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JP2021180663A - 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法 - Google Patents

免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法 Download PDF

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Hilary Clark
ダン イートン，
Dan Eaton
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Gonzalez Lino Jr
ジェーン， エル． グロギャン，
L Grogan Jane
ジェイソン ハックニー，
Hackney Jason
クリスティン， ディー． ハーデン，
D Harden Kristin
シン ユー，
Xin Yu
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Abstract

【課題】ＴＩＧＩＴ（Ｔ細胞−Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン）の発現レベルによりＴ細胞の成熟を評価する方法、ＴＩＧＩＴ様タンパク質及び該タンパク質の同定方法、及び、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を調整する薬剤の使用方法を提供する。【解決手段】試験免疫細胞において活性化ないし正常なＴ細胞とＴＩＧＩＴの発現レベルと比較、又は複数の既知の基準ＴＩＧＩＴ発現値と比較することによるＴ細胞の成熟を評価する方法、ＴＩＧＩＴの保存された残基及び／又は同定された構造上のサブモチーフの有無を評価することにより同定されたＴＩＧＩＴ様タンパク質及びその同定方法、及び、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を調整する薬剤の免疫障害のための使用。【選択図】なし

Description

本発明は、免疫関連疾患の診断および治療のために有用な組成物および方法に関する。
免疫関連及び炎症疾患は、正常な生理機能では、発作又は傷害に反応して、発作又は傷害からの修復を開始し、外来生物体に対する生得的及び後天的防御を開始するのに重要な、かなり複雑で、多くの場合は多重に相互関連した生物学的経路の現れ又は結果である。疾患又は病理は、これらの正常な生理学的経路が、反応の強さに直接関連してか、異常な調節又は過度な刺激の結果として、自己に対する反応として、又はこれらの組合せとして、更なる発作又は傷害を引き起こすときに生じる。
これらの疾患の発生は、多くの場合、多段階経路及びしばしば多数の異なった生物学的システム／経路に関与しているが、一又は複数のこれら経路の重要な点における介在により改善又は治療効果を有し得る。治療的介在は有害なプロセス／経路の拮抗作用又は有益なプロセス／経路の刺激のいずれかにより生じる。
多くの免疫関連疾患が知られており、広範囲にわたって研究されている。このような疾患には、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染疾患、免疫欠損症、異常増殖等が含まれる。
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は哺乳動物の免疫反応の重要な成分である。Ｔ細胞は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）内の遺伝子によりコードされる自己分子に関連する抗原を認識する。抗原は抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片等の表面上のＭＨＣ分子と共に提示され得る。Ｔ細胞系は宿主哺乳動物の健康を脅かすこれらの改変細胞を除去するものである。Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞及び細胞障害性Ｔ細胞を含む。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞上の抗原-ＭＨＣ複合体の認識に続いて広範囲に増殖する。またヘルパーＴ細胞は種々のサイトカイン、例えばリンホカインを分泌し、これはＢ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、及び免疫反応に寄与している種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を担っている。ヘルパーＴ細胞の他のサブカテゴリは濾胞性ヘルパーＴ細胞(ＴＦｈ)である(概要のためにVineusa et al., Nat. Rev. Immunol. 5: 853-865 (2005)を参照のこと)。ＣＸＣ-ケモカインレセプター５の特徴的な発現によって検出可能であり(Schaerli et al., J. Exp. Med. 192: 1553-62 (2000))、これらの細胞はＩＬ−１０とおそらくＩＬ−２１を生産することが明らかとされた。ＴＦｈ細胞は胚中心Ｂ細胞を助けるものであり、特にＢ細胞の生存および増殖を補助し、Ｂ細胞と共に培養する間に抗体産生を強力に誘導する。また、それらは免疫寛容導入に関係していた。
調節Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)は、自己反応免疫応答の阻害に重要な役割を持ち、腫瘍組織などの慢性炎症の部位に見られることが多い、ヘルパーＴ細胞のサブセットである(Wang, H.Y. & Wang, R.F., Curr Opin Immunol 19, 217-23 (2007))。Ｔｒｅｇｓは、ＣＤ２５、ＣＬＴＡ４、ＧＩＴＲ及びニューロフィリン−１の高い細胞表面発現により表現型的に定められ(Read, S., Malmstrom, V. & Powrie, F., J Exp Med 192, 295-302 (2000)；Sakaguchi, S., et al., J Immunol 155, 1151-64 (1995)；Takahashi, T. et al., J Exp Med 192, 303-10 (2000)；McHugh, R.S. et al., Immunity 16, 311-23 (2002)；Bruder, D. et al., Eur J Immunol 34, 623-30 (2004))、そして、転写因子ＦＯＸＰ３の制御下にある(Hori, S., Nomura, T. & Sakaguchi, S., Science 299, 1057-61 (2003))。Ｔｒｅｇｓは、接触依存性メカニズムとサイトカイン産生により活性化Ｔ細胞に対してその抑制的機能を果たす(Fehervari, Z. & Sakaguchi, Curr Opin Immunol 16, 203-8 (2004))。また、Ｔｒｅｇｓは、樹状細胞(ＤＣ)上のリガンドとの直接的な相互作用、例えばインドールアミン２,３-ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)の誘導を誘発するＤＣ上のＢ７分子とＣＴＬＡ４との相互作用(Fallarino, F. et al., Nat Immunol 4, 1206-12 (2003))、およびＣＤ４０Ｌライゲーション(Serra, P. et al., Immunity 19, 877-89 (2003))によって、免疫応答を調整する。ＤＣは、自己又は非自己の抗原に対する免疫又は耐性を誘導することができる専門的な抗原提示細胞である。ＤＣ拡張した(DC-expanded)Ｔｒｅｇｓはインビトロでアロ反応性応答を抑制し(Yamazaki, S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 2758-63 (2006)；Ahn, J.S., Krishnadas, D.K. & Agrawal, Int Immunol 19, 227-37 (2007))、養子導入した場合、適切なＴｒｅｇｓはＮＯＤ.ｓｃｉｄマウスの糖尿病を妨げ(Tarbell, K.V. et al., J Exp Med 199, 1467-77 (2004))、又は実験的に喘息を誘導した(Lewkowich, I.P. et al. J Exp Med 202, 1549-61 (2005))。また、ＤＣ上のリガンドとＴｒｅｇｓとの特定の相互作用は、マウスでのＧＩＴＲの嵌入といった抑制的機能を無効にしうることから(Shimizu, J., et al., Nat Immunol 3, 135-42 (2002))、Ｔｒｅｇ機能の調整時にＤＣに多元的な役割があることが示唆される。
分子ＣＴＬＡ４およびＧＩＴＲは、ＣＤ２８−Ｂ７内に定められるリガンド、及びＴＮＦスーパーファミリの同時刺激／同時抑制の分子それぞれの代表である(Greenwald, R.J., et al., Annu Rev Immunol 23, 515-48 (2005))。これらの分子は、Ｔｒｅｇｓ上で高いが、一般的に活性化されたＴ細胞では上方制御されている。Ｔｒｅｇ細胞で発現される新規の共刺激分子を探索するために、探索を行い、Ｉｇドメイン及び免疫レセプターチロシンベースの活性化又は阻害性(ＩＴＡＭ／ＩＴＩＭ)モチーフの両方を持つ、Ｔ細胞で特異的に発現される遺伝子を同定した(Abbas, A.R. et al., Genes Immun 6, 319-31 (2005))。これら２つのゲノムワイドバイオインフォマティックス探索方策の交わりにより、ＩｇＶドメイン、膜貫通ドメイン及び２つの推定上の免疫レセプターチロシン阻害性モチーフをコードするタンパク質との新規の細胞表面結合タンパク質が同定された(出典明記によって本明細書中に援用される、米国公開特許ＵＳ２００４０１２１３７０を参照)。ＴＩＧＩＴ(Ｔ細胞−Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン)と称されるタンパク質が、Ｔ細胞、特にＴｒｅｇ及びメモリー細胞サブセット並びにＮＫ細胞上で発現されることが示された。 免疫障害、特に自己免疫障害に対処するための新規の治療法および治療方法が求められている。本明細書において、出願人は、ＴＩＧＩＴ結合パートナーを同定し、これら結合パートナーとのＴＩＧＩＴ相互作用やＴ細胞成熟や活性に対する解明されたＴＩＧＩＴ作用により調節される免疫障害のための新規の組成物、検出方法及び治療方法を提供する。
本発明は、ヒトを含む哺乳動物の免疫関連疾患の診断と治療に有用な組成物および方法に関する。本発明は、ある種の免疫細胞の増殖及び機能のネガティブ調節に関与するタンパク質の同定に基づく。免疫関連疾患は、免疫応答を抑制するかまたは上げることによって治療されうる。免疫応答を亢進する分子は抗原への免疫応答を刺激するかまたは強化する。免疫応答を刺激する分子は、免疫応答の亢進により利益を得る場合に治療上用いられうる。あるいは、免疫応答を抑制するか又は抗原への免疫応答を減弱ないし低減する分子(例えば中和抗体)は、免疫応答の減弱により利益を得る場合(例えば炎症)に治療上用いられうる。本明細書において、出願人は、ＴＩＧＩＴ(「Ｔ細胞−Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン」の略)タンパク質がポリオウイルスレセプター(ＰＶＲ、ＣＤ１５５としても知られる)及び新規に解明されたタンパク質ファミリー種種の他のメンバーに特異的に結合すること、そしてこのＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ相互作用がＴ細胞活性化及び増殖をネガティブに制御することを示す。したがって、ＴＩＧＩＴポリペプチド、そのアゴニストおよびそのアンタゴニスト、並びにＰＶＲポリペプチド、そのアゴニストおよびそのアンタゴニストは、免疫関連疾患及び炎症性疾患の治療のための医薬及び薬物の調製に有用である。また、本発明は、免疫関連疾患及び炎症性疾患の治療方法、並びに免疫関連疾患及び炎症性疾患の状態を検出及び評価するための方法及び組成物を提供する。
一実施態様では、本発明は、以下のアミノ酸：ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位６７に対応するアミノ酸位のアラニン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位７４に対応するアミノ酸位のグリシン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１４に対応するアミノ酸位のプロリン、およびヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１６に対応するアミノ酸位のグリシン、の一又は複数を含むアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。一態様では、ポリペプチドは、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ２、ＰＶＲＬ３、ＰＶＲＬ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６又はＣＤ２２６でない。他の態様では、ポリペプチドは、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位５４に対応するアミノ酸位にバリン、イソロイシンおよびロイシンから選択されるアミノ酸、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位５５に対応するアミノ酸位にセリンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位５６に対応するアミノ酸位にグルタミン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１２に対応するアミノ酸位にスレオニン、およびヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１３に対応するアミノ酸位にフェニルアラニンおよびチロシンから選択されるアミノ酸、の一又は複数をさらに含む。他の態様では、ポリペプチドは、
ａ．アミノ酸位５４にバリンおよびイソロイシンから選択されるアミノ酸−アミノ酸位５５にセリンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸−アミノ酸位５６にグルタミン、
ｂ．位置６７にアラニン−アミノ酸位６８〜７３の各位に任意のアミノ酸−アミノ酸位７４にグリシン、及び、
ｃ．アミノ酸位１１２にスレオニン−アミノ酸位１１３にフェニルアラニン及びチロシンから選択されるアミノ酸−アミノ酸位１１４にプロリン−アミノ酸位１１５に任意のアミノ酸−アミノ酸位１１６にグリシン、
から選択される一又は複数の構造サブモチーフを更に含み、ここでアミノ酸位の番号がヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位置に対応するものであり、ただしポリペプチドのアミノ酸の絶対的な番号付けは異なりうる。
他の実施態様では、本発明は、試験ポリペプチドがＴＬＰファミリのポリペプチドのメンバーであるか否かを決定する方法であって、試験ポリペプチドのアミノ酸配列をＴＬＰファミリのポリペプチドの一又は複数のメンバーのアミノ酸配列と整列配置することと、試験ポリペプチドのアミノ酸配列における、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位６７に対応するアミノ酸位のアラニン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位７４に対応するアミノ酸位のグリシン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１４に対応するアミノ酸位のプロリン、およびヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１６に対応するアミノ酸位のグリシンの一又は複数の有無を評価することとを含む方法を提供する。他の実施態様では、本発明は、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位６７に対応するアミノ酸位のアラニン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位７４に対応するアミノ酸位のグリシン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１４に対応するアミノ酸位のプロリン、およびヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１６に対応するアミノ酸位のグリシンから選択される少なくとも一のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、一又は複数の配列データベース中のタンパク質を同定することによる、ＴＬＰタンパク質ファミリの一又は複数のメンバーを同定する方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ＴＬＰファミリメンバーの一又は複数の保存された、ないしは実質的に保存された領域と特異的に相互作用する単離された薬剤を提供する。一態様では、薬剤は、ＴＬＰファミリメンバーの発現及び／又は活性のアンタゴニストである。他の態様では、アンタゴニストは、小分子阻害剤、阻害性抗体ないしその抗原結合性断片、アプタマー、阻害性核酸および阻害性ポリペプチドから選択される。他の態様では、薬剤は、ＴＬＰファミリメンバーの発現及び／又は活性のアゴニストである。他の態様では、薬剤は、アゴナイズ的抗体ないしその抗原結合断片、アゴナイズ的ペプチド、及びＰＶＲが媒介するＰＶＲ及び／又はＴＩＧＩＴの細胞内シグナル伝達へのＴＩＧＩＴ結合を活性化する小分子ないしタンパク質から選択される。他の実施態様では、本発明は、推定ＴＬＰファミリメンバーのポリペプチドを上記の少なくとも一の薬剤と接触させ、推定ＴＬＰファミリメンバーへの少なくとも一の薬剤の結合を決定することによる、一又は複数のＴＬＰファミリメンバーの同定又は検出方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、試験免疫細胞が活性化ないし正常なＴｒｅｇ、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＦｈ細胞のいずれであるかを決定する方法であって、試験免疫細胞においてＴＩＧＩＴの発現レベルを評価することと、既知の活性化ないし正常なＴｒｅｇ、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＦｈ細胞におけるＴＩＧＩＴの発現レベルと比較するか、又は試験免疫細胞でのＴＩＧＩＴの発現レベルを一又は複数の既知の基準ＴＩＧＩＴ発現値と比較することとを含む方法を提供する。他の実施態様では、本発明は、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ３およびＰＶＲＬ２の一又は複数へのＴＩＧＩＴの結合を調整することを含む、免疫系の機能および／または活性の調整方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：２３〜２８に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも一のＨＶＲを含む抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。他の実施態様では、本発明は、配列番号：３１〜３６に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも一のＨＶＲを含む抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。他の実施態様では、本発明は、抗体軽鎖が配列番号：２１に示すアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。他の実施態様では、本発明は、抗体軽鎖が配列番号：２９に示すアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。他の実施態様では、本発明は、抗体重鎖が配列番号：２２に示すアミノ酸配列ないしその一部を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。他の実施態様では、本発明は、抗体重鎖が配列番号：３０に示すアミノ酸配列ないしその一部を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。他の実施態様では、本発明は、抗体軽鎖が配列番号：２１に示すアミノ酸配列ないしその一部を含み、抗体重鎖が配列番号：２２に示すアミノ酸配列ないしその一部を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。他の実施態様では、本発明は、抗体軽鎖が配列番号：２９に示すアミノ酸配列ないしその一部を含み、抗体重鎖が配列番号：３０に示すアミノ酸配列ないしその一部を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。他の実施態様では、本発明は、抗体軽鎖が配列番号：５０に示すヌクレオチド配列ないしその一部によってコードされる抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。他の実施態様では、本発明は、抗体重鎖が配列番号：５１に示すヌクレオチド配列ないしその一部によってコードされる抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片を提供する。一態様では、本発明の抗体ないしその抗原結合断片は、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体およびイムノトキシンから選択される。
他の態様では、本発明の少なくとも一のＨＶＲは、配列番号：２３〜２８のいずれかに示すＨＶＲに、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。他の態様では、本発明の少なくとも一のＨＶＲは、配列番号：３１〜３６のいずれかに示すＨＶＲに、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。他の態様では、本発明の抗体ないし抗原結合断片の軽鎖は、配列番号：２１に示すアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を含む。他の態様では、本発明の抗体ないし抗原結合断片の軽鎖は、配列番号：２９に示すアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を含む。他の態様では、本発明の抗体ないし抗原結合断片の重鎖は、配列番号：２２に示すアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を含む。他の態様では、本発明の抗体ないし抗原結合断片の重鎖は、配列番号：３０に示すアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を含む。他の態様では、本発明の抗体ないし抗原結合断片は、配列番号：２１に示すアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号：２２に示すアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を含む重鎖とを含む。他の態様では、本発明の抗体ないし抗原結合断片は、配列番号：２９に示すアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号：３０に示すアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を含む重鎖とを含む。
他の実施態様では、本発明は、インビボ又はインビトロで、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、又はＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニストの少なくとも一を投与することを含む、ＣＤ２２６−ＰＶＲ相互作用及び／又はＣＤ９６−ＰＶＲ相互作用の調節方法を提供する。一態様では、ＴＩＧＩＴ又はＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニストが投与され、ＣＤ２２６−ＰＶＲ相互作用及び／又はＣＤ９６−ＰＶＲ相互作用が阻害又は遮断される。他の態様では、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニストが投与され、ＣＤ２２６−ＰＶＲ相互作用及び／又はＣＤ９６−ＰＶＲ相互作用が刺激される。
他の実施態様では、本発明は、ＴＩＧＩＴ及び／又はＰＶＲの発現及び／又は活性を調整することによる、または、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴによって媒介される細胞内シグナル伝達を調整することによる、免疫細胞機能および／または活性の調整方法を提供する。一態様では、調整は、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアゴニストにてインビトロ又はインビボの細胞を処理することによる、又はＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を刺激することによる、一又は複数の免疫細胞の増殖か又は一又は複数の免疫細胞による炎症誘発性サイトカイン放出を低減ないし阻害することである。他の態様では、調整は、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアンタゴニストにてインビトロ又はインビボの細胞を処理することによる、又はＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を阻害することによる、一又は複数の免疫細胞の増殖か又は一又は複数の免疫細胞による炎症誘発性サイトカイン放出を増加ないし刺激することである。
他の実施態様では、本発明は、インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアゴニストを投与することによるか又は、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を刺激することによる、免疫応答の阻害方法を提供する。他の実施態様では、本発明は、インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアンタゴニストを投与することによるか又は、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を阻害することによる、免疫応答の増強ないし刺激方法を提供する。他の実施態様では、本発明は、インビトロ又はインビボでＴＩＧＩＴ又はＰＶＲの発現及び／又は活性を調節することによる、免疫細胞からのサイトカイン産生の種類及び／又は量の調節方法を提供する。一態様では、炎症誘発性サイトカイン産生は、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアンタゴニストを投与することによってか又は、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を阻害することによって刺激される及び／又は増強される。他の態様では、炎症誘発性サイトカイン産生は、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアゴニストを投与することによってか又は、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を刺激することによって阻害される。
他の実施態様では、本発明は、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、又はＰＶＲの発現及び／又は活性のアゴニストにより一又は複数の免疫細胞を処理することを含む、一又は複数の免疫細胞のＥＲＫ経路による細胞内シグナル伝達及び／又はＥＲＫリン酸化の刺激方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、被検体の異常な免疫細胞応答に関連する免疫関連疾患の診断方法であって、被検体からの試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を評価することと、ＴＩＧＩＴのその発現及び／又は活性をＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の対照量及び／又は正常被検体の試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の量と比較することとを含む方法を提供する。一態様では、免疫関連疾患は、乾癬、関節炎、炎症性腸疾患又は癌から選択される。他の態様では、癌は乳癌である。他の実施態様では、本発明は、被検体の異常な免疫細胞応答に関連する免疫関連疾患の重症度の評価方法であって、被検体からの試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を評価することと、ＴＩＧＩＴのその発現及び／又は活性をＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の対照量及び／又は正常被検体の試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の量と比較することとを含む方法を提供する。一態様では、免疫関連疾患は、乾癬、関節炎、炎症性腸疾患又は癌から選択される。他の態様では、癌は乳癌である。他の実施態様では、本発明は、被検体のＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を調整することを含む、被検体の異常な免疫細胞応答に関連する免疫関連疾患の予防方法を提供する。一態様では、免疫関連疾患は、乾癬、関節炎、炎症性腸疾患又は癌から選択される。他の態様では、癌は乳癌である。他の実施態様では、本発明は、被検体のＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を調整することを含む、被検体の異常な免疫細胞応答に関する免疫関連疾患の重症度の治療ないし低減方法を提供する。一態様では、免疫関連疾患は、乾癬、関節炎、炎症性腸疾患又は癌から選択される。他の態様では、癌は乳癌である。
ヒト、マウス、アカゲザルおよびイヌのＴＩＧＩＴタンパク質配列のアラインメントを示す。陰線は、３又は４つの種での同一アミノ酸を含む位置を示す。シグナル配列を破線で示し、免疫グロブリンＶセットドメインを二重線で示し、Ｎグリコシル化部位を必須部位の上に細い線で示し、膜貫通ドメインは太線で示し、推定伸長ＩＴＩＭモチーフを二重の破線で示す。ヒトＴＩＧＩＴは、アカゲザル、イヌおよびマウスの配列とそれぞれ８８％、６７％および５８％の同一性を有する。 示されたＰＶＲファミリタンパク質のＩｇＶドメインのタンパク質配列のアラインメントを示す。配列間の類似性を共有する側鎖は性質に従って印を付す。Ｖ-フレームフィンガープリント残基(●)とＰＶＲ関連のフィンガープリント残基(残基を囲む厚線)。比較するために、非ＰＶＲファミリメンバーの６つのＩｇＶドメイン配列(水平線で示す)をアラインメントする。 同上。 実施例２に記載のように、様々なタンパク質に結合するＴＩＧＩＴ-Ｆｃ(薄い灰色の線)又はコントロールＦｃタンパク質(黒線)の能力を評価するための、バイオセンサー分析の結果を示す。番号１−８はそれぞれ、ＥＳＡＭ、ＯＴＯＲ、ＴＥＫ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＩＧＦＢＰ４、ＰＶＲ、ＩＬ−１９およびＴＥＫを表す。 実施例２に記載のように、固定されたＴＩＧＩＴ-Ｆｃへの様々なＦｃ融合タンパク質の結合を評価するための、バイオセンサーアッセイの結果を示す。 実施例２に記載のように、レセプター発現しているＣＨＯ安定性形質移入体へのビオチン化Ｆｃ-融合タンパク質の結合を評価するための、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 実施例２に記載のように、ＴＩＧＩＴ-ＦｃとＰＶＲを発現するＣＨＯ細胞との間の結合のＫｄを決定するための、ある代表的なラジオリガンド結合実験の結果を示す。 実施例２に記載のように、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、ＣＤ２２６およびＣＤ９６間の競合結合試験の結果を示すグラフを示す。 実施例２に記載のように、ＴＩＧＩＴ又はＣＤ２２６へのＰＶＲ結合を遮断する抗ＰＶＲ抗体の能力を評価する実験の結果を示す。図７Ａは、１０倍モル過剰量の抗体Ｄ１７１の存在下(点線)又は非存在下(実線)での、ＣＤ２２６又はＴＩＧＩＴを発現するＣＨＯ形質移入体へのビオチン化ＰＶＲ-Ｆｃの結合を示す。一致したアイソタイプコントロール抗体の結果は陰影をつけた領域で示す。図７Ｂは、ＣＤ２２６-Ｆｃ又はＴＩＧＩＴ-Ｆｃをロードしたバイオセンサへの、ＰＶＲ-Ｆｃ(上方線)又はバッファ(下方線)の結合を示す。中央の線は、ＰＶＲ-Ｆｃへの曝露の前に抗体Ｄ１７１にて遮断したＣＤ２２６-Ｆｃ又はＴＩＧＩＴ-ＦｃをプレロードしたバイオセンサへのＰＶＲ-Ｆｃ結合を示す。 実施例２(Ａ)に記載されるように、様々な免疫細胞種におけるＴＩＧＩＴ発現データ(左パネル)又はＣＤ２２６発現データ(右パネル)を示す。 実施例２(Ａ)に記載されるように、扁桃Ｔｆｈ細胞におけるＴＩＧＩＴ及びＩＣＯＳのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。 実施例３に記載されるように、細胞表面のＴＩＧＩＴに結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７の能力を試験する実験の結果を示す。図９Ａは、安定性２９３-ＴＩＧＩＴ細胞株への抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７の結合(実線)と、ＰＶＲ-Ｆｃの存在下でのその結合の排除(点線)を示す。灰色の領域は、アイソタイプ一致のコントロール抗体の結合を示す。図９Ｂは、ＴＩＧＩＴがＧＩＴＲ＋ＣＤ４Ｔ細胞においてＦｏｘＰ３と共発現することを示すＦＡＣＳ分析の結果を示す。示されるデータは２つの独立した実験の代表である。 実施例３に記載のように、ｍＲＮＡ分析によって、または、細胞表面での結合試験によって、ＴＩＧＩＴ発現を評価する実験の結果を示す。 実施例２(Ａ)に記載のように、休止ないし活性化(１日又は２日間)ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋(左パネル)又はＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞(右パネル)上でのＴＩＧＩＴ及びＣＤ２２６の発現を決定するための、フローサイトメトリー実験の結果を示す。 同上。 ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞におけるＴＩＧＩＴのｍＲＮＡレベルと比較したときの、ＰＢＭＣからエクスビボで直接分類された異なる種類の免疫細胞におけるＴＩＧＩＴのｍＲＮＡの倍数変化を示す棒グラフを示す。 非刺激細胞と比較したときの、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８にて１日又は２日間活性化した、分類したＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ Ｔｒｅｇ細胞又は、ＩＬ−２にて１日間活性化した分類したＣＤ５６＋ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴのｍＲＮＡレベルの倍数変化を示す棒グラフを示す。示されたＦＡＣＳプロットはある代表実験からのものであり、ＲＴ−ＰＣＲ値は３つのドナーの平均である。 ＣＤ２５−ヒトＰＢＭＣ細胞がＴＩＧＩＴ発現を欠くことを示すＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 低い又は高い量のＣＤ２５を発現するヒトＰＢＭＣ細胞におけるＴＩＧＩＴの細胞表面発現を評価するＦＡＣＳ実験の結果を示し、ＴＩＧＩＴの発現がＦＯＸＰ３の発現と相関することを示す。 抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８にて２４時間活性化した分類したＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴ細胞におけるＴＩＧＩＴ発現を評価するＦＡＣＳ実験(左パネル)と、休止又は活性化ＣＤ２５−又はＣＤ２５ｈｉＣＤ４＋細胞におけるＴＩＧＩＴのｍＲＮＡレベルの補完的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。 実施例２(Ａ)に記載のように、休止ないし活性化(１日又は２日間)ＣＤ２５、ＣＤ２５＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞におけるＴＩＧＩＴ又はＣＤ２２６の発現の倍数変化を示すグラフである。 実施例３に記載のように、Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴ発現の安定性を評価するための、フローサイトメトリ実験の結果を示す。 実施例３に記載のように、様々な濃度の抗ＣＤ３に曝した、分類したＴＩＧＩＴ＋およびＴＩＧＩＴ−細胞におけるＴＩＧＩＴ発現を評価するための、プレートベースのアッセイの結果を示す。 実施例５に記載のように、ＢおよびＴ細胞を欠損しているｓｃｉｄマウスにおいてＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０産生を調整するＴＩＧＩＴの能力を評価する実験の結果を示すプロット線を示す。 同上。 同上。 実施例２(Ａ)に記載のように、ＩＬ-１７-産生Ｔヘルパー細胞とＩＬ-２-産生Ｔヘルパー細胞上のＴＩＧＩＴ発現を評価するための、フローサイトメトリ実験の結果を示す。各パネルのデータは、異なるドナーのＰＢＭＣを用いた代表的な実験である。 実施例３に記載のように、疾患組織試料におけるＴＩＧＩＴの発現レベルを評価するｍＲＮＡ分析の結果を示す。最も右のパネルは、関節リウマチの滑膜組織から入手した分類した細胞からの発現データである。ＰＶＲおよびＣＤ２２６の発現はこれらの試料では検出不可能であった。 正常試料と比較して、コラーゲン誘導関節炎のマウスモデルから様々な時点で採取した組織におけるＴＩＧＩＴ(上方パネル)又はＣＤ２２６(下方パネル)の発現を評価するＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を示す。 実施例３に記載のように、喘息およびコントロールのアカゲザルからの組織試料における、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲおよびＣＤ２２６の発現レベルを評価するｍＲＮＡ分析の結果を示す。 正常又は癌性の細胞におけるＴＩＧＩＴの発現レベル(上方パネル)又は、様々な胸部腫瘍試料におけるＣＤ４の発現(下方パネル)を評価するｍＲＮＡ分析の結果を示す。 実施例３に記載のように、様々な癌試料における、ＴＩＧＩＴ(図１８Ｂ)の発現レベルを評価するｍＲＮＡ分析の結果を示す。下方パネルは、様々な割合の腫瘍細胞を含有する癌試料における、ＴＩＧＩＴの発現のレベルを示す。全パネル中の囲みは統計学的に有意なデータを表す。 実施例３に記載のように、様々な癌試料における、ＰＶＲ(図１８Ｃ)の発現レベルを評価するｍＲＮＡ分析の結果を示す。下方パネルは、様々な割合の腫瘍細胞を含有する癌試料における、ＰＶＲの発現のレベルを示す。全パネル中の囲みは統計学的に有意なデータを表す。 実施例３に記載のように、様々な癌試料における、ＣＤ２２６(図１８Ｄ)の発現レベルを評価するｍＲＮＡ分析の結果を示す。下方パネルは、様々な割合の腫瘍細胞を含有する癌試料における、ＣＤ２２６の発現のレベルを示す。全パネル中の囲みは統計学的に有意なデータを表す。 実施例４に記載のように、Ｔ細胞活性化に対するＴＩＧＩＴの効果を評価する実験の結果を示す。 ＣＤ１４＋単球、ｉＭＤＤＣおよびＭＤＤＣ上のＰＶＲ発現を評価するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。抗ＰＶＲ実験は陰線なしで示し、アイソタイプ一致のコントロールを灰色で示す。 Ｔ細胞増殖に対するＴＩＧＩＴ-Ｆｃの効果を評価する、ＴＮＦα成熟したＤＣ及び単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を使用したインビトロＭＬＲアッセイの結果を示す。アスタリスクを付したデータはｐ＜０．００１を有する。 自己由来ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ及び抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７(黒バー)又はアイソタイプコントロール(白バー)の存在下で可溶性抗ＣＤ３によって活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞における、[３Ｈ]-チミジン取込(ｃｐｍ)によるＴ細胞増殖(左パネル)及びＥＬＩＳＡによるＩＦＮ-γ産生(右パネル)を評価する実験の結果を示す。単一アスタリスクはｐ＜０．０１を示し、二重アスタリスクはｐ＜０．００１を示す。 １００μｇ／ｍｌのＴＩＧＩＴ-Ｆｃ(灰色バー)又はアイソタイプコントロール(白バー)の存在下で、自己由来ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよび可溶性抗ＣＤ３にて活性化されたナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞における増殖とＩＦＮ-γ産生を評価する実験の結果を示す。単一アスタリスクはｐ＜０．０１を示し、二重アスタリスクはｐ＜０．００１を示す。 実施例４に記載のように、ＭＬＲアッセイにおける、ＴＩＧＩＴ−Ｔ細胞増殖を阻害する分類されたＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞の能力を評価する実験の結果を示す。 図２１Ａは、実施例４に記載のように、抗ＴＩＧＩＴ抗体(１０Ａ７)の有無の下での他のＴ細胞およびＡＰＣの増殖に対するＴＩＧＩＴ＋Ｔｒｅｇの効果、並びにこれらの細胞群におけるＩＦＮγ及びＩＬ−１０の産生を評価する増殖アッセイの結果を示す。図２１Ｂは、実施例４Ａに記載のように、ＴＩＧＩＴ−Ｔｒｅｇと比較したときの、ナイーブＴ細胞増殖に対するＴＩＧＩＴ＋Ｔｒｅｇｓの効果を評価する増殖アッセイの結果を示す。 実施例５に記載のように、成熟されたｉＭＤＤＣおよびＤＣにおけるサイトカイン産生を調整するＴＩＧＩＴの能力を評価する実験の結果を示す。 ｉＭＤＤＣ、ＴＮＦαにて刺激したｉＭＤＤＣ、ＣＤ４０Ｌにて刺激したｉＭＤＤＣ、ＬＰＳにて刺激したｉＭＤＤＣ、又はＰａｍ３ＣＳＫ４にて刺激したｉＭＤＤＣにおけるＩＬ−１０又はＩＬ−１２ｐ４０の産生を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。示される結果は３つの実験の平均である。各パネルの線は３つの異なるドナーそれぞれのデータを表す。 同上。 同上。 細胞表面成熟マーカーであるＨＬＡ-ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を測定するためのＦＡＣＳ分析の結果を示す。値は平均蛍光強度(ＭＦＩ)として表し、示されるデータは３つのドナーの代表である。 ＴＮＦα成熟したＭＤＤＣ又はＬＰＳ成熟したＭＤＤＣからの他の炎症誘発性サイトカイン産生に対するＴＩＧＩＴ効果を測定する実験のデータを示す。示されるデータは３つの実験の代表である。実施例５に記載のように、ＩＬ-６、ＩＬ１２ｐ７０およびＩＬ-１８のレベルはＬＵＭＩＮＥＸ分析にて決定した。 実施例５に記載のように、ＴＩＧＩＴ.Ｆｃ又はアイソタイプ一致のコントロールに応答したｉＭＤＤＣでのＴＧＦβ分泌の相対量を表すグラフを示す。 実施例６に記載のように、ＰＶＲによる下流のシグナル伝達の活性化に対するＴＩＧＩＴ処置の効果を評価する実験の結果を示す。図２３Ａは、ＴＩＧＩＴ又はコントロールにて処置したＰＶＲのチロシンリン酸化状態のウエスタンブロット分析を示す。図２３Ｂは、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡ又はコントロールによるｉＭＤＤＣの処置の際の、ＥＲＫ二量体化状態のウエスタンブロット分析を示す。図２３Ｃは、ＴＩＧＩＴ処置ｉＭＤＤＣとコントロール処置ｉＭＤＤＣにおける活性化と総β-カテニンとのウエスタンブロット分析を示す。 実施例６に記載のように、ＴＮＦα成熟したＭＤＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ４０産生のＴＩＧＩＴ誘導性減少に対する、様々な下流のシグナル伝達分子の遮断の効果を評価する実験の結果を示す。図２４Ａは、ＩＬ−１２ｐ４０産生のＴＩＧＩＴ-Ｆｃ又はＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡが誘導する減少に対する、ＭＡＰＫキナーゼ阻害因子の影響を試験している実験の結果のグラフを示す。図２４Ｂは、ＴＮＦα成熟ＭＤＤＣからのＩＬ−１２ｐ４０産生のＴＩＧＩＴが媒介する減少に対する、抗ＴＩＧＩＴ抗体(１０Ａ７)、抗ＩＬ−１０抗体又は抗ＣＤ３２抗体の影響を評価している実験の結果のグラフを示す。 実施例７に記載のように、Ｔ細胞活性化に対するＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置の影響を評価している実験の結果を表す。ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ又はコントロール抗体にて処置したＴＮＦα／ＣＤ４０Ｌ成熟ＭＤＤＣ培養物又はｉＭＤＤＣ培養物によって／において誘導された、Ｔ細胞増殖(図２５Ａ)及びＩＬ−２産生(図２５Ｂ)の量を評価している実験のデータのグラフ。 実施例７に記載のように、活性化されたヒトＭＤＤＣにおけるＩＬＴの発現に対する、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置の影響を評価している実験の結果を示す。 実施例７に記載のように、マウスにおける遅延型過敏症応答に対するＴＩＧＩＴ処置の効果を評価している実験の結果を示す。 抗ブタクサ抗体、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ又はＣＴＬＡ４にて処置した野生型又はＩＬ−１０ノックアウトマウスからの耳腫脹データを表すグラフを示す。 ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-、ＣＴＬＡ４-Ｆｃ-又はコントロール-処置したマウスの脾細胞の、ＫＬＨ再刺激に対する増殖応答を表しているデータを示す。データは応答±標準偏差として示す(１群当たりｎ＝３；インビトロ想起アッセイは３通りのウェルで行った)。 ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡ又は抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７にて処置した野生型マウスの耳腫脹データを表すグラフを示す。 野生型(図２７Ｄ)のＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置マウスの脾細胞の、ＫＬＨ再刺激に対する増殖応答を示しているグラフを示す。 ＩＬ−１０ノックアウト(図２７Ｅ)のＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置マウスの脾細胞の、ＫＬＨ再刺激に対する増殖応答を示しているグラフを示す。 ＫＬＨにて２日間再活性化させた野生型(図２７Ｆ)のＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置マウスから単離した脾細胞の培養物上清におけるＩＬ−２又はＩＦＮ-γのレベルを示しているグラフを示す。データは平均±ｓ.ｄ.として示す(１群当たりｎ＝３；インビトロ想起は３通りのウェルで実施した)。アスタリスクはｐ＜０．００１を示す。 ＫＬＨにて２日間再活性化させたＩＬ−１０ノックアウト(図２７Ｇ)のＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置マウスから単離した脾細胞の培養物上清におけるＩＬ−２又はＩＦＮ-γのレベルを示しているグラフを示す。データは平均±ｓ.ｄ.として示す(１群当たりｎ＝３；インビトロ想起は３通りのウェルで実施した)。アスタリスクはｐ＜０．００１を示す。 ｑＲＴ−ＰＣＲ(ｎ＝８)によって決定されるように、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ及びアイソタイプコントロールにて処置した野生型ないしＩＬ−１０欠損マウスのＣＤ１１ｃ＋脾細胞からの、ＩＬ−１０(左パネル)、ＩＬ−１２／２３ｐ４０(中央のパネル)及びＩＬ−１２ｐ３５(右パネル)の相対的ｍＲＮＡレベルを示すグラフを示す。また、ＷＴ ＣＤ１１ｃ枯渇脾細胞からのＩＬ-１０ｍＲＮＡレベルはコントロールとして決定した。データは、免疫化されていないマウスの対応するｍＲＮＡレベルと比較して任意のｍＲＮＡレベルを表す。アスタリスクはｐ＜０．０５を示す。 実施例４(Ｂ)に記載のように、ＴＩＧＩＴ特異的なｓｉＲＮＡによるＴＩＧＩＴ発現のノックダウンの効果を評価する実験の結果を示す。 コントロールｓｉＲＮＡに対するＴＩＧＩＴノックダウン効率のｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ＣＴＬＡ４ｍＲＮＡレベルは非標的コントロールとして決定した。 ｓｉＲＮＡコントロールおよびｓｉＲＮＡＴＩＧＩＴにて処置した細胞における表面ＴＩＧＩＴ発現のＦＡＣＳ分析を示す(表７にまとめる)。 ｓｉＲＮＡコントロールないしｓｉＲＮＡＴＩＧＩＴ(図２７Ｃ)の存在下での、プレート結合した抗ＣＤ３単独ないし抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８にて活性化させたＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ヒトＴ細胞の細胞増殖のＦＡＣＳ分析の結果を示す。 ｓｉＲＮＡコントロールないし抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７(図２７Ｄ)の存在下での、プレート結合した抗ＣＤ３単独ないし抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８にて活性化させたＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ヒトＴ細胞の細胞増殖のＦＡＣＳ分析の結果を示す。 ２日間の培養の後の図２８Ｃのアッセイにおいて用いた細胞からのサイトカイン産生の分析の結果を示す。示されるデータは４つの個体ドナーと実験の代表である。 様々な細胞種及び様々な処置でのＣＤ２２６の発現を評価している実験の結果を示す。 抗ＣＤ２２６を用いた、休止ないし抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８にて活性化した(１日及び２日)分類したナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞(上パネル)又はメモリーＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞(下パネル)上での、ＣＤ２２６の表面発現を示すＦＡＣＳ分析の結果を示す。 刺激していない細胞と比較したときの、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８にて１日又は２日間活性化させた分類したＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ８＋細胞、及びＩＬ−２とＩＬ−１５にて１日間活性化させた分類したＣＤ５６＋ＮＫ細胞における、ｍＲＮＡレベルの倍数増加を示すグラフである。 ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞と比較したＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴｒｅｇｓ、ＮＫ及びＣＤ１１ｃ＋ＤＣ細胞群の指標として、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＰＢＭＣからエクスビボで直接分類した細胞における様々な細胞マーカーの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。示されるデータは３つのドナーのデータの平均を表す。 抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ２２６にて染色した総ヒトＰＢＭＣ群から採取したゲートしたＣＤ４＋細胞における、ＣＤ２２６とＣＤ２５の共発現を決定するためのＦＡＣＳ分析の結果を示す。示されるプロットは２つのドナーの代表である。 ＰＢＭＣから単離した活性化及び休止ＣＤ４＋ＣＤ２５−及びＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ細胞におけるＴＩＧＩＴ及びＣＤ２２６のｍＲＮＡレベルを示すグラフを示す。ｍＲＮＡレベルは、休止ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞の倍数変化として表し、２つのドナーのデータの平均である。 実施例８に記載のように、ＴＩＧＩＴ欠損マウスにおいて機能的な免疫細胞を評価している実験の結果を示す。 野生型抗原提示細胞の非存在下(左パネル)又は存在下(中央パネル)での、ＴＩＧＩＴ欠損(ＴＩＧＩＴ.ＫＯ)Ｔ細胞と野生型Ｔ細胞の増殖を比較するグラフを示す。右パネルは、ＴＩＧＩＴ.ＫＯ抗原提示細胞の存在下での野生型Ｔ細胞に対するＴＩＧＩＴ.ＫＯ Ｔ細胞の割合を比較するグラフを示す。 ＴＩＧＩＴ.ＫＯと野生型のＴ細胞におけるＩＦＮγおよびＩＬ−４のレベルを評価しているＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 ＴＩＧＩＴ.ＫＯ又は野生型のＴ細胞の上清における示されたサイトカインの測定されたレベルを示しているグラフである。
ＴＩＧＩＴは免疫機能の予測されるモジュレーターとして同定された(例として、出典明記によって本明細書中に援用される米国公開特許ＵＳ２００４０１２１３７０を参照のこと)。本明細書において、出願人は、ＴＩＧＩＴが、ポリオウイルスレセプター(ＰＶＲ、ＮＥＣＬ５又はＣＤ１５５としても知られる)、ＰＶＲ様タンパク質１−４(ＰＶＲＬ１−４)、ＣＤ９６およびＣＤ２２６を含む免疫関連タンパク質の新規に記載されたファミリーのメンバーであることを示す。出願人は、メンバーが免疫の調節及び機能に役割を有するこの新規なファミリの保存された構造的成分を示し、更なるファミリメンバーを同定するための方法を提供する。
出願人は、ＴＩＧＩＴがＰＶＲと強く結合し、ＰＶＲＬ３(別名ネクチン-３又はＣＤ１１３)およびＰＶＲＬ２(別名ネクチン-２又はＣＤ１１２)に小さいＫｄで結合することを示す。ＰＶＲは、樹状細胞(ＤＣ)、並びにＦＤＣ、線維芽細胞、内皮細胞、及びいくつかの腫瘍細胞上で高く発現される細胞表面レセプターである(Sakisaka, T. & Takai, Y., Curr Opin Cell Biol 16, 513-21 (2004)；Fuchs, A. & Colonna, M., Semin Cancer Biol 16, 359-66 (2006))。出願人は、ＴＩＧＩＴが主に様々な活性化されたＴ細胞、特に調節Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞および濾胞性Ｔヘルパー細胞(Ｔｆｈ)に発現することをｍＲＮＡおよびＦＡＣＳ分析によって示す。本明細書において記述される試験は、ＤＣ上のＰＶＲとＴＩＧＩＴとの相互作用を示し、この結合相互作用がＤＣ機能、特にサイトカイン産生を調整することを示唆する。ＴＩＧＩＴが結合したヒトのＤＣは、高いレベルのＩＬ−１０と僅かな炎症誘発性サイトカイン(例えばＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０)を分泌した。未成熟Ｔ細胞にＴＩＧＩＴが結合すると(ＴＩＧＩＴ融合コンストラクトを使用して評価される)、Ｔ細胞活性化および増殖が阻害された。特に、この阻害はＥＲＫ阻害剤がある場合に逆転したことから、ＥＲＫ活性化がＤＣ活性を調整するＴＩＧＩＴの機能において重要な工程でありうることを示唆する。出願人は、本明細書において、ＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞が他のＴＩＧＩＴ−Ｔ細胞だけでなく、免疫細胞の混合種群に存在する場合には抗原提示細胞の増殖を抑制すること、そして、混合物中にブロック抗ＴＩＧＩＴ抗体が含まれると観察される抑制は大きく低減するのでＴＩＧＩＴ自体がこの抑制効果の原因であることを示す。
本明細書において示されるように、ＴＩＧＩＴは、正常コントロール組織と比較して、関節炎、乾癬、炎症性腸疾患および乳癌組織において発現が増加される。また、出願人は、ＴＩＧＩＴ融合タンパク質が遅延型過敏症インビボアッセイにおいてインビトロのヒトのＴ細胞応答とマウスのＴ細胞活性化を阻害したことを示すことによって、免疫応答を調節するＴＩＧＩＴの能力を直接示す。ＴＩＧＩＴが有意に成熟ＤＣを変更し、未成熟ＤＣを僅かにしか変更しなかったことから、いったんＤＣが完全に活性化された抗原提供細胞になると、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ相互作用は調節免疫応答を微調整するのに重要であることを示唆する。本明細書において提示される実験は、ＴＩＧＩＴがＤＣでのＩＬ−１０を誘導することによる阻害性フィードバックループによってＴ細胞活性化を阻害するメカニズムを示唆する。したがって、本発明はさらに、特定のサブセットのサイトカイン又は特定のサブセットの免疫細胞を調節することによる、免疫機能を調節する新規の方法を提供する。これら及び他の態様の本発明は、以下により詳細に記述される。
Ｉ．定義
「ＴＩＧＩＴポリペプチド」、「ＴＩＧＩＴタンパク質」および「ＴＩＧＩＴ」なる用語は、本明細書において交換可能に用いられ、本明細書において記述されるように特定のポリペプチド配列を指す。本明細書において記述されるＴＩＧＩＴポリペプチドは、ヒト組織ないしは非ヒト生物の組織といった、様々な供与源から単離してもよいし、または組換え又は合成方法によって調製されてもよい。一実施態様では、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号：１−４のいずれかに示すアミノ酸を有する。「ＴＩＧＩＴポリペプチド」に関する本明細書中のすべての開示は、各々のポリペプチドを個々に並びにまとめて指す。例えば、〜の調製、〜の精製、〜の誘導体、〜へないしはに対する抗体の形成、〜の投与、〜を含有する組成物、〜を有する疾患の治療などの記載は、本発明の各々のポリペプチドに別々に関連する。また、「ＴＩＧＩＴポリペプチド」、「ＴＩＧＩＴタンパク質」又は「ＴＩＧＩＴ」なる用語には、本明細書において開示されるかまたは当分野で公知のＴＩＧＩＴポリペプチドの変異体が含まれる。
「天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチド」は、天然由来の対応するＴＩＧＩＴポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチド」という用語には、特に、特定のＴＩＧＩＴポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチドは、完全長アミノ酸配列を含有する成熟又は完全長天然配列ポリペプチドである。しかし、関連する図に開示されているＴＩＧＩＴポリペプチドは、該図においてアミノ酸位置１と称されているメチオニン残基で開始することが示されている一方で、図のアミノ酸位置１より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、ＴＩＧＩＴポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることも考えられるし可能である。
ＴＩＧＩＴポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＴＩＧＩＴポリペプチドの形態を意味する。通常、ＴＩＧＩＴポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＴＩＧＩＴポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、ここで同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を超えない可能性が高い。従って、ＴＩＧＩＴポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、膜貫通ドメイン／細胞外ドメインの境界のいずれかの末端から約５を超えないアミノ酸を含みうるし、付着のシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。一実施態様では、ＴＩＧＩＴ ＥＣＤは配列番号：１に示すヒトＴＩＧＩＴタンパク質のアミノ酸１−１３９を包含する。
本明細書中に開示される様々なＴＩＧＩＴポリペプチドの「シグナルペプチド」のおよその位置は、当分野で公知の方法を用いて同定されうる。例えば、配列番号：１に示すヒトＴＩＧＩＴポリペプチドのシグナル配列は、アミノ酸１−１５にわたると予測される(例として米国公開特許２００４０１２１３７０を参照)。しかしながら、シグナルペプチドのＣ末端境界は変化してもよいが、本明細書中で最初に同定したシグナルペプチドのＣ末端境界のいずれかの端でおよそ５以下が異なる可能性が高く、このときシグナルペプチドのＣ末端境界は、アミノ酸配列エレメントの種類を同定するために当分野で関連的に用いられる基準に従って同定されてよい(例として、Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986))。さらに、場合によって、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全に一定ではないので、２以上の分泌された部分が生じる。シグナルペプチドが本明細書中で同定されたシグナルペプチドのＣ末端境界のいずれかの端でおよそ５以下のアミノ酸内で切断されている成熟ペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチドは、本発明によって考慮される。
「ＴＩＧＩＴポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される完全長天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＴＩＧＩＴポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＴＩＧＩＴポリペプチドの細胞外ドメイン又は完全長ＴＩＧＩＴポリペプチド配列の他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＴＩＧＩＴポリペプチドを意味する。このようなＴＩＧＩＴポリペプチド変異体には、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＴＩＧＩＴポリペプチドが含まれる。通常、ＴＩＧＩＴポリペプチド変異体は、ここに開示される完全長天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＴＩＧＩＴポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示されたＴＩＧＩＴポリペプチドの細胞外ドメイン又は完全長ＴＩＧＩＴポリペプチド配列の特に同定された他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＴＩＧＩＴ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、或いは少なくとも約２０アミノ酸長、或いは少なくとも約３０アミノ酸長、或いは少なくとも約４０アミノ酸長、或いは少なくとも約５０アミノ酸長、或いは少なくとも約６０アミノ酸長、或いは少なくとも約７０アミノ酸長、或いは少なくとも約８０アミノ酸長、或いは少なくとも約９０アミノ酸長、或いは少なくとも約１００アミノ酸長、或いは少なくとも約１５０アミノ酸長、或いは少なくとも約２００アミノ酸長、或いは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
ここに定義されるＴＩＧＩＴポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＴＩＧＩＴポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが公的に入手可能である配列比較プログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表１及び２に、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＴＩＧＩＴ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。「ＴＩＧＩＴ」は対象となる仮説的ＴＩＧＩＴポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は対象となる「ＴＩＧＩＴ」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を表し、そして「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」の各々は異なった仮説的アミノ酸残基を表している。
表１
対象のタンパク質 XXXXXXXXXXXXXXX (長さ＝１５アミノ酸)
比較タンパク質 XXXXXYYYYYYY (長さ＝１２アミノ酸)
% アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定される２つのポリペプチド配列間の同一に一致するアミノ酸残基の数）÷（対象のタンパク質のアミノ酸残基の総数）＝５÷１５＝３３．３％
表２
対象のタンパク質 XXXXXXXXXX (長さ＝１０アミノ酸)
比較タンパク質 XXXXXYYYYYYZZYZ (長さ＝１５アミノ酸)
% アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定される２つのポリペプチド配列間の同一に一致するアミノ酸残基の数）÷（対象のタンパク質のアミノ酸残基の総数）＝５÷１０＝５０％
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、前段及び表１と２に記載のようにＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。更に、殆どのＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２が用いられた場合には、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＴＩＧＩＴポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＴＩＧＩＴポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするＴＩＧＩＴポリペプチドが比較されるＴＩＧＩＴポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＴＩＧＩＴポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象である比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象であるＴＩＧＩＴポリペプチドのアミノ酸配列である。
また、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
「ＴＩＧＩＴポリヌクレオチド」及び「ＴＩＧＩＴヌクレオチド」なる用語は、本明細書中で交換可能に用いられ、ＴＩＧＩＴポリペプチドをコードする特定のポリヌクレオチド配列を指す。これらのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡあるいはＤＮＡとＲＮＡの両方を含んでよい。本明細書中に記載されるＴＩＧＩＴポリヌクレオチドは、ヒト組織又は非ヒト生物からの組織といった様々な供与源から単離されても、又は組み換えないし合成方法によって調製されてもよい。「ＴＩＧＩＴポリヌクレオチド」に関する本明細書中のすべての開示は、各々のポリヌクレオチドを個々に並びにまとめて指す。例えば、〜の調製、〜の精製、〜の誘導体、〜の投与、〜を含有する組成物、〜を有する疾患の治療などの記載は、本発明の各々のポリペプチドに別々に関連する。また、「ＴＩＧＩＴポリヌクレオチド」及び「ＴＩＧＩＴヌクレオチド配列」なる用語には、本明細書において開示されるＴＩＧＩＴポリヌクレオチドの変異体が含まれる
「天然配列ＴＩＧＩＴポリヌクレオチド」は、天然由来の対応するＴＩＧＩＴポリヌクレオチドと同じ核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。このような天然配列ＴＩＧＩＴポリヌクレオチドは、天然から単離されてもよいし、組換え又は合成手段によって製造されてもよい。「天然配列ＴＩＧＩＴポリヌクレオチド」なる用語には、特に、特定のＴＩＧＩＴポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドが含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列ＴＩＧＩＴポリヌクレオチドは、完全長核酸配列を含有する成熟又は完全長天然配列ポリヌクレオチドである。
「ＴＩＧＩＴ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＴＩＧＩＴ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＴＩＧＩＴポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する完全長天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた完全長天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＴＩＧＩＴポリペプチドの細胞外ドメイン、又は完全長ＴＩＧＩＴポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。通常、ＴＩＧＩＴ変異体ポリヌクレオチドは、完全長天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠いた完全長天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないＴＩＧＩＴポリペプチドの細胞外ドメイン、又は完全長ＴＩＧＩＴポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＴＩＧＩＴ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約６０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約９０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約３００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、或いは少なくとも約６００ヌクレオチド長、或いは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
ここで同定されるＴＩＧＩＴコード核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、対象のＴＩＧＩＴ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２はジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、公的に入手可能なソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さがアミノ酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、表３及び４に「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＴＩＧＩＴ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。「ＴＩＧＩＴ-ＤＮＡ」は対象となる仮説的ＴＩＧＩＴコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は対象となる「ＴＩＧＩＴ-ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々は異なった仮説的アミノ酸残基を表している。
表３
対象のＤＮＡ NNNNNNNNNNNNNN (長さ＝１４ヌクレオチド)
比較ＤＮＡ NNNNNNLLLLLLLLLL (長さ＝１６ヌクレオチド)
％核酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定される２つの核酸配列間の同一に一致するヌクレオチドの数）÷（対象のＤＮＡのヌクレオチドの総数）＝６÷１４＝４２．９％
表４
対象のＤＮＡ NNNNNNNNNNNN (長さ＝１２ヌクレオチド)
比較ＤＮＡ NNNNLLLVV (長さ＝９ヌクレオチド)
％核酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定される２つの核酸配列間の同一に一致するヌクレオチドの数）÷（対象のＤＮＡのヌクレオチドの総数）＝４÷１２＝３３．３％
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフ及び表３と４に示したようにＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性値は、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。更に、殆どのＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２が用いられた場合、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＴＩＧＩＴポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸配列（即ち、対象とするＴＩＧＩＴポリペプチドコード化核酸分子が比較されるＴＩＧＩＴポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２によって決定した一致する同一核酸残基の数を、（ｂ）対象とするＴＩＧＩＴポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＴＩＧＩＴポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
また、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
核酸配列比較にＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（或いは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ-ＢＬＡＳＴ２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
他の実施態様では、ＴＩＧＩＴ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＴＩＧＩＴポリペプチドをコードし、好ましくはストリンジェンシーハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示する完全長ＴＩＧＩＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。ＴＩＧＩＴ変異体ポリペプチドは、ＴＩＧＩＴ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端或いは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、或いは、（２）クーマシーブルー或いは好ましくは銀染色を用いた非還元或いは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。
「単離された」ＴＩＧＩＴポリペプチドコード化核酸は、同定され、ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態或いは設定以外のものである。ゆえに、単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在する特定のポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるポリペプチドコード化核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列或いは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター或いはリンカーが使用される。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体又は本明細書中に記載するいずれか他のポリペプチドを特異的に結合する抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、多エピトープ特異性を持つ抗ＴＩＧＩＴ抗体ないし抗体組成物、一本鎖抗ＴＩＧＩＴ抗体ないし他の抗体、及び抗ＴＩＧＩＴ抗体ないし他の抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェンシーにするが、低い温度はストリンジェンシーを低下させる。更に、ストリンジェンシーは塩濃度に逆比例する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「ストリンジェンシー条件」又は「高度のストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度を用いるもの、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いるもの、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファーに７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを添加したもの；又は（３）４２℃において５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用い、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で、５５℃において５０％ホルムアミド中で洗浄した後、５５℃においてＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものによって同定できる。
「中程度のストリンジェンシー条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように特定され、上記のものよりストリンジェンシーが低い洗浄液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェンシー条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション後に、３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルター洗浄を行うという条件である。プローブ長などの因子に必要に応じて適合させるには、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは当業者であれば分かるであろう。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合した対象のポリペプチド（ある非限定的な例として、ＴＩＧＩＴポリペプチド）を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、そのポリペプチドの天然又は天然に生じる形態の生物学的及び／又は免疫学的活性（先の例では、ＴＩＧＩＴ活性）を保持するポリペプチド（非限定的な例として、ＴＩＧＩＴポリペプチド）の形態を意味し、ここで、「生物学的」活性とは、天然又は天然に生じるポリペプチドが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘発する能力以外の、天然又は天然に生じるポリペプチドによって引き起こされる生物機能（阻害又は刺激）を意味し、「免疫」活性とは、天然又は天然に生じるポリペプチドが保持する抗原性エピトープ（先の例では、ＴＩＧＩＴ抗原性エピトープ）に対する抗体の生産を誘発する能力を意味する。
「アプタマー」なる用語は、ポリペプチドなどの標的分子に結合することができる核酸分子を指す。例えば、本発明のアプタマーは、ＴＩＧＩＴポリペプチド、又はＴＩＧＩＴの発現を調節するシグナル経路内の分子に特異的に結合することができる。アプタマーの生成および治療的使用は当分野において十分に確立されている。例として、加齢性黄斑変性症の治療については、米国特許第５４７５０９６号及びＭａｃｕｇｅｎ(登録商標)(Eyetech, New York)の治療効率を参照のこと。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子、などを含む。ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、ポリペプチドに正常に関連している一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含んでもよい。
「ＴＩＧＩＴアンタゴニスト」及び「ＴＩＧＩＴ活性又はＴＩＧＩＴ発現のアンタゴニスト」なる用語は、交換可能に用いられ、ＴＩＧＩＴコード核酸の転写ないし翻訳を低減するか又はＴＩＧＩＴポリペプチド活性を阻害するかないしはブロックする、又はその両方によって、ＴＩＧＩＴの正常な機能を干渉する化合物を指す。ＴＩＧＩＴアンタゴニストの例には、限定するものではないが、アンチセンスポリヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＴＩＧＩＴ特異的アプタマー、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴ結合断片、ＴＩＧＩＴ結合小分子、ＴＩＧＩＴ結合ペプチド、及びＴＩＧＩＴ(限定するものではないが、場合によって一又は複数の他のドメインと融合した、一又は複数のＴＩＧＩＴリガンドのＴＩＧＩＴ結合断片を含む)を特異的に結合し、ＴＩＧＩＴアンタゴニストとＴＩＧＩＴとの相互作用によりＴＩＧＩＴの活性又は発現の低減又は停止を生じさせる他のポリペプチドが含まれる。場合によって、ＴＩＧＩＴアンタゴニストが他のＴＩＧＩＴ活性に作用することなく１つのＴＩＧＩＴ活性を中和しうることは、当分野の技術者に理解されている。例えば、本明細書中のある方法に使用するための望ましいＴＩＧＩＴアンタゴニストは、例えば他のいずれかのＴＩＧＩＴ相互作用に影響しないか又は最小限の影響で、ＰＶＲ相互作用、ＰＶＲＬ３相互作用又はＰＶＲＬ２相互作用のうちの一つに応答してＴＩＧＩＴ活性を中和するＴＩＧＩＴアンタゴニストである。
「ＰＶＲアンタゴニスト」及び「ＰＶＲ活性又はＰＶＲ発現のアンタゴニスト」なる用語は、交換可能に用いられ、ＰＶＲコード核酸の転写ないし翻訳を低減するか又はＰＶＲポリペプチド活性を阻害するかないしはブロックする、又はその両方によって、ＰＶＲの正常な機能を干渉する化合物を指す。ＰＶＲアンタゴニストの例には、限定するものではないが、アンチセンスポリヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＶＲ特異的アプタマー、抗ＰＶＲ抗体、抗ＰＶＲ抗体のＰＶＲ結合断片、ＰＶＲ結合小分子、ＰＶＲ結合ペプチド、及びＰＶＲ(限定するものではないが、場合によって一又は複数の他のドメインと融合した、一又は複数のＰＶＲリガンドのＰＶＲ結合断片を含む)を特異的に結合し、ＰＶＲアンタゴニストとＰＶＲとの相互作用によりＰＶＲの活性又は発現の低減又は停止を生じさせる他のポリペプチドが含まれる。場合によって、ＰＶＲアンタゴニストが他のＰＶＲ活性に作用することなく１つのＰＶＲ活性を中和しうることは、当分野の技術者に理解されている。例えば、本明細書中のある方法に使用するための望ましいＰＶＲアンタゴニストは、ＰＶＲ−ＣＤ９６及び／又はＰＶＲ−ＣＤ２２６の相互作用に影響することなく、ＴＩＧＩＴ相互作用に応答してＰＶＲ活性を中和するＰＶＲアンタゴニストである。
「ＴＩＧＩＴアゴニスト」及び「ＴＩＧＩＴ活性又はＴＩＧＩＴ発現のアゴニスト」なる用語は、交換可能に用いられ、ＴＩＧＩＴコード核酸の転写ないし翻訳を増加させることにより、及び／又はＴＩＧＩＴ発現又はＴＩＧＩＴ活性を阻害する分子の活性を妨げるかないしはブロックすることにより、及び／又は正常なＴＩＧＩＴ活性を亢進させる(限定するものではないが、ＴＩＧＩＴの安定性を亢進させる又は一又は複数の標的リガンドへのＴＩＧＩＴの結合を亢進させることを含む)ことによって、ＴＩＧＩＴの正常な機能を亢進させる又は刺激する化合物を指す。例えば、ＴＩＧＩＴアゴニストは、抗体、抗原結合断片、アプタマー、干渉ＲＮＡ、小分子、ペプチド、アンチセンス分子、及び他の結合ポリペプチドから選択されてよい。他の例では、ＴＩＧＩＴアゴニストは、アプタマー、干渉ＲＮＡ、又はＴＩＧＩＴ阻害性分子の転写および／または翻訳に干渉するアンチセンス分子から選択されるポリヌクレオチドであってよい。場合によって、ＴＩＧＩＴアゴニストが他のＴＩＧＩＴ活性に影響することなく１つのＴＩＧＩＴ活性をアゴナイズしうることは、当分野の技術者に理解されている。例えば、本明細書中のある方法に使用するための望ましいＴＩＧＩＴアゴニストは、例えば他のいずれかのＴＩＧＩＴ相互作用に影響しないか又は最小限の影響で、ＰＶＲ相互作用、ＰＶＲＬ３相互作用又はＰＶＲＬ２相互作用のうちの一つに応答してＴＩＧＩＴ活性をアゴナイズするＴＩＧＩＴアゴニストである。
「ＰＶＲアゴニスト」及び「ＰＶＲ活性又はＰＶＲ発現のアゴニスト」なる用語は、交換可能に用いられ、ＰＶＲコード核酸の転写ないし翻訳を増加させることにより、及び／又はＰＶＲ発現又はＰＶＲ活性を阻害する分子の活性を妨げるかないしはブロックすることにより、及び／又は正常なＰＶＲ活性を亢進させる(限定するものではないが、ＰＶＲの安定性を亢進させる又は一又は複数の標的リガンドへのＰＶＲの結合を亢進させることを含む)ことによって、ＰＶＲの正常な機能を亢進させる又は刺激する化合物を指す。例えば、ＰＶＲアゴニストは、抗体、抗原結合断片、アプタマー、干渉ＲＮＡ、小分子、ペプチド、アンチセンス分子、及び他の結合ポリペプチドから選択されてよい。他の例では、ＰＶＲアゴニストは、アプタマー、干渉ＲＮＡ、又はＰＶＲ阻害性分子の転写および／または翻訳に干渉するアンチセンス分子から選択されるポリヌクレオチドであってよい。場合によって、ＰＶＲアゴニストが他のＰＶＲ活性に影響することなく１つのＰＶＲ活性をアゴナイズしうることは、当分野の技術者に理解されている。例えば、本明細書中のある方法に使用するための望ましいＰＶＲアゴニストは、例えばＰＶＲ−ＣＤ９６ないしはＰＶＲ−ＣＤ２２６の結合相互作用に影響しないか又は最小限の影響で、ＴＩＧＩＴ相互作用に応答してＰＶＲ活性をアゴナイズするか又はＰＶＲに干渉する際にＴＩＧＩＴを模倣するＰＶＲアゴニストである。
「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又は疾患を防止又は低下（減少）させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が予防されるべきものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS(商品名)を含む。
「抗体断片」は、原型の抗体の一部、好ましくは原型の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片を生じ、それは二つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの三つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な三つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ’断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合とって望ましい構造の形成を可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP404,097；WO93/11161；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に、より十分に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端或いは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、或いは、（３）限定するものではないがクーマシーブルー或いは銀染色といった色素又は染色を用いた非還元或いは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
「特異的に結合する」抗体、又は特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ特異的な抗体とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
本明細書中で使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列が高頻度に変化する、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲ、つまり、ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、及びＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)を含む。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループとの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ カバット ＡｂＭ Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (カバット番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
ＨＶＲは、次のような「伸展したＨＶＲ」を含んでもよい、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義されるＨＶＲ以外の可変ドメイン残基である。
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat et al.の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
カバット番号付けシステムは一般に、可変ドメイン内の残基を指す場合に用いられる(軽鎖のおよそ残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３)(例えばKabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は一般に、イムノグロブリン重鎖定常領域を指す場合に用いられる(例えば上掲のKabat et al.において報告されたＥＵインデックス)。「カバットにおけるＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けする残基を意味する。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けする残基を意味する(例えば、米国特許仮出願第６０／６４０３２３号のＥＵ番号付けに関する図を参照のこと)。
「親和性成熟した」抗体は、その一又は複数のＨＶＲに一又は複数の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。一実施態様では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知のある方法により生産されうる。例えば、Marks等は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、例としてBarbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)；Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)；Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)；Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995)；及びHawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)に開示されている。
「遮断(ブロッキング)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減するものである。ある遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は、実質的又は完全に、抗原の生物学的活性を阻害する。本明細書中で用いる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一を部分的ないし完全に模倣する抗体である。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含むがこれらには限定されない。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（本明細書中に記載のポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の構成成分が哺乳動物の病的状態を引き起こし、媒介し、或いは寄与する疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は処置が、疾患の進行に対して改善的な効果を有するような疾患をも含む。この用語には、免疫媒介炎症性疾患、非免疫媒介炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全性疾患、腫瘍形成等が含まれる。
「Ｔ細胞媒介疾患」という用語は、Ｔ細胞が哺乳動物の病的状態を直接、又は間接に媒介する、或いは寄与する免疫関連疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は、細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等、そして例えば、Ｔ細胞によって分泌されたリンホカインによってＢ細胞が刺激された場合に、Ｂ細胞と関連している効果にさえも関連している。
免疫関連疾患及び炎症性疾患は、免疫又はＴ細胞媒介性のものを含み、本発明により治療可能である。それらの疾患には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少症（特発的血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫性腎臓疾患（糸状体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害、又はギランバレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及びその他の非肝性ウイルス）、自己免疫慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン感受性腸疾患、フィップル疾患、自己免疫性又は免疫媒介性皮膚疾患、水泡性皮膚疾患、多形滲出性紅斑、接触皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、蕁麻疹、肺の免疫学的疾患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、高感受性間質性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。ＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ型肝炎等、細菌感染症、真菌感染症、原生動物感染症、及び寄生虫感染症といったウイルス性疾患を含む感染性疾患もまた免疫及び／又は炎症性の成分及び／又は病因でありうる。
いくつかの皮膚疾患は、異常な免疫応答及び自己免疫状態に関連する。乾癬のような疾患は、皮膚水疱形成、皮膚白点形成、浮腫および皮膚タンパク質に結合する自己抗体の存在といった特徴がある。本出願では、実験によりＴＩＧＩＴ発現が正常皮膚に対して乾癬皮膚では上方制御されることを決定する。ＴＩＧＩＴの発現および／または活性の調節は、乾癬の症状又は根本的な原因を治療する際に有用となりうる。
炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）という用語は、腸管（腸）に炎症を起こし、時に反復性の腹痛又は下痢を起こす原因不明の慢性炎症性障害の一群を意味する。米国におけるＩＢＤの罹患率は、人口１０万人あたり約２００人と推定されている。ＩＢＤ患者は、潰瘍性大腸炎（「ＵＣ」）を伴うグループ、及びクローン病（「ＣＤ」）を伴うグループの、２つの主要グループに分けられる。
ＵＣ患者には、主に結腸粘膜の炎症性反応が見られる。通常炎症は均一且つ連続的で、部分的にしろ途中に正常粘膜は見られない。陰窩上皮および粘膜下、並びに表面の粘膜細胞に、好中球の浸潤による炎症反応が起こっている。通常最終的にこのような状況は上皮の損傷へと進行し、上皮細胞が失われてその結果複数の潰瘍形成、繊維症、異形成、及び縦方向の大腸退縮が起こる。
ＣＤは、炎症が腸壁の全ての層に亘る点でＵＣとは異なり、またリンパ節だけでなく腸管壁にも炎症が起こる。ＣＤは、口から肛門までに亘る、消化管のいずれの部分にも起こり得る。この疾病は不連続性であることが多く、つまり腸の重症部分と明らかに疾病を有さない領域とが分離している。ＣＤではまた、腸壁が厚くなり、閉塞に繋がることがあり得る。加えて、瘻孔及び亀裂が珍しくない。
臨床的に、ＩＢＤは、慢性の予測不能な経過に繋がることが多い多様な症状を特徴とする。観血的な下痢、及び腹痛は、多くの場合発熱と体重減少を伴う。重度の疲労感と同様に貧血も多い。関節痛から急性関節炎に亘る関節症状や、肝機能の異常も一般にＩＢＤと関連しているとされる。また、ＩＢＤ患者が大腸癌にかかる危険は平均より大きい。ＩＢＤの急性の「発作」が起こっている間は、仕事やその他の日常活動は通常不可能であり、患者が入院することも多い。
ＩＢＤの原因は依然として不明であるが、遺伝、感染、及び免疫的感受性等の複数の要因が関係していると思われている。ＩＢＤは白人に多く、特にユダヤ系の白人に多い。症状が慢性的炎症性の性質であることにより、感染的原因の可能性に対する熱心な調査が急ぎ行われた。急性炎症を刺激する薬剤が見つかったものの、ＩＢＤに関連して慢性的炎症の原因となるものは見つかっていない。ＩＢＤが自己免疫性疾患であるという仮説は、関節炎など前述したようにＩＢＤが腸以外に症状を有すること、並びに、免疫反応を抑制することが知られている副腎性グルココルチコイド、シクロスポリン及びアザチオプリン等の治療薬によりＩＢＤにポジティブな反応が見られることが既知であることにより支持されている。加えて、胃腸管は、身体の他のどの器官よりも、連続的に食物由来のタンパク質、細菌性副産物（ＬＰＳ）等の抗原性物質の可能性に曝されている。
さらに、重度の潰瘍性大腸炎を持つ患者では、特に疾病が複数年に亘る場合、大腸癌の危険が大きく上昇する。大量出血、慢性的衰弱性の病気、大腸の穿孔、又は癌の危険のため、約２０〜２５％のＩＢＤ患者に最終的に大腸切除手術が必要になる。他の形態の医学的処置が失敗した場合、或いは、ステロイドの副作用や他の薬物適用により患者の健康が脅かされる場合にも手術が行われる場合がある。手術は侵襲性であり、劇的に人生を変えるので、あまり望ましい治療方式ではなく、通常は最後の処置である。この疾病に対する理解を深め、治療を可能にするための実験を行い、正常組織と比較した場合にＣＤとＵＣの両方においてＴＩＧＩＴが上方制御されることが確認された。ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の調整は一又は複数のＩＢＤの形態の治療に有用であろう。
リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に付随し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体を生成する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば、関節空間／液でもしかりである。罹患組織は、多くの場合対称的なパターンで、主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患もまた生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発生である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官において血管炎が付随する。多くの場合、患者には、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６歳未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子が陽性である患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は３つの主要なカテゴリー：小関節(pauarticular)、多関節及び全身性に細分類される。関節炎は重度で典型的には破壊的であり、関節強直症及び遅延成長に至る。他の徴候には慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
「有効量」とは、特に定まった目的を達成することを引き起こすポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量である。ポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの「有効量」は経験的に決定されうる。更には、「治療的有効量」とは、定まった治療的有効量を達成するために効果的なポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量である。また、この量は経験的に決定されうる。
ここで用いられる「細胞傷害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞破壊を起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、タキソイド類、例えばパクリタキセル(タキソール, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドセタキセル(docetaxel)(タキソテール(Taxotere), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン(vinorelbine)、カルボプラチン、テニポシド(teniposide)、ダウノマイシン、カルミノマイシン(carminomycin)、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン(esperamicins)(米国特許第４６７５１８７号参照)、メルファラン、及び他の関連したナイトロジェンマスタードが含まれる。またこの定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン及びオナプリストーン(onapristone)も含まれる。
ここで使用される場合の「増殖阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、特にここで同定された任意の遺伝子を過剰発現する細胞の増殖を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、増殖阻害剤とは、Ｓ期におけるそのような遺伝子の過剰発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。増殖阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ期以外の場所において)、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ期停止へ波及する。更なる情報は、例えば、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインのある例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、例えば、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのような形質転換成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子-I及び-II；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン-α、-β、及び-γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、又はＩＬ-１７等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここで用いられる「炎症性細胞」という用語は、単核細胞、好酸球、マクロファージ、及び多形核球好中球（ＰＭＮ）等の炎症性反応を増強する細胞を意味する。
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
ＴＩＧＩＴは免疫機能の予測されるモジュレーターとして同定された(例として、出典明記によって本明細書中に援用される米国公開特許ＵＳ２００４０１２１３７０を参照のこと)。本明細書において、出願人は、ＴＩＧＩＴが、ポリオウイルスレセプター(ＰＶＲ、ＮＥＣＬ５又はＣＤ１５５としても知られる)、ＰＶＲ様タンパク質１−４(ＰＶＲＬ１−４)、ＣＤ９６およびＣＤ２２６を含む、「ＴＩＧＩＴ様タンパク質」(ＴＬＰ)ファミリと称する免疫関連タンパク質の新規に記載されたファミリーのメンバーであることを示す。出願人は、メンバーが免疫の調節及び機能に役割を有するこの新規なＴＬＰファミリの保存された構造的成分を示し、更なるファミリメンバーを同定するための方法を提供する。ＰＶＲＬ１−４およびＰＶＲは共通のドメインアーキテクチャ(ＩｇＶ−ＩｇＣ−ＩｇＶ)を共有するのに対して、ＣＤ２２６およびＣＤ９６は膜近位のＩｇＶドメインを欠いている。これら８つのタンパク質の細胞内セグメントは、ＰＶＲＬ１−３間で共有されるａｆａｄｉｎ結合モチーフの外で、互いに限られた類似性を示し、ＰＶＲＬ４はこの配列を欠いているが、ａｆａｄｉｎを結合することが知られている。ＮＥＣＬ-１の関連するＩｇＶドメインの結晶構造に基づいて(Dong, X. et al., J Biol Chem 281, 10610-7 (2006))、第一及び第３のモチーフは、それぞれＢとＣの間およびＦとＧβ-鎖の間のヘアピンループにあることが予測される。これら２つのループは、ＩｇＶホールドの一端で互いに隣接している。第二のモチーフは、ＮＥＣＬ−１のためのホモ二量体界面の一部を形成するのに関与するＣ'とＣ''β鎖を含む。ゆえに、これら配列のモチーフは、ＰＶＲファミリメンバー間で観察される特定のホモおよびヘテロ型の相互作用において機能しうる。
ＴＬＰファミリは、アラニン６７、グリシン７４、プロリン１１４およびグリシン１１６を含む多くの完全に保存されたアミノ酸を含む。さらに、ＴＬＰファミリは、位置５４にバリン、イソロイシンおよびロイシンから選択されるアミノ酸、位置５５にセリンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸、位置５６にグルタミン、位置１１２にスレオニン、および位置１１３にフェニルアラニンおよびチロシンから選択されるアミノ酸を含む、実質的に保存されている(例えばファミリメンバーの多くに見られるが、すべてのファミリメンバーに見られるわけではない)いくつかのアミノ酸を含む。また、ＴＬＰファミリのメンバーは、３つの構造的サブモチーフ：バリン／イソロイシン５４−セリン／スレオニン５５−グルタミン５６；アラニン６７−Ｘ６８−７３−グリシン７４(Ｘは任意のアミノ酸である)；及び、スレオニン１１２−フェニルアラニン／チロシン１１３−プロリン１１４−Ｘ１１５−グリシン１１６(Ｘは任意のアミノ酸である)を含む。上で使用する番号付けはヒトＴＩＧＩＴタンパク質配列に関するものであり、これらの保存された残基の相対的な位置やＴＬＰタンパク質ファミリの異なるメンバーにあるモチーフがヒトＴＩＧＩＴ配列のこれらアミノ酸の位置と同一であるが、他のＴＬＰファミリのこれら残基の絶対的な番号付けは異なりうることは、当分野の技術者は理解している。
免疫の調節および機能に同定されたＴＬＰファミリメンバーが関与しているので、このタンパク質ファミリの他のメンバーも免疫の調節及び機能に関与しているようである。したがって、本発明は、ポリペプチドの配列を、一又は複数の先に同定したファミリメンバーの配列に整列配置することと、先に同定した完全に保存された残基、先に同定された実質的に保存された残基及び／又は先に同定された構造上のサブモチーフの、あるタンパク質配列における有無を評価することによる、あるポリペプチドがＴＬＰファミリのメンバーであるか否かを決定する方法を提供する。また、本発明は、アミノ酸配列に先に同定した完全に保存された残基、先に同定された実質的に保存された残基及び／又は先に同定された構造上のサブモチーフが含まれているタンパク質について、一又は複数の配列データベースを検索することによる、ＴＬＰタンパク質ファミリの他のメンバーの同定方法を提供する。
また、本明細書において出願人によるＴＬＰファミリの同定は、ＴＬＰファミリの共通の構造的特徴によりＴＬＰファミリの２以上のメンバーは同じように調節されうるという可能性を示唆する。例えば、各々のＴＬＰファミリメンバーで保存された及び実質的に保存されたアミノ酸残基とサブモチーフが各タンパク質の一又は複数のドメインでこれらファミリメンバーに類似の三次元構造を生じさせている場合、これら類似の三次元構造は、同時に、２以上のＴＬＰファミリメンバー又はすべてのＴＬＰファミリメンバーを同時に調節するために標的とされうる。したがって、本発明はまた、ＴＬＰファミリメンバーのこのような保存された又は実質的に保存された領域と特異的に相互作用する薬剤(「ＴＬＰ相互作用剤」)を提供する。このような薬剤を用いて、候補タンパク質がＴＬＰ相互作用剤と相互作用するか否かを評価することによってＴＬＰファミリの一又は複数の更なるメンバーを同定してよい。候補タンパク質のＴＬＰ相互作用剤との相互作用は、タンパク質がＴＬＰファミリメンバーでありうることを示す。ＴＬＰ相互作用剤はＴＬＰ活性を調整しうる。例えば、ＴＬＰ相互作用剤は、限定するものではないが、小分子阻害因子、阻害性抗体ないしその抗原結合断片、アプタマーおよび阻害性ペプチドを含む、ＴＬＰ活性のアンタゴニストであってよい。他の例では、ＴＬＰ相互作用剤は、限定するものではないが、アゴナイズ抗体ないしその抗原結合断片、アゴナイズペプチド、及びＴＬＰタンパク質の構造を安定化してＴＬＰタンパク質活性を容易にさせる小分子を含む、ＴＬＰ活性のアゴニストであってよい。ＴＬＰ相互作用剤は、当分野で公知の様々な方法、例えば本明細書において記述されるスクリーニング法を用いて同定されうる。
出願人は、ＴＩＧＩＴが主に様々な活性化されたＴ細胞、特に扁桃腺組織から単離した調節Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞および濾胞性Ｂ細胞ヘルパーＴ細胞(Ｔｆｈ)に発現することをｍＲＮＡおよびＦＡＣＳ分析によって示す。ゆえに、本発明は、細胞がＴＩＧＩＴを発現するか否かに基づく、選択された細胞がＴｒｅｇ、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＦｈ細胞であるか否かを識別する方法を提供する。また、本発明は、当分野で公知及び／又は本明細書中に記載されるいずれかの精製方法(非限定的な例としてフローサイトメトリー)を用いて、ＴＩＧＩＴを発現しない他の種類の免疫細胞からＴｒｅｇ、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞及びＴＦｈ細胞を精製するためにＴＩＧＩＴを使用する方法を提供する。また、出願人は、これらの細胞群の中で活性化されたＴｒｅｇｓにおいて最も高いＴＩＧＩＴ発現が生じることを示す。ゆえに、本発明はまた、一又は複数のコントロール試料でのＴＩＧＩＴの発現レベルと比較したＴＩＧＩＴの発現レベルに基づいて、ある細胞が活性化されたＴｒｅｇｓであるか否かを同定する方法を提供する(ここで、コントロール試料は例示的なＴ細胞サブセット群からの既定値でってもよいし、コントロール試料は活性化されたＴｒｅｇ、非活性化Ｔｒｅｇ、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞、ＴＦｈ細胞又は他のＴ細胞群といった既知の細胞サブ集団からの他の試料であってもよい)。また、一又は複数のコントロール活性化ないしは非活性化Ｔｒｅｇ試料におけるＴＩＧＩＴ発現レベルと比較して、又は既知の活性化ないしは非活性化のＴｒｅｇ細胞群における既定のＴＩＧＩＴ発現値と比較して、ＴＩＧＩＴの発現レベルを決定することによる、あるＴｒｅｇ細胞が活性化されているか否かを決定する方法も提供される。さらに、細胞において発現されるＴＩＧＩＴの量を用いて他の細胞から細胞を分離する、当分野で公知及び／又は本明細書中に記載されるいずれかの精製方法(非限定的な例として、フローサイトメトリー)を用いて、他のＴ細胞から活性化されたＴｒｅｇを別々に単離する方法を提供する。
出願人は、ＴＩＧＩＴがＰＶＲと強く結合し、ＰＶＲＬ３(別名ネクチン-３又はＣＤ１１３)およびＰＶＲＬ２(別名ネクチン-２又はＣＤ１１２)に小さいＫｄで結合することを示す。出願人によって例証されるように、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴはＣＤ２２６及びＣＤ９６といった２つの他のリガンドとＰＶＲとの相互作用を遮断し、ＣＤ２２６は、ＰＶＲ−ＣＤ２２６相互作用のＴＩＧＩＴよりも効果の低い、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ相互作用の阻害因子である。出願人は、細胞表面に発現されるＰＶＲに対するＴＩＧＩＴ又はＴＩＧＩＴ融合タンパク質の結合を阻害する抗ＴＩＧＩＴ抗体(例えば本明細書において記述される抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７)を製造した。出願人は、さらに、１０Ａ７とは異なるＴＩＧＩＴ上のエピトープ特異性を有する、本明細書中に記載の抗体１Ｆ４といった他の抗体を製造した。特に、ＣＤ２２６は、ＴＩＧＩＴを高く発現する細胞種であるＴｒｅｇｓ又はＴＦｈでは有意に発現されない。
これらの所見によって裏付けられるように、本発明は、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ相互作用、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲＬ２相互作用及びＴＩＧＩＴ−ＰＶＲＬ３相互作用のアゴニスト及びアンタゴニスト、並びにこのアゴニスト及びアンタゴニストを用いたインビトロ又はインビボでのＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ結合、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲＬ２結合及びＴＩＧＩＴ−ＰＶＲＬ３結合の調節方法を提供する。また、インビトロ又はインビボでＴＩＧＩＴ(ＰＶＲ結合の競合物質)又は抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしはその抗原結合断片を投与することによる、ＣＤ２２６−ＰＶＲ相互作用及び／又はＣＤ９６−ＰＶＲ相互作用の調節方法を提供する。さらに、本発明は、アゴナイズ及びアンタゴナイズする抗ＴＩＧＩＴ抗体及びその断片、特に抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７及び１Ｆ４と、抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７及び／又は１Ｆ４のＣＤＲを含む代替的種類の抗体を包含する。
本明細書において記述される試験は、ＤＣ上のＰＶＲとＴＩＧＩＴとの相互作用を示し、この結合相互作用がＤＣ機能、特にサイトカイン産生を調整することを示唆する。ＰＶＲは、樹状細胞(ＤＣ)、並びにＦＤＣ、線維芽細胞、内皮細胞、及びいくつかの腫瘍細胞上で高く発現されることが知られている細胞表面レセプターである(Sakisaka, T. & Takai, Y., Curr Opin Cell Biol 16, 513-21 (2004)；Fuchs, A. & Colonna, M., Semin Cancer Biol 16, 359-66 (2006))。ＴＩＧＩＴが結合したヒトのＤＣは、ＩＬ−１０を高レベルに分泌したが、炎症誘発性及び他のサイトカイン(例えばＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＩＬ−１８およびＩＦＮγ)は僅かにしか分泌しなかった。ＴＩＧＩＴはＩＬ−２３といった特定のサイトカインの産生には作用しなかった。ＴＩＧＩＴ結合時のこのサイトカインの歪みは、ＴＮＦα又はＣＤ４０／ＬＰＳによって刺激された細胞にのみ観察され、ＴＬＲ２−又はＰａｍ３ＣＳＫ４−刺激細胞では観察されなかったことから、ＴＩＧＩＴは免疫系がＤＣ機能を微調節しうる一つの手段であることを示唆する。未成熟Ｔ細胞にＴＩＧＩＴが結合すると(ＴＩＧＩＴ融合コンストラクトを使用して評価される)、Ｔ細胞活性化および増殖が阻害された。しかしながら、ＴＩＧＩＴ処置は、未成熟単核球由来ＤＣ(ｉＭＤＤＣ)の成熟能には影響せず、この細胞の成熟を直接誘導しなかったとりわけ、この阻害はＥＲＫ阻害因子の存在下で逆転したことから、ＥＲＫ活性化は、ＴＩＧＩＴのＤＣ活性を調節する機能において重要な工程であることを示す。実際に、出願人は、ＰＶＲにＴＩＧＩＴが結合すると、ＰＶＲのリン酸化とｐＥＲＫ単量体でなくｐＥＲＫ二量体のリン酸化の増加が生じることを示す。これは、例えばｐ３８細胞内シグナル伝達経路が細胞のＴＩＧＩＴ−Ｆｃ処理により調節されなかったので、一般的な作用ではなかった。出願人は、本明細書において、ＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞が他のＴＩＧＩＴ−Ｔ細胞だけでなく、免疫細胞の混合種群に存在する場合には抗原提示細胞の増殖も抑制することを示す。出願人はさらに、実験に抗ＴＩＧＩＴ抗体又は抗ＰＶＲ抗体を含めると、観察される増殖の抑制、ＤＣサイトカイン産生の調節、及び他の免疫細胞の増殖の抑制が大幅に低減したので、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ相互作用が先に観察された効果を媒介することを示す。まとめると、本出願人によって示されたデータは、ＴＩＧＩＴが免疫応答をネガティブに調節することによって免疫系のフィードバック機構を提供することを示唆する。
したがって、本発明は、ＴＩＧＩＴ又はＰＶＲの発現および／または活性を調整することによる免疫細胞(例えばＤＣ)機能を調整する方法を提供する。例えば、インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性のアゴニスト又はＰＶＲの発現および／または活性のアゴニストにて免疫細胞を処置することによる、免疫細胞(例えばＤＣ又は抗原提示細胞)の増殖の低減ないし阻害方法が提供される。また、インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性のアンタゴニスト又はＰＶＲの発現および／または活性のアンタゴニストにて免疫細胞を処置することによる、免疫細胞(例えばＤＣ又は抗原提示細胞)の増殖の増加方法が提供される。また、本発明は、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性のアンタゴニスト又はＰＶＲの発現および／または活性のアンタゴニストを投与することによる免疫応答の増加／刺激方法を提供する。同様に、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性のアゴニスト又はＰＶＲの発現および／または活性のアゴニストを投与することによる、免疫応答の低減／阻害方法が提供される。
また、本発明は、ＴＩＧＩＴ又はＰＶＲの発現及び／又は活性を調節することによる、免疫細胞(例えばＤＣ)からのサイトカイン産生の種類および／または量の調節方法を提供する。具体的には、本発明は、インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性のアゴニスト又はＰＶＲの発現および／または活性のアゴニストにて細胞を処置することによる、免疫細胞、例えばＤＣによるＩＬ−１０産生を増やす方法を提供する。また、インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性のアゴニスト又はＰＶＲの発現および／または活性のアゴニストにて細胞を処置することによる、免疫細胞、例えばＤＣによる炎症誘発性サイトカイン産生及び／又は放出を低減する方法が提供される。同様に、インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニスト又はＰＶＲの発現及び／又は活性のアンタゴニストにて細胞を処置することによる、免疫細胞、例えばＤＣによるＩＬ−１０産生を低減させる方法も提供される。本発明は、さらに、インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニスト又はＰＶＲの発現及び／又は活性のアンタゴニストにて細胞を処置することによる、免疫細胞、例えばＤＣによる炎症誘発性サイトカイン産生及び／又は放出を増加させる方法を提供する。また、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、又はＰＶＲの発現及び／又は活性のアゴニストにより細胞を処理することによる、一又は複数の細胞におけるＥＲＫ経路による細胞内シグナル伝達及び／又はＥＲＫリン酸化の刺激方法が提供される。同様に、本発明は、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニスト、又はＰＶＲの発現及び／又は活性のアンタゴニストにより細胞を処理することによる、一又は複数の細胞におけるＥＲＫ経路による細胞内シグナル伝達及び／又はＥＲＫリン酸化を阻害する又は低減させる方法を提供する。
本明細書において示されるように、ＴＩＧＩＴは、正常コントロール組織と比較して、関節炎、乾癬、炎症性腸疾患および乳癌組織において発現が増加される。乳癌組織に関して、出願人は、ＴＩＧＩＴの発現が腫瘍細胞自体と相関するのではなく、むしろ腫瘍中のＣＤ４＋免疫細胞浸潤物と相関することを示す。また、出願人は、ＴＩＧＩＴ融合タンパク質が遅延型過敏症インビボアッセイにおいてインビトロのヒトのＴ細胞応答とマウスのＴ細胞活性化を阻害したことを示すことによって、免疫応答を調節するＴＩＧＩＴの能力を直接示す。したがって、本発明は、被検体からの試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を評価することと、その発現及び／又は活性をＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の対照量あるいは正常被検体の試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の量と比較することによる、被検体の異常な免疫細胞応答に関連する疾患／障害の診断方法を提供する。また、本発明は、被検体からの試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を評価することと、その発現及び／又は活性をＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の対照量あるいは正常被検体の試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の量と比較することによる、被検体の異常な免疫細胞応答に関連する疾患ないし障害(すなわち免疫関連疾患)の重症度の評価方法を提供する。また、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を調節することによる、異常な免疫細胞応答に関連する疾患ないし障害(すなわち免疫関連疾患)の予防方法が提供される。さらに、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を調節することによる、異常な免疫細胞応答に関連する疾患ないし障害(すなわち免疫関連疾患)の重症度の治療ないし低減方法が提供される。ＴＩＧＩＴのネガティブ調節活性が疾患状態に貢献する場合には、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性の調節は、(すなわち、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト又はＰＶＲアンタゴニストによって)ＴＩＧＩＴの活性および／または発現を阻害するという形態を取ってよい。例えば、ＤＣ増殖の増加および／またはＤＣによる炎症誘発性サイトカイン産生の増加が望ましい場合には、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性を中和する(アンタゴナイズする)ことが望ましい。疾患状態を制御するためにＴＩＧＩＴのネガティブ調節活性が望ましい場合には、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性の調節は、(すなわち、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴアゴニスト又はＰＶＲアゴニストを投与することによって)ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を活性化するないしは増加させるという形態を取ってよい。例えば、ＤＣ増殖の減少および／またはＤＣによる炎症誘発性サイトカイン放出の減少が望ましい場合には、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性をアゴナイズすることが望ましい。これら及び他の本発明の態様は、以下により詳細に記述される。
Ａ．完全長ＴＩＧＩＴポリペプチド
本発明は、ＴＩＧＩＴポリペプチドとして本出願において称されるポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、以降の本明細書中及び実施例中にさらに詳細に開示されるように、様々なＴＩＧＩＴポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され、単離された。本発明は本発明の方法に有用な他のポリペプチド(すなわちＰＶＲ)も提供すること、そして、ＴＩＧＩＴポリペプチドの創造、製造、標識、翻訳後修飾、使用の方法又は他の態様について具体的に記載された本明細書中のいずれの記載もＴＩＧＩＴでない他のポリペプチドにも適用できることは、当分野の技術者は理解している。
Ｂ．ＴＩＧＩＴポリペプチド変異体
ここに記載した完全長天然配列ＴＩＧＩＴポリペプチドに加えて、ＴＩＧＩＴ変異体も調製できると考えられる。ＴＩＧＩＴ変異体は、ＴＩＧＩＴポリヌクレオチドに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／或いは所望のＴＩＧＩＴポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、ポリペプチドのグリコシル化部位の数又は位置の変化或いは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＴＩＧＩＴポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然完全長配列ＴＩＧＩＴ又はここに記載したＴＩＧＩＴポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＴＩＧＩＴと比較してＴＩＧＩＴポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＴＩＧＩＴポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失及び／又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも一のアミノ酸のＴＩＧＩＴの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＴＩＧＩＴの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作製し、得られた変異体を完全長又は成熟天然タンパク質によって提示された活性について試験することにより決定される。
また、ＴＩＧＩＴポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＴＩＧＩＴポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＴＩＧＩＴ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、或いは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＴＩＧＩＴ断片の生成を含む。更に他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＴＩＧＩＴポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＴＩＧＩＴポリペプチドと少なくとも一の生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
ある実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換と題して表５に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表５に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類で更に記載するように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
表５
Figure 2021180663
ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
（２）中性の親水性：cys, ser, thr；
（３）酸性：asp, glu；
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg；
（５）鎖配向に影響する残基：gly, Pro；及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とする。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発といったこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)；Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して変異体ＤＮＡを作製することもできる。
また、隣接配列に沿って一つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。更に、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
Ｃ．ＴＩＧＩＴの修飾
ＴＩＧＩＴポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つの型は、ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＴＩＧＩＴポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＴＩＧＩＴポリペプチドを、抗ＴＩＧＩＴ抗体の精製方法に用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面に架橋させるのに有用であり、またその逆も可である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸とのエステル、３，３’-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular ＴＩＧＩＴperties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＴＩＧＩＴポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列ＴＩＧＩＴに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＴＩＧＩＴに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加をここでは意味する。更に、この語句は、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含み、そこには、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化も含まれる。
ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ポリペプチド（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ポリペプチドアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸を翻訳するようにコドンを生成することによって変更されてもよい。
ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に公開されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、或いはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddi等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本明細書中で開示されるポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと対象のポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には対象のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような対象のポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって対象のポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。実施例は、ポリ−ヒスチジン（ポリ-ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ-ｈｉｓ-ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210(1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)］を含むがこれらに限定しない。
それに代わる実施態様では、キメラ分子は免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも一つの可変領域に換えてポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。一実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照のこと。
Ｄ．ポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、対象のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりポリペプチドを製造する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、ポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスターシティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長ポリペプチドを生産してもよい。
１．ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
対象のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトのポリペプチドをコードするＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子或いはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（ポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等）によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化或いは酵素標識の使用が含まれる。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等,に示されている。
このようなライブラリスクリーニング法において同定された配列は、Genbank等,の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は完全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等,に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したポリペプチド製造のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編（IRL Press, 1991）及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等,に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のＷＯ89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、未処理の細胞、又はポリブレン、ポリオルニチン等のポリカチオンを用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニング或いは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型tonA prt3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (algF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。或いは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces Prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290:140 [1981]；1985年5月2日発行のEP139,383）；クルベロミセス宿主(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号；Fleer等, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)）、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574；Louvencourt等, J. Bacteriol.154(2):737-742 [1983]）、クルベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ １２，４２４）、クルベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ １６，０４５）、クルベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ ２４,１７８）、クルベロミセスワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ ５６，５００）、クルベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ ３６，９０６；Van den Berg等, Bio/Technology, 8:135 (1990)）、クルベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP402,226）；ピチア・パストリス(Pichia pastoris)（EP183,070；Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28:265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデル・マレーシア(Trichoderma reesia)（EP244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（1990年10月31日発行のEP394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO91/00357）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Balance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]；Tilburn等, Gene, 26:205-221 [1983]；Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 [1984]）、及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
グリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ（CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞 （Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；及びマウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、一つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一つ又は複数を含む適当なベクターの作製には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列或いは成熟タンパク質或いはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ或いは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５０１０１８２号に記載されている）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一或いは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
発現及びクローニングベクターは、共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート或いはテトラサイクリンのような抗生物質或いは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素、例えば桿菌のＤ-アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲ或いはチミジンキナーゼのようにポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分の同定を可能にするものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているように調製され増殖された、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ細胞株である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282:39 (1979)；Kingsman等, Gene, 7:141 (1979)；Tschemper等, Gene, 10:157 (1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６或いはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ポリペプチドコード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(Ｓ．Ｄ．)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17:4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターはEP73,657に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＴＩＧＩＴ転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２２１１５０４）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また、真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養での対象のポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979)；EP117,060；及びEP117,058に記載されている。
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。或いは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
或いは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はポリペプチドをコードするＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
５．ポリペプチドの精製
対象のポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン-Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる製造方法及び特に製造される特定のポリペプチドの性質に依存する。
Ｅ．組織分布
本発明のポリペプチドを発現する組織の位置は、種々のヒト組織でのｍＲＮＡ発現の測定により確認できる。そのような遺伝子の位置は、ポリペプチドの活性の刺激及び阻害によって最も影響を受けやすい組織に関する情報を提供する。また、特定の組織中の遺伝子の位置は、下記において論じる活性遮断／活性化アッセイのための試料組織を提供する。
上記したように、種々の組織における遺伝子増幅又は遺伝子発現は、ｍＲＮＡの転写の定量化のための従来のサザンブロット、ノーザンブロット（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]）、ドットブロット（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、ここに提供する配列に基づき、適切な標識プローブを用いて測定できる。或いは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識する抗体を用いてもよい。
或いは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片及び細胞培地又は体液の免疫組織学的染色などの免疫的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。都合良く、抗体は、ポリペプチドの天然配列に対して、又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、或いはポリペプチドをコードし、特異的抗体エピトープをコードするＤＮＡと融合した外来配列に対して調製してもよい。下記に、抗体を生成するための一般的な技術、並びにノーザンブロット及びインサイツハイブリダイゼーションのプロトコールを提供する。
Ｆ．抗体結合の研究
本発明のポリペプチドの活性は、組織細胞に対するポリペプチドの効果を阻害する抗ポリペプチド抗体の能力が試験される抗体結合の研究によって更に確認できる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロコンジュゲート抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。例としてZola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)を参照。
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。試験試料中の（腫瘍細胞で増幅された遺伝子にコードされる）標的タンパク質の量は、抗体に結合し始める標準物の量に逆比例する。結合し始める標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に固定化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
サンドウィッチアッセイは二つの抗体の使用を含み、各々が検出すべきタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第一の抗体に結合し、その後第二の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３成分複合体が形成される。例えば米国特許第４３７６１１０号参照。第二の抗体は検出可能部分で標識され（直接サンドウィッチアッセイ）、或いは検出可能部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。
免疫組織学のためには、腫瘍試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
Ｇ．細胞ベースアッセイ
細胞ベースアッセイ及び乾癬等の免疫関連疾患の動物モデルを、ここで同定された遺伝子とポリペプチド、並びに乾癬の発達と病原性との関係を更に理解するのに用いることができる。
異なる方法では、免疫関連疾患に関与することが知られている或る細胞型の細胞へここに記載されたｃＤＮＡを形質移入し、これらのｃＤＮＡの免疫関連疾患を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞は所望の遺伝子で形質移入し、そしてそのような機能活性をモニターすることができる。このような形質移入された細胞株は、乾癬を阻害又は刺激するポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するのに用いることができる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、更に、免疫関連疾患の治療の候補薬の同定に用いることができる。
更には、当分野では安定な細胞株がより一般的に用いられるが、トランスジェニック動物から誘導された一次培地を（下記のような）、ここでの細胞ベースアッセイに使用することができる。トランスジェニック動物から連続細胞株を誘導する技術は、この分野で良く知られている（Small等, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]参照）。
一つの適切な細胞ベースアッセイは、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)である。Current Protocols in Immunology, unit3.12；J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Inc。このアッセイでは、活性Ｔ細胞の増殖を刺激又は阻害する試験化合物の能力が評価される。レスポンダーＴ細胞の懸濁液を同種刺激細胞と培養し、Ｔ細胞の増殖をトリチウム化チミジンの取り込みによって測定する。このアッセイは、Ｔ細胞反応性の一般的な測定法である。活性化によって、Ｔ細胞の大多数がＩＬ-２へ応答し、ＩＬ-２を生産することから、このアッセイでの応答性の相違の一部は、応答細胞によるＩＬ-２生産の違いを反映する。ＭＬＲの結果は、標準的なリンフォカイン（ＩＬ-２）検出アッセイによって確かめられる。Current Protocols in Immunology, 上掲, ３．１５，６．３。
ＭＬＲアッセイにおける増殖性のＴ細胞応答は、アッセイされた分子の直接的な分裂促進特性又は外来性の抗原誘導活性化に起因する。また、共刺激アッセイによりポリペプチドのＴ細胞刺激活性が検証されうる。Ｔ細胞活性化には、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を通して媒介される抗原特異性シグナルと二番目のリガンド結合による相互作用を通して媒介される同時刺激シグナル、例えばＢ７（ＣＤ８０，ＣＤ８６）／ＣＤ２８結合相互作用が必要される。ＣＤ２８架橋は、活性化Ｔ細胞によるリンフォカインの分泌を増加させる。Ｔ細胞活性化は、ネガティブ又はポジティブ効果のあるリガンド結合を通して、ネガティブ及びポジティブコントロールの両方を有する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ-４はＢ７と結合するＩｇスーパーファミリーの関連する糖タンパク質である。Ｂ７へのＣＤ２８の結合には、Ｔ細胞活性化のポジティブ同時刺激効果がある；逆を言えば、Ｂ７へのＣＴＬＡ-４の結合には、Ｔ細胞非活性化効果がある。Chambers, C.A.及びAllison, J.P., Curr. Opin. Immunol.(1997) 9:396；Schwartz, R.H., Cell(1992) 71: 1０65；Linsey, P.S.及びLedbetter, J.A., Annu. Rev. Immunol.(1993) 11:191；June, C.H.ら., Immunol. Today(1994) 15:321；Jenkins, M.K., Immunity(1994) 1:4０5。同時刺激アッセイでは、Ｔ細胞同時刺激性又は阻害活性についてポリペプチドをアッセイする。
本発明におけるような刺激化合物の直接的用途は、初期Ｔ細胞上に発現するリガンド（４-１ＢＢＬ）と結合し、Ｔ細胞活性化と成長の信号を伝達する、腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーである４-１ＢＢ糖タンパク質をともなう実験において確かめられている。Alderson, M.E.ら., J. Immunol. (1994) 24:2219。
アゴニスト刺激性化合物の用途も実験的に確かめられている。一例として、アゴニスト抗-４-１ＢＢ抗体による治療での４-１ＢＢの活性化は、腫瘍の根絶を促進する。Hellstrom, I.及びHellstrom, K.E., Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1。下記により詳しく記載されている免疫吸着剤療法による腫瘍の治療は、本発明の刺激性化合物の用途のもう一つの例である。
あるいは、免疫刺激又は増強効果は、また、血管透過性を高める特性を有するポリペプチドの投与によって達成することができる。高まった血管透過性は、免疫細胞（例えば、単球、好酸球、ＰＭＮ）の局所的な浸潤によって和らげることが可能な疾患に対して有益である。
一方では、Ｔ細胞増殖／活性化、炎症誘発性サイトカイン分泌、及び／又は血管透過性の直接的阻害剤である本発明の他の化合物と同様にＴＩＧＩＴポリペプチドは、免疫応答を抑制へ直接に用いることができる。これらの化合物は、免疫応答の程度を減じること、並びに異常に活発な、並外れに最適な、又は自己免疫性の応答によって特徴付けられる免疫関連疾患を治療するのに有用である。本発明のこの化合物の用途は、レセプターＢ７へのＣＴＬＡ-４の結合がＴ細胞を不活性化させる上記に記載の実験によって確認されている。本発明の直接的阻害性化合物は、類似の方法で機能する。血管透過性を抑制する化合物の用途は、炎症を減じることが期待できる。そのような用途は、過度の炎症に関連する症状を治療するのに有益である。
同様に、例えば、本発明のＴＩＧＩＴ阻害性ポリペプチドと結合し、ＴＩＧＩＴ阻害性ポリペプチドの効果を遮断する抗体は、正味の阻害性効果を生成し、Ｔ細胞増殖／活性化及び／又はリンフォカイン分泌を阻害するためにＴＩＧＩＴを遊離することによってＴ細胞性免疫応答を抑制することにも用いることができる。このポリペプチドの阻害性効果を遮断することにより、哺乳動物の免疫応答が抑制される。
あるいは、不十分なＴ細胞媒介免疫応答および／または炎症と関係している状態のために、ＴＩＧＩＴの活性および／または発現を阻害することまたは少なくすること、またはＰＶＲに結合しておよび／またはＰＶＲによりシグナルを送るＴＩＧＩＴの能力に干渉することは、治療に有益である。このような阻害又は少なくすることは、ＴＩＧＩＴの発現および／または活性のアンタゴニストおよび／またはＰＶＲの発現および／または活性のアンタゴニストの投与によって提供されうる。
Ｈ．動物モデル
更に、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデル及びＴ細胞機能のアッセイにより証明することができる。免疫関連疾患の進行及び病因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アンタゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、ヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作製される。
移植片対宿主病は、免疫適格細胞が免疫抑制され又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は宿主抗原を認識しそれに反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主病モデルはＭＨＣ抗原及び少量の移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上記のCurrent protocols in Immunology, unit4.3.に詳細に記載されている。
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、Ｔ細胞がインビボで組織の破壊を媒介する能力を試験する手段であり、移植拒絶におけるそれらの役割の指標である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾の皮膚の移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞及びキラー-エフェクターＴ細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが分かった。Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W.E.Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992。適切な手順は上掲のCurrent protocols in Immunology, unit4.4.に詳細に記載されている。本発明の化合物の試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Tanabe, M.等, Transplantation (1994) 58:23及びTinubu, S.A.等, J. Immunol. (1994) 4330-4338により記載されている同種心臓移植片モデルである。
遅延型過敏症の動物モデルは、同様に細胞媒介免疫機能のアッセイ法を提供する。詳細な型の過敏症反応は、抗原負荷後時間が経過するまでピークに達しない炎症を特徴とするＴ細胞媒介免疫反応である。これらの反応はまた、組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）及び実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ、ＭＳのモデル）を起こす。好適な手法は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 4.5に詳細に記載されている。
ＥＡＥは、Ｔ細胞及び単核球炎症、及びその結果生じた中枢神経系の軸索の脱髄によって特徴付けられるＴ細胞性自己免疫疾患である。ＥＡＥは、一般的には、ヒトのＭＳの関連する動物モデルであると考えられる。Bolton, C., Multiple Sclerosis(1995) 1: 143。急性及び再発性軽減モデルの両方が開発されている。Current Protocols in Immunology, unit 15.1及び15.2に記載のプロトコールを用いて、本発明の化合物は、免疫性脱髄疾患に対するＴ細胞刺激性又は阻害性活性について試験することができる。Duncan, I.D.ら, Molec. Med. Today(1997) 554-561に記載されている、オリゴデンドログリア又はシュワン細胞が中枢神経系へ移植されるミエリン疾患のモデルも参照のこと。
接触性過敏症は、細胞媒介免疫機能の単純な遅発型過敏インビボアッセイである。この手順において、遅発型過敏反応を生じさせる外因性ハプテンに皮膚を暴露し、反応を測定して定量する。接触過敏症は最初の感作段階に顕在化段階が続く。顕在化段階はＴリンパ球が過去に接触したことのある抗原に遭遇したときに生じる。腫れと炎症が生じ、ヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルが作製される。適切な手順は、Current protocols in Immunology, J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, 及びW.Strober編, John Wiley & Sons, Inc, unit4.2に詳細に記載されている。また、Grabbe, S.及びSchwarz, T. Immun. Today 19(1):37-44(1998)も参照のこと。
関節炎の動物モデルはコラーゲン誘発関節炎である。このモデルは、ヒトの自己免疫性慢性関節リウマチと臨床的、組織学的及び免疫学的特徴を共有し、ヒトの自己免疫性関節炎の許容されるモデルである。マウス及びラットモデルは、滑膜炎、軟骨及び肋軟骨下骨の浸食を特徴とする。本発明の化合物は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 15.5に記載されているプロトコールを用いて、自己免疫性関節炎に対する活性について試験できる。また、Issekutz, A.C.ら, Immunology 88: 569 (1996)に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ-４インテグリンに対するモノクローナル抗体を用いたモデルも参照のこと。
コラーゲン誘導関節炎(ＣＩＡ)モデルは、ヒト関節リウマチ(ＲＡ)に対する多くの免疫学的及び病理学的な類似性、局所的腫瘍組織適合性の関与、完全クラスＩＩ限局性Ｔヘルパーリンパ球活性化及び組織病変の類似性があるので、ヒト関節炎における候補薬剤又は生物活性を研究するための好適なモデルであるとされている。ＲＡ患者に見られる特徴と類似するこのＣＩＡモデルの特徴には、関節領域の軟骨及び骨の浸食(Ｘ線像に見られる)、増殖性滑膜炎、軸や骨格ではなく付属器官(四肢)の小及び中型の末梢関節の対称的な併発が含まれる。Jamieson et al., Invest.Radiol. 20: 324-9 (1985)。さらに、ＩＬ-１およびＴＮ-αはＲＡのようにＣＩＡにおいて関連しているようである。Joosten et al., J. Immunol. 163: 5049-5055 (1999)。ＴＮＦ-中和抗体及びＴＮＦＲ：ＦｃはそれぞれこのモデルのＲＡの症状を低減した(Williams et al., PNAS, 89:9784-9788 (1992)；Wooley et al., J. Immunol.151: 6602-6607 (1993))。
ＲＡのこのモデルにおいて、タイプＩＩコラーゲンは、ウシ関節軟骨から精製され(Miller, Biochemistry 11:4903 (1972))、免疫マウスに用いられる(Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2762 (1994))。関節炎の症状には、組織学によって決定されるように、四肢の紅斑および／または腫脹並びに軟骨及び骨の浸食又は欠損が含まれる。この広く用いられるモデルは、例としてHolmdahl et al., APMIS 97:575 (1989)、そして、Current Protocols in Immunology, supra, units 15.5、そして、Issekutz et al., Immunology, 88:569 (1996)、並びに本明細書中の以降の実施例にも記載される。
喘息のモデルは記載され、そこでは抗原誘発気道過剰反応性、肺性好酸球増加症及び炎症が、動物をオボアルブミンで感作し、次いで動物にエアロゾルで運ばれる同じタンパク質を負荷することにより誘発される。幾つかの動物モデル（モルモット、ラット、非ヒト霊長類）は、エアロゾル抗原で負荷した際にヒトのアトピー性喘息に似た徴候を示す。マウスモデルは、ヒト喘息の多くの特徴を持つ。本発明の化合物の喘息治療における活性及び有効性を試験するための好適な方法は、Wolyniec, W.W.ら, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 18: 777(1998) 及びその引用文献に記載されている。
更に、本発明の化合物は乾癬様疾患の動物モデルにおいて試験することができる。ある証拠によりＴ細胞が乾癬の病原であることが示唆されている。本発明の化合物は、Schon. M.P.等, Nat. Med. (1997) 3:183により記載されているscid／scidマウスモデルにおいて試験することができ、そのモデルではマウスは乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示す。他の適切なモデルはNickoloff, B.J.等, Am. J. Path. (1995) 146:580に記載されているようにして調製されたヒトskin／scidマウスキメラである。
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作製のための標準的技術を用いて、対象とする動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、全核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性肝細胞での遺伝子標的化（Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；精子媒介遺伝子転移（Lavitrano等, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説としては、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えばLasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて分析できる。
例えば免疫細胞の特定の細胞への浸潤を確定するための組織学的検査によって、免疫疾患病理の兆候に関してこの動物を更に調べてもよい。本発明の化合物によるＴ細胞増殖の刺激又は阻害の程度を確定するために、この化合物で処理したトランスジェニック動物で遮断実験をも行うことができる。これらの実験では、上記に記載のようにして調製した本発明のポリペプチドと結合する遮断抗体が動物へ投与され、そして免疫機能への影響が測定される。
或いは、「ノックアウト」動物は、ここで同定されたポリペプチドをコードする内在性の遺伝子と、動物の胚性細胞へ導入されたそのポリペプチドをコードする改変ゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、ここで同定されたポリペプチドをコードする欠陥又は改変遺伝子を有するものとして構築することができる。例えば、ある特定ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立されている技術によって、そのポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに利用できる。ある特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部は、その他の遺伝子、例えば組み込みをモニターするために利用できる選択可能なマーカーをコードする遺伝子によって置き換え又は除去できる。概して、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ（５'と３'末端の両方）を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503 (1987)を参照のこと］。ベクターを胚性幹細胞へ（例えば電気穿孔法等によって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば腫瘍の発達を含む、ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けられる。
Ｉ．免疫アジュバント治療
一実施態様では、本発明の免疫刺激化合物は腫瘍（癌）治療における免疫アジュバント治療に使用することができる。Ｔ細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することは十分に確立されている。遺伝子のＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーによりコードされる腫瘍抗原の一グループは全ての成人の正常組織においてサイレントであるが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、膀胱癌においては有意の量で発現している。DeSmet. C.等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci.93:7149。Ｔ細胞の共刺激により、インビトロ及びインビボの双方において、腫瘍の退行及び抗腫瘍反応が誘発されることが示されている。Melero. I.等, Nature Medicine (1997) 3:682；Kwon. E.D.等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1997) 94:8099；Lynch. D.H.等, Nature Medicine (1997) 3:625；Finn. O.J.及びLotze. M.T., J. Immunol. (1998) 21:114。本明細書中で示すデータは、ＴＩＧＩＴ発現が乳癌腫瘍の免疫細胞浸潤と相関していることを示す。また、ＴＩＧＩＴは本明細書中で、ＤＣ及び他の免疫細胞の増殖を阻害すること、そしてこれら細胞からの炎症誘発性サイトカイン産生を阻害することが示される。よって、腫瘍でのＴ細胞活性の減少は望ましくないので、腫瘍免疫浸潤細胞におけるＴＩＧＩＴの発現は異常でありうる。ＴＩＧＩＴアンタゴニスト及び／又はＴＩＧＩＴ−ＰＶＲシグナル相互作用のアンタゴニスト（すなわちＰＶＲアンタゴニスト）はアジュバントとして単独で又は成長調節剤、細胞障害性薬又は化学療法剤と共に投与することができ、Ｔ細胞増殖／活性化及び腫瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激する。成長調節剤、細胞障害性薬又は化学療法剤は既知の投与方法で使用されている従来からの量で投与することができる。本発明のＴＩＧＩＴアンタゴニスト性及びＴＩＧＩＴ活性アンタゴニスト性の化合物による免疫刺激活性により、成長調節剤、細胞障害性薬又は化学療法剤の量を減らすことができ、よって、潜在的に患者に対する毒性を低下させることができる。
Ｊ．候補薬ためのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によってコードされているポリペプチド、或いはその生物活性断片と結合又は複合化する化合物、或いはそうでなければコードされているポリペプチドと他の細胞性タンパク質の相互作用を妨害する化合物を同定するように設計されている。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含み、特に、小分子候補薬の同定に適している。考えられる小分子には、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド-免疫グロブリン融合物を含む合成有機又は無機化合物を含み、そして特に限定することなく、ヒト抗体及び抗体断片と並んで、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びそのような抗体又は断片のキメラ又はヒト化異形を含む抗体を含む。このアッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。すべてのアッセイは、候補薬とここで同定された核酸によってコードされているポリペプチドの相互作用を可能にする条件下及び十分な時間に渡って、これら二つの分子を接触させることを必要とするという点で共通である。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、或いは反応混合物中で検出することができる。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。或いは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
候補化合物が相互作用するが特定のタンパク質に結合しない場合、そのレセプターとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。更に、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989)；Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているようにモニターすることができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、二つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「ツーハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、二つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。ツーハイブリッド技術を用いた二つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定された遺伝子の相互作用を妨害する化合物と、試験が可能な他の細胞内又は細胞外成分を見出すために、二つの産物の相互作用と結合を可能にする条件と時間の下で、遺伝子の生産物、並びに細胞内又は細胞外成分を含有するように、反応混合物は、通常は調製される。試験化合物の結合を阻害する能力を試験するためには、反応を試験化合物が存在する場合と存在しない場合で実施する。更に、第三の反応混合物へプラシーボを添加してポジティブコントロールとしてもよい。コントロール反応において複合体の形成があり、試験化合物を含有しない反応混合物では複合体の形成がないことは、試験化合物が、試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
Ｋ．免疫関連疾患の治療のための組成物及び方法
免疫関連疾患の治療に有用な組成物は、限定されないが、タンパク質、抗体、小有機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子などを含み、免疫機能、例えばＴ細胞増殖／活性化、リンホカイン放出、又は免疫細胞の浸潤を阻害する。
例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を防止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止する。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4:469-471 (1994)及びＰＣＴ公報番号ＷＯ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。更なる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９７／３３５５１, 上掲を参照。
これらの分子は上記のスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組み合わせにより、又は当業者に知られた他のスクリーニング技術により同定できる。
Ｌ．抗ＴＩＧＩＴ抗体
本発明は、更に抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。当業者は、本発明が他のポリペプチドに対する抗体（すなわち、抗ＰＶＲ抗体）を提供すること、そして、抗ＴＩＧＩＴ抗体の製造、産生、種類、使用の方法又は他の態様についての本明細書中の具体的な記載は他のＴＩＧＩＴ以外のポリペプチドに特異的な抗体にも適用されうることを理解するであろう。
１．ポリクローナル抗体
抗ＴＩＧＩＴ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫剤は、ＴＩＧＩＴポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
２．モノクローナル抗体
或いは、抗ＴＩＧＩＴ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするＴＩＧＩＴポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化細胞株は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。或いは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、或いは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、或いは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。或いは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製には、同じくインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成が可能である。
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、更にヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖或いはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２或いは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全て或いはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て或いはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、原型のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:381 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作製することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77 (1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
また、抗体は、上記に記載のような既知の選択及び／又は突然変異誘発法を利用して親和的に成熟している。好ましい親和性成熟抗体は、５倍、より好ましくは１０倍、更により好ましくは２０又は３０倍も成熟抗体の調製の元である出発抗体（一般的には、マウス、ヒト化又はヒト）より高い親和性を有する。
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合においては、結合特異性の一方はＴＩＧＩＴに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際公開９３／０８８２９、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性（抗体-抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作製するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
国際公開９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第二の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は原型の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’-チオールに再転換し、他のＦａｂ’-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ’フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作製し分離する様々な方法が記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。非限定的な例として、三重特異性抗体を調製することができる。例としてTutt等, J.Immunol. 147:60 (1991)を参照。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＴＩＧＩＴポリペプチドの二つの異なるエピトープに結合しうる。或いは、抗ＴＩＧＩＴポリペプチドのアームは、特定のＴＩＧＩＴポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲII（ＣＤ３２）及びＦｃγＲIII（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＴＩＧＩＴポリペプチドを発現する細胞に細胞障害性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＴＩＧＩＴ結合アーム及び細胞障害性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。興味の対象となる他の二重特異性抗体はＴＩＧＩＴポリペプチドを結合し、そして更に組織因子（ＴＦ）に結合する。
５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、二つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開９１／００３６０；国際公開９２／２００３７３；欧州特許０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作製することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。或いは、抗体は、二つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
７．イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素ないしその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞障害性剤にコンジュゲートした抗体を含む、免疫コンジュゲートに関連する。
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素ないしその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの一又は複数の細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む、免疫コンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)を提供する。
免疫コンジュゲートは、細胞障害性剤、すなわち癌治療における細胞を殺す又は増殖ないし成長を阻害するための薬剤の局部運搬に有用である(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549；Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146；Payne, G. (2003) i 3:207-212；Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26: 151-172；米国特許第４９７５２７８号)。イムノコンジュゲートは、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬剤の全身投与により除去しようとする腫瘍細胞だけでなく正常細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等, (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性作用を及ぼす。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等, (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第４９７０１９８号；同第５０７９２３３号；同第５５８５０８９号；同第５６０６０４０号；同第５６９３７６２号；同第５７３９１１６号；同第５７６７２８５号；同第５７７３００１号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃及びその他の癌の治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは抗体と化学療法剤又は他の毒素を含む。免疫複合体(イムノコンジュゲート)の生成に有用な化学治療薬を本明細書中(例えば、上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として１９９３年１０月２８日に公開の国際公開公報９３／２１２３２を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
ａ．メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している抗体(完全長又は断片)を含んでなる。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号(この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び２００４年１０月８日に出願の米国特許出願番号１０／９６０６０２(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、２００４年１０月８日に出願の米国特許出願番号１０／９６０６０２に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
ｂ．アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号)にコンジュゲートした抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第５６６３１４９号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報０２／０８８１７２)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、２００４年１１月５日に出願の米国特許出願番号１０／９８３３４０、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願のUS Ser. No. 10/983,340も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)。
ｃ．カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ １(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
ｄ．他の細胞障害剤
抗体にコンジュゲート可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、及びスルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
ｅ．抗体薬剤コンジュゲートの調製
抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)を、リンカー(Ｌ)を介して、一つ以上の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：(1) 共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ＡＤＣを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ Ｉ
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願した米国出願番号１０／９８３３４０を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリシン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：(i) 活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体(又は、その断片)に導入されてもよい。
また、抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第５３６２８５２号)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：(i) 活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物)；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び第４５４４５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst., 81(19) 1484 (1989)参照。
Ｍ．製薬組成物
本発明の活性な分子（例えば、ＴＩＧＩＴポリペプチド、抗ＴＩＧＩＴ抗体、これらの変異体、ＴＩＧＩＴアゴニスト、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、ＰＶＲアゴニスト及びＰＶＲアンタゴニスト）並びに上記に開示されるスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、薬学的組成物の形態で、免疫関連疾患の治療のために投与されうる。
活性な分子、例えば本発明のポリペプチド又は抗体の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性分子を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）又はトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）ＴＭ、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）ＴＭ、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書中で開示されるスクリーニングアッセイで同定される化合物は、同様の方式で、この分野で知られた標準技術を用いて製剤される。
リポフェクション又はリポソームもまた、活性分子を細胞に運搬するために用いられうる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる（例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 [1993]）。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的仮性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は増殖阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
活性分子の徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
Ｎ．治療方法
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性物質は、組織への炎症細胞の浸潤、Ｔ細胞の増殖の刺激、Ｔ細胞の増殖の阻害、サイトカイン産生の増加又は減少、及び／又は血管透過性の増加又は低減又はその阻害によって特徴付けられるものを含む、Ｔ細胞媒介疾患等の種々の免疫関連疾患及び病状を治療するために使用できると考えられる。本明細書中でＴ細胞増殖及びサイトカイン産生の調節におけるＴＩＧＩＴの役割が示されたので、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の調節はこれら疾患の予防及び／又は治療に有用でありうる。
本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物で治療される病状又は疾患の例には、限定するものではないが、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節症、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、多発性硬化症、特発性脱随性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害などの中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、感染性肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性ウイルス)、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎などの肝胆道疾患、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎；クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹などのアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎などの肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
全身性紅斑性狼瘡では、疾患の中心的な媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産生と、続いての免疫媒介炎症の発生である。抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。Ｔリンパ球は組織損傷に直接的には関与していることは示されていないが、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発育に必要である。よって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的に冒される。
リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に付随し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体を生成する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば、関節空間／液でもしかりである。冒されている組織は、多くの場合対称的なパターンで、主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患もまた生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発生である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官において血管炎が付随する。多くの場合、患者には、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６歳未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子が陽性である患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は３つの主要なカテゴリー：小関節(pauarticular)、多関節及び全身性に細分類される。関節炎は重度で典型的には破壊的であり、関節強直症及び遅延成長に至る。他の徴候には慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
脊椎関節症は、いくつかの共通した臨床的特徴とＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現との共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には：Bechterew氏病（ankylosingsponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。顕著な特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；炎症非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７(クラスＩＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある血清学的に定義された対立遺伝子)との関連；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関わっている細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球で、クラスＩＭＨＣ分子により提示される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７に対して反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞の反応を誘発すると仮定されている。本明細書中で示されるように、ＴＩＧＩＴはＣＤ８＋Ｔ細胞で発現され、この細胞でのＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の調節はこの疾患の症状を調節し、及び／又は予防しうる。
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり；これは活性な炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身性であり：血管病巣が共通しており、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準は、皮膚病巣における単核細胞浸潤の存在と、多くの患者において抗細胞核抗体の存在によって導かれる。多くの場合、ＩＣＡＭ-１が皮膚病巣の線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションされ、これらの細胞とのＴ細胞の相互作用が疾患の病因においてある役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：結果的に異常なぜん動／運動性となる平滑筋萎縮症及び線維症：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対照的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症と、涙腺及び唾液腺の続く機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患に関連するか又はそれに伴なう場合がある。この疾患は、双方とも小さいＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体産生に関連している。病巣は乾性角結膜炎、口内乾燥症で、胆汁性硬変、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病を含む他の徴候又は関連を伴うものに至る。
全身性血管炎症は一次病巣が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として冒された脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、いくつかのケースでは最終的な末端器官機能障害になるといった疾患である。また、血管炎(vasculitides)は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の生成に関連した疾患等の続発症として又は二次病変として生じる場合がある。原発性全身性血管炎症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritisnodosa)、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。その他の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、隔離されたＣＮＳ血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の発病メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど全ての組織中における類上皮細胞肉芽腫の存在により特徴づけられる病因がよく知られていない病状であり；肺の関与が最も一般的である。病因は疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞型より放出される局部的又は全身的活性産物の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、及び発作性夜間血色素尿を含む自己免疫溶性血性貧血は、赤血球(いくつかの場合においては血小板もまた含む他の血液細胞)表面で発現した抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的環境における血小板減少性紫斑病及び免疫媒介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、血小板破壊／除去が、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムにより除去される結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に存在し多くの場合甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。自然のモデル：ラット(ＢＵＦ及びＢＢラット)及びチキン(肥満チキン種)；誘導性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)のいずれかでの動物の免疫化を含む実験用モデルが存在する。
１型真性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は膵臓ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン-非反応性の表現型をつくりだすことができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫媒介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産生される結果として直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応性である、腎臓中の抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果として間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の生成をもたらす他の免疫媒介疾患により、間接的続発症として免疫媒介腎疾患も誘発しうる。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として、器官機能が損なわれ、いくつかの場合では腎臓機能不全に進行する、病巣発達を腎組織に生じさせ／誘発する炎症反応が生じる。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が障害の発病に関与しうる。
多発性硬化症；特発性脱随性多発神経障害又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱随性多発神経障害を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患は、自己免疫に原因を有し、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に引き起こされる損傷の結果として神経脱髄が生じると考えられている。ＭＳにおいては、疾患の誘発及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病巣は優勢なＴ細胞媒介小膠細胞の湿潤と、浸潤しているマイクロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣における優勢な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死と続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球により推進されていると思われる。
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。その反応の阻害は治療的に有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はＴリンパ球依存性である。
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患はTリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(ＧＶＨＤ)を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及びヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(ＭＬＲを刺激する分子(又は誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)を含む感染疾患、ＭＬＲを刺激し、治療に利用し、遺伝子し、獲得し、感染誘発された(例えばＨＩＶ感染)状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることが可能な免疫欠損疾患（分子／誘導体／アゴニスト)又は医原性(即ち、化学療法からのもの)免疫欠損、及び異常増殖である。
ヒト癌患者の中には、異常増殖細胞上の抗原に反応する抗体及び／又はＴリンパ球を発生させるものもいることが証明されている。また、異常増殖のある動物モデルにおいても、免疫反応を増強することで、特定の異常増殖が拒絶又は退行する結果になることも示されている。ＭＬＲにおけるＴリンパ球反応を増強する分子は、異常増殖に対する免疫反応を増強するインビボでの利用性を有している。ＭＬＲにおけるＴリンパ球増殖反応を増強する分子(又は拮抗的に同じレセプターに影響を及ぼした小分子アゴニスト又は抗体)は、癌の治療に治療的に使用することができる。また、ＭＬＲにおいてリンパ球反応を阻害する分子(すなわちＴＩＧＩＴ)は、異常増殖中に、新生物に対する免疫反応を抑制するように、インビボで機能し；このような分子は新生物細胞自体により発現されうるか、又はその発現は他の細胞中の新生物により誘発されうる。このような阻害分子(抗体、小分子アンタゴニスト又は他の手段による)の拮抗作用により免疫媒介腫瘍拒絶が増強される。
さらに、炎症誘発性特性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害；脳卒中；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化；急性肺傷害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血症ショック；急性尿細管壊死；子宮内膜症；変性関節疾患及び膵炎(pancreatis)の治療に有益である。
本発明の化合物、例えばポリペプチド、小分子又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入(鼻孔内、肺内)経路などにより投与される。ポリペプチド及び抗体の静脈内、皮下又は吸入投与が最も一般的に用いられる。
免疫アジュバント治療において、抗癌剤の投与などの他の投薬計画は、本発明のタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わされてもよい。例えば、本発明の免疫アジュバントで治療される患者は、抗癌剤(化学療法剤)又は放射線治療を受けてもよい。このような化学療法剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapyServiceEd.M.C.Perry編,Williams&Wilkins,Baltimore,MD(1992)にも記載されている。化学療法剤は、免疫アジュバントの投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。加えて、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン(欧州特許６１６８１２号参照)を、それらの分子について知られた用量で付与してもよい。
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、限定するものではないが例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。例えば、一実施態様では、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、増殖阻害剤と同時投与される。例えば、まず増殖阻害剤を投与し、続いてＴＩＧＩＴポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。増殖阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、増殖阻害剤と例えばＴＩＧＩＴポリペプチドとの組み合わせ(相乗)効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与されうる。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ(例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のポリペプチド又は抗体が、例えば、一又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
Ｏ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質(例えばＴＩＧＩＴ分子、ＴＩＧＩＴアゴニスト、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、ＰＶＲアゴニスト又はＰＶＲアンタゴニストを含有するもの)を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド又は抗体である。容器上又は添付される使用説明書又はラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
Ｐ．免疫関連疾患の診断及び予知
ある種の免疫関連疾患で過剰発現されるタンパク質等の細胞表面タンパク質(すなわちＴＩＧＩＴ)は候補薬剤又は疾患治療の優れた調節標的である。同じタンパク質は免疫関連疾患で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに、これらの疾患の診断及び予知における付加的な用途が見出される。例えば、関節リウマチ又は他の免疫関連疾患において増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は診断又は予知として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅又は過剰発現された遺伝子にコードされるタンパク質(「マーカー遺伝子産物」)の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によってモニターできる。これらの技術は、過剰発現した遺伝子が細胞表面タンパク質をコードする場合に特に適切である。このような結合アッセイは、本質的に上述したように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を重層することにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。また当分野では、例えば蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)といった他の技術も周知である。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
実施例１：ＴＩＧＩＴの他の特徴
ＴＩＧＩＴは、細胞外Ｉｇドメイン、タイプ１膜貫通領域及び細胞内免疫レセプターチロシンベースの活性化又は阻害(ＩＴＡＭ／ＩＴＩＭ)モチーフ(一又は複数)からなるドメイン構造を有する、免疫細胞によって特異的に発現される遺伝子をターゲットとしたゲノム大規模検索戦略において既に同定された(例えば、出典明記によってその全体が本明細書中に援用される米国公開特許ＵＳ２００４０１２１３７０を参照)(Abbas, A.R. et al. Genes Immun 6, 319-31 (2005)；Burshtyn, D.N. et al., J Biol Chem 272, 13066-72 (1997)；Kashiwada, M. et al., J Immunol 167, 6382-7 (2001))。ヒトのＴＩＧＩＴの配列およびマウス(Ｇｅｎｂａｎｋに提出されたもの)、アカゲザル(Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１１０７６９８)およびイヌ(Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿５４５１０８)のホモログを図１に示す。免疫機能におけるＴＩＧＩＴの役割を更に説明するために、ＴＩＧＩＴ Ｉｇドメインが、ポリオウイルスレセプター(ＰＶＲ)タンパク質およびＰＶＲ様タンパク質１−４(ＰＶＲＬ１−４)のＮ末端ＩｇＶドメイン、並びにＣＤ９６及びＣＤ２２６のＮ末端ＩｇＶドメインに類似していることを示すホモロジー検索を行った(図２Ａ-２Ｂを参照)。これらのタンパク質のアラインメントにより、標準的なＩｇＶドメインを定める高度に保存された残基がＴＩＧＩＴにおいて保存されることが示され、これら８つのタンパク質がＩｇファミリの関連したサブセットを含みうることが更に示唆された。保存されたＶフレームの残基は、Ｖフレームホールドを構築するために重要であることが示された(Wiesmann, C. & de Vos, A.M. Cell Mol Life Sci 58, 748-59 (2001))。３つのサブモチーフ(Ｖ／Ｉ５４−Ｓ／Ｔ５５−Ｑ５６)、(Ａ６７−Ｘ(６)−Ｇ７４)及び(Ｔ１１２−Ｆ／Ｙ１１３−Ｐ１１４−Ｘ−Ｇ１１６)を含む、４つの完全に保存された残基(Ａ６７、Ｇ７４、Ｐ１１４およびＧ１１６)および５つの保存された残基(Ｖ／Ｉ／Ｌ５４、Ｓ／Ｔ５５、Ｑ５６、Ｔ１１２およびＦ／Ｙ１１３)を含め、多くの残基がＶフレームホールド近くで８つのタンパク質間で保存されていたことが同定された。ＴＩＧＩＴの場合、これらのサブモチーフは、種間で保存されているようであり(図１を参照)、他の現在示されているＩｇＶドメイン含有のタンパク質には存在しない。これらの保存された残基は、ＰＶＲ、ＰＶＲ様タンパク質１−４、ＣＤ９６、ＣＤ２２６およびＴＩＧＩＴを含むＰＶＲ様タンパク質の種類を定めうる。
ＰＶＲＬ１−４およびＰＶＲは共通のドメイン構造(ＩｇＶ-ＩｇＣ-ＩｇＶ)を共有しているのに対して、ＣＤ２２６およびＣＤ９６は膜近位のＩｇＶドメインを欠いている。ＴＩＧＩＴは、単一のＩｇＶドメインからなる、最も効率的なファミリのメンバーである。これら８つのタンパク質の細胞内セグメントは、ＰＶＲＬ１−３間で共有されるａｆａｄｉｎ結合モチーフの外で、互いに限られた類似性を示す。ＮＥＣＬ-１の関連するＩｇＶドメインの結晶構造に基づいて(Dong, X. et al., J Biol Chem 281, 10610-7 (2006))、第一及び第３のモチーフは、それぞれＢとＣの間およびＦとＧβ-鎖の間のヘアピンループにあることが予測される。これら２つのループは、ＩｇＶホールドの一端で互いに隣接している。第二のモチーフは、ＮＥＣＬ−１のためのホモ二量体界面の一部を形成するのに関与するＣ'とＣ''β鎖を含む。ゆえに、ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲファミリにおいて観察される配列のモチーフは、ＰＶＲファミリメンバー間で観察される特定のホモおよびヘテロ型の相互作用において機能しうる。ＰＶＲはすでに、ｎｅｃｔｉｎ様タンパク質として特徴が示されていたが、上記の配列分析により、むしろＰＶＲはＰＶＲファミリメンバーと考えられうることが示唆され、あるネクチン(すなわちＰＶＲＬ１−４)はＰＶＲファミリから枝分かれしたものとして分類される。
実施例２：ＰＶＲリガンドの同定
固定されたＴＩＧＩＴを結合したタンパク質を探すために、分泌されたタンパク質の大きなライブラリをスクリーニングすることによってＴＩＧＩＴの結合パートナーとなりうる物質を同定した。簡単に言うと、ＴＩＧＩＴのＦｃ融合(ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ)は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域(ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ)の直前に、ベクター内へヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸１−１３８をクローニングすることによって構築した。また、標準的な部位特異的突然変異技術を用いてＤ２５６ＡおよびＮ２９７ＡのＴＩＧＩＴ-ＦｃのＦｃテールに２つの突然変異を導入することによって、ＦｃγＲ結合が破壊されているＴＩＧＩＴ-Ｆｃの代替バージョンを構築した(ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡ)。結果として生じる融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞で過渡的に発現させ、標準的な親和性クロマトグラフィ技術を用いて精製した。ヘキサヒスチジン又はＦｃタグに融合した個々の分泌タンパク質のライブラリを、Ｏｃｔｅｔシステム(ForteBio)を用いてＴＩＧＩＴ-Ｆｃへの結合についてスクリーニングした。タンパク質は、ＨＢＳ−Ｐ(１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４；０．１５Ｍ ＮａＣｌ；０．００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０)中での結合について試験した。ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ又はコントロールＦｃ融合タンパク質は、抗ヒトＦｃバイオセンサーに流し、飽和状態にした。バイオセンサーは、バッファにて洗浄し(３０秒)、５μｇ／ｍｌのタンパク質を含むウェルに３分間置き、再び３０秒間洗浄した。センサーをリロードし、それぞれ２回の結合サイクルの後に洗浄した。結合は、０．２ｎｍより大きい応答レベルの増加として示し、特異性は、コントロールＦｃ融合タンパク質と比較することによって決定した。ＴＩＧＩＴを結合した単一のタンパク質は、分析した１０００以上のタンパク質において同定された。図３に示すように、抗ヒトＦｃバイオセンサー上に固定したＴＩＧＩＴ-Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＶＲ-Ｆｃ融合タンパク質と特異的に相互作用した。この相互作用の特異性は、ライブラリ内の他の任意のタンパク質とはＴＩＧＩＴが特異的に相互作用しないことによって、さらに、他のＩｇドメイン含有タンパク質をロードしたバイオセンサーがＰＶＲへの応答を誘発しなかったという事実によって裏付けられた。
ＰＶＲ、ＰＶＲＬ１−４、ＣＤ９６およびＣＤ２２６が互いに相互作用することが既に知られているので(He, Y. et al., J Virol 77, 4827-35 (2003)；Satoh-Horikawa, K. et al., J Biol Chem 275, 10291-9 (2000)；Bottino, C. et al. J Exp Med 198, 557-67 (2003)；Fuchs, A. et al., J Immunol 172, 3994-8 (2004)；Reymond, N. et al., J Exp Med 199, 1331-41 (2004))、各々のこれらタンパク質とのＴＩＧＩＴの相互作用は、上記のバイオセンサーシステムを使用して評価した。ＴＩＧＩＴ-Ｆｃについて上記したように、試験した各タンパク質についてＦｃ融合タンパク質を構築し、精製した。具体的には、ＰＶＲ様タンパク質１(ＰＶＲＬ１)のアミノ酸１−３４３、ＰＶＲ様タンパク質２(ＰＶＲＬ２)のアミノ酸１−３６０、ＰＶＲ様タンパク質３(ＰＶＲＬ３)のアミノ酸１−４１１、ＰＶＲ様タンパク質４(ＰＶＲＬ４)のアミノ酸１−３４９、ＣＤ２２６のアミノ酸１−２５９又はＣＤ９６のアミノ酸１−５００を、ヒトのＩｇＧ１のＦｃ領域の直前に融合した。結果として生じるＦｃ融合タンパク質は、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃへの結合について試験した。ＰＶＲ-Ｆｃ、ＰＶＲＬ３-ＦｃおよびＰＶＲＬ２-ＦｃはＴＩＧＩＴ-Ｆｃを結合したのに対して、ＣＤ２２６-Ｆｃ、ＣＤ９６-Ｆｃ、ＰＶＲＬ１-Ｆｃ及びＰＶＲＬ４-Ｆｃは、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃを結合しなかった(図４Ａ)。３つの観察した結合体の中で、ＰＶＲ-ＦｃはＴＩＧＩＴ-Ｆｃに最も大きな結合を示し、次にＰＶＲＬ３-Ｆｃが続き、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃに対して３つの中で最少の結合量はＰＶＲＬ２-Ｆｃに観察された。
また、ＦＡＣＳ分析を行って、ＴＩＧＩＴを発現するＣＨＯ細胞上に構築されるＰＶＲファミリメンバーＦｃ融合の結合を評価した。Ｆｃ融合タンパク質は、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン(Pierce)を含むＰＢＳを用いてアミン共役によりビオチン化した。ビオチン−リガンドの結合は、フィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジン(Caltag)を使用して検出した。ｇＤタグ(Genentech)に対するマウスモノクローナル抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７(Invitrogen)にコンジュゲートした。抗体は、標準的な技術を用いて適切な蛍光標識にコンジュゲートした。製造業者の指示に従って細胞を染色した。染色の前に、適切な血清又は精製したＩｇＧにて細胞をブロックした。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD Biosciences)にて獲得し、ＪｏＦｌｏソフトウェア(Tree Star, Inc.)にて分析した。前方および側方の散乱生きている細胞をゲート化した。結果は、図４Ｂ−１から４Ｂ−６に示し、人工のバイオセンサーアッセイにおいて観察される結合パターンが、細胞表面の生理学的な環境において観察されたものと同じであったことを示す。
ＰＶＲ-ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲＬ２-ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＬ３-ＴＩＧＩＴ結合相互作用の強度を決定するために、これらタンパク質を安定して形質移入したＣＨＯ細胞を用いて、直接の放射性リガンド結合アッセイを行った。ＣＨＯ細胞表面発現のために、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、ＰＶＲＬ３、ＣＤ２２６およびＣＤ９６の完全長ＤＮＡを、ベクター内のｇＤシグナル配列(MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRG(配列番号：１９))及びｇＤタグ(KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVL(配列番号：２０))の直後にクローニングした。プラスミドは、リポフェクタミンＬＴＸ(Invitrogen)を用いてＣＨＯ細胞に形質移入した。ｇＤタグ付加タンパク質の発現は、Ａｌｅｘａ-６４７抗ｇＤコンジュゲートを使用たフローサイトメトリによって調べた。安定して形質移入した細胞株は、使用前の精製のためにＦＡＣＳによって２回分類した。上記の通りに構築したＦｃ-融合タンパク質は、Ｉｏｄｏｇｅｎ法を使用してヨウ素化(１２５Ｉ)した。０．１〜３ｎＭのヨウ素化リガンドを用いて３通りの安定形質移入体を用いて結合試験を行った。ヨウ素化タンパク質は、非標識競合タンパク質(２５ｐＭ−５μＭ)の段階希釈液の存在下で１×１０５−２×１０５細胞と共に４℃で４時間インキュベートした。細胞懸濁物をニトロセルロース膜(Millipore)に回収し、十分に洗浄した。乾燥させたフィルターを計数し、ＮｅｗＬｉｇａｎｄ１．０５ソフトウェア(Genentech)を用いてスキャッチャード分析を行い、結合親和性(Ｋｄ)を決定した。
図５Ａおよび５Ｂは、ＰＶＲ発現ＣＨＯ細胞への放射能標識したＴＩＧＩＴ-Ｆｃタンパク質の結合を示す。４つの実験についてのＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＰＶＲ相互作用の平均Ｋｄは、３．１５ｎＭであった。表６は、すべての分析物の結果を表形式で示す。
表６．ＰＶＲファミリタンパク質の細胞結合。レセプターはＣＨＯ細胞上に発現し、すべてのリガンドは-Ｆｃコンストラクトであった。レセプター陽性細胞のゲート後、ビオチン化したＦｃ-リガンドによるフローサイトメトリーによってＭＦＩを決定した。結合親和性(Ｋｄ)は競合放射能リガンド結合アッセイによって決定した。Ｋｄは(ｎＭ)で示し、(＊)を付したものを除き、少なくとも３つの独立したアッセイの平均値である。
Figure 2021180663
++++ ＭＦＩ＞５０００
+++ ＭＦＩ＝１０００−４９９９
++ ＭＦＩ＝１００−９９９
+ ＭＦＩ＜１００
- 結合なし
& 特異的な結合であるがＫｄは不明瞭
* ２つのアッセイの平均
ＴＩＧＩＴのＰＶＰとの相互作用は最も高い親和性(Ｋｄ＝１〜３ｎＭ)を示したが、ＴＩＧＩＴのＰＶＲＬ３への結合の親和性はおよそ１０〜３０分の１(Ｋｄ＝３８．９ｎＭ)であった(表６を参照)。放射能リガンドアッセイにおける曲線フィッティングが乏しいので、ＰＶＲＬ２-ＴＩＧＩＴ相互作用の結合定数は決定できなかったが、それにもかかわらず特定の結合が観察され、ＰＶＲＬ２-ＦｃのＣＨＯ-ＴＩＧＩＴへの中程度の結合を示す上記ＦＡＣＳデータと一致しており、さらにＰＶＲＬ２とＴＩＧＩＴとの結合が低親和性相互作用であるという発見を強めた。ヨウ素化Ｆｃ融合タンパク質(リガンド)は、示した濃度でレセプター発現ＣＨＯ細胞に結合し、ＣＤ２２６-Ｆｃ(ＣＨＯ-ＴＩＧＩＴの８μＭ；ＣＨＯ-ＰＶＲの５μＭ)、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ(ＣＨＯ-ＰＶＲの２μＭ；ＣＨＯ-ＣＤ２２６およびＣＨＯ-ＣＤ９６の６μＭ)の１０-倍階段希釈物と競合した。非特異的結合は２０００倍過剰な非標識リガンドを使用して決定し、全結合量から減算した。競合試験は、ＴＩＧＩＴはその他のコレセプターであるＣＤ２２６及びＣＤ９６とのＰＶＲの相互作用を効果的にブロックしたのに対して、ＣＤ２２６はＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ相互作用の効果の低い阻害剤であったことを示した(図６)。このデータは、ＰＶＲ−ＣＤ２２６相互作用(Tahara-Hanaoka, S. et al. Int Immunol 16, 533-8 (2004)、およそ１１５ｎＭ)と比較して、ＰＶＲ−ＴＩＧＩＴ相互作用(１−３ｎＭ)の観察された高い親和性と一致していた。ＣＤ９６による直接競合試験は、そのタンパク質の発現が低いためにできなかったが、ＴＩＧＩＴはＣＤ９６発現ＣＨＯ細胞へのＰＶＲ結合を完全に阻害した。前述の競合試験は、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２２６及びＣＤ９６がＰＶＲ上の共通の結合部位又は重なり合う結合部位を共有することを示した。この発見は、ＰＶＲのＮ末端ＩｇＶドメインに結合する抗ＰＶＲ抗体であるＤ１７１が、ＰＶＲへのＴＩＧＩＴ及びＣＤ２２６の結合をブロックするという所見により裏付けられた(図７)。
実施例３：ＴＩＧＩＴ及びＰＶＲの発現
(Ａ) 休止及び活性化免疫細胞におけるＴＩＧＩＴ及びＰＶＲの発現
免疫細胞上のＴＩＧＩＴおよびＰＶＲの相対的な分布および発現は、正常な免疫機能におけるこれら２つの分子の役割の指標として評価し、インビボでＰＶＲと相互作用することが既に公知であり実施例２において示されている分子であるＣＤ２２６の発現と比較した。以前の研究は、複数の免疫細胞種並びに組織のアレイにわたって、ＴＩＧＩＴの発現がＴ及びＮＫ細胞に特異的であったことを示した(Abbas, A.R. et al., Genes Immun 6, 319-31 (2005))。様々な免疫細胞およびエクスビボの組織での、そして、活性化後のＴＩＧＩＴの発現を更に分析した。図８Ａ及び８Ｂに示すように、ＴＩＧＩＴは、調節Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)において最も強く発現され、また、ヒトの扁桃腺組織からのＮＫ細胞およびＴｆｈ細胞において高く発現される。ＴＩＧＩＴは、非刺激ＮＫ細胞、活性化及び休止メモリーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＴｈ２及びＴｈ１細胞においてより小さい範囲で発現される。このデータは米国公開特許２００４０１２１３７０に示されるデータと相関しており、この出願では、ＴＩＧＩＴが単離された休止ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、抗ＣＤ３／ＩＣＡＭ−１および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８によって活性化された単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞において有意に過剰発現されることが示された。それに反して、ＰＶＲは、内皮細胞、線維芽細胞、破骨細胞、濾胞性樹状細胞、樹状細胞、及び腫瘍細胞において発現されることが報告された(Sakisaka, T. & Takai, Y., Curr Opin Cell Biol 16, 513-21 (2004)；Fuchs, A. & Colonna, M., Semin Cancer Biol 16, 359-66 (2006))。このデータから、ＴＩＧＩＴが免疫応答を抑制しうる調節サイトカインを生産するＴ細胞と関係していることが強調される。
また、実施例２に記載されたのと同じ方法を用いて、補完的フローサイトメトリー分析を行った。ヒトのエクスビボＴ細胞は、ヒトＴＩＧＩＴに交差反応し、ＴＩＧＩＴのＰＶＲとの相互作用を遮断するハムスター抗マウスＴＩＧＩＴ抗体(１０Ａ７)を用いて、表面ＴＩＧＩＴ発現について活性化後に試験した(図９を参照)。抗ＴＩＧＩＴ抗体は、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ融合タンパク質によりハムスターを免疫化し、標準的な技術を使用してそこからハムスター抗マウス抗体を得ることによって製造した。１０Ａ７および１Ｆ４の２つの抗体もまた、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合し(データは示さない)、更なる実験に用いた。特に、１０Ａ７及び１Ｆ４はヒトＴＩＧＩＴ上の異なるエピトープに結合する。このことは、ＴＩＧＩＴに対する１Ｆ４の結合がＴＩＧＩＴを発現する２９３細胞の表面上のＴＩＧＩＴに対する１０Ａ７の結合を遮断しないという事実によって裏付けられる(データは示さない)。１０Ａ７の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は標準的な技術を用いて決定した。この抗体の軽鎖配列は、DIVMTQSPSSLAVSPGEKVTMTCKSSQSLYYSGVKENLLAWYQQKPGQS PKLLIYYASIRFTGVPDRFTGSGSGTDYTLTITSVQAEDMGQYFCQQGINNPLTFGDGTKLEIKR(配列番号：２１)であり、そしてこの抗体の重鎖配列は、EVQLVESGGGLTQPGKSLKLSCEASGFTFSSFTMHWVRQSPGKGLEWVAFIRSGSGIVFYADAVRGRFTISRDNAKNLLFLQMNDLKSEDTAMYYCARRPLGHNTFDSWGQGTLVTVSS(配列番号：２２)であり、ここで、各鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)を下線を付して示す。ゆえに、１０Ａ７軽鎖のＣＤＲ１は配列KSSQSLYYSGVKENLLA(配列番号：２３)を有し、１０Ａ７軽鎖のＣＤＲ２は配列ASIRFT(配列番号：２４)を有し、１０Ａ７軽鎖のＣＤＲ３は配列QQGINNPLT(配列番号：２５)を有する。１０Ａ７重鎖のＣＤＲ１は配列GFTFSSFTMH(配列番号：２６)を有し、１０Ａ７重鎖のＣＤＲ２は配列FIRSGSGIVFYADAVRG(配列番号：２７)を有し、１０Ａ７重鎖のＣＤＲ３は配列RPLGHNTFDS(配列番号：２８)を有する。
１Ｆ４抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、５'ＲＡＣＥを用いて決定した(例としてOzawa et al., BioTechniques 40(4): 469-478 (2006)を参照)。この抗体の軽鎖配列は、DVVLTQTPLSLSVSFGDQVSISCRSSQSLVNSYGNTFLSWYLHKPGQSPQLLIFGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPPTFGPGTKLEVK(配列番号：２９)であり、そして、この抗体の重鎖配列は、EVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKASGYSFTGHLMNWVKQSHGKNLEWIGLIIPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSDDSAVYFCSRGLRGFYAMDYWGQGTSVTVSS(配列番号：３０)であり、ここで各鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)を下線を付して示す。ゆえに、１Ｆ４軽鎖のＣＤＲ１は配列RSSQSLVNSYGNTFLS(配列番号：３１)を有し、１Ｆ４軽鎖のＣＤＲ２は配列GISNRFS(配列番号：３２)を有し、１Ｆ４軽鎖のＣＤＲ３は配列LQGTHQPPT(配列番号：３３)を有する。１Ｆ４重鎖のＣＤＲ１は配列GYSFTGHLMN(配列番号：３４)を有し、１Ｆ４重鎖のＣＤＲ２は配列LIIPYNGGTSYNQKFKG(配列番号：３５)を有し、１Ｆ４重鎖のＣＤＲ３は配列GLRGFYAMDY(配列番号：３６)を有する。ＲＡＣＥ配列決定法に使用するプライマーは以下の通りとした。ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子特異的プライマー：(ｉ) 重鎖：ＩｇＧＲａｃｅ４：TTTYTTGTCCACCKTGGTGCTGC(配列番号：３７)；ＩｇＧＲａｃｅ２：CTGGACAGGGATCCAGAGTTCC(配列番号：３８)；ＩｇＧＲａｃｅ７：CARGTCAMDGTCACTGRCTCAG(配列番号：３９)；ＩｇＧＲａｃｅ１：GAARTARCCCTTGACCAGGC(配列番号：６４)；(ｉｉ) 軽鎖：ＫａｐＲａｃｅ３：GTAGAAGTTGTTCAAGAAG(配列番号：４０)；ＫａｐＲａｃｅ２：GAGGCACCTCCAGATGTTAAC(配列番号：４１)；ＫａｐＲａｃｅ７：CTGCTCACTGGATGGTGGGAAG(配列番号：４２)；ＫａｐＲａｃｅ１：GAAGATGGATACAGTTGGTGC(配列番号：４３)；そして、５'ＲＡＣＥテールＰＣＲプライマー：ＯＤＣ２：GATTCAAATCTCAATTATATAATCCGAATATGTTTACCGGCTCGCTCATGGACCCCCCCCCCCCDN(配列番号：４４)；ＯＤＣ３：GAATTCCCCCCCCCCCCCC(配列番号：４５)；ＯＤＣ４：CTCATGGACCCCCCCCCCCC(配列番号：４６)；ＯＤＣ５：AAATATAATACCCCCCCCCCCCCC(配列番号：４７)；ＡＤＣ５：AAATATAATACCCCCCC(配列番号：４８)、およびＡＤＣ５Ｘ：CTCATGGACCCCCCC(配列番号：４９)。
１Ｆ４軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、GATGTTGTGTTGACTCAAACTCCACTCTCCCTGTCTGTCAGCTTTGGAGATCAAGTTTCTATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTTGTAAACAGTTATGGGAACACCTTTTTGTCTTGGTACCTGCACAAGCCTGGCCAGTCTCCACAGCTCCTCATCTTTGGGATTTCCAACAGATTTTCTGGGGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCACAATAAAGCCTGAGGACTTGGGAATGTATTACTGCTTACAAGGTACGCATCAGCCTCCCACGTTCGGTCCTGGGACCAAGCTGGAGGTGAAA(配列番号：５０)であることが決定され、１Ｆ４重鎖をコードするヌクレオチド配列は、GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAACTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCCATCTTATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTATTCCTTACAATGGTGGTACAAGCTATAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACTTCTGATGACTCTGCAGTCTATTTCTGTTCAAGAGGCCTTAGGGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(配列番号：５１)であることが決定された。
ヒト末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)は、フィコール-Ｐａｑｕｅプラス(Amersham Biosciences)の遠心分離法によって、バフィーコートから単離した。示されたサブセットの細胞は、対応するＭＡＣＳキット(Miltenyi)にて精製した。分類した細胞の純度はフローサイトメトリによって確認し、磁気細胞分類法によって精製した細胞では９３％超からフローサイトメトリによって精製した細胞では９８％超の範囲であった。すべての細胞は、染色前に１０〜２０％の適切な血清又は精製したＩｇＧにて遮断した。定量的ＰＣＲ分析を行い、分類した細胞群における対象のタンパク質のｍＲＮＡレベルを評価した。分類した細胞の総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット(Qiagen)にて単離して、ＤＮＡアーゼＩ(Qiagen)にて消化した。７５００配列検出システム(Applied Biosystems)を用いて製造業者の指示に従って、総細胞ＲＮＡを逆転写し、リアルタイムＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲによって３通り分析した。任意の発現単位を刺激していない細胞に対する倍数発現とした。ＴＩＧＩＴを検出するために用いたフォワード及びリバースのプライマーはそれぞれ、TGCCAGGTTCCAGATTCCA(配列番号：５２)および、ACGATGACTGCTGTGCAGATG(配列番号：５３)であり、使用するＴＩＧＩＴプローブ配列は、AGCCATGGCCGCGACGCT(配列番号：５４)とした。
ＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ８にて活性化した。細胞表面に発現したＴＩＧＩＴが、非刺激ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞において検出されなかったのに対して、非刺激ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞では低いが発現が検出された(図１０Ａ−１から１０Ａ−２)。図１０Ａ−１から１０Ａ−２に示されるように、ＴＩＧＩＴ発現は、ＲＡ＋とＲＯ＋のサブセットのＣＤ４ Ｔ細胞では有意に異なっていた。ＰＢＭＣからエクスビボで直接分類した免疫細胞群のｍＲＮＡの分析から、ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞におけるＴＩＧＩＴ発現と比較して、試験した他の細胞種よりもＴｒｅｇ、ＲＯおよびＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴの発現が大きいことが示された(図１０Ｂ)。図１０Ａ−１から１０Ａ−２に示すように、抗ＣＤ３およびＣＤ２８による活性化の後、細胞表面に発現するＴＩＧＩＴは、ナイーブおよびメモリーＴ細胞群の両方において上方制御されていた。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋メモリー細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブ細胞と比較して、活性化の２４及び４８時間後に発現レベルが有意に高かった(図１０Ａ−１から１０Ａ−２)。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋メモリー細胞が１日目に０日目の５．３倍のＴＩＧＩＴ ｍＲＮＡを発現したのに対して、ナイーブ細胞は０日目と比較して１．４倍しかＴＩＧＩＴの発現が増えていなかった(図１０Ｃ)。ＴＩＧＩＴ発現は６日目まで検出できなかった。
また、Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴ発現の安定性も評価した。簡単に言うと、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞を単離し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８にて１日活性化した。細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ４＋ＴＩＧＩＴ＋群についてＦＡＣＳによってフロー分類した。分類後５日間休止させた後、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８にて最大３日間再刺激し、細胞表面ＴＩＧＩＴ発現をＦＡＣＳにて測定した。異なる実験において、分類したＴＩＧＩＴ＋細胞およびＣＤ４＋細胞を、様々な濃度の抗ＣＤ３(０〜０．８μｇ／ｍｌ)、１００μｌ容量にてコートした９６ウェルプレートに、２×１０５細胞／ウェルの密度でプレートし、標準的な条件下で４日間培養した。培養の最後の１８時間に３Ｈチミジンを添加し、その後洗浄した。４日の終わりに、細胞を可溶化し、各試料と関係する放射能をシンチレーション計数器にて測定した。図１２Ａ及び１２Ｂに示されるように、ＴＩＧＩＴ発現はＴＩＧＩＴ＋細胞およびＴＩＧＩＴ−細胞の両方で誘導された。このことは、ＴＩＧＩＴ−細胞が特定の条件下でＴＩＧＩＴを発現することができること、そしてＴＩＧＩＴ＋細胞が一定の細胞群でないことを示す。
エフェクターメモリー細胞上でＴＩＧＩＴの発現が高いことから、Ｔ細胞サブセットでの発現を更に調べた。活性化されたエフェクター／メモリーＴ細胞上で発現される同時刺激又は同時抑制性分子が誘導されるＴｒｅｇｓに発現されることがおおいことから、ＴｒｅｇｓのＴＩＧＩＴ発現を評価した。Ｔｒｅｇｓは、ＣＤ２５ｈｉ細胞として表現型を定義され、転写因子ＦｏｘＰ３を発現することが知られている(Fontenot, J.D. et al., Immunity 22, 329-41 (2005))。マウスでは、転写因子ＦｏｘＰ３は、Ｔｒｅｇ群を同時に定義するために用いられる(Linsley, P.S. et al., Science 257, 792-5 (1992))。しかしながら、すべての活性化されたヒトＴ細胞がＦｏｘＰ３を発現するので、この関連は、ヒトＴ細胞において保たれていない(Ziegler SF., Eur J Immunol. 37(1): 21-3 (2007)))。エクスビボで新たに単離したＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ細胞がＴＩＧＩＴを発現したのに対して、ＣＤ２５−細胞はＴＩＧＩＴの細胞表面発現について陰性であった(図Ｒ(Ｄ))。また、ＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞がＦｏｘＰ３およびＧＩＴＲを同時に発現した(図９および１０Ｅ)。分類されたＣＤ２５＋細胞の活性化により、ＴＩＧＩＴタンパク質発現の上方制御(図１０Ｆ)とｍＲＮＡレベルの６．５倍の増加(図１０Ｃおよび１０Ｆ)が生じた。ＴＩＧＩＴ ｍＲＮＡの倍数的な増加は、ＴｒｅｇおよびメモリーＴ細胞において同等であった。
ドナーＰＢＭＣからエクスビボで直接分類した免疫細胞からのｍＲＮＡレベルの比較から、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ Ｔｒｅｇｓ、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋およびＮＫ細胞がそれぞれ有意にＴＩＧＩＴを発現しており、Ｔｒｅｇｓが最も高い発現を表したことが示された(図１０Ｃ)。ＴＩＧＩＴ発現は、休止又は活性化されたＢ細胞又は単核細胞において観察されなかった(図１０Ｃおよびデータは示さない)。特に、ＰＶＲのための他のコレセプターであるＣＤ２２６がＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ Ｔｒｅｇ細胞において上方制御されていなかったことから、ＴＩＧＩＴとＣＤ２２６の異なる調節的役割が示唆される(図１１)。
他の実験では、ヒト扁桃腺Ｔ(ＴＦＨ)細胞上のＴＩＧＩＴ発現を、上記のような標準的なプロトコールに従って、フローサイトメトリーを用いて試験した。ただし、ＦｏｘＰ３を用いるアッセイのために、上記のプロトコールに従って抗体にて染色し、その後細胞を固定及び透過処理し、抗ＦｏｘＰ３又はコントロールＩｇＧにて染色した。ＴＩＧＩＴ発現は、ＴＦＨ細胞において典型的に観察されるマーカーであるＣＸＣＲ５とＩＣＯＳのＴ細胞での高レベルの同時発現と相関していた(図８Ａ)。それに反して、それら細胞におけるＣＤ２２６(ＤＮＡＭ)発現は、低いか又は存在しなかった(図８Ａ)。また、高レベルのＴＩＧＩＴ発現は、ＣＤ４＋ＣＣＲ４＋ＣＣＲ６＋ＩＬ−１７産生Ｔｈ細胞においても観察された(図１４)。総して、ＴＩＧＩＴは、休止及び活性化されたＴ調節細胞、ヒトの扁桃腺のＴｆｈ細胞、ＩＬ１７を産生するヘルパーＴ細胞、休止及び活性化されたエフェクター／メモリーＴヘルパー細胞(ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞)およびＮＫ細胞によって発現されることが示され、これらの細胞の活性化によりさらに上方制御されうる。また、ＣＤ８＋細胞はＴＩＧＩＴを発現し、この発現は細胞活性化時にわずかに上方制御される。ＣＤ２２６は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、マスト細胞、血小板、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、活性化されたＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞によって発現されることが、本明細書中で示され、当分野で公知でもある。ＴＩＧＩＴは、ＴｒｅｇおよびＴＦｈおよび休止のエフェクター／メモリーＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞に特異的に発現されるのに対して、ＣＤ２２６は、これらの細胞において発現されない。
(Ｂ) ヒトの疾患におけるＴＩＧＩＴ及びＰＶＲの発現
次に、ＴＩＧＩＴが免疫細胞の特定の集団に高く発現されることがわかっているので、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲおよびＣＤ２２６の発現レベルを、乾癬、炎症性腸疾患、関節炎、喘息および癌を含む異なる免疫関連疾患状態からの組織において評価した。試験のためにマイクロアレイベースのシステムを用い、好適なマイクロアレイプロトコールの記載は、例えば、出典明記によって本明細書中に援用される米国公開特許２００８００３８２６４などの文献に見られる。図１５に示されるように、炎症を起こしていない組織と比較して、炎症を起こしたヒトの滑液組織においてＴＩＧＩＴの有意な発現が観察され、これは特に関節リウマチ組織の場合に顕著であった。炎症を起こした関節炎組織試料内で、ＴＩＧＩＴ発現は、マクロファージ又は線維芽細胞とは対照的に、主にＴ細胞と相関していた(図１５、右パネルを参照)。このデータは、ＴＩＧＩＴ ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、マウスのコラーゲン誘導性関節炎(ＣＩＡ)モデルにおいてさらに確認された(図１６を参照)。本明細書中で用いられるＣＩＡモデルにおいて、ＤＢＡ−１Ｊマウスを、０日目及び２１日目に、１００μｌの完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ)中の１００μｇのウシコラーゲンタイプＩＩの皮下接種にて免疫化した。２８、３０及び４０日目に、後足の関節からＲＮＡを抽出し、上記の通りにＴＩＧＩＴおよびＣＤ２２６発現について評価した。図１６に示されるように、４０日目にＴＩＧＩＴ発現の増加が観察されたのに対して、４０日目までにＣＤ２２６発現は有意に下方制御された。
正常組織と比較したときのＴＩＧＩＴ発現の僅かな増加は、乾癬組織試料および炎症性腸疾患組織試料において観察された。アカゲザルの喘息組織試料における同種の分析により、ＴＩＧＩＴ発現が正常なコントロール組織と比較して、患部組織において有意に上昇されることが示された(図１７)。また、正常な胸部組織と比較して、乳癌試料はＴＩＧＩＴ発現が大きく増加しており、その量は乳癌組織の種類によって異なる。図１８Ｂの上パネルに示されるように、最も低い割合の腫瘍細胞を有する腫瘍試料において、ＴＩＧＩＴの最も大きな発現が観察されたことから、ＴＩＧＩＴ発現は、腫瘍細胞自体よりも、腫瘍に浸潤する他の細胞と相関していることが示唆される。図１８Ａの下パネルは、低い割合で腫瘍細胞を有する腫瘍試料においてＣＤ４＋細胞が増加していることを示す。Ｔｒｅｇおよび他のＴ細胞サブセット上のＴＩＧＩＴの発現について本明細書中でデータが示されたので、最も低い割合で腫瘍細胞を有する胸部腫瘍試料において観察された高レベルのＴＩＧＩＴ発現は、ＴＩＧＩＴが免疫細胞腫瘍浸潤物、たぶんＴｒｅｇ浸潤物によって発現されていることを示唆する。乳癌試料におけるＴＩＧＩＴ発現とＴ細胞との相関性は、ＴＩＧＩＴが腫瘍調節において役割があることが示唆される。例えば、腫瘍は、ＴＩＧＩＴ＋Ｔｒｅｇｓを補充する／活性化することによって、宿主の免疫応答を回避するかもしれない。
実施例４：Ｔ細胞活性化におけるＴＩＧＩＴの役割
ＴｒｅｇおよびメモリーＴ細胞によるＴＩＧＩＴの高レベルの発現が上記に示され、樹状細胞上でのＰＶＲの発現が公知であるので(Pende, D. et al., Blood 107, 2030-6 (2006))、ＴＩＧＩＴがＤＣ機能を修飾し、Ｔ細胞活性化を生じるかもしれない可能性を調べた。
(Ａ) Ｔ細胞増殖を調節する際のＴＩＧＩＴの機能
混合リンパ球反応(ＭＬＲ)増殖アッセイにおけるＴＩＧＩＴ-Ｆｃの作用を、ＴＮＦαにて成熟された単球由来のヒトのＤＣを用いて評価した。簡単に言うと、ヒトの総ＰＢＭＣ(Miltenyi Biotec)のネガティブ選択によって単球を単離した。未成熟の単球由来のＤＣ(ｉＭＤＤＣ)は、単球(３×１０５細胞／ｍｌ)を、ヒト組換えＩＬ−４(１２５ｎｇ／ｍＬ、R&D Biosystems)およびヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ(５０ｎｇ／ｍＬ、R&D Biosystems)を添加し、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する完全ＲＰＭＩ１６４０中で、加湿した空気中、３７℃、５％ＣＯ２にて５日間インキュベートすることによって生成した。２日目及び４日目に、ＧＭ-ＣＳＦおよびＩＬ-４を新鮮な完全ＲＰＭＩ１６４０培地と共に再び添加した。５日の培養の後、ＦＡＣＳ分析にて確認すると、細胞の９０％以上が未成熟のＤＣ表現型(ＣＤ１４−、ＭＨＣクラスＩＩ＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋およびＣＤ８３ｌｏｗ)を表す。これら未成熟ＤＣをここで、ＬＰＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦα、Ｐａｍ３ＣＳＫ４とＴＳＬＰ、及び示した融合タンパク質による処置のために用いて、その成熟を誘導した。ＭＤＤＣおよび細胞株の表現型分析は免疫蛍光法によって行った。細胞表面染色のために用いたモノクローナル抗体は、ＰＥ標識抗ＣＤ８３、ＦＩＴＣ−ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＥ−抗ＣＤ８６およびＦＩＴＣ−抗ＣＤ８０を含む。すべてのインキュベートは、融合／抗体のＦｃ部分による結合を予防するために、１０％ヒトＡＢ血清の存在下で行った。ＴＮＦα(０．１μｇ／ｍＬ)による刺激の前に、示した分子を、１０μＭのＭＥＫ１阻害剤(ＰＤ９８０５９)、１μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−１０抗体、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３２抗体又は１０μｇ／ｍｌの抗ＴＩＧＩＴ抗体と予めインキュベートすることによって、阻害剤試験を行った。溶媒ＤＭＳＯ又はヒトＩｇＧをコントロールとして用いた。１６時間後に細胞培養物上清を回収し、ＥＬＩＳＡにてＩＬ−１２ｐ４０の産生についてアッセイした。
Ｔ細胞増殖および活性化に対するブロック抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７の効果を評価した。抗ＣＤ３活性化ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の１０Ａ７とのインキュベートでは効果は観察されなかった。Ｔ細胞を自己由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣと抗ＣＤ３と共に培養すると、Ｔ細胞増殖が２倍増加し(ｐ＜０．０１)、ＩＦＮγ産生が４倍増加した(ｐ＜０．００１)(図１９Ｃ)。Ｔ細胞活性のこの悪化は、総ＰＢＭＣにおいて僅かに観察された。対照的に、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃは、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの存在下で、Ｔ細胞活性化(ｐ＜０．０１)とＩＦＮγ産生(ｐ＜０．００１)を有意に阻害した(図１９Ｄ)。総ＰＢＭＣを抗ＣＤ３にて活性化したときに、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃが先の試験において観察された効果よりも軽い効果を示したことから、細胞上に存在するＰＶＲの量は活性に重要である可能性が示唆された。ＴＩＧＩＴはＴ細胞に結合しないので、予測されるとおり、Ｔ細胞単独には効果は観察されなかった。また、抗ＴＩＧＩＴ抗体処置は、ＡＰＣの存在下でのみ、Ｔ細胞増殖のＴｒｅｇ抑制をブロックすることが明らかとなった。さらに、ＴＩＧＩＴ.Ｆｃは、トランスウェルアッセイにおいてＣＤ１１ｃ＋細胞機能を制御すること、そしてナイーブＴ細胞増殖を阻害することが明らかとされたことから、細胞の行動及び増殖における観察された変更は、特にＴＩＧＩＴ結合によるものであることが示された。まとめると、これらのデータから、ＴＩＧＩＴがＡＰＣへのリガンド、特にＰＶＲとの相互作用によりＴ細胞活性化を調節することが示唆された。
ｉＭＤＤＣとＴＮＦα成熟ＭＤＤＣは共に表面ＰＶＲを発現し、ＭＤＤＣはｉＭＤＤＣよりも高いレベルのＰＶＲを発現した(図１９Ａ)。また、ＴＮＦα成熟ＭＤＤＣは、非刺激ｉＭＤＤＣよりもＴ細胞の増殖を増加させた(図１９Ｂ)。ＭＬＲアッセイでは、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃを添加すると僅かではあるが有意に増殖が減少したのに対して、ＴＮＦα成熟ＭＤＤＣにＴＩＧＩＴ-Ｆｃを添加すると基準レベルに増殖が低減した。ＴＩＧＩＴが誘導する増殖の阻害は、抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７又は抗ＰＶＲ抗体ＴＸ２１を更に含めると妨げられた。３日目に測定した分泌されたＩＬ−１０のレベルは、アイソタイプコントロールを含む培養物よりも、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃを含む培養物において有意に高かった(４５±５ｐｇ／ｍＬ対２９±８ｐｇ／ｍＬ、それぞれｐ＝０．０４)。また、抗ＴＩＧＩＴ抗体又は抗ＰＶＲ抗体を含めると、分泌されるＩＬ−１０のＴＩＧＩＴ-Ｆｃが誘導する増加が妨げられた(データは示さない)。ＩＦＮγレベルは、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置によって低減した(データは示さない)。まとめると、このデータから、ＴＩＧＩＴがＴ細胞活性化を調整することが示唆された。
さらに、共培養におけるＴＩＧＩＴ−Ｔ細胞増殖に対するＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞の効果を調べるために、ＭＬＲアッセイを行った。簡単に言うと、ヒトのＰＢＭＣからＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を単離し、５日間活性化した。６日目に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８にて細胞を終夜再刺激し、ＴＩＧＩＴ＋細胞をＦＡＣＳによってＴＩＧＩＴ−細胞と別に分類した。ＴＩＧＩＴ−細胞をＣＦＳＥ標識し、培養物中に同じ数のＴＩＧＩＴ＋細胞のある場合と無い場合の、第二ドナーから単離したＣＤ１１ｃ＋細胞と共に１０:１の比で混合した。サイトカイン産生(ＩＦＮγ又はＩＬ-１７)のルミネックス分析のために７日目に培養物上清を回収した。８日目に、ＣＦＳＥ＋生細胞についてゲートしたＦＡＣＳにて細胞増殖を分析した。結果は、図２０Ａおよび２０Ｂに示す。図２０Ａに示されるように、ＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞は、ＴＩＧＩＴ−Ｔ細胞より低いレベルのＩＦＮγおよびＩＬ−１７を発現した。ＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞をＴＩＧＩＴ−Ｔ細胞と混合すると、結果として生じた培養物はこれら２つのサイトカインの産生が有意に低くなったことから、ＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞はこれら２つのサイトカインのＴＩＧＩＴ−Ｔ細胞産生を阻害することが示された。また、ＴＩＧＩＴ＋細胞は、ＴＩＧＩＴ−Ｔ細胞の増殖を阻害した(図２０Ｂ)。これはさらに、ＴＩＧＩＴ＋細胞が実際は調節細胞であって、阻害性サイトカインの分泌により直接か又は抗原提示細胞上のＰＶＲの嵌入を経て間接的にそれらの応答を阻害するようにＣＤ４＋細胞に作用しうるという考えを裏付けるものである。
ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴｒｅｇ細胞が特に高くＴＩＧＩＴを発現するという実施例３(Ａ)の所見に基づいて、アッセイを行って、ＴｒｅｇＴ細胞サブユニットの、他の免疫細胞の増殖を阻害する能力を調べた。簡単に言うと、製造業者の指示に従ってＭＡＣＳキット(Miltenyi)にてバフィーコートからＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴｒｅｇ細胞を単離した。また、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞は、アッセイに用いるためにエフェクターＴ細胞として調製した。ＭＡＣＳ ＣＤ３ミクロビーズ(Miltenyi)を使用してＴ細胞において予め枯渇させていたＰＢＭＣに照射することによって、標準的な方法によって、抗原提供細胞(ＡＰＣ)群を単離した。単離したＴｒｅｇ、エフェクターＴ細胞およびＡＰＣを１:４:４の比に混合し、０．５μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３と共にインキュベートした。細胞混合物を、１０μｇ／ｍｌの抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７又はコントロールＩｇＧにてコートしたウェルに播き、４日間培養し、[３Ｈ]-チミジンを添加して最後に１８時間のインキュベートを行った。各ウェルの細胞を可溶化し、各細胞試料の放射能量を定量化した。示された増殖値の割合は、Ｔｒｅｇ細胞非存在下でのエフェクター細胞において観察される放射能の量との相対として算出した。結果を図２１Ａに示す。ＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞がＴＩＧＩＴ−Ｔ細胞の増殖を阻害したという前記の実験の所見と一致して、コントロールＩｇＧにてコートしたウェルではおよそ５５％の細胞増殖が観察された。ウェルに抗ＴＩＧＩＴ抗体を含めると、観察される増殖が有意に増加したことから、ＴＩＧＩＴは抑制効果を媒介することが確認された。さらにこの所見は、ＴＩＧＩＴ＋Ｔｒｅｇが免疫細胞の増殖及び機能のネガティブ調節因子として働きうることを示唆する。実際に、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴＩＧＩＴ＋ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴＩＧＩＴ−Ｔｒｅｇを単離し、ナイーブＴ細胞増殖を抑制する能力について別々に試験すると、ＴＩＧＩＴ−ＴｒｅｇよりＴＩＧＩＴ＋ＴｒｅｇがナイーブＴ細胞増殖の抑制に強力であったことが明らかとなった。簡単に言うと、ＴＩＧＩＴ＋およびＴＩＧＩＴ−のＴｒｅｇをＦＡＣＳにて単離した。ＣＤ１１ｃ＋細胞を、ＣＤ１１ｃ-ＰＥ(BD Biosciences)および抗ＰＥミクロビーズ(MACS)を用いて陽性選別した。ナイーブＴ細胞を、４×１０５の密度で、２×１０５のＴｒｅｇおよび０．８×１０５のＣＤ１１ｃ＋抗原提示細胞とともに、Ｕ底９６ウェルプレートに播いた。図２１Ｂに示されるように、ナイーブＴ細胞増殖の抑制において、ＴＩＧＩＴ＋ＴｒｅｇはＴＩＧＩＴ−Ｔｒｅｇのおよそ２倍の強さであったは、ＴＩＧＩＴ＋Ｔｒｅｇは免疫細胞の増殖及び機能のネガティブ調節因子として働きうるという発見を裏付けるものである。
(Ｂ) ＴＩＧＩＴのノックダウン
前記のように構築したｇＤタグ付加ＴＩＧＩＴを発現する安定細胞株(２９３-ＴＩＧＩＴ細胞)を使用して、これらの細胞が、外因性ＰＶＲ、架橋抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体１０Ａ７との相互作用により、又は過バナジン酸処置によりＴＩＧＩＴのリン酸化を表さなかったことが明らかとなった。加えて、これらの細胞の１０Ａ７処置では、ＴＣＲシグナル伝達に対する有意な効果は生じなかった。これらのデータは、構築した細胞において発現されるＴＩＧＩＴのいずれかのＩＴＩＭモチーフが機能していなかった、または、安定細胞株がＴＩＧＩＴ活性化に必要な一又は複数の構成成分を欠いていたことを示唆した。
ＴＩＧＩＴの細胞内在性機能をさらに説明するために、阻害性ＲＮＡ(ＲＮＡｉ)研究を実施した。Ｏｎ−Ｔａｒｇｅｔｐｌｕｓ遺伝子特異的ｓｉＲＮＡおよびネガティブコントロールｓｉＲＮＡは、Dharmacon RNAi Technologyから入手した。ＭＡＣＳＴＭキット(Miltenyi Biotec)によりバフィコートからヒトＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を精製し、ＣＦＳＥにて標識した。製造業者の指示に従って、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ技術(Amaxxa)にてｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡコントロール又はｓｉＲＮＡＴＩＧＩＴ)をこれら細胞に形質移入した。２４時間後に、形質移入した細胞を、プレート結合抗ＣＤ３(５μｇ／ｍＬ)単独又はそれと２μｇ／ｍＬの可溶化抗ＣＤ２８にて活性化した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ(ｑＲＴ-ＰＣＲ)又はＦＡＣＳ分析のために、活性化後２日目又は５日目にいくつかの細胞を採取した。５日目に、Ｔ細胞増殖を上記の通りにＦＡＣＳによって測定した。前記の実施例３(Ａ)に記載のようにｑＲＴ-ＰＣＲを実施し、各試料のＲＰＬ-１９ｍＲＮＡレベルを内部コントロールとして用いた。ＴＩＧＩＴプライマーは上記の通りであり、ヒトのＣＴＬＡ４およびＣＤ２２６プライマーおよび問題は、Applied Biosystemsから入手した。マウスＩＬ−１２およびＩＬ−１０の異なる種を検出するために用いたプライマーおよびプローブの配列は以下の通りとした。ｍＩＬ-１２ｐ４０：フォワードプライマー：5'-ACATCTACCGAAGTCCAATGCA-3'(配列番号：５５)；リバースプライマー：5'-GGAATTGTAATAGCGATCCTGAGC-3'(配列番号：５６)；プローブ：5'-TGCACGCAGACATTCCCGCCT-3'(配列番号：５７)；ｍＩＬ-１２ｐ３５：フォワードプライマー：5'-TCTGAATCATAATGGCGAGACT-3'(配列番号：５８)；リバースプライマー：5'-TCACTCTGTAAGGGTCTGCTTCT-3'(配列番号：５９)；プローブ：5'-TGCGCCAGAAACCTCCTGTGG-3'(配列番号：６０)；ｍＩＬ-１０：フォワードプライマー：5'-TGAGTTCAGAGCTCCTAAGAGAGT-3'(配列番号：６１)；リバースプライマー：5'-AAAGGATCTCCCTGGTTTCTC-3'(配列番号：６２)；プローブ：5'-TCCCAAGACCCATGAGTTTCTTCACA-3'(配列番号：６３)。
ＴＩＧＩＴに特異的なＲＮＡｉを用いて、通常ではＴＩＧＩＴを高いレベルで発現する原発性ヒトＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞においてＴＩＧＩＴ発現を特異的にノックダウンした(図１０Ａ−１から１０Ａ−２)。この方法を用いたＴＩＧＩＴノックダウンの有効性を、ｑＲＴ-ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析によって評価した(図２８Ａ、２８Ｂ及び表７)。処置の２日目までに、ＴＩＧＩＴ転写は、スクランブルしたｓｉＲＮＡコントロールと比較して、ｓｉＲＮＡＴＩＧＩＴ処置により９０％より多く低減したのに対して、ＣＴＬＡ４ ｍＲＮＡ(コントロールタンパク質)はこの処置により変化しなかった。ＴＩＧＩＴｍＲＮＡの低減により、Ｔ細胞の平均２５％から２％未満に細胞表面ＴＩＧＩＴが減少した(図２８Ｂ)。５日目までに、これら同じ細胞でのＴＩＧＩＴ発現は、コントロール細胞での発現と比較して７０％減少した(図２８Ａおよび２８Ｂ、および表７)。ＴＩＧＩＴのノックダウンは、抗ＣＤ３(最適以下又は最適濃度のいずれか)又は抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８に応答したＴ細胞増殖には有意な効果を示さなかった(図２８Ｃ)。同様に、ＴＩＧＩＴのノックダウンはまた、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０又はＩＦＮ-γの産生に対しても効果が観察されなかった(図２８Ｅ)。さらに、細胞を抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７にて処置しても、上記と同じ条件下ではＴＩＧＩＴを発現するＴ細胞の活性化に対する効果は観察されなかった(図２８Ｄ)。
表７ ＴＩＧＩＴ ＲＮＡｉノックダウン効果
Figure 2021180663
*ＣＴ値は、ＴＩＧＩＴ又はＣＴＬＡ４のＣＴ値±標準偏差を示す。
実施例５：サイトカイン産生に対するＴＩＧＩＴの効果
ＴＩＧＩＴがＴ細胞成熟に対して上記の全般的な効果以外にＤＣに対して直接作用したか否かを決定するために、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃの存在および非存在下でＤＣの成熟および機能を評価した。混合Ｔ細胞群におけるＩＦＮγ及びＩＬ−１７の産生を調節するＴＩＧＩＴの能力に関する実施例４の結果から、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃにて処理したＤＣによるサイトカイン産生の更なる。無処置のＴ細胞はネガティブ選択によって精製し(ＣＤ４ Ｔ細胞単離キット、Miltenyi Biotech)、９５％を上回る純度にした。細胞は、標準的な栄養成分を有する完全なＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。同種異系のＴ細胞(２×１０５)は、９６ウェルＵ底マイクロプレート(Nunc)に１ウェル当たり２００μｌの培地中で、示した比率のｉＭＤＤＣ及びＭＤＤＣの非存在下(培地のみ)又は存在下で培養した。細胞を７２時間培養した後、[３Ｈ]チミジン(Amersham)の１μＣｉ(０．０３７ＭＢｑ)にて１８時間パルスを与えた。細胞採取器を用いてＵｎｉｆｉｌｔｅｒ-９６プレートＧＦ／Ｃへ細胞を移し、[３Ｈ]チミジン取込みをシンチレーションカウンター(Canberra Packard Ltd.)を使用したシンチレーション液において測定した。すべての測定は３通り行った。ｉＭＤＤＣによるサイトカイン産生は、培養の５日目に採取し、−８０℃に保存した上清で分析した。同じＭＤＤＣは、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ又はＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡの有無の下で、示した刺激の存在下又は非存在で２４時間成熟させた。４８時間の刺激の後に、上清を採取し、−８０℃に保存した。サイトカイン濃度は、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ (R&D Biosystems)によって、または、製造業者の指示に従ってＬｕｍｉｎｅｘ１００の計測器(Luminex)による検出を有するＬＩＮＣＯｐｌｅｘ抗体固定ビーズ(LINCO Research)を用いることによって測定した。
ＴＮＦα又は可溶性ＣＤ４０Ｌによる成熟の間にＴＩＧＩＴ-Ｆｃ、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡ又はＣＤ２２６-ＦｃをｉＭＤＤＣに加えると、ＩＬ−１２／２３ｐ４０産生およびＩＬ−１２ｐ７０産生は、アイソタイプ一致のコントロールによる処置と比較して有意に低減し(それぞれｐ＝０．００７及びｐ＝０．０３)、ｉＭＤＤＣに相当するレベルであった(図２２Ａ−１から２２Ａ−３)。反対に、ＩＬ−１０の分泌は、アイソタイプ一致のコントロールによる処置と比較して、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡ又はＣＤ２２６-Ｆｃ処置により増加した(それぞれｐ＝０．０２７及びｐ＝０．１８)(図２２Ａ−１から２２Ａ−３)。また、ＴＧＦβ分泌は、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置に応答してｉＭＤＤＣにおいて増加した(図２２Ｄを参照)。しかしながら、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＨＬＡ-ＤＲがアイソタイプコントロール培養物において等しく上方制御されていたので、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃは、ＭＤＤＣへ成熟するｉＭＤＤＣの能力に作用しなかった(図２２Ｂ)。特に、ＴＩＧＩＴ-ＰＶＲ相互作用はＤＣ成熟を直接誘導しなかった。
また、ＴＬＲが媒介するＤＣ成熟経路に対するＴＩＧＩＴ-Ｆｃ、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡおよびＣＤ２２６-Ｆｃの効果を調べた。３つのＦｃタンパク質のそれぞれによって処置すると、ＬＰＳからのＩＬ−１０産生が僅かに増加したが(ＴＬＲ４成熟ＭＤＤＣ(ｐ＜０．０１))類似の、ＩＬ−１２／２３ｐ４０の減少(ｐ＝０．０７〜０．１８)およびＩＬ−１２ｐ７０産生の有意な減少(すべての融合タンパク質についてｐ＜０．０５)が現れ(図２２Ａ−１から２２Ａ−３を参照)、ＴＬＲ２成熟経路に対しては効果を示さなかった。ＤＣのＴＩＧＩＴ処置によるＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ４０産生のこの変更は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４による分化の間にＴＩＧＩＴ-Ｆｃを単球に加えても、または、成熟段階の間に加えたときでも同様であった(データは示さない)。成熟していないｉＭＤＤＣにおけるＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ４０の産生に対するＴＩＧＩＴ−Ｆｃの効果は軽度であるが、ｉＭＤＤＣにおいて観察されるこれらサイトカインのレベルは低いので、統計学的に有意な効果は検出が困難であった(図２２Ｂ)。特に、これらアッセイにおいてＣＤ２２６はＴＩＧＩＴと同様に機能した。これは、ＭＤＤＣのＰＶＲに対する役割を裏付ける。ＣＤ２２６はＩＴＡＭモチーフを有し、ＴＣＲシグナルを亢進するように働くので(Dalhardon et al. J. Immunol. 175: 1558-1565 (2005))、異なるサブセットのＴ細胞上でのＴＩＧＩＴおよび／またはＣＤ２２６の発現の程度は、インビボの局所炎症反応の差次的な調節に寄与しうる(図１０、図２９)。
また、ＴＩＧＩＴ-ＦｃによるＤＣ処置によって他の炎症誘発性サイトカインの産生のレベルを決定した。ＩＬ-６及びＩＬ-１８の産生は、すべての成熟したＭＤＤＣ群でのＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置によって有意に減少した。ＩＬ−１２ｐ４０はＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２３の公知のサブユニットであるので、それら両方のサイトカインの産生のレベルをＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置したＭＤＤＣ培養物において測定した。コントロール培養物と比較して、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置により、ＴＮＦα又はＣＤ４０Ｌによって成熟されたＭＤＤＣによってＩＬ−１２ｐ７０の産生が有意に減少した(図２２Ｃ)。ＩＬ-２３レベルは相対的に低く、アッセイ条件下で僅かに検出可能であった。ＴＩＧＩＴ-Ｆｃはすべて成熟したＭＤＤＣの条件下でＩＬ−６とＩＬ−１８を低減したが、ドナーに多様性があるために、観察された減少は統計学的に有意なものでなかった。
観察されたＴＩＧＩＴ-Ｆｃの効果がＰＶＲの架橋結合を必要としていたのか否かを調べるために、ＦｃγＲ結合が完全にされていないＴＩＧＩＴ-ＦｃのＦｃ変異型(実施例１に記載のＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡ)を用いた。図２２Ａ−１から２２Ａ−３に示されるように、ＴＩＧＩＴ-ＦｃとＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡは等しく有意にＩＬ−１２ｐ４０を阻害し、ＴＮＦαによって成熟されたＤＣからのＩＬ−１０産生を亢進した。この結果は、ＴＩＧＩＴ融合タンパク質によって歪んだサイトカインがＦｃが媒介する架橋結合に依存していないことを示した。
ＤＣからのサイトカイン産生パターンを変更するＴＩＧＩＴの能力は、すべてのインビトロ成熟条件下で観察されたわけではなかった。効果は、ＴＮＦα、可溶性ＣＤ４０ＬおよびＬＰＳ(ＴＬＲ４)誘導性成熟経路に対して最も現れたのに対して、ＴＬＲ２媒介性の成熟は影響を受けないままであった。ＬＰＳおよびＰａｍ３ＣＳＫ４が様々な程度にＥＲＫおよびｐ３８を活性化し、ＬＰＳは主にｐ３８を活性化し、Ｐａｍ３ＣＳＫ４処置により高いＥＲＫキナーゼ活性が生じることが示された。したがって、Ｐａｍ３ＣＳＫ４成熟ＤＣのＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置はほとんど効果を示さなかった(図２２Ａ−１から２２Ａ−３)。ＥＲＫ／ｐ３８経路を制御するＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌのようなこれらおよび他の刺激の差次的能力は、ＭＤＤＣ機能の結果を決定する際に重要である。ＤＣはＴｒｅｇｓを拡大することが示されただけでなく、ＤＣはＴｒｅｇ耐性を壊し、活性化およびＩＬ−２産生を誘導しうる(Fehervari, Z. & Sakaguchi, S., Curr Opin Immunol 16, 203-8 (2004))。他の成熟条件ではなく特定の成熟条件下でＴＩＧＩＴがＤＣを変更することができることから、ＴＩＧＩＴ調節はＴｒｅｇおよび活性化されたＴ細胞がＤＣ機能を微調整しうる一つの方法であることが示唆される。
また、Ｂ細胞及びＴ細胞を欠いているがマクロファージおよび樹状細胞を有するマウスモデル(ｓｃｉｄマウス)においてＴＩＧＩＴ機能の研究を行った。簡単に言うと、ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウス(６〜８週齢)に、２００μｇのＴＩＧＩＴ.Ｆｃ、ＴＩＧＩＴ.ＤＡＮＡ又はコントロール抗ブタクサ抗体を１回静脈注射した。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体又はアイソタイプコントロール(２００μｇ／マウス)を６時間後に投与した。血清を１６時間後に採取し、ＥＬＩＳＡアッセイによってＩＬ-１０、ＭＣＰ-１、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ-１２ｐ７０のレベルを分析した。ｓｃｉｄマウスにおけるＴＩＧＩＴ-Ｆｃ又はＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡの投与により、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０の産生が刺激され、ＩＬ−１２ｐ７０の産生が低減した(図１３Ａ−Ｃ)。この所見は、上記のインビトロデータと一致しており、サイトカイン調節効果を発揮するためにＴＩＧＩＴはＢ細胞又はＴ細胞を必要としないことを示唆する。
先の実施例から、ＴＩＧＩＴの発現はＴ細胞及びＮＫ細胞に限定されており、Ｔｒｅｇｓで最も高い発現が見られた。ＰＶＲのための低親和性リガンドであるＣＤ２２６は、活性化されたＴ細胞上で発現されるにもかかわらず、Ｔｒｅｇｓでは発現されない(Abbas, A.R. et al., Genes Immun 6, 319-31 (2005)；Dardalhon, V. et al., J Immunol 175, 1558-65 (2005))。インビボでのＴＩＧＩＴとＣＤ２２６のバランスは決定されていないままであるが、ＰＶＲに対してＴＩＧＩＴの親和性が高いことから、その両方が同時に発現されると優性の役割を示すことが示唆される。まとめると、活性化されたＴ細胞およびＴｒｅｇ上でＴＩＧＩＴの発現が高いこと、そして、ＩＬ−１０を誘導し、成熟したＤＣからの炎症誘発性サイトカイン放出を阻害するＰＶＲとＴＩＧＩＴとの相互作用から、ＴＩＧＩＴは免疫応答を下方制御するフィードバック機構を提供することが示唆される。
実施例６：ＰＶＲシグナル伝達に対するＴＩＧＩＴの効果
ＭＡＰＫシグナル伝達経路がＩＬ−１０経路を制御する際に重要であるので(Xia, C.Q. & Kao, K.J., Scand J Immunol 58, 23-32 (2003))、ＭＡＰＫ経路のいくつかのメンバーの活性をＴＩＧＩＴで処置したＭＤＤＣにおいて評価した。ＣＨＯ-ＰＶＲを３時間血清飢餓状態にし、その後、５０μｇ／ｍＬのＴＩＧＩＴ-Ｆｃにて３７℃で１５分間処置するか又は処置しないものを作製した。細胞を均質にし、膜タンパク質を、細胞膜抽出キット(BioVision)を使用して抽出し、非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)を行い、その後ニトロセルロースメンブラン(BioRad)に移した。メンブランは、５０ｍＭ トリス-ＨＣｌ(ｐＨ７．６)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の５％ＢＳＡにてブロックし、次いで、抗ホスホチロシン−ＨＲＰ(BD Bioscience)にてプローブし、Ｒｅｓｔｏｒｅバッファ(Pierce)にて取り除き、そして、抗ＰＶＲヤギポリクローナル抗体(R&D Systems)にて再プローブした。５日目にｉＭＤＤＣを、１０μｇ／ｍＬのＴＩＧＩＴ-Ｆｃ又はコントロールヒトＩｇＧにて３７℃で示した時間の間処置した。総細胞溶解物はＲＩＰＡバッファに調製し、還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、イモビロン重合ビニリデン二フッ化物メンブラン(ＰＶＤＦ、Millipore)へ移した。５０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ-２０中の１％ＢＳＡにてブロックした後、化学発光タンパク質検出を行った。再プロービングのために、メンブランを、ストリッピングバッファ(６２．５ｍＭ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．７、１００ｍＭ β-メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ)中で、時々撹拌しながら５０℃で３０分間インキュベートした。抗ホスホチロシンに特異的なポリクローナル抗体(Upstate)、抗ホスホｐ３８ＭＡＰＫ(Cell Signaling Technology)およびモノクローナル抗ホスホｐ４４／４２ＭＡＰＫ(Cell Signaling Technology)を用いて、ホスホチロシン、リン光体-ｐ３８ＭＡＰＫおよびリン光体-ＥＲＫの検出を行った。タンパク質負荷のためのコントロールとして、ＥＲＫ (Cell Signaling Technology)、ｐ３８ＭＡＰＫ (Cell Signaling Technology)又はβ-アクチン(NeoMarkers)、β-カテニン(BD Pharmingen)又は活性なβ-カテニン(Upstate)に対するポリクローナル抗血清を用いて再プローブした。
図２３Ａに示されるデータは、ＴＩＧＩＴへの結合によりＰＶＲがリン酸化されることを示す(図の下方に同程度に濃いバンドとして示されるようにＰＶＲの全量は一定であったが、ＴＩＧＩＴ処置細胞に対してアイソタイプ一致のコントロールで観察されたリン酸化チロシンバンドは比較的僅かであった)。これは、ＴＩＧＩＴ結合がＰＶＲによって媒介されるシグナル伝達機能を惹起することを示唆した。ＴＩＧＩＴ-ＦｃおよびＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡ処置ｉＭＤＤＣでは、単量体(４２ＫＤ)ではなくｐＥＲＫ二量体(９１ＫＤ)のリン酸化の増加が観察された(図２３Ｂ)。対照的に、ｐ３８活性は影響を受けなかった(図２３Ｂ)。最近の報告から、Ｅ-カドヘリンの刺激と活性なβ-カテニンの誘導は、マウス骨髄由来のＤＣを、インビボで免疫応答を阻害することができる免疫寛容誘発ＤＣに成熟させたことが示唆された(Jiang, A. et al., Immunity 27, 610-24 (2007))。ここで、ヒトＭＤＤＣをＴＩＧＩＴ-Ｆｃで処置すると、β-カテニン経路の活性型が誘導された。アイソタイプ一致のコントロールでは効果は観察されなかった(図２３Ｃ)。
これらの結果は、ＴＩＧＩＴが、ＰＶＲとの相互作用によって、ＥＲＫ活性を調節し、そしてＭＤＤＣによるサイトカイン産生を調整することを示唆した。この所見を確認するために、ＥＲＫキナーゼ特異的阻害剤をＴＩＧＩＴ-Ｆｃと共にＭＤＤＣ培養物に加え、この培養物から分泌されるＩＬ−１２のレベルを決定した。ＴＩＧＩＴ-Ｆｃが媒介するＩＬ−１２ｐ４０産生の下方調節は、ＥＲＫ阻害剤の存在下で逆転した(図２４Ａ)。中和抗ＩＬ−１０抗体を培養物に含めると、同様な効果が観察された(図２４Ｂを参照)。また、ＴＩＧＩＴが調節するＭＤＤＣからのサイトカイン産生は、抗ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７又はブロック抗ＰＶＲ抗体によってもブロックされた(図２４Ｂ)。まとめると、これらの結果は、ＴＩＧＩＴ-ＰＶＲライゲーションは、ＥＲＫキナーゼ活性に作用して、他の生産されたサイトカインと比較してＤＣでのＩＬ−１０／ＩＬ−１２サイトカイン産生の比率を増やすことを示した。
実施例７：Ｔ細胞活性化に対するＴＩＧＩＴ調節ＭＤＤＣの影響
ＤＣサイトカイン産生に対するＴＩＧＩＴの影響が機能的な結果であったか否かを決定するために、実験を行い、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生に対するＭＤＤＣのＴＩＧＩＴ調節の効果を評価した。ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処理したＭＤＤＣ(ＴＮＦα又はｓＣＤ４０Ｌにて成熟されたもの)を上記のようにＭＬＲ応答にあるＴ細胞と培養した。ＴＩＧＩＴ変更ＤＣを含む培養物をコントロールＤＣと比較すると、Ｔ細胞増殖が平均５０％(ｐ＜０．０５)阻害された(図２５Ａ)。加えて、培養物中のＩＬ−２レベルは２分の１に低減した(ｐ＜０．０１)(図２５Ｂ)。このデータは、先の実施例に記載したように、ＩＬ−１２の減少とＴＩＧＩＴにて処理されたＤＣでのＩＬ−１０産生の増加と相関している。概して、ＴＩＧＩＴ変更ＭＤＤＣがＴ細胞を阻害したことから、ＤＣが完全に成熟されるとＴＩＧＩＴはＤＣの機能的能力を制御しうることが示唆される。特に、ＭＤＤＣ-Ｔ細胞培養物にＴＩＧＩＴ-Ｆｃを添加するとＴ細胞の増殖が阻害されることから、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃは、ＤＣを変更するためのＤＣ成熟の惹起時には必要でないことが示される。
また、活性化ヒトＭＤＤＣにおける他の細胞表面分子の発現に対するＴＩＧＩＴ処置の影響を調べた。ＤＣ上の特定の免疫グロブリン様転写産物(ＩＬＴ)レセプターの発現はこれら細胞の活性化に応答して調節されることが知られている(Velten et al., Eur. J. Immunol. 34: 2800-2811 (2004)；Ju et al., Gene 331: 159-164 (2004))。例えば、ＩＬＴ２およびＩＬＴ３レセプターの発現はＣｐＧ−ＤＮＡ活性化ＤＣにおいて下方制御されており、ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４及びＩＬＴ５の発現はＩＬ−１０誘導ＤＣにおいて上方制御される。ＴＩＧＩＴがＤＣでのＩＬ−１０産生を刺激するので、活性化ＤＣでのＩＬＴ発現に対するＴＩＧＩＴのの影響を調べた。上記のようにｉＭＤＤＣを単離した。特定のｉＭＤＤＣ群を、ＴＮＦ又はＣＤ４０Ｌにて活性化し、また、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ又はアイソタイプ一致のコントロールにて処置した。処置した細胞は、免疫グロブリン様転写産物２、３又は５(ＩＬＴ２、ＩＬＴ３又はＩＬＴ５)の発現に基づいたＦＡＣＳにて分類した。図２６に示されるように、ｉＭＤＤＣの活性化は、ＩＬＴ２、ＩＬＴ３およびＩＬＴ５発現を下方制御する。対照的に、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃによる活性化及び刺激の処置により、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃにて処置していないが活性化されたｉＭＤＤＣに見られる下方制御と比較して、ＩＬＴ２、ＩＬＴ３及びＩＬＴ５の発現の下方制御が減少した。この観察された効果は、ＤＣでのＩＬ−１０産生を刺激するＴＩＧＩＴの能力によるものであるかもしれない。ＩＬ-１０を発現するＤＣは、免疫寛容原性であって、ＩＬＴの発現レベルが高いことが知られている。しかしながら、ＩＬＴ２、３および５のようなＩＬＴの下方制御も、ＴＩＧＩＴの直接的な効果であり得、ＴＩＧＩＴが耐性を誘導するある方法であるかもしれない。
Ｔ細胞活性化に対する観察されたＴＩＧＩＴ処置のインビトロ効果がインビボ環境に適用しうるか否かを決定するために、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置の効果を、遅発性過敏症(ＤＴＨ)応答でのＴ細胞応答の十分に裏付けされた阻害因子である(Linsley, P.S. et al., Science 257, 792-5 (1992))ＣＴＬＡ４-Ｆｃの効果と比較した。簡単に言うと、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾部の底部に、１００μｌのＣＦＡ(Difco Laboratories)中の１００μｇキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)(Sigma)を皮下投与することによって該マウスを免疫化した。動物の１コホート(ｎ＝１０)は、１、４及び６日目に、１００μｇのマウスのＴＩＧＩＴ-Ｆｃ、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡ、ＣＴＬＡ-４-Ｆｃ又はネガティブアイソタイプコントロール抗ブタクサＩｇＧ２ａを腹腔内投与することによって処置した。６日目に左右の耳厚を計測した。次いで、右耳に２５μｌの生理食塩水を投与し、左耳に２５μｌの生理食塩水中の３０μｇのＫＬＨを投与して抗原刺激した。７日目に、左右の耳厚を再び計測し、７日目と６日目の耳厚の相違を耳腫脹として定めた。各処置群の生理食塩水のみを投与した耳の耳腫脹は０．０２ｍｍ未満であった。耳腫脹測定の後、マウスを安楽死し、脾臓を採取した。単細胞懸濁液を調製し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、ペニシリン(１００Ｕ／ｍｌ)およびストレプトマイシン(１００μｇ／ｍＬ)を含有するＤＭＥＭ中、１×１０６細胞／ｍｌ(２００μｌ／ウェル)の密度で９６ウェル平底プレートで培養した。細胞を、培地単独又は様々な濃度のＫＬＨの存在下で培養した。Ｔ細胞活性化のためのポジティブコントロールとして、細胞を、２μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８(BD Biosciences)を有する５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３(BD Biosciences)にて予めコートしたウェル上で培養した。増殖分析のために、４日間の培養の最後の１８時間に１μＣｉ[３Ｈ]チミジン(Perkin Elmer)を５０μｌの容量で各ウェルに添加し、細胞を採取して、[３Ｈ]チミジンの取込みを液体シンチレーション計測器にて測定した。
ＴＩＧＩＴ-ＦｃおよびＣＴＬＡ４-Ｆｃ処置マウスでは、コントロール処置と比較して有意に低い耳腫脹が測定され、強度は両処置群で同じであった(両群、ｐ＜０．０００１)(図２７Ａ)。ＴＩＧＩＴ-ＦｃとＣＴＬＡ４-Ｆｃとの間に統計的な差はなかった(ｐ＝０．０７)。意味深いことに、ＩＬ-１０欠損マウスでは、ＣＴＬＡ４-ＦｃによりＤＴＨが阻害されるにもかかわらず(ｐ＝０．００４)、ＴＩＧＩＴ-ＦｃはＤＴＨ応答に対して効果がなかった。これはＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ機能でのＩＬ−１０の役割を裏付けるものである。ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ-ＤＡＮＡは、ＤＴＨの阻害時の効果において、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃと類似していたことから、ＴＩＧＩＴ-ＦｃはＦｃが媒介するＰＶＲの架橋結合を必要としなかったことを示す。抗ＴＩＧＩＴはＤＴＨに対して効果がなかった(図２７Ｃ)。アッセイを行い、処置されたマウスでのＫＬＨに対するインビトロ想起(recall)応答を決定し、増殖、ＩＬ−２及びＩＦＮγサイトカイン産生が、ＩＬ−１０欠損マウスではなくＴＩＧＩＴ−Ｆｃ処置野生型において有意に低減していたことが示された(図２７Ｄ−Ｇ)。
試験期間(７日目)にＤＴＨマウスの脾臓からＣＤ１１ｃ＋ＤＣを単離し、ＤＣ増殖及びサイトカインプロフィールに対するＴＩＧＩＴ-Ｆｃの効果を、上記のようにｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＴＩＧＩＴ-ＦｃおよびＣＴＬＡ４-Ｆｃ処置動物から単離した脾臓Ｔ細胞は、アイソタイプ処置コントロール動物と比較して、想起アッセイでのＫＬＨに応答して増殖しなかった(両処置群、ｐ＜０．００１)(図２７Ｂ)。この結果は、ＴＩＧＩＴがＴ細胞初回抗原刺激およびＴ細胞作動性免疫応答のエフェクター段階の間に重要であるかもしれないことを示す。先のＭＤＤＣ試験から得られたインビトロデータと同様に、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置マウスから単離したＣＤ１１ｃ＋細胞は、ＩＬ−１０のｍＲＮＡを増加させ(ｐ＜０．０５)、ＩＬ−１２／２３ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ３５のｍＲＮＡを減少させたが、後者の測定値は統計的有意差には至らなかった(それぞれｐ＝０．０７及び０．０８)(図２７Ｈ)。しかしながら、ＴＩＧＩＴ-Ｆｃ処置は、ＩＬ−１０ＫＯマウス由来のＣＤ１１ｃ＋細胞においてＩＬ−１２ｐ４０／ｐ３５転写に対して僅かな効果しか示さなかったことから、ＴＩＧＩＴが媒介するＩＬ−１２ｐ４０／ｐ３５のｍＲＮＡレベルの下方制御は特異的であって、ＴＩＧＩＴが媒介するＩＬ−１０の上方制御はこのモデルでの炎症誘発性サイトカインＩＬ−１２の下方制御に必要であることが示された。
実施例８：ＴＩＧＩＴ欠損マウス
標準的な技術を用いてＴＩＧＩＴノックアウトマウスを作製した。これらのマウスでの機能的ＴＩＧＩＴ遺伝子の欠如を確認するために、ノックアウト又は野生型マウスの脾臓から総Ｔ細胞を単離し、その後、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と共に３日間インキュベートした。ＲＮｅａｓｙキット(Qiagen)を用いて細胞から総ＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ってＴＩＧＩＴｍＲＮＡを測定した。また、ＣＤ９６ｍＲＮＡレベルをコントロールとして評価した。研究の結果は、ノックアウトマウスがＴＩＧＩＴ発現を欠損していることを示した。
実施例３Ａに記載のようにＦＡＣＳ分析を用いて、腸間膜リンパ節の免疫細胞群を、野生型マウスと比較して９か月齢のＴＩＧＩＴノックアウトマウスにおいて調べた。ＴＩＧＩＴノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ｍＤＣ、ｐＤＣ、単球、ＣＤ１１ｃ＋ＰＶＲｈｉ Ｔ細胞および全Ｂ細胞の数の増加を表した。ナイーブおよび成熟したＣＤ４＋細胞の集団は、ノックアウトマウスと野生型マウスの間で類似していた。また、野生型マウスと比較して、ノックアウトマウスは、脾臓のＭＺＢ(Ｂ２２０＋ＣＤ２１ｈｉ)、ＮＫＴ(ＤＸ５＋ＣＤ４＋又はＤＸ５＋ＣＤ８＋)およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の数が増加していたことが明らかとなった。また、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞レベルの増加は、ノックアウトマウスの腸間膜リンパ節およびパイエル板細胞においても観察された。ノックアウトマウスの腸間膜リンパ節において観察されたｐＤＣ及び単球細胞の数の増加は、それらマウスの脾臓およびパイエル板でも観察されたが、野生型マウスと比較したときのレベルの差異は腸間膜リンパ節においてさほど顕著ではなかった。
また、ＴＩＧＩＴ欠損マウスから単離したＴ細胞の活性も調べた。簡単に言うと、９か月齢のＴＩＧＩＴ欠損マウスと野生型同腹仔から総脾細胞を単離した。各タイプのマウスの１０６細胞を、平底９６ウェルプレートに播き、プレート結合抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)＋抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ)にて刺激した。２日目に、上清を採取し、サイトカイン産生をＬｕｍｉｎｅｘにて分析した。細胞を採取し、ＦＡＣＳを行い、細胞内ＩＦＮγおよびＩＬ−４の存在により分類した。実施例３Ａに記載したように、３Ｈ−チミジン取込みによって細胞増殖を測定した。全般的に実施例４Ａに記載される方法に従ってＭＬＲアッセイを行った。具体的には、ネガティブ単離(ＭＡＣＳ)によって、ＴＩＧＩＴ欠損マウス又は野生型同腹仔の脾臓からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。Ｔ細胞枯渇Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞を３０００ラドで照射し、抗原提示細胞として用いた。２×１０５のＣＤ４＋Ｔ細胞は、１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３(Ｔ細胞のみ)にて刺激するか、又は同種異系の抗原提示細胞と１:２の比率で混合した。実施例３Ａに記載のように、３日目に、３Ｈ−チミジン取込によって増殖を測定した。第二実験では、ＭＬＲアッセイを同じように実施したが、Ｂａｌｂ／ｃマウスからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ＴＩＧＩＴ欠損マウス又は野生型マウスから抗原提示細胞を調製した。
標準的な増殖アッセイにおいて、ＴＩＧＩＴ欠損マウスのＴ細胞は、野生型マウスのＴ細胞と同様に増殖した(図３０Ａ、左パネル)。しかしながら、抗原提示細胞がある場合には、ＴＩＧＩＴ欠損Ｔ細胞は、野生型Ｔ細胞と比較して増殖が増加していた(図３０Ａ、中央パネル)。特に、ＴＩＧＩＴ欠損マウスの脾臓からの抗原提示細胞は、野生型マウスから得た抗原提示細胞と同じ程度に、野生型Ｔ細胞の増殖を刺激した(図３０Ａ、右パネル)。併せて、このデータから、Ｔ細胞は、抗原提示細胞上というよりもＴ細胞上に発現されるＴＩＧＩＴが関与するメカニズムによってそのＴ細胞の増殖が下方制御されることが示唆され、さらに、Ｔ細胞応答の下方制御におけるＴＩＧＩＴの活性が裏付けられる。ＴＩＧＩＴ欠損マウスの多くの割合のＴ細胞は、野生型マウスＴ細胞よりも細胞内ＩＦＮγのレベルが高かった(図３０Ｂ)。ＴＩＧＩＴ欠損のＴ細胞及び野生型のＴ細胞の上清のサイトカイン産生の分析から、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生／分泌が、野生型Ｔ細胞と比較してＴＩＧＩＴ欠損Ｔ細胞において増加していたのに対して、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ７０レベルは２つの細胞群の間で同じであったことが示された。

Claims (38)

  1. 試験免疫細胞が活性化ないし正常なＴｒｅｇ、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＦｈ細胞のいずれであるかを決定する方法であって、試験免疫細胞においてＴＩＧＩＴの発現レベルを評価することと、既知の活性化ないし正常なＴｒｅｇ、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＦｈ細胞におけるＴＩＧＩＴの発現レベルと比較するか、又は試験免疫細胞でのＴＩＧＩＴの発現レベルを一又は複数の既知の基準ＴＩＧＩＴ発現値と比較することとを含む方法。
  2. ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位６７に対応するアミノ酸位のアラニン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位７４に対応するアミノ酸位のグリシン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１４に対応するアミノ酸位のプロリン、およびヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１６に対応するアミノ酸位のグリシン、の一又は複数を含むアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
  3. ポリペプチドがＰＶＲ、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ２、ＰＶＲＬ３、ＰＶＲＬ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６又はＣＤ２２６ではない、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. ポリペプチドが、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位５４に対応するアミノ酸位にバリン、イソロイシンおよびロイシンから選択されるアミノ酸、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位５５に対応するアミノ酸位にセリンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位５６に対応するアミノ酸位にグルタミン、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１２に対応するアミノ酸位にスレオニン、およびヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位１１３に対応するアミノ酸位にフェニルアラニンおよびチロシンから選択されるアミノ酸、の一又は複数をさらに含む、請求項２又は３に記載のポリペプチド。
  5. ポリペプチドが、
    ａ．アミノ酸位５４にバリンおよびイソロイシンから選択されるアミノ酸−アミノ酸位５５にセリンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸−アミノ酸位５６にグルタミン、
    ｂ．位置６７にアラニン−アミノ酸位６８〜７３の各位に任意のアミノ酸−アミノ酸位７４にグリシン、及び、ｃ．アミノ酸位１１２にスレオニン−アミノ酸位１１３にフェニルアラニン及びチロシンから選択されるアミノ酸−アミノ酸位１１４にプロリン−アミノ酸位１１５に任意のアミノ酸−アミノ酸位１１６にグリシン
    から選択される一又は複数の構造サブモチーフを更に含み、ここでアミノ酸位の番号がヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸位置に対応するものである、請求項２又は３に記載のポリペプチド。
  6. 試験ポリペプチドがＴＬＰファミリのポリペプチドのメンバーであるか否かを決定する方法であって、試験ポリペプチドのアミノ酸配列をＴＬＰファミリのポリペプチドの一又は複数のメンバーのアミノ酸配列と整列配置することと、試験ポリペプチドのアミノ酸配列における請求項２に記載のいずれかのアミノ酸の有無を評価することとを含む方法。
  7. 請求項２に記載されるアミノ酸の少なくとも一を含むアミノ酸配列を有する、一又は複数の配列データベース中のタンパク質を同定することによる、ＴＬＰタンパク質ファミリの一又は複数のメンバーを同定する方法。
  8. ＴＬＰファミリメンバーの一又は複数の保存された領域又は実質的に保存された領域と特異的に相互作用する単離された薬剤。
  9. 薬剤がＴＬＰファミリメンバーの発現及び／又は活性のアンタゴニストである、請求項８に記載の薬剤。
  10. アンタゴニストが小分子阻害剤、阻害性抗体ないしその抗原結合性断片、アプタマー、阻害性核酸および阻害性ポリペプチドから選択される、請求項９に記載の薬剤。
  11. 薬剤がＴＬＰファミリメンバーの発現及び／又は活性のアゴニストである、請求項８に記載の薬剤。
  12. 薬剤が、アゴナイズ的抗体ないしその抗原結合断片、アゴナイズ的ペプチド、及びＰＶＲが媒介するＰＶＲ及び／又はＴＩＧＩＴの細胞内シグナル伝達へのＴＩＧＩＴ結合を活性化する小分子ないしタンパク質から選択される、請求項１１に記載の薬剤。
  13. 推定ＴＬＰファミリメンバーのポリペプチドを請求項８に記載の薬剤と接触させ、推定ＴＬＰファミリメンバーへの薬剤の結合を決定することによる、一又は複数のＴＬＰファミリメンバーの同定又は検出方法。
  14. 一又は複数のＰＶＲ、ＰＶＲＬ３およびＰＶＲＬ２へのＴＩＧＩＴの結合を調整することを含む、免疫系機能および／または活性の調整方法。
  15. 配列番号：２３〜２８又は配列番号：３１〜３６に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも一のＨＶＲを含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片。
  16. 抗体軽鎖が配列番号：２１又は２９に示すアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその抗原結合断片。
  17. 抗体重鎖が配列番号：２２又は３０に示すアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその抗原結合断片。
  18. 抗体軽鎖が配列番号：２１又は２９に示すアミノ酸配列を含み、抗体重鎖が配列番号：２２又は３０に示すアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその抗原結合断片。
  19. 抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体およびイムノトキシンから選択される、請求項１５に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその抗原結合断片。
  20. 少なくとも一のＨＶＲは、配列番号：２３〜２８又は３１〜３６のいずれかに示すＨＶＲと少なくとも９０％同一である、請求項１５に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその抗原結合断片。
  21. 軽鎖および／または重鎖が、それぞれ配列番号：２１あるいは２９又は２２あるいは３０に示すアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６又は１７に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体ないしその断片。
  22. インビボ又はインビトロで、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、又はＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニストの少なくとも一を投与することを含む、ＣＤ２２６−ＰＶＲ相互作用及び／又はＣＤ９６−ＰＶＲ相互作用の調節方法。
  23. ＴＩＧＩＴ又はＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニストが投与され、ＣＤ２２６−ＰＶＲ相互作用及び／又はＣＤ９６−ＰＶＲ相互作用が阻害される、請求項２２に記載の方法。
  24. ＴＩＧＩＴ発現及び／又は活性のアンタゴニストが投与され、ＣＤ２２６−ＰＶＲ相互作用及び／又はＣＤ９６−ＰＶＲ相互作用が刺激される、請求項２２に記載の方法。
  25. ＴＩＧＩＴ及び／又はＰＶＲの発現及び／又は活性を調整することによる、または、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴによって媒介される細胞内シグナル伝達を調整することによる、免疫細胞機能および／または活性の調整方法。
  26. 調整が、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアゴニストにてインビトロ又はインビボの細胞を処理することによる、又はＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を刺激することによる、一又は複数の免疫細胞の増殖か又は一又は複数の免疫細胞による炎症誘発性サイトカイン放出を低減ないし阻害することである、請求項２５に記載の方法。
  27. 調整が、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアンタゴニストにてインビトロ又はインビボの細胞を処理することによる、又はＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を阻害することによる、一又は複数の免疫細胞の増殖か又は一又は複数の免疫細胞による炎症誘発性サイトカイン放出を増加ないし刺激することである、請求項２５に記載の方法。
  28. インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアゴニストを投与することによるか又は、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を刺激することによる、免疫応答の阻害方法。
  29. インビトロ又はインビボで、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアンタゴニストを投与することによるか又は、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を阻害することによる、免疫応答の増強ないし刺激方法。
  30. インビトロ又はインビボでＴＩＧＩＴ又はＰＶＲの発現及び／又は活性を調節することによる、免疫細胞からのサイトカイン産生の種類及び／又は量の調節方法。
  31. 炎症誘発性サイトカイン産生が、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアンタゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアンタゴニストを投与することによってか又は、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を阻害することによって刺激される及び／又は増強される、請求項３０に記載の方法。
  32. 炎症誘発性サイトカイン産生が、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、ＰＶＲの発現及び／又は活性のアゴニストを投与することによってか又は、ＰＶＲに結合するＴＩＧＩＴが媒介する細胞内シグナル伝達を刺激することによって阻害される、請求項３０に記載の方法。
  33. ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性のアゴニスト、又はＰＶＲの発現及び／又は活性のアゴニストにより一又は複数の免疫細胞を処理することを含む、一又は複数の免疫細胞のＥＲＫ経路による細胞内シグナル伝達及び／又はＥＲＫリン酸化の刺激方法。
  34. 被検体の異常な免疫細胞応答に関連する免疫関連疾患の診断方法であって、被検体からの試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を評価することと、ＴＩＧＩＴのその発現及び／又は活性をＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の対照量あるいは正常被検体の試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の量と比較することとを含む方法。
  35. 被検体の異常な免疫細胞応答に関連する免疫関連疾患の重症度の評価方法であって、被検体からの試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を評価することと、ＴＩＧＩＴのその発現及び／又は活性をＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の対照量あるいは正常被検体の試料におけるＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性の量と比較することとを含む方法。
  36. 被検体のＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を調整することを含む、被検体の異常な免疫細胞応答に関する免疫関連疾患の予防方法。
  37. 被検体のＴＩＧＩＴの発現及び／又は活性を調整することを含む、被検体の異常な免疫細胞応答に関する免疫関連疾患の重症度の治療ないし低減方法。
  38. 免疫関連疾患が、乾癬、関節炎、炎症性腸疾患又は癌から選択される、請求項３４から３７のいずれか一に記載の方法。
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