JP2021519084A - ヘマグルチニンを含む広範に防御的なワクチン組成物を生成する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、組換えヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを生成するためのクラスターベースコンセンサスアプローチに関する。本開示は、組換えＨＡポリペプチドを含むインフルエンザワクチン組成物にさらに関する。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、その内容を全体として参照により組み入れる米国仮出願第６２／６４９，００４号、２０１８年３月２８日出願の優先権を主張する。

本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体を参照により本明細書に組み入れる配列表を含む。２０１９年３月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０１１２１−００３６−００ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズ８５，９６４バイトである。

インフルエンザは、パンデミック、伝染、再流行および大発生の長い歴史を有する。例えば、毎年のインフルエンザ伝染は、世界で３００から５００万人の重症疾患および約２９０，０００から６５０，０００名の死者を生じると考えられている。現在、ワクチンは、インフルエンザに対する最も有効な防御を提供する。ワクチン組成物は、蔓延しているインフルエンザ株における差異に適応するように世界保健機関によって毎年更新されている。しかし、不正確な予測から生じるワクチンミスマッチは、ワクチン接種された集団においてさえ顕著な罹患率および死亡率を生じる場合がある。

インフルエンザウイルスは、ウイルス膜の表面に２つの構造糖タンパク質、すなわち、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する。ＨＡは、シアル酸に結合し、ウイルス侵入に関与するホモ三量体膜タンパク質である。ＮＡは、シアル酸の除去により感染細胞からのウイルスの放出に関与する。現在、インフルエンザワクチンは、一般に、ＨＡを認識する中和抗体の誘導に依拠している。しかし、かかる中和抗体は、しばしば株特異的である。したがって、ＨＡにおける可変性（例えば、抗原シフトによる）は、免疫回避およびワクチン有効性の減少を生じる場合がある。

したがって、ミスマッチ株を含むインフルエンザウイルスに対して広範で、持続的な（例えば、複数シーズン）防御を提供できる有効なインフルエンザワクチンに対する必要性が残っている。

本発明は、特に、複数のインフルエンザ株に対して広範に反応性の免疫応答を誘発することができるＨＡポリペプチドを生成するためのクラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）アプローチを提供する。種々の実施形態では、方法は：
・１つより多いインフルエンザＨＡポリペプチド配列を選択すること、および配列をアラインすること；
・ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出すること；
・ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定することおよび創出すること；
・各クラスター内で、ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；
・各クラスターについてコンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第１の配列を生成すること；
・場合により、１つより多いクラスターが分析される場合：
○各クラスターについて生成された配列をアラインすること；
○ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；および
○コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第２の配列を生成すること
によって、クラスターから生成された第１の配列と別のクラスターまたは複数のクラスターにおいて生成された配列とを比較すること；
・生成された第１の配列または第２の配列内で：
○第１のまたは第２の配列に基づいて一連の検査配列を生成することであって、検査アミノ酸を可変アミノ酸位置に位置させること；
○検査配列それぞれについて分子モデリングを実行すること；
○負の総エネルギー値を有するポリペプチドをもたらすアミノ酸（複数可）を選択することによって各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸を決定すること
によって、各可変アミノ酸位置についてコンセンサスアミノ酸を決定すること、ならびに
・コンセンサスアミノ酸を含むインフルエンザＨＡポリペプチドを生成すること
を含む。

種々の実施形態では、本発明は、本発明の方法を使用して生成されたＨＡポリペプチドを提供する。例示的実施形態では、ＨＡポリペプチは、配列番号１〜１６またはこれらの断片のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のＨＡポリペプチドを含む三量体ＨＡタンパク質にさらに関する。

種々の実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドおよび／または三量体ＨＡタンパク質は、ワクチン抗原として利用される。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドおよび三量体ＨＡタンパク質は、複数のインフルエンザ株、型またはサブタイプに対して広範に防御的な免疫応答を提供する。理論に束縛されることを望むわけではないが、ＨＡポリペプチドおよび三量体ＨＡタンパク質がインフルエンザウイルス内の複数のエピトープ（例えば、保存されたエピトープ）に対する中和抗体応答を誘発できると考えられる。

本出願のさらなる実施形態は、以下のとおりである：
実施形態Ａ１．コンセンサスアミノ酸を含む組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを生成するための方法であって：
ａ．１つより多いインフルエンザＨＡポリペプチド配列を選択すること、および配列をアラインすること；
ｂ．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出すること；
ｃ．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定することおよび創出すること；
ｄ．各クラスター内で、ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；
ｅ．各クラスターについてコンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第１の配列を生成すること；
ｆ．場合により、複数のクラスターが分析される場合：
ｉ．各クラスターについて工程（ｅ）において生成された配列をアラインすること；
ｉｉ．ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；ならびに
ｉｉｉ．コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第２の配列を生成すること
によって、クラスターの工程（ｅ）において生成された第１の配列と別のクラスターまたは複数のクラスターにおいて生成された第１の配列とを比較すること；
ｇ．工程（ｅ）において生成された第１の配列または工程（ｆ）（ｉｉｉ）において生成された第２の配列内で：
ｉｖ．第１のまたは第２の配列に基づいて一連の検査配列を生成することであって、検査アミノ酸を可変アミノ酸位置に位置させること；
ｖ．検査配列それぞれについて分子モデリングを実行すること；
ｖｉ．負の総エネルギー値を有するポリペプチドをもたらすアミノ酸（複数可）を選択することによって各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸を決定すること
によって、各可変アミノ酸位置についてコンセンサスアミノ酸を決定すること、ならびに
ｈ．コンセンサスアミノ酸を含む組換えインフルエンザＨＡポリペプチドを生成すること
を含む方法。
実施形態Ａ２．配列をアラインすることは、ＭＡＦＦＴ、ＭＵＳＣＬＥ、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、ＦＡＳＴＡ、これらの組合せまたは任意の他の多重配列アライメントソフトウェアパッケージを使用することを含む、実施形態Ａ１の方法。
実施形態Ａ３．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出することは、ＢＬＯＳＵＭ、ＰＡＭ、ＩＤＥＮＴＩＴＹ置換マトリクスまたはこれらの組合せを使用することを含む、実施形態Ａ１またはＡ２の方法。
実施形態Ａ４．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定および創出することは、Ｋ平均クラスタリング、ミニマックスクラスタリング（minimax clustering）、主成分分析（ＰＣＡ）、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）またはこれらの組合せを使用することを含む、実施形態Ａ１〜３のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ５．分子モデリングは、インフルエンザＨＡポリペプチドまたはタンパク質の結晶構造と比較することを含む、実施形態Ａ１〜４のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ６．分子モデリングは、Ｒｏｓｅｔｔａまたは任意の他の分子モデリングソフトウェアの使用を含む、実施形態Ａ１〜５のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ７．検査アミノ酸は、タンパク質に見出される任意の天然または非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ１〜６のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ８．実施形態Ａ１〜７のいずれか１つの方法を使用して生成された組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
実施形態Ａ９．配列番号１〜１６またはこれらの断片のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列、または配列番号１〜１６またはその断片のいずれか１つに少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ８の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
実施形態Ａ１０．実施形態Ａ８またはＡ９の１つまたはそれ以上の組換えＨＡポリペプチドを含む組換え三量体ＨＡタンパク質。
実施形態Ａ１１．実施形態Ａ８もしくはＡ９の組換えＨＡポリペプチドまたは実施形態Ａ１０の組換え三量体ＨＡタンパク質をコードする単離された核酸。
実施形態Ａ１２．実施形態Ａ１１の核酸を含むベクター。
実施形態Ａ１３．実施形態Ａ１２のベクターを含む、単離された細胞。
実施形態Ａ１４．哺乳動物細胞である、実施形態Ａ１３の単離された細胞。
実施形態Ａ１５．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞である実施形態Ａ１４の単離された細胞
実施形態Ａ１６．昆虫細胞である、実施形態Ａ１３の単離された細胞。
実施形態Ａ１７．実施形態Ａ８もしくはＡ９の組換えＨＡポリペプチドまたは実施形態Ａ１０の組換え三量体ＨＡタンパク質を含む融合タンパク質。
実施形態Ａ１８．実施形態Ａ８もしくはＡ９の組換えＨＡポリペプチドまたは実施形態Ａ１０の組換え三量体ＨＡタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
実施形態Ａ１９．インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、インフルエンザマトリクス（Ｍ１）タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇａｇタンパク質またはこれらの組合せの１つもしくはそれ以上をさらに含む、実施形態Ａ１８のインフルエンザＶＬＰ。
実施形態Ａ２０．実施形態Ａ８もしくはＡ９の組換えＨＡポリペプチド、実施形態Ａ１０の組換え三量体ＨＡタンパク質、実施形態Ａ１７の融合タンパク質または実施形態Ａ１８もしくはＡ１９のインフルエンザＶＬＰおよび薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物。
実施形態Ａ２１．１つまたはそれ以上のインフルエンザ株、型および／またはサブタイプに対する免疫応答を誘発する、実施形態Ａ２０の医薬組成物。
実施形態Ａ２２．インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、実施形態Ａ８もしくはＡ９の組換えＨＡポリペプチド、実施形態Ａ１０の組換え三量体ＨＡタンパク質、実施形態Ａ１７の融合タンパク質、実施形態Ａ１８もしくはＡ１９のインフルエンザＶＬＰまたは実施形態Ａ２０もしくはＡ２１の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
実施形態Ａ２３．対象においてインフルエンザウイルスへの免疫応答を誘導する方法であって、実施形態Ａ８もしくはＡ９の組換えＨＡポリペプチド、実施形態Ａ１０の組換え三量体ＨＡタンパク質、実施形態Ａ１７の融合タンパク質、実施形態Ａ１８もしくはＡ１９のインフルエンザＶＬＰまたは実施形態Ａ２０もしくはＡ２１の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
実施形態Ａ２４．インフルエンザウイルスは、季節性またはパンデミックインフルエンザウイルスである、実施形態Ａ２２またはＡ２３の方法。
実施形態Ａ２５．免疫応答は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルス株、型またはサブタイプに対する抗体の産生を含む、実施形態Ａ２３またはＡ２４の方法。
実施形態Ａ２６．対象は、哺乳動物である、実施形態Ａ２２〜Ａ２５のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ２７．対象は、ヒトである、実施形態Ａ２６の方法。
実施形態Ａ２８．投与することは、筋肉内、鼻腔内、皮内、皮下、経口または静脈内経路を介して実行される、実施形態Ａ２２〜Ａ２７のいずれか１つの方法。

追加的目的および有利点は、続く記載に部分的に記載され、部分的に記載から明らかになり、実行によって収得される。目的および有利点は、添付の特許請求の範囲に具体的に示される要素および組合せの手段によって認識され、達成される。

前述の一般的な記載および続く詳細な記載の両方は、例示的および説明的なだけであり、特許請求の範囲の限定ではないことは理解される。

本明細書に組み入れられ、その一部を構成する添付の図は、１つ（複数）の実施形態（複数可）を例示し、記載と共に本明細書に記載の原理を説明する目的を果たす。

ＨＡポリペプチドを設計するための例示的クラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）法を示す図である。図１Ａは、主成分分析（ＰＣＡ）によるＨＡ配列クラスターの生成を示している。８個のＨＡ配列クラスターが同定され、円で示されている。 ＨＡポリペプチドを設計するための例示的クラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）法を示す図である。図１Ｂは、実施例１に記載のティア割り当て（Tier assignment）およびアセンブリ順を例示する。 種々のティア１、ティア２およびティア３ ＣＢＣ ＨＡポリペプチドが正しくフォールドされ、機能を保持していることを例示する図である。ＣＢＣ ＨＡポリペプチドは、２９３ＦＴ細胞で発現され、表面発現は、球状頭部（すなわち、ＣＨ６５、５Ｊ８および４Ｋ８）またはステム（すなわち、Ｃ１７９）領域中の保存されたエピトープを認識することが周知であるモノクローナル抗体を使用して検出された。 ＣＢＣ ＨＡタンパク質を発現するインフルエンザＡウイルスを回収するための逆遺伝学システムの使用を例示する図である。ティア１および２ ＣＢＣ ＨＡ配列（すなわち、ＨＡｃｏ３Ｍ、ＨＡｃｏ４Ｍ、ＨＡｃｏ５ＭおよびＨＡｃｂ３４５Ｍ）を内部に有する組換えインフルエンザＡウイルスの良好なレスキューがプラークアッセイおよびヘマグルチニン活性によって決定された。 実施例３に記載の免疫原性研究の模式図である。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、プラーク減少中和試験（Plaque Reduction Neutralization Test）（ＰＲＮＴ）によって決定されるとおり中和抗体応答を誘導したことを示す図である。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、プラーク減少中和試験（Plaque Reduction Neutralization Test）（ＰＲＮＴ）によって決定されるとおり中和抗体応答を誘導したことを示す図である。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、プラーク減少中和試験（Plaque Reduction Neutralization Test）（ＰＲＮＴ）によって決定されるとおり中和抗体応答を誘導したことを示す図である。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、プラーク減少中和試験（Plaque Reduction Neutralization Test）（ＰＲＮＴ）によって決定されるとおり中和抗体応答を誘導したことを示す図である。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、プラーク減少中和試験（Plaque Reduction Neutralization Test）（ＰＲＮＴ）によって決定されるとおり中和抗体応答を誘導したことを示す図である。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、プラーク減少中和試験（Plaque Reduction Neutralization Test）（ＰＲＮＴ）によって決定されるとおり中和抗体応答を誘導したことを示す図である。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、プラーク減少中和試験（Plaque Reduction Neutralization Test）（ＰＲＮＴ）によって決定されるとおり中和抗体応答を誘導したことを示す図である。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイによって決定されるとおり中和抗体応答を誘導したことを示す図である。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、抗体フォレンジック（Antibody Forensic）（ＡＦ）アッセイによって決定されるとおり抗体結合を誘導したことを示す図である。結果は、野生型ウイルス（図７Ａおよび７Ｃ）ならびにティアウイルス（図７Ｂおよび７Ｄ）について示されている。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、抗体フォレンジック（Antibody Forensic）（ＡＦ）アッセイによって決定されるとおり抗体結合を誘導したことを示す図である。結果は、野生型ウイルス（図７Ａおよび７Ｃ）ならびにティアウイルス（図７Ｂおよび７Ｄ）について示されている。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、抗体フォレンジック（Antibody Forensic）（ＡＦ）アッセイによって決定されるとおり抗体結合を誘導したことを示す図である。結果は、野生型ウイルス（図７Ａおよび７Ｃ）ならびにティアウイルス（図７Ｂおよび７Ｄ）について示されている。 ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えウイルスが、抗体フォレンジック（Antibody Forensic）（ＡＦ）アッセイによって決定されるとおり抗体結合を誘導したことを示す図である。結果は、野生型ウイルス（図７Ａおよび７Ｃ）ならびにティアウイルス（図７Ｂおよび７Ｄ）について示されている。 実施例４に記載のＶＬＰ免疫処置研究の模式図である。 ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイによって決定された種々のＣＢＣ ＨＡタンパク質を発現するＶＬＰの免疫原性プロファイルを示す図である。各パネル（縦線によって分けられている）内で、検査されたウイルスは、左から右に、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９；Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１０／７６；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４；Ａ／Ｆｏｒｔ／ＭｏｎＭｏｕｔｈ／１／１９４７；Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７；Ａ／Ｂｒａｚｉｌ／１１／１９７８；Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／１９８３；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／８６；Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／１９９５；Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６；およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７であった。 マイクロ中和試験（ＭＮ）アッセイによって決定された種々のＣＢＣ ＨＡタンパク質を発現するＶＬＰの免疫原性プロファイルを示す図である。各パネル内で、検査されたウイルスは、左から右に、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９；Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１０／７６；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４；Ａ／Ｆｏｒｔ／ＭｏｎＭｏｕｔｈ／１／１９４７；Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７；Ａ／Ｂｒａｚｉｌ／１１／１９７８；Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／１９８３；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／８６；Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／１９９５；Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６；およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７であった。 図１０−１の続き。

配列の記載

定義
アジュバント：本明細書において使用される場合、アジュバントは、抗原への免疫応答を非特異的に増強する物質またはビヒクルを指す。アジュバントとして、抗原が吸着されるミネラル（例えば、アラム、水酸化またはリン酸アルミニウム）の懸濁物；抗原溶液がミネラル油中または水中に乳化されている油中水または水中油乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント）が非限定的に挙げられる。時に、死菌マイコバクテリアが抗原性をさらに増強するために含まれる（例えば、フロイント完全アジュバント）。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ）もアジュバントとして使用できる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび共刺激分子などの生物学的分子も含む。例示的生物学的アジュバントとして、これだけに限らないが、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−ａ、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ、４１ ＢＢＬまたはこれらの組合せが挙げられる。

抗体：本明細書において使用される場合、抗体は、特定の抗原に特異的結合を付与するために十分なカノニカル免疫グロブリン配列エレメントを含むタンパク質またはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む古典的抗体である。各重鎖は、１つの可変領域（例えば、Ｖ_Ｈ）ならびに少なくとも３つの定常領域（例えば、ＣＨ_１、ＣＨ_２およびＣＨ_３）を含み、各軽鎖は、１つの可変領域（Ｖ_Ｌ）および１つの定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。可変領域は、抗体の特異性を決定する。各可変領域は、４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）に隣接された、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても周知の３つの高頻度可変性領域を含む。３つのＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称され、抗体結合特異性に寄与する。一部の実施形態では、抗体は、例えば、抗体の抗原結合または可変領域などの未処置抗体の一部を含む「抗体断片」または「抗体断片（複数）」とも称される。「抗体断片」の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、三価抗体（triabody）、四価抗体（tetrabody）、直鎖抗体、１本鎖抗体分子および多特異性抗体に含まれるＣＤＲ含有部分が挙げられる。ある特定の実施形態では、天然抗体において見出されるような十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、かかるポリペプチドが天然で産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）、または組換え工学、化学合成もしくは他の人工システムもしくは方法によって産生されるかに関わらず、「抗体」と呼ばれるおよび／または「抗体」として使用される。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナルである；一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナルである。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒト化されている。

抗原：本明細書において使用される場合、抗原は、生物に曝露もしくは投与される場合に免疫応答を誘発する作用剤および／または、Ｔ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）によって結合されるもしくは抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生される）に結合する作用剤を指す。一部の実施形態では、抗原は、生物において液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発する。代替的にまたは追加的に、一部の実施形態では、抗原は、生物において細胞性応答（例えば、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を含む）を誘発する。具体的な抗原が標的生物（例えば、マウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つまたはいくつかのメンバーにおいて免疫応答を誘発できるが、標的生物種のすべてのメンバーにおいてではないことは、当業者によって理解される。一部の実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％において免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、抗原は、抗体および／またはＴ細胞受容体に結合し、生物において具体的な生理学的応答を誘導する場合としない場合がある。一部の実施形態では、例えば抗原は、かかる相互作用がｉｎ ｖｉｖｏで生じるかどうかに関わらずｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体に、および／またはＴ細胞受容体に結合できる。一部の実施形態では、抗原は、異種性免疫原によって誘導されたものを含む特異的液性または細胞性免疫の産生物と反応する。一部の実施形態では、インフルエンザＨＡポリペプチドまたはその免疫原性断片は、抗原である。

抗原ドリフト：本明細書において使用される場合、抗原ドリフトは、比較的頻繁に生じるＨＡまたはＮＡ抗原における変異を指す。抗原ドリフトは、インフルエンザウイルスが免疫認識を逃れられるようにでき、ワクチン効能を減少させる場合がある。

抗原シフト：本明細書において使用される場合、抗原シフトは、異なるインフルエンザ株間の遺伝子材料の再集合によって生じるＨＡまたはＮＡ抗原における主な変化を指す。

およそ：本明細書において使用される場合、用語「およそ」または「約」は、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される場合、述べられる基準値に近い値を指す。ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、他に述べられない限りまたは内容から他が明らかでない限り、述べられた基準値のいずれかの方向における（超えるまたは少ない）約２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはこれ未満の範囲内の値の範囲を指す（かかる値が可能値の１００％を超える場合を除く）。

エピトープ：本明細書において使用される場合、免疫グロブリン（例えば、抗体または受容体）結合成分の全体または部分によって特異的に認識される任意の部分を指す。一部の実施形態では、エピトープは、抗原上の複数の化学原子または基からなる。一部の実施形態では、かかる化学的原子または基は抗原が適切な三次元コンホメーションをとった場合に表面に曝露される。一部の実施形態では、かかる化学原子または基は、抗原がかかるコンホメーションをとった場合に空間的に互いに物理的に近い。一部の実施形態では、化学的原子または基の少なくとも一部は、抗原が代替的コンホメーションをとった（例えば、直鎖化されている）場合に互いに物理的に離される。

頭部領域：本明細書において使用される場合、用語「頭部領域」は、インフルエンザＨＡタンパク質の膜遠位球形ドメインを指す。ＨＡ頭部領域は、受容体結合を媒介し、ＨＡタンパク質のＨＡ１サブユニット内に存在する。

ヘマグルチニンまたはＨＡタンパク質：本明細書において使用される場合、ヘマグルチニンまたはＨＡタンパク質は、インフルエンザウイルス膜の表面上の膜内在性糖タンパク質を指す。詳細には、ＨＡタンパク質は、通常、インフルエンザビリオンの表面上のホモ三量体複合体として発現される。個々のＨＡモノマーポリペプチドは、膜遠位球状頭部領域と膜近位ステム領域とにさらに分離される。ＨＡタンパク質は、標的細胞とのウイルス付着および続く、膜融合に関与している。現在、抗体とのそれらの相互作用によって決められる少なくとも１８個の周知のＨＡサブタイプ（すなわち、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８）がある。ヒトは、一般にＨ１、Ｈ２およびＨ３サブタイプのウイルスに感染する。一部の実施形態では、ＨＡタンパク質は、モノマーであり、単一のＨＡポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＨＡタンパク質は、三量体であり、３つのＨＡポリペプチドを含む。本明細書において使用される場合、「ヘマグルチニンポリペプチド」または「ＨＡポリペプチド」は、そのアミノ酸配列がＨＡの少なくとも１つの特徴的な配列を含むポリペプチドを指す。ＨＡポリペプチドは、全長インフルエンザＨＡポリペプチド配列およびその断片を含む場合がある。当業者は、ＨＡポリペプチド一般の、および／または具体的なＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２もしくはＨ３ポリペプチド）または具体的な宿主（例えば、鳥類、ラクダ、イヌ、ネコ、ジャコウネコ、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アシカ、ムナジロテン、ブタ、トラ、クジラなど）の感染を媒介するＨＡの特徴的である配列を容易に同定できる。ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）は、ＨＡポリペプチド配列のデータベースを維持している。

宿主：本明細書において使用される場合、用語「宿主」は、目的のポリペプチドが存在するシステム（例えば、細胞、生物など）を指す。一部の実施形態では、宿主は、特定の感染病原体での感染に感受性であるシステムである。一部の実施形態では、宿主は、目的の特定のポリペプチドまたはタンパク質を発現するシステムである。

宿主細胞：本明細書において使用される場合、「宿主細胞」は、外来性ＤＮＡ（組換えまたはその他）が導入される細胞を指す。例えば、宿主細胞は、標準的組換え技術によって本明細書に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを産生するために使用できる。当業者は、かかる用語が具体的な対象細胞だけでなく、かかる細胞の後代も指すことを理解する。ある特定の改変が、変異または環境の影響のいずれかのために続く世代に生じる場合があることから、かかる後代は、実際に、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書において使用される、用語「宿主細胞」の範囲内にいまだ含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞は、外来性ＤＮＡ（例えば、組換え核酸配列）を発現するために好適な任意の原核および真核細胞を含む。例示的細胞として、原核もしくは真核細胞（単細胞もしくは多細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス種、ストレプトマイセス種などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、Ｐ．パストリス、Ｐ．メタノリカ（P.methanolica）など）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合物（例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマ）が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞であり、これだけに限らないが、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、ジャーカット、ダウディ、Ａ４３１（上皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前述の細胞由来の細胞系から選択される。一部の実施形態では、細胞は、１つまたはそれ以上のウイルス遺伝子を含む、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）。

免疫応答：本明細書において使用される場合、用語「免疫応答」は、抗原またはワクチンなどの刺激への、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージまたは多形核球（polymorphonucleocyte）などの免疫システムの細胞の応答を指す。免疫応答は、例えば、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関与する任意の体細胞を含む。免疫応答として、これだけに限らないが、自然および／または適応免疫応答が挙げられる。本明細書において使用される場合、防御免疫応答は、対象を感染から保護する（例えば、感染を予防するまたは感染に関連する疾患の発症を予防する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は、当技術分野において十分周知であり、例えば、リンパ球（ＢまたはＴ細胞など）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生などを測定することによるものが挙げられる。

免疫原：本明細書において使用される場合、用語「免疫原」は、動物に注射または吸収される組成物を含む、好適な条件下で動物において抗体の産生またはＴ細胞応答などの免疫応答を刺激できる化合物、組成物または物質を指す。本明細書において使用される場合、「免疫原性組成物」は、免疫原（ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質など）を含む組成物である。本明細書において使用される場合、「免疫化」は、ワクチン接種によってなど感染性疾患から対象が保護されるようにすることを意味する。

インフルエンザウイルス：本明細書において使用される場合、オルトミクソウイルス科に属するセグメント化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを指す。

インフルエンザワクチン：本明細書において使用される場合、インフルエンザウイルス感染の予防、回復または処置のために投与される、免疫応答を刺激できる免疫原性組成物を指す。インフルエンザワクチンとして、例えば、弱毒化または死菌（例えば、分割された）インフルエンザウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）および／または抗原ポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、本明細書に記載のＨＡポリペプチドもしくは三量体ＨＡタンパク質）またはそれら由来のＤＮＡまたはかかる免疫原性材料の任意の組換えバージョンが挙げられる。インフルエンザワクチンは、ＤＮＡおよびウイルスベクターに基づくワクチンも含む。本明細書において検討されるワクチンは、場合により、１つまたはそれ以上のアジュバントを含む場合がある。

単離された：本明細書において使用される場合、（ｉ）最初に産生された（天然において、または実験設定においてであるかに関わらず）際に付随していた構成成分の少なくとも一部から分離された；または（ｉｉ）人工的に産生された、のいずれかである作用剤または実体を指す。単離された作用剤または実体は、最初に付随していた他の構成成分の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはこれ超から分離されている。一部の実施形態では、単離された作用剤は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて純粋である。本明細書において使用される場合、他の構成成分を実質的に含まない場合に物質は、「純粋」である。一部の実施形態では、当業者によって理解されるとおり、物質は、例えば、１つまたはそれ以上の担体または賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）などのある特定の他の構成成分と配合された後でも「単離された」または「純粋」とさえ見なすことができ；かかる実施形態では、物質の単離または純度パーセントは、かかる担体または賦形剤を含まずに算出される。例示的実施形態では、天然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生物学的ポリマーは、ａ）その起源または誘導の供給源が、天然でのその天然状態においてそれに伴う構成成分の一部またはすべてと付随しない理由から；ｂ）天然でそれを産生する種と同じ種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない；ｃ）天然でそれを産生する種のものではない細胞または他の発現システムによって発現される、またはそれ由来の構成成分に付随する、場合に、「単離された」と見なされる。したがって、例えば、一部の実施形態では、化学的に合成されるまたは、天然でそれを産生するのとは異なる細胞システムにおいて合成されるポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドと見なされる。代替的にまたは追加的に、一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の精製技術に供されたポリペプチドは、ａ）天然でそれに付随する；および／またはｂ）最初に産生された際に付随する、他の構成成分から分離されている程度に「単離された」ポリペプチドと見なされる。

大発生：本明細書において使用される場合、インフルエンザウイルス「大発生」は、所与の年に単一の国の中から単離されたウイルスの集合物を指す。

パンデミック、季節性、ブタ株：本明細書において使用される場合、「パンデミック」インフルエンザ株は、ヒト集団のパンデミック感染を生じたまたは生じる能力を有するものである。一部の実施形態では、パンデミック株は、パンデミック感染を生じさせたことがある。一部の実施形態では、かかるパンデミック感染は、複数の地域にわたる伝染性感染を含む。一部の実施形態では、パンデミック感染は、感染がそれらの間を通常は通過しないような互いに分かれている地域（例えば、山、水域によって、異なる大陸の部分としてなど）にわたる感染を含む。一部の実施形態では、パンデミックインフルエンザ株は、ヒトがそれに対する免疫を欠いているトリまたはブタ由来の新規ＨＡまたはＮＡを有するウイルスを生じる、ヒトインフルエンザウイルスとトリまたはブタインフルエンザウイルスとの間の再集合から生じるもの（およそ２０〜３０年ごとに生じる抗原シフト）を含む。言い換えると、ヒト集団は、無感作であり、過去のワクチン接種または過去の曝露のいずれかの結果としての抵抗性を有さないまたはわずかしか有さないと考えられる。パンデミック株と季節性株とは、抗原的に異なり、配列によって全く異なる。一般に、季節性インフルエンザ株は、具体的な季節または具体的な年、例えば、１９８６年から２００９年（パンデミックではない２００９年配列を含む）由来の蔓延している株、および抗原領域をコードする実質的に類似（すなわち、抗原配列空間において類似）の遺伝配列を有する他の株と定義される。ブタインフルエンザ株は、ブタに固有のウイルスに関連する任意のインフルエンザ株を指す。例示的パンデミック株として、非限定的に、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９、Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／１４５／２００９、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／０１／１９１８およびＡ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６が挙げられる。パンデミックサブタイプとして、特に、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９およびＨ１０Ｎ７サブタイプが挙げられる。例示的季節性株として、非限定的に、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、Ａ／Ｆｏｒｔ Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／１９４７、Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／１９８３、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／６／１９８６、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／０３／２００６、およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７が挙げられる。例示的ブタ株として、非限定的に、Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６単離体およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９が挙げられる。追加的インフルエンザパンデミック、季節性および／またはブタ株は、当技術分野において周知である。

予防：本明細書において使用される場合、具体的な疾患、障害または状態（例えば、感染、例えばインフルエンザウイルスでの）の、予防（prophylaxis）、疾患顕在化の回避、発病の遅延ならびに／または１つまたはそれ以上の症状の頻度および／もしくは重症度の低減を指す。一部の実施形態では、予防は集団ベースで評価され、疾患、障害または状態の発症、頻度および／または１つまたはそれ以上の症状の強度における統計的に有意な減少が疾患、障害または状態に感受性の集団において観察される場合に、作用剤は具体的な疾患、障害または状態を「予防」すると見なされる。

組換え：本明細書において使用される場合、用語「組換え」は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド、組換え、コンビナトリアルポリペプチドライブラリーから単離されたポリペプチドまたは、選択された配列エレメントを互いにスプライシングすることを含む任意の他の手段によって製造、発現、創出または単離されたポリペプチドなどの、組換え手段によって設計、操作、製造、発現、創出または単離されるポリペプチドまたはタンパク質（例えば、本明細書に記載のＨＡポリペプチドもしくは三量体ＨＡタンパク質）を指すと意図される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のかかる選択された配列エレメントは、天然で見出される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のかかる選択された配列エレメントは、コンピューターで設計される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のかかる選択された配列エレメントは、周知の配列エレメント、例えば、天然または合成供給源由来、の変異導入（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）から生じる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のかかる選択された配列エレメントは、同じポリペプチドに天然では存在しない複数（例えば、２つ以上）（例えば、２つの別々のＨＡポリペプチド由来の２つのエピトープ）の周知の配列エレメントの組合せから生じる。

ステム領域：本明細書において使用される場合、用語「ステム領域」または「ストーク領域」は、インフルエンザＨＡタンパク質の球状頭部ドメインから出ている膜近位の伸長されたドメインを指す。ステム領域は、膜融合を媒介し、ＨＡタンパク質のＨＡ１およびＨＡ２サブユニットの配列領域からなる。

シグナル配列、分泌シグナル、または分泌シグナルペプチド：本明細書において使用される場合、用語は、細胞からの分泌のためのシグナルを伝達するペプチド配列を指す。分泌シグナルは、そうでなければ分泌されないポリペプチドまたはタンパク質の分泌をもたらすことができる。

三量体化ドメイン：本明細書において使用される場合、用語は、ポリペプチドまたはタンパク質の三量体アセンブリを生じるドメインをコードするアミノ酸配列を指す。具体的なタンパク質に由来しない三量体化ドメインは、人工または異種性三量体化ドメインと称される。例示的三量体化ドメインとして、これだけに限らないが、コラーゲンの三量体化ドメイン、ＧＣＮ４−ベースイソロイシンジッパー、ＨＩＶ ｇｐ４１三量体化ドメインまたはＴ４バクテリオファージフィブリチンフォールドン（fibritin foldon）（Ｆｄ）三量体化ドメインが挙げられる。

配列同一性：アミノ酸配列または核酸配列間の類似性は、配列間の類似性および／または同一性の観点から表される。配列類似性は、配列同一性および相同性によって密接に関連している配列の要素を含む。配列類似性は、類似性（または同一性もしくは相同性）百分率の観点からしばしば測定される；百分率が高いほど２つの配列はより類似している。所与の遺伝子またはタンパク質のホモログまたはバリアントは、標準的方法を使用してアラインされた場合に比較的高い程度の配列同一性を有する。比較のための配列のアライメント法は、当技術分野において十分周知である。種々のプログラムおよびアライメントアルゴリズムが当技術分野において記載されている：Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７〜２４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１〜１０８９０，１９８８およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８．Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９〜１２９，１９９４。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（登録商標））（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，１９９０）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとの関連での使用のためにｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を含むいくつかの供給元から入手可能である。

対象：本明細書において使用される場合、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「対象」はヒトを指す。一部の実施形態では、「対象」は非ヒト動物を指す。一部の実施形態では、対象として、これだけに限らないが、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫および／または虫が挙げられる。ある特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝的に操作された動物、および／またはクローンである場合がある。本発明のある特定の実施形態では、対象は、成人、青年または幼児である。一部の実施形態では、用語「個体」または「患者」は、「対象」と互換的であるとして使用され、意図される。本発明によって同様に検討されるのは、子宮内での医薬組成物の投与および／または処置法の実施である。

ワクチン接種：本明細書において使用される場合、用語「ワクチン接種」または「ワクチン接種する」は、例えば病原体への、免疫応答を生成する目的の組成物の投与を指す。ワクチン接種は、病原体への曝露および／または１つまたはそれ以上の症状の発症の前、その間および／または後、一部の実施形態では、病原体への曝露の前、その間および／または直後に投与される。一部の実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン接種組成物の適切な時間間隔での複数回投与を含む。

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書において使用される場合、句「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、ウイルスに類似しているが、いかなるウイルス遺伝材料も欠いており、したがって感染性でない粒子を指す。「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、哺乳動物細胞系、昆虫細胞系、酵母および植物細胞を含む種々の細胞培養システムにおける異種性発現によって産生される。加えてＶＬＰは、当技術分野において周知の方法によって精製される。一部の実施形態では本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチドおよび／またはＮＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチドおよび／または構造ポリペプチドを含む。一部のある特定の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチドおよび／またはインフルエンザＭ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチドおよび／またはＨＩＶｇａｇポリペプチドを含む。当業者は、他のウイルス構造タンパク質を本明細書に例示されるものの代替として使用できることを認識する。インフルエンザＶＬＰは、ＨＡおよびＮＡタンパク質、ならびに場合によりＭ１タンパク質および／またはＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするプラスミドを用いた、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）のトランスフェクションによって産生できる。タンパク質発現を可能にするための好適な期間でのトランスフェクトされた細胞のインキュベーション後に、ＶＬＰは細胞培養上清から単離される。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）での一過性トランスフェクションによって産生される。一部の実施形態では、インフルエンザＶＬＰは、１つまたはそれ以上のアッセイの使用によって分析される。例えば、インフルエンザＶＬＰ粒子サイズは、動的光散乱によって分析でき、かかるＶＬＰは、タンパク質染色によって、ヘマグルチニン活性およびヘマグルチニン含有量の定量についても分析される。

野生型：当技術分野において理解されるとおり、用語「野生型」は、天然で見出されるタンパク質または核酸の通常の形態を一般に指す。例えば、野生型ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の単離物において見出される。種々の異なる野生型ＨＡ配列をＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースにおいて見出すことができる。

ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを設計するための方法
コンセンサスインフルエンザタンパク質配列を生成することに関連する重要な課題は、時間的および地理的配列バイアスに関する。かかるバイアスは、一部は、公的なおよび／または民間の配列データベースに提供される配列記録がしばしばより最近の配列に大きく偏っているために存在する。さらに、合衆国などのある特定の地理的領域と関連する配列がしばしば大きな比率を占める。一態様では、本発明は、かかる時間的および地理的配列バイアスを克服するクラスターベースコンセンサスアプローチを使用して、コンセンサスアミノ酸を含むインフルエンザＨＡポリペプチドを生成するための新規方法を提供する。本発明の方法は、系統発生学的情報と無関係で、一次アミノ酸配列に含有される情報だけに依存する。したがって、本方法は、全体的な配列多様性を反映し、時間的または地理的に大きな比率を占める配列へのバイアスがないＨＡポリペプチド配列を生成することができる。

種々の実施形態では、方法は、複数のインフルエンザＨＡ配列における配列差異のコンピューター分析に基づいてＨＡポリペプチド配列を設計すること、類似配列のクラスターを生成するためにコンセンサスベース配列アルゴリズムを適用すること、およびコンセンサスアミノ酸配列を有するＨＡポリペプチドの構造分析を実施することを含む。一部の実施形態では、本方法は、Ｋ平均法、ミニマックスクラスタリングおよび最遠距離優先クラスタリング（Farthest-First clustering）などのツールを使用してクラスター化できるペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを生成する。代替的にまたは追加的に、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスは、好適なクラスターを定義するため（例えば、クラスターを分離し、数を決めるため）の、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）または主成分分析（ＰＣＡ）などのオーディネーション技術を使用してコンパクト表現で可視化される。さらに本方法は、コンセンサス配列内の可変アミノ酸位置を解明し、正しくフォールドし、それにより機能性であり易い候補を順位付けるために、分子モデリングおよび結晶構造との比較を利用する。

理論に束縛されることを望むわけではないが、本発明の方法は、さまざまなインフルエンザ株、型および／またはサブタイプにわたって保存されたエピトープを含むＨＡポリペプチドを生成すると考えられる。したがって、種々の実施形態では、本方法は、広範なインフルエンザ株（例えば、１つまたはそれ以上の季節性、パンデミックもしくはブタ株）、インフルエンザ型（例えば、１つまたはそれ以上のインフルエンザＡ型、Ｂ型もしくはＣ型）および／またはインフルエンザサブタイプ（例えば、非限定的に、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２もしくはＨ５Ｎ１などの１つまたはそれ以上のインフルエンザサブタイプ）に対して交差反応性免疫応答の増強を誘導できるＨＡポリペプチドを生成する。

一部の実施形態では、本方法は、種々のインフルエンザＨＡポリペプチド配列を選択することを含む。種々の異なるＨＡ配列は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）インフルエンザウイルス配列データベースなどの配列データベースにおいて見出すことができる。一部の実施形態では、固有の配列の非重複サブセットは、配列アライメントのために選択される。

一部の実施形態では、本方法は、インフルエンザＨＡポリペプチド配列をアラインすることを含む。当技術分野において周知の任意の多重配列アライメントツールを使用できる。例えば、Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ（２００２）ＮＡＲ，３０：３０５９；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｓｔａｎｄｌｅｙ（２０１３）Ｍｏｌ ＢｉｏＬ Ｅｖｏｌ ３０：７７２；Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．（２００４）ＮＡＲ，３２：１７９２；Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．（２００４）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆ，１１３；Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｓｙｓ Ｂｉｏｌ ７：５３９；およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ．（１９８８）ＰＮＡＳ，８５：２４４４を参照されたい。本発明のために利用できる例示的配列アライメントツールとして、これだけに限らないが、ＭＡＦＦＴ、ＭＵＳＣＬＥ、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、ＦＡＳＴＡ、またはこれらの組合せが挙げられる。

一部の実施形態では、特異的配列領域は、さらなる分析から遮蔽される場合がある。例えば、ＨＡシグナルペプチド配列、膜貫通ドメイン配列、細胞質側末端配列または任意の他の保存ＨＡドメインの任意の１つは、さらなる分析から遮蔽される場合がある。

一部の実施形態では、本方法は、アラインされた配列からペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出することを含む。２つ以上の配列間の距離を算出するための任意の方法を使用できる。ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出するための例示的ツールとして、これだけに限らないが、ＢＬＯＳＵＭ、ＰＡＭ、ＩＤＥＮＴＩＴＹ置換マトリクスまたはこれらの組合せが挙げられる。一実施形態では、ＦａｓｔＴｒｅｅなどのペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出するための代替法を使用する場合がある（Ｐｒｉｃｅ，Ｍ．Ｎ．，Ｄｅｈａｌ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２６：１６４１〜１６５０）。

一部の実施形態では、本方法は、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定するおよび創出することをさらに含む。類似配列のクラスターを同定するための例示的ツールとして、これだけに限らないが、Ｋ平均クラスタリング、ミニマックスクラスタリング、最遠距離優先クラスタリング、主成分分析（ＰＣＡ）、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）またはこれらの組合せが挙げられる。一実施形態では、クラスタリングのためにＫ平均法が利用される（Ｈａｒｔｉｇａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｃ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２８（１）：１００〜１０８を参照されたい）。別の実施形態では、ミニマックスクラスタリング（例えば、類似性マトリクスのミニマックスリンケージ階層クラスタリング（linkage hierarchical clustering））が利用される（Ｂｉｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを参照されたい）。さらなる実施形態では、近似解法（farthest-first traversal）が使用される（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９７７）ＳＩＡＭ Ｊ Ｃｏｍｐ，６：５６３を参照されたい）。

一部の実施形態では、オーディネーション技術が、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクス由来の類似配列のクラスターを同定および創出するために使用される。例えば、一部の実施形態では、ＰＣＡは、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスの次元削減（dimension reduction）のために使用される。ＰＣＡは、高次元、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを、類似配列のクラスターの可視化および同定を促進する低次元サブ空間に変換するために利用できる（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｋ．（１９０１）Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ Ｍａｇａｚｉｎｅ ２（１１）：５５９〜５７２およびＨｏｔｅｌｌｉｎｇ，Ｈ．（１９３３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ，２４，４１７〜４４１，ａｎｄ ４９８〜５２０を参照されたい）。さらなる実施形態では、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）が使用される。ＭＤＳは、多次元データセットの類似性および非類似性のレベルを算出および可視化し、一連の点のすべての対の間の距離を最良に再現する次元の削減されたセットを見出す手段を指す。一部の実施形態では、ＭＤＳは、オブジェクト間の距離が維持されるように、Ｎ次元空間中の各オブジェクトを位置させるために使用される。一部の実施形態では、ＭＤＳは、距離マトリクスに含有される情報の提示を可能にする。一部の実施形態では、ＭＤＳは、削減された次元空間にＨＡ配列を置き、それによりウイルス配列の対の間の相対距離を正確に維持する。一部の実施形態では、系統発生学的方法が再集合および／または組換えの存在下で一致しない場合があることから、ＭＤＳは、系統発生学的方法における欠点を克服する。一部の実施形態では、ＭＤＳは、無作為であるインフルエンザウイルスにおける中立置換を除去する。種々の実施形態では、ＭＤＳまたはＰＣＡなどのオーディネーション技術は、クラスターの可視化および同定を促進するために、高次元、ペアワイズ距離マトリクスを低次元サブ空間に変換することを助ける。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、類似配列の１より多いクラスター（例えば、季節性様、パンデミック様またはブタ様配列）を創出する。本明細書に記載の方法での使用のための配列の例示的クラスターは、これだけに限らないが、図１Ａおよび１Ｂに示されるものである。

一部の実施形態では、各クラスター内で、コンセンサス配列は、多重配列アライメントにおける各位置で最も頻繁なアミノ酸に基づいて算出される。例えば、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％（または使用者が定義する任意の他の閾値）以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定される。代替的に、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％（または使用者が定義する任意の他の閾値）未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定される。一部の実施形態では、第１の配列は、コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む各クラスターについて生成される。一部の実施形態では、各クラスターについて生成された第１の配列は、クラスター内コンセンサス配列と指定される。

一部の実施形態では、コンセンサス配列は、複数配列クラスターについて生成される。かかる実施形態では、複数クラスターについて選択されたクラスター内コンセンサス配列は、特定された結果の特性に基づいて追加的コンセンサス配列を導き出すためにマージされる。例えば、特定の地理的領域、宿主または時期と関連するクラスター内コンセンサス配列は、クラスターを超えるコンセンサス配列（例えば、第２の配列）を生成するためにマージされる。

種々の実施形態では、クラスターを超えるコンセンサス配列を生成するために、１つのクラスターから生成されたクラスター内コンセンサス配列（例えば、第１の配列）は、別のクラスターまたは複数クラスターから生成されたクラスター内コンセンサス配列（例えば、第１の配列）と比較される。一部の実施形態では、生成された配列は、互いに対してアラインされる。一部の実施形態では、ペアワイズアライメント法は、アライメントにおいて各位置に対するコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定するために利用される。既に記載したとおり、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％（または使用者が定義する任意の他の閾値）以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％（または使用者が定義する任意の他の閾値）未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定される。一部の実施形態では、コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含むクラスターを超えるコンセンサス配列（例えば、第２の配列）は、かかる多重クラスター分析から生成される。種々の実施形態では、各位置で配列をアラインするおよびコンセンサスアミノ酸を決定するプロセスは、目的のすべての配列クラスターが検討されるまで繰り返し実施される。

一部の実施形態では、追加的工程は、生成されたクラスター内コンセンサス配列内、および／またはクラスターを超えるコンセンサス配列（例えば、第１の配列および／または第２の配列）内の、各可変アミノ酸位置についてコンセンサスアミノ酸を決定するために実施される。かかる実施形態では、一連の検査配列は、コンセンサス配列（例えば、第１のおよび／または第２の配列）に基づいて生成され、検査アミノ酸を、可変アミノ酸位置に位置させる。本明細書に記載の方法において使用される検査アミノ酸は、必須または非必須アミノ酸を含むタンパク質において見出される任意の天然または非天然（例えば、非古典的）アミノ酸を包含する。例示的アミノ酸として、下の表２に提供されるアミノ酸および本明細書他所に記載されるものが挙げられる。

種々の実施形態では、本方法は、検査配列を分析するための分子モデリングの使用を検討する。一部の実施形態では、分子モデリングは、検査配列のそれぞれについて実施される。一部の実施形態では、分子モデリングは、分析されるインフルエンザタンパク質（すなわち、ＨＡ）の結晶構造との比較を含む。かかる結晶構造情報は、例えば、ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋから容易に入手可能である。一実施形態では、分子モデリングは、Ｒｏｓｅｔｔａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｏｓｅｔｔａｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ）または任意の他の同様の分子モデリングソフトウェアの使用を含む（例えば、Ｌｅａｖｅｒ−Ｆａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４８７：５４５〜７４を参照されたい）。例えば、コンセンサス配列中の可変アミノ酸位置を解明するために、Ｒｏｓｅｔｔａ内のメトロポリス−モンテカルロシミュレートされたアニーリングプロトコールは、差異の同定された部位に存在するアミノ酸残基のすべての可能な組合せの置換を標本抽出するために使用される。次いで可能な置換は、エネルギー値に基づいてスコア化される。

一部の実施形態では、各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸は、出発値と同様のまたはそれより低い算出された総エネルギー値を有するＨＡポリペプチドを生じるアミノ酸（複数可）を選択することによって決定される。一部の実施形態では、各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸は、負の総エネルギー値を有するＨＡポリペプチドを生じるアミノ酸（複数可）を選択することによって決定される。理論に束縛されることを望むわけではないが、負の総エネルギースコアを有するＨＡポリペプチドは、安定なタンパク質にさらにフォールドし易い一方で、正のエネルギースコアを有するポリペプチドは、あまり正しくフォールドしないと考えられる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＨＡポリペプチドは、それらの負の総エネルギースコアおよび／または参照構造との比較に従って生成され、順位付けられる。

種々の実施形態では、本方法は種々の位置にコンセンサスアミノ酸を含むＨＡポリペプチド配列を生成する。本発明の方法を使用して生成された例示的ＨＡポリペプチドは表１に示されている（すなわち、配列番号１〜１６）。

ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドおよびタンパク質
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法を用いて生成されたＨＡポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、コンセンサスアミノ酸配列を含み、複数のインフルエンザ株（例えば、１つまたはそれ以上のパンデミック、季節性、および／またはブタインフルエンザ株）、タイプ（例えば、１つまたはそれ以上のインフルエンザＡ型、Ｂ型、および／またはＣ型ウイルス）、および／またはサブタイプ（例えば、１つまたはそれ以上のＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、またはＨ５Ｎ１）に対する免疫応答を誘発することができる。したがって、一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、インフルエンザに対する改良された防御免疫を提供するために、抗原としてワクチン組成物中に取り込まれ得る。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１６またはこれらの断片のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、配列番号１〜１６またはその断片のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

例えば、一部の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１６のいずれか１つの断片を含むＨＡポリペプチドを提供する。例示的実施形態では、ＨＡポリペプチドは、シグナルペプチドを欠いている場合がある。別の例示的実施形態では、ＨＡポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠いている場合がある。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１６またはこれらの断片のいずれか１つと比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸変異を有するＨＡポリペプチドを提供する。例えば、ＨＡポリペプチドは、配列番号１〜１６またはこれらの断片のいずれか１つに対して、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、もしくは約５０個のアミノ酸突然変異を含むことができる。

一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸突然変異は、置換、挿入、欠失、および切断から独立して選択される。一部の実施形態では、アミノ酸突然変異は、アミノ酸置換であり、保存的および／または非保存的置換を含み得る。

保存的置換は、例えば、関連するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行われる。例えば、２０個の天然に存在するアミノ酸は、以下の６つの標準なアミノ酸群に群分けすることができる：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、上記で示された６つの標準的なアミノ酸群と同じ群内にリストされた別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、改変されたポリペプチドに１つの負電荷を保持する。さらに、α−ヘリックスを破壊する能力に基づいて、グリシンおよびプロリンが互いに置換される。本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、上記で示された６つの標準アミノ酸群の異なる群にリストされた別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。

種々の実施形態では、置換はまた、非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロリジン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡおよびδ−アミノレブリン酸、４−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ、シトルリン、ホモシトルリン、シスチン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、βメチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体）を含み得る。

種々の実施形態では、本発明は、さらに、３つのＨＡポリペプチドを含む三量体ＨＡタンパク質を提供する。一部の実施形態では、三量体ＨＡタンパク質内の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＨＡポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む。例えば、三量体ＨＡタンパク質の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＨＡポリペプチドは、配列番号１〜１６のアミノ酸配列、またはその断片を含み得る。一部の実施形態では、三量体ＨＡタンパク質は、３つの同一のＨＡポリペプチドを含む。他の実施形態では、三量体ＨＡタンパク質は、異なるアミノ酸配列を有する２つ以上の非同一のＨＡポリペプチドを含む。

種々の実施形態では、本発明は、本発明のＨＡポリペプチド、またはその断片を含む融合タンパク質をさらに提供する。

種々の実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドは、モノマーＨＡポリペプチドの三量体ＨＡタンパク質へのアセンブリを促進する三量体化配列または三量体化ドメインを含む場合がある。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、天然インフルエンザ単離物において見出されるＨＡポリペプチドに存在する三量体化を促進する配列またはドメインを含む。例えば、ＨＡポリペプチドは、三量体形成を促進することが周知であるステム領域を含むＨＡ２配列において見出される配列を含む。他の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、野生型ＨＡポリペプチドには天然で存在しない操作されたもしくは異種性三量体化配列または三量体化ドメインを含む。種々の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、任意の三量体化配列または三量体化ドメインを含むように操作される。例示的三量体化配列として、これだけに限らないが、共有結合性または非共有結合性架橋結合のいずれかを形成するアミノ酸が挙げられ、三量体化ドメインとして、これだけに限らないが、コラーゲンの三量体化ドメイン、ＧＣＮ４−ベースイソロイシンジッパー、ＨＩＶ ｇｐ４１三量体化ドメインまたはＴ４バクテリオファージフィブリチンフォールドン（Ｆｄ）三量体化ドメインが挙げられる。

一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、分泌シグナルペプチドを含み得る。一実施形態では、分泌シグナルペプチドの取り込みは、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質が宿主細胞から分泌されることを可能にする。別の実施形態では、分泌シグナルペプチドの取り込みは、タンパク質の発現および生成に使用される宿主細胞（例えば、宿主細胞の上清）からのＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質の精製を可能にする。

当該技術分野において公知である任意の分泌シグナルペプチドを本発明のＨＡポリペプチドに組み込むことができると期待される。一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、タンパク質の発現および生成に使用される宿主細胞に特異的である。例示的な分泌シグナルペプチドには、限定されないが、ＣＤ３３シグナルペプチド配列、ヒトＩｇＧカッパ軽鎖シグナルペプチド（ヒト細胞における発現のため）、ミツバチメリチンシグナル配列（昆虫細胞における発現のため）、および酵母アルファ−因子シグナル配列（酵母細胞における発現のため）が含まれる。例示的な実施形態では、分泌シグナル配列は、ＣＤ５分泌シグナルペプチドである。一実施形態では、ＣＤ５分泌シグナルペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、リンカー配列などのさらなる機能的配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸の長さが約１００個未満である。例えば、リンカーは、アミノ酸の長さが約１００個未満、約９０個、約８０個、約７０個、約６０個、約５０個、約４０個、約３０個、約２０個、約１９個、約１８個、約１７個、約１６個、約１５個、約１４個、約１３個、約１２個、約１１個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個、約５個、約４個、約３個、または約２個であり得る。

種々の実施形態では、リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基（例えば、約３０％、もしくは約４０％、もしくは約５０％、もしくは約６０％、もしくは約７０％、もしくは約８０％、もしくは約９０％、もしくは約９５％、もしくは約９７％のグリシンおよびセリン）で実質的に構成される。例えば、一部の実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎであり、ｎは約１〜約８、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８（配列番号１９）である。ある実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２０）である。さらなる例示的リンカーには、限定されないが、配列ＬＥ、ＧＧＧＧＳ（配列番号２１）、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ｎ＝１〜４）（配列番号２２）、（Ｇｌｙ）_８（配列番号２３）、（Ｇｌｙ）_６（配列番号２４）、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号２５）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号２６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２７）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）_４Ａ（配列番号２８）、ＰＡＰＡＰ（配列番号２９）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３０）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号３１）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号３４）、および（ＸＰ）_ｎ、（Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕを示す）を有するリンカーが含まれる。例示的な実施形態では、リンカーは、ＧＧＳまたはＧＳＧである。別の例示的な実施形態では、リンカーはＳＡである。

一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、機能的タグ配列（例えば、タンパク質精製を促進するため）をさらに含む。限定されないが、ＨＡポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（例えば、６×Ｈｉｓ（配列番号３３）））、プロテインＡ、ストレプトアビジン／ビオチンベースのタグ、ならびに当該技術分野において公知である任意の他のタンパク質タグなどのアフィニティータグを含み得る。

一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、トロンビン切断部位、トリプシン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、または当該技術分野において公知である任意の他のプロテアーゼ切断部位などのプロテアーゼ切断部位をさらに含む。

種々の実施形態では、本明細書に記載のＨＡポリペプチド（または三量体ＨＡタンパク質）は、異なる配列を有するある範囲のインフルエンザウイルスに対する改良された防御免疫（例えば、広範な反応性の免疫応答）を提供する。種々の実施形態では、本明細書に記載のＨＡポリペプチド（または三量体ＨＡタンパク質）は、複数のインフルエンザ株の間で保存されたエピトープに対する増強された免疫応答を誘発する。種々の実施形態では、本明細書に記載のＨＡポリペプチド（または三量体ＨＡタンパク質）は、抗原シフトまたは抗原ドリフトを示す異なるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質は、野生型または天然に存在するインフルエンザウイルス株由来のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質と比較して、異なるインフルエンザ株／タイプ／サブタイプにわたってより大きな免疫原性を示す。一部の実施形態では、本明細書に記載のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質は、野生型または天然に存在するインフルエンザウイルス株由来のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質と比較してより大きな安定性を有する。

核酸の構築および発現
種々の実施形態では、組換えＨＡポリペプチドを産生する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載のクラスターベースコンセンサス法を用いて、コンセンサスアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを生成し、宿主細胞を、ＨＡポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトすることによってＨＡポリペプチドを生成することを含む。種々の実施形態では、組換え三量体ＨＡタンパク質を生成する方法もまた提供される。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＨＡポリペプチドは、当該技術分野において公知である分子生物学的方法を使用して、核酸から産生される。例えば、核酸分子は、適切な宿主細胞に導入された場合にＨＡポリペプチドを発現することができるベクターに挿入される。適切な宿主細胞には、限定されないが、細菌、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞、ならびに本明細書の他の箇所に記載される任意の他の細胞型が含まれる。ベクターへのＤＮＡ断片の挿入のための当業者に公知である任意の方法を使用して、転写／翻訳制御シグナルの制御下でＨＡポリペプチドをコードする発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡおよび合成クローニング技術、ならびにインビボの組換え技術を含み得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）を参照されたい）。

一部の実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸に相補的な核酸を提供する。他の実施形態では、本発明は、三量体ＨＡタンパク質をコードする核酸をさらに提供する。

一部の実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸にハイブリダイズする核酸分子を提供する。このような核酸は、例えば、プライマーとしてまたはプローブとして用いることができる。例示的な実施形態では、このような核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして、ハイブリダイゼーション（インサイチュのハイブリダイゼーションを含む）のためのプローブとして、および／または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのプライマーとして使用することができる。

一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、一本鎖または二本鎖であり得る。一部の実施形態では、本発明による核酸は、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、本発明による核酸は、天然ヌクレオチドのみを含む。

本発明による核酸分子の発現は、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において分子が発現されるように、第２の核酸配列によって調節される。例えば、本発明の核酸分子の発現は、当該技術分野において公知であるプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントによって制御することができる。

一部の実施形態では、核酸分子を含む発現ベクターは、核酸構築物によってコードされるＨＡポリペプチドまたはタンパク質の生成を可能にするために、適切な宿主細胞に形質転換される。次に、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、本発明のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質の生成を可能にする条件下で増殖させ、続いて、ポリペプチドまたはタンパク質を回収する。本発明で用いることができる例示的な細胞型には、限定されないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、および細菌細胞が含まれる。昆虫細胞には、限定されないが、ＳＦ細胞、毛虫細胞、蝶細胞、蛾細胞、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、ショウジョウバエ細胞、Ｓ２細胞、ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）細胞、キャベツルーパー細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌａｓｉａ ｎｉ）細胞が含まれる。適切な哺乳動物細胞には、限定されないが、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＥＢｘ細胞、ニワトリ胚細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎臓細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＳＯ細胞、骨髄腫細胞、ハイブリドーマ細胞、初代アデノイド細胞株、初代気管支上皮細胞、形質転換ヒト細胞株、およびＰｅｒ．Ｃ６細胞が含まれる。他の有用な細胞または細胞系には、限定されないが、植物ベースのシステム（例えば、タバコ植物；例えば、Ｊｕｌ−Ｌａｒｓｅｎ，Ａ．ら、Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、８巻（５号）：６５３〜６１頁、２０１２年を参照されたい）、酵母（例えば、Ａｔｈｍａｒａｍ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｖｉｒｏｌ Ｊ．、８巻：５２４頁、２０１１年を参照されたい）、および真菌（例えば、Ａｌｌｇａｉｅｒ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、３７巻：１２８〜３２頁、２００９年を参照されたい）が含まれる。細菌ベースの発現系もまた、本発明に包含される（例えば、Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｅ、２１巻：２７３〜２８４頁、１９８３年を参照されたい）。本発明は、さらに、バキュロウイルスシステムの使用を意図する。

本発明のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質は、当該技術分野において公知である任意の技術によって精製することができる。例えば、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質は、可溶性画分においてまたは封入体として細胞から回収することができ、そこから、例えば、塩酸グアニジニウムおよび透析によってこれらを抽出することができる。ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質をさらに精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、またはこれらの組み合わせを使用することができる。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質はまた、真核細胞または原核細胞からの分泌後に、馴化培地から回収することができる。このような実施形態では、精製された組換えＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質は、細胞がポリペプチドまたはタンパク質を培養上清中に分泌するのに十分な条件下で宿主細胞を培養し、上清からポリペプチドまたはタンパク質を精製することによって産生される。

一部の実施形態では、組換えＨＡポリペプチドは、モノマーとして宿主細胞から精製される。他の実施形態では、組換えＨＡポリペプチドは、三量体として宿主細胞から精製される。

ＨＡポリペプチドおよびタンパク質の評価
一部の実施形態では、本発明は、（ｉ）１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するかどうか、（ｉｉ）１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する防御的な免疫応答を提供するかどうか、または（ｉｉｉ）対象への投与後に１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する抗体を産生するかどうかを決定するために、本明細書に記載の方法を用いて産生されたＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質を評価することを意図する。このような機能を試験するための種々の方法は、当該技術分野において周知であり、利用することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って生成されたＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質は、所望の発現および立体構造について評価される。スクリーニング法は当該技術分野において周知であり、無細胞、細胞ベース、および動物アッセイを含む。インビトロアッセイには、検出可能な標識の使用を伴う固体状態または可溶性標的分子検出法が含まれる。このようなアッセイにおいて、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質は、標的分子（例えば、免疫グロブリン）への結合を介して同定される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＨＡポリペプチドまたはタンパク質は、所望の発現および立体構造特性に基づいて選択される。

本発明は、さらに、動物宿主においてＨＡポリペプチドを試験する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「動物宿主」は、インフルエンザ研究に適した任意の動物モデルを含む。例えば、動物宿主には、哺乳動物宿主が含まれ、限定されないが、霊長類、フェレット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギ、およびげっ歯類、例えば、マウス、ハムスター、およびラットを含む。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質の投与前にまたはそれと同時に、動物宿主にインフルエンザウイルスを接種し、動物宿主をインフルエンザウイルスに感染させ、または代わりに動物宿主をインフルエンザウイルスに曝露する。あるいは、動物宿主は、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ分子とともに投与される。鼻腔内経路を含む、当該技術分野において公知である任意の方法により、動物宿主にインフルエンザウイルスを接種し、動物宿主をインフルエンザウイルスに感染させ、または代わりに動物宿主をインフルエンザウイルスに曝露する。

一部の実施形態では、動物宿主は、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質（場合により、組成物中の成分として）の投与前に、ウイルス曝露または感染に対して未感作である。未感作および／または接種された動物は、種々の研究のいずれにも使用することができる。例えば、このような動物モデルは、当該技術分野において公知であるように、ウイルス伝播の研究に使用することができる。例えば、接種された動物（例えば、フェレット）から未感作動物へのウイルスインフルエンザの空気伝播が公知である（Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５巻；６５５〜５９頁）。例示的なウイルス伝播研究において、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質を適切な動物宿主に投与して、動物宿主において広範な免疫応答を誘発する上での上記ＨＡポリペプチドまたはタンパク質の有効性を決定することができる。動物宿主における研究から収集されたこのような情報を使用して、ヒト宿主において免疫応答を誘発するためのＨＡポリペプチドまたはタンパク質の有効性を予測することができる。

インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるように、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。インフルエンザＶＬＰは、一部の実施形態では、一般的に、ＨＡ、ＮＡおよび／またはウイルス構造タンパク質（例えば、ＨＩＶ ｇａｇ、インフルエンザＭ１タンパク質）から構成される。インフルエンザＶＬＰの生成は、当該技術分野において公知である。例えば、インフルエンザＶＬＰは、ＨＡ、ＮＡおよび／もしくはＨＩＶ ｇａｇまたはＭ１タンパク質をコードするプラスミドで宿主細胞をトランスフェクションすることによって産生される。例示的な実施形態では、適切な宿主細胞は、ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）を含む。トランスフェクトされた細胞を適切な時間インキュベートして、タンパク質発現を可能にした後（例えば、約７２時間）、ＶＬＰを細胞培養上清から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるインフルエンザＶＬＰは、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する広範な中和免疫応答を誘発するためのインフルエンザワクチンとして使用される。

医薬組成物および投与
種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるようなＨＡポリペプチドもしくは三量体ＨＡタンパク質、および／または関連実体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、インフルエンザウイルスに対する防御的な免疫応答などの免疫応答を誘発することができる免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。

例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、以下：（１）生弱毒化インフルエンザウイルス、例えば、複製欠損ウイルス、（２）不活化ウイルス、（３）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、（４）本発明の組換えＨＡポリペプチドもしくは組換え三量体ＨＡタンパク質、またはその特徴的もしくは生物学的活性部分、（５）本発明のＨＡポリペプチドもしくは三量体ＨＡタンパク質をコードする核酸、またはその特徴的もしくは生物学的活性部分、（６）本発明のＨＡポリペプチドもしくは三量体ＨＡタンパク質をコードするＤＮＡベクター、またはその特徴的もしくは生物学的活性部分、ならびに／または（７）発現系、例えば、本発明のＨＡポリペプチドもしくは三量体ＨＡタンパク質を発現する細胞のうちの１つまたはそれ以上を含み得る。

一部の実施形態では、本発明は、本発明のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質に関連する抗体または他の薬剤を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質に結合および／または競合する抗体を含む。あるいは、抗体は、本明細書に記載のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質を含むウイルス粒子を認識することができる。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質と相互作用するかまたは競合する小分子を含む。さらなる実施形態では、医薬組成物は、遺伝子サイレンシングに用いることができる、ＨＡポリペプチド配列に相補的な配列を有する核酸などの核酸を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、免疫応答を増強するために、単独でまたは１つまたはそれ以上の薬剤と組み合わせて投与される。例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントと組み合わせて投与される。本発明は、任意の公知のアジュバントの使用を意図する。例示的アジュバントには、限定されないが、フロイント不完全アジュバントまたはフロイント完全アジュバントが含まれる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、またはＩＦＮ−γ）、１つまたはそれ以上の増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ）、１つまたはそれ以上の分子、例えば、ＯＸ−４０Ｌもしくは４１ ＢＢＬ、またはこれらの組み合わせが、生物学的アジュバントとして使用される。一部の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてアルミニウム塩およびモノホスホリルリピドＡを含み得る。代替的にまたは追加的に、ヒトワクチン、例えば、ＭＦ５９（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＣＰＧ ７９０９（Ｃｏｏｐｅｒら（２００４年）Ｖａｃｃｉｎｅ、２２巻：３１３６頁）、およびサポニン、例えば、ＱＳ２１（Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎら（２００６年）Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻：２２７５頁）に使用されるアジュバントを用いることができる。アジュバントのさらなる例としては、限定されないが、ポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ；Ｐａｙｎｅら（１９９８年）Ｖａｃｃｉｎｅ、１６巻：９２頁）、ブロック共重合体Ｐ１２０５（ＣＲＬ１００５；Ｋａｔｚら（２０００年）Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻：２１７７頁）、およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ；Ｋｒｅｕｔｅｒら（１９８１年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、７０巻：３６７頁）が挙げられる。さらなるアジュバントは、本明細書の他の箇所に記載される。

一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「担体」とは、医薬組成物とともに投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。例示的な実施形態では、担体には、無菌液体、例えば、水および油が含まれ得、石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。一部の実施形態では、担体は、１つまたはそれ以上の固体成分であるかまたはそれを含む。また、薬学的に許容される担体には、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれる。本明細書で使用される場合、賦形剤は、医薬組成物に含まれる任意の非治療剤であり、例えば、所望の稠度もしくは安定化効果を提供または寄与し得る。適切な医薬賦形剤には、限定されないが、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールが含まれる。種々の実施形態では、医薬組成物は無菌である。

一部の実施形態では、医薬組成物は、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、安定剤、緩衝剤、または保存剤などの種々の添加剤のいずれかを含み得る。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤を含むことができる。

種々の実施形態では、医薬組成物は、任意の所望の投与様式に適合するように製剤化される。例えば、医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、液滴、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体を含有するカプセル、ゼラチンカプセル、粉末、徐放性製剤、坐薬、エマルジョン、エアロゾル、スプレー、懸濁液、凍結乾燥粉末、凍結懸濁液、乾燥粉末、または使用に適した任意の他の形態をとることができる。医薬剤の製剤化および製造における一般的な考察は、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年に見出される。

医薬組成物は、任意の投与経路を介して投与することができる。投与経路には、例えば、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、粘膜内、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸、気管内点滴、気管支点滴、吸入、または局所的が含まれる。投与は、局所または全身であり得る。一部の実施形態では、投与は、経口的に行われる。別の実施形態では、投与は非経口注射による。場合によっては、投与は、本明細書に記載のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質の血流中への放出をもたらす。投与様式は、医師の裁量に任せることができる。

ある実施形態では、医薬組成物は、経口投与に適合される。経口送達のための組成物は、例えば、錠剤、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、顆粒、粉末、エマルジョン、カプセル、シロップ、またはエリキシルの形態であり得る。

別の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、および皮下）に適している。このような組成物は、例えば、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョンなどとして製剤化することができる。これらはまた、使用直前に無菌注射可能媒体に溶解または懸濁することができる無菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造することができる。例えば、非経口投与は、注射によって達成することができる。このような実施形態では、注射剤は、慣用の形態、すなわち、液体溶液または懸濁液、注射前の液体の溶液または懸濁液に適した固体形態、またはエマルジョンとして調製される。一部の実施形態では、注射溶液および懸濁液は、無菌粉末、凍結乾燥粉末、または顆粒から調製される。

さらなる実施形態では、医薬組成物は、吸入による送達（例えば、肺および呼吸器系への直接送達）のために製剤化される。例えば、組成物は、鼻スプレーまたは任意の他の公知のエアロゾル製剤の形態をとることができる。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、このような調製物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンの平均粒径を有することができる。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、例えば、湿潤剤の含有を介して、湿潤粉末として製剤化される。一部の実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理的ｐＨの他の液体からなる群から選択される。

一部の実施形態では、本発明による医薬組成物は、液滴として鼻腔または口腔に投与される。一部の実施形態では、用量は、複数の液滴（例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５など）を含み得る。

一部の実施形態では、医薬組成物は、脂質小胞内にカプセル化され、トラップされ、もしくは結合されるＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質、生物学的利用能および／もしくは生体適合性および／もしくは生分解性マトリックス、または他の微粒子を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質を示すナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、フェリチンナノ粒子である（例えば、米国特許公開第２０１４／００７２９５８号を参照されたい）。

本発明の医薬組成物は、所望の結果を達成するのに適切な任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の結果は、１つまたはそれ以上インフルエンザ株に対する長期持続性適応免疫応答の誘導である。一部の実施形態では、所望の結果は、インフルエンザ感染の１つまたはそれ以上の症状の強度、重症度、頻度の減少、および／または発症の遅延である。一部の実施形態では、所望の結果は、インフルエンザウイルス感染の阻害または予防である。必要とされる用量は、対象の種、年齢、体重、および一般的な状態、予防または治療される感染の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に依存して、対象によって変化する。

一部の実施形態では、本発明による医薬組成物は、単回または複数回用量で投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、異なる日に複数回用量で投与される（例えば、プライム−ブーストワクチン接種戦略）。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象が治療的投薬の期間中に介在する治療的投薬より少ない期間を経ないように、連続投薬レジメンに従って投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象が治療的投薬の２つの期間中に介在する治療的投薬より少ない、少なくとも１つの期間を受けるように、間欠的投薬レジメンに従って投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ブーストレジメンの一部として投与される。

種々の実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤と同時に投与される。同時投与は、これらの投与のタイミングが、追加の治療剤およびＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質の薬理活性が時間的に重なり合い、それによって組み合わされた治療効果を発揮するようなものである場合、同時に投与される治療剤を必要としない。一般的に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量および時間スケジュールで投与される。

一部の実施形態では、本発明は、薬剤と併用して、それらの生物学的利用能を改善し、これらの代謝を減少もしくは修飾し、これらの排出を阻害し、および／または体内でのこれらの分布を修飾し得る医薬組成物の送達を包含する。一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１つまたはそれ以上の抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビル［ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標）］またはザナマビル［ＲＥＬＥＺＡ（登録商標）］など）と併用して投与される。

ＨＡポリペプチドに対する抗体
本発明は、本発明に従って生成されたＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質に対する抗体を提供する。これらは、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、当業者に公知である種々の技術（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい）のいずれかによって調製される。例えば、抗体は、モノクローナル抗体の生成を含む細胞培養技術によって、または抗体の生成を可能にするために、適切な細菌もしくは哺乳動物の宿主細胞への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して産生される。

一部の実施形態では、抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖で構成される古典的な抗体であり得る。他の実施形態では、抗体は、抗体誘導体であり得る。例えば、一部の実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、マイクロプロテイン（システインノットプロテイン、ノッティン）、ＤＡＲＰｉｎ、テトラネクチン、アフィボディ、トランスボディ、アンチカリン、アドネクチン、アフィリン、マイクロボディ、ペプチドアプタマー、オルターラーゼ、プラスチック抗体、フィロマー、ストラドボディ、マキシボディ、エビボディ、フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、クニッツドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオマブ、トロイボディ、ペプボディ；ワクシボディ、ユニボディ；アフィマー、デュオボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ペプチド模倣分子、もしくは合成分子、または当該技術分野において公知である任意の他の抗体フォーマットであり得る。

免疫化およびインフルエンザウイルスからの防御方法
別の態様では、本発明は、対象における１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法を提供する。本発明は、さらに、対象における１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の有効量の組換えＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の有効量のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質を含むＶＬＰを対象に投与することを含む。

種々の実施形態では、本明細書に提供される免疫化方法は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルス内の複数のエピトープに対する広範な防御的な免疫応答を誘発する。種々の実施形態では、本明細書に提供される免疫化方法は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する広範な中和免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、免疫応答は、抗体応答を含む。したがって、種々の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、異なるタイプのインフルエンザウイルスに対して広範な交差防御を与えることができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、トリ、ブタ、季節性および／またはパンデミックインフルエンザウイルスに対する交差防御を与える。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上インフルエンザＡ、Ｂ、またはＣサブタイプに対する交差防御を与える。一部の実施形態では、医薬組成物は、インフルエンザＡ Ｈ１サブタイプウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ Ｈ３サブタイプウイルス（例えば、Ｈ３Ｎ２）、および／またはインフルエンザＡ Ｈ５サブタイプウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１）の複数の株に対して交差防御を与える。

一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上の季節性インフルエンザ株に対する改善された免疫応答を誘発することができる。例示的な季節性株には、限定されないが、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、Ａ／Ｆｏｒｔ Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／１９４７、Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／１９８３、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／６／１９８６、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／０３／２００６、およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７が含まれる。一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上のパンデミックインフルエンザ株に対する改善された免疫応答を誘発することができる。例示的なパンデミック株としては、限定されないが、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９、Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／１４５／２００９、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／０１／１９１８、およびＡ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６が挙げられる。パンデミックのサブタイプには、特にＨ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、Ｈ１０Ｎ７のサブタイプが含まれる。一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上のブタインフルエンザ株に対する改善された免疫応答を誘発することができる。例示的なブタ株としては、限定されないが、Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６分離株およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９が挙げられる。追加のインフルエンザパンデミック、季節性、および／またはブタ株は、当該技術分野において公知である。

種々の実施形態では、本方法は、ある範囲の抗原的に異なるインフルエンザ株にわたって免疫防御を拡大することができる。例えば、本発明の方法は、抗原シフトから生じる新たなパンデミック株に対する免疫応答を誘発することができる（すなわち、これらが、延長されたタイムラインにわたって遺伝的配列空間において遠く離れている抗原的に異なる株をカバーするようにする）。本発明の医薬組成物が、抗原的に浮遊した蔓延している季節性株に対する免疫応答（例えば、改良された季節応答）を誘発することによって継続して有効であるように、比較的短い期間にわたって生じる遺伝的変化に対処するために、本発明の方法を適用させることもできる。したがって、種々の実施形態では、本方法は、（１）１つまたはそれ以上の季節性株に対するカバレッジ（すなわち、中和免疫応答を誘発する能力）を拡大するため；（２）１つまたはそれ以上のパンデミック株に対するカバレッジを拡大するため（抗原ドリフトに対処するため）；および（３）任意の他の抗原的に異なるインフルエンザ株に対するカバレッジを拡大するために使用される。本方法は、ミスマッチ株を含むインフルエンザウイルスに対して、広範な、長期間持続する（例えば、多季節）防御を提供することができると期待される。

一部の実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することによって、インフルエンザ感染を予防または治療する方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、インフルエンザ感染に罹患しているかまたはそれに感受性である。一部の実施形態では、対象がインフルエンザ感染に一般的に関連する１つまたはそれ以上の症状を示す場合、対象はインフルエンザ感染に罹患していると考えられる。一部の実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されたことが知られているかまたは曝露されたと思われる。一部の実施形態では、対象がインフルエンザウイルスに曝露されたことが知られているかまたは曝露されたと思われる場合、対象はインフルエンザ感染に感受性であると考えられる。一部の実施形態では、対象が、インフルエンザウイルスに感染したことが知られているかもしくはそれが疑われる他の個人と接触していた場合、および／または対象が、インフルエンザ感染が知られているもしくは流行していると考えられる場所にいるかもしくはそこにいた場合、インフルエンザウイルスに曝露されたことが知られているか、または曝露されたと思われる。

種々の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、インフルエンザ感染の１つまたはそれ以上の症状の発症前または後に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、予防として投与される。このような実施形態では、本発明の方法は、インフルエンザウイルス感染から対象を予防または防御するのに有効である。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、季節性および／もしくはパンデミックインフルエンザワクチンの成分として、または長期にわたる（多季節）防御を付与することを意図したインフルエンザワクチン接種レジメンの一部として使用される。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、インフルエンザ感染の症状を治療するために使用される。

一部の実施形態では、インフルエンザ感染に罹患しているかまたは感受性である対象は、本発明による医薬組成物の投与前、投与中、または投与後に、本発明のＨＡポリペプチドまたは三量体ＨＡタンパク質に対する抗体について試験される。一部の実施形態では、このような抗体を有する対象は、本発明の医薬組成物を投与されない。一部の実施形態では、医薬組成物の適切な用量は、このような抗体の検出（またはその欠如）に基づいて選択される。

種々の実施形態では、対象は、動物界の任意のメンバーである。一部の実施形態では、対象は、非ヒト動物である。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、トリ（例えば、ニワトリまたはトリ）、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または線虫である。特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝的に操作された動物、および／またはクローンである。

一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、成人、青年、または乳児である。一部の実施形態では、ヒト対象は、６カ月未満の年齢である。一部の実施形態では、ヒト対象は、６カ月以上の年齢であり、６カ月齢から３５カ月の年齢であり、３６カ月の年齢から８歳であり、または９歳以上である。一部の実施形態では、ヒト対象は、５５歳以上の高齢者、例えば、６０歳以上、または６５歳以上である。また、本発明は、医薬組成物の投与および／または子宮内での処置法の性能も意図している。

この説明および例示的な実施形態は、限定的であるものとして解釈されるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲の目的で、特に断らない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される量、パーセンテージ、または比率を表すすべての数字、および他の数値は、すべての場合において、これらがまだそのように修飾されていない範囲で、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、別段の指示がない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効桁数に照らし、通常の丸め技法を適用して、少なくとも解釈されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに任意の単語の任意の単数形の使用は、明示的であり、明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書で使用される場合、用語「含む」およびその文法的変形は、リスト中の項目の記載が、リスト中の項目に置換または追加される他の類似の項目の除外にならないように、非限定的であることが意図される。

本発明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解される。本明細書に含まれるすべての文献の引用は、参照により組み入れられる。

以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を説明するために提供されるのであって、いかなる形態においても本開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本明細書において使用される場合、ＣＢＣ ＨＡは、本明細書において説明されるクラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）アプローチを使用して設計されたＨＡポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

実施例１
組換えインフルエンザＨＡポリペプチドを設計するためのクラスターベースのコンセンサスアプローチ
組換えインフルエンザＨＡポリペプチドをクラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）アプローチを使用して生成した。第１の工程として、１９１８から現在までのインフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質配列（サブタイプＨ１Ｎ１）（Ｎ＝５６６４、その内２０４３は、固有の配列）をｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅからダウンロードした（Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２，５９６〜６０１を参照されたい）。ＨＡ配列をシグナルペプチド配列および膜貫通領域を除去するために編集した。次いで、２０４３個の固有の配列の非重複セットの多重配列アライメントを作成した。完全なペアワイズ同一性マトリクス（２０４３ｘ２０４３）を算出し、主成分分析（ＰＣＡ）のためのインプットとして使用した。ＰＣＡからの最初の２つの構成成分は、２次元ユークリッド空間での高次元インプットマトリクスのコンパクト表現を可能にするために保持した。関連配列の８個の代表的なクラスターを図１Ａに示すとおり同定した。

続いて、個々のクラスター内のそれぞれの配列を各位置で最も高い頻度で生じる残基を同定するためおよびコンセンサスアミノ酸配列を含む代表的なＨＡポリペプチドを得るために分析した。例として、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上であった場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満であった場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定される。アラインメントにおける特定の位置においてアミノ酸が変動する場合（例えば、最大頻度が＜０．５である場合）、当該位置における代表的なアミノ酸の決定は、比較モデル化によって生成されたコンセンサス配列の構造モデルの分析に基づいた。

詳細には、明確な多数決が、配列における特定の位置において単一のアミノ酸を定義することができない場合には、複数のコンセンサス配列（当該アラインメントに基づいて可能性のある各アミノ酸に対して１つ）を生成させた。明確に決定することができない位置は、任意の１つの特定の場所において生じ得る、可能性の高いアミノ酸の唯一のセットから分子モデリングによって解決されるように、「Ｘ」としてコードした。したがって、潜在的な構造上の問題を解決するため、および可変位置において好適なアミノ酸を選択するため、および計算された低いエネルギーに基づいて配列を選択するために、当該設計の重要な一面を、分子モデリングによって洗練させた。例えば、当該コンセンサス法によって生成された配列の３Ｄ構造を、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇパッケージ（Ｌｅａｖｅｒ−Ｆａｙら． （２０１１） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４８７：５４５〜７４）を使用してモデル化した。負の総エネルギー値を有する分子は、安定なおよび／または機能的なタンパク質への折り畳みの高い可能性を有すると予測され、その一方で、正のエネルギー値を有するものは、適切に折り畳まれる可能性は低いと考えられた。したがって、コンセンサス生成法を使用して残基位置を明確に割り当てることがでない場合、最も低い、または最も低い値に近い、計算されたポテンシャルエネルギーを有する構造を生じるアミノ酸を選択したが、それは、それらが安定であると推定されるためであり、したがって、発現される可能性が高く、機能的であると見込まれるためである。

このプロセスを使用することにより、複数の候補配列を含む、エネルギー最小化設計のセットを生成させた。特に、８個のクラスター（クラスター原型配列内）のそれぞれについて単一の代表的な配列をさらなる評価のために選択した。これらの代表的な配列は、「ティア１」配列と記された。ティア１配列の４個は、新規であることが明らかになり、公的なデータベースに存在しなかった。他の４個の配列は、天然で出現したことがあることが周知であった（クラスター１：Ａ／Ｋｏｒｅａ／ＣＪ０４／２００９；クラスター３：Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０２／２００８；クラスター４：Ａ／Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ／１０／２００５；およびクラスター５：Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／０６／１９９６）。これらの４個の天然に存在する配列は、知られている限りではワクチン抗原として使用されたことはなく、したがって本発明の範囲内で新規適用を有する。

抗原適用範囲の幅をさらに広げるために、複数のティア１コンセンサス配列を組み合わせることにより、コンセンサス配列を定義するのと同じ手順および前に説明したような構造モデリングを使用して、クラスター間コンセンサス配列を得た。この手順を使用して、ティア１原型配列の複合グループ分け（combined grouping）は、３個の「ティア２」配列を生じた。具体的には、クラスター１および２の複合は「パンデミックまたはブタ様」ティア２配列をもたらし；クラスター３、４および５の複合は「季節性様群１」ティア２配列をもたらし；クラスター６および７の複合は「季節性様群２」ティア２配列をもたらした。

「ティア３」コンセンサス配列を算出し、続いて生成するためにティア２配列をマージすることによって工程をさらにもう一度繰り返した。具体的には、ティア２およびティア３コンセンサス配列を、さまざまな配列クラスターに見出される不均等な数の配列を扱い、より多い配列を含む大きなクラスターによる小さなクラスターのシグナルのいかなる遮蔽の可能性も最少化するように設計した。加えて、ティア２およびティア３配列を、配列の安定性を評価し、アミノ酸差異を解明し、生物物理学的および免疫学的特徴の改善を示す十分にフォールドした分子を生成するために、構造情報に基づくモデリングおよび設計にも供した。

本明細書に記載のクラスターベースコンセンサスアプローチを使用して設計した例示的ティア１、ティア２およびティア３配列を配列番号１〜１６として表１に示す。これらの配列は、シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを含む全長ＨＡ配列である。

実施例２
ＣＢＣ ＨＡタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現
ＣＢＣ ＨＡタンパク質が自然の進化工程とは異なる基準に従って設計されたことから、正しい発現、アセンブリ、フォールディングおよび／またはエピトープ完全性の維持を確認することは重要であった。したがって、ティア１、ティア２およびティア３ ＣＢＣ ＨＡタンパク質が哺乳動物細胞の表面に発現され、頭部またはステム領域中の保存されたエピトープを認識する抗ＨＡ抗体によって検出されるかどうかを決定するために実験を実施した。これらの実験では、抗体結合は、フローサイトメトリーによって評価した。

例えば、モノクローナル抗体Ｃ１７９は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡタンパク質の保存されたＨＡステムドメイン中のコンホメーショナルエピトープに結合することが周知であった（Ｏｋｕｎｏ，Ｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９３）。図２に示すとおり、Ｃ１７９抗体は、エピトープ曝露またはタンパク質発現レベルにおける差異を示唆する効率の変動を有するが、検査した野生型およびＣＢＣ ＨＡタンパク質のすべてに結合した。

３種のＨＡ頭部特異的モノクローナル抗体（すなわち、ＣＨ６５、５Ｊ８および４Ｋ８）は、いくつかの、しかしすべてではない野生型およびＣＢＣ ＨＡ タンパク質を認識した。５Ｊ８および４Ｋ８抗体の両方は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｃａ０９）由来のＨＡに結合したが、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（ＮＣ９９）由来のＨＡには結合しなかった。ＣＨ６５抗体は、ＮＣ９９のＨＡに結合したが、パンデミックＣａ０９由来のＨＡには結合しなかった。比較すると、５Ｊ８および４Ｋ８抗体の両方は、いくつかのティア１およびティア２ ＣＢＣ ＨＡタンパク質（すなわち、ＨＡｃｏ１Ｍ、ＨＡｃｏ２Ｍ、ＨＡｃｏ６Ｍ、ＨＡｃｂ１２ＭおよびＨＡｃｂ６７Ｍ）ならびにすべてのティア３ ＣＢＣ ＨＡタンパク質に結合し、これらのＣＢＣ ＨＡタンパク質がＣａ０９に抗原的に関連することを示唆している。野生型ＨＡでは観察されなかった異なる抗体結合パターンが、ＣＨ６５および５Ｊ８抗体結合に関してティア１およびティア２タンパク質ＨＡｃｏ３Ｍ、ＨＡｃｏ４Ｍ、ＨＡｃｏ５ＭおよびＨＡｃｂ３４５Ｍによって示された。

全体として、これらのデータは、すべてのＣＢＣ ＨＡタンパク質が発現され、プロセシングされ、抗体結合を可能にするように正しくフォールドされ、提示される細胞表面に輸送されたことを示している。さらにＣＢＣ ＨＡタンパク質は、機能性であり、赤血球上のシアル酸に結合した。したがって、本明細書に記載のクラスターベースコンセンサスアプローチは、正しくフォールドし、機能を維持したＨＡポリペプチドおよびタンパク質を生成することができた。

実施例３
ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えインフルエンザＡウイルスの生成
ＣＢＣ ＨＡ配列を含むインフルエンザＡウイルスを逆遺伝学によって生成した。具体的には、１２−プラスミド逆遺伝学システムを、ノイラミニダーゼおよび８個の他のウイルス遺伝子セグメントと共にＣＢＣ ＨＡ配列を内部に有する組換えＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（ＰＲ８）Ｈ１Ｎ１ウイルス（卵での高い増殖特性を付与された弱毒化ヒトウイルス）を生成するために使用した（図３）。１２個のベクターを２９３ＴとＭＤＣＫ細胞との混合物にトランスフェクトした。３〜４日後、細胞培養上清を回収し、さらなるウイルス増殖（propagation）のために胚形成ニワトリ卵の尿膜腔に接種した。

ティア１および２ＨＡ配列（すなわち、ＨＡｃｏ３Ｍ、ＨＡｃｏ４Ｍ、ＨＡｃｏ５ＭおよびＨＡｃｂ３４５Ｍ）を内部に有するインフルエンザ組換えウイルスの良好なレスキューは、プラークアッセイでの感染性ウイルスの検出およびヘマグルチニン活性の決定によって実証した（図３）。組換えウイルス中のＣＢＣ ＨＡ配列の存在は、サンガー配列決定によっても確認した。

これらの結果は、ＣＢＣ ＨＡ配列を発現するインフルエンザウイルスが生成され、スプリット不活化ワクチンに潜在的になることを実証した。

実施例４
ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えインフルエンザＡウイルスの免疫原性研究
ＣＢＣ ＨＡ配列を発現する組換えインフルエンザＡウイルスの免疫原性を評価した。図４は、さまざまな免疫原性研究の模式図を示す。

プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）をウイルスのパネルに対する中和抗体を誘導する組換えウイルスの能力を評価するために実施した。具体的にはパネルは、複数のＨＡ配列クラスター由来のウイルスを含んだ（図５Ｇを参照されたい）。マウスを種々のティア１およびティア２ ＣＢＣ ＨＡまたは野生型ＨＡを発現する組換えウイルスを用いて鼻腔内感染させた。感染マウスから血清を回収し、中和抗体の誘導について評価した。

図５Ａおよび５Ｂに示すとおり、野生型Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９ ＨＡを発現する組換えウイルス（クラスター４由来ウイルス）は、ウイルスのパネルに対して相当に広い幅の中和応答を誘導した。ＨＡｃｏ４Ｍ（クラスター４由来ティア１ ＣＢＣ ＨＡ配列）を発現する組換えウイルスは、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９ ＨＡを発現するウイルスに相当する幅の防御を示した。注目すべきことに、ＨＡｃｏ４Ｍを発現する組換えウイルスは、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１ウイルス（クラスター５由来ウイルス）に対して、野生型ＨＡを発現するウイルスよりもさらに高い中和応答を潜在的に誘導した。

ＨＡｃｏ５Ｍ（ティア１ ＣＢＣ ＨＡ）を発現する組換えウイルスも評価し、その防御の幅を野生型Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１ ＨＡを発現する組換えウイルスと比較した。図５Ｃに示すとおり、２つの組換えウイルスは、ウイルスのパネルに対して同様の幅の中和応答を誘導した。

加えて、ＨＡｃｂ３４５Ｍ（ティア２ ＣＢＣ ＨＡ）を発現する組換えウイルスの免疫原性をティア１ ＣＢＣ ＨＡ（すなわち、ＨＡｃｏ４ＭおよびＨＡｃｏ５Ｍ）を発現する組換えウイルスと比較した。図５Ｄに示すとおり、ＨＡｃｂ３４５Ｍを発現する組換えウイルスは、ＨＡｃｏ４Ｍを発現するウイルスと比較した場合に、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７ウイルス（クラスター３ウイルス）に対して同様の中和応答を示した。注目すべきことに、ＨＡｃｂ３４５Ｍを発現する組換えウイルスは、ＨＡｃｏ４Ｍを発現するウイルスと比較した場合に、クラスター４ Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１ウイルスに対してわずかに改善された活性、およびＨＡｃｏ５Ｍを発現するウイルスと比較した場合に、クラスター３ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７ウイルスに対する顕著に改善された活性を潜在的に示した（図５Ｄ）。

野生型ＨＡを発現する組換えウイルスと比較した場合に、ＨＡｃｂ３４５Ｍを発現する組換えウイルスは、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７ウイルスに対して同等の中和応答を誘導したが、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９およびＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄ／３／２００６ウイルスに対して低い応答を誘導した（図５Ｅ）。それにも関わらず、図５Ｆに示すとおり、ＣＢＣ ＨＡｃｂ３４５Ｍを発現する組換えウイルスは、検査したウイルスのパネルに対してさらに均衡のとれた中和のプロファイルを示した一方で、野生型ウイルスは、相同ウイルスに対して最も強い中和抗体応答を示した。

種々の組換えウイルスの免疫原性もヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイによって評価した。ＨＡＩアッセイプロトコールをｔｈｅ ＣＤＣ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｂａｓｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｍａｎｕａｌから翻案した。図６に示すとおり、ＣＢＣ ＨＡを発現する組換えウイルスによって誘導されたＨＡＩ力価は、野生型ＨＡを発現する組換えウイルスによって誘導されたものと同等であった。同様の結果が全体的な抗体結合を抗体フォレンジック（ＡＦ）アッセイを用いて評価した場合に得られた（図７Ａ〜７Ｄ）。

実施例６
ＣＢＣ ＨＡタンパク質を発現するウイルス様粒子（ＶＬＰ）の特徴付け
免疫処置研究を種々のＣＢＣ ＨＡタンパク質を発現するウイルス様粒子（ＶＬＰ）の免疫原性を研究するために実施した。ＶＬＰを生成するために、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をＨＩＶ−１ Ｇａｇ、ＮＡ（Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｌｂｅｒｔａ／２４／０１；Ｈ７Ｎ３）およびＣＢＣ ＨＡまたは野生型Ｈ１Ｎ１株由来のＨＡを発現するプラスミドを用いて一過的にトランスフェクトし、７２時間、３７℃でインキュベートした。上清を回収し、細胞デブリを低速遠心分離に続く０．２２μｍ滅菌フィルターを通した真空ろ過によって除去した。ＶＬＰを、超遠心分離（２０％グリセリン、体積あたりの重量、を通した１００，０００Ｘｇ）、４時間、４℃を介して精製した。次にペレットをＰＢＳ ｐＨ７．２に再懸濁し、単回使用アリコート中、−８０℃で使用まで保存した。総タンパク質濃度をＭｉｃｒｏ ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）によって決定した。ＶＬＰを電子顕微鏡によって、および動的光散乱分析によって特徴付けた。さらに、ＨＡが機能的に活性であることを示すために、ＶＬＰでのＨＡの量をＨＡアッセイによって定量した。

ＶＬＰの免疫原性（ＡＦ０４アジュバントとの組合せで）の評価のために、研究０および２１日目の２回マウスに皮下注射した（図８）。比較のために、マウスを代表的な生インフルエンザウイルスの広いパネルを用いてもチャレンジした。次に、チャレンジしたマウスから血液サンプルを研究日−１、２０および３５日目に回収した。血清サンプルをヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）およびマイクロ中和試験（ＭＮ）アッセイを使用して、インフルエンザ特異的抗体応答について分析した。

図９に示すとおり、野生型Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９ ＨＡを発現するＶＬＰを用いた免疫処置は、生Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９ウイルス感染と同様の幅の中和抗体応答を誘導した。しかし、ＶＬＰ免疫処置は、高ＨＡＩ力価を誘導した。ＣＢＣ ＨＡｃｂ３４５Ｍを発現するＶＬＰは、ＨＡＩアッセイ（図９）およびＭＮアッセイ（図１０）の両方によって検出されるとおり、相当に広い中和抗体応答を誘導した。ＣＢＣ ＨＡｃｏ５Ｍを発現するＶＬＰもＭＮアッセイにおいて検出されたとおり、適度に広く均衡のとれた中和抗体応答を誘導した。

全体として、これらのデータは、ＣＢＣアプローチを使用して設計された例示的ＨＡタンパク質が機能性でありｉｎ ｖｉｖｏで中和抗体応答を誘導することができたことを実証している。

Claims (28)

1. コンセンサスアミノ酸を含む組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを生成するための方法であって：
   ａ．１つより多いインフルエンザＨＡポリペプチド配列を選択すること、および該配列をアラインすること；
   ｂ．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出すること；
   ｃ．該ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定することおよび創出すること；
   ｄ．各クラスター内で、ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；
   ｅ．各クラスターについてコンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第１の配列を生成すること；
   ｆ．場合により、複数のクラスターが分析される場合：
   ｉ．各クラスターについて工程（ｅ）において生成された該配列をアラインすること；
   ｉｉ．ペアワイズアライメント法を使用して該配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；ならびに
   ｉｉｉ．コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第２の配列を生成すること
   によって、クラスターの工程（ｅ）において生成された該第１の配列と別のクラスターまたは複数のクラスターにおいて生成された第１の配列とを比較すること；
   ｇ．工程（ｅ）において生成された該第１の配列または工程（ｆ）（ｉｉｉ）において生成された該第２の配列内で：
   ｉ．該第１のまたは第２の配列に基づいて一連の検査配列を生成することであって、検査アミノ酸を可変アミノ酸位置に位置させること；
   ｉｉ．該検査配列それぞれについて分子モデリングを実行すること；
   ｉｉｉ．負の総エネルギー値を有するポリペプチドをもたらすアミノ酸（複数可）を選択することによって各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸を決定すること
   によって、各可変アミノ酸位置についてコンセンサスアミノ酸を決定すること、ならびに
   ｈ．該コンセンサスアミノ酸を含む組換えインフルエンザＨＡポリペプチドを生成すること
   を含む前記方法。
2. 配列をアラインすることは、ＭＡＦＦＴ、ＭＵＳＣＬＥ、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、ＦＡＳＴＡ、これらの組合せまたは任意の他の多重配列アライメントソフトウェアパッケージを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
3. ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出することは、ＢＬＯＳＵＭ、ＰＡＭ、ＩＤＥＮＴＩＴＹ置換マトリクスまたはこれらの組合せを使用することを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定および創出することは、Ｋ平均クラスタリング、ミニマックスクラスタリング、主成分分析（ＰＣＡ）、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）またはこれらの組合せを使用することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 分子モデリングは、インフルエンザＨＡポリペプチドまたはタンパク質の結晶構造と比較することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 分子モデリングは、Ｒｏｓｅｔｔａまたは任意の他の分子モデリングソフトウェアの使用を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 検査アミノ酸は、タンパク質に見出される任意の天然または非天然アミノ酸を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を使用して生成された組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
9. 配列番号１〜１６またはこれらの断片のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列、または配列番号１〜１６またはその断片のいずれか１つに少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
10. 請求項８または９に記載の１つまたはそれ以上の組み換えＨＡポリペプチドを含む、組換え三量体ＨＡタンパク質。
11. 請求項８または９に記載の組換えＨＡポリペプチドまたは請求項１０に記載の組換え三量体ＨＡタンパク質をコードする単離された核酸。
12. 請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
13. 請求項１２に記載のベクターを含む、単離された細胞。
14. 哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の単離された細胞。
15. ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
16. 昆虫細胞である、請求項１３に記載の単離された細胞。
17. 請求項８または９に記載の組換えＨＡポリペプチドまたは請求項１０に記載の組換え三量体ＨＡタンパク質を含む融合タンパク質。
18. 請求項８または９に記載の組換えＨＡポリペプチドまたは請求項１０に記載の組換え三量体ＨＡタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
19. インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、インフルエンザマトリクス（Ｍ１）タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇａｇタンパク質またはこれらの組合せの１つもしくはそれ以上をさらに含む、請求項１８に記載のインフルエンザＶＬＰ。
20. 請求項８または９に記載の組換えＨＡポリペプチド、請求項１０に記載の組換え三量体ＨＡタンパク質、請求項１７に記載の融合タンパク質または請求項１８もしくは１９に記載のインフルエンザＶＬＰおよび薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物。
21. １つまたはそれ以上のインフルエンザ株、型および／またはサブタイプに対する免疫応答を誘発する、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、請求項８または９に記載の組換えＨＡポリペプチド、請求項１０に記載の組換え三量体ＨＡタンパク質、請求項１７に記載の融合タンパク質、請求項１８もしくは１９に記載のインフルエンザＶＬＰまたは請求項２０もしくは２１に記載の医薬組成物の有効量を該対象に投与することを含む前記方法。
23. 対象においてインフルエンザウイルスへの免疫応答を誘導する方法であって、請求項８または９に記載の組換えＨＡポリペプチド、請求項１０に記載の組換え三量体ＨＡタンパク質、請求項１７に記載の融合タンパク質、請求項１８もしくは１９に記載のインフルエンザＶＬＰまたは請求項２０もしくは２１に記載の医薬組成物の有効量を該対象に投与することを含む前記方法。
24. インフルエンザウイルスは、季節性またはパンデミックインフルエンザウイルスである、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 免疫応答は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルス株、型またはサブタイプに対する抗体の産生を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 対象は、哺乳動物である、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 対象は、ヒトである、請求項２６に記載の方法。
28. 投与することは、筋肉内、鼻腔内、皮内、皮下、経口または静脈内経路を介して実行される、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。

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