JP2021090418A - 軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法及び軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置、並びに軟骨細胞シートの評価方法及び軟骨細胞シートの評価装置、並びに軟骨細胞シート、軟骨細胞シートの製造方法及び軟骨細胞シートを用いた軟骨再生方法 - Google Patents
軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法及び軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置、並びに軟骨細胞シートの評価方法及び軟骨細胞シートの評価装置、並びに軟骨細胞シート、軟骨細胞シートの製造方法及び軟骨細胞シートを用いた軟骨再生方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性に関連するマーカー遺伝子を移植前の軟骨細胞シートから探索するためのマーカー遺伝子探索方法等を提供する。【解決手段】本発明は、移植前の軟骨細胞シートにおける遺伝子の発現量を測定する測定工程と、移植モデルを用いて移植後の軟骨細胞シートの遺伝子発現及び分泌タンパク質の評価を行い、測定工程で得られた測定結果から、移植後に有効性を示した軟骨細胞シートに特徴的な遺伝子発現プロファイルを解析する解析工程と、解析工程で解析された遺伝子発現プロファイルに基づいて、移植後の有効性に対して正の相関関係を示す遺伝子及び／又は負の相関関係を示す遺伝子を探索する探索工程と、を備える軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法である。【選択図】 図１
Description
本発明は、軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法及び軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置、並びに軟骨細胞シートの評価方法及び軟骨細胞シートの評価装置、並びに軟骨細胞シート、軟骨細胞シートの製造方法及び軟骨細胞シートを用いた軟骨再生方法に関する。
関節軟骨が容易には再生しないことはよく知られている。外傷や変形性関節症（ＯＡ）による損傷後の軟骨の自然修復は期待できない。実際、ＯＡは変性性軟骨疾患に指定されており、４０歳以上の約半数が潜在的な患者と推定されている（非特許文献１）。治療が必要な軟骨損傷の大部分はＯＡが占めているが、ＯＡに対する決定的な治療法は確立されていない。
軟骨細胞シートは、動物由来のコラーゲンなどの材料を用いることなく、熱応答性高分子グラフト培養皿などの温度応答性培養装置を用いて、細胞が付着し、増殖し、シート状に形成されることで作成することができる（非特許文献２、３）。このシートは、温度を下げることで酵素消化を行わずに収穫することができる。この技術を用いることで、軟骨細胞自身が産生する細胞外マトリックスや接着分子を保持したまま、軟骨シートを軟骨病変部に移植することができる（非特許文献４）。軟骨細胞シートは、縫合することなく移植先に付着させることができるため、軟骨細胞は移植部位に留まることになる。
したがって、軟骨シート移植は、関節軟骨病変の治療に有望なアプローチである。関節機能に重要な硝子軟骨（ヒアリン軟骨）による関節軟骨の再生は、ラット、ウサギ、ブタの部分厚や骨軟骨欠損モデルを用いて実証されている（非特許文献４〜７）。
したがって、軟骨シート移植は、関節軟骨病変の治療に有望なアプローチである。関節機能に重要な硝子軟骨（ヒアリン軟骨）による関節軟骨の再生は、ラット、ウサギ、ブタの部分厚や骨軟骨欠損モデルを用いて実証されている（非特許文献４〜７）。
外傷やＯＡ変性による膝関節軟骨損傷を有する２０〜６０歳の患者に対して、患者自身の細胞を用いた軟骨シートによる治療が行われてきた。硝子軟骨を用いて関節軟骨を修復し、治療により関節の臨床状態スコアが改善された（非特許文献８）。これらの結果は、細胞シート移植がＯＡ関連の関節軟骨病変に対する決定的な治療法になる可能性を示唆している。
同種移植の長年の経験に基づき、軟骨組織が免疫寛容であることはよく知られている。同種軟骨片は市販されており、米国では広く移植されている（非特許文献９）。したがって、同種軟骨シートの使用は、適用可能な治療法であると考えられる。同種軟骨細胞シートの関節疾患治療への応用を検討するにあたり、若年性多指症患者の手術検体から得られた軟骨細胞の応用が検討されてきた。これまでに、軟骨細胞シート（ＰＤ（多指症患者由来）シート：ＰＤ軟骨シートともいう）は、間葉系細胞表面マーカーの発現や一部の軟骨同化因子の産生など、自家軟骨細胞と類似した特性を有することを報告されている（非特許文献１０）。
多指症手術の多くは乳児期に行われるため、増殖性の高い軟骨細胞を得ることができる。多くのシートを作製するには単一のドナーから得られる軟骨細胞の数が不十分である場合には、軟骨細胞を培養して増殖させ、将来のＰＤシート作製のための材料として凍結保存する。
ヒト成人膝軟骨細胞シートの骨軟骨欠損に対する有効性は、免疫抑制剤を投与したウサギを用いた異種移植モデルを用いて直接評価できることが報告されている（非特許文献１１）。
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しかし、多指症手術で得られた軟骨組織は、ドナーによって大きさ、軟骨の発達の成熟段階、軟骨膜の割合、軟骨の深さ、肥大帯などが大きく異なる。また、軟骨細胞はディッシュ上での拡大培養では脱分化しやすいことが知られており、培養期間や通過回数のばらつきによってＰＤシートの特性が影響を受けることが想定される。これらの理由から、同種細胞シートに関連する多様性が細胞シート移植の効果に及ぼす影響を明らかにする必要がある。
本発明の目的は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性に関連するマーカー遺伝子を移植前の軟骨細胞シートから探索するための軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法及び軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置を提供することにある。また、本発明の他の目的は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性を移植前の軟骨細胞シートから予測するための軟骨細胞シートの評価方法、軟骨細胞シートの評価装置を提供することにある。また、本発明の他の目的は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性が高い軟骨細胞シート及びその製造方法を提供することにある。また、本発明のさらに他の目的は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性が高い軟骨細胞シートを使用した軟骨再生方法を提供することにある。
本発明者らは、免疫抑制剤を投与したウサギを用いた上記の異種移植モデルを用いて骨軟骨欠損に対するＰＤシートの有効性を評価するとともに、移植したＰＤシートの遺伝子発現や分泌タンパク質の評価を行った。トランスクリプトーム解析及びプロテオーム解析の結果、有効なＰＤシートに特徴的な遺伝子発現プロファイル及び産生因子が明らかになった。さらに、本発明者らは、ＰＤシートの有効性に寄与する分子の生物学的機能を推定し、本発明を完成させた。
本発明は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性に関連するマーカー遺伝子を移植前の軟骨細胞シートから探索するための軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法であって、移植前の軟骨細胞シートを複数ロット準備するシート準備工程と、前記複数ロットの前記移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数のタンパク質の分泌量を測定するタンパク質測定工程と、前記複数ロットの前記軟骨細胞シートのそれぞれを骨軟骨欠損モデル生物に移植して各軟骨細胞シートについて軟骨再生に関する有効性のスコアを算出するスコア算出工程と、前記タンパク質測定工程で測定されたタンパク質の分泌量と、前記スコア算出工程で算出された前記スコアとの相関関係から、前記スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定する遺伝子同定工程と、を備えることを特徴とする軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法である。
この場合において、前記複数ロットの前記移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数の遺伝子の発現レベルを測定する遺伝子測定工程を更に備え、前記遺伝子同定工程は、前記遺伝子測定工程で測定された複数の遺伝子の発現レベルと、前記スコア算出工程で算出された前記スコアとの相関関係から前記スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定することが好ましい。
また、本発明は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性に関連するマーカー遺伝子を移植前の軟骨細胞シートから探索するための軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置であって、移植前の軟骨細胞シートを複数ロット準備するシート準備手段と、前記複数ロットの前記移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数のタンパク質の分泌量を測定するタンパク質測定手段と、前記複数ロットの前記軟骨細胞シートのそれぞれを骨軟骨欠損モデル生物に移植して各軟骨細胞シートについて軟骨再生に関する有効性のスコアを算出するスコア算出手段と、前記タンパク質測定手段で測定されたタンパク質の分泌量と、前記スコア算出手段で算出された前記スコアとの相関関係から、前記スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定する遺伝子同定手段と、を備えることを特徴とする軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置である。
この場合において、前記複数ロットの前記移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数の遺伝子の発現レベルを測定する遺伝子測定手段を更に備え、前記遺伝子同定手段は、前記遺伝子測定手段で測定された複数の遺伝子の発現レベルと、前記スコア算出手段で算出された前記スコアとの相関関係から前記スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定することが好ましい。
また、本発明は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性を移植前の軟骨細胞シートから予測するための軟骨細胞シートの評価方法であって、前記移植前の軟骨細胞シートにおける、ＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＳＳ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＧＲＮ、ＣＹＣＳ、ＩＬ６Ｒ、ＴＨＢＳ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＬＰＩ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＲＣ２、ＤＫＫ４、ＵＦＣ１、ＳＳＴからなる群より選択される正の相関遺伝子の発現量、及び／又はＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦ、ＮＡＣＡ、ＣＸＣＬ６、ＳＭＰＤＬ３Ａ、ＤＫＫＬ１、ＰＲＬ、ＴＥＣ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＣＸＣＬ１２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＩＭＰ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＰＨＢ４、ＫＤＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＳＴＫ１６、ＴＮＦＳＦ１２からなる群より選択される負の相関遺伝子の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定した前記正の相関遺伝子の発現量及び／又は前記負の相関遺伝子の発現量に基づいて前記軟骨細胞シートの移植後の有効性を推定する推定工程と、を備えることを特徴とする軟骨細胞シートの評価方法である。
この場合において、前記正の相関遺伝子が、ＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡからなる群より選択されることが好ましい。
また、前記推定工程は、前記正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上のときに、前記移植前の軟骨細胞シートの有効性が高いと推定することが好ましい。
この場合において、前記負の相関遺伝子が、ＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦからなる群より選択されることが好ましい。
また、前記推定工程は、前記負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下のときに、前記移植前の軟骨細胞シートの有効性が高いと推定することが好ましい。
上記の場合において、前記測定工程は、前記相関遺伝子から転写されたＲＮＡを定量すること、及び／又は前記相関遺伝子がコードするタンパク質を定量することで、前記相関遺伝子の発現量を測定することが好ましい。
また、本発明は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性を移植前の軟骨細胞シートから予測するための軟骨細胞シートの評価装置であって、前記移植前の軟骨細胞シートにおける、ＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＳＳ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＧＲＮ、ＣＹＣＳ、ＩＬ６Ｒ、ＴＨＢＳ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＬＰＩ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＲＣ２、ＤＫＫ４、ＵＦＣ１、ＳＳＴからなる群より選択される正の相関遺伝子の発現量、及び／又はＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦ、ＮＡＣＡ、ＣＸＣＬ６、ＳＭＰＤＬ３Ａ、ＤＫＫＬ１、ＰＲＬ、ＴＥＣ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＣＸＣＬ１２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＩＭＰ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＰＨＢ４、ＫＤＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＳＴＫ１６、ＴＮＦＳＦ１２からなる群より選択される負の相関遺伝子の発現量を測定する測定手段と、前記測定手段で測定した前記正の相関遺伝子の発現量及び／又は負の相関遺伝子の発現量に基づいて前記軟骨細胞シートの移植後の有効性を推定する推定手段と、を備えることを特徴とする軟骨細胞シートの評価装置である。
この場合において、前記正の相関遺伝子が、ＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡからなる群より選択されることが好ましい。
この場合において、前記推定手段は、前記正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上のときに、前記移植前の軟骨細胞シートの有効性が高いと推定することことが好ましい。
この場合において、前記負の相関遺伝子が、ＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦからなる群より選択されることが好ましい。
この場合において、前記推定手段は、前記負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下のときに、前記移植前の軟骨細胞シートの有効性が高いと推定することが好ましい。
上記の場合において、前記測定手段は、前記相関遺伝子から転写されたＲＮＡを定量すること、及び／又は前記相関遺伝子がコードするタンパク質を定量することで、前記相関遺伝子の発現量を測定することが好ましい。
また、本発明は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートであって、移植前の軟骨細胞シートにおけるＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＳＳ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＧＲＮ、ＣＹＣＳ、ＩＬ６Ｒ、ＴＨＢＳ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＬＰＩ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＲＣ２、ＤＫＫ４、ＵＦＣ１、ＳＳＴからなる群より選択される正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上であること、及び／又はＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦ、ＮＡＣＡ、ＣＸＣＬ６、ＳＭＰＤＬ３Ａ、ＤＫＫＬ１、ＰＲＬ、ＴＥＣ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＣＸＣＬ１２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＩＭＰ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＰＨＢ４、ＫＤＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＳＴＫ１６、ＴＮＦＳＦ１２からなる群より選択される負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下であることを特徴とする軟骨細胞シートである。
さらに、本発明は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの製造方法であって、移植前の軟骨細胞シートにおけるＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＳＳ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＧＲＮ、ＣＹＣＳ、ＩＬ６Ｒ、ＴＨＢＳ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＬＰＩ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＲＣ２、ＤＫＫ４、ＵＦＣ１、ＳＳＴからなる群より選択される正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上となるように、及び／又はＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦ、ＮＡＣＡ、ＣＸＣＬ６、ＳＭＰＤＬ３Ａ、ＤＫＫＬ１、ＰＲＬ、ＴＥＣ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＣＸＣＬ１２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＩＭＰ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＰＨＢ４、ＫＤＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＳＴＫ１６、ＴＮＦＳＦ１２からなる群より選択される負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下となるように、軟骨細胞シートを培養することを特徴とする軟骨細胞シートの製造方法である。
さらにまた、本発明は、軟骨細胞シートを用いた軟骨再生方法であって、移植前の軟骨細胞シートにおけるＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＳＳ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＧＲＮ、ＣＹＣＳ、ＩＬ６Ｒ、ＴＨＢＳ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＬＰＩ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＲＣ２、ＤＫＫ４、ＵＦＣ１、ＳＳＴからなる群より選択される正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上である、及び／又はＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦ、ＮＡＣＡ、ＣＸＣＬ６、ＳＭＰＤＬ３Ａ、ＤＫＫＬ１、ＰＲＬ、ＴＥＣ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＣＸＣＬ１２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＩＭＰ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＰＨＢ４、ＫＤＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＳＴＫ１６、ＴＮＦＳＦ１２からなる群より選択される負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下である、軟骨細胞シートを準備する工程と、前記軟骨細胞シートを患者に移植する工程と、を有することを特徴とする軟骨再生方法である。
本発明によれば、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性に関連するマーカー遺伝子を移植前の軟骨細胞シートから探索するための軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法及びマーカー遺伝子探索装置を提供することができる。また、本発明によれば、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性を移植前の軟骨細胞シートから予測するための軟骨細胞シートの評価方法、軟骨細胞シートの評価装置を提供することができる。また、本発明によれば、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性が高い軟骨細胞シート及びその製造方法を提供することができる。さらに、本発明によれば、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性が高い軟骨細胞シートを使用した軟骨再生方法を提供することができる。
以下、本発明の軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法及びマーカー遺伝子探索方法について説明する。また、以下では、軟骨細胞シートの評価方法及び軟骨細胞シートの評価装置並びに軟骨細胞シート、軟骨細胞シートの製造方法及び軟骨細胞シートを用いた軟骨再生方法についても説明する。なお、以下の実施形態及び実施例では、軟骨細胞シートの一種であるＰＤシート（多指症患者由来シート）を用いた例で説明しているが、軟骨細胞シートとしてはＰＤシートに限定されない。
１．軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法
本発明は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性に関連するマーカー遺伝子を移植前の軟骨細胞シートから探索するための軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法である。本発明の軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法は、移植前の軟骨細胞シートを複数ロット準備するシート準備工程と、この複数ロットの移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数のタンパク質の分泌量を測定するタンパク質測定工程と、複数ロットの軟骨細胞シートのそれぞれを骨軟骨欠損モデル生物に移植して各軟骨細胞シートについて軟骨再生に関する有効性のスコアを算出するスコア算出工程と、タンパク質測定工程で測定されたタンパク質の分泌量と、前記スコア算出工程で算出された前記スコアとの相関関係から、スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定する遺伝子同定工程と、を備える。
本発明は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性に関連するマーカー遺伝子を移植前の軟骨細胞シートから探索するための軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法である。本発明の軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法は、移植前の軟骨細胞シートを複数ロット準備するシート準備工程と、この複数ロットの移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数のタンパク質の分泌量を測定するタンパク質測定工程と、複数ロットの軟骨細胞シートのそれぞれを骨軟骨欠損モデル生物に移植して各軟骨細胞シートについて軟骨再生に関する有効性のスコアを算出するスコア算出工程と、タンパク質測定工程で測定されたタンパク質の分泌量と、前記スコア算出工程で算出された前記スコアとの相関関係から、スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定する遺伝子同定工程と、を備える。
１．１．シート準備工程
シート準備工程では、移植前の軟骨細胞シートを複数ロット準備する。軟骨細胞シートの一例であるＰＦシートは、多指症患者から得られた軟骨組織を培養してシート状にすることで得ることができる。本実施形態では、複数の多指症患者由来のＰＤシートで複数ロットの軟骨細胞シートを得ている。
シート準備工程では、移植前の軟骨細胞シートを複数ロット準備する。軟骨細胞シートの一例であるＰＦシートは、多指症患者から得られた軟骨組織を培養してシート状にすることで得ることができる。本実施形態では、複数の多指症患者由来のＰＤシートで複数ロットの軟骨細胞シートを得ている。
１．２．タンパク質測定工程
タンパク質測定工程では、移植前の軟骨細胞シートにおけるタンパク質の分泌量を測定する。本実施形態では、軟骨細胞シートを培養して分泌され培養液の上清に含まれるタンパク質を多重アダプタマーアッセイによって定量している。多重アダプタマーアッセイとしては、ＳＯＭＡｓｃａｎアッセイプラットフォームを用いたアッセイを例示することができる。
タンパク質測定工程では、移植前の軟骨細胞シートにおけるタンパク質の分泌量を測定する。本実施形態では、軟骨細胞シートを培養して分泌され培養液の上清に含まれるタンパク質を多重アダプタマーアッセイによって定量している。多重アダプタマーアッセイとしては、ＳＯＭＡｓｃａｎアッセイプラットフォームを用いたアッセイを例示することができる。
１．３．遺伝子測定工程
遺伝子測定工程では、移植前の軟骨細胞シートにおける遺伝子の発現量を測定する。具体的には、軟骨細胞シートの全ＲＮＡを精製し、これを増幅して定量する。ＲＮＡをシアニン３などで標識したのち、二本鎖ｃＤＮＡに逆転写し、蛍光ｃＲＮＡを生成させ、マイクロアレイを用いてハイブリダイズさせることで、軟骨細胞シートで発現している遺伝子を同定・定量することができる。
遺伝子測定工程では、移植前の軟骨細胞シートにおける遺伝子の発現量を測定する。具体的には、軟骨細胞シートの全ＲＮＡを精製し、これを増幅して定量する。ＲＮＡをシアニン３などで標識したのち、二本鎖ｃＤＮＡに逆転写し、蛍光ｃＲＮＡを生成させ、マイクロアレイを用いてハイブリダイズさせることで、軟骨細胞シートで発現している遺伝子を同定・定量することができる。
１．４．スコア算出工程
スコア算出工程では、複数ロットの軟骨細胞シートのそれぞれを骨軟骨欠損モデル生物に移植する。骨軟骨欠損モデル生物としてはウサギなどを使用することができる。軟骨細胞シート移植後の２〜６週間後に骨軟骨欠損モデル生物から移植部位を採取し、再生軟骨の組織学的スコアリングを行う。ここで「有効性」とは、軟骨細胞シートによって軟骨が再生し軟骨欠損が修復することを意味し、「有効性のスコア」とは、軟骨がどの程度再生したかの具体的な数値を意味する。有効性のスコアとしては、国際軟骨修復協会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ：ＩＣＲＳ）スコア、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコア、Ｗａｋｉｔａｎｉスコアなどを挙げることができる。例えば、後述する実施例では、未治療群の４週間後のＩＣＲＳスコアは約１９〜２５であり、ＩＣＲＳスコアがこれよりも所定の基準値（例えば１０）高ければ有効性ありと判断することができる。
スコア算出工程では、複数ロットの軟骨細胞シートのそれぞれを骨軟骨欠損モデル生物に移植する。骨軟骨欠損モデル生物としてはウサギなどを使用することができる。軟骨細胞シート移植後の２〜６週間後に骨軟骨欠損モデル生物から移植部位を採取し、再生軟骨の組織学的スコアリングを行う。ここで「有効性」とは、軟骨細胞シートによって軟骨が再生し軟骨欠損が修復することを意味し、「有効性のスコア」とは、軟骨がどの程度再生したかの具体的な数値を意味する。有効性のスコアとしては、国際軟骨修復協会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ：ＩＣＲＳ）スコア、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコア、Ｗａｋｉｔａｎｉスコアなどを挙げることができる。例えば、後述する実施例では、未治療群の４週間後のＩＣＲＳスコアは約１９〜２５であり、ＩＣＲＳスコアがこれよりも所定の基準値（例えば１０）高ければ有効性ありと判断することができる。
１．５．遺伝子同定工程
遺伝子同定工程では、タンパク質測定工程で測定されたタンパク質の分泌量（発現レベル）と、スコア算出工程で算出されたスコアとの相関関係を解析する。具体的には、タンパク質の分泌量とスコアとの間でピアソン相関係数を算出し、所定の値（例えば０．４）以上の遺伝子を正の相関を示す遺伝子、所定の値（たとえば０．４）未満の遺伝子を負の相関を示す遺伝子として同定する。
遺伝子同定工程では、タンパク質測定工程で測定されたタンパク質の分泌量（発現レベル）と、スコア算出工程で算出されたスコアとの相関関係を解析する。具体的には、タンパク質の分泌量とスコアとの間でピアソン相関係数を算出し、所定の値（例えば０．４）以上の遺伝子を正の相関を示す遺伝子、所定の値（たとえば０．４）未満の遺伝子を負の相関を示す遺伝子として同定する。
この遺伝子同定工程では、遺伝子測定工程で測定された複数の遺伝子の発現レベルと、スコア算出工程で算出されたスコアとの相関関係から、スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定してもよい。この場合、遺伝子の発現レベルとスコアとの間でピアソン相関係数を算出し、所定の値（例えば０．４）以上の遺伝子を正の相関を示す遺伝子、所定の値（たとえば０．４）未満の遺伝子を負の相関を示す遺伝子として同定する。
さらに、遺伝子同定工程では、タンパク質の分泌量とスコアとの間で相関関係を示す遺伝子と、遺伝子の発現レベルとスコアとの間で相関関係を示す遺伝子の両方で共通する遺伝子を、正の相関を示す遺伝子及び／又は負の相関を示す遺伝子として同定してもよい。このように、軟骨細胞シートで分泌されるタンパク質の分泌量と軟骨細胞シートで発現する遺伝子の発現レベルの両方に基づいて相関遺伝子を同定することで、より確実に有効な遺伝子を同定することができる。
２．軟骨細胞シートの評価方法
本発明の軟骨細胞シートの評価方法は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性を移植前の軟骨細胞シートから予測するための軟骨細胞シートの評価方法であって、（１）正の相関遺伝子の発現量及び／又は負の相関遺伝子の発現量を測定する測定工程と、（２）測定工程で測定した正の相関遺伝子の発現量及び／又は負の相関遺伝子の発現量に基づいて軟骨細胞シートの移植後の有効性を推定する推定工程とを備える。
本発明の軟骨細胞シートの評価方法は、軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性を移植前の軟骨細胞シートから予測するための軟骨細胞シートの評価方法であって、（１）正の相関遺伝子の発現量及び／又は負の相関遺伝子の発現量を測定する測定工程と、（２）測定工程で測定した正の相関遺伝子の発現量及び／又は負の相関遺伝子の発現量に基づいて軟骨細胞シートの移植後の有効性を推定する推定工程とを備える。
ここで、正の相関遺伝子は、ＥＳＭ１（内皮細胞特異的分子１）、ＧＲＥＭ１（グレムリン１、ＤＡＮファミリーＢＭＰアンタゴニスト）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（セルピンファミリーＡメンバー３）、ＤＫＫ１（ディックコプフＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤１）、ＭＩＡ（メラノーマ阻害活性）、ＮＴＮ４（ネトリン４）、ＦＡＢＰ３（脂肪酸結合タンパク質３）、ＰＤＧＦＡ（血小板由来成長因子Ａサブユニット）、ＣＯＬＥＣ１２（コレクチンサブファミリーメンバー１２）、ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）、ＦＴＬ（フェリチン軽鎖）、ＦＴＨ１（フェリチン重鎖１）、ＧＲＮ（グラヌリン前駆体）、ＣＹＣＳ（シトクロムｃ、体細胞）、ＩＬ６Ｒ（インターロイキン６受容体）、ＴＨＢＳ２（トロンボスポンジン２）、ＰＲＫＣＤ（プロテインキナーゼＣデルタ）、ＳＬＰＩ（分泌白血球ペプチダーゼ阻害剤）、ＩＬ１２Ｂ（インターロイキン１２Ｂ）、ＩＬ２３Ａ（インターロイキン２３サブユニットα）、ＭＲＣ２（マンノースレセプターＣ型２）、ＤＫＫ４（ディックコプフＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤４）、ＵＦＣ１（ユビキチン修飾酵素結合酵素１）、ＳＳＴ（ソマトスタチン）からなる群より選択される遺伝子である。
正の相関遺伝子としては、これらのうち、特に、ＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡからなる群より選択される遺伝子であることが好ましい。これらの遺伝子は、後述する実施例で示すように、軟骨細胞シートから分泌されるタンパク質と、軟骨細胞シートで発現する遺伝子の両方において、有効性のスコアと間で正の相関関係を示している。
ここで、負の相関遺伝子は、ＲＡＲＲＥＳ２（レチノイン酸受容体レスポンダー２）、ＡＰＯＥ（アポリポ蛋白質Ｅ）、ＰＧＦ（胎盤成長因子）、ＮＡＣＡ（ナッセントポリペプチド関連複合体アルファサブユニット）、ＣＸＣＬ６（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド６）、ＳＭＰＤＬ３Ａ（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ酸様３Ａ）、ＤＫＫＬ１（ディックコプフ様アクロソームタンパク質１）、ＰＲＬ（プロラクチン）、ＴＥＣ（テックプロテインチロシンキナーゼ）、ＣＣＬ１１（Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１）、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１ベータ）、ＩＦＮＧＲ１（インターフェロン・ガンマ受容体１）、ＣＸＣＬ１２（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１２）、ＭＡＰ３Ｋ７（ミトゲン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ７）、ＴＡＢ１（ＴＧＦ−β活性化キナーゼ１（ＭＡＰ３Ｋ７）結合タンパク質１）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ）、ＴＩＭＰ１（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤１）、ＥＥＦ１Ｂ２（核酸翻訳伸長因子１ベータ２）、ＥＰＨＢ４（ＥＰＨ受容体Ｂ４）、ＫＤＲ（キナーゼ挿入型ドメイン受容体）、ＡＮＧＰＴＬ４（アンジオポエチン様４）、ＳＴＫ１６（セリン／スレオニンキナーゼ１６）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１２）からなる群より選択される遺伝子である。
正の相関遺伝子としては、これらのうち、ＲＡＲＲＥＳ２（レチノイン酸受容体レスポンダー２）、ＡＰＯＥ（アポリポ蛋白質Ｅ）、ＰＧＦ（胎盤成長因子）からなる群より選択される遺伝子であることが好ましい。これらの遺伝子は、後述する実施例で示すように、軟骨細胞シートから分泌されるタンパク質と、軟骨細胞シートで発現する遺伝子の両方において、有効性のスコアと間で負の相関関係を示している。
３．１．測定工程
測定工程は、移植前の軟骨細胞シートで発現している遺伝子の発現レベルを測定する工程である。遺伝子の発現レベルは、上記「１．２．タンパク質測定工程」で説明したように、移植前の軟骨細胞シートにおいて、遺伝子がコードするタンパク質の分泌量から定量することができる。また、遺伝子の発現レベルは、「１．３．遺伝子測定工程」で説明したように、移植前の軟骨細胞シートにおいて遺伝子（ＤＮＡ）から転写されたＲＮＡ量から定量することができる。
測定工程は、移植前の軟骨細胞シートで発現している遺伝子の発現レベルを測定する工程である。遺伝子の発現レベルは、上記「１．２．タンパク質測定工程」で説明したように、移植前の軟骨細胞シートにおいて、遺伝子がコードするタンパク質の分泌量から定量することができる。また、遺伝子の発現レベルは、「１．３．遺伝子測定工程」で説明したように、移植前の軟骨細胞シートにおいて遺伝子（ＤＮＡ）から転写されたＲＮＡ量から定量することができる。
３．２．推定工程
推定工程では、上記の測定工程で測定した遺伝子の発現レベルに基づいて軟骨細胞シートの移植後の有効性を推定する。ここで、有効であると判断される遺伝子の発現量は、遺伝子の種類によって発現量が異なるため、有効性を示す軟骨細胞シートと、有効性がないかあるいは有効性の低い軟骨細胞シートとの対比で相対的に決定される。有効性がないかあるいは有効性の低い軟骨細胞シートは、上述した「１．軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法」で説明した未治療群の４週間後のＩＣＲＳスコアが約１９〜２５（平均２２）であることから、これよりもＩＣＲＳスコアが１０高いＩＣＲＳスコア３２を下回る軟骨細胞シートを有効性がないかあるいは有効性の低い軟骨細胞シートとすることができる。
推定工程では、上記の測定工程で測定した遺伝子の発現レベルに基づいて軟骨細胞シートの移植後の有効性を推定する。ここで、有効であると判断される遺伝子の発現量は、遺伝子の種類によって発現量が異なるため、有効性を示す軟骨細胞シートと、有効性がないかあるいは有効性の低い軟骨細胞シートとの対比で相対的に決定される。有効性がないかあるいは有効性の低い軟骨細胞シートは、上述した「１．軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法」で説明した未治療群の４週間後のＩＣＲＳスコアが約１９〜２５（平均２２）であることから、これよりもＩＣＲＳスコアが１０高いＩＣＲＳスコア３２を下回る軟骨細胞シートを有効性がないかあるいは有効性の低い軟骨細胞シートとすることができる。
以下、正の相関遺伝子について説明する。有効性がないかあるいは有効性の低い軟骨細胞シートにおける遺伝子の発現量と比較して、軟骨細胞シートにおける正の相関遺伝子の発現量が、例えばＩＣＲＳスコアが所定の基準値（例えば１０）向上する遺伝子の発現量以上となった場合に、その軟骨細胞シートは有効であると判断することができる。逆に、正の相関遺伝子の発現量が、この所定の基準値となる遺伝子の発現量未満となった場合に、その軟骨細胞シートは有効ではないと判断することができる。
この所定の基準値は、後述する実施例の条件では１０であることが好ましいが、軟骨細胞シートの評価条件に応じて適宜設定することができ、例えば１０以外にも、２０、１５、５、４、３、２などであってもよい。この基準値は、軟骨細胞シートで発現する遺伝子と、軟骨細胞シートから分泌されるタンパク質の分泌量とで、同じ値であってもよく、異なる値であってもよい。以下、所定の基準値が１０の例について説明する。
正の相関遺伝子の代表的なものについて、下記表に、ＩＣＲＳスコアが１０向上する遺伝子の発現量を記載した。例えば、有効性を示す数値指標として、ＩＴＧＡ１０の場合、その遺伝子の発現量が１９．１倍に増えると、移植後の有効性を示すＩＣＲＳスコアが１０向上する。ＡＣＡＮの場合、２８．３倍発現量が増えると、移植後の有効性を示すＩＣＲＳスコアが１０向上する。同様に、各遺伝子を検討すると、ＮＧＥＦの場合６．０倍、Ｃ１５ｏｒｆ５２の場合３．４倍、ＨＯＸＡ３の場合３．９倍などとなる。なお、ＩＣＲＳスコアを１０倍向上した場合の発現量比は、遺伝子の発現値とＩＣＲＳとの相関解析において、回帰分析を行い、最小二乗法を適応した際に求められる傾きから、発現量比とＩＣＲＳスコアの差との関係を導きだして算出した。後述する分泌タンパク質における発現量比についても同様である。以下の表に、回帰分析を行った結果の回帰直線式を記載する。なお、遺伝子の発現量は、取得データ（シグナル強度）が１上がると量が２倍という換算になっている。この回帰直線式とＩＣＲＳスコアとから発現量の絶対値を算出できるため、例えばＩＣＲＳスコアの値が３２以上の発現量の場合に軟骨細胞シートの有効性が高いと判断することが可能である。
また、正の相関遺伝子の代表的なものに関して、下記表に、ＩＣＲＳスコアが１０向上する分泌タンパク質の発現量（分泌量）を記載した。軟骨細胞シートから分泌されるタンパク質の分泌量比として、ＥＳＭ１が６．５倍増えると、ＩＣＲＳスコアが１０向上する。同様に、ＧＲＥＭ１が３．４倍増えると、ＩＣＲＳスコアが１０向上する。同様に、ＳＥＲＰＩＮＡ３は９．８倍、ＤＫＫ１は９．１倍、ＭＩＡは１４．０倍、ＮＴＮ４は７．０倍、ＰＤＧＦＡは３．１倍、ＦＡＢＰ３は１３５倍である。
次に、負の相関遺伝子の代表的なものについて説明する。有効性がないかあるいは有効性の低い軟骨細胞シートにおける遺伝子の発現量と比較して、軟骨細胞シートにおける負の相関遺伝子の発現量が、例えばＩＣＲＳスコアが所定の基準値（例えば１０）低下する遺伝子の発現量以下となった場合に、その軟骨細胞シートは有効であると判断することができる。逆に、負の相関遺伝子の発現量が、この所定の基準値となる遺伝子の発現量以上となった場合に、その軟骨細胞シートは有効ではないと判断することができる。
この所定の基準値は、後述する実施例の条件では１０であることが好ましいが、軟骨細胞シートの評価条件に応じて適宜設定することができ、例えば１０以外にも、２０、１５、５、４、３、２などであってもよい。この基準値は、軟骨細胞シートで発現する遺伝子と、軟骨細胞シートから分泌されるタンパク質の分泌量とで、同じ値であってもよく、異なる値であってもよい。以下、所定の基準値が１０の例について説明する。
また、例えば、負の相関遺伝子の代表的なものに関して、下記表に、ＩＣＲＳスコアが１０低下する遺伝子の発現量を記載した。ＢＲＤ９の場合、その遺伝子発現量が３．６倍増えると、移植後の有効性を示すＩＣＲＳスコアが１０低下する。ＴＵＳＣ１の場合、６．５倍発現量が増えると、移植後の有効性を示すＩＣＲＳスコアが１０低下する。同様に、ＳＰＲＹ１は６．２倍、Ｃ１ｏｒｆ２２９は５．１倍、ＨＡＧＨＬは７．０倍などとなる。
また、負の相関遺伝子に関して、下記表に、ＩＣＲＳスコアが１０低下する分泌タンパク質の発現量（分泌量）を記載した。軟骨細胞シートから分泌されるタンパク質の分泌量比として、ＲＡＲＲＥＳ２が１３．１倍増えると、ＩＣＲＳスコアが１０低下する。同様に、ＡＰＯＥは４．８倍、ＰＧＦは１８．６倍である。
３．軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置及び軟骨細胞シートの評価装置
本発明のマーカー遺伝子探索装置及び軟骨細胞シートの評価装置は、上記のマーカー遺伝子探索方法及び軟骨細胞シートの評価方法をそれぞれ実施するための装置である。図１は、マーカー遺伝子探索装置及び軟骨細胞シートの評価装置の概要を示す模式図である。まず、上記の軟骨細胞シートを用意する（シート準備手段）。また、軟骨細胞シートをＰＣＲ Ｐａｎｅｌなどで分析して遺伝子の発現量を測定する（遺伝子測定手段：測定手段）。また、軟骨細胞シートをタンパク質発現解析によってタンパク質の分泌量を測定する（タンパク質測定手段：測定手段）。解析されたデータは解析・数値化実行データベースに格納される。なお、解析・数値化実行データベースには、公共データベースを使用して解析したデータを格納してもよい。
本発明のマーカー遺伝子探索装置及び軟骨細胞シートの評価装置は、上記のマーカー遺伝子探索方法及び軟骨細胞シートの評価方法をそれぞれ実施するための装置である。図１は、マーカー遺伝子探索装置及び軟骨細胞シートの評価装置の概要を示す模式図である。まず、上記の軟骨細胞シートを用意する（シート準備手段）。また、軟骨細胞シートをＰＣＲ Ｐａｎｅｌなどで分析して遺伝子の発現量を測定する（遺伝子測定手段：測定手段）。また、軟骨細胞シートをタンパク質発現解析によってタンパク質の分泌量を測定する（タンパク質測定手段：測定手段）。解析されたデータは解析・数値化実行データベースに格納される。なお、解析・数値化実行データベースには、公共データベースを使用して解析したデータを格納してもよい。
一方、本軟骨欠損モデル生物に軟骨細胞シートを移植し、軟骨の再生状況を解析して軟骨再生の有効性のスコアを算出する統合情報解析システム（スコア算出手段）と、これをデータベース化した細胞情報データベースを備えている。細胞情報データベースに格納された細胞情報データは、解析・数値化実行データベースのデータとともに、統合情報解析システムで解析される。この統合情報解析システムでは、上記の「遺伝子同定工程」と同様に、タンパク質の分泌量（発現レベル）と有効性のスコアとの相関関係をプログラム・アルゴリズム（遺伝子同定手段）で解析して、有効性と相関関係を示す遺伝子を同定する。また、遺伝子の発現レベルと有効性のスコアとの相関関係を解析して遺伝子を同定することもできる。さらに、タンパク質の分泌量と遺伝子の発現レベルの両方で共通する遺伝子を同定することもできる。
さらに、統合情報解析システム（推定手段）では、正の相関遺伝子と負の相関遺伝子の発現レベルに基づいて、マーカーによる有効性を予測することもできる。すなわち、解析・数値化実行データベースに格納された正の相関遺伝子の発現レベルが所定の数値以上の軟骨細胞シートについては有効性ありと評価し、負の相関遺伝子の発現レベルが所定の数値以上の軟骨細胞シートについては有効性なしと評価する。あるいは、正の相関遺伝子の発現レベルが所定の数値未満の軟骨細胞シートについては有効性なしと評価し、負の相関遺伝子の発現レベルが所定の数値未満の軟骨細胞シートについては有効性ありと評価してもよい。評価結果は、細胞機能・品質評価レポートとして出力することができる。
４．軟骨細胞シート及びその製造方法
次に、本発明の軟骨細胞シート及びその製造方法について説明する。本発明の軟骨細胞シートは、移植前の軟骨細胞シートにおける正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上であること、及び／又は負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下である。ここで、正の相関遺伝子及び負の相関遺伝子は、上記の「２．軟骨細胞シートの評価方法」で挙げた遺伝子である。
次に、本発明の軟骨細胞シート及びその製造方法について説明する。本発明の軟骨細胞シートは、移植前の軟骨細胞シートにおける正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上であること、及び／又は負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下である。ここで、正の相関遺伝子及び負の相関遺伝子は、上記の「２．軟骨細胞シートの評価方法」で挙げた遺伝子である。
また、本発明の軟骨細胞シートの製造方法は、移植前の軟骨細胞シートにおける正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上となるように、及び／又は負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下となるように、軟骨培養シートを培養する方法である。ここで、正の相関遺伝子及び負の相関遺伝子は、上記の「２．軟骨細胞シートの評価方法」で挙げた遺伝子である。
軟骨細胞シートの製造方法は、まず、若年性多指症患者の多指から得られた軟骨組織を調製培地で消化して軟骨細胞を単離し、これを培養皿に載せて培養する。調製培地としては、（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ-Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）などを挙げることができる。次に、上記で培養した軟骨細胞を培養インサートに播種して培養することで、軟骨培養シートを得ることができる。
本発明では、移植前の軟骨細胞シートにおける正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上となるような条件で上記の培養を行う。このような条件としては、正の相関遺伝子の発現を促進させる因子（化合物など）を添加して培養を行うことなどが考えられる。また、本発明では、移植前の軟骨細胞シートにおける負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下となるような条件で上記の培養を行う。このような条件としては、負の相関遺伝子の発現を低下させる因子（化合物など）を添加して培養を行うことなどが考えられる。
５．軟骨細胞シートを用いた軟骨再生方法
本発明は、移植前の軟骨細胞シートにおける正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上である、及び／又は負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下である、軟骨細胞シートを準備する工程と、軟骨細胞シートを患者に移植する工程と、を有する方法である。ここで、正の相関遺伝子及び負の相関遺伝子は、上述した「２．軟骨細胞シートの評価方法」で挙げた遺伝子である。
本発明は、移植前の軟骨細胞シートにおける正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上である、及び／又は負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下である、軟骨細胞シートを準備する工程と、軟骨細胞シートを患者に移植する工程と、を有する方法である。ここで、正の相関遺伝子及び負の相関遺伝子は、上述した「２．軟骨細胞シートの評価方法」で挙げた遺伝子である。
本発明の軟骨再生方法では、移植後の有効性の高い軟骨細胞シートを患者に移植しているため、軟骨再生効率が高く、軟骨細胞シートの移植後の予後が良好である。
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。また、以下の実施例において「％」表示は特に規定しない限り質量基準（質量パ−セント）である。
１．材料と方法
１．１．倫理声明
実験は東海大学医学部臨床研究審査委員会の承認と指導のもとに実施した。インフォームドコンセントはすべての場合において、提供者の保護者から取得した。一部の手術標本は不可逆的に身元が特定できないようにした。ヒトの細胞や組織を扱うすべての実験は、ヘルシンキ宣言の信条に沿って行われた。
動物実験は、東海大学の施設動物実験委員会の承認を得て、動物の取り扱いや飼育については、文部科学省所管の「動物実験に関する施設規則」及び「学術研究機関における動物実験等の適正な実施のための基本指針」に準拠して実施した。
１．１．倫理声明
実験は東海大学医学部臨床研究審査委員会の承認と指導のもとに実施した。インフォームドコンセントはすべての場合において、提供者の保護者から取得した。一部の手術標本は不可逆的に身元が特定できないようにした。ヒトの細胞や組織を扱うすべての実験は、ヘルシンキ宣言の信条に沿って行われた。
動物実験は、東海大学の施設動物実験委員会の承認を得て、動物の取り扱いや飼育については、文部科学省所管の「動物実験に関する施設規則」及び「学術研究機関における動物実験等の適正な実施のための基本指針」に準拠して実施した。
１．２．ＰＤシートの作製
１．２．１．軟骨細胞の調製
軟骨細胞は、上記に記載された調製手順に従って単離した（非特許文献１０）。簡潔に説明すると、若年性多指症患者（１１人の患者、年齢８〜２３ヶ月、５人の女児、４人の男児及び２人の非同定ドナー）から得られた軟骨組織を、２０％ウシ胎児血清及び１％抗生物質−抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）を補充した調製培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ-Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）， Ｇｉｂｃｏ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＵＳＡ）中で、５ｍｇ／ｍｌのＣＬＳ１（コラゲナーゼＩ型）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．Ｌａｋｅｗｏｏｄ， ＮＪ ，ＵＳＡ）により、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気中で、３７℃で２〜３時間撹拌して消化した。単離した軟骨細胞を調製培地で洗浄し、培養皿に播種した。培養皿に細胞が付着して増殖を開始した後、１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸（日清製薬、山形県、日本）を含む調製培地に培地を交換した。２つのケースでは、組織を１ｍｍ３以下の大きさにミンチ状にし、調製培地中の培養皿に載せ、細胞が不完全になるまで培養した。軟骨細胞は、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、東京、日本）を用いて採取し、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲＴＭ（ゼノアック社、福島県、日本）又はＴＣ−Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ細胞凍結培地（ＫＡＣ社、京都府、日本）で凍結保存した。いくつかのドナーは、凍結保存前に最大５回まで継代された。
１．２．１．軟骨細胞の調製
軟骨細胞は、上記に記載された調製手順に従って単離した（非特許文献１０）。簡潔に説明すると、若年性多指症患者（１１人の患者、年齢８〜２３ヶ月、５人の女児、４人の男児及び２人の非同定ドナー）から得られた軟骨組織を、２０％ウシ胎児血清及び１％抗生物質−抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）を補充した調製培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ-Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）， Ｇｉｂｃｏ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＵＳＡ）中で、５ｍｇ／ｍｌのＣＬＳ１（コラゲナーゼＩ型）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．Ｌａｋｅｗｏｏｄ， ＮＪ ，ＵＳＡ）により、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気中で、３７℃で２〜３時間撹拌して消化した。単離した軟骨細胞を調製培地で洗浄し、培養皿に播種した。培養皿に細胞が付着して増殖を開始した後、１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸（日清製薬、山形県、日本）を含む調製培地に培地を交換した。２つのケースでは、組織を１ｍｍ３以下の大きさにミンチ状にし、調製培地中の培養皿に載せ、細胞が不完全になるまで培養した。軟骨細胞は、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、東京、日本）を用いて採取し、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲＴＭ（ゼノアック社、福島県、日本）又はＴＣ−Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ細胞凍結培地（ＫＡＣ社、京都府、日本）で凍結保存した。いくつかのドナーは、凍結保存前に最大５回まで継代された。
１．２．２．ＰＤシートの作製
凍結保存した１２ロットの軟骨細胞を解凍し、培地中で１回継代し、温度応答性培養インサート（株式会社セルシード、東京都、日本）に１×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、２週間培養した。得られたＰＤシートを４つのグループに分けて、有効性評価、特性評価、遺伝子発現解析、タンパク質分泌解析に使用した。
凍結保存した１２ロットの軟骨細胞を解凍し、培地中で１回継代し、温度応答性培養インサート（株式会社セルシード、東京都、日本）に１×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、２週間培養した。得られたＰＤシートを４つのグループに分けて、有効性評価、特性評価、遺伝子発現解析、タンパク質分泌解析に使用した。
１．２．３．ＰＤシートの特性評価
細胞数を決定するために、ＰＤシートをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、３７℃で３０分間消化し、次いで０．２５ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−Ｐ（Ｒｏｃｈｅ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、３７℃で３０分間インキュベートした。分散した細胞を培養液で洗浄し、細胞数及び生存率をトリパンブルー色素排除アッセイによって決定した。ＰＤシートの厚さを決定するために、各ＰＤシートをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテック、東京、日本）に埋め込み、−８０℃で凍結した。厚さ１０μｍのＰＤシートの断面を切断し、スライドグラスに載せて空気乾燥し、０．０１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで、室温で３０分間固定した。切片は、標準的なプロトコルに従ってヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。顕微鏡画像を撮影し、点のペア間の距離を、ＢＺ−８０００顕微鏡（キーエンス、大阪、日本）を使用して測定した。
細胞数を決定するために、ＰＤシートをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、３７℃で３０分間消化し、次いで０．２５ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−Ｐ（Ｒｏｃｈｅ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、３７℃で３０分間インキュベートした。分散した細胞を培養液で洗浄し、細胞数及び生存率をトリパンブルー色素排除アッセイによって決定した。ＰＤシートの厚さを決定するために、各ＰＤシートをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテック、東京、日本）に埋め込み、−８０℃で凍結した。厚さ１０μｍのＰＤシートの断面を切断し、スライドグラスに載せて空気乾燥し、０．０１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで、室温で３０分間固定した。切片は、標準的なプロトコルに従ってヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。顕微鏡画像を撮影し、点のペア間の距離を、ＢＺ−８０００顕微鏡（キーエンス、大阪、日本）を使用して測定した。
１．３．骨軟骨欠損に対するＰＤシートの有効性の評価
１．３．１．免疫抑制ウサギ骨軟骨欠損モデル
ウサギにおけるＰＤシートの有効性評価は、非特許文献１１に記載されているように行った。雌の日本産白ウサギ（平均体重＝３．０ｋｇ：東京実験動物科学株式会社）合計６９羽を使用した。手術前に、ウサギを体重により無作為に欠陥のみの群とＰＤシート移植群のいずれかに割り付けた。免疫抑制のために、タクロリムス（１．６ｍｇ／ｋｇ／日）を移植の２日前から１０日間、毎日筋肉内に投与し、その後、手術後４週間まで隔日投与した。ウサギは、手術及び移植前に亜酸化窒素２Ｌ／ｍｉｎ、酸素１Ｌ／ｍｉｎ、イソフルラン２．５〜３．０％（Ｐｆｉｚｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡ）で麻酔をかけた。５ｍｍ生検パンチ（甲斐工業、岐阜県、日本）をマーキングガイドとし、５ｍｍドリルを用いて、大腿骨の膝蓋溝に骨軟骨欠損（直径＝５ｍｍ、深さ＝３ｍｍ）を作成した。軟骨下骨からのわずかな出血を確認し、生理食塩水（ニプロ、大阪府、日本）を用いて欠損部を洗浄し、熱損傷を防止した。
１．３．１．免疫抑制ウサギ骨軟骨欠損モデル
ウサギにおけるＰＤシートの有効性評価は、非特許文献１１に記載されているように行った。雌の日本産白ウサギ（平均体重＝３．０ｋｇ：東京実験動物科学株式会社）合計６９羽を使用した。手術前に、ウサギを体重により無作為に欠陥のみの群とＰＤシート移植群のいずれかに割り付けた。免疫抑制のために、タクロリムス（１．６ｍｇ／ｋｇ／日）を移植の２日前から１０日間、毎日筋肉内に投与し、その後、手術後４週間まで隔日投与した。ウサギは、手術及び移植前に亜酸化窒素２Ｌ／ｍｉｎ、酸素１Ｌ／ｍｉｎ、イソフルラン２．５〜３．０％（Ｐｆｉｚｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡ）で麻酔をかけた。５ｍｍ生検パンチ（甲斐工業、岐阜県、日本）をマーキングガイドとし、５ｍｍドリルを用いて、大腿骨の膝蓋溝に骨軟骨欠損（直径＝５ｍｍ、深さ＝３ｍｍ）を作成した。軟骨下骨からのわずかな出血を確認し、生理食塩水（ニプロ、大阪府、日本）を用いて欠損部を洗浄し、熱損傷を防止した。
１．３．２．ＰＤシートの移植
ＰＤシートの移植のため、ＰＤシートを入れた培養プレートを２５℃で３０分間保持して剥離させた。ポリビニリデンジフルオライド膜を用いて、骨軟骨欠損部に膝につき１枚のＰＤシートを移植した。膝蓋骨の修復後、大腿四頭筋と腱を縫合し、脱臼を防止した。
ＰＤシートの移植のため、ＰＤシートを入れた培養プレートを２５℃で３０分間保持して剥離させた。ポリビニリデンジフルオライド膜を用いて、骨軟骨欠損部に膝につき１枚のＰＤシートを移植した。膝蓋骨の修復後、大腿四頭筋と腱を縫合し、脱臼を防止した。
１．３．３．再生軟骨の組織学的スコアリング
ＰＤシート移植から４週間後、５０ｍｇ／ｍｌのペントバルビタール（東京化成工業製、東京都）を静脈内投与してウサギを安楽死させた。手術した大腿骨を採取し、２０％ホルマリン（和光純薬工業）で３〜５日間固定した。標本を１０％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（和光純薬工業）中で３〜４週間脱灰し、パラフィンを埋め込んだ。直列切片（３μｍ）は、大腿骨の長軸と平行に、欠損部の中心付近で切断した。組織学的検査のために、切片は、標準的なプロトコルに従ってヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）、サフラニンＯ、及びファストグリーンで染色した。ステンドされた切片は、ランダム化され、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアと国際軟骨修復協会（ＩＣＲＳ）スコア［４４，４５］の修正版を使用して、訓練を受けた２人の整形外科医によって別々に採点された。
ＰＤシート移植から４週間後、５０ｍｇ／ｍｌのペントバルビタール（東京化成工業製、東京都）を静脈内投与してウサギを安楽死させた。手術した大腿骨を採取し、２０％ホルマリン（和光純薬工業）で３〜５日間固定した。標本を１０％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（和光純薬工業）中で３〜４週間脱灰し、パラフィンを埋め込んだ。直列切片（３μｍ）は、大腿骨の長軸と平行に、欠損部の中心付近で切断した。組織学的検査のために、切片は、標準的なプロトコルに従ってヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）、サフラニンＯ、及びファストグリーンで染色した。ステンドされた切片は、ランダム化され、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアと国際軟骨修復協会（ＩＣＲＳ）スコア［４４，４５］の修正版を使用して、訓練を受けた２人の整形外科医によって別々に採点された。
１．３．４．免疫染色
Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬ１）及びＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２）の免疫染色のために、脱パラフィン化した３−μｍ切片を０．４％ペプシン（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ， ＵＳＡ）で、３７℃で３０分間処理して抗原を回収した。次に、切片を０．４％ペプシン（ＤＡＫＯ， Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）により３７℃で３０分間インキュベートし、蒸留水で洗浄した後、０．３％過酸化水素／メタノール溶液にて室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次に、切片をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、２．５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）により１０分間室温（ＲＴ）でブロッキングし、ヒトＣＯＬ１又はヒトＣＯＬ２のいずれかのマウスモノクローナル抗体（協和薬品工業株式会社、富山県、日本）をＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１：１００に希釈したものを用いて３時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。最後に、染色切片をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬抗マウスＩｇ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いてＲＴでインキュベートし、０．０２％ジアミノベンジジン及び０．００５％過酸化水素を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に２〜８分間浸漬し、Ｈ＆Ｅでカウンター染色した。
Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬ１）及びＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２）の免疫染色のために、脱パラフィン化した３−μｍ切片を０．４％ペプシン（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ， ＵＳＡ）で、３７℃で３０分間処理して抗原を回収した。次に、切片を０．４％ペプシン（ＤＡＫＯ， Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）により３７℃で３０分間インキュベートし、蒸留水で洗浄した後、０．３％過酸化水素／メタノール溶液にて室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次に、切片をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、２．５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）により１０分間室温（ＲＴ）でブロッキングし、ヒトＣＯＬ１又はヒトＣＯＬ２のいずれかのマウスモノクローナル抗体（協和薬品工業株式会社、富山県、日本）をＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１：１００に希釈したものを用いて３時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。最後に、染色切片をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬抗マウスＩｇ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いてＲＴでインキュベートし、０．０２％ジアミノベンジジン及び０．００５％過酸化水素を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に２〜８分間浸漬し、Ｈ＆Ｅでカウンター染色した。
ヒトビメンチン検出のために、脱パラフィン化切片を、抗原検索のためにマイクロ波により９８℃で１０分間、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で処理した。切片を、ブロッキングのための５％ＮＧＳを含むＰＢＳでインキュベートし、続いて、ヒトビメンチンを検出するために、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミンと１：１００で希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ， ＵＳＡ）により４℃で一晩インキュベートした。切片を蒸留水で洗浄し、次いでマウントし、製造業者の指示に従って４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で硬化させた。すべての顕微鏡画像は、ＢＺ−９０００第ＩＩ世代蛍光顕微鏡（キーエンス社）を用いて得た。
１．４．ＰＤシートの遺伝子発現解析
１．４．１．ＲＮＡの単離
ＳＨＡＫＥ Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｏ（Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、日本）を用いてＰＤシートをＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で破壊し、製造者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡをさらに精製した。ＲＮＡの量及び質は、推奨通りに、ナノドロップワン分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びアジレント・バイオアナライザ（アジレント・テクノロジーズ）を用いて決定した。
１．４．１．ＲＮＡの単離
ＳＨＡＫＥ Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｏ（Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、日本）を用いてＰＤシートをＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で破壊し、製造者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡをさらに精製した。ＲＮＡの量及び質は、推奨通りに、ナノドロップワン分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びアジレント・バイオアナライザ（アジレント・テクノロジーズ）を用いて決定した。
１．４．２．ｃＲＮＡの増幅と標識
メーカーの指示に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ， ｏｎｅ−ｃｏｌｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを増幅し、シアニン３（Ｃｙ３）で標識した。簡潔にいうと、ポリｄＴ−Ｔ７プロモータープライマーを用いて、全ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。プライマー、テンプレート ＲＮＡ、及び既知の濃度及び品質の品質管理転写物を、まず６５℃で１０分間変性し、５Ｘ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ、０．１Ｍ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０ｍＭ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｉｘ、及びＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ ＲＮａｓｅ Ｂｌｏｃｋ Ｍｉｘを用いて、４０℃で２時間インキュベートした。ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ酵素を７０℃で１５分間失活させた後、ｃＤＮＡ産物をインビトロ転写のテンプレートとして使用して蛍光ｃＲＮＡを生成させた。ｃＤＮＡ産物を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＣｙ３標識ＣＴＰの存在下で転写マスターミックスと混合し、４０℃で２時間インキュベートした。標識したｃＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを用いて精製し、３０μＬのヌクレオースフリー水で溶出した。増幅及び標識後、ナノドロップＮＤ−１０００分光光度計及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、ｃＲＮＡの量及びシアニンの取り込みの程度を決定した。
メーカーの指示に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ， ｏｎｅ−ｃｏｌｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを増幅し、シアニン３（Ｃｙ３）で標識した。簡潔にいうと、ポリｄＴ−Ｔ７プロモータープライマーを用いて、全ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。プライマー、テンプレート ＲＮＡ、及び既知の濃度及び品質の品質管理転写物を、まず６５℃で１０分間変性し、５Ｘ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ、０．１Ｍ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０ｍＭ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｉｘ、及びＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ ＲＮａｓｅ Ｂｌｏｃｋ Ｍｉｘを用いて、４０℃で２時間インキュベートした。ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ酵素を７０℃で１５分間失活させた後、ｃＤＮＡ産物をインビトロ転写のテンプレートとして使用して蛍光ｃＲＮＡを生成させた。ｃＤＮＡ産物を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＣｙ３標識ＣＴＰの存在下で転写マスターミックスと混合し、４０℃で２時間インキュベートした。標識したｃＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを用いて精製し、３０μＬのヌクレオースフリー水で溶出した。増幅及び標識後、ナノドロップＮＤ−１０００分光光度計及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、ｃＲＮＡの量及びシアニンの取り込みの程度を決定した。
１．４．３．サンプルのハイブリダイゼーション
各ハイブリダイゼーションについて、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＧＥ ｖ３ ８ｘ６０Ｋ マイクロアレイ （デザインＩＤ：０７２３６３）を使用して、０．６０μｇのＣｙ３標識ｃＲＮＡを断片化し、６５℃で１７時間ハイブリダイズした。洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡマイクロアレイスキャナーを使用してマイクロアレイをスキャンした。
各ハイブリダイゼーションについて、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＧＥ ｖ３ ８ｘ６０Ｋ マイクロアレイ （デザインＩＤ：０７２３６３）を使用して、０．６０μｇのＣｙ３標識ｃＲＮＡを断片化し、６５℃で１７時間ハイブリダイズした。洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡマイクロアレイスキャナーを使用してマイクロアレイをスキャンした。
１．４．４．有効性相関遺伝子の同定
各スキャンされた特徴の強度は、Ａｇｉｌｅｎｔの特徴抽出ソフトウェア・バージョン１１．５．１．１．１を使用して定量化した。エラーがないとフラグが立てられた特徴（「検出された」フラグ）のみを使用し、陽性ではない、有意ではない、一様ではない、背景より上ではない、飽和している、又は集団の外れ値であるとフラグが立てられた特徴（「検出されなかった」フラグと「妥協した」フラグ）は除外した。分位正規化は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア・バージョン１４．９．１を使用して行った。生のシグナルデータの四分位正規化後、遺伝子記号の既存のアノテーションと全サンプル（ｃｏｖｅｔｅｄ ｌｏｇ２強度が５以上）の平均シグナル強度に基づいて、プローブをフィルタリングした。マーカー遺伝子の抽出は、各プローブの発現レベルとＩＣＲＳスコアとの間のピアソン相関係数を算出し、０．４以上又は０．４未満のプローブを選択した。最終的に、これらの基準で４４３個の遺伝子を同定し、すべてのサンプルにおいて、分散が大きく、ｌｏｇ２強度が０．５以上であった。階層的クラスタリング分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア・バージョン１４．９．１を使用して行った（類似度測定：ユークリッド、リンケージルール：平均）。
各スキャンされた特徴の強度は、Ａｇｉｌｅｎｔの特徴抽出ソフトウェア・バージョン１１．５．１．１．１を使用して定量化した。エラーがないとフラグが立てられた特徴（「検出された」フラグ）のみを使用し、陽性ではない、有意ではない、一様ではない、背景より上ではない、飽和している、又は集団の外れ値であるとフラグが立てられた特徴（「検出されなかった」フラグと「妥協した」フラグ）は除外した。分位正規化は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア・バージョン１４．９．１を使用して行った。生のシグナルデータの四分位正規化後、遺伝子記号の既存のアノテーションと全サンプル（ｃｏｖｅｔｅｄ ｌｏｇ２強度が５以上）の平均シグナル強度に基づいて、プローブをフィルタリングした。マーカー遺伝子の抽出は、各プローブの発現レベルとＩＣＲＳスコアとの間のピアソン相関係数を算出し、０．４以上又は０．４未満のプローブを選択した。最終的に、これらの基準で４４３個の遺伝子を同定し、すべてのサンプルにおいて、分散が大きく、ｌｏｇ２強度が０．５以上であった。階層的クラスタリング分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア・バージョン１４．９．１を使用して行った（類似度測定：ユークリッド、リンケージルール：平均）。
１．４．５．エンリッチメント分析
有効性に関連する遺伝子は、Ｍｅｔａｓｃａｐｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａｓｃａｐｅ．ｏｒ．／）［１２］のオンラインツールを用いて解析した。デフォルトセッティングに対して機能的エンリッチメントを行った。また、正の相関を持つ遺伝子と負の相関を持つ遺伝子を含む複数の入力遺伝子リストを解析した。
有効性に関連する遺伝子は、Ｍｅｔａｓｃａｐｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａｓｃａｐｅ．ｏｒ．／）［１２］のオンラインツールを用いて解析した。デフォルトセッティングに対して機能的エンリッチメントを行った。また、正の相関を持つ遺伝子と負の相関を持つ遺伝子を含む複数の入力遺伝子リストを解析した。
１．４．６．ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰＤシートの全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡのプリアンプ化には、ＴａｑＭａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。蛍光プローブ及びフォワード／リバースプライマーを含むＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（下記表参照）を、製造元の指示に従って、最終濃度が０．２×にプールされたアッセイミックスが得られるように、トリス及びＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１×）で希釈した。２５μＬのＴａｑＭａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）、１２．５μＬのプールされたアッセイミックス（０．２×）、１μＬのｃＤＮＡサンプル、及び５０μＬの合計に調整するためのヌクレオターゼフリーの水を調製し、この５０μＬで反応を行った。サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を９５℃で１０分間、９５℃で１５−ｓサイクルを１４回、６０℃で４分間、プリアンプ化ＰＣＲを行った。プリアンプ化されたｃＤＮＡ産物は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析用のテンプレートとして使用するために、ＴＥ緩衝液（１×）で１：２０に希釈した。ＴａｑＭａｎ リアルタイム ＰＣＲは ７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。ＰＣＲ反応混合物は、１０μＬのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）、１μＬのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（２０×）、５μＬのプリアンプ化されたｃＤＮＡ、及び２０μの合計に調整するためのヌクレオターゼフリーの水で構成される。サーマルサイクラー７５００リアルタイムＰＣＲシステムを、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５−ｓサイクルを４０回、６０℃で１分間、増幅のために実行した。サイクル閾値（Ｃｔ）値は、７５００リアルタイムＰＣＲシステムソフトウェアｖ．２．０．６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。各遺伝子の相対発現値（ΔＣｔ値）は、内部コントロールＡＣＴＢのＣｔに対して導出した。
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰＤシートの全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡのプリアンプ化には、ＴａｑＭａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。蛍光プローブ及びフォワード／リバースプライマーを含むＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（下記表参照）を、製造元の指示に従って、最終濃度が０．２×にプールされたアッセイミックスが得られるように、トリス及びＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１×）で希釈した。２５μＬのＴａｑＭａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）、１２．５μＬのプールされたアッセイミックス（０．２×）、１μＬのｃＤＮＡサンプル、及び５０μＬの合計に調整するためのヌクレオターゼフリーの水を調製し、この５０μＬで反応を行った。サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を９５℃で１０分間、９５℃で１５−ｓサイクルを１４回、６０℃で４分間、プリアンプ化ＰＣＲを行った。プリアンプ化されたｃＤＮＡ産物は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析用のテンプレートとして使用するために、ＴＥ緩衝液（１×）で１：２０に希釈した。ＴａｑＭａｎ リアルタイム ＰＣＲは ７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。ＰＣＲ反応混合物は、１０μＬのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）、１μＬのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（２０×）、５μＬのプリアンプ化されたｃＤＮＡ、及び２０μの合計に調整するためのヌクレオターゼフリーの水で構成される。サーマルサイクラー７５００リアルタイムＰＣＲシステムを、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５−ｓサイクルを４０回、６０℃で１分間、増幅のために実行した。サイクル閾値（Ｃｔ）値は、７５００リアルタイムＰＣＲシステムソフトウェアｖ．２．０．６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。各遺伝子の相対発現値（ΔＣｔ値）は、内部コントロールＡＣＴＢのＣｔに対して導出した。
１．５．ＰＤシートが分泌するタンパク質の解析
１．５．１．ＰＤシートの上澄みの調製
１％ウシ胎児血清と１×抗生物質−抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）３ｍＬで各ＰＤシートを７２時間培養した。上清を回収し、１３，０００ｇで１０分間遠心分離することにより破片を除去し、一定分量に分割し、使用するまで−８０℃で保存した。
１．５．１．ＰＤシートの上澄みの調製
１％ウシ胎児血清と１×抗生物質−抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）３ｍＬで各ＰＤシートを７２時間培養した。上清を回収し、１３，０００ｇで１０分間遠心分離することにより破片を除去し、一定分量に分割し、使用するまで−８０℃で保存した。
１．５．２．ＳＯＭＡｓｃａｎを用いたプロテオミクス解析
スローオフレート修飾アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒｓ）による１，１２９個のタンパク質を検出する多重アプタマーベースのアッセイであるＳＯＭＡｓｃａｎアッセイプラットフォーム（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ社）を用いて上清を分析した［１３］。このアッセイでは、化学的に修飾されたヌクレオチドを使用して、タンパク質シグナルをマイクロアレイ上の相対蛍光を使用して定量できるヌクレオチドシグナルに変換する。生のシグナルデータにランクベースの分位正規化を適用した。次に、プローブをシグナル強度（ｃｏｖｅｔｅｄ ｌｏｇ２強度が６以上）に基づいてフィルタリングし、全サンプルの平均強度を得た。マーカータンパク質の抽出については、それらの各プローブのタンパク質発現レベルと個々のＩＣＲＳスコアとの間でピアソン相関係数を算出し、０．４以上又は０．４未満のものを選択した。最後に、これらの基準を用いて１１２個の遺伝子を同定し、分散が大きいものはすべてのサンプルについてｌｏｇ２強度が０．５以上であることを確認した。
スローオフレート修飾アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒｓ）による１，１２９個のタンパク質を検出する多重アプタマーベースのアッセイであるＳＯＭＡｓｃａｎアッセイプラットフォーム（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ社）を用いて上清を分析した［１３］。このアッセイでは、化学的に修飾されたヌクレオチドを使用して、タンパク質シグナルをマイクロアレイ上の相対蛍光を使用して定量できるヌクレオチドシグナルに変換する。生のシグナルデータにランクベースの分位正規化を適用した。次に、プローブをシグナル強度（ｃｏｖｅｔｅｄ ｌｏｇ２強度が６以上）に基づいてフィルタリングし、全サンプルの平均強度を得た。マーカータンパク質の抽出については、それらの各プローブのタンパク質発現レベルと個々のＩＣＲＳスコアとの間でピアソン相関係数を算出し、０．４以上又は０．４未満のものを選択した。最後に、これらの基準を用いて１１２個の遺伝子を同定し、分散が大きいものはすべてのサンプルについてｌｏｇ２強度が０．５以上であることを確認した。
１．５．３．酵素結合免疫吸着剤アッセイ
上清を解凍し、ＭＩＡ（メラノーマ阻害活性）（ロシュ）及びＤＫＫ１（ディックコプフＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤１）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）のＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットを用いてタンパク質の濃度を決定した。
上清を解凍し、ＭＩＡ（メラノーマ阻害活性）（ロシュ）及びＤＫＫ１（ディックコプフＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤１）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）のＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットを用いてタンパク質の濃度を決定した。
１．６．統計解析
数値結果の要約は平均と標準偏差で表した。ＩＣＲＳスコアの分析には分散分析を用い、ポストホック分析にはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた。
数値結果の要約は平均と標準偏差で表した。ＩＣＲＳスコアの分析には分散分析を用い、ポストホック分析にはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた。
２．結果
２．１．ＰＤシートの硝子軟骨再生に対する効果
今回の全体的な実験デザインを図２（ａ）に示す。ＰＤシートの多様性が有効性及びトランスクリプトーム及びプロテオームプロファイルに与える影響を評価するために、１１人のドナーから得られた１２ロットのＰＤ軟骨細胞についてＰＤシートを作成した。これらのロットには、異なる通過数、異なる条件での培養拡大、及び異なる凍結保存培地が含まれる（下記表参照）。図２（ｂ）には、組織学的修復が良好な場合と不良な場合の欠損群と移植群の欠損部の代表的なマクロ画像が示されている。図２（ｃ）及び（ｄ）は、使用したウサギの同所性異種移植モデルにおける骨軟骨欠損に対するＰＤシートの評価結果を示す。
２．１．ＰＤシートの硝子軟骨再生に対する効果
今回の全体的な実験デザインを図２（ａ）に示す。ＰＤシートの多様性が有効性及びトランスクリプトーム及びプロテオームプロファイルに与える影響を評価するために、１１人のドナーから得られた１２ロットのＰＤ軟骨細胞についてＰＤシートを作成した。これらのロットには、異なる通過数、異なる条件での培養拡大、及び異なる凍結保存培地が含まれる（下記表参照）。図２（ｂ）には、組織学的修復が良好な場合と不良な場合の欠損群と移植群の欠損部の代表的なマクロ画像が示されている。図２（ｃ）及び（ｄ）は、使用したウサギの同所性異種移植モデルにおける骨軟骨欠損に対するＰＤシートの評価結果を示す。
ＰＤシートは欠損部の硝子軟骨の再生を促進したが、効果にばらつきがあり、いくつかのロットでは効果が発揮されなかった。未治療群の４週間後のＩＣＲＳスコアは２２．１３±３．０９（ｎ＝５）であり、移植群のＩＣＲＳスコアは１８．１〜３５．２の間とばらつきがあった（図２（ｃ）参照）。図２（ｄ）は、ＰＤシートの厚さ、細胞数、及びＰＤシートに含まれる細胞の生存率に関するＰＤシートの特性分布を示している。ＰＤシートはパイルドセル構造を形成しており、その厚さは７．７〜１８．３μｍ（平均１１．５２〜３±３．２３μｍ）であった。また、細胞数もＰＤシート１枚あたり１．７〜４．２×１０６個（平均２．６５±０．６７×１０６個）の範囲で変動していた。
２．２．ＰＤシートの有効性に関連した遺伝子発現プロファイル
同所性異種移植モデルを介してその有効性を検討した１２ロットのＰＤシートの遺伝子発現を、マイクロアレイを用いて解析した。アレイシグナルとＩＣＲＳスコアとの相関関係から遺伝子を抽出し、ＩＣＲＳスコアと正の相関を示す遺伝子２０５個、負の相関を示す遺伝子２３８個を得た。正の相関が最も高かった２０個の遺伝子を下記の表（正の相関がある遺伝子トップ20）に、負の相関が最も高かった２０個の遺伝子を下記の表（負の相関のある遺伝子トップ20）にそれぞれ示す。図３は、抽出された４４３個の遺伝子について、遺伝子発現のヒートマップを用いてクラスター分析を行った結果を示している。これらを効能関連遺伝子と考えることができる。ＩＣＲＳスコアが最も低い５ロットのＰＤシートについては、４ロットが同一クラスターに分類されており、これらの遺伝子セットの発現レベルが有効なＰＤシートの同定に有用である可能性を示唆している。
同所性異種移植モデルを介してその有効性を検討した１２ロットのＰＤシートの遺伝子発現を、マイクロアレイを用いて解析した。アレイシグナルとＩＣＲＳスコアとの相関関係から遺伝子を抽出し、ＩＣＲＳスコアと正の相関を示す遺伝子２０５個、負の相関を示す遺伝子２３８個を得た。正の相関が最も高かった２０個の遺伝子を下記の表（正の相関がある遺伝子トップ20）に、負の相関が最も高かった２０個の遺伝子を下記の表（負の相関のある遺伝子トップ20）にそれぞれ示す。図３は、抽出された４４３個の遺伝子について、遺伝子発現のヒートマップを用いてクラスター分析を行った結果を示している。これらを効能関連遺伝子と考えることができる。ＩＣＲＳスコアが最も低い５ロットのＰＤシートについては、４ロットが同一クラスターに分類されており、これらの遺伝子セットの発現レベルが有効なＰＤシートの同定に有用である可能性を示唆している。
２．３．有効性関連遺伝子による機能予測
このような有効性関連遺伝子の生物学的機能を明らかにするために、Ｍｅｔａｓｃａｐｅ［１２］を用いてこれらの遺伝子の濃縮解析を行った。その結果、正の相関を持つ遺伝子は、骨格系の発生経路、軟骨の発生、間葉系幹細胞の分化に関与していることが示唆された（図４）。また、一部の遺伝子は血管新生や細胞外マトリックスの組織化に関与していた。
このような有効性関連遺伝子の生物学的機能を明らかにするために、Ｍｅｔａｓｃａｐｅ［１２］を用いてこれらの遺伝子の濃縮解析を行った。その結果、正の相関を持つ遺伝子は、骨格系の発生経路、軟骨の発生、間葉系幹細胞の分化に関与していることが示唆された（図４）。また、一部の遺伝子は血管新生や細胞外マトリックスの組織化に関与していた。
下記表に、エンリッチド遺伝子オントロジー（ＧＯ：ジーンオントロジー）の観点から記載され、アノテーションされた効能関連遺伝子を示す。また、ＧＯ：００３０１９８細胞外マトリックス組織化に関連する遺伝子の一部は、ＧＯ：００６１０３５軟骨の発生制御にも関連していた。我々は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイのために５つのＧＯ注釈付け遺伝子を選択した。アグレカン（ＡＣＡＮ）、インテグリンアルファ１０（ＩＴＧＡ１０）、成長分化因子５（ＧＤＦ５）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ＢＯＸ転写因子９（ＳＯＸ９）、ＳＲＹ−ＢＯＸ転写因子５（ＳＯＸ５）の発現をＲＴ−ＰＣＲで検証し、ＩＣＲＳスコアとの相関を解析した。その結果、ＡＣＡＮ、ＩＴＧＡ１０、ＧＤＦ５、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５についてはアクチンベータ（ＡＣＴＢ）に関するＣΔとＩＣＲＳスコアとの間に相関があったが、ＳＯＸ５については相関がなかった（図５）。
２．４．ＰＤシートの効果に関連する分泌要因の分析
ＰＤシートから継続的に供給される体液性因子が硝子軟骨の再生促進に寄与していると考えられる。そこで、ＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームを用いて、ＰＤシートから分泌されるタンパク質の相対量とＩＣＲＳスコアとの相関を解析した［１３，１４］。ＳＯＭＡｓｃａｎで解析可能なタンパク質因子のうち、有効性スコアと正の相関を持つタンパク質が４９個、負の相関を持つタンパク質が６３個抽出された（下記表（正の相関のある分泌タンパク質トップ20）、表（負の相関のある分泌タンパク質トップ20）参照）。図６（ａ）に有効性相関因子の濃縮解析結果を示す。負の相関を示す因子は、ＧＯ：アポトーシスシグナル伝達経路に集中していた。正の相関を示した因子は、骨格発達の親項（ｐａｒｅｎｔ ｔｅｒｍ）である結合組織発達と、血管新生の親項である血管発達に集中していた。これらの経路は、遺伝子発現解析における集中と同様の結果が得られた。有効性に関連する遺伝子の発現を示したタンパク質のうち、有効性と相関する８つのタンパク質が上清中に同定された。ＥＳＭ１（内皮細胞特異的分子１）、ＧＲＥＭ１（グレムリン１）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（セルピンファミリーＡメンバー３）、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４（ネトリン４）、ＦＡＢＰ３（脂肪酸結合タンパク質３）、ＰＤＧＦＡ（血小板由来成長因子Ａサブユニット）の８種類のタンパク質が上清中に確認された（図６（ｂ）、（ｃ））。３つのタンパク質は負の相関を示した。ＲＡＲＲＥＳ２（レチノイン酸受容体レスポンダー２）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＰＧＦ（胎盤成長因子）である。
ＰＤシートから継続的に供給される体液性因子が硝子軟骨の再生促進に寄与していると考えられる。そこで、ＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームを用いて、ＰＤシートから分泌されるタンパク質の相対量とＩＣＲＳスコアとの相関を解析した［１３，１４］。ＳＯＭＡｓｃａｎで解析可能なタンパク質因子のうち、有効性スコアと正の相関を持つタンパク質が４９個、負の相関を持つタンパク質が６３個抽出された（下記表（正の相関のある分泌タンパク質トップ20）、表（負の相関のある分泌タンパク質トップ20）参照）。図６（ａ）に有効性相関因子の濃縮解析結果を示す。負の相関を示す因子は、ＧＯ：アポトーシスシグナル伝達経路に集中していた。正の相関を示した因子は、骨格発達の親項（ｐａｒｅｎｔ ｔｅｒｍ）である結合組織発達と、血管新生の親項である血管発達に集中していた。これらの経路は、遺伝子発現解析における集中と同様の結果が得られた。有効性に関連する遺伝子の発現を示したタンパク質のうち、有効性と相関する８つのタンパク質が上清中に同定された。ＥＳＭ１（内皮細胞特異的分子１）、ＧＲＥＭ１（グレムリン１）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（セルピンファミリーＡメンバー３）、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４（ネトリン４）、ＦＡＢＰ３（脂肪酸結合タンパク質３）、ＰＤＧＦＡ（血小板由来成長因子Ａサブユニット）の８種類のタンパク質が上清中に確認された（図６（ｂ）、（ｃ））。３つのタンパク質は負の相関を示した。ＲＡＲＲＥＳ２（レチノイン酸受容体レスポンダー２）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＰＧＦ（胎盤成長因子）である。
このうち、ＯＡ予防効果が期待されるＤＫＫ１［１５］と軟骨分化マーカーであり同化因子であるＭＩＡ［１６−１８］に着目した。これらの因子の量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量した結果、ＰＤシート間でタンパク質量にばらつきがあり、ＭＩＡは０〜３８．４ｎｇ／ｍＬ、ＤＫＫ１は２．６〜２６．６ｎｇ／ｍＬの範囲であった。また、ＩＣＲＳスコアとの相関は弱かった（図６（ｄ））。
３．議論
本研究では、ＰＤシートを用いた同所性異種移植モデルにおいても、成体膝軟骨シートを用いた場合と同様に、ＰＤシートを用いることが有効であることを確認した。ヒト成体軟骨細胞シートの作製では、２Ｄ培養環境下で軟骨細胞が増殖するため、Ｃｏｌ２Ａ１の発現が低下し、軟骨細胞シートは脱分化していると考えられる。しかし、動物モデル［１１］やヒト臨床研究［８］では、移植された関節で硝子軟骨に再分化することがわかっている。我々は、ＰＤシートを用いることで、ヒト細胞由来の欠損部に硝子軟骨様組織を見出しており、ＰＤシートも生体内で硝子軟骨に再分化することが示唆されている。
ラットの軟骨細胞シート同所性移植を追跡するためにｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用した結果は、関節内の同種軟骨細胞のルシフェラーゼシグナルの大部分が数ヶ月以内に消失することを示しており［１９］、長期的には同種移植片由来の組織がレシピエント由来の組織に置き換わることを示唆している。我々の結果は、少なくとも短期的には、ＰＤシートが軟骨前駆細胞として作用する可能性があることを示唆している。
本研究では、ＰＤシートを用いた同所性異種移植モデルにおいても、成体膝軟骨シートを用いた場合と同様に、ＰＤシートを用いることが有効であることを確認した。ヒト成体軟骨細胞シートの作製では、２Ｄ培養環境下で軟骨細胞が増殖するため、Ｃｏｌ２Ａ１の発現が低下し、軟骨細胞シートは脱分化していると考えられる。しかし、動物モデル［１１］やヒト臨床研究［８］では、移植された関節で硝子軟骨に再分化することがわかっている。我々は、ＰＤシートを用いることで、ヒト細胞由来の欠損部に硝子軟骨様組織を見出しており、ＰＤシートも生体内で硝子軟骨に再分化することが示唆されている。
ラットの軟骨細胞シート同所性移植を追跡するためにｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用した結果は、関節内の同種軟骨細胞のルシフェラーゼシグナルの大部分が数ヶ月以内に消失することを示しており［１９］、長期的には同種移植片由来の組織がレシピエント由来の組織に置き換わることを示唆している。我々の結果は、少なくとも短期的には、ＰＤシートが軟骨前駆細胞として作用する可能性があることを示唆している。
軟骨病変部に付着した軟骨シートは、軟骨組織マトリックスの流出を防ぎながら、触媒因子に対するバリアとして作用することが示唆されている［４，２０］。さらに、軟骨シートから産生される同化因子が軟骨再生を促進するためのパラクリン因子として働くことが示唆されている［１０，２１，２２］。我々の研究では、細胞外マトリックス、骨格形成、骨化、血管新生に関連する遺伝子の発現とタンパク質因子の分泌の両方がＰＤシートの有効性に関与していることを示している。我々は以前、ＰＤシートが同化因子としてＭＩＡを分泌することを報告しており［１０］、今回の研究でもそれが確認された。さらに、ＰＤシートの有効性に寄与する他の同化因子の候補（ＧＲＥＭ１、ＤＫＫ１、ＰＤＧＦ）も同定している。
ＧＲＥＭ１とＤＫＫ１はＷｎｔシグナルの調節に関与していることが知られており、関節軟骨におけるＷｎｔシグナルの障害は軟骨の恒常性維持不全を引き起こすと考えられている［２３−２６］。肥大性軟骨細胞の分化を抑制し、軟骨表面及び静止性軟骨細胞層を増加させることが報告されている［２７］。また、ＤＫＫ１トランスジェニックマウスにおけるＯＡ発症の抑制も報告されている［１５］。ＰＤＧＦ−ＡＡは軟骨のプロテオグリカン産生や軟骨細胞増殖を促進する軟骨栄養因子として指摘されており［２８，２９］、ＰＤＧＦ−ＡＡの減少は軟骨の変性を促進する［３０］。
我々の結果は、ＰＤシートがこれらの因子を産生することで、硝子軟骨の再生を促進していることを示唆している。ＰＤシートは生きた組織であるため、硝子軟骨へと再分化する過程で、軟骨表層、深層、軟骨下層という微小環境に応じて因子の産生を調整することができる可能性がある。これらの因子の産生は、細胞シート製造のためのドナーの選択や培養方法の改良の際に、ＰＤシートの有効性を予測するための有用なマーカーとなり得る。
さらに、我々の研究では、これまで軟骨組織に特異的な役割を持つとは報告されていないＮＴＮ４及びＥＳＭ１の産生がＰＤシートの有効性と相関していることが示された。ＮＴＮ４はネットリンファミリー因子であり、骨芽細胞の分化を促進し［３１］、軟骨細胞におけるＳＭＡＤシグナル伝達を修飾することが報告されている［３２］ことから、ＮＴＮ４が軟骨細胞自体や軟骨下骨に何らかの影響を与えている可能性が示唆されている。また、ＮＴＮ４は血管新生を抑制することも報告されている［３３，３４］。ＥＳＭ１はダーマタン硫酸プロテオグリカンであり、その発現はＶＥＧＦによって増強される［３５，３６］。ＥＳＭ１は軟骨の他の部分よりも深部の軟骨層で高発現することが報告されており［３７］、軟骨細胞の分化に関連した生物学的役割を示唆している。Ｒｏｃｈａらは、ＥＳＭ１がフィブロネクチンと競合的に結合することにより、ＶＥＧＦ−１６５のバイオアベイラビリティを増加させることを報告している［３８］。ＰＤシートは豊富なフィブロネクチンを発現しているので、ＰＤシートから分泌されたＥＳＭ１は、ＰＤシート自体又はレシピエント組織中のフィブロネクチンと結合して飽和すると推測される。ＥＳＭ１は、ＶＥＧＦの結合及び新生血管の侵食を防止する可能性がある。
関節軟骨の血管新生は軟骨の変性や骨棘形成の原因となると考えられている。我々は以前、前十字靭帯切開ウサギモデルにおいて、抗ＶＥＧＦ抗体投与により骨棘形成が抑制されることを報告している［３９，４０］。これらの結果は、血管新生の抑制がＯＡ予防のための有望なアプローチであることを示唆している。ＰＤシートが産生するＮＴＮ４及びＥＳＭ１は、軟骨欠損部の修復中に血管新生及びその後の石灰化を抑制することで、硝子軟骨の再生に寄与する可能性がある。
ＳＥＲＰＩＮＡ３はセリンプロテアーゼファミリーの一種であり、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が軟骨細胞に分化する際に発現量が変化する遺伝子として報告されている［４１］。ＦＡＢＰ３は脂肪酸結合タンパク質であり、細胞内脂質滴の蓄積に必要であり、ＭＳＣの生存率を高めることが報告されている［４２，４３］。しかし、ＦＡＢＰ３は通常ゴルジ体に局在するタンパク質であるため、上清中の量の増加はＦＡＢＰ３を発現する細胞の細胞死に関係している可能性がある。これらの因子の効果への寄与は現在のところ不明であり、さらなる解析が必要である。
本研究の限界の一つは、免疫抑制剤を用いた異種移植モデルから得られた結果である。そのため、異種移植と同種移植の間には、ヒトへの応用において考慮すべき、巻き込みや拒絶反応のプロセスに違いがある可能性がある。ＰＤシートのエングラフトメントは有効性の観点から非常に重要であると考えられ、異種移植では軟骨の再生を促進するというよりもエングラフトメントを促進する要因があると考えられる。
ドナーの違いにより性質が異なる可能性のある同種細胞を用いた再生医療では、組織工学的に作製した細胞の性質を安定化させることが臨床応用上の避けて通れない課題となっている。そのためには、生体内での有効性に寄与する生物学的特性を明らかにすることが不可欠である。これにより、同定された生物学的特性に基づいてドナー細胞や培養条件を検証することが可能となる。
本研究では、ＰＤシート移植による硝子軟骨再生に寄与する可能性のある生物学的経路及び関連遺伝子を同定した。これらの構成要素は、ＰＤシートのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を予測するためのマーカーとして利用できる可能性がある。これらのマーカーを有効性予測に利用するためには、独立したデータを用いて有効性との相関関係をさらに解析し、マーカーの閾値を決定する必要がある。最終的には、これらの因子がＰＤシートの有効性にどのように寄与しているかをヒト臨床試験で確認した上で、品質マーカーとして使用する必要がある。
４．結論
本研究では、ＰＤシート移植による硝子軟骨再生に寄与すると考えられる有効性関連遺伝子を同定した。このように同定された特徴は、ＰＤシートを使用した場合のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を予測するマーカーとして機能する可能性がある。さらに、これらの因子が軟骨再生を促進するメカニズムがさらに解明されれば、ＯＡ治療への新たなアプローチを提供することになる。
本研究では、ＰＤシート移植による硝子軟骨再生に寄与すると考えられる有効性関連遺伝子を同定した。このように同定された特徴は、ＰＤシートを使用した場合のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を予測するマーカーとして機能する可能性がある。さらに、これらの因子が軟骨再生を促進するメカニズムがさらに解明されれば、ＯＡ治療への新たなアプローチを提供することになる。
軟骨シート移植は、変形性関節症に伴う軟骨欠損を有する患者を治療するための新規かつ有望なアプローチである。自己軟骨シートによる硝子軟骨再生は、臨床研究ですでに実証されている。本研究では、標準的な軟骨細胞シートの同種移植モデルを用いて、標準的な軟骨細胞シートに代わる同種移植モデルとしての多孔性の軟骨細胞シート（ＰＤシート）の有効性を検討した。さらに、マイクロアレイとＤＮＡアプタマーアレイを用いて、ＰＤシート中の遺伝子と分泌タンパク質の発現を解析した。ＰＤシートの軟骨欠損に対する有効性を組織学的スコアで評価し、有効性と相関を示すシグナルに含まれる遺伝子やタンパク質を同定した。有効性と相関のある遺伝子・タンパク質をエンリッチメント解析したところ、細胞外マトリックス、骨格発生、血管新生に関連することがわかった。ＰＤシートの有効性と正の相関を示したのは８つの遺伝子（ＥＳＭ１，ＧＲＥＭ１，ＳＥＲＰＩＮＡ３，ＤＫＫ１，ＭＩＡ，ＮＴＮ４，ＦＡＢＰ３，ＰＤＧＦＡ）であり、３つの遺伝子（ＲＡＲＲＥＳ２，ＡＰＯＥ，ＰＧＦ）はトランスクリプトーム解析とプロテオーム解析の両方で負の相関を示した。このうち、骨格発生経路に関与するＭＩＡとＤＫＫ１は分泌量と有効性の間に弱い相関を示した。これらの結果から、ＤＫＫ１とＭＩＡはＰＤシートの有効性を予測するのに有用であり、ＰＤシートを介したヒアルロン酸軟骨の再生に寄与する可能性が示唆された。
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44. Mainil-Varlet, P.; Aigner, T.; Brittberg, M.; Bullough, P.; Hollander, A.; Hunziker, E.; Kandel, R.; Nehrer, S.; Pritzker, K.; Roberts, S.; et al. Histological Assessment of Cartilage Repair. The Journal of Bone & Joint Surgery 2003, 85, 45-57.
45. O’Driscoll, S.W.; Keeley, F.W.; Salter, R.B. The chondrogenic potential of free autogenous periosteal grafts for biological resurfacing of major full-thickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion. An experimental investigation in the rabbit. J Bone Joint Surg Am 1986, 68, 1017-1035.
Claims (18)
- 軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性に関連するマーカー遺伝子を移植前の軟骨細胞シートから探索するための軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法であって、
移植前の軟骨細胞シートを複数ロット準備するシート準備工程と、
前記複数ロットの前記移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数のタンパク質の分泌量を測定するタンパク質測定工程と、
前記複数ロットの前記軟骨細胞シートのそれぞれを骨軟骨欠損モデル生物に移植して各軟骨細胞シートについて軟骨再生に関する有効性のスコアを算出するスコア算出工程と、
前記タンパク質測定工程で測定されたタンパク質の分泌量と、前記スコア算出工程で算出された前記スコアとの相関関係から、前記スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定する遺伝子同定工程と、
を備えることを特徴とする軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法。 - 前記複数ロットの前記移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数の遺伝子の発現レベルを測定する遺伝子測定工程を更に備え、
前記遺伝子同定工程は、前記遺伝子測定工程で測定された複数の遺伝子の発現レベルと、前記スコア算出工程で算出された前記スコアとの相関関係から前記スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定することを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索方法。 - 軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性に関連するマーカー遺伝子を移植前の軟骨細胞シートから探索するための軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置であって、
移植前の軟骨細胞シートを複数ロット準備するシート準備手段と、
前記複数ロットの前記移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数のタンパク質の分泌量を測定するタンパク質測定手段と、
前記複数ロットの前記軟骨細胞シートのそれぞれを骨軟骨欠損モデル生物に移植して各軟骨細胞シートについて軟骨再生に関する有効性のスコアを算出するスコア算出手段と、
前記タンパク質測定手段で測定されたタンパク質の分泌量と、前記スコア算出手段で算出された前記スコアとの相関関係から、前記スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定する遺伝子同定手段と、
を備えることを特徴とする軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置。 - 前記複数ロットの前記移植前の軟骨細胞シートのそれぞれについて複数の遺伝子の発現レベルを測定する遺伝子測定手段を更に備え、
前記遺伝子同定手段は、前記遺伝子測定手段で測定された複数の遺伝子の発現レベルと、前記スコア算出手段で算出された前記スコアとの相関関係から前記スコアと正の相関を示す正の相関遺伝子及び／又は負の相関を示す負の相関遺伝子を同定することを特徴とする請求項３に記載の軟骨細胞シートのマーカー遺伝子探索装置。 - 軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性を移植前の軟骨細胞シートから予測するための軟骨細胞シートの評価方法であって、
前記移植前の軟骨細胞シートにおける、ＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＳＳ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＧＲＮ、ＣＹＣＳ、ＩＬ６Ｒ、ＴＨＢＳ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＬＰＩ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＲＣ２、ＤＫＫ４、ＵＦＣ１、ＳＳＴからなる群より選択される正の相関遺伝子の発現量、及び／又はＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦ、ＮＡＣＡ、ＣＸＣＬ６、ＳＭＰＤＬ３Ａ、ＤＫＫＬ１、ＰＲＬ、ＴＥＣ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＣＸＣＬ１２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＩＭＰ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＰＨＢ４、ＫＤＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＳＴＫ１６、ＴＮＦＳＦ１２からなる群より選択される負の相関遺伝子の発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定した前記正の相関遺伝子の発現量及び／又は前記負の相関遺伝子の発現量に基づいて前記軟骨細胞シートの移植後の有効性を推定する推定工程と、を備えることを特徴とする軟骨細胞シートの評価方法。 - 前記正の相関遺伝子が、ＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡからなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載の軟骨細胞シートの評価方法。
- 前記推定工程は、前記正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上のときに、前記移植前の軟骨細胞シートの有効性が高いと推定することを特徴とする請求項５に記載の軟骨細胞シートの評価方法。
- 前記負の相関遺伝子が、ＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦからなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載の軟骨細胞シートの評価方法。
- 前記推定工程は、前記負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下のときに、前記移植前の軟骨細胞シートの有効性が高いと推定することを特徴とする請求項５に記載の軟骨細胞シートの評価方法。
- 前記測定工程は、前記相関遺伝子から転写されたＲＮＡを定量すること、及び／又は前記相関遺伝子がコードするタンパク質を定量することで、前記相関遺伝子の発現量を測定することを特徴とする請求項５に記載の軟骨細胞シートの評価方法。
- 軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの移植後の有効性を移植前の軟骨細胞シートから予測するための軟骨細胞シートの評価装置であって、
前記移植前の軟骨細胞シートにおける、ＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＳＳ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＧＲＮ、ＣＹＣＳ、ＩＬ６Ｒ、ＴＨＢＳ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＬＰＩ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＲＣ２、ＤＫＫ４、ＵＦＣ１、ＳＳＴからなる群より選択される正の相関遺伝子の発現量、及び／又はＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦ、ＮＡＣＡ、ＣＸＣＬ６、ＳＭＰＤＬ３Ａ、ＤＫＫＬ１、ＰＲＬ、ＴＥＣ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＣＸＣＬ１２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＩＭＰ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＰＨＢ４、ＫＤＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＳＴＫ１６、ＴＮＦＳＦ１２からなる群より選択される負の相関遺伝子の発現量を測定する測定手段と、
前記測定手段で測定した前記正の相関遺伝子の発現量及び／又は負の相関遺伝子の発現量に基づいて前記軟骨細胞シートの移植後の有効性を推定する推定手段と、を備えることを特徴とする軟骨細胞シートの評価装置。 - 前記正の相関遺伝子が、ＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡからなる群より選択されることを特徴とする請求項１１に記載の軟骨細胞シートの評価装置。
- 前記推定手段は、前記正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上のときに、前記移植前の軟骨細胞シートの有効性が高いと推定することを特徴とする請求項１１に記載の軟骨細胞シートの評価装置。
- 前記負の相関遺伝子が、ＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦからなる群より選択される、請求項１１に記載の軟骨細胞シートの評価装置。
- 前記推定手段は、前記負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下のときに、前記移植前の軟骨細胞シートの有効性が高いと推定することを特徴とする請求項１１に記載の軟骨細胞シートの評価装置。
- 前記測定手段は、前記相関遺伝子から転写されたＲＮＡを定量すること、及び／又は前記相関遺伝子がコードするタンパク質を定量することで、前記相関遺伝子の発現量を測定することを特徴とする請求項１１に記載の軟骨細胞シートの評価装置。
- 軟骨再生に使用される軟骨細胞シートであって、
移植前の軟骨細胞シートにおけるＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＳＳ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＧＲＮ、ＣＹＣＳ、ＩＬ６Ｒ、ＴＨＢＳ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＬＰＩ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＲＣ２、ＤＫＫ４、ＵＦＣ１、ＳＳＴからなる群より選択される正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上であること、及び／又はＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦ、ＮＡＣＡ、ＣＸＣＬ６、ＳＭＰＤＬ３Ａ、ＤＫＫＬ１、ＰＲＬ、ＴＥＣ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＣＸＣＬ１２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＩＭＰ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＰＨＢ４、ＫＤＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＳＴＫ１６、ＴＮＦＳＦ１２からなる群より選択される負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下であることを特徴とする軟骨細胞シート。 - 軟骨再生に使用される軟骨細胞シートの製造方法であって、
移植前の軟骨細胞シートにおけるＥＳＭ１、ＧＲＥＭ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＤＫＫ１、ＭＩＡ、ＮＴＮ４、ＦＡＢＰ３、ＰＤＧＦＡ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＳＳ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＧＲＮ、ＣＹＣＳ、ＩＬ６Ｒ、ＴＨＢＳ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＬＰＩ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＲＣ２、ＤＫＫ４、ＵＦＣ１、ＳＳＴからなる群より選択される正の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以上となるように、及び／又はＲＡＲＲＥＳ２、ＡＰＯＥ、ＰＧＦ、ＮＡＣＡ、ＣＸＣＬ６、ＳＭＰＤＬ３Ａ、ＤＫＫＬ１、ＰＲＬ、ＴＥＣ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＣＸＣＬ１２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＩＭＰ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＰＨＢ４、ＫＤＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＳＴＫ１６、ＴＮＦＳＦ１２からなる群より選択される負の相関遺伝子の発現量が所定の発現レベル以下となるように、軟骨細胞シートを培養することを特徴とする軟骨細胞シートの製造方法。
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|---|---|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023084388A1 (en) * | 2021-11-10 | 2023-05-19 | Novartis Ag | Methods for determining the biological activity of angptl polypeptides |
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2020
- 2020-12-07 JP JP2020202431A patent/JP2021090418A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023084388A1 (en) * | 2021-11-10 | 2023-05-19 | Novartis Ag | Methods for determining the biological activity of angptl polypeptides |
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