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JP2020528753A - 組換え受容体を発現している細胞を増大させるための試薬 - Google Patents

組換え受容体を発現している細胞を増大させるための試薬 Download PDF

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Abstract

本開示は、組換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体を発現する操作細胞を刺激、富化、増大、および/または活性化するための組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、提供される方法は、組換え受容体を認識するかまたはそれと結合するポリペプチド抗原または抗イディオタイプ抗体などの結合分子と結びついた粒子、例えば、ビーズ粒子とのインキュベーションによる細胞のエクスビボまたはインビトロ刺激、富化、増大、および/または活性化を含む。結合分子が結びついた粒子の存在下で細胞に形質導入または形質移入することにより、活性化剤または刺激剤と共に事前にインキュベートされていない、例えば、抗CD3/抗CD28抗体および/または1種もしくは複数種の組換えサイトカインと共にインキュベートされていない細胞に形質移入または形質導入するための方法が、また、本明細書において提供される。いくつかの態様において、提供される組成物は、養子免疫療法のための細胞、例えば、遺伝子操作T細胞を調製するための方法に使用することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2017年7月29日に出願された「REAGENTS FOR EXPANDING CELLS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS」という名称の米国仮特許出願第62/538,671号、2017年12月8日に出願された「REAGENTS FOR EXPANDING CELLS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS」という名称の米国仮特許出願第62/596,742号、2018年2月9日に出願された「REAGENTS FOR EXPANDING CELLS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS」という名称の米国仮特許出願第62/628,889号、および2018年5月1日に出願された「REAGENTS FOR EXPANDING CELLS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS」という名称の米国仮特許出願第62/665,468号の優先権の恩典を主張し、それらの内容は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
配列表の参照による組込み
本出願は、電子的フォーマットでの配列表と一緒に提出されている。配列表は、735042007340SeqList.TXT（2018年7月27日作成、サイズ：123,336バイト）と題されるファイルとして提供される。配列表の電子的フォーマットでの情報はその全体が参照により組み入れられる。
分野
本開示は、組換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体を発現する操作細胞を刺激、富化、増大、および/または活性化するための組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、提供される方法は、組換え受容体を認識するかまたはそれと結合する結合分子と結びついた粒子、例えば、ビーズ粒子とのインキュベーションによる細胞のエクスビボまたはインビトロ刺激、富化、増大、および/または活性化を含む。いくつかの態様において、結びついた結合分子は、組換え受容体と結合するポリペプチド、例えば、ポリペプチド抗原または抗イディオタイプ抗体である。いくつかの態様において、提供される組成物は、養子免疫療法のための細胞、例えば、遺伝子操作T細胞を調製するための方法に使用することができる。
背景
養子細胞免疫療法または癌療法に使用するために抗原特異的T細胞をインビトロで増大させるためを含む、細胞集団をインビトロまたはエクスビボで刺激または増大させるために、様々な戦略が利用可能である。研究目的、診断目的および治療目的を含む、細胞集団を刺激または増大させるために改善された戦略が必要である。このような必要性に見合う試薬、方法、ならびに製品およびキットが、提供される。
概要
本明細書において、特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含有する組換え抗原受容体を発現している細胞を含有するインプット組成物を、複数の粒子と共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子のそれぞれが、特異的に抗原結合ドメインと結合する結合分子を含有する方法が提供され、その際、抗原結合ドメインへの結合分子の結合が、組換え抗原受容体を含有する細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含有するアウトプット組成物を産生する。いくつかの態様において、組換え抗原受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含有する。一部の例において、抗原結合性フラグメントは、単鎖抗体フラグメントであるかまたはそれを含有する。いくつかの態様において、その抗原結合性フラグメントは、柔軟なリンカーによりつながった抗体可変領域を含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、その抗原結合性フラグメントは、scFvであるかまたはそれを含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXもしくはG250としても公知）、癌-精巣抗原、癌/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、癌胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても公知）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Ra）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メソセリン、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグ関連抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体により発現される分子より選択される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原は、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、炭酸脱水酵素9（CAIX）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerbB2）、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児型アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子、（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、TAG72、B7-H6、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児型AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、癌-精巣抗原、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、病原体特異抗原およびユニバーサルタグに関連する抗原より選択される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、組換え抗原受容体のリンカーまたはスペーサー領域と結合せずかつそれを認識せず、リンカーまたはスペーサー領域は、抗原結合ドメインを抗原受容体の膜貫通ドメインと接続している。任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含有するインプット組成物を、複数の粒子と共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれが、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである結合分子を含有し、抗原結合ドメインへの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、キメラ抗原受容体を含有する細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含有するアウトプット組成物を産生する方法が、本明細書において提供される。任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部を含有する。
特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含有するインプット組成物を、複数の粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子のそれぞれが、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部を含有する結合分子を含有し、抗原結合ドメインへの組換え抗原またはその一部の結合が、キメラ抗原受容体を含有する細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含有するアウトプット組成物を産生する方法が、本明細書において提供される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXもしくはG250としても公知）、癌-精巣抗原、癌/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、癌胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても公知）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソセリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、TYRP1もしくはgp75としても公知）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼもしくはDCTとしても公知）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的または病原体発現抗原、またはユニバーサルタグ関連抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子より選択される。
いくつかの態様において、組換え抗原は、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、炭酸脱水酵素9（CAIX）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerbB2）、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児型アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子、（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、TAG72、B7-H6、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児型AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、癌-精巣抗原、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138および病原体特異抗原または抗原結合ドメインにより認識される前記のいずれかの一部より選択される。一部の例において、組換え抗原は、BCMA、CD22もしくはROR1、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原の一部は、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部を含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原の一部は、本質的に、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部を含有する。
いくつかの態様において、特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現している細胞を含むインプット組成物を、特異的に抗原結合ドメインと結合するかまたはそれを認識する結合分子が結びついたビーズであるかまたはそれを含む複数の粒子と共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、（i）複数の粒子が、0.5μg/mLと500μg/mLとの間または約0.5μg/mLと約500μg/mLとの間（両端の値を含む）の結合分子濃度を有する組成物からのものであり、インキュベートの間に、インプット組成物中に存在する総細胞と複数の粒子との比が、5：1〜1：5または約5：1〜約1：5（両端の値を含む）であり、（ii）抗原結合ドメインへの結合分子の結合が、キメラ抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する方法が、本明細書において提供される。
特異的にB細胞成熟抗原（BCMA）と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含有するインプット組成物を、複数の粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれが、抗原結合ドメインにより認識されるBCMAの細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部を含有する結合分子を含有し、抗原結合ドメインへのBCMAの細胞外ドメインまたはその一部の結合が、キメラ抗原受容体を含有する細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含有するアウトプット組成物を産生する方法が、また、本明細書において提供される。いくつかの例において、BCMAの一部は、本質的に、細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部からなる。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、部分構造に連結した組換え抗原またはその一部を含有する融合ポリペプチドであり、任意で、部分構造は、粒子との結びつきを促進する。一部の例において、部分構造は、組換え抗原のC末端に連結されている。場合によっては、部分構造は、疎水性であるかまたは疎水性アミノ酸に富んでいる。いくつかの態様において、部分構造は、Fcドメインであるかまたはそれを含有する。いくつかの例において、Fc領域は、ヒトIgGに由来する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原は、CD19である。
特異的にCD19と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含有するインプット組成物を、複数の粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子のそれぞれが、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである結合分子を含有し、抗原結合ドメインへの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、キメラ抗原受容体を含有する細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含有するアウトプット組成物を産生する方法が、また、本明細書において提供される。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原結合性フラグメントは、scFvであるかまたはそれを含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原または組換え抗原は、ヒト由来である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有する。いくつかの例において、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部は、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含有するFc領域またはFcの一部を含有する。いくつかの態様において、定常領域またはFc領域は、ヒトIgGに由来する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、インタクト抗体または完全長抗体である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、粒子、例えば、ビーズと共有結合的または非共有結合的に結びついている。任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれと、結合分子のC末端アミノ酸残基もしくはその近くで結びついており、かつ/または複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれへの結合分子の結びつきが、実施されることにより、抗原受容体の抗原結合ドメインにより認識される結合分子の領域もしくはエピトープが、抗原受容体により認識可能なように配向される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子、例えば、ビーズは、合成粒子、不溶性粒子、固体粒子または非細胞性粒子である。本明細書に開示される任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、ビーズである。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子は、ビーズを含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、1種または複数種のポリマーもしくはオリゴマーであるかもしくはそれを含み、かつ/またはポリマー性および/もしくはオリゴマー性である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子は、1μmと10μmとの間もしくは約1μmと10μmとの間または2μmと5μmとの間もしくは約2μmと5μmとの間の平均直径を含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズは、約2.8μmの平均直径を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズは、約4.5μmの平均直径を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズは、約0.5g/cm3と5.0g/cm3との間または1g/cm3と2g/cm3との間もしくは約1g/cm3と約2g/cm3との間の平均密度を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズは、約1.3g/cm3の平均密度を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズは、約1.5g/cm3の平均密度を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズは、単分散性である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、粒子と共有結合的に結びついている。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、結合分子の結びつきのための表面に露出した官能基を含有し、かつ/または結合分子が、表面に露出した官能基を介して粒子と共有結合的に結びついている。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、表面に露出した官能基は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、クロロメチル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、トシル基またはヒドラジン基である。いくつかの態様において、表面に露出した官能基は、トシル基である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズは、生体適合性であるか、または細胞に無毒である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズは、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、ヒドロキシカルボン酸のコポリマー、ジカルボン酸のコポリマー、または金属を含む粒子を含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子、例えばビーズは、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、炭素、またはそれらの組み合わせを含む表面を含有する。いくつかの例において、ポリマーは、ポリエチレングリコール、乳酸グリコール酸共重合体、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレン、およびポリビニルアルコール、またはそれらの組み合わせである。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子は、疎水性表面を含む粒子を含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えばビーズは、ポリスチレン表面を含む粒子を含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えばビーズは、磁性であるおよび/または磁性コア、常磁性コア、もしくは超常磁性コアを含む粒子を含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、0.5μg/mLと500μg/mLとの間、1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは5μg/mLと100μg/mLとの間、または約0.5μg/mLと500μg/mLとの間、約1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは約5μg/mLと100μg/mLとの間（両端の値を含む）である結合分子濃度を有する組成物からのものである。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、少なくとも1μg/mL、少なくとも5μg/mL、少なくとも10μg/mL、少なくとも25μg/mL、少なくとも50μg/mL、少なくとも100μg/mLもしくは少なくとも200μg/mL、または少なくとも約1μg/mL、少なくとも約5μg/mL、少なくとも約10μg/mL、少なくとも約25μg/mL、少なくとも約50μg/mL、少なくとも約100μg/mLもしくは少なくとも約200μg/mLである結合分子濃度を有する組成物からのものである。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれは、結合分子の少なくとも10コピー、少なくとも102コピー、少なくとも103コピー、少なくとも104コピー、少なくとも105コピーもしくは少なくとも106コピー、または少なくとも約10コピー、少なくとも約102コピー、少なくとも約103コピー、少なくとも約104コピー、少なくとも約105コピーもしくは少なくとも約106コピーを含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、補助シグナルを提供しかつ/または抑制シグナルを遮断するために、細胞上の追加的な分子と特異的に結合する作用物質の存在下で、インキュベーションの少なくとも一部は行われる。任意のこのような態様のいくつかにおいて、作用物質は、粒子、例えばビーズと一緒に提供され、任意で、作用物質は、複数の粒子またはそのサブセットのそれぞれにより含有される。任意のこのような態様のいくつかにおいて、作用物質は、複数の粒子、例えばビーズから、別々に提供される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子、例えばビーズは、補助シグナルを提供しかつ/または抑制シグナルを遮断するために細胞上の追加的な分子と特異的に結合する作用物質をさらに含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、作用物質は、リガンドであるか、または抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである。任意のこのような態様のいくつかにおいて、分子は、共刺激分子または活性化共受容体である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、共刺激分子または活性化共受容体は、OX-40、ICOS、DAP10、CD28または4-1BBである。いくつかの態様において、分子は、OX-40L、ICOSL、B7-1、B7-2または4-1BBLなどの、活性化受容体または共受容体のリガンドである。任意のこのような態様のいくつかにおいて、分子は、抑制性受容体である。いくつかの例において、抑制性受容体は、CTLA-4、PD-1、LAG-3、Tim-3、BTLAまたはTIGITである。任意のこのような態様のいくつかにおいて、作用物質は、粒子、例えばビーズと共有結合的に結びついている。いくつかの態様において、分子は、抑制性受容体のリガンドであり、例えば、PD-L1、PD-L2、CD155、CD112またはLIGHTである。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子と、粒子、例えばビーズにより含有される作用物質との比、任意で、モル比または重量比は、1：1または約1：1である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、インプット組成物中に存在する総細胞と粒子、例えばビーズとの比は、5：1〜1：5、3：1〜1：3、もしくは2：1〜1：2、または約5：1〜1：5、約3：1〜1：3もしくは約2：1〜1：2である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、インプット組成物中に存在する総細胞と粒子、例えばビーズとの比は、1：0.1〜1：5または約1：0.1〜1：5である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、インプット組成物中に存在する総細胞と粒子、例えばビーズとの比は、1：1または約1：1である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、インキュベーションは、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、もしくは少なくとも14日間、または2時間超、4時間超、8時間超、12時間超、24時間超、2日間超、3日間超、4日間超、5日間超、6日間超、7日間超、8日間超、9日間超、10日間超、11日間超、12日間超、13日間超、もしくは14日間超、または約2時間超、約4時間超、約8時間超、約12時間超、約24時間超、約2日間超、約3日間超、約4日間超、約5日間超、約6日間超、約7日間超、約8日間超、約9日間超、約10日間超、約11日間超、約12日間超、約13日間超、もしくは約14日間超実施される。任意のこのような態様のいくつかにおいて、インキュベーションは、30℃と39℃との間または約30℃と約39℃との間の温度（両端の値を含む）で実施される。任意のこのような態様のいくつかにおいて、インキュベーションは、37°±2.0℃の温度で実施される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、細胞は、免疫細胞または人工多能性幹細胞（iPSC）を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、免疫細胞は、T細胞またはNK細胞である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、細胞は、CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、CD4+細胞とCD8+細胞との比は、1：1、1：2、2：1、1：3もしくは3：1、または約1：1、約1：2、約2：1、約1：3もしくは約3：1である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、細胞は、対象、任意で、ヒト対象から得られた初代細胞である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、細胞は、ヒト由来である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、細胞の組成物を、組換え抗原受容体をコードする核酸分子と、組成物中の1つまたは複数の細胞中に核酸分子を導入するための条件で接触させることを含む方法により、インプット組成物が産生される。
細胞の組成物を、組換え抗原受容体をコードする核酸分子と、組成物中の1つまたは複数の細胞中に核酸分子を導入するための条件で接触させ、それにより、インプット組成物を産生すること、およびインプット組成物の細胞を、本明細書に記載の方法によりインキュベートすることを含む、細胞を遺伝子操作する方法が、また、本明細書において提供される。いくつかの態様において、接触させることおよびインキュベートすることの少なくとも一部は、同時に実施される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、核酸分子は、ウイルスベクター、エピソームベクターまたはトランスポゾン中に含まれる。任意のこのような態様のいくつかにおいて、接触させることは、トランスポゾン/トランスポサーゼ遺伝子導入により実施される。任意のこのような態様のいくつかにおいて、接触させることは、ウイルスベクターによる形質導入により実施される。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、任意で、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであるレトロウイルスである。
場合によっては、接触させることは、ウイルスベクターを細胞の組成物と共にスピン接種する（spinoculate）段階を含む。一部の例において、スピン接種することは、遠心分離チャンバーの内部空洞中でウイルスベクター粒子および細胞の組成物を回転させることを含み、その際、回転は、空洞の側壁内面で、500gと2500gとの間、500gと2000gとの間、500gと1600gとの間、500gと1000gとの間、600gと1600gとの間、600gと1000gとの間、1000gと2000gとの間もしくは1000gと1600gとの間、または約500gと2500gとの間、約500gと2000gとの間、約500gと1600gとの間、約500gと1000gとの間、約600gと1600gとの間、約600gと1000gとの間、約1000gと2000gとの間もしくは約1000gと1600gとの間（それぞれ両端の値を含む）、あるいは少なくとも600g、少なくとも800g、少なくとも1000g、少なくとも1200g、少なくとも1600g、もしくは少なくとも2000g、または少なくとも約600g、少なくとも約800g、少なくとも約1000g、少なくとも約1200g、少なくとも約1600g、もしくは少なくとも約2000gである相対遠心力である。いくつかの態様において、スピン接種することは、5分超もしくは約5分超、10分超もしくは約10分超、15分超もしくは約15分超、20分超もしくは約20分超、30分超もしくは約30分超、45分超もしくは約45分超、60分超もしくは約60分超、90分超もしくは約90分超または120分超もしくは約120分超、あるいは5分と60分との間、10分と60分との間、15分と60分との間、15分と45分との間、30分と60分との間もしくは45分と60分との間、または約5分と60分との間、約10分と60分との間、約15分と60分との間、約15分と45分との間、約30分と60分との間もしくは約45分と60分との間（それぞれ両端の値を含む）である時間である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、接触させることは、形質導入補助剤の存在下で実施される。任意のこのような態様のいくつかにおいて、細胞の組成物は、複数のT細胞を含有し、接触させることの前に、方法は、T細胞を刺激することも活性化することも含まない。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、細胞の組成物は複数のT細胞を含まず、接触させることの前に、方法は、TCR複合体を経由するシグナルを誘導することが可能な1種もしくは複数種の作用物質の存在下で組成物をインキュベートすること、ならびに/またはT細胞、CD4+ T細胞、および/もしくはCD8+ T細胞の増殖を誘導することが可能な1種もしくは複数種の作用物質、および/もしくはCD3結合分子、CD28結合分子、組換えIL-2、組換えIL-15、および組換えIL-7もしくはそれらの組み合わせの存在下でのインキュベーションを含まない。いくつかの態様において、接触させることの前に、方法は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体の存在下でT細胞を刺激することを含まない。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、細胞の組成物は、複数のT細胞を含有し、該複数の細胞は、対象由来の試料から得られたものであり、接触させることは、対象から試料を得た後、24時間以内に開始され、かつ/あるいは接触させることの前に、T細胞は、対象から試料を得た後、15℃超、18℃超、22℃超もしくは25℃超、または約15℃超、約18℃超、約22℃超もしくは約25℃超の温度に、1時間超、2時間超、4時間超、6時間超、8時間超、12時間超、もしくは24時間超の時間、供されたことがなく、かつ/あるいは接触させることの前に、T細胞が、対象から試料を得た後、37°±2.0℃、約37°±2.0℃、37°±2.0℃超、または約37°±2.0℃超の温度に、15分超、30分超、1時間超または2時間超の時間、供されたことがない。任意のこのような態様のいくつかにおいて、接触させることの前に、T細胞の5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、もしくは40％以下が、活性化細胞であり、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、IL-2、IFN-ガンマ、TNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、細胞周期のG1期もしくはより後期であり、かつ/または増殖することが可能である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、方法は、インキュベーションまたは接触させることの前に、細胞を含有する対象から生物学的試料を得ること、および任意で、試料から、細胞、任意でT細胞を選択または富化することをさらに含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、インプット組成物中の組換え抗原受容体を発現している細胞のパーセントは、75％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満もしくはそれ未満または約75％未満、約70％未満、約60％未満、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満もしくはそれ未満である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、細胞の組成物またはインプット組成物は、少なくとも1×102個の細胞、少なくとも1×103個の細胞、少なくとも1×104個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも1×106個の細胞もしくは少なくとも1×107個の細胞、または少なくとも約1×102個の細胞、少なくとも約1×103個の細胞、少なくとも約1×104個の細胞、少なくとも約1×105個の細胞、少なくとも約1×106個の細胞もしくは少なくとも約1×107個の細胞を含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、アウトプット組成物中に存在する細胞の活性化マーカーまたは疲弊マーカーの表面発現は、類似のインキュベーション後であるが、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能なポリクローナル刺激分子の存在下で産生された細胞の組成物中のマーカーの表面発現よりも少ない。一部の例において、疲弊マーカーは、抑制性受容体である。場合によっては、疲弊マーカーは、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLAまたはTIGITである。いくつかの例において、活性化マーカーは、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lまたは4-1BBである。任意のこのような態様のいくつかにおいて、表面発現は、少なくとも1.2倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2.0倍、少なくとも3.0倍、少なくとも4.0倍、少なくとも5.0倍、少なくとも10.0倍もしくはこれを超える、または少なくとも約1.2倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2.0倍、少なくとも約3.0倍、少なくとも約4.0倍、少なくとも約5.0倍、少なくとも約10.0倍もしくはこれを超える。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、アウトプット組成物中の細胞数は、類似のインキュベーションによるが、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能なポリクローナル刺激分子の存在下で産生された細胞の組成物中の細胞数と実質的に同じであるか、またはそれよりも大きい。任意のこのような態様のいくつかにおいて、ポリクローナル刺激分子は、抗CD3抗体もしくはフラグメントおよび/または抗CD28抗体もしくはフラグメントを含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、アウトプット組成物中の細胞数は、インプット組成物中の細胞数よりも1.2倍超、1.5倍超、2.0倍超、3.0倍超、4.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、25倍超、50倍超、100倍超もしくはこれを超える、または約1.2倍超、約1.5倍超、約2.0倍超、約3.0倍超、約4.0倍超、約5.0倍超、約10.0倍超、約25倍超、約50倍超、約100倍超、もしくはこれを超えるより多い。任意のこのような態様のいくつかにおいて、アウトプット組成物中の組換え抗原受容体を含有する細胞のパーセントは、50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、95％超もしくはこれを超える、または約50％超、約60％超、約70％超、約80％超、約90％超、約95％超もしくはこれを超える。任意のこのような態様のいくつかにおいて、組換え抗原受容体を含有するアウトプット組成物中の細胞の数は、インプット組成物中の抗原受容体を含有する細胞の数と比較して、1.2倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10倍またはこれを超えて、増加または富化されている。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、インキュベーションの少なくとも一部は、細胞の増大または活性をモジュレートする1種または複数種の追加的な作用物質の存在下で実施される。一部の例において、1種または複数種の追加的な作用物質は、レナリドミドである。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、方法は、インビトロまたはエクスビボで行われる。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原受容体は、CARであり、CARは、ITAMを含有する細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含有する。一部の例において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内ドメインを含有する。いくつかの態様において、CARは、共刺激シグナル伝達領域をさらに含有する。いくつかの局面において、共刺激シグナル伝達領域は、CD28または4-1BBのシグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの例において、共刺激ドメインは、CD28である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、方法は、アウトプット組成物から複数の粒子、例えばビーズを除去することをさらに含む。
本明細書において提供される方法のいずれかにより産生される細胞の組成物が、本明細書において提供される。粒子および粒子の表面と結合した結合分子を含有する表面修飾粒子が、また、本明細書において提供され、その際、結合分子は、特異的に抗原受容体の細胞外抗原結合ドメインと結合する。いくつかの態様において、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの態様において、結合分子は、組換え抗原受容体のリンカーまたはスペーサー領域と結合せずかつそれを認識せず、該リンカーまたはスペーサー領域は、抗原結合ドメインを抗原受容体の膜貫通ドメインと接続している。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、組換え抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXもしくはG250としても公知）、癌-精巣抗原、癌/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、癌胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても公知）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソセリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、TYRP1もしくはgp75としても公知）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼもしくはDCTとしても公知）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグ関連抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子より選択される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部を含有する。いくつかの局面において、組換え抗原は、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、炭酸脱水酵素9（CAIX）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerbB2）、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児型アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子、（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、TAG72、B7-H6、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児型AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、癌-精巣抗原、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138および病原体特異抗原または抗原結合ドメインにより認識される前記のいずれかの一部より選択される。
いくつかの態様において、組換え抗原は、CD19、BCMA、CD22もしくはROR1であるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原の一部は、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部を含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原の一部は、本質的に、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部からなる。
粒子および粒子の表面と結合した結合分子を含有する表面修飾粒子が、本明細書において提供され、その際、結合分子は、B細胞成熟抗原（BCMA）の細胞外ドメインまたはその一部を含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、組換え抗原または部分構造と連結したその一部を含有する融合ポリペプチドであり、任意で、その際、部分構造は、粒子との結びつきを促進する。一部の例において、部分構造は、組換え抗原のC末端に連結している。いくつかの態様において、部分構造は、疎水性であるかまたは疎水性アミノ酸に富む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、部分構造は、Fcドメインであるかまたはそれを含有する。場合によっては、Fc領域は、ヒトIgGに由来する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、組換え抗原は、ヒト由来である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントを含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原結合ドメインにより認識される抗原は、CD19である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含有する。いくつかの態様において、抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含有する。いくつかの態様において、抗原結合性フラグメントは、scFvであるかまたはそれを含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有する。場合によっては、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部は、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含有するFc領域またはFcの一部を含有する。いくつかの態様において、定常領域またはFc領域は、ヒトIgGに由来する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、インタクト抗体または完全長抗体である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、粒子、例えば、ビーズと共有結合的または非共有結合的に結びついている。任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれと、結合分子のC末端アミノ酸残基もしくはその近くで結びついており、かつ/または複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれへの結合分子の結びつきが、実施されることにより、抗原受容体の抗原結合ドメインにより認識される結合分子の領域もしくはエピトープが、抗原受容体により認識可能なように配向される。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子、例えばビーズは、合成粒子、不溶性粒子、固体粒子、または非細胞性粒子である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えばビーズは、ビーズを含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、1μmと10μmとの間もしくは約1μmと10μmとの間または2μmと5μmとの間もしくは約2μmと5μmとの間の直径（それぞれ両端の値を含む）を有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、約2.8μmの直径を有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、約4.5μmの直径を有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子は、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、結合分子の結びつきのための表面に露出した官能基を含有し、かつ/または結合分子は、表面に露出した官能基を介して粒子と共有結合的に結びついている。いくつかの態様において、表面に露出した官能基は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、クロロメチル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、トシル基またはヒドラジン基である。一部の例において、表面に露出した官能基は、トシル基である。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、生体適合性であるか、または細胞に無毒である。任意のこのような態様のいくつかにおいて、複数の粒子、例えば、ビーズは、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、ヒドロキシカルボン酸のコポリマー、ジカルボン酸のコポリマー、または金属を含有する粒子、例えばビーズを含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子、例えばビーズは、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、炭素、またはそれらの組み合わせを含む表面を含有する。場合によっては、ポリマーは、ポリエチレングリコール、乳酸グリコール酸共重合体、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレン、およびポリビニルアルコール、またはそれらの組み合わせである。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、疎水性表面を含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子、例えばビーズは、ポリスチレン表面を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、磁性である、および/または磁性コア、常磁性コアもしくは超常磁性コアを含有する。任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、結合分子の少なくとも10コピー、少なくとも102コピー、少なくとも103コピー、少なくとも104コピー、少なくとも105コピーもしくは少なくとも106コピーまたは少なくとも約10コピー、少なくとも約102コピー、少なくとも約103コピー、少なくとも約104コピー、少なくとも約105コピーもしくは少なくとも約106コピーを含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、粒子は、補助シグナルを提供しかつ/または抑制シグナルを遮断するために細胞上の追加的な分子と特異的に結合する作用物質をさらに含有し、それにより、細胞の増大をモジュレートする。任意のこのような態様のいくつかにおいて、作用物質は、リガンドであるか、または抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、分子は、共刺激分子または活性化共受容体である。いくつかの例において、共刺激分子または活性化共受容体は、OX-40、ICOS、DAP10、CD28または4-1BBである。いくつかの態様において、分子は、OX-40L、ICOSL、B7-1、B7-2または4-1BBLなどの、活性化受容体または共受容体のリガンドである。一部の例において、分子は、抑制性受容体である。いくつかの例において、抑制性受容体は、CTLA-4、PD-1、LAG-3、Tim-3、BTLAまたはTIGITである。いくつかの態様において、分子は、PD-L1、PD-L2、CD155、CD112またはLIGHTなどの、抑制性受容体のリガンドである。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、作用物質は、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている。任意のこのような態様のいくつかにおいて、結合分子と、粒子により含有される作用物質との比、任意で、モル比または重量比は、1：1または約1：1である。
本明細書に記載の複数の表面修飾粒子、例えばビーズを含有する組成物が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、粒子は、0.5μg/mLと500μg/mLとの間、1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは5μg/mLと100μg/mLとの間、または約0.5μg/mLと500μg/mLとの間、約1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは約5μg/mLと100μg/mLとの間（それぞれ両端の値を含む）である結合分子濃度を有する組成物からのものである。いくつかの態様において、粒子は、少なくとも1μg/mL、少なくとも5μg/mL、少なくとも10μg/mL、少なくとも25μg/mL、少なくとも50μg/mL、少なくとも100μg/mLもしくは少なくとも200μg/mL、または少なくとも約1μg/mL、少なくとも約5μg/mL、少なくとも約10μg/mL、少なくとも約25μg/mL、少なくとも約50μg/mL、少なくとも約100μg/mLもしくは少なくとも約200μg/mLである結合分子濃度を有する組成物からのものである。任意のこのような態様のいくつかにおいて、組成物は、単分散性である。
本明細書に記載の粒子、例えばビーズのいずれかまたは本明細書に記載の組成物のいずれかと、使用説明書とを含有するキットが、また、本明細書において提供される。一部の例において、説明書は、細胞集団から、結合分子により特異的に認識される抗原結合ドメインを含有する抗原受容体を発現している細胞を選択または富化するためのものである。場合によっては、説明書は、細胞集団から、結合分子により特異的に認識される抗原結合ドメインを含有する抗原受容体を発現している細胞を増大させるためのものである。いくつかの態様において、細胞集団中の組換え抗原受容体を発現している細胞のパーセントは、75％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満もしくはそれ未満、または約75％未満、約70％未満、約60％未満、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満もしくはそれ未満である。
細胞集団を、本明細書に記載の粒子、例えばビーズのいずれか、または本明細書に記載の組成物のいずれかと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させるための方法が、本明細書において提供される。細胞集団を、本明細書に記載の粒子、例えばビーズのいずれか、または本明細書に記載の組成物のいずれかと接触させることを含む、細胞を選択または富化する方法もまた、提供される。
特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体（CAR）を発現しているT細胞を含有するインプット組成物を、インプット組成物中の細胞におけるCAR依存性活性を刺激するための条件で少なくとも10日間インキュベートし、それにより、アウトプット組成物を産生すること、およびアウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の1つまたは複数の表現型または活性を評価することを含む、細胞組成物を評価するための長期刺激方法が、本明細書において提供される。
長期刺激方法の任意の態様のいくつかにおいて、CAR依存性活性を刺激するための条件は、特異的にCARの抗原結合ドメインと結合する結合分子の存在を含む。いくつかの態様において、結合分子は、支持体と結びついている。いくつかの態様において、支持体は、固体支持体である。いくつかの態様において、固体支持体は、マイクロプレートのウェルまたはビーズの表面である。いくつかの態様において、固体支持体は、結合分子がマイクロプレートと結びついたマイクロプレートであり、インキュベーションは、マイクロプレート中で実施される。いくつかの態様において、固体支持体は、結合分子が結びついたビーズであり、インキュベーションは、複数のビーズの存在下で実施される。
長期刺激方法の任意の態様のいくつかにおいて、結合分子は、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、組換え抗原またはその一部は、BCMAであるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である。いくつかの態様において、結合分子は、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む。
長期刺激方法の任意の態様のいくつかにおいて、方法は、インビトロまたはエクスビボで実施される。
長期刺激方法の任意の態様のいくつかにおいて、インプット組成物は、組換えサイトカインを含まない培地の存在下でインキュベートされる。いくつかの態様において、インキュベーションは、連続的に実施される、またはある期間にわたり中断されない。いくつかの態様において、インキュベーションの間に、細胞は再播種されず、培地は交換されず、かつ結合分子は添加されない。
長期刺激方法の任意の態様のいくつかにおいて、方法は、アウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の活性化、疲弊または分化状態の1つまたは複数の表現型を評価することを含む。いくつかの態様において、表現型は、疲弊であり、評価することは、CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTA、またはCD96より選択される1つまたは複数のマーカーの発現、任意で、表面発現を測定することを含む。いくつかの態様において、表現型は、活性化であり、評価することは、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3、またはKi67より選択される1つまたは複数つのマーカーの発現、任意で、表面発現を測定することを含む。いくつかの態様において、表現型は、分化状態であり、評価することは、（i）CD25、CD45RO、CD56、KLRG1、およびCD95の1つもしくは複数ならびに/または（ii）CD45RA、CD27、CD28、CD62L、およびCCR7の1つもしくは複数より選択される1つまたは複数のマーカーを測定することを含み、任意で、1つまたは複数のマーカーは、ナイーブ様T細胞と正または逆に関連するマーカーである。
長期刺激方法の任意の態様のいくつかにおいて、方法は、アウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の1つまたは複数の活性を評価することを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の活性は、CAR依存性活性、任意で、抗原に刺激される活性を含む。長期刺激方法の任意の態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の活性は、細胞溶解活性またはサイトカイン産生を含む。
長期刺激方法の任意のいくつかの態様において、期間は、少なくとも11日、少なくとも12日、少なくとも13日、少なくとも14日、もしくは15日、または少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、もしくは少なくとも約15日である。いくつかの態様において、期間は、11日、12日、13日、14日もしくは15日であるか、または約11日、約12日、約13日、約14日もしくは約15日である。
長期刺激方法の任意の態様のいくつかにおいて、インプット組成物は、インキュベーションの前に試験作用物質または化合物に曝露または接触されていた細胞を含有し、任意で、曝露または接触させることが、CARを発現しているT細胞を含むインプット組成物を産生するための工程の1つまたは複数の段階の間に実施される。いくつかの態様において、方法は、複数のインプット組成物に対して実施され、複数のインプット組成物のそれぞれが、異なる工程により産生される。
長期刺激方法の任意の態様のいくつかにおいて、方法は、アウトプット組成物の表現型または活性と、対照組成物の表現型または活性とを比較することをさらに含み、任意で、対照組成物は、CAR依存性活性を刺激するための同じ条件で少なくとも10日間インキュベートされていたT細胞の組成物であって、試験作用物質もしくは化合物の存在下で産生されたものではない、またはインプット組成物と比較して代替的な工程により産生されていたT細胞の組成物である。いくつかの態様において、方法は、例えば対照組成物と比較して、低下した疲弊、低下した活性化または減少した分化を示すアウトプット組成物を同定することをさらに含む。いくつかの態様において、減少した分化は、1つまたは複数のナイーブ様T細胞マーカーの増加した発現を含む。
BCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後の抗BCMA CAR（CAR T細胞）を発現しているCD3+ T細胞およびCARを発現していないCD3+細胞（モック）におけるCell Trace Violet（CTV）染色のヒストグラムを示す。 抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート型ビーズ（左）またはBCMAコンジュゲート型ビーズ（右）と共にインキュベーション後の細胞におけるCD25表面発現（y軸）およびCTV染色強度（x軸）についてのドットプロットを示す。 抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート型ビーズまたはBCMAコンジュゲート型ビーズによる処理後の細胞のCTV染色のヒストグラムを示す。 細胞を抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート型ビーズまたはBCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後のCD4+細胞（左）またはCD8+細胞（右）におけるPD-1発現のヒストグラムを示す。 図3Aは、CAR発現T細胞を含有する3つの異なるT細胞組成物（それぞれ異なるドナーから生成）のそれぞれを、BCMAコンジュゲート型ビーズと共に最大14日間インキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞のパーセンテージを示す。各細胞組成物からの結果を、三角、四角、および丸により別々にプロットする。図3Bは、BCMAコンジュゲート型ビーズと共に最大14日間の、4、7、または14日のインキュベーション後のCD8+細胞におけるCD25（左）、CCR7（中央）、およびCD27（右）の検出のための平均蛍光強度（MFI）により決定された表面発現を示す。図3Aに記載された抗BCMA CAR発現細胞を含有する3つの異なる細胞組成物のそれぞれについて結果を示し、三角、四角、および丸により別々にプロットする。 図4Aは、異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞（左欄）またはCD8+ T細胞（右欄）におけるCD25の表面発現についてのグラフを示す。図4Bは、異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞（左欄）またはCD8+ T細胞（右欄）におけるPD-1の表面発現についてのヒストグラムプロットを示す。BCMA50、BCMA25、BCMA10、およびBCMA5は、約4×108個のビーズあたりそれぞれ50、25、10、および5μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 図5A〜Bは、異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在する総CD3+ T細胞数（図5A）またはCD4+ T細胞上のCTV増殖マーカー色素のレベル（図5B）を表すグラフである。BCMA50、BCMA25、BCMA10、およびBCMA5は、約4×108個のビーズあたりそれぞれ50、25、10、および5μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞上のCD25表面発現を表すグラフである。BCMA50、BCMA25、BCMA10、およびBCMA5は、約4×108個のビーズあたりそれぞれ50、25、10、および5μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 図7A〜Hは、BCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベートした抗BCMA CAR+ T細胞組成物における様々なマーカーについての染色または増殖レベルを示す。図7Aは、異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞（左欄）またはCD8+ T細胞（右欄）におけるCD25の表面発現についてのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図7Bは、異なる比のT細胞とビーズ（200μg/mL BCMAコンジュゲート型ビーズ組成物）、または固定化抗CD3と共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞（左欄）またはCD8+ T細胞（右欄）におけるCD25の表面発現についてのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図7Cは、異なる比のT細胞とビーズ（200μg/mL BCMAコンジュゲート型ビーズ組成物）、または固定化抗CD3と共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞（左欄）またはCD8+ T細胞（右欄）におけるCD69の表面発現についてのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図7Dは、異なる比のT細胞とビーズ（200μg/mL BCMAコンジュゲート型ビーズ組成物）、または固定化抗CD3と共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞（左欄）またはCD8+ T細胞（右欄）におけるTIM3の表面発現についてのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図7Eは、異なる比のT細胞とビーズ（200μg/mL BCMAコンジュゲート型ビーズ組成物）、または固定化抗CD3と共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞（左欄）またはCD8+ T細胞（右欄）におけるPD-1の表面発現についてのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図7Fは、T細胞とビーズとの比が1：1で、5μMレナリドミドの存在下または非存在下でビーズ（200μg/mL BCMAコンジュゲート型ビーズ組成物）と共にインキュベーション後の、抗BCMA CAR+ T細胞組成物中の総細胞のCTV染色（増殖の尺度）のヒストグラムプロットを示す。図7Gおよび図7Hは、T細胞とビーズとの比が1：1で、それぞれレナリドミドの存在下または非存在下でビーズ（200μg/mL BCMAコンジュゲート型ビーズ組成物）または固定化抗CD3と共にインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞（左欄）またはCD8+ T細胞（右欄）におけるCD25についてのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。上図において、「50」、「100」、および「200」は、約4×108個のビーズあたりそれぞれ50、100、および200μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 図8A〜Iは、刺激なしに、または異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズもしくは抗CD3および抗CD28コンジュゲート型ビーズと共に、0μM、0.5μM、または50μMレナリドミドの存在下でインキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中に存在するCD4+ T細胞（左欄）またはCD8+ T細胞（右欄）中またはその上の転写因子および活性化マーカーのレベルを表すグラフを示す。Blimp1（図8A）、CD25（図8B）、CD31（図8C）、PD-1（図8D）、Tbet（図8E）、EOMES（図8F）、GATA3（図8G）、Helios（図8H）、およびIkaros（図8I）のレベルを示す。200 BCMA、50 BCMA、および5 BCMAは、約4×108個のビーズあたりそれぞれ200、50、および5μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 図9A〜Cは、抗BCMA CAR+ T細胞組成物を5μMレナリドミドの存在下または非存在下で2つの異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後の培養物からの細胞外IFN-ガンマ（図9A）、IL-2（図9B）、およびTNFアルファ（図9C）のレベルを表すグラフである。50μg BCMAおよび5μg BCMAは、約4×108個のビーズあたりそれぞれ50および5μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 2人の異なるドナー（ドナーAおよびドナーB）からの細胞からの抗BCMA CAR+ T細胞組成物を0μM、1μM、または5μMレナリドミドの存在下で異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後の培養物からの細胞外IL-2のレベルを表すグラフを示す。200 BCMAおよび5 BCMAは、約4×108個のビーズあたりそれぞれ200および5μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 50μg BCMAビーズを用いた2時間のCAR刺激（stim）後のリン酸化STAT5（pSTAT5）のフローサイトメトリー分析を示す。刺激なし対照を点線で示す。 図9Fは、24時間のBCMAビーズ刺激後の代表的な正常CAR Tドナーに対する細胞内サイトカインレベルのフローサイトメトリー分析を示す（形質導入された生存CD3+にゲート設定）。 5μMレナリドミドの存在下で異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共に4日間（図9G）または7日間（図9H）インキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物の培養後の総細胞数を示す。50 BCMAおよび5 BCMAは、約4×108個のビーズあたりそれぞれ50および5μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 図9Gの説明を参照のこと。 5μMレナリドミドの存在下（5uM Len）またはレナリドミドの非存在下（ビヒクル）でBCMAコンジュゲート型ビーズと共に4または7日間インキュベーション後の抗BCMA CAR+ T細胞組成物中のCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞のCTV染色（増殖の尺度）のヒストグラムプロットを示す。 抗BCMA CAR+ T細胞組成物を5μMレナリドミドの存在下またはレナリドミドの非存在下（ビヒクル）で異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共に4日間（図9J）または7日間（図9K）インキュベーション後に、抗EGFR抗体により決定される代替マーカーEGFRt陽性の細胞のパーセンテージを表すグラフを示す。「50」および「5」は、約4×108個のビーズあたりそれぞれ50および5μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 図9Jの説明を参照のこと。 5μMレナリドミドの存在下またはレナリドミドの非存在下（ビヒクル）で異なる量のBCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベートされていた抗BCMA CAR+ T細胞エフェクター細胞によるRPMI-8226標的細胞の細胞殺滅パーセントを示す。3：1または1：1のエフェクター細胞と標的細胞との比を含有し、さらにレナリドミドの存在下または非存在下の組成物の細胞溶解活性を示す。「50」および「5」は、約4×108個のビーズあたりそれぞれ50および5μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成したBCMAコンジュゲート型ビーズを示す。 RPMI-8226標的細胞と、新鮮抗BCMA CAR+ T細胞エフェクター細胞、またはBCMAコンジュゲート型ビーズ（約4×108個のビーズあたり50μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成した50μg/mL組成物）と共に24時間または7日間インキュベートされていた抗BCMA CAR+ T細胞エフェクター細胞とを含有する培養物における殺滅アッセイの間に産生された細胞外IFN-ガンマのレベルを表すグラフを示す。0.3：1または1：1のエフェクター細胞と標的細胞との比を含有する培養物からの結果を示す。 RPMI-8226標的細胞と、新鮮抗BCMA CAR+ T細胞エフェクター細胞、またはBCMAコンジュゲート型ビーズ（約4×108個のビーズあたり50μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成した50μg/mL組成物）と共に24時間または7日間インキュベートされていた抗BCMA CAR+ T細胞エフェクター細胞とを含有する培養物における、標的細胞数に対して規準化した細胞殺滅を示す。0.3：1または1：1のエフェクター細胞と標的細胞との比を含有する培養物からの結果を示す。 図10AおよびBは、BCMAコンジュゲート型ビーズ（約4×108個のビーズあたり50μgのBCMAの量でBCMAをビーズと共にインキュベートすることにより生成した50μg/mL）と共に7日間インキュベートされていた抗BCMA CAR T細胞組成物の連続再刺激アッセイの結果を示す。3つの異なるドナー組成物からの結果を示す。図10Aおよび図10Bは、2つの異なるドナーについて各時点での抗BCMA CAR+ T細胞の細胞溶解活性を示す。 抗BCMA CARをコードするレンチウイルスベクターによる形質導入直後に、BCMAコンジュゲート型ビーズ（実線）の存在下で、または抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート型ビーズ（点線）と共にインキュベートされた5つの異なる抗BCMA CAR+細胞組成物における経時的なCAR+ T細胞のパーセンテージを表すグラフを示す。 図12AおよびBは、サイトカインの存在下（実線）または非存在下（破線）で、抗イディオタイプ抗体で被覆されたビーズ（抗ID B-1）または対照抗CD3/抗CD28抗体被覆ビーズの表示した比で刺激されたEGFRt+/CD4+ T細胞またはEGFRt+/CD4+ T細胞の増大倍率および累積細胞数をそれぞれ示す。抗CD3/抗CD28抗体被覆ビーズと細胞とが3：1（丸）、抗ID B-1被覆ビーズと細胞とが1：1（四角）、および抗ID B-1被覆ビーズと細胞とが1：5（三角）で刺激した結果を示す。 サイトカインの存在下（実線）または非存在下（破線）で、抗イディオタイプ抗体で被覆されたビーズ（抗ID B-1）または対照抗CD3/抗CD28抗体被覆ビーズの表示した比で刺激後の、培養3、7、10および14日目にフローサイトメトリーにより評価された抗EGFR抗体陽性のCD4+ T細胞のPD-1発現レベルを示す。抗CD3/抗CD28抗体被覆ビーズと細胞とが3：1（丸）、抗ID B-1被覆ビーズと細胞とが1：1（四角）、および抗ID B-1被覆ビーズと細胞とが1：5（三角）で刺激した結果を示す。 サイトカインの存在下（実線）または非存在下（破線）で、抗イディオタイプ抗体で被覆されたビーズ（抗ID B-1）または対照抗CD3/抗CD28抗体被覆ビーズの表示した比で刺激後の、培養3、7、10および14日目にフローサイトメトリーにより評価された、FMC63由来CARを発現しているCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞のフローサイトメトリーにより評価された生存率を示す。抗CD3/抗CD28抗体被覆ビーズと細胞とが1：3（丸）、抗ID B-1被覆ビーズと細胞とが1：1（四角）、および抗ID B-1被覆ビーズと細胞とが1：5（三角）で刺激した結果を示す。 FMC63由来のscFv特異的抗イディオタイプ抗体（抗ID B-1）被覆ビーズで刺激後の、FMC63由来CARを発現しているT細胞のIL-2、TNFα、およびIFNγについての細胞内サイトカイン染色を示す。EGFRt代替マーカーが陽性または陰性のCD8+ T細胞についての結果を示す（EGFRt+またはEGFRt-）。 抗原発現K562-CD19細胞で刺激後の、FMC63由来CARを発現しているT細胞のIL-2、TNFα、およびIFNγについての細胞内サイトカイン染色を示す。EGFRt代替マーカー陽性のCD8+ T細胞の結果を示す。 サイトカインの存在下（実線）または非存在下（破線）で、抗イディオタイプ抗体で被覆されたビーズ（抗ID B-1）または対照抗CD3/抗CD28抗体被覆ビーズの表示した比で刺激後の、FMC63由来CARを発現しているT細胞の培養期間14日にわたる連続刺激アッセイにおける集団倍加数を示す。EFGRt代替マーカー陽性（EGFRt+）のCD4+ T細胞またはEGFRt代替マーカー陽性（EGFRt+）のCD8+ T細胞についての結果を示す。抗CD3/抗CD28抗体被覆ビーズと細胞とが1：3（丸）、抗ID B-1被覆ビーズと細胞とが1：1（四角）、および抗ID B-1被覆ビーズと細胞とが1：5（三角）で刺激した結果を示す。 図17A〜Cは、単独培養された（実線）、またはFMC63由来scFv特異的抗イディオタイプ抗体（抗ID B-1）被覆ビーズとの共培養（破線）としての、FMC63由来CARを発現しているCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞の刺激後の結果を示す。結果を2人の異なるドナー（丸および四角で表示）について示す。図17Aは、EGFRt代替マーカーについて陽性（EGFRt+/CD4+またはEGFRt+/CD8+）であった培養物中のCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞の増大倍率を示す。図17Bは、EGFRt代替マーカーについて陽性（EGFRt+/CD4+またはEGFRt+/CD8+）であった培養物中のCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞の度数を示す。図17Cは、培養物中のCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞の生存率を示す。 図18AおよびBは、単独培養された、またはFMC63由来scFv特異的抗イディオタイプ抗体（抗ID B-1）被覆ビーズとの共培養としての、FMC63由来CARを発現しているCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞の刺激後、培養5、7および9日目のT細胞表面マーカーについてのフローサイトメトリーの結果を示す。図18Aは、EGFRt代替マーカーについて陽性であった培養物中のCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞（EGFRt+/CD4+またはEGFRt+/CD8+）上のPD-1の表面発現を示す。図18Bは、EGFRt代替マーカーについて陽性であった培養物中のCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞（EGFRt+/CD4+またはEGFRt+/CD8+）上のCD25の表面発現を示す。 CD19発現K562細胞またはPMA/イオノマイシンのいずれかとの培養で増大されていた、FMC63由来CARを発現しているT細胞を含有する解凍組成物中に存在するCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞のフローサイトメトリーにより評価された、TNFα、IFNγ、およびIL-2の細胞内サイトカインレベルを示す。単独または共培養としての、解凍時（d=0）の、または抗ID B-1コンジュゲート型ビーズの存在下で追加的に9日間さらに培養後のCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞中のサイトカインのレベルを示す。 CD19発現K562細胞またはPMA/イオノマイシンのいずれかとの培養で増大されていた、FMC63由来CARを発現しているT細胞を含有する解凍組成物中に存在するCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞のフローサイトメトリーにより評価された、CD25またはKi67について陽性の細胞の度数を示す。単独または共培養としての、解凍時（d=0）の、または抗ID B-1コンジュゲート型ビーズの存在下で追加的に9日間さらに培養後のCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞中のマーカーのレベルを示す。 図20Aは、CAR抗原特異的細胞溶解活性についての結果を示し、図20Bは、レナリドミド存在下に対して非存在下で培養された細胞を比較して、共培養物中のBCMAビーズで予備刺激されていた抗BCMA CAR-T細胞についてのサイトカイン産生に関する結果を（新鮮解凍（予備刺激なしの）抗BCMA CAR-T細胞と比較して）示す。図20Cは、3人の抗BCMA CAR Tドナーについて評価された全生存率および細胞数を示す。図20Dは、1μMレナリドミド存在下または非存在下で、BCMAビーズで7日間刺激（予備刺激）後のCD4+抗BCMA CAR T細胞およびCD8+ 抗BCMA CAR T細胞についての表面CD25およびPD-1発現（平均蛍光強度（MFI）のフローサイトメトリー分析の結果を示す。図20Eは、CD4+ CAR+サブセットおよびCD8+ CAR+サブセット（生存CD3+細胞にゲート設定）における蛍光強度の中央値（MFI；CD25およびTim3）、またはT細胞マーカー表面の陽性PD-1およびLag3マーカーのパーセンテージについてのCAR T ドナーにわたるフローサイトメトリー分析を示す。示された値は、ベースライン（ビヒクル）に対するパーセンテージMFI、生存率、または数である。 3人のドナーのそれぞれについてベースライン（ビヒクル）応答と比較して1μMレナリドミドの存在下で、50μgBCMAビーズ上で24時間、CAR特異的刺激を行った後のエフェクターサイトカイン産生の分析を示す。 レナリドミドの非存在下（左の棒線）または0.1μM（中央の棒線）もしくは1μM（右の棒線）の存在下で異なる濃度のBCMAビーズ（すなわち、5μg、50μg、および200μg）上で活性化された抗BCMA CAR T細胞のCAR Tエフェクターサイトカイン産生に対する効果を示す。 1μMレナリドミドの存在下または非存在下でビーズ上にPD-L1が付加されている、または付加されていないBCMAビーズ上で刺激された代表的な健常ドナーおよび多発性骨髄腫患者に由来する抗BCMA CAR T細胞のサイトカイン産生を示す。 図22AおよびBは、抗BCMA CAR発現T細胞におけるサイトカイン産生を示すグラフを示す。図22Aは、抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート型ビーズと共に24時間インキュベーション後の抗BCMA CAR発現T細胞（CD3/CD28）、約4×108個のビーズあたり200μg/ml、50μg/ml、もしくは5μg/mlのコンジュゲート型BCMAの濃度を有するBCMAコンジュゲート型ビーズと共に24時間インキュベーション後の抗BCMA CAR発現T細胞（それぞれ200μg、50μg、もしくは5μg BCMA）、またはビーズなしでインキュベートされた細胞（刺激なし）から収集した上清中のIFN-ガンマ、IL-2、TNF-アルファ、IL-6、GM-CSF、およびIL-4の濃度（pg/mL）を示す。水平の破線は、定量上限（ULOQ）を示す。図22Bは、CD3/CD28ビーズ、200μg、50μg、もしくは5μg BCMAコンジュゲート型ビーズと共にインキュベーション後または刺激なしのIFN-ガンマ、IL-2、またはTNF-アルファの細胞内染色陽性のCD4+CAR+細胞（上の列）またはCD8+CAR+細胞のパーセンテージ（下の列）を示す。 図23AおよびBは、抗CD19 CAR+ T細胞を含有するT細胞組成物の活性を示すグラフを示す。活性を評価する前に、細胞を抗CD19抗体抗IDコンジュゲート型ビーズと共に14日間インキュベートした（14日；二次）、またはインキュベートしなかった。CD19発現細胞に曝露後の細胞毒性アッセイ（図23A）および細胞内サイトカイン染色（ICS）アッセイからの結果を示す（図23B）。 図24A〜Cは、抗CD19抗体抗IDコンジュゲート型ビーズと共に14日間インキュベーションする途中または後の抗CD19 CAR+ T細胞含有T細胞組成物の特徴を示すグラフを示す。異なる試験化合物またはビヒクルの存在下で生成したT細胞組成物からの結果を示す。図24Aおよび24Bは、インキュベートされなかった（一次）または14日間インキュベートされた（二次）T細胞組成物のCD19細胞への曝露に対する応答における活性を示す。CD19発現細胞への曝露後のICSによる多機能染色（図24A）および細胞溶解活性（図24B）の結果を示す。図24Cは、CD19発現細胞と共に1：1の比で20時間インキュベートされた抗CD19 CAR発現細胞を含有する細胞組成物の上清からの分泌サイトカインのレベルを示す。IL2、TNF、およびIFN-ガンマの量を測定し、全部で3種のサイトカインについての尺度得点の平均を示す。 図25A〜Dは、抗CD19 CARに特異的な抗イディオタイプ抗体とコンジュゲートしたビーズ表面で刺激後に、培地のみ、DMSOビヒクル対照、化合物1または化合物2の存在下で増大した生成抗CD19 CAR-T細胞組成物からのT細胞の活性を表すグラフを示す。図25Aは、抗イディオタイプ抗体とコンジュゲートしたビーズ表面と共に共培養された生成抗CD19 CAR-T細胞組成物からのT細胞のウェル1つあたりの総生存T細胞数を示す。図25Bは、培地のみの対照と比べた生存T細胞数について計算した曲線下面積（AUC）を示す。図25Cは、照射K562-CD19標的細胞と共に16時間共培養して刺激子、続いて抗イディオタイプ抗体とコンジュゲートしたビーズ表面と共に15日間インキュベーションした後の生成抗CD19 CAR-T細胞組成物からのT細胞によるTNF-アルファ（TNF）、IFN-ガンマ（IFNg）、およびIL-2の産生を表すグラフを示す。培地のみの条件と比較した細胞外TNF-アルファ（TNF）、IFN-ガンマ（IFNg）、およびIL-2の変化倍率を示す。図25Dは、抗イディオタイプ抗体とコンジュゲートしたビーズと共に15日間インキュベーションした後の生成抗CD19 CAR-T細胞組成物からのCD8+ T細胞の多機能サイトカインプロファイルを示すグラフを示す。
詳細な説明
組換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する遺伝子操作細胞を富化、増大、および/または活性化するための組成物および方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、提供される方法は、組換え受容体を認識するかまたはそれと結合する結合分子と結びついた粒子、例えばビーズ粒子とのインキュベーションによる細胞のエクスビボまたはインビトロの富化、増大、および/または活性化を含む。いくつかの態様において、結びついた結合分子は、ポリペプチド、例えば、組換え受容体と結合するポリペプチド抗原または抗イディオタイプ抗体である。
いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞を増大、富化、または活性化する既存の手段よりも1つまたは複数の利点を有する。エクスビボまたはインビトロ増大のための多数の既存のプロトコールは、細胞、例えば、T細胞を、TCR複合体の成分を活性化することが可能な1種または複数種のポリクローナル刺激分子と共にインキュベートすることに依存する。例えば、細胞を増大させるための一般的なプロトコールは、細胞を常磁性ビーズと結びついている抗CD3抗体および抗CD28抗体と共にインキュベートすることなどにより、細胞を抗CD3抗体および抗CD28抗体と共にインキュベートすることである。この方法の1つの欠点は、所与の組成物の細胞、例えば、培養T細胞のすべてまたは大部分が、抗体により接触および刺激されることである。したがって、いくつかの態様において、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触された所与の細胞の組成物について、細胞のすべてまたは大部分は、それらが組換え受容体を発現する、発現しないにかかわらず活性化するようになる。対照的に、細胞が本明細書において提供される粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートされる特定の態様において、粒子、例えば、ビーズの結合分子は、組換え受容体と直接結合し、したがって、その受容体を欠如する細胞と比較して、組換え受容体を発現している細胞の方が大きい刺激、活性化、増殖、および/または増大を生じる。いくつかの態様において、組換え受容体を発現する細胞を含む細胞を、本明細に書記載の粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることは、組換え受容体を発現する細胞の一部、画分、またはサブセットを増加させる。
特定の態様において、他の方法、例えば抗CD3抗体および抗CD28抗体による刺激と比較して、本明細書に記載の粒子、例えば、ビーズを用いて細胞を増大、富化、および/または活性化する1つの利点は、本明細書において提供される粒子とのインキュベーションが、他の方法により増大、富化、および/または活性化される細胞と対照的に、より少ない活性化および/または疲弊を生じることである。例えば、いくつかの態様において、本明細書において提供される粒子と共にインキュベートされた細胞は、TCR複合体の成分を活性化することが可能なポリクローナル刺激分子、例えば、抗CD3抗体および抗CD28抗体と共にインキュベートされた細胞と比較して、活性化に関連するマーカー、例えば、CD25の表面発現または疲弊に関連するマーカー、例えば、PD1の発現の低いレベルを発現する。
ある態様において、細胞にウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを形質導入または形質移入して、組換え受容体またはCARをコードする核酸を細胞に送達する一方で、形質導入または形質移入工程の少なくとも一部について、細胞が本明細書に記載の粒子、例えば、ビーズと接触される、それで処理される、またはそれと共にインキュベートされる方法が、提供される。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズの存在下で細胞に形質導入または形質移入する1つの利点は、ポリクローナル刺激分子、例えば、抗CD3抗体および抗CD28抗体で事前に活性化されていない細胞の形質移入または形質導入を可能にすることである。特定の態様は、ポリクローナル分子を用いた事前活性化なしに形質導入または形質移入された細胞が、形質移入または形質導入前に活性化された細胞と比較して、増加した持続性および/または低下した疲弊を示すであろうと考えている。
特定の態様は、記載されたような粒子、例えば、ビーズと結びついた特定の組換え抗原、またはそのフラグメントが、抗原を認識する抗原結合ドメインを含有するCARを特異的に刺激するための使用に特に適する場合があることを企図している。一部の例において、ある組換え抗原、例えばBCMAは、抗原が非特異的に細胞に貼りつくまたは細胞によって吸い取られることを防止するまたは最小限にする、細胞との非特異的タンパク質-タンパク質相互作用または非特異的相互作用などの、非特異的相互作用をほとんどまたはまったく有しない場合がある。一部の例において、これは、CAR発現細胞の刺激の質を改善することができる。いくつかの態様において、ビーズまたは粒子との結びつきは、組換え抗原が、プレートまたは皿の表面などの異なる固体支持体と結合していない場合または結合している場合と比較して、細胞の増加した、増強した、一貫した、および/またはより信頼できる刺激、活性化、または増大を生じる。ある態様において、結合分子は、組換えBCMAまたはそのフラグメントであるかまたはそれを含む。
特定の態様において、細胞組成物の細胞を活性化、刺激、または増大させるために、結びついた組換えBCMA（組換えBCMA-FC融合体など）を含有する粒子またはビーズが、提供される方法と共に使用される。いくつかの態様において、組換えBCMAを含有する粒子またはビーズは、BCMA、例えば、抗BCMA CARと結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含有する組換え受容体を発現している細胞を選択的に活性化、刺激、または増大させる。ある態様において、細胞、例えば、抗BCMA CAR発現細胞の活性化、刺激、または増大は、例えば抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート型ビーズ試薬などの他の試薬による活性化、刺激、または増大と比較して大きいまたは増加している。ある態様において、細胞、例えば、抗BCMA CAR発現細胞の活性化、刺激、または増大は、例えば抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート型ビーズ試薬などの他の試薬による活性化、刺激、または増大と比較して、インビボのおよび/または内因性抗原に応答した細胞の活性化、刺激、または増大をより大きく指し示す。いくつかの局面において、結びついた組換えBCMAを含有する粒子またはビーズにより細胞が活性化、刺激または増大される程度は、粒子もしくはビーズと結びついた組換えBCMAの量を変更することにより、または粒子もしくはビーズと細胞との比を変更することにより、調整、修飾または制御することができる。いくつかの局面において、組換えBCMAによる細胞、例えば、抗BCMA CAR発現細胞の活性化、刺激、または増大は、組換えBCMAが自由浮遊しているもしくは結びついていない場合、または組換えBCMAが異なる表面、例えば、培養皿もしくはプレートと結びついている場合よりも、組換えBCMAが粒子またはビーズと結びついている場合の方が有効である。
いくつかの態様において、結合分子は、組換え受容体、例えば、CARと結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体（抗ID）である。特定の態様において、結びついた組換え抗IDを含有する粒子またはビーズは、提供される方法と共に使用されて、細胞組成物の細胞を活性化、刺激、または増大させる。様々な態様では、抗IDを含有する粒子またはビーズは、組換え受容体、例えば、CARを発現している細胞などの、組成物の細胞を選択的に活性化、刺激、または増大させる。ある態様において、細胞、例えば、CAR発現細胞の活性化、刺激、または増大は、例えば抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート型ビーズ試薬などの他の試薬による、活性化、刺激、または増大と比較して大きいまたは増加している。ある局面において、細胞が、抗IDを含有する粒子またはビーズにより活性化、刺激、または増大される程度は、粒子もしくはビーズと結びついた抗IDの量を変更することにより、または粒子もしくはビーズと細胞との比を変更することにより、調整、修飾または制御することができる。特定の態様において、抗IDは、抗CD19抗体抗IDである。特定の態様において、抗CD19抗体抗IDを含有する粒子またはビーズによる抗CD19 CAR発現細胞の活性化、刺激、または増大は、例えば、抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート型ビーズ試薬などの他の試薬による活性化、刺激、または増大と比較して大きいまたは増加している。
いくつかの態様において、提供される組成物および方法は、対象に投与された場合、他の技法により増大された遺伝子操作T細胞と比較して増加した持続性および/または低下した疲弊を示す、組換え受容体またはCARを発現する遺伝子操作T細胞を増大および活性化する。いくつかの態様において、増加した持続性および/または低下した疲弊を有する遺伝子操作T細胞は、それらが投与された対象においてより優れた効力を示す。
本出願において言及される特許文書、科学論文およびデータベースを含むすべての刊行物は、あたかも各々個々の刊行物が個別に参照により組み入れられるのと同じ程度に、すべての目的でその全体が参照により組み入れられる。本明細書において示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開出願および他の刊行物において示される定義と相反するか、またはさもなければ他の方法で矛盾する場合は、本明細書において示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義よりも優先される。
本明細書に使用される節の見出しは、組織化の目的だけのものであり、記載されている主題を限定すると解釈されるべきでない。
I. 粒子コンジュゲート
キメラ抗原受容体（CAR）などの組換え受容体の抗原結合ドメインと結合するかまたはそれにより認識される結合分子とコンジュゲートしているかまたは他の方法で結びついている、ビーズなどの粒子およびその使用方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、非細胞性粒子である。
A. 粒子
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体（CAR）などの組換え受容体の抗原結合ドメインと結合するかまたはそれにより認識される結合分子は、粒子（例えば、ビーズ粒子）、例えば粒子の表面と結合している、または他の方法で結びついている。ある態様において、粒子は、非細胞性粒子である。特定の態様において、粒子は、コロイド粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、磁性ビーズなどのビーズ等を含む場合がある。いくつかの態様において、粒子またはビーズは、生体適合性である、すなわち無毒である。ある態様において、粒子またはビーズは、培養細胞、例えば、培養T細胞に無毒である。特定の態様において、粒子は、単分散性である。ある態様において、「単分散性」は、5％未満の標準偏差を有し、例えば、直径が5％未満の標準偏差を有するサイズ分散の粒子（例えば、ビーズ粒子）を包含する。
いくつかの態様において、本明細書に記載の粒子（例えば、ビーズ粒子）は、本明細書に記載の結合分子などの結合分子（例えば、抗原または抗体）が、結合分子と細胞との間の相互作用、特に結合分子と、細胞の表面に発現された組換え受容体、例えば、CARとの間の結合を可能にする方法で結合または結びつくことができる固体支持体またはマトリックスを提供する。特定の態様において、コンジュゲートしたまたは結びついた結合分子と細胞との間の相互作用は、細胞表面の1つまたは複数の組換え受容体の発現または発現レベルに基づき細胞集団中の1つまたは複数の細胞型の富化、活性化、刺激および/または増大を促進するための方法に使用することができる。ある態様において、粒子（例えば、ビーズ粒子）は、細胞表面に発現される組換え受容体、例えば、CARの抗原結合領域と結合する1種または複数種の結合分子（例えば、抗体または抗原）を含む。
いくつかの態様において、粒子またはビーズは、生体適合性である、すなわち、生物学的使用に適した材料から構成されている。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、培養細胞、例えば、培養T細胞に無毒である。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、結合分子と細胞との間の相互作用を可能にする方法で結合分子と結びつくことが可能な任意の粒子であり得る。ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、例えば、粒子の表面での結合分子の結びつきを可能にするために修飾される、例えば、表面官能化されることができる任意の粒子であり得る。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、またはヒドロキシカルボン酸とジカルボン酸とのコポリマーから構成される。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、直鎖もしくは分岐、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和、線状もしくは架橋のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、もしくはアルコキシヒドロキシ酸のポリエステル、または直鎖もしくは分岐、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和、線状もしくは架橋のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、もしくはアルコキシジカルボン酸のポリ無水物から構成される、または少なくとも部分的に構成される場合がある。追加的に、粒子、例えば、ビーズは、量子ドットであることができ、または量子ドットポリスチレン粒子、例えば、ビーズなどの量子ドットから構成することができる。エステルと無水結合との混合物（例えば、グリコール酸とセバシン酸とのコポリマー）を含む粒子、例えばビーズもまた、採用される場合がある。例えば、粒子、例えばビーズは、ポリグリコール酸ポリマー（PGA）、ポリ乳酸ポリマー（PLA）、ポリセバシン酸ポリマー（PSA）、乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）、[rho]ポリ乳酸−セバシン酸コポリマー（PLSA）、ポリグリコール酸−セバシン酸コポリマー（PGSA）などを含む材料を含む場合がある。粒子、例えば、ビーズが構成され得る他のポリマーには、カプロラクトン、カーボネート、アミド、アミノ酸、オルトエステル、アセタール、シアノアクリレートおよび分解性ウレタンのポリマーまたはコポリマーだけでなく、これらと直鎖または分岐、置換または非置換のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルケニル、または芳香族ヒドロキシ酸もしくはジカルボン酸とのコポリマーが含まれる。加えて、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンおよびシステインなどの、反応性側鎖基を有する生物学的に重要なアミノ酸、またはそれらの鏡像異性体が、前記材料のいずれかとのコポリマー中に含まれて、ポリペプチド抗原または抗体などの結合分子とコンジュゲートするための反応基を提供する場合がある。
いくつかの態様において、粒子またはビーズは、0.001μm超、0.01μm超、0.05μm超、0.1μm超、0.2μm超、0.3μm超、0.4μm超、0.5μm超、0.6μm超、0.7μm超、0.8μm超、0.9μm超、1μm超、2μm超、3μm超、4μm超、5μm超、6μm超、7μm超、8μm超、9μm超、10μm超、20μm超、30μm超、40μm超、50μm超、100μm超、500μm超、および/または1,000μm超の直径を有する。いくつかの態様において、粒子またはビーズは、0.001μmと1,000μmとの間、0.01μmと100μmとの間、0.1μmと10μmとの間、0.1μmと100μmとの間、0.1μmと10μmとの間、0.001μmと0.01μmとの間、0.01μmと0.1μmとの間、0.1μmと1μmとの間、1μmと10μmとの間、1μmと2μmとの間、2μmと3μmとの間、3μmと4μmとの間、4μmと5μmとの間、1μmと5μmとの間、および/もしくは5μmと10μmとの間、または約0.001μmと1,000μmとの間、約0.01μmと100μmとの間、約0.1μmと10μmとの間、約0.1μmと100μmとの間、約0.1μmと10μmとの間、約0.001μmと0.01μmとの間、約0.01μmと0.1μmとの間、約0.1μmと1μmとの間、約1μmと10μmとの間、約1μmと2μmとの間、約2μmと3μmとの間、約3μmと4μmとの間、約4μmと5μmとの間、約1μmと5μmとの間、および/もしくは約5μmと10μmとの間（それぞれ両端の値を含む）の直径を有する。ある態様において、粒子またはビーズは、1μmおよび10μm（それぞれ両端の値を含む）の平均直径を有する。ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、1μmまたは約1μmの直径を有する。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、2.8μmまたは約2.8μmの平均直径を有する。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、4.8μmまたは約4.8μmの直径を有する。
ある態様において、複数の粒子、例えば、ビーズは、均一な粒子サイズを有する。いくつかの態様において、均一な粒子サイズは、複数の平均直径の10％未満、5％未満、または1％未満の直径標準偏差を含む。特定の態様において、複数の粒子、例えば、ビーズは、複数の平均直径の10％未満、5％未満、または1％未満の直径標準偏差を有する。
特定の態様において、粒子（例えば、ビーズ粒子）は、均一に形成される。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、球状である。ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、非球状である。
いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、0.001g/cm3超、0.01g/cm3超、0.05g/cm3超、0.1g/cm3超、0.5g/cm3超、0.6g/cm3超、0.7g/cm3超、0.8g/cm3超、0.9g/cm3超、1g/cm3超、1.1g/cm3超、1.2g/cm3超、1.3g/cm3超、1.4g/cm3超、1.5g/cm3超、2g/cm3超、3g/cm3超、4g/cm3超、または5g/cm3超の密度を有する。いくつかの態様において、粒子またはビーズは、0.001g/cm3と100g/cm3との間、0.01g/cm3と50g/cm3との間、0.1g/cm3と10g/cm3との間、0.1g/cm3と0.5g/cm3との間、0.5g/cm3と1g/cm3との間、0.5g/cm3と1.5g/cm3との間、1g/cm3と1.5g/cm3との間、1g/cm3と2g/cm3との間、もしくは1g/cm3と5g/cm3との間、または約0.001g/cm3と100g/cm3との間、約0.01g/cm3と50g/cm3との間、約0.1g/cm3と10g/cm3との間、約0.1g/cm3と0.5g/cm3との間、約0.5g/cm3と1g/cm3との間、約0.5g/cm3と1.5g/cm3との間、約1g/cm3と1.5g/cm3との間、約1g/cm3と2g/cm3との間、もしくは約1g/cm3と5g/cm3との間の密度を有する。いくつかの態様において、粒子またはビーズは、0.5g/cm3、0.5g/cm3、0.6g/cm3、0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.9g/cm3、1.0g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、もしくは2.0g/cm3、または少なくとも0.5g/cm3、少なくとも0.5g/cm3、少なくとも0.6g/cm3、少なくとも0.7g/cm3、少なくとも0.8g/cm3、少なくとも0.9g/cm3、少なくとも1.0g/cm3、少なくとも1.1g/cm3、少なくとも1.2g/cm3、少なくとも1.3g/cm3、少なくとも1.4g/cm3、少なくとも1.5g/cm3、少なくとも1.6g/cm3、少なくとも1.7g/cm3、少なくとも1.8g/cm3、少なくとも1.9g/cm3、もしくは少なくとも2.0g/cm3、または約0.5g/cm3、約0.5g/cm3、約0.6g/cm3、約0.7g/cm3、約0.8g/cm3、約0.9g/cm3、約1.0g/cm3、約1.1g/cm3、約1.2g/cm3、約1.3g/cm3、約1.4g/cm3、約1.5g/cm3、約1.6g/cm3、約1.7g/cm3、約1.8g/cm3、約1.9g/cm3、もしくは約2.0g/cm3（それぞれ端の値を含む）の密度を有する。ある態様において、ビーズまたは粒子は、1.6g/cm3または約1.6g/cm3の密度を有する。特定の態様において、ビーズまたは粒子は、1.5g/cm3または約1.5g/cm3の密度を有する。ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、1.3g/cm3または約1.3g/cm3の密度を有する。
ある態様において、複数の粒子またはビーズは、均一な密度を有する。ある態様において、均一な密度は、平均粒子密度の10％未満、5％未満、または1％未満の密度標準偏差を含む。
いくつかの態様において、粒子またはビーズは、粒子、例えば、ビーズ1グラムあたり0.001m2（m2/g）と1,000m2/gとの間、0.010m2/gと100m2/gとの間、0.1m2/gと10m2/gとの間、0.1m2/gと1m2/gとの間、1m2/gと10m2/gとの間、10m2/gと100m2/gとの間、0.5m2/gと20m2/gとの間、0.5m2/gと5m2/gとの間、もしくは1m2/gと4m2/gとの間、または約0.001m2（m2/g）と1,000m2/gとの間、約0.010m2/gと100m2/gとの間、約0.1m2/gと10m2/gとの間、約0.1m2/gと1m2/gとの間、約1m2/gと10m2/gとの間、約10m2/gと100m2/gとの間、約0.5m2/gと20m2/gとの間、約0.5m2/gと5m2/gとの間、もしくは約1m2/gと4m2/gとの間（それぞれ両端の値を含む）の表面積を有する。いくつかの態様において、粒子またはビーズは、1m2/g〜4m2/gまたは約1m2/g〜4m2/gの表面積を有する。
特定の態様において、粒子（例えば、ビーズ粒子）は、0.01と100との間、0.1と10との間、0.5と5との間、1と10との間、1と2との間、1.1と1.8との間、もしくは1.2と1.5との間、または約0.01と100との間、約0.1と10との間、約0.5と5との間、約1と10との間、約1と2との間、約1.1と1.8との間、もしくは約1.2と1.5との間（それぞれ両端の値を含む）の比重、すなわち粒子、例えば、ビーズの密度と水の密度との比を有する。ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、1.2および1.5の比重を有する。ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、単分散性であり、比重は、均一である。特定の態様において、均一な比重を有する粒子、例えば、ビーズは、10％未満、5％未満、または1％未満の比重標準偏差を有する。様々な態様では、粒子は、単分散性であり、10％未満、5％未満、または1％未満の標準偏差を有する比重を有する。
ある態様において、粒子表面は、結合分子と結合するまたは結びつくことができる、結びついた生体分子を含む。特定の態様において、生体分子は、ポリペプチドである。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、表面に露出したプロテインA、プロテインG、またはビオチンを含む。
態様のいくつかにおいて、粒子は、粒子の表面の1つまたは複数のコートまたはコーティング（例えば、表面コーティング）などの1つまたは複数のコートまたはコーティングを含有する。いくつかの態様において、1つまたは複数のコートまたはコーティングは、結合分子とのコンジュゲーションまたはカップリングのための材料、例えば、表面官能化されている、または表面官能化が可能なコートを提供する。ある態様において、コートは、表面に露出した官能基を含む、またはそれと結びつくことが可能である。特定の態様において、コーティングは、表面に露出したカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、トシル基、エポキシ基、クロロメチル基、またはそれらの組み合わせを含む、またはそれと結びつくことが可能である。いくつかの態様において、コートまたはコーティングは、疎水性である。特定の態様において、コートまたはコーティングは、非疎水性である。
1. 磁性粒子
いくつかの態様において、粒子（例えば、ビーズ粒子）は、磁場中で反応する。いくつかの態様において、粒子は、磁性粒子（例えば、磁性ビーズ粒子）である。いくつかの態様において、磁性粒子は、常磁性である。特定の態様において、磁性粒子は、超常磁性である。ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、それらが磁場に曝露されないかぎり、いかなる磁性性質も示さない。
特定の態様において、粒子は、内部コアを含有する複合粒子であってよい。いくつかの態様において、内部コアは、磁性コア、常磁性コアまたは超常磁性コアである。いくつかの態様において、内部コア（例えば、磁性コア）は、金属であるかまたはそれを含有する。いくつかの態様において、金属は、鉄、ニッケル、銅、コバルト、ガドリニウム、マンガン、タンタル、亜鉛、ジルコニウムまたはそれらの任意の組み合わせであることができるが、それに限定されるわけではない。本明細書に記載の内部コア（例えば、磁性コア）に含まれ得る適切な物質には、金属酸化物（例えば、酸化鉄）、フェライト（例えば、マンガンフェライト、コバルトフェライト、ニッケルフェライトなど）、赤鉄鉱および金属合金（例えば、CoTaZn）が含まれるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、内部コアは、フェライト、金属、金属合金、酸化鉄、または二酸化クロムのうち1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、内部コアは、元素鉄またはその化合物を含む。いくつかの態様において、内部コアは、磁鉄鉱（Fe3O4）、マグヘマイト（γFe2O3）、またはグレイジャイト（Fe3S4）のうち1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、内部コアは、酸化鉄（例えば、Fe3O4）を含む。
ある態様において、粒子は、表面官能化されたコートまたはコーティングにより覆われた磁性、常磁性、および/または超常磁性コアを含有する。いくつかの態様において、粒子は、表面に露出したトシル基を含む。
いくつかの態様において、コートは、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、タンパク質、炭素、またはそれらの組み合わせを含むことができるが、それに限定されるわけではない材料を含有することができる。いくつかの態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコール、乳酸グリコール酸共重合体、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレン、またはポリビニルアルコールであってよい。ある態様において、外側コートまたはコーティングは、ポリスチレンを含む。いくつかの態様において、コートは、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、プロテインA、およびプロテインGであるタンパク質であるかまたはそれを含む材料を含有するか、またはそれを含む。いくつかの態様において、炭素は、アクリルアミドまたはマレイン酸である。いくつかの態様において、材料は、本明細書に記載の結合分子とカップリング、連結またはコンジュゲートしている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の粒子（例えば、ビーズ粒子）は、内部コアおよびコート（例えば、保護コート）を有してよく、その際、コートは、本明細書に記載の1種または複数種の材料を含有する。いくつかの態様において、コートは、疎水性である。ある態様において、コートは、親水性である。いくつかの態様において、本明細書に記載の粒子（例えば、ビーズ粒子）は、金属酸化物コア（例えば、酸化鉄内部コア）およびコート（例えば、保護コート）を有し、その際、コートは、ポリスチレンを含む。
本明細書に記載の方法に使用される粒子（例えば、ビーズ粒子）は、商業的に生産または入手することができる。粒子、例えば、ビーズを産生する方法を含む、粒子、例えば、ビーズは、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第6,074,884号；同第5,834,121号；同第5,395,688号；同第5,356,713号；同第5,318,797号；同第5,283,079号；同第5,232,782号；同第5,091,206号；同第4,774,265号；同第4,654,267号；同第4,554,088号；同第4,490,436号；同第4,452,773号；米国特許出願公開第20100207051号；およびSharpe, Pau T., Methods of Cell Separation, Elsevier, 1988を参照されたい。市販の粒子、例えば、ビーズ（例えば、ビーズ粒子）には、ProMag（商標）（PolySciences, Inc.）；COMPEL（商標）（PolySciences, Inc.）；BioMag（登録商標）Plus （PolySciences, Inc.）およびBioMag（登録商標）Maxi（Bang Laboratories, Inc.）を含むBioMag（登録商標）（PolySciences, Inc.）；M-PVA（Cehmagen Biopolymer Technologie AG）；SiMAG （Chemicell GmbH）；beadMAG （Chemicell GmbH）；MagaPhase（登録商標）（Cortex Biochem）；Dynabeads（登録商標）M-280ヒツジ抗ウサギIgG（Invitrogen）、Dynabeads（登録商標）FlowComp（商標）（例えば、Dynabeads（登録商標）FlowComp（商標）ヒトCD3, Invitrogen）、Dynabeads（登録商標）M-450（例えば、Dynabeads（登録商標）M-450トシル活性化、Invitrogen）、Dynabeads（登録商標）Untouched（商標）（例えば、Dynabeads（登録商標）Untouched（商標）ヒトCD8 T細胞、Invitrogen）、ならびにT細胞と結合、それを増大および/もしくは活性化するDynabeads（登録商標）（例えば、Dynabeads（登録商標）T細胞の増大および活性化のためのヒトT-活性化物質CD3/CD28、Invitrogen）を含むDynabeads（登録商標）（Invitrogen）；Estapor（登録商標）M（Merk Chimie SAS）；Estapor（登録商標）EM（Merk Chimie SAS）；MACSiBeads（商標）粒子（例えば、抗ビオチンMACSiBead粒子、Miltenyi Biotec、カタログ番号130-091-147）；Streptamer（登録商標）磁性ビーズ（IBA BioTAGnology）；Strep-Tactin（登録商標）磁性ビーズ（IBA BioTAGnology）；Sicastar（登録商標）-M（Micormod Partikeltechnologie GmbH）Micromer（登録商標）-M（Micromod Partikeltechnologie）；MagneSil（商標）（Promega GmbH）；MGP（Roche Applied Science Inc.）；Pierce（商標）プロテインG磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；Pierce（商標）プロテインA磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；Pierce（商標）プロテインA/G磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；Pierce（商標）NHS活性化磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；Pierce（商標）プロテインL磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；Pierce（商標）抗HA磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；Pierce（商標）抗c-Myc 磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；Pierce（商標）グルタチオン磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；Pierce（商標）ストレプトアビジン磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；MagnaBind（商標）磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；Sera-Mag（商標）磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）；抗FLAG（登録商標）M2磁性ビーズ（Sigma-Aldrich）；SPHERO（商標）磁性粒子（Spherotech Inc.）；ならびにHisPur（商標）Ni-NTA磁性ビーズ（Thermo Fisher Scientific Inc.）が含まれるが、それに限定されるわけではない。
ある態様において、粒子は、超常磁性鉄コア、例えば、磁鉄鉱（Fe3O4）またはマグヘマイト（γFe2O3）コア、ポリスチレンコートまたはコーティング、および露出したトシル基を含む官能化表面を含む単分散性の超常磁性ビーズ粒子である。ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、密度約1.5g/cm3および表面積約1m2/g〜約4m2/gを有する。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、直径約4.5μmおよび密度約1.5g/cm3を有する単分散性の超常磁性粒子、例えば、ビーズである。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズ、粒子は、平均直径約2.8μmおよび密度約1.3g/cm3を有する単分散性の超常磁性粒子である。
2. オリゴマー粒子
いくつかの態様において、粒子は、オリゴマーまたはポリマーである。いくつかの態様において、粒子は、タンパク質、例えば、ストレプトアビジンから構成されるオリゴマーまたはポリマーである。いくつかの態様において、粒子は、天然に存在するタンパク質、例えば、ストレプトアビジンもしくはその異種の個別の分子を直接的もしくは間接的に連結することにより、または個別分子を作り上げる単量体もしくはサブユニットの複合体の個別分子を直接的もしくは間接的に連結すること（例えば、天然に存在するタンパク質の二量体、三量体、四量体などを直接的または間接的に連結すること）により生成することができるオリゴマーまたはポリマーである。例えば、ストレプトアビジンまたはアビジンの四量体性ホモ二量体またはヘテロ二量体は、それぞれのオリゴマーまたはポリマーの個別分子または最小の構成要素と称される場合がある。いくつかの態様において、オリゴマーまたはポリマーは、タンパク質の少なくとも2つの個別分子の連結を含有することができる（例えば、二量体である）、またはタンパク質（例えば、単量体、四量体）の個別分子の少なくとも三量体、少なくとも四量体、少なくとも五量体、少なくとも六量体、少なくとも七量体、少なくとも八量体、少なくとも九量体、少なくとも十量体、少なくとも十一量体、少なくとも十二量体、少なくとも十三量体、少なくとも十四量体、少なくとも十五量体、少なくとも十六量体、少なくとも十七量体、少なくとも十八量体、少なくとも十九量体、少なくとも二十量体、少なくとも二十五量体、少なくとも三十量体、少なくとも三十五量体、少なくとも四十量体、少なくとも四十五量体または少なくとも五十量体であってよい。いくつかの態様において、試薬は、多量体であるか、またはオリゴマー性試薬は、多量体性試薬である。特定の態様において、粒子は、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンのムテイン（例えば、STREP-TACTIN（登録商標）またはSTREP-TACTIN（登録商標）XTストレプトアビジンムテイン）を含むオリゴマーまたはポリマーである。
オリゴマーは、米国特許出願公開第2004/0082012号に記載されたいずれかなどの、当技術分野において公知の任意の方法を使用して生成することができる。いくつかの態様において、オリゴマーまたはポリマーは、多糖または二官能性リンカーなどにより架橋され得る2つ以上の個別分子を含む。
いくつかの態様において、粒子は、個別分子を架橋することにより得られるオリゴマーもしくはポリマー、または多糖の存在下で個別分子を作り上げるサブユニットの複合体である。いくつかの態様において、粒子は、多糖、例えば、デキストランへのカルボキシル残基の導入により調製することができるオリゴマーまたはポリマーである。いくつかの局面において、粒子の個別分子（例えば、単量体、四量体）は、従来のカルボジイミド化学反応を使用して、内部リシン残基の一級アミノ基および/または遊離N末端を介してデキストラン主鎖中のカルボキシル基とカップリングすることができる。いくつかの態様において、カップリング反応は、デキストラン1モルあたり約60モルの試薬の個別分子（例えば、単量体、四量体）のモル比で行われる。
いくつかの態様において、粒子は、1種または複数種のストレプトアビジンもしくはアビジンまたはストレプトアビジンの任意の類似体もしくはムテイン（例えば、Strep-Tactin（登録商標）もしくはStrep-Tactin（登録商標）XT）またはアビジン（例えば、ニュートラアビジン）の類似体もしくはムテインのオリゴマーまたはポリマーである。いくつかの態様において、アビジンまたはストレプトアビジンは、個別分子中に最大4つの結合部位がある（例えば、四量体は、4つの結合部位Zを含有する）ことができるアビジンまたはストレプトアビジンの天然ビオチン結合部位である結合部位Zを含み、その際、ホモ四量体は、同じである最大4つの結合部位、すなわちZ1を含有することができ、一方、ヘテロ四量体は、異なってもよい最大4つの結合部位を含有することができ、例えば、Z1およびZ2を含有する。いくつかの態様において、オリゴマーは、同じストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジンまたはアビジンムテインの複数の個別分子（例えば、複数のホモ四量体）から生成または産生され、その場合、オリゴマーの各結合部位Z、例えば、Z1は、同じである。例えば、一部の例において、オリゴマーは、複数の結合部位Z1、例えば、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50個またはこれを超える結合部位Z1を含有することができる。いくつかの態様において、オリゴマーは、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジンもしくはアビジンムテインのヘテロ四量体であることができる複数の個別分子から、および/または結合部位Z、例えば、Z1およびZ2が異なる、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジンもしくはアビジンムテインの複数の2つもしくはこれを超える異なる個別の分子（例えば、異なるホモ四量体）から生成または産生され、その場合、複数の異なる結合部位Z、例えば、Z1およびZ2が、オリゴマー中に存在する場合がある。例えば、一部の例において、オリゴマーは、組み合わせて、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50個またはこれを超える結合部位Z1およびZ2の組み合わせを含むことができる複数の結合部位Z1および複数の結合部位Zを含有することができる。
いくつかの態様において、粒子は、二官能性リンカーもしくはアビジンなどの他の化学リンカーを使用して、または当技術分野において公知の他の方法により、個別分子または個別分子を作り上げるサブユニットの複合体を架橋することにより得られるオリゴマーまたはポリマーである。いくつかの局面において、ストレプトアビジンもしくはアビジンまたはストレプトアビジンもしくはアビジンの任意のムテインもしくは類似体の架橋オリゴマーまたはポリマーは、グルタルアルデヒドなどのリンカーとして役立つ二官能性分子を介して個別のストレプトアビジンもしくはアビジン分子を架橋することにより、または当技術分野において記載された他の方法により、得てもよい。例えば、ストレプトアビジンムテイン中にチオール基を導入することによりストレプトアビジンムテインのオリゴマーを生成することが可能である（これは、例えば、ストレプトアビジンムテインを2-イミノチオラン（トラウト試薬）と反応させることにより、および例えば別の反応で、ストレプトアビジンムテイン中の利用可能なアミノ基を活性化することにより、行うことができる。いくつかの態様において、アミノ基のこの活性化は、ストレプトアビジンムテインと、市販のヘテロ二官能性架橋剤、例えばスルホスクリンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホSMCC）またはスクシンイミジル-6-[(β-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（SMPH）との反応により達成することができる。いくつかのこのような態様において、このように得られた2つの反応産物が一緒に混合され、典型的には、修飾ストレプトアビジンムテインの一方のバッチ中に含有されるチオール基と、修飾ストレプトアビジンムテインの他方のバッチの（マレイミド官能基などによる）活性化アミノ酸との反応がもたらされる。一部の例において、この反応により、ストレプトアビジンムテインの多量体/オリゴマーが形成される。これらのオリゴマーは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50個またはこれを超えるものなどの任意の適切な数の個別分子を有することができ、オリゴマー化度は、反応条件により変動することができる。
いくつかの態様において、オリゴマーまたはポリマー試薬は、サイズ排除クロマトグラフィーを介して単離することができ、任意の所望の画分を粒子として使用することができる。いくつかの態様において、修飾ストレプトアビジンムテインを2-イミノチオランおよびスルホSMCCなどのヘテロ二官能性架橋剤の存在下で反応させた後、オリゴマーまたはポリマー試薬は、サイズ排除クロマトグラフィーを介して単離することができ、任意の所望の画分を粒子として使用することができる。いくつかの態様において、オリゴマーは、単一の分子量を有しない（および有する必要がない）が、オリゴマーは、ガウス分布などの統計的重量分布を認める場合がある。一部の例において、3つ超のストレプトアビジンまたはムテイン四量体、例えば、ホモ四量体またはヘテロ四量体を有する任意のオリゴマー、例えば一般的に3〜50個の四量体、例えば、ホモ四量体もしくはヘテロ四量体、10〜40個の四量体、例えば、ホモ四量体もしくはヘテロ四量体、または25〜35個の四量体、例えば、ホモ四量体もしくはヘテロ四量体は、可溶性粒子として使用することができる。オリゴマーは、例えば、3〜25個のストレプトアビジンムテイン四量体、例えば、ホモ四量体またはヘテロ四量体を有する場合がある。いくつかの局面において、ストレプトアビジンムテインについて約50kDaの分子量を有して、可溶性オリゴマーは、150kDa〜2000kDa、150kDa〜1500kDa、150kDa〜1250kDa、150kDa〜1000kDa、150kDa〜500kDaもしくは150kDa〜300kDa、300kDa〜2000kDa、300kDa〜1500kDa、300kDa〜1250kDa、300kDa〜1000kDa、300kDa〜500kDa、500kDa〜2000kDa、500kDa〜1500kDa、500kDa〜1250kDa、500kDa〜1000kDa、1000kDa〜2000kDa、1000kDa〜1500kDa、1000kDa〜1250kDa、1250kDa〜2000kDaもしくは1500kDa〜2000kDa、または約150kDa〜2000kDa、約150kDa〜1500kDa、約150kDa〜1250kDa、約150kDa〜1000kDa、約150kDa〜500kDaもしくは約150kDa〜300kDa、約300kDa〜2000kDa、約300kDa〜1500kDa、約300kDa〜1250kDa、約300kDa〜1000kDa、約300kDa〜500kDa、約500kDa〜2000kDa、約500kDa〜1500kDa、約500kDa〜1250kDa、約500kDa〜1000kDa、約1000kDa〜2000kDa、約1000kDa〜1500kDa、約1000kDa〜1250kDa、約1250kDa〜2000kDaもしくは約1500kDa〜2000kDaの分子量を有することができる。一般的に、各ストレプトアビジン分子/ムテインは4つのビオチン結合部位を有するので、このような試薬は、12〜160個の結合部位Z、例えば12〜100個の結合部位Zを提供することができる。
B. 結合分子
粒子、例えば、ビーズ粒子とコンジュゲートしたまたはそれと結びついたCARなどの組換え受容体の抗原結合ドメインと結合するかまたはそれにより認識される結合分子、例えば、ポリペプチド抗原または抗体が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、結合分子は、ポリペプチドである。ある態様において、結合分子は、抗原受容体、例えばCARなどの組換え受容体が結合または認識するように設計することができる、任意のポリペプチドを含む。特定の態様において、結合分子は、抗原受容体、例えばCARなどの組換え受容体の抗原結合ドメインと結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体である。特定の態様において、結合分子は、抗原受容体、例えばCARなどの組換え受容体の抗原結合ドメインにより結合または認識されるポリペプチドである。ある態様において、結合分子は、CARの抗原結合ドメインにより結合または認識されるポリペプチドである。
いくつかの態様において、結合分子は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）の膜貫通ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインを含まないCARと結合するかまたはそれにより認識される。ある態様において、結合分子は、KIR2DS2、KIR2DL3、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DS1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1およびKIR3DP1のいずれかからの膜貫通ドメインも細胞内ドメインも含まないCARと結合するかまたはそれにより認識される。
1. 抗原
いくつかの態様において、結合分子は、抗原、例えば、組換え抗原またはそのフラグメントである。ある態様において、抗原は、疾患、例えば、癌に関連するポリペプチド、またはポリペプチドの一部である。いくつかの態様において、抗原は、疾患に関連する細胞、例えば、癌細胞および/または腫瘍細胞の表面に発現されるポリペプチド、またはポリペプチドの異種もしくはフラグメントである。
いくつかの態様において、抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXもしくはG250としても公知）、癌-精巣抗原、癌/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、癌胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても公知）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソセリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、TYRP1もしくはgp75としても公知）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼもしくはDCTとしても公知）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的または病原体発現抗原、またはユニバーサルタグ関連抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子であるかまたはそれを含む。受容体により標的とされる抗原は、いくつかの態様において、いくつかの公知のB細胞マーカーのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79b、もしくはCD30であるかまたはそれを含む。
いくつかの態様において、結合分子は、組換え受容体および/またはCARにより認識または結合されるポリペプチド抗原の一部を含む。特定の態様において、結合分子は、組換え受容体および/またはCARにより認識または結合されるエピトープを含む。ある態様において、ポリペプチド抗原の一部は、組換え受容体および/またはCARにより認識または結合されるポリペプチドの10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、もしくは500個のアミノ酸、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約250、約300、約400、もしくは約500個のアミノ酸、または少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも400、もしくは少なくとも500個のアミノ酸、一部の例において、隣接アミノ酸を含有する。ある態様において、ポリペプチドの一部は、組換え受容体および/またはCARにより認識されるエピトープのアミノ酸配列を含む。
ある態様において、結合分子は、組換え受容体および/またはCARにより結合および/または認識されるポリペプチドと50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、もしく99.5％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約97％、約98％、約99％、もしく約99.5％、または少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくは少なくとも99.5％のアミノ酸配列同一性を含有するポリペプチド異種である。
ある態様において、粒子は、ポリペプチド抗原の一部を含む結合分子と結合しており、その際、この一部は、組換え受容体、すなわちCARにより結合および/もしくは認識される、または潜在的に結合もしくは認識されることができる抗原の一部である。いくつかの態様において、結合分子は、組換え受容体により認識されるエピトープを含有する抗原の一部を含む。ある態様において、抗原の一部は、一部である。いくつかの態様において、抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXもしくはG250としても公知）、癌-精巣抗原、癌/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、癌胎児抗原（CEA）、aサイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFRvIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても公知）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソセリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、TYRP1もしくはgp75としても公知）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼもしくはDCTとしても公知）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的または病原体発現抗原、またはユニバーサルタグ関連抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子であるかまたはそれを含む。受容体により標的とされる抗原は、いくつかの態様において、いくつかの公知のB細胞マーカーのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igλ、CD79a、CD79b、もしくはCD30であるかまたはそれを含む。
ある態様において、粒子は、BCMAポリペプチドの一部を含む結合分子と結合している。いくつかの態様において、粒子は、CD22ポリペプチドの一部を含む結合分子と結合している。ある態様において、粒子は、ROR1ポリペプチドの一部を含む結合分子と結合している。
ある態様において、ポリペプチド抗原の一部は、BCMAポリペプチドの一部である。ある態様において、ポリペプチド抗原は、BCMAポリペプチドの少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、または少なくとも180個の隣接アミノ酸と50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、もしくは99.5％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約97％、約98％、約99％、もしくは約99.5％、または少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくは少なくとも99.5％のアミノ酸配列同一性を含有する。特定の態様において、BCMAポリペプチド異種は、組換え受容体および/またはCARにより結合および/または認識されるBCMAエピトープのアミノ酸配列と70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、もしくは98％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約97％、もしくは約98％、または少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、もしくは少なくとも98％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、抗原は、BCMA、またはその一部もしくは異種である。いくつかの態様において、BCMAポリペプチドは、哺乳動物BCMAポリペプチドである。特定の態様において、BCMAポリペプチドは、ヒトBCMAポリペプチドである。いくつかの態様において、BCMA抗原は、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープを含むBCMAの細胞外ドメインまたはその一部であるかまたはそれを含む。ある態様において、BCMA抗原は、SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：1の少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、もしくは少なくとも180個の隣接アミノ酸を含有するそのフラグメントと少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはこれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、BCMA抗原は、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープであるかまたはそれを含有する、SEQ ID NO：1に示される配列またはその一部であるかまたはそれを含む。
いくつかの態様において、抗原は、ROR1、またはその一部もしくは異種である。ある態様において、ROR1ポリペプチドは、哺乳動物性である。特定の態様において、ROR1ポリペプチドは、ヒト由来である。いくつかの態様において、ROR1抗原は、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープを含むROR1の細胞外ドメインまたはその一部であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、ROR1抗原は、SEQ ID NO：31またはSEQ ID NO：31の少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、もしくは少なくとも180個の隣接アミノ酸を含有するそのフラグメントと少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはこれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。いくつかの態様において、ROR抗原は、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープを含む、SEQ ID NO：31に示される配列またはその一部を含む。
いくつかの態様において、抗原は、CD22、またはその一部もしくは異種である。ある態様において、CD22ポリペプチドは、哺乳動物性である。特定の態様において、CD22ポリペプチドは、ヒト由来である。いくつかの態様において、抗原は、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープを含む、CD22の細胞外ドメインまたはその一部である。いくつかの態様において、抗原は、SEQ ID NO：29またはSEQ ID NO：29の少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、もしくは少なくとも180個の隣接アミノ酸と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはこれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。いくつかの態様において、CD22抗原は、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープを含む、SEQ ID NO：29またはその一部に示される配列を含む。
いくつかの態様において、ポリペプチド抗原の一部は、BCMAポリペプチドの一部である。ある態様において、ポリペプチド抗原の一部は、CD22ポリペプチドの一部である。特定の態様において、ポリペプチド抗原の一部は、ROR1ポリペプチドの一部である。ある態様において、ポリペプチドの一部は、SEQ ID NO：1、29、または31に示されるアミノ酸配列の少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、または少なくとも180個の隣接アミノ酸を含有する。
いくつかの態様において、細胞は、抗体またはそのフラグメントもしくは異種に融合することができるユニバーサルタグと結合するかまたはそれを認識するCARを発現する。特定の態様において、このようなCARを発現している細胞は、ユニバーサルタグと融合されていた抗体により結合されている標的細胞、例えば腫瘍細胞を特異的に認識および殺滅することが可能である。一例には、様々なヒト癌細胞が、癌反応性FITC標識抗体により結合されている場合に、これらの細胞と結合するおよび/またはこれらの細胞を認識することができる抗FITC CAR発現T細胞が含まれるが、それに限定されるわけではない。したがって、いくつかの態様において、ユニバーサルタグを含有する癌関連抗原を認識する抗体が利用可能であるならば、ユニバーサルタグと結合する同じCARが、異なる癌の処置に有用である。特定の態様において、粒子（例えば、ビーズ粒子）は、ユニバーサルタグと結合する抗原受容体、例えばCARと結合するかまたはそれにより認識される抗原またはその一部を含む表面に露出した結合分子を含む。ある態様において、結合分子は、抗原受容体、例えばCARにより結合または認識されるユニバーサルタグまたはその一部である。
特定の態様は、抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは異種と融合することができる任意のポリペプチドドメインであって、抗体がそのそれぞれの標的と結合するのを防止しないポリペプチドドメインが、ユニバーサルタグとしての使用に適していると考えている。いくつかの態様において、粒子は、FITC、ストレプトアビジン、ビオチン、ヒスチジン、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、PE、HRP、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、およびマルトース結合タンパク質からなる群より選択されるユニバーサルタグまたはその一部を含む結合分子と結合している。
いくつかの態様において、結合分子は、抗原受容体（例えばCAR）などの組換え受容体により認識および/または結合される2つ以上のポリペプチド抗原、またはその一部もしくは異種を含む多量体、例えば二量体である。いくつかの態様において、ポリペプチド抗原、またはその一部は、同一である。ある態様において、ポリペプチド抗原は、ドメインまたは領域の間の相補的相互作用により2つ以上のポリペプチド抗原の間の相互作用を促進または安定化する領域またはドメイン、例えば多量体化ドメインと直接的または間接的に連結している。いくつかの態様において、ポリペプチド抗原を多量体、例えば二量体として提供することは、結合分子と抗原受容体、例えばCARの抗原結合ドメインとの間の多価相互作用を提供し、このことは、いくつかの局面において、相互作用の結合活性を増加させることができる。いくつかの態様では、増加した結合活性は、ビーズとコンジュゲートした結合分子による、抗原受容体、例えばCARの刺激活性またはアゴニスト活性に好都合であり得る。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、多量体化ドメインと直接的または間接的につながっている。例示的な多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列またはその一部、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、および適合性のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインを含む。例えば、多量体化ドメインは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプを含むIgG、IgA、IgE、IgDおよびIgMならびにそれらの修飾形からのFcドメインまたはその一部などの免疫グロブリン定常領域またはドメインであることができる。特定の態様において、ポリペプチド抗原は、Fcドメインと直接的または間接的に連結している。いくつかの態様において、ポリペプチドは、ポリペプチド抗原またはその一部およびFcドメインを含む融合ポリペプチドである。
特定の態様において、結合分子は、Fcドメインを含む融合ポリペプチドである。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG、IgAまたはIgDアイソタイプの重鎖の第2および第3定常ドメイン（すなわち、CH2ドメインおよびCH3ドメイン）、例えばIgG、IgAおよびIgDアイソタイプのCH2またはCH3から構成される。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgMまたはIgEアイソタイプの3つの重鎖定常ドメイン（すなわち、CH2、CH3、およびCH4ドメイン）から構成される。いくつかの態様において、Fcドメインは、ヒンジ配列またはその一部をさらに含む場合がある。ある局面において、Fcドメインは、免疫グロブリン分子のヒンジドメインに加えて、CH2およびCH3ドメインの部分またはすべてを含有する。一部の例において、Fcドメインは、1つまたは複数のジスルフィド結合によりつながった2つのポリペプチド鎖の二量体を形成することができる。いくつかの態様において、Fcドメインは、適切な哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、またはサル）の免疫グロブリン（例えば、IgG、IgA、IgM、またはIgE）に由来する。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgGのCH2およびCH3ドメインを含む。ある態様において、Fcドメインは、ポリペプチド抗原のC末端に融合している。特定の態様において、Fcドメインは、ポリペプチド抗原のN末端に融合している。
いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG Fcドメイン、またはその一部もしくは異種である。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：2に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：2に示される配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、ヒトIgG Fcドメイン、またはその一部もしくは異種である。特定の態様では、Fcドメインは、野生型ヒトIgG Fcドメイン、またはその一部もしくは異種である。特定の態様において、Fcドメインは、野生型ヒトIgG1 Fcドメインの異種である。
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、異種Fcドメインを含む。ある態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインと軽鎖との間の対形成を低下、減少、および/または縮小する変異、例えば置換、欠失、または挿入を含有する。いくつかの態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、FcドメインとFc受容体との間の結合親和性を低下させる変異を含有する。特定の態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、FcドメインとFc受容体との間の相互作用、または相互作用の確率もしくは可能性を低下、減少、および/または縮小する変異を含有する。いくつかの態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインと補体系タンパク質との間の結合親和性を低下させる変異を含有する。特定の態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインと補体系タンパク質との間の相互作用、または相互作用の確率もしくは可能性を低下、減少、および/または縮小する変異を含有する。
いくつかの態様において、結合分子は、異種ヒトIgG1 Fcドメインを含む。いくつかの態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインのヒンジ領域中にシスチンからセリンへの置換を含有する。いくつかの態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインのヒンジ領域中にロイシンからアラニンへの置換を含有する。特定の態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、ヒンジ領域中にグリシンからアラニンへの置換を含有する。ある態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、FcドメインのCH2領域中にアラニンからセリンへの置換を含有する。いくつかの態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、FcドメインのCH2領域中にプロリンからセリンへの置換を含む。いくつかの態様において、異種ヒトIgG Fcドメインは、SEQ ID NO：28により示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、結合分子は、Fcドメインを含む融合ポリペプチドを含み、その際、Fcドメインは、融合ポリペプチドのC末端に存在する。
いくつかの態様において、結合分子は、BCMAポリペプチドまたはその一部と、Fcドメインとを含む融合ポリペプチドである。いくつかの態様において、BCMAポリペプチドまたはその一部は、SEQ ID NO：1に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：1と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示し、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープを含有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：2に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：2と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：28に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：28と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、BCMA抗原は、BCMA、またはその一部もしくは異種と、タグまたは融合ドメイン、例えば、Fcドメインとを含む。特定の態様において、BCMA抗原は、SEQ ID NO：35に示されるアミノ酸配列のすべてもしくは一部、またはSEQ ID NO：35と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示すアミノ酸配列であって、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープを含むアミノ酸配列を含有する。
いくつかの態様において、結合分子は、ROR1ポリペプチドまたはその一部と、Fcドメインとを含む融合ポリペプチドである。いくつかの態様において、ROR1ポリペプチドまたはその一部は、SEQ ID NO：31に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：31と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示す、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープおよびFcドメインを含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：2に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：2と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：28に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：28と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示すアミノ酸配列を含む。ある態様において、結合分子は、SEQ ID NO：33に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：33と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示し、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープを含むアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。
特定の態様において、結合分子は、SEQ ID NO：29に示されるCD22ポリペプチドもしくはその一部、またSEQ ID NO：29と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示すアミノ酸配列を含み、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープと、Fcドメインとを含む融合ポリペプチドである。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：2に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：2と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：28に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：28と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示すアミノ酸配列を含む。ある態様において、融合ポリペプチドは、SEQ ID NO：34に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：34と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示すアミノ酸配列であって、抗原受容体、例えばCARにより認識されるエピトープを含むアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Fcドメインなどの抗原および多量体化ドメインは、アミノ酸リンカーなどのリンカーにより接続されている。ある態様において、抗原は、アミノ酸リンカーのN末端と融合され、Fcドメインなどの多量体化ドメインは、リンカーのC末端と融合されている。アミノ酸リンカーは、任意の長さであり、任意の組み合わせのアミノ酸を含有することができ、リンカーの長さは、連結したドメイン間の相互作用を低下させるために比較的短い場合がある（例えば、10個またはそれ未満のアミノ酸）。リンカーのアミノ酸組成物は、また、かさ高い側鎖を有するアミノ酸または二次構造を導入する可能性のあるアミノ酸の数を低下させるように調整される場合がある。適切なアミノ酸リンカーは、最大で3、4、5、6、7、10、15、20、または25アミノ酸長のリンカーを含むが、それに限定されるわけではない。代表的なアミノ酸リンカー配列には、GGGGS（SEQ ID NO：27）、およびGGGGS（SEQ ID NO：27）の2、3、4、または5つのコピーを含むリンカーが含まれる。
いくつかの態様において、結合分子は、ポリペプチド抗原またはその一部と、Fcドメインとを含有する2つのFc融合ポリペプチド、例えばBCMA-Fc、ROR1-FcまたはCD22-Fcにより形成される二量体である。Fc融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子が、また、提供される。核酸分子をコードする発現ベクターを含むベクターが、また、提供される。いくつかの態様において、結合分子は、適切な宿主細胞における発現により細胞において産生されることができる。いくつかの態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞株である。タンパク質の組換え発現のための哺乳動物細胞の例には、HEK293細胞もしくはCHO細胞またはそれらの派生細胞が含まれる。いくつかの局面において、結合分子は、細胞からの分泌のためのシグナルペプチドをさらに含む。例示的な態様において、シグナルペプチドは、CD33（例えばSEQ ID NO：30に示される）である。いくつかの態様において、結果として生じるポリペプチド抗原-Fc融合タンパク質、例えばBCMA-Fc、ROR1-FcまたはCD22-Fcは、宿主細胞において発現される、例えば、発現ベクターにより形質転換されることができ、その際、Fcドメイン間の集合が、Fcの部分構造の間で形成される鎖間ジスルフィド結合により起こって、二価のポリペプチド抗原融合タンパク質などの二量体を回収することができる。
特定の態様において、結合分子は、ヒトBCMAまたはその一部であるかまたはそれを含有する。いくつかの態様において、結合分子は、ヒトBCMAの細胞外ドメインを含む。特定の態様において、結合分子は、SEQ ID NO：1に示されるポリペプチド配列を有するヒトBCMAの一部を含む。特定の態様において、結合分子は、ヒトBCMAの細胞外ドメインとFcドメインとを含む融合ポリペプチドである。ある態様において、Fcドメインは、ヒトIgG1 Fcドメインの異種である。ある態様において、Fcドメインは、融合ポリペプチドのC末端に配置される。特定の態様において、融合ポリペプチドは、SEQ ID NO：1に示されるアミノ酸配列を含むヒトBCMAの一部およびSEQ ID NO：29に示されるアミノ酸を含む異種ヒトIgG1 Fcドメインを含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、BCMAポリペプチドをFcドメインとつなぐリンカーを含む。特定の態様において、リンカーは、SEQ ID NO：27に示されるアミノ酸配列を有する。ある態様において、結合分子は、ヒトBCMAポリペプチド（またはその一部もしくは異種）と、C末端Fcドメインとを含む融合ポリペプチドであり、表面にコンジュゲートしているまたは他の方法で粒子（例えば、ビーズ粒子）と結びついている。特定の態様において、融合ポリペプチドは、Fcドメイン内の部位で粒子と結びついている。いくつかの態様において、粒子は、CD28と結合するかまたはそれを認識する表面コンジュゲート型抗体またはそのフラグメントもしくは異種をさらに含む。
2. 抗イディオタイプ抗体
いくつかの態様において、本明細書において提供される粒子、例えば、ビーズとコンジュゲートした結合分子は、標的抗原受容体、例えばCARと結合する抗イディオタイプ抗体、またはその抗原結合性フラグメント（「抗ID」）、またはその活性フラグメントである。ある態様において、結合分子は、CARの抗原結合ドメインと結合する抗IDである。特定の態様において、CARの抗原結合ドメインは、scFvドメインを含む。いくつかの態様において、結合分子は、抗原結合ドメインでCARと結合する抗IDであって、抗原結合ドメイン、例えば、scFvをCARの膜貫通ドメインと接続しているCARのリンカーまたはスペーサー領域と結合しない抗IDである。
いくつかの態様において、抗IDは、疾患または状態、例えば癌の細胞または組織に関連するまたはその上に発現される標的抗原などの、標的抗原と結合する抗体を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、抗IDは、抗原と結合する標的抗体を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXもしくはG250としても公知）、癌-精巣抗原、癌/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、癌胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFRvIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても公知）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソセリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、TYRP1もしくはgp75としても公知）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼもしくはDCTとしても公知）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的または病原体発現抗原、またはユニバーサルタグ関連抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子であるかまたはそれを含む。受容体により標的とされる抗原は、いくつかの態様において、いくつかの公知のB細胞マーカーのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79bまたはCD30であるかまたはそれを含む。
いくつかの態様において、抗IDは、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、炭酸脱水酵素9（CAIX）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerbB2）、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児型アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子、（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、TAG72、B7-H6、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児型AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、癌-精巣抗原、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、または病原体特異抗原と結合する標的抗体を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体または抗原結合性フラグメントである。
いくつかの態様において、抗IDは、標的抗CD19抗体の部分構造を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体または抗原結合性フラグメント（「抗ID」）である。いくつかの態様において、提供される抗体は、SJ25C1もしくはその抗原結合性フラグメントであるかまたはSJ25C1に由来する抗体もしくは抗原結合性フラグメントである標的抗CD19抗体を認識する。いくつかの態様において、提供される抗体は、FMC63もしくはその抗原結合性フラグメントであるかまたはFMC63に由来する抗体もしくは抗原結合性フラグメントである標的抗CD19抗体を認識する。
SJ25C1は、ヒト起源のCD19を発現しているNalm-1細胞およびNalm-16細胞に対して産生されたマウスモノクローナルIgG1抗体である（Ling、N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。SJ25C1抗体は、それぞれSEQ ID NO：40〜42に示されるCDRH1、H2およびH3配列、ならびにそれぞれSEQ ID NO：43〜45に示されるCDRL1、L2およびL3配列を含む。SJ25C1抗体は、SEQ ID NO：36のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）およびSEQ ID NO：37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
いくつかの態様において、標的抗体は、SJ25C1またはSJ25C1に由来する抗体である。いくつかの態様において、「SJ25C1に由来する抗体」は、SJ25C1のVHおよび/もしくはVL、SJ25C1のイディオタイプ、SJ25C1のパラトープ、またはSJ25C1の1つもしくは複数の相補性決定領域（CDR）を含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、SJ25C1またはSJ25C1に由来する抗体である標的抗体は、SEQ ID NO：36に示されるSJ25C1のVH、もしくはSEQ ID NO：36と少なくとも90％の配列同一性を有するその異種、および/またはSEQ ID NO：37に示されるSJ25C1のVL、もしくはSEQ ID NO：37と少なくとも90％の配列同一性を有するその異種を含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：36に示されるSJ25C1のVH、またはSEQ ID NO：36と少なくとも90％の配列同一性を有するその異種、およびSEQ ID NO：37に示されるSJ25C1のVL、またはSEQ ID NO：37と少なくとも90％の配列同一性を有するその異種を含む。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、それぞれSEQ ID NO：36およびSEQ ID NO：37に示されるSJ25C1のVHおよびVLを含む。いくつかの態様において、異種は、SEQ ID NO：36および/またはSEQ ID NO：37と少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはこれを超える配列同一性を有する。
いくつかの態様において、SJ25C1またはSJ25C1に由来する抗体である標的抗体は、SEQ ID NO：36に示される、例えばSEQ ID NO：40〜42に示されるSJ25C1 VHの1つもしくは複数の重鎖CDR（CDR-H）および/またはSEQ ID NO：37に示される、例えばSEQ ID NO：43〜45に示されるSJ25C1 VLの1つまたは複数の軽鎖CDR（CDR-L）を含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、SJ25C1のCDR-H3（例えばSEQ ID NO：42に示される）および/またはSJ25C1のCDR-L3（例えばSEQ ID NO：45に示される）を含む。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、SJ25C1のCDR-H3およびCDR-L3（例えば、それぞれSEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：43に示される）を含む。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、SJ25C1のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3（例えば、それぞれSEQ ID NO：40、41、42に示される）の1つもしくは複数ならびに/またはSJ25C1のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3（例えば、それぞれSEQ ID NO：43、44、45に示される）の1つもしくは複数を含む。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、SJ25C1のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3（例えば、それぞれSEQ ID NO：40、41、42に示される）ならびに/またはSJ25C1のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3（例えば、それぞれSEQ ID NO：43、44、45に示される）を含む。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、SJ25C1のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3（例えば、それぞれSEQ ID NO：40、41、42に示される）ならびにSJ25C1のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3（例えば、それぞれSEQ ID NO：43、44、45に示される）を含む。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、フラグメント抗原結合性（Fab）、F(ab')2、Fab'、フラグメント可変（Fv）、または単鎖Fv（scFv）などの抗原結合性フラグメントを含む。例えばBejcek, B. E., et al. (1995). Cancer research. 55(11): 2346-2351を参照されたい。
FMC63は、ヒト起源のCD19を発現しているJVM3細胞に対して産生されたマウスモノクローナルIgG1抗体である（Nicholson., et al. (1997). Molecular Immunology. 34(16-17):1157-1165）。FMC63抗体は、それぞれSEQ ID NO：46〜48に示されるCDRH1、H2およびH3配列、ならびにそれぞれSEQ ID NO：49〜51に示されるCDRL1、L2およびL3配列を含む。FMC63抗体は、SEQ ID NO：38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）およびSEQ ID NO：39のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
いくつかの態様において、標的抗体は、FMC63またはFMC63に由来する抗体である。いくつかの態様において、FMC63に由来する抗体は、FMC63のVHおよび/またはVL、FMC63のイディオタイプ、FMC63のパラトープ、またはFMC63の1つもしくは複数の相補性決定領域（CDR）を含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、FMC63またはFMC63に由来する抗体である標的抗体は、SEQ ID NO：38に示されるFMC63のVH、もしくはSEQ ID NO：38と少なくとも90％の配列同一性を有するその異種、および/またはSEQ ID NO：39に示されるFMC63のVL、もしくはSEQ ID NO：39と少なくとも90％の配列同一性を有するその異種を含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：38に示されるFMC63のVH、またはSEQ ID NO：38と少なくとも90％の配列同一性を有するその異種、およびSEQ ID NO：39に示されるFMC63のVL、またはSEQ ID NO：39と少なくとも90％の配列同一性を有するその異種を含む。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、それぞれSEQ ID NO：38および39に示されるFMC63のVHおよびVLを含む。いくつかの態様において、異種は、SEQ ID NO：38および/またはSEQ ID NO：39と少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはこれを超える配列同一性を有する。
いくつかの態様において、FMC63またはFMC63に由来する抗体である標的抗体は、SEQ ID NO：38に示されるFMC63 VHの1つもしくは複数の重鎖CDR（CDR-H）、例えばSEQ ID NO：46〜48に示されるものおよび/またはSEQ ID NO：39に示されるFMC63VLの1つもしくは複数の軽鎖CDR（CDR-L）、例えばSEQ ID NO：49〜51に示されるものを含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、FMC63またはFMC63に由来する抗体である標的抗体は、FMC63のCDR-H3（例えば、SEQ ID NO：48に示される）および/またはFMC63のCDR-L3（例えば、SEQ ID NO：51に示される）を含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、CDR-H3（例えば、SEQ ID NO：48に示される）およびFMC63のCDR-L3（例えば、SEQ ID NO：51に示される）を含む。いくつかの態様において、FMC63またはFMC63に由来する抗体である標的抗体は、FMC63のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3（例えば、それぞれSEQ ID NO：46、47、48に示される）のうち1つもしくは複数ならびに/またはFMC63のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3（例えば、それぞれSEQ ID NO：49、50、51に示される）のうち1つもしくは複数を含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、FMC63またはFMC63に由来する抗体である標的抗体は、FMC63のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3（例えば、それぞれSEQ ID NO：46、47、48に示される）ならびに/またはFMC63のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3（例えば、それぞれSEQ ID NO：49、50、51に示される）を含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、FMC63またはFMC63に由来する抗体である標的抗体は、FMC63のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3（例えば、それぞれSEQ ID NO：46、47、48に示される）ならびにFMC63のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3（例えば、それぞれSEQ ID NO：49、50、51に示される）を含む抗体または抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、フラグメント抗原結合性（Fab）、F(ab')2、Fab'、フラグメント可変（Fv）、または単鎖Fv（scFv）などの抗原結合性フラグメントを含む。
いくつかの態様において、提供される抗イディオタイプ抗体は、SJ25C1またはFMC63に由来する、単鎖Fv（scFv）などの可変ドメイン（Fv）と特異的に結合する抗体を含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、Fvの特定のエピトープまたは領域、一般的に1つまたは複数の相補性決定領域を含むエピトープまたは領域と特異的に結合する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、Fvパラトープと重複するエピトープまたは領域と特異的に結合する。
いくつかの態様において、提供される抗イディオタイプ抗体は、標的キメラ抗原受容体（CAR）の細胞外ドメインの部分として含有される、SJ25C1またはFMC63に由来する抗CD19の部分構造と特異的に結合するものを含む。いくつかの態様において、標的CARは、SJ25C1もしくはFMC63抗体分子またはSJ25C1もしくはFMC63抗体の抗原結合性フラグメントもしくは一部を含有する抗原結合性の一部を含有する。いくつかの態様において、標的CARは、抗体SJ25C1またはFMC63のVH鎖およびVL鎖に由来するscFvである抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体SJ25C1またはFMC63に由来するscFvを含有する抗CD19 CARと特異的に結合する抗イディオタイプ抗体が、提供される。CARの例示的な特徴は、下にさらに説明される。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、インタクト抗体、ならびにフラグメント抗原結合（Fab）フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント、組換えIgG（rIgG）フラグメント、一本鎖可変フラグメント（scFv）を含む一本鎖抗体フラグメント、および単一ドメイン抗体（例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ）フラグメントを含む機能性（抗原結合）抗体フラグメントを含む、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作されたおよび/または他の方法で改変された形態、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムdi-scFv、タンデムtri-scFvを包含する。特に明記されないかぎり、「抗体」という用語は、その機能性抗体フラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語はまた、IgGならびにそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、およびIgDを含む任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、インタクトまたは完全長抗体も包含する。
「抗イディオタイプ抗体」という用語は、抗体の抗原結合性フラグメントなどのイディオトープを特異的に認識する、それを特異的に標的とする、および/またはそれと特異的に結合する抗体をその抗原結合性フラグメントを含めて指す。抗体のイディオトープは、抗体の相補性決定領域（CDR）、抗体の可変領域、ならびに/またはこのような可変領域および/もしくはこのようなCDRの部分的一部もしくは一部、ならびに/または前記の任意の組み合わせのうちの1つもしくは複数に含まれる残基を含み得るが、必ずしもそれに限定されるわけではない。CDRは、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3からなる群より選択される1つまたは複数であり得る。抗体の可変領域は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせであり得る。抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域の部分フラグメントまたは一部は、2個以上、5個以上、または10個以上の隣接アミノ酸、例えば、2個〜100個、5個〜100個、10個〜100個、2個〜50個、5個〜50個、もしくは10個〜50個、または約2個〜100個、約5個〜100個、約10個〜100個、約2個〜50個、約5個〜50個、もしくは約10個〜50個の隣接アミノ酸を抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域内に含むフラグメントの場合があり、イディオトープは、複数の非隣接アミノ酸ストレッチを含む場合がある。抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の部分フラグメントは、2個以上、5個以上、または10個以上の隣接アミノ酸、例えば、2個〜00個、5個〜100個、10個〜100個、2個〜50個、5個〜50個、もしくは10個〜50個、または2個〜00個、5個〜100個、10個〜100個、2個〜50個、5個〜50個、もしくは10個〜50個の隣接アミノ酸を可変領域内に含むフラグメントである場合があり、いくつかの態様において、1つまたは複数のCDRまたはCDRフラグメントを含有する場合がある。CDRフラグメントは、CDR内の連続する、または不連続である2個以上、または5個以上のアミノ酸であり得る。したがって、抗体のイディオトープは、1つもしくは複数のCDRまたは1つもしくは複数のCDRフラグメントを抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域内に含有する2個〜100個、5個〜100個、10個〜100個、2個〜50個、5個〜50個、もしくは10個〜50個、または約2個〜100個、約5個〜100個、約10個〜100個、約2個〜50個、約5個〜50個、もしくは約10個〜50個の隣接アミノ酸であり得る。別の態様において、イディオトープは、抗体の可変領域、例えば、CDR部位に位置する単一のアミノ酸であり得る。
いくつかの態様において、イディオトープは、抗体の可変部分内の任意の単一の抗原決定基またはエピトープである。一部の例において、イディオトープは、抗体の実際の抗原結合部位と重なることができ、一部の例において、イディオトープは、可変領域配列を抗体の抗原結合部位の範囲外に含む場合がある。抗体の個別のイディオトープのセットは、いくつかの態様において、このような抗体の「イディオタイプ」と称される。
「相補性決定領域」および「CDR」という用語は、「超可変領域」または「HVR」と同義であって、抗原特異性および/または結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の非隣接配列を指すことが、当技術分野において公知である。一般に、各重鎖可変領域中に3つのCDR（CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3）、ならびに各軽鎖可変領域中に3つのCDR（CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3）がある。「フレームワーク領域」および「FR」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非CDRの一部を指すことが、当技術分野において公知である。一般に、各完全長重鎖可変領域中に4つのFR（FR-H1、FR-H2、FR-H3、およびFR-H4）、ならびに各完全長軽鎖可変領域中に4つのFR（FR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4）がある。
所与のCDRまたはFRの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Kabat」ナンバリングスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 （「Chothia」ナンバリングスキーム）、MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745."（「Contact」ナンバリングスキーム）、Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunolobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1): 55-77（「IMGT」ナンバリングスキーム）、およびHonegger A and Plueckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3): 657-70（「Aho」ナンバリングスキーム）に記載されているものを含めて、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。
所与のCDRまたはFRの境界は、同定のために使用されるスキームに応じて変動する場合がある。例えば、Kabatスキームは構造アライメントに基づき、一方、Chothiaスキームは構造情報に基づく。KabatスキームとChothiaスキームはどちらのナンバリングも最も一般的な抗体領域配列長に基づき、挿入には挿入文字、例えば「30a」で対応し、一部の抗体には欠失が現れる。これら2つのスキームは、一定の挿入および欠失（「インデル」）を異なる位置に置くことで、差異のあるナンバリングをもたらす。Contactスキームは、複合体結晶構造の解析に基づき、多くの点でChothiaナンバリングスキームに類似している。
下の表1は、Kabat、Chothia、およびContactスキームによってそれぞれ同定されたCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3の例示的な位置境界を列挙するものである。CDR-H1については、KabatナンバリングスキームとChothiaナンバリングスキームとの両方を使用して残基ナンバリングを列挙する。FRは、CDRの間に位置し、例えばFR-L1はCDR-L1とCDR-L2との間に位置するなどである。表示のKabatナンバリングスキームは、挿入をH35AおよびH35Bに置くので、Chothia CDR-H1ループの末端は、表示のKabatナンバリング法を使用してナンバリングした場合に、ループの長さに応じてH32とH34との間で変動することに注意されたい。
（表１）
Figure 2020528753
1 - Kabat et al. (1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest”」 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD
2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
したがって、特に指定しない限り、所与の抗体またはその可変領域などのその領域の「CDR」、もしくは「相補性決定領域」、または個別の特定されたCDR（例えば「CDR-H1、CDR-H2）は、上述のスキームのいずれかにより定義される相補性決定領域（または特定の相補性決定領域）を包含すると理解されるべきである。例えば、ある特定CDR（例えばCDR-H3）が所与のVHアミノ酸配列またはVLアミノ酸配列中の対応するCDRのアミノ酸配列を含有するという場合、このようなCDRは上述のスキームのいずれかにより定義される可変領域内の対応するCDR（例えばCDR-H3）の配列を有することが理解されている。いくつかの態様では、特定のCDR配列が特定される。
同様に、特に特定しない限り、所与の抗体またはその可変領域などのその領域のFRまたは個々の特定されたFR（例えばFR-H1、FR-H2）は、公知のスキームのいずれかにより定義されるフレームワーク領域（または特定のフレームワーク領域）を包含すると理解されるべきである。場合によっては、1つまたは複数の特定のCDRまたはFRRを同定するためのスキームが、Kabat、Chothia、またはContact法により定義されるCDRなどのように、特定される。他の場合には、CDRまたはFRの特定アミノ酸配列が与えられる。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は概して、類似した構造を有し、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域（FR）および3つのCDRを含む（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい）。単一のVHドメインまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合する抗体を、抗原に結合する抗体由来のVHドメインまたはVLドメインを用いて単離して、それぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリをスクリーニングしてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991)を参照されたい。
提供される抗体の中には、抗体断片がある。「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばscFv）；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されない。特定の態様において、抗体は、scFvなどの、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体断片である。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。
抗体断片は、インタクト抗体のタンパク質分解消化、および組換え宿主細胞による産生を含むがそれらに限定されない、様々な技法によって作ることができる。いくつかの態様において、抗体は、組換え生産された断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された2つ以上の抗体領域もしくは鎖を有するものなどの、天然には存在しない配置、および/または天然に存在するインタクト抗体の酵素消化によっては生じ得ない配置を含む断片である。いくつかの局面において、抗体断片はscFvである。
「ヒト化」抗体は、すべてのまたは実質的にすべてのCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由来し、すべてのまたは実質的にすべてのFRアミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。非ヒト抗体の「ヒト化型」は、典型的には、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるために、ヒト化を受けている非ヒト抗体のバリアントを指す。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復するかまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、CDR残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
提供される抗体の中には、ヒト抗体がある。「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持つか、ヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体コード配列（例えばヒト抗体ライブラリー）を利用する非ヒト供給源によって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持つ抗体である。非ヒト抗原結合領域を含む非ヒト抗体のヒト化型、例えばCDRのすべてまたは実質的にすべてが非ヒトであるものは、この用語から除外される。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製しうる。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部であって、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えているか、染色体外に存在するか、動物の染色体にランダムに組み込まれているものを含有する。そのようなトランスジェニック動物において内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活化されている。ヒト抗体は、ヒトレパートリーに由来する抗体コード配列を含有するファージディスプレイおよび無細胞ライブラリーを含むヒト抗体ライブラリーからも誘導されうる。
提供される抗体の中には、モノクローナル抗体断片を含む、モノクローナル抗体がある。本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質上均一な抗体の集団から得られる抗体またはそのような集団内にある抗体を指す。すなわち集団を構成する個々の抗体は、天然の突然変異を含有する変異体またはモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる変異体が考えられる点を除けば同一であり、そのような変異体は一般に微量で存在する。典型的には異なるエピトープを指向する異なる抗体を含むポリクローナル調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、ある抗原上の単一エピトープを指向する。この用語は、何らかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈してはならない。モノクローナル抗体は、例えば限定するわけではないが、ハイブリドーマからの生成、組換えDNA法、ファージディスプレイ、および他の抗体ディスプレイ法など、様々な技法によって製造されうる。
a. SJ25C1由来の抗体
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれに由来する標的抗CD19抗体に特異的である。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：52に示されるVH領域アミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性、例えば、それと少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を含む重鎖可変（VH）領域を含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：53もしくは54に示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域3（CDR-H3）および/またはSEQ ID NO：52に示される重鎖可変（VH）配列内に含有されるCDR-H3を含有する重鎖可変（VH）領域を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO：55、56、57、もしくは58に示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、および/またはSEQ ID NO：52に示されるVH配列内に含有されるCDR-H1、ならびに/あるいはSEQ ID NO：59、60、61、もしくは62に示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（CDR-H2）および/またはSEQ ID NO：52に示されるVH配列内に含有されるCDR-H2を含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変（VH）領域を含み、その際、CDR-H1は、SEQ ID NO：55、56、57、もしくは58に示されるアミノ酸配列を含み、CDR-H2は、SEQ ID NO：59、60、61、もしくは62に示されるアミノ酸配列を含み、および/またはCDR-H3は、SEQ ID NO：53もしくは54に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、SEQ ID NO：55、56、57、または58に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H1、SEQ ID NO：59、60、61、または62に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H2、およびSEQ ID NO：53または54に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H3を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントが、提供される。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：52に示されるVH領域アミノ酸配列内に含有される重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、CDR-H2、およびCDR-H3のアミノ酸配列をそれぞれ含む、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。
任意のそのような態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO：52に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4とそれぞれ少なくとも90％の配列同一性を有するFR1配列、FR2配列、FR3配列および/またはFR4配列を含有する。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO：52に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4とそれぞれ少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1配列、FR2配列、FR3配列および/またはFR4配列を含有する。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO：52に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3およびFR4とそれぞれ少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1配列、FR2配列、FR3配列およびFR4配列を含有する。
このような態様のいずれかのいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO：52に示されるアミノ酸配列を有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体または抗原結合性フラグメントは、重鎖のみである、VHのみである、および/またはVLもしくはその抗原結合部分を含まない、および/あるいは抗イディオタイプ抗体またはフラグメントの抗原結合部位は、重鎖のみからの残基を含み、かつ/または軽鎖からの残基を含まない。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはフラグメントは、軽鎖可変（VL）領域を含有せず、CDR-L1、CDR-L2、および/もしくはCDR-L3を含有せず、かつ/またはVH領域のみを含有する単一ドメイン抗体（sdAb）である。いくつかの態様において、抗体またはフラグメントは、記載したいずれかからのVH領域のみを含有するsdAbである。
上記VH領域配列のいずれかを含有する抗イディオタイプ抗体またはフラグメントのいずれかのいくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはフラグメントは、軽鎖可変（VL）領域をさらに含む。いくつかのこのような態様において、VL領域は、SEQ ID NO：63に示されるVL領域アミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性、例えば、SEQ ID NO：63に示されるVL領域アミノ酸配列と少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：64または65に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（CDR-L3）を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：64または65に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域3（CDR-L3）を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：66もしくは67に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、および/またはSEQ ID NO：63に示されるVL配列内に含有されるCDR-L1、ならびに/あるいはSEQ ID NO：68もしくは69に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（CDR-L2）、および/またはSEQ ID NO：63に示されるVL配列内に含有されるCDR-L2を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：66もしくは67に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、および/またはSEQ ID NO：63に示されるVL配列内に含有されるCDR-L1、ならびに/あるいはSEQ ID NO：68もしくは69に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域2（CDR-L2）、および/またはSEQ ID NO：63に示されるVL配列内に含有されるCDR-L2を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：66または67に示されるアミノ酸配列を含有するCDR-L1、SEQ ID NO：68または69に示されるアミノ酸配列を含有するCDR-L2、およびSEQ ID NO：64または65に示されるアミノ酸配列を含有するCDR-L3を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：63に示されるVL領域アミノ酸配列内に含有されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のアミノ酸配列をそれぞれ含む、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：63に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3、および/またはFR4とそれぞれ少なくとも90％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3、および/またはFR4を含む。いくつかの態様において、VL領域は、SEQ ID NO：63に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3、および/またはFR4とそれぞれ少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3、および/またはFR4配列を含む。いくつかの態様において、VL領域は、SEQ ID NO：63に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3、およびFR4とそれぞれ少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3、およびFR4配列を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：63に示されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：52に示されるVH領域アミノ酸配列内に含有されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3配列のアミノ酸配列を含み、かつ/またはSEQ ID NO：63に示される軽鎖可変（VL）領域アミノ酸配列内に含有されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3配列のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：52および63とそれぞれ少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有するアミノ酸配列を有するVH領域およびVL領域を含む。
いくつかの態様において、SEQ ID NO：52および63にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するVH領域およびVL領域を含む抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、提供される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VH領域およびVL領域は、それぞれSEQ ID NO：52および63のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントに特異的な抗イディオタイプ抗体は、scFvまたはダイアボディなどの単鎖抗体フラグメントである。いくつかの態様において、単鎖抗体は、可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）などの2つの抗体ドメインまたは領域をつなぐ1つまたは複数のリンカーを含む。リンカーは、典型的にはペプチドリンカー、例えば、可動性ペプチドリンカーおよび/または可溶性ペプチドリンカーである。リンカーの中に、グリシンおよびセリンならびに/または一部の例においてトレオニンに富むリンカーが含まれる。いくつかの態様において、リンカーは、溶解性を改善することができるリシンおよび/またはグルタメートなどの荷電残基をさらに含む。いくつかの態様において、リンカーは、1つまたは複数のプロリンをさらに含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、インタクト抗体または完全長抗体である。いくつかの態様において、抗IDは、1つまたは複数の定常領域ドメインなどの、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有する場合がある。いくつかの態様において、定常領域は、軽鎖定常領域（CL）および/または重鎖定常領域1（CH1）を含む。いくつかの態様において、抗IDは、Fc領域のように、CH2ドメインおよび/またはCH3ドメインを含む。いくつかの態様において、Fc領域は、IgG1またはIgG4などのヒトIgGのFc領域である。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO：115に示されるCHドメインまたはSEQ ID NO：115と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO：118に示されるCLドメインもしくはその一部、またはSEQ ID NO：118と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示すアミノ酸配列もしくはその一部を含有する。
いくつかの態様において、SJ25C1に特異的な抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO：116に示される重鎖配列またはSEQ ID NO：116と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を含み、かつ/あるいはSEQ ID NO：119に示される軽鎖配列またはSEQ ID NO：119と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を含む。いくつかの態様において、SJ25C1に特異的な抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO：116に示される重鎖配列および/またはSEQ ID NO：119に示される軽鎖配列を含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体の重鎖および/または軽鎖は、シグナルペプチドをさらに含む。一部の例において、シグナルペプチドは、SEQ ID NO：117またはSEQ ID NO：120に示される配列を有する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、抗原結合性フラグメントは、フラグメント抗原結合（Fab）フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント、単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。
したがって、典型的には、VHおよびVLドメインなどの2つの抗イディオタイプ抗体ドメインまたは領域をつなぐリンカーを含む、scFvおよびダイアボディなどの単鎖抗体フラグメント、特にヒト単鎖フラグメントが提供される。リンカーは、典型的には、ペプチドリンカー、例えば、グリシンおよびセリンに富むペプチドリンカーなどの可動性ペプチドリンカーおよび/または可溶性ペプチドリンカーである。
いくつかの局面において、グリシンおよびセリン（および/またはトレオニン）に富むリンカーは、このようなアミノ酸を少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％含む。いくつかの態様において、それらは、グリシン、セリン、および/またはトレオニンを少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも70％、もしくは少なくとも75％、または少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、もしくは少なくとも約75％含む。いくつかの態様において、リンカーは、グリシン、セリン、および/またはトレオニンから実質的に完全に構成される。リンカーは、一般的に、5と50アミノ酸長との間または約5と50アミノ酸長との間、典型的には10または約10と30または約30との間、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸長であり、いくつかの例において、10と25アミノ酸長との間である。例示的なリンカーは、このような配列の2、3、4、および5つの繰り返しの間などの、配列GGGS（3GS；SEQ ID NO：70）またはGGGGS（4GS；SEQ ID NO：27）の様々な数の繰り返しを有するリンカーを含む。例示的なリンカーは、
Figure 2020528753
に示される配列を有するかまたはそれからなるリンカーを含む。例示的なリンカーは、
Figure 2020528753
に示される配列を有するかまたはそれからなるリンカーをさらに含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、単離された抗体を含む。いくつかの態様において、抗IDは、ヒト化されている、組換えである、および/またはモノクローナルである。いくつかの態様において、抗IDは、ヒト由来である。
b. FMC63由来の抗体
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれに由来する標的抗CD19抗体に特異的である。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：73または74に示されるVH領域アミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性、例えば、それと少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を含む重鎖可変（VH）領域を含む。
いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
Figure 2020528753
のアミノ酸配列［配列中、X3は、TもしくはSであり、X5は、TもしくはSであり、X6は、DもしくはRであり、X8は、YもしくはWであり、X10は、KもしくはNである］を含有する重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、および/または
Figure 2020528753
のアミノ酸配列［配列中、X4は、DもしくはMであり、X6は、NもしくはHであり、X8は、NもしくはSであり、X9は、NもしくはDであり、X10は、GもしくはSであり、X11は、GもしくはEであり、X13は、DもしくはRであり、X14は、YもしくはLであり、X17は、NもしくはKであり、X20は、GもしくはDである］を含有する重鎖相補性決定領域2（CDR-H2）、および/または
Figure 2020528753
のアミノ酸配列［配列中、X2は、RもしくはSであり、X3は、EもしくはIであり、X4は、GもしくはYであり、X5は、NもしくはYであり、X6は、NもしくはEであり、X7は、Yもしくはヌルであり、X8は、Gもしくはヌルであり、X9は、Sもしくはヌルであり、X10は、Rもしくはヌルであり、X11は、Dもしくはヌルであり、X12は、Aもしくはヌルであり、X13は、Mもしくはヌルであり、X14は、DもしくはEであり、X15は、YもしくはAである］を含有する重鎖相補性決定領域3（CDR-H3）
を有するVH領域を含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：75、76、77、もしくは78に示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域3（CDR-H3）および/またはSEQ ID NO：73もしくは74に示される重鎖可変（VH）配列内に含有されるCDR-H3を含有する重鎖可変（VH）領域を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO：79、80、81、82、83、84、85、もしくは86に示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、および/またはSEQ ID NO：73もしくは74に示されるVH配列内に含有されるCDR-H1、ならびに/あるいはSEQ ID NO：87、88、89、90、91、92、93、もしくは94に示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（CDR-H2）、および/またはSEQ ID NO：73もしくは74に示されるVH配列内に含有されるCDR-H2を含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変（VH）領域を含み、その際、CDR-H1は、SEQ ID NO：79、80、81、82、83、84、85、もしくは86に示されるアミノ酸配列を含み、CDR-H2は、SEQ ID NO：87、88、89、90、91、92、93、もしくは94に示されるアミノ酸配列を含み、かつ/またはCDR-H3は、SEQ ID NO：75、76、77、もしくは78に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、SEQ ID NO：79、80、81、82、83、84、85、もしくは86に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H1、SEQ ID NO：87、88、89、90、91、92、93、もしくは94に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H2、およびSEQ ID NO：75、76、77、もしくは78に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H3を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、提供される。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：73または74に示されるVH領域アミノ酸配列内に含有される重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、CDR-H2、およびCDR-H3のアミノ酸配列をそれぞれ含む、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：79、81、82、83に示されるCDR-H1、SEQ ID NO：87、89、90、91に示されるCDR-H2、および/またはSEQ ID NO：71もしくは77に示されるCDR-H3を含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：80、84、85、86に示されるCDR-H1、SEQ ID NO：88、92、93、94に示されるCDR-H2、および/またはSEQ ID NO：76、78に示されるCDR-H3をそれぞれ含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO：73または74に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3、および/またはFR4とそれぞれ少なくとも90％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3、および/またはFR4配列を含有する。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO：73または74に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3、および/またはFR4とそれぞれ少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3、および/またはFR4配列を含有する。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO：73または74に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3、およびFR4とそれぞれ少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3、およびFR4配列を含有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO：73または74に示されるアミノ酸配列を有する。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体または抗原結合性フラグメントは、重鎖のみである、VHのみである、および/またはVLもしくはその抗原結合部分を含まず、かつ/あるいは抗イディオタイプ抗体またはフラグメントの抗原結合部位は、重鎖のみからの残基を含み、かつ/または軽鎖からの残基を含まない。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはフラグメントは、軽鎖可変（VL）領域を含有せず、CDR-L1、CDR-L2、および/もしくはCDR-L3を含有せず、かつ/またはVH領域のみを含有する単一ドメイン抗体（sdAb）である。いくつかの態様において、抗体またはフラグメントは、記載したいずれかからのVH領域のみを含有するsdAbである。
上記VH領域配列のいずれかを含有する抗イディオタイプ抗体またはフラグメントのいずれかのいくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはフラグメントは、軽鎖可変（VL）領域をさらに含む。いくつかのこのような態様において、VL領域は、SEQ ID NO：98または99に示されるVL領域アミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性、例えば、SEQ ID NO：98または99に示されるVL領域アミノ酸配列と少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。
いくつかの態様において、
Figure 2020528753
のアミノ酸配列［配列中、X1は、SもしくはRであり、X3は、SもしくはRであり、X4は、SもしくはGであり、X5は、GもしくはNであり、X6は、VもしくはIであり、X7は、IもしくはHであり、X8は、Nもしくはヌルであり、X10は、MもしくはLであり、X11は、YもしくはAである］を含有する軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、および/または
Figure 2020528753
のアミノ酸配列［配列中、X1は、PもしくはLであり、X2は、WもしくはLであり、X3は、IもしくはVであり、X5は、LもしくはNであり、X6は、TもしくはAであり、X7は、SもしくはKであり、X8は、NもしくはTであり、X11は、SもしくはDである］を含有する軽鎖相補性決定領域2（CDR-L2）、および/または
QX2X3X4X5X6PX8T（SEQ ID NO：114）のアミノ酸配列［配列中、X2は、QもしくはHであり、X3は、WもしくはFであり、X4は、SもしくはWであり、X5は、SもしくはWであり、X6は、NもしくはTであり、X8は、LもしくはYである］を含有する軽鎖相補性決定領域3（CDR-L3）
を有するVH領域を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、提供される。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：100、101、102、または103に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（CDR-L3）を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：100、101、102、または103に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域3（CDR-L3）を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：104、105、106、もしくは107に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、および/またはSEQ ID NO：98もしくは99に示されるVL配列内に含有されるCDR-L1、ならびに/あるいはSEQ ID NO：108、109、110、もしくは111に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（CDR-L2）、および/またはSEQ ID NO：98もしくは99に示されるVL配列内に含有されるCDR-L2を含む。任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：104、105、106、もしくは107に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、および/またはSEQ ID NO：98もしくは99に示されるVL配列内に含有されるCDR-L1、ならびに/あるいはSEQ ID NO：108、109、110、もしくは111に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域2（CDR-L2）、および/またはSEQ ID NO：98もしくは99に示されるVL配列内に含有されるCDR-L2を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：104、105、106、もしくは107に示されるアミノ酸配列を含有するCDR-L1、SEQ ID NO：108、109、110、もしくは111に示されるアミノ酸配列を含有するCDR-L2、およびSEQ ID NO：100、101、102、もしくは103に示されるアミノ酸配列を含有するCDR-L3を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：98または99に示されるVL領域アミノ酸配列内に含有されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のアミノ酸配列をそれぞれ含む、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：104もしくは106に示されるCDR-L1、SEQ ID NO：108もしくは110に示されるCDR-L2、および/またはSEQ ID NO：100もしくは101に示されるCDR-L3を含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：105もしくは07に示されるCDR-L1、SEQ ID NO：109もしくは111に示されるCDR-L2、および/またはSEQ ID NO：102もしくは103に示されるCDR-L3をそれぞれ含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：98または99に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3、および/またはFR4と少なくとも90％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3、および/またはFR4を含む。いくつかの態様において、VL領域は、SEQ ID NO：98または99に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3、および/またはFR4とそれぞれ少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3、および/またはFR4配列を含む。いくつかの態様において、VL領域は、アミノ酸配列 SEQ ID NO：98または99に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3、およびFR4とそれぞれ少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3、およびFR4配列を含む。
任意のこのような態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO：98または99に示されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：73もしくは74に示されるVH領域アミノ酸配列内に含有されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3配列のアミノ酸配列を含み、ならびに/またはSEQ ID NO：98もしくは99に示される軽鎖可変（VL）領域アミノ酸配列内に含有されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3配列のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：73または74と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有するアミノ酸配列を有するVH領域、およびSEQ ID NO：98または99と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有するアミノ酸配列を有するVL領域を含む。
いくつかの態様において、SEQ ID NO：73または74に示されるアミノ酸配列を有するVH領域、およびSEQ ID NO：98または99に示されるアミノ酸配列を有するVL領域を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、提供される。態様のいくつかにおいて、提供される抗体は、SEQ ID NO：73に示されるVH領域およびSEQ ID NO：98に示されるVL領域を含有する。態様のいくつかにおいて、提供される抗体は、SEQ ID NO：74に示されるVH領域およびSEQ ID NO：99に示されるVL領域を含有する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、scFvまたはダイアボディなどの単鎖抗体フラグメントである。いくつかの態様において、単鎖抗体は、可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）などの2つの抗体ドメインまたは領域をつないでいる1つまたは複数のリンカーを含む。リンカーは、典型的には、ペプチドリンカー、例えば、可動性ペプチドリンカーおよび/または可溶性ペプチドリンカーである。リンカーの中に、グリシンおよびセリンならびに/または一部の例においてトレオニンに富むリンカーが含まれる。いくつかの態様において、リンカーは、溶解性を改善することができるリシンおよび/またはグルタメートなどの荷電残基をさらに含む。いくつかの態様において、リンカーは、1つまたは複数のプロリンをさらに含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、インタクト抗体または完全長抗体である。いくつかの態様において、抗IDは、1つまたは複数の定常領域ドメインなどの、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有する場合がある。いくつかの態様において、定常領域は、軽鎖定常領域（CL）および/または重鎖定常領域1（CH1）を含む。いくつかの態様において、抗IDは、Fc領域のように、CH2ドメインおよび/またはCH3ドメインを含む。いくつかの態様において、Fc領域は、IgG1またはIgG4などのヒトIgGのFc領域である。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO：121もしくは127に示されるCHドメインまたはその一部、あるいはSEQ ID NO：121もしくは127と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示すアミノ酸配列またはその一部を含有する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO：124もしくは130に示されるCLドメインまたはその一部、あるいはSEQ ID NO：124もしくは130と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示すアミノ酸配列またはその一部を含有する。
いくつかの態様において、SJ25C1に特異的な抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO：122もしくは128に示される重鎖配列、またはSEQ ID NO：122もしくは128と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を含み、かつ/あるいはSEQ ID NO：125もしくは131に示される軽鎖配列、またはSEQ ID NO：125もしくは131と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を含む。いくつかの態様において、SJ25C1に特異的な抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO：122に示される重鎖配列および/またはSEQ ID NO：131に示される軽鎖配列を含む。いくつかの態様において、SJ25C1に特異的な抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO：128に示される重鎖配列および/またはSEQ ID NO：131に示される軽鎖配列を含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体の重鎖および/または軽鎖は、シグナルペプチドをさらに含む。一部の例において、シグナルペプチドは、SEQ ID NO：123、126、129または132に示される配列を有する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様において、抗原結合性フラグメントは、フラグメント抗原結合（Fab）フラグメント、F(ab'）2フラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント、単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。
したがって、典型的には、VHおよびVLドメインなどの2つの抗イディオタイプ抗体ドメインまたは領域をつなぐリンカーを含む、scFvおよびダイアボディなどの単鎖抗体フラグメント、特にヒト単鎖フラグメントが提供される。リンカーは、典型的には、ペプチドリンカー、例えば、グリシンおよびセリンに富むペプチドリンカーなどの可動性ペプチドリンカーおよび/または可溶性ペプチドリンカーである。
いくつかの局面において、グリシンおよびセリン（および/またはトレオニン）に富むリンカーは、このようなアミノ酸を少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％含む。いくつかの態様において、それらは、グリシン、セリン、および/またはトレオニンを少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも70％、もしくは少なくとも75％、または少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、もしくは少なくとも約75％含む。いくつかの態様において、リンカーは、実質的に完全にグリシン、セリン、および/またはトレオニンから構成される。リンカーは、一般的に、5と50アミノ酸長との間または約5と50アミノ酸長との間、典型的には10または約10と30または約30との間、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸長であり、いくつかの例において、10と25アミノ酸長との間である。例示的なリンカーは、このような配列の2、3、4、および5つの繰り返しの間などの、配列GGGS（3GS；SEQ ID NO：70）またはGGGGS（4GS；SEQ ID NO：27）の様々な数の繰り返しを有するリンカーを含む。例示的なリンカーは、
Figure 2020528753
に示される配列を有するかまたはそれからなるリンカーを含む。例示的なリンカーは、
Figure 2020528753
に示される配列を有するかまたはそれからなるリンカーをさらに含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、単離された抗体を含む。いくつかの態様において、抗IDは、ヒト化されている、組み換えられている、および/またはモノクローナルである。いくつかの態様において、抗IDは、ヒト由来である。
3. 追加的な成分
ある態様において、粒子、例えば、ビーズ粒子は、組換え受容体、例えば、CARの抗原結合ドメインと結合するかまたはそれにより認識される、表面コンジュゲート型結合分子、またはその他の方法で結びついた結合分子、および細胞上の追加的な分子と結合および/またはそれを認識することが可能な1種または複数種の追加的な作用物質を含む。いくつかの態様において、1種または複数種の追加的な作用物質は、追加的な結合分子である。いくつかの態様において、1種または複数種の追加的な結合分子は、組換え受容体を発現する細胞の表面に存在するポリペプチド（例えば、糖タンパク質）と結合する抗体（またはそのフラグメントもしくは異種）である。特定の態様において、1種または複数種の追加的な結合分子は、組換え受容体を発現する細胞などの細胞の表面に発現される、受容体、例えば活性化受容体、共刺激受容体または共受容体などの細胞表面分子と結合するポリペプチドまたはその一部である。特定の態様において、1種または複数種の追加的な結合分子は、組換え受容体を発現する細胞などの細胞の表面に存在するポリペプチドと結合するリガンドまたはその一部である。ある態様において、1つまたは複数の追加的な作用物質は、粒子表面に露出している。
特定の態様において、1種または複数種の追加的な作用物質は、細胞表面の追加的な分子と結合することにより、細胞の機能、例えば、増大をモジュレートすることができる。いくつかの態様において、作用物質は、細胞上の追加的な分子と結合し、細胞に対する補助シグナルを活性化する、すなわち、細胞表面の追加的な分子への追加的な作用物質の結合は、1つまたは複数の細胞機能、例えば、増大に対して細胞表面の追加的な分子へのアクセサリー分子の結合と同じまたは類似の効果を有する。いくつかの態様において、追加的な作用物質は、細胞表面の追加的な分子と結合するかまたはそれを認識する抗体またはそのフラグメントである。特定の態様において、作用物質は、細胞表面の追加的な分子と結合するかまたはそれを認識するリガンドまたはその一部である。
いくつかの態様において、1種または複数種の追加的な作用物質により認識または結合される分子は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54（ICAM-1）、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、ICOSL、PD-1（CD279）、PD-L1（CD274、B7-H1）、PDL2（CD273、B7-DC）、OX40（CD134、TNFRSF4）、OX-40L、DAP10、CD27L（CD70）、4-1BB（CD137）、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-ガンマR、TNF-アルファR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDlla（LFA-1）、CD62L（L-セレクチン）、CD29/CD49d（VLA-4）、Notchリガンド（例えば、デルタ様1/4、Jagged 1/2等）、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CXCR3、CTLA-4、LAG-3（CD223）、TIM-3、4-1BB（CD137）、GITR（TNFRSF18、AITR）、CD40、CXCR2、腫瘍関連抗原（TAA）、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4（CD2ファミリーの分子に属し、すべてのNK、γδ、およびメモリーCD8+（αβ）T細胞上に発現される）、CD160（BY55とも称される）、CGEN-15049、CEACAM（例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5）、TIGIT、CD155、CD155、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、HVEM（TNFRSF14またはCD270）、LIGHT、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン、または形質転換増殖因子受容体（TGFR；例えば、TGFRベータ）である。
いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、組換え受容体、例えば、CARの抗原結合ドメインと結合するかまたはそれにより認識される、表面コンジュゲート型結合分子、またはその他の方法で結びついた結合分子、および抑制性受容体もしくは活性化受容体またはそのリガンドなどのチェックポイント分子と結合する1種または複数種の追加的な結合分子を含む。いくつかの態様において、結合分子は、抑制性受容体もしくはそのリガンドまたは活性化受容体もしくはそのリガンドの細胞外ドメインまたはその結合部分を含有する。いくつかの態様において、結合分子は、Fc領域またはドメインなどの多量体化ドメインと融合している。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、組換え受容体、例えば、CARの抗原結合ドメインと結合するかまたはそれにより認識される表面コンジュゲート型結合分子、またはその他の方法で結びついた結合分子、およびOX-40、ICOS、DAP10、CD28または4-1BB、CTLA-4、PD-1、LAG-3、Tim-3、BTLAまたはTIGITと結合する1種または複数種の追加的な結合分子を含む。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、組換え受容体、例えば、CARの抗原結合ドメインと結合するかまたはそれにより認識される表面コンジュゲート型結合分子、またはその他の方法で結びついた結合分子、およびOX-40L、ICOSL、B7-1、B7-2または4-1BBL、PD-L1、PD-L2、CD155、CD112またはLIGHTと結合する1種または複数種の追加的な結合分子を含む。
特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、組換え受容体、例えば、CARの抗原結合ドメインと結合するかまたはそれにより認識される表面コンジュゲート型結合分子、またはその他の方法で結びついた結合分子、ならびにCD3および/またはCD28と結合する1種または複数種の追加的な結合分子、例えば、抗体またはそのフラグメントもしくは異種を含む。いくつかの態様において、1種または複数種の追加的な分子は、CD2またはCD28と結合する。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、組換え受容体、例えば、CARの抗原結合ドメインと結合するかまたはそれにより認識される表面コンジュゲート型結合分子、またはその他の方法で結びついた結合分子、およびCD28と結合する1種または複数種の追加的な結合分子を含む。
いくつかの態様において、粒子は、表面コンジュゲート型結合分子、およびCD2と結合する追加的な表面コンジュゲート型作用物質を含有する。ある態様において、粒子は、表面コンジュゲート型結合分子および表面コンジュゲート型抗CD2抗体を含有する。特定の態様において、粒子は、表面コンジュゲート型結合分子、およびCD28と結合する追加的な表面コンジュゲート型作用物質を含有する。様々な態様において、粒子は、表面コンジュゲート型結合分子および表面コンジュゲート型抗CD28抗体を含有する。いくつかの態様において、粒子は、表面コンジュゲート型結合分子、ならびにCD2およびCD28と結合する追加的な表面コンジュゲート型作用物質を含有する。様々な態様において、粒子は、表面コンジュゲート型結合分子ならびに表面コンジュゲート型抗CD2抗体および抗CD28抗体を含有する。ある態様において、結合分子は、BCMA、ROR1、またはCD22抗原またはエピトープを含有するフラグメントであるかまたはそれを含有する。ある態様において、結合分子は、組換え受容体、例えば、CARと結合するかまたはそれを認識する抗IDである。
特定の態様において、粒子は、表面コンジュゲート型抗ID、例えば、抗CD19 CARなどのCARと結合するかまたはそれを認識する抗ID、および表面コンジュゲート型抗CD2抗体を含有する。ある態様において、粒子は、表面コンジュゲート型抗ID、例えば、抗CD19 CARなどのCARと結合するかまたはそれを認識する抗ID、および表面コンジュゲート型抗CD28抗体を含有する。様々な態様において、粒子は、表面コンジュゲート型抗ID、例えば、抗CD19 CARなどのCARと結合するかまたはそれを認識する抗ID、ならびに表面コンジュゲート型抗CD2抗体および抗CD28抗体を含有する。
いくつかの態様において、結合分子と、追加的な作用物質または分子との比、例えばモル比または重量比は、1：10〜10：1または約1：10〜10：1、例えば、1：5〜5：1もしくは1：2もしくは2：1であるか、または約1：1である。ある態様において、結合分子と、2種の追加的な作用物質との比、例えばモル比または重量比は、1：1：1または約1：1：1である。
C. コンジュゲーションの方法
組換え受容体（例えば、CAR）と結合するかまたはそれを認識する結合分子（例えば、ポリペプチド抗原または抗体）とコンジュゲートしたおよび/または結びついた粒子（例えば、ビーズ粒子）が、本明細書において提供される。粒子（例えば、ビーズ粒子）に結合分子、例えば、ポリペプチド抗原および抗イディオタイプ抗体をコンジュゲートするために当技術分野において周知の多様な手段が使用される場合がある。これらの方法は、結合分子の生物活性または構造を破壊または著しく制限しない任意の標準的な化学反応であって、結合分子、例えば、抗原ペプチドまたはタンパク質と、組換え受容体との相互作用が可能になるように、十分な数の結合分子を粒子とコンジュゲート可能にする、任意の標準的な化学反応を含む。いくつかの態様において、結合分子、例えば、ポリペプチド結合分子のC末端領域を粒子とコンジュゲートするコンジュゲーション方法が、選択される。当業者は、コンジュゲーションのための正確な化学反応が、粒子の材料の性質、粒子の表面に露出した官能基、結合分子とのC末端融合物の存在または非存在、およびコンジュゲート部分構造の存在または非存在に依存する場合があることを理解しているであろう。どの化学反応が選択されようと、コンジュゲーション方法が、結合分子の機能および/または構造確認を変更しないことが重要である。例えば、結合分子が抗原の場合、粒子に抗原をコンジュゲートするために選択される方法は、抗原が、そのコンジュゲート受容体により認識されることを阻止してはならない。ある態様において、結合分子が抗体、例えば抗IDの場合、コンジュゲーション方法は、抗体がその標的抗原と結合することを阻止してはならない。
いくつかの態様において、結合分子（例えば、ポリペプチド抗原または抗ID）は、平らな（plain）粒子表面への受動吸収により粒子（例えば、ビーズ粒子）と結びついている。この方法による結びつきは、典型的には、ビーズに結合分子を結合させる疎水性相互作用に依存する。この方法は、比較的単純であるが、一方、いくつかの態様において、この方法は、本明細書の例えばセクションI-Cに記載された技法のいずれかのような、結合分子を結びつける他の技法に対して、結びついた分子の最終的な配向への制御をほとんど提供しない。
1. 粒子表面との結合
ある態様において、結合分子は、共有結合的化学結合を介して担体と結合している。特定の態様において、結合分子は、ポリペプチドであり、アミノ酸の反応基または部分構造は、粒子の表面の反応基または部分構造と直接化学反応により直接的にコンジュゲートされている。ある態様において、結合分子のアミノ酸カルボキシル基（例えば、C末端カルボキシル基）、ヒドロキシル、チオール、またはアミン基（アミノ酸側鎖基など）は、PLAまたはPGAポリマーのヒドロキシルもしくはカルボキシル基、デンドリマーの末端アミン基もしくはカルボキシル基、またはリン脂質のヒドロキシル基、カルボキシル基もしくはリン酸基と直接的にコンジュゲートされている。いくつかの態様において、コンジュゲート部分構造は、例えば、結合分子と粒子との両方とコンジュゲートし、例えば共有結合し、それにより、それらを一緒に連結する。
ある態様において、粒子の表面は、結合分子（例えば、ポリペプチド抗原または抗体）の結びつき（例えば、共有結合的、非共有結合的）を可能にする化学的部分構造および/または官能基を含む。いくつかの態様において、粒子上の化学的部分構造および/または官能基の数、配向、スペーシングなどは、粒子の化学的性質および結合分子の特性に応じて変動する。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、導入された修飾表面を有する。特定の態様において、粒子表面は、露出した官能基を含有する。表面に露出した適切な官能基には、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、硫酸基、トシル、エポキシ、およびクロロメチル基が含まれるが、それに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、結合分子は、ポリペプチドであり、表面に露出した官能基とコンジュゲートしている。いくつかの態様において、表面に露出した官能基は、活性化されなければならず、すなわち、ポリペプチドと直接結合することが可能な中間産物を得るために化学反応を受けなければならない。特定の態様は、結合分子のコンジュゲーションを可能にするための粒子の表面に露出した官能基の活性化が、当技術分野における日常的な技術の問題であり、技術者は、結合分子を粒子とコンジュゲートするために任意の必要な活性化段階を行うために適切な試薬およびプロトコールを容易に特定すると考えている。
いくつかの態様において、ポリペプチド結合分子をカルボキシル化粒子、例えば、ビーズ粒子と結合させるために、粒子の表面に露出したカルボキシル基は、官能基を、アミン基と直接結合することが可能な中間体エステルをもたらす作用物質と接触させることによる活性化を必要とする。粒子表面の反応性（すなわち活性化）カルボキシル基は、ポリペプチド上の遊離アミン（例えば、Lys残基からのもの）とコンジュゲートされる場合がある。適切な作用物質には、カルボジイミド（EDC）、エチレンカルボジイミド（ECDI）、ヘキサメチレンジイソシアネート、2つのエポキシ残基を含有するプロピレングリコールジ-グリシジルエーテル、エピクロロヒドリン、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）またはスルホ-NHSまたはエチル（ジメチルアミノプロピル）が含まれるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、ポリペプチド結合分子は、表面に露出したカルボキシル基で粒子と共有結合的に結びついている。特定の態様において、ポリペプチド結合分子は、最初にカルボキシル基を作用物質と接触させて中間体エステルを生成することにより、表面に露出したカルボキシル基と共有結合的に結びついている。
いくつかの態様において、ポリペプチド結合分子の官能基は、表面に露出した官能基とポリペプチドをコンジュゲートする前に活性化される。例えば、ポリペプチド分子のカルボキシル基は、上記の作用物質と活性化されて、粒子の表面に露出したアミノ基と直接結合することが可能な中間体エステルを生成する場合がある。いくつかの態様において、ポリペプチド結合分子は、表面に露出したアミン基で粒子とコンジュゲートしている。特定の態様において、ポリペプチド結合分子のカルボキシル基は、粒子の表面に露出したカルボキシル基と粒子を共有結合的に結びつける前に、作用物質と接触されて、中間体エステルを生成する。あるいは、担体表面の遊離アミン基は、スルホスクシンイミジル（4-ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ-SIAB）化学反応を使用して、抗原ペプチドおよびタンパク質、または抗原ペプチドもしくはタンパク質融合タンパク質と共有結合的に結合される場合がある。
特定の態様において、ポリペプチド結合分子は、共有結合的な結びつきを形成する前に作用物質による活性化を必要としない表面に露出した官能基で、粒子、例えば、ビーズ粒子と共有結合的に結びついている。このような官能基の例には、トシル、エポキシ、およびクロロメチル基が含まれるが、それに限定されるわけではない。特定の態様において、共有結合的な結びつきは、当業者により任意のこのような官能基について容易に同定および実行することができる、特定の緩衝液の存在下で、特定のpH範囲で、特定の温度範囲で、および特定の時間で行うことができる。例えば、いくつかの態様において、粒子表面のトシル基は、pHに応じて結合分子（例えば、ポリペプチド抗原または抗体）のアミノ基またはスルフヒドリル基と結合する。ポリペプチドのスルフヒドリル基をトシル基と結合させるために中性pHが使用されるのに対し、ポリペプチドのアミノ基をトシル基と結合させるためにより塩基性のpHが使用される。特定の態様において、ポリペプチド結合分子（例えば、抗原または抗体）は、粒子の表面に露出したトシル基、エポキシ基、またはクロロメチル基で粒子（例えば、ビーズ粒子）と共有結合的に結びついている。特定の態様において、ポリペプチド結合分子は、トシル化粒子（すなわち、表面に露出したトシル基を含む粒子）と結びついている。
いくつかの態様において、抗原ペプチドまたはタンパク質と結合したリガンドと、担体と結びついた抗リガンドとの間の非共有結合は、抗原を担体とコンジュゲートする場合がある。いくつかの態様において、ビオチンリガーゼ認識配列タグが、抗原ペプチドまたはタンパク質のC末端とつなげられる場合があり、このタグが、ビオチンリガーゼによりビオチン化される場合がある。次に、ビオチンが、抗原ペプチドまたはタンパク質を、抗リガンドとして担体の表面に吸着された、またはその他の方法で結合されたアビジンまたはストレプトアビジンと非共有結合的にコンジュゲートするためのリガンドとして役立つ場合がある。あるいは、抗原ペプチドおよびタンパク質が、上記のようにFc領域を担持する免疫グロブリンドメインと融合される場合、Fcドメインは、リガンドとして作用する場合があり、担体の表面に共有結合的または非共有結合的に結合したプロテインAは、抗原ペプチドまたはタンパク質を担体と非共有結合的にコンジュゲートするための抗リガンドとして役立つ場合がある。抗原ペプチドおよびタンパク質を担体と非共有結合的にコンジュゲートするために採用される場合がある、金属イオンキレート化技法（例えば、抗原ペプチドもしくはタンパク質、または抗原ペプチドもしくはタンパク質融合タンパク質のC末端のポリ-Hisタグ、およびNi被覆担体を使用する）を含む他の手段が、当技術分野において周知であり、これらの方法は、本明細書に記載された方法の代わりとなる場合がある。
いくつかの態様において、結合分子は、リンカーにより粒子とコンジュゲートしている。ある態様において、リンカーは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシレート、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルHCLなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス-アジド化合物（ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンなど）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン2,6-ジイソシアネートなど）、およびビス-活性フッ素化合物（l,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンなど）のような多様な二官能性タンパク質カップリング剤を含むことができるが、それに限定されるわけではない。特定のカップリング剤は、ジスルフィド結合を提供するためのN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）およびN-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノエート（SPP）を含む。
2. 可逆的結合
いくつかの態様において、結合分子は、粒子、例えば、ビーズ粒子と可逆的に結びついている、またはその他の方法で関連している。ある態様では、結合分子は、粒子と結びついている試薬と可逆的に結びついている、またはその他の方法で関連している。特定の態様において、試薬は、粒子表面に露出している。ある態様において、試薬は、結合分子と可逆的に結合することが可能な複数の結合部位を含有する。いくつかの態様において、試薬は、多量体化試薬である。いくつかの態様において、結合分子と試薬との結合相互作用は、非共有結合的相互作用である。いくつかの態様において、結合分子と試薬との結合相互作用、例えば、非共有結合的結合相互作用は、可逆的である。いくつかの態様において、結合分子は、タンパク質、例えば、ストレプトアビジンから構成されるオリゴマーまたはポリマーである粒子と可逆的に結びついている。
いくつかの態様において、結合分子と試薬との間の可逆的関連は、競合試薬（溶出試薬とも呼ばれる）などの物質の存在下で媒介されることができ、この物質は、また、試薬の、結合分子により結合されるのと同じ結合部位（または複数の部位）に結合することができる結合部位であるかまたはそれを含有する。一般的に、この物質（例えば、競合試薬）は、試薬中に存在する結合部位に対する結合親和性がより高く、および/または結合分子よりも高い濃度で存在し、それにより、試薬から結合分子を引き離すおよび/または解離させることから、競合物質として作用することができる。いくつかの態様において、試薬上の少なくとも1つの結合部位に対するこの物質（例えば、競合試薬）の親和性は、試薬上の少なくとも1つの結合部位に対する結合分子の親和性よりも大きい。したがって、いくつかの態様において、試薬の結合と結合分子との結合は、この物質（例えば、競合試薬）の添加により破壊され、それにより、薬剤（例えば、受容体結合作用物質または選択剤）と試薬との関連を可逆的にすることができる。
このような可逆システムに使用することができる試薬は、当技術分野において記載されており、公知である。例えば、米国特許第5,168,049号、同第5,506,121号、同第6,103,493号、同第7,776,562号、同第7,981,632号、同第8,298,782号、同第8,735,540号、同第9,023,604号、および国際公開公報PCT出願番号WO2013/124474およびWO2014/076277を参照されたい。可逆的相互作用を形成することが可能な試薬および結合パートナー、ならびにこのような結合を逆転させることが可能な物質（例えば、競合試薬）の非限定的な例を、下に記載する。
いくつかの態様において、試薬は、粒子、例えば、ビーズ粒子の表面と結びつき、露出しており、特異的に結合分子と結合することができる複数の結合部位を含有することにより、試薬は、複数の結合分子と可逆的に結合することが可能であり、例えば、多量体化試薬である。いくつかの態様において、試薬は、粒子の表面と結びついている、個別分子（例えば、単量体）または個別分子を作り上げる複合体（例えば、四量体）のオリゴマーまたはポリマーであり、それぞれ、結合分子と結合することが可能な少なくとも1つの結合部位を含有する。いくつかの態様において、粒子は、試薬から構成される。すなわち、粒子は、試薬のオリゴマーまたはポリマーである。
いくつかの態様において、試薬は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジン、アビジンムテインもしくは類似体（ニュートラアビジンなど）またはその混合物であり、その際、このような試薬は、結合分子と可逆的に関連可能な1つまたは複数の結合部位を含有する。いくつかの態様において、結合分子は、特異的に試薬と結合することができるビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体、またはストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の分子を含む。いくつかの態様において、結合分子は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジンまたはアビジンムテインもしくは類似体と特異的に結合することができる、ビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体、またはストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の分子を含む。ある態様において、結合分子は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジンまたはアビジンムテインもしくは類似体と特異的に結合することができる、ビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体、またはストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の分子である融合ドメインを含むポリペプチド、例えば、ポリペプチド抗原または抗体である。いくつかの態様において、結合分子は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジンまたはアビジンムテインもしくは類似体と特異的に結合することができるビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体、またはストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の分子である融合ドメインを含むポリペプチドであり、試薬は、ビオチン、ビオチン類似体またはその生物学的活性フラグメントと可逆的に結合するストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン、または類似体もしくはムテインもしくはアビジンであるかまたはそれを含む。ある態様において、融合ドメインは、結合分子のC末端に位置する。いくつかの態様において、試薬は、ストレプトアビジン結合ペプチドと可逆的に結合する、ストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン、またはアビジンの類似体もしくはムテインであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、物質（例えば、競合試薬）は、試薬の1つまたは複数の結合部位を結合分子と結合を競合することが可能な、ビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体、またはストレプトアビジン結合ペプチドであることができる。いくつかの態様において、結合分子および物質（例えば、競合試薬）の融合ドメインは異なり、物質（例えば、競合試薬）は、試薬への結合分子の親和性と比較して、試薬に対して高い結合親和性を示す。ある態様において、融合ドメインおよび物質、例えば競合試薬は、同じである。
いくつかの態様において、ストレプトアビジンは、野生型ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、または類似体、例えば、ストレプトアビジン様ポリペプチドであることができる。同様に、アビジンは、いくつかの局面において、野生型アビジンもしくはムテイン、またはアビジンの類似体、例えば、典型的には、より中性の等電点を示し、ネイティブなアビジンの代替として利用可能な、修飾アルギニンを有するニュートラアビジン、脱グリコシル化アビジンを含む。一般的に、脱グリコシル化された中性形態のアビジンには、例えば、Sigma Aldrichにより入手可能な「Extravidin」、またはThermo ScientificもしくはInvitrogenから入手可能な「NeutrAvidin」などの市販形態が含まれる。
いくつかの態様において、試薬は、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインもしくは類似体である。いくつかの態様において、野生型ストレプトアビジン（wt-ストレプトアビジン）は、Argarana et al, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882（SEQ ID NO：21）により開示されたアミノ酸配列を有する。一般に、ストレプトアビジンは、4つの同一のサブユニットの四量体として天然に存在し、すなわち、これは、各サブユニットがビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体またはビオチン模倣物に対する単一の結合部位を含有する、ホモ四量体である。ストレプトアビジンサブユニットの例示的な配列は、SEQ ID NO：21に示されるアミノ酸配列であるが、このような配列は、また、他のストレプトマイセス（Streptomyces）種からのそのホモログ中に存在する配列を含むことができる。特に、ストレプトアビジンの各サブユニットは、約10-14M程度の平衡解離定数（KD）でビオチンに対して強い結合親和性を示す場合がある。一部の例において、ストレプトアビジンは、4つの結合部位の1つだけが機能的な一価四量体（Howarth et al. (2006) Nat. Methods, 3:267-73; Zhang et al. (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun., 463:1059-63））、もしくは4つの結合部位の2つが機能的な二価四量体（Fairhead et al. (2013) J. Mol. Biol., 426:199-214）として存在することができる、または単量体もしくは二量体形態として存在することができる（Wu et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:23225-31; Lim et al. (2010) Biochemistry, 50:8682-91）。
いくつかの態様において、結合分子は、例えば、ビオチン模倣物として作用するペプチド配列であって、ストレプトアビジンに対して結合親和性を示す、米国特許第5,506,121号に開示されたようなStrep-tagである融合ドメインを含む。一部の例において、結合親和性は、ストレプトアビジン分子内に変異を起こすことによりさらに改善することができる。例えば、米国特許第6,103,493号または国際公開公報PCT出願番号WO2014/076277を参照されたい。いくつかの態様において、結合親和性は、当技術分野において公知の方法により決定することができる。
いくつかの態様において、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインなどの試薬は、結合分子の融合ドメインに対して結合親和性を示す。いくつかの態様において、融合ドメインは、SEQ ID NO：11に示される一般式を有する配列を含有する、例えば、SEQ ID NO：12に示される配列を含有する、ペプチド配列を含む。いくつかの態様において、ペプチド配列は、SEQ ID NO：43に示されるものなどの、SEQ ID NO：13に示される一般式を有する。一例において、ペプチド配列は、SEQ ID NO：9に示される。一例において、STREP-TAG（登録商標）IIストレプトアビジンポリペプチドとしても公知のペプチド配列は、SEQ ID NO：10に示される。いくつかの態様において、ペプチドリガンドは、少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含有し、その際、2つのモジュールの間の距離は、少なくとも0であり、50アミノ酸以下であり、その際、1つの結合モジュールは、3〜8アミノ酸を有し、少なくとも配列His-Pro-Xaa（SEQ ID NO：11）［配列中、Xaaは、グルタミン、アスパラギン、またはメチオニンである］を含有し、その際、他方の結合モジュールは、SEQ ID NO：13に示されるものなどの、同じまたは異なるストレプトアビジンペプチドリガンドを有する（例えば、国際公開公報PCT出願番号WO02/077018;米国特許第7,981,632号を参照されたい）。いくつかの態様において、ペプチドリガンドは、SEQ ID NO：15または16のいずれかに示される式を有する配列を含有する。いくつかの態様において、ペプチドリガンドは、SEQ ID NO：15〜22のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様において、試薬は、非限定的に、ビオチン、イミノビオチン、リポ酸、デスチオビオチン、ジアミノビオチン、HABA（ヒドロキシアゾベンゼン-安息香酸）および/またはジメチル-HABAなどの他のストレプトアビジンリガンドと結合するかまたはそれと認識するストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン（またはその一部）である。いくつかの態様において、ストレプトアビジンムテインは、ビオチンまたはデスチオビオチンなどの別のストレプトアビジンリガンドに対して結合親和性を示し、この結合親和性は、SEQ ID NO：7〜19のいずれかに示されるものなどの、ビオチン模倣ペプチドリガンドに対するストレプトアビジンムテインの結合親和性よりも大きい。したがって、いくつかの態様において、ビオチンまたはビオチン類似体もしくは誘導体（例えば、デスチオビオチン）を、提供される方法における競合試薬として採用することができる。例えば、例として、Strep-tactin（登録商標）と呼ばれるムテインストレプトアビジンの相互作用である（例えば、SEQ ID NO：23に示される配列を含有する。
いくつかの態様において、試薬は、遷移金属イオンと結合することが可能であり得る少なくとも2つのキレート基Kを含む。いくつかの態様において、試薬は、オリゴヒスチジン親和性タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、カルモジュリンもしくはその類似体、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、FLAG-ペプチド、HA-タグ、マルトース結合タンパク質（MBP）、HSVエピトープ、mycエピトープ、および/またはビオチン化担体タンパク質と結合することが可能であり得る。
3. 結合分子の配向
いくつかの態様において、結合分子は、結合分子と、結合分子により結合または認識される組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞との間の相互作用を可能にするように最適化された配向で、粒子、例えば、ビーズ粒子と結合しているか、または結びついている。いくつかの態様において、最適化された配向は、結合分子が結合している粒子による干渉が最小でまたは無干渉で、結合分子と組換え受容体との間の結合を可能にする。いくつかの態様において、CARと結合するかまたはそれを認識する結合分子、例えば、抗原または抗IDの領域に関する粒子の相対位置は、この領域が、組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞と接触するためのアクセスを阻止しない。いくつかの態様において、結合分子、例えば抗原または抗IDは、標的細胞の組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する領域と異なる領域、例えば、融合ドメインで、粒子と結びついている。ある態様において、結合分子は、組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する領域で粒子と結びついていない。ある態様において、結合分子は、結合分子の別の領域と比較して、組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する領域で粒子と結びついている可能性が低い。
特定の態様は、結合分子が、結合分子の一端、例えば、C末端で粒子、例えば、ビーズ粒子と結合している場合、これは、結合分子が組換え受容体と結合する最適な配向を提供すると考えている。いくつかの態様において、結合分子は、組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する領域と反対の末端で粒子と結合している。ある態様において、結合分子は、組換え受容体、例えば、抗原または抗IDと結合する領域が、粒子から離れて配置されるように、粒子と結びついている。特定の態様において、結合分子は、一端、例えば、そのC末端で粒子と結びついており、組換え受容体と結合する領域は、結合分子の反対の末端、例えば、N末端である。特定の態様において、結合分子は、結合分子の抗原または抗IDが、粒子に関して外向き配向で配置されるように、粒子と結びついている。いくつかの態様は、粒子からの組換え受容体と結合する領域についての外向き配向が、結合分子と、組換え受容体を発現する細胞との間の相互作用について最大の確率を提供すると考えている。
いくつかの態様において、結合分子、例えば、ポリペプチドは、標的細胞の組換え受容体、例えば、抗原または抗IDと結合するかまたはそれを認識する領域を含み、別の領域、例えば、融合ドメインで粒子と結びついているかまたは結合している。ある態様において、組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する領域と、別の領域、例えば、融合ドメインとは、結合分子の相対する末端にある。ある態様において、結合分子は、結合分子のN末端またはその近くにある、標的細胞の組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する領域と、C末端ドメインまたはその近くにある別の領域、例えば、融合ドメインとを含む。いくつかの態様において、結合分子は、結合分子のC末端またはその近くにある、標的細胞の組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する領域と、N末端ドメインまたはその近くにある別の領域、例えば、融合ドメインとを含む。いくつかの態様において、結合分子、例えば、ポリペプチド抗原または抗体の領域は、当該領域が、N末端またはC末端から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、または100アミノ酸以内に位置する場合、N末端またはC末端近くにある。
いくつかの態様において、結合分子は、粒子と結合する融合ドメインを含む、ポリペプチド、例えば、ポリペプチド抗原または抗体である。いくつかの態様において、結合分子は、融合ドメイン内の1つまたは複数の部位で粒子と結合する。ある態様において、結合分子は、融合ドメインの範囲外である結合分子の1つまたは複数の部位よりも、融合ドメイン内の1つまたは複数の部位で粒子と結合する可能性が高い。いくつかの態様において、結合分子は、融合ドメインの範囲外である結合分子の1つまたは複数の部位よりも、融合ドメイン内の1つまたは複数の部位で粒子と結合する可能性が、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも99.9％または少なくとも100％高い。ある態様において、結合分子は、融合ドメインの範囲外である結合分子の1つまたは複数の部位よりも、融合ドメイン内の1つまたは複数の部位で粒子と結合する可能性が、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍または少なくとも1,000倍高い。
ある態様において、結合分子は、融合ドメインまたはタグと連結されている。いくつかの態様において、結合分子は、抗原受容体またはCARなどの組換え受容体により認識および/または結合される抗原または抗IDが、融合ドメインまたはタグと直接的または間接的に連結されたものであるかまたはそれを含有する。いくつかの態様において、結合分子は、抗原またはその一部および融合ドメインまたはタグを含有する融合ポリペプチドである。いくつかの態様において、結合分子は、融合ドメインまたはタグまたはその内部の部位（例えば、アミノ酸の側鎖）で粒子とコンジュゲートしている。ある態様において、融合ドメインまたはタグでの粒子への結合分子の結びつきは、組換え受容体またはCARにより結合または認識されるべき粒子とコンジュゲートしている結合分子にとって最適な配向を生じる。いくつかの態様において、抗原受容体、例えばCARにより認識される抗原または抗IDを含む結合分子は、C末端で融合ドメインまたはタグと連結されており、その場合、融合ドメインまたはタグを介した粒子へのコンジュゲーションは、抗原受容体、例えばCARとの相互作用のための結合した結合分子のN末端領域を優先的に配向または露出する。
融合ドメインまたはタグは、当技術分野において周知であり、提供される結合分子中で抗原と連結されて、所望の性質、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離、または粒子表面の官能基への共有結合的結びつきを付与することができる。このような融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Glu-Glu、アビジン、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、免疫グロブリン重鎖定常領域（Fc）、マルトース結合タンパク質（MBP）、またはヒト血清アルブミンが含まれるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、融合ドメインは、ポリペプチドタグである。ポリペプチドタグの周知の例には、AviTag（SEQ ID NO：3）、カルモジュリンタグ（SEQ ID NO：4）、ポリグルタメートタグ（SEQ ID NO：5）、FLAGタグ（SEQ ID NO：6）、HAタグ（SEQ ID NO：7）、Hisタグ、（5〜10個のヒスチジン）、Mycタグ（SEQ ID NO：8）、および蛍光タンパク質タグ（例えば、EGFP）が含まれるが、それに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、融合ドメインまたはタグは、ストレプトアビジン結合ペプチド配列を含む。いくつかの態様において、配列は、SEQ ID NO：9および10に例示されるようなSTREP-TAG（登録商標）ストレプトアビジン結合ペプチド配列である。いくつかの態様において、融合ドメインは、SEQ ID NO：11〜19に示されるアミノ酸配列により例示されるストレプトアビジン結合ペプチド配列を含む。
いくつかの態様において、結合分子は、粒子の表面に露出したグルタチオンと結合するGST融合ドメインを含む。特定の態様において、GST融合ドメインは、結合分子のC末端またはその近くに位置する。いくつかの態様において、結合分子は、粒子の表面に露出したビオチンまたはストレプトアビジンリガンドと結合するstrep-tag融合ドメインを含む。いくつかの態様において、strep-tag融合ドメインは、結合分子のC末端またはその近くにある。特定の態様において、結合分子は、粒子の表面と結びついたFcポリペプチドと結合するプロテインA融合ドメインを含む。いくつかの態様において、プロテインA融合ドメインは、結合分子のC末端またはその近くにある。ある態様において、結合分子は、粒子の表面と結びついたアルブミンまたはFcポリペプチドと結合するプロテインG融合ドメインを含む。いくつかの態様において、プロテインA融合ドメインは、結合分子のC末端またはその近くにある。
特定の態様において、結合分子は、疎水性領域または結合分子の残りよりも疎水性が高い領域を含有する。いくつかの態様において、結合分子は、疎水性領域の範囲外にある結合分子の部位よりも疎水性が高い領域を含む。いくつかの態様において、疎水性領域は、融合ドメインである。特定の態様において、疎水性領域は、Fcドメインである。ある態様において、結合分子は、粒子の表面が疎水性である場合、結合分子の異なる領域よりも、疎水性領域中の1つまたは複数の部位で粒子と結合または結びつく可能性が高い。様々な態様において、結合分子の疎水性領域は、粒子の表面に露出した官能基と結合する。いくつかの態様において、官能基は、トシル基であるか、またはそれを含有する。
いくつかの態様において、結合分子は、Fcドメインを含み、その際、Fcドメインは、融合ポリペプチドのC末端に存在する。いくつかの態様において、結合分子は、Fcドメインを含む抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体である。特定の態様において、Fcドメインは、粒子の表面に露出したプロテインGまたはプロテインAと結合するか、または結びつく。いくつかの態様において、Fcドメイン上に存在する1つまたは複数のアミノ酸の1つまたは複数の官能基は、粒子の官能基と結合する。特定の態様において、融合ポリペプチドまたは抗体のFcドメインは、結合分子の抗原または抗体領域よりも疎水性が高い。そして、粒子表面が、Fcドメインの範囲外にある結合分子の部位よりも疎水性である場合、Fcドメイン内の部位は、例えば表面に露出した官能基で、粒子と結合する可能性が高い。
特定の態様において、Fcドメインを含む結合分子は、Fc領域内の1つまたは複数の部位で粒子と結合している。Fc領域に位置する部位における粒子、例えば、ビーズ粒子との結合分子の結合は、当技術分野において標準的な技法により容易に行われる場合がある。例えば、Fcドメインは、疎水性である傾向があり、Fcドメインが結合分子（例えば、ポリペプチド抗原）のその他のドメインよりも疎水性が高い場合、粒子表面が疎水性であるならば、Fcドメイン内に位置するアミノ酸側鎖と、粒子上に位置する表面に露出した官能基（例えば、トシル基）との間で結合が起こる場合がある。いくつかの態様において、粒子の表面は、疎水性である。いくつかの態様において、粒子の表面は、非親水性である。特定の態様において、粒子の表面は、疎水性であり、表面に露出したトシル基を含む。
いくつかの態様において、粒子は、非疎水性である。ある態様において、粒子は、親水性である。いくつかの態様において、粒子の表面は、非疎水性である。いくつかの態様において、粒子の表面は、親水性である。
4. コンジュゲート型粒子
いくつかの態様において、結合分子（例えば、ポリペプチド抗原または抗体）は、粒子、例えば、ビーズ粒子と結びついている。ある態様において、ポリペプチドは、粒子と共有結合的に結びついている。いくつかの態様において、ポリペプチドは、粒子と非共有結合的に結びついている。いくつかの態様において、少なくとも1つの結合分子、少なくとも10個の結合分子、少なくとも102個の結合分子、少なくとも103個の結合分子、少なくとも104個の結合分子、少なくとも105個の結合分子、少なくとも106個の結合分子、少なくとも107個の結合分子、少なくとも108個の結合分子、または少なくとも109個の結合分子が、各粒子と結びついている。特定の態様において、102個の結合分子と109個の結合分子との間もしくは約102個の結合分子と109個の結合分子との間、102個の結合分子と107個の結合分子との間もしくは約102個の結合分子と107個の結合分子との間、103個の結合分子と109個の結合分子との間もしくは約103個の結合分子と109個の結合分子との間、103個の結合分子と108個の結合分子との間もしくは約103個の結合分子と108個の結合分子との間、または103個の結合分子と106個の結合分子との間もしくは約103個の結合分子と106個の結合分子との間が、各粒子と共有結合的に結びついている（それぞれ両端の値を含む）。特定の態様において、103個の結合分子と106個の結合分子との間または約103個の結合分子と106個の結合分子との間（それぞれ両端の値を含む）が、各粒子と共有結合的に結びついている。特定の態様において、104個の結合分子と106個の結合分子との間または約104個の結合分子と106個の結合分子との間（それぞれ両端の値を含む）が、各粒子と共有結合的に結びついている。ある態様において、104個の結合分子と105個の結合分子との間または約104個の結合分子と105個の結合分子との間が、各粒子と共有結合的に結びついている。いくつかの態様において、約105個の結合分子と106個の結合分子との間（それぞれ両端の値を含む）が、各粒子と共有結合的に結びついている。
ある態様において、結合分子は、粒子、例えば、ビーズ粒子と共有結合的に結びついている。特定の態様において、107個の粒子毎に少なくとも0.001μg、少なくとも0.01μg、少なくとも0.1μg、少なくとも0.5μg、少なくとも1μg、少なくとも1.5μg、少なくとも2μg、少なくとも2.5μg、少なくとも3μg、少なくとも3.5μg、少なくとも4μg、少なくとも4.5μg、少なくとも5μg、少なくとも6μg、少なくとも7μg、少なくとも8μg、少なくとも9μg、少なくとも10μg、または少なくとも50μgの量のポリペプチド結合分子が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている。いくつかの態様において、107個の粒子毎にポリペプチド結合分子の0.001μgと100μgとの間もしくは約0.001μgと100μgとの間、0.01μgと50μgとの間もしくは約0.01μgと50μgとの間、0.1μgと10μgとの間もしくは約0.1μgと10μgとの間、0.5μgと10μgとの間もしくは約0.5μgと10μgとの間、0.1μgと1μgとの間もしくは約0.1μgと1μgとの間、1μgと10μgとの間もしくは約1μgと10μgとの間、0.5μgと5μgとの間もしくは約0.5μgと5μgとの間、または1μgと5μgとの間もしくは約1μgと5μgとの間（それぞれ両端の値を含む）が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている。特定の態様において、107個の粒子毎にポリペプチド結合分子の1μgと10μgとの間または約1μgと約10μgとの間（それぞれ両端の値を含む）が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている。
ある態様において、結合分子は、粒子、例えば、ビーズ粒子と結合しているか、または結びついている。特定の態様において、ポリペプチド結合分子の0.0001pg、0.001pg、0.005pg、0.01pg、0.02pg、0.03pg、0.04pg、0.05pg、0.06pg、0.07pg、0.08pg、0.09pg、0.1pg、0.2pg、0.3pg、0.4pg、0.5pg、0.6pg、0.7pg、0.8pg、0.9pg、1.0pg、もしくは5.0pg、約0.0001pg、約0.001pg、約0.005pg、約0.01pg、約0.02pg、約0.03pg、約0.04pg、約0.05pg、約0.06pg、約0.07pg、約0.08pg、約0.09pg、約0.1pg、約0.2pg、約0.3pg、約0.4pg、約0.5pg、約0.6pg、約0.7pg、約0.8pg、約0.9pg、約1.0pg、もしくは約5.0pg、または少なくとも0.0001pg、少なくとも0.001pg、少なくとも0.005pg、少なくとも0.01pg、少なくとも0.02pg、少なくとも0.03pg、少なくとも0.04pg、少なくとも0.05pg、少なくとも0.06pg、少なくとも0.07pg、少なくとも0.08pg、少なくとも0.09pg、少なくとも0.1pg、少なくとも0.2pg、少なくとも0.3pg、少なくとも0.4pg、少なくとも0.5pg、少なくとも0.6pg、少なくとも0.7pg、少なくとも0.8pg、少なくとも0.9pg、少なくとも1.0pg、もしくは少なくとも5.0pgの平均量が、各粒子と結合しているか、または結びついている。いくつかの態様において、結合分子の0.0001pgと10pgとの間、0.001pgと1pgとの間、0.001pgと1pgとの間、0.001μgと0.1pgとの間、0.01pgと0.1pgとの間、1pgと10pgとの間、0.5pgと5pgとの間、もしくは1pgと5pgとの間、または約0.0001pgと約10pgとの間、約0.001pgと1pgとの間、約0.001pgと1pgとの間、約0.001μgと0.1pgとの間、約0.01pgと0.1pgとの間、約1pgと10pgとの間、約0.5pgと5pgとの間、もしくは約1pgと5pgとの間（それぞれ両端の値を含む）が、粒子と結合しているか、または結びついている。特定の態様において、ポリペプチド結合分子の0.0001pg、0.001pg、0.005pg、0.01pg、0.02pg、0.03pg、0.04pg、0.05pg、0.06pg、0.07pg、0.08pg、0.09pg、0.1pg、0.2pg、0.3pg、0.4pg、0.5pg、0.6pg、0.7pg、0.8pg、0.9pg、1.0pg、もしくは5.0pgと等しいかまたはそれ未満の平均量が、各粒子と結合しているか、または結びついている。特定の態様において、粒子は、約2.8μmの直径を有し、結合分子の.001と0.1pgとの間または約.001と0.1pgとの間（両端の値を含む）が、粒子と結合しているか、または結びついている。特定の態様において、粒子は、約4.5μmの直径を有し、結合分子の.01と1pgとの間または約.01と約1pgとの間（両端の値を含む）が、粒子と結合しているか、または結びついている。
特定の態様において、結合分子は、107個の粒子毎に少なくとも10-16mol、少なくとも10-15mol、少なくとも10-14mol、少なくとも10-13mol、少なくとも10-12mol、少なくとも10-11mol、少なくとも10-10mol、少なくとも10-9mol、少なくとも10-8mol、少なくとも10-7mol、少なくとも10-6mol、少なくとも10-5mol、少なくとも10-4mol、少なくとも10-3mol、少なくとも10-2mol、少なくとも10-1mol、または少なくとも1molの量で粒子、例えば、ビーズ粒子と結合している結びついている。いくつかの態様において、107個の粒子毎に1×10-13molと1×10-9molとの間、1×10-12molと1×10-9molとの間、1×10-13molと1×10-10molとの間、もしくは1×10-12molと1×10-9molとの間、または約1×10-13molと1×10-9molとの間、約1×10-12molと1×10-9molとの間、約1×10-13molと1×10-10molとの間、もしくは約1×10-12molと1×10-9molとの間（それぞれ両端の値を含む）が、粒子と結合しているか、または結びついている。
いくつかの態様において、結合分子は、粒子、例えば、ビーズ粒子と、少なくとも10-20mol、少なくとも10-19mol、少なくとも10-18mol、少なくとも10-17mol、少なくとも10-16mol、少なくとも10-15mol、少なくとも10-14mol、少なくとも10-13mol、少なくとも10-12mol、少なくとも10-11mol、または少なくとも10-10molの量で各粒子と結合しているか、または結びついている。いくつかの態様において、各粒子について10-21molと10-10molとの間、10-20molと10-18molとの間、10-19molと10-17molとの間、もしくは10-21molと10-19molとの間、または約10-21molと10-10molとの間、約10-20molと10-18molとの間、約10-19molと10-17molとの間、もしくは約10-21molと10-19molとの間（それぞれ両端の値を含む）が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、約2.8μmの直径を有し、結合分子は、10-20molと10-18molとの間または約10-20molと約10-18molとの間（両端の値を含む）の量で粒子と結合しているか、または結びついている。ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、直径約4.5μmを有し、結合分子は、10-19molと10-17molとの間または約10-19molと10-17molとの間（両端の値を含む）の量で粒子と結合しているか、または結びついている。
ある態様において、結合分子を粒子、例えば、ビーズと結びつけるおよび/またはコンジュゲートするために、結合分子は、粒子、例えば、ビーズ、例えば、トシル活性化ビーズと共にインキュベートされる。特定の態様において、結合分子および粒子、例えば、ビーズは、1×108と1×1010個との間の粒子（両端の値を含む）あたり1μg、2μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、25μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、もしくは200μg、または約1μg、約2μg、約2.5μg、約5μg、約10μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg、約50μg、約60μg、約70μg、約75μg、約100μg、約125μg、約150μg、約175μg、もしくは約200μgの結合分子濃度でインキュベートされ、結合分子は、粒子、例えば、ビーズと、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、99.9％、または約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約97％、約98％、約99％、約99.9％、または50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、95％超、97％超、98％超、99％超、99.9％超、または100％もしくは約100％の効率で結びつけられる、および/またはコンジュゲートされる。いくつかの態様において、結合分子および粒子、例えば、ビーズは、4×108と5×108個との間の粒子（両端の値を含む）あたり、1μg、2μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、25μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、もしくは200μg、または約1μg、約2μg、約2.5μg、約5μg、約10μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg、約50μg、約60μg、約70μg、約75μg、約100μg、約125μg、約150μg、約175μg、もしくは約200μgの濃度でインキュベートされ、結合分子は、粒子、例えば、ビーズと、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、99.9％、または約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約97％、約98％、約99％、約99.9％、または50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、95％超、97％超、98％超、99％超、99.9％超または100％もしくは約100％の効率で結びつけられる、および/またはコンジュゲートされる。特定の態様において、結合分子および粒子、例えば、ビーズは、3.5×109と4.5×109個との間の粒子（両端の値を含む）あたり、1μg、2μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、25μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、もしくは200μgの結合分子、または約1μg、約2μg、約2.5μg、約5μg、約10μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg、約50μg、約60μg、約70μg、約75μg、約100μg、約125μg、約150μg、約175μg、もしくは約200μgの結合分子濃度でインキュベートされ、結合分子は、粒子と50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、99.9％、または約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約97％、約98％、約99％、約99.9％、または50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、95％超、97％超、98％超、99％超、99.9％超または100％もしくは約100％の効率で結びつけられ、および/またはコンジュゲートされる。特定の態様において、1μgと5μgとの間、5μgと25μgとの間、1μgと50μgとの間、10μgと50μgとの間、0.1μgと10μgとの間、または50μgと200μgとの間（それぞれ両端の値を含む）の結合分子が、4×108と5×108個との間もしくは約4×108と5×108個との間の粒子、または3.5×109と4.5×109個との間の粒子（それぞれ両端の値を含む）と共にインキュベートされ、結合分子は、粒子、例えば、ビーズと、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、99.9％、または約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約97％、約98％、約99％、約99.9％、または50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、95％超、97％超、98％超、99％超、99.9％超または100％もしくは約100％の効率で結びつけられ、および/またはコンジュゲートされる。
いくつかの態様において、粒子とコンジュゲートした、または結びついた結合分子の平均量は、2×10-16g/粒子、1×10-15g/粒子、2×10-15g/粒子、5×10-15g/粒子、1×10-14g/粒子、2×10-14g/粒子、5×10-14g/粒子、1×10-13g/粒子、2×10-13g/粒子、5×10-13g/粒子、1×10-13g/粒子、および2×10-13g/粒子、約2×10-16g/粒子、約1×10-15g/粒子、約2×10-15g/粒子、約5×10-15g/粒子、約1×10-14g/粒子、約2×10-14g/粒子、約5×10-14g/粒子、約1×10-13g/粒子、約2×10-13g/粒子、約5×10-13g/粒子、約1×10-13g/粒子、および約2×10-13g/粒子、または少なくとも2×10-16g/粒子、少なくとも1×10-15g/粒子、少なくとも2×10-15g/粒子、少なくとも5×10-15g/粒子、少なくとも1×10-14g/粒子、少なくとも2×10-14g/粒子、少なくとも5×10-14g/粒子、少なくとも1×10-13g/粒子、少なくとも2×10-13g/粒子、少なくとも5×10-13g/粒子、少なくとも1×10-13g/粒子、および少なくとも2×10-13g/粒子±50％、±40％、±30％、±25％、±20％、±10％、±5％、または±1％である。ある態様において、粒子とコンジュゲートした、または結びついた結合分子の平均量は、2×10-16g/粒子または約2×10-16g/粒子±50％、±40％、±30％、±25％、±20％、±10％、±5％、または±1％である。特定の態様において、粒子とコンジュゲートした、または結びついた結合分子の平均量は、1×10-15g/粒子または約1×10-15g/粒子±50％、±40％、±30％、±25％、±20％、±10％、±5％、または±1％である。ある態様において、粒子とコンジュゲートした、または結びついた結合分子の平均量は、2×10-15g/粒子または約2×10-15g/粒子±50％、±40％、±30％、±25％、±20％、±10％、±5％、または±1％である。特定の態様において、粒子とコンジュゲートした、または結びついた結合分子の平均量は、1×10-14g/粒子または約1×10-14g/粒子±50％、±40％、±30％、±25％、±20％、±10％、±5％、または±1％である。ある態様において、粒子とコンジュゲートした、または結びついた結合分子の平均量は、5×10-13g/粒子、2×10-13g/粒子、1×10-13g/粒子、5×10-14g/粒子、2×10-14g/粒子、1×10-14g/粒子、5×10-15g/粒子、2×10-15g/粒子、1×10-15g/粒子、もしくは2×10-16g/粒子と等しいかまたはそれ未満である。
いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、CARの抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体、またはその活性フラグメントである結合分子を含む。ある態様において、抗イディオタイプ抗CAR抗体、またはその活性フラグメントは、抗体のFcドメイン内に位置する部位（例えば、アミノ酸の側鎖アミノ基またはスルフヒドリル基）で、粒子の表面に露出したトシル基と結合している。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、単分散性および超常磁性である。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、約2.8μmの直径を有し、粒子1つあたり結合分子、すなわち、抗イディオタイプ抗CAR抗体の約104と約106コピーとの間（両端の値を含む）を含む。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、約4.5μmの直径を有し、粒子1つあたり抗イディオタイプ抗CAR抗体の約5×105と約5×106コピーとの間（両端の値を含む）を含む。
ある態様において、粒子、例えば、ビーズは、BCMAポリペプチド抗原であるかまたはそれを含有する結合分子を含む。特定の態様において、結合分子は、一部の例において、C末端FcドメインであるヒトBCMA細胞外ドメインおよびFcドメインを含む。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、約280μmの直径を有し、粒子1つあたり結合分子、例えば、BCMA融合ポリペプチドの約105コピーを含む。ある態様において、BCMA融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドのFcドメイン内に位置する部位（例えば、アミノ酸の側鎖アミノ基またはスルフヒドリル基）で粒子の表面に露出したトシル基と結合している。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、単分散性および超常磁性である。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、約2.8μmの直径を有し、粒子1つあたり結合分子、すなわち、BCMA融合ポリペプチドの約104と約106コピーとの間（両端の値を含む）を含む。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、約4.5μmの直径を有し、粒子1つあたりBCMA融合ポリペプチドの5×105と5×106コピーとの間または約5×105個と約5×106個のコピーとの間（両端の値を含む）を含む。
II. 細胞のエクスビボ刺激または増大
組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞を刺激または増大させる方法であって、CARを発現している細胞を含むインプット組成物を、特異的に組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する結合分子を含む粒子、例えば、ビーズ、例えば、抗IDコンジュゲート型ビーズまたはBCMAコンジュゲート型ビーズなどの提供されるビーズコンジュゲート型試薬と共にインキュベートすることを含む方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、結合分子と組換え受容体、例えば、CARとの間の結合は、CARを発現している細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する。特定の態様において、組換え受容体は、CARである。ある態様において、結合分子は、組換え受容体の抗原結合性フラグメントと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである。ある態様において、結合分子は、CARと結合するかまたはそれにより認識される抗原である。
いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズは、1つまたは複数の細胞を含むインプット組成物と接触またはインキュベートされて、アウトプット組成物を生成する。ある態様において、インプット組成物またはインプット細胞は、インプット組成物の細胞のうち少なくとも一部を刺激する、活性化する、それに1つもしくは複数の変化を引き起こす、生成する、および/または産生するであろう条件で処理、インキュベート、または接触させ、それにより、インプット組成物をアウトプット組成物に変換するために望ましい組成物および/または複数の細胞を指す。いくつかの態様において、インプット細胞は、組換え受容体、例えば、CARを発現している細胞を含有する免疫細胞の組成物、例えば、T細胞の組成物である。特定の態様において、インプット組成物中の細胞の少なくとも一部は、提供される方法の実施により、生成したアウトプット組成物中で活性化、増大、および/または富化される。
ある態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズは、インプット組成物からの細胞と接触またはインキュベートされて、インプット細胞の少なくとも一部、例えばサブグループまたは画分を増大、富化、および/または活性化することによりアウトプット組成物を生成する。特定の態様において、インプット組成物からの細胞は、組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞の少なくとも一部、および/または組換え受容体をコードする異種核酸分子を含有する細胞の少なくとも一部を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、結合分子を含む粒子で処理される、それと接触またはインキュベートされることになる細胞を含み、その際、作用物質による処理、それとの接触、またはそれとのインキュベーションは、インプット組成物の細胞の少なくとも一部を変更し、それにより、アウトプット組成物を生成するであろう。このような変更には、細胞の一部を増大および/もしくは富化すること、細胞の少なくとも一部の活性化、ならびに/または細胞の少なくとも一部の少なくとも1つの遺伝子の発現を増加もしくは減少させることを含む場合があるが、それに限定されるわけではない。ある態様において、アウトプット組成物は、作用物質による処理、それとの接触またはそれとのインキュベーションによる変更後の、変更を受けたインプット組成物からの細胞の少なくとも一部を含む。
いくつかの態様において、細胞を、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることにより達成される増大、富化、刺激、および/または活性化は、各粒子とコンジュゲートした、または他の方法で結びついた特定の数、レベル、または量の結合分子を用いて粒子、例えば、ビーズを選択することにより、判定（titrate）、調整、および/または制御される場合がある。特定の態様において、各粒子とコンジュゲートした、または他の方法で結びついた結合分子の数を増加させることは、細胞を粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることにより達成される増大、富化、刺激、および/または活性化を増加させる。ある態様において、各粒子とコンジュゲートした、または他の方法で結びついた結合分子の数を減少させることは、細胞を粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることにより達成される増大、富化、刺激、および/または活性化を減少させる。特定の態様において、増大、富化、刺激、および/または活性化は、任意の適切な公知の手段により測定される。特定の態様において、増大、富化、刺激、および/または活性化における増加は、統計的に有意な増加であり、ならびに/または例えば、対照および/もしくは異なる条件でのインキュベーションと比較して、粒子、例えば、ビーズとのインキュベーションの途中もしくは後の細胞から取得された増大、富化、刺激、および/もしくは活性化に関連する測定値の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍の増加もしくは少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約1倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約100倍の増加である。ある態様において、増大、富化、刺激、および/または活性化における減少は、統計的に有意な減少であり、および/または粒子、例えば、ビーズとのインキュベーションの途中もしくは後の細胞から取得された増大、富化、刺激、および/もしくは活性化に関連する測定値の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％もしくは少なくとも99.9％、または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％もしくは少なくとも約99.9％の減少である。
いくつかの態様において、インプット組成物は、哺乳動物細胞などの真核細胞を含む。ある態様において、インプット組成物は、ヒト細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、血液、骨髄、リンパ液、またはリンパ器官に由来する細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物は、免疫系の細胞、すなわち、自然免疫細胞または適応免疫細胞、例えば、リンパ球、典型的にはT細胞および/またはNK細胞を含む骨髄系細胞またはリンパ系細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、人工多能性幹細胞（iPSC）を含む複能性幹細胞および多能性幹細胞などの幹細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物は、CD3+細胞を含む。ある態様において、アウトプット組成物は、CD4+細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、CD8+細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、CD28も低レベル発現するまたは発現しない、CD3+細胞を含む。
いくつかの態様において、結合分子は、低レベルのCD28を発現している細胞またはCD28陰性の細胞の活性化および/または増大を刺激する。ある態様において、細胞は、細胞を結合分子と接触させる前に、抗CD3/抗CD28コンジュゲート型試薬とは接触させない。
いくつかの態様において、方法および結合分子を含む粒子、例えば、ビーズ（例えば、抗IDコンジュゲート型ビーズまたはBCMAコンジュゲート型ビーズなどの、提供されるビーズコンジュゲート型試薬）は、1種または複数種の共刺激受容体または抗原受容体またはサイトカイン受容体などの1種または複数種の天然シグナル伝達分子を欠損するかまたはダウンレギュレーションしているT細胞であって、提供されるビーズコンジュゲート型試薬の結合分子により認識されるキメラ受容体、例えばCARを発現するT細胞を刺激することが可能である。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、CD28または他の共刺激分子または他のシグナル伝達分子の表面発現が低いまたは陰性である。したがって、いくつかの態様において、所望のシグナルおよび/またはこのようなシグナルの最大限を提供するために、例えば、共刺激シグナルを提供するためにおよび完全活性化を達成するために、CD28または他の内因性シグナル伝達分子の表面発現を必要とし得るかまたはそれに依存し得るある他の活性化作用物質もしくは刺激作用物質または方法と比較して、提供される試薬および方法は、ある利点を有する。いくつかの態様において、提供される作用物質および方法は、抗CD3/抗CD28試薬（例えばビーズ）と比較してこの点で有利であり、いくつかの局面において、提供される粒子、例えば、結合分子を含むビーズ（例えば、抗IDコンジュゲート型ビーズまたはBCMAコンジュゲート型ビーズなどの、提供されるビーズコンジュゲート型試薬）は、CD28または他の天然シグナル伝達分子が低いまたは陰性である細胞の活性化または増殖などの所望の効果を刺激または達成することができる点で有利である。いくつかの局面において、抗ID抗体を用いた刺激によりCARを経由してシグナル伝達することは、単一の試薬のみを使用してCARを介した一次シグナルおよび二次（共刺激）シグナルの療法を生じる。いくつかの態様において、インプット組成物は、低レベルのCD28または他の内因性シグナル伝達分子を発現するCD3+細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、CD28陰性であるかまたは他の内因性シグナル伝達分子が陰性であるCD3+細胞を含む。いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズ（例えば、抗IDコンジュゲート型ビーズまたはBCMAコンジュゲート型ビーズなどの、提供されるビーズコンジュゲート型試薬）は、CD28を低レベル発現している細胞またはCD28陰性である細胞の活性化および/または増大を刺激する。
特定の態様において、インプット組成物は、ヒトT初代細胞であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、富化されたCD4+ T細胞であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、富化されたCD8+ T細胞であるかまたはそれを含む。ある態様において、インプット組成物は、CD4+細胞およびCD8+細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物中のCD4+細胞とCD8+細胞との比は、約50：1よりも大きい、または25：1と50：1との間、10：と25：1との間、5：1と10：1との間、3：1と5：1との間、2：1と3：1との間、1：1と2：1との間、1：1と1：2との間、2：1と1：2との間、1：2と1：3との間、1：3と1：5との間、1：5と1：10との間、1：10と1：25との間、もしくは1：25と1：50との間、または約25：1と50：1との間、約10：と25：1との間、約5：1と10：1との間、約3：1と5：1との間、約2：1と3：1との間、約1：1と2：1との間、約1：1と1：2との間、約2：1と1：2との間、約1：2と1：3との間、約1：3と1：5との間、約1：5と1：10との間、約1：10と1：25との間、もしくは約1：25と1：50との間（それぞれ両端の値を含む）である。
いくつかの態様において、インプット組成物は、粒子、例えば、ビーズの結合分子により結合または認識される組換え受容体、例えば、CARをコードする1つまたは複数の核酸を形質導入もしくは形質移入された細胞集団、または形質導入もしくは形質移入された細胞に由来する細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、結合分子により結合または認識される組換え受容体をコードする1つまたは複数の核酸を形質導入もしくは形質移入された細胞集団、または形質導入もしくは形質移入された細胞に由来する細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物からの細胞は、本明細書に、例えば、セクションIIIに記載された任意の方法により形質移入または形質導入されている。ある態様において、1つまたは複数の核酸は、本明細書に、例えば、セクションIIIに記載されたウイルスにより細胞中に形質移入されている。いくつかの態様において、1つまたは複数の核酸は、本明細書に、例えば、セクションIIIに記載された非ウイルス性プラスミド、例えば、エピソームまたはトランスポゾンにより細胞中に形質移入されている。特定の態様において、インプット組成物は、粒子、例えば、ビーズの結合分子により結合または認識される組換え受容体、例えば、CARを細胞表面に発現する細胞を含む。
特定の態様において、インプット組成物は、本明細書に、例えば、セクションIIIに記載された方法のいずれかに由来するものなどの、組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞を含む。
特定の態様において、インプット組成物は、組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞を初めは含まない。いくつかの態様において、組換え受容体を発現する細胞を初めに含まないインプット組成物の細胞は、結合分子により結合または認識される組換え受容体を発現している遺伝子を含む1つまたは複数の核酸による細胞の形質移入または形質導入の少なくとも一部の間に、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。いくつかの態様において、形質移入または形質導入は、本明細書に、例えば、セクションIIIに記載されたように行われる。いくつかの態様において、細胞内への核酸の導入の際、結合分子と共にインキュベートする少なくとも一部の間に、組換え受容体は、それが結合分子と相互作用することができる細胞表面に発現するようになる。特定の態様において、形質移入または形質導入は、任意の事前の増大段階、活性化段階、および/または単離段階なしに行われる。ある態様において、細胞は、形質移入または形質導入の前に、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な1つまたは複数のポリクローナル刺激分子と共にインキュベートされない、それで処理されない、またはそれと接触されない。特定の態様において、細胞は、形質導入または形質移入の前に、抗CD3抗体および抗CD28抗体である1種または複数種のポリクローナル刺激分子と接触されない。
ある態様において、インプット組成物は、結合分子により結合または認識される組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞と、発現しない細胞との両方を含む。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞を、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理すること、それと接触させること、またはそれと共にインキュベートすることは、組換え受容体、例えば、CARを発現している細胞の活性化および/または増大を刺激するであろうが、組換え受容体を発現しない細胞の活性化および/または増大を刺激しないであろう。ある態様において、インプット組成物の細胞を、組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理すること、それと接触させること、またはそれと共にインキュベートすることは、組換え受容体を発現しない細胞の活性化および/または増大を、組換え受容体を発現する細胞よりも低い程度で刺激するであろう。
特定の態様において、インプット組成物の細胞の一部は、組換え受容体、例えば、CARをコードする異種DNAを発現または含有する。ある態様において、細胞の0.01％未満、0.1％未満、1％未満、5％未満、10％未満、20％未満、25％未満、30％未満、35％未満、40％未満、45％未満、50％未満、55％未満、60％未満、65％未満、70％未満、80％未満、または90％未満が、組換え受容体をコードする遺伝子を含有する1つまたは複数の核酸を発現または含有する。組換え受容体を発現する、または組換え受容体をコードする異種DNAを含む細胞は、当技術分野において公知の任意の手段、例えば非限定的に、細胞中の組換え受容体をコードするmRNAの検出により、異種受容体を直接検出することにより、例えば、組換え受容体と結合する標識プローブもしくは標識抗体の結合を検出することにより、または異種DNAによりコードされる代替マーカーの検出により同定される場合がある。いくつかの態様において、細胞は、代替マーカーを検出することにより同定される組換え受容体を発現する。ある態様において、代替マーカーは、切断型EGFRポリペプチドである。
特定の態様において、インプット細胞は、粒子、例えば、ビーズと接触する前に、ウイルスベクター粒子、例えば、ビーズのコピーと、細胞との比および/または感染単位（IU）が少ない量のウイルス粒子、例えば、ビーズにより形質移入および/または形質導入された細胞であるかまたはそれを含む。特定の態様において、インプット細胞、例えば、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズと接触された、それと共にインキュベートされた、および/またはそれで処理された細胞は、ポリクローナル刺激、例えば、抗CD抗体3および/または抗CD28抗体で被覆された粒子により増大および/または富化されたインプット細胞よりも、ウイルスベクター粒子、例えば、ビーズのコピーと細胞との比および/またはIUが少ない量のウイルス粒子により形質導入された細胞である。例えば、いくつかの態様において、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートされたインプット組成物は、ポリクローナル刺激により増大および/または富化されたインプット組成物よりも、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、もしくは60IU/細胞より少なく、または少なくとも0.5、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、もしくは少なくとも60IU/細胞より少なく形質導入された細胞から生成される。いくつかの態様において、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートされたインプット組成物は、ポリクローナル刺激により増大および/または富化されたインプット組成物よりも、1×105IU/mL、5×105IU/mL、1×106IU/mL、5×106IU/mL、6×106IU/mL、7×106IU/mL、8×106IU/mL、9×106IU/mL、もしくは1×107IU/mL少ない、または少なくとも1×105IU/mL、少なくとも5×105IU/mL、少なくとも1×106IU/mL、少なくとも5×106IU/mL、少なくとも6×106IU/mL、少なくとも7×106IU/mL、少なくとも8×106IU/mL、少なくとも9×106IU/mL、もしくは少なくとも1×107IU/mLより少ないウイルスベクター粒子、例えば、ビーズの力価で形質導入された細胞から生成される。
特定の態様において、高いIU/細胞で細胞を形質導入することは、高い形質導入効率をもたらすであろうが、いくつかの態様において、また、安全上のリスクを提示する可能性があり、規制基準に適合しない場合がある、高いベクターコピー数（VCN）を有する形質移入細胞をもたらす場合がある。特定の態様において、細胞が形質導入されるIU/細胞を低減することは、形質導入効率を低減するが、VCNを低下させる。特定の態様において、細胞が形質導入されるIU/細胞を増加させることは、形質導入効率を増加させるが、VCNも増加させる。
特定の態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインプット組成物からの細胞のインキュベーション、粒子との接触、または粒子による処理は、細胞の刺激、増大、および/または活性化のための条件で行われ、その条件は、1つまたは複数の特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、ならびに/またはサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質などの刺激因子を含むことができる。
いくつかの態様において、組換え受容体、例えば、CARを発現しないインプット組成物の細胞は、組換え受容体をコードする遺伝子を含む1つまたは複数の核酸と接触される間に、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートされる、それと接触させる、またはそれで処理される。ある態様において、粒子、例えば、ビーズの結合分子は、遺伝子によりコードされる組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する。いくつかの態様において、1つまたは複数の核酸は、ウイルス粒子中に送達される。特定の態様において、1つまたは複数の核酸は、エピソームベクターである。いくつかの態様において、1つまたは複数の核酸は、トランスポゾンである。ある態様において、インプット組成物の細胞は、1つまたは複数の核酸がインプット組成物の細胞と接触する時間の少なくとも一部で、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理される、それと共にインキュベートされる、またはそれと接触される。特定の態様において、細胞は、本明細書に、例えば、セクションIIIに記載されたように1つまたは複数の核酸と接触される。
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、組換え受容体、例えば、CARをコードする遺伝子を含む1つの核酸により形質移入または形質導入されており、インプット組成物は、組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞を含み、細胞は、組換え受容体と結合するかまたはそれを認識する結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、細胞が形質導入または形質移入された後で、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理される、それと共にインキュベートされる、またはそれと接触される。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、本明細書に、例えば、セクションIIIに記載されたように、細胞が1つまたは複数の核酸により形質導入または形質移入された後で、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理される、それと共にインキュベートされる、またはそれと接触される。特定の態様において、インプット組成物の細胞は、細胞が1つまたは複数の核酸と接触された後すぐに、約1分以内、約5分以内、約30分以内、約1時間以内、約2時間以内、約4時間以内、約6時間以内、約8時間以内、約12時間以内、約24時間以内、約2日以内、約3日以内、約4日以内、約5日以内、約6日以内、約1週間以内、約2週間以内、約3週間以内、約4週間以内、約5週間以内、または約6週間以内に、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理される、それと共にインキュベートされる、またはそれと接触される。
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、例えば、セクションIIIに記載された、組換え受容体をコードする遺伝子を含む1つまたは複数の核酸により形質導入または形質移入され、細胞は、続いて凍結され、細胞を解凍および増大させる前の間、保存される。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、凍結されており、細胞が解凍された後1分以内、5分以内、30分以内、1時間以内、2時間以内、4時間以内、6時間以内、8時間以内、12時間以内、24時間以内、2日以内、3日以内、4日以内、5日以内、6日以内、1週間以内、2週間以内、3週間以内、4週間以内、5週間以内、もしくは6週間以内、または約1分以内、約5分以内、約30分以内、約1時間以内、約2時間以内、約4時間以内、約6時間以内、約8時間以内、約12時間以内、約24時間以内、約2日以内、約3日以内、約4日以内、約5日以内、約6日以内、約1週間以内、約2週間以内、約3週間以内、約4週間以内、約5週間以内、もしくは約6週間以内に、細胞は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞を、結合分子を含む粒子（例えば、ビーズ）と接触させること、それと共にインキュベートすること、またはそれで処理することは、容器中、例えば、細胞培養皿、細胞培養ウェル、またはバッグ中で実施される。
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、インプット組成物の総細胞と、粒子、例えば、ビーズとの比が、100：1〜1：100の間、50：1〜1：50の間、25：1〜1：25の間、10：1〜1：10の間、5：1〜1：5の間、3：1〜1：3の間、もしくは2：1〜1：2の間、または約100：1〜1：100の間、約50：1〜1：50の間、約25：1〜1：25の間、約10：1〜1：10の間、約5：1〜1：5の間、約3：1〜1：3の間、もしくは約2：1〜1：2の間で、粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。特定の態様において、比は、1：0.1〜1：5または約1：0.1〜約1：5である。いくつかの態様において、インプット組成物の総細胞と粒子、例えば、ビーズとの比は、約1：1である。
いくつかの態様において、インプット組成物からの102と1012個との間、103と1010個との間、104と109個との間、103と106個との間、104と108個との間、102と104個との間、103と105個との間、104と106個との間、105と107個との間、もしくは106と108個との間、または約102と1012個との間、約103と1010個との間、約104と109個との間、約103と106個との間、約104と108個との間、約102と104個との間、約103と105個との間、約104と106個との間、約105と107個との間、もしくは約106と108個との間の細胞（それぞれ両端の値を含む）は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。ある態様において、インプット組成物からの約102個未満、または102と103との間、103と104との間、104と105との間、105と106との間、106と107との間、107と108との間、108と109との間、109と1010との間、1010と1011との間、もしくは1011と1012との間の細胞、または約102と103との間、約103と104との間、約104と105との間、約105と106との間、約106と107との間、約107と108との間、約108と109との間、約109と1010との間、約1010と1011との間、もしくは約1011と1012との間の細胞（それぞれ両端の値を含む）は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞とのインキュベーションまたは接触は、インプット組成物中の1つもしくは複数の細胞への結合分子の結合を可能にする、ならびに/またはインプット組成物中の1つもしくは複数の細胞の刺激、活性化および/もしくは増殖を誘導するのに十分な量の、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで実施される。粒子、例えば、ビーズの特定の数、または粒子、例えば、ビーズとインプット組成物との特定の比は、ビーズ1つあたりの結合分子の特定の量、特定の抗原、インプット組成物の細胞の起源、および技術者の水準の範囲内の他の要因に応じて経験的に決定することができる。
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞に添加される粒子、例えば、ビーズの量は、インキュベーションまたは接触の間に、インプット組成物の細胞1つあたり1つの結合分子と1012個の結合分子との間、または約1つの結合分子と1012個の結合分子との間、例えば、インキュベーションまたは接触の間に、インプット組成物の細胞1つあたり102個の結合分子と1010個の結合分子との間、103個の結合分子と108個の結合分子との間、104個の結合分子と106個の結合分子との間、1つの結合分子と102個の結合分子との間、102個の結合分子と103個の結合分子との間、103個の結合分子と104個の結合分子との間、104個の結合分子と105個の結合分子との間、105個の結合分子と106個の結合分子との間、105個の結合分子と106個の結合分子との間、106個の結合分子と107個の結合分子との間、107個の結合分子と108個の結合分子との間、109個の結合分子と1010個の結合分子との間、1010個の結合分子と1011個の結合分子との間、もしくは1011個の結合分子と1012個の結合分子との間、または約102個の結合分子と1010個の結合分子との間、約103個の結合分子と108個の結合分子との間、約104個の結合分子と106個の結合分子との間、約1つの結合分子と102個の結合分子との間、約102個の結合分子と103個の結合分子との間、約103個の結合分子と104個の結合分子との間、約104個の結合分子と105個の結合分子との間、約105個の結合分子と106個の結合分子との間、約105個の結合分子と106個の結合分子との間、約106個の結合分子と107個の結合分子との間、約107個の結合分子と108個の結合分子との間、約109個の結合分子と1010個の結合分子との間、約1010個の結合分子と1011個の結合分子との間、もしくは約1011個の結合分子と1012個の結合分子との間（それぞれ両端の値を含む）を提供するための量である。いくつかの態様において、インプット組成物に添加される粒子、例えば、ビーズの量は、インキュベーションまたは接触の間に、インプット組成物中の各細胞について約104個の結合分子と約106個の結合分子との間を提供するための量である。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズの量は、インキュベーションまたは接触の間に、インプット組成物中の各細胞について約105個の結合分子を含有する。
いくつかの態様において、インキュベーションまたは接触の間にインプット組成物に添加される、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズの量は、インキュベーションまたは接触の間のインプット組成物中の各細胞について、0.0001pgと10pgとの間、0.001pgと1pgとの間、0.001pgと1pgとの間、0.001pgと0.1pgとの間、0.005pgと0.05pgとの間、0.005pgと0.02pgとの間、もしくは0.01pgと0.05pgとの間、または約0.0001pgと約10pgとの間、約0.001pgと約1pgとの間、約0.001pgと約1pgとの間、約0.001pgと約0.1pgとの間、約0.005pgと約0.05pgとの間、約0.005pgと約0.02pgとの間、もしくは約0.01pgと約0.05pgとの間の結合分子（それぞれ両端の値を含む）を含有する粒子、例えば、ビーズの量である。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞に添加される粒子、例えば、ビーズの合計量は、0.0001μgと10μgとの間、0.001μgと1μgとの間、0.001μgと1μgとの間、0.001μgと0.1μgとの間、0.005μgと0.05μgとの間、0.005μgと0.02μgとの間、もしくは0.01μgと0.05μgとの間、または約0.0001μgと10μgとの間、約0.001μgと1μgとの間、約0.001μgと1μgとの間、約0.001μgと0.1μgとの間、約0.005μgと0.05μgとの間、約0.005μgと0.02μgとの間、もしくは約0.01μgと0.05μgとの間の結合分子（それぞれ両端の値を含む）を提供する量である。
いくつかの態様において、インキュベーションまたは接触の間にインプット組成物に添加される、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズの量は、インキュベーションまたは接触の間のインプット組成物中の各細胞について、少なくとも10-20mol、少なくとも10-19mol、少なくとも10-18mol、少なくとも10-17mol、少なくとも10-16mol、少なくとも10-15mol、少なくとも10-14mol、少なくとも10-13mol、少なくとも10-12mol、少なくとも10-11mol、または少なくとも10-10molの結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズの量である。いくつかの態様において、この量は、インキュベーションまたは接触の間のインプット組成物中の各細胞について10-21molと10-10molとの間、10-20molと10-18molとの間、10-19molと10-17molとの間、もしくは10-21molと10-19molとの間、または約10-21molと10-10molとの間、約10-20molと10-18molとの間、約10-19molと10-17molとの間、もしくは約10-21molと10-19molとの間（それぞれ両端の値を含む）の結合分子を含有する。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞に添加される粒子、例えば、ビーズの合計量は、少なくとも10-16mol、少なくとも10-15mol、少なくとも10-14mol、少なくとも10-13mol、少なくとも10-12mol、少なくとも10-11mol、少なくとも10-10mol、少なくとも10-9mol、少なくとも10-8mol、少なくとも10-7mol、少なくとも10-6mol、少なくとも10-5mol、少なくとも10-4mol、少なくとも10-3mol、少なくとも10-2mol、少なくとも10-1mol、または少なくとも1molの結合分子を提供する量である。
いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズをインプット組成物と接触またはインキュベートすることは、0.01mLと50mLとの間、0.01mLと25mLとの間、0.01mLと10mLとの間、0.01mLと5mLとの間、0.01mLと1mLとの間、0.01mLと0.5mLとの間、0.01mLと0.1mLとの間、0.01mLと0.05mLとの間、0.05mLと100mLとの間、0.05mLと50mLとの間、0.05mLと25mLとの間、0.05mLと10mLとの間、0.05mLと5mLとの間、0.05mLと1mLとの間、0.05mLと0.5mLとの間、0.05mLと0.1mLとの間、0.1mLと100mLとの間、0.1mLと50mLとの間、0.1mLと25mLとの間、0.1mLと10mLとの間、0.1mLと5mLとの間、0.1mLと1mLとの間、0.1mLと0.5mLとの間、0.5mLと100mLとの間、0.5mLと50mLとの間、0.5mLと25mLとの間、0.5mLと10mLとの間、0.5mLと5mLとの間、0.5mLと1mLとの間、1mLと100mLとの間、1mLと50mLとの間、1mLと25mLとの間、1mLと10mLとの間、1mLと5mLとの間、5mLと100mLとの間、5mLと50mLとの間、5mLと25mLとの間、5mLと10mLとの間、10mLと100mLとの間、10mLと50mLとの間、10mLと25mLとの間、25mLと100mLとの間、25mLと50mLとの間または50mLと100mLとの間などの、0.01mLと100mLとの間または約0.01mLと100mLとの間（それぞれ両端の値を含む）の体積で実施される。いくつかの態様において、この体積は、培地または薬学的に許容される緩衝液などの溶液により提供される。
いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズは、少なくとも0.001μg/ml、少なくとも0.01μg/ml、少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも1.5μg/ml、少なくとも2μg/ml、少なくとも3μg/ml、少なくとも4μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも7μg/ml、少なくとも8μg/ml、少なくとも9μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも500μg/ml、少なくとも1mg/ml、または少なくとも10mg/mlの結合分子濃度を有する粒子、例えば、ビーズの組成物からのものである。いくつかの態様において、粒子の組成物は、粒子もしくはビーズ5×107と1×1010個/mlとの間または約5×107と1×1010個/mlとの間（両端の値を含む）を含有する。特定の態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズは、0.001μg/ml〜10mg/mlの間、0.001μg/mlと1μg/mlとの間、0.001μg/mlと1μg/mlとの間、0.001μg/mlと0.1μg/mlとの間、0.01μg/mlと1μg/mlとの間、1μg/mlと10μg/mlとの間、0.5μg/mlと5μg/mlとの間、もしくは1μg/mlと5μg/mlとの間、または約0.001μg/ml〜10mg/mlの間、約0.001μg/mlと1μg/mlとの間、約0.001μg/mlと1μg/mlとの間、約0.001μg/mlと0.1μg/mlとの間、約0.01μg/mlと1μg/mlとの間、約1μg/mlと10μg/mlとの間、約0.5μg/mlと5μg/mlとの間、もしくは約1μg/mlと5μg/mlとの間の結合分子濃度を有する粒子、例えば、ビーズの組成物からのものである。いくつかの態様において、粒子の組成物は、個粒子もしくはビーズ5×107と1×1010個/mlとの間、1×108と5×109個/mlとの間、もしくは4×108と4×109個/mlとの間、または約5×107と1×1010個/mlとの間、約1×108と5×109個/mlとの間、もしくは約4×108と4×109個/mlとの間（それぞれ両端の値を含む）を含有する。
ある態様において、インキュベーションまたは接触の間にインプット組成物に添加される、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズの量は、10-13M、少なくとも10-12M、少なくとも10-11M、少なくとも10-10M、少なくとも10-9M、少なくとも10-8M、少なくとも10-7M、少なくとも10-6M、少なくとも10-5M、少なくとも10-4M、少なくとも10-3M、少なくとも10-2M、少なくとも0.1M、少なくとも1M、または少なくとも10Mの結合分子濃度を提供する粒子、例えば、ビーズの量である。いくつかの態様において、インキュベーションまたは接触の間にインプット組成物に添加される、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズの量は、10-10Mと10-3Mとの間、10-9Mと10-6Mとの間、10-10Mと10-7Mとの間、もしくは10-9Mと約10-6Mとの間、または約10-10Mと10-3Mとの間、約10-9Mと10-6Mとの間、約10-10Mと10-7Mとの間、もしくは約10-9Mと約10-6Mとの間（両端の値を含む）の濃度を提供する粒子、例えば、ビーズの量である。
特定の態様において、インプット組成物からの細胞は、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日、少なくとも9日、少なくとも10日、少なくとも11日、少なくとも12日、少なくとも13日、少なくとも14日、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、または少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、少なくとも約3週間、もしくは少なくとも約4週間、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。特定の態様において、インプット組成物からの細胞は、30分未満、1時間未満、2時間未満、6時間未満、12時間未満、1日未満、2日未満、3日未満、4日未満、5日未満、6日未満、もしくは12日未満、または約30分未満、約1時間未満、約2時間未満、約6時間未満、約12時間未満、約1日未満、約2日未満、約3日未満、約4日未満、約5日未満、約6日未満、もしくは約12日未満、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。いくつかの態様において、インプット組成物からの細胞は、1日と14日との間、3日と7日との間、もしくは4日と6日との間、または約1日と約14日との間、約3日と約7日との間、もしくは約4日と約6日との間（両端の値を含む）、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。いくつかの態様において、インプット組成物からの細胞は、約5日間、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。ある態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズは、例えば組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞を含む、インプット組成物からの細胞と、インプット組成物の1つまたは複数の細胞を増大させるための時間、例えば、組換え受容体を発現するインプット組成物の細胞を増大させるための時間、接触またはインキュベートされる。特定の態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズは、例えば、組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞を含む、インプット組成物からの細胞と、組成物を慢性的にインプットするための時間、接触またはインキュベートされる。
特定の態様において、例えば、組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞を含む、インプット組成物からの細胞は、組換え受容体を発現するインプット組成物の細胞を増大させるために室温よりも高い温度で、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートされる、それと接触される、またはそれで処理される。いくつかの態様において、処理、インキュベーション、または接触は、約25℃よりも高い、例えば一般的に、32℃、35℃もしくは37℃よりも高い、または約32℃、約35℃もしくは約37℃よりも高い温度で行われる。いくつかの態様において、処理、接触、またはインキュベーションは、37℃±2℃または約37℃±2℃の温度で、例えば、37℃または約37℃の温度で行われる。
いくつかの態様において、例えば、組換え受容体、例えば、CARを発現している細胞を含む、インプット組成物の細胞は、結合分子および1種または複数種の追加的な作用物質（例えば、刺激作用物質および/または補助作用物質）、例えば、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能なリガンドを含有する粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートされる、それで処理される、またはそれと接触される。
いくつかの態様において、追加的な作用物質は、粒子の表面と結びついている。
ある態様において、1種または複数種の追加的な作用物質は、粒子、例えば、ビーズと離れている。いくつかの態様において、1種または複数種の追加的な作用物質は、1種または複数種のサイトカインである。特定の態様において、1種または複数種の追加的な作用物質は、1種または複数種の組換えサイトカインであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、1種または複数種のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある態様において、1種または複数種のサイトカインは、T細胞により発現される、および/またはT細胞に対して内因性である受容体と結合する、および/またはそれと結合することが可能である。特定の態様において、1種または複数種のサイトカインは、4本アルファ-ヘリックス束ファミリーのサイトカインの1つまたは複数のメンバーであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、1種または複数種のサイトカインは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が含まれる場合があるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、1種または複数種のサイトカインは、IL-2、IL-7、およびIL-15のうち1つまたは複数であるかまたはそれを含む。
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞の少なくとも一部は、CARを発現し、細胞は、結合分子が結びついた粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートされる、それで処理される、またはそれと接触され、その際、結合分子は、CARの抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体、またはその活性フラグメントである。いくつかの態様において、細胞は、約3〜7日の間（両端の値を含む）インキュベートされる。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、約280μmの直径を有し、粒子、例えば、ビーズは、粒子1つあたり結合分子、すなわち、抗イディオタイプ抗CAR抗体の約105コピーを含み、細胞は、粒子、例えば、ビーズと細胞との約1：1の比で、細胞と共にインキュベートされる、それと接触される、および/またはそれで処理される。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、約450μmの直径を有し、粒子、例えば、ビーズは、粒子1つあたり抗イディオタイプ抗CAR抗体の約1×106コピーと約2×106コピーとの間を含み、細胞は、粒子、例えば、ビーズと細胞との約1：1の比で、細胞と共にインキュベートされる、それと接触される、および/またはそれで処理される。
特定の態様は、特異的にBCMAと結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを有するCARを発現している細胞を含むインプット組成物を、CARと結合するかまたはそれを認識する結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法を対象とする。いくつかの態様において、結合分子は、ヒトBCMA細胞外ドメインおよびC末端Fcドメインを含む融合ポリペプチドである。いくつかの態様において、細胞は、約3〜7日の間インキュベートされる。特定の態様において、粒子、例えば、ビーズは、約280μmの直径を有し、粒子、例えば、ビーズは、粒子1つあたり結合分子、すなわち、BCMA融合ポリペプチドの約105コピーを含み、細胞は、粒子、例えば、ビーズと細胞とが約1：1の比で、細胞と共にインキュベートされる、それと接触される、および/またはそれで処理される。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、約450μmの直径を有し、粒子、例えば、ビーズは、粒子1つあたり結合分子、すなわち、BCMA融合ポリペプチドの約1×106と約2×106コピーとの間を含み、細胞は、粒子、例えば、ビーズと細胞とが約1：1の比で、細胞と共にインキュベートされる、それと接触される、および/またはそれで処理される。
特定の態様において、インプット組成物からの細胞は、例えば、10日よりも長い長期刺激を実施するために長期間、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触される、それと共にインキュベートされる、またはそれで処理される。いくつかの態様において、組換え受容体を発現している細胞は、結合分子を含有する粒子またはビーズと共に少なくとも10日、11日、12日、13日、14日、15日または16日間インキュベートされ、例えば、連続的にまたは中断なくインキュベートされる。いくつかの局面において、インキュベーションのために選択される時間の長さは、組成物の細胞の1つまたは複数の機能または活性が、インキュベーションの終止もしくは終わりに、慢性的に刺激された細胞または抗原に長期曝露された細胞の特徴を示す時間である。いくつかの態様において、例えば、慢性的に刺激された細胞または抗原に長期曝露された細胞の特徴をモデル化するための長期刺激方法を行うために、組換え受容体を発現している細胞は、粒子またはビーズと共にインキュベートされる。
アウトプット組成物の例示的な特徴
特定の態様において、インプット組成物の細胞を、結合分子（例えば、提供される通りのビーズコンジュゲート試薬、例えば、抗IDコンジュゲートビーズまたはBCMAコンジュゲートビーズ）を含む粒子、例えば、ビーズ、と接触させることは、インプット組成物の対応する細胞と異なる少なくとも1つの性質、例えば、総細胞数、組換え受容体を発現する細胞の部分もしくはサブセット、細胞増殖率および/または活性化マーカーもしくは疲弊マーカーなどの遺伝子の発現を含むアウトプット組成物をもたらす。いくつかの態様において、該方法は、結合分子によって認識されるCARなどのキメラ受容体を発現する細胞の、増殖、活性化、刺激、サイトカイン放出または他の機能的結果、例えば、活性化マーカーのアップレギュレーションまたはサイトカイン放出もしくは産生をもたらす。いくつかの局面において、そのような増殖または他の機能的応答もしくはリードアウトは、そのような細胞において、細胞とT細胞の増殖を刺激する作用物質および/または条件、抗CD3/CD28ビーズおよび/または架橋された抗CD3などとのインキュベーションによって誘導されるものと類似したまたはそれより大きい程度まで、誘導される。
いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズは、アウトプット組成物から除去される。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、磁化可能なまたは磁気応答性、例えば、常磁性または超常磁性の粒子、例えば、ビーズである。いくつかの態様において、粒子、例えば、ビーズは、ストレプトアビジンオリゴマーである。細胞から、粒子、例えば、ビーズ（例えば、ビーズ粒子、例えば、ビーズ、または磁化可能粒子）を除去するための方法は、公知である。いくつかの態様において、例えば、結合分子に結合して、細胞上のその組換え受容体に対するその親和性を変更する、競合する非標識抗体を使用することができ、それにより、結合分子、それゆえ粒子の穏やかな脱離を可能にする。いくつかの場合に、脱離後、競合抗体は、粒子の結合分子と会合したままであり得るが、一方で、未反応の非標識抗体は、洗い流されるかまたは洗い流されてよく、かつ細胞は、抗体および結合分子を含まない。例示的なそのような試薬は、DETACaBEADである（Friedl et al. 1995; Entschladen et al. 1997）。いくつかの態様において、粒子（例えば、ビーズ粒子）を、切断可能リンカー（例えば、DNAリンカー）の存在下で、粒子が結合した抗体がリンカー（例えば、CELLection, Dynal）にコンジュゲートされることによって、除去することができる。いくつかの場合に、リンカー領域は、例えばDNaseまたは他の放出緩衝液の添加によって単離後に細胞から粒子（例えば、ビーズ粒子）を除去するための、切断可能部位を提供する。いくつかの態様において、細胞からの粒子（例えば、ビーズ粒子）の放出のために他の酵素的方法を用いることもできる。いくつかの態様において、粒子（例えば、ビーズ粒子または磁化可能粒子）は、生分解性である。
いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとインキュベート、接触または処理したアウトプット組成物由来の細胞を、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物、すなわち、同じ細胞構成を有するインプット組成物から生じたアウトプット組成物と比較する。特定の態様において、同一のインプット組成物は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理されなかった。いくつかの態様において、同一のインプット組成物由来の細胞を、結合分子を含む粒子（例えば、ビーズ）で処理したインプット組成物由来の細胞と同じ条件（例えば、同じ培地、同じ温度、同じ期間、ならびに、結合分子の量および/または濃度と同じ量および/または濃度の1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子）で、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子と接触、インキュベートまたは処理した。いくつかの態様において、同一のインプット組成物の細胞を、表面に付着している1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子と接触させた。特定の態様において、同一のインプット組成物の細胞を、粒子（例えば、ビーズ粒子）の表面に付着している1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子と接触させた。特定の態様において、同一のインプット組成物の細胞を、抗CD3抗体および抗CD28抗体である1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子と接触させた。
特定の態様において、アウトプット組成物中の細胞の数は、インプット組成物中の細胞の数よりも、少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約100％、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍多い。
特定の態様において、アウトプット組成物は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子、例えば、抗CD3抗体および抗CD28抗体とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物、すなわち、同じ細胞構成を有するインプット組成物から生じたアウトプット組成物よりも多くの数の細胞を含む。いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理したアウトプット組成物の細胞の数は、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物からのアウトプット組成物由来の細胞の数よりも、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍もしくは少なくとも100倍、または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約100％、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約50倍もしくは少なくとも約100倍多い。
特定の態様において、インプット組成物の細胞を、インプット組成物の細胞サブセットによって発現される組換え受容体に結合するかまたはそれによって認識される結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理、接触またはインキュベートして、それにより、インプット組成物中よりも多くの組換え受容体を発現する細胞サブセットを含むアウトプット組成物をもたらす。特定の態様において、組換え受容体を発現する細胞サブセットは、インプット組成物中よりも、少なくとも1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍もしくは100倍または少なくとも約1％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約95％、約100％、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約50倍もしくは約100倍アウトプット組成物中で多い。
いくつかの態様において、アウトプット組成物は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理前のインプット組成物よりも多くの組換え受容体を発現する細胞サブセットを含む。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも99.9％または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％もしくは少なくとも約99.9％が組換え受容体を発現する。
特定の態様において、アウトプット組成物は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、TCR複合体の1つまたは複数の成分を活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子、例えば、抗CD3抗体および抗CD28抗体とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物から生じたアウトプット組成物中の組換え受容体を発現する細胞サブセットよりも多くの結合分子により結合または認識される組換え受容体を発現する細胞サブセットを含む。いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理した細胞のアウトプット組成物中の組換え受容体を発現する細胞サブセットは、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物から生じたアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞サブセットよりも、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍もしくは少なくとも100倍、または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約100％、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約50倍もしくは少なくとも約100倍多い。
いくつかの態様において、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズとのインキュベート、処理および/または接触させたアウトプット組成物中の組換え受容体、例えば、CARを発現する細胞は、ポリクローナル刺激、例えば、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体とのインキュベーションを受けたアウトプット組成物の細胞よりも、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも99.9％、または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％もしくは少なくとも約99.9％低いVCNを含有する。いくつかの態様において、アウトプットのCAR発現細胞の平均VCNは、10、5、4、2.5、1.5もしくは1以下または約10、約5、約4、約2.5、約1.5もしくは約1である。
いくつかの態様において、アウトプット組成物は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理前のインプット組成物よりも多くの活性化された細胞サブセットを含む。いくつかの態様において、活性化された細胞は、活性化に関連する少なくとも1つの活性化マーカー、すなわち、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現する細胞である。いくつかの態様において、活性化された細胞は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、または10より多くの異なる活性化マーカーを発現する。いくつかの態様において、活性化マーカーは、ヒト白血球抗原-抗原D関連（HLA-DR）、CD25、CD69、CD71、CD40Lまたは4-1BB（CD137）である。特定の態様において、活性化マーカーは、IL-2、IFNガンマまたはTNF-アルファである。いくつかの態様において、活性化マーカーは、IL-2、IFNガンマまたはTNF-アルファの細胞内発現である。特定の態様において、活性化マーカーは、分泌されたIL-2、IFNガンマまたはTNF-アルファである。特定の態様において、活性化マーカーを発現する細胞サブセットは、インプット組成物中よりも、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍もしくは少なくとも100倍、または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約100％、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約50倍もしくは少なくとも約100倍アウトプット組成物中で多い。
いくつかの態様において、アウトプット組成物は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理前のインプット組成物よりも多くの活性化された細胞の細胞数を含む。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも99.9％、または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％または少なくとも約99.9％が活性化されている。いくつかの態様において、該細胞の1％未満、5％未満、10％未満、15％未満、20％未満、25％未満、30％未満、35％未満、40％未満、45％未満、50％未満、55％未満、60％未満、65％未満もしくは70％未満、または約1％未満、約5％未満、約10％未満、約15％未満、約20％未満、約25％未満、約30％未満、約35％未満、約40％未満、約45％未満、約50％未満、約55％未満、約60％未満、約65％未満もしくは約70％未満が活性化されている。
いくつかの態様において、アウトプット組成物は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物、すなわち、同じ細胞構成を有するインプット組成物から生じたアウトプット組成物よりも少ない活性化された細胞サブセットを含む。いくつかの態様において、結合分子を含む粒子（例えば、ビーズ）で処理したアウトプット組成物の活性化された細胞サブセットは、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物から生じるアウトプット組成物の活性化された細胞サブセットの1％未満、5％未満、10％未満、15％未満、20％未満、l 25％未満、30％未満、35％未満、40％未満、45％未満、50％未満、55％未満、60％未満、65％未満、70％未満、75％未満、80％未満、85％未満、95％未満、99％未満もしくは99.9％未満、または約1％未満、約5％未満、約10％未満、約15％未満、約20％未満、約l 25％未満、約30％未満、約35％未満、約40％未満、約45％未満、約50％未満、約55％未満、約60％未満、約65％未満、約70％未満、約75％未満、約80％未満、約85％未満、約95％未満、約99％未満もしくは約99.9％未満である。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理前のインプット組成物よりも活性化されている。いくつかの態様において、細胞は、より活性化されていない細胞または活性化されていない細胞よりも高いレベルの少なくとも1つの活性化マーカーを発現するときに、より活性化されている。いくつかの態様において、より活性化された細胞は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、または10より多くの異なる活性化マーカーを、より活性化されていないまたは活性化されていない細胞よりも大きなレベルで発現する。いくつかの態様において、活性化された細胞は、インプット組成物由来の細胞よりも多くの量のヒト白血球抗原-抗原D関連（HLA-DR）、CD25、CD69、CD71、CD40Lまたは4-1BB（CD137）の少なくとも1つを発現する。特定の態様において、活性化された細胞は、より大きなレベルのIL-2、IFNガンマまたはTNF-アルファ、例えば、mRNAまたはポリペプチドを発現する。いくつかの態様において、活性化された細胞は、より多くの量の細胞内IL-2、IFNガンマまたはTNF-アルファを発現する。特定の態様において、活性化された細胞は、より多くの量のIL-2、IFNガンマまたはTNF-アルファを分泌する。特定の態様において、活性化された細胞は、インプット組成物由来の細胞によって発現される活性化マーカーの量よりも、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍もしくは少なくとも100倍、または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約100％、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約50倍もしくは少なくとも約100倍多い量の活性化マーカーを発現する。
いくつかの態様において、アウトプット組成物は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物、すなわち、同じ細胞構成を有するインプット組成物から生じたアウトプット組成物よりも活性化されていない細胞を含む。いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理したアウトプット組成物の細胞中の少なくとも1つの活性化マーカーの発現は、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物からのアウトプット組成物由来の細胞中の少なくとも1つの活性化マーカーの発現の1％未満、5％未満、10％未満、15％未満、20％未満、l 25％未満、30％未満、35％未満、40％未満、45％未満、50％未満、55％未満、60％未満、65％未満、70％未満、75％未満、80％未満、85％未満、95％未満、99％未満もしくは99.9％未満、または約1％未満、約5％未満、約10％未満、約15％未満、約20％未満、約l 25％未満、約30％未満、約35％未満、約40％未満、約45％未満、約50％未満、約55％未満、約60％未満、約65％未満、約70％未満、約75％未満、約80％未満、約85％未満、約95％未満、約99％未満もしくは約99.9％未満である。
いくつかの態様において、アウトプット組成物由来の組換え受容体（結合分子により認識される）を発現するより多くの細胞サブセットは、結合分子を含む粒子（例えば、ビーズ）とのインキュベーション、接触または処理後に、結合分子を含む粒子（例えば、ビーズ）とのインキュベーション、接触または処理前のインプット組成物の組換え受容体を発現する細胞よりも活性化されている。特定の態様において、活性化された組換え受容体を発現する細胞サブセットは、インプット組成物由来の組換え受容体を発現する活性化された細胞サブセットよりも、少なくとも1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍もしくは100倍、または少なくとも約1％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約95％、約100％、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約50倍もしくは約100倍アウトプット組成物中で多い。
いくつかの態様において、アウトプット組成物の組換え受容体（結合分子により結合または認識される）を発現する細胞は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理前のインプット組成物よりも多くの活性化された細胞サブセットを含む。いくつかの態様において、アウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくは少なくとも99.9％、または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、もしくは少なくとも約99.9％が活性化されている。いくつかの態様において、組換え受容体を発現する細胞の1％未満、5％未満、10％未満、15％未満、20％未満、l 25％未満、30％未満、35％未満、40％未満、45％未満、50％未満、55％未満、60％未満、65％未満、70％未満、または約1％未満、約5％未満、約10％未満、約15％未満、約20％未満、約l 25％未満、約30％未満、約35％未満、約40％未満、約45％未満、約50％未満、約55％未満、約60％未満、約65％未満、約70％未満が活性化されている。
いくつかの態様において、アウトプット組成物由来の組換え受容体（結合分子により結合または認識される）を発現するより少ない細胞サブセットが、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物、すなわち、同じ細胞構成を有するインプット組成物から生じたアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞と比較して活性化されている。いくつかの態様において、活性化されたアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞サブセットは、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物から生じるアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞サブセットよりも1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、99％もしくは99.9％少ない、または約1％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約95％、約99％もしくは約99.9％少ない。
特定の態様において、アウトプット組成物の組換え受容体（結合分子に結合するかまたはそれにより認識される）を発現する細胞は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理前のインプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞よりも活性化されている。いくつかの態様において、アウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞は、インプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞と比較した場合に、より多くの量の少なくとも1つの活性化マーカーを発現する。特定の態様において、アウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞は、インプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞よりも多くの量のヒト白血球抗原-抗原D関連（HLA-DR）、CD25、CD69、CD71、CD40Lまたは4-1BB（CD137）の少なくとも1つを発現する。
特定の態様において、組換え受容体を発現する細胞は、より大きなレベルのIL-2、IFNガンマまたはTNF-アルファを発現する。いくつかの態様において、組換え受容体を発現する細胞は、より多くの量の細胞内IL-2、IFNガンマまたはTNF-アルファを発現する。特定の態様において、組換え受容体を発現する細胞は、より多くの量のIL-2、IFNガンマまたはTNF-アルファを分泌する。特定の態様において、アウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞は、インプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞によって発現される活性化マーカーの量よりも、少なくとも1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍もしくは100倍、または少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約100％、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約50倍もしくは少なくとも約100倍多い量の活性化マーカーを発現する。
いくつかの態様において、アウトプット組成物は、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション、接触または処理後に、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物、すなわち、同じ細胞構成を有するインプット組成物から生じたアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞よりも活性化されていない組換え受容体（結合分子により結合または認識される）を発現する細胞を含む。いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理したアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞中の少なくとも1つの活性化マーカーの発現は、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物から生じるアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞中の少なくとも1つの活性化マーカーの発現の1％未満、5％未満、10％未満、15％未満、20％未満、l 25％未満、30％未満、35％未満、40％未満、45％未満、50％未満、55％未満、60％未満、65％未満、70％未満、75％未満、80％未満、85％未満、95％未満、99％未満もしくは99.9％未満、または約1％未満、約5％未満、約10％未満、約15％未満、約20％未満、約l 25％未満、約30％未満、約35％未満、約40％未満、約45％未満、約50％未満、約55％未満、約60％未満、約65％未満、約70％未満、約75％未満、約80％未満、約85％未満、約95％未満、約99％未満もしくは約99.9％未満である。
いくつかの態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとインキュベート、接触または処理したアウトプット組成物の細胞は、同じ条件で、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触した同一のインプット組成物、すなわち、同じ細胞構成を有するインプット組成物から生じたアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞と比較した場合に、低減したまたはより低いレベルの疲弊を呈する。特定の態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとインキュベート、接触または処理したアウトプット組成物の細胞は、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物から生じたアウトプット組成物由来の細胞と比較した場合に、低減したまたはより低い疲弊マーカーの発現を呈する。いくつかの態様において、疲弊マーカーは、疲弊に関連するポリペプチドであるか、または疲弊に関連するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、疲弊マーカーの発現は、疲弊マーカーポリペプチドの表面発現を含む。いくつかの態様において、疲弊マーカーは、阻害性受容体、すなわち、その対応するリガンドによって結合されたときに細胞の少なくとも1つの免疫活性または細胞活性を低減する、受容体である。特定の態様において、疲弊マーカーは、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLAまたはTIGITである。特定の態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触、処理またはインキュベートしたアウトプット組成物由来の細胞は、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子と接触、処理またはインキュベートしたアウトプット組成物由来の細胞よりも、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、99％もしくは99.9％少ない、または約1％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約95％、約99％もしくは約99.9％少ない、少なくとも1つの疲弊マーカーの発現を有する。
特定の態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとインキュベート、接触または処理したアウトプット組成物の組換え受容体を発現する細胞は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触させた同一のインプット組成物から生じたアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞と比較した場合に、低減したまたはより低いレベルの疲弊を呈する。特定の態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズとインキュベート、接触または処理したアウトプット組成物の組換え受容体を発現する細胞は、同じ条件で、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子とインキュベート、処理または接触した同一のインプット組成物から生じたアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞と比較した場合に、低減したまたはより低い疲弊マーカーの発現を呈する。特定の態様において、結合分子を含む粒子、例えば、ビーズと接触、処理またはインキュベートしたアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞は、1つまたは複数のポリクローナル刺激性分子と接触、処理またはインキュベートしたアウトプット組成物由来の組換え受容体を発現する細胞よりも、1％、5％、10％、15％、20％、l 25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、99％もしくは99.9％少ない、または約1％、約5％、約10％、約15％、約20％、約l 25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約95％、約99％もしくは約99.9％少ない、少なくとも1つの疲弊マーカーの発現を有する。
III. 長期刺激を評価するための方法
本明細書において、とりわけ、細胞組成物、例えば、細胞組成物の表現型、特性または活性を評価するために有用である、長期刺激法（本明細書において、長期刺激のための方法とも称される）が提供される。いくつかの態様において、長期刺激法は、CARなどの組換え受容体を発現する細胞を含有する細胞組成物、例えば、インプット組成物を、細胞において組換え受容体依存性活性（例えば、CAR依存性活性）を刺激する条件下でインキュベートすることであるかまたはそれを含む。いくつかの局面において、細胞組成物、例えば、インプット組成物は、抗原に特異的に結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含む組換え受容体（例えば、CAR）を発現するT細胞を含有する。いくつかの局面において、インキュベーションは、慢性的に刺激された細胞のまたは抗原に長期曝露された細胞の特徴を示す細胞を含有する、T細胞組成物、例えば、アウトプット組成物をもたらす。
いくつかの態様において、長期刺激法は、CARなどの組換え受容体を発現する細胞を含有する細胞組成物、例えば、インプット組成物を、細胞において組換え受容体依存性活性（例えば、CAR依存性活性）を刺激する条件下でインキュベートすることであるかまたはそれを含む。そのような態様において、組換え受容体依存性活性は、組換え受容体（例えば、CAR）の刺激に特異的である活性（例えば、組換え受容体（例えば、CAR）の抗原結合ドメインによって認識される抗原または他の作用物質の存在を介する）、または組換え受容体を特異的に刺激する活性である。いくつかの局面において、細胞組成物、例えば、インプット組成物は、抗原に特異的に結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含む組換え受容体（例えば、CAR）を発現するT細胞を含有する。いくつかの局面において、インキュベーションは、慢性的に刺激された細胞のまたは抗原に長期曝露された細胞の特徴を示す細胞を含有する、T細胞組成物、例えば、アウトプット組成物をもたらす。特定の態様において、インキュベーションは、中断なしに連続的に実施される。
特定の態様において、本明細書において提供される長期刺激のための方法は、とりわけ、インビボ投与されたときに、維持または拡張された持続性、生存性または活性などの望ましい特徴を有し得る、細胞組成物を特定するために有用である。いくつかの態様において、該方法は、2つ以上の異なる細胞組成物に対して、細胞がインビボ投与されたときなどに、持続性、活性もしくは生存性を増強もしくは延長し得る相違または疲弊もしくは分化を減少し得る相違を特定するために実施される。いくつかの態様において、そのような相違は、製造プロセスの局面、例えば、操作プロセスの異なる工程に使用されるタイミング、条件もしくは試薬、組換え受容体における相違（例えば、組換え受容体を送達するために使用される構築物もしくはベクター中のアミノ酸配列の相違、または異なる遺伝子送達の方法）、細胞における相違（例えば、細胞タイプもしくはサブタイプまたは細胞源における相違、例えば、細胞が得られる試料または対象における相違）、異なる貯蔵条件（例えば、事前の凍結-融解サイクルの数、貯蔵温度、貯蔵培地の配合、貯蔵容器、凍結保存剤（cyropreservative）または細胞密度）、またはアッセイ条件（インキュベーションの間の対照または試験化合物の存在または非存在など）を含み得るが、それに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、結合分子は、組換え受容体によって結合または認識される抗原（組換え抗原またはそのフラグメントなど）である。特定の態様において、結合分子は、組換え受容体に結合するかまたはそれを認識する抗IDである。いくつかの態様において、そのような特徴は、減少した生存性、活性もしくは持続性または増加した疲弊もしくは分化の証拠を含み得る。様々な態様において、細胞と結合分子とを、細胞の分裂、成長、増大または活性化を促進する追加の作用物質なしの培地の存在下でインキュベートする。いくつかの態様において、細胞と粒子とを、延長された時間、例えば、14日間、いかなる追加の操作（例えば、培地変更、ビーズ交換、または細胞の分割もしくは再プレーティング）もなしにインキュベートする。
特定の態様は、本明細書において提供される長期刺激法が、とりわけ、対象、例えば、ヒト対象にインビボ投与されたときに細胞治療の細胞が受ける条件をエクスビボでモデリングするために有用であることを想定する。したがって、いくつかの局面において、提供されるアッセイは、インビボ投与されたときに、限定されないが維持または拡張された持続性、生存性または活性などの望ましい特徴を有し得る、細胞組成物を特定するために有用である。
特定の態様において、長期刺激法は、2つ以上の細胞組成物、例えば、インプット組成物において、生存性、活性もしくは持続性を増加もしくは維持する細胞組成物、または、増加した生存性、活性もしくは持続性の指標となるマーカー、例えば、バイオマーカーの発現を増加もしくは維持する細胞組成物を特定するために実施される。特定の態様において、長期刺激法は、2つ以上の細胞組成物において、疲弊もしくは分化（例えば、老化状態への分化など）を減少もしくは防止する細胞組成物、または、増加した疲弊または分化の指標となるマーカーの発現を減少する細胞組成物における相違を特定するために実施される。いくつかの態様において、結合分子は、細胞培養プレートまたはディッシュの表面などの固体表面に付着またはコンジュゲートされる。特定の態様において、結合分子は、粒子、例えば、ビーズにコンジュゲートまたは付着される。
特定の態様において、該方法は、細胞を、結合分子、例えば、組換え受容体に結合するかまたはそれを認識する結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズの存在下でインキュベートするための工程を含む。いくつかの態様において、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズは、提供される通りのビーズコンジュゲート試薬、例えば、抗IDコンジュゲートビーズまたはBCMAコンジュゲートビーズであるかまたはそれを含む。特定の態様において、細胞または細胞の組成物を、本明細書に、例えば、セクションIに記載の結合分子が付着した粒子とインキュベートする。特定の態様において、粒子は、本明細書に、例えば、セクションI〜Aに記載の粒子である。特定の態様において、結合分子は、本明細書に、例えば、セクションI〜Bに記載の結合分子である。特定の態様において、結合分子は、組換え受容体に結合するかまたはそれを認識する。
特定の態様において、インプット組成物を、結合分子と、例えば、結合分子を含有する粒子またはビーズと、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間もしくは21日間、約10日間、約11日間、約12日間、約13日間、約14日間、約15日間、約16日間、約17日間、約18日間、約19日間、約20日間もしくは約21日間、または少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間もしくは少なくとも21日間インキュベートする。様々な態様において、インプット組成物を、結合分子と、例えば、結合分子を含有する粒子またはビーズと、10日間と21日間との間、12日間と18日間との間もしくは14日間と16日間との間、または約10日間と21日間との間、約12日間と18日間との間もしくは約14日間と16日間との間（両端の値を含む）インキュベートする。特定の態様において、細胞を、結合分子と、例えば、結合分子を含有する粒子またはビーズと、14日間、約14日間または少なくとも14日間インキュベートする。特定の態様において、細胞組成物の細胞を、結合分子と、室温よりも高い温度でインキュベートする。いくつかの態様において、インキュベーションは、約25℃よりも高い、例えば一般的に、32℃、35℃もしくは37℃よりも高い、または約32℃、約35℃もしくは約37℃よりも高い温度で行われる。いくつかの態様において、インキュベーションは、37℃±2℃または約37℃±2℃の温度で、例えば、37℃または約37℃の温度で行われる。
いくつかの態様において、細胞を、結合分子と、例えば、結合分子を含有する粒子またはビーズと、細胞（例えば、T細胞）の分裂、成長、増大または活性化を促進する追加の作用物質なしの培地の存在下でインキュベートする。いくつかの態様において、細胞を、結合分子と、任意の組換えサイトカインの非存在下でインキュベートする。特定の態様において、インキュベーションは、中断なしに、例えば、再プレーティング、培地交換または新鮮な結合分子の添加などなしに行われる。特定の態様において、インキュベーションは、静止条件下で行われる。特定の態様において、インキュベーションは、灌流、混合、揺動または振盪一切なしに行われる。いくつかの局面において、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズは、インキュベーションの期間全体にわたって存在する。特定の態様において、結合分子は、インキュベーションの間、変更または交換されない。特定の態様は、いくつかの局面において、培地は、いかなる組換えサイトカインも含有しないので、インキュベーションの間に培地中に存在するサイトカインは、細胞によって、例えば、細胞の組換え受容体と粒子の結合分子との間の相互作用に応答して、産生されたものと想定する。
いくつかの態様において、提供される長期刺激のための方法を使用して、異なる細胞または細胞組成物を比較してよい。例えば、いくつかの態様において、同じ組換え受容体、例えば、同じCARを発現する細胞を各々含有する2つ以上の細胞組成物を、細胞を同じ結合分子と、例えば、組換え受容体に結合するかまたはそれを認識する同じ結合分子を含有する粒子またはビーズとインキュベートすることによって、比較してよい。特定の態様において、2つ以上の細胞組成物は、異なる操作プロセス、例えば、異なる条件、異なるタイミングおよび期間または異なる設備もしくは試薬を伴うプロセスによって作製される。特定の態様において、細胞組成物を、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズと、1つまたは複数の試験作用物質または化合物、例えば、疲弊を低減または持続性を促進する疑いのある作用物質の存在下でインキュベートする。特定の態様において、細胞組成物を、対照または参照細胞組成物と比較してよい。いくつかの局面において、対照または参照細胞組成物は、いかなるインキュベーションも受けない細胞組成物、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズの存在下でインキュベートされない細胞組成物、組換え受容体を発現する細胞を含有しない細胞組成物、異なる操作プロセスから作製される細胞組成物、および/または、ビヒクルもしくは対照化合物の存在下でインキュベートされる細胞組成物を含み得るが、それに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、長期刺激法は、1つまたは複数の試験作用物質または化合物の存在下で実施される。特定の態様において、試験作用物質または化合物は、細胞組成物の細胞、例えば、組換え受容体を発現する細胞の1つまたは複数の特性、表現型または活性を、インキュベーションの間またはインキュベーション後、変化させるかまたはそれに影響を及ぼす疑いのある作用物質であるかまたはそのための候補である。いくつかの局面において、試験作用物質または化合物は、T細胞の1つまたは複数の表現型、特性または活性、例えば、成長、分裂、増大、分裂、持続性、分化、活性化もしくは疲弊、または活性（例えば、限定されないが細胞溶解活性またはサイトカイン産生を含めた、抗原刺激された活性）を増加もしくは減少する、または増加もしくは減少する疑いがある。特定の態様において、試験作用物質または化合物は、天然もしくは化学修飾されたポリペプチド、抗体、天然もしくは化学修飾された小オリゴペプチド、天然、非天然もしくは化学修飾されたアミノ酸、ポリヌクレオチド、天然もしくは化学修飾されたオリゴヌクレオチド、RNAi、shRNA、siRNA、小ヌクレオチド、天然もしくは化学修飾されたモノヌクレオチド、リポペプチド、抗菌剤、低分子、または薬学的分子である。
特定の態様において、異なる組換え受容体、例えば、異なるCARを発現する細胞を各々含有する2つ以上の細胞組成物を、細胞を結合分子と、例えば異なる組換え受容体に結合するかまたはそれを認識する異なる結合分子を含有する粒子またはビーズとインキュベートすることによって、比較してよい。
いくつかの態様において、アウトプット組成物は、長期刺激法、例えば、本明細書に記載の長期刺激法の全てまたは一部を受けた細胞から構成される。特定の態様において、長期刺激法を受ける細胞は、インキュベーションの間の異なる時点で評価される。例えば、いくつかの局面において、1つまたは複数の細胞組成物由来の細胞の表現型、特性または活性は、インキュベーションの中間の時点、例えば、インキュベーションの5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、約5％、約10％、約20％、約25％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約75％、約80％、約90％、または少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％が完了した時点で評価される。特定の態様において、細胞は、インキュベーションの間に、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回または10回より多く評価される。特定の態様において、細胞は、インキュベーションの間の異なる間隔、例えば、6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、1日、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間もしくは8日間、約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約36時間、約48時間、約1日、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間もしくは約8日間、または少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも18時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも1日、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間もしくは少なくとも8日間の間隔の後に評価される。いくつかの態様において、細胞は、毎日評価される。いくつかの態様において、細胞は、3日毎に評価される。特定の態様において、細胞は、7日毎に評価される。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞、例えば、長期刺激法を受けた細胞は、活性、例えば、抗原刺激された活性、表現型または特性について評価される。いくつかの態様において、抗原刺激された活性は、該方法の間または該方法が完了した後、例えば、結合分子とのインキュベーションの間またはインキュベーション後、細胞において評価される。特定の態様において、評価の結果は、異なる細胞組成物、例えば、対照または参照細胞組成物由来の細胞において測定された同じまたは類似の活性の評価と比較される。
いくつかの態様において、活性は、抗原刺激された活性である。特定の態様は、組換え受容体を発現するT細胞などの細胞の抗原刺激された活性を、多数の公知の好適な技術のいずれかによって評価できることを想定する。いくつかの態様において、1つまたは複数のサイトカインの産生は、細胞内サイトカイン染色によって測定、検出および/または定量される。いくつかの局面において、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色（ICS）は、サイトカイン産生を単一細胞レベルで研究するためによく適している技術である。特定の局面において、ICSは、抗原を発現する細胞または粒子、例えば、ビーズ粒子による、コンジュゲート抗原によるなどの細胞刺激後の小胞体内のサイトカインの産生および蓄積を検出するために有用であり、特定のサイトカインの産生に陽性もしくは陰性である細胞集団の識別または高産生細胞と低産生細胞の閾値に基づいた分離を可能にする。また、ICSを、細胞表面マーカー、例えば、CD4またはCD8を使用したイムノフェノタイピング用の他のフローサイトメトリープロトコールと組み合わせて使用して、特定の細胞サブグループにおけるサイトカイン産生を評価することもできる。サイトカイン産生を測定または検出するための他の単一細胞技術は、ELISPOT、限界希釈およびT細胞クローニングを含むが、それに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、抗原刺激された活性は、1つまたは複数のサイトカインの産生である。抗原刺激に応答して産生され得るサイトカインは、IL-1、IL-1β、IL-2、sIL-2Ra、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL 27、IL-33、IL-35、TNF、TNFアルファ、CXCL2、CCL2、CCL3、CCL5、CCL17、CCL24、PGD2、LTB4、インターフェロンガンマ（IFN-γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)-1a、MIP-1b、Flt-3L、フラクタルカイン（fracktalkine）、および/またはIL-5を含み得るが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、1つまたは複数のサイトカインは、IL-2、IFN-ガンマまたはTNF-アルファの1つまたは複数であるかまたはそれらを含む。いくつかの態様において、サイトカイン分泌は、細胞外サイトカインの量または濃度を、抗原発現細胞との共培養後に、または、付着した抗原もしくは抗原フラグメントを含有する粒子、例えば、ビーズのインキュベーション後に、測定、検出または定量することによって評価される。
特定の態様において、抗原刺激された活性は、細胞溶解（細胞傷害）活性である。いくつかの態様において、細胞溶解活性は、組成物の細胞、例えば、組換え受容体を発現する細胞を、組換え受容体によって認識される抗原またはエピトープを発現する標的細胞に曝露、インキュベートおよび/または接触させることによって評価される。標的細胞数を経時的に直接的または間接的に測定することによって、細胞溶解活性を測定することができる。例えば、標的細胞を、組換え受容体を発現する細胞とインキュベートする前に、標的細胞が溶解したときに検出可能であるか、または生存能力のある標的細胞においてのみ検出可能であるそのようなマーカーとインキュベートしてよい。これらのリードアウトは、直接的または間接的な標的細胞数および/または標的細胞死を提供し、これは、アッセイの間の異なる時点で測定することができる。標的細胞数の低減および/または標的細胞死の増加は、細胞の細胞溶解活性を指し示す。細胞溶解性アッセイを実施するための好適な方法は、当技術分野において公知であり、これらは、クロム-51放出アッセイ、非放射性クロムアッセイ、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）、PKH-2およびPKH-26などの蛍光色素を使用するフローサイトメトリーアッセイを含むが、それに限定されるわけではない。
特定の態様において、組成物の細胞、例えば、組換え受容体を発現する細胞は、1つまたは複数の特性または表現型について、アッセイの間またはアッセイ後、例えば、結合受容体を含有する粒子、例えば、ビーズとのインキュベーションの間またはインキュベーション後に評価される。いくつかの態様において、1つまたは複数の特性または表現型は、活性化、疲弊または分化の1つまたは複数であるかまたはそれに関する。特定の態様において、1つまたは複数の表現型または特性は、1つまたは複数のマーカーの存在、非存在、量またはレベルを測定、検出または定量することによって評価される。
いくつかの態様において、活性化、疲弊または分化に陽性にまたは陰性に関連するマーカー、例えば、バイオマーカーの発現は、試料中のマーカーのレベル、量または濃度を評価、測定、検出および/または定量することであるかまたはそれを含む。特定の態様において、マーカーは、遺伝子によってコードされる情報に基づいて組み立て、作製および/または合成される、遺伝子産物、例えば、任意の生体分子であり、ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを含み得る。特定の態様において、マーカーのレベル、量または濃度は、変換されても（例えば、正規化されても）、直接分析されてもよい（例えば、生の）。いくつかの態様において、マーカーは、タンパク質である。特定の態様において、マーカーは、遺伝子によってコードされるポリヌクレオチド、例えば、mRNAまたはタンパク質である。
特定の態様において、ポリヌクレオチドであるマーカーの量またはレベルは、任意の好適な公知の手段によって、評価、測定、判定および/または定量されてよい。例えば、いくつかの態様において、ポリヌクレオチドマーカーの量またはレベルを、逆転写酵素(rt)PCR、ドロップレットデジタルPCR、リアルタイムおよび定量PCR法を含めたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、TAQMAN（登録商標）、モレキュラービーコン、LIGHTUP（商標）、SCORPION（商標）、SIMPLEPROBES（登録商標）を含む；例えば、米国特許第5,538,848号；第5,925,517号；第6,174,670号；第6,329,144号；第6,326,145号および第6,635,427号を参照のこと）；ノーザンブロッティング；サザンブロッティング、例えば、逆転写産物および誘導体のサザンブロッティング；ブロッテッドアレイ、マイクロアレイもしくはインサイチュー合成アレイを含めたアレイに基づく方法；ならびに、シーケンシング、例えば、合成によるシーケンシング、パイロシーケンシング、ジデオキシシーケンシングもしくはライゲーションによるシーケンシング、または当技術分野において公知の任意の他の方法、例えば、HELICOS（登録商標）、ROCHE（登録商標）454、ILLUMINA（登録商標）/SOLEXA（登録商標）、ABI SOLiD（登録商標）およびPOLONATOR（登録商標）シーケンシングのような特定のプラットフォームを含めた、Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004) または Nowrousian, Euk. Cell 9(9): 1300-1310 (2010)に考察されている方法によって、評価、測定、判定および/または定量することができる。特定の態様において、核酸遺伝子産物のレベルは、qRT-PCRによって測定される。いくつかの態様において、qRT-PCRは、各遺伝子について3つの核酸セットを使用し、ここで、3つの核酸は、プライマーペアを、プライマーが結合する標的核酸の領域間に結合するプローブと一緒に含む-TAQMAN（登録商標）アッセイとして商業上公知である。
特定の態様において、2つ以上のポリヌクレオチドマーカーの発現は、同時に測定または評価される。特定の態様において、2つ以上の遺伝子産物のレベル、量または濃度を評価、測定、判定および/または定量する、マルチプレックスPCR、例えば、マルチプレックスrt-PCR。いくつかの態様において、マイクロアレイ（例えば、AFFYMETRIX（登録商標）、AGILENT（登録商標）およびILLUMINA（登録商標）-スタイルアレイ）が、2つ以上の遺伝子産物のレベル、量または濃度を評価、測定、判定および/または定量するために使用される。いくつかの態様において、マイクロアレイが、RNA遺伝子産物から生じるcDNAポリヌクレオチドのレベル、量または濃度を評価、測定、判定および/または定量するために使用される。
いくつかの態様において、1つまたは複数のポリヌクレオチドマーカーの発現は、マーカーmRNAまたはマーカーmRNAから生じるcDNAポリヌクレオチドをシーケンシングすることによって判定される。いくつかの態様において、シーケンシングは、非サンガーシーケンシング法および/または次世代シーケンシング（NGS）技術によって実施される。次世代シーケンシング技術の例は、大規模並列処理特徴シーケンシング（MPSS）、ポロニーシーケンシング、パイロシーケンシング、リバーシブルダイターミネーターシーケンシング、SOLiDシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、DNAナノボールシーケンシング、ヘリオスコープ単一分子シーケンシング、単一分子リアルタイム（SMRT）シーケンシング、単一分子リアルタイム（RNAP）シーケンシング、およびナノポアDNAシーケンシングを含むが、それに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、NGS技術は、RNAシーケンシング（RNA-Seq）である。特定の態様において、1つまたは複数のポリヌクレオチド遺伝子産物の発現は、RNA-Seqによって測定、判定および/または定量される。全トランスクリプトームショットガンシーケンシングとも呼ばれるRNA-Seqは、試料中のRNAの存在および量を判定する。RNAシーケンシング法は、最も一般的なDNAシーケンシングプラットフォーム［HiSeq systems (Illumina)、454 Genome Sequencer FLX System (Roche)、Applied Biosystems SOLiD (Life Technologies)、IonTorrent (Life Technologies)］に適合されている。これらのプラットフォームは、RNAからcDNAへの初期逆転写を必要とする。反対に、単一分子シーケンサーHeliScope（Helicos BioSciences）は、シーケンシングの鋳型としてRNAを使用することができる。また、PacBio RSプラットフォームにおける直接RNAシーケンシングの原理証明も実証されている（Pacific Bioscience）。いくつかの態様において、1つまたは複数のRNA遺伝子産物は、RNA-seqによって評価、測定、判定および/または定量される。いくつかの態様において、RNA-seqは、タグに基づくRNA-seqまたはショットガンRNA-seqである。
特定の態様において、マーカーは、タンパク質またはそのフラグメントである。特定の態様において、1つまたは複数のタンパク質マーカーは、当技術分野において公知の任意の好適な手段によって測定される。1つまたは複数のタンパク質マーカーのレベル、量または濃度を評価、測定、判定および/または定量するための好適な方法は、イムノアッセイ、核酸に基づくまたはタンパク質に基づくアプタマー技術、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）、ペプチドシーケンシング（エドマン分解シーケンシングまたは質量分析（MS/MSなど）、場合によりHPLCに接続されたなど）、および前述のいずれかのマイクロアレイ適応物（核酸、抗体またはタンパク質-タンパク質（すなわち、非抗体）アレイを含む）による検出を含むが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、イムノアッセイは、免疫学的反応に基づいて、例えば、抗体または抗原結合抗体フラグメントの遺伝子産物への結合を検出することによって、タンパク質を検出する方法またはアッセイであるかまたはそれを含む。イムノアッセイは、定量免疫細胞化学または免疫組織化学、ELISA（直接、間接、サンドイッチ、競合、マルチプルおよびポータブルELISA（例えば、米国特許第7,510,687号を参照のこと）を含む）、ウェスタンブロッティング（一次元、二次元もしくはより高次元のブロッティングまたは他のクロマトグラフィー手段、場合によりペプチドシーケンシングを含む、を含む）、酵素イムノアッセイ（EIA）、RIA（ラジオイムノアッセイ）、およびSPR（表面プラズモン共鳴）を含むが、それに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、タンパク質マーカーは、フローサイトメトリーによって測定、検出または定量される。いくつかの局面において、フローサイトメトリーは、細胞を流体の流れにおいて懸濁して、これらを電子検出装置に通すことによるマーカー検出において用いられる、レーザーまたはインピーダンスに基づく生物物理学的技術である。細胞上に存在するマーカーは、フローサイトメトリーによる検出のために蛍光タグ化抗体などで標識されてよい。いくつかの局面において、フローサイトメトリーは、ある細胞集団中に存在するマーカーの存在、非存在、量またはレベルを測定、検出または定量するために用いられる。いくつかの局面において、該細胞集団は、細胞組成物のまたは細胞組成物由来の細胞サブセット由来の全細胞または生存能力のある全細胞、例えば、組換え受容体に陽性の細胞、CD4+T細胞またはCD8+T細胞であり得る。
特定の態様において、マーカーは、活性化または活性化様状態に陽性に関連または相関する。いくつかの態様において、マーカーは、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3またはKi67であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、マーカーは、疲弊または疲弊に関係する状態に陽性に関連または相関する。特定の態様において、マーカーは、CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTAまたはCD96の1つまたは複数であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、マーカーは、T細胞の分化に関連する。特定の態様において、マーカーは、CD25、CD45RO、CD56、KLRG1、CD95の1つまたは複数ならびに/またはCD45RA、CD27、CD28、CD62LおよびCCR7の1つまたは複数であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、細胞、例えば、アウトプット組成物の細胞は、CD45RA、CD27、CD28、CD62LおよびCCR7からなる群より選択されるT細胞活性化マーカーに表面陽性である細胞；ならびに/またはCD25、CD45RO、CD56、KLRG1からなる群より選択されるマーカーに表面陰性である細胞；ならびに/またはCD95の低発現を有する細胞；ならびに/またはIL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10からなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現に陰性である細胞について評価される。一部において、アウトプット組成物は、CD45RA+、CD27+、CCR7+および/またはCD45RO-である細胞について評価される。
いくつかの態様において、細胞組成物、例えば、アウトプット細胞組成物の細胞は、長期刺激法後に、例えば、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション後に、長期または慢性刺激を受けた細胞の特徴を呈する。いくつかの態様において、細胞組成物、例えば、参照または対照細胞組成物の組換え受容体を発現する細胞は、アッセイ後に、例えば、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズとのインキュベーション後に、長期または慢性刺激を受けた細胞の特徴を呈する。
いくつかの態様において、長期刺激法、例えば、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズとのインキュベーションを受けたアウトプット組成物由来の細胞は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、低減された抗原刺激された活性を呈する。特定の態様において、抗原刺激された活性は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約99.9％、または少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％低減される。特定の態様において、抗原刺激された活性は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、検出可能で実質的に有意な量低減される。いくつかの態様において、抗原刺激されたサイトカイン産生は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、低減される。特定の態様において、抗原刺激されたサイトカイン分泌は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、低減される。特定の態様において、抗原刺激された細胞溶解活性は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、低減される。
特定の態様において、アウトプット組成物由来の細胞、例えば、対照または参照組成物由来の細胞は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、ナイーブ様T細胞に関連するマーカーに陽性の細胞のレベル、発現または量の低減を呈する。特定の態様において、マーカーに陽性の細胞の量、例えば、検出可能量のマーカーを有するまたは染色の閾値レベルもしくは量を超える量もしくは発現を有する細胞の量は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約99.9％、または少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％低減される。特定の態様において、マーカーに陽性の細胞の量は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、検出可能で実質的に有意な量低減される。
いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞または細胞サブセットの活性化に関連するマーカーまたはナイーブ様状態に陽性に関連するマーカーなどのマーカーの平均、中間もしくは中央の発現、量またはレベルは、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約99.9％、または少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％低減される。特定の態様において、活性化に関連するマーカーに陽性の細胞の量は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、検出可能で実質的に有意な量低減される。
特定の態様において、アウトプット組成物由来の細胞、例えば、長期刺激法、例えば、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズとのインキュベーションを受けたアウトプット組成物または対照もしくは参照組成物由来の細胞は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、疲弊に陽性に関連するマーカーまたは分化したT細胞に陽性に関連するマーカーなどのマーカーに陽性の細胞のレベル、発現または量の増加を呈する。特定の態様において、マーカーに陽性の細胞の量、例えば、検出可能量のマーカーを有するまたは染色の閾値レベルもしくは量を超える量もしくは発現を有する細胞の量は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、150％、200％、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍もしくは100倍、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約100％、約150％、約200％、約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍もしくは約100倍、または少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも200％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍もしくは少なくとも100倍増加する。特定の態様において、マーカーに陽性の細胞の量は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、検出可能で実質的に有意な量増加する。
様々な態様において、長期刺激法を受けた細胞または細胞サブセットの疲弊に陽性に関連するマーカーまたは分化したT細胞に陽性に関連するマーカーなどのマーカーの平均、中間もしくは中央の発現、量またはレベルは、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、150％、200％、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍もしくは100倍、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約100％、約150％、約200％、約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍もしくは約100倍、または少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも200％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍もしくは少なくとも100倍増加する。特定の態様において、疲弊に陽性に関連するマーカーに陽性の細胞の量は、長期刺激法を受けなかった組成物の細胞と比較した場合に、検出可能で実質的に有意な量増加する。
特定の態様において、組換え受容体を発現する細胞を含有する細胞組成物を、結合分子を含有する粒子の存在下で、7日間〜21日間インキュベートする。特定の態様において、CAR発現細胞を含有する細胞組成物の細胞を、結合分子を含有する粒子、例えば、ビーズと、少なくとも14日間、組換えサイトカインの非存在下でインキュベートする。特定の態様において、長期刺激法に続いて、細胞または細胞サブセット、例えば、CAR+細胞は、抗原刺激された活性、例えばサイトカイン産生または細胞溶解活性について評価される。特定の態様において、エクスビボアッセイに続いて、組成物の細胞または細胞サブセットは、1つまたは複数のマーカーの発現について評価される。特定の態様において、長期刺激法を受ける2つ以上の細胞組成物を比較して、これらが対象にインビボ投与されたときに細胞組成物の持続性、生存性または活性を改善するバリエーションまたは試薬を特定する。
IV. 遺伝子操作された細胞および組換え受容体
いくつかの態様において、提供される方法、例えば、組換え受容体発現細胞を刺激または増大するための方法は、組換え受容体を発現する細胞を含むインプット組成物に対して、および/または、細胞を組換え受容体で遺伝子操作するための方法と併せて行われる。いくつかの局面において、細胞を組換え受容体で遺伝子操作することは、細胞の組成物と、組換え受容体（例えば、CAR）をコードする遺伝子を含有する核酸分子、例えば、ウイルスまたは非ウイルスプラスミドとを、核酸分子を組成物の1つまたは複数の細胞に送達するための条件下で接触させることを伴う。
いくつかの態様において、細胞は、提供される方法に従って遺伝子操作を介して導入された1つまたは複数の核酸を含み、それによって、そのような核酸の組換えまたは遺伝子操作された産物を発現する。いくつかの態様において、核酸は、異種であり、すなわち、細胞または細胞から得られる試料中に通常存在しない、例えば、操作されている細胞中に通常見いだされない別の生物もしくは細胞から得られる核酸および/またはそのような細胞が由来する生物から得られる核酸である。いくつかの態様において、核酸は、天然に存在しない、例えば、複数の異なる細胞タイプ由来の様々なドメインをコードする核酸のキメラな組み合わせを含む核酸を含めた、自然界に見いだされない核酸である。特定の態様において、核酸は、組換え受容体、例えばCARをコードする遺伝子を含有する。
いくつかの態様において、提供される方法は、遺伝子操作された細胞を製造または調製するための1つまたは複数の処理工程と同時に、連続的にまたは並行して行われてよい。該方法の処理工程は、多数の細胞処理工程のいずれか1つまたは複数を、単独または組み合わせで含んでよい。特定の態様において、処理工程は、1つまたは複数の核酸、例えば、組換え受容体をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドによる、細胞の形質導入またはトランスフェクションを含む。特定の態様において、細胞は、レトロウイルスベクター、細胞において発現させるための組換え産物をコードするレトロウイルスベクターなどを含有するウイルスベクター粒子で形質導入される。特定の態様において、細胞に、1つまたは複数の非ウイルス核酸、例えば、エピソームプラスミドまたはトランスポゾンがトランスフェクトされる。該方法は、さらにかつ/または代替的に、他の処理工程、例えば、細胞の単離、分離、選択、洗浄、懸濁、希釈、濃縮および/または製剤化のための工程を含んでよい。いくつかの場合に、該方法はまた、細胞の培養、刺激または増大のためのエクスビボ工程（例えば、細胞の、例えば、それらの増殖および/または活性化を誘導するための刺激）を含むこともでき、これらは、いくつかの場合に、提供される方法に従って行うことができる。いくつかの態様において、該方法は、対象から細胞を単離すること、それらを調製すること、処理すること、培養することおよび/または操作すること、そして、凍結保存の前または後に、それらを同じ対象に再導入することを含む。
いくつかの態様において、該方法は、以下の順序で行われる処理工程を含む：細胞、例えば、初代細胞を、生物学的試料から、最初に単離する、例えば選択または分離する；選択された細胞を、形質導入のためにウイルスベクター粒子とインキュベートする；および形質導入された細胞を組成物に製剤化する。いくつかの場合に、形質導入された細胞を、例えば、刺激試薬の存在下での刺激によって、例えば、提供される方法に従って、エクスビボで活性化、増大または繁殖させる。いくつかの態様において、該方法は、細胞の洗浄、懸濁、希釈および/または濃縮の中からの1つまたは複数の処理工程を含むことができ、これらは、単離（分離または選択など）、形質導入、刺激および/または製剤化工程の1つまたは複数の前に、その間に、またはそれと同時にまたはそれに続いて、行うことができる。
特定の態様において、トランスフェクトまたは形質導入されるべき細胞は、1つまたは複数の核酸との接触の前に単離も、選択も富化もされない。いくつかの態様において、細胞は、細胞と1つまたは複数の核酸との接触の前に選択されない。いくつかの態様において、トランスフェクトまたは形質導入されるべき細胞は、細胞と1つまたは複数の核酸との接触の前に富化されない。
いくつかの態様において、処理工程、例えば、単離、選択および/または富化、処理、形質導入および操作と関連付けたインキュベーション、刺激ならびに/または活性化および製剤化工程の1つまたは複数または全てが、統合型もしくは自給型システム、および/または自動化もしくはプログラム可能な様式のシステム、デバイスまたは装置を使用して行われる。いくつかの局面において、システムまたは装置は、システムまたは装置と通信しているコンピュータおよび/またはコンピュータプログラムを含み、それは、ユーザーが、処理、単離、操作および製剤化工程の様々な局面をプログラム、制御、結果の評価、および/または調整することを可能にする。一例として、システムは、国際特許出願公開番号WO2009/072003、またはUS 20110003380 A1に記載されているようなシステムである。一例として、システムは、国際公開番号WO2016/073602に記載されているようなシステムである。
いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞を含有する組成物を調製することとの関連付けを含めて、提供される方法と関連付けて細胞を調製、処理および/またはインキュベートすることと関連付けられる細胞処理工程の1つまたは複数を、他の利用可能な方法と比較してある特定の利点を提供することができる、一般に円筒の形状であり回転軸を中心に回転可能な遠心分離チャンバー、例えば、実質的に剛性のチャンバーの内部空洞で行うことができる。いくつかの態様において、全ての処理工程が、同じ遠心分離チャンバーで行われる。いくつかの態様において、1つまたは複数の処理工程が、同じタイプの複数の遠心分離チャンバーなどの異なる遠心分離チャンバーで行われる。そのような方法は、国際公開番号WO2016/073602に記載されているような方法のいずれかを含む。
例示的な遠心分離チャンバーは、A-200/FおよびA-200遠心分離チャンバーを含む、Sepax（登録商標）およびSepax（登録商標）2システムと共に使用するための遠心分離チャンバーを含めた、Biosafe SAによって生産および販売されている遠心分離チャンバー、ならびにそのようなシステムと共に使用するための様々なキットを含む。例示的なチャンバー、システムおよび処理機器およびキャビネットは、例えば、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および公開米国特許出願公開番号：US 2008/0171951、ならびに公開国際特許出願公開番号WO 00/38762に記載されており、その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。特定のプロセス（例えば、希釈、洗浄、形質導入、製剤化）に応じて、プロセスに適した特定のキットを選択することは、当業者の技能の範囲内である。そのようなシステムと共に使用するための例示的なキットは、BioSafe SAによって製品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1またはCS-900.2で販売されている単回使用キットを含むが、それに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、システムは、システムにおいて実施される様々な処理工程の局面を操作、自動化、制御および/またはモニタリングする機器を含めた他の機器と共に含まれ、かつ/または、それと関連して設置される。この機器は、いくつかの態様において、キャビネット内に含有される。いくつかの態様において、機器は、制御回路を含有する筺体、遠心分離機、カバー、モーター、ポンプ、センサー、ディスプレイおよびユーザーインターフェースを含む、キャビネットを含む。例示的なデバイスは、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号およびUS 2008/0171951に記載されている。
いくつかの態様において、システムは、一連の容器、例えば、バッグ、チューブ、ストップコック、クランプ、コネクターおよび遠心分離チャンバーを含む。いくつかの態様において、容器、例えば、バッグは、形質導入またはトランスフェクトされるべき細胞およびベクター粒子、例えば、ウイルスベクター粒子または非ウイルスプラスミドを同じ容器または別個の容器、例えば、同じバッグまたは別個のバッグに含有する1つまたは複数の容器、例えば、バッグを含む。いくつかの態様において、システムはさらに、成分および/または組成物を該方法の間に希釈、再懸濁および/または洗浄するためにチャンバーおよび/または他の構成要素に引き入れられた媒体、例えば、希釈剤および/または洗浄液を含有する1つまたは複数の容器、例えば、バッグを含む。容器は、システムにおける1つまたは複数の位置で、例えば、投入ライン、希釈ライン、洗浄ライン、廃棄ラインおよび/または排出ラインに対応する位置で接続することができる。
いくつかの態様において、システム、例えば閉鎖システムは、無菌である。いくつかの態様において、システムの構成要素の全ての接続、例えば、コネクターを介したチューブラインと容器との間の接続は、無菌条件下でなされる。いくつかの態様において、接続は、層流下でなされる。いくつかの態様において、接続は、無菌接続、例えば無菌溶接をチューブと容器との間に生じさせる無菌接続デバイスを使用してなされる。いくつかの態様において、無菌接続デバイスは、無菌性を維持するために十分に高い熱条件下で、例えば少なくとも200℃の温度、例えば少なくとも260℃または300℃で接続をもたらす。
いくつかの態様において、システムは、使い捨てキット、例えば、単回使用キットであってよい。いくつかの態様において、単回使用キットを、例えば、連続様式または半連続様式で行われるプロセスにおいて、1つまたは複数のプロセスの複数のサイクルで、例えば、少なくとも2回、3回、4回、5回または複数回で利用することができる。いくつかの態様において、システム、例えば、単回使用キットは、単一患者からの細胞を処理するために用いられる。該方法の局面において、プロセスは、同じ閉鎖システムにおいて、例えば、同じ遠心分離チャンバーにおいて実施される必要はないが、異なる閉鎖システム下で、例えば、異なる遠心分離チャンバーにおいて実施することができる；いくつかの態様において、そのような異なる遠心分離チャンバーは、該方法において、同じシステムと関連付けて位置付けられた、例えば、同じ遠心分離機と関連付けて位置付けられたそれぞれの点にある。いくつかの態様において、全ての処理工程は、各々の1つまたは複数の処理工程の全てまたはサブセットが、同じ遠心分離チャンバーまたは異なる遠心分離チャンバーにおいて実施される、閉鎖システムで実施される。
A. 試料および細胞の調製
本明細書において、組換え受容体を含有する操作された細胞を含めた細胞が提供される。また、そのような細胞の集団およびそのような細胞を含有する組成物も提供される。中でも、組成物は、細胞を含有するインプット組成物であって、1つまたは複数の細胞が、細胞とインキュベートまたは接触される1つまたは複数の粒子上に存在する結合分子が認識または結合ことができる組換え受容体を発現することが公知であるか、または発現する可能性がある、または発現するであろう、インプット組成物である。また、中でも、組成物は、提供される方法によって生産される組成物であって、粒子の結合分子により結合または認識される組換え受容体を含有する細胞が富化された組成物、例えば、組換え受容体、例えばキメラ受容体を発現する細胞が、組成物中の総細胞のあるいはT細胞またはCD8+もしくはCD4+細胞などの特定のタイプの細胞の少なくとも50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセントまたはより多くを構成する組成物を含め、刺激または増大された細胞が含有されるアウトプット組成物を含めた、組成物でもある。したがって、組換え受容体（例えば、CAR）を発現する遺伝子操作された細胞が提供される。
中でも、組成物は、投与のための、例えば養子細胞治療のための、薬学的組成物および製剤である。また、そのような細胞を操作、産生または作製するための方法、細胞および組成物を対象（例えば、患者）に投与するための治療方法、ならびにそのような細胞を検出、選択、単離または分離するための方法も提供される。
細胞は、一般に、哺乳動物細胞などの真核生物細胞であり、典型的には、ヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、血液、骨髄、リンパまたはリンパ系器官に由来し、自然免疫細胞または適応免疫細胞などの免疫系の細胞、例えば、骨髄系細胞またはリンパ系細胞（リンパ球を含む）であり、典型的には、T細胞および/またはNK細胞である。他の例示的な細胞は、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（iPSC）を含めた複能性幹細胞および多能性幹細胞を含む。
細胞は、典型的には、初代細胞、例えば、対象から直接単離された細胞、および/または、対象から単離され、凍結された細胞である。いくつかの態様において、細胞は、T細胞または他の細胞タイプの1つまたは複数のサブセット、例えば、全T細胞集団、CD4+細胞、CD8+細胞、およびそれらの亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化能、増大、再循環、局在化および/もしくは持続性についての潜在的能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官もしくは区画における存在、マーカーもしくはサイトカイン分泌プロフィル、ならびに/または分化の程度によって規定されるものを含む。処置されるべき対象に関して、細胞は、同種および/または自家であってよい。中でも、該方法は、既製の方法を含む。いくつかの局面において、例えば、既製の技術のために、細胞は、多能性および/または複能性であり、例えば、人工多能性幹細胞（iPSC）などの幹細胞である。
中でも、T細胞のサブタイプおよび亜集団ならびに/またはCD4+および/もしくはCD8+T細胞のサブタイプおよび亜集団は、ナイーブT(TN)細胞、エフェクターT細胞(TEFF)、メモリーT細胞およびそのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーT(TSCM)細胞、セントラルメモリーT(TCM)細胞、エフェクターメモリーT(TEM)細胞、または最終分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞、天然に存在する適応性の制御性T(Treg)細胞、ヘルパーT細胞、例えば、TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞ヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞、およびデルタ/ガンマT細胞である。
いくつかの態様において、細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞である。いくつかの態様において、細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄系細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、および/または好塩基球である。
いくつかの態様において、細胞は、細胞株、例えば、T細胞株に由来する。細胞は、いくつかの態様において、異種供給源から、例えば、マウス、ラット、ヒト以外の霊長類およびブタから得られる。
いくつかの態様において、細胞は、生物学的試料などの試料、例えば、対象から得られた試料または対象に由来する試料から単離されてよい。いくつかの態様において、細胞が単離される対象は、疾患もしくは病態を有するもの、または細胞治療を必要とするもの、または細胞治療が投与されるものである。対象は、いくつかの態様において、細胞が単離、処理および/または操作される養子細胞治療などの特定の治療的介入を必要とするヒトである。
したがって、細胞は、いくつかの態様において、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。試料は、対象から直接採取された組織、流体および他の試料も、分離、遠心分離、遺伝子操作（例えば、ウイルスベクターによる形質導入)、洗浄および/またはインキュベーションなどの1つまたは複数の処理工程から生じた試料も含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られた試料、または処理された試料であることができる。生物学的試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液、組織ならびに器官の試料（それらから生じる処理された試料を含む)を含むが、それに限定されるわけではない。
いくつかの例において、対象の循環血液由来の細胞が、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。特定の態様において、血液細胞は、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球および/または血小板を含めたリンパ球を含有し、いくつかの局面において、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。いくつかの態様において、細胞の選択および/または富化の前に、試料または試料中の細胞は、さらなる処理工程の前に休止させることも、保持することもできる。いくつかの態様において、試料は、2℃〜8℃または約2℃〜8℃の温度で最大48時間、例えば最大12時間、24時間または36時間、維持または保持される。特定の態様において、細胞は、細胞と1つまたは複数の核酸との接触の前に、選択および/または富化されない。いくつかの態様において、試料または細胞を、細胞と1つまたは複数の核酸との接触またはインキュベーションの前に、休止させることも、保持することもできる。特定の態様において、試料は、細胞と1つまたは複数の核酸との接触またはインキュベーションの前に、2℃〜8℃または約2℃〜8℃の温度で最大48時間、例えば最大12時間、24時間または36時間、維持または保持される。
いくつかの態様において、調製方法は、細胞を、細胞の単離、選択および/または富化、形質導入ならびに操作および/または刺激のためのインキュベーション、活性化および/または増大の前または後のいずれかに、凍結、例えば、冷凍保存するための工程を含む。いくつかの態様において、細胞は、例えば、血漿および血小板を除去する洗浄工程に続いて、凍結溶液中に懸濁される。いくつかの局面において、多種多様な公知の凍結溶液およびパラメータのいずれを使用してもよい。一例は、20％ DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、または他の好適な細胞凍結培地を使用することを伴う。次いで、これを、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10％および4％になるように培地で1：1希釈する。次いで、細胞を一般に、毎分1°の速度で-80℃まで凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保存する。
いくつかの態様において、細胞の単離は、1つまたは複数の調製および/または非親和性ベース細胞分離工程を含む。いくつかの例において、細胞は、例えば不要な成分を除去する、所望の成分を富化する、特定の試薬に感受性の細胞を溶解または除去するために、洗浄、遠心分離および/または1つまたは複数の試薬の存在下でインキュベートされる。いくつかの例において、細胞は、密度、付着性、サイズ、感受性および/または特定の成分に対する耐性などの1つまたは複数の性質に基づいて分離される。
いくつかの態様において、該方法は、密度に基づく細胞分離方法、例えば、赤血球を溶解することによる末梢血からの白血球の調製、およびパーコールまたはフィコール勾配による遠心分離を含む。
いくつかの態様において、単離方法は、表面マーカー（例えば、表面タンパク質）、細胞内マーカーまたは核酸などの1つまたは複数の特定の分子の細胞における発現または存在に基づく異なる細胞タイプの分離を含む。いくつかの態様において、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の公知の方法を使用してよい。いくつかの態様では、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、単離は、いくつかの局面において、1つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞の発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団の分離であって、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーションと一般にそれに続く洗浄工程および抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの抗体または結合パートナーに結合した細胞の分離による、分離を含む。
そのような分離工程は、試薬に結合した細胞がさらなる使用のために保持される陽性選択、および/または、抗体もしくは結合パートナーに結合しなかった細胞が保持される陰性選択に基づくことができる。いくつかの例において、両方の画分がさらなる使用のために保持される。いくつかの局面において、陰性選択は、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて分離が最も良好に行われるように、異種集団において細胞タイプを特異的に特定する抗体が利用可能ではない場合に特に有用であり得る。
分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の100％の富化または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定のタイプの細胞の陽性選択または富化は、そのような細胞の数または割合を増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な欠如をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞などの特定のタイプの細胞の陰性選択、除去または枯渇は、そのような細胞の数または割合を減少させることを指すが、そのような細胞全ての完全な除去をもたらす必要はない。
いくつかの例において、1回の工程から陽性または陰性選択された画分が、その後の陽性選択または陰性選択などの別の分離工程に供される、複数回の分離工程が行われる。いくつかの例において、各々が陰性選択の標的となるマーカーに特異的な複数の抗体または結合パートナーと細胞をインキュベートすることなどによって、複数のマーカーを同時に発現する細胞を単一の分離工程で枯渇させることができる。同様に、様々な細胞タイプ上に発現される複数の抗体または結合パートナーと細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞タイプを同時に陽性選択することができる。
例えば、いくつかの局面において、1つまたは複数の表面マーカーに陽性の細胞またはそれを高レベルで発現する細胞、例えばCD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+ T細胞のようなT細胞の特定の亜集団が、陽性または陰性選択技術によって単離される。
例えば、CD3+, CD28+ T細胞を、抗CD3/抗CD28コンジュゲート磁気ビーズ（例えば、DYNAビーズ（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を使用して陽性選択することができる。特定の態様において、細胞を、細胞と1つまたは複数の核酸との接触の前に、抗CD3/抗CD28コンジュゲート磁気ビーズ（例えば、DYNAビーズ（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）と接触させて、CD3+, CD28+ T細胞を増大させる。特定の態様において、細胞を、細胞と1つまたは複数の核酸との接触の前に、抗CD3/抗CD28コンジュゲート磁気ビーズと接触させない。
いくつかの態様において、単離は、陽性選択による特定の細胞集団の富化、または陰性選択による特定の細胞集団の枯渇によって行われる。いくつかの態様において、陽性選択または陰性選択は、それぞれ、陽性選択または陰性選択された細胞上に発現される1つまたは複数の表面マーカー（マーカー+）または比較的高いレベルで発現される1つまたは複数の表面マーカー（マーカーhigh）に特異的に結合する1つまたは複数の抗体または他の結合物質と細胞をインキュベートすることによって達成される。
いくつかの態様において、T細胞は、B細胞、単球または他の白血球などの非T細胞上に発現されるマーカー、例えばCD14の陰性選択によって、PBMC試料から分離される。いくつかの局面において、CD4+またはCD8+選択工程を使用して、CD4+ヘルパーT細胞とCD8+細胞傷害性T細胞を分離する。そのようなCD4+およびCD8+集団は、1つまたは複数のナイーブT細胞、メモリーT細胞および/またはエフェクターT細胞亜集団上に発現されるまたは比較的高い程度に発現されるマーカーについての陽性または陰性選択によって、さらに亜集団に分類することができる。
いくつかの態様において、CD8+細胞は、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性選択または陰性選択などによって、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリーおよび/またはセントラルメモリー幹細胞についてさらに富化または枯渇される。いくつかの態様において、セントラルメモリーT(TCM)細胞についての富化は、投与後の長期生存、増大および/または生着を改善するためなどの有効性を高めるために行われ、これは、いくつかの局面において、そのような亜集団において特に堅固である。Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。いくつかの態様において、TCMが富化されたCD8+ T細胞とCD4+ T細胞とを組み合わせることは、有効性をさらに増強する。
態様において、メモリーT細胞は、CD8+末梢血リンパ球のCD62L+およびCD62L-の両サブセットに存在する。例えば抗CD8抗体および抗CD62L抗体を使用して、PBMCを、CD62L-CD8+および/またはCD62L+CD8+画分について富化または枯渇させることができる。
いくつかの態様において、セントラルメモリーT(TCM)細胞についての富化は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3および/またはCD127の陽性または高表面発現に基づく；いくつかの局面において、それは、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現するまたは高発現する細胞についての陰性選択に基づく。いくつかの局面において、TCM細胞について富化されたCD8+集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、およびCD62Lを発現する細胞の陽性選択または富化によって行われる。一局面において、セントラルメモリーT(TCM)細胞についての富化は、CD4発現に基づいて選択された細胞の陰性画分から出発して、これをCD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択、ならびにCD62Lに基づく陽性選択に供して行われる。そのような選択は、いくつかの局面においては、同時に行われ、他の局面においては、連続的にいずれかの順序で行われる。いくつかの局面において、CD4に基づく分離からの陽性画分と陰性画分の両方が保持され、場合により1つまたは複数のさらなる陽性または陰性選択工程後に、該方法のその後の工程で使用されるように、CD8+細胞集団または亜集団を調製する際に使用される同じCD4発現に基づく選択工程をまた、CD4+細胞集団または亜集団を作製するために使用する。
特定の例において、PBMCの試料または他の白血球試料を、陰性画分と陽性画分の両方が保持されるCD4+細胞の選択に供する。次いで、陰性画分を、CD14およびCD45RAまたはCD19の発現に基づく陰性選択、ならびにCD62LまたはCCR7などのセントラルメモリーT細胞に特徴的なマーカーに基づく陽性選択に供し、この場合、陽性選択と陰性選択は、いずれかの順序で行われる。
CD4+ Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞およびエフェクター細胞に分類される。CD4+リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの態様において、ナイーブCD4+ Tリンパ球は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、およびCD4+ T細胞である。いくつかの態様において、セントラルメモリーCD4+細胞は、CD62L+およびCD45RO+である。いくつかの態様において、エフェクターCD4+細胞は、CD62L-およびCD45RO-である。
一例として、陰性選択によってCD4+細胞について富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DRおよびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様において、抗体または結合パートナーは、陽性および/または陰性選択のための細胞の分離を可能にするために磁気ビーズまたは常磁性ビーズなどの固体支持体またはマトリックスに結合される。例えば、いくつかの態様において、細胞および細胞集団 は、免疫磁気（または親和性磁気）分離技術（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher（著作権）Humana Press Inc., Totowa, NJに総説されている）を使用して分離または単離される。
いくつかの局面において、分離されるべき細胞の試料または組成物を、小型の磁化可能または磁気応答性材料、例えば磁気応答性粒子または微粒子、例えば常磁性ビーズ（例えばDynalbeadsまたはMACSビーズなど）とインキュベートする。磁気応答性材料、例えば、粒子は、一般に、分離することが望まれる、例えば、陰性または陽性選択することが望まれる1つの細胞もしくは複数の細胞または細胞集団上に存在する分子、例えば、表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば、抗体に、直接的または間接的に付着される。
いくつかの態様において、磁性粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合メンバーに結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離方法に使用される多くの周知の磁気応答性材料がある。好適な磁性粒子は、参照により本明細書に組み入れられる、Moldayの米国特許第4,452,773号および欧州特許明細書EP 452342 Bに記載されているものを含む。Owenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているものなどのコロイドサイズの粒子が他の例である。
インキュベーションは、一般に、磁性粒子もしくはビーズに付着している、抗体もしくは結合パートナー、またはそのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する二次抗体もしくは他の試薬などの分子が、試料中の細胞上に存在する場合、細胞表面分子に特異的に結合する条件下で行われる。
いくつかの局面において、試料を磁場中に置くと、磁気応答性粒子または磁化可能粒子が付着している細胞は、磁石に引きつけられ、非標識細胞から分離される。陽性選択の場合は、磁石に引きつけられた細胞が保持される；陰性選択の場合は、引きつけられない細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの局面において、陽性選択と陰性選択の組み合わせが同じ選択工程の間に行われ、この場合、陽性画分と陰性画分が保持され、さらに処理されるかまたはさらなる分離工程に供される。
特定の態様において、磁気応答性粒子は、一次抗体または他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素またはストレプトアビジンで被覆される。特定の態様において、磁性粒子は、1つまたは複数のマーカーに特異的な一次抗体の被覆を介して細胞に付着される。特定の態様において、ビーズではなく細胞を一次抗体または結合パートナーで標識し、次いで、細胞タイプ特異的二次抗体または他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）で被覆した磁性粒子を加える。特定の態様において、ストレプトアビジン被覆磁性粒子を、ビオチン化一次抗体または二次抗体と併せて使用する。
いくつかの態様において、磁気応答性粒子は、その後インキュベート、培養および/または操作されるべき細胞に付着したままである；いくつかの局面において、粒子は、患者への投与のための細胞に付着したままである。いくつかの態様において、磁化可能粒子または磁気応答性粒子は細胞から除去される。細胞から磁化可能粒子を除去するための方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、および磁化可能粒子または切断可能なリンカーにコンジュゲートされた抗体の使用を含む。いくつかの態様において、磁化可能粒子は、生分解性である。
いくつかの態様において、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（MACS）（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を介するものである。磁気活性化細胞選別（MACS）システムは、磁化粒子が付着した細胞の高純度の選択が可能である。特定の態様において、MACSは、外部磁場の印加後に非標的種と標的種が連続的に溶出されるモードで作動する。すなわち、磁化粒子に付着した細胞は、付着していない種が溶出されている間、適所に保持される。次いで、この最初の溶出工程が完了した後、磁場に捕捉されて溶出が妨げられていた種が、それらを溶出および回収できるような何らかの方法で解放される。特定の態様において、非標的細胞は、標識され、不均一な細胞集団から枯渇される。
特定の態様において、単離または分離は、該方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養および/または製剤化工程の1つまたは複数を実行するシステム、デバイスまたは装置を使用して行われる。いくつかの局面において、例えば、エラー、ユーザー操作および/または汚染を最小限に抑えるために、システムを使用して、これらの工程の各々を閉鎖環境または無菌環境で行う。一例として、システムは、国際特許出願公開番号WO2009/072003またはUS 20110003380 A1に記載されているようなシステムである。一例として、システムは、国際公開番号WO2016/073602に記載されているようなシステムである。
いくつかの局面において、分離および/または他の工程は、例えば、閉鎖系および無菌系における臨床規模レベルでの細胞の自動分離のために、CliniMACSシステム（Miltenyi Biotec）を使用して行われる。構成要素は、統合マイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプおよび様々なピンチバルブを含むことができる。統合コンピュータは、いくつかの局面において、機器の全ての構成要素を制御し、標準化された順序で反復手順を実行するようにシステムに指令を出す。磁気分離ユニットは、いくつかの局面において、可動永久磁石および選択カラム用ホルダーを含む。蠕動ポンプは、チューブセット全体の流速を制御し、ピンチバルブと共に、システムを通る緩衝液の制御された流れおよび細胞の継続的な懸濁を確実にする。
CliniMACSシステムは、いくつかの局面において、滅菌非発熱性溶液中に供給される抗体結合磁化可能粒子を使用する。いくつかの態様において、細胞を磁性粒子で標識した後、細胞を洗浄して、過剰の粒子を除去する。次いで、細胞調製バッグをチューブセットに接続し、これを、緩衝剤を含むバッグおよび細胞収集バッグに接続する。チューブセットは、プレカラムと分離カラムを含む予め組み立てられた滅菌チューブからなり、単回使用専用である。分離プログラムの開始後、システムは、細胞試料を自動的に分離カラム上に適用する。標識細胞は、カラム内に保持される一方で、非標識細胞は、一連の洗浄工程によって除去される。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、標識されておらず、カラム内に保持されない。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、標識されており、カラム内に保持される。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、磁場の除去後にカラムから溶出され、細胞収集バッグ内に収集される。
特定の態様において、分離および/または他の工程は、CliniMACS Prodigyシステム（Miltenyi Biotec）を使用して行われる。CliniMACS Prodigyシステムは、いくつかの局面において、遠心分離による細胞の自動洗浄および分画を可能にする細胞処理ユニットを備える。CliniMACS Prodigyシステムはまた、ソース細胞産物の巨視的層を識別することによって最適な細胞分画エンドポイントを判定する搭載カメラおよび画像認識ソフトウェアを含むこともできる。例えば、末梢血は、赤血球、白血球および血漿層に自動的に分離される。CliniMACS Prodigyシステムはまた、例えば、細胞分化および増大、抗原負荷ならびに長期細胞培養などの細胞培養プロトコールを達成する統合細胞培養チャンバーを含むこともできる。インプットポートは、培地の無菌除去および補充を可能にし、統合顕微鏡を使用して細胞をモニタリングすることができる。例えば、Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, および Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞集団は、フローサイトメトリーを介して収集および富化（または枯渇）され、フローサイトメトリーでは、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体流れ中で運ばれる。いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞集団は、分取規模（FACS）選別によって収集および富化（または枯渇）される。特定の態様において、本明細書に記載の細胞集団は、FACSに基づく検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（MEMS）チップの使用によって収集および富化（または枯渇）される（例えば、WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; および Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376を参照のこと）。どちらの場合も、細胞を複数のマーカーで標識することができ、それによって、明確に定義されたT細胞サブセットを高純度で単離することができる。
いくつかの態様において、抗体または結合パートナーは、陽性選択および/または陰性選択のための分離を容易にするために、1つまたは複数の検出可能なマーカーで標識される。例えば、分離は、蛍光標識抗体への結合に基づき得る。いくつかの例において、1つまたは複数の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、流体流れ中で、例えばフローサイトメトリー検出システムと組み合わせた、分取規模（FACS）および/または微小電気機械システム（MEMS）チップを含めた、蛍光活性化細胞選別（FACS）などによって行われる。そのような方法は、複数のマーカーに基づく陽性選択および陰性選択を同時に可能にする。
いくつかの態様において、細胞は、細胞を遺伝子操作する、例えば、細胞を形質導入またはトランスフェクトすることによるための1つまたは複数の工程の前に、活性化または刺激される。特定の態様において、細胞は、細胞を遺伝子操作するための1つまたは複数の工程の前に、刺激条件下で培養またはインキュベートされる。いくつかの態様において、刺激条件または刺激物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数の作用物質、例えば、リガンドを含む。いくつかの局面において、作用物質は、T細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを作動または開始させる。そのような作用物質は、TCRに特異的なものなどの抗体、例えば抗CD3を含むことができる。いくつかの態様において、刺激条件は、共刺激性受容体、例えば、抗CD28を刺激することができる1つまたは複数の作用物質、例えば、リガンドを含む。いくつかの態様において、そのような作用物質および/またはリガンドは、ビーズなどの固体支持体および/または1つまたは複数のサイトカインに結合されてよい。場合により、活性化または刺激は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を培養培地に（例えば、少なくとも約0.5ng/mlの濃度で）加える工程をさらに含んでよい。いくつかの態様において、刺激物質は、IL-2、IL-15および/またはIL-7を含む。いくつかの局面において、IL-2濃度は、少なくとも約10単位/mLである。
B. 異種タンパク質をコードする核酸
また、組換え受容体をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、核酸分子）、そのような受容体を発現するように細胞を遺伝子操作するためのベクター、および操作された細胞を生産するための方法が提供される。いくつかの態様において、ベクターは、組換え受容体をコードする核酸を含有する。特定の態様において、ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。いくつかの場合に、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。
いくつかの態様において、細胞は、細胞の事前活性化なしに、および/または、対象から細胞を得た後24時間以内に始まる期間内に、および/または、対象から細胞を得た後24時間以内に細胞が15℃〜25℃超、例えば37℃±2.0℃超もしくは約37℃±2.0℃超の温度に供されなかった場合に、ベクターと接触される。特定の態様において、ベクターは、最初の処理なしに、すなわち、細胞をウイルス粒子と接触またはインキュベートする前のおよび/またはそれと併せた、T細胞をエクスビボ刺激試薬（例えば、抗CD3/抗CD28試薬）で遺伝子操作（例えば、形質導入またはトランスフェクション）、活性化および/または刺激する前に、細胞に接触される。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスもしくはレンチウイルス、非ウイルスベクターまたはトランスポゾン、例えば、Sleeping Beautyトランスポゾン系、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクター、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、脾フォーカス形成ウイルス（SFFV）またはアデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクター、レトロウイルスベクターを含む。
いくつかの態様において、ウイルスベクターまたは非ウイルスDNAは、異種の組換えタンパク質をコードする核酸を含有する。いくつかの態様において、異種の組換え分子は、組換え受容体、例えば、抗原受容体、SB-トランスポゾン（例えば、遺伝子サイレンシングのための）、カプシド封入トランスポゾン、同種二本鎖核酸（例えば、ゲノム組換えのための）またはレポーター遺伝子（例えば、GFPまたはルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質）であるかまたはそれを含む。
いくつかの態様において、ウイルスベクターまたは非ウイルスDNAは、組換え受容体および/またはキメラ受容体、例えば異種の受容体タンパク質をコードする核酸を含有する。組換え受容体、例えば、異種の受容体は、抗原受容体、例えば、キメラ抗原受容体（CAR）を含めた機能的な非TCR抗原受容体、およびトランスジェニックT細胞受容体（TCR）などの他の抗原結合受容体を含んでよい。受容体はまた、他の受容体、例えば、他のキメラ受容体、例えば、特定のリガンドに結合してCAR中に存在するものと類似した膜貫通および/または細胞内シグナル伝達ドメインを有する受容体を含んでもよい。
いくつかの態様において、核酸は、ウイルスベクターのある領域に、例えば、一般にウイルスゲノムの非必須領域に、挿入または位置付けられる。いくつかの態様において、核酸は、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損であるウイルスを産生する。特定の態様において、核酸は、非ウイルスDNA内、例えば、トランスポゾン内に位置付けられる。
CARおよび組換えTCRを含む抗原受容体、ならびにそれらの生産および導入は、いくつかの態様において、例えば、国際特許出願公開番号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、米国特許出願公開番号US2002131960、US2013287748、US20130149337、米国特許第6,451,995号、第7,446,190号、第8,252,592号、第8,339,645号、第8,398,282号、第7,446,179号、第6,410,319号、第7,070,995号、第7,265,209号、第7,354,762号、第7,446,191号、第8,324,353号および第8,479,118号、ならびに欧州特許出願番号EP2537416に記載されているもの、ならびに/または、Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75に記載されているものを含む。
1. キメラ抗原受容体
いくつかの態様において、特定の抗原（またはマーカーまたはリガンド）、例えば、特定の細胞型の表面上に発現される抗原に対して特異性を有するCARを発現する操作された細胞、例えばT細胞が提供される。いくつかの態様において、抗原はポリペプチドである。いくつかの態様において、抗原は、糖質または他の分子である。いくつかの態様において、抗原は、正常のまたは非標的の細胞または組織と比較して、疾患または状態の細胞、例えば、腫瘍または病原性細胞上に選択的に発現されるか、または過剰発現される。他の態様において、抗原は、正常細胞上に発現され、かつ/または操作された細胞上に発現される。
特定の態様において、組換え受容体、例えばキメラ受容体は、細胞内シグナル伝達領域を含有し、これは、T細胞において一次活性化シグナルを誘導することができる細胞質（細胞内）領域などの細胞質シグナル伝達ドメイン（互換的に細胞内シグナル伝達ドメインとも呼ばれる）、例えば、T細胞受容体（TCR）構成要素の細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖のζ鎖の細胞質シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアントもしくはシグナル伝達部分）を含み、かつ/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む。
いくつかの態様において、キメラ受容体は、リガンド（例えば抗原）抗原に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインをさらに含有する。いくつかの態様において、キメラ受容体は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含有するCARである。いくつかの態様において、抗原などのリガンドは、細胞の表面上に発現されるタンパク質である。いくつかの態様において、CARはTCR様CARであり、抗原は、細胞内タンパク質のペプチド抗原などのプロセシングされたペプチド抗原であり、これは、TCRのように、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子に関連して細胞表面上で認識される。
CARを含む例示的な抗原受容体、およびそのような受容体を操作して細胞中に導入するための方法は、例えば、国際特許出願公開番号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、米国特許出願公開第2002131960号、同第2013287748号、同第20130149337号、米国特許第6,451,995号、同第7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319号、同第7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号、および同第8,479,118号、ならびに欧州特許出願番号EP2537416に記載されているもの、ならびに/または、Sadelain et al., Cancer Discov.2013 April；3（4）:388-398；Davila et al.（2013）PLoS ONE 8（4）:e61338；Turtle et al., Curr.Opin.Immunol.,2012 October；24（5）:633-39；Wu et al., Cancer,2012 March 18（2）:160-75によって記載されているものを含む。いくつかの局面において、抗原受容体は、米国特許第7,446,190号に記載されているCAR、および国際特許出願公開番号WO/2014055668 A1に記載されているものを含む。CARの例には、WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、米国特許第7,446,190号、米国特許第8,389,282号、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013)；Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)などの前述の刊行物のいずれかにおいて開示されているCARが含まれる。WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、米国特許第7,446,190号、および米国特許第8,389,282号も参照されたい。
いくつかの態様において、CARは、特定の抗原（またはマーカーまたはリガンド）、例えば、養子療法によって標的とされる特定の細胞型において発現される抗原、例えばがんマーカー、および/または正常細胞型もしくは非罹患細胞型上に発現される抗原などの減衰応答を誘導することが意図される抗原に対する特異性を備えて構築される。したがって、CARは、典型的には、その細胞外部分に、1つもしくは複数の抗原結合断片、ドメイン、もしくは一部分などの1つもしくは複数の抗原結合分子、または1つもしくは複数の抗体可変ドメイン、および/または抗体分子を含む。いくつかの態様において、CARは、モノクローナル抗体（mAb）の可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）に由来する一本鎖抗体断片（scFv）などの、抗体分子の1つまたは複数の抗原結合部分を含む。
いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合部分は、組換え受容体、例えば抗原受容体の一部として細胞上に発現される。抗原受容体の中には、機能的非TCR抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）がある。概して、ペプチド-MHC複合体に対してTCR様の特異性を示す抗体または抗原結合断片を含有するCARはまた、TCR様CARとも呼ばれ得る。いくつかの態様において、TCR様CARのMHC-ペプチド複合体に特異的な細胞外抗原結合ドメインは、いくつかの局面においてはリンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成要素に連結されている。いくつかの態様において、そのような分子は、典型的には、TCRなどの天然の抗原受容体を介するシグナル、および任意で、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を介するシグナルを模倣するかまたは近似することができる。
いくつかの態様において、組換え受容体、例えばキメラ受容体（例えばCAR）は、抗原（またはリガンド）に結合する、例えば特異的に結合するリガンド結合ドメインを含む。キメラ受容体によって標的とされる抗原の中には、養子細胞療法を介して標的とされる疾患、状態、または細胞型に関連して発現されるものがある。疾患および状態の中には、血液がん、免疫系のがん、例えば、B、Tおよび骨髄性の白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫などのリンパ腫、白血病、および/または骨髄腫を含むがんおよび腫瘍を含む、増殖性、新生物性、および悪性の疾患および障害がある。
いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）はポリペプチドである。いくつかの態様において、抗原は、糖質または他の分子である。いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）は、正常のまたは非標的の細胞または組織と比較して、疾患または状態の細胞、例えば、腫瘍または病原性細胞上に選択的に発現されるか、または過剰発現される。他の態様において、抗原は、正常細胞上に発現され、かつ/または操作された細胞上に発現される。
いくつかの態様において、CARは、細胞の表面上に発現される抗原、例えばインタクトな抗原を特異的に認識する、抗体または抗原結合断片（例えばscFv）を含有する。
いくつかの態様において、抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られている）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質結合受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD(NKG2D)リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG、5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼまたはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子であるかまたはそれを含む。受容体の標的となる抗原は、いくつかの態様において、任意の多数の公知のB細胞マーカーなどのB細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79bまたはCD30であるかまたはそれを含む。
いくつかの態様において、抗原は病原体特異的抗原である。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス抗原（例えばHIV、HCV、HBVなど由来のウイルス抗原）、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。
いくつかの態様において、CARは、TCR様抗体、例えば、細胞表面上にMHC-ペプチド複合体として提示される腫瘍関連抗原などの細胞内抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合断片（例えばscFv）を含有する。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、組換え受容体、例えば抗原受容体の一部として細胞上に発現されることができる。抗原受容体の中には、機能的非TCR抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）がある。概して、ペプチド-MHC複合体に対してTCR様の特異性を示す抗体または抗原結合断片を含有するCARはまた、TCR様CARとも呼ばれ得る。
「主要組織適合遺伝子複合体」（MHC）への言及は、いくつかの場合には、細胞機構によってプロセシングされたペプチド抗原を含むポリペプチドのペプチド抗原と複合体を形成することができる、多型ペプチド結合部位または結合溝を含有するタンパク質、概して糖タンパク質を指す。いくつかの場合には、MHC分子は、TCRまたはTCR様抗体などの、T細胞上の抗原受容体が認識可能な立体配座での抗原の提示のために、ペプチドとの複合体、すなわちMHC-ペプチド複合体としてのものを含めて、細胞表面上に表示されるかまたは発現されることができる。概して、MHCクラスI分子は、いくつかの場合には3つのαドメインを備える膜貫通α鎖、および非共有結合したβ2ミクログロブリンを有するヘテロ二量体である。概して、MHCクラスII分子は、2つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβから構成され、それらは両方とも、典型的には膜を貫通している。MHC分子は、ペプチドに結合するための1つまたは複数の抗原結合部位、および適切な抗原受容体による認識に必要な配列を含有するMHCの有効部分を含むことができる。いくつかの態様において、MHCクラスI分子は、サイトゾルが起源であるペプチドを細胞表面に送達し、ここでMHC-ペプチド複合体は、概してCD8+ T細胞であるが、いくつかの場合にはCD4+ T細胞などのT細胞によって認識される。いくつかの態様において、MHCクラスII分子は、小胞系が起源であるペプチドを細胞表面に送達し、ここでそれらは、典型的にはCD4+ T細胞によって認識される。概して、MHC分子は、マウスではH-2、ヒトではヒト白血球抗原（HLA）と総称される一群の連鎖する遺伝子座によってコードされる。したがって、典型的には、ヒトMHCはまた、ヒト白血球抗原（HLA）とも呼ばれ得る。
「MHC-ペプチド複合体」もしくは「ペプチド-MHC複合体」という用語またはその変形は、例えば、概して、MHC分子の結合溝または裂におけるペプチドの非共有結合性相互作用による、ペプチド抗原とMHC分子との複合体または会合を指す。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、細胞の表面上に存在するかまたは表示される。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、抗原受容体、例えばTCR、TCR様CAR、またはその抗原結合部分によって特異的に認識されることができる。
いくつかの態様において、ポリペプチドの、ペプチド抗原またはエピトープなどのペプチドは、例えば抗原受容体による認識のために、MHC分子と会合することができる。概して、ペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質などのより長い生物学的分子の断片に由来するか、またはそれに基づく。いくつかの態様において、ペプチドは、典型的には、長さが約8〜約24アミノ酸である。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスII複合体における認識のために、9〜22アミノ酸または約9〜22アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスI複合体における認識のために、8〜13アミノ酸または約8〜13アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体などのMHC分子に関連したペプチドの認識時に、抗原受容体、例えばTCRまたはTCR様CARは、T細胞増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性T細胞応答、または他の応答などのT細胞応答を誘導する、T細胞への活性化シグナルを生じるかまたは誘発する。
いくつかの態様において、TCR様抗体または抗原結合部分は、当技術分野で公知であるか、または当技術分野で公知の方法によって作製することができる（例えば、米国特許出願公開第2002/0150914号；同第2003/0223994号；同第2004/0191260号；同第2006/0034850号；同第2007/00992530号；同第20090226474号；同第20090304679号；および国際PCT公開番号WO 03/068201を参照されたい）。
いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、特異的なMHC-ペプチド複合体を含有する有効量の免疫原で宿主を免疫することによって作製することができる。いくつかの場合には、MHC-ペプチド複合体のペプチドは、MHCに結合することができる抗原、例えば腫瘍抗原、例えば、ユニバーサル腫瘍抗原、骨髄腫抗原、または以下に記載される他の抗原のエピトープである。いくつかの態様において、次いで、免疫応答を惹起するために有効量の免疫原を宿主に投与し、ここで免疫原は、MHC分子の結合溝におけるペプチドの三次元提示に対する免疫応答を惹起するのに十分な期間、その三次元形態を保持する。次いで、宿主から収集した血清をアッセイして、MHC分子の結合溝におけるペプチドの三次元提示を認識する所望の抗体が生じているかどうかを判定する。いくつかの態様において、生じた抗体を評価して、抗体が、MHC分子単独、関心対象のペプチド単独、およびMHCと無関係なペプチドとの複合体からMHC-ペプチド複合体を識別できることを確認することができる。次いで、所望の抗体を単離することができる。
いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、ファージ抗体ライブラリなどの抗体ライブラリディスプレイ法を使用することによって作製できる。いくつかの態様において、例えば、ライブラリのメンバーが1つまたは複数のCDRの1個または複数個の残基で変異している、変異体Fab、scFv、または他の抗体型のファージディスプレイライブラリを生成することができる。例えば、米国特許出願公開第20020150914号、同第2014/0294841号；およびCohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332を参照されたい。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、インタクト抗体、ならびに断片抗原結合（Fab）断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、組換えIgG（rIgG）断片、抗原に特異的に結合することができる可変重鎖（VH）領域、一本鎖可変断片（scFv）を含む一本鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ）断片を含む機能的（抗原結合）抗体断片を含む、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作されたおよび/または他の方法で改変された形態、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムdi-scFv、タンデムtri-scFvを包含する。特に明記されない限り、「抗体」という用語は、その機能的抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、IgGならびにそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、およびIgDを含む任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、インタクトなまたは完全長の抗体も包含する。
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質、抗体、およびその抗原結合断片は、完全長抗体の抗原を特異的に認識する。いくつかの態様において、抗体の重鎖および軽鎖は、完全長であることができ、または抗原結合部分（Fab、F(ab')2、Fv、もしくは一本鎖Fv断片（scFv））であることができる。他の態様において、抗体重鎖定常領域は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、およびIgEから選択され、特に、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、より詳細にはIgG1（例えばヒトIgG1）から選択される。別の態様において、抗体軽鎖定常領域は、例えば、κまたはλ、特にκから選択される。
提供される抗体の中には、抗体断片がある。「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；直鎖抗体；可変重鎖（VH）領域、scFvおよび単一ドメインVH単一抗体などの一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されない。特定の態様において、抗体は、scFvなどの、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体断片である。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は概して、類似した構造を有し、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域（FR）および3つのCDRを含む。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。）単一のVHまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、抗原に結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを用いて単離して、それぞれ相補的なVLまたはVHドメインのライブラリをスクリーニングしてもよい。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、CARは、抗原、例えばがんマーカーまたは標的とされる細胞もしくは疾患、例えば腫瘍細胞もしくはがん細胞の細胞表面抗原、例えば本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の標的抗原のいずれかに特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む。
抗体断片は、インタクト抗体のタンパク質分解消化、および組換え宿主細胞による産生を含むがそれらに限定されない、様々な技法によって作ることができる。いくつかの態様において、抗体は、組換え生産された断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された2つ以上の抗体領域もしくは鎖を有するものなどの、天然には存在しない配置、および/または天然に存在するインタクト抗体の酵素消化によっては生じ得ない配置を含む断片である。いくつかの態様において、抗体断片はscFvである。
「ヒト化」抗体は、すべてのまたは実質的にすべてのCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由来し、すべてのまたは実質的にすべてのFRアミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。非ヒト抗体の「ヒト化型」は、典型的には、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるために、ヒト化を受けている非ヒト抗体のバリアントを指す。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復するかまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、CDR残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
したがって、いくつかの態様において、TCR様CARを含むキメラ抗原受容体は、抗体または抗体断片を含有する細胞外部分を含む。いくつかの態様において、抗体または断片は、scFvを含む。いくつかの局面において、キメラ抗原受容体は、抗体または断片を含有する細胞外部分、および細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞において一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）構成要素のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む。
いくつかの態様において、組換え受容体、例えばCAR、例えばその抗体部分は、スペーサーをさらに含み、これは、ヒンジ領域、例えば、IgG4ヒンジ領域、ならびに/またはCH1/CLおよび/もしくはFc領域などの、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは改変バージョンの少なくとも一部分であってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの態様において、組換え受容体は、スペーサーおよび/またはヒンジ領域をさらに含む。いくつかの態様において、定常領域または一部分は、IgG4またはIgG1などのヒトIgGのものである。いくつかの局面において、定常領域の一部分は、抗原認識構成要素、例えばscFvと膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として働く。スペーサーは、スペーサーの非存在下と比較して、抗原結合後に増加した細胞の応答性を提供する長さのものであることができる。いくつかの例において、スペーサーは、12アミノ酸もしくは約12アミノ酸の長さであるか、または12アミノ酸以下の長さである。例示的なスペーサーには、少なくとも約10〜229アミノ酸、約10〜200アミノ酸、約10〜175アミノ酸、約10〜150アミノ酸、約10〜125アミノ酸、約10〜100アミノ酸、約10〜75アミノ酸、約10〜50アミノ酸、約10〜40アミノ酸、約10〜30アミノ酸、約10〜20アミノ酸、または約10〜15アミノ酸を有する、および列挙された範囲のいずれかの両端の値の間の任意の整数を含むものが含まれる。いくつかの態様において、スペーサー領域は、約12アミノ酸以下、約119アミノ酸以下、または約229アミノ酸以下を有する。例示的なスペーサーには、IgG4ヒンジ単独、CH2およびCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジが含まれる。例示的なスペーサーには、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153または国際特許出願公開番号WO2014031687に記載されているものが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:133に示される配列を有し、SEQ ID NO:134に示される配列によってコードされる。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:135に示される配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:136に示される配列を有する。
いくつかの態様において、定常領域または一部分は、IgDのものである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:137に示される配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:133、135、136、および137のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。
抗原認識ドメインは概して、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成要素、例えば、CARの場合には、TCR複合体などの抗原受容体複合体を介する活性化、および/または別の細胞表面受容体を介するシグナルを模倣するシグナル伝達構成要素に連結されている。したがって、いくつかの態様において、抗原結合構成要素（例えば抗体）は、1つまたは複数の膜貫通領域および細胞内シグナル伝達領域に連結されている。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、細胞外ドメインに融合されている。1つの態様において、受容体、例えばCAR中のドメインのうちの1つと天然で会合している膜貫通ドメインが用いられる。いくつかの例において、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように、選択されるかまたはアミノ酸置換によって改変される。
いくつかの態様における膜貫通ドメインは、天然の供給源または合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、いくつかの局面におけるドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域には、T細胞受容体のα、β、またはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来する（すなわち、少なくともその膜貫通領域を含む）ものが含まれる。あるいは、いくつかの態様における膜貫通ドメインは合成である。いくつかの局面において、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。いくつかの局面において、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。いくつかの態様において、連結は、リンカー、スペーサー、および/または膜貫通ドメインによるものである。
細胞内シグナル伝達領域の中には、天然の抗原受容体を介するシグナル、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を介するシグナル、および/または共刺激受容体のみを介するシグナルを模倣するかまたは近似するものがある。いくつかの態様において、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば、グリシンおよびセリンを含有するもの、例えばグリシン-セリンダブレットなどの2〜10アミノ酸の長さのリンカーが存在し、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に連結を形成する。
受容体、例えばCARは、概して、少なくとも1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成要素を含む。いくつかの態様において、受容体は、T細胞活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖、例えばCD3ζ鎖などのTCR複合体の細胞内構成要素を含む。したがって、いくつかの局面において、CARの抗原結合ドメインは、1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結されている。いくつかの態様において、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、受容体、例えばCARは、Fc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16などの1つまたは複数の追加の分子の一部分をさらに含む。例えば、いくつかの局面において、CARは、CD3ゼータ（CD3ζ）またはFc受容体γとCD8、CD4、CD25、またはCD16との間のキメラ分子を含む。
いくつかの態様において、CARの連結時に、CARの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達領域は、免疫細胞、例えば、CARを発現するように操作されたT細胞の正常なエフェクター機能または応答のうちの少なくとも1つを活性化する。例えば、いくつかの状況において、CARは、T細胞の機能、例えば細胞溶解活性またはTヘルパー活性、例えばサイトカインまたは他の因子の分泌を誘導する。いくつかの態様において、抗原受容体構成要素または共刺激分子の細胞内シグナル伝達領域の切断部分が、例えば、それがエフェクター機能シグナルを伝達する場合、インタクトな免疫刺激鎖の代わりに用いられる。いくつかの態様において、1つまたは複数の細胞内ドメインを例えば含む細胞内シグナル伝達領域は、T細胞受容体（TCR）の細胞質配列を含み、およびいくつかの局面においてはまた、天然の状況でそのような受容体と協調的に作用して、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始する共受容体のもの、および/またはそのような分子の任意の誘導体もしくはバリアント、および/または同じ機能的能力を有する任意の合成配列も含む。
天然のTCRに関連して、完全な活性化は概して、TCRを介するシグナル伝達だけではなく、共刺激シグナルも必要とする。したがって、いくつかの態様において、完全な活性化を促進するために、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための構成要素もCARに含まれる。他の態様において、CARは、共刺激シグナルを生成するための構成要素を含まない。いくつかの局面において、追加のCARが、同じ細胞において発現され、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための構成要素を提供する。
T細胞活性化は、いくつかの局面において、2つのクラスの細胞質シグナル伝達配列：TCRを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、および抗原非依存性の様式で作用して、二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると説明される。いくつかの局面において、CARは、そのようなシグナル伝達構成要素の一方または両方を含む。
いくつかの局面において、CARは、TCR複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはITAMとして公知であるシグナル伝達モチーフを含有してもよい。ITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例には、TCRまたはCD3ζ、FcRγまたはFcRβに由来するものが含まれる。いくつかの態様において、CAR中の細胞質シグナル伝達分子は、CD3ζに由来する細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部分、または配列を含有する。
いくつかの態様において、CARは、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、およびICOSなどの、共刺激受容体のシグナル伝達領域および/または膜貫通部分を含む。いくつかの局面において、同じCARが、シグナル伝達領域および共刺激構成要素を両方とも含む。
いくつかの態様において、シグナル伝達領域は、1つのCAR内に含まれ、他方、共刺激構成要素は、別の抗原を認識する別のCARによって提供される。いくつかの態様において、CARは、活性化CARまたは刺激CAR、および共刺激CARを含み、両方とも同じ細胞上で発現される（WO2014/055668を参照されたい）。
ある特定の態様において、細胞内シグナル伝達領域は、CD3（例えばCD3ζ）細胞内ドメインに連結されたCD28膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、CD3ζ細胞内ドメインに連結された、キメラCD28およびCD137（4-1BB、TNFRSF9）共刺激ドメインを含む。
いくつかの態様において、CARは、細胞質部分に、1つまたは複数の、例えば、2つ以上の共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを包含する。例示的なCARには、CD3ζ、CD28、および4-1BBの細胞内構成要素が含まれる。
いくつかの場合には、CARは、第一世代、第二世代、および/または第三世代のCARと呼ばれる。いくつかの局面において、第一世代のCARは、抗原結合時にCD3鎖誘導シグナルを提供するだけのものである；いくつかの局面において、第二世代のCARは、そのようなシグナルおよび共刺激シグナルを提供するもの、例えば、CD28またはCD137などの共刺激受容体由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含むものである；いくつかの局面において、いくつかの局面における第三世代のCARは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載される抗体または断片を含有する細胞外部分を含む。いくつかの局面において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載される抗体または断片を含有する細胞外部分、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体または断片は、scFvまたは単一ドメインVH抗体を含み、細胞内ドメインは、ITAMを含有する。いくつかの局面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖のζ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間に配置された膜貫通ドメインを含む。
いくつかの局面において、膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通部分を含有する。細胞外ドメインと膜貫通ドメインとは、直接または間接的に連結されることができる。いくつかの態様において、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとは、本明細書に記載されるいずれかなどのスペーサーによって連結されている。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを、例えば膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に含有する。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子は、CD28または4-1BBである。
いくつかの態様において、CARは、抗体、例えば抗体断片、CD28の膜貫通部分またはその機能的バリアントであるかまたはそれを含有する膜貫通ドメイン、ならびにCD28のシグナル伝達部分またはその機能的バリアントおよびCD3ζのシグナル伝達部分またはその機能的バリアントを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの態様において、CARは、抗体、例えば抗体断片、CD28の膜貫通部分またはその機能的バリアントであるかまたはそれを含有する膜貫通ドメイン、ならびに4-1BBのシグナル伝達部分またはその機能的バリアントおよびCD3ζのシグナル伝達部分またはその機能的バリアントを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかのそのような態様において、受容体は、ヒトIg分子などのIg分子の一部分、例えばIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジを含有するスペーサー、例えばヒンジのみのスペーサーをさらに含む。
いくつかの態様において、受容体、例えばCARの膜貫通ドメインは、ヒトCD28の膜貫通ドメインまたはそのバリアント、例えば、ヒトCD28（アクセッション番号P10747.1）の27アミノ酸膜貫通ドメインであるか、または、SEQ ID NO:138に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:138に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインであり；いくつかの態様において、組換え受容体の膜貫通ドメイン含有部分は、SEQ ID NO:139に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとももしくは約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子は、CD28または4-1BBである。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、ヒトCD28の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアントもしくは一部分、例えば、その41アミノ酸ドメインおよび/または天然CD28タンパク質の位置186〜187にLLからGGへの置換を有するそのようなドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:140もしくは141に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:140もしくは141に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、細胞内領域は、4-1BBの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアントもしくは一部分、例えば、ヒト4-1BB（アクセッション番号Q07011.1）の42アミノ酸細胞質ドメインまたはその機能的バリアントもしくは一部分、例えば、SEQ ID NO:142に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:142に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、ヒトCD3鎖、任意でCD3ζ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアント、例えば、ヒトCD3ζのアイソフォーム3（アクセッション番号P20963.2）の112 AAの細胞質ドメイン、または米国特許第7,446,190号もしくは米国特許第8,911,993号に記載されているCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、SEQ ID NO:143、144、もしくは145に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:143、144、もしくは145に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの局面において、スペーサーは、IgGのヒンジ領域のみ、例えばIgG4またはIgG1のヒンジのみ、例えば、SEQ ID NO:133に示されるヒンジのみのスペーサーを含有する。他の態様において、スペーサーは、CH2および/またはCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:135に示されるような、CH2およびCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:136に示されるような、CH3ドメインのみに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列または他のフレキシブルリンカー、例えば公知のフレキシブルリンカーであるかまたはそれを含む。
いくつかの態様において、組換え受容体、例えば、CARまたは他の抗原受容体はさらに、短縮EGFR（tEGFR）などの細胞表面受容体の短縮バージョンなどの受容体を発現させるための細胞の形質導入または操作を確認するために使用され得る、細胞表面マーカーなどのマーカーを含む。いくつかの局面において、マーカーは、CD34、NGFR、または上皮増殖因子受容体（例えば、tEGFR）の全てまたは一部（例えば、短縮型）を含む。特定の態様において、tEGFRは、SEQ ID NO：147または148に示されるアミノ酸配列を含有する。特定の態様において、tEGFRは、SEQ ID NO：147または148に示される配列と75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％もしくは99％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％もしくは約99％、または少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する。いくつかの態様において、マーカーをコードする核酸は、リンカー配列、例えば切断可能リンカー配列（例えばT2A）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。例えば、マーカー、および場合によりリンカー配列は、公開特許出願第WO2014031687号に開示されているようないずれかであることができる。例えば、マーカーは、場合によりリンカー配列、例えばT2A切断可能リンカー配列に連結された、短縮EGFR（tEGFR）であることができる。
核酸分子が2つ以上の異なるポリペプチド鎖をコードするある特定の場合に、ポリペプチド鎖の各々は、別個の核酸分子によってコードされることができる。例えば、2つの別個の核酸が提供され、各々を、細胞における発現のために細胞に個々に移入または導入することができる。
ポリヌクレオチドが第一の核酸配列および第二の核酸配列を含有する態様などのいくつかの態様において、異なるポリペプチド鎖の各々をコードするコード配列を、同じであっても異なっていてもよいプロモーターに機能的に連結させることができる。いくつかの態様において、核酸分子は、2つ以上の異なるポリペプチド鎖の発現を駆動するプロモーターを含有することができる。いくつかの態様において、そのような核酸分子は、マルチシストロン性（バイシストロン性またはトリシストロン性、例えば、米国特許第6,060,273号を参照のこと）であることができる。いくつかの態様において、単一のプロモーターからのメッセージによって遺伝子産物（例えば、PSMAまたはその改変形態をコードするものおよび組換え受容体をコードするもの）の共発現を可能にする、IRES（内部リボソーム進入部位）を含有するバイシストロン性ユニットとして、転写ユニットを操作することができる。あるいは、いくつかの場合に、単一のプロモーターは、自己切断ペプチドをコードする配列（例えば、2A配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フーリン）をコードする配列によって互いに分離された2または3つの遺伝子（例えば、PSMAまたはその改変形態をコードするものおよび組換え受容体をコードするもの）を単一のオープンリーディングフレーム（ORF）に含有するRNAの発現を指令し得る。したがって、ORFは、翻訳の間（2Aの場合）またはその後のいずれかに個々のタンパク質にプロセシングされる、単一のポリペプチドをコードする。いくつかの場合に、T2Aなどのペプチドは、リボソームに、2AエレメントのC末端でのペプチド結合の合成をスキップさせることができ（リボソームスキッピング）、それによって、2A配列の端と次のペプチド下流との間の分離を導くことができる（例えば、de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) および deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004) を参照のこと）。様々な2Aエレメントが公知である。本明細書に開示の方法およびシステムにおいて使用できる2A配列の例は、非限定的に、米国特許公開番号20070116690に記載されているような、口蹄疫ウイルス由来の2A配列（F2A、例えば、SEQ ID NO：32）、ウマ鼻炎Aウイルス由来の2A配列（E2A、例えば、SEQ ID NO：153）、Thosea asignaウイルス由来の2A配列（T2A、例えば、SEQ ID NO：146または149）、およびブタテッショウウイルス-1由来の2A配列（P2A、例えば、SEQ ID NO：151または152）を含む。
2. T細胞受容体（TCR）
いくつかの態様において、腫瘍の抗原、ウイルスまたは自己免疫タンパク質などの標的ポリペプチドのペプチドエピトープまたはT細胞エピトープを認識するT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合部分を発現する操作された細胞、例えばT細胞が提供される。
いくつかの態様において、「T細胞受容体」または「TCR」は、可変α鎖およびβ鎖（それぞれ、TCRαおよびTCRβとしても知られる）もしくは可変γ鎖およびδ鎖（それぞれ、TCRαおよびTCRβとしても知られる）、またはその抗原結合部分を含有し、MHC分子に結合したペプチドに特異的に結合することができる分子である。いくつかの態様において、TCRはαβ形態である。典型的には、αβ形態およびγδ形態で存在するTCRは概して、構造的に類似しているが、それらを発現するT細胞は、別個の解剖学的場所または機能を有し得る。TCRは、細胞の表面上にまたは可溶型で見出されることができる。概して、TCRは、T細胞（またはTリンパ球）の表面上に見出され、ここで概して、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子に結合した抗原を認識することを担う。
特に明記されない限り、「TCR」という用語は、完全なTCR、およびその抗原結合部分または抗原結合断片を包含すると理解されるべきである。いくつかの態様において、TCRは、αβ形態またはγδ形態のTCRを含む、インタクトなまたは完全長のTCRである。いくつかの態様において、TCRは、完全長未満のTCRであるが、MHC分子に結合した特異的なペプチドに結合する、例えば、MHC-ペプチド複合体に結合する抗原結合部分である。いくつかの場合には、TCRの抗原結合部分または断片は、完全長またはインタクトなTCRの構造ドメインの一部分のみを含有することができるが、それでもなお、完全なTCRが結合するMHC-ペプチド複合体などのペプチドエピトープに結合することができる。いくつかの場合には、抗原結合部分は、特異的なMHC-ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なTCRの可変ドメイン、例えばTCRの可変α鎖および可変β鎖を含有する。概して、TCRの可変鎖は、ペプチド、MHC、および/またはMHC-ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域を含有する。
いくつかの態様において、TCRの可変ドメインは、概して抗原認識ならびに結合能力および特異性への主たる寄与因子である、超可変ループまたは相補性決定領域（CDR）を含有する。いくつかの態様において、TCRのCDRまたはそれらの組み合わせは、所与のTCR分子の抗原結合部位のすべてまたは実質的にすべてを形成する。TCR鎖の可変領域内の様々なCDRは概して、CDRと比較してTCR分子の間でより低い変動性を概して示すフレームワーク領域（FR）によって分離されている（例えば、Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990；Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988を参照されたい；またLefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003も参照されたい）。いくつかの態様において、CDR3は、抗原結合もしくは特異性を担う主なCDRであるか、または抗原認識のため、および/もしくはペプチド-MHC複合体のプロセシングされたペプチド部分との相互作用のために、所与のTCR可変領域上の3つのCDRの中で最も重要である。いくつかの状況において、α鎖のCDR1は、ある特定の抗原ペプチドのN末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況において、β鎖のCDR1は、ペプチドのC末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況において、CDR2は、MHC-ペプチド複合体のMHC部分との相互作用またはMHC部分の認識に最も強く寄与するか、またはそれを担う主たるCDRである。いくつかの態様において、β鎖の可変領域は、概してスーパー抗原結合に関与し、抗原認識には関与しないさらなる超可変領域（CDR4またはHVR4）を含有することができる（Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426）。
いくつかの態様において、TCRはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または短い細胞質尾部も含有することができる（例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照されたい）。いくつかの局面において、TCRの各鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびC末端に短い細胞質尾部を保有することができる。いくつかの態様において、TCRは、シグナル伝達の媒介に関与するCD3複合体のインバリアントタンパク質と会合している。
いくつかの態様において、TCR鎖は、1つまたは複数の定常ドメインを含有する。例えば、所与のTCR鎖（例えば、α鎖またはβ鎖）の細胞外部分は、2つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば可変ドメイン（例えば、VαまたはVβ；典型的にはKabatナンバリングに基づくアミノ酸1〜116、Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.）、および細胞膜に隣接する定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインもしくはCα、典型的にはKabatナンバリングに基づく鎖の位置117〜259、またはβ鎖定常ドメインもしくはCβ、典型的にはKabatに基づく鎖の位置117〜295）を含有することができる。例えば、いくつかの場合には、2本の鎖によって形成されるTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメイン、および2つの膜遠位可変ドメインを含有し、この可変ドメインは各々、CDRを含有する。TCRの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによってTCRの2本の鎖を連結する短い接続配列を含有し得る。いくつかの態様において、TCRが定常ドメイン中に2つのジスルフィド結合を含有するように、TCRは、α鎖およびβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有し得る。
いくつかの態様において、TCR鎖は膜貫通ドメインを含有する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは正に荷電している。いくつかの場合には、TCR鎖は細胞質尾部を含有する。いくつかの場合には、その構造は、TCRがCD3およびそのサブユニットのような他の分子と会合することを可能にする。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含有するTCRは、タンパク質を細胞膜に固定し、CD3シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合し得る。CD3シグナル伝達サブユニット（例えば、CD3γ、CD3δ、CD3ε、およびCD3ζ鎖）の細胞内尾部は、TCR複合体のシグナル伝達能力に関与する1つまたは複数の免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはITAMを含有する。
いくつかの態様において、TCRは、2本の鎖αおよびβ（または任意でγおよびδ）のヘテロ二量体であり得るか、または一本鎖TCR構築物であり得る。いくつかの態様において、TCRは、例えば1つまたは複数のジスルフィド結合によって連結されている、2本の別々の鎖（α鎖およびβ鎖、またはγ鎖およびδ鎖）を含有するヘテロ二量体である。
いくつかの態様において、TCRは、実質的に完全長のコード配列が容易に入手可能である、Vα、β鎖の配列などの公知のTCR配列から生成することができる。V鎖配列を含む完全長TCR配列を細胞供給源から得るための方法は、周知である。いくつかの態様において、TCRをコードする核酸は、例えば、所与の1つまたは複数の細胞内のもしくは細胞から単離されたTCRコード核酸のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、または公的に入手可能なTCR DNA配列の合成によって、様々な供給源から得ることができる。
いくつかの態様において、TCRは、生物学的供給源から、例えば細胞から、例えば、T細胞（例えば細胞傷害性T細胞）、T細胞ハイブリドーマ、または他の公的に入手可能な供給源から得られる。いくつかの態様において、T細胞は、インビボで単離された細胞から得ることができる。いくつかの態様において、TCRは、胸腺的に選択されたTCRである。いくつかの態様において、TCRは、ネオエピトープ拘束性TCRである。いくつかの態様において、T細胞は、培養されたT細胞ハイブリドーマまたはクローンであることができる。いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合部分またはその抗原結合断片は、TCRの配列の知識から合成的に生成することができる。
いくつかの態様において、TCRは、標的ポリペプチド抗原またはその標的T細胞エピトープに対して候補TCRのライブラリをスクリーニングすることから同定されたかまたは選択されたTCRから生成される。TCRライブラリは、PBMC、脾臓、または他のリンパ系器官中に存在する細胞を含む、対象から単離されたT細胞からの、VαおよびVβのレパートリの増幅によって生成することができる。いくつかの場合には、T細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）から増幅することができる。いくつかの態様において、TCRライブラリは、CD4+またはCD8+細胞から生成することができる。いくつかの態様において、TCRは、正常な健常対象のT細胞供給源、すなわち正常なTCRライブラリから増幅することができる。いくつかの態様において、TCRは、罹患対象のT細胞供給源、すなわち罹患TCRライブラリから増幅することができる。いくつかの態様において、ヒトから得られたT細胞などの試料において、例えばRT-PCRによってVαおよびVβの遺伝子レパートリを増幅するために、縮重プライマーが用いられる。いくつかの態様において、scTvライブラリは、ナイーブVαおよびVβライブラリからアセンブルすることができ、ここで、増幅産物がクローニングされるか、またはリンカーによって分離されるようにアセンブルされる。対象および細胞の供給源に依存して、ライブラリは、HLA対立遺伝子特異的であることができる。あるいは、いくつかの態様において、TCRライブラリは、親または骨格TCR分子の突然変異誘発または多様化によって生成することができる。いくつかの局面において、TCRは、例えば、α鎖またはβ鎖の突然変異誘発などによって、指向性進化に供される。いくつかの局面において、TCRのCDR内の特定の残基が、変更される。いくつかの態様において、選択されたTCRを、親和性成熟によって改変することができる。いくつかの態様において、抗原特異的T細胞は、ペプチドに対するCTL活性を評価するためのスクリーニングなどによって選択され得る。いくつかの局面において、例えば、抗原特異的T細胞上に存在するTCRは、結合活性、例えば、抗原に対する特定の親和性または結合力などによって選択され得る。
いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合部分は、改変されているかまたは操作されているものである。いくつかの態様において、特異的なMHC-ペプチド複合体に対するより高い親和性などの変更された特性を有するTCRを生成するために、指向性進化法が用いられる。いくつかの態様において、指向性進化は、酵母ディスプレイ（Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62；Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92）、ファージディスプレイ（Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54）、またはT細胞ディスプレイ（Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84）を含むがそれらに限定されないディスプレイ法によって達成される。いくつかの態様において、ディスプレイアプローチは、公知の、親または参照TCRを操作することまたは改変することを含む。例えば、いくつかの場合には、野生型TCRを、CDRのうちの1個または複数個の残基が変異している変異誘発されたTCRを作製するための鋳型として用いることができ、所望の標的抗原に対するより高い親和性などの所望の変更された特性を有する変異体が選択される。
いくつかの態様において、関心対象のTCRの作製または生成における使用のための標的ポリペプチドのペプチドは、公知であるか、または当業者によって容易に同定されることができる。いくつかの態様において、TCRまたは抗原結合部分の生成における使用に適しているペプチドは、下記の標的ポリペプチドなどの、関心対象の標的ポリペプチド中のHLA拘束性モチーフの存在に基づいて決定することができる。いくつかの態様において、ペプチドは、利用可能なコンピュータ予測モデルを用いて同定される。いくつかの態様において、MHCクラスI結合部位を予測するために、そのようなモデルは、ProPred1（Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237）、およびSYFPEITHI（Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007を参照されたい）を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、MHC拘束性エピトープはHLA-A0201であり、これは、すべての白人のおよそ39〜46％において発現され、そのため、TCRまたは他のMHC-ペプチド結合分子を調製する使用のためのMHC抗原の適している選択である。
コンピュータ予測モデルを用いたHLA-A0201結合モチーフならびにプロテアソームおよび免疫プロテアソームについての切断部位が、当業者に公知である。MHCクラスI結合部位を予測するために、そのようなモデルは、ProPred1（Singh and Raghava, ProPred:prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17 (12):1236-1237 2001により詳細に記載されている）、およびSYFPEITHI（Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol. 409(1): 75-93 2007を参照されたい）を含むが、それらに限定されない。
いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合部分は、結合特性などの1つまたは複数の特性が変更されている、組換え生産された天然のタンパク質またはその変異型であってもよい。いくつかの態様において、TCRは、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物などの様々な動物種のうちの1つに由来してもよい。TCRは、細胞結合型であってもよく、または可溶型であってもよい。いくつかの態様において、提供される方法の目的で、TCRは、細胞の表面上に発現される細胞結合型である。
いくつかの態様において、TCRは完全長TCRである。いくつかの態様において、TCRは抗原結合部分である。いくつかの態様において、TCRは二量体TCR（dTCR）である。いくつかの態様において、TCRは一本鎖TCR（sc-TCR）である。いくつかの態様において、dTCRまたはscTCRは、WO 03/020763、WO 04/033685、WO2011/044186に記載されている構造を有する。
いくつかの態様において、TCRは、膜貫通配列に対応する配列を含有する。いくつかの態様において、TCRは、細胞質配列に対応する配列を含有する。いくつかの態様において、TCRは、CD3とTCR複合体を形成することができる。いくつかの態様において、dTCRまたはscTCRを含むTCRのいずれかは、シグナル伝達ドメインに連結されることができ、T細胞の表面上に活性TCRを生じる。いくつかの態様において、TCRは、細胞の表面上に発現される。
いくつかの態様において、dTCRは、TCRα鎖可変領域配列に対応する配列がTCRα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合している第1のポリペプチド、およびTCRβ鎖可変領域配列に対応する配列がTCRβ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合している第2のポリペプチドを含有し、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとはジスルフィド結合によって連結されている。いくつかの態様において、結合は、天然の二量体αβTCR中に存在する天然の鎖間ジスルフィド結合に対応することができる。いくつかの態様において、鎖間ジスルフィド結合は、天然のTCR中に存在しない。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数のシステインを、dTCRポリペプチド対の定常領域細胞外配列中に組み込むことができる。いくつかの場合には、天然および非天然のジスルフィド結合が両方とも、望ましい可能性がある。いくつかの態様において、TCRは、膜に固定するための膜貫通配列を含有する。
いくつかの態様において、dTCRは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのC末端に付着した第1の二量体化モチーフを含有するTCRα鎖、ならびに可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのC末端に付着した第1の二量体化モチーフを含むTCRβ鎖を含有し、ここで、第1および第2の二量体化モチーフは容易に相互作用して、第1の二量体化モチーフ中のアミノ酸と第2の二量体化モチーフ中のアミノ酸との間に共有結合を形成し、TCRα鎖とTCRβ鎖を一緒に連結する。
いくつかの態様において、TCRはscTCRである。典型的には、scTCRは、当業者に公知の方法を用いて生成することができる。例えば、Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992)；Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994)；Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993)；国際公開PCT番号WO 96/13593、WO 96/18105、WO99/60120、WO99/18129、WO 03/020763、WO2011/044186；およびSchlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)を参照されたい。いくつかの態様において、scTCRは、TCR鎖の会合を容易にするために導入された非天然のジスルフィド鎖間結合を含有する（例えば、国際公開PCT番号WO 03/020763を参照されたい）。いくつかの態様において、scTCRは、そのC末端に融合した異種のロイシンジッパーが鎖の会合を容易にする、非ジスルフィド結合切断型TCRである（例えば、国際公開PCT番号WO99/60120を参照されたい）。いくつかの態様において、scTCRは、ペプチドリンカーを介してTCRβ可変ドメインに共有結合で連結されたTCRα可変ドメインを含有する（例えば、国際公開PCT番号WO99/18129を参照されたい）。
いくつかの態様において、scTCRは、TCRα鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第1のセグメント、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のN末端に融合したTCRβ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第2のセグメント、および第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含有する。
いくつかの態様において、scTCRは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第1のセグメント、ならびにβ鎖細胞外定常配列および膜貫通配列の配列のN末端に融合したβ鎖可変領域配列によって構成される第2のセグメント、ならびに任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含有する。
いくつかの態様において、scTCRは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合したTCRβ鎖可変領域配列によって構成される第1のセグメント、ならびにα鎖細胞外定常配列および膜貫通配列の配列のN末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第2のセグメント、ならびに任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含有する。
いくつかの態様において、第1および第2のTCRセグメントを連結するscTCRのリンカーは、TCRの結合特異性を保持しながら、単一のポリペプチド鎖を形成できる任意のリンカーであることができる。いくつかの態様において、リンカー配列は、例えば、式-P-AA-P-を有してもよく、式中、Pはプロリンであり、AAはアミノ酸配列を表し、アミノ酸はグリシンおよびセリンである。いくつかの態様において、第1および第2のセグメントは、その可変領域配列がそのような結合のために配向されるように対合される。したがって、いくつかの場合には、リンカーは、第1のセグメントのC末端と第2のセグメントのN末端との間、またはその逆の間の距離を橋渡しするのに十分な長さを有するが、標的リガンドに対するscTCRの結合を遮断するかまたは低減するほど長くはない。いくつかの態様において、リンカーは、10〜45アミノ酸または約10〜45アミノ酸、例えば10〜30アミノ酸または26〜41アミノ酸残基、例えば、29、30、31、もしくは32アミノ酸を含有することができる。いくつかの態様において、リンカーは、式-PGGG-(SGGGG)5-P-を有し、式中、Pはプロリンであり、Gはグリシンであり、かつSはセリンである（SEQ ID NO:28）。いくつかの態様において、リンカーは、配列
Figure 2020528753
を有する。
いくつかの態様において、scTCRは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基をβ鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する、共有ジスルフィド結合を含有する。いくつかの態様において、天然のTCR中の鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数のシステインを、scTCRポリペプチドの第1および第2のセグメントの定常領域細胞外配列中に組み込むことができる。いくつかの場合には、天然および非天然のジスルフィド結合が両方とも、望ましい可能性がある。
導入された鎖間ジスルフィド結合を含有するdTCRまたはscTCRのいくつかの態様において、天然のジスルフィド結合は存在しない。いくつかの態様において、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成する天然のシステインのうちの1つまたは複数は、セリンまたはアラニンなどの別の残基に置換されている。いくつかの態様において、導入されるジスルフィド結合は、第1および第2のセグメント上の非システイン残基をシステインに変異させることによって形成することができる。TCRの例示的な非天然のジスルフィド結合は、国際公開PCT番号WO2006/000830に記載されている。
いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合断片は、10-5〜10-12M または約10-5〜10-12 Mならびにその中のすべての個々の値および範囲の、標的抗原に対する平衡結合定数で親和性を示す。いくつかの態様において、標的抗原は、MHC-ペプチド複合体またはリガンドである。
いくつかの態様において、α鎖およびβ鎖などのTCRをコードする1つまたは複数の核酸は、PCR、クローニング、または他の適している手段によって増幅し、適している1つまたは複数の発現ベクターにクローニングすることができる。発現ベクターは、任意の適している組換え発現ベクターであることができ、任意の適している宿主を形質転換するかまたはトランスフェクトするために用いることができる。適しているベクターには、プラスミドおよびウイルスなどの、増殖および増大のため、または発現のため、またはその両方のために設計されたものが含まれる。
いくつかの態様において、ベクターは、pUCシリーズ（Fermentas Life Sciences）、pBluescriptシリーズ（Stratagene, LaJolla, Calif.）、pETシリーズ（Novagen, Madison, Wis.）、pGEXシリーズ（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）、またはpEXシリーズ（Clontech, Palo Alto, Calif.）のベクターであることができる。いくつかの場合には、λG10、λGT11、λZapII（Stratagene）、λEMBL4、およびλNM1149などのバクテリオファージベクターも用いることができる。いくつかの態様において、植物発現ベクターを用いることができ、これには、pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121、およびpBIN19（Clontech）が含まれる。いくつかの態様において、動物発現ベクターには、pEUK-Cl、pMAM、およびpMAMneo（Clontech）が含まれる。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが用いられる。
いくつかの態様において、組換え発現ベクターは、標準的な組換えDNA技法を用いて調製することができる。いくつかの態様において、ベクターは、適切なように、かつベクターがDNAベースであるかまたはRNAベースであるかを考慮に入れて、ベクターが導入されることになる宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的である制御配列、例えば転写および翻訳開始および終止コドンを含有することができる。いくつかの態様において、ベクターは、TCRまたは抗原結合部分（または他のMHC-ペプチド結合分子）をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された非天然のプロモーターを含有することができる。いくつかの態様において、プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復配列において見出されるプロモーターであることができる。他の公知のプロモーターもまた、企図される。
いくつかの態様において、TCRをコードするベクターを生成するために、関心対象のTCRを発現するT細胞クローンから単離された全cDNAから、α鎖およびβ鎖をPCR増幅して、発現ベクターにクローニングする。いくつかの態様において、α鎖とβ鎖とは、同じベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、α鎖とβ鎖とは、異なるベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、生成されたα鎖およびβ鎖は、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター中に組み込まれる。
C. 核酸およびベクターの細胞への導入
遺伝子操作された構成要素、例えば、組換え受容体、例えば、CARまたはTCRの導入のための様々な方法が、周知であり、提供される方法および組成物と共に用いられてもよい。例示的な方法には、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスもしくはレンチウイルス、非ウイルスベクター、またはトランスポゾン、例えばSleeping Beautyトランスポゾンシステムを介してのものを含む、ポリペプチドまたは受容体をコードする核酸の移入のためのものが含まれる。遺伝子移入の方法には、形質導入、エレクトロポレーション、または細胞中への遺伝子移入を結果としてもたらす他の方法が含まれ得る。
いくつかの態様において、遺伝子移入は、例えば、サイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定されるような、増殖、生存、および/または活性化などの応答を誘導する刺激薬と細胞を組み合わせることなどにより、細胞を最初に刺激すること、ならびにその後続く、活性化細胞の形質導入、および臨床応用に十分な数までの培養における増大によって達成される。
いくつかの状況において、対象における毒性に関連する因子などの刺激因子（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現が、対象において不要な成果またはより低い有効性を潜在的に結果としてもたらし得る可能性を防ぐことが望ましい場合がある。したがって、いくつかの状況において、操作された細胞は、養子免疫療法における投与時などに、細胞をインビボでの陰性選択を受けやすくさせる遺伝子セグメントを含む。例えば、いくつかの局面において、細胞は、それらが投与される患者のインビボ状態における変化の結果として排除され得るように操作される。陰性選択可能な表現型は、投与される作用物質、例えば化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から結果として生じ得る。陰性選択可能な遺伝子には、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ（HSV-I TK）遺伝子（Wigler et al., Cell 2 :223, 1977）；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）遺伝子、細菌シトシンデアミナーゼが含まれる（Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)）。
いくつかの態様において、細胞、例えば、T細胞に、増大の間またはその後のいずれかに、例えば、組換え受容体、例えば、T細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸をトランスフェクトしてよい。所望のポリペプチドまたは受容体の遺伝子の導入のためのこのトランスフェクションは、レトロウイルスベクターを介するなどの任意の好適な遺伝子に基づく移送系を用いて行うことができる。いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞集団を、抗原刺激と並行して、それと同時にまたはその後に、例えば、デノボに導入された受容体を介して、例えば、提供される方法に従って、刺激することができる。いくつかの態様において、提供される粒子、例えば、ビーズ上に存在する結合分子は、抗原刺激、例えば、遺伝子導入された受容体の同族（架橋）抗原もしくはリガンド（例えば、CARの天然リガンド）または組換え受容体に直接結合するかもしくはそれを認識する抗イディオタイプ抗体の形態で提供される、抗原刺激を提供する。
中でも、導入のための追加の核酸、例えば、遺伝子は、移入された細胞の生存性および/または機能を促進することなどによって治療の有効性を改善する遺伝子;例えば、インビボ生存または局在化を評価するための、細胞の選択および/または評価のための遺伝子マーカーを提供する遺伝子;Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991);およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)に記載されているような、例えば、細胞をインビボでの陰性選択に感受性にすることによって、安全性を改善する遺伝子である；また、優勢な陽性選択マーカーを陰性選択マーカーと融合することから得られる二機能性の選択可能な融合遺伝子の使用について記載しているLuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の公開公報も参照されたい。例えば、Riddellらの米国特許第6,040,177号、第14欄〜第17欄を参照されたい。
上記の通り、いくつかの態様において、細胞を、遺伝子操作の前にまたはそれと関連付けて、インキュベートおよび/または培養する。インキュベーション工程は、培養、栽培、刺激、活性化、繁殖および/または保存のための凍結、例えば凍結保存を含むことができる。
1. ウイルスベクター粒子
いくつかの態様において、組換え核酸は、例えば、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を用いて、細胞中に移入される。いくつかの態様において、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクターを用いて、T細胞中に移入される（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25；Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46；Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93；Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照されたい）。
いくつかの態様において、レトロウイルスベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、脾フォーカス形成ウイルス（SFFV）、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するレトロウイルスベクターは、長い末端反復配列（LTR）を有する。ほとんどのレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。いくつかの態様において、レトロウイルスには、任意の鳥類または哺乳類の細胞供給源に由来するものが含まれる。レトロウイルスは、典型的には両種指向性であり、これは、それらが、ヒトを含む数個の種の宿主細胞に感染できることを意味している。1つの態様において、発現されることになる遺伝子は、レトロウイルスのgag、pol、および/またはenv配列に取って代わる。いくつかの例証となるレトロウイルスシステムが、記載されている（例えば、米国特許第5,219,740号；同第6,207,453号；同第5,219,740号；Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990；Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852；Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037；およびBoris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109）。
レンチウイルス形質導入の方法は、公知である。例示的な方法は、例えば、Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644；Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114；およびCavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505に記載されている。
いくつかの態様において、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスゲノムに基づくベクターから生じる、例えば、レンチウイルスゲノムに基づくベクターから生じるゲノムを含有する。提供されるウイルスベクターのいくつかの局面において、組換え受容体、例えば抗原受容体、例えばCARをコードする異種核酸は、ベクターゲノムの5'LTR配列と3'LTR配列との間に含有され、かつ/または、位置付けられる。
いくつかの態様において、ウイルスベクターゲノムは、HIV-1ゲノムまたはSIVゲノムなどのレンチウイルスゲノムである。例えば、レンチウイルスベクターは、ビルレンス遺伝子を複合的に弱毒化することによって作製され、例えば、遺伝子env、vif、vpuおよびnefを欠失させることができ、これによってこのベクターは治療目的に安全になる。レンチウイルスベクターは公知である。Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 米国特許第6,013,516号；および第5,994,136号)を参照されたい。いくつかの態様において、これらのウイルスベクターは、プラスミドに基づくかまたはウイルスに基づき、外来核酸を組み込むため、選択のため、および宿主細胞への核酸の移入のための必須配列を担持するように構成される。公知のレンチウイルスは、American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209）などのデポジトリーまたはコレクションから容易に得ることもでき、一般に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離することもできる。
レンチウイルスベクターの非限定例は、ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）、HIV-2、シミアン免疫不全ウイルス（SIV）、ヒトT-リンパ球向性ウイルス1（HTLV-1）、HTLV-2またはウマ感染性貧血ウイルス（E1AV）などのレンチウイルスから生じるものを含む。例えば、レンチウイルスベクターは、HIVビルレンス遺伝子を複合的に弱毒化することによって作製され、例えば、遺伝子env、vif、vpr、vpuおよびnefが欠失され、これによってこのベクターは治療目的に安全になる。レンチウイルスベクターは、当技術分野において公知であり、Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 米国特許第6,013,516号；および第5,994,136号)を参照されたい。いくつかの態様において、これらのウイルスベクターは、プラスミドに基づくかまたはウイルスに基づき、外来核酸を組み込むため、選択のため、および宿主細胞への核酸の移入のための必須配列を担持するように構成される。公知のレンチウイルスは、American Type Culture Collection（"ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209）などのデポジトリーまたはコレクションから容易に得ることもでき、一般に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離することもできる。
いくつかの態様において、ウイルスゲノムベクターは、レンチウイルスなどのレトロウイルスの5'LTRおよび3'LTRの配列を含有することができる。いくつかの局面において、ウイルスゲノム構築物は、レンチウイルスの5'LTRおよび3'LTR由来の配列を含有してよく、特に、レンチウイルスの5'LTR由来のR配列およびU5配列ならびにレンチウイルス由来の不活性化されたまたは自己不活性化3'LTRを含有することができる。LTR配列は、任意の種由来の任意のレンチウイルス由来のLTR配列であることができる。例えば、これらは、HIV、SIV、FIVまたはBIV由来のLTR配列であってよい。典型的には、LTR配列は、HIV LTR配列である。
いくつかの態様において、ウイルスベクター、例えばHIVウイルスベクターの核酸は、追加の転写ユニットを欠いている。そのベクターゲノムは、不活性化されたまたは自己不活性化3'LTRを含有することができる（Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998）。例えば、ウイルスベクターRNAを生産するために使用される核酸の3'LTRのU3領域の欠失を使用して、自己不活性化（SIN）ベクターを作製することができる。次いで、この欠失は、逆転写の間にプロウイルスDNAの5'LTRに移すことができる。自己不活性化ベクターは、一般に、3'の長い末端反復（LTR）由来のエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有し、それはベクターインテグレーションの間に5'LTRにコピーされる。いくつかの態様において、LTRの転写活性を無効にするために、TATAボックスの除去を含め十分な配列を排除することができる。これは、形質導入された細胞において完全長ベクターRNAの生産を防止することができる。いくつかの局面において、3'LTRのU3エレメントは、そのエンハンサー配列、TATAボックス、Sp1およびNF-カッパB部位の欠失を含有する。自己不活性化3'LTRの結果として、侵入および逆転写後に生成されたプロウイルスは、不活性化された5'LTRを含有する。これは、ベクターゲノムの可動化のリスクおよび近傍の細胞性プロモーターへのLTRの影響を低減することによって安全性を改善することができる。自己不活性化3'LTRは、当技術分野において公知の任意の方法によって構築することができる。いくつかの態様において、これは、ベクター力価にもベクターのインビトロまたはインビボ特性にも影響を及ぼさない。
場合により、レンチウイルス5'LTR由来のU3配列は、ウイルス構築物中のプロモーター配列、例えば異種プロモーター配列と置換することができる。これは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を増加させることができる。また、エンハンサー配列を含めることもできる。パッケージング細胞株におけるウイルスRNAゲノムの発現を増加させるあらゆるエンハンサー/プロモーターの組み合わせを使用してよい。一例として、CMVエンハンサー/プロモーター配列が使用される（米国特許第5,385,839号および米国特許第5,168,062号）。
特定の態様において、レトロウイルスベクターゲノム、例えばレンチウイルスベクターゲノムをインテグレーション欠陥になるように構築することによって、挿入変異誘発のリスクを最小限に抑えることができる。非組み込みベクターゲノムを生産するために多種多様なアプローチを遂行することができる。いくつかの態様において、不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、pol遺伝子のインテグラーゼ酵素成分への変異を操作することができる。いくつかの態様において、例えば、付着部位の一方または両方を変異もしくは欠失させるか、または欠失もしくは修飾を通して3'LTR近位ポリプリントラクト（PPT）を非機能的にすることによって、ベクターゲノムそれ自体を修飾して、インテグレーションを防止することができる。いくつかの態様において、非遺伝的アプローチが利用可能であり；これらは、インテグラーゼの1つまたは複数の機能を阻害する薬理学的物質を含む。このアプローチは、相互に排他的ではなく；すなわち、それらの1つより多くを一度に使用することができる。例えば、インテグラーゼおよび付着部位の両方が非機能的であることも、インテグラーゼおよびPPT部位が非機能的であることも、付着部位およびPPT部位が非機能的であることも、それらの全てが非機能的であることもできる。そのような方法およびウイルスベクターゲノムは、公知であり、利用可能である（Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995; Brown et al J Virol 73:9011 (1999); WO 2009/076524; McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003; Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996)を参照のこと）。
いくつかの態様において、ベクターは、宿主細胞、例えば原核生物宿主細胞において繁殖するための配列を含有する。いくつかの態様において、ウイルスベクターの核酸は、原核生物細胞、例えば細菌細胞において繁殖するための1つまたは複数の複製起点を含有する。いくつかの態様において、原核生物の複製起点を含むベクターはまた、その発現が検出可能または選択可能なマーカー、例えば薬物耐性を付与する遺伝子を含有してもよい。
ウイルスベクターゲノムは、典型的には、パッケージング細胞株または産生細胞株へトランスフェクションできるプラスミド形態で構築される。そのゲノムがウイルスベクターゲノムのRNAコピーを含有するレトロウイルス粒子を生産するために、多種多様な公知の方法のいずれかを使用することができる。いくつかの態様において、少なくとも2つの成分が、ウイルスに基づく遺伝子送達系の製造に関与する：第一は、ウイルスベクター粒子を作製するのに必要な構造タンパク質および酵素を包含する、パッケージングプラスミド、そして、第二は、ウイルスベクターそれ自体、すなわち、移入されるべき遺伝子物質。これらの成分の一方または両方の設計にバイオセーフティー予防措置を導入することができる。
いくつかの態様において、パッケージングプラスミドは、エンベロープタンパク質以外のHIV-1などの全てのレトロウイルスタンパク質を含有することができる（Naldini et al., 1998）。他の態様において、ウイルスベクターは、追加のウイルス遺伝子、例えば病原性に関連するもの、例えば、vpr、vif、vpuおよびnef、ならびに／またはTat（HIVの一次トランス活性化因子）を欠く可能性がある。いくつかの態様において、レンチウイルスベクター、例えば、HIVに基づくレンチウイルスベクターは、親ウイルスの3つの遺伝子：gag、polおよびrevのみを含み、これは、組換えを通じた野生型ウイルスの再構築の実現性を低減または排除する。
いくつかの態様において、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されるウイルスゲノムRNAをウイルス粒子中へパッケージングするのに必要な成分全てを含有するパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、関心対象の1つまたは複数の配列、例えば、組換え核酸に加えて、ウイルス成分をコードする1つまたは複数の遺伝子を含んでよい。いくつかの局面において、しかしながら、標的細胞におけるゲノムの複製を防止するために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子は除去され、パッケージング細胞株に別々に提供される。
いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、粒子を作製するのに必要な成分を含有する1つまたは複数のプラスミドベクターがトランスフェクトされる。いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、LTR、シス作用型パッケージング配列および関心対象の配列、すなわち抗原受容体、例えば、CARをコードする核酸を含む、ウイルスベクターゲノムを含有するプラスミド；ならびにウイルス酵素および/または構造成分、例えば、Gag、polおよび/またはrevをコードする1つまたは複数のヘルパープラスミドがトランスフェクトされる。いくつかの態様において、レトロウイルスベクター粒子を生じる様々な遺伝子成分を分離するために複数のベクターが利用される。いくつかのこのような態様において、分離したベクターをパッケージング細胞へ提供することは、そうでなければ複製能を有するウイルスを生じさせ得る、組換え事象の機会を低減する。いくつかの態様において、レトロウイルス成分の全てを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。
いくつかの態様において、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子は、宿主細胞の形質導入効率を増加させるためにシュードタイプ化される。例えば、レトロウイルスベクター粒子、例えばレンチウイルスベクター粒子は、いくつかの態様において、VSV-G糖タンパク質でシュードタイプ化され、これは、形質導入することができる細胞タイプを拡張する広範な細胞宿主範囲を提供する。いくつかの態様において、例えば、異種指向性、多指向性または両指向性エンベロープ、例えばシンドビスウイルスエンベロープ、GALVまたはVSV-Gを含むように、パッケージング細胞株に、非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドまたはポリヌクレオチドがトランスフェクトされる。
いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムRNAのレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングにトランスで必要な、ウイルス調節タンパク質および構造タンパク質を含めた成分を提供する。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現および機能的レンチウイルスベクター粒子を産生することができる、任意の細胞株であってよい。いくつかの局面において、好適なパッケージング細胞株は、293細胞（ATCC CCL X）、293T細胞、HeLA細胞（ATCC CCL 2）、D17細胞（ATCC CCL 183）、MDCK細胞（ATCC CCL 34）、BHK細胞（ATCC CCL-10）およびCf2Th細胞（ATCC CRL 1430）を含む。
いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、ウイルスタンパク質を安定に発現する。例えば、いくつかの局面において、gag、pol、revおよび/または他の構造遺伝子を含有するがLTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築することができる。いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、1つまたは複数のウイルスタンパク質をコードする核酸分子を、異種タンパク質をコードする核酸分子および/またはエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含有するウイルスベクターゲノムと一緒に一過性にトランスフェクトすることができる。
いくつかの態様において、ウイルスベクターならびにパッケージングおよび/またはヘルパープラスミドは、トランスフェクションまたは感染を介して、パッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有するウイルスベクター粒子を産生する。トランスフェクションまたは感染のための方法は、周知である。非限定例は、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法およびリポフェクション法、エレクトロポレーションならびにマイクロインジェクションを含む。
組換えプラスミドならびにレトロウイルスのLTR配列およびパッケージング配列が特定の細胞株に導入されるとき（例えば、リン酸カルシウム沈降などによって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子内にパッケージングされることを可能し得、これが次いで培養培地中に分泌され得る。組換えレトロウイルスを含有する培地は、いくつかの態様において、その後収集され、場合により濃縮され、そして遺伝子移入に使用される。例えば、いくつかの局面において、パッケージングプラスミドおよび移入ベクターのパッケージング細胞株への同時トランスフェクション後、ウイルスベクター粒子が培養培地から回収され、当業者によって使用される標準法によって力価測定される。
いくつかの態様において、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを、パッケージング細胞株、例えば、例示的なHEK 293T細胞株において、レンチウイルス粒子の作製を可能にするプラスミドの導入によって産生させることができる。いくつかの態様において、パッケージング細胞に、gagおよびpolをコードするポリヌクレオチド、ならびに組換え受容体、例えば抗原受容体、例えばCARをコードするポリヌクレオチドがトランスフェクトされ、かつ/または、それらを含有する。いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、場合によりおよび/または追加的に、revタンパク質をコードするポリヌクレオチドがトランスフェクトされ、かつ/または、それを含有する。いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、場合によりおよび/または追加的に、VSV-Gなどの非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドがトランスフェクトされ、かつ/または、それを含有する。いくつかのこのような態様において、細胞、例えば、HEK 293T細胞のトランスフェクションのおよそ2日後、細胞上清は、回収かつ力価測定することができる組換えレンチウイルスベクターを含有する。
回収かつ／または産生されたレトロウイルスベクター粒子を使用し、記載の通りの方法を使用して、標的細胞を形質導入することができる。一旦標的細胞に入れば、ウイルスRNAは、逆転写され、核に輸送され、宿主ゲノムに安定に組み込まれる。ウイルスRNAのインテグレーションの1日または2日後、組換えタンパク質、例えば抗原受容体、例えば、CARの発現を検出することができる。
いくつかの態様において、提供される方法は、複数の細胞を含む細胞組成物とウイルス粒子とを接触、例えば、インキュベートすることによる細胞を形質導入する方法を伴う。いくつかの態様において、トランスフェクトまたは形質導入されるべき細胞は、対象から得られた初代細胞、例えば、対象から富化されたおよび/または選択された細胞であるかまたはそれを含む。
いくつかの態様において、組成物の形質導入されるべき細胞の濃度は、1.0×105の細胞/mL〜1.0×108の細胞/mLまたは約1.0×105の細胞/mL〜1.0×108の細胞/mL、例えば、少なくとも1.0×105の細胞/mL、少なくとも5×105の細胞/mL、少なくとも1×106の細胞/mL、少なくとも5×106の細胞/mL、少なくとも1×107の細胞/mL、少なくとも5×107の細胞/mLもしくは少なくとも1×108の細胞/mL、または約少なくとも1.0×105の細胞/mL、約少なくとも5×105の細胞/mL、約少なくとも1×106の細胞/mL、約少なくとも5×106の細胞/mL、約少なくとも1×107の細胞/mL、約少なくとも5×107の細胞/mLもしくは約少なくとも1×108の細胞/mL、または約1.0×105の細胞/mL、約5×105の細胞/mL、約1×106の細胞/mL、約5×106の細胞/mL、約1×107の細胞/mL、約5×107の細胞/mLもしくは約1×108の細胞/mLである。
いくつかの態様において、ウイルス粒子は、ウイルスベクター粒子のコピーまたはその感染単位（IU）の、形質導入されるべき総細胞数当たりの特定の比率（IU/細胞）で提供される。例えば、いくつかの態様において、ウイルス粒子は、接触の間、1細胞当たり、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50もしくは60IU、または約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約10、約15、約20、約30、約40、約50もしくは約60IU、または少なくとも0.5、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50もしくは少なくとも60IU、または少なくとも約0.5、少なくとも約1、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50もしくは少なくとも約60IUのウイルスベクター粒子で存在する。
いくつかの態様において、ウイルスベクター粒子の力価は、1×106 IU/mL〜1×108 IU/mLまたは約1×106 IU/mL〜1×108 IU/mL、例えば、5×106 IU/mL〜5×107 IU/mLまたは約5×106 IU/mL〜5×107 IU/mL、例えば、少なくとも6×106 IU/mL、少なくとも7×106 IU/mL、少なくとも8×106 IU/mL、少なくとも9×106 IU/mL、少なくとも1×107 IU/mL、少なくとも2×107 IU/mL、少なくとも3×107 IU/mL、少なくとも4×107 IU/mL、または少なくとも5×107 IU/mLである。
いくつかの態様において、形質導入は、100未満、例えば一般に60、50、40、30、20、10、5未満のまたはより小さい多重感染度（MOI）で達成することができる。
いくつかの態様において、該方法は、細胞とウイルス粒子とを接触またはインキュベートすることを伴う。いくつかの態様において、接触させることは、30分〜72時間、例えば、30分〜48時間、30分〜24時間または1時間〜24時間、例えば、少なくともまたは約少なくとも30分、1時間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間またはより長い接触である。
いくつかの態様において、接触させることは、溶液中で実施される。いくつかの態様において、細胞とウイルス粒子とを、0.5mL〜500mLまたは約0.5mL〜500mL、例えば、0.5mL〜200mL、0.5mL〜100mL、0.5mL〜50mL、0.5mL〜10mL、0.5mL〜5mL、5mL〜500mL、5mL〜200mL、5mL〜100mL、5mL〜50mL、5mL〜10mL、10mL〜500mL、10mL〜200mL、10mL〜100mL、10mL〜50mL、50mL〜500mL、50mL〜200mL、50mL〜100mL、100mL〜500mL、100mL〜200mLもしくは200mL〜500mL、または、約0.5mL〜200mL、約0.5mL〜100mL、約0.5mL〜50mL、約0.5mL〜10mL、約0.5mL〜5mL、約5mL〜500mL、約5mL〜200mL、約5mL〜100mL、約5mL〜50mL、約5mL〜10mL、約10mL〜500mL、約10mL〜200mL、約10mL〜100mL、約10mL〜50mL、約50mL〜500mL、約50mL〜200mL、約50mL〜100mL、約100mL〜500mL、約100mL〜200mLもしくは約200mL〜500mLの容量で接触させる。
いくつかの態様において、接触させることは、遠心分離、例えばスピノキュレーション（例えば、遠心接種）で実施することができる。いくつかの態様において、細胞、ウイルス粒子および試薬を含有する組成物を、一般に、比較的低い力または速度で、例えば細胞をペレット化するのに使用されるより遅い速度、例えば、600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜1700rpm（例えば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、約1000rpm、もしくは約1500rpmもしくは約1700rpm、または少なくとも600rpm、少なくとも1000rpm、もしくは少なくとも1500rpmもしくは少なくとも1700rpm）で回転させることができる。いくつかの態様において、回転は、例えばチャンバーまたはキャビティの内壁または外壁で測定された場合に、例えば100g〜3200gまたは約100g〜3200g（例えば、100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3200g、または約100g、約200g、約300g、約400g、約500g、約1000g、約1500g、約2000g、約2500g、約3000gもしくは約3200g、または少なくとも100g、少なくとも200g、少なくとも300g、少なくとも400g、少なくとも500g、少なくとも1000g、少なくとも1500g、少なくとも2000g、少なくとも2500g、少なくとも3000gもしくは少なくとも3200g、または少なくとも約100g、少なくとも約200g、少なくとも約300g、少なくとも約400g、少なくとも約500g、少なくとも約1000g、少なくとも約1500g、少なくとも約2000g、少なくとも約2500g、少なくとも約3000gもしくは少なくとも約3200g）の力、例えば、相対遠心力で実施される。「相対遠心力」またはRCFという用語は、一般に、回転軸と比較した空間内の特定の点における、地球の重力に相対的な、物体または物質（例えば、細胞、試料もしくはペレットおよび/または回転させられているチャンバーもしくは他の容器内の点）に付与される有効力であると理解される。その値は、周知の式を使用して、重力、回転速度および回転半径（回転軸からの距離およびRCFが測定されている物体、物質または粒子）を考慮に入れて判定され得る。
特定の態様において、インプット細胞を、ウイルスDNAによってコードされる組換え受容体に結合するかまたはそれを認識する結合分子を含む粒子、例えば、ビーズで処理、インキュベートまたは接触させる。
いくつかの態様において、細胞とウイルスベクター粒子とのインキュベーションは、ウイルスベクター粒子で形質導入された細胞を含むアウトプット組成物をもたらすかまたは産生する。
2. 非ウイルスベクター
いくつかの態様において、組換え核酸は、エレクトロポレーションを介してT細胞に移入される（例えば、Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 および Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437を参照のこと）。いくつかの態様において、組換え核酸は、転移を介してT細胞に移入される（例えば、Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; および Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126を参照のこと）。免疫細胞において遺伝物質を導入および発現させる他の方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.に記載されているような）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション；タングステン粒子促進性マイクロパーティクルボンバードメント（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)）；およびリン酸ストロンチウムDNA共沈殿（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）を含む。
組換え産物をコードする核酸を移入するための他のアプローチおよびベクターは、例えば、国際特許出願公開番号：WO2014055668、および米国特許第7,446,190号に記載されているものである。
いくつかの態様において、組換え核酸は、トランスポゾンを介してT細胞に移入される。トランスポゾン（転位性エレメント）は、ゲノム内のある遺伝子座から別の遺伝子座に移動することができる移動可能なDNAセグメントである。これらのエレメントは、保存的な「カットアンドペースト」機構を介して移動する：トランスポザーゼは、トランスポゾンのその元の位置からの切除を触媒し、ゲノム中での他の場所での再インテグレーションを促進する。トランスポザーゼ欠損エレメントは、トランスポザーゼが別のトランスポザーゼ遺伝子によって提供される場合に、動員され得る。したがって、トランスポゾンを利用すれば、ウイルス形質導入系の使用なしに、外来DNAを宿主ゲノムに組み込むことができる。哺乳動物細胞、例えば、ヒト初代白血球との使用に適したトランスポゾンの例は、Sleeping BeautyおよびPiggybacを含むが、それに限定されるわけではない。
トランスポゾンに基づくトランスフェクションは、トランスポザーゼとトランスポゾンからなる2成分系である。いくつかの態様において、この系は、付随するトランポザーゼ(tranposase）によって認識される逆位反復/直列反復（IR/DR）配列によって挟まれている、外来DNA（本明細書においてカーゴDNAとも呼ばれる）、例えば、組換え受容体をコードする遺伝子を含むように操作されたトランスポゾンを含む。いくつかの態様において、非ウイルスプラスミドは、プロモーターの制御下のトランスポザーゼをコードする。宿主細胞へのプラスミドのトランスフェクションは、トランスポザーゼの一過性発現をもたらし、したがってトランスフェクション後の初期の間、トランスポゾンをゲノムDNAに組み込むのに十分なレベルでトランスポザーゼが発現される。いくつかの態様において、トランスポザーゼそれ自体は、ゲノムDNAに組み込まれず、それゆえ、トランスポザーゼの発現は、経時的に減少する。いくつかの態様において、トランスポザーゼ発現は、宿主細胞によって、対応するトランスポゾンを組み込むのに十分なレベルで、約4時間未満、約8時間未満、約12時間未満、約24時間未満、約2日未満、約3日未満、約4日未満、約5日未満、約6日未満、約7日未満、約2週間未満、約3週間未満、約4週間未満、約週間未満または約8週間未満発現される。いくつかの態様において、少なくとも宿主がカーゴDNAを切除できる内因性トランスポザーゼを発現しないので、宿主のゲノムに導入されるカーゴDNAは、宿主のゲノムからその後除去されない。
Sleeping Beauty（SB）は、サケ科の魚のゲノムが保有する休眠エレメントから再構成される、Tc/1-マリナースーパーファミリーのトランスポゾンの合成メンバーである。SBトランスポゾンに基づくトランスフェクションは、トランスポザーゼと、TAジヌクレオチドへの正確なインテグレーションをもたらす逆位反復/直列反復（IR/DR）配列を含有するトランスポゾンからなる2成分系である。トランスポゾンは、関心対象の発現カセットがIR/DRによって挟まれるように設計される。SBトランスポザーゼは、Sleeping BeautyトランスポゾンのIR上に位置する特異的な結合部位に結合する。SBトランスポザーゼは、トランスポゾンのインテグレーションを媒介する、触媒酵素（SB）のための結合部位を保有する逆位末端反復によって両側上で挟まれたカーゴ配列をコードする移動可能なエレメントである。SBが、カットアンドペースト機構を通じてTA標的ジヌクレオチドで脊椎動物染色体に遺伝子配列を挿入したときに、安定な発現が生じる。この系は、初代ヒト末梢血白血球を含めた多種多様な脊椎動物細胞タイプを操作するために使用されている。いくつかの態様において、細胞を、SB IR配列によって挟まれたカーゴ遺伝子、例えば、組換え受容体またはCARをコードする遺伝子を含むSBトランスポゾンと接触、インキュベートおよび/または処理する。特定の態様において、トランスフェクトされるべき細胞を、SB IR配列によって挟まれたカーゴ遺伝子、例えば、CARをコードする遺伝子を含むSBトランスポゾンを含むプラスミドと接触、インキュベートおよび/または処理する。特定の態様において、プラスミドはさらに、SB IR配列によって挟まれていないSBトランスポザーゼをコードする遺伝子を含む。
例示的なSB IR配列は、SEQ ID NO：26によって提供される。SBトランスポザーゼをコードする例示的なポリヌクレオチド配列、および例示的なSBトランスポザーゼのアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：24および25によって提供される。
PiggyBac（PB）は、カーゴDNAを宿主（例えば、ヒト）のゲノムDNAに組み込むために使用できる別のトランスポゾン系である。PBトランスポザーゼは、トランスポゾンの両末端上に位置するPBトランスポゾン特異的逆位末端反復配列（ITR）を認識し、内容物を元の部位から効率的に移動させ、それらをTTAA染色体部位に効率的に組み込む。PBトランスポゾン系は、PBベクター内の2つのITR間の関心対象の遺伝子が標的ゲノム内に動員されることを可能にする。PB系は、初代ヒト細胞を含めた多種多様な脊椎動物細胞タイプを操作するために使用されている。いくつかの態様において、トランスフェクトされるべき細胞を、PB IR配列によって挟まれたカーゴ遺伝子、例えば、CARをコードする遺伝子を含むPBトランスポゾンと接触、インキュベートおよび/または処理する。特定の態様において、トランスフェクトされるべき細胞を、PB IR配列によって挟まれたカーゴ遺伝子、例えば、CARをコードする遺伝子を含むPBトランスポゾンを含むプラスミドと接触、インキュベートおよび/または処理する。特定の態様において、プラスミドはさらに、PB IR配列によって挟まれていないSBトランスポザーゼをコードする遺伝子を含む。
例示的なPB IR配列は、SEQ ID NO：27によって例証される。PBトランスポザーゼをコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：28によって例証される。例示的なPBトランスポザーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：29によって例証される。
いくつかの態様において、対象の方法、例えば、SBまたはPBベクターで用いられるトランスポゾン/トランスポザーゼの様々なエレメントを、制限酵素切断、ライゲーションおよび分子クローニングの標準的な方法によって生産させてよい。対象のベクターを構築するための1つのプロトコールは、以下の工程を含む。第一に、所望の構成要素ヌクレオチド配列を含有する精製された核酸フラグメントおよび外部の配列を、初期供給源、例えば、トランスポザーゼ遺伝子を含むベクター由来の制限エンドヌクレアーゼで切断する。次いで、、例えば、アガロースゲル電気泳動による、従来の分離方法を使用して、所望のヌクレオチド配列を含有するフラグメントを、異なるサイズの望ましくないフラグメントから分離する。所望のフラグメントをゲルから切り出し、上記の通りの所望の配列、例えば、対象のベクターの様々なエレメントに対応する配列を含有する環状核酸またはプラスミドが産生されるように、適切な配置で一緒にライゲーションする。所望の場合、次いで、このようにして構築した環状分子を原核生物宿主、例えば、E. coli中で増幅させる。これらの工程に関与する切断、プラスミド構築、細胞形質転換およびプラスミド産生の手順は、当業者に周知であり、制限およびライゲーションに必要な酵素は市販されている（例えば、R. Wu, Ed., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic Press, N.Y. (1979); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Catalog 1982-83, New England Biolabs, Inc.; Catalog 1982-83, Bethesda Research Laboratories, Inc.を参照のこと）。対象の方法において用いられるベクターを構築する方法の一例は、以下の実験の部に提供される。代表的なSleeping Beautyトランスポゾン系の調製はまた、WO 98/40510およびWO 99/25817に開示されている。
いくつかの態様において、トランスポゾンによる形質導入は、トランスポザーゼ遺伝子を含むプラスミドと、トランスポザーゼによって認識される逆位反復/直列反復（IR/DR）配列によって挟まれているカーゴDNA配列を含有するトランスポゾンを含むプラスミドを用いて実施される。特定の態様において、カーゴDNA配列は、異種タンパク質、例えば、組換えT細胞受容体またはCARをコードする。いくつかの態様において、プラスミドは、トランスポザーゼおよびトランスポゾンを含む。いくつかの態様において、トランスポザーゼは、遍在的プロモーター、または標的細胞においてトランスポザーゼの発現を駆動するのに適正した任意のプロモーターの制御下にある。遍在的プロモーターは、EF1a、CMB、SV40、PGK1、Ubc、ヒトβ-アクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、CaMKIIaおよびU6を含むが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、カーゴDNAは、ゲノムDNAにおいてカーゴDNAが安定なインテグレーションを伴う細胞の選択を可能にする選択カセットを含む。好適な選択カセットは、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子およびポリミキシンB耐性遺伝子をコードする選択カセットを含むが、それに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、トランスポゾン、例えば、SBトランスポザーゼおよびSBトランスポゾンを含むプラスミドによる形質導入のための成分が、標的細胞に導入される。任意の簡便なプロトコールを用いてよく、この場合のプロトコールは、標的細胞の場所に応じて、この系成分の標的細胞へのインビトロまたはインビボ導入を提供し得る。例えば、標的細胞が単離された細胞である場合、この系を、標的細胞の生存性を許容する細胞培養条件下で、例えば、標準的な形質転換技術を使用することによって、細胞に直接導入してよい。そのような技術は、ウイルス感染、形質転換、コンジュゲーション、原形質融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、ウイルスベクター送達などを含むが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞のタイプおよび形質転換が行われる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボまたはインビボ）に依存する。これらの方法の一般的な考察については、Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons,1995に見いだすことができる。
いくつかの態様において、SBトランスポゾンおよびSBトランスポザーゼ供給源は、多細胞生物、例えば、哺乳動物またはヒトの標的細胞に、トランスポゾンを担持するベクターからの逆位反復に挟まれた核酸の切除およびその後の切除された核酸の標的細胞のゲノムへのインテグレーションに十分な条件下で導入される。いくつかの態様は、必要なトランスポザーゼ活性が、導入されたトランスポゾンと一緒に、標的細胞中に存在するようにする工程をさらに含む。トランスポゾンベクターそれ自体の構造、すなわち、ベクターが、トランスポザーゼ活性を有する産物をコードする領域を含むか否かに応じて、該方法は、必要なトランスポザーゼ活性をコードする標的細胞に第二のベクターを導入することをさらに含み得る。
いくつかの態様において、トランスポゾンを含むベクター核酸の量および細胞に導入されるトランスポザーゼをコードするベクター核酸の量は、トランスポゾン核酸の所望の切除および標的細胞ゲノムへの挿入をもたらすのに十分である。よって、導入されるベクター核酸の量は、十分な量のトランスポザーゼ活性および標的細胞に挿入されることが望まれる核酸の十分なコピー数を提供するものであるべきである。標的細胞に導入されるベクター核酸の量は、用いられる特定の導入プロトコール、例えば、用いられる特定のエクスビボ投与プロトコールの効率に応じて変動する。
一旦ベクターDNAが、必要なトランスポザーゼと組み合わされて標的細胞に侵入すれば、逆位反復によって挟まれたベクターの核酸領域、すなわち、Sleeping Beautyトランスポザーゼが認識する逆位反復間に位置付けられたベクター核酸が、提供されるトランスポザーゼを介してベクターから切除され、標的とされる細胞のゲノムに挿入される。よって、標的細胞へのベクターDNAの導入後、その後のベクターによって担持される外因性核酸のトランスポザーゼ媒介性切除および標的とされる細胞のゲノムへの挿入が続く。特定の態様において、SBトランスポゾンおよび/またはSBトランスポザーゼがトランスフェクトされた細胞の少なくとも1％、少なくとも2％、少なくとも3％、少なくとも4％、少なくとも5％、少なくとも6％、少なくとも7％ 少なくとも8％、少なくとも9％、少なくとも10％、少なくとも15％または少なくとも20％のゲノムに、ベクターが組み込まれる。いくつかの態様において、標的細胞ゲノムへの核酸のインテグレーションは、安定であり、すなわち、ベクター核酸は、標的細胞ゲノム中に一過性ではなくより長い期間にわたって留まり、染色体遺伝物質の一部を標的細胞の子孫に伝える。
特定の態様において、トランスポゾンを使用して、様々なサイズの核酸、すなわちポリヌクレオチドを標的細胞ゲノムに組み込む。いくつかの態様において、対象の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、約0.1kb〜200kb、約0.5kb〜100kb、約1.0kb〜約8.0kb、約1.0〜約200kb、約1.0〜約10kb、約10kb〜約50kb、約50kb〜約100kb、または約100kb〜約200kbの範囲である。いくつかの態様において、対象の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、1.0kb〜8.0kbまたは約1.0kb〜約8.0kbの範囲である。いくつかの態様において、対象の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、約1.0〜約200kbの範囲である。特定の態様において、対象の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、約1.0kb〜約8.0kbの範囲である。
V. 検出および定量のための方法
本明細書において、抗BCMA抗体である細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を検出するための方法であって、CARを発現する細胞（CAR発現細胞）を含有する組成物または生物学的試料とBCMA-Fc融合タンパク質とを接触させることによる方法が提供される。いくつかの態様において、該方法はさらに、BCMA-Fc融合タンパク質と組成物または生物学的試料中の細胞によって発現されるまたは細胞上のCARとの間に複合体が形成されるかどうかを検出すること、例えば、そのような結合の存在または非存在またはレベルを検出することを含む。いくつかの態様において、検出することは、BCMA-Fc融合物と結合している細胞を検出することを含む。いくつかの態様において、BCMA-Fc融合物は、検出のために直接的または間接的に標識される。
いくつかの態様において、BCMA-Fc融合タンパク質のBCMA抗原は、抗原受容体、例えばCARによって認識されるエピトープを含むBCMAの細胞外ドメインまたはその一部であるかまたはそれを含む。特定の態様において、組換えBCMA-Fc融合タンパク質は、CARによって認識されるエピトープであるかまたはそれを含有するヒトBCMAの細胞外ドメインまたはその一部を含有するBCMA抗原を含有する。いくつかの態様において、BCMA-Fc融合物のBCMA抗原は、天然のヒトBCMAの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有しない。したがって、いくつかの態様において、BCMA-Fc融合物のBCMA抗原は、天然のヒトBCMAの細胞外ドメインまたはその一部である、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、BCMA-Fc融合タンパク質のBCMA抗原は、SEQ ID NO：1と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはこれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであるかもしくはそれを含む、いくつかの場合に、それからなる、またはそれから本質的になる、あるいは、CARの抗原結合ドメインによって認識されるかまたは特異的に結合されるSEQ ID NO：1の少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、または少なくとも180の連続的アミノ酸を含有するそのフラグメントである。いくつかの態様において、BCMA抗原は、SEQ ID NO：1に示される配列、または、抗原受容体、例えばCARによって認識されるエピトープであるかまたはそれを含有するその一部であるかもしくはそれを含む、いくつかの場合に、それからなる、またはそれから本質的になる。
いくつかの態様において、組換えBCMA抗原またはその部分は、IgG（IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプを含む）、IgA、IgE、IgDおよびIgMならびにそれらの改変形態由来の免疫グロブリン定常領域またはドメイン、例えば、Fcドメインまたはその部分などに、直接的または間接的に融合される。特定の態様において、BCMA抗原は、Fcドメインに、直接的または間接的に連結される。いくつかの態様において、ポリペプチドは、BCMA抗原またはその部分およびFcドメインを含む、融合ポリペプチドである。
いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG、IgAまたはIgDアイソタイプの重鎖の第二および第三の定常ドメイン（すなわち、CH2およびCH3ドメイン）、例えば、IgG、IgAおよびIgDアイソタイプのCH2またはCH3から構成される。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgMまたはIgEアイソタイプの3つの重鎖定常ドメイン（すなわち、CH2、CH3およびCH4ドメイン）から構成される。いくつかの態様において、Fcドメインはさらに、ヒンジ配列またはその部分を含み得る。特定の局面において、Fcドメインは、免疫グロブリン分子のヒンジドメインの一部または全部＋CH2およびCH3ドメインを含有する。いくつかの場合に、Fcドメインは、1つまたは複数のジスルフィド結合によって接続された2つのポリペプチド鎖の二量体を形成することができる。いくつかの態様において、Fcドメインは、好適な哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジまたはサル）の免疫グロブリン（例えば、IgG、IgA、IgMまたはIgE）に由来する。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgGのCH2およびCH3ドメインを含む。特定の態様において、Fcドメインは、BCMA抗原のC末端に融合される。特定の態様において、Fcドメインは、BCMA抗原のN末端に融合される。
いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG Fcドメイン、またはその一部もしくはバリアントである。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：2に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：2に示される配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、ヒトIgG Fcドメイン、またはその一部もしくはバリアントである。特定の態様において、Fcドメインは、野生型ヒトIgG Fcドメイン、またはその一部もしくはバリアントである。特定の態様において、Fcドメインは、野生型ヒトIgG1 Fcドメインのバリアントである。
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、バリアントFcドメインを含む。特定の態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインと軽鎖との間の対合を低減、減少および/または低下させる、変異、例えば、置換、欠失または挿入を含有する。いくつかの態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、FcドメインとFc受容体との間の結合親和性を低減する変異を含有する。特定の態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、FcドメインとFc受容体との間の相互作用、または相互作用の確率もしくは可能性を低減、減少および/または低下させる変異を含有する。いくつかの態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインと補体系のタンパク質との間の結合親和性を低減する変異を含有する。特定の態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインと補体系のタンパク質との間の相互作用、または相互作用の確率もしくは可能性を低減、減少および/または低下させる変異を含有する。
いくつかの態様において、BCMA-Fcは、バリアントヒトIgG1 Fcドメインを含む。いくつかの態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインのヒンジ領域にシスチンからセリンへの置換を含有する。いくつかの態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、Fcドメインのヒンジ領域にロイシンからアラニンへの置換を含有する。特定の態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、ヒンジ領域にグリシンからアラニンへの置換を含有する。特定の態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、FcドメインのCH2領域にアラニンからセリンへの置換を含有する。いくつかの態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、FcドメインのCH2領域にプロリンからセリンへの置換を含む。いくつかの態様において、バリアントヒトIgG Fcドメインは、SEQ ID NO：28によって示される通りのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、BCMA-Fcは、Fcドメインを含む融合ポリペプチドであって、Fcドメインが融合ポリペプチドのC末端に存在する、融合ポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、BCMA-Fcは、BCMAポリペプチドまたはその一部およびFcドメインを含む、融合ポリペプチドである。いくつかの態様において、BCMAポリペプチドまたはその部分は、SEQ ID NO：1に示されるアミノ酸配列、または、SEQ ID NO：1と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示し、かつ、抗原受容体、例えばCARによって認識されるエピトープを含有するアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：2に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：2と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、SEQ ID NO：28に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：28と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示すアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様において、BCMA抗原は、BCMAまたはその一部もしくはバリアント、およびタグまたは融合ドメイン、例えばFcドメインを含む。特定の態様において、BCMA抗原は、SEQ ID NO：35に示されるアミノ酸配列、または、SEQ ID NO：35と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を示し、かつ、抗原受容体、例えばCARによって認識されるエピトープを含むアミノ酸の配列の全てまたは一部を含有する。
いくつかの態様において、BCMA-Fは、各々CARによって認識および/または結合される記載の通りの2つ以上のBCMA抗原を含む、二量体である。いくつかの態様において、その2つ以上のBCMA抗原は、同一である。
特定の態様において、本明細書に記載のBCMA-Fc融合物を用いてCAR発現細胞を検出するための方法を使用して、対象におけるCAR発現細胞を評価する。いくつかの態様において、治療用細胞組成物のCAR発現細胞のインビボ薬物動態、増大および/または持続性を評価、測定および/または定量するための、BCMA-Fc融合物の使用方法が本明細書において提供される。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法における、免疫治療、例えばCAR-T細胞治療のために投与されるCAR発現細胞などの、細胞のインビボ薬物動態、増大および/もしくは持続性、ならびに/または細胞の細胞表現型もしくは機能的活性の変化を、BCMA-Fc融合タンパク質を用いて測定することができる。いくつかの態様において、CAR発現細胞の薬物動態、増大および/または持続性は、治療用細胞組成物の投与後の対象および/または対象から得られた生物学的試料中のCARを発現する細胞の存在および/または量を治療の投与の間および/またはその後に検出することによって、測定または評価される。
いくつかの局面において、BCMA-Fc融合物をフローサイトメトリーと共に使用して、対象の血液もしくは血清または器官もしくは組織試料（例えば、疾患部位、例えば、腫瘍試料）中のCAR発現細胞の量を評価する。いくつかの局面において、持続性は、試料の、例えば、血液もしくは血清の1マイクロリットル当たりの、または、試料の1マイクロリットル当たりの末梢血単核細胞（PBMC）もしくは白血球もしくはT細胞の総数当たりの、CAR発現細胞の数として定量される。特定の局面において、増大は、試料、例えば、血液もしくは血清の間の1マイクロリットル当たりの、または、試料の1マイクロリットル当たりの末梢血単核細胞（PBMC）もしくは白血球もしくはT細胞の総数当たりの、経時的なCAR発現細胞の数の増加として定量される。いくつかの態様において、薬物動態、増大および/または持続性は、対象および/または対象から収集された試料中の複数の時点でのCAR発現細胞の量を検出することによって測定または評価される。特定の態様において、治療用細胞組成物が投与された後の24時間、48時間、72時間、4日、5日、6日、7日、10日、14日、21日、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、3ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、1年以内または1年超に、1つまたは複数の試料が、対象から収集、取得および/または採取される。
いくつかの態様において、個体における抗BCMA CAR T細胞治療を評価する方法であって、CARが、抗BCMA抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、そして、対象由来の試料をBCMA-Fc融合タンパク質とインキュベートすること、およびBCMA-Fc融合タンパク質と結合しているT細胞の量を判定することを含む、方法が提供される。いくつかの態様において、BCMA-Fc融合物が標識され、そして、BCMA-Fc融合物が結合したT細胞がフローサイトメトリーによってアッセイされる。いくつかの態様において、試料は、血液由来試料であるか、または、アフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物であるかもしくはそれから生じる。いくつかの局面において、投与は、該治療の第一用量の開始後に行われる。
一態様において、BCMA-Fcを使用して、個体におけるCAR T細胞治療への調整が必要かどうか、例えば、個体におけるCAR T細胞の低レベルが、該治療を調整する必要性を示す場合を判定する。いくつかの局面において、該治療は、（i）血液または他の生物学的試料中で検出可能なT細胞治療の細胞の数が、検出可能であった後、検出可能でないかまたは低減される、場合によりT細胞治療の投与後の先行時点と比較して低減される場合；（ii）血液または他の生物学的試料中で検出可能なT細胞治療の細胞の数が、T細胞治療の投与の開始後、場合により第一、第二または後続の用量後の対象の血液または生物学的試料中で検出可能なT細胞治療の細胞のピーク数または最大数の1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍もしくはより多く減少したまたは1.5倍超、2.0倍超、3.0倍超、4.0倍超、5.0倍超、10倍超もしくはより多く減少した場合；（iii）T細胞治療の細胞のピークレベルまたは最大レベルが対象の血液中で検出可能となった時点で、対象由来の血液中で検出可能なT細胞の数またはそれから生じる細胞の数が、対象の血液中の総末梢血単核細胞（PBMC）の10％未満、5％未満、1％未満または0.1％未満である場合；ならびに/または（iv）血液中で検出可能な細胞治療のCD3+細胞またはCD8+細胞の数が、1μL当たり20細胞未満、1μL当たり15細胞、1μL当たり10細胞、1μL当たり5細胞未満または1μL当たり1細胞未満である場合に調整される。いくつかの態様において、該治療は、CAR-T細胞治療の1つまたは複数の追加の用量を投与すること、CAR-T細胞治療の増加した用量を投与すること、同じまたは異なる抗原に特異的な代替CAR-T細胞治療を投与すること、CAR-T細胞の増大または持続性を促進または増加させるために1つまたは複数の免疫調節剤または他の作用物質を投与することによって調整される。
CAR発現細胞へのBCMA-Fc融合物の結合を検出するための当技術分野において公知の様々な方法を使用することができる。いくつかの態様において、該方法は、フローサイトメトリーまたはイムノアッセイを含む。指示部分または標識基を、BCMA-Fc融合物に付着させることができ、これは、アッセイ設備の利用可能性および適合するイムノアッセイ手順に左右されることが多い方法の様々な使用の必要性を満たすように選択される。いくつかの態様において、標識は、蛍光部分またはタンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、GFPまたはBFP）、または発光部分（例えば、Quantum Dot Corporation, Palo Alto, Calif.から供給されるQdot（商標）ナノ粒子）から選択される。上記の様々なイムノアッセイを実施する際に使用されるべき様々な一般技術が公知である。
いくつかの態様において、BCMA-Fc融合物は、標識される必要はなく、BCMA-Fc融合物に結合する標識抗体を使用してその存在を検出することができる。いくつかの態様において、標識抗体は、該分子のFc部分に特異的である。
いくつかの態様において、BCMA-Fc融合物は、固体支持体に固定または結合され、CAR-T細胞を含む1つまたは複数の標的細胞を含有する組成物または生物学的試料が、固体支持体と接触する。いくつかの態様において、固体支持体は、ビーズである。いくつかの態様において、固体支持体は、ウェルまたはプレート、例えば、細胞培養プレートの表面である。いくつかの態様において、固体支持体は、例えばCAR+T細胞のクロマトグラフ単離または選択を可能にするための、クロマトグラフィーカラム中に存在するまたはその内部に含有される樹脂またはマトリックスである。いくつかの態様において、BCMA-Fc融合タンパク質は、固体支持体に可逆的に結合するかまたは結合することができる。いくつかの態様において、固体支持体は、BCMA-Fc融合タンパク質中に存在する結合パートナーに結合する、例えば可逆的に結合することができる1つまたは複数の結合部位を含む親和性クロマトグラフィーマトリックスである。例示的な一態様において、BCMA-Fc融合タンパク質は、固体支持体上に存在または固定されたストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子に結合することができるストレプトアビジン結合ペプチドまたは他のストレプトアビジン結合部分を含み、これらは、いくつかの場合に、ビオチンなどの競合物質の存在下で解離させることができる。例示的なそのような系は、米国公開特許出願第US20150024411号に記載されているものを含む。
VI. 製造物品およびキット
いくつかの態様において、また、提供される方法を実施する際に有用なシステム、装置およびキットが提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載の粒子、例えば、ビーズ、すなわち、結合分子が付着した粒子、例えば、ビーズを含有する、製造物品、例えばキットまたはデバイスが提供される。いくつかの態様において、結合分子は、組換え受容体またはCARに結合するかまたはそれを認識する抗原または抗体を含む。いくつかの態様において、キットを、細胞を増大、選択および/または富化させるための方法において、例えば養子細胞治療のための遺伝子操作された細胞の調製に従って、使用することができる。特定の態様において、遺伝子操作された細胞は、付着した結合分子により結合または認識される組換え受容体、例えばCARを発現する。
いくつかの態様において、製造物品は、1つまたは複数の容器、典型的には複数の容器と、パッケージング材料と、1つの容器または複数の容器および/またはパッケージング上もしくはそれに付随するラベルまたは添付文書（一般に、1つまたは複数の核酸、例えば、組換え受容体またはCARをコードする遺伝子を含む1つまたは複数の核酸で形質導入されるまたはトランスフェクトされる対象由来の細胞などの細胞を増大させるための説明書を含む）を含む。
特定の態様において、キットはさらに、ある細胞集団から組換え受容体を発現する細胞を選択または富化させるための、本明細書に記載の粒子、例えば、ビーズの使用説明書を含む。いくつかの態様において、キットは、CARを発現する細胞を富化させるための、本明細書に記載の粒子、例えば、ビーズの使用説明書を含む。特定の態様において、キットは、細胞（全てではなくより少ない細胞がCARを発現する）を含む組成物を本明細書に記載の粒子、例えば、ビーズとインキュベート、接触または処理するための説明書を含む。いくつかの態様において、キットは、CARを発現する細胞を活性化、増大および/または富化させるための説明書を含む。特定の態様において、キットは、細胞の0.01％未満、0.1％未満、1％未満、5％未満、10％未満、15％未満、20％未満、25％未満、30％未満、35％未満、40％未満、45％未満、50％未満、55％未満、60％未満、65％未満、70％未満、80％未満または90％未満がCARを発現する細胞集団からCARを発現する細胞を活性化、増大および/または富化させるための説明書を含む。
いくつかの態様において、キットはさらに、トランスフェクションまたは形質導入の前に増大、活性化および/または富化されていない細胞に、細胞を本明細書に記載の粒子、例えば、ビーズと接触、インキュベートまたは処理することによって、組換え受容体、例えばCARをコードする1つまたは複数の核酸をトランスフェクトまたは形質導入するための説明書を含有する。
VII. 定義
別途定義される場合を除き、本明細書において使用するすべての専門用語、表記法、ならびに他の技術用語および科学用語または用語法は、特許請求の範囲に記載された対象が関係する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有することが意図される。いくつかの場合において、通常理解されている意味を有する用語が、明確化のために、かつ/または即座の参照のために本明細書において定義されており、そのような定義が本明細書に含まれることは、当技術分野において一般に理解されていることを超える実質的な違いを表すように必ずしも解釈されるべきではない。
本明細書において用いられる場合、抗体の「対応する形態」への言及は、2つの抗体の性質または活性を比較したときに、その性質が抗体の同じ形態を使って比較されることを意味する。例えば、ある抗体が、第一の抗体の対応する形態の活性と比較して高い活性を有するという場合、それは、その抗体のscFvなどの特定の形態が、第一の抗体のscFv形態と比較して高い活性を有することを意味する。
本明細書において用いられる場合、ヌクレオチド位置またはアミノ酸位置が、配列表に示されるものなど、開示された配列におけるヌクレオチド位置またはアミノ酸位置「に対応する」という記載は、標準的なアライメントアルゴリズム、例えばGAPアルゴリズムなどを用いて同一性を最大となるように開示された配列とのアライメント時に特定されたヌクレオチド位置またはアミノ酸位置を指す。配列をアライメントすることによって、当業者は、例えば、保存アミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして用いて、対応する残基を特定することができる。一般に、対応する位置を特定するために、アミノ酸の配列は、最も高水準の一致が得られるようにアライメントされる（例えば：Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; および Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を参照のこと）。
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプによって変動する、抗体のFc領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）；食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）のダウンレギュレーション；ならびにB細胞活性化を含む。
本明細書における用語「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために使用される。この用語は、天然配列Fc領域およびバリアントFc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226またはPro230から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。ただし、Fc領域のC末端リシン（Lys447）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書において特段の指定のない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているようなEUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」は、本明細書において互換的に用いられ、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体または本明細書に規定するFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相HPLC）による判定で、95％超または99％超の純度まで精製される。抗体純度の評価方法の概要については、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照されたい。
「単離された」核酸は、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、該核酸分子を通常含有する細胞中に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に存在するか、その自然の染色体位置と異なる染色体位置にある。
「抗イディオタイプ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体重鎖および軽鎖（またはそのフラグメント）をコードする1つまたは複数の核酸分子を指し、単一ベクターまたは別個のベクター中のそのような核酸分子、および宿主細胞中の1つまたは複数の場所に存在するそのような核酸分子を含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、互換的に用いられ、その中に外因性核酸が導入されている細胞を、そのような細胞の子孫を含めて指す。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞、および継代の数に関係なくそれらに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸の内容において親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は本明細書において含まれる。
本明細書において用いられる場合、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）に関して使用するとき「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」および「パーセント同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアライメントし、必要に応じて、ギャップを導入した後の、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列（例えば、対象の抗体またはフラグメント）におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的とするアライメントは、当技術分野における技術の範囲内である種々の方法で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定することができる。
アミノ酸置換は、ポリペプチド中のあるアミノ酸が別のアミノ酸に置き換わることを含み得る。置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得る。アミノ酸置換を、関心対象の結合分子、例えば、抗体に導入して、そして、その生成物を、所望の活性、例えば、保持された/改善された抗原結合、減少した免疫原性または改善されたADCCもしくはCDCについてスクリーニングしてよい。
アミノ酸は、一般に、以下の共通の側鎖特性に従って分類することができる：
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性の親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；
（6）芳香族性：Trp、Tyr、Phe。
いくつかの態様において、保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを同じクラスの別のメンバーに交換することを包含することができる。いくつかの態様において、非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスに交換することを包含することができる。非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスに交換することを包含する。
用語「ベクター」は、本明細書において用いられる場合、それに連結される別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製性核酸構造体としてのベクターならびに導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターが含まれる。ある種のベクターは、機能的に連結された核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
本明細書において用いられる単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示す場合を除き、複数の指示対象を包含する。例えば、「a」または「an」は、「少なくとも1つ」または「1つまたは複数」を意味する。本明細書において記載される局面および変化形は、局面および変化形「からなる」ことおよび/またはそれら「から本質的になる」ことを包含することが理解される。
本開示の全体を通して、特許請求の範囲に記載される対象の種々の局面が範囲形式で示される。範囲形式での記載は単に便宜および簡潔性のためであり、特許請求の範囲に記載される対象の範囲に関して柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能性のある部分範囲ならびにその範囲内にある個々の数値をすべて具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、値の範囲が与えられる場合、その範囲の上限と下限との間にある各介在する値（intervening value）、およびその表記された範囲における任意の他の表記された値または介在する値が、特許請求の範囲に記載される対象の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、このより小さい範囲に独立して含まれてもよく、表記された範囲における任意の特に除外される限界に従うことを条件に、特許請求の範囲に記載される対象の範囲内にも包含される。表記された範囲が限界点の一方または両方を含む場合、そのような含まれた限界点のどちらかまたは両方を除外する範囲もまた、特許請求の範囲に記載される対象において含まれる。このことは、範囲の広さにかかわらず、当てはまる。
本明細書において用いられる用語「約」は、この技術分野における当業者には容易に理解されるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及には、その値またはパラメータ自体に関する態様が含まれる（および記載される）。例えば、「約X」に言及する記載は、「X」の記載を含む。いくつかの態様において、「約」は、その値またはパラメータの±20％、±15％、±10％、±5％または±1％以内を指す。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小の長さに限定されない。提供される抗体および抗体鎖および他のペプチド（例えば、リンカー）を含めたポリペプチドは、天然および/または非天然アミノ酸残基を含めたアミノ酸残基を含み得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。いくつかの局面において、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブ配列または天然配列に対する修飾を含有し得る。これらの修飾は、部位特異的変異誘発によるなどの意図的な修飾であっても、タンパク質を産生する宿主の変異またはPCR増幅に起因するエラーによるなどの偶発的な修飾であってもよい。
本明細書において用いられる場合、組成物は、細胞を含めて、2つ以上の生成物、物質または化合物の任意の混合物を指す。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
本明細書において用いられる場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陽性」であるという記述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの細胞上でのまたは細胞内での検出可能な存在を指す。表面マーカーを指す場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体によって染色し、該抗体を検出することによって検出されるような表面発現の存在を指し、ここで、染色は、アイソタイプが一致する対照を用いてそれ以外は同一条件下で同じ手法を行って検出される染色を実質的に上回るレベルで、および/またはマーカーが陽性であることが公知の細胞のものと実質的に同様のレベルで、および/またはマーカーが陰性であることが公知である細胞のものより実質的に高いレベルで、フローサイトメトリーによって検出することができる。
本明細書において用いられる場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陰性」であるという記述は、特定のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞上でのまたは細胞内での実質的に検出可能な存在の非存在を指す。表面マーカーを指す場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体によって染色し、該抗体を検出することによって検出されるような表面発現の非存在を指し、ここで、染色は、アイソタイプが一致する対照を用いてそれ以外は同一条件下で同じ手法を行って検出される染色を実質的に上回るレベルでフローサイトメトリーによって検出されず、および/またはマーカーが陽性であることが公知の細胞のものより実質的に低いレベルで、および/またはマーカーが陰性であることが公知である細胞のものと比較して実質的に同様のレベルである。
VIII. 例示的な態様
提供される態様には、以下がある。
1. 特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含む組換え抗原受容体を発現している細胞を含むインプット組成物を、複数の粒子、例えばビーズと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれが、特異的に抗原結合ドメインと結合する結合分子を含み、抗原結合ドメインへの結合分子の結合が、組換え抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する、方法。
2. 組換え抗原受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、態様1記載の方法。
3. 抗原結合ドメインが、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、態様1または態様2記載の方法。
4. 抗原結合性フラグメントが、単鎖抗体フラグメントであるかまたはそれを含む、態様3記載の方法。
5. その抗原結合性フラグメントが、柔軟なリンカーによりつながった抗体可変領域を含む、態様3または態様4記載の方法。
6. その抗原結合性フラグメントが、scFvであるかまたはそれを含む、態様3〜5のいずれか1つに記載の方法。
7. 抗原が、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、炭酸脱水酵素9（CAIX）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerbB2）、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児型アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子、（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、TAG72、B7-H6、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児型AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、癌-精巣抗原、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、病原体特異抗原およびユニバーサルタグ関連抗原より選択され、かつ/あるいは抗原が、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXもしくはG250としても公知）、癌-精巣抗原、癌/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、癌胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても公知）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Ra）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メソセリン、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグ関連抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子より選択される、態様1〜6のいずれか記載の方法。
8. 結合分子が、組換え抗原受容体のリンカーまたはスペーサー領域と結合せずかつそれを認識せず、リンカーまたはスペーサー領域が、抗原結合ドメインを抗原受容体の膜貫通ドメインと接続している、態様1〜7のいずれか記載の方法。
9. 結合分子が、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである、態様1〜8のいずれか記載の方法。
10. 特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含むインプット組成物を、複数の粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれが、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである結合分子を含み、抗原結合ドメインへの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、キメラ抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する、方法。
11. 結合分子が、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部を含む、態様1〜8のいずれか記載の方法。
12. 特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含むインプット組成物を、複数の粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれが、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部を含む結合分子を含み、抗原結合ドメインへの組換え抗原、またはその一部の結合が、キメラ抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する、方法。
13. 組換え抗原が、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、炭酸脱水酵素9（CAIX）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerbB2）、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児型アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子、（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、TAG72、B7-H6、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児型AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、癌-精巣抗原、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138および病原体特異抗原、もしくは抗原結合ドメインにより認識される前記のいずれかの一部より選択され、かつ/あるいは抗原が、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXもしくはG250としても公知）、癌-精巣抗原、癌/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、癌胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても公知）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Ra）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メソセリン、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的または病原体発現抗原、またはユニバーサルタグ関連抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子より選択される、態様11または態様12記載の方法。
14. 組換え抗原が、BCMA、CD22もしくはROR1であるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である、態様11〜13のいずれか記載の方法。
15. 抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原の一部が、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部を含む、態様11〜14のいずれか記載の方法。
16. 抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原の一部が、本質的に、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部からなる、態様11〜14のいずれか記載の方法。
17. 特異的にB細胞成熟抗原（BCMA）と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含むインプット組成物を、複数の粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれが、BCMAの細胞外ドメインまたは抗原結合ドメインにより認識される細胞外ドメインの一部を含む結合分子を含み、抗原結合ドメインへのBCMAの細胞外ドメインまたはその一部の結合が、キメラ抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する、方法。
18. BCMAの一部が、本質的に、細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部からなる、態様17記載の方法。
19. 結合分子が、部分構造に連結した組換え抗原またはその一部を含む融合ポリペプチドであり、任意で、部分構造が、粒子との結びつきを促進する、態様11〜18のいずれか記載の方法。
20. 部分構造が、組換え抗原のC末端に連結されている、態様19記載の方法。
21. 部分構造が、疎水性であるか、または疎水性アミノ酸に富む、態様19または態様20記載の方法。
22. 部分構造が、Fcドメインであるかまたはそれを含む、態様19〜21のいずれか記載の方法。
23. Fc領域が、ヒトIgGに由来する、態様22記載の方法。
24. 抗原が、CD19である、態様1〜12のいずれか記載の方法。
25. 特異的にCD19と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含むインプット組成物を、複数の粒子、例えば、ビーズと共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させる方法であって、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれが、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである結合分子を含み、抗原結合ドメインへの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、キメラ抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する、方法。
26. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、態様9、態様24または態様25記載の方法。
27. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、態様9、態様24または態様25記載の方法。
28. 抗原結合性フラグメントが、scFvであるかまたはそれを含む、態様26または態様27記載の方法。
29. 抗原または組換え抗原が、ヒト由来である、態様1〜28のいずれか記載の方法。
30. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む、態様9、10および25〜29のいずれか記載の方法。
31. 免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部が、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域またはFcの一部を含む、態様30記載の方法。
32. 定常領域またはFc領域が、ヒトIgG由来である、態様30または態様31記載の方法。
33. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、インタクト抗体または完全長抗体である、態様9、10および25〜32のいずれか1つに記載の方法。
34. 結合分子が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的または非共有結合的に結びついている、態様1〜33のいずれか記載の方法。
35. 結合分子が、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれと、結合分子のC末端アミノ酸残基もしくはその近くで結びついており、かつ/または抗原受容体の抗原結合ドメインにより認識される結合分子の領域もしくはエピトープが、抗原受容体により認識可能なように配向されるように、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれへの結合分子の結びつきが実施される、態様1〜34のいずれか記載の方法。
36. 粒子、例えば、ビーズが、合成粒子、不溶性粒子、固体粒子または非細胞性粒子である、態様1〜35のいずれか記載の方法。
37. 複数の粒子が、ビーズを含む、態様1〜35のいずれか記載の方法。
38. 複数の粒子、例えば、ビーズが、1μmと10μmとの間もしくは約1μmと10μmとの間または2μmと5μmとの間もしくは約2μmと5μmとの間の平均直径を含む、態様1〜37のいずれか記載の方法。
39. 複数の粒子、例えば、ビーズが、約2.8μmの平均直径を含む、態様1〜38のいずれか記載の方法。
40. 複数の粒子、例えば、ビーズが、約4.5μmの平均直径を含む、態様1〜38のいずれか記載の方法。
41. 複数の粒子、例えば、ビーズが、約0.5g/cm3と5.0g/cm3との間または1g/cm3と2g/cm3との間もしくは約1g/cm3と約2g/cm3との間の平均密度を含む、態様1〜40のいずれか記載の方法。
42. 複数の粒子、例えば、ビーズが約1.3g/cm3の平均密度を含む、態様1〜41のいずれか記載の方法。
43. 複数の粒子、例えば、ビーズが、約1.5g/cm3の平均密度を含む、態様1〜42記載の方法。
44. 複数の粒子、例えば、ビーズが、単分散性である、態様1〜43のいずれか記載の方法。
45. 結合分子が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている、態様1〜44のいずれか記載の方法。
46. 粒子が、結合分子の結びつきのための表面に露出した官能基を含み、かつ/または結合分子が、表面に露出した官能基を介して粒子と共有結合的に結びついている、態様1〜45のいずれか記載の方法。
47. 表面に露出した官能基が、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、クロロメチル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、トシル基またはヒドラジン基である、態様46記載の方法。
48. 表面に露出した官能基が、トシル基である、態様46または態様47記載の方法。
49. 複数の粒子、例えば、ビーズが、生体適合性であるか、または細胞に無毒である、態様1〜48のいずれか記載の方法。
50. 複数の粒子、例えば、ビーズが、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、ヒドロキシカルボン酸のコポリマー、ジカルボン酸のコポリマー、または金属を含む粒子を含む、態様1〜49のいずれか記載の方法。
51. 粒子、例えば、ビーズが、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、炭素またはそれらの組み合わせを含む表面を含む、態様1〜50のいずれか記載の方法。
52. ポリマーが、ポリエチレングリコール、乳酸グリコール酸共重合体、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレン、およびポリビニルアルコールまたはそれらの組み合わせである、態様51記載の方法。
53. 複数の粒子、例えば、ビーズが、疎水性表面を含む粒子を含む、態様1〜52のいずれか記載の方法、
54. 複数の粒子、例えば、ビーズが、ポリスチレン表面を含む粒子を含む、態様1〜53のいずれか記載の方法。
55. 複数の粒子、例えば、ビーズが、磁性である、および/または磁性コア、常磁性コアもしく超常磁性コアを含む、粒子を含む、態様1〜54のいずれか記載の方法。
56. 結合分子の濃度が、0.5μg/mLと500μg/mLとの間、1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは5μg/mLと100μg/mLとの間、または約0.5μg/mLと500μg/mLとの間、約1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは約5μg/mLと100μg/mLとの間である、態様1〜55のいずれか記載の方法。
57. 結合分子の濃度が、少なくとも1μg/mL、少なくとも5μg/mL、少なくとも10μg/mL、少なくとも25μg/mL、少なくとも50μg/mL、少なくとも100μg/mLもしくは少なくとも200μg/mLまたは少なくとも約1μg/mL、少なくとも約5μg/mL、少なくとも約10μg/mL、少なくとも約25μg/mL、少なくとも約50μg/mL、少なくとも約100μg/mLもしくは少なくとも約200μg/mLである、態様1〜56のいずれか記載の方法。
58. 複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれが、結合分子の少なくとも10コピー、少なくとも102コピー、少なくとも103コピー、少なくとも104コピー、少なくとも105コピーもしくは少なくとも106コピーまたは少なくとも約10コピー、少なくとも約102コピー、少なくとも約103コピー、少なくとも約104コピー、少なくとも約105コピーもしくは少なくとも約106コピーを含む、態様1〜57のいずれか記載の方法。
59. インキュベーションの少なくとも一部が、特異的に細胞上の追加的な分子と結合する作用物質の存在下で行われて、補助シグナルを提供し、かつ/または抑制シグナルを遮断する、態様1〜58のいずれか記載の方法。
60. 作用物質が、粒子、例えば、ビーズと一緒に提供され、任意で、作用物質が、複数の粒子、例えば、ビーズ、またはそのサブセットのそれぞれにより含まれる、態様1〜59のいずれか記載の方法。
61. 作用物質が、複数の粒子、例えば、ビーズとは別に提供される、態様1〜59のいずれか記載の方法。
62. 細胞上の追加的な分子と特異的に結合し、補助シグナルを提供し、かつ/または抑制シグナルを遮断する作用物質を、粒子、例えば、ビーズがさらに含む、態様1〜60のいずれか記載の方法。
63. 作用物質が、リガンドであるか、または抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである、態様59〜62のいずれか記載の方法。
64. 分子が、共刺激分子であるか、または活性化共受容体もしくはそのリガンドである、態様58〜63のいずれか記載の方法。
65. 共刺激分子または活性化共受容体が、OX-40、ICOS、DAP10、CD28もしくは4-1BBであるか、またはそのリガンド、任意で、OX-40L、ICOSL、B7-1、B7-2もしくは4-1BBLである、態様64記載の方法。
66. 分子が、抑制性受容体またはそのリガンドである、態様58〜63のいずれか記載の方法。
67. 抑制性受容体が、CTLA-4、PD-1、LAG-3、Tim-3、BTLAもしくはTIGITであるか、またはそれらのリガンド、任意で、PD-L1、PD-L2、CD155、CD112もしくはLIGHTである、態様66記載の方法。
68. 作用物質が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている、態様62〜67のいずれか記載の方法。
69. 結合分子と、粒子、例えば、ビーズにより含まれる作用物質との比、任意で、モル比または重量比が、1：1または約1：1である、態様62〜68のいずれか記載の方法。
70. インプット組成物中に存在する総細胞と、粒子、例えば、ビーズとの比が、5：1〜1：5もしくは約5：1〜1：5、3：1〜1：3もしくは約3：1〜1：3または2：1〜1：2もしくは約2：1〜1：2である、態様1〜69のいずれか記載の方法。
71. インプット組成物中に存在する総細胞と、粒子、例えば、ビーズとの比が、1：0.1〜1：5または約1：0.1〜1：5である、態様1〜70のいずれか記載の方法。
72. インプット組成物中に存在する総細胞と、粒子、例えば、ビーズとの比が、1：1または約1：1である、態様1〜71のいずれか記載の方法。
73. インキュベーションが、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間もしくは12日間または約2時間、約4時間、約8時間、約12時間、約24時間、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約8日間、約9日間、約10日間、約11日間もしくは約12日間よりも長く実施される、態様1〜72のいずれか記載の方法。
74. インキュベーションが、30℃と39℃との間または約30℃と39℃との間の温度で実施される、態様1〜73のいずれか記載の方法。
75. インキュベーションが、37°±2.0℃の温度で実施される、態様1〜74のいずれか記載の方法。
76. 細胞が、免疫細胞または人工多能性幹細胞（iPSC）を含む、態様1〜75のいずれか記載の方法。
77. 免疫細胞が、T細胞またはNK細胞である、態様1〜76のいずれか記載の方法。
78. 細胞が、CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を含む、態様1〜77のいずれか記載の方法。
79. CD4+細胞とCD8+細胞との比が、1：1、1：2、2：1、1：3もしくは3：1、または約1：1、約1：2、約2：1、約1：3もしくは約3：1である、請求項1〜78のいずれか記載の方法。
80. 細胞が、対象、任意で、ヒト対象から得られた初代細胞である、態様1〜79のいずれか記載の方法。
81. 細胞が、ヒト由来である、態様1〜80のいずれか記載の方法。
82. インプット組成物が、細胞の組成物を、組換え抗原受容体をコードする核酸分子と、組成物中の1つまたは複数の細胞中に核酸分子を導入するための条件で接触させることを含む方法により産生される、態様1〜81のいずれか記載の方法。
83. （a）細胞の組成物を、組換え抗原受容体をコードする核酸分子と、組成物中の1つまたは複数の細胞中に核酸分子を導入するための条件で接触させ、それにより、インプット組成物を産生すること、および
（b）インプット組成物の細胞を、態様1〜74のいずれか記載の方法によりインキュベートすること
を含む、細胞を遺伝子操作する方法。
84. 接触させることおよびインキュベートすることの少なくとも一部が、同時に実施される、態様82または態様83記載の方法。
85. 核酸分子が、ウイルスベクター、エピソームベクターまたはトランスポゾン中に含まれる、態様82〜84のいずれか記載の方法。
86. 接触させることが、トランスポゾン/トランスポサーゼ遺伝子導入により実施される、態様82〜85のいずれか記載の方法。
87. 接触させることが、ウイルスベクターによる形質導入により実施される、態様82〜85のいずれか記載の方法。
88. ウイルスベクターが、任意で、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであるレトロウイルスである、態様85または態様87記載の方法。
89. 接触させることが、ウイルスベクターを細胞の組成物と共にスピン接種する段階を含む、態様87または態様88記載の方法。
90. スピン接種することが、遠心分離チャンバーの内部空洞中でウイルスベクター粒子および細胞の組成物を回転させることを含み、回転が、空洞の側壁内面で、
500gと2500gとの間、500gと2000gとの間、500gと1600gとの間、500gと1000gとの間、600gと1600gとの間、600gと1000gとの間、1000gと2000gとの間もしくは1000gと1600gとの間、または約500gと2500gとの間、約500gと2000gとの間、約500gと1600gとの間、約500gと1000gとの間、約600gと1600gとの間、約600gと1000gとの間、約1000gと2000gとの間もしくは約1000gと1600gとの間（それぞれ両端の値を含む）、あるいは
少なくとも600g、少なくとも800g、少なくとも1000g、少なくとも1200g、少なくとも1600g、もしくは少なくとも2000g、または少なくとも約600g、少なくとも約800g、少なくとも約1000g、少なくとも約1200g、少なくとも約1600g、もしくは少なくとも約2000gである相対遠心力である、
態様89記載の方法。
91. スピン接種することが、
5分超もしくは約5分超、10分超もしくは約10分超、15分超もしくは約15分超、20分超もしくは約20分超、30分超もしくは約30分超、45分超もしくは約45分超、60分超もしくは約60分超、90分超もしくは約90分超または120分超もしくは約120分超、あるいは
5分と60分との間、10分と60分との間、15分と60分との間、15分と45分との間、30分と60分との間もしくは45分と60分との間、または約5分と60分との間、約10分と60分との間、約15分と60分との間、約15分と45分との間、約30分と60分との間もしくは約45分と60分との間（それぞれ両端の値を含む）
である時間である、態様89または態様90記載の方法。
92. 接触させることが、形質導入補助剤の存在下で実施される、態様87〜91のいずれか記載の方法。
93. 細胞の組成物が、複数のT細胞を含み、接触させることの前に、方法が、T細胞を刺激する工程も活性化する工程も含まない、態様82〜92のいずれか記載の方法。
94. 細胞の組成物が、複数のT細胞を含み、接触させることの前に、方法が、TCR複合体を経由するシグナルを誘導することが可能な1種もしくは複数種の作用物質の存在下で組成物をインキュベートすること、ならびに/またはT細胞、CD4+ T細胞、および/もしくはCD8+ T細胞の増殖を誘導することが可能な1種もしくは複数種の作用物質、ならびに/またはCD3結合分子、CD28結合分子、組換えIL-2、組換えIL-15、および組換えIL-7もしくはそれらの組み合わせの存在下でのインキュベーションを含まない、態様82〜93のいずれか記載の方法。
95. 接触させることの前に、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体の存在下でT細胞を刺激する工程を含まない、請求項93または態様94記載の方法。
96. 細胞の組成物が、複数のT細胞を含み、複数の細胞が、対象からの試料から得られたものであり、
接触させることが、対象から試料を得た後、24時間以内に開始され、かつ/あるいは
接触させることの前に、T細胞が、対象から試料を得た後、15℃超、18℃超、22℃超もしくは25℃超、または約15℃超、約18℃超、約22℃超もしくは約25℃長の温度に、1時間超、2時間超、4時間超、6時間超、8時間超、12時間超、または24時間超の時間供されたことがなく、かつ/あるいは
接触させることの前に、T細胞が、対象から試料を得た後、37°±2.0℃、約37°±2.0℃、37°±2.0℃超、または約37°±2.0℃超の温度に、15分超、30分超、1時間超または2時間超の時間供されたことがない、
態様82〜95のいずれか記載の方法。
97. 接触させることの前に、T細胞の5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、もしくは40％以下が、活性化細胞であり、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、IL-2、IFN-ガンマ、TNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、細胞周期のG1期もしくはより後期であり、かつ/または増殖することが可能である、態様82〜96のいずれか記載の方法。
98. インキュベーションまたは接触させることの前に、細胞を含む対象から生物学的試料を得ること、および任意で、試料から、細胞、任意で、T細胞を選択または富化することをさらに含む、態様1〜97のいずれか記載の方法。
99. インプット組成物中の組換え抗原受容体を発現している細胞のパーセントが、75％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満もしくはそれ未満または約75％未満、約70％未満、約60％未満、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満もしくはそれ未満である、態様1〜98のいずれか記載の方法。
100. 細胞の組成物またはインプット組成物が、少なくとも1×102個の細胞、少なくとも1×103個の細胞、少なくとも1×104個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも1×106個の細胞もしくは少なくとも1×107個の細胞、または少なくとも約1×102個の細胞、少なくとも約1×103個の細胞、少なくとも約1×104個の細胞、少なくとも約1×105個の細胞、少なくとも約1×106個の細胞もしくは少なくとも約1×107個の細胞を含む、態様1〜99のいずれか記載の方法。
101. アウトプット組成物中に存在する細胞の活性化マーカーまたは疲弊マーカーの表面発現が、類似のインキュベーション後であるが、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能なポリクローナル刺激分子の存在下で産生された細胞の組成物中のマーカーの表面発現よりも少ない、態様1〜100のいずれか記載の方法。
102. 疲弊マーカーが、抑制性受容体である、態様101記載の方法。
103. 疲弊マーカーが、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLAまたはTIGITである、態様101または態様102記載の方法。
104. 活性化マーカーが、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lまたは4-1BBである、態様103記載の方法。
105. 表面発現が、少なくとも1.2倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2.0倍、少なくとも3.0倍、少なくとも4.0倍、少なくとも5.0倍、少なくとも10.0倍もしくはこれを超える、または少なくとも約1.2倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2.0倍、少なくとも約3.0倍、少なくとも約4.0倍、少なくとも約5.0倍、少なくとも約10.0倍もしくはこれ超少ない、態様93〜96のいずれか記載の方法。
106. アウトプット組成物中の細胞数が、類似のインキュベーションによるが、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能なポリクローナル刺激分子の存在下で産生された細胞の組成物中の細胞数と実質的に同じであるか、またはそれよりも大きい、態様1〜105のいずれか記載の方法。
107. ポリクローナル刺激分子が、抗CD3抗体もしくはフラグメントおよび/または抗CD28抗体もしくはフラグメントを含む、態様101〜106のいずれか記載の方法。
108. アウトプット組成物中の細胞数が、インプット組成物中の細胞数よりも1.2倍超、1.5倍超、2.0倍超、3.0倍超、4.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、25倍超、50倍超、100倍超もしくはこれを超える、または約1.2倍超、1.5倍超、2.0倍超、3.0倍超、4.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、25倍超、50倍超、100倍超もしくはこれを超えて大きい、態様1〜107のいずれか記載の方法。
109. アウトプット組成物中の組換え抗原受容体を含む細胞のパーセントが、50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、95％超もしくはこれを超える、または約50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、95％超もしくはこれを超えて大きい、態様1〜108のいずれか記載の方法。
110. 組換え抗原受容体を含むアウトプット組成物中の細胞数が、インプット組成物中の抗原受容体を含む細胞の数と比較して、1.2倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10倍またはこれを超えて増加または富化されている、態様1〜109のいずれか記載の方法。
111. インキュベーションの少なくとも一部が、細胞の増大または活性をモジュレートする1種または複数種の追加的な作用物質の存在下で実施される、態様1〜110のいずれか記載の方法。
112. 1種または複数種の追加的な作用物質が、1種または複数種のサイトカインである、態様111記載の方法。
113. インビトロまたはエクスビボで行われる、態様1〜112のいずれか記載の方法。
114. 抗原受容体が、CARであり、CARが、ITAMを含む細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、態様1〜113のいずれか記載の方法。
115. 細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、態様114記載の方法。
116. CARが、共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、態様114または態様115記載の方法。
117. 共刺激シグナル伝達領域が、CD28または4-1BBのシグナル伝達ドメインを含む、態様116記載の方法。
118. 共刺激ドメインが、CD28である、態様117記載の方法。
119. アウトプット組成物から複数の粒子、例えば、ビーズを除去することをさらに含む、態様1〜118のいずれか記載の方法。
120. 態様1〜119のいずれか記載の方法により産生される細胞の組成物。
121. 粒子および粒子の表面と結合した結合分子を含む表面修飾粒子であって、結合分子が、特異的に抗原受容体の細胞外抗原結合ドメインと結合する、表面修飾粒子。
122. 抗原受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、態様121記載の表面修飾粒子。
123. 結合分子が、組換え抗原受容体のリンカーまたはスペーサー領域と結合せずかつそれを認識せず、リンカーまたはスペーサー領域が、抗原結合ドメインを抗原受容体の膜貫通ドメインと接続している、態様121または態様122記載の表面修飾粒子。
124. 結合分子が、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部を含む、態様121〜123のいずれか記載の表面修飾粒子。
125. 組換え抗原が、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、炭酸脱水酵素9（CAIX）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerbB2）、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児型アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子、（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、TAG72、B7-H6、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児型AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、癌-精巣抗原、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138および病原体特異抗原もしくは抗原結合ドメインにより認識される前記のいずれかの一部より選択され、かつ/あるいは抗原が、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXもしくはG250としても公知）、癌-精巣抗原、癌/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、癌胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても公知）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Ra）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メソセリン、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的または病原体発現抗原、またはユニバーサルタグ関連抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子より選択される、態様124記載の表面修飾粒子。
126. 組換え抗原が、BCMA、CD22もしくはROR1であるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である、態様124または態様125記載の表面修飾粒子。
127. 抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原の一部が、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部を含む、態様124〜126のいずれか記載の方法。
128. 抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原の一部が、本質的に、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部からなる、態様124〜126のいずれか記載の方法。
129. 粒子および粒子の表面と結合した結合分子を含む表面修飾粒子であって、結合分子が、B細胞成熟抗原（BCMA）の細胞外ドメインまたはその一部を含む、表面修飾粒子。
130. 結合分子が、部分構造と連結した組換え抗原またはその一部を含む融合ポリペプチドであり、任意で、部分構造が、粒子との結びつきを促進する、態様124〜129のいずれか記載の表面修飾粒子。
131. 部分構造が、組換え抗原のC末端に連結している、態様130記載の表面修飾粒子。
132. 部分構造が、疎水性であるか、または疎水性アミノ酸に富む、態様130または態様131記載の表面修飾粒子。
133. 部分構造が、Fcドメインであるかまたはそれを含む、態様130〜132のいずれか記載の表面修飾粒子。
134. Fc領域が、IgGに由来する、態様133記載の表面修飾粒子。
135. 組換え抗原が、ヒト由来である、態様130〜134のいずれか記載の表面修飾粒子。
136. 結合分子が、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、態様121〜123のいずれか記載の表面修飾粒子。
137. 抗原結合ドメインにより認識される抗原が、CD19である、態様121〜123および136のいずれか記載の表面修飾粒子。
138. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、態様136または態様137記載の表面修飾粒子。
139. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、態様136または態様137記載の表面修飾粒子。
140. 抗原結合性フラグメントが、scFvであるかまたはそれを含む、態様138または態様139記載の表面修飾粒子。
141. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む、態様136〜140のいずれか記載の表面修飾粒子。
142. 免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部が、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域またはFcの一部を含む、態様141記載の表面修飾粒子。
143. 定常領域またはFc領域が、ヒトIgGに由来する、態様141または態様142記載の表面修飾粒子。
144. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、インタクト抗体または完全長抗体である、態様136〜143のいずれか記載の表面修飾粒子。
145. 結合分子が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的または非共有結合的に結びついている、態様121〜144のいずれか記載の表面修飾粒子。
146. 結合分子が、複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれと、結合分子のC末端アミノ酸残基もしくはその近くで結びついており、かつ/または複数の粒子、例えば、ビーズのそれぞれへの結合分子の結びつきが、実施されることにより、抗原受容体の抗原結合ドメインにより認識される結合分子の領域もしくはエピトープが、抗原受容体により認識可能なように配向される、態様121〜145のいずれか記載の表面修飾粒子。
147. 粒子、例えば、ビーズが、合成粒子、不溶性粒子、固体粒子、または非細胞性粒子である、態様121〜146のいずれか記載の表面修飾粒子。
148. 複数の粒子が、ビーズを含む、態様121〜147のいずれか記載の表面修飾粒子。
149. 1μmと10μmとの間もしくは約1μmと10μmとの間または2μmと5μmとの間もしくは約2μmと5μmとの間の直径を有する、態様121〜148のいずれか記載の表面修飾粒子。
150. 約2.8μmの直径を有する、態様121〜149のいずれか記載の表面修飾粒子。
151. 約4.5μmの直径を有する、態様121〜149のいずれか記載の表面修飾粒子。
152. 結合分子が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている、態様121〜151のいずれか記載の表面修飾粒子。
153. 粒子が、結合分子の結びつきのための表面に露出した官能基を含み、かつ/または結合分子が、表面に露出した官能基を介して粒子と共有結合的に結びついている、態様121〜152のいずれか記載の表面修飾粒子。
154. 表面に露出した官能基が、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、クロロメチル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、トシル基またはヒドラジン基である、態様153記載の表面修飾粒子。
155. 表面に露出した官能基が、トシル基である、態様154記載の表面修飾粒子。
156. 生体適合性であるか、または細胞に無毒である、態様121〜155のいずれか記載の表面修飾粒子。
157. 複数の粒子、例えば、ビーズが、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、ヒドロキシカルボン酸のコポリマー、ジカルボン酸のコポリマー、または金属を含む粒子を含む、態様121〜156のいずれか記載の表面修飾粒子。
158. 粒子、例えば、ビーズが、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、炭素またはそれらの組み合わせを含む表面を含む、態様121〜157のいずれか記載の表面修飾粒子。
159. ポリマーが、ポリエチレングリコール、乳酸グリコール酸共重合体、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレン、およびポリビニルアルコール、またはそれらの組み合わせである、態様158記載の表面修飾粒子。
160. 疎水性表面を含む、態様121〜149のいずれか記載の表面修飾粒子。
161. 粒子、例えば、ビーズが、ポリスチレン表面を含む、態様121〜160のいずれか記載の表面修飾粒子。
162. 磁性である、および/または磁性コア、常磁性コアもしくは超常磁性コアを含む、態様121〜161のいずれか記載の表面修飾粒子。
163. 結合分子の少なくとも10コピー、少なくとも102コピー、少なくとも103コピー、少なくとも104コピー、少なくとも105コピーもしくは少なくとも106コピー、または少なくとも約10コピー、少なくとも約102コピー、少なくとも約103コピー、少なくとも約104コピー、少なくとも約105コピーもしくは少なくとも約106コピーを含む、態様121〜162のいずれか記載の表面修飾粒子。
164. 補助シグナルを提供し、かつ/または抑制シグナルを遮断する細胞上の追加的な分子と特異的に結合する作用物質をさらに含み、それにより細胞の増大をモジュレートする、態様121〜163のいずれか記載の表面修飾粒子。
165. 作用物質が、リガンドであるか、または抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである、態様165記載の表面修飾粒子。
166. 分子が、共刺激分子であるか、または活性化共受容体もしくはそのリガンドである、態様164または態様165記載の表面修飾粒子。
167. 共刺激分子または活性化共受容体が、OX-40、ICOS、DAP10、CD28もしくは4-1BBであるか、またはそのリガンド、任意で、OX-40L、ICOSL、B7-1、B7-2もしくは4-1BBLである、態様166記載の表面修飾粒子。
168. 分子が、抑制性受容体またはそのリガンドである、態様164または態様165記載の表面修飾粒子。
169. 抑制性受容体が、CTLA-4、PD-1、LAG-3、Tim-3、BTLAもしくはTIGITであるか、またはそのリガンド、任意で、PD-L1、PD-L2、CD155、CD112もしくはLIGHTである、態様168記載の表面修飾粒子。
170. 作用物質が、粒子、例えば、ビーズと共有結合的に結びついている、態様164〜169のいずれか記載の表面修飾粒子。
171. 結合分子と、粒子により含まれる作用物質との比、任意で、モル比または重量比が、1：1または約1：1である、態様164〜170のいずれか記載の表面修飾粒子。
172. 態様113〜153のいずれか記載の複数の表面修飾粒子、例えば、ビーズを含む組成物。
173. 結合分子の濃度が、0.5μg/mLと500μg/mLとの間、1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは5μg/mLと100μg/mLとの間、または約0.5μg/mLと500μg/mLとの間、約1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは約5μg/mLと100μg/mLとの間である、態様172記載の組成物。
174. 結合分子濃度が、少なくとも1μg/mL、少なくとも5μg/mL、少なくとも10μg/mL、少なくとも25μg/mL、少なくとも50μg/mL、少なくとも100μg/mLもしくは少なくとも200μg/mL、または少なくとも約1μg/mL、少なくとも約5μg/mL、少なくとも約10μg/mL、少なくとも約25μg/mL、少なくとも約50μg/mL、少なくとも約100μg/mLもしくは少なくとも約200μg/mLである、態様172または態様173記載の組成物。
175. 単分散性である、態様172〜174のいずれか記載の組成物。
176. 態様121〜171のいずれか記載の粒子または態様154〜158のいずれか記載の組成物と、使用説明書とを含むキット。
177. 説明書が、細胞集団から、結合分子により特異的に認識される抗原結合ドメインを含む抗原受容体を発現している細胞を選択または富化するためのものである、態様176記載のキット。
178. 説明書が、細胞集団から、結合分子により特異的に認識される抗原結合ドメインを含む抗原受容体を発現している細胞を増大させるためのものである、態様176記載のキット。
179. 細胞集団中の組換え抗原受容体を発現している細胞のパーセントが、75％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満もしくはそれ未満、または約75％未満、約70％未満、約60％未満、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満もしくはそれ未満である、態様177または態様178記載のキット。
180. 細胞集団を、態様121〜171のいずれか記載の粒子または態様172〜175のいずれか記載の組成物と共にインキュベートすることを含む、細胞を増大させるための方法。
181. 細胞集団を、態様121〜171のいずれか記載の粒子または態様172〜175のいずれか記載の組成物と接触させることを含む、細胞を選択または富化する方法。
182. 特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現しているT細胞を含むインプット組成物を、インプット組成物中の細胞におけるCAR依存性活性を刺激するための条件下で、少なくとも10日間インキュベートし、それにより、アウトプット組成物を産生する工程、および
アウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の1つまたは複数の表現型または活性を評価する工程
を含む、細胞組成物を評価するための長期刺激方法。
183. CAR依存性活性を刺激するための条件が、特異的にCARの抗原結合ドメインと結合する結合分子の存在を含む、態様182記載の方法。
184. 結合分子が、支持体と結びついている、態様183記載の方法。
185. 支持体が、固体支持体である、態様184記載の方法。
186. 固体支持体が、マイクロプレートのウェルまたはビーズの表面である、態様185記載の方法。
187. 固体支持体が、マイクロプレートと結びついた結合分子を有するマイクロプレートであり、インキュベーションが、マイクロプレート中で実施される、態様183〜186のいずれか記載の方法。
188. 固体支持体が、結合分子が結びついたビーズであり、インキュベーションが、複数のビーズの存在下で実施される、態様183〜187のいずれか記載の方法。
189. 結合分子が、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部であるかまたはそれを含む、態様183〜187のいずれか記載の方法。
190. 組換え抗原またはその一部が、BCMAであるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である、態様189記載の方法。
191. 結合分子が、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、態様183〜190のいずれか記載の方法。
192. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、態様191記載の方法。
193. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、態様192記載の方法。
194. インビトロまたはエクスビボで実施される、態様183〜193のいずれか記載の方法。
195. インプット組成物が、組換えサイトカインを含まない培地の存在下でインキュベートされる、態様182〜194のいずれか記載の方法。
196. インキュベーションが、連続的に実施される、またはある期間にわたり中断されない、態様182〜195のいずれか記載の方法。
197. インキュベーションの間に、細胞が再播種されず、培地が交換されず、かつ結合分子が添加されない、態様182〜196のいずれか記載の方法。
198. アウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の活性化、疲弊または分化状態の1つまたは複数の表現型を評価する工程を含む、態様182〜197のいずれか記載の方法。
199. 表現型が疲弊であり、評価する工程が、CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTA、またはCD96より選択される1つまたは複数のマーカーの発現、任意で表面発現を測定することを含む、態様198記載の方法。
200. 表現型が活性化であり、評価する工程が、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3、またはKi67より選択される1つまたは複数のマーカーの発現、任意で表面発現を測定することを含む、態様198記載の方法。
201. 表現型が分化状態であり、
評価する工程が、
（i）CD25、CD45RO、CD56、KLRG1、CD95の1つもしくは複数、ならびに/または
（ii）CD45RA、CD27、CD28、CD62L、およびCCR7の1つもしくは複数
より選択される1つまたは複数のマーカーを測定することを含み、
任意で、1つまたは複数のマーカーが、ナイーブ様T細胞と正または逆に関連するマーカーである、
態様198記載の方法。
202. アウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の1つまたは複数の活性を評価する工程を含む、態様182〜201のいずれか記載の方法。
203. 1つまたは複数の活性が、CAR依存性活性、任意で、抗原に刺激される活性を含む、態様182〜202のいずれか記載の方法。
204. 1つまたは複数の活性が、細胞溶解活性またはサイトカイン産生を含む、態様202または203記載の方法。
205. 期間が、少なくとも11日、少なくとも12日、少なくとも13日、少なくとも14日、もしくは少なくとも15日、または少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、もしくは少なくとも約15日である、態様182〜204のいずれか記載の方法。
206. 期間が、11日、12日、13日、14日もしくは15日であるか、または約11日、約12日、約13日、約14日もしくは約15日である、態様182〜205のいずれか記載の方法。
207. インプット組成物が、インキュベーションの前に試験作用物質または化合物に曝露または接触されていた細胞を含み、任意で、曝露または接触させることが、CARを発現しているT細胞を含むインプット組成物を産生するためのプロセスの1つまたは複数の段階の間に実施される、態様182〜206のいずれか記載の方法。
208. 前記方法が、複数のインプット組成物に対して実施され、複数の該インプット組成物のそれぞれが、異なるプロセスにより産生される、態様182〜207のいずれか記載の方法。
209. 前記方法が、アウトプット組成物の表現型または活性と、対照組成物の表現型または活性とを比較する工程をさらに含み、
任意で、対照組成物が、CAR依存性活性を刺激するための同じ条件下で少なくとも10日間インキュベートされていたT細胞の該組成物であり、
T細胞の該組成物が、試験作用物質もしくは化合物の存在下で産生されたものではないか、またはインプット組成物と比較して代替的なプロセスにより産生されたものである、態様182〜208のいずれか記載の方法。
210. 前記方法が、低下した疲弊、低下した活性化または減少した分化を示すアウトプット組成物を同定する工程をさらに含み、任意で、減少した分化が、1つまたは複数のナイーブ様T細胞マーカーの増加した発現を含む、態様182〜209のいずれか記載の方法。
IX. 実施例
以下の実施例は、例示のみを目的として含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例1：BCMAコンジュゲートビーズの作製
B細胞成熟抗原（BCMA）を、BCMA-Fc融合ポリペプチド（そのC末端でIgGのFc領域に融合された可溶性ヒトBCMAを含有する）を市販のトシル活性化磁気ビーズ（ThermoFisher, Waltham MA）の表面に共有カップリングさせることによって、ビーズにコンジュゲートさせた。ビーズは、第一級アミノ基およびスルフヒドリル基に共有結合する、超常磁性かつ非多孔性かつ単分散性のトシル活性化ビーズである。およそ2.8μm（M-280と命名）または4.5μm（M-450と命名）の直径を有するビーズを使用してコンジュゲーションを実施した。
BCMA-Fc（SEQ ID NO：35）は、以下の通りリンカーで接続された、ヒトBCMAの細胞外ドメイン（GenBank No. NP_001183.2）およびヒトIgG1 Fcを含有した：
Figure 2020528753
（BCMAの細胞外ドメイン；SEQ ID NO：1）
GGGGS（リンカー；SEQ ID NO：27）
Figure 2020528753
N末端CD33リーダー配列（SEQ ID NO：30）を有する組換えヒトBCMA-Fc融合構築物をコードするクローンを発現ベクターに挿入し、HEK 293細胞中で発現させた。一過性トランスフェクトされたHEK細胞からの上清を5日後に採取し、そして、プロテインA親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によってBCMA-FC融合タンパク質を精製した。得られたBCMA-Fc融合タンパク質は、ゲル浸透クロマトグラフィーによる評価で95％を超える純度を有すると判定された。結合を試験するために、BCMA-Fc融合タンパク質を、抗BCMA CARを発現するT細胞およびBCMAに結合しないCARを発現するT細胞とインキュベートした。フローサイトメトリーからの結果は、BCMA-Fc融合タンパク質が、抗BCMA CARを発現するT細胞に特異的に結合したことを示した。
5μg〜200μgの範囲の様々な濃度のBCMA-Fc融合タンパク質を、およそ1mLのトシル活性化ビーズ（例えば、2.8μmの直径を有する約4×109のトシル活性化ビーズまたは4.5μmの直径を有する約4×108のトシル活性化ビーズを含有する）に加えた。共有カップリングを、0.1％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するリン酸緩衝液（PBS）中、37℃で一晩インキュベーションすることによって実施した。ビーズを、0.1％ HSA含有PBS 1mL中で洗浄して再懸濁した。コンジュゲーションの前後に、Cellometerを使用してビーズ濃度を判定した。ビーズにカップリングしたBCMA-Fc抗原のパーセンテージを、SDSページ分析で判定した。以下の実施例では、様々な研究で使用されるBCMAコンジュゲートビーズを、コンジュゲーションの間の1mL当たり加えられるBCMA-Fc抗原の量または抗原濃度（μg/mL）のいずれかを基準にして言及する（例えば、5μgまたは5μg/mL；50μgまたは50μg/mL；200μgまたは200μg/mLなど）。
下記の研究のいくつかについて、ビーズを、実質的に上記の通りの手順を使用して、BCMA-Fcおよび抗CD28抗体と1：1比で二重コンジュゲートさせた。
実施例2：CAR T細胞の抗BCMA抗体コンジュゲートビーズ刺激
実施例1に記載したように作製したBCMAコンジュゲートビーズ（直径4.5μm）を、抗BCMA CARを発現するT細胞とインキュベートした。健常ドナー由来の白血球アフェレーシス試料からの免疫親和性に基づく富化によってT細胞を単離した。各々がBCMAに特異的な異なるscFv抗原結合ドメイン、スペーサー、CD28膜貫通領域、4-1BB共刺激性シグナル伝達領域およびCD3ゼータ由来細胞内シグナル伝達ドメインを含有する2つの抗BCMA CAR（抗BCMA CAR #1および抗BCMA CAR #2と命名、scFv部分だけが異なる）の1つをコードするウイルスベクターで、単離されたT細胞を形質導入した。ウイルスベクター構築物はさらに、CAR発現の代理マーカーとしての役割を果たす短縮EGFR（EGFRt）をコードした；EGFRtをコードする領域を、T2Aスキップ配列によってCAR配列と分離した。形質導入後、細胞を増大させ、CAR+ CD4+ T細胞対CAR+ CD8+ T細胞比およそ1：1で製剤化し、そして、得られた組成物を凍結保存によって凍結した。記載の研究について、抗BCMA CAR #1および抗BCMA CAR#2を発現するT細胞組成物の形質導入効率は、EGFRt代理マーカーの検出用の抗EGFR抗体を使用した判定で、それぞれ45％または56％であった。
抗BCMA-CAR+T細胞を含有するT細胞組成物を融解し、そして、100μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズを、ビーズ：細胞比1：1で細胞に加え、5日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、抗CD3/抗CD28ビーズとビーズ：細胞比1：1で5日間培養した。CARを発現しなかったT細胞（モック研究群）も、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後に評価した。
増殖を評価するために、抗BCMA CARを発現するT細胞を含有する細胞組成物を、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションの前に、増殖マーカー色素CELLTRACE VIOLET（CTV; ThermoFisher Scientific, Waltham MA）で製造業者のプロトコールに従って標識した。図1に示される例示的な結果は、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションが、CD3+T細胞においてCTV染色の減少した蛍光強度をもたらしたことを実証しており、このことは、細胞分裂の数によって増殖度を表す増殖色素の希薄化を示している。モック細胞について、インキュベーション後にCD3+T細胞はほとんど生存しておらず、抗BCMA CARを発現しなかったモック細胞についてCTV強度の減少は観察されなかった。これらのデータは、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションが、抗BCMA CARを発現するT細胞において細胞増殖を特異的に増加させたことを示した。
BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後にCAR+T細胞の増大が特異的に富化されたかどうかを評価するために、T細胞組成物の細胞を、CD4またはCD8の表面発現についておよびEGFRt形質導入マーカーの発現について抗EGFR抗体を使用して染色し、フローサイトメトリーによって解析した。BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後のCAR+T細胞の富化の程度（EGFRt代理マーカーの発現によって検出）を、抗CD3/抗CD28ビーズを使用したポリクローナル刺激後の富化と比較した。また、細胞増殖度（CTV増殖色素の染色強度の希薄化によって判定）および活性化度（CD25またはPD-1の表面発現によって判定）を、BCMAコンジュゲートビーズまたは対照の抗CD3/抗CD28ビーズのいずれかとインキュベートしたT細胞組成物において比較した。
表E1に示すように、抗BCMA CAR+T細胞を含有するT細胞組成物とBCMAコンジュゲートビーズとの5日間のインキュベーションは、同じT細胞組成物と抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズとのインキュベーションと比較した場合に、EGFRtを発現するCD4+細胞およびCD8+細胞のより大きなパーセンテージをもたらし、このことは、BCMAコンジュゲートビーズが抗BCMA CAR+T細胞を富化することを示している。
（表Ｅ１）BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後のEGFRt+細胞のパーセンテージ
Figure 2020528753
図2Aに示すように、抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズとのインキュベーションと比較した場合に、抗BCMA-CARを発現するT細胞を含有するT細胞組成物とBCMAコンジュゲートビーズとの5日間のインキュベーションは、低減されたCD25発現をもたらしたが、CTV増殖色素の強度のより大きな減少によって明らかなようにいくらかより大きい増殖能をもたらした。図2Bは、x軸が、CTV染色の強度を示し、そして、y軸が、FlowJoソフトウェアに従ってデータを「最大に対する％」を単位として描写するために正規化された細胞の数（「モードに対して正規化された」と命名）を示す、ヒストグラムプロットを提供する。最大に対する％は、最大細胞数を含有するビン中の細胞の数で割った各ビン（x軸上のパラメータについての数値範囲）中の細胞の数を表す。FlowJoは、256のビンを使用し、そして、各グラフは、その最大ビンのパーセンテージにスケール調整された。示すように、抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズとインキュベートしたT細胞と比較して、CTV染色のわずかに減少した強度（細胞増殖を証明するより大きな希薄化）が少なくとも細胞サブセットで観察された。加えて、図2Cに示すように、PD-1の発現は、抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズとインキュベートしたCD4+およびCD8+T細胞において増加したが、CD4+およびCD8+T細胞とBCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションは、PD-1の増加した発現を、特にCD8+T細胞においてもたらさなかった。
CAR+T細胞の富化の程度をさらに評価するために、抗BCMA CARを発現するように操作された3人の異なるドナーに由来するT細胞を含む3つの別個のT細胞組成物を、BCMAコンジュゲートビーズとインキュベートした。4、7または14日間のインキュベーション（細胞を7日目に再プレーティングした）後、細胞をフローサイトメトリーによって解析した。図3Aに示すように、抗BCMA CARを発現するT細胞のパーセンテージは、3つ全てのT細胞組成物において経時的に増加した。4、7または14日間のインキュベーション後、各組成物由来のCD8+CAR+細胞を、CD25、CD27またはCCR7の表面発現についてフローサイトメトリーによって解析した。図3Bに示すように、CD25およびCCR7表面発現のレベルは、4日目の測定値と比較した場合に、インキュベーションの間減少した。対照的に、CD8+CAR+細胞におけるCD27の表面発現は、比較的一貫したままであった。
実施例3：CAR T細胞に対するBCMAコンジュゲートビーズ用量設定の効果
得られた製剤化組成物がおよそ74％のCD8+細胞および21％のCD4+細胞を含有した以外は実質的に実施例2に記載しているように、抗BCMA CAR+CD4/CD8 T細胞を含有するT細胞組成物を作製し、総細胞の82％が抗BCMA CARに陽性であり（可溶性BCMA-FCを使用した判定で）、68％が抗EGFR抗体を使用した判定でEGFRtに陽性であった。抗BCMA CAR+T細胞を含有する組成物を凍結保存によって凍結して、以下の研究で使用する前に融解した。
実施例1に記載しているように調製したBCMAコンジュゲートビーズ（直径4.5μm；50μg/ml、25μg/ml、10μg/mlまたは5μg/ml BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズを含む）の様々な調製物を、ビーズ：細胞比1：1で、抗BCMA CARを発現するT細胞を含有する細胞組成物に加え、次いで、4日間インキュベートした。CTV増殖マーカー色素で標識されているT細胞について、細胞増殖の指標としてCTVシグナルの強度をフローサイトメトリーによってモニタリングした。細胞をまた、CD3、CD4、CD8、CD25、PD1およびEGFRt代理マーカーの表面発現についてフローサイトメトリーによって評価した。
図4Aは、CD4+およびCD8+細胞における表面CD25染色のレベルの棒グラフを描写し、そして、図4Bは、表示濃度のBCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後のCD4+またはCD8+T細胞におけるPD-1の表面発現についての、上記の通りモードに対して正規化されたヒストグラムプロットを描写する。図4Aおよび4Bに示すように、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションは、CD4+細胞とCD8+細胞の両方において、CD25（上のパネル）およびPD-1（下のパネル）の表面発現の用量依存的増加をもたらした。
図5Aおよび図5Bに示すように、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後に、CD3+細胞の数による評価で総T細胞カウントの用量依存的な差はなかったが（図5A）、CD4+細胞においてCTV平均蛍光強度（MFI）のわずかな用量依存的減少があった（図5B）。図6に示すように、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションは、CD4+細胞においてCD25表面発現の用量依存的増加をもたらした。
まとめると、これらのデータは、BCMA濃度がより低いBCMAコンジュゲートビーズが、より低い活性化マーカー発現およびより高い増殖を実証したことを示した。これらのデータは、ビーズにコンジュゲートされたBCMA抗原の量の設定によって、抗BCMA CAR+T細胞を含有するT細胞組成物の特定の属性を操作できることを示している。
実施例4：BCMAコンジュゲートビーズで刺激された抗BCMA CAR+T細胞上のT細胞マーカーの評価
実施例1に記載しているような様々な量のBCMA抗原とコンジュゲートされたBCMAコンジュゲートビーズ（直径4.5μm）を抗BCMA CAR+T細胞とインキュベートし、T細胞マーカーの発現を評価した。
1つの実験では、実質的に実施例2に記載しているように生産してCD4+T細胞とCD8+T細胞1：1比で製剤化した低温凍結抗BCMA CAR T細胞を、融解し、12ウェルプレートの1ウェル当たり1.5×106の細胞で播種した。細胞を、50μg/ml、100μg/mlまたは200μg/ml BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズの存在下で、3日間インキュベートした。インキュベーションをT細胞対ビーズ比1：1で行った。フローサイトメトリーによるCD4+およびCD8+細胞上のCD25表面発現の解析は、BCMAコンジュゲートビーズの全ての濃度でCD25の類似の誘導を示した（図7A）。
別の実験では、上記の通り調製したおよそ1.5×106のCAR+T細胞を12ウェルプレートのウェルに加え、200μg BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズと、CAR+T細胞対BCMAコンジュゲートビーズ比1：0.3、1：1または1：3（それぞれ、1ウェル当たりおよそ0.5×106、1.5×106および4.5×106のビーズ）でインキュベートした。対照として、5μg/mL 抗CD3抗体をウェルに被覆するか（刺激の最適下限濃度）、または、細胞をあらゆる作用物質の非存在下で播種した（刺激なしの対照）。各条件を、5μMレナリドミドの存在下または非存在下でインキュベートした。細胞を4日間インキュベートし、次いで、CD4、CD8、Tim3、PD-1、CD25およびCD69の表面発現についてフローサイトメトリーによって解析した。抗BCMA CAR+T細胞とBCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションは、CD4+およびCD8+T細胞上のCD25（図7B）、CD69（図7C）およびTim3（図7D）の表面発現を増加させた。CAR+T細胞対ビーズ比1：3で提供された最高量のビーズの存在下で刺激された細胞は、これらのマーカーの発現の最大の増加を示した。図7Eに示すように、抗BCMA CAR+T細胞上のPD-1の表面発現はまた、CD4+細胞をCAR+T細胞対ビーズ比1：3でインキュベートしたときも最大であった。また、CAR+T細胞対ビーズ比1：3で提供されたより高いBCMAビーズ濃度のBCMAコンジュゲートビーズで刺激されたときに、CD8+細胞上のPD-1表面発現のわずかな増加があった。この結果は、インキュベーションの間に存在するBCMA濃度がCAR+T細胞上の表面マーカー発現を差次的に調節できるという知見と一致する。
図7Fに示すように、5μMレナリドミドの存在は、200μg BCMA抗原とコンジュゲートされたビーズとのT細胞対ビーズ比1：1での3日間のインキュベーション後、レナリドミドの非存在下でのビーズとのインキュベーション（ビヒクル対照）と比較して、T細胞の増殖能を増加させた（CTV色素の強度の減少によって観察される）。図7Gおよび7Hに示すように、インキュベーションの間のレナリドミドの存在は、抗BCMA CAR+T細胞とBCMAコンジュゲートビーズのインキュベーション（図7G）または抗CD3刺激（図7H）後に誘導されるCD4+およびCD8+T細胞におけるCD25の表面発現の程度をさらに増加させた。
さらなる実験では、実質的に実施例1に記載しているように生産した抗BCMA CAR-T細胞組成物を、96ウェルプレートに1ウェル当たり5×105の細胞の密度でプレーティングした。試験したCAR-T細胞組成物は、プレーティング時に、平均して、およそ45％の抗BCMA CAR+細胞を含有した。各組成物由来の細胞を、5μg/ml、50μg/mlまたは200μg/ml BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズの存在下、T細胞対ビーズ比1：1で、18時間インキュベートした。対照として、細胞を、抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズと（陽性対照）または作用物質添加なしで（陰性対照）インキュベートした。レナリドミドの非存在下または0.5μMもしくは5μMレナリドミドの存在下でインキュベーションを行った。インキュベーション後、転写因子Blimp1、EOMES、GATA-3、ikaros、heliosおよびTbetならびにマーカーCD25、CD31およびPD-1についてのフローサイトメトリーによる細胞外および細胞内抗体染色を可能にする試薬で細胞を処理した。
1人の例示的なドナー由来のCAR+T細胞組成物のインキュベーション後のマーカーのレベルを、BLIMP-1（図8A）、CD25（図8B）、CD31（図8C）、PD-1（図8D）、Tbet（図8E）、およびEOMES（図8F）、GATA-3（図8G）、Helios（図8H）、およびIkaros（図8I）について示す。示すように、多数の評価されたTエフェクター細胞関連転写因子および活性化マーカーの発現は、BCMAコンジュゲートビーズでの刺激後に増加した。評価されたマーカーの多くについて、増加した発現の程度は、抗CD3/抗CD28ビーズでの刺激によって誘導された発現と類似していた。いくつかの場合に、BCMAコンジュゲートビーズでの刺激度は、ビーズ5μgの存在下で最高であった。図8Iに示すように、Ikarosの発現レベルは、全ての条件でレナリドミドの存在下で減少した。第二のドナーから作製したCAR+T細胞組成物から、試験条件下で刺激したときにこのドナー由来の細胞からHelios発現の変化が観察されなかったこと以外は、類似の結果が観察された。
実施例5：BCMAコンジュゲートビーズで刺激された抗BCMA CAR T細胞の活性の評価
BCMAコンジュゲートビーズの存在下での増大を含むプロセスから作製した抗BCMA CAR T細胞の活性を評価した。
A. エフェクター応答
実質的に実施例2に記載しているように生産してCD4+T細胞およびCD8+T細胞比1：1で製剤化した低温凍結抗BCMA CAR T細胞を融解した。特段の指定のない限り、実施例1に記載したように作製した5μg/mlまたは50μg/ml BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズ（直径約4.5μm）を、5μMレナリドミドの存在下または非存在下、T細胞対ビーズ比1：2でウェルに加えた。細胞を最大14日インキュベートし、サイトカイン分泌、EGFRt代理マーカーのフローサイトメトリーによる細胞増大、および細胞溶解活性について様々な時点で解析した。
a. サイトカイン発現
（i）上清中のサイトカインの存在
BCMAコンジュゲートビーズの添加の24時間後、培養上清中のTNF-α、IFNγおよびIL-2の存在を評価した。図9A〜9Cに示すように、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションは、培養上清中へのIFNγ（図9A）、IL-2（図9B）およびTNF-α（図9C）の分泌を誘導した。サイトカイン産生度は、5μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物と比較して、50μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズと細胞をインキュベートしたときにより大きく、このことは、BCMAビーズを介したCAR刺激が用量依存的であったことを実証している。示すように、レナリドミドは、BCMAコンジュゲートビーズでの刺激後のBCMA誘導性のCAR+T細胞サイトカイン産生を増加させた。
さらなる例示的な研究において、各々が同じ抗BCMA CARを発現するT細胞を含有する異なるドナーから、2つの異なる抗BCMA CAR T細胞組成物を作製した。細胞を融解し、実施例1に記載したように作製した5μg/mLまたは200μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズ（直径約4.5μm）とインキュベートした。1μMまたは5μMレナリドミドの存在下または非存在下、T細胞対ビーズ比1：1でインキュベーションを行った。BCMAコンジュゲートビーズの添加の24時間後、抗BCMA CAR+T細胞によるIL-2産生を培養上清中で評価した。図9Dに示すように、低い抗原刺激（5μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ）と比較して、高い抗原刺激（200μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ）の存在下でより高いIL-2産生が観察された。1μMまたは5μMのいずれかのレナリドミドは、高い抗原刺激と低い抗原刺激の両方の存在下で、サイトカイン産生を増加させた。
（ii）細胞内サイトカインレベル
抗BCMA CAR+T細胞を、1μMレナリドミドまたはビヒクルおよび50μg/mL BCMA-Fcコンジュゲートビーズの存在下で2時間インキュベートし、そして、リン酸化STAT 5についてフローサイトメトリーによって細胞を評価した。IFNγおよびTNFαサイトカインレベルを評価するために、抗BCMA CAR+T細胞を、0.1μMまたは1μMレナリドミドまたはビヒクルおよび5μg/mL、50μg/mLまたは200μg/mL BCMA-Fcコンジュゲートビーズの存在下で24時間インキュベートした。細胞を、形質導入された生CD3+細胞に対してゲーティングし、CD4+およびCD8+細胞においてIFNγおよびTNFαの細胞内サイトカイン蓄積についてフローサイトメトリーによって評価した。
図9Eに示すように、抗原での2時間刺激は、刺激なし対照（点線で示される）と比較して、ホスホル-STAT5に陽性の細胞のパーセントを増加させた。代表的な正常CAR-T細胞ドナーから作製した抗BCMA CAR T細胞からのIFNγおよびTNFαの細胞内サイトカインレベルについての結果を図9Fに示す。この研究では、抗BCMA CAR-T細胞サイトカイン産生は、広範囲の抗原レベルおよび濃度にわたって、レナリドミドによって増加した。
b. 細胞増殖
4日目（図9G）および7日目（図9H）にモニタリングされた総細胞カウントは、5μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物ではなく50μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズでの抗BCMA CAR+T細胞の刺激後、インキュベーションの開始時点に存在する細胞（破線）と比較して増加した。レナリドミドの存在下でビーズ50ugとインキュベートした細胞において7日目に、増殖のわずかな増加が観察された。
増殖をさらに評価するために、抗BCMA CARを発現するT細胞を含有する細胞を、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションの前に、増殖マーカー色素CELLTRACE VIOLET（CTV; ThermoFisher Scientific, Waltham MA）で製造業者のプロトコールに従って標識した。50μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズで刺激した細胞に対するフローサイトメトリーを使用した色素希釈によって、増殖を評価した。レナリドミドの非存在下での増殖と比較して、レナリドミドの存在下ではCTV希釈によって評価したところ、7日目ではなく4日目に増殖のわずかな遅延があった（図9I）。
c. 増大
BCMAコンジュゲートビーズの添加の4日および7日後、インキュベートした細胞をCD4またはCD8および抗EGFR抗体で染色して、CAR+T細胞の代理としてEGFRtに陽性の細胞のパーセンテージを判定した。プレーティング時に、BCMA-Fcでの染色によって判定したところ、CD4+細胞の26％が抗BCMA CARを発現し、そして、CD8+細胞の39％が抗BCMA CARを発現した。EGFRt+CD4+T細胞のパーセントは、50μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズの存在下で細胞をインキュベートしたとき、インキュベーション開始時の約26％から4日目までに40％超に増加し（図9J）、そして、7日目までに60％超に増加した（図9K）。図9Kに示すように、EGFRt+CD8+T細胞のパーセントは、50μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズの存在下で細胞をインキュベートしたとき、7日目までにインキュベーション開始時の約38％から60％超に増加した。細胞増大の程度は、5μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズと比較して、50μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズの存在下で細胞をインキュベートしたときに最大であった。レナリドミドの存在は、この研究において、CAR+ T細胞の増大の程度にほとんど影響を及ぼさなかった。
d. 細胞溶解活性
BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後のCAR+T細胞の細胞溶解活性を、BCMA+多発性骨髄腫細胞株であるBCMAを発現する標的細胞株RPMI-8226とのインキュベーションによって評価した。レナリドミドの存在下または非存在下での抗BCMA CAR+T細胞とBCMAコンジュゲートビーズ（5μg/mlまたは50μg/ml）とのインキュベーションの7日後、ビーズを培養物から取り出し、5μMレナリドミドのさらなる存在下または非存在下、細胞をRPMI-8226標的細胞とエフェクター細胞対標的細胞比3：1または1：1でプレーティングした。細胞溶解性アッセイを実施するために、顕微鏡検査による標的細胞の追跡を可能にするNucLight Red（NLR）で標的RPMI-8226細胞を標識した。赤色蛍光シグナルによる判定（INCUCYTE（登録商標）Live Cell Analysis System, Essen Bioscienceを使用）で、4日間の期間にわたって生存能力のある標的細胞の喪失を測定することによって、細胞溶解活性を評価した。RPMI-8226標的細胞とのインキュベーションの前に、生存能力のある細胞の数を0日目の細胞に対して正規化した。
エフェクター対標的細胞比1：1での例示的な結果を図9Lに示す。示すように、抗BCMA CAR+T細胞は、アッセイにおいて効果的な殺傷を実証した。5μg/ml BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズで刺激された抗BCMA CAR+T細胞は、5μg/ml BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズで刺激された抗BCMA CAR+T細胞よりもわずかに低い細胞殺傷効率であった。全ての条件について、殺傷アッセイの前、7日間のインキュベーションの間のレナリドミドとのプレインキュベーションは、CAR+T細胞の細胞溶解活性を増加した。細胞殺傷アッセイの間のレナリドミドの存在は、殺傷活性にほとんど影響を及ぼさなかった。RPMI 8226細胞を単独またはレナリドミドの存在下で培養したときに細胞殺傷は観察されなかったが、このことは、レナリドミドがこのアッセイにおいて標的細胞の生存性に直接影響しなかったことを実証している。
さらなる例示的な研究において、抗BCMA CAR+T細胞を、処理しないか、または、実施例1に記載したように作製した50μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズ（直径約4.5μm）とビーズ対細胞比1：1で24時間もしくは7日間インキュベートした。抗BCMA CAR T+細胞を培養物から取り出し、RPMI-8226標的細胞とエフェクター細胞対標的細胞比0.3：1または1：1でインキュベートした。BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後の標的細胞に対するサイトカイン応答を評価するために、IFNガンマレベルを上清中で測定した。図9Mに示すように、BCMAコンジュゲートビーズと24時間インキュベートした抗BCMA CAR+T細胞は、RPMI-8226標的細胞といずれかの比で培養したとき、他の試験細胞と比較してより多くのIFN-ガンマを産生した。エフェクター対標的細胞比1：1について図9Nに示すように、抗BCMA CAR T細胞は、BCMAコンジュゲートビーズとの24時間または7日間のインキュベーション後に効果的な殺傷を実証したが、このことは、ビーズでの刺激後に細胞が機能を保持していたことを実証している。
B. 連続再刺激
各々が同じ抗BCMA CARを発現するT細胞を含有する3人の異なるドナーから抗BCMA CAR T細胞組成物を作製し、融解し、実施例1に記載したように作製した50μg/mL BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来のビーズ（直径約4.5μm）とビーズ対細胞比1：1で7日間インキュベートした。5μMレナリドミドの存在下またはレナリドミドの非存在下（ビヒクル対照）でインキュベーションを行った。7日後に細胞を採取し、3回のさらなるラウンド（各々、初期播種密度に再設定し、同じ濃度のレナリドミドの存在下で追加の7日間インキュベートすることを伴う）で最大28日、再プレーティングした。
前処理後の各再設定時に、レナリドミドのさらなる存在下または非存在下、BCMAを発現する標的細胞株RPMI-8226（NucLight Red (NLR)で標識された）とのエフェクター対標的細胞（E：T）比1：1でのインキュベーションによって、細胞溶解活性を評価した。赤色蛍光シグナルによる判定（IncuCyte（登録商標）Live Cell Analysis System, Essen Bioscienceを使用）で、最大80〜150時間の期間にわたって生存能力のある標的細胞の喪失を測定することによって、細胞溶解活性を評価した。各条件からの細胞を3連でプレーティングした。ビヒクルのみの対照（100％に設定）と比較した細胞殺傷％を判定した。
図10Aは、7日間、14日間または21日間の前処理後の例示的なドナー由来の抗BCMA CAR+T細胞の細胞溶解活性についての結果を示す。示すように、レナリドミドと7日間または14日間プレインキュベートした抗BCMA CAR+T細胞は、レナリドミドの存在下でプレインキュベートしなかった細胞と比較してより高い細胞溶解活性を示した。このドナーでは、7日目と比較して、レナリドミドと14日間または21日間プレインキュベートした抗BCMA CAR+T細胞による殺傷効力の全体的な減少が観察された。レナリドミドで7日間または14日間前処理した後の抗BCMA CAR+T細胞の細胞溶解活性に対する類似の効果が該ドナーで観察された；このドナーでは21日間のレナリドミド前処理後の細胞溶解活性を評価しなかった。図10Bに示すように、このドナーの全ての時点でレナリドミドとプレインキュベートした細胞において、抗BCMA CAR+T細胞の増加した殺傷効力が観察された。
実施例6：BCMAコンジュゲートビーズの存在下での抗BCMA CAR+T細胞の形質導入および増大
白血球アフェレーシス収集システムを使用して対象由来の全血試料から、単核細胞が富化されたヒト白血球アフェレーシス試料を得た。白血球アフェレーシスと同日に、白血球アフェレーシス試料の細胞を、親和性に基づく選択において使用する緩衝液（リン酸緩衝食塩水（PBS）、EDTAおよびヒト血清アルブミンを含有する）中で洗浄し、再懸濁した。T細胞の免疫親和性に基づく選択のために、選択緩衝液中の洗浄した細胞を、CD4およびCD8に特異的なモノクローナル抗体にカップリングされた磁気ビーズと室温で30分間インキュベートし、磁気分離カラムを使用した陽性選択によって富化させた。富化させた1：1比のCD4+細胞およびCD8+細胞を凍結保存培地に再懸濁し、そして、細胞をコントロールレートフリーザー内で凍結保存し、さらなる使用まで液体窒素中で貯蔵した。4人の異なるドナー由来の凍結保存した細胞を使用した。
凍結保存したCD4+およびCD8+T細胞を、融解し、洗浄し、次いで、T細胞活性化剤による細胞の事前活性化なしに、例えば細胞を抗CD3/抗CD28とインキュベートすることなしに、レンチウイルスベクター粒子と接触させた。形質導入のために、およそ1×106の融解したT細胞を、96ウェルプレートの個々のウェルに加えた。ポリカチオン形質導入アジュバント（この場合、100μg/ml硫酸プロタミン）と予混合したレンチウイルスベクター粒子をウェルに加えた。レンチウイルスベクター粒子は、抗BCMA CARをコードする導入遺伝子をコードする核酸、および自己切断T2A配列によってCAR配列から分離された形質導入マーカーとして使用するための短縮EGFR（EGFRt）配列を含有した。1ウェル当たりの最終容量を100μlに調整した。抗BCMA CARを発現するように操作された細胞を含有する5つの異なる組成物を上記の手順を使用して調製した。
BMCA-Fcおよび抗CD28とコンジュゲートされたビーズ（BCMA/抗CD28コンジュゲートビーズと命名）を、実質的に実施例1に記載しているように調製した。形質導入直後に、各ドナーから生成されたおよそ50μLの細胞を、BCMA/抗CD28コンジュゲートビーズまたは抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズを含有する培地500μLに1細胞当たり1：1のビーズ比で加え、12日間インキュベートした。
細胞を一日おきに計数し、トランスフェクション後3日目、7日目、10日目および12日目に抗EGFR抗体を使用してEGFRt（CAR発現の代理マーカー）の発現について染色した。データは、抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズの存在下で最大12日間インキュベートしたT細胞組成物が、培養液中で増大し、培養の12日目までにおよそ95倍〜140倍の増大が起こったことを示した。また、形質導入しなかったが抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズとインキュベートした対照のモックT細胞の増大も、インキュベーションの開始と比較して、12日目に約65倍の増大を示した。形質導入直後にBCMA/抗CD28ビーズとインキュベートしたT細胞組成物の増大倍率は、12日目までに約1.0倍〜7.0倍であった。
図11に示すように、抗CD3/抗CD28の存在下でインキュベートしたT細胞組成物は、ウイルス粒子での形質導入の前に細胞を活性化しなくても、EGFRt形質導入マーカーの高い発現を示した。この結果は、即時刺激が表面CAR発現に関連していることと一致する。BCMA/抗CD28ビーズで刺激されたT細胞は、EGFRtに陽性の細胞の同じパーセンテージを達成するためにより長い動態を示したが、12日目までに細胞の約60％〜90％がEGFRtに陽性であった。結果は、BCMA/抗CD28ビーズとのインキュベーション後の細胞の成長が抗CD3/抗CD28ビーズと比較した場合により遅いにもかかわらず、CAR+T細胞が培養の12日間にわたって富化できたことを示しており、このことは、BCMA/抗CD28ビーズがCAR+T細胞を増大させたことを示している。
また、レンチウイルスベクター粒子での形質導入の前に細胞を活性化せずに上記の条件下でインキュベートしたT細胞も、12日目にCD4およびCD8の表面発現について染色し、フローサイトメトリーによって解析した。対照として、同じくCD4+細胞およびCD8+細胞比1：1のドナー細胞から作製したT細胞組成物を、抗CD3/抗CD28ビーズでの24時間の刺激によって形質導入の前に活性化し、その後、上記の通り、活性化された細胞を抗BCMA CARを発現するレンチウイルスベクター粒子と接触させた；この条件では、12日間ではあるがコンジュゲートビーズの非存在下で細胞をさらにインキュベートした。
表E2は、上の条件下でインキュベートした同じドナー細胞からの結果をまとめる。示すように、形質導入前に細胞を活性化しない、細胞と抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズまたはBCMA/抗CD28ビーズとのインキュベーションは、形質導入の前に抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズの存在下で最初に24時間活性化させた細胞と比較して、CD4/CD8 T細胞の比を変化させた。その上、これらの結果は、T細胞の事前活性化なしのBCMA/抗CD28抗体コンジュゲートビーズまたは抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズとのインキュベーションが、類似のCAR発現レベルおよびCD4/CD8細胞表現型をもたらしたことを示した。表E3に示すように、4人の異なるドナーに由来するT細胞において、形質導入前に細胞を活性化しないで抗CD3/抗CD28ビーズとインキュベートしたとき、形質導入の前に抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズの存在下で最初に24時間活性化させた細胞と比較してCD4/CD8 T細胞の比の類似の逆転が観察された。
（表Ｅ２）抗原および/または抗体コンジュゲートビーズで処理したT細胞培養物中のCD4+細胞およびCD8+細胞のパーセンテージ
Figure 2020528753
（表Ｅ３）抗体コンジュゲートビーズで処理したT細胞培養物中のCD4+細胞およびCD8+細胞のパーセンテージ
Figure 2020528753
実施例7：ROR1コンジュゲートビーズの作製
受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）を、ROR1-Fc融合ポリペプチド（そのC末端でIgGのFc領域に融合されたヒトROR1の細胞外ドメインを含有する）を市販のトシル活性化磁気ビーズ（ThermoFisher, Waltham MA）の表面に共有カップリングさせることによって、ビーズにコンジュゲートさせた。ビーズは、第一級アミノ基およびスルフヒドリル基に共有結合する、超常磁性かつ非多孔性かつ単分散性のトシル活性化ビーズであった。およそ2.8μm（M-280と命名）または4.5μm（M-450と命名）の直径を有するビーズを使用してコンジュゲーションを実施した。
ROR1-Fcは、以下の通りリンカーで接続された、ヒトROR1のフラグメントおよびヒトIgG1 Fcを含有した。
Figure 2020528753
様々な濃度のROR1-Fc融合タンパク質を、およそ1mLのトシル活性化ビーズ（例えば、2.8μmの直径を有する4×109のトシル活性化ビーズ）に加えた。共有カップリングを、0.1％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するリン酸緩衝液（PBS）中、37℃で一晩インキュベーションすることによって実施した。ビーズを、0.1％ HSA含有PBS 1mL中で洗浄して再懸濁した。コンジュゲーション後、Cellometerを使用してビーズ濃度を判定した。
抗ROR1 CARを発現するT細胞は、ROR1 Fcコンジュゲートビーズとのインキュベーションによって刺激される。
実施例8：CD22コンジュゲートビーズの作製
CD22を、CD22-Fc融合ポリペプチド（そのC末端でIgGのFc領域に融合されたヒトCD22の細胞外ドメインを含有する）を市販のトシル活性化磁気ビーズ（ThermoFisher, Waltham MA）の表面に共有カップリングさせることによって、ビーズにコンジュゲートさせた。ビーズは、第一級アミノ基およびスルフヒドリル基に共有結合する、超常磁性かつ非多孔性かつ単分散性のトシル活性化ビーズであった。およそ2.8μm（M-280と命名）または4.5μm（M-450と命名）の直径を有するビーズを使用してコンジュゲーションを実施した。
CD22-Fcは、以下の通りリンカーで接続された、ヒトCD22の細胞外ドメインおよびヒトIgG1 Fcを含有した。
Figure 2020528753
様々な濃度のCD22-Fc融合タンパク質を、およそ1mLのトシル活性化ビーズ（例えば、2.8μmの直径を有する4×109のトシル活性化ビーズ）に加えた。共有カップリングを、リン酸緩衝液（PBS）中、37℃で一晩インキュベーションすることによって実施した。ビーズを、0.1％ HSA含有PBS 1mL中で洗浄して再懸濁した。コンジュゲーション後、Cellometerを使用してビーズ濃度を判定した。
抗CD22 CARを発現するT細胞は、CD22-Fcコンジュゲートビーズとのインキュベーションによって刺激される。
実施例9：ビーズへの抗イディオタイプ抗体のコンジュゲーション
2つの異なる抗CD19抗体 抗イディオタイプ（ID）抗体の1つである、FMC63由来scFv特異的抗ID抗体（表E4に示される配列）を、超常磁性かつ非多孔性かつ単分散性のトシル活性化ビーズである市販のトシル活性化磁気ビーズ（ThermoFisher, Waltham MA）の表面に共有カップリングさせた。ビーズは、第一級アミノ基およびスルフヒドリル基に共有結合された。およそ2.8μm（M-280と命名）または4.5μm（M-450と命名）の直径を有するビーズを使用してコンジュゲーションを実施した。
（表Ｅ４）抗ID B-1およびB-2配列
Figure 2020528753
抗ID抗体200μgを、およそ1mLのトシル活性化ビーズ（例えば、2.8μmの直径を有するおよそ4×109のトシル活性化ビーズまたは4.5μmの直径を有する約4×108のトシル活性化ビーズ）に加え、共有カップリングを、0.1％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するリン酸緩衝液（PBS）中、37℃で一晩インキュベーションすることによって実施した。ビーズを、0.1％ HSA含有PBS 1mL中で洗浄して再懸濁した。コンジュゲーション後、Cellometerを使用してビーズ濃度を判定した。
抗IDコンジュゲートビーズの安定性を評価するために、ビーズをペレット化し、上清を取り出し、4〜12％ Bis-Tris SDS-PAGEゲル上にロードし、そして、ゲルをクマシーブルーで染色した。ビーズ上にコンジュゲートされた総タンパク質の対照として、ペレット化したビーズを、4×（ドデシル硫酸リチウム）LDS試料緩衝液中、約70℃で20分間沸騰させ、そして、およそ12.5μLまたは25μLの沸騰させた上清もSDS-PAGEゲル上に流し、クマシーブルーによって評価した。ビーズにコンジュゲートしなかった抗ID抗体（陽性対照）およそ2.5μgもしくは5.0μgまたは0.1％ HSA（陰性対照）5μLも、SDS-PAGEおよびクマシーブルー染色によって評価した。沸騰しなかったコンジュゲート試料由来の上清中に抗ID抗体は検出されず、このことは、このコンジュゲーションが安定であったことを示しているが、沸騰したコンジュゲート試料由来の上清中には抗ID抗体が検出された。
実施例10：抗イディオタイプ抗体コンジュゲートビーズと培養したT細胞の刺激の評価
FMC63由来scFv特異的抗ID B-1コンジュゲートビーズをT細胞とインキュベートした。健常ドナー由来の白血球アフェレーシス試料からの免疫親和性に基づく富化によって、CD3精製のT細胞を単離した。単離された細胞を、FMC63に由来するscFvを有する抗CD19 CARをコードするウイルスベクターで形質導入した。ウイルスベクター構築物はさらに、CAR発現の代理マーカーとしての役割を果たす短縮EGFR（EGFRt）をコードした；EGFRtをコードする領域を、T2Aスキップ配列によってCAR配列と分離した。形質導入後、細胞を培養下で増大させ、凍結保存によって凍結した。
T細胞刺激の研究のために、融解したCD4+またはCD8+CAR発現細胞を、1ウェル当たりおよそ50,000の総細胞で別々に播種した。いくつかの場合に、培養培地に、以下の通りサイトカインを追加で補充した：CD4+細胞の場合、およそ1200IU/mL 組換えIL-7、20IU/mL 組換えIL-15および100IU/mL 組換えIL-2；CD8+細胞の場合、およそ200IU/mL 組換えIL-2および20IU/mL 組換えIL-15。抗ID B-1コンジュゲートビーズを、細胞：ビーズ比1：1または1：5で細胞に加え、2〜3日毎に50％の培地交換しながら最大14日インキュベートした。陽性対照として、細胞を、表示のサイトカインの存在下または非存在下、抗CD3/抗CD28磁気ビーズと細胞：ビーズ比3：1で培養した。
様々な培養時点に、CD4+またはCD8+形質導入細胞（代理マーカーの発現についての抗EGFRによる検出）を増大、PD-1発現および生存性について評価した。
図12Aおよび12Bに示すように、細胞を、抗IDコンジュゲートビーズと細胞：ビーズ比1：1または1：5のいずれかで、特にサイトカインの存在下で培養したときに、CD4+およびCD8+T細胞の増大がそれぞれ観察された。増大の程度は、細胞を対照の抗CD3/抗CD28磁気ビーズと培養したときよりも大きかった。
CD4+細胞サブセット上のPD-1の表面発現を、培養の3日目、7日目、10日目および14日目にフローサイトメトリーによって評価した。図13に示すように、PD-1発現は、抗CD3/抗CD28磁気ビーズと培養した細胞上で高かったが、PD-1のレベルは、抗IDコンジュゲートビーズと培養した細胞において実質的により低いかまたは検出不能であった。
図14に示すように、抗IDコンジュゲートビーズまたは対照の抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズと1：1または1：5のいずれかの比で培養したCD4+およびCD8+T細胞の生存率は、細胞をサイトカインの存在下で追加培養したときに、培養期間中、一貫して高いままであった。しかしながら、全ての条件下、細胞の生存性は、追加サイトカインの非存在下で減少し、細胞培養の後日に細胞生存性の最大の喪失が生じた。
実施例11：抗イディオタイプ抗体コンジュゲートビーズと培養したT細胞のサイトカイン産生の評価
FMC63に由来するscFvを有する抗CD19 CARで操作したT細胞を、実質的に実施例10に記載しているように作製した。融解したCD8+T細胞を、ゴルジ阻害剤の存在下で、抗ID B-1コンジュゲートビーズと4時間培養した。TNFα、IFNγおよびIL-2の細胞内サイトカインレベルを、フローサイトメトリーによって、CAR+ T細胞サブセット（代理マーカーの抗EGFRでの陽性表面染色による判定）またはCAR- T細胞サブセット（抗EGFRでの陰性表面染色による判定）のいずれかにおいて判定した。比較として、また、CAR+T細胞（EGFRt+）を、CD19を発現する標的細胞（CD19を発現するように形質導入されたK562細胞、K562-CD19）とエフェクター：T細胞比1：2で培養した。
図15Aに示すように、細胞を抗ID B-1コンジュゲートビーズの存在下で培養したときに、TNFα、IFNγおよびIL2サイトカインの細胞内サイトカインレベルが、CAR+T細胞（EGFRt+）において誘導されたが、CAR-T細胞（EGFRt-）では誘導されなかった。この研究では、抗IDコンジュゲートビーズの存在下で観察された刺激の程度は、代替のCAR特異的刺激試薬である抗原発現K562-CD19細胞を使用したCAR+T細胞の刺激と類似していた（図15B）。これらの結果は、ビーズにコンジュゲートされた抗IDがアゴニスト性であり、かつ、抗ID抗体によって認識される抗原結合ドメインを有するCARを発現するT細胞を特異的に刺激することを実証した。さらに、ビーズ試薬は、細胞培養を必要としかつロット毎の変動を生じやすい細胞株と比較して、より良好なCAR特異的刺激試薬を提供する。
実施例12：連続再刺激後の増大の評価
細胞が反復刺激後にエクスビボ増大できることは、CAR+T細胞の持続能（例えば、初期活性化後）の潜在的な代用であり得、かつ/またはインビボでの機能の指標となる（Zhao et al. (2015) Cancer Cell, 28:415-28）。CAR+T細胞を上記の通り作製し、融解したCD4+またはCD8+CARを発現するT細胞を50,000のCAR+細胞/ウェルで別々にプレーティングした。抗ID B-1コンジュゲートビーズを、実施例10に記載しているようにサイトカインの存在下または非存在下、細胞：ビーズ比1：1または1：5で細胞に加えた。対照として、抗CD3/抗CD28磁気ビーズを、サイトカインの存在下または非存在下、細胞：ビーズ比3：1で細胞に加えた。細胞を3〜4日毎に採取し、計数し、そして、細胞数をラウンド毎に初期播種密度に再設定した後で同じ培養条件を使用して新たな標的細胞で再刺激した。14日間の培養期間中の合計で4ラウンドの刺激を行った。刺激のラウンド毎に、倍加数を判定した。
図16に示すように、CARを発現する（EGFRt+）CD4+細胞の継続した細胞増大が、抗IDコンジュゲートビーズでの再刺激後に観察されたが、増大の程度は、細胞をサイトカインの存在下で培養したときにより大きかった。また、増大の程度は、細胞を抗CD3/抗CD28ビーズと培養したときよりも大きかった。CD8+T細胞については、類似した増大動態が、細胞を抗IDコンジュゲートビーズまたは抗CD3/抗CD28ビーズのいずれかの存在下で培養したときに観察されたが、増大は、細胞を抗IDコンジュゲートビーズと、特に追加の組換えサイトカインの非存在下で培養したときにいくらかより大きかった。
実施例13：抗イディオタイプ抗体コンジュゲートビーズを使用したCAR特異的細胞増大のさらなる分析
2人の異なる患者ドナーから作製したCARを発現するT細胞を使用した以外は実施例11および12に記載のものと類似の研究を実施した。CD3精製のT細胞を、2人のドナー患者の末梢血単核細胞（PBMC）から単離し、FMC63に由来するscFvを有する抗CD19 CARをコードするウイルスベクターで形質導入し、培養で増大させ、凍結し、融解した。
融解したCD4+、CD8+またはCD4/CD8共培養物（1：1比）を、6ウェルプレートのウェルに、以下の通りサイトカインを追加で補充した培養培地中およそ5×106の総細胞/ウェルで播種した：CD4+細胞またはCD4+/CD8+共培養物の場合、培地に、およそ1200IU/mL 組換えIL-7、20IU/mL 組換えIL-15および100IU/mL 組換えIL-2を補充し；CD8+細胞の場合、培地に、200IU/mL 組換えIL-2および20IU/mL 組換えIL-15を補充した。抗ID B-1コンジュゲートビーズを、細胞：ビーズ比1：1で細胞に加え、2〜3日毎に50％の培地交換しながら最大9日インキュベートした。
様々な培養時点に、条件毎に培養物中に存在するCD4+またはCD8+形質導入細胞の数（EGFRt代理マーカーの発現についての抗EGFRによる検出）を評価し、総細胞のパーセントとしてのCAR発現細胞の増大倍率または頻度を判定した。PD-1およびCD25の発現ならびに細胞生存性も判定した。
図17Aに示すように、CD4+細胞を抗IDコンジュゲートビーズとだけ培養したときに、CARを発現する（EGFRt+）CD4+T細胞の60倍を超える増大が観察された。CD8+T細胞について、CARを発現する（EGFRt+）CD8+T細胞の実質的により高い増大が、CD8+T細胞をCD4+細胞と共培養したときに、抗IDコンジュゲートビーズの存在下で生じた。図17Bに示すように、CARを発現する（EGFRt+）CD4+またはCD8+の頻度が、抗IDコンジュゲートビーズの存在下における9日間の培養の間に増加し、>90％の形質導入細胞（EGFRt+）が9日目での培養物中に存在した。CD4+およびCD8+細胞の生存性も、培養の間100％に近いままであり、CD4+T細胞と共培養したときにCD8+T細胞のいくらかより大きい生存性が観察された（図17C）。類似の結果が両方のドナーについて観察された。これらの結果は、CAR特異的抗イディオタイプ抗体コンジュゲートビーズの使用による事前CAR選択なしのCAR+T細胞の富化と一致する。
形質導入された（EGFR+）CD4+またはCD8+細胞上のPD-1およびCD25の表面発現を、抗IDコンジュゲートビーズとの培養の5日目、7日目および9日目にフローサイトメトリーによって評価した。図18Aに示すように、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の両方におけるPD-1発現は、抗IDコンジュゲートビーズと培養した時間と共に大幅に減少した。図18Bに示すように、抗IDコンジュゲートビーズの存在下での培養の9日後にCD25発現も減少した。類似の結果が両方のドナーについて観察された。
実施例14：抗イディオタイプ抗体コンジュゲートビーズとの培養後のサイトカインレベルおよび表現型の比較
2人のドナー患者の末梢血単核細胞（PBMC）からCD3精製のT細胞を単離し、FMC63に由来するscFvを有する抗CD19 CARをコードするウイルスベクターで形質導入し、抗CD3抗体被覆ビーズおよび抗CD28抗体被覆ビーズとの培養で増大させた。増大後、増大させたT細胞を凍結保存によって凍結した。研究のために、凍結T細胞を融解し、CD4+およびCD8+T細胞を細胞内サイトカインレベルまたは表面表現型について評価するか（d=0）、または、融解したCD4+、CD8+またはCD4+/CD8+共培養T細胞を抗ID B-1コンジュゲートビーズの存在下で追加の9日間培養した後、細胞内サイトカインレベルおよび表面マーカー表現型をPMA/イオノマイシンまたはCD19形質導入K562細胞による刺激後に評価した（d=9）。
細胞内サイトカインレベルの評価のために、ゴルジ阻害剤を4時間加え、次いで、TNFα、IFNγおよびIL-2をフローサイトメトリーによって評価した。全ての条件について、細胞内サイトカイン発現の程度は、CD19形質導入K562細胞でのCAR特異的刺激と比較した場合に、細胞をPMA/イオノマイシンで刺激したときに実質的により高かった。図19Aに示すように、TNFαおよびIL-2サイトカインのレベルは、対応するCD4+もしくはCD8+細胞、または抗IDコンジュゲートビーズの存在下で9日間さらに培養したCD4/CD8 T細胞の共培養物と比較して、融解直後のCD4+またはCD8+細胞において類似していた。融解直後のCD4+またはCD8+T細胞におけるIFNγのレベルと比較して、抗IDコンジュゲートビーズの存在下で9日間さらに培養した融解したCD4+、CD8+またはCD4/CD8共培養T細胞において、IFNγの増加したレベルが観察された。これらの結果は、抗IDコンジュゲートビーズによる9日間の増大後、T細胞機能が、新鮮融解したCAR+T細胞と比較して維持されたことを実証した。同様の結果が、2人のドナー由来の細胞において得られた。
また、活性化マーカーCD25の表面発現、阻害性受容体PD-1およびLAG-3の表面発現、ならびに増殖マーカーKi-67の核発現も、融解直後のCD4+もしくはCD8+細胞（d=0）において、または、単独で増大させたもしくは抗IDコンジュゲートビーズの存在下で追加の9日間CD4/CD8共培養物として増大させたCD4+もしくはCD8+T細胞（d=9）において評価した。図19Bに示すように、融解直後のT細胞と比較して、抗IDコンジュゲートビーズの存在下で9日間さらに培養した細胞において、Ki-67ではなくCD25の低減された発現が観察された。低減されたCD25発現は、CD4+細胞においてよりもCD8+細胞において実質的により大きかった。加えて、融解直後の細胞における発現と比較して、単独で培養させたまたは抗IDコンジュゲートビーズとの9日間インキュベーション後のCD4/CD8共培養物として培養させたCD4+細胞およびCD8+細胞の両方において、PD-1およびLAG-3の減少した発現も観察された。この結果は、抗IDコンジュゲートビーズとのインキュベーション後、以前に凍結された形質導入細胞は、細胞増殖の指標となるマーカーKi-67に陽性である細胞の高いパーセンテージによって明白であるように、機能的能力を保持したが、CD25活性化マーカーと阻害性受容体マーカーPD-1およびLAG-3についての低い表面発現によって特徴付けられる異なる活性化状態も示したことを実証した。
実施例15：PD-1発現および/またはシグナル伝達に対する抗BCMAコンジュゲートビーズまたは抗BCMA/PD-L1コンジュゲートビーズの刺激の効果
代表的な健常ドナー由来の試料または多発性骨髄腫患者由来材料から作製した抗BCMA CAR-T細胞を、50μg/mL BCMA-Fcコンジュゲートビーズ（実施例1に記載したように作製した）と、ビーズ：CAR+T細胞比1：1で、7日間、1μMレナリドミドまたはビヒクル対照の1つの存在下で培養した。次いで、異なる条件下で培養したCAR T細胞上のCD25、PD-1、Tim3およびLag3の発現（代理CARマーカーの抗体を使用）をフローサイトメトリーによって評価した。
次いで、レナリドミドの存在下または非存在下においてビーズで事前刺激されたそのような抗BCMA CAR-T細胞、または同等なドナー試料から作製した新鮮融解した抗BCMA CAR-T細胞を、脱ビーズ化し、洗浄し、そして、RPMI-8226標的細胞（顕微鏡検査による追跡を可能にするNucLight Red （NLR）で標識された）と、1μMレナリドミドまたはビヒクル対照の存在下で培養した。具体的には、前処理がレナリドミドの存在下で実行された前処理細胞の場合、細胞を、レナリドミドの存在下で標的細胞と培養した；同様に、前処理がビヒクルの存在下で実行された前処理細胞の場合、細胞を、ビヒクルの存在下で標的細胞と培養した。共培養後、赤色蛍光シグナルによる判定で7日間の期間にわたって生存能力のある標的細胞の喪失を測定することによって、細胞溶解活性を評価した。殺傷パーセンテージを、ビヒクルの存在下においてビーズ上で事前刺激した抗BCMA CAR T細胞に対して正規化した。サイトカイン産生を、標的細胞と24時間培養した後の上清からのELISAによって評価した。実験を3人のドナーで2回実施した。線形固定効果または混合効果モデルを使用して、細胞溶解活性およびサイトカイン産生に対するレナリドミド処置の有意性を評価し、ここで、処置、ドナーおよび時間を固定効果として扱い、そして、動物をランダム効果として扱い、反復測定が同じ動物に由来したときネスト化した。関心対象の効果を有するフルモデルを関心対象の効果のないモデルに対して比較する尤度比検定によってP値を得た。
図20Aは、CAR抗原特異的細胞溶解活性についての結果を示し、そして、図20Bは、共培養中のBCMAビーズで事前刺激された抗BCMA CAR-T細胞（新鮮融解した（事前刺激しない）抗BCMA CAR-T細胞と比較した）のサイトカイン産生についての結果を示し、レナリドミドの存在下対非存在下で培養した細胞を比較している。事前刺激したCAR T細胞は、新鮮融解した抗BCMA CAR T細胞と比較して、減少した細胞溶解活性（P=2.1×10-4）およびサイトカイン産生（IFN-γについてP= .03）を示した。
前処理およびその後の共培養においてレナリドミドの非存在下で、CAR-T細胞を事前刺激した結果は、新鮮なCAR-T細胞と比較して低減された細胞殺傷およびサイトカイン産生を示し、このことは、慢性事前刺激が機能障害を導くことを示している。これらの結果は、BCMAコンジュゲートビーズ上での事前刺激によって誘導された疲弊様表現型と一致する。事前刺激期間の間のレナリドミドの存在は、細胞溶解機能を保存し（P=.04）、そして、事前刺激期間の間にビヒクルに曝露された細胞と比較して、サイトカイン産生の増加傾向があった（図24B）。このアッセイにおけるレナリドミドの存在は、レナリドミドが事前刺激したCAR-T細胞において機能的な疲弊様表現型を低減し得るという観察と一致した。
図20Cに示すように、BCMAビーズ上で7日間刺激した抗BCMA CAR T細胞の表現型を評価したところ、レナリドミドの添加は、抗BCMA CAR T材料のCAR+生存性を3人の健常ドナーにわたって有意に増加させた（P=0.04）。レナリドミドの添加は、この7日間で全てのドナーにわたって総細胞カウントを変化させることなく、そして、ビヒクル処理CAR T細胞とレナリドミド処理CAR T細胞との間のCAR+パーセンテージに有意差は観察されなかった。図20Dは、1μMレナリドミドの存在下または非存在下においてBCMAビーズで7日間刺激（前処理）した後のCD4+またはCD8+抗BCMA CAR T細胞についての、表面CD25およびPD-1発現（平均蛍光強度（MFI））のフローサイトメトリー解析の代表的な結果を示す。示すように、結果は、レナリドミドが、長期刺激後にCD25発現を増加させながら、BCMA-CAR-T細胞のPD-1発現を低減させたことを示した。図20Eに示すように、3人のCAR Tドナーにわたるフローサイトメトリー解析は、レナリドミドの添加が、CD8+集団においてTim3の表面発現を増加させ（P=4.0×10-4）、CD4+CAR+集団に対して混合効果をもたらしたことを示した。全てのドナーにわたり、かつ、CD4+とCD8+両方のCAR+集団において、レナリドミドは、CD25（CD4+およびCD8+；P=2.2×10-16）、およびLag3発現に陽性のパーセンテージ（CD8+ P<0.03；CD4+ P=0.002）を増加させた。注目すべきことに、PD-1+細胞のパーセンテージの減少もCD4+集団において観察され（P=0.04）、3人のドナーのうち2人はCD8+集団の減少も示した。
別の研究で、低刺激（5μg/mL）、中刺激（50μg/mL）および高刺激（200μg/mL）のいずれかの刺激の規模を用量設定するために、組換えヒトBCMAコンジュゲートビーズを使用してCAR T細胞を様々な濃度で刺激した。中刺激条件では、刺激の24時間後の分泌されたサイトカイン産生を測定したところ、ビヒクル対照と比較してIL-2およびTNF-α濃度の200％の増加がIFN-γのドナー依存的増加と共に観察された（図21A）。細胞を、0.1μMもしくは1.0μMレナリドミドまたはビヒクル対照の存在下、BCMAコンジュゲートビーズで24時間刺激した。タンパク質輸送阻害剤をインキュベーションの最後の時間に加え、そして、細胞を細胞内IL-2、IFN-γおよびTNF-αについて染色した。
BCMAビーズ上で活性化された抗BCMA CAR T細胞は、サイトカイン産生に対して刺激レベル依存的効果を示し、BCMAビーズ5μgは、BCMAビーズ50μgおよび200μgと比較して、限定されたCAR Tエフェクターサイトカイン産生を引き起こした（図21B）。レナリドミドは、CD4+とCD8+両方のCAR T細胞について、全ての刺激レベルでIFN-γ+およびTNF-α+細胞内染色のパーセンテージを増加させた。この規模の刺激は、レナリドミドに応答してIL-2を増加または減少させ、レナリドミドは、50μgおよび200μg刺激でIL-2+ CAR+ T細胞のパーセンテージを減少させたが、5μg刺激条件ではIL-2+ CAR+ T細胞のパーセンテージを増加させた。刺激の非存在下では、レナリドミドは、CAR Tサイトカイン産生に対して効果がなく、このことは、レナリドミドによって提供されるサイトカイン増強には刺激が必要であることを示している。
別の研究で、細胞を、実施例1に記載したように作製したBCMAビーズ（ヒト組換えPD-L1-Fcの追加のコンジュゲーションありまたはなし）の存在下で培養した。健常ドナーまたは患者由来のCAR T細胞を、BCMAコンジュゲートビーズまたはBCMA/PD-L1コンジュゲートビーズの存在下で24時間、1μMレナリドミドの存在下で刺激した。サイトカイン産生を上清中で測定した。結果を図21Cに示す。図25Cに示すように、健常ドナーと患者ドナー両方のCAR T細胞の評価は、組換えBCMAビーズへの組換えPD-L1の付加が、IFN-γ、IL-2およびTNF-αを低減させたことを実証した。レナリドミド処理は、分泌されたサイトカインレベルを、PD-L1の存在下でビヒクルによって処理したCAR T細胞のサイトカインレベル以上に高めたことが示された。この結果は、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後の抗BCMA CAR-Tサイトカイン産生が、PD-L1媒介性阻害の存在下、レナリドミドによって増加されるという結論と一致した。
実施例16：BCMAコンジュゲートビーズで刺激された抗BCMA CAR T細胞によるサイトカイン産生の評価
抗BCMA CAR T細胞を、一般に実施例2に記載しているように作製した。抗BCMA CAR T細胞を、CD4+ T細胞およびCD8+T細胞比1：1で製剤化し、融解し、96ウェルプレート中1ウェル当たり5.0×105の細胞で培養した。抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズまたはBCMAコンジュゲートビーズ（直径4.5または2.8μm）（実施例1に記載したように作製した5μg/ml、50μg/mlまたは200μg/ml BCMAコンジュゲートビーズ組成物由来）を、抗BCMA CAR-T細胞対ビーズ比1：1で培養物に加えた。抗CD3/抗CD28抗体またはBCMAコンジュゲートビーズの非存在下で培養した抗BCMA CAR-T細胞を対照とした。
24時間のインキュベーション後、マルチプレックスサイトカインイムノアッセイ（Luminex（登録商標））を使用して、培養上清中のIFN-ガンマ、IL-2、TNF-アルファ、IL-6、GM-CSFおよびIL-4の存在を評価した。図22Aに示すように、抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズとのインキュベーションは、BCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーションと比較した場合に、上清中により高い濃度のサイトカインの存在をもたらした。このアッセイでは、BCMAコンジュゲートビーズとインキュベートした細胞からのサイトカイン産生の規模は、用量依存的であり、ビーズコンジュゲーションに使用されたBCMAの漸増濃度（すなわち、5μg/ml、50μg/mlまたは200μg/ml）と相関関係にあった。この結果は、ビーズにコンジュゲートされるBCMAの量を変更することによって、BCMA指向性CAR活性化を制御および用量設定できるという知見と一致する。抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズまたはBCMAコンジュゲートビーズとのインキュベーション後のサイトカイン放出の比較は、サイトカイン産生の規模および質の差を明らかにし、BCMAコンジュゲートビーズでの刺激後により多くのTh1様サイトカイン放出プロファイルが観察された。
抗BCMA CAR-T細胞を上記の通り培養し、フローサイトメトリーによって細胞内サイトカインレベルについて評価した。抗BCMA CAR T細胞を、抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズまたはBCMAコンジュゲートビーズと抗BCMA CAR-T細胞対ビーズ比1：1で20時間インキュベートし、続いて、タンパク質輸送阻害剤と4時間インキュベーションした。細胞を、生存性、CAR発現、CD4およびCD8について染色し、次いで固定し、透過処理し、そして、IFN-ガンマ、IL-2およびTNF-アルファの細胞内レベルについて染色した。図22Bに示すように、BCMAコンジュゲートビーズでの刺激は、CD4+とCD8+両方の抗BCMA CAR発現細胞においてサイトカイン産生をもたらした。上と同じく、細胞内サイトカインレベルの規模は、ビーズにコンジュゲートされたBCMAの量と相関関係にあるように見えた。
実施例17：抗CD19抗体 抗IDおよび抗CD2抗体コンジュゲートビーズの作製
抗CD2および抗CD19抗体 抗ID抗体被覆ビーズを作製した。マウス抗CD2抗体（クローンRPA-2.10, ED biosciences）および実施例9に記載の抗ID B-2抗イディオタイプ抗体を、およそ4.5μmの直径を有する市販のトシル活性化超常磁性体（M-450と命名；ThermoFisher, Waltham MA）の表面に共有カップリングさせた。
トシル活性化ビーズ（例えば、およそ4×108のビーズ/mL）1mL当たりに各抗体およそ6.67×10-10モルを加え、共有カップリングを、0.1％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するリン酸緩衝液（PBS）中、37℃で一晩インキュベーションすることによって実施した。ビーズを、0.1％ HSA含有PBS 1mL中で洗浄して再懸濁した。コンジュゲーション後、Cellometerを使用してビーズ濃度を判定した。カップリング濃度およびビーズカウントに基づいて、ビーズ上の分子の概数は、1ビーズ当たり抗体分子1.58×106個であった。抗体被覆ビーズを、4.1×108のビーズ/mLの濃度で溶液に懸濁した。
抗体コンジュゲートビーズの安定性を、抗体コンジュゲートビーズをペレット化し、得られた上清を4〜12％ Bis-Trisゲル上に流し、そして、ゲルをクマシーブルーでタンパク質について染色することによって評価した。ビーズ上にコンジュゲートされた総タンパク質の対照として、LDS試料緩衝液中で沸騰させたペレット化ビーズ由来の上清10μL試料も評価した。対照はまた、抗CD2抗体1μg、ビーズにコンジュゲートしなかった抗ID B-2抗体（陽性対照）1μgおよび0.1％ HSA（陰性対照）5μLの評価も含んだ。抗体に相当するバンドが、沸騰させた試料由来の上清を含む試料中に検出された。沸騰しなかったコンジュゲート試料由来の上清中に抗ID抗体は検出されず、このことは、安定なコンジュゲーションと整合した。
実施例18：抗CD19抗体 抗IDおよび抗CD28抗体コンジュゲートビーズの作製
抗CD28および抗CD19抗体 抗ID抗体被覆ビーズを作製した。マウス抗CD28抗体（低エンドトキシン、アジドフリー（LEAF）精製クローンCD28.2（Biolegend））および実施例9に記載の抗ID B-2イディオタイプ抗体を、およそ4.5μmの直径を有する市販のトシル活性化超常磁性体（M-450と命名；ThermoFisher, Waltham MA）の表面に共有カップリングさせた。トシル活性化ビーズ（例えば、およそ4×108のビーズ/mL）1mL当たりに各抗体およそ6.67×10-10モルを加え、実質的に実施例に17記載しているように共有カップリングさせた。カップリング濃度およびビーズカウントに基づいて、ビーズ上の分子の概数は、1ビーズ当たり抗体分子1.79×106個であった。抗体被覆ビーズを、Cellometerでの判定で3.2×108のビーズ/mLの濃度で溶液に懸濁した。
実施例19：表面コンジュゲート抗CD19抗体 抗ID、抗CD2および抗CD28抗体を含有するビーズの作製
抗CD2抗体、抗CD28抗体で被覆した常磁性ビーズ、および抗CD19抗体 抗ID抗体被覆ビーズを作製した。マウス抗CD2抗体（クローンRPA-2.10, ED biosciences）、マウス抗CD28（LEAF精製クローンCD28.2, Biolegend）および実施例9に記載の抗ID B-2イディオタイプ抗体を、およそ4.5μmの直径を有する市販のトシル活性化超常磁性体（M-450と命名；ThermoFisher, Waltham MA）の表面に共有カップリングさせた。
トシル活性化ビーズ（例えば、およそ4×108のビーズ/mL）1mL当たりに各抗体およそ4.44×10-10モルを加え、実質的に実施例17に記載しているように共有カップリングさせた。カップリング濃度およびビーズカウントに基づいて、ビーズ上の分子の概数は、1ビーズ当たり抗体分子1.56×106個であった。抗体被覆ビーズを、3.91×108のビーズ/mLの濃度で溶液に懸濁した。
抗体コンジュゲートビーズの安定性を、抗体コンジュゲートビーズをペレット化し、得られた上清を4〜12％ Bis-Trisゲル上に流し、そして、ゲルをクマシーブルーでタンパク質について染色することによって評価した。ビーズ上にコンジュゲートされた総タンパク質の対照として、LDS試料緩衝液中で沸騰させたペレット化ビーズ由来の上清10μLを評価した。抗CD2抗体1μg、ビーズにコンジュゲートしなかった抗ID B-2抗体（陽性対照）1μgおよび0.1％ HSA（陰性対照）5μLの追加の対照も評価した。沸騰しなかったコンジュゲート試料由来の上清中に抗ID抗体は検出されず、このことは、このコンジュゲーションが安定であったことを示しているが、沸騰させた試料由来のロードした上清中に抗体に相当するバンドが検出された。
実施例20：抗IDコンジュゲートビーズを利用したCAR+T細胞の慢性刺激のためのインビトロアッセイ
CD4+細胞およびCD8+細胞の別個の組成物をヒトドナーから単離し、活性化し、FMC63に由来するscFvを有する抗CD19 CARをコードするウイルスベクターで形質導入した。次いで、各ドナー由来のCD4+T細胞およびCD8+T細胞を別々に採取し、製剤化し、そして低温凍結した。低温凍結した操作されたCD4+およびCD8+T細胞を融解し、同じドナー由来のCD4+T細胞およびCD8+T細胞比1：1で製剤化して、CAR+T細胞を含有するT細胞組成物を作製した。抗CD19 CARに対する抗IDコンジュゲートビーズを、ビーズ：細胞比1：1で、細胞と14日間インキュベートした。
抗IDコンジュゲートビーズでCAR特異的刺激した後14日目に採取されたCAR-T細胞の二次応答（14日目；二次）を、K562-CD19抗原を発現する標的細胞によりエフェクター対標的比1：1（サイトカインレベルを評価するために）または3：1（細胞溶解活性を評価するために）で刺激した後に評価した。また、抗IDコンジュゲートビーズとインキュベートしなかったT細胞組成物由来のT細胞の一次応答を、抗原発現細胞との類似の刺激によって判定した（0日目；「一次」）。細胞溶解活性を評価するために、蛍光顕微鏡検査による追跡を可能にするNucLight Red（NLR）で標的細胞を標識した。動態蛍光顕微鏡検査（INCUCYTE（登録商標）Live Cell Analysis System, Essen Bioscienceを使用）による経時的な蛍光シグナルの喪失による判定で、72時間にわたって生存能力のある標的細胞の喪失を測定することによって、殺傷活性を評価した。経時的な標的蛍光の曲線下面積（AUC）の逆数として、殺傷インデックスを判定した。また、ゴルジ阻害剤の存在下でのインキュベーション後の共培養したT細胞において、フローサイトメトリーによってIL-2およびTNF-アルファの細胞内サイトカインレベルを評価した。
図23Aに示すように、抗IDコンジュゲートビーズでの14日間のCAR特異的刺激後に収集されたCAR+T細胞を含有するT細胞組成物による標的細胞殺傷は、事前のCAR特異的刺激を受けなかったCAR+T細胞の細胞溶解活性と比較して低減された。また、抗IDコンジュゲートビーズでの長期のCAR特異的刺激を受けたCAR+T細胞においてもIL-2およびTNF-アルファの細胞内サイトカインレベルが低減された（図23B）。これらの結果は、抗IDコンジュゲートビーズとの14日間のインキュベーションによるなどの長期のCAR特異的刺激が、CARの慢性刺激および持続的な機能の喪失を導くという観察と一致する。
上記の慢性刺激アッセイを使用して、長期刺激後のCAR+T細胞機能を改善することに対する様々な化合物の効果を評価した。異なる化合物またはビヒクル対照の存在以外は上記の通り抗CD19 CAR+T細胞組成物を作製した。作製したCAR-T細胞組成物各々由来の細胞を、抗IDコンジュゲート常磁性ビーズとビーズ対細胞比1：1で14日間インキュベートした。
融解時のCAR-T細胞組成物の一次応答（抗IDコンジュゲートビーズでの刺激なし）またはCARによって刺激されたCAR-T組成物の二次応答（抗IDコンジュゲートビーズでのCAR特異的刺激の14日後）を、抗原発現細胞での刺激後に評価した。CAR-T細胞組成物を、ゴルジ阻害剤の存在下、K562-CD19抗原発現細胞と1：1で培養し、そして、IL-2、IFN-ガンマおよびTNF-アルファについての細胞内サイトカイン染色後にフローサイトメトリーによって多機能性サイトカイン産生を評価した。ドナーコホート内でスケール調整することによってデータを正規化した後にCD8+細胞において判定することで、サイトカインの累積レベルから多機能性スコアを決定した（図24A）。標的細胞との20時間のインキュベーション後の共培養物の細胞培養上清由来の総分泌IL-2、TNFおよびIFN-ガンマサイトカインを判定し、そして、3種全てのサイトカインについてのスケール調整したスコアの平均を図24Bに示すように算出した。図24Aおよび24Bに示すように、ある種の化合物は、CAR-T細胞組成物のサイトカイン産生能力に基づき、改善された一次応答または二次応答をもたらした。また、一次または二次の細胞溶解性応答の改善が、標的細胞とエフェクター：標的細胞比3：1で上記の通り共培養した後、ある種の化合物の存在下で産生されたT細胞組成物の間で観察された（図24C）。
これらの結果は、CAR-T細胞組成物（異なる条件下または化合物もしくは他の作用物質の存在下で産生された異なるCAR-T細胞組成物を含む）を、慢性CAR-T細胞刺激後に長期生存を示す能力および/または機能を持続する能力（例えば、抗原へのインビボ長期曝露後に生じ得る）について評価するための、慢性刺激アッセイの有用性を実証する。
実施例21：低分子化合物の存在下で増大させたキメラ抗原受容体（CAR）形質導入T細胞（CAR T細胞）の機能性評価
抗CD19 CARを発現するT細胞を含有する操作されたT細胞組成物を、異なる化合物またはビヒクル対照の存在下で、3人の別個のドナーから作製した。
異なるT細胞組成物由来の細胞のCARの刺激後の増大能力を、作製した抗CD19 CAR-T細胞組成物の細胞と抗CD19 CARに特異的な抗イディオタイプ抗体で表面コンジュゲートされたビーズとをインキュベートすることによって評価した。抗IDコンジュゲートビーズと細胞とを、24ウェルG-rex増大槽（Argos Technologies）のウェル内でビーズ：細胞比1：1で15日間インキュベートした。培養物中の細胞を5日毎に計数することによって、1ウェル当たりの総生T細胞を判定した（図25A）。経時的なT細胞数の関数の平均曲線下面積（AUC）を、培地のみで増大させた細胞のAUCと比べて算出した（図25B）。
図25Aに示すように、抗イディオタイプ抗体コンジュゲートビーズでの細胞の刺激は、初期増大とそれに続く細胞数の減退をもたらした。化合物とのインキュベーションによって以前に増大させた作製した抗CD19 CAR T細胞組成物由来のT細胞は、ビヒクル対照で以前に増大させたT細胞と比較して、より大きな平均AUCを有していた（図25B）。結果は、長期刺激アッセイの存在を使用して、いくつかの場合に、作製したT細胞組成物の単一CAR特異的刺激後の増大および生存能力を改善する、化合物を特定できることを示す。
抗IDコンジュゲートビーズでの増大後11日目に採取されたT細胞組成物由来のCAR-T細胞に対して、抗原発現細胞での刺激後の二次サイトカイン応答を評価した。抗IDで刺激した細胞を、放射線照射K562-CD19標的細胞とエフェクター：標的比1：1でおよそ16時間インキュベートした。上清を収集し、そして、Luminexマルチプレックスアッセイを使用してTNF-アルファ、IFN-ガンマおよびIL-2サイトカイン産生を測定した。共培養上清中で観察されるサイトカイン産生の倍率変化を、培地のみで増大させた細胞と比較して、化合物またはビヒクル対照の存在下で増大させた作製した抗CD19 CAR-T細胞組成物から判定した。図25Cに示すように、このアッセイは、後続の抗原での刺激後に改善された二次サイトカイン産生を示した、ある種の化合物の存在下で以前に増大させた抗CD19 CAR T細胞組成物から生成されたT細胞組成物を特定した。加えて、該アッセイは、化合物の存在下で操作および増大させたときに、実質的に上記の通りのゴルジ阻害剤との4時間のインキュベーション後の細胞内サイトカイン染色による判定で、11日目にCD107a+IFNγ+細胞であったCD8+T細胞の頻度の増加を示した、いくつかのドナー由来細胞からのT細胞組成物を特定した（図25D）。これらの結果は、操作されたT細胞組成物の機能を改善するためにT細胞を操作するプロセスにおいて使用される化合物の効果を同定するための長期刺激アッセイの使用と一致する。
本発明は、特定の開示される態様に範囲を限定されることを意図せず、それらは、例えば、本発明の様々な局面を例証するために提供される。記載される組成物および方法に対する様々な変更が、本明細書における説明および教示から明らかになるであろう。そのような変形は、本開示の真の範囲および精神から逸脱することなく実施されてよく、本開示の範囲内に含まれることが意図されている。
配列表
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Claims (155)

  1. 特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現している細胞を含むインプット組成物を、ビーズであるかまたはそれを含む複数の粒子と共にインキュベートする工程を含む、細胞を増大させる方法であって、
    複数の粒子が、2μmと5μmとの間または約2μmと5μmとの間の平均直径を含み、かつ特異的に抗原結合ドメインと結合するかまたはそれを認識する結合分子と結びついており、
    抗原結合ドメインへの結合分子の結合が、キメラ抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する、
    方法。
  2. 結合分子が、キメラ抗原受容体のリンカーまたはスペーサー領域と結合せずかつそれを認識せず、リンカーまたはスペーサー領域が、抗原結合ドメインを抗原受容体の膜貫通ドメインと接続している、請求項1記載の方法。
  3. 結合分子が、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項1または請求項2記載の方法。
  4. 抗原がCD19である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
  5. 結合分子が、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部を含む、請求項1または請求項2記載の方法。
  6. 組換え抗原が、BCMAであるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である、請求項5記載の方法。
  7. 特異的にB細胞成熟抗原（BCMA）と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含むインプット組成物を、抗原結合ドメインにより認識されるBCMAの細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部を含む結合分子が結びついた複数の粒子と共にインキュベートする工程を含む、細胞を増大させる方法であって、
    抗原結合ドメインへのBCMAの細胞外ドメインまたはその一部の結合が、キメラ抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する、
    方法。
  8. 結合分子が、部分構造に連結した組換え抗原またはその一部を含む融合ポリペプチドであり、任意で、部分構造が、粒子との結びつきを促進する、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. 部分構造が、組換え抗原のC末端に連結している、請求項8記載の方法。
  10. 部分構造が、Fcドメインであるかまたはそれを含む、請求項8または請求項9記載の方法。
  11. 特異的にCD19と結合するかまたはそれを認識する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現している細胞を含むインプット組成物を、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである結合分子が結びついた複数の粒子と共にインキュベートする工程を含む、細胞を増大させる方法であって、
    抗原結合ドメインへの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、キメラ抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する、
    方法。
  12. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、請求項3、4または請求項11記載の方法。
  13. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、請求項3、4または請求項11記載の方法。
  14. 粒子が、合成粒子、不溶性粒子、固体粒子または非細胞性粒子である、請求項7〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. 複数の粒子が、ビーズを含む、請求項7〜14のいずれか一項記載の方法。
  16. 複数の粒子が、0.5μg/mLと500μg/mLとの間または約0.5μg/mLと500μg/mLとの間（両端の値を含む）の結合分子濃度を有する組成物からのものである、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
  17. インキュベートする間に、インプット組成物中に存在する総細胞と複数の粒子との比が、5：1〜1：5または約5：1〜1：5（両端の値を含む）である、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
  18. 特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現している細胞を含むインプット組成物を、特異的に抗原結合ドメインと結合するかまたはそれを認識する結合分子が結びついたビーズであるかまたはそれを含む複数の粒子と共にインキュベートする工程を含む、細胞を増大させる方法であって、
    複数の粒子が、0.5μg/mLと500μg/mLとの間または約0.5μg/mLと500μg/mLとの間（両端の値を含む）の結合分子濃度を有する組成物からのものであり、インキュベートする間に、インプット組成物中に存在する総細胞と、複数の粒子との比が、5：1〜1：5または約5：1〜1：5（両端の値を含む）であり、
    抗原結合ドメインへの結合分子の結合が、キメラ抗原受容体を含む細胞の増大を誘導し、それにより、増大した細胞を含むアウトプット組成物を産生する、
    方法。
  19. 結合分子が、キメラ抗原受容体のリンカーまたはスペーサー領域と結合せずかつそれを認識せず、リンカーまたはスペーサー領域が、抗原結合ドメインを抗原受容体の膜貫通ドメインと接続している、請求項18記載の方法。
  20. 結合分子が、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項18または19記載の方法。
  21. 抗原がCD19である、請求項20記載の方法。
  22. 結合分子が、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部を含む、請求項18または請求項19記載の方法。
  23. 組換え抗原が、BCMAであるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である、請求項22記載の方法。
  24. 複数の粒子が、1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは5μg/mLと100μg/mLとの間または約1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは約5μg/mLと100μg/mLとの間（それぞれ両端の値を含む）の結合分子濃度を有する組成物からのものである、あるいは
    複数の粒子が、少なくとも1μg/mL、少なくとも5μg/mL、少なくとも10μg/mL、少なくとも25μg/mL、少なくとも50μg/mL、少なくとも100μg/mLもしくは少なくとも200μg/mL、または少なくとも約1μg/mL、少なくとも約5μg/mL、少なくとも約10μg/mL、少なくとも約25μg/mL、少なくとも約50μg/mL、少なくとも約100μg/mLもしくは少なくとも約200μg/mLの結合分子濃度を含む組成物からのものである、
    請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
  25. 複数の粒子が、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mLもしくは200μg/mL、または約5μg/mL、約10μg/mL、約25μg/mL、約50μg/mL、約100μg/mLもしくは約200μg/mLの結合分子濃度を有する組成物からのものである、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
  26. インキュベーションの間に、インプット組成物中に存在する総細胞と複数の粒子との比が、3：1〜1：3もしくは2：1〜1：2、または約3：1〜1：3もしくは約2：1〜1：2である（それぞれ両端の値を含む）、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
  27. インキュベーションの間に、インプット組成物中に存在する総細胞と複数の粒子との比が、1：1または約1：1である、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
  28. 複数のビーズが、2μmと5μmとの間もしくは約2μmと5μmとの間の平均直径または1g/cm3と2g/cm3との間もしくは約1g/cm3と約2g/cm3との間の平均密度を含む、請求項15〜27のいずれか一項記載の方法。
  29. 平均直径が、2.8μmもしくは4.5μm、または約2.8μmもしくは約4.5μmである、請求項1〜6および28のいずれか一項記載の方法。
  30. 抗原結合性フラグメントが、scFvであるかまたはscFvを含む、請求項3、4、11〜17、20、21および24〜29のいずれか一項記載の方法。
  31. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、任意で、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域またはFcの一部を含む、請求項3、4および11〜30のいずれか一項記載の方法。
  32. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、インタクト抗体または完全長抗体である、請求項3、4、11〜17、20、21、および24〜31のいずれか一項記載の方法。
  33. 結合分子が、複数の粒子のそれぞれと、結合分子のC末端アミノ酸残基でまたはその近くで結びついている、請求項1〜32のいずれか一項記載の方法。
  34. 複数の粒子が、単分散性である、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
  35. 結合分子が、表面に露出した官能基を介して粒子と共有結合的に結びついている、請求項1〜34のいずれか一項記載の方法。
  36. 表面に露出した官能基が、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、クロロメチル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、トシル基またはヒドラジン基である、請求項35記載の方法。
  37. 表面に露出した官能基が、トシル基である、請求項35または請求項36記載の方法。
  38. 複数の粒子が、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、ヒドロキシカルボン酸のコポリマー、ジカルボン酸のコポリマー、または金属を含む粒子を含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の方法。
  39. 粒子が、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、炭素またはそれらの組み合わせを含む表面を含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の方法。
  40. ポリマーが、ポリエチレングリコール、乳酸グリコール酸共重合体、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレン、およびポリビニルアルコールまたはそれらの組み合わせである、請求項39記載の方法。
  41. 複数の粒子が、疎水性表面を含む粒子を含む、請求項1〜40のいずれか一項記載の方法。
  42. 複数の粒子が、ポリスチレン表面を含む粒子を含む、請求項1〜41のいずれか一項記載の方法。
  43. 複数の粒子が、
    磁性である、および/または磁性コア、常磁性コア、もしくは超常磁性コアを含む、粒子
    を含む、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
  44. 細胞上の追加的な分子と特異的に結合して、補助シグナルを提供しかつ/または抑制シグナルを遮断する作用物質の存在下で、インキュベーションの少なくとも一部が行われる、請求項1〜43のいずれか一項記載の方法。
  45. 作用物質が、粒子と一緒に提供され、任意で、作用物質が、複数の粒子またはそのサブセットのそれぞれと結びついている、請求項44記載の方法。
  46. 作用物質が、粒子と結びついており、作用物質が、細胞上の追加的な分子と特異的に結合して、補助シグナルを提供しかつ/または抑制シグナルを遮断する、請求項44または請求項45記載の方法。
  47. 作用物質が、リガンドであるか、または抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである、請求項44〜46のいずれか一項記載の方法。
  48. 追加的な分子が、
    共刺激分子であるか、または活性化共受容体、任意で、OX-40、ICOS、DAP10、B7-1、B7-2、CD28もしくは4-1BBである、あるいは
    抑制性受容体、任意で、CTLA-4、PD-1、LAG-3、Tim-3、BTLAまたはTIGITである、あるいは
    T細胞表面タンパク質、任意で、CD2またはCD3である、
    請求項44〜47のいずれか一項記載の方法。
  49. 追加的な分子が、CD2またはCD28である、請求項44〜48のいずれか一項記載の方法。
  50. 粒子が、抗CD2抗体および抗CD28抗体のうち一方または両方を含む、請求項44〜49のいずれか一項記載の方法。
  51. 結合分子が、抗CD19抗イディオタイプ抗体である、請求項50記載の方法。
  52. 結合分子が、キメラ抗原受容体により認識される組換え抗原であり、任意で、組換え抗原が、BCMAであるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である、請求項50記載の方法。
  53. 作用物質が、粒子と共有結合的に結びついている、請求項45〜52のいずれか一項記載の方法。
  54. 結合分子と、粒子と結びついている作用物質との比、任意で、モル比または重量比が、1：1または約1：1である、請求項45〜53のいずれか一項記載の方法。
  55. インキュベーションが、2時間超、4時間超、8時間超、12時間超、24時間超、2日超、3日超、4日超、5日超、6日超、7日超、8日超、9日超、10日超、11日超もしくは12日超、または約2時間超、約4時間超、約8時間超、約12時間超、約24時間超、約2日超、約3日超、約4日超、約5日超、約6日超、約7日超、約8日超、約9日超、約10日超、約11日超もしくは約12日超にわたって実施される、請求項1〜54のいずれか一項記載の方法。
  56. インキュベーションが、24時間超、2日超、3日超、4日超、5日超、6日超、7日超、8日超、9日超、10日超、11日超もしくは12日超、または約24時間超、約2日超、約3日超、約4日超、約5日超、約6日超、約7日超、約8日超、約9日超、約10日超、約11日超もしくは約12日超にわたって実施される、請求項1〜55のいずれか一項記載の方法。
  57. インキュベーションが、10日超、11日超、12日超、13日超、14日超、15日超、もしくは16日超、または10日超、11日超、12日超、13日超、14日超、15日超、もしくは16日超にわたって実施される、請求項1〜56のいずれか一項記載の方法。.
  58. 細胞が、免疫細胞または人工多能性幹細胞（iPSC）を含む、請求項1〜57のいずれか一項記載の方法。
  59. 免疫細胞が、T細胞またはNK細胞である、請求項1〜58のいずれか一項記載の方法。
  60. 細胞が、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞のうち一方または両方を含む、請求項1〜59のいずれか一項記載の方法。
  61. CD4+細胞とCD8+細胞との比が、1：2と2：1との間もしくは1：3と3：1との間、または約1：2と2：1との間もしくは約1：3と3：1との間であるか、または1：1もしくは約1：1である、請求項1〜60のいずれか一項記載の方法。
  62. 細胞が、対象、任意でヒト対象から得られた初代細胞である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
  63. 細胞の組成物を、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と、組成物中の1つまたは複数の細胞中に核酸分子を導入するための条件下で接触させる工程を含む方法により、インプット組成物が産生される、請求項1〜62のいずれか一項記載の方法。
  64. （a）細胞の組成物を、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と、組成物中の1つまたは複数の細胞中に核酸分子を導入するための条件下で接触させる工程であって、それにより、インプット組成物を産生する、工程、および
    （b）インプット組成物の細胞を、請求項1〜63のいずれか一項記載の方法によりインキュベートする工程
    を含む、細胞を遺伝子操作する方法。
  65. 接触させる工程およびインキュベートする工程の少なくとも一部が、同時に実施される、請求項63または請求項64記載の方法。
  66. 接触させる工程が、ウイルスベクターによる形質導入により実施され、任意で、ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項63〜65のいずれか一項記載の方法。
  67. 細胞の組成物が、複数のT細胞を含み、前記方法が、接触させる工程の前にT細胞を刺激する工程も活性化する工程も含まない、請求項62〜66のいずれか一項記載の方法。
  68. 細胞の組成物が、複数のT細胞を含み、
    前記方法が、接触させる工程の前に、TCR複合体を経由するシグナルを誘導することが可能な1種もしくは複数種の作用物質の存在下で組成物をインキュベートする工程、ならびに/またはT細胞、CD4+ T細胞、および/もしくはCD8+ T細胞の増殖を誘導することが可能な1種もしくは複数種の作用物質、ならびに/またはCD3結合分子、CD28結合分子、組換えIL-2、組換えIL-15、および組換えIL-7もしくはそれらの組み合わせの存在下でのインキュベーションを含まず、
    任意で、前記方法が、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体の存在下でT細胞を刺激する工程を含まない、請求項63〜67のいずれか一項記載の方法。
  69. アウトプット組成物中に存在する細胞の活性化マーカーまたは疲弊マーカーの表面発現が、類似のインキュベーション後であるが、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能なポリクローナル刺激分子の存在下で産生される細胞の組成物中のマーカーの表面発現よりも少なく、
    任意で、ポリクローナル刺激分子が、抗CD3抗体もしくはフラグメントおよび/または抗CD28抗体もしくはフラグメントを含む、
    請求項1〜68のいずれか一項記載の方法。
  70. 疲弊マーカーが、抑制性受容体、任意で、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLAまたはTIGITである、請求項69記載の方法。
  71. 活性化マーカーが、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lまたは4-1BBである、請求項69記載の方法。
  72. キメラ抗原受容体を含むアウトプット組成物中の細胞の数が、インプット組成物中の抗原受容体を含む細胞の数と比較して、1.2倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10倍またはそれよりも大きく増加または富化される、請求項1〜71のいずれか一項記載の方法。
  73. インビトロまたはエクスビボで行われる、請求項1〜72のいずれか一項記載の方法。
  74. CARが、特異的に抗原と結合する細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通領域、およびITAMを含む細胞内シグナル伝達領域を含む、請求項1〜73のいずれか一項記載の方法。
  75. 細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、請求項74記載の方法。
  76. CARが、CD28または4-1BBのシグナル伝達ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項74または請求項75記載の方法。
  77. アウトプット組成物から複数のビーズを除去する工程をさらに含む、請求項1〜76のいずれか一項記載の方法。
  78. 請求項1〜77のいずれか一項記載の方法により産生される細胞の組成物。
  79. （i）2μmと5μmとの間または約2μmと5μmとの間の直径を含むビーズである粒子、および
    （ii）ビーズの表面と結びついた結合分子
    を含む表面修飾粒子であって、
    結合分子が、特異的にキメラ抗原受容体の細胞外抗原結合ドメインと結合する、
    表面修飾粒子。
  80. 結合分子が、組換え抗原受容体のリンカーまたはスペーサー領域と結合せずかつそれを認識せず、該リンカーまたはスペーサー領域が、抗原結合ドメインを抗原受容体の膜貫通ドメインと接続している、請求項79の表面修飾粒子。
  81. 結合分子が、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部を含む、請求項79または請求項80の表面修飾粒子。
  82. 組換え抗原が、BCMAであるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である、請求項81記載の表面修飾粒子。
  83. 粒子と、粒子の表面と結びついた結合分子とを含む、表面修飾粒子であって、
    結合分子が、B細胞成熟抗原（BCMA）である組換え抗原の細胞外ドメインまたはその一部を含む、
    表面修飾粒子。
  84. 結合分子が、部分構造に連結した組換え抗原またはその一部を含む融合ポリペプチドであり、任意で、部分構造が、粒子との結びつきを促進する、請求項81〜83のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  85. 部分構造が、組換え抗原のC末端に連結している、請求項84記載の表面修飾粒子。
  86. 部分構造が、Fcドメインであるかまたはそれを含む、請求項84または請求項85記載の表面修飾粒子。
  87. 結合分子が、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、請求項79または請求項80記載の表面修飾粒子。
  88. 抗原結合ドメインにより認識される抗原が、CD19である、請求項79、80および87のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  89. キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、請求項87または請求項88記載の表面修飾粒子。
  90. キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、請求項87または請求項88記載の表面修飾粒子。
  91. 抗原結合性フラグメントが、scFvであるかまたはそれを含む、請求項89または請求項90記載の表面修飾粒子。
  92. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、任意で、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域またはFcの一部を含む、請求項87〜91のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  93. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントが、インタクト抗体または完全長抗体である、請求項87〜92のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  94. 結合分子が、結合分子のC末端アミノ酸残基でまたはその近くで、粒子に結びついている、請求項79〜93のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  95. 合成粒子、不溶性粒子、固体粒子または非細胞性粒子である、請求項83〜94のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  96. ビーズである、請求項83〜95のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  97. 2μmと5μmとの間または約2μmと5μmとの間の直径を有する、請求項79〜96のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  98. 2.8μmもしくは4.5μmまたは約2.8μmもしくは約4.5μmの直径を有する、請求項79〜97のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  99. 結合分子が、前記粒子に共有結合的に結びついている、請求項79〜98のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  100. 結合分子が、表面に露出した官能基を介して前記粒子に共有結合的に結びついている、請求項79〜99のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  101. 表面に露出した官能基が、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、クロロメチル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、トシル基またはヒドラジン基である、請求項100記載の表面修飾粒子。
  102. 表面に露出した官能基が、トシル基である、請求項101記載の表面修飾粒子。
  103. ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、ヒドロキシカルボン酸のコポリマー、ジカルボン酸のコポリマー、または金属であるかまたはそれを含む、請求項79〜102のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  104. ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、炭素またはそれらの組み合わせを含む表面を含む、請求項79〜103のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  105. ポリマーが、ポリエチレングリコール、乳酸グリコール酸共重合体、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレン、およびポリビニルアルコールまたはそれらの組み合わせである、請求項104記載の表面修飾粒子。
  106. 疎水性表面を含む、請求項79〜105のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  107. ポリスチレン表面を含む、請求項79〜106のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  108. 磁性である、および/または磁性コア、常磁性コア、もしくは超常磁性コアを含む、請求項79〜107のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  109. 結合分子の少なくとも10コピー、少なくとも102コピー、少なくとも103、少なくとも104コピー、少なくとも105コピーもしくは少なくとも106コピー、または少なくとも約10コピー、少なくとも約102コピー、少なくとも約103コピー、少なくとも約104コピー、少なくとも約105コピーもしくは少なくとも約106コピーを含む、請求項79〜108のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  110. 前記粒子が、粒子の表面と結びついた少なくとも1種の作用物質をさらに含み、少なくとも1種の作用物質が、細胞上の追加的な分子と特異的に結合して、補助シグナルを提供しかつ/または抑制シグナルを遮断する、請求項79〜109のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  111. 少なくとも1種の作用物質が、リガンドであるか、または抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである、請求項110記載の表面修飾粒子。
  112. 追加的な分子が、共刺激分子または活性化共受容体、任意で、OX-40、ICOS、DAP10、B7-1、B7-2、CD28または4-1BBである、請求項110または請求項111の表面修飾粒子。
  113. 追加的な分子が、抑制性受容体、任意で、CTLA-4、PD-1、LAG-3、Tim-3、BTLAまたはTIGITである、請求項110または請求項111記載の表面修飾粒子。
  114. 追加的な分子が、T細胞表面タンパク質、任意で、CD2またはCD3である、請求項110または請求項111記載の表面修飾粒子。
  115. 追加的な分子が、CD2またはCD28である、請求項110または請求項111記載の表面修飾粒子。
  116. 抗CD2抗体および抗CD28抗体のうち一方または両方を含む、請求項115記載の表面修飾粒子。
  117. 少なくとも1つの作用物質が、粒子に共有結合的に結びついている、請求項110〜116のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  118. 結合分子と、粒子により含まれる少なくとも1種の作用物質との比、任意で、モル比または重量比が、1：1または約1：1である、請求項110〜117のいずれか一項記載の表面修飾粒子。
  119. 請求項79〜118のいずれか一項記載の複数の表面修飾粒子を含む、組成物。
  120. 組成物中の結合分子の濃度が、0.5μg/mLと500μg/mLとの間、1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは5μg/mLと100μg/mLとの間、または約0.5μg/mLと500μg/mLとの間、約1μg/mLと200μg/mLとの間もしくは約5μg/mLと100μg/mLとの間である、あるいは
    組成物中の結合分子の濃度が、少なくとも1μg/mL、少なくとも5μg/mL、少なくとも10μg/mL、少なくとも25μg/mL、少なくとも50μg/mL、少なくとも100μg/mLもしくは少なくとも200μg/mL、または少なくとも約1μg/mL、少なくとも約5μg/mL、少なくとも約10μg/mL、少なくとも約25μg/mL、少なくとも約50μg/mL、少なくとも約100μg/mLもしくは少なくとも約200μg/mLである、
    請求項119記載の組成物。
  121. 複数の表面修飾粒子が、単分散性である、請求項119または請求項120記載の組成物。
  122. 請求項79〜118のいずれか一項記載の表面修飾粒子または請求項119〜121のいずれか一項記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
  123. 説明書が、結合分子により特異的に認識される抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現している細胞を、細胞集団から選択または富化するためのものである、請求項122記載のキット。
  124. 説明書が、結合分子により特異的に認識される抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現している細胞を、細胞集団から刺激または増大させるためのものである、請求項122記載のキット。
  125. 請求項79〜118のいずれか一項記載の表面修飾粒子または請求項119〜121のいずれか一項記載の組成物と共に、細胞集団をインキュベートする工程を含む、細胞を増大させるための方法。
  126. 請求項79〜118のいずれか一項記載の表面修飾粒子または請求項119〜121のいずれか一項記載の組成物と、細胞集団を接触させる工程を含む、細胞を選択または富化する方法。
  127. 特異的に抗原と結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現しているT細胞を含むインプット組成物を、インプット組成物中の細胞におけるCAR依存性活性を刺激するための条件下で、少なくとも10日間インキュベートし、それにより、アウトプット組成物を産生する工程、および
    アウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の1つまたは複数の表現型または活性を評価する工程
    を含む、細胞組成物を評価するための長期刺激方法。
  128. CAR依存性活性を刺激するための条件が、特異的にCARの抗原結合ドメインと結合する結合分子の存在を含む、請求項127記載の方法。
  129. 結合分子が、支持体と結びついている、請求項128記載の方法。
  130. 支持体が、固体支持体である、請求項129記載の方法。
  131. 固体支持体が、マイクロプレートのウェルまたはビーズの表面である、請求項130記載の方法。
  132. 固体支持体が、マイクロプレートと結びついた結合分子を有するマイクロプレートであり、インキュベーションが、マイクロプレート中で実施される、請求項130または請求項131記載の方法。
  133. 固体支持体が、結合分子が結びついたビーズであり、インキュベーションが、複数のビーズの存在下で実施される、請求項130または請求項131記載の方法。
  134. 結合分子が、抗原結合ドメインにより認識される組換え抗原またはその一部であるかまたはそれを含む、請求項128〜133のいずれか一項記載の方法。
  135. 組換え抗原またはその一部が、BCMAであるか、または抗原結合ドメインにより認識されるその一部である、請求項134記載の方法。
  136. 結合分子が、特異的に抗原結合ドメインと結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、請求項128〜133のいずれか一項記載の方法。
  137. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体SJ25C1またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、請求項136記載の方法。
  138. 抗原受容体の抗原結合ドメインが、抗体FMC63またはその抗原結合性フラグメントであるかまたはそれを含む、請求項136記載の方法。
  139. インビトロまたはエクスビボで実施される、請求項127〜138のいずれか一項記載の方法。
  140. インプット組成物が、組換えサイトカインを含まない培地の存在下でインキュベートされる、請求項127〜139のいずれか一項記載の方法。
  141. インキュベーションが、連続的に実施される、またはある期間にわたり中断されない、請求項127〜140のいずれか一項記載の方法。
  142. インキュベーションの間に、細胞が再播種されず、培地が交換されず、かつ結合分子が添加されない、請求項127〜140のいずれか一項記載の方法。
  143. アウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の活性化、疲弊または分化状態の1つまたは複数の表現型を評価する工程を含む、請求項127〜142のいずれか一項記載の方法。
  144. 表現型が疲弊であり、評価する工程が、CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTA、またはCD96より選択される1つまたは複数のマーカーの発現、任意で表面発現を測定することを含む、請求項143記載の方法。
  145. 表現型が活性化であり、評価する工程が、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3、またはKi67より選択される1つまたは複数のマーカーの発現、任意で表面発現を測定することを含む、請求項143記載の方法。
  146. 表現型が分化状態であり、
    評価する工程が、
    （i）CD25、CD45RO、CD56、KLRG1、CD95の1つもしくは複数、ならびに/または
    （ii）CD45RA、CD27、CD28、CD62L、およびCCR7の1つもしくは複数
    より選択される1つまたは複数のマーカーを測定することを含み、
    任意で、1つまたは複数のマーカーが、ナイーブ様T細胞と正または逆に関連するマーカーである、
    請求項143記載の方法。
  147. アウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の1つまたは複数の活性を評価する工程を含む、請求項127〜146のいずれか一項記載の方法。
  148. 1つまたは複数の活性が、CAR依存性活性、任意で、抗原に刺激される活性を含む、請求項127〜147のいずれか一項記載の方法。
  149. 1つまたは複数の活性が、細胞溶解活性またはサイトカイン産生を含む、請求項147または148記載の方法。
  150. 期間が、少なくとも11日、少なくとも12日、少なくとも13日、少なくとも14日、もしくは少なくとも15日、または少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、もしくは少なくとも約15日である、請求項127〜149のいずれか一項記載の方法。
  151. 期間が、11日、12日、13日、14日もしくは15日であるか、または約11日、約12日、約13日、約14日もしくは約15日である、請求項127〜149のいずれか一項記載の方法。
  152. インプット組成物が、インキュベーションの前に試験作用物質または化合物に曝露または接触されていた細胞を含み、任意で、曝露または接触させることが、CARを発現しているT細胞を含むインプット組成物を産生するためのプロセスの1つまたは複数の段階の間に実施される、請求項127〜151のいずれか一項記載の方法。
  153. 前記方法が、複数のインプット組成物に対して実施され、複数の該インプット組成物のそれぞれが、異なるプロセスにより産生される、請求項127〜152のいずれか一項記載の方法。
  154. 前記方法が、アウトプット組成物の表現型または活性と、対照組成物の表現型または活性とを比較する工程をさらに含み、
    任意で、対照組成物が、CAR依存性活性を刺激するための同じ条件下で少なくとも10日間インキュベートされていたT細胞の該組成物であり、
    T細胞の該組成物が、試験作用物質もしくは化合物の存在下で産生されたものではないか、またはインプット組成物と比較して代替的なプロセスにより産生されたものである、請求項127〜153のいずれか一項記載の方法。
  155. 前記方法が、低下した疲弊、低下した活性化または減少した分化を示すアウトプット組成物を同定する工程をさらに含み、任意で、減少した分化が、1つまたは複数のナイーブ様T細胞マーカーの増加した発現を含む、請求項127〜154のいずれか一項記載の方法。
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