JP2021172628A - Selective trp channel activator and applications thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、選択的ＴＲＰチャネル活性化剤、具体的にはＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＭ８の活性化剤に関する。 The present invention relates to selective TRP channel activators, specifically TRPV1 and / or TRPM8 activators.
清涼感や刺激感を付与することを目的として、従来より、化粧品、ヘアケア製品、口腔ケア製品、トイレタリー製品、入浴剤、医薬品等の各種製品には、メントールを始めとする冷感物質がしばしば配合されている。メントールによる冷感の付与は、皮膚や粘膜組織中に存在する知覚神経終末にメントールが直接作用することにより生じると考えられており、この冷感付与に関するメカニズムの検討が進められてきた。 For the purpose of imparting a refreshing and stimulating feeling, various products such as cosmetics, hair care products, oral care products, toiletry products, bath salts, and pharmaceuticals often contain menthol and other cooling substances. Has been done. It is thought that the imparting of cold sensation by menthol is caused by the direct action of menthol on the sensory nerve endings existing in the skin and mucosal tissues, and the mechanism for imparting this cooling sensation has been studied.
この検討のなかで、ラットを用いた試験により、感覚神経のうち、弱い冷却刺激が応答して内向きのイオン電流が生じるニューロンが、メントールに対しても同様の応答性を示すことが発見された（非特許文献１）。この発見により、メントールの刺激による冷感は、内向きのカルシウム電流により引き起こされることが明らかになった。そして、メントール及び冷刺激に応答性を示す受容体として、三叉神経ニューロンからＣＭＲ−１（cold and menthol sensitive receptor）が同定された（非特許文献２）。この受容体は、温度感受性（Transient Receptor Potential：ＴＲＰ）イオンチャネルファミリーに属する興奮性のイオンチャネルであり、ＴＲＰＭ８と称され、これが前述のカルシウム電流を引き起こすと考えられている。前述するように、ＴＲＰＭ８は活性化により冷感を引き起こすため、ＴＲＰＭ８活性化作用を有する化合物は、メントールと同様に冷感（清涼感を含む。以下、同じ）を引き起こす作用を有し、冷感剤として有用であることが知られている（例えば、特許文献１等参照）。そのほか、ＴＲＰＭ８の活性化は鎮痛に関与することが報告されており（非特許文献３）、特に慢性ニューロパシー痛に対して鎮痛作用を発揮することが知られている（特許文献２）。
In this study, a rat study found that among the sensory nerves, neurons that generate inward ion currents in response to weak cooling stimuli show similar responsiveness to menthol. (Non-Patent Document 1). This finding revealed that the menthol-stimulated cooling sensation was caused by an inward calcium current. Then, CMR-1 (cold and menthol sensitive receptor) was identified from trigeminal nerve neurons as a receptor responsive to menthol and cold stimuli (Non-Patent Document 2). This receptor is an excitatory ion channel belonging to the Transient Receptor Potential (TRP) ion channel family and is called TRPM8, which is thought to cause the calcium current described above. As described above, since TRPM8 causes a cooling sensation by activation, the compound having a TRPM8 activating action has an action of causing a cooling sensation (including a refreshing sensation; hereinafter the same) as in menthol, and has a cooling sensation. It is known to be useful as an agent (see, for example,
一方、ＴＲＰＭ８と同じく、ＴＲＰイオンチャネルファミリーに属する興奮性のイオンチャネルであるＴＲＰＶ１は、カプサイシンや４３℃以上の熱刺激で活性化される熱受容体として機能することが確認されている（非特許文献４及び５）。ＴＲＰＶ１は活性化により歯肉上皮細胞を増殖する等の口腔機能への関与が知られている（非特許文献６）。また、ＴＲＰＶ１は表皮細胞にも存在し、ＴＲＰＶ１を刺激して活性化することで表皮細胞のカルシウムイオン濃度が変動すること（特許文献３）、グリコール酸などのケミカルピーリング剤による表皮細胞や真皮線維芽細胞の増殖には、表皮細胞に存在するＴＲＰＶ１の活性化が関与していることが知られている（特許文献４及び５）。 On the other hand, like TRPM8, TRPV1, which is an excitatory ion channel belonging to the TRP ion channel family, has been confirmed to function as a heat receptor activated by capsaicin or a thermal stimulus of 43 ° C. or higher (non-patent). Documents 4 and 5). TRPV1 is known to be involved in oral function such as proliferation of gingival epithelial cells by activation (Non-Patent Document 6). In addition, TRPV1 is also present in epidermal cells, and the calcium ion concentration of epidermal cells fluctuates by stimulating and activating TRPV1 (Patent Document 3), and epidermal cells and dermal fibers due to chemical peeling agents such as glycolic acid. It is known that activation of TRPV1 present in epidermal cells is involved in the proliferation of blast cells (Patent Documents 4 and 5).
ところで、ヒノキチオールは、従来より、抗菌作用、組織に対する収斂作用、および抗炎症作用が知られており、口腔内の歯肉炎や歯槽膿漏の予防または治療を目的として口腔用組成物に配合されている。また、皮膚の創傷治癒、肌荒れの防止または改善、および皮膚のたるみやつやの消失を防ぐ老化防止効果などを目的として、皮膚外用組成物に配合されている。しかしながら、ＴＲＰチャネルへの作用は知られていない。 By the way, hinokitiol has been conventionally known to have antibacterial action, astringent action on tissues, and anti-inflammatory action, and has been incorporated into an oral composition for the purpose of preventing or treating gingival inflammation and alveolar pyorrhea in the oral cavity. There is. In addition, it is blended in an external composition for skin for the purpose of healing wounds on the skin, preventing or improving rough skin, and antiaging effect of preventing sagging and loss of luster of the skin. However, its effect on TRP channels is unknown.
本発明は、ヒノキチオールについて新たに見出した機能に基づいて、ヒノキチオールの新規用途を提供することを課題とする。具体的には、ヒノキチオールを有効成分とする選択的ＴＲＰチャネル活性化剤、具体的にはＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＭ８の活性化剤を提供することを課題とする。また、ヒノキチオールの選択的ＴＲＰチャネル活性化作用に基づく新たな用途を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a new use of hinokitiol based on a function newly found for hinokitiol. Specifically, it is an object of the present invention to provide a selective TRP channel activator containing hinokitiol as an active ingredient, specifically, an activator of TRPV1 and / or TRPM8. Another object of the present invention is to provide a new application based on the selective TRP channel activation action of hinokitiol.
本発明者等は、ヒノキチオールについて新たな機能を見出すべく研究を進めていたところ、ヒノキチオールに、ＴＲＰチャネルの一種であるＴＲＰＶ１を選択的に活性化する機能があることを見出した。さらにヒノキチオールと構造類似の化合物であるγ−ツヤプリシンおよびトロポロンにも、ヒノキチオールと同様にＴＲＰＶ１を選択的に活性化する作用があることを確認した。
さらに本発明者等は、ヒノキチオールに、ＴＲＰチャネルの一種であるＴＲＰＭ８を選択的に活性化する機能があることを見出した。
本発明は、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねて完成したものであり、下記の実施形態を包含するものである。
The present inventors have been conducting research to find a new function for hinokitiol, and have found that hinokitiol has a function of selectively activating TRPV1 which is a kind of TRP channel. Furthermore, it was confirmed that γ-thujaplicin and tropolone, which are compounds structurally similar to hinokitiol, also have an action of selectively activating TRPV1 in the same manner as hinokitiol.
Furthermore, the present inventors have found that hinokitiol has a function of selectively activating TRPM8, which is a kind of TRP channel.
The present invention has been completed by further studying based on these findings, and includes the following embodiments.
（Ｉ）選択的ＴＲＰチャネル活性化剤
（Ｉ−１）ヒノキチオール及びその構造類似化合物よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、選択的ＴＲＰチャネル活性化剤。
（Ｉ−２）活性化されるＴＲＰチャネルが、ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＭ８よりなる群から選択される少なくとも１つである、（Ｉ−１）記載の選択的ＴＲＰチャネル活性化剤。
（Ｉ−３）ヒノキチオールの構造類似化合物が、γ−ツヤプリシンおよびトロポロンよりなる群から選択される少なくとも１つである、（Ｉ−１）または（Ｉ−２）記載の選択的ＴＲＰチャネル活性化剤。
(I) Selective TRP Channel Activator (I-1) A selective TRP channel activator containing at least one selected from the group consisting of hinokitiol and structural analogs thereof as an active ingredient.
(I-2) The selective TRP channel activator according to (I-1), wherein the TRP channel to be activated is at least one selected from the group consisting of TRPV1 and TRPM8.
(I-3) The selective TRP channel activator according to (I-1) or (I-2), wherein the structure-similar compound of hinokitiol is at least one selected from the group consisting of γ-thujaplicin and tropolone. ..
（ＩＩ）温冷覚刺激剤
（ＩＩ−１）ヒノキチオールを有効成分とする温冷覚刺激剤。
（ＩＩ−２）温感剤、冷感剤、または温感若しくは冷感による刺激剤である（ＩＩＩ−１）に記載する温冷覚刺激剤。
(II) Warm / cold stimulant (II-1) A warm / cold stimulant containing hinokitiol as an active ingredient.
(II-2) The warm / cold stimulant according to (III-1), which is a warming agent, a cooling sensitizer, or a warming or cooling stimulant.
（ＩＩＩ）ヒノキチオールの使用方法
（ＩＩＩ−１）ヒノキチオール及びその構造類似化合物よりなる群から選択される少なくとも１種のヒノキチオール化合物を組成物に配合することにより、当該組成物に対して、ＴＲＰＶ１活性化作用、ＴＲＰＭ８活性化作用、および／またはこれらの少なくとも一方の作用に起因する機能を付与することを特徴とする、ヒノキチオール化合物の使用方法。
（ＩＩＩ−２）前記ＴＲＰＶ１活性化作用に起因する機能が、温覚刺激機能である、（ＩＩＩ−１）に記載する方法。
（ＩＩＩ−３）前記ＴＲＰＭ８活性化作用に起因する機能が、冷覚刺激機能である、（ＩＩＩ−１）に記載する方法。
（ＩＩＩ−４）ヒノキチオールの構造類似化合物が、γ−ツヤプリシンおよびトロポロンよりなる群から選択される少なくとも１つである、（ＩＩＩ−１）記載の方法。
(III) Method of Using Hinokitiol (III-1) TRPV1 activation is performed on the composition by blending at least one hinokitiol compound selected from the group consisting of hinokitiol and its structurally similar compounds into the composition. A method of using a hinokitiol compound, which comprises imparting a function resulting from an action, a TRPM8 activating action, and / or at least one of these actions.
(III-2) The method according to (III-1), wherein the function caused by the TRPV1 activating action is a warm sensation stimulating function.
(III-3) The method according to (III-1), wherein the function caused by the TRPM8 activating action is a cold sensation stimulating function.
(III-4) The method according to (III-1), wherein the structure-similar compound of hinokitiol is at least one selected from the group consisting of γ-thujaplicin and tropolone.
ヒノキチオールまたはその構造類似化合物は、細胞中のＴＲＰＶ１を活性化する作用を有しており、ＴＲＰＶ１活性化剤として有用である。このため、ヒノキチオールまたはその構造類似化合物は、ＴＲＰＶ１の活性化に起因する種々の機能を発揮することができる。また、ヒノキチオールまたはその構造類似化合物を、組成物に添加配合することで、当該組成物に対して、ＴＲＰＶ１活性化作用を付与し、当該作用に起因する種々の機能を付与することができる。かかる機能として、制限されないものの、例えば、上皮細胞、表皮細胞、または真皮線維芽細胞の増殖促進作用、および温覚刺激機能を挙げることができる。このため、ヒノキチオール若しくはその構造類似化合物、及びこれらの少なくとも一種を含む組成物は上皮細胞、表皮細胞または真皮線維芽細胞の増殖促進剤としても、また温覚刺激剤（例えば温感剤や熱感剤など）として有用である。 Hinokitiol or a structurally similar compound thereof has an action of activating TRPV1 in cells and is useful as a TRPV1 activator. Therefore, hinokitiol or a structurally similar compound thereof can exert various functions due to activation of TRPV1. Further, by adding and blending hinokitiol or a structurally similar compound thereof to the composition, a TRPV1 activating action can be imparted to the composition, and various functions resulting from the action can be imparted. Such functions include, but are not limited to, proliferative effects of epithelial cells, epidermal cells, or dermal fibroblasts, and warm sensation stimulating functions. Therefore, hinokitiol or a structurally similar compound thereof, and a composition containing at least one of them can be used as a growth promoter for epithelial cells, epidermal cells or dermal fibroblasts, and also as a warming stimulant (for example, warming agent or heat sensation). It is useful as an agent).
ヒノキチオールは、細胞中のＴＲＰＭ８を活性化する作用を有しており、ＴＲＰＭ８活性化剤として有用である。このため、ヒノキチオールは、ＴＲＰＭ８の活性化に起因する種々の機能を発揮することができる。また、ヒノキチオールを、組成物に添加配合することで、当該組成物に対して、ＴＲＰＭ８活性化作用を付与し、当該作用に起因する種々の機能を付与することができる。かかる機能として、制限されないものの、例えば冷覚刺激機能を挙げることができる。このため、ヒノキチオール、またはこれを含む組成物は冷覚刺激剤（例えば清涼剤や冷感剤など）として有用である。 Hinokitiol has an action of activating TRPM8 in cells and is useful as a TRPM8 activator. Therefore, hinokitiol can exert various functions due to the activation of TRPM8. Further, by adding and blending hinokitiol to the composition, it is possible to impart a TRPM8 activating action to the composition and impart various functions caused by the action. Examples of such a function include, but are not limited to, a cold sensation stimulating function. Therefore, hinokitiol, or a composition containing the same, is useful as a cooling stimulant (for example, a cooling agent or a cooling sensation agent).
ヒノキチオール
本発明の選択ＴＲＰチャネル活性化剤（ＴＲＰＶ１活性化剤、ＴＲＰＭ８活性化剤）、及び温冷覚刺激剤は、いずれもヒノキチオールを有効成分（活性本体）とするものである。ヒノキチオールは、β−ツヤプリシンとも称される公知の化合物であり、商業的に入手することができる。ヒノキチオールとして、天然由来のものを使用しても、また化学合成されたものを使用してもよい。また、本発明においてヒノキチオールは、本発明の効果を損なわないかぎり、精製品であっても、粗精製品であってもよく、後者としては、例えばヒバやヒノキなどの樹木から得られるヒノキチオール含有精油を例示することができる。
Hinokitiol The selected TRP channel activator (TRPV1 activator, TRPM8 activator) and the thermo-cooling stimulant of the present invention all contain hinokitiol as an active ingredient (active body). Hinokitiol is a known compound also called β-thujaplicin and is commercially available. As the hinokitiol, a naturally derived one or a chemically synthesized one may be used. Further, in the present invention, the hinokitiol may be a refined product or a crude product as long as the effect of the present invention is not impaired, and the latter is a hinokitiol-containing essential oil obtained from a tree such as hiba or hinoki. Can be exemplified.
ヒノキチオールの構造類似化合物
ヒノキチオールの構造類似化合物としては、γ−ツヤプリシンおよびトロポロンを挙げることができる。当該構造類似化合物は、ヒノキチオールに代えて、またはヒノキチオールと組み合わせて、選択ＴＲＰチャネル活性化剤、特にＴＲＰＶ１活性化剤として使用することができる。当該構造類似化合物も公知の化合物であり、商業的に入手することができる。
Structure-Similar Compounds of Hinokitiol Examples of the structure-similar compound of hinokitiol include γ-thujaplicin and tropolone. The structure analog can be used as a selective TRP channel activator, in particular a TRPV1 activator, in place of or in combination with hinokitiol. The structurally similar compound is also a known compound and is commercially available.
（Ｉ）選択的ＴＲＰチャネル活性化剤
温度感受性Transient Receptor Potential（ＴＲＰ）チャネルは、生体の温感センサーとして発見された受容体である。熱いものや冷たいものに触れたり、極端に暑いまたは寒い環境におかれたりすると、生体に備わっている温感センサーのＴＲＰチャネルが活性化して、脳に危険性を伝える。このとき、ＴＲＰチャネルは、温度だけでなく多くの化学的・物理的刺激を感受するセンサーとして多様な生体機能に関わっている。化学物質への感受性は、有害化合物の暴露に対する生体防御システムとしての役割を担い、有害化合物によりもたらされる刺激は、生体侵害に対する警告信号となっている。一方、さまざまな風味を付与する香辛料やハーブ類は、口蓋や鼻腔における体性感覚神経を活性化することで独特の感覚を惹起し、その適度な刺激（辛み、温感、冷感）が好まれて積極的に摂取されている。ＴＲＰチャネル刺激物質（ＴＲＰチャネル活性化剤）によりもたらされる体性感覚の伝達は抹消から中枢へ至る求心性の一般知覚性神経によって担われる。
(I) Selective TRP channel activator Temperature-sensitive Transient Receptor Potential (TRP) channels are receptors discovered as biological warmth sensors. Touching hot or cold objects, or being exposed to extremely hot or cold environments activates the TRP channels of the body's warmth sensor, transmitting danger to the brain. At this time, TRP channels are involved in various biological functions as sensors that sense not only temperature but also many chemical and physical stimuli. Sensitivity to chemicals plays a role as a biological defense system against exposure to harmful compounds, and the irritation caused by harmful compounds is a warning signal against biological infringement. On the other hand, spices and herbs that impart various flavors induce unique sensations by activating somatosensory nerves in the palate and nasal cavity, and their moderate stimulation (spicy, warm, cold) is preferable. It is actively ingested. Somatosensory transmission provided by TRP channel stimulants (TRP channel activators) is carried out by afferent general sensory nerves from the peripheral to the central nervous system.
本発明が対象とするＴＲＰチャネルは、ＴＲＰＶ１（Transient Receptor Potential Vanilloid 1）およびＴＲＰＭ８（Transient Receptor Potential Melastatin 8）である。実験例で示すように、ヒノキチオールは、複数あるＴＲＰチャネルのうち、ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＭ８を選択的に活性化する作用を有する。またヒノキチオールの構造類似化合物であるγ−ツヤプリシンおよびトロポロンもまた、ＴＲＰＶ１を選択的に活性化する作用を有する。その意味で、これらは選択的ＴＲＰチャネル活性化剤と称される。このため、ヒノキチオール及びその構造類似化合物はＴＲＰＶ１活性化剤として使用することができ、またヒノキチオールはＴＲＰＭ８活性化剤として使用することができる。 The TRP channels targeted by the present invention are TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloid 1) and TRPM 8 (Transient Receptor Potential Melastatin 8). As shown in the experimental example, hinokitiol has an action of selectively activating TRPV1 and TRPM8 among a plurality of TRP channels. In addition, γ-thujaplicin and tropolone, which are structural analogs of hinokitiol, also have an action of selectively activating TRPV1. In that sense, they are referred to as selective TRP channel activators. Therefore, hinokitiol and its structurally similar compounds can be used as TRPV1 activators, and hinokitiol can be used as TRPM8 activators.
（Ｉ−１）ＴＲＰＶ１活性化剤
ＴＲＰＶ１は、辛味成分であるカプサイシンに対する受容体として単離されたＴＲＰチャネルの一つであり、カプサイシン等の辛味成分のほか、４３℃以上の熱、酸（プロトン）、ブラジキニン、ＰＧＥ２、またはＡＴＰ等によって活性化されることが知られている。ＴＲＰＶ１は活性化されると、カチオン、主としてカルシウムイオンの輸送を起こす。当該イオンは濃度勾配の低い方へ流れ、脱分極し、次いで神経末端から神経伝達物質の遊離を引き起こす。ＴＲＰＶ１は、脳、腎臓、気管支上皮細胞や歯肉上皮細胞等の上皮細胞、および表皮角質細胞などの、多くの組織に存在していることが報告されている。またＴＲＰＶ１の活性化は、前記上皮細胞、表皮細胞、及び真皮線維芽細胞の増殖に関連することが知られている（非特許文献６、特許文献４及び５）。
(I-1) TRPV1 activator TRPV1 is one of the TRP channels isolated as a receptor for capsaicin, which is a pungent component. In addition to a pungent component such as capsaicin, heat and acid (proton) at 43 ° C. or higher ), Bradykinin, PGE 2 , or ATP is known to be activated. When TRPV1 is activated, it transports cations, mainly calcium ions. The ions flow to the lower concentration gradient, depolarize, and then cause the release of neurotransmitters from nerve endings. TRPV1 has been reported to be present in many tissues such as brain, kidney, epithelial cells such as bronchial epithelial cells and gingival epithelial cells, and epidermal keratinocytes. Further, activation of TRPV1 is known to be associated with the proliferation of the epithelial cells, epidermal cells, and dermal fibroblasts (Non-Patent Documents 6, Patent Documents 4 and 5).
このため、ヒノキチオール及びその構造類似化合物は、ＴＲＰＶ１活性化剤として用いられることで、ＴＲＰＶ１の活性化を介して、当該ＴＲＰＶ１の活性化に起因する種々の機能を発揮することができる。かかる機能には、ＴＲＰＶ１の活性化を介して生じるあらゆる機能が含まれる。これらの機能には、制限されないものの、上皮細胞（気管支上皮細胞、歯肉上皮細胞など）、表皮細胞、または真皮線維芽細胞の増殖を促進する機能が含まれる。また鎮痛機能、および嚥下障害の治療若しくは予防機能（国際特許公報ＷＯ２０１４／１８１７２４）が含まれる。 Therefore, hinokitiol and its structurally similar compounds can exert various functions caused by the activation of TRPV1 through the activation of TRPV1 by being used as the TRPV1 activator. Such functions include all functions that occur through activation of TRPV1. These functions include, but are not limited to, the function of promoting the proliferation of epithelial cells (bronchial epithelial cells, gingival epithelial cells, etc.), epithelial cells, or dermal fibroblasts. It also includes an analgesic function and a therapeutic or preventive function for dysphagia (International Patent Publication WO2014 / 181724).
なお、歯肉上皮細胞は、歯頚部および歯根部を取り囲んで隣接組織の支持構成物としての役割を果たす口腔内粘膜の上皮細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）である。この上皮細胞は、健康な状態では歯牙のエナメル層表面に付着しているが、歯周炎が進行すると歯周ポケットが形成される。このため、歯肉上皮細胞の増殖を促進することは、歯肉細胞の賦活化、歯肉の活性化、正常化、または修復促進につながり、歯の健全な維持に有用である。このため、ヒノキチオール及びその構造類似化合物は、口腔ケア製品に対して、ＴＲＰＶ１活性化剤、歯肉上皮細胞増殖促進剤、歯肉賦活化剤、歯肉活性化剤、または歯肉修復促進剤として、その機能を発揮する有効量を添加配合して用いることができる。その配合量としては、効果を奏する限り、制限されないものの、最終の口腔ケア製品中に０．０００１〜０．５質量％の範囲で含まれるように、適宜設定調整することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％である。 The gingival epithelial cells are epithelial cells of the oral mucosa (oral inner margin mucosal epithelial cells) that surround the cervical region and the root portion and play a role of supporting constituents of adjacent tissues. In a healthy state, these epithelial cells are attached to the surface of the enamel layer of the tooth, but as periodontitis progresses, periodontal pockets are formed. Therefore, promoting the proliferation of gingival epithelial cells leads to activation of gingival cells, activation of gingiva, normalization, or promotion of restoration, and is useful for maintaining healthy teeth. Therefore, hinokitiol and its structurally similar compounds function as TRPV1 activators, gingival epithelial cell proliferation promoters, gingival activators, gingival activators, or gingival repair promoters in oral care products. It can be used by adding and blending an effective amount to be exhibited. The blending amount is not limited as long as it is effective, but can be appropriately set and adjusted so that it is contained in the range of 0.0001 to 0.5% by mass in the final oral care product. It is preferably 0.005 to 0.2% by mass, more preferably 0.001 to 0.2% by mass.
ＴＲＰＶ１活性化による表皮細胞または真皮線維芽細胞の増殖促進メカニズムは、拘束されるものではないが、特許文献４によると、「表皮細胞のＴＲＰＶ１活性化→表皮細胞内へＣａ２＋イオンが流入→表皮細胞からＡＴＰが遊離→表皮細胞が増殖→表皮細胞からＩＬ−１αが遊離→真皮線維芽細胞が増殖」とされている。このため、ヒノキチオールまたはその構造類似化合物は、ＴＲＰＶ１活性化を介して、表皮細胞または真皮線維芽細胞の増殖促進機能を有し、美肌効果を発揮することが可能となる。具体的には、皮膚の皺、シミ、くすみ、またはニキビなどの改善作用を例示することができる。このため、ヒノキチオール及びその構造類似化合物は、皮膚外用組成物（医薬品、医薬部外品、化粧品）に対して、ＴＲＰＶ１活性化剤、表皮細胞増殖促進剤、真皮線維芽細胞増殖促進剤、肌賦活化剤、はり付与剤、美肌剤、抗しわ剤、抗くすみ剤、アンチエイジェント剤、美白剤、または創傷跡治癒促進剤として、その機能を発揮する有効量を添加配合することができる。その配合量としては、効果を奏する限り、制限されないものの、最終の皮膚外用組成物中に０．０００１〜０．５質量％の範囲で含まれるように、適宜設定調整することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％である。 The mechanism of promoting proliferation of epidermal cells or dermal fibroblasts by TRPV1 activation is not restricted, but according to Patent Document 4, "TRPV1 activation of epidermal cells-> Ca 2+ ions flow into epidermal cells-> epidermis It is said that ATP is released from cells → epidermal cells proliferate → IL-1α is released from epidermal cells → dermal fibroblasts proliferate. Therefore, hinokitiol or a structurally similar compound thereof has a function of promoting proliferation of epidermal cells or dermal fibroblasts through TRPV1 activation, and can exert a skin-beautifying effect. Specifically, it can exemplify the effect of improving skin wrinkles, age spots, dullness, acne and the like. Therefore, hinokithiol and its structurally similar compounds are used as TRPV1 activators, epidermal cell growth promoters, dermal fibroblast growth promoters, and skin activating agents for external skin compositions (pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics). As an agent, a swelling agent, a skin-beautifying agent, an anti-wrinkle agent, an anti-dullness agent, an anti-agent agent, a whitening agent, or a scar healing promoter, an effective amount that exerts its function can be added and blended. The blending amount thereof is not limited as long as it exerts an effect, but can be appropriately set and adjusted so as to be contained in the final external composition for skin in the range of 0.0001 to 0.5% by mass. It is preferably 0.005 to 0.2% by mass, more preferably 0.001 to 0.2% by mass.
また、ＴＲＰＶ１活性化剤は、前述するように鎮痛機能を発揮するため、鎮痛剤としても使用することができる。またＴＲＰＶ１活性化剤は、嚥下障害の治療または予防機能を発揮するため、嚥下障害の治療または予防にも有用である。さらにＴＲＰＶ１活性化剤は、温覚刺激機能を発揮するため、温感剤または熱感剤として使用することができる。このため、ヒノキチオール及びその構造類似化合物は、ＴＲＰＶ１の活性化を介して、鎮痛機能、嚥下障害の治療若しくは予防機能、または温覚刺激機能を発揮し、各種組成物に添加配合することで、当該組成物にかかる機能を付与することができる。 Further, since the TRPV1 activator exerts an analgesic function as described above, it can also be used as an analgesic. The TRPV1 activator also exerts a therapeutic or preventive function on dysphagia, and is therefore useful for the treatment or prevention of dysphagia. Further, the TRPV1 activator exerts a warming stimulating function, and therefore can be used as a warming agent or a heat sensitizer. Therefore, hinokitiol and its structurally similar compounds exert an analgesic function, a therapeutic or preventive function of dysphagia, or a warm sensation stimulating function through activation of TRPV1, and are added to various compositions to obtain the above. The function of the composition can be imparted.
（Ｉ−２）ＴＲＰＭ８活性化剤
ＴＲＰＭ８は、約８〜２８℃の低温で活性化する冷刺激受容体である。ＴＲＰＭ８を発現させた細胞での電気生理学的な解析から、ＴＲＰＭ８はＣａ２＋透過性の高い非選択性陽イオンチャネルであり、ＴＲＰＭ８にリガンドが結合することで、ＴＲＰＭ８が活性化されて同チャネルを通過するＣａ２＋の流入量が上昇して膜の脱分極が生じ、それにより冷感が感じられることが知られている。冷感物質として知られているメントールは、上記リガンド（ＴＲＰＭ８活性化剤）として機能することが知られている化合物である。使用中や使用後における冷感（清涼感を含む）を付与することを目的として、化粧品、口腔ケア製品、トイレタリー製品、ヘヤーケア製品（頭皮を対象とする製品を含む）、入浴剤、皮膚外用剤、医薬品等の各種製品には、ＴＲＰＭ８活性化剤（冷感物質）がしばしば配合されている（特許文献１）。また、ＴＲＰＭ８を活性化することで、慢性ニューロパシー痛が和らぐ（鎮痛作用）ことが知られている（特許文献２）。当該特許文献によると慢性ニューロパシー痛は、中枢神経系の変化に関連した症状であり、制限されないが、外傷誘発ニューロパシー痛、脱髄誘発痛、炎症痛状態、幻肢痛、癌に関連したニューロパシー痛、化学療法誘発ニューロパシー痛、背痛、ならびに骨痛及び癌誘発性骨痛が、含まれるとされている。
(I-2) TRPM8 Activator TRPM8 is a cold stimulus receptor that is activated at a low temperature of about 8 to 28 ° C. From electrophysiological analysis in cells expressing TRPM8, TRPM8 is a non-selective cation channel with high Ca 2+ permeability, and the binding of a ligand to TRPM8 activates TRPM8 to activate the channel. It is known that the inflow of Ca 2+ passing through increases and depolarization of the film occurs, which causes a feeling of coldness. Menthol, known as a cooling sensation substance, is a compound known to function as the above-mentioned ligand (TRPM8 activator). Cosmetics, oral care products, toiletry products, hair care products (including products for the scalp), bath salts, and skin external preparations for the purpose of giving a cool feeling (including a refreshing feeling) during and after use. , Pharmaceuticals and other products often contain TRPM8 activators (cooling substances) (Patent Document 1). Further, it is known that activation of TRPM8 relieves chronic neuropathy pain (analgesic action) (Patent Document 2). According to the patent document, chronic neuropathy pain is a symptom associated with changes in the central nervous system, and is not limited, but traumatically induced neuropathy pain, demyelinating pain, inflammatory pain state, phantom limb pain, and cancer-related neuropathy pain. , Chemotherapy-induced neuropathy pain, back pain, and bone pain and cancer-induced bone pain are allegedly included.
ヒノキチオールは、ＴＲＰＭ８活性化剤として用いられることで、ＴＲＰＭ８の活性化を介して、当該ＴＲＰＭ８の活性化に起因する種々の機能を発揮することができる。かかる機能には、ＴＲＰＭ８の活性化を介して生じるあらゆる機能が含まれる。これらの機能には、制限されないものの、冷覚刺激機能、および慢性ニューロパシー痛に対する鎮痛機能などが含まれる。つまり、ヒノキチオールは、各種組成物（例えば、前述する化粧品、口腔ケア製品、トイレタリー製品、ヘヤーケア製品（頭皮を対象とする製品を含む）、入浴剤、皮膚外用剤、医薬品、飲食物等）に対して、ＴＲＰＭ８活性化剤、冷覚刺激剤、または慢性ニューロパシー痛に対する鎮痛剤として、その機能を発揮する有効量を添加配合して用いることができる。その配合量としては、効果を奏する限り、制限されないものの、最終の組成物中に０．０００１〜０．５質量％の範囲で含まれるように、適宜設定調整することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％である。 When hinokitiol is used as a TRPM8 activator, it can exert various functions resulting from the activation of TRPM8 through the activation of TRPM8. Such functions include all functions that occur through activation of TRPM8. These functions include, but are not limited to, cold stimulus function and analgesic function for chronic neuropathy pain. That is, hinokithiol is used for various compositions (for example, the above-mentioned cosmetics, oral care products, toiletry products, hair care products (including products for the scalp), bath salts, external skin preparations, pharmaceuticals, foods and drinks, etc.). Therefore, as a TRPM8 activator, a cold stimulant, or an analgesic for chronic neuropathic pain, an effective amount that exerts its function can be added and blended. The blending amount is not limited as long as the effect is exhibited, but can be appropriately set and adjusted so as to be contained in the final composition in the range of 0.0001 to 0.5% by mass. It is preferably 0.005 to 0.2% by mass, more preferably 0.001 to 0.2% by mass.
（ＩＩ）上皮細胞、表皮細胞または真皮線維芽細胞の増殖促進剤
前述するように、ヒノキチオールまたはその構造類似化合物は、そのＴＲＰＶ１活性化作用に基づいて、上皮細胞、表皮細胞または真皮線維芽細胞の増殖促進剤の有効成分（活性本体）として機能する。ここで上皮細胞には、歯肉上皮細胞、気管支上皮細胞、表皮角化細胞などが制限なく含まれる。好ましくは、歯肉上皮細胞である。
(II) Proliferation Promoter for Epithelial Cell, Epithelial Cell or Dermal Fibroblast As described above, hinokithiol or a structurally similar compound thereof is used for epithelial cell, epithelial cell or dermal fibroblast based on its TRPV1 activating action. It functions as an active ingredient (active body) of a growth promoter. Here, the epithelial cells include gingival epithelial cells, bronchial epithelial cells, epidermal keratinocytes, and the like without limitation. Preferably, it is a gingival epithelial cell.
このため、本発明の一態様は、ヒノキチオールまたはその構造類似化合物を有効成分とする上皮細胞増殖促進剤、好ましくは歯肉上皮細胞増殖促進剤である。当該上皮細胞増殖促進剤は、ヒノキチオールおよびその構造類似化合物よりなる群から選択される少なくとも１種の化合物（以下、ヒノキチオール化合物と総称する）を有効成分（活性本体）とするものであり、これら１００質量％からなるものであってもよい。ヒノキチオールの構造類似化合物には、γ−ツヤプリシンおよびトロポロンが含まれる。ヒノキチオール化合物として、好ましくはヒノキチオールである。上皮細胞増殖促進剤には、ヒノキチオール化合物のＴＲＰＶ１活性化作用に起因する上皮細胞増殖促進作用を損なわないことを限度として、その形態に応じて、ヒノキチオール化合物以外の成分（例えば、賦形剤、増量剤、抗酸化剤など）を、制限されることなく任意に配合することができる。 Therefore, one aspect of the present invention is an epithelial cell growth-promoting agent containing hinokitiol or a structurally similar compound thereof as an active ingredient, preferably a gingival epithelial cell growth-promoting agent. The epidermal growth-promoting agent contains at least one compound (hereinafter collectively referred to as a hinokitiol compound) selected from the group consisting of hinokitiol and its structurally similar compounds as an active ingredient (active substance), and these 100 It may consist of% by mass. Structural analogs of hinokitiol include γ-thujaplicin and tropolone. The hinokitiol compound is preferably hinokitiol. The epidermal growth-promoting agent contains components other than the hinokitiol compound (for example, excipients, increased amounts) depending on the morphology, as long as the epidermal growth-promoting action caused by the TRPV1 activating action of the hinokitiol compound is not impaired. Agents, antioxidants, etc.) can be arbitrarily blended without limitation.
本発明の上皮細胞増殖促進剤、特に歯肉上皮細胞増殖促進剤は、好適には口腔ケア製品に配合して用いることができる。ここで口腔ケア製品とは、通常の使用過程において、口腔内への任意の機能（例えば、清浄、口臭除去、歯石除去、抗炎症、鎮痛、歯周病や歯肉炎の歯肉疾患や虫歯等の予防または治療など）を目的として、一部若しくは全ての、歯表面及び／又は口腔組織と接触させるのに十分な時間にわたって、口腔内に保持される製品を意味する。口腔ケア製品には、歯磨剤（ペースト、ゲル、粉末、タブレット、又は液体の製剤を含む）、洗口剤、歯肉用クリーム、歯肉縁下用ゲル、義歯装着用製品、又はチューインガムやグミなどが含まれる。これらの口腔ケア製品には、本発明の歯肉上皮細胞増殖促進剤（ヒノキチオールまたはその構造類似化合物）に加えて、各種製品の目的や形態に応じて、慣用の成分を配合することができる。制限されないものの、こうした成分として、研磨剤、増粘剤、湿潤剤、緩衝剤、界面活性剤、風味剤、甘味料、着色料、抗う蝕剤、抗過敏症剤、抗炎症剤、抗歯石剤、キレート化剤、抗酸化剤、または鎮痛剤などを例示することができる。 The epithelial cell growth promoter of the present invention, particularly the gingival epithelial cell growth promoter, can be preferably used in combination with oral care products. Here, the oral care product refers to any function (for example, cleansing, halitosis removal, tartar removal, anti-inflammatory, analgesic, periodontal disease or gingival inflammation, gingival disease, tooth decay, etc.) in the oral cavity during normal use. It means a product that is retained in the oral cavity for the purpose of (prevention or treatment, etc.), in part or in whole, for a sufficient period of time to contact the tooth surface and / or oral tissue. Oral care products include dentifrices (including pastes, gels, powders, tablets, or liquid formulations), mouthwashes, gingival creams, subgingival gels, prosthesis products, or chewing gums and gargling. included. In addition to the gingival epithelial cell growth promoter (hinokitiol or a structurally similar compound thereof) of the present invention, these oral care products can contain conventional ingredients according to the purpose and form of various products. These ingredients include, but are not limited to, abrasives, thickeners, wetting agents, buffers, surfactants, flavoring agents, sweeteners, coloring agents, anti-cariogenic agents, anti-hypersensitivity agents, anti-inflammatory agents, anti-tartar agents. , Chelating agents, anti-inflammatory agents, analgesics and the like can be exemplified.
口腔ケア製品に対するヒノキチオール化合物の配合量は、ＴＲＰＶ１活性化作用に基づいて歯肉上皮細胞の増殖を促進する機能を発揮する有効量であればよく、制限されないものの、最終の口腔ケア製品中に０．０００１〜０．５質量％の範囲で含まれるように、適宜設定調整することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％である。 The amount of the hinokitiol compound blended in the oral care product may be an effective amount that exerts a function of promoting the proliferation of gingival epithelial cells based on the TRPV1 activating action, and is not limited, but is 0. It can be appropriately set and adjusted so that it is contained in the range of 0001 to 0.5% by mass. It is preferably 0.005 to 0.2% by mass, more preferably 0.001 to 0.2% by mass.
また本発明の他の一態様は、ヒノキチオールまたはその構造類似化合物を有効成分とする表皮細胞または真皮線維芽細胞の増殖促進剤（以下、「表皮細胞増殖促進剤」と総称する）である。当該表皮細胞増殖促進剤は、ヒノキチオールおよびその構造類似化合物よりなる群から選択される少なくとも１種の化合物（ヒノキチオール化合物）を有効成分（活性本体）とするものであり、これら１００質量％からなるものであってもよい。ヒノキチオール化合物として、好ましくはヒノキチオールである。表皮細胞増殖促進剤には、ヒノキチオール化合物のＴＲＰＶ１活性化作用に起因する表皮細胞増殖促進作用を損なわないことを限度として、その形態に応じて、ヒノキチオール化合物以外の成分（例えば、賦形剤、増量剤、抗酸化剤など）を、制限されることなく任意に配合することができる。 Another aspect of the present invention is an epidermal cell or dermal fibroblast proliferation promoter (hereinafter collectively referred to as "epidermal cell growth promoter") containing hinokitiol or a structurally similar compound thereof as an active ingredient. The epidermal cell growth promoter contains at least one compound (hinokitiol compound) selected from the group consisting of hinokitiol and its structurally similar compounds as an active ingredient (active body), and is composed of 100% by mass of these. It may be. The hinokitiol compound is preferably hinokitiol. The epidermal cell growth-promoting agent contains components other than the hinokitiol compound (for example, excipients, increased amounts) depending on the form, as long as the epidermal cell growth-promoting action caused by the TRPV1 activating action of the hinokitiol compound is not impaired. Agents, antioxidants, etc.) can be arbitrarily blended without limitation.
本発明の表皮細胞増殖促進剤は、好適には皮膚外用組成物に配合して用いることができる。ここで皮膚外用組成物には、化粧料、外用医薬部外品、および外用医薬品が含まれる。皮膚外用組成物の剤形は任意であり、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティック、軟膏、クリーム等が含まれる。また、不織布等のシートに含浸ないし塗布した形態の製剤も含まれる。化粧料として、制限されないものの、具体的には、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料；ファンデーション、口紅、アイシャドー等のメーキャップ化粧料；日焼け止め化粧料（サンスクリーン剤）；ボディー化粧料；芳香化粧料；メーク落とし、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、シャンプー、リンス、育毛料等の毛髪（頭皮）化粧料等を挙げることができる。制限されないものの、日常的な使用が可能であり、塗布直後の洗い流しを要さないリーブオン型の化粧料が好適に例示される。 The epidermal cell growth promoter of the present invention can be preferably used by blending it in a composition for external use on the skin. Here, the external composition for skin includes cosmetics, quasi-drugs for external use, and pharmaceutical products for external use. The dosage form of the external composition for skin is arbitrary, solution system, solubilization system, emulsification system, powder dispersion system, water-oil two-layer system, water-oil-powder three-layer system, gel, mist, spray, mousse, Includes roll-ons, sticks, ointments, creams and the like. In addition, a pharmaceutical product in the form of being impregnated or applied to a sheet such as a non-woven fabric is also included. Although not limited as cosmetics, specifically, facial cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, and pack; makeup cosmetics such as foundation, lipstick, and eye shadow; sunscreen cosmetics (sunscreen); body Cosmetics; Aromatic cosmetics; Makeup remover, skin cleaning agents such as body shampoo; Hair (scalp) cosmetics such as hair liquid, hair tonic, hair conditioner, shampoo, rinse, hair restorer, etc. can be mentioned. Although not limited, leave-on type cosmetics that can be used on a daily basis and do not require rinsing immediately after application are preferably exemplified.
これらの皮膚外用組成物には、本発明の表皮細胞増殖促進剤（ヒノキチオールまたはその構造類似化合物）に加えて、各種製品の目的や形態に応じて、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる慣用の成分を配合することができる。制限されないものの、例えば、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、水溶性高分子、増粘剤、皮膜剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール、糖、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルジョン、ｐＨ調製剤、皮膚栄養剤、ビタミン、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、水等を例示することができる。 In addition to the epidermal cell growth promoter (hinokitiol or a structurally similar compound thereof) of the present invention, these external compositions for skin are usually used for external skin preparations such as cosmetics and pharmaceuticals according to the purpose and form of various products. Can be blended with conventional ingredients. Although not limited, for example, powder components, liquid fats and oils, solid fats and oils, waxes, hydrocarbons, higher fatty acids, higher alcohols, esters, silicones, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants, nonionic surfactants. , Water-soluble polymer, thickener, film agent, UV absorber, metal ion blocker, lower alcohol, polyhydric alcohol, sugar, amino acid, organic amine, polymer emulsion, pH adjuster, skin nutrient, vitamin, Examples thereof include antioxidants, antioxidant aids, fragrances, and water.
皮膚外用組成物に対するヒノキチオール化合物の配合量は、ＴＲＰＶ１活性化作用に基づいて表皮細胞または真皮線維芽細胞の増殖を促進する機能を発揮する有効量であればよく、制限されないものの、最終の皮膚外用組成物中に０．０００１〜０．５質量％の範囲で含まれるように、適宜設定調整することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％である。 The amount of the hinokitiol compound to be added to the composition for external use on the skin may be an effective amount that exerts a function of promoting the proliferation of epidermal cells or dermal fibroblasts based on the TRPV1 activating action, and is not limited, but is used for the final external use on the skin. It can be appropriately set and adjusted so that it is contained in the composition in the range of 0.0001 to 0.5% by mass. It is preferably 0.005 to 0.2% by mass, more preferably 0.001 to 0.2% by mass.
（ＩＩＩ）温冷覚刺激剤
前述するように、ヒノキチオールは、ＴＲＰＶ１活性化作用またはＴＲＰＭ８活性化作用に基づいて体性感覚、特に皮膚感覚を刺激する機能を有する。当該皮膚感覚には、温覚を刺激する機能（温覚刺激機能）、および冷覚を刺激する機能（冷覚刺激機能）が好適に含まれる。ヒトを含む温血動物においてＴＲＰＶ１またはＴＲＰＭ８が活性化されることよって温度感覚閾値温度が変わり、例えばＴＲＰＶ１活性化により温覚が刺激されると、実際は温度上昇を伴っていないにも拘わらず、「温かい」または「熱い」と感じられ、またそれが過ぎると「痛み」として感じられる。一方、ＴＲＰＭ８活性化により冷覚が刺激されると、実際は温度低下を伴っていないにも拘わらず、「涼しい」または「冷たい」と感じられ、またそれが過ぎると「痛み」として感じられる。本発明において、温冷覚刺激機能とは、ヒトを含む温血動物においてＴＲＰＶ１またはＴＲＰＭ８ を活性化することによって生じる上記の機能を意味する。ヒノキチオールは、ヒトを含む温血動物に対して温冷覚刺激をもたらす温冷覚刺激剤の有効成分（活性本体）として有用である。また、ヒノキチオールは、ヒトを含む温血動物に適用される製品に前記の温冷覚刺激作用を付与するための温冷覚刺激剤の有効成分（活性本体）としても有用である。
(III) Warm / Cold Stimulant As described above, hinokitiol has a function of stimulating somatosensory, particularly skin sensation, based on TRPV1 activating action or TRPM8 activating action. The skin sensation preferably includes a function of stimulating warm sensation (warm sensation stimulating function) and a function of stimulating cold sensation (cold sensation stimulating function). In warm-blooded animals including humans, activation of TRPV1 or TRPM8 changes the temperature sensory threshold temperature. For example, when warm-blooded sensation is stimulated by TRPV1 activation, the temperature does not actually increase. It feels "warm" or "hot" and after that it feels "pain". On the other hand, when the cold sensation is stimulated by TRPM8 activation, it is felt as "cool" or "cold" even though it is not actually accompanied by a decrease in temperature, and after that, it is felt as "pain". In the present invention, the warm-cold sensation stimulating function means the above-mentioned function generated by activating TRPV1 or TRPM8 in a warm-blooded animal including human. Hinokitiol is useful as an active ingredient (active body) of a warm-cold stimulant that causes a warm-cold stimulus to a warm-blooded animal including humans. Hinokitiol is also useful as an active ingredient (active body) of a warm-cold stimulant for imparting the above-mentioned warm-cold stimulant action to a product applied to a warm-blooded animal including humans.
具体的にはヒノキチオールを有効成分（活性本体）とする温冷覚刺激剤には、温覚刺激剤、および冷覚刺激剤が含まれる。前者の温覚刺激剤は、ヒトを含む温血動物に適用されることで温血動物に温かいまたは熱いと感じさせる製剤（温感剤または熱感剤とも称される）を意味し、好適には、例えば皮膚外用組成物（化粧料、外用医薬部外品、外用医薬品）、貼付剤、口腔ケア製品、トイレタリー製品、ヘヤーケア製品（頭皮を対象とする製品を含む）、入浴剤、飲食物などの各種製品に配合して用いることができる。後者の冷覚刺激剤は、ヒトを含む温血動物に適用されることで温血動物に涼しいまたは冷たいと感じさせる製剤（清涼剤または冷感剤とも称される）を意味し、好適には、例えば前記の各種製品に配合して用いることができる。 Specifically, the warm / cold stimulant containing hinokitiol as an active ingredient (active body) includes a warm stimulant and a cold stimulant. The former warming stimulant means a preparation (also referred to as a warming agent or a heat sensitizer) that makes a warm-blooded animal feel warm or hot when applied to warm-blooded animals including humans, and is preferably used. For example, skin external compositions (cosmetics, quasi-drugs, external pharmaceuticals), patches, oral care products, toiletry products, hair care products (including products for the scalp), bath salts, foods and drinks, etc. It can be used by blending with various products of. The latter cold stimulant means a preparation (also referred to as a refreshing agent or a cold sensation agent) that makes a warm-blooded animal feel cool or cold when applied to a warm-blooded animal including humans, and is preferably used. For example, it can be used by blending with the above-mentioned various products.
温冷覚刺激剤はヒノキチオール１００質量％からなるものであってもよい。温冷覚刺激剤には、ヒノキチオールのＴＲＰＭ８活性化作用に起因する温冷覚刺激機能を損なわないことを限度として、その形態に応じて、ヒノキチオール以外の成分（例えば、賦形剤、増量剤、抗酸化剤など）を、制限されることなく任意に配合することができる。 The warm / cold stimulant may consist of 100% by mass of hinokitiol. The warm / cold stimulant contains components other than hinokitiol (for example, excipients, bulking agents, etc.) depending on the form, as long as the warm / cold stimulant function due to the TRPM8 activating action of hinokitiol is not impaired. Antioxidants, etc.) can be arbitrarily blended without limitation.
本発明の温冷覚刺激剤は、前述するように好適には皮膚外用組成物（化粧料、外用医薬部外品、外用医薬品）、口腔ケア製品、飲食物などの各種製品に配合して用いることができる。皮膚外用組成物の形態及び他の配合成分は、本発明の効果を妨げないことを限度として、前述した通りであり、上記記載をここに援用することができる。口腔ケア製品の形態及び他の配合成分も、本発明の効果を妨げないことを限度として、前述した通りであり、上記記載をここに援用することができる。飲食物の形態及び他の配合成分も、本発明の効果を妨げないことを限度として、特に制限されず、慣用の形態及び成分を採用することができる。制限されないものの、好適には、キャンディー、ガム、口中清涼剤、タブレット、飲料水、清涼飲料水等を挙げることができる。 As described above, the warm / cold stimulant of the present invention is preferably used by blending it in various products such as skin external compositions (cosmetics, quasi-drugs, external pharmaceuticals), oral care products, foods and drinks. be able to. The form of the external composition for skin and other ingredients are as described above, as long as they do not interfere with the effects of the present invention, and the above description can be incorporated herein by reference. The form of the oral care product and other compounding ingredients are also as described above, as long as they do not interfere with the effects of the present invention, and the above description can be incorporated herein by reference. The form of food and drink and other compounding ingredients are not particularly limited as long as they do not interfere with the effects of the present invention, and conventional forms and ingredients can be adopted. Although not limited, preferred examples include candies, gums, mouth softeners, tablets, drinking water, soft drinks and the like.
これらの製品に対するヒノキチオールの配合量は、ＴＲＰＶ１活性化作用に基づいて温覚刺激機能を発揮する有効量またはＴＲＰＭ８活性化作用に基づいて冷覚刺激機能を発揮する有効量であればよく、制限されないものの、最終の製品中に０．０００１〜０．５質量％の範囲で含まれるように、適宜設定調整することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％である。 The amount of hinokitiol to be added to these products is not limited as long as it is an effective amount that exerts a warm sensation stimulating function based on the TRPV1 activating action or an effective amount that exerts a cold sensation stimulating function based on the TRPM8 activating action. However, it can be appropriately set and adjusted so that it is contained in the final product in the range of 0.0001 to 0.5% by mass. It is preferably 0.005 to 0.2% by mass, more preferably 0.001 to 0.2% by mass.
（ＩＶ）ヒノキチオールの使用方法
本発明は、ヒノキチオール及びその構造類似化合物よりなる群から選択される少なくとも１種のヒノキチオール化合物の使用方法を提供する。
(IV) Method of Using Hinokitiol The present invention provides a method of using at least one hinokitiol compound selected from the group consisting of hinokitiol and structural analogs thereof.
前述するように、ヒノキチオール及びその構造類似化合物（ヒノキチオール化合物）は、ＴＲＰＶ１活性化作用を有し、その作用に起因して各種機能を発揮する。このため、ヒノキチオール化合物を組成物に配合することで、当該組成物に、ＴＲＰＶ１活性化作用を付与することができ、またその作用に基づいて各種機能を付与することができる。ＴＲＰＶ１活性化作用に基づく機能には、上皮細胞、表皮細胞または真皮線維芽細胞の増殖促進機能、温覚刺激機能、鎮痛機能、または嚥下障害の治療若しくは予防機能が含まれる。対象とする組成物は、付与する機能に応じて、適宜選択することができる。例えば、歯肉上皮細胞増殖促進機能を付与する対象の組成物としては口腔ケア製品を、また表皮細胞または真皮線維芽細胞の増殖促進機能を付与する対象の組成物としては皮膚外用組成物（化粧料、外用医薬部外品、外用医薬品）を、また温覚刺激機能を付与する組成物としては、皮膚外用組成物（化粧料、外用医薬部外品、外用医薬品）、貼付剤、口腔ケア製品、トイレタリー製品、ヘヤーケア製品（頭皮を対象とする製品を含む）、入浴剤、または飲食物等を例示することができる。これらの組成物に配合するヒノキチオール化合物の割合は、制限されないものの、最終の組成物中に０．０００１〜０．５質量％の範囲で含まれるように、適宜設定調整することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％である。 As described above, hinokitiol and its structurally similar compounds (hinokitiol compounds) have a TRPV1 activating action and exert various functions due to the action. Therefore, by blending the hinokitiol compound into the composition, the TRPV1 activating action can be imparted to the composition, and various functions can be imparted based on the action. Functions based on TRPV1 activating action include proliferation promoting function of epithelial cells, epidermal cells or dermal fibroblasts, warming stimulating function, analgesic function, or therapeutic or preventive function of dysphagia. The target composition can be appropriately selected depending on the function to be imparted. For example, an oral care product is used as a composition for imparting a gingival epithelial cell proliferation promoting function, and a skin external composition (cosmetics) is used as a target composition for imparting a proliferation promoting function of epidermal cells or dermal fibroblasts. , External medicine external products, external medicines), and as compositions that impart a warming stimulus function, skin external compositions (cosmetics, external medicine external products, external medicines), patches, oral care products, Examples thereof include toiletry products, hair care products (including products targeting the scalp), bathing agents, foods and drinks, and the like. The proportion of the hinokitiol compound to be blended in these compositions is not limited, but can be appropriately set and adjusted so as to be contained in the final composition in the range of 0.0001 to 0.5% by mass. It is preferably 0.005 to 0.2% by mass, more preferably 0.001 to 0.2% by mass.
ヒノキチオールは、ＴＲＰＭ８活性化作用を有し、その作用に起因して各種機能を発揮する。このため、ヒノキチオールを組成物に配合することで、当該組成物に、ＴＲＰＭ８活性化作用を付与することができ、またその作用に基づいて各種機能を付与することができる。ＴＲＰＭ８活性化作用に基づく機能には、冷覚刺激機能、慢性ニューロパシー痛への鎮痛機能が含まれる。対象とする組成物は、付与する機能に応じて、適宜選択することができる。例えば、冷覚刺激機能を付与する対象の組成物としては、皮膚外用組成物（化粧料、外用医薬部外品、外用医薬品）、貼付剤、口腔ケア製品、トイレタリー製品、ヘヤーケア製品（頭皮を対象とする製品を含む）、入浴剤、飲食物等を例示することができる。これらの組成物に配合するヒノキチオール化合物の割合は、制限されないものの、最終の組成物中に０．０００１〜０．５質量％の範囲で含まれるように、適宜設定調整することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％である。 Hinokitiol has a TRPM8 activating action and exerts various functions due to the action. Therefore, by blending hinokitiol into the composition, the TRPM8 activating action can be imparted to the composition, and various functions can be imparted based on the action. Functions based on the TRPM8 activating action include a cold stimulus function and an analgesic function for chronic neuropathy pain. The target composition can be appropriately selected depending on the function to be imparted. For example, the composition to which the cold sensation stimulating function is given includes an external composition for skin (cosmetics, quasi-drugs, external pharmaceuticals), a patch, an oral care product, a toiletry product, and a hair care product (for the scalp). ), Bath salts, foods and drinks, etc. can be exemplified. The proportion of the hinokitiol compound to be blended in these compositions is not limited, but can be appropriately set and adjusted so as to be contained in the final composition in the range of 0.0001 to 0.5% by mass. It is preferably 0.005 to 0.2% by mass, more preferably 0.001 to 0.2% by mass.
以上、本明細書において、「含む」及び「含有する」の用語には、「からなる」及び「から実質的になる」という意味が含まれる。 As described above, in the present specification, the terms "contains" and "contains" include the meanings of "consisting of" and "consisting of substantially".
以下、本発明の構成及び効果について、その理解を助けるために、実験例を用いて本発明を説明する。但し、本発明はこれらの実験例によって何ら制限を受けるものではない。以下の実験は、特に言及しない限り、室温（２５±５℃）、及び大気圧条件下で実施した。なお、特に言及しない限り、以下に記載する「％」は「質量％」、「部」は「質量部」を意味する。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to experimental examples in order to help understanding the structure and effects of the present invention. However, the present invention is not limited by these experimental examples. The following experiments were performed under room temperature (25 ± 5 ° C.) and atmospheric pressure conditions, unless otherwise noted. Unless otherwise specified, "%" described below means "mass%" and "parts" means "parts by mass".
実験方法
後述する実験は、下記の方法を用いて行った。
（１）細胞培養
ヒト胎児腎細胞由来株HEK293細胞を、10％ウシ胎児血清、30単位/ mlペニシリン、および30μg/ mlストレプトマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地（DMEM製）で、5容量％CO2下で培養した。
Experimental method The experiments described below were carried out using the following methods.
(1) Cell culture Human fetal kidney cell-derived strain HEK293 cells were mixed with Dulbecco's modified Eagle's medium (manufactured by DMEM) containing 10% fetal bovine serum, 30 units / ml penicillin, and 30 μg / ml streptomycin in 5 volume% CO 2 Cultured under.
（２）細胞でのcDNA発現
pCI-neoベクター（Promega Corp.製）を用いて、hTRPM8、hTRPV1、hTRPV3、hTRPV4およびhTRPA1のcDNAをそれぞれ有する組換えプラスミド（ヒトTRPM8発現ベクター、ヒトTRPV1発現ベクター、ヒトTRPV3発現ベクター、ヒトTRPV4発現ベクター、またはヒトTRPA1発現ベクター）を調製した。トランスフェクション試薬であるSuperFect Transfection Reagent（Qiagen製）を使用して、HEK293細胞に前記組換えプラスミドをトランスフェクトした。細胞内Ca2+濃度（[Ca2+]i）の測定および電気生理学的測定のために、組換えプラスミドをpEGFP-Fでコトランスフェクトし、緑色蛍光を有するHEK293細胞を分析した。なお、トランスフェクトされた細胞は、18〜36時間培養させた後に、下記の細胞内カルシウムイオン濃度測定（[Ca2+]i測定）及び電気生理学測定に供した。
(2) cDNA expression in cells
Recombinant plasmids (human TRPM8 expression vector, human TRPV1 expression vector, human TRPV3 expression vector, human TRPV4 expression) having hTRPM8, hTRPV1, hTRPV3, hTRPV4 and hTRPA1 cDNA using pCI-neo vector (manufactured by Promega Corp.), respectively. A vector or a human TRPA1 expression vector) was prepared. The recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells using the transfection reagent SuperFect Transfection Reagent (manufactured by Qiagen). For the measurement of intracellular Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] i ) and electrophysiological measurement, the recombinant plasmid was cotransfected with pEGFP-F and HEK293 cells with green fluorescence were analyzed. The transfected cells were cultured for 18 to 36 hours and then subjected to the following intracellular calcium ion concentration measurement ([Ca 2+ ] i measurement) and electrophysiological measurement.
（３）細胞内の遊離Ca2+濃度測定（[Ca2+]i測定）
トランスフェクトされたHEK293細胞は、ポリ-L-リジンでコーティングされたガラスカバースリップの上に播種してから3〜16時間後に[Ca2+]i測定に供した。2 mMのカルシウムを含有するHEPES緩衝生理食塩水（HBS）（107 mM NaCl、6 mM KCl、1.2 mM MgSO4、2 mM CaCl2、11.5 mMグルコース、および20 mM HEPESを含有。NaOHでpH7.4に調整）に、カルシウム感受性蛍光色素であるFura2-AM（1μM，Sigma社製）を添加して調製した水溶液を用いて、トランスフェクトされたHEK293細胞を、37℃のCO２インキュベーターにて30分間インキュベートした。斯くして当該HEK293細胞にFura2-AMを取り込ませた後、前記HEPES緩衝生理食塩水で洗浄し、[Ca2+]i測定に供した。測定は、室温で行い、細胞の蛍光画像を記録し、cellSensDemension（Olympas Corp.製）で分析した。具体的には、細胞を前記HEPES緩衝生理食塩水（2mMカルシウム水溶液）で還流した後、被験物質を約90秒間、還流適用し、細胞内Caイオン濃度の変化を、Caイメージングシステム（cellSenseDemension, オリンパス社製）にて測定し（励起波長：340nm及び380nm、測定波長：510nm）、340nmで励起したときの蛍光強度と380nmで励起したときの蛍光強度との比（340nm/380nmの蛍光比：Fura2-比）を求めた。
(3) Measurement of intracellular free Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] i measurement)
Transfected HEK293 cells were subjected to [Ca 2+ ] i measurements 3-16 hours after seeding on a poly-L-lysine coated glass coverslip. Contains HEPES buffered saline (HBS) containing 2 mM calcium (107 mM NaCl, 6 mM KCl, 1.2 mM DDL 4 , 2 mM CaCl 2 , 11.5 mM glucose, and 20 mM HEPES; pH 7.4 in NaOH. HEK293 cells transfected with an aqueous solution prepared by adding Fura2-AM (1 μM, manufactured by Sigma), which is a calcium-sensitive fluorescent dye, to a CO 2 incubator at 37 ° C for 30 minutes. Incubated. After incorporating Fura2-AM into the HEK293 cells, the cells were washed with the HEPES buffered saline and subjected to [Ca 2+ ] i measurement. The measurement was performed at room temperature, fluorescence images of cells were recorded, and analysis was performed with cellSensDemension (manufactured by Olympas Corp.). Specifically, after recirculating the cells with the above-mentioned HEPES buffered physiological saline (2 mM calcium aqueous solution), the test substance is recirculated for about 90 seconds, and the change in intracellular Ca ion concentration is measured by the Ca imaging system (cellSenseDemension, Olympus). Measured by (manufactured by the same company) (excitation wavelengths: 340 nm and 380 nm, measurement wavelength: 510 nm), the ratio of the fluorescence intensity when excited at 340 nm to the fluorescence intensity when excited at 380 nm (fluorescence ratio of 340 nm / 380 nm: Fura2) -Ratio) was calculated.
（４）電気生理学測定
電気生理学的測定のために、トランスフェクトされたHEK293細胞を含むカバースリップを、溶液の入ったディッシュに入れた。細胞からの電流を、EPC-10（Heka Elektronik、Lambrecht / Pfalz製）パッチクランプアンプを使用したホールセルモードのパッチクランプ技術を使用して、室温で記録した。ホウケイ酸ガラス・キャピラリー管から調製したパッチ電極の抵抗は2〜4メガオームであった。電流信号は、4-ポール・ベッセルフィルターを用いて、2.9 kHzでフィルター処理し、10 kHzでデジタル化した。コマンドパルス制御、データ収集、およびデータ分析には、Patchmaster（Heka Elektronik製）ソフトウェアを使用した。直列抵抗を補うことで（50〜70％）、電圧誤差を最小化した。全ての実験には−80 mVの保持電位を採用した。外部溶液として、100mM NaCl、5mM KCl、2mM BaCl2、5mM MgCl2、25mM HEPES、および30mMグルコース（NaOHでpH7.3に調整し、D-マンニトールで浸透圧を320mosMに調整）を含む水溶液を使用した。ピペット溶液として、140mM CsCl、4mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES（CsOHでpH 7.3およびD-マンニトールで浸透圧300mosMに調整）を含む水溶液を使用した。
(4) Electrophysiological measurement For electrophysiological measurement, a coverslip containing transfected HEK293 cells was placed in a dish containing a solution. Currents from the cells were recorded at room temperature using whole cell mode patch clamp technology using an EPC-10 (Heka Elektronik, Lambrecht / Pfalz) patch clamp amplifier. The resistance of the patch electrode prepared from the borosilicate glass capillary tube was 2-4 megaohms. The current signal was filtered at 2.9 kHz using a 4-pole Bessel filter and digitized at 10 kHz. Patchmaster (Heka Elektronik) software was used for command pulse control, data collection, and data analysis. The voltage error was minimized by compensating for the series resistance (50-70%). A holding potential of -80 mV was used for all experiments. An aqueous solution containing 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM BaCl 2 , 5 mM MgCl 2 , 25 mM HEPES, and 30 mM glucose (adjusted to pH 7.3 with NaOH and osmolality to 320 mosM with D-mannitol) was used as the external solution. bottom. An aqueous solution containing 140 mM CsCl, 4 mM MgCl 2 , 10 mM EGTA, and 10 mM HEPES (adjusted to pH 7.3 with CsOH and
実験例１ ヒノキチオールによるTRPM8チャネル活性化の測定
被験物質としてヒノキチオールを用いて、ヒトTRPM8を発現するHEK293細胞のヒノキチオールに対する応答を、[Ca2+]i測定及び電気生理学測定により評価した。
結果を、図１に示す。
図１Ａは、[Ca2+]i測定において、ヒトTRPM8を発現するHEK293細胞（n=54）に500μMヒノキチオールを適用した際のFura-2比（340nm/380nmの蛍光比）の経時的変化を示す。図１Ｂは、ヒトTRPM8チャネルを発現するHEK293細胞に適用するヒノキチオールの濃度を変えてFura-2比を測定し（50μM（n=56）、200μM（n=66）、500μM（n=54））、ヒノキチオール非含有HEPES緩衝生理食塩水のFura-2比と、ヒノキチオール含有HEPES緩衝生理食塩水還流後のFura-2比の最大値との差（ΔFura-2比）を算出した結果を示す。図１Ｃは、500μMヒノキチオールによって誘導されたヒトTRPM8を介した細胞内電流をトレースしたものである。図１Ｄは、選択的TRPM8アンタゴニストとして知られているAMTB（N-（3-アミノプロピル）-2-[（3-メチルフェニル）メトキシ] -N-（2-チエニルメチル）ベンズアミド）塩酸塩（AMTB）1μMを含む（＋）、または含まない（−）場合における、ｌ-メントール（137μM）またはヒノキチオール（500μM）に対する応答のΔFura-2比を示したものである。アンタゴニストは各薬剤による処理の60秒前に還流し、その後、共還流した。
Experimental Example 1 Measurement of TRPM8 channel activation by hinokitiol Using hinokitiol as a test substance, the response of HEK293 cells expressing human TRPM8 to hinokitiol was evaluated by [Ca 2+ ] i measurement and electrophysiological measurement.
The results are shown in FIG.
FIG. 1A shows the time course of the Fura-2 ratio (fluorescence ratio of 340 nm / 380 nm) when 500 μM hinokitiol was applied to HEK293 cells (n = 54) expressing human TRPM8 in the [Ca 2+ ] i measurement. show. In FIG. 1B, the Fura-2 ratio was measured by varying the concentration of hinokithiol applied to HEK293 cells expressing human TRPM8 channels (50 μM (n = 56), 200 μM (n = 66), 500 μM (n = 54)). , The result of calculating the difference (ΔFura-2 ratio) between the Fura-2 ratio of the HEPES-buffered saline containing no hinokithiol and the maximum value of the Fura-2 ratio after refluxing the HEPES-buffered saline containing hinokithiol is shown. FIG. 1C is a trace of the intracellular current mediated by human TRPM8 induced by 500 μM hinokitiol. FIG. 1D shows AMTB (N- (3-aminopropyl) -2-[(3-methylphenyl) methoxy] -N- (2-thienylmethyl) benzamide) hydrochloride (AMTB) known as a selective TRPM8 antagonist. ) It shows the ΔFura-2 ratio of the response to l-menthol (137 μM) or hinokitiol (500 μM) when it contains (+) or does not contain (−) 1 μM. The antagonist was refluxed 60 seconds before treatment with each drug and then co-refluxed.
これらの結果から、ヒノキチオールの適用により、TRPM8発現細胞の[Ca2+]iおよび電気生理学的変化はいずれも増加することが確認された。またTRPM8発現細胞の[Ca2+]iは、適用するヒノキチオールの濃度依存的に増加することが確認された。また、TRPM8活性化剤として知られているｌ−メントールと同様に、TRPM8発現細胞におけるヒノキチオールによるCa2+流入は、選択的TRPM8アンタゴニストによって阻害されることが確認された。このことから、ヒノキチオールは、ｌ−メントールと同様に、TRPM8を活性化する作用を有するものと考えられる。 From these results, it was confirmed that the application of hinokitiol increased both [Ca 2+ ] i and electrophysiological changes in TRPM8 expressing cells. It was also confirmed that [Ca 2+ ] i in TRPM8-expressing cells increased in a concentration-dependent manner of the applied hinokitiol. It was also confirmed that the Ca 2+ influx by hinokitiol in TRPM8 expressing cells was inhibited by a selective TRPM8 antagonist, similar to l-menthol known as a TRPM8 activator. From this, it is considered that hinokitiol has an action of activating TRPM8 as well as l-menthol.
実験例２ ヒノキチオールによるTRPV1チャネル活性化の測定
被験物質としてヒノキチオールを用いて、ヒトTRPV1を発現するHEK293細胞のヒノキチオールに対する応答を、[Ca2+]i測定及び電気生理学測定により評価した。
結果を、図２に示す。
図２Ａは、[Ca2+]i測定において、ヒトTRPV1を発現するHEK293細胞（n=62）に500μMヒノキチオールを適用した際のFura-2比（340nm/380nmの蛍光比）の経時的変化を示す。図２Ｂは、ヒトTRPV1を発現するHEK293細胞に適用するヒノキチオールの濃度を変えてFura-2比を測定し（50μM（n=81）、200μM（n=77）、500μM（n=62））、ヒノキチオール非含有HEPES緩衝生理食塩水のFura-2比と、ヒノキチオール含有HEPES緩衝生理食塩水還流後のFura-2比の最大値との差（ΔFura-2比）を算出した結果を示す。図２Ｃは、500μMヒノキチオールによって誘導された全細胞（whole cell）のヒトTRPM8を介した細胞内電流をトレースしたものである。図２Ｄは、TRPV1アンタゴニストとして知られている1μM カプサゼピン（CZP）またはSB-366791（SB）を含む、または含まない（−）場合における、カプサイシノイド（350μM）またはヒノキチオール（500μM）に対する応答のΔFura-2比を示したものである。なお、カプサイシノイドとしてノナン酸バニリルアミドを使用した。アンタゴニストは各薬剤による処理の60秒前に還流し、その後、共還流した。
Experimental Example 2 Measurement of TRPV1 channel activation by hinokitiol Using hinokitiol as a test substance, the response of HEK293 cells expressing human TRPV1 to hinokitiol was evaluated by [Ca 2+ ] i measurement and electrophysiological measurement.
The results are shown in FIG.
FIG. 2A shows the time course of the Fura-2 ratio (fluorescence ratio of 340 nm / 380 nm) when 500 μM hinokitiol was applied to HEK293 cells (n = 62) expressing human TRPV1 in the [Ca 2+ ] i measurement. show. In FIG. 2B, the Fura-2 ratio was measured by varying the concentration of hinokitiol applied to HEK293 cells expressing human TRPV1 (50 μM (n = 81), 200 μM (n = 77), 500 μM (n = 62)). The result of calculating the difference (ΔFura-2 ratio) between the Fura-2 ratio of the hinokitiol-free HEPES-buffered physiological saline and the maximum value of the Fura-2 ratio after the hinokitiol-containing HEPES-buffered physiological saline was refluxed is shown. FIG. 2C is a trace of the intracellular current of whole cells induced by 500 μM hinokitiol via human TRPM8. FIG. 2D shows ΔFura-2 in response to capsaicinoids (350 μM) or hinokitiol (500 μM) with or without 1 μM capsazepine (CZP) or SB-366791 (SB) known as TRPV1 antagonists (-). It shows the ratio. Pelargonic acid vanillylamide was used as the capsaicinoid. The antagonist was refluxed 60 seconds before treatment with each drug and then co-refluxed.
これらの結果から、ヒノキチオールの適用により、TRPV1発現細胞の電気生理学的な変化はわずかであるか、またはほとんど観察されなかったものの、[Ca2+]iは明らかな変化が認められ増加することが確認された。その増加は、適用するヒノキチオールの濃度依存的であった。また、TRPV1発現細胞の[Ca2+]i変化の増加は、TRPV1活性化剤として知られているカプサイシノイドと同様に、TRPV1アンタゴニストによって阻害されることが確認された。このことから、カプサイシノイドと同様に、TRPV1を活性化する作用を有するものと考えられる。 From these results, it can be seen that the application of hinokitiol causes a clear change and an increase in [Ca 2+ ] i , although the electrophysiological change in TRPV1-expressing cells is slight or scarcely observed. confirmed. The increase was dependent on the concentration of hinokitiol applied. It was also confirmed that the increase in [Ca 2+ ] i changes in TRPV1-expressing cells was inhibited by TRPV1 antagonists, similar to capsaicinoids known as TRPV1-activators. From this, it is considered that it has an action of activating TRPV1 like capsaicinoid.
実験例３ ヒノキチオールの構造類似化合物のTRPM8チャネルまたはTRPV1チャネルに対する作用
ヒノキチオール（β-ツヤプリシン）に代えて、実験例１及び２と同様にして、その構造類似体であるγ-ツヤプリシン（500μM）およびトロポロン（500μM）を用いて、ヒトTRPM8またはヒトTRPV1を発現するHEK293細胞のCa2+応答性を測定した。
結果を図３に示す。図３は、ヒトTRPM8を発現するHEK293細胞（ａ）、ヒトTRPV1チャネルを発現するHEK293細胞（ｂ）、及び空のベクターでトランスフェクトされたHEK293細胞（ｃ）に、各々γ-ツヤプリシン（500μM）およびトロポロン（500μM）を適用して、Fura-2比を測定し、各化合物非含有HEPES緩衝生理食塩水のFura-2比と、各化合物含有HEPES緩衝生理食塩水還流後のFura-2比の最大値との差（ΔFura-2比）を算出した結果を示す。
Experimental Example 3 Action of a structurally similar compound of hinokitiol on the TRPM8 channel or TRPV1 channel Instead of hinokitiol (β-thujaplicin), the structural analogs γ-thujaplicin (500 μM) and tropolone are used in the same manner as in Experimental Examples 1 and 2. Using (500 μM), the Ca 2+ responsiveness of HEK293 cells expressing human TRPM8 or human TRPV1 was measured.
The results are shown in FIG. FIG. 3 shows γ-thujaplicin (500 μM) in HEK293 cells (a) expressing human TRPM8, HEK293 cells (b) expressing human TRPV1 channel, and HEK293 cells (c) transfected with an empty vector, respectively. And tropolone (500 μM) was applied to measure the Fura-2 ratio, and the Fura-2 ratio of each compound-free HEPES-buffered physiological saline and the Fura-2 ratio of each compound-containing HEPES-buffered physiological saline after reflux. The result of calculating the difference from the maximum value (ΔFura-2 ratio) is shown.
図３に示すように、[Ca2+]i測定において、TRPM8はほとんど応答しなかった。一方、TRPV1は、両化合物により活性化されることが確認された。このことから、ヒノキチオールの構造類似体であるγ-ツヤプリシンおよびトロポロンは、ヒノキチオールと同様に、TRPV1活性化作用を有し、TRPV1チャネル活性化剤として使用できるものと考えられる。 As shown in FIG. 3, TRPM8 hardly responded in the [Ca 2+] i measurement. On the other hand, TRPV1 was confirmed to be activated by both compounds. From this, it is considered that γ-thujaplicin and tropolone, which are structural analogs of hinokitiol, have a TRPV1 activating effect and can be used as a TRPV1 channel activator, similarly to hinokitiol.
実験例４ ヒノキチオールの他のTRPチャネルへの影響
ヒトTRPA1、ヒトTRPV3、またはヒトTRPV4を発現するHEK293細胞を用いて、これらのTRPチャネルに対するヒノキチオール(500μM)と各アゴニストのCa2+応答性を測定した。
各種TRPチャネルのアゴニストとして下記の化合物を使用した。
TRPA1のアゴニスト：500μM アリルイソチオシアネート（AITC）
TRPV3のアゴニスト：200μM 2-アミノエトキシジフェニルボラン（2-APB）
TRPV4のアゴニスト：1μM GSK-1016790A（GSK）
結果を図４に示す。図４に示すように、ヒノキチオールは、[Ca2+] i測定において、TRPA1、TRPV3、またはTRPV4発現細胞に対して、わずかな変化を与えるか、または顕著な変化は与えなかった。このことから、ヒノキチオールは、実験例１〜３で示すように、TRPTM8、及びTRPV1に対して選択的に作用するものと考えられる。
Experimental Example 4 Effect of hinokitiol on other TRP channels Using HEK293 cells expressing human TRPA1, human TRPV3, or human TRPV4, hinokitiol (500 μM) and Ca 2+ responsiveness of each agonist were measured. bottom.
The following compounds were used as agonists for various TRP channels.
TRPA1 Agonist: 500 μM Allyl Isothiocyanate (AITC)
TRPV3 agonist: 200 μM 2-aminoethoxydiphenylborane (2-APB)
TRPV4 agonist: 1 μM GSK-1016790A (GSK)
The results are shown in FIG. As shown in FIG. 4, hinokitiol gave little or no significant changes to TRPA1, TRPV3, or TRPV4-expressing cells in [Ca 2+] i measurements. From this, it is considered that hinokitiol acts selectively on TRPTM8 and TRPV1 as shown in Experimental Examples 1 to 3.
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