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JP2021511027A - アルファ−シヌクレインアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用 - Google Patents

アルファ−シヌクレインアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用 Download PDF

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JP2021511027A
JP2021511027A JP2020538687A JP2020538687A JP2021511027A JP 2021511027 A JP2021511027 A JP 2021511027A JP 2020538687 A JP2020538687 A JP 2020538687A JP 2020538687 A JP2020538687 A JP 2020538687A JP 2021511027 A JP2021511027 A JP 2021511027A
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オルソン，リチャード・イー
カカーチェ，アンジェラ・エム
イェンセン，マリアン・レルベック
ブラウン，ジェフリー・エム
メレディス，ジュニア，ジェレ・イー
ペンドリ，アンナプルナ
マクドナルド，イヴァル・エム
ジル，マーティン
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Abstract

本開示は、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）タンパク質の発現の減少をもたらす、細胞中のＳＮＣＡ転写物をターゲットとする、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。ＳＮＣＡタンパク質発現の減少は、特定の医的障害、例えば、神経学的障害、例えば、シヌクレイン症の処置に有益である。

Description

開示の分野
本開示は、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）タンパク質の発現の減少をもたらす、細胞中のアルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）転写物をターゲットとする、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物（ＡＳＯ）に関する。ＳＮＣＡタンパク質発現の減少は、一定範囲の医的障害、例えば、多系統萎縮症、パーキンソン病、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）及びレビー小体を伴う認知症に有益であることができる。
背景
シヌクレインタンパク質ファミリーの一員であるアルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）は、主に神経組織内で発現する小型の可溶性タンパク質である。Marques O et al., Cell Death Dis. 19: e350 (2012)を参照のこと。ＳＮＣＡは、多くの細胞種で発現しているが、主にニューロンのシナプス前終末内に局在している。正確な機能は、未だに完全には解明されていないが、ＳＮＣＡは、シナプス伝達のレギュレーションにおいて重要な役割を果していることが示唆されている。例えば、ＳＮＣＡは、シナプス小胞とニューロンのシナプス前膜との結合を媒介するＳＮＡＲＥ複合体の形成において、分子シャペロンとして機能する。ＳＮＣＡは、微小管関連タンパク質であるタウ等の他のタンパク質とも相互作用することができ、微小管を安定化し、小胞輸送をレギュレーションするのに役立つ。
シナプス伝達のレギュレーションにおけるＳＮＣＡの役割のために、ＳＮＣＡの発現及び／又は機能の変化は、重要な生物学的プロセスを壊す場合がある。このような破壊は、脳内のＳＮＣＡタンパク質凝集体の異常な蓄積を特徴とする神経変性疾患である、α−シヌクレイン症の一因と考えられてきた。したがって、ミスフォールドされ、凝集し、リン酸化されたＳＮＣＡタンパク質の不溶性封入体は、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）等の疾患についての病理学的特徴である。Galvin JE et al., Archives of Neurology 58: 186-190 (2001)及びValera E et al., J Neurochem 139 Suppl 1: 346-352 (Oct. 2016)を参照のこと。
α−シヌクレイン症、例えば、パーキンソン病は、特に高齢者の間で、非常に多くみられる進行性神経変性脳障害である。Recchia A et al., FASEB J. 18: 617-26 (2004)を参照のこと。世界中で約７００万〜１０００万人が、このような障害を患って生活していると推定されており、米国だけでも毎年約６０，０００人が新たに発症している。個々の人間のための投薬コストは、年間２，５００ドルを軽く超える場合があり、治療手術には、患者あたりに最大１０万ドルのコストがかかる場合がある。したがって、より堅牢で費用効果の高い処置の選択肢が大いに必要とされている。
ＵＳ第２００８／０００３５７０号には、アルファ−シヌクレインをモデュレーションする化合物を特定するためのアルファ−シヌクレイン法における翻訳エンハンサー要素が記載されている。
ＷＯ第２０１２／０６８４０５号には、アルファ−シヌクレインをターゲットとする修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが開示されている。
ＷＯ第２００５／００４７９４号、同第２００５／０４５０３４号、同第２００６／０３９２５３号、同第２００７／１３５４２６号、ＵＳ第２００８／０１３９７９９号、ＷＯ第２００８／１０９５０９号、同第２００９／０７９３９９号、同第２０１２／０２７７１３号の全てに、サイトゾル中のＲＩＳＣ複合体を介して作用する核酸分子、例えば、ｓｉＲＮＡ分子が記載されている。このような分子は、ＳＮＣＡ転写物におけるイントロンをターゲットとすることができない。
ＷＯ第２０１１／０４１８９７号、同第２０１１／１３１６９３号及び同第２０１４／０６４２５７号には、ＣＮＳ中のターゲット分子をモデュレーションするためのＣＮＳへの送達のための核酸分子のコンジュゲーションが記載されている。これらのうちの１つは、アルファ−シヌクレインである。
開示の概要
本開示は、長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、連続ヌクレオチド配列がアルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）転写物内のイントロン核酸領域に少なくとも９０％相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に向けられる。一部の実施態様では、ＳＮＣＡ転写物は、配列番号：１を含み、本開示のＡＳＯは、ヒトＳＮＣＡ転写物を発現している細胞におけるヒトＳＮＣＡ転写物の発現を阻害可能である。
一部の実施態様では、イントロン領域は、配列番号：１のヌクレオチド６３３６〜７６０４に対応するイントロン１；配列番号：１のヌクレオチド７７５１〜１５１１２に対応するイントロン２；配列番号：１のヌクレオチド１５１５５〜２０９０８に対応するイントロン３又は配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜１１４０１９に対応するイントロン４から選択される。
更なる実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、連続ヌクレオチド配列は、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）転写物内の核酸配列に少なくとも９０％相補的であり、ここで、該核酸配列は、ｉ）配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜２９６５４；ｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド３０９３１〜３３９３８；ｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド４４６４０〜４４８６１；ｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド４７９２４〜５８７５２；ｖ）配列番号：１のヌクレオチド４９４２〜５３４３；ｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド６３３６〜７０４１；ｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド７３２９〜７６００；ｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド７７５１〜７７８３；ｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド８２７７〜８５０１；ｘ）配列番号：１のヌクレオチド９０３４〜９５２６；ｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド９９８２〜１４２７９；ｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１５２０４〜１９０４１；ｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド２０３５１〜２０９０８；ｘｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド３４９３２〜３７０７７；ｘｖ）配列番号：１のヌクレオチド３８０８１〜４２８６９；ｘｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド３８０８１〜３８３０３；ｘｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド４０２１８〜４２８６９；ｘｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド４６１７３〜４６９２０；ｘｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド６０６７８〜６０９０５；ｘｘ）配列番号：１のヌクレオチド６２０６６〜６２３９７；ｘｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド６７７５９〜７１６２５；ｘｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド７２９２６〜８６９９１；ｘｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド８８１６８〜９３７８３；ｘｘｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド９４９７６〜１０２５７３；ｘｘｖ）配列番号：１のヌクレオチド１０４９２０〜１０７４３８；ｘｘｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０６３７８〜１０６７５５；ｘｘｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０６７００〜１０６７５５；ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０８９４８〜１１４０１９；及びｘｘｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド１１４２９２〜１１６６３６からなる群より選択される。
特定の実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３から選択される配列を含むか又はこれらからなる。
一部の実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。一部の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）である。ギャップマーは、５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’［式中、（ｉ）領域Ｂは、ＲＮａｓｅをリクルート可能な少なくとも６個のＤＮＡ単位の連続配列であり、（ｉｉ）領域Ａは、１〜１０ヌクレオチドの第１のウイング配列であり、ここで、第１のウイング配列は、１つ以上のヌクレオチド類似体及び場合により、１つ以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１つは、Ａの３’末端に位置し、（ｉｉｉ）領域Ｃは、１〜１０ヌクレオチドの第２のウイング配列であり、ここで、第２のウイング配列は、１つ以上のヌクレオチド類似体及び場合により、１つ以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１つは、Ｃの５’末端に位置する］
で示される式をから構成することができる。
特定の実施態様では、ヌクレオチド類似体（nucleotide analogue or analogues）は、高親和性類似体、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ；２’−アミノ−ＤＮＡ；２’−フルオロ−ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’−フルオロ−ＡＮＡ、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、拘束エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’−Ｏ−メチル核酸（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル核酸（２’−ＭＯＥ）及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、２’糖修飾ヌクレオシドである。一部の実施態様では、ヌクレオチド類似体は、二環式糖を含む。特定の実施態様では、二環式糖は、ｃＥｔ、２’，４’−拘束２’−Ｏ−メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ又はチオ−ＬＮＡを含む。一部の実施態様では、ヌクレオチド類似体は、ＬＮＡを含む。
一部の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、４以下の総スコアのｉｎ ｖｉｖｏ耐容性を有し、ここで、総スコアは、５つのカテゴリーの単位スコアの合計であり、同カテゴリーは、１）過活動；２）活動及び覚醒の低下；３）運動機能障害及び／又は運動失調；４）異常な姿勢及び呼吸並びに５）振戦及び／又は痙攣であり、ここで、各カテゴリーについての単位スコアが、０〜４のスケールで測定される。特定の実施態様では、ｉｎ ｖｉｖｏ耐容性は、３以下の総スコア、２の総スコア、１の総スコア又は０の総スコアである。
一部の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、図１Ａ〜１Ｃの設計からなる群より選択される設計を有する、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３（ここで、大文字は、糖修飾ヌクレオシドであり、小文字は、ＤＮＡである）からなる群より選択される配列を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。特定の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、ＡＳＯ−００８３８７；ＡＳＯ−００８３８８；ＡＳＯ−００８５０１；ＡＳＯ−００８５０２；ＡＳＯ−００８５２９；ＡＳＯ−００８５３０；ＡＳＯ−００８５３１；ＡＳＯ−００８５３２；ＡＳＯ−００８５３３；ＡＳＯ−００８５３４；ＡＳＯ−００８５３５；ＡＳＯ−００８５３６；ＡＳＯ−００８５３７；ＡＳＯ−００８５４３；ＡＳＯ−００８５４５；ＡＳＯ−００８５８４；ＡＳＯ−００８２２６及びＡＳＯ−００８２６１からなる群より選択される化学構造を有する。
また、本明細書において、本明細書で開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートと、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物も提供される。
本開示は、さらに、本明細書で開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は組成物を含む、キットを提供する。
本明細書において、シヌクレイン症の処置を必要とする対象におけるシヌクレイン症を処置するための方法であって、有効量の、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は組成物を投与することを含む、方法が提供される。一部の実施態様では、シヌクレイン症は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、多系統萎縮症、レビー小体を伴う認知症及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
また、本明細書において、医薬の製造のための、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は組成物の使用も提供される。また、本開示は、シヌクレイン症の処置を必要とする対象におけるシヌクレイン症の処置のための医薬の製造のための、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は組成物の使用も提供する。一部の実施態様では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は組成物は、シヌクレイン症の治療を必要とする対象におけるシヌクレイン症の治療における使用のためのものである。他の実施態様では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は組成物は、治療における使用のためのものである。
一部の実施態様では、対象は、ヒトである。一部の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は組成物は、経口、非経口、髄腔内、脳室内(intra-cerebroventricularly)、肺、局所又は脳室内（intraventricularly）に投与される。
図１Ａ〜１Ｃは、ＳＮＣＡ プレｍＲＮＡの領域をターゲットとする例示的なＡＳＯを示す。図１Ａは、野生型ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ（配列番号：２）をターゲットとする例示的なＡＳＯを提供する。図１Ｂは、変異体ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ（「変異体４」／配列番号：５又は「変異体２」／配列番号：３）をターゲットとする例示的ＡＳＯを提供する。図１Ｃは、別の変異体ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ（「変異体３」／配列番号：４）をターゲットとする例示的ＡＳＯを提供する。図１Ａ〜１Ｃの各列は、配列についてのみ指定された配列番号（配列番号：）、ＳＮＣＡ プレｍＲＮＡ配列におけるターゲット開始位置及びターゲット終了位置、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ配列におけるターゲット開始位置及びターゲット終了位置、設計番号（ＤＥＳ Ｎｏ．）、設計によるＡＳＯ配列、ＡＳＯ番号（ＡＳＯ Ｎｏ．）並びに化学構造によるＡＳＯ配列を示す。図では、ＡＳＯ化学のアノテーションは、下記のとおりである。ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオチドは、ＯｘｙＢにより指定され、ここで、Ｂは、ヌクレオチド塩基、例えば、チミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン（ＭＣ）、アデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）を示し、このため、ＯｘｙＡ、ＯｘｙＴ、ＯｘｙＭＣ、ＯｘｙＣ及びＯｘｙＧを含む。ＤＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡｂにより指定され、小文字のｂは、ヌクレオチド塩基、例えば、チミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン（Ｍｃ）、アデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）を示し、このため、ＤＮＡａ、ＤＮＡｔ、ＤＮＡ及びＤＮＡｇを含む。Ｃ又はｃの前の文字Ｍは、５−メチルシトシンを示す。文字ｓは、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合である。 図２は、例示的なウイング設計修飾を有するＳＮＣＡ プレｍＲＮＡをターゲットとするＡＳＯを示す。図２の各列は、配列についてのみ指定された配列番号（配列番号：）、ＳＮＣＡ プレｍＲＮＡ配列におけるターゲット開始位置及びターゲット終了位置、設計番号（ＤＥＳ Ｎｏ．）、設計によるＡＳＯ配列、ＡＳＯ番号（ＡＳＯ Ｎｏ．）並びに化学構造によるＡＳＯ配列並びに特定されたウイング設計修飾を示す。ＤＥＳ−２８７０３３、ＤＥＳ−２８７０４１、ＤＥＳ−２８７０５３、ＤＥＳ−２８７９６５、ＤＥＳ−２８８９０２、ＤＥＳ−２８８９０３、ＤＥＳ−２８８９０５、ＤＥＳ−２９０３１５及びＤＥＳ−２９２３７８は、配列番号：１４６７について可能性のある種々のＡＳＯ設計を示す。ＤＥＳ−２８６７６２、ＤＥＳ−２８６７８５及びＤＥＳ−２８６７８３は、配列番号：１７６４について可能性のある種々のＡＳＯ設計を示す。ＡＳＯ設計について、大文字は、ヌクレオチド類似体（例えば、ＬＮＡ又は２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ））を示し、小文字は、ＤＮＡを示す。下線を有する又は有さない大文字は、２個の文字が異なるヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メチルである場合があることを示す。例えば、下線が引かれた大文字は、２’−Ｏ−メチルであることができ、一方、下線が引かれていない大文字は、ＬＮＡである。化学構造によるＡＳＯの列では、ＯＭｅは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、Ｌは、ＬＮＡであり、Ｄは、ＤＮＡであり、Ｌ又はＤに続く数字は、ＬＮＡ又はＤＮＡの数を意味する。 図３は、ＡＳＯ−００３１７９投与後のカニクイザル（ｃｙｎｏ ｍｏｎｋｅｙ）における相対的ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現レベル（％ 媒体対照として）を示す。動物に、媒体対照（丸）、８mg ＡＳＯ−００３１７９（四角）又は１６mg ＡＳＯ−００３１７９（三角）を、ＩＣＶ注射により与えた。ついで、動物を投与２週間後に殺処分し、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現レベルを下記組織：延髄（左上パネル）、尾状核被殻（中央上パネル）、脳橋（右上パネル）、小脳（左下パネル）、腰髄（中央下パネル）及び前頭皮質（右下パネル）において評価した。個々の動物についてのデータ及び平均値の両方を示す。横線は、１００％の基準値（すなわち、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現が媒体対照群において観察された発現レベルと同等であろう値）を示す。 図４は、カニクイザルの脳組織におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現量に及ぼすＡＳＯ−００３０９２の影響を示す。動物に、４mg（四角）又は８mg（三角形） ＡＳＯ−００３０９２のいずれかを投与し、ついで、異なる脳組織におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現レベルを投与後２週間で評価した。媒体対照を与えた動物を対照として使用した（丸）。ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現レベルを下記組織：延髄（左上パネル）、尾状核被殻（中央上パネル）、脳橋（右上パネル）、小脳（左下パネル）、腰髄（中央下パネル）及び前頭皮質（右下パネル）において評価した。ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化し、ついで、％ 媒体対照として示した。個々の動物についてのデータ及び平均値の両方を示す。横線は、１００％の基準値（すなわち、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現が媒体対照群において観察された発現レベルと同等であろう値）を示す。
開示の詳細な説明
Ｉ 定義
「ａ」又は「ａｎ」実体という用語は、１つ以上のその実体を指すことに留意されたい。例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は，１つ以上のヌクレオチド配列を表わすと理解される。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。
さらに、本明細書で使用する場合、「及び／又は」は、他の特徴を伴う又は伴わない、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。このため、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」等の表現で使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」等の表現で使用される「及び／又は」という用語は、下記態様：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）及びＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。
本明細書において、「含む」という語で説明される態様はどこでも、「からなる」及び／又は「から本質的になる」という用語で説明される他の類似の態様も提供されると理解される。
特に断りない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press及びthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressにより、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書が、当業者に提供される。
単位、接頭辞及び記号は、国際単位系（ＳＩ）に認められた形式で示される。数値範囲は、範囲を画定する数値を含む。特に断りない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に５’から３’の向きで記載される。アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシの向きで記載される。本明細書で提供された見出しは、本開示の種々の態様を限定するものではなく、態様は、本明細書全体を参照することにより把握される。したがって、直下で定義される用語は、本明細書全体を参照することにより、より完全に定義される。
本明細書において、「約」という用語は、おおよそ、およそ、付近又はその領域内を意味するのに使用される。「約」という用語が、数値範囲と共に使用される場合、記載された数値の上下の境界を拡張することにより、その範囲を変更する。一般的には、「約」という用語は、記載された値の上下の数値を、例えば、１０％上下（より高い又はより低い）の分散により変更することができる。例えば、「ＡＳＯは、ＡＳＯの投与後の細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の発現を少なくとも約６０％低下させる」と記載されている場合、ＳＮＣＡレベルは、５０％〜７０％の範囲で低下することを意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（ＡＳＯ）という用語は、ヌクレオチド間結合を介して互いに共有結合している、ヌクレオシド、例えば、天然ヌクレオシド又はその修飾形態のオリゴマー又はポリマーを指す。本開示に有用なＡＳＯは、少なくとも１つの非天然ヌクレオシドを含む。ＡＳＯは、ターゲット核酸に相補的であり、その結果、ＡＳＯは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズする。本明細書で使用する場合、「アンチセンスＡＳＯ」、「ＡＳＯ」及び「オリゴマー」という用語は、「ＡＳＯ」という用語と互換的である。
「核酸」又は「ヌクレオチド」という用語は、複数の核酸を包含することが意図される。一部の実施態様では、「核酸」又は「ヌクレオチド」という用語は、ターゲット配列、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はＤＮＡを指す。この用語が、ターゲット配列における核酸又はヌクレオチドを指す場合、核酸又はヌクレオチドは、細胞内の天然の配列であることができる。他の実施態様では、「核酸」又は「ヌクレオチド」は、本開示のＡＳＯにおける配列を指す。この用語が、ＡＳＯにおける配列を指す場合、核酸又はヌクレオチドは、非天然、すなわち、化学的に合成され、酵素的に産生され、リコンビナントに産生されるか又はそれらの任意の組み合わせである。一実施態様では、ＡＳＯにおける核酸又はヌクレオチドは、合成的に又はリコンビナントに産生され、天然の配列又はそのフラグメントではない。別の実施態様では、ＡＳＯにおける核酸又はヌクレオチドは、本来天然に存在しない少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含有するため、非天然である。「核酸」又は「ヌクレオシド」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する単一の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの類似体を指す。「核酸」又は「ヌクレオシド」は、天然の核酸又は非天然の核酸を含む。一部の実施態様では、「ヌクレオチド」、「単位」及び「モノマー」という用語は、互換的に使用される。ヌクレオチド又はモノマーの配列に言及する場合、言及されるものは、塩基、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵ及びそれらの類似体の配列であることが認識されるであろう。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」という用語は、糖部分、塩基部分及び共有結合基（結合基）、例えば、ホスファート又はホスホロチオアートヌクレオチド間結合基を含むグリコシドを指し、天然ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡと、本明細書において「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる修飾糖及び／又は塩基を含む非天然ヌクレオチドとの両方を包含する。本明細書において、単一ヌクレオチド（単位）も、モノマー又は核酸単位と呼ぶことができる。特定の実施態様では、「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾糖部分を有するヌクレオチドを指す。修飾糖部分を有するヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ）の非限定的な例は、本明細書の他の箇所に開示されている。他の実施態様では、「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドを指す。修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドは、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン及び２−クロロ−６−アミノプリンを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」という用語は、糖部分及び塩基部分を含むグリコシドを指し、同塩基部分は、ＡＳＯのヌクレオシド間のヌクレオチド間結合により共有結合することができる。バイオテクノロジーの分野では、「ヌクレオシド」という用語は、多くの場合、核酸モノマー又は単位を指すのに使用される。ＡＳＯの文脈において、「ヌクレオシド」という用語は、塩基単独、すなわち、シトシン（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、グアニン（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、アデニン（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、チミン（ＤＮＡ）及びウラシル（ＲＮＡ）を含む核酸塩基配列を指すことができる。同配列には、糖骨格及びヌクレオチド間結合の存在が暗示される。同様に、特に、１つ以上のヌクレオチド間結合基が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドを指すことができる。例えば、ヌクレオシド間の結合の存在又は性質を指定する場合であっても、「ヌクレオチド」という用語を使用することができる。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド長」という用語は、所定の配列におけるヌクレオチド（モノマー）の総数を意味する。例えば、ctaacaacttctgaacaaca（配列番号：１４３６）の配列は、２０個のヌクレオチドを有するため、配列のヌクレオチド長は、２０である。したがって、「ヌクレオチド長」という用語は、本明細書において、「ヌクレオチド数」と互換的に使用される。
当業者であれば認識するであろうように、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、５’末端基を含むことができるが、５’ヌクレオチド間結合基を含まない。
本明細書で使用する場合、「コード領域」又は「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチド部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、典型的には、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えることができるが、任意の隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域（「ＵＴＲ」）等は、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は、典型的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端における開始コドンと、得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端における翻訳停止コドンとにより決定される。
本明細書で使用する場合、「非コード領域」という用語は、コード領域ではないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例は、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域（「ＵＴＲ」）、非コードエクソン等を含むが、これらに限定されない。一部のエクソンは、各転写物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）又は３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の全体又は一部であることができる。非翻訳領域は、転写物の効率的な翻訳並びに転写物の翻訳速度及び半減期の制御に重要である。
「領域」という用語は、ヌクレオチド配列の文脈において使用される場合、その配列のセクションを指す。例えば、「ヌクレオチド配列内の領域」又は「ヌクレオチド配列の相補配列内の領域」という表現は、ヌクレオチド配列より短いが、特定のヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列の相補配列それぞれに位置する少なくとも１０ヌクレオチドより長い配列を指す。「サブ配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」もしくは「サブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）」又は「ターゲット領域」という用語は、ヌクレオチド配列の領域を指すこともできる。
「下流」という用語は、ヌクレオチド配列に言及する場合、核酸又はヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に対して３’に位置することを意味する。特定の実施態様では、下流のヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を指す。
特に断りない限り、本明細書で提供された配列は、５’末端（左）から３’末端（右）へと列挙される。
本明細書で使用する場合、「レギュラトリー領域」という用語は、コード領域の上流（５’非コード配列）、コード領域内又はコード領域の下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。レギュラトリー領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ＵＴＲ及びステム−ループ構造を含むことができる。コード領域が、真核細胞における発現について意図される場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に位置するであろう。
本明細書で使用する場合、「転写物」という用語は、ＤＮＡの転写により合成され、プロセシング後にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）になる一次転写物、すなわち、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）及びプロセシングされたｍＲＮＡ自体を指すことができる。「転写物」という用語は、「プレｍＲＮＡ」及び「ｍＲＮＡ」と互換的に使用することができる。ＤＮＡ鎖が、一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、幾つかの方法で修飾され、その成熟した機能形態、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等に変換される。このため、「転写物」という用語は、エクソン、イントロン、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含むことができる。
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ又はポリペプチドを産生するプロセスを指す。発現は、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含むが、これらに限定されない。発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ又は転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであることができる。本明細書に記載された遺伝子産物は、さらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸又は翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合もしくはタンパク質分解性開裂を有するポリペプチドを含む。
２つ以上の核酸の文脈において、「同一」又は％ 「同一性」という用語は、配列同一性の一部として任意の保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大の対応のために比較され、アライメントされた（必要に応じてギャップが導入された）場合に、同じであるか又は同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定の割合を有する２つ以上の配列を指す。％ 同一性は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して又は目視検査により測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るのに使用することができる種々のアルゴリズム及びソフトウェアが、当技術分野において公知である。
配列アラインメントアルゴリズムの１つのこのような非限定的な例は、Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268に記載されており、Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877に記載のとおり改変されており、NBLAST及びXBLASTプログラム（Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402）に組み込まれているアルゴリズムである。特定の実施態様では、Gapped BLASTが、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているように使用することができる。BLAST−2、WU−BLAST−2（Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480）、ALIGN、ALIGN−2（Genentech, South San Francisco, California）又はMegalign（DNASTAR）は、配列をアライメントするのに使用することができる更なる公衆に利用可能なソフトウェアプログラムである。特定の実施態様では、２個のヌクレオチド配列間の％ 同一性は、GCGソフトウェアパッケージにおけるGAPプログラムを使用して（例えば、NWSgapdna.CMPマトリックス及び４０、５０、６０、７０又は９０のギャップ重み及び１、２、３、４、５又は６の長さ重みを使用して）決定される。特定の代替的な実施態様では、Needleman and Wunsch（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）のアルゴリズムを組み込んだGCGソフトウェアパッケージにおけるGAPプログラムを使用して、２つのアミノ酸配列間の％ 同一性を決定することができる（例えば、BLOSUM 62マトリックス又はPAM250マトリックス並びに１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重み及び１、２、３、４、５の長さ重みのいずれかを使用）。代替的には、特定の実施態様では、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の％ 同一性は、Myers and Miller（CABIOS, 4:11-17 (1989)）のアルゴリズムを使用して決定される。例えば、％ 同一性は、ALIGNプログラム（バージョン２．０）を使用し、残基表、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーを有するＰＡＭ１２０を使用して決定することができる。当業者であれば、特定のアラインメントソフトウェアにより、最大アラインメントに適切なパラメータを決定することができる。特定の実施態様では、アライメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
特定の実施態様では、第２のヌクレオチド配列に対する第１のヌクレオチド配列の％ 同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは、第１の配列及び第２の配列のアライメントにおける同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数（目視検査又は特定の配列アライメントプログラムによりアライメントされる）であり、Ｚは、第２の配列における残基の総数である）として計算される。第１の配列の長さが、第２の配列より長い場合、第２の配列に対する第１の配列の％ 同一性は、第１の配列に対する第２の配列の％ 同一性より高いであろう。
ポリヌクレオチド参照配列とアライメントさせた単一のポリヌクレオチドターゲット配列内の異なる領域はそれぞれ、それ自体の％ 配列同一性を有することができる。％ 配列同一性値は、最も近い１０分の１に四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３及び８０．１４は、８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。また、長さの値は、常に、整数であるであろうことにも留意されたい。
本明細書で使用する場合、「相同」及び「相同性」という用語は、「同一性」及び「同一」という用語と互換的である。
「その天然の変異体」という用語は、定義された分類群、例えば、ほ乳類、例えば、マウス、サル及びヒト）内に本来存在するＳＮＣＡポリペプチド配列又はＳＮＣＡ核酸配列（例えば、転写物）の変異体を指す。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然の変異体」に言及する場合、この用語は、また、染色体転座又は重複により染色体位置１７ｑ２１に見出されるＳＮＣＡをコードするゲノムＤＮＡの任意の対立遺伝子変異体、それから得られるＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡも包含することができる。「天然の変異体」は、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの選択的スプライシングにより得られる変異体を含むことができる。特定のポリペプチド配列に言及する場合、例えば、この用語は、天然形態のタンパク質も含み、したがって、例えば、同時修飾又は翻訳後修飾、例えば、シグナルペプチド開裂、タンパク質分解性開裂、グリコシル化によりプロセシングされることができる。
本開示のＡＳＯ（又はその領域）と、ほ乳類ＳＮＣＡタンパク質をコードする核酸（例えば、ＳＮＣＡ遺伝子）のターゲット領域、例えば、本明細書に開示されたものとの間の「相補性」の程度を決定する際には、「相補性」の度合い（また、「相同性」又は「同一性」）は、ＡＳＯの配列（又はその領域）と、それと最も良くアライメントするターゲット領域の配列（又はターゲット領域の逆相補体）との間の％ 同一性（又は％ 相同性）として表わされる。％は、２つの配列間で同一であるアライメントした塩基の数を数え、ＡＳＯにおける連続するモノマーの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。このような比較において、ギャップが存在する場合、このようなギャップは、ギャップ内のモノマーの数が本開示のＡＳＯとターゲット領域との間で異なる領域ではなく、単にミスマッチであることが好ましい。
本明細書で使用する場合、「相補」という用語は、参照配列に相補的な配列を指す。相補性は、ＤＮＡ複製及び転写の基本原理であり、２つのＤＮＡ又はＲＮＡ配列間で共有される性質であることが周知である。このため、それらを互いに逆平行にアライメントさせた場合、配列中の各位置のヌクレオチド塩基は相補的であり、鏡のように見え、逆に見えるであろう。したがって、例えば、５’「ＡＴＧＣ」３’の配列の相補は、３’「ＴＡＣＧ」５’又は５’「ＧＣＡＴ」３’と書くことができる。本明細書で使用する場合、「逆相補」、「逆相補的」及び「逆相補性」という用語は、「相補」、「相補的」及び「相補性」という用語と互換的である。
本明細書で使用する場合、「％ 相補的」という用語は、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）における連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（％）を指す。同連続ヌクレオチド配列は、参照配列（例えば、ターゲット配列又は配列モチーフ）に相補的である。このため、％ 相補性は、（ターゲット配列５’−３’及びオリゴヌクレオチド配列３’−５’とアライメントされた場合）２つの配列間で相補的である（ワトソンクリック塩基対）、アライメントされた核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。このような比較において、アライメント（塩基対を形成している）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと呼ばれる。連続ヌクレオチド配列の％ 相補性の計算において、挿入及び欠失は許容されない。相補性を決定する際に、ワトソンクリック塩基対を形成するための核酸塩基の機能的能力が保持される限り（例えば、％ 同一性を計算する目的で、５’−メチルシトシンは、シトシンと同一と考えられる）、核酸塩基の化学修飾は無視されると理解されるであろう。
「完全に相補的」という用語は、１００％相補性を指す。
２つの別個の核酸又はヌクレオチド配列に言及する場合、「対応すること」及び「対応する」という用語は、相同性及び／又は機能性に基づいて、互いに対応するか又は類似する配列の領域を明確にするのに使用することができ、特定の配列のヌクレオチドは、異なってナンバリングすることができる。例えば、遺伝子転写物の異なるアイソフォームは、ヌクレオチド配列の類似又は保存された部分を有することができ、そのナンバリングは、選択的スプライシング及び／又は他の修飾に基づいて、各アイソフォームにおいて異なる場合がある。加えて、核酸又はヌクレオチド配列（例えば、遺伝子転写物、翻訳開始コドンから配列のナンバリングを開始するか又は５’ＵＴＲを含むかどうかに関わらない）を特徴付ける場合、種々のナンバリングシステムを利用することができると認識される。さらに、遺伝子又は遺伝子転写物の異なる変異体の核酸又はヌクレオチド配列は変化する場合があると認識される。ただし、本明細書で使用する場合、核酸又はヌクレオチド配列の相同性及び／又は機能性を共有する変異体の領域は、互いに「対応する」と見なされる。例えば、配列番号：１のヌクレオチドＸ〜Ｙに対応するＳＮＣＡ転写物のヌクレオチド配列（「参照配列」）は、配列番号：１のヌクレオチドＸ〜Ｙと同一の配列又は類似する配列を有するＳＮＣＡ転写物配列（例えば、ＳＮＣＡプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を指す。当業者であれば、ＳＮＣＡ転写物配列を配列番号：１とアライメントさせることにより、ＳＮＣＡ転写物配列における対応するＸ及びＹ残基を特定することができる。
「対応するヌクレオチド類似体」及び「対応するヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド類似体における核酸塩基及び天然のヌクレオチドが同じ対合又はハイブリダイゼーション能力を有することを示すことを意図している。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位が、アデニンに結合している場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに結合しているペントース単位（２−デオキシリボースとは異なる）を含有する。
本明細書で使用する場合、「ＤＥＳ番号」又は「ＤＥＳ Ｎｏ．」という用語は、ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡ）及びヌクレオシド類似体（例えば、ＬＮＡ）の特異的なパターンを有するヌクレオチド配列に与えられる固有の番号を指す。本明細書で使用する場合、ＡＳＯの設計は、大文字と小文字との組み合わせにより示される。例えば、ＤＥＳ−００３０９２は、LDDLLDDDDDDDDDDLDLLL（すなわち、CtaACaacttctgaaCaACA）（ここで、Ｌ（すなわち、大文字）は、ヌクレオシド類似体（例えば、ＬＮＡ）を示し、Ｄ（すなわち、小文字）は、ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡ）を示す）のＡＳＯ設計を有するctaacaacttctgaacaaca（配列番号：１４３６）のＡＳＯ配列を指す。
本明細書で使用する場合、「ＡＳＯ番号」又は「ＡＳＯ Ｎｏ．」という用語は、成分、例えば、ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ又はＭＣ）及び骨格構造（例えば、ホスホロチオアート又はホスホロジエステル）の詳細な化学構造を有するヌクレオチド配列に与えられる固有の番号を指す。例えば、ＡＳＯ−００３０９２は、ＯｘｙＭＣｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡａｓ ＯｘｙＡｓ ＯｘｙＭＣｓ ＤＮＡａｓ ＤＮＡａｓ ＤＮＡｃｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡｃｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡｇｓ ＤＮＡａｓ ＤＮＡａｓ ＯｘｙＭＣｓ ＤＮＡａｓ ＯｘｙＡｓ ＯｘｙＭＣｓ ＯｘｙＡを指す。
「効力」は、通常、特に断りない限り、μM、nM又はpMでのＩＣ５０値又はＥＣ５０値として表わされる。また、効力は、％ 阻害で表わすこともできる。ＩＣ５０は、治療用分子の阻害濃度の中央値である。ＥＣ５０は、媒体又は対照（例えば、生理食塩水）に対する治療用分子の有効濃度の中央値である。機能アッセイにおいて、ＩＣ５０は、生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡの転写又はタンパク質発現を、治療用分子により達成される生物学的応答の５０％減少させる治療用分子の濃度である。機能アッセイにおいて、ＥＣ５０は、生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡの転写又はタンパク質発現の５０％を生じる治療用分子の濃度である。ＩＣ５０又はＥＣ５０は、当技術分野において公知の任意の数の手段により計算することができる。
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「ほ乳類」は、診断、予後又は治療が所望される任意の対象、特に、ほ乳類の対象を意味する。ほ乳類の対象は、ヒト、家畜、農場動物、競技用動物及び動物園動物を含み、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマ等を含む。
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態にあり、組成物が投与されるであろう対象に対して許容できない毒性の更なる成分を含有しない調製物を指す。このような組成物は無菌であることができる。
本明細書で開示されたＡＳＯの「有効量」は、具体的に記載された目的を行うのに十分な量である。「有効量」は、記載された目的に関連して、経験的かつルーチンな方法で決定することができる。
「処置すること」もしくは「処置」もしくは「処置する」又は「緩和すること」もしくは「緩和する」等の用語は、（１）診断された病態又は障害を治癒し、それらの進行を遅らせ、それらの症状を緩和しかつ／又はそれらの進行を停止させる治療的手段と、（２）ターゲットとする病態又は障害の進展を防止しかつ／又は遅らせる予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）手段との両方を指す。このため、処置が必要なものは、既に障害を有するもの、障害を有する傾向にあるもの及び障害を予防すべきものを含む。特定の実施態様では、例えば、患者が、疾患又は障害に関連する症状の全部、部分的又は一過性の緩和又は消失を示す場合、対象は、本明細書の他の箇所に開示されている疾患又は状態について、本明細書に記載された方法に従って、成功裏に「処置」される。
ＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
本開示は、ほ乳類のα−Ｓｙｎをコードする核酸分子、例えば、ＳＮＣＡ核酸、例えば、ＳＮＣＡプレｍＲＮＡ及びＳＮＣＡ ｍＲＮＡを含むＳＮＣＡ転写物又はほ乳類のα−Ｓｙｎをコードするこのような核酸分子の天然変異体の機能をモデュレーションするのに使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する。本開示の文脈において、「ＡＳＯ」という用語は、２つ以上のヌクレオチドの共有結合により形成される分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を指す。
ＡＳＯは、約１０〜約３０、例えば、１０〜２０、１６〜２０又は１５〜２５ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用する場合、「アンチセンスＡＳＯ」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」及び「オリゴマー」という用語は、「ＡＳＯ」という用語と互換的である
配列番号への言及は、特定の核酸塩基配列を含むが、図１Ａ〜Ｃ又は図２に示された設計又は完全な化学構造を何ら含まない。さらに、本明細書において図面に開示されたＡＳＯは、代表的な設計を示すが、特に断りない限り、図面に示された特定の設計には限定されない。また、本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）は、モノマー又は単位とも呼ぶことができる。本明細書において、特定のＡＳＯ番号に言及する場合、この言及は、配列、特定のＡＳＯ設計及び化学構造を含む。本明細書において、特定のＤＥＳ番号に言及する場合、この言及は、配列及び特定のＡＳＯ設計を含む。例えば、特許請求の範囲（又は明細書）において、配列番号：１４３６に言及する場合、それは、ctaacaacttctgaacaacaのヌクレオチド配列のみを含む。特許請求の範囲（又は明細書）において、ＤＥＳ−００３０９２に言及する場合、それは、図面に示されたＡＳＯ設計を有するctaacaacttctgaacaacaのヌクレオチド配列（すなわち、CtaACaacttctgaaCaACA）を含む。また、代替的には、ＡＳＯ−００３０９２の設計は、配列番号：１４３６として記載することができる。ここで、５’末端から第１のヌクレオチド、第４のヌクレオチド、第５のヌクレオチド、第１６のヌクレオチド及び第１８〜第２０のヌクレオチドはそれぞれ、修飾ヌクレオチド、例えば、ＬＮＡであり、他のヌクレオチドはそれぞれ、非修飾ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）である。ＡＳＯ番号は、配列及びＡＳＯ設計並びにＡＳＯの特定の詳細を含む。したがって、本願で言及されたＡＳＯ−００３０９２は、ＯｘｙＭＣｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡａｓ ＯｘｙＡｓ ＯｘｙＭＣｓ ＤＮＡａｓ ＤＮＡａｓ ＤＮＡｃｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡｃｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡｇｓ ＤＮＡａｓ ＤＮＡａｓ ＯｘｙＭＣｓ ＤＮＡａｓ ＯｘｙＡｓ ＯｘｙＭＣｓ ＯｘｙＡを示す。ここで、「ｓ」は、ホスホロチオアート結合を示す。
種々の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＲＮＡ（単位）を含まない。一部の実施態様では、ＡＳＯは、１つ以上のＤＮＡ単位を含む。一実施態様では、本開示のＡＳＯは、線状分子であるか又は線状分子として合成される。一部の実施態様では、ＡＳＯは、一本鎖分子であり、例えば、同じＡＳＯ内の同等の領域に相補的で少なくとも３、４又は５個の連続ヌクレオチドの短い領域（すなわち、二重鎖）を含まず、この点に関して、ＡＳＯは、（本質的に）二本鎖ではない。一部の実施態様では、ＡＳＯは、本質的に二本鎖ではない。一部の実施態様では、ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡではない。種々の実施態様では、本開示のＡＳＯは、連続ヌクレオチド領域全体からなることができる。このため、一部の実施態様では、ＡＳＯは、実質的に自己相補的ではない。
一実施態様では、本開示のＡＳＯは、任意の薬学的に許容し得る塩の形態にあることができる。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る塩」という用語は、ＡＳＯがその塩を形成することにより修飾（例えば、カチオンが付加）された、本開示のＡＳＯの誘導体を指す。このような塩は、望ましくない毒物学的影響を与えることなく、ＡＳＯの所望の生物学的活性を保持する。一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ナトリウム塩の形態にある。他の実施態様では、ＡＳＯは、カリウム塩の形態にある。
ＩＩ．Ａ．ターゲット
適切には、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ又はＳＮＣＡタンパク質の発現をダウンレギュレーション（例えば、減少又は除去）可能である。この点に関して、開示のＡＳＯは、典型的には、ほ乳類細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、ニューロン細胞において、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡレベルの低下を介して、ＳＮＣＡタンパク質の間接的な阻害に影響を及ぼすことができる。特に、本開示は、ＳＮＣＡ プレｍＲＮＡの１つ以上の領域をターゲットとするＡＳＯに向けられる。
ＳＮＣＡの同義語は公知であり、ＮＡＣＰ、ＡＤアミロイドの非Ａ−ベータ成分、ＰＡＲＫ１、ＰＡＲＫ４及びＰＤ１を含む。ＳＮＣＡ遺伝子についての配列は、公衆に利用可能なアクセッション番号ＮＣ＿０００００４．１２に見出すことができ、ＳＮＣＡ プレｍＲＮＡ転写物についての配列は、公衆に利用可能なアクセッション番号ＮＧ＿０１１８５１．１（配列番号：１）に見出すことができる。ＳＮＣＡタンパク質についての配列は、公衆に利用可能なアクセッション番号：Ｐ３７８４０、Ａ８Ｋ２Ａ４、Ｑ１３７０１、Ｑ４ＪＨＩ３及びＱ６ＩＡＵ６に見出すことができる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ＳＮＣＡ遺伝子産物の天然変異体は公知である。例えば、ＳＮＣＡタンパク質の天然変異体は、Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ｈ５０Ｑ、Ａ５３Ｔ及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含有することができる。したがって、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡタンパク質の天然変異体の発現を減少させ又は阻害するように設計することができる。
ＳＮＣＡにおける突然変異は、１つ以上の病態を引き起こすことが公知である。本開示のＡＳＯは、ＳＮＰ又は１つ以上の突然変異を含有する選択的スプライシングされたＳＮＣＡ転写物の発現を減少させ又は阻害し、その結果、突然変異ＳＮＣＡタンパク質の形成を減少させるのに使用することができる。ＳＮＣＡタンパク質の突然変異体の例は、Ｄ２Ａ、Ｅ３５Ｋ、Ｙ３９Ｆ、Ｈ５０Ａ、Ｅ５７Ｋ、Ｇ６７＿Ｖ７１ｄｅｌ、Ｖ７１＿Ｖ８２ｄｅｌ、Ａ７６＿Ｖ７７ｄｅｌ、Ａ７６ｄｅｌ、Ｖ７７ｄｅｌ、Ａ７８ｄｅｌ、Ａ８５＿Ｆ９４ｄｅｌ、Ｙ１２５Ｆ、Ｙ１３３Ｆ、Ｙ１３６Ｆから選択される１つ以上の突然変異及びそれらの任意の組み合わせを含むＳＮＣＡタンパク質を含むが、これらに限定されない。本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡタンパク質の任意の突然変異体の発現を減少させ又は阻害するように設計することができる。
ＡＳＯのターゲット核酸配列の例は、ＳＮＣＡ プレｍＲＮＡである。配列番号：１は、ＳＮＣＡゲノム配列を表わす。配列番号：１は、配列番号：１におけるヌクレオチド「ｔ」がプレｍＲＮＡにおいて「ｕ」として示されることを除いて、ＳＮＣＡ プレｍＲＮＡ配列と同一である。特定の実施態様では、「ターゲット核酸」は、ＳＮＣＡタンパク質をコードする核酸又はその天然の変異体のイントロン領域及び該核酸から得られるＲＮＡ核酸、例えば、プレｍＲＮＡを含む。他の実施態様では、「ターゲット核酸」は、ＳＮＣＡタンパク質をコードする核酸又はその天然の変異体のエクソン領域及び該核酸から得られるＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡを含む。一部の実施態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、「ターゲット核酸」は、上記ＤＮＡ核酸ターゲット又はＲＮＡ核酸ターゲットから得られるｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであることができる。一実施態様では、ＳＮＣＡゲノム配列は、GenBankアクセッション番号ＮＧ＿０１１８５１．１（配列番号：１）として示される。ＳＮＣＡタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡは、配列番号：２（ＮＭ＿０００３４５．３）として示される。この配列の変異体は、配列番号：３（ＮＭ＿００１１４６０５４．１）、配列番号：４（ＮＭ＿００１１４６０５５．１）及び配列番号：５（ＮＭ＿００７３０８．２）の変異体２〜４それぞれで示される。変異体２は、GenBankアクセッション番号ＮＭ＿００１１４６０５４．１に対応する。変異体３は、GenBankアクセッション番号ＮＭ＿００１１４６０５５．１に対応する。変異体４は、GenBankアクセッション番号ＮＭ＿００７３０８．２に対応する。ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ（配列番号：２）によりコードされるＳＮＣＡタンパク質配列は、配列番号：６として示される。
本発明のオリゴヌクレオチドが相補的であるターゲット核酸配列を以下の表にまとめる。
Figure 2021511027
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、ほ乳類のＳＮＣＡのエクソン領域をターゲットとすることができ又は例えば、以下の表に示されたように、ＳＮＣＡ プレｍＲＮＡにおけるイントロン領域をターゲットとすることができる。
Figure 2021511027
一実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物内の核酸配列、例えば、配列番号：１のエクソン、イントロンもしくはそれらの任意の組み合わせに対応する領域又は配列番号：２、３、４もしくは５内の領域に相補的な、長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、該核酸配列は、（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド４９４２〜５３４３；（ｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６３２６〜７０４１；（ｉｉａ）配列番号：１のヌクレオチド６３３６〜７０４１；（ｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド７３２９〜７６００；（ｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド７６３０〜７７８３；（ｉｖａ）配列番号：１のヌクレオチド７７５０〜７７８３；（ｖ）配列番号：１のヌクレオチド８２７７〜８５０１；（ｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド９０３４〜９５２６；（ｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド９９８２〜１４２７９；（ｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１５２０４〜１９０４１；（ｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド２０３５１〜２９６５４；（ｉｘａ）配列番号：１のヌクレオチド２０３５１〜２０９０８；（ｉｘｂ）配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜２９６５４；（ｘ）配列番号：１のヌクレオチド３０９３１〜３３９３８；（ｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド３４９３２〜３７０７７；（ｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド３８０８１〜４２８６９；（ｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド４４６４０〜４４８６１；（ｘｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド４６１７３〜４６９２０；（ｘｖ）配列番号：１のヌクレオチド４７９２４〜５８７５２；（ｘｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド６０６７８〜６０９０５；（ｘｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６２０６６〜６２３９７；（ｘｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６７７５９〜７１６２５；（ｘｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド７２９２６〜８６９９１；（ｘｘ）配列番号：１のヌクレオチド８８１６８〜９３７８３；（ｘｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド９４９７６〜１０２５７３；（ｘｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０４９２０〜１０７４３８；（ｘｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０８９４８〜１１９２８５；（ｘｘｉｉｉａ）配列番号：１のヌクレオチド１０８９４８〜１１４０１９；（ｘｘｉｉｂ）配列番号：１のヌクレオチド１１４２９２〜１１６６３６；（ｘｘｉｖ）配列番号：５のヌクレオチド１３１〜６７８；（ｘｘｖ）配列番号：３のヌクレオチド１３１〜３４８；（ｘｘｖｉ）配列番号：４のヌクレオチド１〜１６２；（ｘｘｖｉｉ）配列番号：２のヌクレオチド１２６〜３５２；（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のヌクレオチド２７６〜５３７；（ｘｘｉｘ）配列番号：２のヌクレオチド４６１〜６８１及び（ｘｘｘ）配列番号：２のヌクレオチド５４１〜７６６に対応する。
別の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物のイントロン内の領域（例えば、配列番号：１のイントロン（例えば、イントロン１、２、３又は４）に対応する領域）にハイブリダイズするか又は相補的、例えば、少なくとも９０％相補的、例えば、完全に相補的な、１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施態様では、ＡＳＯは、イントロンｉ０（配列番号：１のヌクレオチド１〜６０９７）；ｉ１（配列番号：１のヌクレオチド６３３６〜７６０４）；ｉ２（配列番号：１のヌクレオチド７７５１〜１５１１２）；ｉ３（配列番号：１のヌクレオチド１５１５５〜２０９０８）；ｉ４（配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜１１４０１９）；ｉ５（配列番号：１のヌクレオチド１１４１０４〜１１６６３６）又はｉ６（配列番号：１のヌクレオチド１１９１９９〜１２１１９８）から選択される、ヒトＳＮＣＡのプレｍＲＮＡに存在するイントロン領域に少なくとも９０％相補的、例えば、完全に相補的な、長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施態様では、ＡＳＯは、ヒトＳＮＣＡに少なくとも９０％相補的、例えば、完全に相補的な、長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、該核酸配列は、配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜２０３５１〜２９６５４；配列番号：１のヌクレオチド３０９３１〜３３９３８；配列番号：１のヌクレオチド４４６４０〜４４８６１；又は配列番号：１のヌクレオチド４７９２４〜５８７５２に対応する。
特に、イントロン４（配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜１１４０１９）、例えば、配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜２９６５４；配列番号：１のヌクレオチド２４４８３〜２８７９１；配列番号：１のヌクレオチド３０９３１〜３３９３８；配列番号：１のヌクレオチド３２２２６〜３２２４２；配列番号：１のヌクレオチド４４６４０〜４４８６１；配列番号：１のヌクレオチド４４７４１〜４４７５８；配列番号：１のヌクレオチド４７９２４〜５８７５２又は配列番号：１のヌクレオチド４８６４１〜４８６５９から選択されるイントロン４領域に相補的なＡＳＯが有利である。
別の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物の核酸配列又はこの配列内の領域にハイブリダイズし又は相補的、例えば、少なくとも９０％相補的、例えば、完全に相補的な、１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、該核酸配列は、配列番号：１のヌクレオチド６，４２６〜６，８２５；１８，５６９〜２０，５５５；又は３１，３９８〜１０７，２２０に対応し、ここで、ＡＳＯは、本明細書に記載されている設計（例えば、セクションＩＩ．Ｇ．例えば、ギャップマー設計、例えば、交互フランクギャップマー設計）のうちの１つ又は本明細書の他の箇所（例えば、図１Ａ〜１Ｃ及び図２）に示されている化学構造を有する。
別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド５，０４２〜５，２４３に対応する。
他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド６３３６〜７６０４に対応する。
他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド６３３６〜７０４１に対応する。
他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド６，４２６〜６，９４１に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド７，４２９〜７，６００に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド７，６３０〜７，６８３に対応する。
他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド７７５１〜１５１１２に対応する。
他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド７７５１〜７７８３に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド８，３７７〜８，４０１に対応する。
別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド９，１３４〜９，４２６に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１０，０８２〜１４，１７９に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１５，３０４〜１８，９４１に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１５１５５〜２０９０８に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド２０，４５１〜２９，５５４に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド２０３５１〜２０９０８に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜１１４０１９に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜２９６５４に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド３１，０３１〜３３，８３８に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド３０９３１〜３３９３８に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド３５０３２〜３６９７７に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド３８１８１〜４２７６９に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド４４６４０〜４４８６１に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド４４７４０〜４４７６１に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド４６２７３〜４６８２０に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド４７９２４〜５８７５２に対応する。
他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド４８０２４〜５８７５２に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド６０７７８〜６０８０５に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド６２，１６６〜６２，２９７に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド６７，８５９〜７１，５２５に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド７３０２６〜８６８９１に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド８８２６８〜９３６８３に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド９５０７６〜１０２４７３に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１０５０２０〜１０７３３８に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１０９，０４８〜１１９，１８５に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１０８９４８〜１１４０１９に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１４２９２〜１１６６３６に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：５のヌクレオチド２３１〜２４８又は５６３〜５７８に対応する。
別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：３のヌクレオチド２３１〜２４８に対応する。
一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：４のヌクレオチド３８〜６２に対応する。
他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：２のヌクレオチド２２６〜２５２に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：２のヌクレオチド３７６〜４３７に対応する。
別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：２のヌクレオチド５６１〜５８１に対応する。
一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：２のヌクレオチド６４１〜６６６に対応する。
特定の実施態様では、ＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物、例えば、配列番号：１内の領域にハイブリダイズするか又は相補的、例えば、少なくとも９０％相補的、例えば、完全に相補的であり、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０以上の配列スコアを有する。配列スコアの計算方法は、本明細書の他の箇所に開示されている。
一実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物のエクソン内の領域、例えば、配列番号：１のエクソン、例えば、エクソン２、４、５又は６に対応する領域にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。別の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物の核酸配列又はこの配列内の領域（「ターゲット領域」）にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、該核酸配列は、配列番号：１のヌクレオチド７，６３０〜７，６８３；２０，９３２〜２１，０３２；１１４，０５９〜１１４，０９８；又は１１６，６５９〜１１９，１８５に対応する。別の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物の核酸配列又はこの配列内の領域にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、該核酸配列は、配列番号：１のヌクレオチド７，６３０〜７，６８３；２０，９２６〜２１，０３２；１１４，０５９〜１１４，０９８；又は１１６，６５９〜１１９，１８５に対応し、ここで、ＡＳＯは、本明細書に記載されている設計（例えば、セクションＩＩ．Ｇ．例えば、ギャップマー設計、例えば、交互フランクギャップマー設計）のうちの１つ又は本明細書の他の箇所（例えば、図１Ａ〜１Ｃ及び図２）に示されている化学構造を有する。
別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド７，６３０〜７，６８３に対応する。一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド２０，９３２〜２１，０３２に対応する。特定の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１４，０５９〜１１４，０９８に対応する。一実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１６，６５９〜１１９，１８５に対応する。別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１６，９８１〜１１７，２１２に対応する。一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１６，９８１〜１１７，０１９に対応する。他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１７，０６８〜１１７，０９８に対応する。特定の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１７，１８５〜１１７，２１２に対応する。別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１８，７０６〜１１８，７２５に対応する。特定の実施態様では、ＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物、例えば、配列番号：１のエクソン内の領域にハイブリダイズし、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０以上の配列スコアを有する。配列スコアの計算方法は、本明細書の他の箇所に開示されている。
他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド６，４２６〜６，８２５（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１８，５６９〜２０，５５５（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド２０，９２６〜２１，０３２（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド３１，３９８〜３１，４１３（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド３５，０３２〜３５，０４９（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。特定の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド６８，３７３〜６９，８２７（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド７８，４１８〜７８，４８７（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド９１，６３０〜９１，６４６（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。一部の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１００，０２８〜１０１，１６０（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。特定の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１０７，２０５〜１０７，２２０（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。別の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１４，０５９〜１１４，０９８（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド１１６，６５９〜１１９，１８５（３’末端、５’末端又はその両方に）±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０又は±９０ヌクレオチドに対応する。他の実施態様では、ターゲット領域は、配列番号：１のヌクレオチド７，６０４〜７，６２０（３’末端、５’末端又はその両方に）±１、±２、±３、±４、±５、±６、±７、±８又は±９ヌクレオチドに対応する。
特定の実施態様では、本開示のＡＳＯは、生理学的条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下でターゲット核酸（例えば、ＳＮＣＡ転写物）にハイブリダイズ可能である。一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ターゲット核酸（例えば、ＳＮＣＡ転写物）にハイブリダイズ可能である。一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ストリンジェントな条件下でターゲット核酸（例えば、ＳＮＣＡ転写物）にハイブリダイズ可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件は、とりわけ、生産的細胞取込み、ＲＮＡアクセス性、温度、会合の自由エネルギー、塩濃度及び時間により決まる（例えば、Stanley T Crooks, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Edition, CRC Press(2007)を参照のこと）。一般的には、高〜中程度のストリンジェントな条件は、実質的に類似の核酸間のハイブリダイゼーションを可能にするが、異なる核酸間のハイブリダイゼーションはさせないために、ｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションに使用される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５×生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファー（０．７５M 塩化ナトリウム／０．０７５M クエン酸ナトリウム）中において、４０℃で１時間ハイブリダイゼーションさせ、続けて、サンプルを４０℃で１×ＳＳＣ中で１０回、室温で１×ＳＳＣバッファー中で５回洗浄することを含む。ｉｎ ｖｉｖｏハイブリダイゼーション条件は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとターゲット配列とのハイブリダイゼーションを管理する細胞内条件（例えば、生理的ｐＨ及び細胞内イオン条件）からなる。ｉｎ ｖｉｖｏ条件は、比較的低いストリンジェントな条件により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、２×ＳＳＣ（０．３M 塩化ナトリウム／０．０３M クエン酸ナトリウム）、０．１％ ＳＤＳ中、３７℃で行うことができる。４×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含有する洗浄溶液を３７℃で使用することができ、最後に、１×ＳＳＣ中において４５℃で洗浄する。
ＩＩ．Ｂ．ＡＳＯ配列
本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物の領域の相補体に対応する連続ヌクレオチド配列、例えば、配列番号：１に対応するヌクレオチド配列を含む。
特定の実施態様では、本開示は、合計で長さ１０〜３０ヌクレオチド、例えば、１０〜２５ヌクレオチド、例えば、１６〜２２、例えば、１０〜２０ヌクレオチド、例えば、１４〜２０ヌクレオチド、例えば、１７〜２０ヌクレオチド、例えば、１０〜１５ヌクレオチド、例えば、１２〜１４ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、ＡＳＯを提供し、ここで、連続ヌクレオチド配列は、ほ乳類のＳＮＣＡ転写物、例えば、配列番号：１もしくは配列番号：２又はその天然の変異体（配列番号：３、４又は５）の相補体内の領域と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。このため、例えば、ＡＳＯは、配列番号：１〜５の配列を有する一本鎖核酸分子又はその一部にハイブリダイズする。
一部の実施態様では、該オリゴヌクレオチドは、長さ１０〜３０ヌクレオチド、例えば、１０〜２５ヌクレオチド、例えば、１６〜２２、例えば、１０〜２０ヌクレオチド、例えば、１４〜２０ヌクレオチド、例えば、１７〜２０ヌクレオチド、例えば、１０〜１５ヌクレオチド、例えば、１２〜１４ヌクレオチドの連続配列を含み、同配列は、ほ乳類のＳＮＣＡ転写物、例えば、配列番号：１、２、３、４及び／又は５の領域と、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９３％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％又は１００％相補的である。
ＡＳＯは、ほ乳類のＳＮＣＡタンパク質をコードするターゲット核酸（例えば、配列番号：１〜５）の同等領域に完全に相補的（完璧に相補的）な連続ヌクレオチド配列を含むことができる。ＡＳＯは、ターゲット核酸配列又は配列番号：１のヌクレオチドＸ−Ｙ（ここで、Ｘ及びＹはそれぞれ、ＮＧ＿０１１８５１．１のプレｍＲＮＡ開始部位及びプレｍＲＮＡ終了部位である）に対応するこの配列内の領域、例えば、イントロン領域に完全に相補的（完璧に相補的）な連続ヌクレオチド配列を含むことができる。このような領域の例は、セクションＩＩ．Ａ「ターゲット」に列記されている。さらに、ＡＳＯは、本明細書の他の箇所に記載されている設計（例えば、セクションＩＩ．Ｇ．例えば、ギャップマー設計、例えば、交互フランクギャップマー設計）又は本明細書の他の箇所（例えば、図１Ａ〜１Ｃ及び図２）に示されている化学構造を有することができる。一部の実施態様では、ＡＳＯは、ターゲット核酸配列又は配列番号：２のヌクレオチドＸ−Ｙ（ここで、Ｘ及びＹはそれぞれ、ｍＲＮＡ開始部位及びｍＲＮＡ終了部位である）に対応するこの配列内の領域に完全に相補的（完璧に相補的）な連続ヌクレオチド配列を含む。このような領域の例は、セクションＩＩ．Ａ「ターゲット」に列記されている。他の実施態様では、ＡＳＯは、ターゲット核酸配列又は配列番号：３のヌクレオチドＸ−Ｙ（ここで、Ｘ及びＹはそれぞれ、ｍＲＮＡ開始部位及びｍＲＮＡ終了部位である）に対応するこの配列内の領域に完全に相補的（完璧に相補的）な連続ヌクレオチド配列を含む。このような領域の例は、セクションＩＩ．Ａ「ターゲット」に列記されている。他の実施態様では、ＡＳＯは、ターゲット核酸配列又は配列番号：４のヌクレオチドＸ−Ｙ（ここで、Ｘ及びＹはそれぞれ、ｍＲＮＡ開始部位及びｍＲＮＡ終了部位である）に対応するこの配列内の領域に完全に相補的（完璧に相補的）な連続ヌクレオチド配列を含む。このような領域の例は、セクションＩＩ．Ａ「ターゲット」に列記されている。他の実施態様では、ＡＳＯは、ターゲット核酸配列又は配列番号：５のヌクレオチドＸ−Ｙ（ここで、Ｘ及びＹはそれぞれ、ｍＲＮＡ開始部位及びｍＲＮＡ終了部位である）に対応するこの配列内の領域に完全に相補的（完璧に相補的）な連続ヌクレオチド配列を含む。このような領域の例は、セクションＩＩ．Ａ「ターゲット」に列記されている。
特定の実施態様では、本開示のＡＳＯのヌクレオチド配列又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：７〜１８７８から選択される配列（すなわち、図１Ａ〜１Ｃ及び図２における配列）と、少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば、約１００％の配列同一性（相同）を有する。一部の実施態様では、ＡＳＯは、本明細書の他の箇所に記載されている設計（例えば、セクションＩＩ．Ｇ．Ｉ、例えば、ギャップマー設計、例えば、交互フランクギャップマー設計）又は本明細書の他の箇所（例えば、図１Ａ〜１Ｃ及び図２）に示されているヌクレオシド化学構造を有する。
特定の実施態様では、本開示のＡＳＯのヌクレオチド配列又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３から選択される配列と、少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば、約１００％の配列同一性（相同）を有する。一部の実施態様では、ＡＳＯは、本明細書の他の箇所に記載されている設計（例えば、セクションＩＩ．Ｇ．Ｉ、例えば、ギャップマー設計、例えば、交互フランクギャップマー設計）又は本明細書の他の箇所（例えば、図１Ａ〜１Ｃ及び図２）に示されているヌクレオシド化学構造を有する。
更なる実施態様では、本開示のＡＳＯのヌクレオチド配列又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３から選択される配列からなる。
一実施態様では、本開示のＡＳＯのヌクレオチド配列又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：２７６；２７８；２９６；２９５；３２５；３２８；３２６；３２９；３３０；３２７；３３２；３３３；３３１；３３９；３４１；３９０；５２２及び５５９からなる群より選択される配列を含むか又はそれからなる。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されている設計（例えば、ＤＥＳ番号）を有する少なくとも１つのＡＳＯを含む。一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されている設計（例えば、ＤＥＳ番号）を有する少なくとも１つのＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されているＡＳＯより、３’末端において、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド又は４ヌクレオチド短い。他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されている設計（例えば、ＤＥＳ番号）を有する少なくとも１つのＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されているＡＳＯより、５’末端において、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド又は４ヌクレオチド短い。さらに他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されている設計（例えば、ＤＥＳ番号）を有する少なくとも１つのＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されているＡＳＯより、５’末端及び／又は３’末端において、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド又は４ヌクレオチド短い。
一実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、以下：
Figure 2021511027
（ここで、大文字は、糖修飾ヌクレオシド類似体を示し、小文字は、ＤＮＡを示す）
からなる群より選択される配列及び設計を含むか又はそれからなる。
他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されている化学構造（例えば、ＡＳＯ番号）を有する少なくとも１つのＡＳＯを含む。一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されている化学構造（例えば、ＡＳＯ番号）を有する少なくとも１つのＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されているＡＳＯより、３’末端において、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド又は４ヌクレオチド短い。他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されている化学構造（例えば、ＡＳＯ番号）を有する少なくとも１つのＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されているＡＳＯより、５’末端において、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド又は４ヌクレオチド短い。さらに他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されている化学構造（例えば、ＡＳＯ番号）を有する少なくとも１つのＡＳＯを含み、ここで、ＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に開示されているＡＳＯより、５’末端及び／又は３’末端において、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド又は４ヌクレオチド短い。
一部の実施態様では、ＡＳＯ（又はその連続したヌクレオチド部分）は、配列番号：７〜１８７８からなる群より選択される配列のうちの１つ及びその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか又はそれを含み、ここで、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＳＮＣＡ転写物と比較した場合、場合により、１、２、３又は４個のミスマッチを含むことができる。１個以下のミスマッチ又は２個以下のミスマッチがあると有利である。
一部の実施態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３からなる群より選択される配列のうちの１つ及びその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか又はそれを含み、ここで、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＳＮＣＡ転写物と比較した場合、場合により、１、２、３又は４個のミスマッチを含むことができる。１個以下のミスマッチ又は２個以下のミスマッチがあると有利である。
一実施態様では、ＡＳＯは、配列番号：１４３６（ＡＳＯ−００３０９２の配列）及び配列番号：１５４７（ＡＳＯ−００３１７９の配列）からなる群より選択される配列を含む。
別の実施態様では、ＡＳＯは、ＡＳＯ−００８３８７；ＡＳＯ−００８３８８；ＡＳＯ−００８５０１；ＡＳＯ−００８５０２；ＡＳＯ−００８５２９；ＡＳＯ−００８５３０；ＡＳＯ−００８５３１；ＡＳＯ−００８５３２；ＡＳＯ−００８５３３；ＡＳＯ−００８５３４；ＡＳＯ−００８５３５；ＡＳＯ−００８５３６；ＡＳＯ−００８５３７；ＡＳＯ−００８５４３；ＡＳＯ−００８５４５；ＡＳＯ−００８５８４；ＡＳＯ−００８２２６及びＡＳＯ−００８２６１からなる群より選択される配列を含む。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ターゲット核酸配列（例えば、ＳＮＣＡ転写物）に結合し、３．１３μg、１２．５μg、２５μg、５０μg又は１００μg 用量でｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与された場合、本明細書で開示されたアッセイ、例えば、定量ＰＣＲ又はQUANTIGENE（登録商標）分析により測定されるとき、対照（例えば、内部対照、例えば、ＧＡＤＰＨもしくはチューブリン又は媒体対照単独で投与されたマウス）と比較して、ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するマウス（例えば、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣ）の組織（例えば、脳領域）において、ＳＮＣＡ転写物の発現を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％阻害可能であるか又は低下可能である。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、３．１３μg、１２．５μg、２５μg、５０μg又は１００μg 用量でｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与された場合、本明細書で開示されたアッセイ、例えば、High Contentアッセイ（実施例２Ａを参照のこと）により測定されるとき、対照（例えば、内部対照、例えば、ＧＡＤＰＨもしくはチューブリン又は媒体対照単独で投与されたマウス）と比較して、ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するマウス（例えば、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣ）の組織（例えば、脳領域）において、ＳＮＣＡタンパク質の発現を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％低下可能である。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ターゲット核酸配列（例えば、ＳＮＣＡ転写物）に結合し、４mg、８mg又は１６mg 用量でｉｎ ｖｉｖｏにおいて１回又は２回投与された場合、本明細書で開示されたアッセイ、例えば、定量ＰＣＲ又はQUANTIGENE（登録商標）分析により測定されるとき、対照（例えば、内部対照、例えば、ＧＡＤＰＨもしくはチューブリン又は媒体対照単独で投与されたカニクイザル（ｃｙｎｏ））と比較して、野生型ＳＮＣＡ遺伝子を発現するカニクイザルの組織（例えば、脳領域）において、ＳＮＣＡ転写物の発現を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％阻害可能であるか又は低下可能である。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、４mg、８mg又は１６mg 用量でｉｎ ｖｉｖｏにおいて１回又は２回投与された場合、本明細書で開示されたアッセイ、例えば、High Contentアッセイ（実施例２Ａを参照のこと）により測定されるとき、対照（例えば、内部対照、例えば、ＧＡＤＰＨもしくはチューブリン又は媒体対照単独で投与されたカニクイザル（ｃｙｎｏ））と比較して、野生型ＳＮＣＡ遺伝子を発現するカニクイザルの組織（例えば、脳領域）において、ＳＮＣＡタンパク質の発現を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％低下可能である。
他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ニューロンを５μM、３．３μM、１μM、４nM、４０nM又は２００nM アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させた場合、本明細書で開示されたアッセイ、例えば、QUANTIGENE（登録商標）分析により測定されるとき、対照（例えば、内部対照、例えば、ＧＡＤＰＨもしくはチューブリン又は生理食塩水単独と接触させた全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するマウス初代ニューロン）と比較して、全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するマウス初代ニューロン（例えば、ＰＡＣニューロン）において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％低下可能である。
さらに他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ニューロンを５μM、３．３μM、１μM、４nM、４０nM又は２００nM アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させた場合、本明細書で開示されたアッセイ、例えば、High Contentアッセイ（実施例２Ａを参照のこと）により測定されるとき、対照（例えば、内部対照、例えば、ＧＡＤＰＨもしくはチューブリン又は生理食塩水単独と接触させた全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するマウス初代ニューロン）と比較して、全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するマウス初代ニューロン（例えば、ＰＡＣニューロン）において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＳＮＣＡタンパク質の発現を、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％低下可能である。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、神経芽細胞腫細胞を２５μM アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させた場合、本明細書で開示されたアッセイ、例えば、定量ＰＣＲにより測定されるとき、対照（例えば、内部対照、例えば、ＧＡＤＰＨもしくはチューブリン又は生理食塩水単独と接触させた全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現する神経芽細胞腫細胞）と比較して、全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するヒト神経芽細胞腫細胞系統（例えば、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２））において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％低下可能である。
一部の実施態様では、本明細書で開示されたＡＳＯは、本明細書で開示されたアッセイ、例えば、High Contentアッセイ分析（実施例２Ａを参照のこと）により測定された場合、対照（例えば、内部対照、例えば、ＧＡＤＰＨもしくはチューブリン又は生理食塩水単独と接触させた全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現する神経芽細胞腫細胞）と比較して、神経芽細胞腫細胞を２５μM アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させた場合、全長ヒトＳＮＣＡ遺伝子を発現するヒト神経芽細胞腫細胞系統（例えば、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２））において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＳＮＣＡタンパク質の発現を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％低下可能である。
特定の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物に結合し、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を、細胞における正常な（すなわち、対照）発現レベルと比較して、少なくとも約１０％又は約２０％、例えば、細胞における正常な発現レベル（例えば、ＡＳＯ又はコンジュゲートの不存在下での発現レベル）と比較して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約９５％阻害し又は低下させる。特定の実施態様では、ＡＳＯは、ＡＳＯに曝されていない細胞（すなわち、対照）と比較して、ＡＳＯの投与後の細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の発現を、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％低下させる。一部の実施態様では、ＡＳＯは、ＡＳＯに曝されていない細胞（すなわち、対照）と比較して、ＡＳＯの投与後の細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の発現を、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％低下させる。
特定の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＡＳＯに曝されていない対照細胞と比較して、（１）細胞におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を低下させる；（２）細胞におけるカルシウム振動を著しく減少させない；（３）細胞におけるチューブリン強度を著しく低下させない；（４）細胞におけるα−Ｓｙｎタンパク質の発現を低下させる；及び（５）ＡＳＯに曝されていない対照細胞と比較したそれらの任意の組み合わせ、から選択される少なくとも１つの特性を有する。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、細胞、例えば、ニューロン細胞におけるカルシウム振動を著しく減少させない。ＡＳＯが、細胞におけるカルシウム振動を著しく減少させない場合、ＡＳＯのこの特性は、ＡＳＯの神経毒性の低下に対応する。一部の実施態様では、カルシウム振動は、ＡＳＯに曝されていない細胞における振動の９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７５％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上又は５０％以上である。
カルシウム振動は、ニューロン細胞の適切な機能に重要である。皮質ニューロンのネットワークは、神経伝達物質であるグルタミン酸の放出をもたらす自発的なカルシウム振動を受けることが示されている。カルシウム振動は、ネットワークにおける他の関連ニューロンに加えて、ニューロンと関連グリアとの相互作用をレギュレーションして、グルタミン酸に加えて他の神経伝達物質を放出させることもできる。レギュレーションされたカルシウム振動は、正常な脳機能のためのニューロンネットワークのホメオスタシスに必要である（Shashank et al., Brain Research, 1006(1): 8-17 (2004)；Rose et al., Nature Neurosci., 4:773 - 774 (2001)；Zonta et al., J Physiol Paris., 96(3-4):193-8 (2002)；Pasti et al., J. Neurosci., 21(2): 477-484 (2001)を参照のこと）。また、グルタミン酸は、２個の別個のイオンチャンネルであるα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）レセプター及びＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターを活性化させる。
一部の実施態様では、本方法で測定されるカルシウム振動は、ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動である。一部の実施態様では、カルシウム振動は、ＮＭＤＡ依存性カルシウム振動である。一部の実施態様では、カルシウム振動は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）依存性カルシウム振動である。一部の実施態様では、カルシウム振動は、ＡＭＰＡ依存性、ＮＭＤＡ依存性又はＧＡＢＡ依存性カルシウム振動の２つ以上の組み合わせであることができる。
特定の実施態様では、本方法で測定されるカルシウム振動は、ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動である。ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動を測定するために、Ｍｇ２＋イオン（例えば、ＭｇＣｌ２）の存在下で、カルシウム振動を測定することができる。特定の実施態様では、該方法は、ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動の検出を可能にする量で、Ｍｇ２＋イオン（例えば、ＭｇＣｌ２）を加えることをさらに含む。一部の実施態様では、ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動の検出を可能にする有効イオン濃度は、少なくとも約０．５mMである。他の実施態様では、ＡＭＰＡ依存性カルシウム振動を誘引するための有効イオン濃度は、少なくとも約０．６mM、少なくとも約０．７mM、少なくとも約０．８mM、少なくとも約０．９mM、少なくとも約１mM、少なくとも約１．５mM、少なくとも約２．０mM、少なくとも約２．５mM、少なくとも約３．０mM、少なくとも約４mM、少なくとも約５mM、少なくとも約６mM、少なくとも約７mM、少なくとも約８mM、少なくとも約９mM又は少なくとも約１０mMである。特定の実施態様では、該方法に有用なＭｇ２＋イオン（例えば、ＭｇＣｌ２）の濃度は、１mMである。特定の実施態様では、該方法に有用なＭｇ２＋イオン（例えば、ＭｇＣｌ２）の濃度は、約１mM〜約１０mM、約１mM〜約１５mM、約１mM〜約２０mM又は約１mM〜約２５mMである。Ｍｇ２＋イオンは、マグネシウム塩、例えば、炭酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸マグネシウム及び硫酸マグネシウム七水和物の添加により加えることができる。
一部の実施態様では、カルシウム振動は、細胞内カルシウムレベルの変動を検出する蛍光プローブの使用により、本方法において測定される。例えば、細胞内カルシウムフラックスの検出は、カルシウムイオンに結合する蛍光色素（蛍光カルシウムインジケーターとして公知）で細胞を染色し、結果として検出可能な蛍光変化（例えば、Molecular Probes. Eugene, OR, United States of Americaから入手できるFluo-4 AM及びFura Red AM色素）を得ることにより達成することができる。
他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、細胞におけるチューブリン強度を著しく低下させない。一部の実施態様では、チューブリン強度は、ＡＳＯに曝されていない（又は生理食塩水に曝された）細胞におけるチューブリン強度の９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７５％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上又は５０％以上である。
一部の実施態様では、このような特性は、０．０４nM〜４００μM濃度の本開示のＡＳＯを使用した場合に観察される。同じか又は異なる実施態様では、細胞におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡ及び／又はＳＮＣＡタンパク質の発現の阻害又は低下は、ＡＳＯに曝されていない細胞と比較して、１００％未満、例えば、９８％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、例えば、７０％未満のｍＲＮＡ又はタンパク質レベルで生じる。発現レベルのモデュレーションは、ＳＮＣＡタンパク質レベルを測定することにより、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続けて、ターゲットタンパク質に対して生じる適切な抗体を使用するウェスタンブロッティング等の方法により決定することができる。代替的には、発現レベルのモデュレーションは、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのレベルを測定することにより、例えば、ノーザンブロット又は定量ＲＴ−ＰＣＲにより決定することができる。ｍＲＮＡレベルにより阻害を測定する場合、適切な用量、例えば、約０．０４nM〜約４００μM濃度を使用する場合のダウンレギュレーションのレベルは、一部の実施態様では、典型的には、ＡＳＯの不存在下での細胞における正常レベルの約１０〜２０％のレベルである。
特定の実施態様では、本開示のＡＳＯは、総スコア４以下のｉｎ ｖｉｖｏ耐容性を有し、ここで、総スコアは、１）過活動；２）活動及び覚醒の低下；３）運動機能障害及び／又は運動失調；４）異常な姿勢及び呼吸並びに５）振戦及び／又は痙攣である５つのカテゴリーの単位スコアの合計であり、ここで、各カテゴリーの単位スコアは、０〜４のスケールで測定される。特定の実施態様では、ｉｎ ｖｉｖｏ耐容性は、３以下の総スコア、２の総スコア、１の総スコア又は０の総スコア以下である。一部の実施態様では、ｉｎ ｖｉｖｏ耐容性についての評価は、以下の実施例に記載されるように決定される。
一部の実施態様では、ＡＳＯは、ターゲット配列にハイブリダイズした場合、１、２、３又は４（又はそれ以上）のミスマッチを許容ことができ、それでもなお、ターゲットに十分に結合して、所望の効果、すなわち、ターゲットｍＲＮＡ及び／又はタンパク質のダウンレギュレーションを示すことができる。ミスマッチは、例えば、本明細書の他の箇所に開示されている、ＡＳＯヌクレオチド配列の長さの伸長及び／又はヌクレオチド類似体の数の増加により補償することができる。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ターゲット配列にハイブリダイズした場合、３つ以下のミスマッチを含む。他の実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、ターゲット配列にハイブリダイズした場合、２以下のミスマッチを含む。他の実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、ターゲット配列にハイブリダイズした場合、１以下のミスマッチを含む。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、配列番号：７〜１８７８のいずれか１つのヌクレオチド配列又はこの配列内の領域を含み、ＡＳＯ配列は、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に記載されている設計を有し、ＡＳＯ配列は、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に記載されている化学構造を有する。
ただし、一部の実施態様では、ＡＳＯのヌクレオチド配列は、追加の５’又は３’ヌクレオチド、例えば、１〜５個、例えば、２〜３個の追加のヌクレオチド、例えば、独立して、１、２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを含むことができることが認識される。追加の５’及び／又は３’ヌクレオチドは、好ましくは、ターゲット配列に非相補的である。この点において、本開示のＡＳＯは、一部の実施態様では、追加のヌクレオチドが５’及び／又は３’に隣接する連続ヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施態様では、追加の５’及び／又は３’ヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡである。更なる実施態様では、５’末端又は３’末端の天然ヌクレオチドは、ホスホジエステル（ＰＯ）ヌクレオチド間結合で結合している。このような末端ＰＯ結合は、ターゲット細胞に入るとヌクレアーゼにより開裂可能であり、生物開裂可能リンカーとも呼ばれ、ＷＯ第２０１４／０７６１９５号に詳細に記載されている。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、０．２以上の配列スコアを有し、ここで、配列スコアは、式Ｉ：
Ｃヌクレオチド及びその類似体の＃−Ｇヌクレオチド及びその類似体の＃／全ヌクレオチド長 （Ｉ）
により計算される。
他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、０．２以上の配列スコアを有し、ここで、配列スコアは、式ＩＡ：
Ｃヌクレオチドの＃及び５−メチルシトシンヌクレオチド−Ｇヌクレオチドの＃／全ヌクレオチド長 （ＩＡ）
により計算される。
これらの実施態様では、カットオフ値以上の配列スコアは、ＡＳＯの神経毒性の低下に対応する。
特定の実施態様では、本開示のＡＳＯは、約０．１、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５又は１．０以上の配列スコアを有する。
一実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物の非コード領域にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、ＡＳＯの配列スコアは、約０．１、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５又は１．０以上である。
別の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物のイントロン領域にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、ＡＳＯの配列スコアは、約０．１、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５又は１．０以上である。
別の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＳＮＣＡ転写物のイントロンエクソン接合部にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、ＡＳＯの配列スコアは、約０．１、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５又は１．０以上である。
これらの実施態様の全てにおいて、配列スコアが、カットオフ値以上である場合、ＡＳＯは、低下した神経毒性を有すると考えられる。
ＩＩ．Ｃ．ＡＳＯの長さ
ＡＳＯは、合計長さ１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むことができる。
一部の実施態様では、ＡＳＯは、合計長さ約１０〜２２、例えば、１０〜２１、例えば、１２〜２０、例えば、１５〜２０、例えば、１７〜２０、例えば、１２〜１８、例えば、１３〜１７又は１２〜１６、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１個の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施態様では、ＡＳＯは、合計長さ１０、１１、１２、１３又は１４個の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施態様では、ＡＳＯは、合計長さ１６、１７、１８、１９又は２０個の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、２２ヌクレオチド以下、例えば、２１又は２０ヌクレオチド以下、例えば、１８ヌクレオチド以下、例えば、１５、１６又は１７ヌクレオチドからなる。一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、２２未満のヌクレオチドを含む。ＡＳＯ又は連続ヌクレオチド配列長について範囲が与えられる場合、この範囲は、例えば、１０〜３０の範囲（又はその間）で提供される下限及び上限の長さを含み、１０及び３０の両方を含むと理解されたい。
ＩＩ．Ｄ．ヌクレオシド及びヌクレオシド類似体
本開示の一態様では、ＡＳＯは、１つ以上の非天然ヌクレオチド類似体を含む。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド類似体」は、糖部分及び／又は塩基部分における修飾による、天然ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドの変異体である。類似体は、原則として、オリゴヌクレオチドの文脈において、天然ヌクレオチドに対して単に「サイレント」又は「同等」であることができる、すなわち、オリゴヌクレオチドがターゲット遺伝子発現を阻害するように作用する様式に機能的な影響を有さないことができる。それにもかかわらず、このような「同等」の類似体は、例えば、製造がより容易もしくはより安価であるか又は貯蔵もしくは製造条件に対してより安定であるか又はタグもしくはラベルを表わす場合に有用であることができる。一方、一部の実施態様では、類似体は、ＡＳＯが発現を阻害するように作用する様式に対して、例えば、ターゲットに対する結合親和性の向上及び／又は細胞内ヌクレアーゼに対する耐性の向上及び／又は細胞への輸送の容易さの向上を生じることにより、機能的影響を有するであろう。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213に記載されており、セクションＩＩ．Ｄ．ａ及びスキーム１（セクションＩＩＤ．２ｂ）に例証されている。
ＩＩ．Ｄ．１．核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン部分（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン及びシトシン）部分を含む。また、本開示の文脈において、核酸塩基という用語は、天然の核酸塩基とは異なる場合があるが、核酸ハイブリダイゼーションの間に機能的である、修飾された核酸塩基を包含する。一部の実施態様では、核酸塩基部分は、核酸塩基を修飾するか又は置換することにより修飾される。この文脈において、「核酸塩基」は、天然の核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンと、非天然の変異体との両方を指す。このような変異体は、例えば、Hirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。
一部の実施態様では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを、修飾プリン又は修飾ピリミジン、例えば、置換プリン又は置換ピリミジン、例えば、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル、５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２−チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン及び２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基に変更することにより修飾される。
核酸塩基部分は、各対応する核酸塩基、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵについての文字コードにより示すことができ、ここで、各文字は、場合により、同等の機能の修飾された核酸塩基を含むことができる。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ及び５−メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５−メチルシトシンＬＮＡ（ＭＣ）ヌクレオシドを使用することができる。
ＩＩ．Ｄ．２．糖修飾
本開示のＡＳＯは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見出されるリボース糖部分と比較した場合に、糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含むことができる。リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドが、主に、オリゴヌクレオチドの特定の特性、例えば、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性を改善する目的で作製されてきた。
このような修飾は、リボース環構造が例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）又は二環（典型的には、リボース環におけるＣ２’炭素とＣ４’炭素との間にビラジカル架橋を有する（ＬＮＡ））又は非結合リボース環（典型的には、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素との間の結合を欠いている（例えば、ＵＮＡ））による置き換えにより修飾されたものを含む。他の糖修飾ヌクレオシドは、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（ＷＯ第２０１３／１５４７９８号）を含む。また、修飾ヌクレオシドは、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシドも含む。
また、糖修飾は、リボース環における置換基を水素以外の基又はＲＮＡヌクレオシドに天然に見出される２’−ＯＨ基に変更することによりなされる修飾を含む。置換基は、例えば、２’、３’、４’又は５’位に導入することができる。また、修飾糖部分を有するヌクレオシドは、２’修飾ヌクレオシド、例えば、２’置換ヌクレオシドを含む。実際、多くの焦点が、２’置換ヌクレオシドの開発に費やされており、数多くの２’置換ヌクレオシドについて、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、有益な特性、例えば、ヌクレオシド耐性の向上及び親和性の向上を有することが見出されている。
一部の実施態様では、糖修飾は、親和性向上糖修飾、例えば、ＬＮＡを含む。親和性向上糖修飾は、ターゲットＲＮＡ配列に対するＡＳＯの結合親和性を向上させる。一部の実施態様では、本明細書に開示された糖修飾を含むＡＳＯは、対照（例えば、このような糖修飾を有さないＡＳＯ）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％向上した、ターゲットＲＮＡ配列に対する結合親和性を有する。
ＩＩ．Ｄ．２．ａ ２’修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は−ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）であるか又はリボース環における２’炭素と第２の炭素との間に架橋を形成可能な２’結合ビラジカル、例えば、ＬＮＡ（２’−４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドを含む。
実際、多くの焦点が、２’糖置換ヌクレオシドの開発に費やされており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに対する結合親和性の向上及び／又はヌクレアーゼ耐性の向上を提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213及びDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。以下は、幾つかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
Figure 2021511027
本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、２’架橋ヌクレオシド、例えば、ＬＮＡを含まない。
ＩＩ．Ｄ．２．ｂ ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
ＬＮＡヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間にリンカー基（ビラジカル又は架橋と呼ばれる）を含む修飾ヌクレオシドである。また、これらのヌクレオシドは、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯの修飾ヌクレオシド又はＬＮＡヌクレオシドは、式ＩＩ又はＩＩＩ：
Figure 2021511027
［式中、Ｗは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒａ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、例えば、一部の実施態様では、−Ｏ−から選択され、Ｂは、核酸塩基部分又は修飾核酸塩基部分を指定し、Ｚは、隣接するヌクレオシドへのヌクレオシド間結合又は５’−末端基を指定し、Ｚ＊は、隣接するヌクレオシドへのヌクレオシド間結合又は３’−末端基を指定し、Ｘは、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−及び＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される基を指定する］
で示される一般構造を有する。
一部の実施態様では、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、ＮＨ−、ＮＲａＲｂ、−ＣＨ２−、ＣＲａＲｂ、−Ｃ（＝ＣＨ２）−及び−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−からなる群より選択される。一部の実施態様では、Ｘは、−Ｏ−である。
一部の実施態様では、Ｙは、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−及び＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される基を指定する。一部の実施態様では、Ｙは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＲａＲｂ）Ｃ（ＲａＲｂ）Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−及び−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−からなる群より選択される。
一部の実施態様では、Ｙは、−ＣＨ２−、−ＣＨＲａ−、−ＣＨＣＨ３−、ＣＲａＲｂ−からなる群より選択され、−Ｘ−Ｙ−は一緒になって、二価リンカー基（ラジカル（ｒａｄｉｃｌｅ）とも呼ばれる）を指定し、一緒になって、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−及び＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される１、２、３又は４個の基／原子からなる二価リンカー基を指定する。
一部の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｘ−ＣＨ２−、−Ｘ−ＣＲａＲｂ−、−Ｘ−ＣＨＲａ−、−Ｘ−Ｃ（ＨＣＨ３）−、−Ｏ−Ｙ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨＣＨ３−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−Ｏ−ＮＣＨ２−、−Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ２−、−ＮＲａ−ＣＨ２−、Ｎ−Ｏ−ＣＨ２、−Ｓ−ＣＲａＲｂ−及び−Ｓ−ＣＨＲａ−からなる群より選択されるビラジカルを指定する。
一部の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を指定する。
特定の実施態様では、Ｚは、−Ｏ、−Ｓ−及び−Ｎ（Ｒａ）−から選択され、Ｒｂが存在する場合、それぞれ、水素、場合により置換されているＣ１−６−アルキル、場合により置換されているＣ２−６−アルケニル、場合により置換されているＣ２−６−アルキニル、ヒドロキシ、場合により置換されているＣ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルコキシアルキル、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲンから独立に選択され、ここで、アリール及びヘテロアリールは、場合により置換されていることができ、ここで、２個のジェミナル置換基Ｒａ及びＲｂは一緒になって、場合により置換されているメチレン（＝ＣＨ２）を指定することができ、ここで、全てのキラル中心について、非対称基は、Ｒ又はＳのいずれかの配向で見出すことができる。
一部の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は、水素、場合により置換されているＣ１−６−アルキル、場合により置換されているＣ２−６−アルケニル、場合により置換されているＣ２−６−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルコキシアルキル、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲンからなる群より独立して選択される。ここで、アリール及びヘテロアリールは、場合により置換されていることができ、ここで、２個のジェミナル置換基は一緒になって、オキソ、チオキソ、イミノ又は場合により置換されているメチレンを指定することができる。
一部の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は、Ｃ１−６−アルキル、例えば、メチル及び水素から独立して選択される。
一部の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。
一部の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て、水素であり、Ｒ５及びＲ５＊のいずれかも、水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の他方が、水素以外、例えば、Ｃ１−６−アルキル、例えば、メチルである。
一部の実施態様では、Ｒａは、水素又はメチルのいずれかである。一部の実施態様では、Ｒｂが存在する場合、Ｒｂは、水素又はメチルのいずれかである。
一部の実施態様では、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方が、水素である。
一部の実施態様では、Ｒａ及びＲｂの一方が、水素であり、他方が、水素以外である。
一部の実施態様では、Ｒａ及びＲｂの一方が、メチルであり、他方が、水素である。
一部の実施態様では、Ｒａ及びＲｂの両方が、メチルである。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第９９／０１４２２６号、ＷＯ第００／６６６０４号、ＷＯ第９８／０３９３５２号及びＷＯ第２００４／０４６１６０号（これらの文献は全て、参照により組み入れられる）で開示されており、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ及びアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドとして一般公知ものを含む。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｓ−ＣＨ２−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。このようなチオＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第９９／０１４２２６号及びＷＯ第２００４／０４６１６０号に開示されている。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−ＮＨ−ＣＨ２−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。このようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第９９／０１４２２６号及び同第２００４／０４６１６０号に開示されている。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−又は−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第００／０４７５９９号及びMorita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76（これらの文献は、参照により組み入れられる）で開示されており、２’−Ｏ−４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として一般公知ものを含む。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の全てと、Ｒ５及びＲ５＊の一方が、水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の他方が、水素以外、例えば、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチルである。このような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第２００７／１３４１８１号に開示されている。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここで、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方が、水素以外、例えば、メチルであり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の全てとＲ５及びＲ５＊の一方とが、水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の他方が、水素以外、例えば、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチルである。このようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第２０１０／０７７５７８号に開示されている。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−（２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81）を指定する。一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（２’Ｏ−エチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81）を指定する。一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。このような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第１００３６６９８号及び同第０７０９００７１号に開示されている。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。また、このようなＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野において環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）として公知であり、ＷＯ第０７０９００７１号に開示されている。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を指定する。Ｒ−又はＳ−配置のいずれかにおいて。一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は一緒になって、二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を指定する。一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。また、このような６’メチルＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野において、ｃＥＴヌクレオシドとしても公知であり、ＷＯ第０７０９００７１号（ベータ−Ｄ）及び同第２０１０／０３６６９８号（アルファ−Ｌ）に開示されるように、（Ｓ）ｃＥＴ又は（Ｒ）ｃＥＴ立体異性体のいずれかであることができる。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＲａＲｂ（式中、Ｒａ又はＲｂのいずれかが、水素である）であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。一部の実施態様では、Ｒａ及びＲｂは両方とも、メチルである。このような６’二置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第２００９００６４７８号に開示されている。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｓ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。このような６’置換チオＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第１１１５６２０２号に開示されている。一部の６’置換チオＬＮＡの実施態様では、Ｒａは、メチルである。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、例えば、−Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ２−又は−Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。このようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ第０８１５４４０１号及び同第０９０６７６４７号に開示されている。
一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｎ（−ＯＲａ）−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。一部の実施態様では、Ｒａは、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチルである。このようなＬＮＡヌクレオシドは、Ｎ置換ＬＮＡとしても公知であり、ＷＯ第２００８／１５０７２９号に開示されている。一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は一緒になって、二価リンカー基−Ｏ−ＮＲａ−ＣＨ３−（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を指定する。一部の実施態様では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｎ（Ｒａ）−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。一部の実施態様では、Ｒａは、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチルである。
一部の実施態様では、Ｒ５及びＲ５＊の一方又は両方が、水素であり、置換されている場合、Ｒ５及びＲ５＊の他方は、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチルである。このような実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て、水素であることができ、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−又はＯ−ＣＨ（ＣＲａ）−、例えば、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−から選択することができる。
一部の実施態様では、ビラジカルは、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、例えば、ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。一部の実施態様では、Ｒａは、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチルである。このようなＬＮＡヌクレオシドは、立体配座拘束ヌクレオチド（ＣＲＮ）としても公知であり、ＷＯ第２０１３０３６８６８号に開示されている。
一部の実施態様では、ビラジカルは、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、例えば、Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは、Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て、水素である。一部の実施態様では、Ｒａは、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチルである。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＣＯＣヌクレオチドとしても公知であり、Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238に開示されている。
特に断りない限り、ＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ又はアルファ−Ｌの立体異性体にあることが認識されるであろう。
ＬＮＡヌクレオシドの特定の例をスキーム１に表わす。
Figure 2021511027
特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、例えば、（Ｓ）−６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。
実施例で例証されているように、本開示の一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドにおけるＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドである。
本発明の出発物質又は化合物のうちの１つが、１つ以上の反応工程の反応条件下で安定でないか又は反応性である１つ以上の官能基を含有する場合、当技術分野において周知の方法を適用する重要な工程の前に、適切な保護基（例えば、「Protective Groups in Organic Chemistry」 by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New Yorkに記載されるような）を導入することができる。このような保護基は、文献に記載されている標準的な方法を使用して、合成の後の段階で除去することができる。保護基の例は、tert−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチルカルバマート（Ｆｍｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバマート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。
本明細書に記載された化合物は、幾つかの不斉中心を含有することができ、光学的に純粋なエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、例えば、ラセミ体、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体のラセミ体又はジアステレオ異性体のラセミ体の混合物の形態で存在することができる。
「不斉炭素原子」という用語は、４個の異なる置換基を有する炭素原子を意味する。カーン−インゴルド−プレローグ順位則に従って、不斉炭素原子は、「Ｒ」又は「Ｓ」立体配置のものであることができる。
本説明において、「アルキル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、１〜８個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、特に、１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基及びとりわけ、１〜４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖又は分岐鎖のＣ１〜Ｃ８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル及び異性体オクチル、特に、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチル及びプロピルである。
「シクロアルキル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、３〜８個の炭素原子を有するシクロアルキル環及び特に、３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチル、とりわけ、シクロプロピル及びシクロブチルである。「シクロアルキル」の特定の例は、シクロプロピルである。
「アルコキシ」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、式アルキル−Ｏ−［式中、「アルキル」という用語は、先に与えられた意味を有する］で示される基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ．ブトキシ及びtert．ブトキシを意味する。特定の「アルコキシ」は、メトキシ及びエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。
「オキシ」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−Ｏ−基を意味する。
「アルケニル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、オレフィン結合及び最大８個、好ましくは、最大６個、特に好ましくは、最大４個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル及びイソブテニルである。
「アルキニル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、炭素−炭素三重結合及び最大８個、好ましくは、最大６個、特に好ましくは、最大４個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖炭化水素残基を意味する。
「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素及び特に、フッ素、塩素又は臭素、とりわけ、フッ素を意味する。別の基との組合せにおいて、「ハロ」という用語は、少なくとも１つのハロゲンによる前記基の置換、特に、１〜５個のハロゲン、特に、１〜４個のハロゲン、すなわち、１、２、３又は４個のハロゲンによる前記基の置換を指す。
「ハロアルキル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、少なくとも１つのハロゲンにより置換されている、特に、１〜５個のハロゲン、特に、１〜３個のハロゲンにより置換されているアルキル基を指す。ハロアルキルの例は、モノフルオロ−、ジフルオロ−又はトリフルオロ−メチル、−エチル又は−プロピル、例えば、３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロメチル又はトリフルオロメチルを含む。フルオロメチル、ジフルオロメチル及びトリフルオロメチルは、特定の「ハロアルキル」である。
「ハロシクロアルキル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、少なくとも１つのハロゲンにより置換され、特に、１〜５個のハロゲン、特に、１〜３個のハロゲンにより置換されている上記されたシクロアルキル基を指す。「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特に、フルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピル及びトリフルオロシクロプロピルである。
「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−ＯＨ基を意味する。
「チオヒドロキシル」及び「チオヒドロキシ」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−ＳＨ基を意味する。
「カルボニル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。
「カルボキシ」又は「カルボキシル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−ＣＯＯＨ基を意味する。
「アミノ」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、第一級アミノ基（−ＮＨ２）、第二級アミノ基（−ＮＨ−）又は第三級アミノ基（−Ｎ−）を意味する。
「アルキルアミノ」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、１又は２個の上記定義されたアルキル基により置換されている、上記定義されたアミノ基を意味する。
「スルホニル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−ＳＯ２基を意味する。
「スルフィニル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−ＳＯ−基を意味する。
「スルファニル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−Ｓ−基を意味する。
「シアノ」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−ＣＮ基を意味する。
「アジド」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−Ｎ３基を意味する。
「ニトロ」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、ＮＯ２基を意味する。
「ホルミル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。
「カルバモイル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２基を意味する。
「カバミド」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２基を意味する。
「アリール」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基により場合により置換されている、６〜１０個の炭素環原子を含む一価の芳香族炭素環単環式環系又は二環式環系を指す。アリールの例は、フェニル及びナフチル、特に、フェニルを含む。
「ヘテロアリール」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、３又は４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子がハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基により場合により置換されている炭素である、５〜１２個の環原子の一価の芳香族複素環式単環式環系又は二環式環系を指す。ヘテロアリールの例は、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリル又はアクリジニルを含む。
「ヘテロシクリル」という用語は、単独又は組み合わせにおいて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、３又は４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子がハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基により場合により置換されている炭素である、４〜１２個、特に、４〜９個の環原子の一価で飽和又は部分不飽和の単環式環系又は二環式環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルについての例は、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフランニル、テトラヒドロチエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル又はオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル又は３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルについての例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロオキサゾリル、テトラヒドロピリジニル又はジヒドロピラニルである。
ＩＩ．Ｅ．ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的ヌクレオチド配列と二重鎖を形成した時に、相補的ヌクレオチド配列の分解を媒介可能なオリゴヌクレオチドを指す。
一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能することができ、ここで、本開示のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特に、エンドヌクレアーゼ、好ましくは、エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈをリクルート可能である。ヌクレアーゼ媒介機構を介して作動するオリゴヌクレオチド設計の例は、典型的には、少なくとも５又は６個のＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性向上ヌクレオシドが片側又は両側に隣接しているオリゴヌクレオチド、例えば、ギャップマーである。
ＩＩ．Ｆ．ＲＮａｓｅ Ｈの活性及びリクルート
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖にある場合に、ＲＮａｓｅ Ｈをリクルートし、相補的ＲＮＡ分子の開裂及びその後の分解を誘引するその能力を指す。ＷＯ第０１／２３６１３号には、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法が提供されている。同方法は、ＲＮａｓｅ Ｈをリクルートする能力を決定するのに使用することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的ターゲット核酸配列と共に提供されるとき、試験される修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチドにおける全てのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、ＷＯ第０１／２３６１３号の実施例９１〜９５により提供される方法論を使用する場合に決定される初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は２０％超の、測定された初期速度（pmol/l/分）を有する場合、ＲＮａｓｅ Ｈをリクルート可能であると考えられる。
一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、相補的ターゲット核酸と共に提供されるとき、ＲＮａｓｅＨの初期速度（pmol/l/分で測定）が、試験されるオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチドにおける全てのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、ＷＯ第０１／２３６１３号の実施例９１〜９５により提供される方法論を使用する場合に決定される初期速度の２０％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満である場合、ＲＮａｓｅＨを本質的にリクルート不可能であると考えられる。
ＩＩ．Ｇ．ＡＳＯ設計
本開示のＡＳＯは、天然ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含むことができ、ギャップマーの形態にあることができる。本開示のＡＳＯと共に使用することができるギャップマーの構成の例は、米国特許出願公開第２０１２／０３２２８５１号に記載されている。
本明細書で使用する場合、ギャップマーという用語は、１つ以上の親和性向上修飾ヌクレオシド（フランク）が５’及び３’に隣接するＲＮａｓｅ Ｈリクルートオリゴヌクレオチド（ギャップ）の領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。種々のギャップマー設計が、本明細書に記載されている。ＬＮＡギャップマーという用語は、親和性向上修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドである、ギャップマーオリゴヌクレオチドである。混合ウイングギャップマーという用語は、フランク領域が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド及び少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシド又は非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシド等を含む、ＬＮＡギャップマーを指す。一部の実施態様では、混合ウイングギャップマーは、ＬＮＡヌクレオシドを含む一方のフランク（例えば、５’又は３’）を有し、他方のフランク（それぞれ３’又は５’）は、２’置換修飾ヌクレオシドを含む。
一部の実施態様では、ターゲット領域に対するＡＳＯの親和性向上に加えて、一部のヌクレオシド類似体は、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）結合及び開裂も媒介する。α−Ｌ−ＬＮＡモノマーは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性をある程度までリクルートするため、一部の実施態様では、α−Ｌ−ＬＮＡモノマーを含有するＡＳＯのギャップ領域（例えば、本明細書において領域Ｂと呼ばれる）は、ＲＮａｓｅ Ｈにより認識可能かつ開裂可能なより少ないモノマーからなり、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）構築におけるより柔軟性が導入される。
ＩＩ．Ｇ．１．ギャップマー設計
一実施態様では、本開示のＡＳＯは、ギャップマーである。ギャップマーＡＳＯは、ＲＮａｓｅ、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈをリクルート可能なヌクレオチドの連続ストレッチ、例えば、本明細書において、領域Ｂと呼ばれる少なくとも６個のＤＮＡヌクレオチドの領域（Ｂ）を含むＡＳＯである。ここで、領域Ｂの５’及び３’の両方には、ＲＮａｓｅをリクルート可能なヌクレオチドの連続ストレッチに対して５’及び３’に、親和性向上ヌクレオチド類似体、例えば、１〜１０個のヌクレオチド類似体の領域（これらの領域はそれぞれ、領域Ａ（Ａ）及び領域Ｃ（Ｃ）と呼ばれる）が隣接している。
特定の実施態様では、ギャップマーは、交互フランクギャップマーであり、その例を以下に論じる。特定の実施態様では、交互フランクギャップマーは、伝統的なギャップマーより少ないオフターゲット結合を示す。特定の実施態様では、交互フランクギャップマーは、伝統的なギャップマーより良好な長期耐性を有する。
交互フランクギャップマーは、式（５’から３’）Ａ−Ｂ−Ｃ［式中、領域Ａ（Ａ）（５’領域又は第１のウイング配列）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、１〜１０個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位を含み、領域Ｂ（Ｂ）は、（相補的ＲＮＡ分子、例えば、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡターゲットと二重鎖に形成される場合）ＲＮａｓｅをリクルート可能な少なくとも６つの連続ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡヌクレオチドを含み、領域Ｃ（Ｃ）（３’領域又は第２のウイング配列）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、１〜１０個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位を含み、ここで、領域Ａ及びＣは、Ａ及びＣにおける任意の位置に、１〜３個のＤＮＡヌクレオチド領域の挿入（例えば、ＤＮＡ挿入）を含むことができ、ここで、これらのＤＮＡ挿入はそれぞれ、長さが１〜６個のＤＮＡ単位であることができる］で示される（ポリ）ヌクレオチド配列を含むことができる。
特定の他の実施態様では、ギャップマー、例えば、交互フランクギャップマーは、式（５’から３’）Ａ−Ｂ−Ｃ又は場合により、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ又はＤ−Ａ−Ｂ−Ｃ［式中、領域Ａ（Ａ）（５’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、１〜１０個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位を含み、領域Ｂ（Ｂ）は、（相補的ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡターゲットと二重鎖に形成される場合）ＲＮａｓｅをリクルート可能な少なくとも５つの連続ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡヌクレオチドを含み、領域Ｃ（Ｃ）（３’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、１〜１０個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位を含み、領域Ｄ（Ｄ）が存在する場合、領域Ｄ（Ｄ）は、１、２又は３個のヌクレオチド単位、例えば、ＤＮＡヌクレオチドを含む］で示される（ポリ）ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施態様では、領域Ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位、例えば、２〜５個のヌクレオチド類似体、例えば、２〜５個のＬＮＡ単位、例えば、２〜５個のヌクレオチド類似体、例えば、３〜５個のＬＮＡ単位を含み、及び／又は、領域Ｃは、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位、例えば、２〜５個のヌクレオチド類似体、例えば、２〜５個のＬＮＡ単位、例えば、２〜５個のヌクレオチド類似体、例えば、３〜５個のＬＮＡ単位からなる。
一部の実施態様では、Ｂは、ＲＮａｓｅをリクルート可能な、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３個の連続ヌクレオチド又はＲＮａｓｅをリクルート可能な、６〜１４個、７〜１４個、８〜１４個もしくは７〜１０個もしくは７〜９個、例えば、８個、例えば、９個、例えば、１０個もしくは例えば、１４個の連続ヌクレオチドを含む。一部の実施態様では、領域Ｂは、少なくとも５個のＤＮＡヌクレオチド単位、例えば、５〜２３個のＤＮＡ単位、例えば、５〜２０個のＤＮＡ単位、例えば、５〜１８個のＤＮＡ単位、例えば、６〜１４個のＤＮＡ単位、例えば、８〜１４個のＤＮＡ単位、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個のＤＮＡ単位を含む。
一部の実施態様では、領域Ａは、３、４又は５個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡを含み、領域Ｂは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個のＤＮＡ単位からなり、領域Ｃは、３、４又は５個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡからなる。このような設計は、（Ａ−Ｂ−Ｃ）５−１０−５、３−１４−３、３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、３−９−３、３−９−４、４−９−３、３−８−３、３−８−４、４−８−３、３−７−３、３−７−４及び４−７−３を含み、１〜３個のヌクレオチド単位、例えば、ＤＮＡ単位を有することができる領域Ｄをさらに含むことができる。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯ、例えば、交互フランクギャップマーは、５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’［式中、
ｉ）領域Ｂは、ＲＮａｓｅをリクルート可能な少なくとも５、６、７又は８個、例えば、５〜１８個のＤＮＡ単位の連続配列であり、
ｉｉ）領域Ａは、１〜１０ヌクレオチドの第１のウイング配列であり、ここで、第１のウイング配列は、１つ以上のヌクレオチド類似体及び場合により、１つ以上のＤＮＡ単位（例えば、ＤＮＡ挿入）を含み、ここで、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１つが、Ａの３’末端に位置し、
ｉｉｉ）領域Ｃは、１〜１０ヌクレオチドの第２のウイング配列であり、ここで、第２のウイング配列は、１つ以上のヌクレオチド類似体及び場合により、１つ以上のＤＮＡ単位（例えば、ＤＮＡ挿入）を含み、ここで、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１つが、Ｃの５’末端に位置する］
で示される式を含む。
一部の実施態様では、第１のウイング配列（該式における領域Ａ）は、（ｉ）１〜９個のヌクレオチド類似体及び１個のＤＮＡ単位；（ｉｉ）１〜８個のヌクレオチド類似体及び１〜２個のＤＮＡ単位；（ｉｉｉ）１〜７個のヌクレオチド類似体及び１〜３個のＤＮＡ単位；（ｉｖ）１〜６個のヌクレオチド類似体及び１〜４個のＤＮＡ単位；（ｖ）１〜５個のヌクレオチド類似体及び１〜５個のＤＮＡ単位；（ｖｉ）１〜４個のヌクレオチド類似体及び１〜６個のＤＮＡ単位；（ｖｉｉ）１〜３個のヌクレオチド類似体及び１〜７個のＤＮＡ単位；（ｖｉｉｉ）１〜２個のヌクレオチド類似体及び１〜８個のＤＮＡ単位；並びに（ｉｘ）１個のヌクレオチド類似体及び１〜９個のＤＮＡ単位から選択されるヌクレオチド類似体とＤＮＡ単位との組み合わせを含む。
特定の実施態様では、第２のウイング配列（該式における領域Ｃ）は、（ｉ）１〜９個のヌクレオチド類似体及び１個のＤＮＡ単位；（ｉｉ）１〜８個のヌクレオチド類似体及び１〜２個のＤＮＡ単位；（ｉｉｉ）１〜７個のヌクレオチド類似体及び１〜３個のＤＮＡ単位；（ｉｖ）１〜６個のヌクレオチド類似体及び１〜４個のＤＮＡ単位；（ｖ）１〜５個のヌクレオチド類似体及び１〜５個のＤＮＡ単位；（ｖｉ）１〜４個のヌクレオチド類似体及び１〜６個のＤＮＡ単位；（ｖｉｉ）１〜３個のヌクレオチド類似体及び１〜７個のＤＮＡ単位；（ｖｉｉｉ）１〜２個のヌクレオチド類似体及び１〜８個のＤＮＡ単位；並びに（ｉｘ）１個のヌクレオチド類似体及び１〜９個のＤＮＡ単位から選択されるヌクレオチド類似体とＤＮＡ単位との組み合わせを含む。
一部の実施態様では、ＡＳＯ式における領域Ａは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２における任意のＡＳＯの第１のウイング設計から選択されるサブ式を有し、及び／又は、ＡＳＯ式における領域Ｃは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２における任意のＡＳＯの第２のウイング設計から選択されるサブ式を有し、ここで、大文字は、ヌクレオチド類似体（例えば、糖修飾類似体、Ｌと記載することもできる）であり、小文字は、ＤＮＡ（Ｄと記載することもできる）である。
特定の実施態様では、ＡＳＯ、例えば、交互フランクギャップマーは、５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’［式中、領域Ｂは、５〜１８個のＤＮＡ単位の連続配列であり、領域Ａは、ＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬ又はＬＬＬＤＬで示される式を有し、領域Ｃは、ＬＬＤＬＬ又はＬＤＬＤＬＬで示される式を有し、ここで、ＬはＬＮＡ単位であり、Ｄは、ＤＮＡ単位である］で示される式を有する。
一部の実施態様では、ＡＳＯは、５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’［式中、領域Ｂは、１０個のＤＮＡ単位の連続配列であり、領域Ａは、ＬＤＬで示される式を有し、領域Ｃは、ＬＬＬＬで示される式を有し、ここで、Ｌは、ＬＮＡ単位であり、Ｄは、ＤＮＡ単位である］で示される式を有する。
更なるギャップマー設計は、ＷＯ第２００４／０４６１６０号に示されており、同文献は、その全体を参照により組み入れられる。参照によりその全体が組み入れられるＷＯ第２００８／１１３８３２号では、「ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）」ギャップマーＡＳＯが言及されている。一部の実施態様では、本明細書で提示されたＡＳＯは、このようなショートマーギャップマーであることができる。
一部の実施態様では、ＡＳＯ、例えば、交互フランクギャップマーは、合計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、連続ヌクレオチド配列は、式（５’−３’）Ａ−Ｂ−Ｃ又は場合により、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤもしくはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃ［式中、領域Ａは、１、２、３、４又は５個のヌクレオチド類似体単位、例えば、ＬＮＡ単位からなり；領域Ｂは、相補的ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡターゲット）と二重鎖に形成される場合、ＲＮａｓｅをリクルート可能な、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続ヌクレオチド単位からなり、領域Ｃは、１、２、３、４又は５個のヌクレオチド類似体単位、例えば、ＬＮＡ単位からなる。領域Ｄが存在する場合、領域Ｄは、１個のＤＮＡ単位からなる］で示されるものである。
一部の実施態様では、Ａは、１個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ａは、２個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ａは、３個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ａは、４個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ａは、５個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｃは、１個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、Ｃは、２個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｃは、３個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｃは、４個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｃは、５個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｂは、６個のヌクレオチド単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｂは、７個のヌクレオチド単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｂは、８個のヌクレオチド単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｂは、９個のヌクレオチド単位を含む。特定の実施態様では、領域Ｂは、１０個のヌクレオシド単位を含む。特定の実施態様では、領域Ｂは、１１個のヌクレオシド単位を含む。特定の実施態様では、領域Ｂは、１２個のヌクレオシド単位を含む。特定の実施態様では、領域Ｂは、１３個のヌクレオシド単位を含む。特定の実施態様では、領域Ｂは、１４個のヌクレオシド単位を含み、領域Ｂは、１５個のヌクレオシド単位を含む。特定の実施態様では、領域Ｂは、７〜２３個のＤＮＡモノマー又は５〜１８個のＤＮＡモノマーを含む。一部の実施態様では、領域Ｂは、６〜２３個のＤＮＡ単位、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３個のＤＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｂは、ＤＮＡ単位からなる。一部の実施態様では、領域Ｂは、アルファ−Ｌ配置にある少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、アルファ−Ｌ配置にある２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３個のＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｂは、少なくとも１つのアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位を含むか又はここで、アルファ−Ｌ配置にある全てのＬＮＡ単位が、アルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位である。
一部の実施態様では、Ａ−Ｂ−Ｃに存在するヌクレオチドの数は、（ヌクレオチド類似体単位−領域Ｂ−ヌクレオチド類似体単位）：１−８−１、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４又は１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４、４−９−４又は１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３、３−１０−１及び４−１０−４又は３−１１−４、４−１１−３及び４−１１−４又は３−１２−４及び４−１２−４又は３−１３−３及び３−１３−４又は１−１４−４又は１−１５−４及び２−１５−３から選択される。一部の実施態様では、Ａ−Ｂ−Ｃにおけるヌクレオチドの数は、２−７−１、１−７−２、２−７−２、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４及び４−７−３から選択される。
他の実施態様では、ＡＳＯは、Ｂに１０個のＤＮＡ単位、Ａ（第１のウイング）にＬＤＬＬＬ及びＣ（第２のウイング）にＬＬＤＬＬを含む。さらに他の実施態様では、ＡＳＯは、Ｂに９個のＤＮＡ単位、ＡにＬＤＤＬＬ及びＣにＬＤＬＤＬＬを含有する。さらに他の実施態様では、ＡＳＯは、Ｂに１０個のＤＮＡ単位、ＡにＬＬＤＬＬ及びＣにＬＬＤＬＬを含有する。更なる実施態様では、ＡＳＯは、Ｂに９個のＤＮＡ単位、ＡにＬＬＬＬＬ及びＣにＬＤＤＬＬを含有する。特定の実施態様では、領域Ａ及びＣはそれぞれ、３個のＬＮＡモノマーを含み、領域Ｂは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のヌクレオシドモノマー、例えば、ＤＮＡモノマーからなる。一部の実施態様では、Ａ及びＣは両方とも、それぞれ２個のＬＮＡ単位からなり、Ｂは、７、８又は９個のヌクレオチド単位、例えば、ＤＮＡ単位からなる。種々の実施態様では、他のギャップマー設計は、領域Ａ及び／又はＣが３、４、５又は６個のヌクレオシド類似体、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース糖（２’−ＭＯＥ）を含有するモノマー又は２’−フルオロデオキシリボース糖を含有するモノマーからなり、領域Ｂが７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３個のヌクレオシド、例えば、ＤＮＡモノマーからなり、ここで、領域Ａ−Ｂ−Ｃが３−８−３、３−９−３、３−１０−３、５−１０−５又は４−１２−４のモノマーを有するものを含む。更なるギャップマー設計は、ＷＯ第２００７／１４６５１１号に開示されており、同文献は、その全体を参照により組み入れられる。
一部の実施態様では、交互フランクＡＳＯは、領域Ａ、領域Ｂ及び領域Ｃ（Ａ−Ｂ−Ｃ）を含む少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを有し、ここで、領域Ｂは、少なくとも５個の連続ヌクレオシド単位を含み、１〜８個の連続ヌクレオシド単位の領域Ａが５’に隣接しており、１〜８個の連続ヌクレオシド単位の領域Ｃが３’に隣接しており、ここで、領域Ｂは、相補的ＲＮＡと二重鎖に形成される場合、ＲＮａｓｅ Ｈをリクルート可能であり、ここで、領域Ａ及び領域Ｃは、以下：
（ｉ）領域Ａは、５’ＬＮＡヌクレオシド単位及び３’ＬＮＡヌクレオシド単位並びに５’ＬＮＡヌクレオシド単位と３’ＬＮＡヌクレオシド単位との間に少なくとも１個のＤＮＡヌクレオシド単位を含み、領域Ｃは、少なくとも２個の３’ＬＮＡヌクレオシドを含む；
（ｉｉ）領域Ａは、少なくとも１個の５’ＬＮＡヌクレオシドを含み、領域Ｃは、５’ＬＮＡヌクレオシド単位、少なくとも２個の末端３’ＬＮＡヌクレオシド単位及び５’ＬＮＡヌクレオシド単位と３’ＬＮＡヌクレオシド単位との間に少なくとも１個のＤＮＡヌクレオシド単位を含む；並びに
（ｉｉｉ）領域Ａは、５’ＬＮＡヌクレオシド単位及び３’ＬＮＡヌクレオシド単位並びに５’ＬＮＡヌクレオシド単位と３’ＬＮＡヌクレオシド単位との間に少なくとも１個のＤＮＡヌクレオシド単位を含み、領域Ｃは、５’ＬＮＡヌクレオシド単位、少なくとも２個の末端３’ＬＮＡヌクレオシド単位及び５’ＬＮＡヌクレオシド単位と３’ＬＮＡヌクレオシド単位との間に少なくとも１個のＤＮＡヌクレオシド単位を含む
からなる群より選択される。
一部の実施態様では、領域Ａ又は領域Ｃは、１、２又は３個のＤＮＡヌクレオシド単位を含む。他の実施態様では、領域Ａ及び領域Ｃは、１、２、又は３個のＤＮＡヌクレオシド単位を含む。さらに他の実施態様では、領域Ｂは、少なくとも５個の連続ＤＮＡヌクレオシド単位を含む。特定の実施態様では、領域Ｂは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個の連続ＤＮＡヌクレオシド単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｂは、長さ８、９、１０、１１又は１２ヌクレオチドである。他の実施態様では、領域Ａは、２個の５’末端ＬＮＡヌクレオシド単位を含む。一部の実施態様では、領域Ａは、式５’［ＬＮＡ］１−３［ＤＮＡ］１−３［ＬＮＡ］１−３又は５’［ＬＮＡ］１−２［ＤＮＡ］１−２［ＬＮＡ］１−２［ＤＮＡ］１−２［ＬＮＡ］１−２を有する。他の実施態様では、領域Ｃは、式［ＬＮＡ］１−３［ＤＮＡ］１−３［ＬＮＡ］２−３３’又は［ＬＮＡ］１−２［ＤＮＡ］１−２［ＬＮＡ］１−２［ＤＮＡ］１−２［ＬＮＡ］２−３３’を有する。さらに他の実施態様では、領域Ａは、式５’［ＬＮＡ］１−３［ＤＮＡ］１−３［ＬＮＡ］１−３又は５’［ＬＮＡ］１−２［ＤＮＡ］１−２［ＬＮＡ］１−２［ＤＮＡ］１−２［ＬＮＡ］１−２を有し、領域Ｃは、２、３、４又は５個の連続ＬＮＡヌクレオシド単位を含む。一部の実施態様では、領域Ｃは、式［ＬＮＡ］１−３［ＤＮＡ］１−３［ＬＮＡ］２−３３’又は［ＬＮＡ］１−２［ＤＮＡ］１−２［ＬＮＡ］１−２［ＤＮＡ］１−２［ＬＮＡ］２−３３’を有し、領域Ａは、１、２、３、４又は５個の連続ＬＮＡヌクレオシド単位を含む。さらに他の実施態様では、領域Ａは、５’−３’にかけて、Ｌ、ＬＬ、ＬＤＬ、ＬＬＬ、ＬＬＤＬ、ＬＤＬＬ、ＬＤＤＬ、ＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＤＬ、ＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬ、ＬＬＤＤＬ、ＬＤＤＬＬ、ＬＬＤＬＤ、ＬＤＬＬＤ、ＬＤＤＤＬ、ＬＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＤＬ、ＬＬＬＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＬ、ＬＤＬＬＬＬ、ＬＬＬＤＤＬ、ＬＬＤＬＤＬ、ＬＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＬＬ、ＬＤＬＬＤＬ、ＬＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬ、ＬＬＤＤＤＬ及びＬＤＬＤＬＤ（ここで、Ｌは、ＬＮＡヌクレオシドを表わし、Ｄは、ＤＮＡヌクレオシドを表わす）からなる群より選択されるＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの配列を有する。さらに他の実施態様では、領域Ｃは、５’−３’にかけて、ＬＬ、ＬＬＬ、ＬＬＬＬ、ＬＤＬＬ、ＬＬＬＬＬ、ＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬ、ＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＬＬ、ＬＬＤＤＬＬ、ＬＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬ、ＬＤＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬＬ及びＬＬＤＬＤＬＬからなる群より選択されるＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの配列を有する。更なる実施態様では、領域Ａは、５’−３’にかけて、ＬＤＬ、ＬＬＤＬ、ＬＤＬＬ、ＬＤＤＬ、ＬＬＬＤＬ、ＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬ、ＬＬＤＤＬ、ＬＤＤＬＬ、ＬＬＤＬＤ、ＬＤＬＬＤ、ＬＤＤＤＬ、ＬＬＬＬＤＬ、ＬＬＬＤＬＬ、ＬＬＤＬＬＬ、ＬＤＬＬＬＬ、ＬＬＬＤＤＬ、ＬＬＤＬＤＬ、ＬＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＬＬ、ＬＤＬＬＤＬ、ＬＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬ、ＬＬＤＤＤＬ及びＬＤＬＤＬＤからなる群より選択されるＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの配列を有し、領域Ｃは、５’−３’にかけて、ＬＤＬＬ、ＬＬＤＬ、ＬＬＬＬＬ、ＬＬＤＬＬ、ＬＤＬＬＬ、ＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＬＬ、ＬＬＤＤＬＬ、ＬＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬ、ＬＤＬＤＤＬＬ、ＬＤＤＬＤＬＬ、ＬＤＤＤＬＬＬ及びＬＬＤＬＤＬＬからなる群より選択されるＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの配列を有する。
特定の実施態様では、交互フランクＡＳＯは、５’−３’にかけて、
Figure 2021511027
（ここで、Ｌは、ＬＮＡヌクレオシドを表わし、Ｄは、ＤＮＡヌクレオシドを表わす）
からなる群より選択されるヌクレオシドの配列を含む連続ヌクレオチドを有する。他の実施態様では、ＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡである。
さらに他の実施態様では、交互フランクＡＳＯは、５’−３’にかけて、
Figure 2021511027
（ここで、１番目の数字は、ＬＮＡ単位の数を表わし、次は、ＤＮＡの数を表わし、その後、交互のＬＮＡ領域及びＤＮＡ領域を表わす）
からなる群より選択されるＬＮＡヌクレオシド単位及びＤＮＡヌクレオシド単位の交互配列を含む連続ヌクレオチドを有する。
他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２から選択されるＡＳＯ番号のいずれか１つとして表わされる。
ＩＩ．Ｈ．ヌクレオチド間結合
本明細書に記載されたＡＳＯのモノマー同士は、結合基を介して結合している。適切には、各モノマーは、結合基を介して３’隣接モノマーに結合している。
当業者であれば、本開示の文脈において、ＡＳＯの末端における５’モノマーは、５’末端基を含んでも含まなくてもよいが、５’結合基を含まないことを理解するであろう。
「結合基」及び「ヌクレオチド間結合」という用語は、２個のヌクレオチド同士を共有結合可能な基を意味することが意図される。特定の好ましい例は、ホスファート基及びホスホロチオアート基を含む。
本開示のＡＳＯのヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列同士は、結合基を介して結合している。適切には、各ヌクレオチドは、結合基を介して３’隣接ヌクレオチドに結合している。
適切なヌクレオチド間結合は、ＷＯ第２００７／０３１０９１号に列記されているもの、例えば、同第２００７／０３１０９１号（その全体が参照により組み入れられる）の第３４頁の第１段落に列記されているヌクレオチド間結合を含む。
本開示に使用することができる適切なヌクレオチド間結合の例は、ホスホジエステル結合（ＰＯ又は下付き文字ｏ）、ホスホトリエステル結合、メチルホスホナート結合、ホスホラミダート結合、ホスホロチオアート結合（ＰＳ又は下付き文字ｓ）及びそれらの組み合わせを含む。
一部の実施態様では、ヌクレオチド間結合を、その通常のホスホジエステルから、ヌクレアーゼ攻撃に対してより抵抗性であるもの、例えば、ホスホロチオアート又はボラノホスファート（これらの２つは、ＲＮａｓｅ Ｈにより開裂可能である）に修飾することが好ましく、また、ターゲット遺伝子の発現を低下させる際のアンチセンス阻害の経路も可能にする。
本明細書で提供されたように、適切な硫黄（Ｓ）ヌクレオチド間結合が好ましい場合がある。特に、ギャップマーのギャップ領域（Ｂ）には、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合も好ましい。また、ホスホロチオアート結合も、隣接領域に（Ａ及びＣ並びにＡ又はＣをＤに及び必要に応じて領域Ｄ内で結合するために）使用することができる。
ただし、領域Ａ、Ｂ及びＣは、特に、例えば、ヌクレオチド類似体の使用により、領域Ａ及び領域Ｃ内のヌクレオチド間結合がエンドヌクレアーゼ分解から保護される場合、例えば、領域Ａ及び領域ＣがＬＮＡヌクレオチドを含む場合に、ホスホロチオアート以外のヌクレオチド間結合、例えば、ホスホジエステル結合を含むことができる。
ＡＳＯにおけるヌクレオチド間結合は、ターゲットＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ開裂を可能にするように、ホスホジエステル、ホスホロチオアート又はボラノホスファートであることができる。ホスホロチオアートは、改善されたヌクレアーゼ耐性及び他の理由、例えば、製造の容易さのために好ましい。
一部の実施態様では、ヌクレオチド間結合は、１つ以上の立体規定ヌクレオチド間結合（例えば、立体規定修飾ホスファート結合、例えば、規定された立体化学構造を有するホスホジエステル、ホスホロチオアート又はボラノホスファート結合）を含む。「立体規定ヌクレオチド間結合」という用語は、「キラル制御ヌクレオチド間結合」と互換的に使用され、ヌクレオチド間結合の特定量のＲｐ又はＳｐがＡＳＯ鎖内に存在するように、リン原子の立体化学的指定が制御されるヌクレオチド間結合を指す。キラル結合の立体化学的指定は、例えば、不斉合成により定義（制御）することができる。少なくとも１つの立体定義ヌクレオチド間結合を有するＡＳＯは、完全に立体規定されたＡＳＯ及び部分的に立体規定されたＡＳＯの両方を含む立体規定ＡＳＯと呼ぶことができる。
一部の実施態様では、ＡＳＯは、完全に立体規定される。完全に立体規定されたＡＳＯは、ＡＳＯ内における各ヌクレオチド間結合において、規定されたキラル中心（Ｒｐ又はＳｐ）を有するＡＳＯ配列を指す。一部の実施態様では、ＡＳＯは、部分的に立体規定される。部分的に立体規定されたＡＳＯは、少なくとも１つのヌクレオチド間結合において規定されたキラル中心（Ｒｐ又はＳｐ）を有するが、全てのヌクレオチド間結合においてではないＡＳＯ配列を指す。したがって、部分的に立体規定されたＡＳＯは、少なくとも１つの立体規定結合に加えて、アキラル又は立体非規定である結合を含むことができる。ＡＳＯにおけるヌクレオチド間結合が立体規定される場合、所望の配置、Ｒｐ又はＳｐのいずれかは、ＡＳＯの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は本質的に１００％で存在する。
本開示のＡＳＯの一態様では、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、ホスホロチオアート基により互いに結合している。本発明のオリゴヌクレオチドについては、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を使用することが有利である。
ホスホロチオアートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態及び製造の容易さのために特に有用である。一部の実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列におけるヌクレオシド間結合の少なくとも５０％が、ホスホロチオアートであり、例えば、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列におけるヌクレオシド間結合の少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％又は例えば、少なくとも９０％が、ホスホロチオアートである。一部の実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオアートである。
ホスホジエステル結合、例えば、１又は２個の結合をＡＳＯ（そうでなければホスホロチオアートＡＳＯ）に、特に、ヌクレオチド類似体単位間又は同単位に隣接して（典型的には、領域Ａ及び／又はＣにおいて）含むことにより、ＡＳＯのバイオアベイラビリティー及び／又は生体内分布を修飾することができると認識される。ＷＯ第２００８／１１３８３２号を参照のこと。同文献は、参照により組み入れられる。
一部の実施態様、例えば、上記言及された実施態様では、適切であるが、特に示されない場合、全ての残りの結合基は、ホスホジエステルもしくはホスホロチオアート又はそれらの組み合わせのいずれかである。
一部の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジチオアート結合に加えて、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合及び少なくとも１つのホスホジエステル結合、例えば、２、３又は４個のホスホジエステル結合の両方を含む。ギャップマーオリゴヌクレオチドにおいて、ホスホジエステル結合が存在する場合、ホスホジエステル結合は、ギャップ領域Ｇにおける連続ＤＮＡヌクレオシド間には適切に位置しない。
一部の実施態様では、ヌクレオチド間結合基は全て、ホスホロチオアートである。
特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書で提供されたものに言及する場合、種々の実施態様では、結合がホスホロチオアート結合である場合、代替結合、例えば、本明細書に開示されたものを使用することができ、例えば、ホスファート（ホスホジエステル）結合を、特に、ヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位間の結合に使用することができると理解されるであろう。同様に、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書で提供されたものに言及する場合に、Ｃ残基が、５’−メチル修飾シトシンとして注釈される場合、種々の実施態様では、ＡＳＯに存在する１つ以上のＣｓは、非修飾Ｃ残基であることができる。
米国特許出願公開第２０１１／０１３０４４１号（２０１１年６月２日に公開され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）では、中性ヌクレオシド間結合により３’末端又は５’末端に結合した少なくとも１つの二環式ヌクレオシドを有するＡＳＯ化合物が言及されている。したがって、本発明のＡＳＯは、中性ヌクレオシド間結合、例えば、１つ以上のホスホトリエステル、メチルホスホナート、ＭＭＩ（３’−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−５’）、アミド−３（３’−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）、ホルムアセタール（３’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−５’）又はチオホルムアセタール（３’−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−５’）により３’末端又は５’末端に結合した少なくとも１つの二環式ヌクレオシドを有することができる。残りの結合は、ホスホロチオアートであることができる。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、図１Ａ〜１Ｃ及び図２に記載されたヌクレオチド間結合を有する。本明細書で使用する場合、例えば、図１Ａ〜１Ｃ及び図２において、ホスホロチオアート結合は、「ｓ」として示され、ホスホロジエステル結合は、「ｓ」の欠如により示される。
ＩＩ．Ｉ．コンジュゲート
本明細書で使用する場合、コンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合しているオリゴヌクレオチドを指す。
本開示のオリゴヌクレオチドの１つ以上の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み又は安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。一部の実施態様では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティー、代謝、排泄、透過性及び／又は細胞取込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を修飾し又は向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の臓器、組織又は細胞種にターゲット化し、それにより、その臓器、組織又は細胞種におけるオリゴヌクレオチドの有効性を向上させることができる。同時に、コンジュゲートは、非ターゲット細胞種、組織又は臓器におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えば、非ターゲット細胞種、組織又は臓器におけるオフターゲット活性又は活性を低下させるのに役立つ場合がある。ＷＯ第９３／０７８８３号及び同第２０１３／０３３２３０号には、適切なコンジュゲート部分が提供されている。更なる適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰｒ）に結合可能なものである。特に、三価Ｎ−アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰｒへの結合に適している。例えば、ＷＯ第２０１４／０７６１９６号、同第２０１４／２０７２３２号及び同第２０１４／１７９６２０号を参照のこと。
オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成も、Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001及びManoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103の包括的なレビューにおいて報告されている。
実施態様において、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面レセプターリガンド、薬剤物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施態様では、コンジュゲートは、トランスフェリンレセプターに対する特異的親和性を有し、例えば、参照により組み入れられるＷＯ第２０１２／１４３３７９号に開示されているような、抗体又は抗体フラグメントである。一部の実施態様では、非ヌクレオチド部分は、抗体又は抗体フラグメント、例えば、血液脳関門を跨ぐ送達を容易にする抗体又は抗体フラグメント、特に、トランスフェリンレセプターをターゲットとする抗体又は抗体フラグメントである。
ＩＩ．Ｊ．活性化ＡＳＯ
本明細書で使用する場合、「活性化ＡＳＯ」という用語は、本明細書に記載されたコンジュゲートを形成するために、ＡＳＯの１つ以上のコンジュゲート部分、すなわち、それ自体は核酸又はモノマーではない部分への共有結合を可能にする少なくとも１つの官能性部分に共有結合（すなわち、官能基化）している、本開示のＡＳＯを指す。典型的には、官能性部分は、例えば、アデニン塩基の３’−ヒドロキシル基又は環外ＮＨ２基を介してＡＳＯに共有結合可能な化学基、親水性であることができるスペーサー及びコンジュゲート部分に結合可能な末端基（例えば、アミノ、スルフヒドリル又はヒドロキシル基）を含むであろう。一部の実施態様では、端末基は保護されていない、例えば、ＮＨ２基である。他の実施態様では、端末基は、例えば、任意の適当な保護基、例えば、「Protective Groups in Organic Synthesis」 by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載されているものにより保護される。
一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＡＳＯの５’末端へのコンジュゲート部分の共有結合を可能にするために、５’末端において官能基化されている。他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、３’末端において官能基化させることができる。さらに他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、骨格に沿って又は複素環式塩基部分において官能基化させることができる。さらに他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、５’末端、３’末端、骨格及び塩基から独立して選択される２つ以上の位置において官能基化させることができる。
一部の実施態様では、本開示の活性化ＡＳＯは、合成中に、官能性部分に共有結合している１つ以上のモノマーを組み込むことにより合成される。他の実施態様では、本開示の活性化ＡＳＯは、官能基化されていないモノマーを使用して合成され、ＡＳＯは、合成の完了時に官能基化される。
ＩＩＩ．医薬組成物及び投与経路
本開示のＡＳＯは、医薬製剤及び組成物において使用することができる。適切には、このような組成物は、薬学的に許容し得る希釈剤、担体、塩又は補助剤を含む。
本開示のＡＳＯは、処置される患者において重篤な副作用を引き起こすことなく、治療上有効量を患者に送達するのに十分な量で、単位製剤、例えば、薬学的に許容し得る担体又は希釈剤に含ませることができる。ただし、治療の一部の形態では、重篤な副作用が、治療的処置に対する肯定的なアウトカムを確実にするという観点から、受け入れられる場合がある。
製剤化される薬剤は、薬学的に許容し得る結合剤及び補助剤を含むことができる。カプセル剤、錠剤又は丸剤は、例えば、下記化合物：バインダーとしての微結晶性セルロース、ガム又はゼラチン；賦形剤としてのデンプン又はラクトース；潤滑剤としてのステアラート；種々の甘味料又は着香剤を含有することができる。カプセル剤については、投薬単位は、液体担体、例えば、脂肪油を含有することができる。同様に、糖又は腸溶剤の被覆は、この投薬単位の一部であることができる。また、オリゴヌクレオチド製剤は、活性医薬成分とミセルエマルジョンを形成する脂質とのエマルジョンであることもできる。
本開示の医薬組成物は、局所的又は全身的処置が望まれるかどうか及び処置される領域に応じて、多くの方法で投与することができる。投与は、（ａ）経口、（ｂ）肺（例えば、ネブライザーによるものを含む粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による）；気管内、鼻腔内、（ｃ）表皮、経皮、眼並びに膣及び直腸送達を含む粘膜を含む局所；又は（ｄ）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入を含む非経口；又は頭蓋内、例えば、髄腔内、側脳室内、硝子体内もしくは脳室内投与であることができる。一実施態様では、ＡＳＯは、ＩＶ、ＩＰ、経口、局所的にもしくはボーラス注射として投与されるか又はターゲット臓器に直接投与される。別の実施態様では、ＡＳＯは、ボーラス注射として髄腔内又は側脳室内に投与される。
局所投与のための医薬組成物及び製剤は、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、スプレー剤、座剤、液剤及び散剤を含むことができる。慣用的な医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤等が、必要である又は望ましい場合がある。局所製剤の例は、本開示のＡＳＯが局所送達剤、例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤と混合されているものを含む。経口投与のための組成物及び製剤は、散剤又は顆粒剤、微粒子、ナノ粒子、水又は非水性媒体中の懸濁剤又は溶剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤又はミニ錠剤を含むが、これらに限定されない。非経口、髄腔内、側脳室内又は脳室内投与のための組成物及び製剤は、バッファー、希釈剤並びに他の適切な添加剤、例えば、浸透増強剤、担体化合物及び他の薬学的に許容し得る担体又は賦形剤（これらに限定されない）を含有することもできる、無菌水溶液を含むことができる。
本開示の医薬組成物は、溶液、エマルジョン及びリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化性固体及び自己乳化性半固体を含む（が、これらに限定されない）各種の成分から得ることができる。ターゲット組織への薬剤の送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分枝鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子及びミクロスフェア（Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(l):3-27）を含む（が、これらに限定されない）担体媒介送達により向上させることができる。
本開示の医薬製剤は、単位剤形で適宜提示することができ、医薬業界において周知の従来技術に従って調製することができる。このような技術は、活性成分を医薬担体又は賦形剤と会合させる工程を含む。一般的には、製剤は、活性成分を液体担体又は微細に分割された固体担体又はその両方と均一かつ密接に会合させ、ついで、必要に応じて、生成物を成形することにより調製される。
非経口、皮下、皮内又は局所投与のために、製剤は、無菌希釈剤、バッファー、張性レギュレーター及び抗菌剤を含むことができる。活性ＡＳＯは、制御放出特性を有するインプラント又はマイクロカプセルを含む、身体による分解又は即座の排除から保護する担体を使用して調製することができる。静脈内投与のために、担体は、生理食塩水又はリン酸緩衝食塩水であることができる。２００７年３月２２日に公開された国際公開ＷＯ第２００７／０３１０９１号には、さらに、適切な薬学的に許容し得る希釈剤、担体、及び補助剤が提供されている。同文献は、参照により組み入れられる。
また、本発明は、医薬がくも膜下腔内又は側脳室内投与のための剤形である医薬の製造のための、記載された本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用も提供する。
ＩＶ．診断
本開示は、さらに、ＳＮＣＡ関連疾患、例えば、シヌクレイン症の診断に有用な診断方法を提供する。シヌクレイン症の非限定的な例は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体を伴う認知症及び多系統萎縮症を含むが、これらに限定されない。
本開示のＡＳＯは、個体から得られた組織又は体液中のＳＮＣＡ転写物の発現を測定し、測定された発現レベルを正常な組織又は体液中の標準的なＳＮＣＡ転写物発現レベルと比較するのに使用することができる。それにより、標準と比較した発現レベルの向上は、本開示のＡＳＯにより処置可能な障害を示す。
本開示のＡＳＯは、当業者に公知の任意の方法（Touboul et. al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56；Verjout et. al., Mutat. Res. (2000) 640: 127-38；Stowe et. al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91）を使用して、生体サンプル中のＳＮＣＡ転写物レベルをアッセイするために使用することができる
「生体サンプル」は、個体、細胞系統、組織培養物又はＳＮＣＡ転写物を潜在的に発現する細胞の他の供給源から得られる任意の生体サンプルを意図する。ほ乳類から組織生検及び体液を得るための方法は、当技術分野において周知である。
Ｖ．ＡＳＯを含むキット
本開示は、さらに、本明細書に記載された本開示のＡＳＯを含み、本明細書に記載された方法を実施するのに使用することができるキットを提供する。特定の実施態様では、キットは、１つ以上の容器中に少なくとも１つのＡＳＯを含む。一部の実施態様では、キットは、全ての対照、アッセイを行うための指示書並びに分析及び結果の提示に必要な任意のソフトウェアを含む、検出アッセイを行うのに必要及び／又は十分な部品の全てを含む。当業者であれば、開示されたＡＳＯが当技術分野において周知の確立されたキット形式の１つに容易に包含させることができることを容易に認識するであろう。
ＶＩ．使用方法
本開示のＡＳＯは、治療及び予防に利用することができる。
ＳＮＣＡは、シナプス前終末のニューロンに主に発現する１４０個のアミノ酸のタンパク質であり、シナプス伝達のレギュレーションに役割を果たすと考えられている。折り畳まれていないモノマー及びαヘリックスの安定な四量体の両方としてネイティブに存在することが提唱されており、幾つかの翻訳後修飾を受けることが示されている。広く研究されている１つの修飾は、アミノ酸セリン１２９（Ｓ１２９）におけるＳＮＣＡのリン酸化である。通常、ＳＮＣＡのごく一部は、Ｓ１２９において恒常的にリン酸化される（ｐＳ１２９）が、病的な細胞内封入体に見られるＳＮＣＡの大部分は、ｐＳ１２９ ＳＮＣＡである。これらの病的な封入体は、ミスフォールドしたＳＮＣＡタンパク質の凝集した不溶性の蓄積からなり、シヌクレイン症として総称される一群の神経変性疾患の特徴である。
シヌクレイン症では、ＳＮＣＡは、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、及びレビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）の両者に特徴的なレビー小体として公知のニューロンにおける病的凝集体を形成する場合がある。したがって、本ＡＳＯは、ＳＮＣＡの病的な凝集体の数を減少させることができ又はＳＮＣＡの病的な凝集体の形成を防止することができる。加えて、グリア細胞質封入体（ＧＣＩ）と呼ばれる異常なＳＮＣＡリッチ病変が、乏突起膠細胞にみられ、多系統萎縮症（ＭＳＡ）として公知の急速に進行する致死的なシヌクレイン症の特徴を表わす。一部の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ＧＣＩの数を減少させるか又はＧＣＩの形成を防止する。乏突起膠細胞におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現の検出不能又は低レベルのいずれかの報告から、ＳＮＣＡの幾つかの病態は、高度に発現されているニューロンから乏突起膠細胞に伝播されることが示唆されている。特定の実施態様では、本開示のＡＳＯは、ニューロンからのＳＮＣＡの伝播、例えば、ＳＮＣＡの病態を低下させ又は予防する。
ＡＳＯは、調査において、例えば、細胞及び実験動物におけるＳＮＣＡタンパク質の合成を（典型的には、ｍＲＮＡを分解し又は阻害し、それにより、タンパク質形成を防止することにより）特異的に阻害し、それにより、ターゲットの機能分析又は治療的介入のためのターゲットとしてのその有用性の評価を容易にするのに使用することができる。さらに、細胞又は組織におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡ及び／又はＳＮＣＡタンパク質の発現をダウンレギュレーションする方法であって、細胞又は組織を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで、有効量の１つ以上の本開示のＡＳＯ、コンジュゲート又は組成物と接触させる工程を含む、方法が提供される。
治療剤については、ＳＮＣＡ転写物及び／又はＳＮＣＡタンパク質の発現をモデュレーションすることにより処置することができる、疾患又は障害を有することが疑われる動物又はヒトを、本開示に従ってＡＳＯ化合物を投与することにより処置する。さらに、治療上又は予防上有効量の本開示の１つ以上のＡＳＯ又は組成物を投与することにより、ＳＮＣＡ転写物及び／又はＳＮＣＡタンパク質の発現に関連する疾患又は状態を有するか又はその傾向があると疑われるほ乳類を処置する方法、例えば、人を処置する方法が提供される。本開示のＡＳＯ、コンジュゲート又は医薬組成物は、典型的には、有効量で投与される。一部の実施態様では、本開示のＡＳＯ又はコンジュゲートは、治療において使用される。
本開示は、さらに、本明細書で言及された１つ以上の疾患、例えば、パーキンソン病、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、Ｌｅｗｙ小体を伴う認知症、多系統萎縮及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される疾患を処置するのに使用するための、本開示のＡＳＯを提供する。
本開示は、さらに、α−シヌクレイン症を処置するための方法であって、有効量の１つ以上のＡＳＯ、コンジュゲート又はそれらの医薬組成物を、それを必要とする動物（例えば、それを必要とする患者）に投与することを含む、方法を提供する。
特定の実施態様では、疾患、障害又は状態は、ＳＮＣＡ遺伝子転写物及び／又はＳＮＣＡタンパク質の過剰発現に関連する。
また、本開示は、細胞又は組織におけるＳＮＣＡ遺伝子転写物及び／又はＳＮＣＡタンパク質の発現を（例えば、低下させることにより）阻害する方法であって、細胞又は組織を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて、有効量の本開示の１つ以上のＡＳＯ、コンジュゲート又はその医薬組成物と接触させて、ＳＮＣＡ遺伝子転写物の発現の低下に影響を与え、それにより、ＳＮＣＡタンパク質を減少させることを含む、方法も提供する。
特定の実施態様では、ＡＳＯは、脳、例えば、海馬、脳幹、線条体又はそれらの任意の組み合わせの１つ以上の切片におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を低下させるのに使用される。他の実施態様では、ＡＳＯは、媒体（ＡＳＯなし）の投与又はそれへの暴露後のＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現と比較して、例えば、脳幹及び／又は線条体におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を、３日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目、１５日目、２０日目、２１日目又は２５日目において、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満又は５％未満低下させる。一部の実施態様では、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現は、媒体（ＡＳＯなし）の投与後又はそれへの曝露後のＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現と比較して、２８日目、３０日目、３２日目、３５日目、４０日目、４２日目、４５日目、４９日目、５０日目、５６日目、６０日目、６３日目、７０日目又は７５日目まで、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％を下回って維持される。
他の実施態様では、本開示のＡＳＯは、髄質、尾状核被殻、脳橋、腰髄、前頭皮質及び／又はそれらの任意の組み合わせにおけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡ及び／又はＳＮＣＡタンパク質発現を低下させる。
また、本開示は、医薬の製造のための、記載された本開示のＡＳＯ又はコンジュゲートの使用も提供する。また、本開示は、本明細書で言及された障害の処置における使用のため又は本明細書で言及される障害の処置方法のための、ＡＳＯ又はそのコンジュゲートを含む、組成物も提供する。また、本開示は、治療における使用のための、ＡＳＯ又はコンジュゲートも提供する。本開示は、さらに、シヌクレイン症の処置における使用のための、ＡＳＯ又はコンジュゲートを提供する。
本開示は、さらに、細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の阻害に影響を及ぼすように、本開示のＡＳＯ又はコンジュゲートを細胞に投与することを含む、ＳＮＣＡを発現している細胞におけるＳＮＣＡタンパク質を阻害するための方法を提供する。
本開示は、神経過興奮性を低減し、改善し、予防し又は治療することを必要とする対象におけるこれらをする方法であって、本開示のＡＳＯ又はコンジュゲートを投与することを含む、方法を含む。
また、本開示は、本明細書で言及された障害を処置するための方法であって、本明細書に記載された本開示のＡＳＯもしくはコンジュゲート及び／又は本開示の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法も提供する。
本開示のＡＳＯ及び他の組成は、ＳＮＣＡタンパク質の突然変異したバージョンの過剰発現又は発現に関連する状態の処置に使用することができる。
本開示は、医薬としての使用のため、例えば、α−シヌクレイン症の処置のための、開示のＡＳＯ又はコンジュゲートを提供する。一部の実施態様では、α−シヌクレイン症は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体を伴う認知症、多系統萎縮症及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される疾患である。
本開示は、さらに、本明細書で言及された疾患、障害又は状態の処置のための医薬の製造における、本開示のＡＳＯの使用を提供する。一部の実施態様では、本開示のＡＳＯ又はコンジュゲートは、α−シヌクレイン症、発作障害又はそれらの組み合わせの処置のための医薬の製造に使用される。
一般的に言えば、本開示の一態様は、異常なレベルのＳＮＣＡに関連する状態、すなわち、α−シヌクレイン症を患っているか又はα−シヌクレイン症に感受性のほ乳類を処置する方法であって、治療上有効量の、１つ以上のＬＮＡ単位を含み、ＳＮＣＡ転写物をターゲットとするＡＳＯを、ほ乳類に投与することを含む、方法に向けられる。本開示のＡＳＯ、コンジュゲート又は医薬組成物は、典型的には、有効量で投与される。
一部の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、０．１〜１５mg/kg、例えば、０．２〜１０mg/kg、例えば、０．２５〜５mg/kgの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回又はさらに月に１回であることができる。
本明細書で言及された疾患又は障害は、一部の実施態様では、ＳＮＣＡ遺伝子又はそのタンパク質産物がＳＮＣＡタンパク質と会合するか又は相互作用する遺伝子における突然変異に関連する場合がある。したがって、一部の実施態様では、ターゲットｍＲＮＡは、突然変異型のＳＮＣＡ配列である。
本開示の興味深い態様は、本明細書で言及された疾患、障害又は状態の処置のための医薬の製造のための、本明細書で定義されたＡＳＯ（化合物）又は本明細書で定義されたコンジュゲートの使用に向けられる。
本開示の方法は、異常なレベルのＳＮＣＡタンパク質により引き起こされる疾患に対する治療又は予防に利用することができる。一部の実施態様では、ＳＮＣＡタンパク質の異常なレベルにより引き起こされる疾患は、α−シヌクレイン症である。特定の実施態様では、α−シヌクレイン症は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体を伴う認知症及び多系統萎縮症を含む。
代替的には、一部の実施態様では、本開示は、さらに、異常なレベルのＳＮＣＡタンパク質を処置するための方法であって、本開示のＡＳＯもしくは本開示のコンジュゲート又は本開示の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法に向けられる。
また、本開示は、医薬として使用するための、本明細書で定義されたＡＳＯ、組成物又はコンジュゲートに関する。
本開示は、さらに、異常なレベルのＳＮＣＡタンパク質又は突然変異型のＳＮＣＡタンパク質（例えば、アレル変異体、例えば、本明細書で言及された疾患のうちの１つに関連するもの）の発現の処置のための医薬の製造のための、本明細書で定義された化合物、組成又はコンジュゲートの使用に関する。
処置を必要とする患者は、疾患又は障害を患っているか又は患いそうな患者である。
本開示の実施は、特に断りない限り、当業者の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、リコンビナントＤＮＡ及び免疫学の従来の技術を利用するであろう。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II；Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；Mullis et al. ＵＳ第４，６８３，１９５号；Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation；Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)；Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning；the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155；Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)；Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007)及びAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照のこと。
上記引用された全ての参考文献及び本明細書で引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
実施態様
１． アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）転写物内の核酸配列に相補的な、長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、該核酸配列は、（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド４９４２〜５３４３；（ｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６３２６〜７０４１；（ｉｉａ）配列番号：１のヌクレオチド６３３６〜７０４１；（ｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド７３２９〜７６００；（ｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド７６３０〜７７８３；（ｉｖａ）配列番号：１のヌクレオチド７７５０〜７７８３；（ｖ）配列番号：１のヌクレオチド８２７７〜８５０１；（ｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド９０３４〜９５２６；（ｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド９９８２〜１４２７９；（ｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１５２０４〜１９０４１；（ｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド２０３５１〜２９６５４；（ｉｘａ）配列番号：１のヌクレオチド２０３５１〜２０９０８；（ｉｘｂ）配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜２９６５４；（ｘ）配列番号：１のヌクレオチド３０９３１〜３３９３８；（ｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド３４９３２〜３７０７７；（ｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド３８０８１〜４２８６９；（ｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド４４６４０〜４４８６１；（ｘｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド４６１７３〜４６９２０；（ｘｖ）配列番号：１のヌクレオチド４７９２４〜５８７５２；（ｘｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド６０６７８〜６０９０５；（ｘｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６２０６６〜６２３９７；（ｘｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６７７５９〜７１６２５；（ｘｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド７２９２６〜８６９９１；（ｘｘ）配列番号：１のヌクレオチド８８１６８〜９３７８３；（ｘｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド９４９７６〜１０２５７３；（ｘｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０４９２０〜１０７４３８；（ｘｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０８９４８〜１１９２８５；（ｘｘｉｉｉａ）配列番号：１のヌクレオチド１０８９４８〜１１４０１９；（ｘｘｉｉｂ）配列番号：１のヌクレオチド１１４２９２〜１１６６３６；（ｘｘｉｖ）配列番号：５のヌクレオチド１３１〜６７８；（ｘｘｖ）配列番号：３のヌクレオチド１３１〜３４８；（ｘｘｖｉ）配列番号：４のヌクレオチド１〜１６２；（ｘｘｖｉｉ）配列番号：２のヌクレオチド１２６〜３５２；（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のヌクレオチド２７６〜５３７；（ｘｘｉｘ）配列番号：２のヌクレオチド４６１〜６８１及び（ｘｘｘ）配列番号：２のヌクレオチド５４１〜７６６からなる群より選択される、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
２． 核酸配列が、（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド４９９２〜５１０９；（ｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６３７６〜６９９１；（ｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド７３７９〜７６００；（ｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド７６３０〜７７３３；（ｖ）配列番号：１のヌクレオチド８３２７〜８４５１；（ｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド９０８４〜９４７６；（ｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１００３２〜１４２２９；（ｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１５２５４〜１８９９１；（ｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド２０４０１〜２９６０４；（ｘ）配列番号：１のヌクレオチド３０９８１〜３３８８８；（ｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド３４９８２〜３７０２７；（ｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド３８１３１〜４２８１９；（ｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド４４６９０〜４４８１１；（ｘｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド４６２２３〜４６８７０；（ｘｖ）配列番号：１のヌクレオチド４７９７４〜５８７０２；（ｘｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド６０７２８〜６０８５５；（ｘｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６２１１６〜６２３４７；（ｘｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６７８０９〜７１５７５；（ｘｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド７２９７６〜８６９４１；（ｘｘ）配列番号：１のヌクレオチド８８２１８〜９３７３３；（ｘｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド９５０２６〜１０２５２３；（ｘｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０４９７０〜１０７３８８；（ｘｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０８９９８〜１１９２３５；（ｘｘｉｖ）配列番号：５のヌクレオチド１８１〜６２８；（ｘｘｖ）配列番号：３のヌクレオチド１８１〜２９８；（ｘｘｖｉ）配列番号：４のヌクレオチド１５〜１１２；（ｘｘｖｉｉ）配列番号：２のヌクレオチド１７６〜３０２；（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のヌクレオチド３２６〜４８７；（ｘｘｉｘ）配列番号：２のヌクレオチド５１１〜６３１及び（ｘｘｘ）配列番号：２のヌクレオチド５９１〜７１６からなる群より選択される、実施態様１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３． 核酸配列が、（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド５０４２〜５２４３；（ｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６４２６〜６９４１；（ｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド７４２９〜７６００；（ｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド７６３０〜７６８３；（ｖ）配列番号：１のヌクレオチド８３７７〜８４０１；（ｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド９１３４〜９４２６；（ｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１００８２〜１４１７９；（ｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１５３０４〜１８９４１；（ｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド２０４５１〜２９５５４；（ｘ）配列番号：１のヌクレオチド３１０３１〜３３８３８；（ｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド３５０３２〜３６９７７；（ｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド３８１８１〜４２７６９；（ｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド４４７４０〜４４７６１；（ｘｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド４６２７３〜４６８２０；（ｘｖ）配列番号：１のヌクレオチド４８０２４〜５８７５２；（ｘｖｉ）配列番号：１のヌクレオチド６０７７８〜６０８０５；（ｘｖｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６２１６６〜６２２９７；（ｘｖｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド６７８５９〜７１５２５；（ｘｉｘ）配列番号：１のヌクレオチド７３０２６〜８６８９１；（ｘｘ）配列番号：１のヌクレオチド８８２６８〜９３６８３；（ｘｘｉ）配列番号：１のヌクレオチド９５０７６〜１０２４７３；（ｘｘｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０５０２０〜１０７３３８；（ｘｘｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０９０４８〜１１９１８５；（ｘｘｉｖ）配列番号：５のヌクレオチド２３１〜２４８又は５６３〜５７８；（ｘｘｖ）配列番号：３のヌクレオチド２３１〜２４８；（ｘｘｖｉ）配列番号：４のヌクレオチド３８〜６２；（ｘｘｖｉｉ）配列番号：２のヌクレオチド２２６〜２５２；（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のヌクレオチド３７６〜４３７；（ｘｘｉｘ）配列番号：２のヌクレオチド５６１〜５８１及び（ｘｘｘ）配列番号：２のヌクレオチド６４１〜６６６からなる群より選択される、実施態様１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４． 核酸配列が、配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜２９６５４；配列番号：１のヌクレオチド３０９３１〜３３９３８；配列番号：１のヌクレオチド４４６４０〜４４８６１又は配列番号：１のヌクレオチド４７９２４〜５８７５２に対応する、実施態様１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５． 核酸配列が、配列番号：１のヌクレオチド２４４８３〜２８７９１；配列番号：１のヌクレオチド３２２２５〜３２２４５；配列番号：１のヌクレオチド４４７４０〜４４７６０又は配列番号：１のヌクレオチド４８６４０〜４８６６０に対応する、実施態様１又は４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６． 核酸配列が、（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド７５０２〜７６００；（ｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド７６３０〜７７１９；（ｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１１６８８１〜１１７３１２又は（ｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド１１８６０６〜１１８８２５に対応する、実施態様１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７． 核酸配列が、配列番号：１のヌクレオチド１１６８８１〜１１７１１９；配列番号：１のヌクレオチド１１６９６８〜１１７１９８又は配列番号：１のヌクレオチド１１７０８５〜１１７３１２である、実施態様１又は６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
８． 核酸配列が、（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド７５５２〜７６００；（ｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド７６３０〜７６６９；（ｉｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１１６９３１〜１１７２６２又は（ｉｖ）配列番号：１のヌクレオチド１１８６５６〜１１８７７５である、実施態様１、６又は７記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
９． 核酸配列が、配列番号：１のヌクレオチド１１６９３１〜１１７０６９；配列番号：１のヌクレオチド１１７０１８〜１１７１４８又は配列番号：１のヌクレオチド１１７１３５〜１１７２６２である、実施態様８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１０． 核酸配列が、ヌクレオチド（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１１６９８１〜１１７２１２又は（ｉｉ）配列番号：１のヌクレオチド１１８７０６〜１１８７２５である、実施態様１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１１． 核酸配列が、配列番号：１のヌクレオチド１１６９８１〜１１７０１９；配列番号：１のヌクレオチド１１７０６８〜１１７０９８又は配列番号：１のヌクレオチド１１７１８５〜１１７２１２である、実施態様１０記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１２． 長さ１０〜２４個のヌクレオチド又は長さ１４〜２１個のヌクレオチドを有する、実施態様１〜１１のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１３． 長さ１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１個のヌクレオチドを有する、実施態様１〜１２のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１４． ＳＮＣＡ転写物が、配列番号：１を含む、実施態様１〜１３のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１５． 連続ヌクレオチド配列が、１、２、３又は４個のミスマッチを有する、配列番号：７〜配列番号：１８７８を含む、実施態様１〜１４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１６． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号：７〜配列番号：１８７８を含む、実施態様１〜１５のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１７． 連続ヌクレオチド配列が、２以下のミスマッチを有する、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３を含む、実施態様１又は４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１８． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３から選択される配列からなる、実施態様１又は１７記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１９． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号：２７６；２７８；２９６；２９５；３２５；３２８；３２６；３２９；３３０；３２７；３３２；３３３；３３１；３３９；３４１；３９０；５２２及び５５９からなる群より選択される配列を含む、実施態様１、４、５、１１〜１８のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２０． アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトＳＮＣＡ転写物を発現している細胞におけるヒトＳＮＣＡ転写物の発現を阻害可能である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２１． 連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、実施態様１〜２０のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２２． ヌクレオチド類似体が、２’糖修飾ヌクレオシドである、実施態様２１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２３． ２’糖修飾ヌクレオシドが、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである、実施態様２２記載の方法。
２４． ギャップマーである、実施態様１〜２３のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２５． 交互フランクギャップマーである、実施態様２４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２６． ５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’
［式中、
ａ）領域Ｂが、ＲＮａｓｅをリクルート可能な少なくとも６個のＤＮＡ単位の連続配列であり、
ａ）領域Ａが、１〜１０ヌクレオチドの第１のウイング配列であり、ここで、第１のウイング配列が、１つ以上のヌクレオチド類似体及び場合により、１つ以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１つが、Ａの３’末端に位置し、
ａ）領域Ｃが、１〜１０ヌクレオチドの第２のウイング配列であり、ここで、第２のウイング配列が、１つ以上のヌクレオチド類似体及び場合により、１つ以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１つが、Ｃの５’末端に位置する］
で示される式を含む、実施態様２４又は２５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２７． 領域Ａが、１〜４個のヌクレオチド類似体を含み、領域Ｂが、８〜１５個のＤＮＡ単位からなり、領域Ｃが、２〜４個のヌクレオチド類似体を含む、実施態様２６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２８． 領域Ａが、（ｉ）１〜９個のヌクレオチド類似体及び１個のＤＮＡ単位；（ｉｉ）１〜８個のヌクレオチド類似体及び１〜２個のＤＮＡ単位；（ｉｉｉ）１〜７個のヌクレオチド類似体及び１〜３個のＤＮＡ単位；（ｉｖ）１〜６個のヌクレオチド類似体及び１〜４個のＤＮＡ単位；（ｖ）１〜５個のヌクレオチド類似体及び１〜５個のＤＮＡ単位；（ｖｉ）１〜４個のヌクレオチド類似体及び１〜６個のＤＮＡ単位；（ｖｉｉ）１〜３個のヌクレオチド類似体及び１〜７個のＤＮＡ単位；（ｖｉｉｉ）１〜２個のヌクレオチド類似体及び１〜８個のＤＮＡ単位並びに（ｉｘ）１個のヌクレオチド類似体及び１〜９個のＤＮＡ単位から選択される、ヌクレオチド類似体とＤＮＡ単位との組み合わせを含む、実施態様２６又は２７記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２９． 領域Ｃが、（ｉ）１〜９個のヌクレオチド類似体及び１個のＤＮＡ単位；（ｉｉ）１〜８個のヌクレオチド類似体及び１〜２個のＤＮＡ単位；（ｉｉｉ）１〜７個のヌクレオチド類似体及び１〜３個のＤＮＡ単位；（ｉｖ）１〜６個のヌクレオチド類似体及び１〜４個のＤＮＡ単位；（ｖ）１〜５個のヌクレオチド類似体及び１〜５個のＤＮＡ単位；（ｖｉ）１〜４個のヌクレオチド類似体及び１〜６個のＤＮＡ単位；（ｖｉｉ）１〜３個のヌクレオチド類似体及び１〜７個のＤＮＡ単位；（ｖｉｉｉ）１〜２個のヌクレオチド類似体及び１〜８個のＤＮＡ単位並びに（ｉｘ）１個のヌクレオチド類似体及び１〜９個のＤＮＡ単位から選択される、ヌクレオチド類似体とＤＮＡ単位との組み合わせを含む、実施態様２６又は２７記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３０． 領域Ａが、図１Ａ〜１Ｃ及び図２における任意のＡＳＯから選択される第１のウイング設計であり、並びに／又は、領域Ｃが、図１Ａ〜１Ｃ及び図２における任意のＡＳＯから選択される第２のウイング設計であり、ここで、大文字が、ヌクレオチド類似体であり、小文字が、ＤＮＡである、実施態様２６〜２９のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３１． 少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のヌクレオチド類似体を含む、実施態様１〜３０のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３２． １つ以上のヌクレオチド類似体が、ロックド核酸（ＬＮＡ）；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ；２’−アミノ−ＤＮＡ；２’−フルオロ−ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’−フルオロ−ＡＮＡ、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、拘束エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’−Ｏ−メチル核酸（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル核酸（２’−ＭＯＥ）及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドから独立して選択される、実施態様２１〜３１のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３３． １つ以上のヌクレオチド類似体が、二環式糖を含む、実施態様１〜３２のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３４． 二環式糖が、ｃＥｔ、２’，４’−拘束２’−Ｏ−メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ又はチオ−ＬＮＡを含む、実施態様３３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３５． １つ以上のヌクレオチド類似体が、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡを含む、実施態様２１〜３４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３６． アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上の５’メチルシトシン核酸塩基を含む、実施態様２１〜３５のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３７． アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’領域に、２〜５個のＬＮＡを含む、実施態様２４〜３６のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３８． アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’領域に、２〜５個のＬＮＡを含む、実施態様２４〜３７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３９． ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホナート結合、ホスホラミダート結合、ホスホロチオアート結合及びそれらの組み合わせから選択されるヌクレオシド間結合を含む、実施態様１〜３８のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４０． 連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の５０％が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、実施態様１〜３９のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４１． ヌクレオシド間結合が、１つ以上の立体規定修飾ホスファート結合を含む、実施態様１〜４０のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４２． 連続ヌクレオチド配列における全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートである、実施態様１〜４０のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４３． アンチセンスオリゴヌクレオチドが、４以下の総スコアのｉｎ ｖｉｖｏ耐容性を有し、ここで、総スコアが、５つのカテゴリーの単位スコアの合計であり、同カテゴリーが、１）過活動；２）活動及び覚醒の低下；３）運動機能障害及び／又は運動失調；４）異常な姿勢及び呼吸並びに５）振戦及び／又は痙攣であり、ここで、各カテゴリーについての単位スコアが、０〜４のスケールで測定される、実施態様１〜４２のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４４． ｉｎ ｖｉｖｏ耐容性が、３以下の総スコア、２の総スコア、１の総スコア又は０の総スコアである、実施態様４３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４５． 細胞におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％低下させる、実施態様１〜４４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４６． 細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の発現を、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％低下させる、実施態様１〜４５のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４７． ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ及びＧ並びにヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ及びＧの少なくとも１つの類似体を含み、０．２以上の配列スコアを有し、ここで、配列スコアが、式Ｉ：
Ｃヌクレオチド及びその類似体の＃−Ｇヌクレオチド及びその類似体の＃／全ヌクレオチド長 （Ｉ）
により計算される、実施態様１〜４６のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４８． ヌクレオチド配列が、図１Ａ〜１Ｃ及び図２における設計からなる群より選択される設計を有する、配列番号：７〜１８７８からなる群より選択される配列を含み、これから本質的になり又はこれからなり、ここで、大文字は、糖修飾ヌクレオシドであり、小文字は、ＤＮＡである、実施態様１〜４７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４９． ヌクレオチド配列が、ＡＳＯ−００３０９２の設計を有する配列番号：１４３６及びＡＳＯ−００３１７９の配列の設計を有する配列番号：１５４７を含み、これから本質的になり又はこれからなり、ここで、大文字は、ヌクレオシド類似体であり、小文字は、ＤＮＡである、実施態様３７記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５０． ヌクレオチド配列が、図１Ａ〜１Ｃにおける設計からなる群より選択される設計を有する、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３から選択される配列からなる連続ヌクレオチド配列からなる群より選択される配列を含み、これから本質的になり又はこれからなり、ここで、大文字は、糖修飾ヌクレオシドであり、小文字は、ＤＮＡである、実施態様１〜４８のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５１． 連続ヌクレオチド配列が、以下：
Figure 2021511027
（ここで、大文字が、２’糖修飾ヌクレオシド類似体を示し、小文字が、ＤＮＡを示す）
からなる群より選択される配列設計からなる群より選択される配列を含む、実施態様５０記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５２． ヌクレオチド配列が、図１Ａ〜１Ｃ及び図２における対応する化学構造を有する、配列番号：７〜１８７８からなる群より選択される配列を含み、これから本質的になり又はこれからなる、実施態様１〜４８のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５３． 連続ヌクレオチド配列が、ＡＳＯ−００３０９２又はＡＳＯ−００３１７９の化学構造を有する、実施態様１〜５２のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５４． 連続ヌクレオチド配列が、ＡＳＯ−００８３８７；ＡＳＯ−００８３８８；ＡＳＯ−００８５０１；ＡＳＯ−００８５０２；ＡＳＯ−００８５２９；ＡＳＯ−００８５３０；ＡＳＯ−００８５３１；ＡＳＯ−００８５３２；ＡＳＯ−００８５３３；ＡＳＯ−００８５３４；ＡＳＯ−００８５３５；ＡＳＯ−００８５３６；ＡＳＯ−００８５３７；ＡＳＯ−００８５４３；ＡＳＯ−００８５４５；ＡＳＯ−００８５８４；ＡＳＯ−００８２２６及びＡＳＯ−００８２６１からなる群より選択される化学構造を有する、実施態様１〜５２のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５５． 実施態様１〜５３のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非ヌクレオチド部分又は非ポリヌクレオチド部分に共有結合している、コンジュゲート。
５６． 非ヌクレオチド部分又は非ポリヌクレオチド部分が、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー又はそれらの任意の組み合わせを含む、実施態様５５記載のコンジュゲート。
５７． コンジュゲートが、トランスフェリンレセプターに対して特異的な親和性を有する抗体フラグメントである、実施態様５５記載のコンジュゲート。
５８． 実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲートと、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
５９． さらに、治療剤を含む、実施態様５８記載の組成物。
６０． 治療剤が、アルファ−シヌクレインアンタゴニストである、実施態様５９記載の組成物。
６１． アルファ−シヌクレインアンタゴニストが、アルファ−シヌクレイン抗体又はそのフラグメントである、実施態様６０記載の組成物。
６２． 実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲート又は実施態様５８〜６１のいずれか１つ記載の組成物と、使用のための指示書とを含む、キット。
６３． 実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲート又は実施態様５８〜６１のいずれか１つ記載の組成物と、使用のための指示書とを含む、診断用キット。
６４． 細胞におけるＳＮＣＡタンパク質発現を阻害し又は低下させる方法であって、実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲート又は実施態様５８〜６１のいずれか１つ記載の組成物を、ＳＮＣＡタンパク質を発現している細胞に投与することを含み、ここで、該細胞におけるＳＮＣＡタンパク質発現が、投与後に阻害され又は低下する、方法。
６５． アンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与後の細胞におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を阻害し又は低下させる、実施態様６４記載の方法。
６６． ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、投与後に少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％低下させる、実施態様６４又は６５記載の方法。
６７． アンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与後の細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の発現を、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％低下させる、実施態様６４〜６６のいずれか１つ記載の方法。
６８． 細胞が、ニューロンである、実施態様６４〜６７のいずれか１つ記載の方法。
６９． シヌクレイン症の処置を必要とする対象におけるシヌクレイン症を処置するための方法であって、有効量の、実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲート又は実施態様５８〜６１のいずれか１つ記載の組成物を、該対象に投与することを含む、方法。
７０． 医薬の製造のための、実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲート又は実施態様５８〜６１のいずれか１つ記載の組成物の使用。
７１． シヌクレイン症の処置を必要とする対象におけるシヌクレイン症の処置のための医薬の製造のための、実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲート又は実施態様５８〜６１のいずれか１つ記載の組成物の使用。
７２． 治療における使用のための、実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲート又は実施態様５８〜６１のいずれか１つ記載の組成物。
７３． シヌクレイン症の処置を必要とする対象におけるシヌクレイン症の治療における使用ための、実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲート又は実施態様５８〜６１のいずれか１つ記載の組成物。
７４． シヌクレイン症が、パーキンソン病、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、多系統萎縮症、レビー小体を伴う認知症及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、実施態様６４〜６９のいずれか１つ記載の方法、実施態様７０もしくは７１記載の使用又は実施態様７２もしくは７３記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７５． 対象が、ヒトである、実施態様６４〜６９のいずれか１つ記載の方法、実施態様７０もしくは７１記載の使用又は実施態様７２もしくは７３記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７６． アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は組成物が、経口、非経口、髄腔内、側脳室内、肺、局所又は脳室内に投与される、実施態様６４〜６９のいずれか１つ記載の方法、実施態様７０もしくは７１記載の使用又は実施態様７２もしくは７３記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７７． ヌクレオチド類似体が、糖修飾ヌクレオシドを含む、実施態様１〜５７のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５５〜５７のいずれか１つ記載のコンジュゲート又は実施態様５８〜６１のいずれか１つ記載の組成物、実施態様６２もしくは６３記載のキット、実施態様６４〜６９のいずれか１つ記載の方法、実施態様７０もしくは７１記載の使用又は実施態様７２もしくは７３記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７８． 糖修飾ヌクレオシドが、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである、実施態様６４記載の方法。
実施例
下記実施例は、例示として提供され、限定するものではない。
実施例１：ＡＳＯの構築
本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号：１（ゲノムＳＮＣＡ配列）に示されたＳＮＣＡ プレｍＲＮＡ又は配列番号：２、３、４及び５に示されたＳＮＣＡ ｃＤＮＡにおける種々の領域をターゲットとするように設計した。例えば、ＡＳＯを、ＮＧ＿０１１８５１．１（配列番号：１）のプレｍＲＮＡ開始部位及びプレｍＲＮＡ終了部位並びに／又はそのｍＲＮＡの開始部位及び終了部位を使用して、示された領域をターゲットとするように構築した。ＡＳＯの例示的な配列（例えば、配列番号）を図１Ａ〜１Ｃ及び図２に記載する。一部の実施態様では、ＡＳＯをギャップメーター又は交互フランクギャップマーとなるように設計した。ＤＥＳ番号を参照のこと。
図１Ａ〜１Ｃ及び図２に、選択された配列についてのＡＳＯ設計の非限定的な例を示す。同じ方法を本明細書で開示された任意の他の配列に適用することができる。ギャップマーは、ロックド核酸−ＬＮＡ（大文字）を含有するように構築した。例えば、ギャップマーは、５’末端及び３’末端において、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡを有し、ホスホロチオアート骨格を有することができる。ただし、ＬＮＡを任意の他のヌクレオチド類似体により置換することもでき、骨格を他の種類の骨格（例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホナート結合、ホスホラミダート結合又はそれらの組み合わせ）であることができる。
ＡＳＯを当技術分野において周知の方法を使用して合成した。このようなＡＳＯを調製する例示的な方法は、Barciszewski et al., Chapter 10 - 「Locked Nucleic Acid Aptamers」 in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)に記載されている。同文献の内容全体は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
実施例２Ａ：初代ニューロンにおけるＳＮＣＡタンパク質の減少を測定するためのHigh Contentアッセイ
ＳＮＣＡをターゲットとするＡＳＯを、初代マウスニューロンにおけるＳＮＣＡタンパク質発現を低下させるその能力について試験した。初代ニューロン培養物を、マウスＳＮＣＡノックアウトバックグラウンドに、Ａ５３Ｔ突然変異を有するヒトＳＮＣＡ遺伝子全体を保有するＰＡＣ−Ｔｇ（ＳＮＣＡＡ５３Ｔ）＋／＋；ＳＮＣＡ−／−（「ＰＡＣ−Ａ５３Ｔ」）マウスの前脳から確立した。Kuo Y et al., Hum Mol Genet., 19: 1633-50 (2010)を参照のこと。マウスに関わる全ての手順をBristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee (ACUC)により承認された動物試験法（ＡＴＭ）に従って行った。初代ニューロンを、製造メーカーのプロトコール（Worthington Biochemical Corporation, LK0031050）に従ってパパイン消化により生じさせた。単離されたニューロンを洗浄し、Ｂ２７（Gibco）、１．２５μM Glutamax（Gibco）、１００単位/ml ペニシリン、１００μg/ml ストレプトマイシン及び２５μg/ml アンホテリシンＢを補充したNeurobasal培地（NBM, Invitrogen）に再懸濁させた。
細胞を５，４００個/cm2でマルチウェルポリＤ−リシン被覆プレートに播種した（例えば、３８４ウェルプレートにおいて、２５μL ＮＢＭ中の６，０００個/ウェル）。ＡＳＯを水で希釈し、ＤＩＶ０１（すなわち、播種後１日）で細胞に加えた。ＡＳＯを培地中で２×最終濃度になるように加え、ついで、手作業で細胞に加えた。代替的には、水中のＡＳＯを、Labcyte ECHO音響ディスペンサーを使用して分注した。ECHO分注のために、水中のＡＳＯ ２５０nlを培地中の細胞に加え、続けて、ＮＢＭの等容量アリコートの新たなアリコートを加えた。一次スクリーニングのために、ＡＳＯを５μM、３．３μM、１μM、２００nM又は４０nMの最終濃度になるまで加えた。効力決定のために、ＡＳＯの８〜１０点滴定を０．７５mM ストックから調製し、ついで、２．７〜４０００nM又は４．５〜１０，０００nMの最終濃度範囲で培養細胞に加えた。ＡＳＯ−００００１０（TCTgtcttggctTTG、配列番号：１８７９）及びＡＳＯ−０００８３８（AGAaataagtggtAGT、配列番号：１４０４）（５μM）をそれぞれ、チューブリン及びＳＮＣＡに対する参照対照阻害剤として各プレートに含ませた。細胞をＡＳＯと共に１４日間インキュベーションして、ｍＲＮＡの定常状態減少を達成した。
１４日間のインキュベーション後、細胞を、ウェルに４％ ホルムアルデヒド（J.T. Baker）及び４％ スクロース（Sigma）の最終濃度で固定剤を添加することにより固定した。細胞を１５分間固定し、ついで、固定剤をウェルから吸引した。ついで、細胞を０．３％ Triton-X 100及び３％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は３％ 正常ヤギ血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で２０分間透過処理した。その後、透過バッファーをウェルから吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。ついで、一次抗体を、０．１％ Triton X-100及び３％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈した。ウサギ抗ＳＮＣＡ（Abcam）１：１０００及びニワトリ抗チューブリン（Abcam）１：５００の希釈液を使用した。細胞を一次抗体と共に２時間〜一晩インキュベーションした。インキュベーション後、一次抗体染色溶液を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。０．１％ Triton X-100及び３％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中のヤギ抗ニワトリAlexa 567抗体、ヤギ抗ウサギ−Alexa 488抗体及びHoechst（１０μg/ml）の１：５００希釈液を含有する二次染色溶液をウェルに加え、プレートを１時間インキュベーションした。その後、二次染色溶液をウェルから吸引し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞を洗浄した後、ＰＢＳ ６０μlを各ウェルに加えた。ついで、プレートを画像化までＰＢＳ中で保存した。
画像化のために、プレートを、Spot Detector bio-application（Cellomics）を使用するThermo-Fisher（Cellomics）CX5イメージャーでスキャンして、核（Hoechst染色、チャネル１）、チューブリン伸長（Alexa 567、チャネル２）及びＳＮＣＡ（Alexa 488、チャネル３）を定量した。物体数（核）をモニターしたが、データベースには公表しなかった。チューブリンにより覆われた総面積を特徴ＳｐｏｔＴｏｔａｌＡｒｅａＣｈ２として定量し、ＳＮＣＡについての染色の総強度をＳｐｏｔＴｏｔａｌＩｎｔｅｎＣｈ３として定量した。毒性をモニターするために、チューブリン測定を含めた。ＳＮＣＡタンパク質の減少を決定するために、チューブリン染色面積に対するＳＮＣＡ強度の比を計算し、結果を、媒体処理ウェルの中央値を総計とし、ＡＳＯ−００００１０又はＡＳＯ−０００８３８ウェルをチューブリン又はＳＮＣＡについての最大阻害ウェルとしてそれぞれ使用して、％ 阻害中央値として正規化した。結果を以下の表１、２及び３に示す。
Figure 2021511027
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実施例２Ｂ：自発的カルシウム振動測定
細胞内遊離カルシウム濃度における振動（カルシウム振動）の減少は、神経毒性の増加に対応するため、ｉｎ ｖｉｖｏでの耐容性の低下を示す場合がある。初代皮質ニューロン自発的カルシウム振動を測定するために、ラット初代皮質ニューロンをSprague-Dawleyラット胚（Ｅ１９）から調製した。簡潔に、脳皮質を切開し、パパイン／ＤＮａｓｅ／アール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）中において、３７℃で３０〜４５分間インキュベーションした。細胞ペレットの解離及び遠心分離後、反応を、プロテアーゼ阻害剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＤＮａｓｅを含有するＥＢＳＳとのインキュベーションにより停止させた。ついで、細胞を解離し、２％ Ｂ−２７、１００μg/ml ペニシリン、８５μg/ml ストレプトマイシン及び０．５mM グルタミンを補充したNeurobasal（ＮＢ、Invitrogen）で洗浄した。
細胞を、２５，０００個/ウェルの濃度で、２５μl/ウェル 補充済みNeurobasal（ＮＢ）培地（Ｂ２７サプリメント及び２mM グルタミンを含有）中での３８４ウェルポリ−Ｄ−リシン被覆蛍光画像化プレート（BD Biosciences）に播種した。細胞を、５％ ＣＯ２中３７℃で１２日間増殖させ、ＤＩＶ１２（すなわち、播種後１２日）で使用するために、ＤＩＶ０４（すなわち、播種後４日）及びＤＩＶ０８（すなわち、播種後８日）において、更なる培地 ２５μlを供給した。
実験当日、ＮＢ培地をプレートから除去し、細胞を５０μl/ウェルの３７℃アッセイバッファー（２mM ＣａＣｌ２及び１０mM Ｈｏｐｅｓ ｐＨ７．４を含入するハンク平衡塩類溶液）で１回洗浄した。振動を１mM ＭｇＣｌ２の有無の両方で試験した。細胞に、細胞永久蛍光カルシウム色素、Fluo-4-AM（Invitrogen, Molecular Probes F14201）を負荷した。Fluo-4-AMを、１０％ pluronic F-127を含有するＤＭＳＯ中において２．５mMで調製し、ついで、アッセイバッファー中において、１：１０００に希釈して、最終濃度２．５μMとした。細胞を５％ ＣＯ２中３７℃で２．５μM Fluo-4-AM ２０μLと共に１時間インキュベーションした。インキュベーション後、室温のアッセイバッファー ２０μlをさらに加え、細胞を暗所で室温に１０分間平衡化させた。
プレートを、FDSS 7000蛍光プレートリーダー（Hamamatsu）で、励起波長４８５nm及び発光波長５２５nmにおいて読み取った。総蛍光記録時間を全ての３８４ウェルについて、１Hz取得速度で６００秒とした。初期ベースラインシグナル（細胞内カルシウムの測定）を、ＡＳＯの添加前に９９秒間確立した。ＡＳＯをアッセイバッファー ２０μl中にＦＬＩＰＲでの３８４ウェルヘッドで７５μMで加え、最終濃度を２５μMとした。一部の例では、タウをターゲットとするＡＳＯ、例えば、ＡＳＯ−００００１３（ＯｘｙＡｓ ＯｘｙＴｓ ＯｘｙＴｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡｃｓ ＤＮＡｃｓ ＤＮＡａｓ ＤＮＡａｓ ＤＮＡａｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡｔｓ ＤＮＡｃｓ ＤＮＡａｓ ＯｘｙＭＣｓ ＯｘｙＴｓ ＯｘｙＴ；ATTtccaaattcaCTT、配列番号：１８８０）又はＡＳＯ−００００１０（TCTgtcttggctTTG、配列番号：１８７９)を対照として含ませた。
蛍光時系列強度測定値（上記）をhamamatsuリーダーからエクスポートし、データ処理及び正規化のために、IDBS E-Workbookスイート内の社内独自のアプリケーションに転送した。各３８４ウェルスクリーニングプレートにおいて、最大４８個まで、個々のＡＳＯをクアドルプリケートウェルで試験した。１２個のウェルを、３００秒の取得時間枠中に計数されたカルシウム振動を顕著に阻害する陽性対照（ＡＳＯ−００００１０）に暴露させ、１２個のウェルを、カルシウム振動の観察を阻害しない陰性対照不活性ＡＳＯ（ＡＳＯ−００００１３）に暴露させた。最後に、２４個のウェルを、試験ＡＳＯを希釈するのに使用されたのと同じ濃度のＲＮａｓｅ−ＤＮａｓｅを含まない水からなる媒体対照に供した。カルシウム振動周波数（３００秒間にわたる）に対する個々のウェルにおける試験ＡＳＯの効果を２４個の媒体対照ウェルにおいて計数されたカルシウム振動の中央値の％ 対照として表わした。個々の３８４ウェルアッセイプレートは、陽性及び陰性ＡＳＯ対照（ＡＳＯ−００００１０及びＡＳＯ−００００１３）がＣａアッセイにおいて十分に特徴付けられた薬理学を示し、媒体及び薬理学的対照ウェルが３００秒の実験期間にわたって最低約２０のカルシウム振動を生させた場合、ＱＣ標準に合格した。
実施例２Ｃ：ヒトニューロンにおけるｍＲＮＡ減少を測定するためのQUANTIGENE（登録商標）分析（９６ウェルアッセイ）
ＡＳＯのヒトＳＮＣＡ ｍＲＮＡ及び／又は潜在的なヒトのオフターゲットｍＲＮＡ種を減少させる能力をQUANTIGENE（登録商標）分析によりｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。ヒトニューロン（Ｃellular Dynamics Inc, 「iNeurons」）を、製造メーカーの仕様書に従って解凍し、播種し、培養した。これらのiNeuronsは、Cellular Dynamicの独自の分化及び精製プロトコールを使用して、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から得られたヒトニューロンの高純度集団である。
溶解：細胞をウェルあたりに５０，０００〜１００，０００個（調査されるオフターゲットの発現に応じて）で、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン被覆９６ウェルプレートに播種し、Ｂ２７、glutamax及びペニシリン−ストレプトマイシンを補充したNeurobasal培地中で維持した。ＡＳＯを水で希釈し、ＤＩＶ０１（すなわち、播種後１日）で細胞に加えた。一点測定のために、０．５μMの最終ＡＳＯ濃度を典型的に使用した。ＩＣ５０測定のために、ニューロンを１：４の７点濃度反応希釈液で処理し、最高濃度を５μMとし、ＩＣ５０を定義した。ついで、細胞を３７℃及び５％ ＣＯ２で６日間インキュベーションして、ｍＲＮＡの定常状態減少を達成した。
インキュベーション後、培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、下記のように溶解させた。ライゼートのメッセンジャーＲＮＡの測定を、QUANTIGENE（登録商標）2.0試薬システム（AFFYMETRIX（登録商標））を使用して行った。同システムは、特別に設計されたＲＮＡ捕捉プローブセットに応じた分岐ＤＮＡシグナル増幅法を使用して、ＲＮＡを定量した。プロテイナーゼＫ ５０μlを予備加温（３７℃）溶解混合物 ５mlに加えることにより、作業細胞溶解バッファー溶液を調製し、ｄＨ２Ｏで１：４の最終希釈液に希釈した。作業溶解バッファーをプレートに加え（１００〜１５０μl/ウェル、調査されるオフターゲットの発現に応じて）、１０回解離し、密封し、５５℃で３０分間インキュベーションした。溶解後、ウェルをさらに１０回解離し、プレートを−８０℃で保存するか又は直ちにアッセイした。
アッセイ：使用された特異的捕捉プローブ（すなわち、ＳＮＣＡ、ＰＲＯＳ１又はチューブリン）に応じて、ライゼートを溶解ミックス中で希釈した（又は希釈しなかった）。ついで、ライゼートを８０μl/ウェルの総容量で捕捉プレート（捕捉プローブで被覆された９６ウェルポリスチレンプレート）に加えた。作業プローブセット試薬を、ヌクレアーゼを含まない水（１２．１μl）、溶解混合物（６．６μl）、ブロッキング試薬（１μl）及び特異的な２．０プローブセット（０．３μl）（ヒトＳＮＣＡ カタログ＃ＳＡ−５０５２８、ヒトＰＲＯＳ１ カタログ＃ＳＡ−１０５４２又はヒトベータ３チューブリン カタログ＃ＳＡ−１５６２８）を製造メーカーの指示書（QUANTIGENE（登録商標）2.0 AFFYMETRIX（登録商標））に従って混合することにより生成した。次に、作業プローブセット試薬 ２０μlを捕捉プレートにおけるライゼート希釈液 ８０μl（又はバックグラウンドサンプルについては、溶解ミックス ８０μl）に加えた。プレートを２４０ｇで２０秒間遠心分離し、ついで、５５℃で１６〜２０時間インキュベーションして、ハイブリダイズさせた（ターゲットＲＮＡ捕捉）。
ターゲットＲＮＡのシグナル増幅及び検出を、プレートをバッファーで３回（３００μl/ウェル）洗浄して、任意の結合していない物質を除去することにより開始した。次に、2.0 Pre-Amplifierハイブリダイゼーション試薬（１００μl/ウェル）を加え、５５℃で１時間インキュベーションし、ついで吸引し、洗浄バッファーを加え、それを吸引することを３回行った。ついで、2.0 Amplifierハイブリダイゼーション試薬を記載されたように加え（１００μl/ウェル）、５５℃で１時間インキュベーションし、洗浄工程を前述のように繰り返した。次に、2.0 Label Probeハイブリダイゼーション試薬を加え（１００μl/ウェル）、５０℃で１時間インキュベーションし、洗浄工程を前述のように繰り返した。プレートを再度、２４０ｇで２０秒間遠心分離して、任意の過剰の洗浄バッファーを除去し、ついで、2.0 Substrateをプレートに加えた（１００μl/ウェル）。プレートを室温で５分間インキュベーションし、ついで、プレートをPerkinElmer Envisionマルチラベルリーダーにおいて、ルミノメーターモードで１５分以内に画像化した。
データ測定：目的の遺伝子について、平均アッセイバックグラウンドシグナルを各技術的反復の平均シグナルから差し引いた。ついで、目的の遺伝子についてのバックグラウンドを差し引いた平均シグナルを、ハウスキーピングチューブリンＲＮＡについてのバックグラウンドを差し引いた平均シグナルに対して正規化した。処理サンプルについての％ 阻害を対照処理サンプルライゼートに対して計算した。
実施例２Ｄ：Ｒａｍｏｓ細胞におけるｍＲＮＡ減少を測定するためのQUANTIGENE（登録商標）分析（９６ウェルアッセイ）
潜在的なヒトのオフターゲットＩＫＺＦ３（ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー３）ｍＲＮＡ減少を測定するために、Ｒａｍｏｓ細胞（ヒトリンパ球細胞系統）を使用した。Ｒａｍｏｓ細胞は、ＳＮＣＡを発現しないため、Ｒａｍｏｓ細胞において発現されるＲＢ１（ＲＢ転写コレプレッサー１）を、ＡＳＯ媒介ノックダウンＩＫＺＦ３ ｍＲＮＡ発現を評価するための陽性対照として使用した。２つのＡＳＯを合成して、ヒトＲＢ１ ｍＲＮＡに結合させ、同ｍＲＮＡの発現をノックダウンした。ハウスキーピング遺伝子対照として、ベータ−２ミクログロブリン（β２Ｍ）を使用した。Ｒａｍｏｓ細胞を、ＦＢＳ、グルタミン及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中において懸濁状態で増殖させた。
溶解：細胞をウェルあたりに２０，０００個で、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン被覆９６ウェルプレートに播種し、Ｂ２７、glutamax及びペニシリン−ストレプトマイシンを含有するNeurobasal培地中で維持した。ＡＳＯを水で希釈し、播種後１日（ＤＩＶ０１）で細胞に加えて、最終濃度を１μMにした。ＡＳＯ処理後、細胞を３７℃で４日間インキュベーションして、ｍＲＮＡの定常状態減少を達成した。インキュベーション後、培地を除去し、細胞を下記のように溶解させた。ライゼートのメッセンジャーＲＮＡの測定を、QUANTIGENE（登録商標）2.0試薬システム（AFFYMETRIX（登録商標））を使用して行った。同システムは、特別に設計されたＲＮＡ捕捉プローブセットに応じた分岐ＤＮＡシグナル増幅法を使用して、ＲＮＡを定量した。溶解ミックス（Quantigene 2.0 Affimetrix）をインキュベーター中において、３７℃で３０分間予備加温した。細胞を懸濁状に溶解するために、懸濁液中で細胞を溶解するために、３×溶解バッファー（１０μl/ml プロテイナーゼＫを含む） １００μlを懸濁液 ２００μl中の細胞に加えた。ついで、細胞を１０回解離して溶解し、プレートを密封し、５５℃で３０分間インキュベーションした。その後、ライゼートを−８０℃で保存するか又は直ちにアッセイした。
アッセイ：使用された特異的捕捉プローブ（すなわち、ＩＫＺＦ３、ＲＢ１及びβ２Ｍ）に応じて、ライゼートを溶解ミックス中で希釈した（又は希釈しなかった）。ついで、ライゼートを８０μl/ウェルの総容量で捕捉プレート（捕捉プローブで被覆された９６ウェルポリスチレンプレート）に加えた。作業プローブセット試薬を、ヌクレアーゼを含まない水 １２．１μl、溶解混合物 ６．６μl、ブロッキング試薬 １μl及び特異的な２．０プローブセット ０．３μl（ヒトＩＫＺＦ３ カタログ＃ＳＡ−１７０２７、ヒトＲＢ１ カタログ＃ＳＡ−１０５５０又はヒトベータ−２ミクログロブリン カタログ＃ＳＡ−１００１２）を製造メーカーの指示書（QUANTIGENE（登録商標）2.0 AFFYMETRIX（登録商標））に従って混合することにより生成した。ついで、作業プローブセット試薬 ２０μlを捕捉プレートにおけるライゼート希釈液 ８０μl（又はバックグラウンドサンプルについては、溶解ミックス ８０μl）に加えた。ついで、プレートを５５℃で１６〜２０時間インキュベーションして、ハイブリダイズさせた（ターゲットＲＮＡ捕捉）。ターゲットＲＮＡのシグナル増幅及び検出を、プレートをバッファーで３回（３００μl/ウェル）洗浄して、任意の結合していない物質を除去することにより開始した。次に、2.0 Pre-Amplifierハイブリダイゼーション試薬（１００μl/ウェル）を加え、５５℃で１時間インキュベーションし、ついで吸引し、洗浄バッファーを加え、それを吸引することを３回行った。ついで、2.0 Amplifierハイブリダイゼーション試薬を記載されたように加え（１００μl/ウェル）、５５℃で１時間インキュベーションし、洗浄工程を前述のように繰り返した。次に、2.0 Label Probeハイブリダイゼーション試薬を加え（１００μl/ウェル）、５０℃で１時間インキュベーションし、洗浄工程を再度、前述のように繰り返した。プレートを再度、２４０ｇで２０秒間遠心分離して、任意の過剰の洗浄バッファーを除去し、ついで、2.0 Substrateをプレートに加えた（１００μl/ウェル）。プレートを室温で５分間インキュベーションし、ついで、プレートをPerkinElmer Envisionマルチラベルリーダーにおいて、ルミノメーターモードで１５分以内に画像化した。
データ測定：目的の遺伝子について、平均アッセイバックグラウンドシグナル（すなわち、ライゼートなし、単なる１×溶解バッファー）を各技術的反復の平均シグナルから差し引いた。ついで、目的の遺伝子についてのバックグラウンドを差し引いた平均シグナルを、ハウスキーピングｍＲＮＡ（Ｒａｍｏｓ細胞については、ベータ−２−ミクログロブリンとした）についてのバックグラウンドを差し引いた平均シグナルに対して正規化した。処理サンプルについての％ 阻害を未処理サンプルライゼートの平均に対して計算した。
実施例２Ｅ：ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの減少を測定するためのｑＰＣＲアッセイ
ＳＮＣＡをターゲットとするＡＳＯを、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２２７１）から取得したヒトＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）神経芽細胞腫細胞におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現を低下させるその能力について試験した。
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞を、１０％ ウシ胎仔血清［Sigma、ｃａｔ．ｎｏ Ｆ７５２４］、１×Glutamax（商標）［Sigma、ｃａｔ．ｎｏ ３０５０−０３８］１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液［Sigma、ｃａｔ．ｎｏ Ｍ７１４５］及び０．０２５mg/ml ゲンタマイシン［Sigma、ｃａｔ．ｎｏ Ｇ１３９７］を補充した細胞培養培地（ＭＥＭ［Sigma、ｃａｔ．ｎｏ Ｍ２２７９］）中で増殖させた。細胞を、５日毎にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）［Sigma ｃａｔ．ｎｏ １４１９０−０９４］で洗浄し、続けて、０．２５％ トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Sigma、Ｔ３９２４）を加え、３７℃で２〜３分間インキュベーションし、解離することにより、トリプシン処理し、その後、細胞を播種した。細胞を培養物中で１５継代まで維持した。
実験で使用するために、ウェルあたりに１２，５００個の細胞を、増殖培地 １００μL中の９６ウェルプレート（Nunc ｃａｔ．ｎｏ１６７００８）に播種した。オリゴヌクレオチドを７５０μM ストックから調製した。ＰＢＳに溶解させたＡＳＯを、細胞の播種後約２４時間で加えて、一点研究のために、２５μMの最終濃度とした。細胞を、培地交換を何らせずに４日間インキュベーションした。効力測定のために、８つの濃度のＡＳＯを、１６〜５０，０００nMの最終濃度範囲で調製した。ＡＳＯ−００４３１６（CcAAAtcttataataACtAC、配列番号：１８８１）及びＡＳＯ−００２８１６（TTCctttacaccACAC、配列番号：１８８２）を対照として含ませた。
インキュベーション後、細胞を、培地を除去し、続けて、PureLink（登録商標）Pro 96溶解バッファー（Invitrogen １２１７３．００１Ａ）１２５μL及び７０％ エタノール １２５μLを加えることによりを採取した。ＲＮＡを製造メーカーの指示書に従って精製し、水により最終容量５０μLで溶出し、１０〜２０ng/μlのＲＮＡ濃度を得た。ＲＮＡを、１ステップｑＰＣＲ反応の前に、水で１０倍希釈した。１ステップｑＰＣＲ反応のために、ｑＰＣＲミックス（qScript TMXLE 1-step RT-qPCR TOUGHMIX（登録商標）Low ROX（QauntaBio、ｃａｔ．ｎｏ９５１３４−５００））を２つのTaqmanプローブと１０：１：１（ｑＰＣＲミックス：プローブ１：プローブ２）の比率で混合し、マスターミックスを生成した。Taqmanプローブを、LifeTechnologiesから入手した：ＳＮＣＡ：Ｈｓ０１１０３３８３＿ｍ１；ＰＲＯＳ１：Ｈｓ００１６５５９０＿ｍ１；ＴＢＰ：４３２５８０３； ＧＡＰＤＨ ４３２５７９２。ついで、マスターミックス（６μL）及びＲＮＡ（４μL、１〜２ng/μL）をｑＰＣＲプレート（MICROAMP（登録商標）optical ３８４ウェル、４３０９８４９）中で混合した。密封後、プレートに、１０００ｇの迅速なスピンをＲＴで１分間加え、ViiaTM 7システム（Applied Biosystems, Thermo）に移し、下記ＰＣＲ条件を使用した：５０℃で１５分間；９５℃で３分間；９５℃で５秒間、続けて、１．６℃/秒の温度低下、続けて、６０℃で４５秒間を４０サイクル。データを、QuantStudio（商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェアを使用して分析した。
結果を実施例２Ａにおける表１に示す。
実施例３：ヒトＳＮＣＡ ｍＲＮＡの減少についてのＡＳＯ−００３０９２及びＡＳＯ−００３１７９のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
ＡＳＯ−：１４３６００３０９２（２０塩基 配列番号）及びＡＳＯ−００３１７９（１９塩基 配列番号：１５４７）は、ヒトＳＮＣＡ プレｍＲＮＡ（配列番号：１）のエクソン６領域をターゲットとするＬＮＡ修飾ＡＳＯである。
マウスニューロンにおけるＡＳＯ−００３０９２及びＡＳＯ−００３１７９の効力
実施例２Ａにおいて上記された方法を使用して、ＡＳＯ−００３０９２及びＡＳＯ−００３１７９を、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの減少の下流の結果としてＳＮＣＡタンパク質発現を低下させるそれらの能力について試験した。簡潔に、ＰＡＣ−Ａ５３Ｔマウスから得られた初代ニューロンを、ＡＳＯ−００３０９２、ＡＳＯ−００３１７９又は対照ＡＳＯで１４日間処理した。ついで、細胞を固定し、ＳＮＣＡタンパク質及びチューブリンタンパク質のレベルを、high contet画像化により測定した。チューブリンレベルを、毒性をモニターし、ＳＮＣＡタンパク質減少を正規化するために測定した。
以下の表４及び実施例２Ａにおける表１に示されたように、４０nM ＡＳＯ−００３０９２又はＡＳＯ−００３１７９との細胞のインキュベーションにより、ＳＮＣＡタンパク質発現における７６％及び７３％それぞれの低下がもたらされた。対照的に、両ＡＳＯは、チューブリンタンパク質発現のレベルについて、最少の影響〜無影響であった。
Figure 2021511027
上記結果から、ＡＳＯ−００３０９２及びＡＳＯ−００３１７９が、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡを効果的に減少させ、次に、ＳＮＣＡタンパク質レベルの低下を媒介することが実証される。これらのＡＳＯは、マウス及びヒトのニューロンの両方において良好に耐容性であった。これらの知見から、シヌクレイン症の処置のための疾患修飾治療剤としてのＳＮＣＡ特異的ＡＳＯ（例えば、ＡＳＯ−００３０９２及びＡＳＯ−００３１７９）の継続的な開発が支持される。
実施例４：ｉｎ ｖｉｖｏ耐容性及びｉｎ ｖｉｖｏ ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ減少
選択されたＡＳＯのｉｎ ｖｉｖｏ耐容性を試験し、異なる動物モデル（すなわち、マウス及びカニクイザル）に注射した場合、ＡＳＯがどのように耐容されるかを観察した。
マウス
対象：マウスＳＮＣＡノックアウトバックグラウンドにＡ５３Ｔ突然変異を有するヒトＳＮＣＡ遺伝子全体を担持するオス及びメス（２〜３か月齢）のＰＡＣ−Ｔｇ（ＳＮＣＡＡ５３Ｔ）＋／＋；ＳＮＣＡ−／−（「ＰＡＣ−Ａ５３Ｔ」）マウスを、急性、長期及びＰＫ／ＰＤ ｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究に使用した。一部の場合には、野生型（ＷＴ）Ｃ５７Ｂ／６マウスを長期（すなわち、４週間）健康評価に使用した。マウスを、自由に利用可能な食物及び水と共に、温度制御されたハウジングルーム中で４又は５匹の群で収容した。マウスに関わる全ての手順をBristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee (ACUC)により承認された動物試験法（ＡＴＭ）に従って行った。
ＡＳＯ投与溶液調製：０．２μmのWhatmanフィルターを取り付けた滅菌生理食塩水（１mL）シリンジ及びヌクレアーゼを含まない遠心管を使用して、投与溶液を調製した。指定量の水又は生理食塩水をＡＳＯ粉末に加え、ボルテックス（約１分）して、ＡＳＯ粉末を溶解させた。ついで、この溶液を１０分間静置し、再度約１分間ボルテックスした。チューブを軽く遠心分離して、全ての液体をチューブの底部に戻し、ついで、この溶液を０．２μmの滅菌フィルターを通してろ過して、２本目のＲＮａｓｅを含まないチューブに入れた。Nanodropを使用して濃度を分析するために、一次ストックの少量のアリコートを１mg/mlに希釈した。分析サンプルを手作業で反転させながら３回ボルテックスして、完全に混合させた。ついで、サンプルのＵＶ吸光度を、Nanodropを使用して２６０nmで２回測定した（サンプルを適用する前に、台をすすぎ、３回拭いた）。分析が完了したら、試験サンプルを廃棄した。ＵＶ吸光度が、サンプルの９０〜１１０％であった場合、サンプルを投与の準備ができているとみなした。ＵＶ吸光度が、サンプルの１１０％を超えた場合、二次希釈液を調製した。吸光度が９０％未満であった場合、サンプルをより高い初期濃度で調製し、同様の工程を上記されたように行った。サンプルを使用するまで４℃で保存した。
フリーハンド側脳室内（ＩＣＶ）注射：ＩＣＶ注射を、Ｈａｌｅｙ及びＭｃＣｏｒｍｉｃｋの方法に従って、２７ゲージ又は３０ゲージ針を取り付けたHamiltonマイクロシリンジを使用して行った。針は、脳への針の侵入を制限するために、先端から２．５〜３mmのところにポリエチレンガードを備えていた。マウスを、イソフルラン麻酔薬（１〜４％）を使用して麻酔した。十分に麻酔したら、マウスを片手の親指と人差し指とで首の後ろのゆるい皮膚で保持した。穏やかではあるが強い圧力を加えて、動物の頭部を、堅い平坦な水平面に押し付けることにより固定した。投与を、２７ １／２ｇの針を取り付けた１０μlのHamiltonシリンジを使用して行った。ついで、針の先端を、頭皮及び頭蓋骨を通して、前頭に対して約１mm横方向及び１mm尾側（すなわち、正中線の右側、眼線から測定して約３mm後方）に挿入した。針を配置したら、ＡＳＯを生理食塩水媒体中の５μlの容量で与え、約３０秒間にわたって注射した。針を、取り外す前に５〜１０秒間、適所に放置した。マウスをホームケージに戻し、約２〜４分間回復させた。マウスを、薬剤及び／又は投与の有害な挙動影響について、投与直後に３０分間連続的に観察した。この間、３回以上別々に痙攣を起こしたどのマウスも直ちに安楽死させ、自動スコア２０を与えた。薬剤耐容性を投与１時間±１５分でスコア化した。非耐容性化合物（耐容性スコア＞４）を投与された動物は、１時間の評価の直後に安楽死させた。
ＡＳＯ耐容性評価：ＡＳＯを投与された動物を投与直後に評価し、任意の有害作用について２時間モニターした。急性耐容性（ＡＴ）研究では、マウスを投与時に評価し、再度休薬時、すなわち、ＡＳＯ注射後３日で評価した。長期間の健康評価のために、マウスの体重を毎週測定し、実験が完了するまで、健康及び挙動の何らか問題についてモニターした。最初の体重の１５％を超える体重減少又は耐容性の問題を示したマウスを試験から除外し、安楽死させた。健康及び耐容性の評価を下記チャートに従って行った。
Figure 2021511027
組織採取：最終的な行動評価及び健康評価後に、マウスをギロチンで断頭し、脳をすばやく取り出した。各脳を２つの半球に分割し、ａ）海馬を３日間の急性耐容性研究におけるｍＲＮＡ測定のために切り出した；ｂ）一方の半球からの海馬、脳幹及び線条体をｍＲＮＡ測定のために切り出した。一方、同じ領域を用量反応時間経過ＰＫ／ＰＤ研究におけるタンパク質／ＰＫ測定のために第２半球から切り出した。
一部の研究では、血液と脳脊髄液（ＣＳＦ）も、ＰＫ（血液）及びＰＫ／タンパク質（ＣＳＦ）測定のために採取した。血液及びＣＳＦを採取するために、マウスをイソフルラン（４％）で深麻酔した。血液を、２３Ｇ針を使用する心臓穿刺により採取した。取り出したら、血液を２mlのBD Microtainer（K2EDTA BD #365974）チューブに移し、処理するまで氷上に置いた。血液を処理するために、チューブを４５００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。ついで、血漿を取り出し、０．５mlのEppendorfチューブに入れ、使用するまで−８０℃で保存した。ＣＳＦを採取するために、胸腔を開いて、心臓を露出させ、ＣＳＦの汚染を避けるために多量の血液を排出させた。ＣＳＦサンプルを、マイクロピペットを使用し、大槽を介して採取し、lo-bind protein Eppendorfチューブに入れた。ついで、このチューブを４５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。ＣＳＦを、清潔な０．５mlのlo-bind Eppendorfチューブに注意深く移し、更なる使用まで−８０℃で保存した。
カニクイザルのデータ
対象：研究の開始時に体重３．５〜１０．０kg オスのカニクイザルを使用した。それぞれに、Ｌ３又はＬ４椎骨に入る髄腔内脳脊髄液（ＣＳＦ）カテーテルを埋め込んだ。ポリウレタンカテーテルの遠位先端は、くも膜下腔内で、ほぼＬ１椎骨まで延在した。近位端を、動物の腰に位置する皮下アクセスポートに接続した。動物は研究の開始前少なくとも２週間治癒させた。実験動物ケアは、Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory Animals and the Guide for the Care and use of Laboratory Animals NRC (2011)(National Research Council: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health). National Academies Press (US), Washington (DC))に従った。プロトコールは、Wallingford Animal Care and Use Committee of the Bristol-Myers Squibb Companyにより承認された。
ＣＳＦ及び血液のサンプリング：ＣＳＦポートに、無菌技術を使用して皮下アクセスした。ＣＳＦを霊長類拘束椅子に立位で座った覚醒動物からサンプリングした。採取の開始時に、ＣＳＦ 約０．１mlを廃棄して、カテーテル及びポート内のデッドスペースを無くした。ＣＳＦを、サンプルあたりにＣＳＦを最大０．５mlまで重力流により採取した。ＣＳＦを２，０００ｇ、４℃で１０分間スピンさせた。上清をドライアイス又は液体窒素で凍結させ、分析するまで−９０℃に保った。
血液を入手可能な静脈、典型的には、伏在静脈からサンプリングした。血液サンプルを対象となる特定の測定に応じて、多くの手法で調製した。血漿については、血液をＥＤＴＡ処理チューブに採取した。血清については、血液を血清分離チューブに収集し、遠心分離の前に少なくとも３０分間凝固させた。凝固及び凝固因子の測定のために、血液をクエン酸チューブに採取し、ＲＮＡの分析のために、血液を、RNAlaterを含有するチューブに採取した。処理後、サンプルをドライアイス又は液体窒素で凍結させ、分析するまで凍結させた。
髄腔内投与：動物を覚醒時に投与するように訓練し、改良された市販の拘束椅子を使用して、動物を腹臥位に維持した。ＳＮＣＡターゲット化アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を生理食塩水に溶解させ、ろ過滅菌し、容量 １．０ml中で０．３３ml/分で投与し、続けて、滅菌水 ０．５mlでフラッシュした。総注入時間は４．５分とした。動物を注入後３０分間、腹臥位のままにした。
剖検：カニクイザルに、ケタミン及び／又はイソフルランで麻酔しながら、適切な容量の市販の安楽死溶液を投与した。その直後に剖検組織を採取し、脳を切開のために湿った氷に移した。目的の領域を、ASI Cyno Brain Matrixにおける４〜６mmスライス及びフリーハンド技術を使用して切開した。サンプルをRNAlater中に新鮮に入れるか又は後の分析のためにドライアイスで凍結させた。ＣＮＳ組織をカニクイザルから迅速に取り出し、いずれの軸についても４mm以下の切片を採取し、５mLのRNAlaterに入れた。サンプルを一晩４℃に保存し、ついで、分析するまで、保存のために−２０℃に移した。
分析した脳領域は、髄質、橋、中脳、小脳、尾状核被殻（左右）、海馬（左右）、前頭皮質（左右）、側頭皮質（左右）、頭頂皮質（左右）、後頭皮質（左右）及び皮質白質を含んだ。さらに、脊髄を頚部、胸部及び腰部領域でサンプリングした。また、サンプルを肝臓、腎臓及び心臓からも収集した。ある場合には、三叉神経核、脛骨神経及び大動脈のサンプルを採取して、それらの領域におけるオフターゲット薬理学を検討した。
マウス又はサルの組織、血漿及びＣＳＦ中のＡＳＯ濃度のＥＬＩＳＡ定量
組織を１：１の比の血漿及び水でホモジナイズした。検量線を、血漿（血漿及びＣＳＦについて）及び血漿：水（組織サンプルについて）中で５０００〜４．９nMの２倍系列希釈することにより作成し、ついで、５×ＳＳＣＴ（７５０mM ＮａＣｌ及び７５mM クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０５％（v/v） Tween-20を含有）単独中及び３５nM 捕捉試薬及び３５nM 検出試薬を含有する５×ＳＳＣＴ中で、さらに合計５０００倍に希釈して、１〜１０００pMの標準範囲を得た。使用した希釈係数は、予想されるサンプル濃度範囲に応じて変化させた。捕捉プローブは、３’ビオチン（Exiqon）を有するAAAGGAAとし、検出プローブは、５’ＤｉｇＮ−イソプロピル１８リンカーGTGTGGT（Exiqon）とした。
実験サンプル及び標準を、捕捉バッファー及び検出バッファーで希釈する前かつELISAプレートに移す前に、１：１の比でClarity溶解バッファー（Phenomenex、ｃａｔ＃ＡＬ０−８５７９）に加えた。ＣＳＦサンプルを、溶解バッファーを添加する前に、血漿で希釈した（２倍）。ストレプトアビジン被覆プレート（Thermo 15119）を５×ＳＳＣＴバッファーで３回洗浄した。サンプル １００μlを加え、室温で６０分間インキュベーションした。検出プローブである、０．０５％ Tween-20（Roche Applied Science、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０９３２７４９１０）を含有するＰＢＳ中で１：４０００希釈された抗Ｄｉｇ−ＡＰ Ｆａｂフラグメント １００μlを加え、室温で６０分間インキュベーションした。プレートを２×ＳＳＣＴバッファーで洗浄した後、Tropix CDP-star Sapphire II基質（Applied Biosystems） １００μlを室温で３０分間加えた。アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を発光（Enspire-PerkinElmer）により測定した。
アルファ−シヌクレインタンパク質測定
脳組織サンプルを、５mmのステンレス鋼ビーズを使用するビーズホモジナイザーQiagen Tissuelyser IIを使用して、ＲＩＰＡバッファー（５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム）中において、１０ml/g 組織を２５サイクル/秒で合計２分間ホモジナイズした。ホモジナイズされたサンプルを氷上で３０分間インキュベーションした。各サンプル ５０μlアリコートをＰＫ分析のために保持した。残りのサンプルを２０，８００ｇ、４℃で６０分間遠心分離した。上清を保持し、分析に使用した。総タンパク質を、Pierce BCAタンパク質アッセイキット（２３２２７）を使用して測定した。
脳組織抽出物：ＳＮＣＡタンパク質を、MJFR1+4B12 ELISAを使用して測定した。簡潔に、ELISAプレート（Costar）を、４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）、ＢｕｐＨ炭酸塩−重炭酸塩バッファー、ｐＨ９．４（Thermo Scientific）で希釈した０．１μg/mlの濃度の抗ＳＮＣＡ抗体MJFR1（Abcam） １００μlで被覆した。翌日、プレートをDulbecco’s ＰＢＳ（Life Technologies）で４回洗浄し、ＰＢＳ中の３％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、プロテアーゼフリー、画分Ｖ、Roche Diagnostic）により、室温（ＲＴ）で２〜３時間又は４℃で一晩ブロッキングした。標準及び脳サンプルの両方を、Rocheプロテアーゼ阻害剤（Roche １１８３６１４５００１、１ペレット/２５ml）及びホスファターゼ阻害剤２＆３（Sigma、１：１００）を含有する１％ ＢＳＡ／０．０５％ Tween／ＰＢＳで希釈した。ＳＮＣＡ野生型（rPeptide）を標準として使用した。サンプルをデュプリケート（５０μl/ウェル）でロードし、４℃でＯ／Ｎインキュベーションした。プレートをＲＴに平衡化した後、検出抗体４Ｂ１２（Biolegend）（１％ ＢＳＡ／０．１％ Tween／ＤＰＢＳ中で１：４０００希釈） ５０μlを各ウェルに加え、サンプルと共にＲＴで約２時間共インキュベーションした。検出抗体を、アルカリホスファターゼ（Novus Biologicals製のＡＰキット）と予めコンジュゲーションさせた。ついで、プレートを０．０５％ Tween／ＰＢＳで４回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質（Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II, T-2214, Life Technologies） １００μlで３０分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision（２１０２マルチラベルリーダー）で測定した。アッセイの間、プレートを一定の振とう（タイタープレート振とう器、速度３）に保った。データを、GraphPad Prismを使用して分析した。脳組織中の総タンパク質を、Micro proteinアッセイキット（Thermofisher ＃２３２３５）を使用し、製造メーカーの指示書に従って測定した。
脳脊髄液（ＣＳＦ）：ＳＮＣＡタンパク質を、U-PLEX Human SNCAキット：（ｃａｔ＃ Ｋ１５１ＷＫＫ−２、Meso Scale Discovery）を使用し、製造メーカーの指示書に従って測定した。ＣＳＦサンプルを１０倍希釈した。ＣＳＦサンプル中のヘモグロビンを、AbcamマウスヘモグロビンELISAキット（ａｂ１５７７１５）を使用して測定した。ＣＳＦサンプルをヘモグロビン測定のために４０倍希釈した。
ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ測定
脳領域を採取し、ＲＮＡ安定化溶液であるRNAlaterで予め満たした、１．５mlのRNA-later組織保護チューブ（Qiagen ｃａｔ＃７６５１４）に入れた。RNA-later溶液中の組織を４℃で１か月間又は−２０℃もしくは−８０℃で無期限保存することができる。
ＲＮＡ単離：RNEASY Plus Miniキット：マウスの海馬及び皮質からのＲＮＡを、RNEASY Plus Miniキット（Qiagen ｃａｔ＃７４１３４）を使用して単離した。組織サンプルを、１０μl/ml ２−メルカプトエタノール及び０．５％ 試薬Ｄｘを含有するRLT Plusバッファー ６００μL又は１２００μLの容量中でホモジナイズした。組織サンプルが＜２０mgであった場合、溶解バッファー ６００μLを使用し、＞２０mgの組織サンプルについては、溶解バッファー １２００μLを使用した。ホモジナイゼーションのために、組織サンプルを、RLT Plusバッファー（１０ul/ml ２−メルカプトエタノール及び０．５％ 試薬Ｄｘを含む） ６００μL及び５mmのステンレス鋼ビーズ（Qiagen ｃａｔ＃６９９８９）を含有する２．０mLの丸底Eppendorf Safe-Lockチューブ（Eppendorf ｃａｔ＃０２２６０００４４）に移した。サンプルを、QiagenのTissueLyser II機器を使用してホモジナイズした。サンプルを２０Hzで２．０分間処理し、サンプルを１８０°回転させ、２０Hzでさらに２．０分間処理した。ついで、サンプルを３０Hzで２．０分間処理し、サンプルを１８０°回転させ、３０Hzでさらに２．０分間処理した。処理が完了していなかった場合、より長い及び／又はより高い周波数のホモジナイゼーションを使用した。ついで、組織ライゼート ６００μLを、２．０mLの採取チューブ中のgDNA Eliminatorスピンカラムに移し、サンプルを１０，０００ｇで３０秒間遠心分離した。全ての遠心分離工程をＲＴで行った。フロースルーを採取し、等量の７０％ エタノールを加え、混合した。６００μLを、２．０mLの採取チューブに入れたRNeasyスピンカラムに移し、サンプルを１０，０００ｇで１５秒間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、残ったサンプル ６００μLをスピンカラムに加えた。スピンカラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。カラムを洗浄バッファーＲＷ１ ７００μlで洗浄し、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離し、フロースルー廃棄した。ついで、カラムを、キットプロトコールに記載されているように、４容量 エタノールを含有するバッファーＲＰＥ ５００μLで２回洗浄した。まず、カラムを１回目の洗浄のために、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離し、ついで、２回目の洗浄のために、１０，０００ｇで２．０分間遠心分離した。２回目の洗浄後、カラムを１０，０００ｇで１．０分間１回遠心分離して、メンブレンを乾燥させた。ついで、カラムを新たな１．５mLの採取チューブに移し、ＲＮａｓｅを含まない水 ３０μlをメンブレンの中心に直接加えた。このメンブレンをＲＴで１０分間インキュベーションした。ついで、このカラムを１０，０００ｇで１．０分間遠心分離し、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡを含有する溶出液を収集し、NanoDrop分光光度計（Thermo）を使用するＵＶ吸光度によりＲＮＡ濃度を決定することができるまで、氷上で保存した。ＲＮＡサンプルを−８０℃で保存した。
ＲＮＡ単離：RNEasy（登録商標）Plus Universal Miniキット：他の全てのカニクイザル、マウス及びラットの組織サンプルからのＲＮＡを、RNEasy（登録商標）Plus Universal Miniキット（Qiagen ｃａｔ＃７３４０４）を使用して単離した。ホモジナイゼーションのために、５０μg以下 組織サンプルを、QIAZOL（登録商標）溶解試薬 ９００μL及び５mmのステンレス鋼ビーズ（Qiagen ｃａｔ＃６９９８９）を含有する２．０mLの丸底Eppendorf Safe-Lockチューブ（Eppendorf ｃａｔ＃０２２６０００４４）に移した。サンプルを、QiagenのTissueLyser II機器を使用してホモジナイズした。サンプルを２０Hzで２．０分間処理し、サンプルを１８０°回転させ、２０Hzでさらに２．０分間処理した。ついで、サンプルを３０Hzで２．０分間処理し、サンプルを１８０°回転させ、３０Hzでさらに２．０分間処理した。処理が完了していなかった場合、より長い及び／又はより高い周波数のホモジナイゼーションを使用した。ついで、ホモジナイズされた組織ライゼートを新たな２．０mLの丸底Eppendorf Safe-Lockチューブに入れ、ＲＴで５分間放置した。gDNA Eliminator溶液 １００μLを各チューブに加え、チューブを３０秒間激しく振とうした。クロロホルム（Sigma ｃａｔ＃４９６１８９） １８０μLを各チューブに加え、チューブを３０秒間激しく振とうした。チューブを室温で３分間放置した。チューブを１２，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。遠心分離後、上部水相を新たな２．０mLの丸底Eppendorf Safe-Lockチューブ 約５００μLに移した。等量の７０％ エタノールを加え、混合した。その後の全ての遠心分離工程をＲＴで行った。５００μLを、２．０mLの採取チューブに入れたRNeasyスピンカラムに移し、サンプルを１０，０００ｇで１５秒間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、残ったサンプル ５００μLをスピンカラムに加えた。スピンカラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。カラムを、２容量 エタノールを含有する洗浄バッファーＲＷＴ ７００μlで洗浄した。カラムを１０，０００ｇで１５秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。ついで、カラムを、キットプロトコールに記載されているように、４容量 エタノールを含有するバッファーＲＰＥ ５００μLで２回洗浄した。まず、カラムを１回目の洗浄のために、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離し、ついで、２回目の洗浄のために、１０，０００ｇで２．０分間遠心分離した。２回目の洗浄後、カラムを１０，０００ｇで１．０分間１回遠心分離して、メンブレンを乾燥させた。ついで、カラムを新たな１．５mLの採取チューブに移し、ＲＮａｓｅを含まない水 ３０μlをメンブレンの中心に直接加えた。メンブレンをＲＴで１０分間インキュベーションした。カラムを１０，０００ｇで１．０分間遠心分離し、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡを含有する溶出液を収集し、NanoDrop分光光度計（Thermo）を使用するＵＶ吸光度によりＲＮＡ濃度を決定することできるまで、氷上で保存した。ＲＮＡサンプルを−８０℃で保存した。
逆転写によるｃＤＮＡ合成：３００ng ＲＮＡを、PCR-96-AB-Cマイクロプレート（Axygen ｃａｔ＃３２１−６５−０５１）において、ヌクレアーゼを含まない水（Invitrogen ｃａｔ＃１０９７７−０１５）を使用して、１０．８μLの最終容量に希釈した。下記：５０μM ランダムデカマー（Ambion ｃａｔ＃ＡＭ５７２２Ｇ）２．０μL及び１×ｄＮＴＰミックス（Invitrogen ｃａｔ＃１０２９７−０１８） ４．０μLを含有する反応ミックス１ ６．０μlを各ウェルに加えた。プレートを光学密封テープ（Applied Biosystems ｃａｔ＃ ４３６０９５４）で密封し、ＲＴ、１，０００×ｇで１．０分間遠心分離した。次に、このプレートを、９６ウェルThermal Cycler GeneAmp PCRシステム9700（Applied Biosystems）を使用して、７０℃で３．０分間加熱した。ついで、このプレートを氷上で完全に冷却した。次に、反応ミックス２（１０×鎖バッファー ２μL、200U/μL MMLV-RT逆転写酵素（Ambion ｃａｔ＃２０４４） １．０μL及び４０Ｕ／μL ＲＮａｓｅ阻害剤（Ambion ｃａｔ＃ＡＭ２６８２） ０．２５μLを含有） ３．２５μLを各ウェルに加えた。プレートを光学密封テープで密封し、ＲＴ、１，０００×ｇで１．０分間遠心分離した。９６ウェルサーマルサイクラーを使用して、このプレートを、４２℃で６０分間加熱し、９５℃で１０分間進行させた。ついで、このプレートを氷上で冷却した。ＰＣＲ分析に使用する準備ができるまで、ｃＤＮＡプレートを−２０℃で保存した。
アルファシヌクレイン及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現の増幅及び定量のためのｑＰＣＲ：ｃＤＮＡをPCR-96-AB-Ｃマイクロプレート中において、ヌクレアーゼを含まない水で５倍希釈した。下記：２×Taqman遺伝子発現マスターミックス（Applied Biosystems ｃａｔ＃４３６９０１６） １０μL、２０×Taqmanプライマー−プローブセット（Applied Biosystems） １．０μL及びヌクレアーゼを含まない水 ５．０μLからなるマスターミックス溶液 １６μLを、３８４ウェル光学ＰＣＲプレート（Applied Biosystems ｃａｔ＃４４８３３１５）の各ウェルに加えた。希釈ｃＤＮＡ ４．０μLを３８４ウェル光学ＰＣＲプレートの各ウェルに加えた。プレートを光学密封テープで密封し、１，０００×ｇ、ＲＴで１分間遠心分離した。ＰＣＲを、Applied Biosystems 700 HTファーストリアルタイムＰＣＲシステムにおいて、標準モードでの下記パラメータを使用して行った：５０℃で２．０分間、９５℃で１０分間、続けて、９５℃で１５秒及び６０℃で１．０分間を４０サイクル。
ｑＲＴ−ＰＣＲプライマー−プローブセット：Applied Biosystems（Thermo Fisher）製のプライマー−プローブセットは、下記：
ヒトアルファシヌクレイン（ｃａｔ＃ Ｈｓ０１１０３３８３＿ｍ１）ＦＡＭラベル
ヒトＰＲＯＳ１（ｃａｔ＃ ＨＳ００１６５５９０＿ｍ１）ＦＡＭラベル
カニクイザルアルファシヌクレイン（ｃａｔ＃ Ｍｆ０２７９３０３３＿ｍ１）ＦＡＭラベル
カニクイザルＧＡＰＤＨ（ｃａｔ＃ Ｍｆ０４３９２５４６＿ｇ１）ＦＡＭラベル
カニクイザルＧＡＰＤＨ（ｃａｔ＃ Ｍｆ０４３９２５４６＿ｇ１）VIC labelled Primer Limited
ラットアルファシヌクレイン（ｃａｔ＃ Ｒｎ０１４２５１４１＿ｍ１）ＦＡＭラベル
ラットＧＡＰＤＨ（ｃａｔ＃ Ｒｎ０１７７５７６３−ｇ１）ＦＡＭラベル
ラットＧＡＰＤＨ（ｃａｔ＃ ４３５２３３８Ｅ）VIC labelled Primer Limited
マウスＧＡＰＤＨ（ｃａｔ＃ Ｍｍ９９９９９９１５−ｇ１）ＦＡＭラベル
マウスＧＡＰＤＨ（ｃａｔ＃ ４３５２３３９Ｅ）VIC labelled Primer Limited
を含んでいた。
結果を以下の表６に示す。
Figure 2021511027
Figure 2021511027

Figure 2021511027

Figure 2021511027
実施例５：カニクイザルにおけるＳＮＣＡターゲット化アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のｉｎ ｖｉｖｏ活性及び耐容性の分析
ｉｎ ｖｉｖｏでＡＳＯ活性及び耐容性を評価するために、髄腔内門脈カニクイザルモデル（Ｃｙｎｏ ＩＴ）を開発した。このモデルにより、ＳＮＣＡ及びアルファ−シヌクレインタンパク質ＳＮＣＡのＡＳＯ−００３０９２又はＡＳＯ−００３１７９媒介ノックダウンの評価が可能となる。
実施例３において上記されたように、各動物に、Ｌ３又はＬ４椎骨に入る髄腔内脳脊髄液（ＣＳＦ）カテーテルを埋め込んだ。ＡＳＯ−００３１７９及びＡＳＯ−００３０９２を生理食塩水に溶解させ、動物に投与し、ＩＴポートを使用して４．５分間にわたって注入した（用量群あたりに２匹の動物）。各動物に、（ｉ）ＡＳＯ−００３１７９（合計８又は１６mg）及び（ｉｉ）ＡＳＯ−００３０９２（合計４又は８mg）のうちの１つを受けさせた。ついで、ＡＳＯ曝露及び活性の分析のために組織を採取した際に、動物を投与後の種々の時点で安楽死させた。分析した脳領域は、髄質（Ｍｅｄ）、橋（Ｖ−Ｐｏｎｓ）、中脳（Ｖ−ＭＢ）、小脳（ＣＢＬ）、尾状核被殻（左右）（ＣａｕＰ）、海馬（左右）（Ｈｉｐ）、前頭皮質（左右）（ＦｒＣ）、側頭皮質（左右）（ＴｅＣ）、頭頂皮質（左右）（ＰａＣ）、後頭皮質（左右）（Ｏｃｃ）及び皮質白質（ＷＭ）を含んだ。さらに、脊髄を頚部（ＣＳＣ）、胸部（ＴＳＣ）及び腰部（ＬＳＣ）領域でサンプリングした。また、サンプルを肝臓、腎臓、心臓、三叉神経核、脛骨神経、大動脈から採取し、それらの領域におけるオフターゲット薬理学を検討した。
ＡＳＯの耐容性は、カニクイザルにおいて良好であり、有害作用は観察されなかった（データを示さず）。また、以下の図３及び４並びに表７に示すように、ＡＳＯ−００３１７９を投与した結果、８mg及び１６mgの両方の用量で、投与後２週間で分析された全ての脳組織において、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現の低下がもたらされた（図３）。ＡＳＯ−００３０９２については、投与後２週間において、前頭皮質及び腰髄では、低下が観察されたが、他の組織では観察されなかった（図４）。
Figure 2021511027
ここで提示された結果から、本明細書で開示されたＳＮＣＡ特異的ＡＳＯ（例えば、ＡＳＯ−００３０９２及びＡＳＯ−００３１７９）により、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡが効果的に減少し、ニューロン及びｉｎ ｖｉｖｏでの前臨床種における研究において十分に耐容性であることが実証される。さらに、Ａ５３Ｔ−ＰＡＣニューロンからの結果から、ＡＳＯ−００３０９２及びＡＳＯ−００３１７９媒介ｍＲＮＡ減少により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＳＮＣＡタンパク質レベルの低下がもたらされることが確認される。まとめると、これらの知見は、シヌクレイン症の処置のための疾患修飾治療剤としてのＳＮＣＡ特異的ＡＳＯの継続的な開発を支持する。

Claims (27)

  1. 長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、連続ヌクレオチド配列は、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）転写物内のイントロン領域に少なくとも９０％相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. イントロン領域が、配列番号：１のヌクレオチド６３３６〜７６０４に対応するイントロン１；配列番号：１のヌクレオチド７７５１〜１５１１２に対応するイントロン２；配列番号：１のヌクレオチド１５１５５〜２０９０８に対応するイントロン３又は配列番号：１のヌクレオチド２１０５２〜１１４０１９に対応するイントロン４から選択される、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  3. 連続ヌクレオチド配列が、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）転写物内の核酸配列に少なくとも９０％相補的であり、ここで、該核酸配列が、以下：
    Figure 2021511027
    からなる群より選択される、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. 核酸配列が、配列番号：１のヌクレオチド２４４８３〜２８７９１；配列番号：１のヌクレオチド３２２２６〜３２２４２；配列番号：１のヌクレオチド４４７４１〜４４７５８又は配列番号：１のヌクレオチド４８６４１〜４８６５９に対応する、請求項１〜３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. 連続ヌクレオチド配列が、２以下のミスマッチを有する、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３から選択される配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  6. 連続ヌクレオチド配列が、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３から選択される配列からなる、請求項１〜５のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  7. 連続ヌクレオチド配列が、配列番号：２７６；２７８；２９６；２９５；３２５；３２８；３２６；３２９；３３０；３２７；３３２；３３３；３３１；３３９；３４１；３９０；５２２及び５５９からなる群より選択される配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  8. 少なくとも２個のヌクレオチド類似体を含むギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）である、請求項１〜７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  9. ５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’
    ［式中、
    ａ）領域Ｂが、ＲＮａｓｅをリクルート可能な少なくとも６個のＤＮＡ単位の連続配列であり、
    ｂ）領域Ａが、１〜１０ヌクレオチドの第１のウイング配列であり、ここで、第１のウイング配列が、１つ以上のヌクレオチド類似体及び場合により、１つ以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１つが、Ａの３’末端に位置し、
    ｃ）領域Ｃが、１〜１０ヌクレオチドの第２のウイング配列であり、ここで、第２のウイング配列が、１つ以上のヌクレオチド類似体及び場合により、１つ以上のＤＮＡ単位を含み、ここで、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１つが、Ｃの５’末端に位置する］
    で示される式を含む、請求項１〜８のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  10. 領域Ａが、１〜４個のヌクレオチド類似体を含み、領域Ｂが、８〜１５個のＤＮＡ単位からなり、領域Ｃが、２〜４個のヌクレオチド類似体を含む、請求項９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  11. ヌクレオチド類似体が、ロックド核酸（ＬＮＡ）；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ；２’−アミノ−ＤＮＡ；２’−フルオロ−ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’−フルオロ−ＡＮＡ、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、２’−Ｏ−メチル核酸（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル核酸（２’−ＭＯＥ）及びそれらの任意の組み合わせからなる群より独立して選択される、２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項８〜２７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  12. ＬＮＡが、ｃＥｔ、２’，４’−拘束２’−Ｏ−メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノ−ＬＮＡ又はチオ−ＬＮＡからなる群より独立して選択される、請求項１１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  13. 連続ヌクレオチド配列が、１つ以上のベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ単位を含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  14. 連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、請求項１〜１３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  15. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、４以下の総スコアのｉｎ ｖｉｖｏ耐容性を有し、ここで、総スコアが、５つのカテゴリーの単位スコアの合計であり、同カテゴリーが、１）過活動；２）活動及び覚醒の低下；３）運動機能障害及び／又は運動失調；４）異常な姿勢及び呼吸並びに５）振戦及び／又は痙攣であり、ここで、各カテゴリーについての単位スコアが、０〜４のスケールで測定される、請求項１〜４０のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  16. アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝されていない細胞と比較して、細胞におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの発現を少なくとも６０％減少させる、請求項１〜１５のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  17. ヌクレオチド配列が、図１Ａ〜１Ｃの設計からなる群より選択される設計を有する、配列番号：７〜配列番号：１３０２又は配列番号：１３０９〜１３５３（ここで、大文字が、糖修飾ヌクレオシドであり、小文字が、ＤＮＡである）から選択される配列からなる連続ヌクレオチド配列からなる群より選択される配列を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる、請求項１〜１６のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  18. 連続ヌクレオチド配列が、以下：
    Figure 2021511027
    （ここで、大文字が、２’糖修飾ヌクレオシド類似体を示し、小文字が、ＤＮＡを示す）
    からなる群より選択される配列及び設計を含む、請求項１〜５０のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  19. 連続ヌクレオチド配列が、ＡＳＯ−００８３８７；ＡＳＯ−００８３８８；ＡＳＯ−００８５０１；ＡＳＯ−００８５０２；ＡＳＯ−００８５２９；ＡＳＯ−００８５３０；ＡＳＯ−００８５３１；ＡＳＯ−００８５３２；ＡＳＯ−００８５３３；ＡＳＯ−００８５３４；ＡＳＯ−００８５３５；ＡＳＯ−００８５３６；ＡＳＯ−００８５３７；ＡＳＯ−００８５４３；ＡＳＯ−００８５４５；ＡＳＯ−００８５８４；ＡＳＯ−００８２２６及びＡＳＯ−００８２６１からなる群より選択される化学構造を有する、請求項１〜１８のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  20. 請求項１〜１９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非ヌクレオチド部分又は非ポリヌクレオチド部分に共有結合している、コンジュゲート。
  21. コンジュゲートが、トランスフェリンレセプターに対して特異的な親和性を有する抗体フラグメントである、請求項２０記載のコンジュゲート。
  22. 請求項１〜１９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２０もしくは２１記載のコンジュゲートと、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
  23. 医薬の製造のための、請求項１〜１９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２０もしくは２１記載のコンジュゲート又は請求項２２記載の組成物の使用。
  24. シヌクレイン症の処置を必要とする対象におけるシヌクレイン症の処置のための医薬の製造のための、請求項１〜１９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２０もしくは２１記載のコンジュゲート又は請求項２２記載の組成物の使用。
  25. 医学における使用のための、請求項１〜１９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２０もしくは２１記載のコンジュゲート又は請求項２２記載の組成物。
  26. シヌクレイン症の処置における使用のための、請求項１〜１９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２０もしくは２１記載のコンジュゲート又は請求項２２記載の組成物。
  27. シヌクレイン症が、パーキンソン病、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、多系統萎縮症、レビー小体を伴う認知症及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２６記載の処置における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
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