JP2020072783A - 組織移植片並びにその製造方法及び使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】組織移植片の製造方法の提供。【解決手段】いくつかの実施形態において、本発明は、血管新生化骨移植片等の組織移植片、並びにかかる組織移植片の製造方法及び使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、自己多能性幹細胞等の多能性幹細胞を用いて作製される。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、骨欠損等の置換または修復されるべき組織部分のデジタルモデルを作り出し、該モデルを２つ以上のモデルセグメントに分割し、その後、該モデルセグメントのものに対応するサイズ及び形を有する組織移植片セグメントを製造することによって作製される。かかる組織移植片セグメントは、置換または修復されるべき該組織部分のものに対応するサイズ及び形を有する組織移植片を形成するために組み立てられうる。【選択図】図６

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月３０日に出願された米国仮出願６１／９２１，９１５及び２０１４年１２月４日に出願された米国仮出願６２／０８７，６１４の優先権の恩典を主張するものであり、各該仮出願は、その内容を本書に引用して援用する。

著作権及び引用による援用
本特許文献の開示の一部は、著作権の対象である資料を含む。該著作権の保有者は、特許商標局の特許ファイルまたは記録に記されている特許文献または特許情報公開の誰による複写に対しても異議はないが、何であれ、すべての著作権の権利を保有する。

外傷、先天性異常、及び疾病に起因する骨欠損の負担は重大かつ急増しており、骨修復及び再生療法の米国総年間市場は、２０１７年までに３５億人に達すると予測される。骨格異常の現行の治療方法は、埋め込み型の材料の挿入または骨組織の移植に基づいている。これらの方法は、適用可能性が限定的であり、感染及び／または拒絶の危険を伴い、臨床的関連の成果が得られない。

生物模倣組織工学戦略は、バイオリアクターで適切な培養条件下、骨コンピテント細胞を生体材料と接合させることによる機能性代用骨の生体外培養について研究されているものの、広範囲に及ぶ骨格復元のために、大きく、幾何学的に複雑な骨移植片を人工的に作り出すことは、現行の工学的手法を用いては、いまだ問題がある。特に、通常の灌流バイオリアクターを用いた大きな骨移植片の培養は、移植片の大きなサイズによって生じる流れ抵抗のため、問題がある。新生骨組織の発達は、培地の灌流を次第に制限し、灌流システムの機能及び移植片の生存能力にマイナスの結果をもたらす。従って、機能性骨組織及び大きな骨移植片の生体外での製造を促進する新たな手法及び道具への必要性がある。かかる新たな手法及び道具は、骨以外の他の組織移植片の生体外製造にも使用されうる。

本発明の主な態様の一部を以下に要約する。本発明のさらなる態様は、本特許出願の発明の詳細な説明、実施例、図面、及び特許請求の範囲の節に記載する。本特許出願の該節の各々の記載は、他の節と併せて解釈されることを意図している。さらに、本特許出願の該節の各々に記載の様々な実施形態は、様々な異なる方法で組み合わされてよく、かかる組合せのすべてが、本発明の範囲に含まれることを意図する。

いくつかの実施形態において、本発明は、骨等の機能性組織の、生体外での現行の生成方法に関する障害を克服するために用いることができる新規の方法、組成物、及び装置を提供する。いくつかの実施形態で、本発明が提供する方法は、特定の組織部位（例えば、構築、置換、または修復されるべき組織部位）の３次元モデルを用い、特製の組織培養足場、特製の組織移植片、及び／またはかかる組織移植片の製造用の特製のバイオリアクターを作製する。いくつかのかかる実施形態では、該組織培養足場、組織移植片、及び／またはバイオリアクターは、それらが、所望の組織部位またはそのセグメントに対応するサイズ及び形を備えるように設計及び製造される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、最終的な組織移植片を製造するためにその後組み立てられ／結合されうる２つ以上の組織移植片セグメントの製造によって、組織移植片を作製することを含む。かかる方法は、本書では、分節付加組織工学（ＳＡＴＥ）法と言うことがある。本書に記載の様々な異なる方法に加えて、本発明は、特製の組織移植片、特製の組織培養足場、特製のバイオリアクター、特製のバイオリアクターの移植片室、及び特製のバイオリアクターの移植片室挿入物を含めた特定の組成物及び装置も提供する。本発明のこれら及び他の態様は、以下及び本特許明細書を通して、より詳細に記載される。

いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片及びそれらのセグメント（組織移植片セグメント）の様々な製造方法を提供する。

１つのかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、（ａ）製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階、及び（ｂ）該３次元モデルを２つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階を含む組織移植片の製造方法であって、該モデルが２つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割されている、方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、２つ以上の組織移植片セグメントを製造または獲得する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、２つ以上の組織移植片セグメントを組み立てる段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、（ａ）２つ以上の組織移植片セグメントを製造または獲得する段階、及び（ｂ）該２つ以上の組織移植片セグメントを組み立てて組織移植片を形成する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、（ａ）製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階、（ｂ）該３次元モデルを２つ以上のモデルセグメントに分割する段階、（ｃ）２つ以上の組織移植片セグメントを製造する段階であって、各組織移植片セグメントが、段階（ｂ）の該モデルセグメントのうちの１つに対応するサイズ及び形を有する、段階、並びに（ｄ）該２つ以上の組織移植片セグメントを組み立てて組織移植片を形成する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述したように、または本書の他の部分に記載の通り、組織移植片の製造に用いられる）の製造方法であって、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその３次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述したように、または本書の他の部分に記載の通り、組織移植片の製造に用いられる）の製造方法であって、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分（組織セグメント）またはその３次元モデルに対応するサイズ及び形を有する足場前駆体を獲得する段階、並びに該足場前駆体を分割（例えばスライス）して２つ以上の足場を形成する段階であって、該足場が、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその３次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する段階を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述した、または本書の他の部分に記載の方法のうちの１つと併せて使用するため）の製造方法であって、（ｉ）製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその３次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階、並びに（ｉｉ）１つ以上の細胞集団を該足場に適用する段階を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述した、または本書の他の部分に記載の方法のうちの１つと併せて使用するため）の製造方法であって、（ｉ）製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその３次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階、（ｉｉ）１つ以上の細胞集団を該足場に適用する段階、並びに（ｉｉｉ）該細胞を該足場上で培養して組織移植片セグメントを形成する段階を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述した、または本書の他の部分に記載の方法のうちの１つと併せて使用するため）の製造方法であって、（ｉ）製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその３次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階、（ｉｉ）１つ以上の細胞集団を該足場に適用する段階、（ｉｉｉ）該足場を収容するように構成された移植片室（例えば、該足場に対応する内部のサイズ及び形を有する移植片室または移植片室挿入物を有する）を含む培養容器を獲得する段階、（ｉｖ）該培養容器の該移植片室に該足場を挿入する段階、並びに（ｖ）該細胞を、該培養容器内で該足場上で培養して組織移植片セグメントを形成する段階を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述した、または本書の他の部分に記載の方法のうちの１つと併せて使用するため）の製造方法であって、（ｉ）製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその３次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階、（ｉｉ）該足場を収容するように構成された移植片室を含む培養容器（例えば、該足場に対応する内部のサイズ及び形を有する移植片室または移植片室挿入物を有する）を獲得する段階、（ｉｉｉ）該培養容器の該移植片室に該足場を挿入する段階、（ｉｖ）１つ以上の細胞集団を該移植片室の該足場に適用する段階、並びに（ｖ）該細胞を、該培養容器内で該足場上で培養して組織移植片セグメントを形成する段階を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片または組織移植片セグメントの製造に使用されうる足場の様々な製造方法を提供する。

１つのかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階を含む、足場の前駆体の製造方法であって、該足場の前駆体が、該組織部分またはその３次元モデルに対応するサイズ及び形を有する、方法を提供する。

１つのかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階を含む、足場の製造方法であって、該足場が、該組織部分のセグメントまたは該組織部分の３次元モデルのセグメントに対応するサイズ及び形を有する、方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、足場の製造方法であって、（ａ）製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階、及び（ｂ）該３次元モデルを２つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割する段階を含む、方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階を含む、足場の製造方法であって、該モデルが２つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割されている、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、足場の製造方法であって、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分、またはその３次元モデルに対応するサイズ及び形を有する足場の前駆体を獲得する段階、並びに該足場前駆体を分割（例えばスライス）して２つ以上の足場を形成する段階であって、該足場の各々が、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその３次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する段階を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、本書に記載の該組織移植片及び／または組織移植片セグメントの製造に用いるのに適したバイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物の様々な製造方法を提供する。

１つのかかる実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物の製造方法であって、製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階を含む、方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物の製造方法であって、（ａ）製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階、及び（ｂ）該３次元モデルを２つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割する段階を含む、方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階を含む、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物の製造方法であって、該モデルが、２つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割されている、方法を提供する。

別のかかる実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物の製造方法であって、（ａ）製造、置換、または修復されるべき組織部分の３次元モデルを獲得する段階、（ｂ）該３次元モデルを２つ以上のモデルセグメントに分割する段階、並びに（ｃ）各々が段階（ｂ）の該モデルセグメントのうちの１つのサイズ及び形に対応する内部のサイズ及び形を有する、２つ以上のバイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物を製造する段階を含む、方法を提供する。

上述した方法に加えて、かかる実施形態の多くの変化形が想定され、これらは、限定されないが、上述した方法もしくは上述した方法の段階のいずれか１つ以上を組み合わせた実施形態または上述した方法の段階のいずれかの順序を変えた実施形態を含めて、本発明の範囲内である。

いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片、及びそのセグメント（組織移植片セグメント）を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本書に記載の方法のいずれかを用いて作製された組織移植片及び組織移植片セグメントを提供する。

１つの実施形態において、本発明は、２つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片を提供する。１つの実施形態では、本発明は、２つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、置換もしくは修復されるべき組織部分、またはその３次元モデルに対応する形及びサイズを有する組織移植片を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、２つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、各組織移植片セグメントが、最大厚さ（すなわち、その最も厚い点）約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍを有する組織移植片を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、２つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、各組織移植片セグメントが、幹細胞または前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞）から分化した組織細胞を含む組織移植片を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、２つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、各組織移植片セグメントが、幹細胞または前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞）から分化した内皮細胞等の内皮細胞を含む組織移植片を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、２つ以上の組織移植片セグメントを含む血管組織移植片であって、各組織移植片セグメントが、最大厚さ（すなわち、その最も厚い点）約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍを有する血管組織移植片を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、２つ以上の骨移植片セグメントを含む血管新生化骨移植片であって、各骨移植片セグメントが、最大厚さ（すなわち、その最も厚い点）約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍを有し、該骨移植片が、幹細胞または前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞）由来の骨細胞及び、幹細胞または前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞）由来の内皮細胞を含む、血管新生化骨移植片を提供する。

上述した組織移植片に加えて、かかる組織移植片の多くの変化形が想定され、これらは、限定されないが、本明細書の他の部分に記載されたもの及び、上述のまたは本出願の他の部分に記載された１つ以上の要素のいずれかを組み合わせたものを含めて、本発明の範囲内である。

いくつかの実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、及びバイオリアクターの移植片室挿入物を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本書に記載の方法のいずれかを用いて作製されたバイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、及びバイオリアクターの移植片室挿入物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、及びバイオリアクターの移植片室挿入物を提供し、ここで、それらの内側部分は、置換もしくは修復されるべき組織部分、置換もしくは修復されるべき組織部分のセグメント、またはそれらのいずれかの３次元モデルに対応するサイズ及び形を有する。

１つの実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、及びバイオリアクターの移植片室挿入物を提供し、ここで、それらの内側部分は、足場または、置換もしくは修復されるべき組織部分のセグメントに対応するサイズ及び形を有する組織移植片セグメントを収容するように設計される。

１つの実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、及びバイオリアクターの移植片室挿入物を提供し、ここで、それらの内側部分は、足場または組織移植片セグメントを収容するように設計され、各組織移植片セグメントは最大厚さ（すなわち、その最も厚い点）約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍを有する。

上述したバイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、及びバイオリアクターの移植片室挿入物に加えて、かかるバイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、及びバイオリアクターの移植片室挿入物の多くの変化形が想定され、これらは、限定されないが、本明細書の他の部分に記載されたもの及び、上述のまたは本出願の他の部分に記載された１つ以上の要素のいずれかを組み合わせたものを含めて、本発明の範囲内である。

いくつかの上記実施形態において、該組織移植片または組織移植片セグメントは、骨組織移植片または骨組織移植片セグメントである。いくつかの実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、軟骨移植片または軟骨移植片セグメントである。

いくつかの上記実施形態において、該組織移植片または組織移植片セグメントは、非ヒト霊長類、ヒツジ、またはげっ歯類（ラットやマウス等）由来細胞等の哺乳類細胞を含む。いくつかの上記実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、ヒト細胞を含む。いくつかの上記実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、該組織移植片が移植されるべき対象と同じ対象由来の細胞集団（すなわち、自己細胞）の１つ以上を含む。いくつかの上記実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、幹細胞または前駆細胞、例えば、人工多能性幹細胞由来の細胞集団の１つ以上を含む。

いくつかの上記実施形態において、該組織移植片または組織移植片セグメントは、血管新生化されている。いくつかの上記実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、内皮細胞、例えば、人工多能性幹細胞等の幹細胞もしくは前駆細胞から誘導された内皮細胞を含む。

いくつかの上記実施形態において、該３次元モデル及び／またはモデルセグメントは、デジタルモデル、例えば、組織部分またはそのセグメントの３次元構造の描写を提供するデジタルモデルである。

いくつかの上記実施形態において、該組織移植片セグメントは、例えば最も厚い点で、厚さが約２０ｍｍもしくはそれ以下、１５ｍｍもしくはそれ以下、または１０ｍｍもしくはそれ以下である。例えば、いくつかの上記実施形態では、該組織移植片セグメントは、例えば最も厚い点で、厚さが約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍである。

いくつかの上記実施形態において、該培養容器は、直接灌流バイオリアクター等のバイオリアクターである。いくつかの上記実施形態では、該足場または組織移植片セグメントは、圧入状態でバイオリアクターに配置される。いくつかの上記実施形態では、組織移植片セグメントは、直接灌流下及び／または圧入状態でバイオリアクターにおいて培養される。

いくつかの上記実施形態において、該足場は、コンピュータ支援製造、３次元印刷、注型、フライス加工、レーザ切断、ラピッドプロトタイピング、またはこれらの任意の組合せを用いて生成またはカスタマイズされる。

いくつかの上記実施形態において、該バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物は、コンピュータ支援製造、３次元印刷、注型、フライス加工、レーザ切断、ラピッドプロトタイピング、またはこれらの任意の組合せを用いて生成またはカスタマイズされる。

いくつかの上記実施形態において、該組織移植片は、生体適合性接着剤、ステッチ、縫合糸、ステープル、プレート、ピン、ネジ、またはこれらの任意の組合せを用いて連結された２つ以上の組織移植片セグメントを含む。

いくつかの実施形態において、本発明が提供する方法、組成物、及び装置、並びにそこから製造された組織は、治療目的（病理学的または外傷性組織欠陥の修復等）、美容目的、または、モデル系での疾病の研究もしくは治療法の開発用を含めて、様々な用途に有用でありうる。
[本発明1001]
組織移植片の製造方法であって、
ａ．製造、修復、または置換されるべき組織部分のデジタルモデルを獲得する段階であって、該デジタルモデルが2つ以上のモデルセグメントに分割される、段階；
ｂ．2つ以上の組織移植片セグメントを製造する段階であって、各組織移植片セグメントが、段階（ａ）のモデルセグメントのものに対応するサイズ及び形を有する、段階；並びに
ｃ．段階（ｂ）で製造された前記2つ以上の組織移植片セグメントを組み立てて、段階（ａ）の組織部分のものに対応するサイズ及び形を有する組織移植片を形成する段階
を含む、方法。
[本発明1002]
段階（ｂ）における2つ以上の組織移植片セグメントの製造が、
ａ．モデルセグメントに対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階；
ｂ．段階（ａ）の足場を収容するように、前記モデルセグメントに対応するサイズ及び形を有する移植片室を含む培養容器を獲得する段階；
ｃ．1つ以上の細胞集団を前記足場に適用する段階；並びに
ｄ．前記細胞を、前記培養容器内で、前記足場上で培養して、組織移植片セグメントを形成する段階
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記組織移植片が、骨移植片である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記組織移植片が、軟骨移植片である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記組織移植片が、血管新生化されている、本発明1001の方法。
[本発明1006]
各組織移植片セグメントが、厚さ約1ｃｍまたはそれ以下である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
各組織移植片セグメントが、厚さ約0．3ｍｍから約10ｍｍである、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記培養容器が直接灌流バイオリアクターであり、かつ段階（ｄ）の培養が圧入状態で行われる、本発明1002の方法。
[本発明1009]
段階（ｂ）の移植片室が、移植片室挿入物を含む、本発明1002の方法。
[本発明1010]
前記足場が、コンピュータ支援製造、3次元印刷、注型、フライス加工、レーザ切断、ラピッドプロトタイピング、またはこれらの任意の組合せを用いて生成される、本発明1002の方法。
[本発明1011]
前記細胞が、人工多能性幹細胞から誘導される、本発明1002の方法。
[本発明1012]
前記細胞が、造骨細胞及び／または造骨細胞に分化可能な細胞を含む、本発明1002の方法。
[本発明1013]
前記細胞が、血管形成細胞及び／または血管形成細胞に分化可能な細胞を含む、本発明1002の方法。
[本発明1014]
前記細胞が、間葉系前駆細胞を含む、本発明1002の方法。
[本発明1015]
前記細胞が、内皮前駆細胞を含む、本発明1002の方法。
[本発明1016]
段階（ｃ）の組み立てが、生体適合性接着剤、ステッチ、縫合糸、ステープル、プレート、ピン、ネジ、またはこれらの任意の組合せの使用を含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
2つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、各組織移植片セグメントの最大厚さが約0．3ｍｍから約10ｍｍであり、該組織移植片セグメントが、生体適合性接着剤、ステッチ、縫合糸、ステープル、プレート、ピン、ネジ、またはこれらの任意の組合せを用いて一緒に組み立てられて組織移植片を形成する、組織移植片。
[本発明1018]
骨移植片である、本発明1017の組織移植片。
[本発明1019]
血管新生化骨移植片である、本発明1018の組織移植片。
[本発明1020]
人工多能性幹細胞から誘導された造骨細胞を含む、本発明1019の組織移植片。

（ｉ）骨格異常のデジタルモデルを作り出し、分割（ここでは、Ａ、Ｂ、及びＣと標示した３つのセグメントに分割）し、特製の生体材料製足場及びバイオリアクターを組み立てるのに使用する；（ｉｉ）ＣＡＤソフトを用いて作り出された灌流バイオリアクターの上部（Ａ）及び下部（Ｂ）の例。 骨形成及び血管前駆細胞は、ｈｉＰＳＣから生成し、灌流バイオリアクターにおいて、特製の骨誘導性足場（ここでは、Ａ、Ｂ、及びＣと標示した３つの足場）で共培養する。 人工的に作り出された血管新生化骨セグメント（ここでは、Ａ、Ｂ、及びＣと標示した３つのセグメント）は、生体適合性骨接着剤を用いて組み立てられ、並びに／または３Ｄ印刷されたチタン製ピン及び穴を用いて強化される。大きな動物で臨床的に意義のある骨格異常を修復するため、さらなる研究が計画されうる。 図４Ａ：修復されるべき骨欠損のデジタル再構成（暗灰色）付きヒト大腿骨３次元デジタルモデル。図４Ｂ：図４Ａに示した骨欠損のデジタルモデルの５つのモデルセグメント（暗灰色）への分割。該モデルセグメントは、サイズ及び形が該モデルセグメントの各々に対応する生体材料製の細胞の足場（淡灰色）の製造を行うために用いることができる。 本発明が提供する例示的な細胞培養の足場の斜視図。図５Ａは、単一の足場の拡大図を示す。該足場は、本書に記載の通り、組織の部分のデジタル画像に基づいて設計及び製造されうる。図５Ｂは、異なる形とサイズの複数の足場を示す。複数の足場は、本書に記載の通り、例えば、大きな骨移植片の相補的セグメントの製造に用いることができる。 本発明が提供する例示的多室バイオリアクターの下部（図６Ａ）及び上部（図６Ｂ）の斜視図。図６Ａ：下部は、組織セグメントの集団培養用の複数の移植片室（ａ）を含む。該移植片室は、足場及び／または組織セグメントのサイズ及び形を収容するために望ましい様々なサイズ及び形に示されている。該下部を該上部にネジで固定するのを容易にするための穴（ｂ）も示されている。図６Ｂ：上部は、液だめ（ｃ）、出口（ｄ）、及び該下部の移植片室に合わせた複数の開口（ｅ）を含み、該液だめを該下部の移植片室（図６Ａ）に接続する。該上部を該下部にネジで固定するのを容易にするための穴（ｂ）も示されている。

発明の詳細な説明
いくつかの実施形態において、本発明は、一部分において、血管新生化骨移植片等の組織移植片、並びに、例えば、かかる組織移植片の製造に用いるのに適したバイオリアクター装置を含めて、かかる組織移植片の製造方法及び製造装置を提供する。いくつかの実施形態では、本書に記載の方法は、例えば、骨移植片等の組織移植片を、分節付加骨工学（ＳＡＢＥ）及び／または分節付加組織工学（ＳＡＴＥ）によって生体外で生成するために用いられうる。いくつかの実施形態では、本発明が提供する方法は、生体外で組織のセグメントを成長させるため、組織の部分のデジタルモデル、及び／もしくは特製の組織培養足場、並びに／または特製のバイオリアクターを利用する。いくつかの実施形態では、該足場及びバイオリアクターのサイズ及び形は、限定されないが、医療用画像、コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）、及び／またはコンピュータ支援製造（ＣＡＭ）戦略が挙げられる革新的な工学戦略を用いて、所望の組織移植片のサイズ及び形に対応するようにカスタマイズされうる。いくつかの実施形態では、機能性組織は、所望の（１または複数の）組織を形成可能な任意の適切な細胞、例えば、造骨細胞（例えば、骨移植片の製造用の）もしくは血管形成細胞（例えば、血管組織移植片の製造用の）、または、所望の組織形成細胞に分化できる任意の細胞、例えば、前駆細胞もしくは多能性細胞を用いて育てることができる。いくつかの実施形態では、かかる細胞は、患者自身の細胞（すなわち、自己細胞）であっても、これを含んでもよく、また、患者自身の細胞由来の細胞、例えば、人工多能性幹細胞であっても、これを含んでもよい。いくつかの実施形態では、バイオリアクターでの培養の後、複数の組織セグメントを組み立て、互いに固着して（例えば、「レゴ様」手法で）組織移植片、例えば、特定の組織部分、例えば、置換または再建される必要のある組織部分の寸法と幾何学的形態に対応する組織移植片を形成してもよい。かかる技術は、本書では、分節付加組織工学（ＳＡＴＥ）、または、特に骨の場合は、分節付加骨工学（ＳＡＢＥ）と言うことがある。

いくつかの実施形態において、本発明が提供する組織移植片及び方法は、臨床応用、例えば、対象における骨欠損等の組織欠損を修復または置換するために、組織もしくは代替組織の再現性のある、及び／または大規模な製作を可能にするために用いられうる。本出願の実施例及び他の節にさらに記載されるように、本発明のいくつかの実施形態は、機能性血管新生化組織移植片、例えば、機能性血管新生化骨移植片を作製するために用いることができる。大きな、幾何学的に定義された組織移植片の、例えば人工多能性幹細胞等の細胞を用いた製造は、幹細胞生物学と医用工学の間の接点での新規な革新的戦略であって、限定されないが、臨床応用、病変のモデリング、及び薬剤スクリーニングを含む様々な目的に用いることができる。

本発明の主な実施形態の一部は、本出願の上記発明の概要の節、並びに実施例、図面、及び特許請求の範囲にも記載されている。本発明の詳細な説明の節は、本発明の組成物及び方法に関したさらなる説明を提供し、本出願の発明の概要、実施例、図面、及び特許請求の範囲の節を含めた本特許出願の他の節のすべてと併せて解釈されることを意図している。

略称及び定義
略称「ＣＡＤ」はコンピュータ支援設計を指す。

略称「ＣＡＭ」はコンピュータ支援製造を指す。

略称「ＣＮＣ」はコンピュータ数値制御を指す。

本明細書において、「細胞／足場」、「足場／細胞」、「細胞／足場構築物」、「細胞／足場複合体」、「足場／細胞構築物」、及び「足場／細胞複合体」という用語は、同じ意味で使われ、細胞が適用された足場を指す。

本明細書において、「約」及び「およそ」という用語は、数値に関連して使用された場合、表示の値の＋または−２０％の範囲内を意味する。

さらなる定義及び略称は、本特許明細書の他の部分に記載されるか、または、当技術分野では周知である。

サイズ及び形の変動
本明細書において、「対応した」及び「対応する」という用語は、２つ以上の要素のサイズ及び形の整合が検討される本発明の任意の態様に関して使用された場合、この節に記載のサイズ及び形の変動のいずれかを意味しうる。この節に記載のかかる変動は、２つ以上の要素のサイズ及び形の整合が検討される本発明の態様のすべてに等しく適用することができる。かかる要素としては、組織部分、組織モデル、組織移植片、モデルセグメント、組織セグメント、バイオリアクター、バイオリアクター室（例えば、バイオリアクターの移植片室）及び挿入物（例えば、バイオリアクターの移植片室挿入物）、足場、足場前駆体、細胞／足場構築物、並びに本出願に記載の本発明の他の要素が挙げられる。

この節の例示的実施形態は、本発明の二つの要素‐第一の要素及び第二の要素‐の間のサイズ及び形の変動を記載している。しかしながら、本発明は、任意の所望の数の要素、例えば、３、４、５、またはそれ以上が、本書に記載の通り、対応するサイズ及び形を有しうることを考慮している。限定されないが、本明細書の他の部分に記載されたもの、及び、上述した、または本出願の他の部分に記載の要素の任意の１つ以上を組み合わせるものをふくめて、要素の多数の組合せが想定され、これらは本発明の範囲内である。この節に記載の変動は、要素がサイズ及び形によって整合されうる任意のかかる組合せに等しく適用される。

第一の要素が第二の要素に対応するサイズ及び形を有するいくつかの実施形態では、該第一の要素は、該第二の要素と、同じ、ほぼ同じ、または大体同じサイズ及び形を有する。第一の要素が第二の要素に対応するサイズ及び形を有するいくつかの実施形態では、該第一の要素は、該第二の要素と、同様の、または相補的なサイズ及び形を有する。

第一の要素が第二の要素のサイズ及び形に対応するサイズ及び形を有するいくつかの実施形態では、該第一の要素のサイズ及び形は、該第二の要素のサイズ及び形の、プラスマイナス０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、または２０％変動する。

例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、特定の組織部分（例えば、構築、置換、または修復されるべき組織の部分）に対応するサイズ及び形を有する３次元モデルを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の足場、バイオリアクター、移植片室、移植片室挿入物、及び／または組織セグメントに対応するサイズ及び形を有する３次元モデルセグメントを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、組織部分モデル、モデルセグメント、バイオリアクター、移植片室、移植片室挿入物、組織セグメント、及び／または組織移植片に対応するサイズ及び形を有する細胞の足場または細胞の足場前駆体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、組織部分モデル、モデルセグメント、足場、移植片室、移植片室挿入物、組織セグメント、及び／または組織移植片に対応するサイズ及び形を有するバイオリアクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、組織部分モデル、モデルセグメント、組織セグメント、及び／または組織移植片に対応する形及びサイズを有するバイオリアクターの移植片室またはバイオリアクターの移植片室挿入物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、モデルセグメント、バイオリアクター、足場、移植片室、及び／または移植片室挿入物に対応するサイズ及び形を有する組織セグメントを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、特定の組織部分及び／または特定の組織部分の３次元モデルに対応するサイズ及び形を有する組織移植片を提供する。

サイズ及び形の許容される変動は、サイズ及び形によって整合されるべき２つ以上の要素の所望の機能に基づいて決定されうる。第一の要素が第二の要素のサイズ及び形に対応するサイズ及び形を有するいくつかの実施形態では、該第一及び第二の要素は、一方または両方の要素に所望の機能を実行させる、及び／または所望の特性を備えさせるのに適切な、任意の適切なサイズ及び形を有することができる。例えば、いくつかのかかる実施形態では、組織移植片が組織部分を適切に修復することが可能だという条件で、該組織移植片は修復されるべき該組織部分に対応するサイズ及び形を有する。いくつかのかかる実施形態では、細胞の足場が移植片室または移植片室挿入物に圧入状態で収まるという条件で、該細胞の足場は、該移植片室または移植片室挿入物に対応するサイズ及び形を有する。

さらに、当業者には、サイズ及び形のその他の許容される変動が決定されうること、並びに、かかる変動は、本発明の範囲に含まれることが意図されることが理解されよう。

３次元モデル
本発明のいくつかの実施形態において、例えば、組織移植片または組織移植片セグメントの製造用の鋳型としての役割を果たすため、及び／または、かかる組織移植片もしくは組織移植片セグメントの製造に用いられる足場の製造用の鋳型の役割を果たすため、及び／または、組織移植片もしくは組織移植片セグメントの製造に用いられうるバイオリアクター、バイオリアクター室、もしくはバイオリアクター室の挿入物の製造用の鋳型の役割を果たすため、特定の組織もしくは組織部分の３次元モデルが生成され、並びに／または使用されうる。例えば、図４Ａ〜４Ｂ及び図６を参照されたい。いくつかの実施形態では、かかる３次元モデルは、目的の組織部分の３次元形状及びサイズを表すデジタルモデル等のデジタルモデルである。例えば、体内の構造のデジタルモデルもしくは画像等の３次元モデルまたは画像は、当技術分野で周知の任意の適切な方法によって生成することができ、例えば、Ｘ線を用いて体内の構造及び器官の詳細画像を作製するコンピュータ断層撮影（ＣＴ）（マイクロＣＴ等の小型ＣＴを含む）が挙げられる。いくつかの実施形態では、医療用画像工学を用いて所望の組織部分、例えば、骨格異常等の欠損を含む組織部分のデジタルモデルを生成することができ、その後、このデジタルモデルは、例えば、所望の組織移植片または組織移植片セグメントの製造に用いられるように特注設計された足場及び／またはバイオリアクターの製造を可能にすることによって、組織移植片、及び／または１つ以上の組織移植片セグメントの製造を容易にするために使用されうる。組織部分のモデルは、好ましくは、解剖学的に正確で、体の組織部分及び／または所望の組織移植片に対応する寸法、配置、サイズ、及び形を有する。いくつかの実施形態では、該組織の部分は、外傷性または病理学的欠損等の欠損を含んでよい。いくつかの実施形態では、かかる欠損は、本発明に従って製造された組織移植片を用いて修復することができる。組織部分のデジタルモデルは、任意の適切なコンピュータ支援設計（ＣＡＤ）ソフト、例えば、Ａｕｔｏｃａｄ、Ｓｏｌｉｄｗｏｒｋｓ、ＰｒｏＥ、またはＣｒｅｏを用いて作り出すことができる。いくつかの実施形態では、組織部分のデジタルモデルは、編集され、例えば、本発明に従って製造されうる組織移植片セグメントを表す、及び／またはかかる組織移植片セグメントの製造に用いることができる足場またはバイオリアクター室を表す、２つ以上のより小さい下位部分またはセグメント（これらは「モデルセグメント」または「モデル部分」と呼んでもよい）に分割／区分化されうる。該モデルセグメントの厚さは、同じ厚さを有する組織移植片セグメントが効果的にバイオリアクターで灌流されうるように選ばれうる。従って、いくつかの実施形態では、モデルセグメント、及び／または対応する組織移植片セグメント（例えば、骨移植片セグメント）は、厚さまたは最大厚さが約１ｃｍもしくはそれ以下である。いくつかの実施形態では、該モデルセグメント及び／または対応する組織移植片セグメントは、厚さまたは最大厚さが、約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍ、約０．３ｍｍ〜約５ｍｍ、もしくは約０．３ｍｍ〜約１ｍｍである。いくつかの実施形態では、該モデルセグメント及び／または対応する組織移植片セグメントは、厚さが、約０．３、約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、もしくは約１０ｍｍである。

本書に記載のデジタルモデル等の該モデルは、特製のバイオリアクター及び／または特製の足場を設計及び製造するために用いて、該相補的モデルに対応するサイズ及び形を有する体の組織移植片セグメントを育てることができる。デジタルモデルの場合、該モデルまたはモデルセグメントは、任意の適切なファイル形式、例えば、ＩＧＥＳもしくはＳＬＴ形式を用いて作り出されてよく、またはこれに変換されてよく、また、任意の適切なコンピュータ支援製造（ＣＡＭ）ソフト、例えば、ＳｐｒｕｔＣＡＭを用いて作り出されてよく、またはこれに取り込まれてもよい。特製のバイオリアクター及び足場の製造は、本書にさらに記載する。

本発明が提供する組織及びそのセグメントのデジタルモデルは、本書に記載の通り、生成され、編集され、または操作されうる。さらに、当業者には、その他の適切な方法を用いて、本書に記載の通り、組織やそのセグメントのデジタルモデルを生成、編集、または操作してもよいことが理解されよう。

細胞の足場
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片及び／または組織移植片セグメントの製造に、例えば、本書に記載の通りに用いるのに適切な足場を提供する。足場は、使用目的に適した細孔径、空隙率、及び／または機械的性質を有した任意の適切な材料から作製されうる。かかる適切な材料は、通常、非毒性、生体適合性、及び／または生分解性であり、所望の組織移植片型の細胞、例えば、骨組織移植片の場合は造骨細胞によって浸潤可能である。かかる材料の限定されない例としては、脱細胞化組織（脱細胞化骨等）、コラーゲン、ラミニン、及び／もしくはフィブリン等を含む材料またはこれらの１つ以上の細胞外基質（「ＥＣＭ」）成分、並びに天然もしくは合成ポリマーまたは複合体（セラミック／ポリマー複合材料等）が挙げられる。いくつかの実施形態では、該足場は、細胞によって吸収可能（例えば、再吸収可能な材料）でありうるが、他の実施形態では、非再吸収性足場が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、該足場は、上記材料のいずれか、もしくはその任意の組合せを含み、上記材料のいずれか、もしくはその任意の組合せからなり、または基本的に上記材料のいずれか、もしくはその任意の組合せからなりうる。

いくつかの実施形態において、足場の寸法及び配置は、上述した通り、デジタルモデル等の、組織部分または組織セグメントの３次元モデルのものに対応し、及び／または所望の組織移植片セグメントの組織移植片のものに対応する。いくつかの実施形態では、足場の寸法及び配置は、かかるモデルに基づいて設計または選択することができ、バイオリアクター内の足場上で、細胞、例えば、本書に記載の組織形成細胞または他の細胞の培養を容易にし、さらに後述するように、例えば、サイズ及び形がモデルもしくはモデルセグメントに対応する組織移植片または組織移植片セグメントを製造する。いくつかの実施形態では、足場を、適切なサイズ及び形のバイオリアクター室に収まるように設計し、該足場及び細胞を、圧入状態で、その中で直接灌流（例えば、該組織移植片及び／または組織移植片セグメントの製造過程で）させてもよい。図５Ａ〜５Ｂは、本書に記載の例示的足場を示す。

いくつかの実施形態では、該足場は、コンピュータ支援製造を用いて生成またはカスタマイズされる。例えば、組織モデルセグメントのファイルは、当技術分野で周知の任意の適切な方法を用いて幾何学的に定義された足場の製作を行わせるためのＣＡＭソフト、またはその組合せ、例えば、コンピュータ制御のフライス加工法、ラピッドプロトタイピング法、レーザ切断法、３次元印刷、及び／もしくは注型技術とともに用いられうる。いくつかの実施形態では、該足場の製造は、ラピッドプロトタイピング、フライス盤、注型技術、レーザ切断、及び／もしくは３次元印刷、またはこれらの任意の組合せの使用を含む。いくつかの実施形態では、該足場の製造は、該製造がレーザ切断またはフライス盤の使用を含む場合等に、コンピュータ数値制御の使用を含む。例えば、上述した通りにＣＡＤソフトを用いて生成されたデジタルモデル等のデジタルモデルを処理して、コンピュータ数値制御（ＣＮＣ）フライス盤（例えば、Ｔｏｒｍａｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ）を駆動させるための適切な符号（「Ｇコード」等）を生成し、該足場を所望の形及びサイズ（例えば、組織セグメントのデジタルモデルのものに対応する）に切断するために、適切な工作機械工具ビットを選択し、機械加工経路のプログラムを組むことができる。

本発明が提供する足場は、本書に記載の通りに設計及び製造されうるが、当業者には、様々な他の設計及び製造方法を用いて本発明の足場を生成してもよいことが理解されよう。

バイオリアクター
いくつかの実施形態において、本発明は、例えば本書に記載の、組織移植片及び組織移植片セグメントの製造に用いるのに適した、バイオリアクター等の培養容器を提供する。いくつかの実施形態では、該バイオリアクターは、灌流バイオリアクター、例えば、直接灌流バイオリアクターである。組織工学用途の灌流バイオリアクターは、培養システムであって、通常、限定されないが、細胞／足場構築物が配置される１つ以上の室（本書では、「移植片室」と言う）、培地容器、管材回路、及び養分と酸素の大量輸送を可能にするポンプを含めたいくつかの要素からなる。灌流バイオリアクターは、培地が該細胞／足場構築物の周りまたは中を灌流されるかによって、間接または直接システムに大別されうる。バイオリアクターの総説については、その内容を本書に引用して援用するＳｌａｄｋｏｖａとｄｅ Ｐｅｐｐｏ（２０１４），"Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，"Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ２（２）４９４−５２５を参照されたい。

直接灌流バイオリアクターでは、細胞／足場構築物は、培地が該細胞／足場構築物の周りではなく、強制的に該細胞／足場構築物を通過するように、圧入形式で適切な移植片室に配置される。直接灌流バイオリアクターは、様々なヒト骨コンピテント細胞及び生体材料製足場との組合せを用いて代用骨を人工的に作り出すために用いられている。さらに、骨工学の場合、細胞／足場構築物の様々な組合せの直接灌流は、細胞生存及び細胞増殖、並びに成熟した骨様組織の形成を生体外で支援しうることを研究が実証している（総説については、上記Ｓｌａｄｋｏｖａとｄｅ Ｐｅｐｐｏ（２０１４）参照）。

いくつかの実施形態において、本発明は、新規な直接灌流バイオリアクター等の、特定の新規なバイオリアクター、並びにかかる新規なバイオリアクターの設計及び作製方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態モデルでは、デジタルモデル等の、組織部分またはそのセグメントのモデルは、上述した通り、１つ以上の細胞／足場構築物を圧入形式で直接灌流条件下収容できるバイオリアクターの設計及び製造に用いることができる。いくつかのかかる実施形態では、組織セグメントのＣＡＤファイルは、該バイオリアクターの移植片室が、ここで製造されるべき組織移植片または組織移植片セグメントのものに対応するように特注設計されたサイズ及び配置を有するように、また、該足場及び／または組織移植片／組織移植片セグメントが、該バイオリアクターの移植片室に圧入配置でぴったり収まるように、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物を製作するために用いられうる。かかるバイオリアクター、またはその該移植片室もしくは移植片室挿入物は、任意の適切な材料から作製されうる。バイオリアクター、またはその挿入物の製造に適した材料は、当技術分野で周知であり、任意のかかる材料を用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、バイオリアクター、またはその室もしくは挿入物は、ステンレス鋼等の不活性金属製でよく、または生体適合性プラスチックもしくは当技術分野で周知の他の適切な材料製でよい。

いくつかの実施形態において、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物は、コンピュータ支援製造を用いて生成またはカスタマイズされる。例えば、いくつかのかかる実施形態では、組織セグメントのファイルは、ＣＡＭソフトに組み込まれて、幾何学的に定義された足場及び／または組織移植片もしくは組織移植片セグメントを、当技術分野で周知の任意の適切な方法またはその組合せを用いて収容可能なバイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、もしくはバイオリアクターの移植片室挿入物の製作または特注製造を行うことができる。いくつかのかかる実施形態では、該バイオリアクターの製造または特注製造は、ラピッドプロトタイピング法の使用、フライス盤の使用、注型技術の使用、レーザ切断の使用、及び／もしくは３次元印刷の使用を含みうる。いくつかの実施形態では、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、もしくはバイオリアクターの移植片室挿入物の製作または特注製造は、該製造または特注製造過程が、レーザ切断もしくはフライス盤の使用を含む場合等に、コンピュータ数値制御法の使用を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、例えば上述した通りにＣＡＤソフトを用いて生成されたデジタルモデルを処理して、コンピュータ数値制御（ＣＮＣ）フライス盤（例えば、Ｔｏｒｍａｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ）を駆動させるための該適切なＧコードを生成し、及び／または該バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、もしくはバイオリアクターの移植片室挿入物の材料を所望の形（例えば、該組織セグメントのデジタルモデルと相補的な）に切断するために、適切な工作機械工具ビットを選択し、及び／または機械加工経路のプログラムを組んでもよい。さらに、デジタルドローイング及びシミュレーションソフトを用いて、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、もしくはバイオリアクターの移植片室挿入物の設計を最適化し、その制御された製造または特注製造を行うことができる。いくつかの実施形態では、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、またはバイオリアクターの移植片室挿入物は、組織または組織セグメントのデジタルモデルに基づいて設計され、細胞、例えば、組織形成細胞または本書に記載のもしくは当技術分野で周知の他の細胞の足場上での培養を容易にし、該組織または組織セグメントの相補的デジタルモデルに対応するサイズ及び形を有する組織移植片または組織移植片セグメントを製造することができる。

いくつかの実施形態において、本発明のバイオリアクターは、上部要素及び下部要素からなっていてよく、該上部要素及び下部要素は、例えばネジまたは錠で互いに固着されて、限定されないが、移植片室を含めて、１つ以上の内室を形成する。１つの実施形態では、該上部要素は、培地用の容器、流体の出口、及び１つ以上の流路を含む。１つの実施形態では、該下部要素は、流体の入り口及び１つ以上の流路を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のバイオリアクターは、所望の形及びサイズの足場、組織移植片、もしくは組織移植片セグメントを収容するように設計またはカスタマイズされる移植片室を含んでもよい。１つの実施形態では、これは、該バイオリアクターそのものを所望の形及びサイズを有する移植片室を備えるように設計またはカスタマイズすることによって達成されてもよい。別の実施形態では、これは、バイオリアクターの内部に配置された場合に所望の形及びサイズを備える移植片室を製造する移植片室挿入物を用いて達成されてもよい。１つの実施形態では、本発明のバイオリアクターは、厚さが約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍの足場、組織移植片、または組織移植片セグメントを収容するのに十分なサイズの移植片室を含む。いくつかの実施形態では、該足場及び／または組織移植片セグメントは、本書では「フレーム」とも言うことがある移植片室挿入物を用いて該移植片室に配置されてもよい。上述した通り、フレームまたは移植片室挿入物は、移植片室のサイズ及び形をカスタマイズするため、並びに、所望に応じて、足場及び／または組織移植片セグメントを該移植片室の正しい位置に置くために使用されて、例えば、該組織移植片セグメントの、直接灌流下、圧入状態での培養を可能にし、該足場及び／または組織移植片セグメントを通る流体の流れを最大にし、該足場及び／または組織移植片セグメントの周りの流体の流れを最小にしうる。いくつかの実施形態では、該移植片室は、一般的な形またはサイズを有してよいが、１つ以上のフレームまたは移植片室挿入物を用いて、所望に応じて、該移植片室のサイズ及び形（例えば、内側のサイズ及び形）を、該足場及び／または組織移植片セグメントを収容するようにカスタマイズしてもよい。フレームまたは移植片室挿入物は任意の適切な材料から作製されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、該フレーム及び／または移植片室挿入物は、シリコーンやシリコーン様材料等の生体適合性で非毒性の成形可能なプラスチックを含んでも、該プラスチックから基本的になっていても、該プラスチックからなっていてもよい。いくつかのかかる実施形態では、該フレーム及び／または移植片室挿入物は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含んでよい。フレームまたは移植片室挿入物は、限定されないが、本書に記載の方法を含めて、任意の適切な方法によって設計及び製造されうる。

いくつかの実施形態において、本発明のバイオリアクターは、複数の組織移植片セグメントの集団培養を容易にするために複数の移植片室を含みうる（図６Ａ〜６Ｂ参照）。例えば、１つの実施形態では、本発明のバイオリアクターは、所望に応じて、１、２、３、４、５、またはそれ以上の組織移植片セグメントの培養物を収容するように構成されうる。

いくつかの実施形態において、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、及び移植片室のフレームまたは挿入物は、本発明で規定されているように、本書に記載の通りに、例えば、コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）及びコンピュータ支援製造（ＣＡＭ）法を用いて、設計及び製造することができる。しかしながら、当業者には、本発明のバイオリアクター、バイオリアクターの移植片室、及びバイオリアクターの移植片室のフレームまたは挿入物を生成並びにカスタマイズするため、様々な他の方法を用いてもよいことが理解されよう。

細胞
本書に記載の通り、本発明の組織移植片または組織移植片セグメントの製造において、任意の適切な、または所望の種類の細胞もしくは複数の細胞が使用されうる。通常、選ばれた（１つまたは複数の）細胞は、所望の組織移植片（例えば、血管新生化骨移植片については、本書でさらに説明される、間葉系前駆細胞及び内皮前駆細胞または、骨及び血管の形成に適したもしくは形成が可能な他の細胞種類）の形成が可能であり、または、所望の（１つまたは複数の）組織形成細胞に分化可能な任意の（１つまたは複数の）細胞（例えば、多能性細胞）である。使用されうる細胞の限定されない例としては、多能性細胞、幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、前駆細胞、組織形成細胞、または分化した細胞が挙げられる。

該使用される細胞は、任意の適切な起源由来でよい。いくつかの実施形態では、該細胞はヒトの細胞でありうる。いくつかの実施形態では、該細胞は、哺乳類細胞であってよく、限定されないが、非ヒト霊長類、ヒツジ、またはげっ歯類（ラットやマウス等）由来の細胞が挙げられる。例えば、細胞は、組織バンク、細胞バンク、またはヒト対象から入手されうる。いくつかの実施形態では、該細胞は、自己細胞、例えば、得られた組織移植片がその後移植される予定の対象から採取された細胞であり、または、該細胞は、かかる自己細胞から誘導されてもよい。いくつかの実施形態では、該細胞は、「適合」ドナーから採取されてよく、または、該細胞は、「適合」ドナーから採取された細胞から誘導されてもよい。細胞及び組織移植では、ドナーとレシピエントの細胞は、当技術分野で周知の方法で適合されうる。例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングが、組織または細胞ドナーとレシピエントを適合させ、移植片拒絶反応の危険を低減するために広く用いられている。ＨＬＡは、ほとんどの体細胞に見られるタンパク質マーカーであり、免疫系によって、体内に属する細胞とそうではない細胞を見分けるために用いられる。ＨＬＡ適合性は、レシピエントが移植されたものを異物と認識する可能性が低いため、移植の成功の可能性が高まる。従って、本発明のいくつかの実施形態では、使用される細胞は、ＨＬＡ適合細胞またはＨＬＡ適合細胞から誘導された細胞であり、例えば、組織移植片を受ける予定のレシピエント対象とＨＬＡ適合したドナー対象から採取された細胞である。いくつかの実施形態では、使用される細胞は、レシピエントの免疫系によって認識されることを防ぐために修飾された細胞（例えば、普遍細胞）でよい。いくつかのかかる実施形態では、該細胞は、遺伝子組み換え普遍細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、該普遍細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ発現抑制細胞（例えば、Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．"ＭＨＣ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｅｌｌｓ ｓｕｒｖｉｖｅ ｉｎ ａｎ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ"Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１３：：７９６０４６．Ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１３／７９６０４６参照）等のＭＨＣ普遍細胞でよい。ヒトＭＨＣタンパク質は、それらが最初に白血球で発見されたため、ＨＬＡと呼ばれる。普遍細胞は、いかなるレシピエントにも使用される可能性があり、それ故、適合細胞の必要性を回避する。

いくつかの実施形態において、本発明の組織移植片作製に用いられる細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等の多能性幹細胞であるか、またはこれらを含む。いくつかのかかる実施形態では、該多能性幹細胞は、組織移植片を受ける予定の対象から採取された細胞（すなわち、自己細胞）から生成されうる。他のかかる実施形態では、該多能性幹細胞は、異なる、すなわち、組織移植片を受ける予定の対象ではない個体から採取された細胞（すなわち、同種異系細胞）から生成されうる。いくつかのかかる実施形態では、該多能性幹細胞は、異なる個体、すなわち、組織移植片を受ける予定の対象ではないが、例えば上述した通り、「適合」ドナーである異なる個体から採取された細胞から生成されうる。いくつかの実施形態では、使用される細胞は、骨細胞等の分化した細胞である。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、人工多能性幹細胞等の多能性幹細胞由来である。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、分化した体細胞の分化転換によって、または、多能性細胞（多能性幹細胞または人工多能性幹細胞等）、例えば、体細胞から生成された人工多能性幹細胞の分化転換によって得られてもよい。

多能性幹細胞は、（ａ）自己複製並びに（ｂ）３胚葉すべて（すなわち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の細胞を製造するように分化することが可能な細胞である。「人工多能性幹細胞」とは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）同様、３胚葉すべての細胞への分化能を維持しながら長期にわたって培養することができるが、ＥＳ細胞（これらは胚盤胞の内細胞塊から得られる）とは異なり、体細胞由来、すなわち、潜在能力がより狭く、より決められており、実験的操作なしでは、３胚葉すべての細胞を生じさせることができない細胞由来の多能性幹細胞を網羅する。ｉＰＳＣは、通常、ｈＥＳＣ様形態を有し、核‐細胞質比が大きく、明確な境界及び卓越した核の平坦なコロニーとして成長する。さらに、ｉＰＳＣは通常、限定されないが、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、及びｚｆｐ４２が挙げられる、当業者に周知の１つ以上の肝要な多能性マーカーを発現する。さらに、ｉＰＳＣは、他の多能性幹細胞同様、一般的に奇形腫を形成しやすい。加えて、ｉＰＳＣは、一般的に、生物の外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織の形成またはこれら組織への寄与が可能である。

例示的なｉＰＳＣとしては、ＴａｋａｈａｓｈｉとＹａｍａｎａｋａ（Ｃｅｌｌ １２６（４）：６６３−７６（２００６）、その内容を全体として本書に引用して援用する）による記載の通り、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫｌｆ遺伝子が導入された細胞が挙げられる。他の例示的なｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８が導入された細胞である（Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７−１９２０（２００７）、その内容を全体として本書に引用して援用する）。当業者には、ｉＰＳＣ製造のため、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる群から選ばれた因子等の再プログラム化因子の様々な異なる混合物が使用できることが分かるであろう。本書に記載のｉＰＳＣ製造方法は、例示にすぎず、限定されることを意図されない。正確には、当技術分野で周知の任意の適切な方法または再プログラム化因子の混合物が使用できる。再プログラム化因子が用いられる実施形態では、かかる因子は、当技術分野で周知の任意の適切な手段を用いて供給されうる。例えば、いくつかの実施形態では、センダイウィルスベクター等の任意の適切なベクターが使用されうる。いくつかの実施形態では、再プログラム化因子は、修飾ＲＮＡ法及び系を用いて供給されうる。様々な異なる再プログラム化因子の供給方法及び系が当技術分野で知られており、任意のかかる方法または系が使用されうる。

多能性幹細胞等の細胞培養用に適する任意の培地を本発明に従って使用してよく、いくつかのかかる培地が当技術分野で知られている。例えば、多能性幹細胞の培養用の培地は、ノックアウトＤＭＥＭ、２０％ノックアウト血清代替物、非必須アミノ酸、２．５％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、β‐メルカプトエタノール、１０ｎｇ／μＬのｂＦＧＦ、及び抗生物質を含みうる。使用される培地は、この培地を変動させたものでもよく、例えば、２．５％ＦＢＳを除いたもの、ノックアウト血清代替物がより多いもしくは少ない％のもの、または、抗生物質を除いたものでもよい。使用される培地は、ヒト多能性幹細胞の生育を未分化状態で支援する、ｍＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔから入手可能）、もしくはＥＳ培地、または当技術分野で周知の他の適切な培地等の他の適切な培地でもよい。対象から採取された細胞集団からの多能性幹細胞の他の例示的な生成／獲得方法は、本出願の実施例に示す。

いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、所望の細胞種類、例えば、造骨細胞もしくは血管形成細胞、またはその他の所望の細胞種類に分化させられる。本発明が提供する分化した細胞は、当技術分野で周知の様々な方法で、例えば、成体幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）、及び／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ；多能性状態に再プログラム化された体細胞）を用いて誘導されうる。例えば、様々な分化因子を用いた、多能性幹細胞の有向分化または自然発生的分化の方法が、当技術分野で知られている。多能性幹細胞の分化は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて観察されうる。幹細胞と分化因子処理細胞間のパラメータの変化は、該処理細胞が分化したことを示しうる。顕微鏡観察を用いて、分化の過程の細胞の形態を直接観察してもよい。

本発明の実施形態の各々において、本書に記載の組織移植片及び組織移植片セグメントを製造するために、限定されないが、多能性幹細胞もしくは前駆細胞または分化した細胞が挙げられる、任意の適切なまたは所望の種類の細胞を用いることができる。いくつかの実施形態では、該多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞でよい。人工多能性幹細胞が用いられる実施形態では、かかる細胞は、対象から採取された分化した体細胞から、例えば、かかる分化した体細胞を１つ以上の再プログラム化因子と接触させることによって誘導されうる。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、所望の系列、例えば、間葉系列または内皮細胞系列の方向に誘導されていてもよい。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、任意の適切な種類の分化した細胞でありうる。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、多能性幹細胞（人工多能性幹細胞等の）から、例えば、かかる多能性細胞を１つ以上の分化因子と接触させることによって誘導されうる。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、別の分化した細胞種類の、例えば、該細胞を１つ以上の再プログラム化因子と接触させることによる分化転換によって誘導されうる。分化した細胞を含む本発明の様々な実施形態において、かかる分化した細胞は、限定されないが、骨細胞及び血管細胞が挙げられる任意の所望の分化した細胞種類でよい。

細胞／足場構築物
本書に記載の細胞種類などの任意の適切なもしくは所望の細胞種類を、足場に適用もしくは播種して、本発明の組織移植片または組織移植片セグメントを製造することができる。

いくつかの実施形態において、細胞は足場に適用される前に分化した状態にあってよい。例えば、いくつかの実施形態では、分化した細胞は、得られて直接用いられてよい。同様に、いくつかの実施形態では、非分化の細胞を、当技術分野で周知の任意の適切な方法に従って、例えば培養皿もしくはマルチウェルのプレート、または懸濁状態で、適切な期間または時間、例えば、所望の程度の細胞増殖もしくは分化または他のパラメータが達成されるまで培養してもよく、その後、該分化した細胞を該足場に移し、続いて、該細胞／足場構築物をバイオリアクターに挿入し、組織移植片または組織移植片セグメントの成長を促してもよい。いくつかの実施形態では、非分化細胞（例えば、幹細胞（ｉＰＳＣ等）や前駆細胞）が該足場に適用されてもよい。かかる実施形態では、該非分化細胞は、該足場で培養されつつ、分化を経てもよい。

いくつかの実施形態において、２つ以上の異なる細胞集団を足場に播種して、細胞／足場構築物を製造してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、血管新生化骨移植片の製造用に、造骨細胞と血管形成細胞の両方を足場に播種し、共培養してしてもよい（図７参照）。いくつかの実施形態では、該２つ以上の細胞集団は、該細胞／足場構築物が該バイオリアクターに挿入される前に、適切な時間、例えば、所望の程度の増殖もしくは分化または他のパラメータが達成されるまで該足場で共培養される。細胞集団は、任意の成長段階または分化段階の、任意の所望の細胞種類及びその任意の組合せを含んでも、それらから本質的になっていても、それらからなっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、各細胞集団は、異なる組織を形成可能な細胞を含んでよく、例えば、血管新生化骨移植片の製造については、第一の集団が間葉系前駆細胞等の骨を形成可能な細胞を含み、第二の集団が内皮前駆細胞等の血管を形成可能な細胞を含む。いくつかの実施形態では、各細胞集団は、同じ組織（例えば骨）を形成可能な細胞を含んでよいが、各細胞集団は、異なる分化段階（例えば、間充織幹細胞及び骨髄間質細胞）にありうる。共培養されるべき細胞集団は、所望に応じて、同時にまたは異なる時間に足場に適用されてよい。２つ以上の細胞集団が異なる時間に適用される場合、共培養の並びまたは順番（例えば、どの集団が最初に足場に適用されるか、どの集団が２番目に足場に適用されるか、等）は、所望に応じて選択されてよく、例えば、所望に応じて、使用される細胞種類、該細胞集団の状態、成長、もしくは分化、または、他のパラメータによる。２つ以上の細胞集団が足場に適用されるべき場合、それらは、所望に応じて、任意の適切な細胞比で適用されうる。例えば、いくつかの実施形態では、２つの異なる細胞集団は、約１：１、または、約２：８〜約８：２の任意の比で播種されうる。いくつかの実施形態では、該細胞集団は、約２：８、約３：７、約４：６、約５：５、約６：４、約７：３、または約８：２の比で播種されうる。

細胞／足場構築物は、バイオリアクターに、所望に応じて、任意の適切な点、例えば、細胞播種の直後、播種後の細胞培養の特定の期間の後、該播種された細胞が所望の分化状態または他の所望の段階に達した後に移されうる。いくつかの実施形態では、該細胞／足場構築物は、バイオリアクターに挿入され、圧入状態で培養されて、組織移植片または組織移植片セグメントを形成させる。組織／移植片の成長は、限定されないが、組織学的及び免疫組織化学的検査、生化学分析、高分解能特性化技術（例えば、ＳＥＭ、ＦＩＢ−ＴＥＭ、Ｔｏｆ−ＳＩＭＳ）、撮像法（例えば、ＣＴまたはマイクロＣＴ）、並びに機械的検査（例えば、ヤング率、引張及び圧縮強さ）が挙げられる、当技術分野で周知の任意の適切な定性的または定量的手法を用いて評価できる。

当業者には、無数の細胞の変動及び組合せ並びに培養方法が、本発明の範囲に含まれることが理解されよう。例えば、細胞の播種比、分化因子の濃度、及び共培養の順序を含む細胞培養法は、通常、使用される所望の細胞種類または製造される組織移植片に応じて決定されよう。

組織移植片、並びにその組み立て体及び使用
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の組織移植片セグメントから組み立てられる組織移植片、例えば骨移植片を提供する。本発明は、かかる組織移植片の作製方法もまた提供する。かかる方法は、分節付加組織工学（ＳＡＴＥ）法と言うことがある。特に骨移植片の場合、かかる方法は、分節付加骨工学（ＳＡＢＥ）法と言うことがある。任意の適切な時点、例えば、所望の特性を有する組織移植片セグメントが製造されたとき、組織移植片セグメントは、それらが製造されたバイオリアクターから取り出すことができ、複数の組織移植片セグメントを一緒に組み立て、所望のサイズ及び形、例えば、置換されるべき組織部分に対応するサイズ及び形を有する組織移植片を形成することができる。

組み立てられた組織移植片セグメントは、該セグメントの対象とする組み立て体を維持可能な任意の適切な手段または方法によって、互いに固着または結合されうる。例えば、通常、かかる固着手段または方法は、例えば、該組み立てられた組織移植片が対象に移植される予定の場合、非毒性、生体適合性、及び／または再吸収可能（例えば、体内に吸収されることが可能）である。例えば、いくつかの実施形態では、該組織移植片セグメントは、所望に応じて、接着剤、ステッチもしくは縫合糸、ステープル、プレート、ピン及び穴、ネジ、ボルト等を用いて互いに固着されうる。いくつかの実施形態では、該組織セグメントを互いに固着するために使用される手段は、生体適合性もしくは再吸収可能、またはその両方である。

接着剤が該移植片セグメントを互いに固着するために用いられるいくつかの実施形態において、該接着剤は、生体適合性接着剤、例えば、ＮｏｖｏＳｏｒｂ（ＰｏｌｙＮｏｖｏ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，メルボルン）等の生体適合性ポリマー接着剤または任意のゲル、液体、ゴム様物質、もしくは、２つ以上の組織移植片セグメントを互いに固着可能な他の生体適合性接着材料でよい。例えば、骨移植片の場合、骨移植片セグメントを互いに固着するために用いることができる例示的な骨接着剤としては、限定されないが、ポリウレタン系及びポリメチルメタクリレート系骨接着剤等のポリマー系またはポリマー骨接着剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、該接着剤は、テープ、例えば、サージカルテープでありうる。いくつかの実施形態では、組織移植片セグメントは、例えばプラスチック、金属（例えば、チタン）または他の適切な材料製の、１つ以上のプレート、ピン、ネジ、ボルト、ステープル、ステッチ、縫合糸等を用いて互いに固着されうる。いくつかの実施形態では、かかるピン、ネジ、ボルト、ステープル、ステッチ、縫合糸等は、３Ｄ印刷または当技術分野で周知の他の適切な方法を用いて製造されうる。

いくつかの実施形態において、組織移植片が対象に移植される場合等に、例えば、該組み立てられた組織移植片セグメント間の接続を強化するため、及び／または宿主組織に該組織移植片を結合、固定、もしくは固着するために、該組み立てられた組織移植片セグメントを互いに固着する様々な異なる手段及び／または方法が併用されうる（図８参照）。例えば、いくつかの実施形態では、本書に記載の人工的に作り出された骨移植片セグメントは、生体適合性骨接着剤及び金属製または再吸収可能なピンの両方を用いて一緒に組み立てることができる。

該組織移植片セグメントを一緒に組み立て及び固着した後、得られた組織移植片は、対象に移植することができ、ここで、組織移植片は、さらに対象の組織（骨移植片の場合、周囲の骨等）に固定されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明が提供する方法及び組成物は、組織移植片を、治療及び／または美容用途を含む臨床応用のために、人工的に作り出すのに使用されうる。かかる用途の限定されない例としては、組織欠損もしくは損傷または組織損失の修復もしくは置換、組織再建もしくは復元、組織強化（例えば、組織損傷もしくは組織の損失の進行の防止もしくは遅延のため）、または、外科装置の移植支援（例えば、骨移植片は、関節代用品、プレート、もしくはネジ等の外科的に埋め込まれた装置の周囲で骨の修復を助けるために用いることができる）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、けが、疾病、先天性異常、外傷、または感染によって引き起こされた組織欠損または組織損失を有する。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の組織移植片を対象に移植して、該対象の組織欠損、組織損失、もしくは組織損傷を修復または置換することを含む、組織欠損、組織損失、もしくは組織損傷の修復または置換方法を提供する。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、修復または置換される組織のものに対応するサイズ及び形を有する。本発明の組織移植片は、本書に示した分節付加組織工学すなわちＳＡＴＥ法を用いて製造することができる。従って、いくつかの実施形態では、本発明の組織移植片は、２つ以上の組織移植片セグメントを含んでも、これらからなっていても、これらから本質的になっていてもよいとともに、該組織移植片セグメントは、厚さが約１ｃｍ未満、または、厚さが約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍである。いくつかの実施形態では、かかる組織移植片は、例えば対象自身の細胞または組織（例えば、自己細胞または組織）が該組織移植片の生成に用いられた場合、自家移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ；自己生成（ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ、ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ、またはａｕｔｏｇｅｎｉｃ）移植片とも言う）でありうる。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、例えばドナー及びレシピエント対象が、例えばＨＬＡ適合性で適合している場合、同種移植片である（例えば、組織移植片は、レシピエント対象と同じ種のドナー対象から採取した細胞または組織から生成される）。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、異種移植片である（例えば、組織移植片は、レシピエント対象と異なる種のドナー対象から採取した細胞または組織から生成される）。例えば、ヒト組織を含む組織移植片は、ヒツジ等の非ヒト哺乳類に、例えば特定の生体内試験等を行うために、移植されてもよい。

本発明に従って製造され、対象に移植された組織移植片は、例えば上述した通り、任意の適切な、組織の固着が可能な方法で、該対象の既存の構造（例えば組織）に固定、結合、または固着されうる。いくつかの実施形態では、該移植された組織移植片は、接着剤、ステッチもしくは縫合糸、ステープル、プレート、ピン等によって固着される。いくつかの実施形態では、対象の体内に該組織移植片を固着する手段は、生体適合性もしくは再吸収可能またはその両方である。

モデル系及びスクリーニング方法
いくつかの実施形態において、本発明は、様々な生物学的過程または生物学的特性の研究についてのモデル系、並びに、かかる生物学的過程及び／または生物学的特性への様々な薬剤の影響を検査するためのスクリーニング方法を提供する。いくつかの実施形態では、かかる生物学的過程としては、例えば、疾病もしくは障害に関連するもの、または外科的処置に関連するものを挙げることができる。いくつかのかかる実施形態では、かかる生物学的過程または特性としては、例えば、生物組織の形成に関するもの（限定されないが、組織移植片の製造）、例えば、様々な細胞種類の分化もしくは培養に関するもの、様々な細胞種類の機能性組織の形成能に関するもの、または、組織（もしくは組織移植片）の該生物学的、機械的、免疫学的、もしくは他の生物学的特性に関するもの等を挙げることができる。例えば、本書に記載の方法、組成物（例えば、組織移植片）、及び装置（例えば、バイオリアクター）は、特定の疾病もしくは障害の研究用のモデル、または、幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）等の細胞の、機能性組織の形成能の研究用モデル系等のモデル系で、またはこれらと併せて、用いることができる。同様に、本書に記載の方法、組成物（例えば、組織移植片）、及び装置（例えば、バイオリアクター）は、１つ以上の薬剤（薬もしくは他の薬剤等）が、細胞の組織移植片等の機能性組織の形成能に与える影響の研究用のスクリーニング系で、またはこれらと併せて、用いることができる。例えば、１つの実施形態において、本発明は、疾病もしくは障害の進行の治療、防止、もしくは遅延に、または、特定の組織の形成（例えば、幹細胞から）の支援に、または、１つ以上の所望の特性を有する組織移植片の製造に有用でありうる薬剤の同定方法であって、（ａ）本発明の組織移植片を生体外または生体内で試験薬剤と接触させ、（ｂ）該試験薬剤の該組織移植片及び／または上述した生物学的過程もしくは特性のうちの１つへの影響を評価することを含む方法を提供する。いくつかのかかる方法は、組織移植片を対照薬剤と接触させ、該試験薬剤の影響と対照薬剤の影響を比較することを含んでもよい。いくつかのかかる実施形態では、該組織移植片は、前駆細胞、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、または（ｉ）所望の（１つまたは複数の）組織の形成、もしくは（ｉｉ）所望の（１つまたは複数の）組織の形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された細胞を含む。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、血管組織移植片でありうるとともに、該組織移植片は、内皮細胞または他の血管細胞、例えば、前駆細胞（内皮前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、もしくは（ｉ）内皮及び／もしくは血管形成、もしくは（ｉｉ）内皮及び／もしくは血管形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導されたものを含む。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、人工多能性幹細胞を用いて生成される。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、特定の疾病または障害を有する対象由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、本発明の血管組織移植片は、血管系の疾病または障害研究用のモデル系等のモデル系で、または、これらと併せて用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明の血管組織移植片は、１つ以上の薬剤（薬または他の薬剤等）の血管組織への影響の研究用のスクリーニング系で、または、これらと併せて用いることができる。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の組織移植片を含むモデル系を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、非ヒト哺乳類である対象に移植された本発明の組織移植片を含むモデル系を提供する。１つのかかる実施形態では、該非ヒト哺乳類はヒツジである。いくつかの実施形態において、本発明は、試験材料が対象への移植に適するかどうかを判断するのに使用される、本発明の組織移植片または組織セグメントを含むモデル系を提供する。例えば、いくつかのかかる実施形態では、試験材料は、生体適合性、機械的性質、または毒性等の所望の特性について、スクリーニングまたは検査されうる。いくつかのかかる実施形態では、試験材料は、合成材料もしくは天然材料、または合成及び天然材料の混合物でよい。本発明が提供するモデル系は、発症機序の理解、治療標的の定義、及び化合物のスクリーニングの実施などを含めて、限定されないが、移植用の材料のスクリーニングもしくは試験、並びに所定の組織特異的条件下で疾病を研究するため等、様々な目的に用いることができる。

さらに、当業者には、本書に記載の方法、組成物（例えば、組織移植片）、及び装置（例えば、バイオリアクター）は、様々な異なるモデル系及びスクリーニング方法で、またはこれらと併せて用いることができることが理解されよう。

対象
いくつかの実施形態において、本発明の組織移植片の製造に用いられる細胞は、必要または所望に応じて、任意の対象から採取または誘導されうる。いくつかの実施形態では、本発明が提供する方法（例えば、治療方法）及び組成物（例えば、組織移植片）は、必要または所望に応じて（例えば、病理学的もしくは外傷性組織欠損の修復のため、または美容もしくは再建目的用）任意の対象に使用されうる。いくつかの実施形態では、該対象はヒトである。いくつかの実施形態では、該対象は、哺乳類であって、限定されないが、非ヒト霊長類、ヒツジ、またはげっ歯類（ラットやマウス等）を含む。いくつかの実施形態では、第一の対象はドナー対象であり、第二の対象はレシピエント対象である。いくつかのかかる実施形態では、該ドナー対象または該ドナー対象の細胞は、該レシピエント対象または該レシピエント対象の細胞と、例えば、ＨＬＡ型適合性によって適合しうる。

血管新生化骨移植片
１つの実施形態において、本発明は、血管新生化骨移植片の製造方法であって、（ａ）骨部分の３次元モデルを獲得し；（ｂ）段階（ａ）の３次元モデルを２つ以上の骨セグメントモデルに分割し；（ｃ）（ｉ）段階（ｂ）の骨セグメントモデルの各々に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得し；（ｉｉ）該足場を保持するように構成された内部室を有するバイオリアクターを獲得し；（ｉｉｉ）（１）造骨細胞、または造骨細胞に分化可能な細胞、及び（２）血管形成細胞、または血管形成細胞に分化可能な細胞を該足場に適用し；（ｉｖ）該バイオリアクター内で該細胞を該足場上で培養して骨移植片セグメントを形成し；（ｖ）該骨移植片セグメントを該バイオリアクターから取り出すことを含んで、２つ以上の骨移植片セグメントを製造し；（ｄ）段階（ｃ）で製造された２つ以上の骨移植片セグメントを組み立てて、段階（ａ）の骨部分に対応するサイズ及び形を有する骨移植片を形成することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、（ｃ）の（ｉｉｉ）で足場に適用される細胞は、多能性細胞、人工多能性細胞、前駆細胞、分化した細胞、またはこれらの任意の組合せを含む。１つの実施形態では、（ｃ）の（ｉｉｉ）の（１）の細胞は、骨髄間質細胞、間充織幹細胞、間葉系列に誘導された多能性細胞、もしくは分化した骨細胞、またはこれらの任意の組合せを含む。１つの実施形態では、（ｃ）の（ｉｉｉ）の（２）の細胞は、内皮前駆細胞、内皮細胞系列に誘導された多能性細胞、もしくは分化した内皮細胞、またはこれらの任意の組合せを含む。１つの実施形態では、該骨移植片セグメントは、厚さが約１ｃｍまたはそれ以下である。１つの実施形態では、該骨移植片セグメントは、厚さが約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍである。１つの実施形態では、該骨移植片セグメントの組み立ては、接着剤、１つ以上のピン及び穴、または両方を用いて行われる。１つの実施形態では、該ピンは金属製または再吸収可能である。１つの実施形態では、該ピンはチタンである。１つの実施形態では、該接着剤は、生体適合性骨接着剤、例えば、ＮｏｖｏＳｏｒｂ（ＰｏｌｙＮｏｖｏ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、メルボルン）等のポリマー、または任意のゲル、液体、ゴム様物質、もしくは２つ以上の骨セグメントを互いに固着可能な他の生体適合性材料である。骨接着剤の例としては、限定されないが、ポリウレタン系及びポリメチルメタクリレート系骨接着剤等のポリマー系骨接着剤が挙げられる。１つの態様において、本発明は、対象の骨部分の修復または置換方法であって、上述した段階（ａ）〜（ｄ）を含み、さらに、該骨移植片を対象に移植して、該対象の該骨部分を修復または置換することを含む方法を提供する。

１つの態様において、本発明は、本発明の方法によって製造された血管新生化骨移植片を提供する。別の態様において、本発明は、対象の骨部分を修復または置換するための血管新生化骨移植片であって、該骨移植片が２つ以上の骨移植片セグメントを含み、該２つ以上の骨移植片セグメントが互いに連結されて、修復または置換されるべき該骨部分に対応するサイズ及び形を有する血管新生化骨移植片を形成する血管新生化骨移植片を提供する。いくつかの実施形態では、該骨移植片セグメントは、前駆細胞（間葉系前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、または、（ｉ）骨の形成、もしくは（ｉｉ）骨の形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された骨細胞を含む。いくつかの実施形態では、該骨移植片セグメントは、前駆細胞（内皮前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、もしくは、（ｉ）内皮及び／もしくは血管の形成、もしくは（ｉｉ）内皮及び／もしくは血管の形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された内皮または血管細胞を含む。いくつかの実施形態では、各骨セグメントは、最大厚さが約１ｃｍより小さく、または、最大厚さが約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍである。

いくつかの実施形態において、上記方法に従って用いられる、または上記骨移植片の製造に用いられる細胞は、それらが自己細胞、もしくは自己細胞由来であるように、該骨移植片が配置される同じ対象から誘導されるか、または同じ対象から採取された細胞から誘導される。１つの実施形態では、該細胞は、例えば、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、クローン幹細胞、または成体幹細胞（骨髄系幹細胞等）等の多能性幹細胞から誘導される。いくつかの実施形態では、該人工多能性幹細胞は、該骨移植片が配置される同じ対象から、または、ＨＬＡ適合等の適切に適合したドナーから採取された体細胞から誘導されうる。いくつかの実施形態では、該細胞は、間充織幹細胞及び／または内皮前駆細胞である。いくつかの実施形態では、該細胞は、該足場に、細胞比１：１、または、約２：８〜約８：２の任意の比で播種される。

いくつかの実施形態において、本発明は、骨移植片の製造に用いるのに適する、本書に記載のバイオリアクター等の培養容器を提供する。かかる培養容器は、細胞／足場構築物を挿入し、圧入状態で培養することが可能な１つ以上の特製の移植片室を含む灌流バイオリアクターでよい。バイオリアクターは、互いに固着される上部要素及び下部要素を含んでよい。１つの実施形態では、該上部要素は、培地用の容器、流体の出口、及び１つ以上の流路を含む。１つの実施形態では、該下部要素は、流体の入り口及び１つ以上の流路を含む。１つの実施形態では、該培養容器は、コンピュータ支援製造を用いて生成される。１つの実施形態では、該コンピュータ支援製造は、コンピュータ数値制御フライス盤及び／または３次元印刷を含む。

いくつかの実施形態において、該移植片室は、機能性の骨の成熟まで、該（１つまたは複数の）足場／細胞構築物を収容する特製の（１つまたは複数の）室でよい。いくつかの実施形態では、移植片室は、厚さ約０．３ｍｍ〜１０ｍｍの骨のセグメントを収容するのに十分なサイズのものである。

いくつかの実施形態において、該足場及び／または骨セグメントは、フレームまたは挿入物を用いて該移植片室に配置されうる。フレームまたは挿入物は、所望に応じて移植片室のサイズ及び形をカスタマイズし、該足場及び／または骨セグメントを該移植片室に配置して、該骨セグメントを直接灌流下、圧入状態で培養し、該足場及び／または骨セグメントを通る流体の流れを最大にし、該足場及び／または骨セグメントの周りの流体の流れを最小にするために用いられうる。いくつかの実施形態では、該移植片室は、一般的な形またはサイズを有してよいが、（１つまたは複数の）フレームまたは挿入物を用いて、所望に応じて、該移植片室のサイズ及び形（例えば、内側のサイズ及び形）を、該足場及び／または骨セグメントを収容するようにカスタマイズしてもよい。フレームまたは挿入物は、任意の適切な材料、例えば、生体適合性で非毒性の成形可能なプラスチック製でよい。

１つの実施形態において、本発明は、例えば、本書に記載の通りの骨移植片の製造用に適する足場を提供する。１つの実施形態では、該足場はコンピュータ支援製造を用いて生成される。別の実施形態では、該製造は、コンピュータ数値制御フライス盤、注型技術、レーザ切断、及び／または３次元印刷を含む。１つの実施形態では、該足場は、脱細胞化骨組織から基本的になる。１つの実施形態では、該足場は、合成セラミック／ポリマー複合材料を含む。１つの実施形態では、該足場は、細胞による吸収が可能な材料から基本的になる。

いくつかの実施形態において、本発明は、骨疾患もしくは障害及び／または血管疾患もしくは障害用モデル系であって、本発明の血管新生化骨移植片を含むモデル系を提供する。１つの態様において、本発明は、骨の欠損、欠陥、疾患、または障害用のモデル系であって、２つ以上の骨移植片セグメントを含む血管新生化骨移植片を含むモデル系であり、該２つ以上の骨移植片セグメントが、互いに連結されて骨移植片を形成するモデル系を提供する。１つの態様において、本発明は、骨の欠損、欠陥、疾患、または障害の治療に有用でありうる化合物の同定方法であって、（ａ）互いに連結されて骨移植片を形成する２つ以上の骨移植片セグメントを含む骨移植片を生体内または生体外で試験薬剤と接触させ、（ｂ）該試験薬剤が、（ａ）の骨移植片の、機能を改善するか、成長を高めるか、または変性を防止もしくは遅延させるかどうかを決定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該骨の欠損、欠陥、疾患、または障害は、先天性、病的、もしくは外傷性欠損、美容目的の処置、変性疾患、悪性形質転換に伴う外科的切除、または慢性感染症を含む。１つの態様において、本発明は、血管疾患または障害の治療に有用でありうる化合物の同定方法であって、（ａ）互いに連結されて血管新生化骨移植片を形成する２つ以上の血管新生化骨移植片セグメントを含む血管新生化骨移植片を生体内または生体外で試験薬剤と接触させ、（ｂ）該試験薬剤が、該血管疾患または障害の治療または進行の防止もしくは遅延をさせるかどうかを決定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該骨移植片セグメントは、前駆細胞（間葉系前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、または、（ｉ）骨の形成、もしくは（ｉｉ）骨の形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された骨細胞を含む。いくつかの実施形態では、該骨移植片セグメントは、前駆細胞（内皮前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、もしくは（ｉ）内皮及び／もしくは血管形成、もしくは（ｉｉ）内皮及び／もしくは血管形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された内皮または血管細胞を含む。いくつかの実施形態では、各骨セグメントは、最大厚さが約１ｃｍより小さいか、または、最大厚さが約０．３ｍｍ〜約１０ｍｍである。

以下の限定されない実施例により、本発明の様々な実施形態がさらに説明されうる。

大きな骨格異常の修復のための血管新生化骨移植片の人工的作出
はじめに
外傷、先天性異常、及び疾病に起因する骨欠損は、世界中で患者の増加に影響を与えており、骨修復及び再生療法の米国総年間市場は、２０１７年までに３５億に達すると予測される。これら患者に対する、人工材料の注入または骨組織の移植に頼る現行の治療は最善ではなく、多数の臨床例で、骨格の完全性及び機能性を回復するための別の治療方針が求められている。

本実施例は、複雑な骨格異常の治療の改善のため、ヒト人工多能性幹細胞等（ｈｉＰＳＣ）からの血管新生化骨移植片を人工的に作り出すための戦略を提案する。とりわけ、事実上無限の任意の患者のため、健康な骨を構築する自己骨形成原細胞及び血管細胞をｈｉＰＳＣから誘導する能力は、前例のない治療的資源を意味する。血管新生化代用骨は、骨の発達の生体模倣足場‐バイオリアクター手法を用いて人工的に作り出される。コンピュータ支援及びラピッドプロトタイピング技術が、任意の形及びサイズの代用骨の製造を可能にする。大きな骨欠損のデジタルモデルが作り出され、その後、３Ｄ印刷等のコンピュータ支援設計及び製造技術を用いて、特製の生体材料製足場及びバイオリアクターを製造するために用いられる相補的下位部分に分割される（図１参照）。該工学戦略案は、大きな骨移植片の灌流培養に伴う制約を克服する。間葉系及び内皮前駆細胞は、任意の可能な再プログラム化法を用いて生成されたｈｉＰＳＣから誘導され、その後、準拠した足場と組み合わされ、機能性血管組織の成熟まで、灌流バイオリアクターで培養される（図２参照）。人工的に作り出された骨セグメントは、元の欠損の形と寸法を合わせるため、その後生体適合性骨接着剤を用いて一緒に組み立てられ（レゴ様手法）、及び／または３Ｄ印刷されたチタンの穴とピンを用いて補強される。今後の研究は、ｈｉＰＳＣで人工的に作り出された骨の治療可能性の、複雑な骨格異常の様々な動物モデルを用いた研究に向けられるであろう（図３参照）。

大きな幾何学的に定義された血管新生化骨移植片をｈｉＰＳＣから人工的に作り出すことは、重度の骨量減少によって特徴づけられる骨格異常の治療に対する新規な解決法を意味し、多くの患者に個別治療をもたらす機会を開く。重要なこととして、かかる骨移植片は、骨の発達及び病理の研究のための、並びに新薬及び試験生体材料のスクリーニングの研究のための適格なモデルを表す。

本実施例は、骨格異常の治療の改善のため、血管新生化骨移植片を、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から人工的に作り出すために設計された研究を記載する。患者特異的骨移植片は、生体外での骨の発達の生体模倣足場‐バイオリアクター手法を用いて人工的に作り出され、コンピュータ支援及びラピッドプロトタイピング技術の助けを借りてカスタマイズされ、特異的な臨床的必要性を満たす。患者特異的特製骨移植片の人工的作出は、重度の骨減少によって特徴づけられる臨床的症状において、骨格の完全性及び機能性を回復するための革新的治療の発展に用いられうる。

骨格再建療法は、例えば、先天性（１）及び外傷性（２）骨格異常の再建、美容目的の処置、悪性形質転換後の変性疾患及び外科的切除（３）、並びに慢性感染症（４）に伴う骨欠損を防ぐために必要である。骨の置換及び修復療法に対する世界市場は巨大であり（５、６）、骨組織代替物の必要性は、人口の急増と平均余命の延長によって、増え続けている（７、８）。今日、加齢に伴う骨折を報告している高齢者の数は世界中で年間１億を超えると推定され（９〜１１）、この数は、次の数十年間に増え続け、高齢者（＋６５歳）の数は、２０５０年までに約２０億人になると予測されている（１２）。従って、複雑な骨の再建に対する効果的な治療の開発への新たな手法が求められている。生体模倣組織工学戦略は、近年、機能性組織の成熟を導く機械的な刺激及び適切な環境を与えるバイオリアクターで、適切な培養条件下、骨コンピテント細胞を生体材料と接合させることによる機能性代用骨の生体外培養について研究されている。ヒト間葉幹細胞を骨誘導性足場‐灌流バイオリアクターシステムで培養して、幾何学的に定義された代用骨を人工的に作り出そうとする試みが近年報告されている（１３）。しかしながら、１）成体組織由来の幹細胞の限られた再生能、２）血管新生の欠如、及び３）直接灌流バイオリアクターでの大きな代用骨の培養に関する制約には対処されていなかったが、すべてが、大きく複雑な骨格異常の治療の改善用の機能性移植片を人工的に作り出す能力に影響を与える。特に、大きな細胞／足場構築物の人工的作出は、該大きな構築物による流れ抵抗のため、直接灌流バイオリアクターを用いると厄介である。足場内での新生組織の発達は、該構築物を通る流体の灌流を次第に制限し、灌流システムの機能にマイナスの結果をもたらす。独自の調査で、４ｘ４ｍｍの構築物を直接灌流バイオリアクターで５週間培養した場合に、同様の状況が観察されることが証明された。

本実施例は、血管新生化代用骨をｈｉＰＳＣから人工的に作り出し、医用撮像法、コンピュータ支援技術、及びラピッドプロトタイピングの組み合わせを採用して、臨床的に意義のある代用骨の灌流バイオリアクターでの構築を可能にするための研究を提案する。本戦略は、骨欠損という負担に対処するための新規で革新的な解決を意味し、多くの患者の健康状態と生活の質を改善することによって、その臨床解釈は著しい社会的影響を持つであろう。これらの研究は、多能性幹細胞の成熟組織及び器官への機能分化の理解に重要な、ｈｉＰＳＣの生態についての新たな洞察も与えるであろう。さらに、ｈｉＰＳＣで人工的に作り出された血管新生化骨移植片は、健康及び病的状態での組織発達を研究するための、並びに自然な骨環境のいくつかの面に似た枠組みの中で、新たな薬剤及び生体材料を試験するための貴重な高忠実度モデルを提供するであろう。

背景
骨は、固有の再生及び自己修復能力を見せるが、この能力は、小さな骨折に限られており、多数の病態で、組織の完全性及び機能性を回復するための再建的治療が必要とされている（１４）。現行の治療は、自己及び／もしくは同種異系の骨移植片の移植、または、骨伝導性及び骨誘導性の移植片材料の注入に基づいている。自己骨移植片は、免疫忍容性並びに骨の再生及び修復を支援する必須成分の供給のため、骨置換治療の代表的な治療であるものの、限られた供給力及びドナー部位の病的状態が、しばしばそれらの臨床用途を限定する（１５）。その一方、同種異系脱細胞化骨移植片は、大量に得られるが融合が遅く（１６）、感染伝播の危険を伴い、移植片拒絶反応につながる免疫不適合を呈しうる（１７）。人工材料の注入は、疾病の伝播、複雑な形、及び供給力を含む自己及び同種異系移植片が直面する制限の一部を克服するが、融合に劣り、しばしば生体材料関連の感染をもたらし、生物学的機能性と機械的適合性を欠き、移植不全及び置換につながる（１８）。骨組織工学は、無限量の生育しうる代用骨を人工的に作り出す可能性を開いて特定の臨床的必要性を満たすため、有望な治療の解決法を象徴する（１９）。成体組織由来のヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）は、有望な結果を伴って骨工学用途に広く用いられているが、限られた供給力、不十分な再生能、並びに生体外での拡大及びドナーの年齢に伴う機能性の減少のため、臨床応用の可能性が限られる（２０〜２３）。

サイズ範囲が約１ｃｍの代用自家骨は、成体幹細胞から成長し、実験動物及びヒトでの骨の治癒を促すために用いられている（２４、２５）。しかしながら、それらの臨床的サイズへの拡大及び機能性は、血液の供給不足、並びに培養成体幹細胞の限られた増殖及び血管形成能のために限定される。適切な血液供給が、正常な骨折の治癒の必須要素として認められており、骨折部位の血管形成不全が、不良転帰が生じる際に主として考慮されている（２６）。血液供給の減少は、移植組織の低酸素症と壊死につながり、骨形成の低下（「萎縮骨」）をもたらしうる。同様に、血管供給への連結がない大きな細胞化代用骨の移植は、該移植物の内部領域で細胞死をもたらしうる。細胞生存及び骨再生を促進するため、最近の組織工学的手法は、代用骨内への内皮前駆細胞または血管網の移植を取り込んでいる（２７〜２９）。内皮細胞及び骨形成原細胞の直接共培養モデルにおける好ましい効果が研究で示されている（３０、３１）。さらに、内皮細胞とＢＭＳＣの共移植が生体内での骨新生を促進したこと（２８）、並びに、代用骨内で人工的に作り出された内皮網が、宿主の血管系と機能的に吻合しうること（２７、３２）を研究が示唆する。

多能性幹細胞は、高い再生能及び健康な骨組織を構築するすべての特異性細胞への分化能を呈する（３３、３４）。核の再プログラム化技術を用いて誘導された場合、多能性幹細胞は、個別の用途のための患者特異的代用骨を構築させる。最近、間葉系及び内皮前駆細胞の両方が、多能性幹細胞から誘導されており（３５〜４０）、大きな骨格異常の再構築の改善のための血管新生化代用骨の無制限の構築への新たな機会を開いている。それ故、重度の骨格異常及び骨障害に冒された多くの患者に対する安全かつ有効な治療を発展させるため、人工多能性幹細胞から血管新生化骨移植片を人工的に作り出す可能性を探索することは重要である。

結果
本発明者らは、成体組織由来の間充織幹細胞及びヒト多能性幹細胞からの代用骨の培養に幅広い経験がある。ｈＭＳＣ、及びヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株由来の間葉系前駆細胞の相対的再生能を調べる一連の研究は、ｈＥＳＣで誘導された間葉系前駆細胞の骨工学用途への比較優位を示した（２０、３５、３６）。バイオリアクターでの足場における単層及び３Ｄ培養の研究は、ｈＥＳＣで誘導された間葉系前駆細胞が、形態、表面抗原、及び包括的な遺伝子発現プロファイルの観点からｈＭＳＣに高度に似ているが、骨工学用途の機能性代替物の無制限の構築にすべて最重要な特徴である、より高い増殖力、生合成活性、及び石灰化特性を呈することを示した。該誘導プロトコルは、異なる組織から、非組み込み型ベクターに基づく異なる再プログラム化技術を用いて生成されたｈｉＰＳＣ株にまで拡張され、個別の用途の安全な患者特異的代用骨を人工的に作り出す可能性を開いている。ｈｉＰＳＣ株は、多能性と核型を評価するため、間葉系列へ７日間誘導される前に、免疫組織化学によって特徴づけられた。間葉状表現型は、フローサイトメトリー、並びに、単層（骨形成、脂質生成）及びペレット培養（軟骨形成）での表面マーカー発現及び分化能の調査によって特徴づけられた。骨形成系列への分化は、アルカリホスファターゼ及び石灰化によって確認され、軟骨形成系列への分化は、グリコサミノグリカンによって示され、脂質生成系列への分化は脂質特性化によって示された。

細胞は、次に脱細胞化骨足場（４ｍｍΦｘ４ｍｍ高さ）に播種し、免疫不全マウスへの１２週間の皮下移植前の５週間、骨形成培地で一定の灌流下（直線流速８００μｍ／秒）培養し、安定性とさらなる組織の成熟を評価した。人工的に作り出された骨の組織学的及び免疫組織化学的分析を、バイオリアクターでの培養及び免疫不全マウスでの皮下移植の後に行った。顕微鏡写真は、表現型的に安定した骨状組織の成熟及び血管新生を認めた。人工的に作り出された骨のマイクロＣＴ分析は、ミネラル濃度及び構造パラメータの増加を認めた（４１）。

要するに、これらの結果が示すのは、間葉系前駆細胞は、ｈｉＰＳＣ株から誘導することができ、個別の用途における骨格異常の修復治療用の、成熟した、表現型的に安定な骨組織を人工的に作り出すのに利用できるということである。すべての研究において、灌流バイオリアクターは、それらが生物力学的刺激を細胞に与え（１３）、構築物の内部で細胞の生存を支援し、厚く均質な骨状基質の製造をもたらす（４１）ため、骨の発達のためには特に重要であることが示された。研究は、ここで、大きく幾何学的に複雑な骨格異常の治癒を改善するための血管新生化代用骨を人工的に作り出すために適切なプロトコルの開発に向けられる。予備研究で、機能性内皮前駆細胞が、ｈＥＳＣ株から誘導されうることが示された。管理された条件での胚様体の分化の後、単離されたＣＤ３４陽性細胞は、ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬを特異的に内在化し、マトリゲルにプレート化された際に管を形成することが可能であった。この手法は、患者特異的多細胞複合代用骨の構築のため、ｈｉＰＳＣに置き換えられている。

さらに、３Ｄ培養における血管新生の予備研究で、ｈｉＰＳＣで誘導された間葉系前駆細胞とヒト骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）との共培養が、両方とも、細胞がフィブリン塊に埋め込まれた場合、または、骨格修復治療用のより適合する基材の典型となる脱細胞化骨足場に播種された場合に、長期にわたる血管網の形成をもたらすことが示された。興味深いことに、血管構造の数と安定性は、ＨＵＶＥＣがｈｉＰＳＣで誘導された間葉系前駆細胞とヒトＢＭＳＣとともにフィブリン塊で培養された場合に同様であった。落射蛍光顕微鏡写真で、播種後３週間で、安定な３Ｄ血管網の存在を認めた。塊断面のヘマトキシリン／エオシン染色では、ｈｉＰＳＣ株１０１３Ａから誘導された間葉系前駆細胞とＢＭＳＣのＨＵＶＥＣとの共培養の両方について、播種後４週間で、構築物全体に中空血管の存在を認めた。生体外での血管網の形成を追うため、フィブリン塊に埋め込む前に、細胞集団を異なるＶｙｂｒａｎｔ追跡用色素で特異的に標識し、骨形成及び内皮誘導培地の混合物中で、組織学的分析用の収穫の前に４週間培養した。ＨＵＶＥＣを単独で培養した場合には、血管構造は観察されず、間葉細胞の組織の血管新生の支援及び誘導に対する極めて重要な役割を示唆した。生体外での血管新生化骨組織の成熟を支援するための改良されたプロトコルを開発するために、この発見の根底にある分子機構を同定する研究が行われうる。

同様の結果が、細胞を脱細胞化骨足場（８ｍｍΦｘ２ｍｍ高さ）に播種し、骨形成及び血管誘導条件で６週間培養した場合に観察された。オステオカルシン、オステオポンチン、及び骨シアロタンパク質のポジティブ染色法によって証明された骨状組織の成熟は、構築物の内部での中空血管網の形成を伴った。免疫組織化学的検査は、該管状構造が内皮マーカーＣＤ３１に対して陽性であったことを示した。

血管新生化骨組織形成を改善する可能性を探索するため、並びに、他のｈｉＰＳＣ株の、血管新生化骨移植片を人工的に作り出す可能性を評価するために、異なる播種比、及び培養条件を試験することができる。さらなる研究は、血管新生化過程における灌流バイオリアクターでの動的条件の影響を探索することを目的とする。適切な血管新生化プロトコルの開発は、生体模倣骨誘導足場‐灌流バイオリアクター手法との併用で、複雑な骨格異常の個別の修復治療用の血管新生化骨移植片の構築を可能にするであろう。

研究設計及び方法
本実施例は、系統特異的骨形成及び内皮前駆細胞の誘導から続けて、これら前駆細胞を、生体外での機能性骨組織の制御された発達を保証する「生体模倣」足場‐バイオリアクターモデルにて共培養する段階的分化手法を用いて、ｈｉＰＳＣから血管新生化骨移植片を人工的に作り出すことを提案する。大きな幾何学的に複雑な骨格異常の再建用の特製の代用骨の製作を可能にするため、コンピュータ支援及びラピッドプロトタイピング技術が用いられる。患者特異的な特製の骨移植片の人工的作出を用いて、重度の骨量の減少によって特徴づけられる臨床症状における骨格の完全性及び機能性を回復するための革新的治療を発展させることができる。本実施例は、以下に記載の通り、３つの下位プロジェクトを説明する。

１．骨格モデルのコンピュータ支援設計（ＣＡＤ）並びに生体材料製足場及び灌流バイオリアクターのコンピュータ支援製造（ＣＡＭ）
パート１の目的は、骨格異常のデジタルモデルを創生及び精緻化し、特製の生体材料製足場及び灌流バイオリアクターの設計と製造を誘導することである。骨格異常のデジタルモデルは、ＣＡＤソフトを用いて作り出されて相補的下位部分に分割され、その後、これらのモデルは、対応するサイズ及び形の生体材料製足場及び特製の灌流バイオリアクターのコンピュータ支援製作の参照として使用される。バイオリアクターは、各特異的細胞／足場構築物を、圧入形式で収容し、直接灌流下での培養を可能にするため、該デジタルモデルを用いて機械加工及び／または自由形状製作される。

骨格異常のデジタルモデルは、ＣＡＤソフト（例えば、Ａｕｔｏｃａｄ、Ｓｏｌｉｄｗｏｒｋｓ、ＰｒｏＥ、Ｃｒｅｏ）を用いて作り出される。工学戦略案の治療可能性を実証するため、この手法を異なるサイズ及び形の欠損モデルに拡大することができる。ＣＡＤでの骨格異常の参照モデルは、編集され、灌流システムに影響を与えずに灌流バイオリアクターで培養可能なより小さい相補的下位部分（レゴ様組み立て部品）に分割される。分割された骨試料ファイルは、次に共通ＩＧＥＳまたはＳＬＴフォーマットで保存され、ＣＡＭソフト（例えば、ＳｐｒｕｔＣＡＭ）に取り込まれる。ＣＡＭソフトで生成されたファイルは、次に処理されて、コンピュータ数値制御（ＣＮＣ）フライス盤（例えば、Ｔｏｒｍａｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ）を操縦するための適切なＧコードを生成し、適切な工作機械工具ビットを選択し、機械加工経路のプログラムを組んで、該足場を所望の分節形状に切断する。適切なサイズの骨梁（ウシ及び／またはヒト）のプラグがドリルで穴開けされ、骨髄を除去するために高圧水蒸気で洗浄され、その後、前述（４１）の通り細胞物質を取り除くために連続的に洗浄される。脱細胞化骨プラグは、次に凍結乾燥され、該骨格異常の分割された試料の形及びサイズに対応する足場の製作に用いられる。合成の、再吸収可能な機械的適合性セラミック／ポリマー複合材料の使用可能性は、臨床応用のための代用骨の再現性のある大規模製作のために必須の要件を象徴するため、並行して模索される。製作された足場は、滅菌され、細胞の播種の前に培地中で一夜調整される。ＣＡＤで編集された分割された骨試料ファイルは、次に、（１つまたは複数の）細胞／足場構築物を直接灌流条件下、圧入形式で収容可能な特製のバイオリアクターを設計するために用いられる。再度、該ＣＡＤファイルは共通フォーマットに変換され、ＣＡＭ及び／または３Ｄ印刷ソフトに取り込まれ、異なるプラスチック材料を用いてバイオリアクターを製作するのに用いられる。各バイオリアクターは、例えば、金属製ネジで互いに固着されることになる２つの部分（上部及び下部）で構成される。該細胞／足場構築物は、該上部及び下部要素の間で培養される。該下部は、限定されないが、流動灌流の入り口及び流路、並びに該細胞／足場構築物を収容するための解剖学的に造形された室を含む主要素を具備する。該上部は、培地の容器及び流動灌流の出口等の要素を具備する。該入り口と出口を連結し、蠕動ポンプの制御によって該バイオリアクターの至る所で灌流させるために、管系を用いることができる。

２．特製の灌流バイオリアクターでの血管新生化骨の人工的作出
パート２の目的は、生体外で血管新生化された患者特異的骨移植片を人工的に作り出すことである。非組み込み型ベクターを用いて異なる組織から再プログラム化したｈｉＰＳＣ株は、機能性血管新生化骨組織の成熟を導くため、生体模倣条件下、骨誘導性足場‐灌流バイオリアクターシステムでの培養に先立って、間葉及び内皮細胞系列に誘導される。

異なるドナー及び起源組織（ＢＣ１及び１０１３Ａ株）から、非組み込み型ベクターを用いて再プログラム化したｈｉＰＳＣは、間葉及び内皮細胞系列に誘導される前に、拡大され、多能性を特性化され、核型分類される。誘導された前駆細胞は、拡大され、フローサイトメトリーで特性化され、遺伝的正常性を評価するために核型分類される。生体外での骨形成及び内皮の表現型を評価するため、組織学的及び免疫組織化学的検査、生化学的及び形態学的分析、並びに遺伝子発現解析を含めた定性的及び定量的手法が用いられる。血管誘導は、単層培養及び胚様体で、特異的因子（ＢＭＰ−４、アクチビン、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ）の存在下で検査される。分化した前駆細胞は、表面抗原発現（ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＫＤＲ、Ｃ−ＫＩＴ）に基づいて分類され、内皮の培地で培養される。前駆細胞の収率、生存能力、増殖、及び表現型‐特異的マーカー発現（ＣＤ３１、ｖＷＦ、ＶＥ−カドヘリン、ＳＭＡ）は、フローサイトメトリー、免疫蛍光、及び遺伝子発現によって評価される。ネットワーク形成及び発芽は、共培養研究の前に、コラーゲン／フィブロネクチン／マトリゲルに封入して検査される。ｈｉＰＳＣから誘導した間葉系及び内皮前駆細胞の品質と機能性を評価するために、市販のＢＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ）及びＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）が参照株として用いられる。血管新生化骨組織を人工的に作り出すため、ｈｉＰＳＣから誘導した間葉系及び内皮前駆細胞は、脱細胞化骨足場（またはその他）に共播種され、バイオリアクター中、骨形成及び内皮の混合培地で、培養される。予備分化、細胞の播種比、分化因子の濃度、及びフィブリン封止剤の使用は、生体外での完全血管新生化骨移植片の発達のための最適培養条件を設計するために模索される。バイオリアクターでの培養は、成熟した血管新生化組織の形成まで、３〜５週間行われる。組織発達は、組織学的及び免疫組織化学的検査、生化学分析、高分解能特性化技術（ＳＥＭ、ＦＩＢ−ＴＥＭ、Ｔｏｆ−ＳＩＭＳ）、撮像法（マイクロＣＴ）、並びに機械的検査（ヤング率、引張及び圧縮強さ）を含めた定性的及び定量的手法を用いて評価される。

３．人工的に作り出された骨セグメントの接着及び安定性の評価
パート３の目的は、複雑な骨格の再建のための特製の骨移植片を製作することである。人工的に作り出された血管新生化骨セグメントは、生体適合性骨接着剤を用いて骨格異常の形に合わせるために組み立てられるか、または、３Ｄ印刷された金属製（例えば、チタン）もしくは再吸収可能なピン及び穴を用いて補強される。今後の研究は、臨界サイズの骨格異常（負荷及び無負荷解剖学的部位の両方で）の動物モデルでの人工的に作り出された骨の安全性及び有効性の調査に向けられるであろう。

人工的に作り出された骨セグメントは、大きな骨移植片を溶着させるために生体適合性骨接着剤を用いて骨格異常のモデルの形を合わせるために組み立てられるか、または３Ｄ印刷された金属製（例えば、チタン）もしくは再吸収可能なピン及び穴を用いて補強される。今後の研究は、複雑な臨界サイズの骨格異常（負荷及び無負荷骨格部位の両方で）の動物モデルでの人工的に作り出された骨の安全性及び再生能の調査に向けられるであろう。例えば、成体動物の大腿骨頭欠損のデジタルモデルは、医用撮像法（ＣＴスキャン）並びに加工及び分割された（上述の通り）３Ｄ画像を用いて作り出され、本書に記載の通り、血管新生化骨を人工的に作り出すために用いられる。次に、骨格の完全性及び機能性を回復するため、生成されたデジタルモデル（上述した通り）と人工的に作り出された血管新生化骨の場所をもとの位置に合わせて、ある程度まで大腿骨頭を取り除くための大腿骨頭骨切り術が該動物で行われる。再生組織の組織発達、治癒、及び品質は、医用撮像法を用いて生体内で、並びにそれに続く外植で組織学的及び免疫組織化学的手法、高分解能特性化技術（例えば、ＳＥＭ、ＦＩＢ−ＴＥＭ、Ｔｏｆ−ＳＩＭＳ）、並びに機械的検査（例えば、ヤング率、引張及び圧縮強さ）を用いて評価される。

本書に記載の通り、血管新生化骨移植片は、個別の再建治療用に、ヒト人工多能性幹細胞由来の骨形成及び内皮前駆細胞を用いて人工的に作り出すことができる。内皮前駆細胞はｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの両方から誘導することができる（３８〜４０）が、該誘導の有効性は低く、誘導された前駆細胞は増殖能に乏しく、大きな血管新生化代用骨を人工的に作り出すための十分な細胞生成の可能性が制限される。ｈｉＰＳＣからの高増殖性の内皮前駆細胞誘導の最適化と並行して、適切な血管新生化プロトコルの発展を加速するため、市販のＨＵＶＥＣを使い、その後該プロトコルをｈｉＰＳＣ由来の内皮前駆細胞に置き換えることができる。ｈｉＰＳＣ由来の間葉系前駆細胞は、内皮細胞系列への誘導の前に必要量まで拡大し、その後血管新生化代用骨を人工的に作り出すために用いてもよい。

本書に記載の通り、人工的に作り出された代用骨は、大きな骨移植片の溶着用の生体適合性骨接着剤を用いて組み立て、骨格異常の形を適合させることができるが、高い荷重がかかる場所への移植後に安定した連結を確保するには不十分の可能性がある。この問題を解決するため、３Ｄ印刷された金属製または再吸収可能なピン及び穴を用いた補強を含めて、別の解決法が試されるであろう。

ヒト幹細胞
ヒトｉＰＳＣからの血管新生化骨移植片の製造のため、段階的プロトコルが提案される。これは、（ａ）ヒトｉＰＳＣからの骨形成及び血管前駆細胞の分化及び拡大、並びにこれらの新たな組織形成についての機能的可能性の検査；（ｂ）脱細胞化骨足場または他の生体適合性及び再吸収可能な生体材料製足場の製造及び播種；並びに（ｃ）微小血管網の形成と併せて／連続して、造骨組織相の培養を含む。

細胞株：ヒトｉＰＳＣ株１０１３Ａ（ＮＹＳＣＦ研究所にてセンダイウィルスによって得られた）及びＢＣ１（エピソームプラスミドベクターによって得られた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いることができる。初期研究は、ＥＳＣ株Ｈ９（Ｗｉｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）及び市販の成熟細胞（Ｌｏｎｚａ製ＢＭＳＣ及びＨＵＶＥＣ）と並行して行われる。

材料の調達先
ヒトｉＰＳＣ株ＢＣ１は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。もともとは匿名のドナーの骨髄から誘導されたこの株は、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１年１月１８日）で発表された。この株は、対照株として用いられているが、今後の対照株がこれに対して試験されるであろう。

ヒトｉＰＳＣ株１０１３Ａは、ニューヨーク幹細胞財団研究所にて、皮膚生検から得られた。

参照のＢＭＳＣ及びＨＵＶＥＣ株は、市販されており、Ｌｏｎｚａから入手可能である。

結論
このプロトコルから生じたデータは、ｈｉＰＳＣ由来の血管新生化代用骨開発の概念実証を提供すると期待されている。生体模倣条件で、足場及びバイオリアクターを用いて培養されたｈｉＰＳＣによる骨形成及び血管新生についての新たな洞察が得られるであろう。さらに、人工的に作り出された血管新生化代用骨は、骨の発達及び疾患の生体外定量分析のための、並びに自然な骨環境の選ばれた面に似た枠組みの中で、薬剤スクリーニング及び生体材料試験の貴重な高忠実度モデルを提供するであろう。

実施例中の引用文献：
以下に記載されている各参考文献、及び本特許出願に引用した他の参考文献のすべては、全体として本書に引用して援用する。

前記発明は、明確さと理解のために詳細に記載してきたが、当業者には、本開示を解釈することで、形式上及び細部における様々な変更が、本発明の範囲から逸脱することなくなされうることが明らかであろう。本発明はまた、添付の特許請求の範囲によって、さらに説明される。

Claims (20)

1. 組織移植片の製造方法であって、
   ａ．製造、修復、または置換されるべき組織部分のデジタルモデルを獲得する段階であって、該デジタルモデルが２つ以上のモデルセグメントに分割される、段階；
   ｂ．２つ以上の組織移植片セグメントを製造する段階であって、各組織移植片セグメントが、段階（ａ）のモデルセグメントのものに対応するサイズ及び形を有する、段階；並びに
   ｃ．段階（ｂ）で製造された前記２つ以上の組織移植片セグメントを組み立てて、段階（ａ）の組織部分のものに対応するサイズ及び形を有する組織移植片を形成する段階
   を含む、方法。
2. 段階（ｂ）における２つ以上の組織移植片セグメントの製造が、
   ａ．モデルセグメントに対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階；
   ｂ．段階（ａ）の足場を収容するように、前記モデルセグメントに対応するサイズ及び形を有する移植片室を含む培養容器を獲得する段階；
   ｃ．１つ以上の細胞集団を前記足場に適用する段階；並びに
   ｄ．前記細胞を、前記培養容器内で、前記足場上で培養して、組織移植片セグメントを形成する段階
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記組織移植片が、骨移植片である、請求項１に記載の方法。
4. 前記組織移植片が、軟骨移植片である、請求項１に記載の方法。
5. 前記組織移植片が、血管新生化されている、請求項１に記載の方法。
6. 各組織移植片セグメントが、厚さ約１ｃｍまたはそれ以下である、請求項１に記載の方法。
7. 各組織移植片セグメントが、厚さ約０．３ｍｍから約１０ｍｍである、請求項１に記載の方法。
8. 前記培養容器が直接灌流バイオリアクターであり、かつ段階（ｄ）の培養が圧入状態で行われる、請求項２に記載の方法。
9. 段階（ｂ）の移植片室が、移植片室挿入物を含む、請求項２に記載の方法。
10. 前記足場が、コンピュータ支援製造、３次元印刷、注型、フライス加工、レーザ切断、ラピッドプロトタイピング、またはこれらの任意の組合せを用いて生成される、請求項２に記載の方法。
11. 前記細胞が、人工多能性幹細胞から誘導される、請求項２に記載の方法。
12. 前記細胞が、造骨細胞及び／または造骨細胞に分化可能な細胞を含む、請求項２に記載の方法。
13. 前記細胞が、血管形成細胞及び／または血管形成細胞に分化可能な細胞を含む、請求項２に記載の方法。
14. 前記細胞が、間葉系前駆細胞を含む、請求項２に記載の方法。
15. 前記細胞が、内皮前駆細胞を含む、請求項２に記載の方法。
16. 段階（ｃ）の組み立てが、生体適合性接着剤、ステッチ、縫合糸、ステープル、プレート、ピン、ネジ、またはこれらの任意の組合せの使用を含む、請求項１に記載の方法。
17. ２つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、各組織移植片セグメントの最大厚さが約０．３ｍｍから約１０ｍｍであり、該組織移植片セグメントが、生体適合性接着剤、ステッチ、縫合糸、ステープル、プレート、ピン、ネジ、またはこれらの任意の組合せを用いて一緒に組み立てられて組織移植片を形成する、組織移植片。
18. 骨移植片である、請求項１７に記載の組織移植片。
19. 血管新生化骨移植片である、請求項１８に記載の組織移植片。
20. 人工多能性幹細胞から誘導された造骨細胞を含む、請求項１９に記載の組織移植片。

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