JP2020121977A - 疎水性薬物担体および抗菌剤としての使用のための両親媒性ペプチドナノ微粒子 - Google Patents

Abstract

【課題】がんおよび細菌感染を含む疾患を処置するための疎水性薬物を可溶化、送達、および標的化するために有用なナノ微粒子担体製剤を提供すること。【解決手段】製剤は、疎水性部分および正に帯電した親水性部分を有する両親媒性ペプチドを含有する。ペプチドは、非酸性ｐＨで自己会合し、球形のナノ微粒子形態を有するミセルを形成する。ナノ微粒子の疎水性コアは、抗がん剤を含む疎水性薬物をカプセル化し、水への溶解度を高め、例えばがん細胞に標的化することを可能にする。ナノ微粒子の正に帯電した表面は、ＲＧＤペプチドなどの任意の標的化部分とともに、ナノ微粒子が哺乳類細胞およびインテグリン受容体を過剰発現するがん細胞を含む細菌細胞に選択的に結合することを可能にする。ナノ微粒子の会合／解離のｐＨ依存性は、制御されたｐＨシフトを用いて疎水性薬物をナノ微粒子に便宜的に添加し、それらを酸性細胞内コンパートメント内で添加を解除するために採用し得る。担体製剤が疎水性薬物を可溶化し、標的化する能力は、薬物クルクミンを用いた骨肉腫細胞の死滅などのがん細胞の選択的抑制または死滅のための戦略を生じさせる。また、両親媒性ペプチドおよびそれから誘導されるナノ微粒子は、有用な殺菌特性ならびに医療移植片の細胞足場およびコーティングにおける細胞接着を促進する能力を有する追加の組成物および方法をもたらす。【選択図】なし

Description

クルクミンはその難溶性のためにその標的への投与および送達が困難な疎水性薬物の一例である。それは、多面的な抗がん効果を有するので、がんの多くのタイプに化学療法剤としての可能性を有する。クルクミンは、遺伝子発現、転写、増殖、および細胞外マトリックス合成を含むいくつかの細胞プロセスを標的とする^１。クルクミンは、ＮＦ−ｋＢおよびその下流の遺伝子産物を抑制することよって多くのタイプのがんに対して抗増殖効果を示すだけでなく、がん成長に包含されるさまざまな成長受容体および細胞接着分子にも影響する^２−４。加えて、クルクミンは、骨肉腫細胞を含むさまざまながん細胞株においてｐ５３の発現を上方制御することが示されている^５−７。しかし、そのポリフェノール構造では、クルクミンは水に不溶である^８。クルクミンはアルカリ性条件で不安定であり、生理学的条件下、例えばｐＨ７．２のリン酸緩衝液中で高い分解速度を有する^９。
クルクミンおよびその他の疎水性薬物のための好適な担体を開発するニーズが残存する。

本発明は、疎水性薬物のためのナノ微粒子担体製剤、およびがんおよび細菌感染症を含む疾患を処置する際のその製造および使用に関する方法を提供する。疎水性部分および正に帯電した親水性部分を含む両親媒性ペプチドは、非酸性ｐＨで自己会合して、球形のナノ微粒子形態を有するミセルを形成する。ナノ微粒子の疎水性コアは、抗腫瘍剤を含む疎水性薬物をカプセル化または包埋するために使用され得る。ナノ微粒子の正に帯電した表面は、ＲＧＤペプチドのような任意の標的化部分とともに、ナノ微粒子がインテグリン受容体を過剰発現するがん細胞を含む哺乳動物細胞および細菌細胞に選択的に結合することを可能にする。ナノ微粒子は低ｐＨで可逆的に解離するので、カプセル化されたまたは包埋された疎水性薬物を標的細胞の内部に送達することができる。ナノ微粒子会合／解離のｐＨ依存性は、制御されたｐＨシフトを使用して疎水性薬物でナノ微粒子に簡便に積載するために採用され得る。疎水性薬物を可溶化および標的化する担体製剤の能力は、薬剤クルクミンを用いた骨肉腫細胞の死滅などのがん細胞の選択的抑制または死滅のための戦略をもたらす。また、両親媒性ペプチドおよびそれから誘導されるナノ微粒子は、有用な殺菌剤の特徴ならびに医療移植片のための細胞足場およびコーティングにおける細胞接着を促進する能力を有するさらなる組成物および方法をもたらす。

本発明の一側面は、疎水性薬物用のナノ微粒子担体製剤である。製剤は、複数の両親媒性ペプチド分子および複数の疎水性薬物分子を含有する。各ペプチド分子は、正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を包含する。分子は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中の複数の実質的に球形のナノ微粒子に会合し、各ナノ微粒子は疎水性コアを有する。疎水性薬物分子は、ナノ微粒子の疎水性コアに包埋されている。従って、疎水性薬物は、水性媒体中の疎水性薬物単独の溶解度限界より高い濃度で製剤の水性媒体中で可溶化する。ナノ微粒子は、薬物を哺乳動物細胞の内部に送達することができる。

本発明の別の側面は、上記ナノ微粒子担体製剤の製造方法である。該方法は、（ａ）酸性ｐＨを有し、正に帯電した両親媒性ペプチドを解離状態で包含する水性媒体を提供する工程；（ｂ）疎水性薬物を水性媒体に添加する工程；（ｃ）水性媒体のｐＨを上昇させる工程を含有する。媒質のｐＨを上昇させると、両親媒性ペプチドは、疎水性薬物をカプセル化するかまたはナノ微粒子の疎水性コアに包埋されるようにする疎水性コアを有するナノ微粒子を形成する。

本発明のさらに別の側面は、疎水性薬物を投与する方法である。この方法は、それを必要とする被験体に上記のナノ微粒子の担体製剤を投与することを含有する。投与後、疎水性薬物は、ナノ微粒子の担体によって被験体の細胞内部位に送達される。

本発明のさらに別の側面は、細菌の成長および／または複製を抑制する方法である。この方法は、細菌を複数の両親媒性ナノ微粒子と接触させることを含有する。両親媒性ナノ微粒子は、複数の会合した両親媒性ペプチド分子を含有し、各ペプチド分子は、正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を含む。ナノ微粒子は、実質的に球形であり、正に帯電した表面および疎水性のコアを有する。ナノ微粒子は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中で処方される。ナノ微粒子を細菌と接触させた後、細菌の成長および／または複製が抑制される。関連する側面は、細菌感染を処置する方法である。この方法においては、この段落に記載されているような複数の両親媒性ナノ微粒子が、それを必要とする被験体に投与される。

本発明のさらに別の側面は、被験体の皮膚の中または皮膚上の細菌の成長または複製を抑制することができる化粧品組成物である。この組成物は、複数の両親媒性ナノ微粒子を包含する。両親媒性ナノ微粒子は、順に複数の会合した両親媒性ペプチド分子を含有し、各々は正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分をそれぞれ有する。ナノ微粒子は、実質的に球形であり、正に帯電した表面および疎水性のコアを有する。組成物は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中に製剤化される。

本発明のさらに別の側面は、細胞付着用基質である。基質は、両親媒性ペプチド分子の会合体を含有し、各々は正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を有する。分子は基質のマトリクス中で会合される。ペプチド分子の疎水性部分は互いに会合しており、ペプチド分子の親水性部分はマトリクス中で互いに会合している。本発明の関連する側面は、移植片のコーティングにおけるなどの細胞付着促進基質を含有する、医療移植片である。

本発明のさらなる側面は、以下の事項リストにまとめられる：
１．疎水性薬物のためのナノ微粒子の担体製剤であって、当該製剤は、
複数の両親媒性ペプチド分子で、各分子は正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を含み；前記分子は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中で複数の実質的に球形のナノ微粒子に会合され、各ナノ微粒子は、疎水性コアおよび、
ナノ微粒子の疎水性コアに埋め込まれた複数の疎水性薬物分子を含み、
ここで、疎水性薬物は、水性媒体中で疎水性薬物単独の溶解度限界よりも高濃度において製剤の水性媒体中に可溶化され；および
ここで、ナノ微粒子は、哺乳類の細胞の内部に薬物を送達する能力を有する。

２．前記非酸性ｐＨが約４より高い、項目１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
３．ナノ微粒子が、約４以下のｐＨで可逆的に解離し、約４より高いｐＨで可逆的に会合する、項目２に記載のナノ微粒子担体薬物。
４．両親媒性ペプチド分子の疎水性薬物分子に対するモル比が約２：１〜約１０：１である、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
５．疎水性部分が、１以上の直鎖状または分枝状鎖のアルキル基、シクロアルキル基、芳香族炭化水素、またはそれらの組合せを含む、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
６．疎水性部分が、１以上のＣ８〜Ｃ２２のアルキル基を含む、項目５に記載のナノ微粒子の担体製剤。
７．疎水性部分が、単一のＣ１８のアルキル基からなる、項目６に記載のナノ微粒子の担体製剤。
８．親水性部分が、生理学的ｐＨにおいて正の電荷を有することができる２以上のアミノ酸を含む、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
９．親水性部分が、アルギニン、リジン、およびそれらの混合物から選択されるアミノ酸残基を含む、項目８に記載のナノ微粒子の担体製剤。
１０．親水性部分が、標的とする部分を含む、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。

１１．標的化する部分が、ＲＧＤペプチド、抗体、アプタマー、または細胞表面受容体のためのリガンドを含む、項目１０に記載のナノ微粒子の担体製剤。
１２．両親媒性ペプチドが、１以上のｌｏｇＰ値を有する、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
１３．両親媒性ペプチドが、ｐＨ７．４において１以上のｌｏｇＤ値を有する、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
１４．両親媒性ペプチドが、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号１）である、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
１５．ナノ微粒子が細胞表面に結合する、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
１６．ナノ微粒子が、ｐＨ４以下の細胞間コンパートメントへ疎水性薬物分子を放出する、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
１７．ナノ微粒子が微飲作用によって哺乳類動物の細胞に取り込まれる、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。

１８．疎水性薬物ががん細胞に選択的に送達される、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
１９．前記がん細胞が、骨肉腫、前立腺がん、乳がん、肺がん、膵臓がん、頭頸部がん、子宮頸がん、卵巣がん、大腸がん、骨がん、脳腫瘍、肝臓がん、リンパ腫、メラノーマ、白血病、神経芽細胞腫、皮膚がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、精巣がん、腎臓がん、腸がん、喉頭がん、および甲状腺がんからなる群より選択される、項目１８に記載のナノ微粒子担体製剤。
２０．疎水性薬物が抗がん剤である、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
２１．疎水性薬物ががん細胞に細胞毒性である、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
２２．両親媒性ペプチドが細菌に毒性であるか、細菌の成長または増殖を抑制する、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
２３．凍結乾燥形態で存在する、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
２４．ナノ微粒子が約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲の平均直径を有する、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。

２５．疎水性薬物がクルクミン、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびシスプラチンからなる群から選択される、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子の担体製剤。
２６．疎水性薬物が１以上のＬｏｇＰ値を有する、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子担体製剤。
２７．疎水性薬物が１以上のＬｏｇＤ値を有する、先行する項目のいずれかに記載のナノ微粒子担体製剤。
２８．項目１〜２７のいずれかに記載のナノ微粒子担体製剤を作る方法であって、
（ａ）水性媒体が酸性ｐＨを有し、かつ両親媒性ペプチドが解離状態にある、正に帯電した両親媒性ペプチドを含む水性媒体を提供する工程；と
（ｂ）疎水性薬物を水性媒体に添加する工程；と
（ｃ）水性媒体のｐＨを上げ、それによって両親媒性ペプチドが疎水性コアを有するナノ微粒子を形成し、それにより疎水性薬物がナノ微粒子の疎水性コアに埋め込まれる工程とを有する、前記方法。
２９．（ｄ）水性懸濁液から埋め込まれていない疎水性薬物を除去する工程
をさらに含む、項目２８に記載の方法。

３０．（ｅ）担体製剤を凍結乾燥する工程
をさらに含む、項目２９に記載の方法。
３１．工程（ａ）の前に、
（ａ０）正帯電の両親媒性ペプチドを含む水性媒体を提供し、水性媒体は、非酸性ｐＨを有し、両親媒性ペプチドがナノ微粒子の形態で会合する工程；と
（ａ００）水性媒体のｐＨを酸性ｐＨに低下させ、それによってナノ微粒子が解離する工程、
とをさらに含む、項目２８〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．工程（ｃ）が非酸性ｐＨを有する第２の水性媒体に対して水性媒体を透析する工程を含む、項目２８〜３１のいずれかに記載の方法。
３３． 工程（ｃ）および（ｄ）が、非酸性ｐＨを有し、実質的に疎水性薬物を含まない第２の水性媒体に対して水性媒体を透析することによって同時に行われる、項目２８〜３１のいずれかに記載の方法。
３４． 工程（ｃ）においてｐＨが約４より高く上昇させる、項目２８〜３３のいずれかに記載の方法。
３５． 工程（ｃ）におけるｐＨを約７．０〜約７．４の範囲の値に上昇させる、項目３４の方法。

３６．工程（ｃ）で生成されたナノ微粒子中の疎水性薬物分子に対する両親媒性ペプチド分子のモル比が約２：１〜約１０：１である、項目２８〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．両親媒性ペプチドが疎水性部分および正に帯電された親水性部分を含む、項目２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
３８．疎水性部分が、１つ以上の直鎖状または分枝状鎖アルキル基、シクロアルキル基、芳香族炭化水素、またはそれらの組み合わせを含む、項目３７に記載の方法。
３９．疎水性部分が１以上のＣ８〜Ｃ２２アルキル基を含む、項目３８に記載の方法。
４０．疎水性部分が単一のＣ１８アルキル基からなる、項目３９に記載の方法。

４１．親水性部分が、生理学的ｐＨで正電荷を有することができる２つ以上のアミノ酸を含む、項目３７に記載の方法。
４２．親水性部分が、アルギニン、リジン、およびそれらの混合物から選択される５つ以上のアミノ酸残基を含む、項目４１に記載の方法。
４３．親水性部分が標的化する部分を含む、項目３７に記載の方法。
４４．標的化する部分が、ＲＧＤペプチド、抗体、アプタマー、または細胞表面受容体のリガンドを含む、項目４３に記載の方法。
４５．両親媒性ペプチドが１以上のＬｏｇＰ値を有する、項目２８〜４４のいずれかに記載の方法。
４６．両親媒性ペプチドがｐＨ７．４で１以上のＬｏｇＤ値を有する、項目２８〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．両親媒性ペプチドがＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号１）である、項目２８〜４６のいずれかに記載の方法。
４８．疎水性薬物が抗がん剤である、項目２８〜４７のいずれかに記載の方法。
４９．両親媒性ペプチドが細菌に対して毒性であるか、細菌の成長または増殖を抑制する、項目２８〜４８のいずれかに記載の方法。
５０．工程（ｃ）において形成されたナノ微粒子が、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲の平均直径を有する、項目２８〜４９のいずれかに記載の方法。

５１．疎水性薬物が、クルクミン、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびシスプラチンからなる群から選択される、項目２８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
５２．疎水性薬物が１以上のＬｏｇＰ値を有する、項目２８〜５１のいずれかに記載の方法。
５３．疎水性薬物が１以上のＬｏｇＤ値を有する、項目２８〜５２のいずれかに記載の方法。
５４．疎水性薬物を投与する方法であって、項目１〜２７のいずれか１項に記載のナノ微粒子状担体製剤をそれを必要とする被験体に投与することを含み、疎水性薬物が被験体の細胞内部位に送達される、前記方法。
５５．疎水性薬物が、疎水性薬物による処置を必要とする被験体の細胞に選択的に送達される、項目５４に記載の方法。
５６．被験体ががんを有し、疎水性薬物が被験体のがん細胞に対して細胞毒性である、項目５４〜５５のいずれか１項に記載の方法。
５７．疎水性薬物が、クルクミン、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびシスプラチンからなる群から選択される、項目５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。

５８．がん細胞が、骨肉腫、前立腺がん、乳がん、肺がん、膵臓がん、頭頸部がん、子宮頸がん、卵巣がん、大腸がん、骨がん、脳腫瘍、肝臓がん、リンパ腫、メラノーマ、白血病、神経芽細胞腫、皮膚がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、精巣がん、腎臓がん、腸がん、喉頭がん、および甲状腺がんからなる群より選択される、項目５６に記載の方法。

５９．複数の両親媒性ナノ微粒子を、それを必要とする被験体に投与することを含む、細菌感染症を処置する方法であって、前記両親媒性ナノ微粒子は、複数の会合した両親媒性ペプチド分子を含み、各ペプチド分子は、正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を含み；ナノ微粒子は実質的に球形であり、正に帯電した表面および疎水性コアを有し、前記ナノ微粒子は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中に製剤化され、ナノ微粒子は細菌を死滅させるか、または被験体における細菌の成長または複製を抑制する、前記方法。

６０．細菌感染が細菌性皮膚感染であり、両親媒性ナノ微粒子が被験体の皮膚に投与される、項目５９に記載の方法。
６１．細菌の成長および／または複製を抑制する方法であって、細菌を複数の両親媒性ナノ微粒子と接触させる工程と、両親媒性ナノ微粒子は、複数の会合した両親媒性ペプチド分子を含み、各ペプチド分子は、正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を含み；ナノ微粒子が実質的に球形であり、正に帯電した表面および疎水性コアを有し、前記ナノ微粒子は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中に製剤化され、それによって細菌の成長および／または複製が抑制される、前記方法。
６２．両親媒性ペプチドの疎水性部分が、１つ以上の直鎖状または分枝状鎖のアルキル基、シクロアルキル基、芳香族炭化水素、またはそれらの組み合わせを含む、項目６１に記載の方法。
６３．疎水性部分が１以上のＣ８〜Ｃ２２アルキル基を含む、項目６２に記載の方法。

６４．疎水性部分が単一のＣ１８アルキル基からなる、項目６３に記載の方法。
６５．親水性部分が、生理的ｐＨで正電荷を有することができる２つ以上のアミノ酸を含む、項目６４に記載の方法。
６６．親水性部分が、アルギニン、リジン、およびそれらの混合物から選択される６つ以上のアミノ酸残基を含む、項目６５に記載の方法。
６７．両親媒性ペプチドがＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号１）である、項目６５に記載の方法。

６８．皮膚中または皮膚上に細菌の成長または複製を抑制することができる化粧品組成物であって；組成物は、複数の両親媒性ナノ微粒子を含み；該両親媒性ナノ微粒子は、複数の会合した両親媒性ペプチド分子を含み、各ペプチド分子は、正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を含み；ナノ微粒子が実質的に球形であり、正に帯電した表面および疎水性コアを有し；組成物は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中で製剤化される、前記組成物。

６９．両親媒性ペプチドの疎水性部分が、１以上の直鎖状または分枝状鎖のアルキル基、シクロアルキル基、芳香族炭化水素、またはそれらの組合せを含む、項目６８に記載の化粧品組成物。
７０．疎水性部分が１以上のＣ８〜Ｃ２２アルキル基を含む、項目６９に記載の化粧品組成物。
７１．疎水性部分が単一のＣ１８アルキル基からなる、項目７０に記載の化粧用組成物。
７２．親水性部分が、生理学的ｐＨにおいて正電荷を有することができる２つ以上のアミノ酸を含む、項目６８に記載の化粧品組成物。
７３．親水性部分が、アルギニン、リジン、およびそれらの混合物から選択される６つ以上のアミノ酸残基を含む、項目７２に記載の化粧品組成物。
７４．両親媒性ペプチドがＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号１）である、項目６８に記載の化粧品組成物。

７５．細胞付着用マトリクスであって、該マトリクスは、両親媒性ペプチド分子の会合体を含み、各両親媒性ペプチド分子は正帯電の親水性部分に共有結合された疎水性部分を含み；該分子はマトリクス中に会合し、ペプチド分子の疎水性部分および親水性部分は、マトリクス中に会合している。

７６．両親媒性ペプチドの疎水性部分が、１以上の直鎖または分枝状鎖のアルキル基、シクロアルキル基、芳香族炭化水素、またはそれらの組合せを含む、請求項４８のマトリクス。
７７．疎水性部分が１以上のＣ８〜Ｃ２２アルキル基を含む、項目７５に記載のマトリクス。
７８．疎水性部分が単一のＣ１８アルキル基からなる、項目７７に記載のマトリクス。
７９．親水性部分が、生理学的ｐＨにおいて正電荷を有することができる２つ以上のアミノ酸を含む、項目７５に記載のマトリクス。
８０．親水性部分が、アルギニン、リジンおよびそれらの組合せから選択される６個以上のアミノ酸残基を含む、項目７９に記載のマトリクス。
８１．両親媒性ペプチドがＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号１）である、項目８０に記載のマトリクス。
８２．項目７５のマトリクスを含む、医療移植片。
８３．マトリクスが移植片の表面にコーティングとして存在する、項目８２の医療移植片。

図１Ａは、両親媒性ペプチドＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳの分子構造を示す。 図１Ｂは、本発明の両親媒性ペプチドの概略図を示す。 図１Ｃは、本発明の両親媒性ナノ微粒子薬物担体の一実施態様の概略断面図を示す。 図１Ｄは、本発明によるコーティングされた医療移植片の一部の概略断面図を示す。 図２Ａ〜２Ｆは、異なる条件下でＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ両親媒性ペプチドナノ微粒子（ＡＰＮＰ）のネガティブ染色されたＴＥＭ画像を示す。スケールバーは１００ｎｍであり、選択された個々の構造のサイズが示されている。ナノ微粒子は、脱イオン水中の１．５ｍｇ／ｍＬ（図２Ａ）、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（図２Ｂ）、超音波処理なしの水中（図２Ｃ）、ｐＨ６の酢酸中（図２Ｄ）、ｐＨ４の酢酸中（図２Ｅ）、およびｐＨ２の酢酸中（図２Ｆ）であった。

図３Ａおよび３Ｂは、クルクミン積載Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰのネガティブ染色されたＴＥＭ画像を示す。スケールバーは１００ｎｍであり、選択された個々の構造のサイズが示されている。 図４は、純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰおよびクルクミン積載Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰに対するゼータ電位測定の結果を示す。 図５は、（ｉ）固体クルクミン、（ｉｉ）純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰ、および（ｉｉｉ）クルクミン積載Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰのフーリエ変換赤外スペクトルを示す。 図６は、固体クルクミン、純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰおよびクルクミン積載Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰのＸ線回折パターンを示す。

図７Ａ〜７Ｃは、正常なヒトの骨芽細胞の明視野顕微鏡画像を示す。図７Ａ、対照；７Ｂは、２０μＭのクルクミンのみをリン酸塩緩衝生理食塩水で処理し；図７ＣはＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰに積載されたクルクミンの２０μＭで処理した。図７Ｄ〜７Ｆは、骨肉腫細胞の明視野顕微鏡画像を示す。図７Ｄ、対照；７Ｅは、２０μＭのクルクミンのみをリン酸塩緩衝生理食塩水で処理し；７Ｆは、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰに積載されたクルクミンの２０μＭで処理した。 図８Ａ〜８Ｃは、正常なヒトの骨芽細胞におけるクルクミン摂取の共焦点顕微鏡像を示す。図８Ａ、対照；図８Ｂは、リン酸塩緩衝食塩水中のクルクミン２０μＭで処理した。図８Ｃは、Ｃ８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰに積載されたクルクミン２０μＭで処理した。図８Ｄ〜８Ｆは、骨肉腫細胞におけるクルクミン摂取の共焦点顕微鏡像を示す。図８Ｄ、対照；図８Ｅは、リン酸塩緩衝食塩水中クルクミン２０μＭで処理した。および図８Ｆは、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰに積載されたクルクミン２０μＭで処理した。

図９Ａは、正常なヒトの骨芽細胞（ＨＯＢ）および骨肉腫（ＯＳ）細胞に対する純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの細胞毒性試験の結果を示す。データは、ｎ＝３（１グループ当たり５つの試料）の平均の平均＋−標準誤差として示される。Ｐ値は、純粋なＡＰＮＰ処置群と対照群との間の有意差を表す。*Ｐ，０．０１。 図９Ｂは、正常なヒトの骨芽細胞（ＨＯＢ）および骨肉腫（ＯＳ）細胞に対する純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの細胞毒性試験の結果を示す。データは、ｎ＝３（１グループ当たり５つの試料）の平均の平均＋−標準誤差として示される。Ｐ値は、純粋なＡＰＮＰ処置群と対照群との間の有意差を表す。*Ｐ，０．０１。 図１０Ａ〜１０Ｄは、リン酸塩緩衝食塩水中のクルクミン単独およびＤＭＳＯ中のクルクミン単独と比較した、クルクミン積載Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの細胞毒性試験の結果を示す。図１０Ａおよび１０Ｃの細胞は、骨肉腫（ＯＳ）細胞であり、図１０Ｂと図１０Ｄは正常なヒトの骨芽細胞（ＨＯＢ）であった。データは、図１０Ａおよび１０Ｂにおいて細胞生存率として、図１０Ｃおよび１０Ｄにおいて細胞密度として表される。結果は、ｎ＝３（１グループ当たり５つの試料）の平均の平均±標準誤差として示される。Ｐ値は、対照群（*）、ＰＢＳ中の同じ濃度のクルクミンで処理した群（＃）およびＤＭＳＯに溶解した同じ濃度のクルクミンで処理した群（^）の間の有意差を表す。*、＃、＾Ｐ、０．０１；**、＃＃、＾＾Ｐ、０．００５。 図１１Ａは、ヒトの真皮線維芽細胞の生存率（細胞密度またはコロニー数として測定）に対するＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの増加する濃度の効果を示す。 図１１Ｂは、黄色ブドウ球菌（図１１Ｂ）の生存率（細胞密度またはコロニー数として測定）に対するＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの増加する濃度の効果を示す。 図１２は、黄色ブドウ球菌の成長曲線に対する種々の濃度のＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの効果を示す。

発明の詳細な説明
本発明者らは、疎水性薬物を可溶化および標的化するための担体製剤、ならびにこの製剤を使用してがんおよび細菌感染症を含む疾患を処置する方法を発見した。製剤は、疎水性薬物または他の化学物質のための担体としてそれらを含有する両親媒性ペプチドおよびナノ構造の使用に基づいている。両親媒性ペプチドは、正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を含有するか、またはそれからなる。ペプチドは、非酸性ｐＨにおいて自己会合し、球形のナノ微粒子形態を有するミセルを形成する。ナノ微粒子は、標的細胞と相互作用し、飲食作用（endocytosis）または飲作用（pinocytosis）による細胞内部への薬物送達を助ける疎水性薬物および正に帯電した外表面を隔離する疎水性コアを有する。かかるナノ微粒子は、本明細書では「両親媒性ペプチドナノ微粒子」または「ＡＰＮＰ」と呼ばれ、この用語は、疎水性薬物あるいは薬物を欠くナノ微粒子のいずれかが積載されたナノ微粒子を参照し得る。

親水性部分に近接するアルギニンまたはリジンなどのいくつかのプロトン化可能な基の使用は、発明の方法における薬物の積載（loading）および放出（unloading）に利用されるナノ微粒子の可逆的会合／解離（すなわち、組立て／分解）機構を可能にする。さらに、ＲＧＤペプチドなどの標的化する部分の任意の包含は、ナノ微粒子が選択された標的細胞に選択的に結合することを可能にする。担体製剤が疎水性薬物を可溶化および標的化する能力は、限定された水溶性を有するクルクミンなどの薬物を用いたがん細胞の選択的抑制または死滅を可能にし、新しい治療を可能にする。担体製剤はまた、細菌の死滅または抑制、および細胞足場および細胞移植片のためのコーティングにおける細胞接着を促進するなどの薬物送達とは無関係の用途を有する。

両親媒性分子は、１つ以上の非極性または疎水性部分に連結された１つ以上の極性または親水性部分を包含する。一般に、両親媒性分子は、分子の一端に疎水性部分を有し、分子の反対側端部に親水性部分を有し、２つの部分はそれらの間の共有結合によって結合される。強い疎水性でも親水性でもない分子追加の部分が存在してもよい。本発明において、両親媒性分子は、好ましくは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに共有結合した疎水性部分を有するペプチド結合によって連結されたＬ−アミノ酸からなるペプチドである。

好ましくは、アミノ酸残基の２つ以上、より好ましくは６つ以上、７つ以上、８つ以上、または４−９、または５−１０、または５−１１、または５−１２、または６−１１または６−１２、または７−１１、または７−１２、または８−１１、または８−１２はプロトン化可能であり、生理学的ｐＨで、または酸性ｐＨ（すなわち、７．０未満、好ましくは４．０以下）で正電荷を獲得することが可能である。プロトン化可能な残基は、例えば、Ｌ−アルギニン、またはＬ−リジン、またはそれらの混合物、またはペプチドに組み入れ得る他のプロトン化可能な部分であり得る。疎水性部分の疎水性相互作用は、親水性分子が水溶液中でミセルおよび他のナノスケール構造を形成するための自己組織化の主な推進力であり、一方で、親水性部分はミセルの形態に影響し、水素結合および静電気的相互作用を介して水および帯電部分と相互作用する。プロトン化可能な残基が酸性ｐＨでますます正に帯電するようになるにつれて、電荷反発効果が誘引的な疎水性相互作用を克服し、ナノ微粒子の解離または分解を引き起こす。

ＡＰＮＰ中の疎水性薬物または他の疎水性化学物質の隔離は、薬物とＡＰＮＰ中の両親媒性ペプチド分子の疎水性部分との間の疎水性相互作用の強さに依存する。薬物に結合するのに十分強い疎水性相互作用を有する適切な両親媒性ペプチドの選択、およびペプチド分子と疎水的に相互作用するのに適した薬物の同定は、経験的に決定することができる。例えば、両親媒性ペプチドと疎水性薬物との異なる組み合わせを試みることができ、ＡＰＮＰの安定性および薬物の保持は、既知の方法によって決定することができる。しかしながら、理論的アプローチも適用し得る。

例えば、好適に強い疎水性を有するペプチドおよび薬物は、オクタノール／水二相系における平衡分配係数から決定されるそれらのＬｏｇＰ値を用いて推定することができる。所与のｐＨにおけるペプチドの解離の程度を考慮に入れるために、関連するＬｏｇＤ値を使用することができる。例えば、０．８、１．０、１．２、１．５または２．０より大きいＬｏｇＰ値は、ペプチドまたは薬物のいずれかに対する十分に強い疎水性相互作用を表すと考えられ得る。生理学的範囲のｐＨにおけるＬｏｇＤの同様の値は、許容可能なイオン化レベルを示し得る。イオン化レベルが高すぎる（すなわち、正電荷の密度が高すぎる）と、必要な生理学的ｐＨでＡＰＮＰを形成できないか、または疎水性薬物の保持力が乏しい。

一例として、疎水性薬物クルクミンをＡＰＮＰに積載した（例２〜４参照）。使用した両親媒性ペプチドはＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号１）であり、その構造は図１Ａに示されている。クルクミンは酢酸に可溶性であるため、クルクミンと両親媒性ペプチドを酢酸と共溶解させて以前に自己組織化したペプチドミセル構造を破壊した後、透析により酢酸を除去することによりナノ微粒子を再形成して、クルクミンをＡＰＮＰ凝集体に封鎖した。アルギニンの脱プロトン化は、このｐＨ感受性の自己組織化プロセスの推進要因であると考えられている。

１つのアルギニン残基のｐＫａは１２．４８であり、生理的環境においてアルギニンに富む構造上のグアニジニウム基が正に帯電していることを示しているが、隣接するアルギニン残基のｐＫａは、隣接する正の電荷の電荷反発効果のために、非常に低いことが予想される。本発明を特定の機構に限定するものではないが、低いｐＨでのＡＰＮＰの解離は、徐々に強いアルギニン残基がｐＨ４以下で脱プロトン化されるにつれてますます強い静電気的反発力に起因すると考えられ、結果的にナノ微粒子構造の崩壊を導く。

ｐＨ感受性の会合機構は、内部コアに封入された生物活性分子の細胞取り込みに有益である。例えば、ｐＨが５〜６であるその内腔のエンドソームは細胞外分子を原形質膜からリソソームに輸送することができる膜結合区画である。次いで、リソソームは、約４〜５のｐＨで消化酵素によって分子を加工することができる。したがって、この低ｐＨ環境は、ＡＰＮＰの解離を引き起こし、生物活性分子を細胞質ゾルに放出すると予想される。

本発明における使用のための両親媒性ペプチド分子は、図１Ｂに示される一般構造を有する。両親媒性分子１０は、疎水性部分３０に結合した親水性部分２０を包含する。親水性部分は、２つ以上のプロトン化可能な基（これは実際の電荷数を示すことを意味するものではないが「＋＋＋」として示される）を包含し、プロトン化可能な個々の基のｐＨおよびｐＫａに依存して、正に帯電し得るかし得ない。典型的には、分子は、約７．０〜約７．４の範囲の生理学的ｐＨで１つまたは２つの正電荷を有することができ、低ｐＨ（例えば、約２〜約４のｐＨ範囲）でより多くの正電荷（例えば、２〜５、または１０，１１または１２まで）を有し得る。

非酸性ｐＨ（すなわち、約４より高い）では、分子は図１Ｃに模式的に示されているようなミセル構造に自発的に会合する。ミセルまたは両親媒性ナノ微粒子１００は、多数の正電荷を含む親水性殻１２０によって取り囲まれた、両親媒性ペプチド分子の凝集疎水性部分によって形成される、疎水性コア１１０を包含する。殻はまた、いくつかの負電荷を含むことができるが、好ましくは、プロトン化可能な基によって担持された正味の正電荷を有し、そのうちの少なくともいくつかは約２〜約４、または約１〜約５、約１〜約３、または約２〜約５、または約３〜約５の範囲のｐＫａ値を有する。疎水性薬物分子１３０は、存在すれば、疎水性コア中に位置する。図１Ｃに示すようなＡＰＮＰ構造（埋め込まれた疎水性薬物なし）は、例えば、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳなどの適切な両親媒性ペプチドを、脱イオン水または適切な緩衝液または生理食塩水に室温で単に、好ましくは混合および超音波処理で、溶解することによって、均一かつ分散された構造体を提供する。

本発明の両親媒性ペプチドから形成することができる別の構造体を図１Ｄに示す。コーティングされた医療デバイスまたは移植片、または細胞もしくは組織培養または工学用の支持構造体（例えば、細胞足場）であり得るこの構造体において、構造体２００は、支持構造体２１０を含み、その上に、会合した両親媒性ペプチド分子を包含するマトリクスまたはコーティング２２０を堆積する。

界面活性剤様の両親媒性ペプチドは、典型的には天然に存在するＬ−アミノ酸を包含する両親媒性物質である。そのような両親媒性ペプチドは、生体適合性であり、異なる応用のためのさまざまなペプチド配列の含有によって機能化することもできる。例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）トリペプチドは、ガン細胞上のαｖβ３インテグリンなどの過剰発現受容体を標的化することができ、５〜１１個の連続するアルギニン残基を有するカチオン性ペプチドはマクロピノサイトーシス媒介経路を介した細胞取り込みを促進し得る。例えば、両親媒性ペプチドであるＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳは、遺伝子送達担体として用いられている¹¹。

特定の実施態様においては、両親媒性ペプチドは、腫瘍細胞などの選択された標的細胞に結合する、両親媒性ペプチドの一部、またはペプチドに共有結合した置換基または分子である標的化部分を含有することができる。標的部分は、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ホルモン、細胞表面受容体などのリガンドまたは受容体、サイトカイン、ペプチド模倣体、タンパク質、化学修飾タンパク質、炭水化物、化学修飾炭水化物、化学修飾核酸、または細胞表面タンパク質を標的とするアプタマーである。例えば、ＵＳ２０１１／０１２３４５１を参照されたい。

標的部分は、細胞表面受容体に結合することが知られている分子に由来してもよい。例えば、標的部分は、低密度リポタンパク質、トランスフェリン、ＥＧＦ、インスリン、ＰＤＧＦ、線維素溶解酵素、抗ＨＥＲ２、アネキシン、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、またはコロニー刺激因子に由来し得る。標的化部分は、ナノ微粒子を血液脳関門に標的化する抗体または抗体フラグメント、例えば、トランスフェリン受容体、インスリン受容体、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−２受容体に対する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、米国公開特許出願第２００２／００２５３１３号を参照されたい。標的化部分は、リンカーによってナノ微粒子中のペプチドに結合し得る。さまざまな部分をペプチドに結合させるためのリンカーは、当技術分野で公知である。

任意の疎水性薬物または化学物質、またはそれらの任意の組み合わせは、本発明のＡＰＮＰを用いて封鎖され、可溶化され、標的化されおよび／または送達され得る。例えば、以下の疎水性薬物をＡＰＮＰに積載することができる：クルクミン、ドキソルビシン、シスプラチン、およびパクリタキセルなどの抗腫瘍剤；アロキシプリン、オーラノフィン、アザプロパゾン、ベノリレート、ジフルニサール、エトドラック、フェンブフェン、フェノプロフェンカルシム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダクなどの鎮痛剤および抗炎症剤；アルベンダゾール、ベフェニウムヒドロキシナフトエート、カンベンダゾール、ジクロロフェン、イベルメクチン、メベンダゾール、オキサムニクイン、オクスフェンダゾール、オキサンテルエンボナート、プラジカンテル、ピランテルエンボナート、およびチアベンダゾールなどの駆虫薬；；アミオダロンＨＣｌ、ジソピラミド、フレカイニド酢酸塩およびキニジンサルフェートなどの抗不整脈薬；ベネタミンペニシリン、シノキサシン、シプロフロキサシンＨＣｌ、クラリスロミシン、クロファジミン、クロキサシリン、デメクロシクリン、ドキシシクイリン、エリスロミシン、エチオンアミド、イミペネム、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、リファンピシン、スピラマイシン、スルファベンズアミド、スルファドキシン、スルファメラジン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファフラゾール、スルファメトキサゾール、スルファピリジン、テトラサイクリン、およびトリメトプリムなどの抗菌剤；

ジクマロール、ジピリダモール、ニコウマロン、フェニンジオンなどの抗凝固剤；アモキサピン、マプロチリンＨＣＬ、ミアンセリンＨＣｌ、ノルトリプチリンＨＣｌ、トラゾドンＨＣｌ、マレイン酸トリミプラミンなどの抗うつ薬；アセトヘキサアミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリピジド、トラザミド、トルブタミドなどの抗糖尿病薬；ベクラミド、カルバマゼピン、クロナゼパム、エトトイン、メトイン、メトスキシミド、メチルフェノバルビトン、オキシカルバゼピン、パラメタジオン、フェナセミド、フェノバルビトン、フェニトイン、フェンスキシミド、プリミドン、スルチアム、バルプロ酸などの抗てんかん剤；アムホテリシン、硝酸ブトコナゾール、クロトリマゾール、硝酸エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナタマイシン、ナイスタチン、硝酸スルコナゾール、テルビナフィンＨＣｌ、テルコナゾール、チオコナゾール、およびウンデセン酸のような抗真菌剤；アロプリノール、プロベネシド、およびスルフィン−ピラゾンなどの抗痛風剤；アムロジピン、ベニジピン、ダロジピン、ジリタゼムＨＣＬ、ジアゾキシド、フェロジピン、酢酸グアナベンズ、イスラジピン、ミノキシジル、ニカルジピンＨＣＬ、ニフェジピン、ニモジピン、フェノキシベンザミンＨＣｌ、プラゾシンＨＣＬ、レセルピンおよびテラゾシンＨＣＬなどの抗高血圧剤；

アモジアキン、クロロキン、クロルプログアニルＨＣＬ、塩酸ハロファントリン、メフロキンＨＣＬ、プログアニルＨＣＬ、ピリメタミン、および硫酸キニーネなどの抗マラリア薬；メシル酸ジヒドロエルゴタミン、酒石酸エルゴタミン、マレイン酸メチルセルギド、マレイン酸ピゾチフェン、コハク酸スマトリプタンなどの抗片頭痛薬；アトロピン、ベンズヘキソールＨＣｌ、ビペリデン、エトプロパジンＨＣｌ、ヒヨスチアミン、臭化メペンゾラート、オキシフェンシルシミンＨＣｌ、およびトロピックアミドなどの抗ムスカリン剤；アミノグルテシミド、アムサクリン、アザチオプリン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロスポリン、ダカルバジン、エストラムスチン、エトポシド、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトザントロン、プロカルバジンＨＣｌ、クエン酸タモキシフェン、およびテストラクトンのような免疫抑制薬；ベンズニダゾール、クリオキノール、デコキネート、ジヨードヒドロキシキノリン、ジロキサニド フロエート、ジニトールミド、フルゾリドン、メトロニダゾール、ニモラゾール、ニトロフラゾン、オルニダゾール、およびチニダゾールのような抗プロトザール剤；

カルビマゾールおよびプロピルチオウラシルなどの抗甲状腺剤；アルプラゾラム、アミロバルビトン、バルビトン、ベンタゼパム、ブロマゼパム、ブロムペリドール、ブロチゾラム、ブトバルビトン、カルブロマール、クロルジアゼポキシド、クロルメチアゾール、クロプロマジン、クロバザム、クロルチアゼパム、クロザピン、ジアゼパム、ドロペリドール、エチナメート、フルナニゾン、フルニトラゼパム、フルオプロマジン、デカン酸フルペンチキソール、デカン酸フルフェナジン、フラゼパム、ハロペリドール、ロラゼパム、ロメタゼパム、メダゼパム、メプロバメート、メサクアロン、ミダゾラム、ニトラゼパム、オキサゼパム、ペントバルビトン、ペルペナジンピモジド、プロクロルペラジン、スルピリド、テマゼパム、チオリダジン、トリアゾラム、およびゾピクロンを含有する抗不安薬、鎮静剤、催眠薬、神経遮断薬；

アセブトロール、アルプレノロール、アテノロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ピンドロール、およびプロプラノロールなどのベータブロッカー剤；アムリノン、ジギトキシン、ジゴキシン、エノキシモン、ラノトシドＣおよびメディゴキシンなどの心臓変力剤；ベクロメタゾン、ベータメタゾン、ブデソニド、酢酸コルチゾン、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルコルトロン、プロピオン酸フルチカゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロンなどのコルチコステロイド類；アセトアゾラミド、アミロリド、ベンドロフルアジド、ブメタニド、クロロチアジド、クロルタリドン、エタクリン酸、フルセミド、メトラゾン、スピロノラクトンおよびトリアムテレンのような利尿剤；ブロモクリプチンメシレートおよびマレイン酸リスリドなどの抗パーキンソン剤；

ビサコジル、シメチジン、シサプリド、ジフェノキシレートＨＣｌ、ドンペリドン、ファモチジン、ロペラミド、メサラジン、ニザチジン、オメプラゾール、オンダンセトロンＨＣＬ、ラニチジンＨＣｌ、およびスルファサラジンのような胃腸薬；アクリバスチン、アステミゾール、シナリジン、シクリジン、シプロヘプタジンＨＣｌ、ジメンヒドリナート、フルナリジンＨＣｌ、ロラタジン、メクロジンＨＣｌ、オキサトミド、およびテルフェナジンのようなヒスタミン受容体アンタゴニスト；ベザフィブラート、クロフィブラート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル、プロブコールなどの脂質調節剤；硝酸アミル、グリセリルトリニトレート、二硝酸イソソルビド、一硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリトールを含有する硝酸塩および他の抗狭心症薬；ベータカロテン、ビタミンＡ、ビタミンＢ２、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミンＫなどの栄養補助食品およびビタミン；コデイン、デキストロプロピオキシフェン、ジアモルフィン、ジヒドロコデイン、メプタジノール、メタドン、モルヒネ、ナルブフィンおよびペンタゾシンなどのオピオイド鎮痛剤；クエン酸クロミフェン、ダナゾール、エチニルエストラジオール、酢酸メドロキシプロゲステロン、メストラノール、メチルテストステロン、ノルエチステロン、ノルゲストレル、エストラジオール、共役エストロゲン、プロゲステロン、スタノゾロール、スチベストロール、テストステロン、およびチボロンなどの性ホルモン；および、アンフェタミン、デキサアンフェタミン、デクスフェンフルラミン、フェンフルラミン、マジンドールなどの刺激薬。例えば、米国特許第６，０９６，３３８号を参照されたい。

本発明は、がん細胞を細胞毒性剤または抗腫瘍剤で選択的に標的化することによってがんを処置するために使用することができる。例えば、前立腺がん、乳がん、肺がん、膵臓がん、頭頸部がん、子宮頸がん、卵巣がん、大腸がん、骨がん、脳腫瘍、肝臓がん、リンパ腫、メラノーマ、白血病、神経芽細胞種、皮膚がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、精巣がん、腎臓がん、腸がん、喉頭がんおよび甲状腺がんを含有する任意のがんが標的化し得る。

実施例
例１ 両親媒性ペプチドナノ微粒子の調製
クルクミン（ジフェルロイルメタン）、酢酸およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はSigma-Aldrich社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から供給された。両親媒性ペプチドＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（分子量１，８５０．２８ｇ／モル）は乾燥パウダーとしてBiomatik（ウィルミントン、デラウエア州、米国）から得られた。PlusOne ミニ透析キット（分子量カットオフ１ｋＤａ）は、ＧＥヘルスケア（バッキンガムシャイア、英国）から調達された。
両親媒性ペプチドナノ微粒子（ＡＰＮＰ）は、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳの乾燥粉末（図１）を脱イオン水に溶解し、続いて６０秒間超音波処理することによって調製された。いくつかの実験では、両親媒性ペプチドをｐＨ２、４および６のリン酸緩衝生理食塩水および／または酢酸溶液中に懸濁した。脱イオン水に対する透析によるこれらの異なる溶液中のＡＰＮＰの自己組織化挙動を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察した。

異なる溶液中のＡＰＮＰの形態を、ＪＥＭ−１０１０透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、東京、日本）を用いて観察した。ｐＨ２、４および６の脱イオン水、リン酸緩衝化生理食塩水、および酢酸溶液に両親媒性ペプチドを溶解することによって、異なる水性条件のサンプルを調製した。次に、各サンプルの５μＬアリコートを３００メッシュ銅グリッド（EM Sciences Ltd、ノースバンクーバー、バンクーバー州、カナダ）に載せ、５μＬの１．５％水性リンタングステン酸を５秒間添加することによりネガティブ染色した。過剰の液体を濾紙を用いて注意深く除去した。画像は、加速電圧８０ｋＶで動作する４０，０００〜５０，０００ｘの倍率でＴＥＭによって捕捉された。その結果を図２Ａ〜２Ｄに示す。

ＴＥＭ画像は、ペプチドが１．５ｍｇ／ｍＬの濃度で１５．６（範囲１０−２０）ｎｍの平均直径を有する、脱イオン水およびリン酸緩衝化生理食塩水中の透析中にナノ球体に自己組織化することを示した（図２Ａおよび２Ｂ）。Ｃ１８脂肪族テール基はＡＰＮＰの自己組織化挙動の推進力として働き、一方で、正に帯電したアルギニンに富む基によって機能化されたペプチドの親水性ヘッド基は、隣接する分子間で強い静電気的相互作用を生じる。このように、球状の形態を有するＡＰＮＰの形成は、テール基間の疎水性相互作用とヘッド基間の静電気的相互作用とによって推進された。ペプチドが超音波処理なしで脱イオン水に溶解されたとき、ＡＰＮＰは凝集することが見出された（図２Ｃ）。

両親媒性ペプチドＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳの推定分子長は６．７４ｎｍである。ＴＥＭ画像で測定されたミセルの直径と理論的な分子長とを比較すると、ＡＰＮＰのミセル構造は、固体疎水性コアを有する単層凝集体のミセル構造であると考えられる。
ＡＰＮＰの自己組織化はｐＨ依存性であった。水中の中性ｐＨにおいては、ナノ球状凝集体が形成され、これらは酢酸溶液中のｐＨ６で依然として観察された（図２Ｄ）。しかしながら、ｐＨ値２および４（図２Ｅおよび２Ｆ）においては、ランダムな雲状層が観察され、両親媒性ペプチドはナノ球体（ミセル）に自己組織化しなかった。

例２ 両親媒性ペプチドナノ微粒子におけるクルクミンのカプセル化
クルクミン積載ＡＰＮＰは、低ｐＨでクルクミンをＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳと共溶解し、続いてｐＨを上げるために透析し、それは、ＡＰＮＰの自己組織化を引き起こし、単量体（すなわち、ミセルでない）クルクミンおよびＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳの除去を可能にした。まず、クルクミンを５０％酢酸に溶解し、次いで溶解した両親媒性ペプチドの溶液に加えた。混合物において、ペプチド対クルクミンのモル比は１：２であった。次いで、混合物をキャップ内に透析膜（分子量カットオフ１ｋＤａ）を有する透析チューブに移した。チューブをフロートにキャップダウンして挿入し、８００ｍＬの脱イオン水に対して透析した。透析チューブ中の混合物から酢酸および無積載クルクミンを除去するために、水を新鮮な脱イオン水で４時間毎に置換した。混合物のｐＨが７．０に近いとき、透析チューブを脱イオン水から除去し、ＡＰＮＰを回収した。最終溶液中のクルクミンを積載したＡＰＮＰの形態は、例１に記載したようにＴＥＭによって特徴付けされた。ナノ微粒子は、例１の純粋なＡＰＮＰと同様の形態を有したが、約１８〜３０ｎｍ（平均直径２２．８ｎｍ、図３Ａおよび３Ｂ）のより大きい直径を有していた。

純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳで作られた予め形成されたＡＰＮＰを５０％酢酸中のクルクミン溶液と一緒に共溶解し、続いて脱イオン水に対して透析し、ＡＰＮＰは球状ナノ構造に改変されたが、クルクミンなしの場合より大きな直径を有していた。クルクミンの溶解度は顕著に増加し、橙黄色のクルクミン積載したＡＰＮＰ溶液は、ＡＰＮＰに積載しない場合よりも、より高い安定性および均質性を示した。凍結乾燥後でさえ、得られた粉末は、以前に積載されたクルクミンを保持しながら、水中で容易かつ迅速に溶解することができた。

薬物を積載するナノ微粒子は、純粋なＡＰＮＰと同様のＴＥＭによる形態を有していたが、幾分大きな直径を有していた。従って、自己組織化挙動は薬物調製手順の間に顕著に変化せず、ｐＨ感受性ナノ微粒子は酢酸の除去の際に形成することができた。クルクミンのような疎水性分子は、エネルギー的に有利な疎水性相互作用を介してミセルのステアリルＣ１８脂肪族コアに閉じ込められ、可溶化され、ＡＰＮＰ水溶液中で薬物カプセル化を成功させた。

ＡＰＮＰにカプセル化されたクルクミンの量は、ＤＭＳＯ中の既知のクルクミン濃度と、紫外−可視分光法（SpectraMax M3、Molecular Devices、サニヴェール、カリフォルニア州、米国）によって４３０ｎｍ（Ｒ２．０．９８）の波長において測定された対応する吸光度との間に線形相関を示す標準曲線によって特徴付けされた。簡潔に述べると、クルクミン積載ＡＰＮＰ溶液のアリコートを凍結乾燥機（FreeZone 2.5 Plus、Labconco、カンザスシティ、ミズーリ州、米国）を用いて凍結乾燥させた。次いで乾燥粉末をＤＭＳＯに溶解し、この溶液の４３０ｎｍ波長における吸収を標準曲線と相関させることによりクルクミンの濃度を評価した。クルクミンの濃度を各サンプルについて３回評価した。各３データの平均値を用いて、以下の式により算出されたクルクミンカプセル化効率（ＥＥ％）および積載レベル（ＬＬ％）を評価した。
ＥＥ％＝（薬物カプセル化重量／薬物積載重量）×１００％
ＬＬ％＝（薬物カプセル化重量／ミセル重量）×１００％

水中の同じ量の固体クルクミン懸濁液（溶解度０．１ｍｇ／ｍｌ未満）と比較して、得られた溶液（ＥＥ％＝８．４±２．５％、ＬＬ％＝３．６±１．２％）は、水中のその非援助溶解度を上回るクルクミンの溶解度の顕著な増加を示した。積載レベルを３．６％、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳの分子量を１８５０Ｄａ、クルクミンの分子量を３６８Ｄａとすると、添加量はモル基準で約１８％、すなわち、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳのクルクミンの１分子に対して平均６分子に相当すると推定された。さらに、この溶液は凍結乾燥後でも安定性を示した。凍結乾燥された粉末は、水に容易に再溶解されて、クルクミン含有量または溶解性を失うことなくミセルを再構成することができた。

例３ クルクミン添加両親媒性ペプチドナノ微粒子の特性化
クルクミン添加ＡＰＮＰは例２に記載されたように調製された。ＡＰＮＰの組成および構造は、ゼータ電位、ＩＲ分光光度法、およびＸ線回折法によって特性評価された。
純粋なＡＰＮＰ（クルクミンなし）およびクルクミン添加ＡＰＮＰのゼータ電位は、ＺＳ９０ナノサイザー（Malvern Instruments、マルヴァーン、英国）を用いて測定した。０．４ｍｇ／ｍＬの純粋なＡＰＮＰおよびクルクミン添加ＡＰＮＰを含有する溶液を脱イオン水中で調製し、続いて室温で６０秒間超音波処理した。ナノ微粒子のゼータ電位を、各試料１ｍＬを用いて測定し、各試料を１０回調製に対して３回測定した。

純粋なＡＰＮＰの測定された平均ゼータ電位は＋５９±３．１５ｍＶであったが、クルクミン添加ＡＰＮＰのそれは＋７０．６３±３．０２ｍＶであった（図４）。この結果は、純粋な、およびクルクミンを添加したＡＰＮＰの両方とも水溶液中で安定であったことを示している。クルクミン添加ミセルは、薬物添加後、安定なミセルを形成するように凝集した遊離ペプチドモノマーの数の増加から生じると考えられる、より高いゼータ電位を有する。正に帯電したミセルは、負の膜電位によって媒介される細胞取り込みを促進する。

純粋なクルクミン、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳペプチド粉末、および凍結乾燥したクルクミン添加ＡＰＮＰのフーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）スペクトルを、これらの化合物の化学構造およびＡＰＮＰの薬物添加後の可能な変化を分析するために得られた。減衰全反射法を用いて、ＦＴ−ＩＲ分光計（Vertex 70、Bruker Corporation、Billerica、マサチューセッツ州、米国）を用いて試料を分析した。ＦＴ−ＩＲスペクトルは、２ｃｍ^−１の分解能で５５０〜４，０００ｃｍ^−１の波長範囲で収集した。結果を図５に示す。

プレーンなクルクミンのスペクトルにおいて、１，２２５−１，１７５ｃｍ^−１および１，１２５−１，０９０ｃｍ^−１の範囲に現れたバンドは、約１，０７０−１，０００ｃｍ^−１の範囲の２つの追加の弱いバンドと共に、１：２：４置換の芳香族環を表し得る。隣接する芳香環およびＣ＝Ｏ結合と共役した２つのＣ＝Ｃ結合は、それぞれ１，６２９ｃｍ^−１および１，６０６ｃｍ^−１で特徴付けされた。フェノール基中の分子内水素結合を有するヒドロキシル基は、３，５１９ｃｍ^−１の比較的弱い吸収によって特徴付けされ得る。

純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳのＡＰＮＰのスペクトルにおいて、１，６５４ｃｍ^−１の吸収はアミドＩ基を表し、１，５６０ｃｍ^−１のバンドはアミノ酸配列のＣＯＯＨ基を示し得る。さらに、３，４００−３，３００ｃｍ^−１の２つの広いバンドは、アルギニンに富む構造のアミン基を特徴付け得る。凍結乾燥されたクルクミン添加ＡＰＮＰのスペクトルについて、バンドは純粋なＡＰＮＰの波長と同様の波長で現れたが、１，４０９ｃｍ^−１のバンドはフェノールのＯＨ変角振動を表し得る。ＦＴ−ＩＲスペクトルは、顕著なバンドシフトが観察されなかったので、薬物添加後に両親媒性ペプチドの化学構造が変化しなかったことを示唆し得る。さらに、フェノールのＯＨ変角振動を除いて、クルクミンの吸収帯の大部分は観察されなかった。これは、クルクミン分子がミセルの内側コアで遮蔽され、赤外線がカプセル化された分子を透過できないため、ＡＰＮＰによるクルクミンのカプセル化が成功したことを示す。

Ｘ線回折（ＸＲＤ）研究は、クルクミン、純粋なＡＰＮＰ、および凍結乾燥クルクミン添加ＡＰＮＰの結晶学的構造を分析するために実施した。試料は、４０ｋＶの電圧、４４ｍＡおよび１．７６ｋＷで、Ｘ線回折装置（Ultima IV、株式会社リガク、東京、日本）を用いて分析した。走査角度は５°≦２θ°≦４０°の範囲であり、走査速度は毎分３°であった。結果を図６に示す。

クルクミンのＸＲＤパターンにおいて、一連の特徴的なピークが１５°≦２θ°≦３０°の範囲で観察され、これはクルクミン分子の明確な結晶構造を表している。対照的に、純粋なＡＰＮＰは、そのＸＲＤパターンにピークが見られないので、特徴的な結晶構造を有し得ない。さらに重要なことに、クルクミンを添加したＡＰＮＰは、純粋なＡＰＮＰと同様のＸＲＤパターンを示し、観察可能な結晶構造を示さなかった。クルクミンの結晶構造に特徴的なピークの消失は、ＡＰＮＰによるカプセル化によってもたらされた。純粋なＡＰＮＰのＸＲＤパターンは、これらの分子が不規則な結晶構造または非晶質構造で存在することを示した。したがって、クルクミン添加ＡＰＮＰのＸＲＤパターンは、薬物カプセル化の成功をさらに確認した。

例４．骨肉腫細胞に対するクルクミン添加ＡＰＮＰの毒性
ＭＧ−６３骨肉腫および非がん性ヒト健康骨芽細胞株を用いて、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁したプレーンなクルクミン、ＤＭＳＯに溶解したクルクミン、純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの溶液および比色ＭＴＴアッセイによるクルクミンを添加したＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰ溶液の細胞毒性を評価した。

ＭＧ−６３骨肉腫（ＣＲＬ−１４２７）細胞（American Type Culture Collection）を、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／骨芽細胞の基礎培地で補足したイーグル最小必須培地で培養し、一方、健康なヒト骨芽細胞（C-12760, PromoCell）は、骨芽細胞基礎培地および骨芽細胞成長培地Supplement Mixからなる完全成長培地で培養した。両方の細胞株を、９５％酸素および５％ＣＯ２の雰囲気を有する加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。細胞は、３未満の集団倍加数で使用した。イーグル最小必須培地はAmerican Type Culture Collection（Manassas、ヴァージニア州、米国）から購入し、骨芽細胞基礎培地および骨芽細胞成長培地Supplement MixはPromoCell（ハイデルベルク、ドイツ）から購入した。メチル−チアゾリル−テトラゾリウム（MTT）染料溶液はPromega（Madison、ウィスコンシン州、米国）から購入した。４',６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、およびＡｔｔｏ Ｒｈｏ６Ｇファロイジンは、Sigma-Aldrich（St Louis、ミズーリ州、米国）から供給された。

共焦点レーザー走査顕微鏡および明視野顕微鏡を、クルクミン添加ＡＰＮＰからのクルクミンの細胞摂取の定性的研究のために使用した。まず、骨肉腫細胞株および健康なヒト骨芽細胞株１ｍＬを２４ウェルプレートに２×１０^４細胞／ｍＬの密度で播種した。５％ＣＯ_２中３７℃で２４時間培養した後、ＡＰＮＰ中でカプセル化したクルクミンまたはリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁したクルクミン、２０μＭで細胞を２時間処理した。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回すすぎ、未吸収クルクミンを除去した。その後、クルクミンの定性的な取り込みを明視野顕微鏡法によって観察した。

骨肉腫細胞は、明視野顕微鏡画像（図７Ａ〜７Ｆ）において正常ヒト骨芽細胞よりも顕著に高いクルクミン摂取を示した。リン酸緩衝生理食塩水に懸濁したクルクミンのみで処理した試料において、細胞表面に微量のクルクミン結晶が観察されたが、クルクミンは細胞質ゾルに蓄積しなかった。

別の研究では、細胞の核を共焦点顕微鏡法（図８Ａ〜８Ｆ）を用いた青色蛍光ＤＡＰＩ染色によって追跡し、細胞のＦ−アクチンフィラメントを赤色蛍光ローダミン６Ｇで染色した。１０％ホルムアルデヒド溶液による１０分間の固定化およびその後の０．１％Triton X-100溶液による１０分間の処理後、細胞をＤＡＰＩおよびAtto Rho6Gファロイジンで染色し、Zeiss LSM710レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて観察した。次いで、染色された細胞をＤＡＰＩ蛍光（励起３５８ｎｍ、発光４６１ｎｍ）およびAttoRh6Gファロイジン蛍光（励起５２５ｎｍ、発光５６０ｎｍ）に対して観察し、蛍光イソチオシアネートフィルター（励起４９５ｎｍ、発光５１９ｎｍ）を用いてクルクミンの摂取を観察した¹⁰。明視野顕微鏡法で撮影した画像と同様に、いずれの細胞株もプレーンのクルクミンで処理した試料ではクルクミンの検出可能な蛍光を示さなかった。しかし、クルクミン添加ＡＰＮＰで処理した骨肉腫細胞は強い緑色蛍光を示し、これらの細胞が著しい量のクルクミンを細胞質ゾルに蓄積させたことを示している。正常なヒト骨芽細胞は、細胞質ゾルにおいて弱い緑色の蛍光しか示さなかった。

これらの結果は、クルクミン添加ＡＰＮＰが、骨肉腫細胞の表面膜をより効率的に貫通し、ヒト骨芽細胞よりも顕著に高い細胞摂取を誘導し得ることを実証した。ＲＧＤ機能化ヘッド基では、クルクミン添加ミセルは、骨肉腫細胞上の過剰発現インテグリンの受容体に選択的に付着し、正常なヒト骨芽細胞よりも骨肉腫細胞表面に多くの薬物蓄積をもたらすと考えられている。さらに、正に帯電したミセルは、アルギニンリッチのペプチドのマクロピノサイトーシスを媒介した内部移行を好む静電気的相互作用または水素結合によって、細胞表面のカルボキシレート、サルフェートおよびホスフェート基に付着し得る。したがって、クルクミン分子は、細胞表面膜からリソソームへのエンドソーム経路を介して効率的に細胞質ゾルに内在化すると考えられている。

次に、肉腫細胞生存率に対するＡＰＮＰ送達クルクミンの影響を調べた。１００μＬの骨肉腫および健康な骨芽細胞懸濁液を２×１０^３細胞／ウェル（細胞密度６，１５４細胞／ｃｍ^２）で９６ウェルプレートに播種した。付着のために３７℃で５％ＣＯ_２で２４時間培養した後、細胞は、リン酸緩衝食塩水中のプレーンなクルクミン、ＤＭＳＯに溶解したクルクミン、および異なるクルクミン濃度（３、５、１０、２０、および３０μＭ）を含むクルクミン添加ＡＰＮＰ溶液で処理した。純粋なＡＰＮＰの溶液で処理した細胞について、クルクミン添加ＡＰＮＰの調製（例２参照）に使用したのと同じ共溶解および透析法によって溶液を調製した。培地のみで処理した細胞をポジティブ対照として用いた。ＤＭＳＯに溶解したクルクミンで処理した試料では、同量のＤＭＳＯ（０．５％ｖ／ｖ未満）で処理した細胞を対照試料とみなした。アルギニンに富んだペプチドと血清アルブミンとの間の相互作用を避けるために、血清を含まない培地を全ての試料に用いた。

細胞を２４時間処理した。次いで、培地を各ウェルから除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。次に、１００μＬの細胞培養液と１５μＬのＭＴＴ色素溶液を各ウェルに添加し、細胞を４時間培養してホルマザン結晶を形成させた。培養の終わりに、１００μＬのＭＴＴ停止溶液を各ウェルに添加した。次いで、９６ウェルプレートを、５７０ｎｍの波長で分光光度計（SpectraMax M3、Molecular Devices社）を用いて試験し、光学密度を得た。細胞密度は、異なる細胞密度と光学密度との間の線形相関を表す標準曲線から得られた（Ｒ２=０．９８）。細胞生存率は、対照試料中の細胞密度に対する各試料の細胞密度の比として表わされた。

純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰは、調査された最高濃度で骨肉腫細胞株およびヒト骨芽細胞株の両方において軽微な細胞毒性を示した（図９Ａおよび９Ｂ）。リン酸緩衝化生理食塩水に懸濁したプレーンなクルクミンの細胞毒性は、おそらく水溶液中でのクルクミンの低溶解性に起因する低い細胞取り込みを反映して、両方の細胞株では顕著ではなかった（図１０Ａ〜１０Ｄ）。ＤＭＳＯに溶解すると、調査した全ての濃度において、クルクミンは骨肉腫細胞に対してより高い細胞毒性であった。

さらに重要なことに、クルクミン添加ＡＰＮＰは、骨肉腫細胞における生存率の顕著な選択的減少を示した。クルクミン／ＤＭＳＯサンプルと比較して、クルクミン添加Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの細胞毒性は、２０〜３０μＭの濃度範囲（培地中の総クルクミン濃度）の骨肉腫細胞に対してより選択的であった。３０μＭのクルクミン濃度では、骨肉腫細胞の生存率は、クルクミン添加ＡＰＮＰでの処理後の１５％と同じように低く、一方で、５０％以上のヒト骨芽細胞がこのクルクミン濃度で生存可能であった。この濃度で骨肉腫の生存率が最小値であった場合、２０μＭ濃度のＡＰＮＰ添加クルクミンが最適と思われた。この結果は、がん細胞で過剰発現するανβ３インテグリンに対するＲＧＤペプチド配列の標的効果を確認し、カプセル化薬物のより多くの摂取をもたらす。

例５．ＡＰＮＰの静菌効果
細菌成長および生存率に与える純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの影響を調べた。Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰはＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳを殺菌した脱イオン水に溶解して調製した。
ヒト皮膚線維芽細胞（Lonza、CC-2511）を９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、１０％ウシ胎児血清（FBS、Hyclone）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ、ハイクローン）に維持した。示されたＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳの最終濃度を達成するためにＡＰＮＰを培地に添加し、細胞をＭＴＳアッセイによる細胞密度の測定に先立って２４時間培養した。結果を図１１Ａに示し、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの濃度が４０μＭ以上であると、生存細胞の密度が低下することによって明らかにされるように、細胞生存率の顕著な低下をもたらすことが示された。

平行した実験において、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC12600）の成長に対する純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの効果を測定した。黄色ブドウ球菌をトリプシン大豆ブロス（TSB）中に１０^５ＣＦＵ／ｍｌの密度で播種し、示された最終濃度を達成するために黄色ブドウ球菌の液体培養液にＡＰＮＰを添加した。成長は、２４時間後に寒天プレート上に細菌培養物（１０^４）の希釈物のアリコートを播種し、プレートをさらに１５時間培養し、次いでコロニーを計数することによって測定した。結果を図１１Ｂに示し、培地中のＡＰＮＰの０〜１２μＭ間に生ずる細胞生存率の大きな低下を示す。

黄色ブドウ球菌の成長動力学に対する純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの効果も調査した。最初の濃度が１０^５ＣＦＵ／ｍｌである黄色ブドウ球菌の液体培養物の濁度を、時間の関数として、純粋なＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ ＡＰＮＰの濃度を増加させながら、波長６００ｎｍでの光学密度として測定した。結果を図１２に示す。２μＭ相当に低いＡＰＮＰの濃度は、１５〜２５時間後に達成された定常状態の濁度の低下として、または指数関数的成長の開始までの遅延時間の増加として観察可能の、黄色ブドウ球菌の成長に対する抑制効果を示し、後者の効果は１２μＭ以上のＡＰＮＰ濃度において特に顕著である。

本明細書で使用する場合、「本質的に〜からなる」とは、請求項の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない材料またはステップを排除するものではない。本明細書において、用語「含む（comprising）」の、特に組成物の成分の説明または装置の要素の説明における任意の記述は、「本質的に〜からなる」または「〜からなる」と交換することができる。
本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されたが、当業者は、上記明細書を読んだ後に、本明細書に記載の組成物および方法にさまざまな変更、均等物の置換、および他の変更を行うことができる。

本出願は、２０１４年７月８日に出願された「水溶液中の新規疎水性薬物担体としてのＣ１８Ｒ７ＲＧＤＳ自己組織化両親媒性ペプチドナノ微粒子（ＡＰＮＰ）」と題する米国仮出願第６２／０２１，８５７号の優先権を主張し、その全体は本明細書に参照によって組み入れられる。

参照文献
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Claims (53)

1. 疎水性薬物のためのナノ微粒子の担体製剤であって、当該製剤は、
   複数の両親媒性ペプチド分子で、各分子は正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を含み；前記分子は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中で複数の実質的に球形のナノ微粒子に会合され、；各ナノ微粒子は、疎水性コア；および、
   ナノ微粒子の疎水性コアに埋め込まれた複数の疎水性薬物分子を含み；
   ここで、疎水性薬物は、水性媒体中で疎水性薬物単独の溶解度限界よりも高濃度において製剤の水性媒体中に可溶化され；
   および
   ここで、ナノ微粒子は、哺乳類の細胞の内部に薬物を送達する能力を有する、前記製剤。
2. 前記非酸性ｐＨが約４より大きい、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
3. 前記ナノ微粒子が、約４以下のｐＨで可逆的に解離し、約４を超えるｐＨで会合する、請求項２に記載のナノ微粒子の担体薬物。
4. 両親媒性ペプチド分子と、疎水性薬物分子と、のモル比が約２：１〜約１０：１である、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
5. 疎水性部分が、１以上の直鎖状または分枝状鎖のアルキル基、シクロアルキル基芳香族炭化水素、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
6. 疎水性部分が、１以上のＣ８〜Ｃ２２のアルキル基を含む、請求項５に記載のナノ微粒子の担体製剤。
7. 疎水性部分が、単一のＣ１８のアルキル基からなる、請求項６に記載のナノ微粒子の担体製剤。
8. 親水性部分が、生理学的ｐＨにおいて正の電荷を有することが可能な２以上のアミノ酸を含む、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
9. 親水性部分が、アルギニン、リジン、およびそれらの混合物から選択される５個以上のアミノ酸残基を含む、請求項８に記載のナノ微粒子の担体製剤。
10. 親水性部分が、標的とする部分を含む、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
11. 標的とする部分が、ＲＧＤペプチド、抗体、アプタマー、または細胞表面受容体のためのリガンドを含む、請求項１０に記載のナノ微粒子の担体製剤。
12. 両親媒性ペプチドが、１以上のｌｏｇＰ値を有する、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
13. 両親媒性ペプチドが、ｐＨ７．４において１以上のｌｏｇＤ値を有する、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
14. 両親媒性ペプチドが、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号：１）である、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
15. ナノ微粒子が細胞表面に結合する、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
16. ナノ微粒子が、ｐＨ４以下の細胞間コンパートメント中へ疎水性薬物分子を放出する、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
17. ナノ微粒子が微飲作用によって哺乳類の細胞に取り込まれる、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
18. 疎水性薬物が、がん細胞に選択的に送達される、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
19. 疎水性薬物が、抗腫瘍剤である、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
20. 疎水性薬物が、がん細胞に対して細胞毒性である、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
21. 両親媒性ペプチドが細菌に毒性であるか、細菌の成長または増殖を抑制する、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
22. 凍結乾燥形態で存在する、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
23. ナノ微粒子が、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
24. 疎水性薬物が、クルクミン、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびシスプラチンからなる群から選択される、請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤。
25. 請求項１に記載のナノ微粒子担体製剤を作る方法であって、
    （ａ）水性媒体が酸性ｐＨを有し、かつ両親媒性ペプチドが解離状態にある、正に帯電した両親媒性ペプチドを含む水性媒体を提供する工程；と
    （ｂ）疎水性薬物を水性媒体に添加する工程；と
    （ｃ）水性媒体のｐＨを上げ、それによって両親媒性ペプチドが疎水性コアを有するナノ微粒子を形成し、それにより疎水性薬物がナノ微粒子の疎水性コアに埋め込まれる工程と
    を有する、前記方法。
26. （ｄ）水性懸濁液から埋め込まれていない疎水性薬物を除去する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
27. （ｅ）担体製剤を凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 工程（ａ）の前に、
    （ａ０）水性媒体が、非酸性ｐＨを有し、かつ両親媒性ペプチドがナノ微粒子の形態で会合する、正に帯電した両親媒性ペプチドを含む水性媒体を提供する工程；と
    （ａ００）水性媒体のｐＨを酸性ｐＨに低下させ、それによってナノ微粒子が解離する工程、
    とをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
29. 工程（ｃ）が、非酸性ｐＨを有する第２水性媒体に対して水性媒体を透析する工程を含む、請求項２５に記載の方法。
30. 非酸性ｐＨを有する第２水性媒体に対して水性媒体を透析することにより、工程（ｃ）および工程（ｄ）が同時に行われ、実質的に疎水性薬物を欠く、請求項２５に記載の方法。
31. 工程（ｃ）においてｐＨが約４より高く上げられる、請求項２５に記載の方法。
32. 工程（ｃ）において、ｐＨが、約７．０〜約７．４の範囲の値に上げられる、請求項３１に記載の方法。
33. 両親媒性ペプチドが、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号：１）である、請求項２５に記載の方法。
34. 工程（ｃ）において形成されるナノ微粒子が、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項２５に記載の方法。
35. 疎水性薬物が、クルクミン、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびシスプラチンからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
36. 疎水性薬物を投与する方法であって、それを必要とする被験体に請求項１に記載のナノ微粒子の担体製剤を投与し、それによって、疎水性薬物が被験体の細胞内サイトに送達される前記方法。
37. 疎水性薬物が、疎水性薬物による処置を必要とする被験体の細胞に選択的に送達される、請求項３６に記載の方法。
38. 被験体が、がんを有し、疎水性薬物が被験体のがん細胞に対して細胞毒性である、請求項３６に記載の方法。
39. 疎水性薬物がクルクミン、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびシスプラチンからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
40. 細菌の成長および／または複製を抑制する方法であって、細菌を複数の両親媒性ナノ微粒子と接触させる工程を含み；両親媒性ナノ微粒子は、複数の会合した両親媒性ペプチド分子を含み、各ペプチド分子は、正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を含み；ナノ微粒子は、実質的に球形であり、正に帯電した表面および疎水性コアを有し；ナノ微粒子は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中に製剤化され；それによって細菌の成長および／または複製が抑制される、前記方法。
41. 両親媒性ペプチドの疎水性部分が、１以上の直鎖または分枝状鎖のアルキル基、シクロアルキル基、芳香族炭化水素、またはそれらの組合せを含む、請求項４０に記載の方法。
42. 親水性部分が、アルギニン、リジンおよびそれらの組合せから選択される５以上のアミノ酸残基を含む、請求項４０に記載の方法。
43. 両親媒性ペプチドがＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号：１）である、請求項４０の方法。
44. 皮膚中または皮膚上に細菌の成長または複製を抑制することができる化粧品組成物であって； 該組成物は、複数の両親媒性ナノ微粒子を含み；該両親媒性ナノ微粒子は、複数の会合した両親媒性ペプチド分子を含み、各ペプチド分子は、正に帯電した親水性部分に共有結合した疎水性部分を含み； ナノ微粒子が実質的に球形であり、正に帯電した表面および疎水性コアを有し； 該組成物は、非酸性ｐＨを有する水性媒体中で製剤化される、前記組成物。
45. 両親媒性ペプチドの疎水性部分が、１以上の直鎖または分枝状鎖のアルキル基、シクロアルキル基、芳香族炭化水素、またはそれらの組合せを含む、請求項４４に記載の化粧品組成物。
46. 親水性部分が、アルギニン、リジンおよびそれらの組合せから選択される５個以上のアミノ酸残基を含む、請求項４４に記載の化粧品組成物。
47. 両親媒性ペプチドが、Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号：１）である、請求項４４に記載の化粧品組成物。
48. 細胞付着用マトリクスであって、該マトリクスは、両親媒性ペプチド分子の会合体を含み、各両親媒性ペプチド分子は、正に帯電した親水性部分に共有結合された疎水性部分を含み；該分子は、マトリクス中に会合し；ペプチド分子の疎水性部分および親水性部分は、マトリクス中に会合している、前記マトリクス。
49. 両親媒性ペプチドの疎水性部分が、１以上の直鎖または分枝状鎖のアルキル基、シクロアルキル基、芳香族炭化水素、またはそれらの組合せを含む、請求項４８に記載のマトリクス。
50. 親水性部分が、アルギニン、リジンおよびそれらの組合せから選択される５個以上のアミノ酸残基を含む、請求項４８に記載のマトリクス。
51. 両親媒性ペプチドがＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ（配列番号：１）である、請求項４８に記載のマトリクス。
52. 請求項４８に記載のマトリクスを含む、医療移植片。
53. マトリクスが移植片の表面にコーティングとして存在する、請求項５２に記載の医療移植片。