JP2021514196A - 外因性ネコパラミクソウイルス遺伝子を発現する組換えウイルスベクター系およびそれらから製作されるワクチン - Google Patents
外因性ネコパラミクソウイルス遺伝子を発現する組換えウイルスベクター系およびそれらから製作されるワクチン Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、連邦規則法典第37巻1.821〜1.825に準拠した配列表を含む。本出願に添付されている配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、(ベクター)ワクチンの分野、特に、組換えウイルスベクター系から発現される外因性ネコパラミクソウイルス遺伝子に関する。さらに、本発明は、組換えウイルスベクターに基づくネコパラミクソウイルスワクチンに関する。
ネコパラミクソウイルス
パラミクソウイルスは、ヒトおよび動物の少なからぬ感染性疾患に関連するエンベロープ付きマイナスセンス一本鎖RNA[(−)ssRNA]ウイルスである。パラミクソウイルスには、パラミクソウイルス亜科およびニューモウイルス亜科という2つの亜科があり、パラミクソウイルス亜科内には、少なくとも5つの属、すなわちレスピロウイルス、ルブラウイルス、モルビリウイルス、ヘニパウイルス、およびアブラウイルスがある。パラミクソウイルスの例としては、イヌジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、牛疫ウイルス、おたふくかぜウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルスが挙げられる。パラミクソウイルスは、7つのウイルスポリペプチド:ヌクレオカプシドタンパク質、リンタンパク質、マトリックスタンパク質、融合タンパク質、赤血球凝集素タンパク質、およびポリメラーゼをコードする直鎖状ゲノムを有する。パラミクソウイルスビリオンは、エンベロープ付きであり、球状、糸状性、または多形態性であってもよく、約150nmの直径を有してもよい。融合タンパク質および付着タンパク質(血球凝集素、「H」)は、スパイクとしてビリオン表面に出現する。エンベロープ内部のマトリックスタンパク質(「M」)は、ウイルスの構造を安定させる。ヌクレオカプシドコアは、ゲノムRNA、ヌクレオカプシドタンパク質(「N」)、リンタンパク質(「P」)、およびポリメラーゼタンパク質(「大型タンパク質」を表す「L」)で構成される。融合タンパク質(「F」)は、三量体としてエンベロープ表面から突き出ており、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合を誘導することにより細胞進入を媒介する。
幾つかのネコパラミクソウイルスが、当技術分野に記載されている。米国特許出願公開第2013/0230529号明細書(国際公開第2013/107290号パンフレット)、Wooら(Proc. Nat. Acad. Sci. (2012) 109(14):5435-5440)には、イエネコのTINに関連する、香港で単離されたネコモルビリウイルス(FmoPV)が記載されている。日本(Sakaguchi et al. (2014) General Virology, 95(7), 1464-1468; Furuya et al. (2014) Archives of virology, 159(2), 371-373)、イタリア(Lorusso et al. (2013) Vet Ital. 51(3):235-237)、およびアメリカ合衆国(Sharp et al. (2016) Emerging Infectious Diseases 22(4):760)の他の研究グループも、ネコの尿試料にパラミクソウイルスを検出した。Siegら(Virus Genes (2015) 51(2):294-297)には、慢性腎臓疾患を有するイエネコにネコパラミクソウイルスを発見したことが記載されている。
さらに、この点に関する従来技術は、以下の通りである:特開2015 198654号公報は、ネコモルビリウイルスの新規株を単離/特定するための手段、およびネコモルビリウイルス感染に対する有効な予防対策に関する。Marcacci Mら(Journal of Virological Methods 2016, 234: 160-163)には、イタリアのネコモルビリウイルスのゲノム特徴付けが記載されている。
アビポックスウイルスウイルスベクター系は、天然で宿主限定的なポックスウイルスであるアビポックスウイルスに基づく。そのようなアビポックスウイルスの中でも、カナリアポックスウイルス(CPV)は、外来性、異種性、外的、外因性の遺伝子産物を発現するように遺伝子操作されている(Taylor J et al., Vaccine 1991, 9(3): 190-193;Taylor J et al., Virology 1992, 187(1): 321-328;Taylor J et al., Dev Biol Stand 1994, 82: 131-135)。
組換えポックスウイルスは、当技術分野で公知であり、米国特許第4,769,330号明細書;第4,722,848号明細書;第4,603,112号明細書;第5,110,587号明細書;第5,174,993号明細書;第5,494,807号明細書;および第5,505,941号明細書に記載のワクシニアウイルスおよびアビポックスウイルスなどのポックスウイルスの合成組換え体を創出するための方法に類似する2ステップで構築することができる。これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる従来技術は、以下の通りである:Weli SCら(Virology J. 2011, 8 (1): 49)には、アビポックスウイルス:ワクチンベクターとしての感染生物学およびそれらの使用が記載されている。国際公開第2005/013918号パンフレットは、可溶性短縮ポックスウイルスエンベロープタンパク質を含むポックスウイルスワクチンに関する。De Vries Pら(J. Gen. Virol. 1988, 69: 2071-2083)には、イヌジステンパーウイルス(CDV)免疫刺激性複合体(Iscom)は、CDV感染からイヌを防御するが、麻疹ウイルスiscomは防御しないことが開示される。Marciani DJら(Vaccine 1991, 9(2): 89-96)には、ネコ白血病ウイルスに対する遺伝子的に操作されたサブユニットワクチンのネコにおける防御免疫応答が記載されている。McEachern JAら(Vaccine 2008, 26(31): 3842-3852)には、組換えサブユニットワクチン製剤が、致死性ニパウイルス負荷からネコを防御することが記載されている。
本発明は、中でも、好ましくは、弱毒化カナリアポックスベクターまたは弱毒化鶏痘ベクター、例えばALVACまたはTROVACなどのアビポックスウイルスウイルスベクターにより、ネコパラミクソウイルス(感染症)に対してネコ科動物を免疫する効果的なウイルスベクターワクチンを開発することに関する。そのような弱毒化ベクターは、少なくとも1つのネコパラミクソウイルス抗原をコードし、異種性タンパク質を発現することはできるが、複製は制限されるかまたは生産的でない。
本発明は、ネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体に関係する少なくとも1つの外因性抗原コード配列を含むウイルスベクター、好ましくは組換えおよび/または天然に存在しないウイルスベクターであって、ネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体は、ネコパラミクソウイルスである、ウイルスベクターに関する。好ましくは、ウイルスベクターは、アビポックスウイルスウイルスベクター、イヌモルビリウイルスウイルスベクター、ヘルペスウイルスウイルスベクター、水痘ウイルスウイルスベクターからなる群から選択される。
本発明は、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞に関する。
本発明は、免疫原性組成物またはワクチンを製造するための、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターまたは本明細書に記載および特許請求されている哺乳動物宿主細胞の使用に関する。
(a)本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターもしくは本明細書に記載および特許請求されている哺乳動物宿主細胞、および/または
(b)ウイルス、修飾生ウイルス、もしくはウイルス様粒子(VLP)などの、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターによりコードされるポリペプチド、および
(c)任意に、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体もしくは賦形剤であって、好ましくは、前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適である、担体もしくは賦形剤
を含み、
好ましくは、感染性ウイルスなどのウイルスを含む、免疫原性組成物に関する。
(a)本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターもしくは本明細書に記載および特許請求されている哺乳動物宿主細胞、および/または
(b)ウイルス、修飾生ウイルス、もしくはウイルス様粒子(VLP)などの、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターによりコードされるポリペプチド、および
(c)薬学的にまたは獣医学的に許容される担体もしくは賦形剤であって、好ましくは、前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適である、担体もしくは賦形剤
を含み、
(d)任意に、アジュバントをさらに含む、ワクチンまたは医薬組成物に関する。
(a)本明細書に記載および特許請求されている哺乳動物宿主細胞を、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターで感染させるステップ、
(b)感染細胞を好適な条件下で培養するステップ、
(c)感染細胞培養物を収集するステップ、
(d)任意に、ステップ(c)の収集した感染細胞培養物を精製するステップ、
(e)任意に、前記収集した感染細胞培養物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む方法に関する。
(a)前記ネコ科動物にワクチンを投与することが可能なディスペンサー、および
(b)本明細書に記載および特許請求されている免疫原性組成物または本明細書に記載および特許請求されているワクチン、および
(c)任意に、使用説明書を含み、
好ましくは、少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスは、少なくとも1つのネコパラミクソウイルスであり、好ましくは、前記疾患または前記臨床徴候は、ウイルス血症、発熱、環境へのウイルス排出、泌尿生殖器系の感染症、尿路系の感染症、腎臓疾患、慢性腎臓疾患(CKD)、腎尿細管および腎間質組織の炎症、特発性尿細管間質性腎炎(TIN)からなる群から選択されるキットに関する。
(1)ベクター化ワクチンは、弱毒化生ワクチンと比較して安全性が高いこと。
(2)免疫化が所与の(免疫優性)抗原に対して向けられることにより、ネコパラミクソウイルスの潜在的な免疫抑制タンパク質の発現が回避されること。
(3)ベクター化ワクチンは、市販ワクチン製品と同等の高力価になるまで増殖させることができること。
したがって、上記の技術的課題の解決策は、本明細書および特許請求の範囲で特徴付けられている実施形態により達成され、その異なる態様の本発明は、特許請求の範囲に従って実施される。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書に示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこうした図面を参照することにより、さらにより良好に理解することができる。
概して、本発明は、ネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体に関係する少なくとも1つの外因性抗原コード配列を含むウイルスベクターであって、ネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体は、ネコパラミクソウイルスである、ウイルスベクターに関する。
特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているそのようなウイルスベクターは、アビポックスウイルスウイルスベクター、イヌモルビリウイルスウイルスベクター、ヘルペスウイルスウイルスベクター、水痘ウイルスウイルスベクターからなる群から選択される。
(a)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(b)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号1に記載の核酸配列、
(ii)配列番号1と少なくとも70%同一である、配列番号1と少なくとも75%同一である、配列番号1と少なくとも80%同一である、配列番号1と少なくとも85%同一である、配列番号1と少なくとも90%同一である、配列番号1と少なくとも91%同一である、配列番号1と少なくとも92%同一である、配列番号1と少なくとも93%同一である、配列番号1と少なくとも94%同一である、配列番号1と少なくとも95%同一である、配列番号1と少なくとも96%同一である、配列番号1と少なくとも97%同一である、配列番号1と少なくとも98%同一である、配列番号1と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(c)寄託番号CNCMI−5123として国立培養微生物コレクション(Collection Nationale de Culture de Microorganismes)(CNCM)に寄託されたネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(d)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号2に記載の核酸配列、
(ii)配列番号2と少なくとも70%同一である、配列番号2と少なくとも75%同一である、配列番号2と少なくとも80%同一である、配列番号2と少なくとも85%同一である、配列番号2と少なくとも90%同一である、配列番号2と少なくとも91%同一である、配列番号2と少なくとも92%同一である、配列番号2と少なくとも93%同一である、配列番号2と少なくとも94%同一である、配列番号2と少なくとも95%同一である、配列番号2と少なくとも96%同一である、配列番号2と少なくとも97%同一である、配列番号2と少なくとも98%同一である、配列番号2と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(e)ネコモルビリウイルス(FeMoV);
(f)ネコモルビリウイルス(FeMoV)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号3に記載の核酸配列、
(ii)配列番号3と少なくとも70%同一である、配列番号3と少なくとも75%同一である、配列番号3と少なくとも80%同一である、配列番号3と少なくとも85%同一である、配列番号3と少なくとも90%同一である、配列番号3と少なくとも91%同一である、配列番号3と少なくとも92%同一である、配列番号3と少なくとも93%同一である、配列番号3と少なくとも94%同一である、配列番号3と少なくとも95%同一である、配列番号3と少なくとも96%同一である、配列番号3と少なくとも97%同一である、配列番号3と少なくとも98%同一である、配列番号3と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコモルビリウイルス(FeMoV)。
(b)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号1に記載の核酸配列、
(ii)配列番号1と少なくとも70%同一である、配列番号1と少なくとも75%同一である、配列番号1と少なくとも80%同一である、配列番号1と少なくとも85%同一である、配列番号1と少なくとも90%同一である、配列番号1と少なくとも91%同一である、配列番号1と少なくとも92%同一である、配列番号1と少なくとも93%同一である、配列番号1と少なくとも94%同一である、配列番号1と少なくとも95%同一である、配列番号1と少なくとも96%同一である、配列番号1と少なくとも97%同一である、配列番号1と少なくとも98%同一である、配列番号1と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(c)寄託番号CNCMI−5123として国立培養微生物コレクション(CNCM)に寄託されたネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(d)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号2に記載の核酸配列、
(ii)配列番号2と少なくとも70%同一である、配列番号2と少なくとも75%同一である、配列番号2と少なくとも80%同一である、配列番号2と少なくとも85%同一である、配列番号2と少なくとも90%同一である、配列番号2と少なくとも91%同一である、配列番号2と少なくとも92%同一である、配列番号2と少なくとも93%同一である、配列番号2と少なくとも94%同一である、配列番号2と少なくとも95%同一である、配列番号2と少なくとも96%同一である、配列番号2と少なくとも97%同一である、配列番号2と少なくとも98%同一である、配列番号2と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)。
別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターは、カナリアポックスベクター、好ましくは弱毒化カナリアポックスベクター、より好ましくはALVAC、さらにより好ましくはALVAC−1またはALVAC−2、最も好ましくはブダペスト条約の条項に基づき寄託番号VR−2547としてアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)に寄託されたALVACである。
別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターは、鶏痘ベクター、好ましくは弱毒化鶏痘ベクター、より好ましくはTROVAC、最も好ましくはブダペスト条約の条項に基づき寄託番号VR−2553としてアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)に寄託されたTROVACである。
別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターは、vCP3025、vCP3029、vCP3041からなる群から選択される。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されている少なくとも1つの外因性抗原コード配列は、血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列であり、血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列は、配列番号4と少なくとも70%同一であり、配列番号4と少なくとも75%同一であり、配列番号4と少なくとも80%同一であり、配列番号4と少なくとも85%同一であり、配列番号4と少なくとも90%同一であり、配列番号4と少なくとも91%同一であり、配列番号4と少なくとも92%同一であり、配列番号4と少なくとも93%同一であり、配列番号4と少なくとも94%同一であり、配列番号4と少なくとも95%同一であり、配列番号4と少なくとも96%同一であり、配列番号4と少なくとも97%同一であり、配列番号4と少なくとも98%同一であり、配列番号4と少なくとも99%同一であり、好ましくは配列番号4、配列番号5からなる群から選択される核酸配列を含む。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されている少なくとも1つの外因性抗原コード配列は、2つまたはそれよりも多くの挿入遺伝子座に挿入される。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されている挿入遺伝子座は、挿入遺伝子座C3である。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されている挿入遺伝子座は、挿入遺伝子座C5である。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターは、挿入遺伝子座C5のフランキング配列、好ましくは配列番号47(C5フランキング領域左アーム)および配列番号48(C5フランキング領域右アーム)に記載の挿入遺伝子座C5のフランキング配列を含む。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されている少なくとも1つの外因性抗原コード配列は、少なくとも1つのプロモーター配列、好ましくは少なくとも1つの弱いプロモーター配列に作動可能に連結されている。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているプロモーター配列は、H6ワクシニアプロモーターである。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているプロモーター配列は、I3Lワクシニアプロモーターである。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているプロモーター配列は、42k(長)ポックスウイルスプロモーターである。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているプロモーター配列は、7.5kワクシニアプロモーターである。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているプロモーター配列は、Piワクシニアプロモーターである。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターは、配列番号49、配列番号50、配列番号51からなる群から選択される核酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一であり、好ましくは、配列番号49、配列番号50、配列番号51からなる群から選択される核酸配列である核酸配列を含む。
さらに別の特定の態様では、本明細書に記載および特許請求されているネコ科動物は、ネコ、好ましくはイエネコである。
本発明は、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞に関する。
本発明は、
(a)本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターもしくは本明細書に記載および特許請求されている哺乳動物宿主細胞、および/または
(b)ウイルス、修飾生ウイルス、もしくはウイルス様粒子(VLP)などの、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターによりコードされるポリペプチド、および
(c)任意に、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体もしくは賦形剤であって、好ましくは、前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適である、担体もしくは賦形剤
を含み、
好ましくは、感染性ウイルスなどのウイルスを含む、免疫原性組成物に関する。
(a)本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターもしくは本明細書に記載および特許請求されている哺乳動物宿主細胞、および/または
(b)ウイルス、修飾生ウイルス、もしくはウイルス様粒子(VLP)などの、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターによりコードされるポリペプチド、および
(c)薬学的にまたは獣医学的に許容される担体もしくは賦形剤であって、好ましくは、前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適である、担体もしくは賦形剤
を含み、
(d)任意に、アジュバントをさらに含む、ワクチンまたは医薬組成物に関する。
本発明は、少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスによる感染症に関連するかまたはそれにより引き起こされる1つまたは複数の臨床徴候の発生および/または重症度を低減するための免疫原性組成物またはワクチンを調製するための方法であって、
(a)本明細書に記載および特許請求されている哺乳動物宿主細胞を、本明細書に記載および特許請求されているウイルスベクターで感染させるステップ、
(b)感染細胞を好適な条件下で培養するステップ、
(c)感染細胞培養物を収集するステップ、
(d)任意に、ステップ(c)の収集した感染細胞培養物を精製するステップ、
(e)任意に、前記収集した感染細胞培養物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む方法に関する。
(a)前記ネコ科動物にワクチンを投与することが可能なディスペンサー、および
(b)本明細書に記載および特許請求されている免疫原性組成物または本明細書に記載および特許請求されているワクチン、および
(c)任意に、使用説明書を含み、
好ましくは、少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスは、少なくとも1つのネコパラミクソウイルスであり、好ましくは、前記疾患または前記臨床徴候は、ウイルス血症、発熱、環境へのウイルス排出、泌尿生殖器系の感染症、尿路系の感染症、腎臓疾患、慢性腎臓疾患(CKD)、腎尿細管および腎間質組織の炎症、特発性尿細管間質性腎炎(TIN)からなる群から選択されるキットに関する。
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、出願時に本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は明瞭であるべきである。しかしながら、いかなる隠れた曖昧さがある場合でも、本明細書で提供される定義が、いかなる辞書的定義または外部的定義よりも優先する。さらに、状況により別様の必要がない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。本明細書では、「または」の使用は、別様の記述がない限り、「および/または」を意味する。さらに、用語「含む(including)」、ならびに「含む(includes)」および「含んでいた(included)」などの他の形態の使用は、限定ではない。本明細書で引用された特許および刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスベクターの生成は、限定ではないが、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))またはK.MaramoroschおよびH.Koprowski(Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))に記載のような、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、DNA配列決定、細胞培養でのトランスフェクションの標準技法を含む、当技術分野で周知の任意の好適な遺伝子操作技法を使用して達成することができる。
ウイルスベクターには、任意の既知生物のゲノムに由来する配列を組み込むことができる。配列は、それらの天然形態で組み込まれてもよく、または所望の活性を得るように任意の様式で修飾されていてもよい。例えば、配列は、挿入、欠失、または置換を含んでいてもよい。
本発明の特定の態様によると、用語「ウイルスベクター」またはその代わりに「ウイルス構築物」は、アビポックスウイルスウイルスベクター、イヌモルビリウイルスウイルスベクター、ヘルペスウイルスウイルスベクター、および水痘ウイルスウイルスベクターから選択されるウイルスに由来する組換えウイルス構築物を指す。好ましいウイルスベクターとしては、ALVACおよびTROVACなどのアビポックスウイルスウイルスベクターが挙げられる。
用語「構築物」は、本明細書で使用される場合、人為的に生成されたプラスミド、BAC、または組換えウイルスなどの組換え核酸を指す。
用語「プラスミド」は、細菌宿主細胞内の細菌染色体とは独立して複製する細胞質DNAを指す。本発明の特定の態様では、用語「プラスミド」および/または「トランスファープラスミド」は、例えばウイルスベクターに挿入するための発現カセットの構築に有用な組換えDNA技術の要素を指す。別の特定の態様では、用語「プラスミド」は、DNAワクチン接種目的に有用なプラスミドを指定するために使用される場合がある。
用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「RNA配列」、cDNA配列、または「DNA配列」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、ならびにそれらの断片および部分を指し、ならびに一本鎖または二本鎖であってもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖であってもよい、ゲノム由来または合成由来のDNAまたはRNAを指す。配列は、非コードの配列、コード配列、または両方の混合物であってもよい。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準技法を使用して調製することができる。
用語「調節核酸」、「調節エレメント」、および「発現制御エレメント」は、同義的に使用され、特定の宿主生物における作動可能に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすことができる核酸分子を指す。こうした用語は、広義に使用され、プロモーター、プロモーター配列、RNAポリメラーゼと転写因子との基本的相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサー、および応答エレメントを含む、転写を促進または調節するすべてのエレメントを包含する。原核細胞における例示的な調節エレメントとしては、プロモーター、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞で使用される調節エレメントとしては、限定ではないが、宿主細胞でのコード配列の発現および/またはコート化ポリペプチドの産生を提供および/または調節する、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、内部リボソーム侵入部位(IRES)、およびピコルナウイルス2A配列などの、転写および翻訳制御配列を挙げることができる。
本明細書で使用される場合、本発明の状況では、用語「プロモーター」は、特に、弱いプロモーター(配列)、好ましくは、H6ワクシニアプロモーター、I3Lワクシニアプロモーター、42k(長)ポックスウイルスプロモーター、7.5kワクシニアプロモーター、および/またはPiワクシニアプロモーター、またはそれらの相補的ヌクレオチド配列を指し、配列同一性は、好ましくは、長さ全体にわたって(少なくとも)72%である(またはそれよりもより高い)。
用語「遺伝子」、「目的の遺伝子」は、本明細書で使用される場合、同じ意味を有し、目的の産物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、コード配列に先行する(5’非コードまたは非翻訳配列)および後続する(3’非コードまたは非翻訳配列)調節配列をさらに含んでいてもよい。選択された配列は、全長であってもよくまたは短縮されていてもよく、融合遺伝子またはタグ付き遺伝子であってもよく、cDNA、ゲノムDNA、またはDNA断片であってもよい。ポリペプチドまたはRNAをコードするゲノムDNAは、成熟メッセンジャーRNA(mRNA)からスプライシングされ、したがって同じポリペプチドまたはRNAをコードするcDNAには存在しない非コード領域(つまり、イントロン)を含んでいてもよいことが一般に理解される。ゲノムDNAは、天然配列、つまり天然に存在する形態であってもよく、または突然変異されていてもよく、または異なる供給源に由来する配列またはそうでなければ所望のように修飾されている配列を含んでいてもよい。こうした修飾としては、選択された宿主細胞でのコドン使用頻度を最適化するためのコドン最適化またはタグ付けが挙げられる。さらに、そうした修飾としては、少数の非限定的な例を挙げれば、(クリプティックな)スプライスドナー、アクセプター部位および分岐地点、ポリアデニル化シグナル、TATAボックス、カイ部位、リボソーム侵入部位、反復配列、二次構造(例えば、ステムループ)、転写因子または他の調節因子の結合部位、制限酵素部位などのシス作用性部位の除去または付加を挙げることができる。選択された配列は、分泌性、細胞質内、核内、膜結合性、または細胞表面のポリペプチドをコードすることができる。
「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、ATGまたはAUGなどの翻訳開始シグナルまたは開始コドンおよび終止コドンを含み、潜在的にポリペプチド配列に翻訳することができる、DNAまたはRNAのいずれかである核酸配列の長さを指す。
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、宿主細胞内での核酸配列の転写および/または翻訳を指す。本発明の特定の態様によると、用語「発現」は、宿主細胞内での異種性核酸配列および/または外因性核酸配列の転写および/または翻訳を指す。宿主細胞での所望の産物の発現レベルは、細胞に存在する対応するRNAまたはmRNAの量、または選択された配列によりコードされた所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定することができる。例えば、選択された配列から転写されるmRNAは、ノーザンブロットハイブリッド形成法、リボヌクレアーゼRNA保護、細胞性RNAのin situハイブリッド形成法、またはRTqPCR(逆転写後の定量PCR)により定量化することができる。選択された配列から発現されるタンパク質は、種々の方法により、例えば、ELISAにより、ウエスタンブロッティングにより、ラジオイムノアッセイにより、免疫沈殿により、タンパク質の生物学的活性をアッセイすることにより、またはタンパク質を免疫染色し、続いてFACS分析することにより、定量化することができる。
「プロモーター活性」は、それぞれのプロモーターの制御下で転写されるmRNAを定量化することにより間接的に測定される。mRNAは、内因性標準物質と比べてRTqPCRにより定量化される。
用語「ウイルス量」は、当業者に周知である。用語「ウイルス量」は、本明細書では、用語「ウイルス力価」と同義的に使用される。ウイルス量またはウイルス力価は、活性ウイルス感染症の重症度の尺度であり、当業者に公知の方法により決定することができる。決定は、ウイルスタンパク質に結合する抗体などによりウイルスタンパク質を検出することおよびさらなる検出に基づいてもよく、またはその代わりにRT−PCRなどの増幅法によりウイルス核酸を検出することによるものであってもよい。核酸増幅法による血漿中のビリオン関連ウイルスRNAのモニタリングは、レトロウイルス疾患の状態および進行を評価するために、ならびに予防的および治療的介入の有効性を評価するために広く用いられているパラメーターである。例えば、ウイルス量またはウイルス力価は、血漿1ミリリットル当たりのRNAコピー数などの、関与する体液中のウイルス生存量を推定することにより算出することができる。好ましくは、用語「ウイルス量」または「ウイルス力価」は、ウイルス調製物1容積当たりの感染単位の尺度である。ウイルス力価は、生物学的手順のエンドポイントであり、並行して実施される試験のある割合が効果を示す場合の希釈度であると定義される(Reed and Muench, 1938)。具体的には、1ミリリットル当たりの組織培養感染量50(TCID50/ml)は、その希釈度で並行して接種した細胞培養物の数の50%が感染する、ウイルス調製物の希釈度を示す。
用語「転写開始部位」は、一次転写産物、つまりmRNA前駆体に組み込まれている最初の核酸に対応する、構築物中の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列とオーバーラップしてもよい。
「終結シグナル」または「ターミネーター」または「ポリアデニル化シグナル」または「polyA」または「転写終結部位」または「転写終結エレメント」は、真核生物mRNAの3’末端の特定部位での切断、および切断された3’末端での約100〜200アデニンヌクレオチドの配列(polyA尾部)の転写後組込みを引き起こし、したがってRNAポリメラーゼの転写終結を引き起こすシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは、切断部位の約10〜30ヌクレオチド上流の配列AATAAA、および下流に位置する配列を含む。tk polyA、SV40後期および初期polyA、BGH polyA(例えば、米国特許第5,122,458号明細書に記載されている)、またはハムスター成長ホルモンpolyA(国際公開第2010/010107号パンフレット)などの種々のポリアデニル化エレメントが公知である。
定義により、宿主細胞に挿入されるあらゆるポリヌクレオチド配列またはあらゆる遺伝子、およびそれによりコードされている対応するタンパク質またはRNAは、宿主細胞に関して、「異種性」、「異種性配列」、「異種性遺伝子」、「異種性コード配列」、「導入遺伝子」、または「異種性タンパク質」と呼ばれる。これは、導入しようとする配列または導入しようとする遺伝子が、宿主細胞の内因性配列または内因性遺伝子と同一である場合でさえ、該当する。例えば、ALVAC野生型ウイルスとは異なる部位にまたは修飾形態でALVACウイルスベクターに導入されたALVACプロモーター配列は、定義により異種性配列である。抗原などの目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用される場合、用語「異種性」は、前記目的の配列または遺伝子、特に前記抗原が、その天然亜種の状況外で発現されることを意味する。
用語「天然に存在しない」は、ハイブリッド配列または異なる種に由来する抗原などの目的の配列もしくは遺伝子、あるいは人為的な突然変異、挿入、または欠失などによる、天然の産物ではない抗原などの目的の配列または遺伝子など、この状況では天然に生じない、抗原などの任意の目的の配列または遺伝子を意味する。
用語「組換え」は、本発明の明細書の全体にわたって、用語「天然に存在しない」、「異種性」、および「外因性」と同義的に使用される。したがって、「組換え」タンパク質は、異種性または外因性ポリヌクレオチド配列のいずれかから発現されるタンパク質である。用語「組換え」は、ウイルスに関して使用される場合、ウイルスゲノムの人為的操作により産生されるウイルスを意味する。外因性抗原コード配列などの異種性または外因性配列を含むウイルスは、組換えウイルスである。用語「組換えウイルス」および用語「天然に存在しないウイルス」は同義的に使用される。
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、調節エレメントと遺伝子またはそのコード領域との間の接続を記述するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、1つまたは複数の調節エレメント、例えば、限定ではないが、構成的または誘導可能なプロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーの制御下に置かれている。遺伝子またはコード領域は、調節エレメントに「作動可能に連結されている」または「作動性に連結されている」または「作動可能に関連している」と言われ、遺伝子またはコード領域が、調節エレメントにより制御されるかまたは影響を受けることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現を達成する場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。
本明細書で使用される場合、特に、用語「配列番号Yに記載の核酸配列/アミノ酸配列と少なくともX%配列同一性を有する」(またはその代わりに、用語「配列番号Yの/に示される核酸配列/アミノ酸配列と少なくともX%配列同一性を有する」)は、それぞれ、用語「配列番号Yの長さにわたって、配列番号Yに記載の核酸配列/アミノ酸配列と少なくともX%配列同一性を有する」または用語「配列番号Yの長さ全体にわたって、配列番号Yに記載の核酸配列/アミノ酸配列と少なくともX%配列同一性を有する」と等価である。
本明細書で使用される用語「抗原」は、当技術分野で十分に理解されており、免疫原性である物質、つまり免疫原、ならびに免疫不応答またはアネルギー、つまり外来性物質に対する身体の防衛機構による反応の欠如を誘導する物質を含む。本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、全長タンパク質、ならびにエピトープを含有または含むそれらのペプチド断片を意味することが意図されている。さらに、用語「抗原コード配列」は、抗原をコードする配列に関する。好ましくは、抗原コード配列は、cDNA配列などの核酸配列である。しかしながら、用語「核酸配列」は、本明細書の他所で定義されている。
また、用語「少なくとも1つの外因性抗原コード配列」は、1つよりも多くの外因性抗原コード配列を包含する。したがって、用語「少なくとも1つの外因性抗原コード配列」は、2、3、4、5、または6つの外因性抗原コード配列を包含することが理解されなければならない。したがって、用語「少なくとも2つの外因性抗原コード配列」は、3、4、5、または6つの外因性抗原コード配列を包含する。
「免疫原性組成物」は、本明細書で使用される場合、例えば、本明細書に記載のような免疫学的応答を誘発するウイルス表面タンパク質などの、ポリペプチドまたはタンパク質を指すことができる。用語「免疫原性断片」または「免疫原性部分」は、1つまたは複数のエピトープを含み、したがって本明細書に記載の免疫学的応答を誘発するタンパク質またはポリペプチドの断片または短縮形態および/もしくは置換形態を指す。一般に、そのような短縮形態および/もしくは置換形態または断片は、全長タンパク質に由来する少なくとも6個の連続アミノ酸を含むことになる。そのような断片は、当技術分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を使用して特定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直鎖状エピトープは、タンパク質分子の部分に対応する多数のペプチドを共に固体支持体上に合成し、ペプチドが依然として固体支持体に付着している状態でペプチドを抗体と反応させることにより決定することができる。そのような技法は公知であり、当技術分野に記載されている。例えば、米国特許第4,708,871号明細書;Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002;およびGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715を参照されたい。同様に、立体構造エピトープは、例えば、X線結晶構造解析法および二次元核磁気共鳴法などによりアミノ酸の空間的立体構造を決定することにより容易に特定される。上記のエピトープマッピングプロトコールを参照されたい。合成抗原、例えば、ポリペプチド、フランキングエピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原も、定義内に含まれる。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781;Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249;Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408;およびGardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998を参照されたい。これらの文献の教示および内容はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
用語「必要とする」または「必要のある」は、本明細書で使用される場合、投与/治療が、本発明による免疫原性組成物を受け取る動物の健康もしくは臨床徴候、または健康に対する任意の他の肯定的な医学的効果をブーストもしくは改善することに関連することを意味する。
種々の物理的および化学的な不活化法が当技術分野で公知である。用語「不活化」は、その免疫原性を維持したままそのようなウイルスを不活化または死滅させるように照射されているか(紫外線(UV)、X線、電子ビーム、またはガンマ線)、加熱されているか、または化学的に処理されている、以前は病毒性だったかまたは非病毒性のウイルスを指す。好適な不活化剤としては、β−プロピオラクトン、二成分またはベータ−またはアセチル−エチレンイミン、グルタルアルデヒド(gluteraldehyde)、オゾン、およびホルマリン(ホルムアルデヒド)が挙げられる。
ホルマリンまたはホルムアルデヒドによる不活化の場合、ホルムアルデヒドを、典型的には、水およびメチルアルコールと混合してホルマリンを創出する。メチルアルコールを添加することにより、活性化プロセス中の分解または交差反応が防止される。一実施形態では、約0.1〜1%の37%ホルムアルデヒド溶液を使用して、ウイルスを不活化する。ホルマリンの量を調整して、物質は不活化されるが、高投薬量による副作用があまり生じないことを保証することが重要である。
本明細書で使用される場合、用語「不活化」、「死菌」、または「KV」は、同義的に使用される。
用語「生ワクチン」は、生体生物または複製コンピテントウイルスもしくはウイルスベクターのいずれかを含むワクチンを指す。
アジュバントは、1用量当たり約100μg〜約10mgの量で、好ましくは1用量当たり約100μg〜約10mgの量で、より好ましくは1用量当たり約500μg〜約5mgの量で、さらにより好ましくは1用量当たり約750μg〜約2.5mgの量で、および最も好ましくは1用量当たり約1mgの量で添加することができることが予想される。その代わりに、アジュバントは、最終製品の約0.01〜50容積%の濃度、好ましくは約2容積%〜30容積%の濃度、より好ましくは約5容積%〜25容積%の濃度、さらにより好ましくは約7容積%〜22容積%の濃度、および最も好ましくは10容積%〜20容積%の濃度であってもよい。
「単離された」は、その天然状態から「人の手により」変更されていることを意味し、つまり、自然界で生じる場合であっても、変化されているか、もしくはその元の環境から取り出されているか、またはその両方である。例えば、この用語が本明細書で使用される場合、生体生物に天然で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されている。
好ましくは、本発明に先立って利用可能だった免疫原性組成物で処置されていないかまたは処置されているかのいずれかであるが、続いて特定のネコパラミクソウイルスにより感染させた動物と比較して、処置された動物での発症または重症度が軽減される臨床徴候は、対象の口渇感の増加、排尿の増加、体重減少、食欲減退、倦怠、嘔吐、ウイルス血症、発熱、環境へのウイルスの排出、泌尿生殖器系の感染症、尿路系の感染症、腎臓病、慢性腎臓疾患(CKD)、腎尿細管および腎間質組織の炎症、および特発性尿細管間質性腎炎(TIN)を指す。
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、組成物の状況では、動物における感染もしくは疾患の発生の発生率を低減するかまたは重症度を軽減する免疫応答を誘導することが可能な免疫原性組成物の量を意味する。そのような有効量は、ネコ科動物における特定のネコパラミクソウイルス感染症の発症を減少させることができるか、または特定のネコパラミクソウイルス感染症の臨床徴候の重症度を低減させることができる。特に、有効量は、1用量当たりのコロニー形成単位(CFU)を指す。その代わりに、療法剤の状況では、用語「有効量」は、疾患または障害またはその1つもしくは複数の症状の重症度または継続期間を低減または改善するか、疾患または障害の進行を防止するか、疾患または障害の後退を引き起こすか、疾患または障害に関連する1つまたは複数の症状の再発、発生、発症、または進行を防止するか、あるいは別の療法剤または治療剤の予防または治療を増強または向上させるのに十分な療法剤の量を指す。
本明細書では、「臨床徴候の発症および/または重症度の低減」または「臨床症状の低減」は、これらに限定されないが、群中の感染動物数の低減、感染の臨床徴候を呈する動物数の低減もしくは消失、または野生型感染と比較した、1つもしくは複数の動物に存在する任意の臨床徴候の重症度の低減を意味する。例えば、それは、病原体量、病原体排出のあらゆる低減、病原体伝染の低減、またはネコパラミクソウイルス感染症に特徴的な任意の臨床徴候の低減を指すべきである。好ましくは、こうした臨床徴候は、本発明の治療用組成物を受け取った1つまたは複数の動物では、組成物を受け取っていない感染した動物と比較して少なくとも10%低減される。より好ましくは、臨床徴候は、本発明の組成物を受け取った動物では、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、およびさらにより好ましくは少なくとも50%低減される。
用語「病原体」は、当業者に周知である。用語「病原体」は、細菌およびウイルスを含む。本発明の過程では、用語「ネコ科動物に感染する病原体」は、好ましくは、ネコパラミクソウイルスである。
「持続性防御」は、少なくとも3週間、しかしながらより好ましくは少なくとも3か月間、さらにより好ましくは少なくとも6か月間にわたって継続する「有効性の向上」を指すものとする。
用語「排出」は、鼻汁などの分泌物、およびさらに咳またはくしゃみにより創出されるエアゾールを指す。したがって、排出は、鼻腔スワブのウイルス力価または肺のウイルス力価を検査することにより決定することができる。用語「排出」は、感受性動物(つまり、歩哨動物)へのウイルスの移転をさらに包含する。ウイルス排出を測定する方法は、当業者の一般知識である。
用語「ワクチン接種」または「ワクチン接種する」またはそれらの変異形は、本明細書で使用される場合、これに限定されないが、動物に投与すると、その動物に直接的にまたは間接的に免疫応答を誘発するかまたは誘発することができる本発明の免疫原性組成物を投与することを含むプロセスを意味する。
「死亡」は、本発明の状況では、感染症により引き起こされる死を指し、感染が非常に重度であるため、動物を安楽死させて、苦痛を防止し、その生涯に人道的な終焉が提供される状況を含む。
本発明の製剤は、有効免疫量の1つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。ワクチンは、有効免疫量の1つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。製剤は、投与様式に適合するべきである。
好ましい投与経路としては、これらに限定されないが、鼻腔内、経口、皮内、皮下、および筋肉内が挙げられる。飲料水での、最も好ましくは単一用量での投与が望ましい。当業者であれば、本発明の組成物は、1、2、またはそれよりも多くの用量で、ならびに他の投与経路で投与することもできることが認識されるだろう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、腹腔内が挙げられ、治療の所望持続期間および有効性に応じて、本発明による組成物は、1回または数回、また断続的に、例えば、数日間、数週間、または数か月間にわたって毎日ベースで、および約1×104〜1×109などの様々な投薬量で投与することができる(上記のウイルス力価を参照)。本発明の特定の態様では、投薬量は、約1×104〜1×108TCID50である。
用語「得られる」は、当業者に公知の単離および/または精製ステップ、好ましくは沈殿、カラムなどを使用する単離および/または精製ステップを含んでいてもよい。
用語「免疫試験」および「ゲノム分析試験」は、本発明による免疫原性組成物をワクチン接種した動物、および天然に存在する(疾患に関連する)ネコパラミクソウイルスに感染した動物を区別するための根拠である。免疫試験の例としては、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(ラジオイムノアッセイ)、サンドイッチ酵素免疫試験、蛍光抗体試験(FAT)電気化学発光サンドイッチ免疫測定法(electrochemiluminescence sandwich immunoassay)(ECLIA)、解離促進ランタニド蛍光免疫測定法(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay)(DELFIA)、または固相免疫試験、免疫蛍光試験(IFT)、免疫組織学的染色、ウエスタンブロット分析、または当業者に利用可能な任意の他の好適な方法などの任意の酵素免疫学的または免疫化学的検出法が挙げられる。使用されるアッセイに応じて、抗原または抗体は、酵素、フルオロフォア、または放射性同位体により標識されていてもよい。例えば、Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994);およびFrye et al., Oncogen 4: 1153-1157, 1987を参照されたい。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「ポリペプチド断片」は、本明細書では同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であってもよくまた分岐状であってもよく、修飾アミノ酸またはアミノ酸類似体を含んでいてもよく、アミノ酸以外の化学部分により中断されていてもよい。また、この用語は、天然にまたは介入により、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分もしくは生物活性成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾により修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。
用語「エピトープ」は、特定のB細胞および/またはT細胞が応答する抗原またはハプテンの部位を指す。また、この用語は、「抗原決定基」または「抗原決定基部位」と同義的に使用される。同じエピトープを認識する抗体は、1つの抗体が、標的抗原に対する別の抗体の結合をブロックする能力を示す単純な免疫測定法で特定することができる。
本出願は配列表を含む。配列表は、以下の配列を含む。
配列番号1 FPaV−2「ゴードン株」完全ゲノム配列;マイナスRNA鎖ウイルスゲノムが転写されるプラスRNA鎖に対応するDNA配列として示されており、つまりそれはmRNAと同様に5’から3’方向にORFを含む。
配列番号2 FPaV−2「TV25株」完全ゲノム配列;マイナスRNA鎖ウイルスゲノムが転写されるプラスRNA鎖に対応するDNA配列として示されており、つまりそれはmRNAと同様に5’から3’方向にORFを含む。
配列番号3 FeMoV「ラポン(Lapon)株」完全ゲノム配列;マイナスRNA鎖ウイルスゲノムが転写されるプラスRNA鎖に対応するDNA配列として示されており、つまりそれはmRNAと同様に5’から3’方向にORFを含む。
配列番号4 FPaV−2「ゴードン(Gordon)株」H抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号6 FPaV−2「ゴードン株」H抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号7 FPaV−2「ゴードン株」M抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号8 主にネコ科動物での発現のためにコドン最適化されているFPaV−2「ゴードン株」M抗原核酸;DNA配列として示される。
配列番号9 FPaV−2「ゴードン株」M抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号10 FPaV−2「ゴードン株」F抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号11 主にネコ科動物での発現のためにコドン最適化されているFPaV−2「ゴードン株」F抗原核酸;DNA配列として示される。
配列番号12 FPaV−2「ゴードン株」F抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号13 FPaV−2「ゴードン株」N抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号15 FPaV−2「ゴードン株」P抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号16 FPaV−2「ゴードン株」P抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号17 FPaV−2「ゴードン株」L抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号18 FPaV−2「ゴードン株」L抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号19 FPaV−2「TV25株」H抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号20 FPaV−2「TV25株」H抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号21 FPaV−2「TV25株」M抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号22 FPaV−2「TV25株」M抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号23 FPaV−2「TV25株」F抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号24 FPaV−2「TV25株」F抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号25 FPaV−2「TV25株」N抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号26 FPaV−2「TV25株」N抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号28 FPaV−2「TV25株」P抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号29 FPaV−2「TV25株」L抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号30 FPaV−2「TV25株」L抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号31 FeMoV「ラポン株」H抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号32 主にネコ科動物での発現のためにコドン最適化されているFeMoV「ラポン株」H抗原核酸;DNA配列として示される。
配列番号33 FeMoV「ラポン株」H抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号34 FeMoV「ラポン株」M抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号36 FeMoV「ラポン株」M抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号37 FeMoV「ラポン株」F抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号38 FeMoV「ラポン株」F抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号39 FeMoV「ラポン株」N抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号40 FeMoV「ラポン株」N抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号41 FeMoV「ラポン株」P抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号42 FeMoV「ラポン株」P抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号43 FeMoV「ラポン株」L抗原「野生型」核酸;DNA配列として示される。
配列番号44 FeMoV「ラポン株」L抗原翻訳アミノ酸配列。
配列番号46 ALVAC挿入遺伝子座C3フランキング領域右アーム;DNA配列として示される。
配列番号47 ALVAC挿入遺伝子座C5フランキング領域左アーム;DNA配列として示される。
配列番号48 ALVAC挿入遺伝子座C5フランキング領域右アーム;DNA配列として示される。
配列番号49 C5フランキング領域右アーム、H6ワクシニアプロモーター、コドン最適化ゴードンH抗原、C5フランキング領域左アーム、つまり塩基対304,701〜308,870を含むvCP3025の第3代継代C5挿入遺伝子座。
配列番号50 C5フランキング領域右アーム、H6ワクシニアプロモーター、コドン最適化ゴードンH抗原、C5フランキング領域左アーム、つまり塩基対304,166〜308,380を含むvCP3029の第3代継代C5挿入遺伝子座。
配列番号51 C3フランキング領域右アーム、42k(長)ポックスウイルスプロモーター、コドン最適化ゴードンM抗原、C3フランキング領域左アーム、つまり塩基対38,608〜42,807を含むvCP3029の第3代継代C3挿入遺伝子座。
配列番号52 PCRプライマー「Gordon_M_probe_F」
配列番号53 PCRプライマー「Gordon_M_probe_R」
配列番号54 PCRプライマー「C3F」
配列番号55 PCRプライマー「C3R」
配列番号57 PCRプライマー「7521」
配列番号58 PCRプライマー「C3−PCR−F」
配列番号59 PCRプライマー「C3−PCR−R」
配列番号60 PCRプライマー「C3−R1」
配列番号61 PCRプライマー「C3−R2」
配列番号62 PCRプライマー「C3−R3」
配列番号63 PCRプライマー「C3−R4」
配列番号64 PCRプライマー「C3−R5」
配列番号65 PCRプライマー「C3−R6」
配列番号66 PCRプライマー「C3−R7」
配列番号67 PCRプライマー「C3−R8」
配列番号68 PCRプライマー「C3−R9」
配列番号70 PCRプライマー「Gordon_M_2F」
配列番号71 PCRプライマー「Gordon_M_3F」
配列番号72 PCRプライマー「Gordon_M_1R」
配列番号73 PCRプライマー「C3−F5」
配列番号74 PCRプライマー「C3−F7」
配列番号75 PCRプライマー「7931」
配列番号76 PCRプライマー「7932」
配列番号77 PCRプライマー「7927.DC」
配列番号78 PCRプライマー「7696.CXL」
配列番号79 PCRプライマー「7697.CXL」
配列番号80 PCRプライマー「7925.DC」
配列番号81 PCRプライマー「7792.SL」
配列番号82 PCRプライマー「7793SL」
配列番号83 PCRプライマー「7928.DC」
配列番号85 PCRプライマー「7926.DC」
配列番号86 PCRプライマー「Gordon_H_1R」
配列番号87 PCRプライマー「Gordon_H_2F」
配列番号88 PCRプライマー「Gordon_H_probe_R」
配列番号89 PCRプライマー「Gordon_H_probe_F」
配列番号90 PCRプライマー「Gordon_H_1F」
配列番号91 PCRプライマー「Gordon_H_3F」
配列番号92 PCRプライマー「Gordon_H_4F」
配列番号93 PCRプライマー「Gordon_H_5F」
配列番号94 FeMoV「ラポン株」H抗原「野生型」−BamH1制限酵素部位を有していない−核酸;DNA配列として示される。
配列番号95 挿入遺伝子座C3の右フランキング配列、42k(長)プロモーター、ラポンH(wt;BamHI制限酵素部位無し)、および挿入遺伝子座C3の左フランキング配列を含む、塩基対38,619〜43,588のvCP3041クローン挿入遺伝子座C3およびその理論的ヌクレオチド配列。
1. ネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体に関係する少なくとも1つの外因性抗原コード配列を含むウイルスベクターであって、ネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体は、ネコパラミクソウイルスである、ウイルスベクター。
2. ウイルスベクターは、アビポックスウイルスウイルスベクター、イヌモルビリウイルスウイルスベクター、ヘルペスウイルスウイルスベクター、水痘ウイルスウイルスベクターからなる群から選択される、第1項に記載のウイルスベクター。
3. ネコパラミクソウイルスであるネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体は、
(a)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(b)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号1に記載の核酸配列、
(ii)配列番号1と少なくとも70%同一である、配列番号1と少なくとも75%同一である、配列番号1と少なくとも80%同一である、配列番号1と少なくとも85%同一である、配列番号1と少なくとも90%同一である、配列番号1と少なくとも91%同一である、配列番号1と少なくとも92%同一である、配列番号1と少なくとも93%同一である、配列番号1と少なくとも94%同一である、配列番号1と少なくとも95%同一である、配列番号1と少なくとも96%同一である、配列番号1と少なくとも97%同一である、配列番号1と少なくとも98%同一である、配列番号1と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(c)寄託番号CNCMI−5123で国立培養微生物コレクション(CNCM)に寄託されたネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(d)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号2に記載の核酸配列、
(ii)配列番号2と少なくとも70%同一である、配列番号2と少なくとも75%同一である、配列番号2と少なくとも80%同一である、配列番号2と少なくとも85%同一である、配列番号2と少なくとも90%同一である、配列番号2と少なくとも91%同一である、配列番号2と少なくとも92%同一である、配列番号2と少なくとも93%同一である、配列番号2と少なくとも94%同一である、配列番号2と少なくとも95%同一である、配列番号2と少なくとも96%同一である、配列番号2と少なくとも97%同一である、配列番号2と少なくとも98%同一である、配列番号2と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)
(e)ネコモルビリウイルス(FeMoV);
(f)ネコモルビリウイルス(FeMoV)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号3に記載の核酸配列、
(ii)配列番号3と少なくとも70%同一である、配列番号3と少なくとも75%同一である、配列番号3と少なくとも80%同一である、配列番号3と少なくとも85%同一である、配列番号3と少なくとも90%同一である、配列番号3と少なくとも91%同一である、配列番号3と少なくとも92%同一である、配列番号3と少なくとも93%同一である、配列番号3と少なくとも94%同一である、配列番号3と少なくとも95%同一である、配列番号3と少なくとも96%同一である、配列番号3と少なくとも97%同一である、配列番号3と少なくとも98%同一である、配列番号3と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコモルビリウイルス(FeMoV)
からなる群から選択され、
好ましくは、
(b)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号1に記載の核酸配列、
(ii)配列番号1と少なくとも70%同一である、配列番号1と少なくとも75%同一である、配列番号1と少なくとも80%同一である、配列番号1と少なくとも85%同一である、配列番号1と少なくとも90%同一である、配列番号1と少なくとも91%同一である、配列番号1と少なくとも92%同一である、配列番号1と少なくとも93%同一である、配列番号1と少なくとも94%同一である、配列番号1と少なくとも95%同一である、配列番号1と少なくとも96%同一である、配列番号1と少なくとも97%同一である、配列番号1と少なくとも98%同一である、配列番号1と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(c)寄託番号CNCMI−5123で国立培養微生物コレクション(CNCM)に寄託されたネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(d)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号2に記載の核酸配列、
(ii)配列番号2と少なくとも70%同一である、配列番号2と少なくとも75%同一である、配列番号2と少なくとも80%同一である、配列番号2と少なくとも85%同一である、配列番号2と少なくとも90%同一である、配列番号2と少なくとも91%同一である、配列番号2と少なくとも92%同一である、配列番号2と少なくとも93%同一である、配列番号2と少なくとも94%同一である、配列番号2と少なくとも95%同一である、配列番号2と少なくとも96%同一である、配列番号2と少なくとも97%同一である、配列番号2と少なくとも98%同一である、配列番号2と少なくとも99%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)
からなる群から選択される、第1項または第2項に記載のウイルスベクター。
5. ウイルスベクターは、カナリアポックスベクター、好ましくは弱毒化カナリアポックスベクター、より好ましくはALVAC、さらにより好ましくはALVAC−1またはALVAC−2、最も好ましくはブダペスト条約の条項に基づき寄託番号VR−2547としてアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)に寄託されたALVACである、第1項〜第4項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
7. ウイルスベクターは、vCP3025、vCP3029、vCP3041からなる群から選択される、第1項〜第5項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
8. 少なくとも1つの外因性抗原コード配列は、血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列、マトリックスタンパク質(「M」)コード配列、融合タンパク質(「F」)コード配列、ヌクレオカプシドタンパク質(「N」)コード配列、リンタンパク質(「P」)コード配列、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質(「L」)コード配列からなる群から選択され、より好ましくは血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列および/またはマトリックスタンパク質(「M」)コード配列および/または融合タンパク質(「F」)コード配列である、第1項〜第7項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
25. 少なくとも1つの外因性抗原コード配列は、融合タンパク質(「F」)コード配列であり、融合タンパク質(「F」)コード配列は、配列番号23と少なくとも70%同一であり、配列番号23と少なくとも75%同一であり、配列番号23と少なくとも80%同一であり、配列番号23と少なくとも85%同一であり、配列番号23と少なくとも90%同一であり、配列番号23と少なくとも91%同一であり、配列番号23と少なくとも92%同一であり、配列番号23と少なくとも93%同一であり、配列番号23と少なくとも94%同一であり、配列番号23と少なくとも95%同一であり、配列番号23と少なくとも96%同一であり、配列番号23と少なくとも97%同一であり、配列番号23と少なくとも98%同一であり、配列番号23と少なくとも99%同一であり、好ましくは配列番号23からなる群から選択される核酸配列を含む、第8項に記載のウイルスベクター。
29. 少なくとも1つの外因性抗原コード配列は、リンタンパク質(「P」)コード配列であり、リンタンパク質(「P」)コード配列は、配列番号27と少なくとも70%同一であり、配列番号27と少なくとも75%同一であり、配列番号27と少なくとも80%同一であり、配列番号27と少なくとも85%同一であり、配列番号27と少なくとも90%同一であり、配列番号27と少なくとも91%同一であり、配列番号27と少なくとも92%同一であり、配列番号27と少なくとも93%同一であり、配列番号27と少なくとも94%同一であり、配列番号27と少なくとも95%同一であり、配列番号27と少なくとも96%同一であり、配列番号27と少なくとも97%同一であり、配列番号27と少なくとも98%同一であり、配列番号27と少なくとも99%同一であり、好ましくは配列番号27からなる群から選択される核酸配列を含む、第8項に記載のウイルスベクター。
47. 少なくとも1つの外因性抗原コード配列は、2つまたはそれよりも多くの挿入座に挿入されている、第46項に記載のウイルスベクター。
49. 挿入遺伝子座C3のフランキング配列、好ましくは配列番号45(C3フランキング領域左アーム)および配列番号46(C3フランキング領域右アーム)に記載の挿入遺伝子座C3のフランキング配列を含む、第46項〜第48項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
50. 少なくとも1つの挿入遺伝子座は、挿入遺伝子座C5である、第46項〜第49項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
51. 挿入遺伝子座C5のフランキング配列、好ましくは配列番号47(C5フランキング領域左アーム)および配列番号48(C5フランキング領域右アーム)に記載の挿入遺伝子座C5のフランキング配列を含む、第46項〜第50項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
52. 少なくとも1つの挿入遺伝子座は、挿入遺伝子座C6である、第46項〜第51項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
53. 少なくとも1つの外因性抗原コード配列は、少なくとも1つのプロモーター配列、好ましくは弱いプロモーター配列に作動可能に連結されている、第1項〜第46項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
55. 少なくとも1つのプロモーター配列は、I3Lワクシニアプロモーターである、第53項または第54項に記載のウイルスベクター。
56. 少なくとも1つのプロモーター配列は、42k(長)ポックスウイルスプロモーターである、第53項〜第55項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
57. 少なくとも1つのプロモーター配列は、7.5kワクシニアプロモーターである、第53項〜第56項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
58. 少なくとも1つのプロモーター配列は、Piワクシニアプロモーターである、第53項〜第57項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
59. 終結シグナルおよび/またはポリアデニル化配列など、追加の調節配列をさらに含む、第1項〜第58項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
61. ネコ科動物は、ネコ、好ましくはイエネコである、第1項〜第60項のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
62. 第1項〜第61項のいずれか1項に記載のウイルスベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞。
63. 免疫原性組成物またはワクチンを製造するための、第1項〜第61項のいずれか1項に記載のウイルスベクターまたは第62項に記載の哺乳動物宿主細胞の使用。
64. (a)第1項〜第61項のいずれか1項に記載のウイルスベクターもしくは第62項に記載の哺乳動物宿主細胞、および/または
(b)ウイルス、修飾生ウイルス、もしくはウイルス様粒子(VLP)などの、第1項〜第61項のいずれか1項に記載のウイルスベクターによりコードされるポリペプチド、および
(c)任意に、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体もしくは賦形剤であって、好ましくは、前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適である、担体もしくは賦形剤
を含み、
好ましくは、感染性ウイルスなどのウイルスを含む、免疫原性組成物。
(b)ウイルス、修飾生ウイルス、もしくはウイルス様粒子(VLP)などの、第1項〜第61項のいずれか1項に記載のウイルスベクターによりコードされるポリペプチド、および
(c)薬学的にまたは獣医学的に許容される担体もしくは賦形剤であって、好ましくは前記担体は、経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適である、担体もしくは賦形剤
を含み、
(d)任意に、アジュバントをさらに含む、ワクチンまたは医薬組成物。
(a)第62項に記載の哺乳動物宿主細胞を、第1項〜第61項のいずれか1項に記載のウイルスベクターで感染させるステップ、
(b)感染細胞を好適な条件下で培養するステップ、
(c)感染細胞培養物を収集するステップ、
(d)任意に、ステップ(c)の収集した感染細胞培養物を精製するステップ、
(e)任意に、前記収集した感染細胞培養物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む方法。
(a)前記ネコ科動物にワクチンを投与することが可能なディスペンサー、および
(b)第64項に記載の免疫原性組成物または第65項に記載のワクチン、および、
(c)任意に、使用説明書を含み、
好ましくは、少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスは、少なくとも1つのネコパラミクソウイルスであり、好ましくは、前記疾患または前記臨床徴候は、ウイルス血症、発熱、環境へのウイルス排出、泌尿生殖器系の感染症、尿路系の感染症、腎臓疾患、慢性腎臓疾患(CKD)、腎尿細管および腎間質組織の炎症、特発性尿細管間質性腎炎(TIN)からなる群から選択される、キット。
vCP3025の構築:ALVAC C5/H6p合成ゴードンHおよびvCP3029:ALVAC C3/42k長合成ゴードンM+C5/H6p合成ゴードンH(配列番号49、50、および51を含む;図2、3、および4)
目的:2つのALVAC構築物を生成する:1つは単一インサートを有し、1つは二重インサートを有する。単一構築物は、H6プロモーター下のC5挿入遺伝子座のコドン最適化ゴードンHを発現する。二重構築物は、H6プロモーター下のC5挿入遺伝子座にあるコドン最適化ゴードンH、および42k長プロモーター下のC3挿入遺伝子座にあるコドン最適化ゴードンMを両方とも発現する。
組換え体の基本情報:
A. 親ウイルス:後期継代由来のALVAC、継代レベル;力価=1.5×10^10pfu/mL以外は、本質的に親ALVAC ATCC VR−2547と同じウイルス
B. ドナープラスミド:pC5 H6pゴードンH(opt);pC3 42KゴードンM(opt)
C. 挿入遺伝子座:単一=C5;二重=C3およびC5
D. プロモーター:C5部位/挿入遺伝子座=H6プロモーター;C3部位/挿入遺伝子座=42k長プロモーター
E. in vitro組換え用の細胞:初代ニワトリ胚線維芽細胞(1−CEF)
F. 組換え体を選択するための方法:ゴードンHおよびゴードンM特異的プローブによるプラークハイブリッド形成法
1−CEF細胞をNot I−線状化ドナープラスミドでトランスフェクションすることにより、in vitro組換え(IVR)を実施する。20μgの各ドナープラスミド[pC5 H6pゴードンH(opt)およびpC3 42KゴードンM(opt)]を使用して単一のIVRを実施する。Fugene HD(Promega カタログ番号E2311)は、トランスフェクション試薬である。続いて、トランスフェクトした細胞を、レスキューウイルスとしての親ALVACに10のMOIで感染させる。24時間後、トランスフェクトした感染細胞を回収し、超音波処理し、組換えウイルススクリーニングに使用する。
組換えプラークを、プラークリフトハイブリッド形成法(plaque lift hybridization method)に基づきスクリーニングする。感染単層を、正に荷電されたナイロン転写膜(GE Healthcare カタログ番号RPN82B)にリフトし、リフト緩衝液の存在下で追加のナイロン膜を元のリフトに対して押し付けることにより、そうしたリフトのコピーを製作する。ビオチン標識ゴードンH特異的プローブまたはビオチン標識ゴードンM特異的プローブのいずれかでコピーを探索した。ラウンド3および4にて、第3のセットのリフトを製作し、ALVAC特異的親プローブで探索する(ラウンド3ではC3プローブ;ラウンド4ではC5プローブ)。ALVAC親プローブは、組換え中に欠失されるORFの領域に結合する。Thermo Scientific DecaLabel DNA標識キット;製品番号K0622を使用してプローブを標識する。探索したリフトを、Thermo Scientific化学発光核酸検出モジュールキット;製品番号89880を使用して発色させる。組換えプラークを選択し、元の膜から切り出し、次のラウンドの精製での感染に使用する。第3の連続ラウンドのプラーク精製にて、vCP3029.2.2.1と命名した組換え体をピックアップする。薄膜での結果に基づくと、このプラークは、次のラウンドのスクリーニングにて二重インサートウイルスを産生すると予想される。しかしながら、このピックアップしたプラークを第4のラウンドのスクリーニングでプレーティングすることにより、単一インサート[C5部位のゴードンH(opt)]プラークおよび二重インサート[C5部位のゴードンH(opt)およびC3部位のゴードンM(opt)]プラークが両方とも産生される。二重インサートプラークをピックアップし、vCP3029.2.2.1.2と表記する。単一インサートプラークをピックアップし、vCP3025.2.2.1.1と表記する。
組換え体の分析:P3ストックに対して以下の分析を実施する。
生殖不能性:vCP3025およびvCP3029のP3ストックに対して生殖不能性試験を実施する。各構築物の50μLアリコートを、2つのサブローデキストロース寒天培地(SDA)プレートの各々および5%ヒツジ血液を有する2つのトリプチケースソイ寒天培地(TSA II 5%SB)プレートの各々(BBL それぞれカタログ番号221180およびカタログ番号221239)にプレーティングする。各構築物について、一方のSDAプレートおよび一方のTSA II 5%SBプレートを、37℃で10日間インキュベートし、他方のセットのプレートを室温で10日間インキュベートする。10日間の終了時では、いずれのプレートも、細菌増殖または真菌増殖のいかなる徴候も示さない。
P3ストックの純度を、幾つかの別々のPCR反応により確認する。第1のPCR反応では、C5アームのいずれかの末端に位置するプライマーが使用される(プライマー7931および7932)。こうしたプライマーは、野生型ALVACでは2,470bpバンド、およびC5部位にゴードンH(opt)を含む組換え体では4240bpバンドをもたらす。C3領域全体を増幅することになるプライマーが存在するが、そうしたプライマーは、野生型ALVACでは4539bpバンド、およびC3部位にゴードンM(opt)を含む組換え体では4289bpバンドをもたらすことになる。このサイズ差は、ゲルで検出するのが困難である。そのため、2つの他のPCRを実施してC3部位を分析する。第1の反応では、ゴードンMプローブ(Gordon_M_probe_Fおよびゴードン_M_probe_R)を製作するために使用したプライマーを、試料の増幅に使用する。こうしたプライマーは、C3部位にゴードンM(opt)を含む組換え体では621bpバンドをもたらし、野生型ALVACではバンドをもたらさない。第2の反応では、野生型C3プローブを製作するために使用したプライマー(C3FおよびC3R)を、試料の増幅に使用する。こうしたプライマーは、組換え中に欠失される領域に位置し、野生型ALVACでは1007bpバンドをもたらし、C3部位にゴードンM(opt)を含む組換え体ではバンドをもたらさない。
方法、試薬、およびプライマー
ゴードンH(opt)プローブを増幅するためのプライマー:
ゴードンHプローブ F GTTCGCCACCGTGAACATCC(配列番号89)
ゴードンHプローブ R CACTGCCTTCACGGTCACG(配列番号88)
ゴードンMプローブ F GGAGATCCTGACTCTGAACATCG(配列番号52)
ゴードンMプローブ R CTCCACAGAGTTTTATTCAGCCC(配列番号53)
ALVAC親プローブを増幅するためのプライマー(C3部位):
C3F CGTAGAGTTTTTTGTCTAGTTCTAT(配列番号54)
C3R GTTGTTTTATGCGGTAAAGAATAAT(配列番号55)
ALVAC親プローブを増幅するためのプライマー(C5部位):
7520 TCTTGCTTCGCAGTCATCGTTCTG(配列番号56)
7521 TCTAAAATGCATAATTTCTAA(配列番号57)
C3−PCR−F GCTAACACAAGTTAGAGGCGTATTAC(配列番号58)
C3−PCR−R CATTAATTATGTGATGAGGCATCCAAC(配列番号59)
配列決定のためにC5部位をPCR増幅するためのプライマー:
7931 GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT(配列番号75)
7932 TGATTATAGCTATTATCACAGACTC(配列番号76)
C3部位を配列決定するためのプライマー:
C3-PCR-F GCTAACACAAGTTAGAGGCGTATTAC(配列番号58)
C3-PCR-R CATTAATTATGTGATGAGGCATCCAAC(配列番号59)
C3-R1 TTTATAGGTAAATCCAGGAA(配列番号60)
C3-R2 GCCTACTAAGAAAACTAGAAGATAC(配列番号61)
C3-R3 AGATTGATATAAATGAATATGTAA(配列番号62)
C3-R4 CGACGTTAGGTTAGATACTG(配列番号63)
C3-R5 ATGCGGTACCCTGTTCGAAG(配列番号64)
C3-R6 CAGAAATGAGTAATGGAAGA(配列番号65)
C3-R7 CTGGAAATAGTCCGTTATAT(配列番号66)
C3-R8 CAGTATCTCATAAAGGCACTTA(配列番号67)
C3-R9 CCGTTCTAAATATAGCTGTTGCAT(配列番号68)
ゴードンM 1F ATGACTGAGATCTTCAACCTGG(配列番号69)
ゴードンM 2F TGAGCATGGGGACCATCCTG(配列番号70)
ゴードンM 3F GGGCTGAATAAAACTCTGTGGAG(配列番号71)
ゴードンMプローブ F GGAGATCCTGACTCTGAACATCG(配列番号52)
ゴードンM 1R CGATGTTCAGAGTCAGGATCTCC(配列番号72)
C3−F5 CACGGATTATCTACTGTGAT(配列番号73)
C3−F7 GCAACAGTAGTTATACGATGAG(配列番号74)
7931 GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT(配列番号75)
7932 TGATTATAGCTATTATCACAGACTC(配列番号76)
7927.DC CTCTTGCATATTCGTAATAGTAATTG(配列番号77)
7696.CXL ATTCTATCGGAAGATAGGATACCAG(配列番号78)
7697.CXL ATGCACAACTTCTTGTCTGCATGATG(配列番号79)
7925.DC TACGGCTATATGTAGAGGAGTTAACC(配列番号80)
7792.SL CTCTGAGACACAAAAGAGGTAGCTG(配列番号81)
7793SL CATAGAACGGTATAGAGCGTTAATC(配列番号82)
7928.DC CATCATGAGCAACGCGTTAGTATAT(配列番号83)
7929.DC GGAGATACCTTTAGATATGGATCTG(配列番号84)
7926.DC TCAACAACCGCTCGTGAACAGCTTC(配列番号85)
ゴードンH 1R GCTCGGTGCTCATTGCGTTG(配列番号86)
ゴードンH 2F CAACGCAATGAGCACCGAGC(配列番号87)
ゴードンHプローブ R CACTGCCTTCACGGTCACG(配列番号88)
ゴードンHプローブ F GTTCGCCACCGTGAACATCC(配列番号89)
ゴードンH 1F TCGCGATATCCGTTAAGTTTGTA(配列番号90)
ゴードンH 3F GAATATCCCCACCAGGTCTATCTAC(配列番号91)
ゴードンH 4F TACCGACGATGTGCCCATCC(配列番号92)
ゴードンH 5F ATCTCCGACGGCCTGATCAT(配列番号93)
vCP3025力価=2.3×10^9pfu/mL
vCP3029力価=1.9×10^9pfu/mL
ワクチン接種実施例(vCP3025−ゴードンH;配列番号49を含む;図2)
SD0およびSD21にて、およそ1×108TCID50/mLの力価を有する合計用量が1mLのALVAC−ゴードンHベクターワクチンを、8匹のネコの群(群1)に投与する。この用量は、選択された抗原(FaPV−2血球凝集素)に対する免疫応答を促進するために十分な量のワクチンウイルスを送達すると予想される。陰性対照(群3)には、無関係のALVACベクター構築物(つまり、ALVAC狂犬病)をワクチン接種する。動物は、SD0、SD21、およびSD42にて血液を試料採取し、体液性免疫応答を、特定のELISA、免疫蛍光アッセイ(IFA)、および/またはウイルス/血清中和試験(VNT/SNT)で測定する(実施例4)。SD42にて、それぞれの群の動物に、下記に記載のように(実施例5)負荷ウイルスを静脈内(IV)接種し、加えて、所与の感染パラメーターを測定する(ウイルス血症、排出、ウイルス分布)。
ワクチン接種実施例(vCP3029−ゴードンH+ゴードンM;配列番号50+51を含む;図3+4)
SD0およびSD21にて、およそ1×108TCID50/mLの力価を有する合計用量が1mLのALVAC−ゴードンH+4Mベクターワクチンを、8匹のネコの群(群2)に投与する。この用量は、選択された抗原(FaPV−2血球凝集素およびマトリックスタンパク質)に対する免疫応答を促進するために十分な量のワクチンウイルスを送達すると予想される。陰性対照(群3)には、無関係のALVACベクター構築物(つまり、ALVAC狂犬病)をワクチン接種する。動物は、SD0、SD21、およびSD42にて血液を試料採取し、体液性免疫応答を、特定のELISA、免疫蛍光アッセイ(IFA)、および/またはウイルス/血清中和試験(VNT/SNT)で測定する(実施例4)。SD42にて、それぞれの群の動物に、下記に記載のように(実施例5)負荷ウイルスを静脈内(IV)接種し、所与の感染パラメーターを測定する(ウイルス血症、排出、ウイルス分布)。
ウイルス中和試験(VNT)/血清中和試験(SNT)
FPaV−2などのネコパラミクソウイルスに対する中和抗体を検出するために、ウイルス/血清中和アッセイ(VNT/SNT)を実施する。したがって、ネコ血清試料を、56℃で30分間処理して、補体因子を不活化する。こうした熱不活化血清試料の50μlを、FPaV−2(単離株「ゴードン」)などのネコパラミクソウイルスの100蛍光形成単位(fluorescence forming unit)(FFU)を含む50μlのDMEMと混合し、その後4℃で1時間インキュベートする。混合物を使用して、37℃で2時間、96ウェル細胞培養プレートのLLC−MK2細胞に感染させる。その後、血清/ウイルス混合物を除去し、2%(容積/容積)熱不活化FBS、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むDMEMで置換する。細胞を、37℃、5%CO2、および90%湿度で5日間インキュベートし、続いて下記に記載のように免疫蛍光染色を行う。試験血清試料の中和力価は、血清インキュベーションを行わなかったウイルス対照と比較してウイルス感染力が50%低減された最も高い試験血清希釈度の逆数であると定義される。
FPaV−2感染などのネコパラミクソウイルス感染を検出するために、LLC−MK2細胞を下記に記載のように感染させ、免疫蛍光技法を使用してネコパラミクソウイルス特異的抗体で染色する。この目的のため、付着細胞を、5日間の感染期間後にPBSで洗浄し、続いて−20℃で10分間80%アセトンで固定する。細胞を、PBSで2回洗浄し、37℃で1時間PBS中5%BSAでインキュベーションすることにより、非特異的結合をブロックする。この後で、PBS中1%BSA中1μg/mlの終濃度の抗ネコパラミクソウイルス抗体(例えば、抗FPaV−2ヌクレオカプシド、ポリクローナル、ウサギ)と共に37℃で1時間インキュベーションするステップを行う。細胞を、PBSで3回洗浄し、続いてPBS中1%BSAで1:1000最終稀釈した「ヤギ抗ウサギIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor(登録商標)488コンジュゲート」(Thermo Fisher Scientific)を適用する。37℃で1時間のインキュベーション時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、蛍光顕微鏡を使用してFPaV−2の存在について細胞をスクリーニングする。
負荷モデル
感染および疾患発現の初期段階を調査するための負荷モデル臨床研究を使用する。1×105TCID50/mLの負荷用量にできるだけ近い用量でFPaV−2「ゴードン株」による静脈内(IV)負荷を実施し、負荷後56日間追跡する。CKDの臨床徴候は予想されないため、負荷モデル臨床研究の主な目的は、原始感染、腎機能に対する感染の影響の可能性、感染に対する免疫応答をモニターして、伝播の可能性を評価し、免疫組織化学法(IHC)により腎臓およびおそらくは他の器官におけるウイルス定着を確認することである。
疾患の初期段階で予想される症状は、ウイルス血症と関連する(無気力、高熱、体重減少)。後期段階で予想される徴候は、慢性腎不全に関係する可能性がある(体重喪失、尿毒症、粘膜病変)。FPaV−2「ゴードン株」のウイルスストック(力価1×105TCID50/mlを有する)を、初代ネコ末梢血単核細胞(PBMC)で、またはLLC−MK2細胞株のような他の細胞で調製する。ストックは、一般的なネコ病原体(それぞれ、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、およびネココロナウイルスを含む)の存在について陰性であることが試験されている。雑種ネコに、1mlのウイルスストック(1×105TCID50/ml)を静脈内(IV)接種する。
下記では、ネコ群A1、A2、B1、B2、C1、およびC2は、剖検の異なるタイミングを表す:A1およびA2はD14、B1およびB2はD28、C1およびC2はD56。この細分化は、動物に対する過度のストレスを回避するために、すべてのネコの毎日の試料採取を回避することにより動機付けられる。
・D0〜D14(週末を除く)では毎日ベースの、およびD15〜D56では週2回の臨床検査および直腸温
・D0〜D56での週2回の体重測定
・PCRによるウイルス血症モニタリングのための血液試料採取
各動物の完全な剖検を実施して、腎臓、脾臓、肝臓、膀胱、および肺を試料採取する。組織学およびPCRによるウイルス検出のために器官を試料採取する。
負荷モデル臨床研究により、本発明によるウイルスベクターに基づくワクチンベクターは、ネコに負荷するとネコパラミクソウイルスウイルス血症を予防ならびに/またはその強度および/もしくは持続期間を低減することができるという仮説を試験する。加えて、基礎をなす本発明のウイルスベクターでネコをワクチン接種することにより、例えば、ネコパラミクソウイルス血球凝集素抗原に対する抗体が誘導される。
vCP3041の構築:ALVAC C5/H6p合成ゴードンH+C3/42k長野生型ラポンH(配列番号49+95を含む)
目的:二重インサートを有するALVAC構築物を生成する。構築物は、H6プロモーター下のC5挿入遺伝子座にあるコドン最適化ゴードンH(親として使用される)および42k長プロモーター下のC3挿入遺伝子座にある野生型ラポンH(BamH1制限酵素部位を有しない;配列番号94)(新たなインサート)を発現する(図6および7)。
組換え体の基本情報:
A. 親ウイルス:vCP3025:ALVAC C5/H6p合成ゴードンH;力価=2.3×10^9pfu/mL
B. ドナープラスミド:pC3 42k長ラポンH(wt、BamH1制限酵素部位を有さない)
C. 挿入遺伝子座:C3
D. プロモーター:42k長プロモーター
E. in vitro組換え用の細胞:初代ニワトリ胚線維芽細胞(1−CEF)
F. 組換え体を選択するための方法:ゴードンH(opt)およびラパンH(wt)特異的プローブによるプラークハイブリッド形成法
組換え体生成の詳細な説明。
G. 20μgのNot I−線状化ドナープラスミドで1−CEF細胞をトランスフェクションすることによりin vitro組換え(IVR)を実施する[pC3 42k長ラポンH(wt、BamH1制限酵素部位を有しない)]。Fugene HD(Promega カタログ番号E2311)は、トランスフェクション試薬である。続いて、トランスフェクトした細胞を、レスキューウイルスとしてのvCP3025に10のMOIで感染させる。24時間後、トランスフェクトした感染細胞を回収し、超音波処理し、組換えウイルススクリーニングに使用する。
単一のP2を大規模化して、P3(第3代継代)とする(4つのローラーボトル)。P3物質を、スクロースペレットにより濃縮および精製し、vCP3041と呼ぶ。
組換え体の分析:P3ストックに対して以下の分析を実施する。
生殖不能性:vCP3041のP3ストックに対して生殖不能性試験を実施する。50μLのアリコートを、2つのサブローデキストロース寒天培地(SDA)プレートの各々および5%ヒツジ血液(TSA II 5%SB)を有する2つのトリプチケースソイ寒天培地プレートの各々(BBL それぞれカタログ番号221180およびカタログ番号221239)にプレーティングする。各構築物について、一方のSDAプレートおよび一方のTSA II 5%SBプレートを、37℃で10日間インキュベートし、他方のセットのプレートを室温で10日間インキュベートする。10日後、いずれのプレートでも細菌増殖および真菌増殖がいずれも視認できない場合、構築物は生殖不能性試験に合格する。
P3ストックの純度を、PCRにより確認する。C3アームのいずれかの末端に位置するプライマー(C3−PCR−FおよびC3−PCR−R)を使用して、試料を増幅する。これらプライマーは、C3部位に野生型配列を含むALVACウイルスでは4539bpバンド、およびC3部位にラポンH(wt、BamH1制限酵素部位を有しない)を含む組換え体では5063bpバンドをもたらす。第1のPCRで約4.5Kbバンドと約5Kbバンドとを区別することが難しい場合、第2のPCRが有用であり得る。第2のPCRは、野生型C3プローブ(C3FおよびC3R)を製作するために使用されたプライマーを含む。これらプライマーは、C3部位の組換え中に欠失される領域に位置し、野生型ALVAC配列では1007bpバンドをもたらし、組換え体ではバンドをもたらさない。この第2のPCRにより、親ウイルスがP3試料に残留しないことが確認される。
配列分析:P3ストックのより詳細な配列分析を、vCP3041のC3部位およびC5部位のPCR増幅および配列分析により実施する。C5組換えアームの直ぐ外部に位置するプライマー7931および7932を使用して、C5部位を増幅する。C3組換えアームの直ぐ外部に位置するプライマーC3−PCR−FおよびC3−PCR−Rを使用して、C3部位を増幅する。増幅した領域を配列決定して、プロモーターおよび遺伝子の完全性を確認する。
ALVAC親プローブを増幅するためのプライマー(C3部位):
C3F CGTAGAGTTTTTTGTCTAGTTCTAT(配列番号54)
C3R GTTGTTTTATGCGGTAAAGAATAAT(配列番号55)
C3部位を増幅するためのプライマー:
C3−PCR−F GCTAACACAAGTTAGAGGCGTATTAC(配列番号58)
C3−PCR−R CATTAATTATGTGATGAGGCATCCAAC(配列番号59)
C5部位を増幅するためのプライマー:
7931 GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT(配列番号75)
7932 TGATTATAGCTATTATCACAGACTC(配列番号76)
ワクチン接種実施例(vCP3025−ゴードンH;配列番号49を含む;図2)
SD0およびSD21にて、およそ1×107.7TCID50/用量の力価を有する合計用量が1mLのALVAC−ゴードンHベクターワクチンを、7匹のネコの群(群A)に投与する。この用量は、選択された抗原(FaPV−2血球凝集素)に対する免疫応答を促進するために十分な量のワクチンウイルスを送達することが予想される。陰性対照(群C)にはワクチン接種しない。動物は、SD0、SD21、およびSD35にて血液を試料採取し、体液性免疫応答を、特定のELISA、免疫蛍光アッセイ(IFA)、および/またはウイルス/血清中和試験(VNT/SNT)で測定する(実施例9)。SD49にて、それぞれの群の動物に、下記に記載のように(実施例10)負荷ウイルスを静脈内(IV)接種し、加えて、所与の感染パラメーターを測定する(ウイルス血症、排出、ウイルス分布)。
ワクチン接種実施例(vCP3029−ゴードンH+ゴードンM;配列番号50+51を含む;図3+4)
SD0およびSD21にて、およそ1×107.7TCID50/用量の力価を有する合計用量が1mLのALVAC−ゴードンH+Mベクターワクチンを、7匹のネコの群(群B)に投与する。この用量は、選択された抗原(FaPV−2血球凝集素およびマトリックスタンパク質)に対する免疫応答を促進するために十分な量のワクチンウイルスを送達することが予想される。陰性対照(群C)にはワクチン接種しない。動物は、SD0、SD21、およびSD35にて血液を試料採取し、体液性免疫応答を、特定のELISA、免疫蛍光アッセイ(IFA)、および/またはウイルス/血清中和試験(VNT/SNT)で測定する(実施例9)。SD42にて、それぞれの群の動物に、下記に記載のように(実施例10)負荷ウイルスを静脈内(IV)接種し、所与の感染パラメーターを測定する(ウイルス血症、排出、ウイルス分布)。
ウイルス中和試験(VNT)/血清中和試験(SNT)
FPaV−2などのネコパラミクソウイルスに対する中和抗体を検出するために、ウイルス/血清中和アッセイ(VNT/SNT)を実施する。したがって、ネコ血清試料を、56℃で30分間処理して、補体因子を不活化する。こうした熱不活化血清試料の50μlを、FPaV−2(単離株「ゴードン」)などのネコパラミクソウイルスの100TCID50蛍光形成単位(FFU)を含む50μlのDMEMと混合し、その後37℃で1時間インキュベートする。混合物を使用して、37℃で2時間、96ウェル細胞培養プレートのLLC−MK2細胞に感染させる。細胞を、37℃、5%CO2、および90%湿度で5日間インキュベートし、続いて下記に記載のように免疫蛍光染色を行う。試験血清試料の中和力価は、血清インキュベーションを行わなかったウイルス対照と比較してウイルス感染力が50%低減された最も高い試験血清希釈度の逆数であると定義される。
負荷モデル
感染および疾患発現の初期段階を調査するための負荷モデル臨床研究を使用する。1×105TCID50/mLの負荷用量にできるだけ近い用量でFPaV−2「ゴードン株」による静脈内(IV)負荷を実施し、負荷後56日間追跡する。CKDの臨床徴候は予想されないため、負荷モデル臨床研究の主な目的は、原始感染、腎機能に対する感染の影響の可能性、感染に対する免疫応答をモニターして、伝播の可能性を評価し、免疫組織化学法(IHC)により腎臓およびおそらくは他の器官におけるウイルス定着を確認することである。
疾患の初期段階での予想される症状は、ウイルス血症と関連する(無気力、高熱、体重減少)。後期段階で予想される徴候は、慢性腎不全に関係する可能性がある(体重喪失、尿毒症、粘膜病変)。FPaV−2「ゴードン株」のウイルスストック(力価1×105TCID50/mlを有する)を、初代ネコ末梢血単核細胞(PBMC)で、またはLLC−MK2細胞株のような他の細胞で調製する。ストックは、一般的なネコ病原体(それぞれ、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、およびネココロナウイルスを含む)の存在について陰性であることが試験されている。雑種ネコに、1mlのウイルスストック(1×105TCID50/ml)を静脈内(IV)接種する。
下記では、ネコ群A1、A2、B1、B2、C1、およびC2は、剖検の異なるタイミングを表す:A1およびA2はD14、B1およびB2はD28、C1およびC2はD56。この細分化は、動物に対する過度のストレスを回避するために、すべてのネコの毎日の試料採取を回避することにより動機付けられる。
・D0〜D14(週末を除く)では毎日ベースの、およびD15〜D56では週2回の臨床検査および直腸温
・D0〜D56での週2回の体重測定
・PCRによるウイルス血症モニタリングのための血液試料採取
各動物の完全な剖検を実施して、腎臓、脾臓、肝臓、膀胱、および肺を試料採取する。組織学およびPCRによるウイルス検出のために器官を試料採取する。
負荷モデル臨床研究により、本発明によるウイルスベクターに基づくワクチンベクターは、ネコに負荷するとネコパラミクソウイルスウイルス血症を予防ならびに/またはその強度および/もしくは持続期間を低減することができるという仮説を試験する。加えて、基礎をなす本発明のウイルスベクターでネコをワクチン接種することにより、例えば、ネコパラミクソウイルス血球凝集素抗原に対する抗体が誘導される。
ネコ血清の血清学的検査
ウイルス中和試験(VNT)(実施例9)を使用して、ネコ血清の血清学的検査を実施する。ネコを3つの群に分割した:A)ネコパラミクソウイルス2型「ゴードン」株の血球凝集素(H)タンパク質を発現する組換えALVACベクター(vCP3025)によるワクチン接種;B)ネコパラミクソウイルス2型「ゴードン」株の血球凝集素(H)およびマトリックス(M)タンパク質を発現する組換えALVACベクター(vCP3029)によるワクチン接種;C)ネコにワクチン接種しない(負荷対照群)。
VNT方法論を使用することにより、動物はすべて、0日目においてワクチン接種前にVNT陰性を示すことが明らかに検出される(力価<1:10)。さらに、ワクチン接種しなかったネコは、負荷前のすべての時点でVNT陰性のままであり、これは有効な動物研究の要件である。
結論として、ネコパラミクソウイルス2型「ゴードン」株のHまたはH+Mタンパク質を発現する組換えALVACベクターのいずれかをワクチン接種したネコはすべて、ワクチン接種に際して強力に反応し、血清転換する。また、負荷ウイルスに対するウイルス中和力価の有意な値が、D35およびD49で検出される。群Aの力価中央値は、35日目で1:160、および49日目で1:693.33である。群Bの力価中央値は、35日目では1:160であるが、49日目では1:403.33である。こうした日数は、それぞれ、第2のワクチン接種の14および28日後に対応する。そのような強力なネコパラミクソウイルス2型中和力価は、ネコパラミクソウイルス2型に対する非常に強力なワクチン接種応答を示す。
負荷に際するウイルス血症の予防または低減
ネコを3つの群に分割する:A)ネコパラミクソウイルス2型「ゴードン」株の血球凝集素(H)タンパク質を発現する組換えALVACベクター(vCP3025)によるワクチン接種;B)ネコパラミクソウイルス2型「ゴードン」株の血球凝集素(H)およびマトリックス(M)タンパク質を発現する組換えALVACベクター(vCP3029)によるワクチン接種;C)ネコにワクチン接種しない(負荷対照群)。
負荷の当日(D49)、ネコに、1×105,1TCID50/mlの感染力価を有する1mlのネコパラミクソウイルス2型「ゴードン」株を静脈内(IV)感染させる。ウイルス接種後の3日目(D52)およびウイルス接種後の7日目(D56)にて、ネコから血漿試料を採取する。RNAを血漿から抽出し、ネコパラミクソウイルス2型特異的リアルタイムqPCRを実施する。qPCRの感度は、2.9log10RNAコピー数/mLであり、それを計算のカットオフとして使用する。
群C−ワクチン接種しなかったネコ(負荷対照):ウイルス接種後の3日目(D52)では、ワクチン接種しなかった対照群の6匹のネコのうち5匹がウイルス血症になり、平均RNAコピー数は3.67logs10/mlであるが、7日目(D56)では、ワクチン接種しなかったネコに由来する試料はすべて陽性であり、平均ネコパラミクソウイルス2型RNAコピー数は、5.97log10/mlである。
群A−ALVACゴードンHワクチン:ALVAC−ゴードン−Hワクチンをワクチン接種したネコは、負荷後の3日目および7日目の両日にて完全に陰性のままである。
結論として、ネコパラミクソウイルス2型のHタンパク質を発現する組換えALVACベクターをワクチン接種したネコはすべて、十分に防御されまままであり、ネコパラミクソウイルス2型負荷ウイルスの接種後に検出可能なウイルス血症を示さない。ネコパラミクソウイルス2型のHおよびMタンパク質を発現するALVACベクターをワクチン接種したネコは、防御され、4匹のネコが完全に陰性のままであり、2匹のネコは、両日共にワクチン接種の結果としてネコパラミクソウイルス2型RNAコピー数の低減を示す。
Claims (21)
- ネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体の、またはそれに関係する少なくとも1つの外因性抗原コード配列を含むウイルスベクター、好ましくは組換えおよび/または天然に存在しないウイルスベクターであって、前記ネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体は、ネコパラミクソウイルスである、ウイルスベクター。
- アビポックスウイルスウイルスベクター、イヌモルビリウイルスウイルスベクター、ヘルペスウイルスウイルスベクター、水痘ウイルスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項1に記載のウイルスベクター。
- ネコパラミクソウイルスである前記ネコ科動物に感染する少なくとも1つの病原体が、
(a)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(b)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号1に記載の核酸配列、
(ii)配列番号1と少なくとも70%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(c)寄託番号CNCMI−5123として国立培養微生物コレクション(CNCM)に寄託されたネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(d)ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号2に記載の核酸配列、
(ii)配列番号2と少なくとも70%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2);
(e)ネコモルビリウイルス(FeMoV);
(f)ネコモルビリウイルス(FeMoV)であって、そのゲノムが、
(i)配列番号3に記載の核酸配列、
(ii)配列番号3と少なくとも70%同一である核酸配列
からなる群から選択される核酸配列に相補的なリボ核酸を含む、ネコモルビリウイルス(FeMoV)
からなる群から選択される、請求項1または2に記載のウイルスベクター。 - 前記ウイルスベクターが、カナリアポックスベクター、好ましくは弱毒化カナリアポックスベクター、より好ましくはALVAC、さらにより好ましくはALVAC−1またはALVAC−2、最も好ましくはブダペスト条約の条項に基づき寄託番号VR−2547としてアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)に寄託されたALVACであるか;または前記ウイルスベクターが、鶏痘ベクター、好ましくは弱毒化鶏痘ベクター、より好ましくはTROVAC、最も好ましくはブダペスト条約の条項に基づき寄託番号VR−2553としてアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)に寄託されたTROVACであるか;または前記ウイルスベクターが、vCP3025、vCP3029、vCP3041からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 前記少なくとも1つの外因性抗原コード配列が、血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列、マトリックスタンパク質(「M」)コード配列、融合タンパク質(「F」)コード配列、ヌクレオカプシドタンパク質(「N」)コード配列、リンタンパク質(「P」)コード配列、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質(「L」)コード配列からなる群から選択され、より好ましくは血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列および/またはマトリックスタンパク質(「M」)コード配列および/または融合タンパク質(「F」)コード配列である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 前記少なくとも1つの外因性抗原コード配列が、血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列であり、前記血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列は、配列番号4と少なくとも70%同一であり、好ましくは配列番号4、配列番号5からなる群から選択される核酸配列を含むか、または前記少なくとも1つの外因性抗原コード配列が、血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列であり、前記血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列は、配列番号6と少なくとも70%同一であり、好ましくは配列番号6に記載のアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項5に記載のウイルスベクター。
- 前記少なくとも1つの外因性抗原コード配列が、マトリックスタンパク質(「M」)コード配列であり、前記マトリックスタンパク質(「M」)コード配列は、配列番号7と少なくとも70%同一であり、好ましくは配列番号7、配列番号8からなる群から選択される核酸配列を含むか、または前記少なくとも1つの外因性抗原コード配列が、マトリックスタンパク質(「M」)コード配列であり、前記マトリックスタンパク質(「M」)コード配列は、配列番号9と少なくとも70%同一であり、好ましくは配列番号9に記載のアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項5に記載のウイルスベクター。
- 前記少なくとも1つの外因性抗原コード配列が、融合タンパク質(「F」)コード配列であり、前記融合タンパク質(「F」)コード配列は、配列番号10と少なくとも70%同一であり、好ましくは配列番号10、配列番号11からなる群から選択される核酸配列を含むか、または前記少なくとも1つの外因性抗原コード配列が、融合タンパク質(「F」)コード配列であり、前記融合タンパク質(「F」)コード配列は、配列番号12と少なくとも70%同一であり、好ましくは配列番号12に記載のアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項5に記載のウイルスベクター。
- 2つまたはそれよりも多くの外因性抗原コード配列、好ましくは、血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列およびマトリックスタンパク質(「M」)コード配列、または血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列および融合タンパク質(「F」)コード配列、またはマトリックスタンパク質(「M」)コード配列および融合タンパク質(「F」)コード配列、または血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列およびマトリックスタンパク質(「M」)コード配列および融合タンパク質(「F」)コード配列を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 前記ウイルスベクターが、同じであるが2つの異なる株に由来する2つの外因性抗原コード配列(つまりH+H、F+F、M+M、P+P、L+L、N+N)を含み、例えば、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)株、好ましくは「ゴードン株」または「TV25株」に由来する1つの外因性抗原コード配列と、ネコモルビリウイルス株、好ましくは「ラポン株」に由来する他方の1つの外因性抗原コード配列を含み、例えば、1つの株の血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列と、別の株の血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列とを含み;より好ましくは、前記「1つの株の血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列」の前記1つの株は、ネコパラミクソウイルス2型(FPaV−2)株、より好ましくは「ゴードン株」または「TV25菌株」であり、前記「別の株の血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列」の前記別の株は、ネコモルビリウイルス株、さらにより好ましくは「ラポン株」であり;最も好ましくは、前記「1つの株の血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列」の前記1つの株は、血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列であり、前記血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列は、配列番号4または19と少なくとも70%同一であり、好ましくは配列番号4、配列番号5、配列番号19からなる群から選択される核酸配列を含み;前記「別の株の血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列」の前記別の株は、血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列であり、前記血球凝集素タンパク質(「H」)コード配列は、配列番号31または94と少なくとも70%同一であり、好ましくは配列番号31、配列番号32、配列番号94からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 前記少なくとも1つの外因性抗原コード配列が、少なくとも1つの挿入遺伝子座に、好ましくは前記ウイルスベクターゲノムの非必須領域に挿入されており;または前記少なくとも1つの外因性抗原コード配列が、2つまたはそれよりも多くの挿入座に挿入されており;および/または前記少なくとも1つの挿入遺伝子座は、挿入遺伝子座C3であり;および/または前記ウイルスベクターが、前記挿入遺伝子座C3のフランキング配列、好ましくは配列番号45(C3フランキング領域左アーム)および配列番号46(C3フランキング領域右アーム)に記載の前記挿入遺伝子座C3のフランキング配列を含み;または前記少なくとも1つの挿入遺伝子座は、挿入遺伝子座C5であり;および/または前記ウイルスベクターが、前記挿入遺伝子座C5のフランキング配列、好ましくは配列番号47(C5フランキング領域左アーム)および配列番号48(C3フランキング領域右アーム)に記載の前記挿入遺伝子座C5のフランキング配列を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号95からなる群から選択される核酸配列と少なくとも70%同一であり、好ましくは配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号95からなる群から選択される核酸配列である核酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 前記ネコ科動物が、ネコ、好ましくはイエネコである、請求項1〜12のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のウイルスベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞。
- 免疫原性組成物またはワクチンを製造するための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のウイルスベクターまたは請求項14に記載の哺乳動物宿主細胞の使用。
- (a)請求項1〜13のいずれか1項に記載のウイルスベクターもしくは請求項14に記載の哺乳動物宿主細胞、および/または
(b)ウイルス、修飾生ウイルス、もしくはウイルス様粒子(VLP)などの、請求項1〜13のいずれか1項に記載のウイルスベクターによりコードされるポリペプチド、および
(c)任意に、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体もしくは賦形剤であって、好ましくは、前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適である、担体もしくは賦形剤
を含み、
好ましくは、感染性ウイルスなどのウイルスを含む、免疫原性組成物。 - (a)請求項1〜13のいずれか1項に記載のウイルスベクターもしくは請求項14に記載の哺乳動物宿主細胞、および/または
(b)ウイルス、修飾生ウイルス、もしくはウイルス様粒子(VLP)などの、請求項1〜13のいずれか1項に記載のウイルスベクターによりコードされるポリペプチド、および
(c)薬学的にまたは獣医学的に許容される担体もしくは賦形剤であって、好ましくは前記担体は、経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適である、担体もしくは賦形剤
を含み、
(d)任意に、アジュバントをさらに含む、ワクチンまたは医薬組成物。 - 少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスによる感染症に関連するかまたはそれにより引き起こされる1つまたは複数の臨床徴候の発生および/または重症度を低減するための免疫原性組成物またはワクチンを調製するための方法であって、
(a)請求項14に記載の哺乳動物宿主細胞を、請求項1〜13のいずれか1項に記載のウイルスベクターで感染させるステップ、
(b)前記感染細胞を好適な条件下で培養するステップ、
(c)感染細胞培養物を収集するステップ、
(d)任意に、ステップ(c)の収集した感染細胞培養物を精製するステップ、
(e)任意に、前記収集した感染細胞培養物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む方法。 - 少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスによる感染症により引き起こされる臨床徴候または疾患を低減または予防するための方法で使用するための、または少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスによる感染症を治療および/または予防するための方法で使用するための、請求項16に記載の免疫原性組成物または請求項17に記載のワクチンであって、好ましくは、前記ネコ科動物は、ネコ、より好ましくはイエネコであり、好ましくは、前記少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスは、少なくとも1つのネコパラミクソウイルスであり、好ましくは、前記少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスによる感染症により引き起こされる臨床徴候もしくは疾患、または前記少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスによる感染症は、ウイルス血症、発熱、環境へのウイルス排出、泌尿生殖器系の感染症、尿路系の感染症、腎臓疾患、慢性腎臓疾患(CKD)、腎尿細管および腎間質組織の炎症、および特発性尿細管間質性腎炎(TIN)からなる群から選択される、請求項16に記載の免疫原性組成物または請求項17に記載のワクチン。
- ネコ、より好ましくはイエネコ、などのネコ科動物を、前記ネコ科動物において少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスにより引き起こされる臨床疾患に対して免疫するための方法であって、請求項16に記載の免疫原性組成物または請求項17に記載のワクチンを前記ネコ科動物に投与するステップを含み、前記免疫原性組成物またはワクチンは、感染の臨床徴候を引き起こさないが、前記少なくとも1つのパラミクソウイルスの病原性形態に対して前記ネコ科動物を免疫する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは、前記少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスは、少なくとも1つのネコパラミクソウイルスであり、好ましくは、前記臨床疾患または前記感染の臨床徴候は、ウイルス血症、発熱、環境へのウイルス排出、泌尿生殖器系の感染症、尿路系の感染症、腎臓疾患、慢性腎臓疾患(CKD)、腎尿細管および腎間質組織の炎症、特発性尿細管間質性腎炎(TIN)からなる群から選択される方法。
- ネコ科動物における少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスに関連する疾患に対して、ネコ科動物、好ましくはネコ、より好ましくはイエネコにワクチン接種するための、および/またはネコ科動物において少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスに関連するかまたはそれにより引き起こされる1つまたは複数の臨床徴候の発生または重症度を低減するためのキットであって、
(a)前記ネコ科動物にワクチンを投与することが可能なディスペンサー、および
(b)請求項16に記載の免疫原性組成物または請求項17に記載のワクチン、および、
(c)任意に、使用説明書を含み、
好ましくは、前記少なくとも1つの病原性パラミクソウイルスは、少なくとも1つのネコパラミクソウイルスであり、好ましくは、前記疾患または前記臨床徴候は、ウイルス血症、発熱、環境へのウイルス排出、泌尿生殖器系の感染症、尿路系の感染症、腎臓疾患、慢性腎臓疾患(CKD)、腎尿細管および腎間質組織の炎症、特発性尿細管間質性腎炎(TIN)からなる群から選択される、キット。
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