JP2020076857A - 顕微鏡装置、制御方法、及び、プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】観察すべき三次元領域を高い分解能で早期に観察可能とする。【解決手段】顕微鏡装置１は、レーザ走査顕微鏡２０と、ライトシート顕微鏡３０と、レーザ走査顕微鏡２０とライトシート顕微鏡３０を制御する制御装置４０を備える。レーザ走査顕微鏡２０は、対物レンズ１２ａを含む。ライトシート顕微鏡３０は、対物レンズ１２ａの光軸と同軸上に観察光軸を有する。制御装置４０は、ライトシート顕微鏡３０が取得した試料Ｓの複数の第１断層画像に基づいて、第１三次元画像を構築し、第１三次元画像を表示装置５０に表示し、表示装置５０に表示された第１三次元画像のうちの利用者によって選択された観察対象領域５１ａに対応する試料Ｓの三次元領域を走査領域ＳＲ２に設定し、レーザ走査顕微鏡２０が走査領域ＳＲ２を走査することによって取得した試料Ｓの複数の第２断層画像に基づいて、第２三次元画像を構築する。【選択図】図１

Description

本明細書の開示は、顕微鏡装置、制御方法、及び、プログラムに関する。

共焦点顕微鏡、多光子励起顕微鏡などに代表されるレーザ走査顕微鏡は、高い分解能（resolving power）を有する光学顕微鏡として知られている。レーザ走査顕微鏡は、対物レンズの光軸と直交するXY方向に高い分解能を有するだけではなく、光軸方向（以降、Z方向と記す。）にも高い分解能を有している。このため、高い解像度(resolution)を有する三次元画像を構築することが可能である。なお、以降では、対物レンズの光軸方向の分解能を特にZ分解能と記す。

その一方で、レーザ走査顕微鏡は、レーザ光で試料を走査することによって試料の画像を取得することから、走査範囲が大きくなるほど画像取得に要する時間が長くなる。このため、観察すべき領域が走査範囲に確実に含まれるように、レーザ走査顕微鏡を用いて試料の広い範囲を画像化すると、その画像（以降、広域画像と記す。）の取得に多くの時間を要してしまう。

このような技術的な課題に関連する技術は、例えば、特許文献１に記載されている。特許文献１には、CCDとLSM装置とを含み、CCDにより取得した二次元画像内で、LSM装置で画像を取得すべき観察領域を指定する観察装置が記載されている。この観察装置によれば、CCDによって広域画像を取得し、広域画像内で指定した観察対象領域の画像をLSM装置によって取得することができる。

特開２０１０−２８６５６５号公報

ところで、高分解能で観察すべき観察対象領域は試料内に三次元に広がっていることが少なくないため、広域画像は三次元画像であることが望ましい。しかしながら、特許文献１には、三次元画像の取得について何ら言及されていない。また、たとえ特許文献１に記載の観察装置を三次元画像の構築に応用したとしても、CCDを用いて二次元画像を取得する構成はZ方向に分解能を有しないため、観察対象領域を指定するに足りる画質を有する三次元画像を構築することは難しい。

以上のような実情から、本発明の一側面に係る目的は、観察すべき三次元領域を高い分解能で早期に観察可能とする技術を提供することである。

本発明の一態様に係る顕微鏡装置は、対物レンズを含む、レーザ走査顕微鏡と、前記対物レンズの光軸と同軸上に観察光軸を有する、ライトシート顕微鏡と、前記レーザ走査顕微鏡と前記ライトシート顕微鏡を制御する制御装置と、を備える。前記制御装置は、前記ライトシート顕微鏡が取得した試料の複数の第１断層画像に基づいて、第１三次元画像を構築し、前記第１三次元画像を表示装置に表示し、前記表示装置に表示された前記第１三次元画像のうちの利用者によって選択された観察対象領域に対応する前記試料の三次元領域を走査領域に設定し、前記レーザ走査顕微鏡が前記走査領域を走査することによって取得した前記試料の複数の第２断層画像に基づいて、第２三次元画像を構築する。

本発明の一態様に係る制御方法は、対物レンズを含むレーザ走査顕微鏡と、前記対物レンズの光軸と同軸上に観察光軸を有するライトシート顕微鏡と、を備える顕微鏡装置の制御方法である。前記制御方法は、前記ライトシート顕微鏡が取得した試料の複数の第１断層画像に基づいて、第１三次元画像を構築し、前記第１三次元画像を表示装置に表示し、前記表示装置に表示された前記第１三次元画像のうちの利用者によって選択された観察対象領域に対応する前記試料の三次元領域を走査領域に設定し、前記レーザ走査顕微鏡が前記走査領域を走査することによって取得した前記試料の複数の第２断層画像に基づいて、第２三次元画像を構築する。

本発明の一態様に係るプログラムは、対物レンズを含むレーザ走査顕微鏡と、前記対物レンズの光軸と同軸上に観察光軸を有するライトシート顕微鏡と、を備える顕微鏡装置のコンピュータに、前記ライトシート顕微鏡が取得した試料の複数の第１断層画像に基づいて、第１三次元画像を構築し、前記第１三次元画像を表示装置に表示し、前記表示装置に表示された前記第１三次元画像のうちの利用者によって選択された観察対象領域に対応する前記試料の三次元領域を走査領域に設定し、前記レーザ走査顕微鏡が前記走査領域を走査することによって取得した前記試料の複数の第２断層画像に基づいて、第２三次元画像を構築する処理を実行させる。

上記の態様によれば、観察すべき三次元領域を高い分解能で早期に観察可能とすることができる。

第１実施形態に係る顕微鏡装置１の構成を例示した図である。 制御装置４０の機能構成を例示した図である。 制御装置４０の物理構成を例示した図である。 顕微鏡装置１が行う制御処理の流れを示すフローチャートである。 第１三次元画像の表示例について説明するための図である。 観察光軸方向への走査方法の一例について説明するための図である。 観察対象領域の表示例について説明するための図である。 第２三次元画像の表示例について説明するための図である。 観察光軸方向への走査方法の別の例について説明するための図である。 キャリブレーション処理の流れを示すフローチャートである。 キャリブレーションによる二次元スキャナの走査範囲の変更について説明するための図である。 顕微鏡装置２の構成を例示した図である。 顕微鏡装置３の構成を例示した図である。 貼り合わせ技術を用いた三次元画像の構築方法の一例を示した図である。 貼り合わせ技術を用いた三次元画像の構築方法の別の例を示した図である。

［第１実施形態］
図１は、本実施形態に係る顕微鏡装置１の構成を例示した図である。図２は、顕微鏡装置１に含まれる制御装置４０の機能構成を例示した図である。図３は、顕微鏡装置１に含まれる制御装置４０の物理構成を例示した図である。図１に示す顕微鏡装置１は、生物標本である試料Ｓを観察する生物顕微鏡装置であり、例えば、蛍光観察法を用いて試料Ｓから生じた蛍光を検出することで、試料Ｓの画像を取得する。

顕微鏡装置１は、図１に示すように、顕微鏡本体１０と制御装置４０を備えている。顕微鏡装置１は、さらに、表示装置５０と入力装置６０を備えている。表示装置５０は、例えば、液晶ディスプレイ、有機ＥＬ（OLED）ディスプレイ、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイなどである。入力装置６０は、例えば、マウス、キーボード、ジョイスティック、タッチパネルなどである。入力装置６０は、利用者の入力操作に応じた操作信号を制御装置４０へ出力する。

顕微鏡本体１０は、対物レンズ１２ａを含むレーザ走査顕微鏡２０と、対物レンズ１２ａの光軸と同軸上に観察光軸を有するライトシート顕微鏡３０と、を備えている。レーザ走査顕微鏡２０とライトシート顕微鏡３０は、試料Ｓを載置する電動ステージ１１と、複数の対物レンズ（対物レンズ１２ａ、対物レンズ１２ｂ）と、複数の対物レンズが装着された対物レンズ切換装置であるレボルバ１３と、ミラー１４ａを光路に対して挿脱するためのターレット１４と、を共有している。即ち、顕微鏡装置１では、レーザ走査顕微鏡２０とライトシート顕微鏡３０は、互いの観察光路の一部を共有している。なお、対物レンズ１２ａは、対物レンズ１２ｂよりも低倍率の対物レンズである。

電動ステージ１１は、制御装置４０からの指示に従って移動するステージである。電動ステージ１１は、対物レンズ１２ａの光軸と直交する方向に加えて、対物レンズ１２ａの光軸方向にも移動する。

レボルバ１３は、対物レンズ切換装置であるが、光路上の対物レンズを光軸方向へ移動する焦準装置でもある。レボルバ１３は、制御装置４０からの指示に従って回転する電動レボルバであってもよく、手動操作により回転する手動レボルバであってもよい。

ターレット１４は、レーザ走査顕微鏡２０が試料Ｓの画像を取得するときに、ミラー１４ａを光路上に配置し、ライトシート顕微鏡３０が試料Ｓの画像を取得するときに、ミラー１４ａを光路外に配置する、光路切換装置である。なお、ターレット１４は、制御装置４０からの指示に従って回転する電動ターレットであってもよく、手動で回転する手動ターレットであってもよい。

レーザ走査顕微鏡２０は、共焦点顕微鏡であり、レーザ光を偏向するニ次元スキャナ２３を備えている。より詳細には、レーザ走査顕微鏡２０は、レーザ２１と、絞り２１ａと、ダイクロイックミラー２２と、ニ次元スキャナ２３と、共焦点絞り２４と、光電子増倍管（以降、ＰＭＴと記す）２５を備えている。

レーザ２１から出射したレーザ光は、絞り２１ａを介して入射したダイクロイックミラー２２で反射し、ニ次元スキャナ２３及びミラー１４ａを経由して、対物レンズ１２ａに入射する。対物レンズ１２ａは、レーザ光を試料Ｓに集光し、試料Ｓに光スポットを形成する。

レーザ光が照射された試料Ｓでは、蛍光物質が励起され、レーザ光とは異なる波長の蛍光が放射される。蛍光は、対物レンズ１２ａ、ミラー１４ａ、及び、ニ次元スキャナ２３を経由して入射するダイクロイックミラー２２を透過し、共焦点絞り２４へ入射する。共焦点絞り２４には、対物レンズ１２ａの前側焦点位置と光学的に共役な位置にピンホールが形成されている。このため、光スポットが形成された位置以外で生じた蛍光は共焦点絞り２４で遮断され、光スポットが形成された位置で生じた蛍光だけが共焦点絞り２４を通過してＰＭＴ２５で検出される。なお、前側焦点位置とは、対物レンズ１２ａの焦点位置のうち、電動ステージ１１に近い焦点位置のことをいう。また、蛍光を検出する光検出器は、ＰＭＴに限らない。例えば、複数のガイガーモードＡＰＤ（Avalanche Photodiode）のピクセルからなるＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter、登録商標）などであってもよい。

ニ次元スキャナ２３は、例えば、２つのガルバノミラーを含んでもよく、ガルバノミラーとレゾナントスキャナを含んでもよい。２つのガルバノミラー、または、ガルバノミラーとレゾナントスキャナは、光軸と直交し、且つ、互いに直交する２つの方向にレーザ光を偏向する。これにより、試料Ｓ上に形成される光スポットを、試料面において、光軸と直交し、且つ、互いに直交するＸ方向とＹ方向に独立して移動させることが可能となる。また、ニ次元スキャナ２３は、音響光学偏向器（ＡＯＤ）など、その他の偏向器を含んでもよい。ニ次元スキャナ２３は、ニ次元スキャナ２３の振り角度を変更し、それによって、レーザ光を偏向する方向を変更することで、対物レンズ１２ａの瞳面における光軸に対するレーザ光の角度を変更することが可能である。これにより、光スポットの位置を対物レンズ１２ａの光軸と直交する方向に移動させることができる。従って、レーザ走査顕微鏡２０は、制御装置４０がニ次元スキャナ２３を制御することで、レーザ光で試料Ｓをニ次元に走査することが可能であり、その結果として、試料Ｓの二次元画像を取得することができる。なお、上記のレーザ光を偏向する二次元スキャナを備えたレーザ走査型顕微鏡を、共焦点顕微鏡ではなく、多光子励起顕微鏡としてもよい。この場合、光子密度が極めて高くなる焦点位置でのみ多光子励起が生じると言う多光子励起の特性により共焦点効果を得られるので、共焦点絞り２４を用いなくてもよい。

ライトシート顕微鏡３０は、対物レンズ３１を含む照明光学系と、対物レンズ１２ａとイメージセンサ３２を含む観察光学系と、を備えている。イメージセンサ３２は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサなどの二次元イメージセンサである。

対物レンズ３１の光軸と対物レンズ１２ａの光軸は、交差していて、望ましくは互いに直交している。また、対物レンズ３１と対物レンズ１２ａは、対物レンズ３１の光軸と対物レンズ１２ａの光軸が対物レンズ３１の前側焦点位置付近で交差するように、配置される。

対物レンズ３１は、例えば、対物レンズ１２ａの光軸と直交する方向から、試料Ｓにシート光を照射する。シート光が照射された試料Ｓの領域は、対物レンズ１２ａの光軸方向に薄いシート形状を有している。

シート光が照射された領域では、蛍光物質が励起され、シート光とは異なる波長の蛍光が放射される。その蛍光は、対物レンズ１２ａを経由してイメージセンサ３２上に集光する。つまり、ライトシート顕微鏡３０は、シート光が照射された試料Ｓの領域の光学像をイメージセンサ３２上に投影することが可能であり、その結果として、試料Ｓの二次元画像を取得することができる。

なお、ライトシート顕微鏡３０は、イメージセンサ３２の露光期間内に試料Ｓのニ次元情報を取得することが可能なため、試料Ｓの各点の情報を順次取得するレーザ走査顕微鏡２０よりも高速に二次元画像を得ることができる。また、ライトシート顕微鏡３０は、試料Ｓを、観察光軸と交差する方向、望ましくは直交する方向、から照明することで、Z分解能を有する。ライトシート顕微鏡３０のZ分解能は、シート光の厚さに依存するため、シート光の厚さを適切に設定することで、ライトシート顕微鏡３０は、必要なZ分解能を得ることができる。

制御装置４０は、レーザ走査顕微鏡２０、ライトシート顕微鏡３０、及び表示装置５０を制御する。制御装置４０は、顕微鏡本体１０、表示装置５０、及び、入力装置６０に接続されている。制御装置４０は、レーザ走査顕微鏡２０、ライトシート顕微鏡３０、及び、表示装置５０を主に制御する構成として、図２に示すように、第１画像取得部４１、第２画像取得部４２、記憶部４３、領域設定部４４、駆動制御部４５、三次元画像構築部４６、及び、表示制御部４７を備えている。

第１画像取得部４１は、ライトシート顕微鏡３０が取得した試料Ｓの二次元画像を取得し、記憶部４３へ出力する。以降では、ライトシート顕微鏡３０が取得した試料Ｓのニ次元画像を、第１断層画像と記す。

第２画像取得部４２は、レーザ走査顕微鏡２０が取得した試料Ｓの二次元画像を取得し、記憶部４３へ出力する。以降では、レーザ走査顕微鏡２０が取得した試料Ｓのニ次元画像を、第２断層画像と記す。

記憶部４３は、制御装置４０の各部から出力された情報を記憶する。記憶部４３は、例えば、第１画像取得部４１及び第２画像取得部４２から出力されたニ次元画像を記憶してもよい。また、記憶部４３は、例えば、領域設定部４４から出力された走査領域を特定する情報を記憶してもよい。また、記憶部４３は、例えば、三次元画像構築部４６から出力された三次元画像を記憶してもよい。なお、走査領域とは、三次元画像を構築するために走査する試料上の領域のことである。

領域設定部４４は、入力装置６０からの操作信号に基づいて走査領域を設定し、設定した走査領域を特定する情報を記憶部４３へ出力する。例えば、表示装置５０に表示された三次元画像の中から利用者によって観察対象領域を選択されると、領域設定部４４は、観察対象領域に対応する試料Ｓの三次元領域を走査領域に設定する。

駆動制御部４５は、顕微鏡本体１０の各構成要素を制御する。駆動制御部４５は、例えば、電動ステージ１１を移動してもよく、レボルバ１３とともに対物レンズ１２ａ又は対物レンズ１２ｂを移動してもよい。また、駆動制御部４５は、例えば、レボルバ１３を制御して、光路上に配置される対物レンズを対物レンズ１２ａと対物レンズ１２ｂの間で切り換えてもよい。また、駆動制御部４５は、例えば、ニ次元スキャナ２３を制御して、レーザ走査顕微鏡２０の視野の範囲及び視野の中心位置を変更してもよい。また、駆動制御部４５は、ターレット１４を制御して、ミラー１４ａが光路上に配置される状態と、ミラー１４ａが光路外に配置される状態を切り換えてもよい。

三次元画像構築部４６は、複数のニ次元画像に基づいて三次元画像を構築し、記憶部４３へ出力する。以降では、複数の第１断層画像に基づいて構築された三次元画像を、第１三次元画像と記し、複数の第２断層画像に基づいて構築された三次元画像を、第２三次元画像と記す。

表示制御部４７は、三次元画像を表示装置５０に表示する。また、表示制御部４７は、例えば、観察対象領域と観察対象領域以外の領域とを区別した表示状態で三次元画像を表示装置５０に表示してもよい。

なお、上述した制御装置４０は、汎用装置であっても、専用装置であってもよい。制御装置４０は、特にこの構成に限定されるものではないが、例えば、図３に示すような物理構成を有するコンピュータであってもよい。具体的には、制御装置４０は、プロセッサ４０ａ、メモリ４０ｂ、補助記憶装置４０ｃ、入出力インタフェース４０ｄ、媒体駆動装置４０ｅ、通信制御装置４０ｆを備えてもよく、それらが互いにバス４０ｇによって接続されてもよい。

プロセッサ４０ａは、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）を含む、任意の処理回路である。プロセッサ４０ａは、メモリ４０ｂ、補助記憶装置４０ｃ、記憶媒体４０ｈに格納されているプログラムを実行してプログラムされた処理を行うことで、図２に示す制御装置４０の構成要素を実現してもよい。また、プロセッサ４０ａは、ＡＳＩＣ、ＦＰＧＡ等の専用プロセッサを用いて構成されてもよい。また、図２に示す制御装置４０の構成要素は、それぞれが個別の電子回路によって実現されてもよい。

メモリ４０ｂは、プロセッサ４０ａのワーキングメモリである。メモリ４０ｂは、たとえば、ＲＡＭ（Random Access Memory）等の任意の半導体メモリである。補助記憶装置４０ｃは、ＥＰＲＯＭ（Erasable Programmable ROM）、ハードディスクドライブ（Hard Disc Drive）等の不揮発性のメモリである。入出力インタフェース４０ｄは、外部装置（顕微鏡本体１０、表示装置５０、入力装置６０）と情報をやり取りする。

媒体駆動装置４０ｅは、メモリ４０ｂ及び補助記憶装置４０ｃに格納されているデータを記憶媒体４０ｈに出力することができ、また、記憶媒体４０ｈからプログラム及びデータ等を読み出すことができる。記憶媒体４０ｈは、持ち運びが可能な任意の記録媒体である。記憶媒体４０ｈには、例えば、ＳＤカード、ＵＳＢ（Universal Serial Bus）フラッシュメモリ、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ(Digital Versatile Disc)などが含まれる。

通信制御装置４０ｆは、ネットワークへの情報の入出力を行う。通信制御装置４０ｆとしては、例えば、ＮＩＣ（Network Interface Card）、無線ＬＡＮ（Local Area Network）カード等が採用され得る。バス４０ｇは、プロセッサ４０ａ、メモリ４０ｂ、補助記憶装置４０ｃ等を、相互にデータの授受可能に接続する。

以上のように構成された顕微鏡装置１は、図４に示す制御処理を行う。図４は、顕微鏡装置１が行う制御処理の流れを示すフローチャートである。図５は、第１三次元画像の表示例について説明するための図である。図６は、観察光軸方向への走査方法の一例について説明するための図である。図７は、観察対象領域の表示例について説明するための図である。図８は、第２三次元画像の表示例について説明するための図である。以下、図４から図８を参照しながら、顕微鏡装置１の制御方法について説明する。

まず、顕微鏡装置１は、走査領域ＳＲ１を設定する（ステップＳ１）。走査領域ＳＲ１は、第１三次元画像を構築するために走査する試料Ｓ上の領域である。具体的には、領域設定部４４は、利用者が入力装置６０を用いて指定した三次元領域を入力装置６０からの制御信号に基づいて特定し、特定した三次元領域を走査領域ＳＲ１に設定する。図５（ａ）には、電動ステージ１１上面に試料Ｓが配置されていて、試料Ｓの上方に対物レンズ１２ａが置かれた様子が示されている。また、図５（ａ）には、試料Ｓ全体を包含する広い領域が走査領域ＳＲ１として設定された様子も示されている。なお、図５（ａ）は、ステップＳ１で行われた設定状態について把握することを容易にするためにその設定を図示したものであり、ステップＳ１で設定された走査領域ＳＲ１と試料Ｓの位置関係の一例を示している。

ライトシート顕微鏡３０では、シート光が照射される試料Ｓの断面と対物レンズ１２ａの焦点面を合わせる必要があるため、対物レンズ３１と対物レンズ１２ａの一方を対物レンズ１２ａの光軸方向へ動かすと他方もそれに合わせて動かさなければならない。このため、図６に示すように、対物レンズ１２ａではなく電動ステージ１１を移動することによって、画像化される試料Ｓ上の領域を変更するのが通常である。この場合、画像化される試料Ｓ上の領域の大きさは、観察光学系の倍率によって定まり、画像化される試料Ｓ上の領域の中心位置は、電動ステージ１１の位置によって定まる。従って、走査領域ＳＲ１は、ライトシート顕微鏡３０の観察光学系の倍率情報と電動ステージ１１の座標情報の組み合わせとして管理されてもよい。観察光学系の倍率情報は、例えば、対物レンズ１２ａの倍率であってもよい。また、電動ステージ１１の座標情報は、例えば、電動ステージ１１の光軸と直交する方向の座標と、電動ステージ１１の光軸方向の座標の下限と上限であってもよい。

次に、顕微鏡装置１は、ライトシート顕微鏡３０を用いて複数の第１断層画像を取得する（ステップＳ２）。ここでは、顕微鏡装置１は、第１断層画像の取得と、対物レンズ１２ａの焦点面の移動とを、交互に繰り返すことで、ステップＳ１で設定された走査領域ＳＲ１を対物レンズ１２ａの光軸方向へ走査して、複数の第１断層画像を取得する。具体的には、ライトシート顕微鏡３０が第１断層画像を取得し、第１画像取得部４１が第１断層画像を記憶部４３へ出力すると、記憶部４３が第１断層画像を電動ステージ１１の座標情報と観察光学系の倍率情報に関連付けて記憶する。その後、駆動制御部４５が、図６に示すように、電動ステージ１１を観察光軸の方向へ所定距離D1だけ移動する。これらの処理を繰り返すことで、ライトシート顕微鏡３０が走査領域ＳＲ１を走査して複数の第１断層画像を取得する。なお、ライトシート顕微鏡３０でのZ分解能はシート光の厚さにより決まるため、所定距離D1は、光シートの厚さに揃えてもよい。

複数の第１断層画像を取得すると、顕微鏡装置１は、第１三次元画像を構築し（ステップＳ３）、第１三次元画像を表示する（ステップＳ４）。ここでは、三次元画像構築部４６が、ステップＳ２でライトシート顕微鏡３０が取得した複数の第１断層画像に基づいて、第１三次元画像を構築し、表示制御部４７が構築された第１三次元画像を表示装置５０に表示する。図５（ｂ）には、表示装置５０に第１三次元画像である画像５１が表示された様子が示されている。

その後、顕微鏡装置１は、走査領域ＳＲ２を設定する（ステップＳ５）。走査領域ＳＲ２は、第２三次元画像を構築するために走査する領域である。具体的には、領域設定部４４は、入力装置６０からの制御信号に基づいて、表示装置５０に表示された画像５１のうちの利用者によって選択された観察対象領域５１ａに対応する試料の三次元領域を特定し、特定した三次元領域を走査領域ＳＲ２に設定する。なお、利用者による選択操作は、表示装置５０に表示された画像５１を見ながら、画像５１上の任意の領域を観察対象領域５１ａとしてマウス等の入力装置６０を用いて指定することによって行われる。図７（ａ）には、電動ステージ１１上に試料Ｓが配置されていて、試料Ｓの上方に対物レンズ１２ａが置かれた様子が示されている。また、図７（ａ）には、試料Ｓ全体を包含する広い領域が走査領域ＳＲ１として設定され、さらに、試料Ｓの一部の領域が走査領域ＳＲ２として設定された様子が示されている。なお、図７（ａ）は、ステップＳ５で行われた設定について把握することを容易にするためにその設定状態を図示したものであり、ステップＳ５で設定された走査領域ＳＲ２とステップＳ１で設定された走査領域ＳＲ１と試料Ｓの位置関係の一例を示している。

なお、画像５１上の位置と試料Ｓ上の位置の関係は、既知である。上述したように、画像取得時におけるライトシート顕微鏡３０の観察光学系の倍率情報と電動ステージ１１の座標情報との組み合わせによって画像５１として画像化された試料Ｓ上の領域は特定される。このため、画像５１上の任意の位置は、その画像５１内における相対的な位置が特定されることで試料上の位置に変換することができる。具体的には、上述したライトシート顕微鏡３０の観察光学系の倍率情報と電動ステージ１１の座標情報に加えて、イメージセンサ３２の画素サイズ、画素数などを用いて画像５１内における相対的な位置を特定することで、画像５１上の任意の位置を、試料上の位置に変換することができる。

走査領域ＳＲ２が設定されると、顕微鏡装置１は、観察対象領域５１ａを表示する（ステップＳ６）。ここでは、表示制御部４７は、画像５１を画像５２に更新することで、観察対象領域５１ａと観察対象領域５１ａ以外の領域とを区別した表示状態で、第１三次元画像を表示装置５０に表示する。図７（ｂ）には、表示装置５０に、観察対象領域５１ａと観察対象領域５１ａ以外の領域とを区別した表示状態で第１三次元画像である画像５２が表示された様子が示されている。なお、区別した表示状態とは、視覚的に区別できる状態であればよく、例えば、観察対象領域５１ａとそれ以外とで背景色を異ならせてもよく、また、観察対象領域５１ａとそれ以外とで透過率を異ならせてもよい。

その後、顕微鏡装置１は、顕微鏡本体１０の設定を変更する（ステップＳ７）。具体的には、駆動制御部４５がターレット１４を制御して、ミラー１４ａを光軸上に配置する。これにより、顕微鏡装置１は、レーザ走査顕微鏡２０によって試料Ｓの画像を取得可能な状態となる。

また、ステップＳ７では、駆動制御部４５は、レボルバ１３を用いて、観察光軸上に配置する対物レンズを、ライトシート顕微鏡３０が複数の第１断層画像を取得するときに観察光軸上に配置されていた対物レンズ１２ａよりも高い倍率を有する対物レンズ１２ｂに変更してもよい。これは、走査領域ＳＲ２は走査領域ＳＲ１よりも狭いことから、より高い倍率の対物レンズを用いた場合であっても走査領域ＳＲ２がレーザ走査顕微鏡２０の視野の範囲内に収まるからである。また、一般に、対物レンズの倍率が高いほど開口数も大きくなることから、対物レンズ１２ａよりも高い倍率の対物レンズ１２ｂを用いることで、更に高い分解能を得ることができるからである。

なお、駆動制御部４５は、走査領域ＳＲ２に応じて、レボルバ１３を用いて観察光軸上に配置する対物レンズを変更してよい。例えば、レボルバ１３に対物レンズ１２ａよりも高い倍率を有する複数の対物レンズが装着されている場合であれば、駆動制御部４５は、走査領域ＳＲ２がレーザ走査顕微鏡２０の視野内に収まる対物レンズのうち最も高倍率の対物レンズを、レボルバ１３を用いて観察光軸上に配置してもよい。これにより、走査領域ＳＲ２を視野に収めながら高い分解能を実現することができる。

また、ステップＳ７では、駆動制御部４５は、対物レンズの変更の代わりに、又は、対物レンズの変更に加えて、ニ次元スキャナ２３の振り角度を制限することで、観察倍率を変更してもよい。この場合、駆動制御部４５は、走査領域ＳＲ２に応じて、ニ次元スキャナ２３の振り角度を制限する。ニ次元スキャナ２３の振り角度を制限することで、レーザ走査顕微鏡２０によってレーザ光が照射される領域の大きさを任意の大きさに変更することができる。このため、走査領域ＳＲ２外へのレーザ光の照射を抑制することができるため、レーザ走査顕微鏡２０が試料Ｓへ与えるダメージを抑えることができる。また、二次元スキャナ２３の振り角度を制限する時は、通常、画像データ取得のサンプリング数は変えない。従って、サンプリングを行う空間的なピッチが狭くなるのでピクセル分解能が向上し、より高い分解能を実現することができる。なお、ステップＳ５からステップＳ７の処理は、任意の順番で行われ得る。

その後、顕微鏡装置１は、レーザ走査顕微鏡２０を用いて複数の第２断層画像を取得する（ステップＳ８）。ここでは、顕微鏡装置１は、まず、対物レンズ１２ｂの光軸上に走査領域ＳＲ２の中心が位置するように、電動ステージ１１を対物レンズ１２ｂの光軸と直交する方向へ移動する。その後、顕微鏡装置１は、第２断層画像の取得と、対物レンズ１２ｂの焦点面の移動とを、交互に繰り返すことで、ステップＳ５で設定された走査領域ＳＲ２を走査して、複数の第２断層画像を取得する。より具体的には、レーザ走査顕微鏡２０が第２断層画像を取得し、第２画像取得部４２が第２断層画像を記憶部４３へ出力すると、記憶部４３が第２断層画像を電動ステージ１１の座標情報と観察光学系の倍率情報に関連付けて記憶する。観察光学系の倍率情報には、例えば、対物レンズ１２ｂの倍率、ニ次元スキャナ２３の振り角度などが含まれる。その後、駆動制御部４５が、電動ステージ１１を観察光軸の方向へ所定距離D2だけ移動する。この処理を繰り返すことで、レーザ走査顕微鏡２０が複数の第２断層画像を取得する。

なお、ステップＳ８における所定距離D2は、ステップＳ２における所定距離D1よりも短いことが望ましい。これは、レーザ走査顕微鏡２０が有する高い解像力を活かして第１三次元画像よりも高いZ方向の解像度を有する第２三次元画像を構築するためである。例えば、対物レンズ１２ｂの開口数と使用波長（照明光の波長、及び又は、検出する蛍光の波長）によりに決まるZ分解能以下の値になるように所定距離D2を設定してもよい。

複数の第２断層画像を取得すると、顕微鏡装置１は、第２三次元画像を構築し（ステップＳ９）、第２三次元画像を表示する（ステップＳ１０）。ここでは、三次元画像構築部４６が、ステップＳ８でレーザ走査顕微鏡２０が取得した複数の第２断層画像に基づいて、第２三次元画像を構築し、表示制御部４７が構築された第２三次元画像を表示装置５０に表示する。図８（ｂ）には、表示装置５０に第２三次元画像である画像５３が表示された様子が示されている。また、図８（ａ）には、電動ステージ１１上に試料Ｓが配置されていて、試料Ｓの上方に対物レンズ１２ｂが置かれた様子が示されている。また、図８（ａ）には、試料Ｓ全体を包含する広い領域が走査領域ＳＲ１として設定され、さらに、試料Ｓの一部の領域が走査領域ＳＲ２として設定された様子が示されている。なお、図８（ａ）は、図７（ａ）と比較して対物レンズが変更されている様子が示されており、その他の点については、図７（ａ）と同様である。

以上のように、顕微鏡装置１は、レーザ走査顕微鏡２０よりも高速に画像を取得することが可能なライトシート顕微鏡３０を用いることによって、広い走査領域ＳＲ１に対応する第１三次元画像を構築し、表示装置５０に表示する。このため、利用者は、観察すべき三次元領域を見逃すことなく早期に特定することができる。また、第１三次元画像が表示されることで、利用者は、観察すべき領域を三次元領域として指定することができる。このため、利用者が観察すべき領域を正しく指定することができる。さらに、顕微鏡装置１は、利用者が第１三次元画像を見ながら観察すべき三次元領域として特定した走査領域ＳＲ２に対応する第２三次元画像を、レーザ走査顕微鏡２０を用いて構築する。このため、観察すべき三次元領域をレーザ走査顕微鏡２０が有する高い分解能で観察することができる。従って、顕微鏡装置１によれば、観察すべき三次元領域を高い分解能で早期に観察することができる。

また、顕微鏡装置１では、第１三次元画像上で利用者によって観察対象領域が選択されると、観察対象領域とそれ以外の領域を区別した表示状態で第１三次元画像が表示される。これにより、利用者は、自身が選択した観察対象領域を三次元画像上で確認することができるため、選択操作の誤りなどを早期に発見することができる。従って、顕微鏡装置１によれば、利用者が希望する領域とは異なる領域に対応する第２三次元画像が構築されることを未然に回避することが可能であり、作業のやり直しを少なくすることができる。

また、顕微鏡装置１では、第２断層画像を、第１断層画像よりも高い倍率の対物レンズを用いて取得する。これにより、第１三次元画像の構築に要する時間の短縮化と、第２三次元画像の高解像度化を高いレベルで両立することができる。

［第２実施形態］
図９は、観察光軸方向への走査方法の別の例について説明するための図である。以下、図９を参照しながら、本実施形態に係る顕微鏡装置（以降、本顕微鏡装置と記す）について説明する。

本顕微鏡装置は、ステップＳ８において、電動ステージ１１を移動することによって観察光軸方向へ走査する代わりに、対物レンズ１２ｂを移動することによって観察光軸方向へ走査する点が、顕微鏡装置１とは異なる。本顕微鏡装置は、その他の点については、顕微鏡装置１と同様に動作し、顕微鏡装置１と同様の構成を有する。従って、本顕微鏡装置の構成要素については、顕微鏡装置１の構成要素と同一の符号で参照する。

本顕微鏡装置では、駆動制御部４５は、ライトシート顕微鏡３０が複数の第１断層画像を取得するときには、図６に示すように、電動ステージ１１を観察光軸の方向へ移動し、レーザ走査顕微鏡２０が複数の第２断層画像を取得するときには、図９に示すように、レボルバ１３とともに対物レンズ１２ｂを観察光軸の方向へ移動する。図９には、対物レンズ１２ｂを観察光軸方向へ移動することによって対物レンズ１２ｂの焦点位置を走査領域ＳＲ２内へ動かす様子が示されている。

一般に、電動ステージ１１の質量は複数の対物レンズが装着されたレボルバ１３の質量よりも大きい。このため、レボルバ１３とともに対物レンズ１２ｂを観察光軸の方向へ移動することで、本顕微鏡装置は、顕微鏡装置１よりも、走査領域ＳＲ２を高速に走査することができる。従って、本顕微鏡装置によれば、観察すべき三次元領域を高い分解能で、更に早期に観察することが可能となる。

また、制御装置４０は、レーザ走査顕微鏡２０が複数の第２断層画像を取得するときに、複数の第１断層画像の観察光軸の方向の間隔よりも複数の第２断層画像の観察光軸の方向の間隔が短くなるように、対物レンズ１２ｂを観察光軸の方向へ移動することが望ましい。これは、レーザ走査顕微鏡２０が有する高い解像力を活かして第１三次元画像よりも高いZ方向の解像度を有する第２三次元画像を構築するためである。

なお、本実施形態では、対物レンズ１２ｂの光軸上に走査領域ＳＲ２の中心が位置するように電動ステージ１１を動かした後に、対物レンズ１２ｂを基準位置から観察光軸方向へ動かして走査領域ＳＲ２の上面に対物レンズ１２ｂの焦点を合わせる。ここで、対物レンズ１２ｂの基準位置とは、シート光が照射される試料Ｓの断面と対物レンズ１２ｂの焦点面が一致するときの対物レンズ１２ｂの位置のことである。

対物レンズ１２ｂの動かし方について具体的に説明する。例えば、図９に示すように、電動ステージ１１の上面から走査領域ＳＲ２の上面までの距離γが既知であれば、下式から対物レンズ１２ｂの移動量ΔZを算出し、算出した移動量ΔZだけ対物レンズ１２ｂを移動することで、走査領域ＳＲ２の上面に焦点を合わせることができる。ここで、αは、電動ステージ１１が稼動範囲の最下端に位置するときの電動ステージ１１の上面から光シートの集光位置までの観察光軸方向の距離である。βは、電動ステージ１１が稼動範囲の最下端に位置するときの電動ステージ１１の上面から電動ステージ１１の現在位置における上面までの観察光軸方向の距離である。
ΔZ=β+γ-α

［第３実施形態］
図１０は、キャリブレーション処理の流れを示すフローチャートである。図１１は、キャリブレーションによる二次元スキャナの走査範囲の変更について説明するための図である。以下、図１０及び図１１を参照しながら、本実施形態に係る顕微鏡装置（以降、本顕微鏡装置と記す）について説明する。

本顕微鏡装置は、図１０に示すキャリブレーション処理を行う点が、顕微鏡装置１とは異なる。なお、図１０に示すキャリブレーション処理は、図４に示す制御処理の前に行われる。本顕微鏡装置は、その他の点については、顕微鏡装置１と同様に動作し、顕微鏡装置１と同様の構成を有する。従って、本顕微鏡装置の構成要素については、顕微鏡装置１の構成要素と同一の符号で参照する。

まず、本顕微鏡装置は、ライトシート顕微鏡３０を用いて基準チャートの第１画像を取得する（ステップＳ１１）。基準チャートは、特に限定しないが、例えば、スクエアグリッド、サークルグリッドなどの特定の模様を有する平板である。

次に、本顕微鏡装置は、レーザ走査顕微鏡２０を用いて基準チャートの第２画像を取得する（ステップＳ１２）。ここでは、駆動制御部４５がターレット１４を回転し、ミラー１４ａを光路上に挿入してから、レーザ走査顕微鏡２０が画像を取得する。

第１画像と第２画像が取得されると、本顕微鏡装置は、ライトシート顕微鏡３０とレーザ走査顕微鏡２０の視野の中心位置のズレを算出する（ステップＳ１３）。ここでは、制御装置４０が第１画像と第２画像を比較することで、ライトシート顕微鏡３０の視野の中心位置とレーザ走査顕微鏡２０の視野の中心位置のズレを算出する。

ズレが算出されると、本顕微鏡装置は、ニ次元スキャナ２３の振り角中心位置を調整する（ステップＳ１４）。ここでは、制御装置４０は、図１１に示すように、ライトシート顕微鏡３０の視野の中心位置とレーザ走査顕微鏡２０の視野の中心位置とが一致するように、ニ次元スキャナ２３の振り角中心位置を調整する。その結果、制御装置４０は、図４のステップＳ８において、ライトシート顕微鏡３０の視野の中心位置とレーザ走査顕微鏡２０の視野の中心位置とが一致するように、ニ次元スキャナ２３を制御することになる。なお、ニ次元スキャナ２３の振り角中心位置を調整することで、画像中心位置をシフトする制御は、パン制御とも呼ばれる。

本顕微鏡装置によれば、ライトシート顕微鏡３０で取得する第１断層画像の中心位置と、レーザ走査顕微鏡２０で取得する第２断層画像の中心位置とを高い精度で一致させることができる。このため、第２三次元画像に対応する試料Ｓ上の領域と利用者が画像上で選択した領域に対応する試料Ｓ上の領域を、高い精度で一致させることができる。なお、観察すべき三次元領域を高い分解能で早期に観察することができる点については、顕微鏡装置１と同様である。

［第４実施形態］
図１２は、本実施形態に係る顕微鏡装置２の構成を例示した図である。顕微鏡装置２は、顕微鏡本体１０の代わりに顕微鏡本体７０を備える点が、顕微鏡装置１とは異なる。その他の点は、顕微鏡装置１と同様である。

顕微鏡本体７０は、レーザ走査顕微鏡とライトシート顕微鏡を備える点、レーザ走査顕微鏡とライトシート顕微鏡が電動ステージ１１、複数の対物レンズ、レボルバ１３、ターレット１４を共有している点は、顕微鏡本体１０と同様である。ただし、顕微鏡装置２では、ターレット１４は、レーザ走査顕微鏡が試料Ｓの画像を取得するときに、ミラー１４ａを光路外に配置し、ライトシート顕微鏡が試料Ｓの画像を取得するときに、ミラー１４ａを光路上に配置する。

顕微鏡本体７０は、顕微鏡本体７０が有するレーザ走査顕微鏡８０が、スピニングディスク８３を有する共焦点スキャナと、二次元イメージセンサであるイメージセンサ８５と、を含む共焦点顕微鏡である、という点が顕微鏡本体１０とは異なる。レーザ走査顕微鏡８０は、いわゆるディスク走査型の共焦点顕微鏡である。

レーザ走査顕微鏡８０は、レーザ８１と、複数のマイクロレンズ８２ａが設けられたスピニングディスク８２と、複数のマイクロレンズ８２ａの焦点位置に複数のピンホール８３ａが形成されたスピニングディスク８３と、ダイクロイックミラー８４と、イメージセンサ８５を備えている。スピニングディスク８２とスピニングディスク８３は、互いの位置関係を維持したまま回転する共焦点スキャナの一例である。

レーザ８１から出射したレーザ光は、スピニングディスク８２に設けられた複数のマイクロレンズ８２ａによって複数の光束に分割され、複数の光束のそれぞれがスピニングディスク８３上の異なるピンホール８３ａを通過する。

スピニングディスク８３は、対物レンズ１２ａの前側焦点面と光学的に共役な面に配置されている。このため、複数のピンホール８３ａを通過した複数の光束は、対物レンズ１２ａを経由して、ピンホール８３ａの位置に応じた試料Ｓ上の位置に照射される。また、試料Ｓで生じた蛍光は、対物レンズ１２ａ、及び、蛍光が生じた位置に対応するピンホール８３ａを通過した後に、ダイクロイックミラー８４で反射し、図示しないレンズを経由してイメージセンサ８５へ入射する。

イメージセンサ８５は、対物レンズ１２ａの前側焦点面とスピニングディスク８３の両方と、光学的に共役な面に配置されている。このため、レーザ走査顕微鏡８０は、スピニングディスク８２とスピニングディスク８３を回転して前側焦点面全体を走査することで、イメージセンサ８５に前側焦点面の光学像を投影することが可能であり、その結果、前側焦点面上の試料Ｓの二次元画像を得ることができる。

ライトシート顕微鏡９０は、対物レンズ９１を含む照明光学系と、対物レンズ１２ａとイメージセンサ９２を含む観察光学系と、を備えている。イメージセンサ９２は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサなどの二次元イメージセンサである。

対物レンズ９１の光軸と対物レンズ１２ａの光軸は、交差していて、望ましくは互いに直交している。また、対物レンズ９１と対物レンズ１２ａは、対物レンズ９１の光軸と対物レンズ１２ａの光軸が対物レンズ９１の前側焦点位置付近で交差するように、配置される。

対物レンズ９１は、例えば、対物レンズ１２ａの光軸と直交する方向から、試料Ｓにシート光を照射する。シート光が照射された試料Ｓの領域は、対物レンズ１２ａの光軸方向に薄いシート形状を有している。

シート光が照射された領域では、蛍光物質が励起され、シート光とは異なる波長の蛍光が放射される。その蛍光は、対物レンズ１２ａ及びミラー１４ａを経由して入射するイメージセンサ９２上に集光する。つまり、ライトシート顕微鏡９０は、シート光が照射された試料Ｓの領域の光学像をイメージセンサ９２上に投影することが可能であり、その結果として、試料Ｓの二次元画像を取得することができる。

顕微鏡装置２でも、顕微鏡装置１と同様に、図４に示す制御処理が行われる。つまり、顕微鏡装置２は、レーザ走査顕微鏡８０よりも高速に画像を取得することが可能なライトシート顕微鏡９０を用いることによって、広い走査領域ＳＲ１に対応する第１三次元画像を構築し、表示装置５０に表示する。さらに、顕微鏡装置２は、利用者が第１三次元画像を見ながら観察すべき三次元領域として特定した走査領域ＳＲ２に対応する第２三次元画像を、レーザ走査顕微鏡８０を用いて構築する。従って、顕微鏡装置２によっても、顕微鏡装置１と同様に、観察すべき三次元領域を高い分解能で早期に観察することができる。

また、顕微鏡装置２では、レーザ走査顕微鏡８０がディスク走査型の共焦点顕微鏡であり、多点を同時に照明することで試料Ｓを走査する。このため、第２断層画像を顕微鏡装置１よりも更に高速に取得することができる。従って、顕微鏡装置２によれば、顕微鏡装置１に比べて、観察すべき三次元領域を更に早期に観察することが可能である。

［第５実施形態］
図１３は、本実施形態に係る顕微鏡装置３の構成を例示した図である。顕微鏡装置３は、顕微鏡本体７０の代わりに顕微鏡本体１００を備える点が、顕微鏡装置２とは異なる。その他の点は、顕微鏡装置２と同様である。

顕微鏡本体１００は、レーザ走査顕微鏡８０ａとライトシート顕微鏡９０ａを備えている。レーザ走査顕微鏡８０ａは、ミラー１５ａを光路に対して挿脱するためのターレット１５をライトシート顕微鏡９０ａと共有している点が、レーザ走査顕微鏡８０とは異なる。その他の点は、レーザ走査顕微鏡８０と同様である。また、ライトシート顕微鏡９０ａは、ターレット１５をライトシート顕微鏡９０ａと共有している点と、イメージセンサ９２の代わりにミラー９３を備える点が、ライトシート顕微鏡９０とは異なる。

なお、ターレット１５は、レーザ走査顕微鏡８０ａが試料Ｓの画像を取得するときに、ミラー１５ａを光路外に配置し、ライトシート顕微鏡９０ａが試料Ｓの画像を取得するときに、ミラー１５ａを光路上に配置する。

これにより、顕微鏡装置３では、レーザ走査顕微鏡８０ａとライトシート顕微鏡９０ａが同じイメージセンサ８５を用いて二次元画像を取得することができる。従って、顕微鏡装置３によれば、顕微鏡装置２よりイメージセンサの数が少なくその結果としてコストが抑えられた構成で、顕微鏡装置２と同様の効果を得ることができる。

上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。上述した実施形態の一部を他の実施形態に適用して本発明の更に別の実施形態を構成してもよい。顕微鏡装置、制御方法、及び、プログラムは、特許請求の範囲の記載を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

例えば、顕微鏡装置の実視野を越える大きさの走査領域が利用者によって指定された場合、画像貼り合わせ技術を利用してもよい。顕微鏡装置は、図１４に示すように、複数の二次元画像を貼り合わせてもよい。より具体的には、制御装置は、複数の第１断層画像のうち同一平面を対象とする２つ以上の第１断層画像である画像Ａ１〜Ａ１２を貼り合わせて貼り合わせ画像である画像Ｂ１を構築し、それぞれ異なる平面を対象とする複数の貼り合わせ画像に基づいて、第１三次元画像である画像Ｃ１を構築してもよい。また、顕微鏡装置は、図１５に示すように、複数の三次元画像を貼り合わせてもよい。より具体的には、制御装置は、複数の第１断層画像のうち同軸上に画像中心を有する２つ以上の第１断層画像である画像Ａ２１〜Ａ３２に基づいて、第１三次元画像である画像Ｂ２を構築し、それぞれ異なる画像中心を有する複数の第１三次元画像を貼り合わせて第３三次元画像である画像Ｃ２を構築してもよい。このように、画像貼り合わせ技術を用いることで、観察倍率を変更して実視野の大きさを大きくすることなく第１三次元画像を構築することができる。このため、画像の解像度を低下させることなく広い範囲を画像化することができる。

また、上述した実施形態では、観察対象領域を１つだけ指定する例を示したが、複数の観察対象領域が指定されてもよい。複数の観察対象領域は、利用者が複数の観察対象領域を指定したその順番で走査されてもよい。また、複数の観察対象領域を指定した順番とは異なる順番を利用者が改めて指定したときには、改めて指定した順番で複数の観察対象領域を走査してもよい。なお、各観察対象領域の走査方法については、上述した方法と同じであるので、詳細な説明は省略する。

また、上述した実施形態では、複数の第２断層画像を取得するステップＳ８において、顕微鏡装置が、対物レンズ１２ｂの光軸上に走査領域ＳＲ２の中心が位置するように、電動ステージ１１を対物レンズ１２ｂの光軸と直交する方向へ移動する例を示したが、顕微鏡装置は、対物レンズ１２ｂの光軸上に走査領域ＳＲ２の中心が位置するように、ニ次元スキャナ２３の振り角中心位置を調整してもよい。即ち、パン制御によって対物レンズ１２ｂの光軸と走査領域ＳＲ２の中心位置を一致させてもよい。これにより、電動ステージ１１を動かすことなく走査領域ＳＲ２を走査することができるため、更に高速に第２断層画像を取得することが可能となる。

また、上述した実施形態では、第２断層画像を取得するときに、第１断層画像を取得するときよりも高い倍率の対物レンズを用いる例を示したが、第２断層画像を取得するときと第１断層画像を取得するときで同じ対物レンズを用いてもよい。この場合であっても、レーザ走査顕微鏡が有する高い解像力によって、第１断層画像よりも高い解像度を有する第２断層画像を取得することが可能であり、第１三次元画像よりも高い解像度を有する第２三次元画像を構築することができる。

また、上述した実施形態では、レーザ走査顕微鏡とライトシート顕微鏡が観察光路の一部を共有している例を示したが、ライトシート顕微鏡はレーザ走査顕微鏡の観察光路と同軸上に観察光路を有していればよく、レーザ走査顕微鏡とライトシート顕微鏡は照明光路の一部を共有してもよい。

１、２、３ 顕微鏡装置
１０、７０、１００ 顕微鏡本体
１１ 電動ステージ
１２ａ、１２ｂ、３１、９１ 対物レンズ
１３ レボルバ
１４、１５ ターレット
１４ａ、１５ａ、９３ ミラー
２０、８０、８０ａ レーザ走査顕微鏡
２１、８１ レーザ
２１ａ 絞り
２２、８４ ダイクロイックミラー
２３ ニ次元スキャナ
２４ 共焦点絞り
２５ ＰＭＴ
３０、９０、９０ａ ライトシート顕微鏡
３２、８５、９２ イメージセンサ
４０ 制御装置
４１ 第１画像取得部
４２ 第２画像取得部
４３ 記憶部
４４ 領域設定部
４５ 駆動制御部
４６ 三次元画像構築部
４７ 表示制御部
４０ａ プロセッサ
４０ｂ メモリ
４０ｃ 補助記憶装置
４０ｄ 入出力インタフェース
４０ｅ 媒体駆動装置
４０ｆ 通信制御装置
４０ｇ バス
４０ｈ 記憶媒体
５０ 表示装置
５１、５２、５３ 画像
５１ａ 観察対象領域
６０ 入力装置
８２、８３ スピニングディスク
８３ａ ピンホール
Ａ１〜Ａ１２、Ａ２１〜Ａ３２ 画像
Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２ 画像
Ｓ 試料
ＳＲ１、ＳＲ２ 走査領域

Claims (14)

1. 対物レンズを含む、レーザ走査顕微鏡と、
   前記対物レンズの光軸と同軸上に観察光軸を有する、ライトシート顕微鏡と、
   前記レーザ走査顕微鏡と前記ライトシート顕微鏡を制御する制御装置と、を備え、
   前記制御装置は、
   前記ライトシート顕微鏡が取得した試料の複数の第１断層画像に基づいて、第１三次元画像を構築し、
   前記第１三次元画像を表示装置に表示し、
   前記表示装置に表示された前記第１三次元画像のうちの利用者によって選択された観察対象領域に対応する前記試料の三次元領域を走査領域に設定し、
   前記レーザ走査顕微鏡が前記走査領域を走査することによって取得した前記試料の複数の第２断層画像に基づいて、第２三次元画像を構築する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の顕微鏡装置において、
   前記レーザ走査顕微鏡と前記ライトシート顕微鏡は、前記試料を載置するステージを含み、
   前記制御装置は、
   前記ライトシート顕微鏡が前記複数の第１断層画像を取得するときに、前記ステージを前記観察光軸の方向へ移動し、
   前記レーザ走査顕微鏡が前記複数の第２断層画像を取得するときに、前記対物レンズを前記観察光軸の方向へ移動する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
3. 請求項２に記載の顕微鏡装置において、
   前記制御装置は、前記レーザ走査顕微鏡が前記複数の第２断層画像を取得するときに、前記複数の第１断層画像の前記観察光軸の方向の間隔よりも前記複数の第２断層画像の前記観察光軸の方向の間隔が短くなるように、前記対物レンズを前記観察光軸の方向へ移動する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
   前記制御装置は、前記利用者によって選択された前記観察対象領域と前記観察対象領域以外の領域とを区別した表示状態で前記第１三次元画像を前記表示装置に表示する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
5. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
   前記レーザ走査顕微鏡と前記ライトシート顕微鏡は、前記対物レンズを含む複数の対物レンズが装着された対物レンズ切換装置を備え、
   前記制御装置は、前記レーザ走査顕微鏡が前記複数の第２断層画像を取得するときに、前記対物レンズ切換装置を用いて前記観察光軸上に配置する対物レンズを、前記ライトシート顕微鏡が前記複数の第１断層画像を取得するときに前記観察光軸上に配置されていた対物レンズよりも高い倍率を有する対物レンズに変更する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
6. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
   前記レーザ走査顕微鏡は、前記対物レンズを含む複数の対物レンズが装着された対物レンズ切換装置を備え、
   前記制御装置は、前記走査領域に応じて前記対物レンズ切換装置を用いて前記観察光軸上に配置する対物レンズを変更する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
7. 請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
   前記レーザ走査顕微鏡は、レーザ光を偏向する二次元スキャナを含む共焦点顕微鏡、又は、多光子励起顕微鏡である
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
8. 請求項７に記載の顕微鏡装置において、
   前記制御装置は、前記ライトシート顕微鏡の視野の中心位置と前記レーザ走査顕微鏡の視野の中心位置とが一致するように、前記二次元スキャナを制御する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
9. 請求項７又は請求項８に記載の顕微鏡装置において、
   前記制御装置は、前記走査領域に応じて少なくとも前記二次元スキャナの振り角度を制限する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
10. 請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
    前記レーザ走査顕微鏡は、スピニングディスクを有する共焦点スキャナと、二次元イメージセンサと、を含む共焦点顕微鏡である
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
11. 請求項１に記載の顕微鏡装置において、
    前記制御装置は、
    前記複数の第１断層画像のうち同一平面を対象とする２つ以上の第１断層画像を貼り合わせて貼り合わせ画像を構築し、
    それぞれ異なる平面を対象とする複数の貼り合わせ画像に基づいて、前記第１三次元画像を構築する
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
12. 請求項１に記載の顕微鏡装置において、
    前記制御装置は、
    前記複数の第１断層画像のうち同軸上に画像中心を有する２つ以上の第１断層画像に基づいて、前記第１三次元画像を構築し、
    それぞれ異なる画像中心を有する複数の第１三次元画像を貼り合わせて第３三次元画像を構築する
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
13. 対物レンズを含むレーザ走査顕微鏡と、前記対物レンズの光軸と同軸上に観察光軸を有するライトシート顕微鏡と、を備える顕微鏡装置の制御方法であって、
    前記ライトシート顕微鏡が取得した試料の複数の第１断層画像に基づいて、第１三次元画像を構築し、
    前記第１三次元画像を表示装置に表示し、
    前記表示装置に表示された前記第１三次元画像のうちの利用者によって選択された観察対象領域に対応する前記試料の三次元領域を走査領域に設定し、
    前記レーザ走査顕微鏡が前記走査領域を走査することによって取得した前記試料の複数の第２断層画像に基づいて、第２三次元画像を構築する
    ことを特徴とする制御方法。
14. 対物レンズを含むレーザ走査顕微鏡と、前記対物レンズの光軸と同軸上に観察光軸を有するライトシート顕微鏡と、を備える顕微鏡装置のコンピュータに、
    前記ライトシート顕微鏡が取得した試料の複数の第１断層画像に基づいて、第１三次元画像を構築し、
    前記第１三次元画像を表示装置に表示し、
    前記表示装置に表示された前記第１三次元画像のうちの利用者によって選択された観察対象領域に対応する前記試料の三次元領域を走査領域に設定し、
    前記レーザ走査顕微鏡が前記走査領域を走査することによって取得した前記試料の複数の第２断層画像に基づいて、第２三次元画像を構築する
    処理を実行させることを特徴とするプログラム。