JP2021511799A - 組織および細胞の多重分析のための連続染色 - Google Patents

Abstract

複数の検体検出剤を含む組成物および方法であって、各検体検出剤が検体検出剤と機能的に結合している不安定タグを含み、各不安定タグが互いの不安定タグと異なるシグナルを含み、各検体検出剤が異なる検体を標的とする、組成物および方法が提供される。【選択図】図１９

Description

関連出願
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１月３０日に出願された米国仮出願第６２／６２３，８６６号の利益を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年１月２９日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、１４９０４−４４６ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前を付けられ、１２ＫＢのサイズである。
技術分野
本開示は、試料中の多数の検体を連続染色し、分析するための検出試薬に関連する組成物、およびその組成物を使用する方法に関し、特に、試料中の多数の検体を検出するための不安定タグを含む試薬および方法に関する。

画像化によって細胞、組織および生体標本上の多数の検体をタグ化し、分析する必要性が存在する。現在利用可能な技術は、単一の試料中で標識化され、同定され得る検体の数を含む欠点を有する。
現在、光学顕微鏡に基づく技術は検体用の試料（細胞、組織および他の生物標本）をプローブするために一般に使用されている。通常、これらの試料は、スライドガラスなどの平面基板上に配置され、薬剤（蛍光標識化抗体など）によりプローブされる。しかしながら、試料上で区別することができる明確な蛍光標識はほんの少しであり、したがって各試料中で決定することができる独立した測定または検体の数が制限される。一般に使用される技術は、単一の試料から１〜４つのみの検体についての測定を提供することができ、いくつかの最近の報告は最大で１０までの検体を測定することを示唆している（Remark et al., Science Immunology, 2016; Carstens et al, Nature Comm., 2017）。
必要とされるものは、同じ試料上のより多くの検体を分析するための試薬および方法である。

一態様では、組成物が提供される。組成物は複数の検体検出剤を含み、各検体検出剤は検体検出剤と機能的に結合している不安定タグを含み、各不安定タグは互いの不安定タグと異なるシグナルを含み、各検体検出剤は異なる検体を標的とする。各不安定タグは、複数の検体検出剤が適用される試料を破壊せずに除去可能またはクエンチ可能であり、第２の複数の検体検出剤を用いて試料のさらなる分析を可能にする。
別の態様では、試料を分析する方法が提供される。その方法は、試料を複数の検体検出剤により標識化するステップであって、各検体検出剤は検体検出剤と機能的に結合している不安定タグを含み、各不安定タグは互いの不安定タグと異なるシグナルを含み、各検体検出剤は異なる検体を標的とする、ステップを含む。その方法はまた、試料上の複数の検体検出剤の各々によって生成されるシグナルを検出するステップと、各検体検出剤からシグナルを除去するステップと、ステップａ〜ｃを反復するステップとを含む。

本開示によるＳｅｑＰｒｏｂｅの実施形態を示す図である。 本開示によるＳｅｑＰｒｏｂｅの代替の実施形態を示す図である。 金属ベースの架橋剤を有するＳｅｑＰｒｏｂｅの実施形態を示す図である。 異なるタグ化剤を有する、本開示によるＳｅｑＳｔａｉｎプローブの実施形態を示す図である。 異なるタグ化剤を有する、本開示によるＳｅｑＳｔａｉｎプローブの実施形態を示す図である。 タグ化剤のための異なる付着手段を有するＳｅｑＳｔａｉｎプローブの実施形態を示す図である。 本開示による検体認識剤からタグ化剤を除去するための方法の実施形態を示す図である。 本開示によるタグ化剤を除去するための方法を示す図である。 ＳｅｑＰｒｏｂｅのシグナルを低減させるための方法の実施形態を示す図である。 本開示によるＳｅｑＳｔａｉｎプローブを用いた試料の連続染色のための方法の実施形態を示す図である。 本開示によるＳｅｑＳｔａｉｎプローブを用いてプローブされ得る試料の実施形態を示す図である。 抗体−ストレプトアビジン−オリゴ１コンジュゲートにより染色されたＲＡＷ細胞を示す図である。 オリゴ付着抗体を示す図である。 各ラウンドにおいて２つの抗体を有する２ラウンドのＳｅｑＳｔａｉｎ抗体を用いた同じ試料の染色、脱染および再染色を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎプローブについての分岐ＤＮＡ設計を示す図である。 電場の使用を示す図である。 ヒンジ型プローブ（ｈｉｎｇｅｄ ｐｒｏｂｅ）設計を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎプローブのために使用され得るオリゴヌクレオチド配列の例を示す図である。 抗体のマレイミド標識化の例を示す図である。 ３ラウンドのＳｅｑＳｔａｉｎを示す実施形態を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎワークフローの実施形態を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎ抗体による細胞のフローサイトメトリー染色を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎ試薬の実施形態を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎ試薬の実施形態を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎ抗体による細胞のフローサイトメトリー染色を示す図である。 ３ラウンドの染色を示す図である。 本開示によるＳｅｑＳｔａｉｎプローブの実施形態を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎワークフローの実施形態を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎワークフローの実施形態を示す図である。 本開示によるＳｅｑＳｔａｉｎプローブの実施形態を示す図である。 ＳｅｑＳｔａｉｎ抗体を調製するための配列を示す図である。

他に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法ならびにこれらの技術は当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般に達成されるように、または本明細書に記載されているように実施される。前述の技術および手順は一般的に、当該技術分野において周知の従来の方法に従って、ならびに本開示全体にわたって引用され、論じられる様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照のこと。本明細書に記載されている分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品および薬化学に関連して利用される命名法、ならびにこれらの実験手順および技術は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方、および送達、ならびに患者の治療のために使用される。一般的に、化学元素は、元素周期表、ＣＡＳバージョン、およびHandbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. 1994に従って識別される。さらに、有機化学の一般原理は、「Organic Chemistry」, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999、および「March's Advanced Organic Chemistry」, 5th Ed., Smith, M.B. and March, J., eds. John Wiley & Sons, New York: 2001に記載されており、それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。本開示に従って利用されているように、本開示において定義されている用語は、別段の指示がない限り、本明細書に定義されている意味を有すると理解されるべきである。

同じ試料上のより多くの検体を検出するための組成物および方法が開示される。この組成物は、同じ試料中の複数の検体を検出するために使用され得る、ＳｅｑＳｔａｉｎプローブとしても本明細書において称される連続プローブを含む。この方法は、連続プローブおよび試料の画像化を使用して、試料中の検体を検出するためのプロトコールを使用する。

連続プローブ組成物
試料中の検体を検出するために使用される連続プローブ（ＳｅｑＰｒｏｂｅ）組成物は、検体認識剤およびタグ化剤／標識を含むことができる。タグ化剤は、連続プローブ組成物が検体検出のために試料に添加されると、検体認識剤に作動可能に接続される。一部の実施形態では、タグ化剤は以下により詳細に記載されているように検体認識剤から除去可能である。異なる検体認識剤と組み合わせて、同じ種類または異なる種類のタグ化剤を有するさらなる連続プローブが、最初のタグ化剤が除去された後に、試料に添加されてもよい。一部の実施形態では、連続プローブ組成物は１つまたは複数の官能化リンカーを含んでもよい。一部の実施形態では、連続プローブ組成物は架橋剤を含んでもよい。

検体認識剤
検体認識剤は、検出される検体と相互作用するように結合することができる任意の有機または無機分子を含むことができる。検体認識剤の非限定的な例には、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素基質、遷移状態アナログ、補因子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、レクチン、小分子、リガンド、阻害剤、小分子および他の生体分子を含む薬物、ならびに検出される検体に結合することができる非生体分子が含まれる。「抗体」はその標準的な意味を有し、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ナノボディ、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ抗体、または抗体全体の修飾によって産生されるか、もしくは組換えＤＮＡ技術を使用して新たに合成されるかのいずれかで、抗原と特異的に結合することができる抗体の任意の他の部分を含む、当該技術分野において知られているような、完全長および抗体断片を指すことが意図される。本明細書に使用されている抗体は、例えば、本明細書に開示されているアッセイにおいて検出されるか（すなわち、生体試料中の検体）、または検出するために使用されるか（すなわち、結合剤またはプローブ）のいずれかのタンパク質に対して免疫反応性または免疫特異性であり、したがって、これらのタンパク質と特異的かつ選択的に結合する。本明細書に使用されている抗体は、本明細書に開示されている検体、結合剤、もしくはエピトープのいずれか、またはそれらの任意の組合せに特異的であり得る。ある特定の実施形態では、本開示の検体自体は抗体またはその断片であってもよい。この文脈において、「特異的に結合する」とは、検体認識剤が検体上の結合領域またはエピトープの認識に基づいて検体と結合することを意味する。検体認識剤は好ましくは、試料中の他の分子と結合するよりも高い結合親和性で検体を認識し、それと結合する。好ましくは、検体認識剤は検体を一意的に認識し、それと結合する。

タグ化剤／標識
組成物のタグ化剤／標識とは、検出可能な部分を指す。一部の実施形態では、タグ化剤／標識は、試験される試料への連続プローブの添加の前に検体認識剤に作動可能に付着され得る。一部の実施形態では、タグ化剤／標識は、以下に記載されているように、試料から容易に除去可能である。
適切なタグ化剤／標識は多種多様の可能な部分を包含する。非限定的な例として、タグ化剤／／標識には、限定されないが、ａ）有色または蛍光色素を含む、光学色素；ｂ）抗体または抗原であってもよい、免疫標識；ｃ）アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素；ｄ）放射性または重同位体であってもよい、同位体標識、ｅ）コロイド、磁性粒子などの粒子、ならびに蛍光標識化抗体および化学発光標識化抗体などのそれらの組合せが含まれる。

一部の実施形態では、タグ化剤には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、混合物もしくはペプチド（例えば、ＰＮＡ）などのオリゴヌクレオチド（一本鎖または二本鎖）、または別の種類のポリマーが含まれる。ポリマーは、同じまたは異なる鎖（１つより多い場合）上にあってもよい蛍光標識などの、１つまたは複数の標識を含有してもよい。一部の実施形態では、タグ化剤はまた、蛍光クエンチャーを含有してもよい。任意に、この剤は、エンドヌクレアーゼについての認識部位、転写因子（例えば、ＺＦＰ）などの、酵素的に放出可能な基を含有してもよい。ポリマー鎖はまた、化学的に不活性であってもよいか、またはＤＮＡポリメラーゼを介するなどして伸長可能のいずれかであってもよい。ポリマー鎖はまた、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）、デンドリマーまたはＤＮＡオリガミ（例えば、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを使用する）などの、直鎖または分岐であってもよい。

一部の実施形態では、タグ化剤は蛍光色素を含む。蛍光色素は、蛍光シグナルを提供し、本明細書に記載されている方法およびデバイスに従って使用され得る任意の実体を含んでもよい。典型的に、蛍光色素は、第１の波長における光を吸収し、吸収事象に応答して第２の波長における蛍光を放出する共鳴非局在系または芳香族環系を含む。多種多様のこのような蛍光色素分子は当該技術分野において公知である。例えば、蛍光色素は、様々なクラスの蛍光化合物のいずれかから選択することができ、非限定的な例には、キサンテン、ローダミン、フルオレセイン、シアニン、フタロシアニン、スクアライン、ボディピー色素、クマリン、オキサジンおよびカルボピロニンが含まれる。一部の実施形態では、例えば、タグ化剤が蛍光色素などのフルオロフォアを含有する場合、それらの蛍光は適切な光源によりそれらを励起し、特徴的な蛍光発光波長に感受性のある検出器によってそれらの蛍光をモニターすることによって検出される。一部の実施形態では、タグ化剤は蛍光色素標識化抗体を含む。

非限定的な例として、適切な蛍光レポーター色素には、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＪＯＥ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＨＥＸ）、ＶＩＣ、Ｃｙ３、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎが含まれ得る。以下に記載されているように含まれる場合、適切なクエンチャー分子には、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が含まれる。これらの色素は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．；およびＱｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆから市販されている。
蛍光タグは多くの異なる手段で検体認識剤に付着させることができる。例えば、蛍光標識化オリゴヌクレオチドによりタグ化される検体認識剤としての抗体に関して、蛍光オリゴヌクレオチドは、共有結合、非共有結合（ストレプトアビジンを介してなど）のいずれかを使用して、または金属配位結合を介して（クロロ白金ベースの架橋剤を介してなど）抗体に付着させることができる。一部の実施形態では、タグ化剤は、切断可能なフルオロフォア、切断可能なＤＮＡおよび／またはＵＬＳ標識化ＤＮＡなどの、フルオロフォアにより予め標識化されたＤＮＡを含んでもよい。

一部の実施形態では、タグ化剤は化学発光標識を含む。化学発光標識は、光シグナルを提供し、本明細書に記載されている方法およびデバイスに従って使用され得る任意の実体を含んでもよい。適切な標識には、化学発光による光子放出が誘導されるように化学発光基質と反応することができる酵素が含まれる。このような酵素は、酵素活性を介して他の分子において化学発光を誘導する。このような酵素には、ペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ホスファターゼまたは化学発光基質が利用可能である他のものが含まれ得る。一部の実施形態では、化学発光標識は、様々なクラスのルミノール標識、イソルミノール標識などのいずれかから選択することができる。一部の実施形態では、タグ化剤は化学発光標識化抗体を含む。

一部の実施形態では、タグ化剤は生物発光化合物を含むことができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる、生体系において見出される化学発光の一種である。生物発光化合物の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。適切な生物発光化合物には、限定されないが、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが含まれる。
「検出する」および「検出」はそれらの標準的な意味を有し、検体の存在または不在、測定および／または特徴付けを含む検出を包含することが意図される。

リンカー
一部の実施形態では、連続プローブ組成物は１つまたは複数のリンカーを含んでもよい。リンカーは、タグ化剤／標識を検体認識剤に接続するために使用され得る。リンカーは以下に記載されているように、タグ化剤に直接付着され得るか、またはさらなる部分を介して付着され得る。リンカーは、ビオチン、アジドおよび他のものなどの他の基により官能化して、他の分子に連結させることができる。リンカーはまた、化学的または酵素的に不安定または切断可能であってもよい。
架橋剤
一部の実施形態では、連続プローブ組成物は、共有結合または非共有結合のいずれかで、多数の分子を連結するための１つまたは複数の架橋剤を含んでもよい。架橋剤の非限定的な例には、アビジン、ストレプトアビジンおよびジスルフィドが含まれる。

一部の実施形態では、架橋剤は検体を検出するための基質に生体試料を固定するために使用され得る。基質は、試料の固定を容易にするために、二官能性化学架橋剤、例えば、ビス−ＮＨＳエステル、ＮＨＳ−エステルおよびマレイミド架橋剤（例えば、抗体／Ｆａｂを標識化するためのＳＭＣＣ）、ＵＶ架橋剤、マレイミドまたはＮＨＳ基に付着したＵＶ架橋剤、アジド基、末端の一方においてシュタウディンガー反応（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ’ｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を使用する架橋剤を使用してコーティングされてもよい。さらなる架橋剤もまた、使用されてもよい。
試料
試料は検出される検体を含有する。試料は、様々な成分、すなわち異なるタンパク質を含有する不均質であってもよい。試料は天然に存在する生体材料であってもよい。例えば、試料は、単一の細胞または複数の細胞、血液試料、組織試料、皮膚試料、尿試料、水試料または土壌試料であってもよい。一部の実施形態では、試料は、単一の細胞の内容物または複数の細胞の内容物を含む。一部の実施形態では、試料は、例えば生検からの１つの組織切片または複数の組織切片であってもよい。

一部の実施形態では、検体を検出する前に試料に対して処理が実施されてもよい。例えば、試料は、溶解工程、変性工程、加熱工程、精製工程、沈殿工程、免疫沈降工程、カラムクロマトグラフィー工程、遠心分離などに供されてもよい。一部の実施形態では、試料の分離および固定化は、天然基質、目的の検体、すなわちタンパク質上で実施されてもよいか、またはさらにそれらの内部疎水性基を露出させるために変性を受けてもよい。一部の実施形態では、検体の検出前に試料は固定されてもよい。一部の実施形態では、試料は、ＰＬＬ（ポリ＿ｌ＿リシン）または３−アミノピルトリエトキシシラン（Ａｍｉｎｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）（ＡＰＥＳ）などの薬剤によりプレコーティングされた基質表面を使用して基質に化学的に接着される。一部の態様では、ＡＰＥＳが好ましい。細胞内および核検体を可視化するために、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどの薬剤による透過処理が実施される。一部の実施形態では、試料を基質上に配置した後、基質に接着した試料は荷電分子を含有する溶液によりさらに処理され、その荷電分子は試料の近くに荷電環境を生じ、タグ化剤の非特異的結合を低減させるか、または阻止する。このような荷電分子の例には、合成オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ試料、断片処理済み（ｓｈｅａｒｅｄ）のサケ精子ＤＮＡ、断片処理済みの大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡなどが含まれる。一部の実施形態では、オリゴ／ＤＮＡ含有溶液が適用される。別の実施形態では、このような処理は試料に複数回適用される。

一部の実施形態では、試料は電場または電磁場の存在下で分析される。このような場は、試料とタグ化剤との間の結合の増加した特異性を提供する。このような場はまた、各ラウンドの分析の後にタグ化剤の改善された除去を提供する。例には、潅流チャンバの一端から他端への電場の印加、または１つもしくは複数の表面を電気伝導性にすることが含まれる。一実施形態では、イオン性分子が伝導性を改善するために試料にさらに添加される。例には、ヒスチジン、イミダゾールおよび他の薬剤が含まれる。一部の実施形態では、試料は、電気伝導性表面を生じさせるために、インジウムスズ酸化物でコーティングされたスライドガラスおよび／またはカバースリップ上に配置されてもよい。（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｏ．７０３１９２）（Ｓｕら、Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら、米国特許出願公開第２００３０１１９０２８号、米国特許第６０８３７６３号も参照のこと）。さらに、緩衝剤は、ヒスチジンおよびイミダゾールなどの、電気伝導性を改善する薬剤を含有してもよい。

検出され得る検体の非限定的な例には、天然に存在しないアミノ酸およびアミノ酸アナログを含有するタンパク質を含む、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチド、誘導体ならびにアナログが含まれる。検出され得る検体の他の例には、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ウイルス、代謝産物、補因子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、遷移状態アナログ、阻害剤、薬物、栄養素、電解質、ホルモン、成長因子および他の生体分子、ならびに非生体分子、ならびに上述の全ての断片および組合せが含まれる。ｐＨ、イオン、二価イオン濃度などもまた、測定され得る（Modi et al., Saha et al., Chakraborty et al.）。

検出方法
検体を検出することは、多数の染色が達成され得る限り、当該技術分野において公知の任意の方法によってでもよい。検体検出は、従来の方法および機器を使用してシグナルをモニターすることによって実施され得、非限定的な例には、光検出器、光検出器のアレイ、電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイなどが含まれる。例えば、シグナルは、リアルタイムで連続してモニターされ得、使用者が、検体が試料中に存在するかどうか、および任意に、検体の量または活性を迅速に決定することを可能にする。一部の実施形態では、二次スーパークローン（ｓｕｐｅｒｃｌｏｎａｌ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）が、単一の検体（２つ以上のＤＮＡタグ化モノクローナル二次ｍＡｂまたは二次Ｆａｂの混合物）を検出するために使用されてもよい。一部の実施形態では、赤外色素が、同時に読み取ることができるｍＡｂの数を増加させるためにさらなる検出機構として使用されてもよい。一部の実施形態では、化学センシング法と多重画像化との組合せがデータセットを取得するために一緒に使用されてもよい（Kwak et al., Baker et al.を参照のこと）。一部の実施形態では、連続組織切片の１つより多い切片が、データを得、多重結果についての全体的なデータ品質を改善するために使用されてもよい。ある特定の実施形態では、単一の組織切片は高品質データレポートを提供するのに十分ではない場合があり、それ故、連続切片が変動性を低減させるために使用されてもよい。

本明細書において「多重化」または「多重アッセイ」とは、多数の標的、例えば、多数の検体の存在および／または量が、１つより多いタグ化剤／標識を使用することによって同時にアッセイされ得る、アッセイまたは他の分析方法を指すことがあり、それらの各々は、少なくとも１つの異なる検出特性、例えば、蛍光特性（例えば、励起波長、発光波長、発光強度、ＦＷＨＭ（半値全幅ピーク高さ）または蛍光寿命）または特有の核酸もしくはタンパク質配列特性を有する。複数の実施形態では、２つ以上の異なる検出剤を使用して、第１の検出剤、例えば、１°抗体は検出剤−検体複合体を形成するために１つまたは複数の検体と結合または相互作用することができ、第２の検出剤、例えば、２°抗体は検出剤−検体複合体と結合または相互作用するために使用され得る。

一部の実施形態では、多数の検出剤が色多重化を提供するために多数の基質と共に使用されてもよい。例えば、使用される異なる化学発光基質は、それらが異なる色の光子を放出するように選択される。回折格子、プリズム、一連の色フィルターまたは他の手段を使用することによって達成されるような、異なる色の選択的検出は、どの色光子が流路に沿った任意の位置において放出されているかの決定を可能にし、したがってどの検出剤が各々の放出位置に存在するかの決定を可能にする。一部の実施形態では、異なる化学発光試薬が連続的に供給され得、異なる結合検出剤を連続的に検出することを可能にする。

一部の実施形態では、第１のセットのタグ化剤が検出され、その後、除去またはブロックされてもよく、１つまたは複数のさらなるセットのタグ化剤が検出されてもよい。一部の実施形態では、第１のタグ化剤／標識のセットおよびさらなるセットのタグ化剤の除去は、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよび制限酵素などの酵素を使用して達成され得る。

タグ化剤を除去するための薬剤の非限定的な例には、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、マングビーンエキソヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、ミクロコッカスヌクレアーゼ（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１、ホスホジエステラーゼ、ＤＮａｓｅ Ｉ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ、ＦＥＮ１エンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＶ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩなど）、ＤＮａｓｅ ＩＩ、ベンゾナーゼ、ヌクレアーゼＰ１、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＨ、リボヌクレアーゼＴ１が含まれる。
金属イオン依存性酵素は、ＥＤＴＡなどのキレート剤を使用することによって不活性化され得る。他のものは、熱またはｐＨ変化によって不活性化され得る。

一部の実施形態では、メチル化依存性制限酵素はメチル化ＤＮＡのみを切断する。タグ化剤を除去するためのさらなる薬剤には、リボザイム、ＤＮＡザイム、ＤＮＡ修復酵素、ＲＮＡ加水分解試薬、例えば金属イオンおよび塩基性ｐＨ緩衝剤が含まれる。グリコール結合を酸化し、分解するためのパーヨージエート（ｐｅｒｉｏｄｉａｔｅ）もまた、一部の実施形態において使用されてもよい。ジスルフィド結合を還元し、分解するためのＴＣＥＰ、ベータ−メルカプトエタノールもまた、使用されてもよい。

ヌクレアーゼなどの酵素による処理後、新たな連続プローブと再インキュベートする前に、いずれかの残存する酵素をクエンチするか、またはＥＤＴＡにより潅流して酵素を不活性化するために、試料を圧倒的な量の酵素基質により短時間処理することができる。例えば、ＤＮａｓｅが標識化組織から蛍光タグを除去するために使用される場合、洗浄後、いずれかの残存する酵素をクエンチし、ブロックするために試料を十分な量のサケ精子ＤＮＡを含有する溶液により処理することができる。ＴＥＶプロテアーゼなどのペプチダーゼおよびプロテアーゼの場合、酵素は、約４０℃に加熱することによって、またはヨードアセトアミドなどを使用することによってクエンチすることができる。一部の酵素は、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を使用してブロックすることができる。
別の方法論は、サイクル間で異なる種類のリンカー、例えば、１つのサイクルではＤＮＡリンカー、および別のサイクルではＲＮＡリンカーを使用することを含む。あるいはまたはさらに、１つのサイクルにおいて特定の制限酵素認識配列を含有する二本鎖ＤＮＡ、および次のサイクルにおいて異なる制限酵素認識配列を含有するＤＮＡが使用されてもよい。

プローブされる標本（例えば、細胞および組織切片）は、光透過性表面（例えば、ガラスカバースリップまたはスライド）上に直接的に、またはそれらの試料が表面により安定に結合することを可能にすることができるさらなる化学架橋剤の存在下のいずれかで配置されてもよい。方法は組織試料を配置する前にプレコーティングされた表面を使用することを含む。プレコーティングは、ポリ−ｌ−リシン、二官能性化学架橋剤、例えば、ビス−ＮＨＳエステル、ＮＨＳ−エステルおよびマレイミドリンカー、ＵＶ架橋剤、マレイミドまたはＮＨＳ基に付着したＵＶ架橋剤、アジド基、末端の一方においてシュタウディンガー反応を使用する架橋剤などの薬剤によりなされ得る。一部の実施形態では、試料は、ガラスカバースリップまたはスライド上に配置されてもよく、流体交換を可能にするチャンバ内に配置されてもよい。例には、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製のＲＣ−２１ＢＲＷおよびＲＣ−２１ＢＲなどの潅流チャンバ内のガラスカバースリップ上に配置された、ホルマリン固定組織切片などの組織試料が含まれる。

連続プローブを使用する試料染色の方法の非限定的な例には、ガラスカバースリップ上および潅流チャンバ内に組織および細胞を配置すること、ならびに多くの蛍光標識化抗体のうちの１つを添加することが含まれる。通常、異なるフルオロフォアによりタグ化された３つの異なる抗体が、タグ化剤のセットとして使用され、続いて試料を画像化することができる。この方法は、結合した抗体からフルオロフォアを除去すること、ならびに必要であれば、さらなる抗体によりプローブするために試料を再ブロックすることおよび再調製することを含む。任意に、この方法は、染色および画像化の次のセットのためのバックグラウンドとして使用される新たな画像を獲得することを含む。標識化、画像化、ブロック、再標識化および再画像化のステップは、必要に応じて何度でも反復されてもよい。一部の実施形態では、少なくとも１５個の異なる検体が同じ試料上で検出されてもよい。一部の実施形態では、間の全ての整数を含む、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または１００を超える異なる検体が、同じ試料上で検出されてもよい。

ＳｅｑＰｒｏｂｅ（連続プローブ）の概略図を図１Ａおよび１Ｂに示す。連続プローブは、検体認識剤と、１つまたは複数の除去可能なタグ、例えば蛍光タグとの組合せを含む。リンカーは、蛍光タグを検体認識剤に付着させるために使用される。リンカーは、蛍光タグに直接付着させることができるか、またはさらなる部分を介して付着させることができる。リンカーは、ビオチンなどの他の基により官能化することができる。リンカーにおける遊離ビオチンの場合、ストレプトアビジンなどのビオチン結合剤を使用して、蛍光タグをその剤に付着させることができる。さらに、リンカーは切断可能であってもよく、例えば、リンカーは、ジスルフィド結合、または過ヨウ素酸塩を使用して切断され得るグリコール、または光切断可能な基（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ ｇｒｏｕｐ）、またはＴＥＶプロテアーゼなどのペプチダーゼを使用して選択的に切断され得るペプチド配列を含有してもよい。蛍光標識化された一本鎖または二本鎖ＤＮＡなどの蛍光標識化オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して検体認識剤に付着させることができる。ストレプトアビジン付着剤の場合、オリゴヌクレオチドは、それを検体認識剤に連結させるために、一端においてビオチンにより官能化することができる。したがって、１つまたは複数の蛍光基を、一度に単一の検体認識剤に付着させることができる。付着した蛍光タグは、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ酵素などの切断剤による処理によって、このような連続プローブにおいて除去することができる。この例では、一方または両方の鎖に１つまたは複数の蛍光色素（ｆｌｕｒｏｃｈｒｏｍｅ）を有する二本鎖ＤＮＡが示されている。図１Ａはまた、制限酵素認識配列（Ｒ）を含有する領域を示す。ヌクレアーゼまたは制限酵素のいずれかによる処理は蛍光タグを放出し、その蛍光タグはプローブされる標本上に固定化された連続プローブから洗い流され得る。付着したオリゴヌクレオチドはまた、ローリングサークル増幅またはタンデム反復増幅などにおいて使用することができる。さらに、オリゴヌクレオチド上の蛍光タグは、ジスルフィドまたはグリコールなどの切断可能な化学リンカーを介して付着させることができる。図２６は、いくつかの異なるＳｅｑＳｔａｉｎプローブを示し、各々は別個の検体認識剤および独立した制限部位を有する。図２８は、別個の検体認識剤および別個のタグ化剤／標識を有するＳｅｑＳｔａｉｎプローブを示す。

ＳｅｑＰｒｏｂｅの概略図を図２に示す。示されるように、検体認識剤は、白金試薬（シスプラチンなどのジクロロＰｔ（ＩＩ）試薬など）を使用することなどの、非共有金属配位化学を介して蛍光タグに連結される。この例では、各鎖がフルオロフォアにより標識化された二本鎖ＤＮＡが示されている。図２はまた、制限酵素認識配列を含有する領域を示す。ヌクレアーゼまたは制限酵素のいずれかによる処理は蛍光タグを放出し、その蛍光タグはプローブされる標本上に固定化されたＳｅｑＰｒｏｂｅから洗い流され得る。

蛍光タグの様々な形態を有するさらなるＳｅｑＰｒｏｂｅ設計の概略図を図３Ａ〜３Ｄに示す。図３Ａ。二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖に（例えば、塩基対合を介して）非共有結合により付着している蛍光標識化オリゴヌクレオチドを示す。図３Ｂ。蛍光標識化オリゴヌクレオチドは、分岐ＤＮＡ（ｂ−ＤＮＡ）系にアセンブルされ、それによって多くのフルオロフォアを各リンカーに付着させることができる。各オリゴヌクレオチドは、その上に１つまたは複数のフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）を有することができる。図３Ｃ。蛍光標識化した環状またはコンカテマーオリゴヌクレオチドを使用する。図３Ｄ。オリゴヌクレオチドを使用して、蛍光標識化したペプチド、タンパク質または他のポリマーを分子の残りに付着させる。

蛍光タグの様々な形態を有するさらなるＳｅｑＰｒｏｂｅ設計の概略図を図４Ａ〜４Ｄに示す。図４Ａは、蛍光標識化した一本鎖オリゴヌクレオチドを蛍光タグとして示す。一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヘアピンループなどのさらなる二次および三次折り畳み構造を採ることができる。これはまた、環状化され、ローリングサークル増幅またはタンデムリピート増幅などにおいて使用することができる。図４Ｂ。蛍光標識化したペプチド、小分子、タンパク質またはマイナーもしくはメジャーＤＮＡグルーブバインダー（ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）を使用して、分子の残りに連結された非標識化またはクエンチャー標識化オリゴヌクレオチドに蛍光タグを付与する。図４Ｃ。１つまたは複数の蛍光標識化オリゴヌクレオチドが、リンカーとしてのさらなるオリゴヌクレオチド（一本鎖または二本鎖）を介して抗原認識剤に付着している。図４Ｄ。オリゴヌクレオチドが、介在するビオチン結合を介して、ストレプトアビジンなどの１つまたは複数の蛍光標識化タンパク質に結合するために使用される。

蛍光タグを付着させる様々な手段による、さらなるＳｅｑＰｒｏｂｅ設計の概略図を図５Ａおよび５Ｂに示す。図５Ａ。蛍光タグが、ＴＣＥＰなどの還元剤を使用して切断することができるジスルフィドリンカーを介して連結している。図５Ｂ。タグが、過ヨウ素酸塩を使用して切断することができる、グリコールなどの他の切断可能なリンカーを介して、または光切断可能な基を介して、またはＴＥＶプロテアーゼなどのペプチダーゼを使用して選択的に切断することができるペプチドを介して連結している。さらに、リンカーはフルオロフォアまたは西洋ワサビペルオキシダーゼにより修飾することができる。
ＳｅｑＳｔａｉｎプローブから蛍光標識を除去するための方法の概略図を図６に示す。
図７Ａ〜７Ｄは、オリゴヌクレオチドを切断しやすくするオリゴヌクレオチドにおける様々な修飾されたホスホ結合を示す。ｐＨ変化に敏感なホスホロアミダート結合を示しており、６．０未満のｐＨはこれらの結合を不安定にする。この結合は蛍光タグ化オリゴヌクレオチドを切断するために使用することができる。

ＳｅｑＳｔａｉｎプローブにおける蛍光シグナルを低減させるための別の方法論の概略的な説明を図８に示す。ここで、プライマー伸長を介するか、またはオリゴヌクレオチドライゲーションを介するいずれかのクエンチャー分子の付加は、新たな蛍光シグナルが試料染色の新たなサイクルにおいて得られ得るように、ＳｅｑＳｔａｉｎプローブからの蛍光のクエンチングをもたらし得る。

検体検出剤に連結している切断可能なフルオロフォアを使用するＳｅｑＳｔａｉｎ方法論の概略的な説明を図９に示す。一例として、ガラスカバースリップ上の組織切片を、画像化顕微鏡の上部のフローチャンバ内に配置する。次に、各々が特有のフルオロフォアによりタグ化されている、二本鎖ＤＮＡを介して蛍光タグに連結している抗体のセットをチャンバ内に導入し、一定期間インキュベートする。続いて、チャンバを洗浄し、画像化して、各抗体の位置を記録する。次に、抗体上のフルオロフォアをＤＮａｓｅによる処理によって除去する。続いてチャンバを洗浄し、必要であれば、組織の新たな開始画像を獲得するために再画像化する。続いて、新たなサイクルの抗体インキュベーションを開始することができる。この連続的な染色、画像化および蛍光標識除去ステップは、生物標本の多重分析を実施するために必要に応じて何度でも実施することができる。
画像化平面上の試料の配置の概略的な説明を図１０に示す。表面は任意の形状および任意のサイズ、例えば、円形または正方形または矩形であってもよい。さらに、１つまたは複数の試料がＳｅｑＳｔａｉｎプロトコールにおいて処理され得るように１つまたは複数の試料を単一面上に配置することができる。

実施例：培養したＲＡＷ細胞の連続染色：
２５ｍｍの丸いガラスカバースリップをポリ−Ｌ−リシンによりコーティングし、カバースリップを組織培養皿に入れ、３７℃のインキュベーターにおいて一晩、カバースリップ上のネズミＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を培養した。続いて、細胞単層をＰＢＳにより洗浄し、細胞を４％パラホルムアルデヒドの溶液を使用して室温にて２０分間固定した。細胞をＰＢＳにより２回洗浄し、室温にて１５分間、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにより透過処理した。続いて、細胞をＰＢＳにより２回洗浄し、カバーガラスを画像化アッセイのための潅流チャンバにマウントした。チャンバを、２つのガラスカバースリップの間にゴムガスケットを配置することによって作製した。チャンバを潅流のための入口および出口チューブに取り付けた。続いて、細胞を、ＰＢＳ中の４％ＢＳＡおよび１００ｕｇ／ｍｌの断片処理済みのサケ精子ＤＮＡを含有するブロッキング緩衝剤によりチャンバを潅流することによってブロックし、室温にて１時間インキュベートした。別に、ビオチン化抗ＣＤ１１ｂ抗体（２０ｎＭ）を、精製したストレプトアビジンおよびビオチン化二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチド（オリゴ１）と１：１：３のモル比で室温にて混合することによって標識化混合物を調製した。オリゴ１は、末端フルオロフォアＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８（ＡＦ４８８）および操作されたＥｃｏＲＶ制限部位を含有する。ブロック後、チャンバを抗ＣＤ１１ｂ抗体−オリゴＡＦ４８８複合体（ＣＤ１１ｂ−オリゴＡＦ４８８）での潅流によって染色し、室温にて３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−Ｔにより連続して５分間洗浄し、続いてＣＤ１１ｂ染色のために画像化した（図１１Ａ）。結果は、これらの細胞上のＣＤ１１ｂの強い蛍光染色を示す。続いて、本発明者らは、試料を制限エンドヌクレアーゼにより処理することによって抗体連結フルオロフォアを除去した。チャンバを、ＥｃｏＲＶ制限酵素を含有するＰＢＳにより潅流して、ＥｃｏＲＶ制限部位においてオリゴを切断した。本発明者らは、画像化によって局在化した蛍光シグナルの消失をモニターした。ここで、制限消化後５分毎に細胞を画像化した。驚くべきことに、この濃度自体での酵素単独の潅流は、５分毎の画像化によって可視化されたようにシグナルの漸進的な除去をもたらした（図１１Ｂ〜１１Ｆ）。より驚くべきことに、潅流および洗浄は蛍光シグナルの完全な除去をもたらした（図１１Ｇ）。続いて、０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有する溶液によりチャンバを潅流することによって制限酵素を不活性化した。細胞が再染色され得るかどうかを決定するために、本発明者らは、細胞を抗ＣＤ１１ｂ抗体−オリゴＡＦ４８８複合体（ＣＤ１１ｂ−オリゴＡＦ４８８）により再潅流し、室温にて３０分間インキュベートした。さらにより驚くべきことに、画像化の結果は、試薬が細胞を再染色することができることを示し（図１１Ｈ）、潅流プロトコールおよびアッセイが細胞の喪失をもたらさないことを示唆する。このプロセスは、他の検体に対する抗体を用いて複数回反復することができる。

抗体−オリゴコンジュゲートの設計の例：図１２は、精製したストレプトアビジンを使用して、ビオチン化オリゴ１ ＡＦ４８８およびオリゴ２ ＡＦ５９４にそれぞれコンジュゲートしたビオチン化抗ＣＤ１１ｂおよび抗ＣＤ４５抗体の図を示す。オリゴ１はＥｃｏＲＶ制限部位を含有し、一方、オリゴ２はＳｍａＩ制限部位を含有する。

実施例：マウス脾細胞の連続多重染色：脾細胞の単一細胞懸濁液を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの新たに単離された脾臓から調製した。ＢＤファームライス（ＢＤ ｐｈａｒｍｌｙｓｅ）緩衝系を使用して赤血球を溶解し、脾細胞を完全培地により２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を計数し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定した。固定した細胞を、６ウェル組織培養プレート中のＡＰＥＳコーティングガラスカバースリップ上でウェル当たり２×１０⁶細胞にて播種し、室温にて３０分間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳにより２回洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを使用して１５分間透過処理した。細胞をＰＢＳにより２回洗浄し、潅流チャンバ上にマウントした。チャンバを、４％ＢＳＡおよび１００ｕｇ／ｍｌの断片処理済みのサケ精子ＤＮＡを含有するブロッキング緩衝剤により潅流し、１時間インキュベートした。別に、ビオチン化抗ＣＤ１１ｂ抗体を、精製したストレプトアビジンおよびビオチン化ｄｓＤＮＡオリゴ１と１：１：３のモル比で２０ｎＭ濃度にてコンジュゲートした。別の分離させた反応において、ビオチン化抗ＣＤ４５抗体を、精製したストレプトアビジンおよびビオチン化ｄｓＤＮＡオリゴ２と１：１：３のモル比で２０ｎＭ濃度にてコンジュゲートした。オリゴ１は操作されたＥｃｏＲＶ制限部位および末端Ａｌｅｘｆｌｏｕｒ４８８を含有し、一方、オリゴ２は、操作されたＳｍａＩ制限部位および末端Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ５９４を含有する。ブロック反応後、ガラスカバースリップ上の脾細胞を含有するチャンバを、オリゴとコンジュゲートした抗ＣＤ１１ｂおよび抗ＣＤ４５抗体の両方を含有する溶液により潅流した。脾細胞をＣＤ１１ｂおよびＣＤ４５染色について画像化し（図１３Ａ）、良好な染色を示した。画像化後、細胞を、ＥｃｏＲＶおよびＳｍａＩ酵素の両方を含有する二重消化混合物により潅流し、細胞を５分毎に画像化した。驚くべきことに、制限酵素による２０分の消化後、局在化した蛍光シグナルは有意に低減し、洗浄はこのシグナルを完全に除去した（図１３Ｂ）。次に、制限酵素を、０．５Ｍ ＥＤＴＡを潅流することによって不活性化し、続いて１０分間インキュベートした。次に、本発明者らは、これらの細胞を新たなセットの抗体により染色した。このラウンドの染色のために、ビオチン化抗ＣＤ３およびビオチン化抗ＣＤ４抗体を、精製したストレプトアビジンならびにビオチン化オリゴ１ ＡＦ４８８およびビオチン化オリゴ２ ＡＦ５９４をそれぞれ使用して上記のように調製した。ガラスカバースリップ上の脾細胞を含有するチャンバを、両方の抗体を含有する溶液により潅流し、細胞をＣＤ３およびＣＤ４染色について画像化した。結果は両方について強い染色を示す（図１３Ｃ）。画像化後、細胞を、ＥｃｏＲＶおよびＳｍａＩ酵素の両方を含有する二重消化混合物により潅流した。細胞を５分毎に画像化した。再び、驚くべきことに、エンドヌクレアーゼ消化および洗浄後、両方のシグナルは減少した（図１３Ｄ）。ここでの結果は、この新規技術が、これらの試薬からの試料に対するあらゆる喪失または損傷なしに固定試料からの蛍光シグナルの連続染色および除去を可能にすることを明確に示す。エンドヌクレアーゼ処理が固定試料に損傷を与えなかったことを見出したことは驚くべきことであった。
分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）の設計および配列の例（図１４）。

実施例：電場の使用。試料を多くの手段において伝導性表面に適用することができる。表面全体は伝導性材料から作製することができるか（図１５Ａ）、またはその一部のみが伝導性であってもよい（図１５Ｂ）。あるいは、試料は非伝導性表面上にあってもよく、チャンバの他の部分は存在する伝導性材料を有してもよい（図１５Ｃ）。例示的なスケッチは、電流の存在下でどのように試料を調べることができるかを示す（図１５Ｄ）。一実施形態では、チャンバはまた、加熱器または冷却器などの温度制御モジュールを含有してもよい。

実施例：多数の蛍光標識化タグまたはプローブを、抗体などの検体認識剤に連結させるために使用することができるヒンジ型プローブ設計の概略図（図１６）。一実施形態では、このような切断可能なプローブは、任意の制限部位配列を含有する、多数の連結オリゴヌクレオチドを使用して調製する。多数のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のヒンジプローブを使用して一緒に連結させることができる。オリゴヌクレオチド配列の例を図１７に示す。

実施例：ＳｅｑＳｔａｉｎ法のための抗体調製。抗体を、マレイミド−スルフヒドリル化学を使用してｍａｂリンカーＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。非限定的な例として、試験した抗体は、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１１ｂ、抗Ｇｏｌｇｉｎ９７、抗Ｋｉ６７であった。これらの例において使用した抗体のマレイミド標識化については、マレイミド修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物を、ジスルフィド還元剤としてのＴＣＥＰの存在下で抗体（またはＦａｂ）と共インキュベートする。これにより、（標識化または非標識化）オリゴヌクレオチドとの抗体の効率的な架橋が生じる。未反応の試薬をカラム濾過によって除去する。あるいは、抗体−ｄｎａコンジュゲートの作製は連続反応によってでもよく、ここで抗体を最初にＴＣＥＰにより還元し、濾過（ｆｉｔｌｒａｔｉｏｎ）カラムを使用して精製し、次いでマレイミド修飾オリゴヌクレオチドと反応させる。
コンジュゲーションを、変性４〜１２％ＳＤＳゲル上で試料を泳動することによって確認した。非コンジュゲート抗体に対するｍａｂリンカーの分子量に対応するコンジュゲート抗体のゲルのシフトはコンジュゲーションを示した。コンジュゲーション後、抗体を、ドッキングオリゴ（ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｌｉｇｏ）および蛍光色素オリゴを含有する複合体とアニーリングした。ドッキングオリゴおよび蛍光色素（ｆｌｏｕｒｏｃｈｒｏｍｅ）オリゴを１：５のモル比にてプレアニーリングした。アニーリングの成功は、試料を４％アガロースゲル上で泳動し、４０Ｖにて３時間泳動するゲルシフトアッセイによって確認した。

ＳｅｑＳｔａｉｎの実施例：ＲＡＷ細胞を抗ＣＤ４５抗体により染色した。抗ＣＤ４５ Ａｂを、マレイミド−スルフヒドリル化学を使用して、制限部位および蛍光色素ＡＦ４８８を含有するＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。Ｒａｗ細胞をこの抗体（抗ＣＤ４５ ＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂ）により染色し、制限酵素ＥｃｏＲＶまたはＤＮＡｓｅＩのいずれかを使用して脱染した。対照として、抗体を有さないＤＮＡオリゴ複合体を使用してＲＡＷ細胞を染色した。抗ＣＤ４５ ＳｅｑＳｔａｉｎ抗体によるＲＡＷ細胞の染色の成功を蛍光画像化によって検出し、シグナルの除去をまた、ＥｃｏＲＶおよびＤＮＡｓｅＩ消化の両方によって達成した。脱染後および洗浄後の画像は両方とも、シグナルの除去を示した。

抗ＣＤ４５および抗ＣＤ１１ ＳｅｑＳｔａｉｎｉｎｇのフローサイトメトリー検証を図２１Ａ〜２１Ｄに示す。抗ＣＤ４５および抗ＣＤ１１ｂ Ａｂを、マレイミド−スルフヒドリル化学を使用して、制限部位ならびに蛍光色素ＡＦ４８８およびＡＦ５９４をそれぞれ含有するＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。ＲＡＷ細胞を、抗ＣＤ４５ ＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂを用いたフローによって染色した。対照に関して、抗体を有さないＤＮＡオリゴ複合体を使用した（図２１Ａ）。染色のヒストグラムを図２１Ｂに示す。ＡＦ５９４による抗ＣＤ１１ｂ ＳｅｑＳｔａｉｎＡｂについての同様の染色を図２１Ｃおよび図２１Ｄに示す。

ＳｅｑＳｔａｉｎ法を使用して、ＲＡＷ細胞を２ラウンドの抗体により染色した。抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１１ｂ、抗アセチル化チューブリンおよび抗ビンキュリン抗体を、マレイミド−スルフヒドリル化学を使用して、制限部位および蛍光色素ＡＦ４８８またはＡＦ５９４を含有するＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。ＲＡＷ細胞を、第１のラウンドにおいてＡＦ４８８を有する抗ＣＤ４５ ＳｅｑＳｔａｉｎ ＡｂおよびＡＦ５９４を有する抗ＣＤ１１ｂ抗体により染色し、陽性染色を蛍光画像化により視認した。ＤＮＡｓｅＩを使用した脱染は染色を除去するのに成功し、脱染後および洗浄後における染色の欠如を観察した。ラウンド２において、同じ試料を、ＡＦ４８８を有する抗アセチル化チューブリンＳｅｑＳｔａｉｎ ＡｂおよびＡＦ５９４を有する抗ビンキュリンＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂにより染色し、陽性染色を蛍光画像化により視認した。ＤＮＡｓｅＩを使用した脱染は染色を除去するのに成功し、脱染後および洗浄後における染色の欠如を第２ラウンドについて観察した。
ＳｅｑＳｔａｉｎ法と従来法との比較。抗アセチル化チューブリンおよび抗Ｋｉ−６７抗体を、マレイミド−スルフヒドリル化学を使用して、制限部位および蛍光色素ＡＦ４８８を含有するＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。ＨｅＬａ細胞を、ＳｅｑＳｔａｉｎ抗体またはアセチル化チューブリンもしくは核Ｋｉ−６７についての従来法のいずれかにより染色し、同様の蛍光染色を両方の方法で観察した。

ＤＮＡ溶液のみによるブロックはバックグラウンドを低減させるのに役立つ。ＡＦ４８８を有する抗アセチル化チューブリンＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂを使用して、ＲＡＷ細胞を染色した。染色の前に、ブロックを、１％ＢＳＡおよび３ｎｍｏｌ／ｍｌのブロッキングＤＮＡ混合物を含有する１段階で行うか、またはブロックを、４５分間、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、続いて４５分間、ＤＮＡ混合物のみを含有するブロッキング溶液（０．５Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳ中の１００ｕｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡおよび３ｎａｎｏｍｏｌ／ｍｌのブロッキングオリゴヌクレオチド）を用いて２段階で行い、その後、染色した。オリゴヌクレオチドのみを含有するブロッキング溶液は、２段階法において、オリゴヌクレオチドとＢＳＡなどの他の薬剤との混合物を用いたブロックより良好である。
ＳｅｑＳｔａｉｎに対する抗体の調製は抗体機能を妨げない。蛍光色素ＡＦ４８８を有さない抗ＣＤ４５ ＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂを使用して、抗ラット二次ＡＦ４８８抗体を使用した２段階間接免疫蛍光法においてＲＡＷ細胞を染色した。非修飾抗体と比較した場合、コンジュゲーションのための抗体修飾に起因する染色の喪失は観察されなかった。

ＤＢＣＯ−アジドクリックケミストリー（Ａｚｉｄｅ Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）ＳｅｑＳｔａｉｎ抗体調製。抗ラットまたは抗マウスＦａｂを、図２２Ａに例示されるように、ＤＢＣＯ−アジドクリックケミストリーを使用して、ｍａｂリンカーＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。コンジュゲーションを、変性４〜１２％ＳＤＳゲル上で試料を泳動することによって確認した。ｍａｂリンカーの分子量に対応するゲルのシフトは、成功したコンジュゲーションを示した。
ＤＢＣＯ−アジドクリックケミストリーＳｅｑＳｔａｉｎ法と従来法との比較。抗ＣＤ１１ｂ抗体を、ＤＢＣＯ−アジドクリックケミストリーを使用して、制限部位および蛍光色素ＡＦ４８８を含有するＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。ＲＡＷ細胞を、ＳｅｑＳｔａｉｎ抗体またはＣＤ１１ｂについての従来法のいずれかにより染色した。対照として、抗体を有さないＤＮＡオリゴ複合体を使用してＲＡＷ細胞を染色した。同様の蛍光染色を両方の方法で観察した。

ＣＤ１１ｂを安定に発現するＫ５６２細胞を抗ＣＤ１１ｂ ＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂにより染色し、脱染した。抗ＣＤ１１ｂ Ａｂを、ＤＢＣＯ−アジドクリックケミストリーを使用して、制限部位および蛍光色素ＡＦ４８８を含有するＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。ＣＤ１１ｂを発現するＫ５６２細胞を抗ＣＤ１１ｂ ＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂにより染色し、陽性染色を蛍光画像化により視認した。細胞を制限酵素ＥｃｏＲＶを使用して脱染した。対照として、親Ｋ５６２細胞を抗ＣＤ１１ｂ ＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂにより染色した。

活性化を伴うまたは伴わないＣＤ１１ｂを発現するＫ５６２細胞のフロー染色（ｆｌｏｗ ｓｔａｉｎｉｎｇ）。抗マウスＦａｂを、ＤＢＣＯ−アジドクリックケミストリーを使用して、制限部位および蛍光色素ＡＦ６４７を含有するＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。４４Ａ、ｍａｂ２４などのＣＤ１１ｂに対する抗体の異なるクローンを使用した。ＭｎＣｌ２によるインテグリン活性化により、ＣＤ１１ｂは抗ＣＤ１１ｂ（ｍａｂ２４）抗体に対するエピトープを発現する。ＣＤ１１ｂを発現するＫ５６２細胞は、活性化すると、１：２のモル比でＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂに結合した抗ＣＤ１１ｂ（ｍａｂ２４）抗体を優先的に染色する（図２４Ａ、左パネル）。一方、それらは、活性化状態にかかわらず、１：２のモル比でＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂに結合した抗ＣＤ１１ｂ（４４Ａ）により十分に染色される（図２４Ａ、右パネル）。図２４Ｂは、ＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂ単独と比較したＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂに結合した抗体の染色を示す。図２４Ｂは、ＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂが抗体に結合していない場合、染色を示さないことを示す。

ＣＤ１１ｂを発現するＫ５６２細胞を、ＳｅｑＳｔａｉｎ法を使用して３ラウンドの抗体により染色した。抗マウスおよび抗ラットＦａｂを、ＤＢＣＯ−アジドクリックケミストリーを使用して、制限部位および蛍光色素ＡＦ４８８またはＡＦ５９４を含有するＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。４４Ａ、ＩＢ４およびＭ１／７０などのＣＤ１１ｂに対する抗体の異なるクローンを使用した。抗体４４ＡおよびＭ１７０を、それぞれ１：２のモル比でＡＦ４８８を有する抗マウスおよび抗ラットＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂと結合した。一方、ＩＢ４抗体を、１：２のモル比でＡＦ５９４を有する抗マウスＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂと結合した。ＣＤ１１ｂを発現するＫ５６２細胞を、ＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂに結合した抗ＣＤ１１ｂ（４４Ａ）抗体により染色し、次いでＥｃｏＲＶ制限酵素を使用して脱染した（図２５Ａ）。ＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂに結合した抗ＣＤ１１ｂ（ＩＢ４）（図２５Ｂ）およびＳｅｑＳｔａｉｎ Ｆａｂに結合した抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）（図２５Ｃ）を使用して、さらに２ラウンドの染色および脱染を行った。ＳｅｑＳｔａｉｎにおいてＦａｂを使用する利点は、Ｆａｂが抗体と結合することができ、各抗体がＳｅｑＳｔａｉｎのために調製される必要がないように容易に使用され得ることである。一部の実施形態では、ＴＣＯ−Ｔｚクリックケミストリーを使用することができる。

ＲＡＷ細胞を抗ＣＤ１１ｂ ＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂにより染色し、脱染した。ビオチン化抗ＣＤ１１ｂ Ａｂを、１：１：３の抗体：ストレプトアビジン：ＤＮＡオリゴの比でストレプトアビジンを使用して、制限部位および蛍光色素ＡＦ４８８を含有するビオチン化ＤＮＡオリゴにコンジュゲートした。ＲＡＷ細胞を抗ＣＤ１１ｂ ＳｅｑＳｔａｉｎ Ａｂにより染色し、陽性染色を蛍光画像化により視認した。制限酵素ＥｃｏＲＶを使用して細胞を脱染した。

上記の図面および開示は例示であり、網羅的ではないことを意図する。この説明は当業者に多くの変形および代替を示唆している。全てのこのような変形および代替は添付の特許請求の範囲内に包含されることを意図する。当業者は本明細書に記載されている特定の実施形態に対する他の均等物を認識することができ、これらの均等物もまた、添付の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。

参考文献

Claims (25)

1. 複数の検体検出剤を含む組成物であって、各検体検出剤が、前記検体検出剤と機能的に結合している不安定タグを含み、各不安定タグが互いの不安定タグと異なるシグナルを含み、各検体検出剤が異なる検体を標的とし、
   各不安定タグは、前記複数の検体検出剤が適用される試料を破壊せずに除去可能またはクエンチ可能であり、第２の複数の検体検出剤を用いて前記試料のさらなる分析を可能にする、組成物。
2. 少なくとも１つの不安定タグがフルオロフォアを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記複数の検体検出剤の少なくとも１つがオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖である、請求項３に記載の組成物。
5. 前記オリゴヌクレオチドが蛍光標識を含む、請求項３に記載の組成物。
6. 少なくとも１つの不安定タグが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ポリメラーゼ、ＴＣＥＰ、ベータ−メルカプトエタノール、過ヨウ素酸塩、ｐＨ変化、ペプチダーゼまたはプロテアーゼにより除去可能である、請求項１に記載の組成物。
7. 少なくとも１つの不安定タグがクエンチ可能である、請求項１に記載の組成物。
8. 前記検体検出剤の少なくとも１つが、リンカーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
9. 前記複数の検体検出剤の少なくとも１つが架橋剤を含む、請求項１に記載の組成物。
10. 前記架橋剤が、金属ベースの架橋剤、アビジン、ストレプトアビジンまたはジスルフィドを含む、請求項９に記載の組成物。
11. 試料を分析する方法であって、
    （ａ）試料を複数の検体検出剤により標識化するステップであって、各検体検出剤が前記検体検出剤と機能的に結合している不安定タグを含み、各不安定タグが互いの不安定タグと異なるシグナルを含み、各検体検出剤が異なる検体を標的とする、ステップと、
    （ｂ）前記試料上の前記複数の検体検出剤の各々によって生成されるシグナルを検出するステップと、
    （ｃ）各検体検出剤から前記シグナルを除去するステップと、
    （ｄ）ステップａ〜ｃを反復するステップと
    を含む、方法。
12. ステップａ〜ｃをさらに少なくとも１回反復するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記試料を平面上に配置するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
14. 前記試料を、流体交換を可能にするチャンバ内に配置するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
15. 画像化によって前記シグナルを検出するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
16. 前記タグ上の不安定な結合を標的とする切断試薬により前記試料を処理することによって前記シグナルを除去するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
17. クエンチングによって前記シグナルを除去するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
18. 前記平面に架橋剤を添加するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
19. 前記シグナルが除去された後に前記試料をブロックするステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
20. １５の異なる検体から少なくとも１５の異なるシグナルを検出するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
21. ＥＤＴＡを添加して前記試料に添加された酵素を不活性化するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
22. 少なくとも１つの検体検出剤が分岐ＤＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
23. 電場を印加して各検体検出剤から前記シグナルを除去するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
24. 各不安定タグに特異的な制限酵素を使用して前記不安定タグを選択的に除去するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
25. １つの不安定タグがインタクトなままである、請求項２４に記載の方法。

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