JP2021524228A

JP2021524228A - 内胚葉系統の細胞およびベータ細胞を生成するための方法および組成物、ならびにそれらの使用

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Publication number: JP2021524228A
Application number: JP2020564329A
Authority: JP
Inventors: ジェフリー・アール・ミルマン; ナサニエル・ホグリーブ; ジウォン・ソン; レオナルド・ベラスコ−クルス
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2021-09-13
Also published as: US20210207099A1; CA3100382A1; WO2019222487A1; EP3793579A1; CN112533618A; EP3793579A4; AU2019271288A1

Abstract

本開示の様々な態様の中には、内胚葉系統の細胞およびベータ細胞を生成するための方法および組成物ならびにそれらの使用の提供が含まれる。

Description

関連出願への相互参照：
この出願は、2018年5月16日に出願された米国仮出願シリアル番号62/672,300；2018年5月17日に出願された米国仮出願シリアル番号62/672,695；2019年1月31日に出願された米国仮出願シリアル番号62/799,252；および2019年1月8日に出願された米国仮出願シリアル番号62/789,724からの優先権を主張し、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府が後援する研究または開発に関する声明：
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号DK114233の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

参照により組み込まれる材料：
本開示の一部である配列表は、本発明のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含むコンピューター可読形態を含む。配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、一般に、細胞療法およびベータ様細胞を作製する方法に関する。

発明が解決しようとする課題および解決手段

本開示の様々な態様の中には、内胚葉系統の細胞を生成するための方法および組成物ならびにそれらの使用の提供が含まれる。

本開示の一側面は、懸濁液中でインスリン産生ベータ細胞を生成する方法を提供し、該方法は、幹細胞を提供し；無血清培地を提供し；幹細胞をTGFβ/アクチビンアゴニストまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK）阻害剤またはWNTアゴニストと、最終的な（definitive）内胚葉細胞を形成するのに十分な時間接触させ；最終的な内胚葉細胞をFGFR2bアゴニストと、原始腸管細胞（primitive gut tube cell）を形成するのに十分な時間接触させ；原始腸管細胞をRARアゴニスト、および任意でrhoキナーゼ阻害剤、スムーズンドアンタゴニスト、FGFR2bアゴニスト、プロテインキナーゼCアクチベーター、またはBMPタイプ1受容体阻害剤と、初期膵臓前駆細胞を形成するのに十分な時間接触させ；初期膵臓前駆細胞を少なくとも約3日間インキュベートし、任意で初期膵臓前駆細胞をrhoキナーゼ阻害剤、TGF-β/アクチビンアゴニスト、スムーズンドアンタゴニスト、FGFR2bアゴニスト、またはRARアゴニストと、膵臓前駆細胞を形成するのに十分な時間接触させ；膵臓前駆細胞をAlk5阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、SANT1、Erbb1（EGFR）またはErbb4アゴニスト、またはRARアゴニストと、内胚葉細胞を形成するのに十分な時間接触させ；または約24時間以内に細胞クラスターのサイズを変更させ、ベータ細胞を形成するのに十分な時間、無血清培地で内胚葉細胞を成熟させることを含む。

いくつかの実施形態では、TGFβ/アクチビンアゴニストはアクチビンＡである；グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK）阻害剤またはWNTアゴニストはCHIRである；FGFR2bアゴニストはKGFである；スムーズンドアンタゴニストはSANT-1である；RARアゴニストはレチノイン酸（RA）である；プロテインキナーゼCアクチベーターはPdBUである；BMPタイプ1受容体阻害剤はLDNである；rhoキナーゼ阻害剤はY27632である；Alk5阻害剤はAlk5iである；またはErbb4アゴニストはベータセルリンである。

いくつかの実施形態では、無血清培地は、MCDB131、グルコース、NaHCO₃、BSA、ITS-X、グルタマックス、ビタミンC、ペニシリン−ストレプトマイシン、CMRL 10666、FBS、ヘパリン、NEAA、微量元素A、微量元素B、またはZnSO₄からなる群から選択される1つまたはそれ以上を含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、内胚葉のクラスターサイズを縮小することを含み、細胞クラスターのサイズの変更は、クラスターを分解し、ベータ細胞に成熟する前に再凝集することを含む。

いくつかの実施形態において、膵臓前駆細胞は、血清、T3、N-アセチルシステイン、トロロックス、およびR428のうちのいずれか１つまたはそれ以上とインキュベートされない。

いくつかの実施形態において、最終的な内胚葉細胞、原始腸管細胞、初期膵臓前駆細胞、膵臓前駆細胞、内胚葉細胞、またはベータ細胞を形成するのに十分な時間は、約1日から約8日の間である。

いくつかの実施形態では、この方法は、内胚葉細胞のベータ細胞への成熟においてTGFβR1阻害剤（例えば、Alk5阻害剤II）の使用を含まない。

いくつかの実施形態において、TGFβR1阻害剤の不在は、TGFβシグナル伝達を可能にし、内胚葉細胞からのベータ細胞の機能的成熟を促進する。

いくつかの実施形態において、TGFβR1阻害剤の不在は、グルコースレベルの増加または分泌促進物質（secretogouge）レベルの増加に応答して、細胞からのインスリン分泌の増加を可能にする。

いくつかの実施形態において、この方法は、内胚葉細胞のベータ細胞への成熟において、T3、N-アセチルシステイン、トロロックス、またはR428を含まない。

いくつかの実施形態において、ベータ細胞は、少なくとも１つのβ細胞マーカーを発現するSC−β細胞であり、第1および第2相の動的インスリン分泌を含むグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を受ける；ベータ細胞は、死体のヒト膵島と比較して実質的に同様の量でインスリンを分泌する；または、ベータ細胞は1日またはそれ以上機能を保持する。

いくつかの実施形態では、幹細胞は、HUES8胚性細胞、SEVA 1016、またはSEVA1019である。

本開示の別の側面は、治療有効量のインスリン産生ベータ細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法を提供し、ここで、ベータ細胞は、上記に従って生成される。

本開示の別の側面は、幹細胞を内胚葉系統の細胞に分化させる方法を提供し、該方法は、幹細胞を提供し；無血清培地を提供し；幹細胞をTGFβ/アクチビンアゴニストおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK）阻害剤またはWNTアゴニストと、最終的な内胚葉細胞を形成するのに十分な時間接触させ；最終的な内胚葉細胞をFGFR2bアゴニストと、原始腸管細胞を形成するのに十分な時間接触させ；原始腸管細胞をRARアゴニスト、および任意でスムーズンドアンタゴニスト/ソニックヘッジホッグ阻害剤、FGFファミリーメンバー/FGFR2bアゴニスト、プロテインキナーゼ3アクチベーター、BMP阻害剤、またはrhoキナーゼ阻害剤と、任意で初期膵臓前駆細胞を形成するのに十分な時間接触させ；初期膵臓前駆細胞を少なくとも約3日間インキュベートし、任意で初期膵臓前駆細胞をスムーズンドアンタゴニスト、FGFR2bアゴニスト、RARアゴニスト、rhoキナーゼ阻害剤、またはTGF-β/アクチビンアゴニストと、膵臓前駆細胞を形成するのに十分な時間接触させ；膵臓前駆細胞をAlk5阻害剤/TGF-β受容体阻害剤、甲状腺ホルモン、およびガンマセクレターゼ阻害剤、および任意でSANT1、Erbb1（EGFR）またはErbb4アゴニスト/EGFファミリーメンバー、またはRARアゴニストと、内胚葉細胞または内分泌細胞を形成するのに十分な時間接触させ；任意で内胚葉細胞または内分泌細胞をAlk5阻害剤/TGF-β受容体阻害剤または甲状腺ホルモンと、内胚葉系統の細胞（例えば、膵臓細胞、肝細胞、またはベータ細胞/SC-β細胞）を形成するのに十分な時間接触させ；または一度に、かつ分化効率を高めるのに十分な時間、細胞を硬いまたは柔らかい基板上にプレーティングするか細胞に細胞骨格モジュレーション剤（modulating agent）を導入し、ここで細胞骨格モジュレーション剤は、ラトランクリンA、ラトランクリンB、ノコダゾール、サイトカラシンD、ジャスプラキノリド、ブレビスタチン、y-27632、y-15、gdc-0994、またはインテグリンモジュレーション剤を含む。

本開示の別の側面は、幹細胞を内胚葉系統の細胞に分化させる方法を提供し、該方法は、TGFβ/アクチビンアゴニスト、アクチビンA、WNTアゴニスト、およびCHIRを含む培地中で幹細胞を約24時間インキュベートし、続いて、CHIRを含まずアクチビンAを含む培地中で細胞を約3日間インキュベートしてステージ1の最終的な内胚葉細胞を生成し；外分泌膵臓細胞を生成すべく、FGFR2bアゴニストであるKGFを含む培地中で該ステージ1の最終的な内胚葉細胞を約2日間インキュベートしてステージ2の細胞を生成し；FGFR2bアゴニストであるKGF；BMP阻害剤、LDN193189；TPPB；RARアゴニストであるレチノイン酸（RA）；スムーズンドアンタゴニストであるSANT1を含む培地中で該ステージ2の細胞を2日間インキュベートしてステージ3の細胞を生成し；FGFR2bアゴニストであるKGF；BMP阻害剤、LDN193189；TPPB；RARアゴニストであるレチノイン酸；およびスムーズンドアンタゴニストであるSANT1を含む培地中で該ステージ3細胞を約4日間インキュベートしてステージ4の細胞を生成し、その際、ラトランクリンAをインキュベーションの最初の約24時間に添加するか、またはノコダゾールをインキュベーションの約4日間全体にわたって添加し；ついで、bFGFを含む培地中で該ステージ4の細胞を約6日間インキュベートし、その際、ニコチンアミドを該6日間の最後の2日間に添加し；腸細胞を生成すべく、WNTアゴニスト、CHIRおよびFGF4を含む培地中で該ステージ1び最終的な内胚葉細胞を約4日間インキュベートしてステージ2の細胞を生成し、その際、ラトランクリンAをインキュベーションの最初の約24時間に添加するか、またはノコダゾールをインキュベーションの約4日間全体にわたって添加し；R-スポンジン1およびBMP阻害剤；LDN193189を含む培地中で該ステージ2細胞を約7日間インキュベートし；または、肝細胞を生成すべく、FGFR2bアゴニストであるKGFを含む培地中で該ステージ1の最終的な内胚葉細胞を約2日間インキュベートしてステージ3の細胞を生成し；BMP4を含む培地中で該ステージ3細胞を約4日間インキュベートしてステージ4細胞を生成し、その際、RARアゴニスト、レチノイン酸、およびラトランクリンAまたはノコダゾールのいずれかをインキュベーションの最初の約24時間添加し、ついで、OSM、HGF、およびデキサメタゾンを含む培地中で該ステージ4の細胞を約5日間培養することを含む。

いくつかの実施形態では、前記方法は、内胚葉系統の細胞を形成する前にクラスターのサイズを変更することを含む。

いくつかの実施形態では、TGFβ/アクチビンアゴニストはアクチビンAである；グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK）阻害剤またはWNTアゴニストはCHIRである；FGFR2bアゴニストはKGFである；スムーズンドアンタゴニストまたはソニックヘッジホッグ阻害剤はSANT-1である；FGFファミリーメンバー/FGFR2bアゴニストはKGFである；RARアゴニストはRAである；プロテインキナーゼ3アクチベーターはPDBUである；BMP阻害剤はLDNである；rhoキナーゼ阻害剤はY27632である；Alk5阻害剤/TGF-β受容体阻害剤はAlk5iである；甲状腺ホルモンはT3である；ガンマセクレターゼ阻害剤はXXIである；Erbb1（EGFR）またはErbb4アゴニスト/EGFファミリーのメンバーはベータセルリンである；またはRARアゴニストはRAである。

いくつかの実施形態において、最終的な内胚葉細胞、原始腸管細胞、初期膵臓前駆細胞、膵臓前駆細胞、内胚葉細胞、またはベータ細胞を形成するのに十分な時間は、約1日から約15日の間である。

いくつかの実施形態では、初期膵臓前駆細胞をプレーティングするか、またはYAPをs1p（スフィンゴシン−1−リン酸）で活性化して（例えば、およそステージ４の間）、SC-β細胞誘導を増加させ、望ましくない早すぎる内分泌コミットメント（endocrine commitment）を防止し、または転写因子発現のタイミングを正しくすることを可能にする。

いくつかの実施形態では、ラトランクリンA、ラトランクリンB、またはノコダゾールを膵臓前駆細胞に導入して（例えば、ステージ4を通して、ステージ5または約7日目で）、プレーティングした細胞の内分泌誘導の増強およびその後生成されたβ細胞のグルコース刺激インスリン分泌の増強をもたらす。。

いくつかの実施形態では、ラトランクリンAまたはラトランクリンBを膵臓前駆細胞に導入して肝細胞などの内胚葉系統の細胞を生成するか、またはラトランクリンAまたはラトランクリンBが細胞骨格アクチンを破壊する（例えば、ラトランクリンAまたはラトランクリンBをステージ5の前に導入すると肝細胞が生じ、またはステージ5を通じてラトランクリンAまたはラトランクリンBを導入するとβ細胞の数が増加する）。

いくつかの実施形態では、YAP阻害剤（例えば、ベルテポルフィン）を膵臓前駆細胞に導入する。

いくつかの実施形態では、ラトランクリンAまたはラトランクリンBを膵臓前駆細胞に導入して、グルコース媒介性インスリン分泌またはインスリン遺伝子発現を増加させる。

いくつかの実施形態では、内胚葉系統の細胞は、ベータ細胞、肝臓細胞、または膵臓細胞から選択される。

いくつかの実施形態では、この方法は、ベータ細胞の誘導および機能を増強する。

いくつかの実施形態では、この方法は、平面（付着）培養で培養することを含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、硬い基板上に細胞をプレーティングすることを含み、その際、NKX6.1の発現は、柔らかい基板上または懸濁培養におけるNKX6.1の発現と比較して、硬い基板上で増加する。

いくつかの実施形態では、平面（付着）細胞は分散され、再凝集されるか、または外部キュー（external cue）（例えば、温度）で疎水性を変化させる表面と組み合わされて、細胞の剥離を可能にし、細胞配置、細胞外マトリックスタンパク質、およびインスリン分泌を保持する。

いくつかの実施形態では、ベータ細胞は、SC−β細胞である。

いくつかの実施形態では、幹細胞は、HUES8および1016SeVAから選択される。

本開示の別の側面は、上記の側面または実施形態のいずれか1つから生成された細胞を提供し；または化合物または組成物を細胞に導入することを含むスクリーニング方法を提供する。

本開示の別の側面は、治療有効量の内胚葉系統の細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法を提供し、ここで、細胞は、上記の側面または実施形態のいずれか1つに従って生成される。

いくつかの実施形態では、対象は糖尿病を患っているか、または細胞が対象に移植される。

本開示の別の側面は、上記の側面または実施形態のいずれか1つの方法によって生成された細胞を提供する。

本開示の別の側面は、細胞を生成する方法または上記の側面または実施形態のいずれか1つの方法によって生成される細胞を提供し、ここで、内胚葉系統の細胞、ベータ細胞、または中間細胞はCDX2、CHGA、FOXA2、SOX17、PDX1、NKX6-1、NGN3、NEUROG3、NEUROD1、NXK2-2、ISL1、KRT7、KRT19、PRSS1、PRSS2、またはINSを発現する。

他の目的および特徴は、以下で一部は明らかであり、一部は指摘される。

当業者は、以下に記載される図面が例示のみを目的としていることを理解するであろう。図面は、いかなる方法でも本教示の範囲を制限することを意図するものではない。

図１Ａ−１Ｆは、SC−β細胞クラスターがグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を受けることを示す。（Ａ）使用した分化手順の概要。（Ｂ）位相差下での未染色のステージ6クラスター全体の画像（上側）または明視野下で画像化されたジチゾン（DTZ）で染色された画像（下側）。（Ｃ）グルカゴン（GCG）、NKX6-1、またはPDX1を赤で染色し、C-ペプチド（CP）を緑で染色し、核マーカー4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色した切片パラフィン包埋ステージ6クラスターの免疫染色。（Ｄ）静的グルコース-刺激インスリン分泌（GSIS）アッセイにおける、この研究のプロトコルで生成されたステージ6細胞（n=16）、Pagliucaプロトコルで生成されたステージ6細胞（n=12）、および死体のヒト膵島（n=12）のヒトインスリン分泌。^**P<0.01、^****P<0.001、片側対応のあるt検定による。#P<0.05、####P<0.0001、一元配置分散分析ダネット多重比較検定によるこの研究との比較。（Ｅ）2、5.6、11.1、または20mMグルコースのいずれかにさらされたこの研究からのステージ6細胞の静的GSISアッセイ（n=4）。^*P<0.05、^***P<0.001、2mMグルコースと比較した一元配置分散分析ダネット多重比較検定では有意ではない（ns）。（Ｆ）灌流GSISアッセイにおける、この研究のプロトコルで生成されたステージ6細胞（n=12）、Pagliucaプロトコルで生成されたステージ6細胞（n=4）、および死体のヒト膵島（n=12）の動的ヒトインスリン分泌。高グルコース（20mM）が示されている場合を除いて、細胞を低グルコース（2mM）で灌流する。Act A、アクチビンA；CHIR、CHIR9901；KGF、ケラチノサイト成長因子；RA、レチノイン酸；Y、Y27632；LDN、LDN193189；PdbU、ホルボール12,13-ジブチレート；T3、トリヨードサイロニン；Alk5i、Alk5阻害剤タイプII；ESFM、富化無血清培地。示されているすべてのステージ6データは、HUES8を使用したものである。

図２Ａ−２Ｇは、SC-β細胞がβ細胞および膵島マーカーを発現することを示す。（Ａ）単一細胞分散し、一晩プレーティングし、クロモグラニンA（CHGA）、GCG、ソマトスタチン（SST）、NEUROD1、NKX6-1、PDX1、またはPAX6を赤色で染色し、C-ペプチド（CP）を緑色で染色し、DAPIで染色したステージ6クラスターの免疫染色。（Ｂ）単一細胞分散し、示されたマーカーについて免疫染色したステージ6クラスターの代表的なフローサイトメトリードットプロット。（Ｃ）示されたマーカーを発現する細胞の割合を定量するボックスアンドウィスカープロット。各点は独立した実験である。（Ｄ）この研究のプロトコルで生成されたステージ6細胞（n=8）、Pagliucaプロトコルで生成されたステージ6細胞（n=5）、および死体のヒト膵島（n=7）のリアルタイムPCR分析。ns、^*P<0.05、^**P<0.01、^***P<0.001、^****P<0.0001、この研究と比較した一元配置分散分析ダネット多重比較検定。示されているすべてのステージ6データは、HUES8を使用したものである。

図３Ａ−３Ｈは、SC-β細胞が耐糖能を大幅に改善し、移植後数ヶ月間持続する機能を持っていることを示す。（Ａ）移植後6ヶ月、2g/kgのグルコースの注射後0分および60分で一晩絶食した非STZ処置マウスコホート（n=3）の血清ヒトインスリン。^**P<0.01、片側対応のあるt検定による。（Ｂ）DAPIを用いたC-ペプチド（左）またはDAPIを用いたC-ペプチドおよびPDX1（右）の移植後6ヶ月の非STZ処置マウスの切片化パラフィン包埋外植腎臓の免疫染色。白い破線は、腎臓と移植片（*）の境界を示すために手動で描画したもの。（Ｃ）移植なしのSTZ処置マウスコホート（STZ, No Txp；n=6）、移植なしの未処置マウス（No STZ, No Txp；n=5）および移植を伴うSTZ処置マウス（STZ, Txp；n=6）の手術後10日目のグルコース負荷試験（GTT）。^*P<0.05、^**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001、双方向分散分析テューキー多重比較による。（Ｄ）（Ｃ）に示されているデータの曲線下面積（AUC）計算。^**P<0.01、一元配置分散分析テューキー多重比較検定による。（Ｅ）2g/kgのグルコースの注射後0分および60分で一晩絶食したSTZ, Txpマウス（n=5）の血清ヒトインスリン。^**P<0.01、片側対応のあるt検定による。（Ｆ）STZ, No Txpマウス（n=6）、No STZ, No Txpマウス（n=4）、およびSTZ, Txpマウス（n=5）の手術後10週間のGTT。^**P<0.01、^***P<0.001、^****P<0.0001、双方向配置分散テューキー多重比較検定による。（Ｇ）（ｄ）に示されているデータのAUC計算。^**P<0.01一元配置分散分析テューキー多重比較検定による。（Ｈ）2g/kgのグルコースの注射後0分および60分で一晩絶食させたSTZ, Txpマウス（n=5）の血清ヒトインスリン。^**P<0.01、片側対応のあるt検定による。示されているすべてのデータはHUES8のものである。パネル（Ａ−Ｂ）はSCID/ベージュ、パネル（Ｃ−Ｈ）はNOD/SCIDマウスである。

図４Ａ−４Ｃは、SC−β細胞がインビトロで一過性の動的機能を有し、複数の刺激に応答し、高グルコースで第2相インスリン分泌を維持することを示している。（Ａ）灌流GSISアッセイにおける5、9、15、22、26、および35日間のステージ6の動的ヒトインスリン分泌細胞。個々の時点のデータは平均±SEMとして示され、最終的なグラフは各グラフの平均のみを示している。高グルコース（20mM）が示されている場合を除いて、細胞は低グルコース（2mM）で灌流される（各ステージ6の時点でn=3）。（Ｂ）複数の分泌促進物質で処理された灌流GSISアッセイにおけるステージ6細胞の動的ヒトインスリン分泌。高（20mM）グルコースが示されている場合（Glu）を除いて、細胞を低グルコース（2mM）で灌流し、次に高グルコース単独または追加の化合物（左側のトルブタミド、IBMX、およびエクステンディン-4；右側のKCLおよびL-アルギニン）（Glu+Factorと示す）の2回目のチャレンジで灌流する。（Ｃ）拡張高グルコース処理を伴う灌流GSISアッセイにおけるステージ6細胞の動的ヒトインスリン分泌。高グルコース（20mM）が示されている場合を除いて、細胞は低グルコース（2mM）で灌流される（n=3）。示されているすべてのデータはHUES8のものである。

図５Ａ−５Ｆは、Alk5阻害剤タイプIIがSC−β細胞GSISを減少させることを示す。（Ａ）DMSOまたはAlk5iで処理された静的GSISアッセイにおけるステージ6細胞のヒトインスリン分泌のボックスアンドウィスカープロット（n=9）。^***P<0.001、^****P<0.0001、双方向の対応のあるt検定による。####P<0.0001、双方向の対応のないt検定による。（Ｂ）DMSOまたはAlk5iで処理されたステージ6細胞の細胞インスリン含有量（n=18）。^****P<0.0001、双方向の対応のないt検定による。（Ｃ）DMSOまたはAlk5iで処理されたステージ6細胞の細胞プロインスリン/インスリン含有率（n=17）。双方向の対応のないt検定によるns。（Ｄ−Ｅ）クロモグラニンAおよびPDX1（Ｄ）またはC-ペプチドおよびNKX6-1（Ｅ）について単一細胞分散し、免疫染色されたステージ6クラスターの代表的なフローサイトメトリードットプロット。（Ｆ）灌流GSISアッセイにおいてDMSOまたはAlk5iで処理されたステージ6細胞の動的ヒトインスリン分泌。高グルコース（20mM）が示されている場合（n=12）を除いて、細胞は低グルコース（2mM）で灌流される。示されているすべてのデータはHUES8のものである。

図６Ａ−６Ｇは、ステージ6の間にTGFβシグナル伝達を遮断するとGSISが妨げられることを示す。（Ａ）リン酸化SMAD2/3（pSMAD2/3）、総SMAD2/3（tSMAD2/3）、およびアクチンで染色されたDMSOまたはAlk5iで培養されたステージ6細胞のウエスタンブロット。示されているデータはHUES8からのものである。（Ｂ）GFPに対するshRNA（対照）またはTGFBR1に対する2つの配列（TGFBR1＃1および＃2）の1つを含むレンチウイルスで形質導入されたステージ6細胞のリアルタイムPCR（n=3）。^****P<0.0001、GFPと比較した一元配置分散分析ダネット多重比較検定による。（Ｃ）GFPまたはTGFBR1＃1 shRNAを含むレンチウイルスで形質導入されたステージ6細胞のウエスタンブロット。示されているデータは1013-4FAのものである。（Ｄ）GFP、TGFBR1＃1、またはTGFBR1＃2 shRNAを含むレンチウイルスで形質導入された静的GSISアッセイにおけるステージ6細胞のヒトインスリン分泌（n=3）。^**P<0.01、対応のある双方向t検定による。##P<0.01、GFPと比較した一元配置分散分析ダネット多重比較検定。示されているデータはHUES8からのものである。（Ｅ）灌流GSISアッセイにおいてGFPまたはTGFBR1＃1 shRNAを含むレンチウイルスで形質導入されたステージ6細胞の動的ヒトインスリン分泌。高グルコース（20mM）が示されている場合を除いて、細胞は低グルコース（2mM）で灌流される（n=4）。示されているデータはHUES8からのものである。

図７Ａ−７Ｇは、ステージ5の間のAlk5阻害剤タイプIIしょｒがインスリン産生細胞の生成にとって重要であることを示す。（Ａ−Ｂ）クロモグラニンAおよびNKX6-1（Ａ）またはC-ペプチドおよびNKX6-1（Ｂ）について単一細胞分散し、免疫染色されたステージ5クラスターの代表的なフローサイトメトリードットプロット。（Ｃ）示されたマーカーを発現する細胞の割合（n=3であったCHGAを除いてn=4）。^*P<0.05、^**P<0.01、またはns、対応のない双方向t検定による。（Ｄ−Ｆ）膵臓ホルモン（Ｄ）、β細胞マーカー（Ｅ）、または内分泌マーカー（Ｆ）についてDMSOまたはAlk5iで培養したステージ5細胞の相対的な遺伝子発現を測定するリアルタイムPCR（n=6）。^*P<0.05、^**P<0.01、^****P<0.0001、またはns、対応のない双方向t検定による。（Ｇ）DMSOまたはAlk5iのいずれかでステージ5での培養に加えて、Alk5iおよびクラスターサイズ変更なしでステージ6でのさらに7日間培養した細胞の20mMグルコースでのヒトインスリン分泌（n=3）。^**P<0.01、対応のない双方向t検定による。示されているすべてのデータはHUES8からのものである。

図８Ａ−８Ｄは、新たな分化戦略とhiPSC再生につながるデータを示す。（Ａ）静的GSISアッセイにおいて、サイズ変更の有りまたは無しで、および因子（Alk5iおよびT3）の有りまたは無しで、CMRLSまたはESFMで生成されたステージ6細胞のヒトインスリン分泌。調査した組み合わせは、（1）CMRLS、サイズ変更無し、因子無し（n=3）、（2）CMRLS、サイズ変更有り、因子無し（n=6）、（3）ESFM、サイズ変更無し、因子無し（n=3）、（4）ESFM、サイズ変更有り、因子無し（n=3）、（5）ESFM、サイズ変更有り、因子有り（n=3）であった。HUES8細胞株を使用した。（Ｂ）C-ペプチドおよびNKX6-1に対して免疫染色し、サイズ変更の有りまたは無しで、および因子（Alk5iおよびT3）の有りまたは無しで、CMRLSまたはESFMで生成されたステージ6細胞のフローサイトメトリードットプロット。HUES8細胞株を使用した。（Ｃ）3つのhiPSC系統の静的GSISアッセイにおけるヒトインスリン分泌（それぞれn=3）。 ^*P<0.05、^**P<0.01、および^***P<0.0001、片側対応のあるt検定による。（Ｄ）灌流GSISアッセイで2つのhiPSC系統で生成されたステージ6細胞の動的ヒトインスリン分泌。高グルコース（20mM）が示されている場合を除いて、細胞は低グルコース（2mM）で灌流される（1013-4FAの場合はn=3、1016SeVAの場合はn=4）。

図９Ａ−９Ｃは、ステージ6細胞の追加の免疫染色データを示す。（Ａ）単一細胞分散し、一晩プレーティングし、示されたマーカーについて染色したステージ6クラスターの免疫染色。ステージ6細胞は、この論文のプロトコルを使用した2つのhiPSC系統とPagliucaプロトコルを使用したHUES8細胞株から生成された。スケールバーは、1016SeVAおよび1013-4FAの場合は50μm、Pagliucaプロトコルの場合は25μm。（Ｂ−Ｃ）この論文のプロトコルを使用した2つのhiPSC系統とPagliucaプロトコルを使用したHUES8細胞株から生成されたステージ6細胞のフローサイトメトリードットプロット。

図１０は、ステージ6細胞の追加の遺伝子発現データを示す。リアルタイムPCRで測定されたHUES8（n=8）および1013-4FA（n=10）系統およびヒト膵島（n=7）からの新たな分化プロトコルで生成されたステージ6細胞の遺伝子発現データ。ここにプロットされたHUES8およびヒト膵島は、図２からのものと同じである。

図１１Ａ−１１Ｄは、追加の免疫染色、血清ヒトインスリン測定、およびマウスC-プチド測定を示す。（Ａ）C-ペプチド（CP；β細胞マーカー）、PDX1（β細胞マーカー）、グルカゴン（GCG；α細胞マーカー）、ソマトスタチン（SST；δ細胞マーカー）、KRT19（管マーカー）、およびトリプシン（腺房マーカー）についての移植後6ヶ月の非STZ処置マウスの切片化パラフィン包埋外植腎臓の免疫染色。スケールバー=25μm。（Ｂ）2g/kgのグルコースの注射後0分および60分で一晩絶食させた、STZ、Txp無しマウス（n=6）およびStz無し、Txp無し（n=5）の血清ヒトインスリン。（Ｂ）STZ、Txp無し（n=6）、STZ無し、Txp無し（n=4）、およびSTZ、TXP（n=5）の血清マウスC-ペプチド。^****P<0.0001およびns、一元配置分散分析テューキー多重比較検定による。（Ｃ）示されたマーカーについての移植の11週間後のSTZ処置マウスの切片化パラフィン包埋外植腎臓の免疫染色。スケールバー=25μm。HUES8細胞株を使用した。

図１２Ａ−１２Ｂは、ヒト膵島のステージ6中の時間的フローサイトメトリーおよびKClチャレンジを示す。（Ａ）C-ペプチドおよびNKX6-1について染色された初期（9日）および後期（26日）の時点でのステージ6細胞のフローサイトメトリードットプロット。HUES8細胞株を使用した。（Ｂ）高（20mM）グルコースが示されている場合（Glu）を除いて、低グルコース（2mM）で灌流され、次にKClを用いた高グルコースの2回目のチャレンジで（Glu+因子として示す）灌流された灌流GSISアッセイにおけるヒト膵島の動的ヒトインスリン分泌（n=4）。

図１３Ａ−１３Ｃは、hiPSCから生成されたステージ6細胞が、Alk5iによって阻害されるGSISを受けること、フローサイトメトリー対照、および遺伝子発現データを示す。（Ａ）DMSOまたはAlk5iで処理した静的GSISアッセイで3つのhiPSC系統（1013-4FA、n=4；1016SeVA、n=3；1019SeVF、n=3）から生成されたステージ6細胞のヒトインスリン分泌。^*P<0.05、^**P<0.01、^****P<0.0001、双方向の対応のあるt検定による。##P<0.01、###P<0.001、####P<0.0001、双方向の対応のないt検定による。ここでの制御データは、図２１と同じデータである。（Ｂ）図１９のフローサイトメトリー対照。C−ペプチド/NKX6-1対照は、図１６に示されるものと同じである。（Ｃ）Alk5iまたはDMSOで処理されたサイズ変更有りまたは無しのステージ6細胞のリアルタイムPCR分析（n=3）。データは1013-4FA細胞株で生成された。

図１４Ａ−１４Ｂは、サイズ変更有りおよびサイズ変更無しのステージ6クラスターがSMAD2/3リン酸化を有し、Alk5i処理によりGSISが減少していることを示す。（Ａ）リン酸化SMAD2/3（pSMAD2/3）、総SMAD2/3（tSMAD2/3）、およびアクチンで染色されたサイズ変更有りまたは無しのステージ6細胞のウエスタンブロット。（Ｂ）DMSOまたはAlk5iで処理した、サイズ変更有りまたは無しの静的GSISアッセイにおけるステージ6細胞のヒトインスリン分泌。示されているすべてのデータは1013-4FAのものである。

図１５Ａ−１５Ｉは、細胞骨格の状態が転写因子の発現を制御することを示す一連の図、画像、およびグラフである。膵臓前駆細胞におけるNEUROG3およびNKX6-1。（ａ）懸濁液分化（suspension differentiation）およびプレートダウン（plate down）研究に使用される分化プロトコル⁵の概略図。（ｂ）プロトコルの残りの部分で培養するために、ECMでコーティングされたTCPに分散されプレーティングされたステージ4の開始時のクラスターの画像。スケールバー＝100μm。（ｃ）通常の懸濁液クラスターまたは分散後に再凝集したクラスターと比較した、ステージ4の開始時にコラーゲンIにプレーティングされた細胞のステージ4の終了時の膵臓遺伝子のqRT-PCR（テューキーのHSD検定、n=4）。（ｄ）ステージ4の開始時にコラーゲンIゲルのさまざまな高さにプレーティングされた細胞のステージ4の終了時の膵臓遺伝子のqRT-PCR。TCPに固定されたコラーゲンIゲルの高さの増加は、細胞によって経験される有効剛性（effective stiffnes）の減少と相関する（ANOVA、n=4）。（ｅ）ラトランクリンAを強力な内分泌誘導物質として同定するために細胞骨格修飾化合物のスクリーニングで処理されたプレーティングされたステージ4細胞のqRT-PCR。γ-セクレターゼ阻害剤であるXXiを陽性対照として使用した（ダネットの多重比較検定、n=4）。（ｆ）1μMのラトランクリンA処理がNEUROG3+を増加させ、NKX6-1+細胞を減少させることを示す、ステージ4の終わりでのプレーティング細胞の免疫染色。スケールバー＝50μm。（ｇ）qRT-PCRで測定されたステージ4中に追加された膵臓遺伝子発現のラトランクリンA用量反応（ANOVA、n=4）。（ｈ）PDX1発現は維持されるがF-アクチンの解重合を示す、1μMラトランクリンで24時間処理したプレーティングしたステージ4細胞の免疫染色。（ｉ）異なる培養フォーマット下でラトランクリンAで処理された細胞内のG/Fアクチン比のウエスタンブロット定量（n=3）。すべてのデータはHUES8で生成された。すべてのデータエラーバーはSEMを表す。ns=有意ではない、^*=p<0.05、^**=p<0.01、^***=p<0.001。

図１６Ａ−１６Ｃは、単一細胞RNAシークエンシングを描写する一連の投影、プロット、およびグラフであり、細胞骨格の状態が膵臓前駆細胞の消長を指示することを実証する。（ａ）プレーティングされたステージ4細胞で実行され、0.5μMラトランクリンAまたは5μMノコダゾールで処理された単一細胞RNAシークエンシングのtSNEプロジェクション。3つの条件すべてからの結合された細胞集団の教師なしクラスタリングにより、4つの別々のクラスターが明らかになった。（ｂ）各クラスターで重要なアップレギュレートされた遺伝子を示すバイオリン図。（ｃ）各条件の各クラスター内の細胞のパーセンテージ。すべてのデータはHUES8で生成された。

図１７Ａ−１７Ｉは、ステージ5でのラトランクリンA処理が、プレーティングされた膵臓前駆細胞のSC−β細胞特異化（specification）を劇的に増加させたことを示す一連のプロットおよび画像である。（ａ）ステージ4、5、または6全体で0.5μMラトランクリンAで処理したまたは処理していない、図１５（ａ）のようにプレーティングされた細胞のNKX6-1、CHGA、およびC-ペプチドのステージ6までの2週間のフローサイトメトリー（ダネットの多重比較検定、n=4）。（ｂ）ステージ4、5、または6全体で0.5μMラトランクリンAで処理したまたは処理していない、プレーティング細胞のステージ6までの2週間の静的GSIS（対応のあるt検定は特定の試料での低グルコースと高グルコースを比較し、ダネットの検定は高グルコースでのインスリン分泌を対照と比較する、n=4）。（ｃ）プレーティングされた細胞のステージ5中のラトランクリンA濃度とタイミングの最適化。静的GSISはステージ6の2週間後に実行された（t検定、n=4）。（ｄ）1μMラトランクリンAで24時間処理したまたは処理していない、ステージ6までの2週間のプレーティング細胞のインスリン含有量（対応のないt検定、n=4）。（ｅ）1μMラトランクリンAで24時間処理したまたは処理していない、ステージ6までの2週間のプレーティング細胞のプロインスリン/インスリン比（対応のないt検定、n=4）。（ｆ）1μMラトランクリンAで24時間処理したまたは処理していない、ステージ6までの2週間のプレーティング細胞の膵臓（左）および非膵臓（右）遺伝子発現を測定するqRT-PCR（対応のないt検定、n=4）。（ｇ）1μMラトランクリンAで24時間処理したまたは処理していない、ステージ6までの2週間のプレーティング細胞のAFPおよびC-ペプチドの免疫染色。スケールバー＝100μm。（ｈ）ステージ6において1週間後のプレーティング細胞の凝集の画像。（ｉ）第1相および第2相のインスリン放出を示すステージ6細胞の動的グルコース刺激インスリン分泌。すべてのデータはHUES8で生成された。すべてのデータエラーバーはSEMを表す。ns=有意ではない、^*=p<0.05、^**=p<0.01、^***=p<0.001。

図１８Ａ−１８Ｊは、β細胞マーカーを発現し、インビトロで機能する新たな平面プロトコルで分化したSC-β細胞を示す一連の図、グラフ、および画像である。（ａ）ステージ5の最初の24時間に1μMのラトランクリンA処理を組み込んだSC-β細胞を作成するための新たな平面プロトコルの概略図。（ｂ）内分泌誘導（CHGA+）およびSC-β細胞の特異化（C-ペプチド+/NKX6-1+）を測定する、ステージ5のラトランクリンA処理したおよび処理していないHUES8の細胞のステージ6での1週間後のフローサイトメトリー（対応のないt検定、n=4）。（ｃ）HUES8、1013-4FA、および1016SeVA hPSC系統から分化したステージ6細胞の膵島およびSC-β細胞マーカーのフローサイトメトリー（n=4）。（ｄ）ステージ6細胞およびヒト膵島の許可されていない（disallowed）遺伝子のqRT-PCR（ダネットの多重比較検定、SC-β細胞の場合はn=4、ヒト膵島の場合はn=3）。（ｅ）HUES8からの凝集した平面ステージ6細胞の免疫染色。（ｆ）ステージ6細胞のインスリン含有量（n=4）。（ｇ）ステージ6細胞のプロインスリン/インスリン含有率（n=4）。（ｈ）ステージ6細胞の静的GSIS（対応のあるt検定、n=4）。（ｉ）HUES8（n=7）、1013-4FA（n=3）、および1016SeVA（n=4）から生成された平面ステージ6細胞の動的GSIS。懸濁ステージ6のデータを、Velazco-Cruzら⁵から再プロット（HUES8、n=12；1013-4FA、n=3；1016SeVA、n=4）。（j）Velazco-Cruzら⁵から再プロットしたヒト膵島データと比較して一緒にプロットした（ｉ）からの平面静的GSISデータ（n=12）。この図に示されているすべてのデータは、特に記載がない限り、平面分化プロトコルで生成された細胞のものである。すべてのデータエラーバーはSEMを表す。ns=有意ではない、^*=p<0.05、^**=p<0.01、^***=p<0.001。

図１９Ａ−１９Ｃは、新たな平面プロトコルで生成されたSC-β細胞がマウスの既存の糖尿病を迅速に治癒できることを示す一連のグラフおよび画像である。（ａ）合計19匹のマウスでSTZにより糖尿病が誘発された。注射の4週間後、平面プロトコルで生成されたSC-β細胞をこれらのマウスのうち12匹に移植した。5匹の非糖尿病マウスを対照とした。移植後3、10、13週間にグルコース負荷試験を実施した。移植の12週間後に腎摘出を行った（テューキーのHSD検定、‡=移植なしと異なる、§=移植と異なる、＃=未処理の対照と異なる）。（ｂ）移植後2週間および10週間でSC-β細胞移植を受けたマウスのインビボGSISでヒトインスリンを測定。ns=有意ではない、^*=p<0.05、^**=p<0.01、^***=p<0.001。（ｃ）移植の3週間後にSC-β細胞を移植した切片腎臓の免疫染色は、C-ペプチド+細胞を示す。すべてのデータは、図１９Ａに概説された平面プロトコルを使用して、HUES8で生成された。すべてのデータエラーバーはSEMを表す。

図２０Ａ−２０Ｇは、細胞骨格の状態が内胚葉細胞の消長に影響を与えることを示す一連のヒートマップ、プロット、および画像である。（ａ）ステージ4全体で0.5μMラトランクリンAで処理したまたは処理していない、またはステージ5の最初の24時間に1μMラトランクリンAで処理した、図１５（ａ）のようにステージ6に分化した懸濁およびプレーティングされた膵臓前駆細胞。ステージ6までの2週間の一括RNAシークエンシングを使用して、ステージ5のラトランクリンA処理とプレーティング対照の間で最も差別的に発現した1000個の遺伝子のヒートマップを生成した。（ｂ）複数の内胚葉系統からの選択された遺伝子の一括RNAシークエンシングからのヒートマップ。（ｃ）未処理のプレーティング細胞とステージ5のラトランクリン処理細胞の間の選択された遺伝子の発現の違いを示す一括RNAシークエンシングデータからのボルケーノプロット。（ｄ）複数の内胚葉系統からの選択された遺伝子セットの一括RNAシークエンシングからの遺伝子富化分析。（ｅ）ラトランクリンAまたはノコダゾールで処理された外分泌分化プロトコルで分化した細胞の免疫染色（左）およびqRT-PCR（右）（ダネットの多重比較検定、n=4）。（ｆ）ラトランクリンAまたはノコダゾールで処理された腸分化プロトコルで分化した細胞の免疫染色（左）およびqRT-PCR（右）（ダネットの多重比較検定、n=4）。（ｇ）ラトランクリンAまたはノコダゾールで処理された肝分化プロトコルで分化した細胞の免疫染色（左）およびqRT-PCR（右）（ダネットの多重比較検定、n=4）。スケールバー＝50μm。すべてのデータはHUES8で生成された。すべてのデータエラーバーはSEMを表す。ns=有意ではない、^*=p<0.05、^**=p<0.01、^***=p<0.001。

図２１Ａ−２１Ｄは、一連の画像および棒グラフである。（ａ）図１５（ａ）のようにステージ4の開始時にECMでコーティングされたTCP上にプレーティングされた膵臓前駆細胞の画像。スケールバー＝200μm。（ｂ）ステージ4の終了時におけるプレーティングされた細胞のqRT-PCR（n=4）。（ｃ）ステージ4の開始時および終了時のおける比色抗体ベースのインテグリン接着アッセイにより、コラーゲンIおよびIV（α1、α2、β1）、フィブロネクチン（αV、β1、α5β1）、ビトロネクチン（αV、β1、αVβ5）およびすべてではないがいくつかのラミニンアイソフォーム（α3、β1）に結合するインテグリンサブユニットの高発現が確認された。データはアイソタイプ対照に対して正規化されている。すべてのデータはHUES8で生成された。

図２２Ａ−２２Ｈは、一連のプロットおよびヒートマップである。（ａ）qRT-PCRで測定された1013-4FAおよび1016SeVAからのステージ4中に追加された膵臓遺伝子発現のラトランクリンA用量反応（n=4）。（ｂ）プレーティングされたHUES8へのラトランクリンB投与に応答したステージ4の終了時における膵臓遺伝子発現のqRT-PCR（ANOVA、n=4）。（ｃ）未処理のHUES8プレーティングステージ4細胞、未処理の再凝集クラスター、およびアクチン重合化剤ジャスプラキノリドで処理された再凝集クラスターのqRT-PCR（対応のないt検定、n=4）。（ｄ）膵臓遺伝子の発現を示す、プレーティングされたHUES8膵臓前駆細胞の単一細胞RNAシークエンシングデータから生成されたtSNEプロットヒートマップ。すべてのデータは図１５（ａ）に従って生成された。すべてのデータエラーバーはSEMを表す。ns=有意ではない、^*=p<0.05、^**=p<0.01、^***=p<0.001。

（ａ）0.5μMラトランクリンAでステージ4全体で処理したまたは処理していない、新たな平面プロトコルでステージ4の終了時まで分化したHUES8細胞のqRT-PCRは（対応のないt検定、n=4）。（ｂ−ｄ）ステージ5の開始時に24時間1μMラトランキュリンAで処理したまたは処理していない、平面プロトコルでステージ6まで分化したHUES8細胞のqRT-PCR。（ｂ、ｃ）は膵島およびβ細胞遺伝子の発現を示し、（ｄ）は非膵臓遺伝子の発現を示す（対応のないt検定、n=4）。（ｅ、ｆ）平面プロトコルから生成された凝集体の免疫染色であり、（ｅ）は1013-4FA系統、（ｆ）は1016SeVAiPSC系統を示す。スケールバー＝50μm。（ｇ）マウスからの血清のELISAによるマウスC-ペプチドの定量。（ｈ）移植を行わないマウスの血清中のヒトインスリンの定量。すべてのデータは、HUES8を使用して生成され、新たな平面プロトコルは図１８（ａ）のようであった。すべてのデータエラーバーはSEMを表す。ns=有意ではない、^*=p<0.05、^**=p<0.01、^***=p<0.001。

本開示は、少なくとも部分的に、改変されたプロセスが、グルコースにほぼ膵島様レベルに適切に応答することができる細胞を産生し、第1相および第2相応答の両方を実証するという発見に基づく。本明細書に記載されるのは、動的なインスリン分泌を伴ってヒト多能性幹細胞からベータ様細胞を生成するためのプロトコルである。さらに、本開示は、少なくとも部分的に、アクチン細胞骨格のモジュレーション（modulation）がヒト多能性幹細胞の膵臓分化を増強することができるという発見に基づいている。

動的インスリン分泌を伴うヒト多能性幹細胞からのベータ様細胞の生成：
ここで記載する方法で生成された幹細胞由来ベータ（SC-β）細胞は、公表された文献（Pagliucaら、Cell 2014）の細胞よりも良好に機能し（グルコース刺激インスリン分泌を受ける）、ベータ細胞マーカーを発現することが発見された。これには、静的アッセイでのインスリン分泌の増加、および動的アッセイにおける第1相および第2相のインスリン応答が含まれる。

本明細書に記載されるように、幹細胞由来ベータ（SC-β）細胞は、糖尿病のための細胞療法としてまたは薬物スクリーニングのために有用であり得る。本明細書で開示される方法は、ヒト多能性幹細胞のインスリン産生ベータ細胞への分化を促進する。この方法は、Pagliucaら（Cell 2014）によって公開された以前に記載された6工程の分化プロトコルから変更されている。この新しい方法により、ほぼ膵島のようなレベルに適切にグルコースに応答できる細胞が生成され、第1相および第2相の両方の応答が示された。

上記のモジュレーションを達成するために、以下を実行した。（1）ステージ3を1日に短縮する；（2）Alk5阻害剤IIを除去することにより（現行の文献にはこの阻害剤が含まれる）、ステージ6でのTGFbシグナル伝達を可能にする；（3）ステージ6からT3を除去する（現行の文献にはこの阻害剤が含まれる）；（4）ステージ6を無血清基本培地（製剤を含む）で実行する；および（5）ステージ6の開始時に、クラスターを分解して再凝集する。

上記のモジュレーションを使用して、グルコース刺激インスリン分泌をよりよく実行する強化された幹細胞由来のベータ細胞が生成された。この分野には現在、幹細胞由来のベータ細胞を成熟させるための培養の最終ステージでAlk5阻害剤IIおよびT3が含まれている。この分野では、第1相と第2相の両方のインスリン分泌を伴う機能的な幹細胞由来のベータ細胞を生成することができなかった（幹細胞由来のベータ細胞がこの分野で有する乏しい動的機能については、Rezaniaら、Nature Biotechnology 2014を参照）。

例えば、実施例１は、幹細胞由来のベータ様（SC-β）細胞を生成する方法を記載している。TGFβシグナル伝達のモジュレーション、細胞クラスターサイズの制御、および富化無血清培地（ESFM）の使用に焦点を当てた分化戦略により、β細胞マーカーを発現し、第1相および第2相の動的インスリン分泌を伴うGSISを受けるSC-β細胞を生成されることが見出された。

アクチン細胞骨格のモジュレーションはヒト多能性幹細胞の膵臓分化を促進する：
本明細書に記載されるように、この研究は、アクチン細胞骨格をヒト膵臓細胞の消長の重要な制御因子として同定した。細胞骨格の状態を細胞配列（二次元対三次元）、基板剛性（substrate stiffness）、または直接化学処理のいずれかで制御することにより、重合した細胞骨格が膵臓前駆細胞におけるNEUROG3発現の早すぎる誘導を防ぐが、その後のSC-β細胞への分化を阻害することが本明細書に示されている。

本明細書に示されるように、分化中の特定の時点でのアクチン細胞骨格およびその下流エフェクターであるYes-Associated Protein（YAP）のモジュレーションは、ヒト多能性幹細胞の内胚葉系統の細胞、膵臓前駆細胞、およびインスリン産生ベータ細胞への分化を増強できることが発見された。Pagliucaら（Cell 2014）から変更された6段階の分化プロトコルを使用して、以下の特定の機能が観察された：（1）ステージ4のアクチン重合とYAP活性は、膵臓前駆細胞（PDX1+/NKX6-1+/SOX9+）の生成を促進する；（2）ステージ5、優先的にはステージ5の最初の24〜48時間でのアクチン解重合とYAP活性の喪失は、内分泌細胞、特にグルコース刺激インスリン分泌の増強を示すベータ細胞の生成が増強される。

上記のモジュレーションを達成するために、以下を行うことができる：（1）付着を促進するためにECMタンパク質の薄層を有する組織培養プラスチックなどの硬い表面上にプレーティングすることによってアクチン重合を促進する；（2）ヒドロゲルなどの柔らかい表面にプレーティングすることにより、または細胞をラトランクリンAおよび/またはラトランクリンBで処理することにより、アクチン解重合を促進する；（3）アクチン重合を促進するために同じ方法を使用してYAP転写活性を促進する；および／または（4）アクチンの解重合を促進するために同じ方法を使用して、またはベルテポルフィンで処理することにより、YAP転写活性を阻害する。

上記のモジュレーションを使用して、以前の方法よりもグルコース刺激インスリン分泌をよりよく実行し、付着培養で生成することができる、強化された幹細胞由来ベータ細胞が生成された。現在この分野では、幹細胞由来のベータ細胞を生成することができるが、本明細書で開示されているアプローチほど上手く機能しない。この分野では、プロトコルでアクチン細胞骨格とYAPシグナル伝達を利用していない。この分野ではまた、付着培養中の細胞で機能的な幹細胞由来のベータ細胞を生成することもできない。それは、懸濁凝集体で行うか（添付データセットの多くの実験の対照；Pagliucaら、Cell 2014で最初に報告された）または気液界面上の凝集体で行う（Rezaniaら、Nature Biotechnology 2014で最初に報告された）必要がある。

本明細書に記載されているのは、公表された文献（Pagliucaら、Cell2014）の細胞よりも良好に機能し（グルコース刺激インスリン分泌を受け）、ベータ細胞マーカーを発現する幹細胞由来ベータ細胞の生成である。

本明細書にはまた、グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を受けることができる平面プロトコルで幹細胞由来ベータ細胞を生成するための方法が記載されている。

本明細書にはまた、細胞分散を必要としないUpCell技術を使用するかまたは細胞を分散および再凝集することによって細胞をプレートから分離でき、インスリン分泌能力を維持して移植をより可能にすることの実証が記載されている。

本明細書にはまた、内分泌発現（NGN3、NEUROD1の発現など）が減少し、膵臓前駆細胞の発現（NKX6-1、SOX9の発現など）が増加した膵臓前駆細胞の生成が記載されている。

膵臓前駆細胞および幹細胞由来のベータ細胞は、糖尿病の細胞療法として有用であり得る。幹細胞由来のベータ細胞はまた、薬物スクリーニングにも有用である。本明細書に開示されている付着培養アプローチは、薬物スクリーニング研究のための便利なプラットフォームをもたらす。

本明細書に開示されている培養アプローチはまた、分化の品質および再現性の向上を促進することができ、商業化のための分化プロセスの自動化を助長する。

一例として、実施例２に記載されているように、細胞骨格モジュレーションによるの分化プロトコルは、いくつかの系統の細胞（例えば、SC-β、ベータ様細胞）を生成することができる。アクチン細胞骨格の状態が内胚葉細胞の消長の選択に重要であることが見出された。細胞-生体物質相互作用とアクチン細胞骨格の小分子調節因子（例えば、細胞骨格モジュレーション剤）の組み合わせを利用することにより、内分泌転写因子発現のタイミングを制御して、分化の消長をモジュレーションし、細胞を分化させるための二次元プロトコルを開発することができる。重要なことに、この新しい平面プロトコルは、人工多能性幹細胞（iPSC）系統から分化したSC-β細胞の機能を大幅に強化し、3次元の細胞配列の必要性を排除する。

分化の特定の時点でのアクチン重合の程度が異なると、細胞は異なる内胚葉系統に偏り、したがって、最適でない細胞骨格状態は、細胞の特異化に大きな非効率をもたらした。

さらに、本明細書に記載の方法は、アクチン重合を制御して、これらの他の内胚葉細胞消長の分化を指示し、系統の特異化をモジュレーションすることができる。

提供された方法に従って生成することができる他の系統は、肝臓、食道、外分泌、膵臓、腸、または胃であり得る。

細胞骨格モジュレーション剤は、アクチン重合または微小管重合を促進または阻害する任意の薬剤であり得る。例えば、細胞骨格モジュレーション剤は、アクチン解重合または重合剤、微小管モジュレーション剤、またはインテグリンモジュレーション剤（例えば、抗体および小分子などの化合物）であり得る。例えば、細胞骨格モジュレーション剤は、ラトランクリンA、ラトランクリンB、ノコダゾール、サイトカラシンD、ジャスプラキノリド、ブレビスタチン、y-27632、y-15、gdc-0994、またはインテグリンモジュレーション剤であり得る。細胞骨格モジュレーション剤は、当技術分野で知られている任意の細胞骨格モジュレーション剤であり得る（例えば、Leyら、Nat Rev Drug Discov. 2016 Mar; 15(3): 173-183を参照）。

細胞クラスターのサイズ変更：
細胞クラスターのサイズ変更は、当技術分野で知られている任意の方法によって実施することができる。例えば、細胞のサイズ変更は、細胞クラスターを分解し、再凝集することを含み得る。別の例として、細胞クラスターは、細胞解離試薬中でインキュベートし、セルストレーナー（例えば、100μmナイロンセルストレーナー）に通すことによってサイズを変更することができる。別の例として、TrypLEを使用して単一細胞分散し、再凝集することで細胞のサイズを変更できる。

製剤：
本明細書に記載の薬剤および組成物は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（AR Gennaro編）、第21版、ISBN:0781746736（2005）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている1つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を使用する任意の従来の方法によって処方することができる。そのような製剤は、対象への適切な投与のための形態を提供するために、本明細書に記載の治療有効量の細胞（精製された形態であり得る）を適切な量の担体とともに含むであろう。

「製剤」という用語は、ヒトなどの対象への投与に適した形態で薬物を調製することを指す。したがって、「製剤」は、薬学的に許容される賦形剤（希釈剤または担体を含む）を含み得る。

本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、薬理学的活性の許容できない喪失または許容できない有害な副作用を引き起こさない物質または成分を説明することができる。薬学的に許容される成分の例は、米国薬局方（USP29）および国民医薬品集（NF24）、United States Pharmacopeial Convention, Inc, Rockville, Maryland, 2005（“USP/NF”）、またはより最近の版にモノグラフを有するもの、およびFDAの継続的に更新されるInactive Ingredient Searchオンラインデータベースにリストされている成分であり得る。USP/NFなどに記載されていない他の有用な成分を使用することもできる。

本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、または吸収遅延剤を含むことができる。医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野でよく知られている（一般に、Remington’s Pharmaceutical Sciences（A.R. Gennaro編）、第21版、ISBN:078174676（2005）を参照）。従来の媒体または薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が期待できる。補足の有効成分も組成物に組み込むことができる。

「安定な」製剤または組成物は、約0℃から約60℃などの都合のいい温度で、少なくとも約1日、少なくとも約1週間、少なくとも約1ヶ月、少なくとも約3ヶ月、少なくとも約6ヶ月、少なくとも約1年、または少なくとも約2年などの商業的に合理的な期間保存するのに十分な安定性を有する組成物を指すことができる。。

製剤は投与方法に適合している必要がある。本開示で使用する薬剤は、非経口、肺、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼科、頬側、および直腸を含むがこれらに限定されないいくつかの経路を使用して、対象に投与するための既知の方法によって処方することができる。個々の薬剤はまた、1つまたはそれ以上の追加の薬剤と組み合わせて、または他の生物学的に活性なまたは不活性な薬剤と一緒に投与され得る。そのような生物学的に活性または不活性な薬剤は、薬剤と流体的または機械的に連絡しているか、またはイオン結合、共有結合、ファンデルワールス結合、疎水結合、親水結合または他の物理的力によって薬剤に付着し得る。

制御放出（または徐放）製剤は、薬剤の活性を延長し、投与頻度を減らすように処方することができる。徐放性製剤はまた、作用の開始時間または薬剤の血中レベルなどの他の特性に影響を及ぼし、その結果、副作用の発生に影響を与えるために使用することができる。制御放出製剤は、最初に所望の治療効果を生み出すある量の薬剤を放出し、そして徐々におよび継続的に他の量の薬剤を放出して、長期間にわたって治療効果のレベルを維持するように設計され得る。体内の薬剤のレベルをほぼ一定に維持するために、薬剤は、代謝または体内から排泄される薬剤の量に取って代わる速度で剤形から放出され得る。薬剤の制御放出は、様々な誘導因子、例えば、pHの変化、温度の変化、酵素、水、または他の生理学的条件または分子によって刺激され得る。

本明細書に記載の薬剤または組成物はまた、以下にさらに記載されるように、他の治療法と組み合わせて使用することができる。したがって、本明細書に記載の治療法に加えて、疾患、障害、または状態の治療に有効であることが知られている他の療法を対象に提供することもできる。

治療法：
生成された細胞を細胞置換療法または幹細胞移植に使用する方法も提供される。例えば、開示された組成物および方法は、インスリン分泌を誘導するために、治療有効量の内胚葉系統の細胞またはベータ細胞の投与を必要とする対象において糖尿病または機能不全の内胚葉細胞に関連する他の疾患を治療するために使用することができる。

本明細書に記載の方法は、一般に、それを必要とする対象に対して実施される。本明細書に記載の治療方法を必要とする対象は、糖尿病または機能不全の内胚葉細胞に関連する他の疾患を有する、診断された、有する疑いがある、または発症するリスクがある対象であり得る。治療の必要性の決定は、通常、問題の疾患または状態と一致する病歴および身体検査によって評価されるであろう。本明細書に記載の方法によって治療可能な様々な状態の診断は、当業者の範囲内である。対象は、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、サル、ハムスター、モルモット、およびニワトリなどの哺乳動物、ならびにヒトを含む動物対象であり得る。例えば、対象はヒト対象であり得る。

一般に、内胚葉系統の細胞（例えば、肝細胞、インスリン発現細胞（例えば、β細胞、SC-β細胞）、腸細胞）の安全かつ有効な量は、例えば、望ましくない副作用を最小限に抑えながら、被験者に所望の治療効果を引き起こすであろう量である。

様々な実施形態において、本明細書に記載される有効量の内胚葉系統またはベータ細胞は、インスリンの分泌によってグルコースに応答することができる。様々な実施形態において、本明細書に記載の有効量の細胞は、糖尿病または機能不全の内胚葉細胞に関連する他の疾患を治療し、糖尿病または機能不全の内胚葉細胞に関連する他の疾患を実質的に阻害し、糖尿病または機能不全の内胚葉細胞に関連する他の疾患の進行を遅らせ、または糖尿病または機能不全の内胚葉細胞に関連する他の疾患の発症を制限することができる。

本明細書に記載の方法によれば、投与は、細胞移植、細胞埋込、非経口、肺、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼科、頬側、または直腸投与であり得る。

本明細書に記載の治療に使用する場合、治療有効量のベータ細胞または内胚葉系統の細胞は、純粋な形態で、またはそのような形態が存在する場合は薬学的に許容される塩形態で、薬学的に許容される賦形剤の有無にかかわらず使用することができる。例えば、本開示の化合物は、インスリン分泌を誘発するのに十分な量で、任意の医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で投与することができる。

単一の剤形を生成するために薬学的に許容される担体と組み合わせることができる本明細書に記載の組成物の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて変化するであろう。必要な治療有効量はいくつかの個々の用量の投与によって到達することができるので、各剤形の個々の用量に含まれる薬剤の単位含有量は、それ自体が治療有効量を構成する必要はないことが当業者によって理解されるであろう。

本明細書に記載の組成物の毒性および治療効果は、LD₅₀（集団の50％に致死の用量）およびED₅₀（集団の50％において治療効果のある用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、比率LD₅₀／ED₅₀として表すことができる治療指数であり、より大きな治療指数が一般に当技術分野で最適であると理解されている。

特定の対象に対する特定の治療上有効な用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；使用される特定の化合物の活性；採用された特定の組成物；対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事；投与の時間；投与経路；使用した組成物の排泄率；治療期間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野でよく知られている同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。（例えば、Koda-Kimbleら(2004)Applied Therapeutics；The Clinical Use of Drugs, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781748453；Winter(2003)Basic Clinical Pharmacokinetics、第4版、Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781741475；Sharqel(2004)Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, McGraw-Hill/Appleton & Lange, ISBN 0071375503を参照）。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで組成物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当業者の技術の範囲内である。所望なら、有効な1日量は、投与の目的で複数の用量に分割され得る。結果として、単回投与組成物は、そのような量またはその約倍数を含み、1日投与量を構成し得る。しかしながら、本開示の化合物および組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。

また、本明細書に記載の状況（state）、疾患、障害、および状態（condition）のそれぞれ、ならびに他のものは、本明細書に記載の組成物および方法から利益を得ることができる。一般に、状況、疾患、障害、または状態の治療には、状況、疾患、障害、または状態に苦しんでいる、またはその素因がある可能性があるが、まだその臨床的または亜臨床的症状が表示されていない哺乳動物の臨床症状の出現を予防または遅延させることが含まれる。治療はまた、状況、疾患、障害、または状態を抑制すること、例えば、疾患またはその少なくとも１つの臨床的または亜臨床的症状の発症を阻止または低減することを含み得る。さらに、治療は、疾患を軽減すること、例えば、状況、疾患、障害、または状態、あるいはその臨床的または亜臨床的症状の少なくとも１つの退行を引き起こすことを含み得る。治療される対象への利益は、統計的に有意であるか、または少なくとも対象または医師にとって知覚可能であり得る。

内胚葉系統の細胞またはベータ細胞の投与は、単一のイベントとして、または治療の時間経過にわたって行ってよい。例えば、内胚葉系統の細胞またはベータ細胞は、毎日、毎週、隔週、または毎月投与することができる。急性状態の治療の場合、治療の時間経過は通常、少なくとも数日である。特定の状態は、治療を数日から数週間に延長する可能性がある。例えば、治療は1週間、2週間、または3週間に及ぶ可能性がある。より慢性的な状態の場合、治療は数週間から数ヶ月、さらには1年以上に及ぶ可能性がある。

本明細書に記載の方法に従った治療は、糖尿病または機能不全の内胚葉細胞に関連する他の疾患に対する従来の治療法の前、同時、または後に実施することができる。

投与：
本明細書に記載の薬剤および組成物は、当技術分野で知られている様々な手段にて、本明細書に記載の方法に従って投与することができる。薬剤および組成物は、外因性材料または内因性材料のいずれかとして治療的に使用することができる。外因性薬剤は、体外で生成または製造され、体に投与される薬剤である。内因性薬剤は、体内または体内の他の臓器への送達のために、ある種の装置（生物学的その他）によって体内で生成または製造される薬剤である。

上記のように、投与は、埋込、移植、非経口、肺、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼科、頬側、または直腸投与であり得る。

本明細書に記載の薬剤および組成物は、当技術分野で周知の様々な方法で投与することができる。投与には、例えば、直接注射（例えば、全身的または定位的）、移植、または生成された細胞の埋込、経口摂取、細胞放出生体材料、ポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧システム、多層コーティング、微細粒子、埋め込み型マトリックスデバイス、ミニ浸透圧ポンプ、埋め込み型ポンプ、注入可能なゲルおよびヒドロゲル、リポソーム、ミセル（例えば、最大30μm）、ナノスフェア（例えば、1μm未満）、ミクロスフェア（例えば、1-100μｍ）、貯蔵装置、上記のいずれかの組み合わせ、または様々な比率で所望の放出プロファイルを提供するための他の適切な送達媒体を含む方法が含まれ得る。薬剤または組成物の制御放出送達の他の方法は当業者に知られており、本開示の範囲内である。

送達システムは、例えば、特定の臓器または腫瘍にインスリンまたは化学療法を送達するために使用されるのと同様の方法で細胞を投与するために使用され得る注入ポンプを含み得る。典型的には、そのようなシステムを使用して、細胞は、選択された部位で制御された期間にわたって細胞を含むまたは放出する生分解性、生体適合性ポリマーインプラントと組み合わせて投与することができる。高分子材料の例には、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン酢酸ビニル、およびそのコポリマーおよびそれらの組み合わせが含まれる。さらに、制御放出システムは、治療標的の近くに配置することができ、したがって、全身投与量のほんの一部しか必要としない。

薬剤は、さまざまな担体送達システムにカプセル化して投与できる。担体送達システムの例には、ミクロスフェア、ヒドロゲル、高分子インプラント、スマート高分子担体、およびリポソームが含まれる（一般に、UchegbuおよびSchatzlein編(2006)Polymers in Drug Delivery, CRC, ISBN-10: 0849325331を参照）。分子または生体分子の薬剤送達のための担体ベースのシステムは、治療細胞のその作用部位への輸送を改善することができる；他の薬剤または賦形剤との共局在沈着を可能にすることができる；インビボでの細胞の安定性を改善することができる；クリアランスを減らすことにより、作用部位での細胞の滞留時間を延長することができる；非標的組織への細胞の非特異的送達を減少させることができる；薬剤の免疫原性を変えることができる；投与頻度を減らすことができる；または製品の貯蔵寿命を改善することができる。

スクリーニング：
スクリーニングのための方法も提供される。スクリーニング方法は、本明細書に記載の方法のいずれかによって生成された細胞を提供すること、および化合物または組成物（例えば、分泌促進物質）を細胞に導入することを含むことができる。例えば、スクリーニング方法は、薬物スクリーニングまたは本明細書で提供される内胚葉系統の任意の細胞またはベータ細胞での毒性スクリーニングに使用することができる。

主題の方法は、様々な異なる候補分子（例えば、潜在的に治療可能な候補分子）のスクリーニングにおいて使用を見出す。本明細書に記載の方法によるスクリーニングの候補物質には、組織または細胞の画分、核酸、ポリペプチド、siRNA、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重らせん化合物、抗体、および小さい（例えば、約2000mw未満、または約1000mw未満、または約800mw未満）有機分子または無機分子（塩または金属を含むがこれらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。

候補分子は、多数の化学クラス、例えば、分子量が50ダルトンを超え約2500ダルトン未満の小さな有機化合物などの有機分子を包含する。候補分子は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含むことができ、典型的に少なくともアミン、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、および通常は少なくとも2つの官能化学基を含む。候補分子は、上記の官能基の1つまたはそれ以上で置換された環状炭素または複素環構造および/または芳香族または多芳香族構造を含むことができる。

候補分子は、化合物のライブラリデータベース内の化合物であり得る。当業者は、例えば、スクリーニング用の市販の化合物に関する多数のデータベースに一般的に精通している（例えば、分子の12の異なるサブセットにわたる270万の化合物を有するZINCデータベース、UCSF；Irwin and Shoichet (2005) J Chem Inf Model 45, 177-182を参照）。当業者はまた、商業的供給源または望ましい化合物およびさらなる試験のための化合物のクラスを特定するための様々な検索エンジンに精通している（例えば、ZINCデータベース; eMolecules.com；およびベンダー、例えばChemBridge、Princeton BioMolecular、Ambinter SARL、Enamine、ASDI、Life Chemicalsによって提供される商業的化合物の電子ライブラリを参照）。

本明細書に記載の方法によるスクリーニングのための候補分子には、リード様化合物および薬物様化合物の両方が含まれる。リード様化合物は、一般に、比較的少ない特性（例えば、約3個未満の水素供与体および／または約6未満水素受容体；約-2から約4の疎水性特性xlogP）を有する比較的小さな足場様構造（例えば、約150から約350kDの分子量）を有すると理解されている。（例えば、Angewante(1999)Chemie Int. ed. Engl. 24, 3943-3948を参照）。対照的に、薬物様化合物は、比較的多くの特性（例えば、約10未満の水素受容体および／または約8未満の回転可能な結合；約5未満の疎水性特性xlogP）を有する比較的大きな足場（例えば、約150から約500kDの分子量）を有すると一般に理解されている。（例えば、Lipinski(2000)J. Pharm. Tox. Methods 44, 235-249を参照）。最初のスクリーニングは、リード様化合物を使用して実行できまる。

空間配向データからリードを設計する場合、特定の分子構造が「薬物様」として特徴付けられることを理解することが役立ち得る。このような特性評価は、薬局方内の既知の薬物の幅全体にわたる類似性を比較することによって導き出された、経験的に認識された一連の品質に基づくことができる。薬物がこれらの特性のすべて、またはいずれかを満たす必要はないが、薬物様である場合、薬物候補が臨床的に成功する可能性がはるかに高くなる。

これらの「薬物様」特性のいくつかは、リピンスキーの4つの法則（それらの中で5番が普及しているため、一般に「5の法則」として知られている）にまとめられている。これらの法則は一般に経口吸収に関連し、リード最適化の際の化合物のバイオアベイラビリティを予測するために使用されるが、本開示の方法を使用することによって達成できるような合理的なドラッグデザインの努力中にリード分子を構築するための効果的なガイドラインとして役立つ。

4つの「5の法則」では、候補となる薬物様化合物は、次の特性のうち少なくとも3つを備えている必要があるとされている：（i）500ダルトン未満の重量；（ii）5未満のPの対数；（iii）5以下の水素結合ドナー（OH基とNH基の合計として表される）；および（iv）10以下の水素結合アクセプター（N原子とO原子の合計）。また、薬物様分子は、通常、約8Åから約15Åの間のスパン（幅）を有する。

キット：
キットもまた提供される。そのようなキットは、本明細書に記載の薬剤または組成物、および特定の実施形態では、投与のための説明書を含むことができる。このようなキットは、本明細書に記載の方法の実行を容易にすることができる。キットとして提供される場合、組成物の異なる成分は別々の容器に包装され、使用直前に混合され得る。成分には、本明細書に記載の幹細胞、培地、および因子が含まれるが、これらに限定されない。成分のそのような別個の包装は、必要に応じて、組成物を含む1つまたはそれ以上の単位剤形を含み得るパッケージ、パック、またはディスペンサーデバイスで提示することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含み得る。このように成分を個別にパッケージ化することで、場合によっては、成分活性を失うことなく長期保管を行うこともできます。

キットはまた、例えば、別々に包装された凍結乾燥された活性成分に添加される滅菌水または生理食塩水などの別々の容器内の試薬を含み得る。例えば、密封されたガラスアンプルは、凍結乾燥された成分を含み得、別個のアンプル中に、それぞれが窒素などの中性の非反応性ガス下で包装された滅菌水、滅菌生理食塩水または滅菌を含み得る。アンプルは、任意の適切な材料、例えば、ガラス、有機ポリマー、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、セラミック、金属または試薬を保持するために通常使用される任意の他の材料からなり得る。適切な容器の他の例には、アンプルと同様の物質から製造され得るボトル、およびアルミニウムまたは合金などのホイルで裏打ちされた内部からなり得る包装が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、注射器などが含まれる。容器は、皮下注射針によって突き刺すことができるストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有し得る。他の容器は、容易に取り外し可能な膜によって分離された２つの区画を有し得、これは、取り外されると成分が混合することを可能にする。取り外し可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであり得る。

特定の実施形態では、キットは、説明材料とともに供給され得る。説明書は、紙または他の基板に印刷することができ、および／または電子読み取り可能な媒体、例えば、フロッピーディスク、ミニCD-ROM、CD-ROM、DVD-ROM、Zipディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどとして提供することができる。詳細な手順は、キットに物理的に関連付けられていなくてもよい。代わりに、ユーザーはキットの製造元または販売元によって指定されたインターネットWebサイトに誘導されてよい。

分子生物学プロトコルを利用する本明細書に記載の組成物および方法は、当技術分野で知られている様々な標準技術に従うことができる（例えば、SambrookおよびRussel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10:0879697717；Ausubelら、(2002) Short Protocols in Molecular Biology、第5版 ed., Current Protocols, ISBN-10:0471250929；SambrookおよびRussel(2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10:0879695773；Elhai, J.およびWolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754；Studier(2005)Protein Expr Purif. 41(1), 207-234；Gellissen, ed.(2005)Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10:0954523253を参照）。

本明細書に記載の定義および方法は、本開示をよりよく定義し、本開示の実施において当業者を導くために提供される。特に断りのない限り、用語は、関連技術の当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。

いくつかの実施形態では、本開示の特定の実施形態を説明および主張するために使用される、成分の量、分子量などの特性、反応条件等を表す数字は、場合によっては「約」という用語によって変更されると理解されるべきである。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されるデバイスまたは方法の平均の標準偏差を含むことを示すために使用される。いくつかの実施形態では、書面による説明および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして、および通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。本開示のいくつかの実施形態の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、実行可能な限り正確に報告される。本開示のいくつかの実施形態で提示される数値は、それぞれの試験測定で見出される標準偏差に必然的に起因する特定の誤差を含み得る。本明細書での値の範囲の列挙は、範囲内にある個々の値を個別に参照する簡単な方法として機能することを意図しているにすぎない。本明細書に別段の記載がない限り、個々の値は、本明細書に個別に記載されているかのように明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、特定の実施形態を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の特定の文脈で）使用される用語「a」および「an」および「the」および同様の参照は、特に明記されていない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈することができる。いくつかの実施形態では、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される「または」という用語は、選択肢のみを指すように明示的に示されない限り、または選択肢が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用される。

「comprise」、「have」、「include」という用語は、解放形式の連結動詞である。「comprises」、「comprising」、「has」、「having」、「includes」および「including」など、これらの動詞の1つまたはそれ以上の形式または時制もまた解放形式である。例えば、1つまたはそれ以上の工程を「含む（comprises）」、「持つ（has）」または「含む（includes）」方法は、それらの1つまたはそれ以上の工程のみを所有することに限定されず、他の挙げられていない工程も包含し得る。同様に、1つまたはそれ以上の特性を「含む（comprises）」、「持つ（has）」または「含む（includes）」組成物またはデバイスは、それらの1つまたはそれ以上の特性のみを所有することに限定されず、他の挙げられていない特性を包含し得る。

本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意のすべての例または例示的な言語（例えば、「など（such as）」）の使用は、単に本開示をよりよく明らかにすることを意図しているにすぎず、他の方法で主張される（otherwise claimed）本開示の範囲に限定を付すものではない。本明細書のいかなる文言も、本開示の実施に不可欠なクレームされていない（non-claimed）要素を示すものとして解釈されるべきではない。

本明細書に開示される本開示の選択要素または実施態様のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループの成員は、個別に、またはグループの他の成員または本明細書に見られる他の要素との任意の組み合わせで参照および請求することができる。グループの1つまたはそれ以上の成員は、利便性または特許性の理由から、グループに包含することも、グループから削除することもできる。そのような包含または削除が発生した場合、本明細書では、変更されたグループが含まれていると見なされ、したがって、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマルクーシュグループの書面による説明（written description）を満たす。

本出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および他の参考文献は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の参考文献がすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における参考文献の引用は、それが本開示の先行技術であることを認めるものと解釈されるべきではない。

本開示を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲で定義された本開示の範囲を逸脱することなく、修正、変形、および同等の実施形態が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示におけるすべての例は、非限定的な例として提供されることが理解されるべきである。

実施例：
以下の非限定的な実施例は、本開示をさらに説明するために提供される。以下の実施例に開示される技術は、本発明者らが本開示の実施において十分に機能することを発見したアプローチを表し、したがって、その実施のためのモードの例を構成すると見なすことができることを当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでも本開示の精神および範囲から逸脱することなく同様の結果を得ることができることを理解すべきである。

実施例１
ヒト幹細胞由来のベータ細胞における動的機能の獲得：
以下の実施例では、大量のインスリンを分泌し、グルコース応答性で、第1相と第2相の両方のインスリン放出を示す幹細胞由来β（SC-β）細胞の機能的成熟を改善するための新しい6ステージの分化戦略について説明する。また、幹細胞由来のβ細胞における動的機能もここで記載する。

ヒト多能性幹細胞（hPSC）分化プロトコルの最近の進歩により、膵臓β細胞に似たインスリン産生細胞が生成された。これらの幹細胞由来β（SC-β）細胞はグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を受けることができるが、細胞あたりのインスリン分泌は膵島と比較して低いままであり、明確な第1相および第2相の動的インスリン放出を欠いている。ここでは、この研究は、TGFβシグナル伝達のモジュレーション、細胞クラスターサイズの制御、および富化無血清培地（ESFM）を使用して、β細胞マーカーを発現し、第1相および第2相の動的なインスリン分泌を伴ってGSISを受けるSC-β細胞を生成することに焦点を当てた分化戦略を報告する。これらの細胞をマウスに移植すると、耐糖能が大幅に向上する。これらの結果は、動的機能を達成するために、SC-β細胞の分化中にTGFβシグナル伝達を阻害および許可するための特定の時間枠（または期間）が必要であることを明らかにしている。これらの細胞が動的なインスリン放出を伴うGSISを受ける能力により、これらの細胞は糖尿病細胞療法の有望な細胞源になる。

前書き：
糖尿病は、世界中で4億人以上が罹患している世界的な健康問題であり、有病率が高まっている。糖尿病は主に、膵臓のランゲルハンス島内に見られるインスリン産生β細胞の死または機能不全によって引き起こされ、不適切なインスリン分泌および患者の正常な血糖の維持の失敗をもたらし、重症の場合、ケトアシドーシスおよび死を引き起こし得る。患者はしばしばインスリン注射に依存しているが、それでも網膜症、神経障害、腎症、および心血管疾患を含む長期的な合併症に苦しむ可能性がある。代替治療は、膵島の移植による内因性β細胞の置換である。この治療法は臨床的に成功しているが、死体ドナー膵島の限られた利用可能性は、その広範な適用を大きく妨げている。

hPSCの幹細胞由来β細胞（SC-β細胞）への分化は、糖尿病細胞補充療法や他の応用（疾患のモデリングおよび膵臓の発達の研究など）のための有望な代替細胞源である。胚発生から特定された経路のモジュレーションを通じて、hPSCを用いた研究は初期内胚葉および膵臓前駆細胞に似た細胞を生成するためのプロトコルの詳細を明らかにし、後者（膵臓前駆細胞）はげっ歯類に移植されて数か月後に自然にβ様細胞に分化する。

化合物Alk5阻害剤タイプII（Alk5i）を部分的に使用して、分化の最終段階でTGFβシグナル伝達を阻害する、インビトロでSC-β細胞を生成するためのアプローチが発表されている³⁰。これらのアプローチによって初めて、静的インキュベーションでGSISを受け、β細胞マーカーを発現し、数週間後に糖尿病マウスの血糖値を制御できるSC-β細胞が生成された。しかしながら、これらの細胞は、ヒト膵島と比較して低いインスリン分泌、高グルコースチャレンジに応答した第1相および第2相のインスリン放出がほとんどまたはまったくないことを含めて機能が劣っており、これらのSC-β細胞が膵島のβ細胞よりも成熟していないことを示していた。新しい分化因子を導入したり、プロセスを最適化したりするいくつかの追跡研究が実施されたが、SC-β細胞の機能をヒトの膵島と同等にすることはできなかった^14,26,36,55。

ここで、この研究は、細胞クラスターのサイズ変更およびESFM培養と組み合わせて、Alk5i曝露をモジュレーションして主要なステージでTGFβシグナル伝達を阻害および許可することにより、高レベルのインスリンを分泌しβ細胞マーカーを発現する、内分泌を含むβ様細胞のほぼ純粋な集団を生成する新しい6ステージの分化戦略を説明する。これらの細胞はグルコース応答性であり、第1相および第2相のインスリン放出を示し、複数の分泌促進物質に応答する。移植された細胞は、マウスの耐糖能を大幅に改善する。この研究は、ステージ6でTGFβシグナル伝達を阻害すると、これらの分化細胞の機能が大幅に低下する一方で、ステージ5でのAlk5iによる処理が強力なβ様細胞表現型に必要であることを示している。

結果：
インビトロでのグルコース応答性SC-β細胞への分化：
HUES8細胞株を使用して改良された分化プロトコルを開発した。Y27632をステージ3〜4に、アクチビンAをステージ4に含ませて、クラスターの整合性（cluster integrity）を維持し、ステージ3を2日からわずか1日に短縮して前駆細胞を強化した。また、以前使用されていた血清含有培地に代えるものとしてステージ6用にESFMを開発し、無血清プロトコルとした。プロトコルパイロット研究中に、クラスターのサイズ変更とAlk5iおよびT3の除去の両方が、C-ペプチド+集団を維持しながらインスリン分泌を増加させることが観察された（例えば、図８Ａ〜図８Ｂを参照）。

これらの変更を組み合わせることにより、図１Ａに概説される新しい6ステージの分化プロトコルがもたらされた。ステージ6の細胞は、直径が平均172±34μm（平均±標準偏差；n=353個の個々のクラスター）の懸濁培養（図１Ｂを参照）でクラスターとして成長し、これはサイズ変更前のクラスターの直径（364±55μm；n=155個のクラスター）の半分未満であった。ステージ6のクラスターは、 β細胞を染色する亜鉛キレート色素ジチゾン（DTZ）で赤く染色されている。切片化されたクラスターの免疫染色により、ほとんどの細胞が、PDX1+およびNKX6-1+、β細胞マーカーに加えて、INS遺伝子によっても産生されるタンパク質であるC-ペプチド+であることが明らかになった（例えば、図１Ｃを参照）。細胞のサブセットは、グルカゴン（GCG+）に対して陽性に染色されたか、または多ホルモン性（polyhormonal）であり、C-ペプチドとGCGの両方に対して陽性に染色された。これらの多ホルモン性細胞は、成人のβ細胞に似ていないことが知られており、機能しない。

静的GSISアッセイ（例えば、図１Ｄ〜図１Ｅ；図８Ｃを参照）および動的GSISアッセイ（例えば、図１Ｆ；図８Ｄを参照）の両方を使用して、新しい分化プロトコルで生成されたステージ6細胞について機能を試験したところ、細胞がインスリンを分泌するだけではなく、低グルコースから高グルコースに移したときにインスリン放出を増加させることが見出された。静的GSISでは、ある程度の変動はあったが、ステージ6の細胞は2から20mMのグルコースに移ると、平均で3.0±0.1倍インスリン分泌を増加させた。これは以前に公開されたプロトコル（ここではPagliucaプロトコル³⁰と称する）から生成された細胞（1.4±0.1）と比較して改善されているが、平均してヒト膵島（3.2±0.1）よりは少ない（例えば、図１Ｄを参照）。この研究のステージ6細胞は、5.6mMグルコースに応答してインスリン分泌を増加させなかったが、高濃度（11.1および20mM）には応答して分泌を増加させたので、細胞は低グルコース閾値によって刺激されないことを示している（例えば、図１Ｅを参照）。細胞あたりのインスリン分泌に関しては、ステージ6細胞は、20mMグルコースで平均5.3±0.5μIU/10³細胞を分泌し、Pagliucaプロトコルで生成された細胞の9.2±1.1倍、ヒト膵島の2.3±0.3倍であった（例えば、図１Ｄを参照）。

動的GSISでは、ステージ6細胞は、高グルコース曝露から3〜5分以内に迅速な第1相インスリン放出を示し、159±21μIU/μgDNAに7.6±1.3倍インスリン分泌を増加させ、ステージ6細胞からPagliucaプロトコルで生成されたもの（11±1μIU/μgDNAに1.7±0.2倍増加）よりも高いが、ヒト膵島（245±26μIU/μgDNAに15.0±2.4倍増加）よりも低かった（例えば、図１Ｆを参照）。第2相のインスリン分泌は、継続的な高グルコース曝露で観察され、細胞は最初の低グルコースよりも2.1±0.3高いインスリン分泌を維持し、Pagliucaプロトコル（0.9±0.1）よりも高い増加であるが、ヒト膵島（6.7±0.8）よりも低かった（例えば、図１Ｆを参照）。細胞を低グルコースに戻すと、ステージ6の細胞からのインスリン分泌は低下した速度に戻った。インスリン分泌を高め、高グルコースチャレンジへの第1相および第2相のインスリン放出を示すことは、β細胞の挙動の重要な特徴である。全体として、この分化戦略で生成されたステージ6細胞は、明確な第1相および第2相のインスリン分泌を伴う細胞を生成したが、これはPagliuca³⁰では実証されず、Pagliucaプロトコルで生成されたステージ6細胞では見られなかった。しかしながら、β細胞を含むヒト膵島と比較した場合、これらのステージ6細胞は、高グルコースでの細胞あたりのインスリン分泌が低く、平均してグルコース刺激が低く、第1相インスリン放出がわずかに遅い。

新しい分化プロトコルで生成されたステージ6細胞をさらに特徴づけるため、細胞を膵島マーカーのパネルで免疫染色した（例えば、図２Ａ〜２Ｃ、図９を参照）。細胞の大部分は汎内分泌マーカーであるクロモグラニンA（96±1％）を発現し、ほとんどの細胞はC-ペプチド（73±3％）を発現した（例えば、図２を参照）。これらの画分は、Pagliucaプロトコルで生成されたステージ6細胞（例えば、図９を参照）および以前に報告されたもの³⁰よりも高い。両方のプロトコルからの多くのC-ペプチド+細胞は、β細胞に見られる他のマーカーを発現し、他の膵臓ホルモンの発現が観察された（例えば、図２、図９を参照）。C-ペプチド+細胞の大部分は、NKX6-1を発現し（例えば、図２を参照）、単ホルモン性（monohormonal）であり、これはSC-β細胞集団であると推定された。別のホルモンを発現しないC-ペプチド+細胞の割合は、Pagliucaプロトコルで生成されたステージ6細胞および以前に報告されたもの³⁰と比較して増加したが、別のホルモンを発現するこれらの細胞の割合は同等であった（例えば、図２、図９を参照）。このデータは、この新しい戦略で生成されたステージ6細胞が主に膵臓内分泌であり、大部分がCペプチドを発現していることを示している。

Pagliucaプロトコルで生成されたステージ6細胞、本研究からのプロトコルで生成されたステージ6細胞、およびヒト膵島を比較して、いくつかの遺伝子の発現を測定した（例えば、図２Ｄおよび図１０を参照）。INS、CHGA、NKX2-2、PDX1、NKX6-1、MAFB、GCKおよびGLUT1を含む多くの膵島およびβ細胞遺伝子がPagliucaプロトコルと比較して増加した。興味深いことに、許可されていないβ細胞遺伝子であるLDHAおよびSLC16A1は、Pagliucaプロトコルおよびヒト膵島の両方（LDHA）およびPagliucaプロトコル（SLC16A1）と比較して、ステージ6細胞での発現が低下してした。この研究のプロトコルから生成されたステージ6細胞は、ヒト膵島と比較してCHGA、NKX6-1、MAFB、GCK、およびGLUT1の発現が増加していた。しかしながら、INS、GCG、SST、特にMAFAおよびUCN3は、ステージ6細胞と比較して発現が低下していた。しかしながら、いくつかの最近の報告は、ヒトSC-β細胞の成熟を評価する際のMAFAおよびUCN3の有用性に疑問を呈する証拠を提供している。MAFAの発現は、ヒトの幼若β細胞では低い。MAFBはヒトでは発現されるが、マウスβ細胞では発現されない。UCN3の発現は、ヒトβ細胞よりもマウスではるかに高く、ヒトα細胞でも発現されている。このデータは、この研究で生成されたステージ6細胞が、Pagliucaプロトコルと比較して多くのマーカーの遺伝子発現を改善し、いくつかのβ細胞マーカーの発現がヒト膵島と同等かそれ以上である一方で、他のマーカーは低いままであることを示している。

SC-β細胞の耐糖能異常マウスへの移植：
インビボでのステージ6細胞の機能的可能性を評価するため、細胞を最初に非糖尿病マウスの腎被膜下に移植し、グルコースチャレンジに応答する移植片の能力を評価した（例えば、図３Ａを参照）。移植後の長期間（6ヶ月）後でも、移植片は、ヒトインスリンを1.9±0.5倍増加させることにより、グルコース注射に応答した。移植された腎臓の切除および免疫染色は、他の膵臓内分泌および外分泌マーカーに加えて、一緒にクラスター化される傾向があるC-ペプチド+細胞を明らかにした（例えば、図３Ｂ；図１１Ａを参照）。インビボでステージ6細胞をより厳密に評価するため、ストレプトゾトシン（STZ）で糖尿病になるように化学的に誘導された別のマウスコホートを移植し、機能を初期（10および16日）および後期（10週）の時点で評価した。移植後わずか10日後、ステージ6細胞を投与されたSTZ処置マウスは、STZ処置偽マウスと比較して耐糖能が大幅に改善され、STZ処置なしのマウスと同様のグルコースクリアランスを有した（例えば、図３Ｃ〜図３Ｄを参照）。移植16日後のヒトインスリンの測定は、グルコース注射で16.6±3.1μIU/mLに2.3±0.6倍増加した高いインスリン濃度を明らかにした（例えば、図３Ｅを参照）。これらの値は、同様の条件下で以前に報告された値³⁰（1.4±0.3のインスリン増加および3.8±0.8μIU/ mLの濃度）よりも大きい。移植の10週間後にコホートを観察すると、10日および16日のデータと同様の結果が明らかになり、移植されたマウスは、耐糖能（例えば、図３Ｆ〜図３Ｇを参照）およびグルコース応答性インスリン分泌（例えば、図３Ｈを参照）が大幅に改善された。STZを投与されていないマウスは、治療用量のヒト膵島を投与されたマウスと同様の耐糖能を示した。ステージ6細胞を投与されなかったマウスは、検出できないヒトインスリンを有し、STZを投与されたマウスは、非STZ処置マウスと比較して、マウスC-ペプチドを劇的に減少させた（例えば、図１１Ｂ〜図１１Ｃを参照）。これらのSTZ処置マウスからの移植片は、他の内分泌および外分泌マーカーに加えてβ細胞マーカーを発現する細胞を含んでいた（例えば、図１１Ｄを参照）。全体として、このデータは、新しいプロトコルで生成されたステージ6細胞が、インビボの初期および後期の両方の時点で機能し、STZ処理されていないマウスと同等の耐糖能まで耐糖能を大幅に改善することを示している。

SC-β細胞の動的機能の特徴付け：
分化プロトコルは動的なインスリン分泌が可能な細胞を生成するため、この表現型をより詳細に研究した。細胞がステージ6を進行するときに、動的GSISを細胞に対して行った（例えば、図４Ａを参照）。堅牢な動的機能は一過性であり、後の時点（9〜26日）では明確な第1相および第2相の応答で大量のインスリンを分泌したが、5日目の細胞は少量のインスリンを分泌し、弱い第1相および第2相を示した。この間、C-ペプチド+細胞の割合はわずかに減少した（例えば、図１２Ａを参照）。35日までに、低グルコースでのインスリン分泌が上昇し、第1相および第2相を明確に特定することは困難であった。このデータは、SC-β細胞が動的機能を獲得するためにはステージ6で9日を必要とし、この機能は数週間持続するが、拡張したインビトロ培養の後にグルコース応答性が失われることを示している。同様に、死体のヒト膵島は、インビトロでの機能的寿命が限られていることが知られており、その原因は明らかではない。このデータはさらに、これらの細胞が移植および薬物スクリーニング研究で使用されるのに最適な時間枠を示唆している。動的インスリン分泌をさらに特徴付けるため、灌流実験を実施して、SC-β細胞がいくつかの既知の分泌促進物質による連続的なチャレンジに応答できるかどうかをアッセイした（例えば、図４Ｂを参照）。最初の高グルコースチャレンジの後、SC-β細胞は、最初のチャレンジよりも強くはないが、2回目の高グルコースのみのチャレンジに応答することができ、別の実験で最初のグルコースチャレンジを1時間に延長してもインスリン分泌は減少しなかった（例えば、図４Ｃを参照）。2回目のチャレンジ中に他の分泌促進物質を加えると、インスリン分泌がさらに増加した（例えば、図４Ｂを参照）。膜脱分極剤KClとL-アルギニンが最大の増加を示した。トルブタミド（カリウムチャネルを遮断する）、3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX；細胞質ゾルcAMPを上昇させる）、およびエキセンディン-4（GLP-1受容体のアゴニスト）も、高グルコース単独よりもインスリン分泌を増加させた。インスリン分泌が増加しただけでなく、高グルコース単独の場合よりも速く上昇した。しかしながら、KClチャレンジに対するステージ6細胞の応答は、ヒト膵島よりも強く（例えば、図１２Ｂを参照）、β様細胞をヒト膵島と比較する他の人によってなされた観察は、おそらく継続的な未成熟または幼若β細胞表現型を示している。まとめると、これらのデータは、SC-β細胞が多様な作用機序を持ち、薬物スクリーニングに応用できる可能性のあるいくつかの分泌促進物質に応答できることを示している。

SC-β細胞の分化および成熟におけるTGFβシグナル伝達の役割：
新しいプロトコルで生成されたSC-β細胞を評価した後、SC-β細胞の分化および成熟についての洞察を得るため、行われたプロトコルの変更を調べた。ステージ6中にAlk5iを含めると、静的アッセイで比較的弱いが統計的に有意なGSISが得られたが、Pagliucaプロトコルからのデータ（例えば、図１Ｄを参照）と同様に、Alk5iを省略するとインスリン分泌およびグルコース刺激が大幅に増加した（例えば、図５Ａおよび図１３Ａを参照）。インスリン含有量はまた、ステージ6中のAlk5iの除去とともに増加したが（例えば、図５Ｂを参照）、プロインスリン／インスリン比は同様のままであり（例えば、図５Ｃを参照）、インスリン含有量の増加はホルモン処理によるものではないことを示唆していた。さらに、C-ペプチドを含む膵臓内分泌マーカーを発現する細胞の割合は、DMSO処理細胞とAlk5i処理細胞との間で同様のままであった（例えば、図５Ｄ〜図５Ｅ、図１３Ｂを参照）。遺伝子発現は、Alk5i処理の有無にかかわらず全体的に類似しており、クラスターのサイズ変更が通常、より大きな効果をもたらした（例えば、図１３Ｃを参照）。ステージ6の間にAlk5iで処理された細胞はまた、動的GSISアッセイでインスリン分泌を劇的に減少させ、Pagliucaプロトコルで生成された細胞（例えば、図１Ｆを参照）と同様に、弱い第1および第2相応答を示すかまたは第1および第2相応答を示さなかった（例えば、図５Ｆを参照）。このデータは、ステージ6でのAlk5i処理がSC-β細胞の機能的成熟を阻害することを示している。

ステージ6でのAlk5iの研究では、TGFBR1の阻害がAlk5iの標準的な機能であるため、SC-β細胞の強力な機能的成熟にはTGFβシグナル伝達を許可する必要があることが示唆された。この仮説を試験するため、ウエスタンブロット分析を使用して、TGFβシグナル伝達がSMADリン酸化を介してステージ6細胞で起こっていることを検証した（例えば、図６Ａを参照）。Alk5i処理はリン酸化SMADを減少させ、TGFβシグナル伝達が実際に起こっており、Alk5iによって阻害されたことを確認した。SMADリン酸化は、サイズ変更の有無にかかわらずステージ6クラスターで観察され、Alk5i処理によりサイズ変更にかかわらずGSISが減少したという観察結果と一致した（例えば、図１４を参照）。次に、TGFBR1をノックダウンするように設計されたshRNAを運ぶ2つのレンチウイルス（TGFBR1＃1および＃2）を生成した。これらのウイルスは、Alk5i処理よりもはるかに少ない程度ではあるが（例えば、図６Ｃ、図１４を参照）、ステージ6細胞においてGFPを標的とする対照ウイルスと比較してTGFBR1転写物を減少させることができ（例えば、図６Ｂを参照）、SMADリン酸化を減少させた（例えば、図６Ａを参照）。Alk5i処理（例えば、図５Ａ、図５Ｆを参照）と同様に、TGFBR1に対するshRNAで形質導入されたステージ6細胞は、インスリン分泌が減少し、静的GSISアッセイにおいて陽性グルコース応答性が減少し（例えば、図６Ｃを参照）、動的GSISアッセイにおいてグルコース応答性が鈍化した（例えば、図６Ｄを参照）。このデータは、ステージ6でTGFβシグナル伝達を可能にすることが、Alk5iでの処理によって阻害されるSC-β細胞の機能的成熟にとって重要であることを示している。

最後に、Alk5iの役割を分化のステージ5で調べて、膵臓内分泌細胞への分化に対するAlk5iの影響を評価した。これらの実験は、図１Ａに概要を示すように、Alk5iの存在下または不在下で行った。Alk5iを省略することにより、内分泌細胞（CHGA+）に分化した細胞の割合は変化しなかったが、C-ペプチド+表現型に分化した細胞の割合は減少した（例えば、図７Ａ−図７Ｃを参照）。同様に、C-ペプチドとNKX6-1（β細胞を特定するための重要な転写因子）を共発現する細胞の割合は、Alk5iを省略することによって減少した。INSおよびGCG遺伝子発現はAlk5iの省略により減少したが、驚くべきことにSST発現はわずかに増加した（例えば、図７Ｄを参照）。いくつかの膵臓内分泌マーカーの発現は、変化しないかまたはわずかに変化しただけであったが（例えば、図７Ｆを参照）、NKX6-1およびPDX1の発現は、Alk5iなしで減少した（例えば、図７Ｅを参照）。ステージ5でAlk5iの重要性をさらに試験するため、ステージ5にてAlk5iで処理したまたは処理していない細胞を、Alk5iなしでクラスターのサイズ変更もせずにステージ6でさらに7日間培養したところ、インスリン分泌はステージ5にてAlk5iで処理した細胞で大幅に高かった（例えば、図７Ｇを参照）。まとめると、これらのデータは、ステージ5でのAlk5i処理が、β様細胞消長への特定にプラスの影響を与え、内分泌細胞を特定するのに必要でなく、結果として生じるSC-β細胞の高インスリン分泌に必要であることを示している。さらに、これらの観察結果は、SC-β細胞の生成と機能的成熟の両方に対するTGFβシグナル伝達阻害剤Alk5iのステージ特異的な処理の重要性を示している。

考察：
この研究は、SC-β細胞の機能的成熟の強化が新しい6ステージの分化戦略で達成されることを示している。これらの細胞は大量のインスリンを分泌し、グルコース応答性であり、第1相と第2相の両方のインスリン放出を示す。この分化手順により、選択や選別を行わなくてもほぼ純粋な内分泌細胞集団が生成され、ほとんどの細胞はC-ペプチドやその他のβ細胞マーカーを発現する。STZ処理マウスに移植すると、耐糖能は急速に回復し、機能は数ヶ月持続する。これらのSC-β細胞は、灌流アッセイで複数の分泌促進物質に応答する。TGFβシグナル伝達のモジュレーションは成功に不可欠であり、ステージ5での阻害はSC-β細胞の分化を増加させるが、ステージ6での阻害は機能およびインスリン含有量を減少させる。強力な動的機能には、ステージ6でTGFβシグナル伝達を許可する必要があった。

以前に報告されたプロトコル^30,32によって生成されたSC-β細胞は、グルコース刺激に応答して強力な第1相および第2相のインスリン放出を生成しない。どちらのプロトコルも分化の最終ステージでTGFβシグナル伝達を阻害し、その後の多くの報告には、適切な動的機能を示すことなくTGFβシグナル伝達の阻害剤も含まれている。しかしながら、本研究の主な観察は、重要な細胞移行および成熟段階でのTGFβシグナル伝達の正しいモジュレーションが機能的SC-β細胞への分化を成功させるために重要であり、ステージ6での機能的成熟の改善にはTGFβシグナル伝達を許可することが必要であるということである。

この報告のSC-β細胞は、STZ処理マウスのグルコースを10日以内に迅速に制御することができた。現在、糖尿病細胞補充療法の重要な制限は、機能的なβ細胞の持続可能な供給源の必要性であり、移植されるSC-β細胞の質を改善することは、この課題を克服するのに役立つ。この研究によって実証されたSC-β細胞を作るプロセスはスケーラブルであり、細胞は懸濁培養でクラスターとして成長および分化する。懸濁培養で細胞クラスターを使用すると、大規模な動物移植研究や治療（10⁹個の細胞のオーダー）など、多くのアプリケーションに柔軟に対応できる。

この戦略は、速度論が改善されているため、インビトロで分化したSC-β細胞の薬物スクリーニングのための有用性を高める。適切な動的インスリン放出は、糖尿病で一般的に失われるβ細胞代謝の重要な特徴である。この研究は、糖尿病におけるβ細胞障害のメカニズムをよりよく研究するために使用できる動的なインスリン放出を伴うSC-β細胞の再生可能な資源を確立し、いくつかの分泌促進物質に対するそれらの応答を示した。

プロトコルへの多数の変更の集大成は、動的なグルコース応答を示すSC-β細胞を生成した。TGFβシグナル伝達のモジュレーションに加えて、他の注目すべき変化には、血清の除去、クラスターサイズの縮小、および最終ステージで他のレポートで使用されるいくつかの追加因子（T3、N-アセチルシステイン、トロロックス、およびR428）の欠如が含まれる。この研究は、複数の細胞株にわたるプロトコルの再現性を示したが、マーカーの発現および機能はHUES8細胞株で最大であった。

方法：
未分化細胞の培養：
加湿5％CO₂ 37℃インキュベーター内にて60RPMで回転するローテーター攪拌プレート上の30mLスピナーフラスコでmTeSR1を使用し、未分化hPSC系統を培養した。細胞を単一細胞分散によって3〜4日ごとに継代した。HUES8 hESC系統、1013-4FA（非糖尿病hiPSC系統）、1016SeVA（非糖尿病hiPSC系統）、および1019SeVF（タイプ1糖尿病hiPSCライン）は以前に公開されている^26,30。加湿5％CO₂ 37℃インキュベーター内にて60RPMで回転するローテーター攪拌プレート（Chemglass）上の30 mLスピナーフラスコ（REPROCELL；ABBWVS03A）でmTeSR1（StemCell Technologies；05850）を使用し、未分化細胞を培養した。Accutase（StemCell Technologies；07920）を使用した単一細胞分散によって細胞を3〜4日ごとに継代し、Vi-Cell XR（Beckman Coulter）で生細胞をカウントし、mTeSR1+10μMY27632（Abcam；ab120129）中に6x105細胞/mLにて播種した。

細胞株の分化：
分化を開始するため、Accutaseを使用して未分化細胞を単一細胞分散させ、30mlスピナーフラスコ内のmTeSR1+10μMY27632に6x10⁵細胞/mLで播種した。次に、細胞をmTeSR1で72時間培養し、ついで以下の分化培地で培養した。ステージ1（3日間）：S1培地+100ng/mlアクチビンA（R＆D Systems：338-AC）+3μMChir99021（Stemgent；04-0004-10）1日。S1培地+100ng/mlアクチビンAで2日間。ステージ2（3日間）：S2培地+50ng/ml KGF（Peprotech；AF-100-19）。ステージ3（1日）：S3培地+50ng/ml KGF+200nM LDN193189（Reprocell；040074）+500nM PdBU（MilliporeSigma; 524390）+2μMレチノイン酸（MilliporeSigma；R2625）+0.25μM Sant1（MilliporeSigma；S4572）+10μM Y27632。ステージ4（5日間）：S4培地+5ng/mLアクチビンA+50ng/mL KGF+0.1μMレチノイン酸+0.25μM SANT1+10μM Y27632。ステージ5（7日間）：S5培地+10μM ALK5iII（Enzo Life Sciences；ALX-270-445-M005）+20ng/mLベータセルリン（R＆D Systems；261-CE-050）+0.1μMレチノイン酸+0.25μM SANT1+1μM T3（Biosciences；64245）+1μM XXI（MilliporeSigma；595790）。ステージ6（7-35日間）：ESFM。

使用した分化培地の配合組成は以下の通りであった。S1培地：0.22gグルコース（MilliporeSigma；G7528）、1.23g重炭酸ナトリウム（MilliporeSigma；S3817）、10gウシ血清アルブミン（BSA）（Proliant；68700）、10μL ITS-X（Invitrogen；51500056）、5mL GlutaMAX（Invitrogen；35050079）、22mgビタミンC（MilliporeSigma；A4544）、および5mLペニシリン/ストレプトマイシン（P/S）溶液（Cellgro；30-002-CI）を添加した500mL MCDB131（Cellgro；15-100-CV）。S2培地：0.22gグルコース、0.615g重炭酸ナトリウム、10g BSA、10μL ITS-X、5mL GlutaMAX、22mgビタミンC、および5 mL P/Sを添加した500mL MCDB131。S3培地：0.22gグルコース、0.615g重炭酸ナトリウム、10g BSA、2.5mL ITS-X、5mL GlutaMAX、22mgビタミンC、および5mL P/Sを添加した500mL MCDB131。S5培地：1.8gグルコース、0.877g重炭酸ナトリウム、10g BSA、2.5mL ITS-X、5mL GlutaMAX、22mgビタミンC、5mL P/S、および5mgヘパリン（MilliporeSigma；A4544）を添加した500mL MCDB131。ESFM：0.23gグルコース、10.5g BSA、5.2mL GlutaMAX、5.2mL P/S、5mgヘパリン、5.2mL MEM非必須アミノ酸（Corning；20-025-CI）、84μg ZnSO₄（MilliporeSigma；10883）、523μL微量元素A（Corning；25-021-CI）、および523μL微量元素B（Corning；25-022-CI）を添加した500mL MCDB131。細胞は0.01％DMSOで培養することもあった。Gentle Cell Dissociation Reagent（StemCell Technologies；07174）で8分間インキュベートし、ESFMで洗浄し、100μmナイロンセルストレーナー（Corning；431752）に通し、ついで100RPMに設定されたOrbi-Shaker（ベンチマーク）のウェルプレート中のESFMで6分間培養することにより、ステージ6の1日目に細胞のサイズを変更した。特に明記しない限り、評価アッセイはステージ6の10〜16日の間に実施した。比較のため、ヒト膵島をProdoLabsから入手した。ステージ6実験のサブセットを、クラスターのサイズ変更なしで、Alk5iおよびT3、Alk5i、および/またはCMRL 1066補足（CMRLS）（Mediatech；99-603-CV）+10％ウシ胎児血清（FBS）（HyClone；16777）+1％P/S（示されているように、ESFMではなく）。Pagliucaプロトコルを実行するため、Pagliuca, Millman, Guertler ら、. 2014³⁰に概説されているプロトコルに30mLスピナーフラスコで従った。

光学顕微鏡：
倒立光学顕微鏡（Leica DMi1）を用い、未染色または2.5μg/mLDTZ（MilliporeSigma；194832）で染色した細胞のクラスターの光学顕微鏡画像を得た。

免疫染色：
インビトロ細胞クラスターまたはマウス腎臓内のエクスビボ移植移植片を免疫染色するため、試料を4％パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Science; 15714）で4℃にて一晩固定した。固定後、細胞クラスターをHistogel（Thermo Scientific; hg-4000-012）に埋め込んだ。埋め込まれた細胞クラスターと移植片を70％エタノールに入れ、パラフィン包埋と切片化を行った。Histoclear（Thermo Scientific; C78-2-G）を使用してパラフィンを除去し、試料を再水和し、圧力鍋（Proteogenix; 2100 Retriever）で0.05M EDTA（Ambion; AM9261）を使用して抗原を回収した。試料をブロッキングし、染色緩衝液（PBS中の5％ロバ血清（Jackson Immunoresearch; 017-000-121）および0.1％Triton-X 100（Acros Organics; 327371000））で30分間透過処理し、一次抗体で4℃にて一晩染色し、二次抗体で4℃にて2時間染色し、マウンティング溶液DAPI Fluoromount-G（SouthernBiotech; 0100-20）で処理した。プレーティングした細胞を免疫染色するため、クラスターをTryplE Express（Fisher、12604039）を使用して単一細胞分散させ、Matrigel（Fisher、356230）でコーティングしたプレートにプレーティングし、ESFMで16時間培養し、4％パラホルムアルデヒドで室温にて30分間固定した。固定した細胞をブロッキングし、染色緩衝液で室温にて45分間透過処理し、4℃にて一次抗体で一晩染色し、二次抗体で室温にて2時間染色し、DAPIで5分間染色した。NikonA1Rsi共焦点顕微鏡またはLeicaDMI4000蛍光顕微鏡でイメージングを行った。

一次抗体溶液は、特に記載がない限り、1:300希釈の以下の抗体を含む染色緩衝液で作製した：ラット抗C-ペプチド（DSHB; GN-ID4-S）、1:100マウス抗nkx6.1（DSHB 、F55A12-S）、マウス抗グルカゴン（ABCAM; ab82270）、ヤギ抗pdx1（R＆D Systems; AF2419）、ウサギ抗ソマトスタチン（ABCAM; ab64053）、マウス抗pax6（BDBiosciences; 561462）、ウサギ抗クロモグラニンa（ab15160）、ヤギ抗neurod1（R＆D Systems; AF2746）、マウス抗Islet1（DSHB、40.2d6-s）、1:100マウス抗サイトケラチン19（Dako; MO888 ）、希釈されていないウサギ抗グルカゴン（Cell Marque; 259A-18）、1:100ヒツジ抗トリプシン（R＆D Systems; AF3586）。二次抗体溶液は、1:300希釈の以下の抗体を含む染色緩衝液で作製した：抗ラットalexa fluor488（Invitrogen; a21208）、抗マウスalexa fluor594（Invitrogen; a21203）、抗ウサギalexa fluor594（Invitrogen; a21207）、抗ヤギalexa fluor594（Invitrogen; a11058）。

静的GSIS：
約〜20-30のステージ6クラスターまたは死体のヒト膵島を収集し、KRB緩衝液（128mM NaCl、5mM KCl、2.7mM CaCl₂、1.2mM MgSO₄、1mM Na₂HPO₄、1.2mM KH₂PO₄、5mM NaHCO₃、10mM HEPES（Gibco; 15630-080）、および0.1％BSA）で2回洗浄し、2mMグルコースKRBに再懸濁し、24ウェルプレートのトランスウェル（Corning; 431752）に配置することにより、アッセイを行った。クラスターを2mMグルコースKRBで1時間平衡化してインキュベートした。次に、トランスウェルを排出し、新しい2mMグルコースKRBウェルに移し、古いKRB溶液を廃棄した。クラスターを再び低グルコースで1時間インキュベートし、ついでトランスウェルを排出し、古い2mMグルコースKRBを保持したまま、新しい2、5.6、11.1、または20mMグルコースKRBウェルに移す。次に、クラスターを高グルコースで1時間インキュベートし、ついでトランスウェルを排出し、古いグルコースKRBを保持した。保持したKRBにHuman Insulin Elisa（ALPCO; 80-INSHU-E10.1）を行ってインスリン分泌を定量した。細胞をTrypLE処理によって単一細胞分散し、Vi-Cell XRでカウントし、生細胞数を使用してインスリン分泌を正規化した。

動的グルコース刺激インスリン分泌：
以前に報告されているように⁵、灌流システムを組み立てた。このシステムでは、275μlのセルチャンバー（BioRep; Peri-Chamber）に接続された0.015インチの入口および出口2ストップチューブ（ISMATEC; 070602-04i-ND）と組み合わせた高精度の8チャンネルディスペンサーポンプ（ISMATEC; ISM931C）、および0.04インチ接続チューブ（BioRep; Peri-TUB-040）を使用したディスペンシングノズル（BioRep; PERI-NOZZLE）を使用した。溶液、チューブ、および細胞は、水浴で37℃に維持した。ステージ6のクラスターおよび死体のヒト膵島をKRBで2回洗浄し、2mMグルコースKRBに再懸濁した。次に、細胞を、Bio-Gel P-4ポリアクリルアミドビーズ（Bio-Rad; 150-4124）の2つの層の間に挟まれたBiorep灌流チャンバーにロードした。平衡化のために試料を収集する前に、細胞を2mMグルコースKRBで90分間灌流した。単一の高グルコースチャレンジでは、試料収集を2mMグルコースKRBに12分間曝露した細胞で開始し、続いて20mMグルコースKRBを24分間曝露し、さらに12分間2mMグルコースKRBに戻した。複数の分泌促進物質のチャレンジでは、試料収集を2mMグルコースKRBに6分間曝露した細胞で開始し、続いて12分間の20mMグルコースKRB、6分間の2mMグルコースKRB、12分間の20mMグルコースKRBプラス処理、および最後に6分間の2mMグルコースKRBであった。複数の分泌促進物質による処理は以下のとおりであった：20mMグルコースのみ、10nMエクステンディン-4（MilliporeSigma; E7144）、100μMIBMX（MilliporeSigma; I5879）、300μMトルブタミド（MilliporeSigma; T0891）、20mM L-アルギニン（MilliporeSigma; A5006）、および30mM KCL（Thermo Fisher; BP366500）。流出液は、2〜4分の収集ポイントで100μl/分の流速で収集した。試料収集後、クラスターを収集し、10mM Tris（MilliporeSigma; T6066）、1mM EDTA、および0.2％Triton-X 100溶液で溶解し、Quant-iT Picogreen dsDNAアッセイキット（Invitrogen; P7589）を使用してDNAを定量した。インスリン分泌は、Human Insulin Elisaキットを使用して定量した。

フローサイトメトリー：
クラスターをTrypLEで単一細胞分散させ、4％パラホルムアルデヒドで4℃にて30分間固定し、染色緩衝液で4℃にて30分間ブロッキングおよび透過処理し、染色緩衝液中の一次抗体と4℃にて一晩インキュベートし、。染色緩衝液中の二次抗体と4℃にて2時間インキュベートし、染色緩衝液に再懸濁し、ついでLSRII（BD Biosciences）またはX-20（BD Biosciences）で分析した。ドットプロットおよびパーセンテージをFlowJoを使用して生成した。特に記載のない限り、すべての抗体は1:300希釈で使用した。使用した抗体は、ラット抗C-ペプチド、マウス抗nkx6.1（1:100）、マウス抗グルカゴン、ウサギ抗ソマトスタチン、ウサギ抗クロモグラニンA（1:1000）、ヤギ抗pdx1、抗ラットalexa fluor 488、抗マウスalexa fluor 647（Invitrogen; a31571）、抗ウサギalexa fluor 647（Invitrogen; a31573）、抗ヤギalexa fluor 647（Invitrogen; a21447）、抗ウサギalexa fluor 488（Invitrogen; a21206）であった。

リアルタイムPCR：
DNase処理（Qiagen; 79254）を備えたRNeasy Mini Kit（Qiagen; 74016）を使用してRNAを抽出し、High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit（Applied Biosystems; 4368814）を使用してcDNAを合成した。リアルタイムPCR反応は、StepOnePlus（Applied Biosystems）のPowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems; A25741）で行い、ΔΔCt手法を使用して分析した。TBPは正規化遺伝子として使用した。

移植研究：
すべての動物実験は、ワシントン大学の国際動物管理使用委員会の規則に従って実施した。マウスは、移植群または移植なし群にランダムに割り当てられ、マウス数は、以前の研究に基づいて統計的有意性を可能にするのに十分であるように選択された。すべての手順は、盲検化されていない個人によって実行された。この研究では、2つのマウスコホートを使用した。第一の群は、Charles Riverから購入した50〜56日齢の非STZ処理SCID/ Beige雄マウスで構成されていた。第二の群は、Jackson Laboratoriesから購入した6週齢のSTZ処理および対照処理のNOD/SCID雄マウスで構成されていた。以前に報告されたのと同様に、マウスをイソフルランで麻酔し、腎臓被膜下に約5x10⁶のステージ6細胞または生理食塩水（移植対照なし）を注射した。ブドウ糖負荷試験とインビボGSISを実施することにより、移植後6ヶ月までマウスをモニターした。マウスを16時間絶食させ、ついで2g/kgのグルコースを注射した。テールブリード（tail bleed）により採血した。血糖値は、ハンドヘルド血糖計（Contour Blood Glucose Monitoring System Model 9545C; Bayer）を使用して測定した。ヒトインスリンは、血液を収集し、マイクロベット（Sarstedt; 16.443.100）で血清を分離し、Human Ultrasensitive Insulin ELISA（ALPCO Diagnostics; 80-ENSHUU-E01.1）を使用して定量することによって決定した。血清マウスC-ペプチド濃度は、摂食したマウスから血液を採取し、マイクロベットで血清を分離し、Mouse C-peptide ELISA（ALPCO Diagnostics; 80-CPTMS-E01）を使用して定量することにより決定した。

インスリンおよびプロインスリンの含有量：
ステージ6のクラスターをPBSで充分に洗浄し、1.5％HClおよび70％エタノールの溶液に浸し、-20℃にて24時間保持し、回収して激しくボルテックスし、戻し、-20℃にてさらに24時間維持し、回収して激しくボルテックスし、ついで2100RCFで15分間遠心分離した。上清を回収し、等量の1M TRIS（pH7.5）で中和した。ヒトインスリンおよびプロインスリン含有量を、それぞれHuman Insulin ElisaおよびProinsulin Elisa（Mercodia; 10-1118-01)を使用して定量した。細胞をVi-CellXRを使用して作成された生細胞数に対正規化した。

ウエスタンブロット：
PBSで洗浄した後、50mM HEPES、140mM NaCl（MilliporeSigma; 7647-14-5）、1mM EDTA（MilliporeSigma; 1233508）、1％TritonX-100、0.1％Na-デオキシコレート（MilliporeSigma：D6750）、0.1％SDS（ThermoScientific; 24730020）、1mM Na₃VO₄（MilliporeSigma; 450243）、10mM NaF（MilliporeSigma; S7920）、および1％プロテアーゼ阻害剤カクテル（MilliporeSigma; p8340）からなるウエスタンブロット溶解緩衝液にタンパク質を入れ、シェーカー上で4℃にて15分間インキュベートし、ついで10000RCFで4℃にて10分間遠心分離することにより、細胞クラスターからタンパク質を抽出した。タンパク質の量は、Pierce BCA Protein Assay（Thermo Scientific; 23228）を使用して定量した。タンパク質（30μg）を4-20％勾配のポリアクリルアミドゲル（Invitrogen; SP04200BOX）にロードし、電気泳動で分離し、0.45μmのニトロセルロースメンブレン（BioRad; 1620115）に転写移した。ニトロセルロースメンブレンをブロッティンググレードブロッカー（BioRad; 170-6404）でブロッキングし、ウサギ抗ホスホ−SMAD2/3 1:1000（Cell Signaling Technologies; 8828）抗体およびウサギ抗アクチン1:1000（Santa Cruz Biotechnology; SC1616）抗体とブロッカー中、4℃にて一晩インキュベートした。メンブレンをブロッカー中のウサギ二次抗体1:2500（Jackson Immuno Research Laboratories; 211-032-171）で4℃にて2時間洗浄および染色し、SuperSignal West Femto（Thermo Scientific; 34096）を使用して発色させた。画像はOdyssey FC（Li-COR）で撮影した。イメージング後、Restore Western Blot Stripping Buffer（Thermo Scientific; 21059）を使用してニトロセルロースメンブレンをストリッピングし、ウサギ抗SMAD2/3（Cell Signaling Technologies; 8685）抗体と4℃にて一晩インキュベートし、ブロッカー中のウサギ二次抗体1：2500で4℃にて2時間洗浄および染色し、SuperSignal West Femtoを使用して発色させ、OdysseyFCを使用して画像化した。

レンチウイルス：
shRNA配列を含むpLKO.1TRCプラスミドには、次の配列が含まれていた：shRNA GFP、GCGCGATCACATGGTCCTGCT（配列番号89）；shRNA TGFBR1＃1、GATCATGATTACTGTCGATAA（配列番号90）；shRNA TGFBR1＃2、GCAGGATTCTTTAGGCTTTAT（配列番号91）。レンチウイルス粒子は、pMD-Lgp/RREとpCMV-G、およびshRNAを含めるRSV-REVパッケージングプラスミドを使用して生成および力価測定した。ステージ6の1日目の細胞は、TrypLEを使用して単一細胞に分散させ、300万個の細胞をシェーカー上、MOI3-5にて4mL ESFMレンチウイルス粒子に播種した。形質導入された細胞は、形質導入の16時間後に新鮮なESFMで洗浄した。RNA抽出および静的GSISは、ステージ6の13日目に行った。

統計分析：
統計的有意性は、示された統計的検定を使用し、GraphPadPrismを使用して計算した。勾配と勾配の誤差は、ExcelのLINEST関数を使用して計算した。示されているように、特に記載がない限りまたは最小から最大のポイント範囲を示すボックスアンドウィスカーの他は、データは平均±SEMとして示す。nは、独立した実験の総数を示す。

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実施例２
ヒト膵臓細胞の消長の細胞骨格調節：
以下の実施例では、膵臓の分化を促進するための細胞骨格のモジュレーションについて説明する。細胞骨格モジュレーションの方法は、膵臓細胞だけでなく、いくつかの系統の細胞を生成するために使用することができる。さらに、この実施例では、1型糖尿病（T1D）細胞補充療法および薬物スクリーニングのための疾患モデリングのためのヒト多能性幹細胞（hPSC）からインスリン産生ベータ様細胞を作成する方法について説明する。

ヒト多能性幹細胞（hPSC）のインスリン産生β細胞への分化において最近の進歩が見られ、インスリン依存性糖尿病の細胞補充療法が究極の目標となっている。これらのアプローチは、可溶性因子を添加して発生シグナル伝達経路を活性化し、膵臓の消長を推進することを利用する。興味深いことに、現在成功しているすべてのプロトコルには3次元の細胞凝集が含まれている必要があるが、この要件の理由は不明である。この研究は、微小環境と、膵臓系統の特異化を駆動する重要な膵臓転写因子の発現を伴うアクチン細胞骨格の状態との間のリンクを確立する。得られた結果は、アクチン細胞骨格の時間的制御が内胚葉系統に対する細胞消長の選択に強く影響することを示している。細胞−生体物質相互作用とアクチン解重合剤であるラトランキュリンAとの組み合わせを使用して、強力な動的グルコース刺激インスリン分泌が可能な、いくつかのhPSC系統で再現性の高い幹細胞由来β（SC-β）細胞を生成するための新しい2次元分化プロトコルを開発した。さらに、この研究は、これらのSC-β細胞がマウスの重度の既存の糖尿病を急速に逆転させることができることを示している。

前書き：
SC-β細胞の産生のためのプロトコルの最近の開発は、糖尿病の治療のための細胞ベースの治療の見込みを提供した。これらの分化戦略は、機能的なSC-β細胞の消長を達成するために、可溶性成長因子と小分子による特定の発生経路の正確な活性化と抑制に依存している。興味深いことに、成功しているすべてのSC-β細胞プロトコルは、現在、膵臓前駆細胞をSC-β細胞に分化させるために、懸濁クラスターまたは気液界面上の凝集体として細胞の三次元配置を利用する必要がある。この要件の理由は、特に膵臓の消長の選択に対する不溶性微小環境の影響を理解する上で不明であった。

SC-β細胞を生成するための現在の方法は、中間の内胚葉および膵臓の前駆細胞段階を通じてhPSCを分化させる。適切な信号が与えられると、これらの前駆細胞は、腸や肝細胞（肝臓細胞）などの非膵臓系統を生成することができる。膵臓系統内では、NKX6-1+膵臓前駆細胞の誘導前にNEUROG3などの内分泌遺伝子が早期に誘導されると、非β細胞多ホルモン性細胞が生成される。SC-β細胞の消長への完全な分化は3次元の細胞配列でのみ達成されているが、このNKX6-1+表現型の誘導は、2次元および3次元の両方の細胞培養で実証されている。

細胞は、インテグリンと呼ばれる膜貫通タンパク質を介して周囲の微小環境を感知でき、αおよびβインテグリンサブユニットのさまざまな組み合わせによって、特定の細胞が付着できる細胞外マトリックス（ECM）タンパク質が決まる。ECMタンパク質に結合したインテグリンはクラスターを形成し、アクチン細胞骨格の組み立てのアンカーとして機能する他の接着タンパク質を動員し、細胞が機械的な力を生成する手段を提供する。これらの力は、細胞が移動して形を変えることを可能にするだけでなく、細胞内の生化学的シグナル伝達に変換することもできる。ECM基板の特定の材料特性は、アクチン重合の程度を変えることにより、この応答に劇的な影響を与えることができる。例えば、マトリックスの剛性、形状、および接着密度はすべて、幹細胞の分化を導くことが示されている。しかしながら、細胞骨格を操作するというこの概念は、内胚葉系統の分化には広く適用されていない。

ここで、この研究は、アクチン細胞骨格の状態が内胚葉細胞の消長の選択に重要であることを識別する。SC-β細胞の文脈において、細胞骨格の状態は、NEUROG3が誘導する内分泌誘導とそれに続くSC-β細胞の特異化に大きく影響する。細胞−生体材料相互作用とアクチン細胞骨格の小分子調節因子の組み合わせを利用することにより、内分泌転写因子の発現のタイミングを制御して、分化の消長をモジュレーションし、SC-β細胞を作製するための二次元プロトコルを開発した。重要なことに、この新しい平面プロトコルは、人工多能性幹細胞（iPSC）株から分化したSC-β細胞の機能を大幅に強化し、3次元の細胞配列の必要性を排除する。分化の特定の時点でのアクチン重合の程度が異なると、細胞は異なる内胚葉系統に偏り、したがって、最適でない細胞骨格状態は、SC-β細胞の特異化に大きな非効率をもたらした。さらに、この研究は、アクチン重合を制御するというこの概念をこれらの他の内胚葉細胞消長の有向分化に適用して、系統の特異化をモジュレーションできることを示している。

結果：
アクチン細胞骨格はPDX1を発現する前駆細胞の維持を制御する：
SC-β細胞分化における微小環境の役割をよりよく理解するために、ステージ3PDX1+膵臓前駆細胞を懸濁液ベースの分化プロトコルで生成し、これらのクラスターから単一細胞分散液を作成し、多種多様なECMタンパク質でコーティングされた組織培養ポリスチレン（TCP）プレートに細胞を播種した（例えば、図１５ａ〜図１５ｂ、図２１ａを参照）。プロトコルのこのステージは、NKX6-1+膵臓前駆細胞を生成するように設計されているが、その後のステージ5はNEUROG3を誘導することによってこれらの前駆細胞の内分泌誘導を開始する。これらの実験からの最も際立った観察は、ほとんどのECMタンパク質にステージ4の期間に細胞をプレーティングすることで、通常の懸濁クラスターと比較してNEUROG3の早すぎる発現を防ぐが、単一細胞分散後に細胞をクラスターに再凝集させると発現が大幅に増加したことであった（例えば、図１５ｃ、図２１ｂを参照）。NEUROG3の下流の標的NKX2.2およびNEUROD1は同じ減少傾向をたどったが、SOX9の発現は増加した（例えば、図１５ｃ、図２１ｂを参照）。興味深いことに、最も高いNEUROG3発現を誘導するECMタンパク質はラミニン211であり、これは不十分な細胞接着に対応していた（例えば、図２１ｂを参照）。ステージ4の開始時と終了時の比色抗体ベースのインテグリン接着アッセイにより、コラーゲンIおよびIV（α1、α2、β1）、フィブロネクチン（αV、β1、α5β1）、ビトロネクチン（αV、 β1、αVβ5）およびすべてではないがいくつかのラミニンアイソフォーム（α3、β1）に結合するインテグリンサブユニットの高発現が確認された（例えば、図２１ｃを参照）。したがって、特定のECMタンパク質コーティングの組成ではなく、培養表面への強い付着により、ステージ4での早すぎる内分泌誘導が防止された。

TCPプレートに細胞をプレーティングする場合と比較して、浮遊細胞をクラスターとして培養する場合の大きな違いの1つは、各細胞が経験する基板の剛性に大きな違いがあることである。内分泌誘導に対する基板剛性の影響を試験するため、PDX1を発現する膵臓前駆細胞を、TCPプレートに取り付けられたさまざまな高さの1型コラーゲンゲルにプレーティングしたが、これは、ゲルの高さを下げると細胞が受ける有効剛性が増加するからである。ゲルの高さを増加させると、内分泌誘導と一致して、NEUROG3、NKX2.2、およびNEUROD1が増加し、SOX9が減少した（例えば、図１５ｄを参照）。NKX6-1の発現は、NEUROG3とは逆の傾向をたどり、柔らかい基板によって誘導される早すぎるNEUROG3発現が、膵臓前駆細胞におけるNKX6-1の誘導に有害であることを示している。

細胞接着が内分泌誘導にどのように影響するかをさらに詳しく調べるために、細胞接着のさまざまな側面に影響を与える因子を用いて化合物スクリーニング（compound screen）を実施した。このスクリーニングは、細胞骨格アクチンの単量体型に結合して隔離するラトランクリンAが、NEUROG3ならびにその下流の標的NKX2.2およびNEUROD1の発現を大幅に増加させることを明らかにした（例えば、図１５ｅ〜図１５ｆを参照）。この増加は、γ-セクレターゼ阻害剤XXi（NOTCHシグナル伝達を阻害し、内分泌細胞の生成に使用されてきた）によって誘導される増加よりもさらに大きかった。ラトランクリンA処理に応答したNEUROG3発現は、HUES8（例えば、図１５ｇを参照）および2つのiPSC系統（例えば、図２２ａを参照）の両方について高度に用量依存的であった。ラトランクリンBは前記化合物の効力の低い形態であるが、これも用量依存的にNEUROG3発現を増加させたが、同様の効果を達成するために約10倍高い濃度を必要とした（例えば、図２２ｂを参照）。NKX6-1の発現は、NEUROG3とは逆の傾向をたどり（例えば、図１５ｆ〜図１５ｇを参照）、ステージ4の間にNKX6-1がオンになるために、早すぎるNEUROG3発現を防止する必要性を再び示している。

プレーティングされたステージ4細胞の1μMラトランクリンAでの24時間の処理は、F-アクチンのほぼ完全な解重合（例えば、図１５ｈを参照）および対応するG/F-アクチン比の増加（例えば、図１５ｉを参照）をもたらし、これは高いNEUROG3発現に対応していた。さらに、すべての条件のG/F-アクチン比はNEUROG3発現で観察された傾向と一致し（例えば、図１５ｃを参照）、プレーティングされた細胞が最低レベルであり、それについで通常の懸濁培養、再凝集クラスター、そして最後にラトランクリンA処理を受けているプレーティング細胞であった。対照的に、分散後の再凝集中にアクチン重合化剤ジャスプラキノリドを膵臓前駆細胞に添加すると、早すぎるNEUROG3発現が減弱した（例えば、図２２ｃを参照）。まとめると、これらのデータは、アクチン細胞骨格の重合状態が、重要な膵臓転写因子NEUROG3およびNKX6-1の発現に極めて重要であることを示している。

細胞骨格状態は膵臓前駆細胞プログラムを導く：
細胞骨格の状態が膵臓前駆細胞プログラムにどのように影響するかをさらに調べるため、細胞骨格モジュレーション化合物ラトランクリンAまたはノコダゾールで処理したプレーティング膵臓前駆細胞で単一細胞RNAシークエンシングをステージ4全体で行った。ラトランクリンAはこれらプレーティング前駆細胞のF-アクチンを解重合するが、ノコダゾールによる処理は微小管を解重合し、F-アクチンの過収縮を引き起こす。ステージ4の終了時までに、4つの集団が教師なしクラスタリングで識別された（例えば、図１６ａ〜図１６ｂ、図２２ｄを参照）。膵臓前駆細胞の2つの集団がSOX9およびPDX1の発現によって識別されたが、NKX6-1の発現差に基づいて区別された。対照的に、早すぎる内分泌誘導を経験している細胞は、CHGA、NEUROG3、NKX2-2、NEUROD1、およびISL1などのマーカーの高発現を示した。しかしながら、重要なことに、それらはNKX6-1の発現を欠いていた。外分泌前駆細胞は、管マーカーKRT7およびKRT19と腺房マーカーPRSS1（トリプシン）の高発現によって特徴付けられたた。

ステージ4の間の細胞骨格の状態は、これらの4つのグループへの細胞の分布に劇的な影響を及ぼした（例えば、図１６ｃを参照）。プレーティングした対照の最大の細胞集団（39.0％）は、プロトコルのこのステージで必要な前駆細胞集団である、NKX6-1を発現する膵臓前駆細胞2細胞であった。これらのプレーティングされた細胞のうち、内分泌遺伝子を発現したものはごくわずかであった（4.9％）。逆に、ラトランクリンA処理はNKX6-1+集団を減少させ（2.5％）、同時に内分泌誘導を劇的に増加させた（44.7％）。これらの結果は、膵臓前駆細胞のプレーティングがNEUROG3のオンを防ぐが、NKX6-1の発現を促進する一方で、ラトランクリンAは強力な内分泌誘導物質であることを示す先行するqRT-PCRデータに対応する。対照的に、ノコダゾールによる処理は外分泌様前駆細胞を促進した（67.0％）。これらのデータは、ステージ4でのNKX6-1の発現には最適な細胞骨格状態が必要であることを示唆している。具体的には、ステージ4で解重合した細胞骨格は、NKX6-1がオンになる前に内分泌誘導を引き起こすが、過剰に活性化された細胞骨格もNXK6-1発現を防ぎ、代わりに外分泌前駆細胞様の消長を促進する。まとめると、これらのデータは、膵臓前駆細胞におけるアクチン細胞骨格の重合状態が膵臓細胞の消長の極めて重要な調節因子であることを示している。

SC-β細胞への分化はアクチン細胞骨格によって時間的に制御されている：
膵臓転写因子の発現、特にNKX6-1およびNEUROG3のタイミングは、適切なSC-β細胞分化に重要である。具体的には、NEUROG3がNKX6-1の前に発現すると、機能しない多ホルモン細胞またはグルカゴン陽性細胞が生じるのに対し、NKX6-1誘導後のNEUROG3の発現はSC-β細胞の消長につながる。細胞骨格の状態がこれらの遺伝子の発現に重要であったため、膵臓前駆細胞を1型コラーゲンでコーティングされたTCPにプレーティングした後、ラトランクリンAをSC-β細胞分化プロトコルのさまざまなステージで添加した。ラトランクリンAを添加しない場合、プレーティングされた膵臓前駆細胞は分化効率が低く（例えば、図１７ａを参照）、得られた細胞はほとんどインスリンを分泌しなかった（例えば、図１７ｂを参照）。ステージ4（膵臓前駆細胞）またはステージ6（SC-β細胞成熟）のいずれかを通じて0.5μMのラトランクリンAを添加すると、一般的な内分泌誘導（CHGA+）及びβ細胞の特異化（NKX6-1+/c-ペプチド+）の両方が増加した。しかしながら、内分泌を誘導するように設計されたステージ5の間に添加したラトランクリンAは、内分泌誘導、SC-β細胞の特異化、およびグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）の最大の増加をもたらした（例えば、図１７ａ−ｂを参照）。これらのデータは、TCPへの膵臓前駆細胞の付着がSC-β細胞の分化を阻害することを示しており、これはラトランクリンAによるアクチン細胞骨格のステージ依存的な解重合によって克服される。

SC-β細胞誘導に対するラトランクリンAの利点を最適化するため、ステージ5の間にさまざまな期間および濃度を試験した（例えば、図１７ｃを参照）。期間および濃度の両方がGSISに影響を及ぼし、ステージ5の最初の24時間での1μM処理が最短および最低用量で最大の利益をもたらした。この24時間の処理はSC-β細胞の特異化を救うのに十分であるように見えたが、ステージ5でのラトランクリンAによる長期培養は、この効果を妨げた。その後の特徴付けは、この24時間の1μMラトランクリンA治療が、総インスリン含有量を増加させ（例えば、図１７ｄを参照）、プロインスリン／インスリン比を改善し（例えば、図１７ｅを参照）、内分泌遺伝子の発現を増加させることを示した（例えば、図１７ｆを参照）。細胞形態の違いによって視覚的に容易に区別され、AFPなどの他の非膵臓マーカーで染色されたオフターゲット細胞タイプの領域と同様に（例えば、図１７ｇを参照）、他の内胚葉系統に関連するマーカーの発現が減少した（例えば、図１７ｆを参照）。ラトランクリンA処理で生成されたプレーティングSC-β細胞はステージ6のTCPで機能的であったが（たとえば、図１７ｃを参照）、オービタルシェーカーの6ウェルプレート内でクラスターに凝集することもできた（例えば、図１７ｈを参照）。得られたクラスターは、灌流システムにおける動的GSISアッセイによって評価することができ、第1相および第2相の両方のインスリン分泌を示した（例えば、図１７ｉを参照）。

まとめると、これらのデータは、細胞骨格の状態が、膵臓前駆細胞を維持し、特にSC-β細胞への膵臓細胞の消長を特定するために重要であることを示している。具体的には、適切な細胞骨格重合がステージ4の間の膵臓前駆細胞プログラムにとって重要であるが、SC-β細胞への分化にはステージ5の内分泌誘導中にアクチンの解重合が必要である。TCPの高い剛性は、NEUROG3の早すぎる発現を防ぎステージ4でのNKX6-1発現を促進するアクチン重合を誘発するが、それはまた、ステージ5の間のNEUROG3発現を阻害し、その後SC-β細胞の特定を抑制する。ラトランクリンAによる処理は、ステージ5で細胞骨格を解重合し、3次元の細胞配列を必要とせずにTCP上で機能的なSC-β細胞を確実に生成できるようにする。

ラトランクリンＡ処理は、ＳＣ−β細胞を作製するための平面プロトコルを可能にする：
以前のＥＣＭおよび細胞骨格実験は、まず、最初の３ステージの間、懸濁液ベースの分化プロトコルを使用して細胞を分化させて膵臓前駆細胞を生成し、続いて、ＴＣＰ上に付着させて分化および実験を継続した（例えば、図１５ａを参照）。膵臓分化における細胞骨格の役割についての新たな理解を用いて、この研究では、三次元細胞配置の分野における現在の必要条件を満たす完全平面の新規ＳＣ−β細胞分化プロトコルを開発した（例えば、図１８ａを参照）。以前の実験と同様に、ステージ４の間にラトランクリンＡを添加すると、ＮＥＵＲＯＧ３およびその下流の標的の早期発現が劇的に増加しつつ、同時にＮＫＸ６−１発現が低下し（例えば、図２３ａを参照）、それにより、両方のプロトコルで生成される膵臓前駆細胞がラトランクリンＡへの類似した応答を有することが確認された。平面培養においてラトランクリンＡを使用しない場合、ＳＣ−β細胞はほとんど形成されず（例えば、図１８ｂを参照）、以前の報告書における三次元培養の必要条件と一貫している。しかし、平面分化の間のステージ５の最初の２４時間の間の１μＭラトランクリンＡの添加は、内分泌の誘導およびＳＣ−β細胞の特異化を大いに増加させ、一方で、標的外系統を減少させた（例えば、図１８ｂ、図２２ｂ〜図２２ｄを参照）。

この新規の平面分化プロトコルをさらに特徴付けるために、以前の研究（ＨＵＥＳ８、１０１３−４ＦＡおよび１０１６ＳｅＶＡ）からの３つのｈＰＳＣ系統を、この平面プロトコルで分化させた。ステージ６での１週の後、懸濁液ベースの分化と同じインビトロおよびインビボ調査方法で使用するために、細胞をオービタル振盪機の上でクラスターに凝集させることができた。これは、最高概ね４０％のＳＣ−β細胞（ＮＫＸ６−１＋／ｃ−ペプチド＋）および低い百分率のポリホルモン細胞（Ｃ−ペプチド＋／ＧＣＧ＋またはＣ−ペプチド＋／ＳＳＴ＋）を有する凝集クラスターを与えた（例えば、図１８ｃを参照）。多くのβ細胞および膵島遺伝子の発現は、ヒト膵島における発現と類似していたが、ＭＡＦＡおよびＵＣＮ３の発現は低いままであって（例えば、図１８ｄを参照）、懸濁液プロトコルによる報告書と類似していた。これらのクラスター内のほとんどの細胞は、ｃ−ペプチドで免疫染色され、いくつかの重要なβ細胞マーカーと共陽性だった（例えば、図１８ｅ、図２３ｅ〜図２３ｆを参照）。全ての３つの系統は、類似したインスリン含有量（例えば、図１８ｆを参照）、プロインスリン／インスリン比（例えば、図１８ｇを参照）、静的ＧＳＩＳ（例えば、図１８ｈを参照）および動的ＧＳＩＳ（例えば、図１８ｉを参照）を有していた。懸濁液ベースのプロトコルを使用したＨＵＥＳ８と比較して、１０１３−４ＦＡおよび１０１６ＳｅＶＡから生成されたＳＣ−β細胞によるかなりより弱い動的機能が以前に報告されている^５。しかしながら、この新規の平面プロトコルによる分化は、これらのｉＰＳＣ系の第１および第２相の動的インスリン放出を大いに強化し、全ての３つの系の動的機能は、今やヒト膵島のそれに接近している（例えば、図１８ｉ〜図１８ｊを参照）。したがって、この平面プロトコルは、異なる遺伝子バックグラウンドから生成されるＳＣ−β細胞のより大きな翻訳可能性を可能にする。

これらの細胞のインビボ機能を評価するために、平面プロトコルによってＨＵＥＳ８から生成されたステージ６のクラスターを、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病マウスの腎臓嚢の下に移植した（例えば、図２３ｇを参照）。空腹時グルコースレベルは移植から２週以内に未処置対照のそれらに接近し始め、その後２００ｍｇ／ｄＬ未満にとどまった（例えば、図１９ａを参照）。３週後および１０週後に実行された耐糖能試験は、ＳＣ−β細胞移植を受けたＳＴＺ処置マウスが、未処置の対照マウスと類似した耐糖能を有していたことを実証した（例えば、図１９ａを参照）。さらに、移植されたマウスの血清において高レベルのヒトインスリンが検出され、グルコースレベルによって調節された（例えば、図１９ｂ、図２３ｈを参照）。移植から１２週目の間に、ヒト移植片を除去するために４匹の移植されたマウスで腎切除を実行し、血糖管理の急速な喪失をもたらし、グルコースホメオスタシスの回復が移植された細胞から生じたことを確認した（例えば、図１９ａを参照）。切除された腎臓の免疫染色は、Ｃ−ペプチド＋細胞の大きな領域を明らかにし、過成長は観察されなかった（例えば、図１９ｄを参照）。総合すると、これらのデータは、この新規の平面分化プロトコルが、マウスにおける既存の糖尿病を迅速に回復させることが可能な機能的ＳＣ−β細胞を生成することを実証する。

細胞骨格モジュレーションは内胚葉消長の選択に影響する：
内胚葉細胞消長の選択に及ぼす細胞骨格の影響をさらに調査するために、ステージ４の間にプレーティングされ、膵臓前駆細胞ステージ（ステージ４）または内分泌誘導（ステージ５）の間にラトランクリンＡによって処置された細胞で、ＳＣ−β細胞プロトコルのステージ６において一括ＲＮＡシークエンシングを実行した。これらの細胞は、未処置のプレーティングされた分化および懸濁液分化とも比較された。１０００個の最も差別的に発現された遺伝子のヒートマップは、ラトランクリンＡ処置のタイミングが結果として生じる細胞の発現プロファイルに激烈な影響を及ぼしたことを示す（例えば、図２０ａを参照）。具体的には、最適なステージ５ラトランクリンＡ処置は、プレーティングされた細胞の遺伝子発現プロファイルを懸濁液ベースのＳＣ−β細胞分化のそれの方へシフトさせ、β細胞および膵島遺伝子の発現を増加させた。興味深いことに、多くの他の差別的に発現された遺伝子は、非内分泌系統と関連し（例えば、図２０ｂ〜図２０ｄを参照）、ステージ４ラトランクリンＡ処置は腸および胃の遺伝子発現を増加させ、プレーティングされた対照は肝臓および食道に関連した遺伝子の発現を増加させた。したがって、特定の時点で無傷のまたは解重合された細胞骨格を有することは内胚葉系統の特異化を変更するので、細胞骨格モジュレーションのタイミングは、内胚葉細胞消長に決定的である。

総合すると、これらのデータは、細胞骨格の状態がβ細胞特異化だけでなく、内胚葉細胞消長にも広く重要なことを示す。細胞骨格モジュレーションがＳＣ−β細胞プロトコルの中でいくつかの内胚葉系統への消長選択に影響したので、ラトランクリンＡおよびノコダゾールの他の確立された分化プロトコルへの組込みを、外分泌膵臓、腸および肝臓の生成について試験した。外分泌分化では、ノコダゾールはトリプシン遺伝子発現（ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ２）および免疫染色を大きく増加させたが、内分泌誘導を阻害し（例えば、図２０ｅを参照）、ノコダゾールが外分泌前駆体プログラムを促進していることを示した本発明者らの初期の単細胞ＲＮＡシークエンシング結果に一致した。他方、腸管分化におけるノコダゾールは、ＣＤＸ２遺伝子発現および免疫染色を大きく増加させた（例えば、図２０ｆを参照）。対照的に、ラトランクリンＡ処置は、マーカー腸管幹細胞、ならびにＬＧＲ５＋腸管幹細胞生存度にとって重要であることが知られているパネート細胞を大きく増加させた。肝臓分化では、興味深いことに、ノコダゾールおよびラトランクリンＡの両方は肝細胞遺伝子発現を増加させた（例えば、図２０ｇを参照）。しかしながら、アルブミンのための免疫染色はノコダゾール処置でより豊富だったが、ＡＦＰはラトランクリンＡ処置でより優勢であり、肝臓表現型における差を示唆した。全体として、これらのデータは、細胞骨格が、定方向分化の間の内胚葉細胞消長決定の重要な構成要素であるとの原理実証を提供する。この研究がＳＣ−β細胞分化で実証したように、これらのプロトコルはさらなる最適化が確実に有益かもしれないが、これらのデータは、適切な時間および投薬量で使用されるとき、特定の細胞骨格モジュレーション化合物の使用が、他の内胚葉分化プロトコルの分化効率の上昇を助けることができることを示す。さらに、基板が細胞骨格の動態力学に及ぼすことができる影響のために、このデータは、培養フォーマットがこれらの定方向分化の成功に重要である可能性が最も高いことをさらに示唆する。

考察：
本明細書で、この研究は、アクチン細胞骨格をヒト膵臓細胞消長の決定的な調節因子であると同定した。細胞配置（二次元対三次元）、基板の硬さ、または化学的処理で直接的に細胞骨格の状態を制御することによって、この研究は、重合した細胞骨格は膵臓前駆細胞におけるＮＥＵＲＯＧ３発現の早い誘導を阻止するが、ＳＣ−β細胞への以降の分化も阻害することを示した。ラトランクリンＡによる適時の細胞骨格解重合はこの阻害を克服し、ＳＣ−β細胞の確固とした生成を可能にする。この研究は、マウスに移植の後に第１および第２相の動的インスリン分泌を経て、既存の糖尿病を急速に回復させる、高度に機能的なＳＣ−β細胞を生成することが可能な新規の平面分化プロトコルを開発するためにこれらの知見を変換した。単細胞および一括ＲＮＡシークエンシングは、ＳＣ−β細胞だけでなく複数の内胚葉系統が細胞骨格の状態によって影響されることを明らかにし、これらの方法は、細胞骨格モジュレーションによって外分泌、腸および肝臓細胞の消長への分化の強化を可能にした。

ＮＥＵＲＯＧ３のような重要な転写因子に対するより優れた制御、ならびに、細胞の大きなクラスターと比較して組織培養プレートのより制御された、均一な微小環境のために改善された細胞系再現性を含め、ＳＣ−β細胞を作製するための平面プロトコルにいくつかの異なった利点がある。しかし、この新規のプロトコルのおそらく最も重要な恩恵は、２つのｉＰＳＣ系からのＳＣ−β細胞の動的機能における大きな改善である。懸濁液ベースのプロトコルでは、これらの２つの系で生成されるＳＣ−β細胞はかなりより弱い動的機能を有することが以前に公開されている。分化戦略の変換可能性は、当技術分野が直面する長年の難問であり、弱いインビトロおよびインビボＳＣ−β細胞表現型をしばしば有する患者由来のｉＰＳＣを研究するときに特に問題である。さらに、ある特定のｉＰＳＣ系が、懸濁培養に適合させることさえしばしば困難であるかもしれないことが観察された。ヒト患者ｉＰＳＣによるこの平面アプローチの使用は、糖尿病のための薬物スクリーニングおよび自家細胞補充療法のための糖尿病の厳格な研究をより良く促進する。

この研究は、三次元細胞配置がＳＣ−β細胞の生成のために必要とされる理由の分野における、長年のミステリーも解決する。この研究は、幹細胞分化の研究における細胞培養フォーマットの重要性を強調し、ＳＣ−β細胞の分野に他の実際的な恩恵、すなわち、複雑、面倒で高価な三次元細胞培養必要条件の排除を提供する。平面培養および以降のラトランクリンＡ処置を通した細胞骨格のモジュレーションは、機能的な単一ホルモンＳＣ−β細胞を促進するＮＫＸ６−１およびＮＥＵＲＯＧ３発現の正しいタイミングをより良好に促進することもできる。内分泌誘導の開始時の細胞骨格解重合のための表面上短い時間的要件は、オンにされるとＮＥＵＲＯＧ３発現を維持する正のフィードバックループによる可能性がある。これらの知見は、細胞骨格が発達中の膵臓管の細胞の中で再編成されて、層剥離および以降の膵島形成を誘導する、インビボのアクチン動態力学と一致するようでもある。

この研究からの別の重要な観察は、細胞骨格状態がＳＣ−β細胞分化を調節するだけでなく、内胚葉系統特異化により広く影響するということである。ＳＣ−β細胞分化の間のラトランクリンＡ処置のタイミングによって、外分泌、肝臓、食道、胃および腸の遺伝子サインがステージ６において検出された。これらの知見は、これらの他の系統の一部のための定方向分化プロトコルの間に細胞骨格モジュレーション化合物を加えることによって適用され、しばしば分化転帰を改善した。したがって、細胞骨格状態の影響は、所望の内胚葉系統ならびにこれらの定方向分化プロトコルの中の細胞骨格モジュレーションのタイプおよびタイミングに依存する。これらの他のプロトコルの中のこれらのモジュレーションはさらに最適化することができるが、この研究は、全体として、内胚葉細胞消長に細胞骨格動態力学が決定的であり、細胞骨格シグナル伝達が可溶性生化学的因子と相乗的に働いて細胞消長決定を調節することを強調する。その結果として、内胚葉系統への分化転帰を改善するために、細胞−生体材料相互作用および細胞骨格モジュレーション化合物の組合せを活用することができる。

方法：
幹細胞培養：
ＨＵＥＳ８ｈＥＳＣ系および２つの非糖尿病性ヒトｉＰＳＣ系（１０１３−４ＦＡおよび１０１６ＳｅＶＡ）を含む、ＳＣ−β細胞分化プロトコルで以前に使用された３つの幹細胞系をこの研究で利用した。実験は、特記しない限りＨＵＥＳ８系で実行された。３７℃で５％ＣＯ_２の加湿インキュベーターの中で、未分化細胞をｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０５８５０）で増殖させた。懸濁培養のために、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７９２０）で３日おきに継代し、磁気撹拌プレート（Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ）の上の６０ＲＰＭの３０ｍＬスピナーフラスコ（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ、ＡＢＢＷＶＳ０３Ａ）の中に０．６×１０^６細胞／ｍＬで播種した。平面培養のために、細胞をＴｒｙｐＬＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２−６０４−０３９）で４日おきに継代し、３，０００，０００〜５，０００，０００細胞／ウェルによりマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５６２３０）でコーティングされた６ウェルプレートの上に播種し、密度は細胞系に依存した。１０μＭのＹ−２７６３２を補充したｍＴｅＳＲ１に、全ての細胞を播種した。

ＳＣ−β細胞分化：
懸濁液プロトコル：継代の７２時間後に、３０ｍＬスピナーフラスコの中の細胞を、以下の製剤を使用して６ステージプロトコルで分化させた。ステージ１（３日）：１日のＳ１培地＋１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、３３８−ＡＣ）＋３μＭＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４−０００４−１０）。次の２日間のＳ１培地＋１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ。ステージ２（３日）：Ｓ２培地＋５０ｎｇ／ｍｌＫＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＡＦ−１００−１９）。ステージ３（１日）：Ｓ３培地＋５０ｎｇ／ｍｌＫＧＦ＋２００ｎＭＬＤＮ１９３１８９（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ、０４００７４）＋５００ｎＭＰｄＢＵ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、５２４３９０）＋２μＭレチノイン酸（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｒ２６２５）＋０．２５μＭＳＡＮＴ１（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓ４５７２）＋１０μＭＹ２７６３２。ステージ４（５日）：Ｓ３培地＋５ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋５０ｎｇ／ｍＬＫＧＦ＋０．１μＭレチノイン酸＋０．２５μＭＳＡＮＴ１＋１０μＭＹ２７６３２。ステージ５（７日）：Ｓ５培地＋１０μＭＡＬＫ５ｉＩＩ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＡＬＸ−２７０−４４５−Ｍ００５）＋２０ｎｇ／ｍＬベータセルリン（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、２６１−ＣＥ−０５０）＋０．１μＭレチノイン酸＋０．２５μＭＳＡＮＴ１＋１μＭＴ３（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６４２４５）＋１μＭＸＸＩ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、５９５７９０）。ステージ６（７〜２５日）：富化無血清培地（ＥＳＦＭ）。ステージ６の１日目に、ＴｒｙｐＬＥによる単細胞分散、およびＥＳＦＭの中での１００ＲＰＭのオービタル振盪機（ＢｅｎｃｈｍａｒｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＯｒｂｉＳｈａｋｅｒ）の上の６ウェルプレートにおける再凝集によって、クラスターの大きさを変更した。

各ステージにおいて使用された基礎分化培地処方は、以下の通りであった。Ｓ１培地：０．２２ｇグルコース（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｇ７５２８）、１．２３ｇ重炭酸ナトリウム（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓ３８１７）、１０ｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、６８７００）、１０μＬのＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５１５０００５６）、５ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３５０５００７９）、２２ｍｇビタミンＣ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ａ４５４４）および５ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ、３０−００２−ＣＩ）を補充した５００ｍＬのＭＣＤＢ１３１（Ｃｅｌｌｇｒｏ、１５−１００−ＣＶ）。Ｓ２培地：０．２２ｇグルコース、０．６１５ｇ重炭酸ナトリウム、１０ｇＢＳＡ、１０μＬのＩＴＳ−Ｘ、５ｍＬＧｌｕｔａＭＡＸ、２２ｍｇビタミンＣおよび５ｍＬＰ／Ｓを補充した５００ｍＬＭＣＤＢ１３１。Ｓ３培地：０．２２ｇグルコース、０．６１５ｇ重炭酸ナトリウム、１０ｇＢＳＡ、２．５ｍＬのＩＴＳ−Ｘ、５ｍＬＧｌｕｔａＭＡＸ、２２ｍｇビタミンＣおよび５ｍＬＰ／Ｓを補充した５００ｍＬＭＣＤＢ１３１。Ｓ５培地：１．８ｇグルコース、０．８７７ｇ重炭酸ナトリウム、１０ｇＢＳＡ、２．５ｍＬのＩＴＳ−Ｘ、５ｍＬＧｌｕｔａＭＡＸ、２２ｍｇビタミンＣ、５ｍＬＰ／Ｓおよび５ｍｇヘパリン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ａ４５４４）を補充した５００ｍＬＭＣＤＢ１３１。ＥＳＦＭ：０．２３ｇグルコース、１０．５ｇＢＳＡ、５．２ｍＬＧｌｕｔａＭＡＸ、５．２ｍＬＰ／Ｓ、５ｍｇヘパリン、５．２ｍＬＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ、２０−０２５−ＣＩ）、８４μｇＺｎＳＯ_４（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、１０８８３）、５２３μＬ微量元素Ａ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、２５−０２１−ＣＩ）および５２３μＬ微量元素Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、２５−０２２−ＣＩ）を補充した５００ｍＬＭＣＤＢ１３１。

膵臓前駆細胞のプレーティングの影響を調査する実験のために、細胞をステージ１〜３のための懸濁液プロトコルで分化させた。ステージ３の終わりに、クラスターをＴｒｙｐＬＥで単細胞分散させ、様々なＥＣＭタンパク質でコーティングされた組織培養プレートの上に０．６２５×１０^６細胞／ｃｍ^２でプレーティングした。このハイブリッドプロトコルの残りのための分化培地は、Ｙ−２７６３２およびアクチビンＡがステージ４の２〜５日目に省略されたことを除いて懸濁液プロトコルと同じであった。各実験において、示すような追加の化合物が加えられた：１μＭラトランクリンＡ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、１００１０６３０）、１μＭラトランクリンＢ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、１００１０６３１）、１μＭサイトカラシンＤ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｃ２６１８）、１μＭジャスプラキノリド（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、１１７０５）、１０μＭブレビスタチン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、２０３３８９）、１μＭノコダゾール（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、１３８５７）、１μＭＹ−１５（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、１４４８５）、１０μＭＹ−２７６３２および１０μＭＧＤＣ−０９９４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｓ７５５４）。コラーゲンＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２４９）、コラーゲンＩＶ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２４５）、フィブロネクチン（Ｇｉｂｃｏ、３３０１６−０１５）、ビトロネクチン（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１４７００）、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５６２３０）、ゼラチン（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｇ７−５００）ならびにラミニン１１１、１２１、２１１、２２１、４１１、４２１、５１１および５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ、ＬＮＫＴ−０２０１）を含む様々なＥＣＭコーティングを、このプレーティング方法で最初に試験した。このハイブリッドプロトコルによる全ての以降の実験は、コラーゲンＩで実行した。

平面プロトコル：継代の２４時間後に、６または２４ウェルプレートの上に０．３１３〜０．５２１×１０^６細胞／ｃｍ^２で播種された細胞を、以下の処方を使用した新規の６ステージプロトコルで、培地を毎日交換して分化させた。ステージ１（４日）：最初の２４時間にはＢＥ１培地＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋３μＭＣＨＩＲ９９０２１、続く３日間は１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡだけを含有するＢＥ１。ステージ２（２日）：ＢＥ２培地＋５０ｎｇ／ｍＬＫＧＦ。ステージ３（２日）：ＢＥ３＋５０ｎｇ／ｍＬＫＧＦ、２００ｎＭＬＤＮ１９３１８９、５００ｎＭＴＰＰＢ（Ｔｏｃｒｉｓ、５３４３１）、２μＭレチノイン酸および０．２５μＭＳＡＮＴ１。ステージ４（４日）：ＢＥ３＋５０ｎｇ／ｍＬＫＧＦ、２００ｎＭＬＤＮ１９３１８９、５００ｎＭＴＰＰＢ、０．１μＭレチノイン酸および０．２５μＭＳＡＮＴ１。ステージ５（７日）：Ｓ５培地＋１０μＭＡＬＫ５ｉＩＩ＋２０ｎｇ／ｍＬベータセルリン＋０．１μＭレチノイン酸＋０．２５μＭＳＡＮＴ１＋１μＭＴ３＋１μＭＸＸＩ。１μＭラトランクリンＡは、最初の２４時間だけこの培地に加えた。ステージ６（７〜２５日）：培養は、最初の７日間、ＥＳＦＭを有するプレートの上に保たれた。懸濁培養に移すために、細胞は、ＴｒｙｐＬＥで単細胞分散させ、１００ＲＰＭのオービタル振盪機の上の６ウェルプレートの中の６ｍＬのＥＳＦＭに、４，０００，０００〜５，０００，０００細胞／ウェルの濃度で入れることができた。調査は、クラスター凝集の５〜８日後に実行した。

懸濁液プロトコルと異なった基礎分化培地処方は、以下の通りであった。ＢＥ１培地：０．８ｇグルコース、０．５８７ｇ重炭酸ナトリウム、０．５ｇＢＳＡおよび５ｍＬＧｌｕｔａＭＡＸを補充した５００ｍＬＭＣＤＢ１３１。ＢＥ２培地：０．４ｇグルコース、０．５８７ｇ重炭酸ナトリウム、０．５ｇＢＳＡ、５ｍＬＧｌｕｔａＭＡＸおよび２２ｍｇビタミンＣを補充した５００ｍＬＭＣＤＢ１３１。ＢＥ３培地：０．２２ｇグルコース、０．８７７ｇ重炭酸ナトリウム、１０ｇＢＳＡ、２．５ｍＬのＩＴＳ−Ｘ、５ｍＬＧｌｕｔａＭＡＸおよび２２ｍｇビタミンＣを補充した５００ｍＬＭＣＤＢ１３１。

顕微鏡検査および免疫細胞化学：
ＬｅｉｃａＤＭｉ１倒立光学顕微鏡で明視野像をとり、ＮｉｋｏｎＡ１Ｒｓｉ共焦点顕微鏡で蛍光像を捕捉した。免疫染色のために、室温で３０分の間、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。次に、それらをブロッキングし、ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、２１−０４０−ＣＶ）の中の０．１％トリトンＸ（ＡｃｒｏｓＯｒｇａｎｉｃｓ、３２７３７１０００）および５％ロバ血清（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、０１７０００−１２１）からなる免疫細胞化学（ＩＣＣ）溶液によって、室温で４５分の間透過性にした。次に、４℃で一晩、試料をＩＣＣ溶液に希釈した一次抗体とインキュベートし、ＩＣＣで洗浄し、室温で２時間、ＩＣＣに希釈した二次抗体とインキュベートし、室温で１５分の間ＤＡＰＩで染色した。組織学的切片作製のために、平面プロトコルおよび移植細胞を含有するマウス腎臓で生成された全ＳＣ−β細胞クラスターを、４℃で一晩、４％ＰＦＡで固定した。さらに、インビトロクラスターをＨｉｓｔｏｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｈｇ−４０００−０１２）に包埋した。これらの試料は、次に、Ｓｔ．ＬｏｕｉｓのＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ（ＤＣＭ）ＲｅｓｅａｒｃｈＡｎｉｍａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｒｅによってパラフィン包埋され、切片にされた。Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ７８−２−Ｇ）によってパラフィンを切片試料から除去し、圧力調理器具（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、２１００Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ）の中で０．０５ＭＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９２６１）によって抗原回収を実行した。スライドをブロッキングし、４５分の間ＩＣＣ溶液で透過性にし、４℃で一晩、ＩＣＣ溶液の中で一次抗体とインキュベートし、室温で２時間、二次抗体とインキュベートした。次に、スライドをＤＡＰＩＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、０１００−２０）で密封した。

特記しない限り、一次抗体はＩＣＣ溶液で１：３００に希釈した：ラット抗Ｃ−ペプチド（ＤＳＨＢ、ＧＮ−ＩＤ４−Ｓ）、１：１００のマウス抗ＮＫＸ６−１（ＤＳＨＢ、Ｆ５５Ａ１２−Ｓ）、ヤギ抗ＰＤＸ１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ２４１９）、ヒツジ抗ＮＥＵＲＯＧ３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ２７４６）、１：２００のＴＲＩＴＣコンジュゲートファロイジン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、ＦＡＫ１００）、ウサギ抗ソマトスタチン（ＡＢＣＡＭ、ａｂ６４０５３）、マウス抗グルカゴン（ＡＢＣＡＭ、ａｂ８２２７０）、マウス抗ＮＫＸ２−２（ＤＳＨＢ、７４．５Ａ５−Ｓ）、ヤギ抗ＮＥＵＲＯＤ１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ２７４６）、マウス抗ＩＳＬ１（ＤＳＨＢ、４０．２ｄ６−ｓ）、ウサギ抗ＣＨＧＡ（ＡＢＣＡＭ、ａｂ１５１６０）、１：１００ヒツジ抗ＰＲＳＳ１／２／３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ３５８６）、１：１００マウス抗ＫＲＴ１９（Ｄａｋｏ、ＭＯ８８８）、ヤギ抗ＫＬＦ５（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ３７５８）、ウサギ抗ＣＤＸ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ７６５４１）、マウス抗ＡＦＰ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３９８０）、ウサギ抗アルブミン（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０７３２７）。

二次抗体はＩＣＣ溶液で１：３００に希釈した。全ての二次抗体は、ロバにおいて立ち上げた：抗ヤギａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０５８）、抗ヤギａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ３１５７１、抗マウスａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０２）、抗マウスａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０３）、抗マウスａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ３１５７１）、抗ウサギａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０６）、抗ウサギａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０７）、抗ウサギａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ３１５７３）、抗ラットａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０８）、抗ヒツジａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０１６）。

ｑＲＴ−ＰＣＲ：
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、７４０１６）によってプレートの上の全クラスターまたは細胞から直接抽出した。試料は、抽出の間、ＤＮアーゼキット（Ｑｉａｇｅｎ、７９２５４）で処理した。サーモサイクラー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａ３７０２８）でｃＤＮＡを合成するために、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３６８８１４）を使用した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＰｏｗｅｒＵｐＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａ２５７４１）を使用し、リアルタイムＰＣＲ結果はΔΔＣｔ方法を使用して分析した。ＴＢＰおよびＧＵＳＢの両方を、ハウスキーピング遺伝子として使用した。プライマー配列は、以下の通りであった。

コラーゲンゲル：
製造業者の説明書に従って１０×ＰＢＳ、無菌脱イオン水および１ＭＮａＯＨを使用して、１型コラーゲン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２４９）ゲルを５ｍｇ／ｍＬの濃度で作製した。このコラーゲン溶液の様々な量を２４ウェルプレートのウェルの中央にピペットで入れ、短時間遠心分離して均一なコーティングを得た。コラーゲンゲルの高さは、コラーゲンゲル溶液の量、２４ウェルプレートの半径およびシリンダーの高さの式に基づいて計算した。

Ｇ／Ｆアクチン比：
Ｇ／Ｆアクチン比は、Ｇ−アクチン／Ｆ−アクチンインビボアッセイキット（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社、ＢＫ０３７）の説明書に従って、ウエスタンブロットによって判定した。ウエスタンブロットは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＰＬＵＳＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基板（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４５７７）およびＯｄｙｓｓｅｙＦＣ（ＬＩ−ＣＯＲ）撮影装置を使用して可視化した。

インテグリンアッセイ：
どのインテグリンが膵臓前駆細胞の表面に発現されたか定量するために、懸濁培養で生成された細胞をステージ３またはステージ４の終わりにＴｒｙｐＬＥによって分散させ、Ａｌｐｈａ／ＢｅｔａＩｎｔｅｇｒｉｎ−ＭｅｄｉａｔｅｄＣｅｌｌＡｄｈｅｓｉｏｎＡｒｒａｙＣｏｍｂｏキット（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、ＥＣＭ５３２）を使用して異なるαおよびβインテグリンサブユニットのためのモノクローナル抗体でコーティングしたウェルの上へプレーティングした。インテグリン発現は、製造業者の説明書に従って定量した。

単細胞ＲＮＡシークエンシング：
ステージ３の終わりに懸濁液プロトコルで生成された細胞をクラスターからＴｒｙｐＬＥで単細胞分散させ、コラーゲン１でコーティングされた２４ウェルプレートに０．６２５×１０^６細胞／ｃｍ^２で播種した。ステージ４の全体を通して、０．５μＭラトランクリンＡまたは５μＭノコダゾールを加えた。ステージ４の終わりに、細胞を単細胞分散させ、ＤＭＥＭに懸濁させ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＧｅｎｏｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｃｃｅｓｓＣｅｎｔｅｒに提出した。ライブラリー調製は、ＣｈｒｏｍｉｕｍＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌ３’ＬｉｂｒａｒｙおよびＧｅｌＢｅａｄキットｖ２（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ、１２０２３７）を使用して実行した。簡潔には、微流動プラットフォームを使用して単細胞を乳濁液に単離し、各単細胞の乳濁液を独特なセットのオリゴヌクレオチドでバーコード化した。ライブラリーを構築するために増幅させた各単細胞乳濁液の中で逆転写を実行するために、ＧｅｍＣｏｄｅプラットフォームを使用した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００を使用して、２６ｘ９８ｐｒｉｍｅｒｂｐの対末端の読み取りデータでライブラリーを配列決定した。

単細胞ＲＮＡ分析を実行するために、Ｓｅｕｒａｔｖ２．０を使用した。ＦｉｌｔｅｒＣｅｌｌｓを使用して、２反復細胞および高いミトコンドリア遺伝子発現の細胞をふるい除いた（未処置対照では＞９０００の全遺伝子および＞５％のミトコンドリア遺伝子、ラトランクリンＡでは＞６０００の遺伝子および＞６％のミトコンドリア遺伝子、ノコダゾールでは＞１２０００の遺伝子および＞４％のミトコンドリア遺伝子）。各データセットは、包括的スケーリングの正規化を使用して正規化した。ＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＧｅｎｅｓは、スケーリングされたｚ−スコア分散を使用して外れ値遺伝子を同定し、除去した。データセットを次に組み合わせ、正規の相関分析（ＣＣＡ）をＲｕｎＭｕｌｔｉＣＣＡで実行した。ＡｌｉｇｎＳｕｂｓｐａｃｅはＣＣＡ部分空間を整列させるために使用され、総合分析のために新規の寸法低減を生成した。ＲｕｎＴＳＮＥを使用して管理されないＴＳＮＥプロットを生成し、結果として生じたクラスターはＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓを使用して明確にし、標識した。各クラスターおよび条件にわたって遺伝子発現における差を可視化するために、ＶｌｎＰｌｏｔ（バイオリンプロット）およびＦｅａｔｕｒｅＰｌｏｔ（ｔｓｎｅプロット）を使用した。

フローサイトメトリー：
ＴｒｙｐＬＥで細胞を単細胞分散させ、４％ＰＦＡで３０分の間固定した。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で４５分の間ＩＣＣ溶液とインキュベートし、４℃で一晩、一次抗体とインキュベートし、室温で２時間、二次抗体とインキュベートした。次に細胞をＩＣＣ溶液で２回洗浄し、濾過した後にＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流した。分析は、ＦｌｏｗＪｏで完了した。

グルコースはインスリン分泌を刺激した：
静的ＧＳＩＳ：ハイブリッドプロトコルによって生成される細胞の機能を調査するために、９６または２４ウェル組織培養プレートになお付着している細胞で静的ＧＳＩＳを実行した。平面プロトコルで生成されるクラスターの機能を調査するために、概ね３０個のクラスターを収集し、２４ウェルプレートの組織培養トランスウェルインサート（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、ＰＩＸＰ０１２５０）に置いた。全部をＫＲＢ緩衝液（１２８ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、２．７ｍＭＣａＣｌ_２、１．２ｍＭＭｇＳＯ_４、１ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１．２ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭＮａＨＣＯ_３、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、１５６３０−０８０）および０．１％ＢＳＡ）で先ず２回洗浄した。細胞は３７℃で１時間、２ｍＭグルコースＫＲＢ溶液中で先ずインキュベートし、その後この溶液を捨て、新鮮な２ｍＭグルコースＫＲＢに交換した。さらなる１時間の後、上清を収集した。２０ｍＭグルコースＫＲＢを次の１時間加え、その後上清を再び収集した。各溶液の交換の間、細胞を新鮮なＫＲＢで洗浄した。次にＴｒｙｐＬＥで細胞を単細胞分散させ、Ｖｉ−ＣｅｌｌＸＲ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）で計数した。低いおよび高いグルコースチャレンジからの上清を、ヒトインスリンＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ、８０−ＩＮＳＨＵ−Ｅ１０．１）で定量し、細胞数はインスリン分泌を正規化するために使用した。

動的ＧＳＩＳ：本発明者らが報告したように^５、ＳＣ−β細胞の動的機能を洗い流しセットアップで調査した。０．０１５インチのインレットおよびアウトレットチュービング（ＩＳＭＡＴＥＣ、０７０６０２−０４ｉ−ＮＤ）を、２７５μｌ細胞チャンバー（ＢｉｏＲｅｐ、Ｐｅｒｉ−Ｃｈａｍｂｅｒ）および分注ノズル（ＢｉｏＲｅｐ、ＰＥＲＩ−ＮＯＺＺＬＥ）に、０．０４”接続チュービング（ＢｉｏＲｅｐ、Ｐｅｒｉ−ＴＵＢ−０４０）で接続した。概ね３０個のＳＣ−β細胞クラスターをＫＲＢ緩衝液で２回洗浄し、チャンバーに入れ、水和バイオゲルＰ−４ポリアクリルアミドビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１５０−４１２４）の２層の間に挟んだ。これらのチャンバーは、高精度８チャネルディスペンサーポンプ（ＩＳＭＡＴＥＣ、ＩＳＭ９３１Ｃ）に接続し、残りのアッセイのために３７℃の水浴に沈めた。最初の９０分間、２ｍＭグルコースＫＲＢ溶液を１００μＬ／分の流速でチャンバー内を潅流させた。この平衡化期間の後、流出水を２分間隔で収集し、以下の通りにグルコース溶液を切り替えた：２ｍＭグルコースＫＲＢで１２分間、２０ｍＭグルコースＫＲＢで２４分間および２ｍＭグルコースＫＲＢで１６分間。次に、ＳＣ−β細胞クラスターを１０ｍＭトリス（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｔ６０６６）、１ｍＭＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９２６１）および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＡｃｒｏｓＯｒｇａｎｉｃｓ、３２７３７１０００）の溶液で溶解した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴＰｉｃｏｇｒｅｅｎｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ７５８９）を使用してＤＮＡを定量し、ヒトインスリンＥＬＩＳＡで定量したインスリン値を正規化するために使用した。

インスリンおよびプロインスリン含有量：
培養プレートに付着した全ＳＣ−β細胞クラスターまたは細胞を、ＰＢＳで２回完全に洗浄した。クラスターの半分またはプレーティングされた細胞の同等のウェルを、Ｖｉ−ＣｅｌｌＸＲの上の細胞数のためにＴｒｙｐＬＥに沈めた。試料の残り半分のために、１．５％ＨＣｌおよび７０％エタノールの溶液を、エッペンドルフチューブの中のクラスターに、またはプレーティングされた細胞に直接加えた。１５分後、プレーティングされた細胞を激しくピペット操作し、エッペンドルフチューブに移した。クラスターおよびプレーティングした細胞からのエッペンドルフチューブを−２０℃に７２時間保ち、２４時間おきに激しく撹拌した。次に２１００ＲＣＦで１５分の間、試料を遠心分離した。各試料の上清を収集し、等量の１Ｍトリス（ｐＨ７．５）で中和し、プロインスリンＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、１０−１１１８−０１）およびヒトインスリンＥＬＩＳＡキットを使用して定量した。プロインスリンおよびインスリン分泌を、生存細胞数に正規化した。

移植研究：
ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅの規則に従って、インビボ研究を実行した。７週齢雄の免疫不全マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＩ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）を、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。腹腔内注射を通してＰＢＳ中の４５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、１６２１５００）を５日連続で投与することによって、ランダムに選択されたマウスで糖尿病を誘導した。マウスは、ＳＴＺ処置の概ね１週後に糖尿病になった。さらなる２週後、イソフルランで麻酔をかけた糖尿病マウスの腎臓嚢の下に、平面プロトコルで生成された約５百万のＳＣ−β細胞を注射することによって、移植手術を実行した。移植手術の後、全てのマウスを毎週モニターした。ランダムに選択された移植マウスのＳＣ−β細胞を含有する腎臓の取り出しを、移植の１２週目の間に実行した。

空腹時血糖測定、耐糖能試験およびインビボＧＳＩＳを、インビボ調査のために実行した。全ての研究のために、マウスを４〜６時間絶食させた。空腹時測定のために、血糖レベルは、手持ち式のグルコメーター（Ｂａｙｅｒ、９５４５Ｃ）を使用して尾の放血から得られた。耐糖能試験のために、０．９％食塩水（Ｍｏｌｔｏｘ、５１−４０５０２２．０５２）中の２ｇ／ｋｇグルコースを注射して、血糖を１５０分の間３０分おきに測定した。インビボＧＳＩＳのために、グルコース注射の前および６０分後に、尾の放血を通した概ね３０μＬの血液を、ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、１６．４４３．１００）を使用して収集した。血液試料は、４℃で１５分間の２５００ｒｐｍで遠心分離し、ヒトＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅインスリンＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、８０−ＥＮＳＨＵＵ−Ｅ０１．１）およびマウスＣ−ペプチドＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、８０−ＣＰＴＭＳ−Ｅ０１）で定量するために、血清を収集した。

一括ＲＮＡシークエンシング：
ステージ３の終わりに懸濁液プロトコルで生成された細胞をクラスターからＴｒｙｐＬＥで単細胞分散させ、コラーゲン１でコーティングされた２４ウェルプレートに０．６２５×１０^６細胞／ｃｍ^２で播種した。０．５μＭラトランクリンＡをステージ４の全体で加えたか、または、１μＭラトランクリンＡをステージ５の最初の２４時間加えた。ステージ６における２週後に、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４０１６）でＲＮＡを抽出し、抽出の間、ＤＮアーゼ処理（Ｑｉａｇｅｎ、７９２５４）が含まれた。ライブラリー調製および配列決定のために、試料をＳｔ．ＬｏｕｉｓＧｅｎｏｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｃｃｅｓｓＣｅｎｔｅｒのＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙに届けた。試料は、ライブラリーキットの製造業者のプロトコルに従ってＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏを使用して、ＲＮＡ消去によって調製し、インデックスを付け、プールし、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑで配列決定をした。

差別的遺伝子発現分析は、ＥｄｇｅＲを使用して実行した。カウントオブジェクトを作製するためにＤＧＥＬｉｓｔを使用し、トリムド平均Ｍ−値（ＴＭＭ）方法をｃａｌｃＮｏｒｍＦａｃｔｏｒｓと使用してデータを正規化した。ｅｘａｃｔＴｅｓｔを使用してペアワイズ比較を実行し、差別的に発現された遺伝子ならびにそれらのそれぞれのｌｏｇ変化倍率（ｌｏｇＦＣ）および調整ｐ値（ＦＤＲ）を得るためにｔｏｐＴａｇｓを使用した。これらの値は、ｇｇｐｌｏｔ２を使用してボルケーノプロットを生成するために使用した。階層的クラスタリングおよびヒートマップは、ｌｏｇＣＰＭによって計算された発現レベルを使用してｈｅａｔｍａｐ．２（ｇｐｌｏｔｓ）で実行され、生成された。遺伝子セット分析は、遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）で実行した。外分泌（ＧＯ：００３５２７２、Ｍ１３４０１）、膵臓ベータ細胞（Ｈａｌｌｍａｒｋ、Ｍ５９５７）および腸管上皮（ＧＯ：００６０５７６、Ｍ１２９７３）を含む系統特異的遺伝子セットは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｇｎａｔｕｒｅｓＤａｔａｂａｓｅ（ＭｄｉｇＤＢ）から得た。肝臓、食道および胃のための遺伝子セットは、ヒトタンパク質地図および文献を使用してカスタマイズした。

他の内胚葉系統への分化：
他の内胚葉系統への分化のために、ＨＵＥＳ８幹細胞を培養し、正常に継代させた。０．５２１×１０^６細胞／ｃｍ^２で２４ウェルプレートに播種してから２４時間後に、分化を開始させた。外分泌膵臓、腸および肝臓のためのプロトコルは、文献から応用した。各プロトコルに示すように、ラトランクリンＡまたはノコダゾールを加えた。全ての３つの分化プロトコルは、内胚葉を誘導するために同じステージ１を使用した。ステージ１（４日）：最初の２４時間にはＢＥ１培地＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋３μＭＣＨＩＲ９９０２１、続く３日間は１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡだけを含有するＢＥ１。

外分泌膵臓：ステージ２（２日）：ＢＥ２培地＋５０ｎｇ／ｍＬＫＧＦ。ステージ３（２日）：ＢＥ３＋５０ｎｇ／ｍＬＫＧＦ、２００ｎＭＬＤＮ１９３１８９、５００ｎＭＴＰＰＢ、２μＭレチノイン酸および０．２５μＭＳＡＮＴ１。ステージ４（４日）：ＢＥ３＋５０ｎｇ／ｍＬＫＧＦ、２００ｎＭＬＤＮ１９３１８９、５００ｎＭＴＰＰＢ、０．１μＭレチノイン酸および０．２５μＭＳＡＮＴ１。１μＭラトランクリンＡをこのステージの最初の２４時間加えたか、または、１μＭノコダゾールをステージ４全体で加えた。ステージ５（６日）：Ｓ５培地＋１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ。１０ｍＭニコチンアミド（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、７２３４０）を、最後の２日間加えた。

腸分化：ステージ２（４日）：ＢＥ２培地＋３μＭＣＨＩＲ９９０２１＋５００ｎｇ／ｍＬＦＧＦ４（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、２３５−Ｆ４）。１μＭラトランクリンＡをこのステージの最初の２４時間加えたか、または、１μＭノコダゾールをステージ２全体で加えた。ステージ３（７日）：ＢＥ３培地＋５００ｎｇ／ｍＬＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、４６４５−ＲＳ）＋１００ｎｇ／ｍＬＥＧＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、２３６−ＥＧ）＋２００ｎＭＬＤＮ１９３１８９。

肝臓分化：ステージ２（２日）：ＢＥ２培地＋５０ｎｇ／ｍＬＫＧＦ。ステージ３（４日）：ＢＥ３培地＋１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ＋３０ｎｇ／ｍＬＢＭＰ４（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、３１４−ＢＰ）。最初の２４時間だけ、２μＭレチノイン酸および１μＭラトランクリンＡまたは１μＭノコダゾールのいずれかを加えた。ステージ４（５日）：ＢＥ３培地＋２０ｎｇ／ｍＬＯＳＭ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、２９５−ＯＭ）＋２０ｎｇ／ｍＬＨＧＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、２９４−ＨＧ）＋１００ｎＭデキサメタゾン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｄ４９０２）。

統計分析
データ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ、バージョン７で実行した。分析したデータは両側ｔ検定またはＡＮＯＶＡによって、続いてダネットの多重比較検定またはテューキーのＨＳＤ検定によって評価した。ｐ値を示すために、以下の表記法を使用する：ｎｓ＝有意でない、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。全てのデータのエラーバーは、ＳＥＭを表す。試料サイズ（ｎ）は、生物学的反復の総数を示す。

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Claims

懸濁液中でインスリン産生ベータ細胞を生成する方法であって、
幹細胞を提供し；
無血清培地を提供し；および
幹細胞をTGFβ/アクチビンアゴニストまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK）阻害剤またはWNTアゴニストと、最終的な内胚葉細胞を形成するのに十分な時間接触させ；
最終的な内胚葉細胞をFGFR2bアゴニストと、原始腸管細胞を形成するのに十分な時間接触させ；
原始腸管細胞をRARアゴニスト、および任意でrhoキナーゼ阻害剤、スムーズンドアンタゴニスト、FGFR2bアゴニスト、プロテインキナーゼCアクチベーター、またはBMPタイプ1受容体阻害剤と、初期膵臓前駆細胞を形成するのに十分な時間接触させ；
初期膵臓前駆細胞を少なくとも約3日間インキュベートし、任意で初期膵臓前駆細胞をrhoキナーゼ阻害剤、TGF-β/アクチビンアゴニスト、スムーズンドアンタゴニスト、FGFR2bアゴニスト、またはRARアゴニストと、膵臓前駆細胞を形成するのに十分な時間接触させ；または
膵臓前駆細胞をAlk5阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、SANT1、Erbb1（EGFR）またはErbb4アゴニスト、またはRARアゴニストと、内胚葉細胞を形成するのに十分な時間接触させ；および
細胞クラスターのサイズを変更させる（任意で約24時間以内のインキュベーション）ことを含む細胞クラスターのサイズを縮小し、およびベータ細胞を形成するのに十分な時間、無血清培地で内胚葉細胞を成熟させる
ことを含む方法。
TGFβ/アクチビンアゴニストがアクチビンＡであり；
グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK）阻害剤またはWNTアゴニストがCHIRであり；
FGFR2bアゴニストがKGFであり；
スムーズンドアンタゴニストがSANT-1であり；
RARアゴニストがレチノイン酸（RA）であり；
プロテインキナーゼCアクチベーターがPdBUであり；
BMPタイプ1受容体阻害剤がLDNであり；
rhoキナーゼ阻害剤がY27632であり；
Alk5阻害剤がAlk5iであり；または
Erbb4アゴニストがベータセルリンである、請求項１に記載の方法。
無血清培地が、MCDB131、グルコース、NaHCO₃、BSA、ITS-X、グルタマックス、ビタミンC、ペニシリン−ストレプトマイシン、CMRL 10666、FBS、ヘパリン、NEAA、微量元素A、微量元素B、またはZnSO₄からなる群から選択される1つまたはそれ以上を含む、請求項１または２のいずれか1つに記載の方法。
内胚葉のクラスターサイズを縮小することを含み、細胞クラスターのサイズの変更が、クラスターを分解し、ベータ細胞に成熟する前に再凝集することを含む、請求項１に記載の方法。
膵臓前駆細胞が、血清、T3、N-アセチルシステイン、トロロックス、およびR428のうちのいずれか１つまたはそれ以上とインキュベートされない、請求項１に記載の方法。
最終的な内胚葉細胞、原始腸管細胞、初期膵臓前駆細胞、膵臓前駆細胞、内胚葉細胞を形成するのに十分な時間が、約1日から約8日の間であり、またはベータ細胞を形成するのに十分な時間が、約1日から約9日の間である、請求項１に記載の方法。
内胚葉細胞のベータ細胞への成熟においてTGFβR1阻害剤（任意でAlk5阻害剤II）または甲状腺ホルモン（任意でT3）の使用を含まない、請求項１に記載の方法。
TGFβR1阻害剤の不在が、TGFβシグナル伝達を可能にし、内胚葉細胞からのベータ細胞の機能的成熟を促進し、またはグルコースレベルの増加または分泌促進物質レベルの増加に応答して、細胞からのインスリン分泌の増加を可能にする、請求項７に記載の方法。
内胚葉細胞のベータ細胞への成熟において、T3、N-アセチルシステイン、トロロックス、またはR428を含まない、請求項７に記載の方法。
ベータ細胞が、少なくとも１つのβ細胞マーカー、少なくとも１つの膵島細胞マーカーを発現するSC−β細胞であり、第1および第2相の動的インスリン分泌を含むグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を受け；
ベータ細胞が、死体のヒト膵島と比較して実質的に同様の量でインスリンを分泌し；または
ベータ細胞は1日またはそれ以上機能を保持する、請求項１に記載の方法。
幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPSC）（患者由来のiPSCなど）、HUES8胚性細胞、1013-4FA、SEVA 1016、またはSEVA1019である、請求項１に記載の方法。
治療有効量のインスリン産生ベータ細胞を対象に投与することを含み、その際、ベータ細胞が請求項１に従って生成される、それを必要とする対象を治療する方法。
幹細胞を内胚葉系統の細胞に分化させる方法であって、
幹細胞を提供し；
無血清培地を提供し；
幹細胞をTGFβ/アクチビンアゴニストおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK）阻害剤またはWNTアゴニストと、最終的な内胚葉細胞を形成するのに十分な時間接触させ；
最終的な内胚葉細胞をFGFR2bアゴニストと、原始腸管細胞を形成するのに十分な時間接触させ；
原始腸管細胞をRARアゴニスト、および任意でスムーズンドアンタゴニスト/ソニックヘッジホッグ阻害剤、FGFファミリーメンバー/FGFR2bアゴニスト、プロテインキナーゼ3アクチベーター、BMP阻害剤、またはrhoキナーゼ阻害剤と、必要に応じて初期膵臓前駆細胞を形成するのに十分な時間接触させ；
初期膵臓前駆細胞を少なくとも約3日間インキュベートし、必要に応じて初期膵臓前駆細胞をスムーズンドアンタゴニスト、FGFR2bアゴニスト、RARアゴニスト、rhoキナーゼ阻害剤、またはTGF-β/アクチビンアゴニストと、膵臓前駆細胞を形成するのに十分な時間接触させ；
膵臓前駆細胞をAlk5阻害剤/TGF-β受容体阻害剤、甲状腺ホルモン、およびガンマセクレターゼ阻害剤、および必要に応じてSANT1、Erbb1（EGFR）またはErbb4アゴニスト/EGFファミリーメンバー、またはRARアゴニストと、内胚葉細胞または内分泌細胞を形成するのに十分な時間接触させ；
必要に応じて内胚葉細胞または内分泌細胞をAlk5阻害剤/TGF-β受容体阻害剤または甲状腺ホルモンと、内胚葉系統の細胞（例えば、膵臓細胞、肝細胞、またはベータ細胞/SC-β細胞）を形成するのに十分な時間接触させ；および
細胞骨格をモジュレーションすべく、一度に、かつ分化効率を高めるのに十分な時間、細胞を硬い基板（付着を促進するためにECMタンパク質の薄層を有する組織培養プラスチックなど）または柔らかい基板上にプレーティングするか細胞に細胞骨格モジュレーション剤を導入する、ここで細胞骨格モジュレーション剤は、ラトランクリンA、ラトランクリンB、ノコダゾール、サイトカラシンD、ジャスプラキノリド、ブレビスタチン、y-27632、y-15、gdc-0994、またはインテグリンモジュレーション剤を含む
ことを含む方法。
幹細胞を内胚葉系統の細胞に分化させる方法であって、
TGFβ/アクチビンアゴニスト、アクチビンA、WNTアゴニスト、およびCHIRを含む培地中で幹細胞を約24時間インキュベートし、続いて、CHIRを含まずアクチビンAを含む培地中で細胞を約3日間インキュベートしてステージ1の最終的な内胚葉細胞を生成し；および
外分泌膵臓細胞を生成すべく、FGFR2bアゴニストであるKGFを含む培地中で該ステージ1の最終的な内胚葉細胞を約2日間インキュベートしてステージ2の細胞を生成し；FGFR2bアゴニストであるKGF；BMP阻害剤、LDN193189；TPPB；RARアゴニストであるレチノイン酸（RA）；スムーズンドアンタゴニストであるSANT1を含む培地中で該ステージ2の細胞を2日間インキュベートしてステージ3の細胞を生成し；FGFR2bアゴニストであるKGF；BMP阻害剤、LDN193189；TPPB；RARアゴニストであるレチノイン酸；およびスムーズンドアンタゴニストであるSANT1を含む培地中で該ステージ3細胞を約4日間インキュベートしてステージ4の細胞を生成し、その際、ラトランクリンAをインキュベーションの最初の約24時間に添加するか、またはノコダゾールをインキュベーションの約4日間全体にわたって添加し；ついで、bFGFを含む培地中で該ステージ4の細胞を約6日間インキュベートし、その際、ニコチンアミドを該6日間の最後の2日間に添加し；
腸細胞を生成すべく、WNTアゴニスト、CHIRおよびFGF4を含む培地中で該ステージ1び最終的な内胚葉細胞を約4日間インキュベートしてステージ2の細胞を生成し、その際、ラトランクリンAをインキュベーションの最初の約24時間に添加するか、またはノコダゾールをインキュベーションの約4日間全体にわたって添加し；R-スポンジン1およびBMP阻害剤；LDN193189を含む培地中で該ステージ2細胞を約7日間インキュベートし；または
肝細胞を生成すべく、FGFR2bアゴニストであるKGFを含む培地中で該ステージ1の最終的な内胚葉細胞を約2日間インキュベートしてステージ3の細胞を生成し；BMP4を含む培地中で該ステージ3細胞を約4日間インキュベートしてステージ4細胞を生成し、その際、RARアゴニスト、レチノイン酸、およびラトランクリンAまたはノコダゾールのいずれかをインキュベーションの最初の約24〜48時間添加し、ついで、OSM、HGF、およびデキサメタゾンを含む培地中で該ステージ4の細胞を約5日間培養する
ことを含む方法。
内胚葉系統の細胞を形成する前にクラスターのサイズを変更することを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
TGFβ/アクチビンアゴニストはアクチビンAであり；
グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK）阻害剤またはWNTアゴニストがCHIRであり；
FGFR2bアゴニストがKGFであり；
スムーズンドアンタゴニストまたはソニックヘッジホッグ阻害剤がSANT-1であり；
FGFファミリーメンバー/FGFR2bアゴニストがKGFであり；
RARアゴニストがRAであり；
プロテインキナーゼ3アクチベーターがPDBUであり；
BMP阻害剤がLDNであり；
rhoキナーゼ阻害剤がY27632であり；
Alk5阻害剤/TGF-β受容体阻害剤がAlk5iであり；
甲状腺ホルモンがT3であり；
ガンマセクレターゼ阻害剤がXXIであり；
Erbb1（EGFR）またはErbb4アゴニスト/EGFファミリーのメンバーがベータセルリンであり；または
RARアゴニストがRAである
請求項１３に記載の方法。
培地が、MCDB131、グルコース、NaHCO3、BSA、ITS-X、グルタマックス、ビタミンC、ペニシリン−ストレプトマイシン、CMRL 10666、FBS、ヘパリン、NEAA、微量元素A、微量元素B、またはZnSO4からなる群から選択される1つまたはそれ以上を含む無血清培地である、請求項１３または１４のいずれか1つに記載の方法。
最終的な内胚葉細胞、原始腸管細胞、初期膵臓前駆細胞、膵臓前駆細胞、内胚葉細胞、またはベータ細胞を形成するのに十分な時間が、約1日から約15日の間である、請求項１３に記載の方法。
初期膵臓前駆細胞をプレーティングするか、またはYAPをs1p（スフィンゴシン−1−リン酸）で活性化して、SC-β細胞誘導を増加させ、望ましくない早すぎる内分泌コミットメントを防止し、または転写因子発現のタイミングを正しくすることを可能にする、請求項１３に記載の方法。
ラトランクリンA、ラトランクリンB、またはノコダゾールを膵臓前駆細胞に導入して、プレーティングした細胞の内分泌誘導の増強およびその後生成されたβ細胞のグルコース刺激インスリン分泌の増強をもたらす、請求項１３に記載の方法。
ラトランクリンAまたはラトランクリンBを膵臓前駆細胞に導入して肝細胞などの内胚葉系統の細胞を生成するか、またはラトランクリンAまたはラトランクリンBが細胞骨格アクチンを破壊する（例えば、ラトランクリンAまたはラトランクリンBをステージ5の前に導入すると肝細胞が生じ、またはステージ5を通じてラトランクリンAまたはラトランクリンBを導入するとβ細胞の数が増加する）、請求項１３に記載の方法。
YAP阻害剤（例えば、ベルテポルフィン）を膵臓前駆細胞に導入する、請求項１３に記載の方法。
ラトランクリンAまたはラトランクリンBを膵臓前駆細胞に導入して、グルコース媒介性インスリン分泌またはインスリン遺伝子発現を増加させる、請求項１３に記載の方法。
内胚葉系統の細胞が、ベータ細胞、肝臓細胞、または膵臓細胞から選択される、請求項１３に記載の方法。
ベータ細胞の誘導および機能を増強する、請求項１３に記載の方法。
平面（付着）培養で培養することを含む、請求項１３に記載の方法。
硬い基板上に細胞をプレーティングすることを含み、その際、NKX6.1の発現は、柔らかい基板上または懸濁培養におけるNKX6.1の発現と比較して、硬い基板上で増加する、請求項１３に記載の方法。
平面（付着）細胞が分散され、再凝集されるか、または外部キュー（例えば、温度）で疎水性を変化させる表面と組み合わされて、細胞の剥離を可能にし、細胞配置、細胞外マトリックスタンパク質、およびインスリン分泌を保持する、請求項１３に記載の方法。
ベータ細胞がSC−β細胞である、請求項１３に記載の方法。
幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPSC）（患者由来のiPSCなど）、HUES8、1013-4FA、1013-4FA、1016SeVA、および1019SeVAから選択される、請求項１３に記載の方法。
請求項１、１３、または１４のいずれか1つから生成された細胞を提供し；および
化合物または組成物を細胞に導入する
ことを含むスクリーニング方法。
治療有効量の内胚葉系統の細胞を対象に投与することを含み、該細胞が請求項１、１３、または１４のいずれか1つに従って生成される、それを必要とする対象を治療する方法。
対象が糖尿病を患っているか、または細胞が対象に移植され、移植された細胞が対象において耐糖能を改善し、移植後少なくとも約1か月、少なくとも約2か月、少なくとも約3か月、少なくとも約4か月、少なくとも約5か月、または少なくとも約6か月持続する機能を持つ、請求項３２に記載の方法。
請求項１、１３、または１４のいずれか1つの方法によって生成された細胞。
内胚葉系統の細胞、ベータ細胞、または内胚葉系統の中間細胞が、CDX2、CHGA、FOXA2、SOX17、PDX1、NKX6-1、NGN3、NEUROG3、NEUROD1、NXK2-2、ISL1、KRT7、KRT19、PRSS1、PRSS2、またはINSを発現する、請求項３４の細胞または請求項１、１３、または１４のいずれか1つの方法によって生成された細胞。