液滴の直径は、広い値の範囲にわたって、バルブ開放時間に比例している。（約１００マイクロ秒および６０ミクロンの直径を超える）極めて大きな液滴と長い開放時間でのみ、関数的な依存性は、線形挙動とは異なっている。

したがって、選別パルスの長さによって、生成される液滴のサイズを決定することができる。パルスが短すぎると、油のメニスカスが損なわれずに、水滴が形成されない場合がある。選別パルスが十分に長いと、液滴は出口で形成されて、非混和性の第２の流体の流れの中へと放出することができる。

ターゲット細胞５がこの時間範囲内で選別されると、ターゲット細胞５は、水性の液滴中に封入され得る。ターゲット粒子がこの時間範囲内で選別されないと、液滴中に封入された粒子５を有さない液滴である空の水性の液滴が形成され得る。このような状態は図４に示されている。

上述したように、ＭＥＭＳバルブ１１０は、少なくとも１つの半導体基板の製作表面に形成されてよい。より一般的には、ＭＥＭＳバルブ１１０の製作のためにマルチ基板スタックが使用されてよい。’１４４特許で説明されているように、マルチレイヤースタックは、シリコン基板のような、少なくとも１つの半導体基板と、透明ガラス基板とを含んでいてよい。透明基板は、励起レーザをレーザ問合せ領域１７０に適用できるようにするために、必要な場合がある。

液滴３００は、半導体基板の縁部に、または特に、マルチレイヤースタックの縁部に形成されてよい。液滴３００は、このマルチレイヤースタックからの選別通路１２２の出口で形成されてよい。別の実施形態では、液滴は、マルチレイヤースタックの縁部では形成されずに、半導体基板内で、選別流と油流入部との交点で形成されてよい。この位置では、液滴の形成を促進するための構造が形成されてよい。この構造は、鋭く丸み付けられた角隅を含んでいてよく、これにより表面張力、メニスカスの形成、濡れ角を操作することができる。液滴の形成を促進するために設計された構造は、本明細書ではノズル１５０と呼ばれてよく、「ノズル」という用語は、一般的に、液滴を形成することができる場所を呼称し得る。

図４に示した構造では、微細加工ＭＥＭＳバルブの下流、ノズル構造１５０の近傍に、非混和性の第２の流体との合流点が位置していてよい。バルブの下流の選別通路内には、側面から選別通路１２２へと流れる（水滴の担体としての）油との合流点が存在していてよい。合流点は、選別通路１２２のいずれかの端部に、入口２２０および２４０を有していてよく、ノズル１５０および選別通路１２２の下流に油流２００を形成している。

バルブを使用して油内に液滴を形成するための選別法
油内に液滴を形成するための方法は、以下の通りであってよい。まずターゲット細胞が、レーザ問合せ領域１７０で検出される。コンピュータまたは制御装置が、レーザ問合せ領域からの信号をモニタすることができる。領域内にターゲット粒子を検出すると、コンピュータまたは制御装置は、電磁石を励磁することにより、ＭＥＭＳバルブ１１０を開放するための信号を送信することができる。すると磁気的な相互作用により、ＭＥＭＳバルブは図２に示されたように動かされる。この開放（選別）位置ではターゲット細胞５は、所定の量の懸濁液と共に選別通路へと変向されてよい。

次いでビーズを、固有のバーコードとして、選別された細胞に付随するように選別する。第２の選別パルスは、油と水の境界を不安定にさせ、細胞とビーズとを含む水滴を油中に形成するのに十分な長さである。

図１に示すように、バルブが静止していて、選別が行われていない場合、選別内の水の流れを遮断しながら、油は、選別出口路に向かって流れ続ける。しかしながら実際には、図１および図２に示されたＭＥＭＳバルブ１１０の可動縁部間に微細な隙間があるので、流体サンプル流の少量ではあるが限定的な量の流体が、選別通路１２２へと流れ続け得る。しかしながら、バルブの隙間を通るこのような漏れ流の割合は、通常の作動では、油フロントを破壊し、水滴を形成するためには不十分である。

しかしながら、油は流れ続けることができるので、ターゲット粒子が検出されるまで、流出物は、廃棄物収容部へと送られてよい。ＭＥＭＳバルブ１１０の周囲のギャップを通る流体サンプル流の継続的な漏れが、場合によっては水滴を形成させることもある。ターゲット細胞が検出されず、ＭＥＭＳバルブ１１０が開放されていないので、このような水性の液滴は空であってよい。

したがって、図４は、油２００中に空の第１の流体液滴３００が生成されている非混和性の流体と共に示す、微細加工液滴ディスペンサの実施形態の概略図である。このような状態は、ターゲット粒子が、流体サンプル流中に存在しない場合に生じ得る。ＭＥＭＳバルブ１１０は僅かに漏れて、水性の液滴が形成されるかもしれないが、封入されたターゲット粒子は存在しない。この場合、液滴は、保持容器の廃棄物領域内へと流れることができる。

別の実施形態では、図５に示したように、ＭＥＭＳバルブ１１０は、ターゲット粒子５（この場合、ターゲット細胞３２０）とビーズ３１０との両方を選別してもよい。ビーズは、生物学的に活性な物質、および付加的に化合物によってコーティングされた生物学的に不活性な物質であってよい。生物学的に活性な物質は抗体であってよく、これらの抗体は、ターゲット細胞表面３２０上に出現する抗原と結合することができるようになる。抗原および不活性物質に加えて、ビーズはさらに、複数の蛍光標識に連結されてもよく、蛍光標識は、適切な波長と強度の励起レーザにより照射されると蛍光する化合物である。この複数の蛍光標識は、ビーズ３１０ごとに異なっていてよく、したがって、そのビーズの特徴または識別子として機能することができる。

ビーズ３１０が、ターゲット細胞３２０の近位にあり、ビーズ３１０の抗体が細胞の抗原に結合できるようになると、識別用蛍光標識を伴うビーズは、細胞３２０に付着するようになることがある。したがって、ビーズ３１０は、細胞３２０のための識別マーカを、または細胞を識別する「バーコード」を提供する。コンピュータまたは制御装置は、この特定のバーコードを、特定の細胞に結び付けることができる。したがって、それぞれターゲット細胞と識別バーコードとを含む多数のこのような液滴が、少量の流体内に配置されてよく、全てが単一の検出器の視野内にある。これにより極めて多数の生物学的アッセイまたはポリメラーゼ連鎖反応を、並行して単一の検出システムのもとで行うことができる。

図５は、油内に液滴が生成されている非混和性の流体と共に示す、微細加工液滴ディスペンサの実施形態の概略図であって、この場合、液滴は、粒子または細胞３２０およびビーズ３１０の両方を含んでいる。したがって、ＭＥＭＳバルブ１１０は、まず粒子３２０を選別し、上述したように水性の液滴内に粒子３２０を封入することができる。ＭＥＭＳバルブ１１０は次いで、バーコード化されたビーズ３１０も選別することができ、粒子３２０とビーズ３１０との両方を、図５に示したように、同じ水性の液滴内に封入することができる。

図６は、突き合わせ合流部内の非混和性の流体と共に示す、微細加工液滴ディスペンサの別の実施形態の概略図である。この実施形態では、取り囲んでいる第２の非混和性の流体の適用は非対称である。油２００は、ノズル領域の左右両方から来るのではなく、油合流部は、選別通路１２２と平行に適用され、選別通路１２２の下流２６０から出ることができる。第２の非混和性の流体は、右から左へと流れることができる。水性流体の液滴は、図示したように、側方の通路からの油のメニスカスを破壊してよい。上述したように、油２００内の各液滴３００は、ターゲット細胞３２０と識別ビーズ３１０との両方を含んでいてよい。

レーザ支援液滴形成
図７は、レーザ支援液滴融合が行われる、微細加工液滴ディスペンサの別の実施形態の概略図である。この実施形態では、２つの粒子、ターゲット細胞３２０とビーズ３１０とが、別個に選別されて、油流２００内で２つの別個の水性の液滴内へと配置される。各事象、すなわち、ターゲット細胞３２０の通過およびビーズ３１０の通過のために、選別パルスは、油と水の境界を不安定にさせ、細胞を含む水滴を油中に形成するのに十分な長さである。２つの別個の液滴は、次いで、水性の液滴を含む油通路にレーザ光４００を適用することにより融合される。

様々なパルスレーザまたは連続波レーザのいずれもが、この用途に適していてよい。例えば、パルスＣＯ_２レーザは、図７に示したように、液滴を加熱するために、通路に向けられてよい。エネルギの適用により、流体を加熱し、これによりメニスカスと膜力とが弱まり、液滴は融合できるようになる。

図７では、前述の実施形態と同様に、図７の微細加工液滴ディスペンサは、対称（または非対称）の油流入構造を有していてよい。どちらの構成でも、液滴３００は、脂質流体または油２００のような非混和性の第２の流体内に入れることができる。油流入部２２０および油流入部２４０から、油２００を対称に投入することができる。油の流れは、選別出口路２６０から出て行くことができる。

図７に示した実施形態は、２つの水性の液滴を選別し、次いでこれらの液滴を合併させて単一のより大きな液滴とすることができる流れ通路を有していてよい。この実施形態では、選別パルスは、油と水の境界を不安定にさせ、細胞を含む水滴を油中に形成するのに十分な長さである。次いで、ビーズが選別されて、別個の液滴が形成される。したがって、上述したように、第１の液滴はターゲット細胞３２０を含んでいてよく、第２の水性の液滴はビーズ３１０を含んでいてよい。合併領域は、レーザ４００が向けられている選別流通路１２２の部分である。レーザ光は、そのピーク強度を高めるために焦点を合わせることができる。適用されるレーザ光は、液滴と、その周りの流体とを加熱することができ、２つの液滴を合併させることができる。合併は、レーザ誘起加熱と、その結果として生じる流体液滴の表面張力の弱化により引き起こすことができる。

代替的には、第１の液滴がビーズ３１０を含んでいてよく、第２の水性の液滴がターゲット細胞３２０を含んでいてもよい。いずれの場合でも、レーザ４００内での通路への加熱の適用は、流体の加熱のために働くことができ、２つの液滴の合併を可能にする。したがって、微細加工液滴ディスペンサの流出部では、油内に入れられた１つの水性の液滴が出現してよく、この液滴はターゲット細胞３２０およびビーズ３１０の両方を含んでいる。ビーズ３１０は、ビーズに取り付けられた蛍光のバーコードを有していてよく、ビーズは、ターゲット細胞３２０に結合されてよい。

ジオメトリに起因する流れの減速
図８は、可変の通路横断面を有する微細加工液滴ディスペンサの実施形態の概略図である。前述の実施形態と同様に、図８の微細加工液滴ディスペンサは、対称（または非対称）の油流入構造を有していてよい。この構成では、液滴は、脂質流体または油２００のような非混和性の第２の流体内に入れられてよい。油流入部２２０および油流入部２４０から、油２００を対称に投入することができる。油の流れは、選別出口路２６０から出て行くことができる。

図８に示した実施形態は、２つの水性の液滴を選別し、次いでこれらの液滴を合併させて単一のより大きな液滴とすることができる流れ通路を有していてよい。この実施形態では、選別パルスは、油と水の境界を不安定にさせ、細胞を含む水滴３００を油中に形成するのに十分な長さである。次いで、ビーズ３１０が選別されて、別個の液滴が形成される。したがって、上述したように、第１の液滴は、ターゲット細胞３２０を含んでいてよく、第２の水性の液滴はビーズ３１０を含んでいてよい。合併領域５００は、可変の横断面５００を有している選別通路１２２の部分である。合併領域５００における通路の急な拡幅により、合併領域内で流れを減速させることができ、２つの液滴を合併させることができる。換言すると、急な拡幅により、ジオメトリに起因する流れの減速を発生させることができ、これにより液滴を合併させることができる。

代替的には、第１の液滴がビーズ３１０を含んでいてよく、第２の水性の液滴がターゲット細胞３２０を含んでいてよい。どちらの場合でも、合併領域５００における通路の急な拡幅により、合併領域内で流れを減速させることができ、２つの液滴を合併させることができる。したがって、微細加工液滴ディスペンサの流出部では、油２００に入れられた水性の液滴３００が出現してよく、この液滴３００はターゲット細胞３２０およびビーズ３１０の両方を含んでいる。ビーズ３１０は、ビーズに取り付けられた蛍光のバーコードを有していてよく、ビーズは、ターゲット細胞３２０に結合されてよい。

したがって、本明細書に記載された微細加工液滴ディスペンサは、基板に形成されたマイクロ流体通路と、マイクロ流体通路内を流れる流体と、マイクロ流体通路を開閉するように構成された微細加工ＭＥＭＳ流体バルブと、マイクロ流体通路の端部で分配された第１の流体を含む液滴であって、液滴の寸法は、微細加工マイクロ流体バルブの開閉のタイミングによって決定される液滴と、第１の流体と非混和性の第２の流体の供給源と、を有しており、この場合、液滴は、マイクロ流体通路から第２の非混和性の流体へと分配され、その中に浸漬される。

液滴ディスペンサはさらに、マイクロ流体通路内を流れる流体サンプル流を有していてよく、この流体サンプル流は、ターゲット粒子と、非ターゲット物質とを含み、マイクロ流体通路内に問合せ領域を有しており、ここでターゲット粒子が、非ターゲット物質の中から識別され、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブは、問合せ領域からの信号に反応してターゲット粒子を非ターゲット物質から分離して、ターゲット粒子を液滴内へと方向付けるように構成されている。流体サンプル流はさらに、複数の蛍光標識に取り付けられたビーズを含んでいてよく、蛍光標識は、蛍光シグナルによって、ビーズの識別を指定し、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブは、ビーズを分離し、ビーズを液滴内へと方向付けるように構成されており、ビーズとターゲット粒子とは、同じ液滴内に位置している。ビーズは複数の蛍光標識を有していてよく、これによりビーズは、識別蛍光特徴を有する。ビーズは、ターゲット粒子の抗原に結合する少なくとも１つの抗体を有していてよい。

微細加工ＭＥＭＳバルブは、開閉の際に単一の平面内で動いてよく、この平面は、基板の表面に対して平行である。液滴は、基板内のマイクロ流体通路内に形成されたノズル構造で分配されてよい。非混和性の流体の供給源は、ノズルの周りに対称に配置されている。界面活性剤を流体流に加えてもよい。

液滴ディスペンサは、さらに、ノズル上流のマイクロ流体通路に焦点を合わせられたレーザを有していてよく、このレーザは、マイクロ流体通路内の流体からの液滴を分離するのを支援するために液滴を加熱し、またはマイクロ流体通路内の隣接する液滴を結合させるために液滴を加熱する。マイクロ流体通路は、通路拡幅領域を有していてよく、この場合、通路の横断面が拡大し、次いで縮小する。マイクロ通路は、突き合わせ合流部において非混和性の流体の供給源に交差してよい。ターゲット粒子は、Ｔ細胞、幹細胞、癌細胞、腫瘍細胞、タンパク質、およびＤＮＡ鎖のうちの少なくとも１つである。

液滴を分配するための方法も記載されている。この方法は、基板上にマイクロ流体通路を形成するステップ、マイクロ流体通路を流れる流体を供給するステップ、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブを開放および閉鎖するステップを含んでいてよい。この方法はさらに、マイクロ流体通路を開放および閉鎖するために、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブを開放および閉鎖するステップ、ターゲット粒子、および識別子が配置されたビーズのうちの少なくとも１つを捕捉するステップ、第１の流体と非混和性の、第２の非混和性の流体の供給源を設けるステップ、第１の液滴を分配するステップ、を含んでいてよく、この場合、液滴のサイズは、微細加工マイクロ流体バルブの開閉のタイミングにより決定され、液滴はビーズおよびターゲット粒子のうちの少なくとも１つを取り囲んでいる。

マイクロ流体通路を流れる流体は、ターゲット粒子と非ターゲット物質とを含んでいてよい。この方法はさらに、レーザ問合せ領域で、非ターゲット物質の中からターゲット粒子を識別するステップ、問合せ領域からの信号に反応して、識別されたターゲット粒子を非ターゲット物質から分離するために、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブを開放および閉鎖するステップ、ターゲット粒子を液滴内へと方向付けるステップ、を含んでいてよい。

この方法はさらに、複数の蛍光標識に取り付けられたビーズを供給するステップであって、蛍光標識は、蛍光シグナルによって、ビーズの識別を明示しているステップ、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブを使用してビーズを分離するステップ、ビーズを液滴内へと方向付けるステップであって、ビーズとターゲット粒子とは、同じ液滴内に位置しているステップ、を有していてよい。

液滴は、基板に形成されたノズル構造で形成されてよい。この方法はさらに、ノズルのすぐ上流に焦点合わせされたレーザによって流体を加熱するステップを含んでいてよい。

上記概説した例示的な実施形態に関連して様々な詳細を説明したが、公知の、または現時点では想定されていないもしくは想定され得ない様々な代替案、修正、変化形、改良、および／または実質的に同等なものは、前述した開示を検討するうえで明らかになるかもしれない。したがって、上記の例示的な実施形態は、限定的なものではなく、一例であることを意図している。

Claims (23)

1. 微細加工液滴ディスペンサであって、
   基板に形成されたマイクロ流体通路と、
   前記マイクロ流体通路を流れるとき、少なくとも１つのターゲット粒子と非ターゲット物質とを含んでいる第１の流体と、
   前記マイクロ流体通路を開閉するように構成された微細加工ＭＥＭＳ流体バルブと、
   所定の量の前記第１の流体を含む液滴であって、前記液滴の寸法は、前記微細加工マイクロ流体バルブの開閉のタイミングによって決定される液滴と、
   前記第１の流体と非混和性の第２の流体の供給源であって、前記液滴が前記非混和性の第２の流体内に分配され、前記第２の流体に浸漬される、第２の流体の供給源と、
   を有している、
   微細加工液滴ディスペンサ。
2. 前記マイクロ流体通路における問合せ領域と、
   前記レーザ問合せ領域に向けられるレーザと、をさらに有し、前記レーザは、ターゲット粒子を識別し、前記微細加工ＭＥＭＳ流体バルブは、前記問合せ領域からの信号に反応して、前記ターゲット粒子を前記非ターゲット物質から分離し、前記ターゲット粒子を前記液滴内へと方向付けるように構成されている、
   請求項１記載の微細加工液滴ディスペンサ。
3. 前記第１の流体内に配置されたビーズをさらに有していて、前記ビーズは、複数の蛍光標識に取り付けられており、前記蛍光標識は、前記ビーズを蛍光シグナルによって識別し、前記微細加工ＭＥＭＳ流体バルブは、前記ビーズを分離し、前記ビーズを前記液滴内へと方向付けるように構成されており、前記ビーズと前記ターゲット粒子とは、同じ前記液滴内に位置している、請求項１記載の微細加工液滴ディスペンサ。
4. 前記微細加工ＭＥＭＳ流体バルブは、開閉の際に単一の平面内で動き、前記平面は、前記基板の表面に対して平行である、請求項１記載の微細加工液滴ディスペンサ。
5. 前記微細加工ＭＥＭＳ流体バルブは、開閉の際に単一の平面内で動き、前記微細加工ＭＥＭＳ流体バルブに作用する電磁力の結果として動く、請求項１記載の微細加工液滴ディスペンサ。
6. 前記液滴は、ターゲット細胞、および蛍光によりラベリングされたビーズのうちの少なくとも１つを含む、請求項１記載の微細加工液滴ディスペンサ。
7. 非混和性の流体の前記供給源は、前記基板に形成されたノズル構造の周りに対称に配置されている、請求項６記載の微細加工液滴ディスペンサ。
8. 前記第１の流体に、界面活性剤が添加されている、請求項１記載の微細加工液滴ディスペンサ。
9. 前記ビーズは、複数の蛍光標識を有していて、これにより前記ビーズは、識別蛍光特性を有している、請求項３記載の微細加工液滴ディスペンサ。
10. 前記ビーズはさらに、前記少なくとも１つのターゲット粒子上の抗原に結合する、少なくとも１つの抗体を有している、請求項９記載の微細加工液滴ディスペンサ。
11. 非混和性の流体の前記供給源は、前記ノズルの周りに非対称に配置されている、請求項７記載の微細加工液滴ディスペンサ。
12. 前記マイクロ流体通路に焦点を合わせられ、前記液滴に方向付けられるレーザをさらに有していて、前記レーザは、前記マイクロ流体通路内の隣接する液滴を合体させるために前記液滴を加熱するように形成されている、請求項３記載の微細加工液滴ディスペンサ。
13. 前記マイクロ流体通路は、通路拡幅領域を有していて、前記通路の横断面は拡大し、次いで減少する、請求項３記載の微細加工液滴ディスペンサ。
14. 前記マイクロ通路は、突き合わせ合流部における非混和性の流体の前記供給源に交差している、請求項３記載の微細加工液滴ディスペンサ。
15. 前記ターゲット粒子は、Ｔ細胞、幹細胞、癌細胞、腫瘍細胞、タンパク質、およびＤＮＡ鎖のうちの少なくとも１つを有している、請求項３記載の微細加工液滴ディスペンサ。
16. 非混和性の流体内に液滴を形成する方法であって、
    基板に第１の流体通路を形成するステップと、
    前記第１のマイクロ流体通路内を流れる第１の流体を供給するステップと、
    前記マイクロ流体通路を開放および閉鎖するために、微細加工ＭＥＭＳ流体バルブを開放および閉鎖するステップと、
    ターゲット粒子、および識別子が配置されたビーズのうちの少なくとも１つを捕捉するステップと、
    前記第１の流体と非混和性の第２の流体の供給源を設けるステップと、
    前記第１の流体の液滴を非混和性の前記第２の流体内に分配するステップと、を有しており、前記液滴の寸法は、前記微細加工マイクロ流体バルブの開閉のタイミングによって決定され、前記液滴は、前記ビーズおよび前記ターゲット粒子のうちの少なくとも１つを取り囲んでいる、
    方法。
17. 前記マイクロ流体通路内を流れる前記第１の流体が、ターゲット粒子と非ターゲット物質とを有しており、前記ターゲット粒子は、Ｔ細胞、幹細胞、癌細胞、腫瘍細胞、タンパク質、およびＤＮＡ鎖のうちの少なくとも１つを有している、請求項１６記載の方法。
18. レーザ問合せ領域で、ターゲット粒子を非ターゲット物質から識別するステップと、
    前記問合せ領域からの信号に反応して、識別された前記ターゲット粒子を非ターゲット物質から分離するために、前記微細加工ＭＥＭＳ流体バルブを開放および閉鎖するステップと、
    前記ターゲット粒子を前記液滴内へと方向付けるステップと、
    をさらに有する、請求項１６記載の方法。
19. 複数の蛍光標識に取り付けられたビーズを供給するステップであって、前記蛍光標識は、蛍光シグナルによって、前記ビーズの識別を明示するステップと、
    前記微細加工ＭＥＭＳ流体バルブを使用して前記ビーズを分離するステップと、
    前記ビーズを前記液滴内へと方向付けるステップであって、前記ビーズと前記ターゲット粒子とは、同じ前記液滴内に位置しているステップと、をさらに有する、
    請求項１６記載の方法。
20. 前記液滴は、前記基板に形成されたノズル構造で形成される、請求項１６記載の方法。
21. 前記液滴に方向付けられたレーザによって、流体の前記液滴を加熱するステップをさらに有する、請求項１６記載の方法。
22. ラベリングされたビーズを捕捉するために、第１の選別パルスを発生させるステップと、
    次いで、ターゲット細胞を捕捉するために、第２の選別パルスを続いて発生させるステップと、をさらに有し、前記両選別パルスは、前記ビーズとターゲット粒子とが、非混和性の前記第２の流体内へ分配される同じ前記液滴内に位置するように、生成される、請求項１６記載の方法。
23. ターゲット細胞を捕捉するために、第１の選別パルスを発生させるステップと、
    次いで、ラベリングされたビーズを捕捉するために、第２の選別パルスを続いて発生させるステップと、をさらに有し、前記両選別パルスは、前記ビーズとターゲット粒子とが、非混和性の前記第２の流体内へ分配される同じ前記液滴内に位置するように、生成される、請求項１６記載の方法。

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