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JP2019508404A - 癌患者の層別化および癌治療のための化合物、組成物および方法 - Google Patents

癌患者の層別化および癌治療のための化合物、組成物および方法 Download PDF

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JP2019508404A JP2018540842A JP2018540842A JP2019508404A JP 2019508404 A JP2019508404 A JP 2019508404A JP 2018540842 A JP2018540842 A JP 2018540842A JP 2018540842 A JP2018540842 A JP 2018540842A JP 2019508404 A JP2019508404 A JP 2019508404A
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Abstract

本発明は、改良された化合物、特に

薬物感受性と相関するバイオマーカー（例えば、PDE3A、SLFN12および／またはCREB3L1）を使用して癌を有する患者を特定し、結果として本発明の薬剤（例えば、本明細書に開示される化合物1〜6）で患者集団を治療する方法を特徴とする。

Description

「関連出願の相互参照」
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年2月5日に出願された米国仮特許出願第62／291935号の優先権および利益を主張するものである。
「連邦政府資金による研究開発の記載」
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号3U54HG005032の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
癌により、毎年米国では55万人以上および世界では800万人以上が死亡している。小分子、組織特異的増殖要件に影響を及ぼす分子、および免疫調節剤を含む新しい薬剤は、癌が特有のゲノム変異または他の特徴を有する一部の患者に利益をもたらすことが示されている。残念なことに、多くの癌患者が有効な治療選択肢がまだない。
新しい抗癌剤を同定するための1つのアプローチは、癌細胞株間で強力な選択性を示す新規な小分子を発見するための表現型スクリーニング、引き続いて薬物反応に関連する細胞の特徴を同定するための予測的ケモゲノミクスである。1990年代、Weinsteinおよび同僚らは、化合物の細胞傷害性プロファイルを使用して、薬物感受性と相関する遺伝子発現プロファイルおよびDNAコピー数などの細胞特性を同定することができることを実証した。近年、細胞株の包括的なゲノムおよび表現型の特徴付けと組み合わせた細胞株の大きなパネルの自動化ハイスループット化学感受性試験により、小分子に対する反応を媒介する癌細胞株の特徴を同定する能力が大いに増加している。小分子感受性の表現型観察は、トラスツズマブ感受性HER2増幅乳癌またはエルロチニブ感受性EGFR変異肺癌の例と同様に、発現パターンまたは体細胞の変化に関連があり得る。
Savaiら（Expert Opinion on investigational Drugs, Vol. 19, issue 1, 2010, p. 117−131）は、ホスホジエステラーゼ阻害剤で癌を標的化することが、癌の治療に有望な手法であり得ることを述べた。しかし、心血管適応症および血小板凝固の阻害のためのPDE3阻害剤ミルリノン、シロスタゾールおよびレボシメンダン、ならびに血小板血症のためのPDE3阻害剤アナグレリドを含むいくつかのホスホジエステラーゼ阻害剤が臨床治療に承認されているが、癌適応のものはない。PDE阻害剤の最近の品質審査（Nature Reviews Drug Discovery 13, 290−314, （2014））は、癌にほとんど言及していない。国際公開第2014／164704号から、癌の治療のためのいくつかの新しいPDE3阻害剤が公知である。
国際公開第2014／164704号
Savaiら（Expert Opinion on investigational Drugs, Vol. 19, issue 1, 2010, p. 117−131） Nature Reviews Drug Discovery 13, 290−314, （2014）
分子レベルで悪性腫瘍を特徴付ける方法は、患者を層別化し、それによって患者を有効な療法に迅速に導くために有用である。癌を有する対象の反応性を予測するための改善された方法が緊急に必要とされている。
下に記載されるように、本発明は、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーター（例えば、化合物1〜6）による治療に感受性が高い癌（例えば本明細書に記載される癌の種類）を有する患者を特定する方法であって、かかる患者由来の癌細胞でPDE3AおよびSchlafen 12（SLFN12）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同時発現を検出することによる、かつ／あるいはCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現が低下していないことを検出することによる、方法を特徴とする。
一態様では、本発明は、構造：
を有する1以上のPDE3Aモジュレーター化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、および化合物6と癌細胞を接触させる工程であって；
該細胞が、参照と比較してPDE3AまたはSchlafen12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその組合せのレベルが増加しているとして選択されたものであり、それによって前記癌細胞の生存を減少させる工程を含む、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞を死滅させるかまたはその生存を減少させる方法を提供する。
もう一つの態様では、本発明は、対象にPDE3Aモジュレーターを投与することを含む、構造：
を有する1以上のPDE3Aモジュレーターに反応性である癌を有するとして予め選択された対象において癌細胞増殖を減少させる方法であって、該対象が、参照と比較してPDE3AまたはSchlafen12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその組合せのレベルが増加していることを検出することによって予め選択され、それによって前記対象での癌細胞増殖を減少させる方法を提供する。
もう一つの態様では、本発明は、PDE3A調節に抵抗性の癌を有する対象を特定する方法であって、該方法が、参照と比較して対象の生体試料中のCREB3L1またはSLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドレベルが低下していることを検出し、それによってPDE3A調節に抵抗性の癌を有するとして前記対象を特定する工程を含む方法を提供する。
もう一つの態様では、本発明は、PDE3A調節に抵抗性の癌を有する対象を特定する方法であって、該方法が、参照と比較して対象の生体試料中のCREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドレベルが低下していることを検出し、それによってPDE3A調節に抵抗性の癌を有するとして前記対象を特定する工程を含む方法を提供する。
もう一つの態様では、本発明は、CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する捕捉試薬を含む、PDE3A調節に反応性の癌を有する対象を特定するためのキットを提供する。特定の実施形態では、キットには、SLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する捕捉試薬が含まれる。
一態様では、本発明は、構造：
を有する化合物；あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグを提供する。
もう一つの態様では、本発明は、1以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と、構造：
を有する化合物；あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグを含有する医薬組成物を提供する。
もう一つの態様では、本発明は、治療を必要とする対象に、構造：
を有する化合物；あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグを投与する工程を含む、過剰増殖性疾患、特に癌を治療する方法を提供する。
もう一つの態様では、本発明は、治療を必要とする対象に、構造：
を有する化合物；あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグを投与する工程を含む、過剰増殖性疾患、特に癌を治療する方法を提供し、前記癌は、PDE3Aモジュレーターに反応性である。
もう一つの態様では、本発明は、治療を必要とする対象に、構造：
を有する化合物；あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグを投与する工程を含む、過剰増殖性疾患、特に癌を治療する方法を提供し、前記対象は、PDE3Aモジュレーターに反応性である癌と診断されている。もう一つの態様では、本発明は、治療を必要とする対象に、構造：
を有する化合物；あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグを投与する工程を含む、過剰増殖性疾患、特に癌を治療する方法を提供し、前記癌は、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である。
もう一つの態様では、本発明は、PDE3Aモジュレーターに反応性であるとして予め選択された対象において癌細胞増殖を減少させるための、構造：
を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグを含むキットを提供する。
もう一つの態様では、本発明は、癌の治療のための医薬の製造のためのPDE3Aモジュレーターの使用を提供し、該PDE3Aモジュレーターは、構造：
を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグである。
もう一つの態様では、本発明は、癌の治療に使用するためのPDE3Aモジュレーターを提供し、該PDE3Aモジュレーターは、構造：
を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグである。
その他の実施形態では、本発明は、癌の治療に使用するためのPDE3Aモジュレーターを提供し、該PDE3Aモジュレーターは、構造：
を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩またはプロドラッグであり、該癌は、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、PDE3Aモジュレーターは、PDE3Aの活性を低下させる。
様々な実施形態では、PDE3Aモジュレーターは、構造：
を有する。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、本方法は、参照と比較してCREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルが低下していないことを検出することを含む。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、本方法は、SLFN12レベルの低下を検出することを含む。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、生体試料は、癌細胞を含む組織試料である。
様々な実施形態では、PDE3A、SLFN12、またはCREB3L1ポリペプチドレベルは、免疫ブロット法、質量分析、および免疫沈降からなる群から選択される方法によって検出される。
様々な実施形態では、PDE3A、SLFN12、またはCREB3L1ポリヌクレオチドレベルは、定量的PCR、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析、およびインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法によって検出される。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞は、CREB3L1を発現するか、または参照と比較してCREB3L1発現が消失しない。
様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性であるとして選択されている癌細胞は、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌細胞である。
したがって、本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、上に開示される方法は、参照と比較してCREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドレベルが低下していないことをさらに含む。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性である癌細胞は、参照と比較してCREB3L1またはSLFN12の発現が減少しているか、あるいはCREB3L1またはSLFN12の発現が消失している。
様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞は、黒色腫、子宮内膜癌、肺癌、造血系／リンパ系癌、卵巣癌、子宮頚癌、軟部組織肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、神経膠芽腫、または乳癌細胞である。ある種の実施形態では、癌細胞は、B細胞増殖型の癌である。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞は、PDE3AまたはSchlafen12（SLFN12）の発現が増加した。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性である癌細胞は、参照と比較してCREB3L1またはSLFN12の発現が減少しているか、あるいはCREB3L1またはSLFN12の発現が消失している。
「参照」とは、この文脈において、腫瘍細胞または腫瘍細胞株の代表的なパネルでの平均的な発現を意味する。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、癌はPDE3Aモジュレーターに反応性である。
様々な実施形態では、対象はPDE3Aモジュレーターに反応性である癌と診断されている。
様々な実施形態では、癌は、黒色腫、子宮内膜癌、肺癌、造血系／リンパ系癌、卵巣癌、子宮頚癌、軟部組織肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、神経膠芽腫、または乳癌である。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、PDE3Aモジュレーターは、経口投与される。
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、PDE3Aモジュレーターは静脈注射によって投与される。
本発明は、癌においてPDE3Aおよび／またはSchlafen12（SLFN12）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同時発現ならびに／あるいはCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の低下がないことを検出することによる、化合物1〜6から選択されたPDE3Aモジュレーターによる治療に反応性であるとして特定された癌を有する対象を治療する方法を提供する。
したがって、本発明は、バイオマーカーとしてCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を使用して、患者の層別化のためにCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を検出する方法をさらに提供する。
本発明はさらに、バイオマーカーとしてPDE3Aおよび／またはSchlafen12（SLFN12）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を使用して、患者の層別化のためにPDE3Aおよび／またはSchlafen12（SLFN12）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を検出する方法を提供する。
本発明によって定義される組成物および物品は、以下に提供される実施例に関連して単離したまたは製造した。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
「定義」
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を提供する：Singletonら, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（第2版1994）；The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker編、1988）；The Glossary of Genetics、第5版、R. Riegerら（編）, Springer Verlag（1991）；およびHale＆Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology（1991）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、以下のそれらに帰属する意味を有する。
「アナグレリド」（IUPAC名6,7−ジクロロ−1,5−ジヒドロイミダゾ（2,1−b）キナゾリン−2（3H）−オン）とは、以下の構造を有する小分子ホスホジエステラーゼ阻害剤を意味する：
「シロスタミド」（IUPAC名N−シクロヘキシル−N−メチル−4−［（2−オキソ−1H−キノリン−6−イル）オキシ］ブタンアミド）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「シロスタゾール」（IUPAC名6−［4−（1−シクロヘキシル−1H−テトラゾール−5−イル）ブトキシ］−3,4−ジヒドロ−2（1H）−キノリノン）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「DNMDP」（IUPAC名6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「フォルスコリン」（IUPAC名（3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS）−6,10,10b−トリヒドロキシ−3,4a,7,7,10a−ペンタメチル−1−オキソ−3−ビニルドデカヒドロ−1H−ベンゾ［f］クロメン−5−イルアセテート）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「レボシメンダン」（IUPAC名（E）−2−シアノ−1−メチル−3−（4−（4−メチル−6−オキソ−1,4,5,6−テトラヒドロピリダジン−3−イル）フェニル）グアニジン）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「ミルリノン」（IUPAC名：2−メチル−6−オキソ−1,6−ジヒドロ−3,4’−ビピリジン−5−カルボニトリル）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「パパベリン」（IUPAC名1−（3,4−ジメトキシベンジル）−6,7−ジメトキシイソキノリン）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「シグアゾダン」（IUPAC名（E）−2−シアノ−1−メチル−3−（4−（4−メチル−6−オキソ−1,4,5,6−テトラヒドロピリダジン−3−イル）フェニル）グアニジン）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「シルデナフィル」（IUPAC名1−［4−エトキシ−3−（6,7−ジヒドロ−1−メチル−7−オキソ−3−プロピル−1H−ピラゾロ［4,3−d］ピリミジン−5−イル）フェニルスルホニル］−4−メチルピペラジン）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「トレキンシン」（IUPAC名：9,10−ジメトキシ−3−メチル−2−（2,4,6−トリメチルフェニル）イミノ−6,7−ジヒドロピリミド［6,1−a］イソキノリン−4−オン）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「バルデナフィル」（IUPAC名4−［2−エトキシ−5−（4−エチルピペラジン−1−イル）スルホニル−フェニル］−9−メチル−7−プロピル−3,5,6,8−テトラアザビシクロ［4.3.0］ノナ−3,7,9−トリエン−2−オン）とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「ザルダベリン（IUPAC名3−［4−（ジフルオロメトキシ）−3−メトキシフェニル］−1H−ピリダジン−6−オン）」とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「化合物1」とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「化合物2」とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「化合物3」とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「化合物4」とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「化合物5」とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
「化合物6」とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
描かれる構造には、結合について全ての許容される回転が含まれる。
一部の実施形態では、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、および化合物6の化合物のいずれか1つは小分子ホスホジエステラーゼ阻害剤である。
一部のその他の実施形態では、化合物シロスタミド、シロスタゾール、DNMDP、フォルスコリン、レボシメンダン、ミルリノン、パパベリン、シグアゾダン、シルデナフィル、トレキンシン、バルデナフィルおよびザルダベリンのいずれか1つは、小分子ホスホジエステラーゼ阻害剤である。
一部の実施形態では、小分子ホスホジエステラーゼ阻害剤またはモジュレーターの組合せが使用されてよい。
一部の実施形態では、化合物1〜6の任意の組合せが使用されてよい。
一部の実施形態では、小分子ホスホジエステラーゼ阻害剤またはモジュレーターの組合せ、特に化合物1〜6、より特に抗癌剤と化合物6が使用されてよい。
本発明のさらなる態様は、化合物6を調製する方法であり、前記方法は、
ラセミ化合物3a
を、10〜15℃（10℃および15℃を含む）の温度範囲で酢酸中のNaOClと反応させて、ラセミ化合物6a
を得、その後、化合物6aのエナンチオマー分離を実施して、化合物6
を得る工程
を含む。
本発明の別の態様は、化合物6を調製する方法であり、前記方法は、
場合により先行する工程で化合物3a
をエナンチオマー分離して化合物3
を得、10〜15℃（10℃および15℃を含む）の温度範囲の酢酸中のNaOClとの反応工程をエナンチオマー化合物3と実施することをさらに含み、場合によりその後にエナンチオマーを分離することをさらに含む。
本発明のさらなる態様は、エナンチオマー化合物3
を反応させてエナンチオマー化合物6
を得る、化合物6の調製のための方法である。
本発明の別の態様は、化合物3
の、化合物6
の調製のための使用である。
「CREB3L1ポリペプチド」とは、小胞体ストレスによって切断され、転写因子活性を有するGenBank受託番号AAH14097.1で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片を意味する。GenBank受託番号AAH14097.1で提供されるアミノ酸配列を下に示す。
「CREB3L1ポリヌクレオチド」とは、CREB3L1ポリペプチドまたはその断片をコードする、DNAおよびRNAを含む任意の核酸分子を意味する。代表的なCREB3L1核酸配列はNCBI参照番号：NM＿052854.3で提供される：NCBI参照番号：NM＿052854.3で提供される配列を下に再現する：
「PDE3Aポリペプチド」とは、環状アデノシン一リン酸（cAMP）および環状グアノシン一リン酸（cGMP）の加水分解を触媒するNCBI参照番号NP＿000912.3で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片を意味する。代表的なヒト全長PDE3Aアミノ酸配列を以下に提供する：
MAVPGDAARVRDKPVHSGVSQAPTAGRDCHHRADPASPRDSGCRGCWGDLVLQPLRSSRKLSSALCAGSLSFLLALLVRLVRGEVGCDLEQCKEAAAAEEEEAAPGAEGGVFPGPRGGAPGGGARLSPWLQPSALLFSLLCAFFWMGLYLLRAGVRLPLAVALLAACCGGEALVQIGLGVGEDHLLSLPAAGVVLSCLAAATWLVLRLRLGVLMIALTSAVRTVSLISLERFKVAWRPYLAYLAGVLGILLARYVEQILPQSAEAAPREHLGSQLIAGTKEDIPVFKRRRRSSSVVSAEMSGCSSKSHRRTSLPCIPREQLMGHSEWDHKRGPRGSQSSGTSITVDIAVMGEAHGLITDLLADPSLPPNVCTSLRAVSNLLSTQLTFQAIHKPRVNPVTSLSENYTCSDSEESSEKDKLAIPKRLRRSLPPGLLRRVSSTWTTTTSATGLPTLEPAPVRRDRSTSIKLQEAPSSSPDSWNNPVMMTLTKSRSFTSSYAISAANHVKAKKQSRPGALAKISPLSSPCSSPLQGTPASSLVSKISAVQFPESADTTAKQSLGSHRALTYTQSAPDLSPQILTPPVICSSCGRPYSQGNPADEPLERSGVATRTPSRTDDTAQVTSDYETNNNSDSSDIVQNEDETECLREPLRKASACSTYAPETMMFLDKPILAPEPLVMDNLDSIMEQLNTWNFPIFDLVENIGRKCGRILSQVSYRLFEDMGLFEAFKIPIREFMNYFHALEIGYRDIPYHNRIHATDVLHAVWYLTTQPIPGLSTVINDHGSTSDSDSDSGFTHGHMGYVFSKTYNVTDDKYGCLSGNIPALELMALYVAAAMHDYDHPGRTNAFLVATSAPQAVLYNDRSVLENHHAAAAWNLFMSRPEYNFLINLDHVEFKHFRFLVIEAILATDLKKHFDFVAKFNGKVNDDVGIDWTNENDRLLVCQMCIKLADINGPAKCKELHLQWTDGIVNEFYEQGDEEASLGLPISPFMDRSAPQLANLQESFISHIVGPLCNSYDSAGLMPGKWVEDSDESGDTDDPEEEEEEAPAPNEEETCENNESPKKKTFKRRKIYCQITQHLLQNHKMWKKVIEEEQRLAGIENQSLDQTPQSHSSEQIQAIKEEEEEKGKPRGEEIPTQKPDQ（配列番号3）
3つのPDE3Aアイソフォーム、PDE3A1、PDE3A2、およびPDE3A3が知られている。PDE3A1は全長PDE3Aアミノ酸配列のアミノ酸146〜1141を含み、PDE3A2アイソフォーム2は全長PDE3Aアミノ酸配列のアミノ酸299〜1141を含み、PDE3A3は全長PDE3Aアミノ酸配列のアミノ酸483〜1141を含む。
「PDE3Aポリヌクレオチド」とは、PDE3Aポリペプチドまたはその断片をコードするDNAおよびRNAを含む任意の核酸分子を意味する。代表的なPDE3A核酸配列はNCBI参照番号：NM＿000921.4で提供される：
「Schlafen12（SLFN12）ポリペプチド」とは、本明細書に記載される化合物の一つと結合するとPDE3Aと相互作用する、NCBI参照番号NP＿060512.3で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片を意味する。代表的なヒトSLFN12アミノ酸配列を以下に提供する：
MNISVDLETNYAELVLDVGRVTLGENSRKKMKDCKLRKKQNESVSRAMCALLNSGGGVIKAEIENEDYSYTKDGIGLDLENSFSNILLFVPEYLDFMQNGNYFLIFVKSWSLNTSGLRITTLSSNLYKRDITSAKVMNATAALEFLKDMKKTRGRLYLRPELLAKRPCVDIQEENNMKALAGVFFDRTELDRKEKLTFTESTHVEIKNFSTEKLLQRIKEILPQYVSAFANTDGGYLFIGLNEDKEIIGFKAEMSDLDDLEREIEKSIRKMPVHHFCMEKKKINYSCKFLGVYDKGSLCGYVCALRVERFCCAVFAKEPDSWHVKDNRVMQLTRKEWIQFMVEAEPKFSSSYEEVISQINTSLPAPHSWPLLEWQRQRHHCPGLSGRITYTPENLCRKLFLQHEGLKQLICEEMDSVRKGSLIFSRSWSVDLGLQENHKVLCDALLISQDSPPVLYTFHMVQDEEFKGYSTQTALTLKQKLAKIGGYTKKVCVMTKIFYLSPEGMTSCQYDLRSQVIYPESYYFTRRKYLLKALFKALKRLKSLRDQFSFAENLYQIIGIDCFQKNDKKMFKSCRRLT（配列番号5）
「Schlafen12（SLFN12）ポリヌクレオチド」とは、SLFN12ポリペプチドまたはその断片をコードする、DNAおよびRNAを含む任意の核酸分子を意味する。代表的なSLFN12核酸配列はNCBI参照番号：NM＿018042.4で提供される：
一部の態様では、化合物は異性体である。「異性体」は同じ分子式を有する異なる化合物である。「立体異性体」は、原子が空間に配置される方法のみが異なる異性体である。本明細書で使用される場合、「異性体」という用語は、任意のおよび全ての幾何異性体および立体異性体を含む。例えば、「異性体」は、本発明の範囲に入るものとして、E−異性体およびZ−異性体とも呼ばれる幾何学的二重結合シス−およびトランス−異性体；R−およびS−エナンチオマー；ジアステレオマー、（d）−異性体および（l）−異性体、それらのラセミ混合物；ならびにこれらの他の混合物を含む。
記号
は、本明細書に記載される単結合、二重結合または三重結合であり得る結合を示す。本明細書では、炭素−炭素二重結合の周りの置換基の配置または炭素環の周りの置換基の配置から生じる種々の幾何異性体およびその混合物が提供される。炭素−炭素二重結合の周りの置換基は、「Z」または「E」配置であると指定され、「Z」および「E」という用語はIUPAC基準に従って使用される。特に指定されない限り、二重結合を示す構造は、「E」異性体と「Z」異性体の両方を包含する。
あるいは、炭素−炭素二重結合の周りの置換基を「シス」または「トランス」と呼ぶことができ、「シス」は二重結合の同じ側の置換基を表し、「トランス」は二重結合の反対側の置換基を表す。炭素環の周りの置換基の配置を「シス」または「トランス」と呼ぶこともできる。「シス」という用語は、環の面の同じ側の置換基を表し、「トランス」という用語は、環の面の反対側の置換基を表す。置換基が環の面の同じ側と反対側の両方に配置されている化合物の混合物は、「シス／トランス」と呼ばれる。
「エナンチオマー」という用語は、互いに重ね合わせることができない鏡像である一対の立体異性体を指す。非対称な置換基のセットを有する原子がエナンチオマーを生じ得る。任意の割合の対のエナンチオマーの混合物は「ラセミ」混合物として知られ得る。「（±）」という用語は、適切な場合にはラセミ混合物を示すために使用される。「ジアステレオ異性体」は、少なくとも2個の不斉原子を有するが、互いに鏡像ではない立体異性体である。絶対立体化学は、カーン・インゴルド・プレローグR−Sシステムにより指定される。化合物がエナンチオマーである場合、各キラル炭素における立体化学は、RまたはSのいずれかによって指定することができる。絶対配置が未知である分割された化合物は、ナトリウムD線の波長で平面偏光を回転させる方向（右旋性または左旋性）に応じて（＋）または（−）で表すことができる。本明細書に記載される化合物のうちのあるものは、1個または複数の不斉中心を含むので、それぞれの不斉原子における絶対立体化学的な観点から、（R）−または（S）−として定義することができるエナンチオマー、ジアステレオマーおよび他の立体異性体形態を生じ得る。本化学物質、医薬組成物および方法は、ラセミ混合物、光学的に実質的に純粋な形態および中間体混合物を含む、全てのこのような可能な異性体を含むことを意味する。
光学活性な（R）−および（S）−異性体は、例えば、キラルシントンもしくはキラル試薬を用いて調製することがでる、または慣用的な技術を用いて分割することができる。エナンチオマーは、キラル高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、キラル塩の形成および結晶化を含む当業者に公知の任意の方法によってラセミ混合物から単離することができる、または不斉合成によって調製することができる。
光学異性体は、慣用的な方法によるラセミ混合物の分割、例えばジアステレオ異性体塩の形成、光学活性酸または塩基による処理によって得ることができる。適当な酸の例には、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸およびカンファースルホン酸がある。結晶化によるジアステレオ異性体の混合物の分離、引き続いてこれらの塩からの光学活性塩基の遊離により、異性体が分離される。別の方法は、開示される化合物を活性化形態の光学的に純粋な酸または光学的に純粋なイソシアネートと反応させることによる共有結合ジアステレオ異性体分子の合成を含む。合成されたジアステレオ異性体は、クロマトグラフィー、蒸留、結晶化または昇華などの慣用的な手段によって分離し、次いで、加水分解してエナンチオマー濃縮化合物を得ることができる。光学活性化合物はまた、活性出発材料を使用して得ることもできる。いくつかの実施形態では、これらの異性体が遊離酸、遊離塩基、エステルまたは塩の形態であり得る。
一定の実施形態では、本発明の化合物は、互変異性体であり得る。本明細書で使用される場合、「互変異性体」という用語は、水素原子の少なくとも1つの正式な移動および原子価の少なくとも1つの変化（例えば、単結合が二重結合に、三重結合が単結合に、またはその逆も同様）から生じる2つ以上の相互変換可能な化合物を含む種類の異性体である。「互変異性化」には、プロトン移動またはプロトンシフト互変異性化が含まれ、これは酸−塩基化学のサブセットと考えられている。「プロトン移動互変異性化」または「プロトンシフト互変異性化」は、結合順序の変化を伴うプロトンの移動を含む。互変異性体の正確な比は、温度、溶媒およびpHを含むいくつかの因子に依存する。互変異性化が可能である場合（例えば、溶液中で）、互変異性体の化学平衡に達することができる。互変異性化（すなわち、互変異性体対を提供する反応）は、酸もしくは塩基により触媒され得る、または外部作用物質の作用も存在もなしに起こり得る。代表的な互変異性化には、それだけに限らないが、ケト−エノール；アミド−イミド；ラクタム−ラクチム；エナミン−イミン；エナミン−（異なる）エナミン互変異性化が含まれる。ケト−エノール互変異性化の具体例は、ペンタン−2,4−ジオンと4−ヒドロキシペンタ−3−エン−2−オン互変異性体の相互変換である。互変異性化の別の例は、フェノール−ケト互変異性化である。フェノール−ケト互変異性化の具体例は、ピリジン−4−オールとピリジン−4（1H）−オン互変異性体の相互変換である。
具体的な立体化学または異性体形態が具体的に示されていない限り、構造の全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミおよび幾何異性体が意図される。本発明の化合物を調製するために使用される全ての方法およびそこで生成される中間体は、本発明の一部とみなされる。示されるまたは記載される化合物の全ての互変異性体もまた、本発明の一部とみなされる。
「薬剤」とは、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチド、またはその断片を意味する。
「改善する」とは、疾患の発症または進行を減少させる、抑制する、減弱する、減らす、停止するまたは安定化することを意味する。
「改変」とは、本明細書に記載されるものなどの標準的な技術公知の方法によって検出される遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書で使用される場合、一実施形態では、改変は、発現レベルの約10％の変化、好ましくは約25％の変化、より好ましくは約40％の変化、最も好ましくは発現レベルの約50％以上の変化を含む。ある種の実施形態では、改変は、発現レベルの10％以下（10％を含む）の変化、好ましくは25％以下（25％を含む）の変化、より好ましくは40％以下（40％を含む）の変化、最も好ましくは50％以下（50％を含む）またはそれ以上の発現レベルの変化を含む。その他の実施形態では、改変は、発現レベルの9％〜11％（9％および11％を含む）の変化、好ましくは10％〜25％（10％および25％を含む）の変化、より好ましくは25％〜40％（25％および40％を含む）の変化、最も好ましくは40％〜50％（40％および50％を含む）または50％（50％を含む）以上の発現レベルの変化を含む。その他の特定の実施形態では、改変は、発現レベルの9％〜11％（9％および11％を含む）の変化、好ましくは22％〜28％（22％および28％を含む）の変化、より好ましくは35％〜45％（35％および45％を含む）の変化、最も好ましくは45％〜55％（45％および55％を含む）または55％以上の発現レベルの変化を含む。
「類似体」とは、同一ではないが、類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を保持するが、天然ポリペプチドと比較して類似体の機能を強化する一定の生化学的修飾を有する。このような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を改変することなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性または半減期を増加させることができるだろう。類似体は非天然アミノ酸を含むことがある。
本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」および「有する（having）」などは、米国特許法で帰される意味を有することができて、「含む（includes）」、「含む（including）」などを意味することができる；「から本質的になる（consisting essentially of）」または「本質的になる（consists essentially）」も同様に米国特許法に帰する意味を有し、この用語はオープンエンドであり、列挙されるものよりも多く存在することによって列挙されるその基本的なまたは新規な特徴が変化しない限り、列挙されるものよりも多く存在することが可能であるが、先行技術の実施形態を除外する。
「検出する」は、検出される分析物の存在、不存在または量を同定することを指す。特定の実施形態では、分析物はPDE3AまたはSLFN12ポリペプチドである。
「疾患」とは、細胞、組織または器官の正常な機能を損なうかまたは妨げる任意の状態または障害を意味する。疾患の例としては、黒色腫、腺癌、肺癌、子宮頸癌、肝臓癌および乳癌が挙げられる。
「有効量」とは、未治療患者と比較して疾患の症状を改善するために必要とされる、本明細書に記載される化合物の量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施するために使用される1種または複数の活性化合物の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重および全身の健康状態に応じて変化する。最終的に、主治医または獣医師が適切な量および投与計画を決定する。そのような量が「有効」量と呼ばれる。さらにその他の実施形態では、PDE3Aモジュレーターは、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、または化合物6である。
本発明は、本明細書で描写される方法によって特徴付けられる障害を治療するための高度に特異的な薬物の開発に有用ないくつかの標的を提供する。さらに、本発明の方法は、対象に使用するために安全な治療法を特定するための容易な手段を提供する。さらに、本発明の方法は、ハイスループット、高感度および低複雑性で、本明細書に記載される疾患に対する効果について実質的に多くの化合物を分析するための経路を提供する。
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％または約90％を含む。ある種の実施形態では、この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも9％〜11％（9％および11％を含む）、18％〜22％（18％および22％を含む）、27％〜33％（27％および33％を含む）、36％〜44％（36％および44％を含む）、45％〜55％（45％および55％を含む）、54％〜66％（54％および66％を含む）、63％〜77％（63％および77％を含む）、72％〜88％（72％および88％を含む）、または81％〜99％（81％および99％を含む）を含む。断片は、約10個、約20個、約30個、約40個、約50個、約60個、約70個、約80個、約90個、約100個、約200個、約300個、約400個、約500個、約600個、約700個、約800個、約900個または約1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる。ある種の実施形態では、断片は、9〜11、約18〜22、27〜33、36〜44、45〜55、54〜66、63〜77、72〜88、81〜99、90〜110、180〜220、270〜330、360〜440、450〜550、540〜660、630〜770、720〜880、810〜990、または900〜1100個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる（それぞれ言及される限界を含む、例えば「9〜11」は9および11を含む）。
「血液腫瘍」には、白血病およびリンパ腫の侵襲性および低悪性度型、つまり非ホジキン病、慢性および急性骨髄性白血病（CML／AML）、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、ホジキン病、多発性骨髄腫およびT細胞リンパ腫が含まれる。また、骨髄異形成症状群、形質細胞腫瘍、腫瘍随伴症状群、および原発部位が不明な癌ならびにAIDS関連悪性腫瘍も含まれる。
「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってよい、水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対形成する相補的な核酸塩基である。
「過剰増殖性疾患」には、例えば乾癬、ケロイドおよびその他の皮膚に影響を及ぼす過形成、良性過剰増殖性疾患、造血過剰増殖性疾患（hematopoietic hyperproliferative diseases）、癌（特に転移性または悪性腫瘍、より特に固形腫瘍および血液腫瘍）が含まれる。
「良性過剰増殖性疾患」には、例えば、子宮内膜症、平滑筋腫および良性前立腺過形成が含まれる。
「造血過剰増殖性疾患」は、骨髄増殖性疾患としても公知であり、例えば真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、血小板増多症、原発性骨髄線維症などが含まれる。
「マーカー」または「バイオマーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは（例えば、タンパク質またはmRNAレベルでの）活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、本発明のマーカーがPDE3AまたはSLFN12またはCREB3L1である。
「モジュレーター」とは、ポリペプチドに結合し、そのポリペプチドの生物学的機能または活性を変化させる任意の作用物質を意味する。モジュレーターは、限定されないが、ポリペプチドの生物学的機能または活性を低下または排除する薬剤（例えば、「阻害剤」）を含む。例えば、モジュレーターはポリペプチドの触媒活性を阻害することができる。モジュレーターは、限定されないが、ポリペプチドと別の薬剤との結合を増加または減少させる薬剤を含む。例えば、モジュレーターは、ポリペプチドと別のポリペプチドとの結合を促進することができる。いくつかの実施形態では、PDE3AポリペプチドのモジュレーターはDNMDPである。いくつかの他の実施形態では、PDE3Aポリペプチドのモジュレーターはアナグレリドまたはザルダベリンである。さらにその他の実施形態では、PDE3Aポリペプチドのモジュレーターは、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、または化合物6である。
「プロドラッグ」という用語は、それ自体は生物学的に活性であっても不活性であってもよいが、体内での滞留時間中に本発明による化合物に（例えば、代謝的にまたは加水分解的に）変換される化合物を示す。生物系で化合物6またはその塩に変換される化合物6およびその塩の誘導体（生物学的前駆体またはプロドラッグ）は、本発明に包含される。前記生物系は、例えば、哺乳類生物、特にヒト対象であってよい。生物学的前駆体は、例えば、代謝プロセスによって化合物6またはその塩に変換される。
「参照」とは、標準または対照状態を意味する。
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内因性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内因性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。
「ハイブリダイズする」は、種々のストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子）またはその一部との間で二本鎖分子を形成する対を意味する。（例えば、Wahl, G. M. およびS. L. Berger（1987）Methods Enzymol. 152：399；Kimmel, A. R. （1987）Methods Enzymol. 152：507参照）。
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満である。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができるが、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50％ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。ハイブリダイゼーション時間、洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、および担体DNAの包含または排除などの付加的なパラメータを変えることは、当業者に周知である。種々のレベルのストリンジェンシーは、必要に応じてこれらの種々の条件を組み合わせることによって達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1％SDS中、30℃で行われる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミドおよび100μg／ml変性サケ精子DNA（ssDNA）中、37℃で行われる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションが、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミドおよび200μg／ml ssDNA中、42℃で行われる。これらの条件の有用な変形は、当業者には容易に明らかであろう。
大部分の用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もストリンジェンシーにおいて変化する。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによって、または温度を上昇させることによって増加させることができる。例えば、洗浄工程のストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄工程のストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。好ましい実施形態では、洗浄工程が、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、25℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄工程が、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、42℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄工程が、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、68℃で行われる。これらの条件のさらなる変形は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、BentonおよびDavis（Science 196：180、1977）；GrunsteinおよびHogness（Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 72：3961、1975）；Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience、ニューヨーク、2001）；BergerおよびKimmel（Guide to Molecular Cloning Techniques、1987、Academic Press、ニューヨーク）；ならびにSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨークに記載されている。
「固形腫瘍」には、例えば、乳房、気道、脳、骨、中枢神経系および末梢神経系、結腸、直腸、肛門、生殖器（例えば、子宮頸部、卵巣、前立腺）、胃腸管、尿生殖路、内分泌腺（例えば、甲状腺および副腎皮質）、甲状腺、副甲状腺、食道、子宮内膜、眼、生殖細胞、頭頚部、腎臓、肝臓、喉頭および下咽頭、肺、中皮腫、膵臓、前立腺、直腸、腎臓、小腸、皮膚、軟組織、胃、精巣、尿管、膣および外陰部の腫瘍ならびにこれらの腫瘍の結合組織および転移が含まれる。悪性新生物には、網膜芽細胞腫およびウィルムス腫瘍によって例示される遺伝性癌が含まれる。
治療することのできる「乳腺腫瘍」としては、例えば、ホルモン受容体陽性状態の乳癌、ホルモン受容体陰性状態の乳癌、Her2陽性乳癌、ホルモン受容体陰性およびHer2陰性乳癌、BRCA関連乳乳癌および炎症性乳癌が挙げられる。
治療することのできる「気道の腫瘍」としては、例えば、非小細胞気管支癌および小細胞気管支癌、非小細胞肺癌、および小細胞肺癌が挙げられる。
治療することのできる「脳腫瘍」としては、例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫および髄芽細胞腫が挙げられる。
治療することのできる「男性生殖器の腫瘍」としては、例えば、前立腺癌、悪性精巣上体腫瘍、悪性精巣腫瘍および陰茎癌が挙げられる。
治療することのできる「女性生殖器の腫瘍」としては、例えば、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、膣癌および外陰癌が挙げられる。
治療することのできる「胃腸管の腫瘍」としては、例えば、結腸直腸癌腫、肛門癌、胃癌、膵癌、食道癌、胆嚢癌、小腸癌、唾液腺癌、神経内分泌腫瘍および消化管間質腫瘍が挙げられる。
治療することのできる「尿生殖路の腫瘍」としては、例えば、膀胱癌、腎細胞癌、ならびに腎盂および尿路の癌が挙げられる。
治療することのできる「眼の腫瘍」としては、例えば、網膜芽細胞腫および眼内黒色腫が挙げられる。
治療することのできる「肝臓の腫瘍」としては、例えば、肝細胞癌および胆管細胞癌が挙げられる。
治療することのできる「皮膚の腫瘍」としては、例えば、悪性黒色腫、基底細胞腫、有棘細胞癌、カポジ肉腫およびメルケル細胞癌が挙げられる。
治療することのできる「頭頚部の腫瘍」としては、例えば、例えば、喉頭癌ならびに咽頭および口腔の癌が挙げられる。
治療することのできる「肉腫」としては、例えば、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、ラブドイド肉腫および骨肉腫が挙げられる。
治療することのできるリンパ腫としては、例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚リンパ腫、中枢神経系のリンパ腫およびAIDS関連リンパ腫が挙げられる。
治療することのできる白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病およびヘアリーセル白血病（hair cell leukaemia）が挙げられる。
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか1つ）と少なくとも50％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列とアミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60％、より好ましくは80％または85％、より好ましくは90％、95％またはさらには99％同一である。
配列同一性は、一般に、配列解析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705の配列解析ソフトウェアパッケージ、BLAST、BESTFIT、GAPまたはPILEUP／PRETTYBOXプログラム）を用いて測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失および／または他の修飾との相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を一致させる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための代表的なアプローチでは、e−3とe−100との間の確率スコアが密接に関連する配列を示すBLASTプログラムを使用することができる。
「対象」とは、それだけに限らないが、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコを含む哺乳動物を意味する。
本明細書で提供される範囲は、範囲内の値の全ての略語であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50からなる群の任意の数、数の組合せまたは部分範囲を含むと理解される。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、それに関連する障害および／または症状を減少させるまたは改善することを指す。除外されないが、障害または状態を治療することは、それに関連する障害、状態または症状が完全に排除されることを必要としないことが認識されるだろう。
特に明記されていない、または文脈から自明でない限り、本明細書中で使用される場合、「または」という用語は包括的であると理解される。特に明記されていない、または文脈から自明でない限り、本明細書中で使用される場合、「a」、「an」および「the」という用語は単数形または複数形であると理解される。
特に明記されていない、または文脈から自明でない限り、本明細書中で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の公差範囲内、例えば平均の2標準偏差内として理解される。約は、明記される値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％または0.01％以内と理解され得る。文脈から特に明白でない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
特に明記されていない、または文脈から自明でない限り、本明細書中で使用される場合、範囲が与えられる場合には、上限および下限は常にそれに含まれるものとする。
本明細書における変数の任意の定義における化学基のリストの列挙は、任意の単一の基または列挙される基の組合せとしてのその変数の定義を含む。本明細書における変数または態様の実施形態の列挙は、その実施形態を任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せで含む。
本明細書で提供される任意の組成物または方法は、本明細書で提供される他の組成物および方法のいずれかの1つまたは複数と組み合わせることができる。
図1A〜図1Dは、強力で選択的な癌細胞細胞傷害剤である6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）の同定および特徴付けを示す。図1Aは、10μMの濃度での処理の48時間後の、非小細胞肺癌細胞株であるTP53変異型NCI−H1734細胞および別の肺癌細胞株であるTP53野生型A549細胞の平均生存率を示す1924種の化合物の散布図である。DNMDPは大きな矢印で示されている。NCI−H1734細胞を選択的に死滅させる他の化合物は小さな矢印で示されている。陽性対照のスタウロスポリンは長い矢印で示されている。 図1Bは、示される濃度のDNMDPで48時間処理した細胞株のパネルを示す線グラフである。図1Cは、示される濃度のDNMDPの分離されたエナンチオマーで48時間処理したHeLa細胞株を示す線グラフである。（R）−エナンチオマーは、（S）−エナンチオマーと比較して500倍低いEC50を有していた。図1Dは、（R）−DNMDPの構造を示す図である。 DNMDPがNCI−H1734を選択的に死滅させ、A549の細胞生存率に影響を与えなかったことを示す。NCI−H1734およびA549細胞株を、示される化合物および濃度で48時間処理した。 （R）−6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（R）−DNMDP）および類似体の合成スキームを示す。反応条件は以下の通りである：（a）Ac2O（91％）；（b）90％HNO3、H2SO4、（19％）；（c）NaOH、MeOH／H2O、（100％）、次いで、CH3CHO、NaBH（OAc）3（7％）；（d）（BrCH2CH2）2O、K2CO3、DMF、（46％）；（e）CH3CHO、NaBH3CN、MeOH（82％）。 図4A〜図4Cは、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）の超臨界流体（SCF）クロマトグラフを示す（上から下に：ES＋、ダイオードアレイ、ES−トレース）。図4Aは、ピーク1（CRO分離）を示す3つのクロマトグラフである。 図4Bは、ピーク2（CRO分離）を示す3つのクロマトグラフである。 図4Cは、合成された（R）−DNMDP（uvにより5：95比ピーク1：2）を示す3つのクロマトグラフである。 図5A〜図5Cは、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）発現が6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）に対する感受性と相関したが、PDE3A媒介cAMP加水分解の阻害は細胞傷害性と相関しなかったことを示す。図5Aは、DNMDP感受性と、766のゲノム特徴付け細胞株における18988個の遺伝子の発現との間の相関を示す散布図である。細胞株を、2倍段階希釈の66.4μM〜2nMに及ぶ濃度で72時間処理した。PDE3A発現とDNMDPに対する感受性との間のピアソン相関のZスコアは8.5である。図5Bは、480種の化合物で処理したパネルAの細胞株の結果を示す散布図である。DNMDPは、PDE3A発現と感受性との間に最良の相関を示した。図5Cは、最大10μMの示される化合物で48時間処理した、公開されたPDE3阻害剤IC50値およびHeLa細胞のEC50値を示す散布図である。PDE3A阻害についてのDNMDP IC50濃度は図7Bで決定した。 図6A〜図6Cは、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）、シグアゾダン、およびレボシメンダンの化学構造をそれぞれ示す。 図7Aおよび図7Bは、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）のホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）インビトロIC50の決定を示すグラフである。図7Aは、示される濃度の陽性対照トレキンシンによるPDE3Aインビトロ阻害を示す（IC50曲線をCaliperによって行った）。図7Bは、示される濃度のDNMDPによるPDE3Aインビトロ阻害を示す（IC50曲線をCaliperによって行った）。 図8Aおよび図8Bは、cAMPシグナル伝達の誘導が、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）によって誘導された細胞傷害性を表現型模写しなかったことを示すグラフである。フォルスコリン：FSK。図8Aは、HeLa細胞中の示される化合物および濃度による処理の1時間後に測定されたcAMP濃度を示す。図8Bは、示される化合物および濃度で48時間処理したHeLa細胞の生存率を示す。 図9A〜図9Cは、非致死性ホスホジエステラーゼ3（PDE3）阻害剤が、PDE3Aの結合について競合することによって、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）によって誘発される細胞死を救済したことを示す。図9Aは、30nM（EC70）のDNMDPと組み合わせて20μMの濃度で1600種の生物活性化合物で48時間処理したHeLa細胞の生存率を示す散布図である。生存率は、未処理DMSO対照の百分率として計算した。図9Bは、示される濃度の非致死性PDE3およびpan−PDE阻害剤と組み合わせてDNMDPで48時間処理したHeLa細胞の生存率を示す線グラフである。図9Cは、非致死性PDE3阻害剤と同じ救済特性を有する固相に繋がれたDNMDPリンカー類似体を用いて、HeLa細胞溶解物200μgに対して行った親和性精製の結果を示すSDS−PAGEゲルを示す。示される化合物をリンカー類似体と共にインキュベートした。アフィニティー精製画分をSDS−PAGEゲル上に流し、PDE3Aについて調べた。 図10Aおよび図10Bは、リンカー化合物tert−ブチル（R）−（2−（2−（2−（エチル（4−（4−メチル−6−オキソ−1,4,5,6−テトラヒドロピリダジン−3−イル）フェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（DNMDP）−2Lの構造および救済表現型を示す。図10Aは、DNMDP−2Lの構造を示す。図10Bは、示される化合物および濃度で48時間処理したHeLa細胞の生存率を示す線形グラフである。 図11A〜図11Cは、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）が感受性細胞株において必須ではないが、細胞傷害性シグナルを中継するために必要であったことを示す。図11Aは、ウェスタンブロットである。HeLa細胞をCas9およびPDE3Aに対する示されるガイドRNA（sgRNA）に感染させた。示される時点でウェスタンブロットをPDE3Aについて調べた。 図11Bは、示されるsgRNAに2週間感染させ、1μMの6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）で48時間処理したHeLa細胞の救済率を示す棒グラフである。救済率をCas9のみの対照に対して正規化した。図11Cは、示されるsgRNAに感染させ、種々の濃度の6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）で処理した細胞の生存率を示すプロットである。 図12Aおよび図12Bは、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）タンパク質レベルの低下が、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）に対する耐性を引き起こしたことを示すウェスタンブロットおよびグラフである。図12Aでは、HeLa細胞を、スクランブル対照siRNAまたはPDE3Aを標的とする4つの異なるsiRNAの組合せで処理した。細胞を示される時点で溶解し、PDE3Aおよびアクチンについて免疫ブロットした。図12Bは、示される濃度のDNMDP類似体3で48時間処理したHeLa細胞の生存率を示す線グラフである。 図13A〜図13Cは、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）の存在下でのホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）免疫沈降が、新規なSIRT7とSLFN12の相互作用を明らかにしたことを示す。図13Aは、HeLa細胞で行ったPDE3Aの親和性濃縮、引き続いて定量的プロテオミクスの概略図である。全ての細胞を、10μMの示される化合物での溶解前に4時間処理した。全ての化合物の存在を、洗浄工程を含む実験を通して維持した。 図13Bは、PDE3A抗体に特異的なブロッキングペプチドの存在下での抗PDE3A免疫沈降物と比較した、DMSO処理HeLa細胞における抗PDE3A免疫沈降物が濃縮したタンパク質のlog2比を示す散布図である（各点はタンパク質を表す）。図13Cは、DNMDP対トレキンシンの存在下でのPDE3Aに結合したタンパク質の変化のLog2比を示す散布図である。各点は、個々のタンパク質についての1条件当たり2回の反復の平均を表す。全ての場合で、プロットされたデータは再現性について95％信頼区間でBland−Altman試験に合格した。 図14A〜図14Cは、様々な条件下でPDE3Aをベイトとして使用した、反復PDE3Aタンパク質相互作用試験の結果を示す。各散布図は、ブロッキングペプチドの存在下でのPDE3Aによる濃縮に対する様々な条件下でPDE3Aにより濃縮されたタンパク質についての2回の反復のlog2比を示した。各点はその特定のタンパク質のlog2比を表し、中程度の灰色の点はBenjamini−Hochbergの調整されたp値＜0.01に相当し、明るい灰色の点は95％信頼区間内の再現性についてのBlandt−Altman検定の外にあるタンパク質を表す。図14Aは、抗PDE3Aを用いた免疫沈降によってタンパク質濃縮を達成したことを示す図である。図14Bでは、DNMDPの存在下で抗PDE3Aを用いた免疫沈降によってタンパク質濃縮を達成した。 図14Cでは、トレキンシンの存在下で抗PDE3Aを用いた免疫沈降によってタンパク質濃縮を達成した。 図15A〜図15Eは、SLFN12およびPDE3Aの二重発現を有する細胞株が、DNMDP感受性細胞株に対して有意に濃縮されたことを示す。図15Aは、示される感受性細胞株を有する癌細胞株百科事典（CCLE）データベース（ヒト癌細胞株の大きなパネルの詳細な遺伝的特徴付け）からのPDE3AおよびSLFN12のmRNAロバストマルチチップ平均（RMA）発現値を示す散布図である（Barretinaら、Nature 483、603〜607、2012）。21の感受性細胞株を、曲線下面積（AUC）ランクに基づいて7の3つのグループに分類した。 図15Bは、SLFN12とPDE3A（RMA Log2＞5）の両方の発現が他の細胞株と比較して高い細胞株のDNMDP感受性に対するフィッシャーの正確確率検定の結果を示す棒グラフである。右の棒の上半分は黒色腫細胞株を示す。図15Cは、RNA配列決定データからのPDE3AおよびSLFN12についてのmRNA RPKM＋1発現値を示す散布図である。 図15Dは、GAPDHに正規化されたshSLFN12を形質導入されたHeLa細胞におけるSLFN12のqPCR発現変化を示す棒グラフである。図15Eは、示されるshRNA試薬で形質導入され、示される濃度のDNMDPで72時間処理されたHeLa細胞の生存率を示すプロットである。 図16Aおよび図16Bは、SLFN12発現がDNMDP感受性と相関する最上位の遺伝子の中にあったことを示す散布図である。図16Aは、DNMDP感受性と、766のゲノム特徴付け細胞株における18988個の遺伝子の発現との間の相関を示す。細胞株を、2倍段階希釈の66.4μM〜2nMに及ぶ濃度で72時間処理した。図16Bは、SLFN12発現がDNMDP感受性と相関する最上位の遺伝子の中にあったことを示す散布図である。DNMDP感受性と、766のゲノム特徴付け細胞株における18988個の遺伝子の発現との間の相関を示す散布図である。発現レベルを、先に記載されるようにPDE3A発現について補正した（Kimら、Genetica 131、151〜156、2007）。細胞株を、2倍段階希釈の66.4μM〜2nMに及ぶ濃度で72時間処理した。 図17Aおよび図17Bは、DNMDPがHeLa細胞においてアポトーシスを誘導することを示す。図17Aは、示される濃度のDNMDPで48時間処理したHeLa細胞の生存率を示すプロットである。カスパーゼ−Gloは、アポトーシスの誘導を示すカスパーゼ3／7活性を表す。CellTiter−Gloは生存率を反映する。図17Bは、免疫ブロットである。HeLa細胞を、示される化合物および濃度で36時間処理した。HeLa細胞を採取し、アポトーシスを示すPARP切断産物について免疫ブロットした。 766種の癌細胞株のPDE3A mRNA発現およびDNMDPに対する感受性の散布図である。 DNMDPがHeLa細胞におけるPDE3AとSIRT7およびSLFN12との間の相互作用を誘導することを示す免疫ブロットである。HeLa細胞を示されるプラスミドでトランスフェクトし、最終濃度10μMの指示される化合物で4時間処理した。内因性PDE3Aを免疫沈降させ、V5について免疫ブロットして、SIRT7およびSLFN12との新規な相互作用を同定した（上の2つのパネル）。免疫沈降物のインプットをPDE3AおよびV5について免疫ブロットした（下の2つのパネル）。V5−SLFN12は全細胞溶解物中で検出できなかった。 親和性試薬を用いた本明細書の質量分析結果の確認を示す免疫ブロットである。SLFN 12がDNMDP活性に必要であることを示す。DNMDPおよび（弱く）アナグレリドがPDE3AとSLFN12の複合体形成を誘導したがトレキンシンはしなかったことを示す。 図21A〜図21Cは、用量依存性PDE3A／SLFN12複合体がHeLa細胞での細胞死滅能力に相関することを示す。図21Aは、化合物7、化合物8および化合物3で処理した細胞でのSLFN12−V5レベルを示す免疫ブロットである。図21Bは、図21Aの化合物7、化合物8および化合物3で処理した細胞でのSLFN12−V5レベルを数量化することによって測定される、HeLa細胞での複合体形成を示すプロットである。図21Cは、化合物7、化合物8および化合物3で処理したHeLa細胞での細胞死滅を示すプロットである。化合物の構造を下に示す： SLFN12およびCREB3Lが、DNMDPに対する耐性を獲得した細胞において失われたことを示す一組の表である。 図23Aは、PDE3A阻害剤トレキンシンによって競合が弱まった、SLFN12の発現によるDNMDP耐性HeLa細胞株の感作を示すプロットである。図23Bは、SLFN12の発現またはSLFN12およびPDE3Aの発現によるDNMDP耐性細胞株（A549）の感作を示すプロットである。 SLFN12およびPDE3A発現レベルに基づくPDE3A調節に対する平滑筋肉腫（LMS）の予測される感受性を示す散布図である。
表1は、DNMDPで処理した766種の癌細胞株の感受性データを示す。細胞株を、2倍段階希釈の66.4μM〜2nMに及ぶ濃度で72時間処理した。
表1aは、化合物6の細胞（ell）増殖結果測定によって得たIC50値を示す。
表2は、Caliperによって行われた19のホスホジエステラーゼ阻害反応のパネルの結果を示す。DNMDP濃度は100nMであった。
表3は、複数の健康な組織型におけるSLFN12およびPDE3A発現のRPKM値を示す。
表4は、平滑筋肉腫がDNMDPに感受性があると予測されることを示す。
表5は、DNMDPとPDE3A（677〜1141）の結合を示す。
本発明によって定義される組成物および物品は、以下に提供される実施例に関連して単離したまたは製造した。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
以下に記載されるように、本発明は、患者に由来する癌細胞中のPDE3AおよびSchlafen 12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同時発現を検出することによって、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターによる治療に感受性のある癌（例えば本明細書に記載される癌の種類）を有する患者を特定する改善された方法を特徴とする。本発明は、少なくとも一部が、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オンまたはDNMDPなどのホスホジエステラーゼ3Aモジュレーターに対する感受性が、766の癌細胞株において、ホスホジエステラーゼ3A遺伝子、PDE3Aの発現と相関するという発見に基づく。DNMDPのように、PDE3A阻害剤のサブセットは選択された癌細胞を死滅させるが、他のものは死滅させない；これらの細胞節約型PDE3A阻害剤は、代わりにDNMDP誘発細胞傷害性をブロックする。さらに、PDE3A枯渇はDNMDP耐性をもたらす。DNMDPのPDE3Aとの結合は、PDE3Aとサーチュイン7（SIRT7）およびSchlafen12（SLFN12）との間の相互作用を促進し、これは新形態活性、およびDNMDP感受性と相関するSLFN12とPDE3Aの同時発現を示唆する。これらの結果は、PDE3Aモジュレーターが有望な癌治療剤であり、小分子発見および標的同定における予測的ケモゲノミクスの能力を実証することを示している。
したがって、本発明は、PDE3Aモジュレーターに反応する癌を有する対象を選択する方法であって、前記対象に由来する癌細胞中のPDE3AおよびSchlafen12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同時発現を検出する工程を含む方法を提供する。
特定の一実施形態では、CREB3L1またはSLFN12ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現は、PDE3Aモジュレーターに対する耐性を獲得した癌細胞において低下しているかまたは検出不能である。
「PDE3Aモジュレーター」
PDE3Aモジュレーターの同定を、変異型tp53バックグラウンド中の細胞傷害性小分子を同定するよう設計された表現型スクリーニングに関連して行った。予測的ケモゲノミクスアプローチは、広範なインビトロおよびインビボ標的検証からなる標的駆動薬物開発プログラムを補完し、逆ケモゲノミクスとも呼ばれ得る（Zhengら、Curr Issues Mol Biol 4、33〜43、2002）。こうして多くの米国食品医薬品局（FDA）承認標的療法が開発され、その中に発癌性体細胞ドライバー変異を標的とする小分子キナーゼ阻害剤がある（Moffatら、Nat Rev Drug Discov 13、588〜602、2014）。しかしながら、標的療法の発見および開発は、しばしば、標的の生物学的機能、その作用機序、および標的を選択的に阻害するための利用可能な化学物質に関する知識の限界によって妨げられる。
表現型スクリーニングは、将来の研究によってその特定の分子機序がしばしば解明される癌療法のための新規な標的を発見することができる（Swinneyら、Nat Rev Drug Discov 10、507〜519、2011）。近年、不偏表現型スクリーニング研究によって見出された2つのクラスの抗癌剤がFDAによって承認されている。レナリドミドおよびポマリドミドは、その標的の親和性を変化させ、系統特異的転写因子の分解をもたらすE3−リガーゼのモジュレーターであることが分かった一方で（Kronkeら、Science 343、301〜305、2014；Luら、Science 343、305〜309、2014）、ロミデプシンおよびボリノスタットは、後に、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤として同定された（Moffatら、Nat Rev Drug Discov 13、588〜602、2014；Nakajimaら、Exp. Cell Res. 241、126〜133、1998、Marksら、Nat Biotechnol 25、84〜90、2007）。
BRCA1／BRCA2変異癌のオラパリブ治療などの合成致死アプローチが有効であることが判明しているが、腫瘍抑制剤変更は、小分子では直接標的化できないため、表現型スクリーニングの適切な標的である。現在の知見によれば、tp53腫瘍抑制遺伝子は、全エキソーム配列決定を受けた4742種の癌の36％において体細胞突然変異が検出され、ヒト癌にわたって最も頻繁に変異している。多くの試みにもかかわらず、tp53変異型細胞を選択的に死滅させる化合物は同定されていない。
tp53変異癌細胞において合成致死を引き起こす小分子を同定するために開発された表現型スクリーニングは、本明細書中以下で記載されるように、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）のモジュレーターとして作用するクラスの癌選択的細胞傷害剤の運が良い発見を可能にした。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼは、二次メッセンジャー分子である環状アデノシン一リン酸（cAMP）および環状グアノシン一リン酸（cGMP）の加水分解を触媒し、多くの生理学的過程において重要である。心血管適応症および血小板凝固の阻害のためのPDE3阻害剤ミルリノン、シロスタゾールおよびレボシメンダン、ならびに血小板血症のためのPDE3阻害剤アナグレリドを含むいくつかのホスホジエステラーゼ阻害剤が臨床治療に承認されている。さらなるPDE3A阻害剤は国際公開第2014／164704号から公知である。PDE5阻害剤、例えば、バルデナフィルは勃起不全および肺動脈高血圧を含む平滑筋障害に使用され、PDE4阻害剤ロフルミラストは慢性閉塞性肺疾患（COPD）からの憎悪を軽減する。
ホスホジエステラーゼ阻害剤は、それらの標的の直接阻害またはアロステリック調節によって作用する；例えば、PDE4の構造解析は、PDE4DおよびPDE4Bアロステリックモジュレーターの設計をもたらした（Burginら、Nat Biotechnol 28、63〜70、2010；Gurneyら、Neurotherapeutics 12、49〜56、2015）。本明細書で以下に提供されるデータは、癌細胞傷害性ホスホジエステラーゼモジュレーターDNMDPが類似のアロステリック機序を介して作用する可能性が高いことを示している。
したがって、本発明は、癌細胞を含む対象の生体試料中のPDE3AおよびSLFN12発現レベルに基づいてPDE3Aモジュレーター治療に反応する可能性のある悪性腫瘍を有する対象を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、PDE3AモジュレーターはDNMDPである。いくつかの他の実施形態では、PDE3Aモジュレーターはアナグレリドまたはザルダベリンである。さらにその他の実施形態では、PDE3Aモジュレーターは、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、または化合物6である。
特定の実施形態では、本発明は、参照と比較してCREB3L1またはSLFN12の発現の消失またはその発現レベルの低下に基づいて、PDE3Aモジュレーター治療に耐性である悪性腫瘍を有する対象を特定する方法を提供する。
「化合物形態および塩」
本発明の化合物は、化合物自体、ならびに適用可能であればそれらの塩およびそれらのプロドラッグを含む。塩は、例えば、アニオンと、本明細書に記載される化合物上の正に帯電した置換基（例えば、アミノ）との間で形成され得る。適切なアニオンには、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩および酢酸塩が含まれる。同様に、塩は、カチオンと、本明細書に記載される化合物上の負に帯電した置換基（例えば、カルボキシレート）との間でも形成され得る。適切なカチオンには、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンおよびアンモニウムカチオン（テトラメチルアンモニウムイオンなど）が含まれる。プロドラッグの例としては、対象に投与すると、活性化合物を提供することができるカルボン酸基のC1〜6アルキルエステルが挙げられる。
本開示の化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基に由来するものを含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的に許容される酸または塩基を本明細書で開示される化合物に添加することによって形成される塩を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という句は、毒物学的観点から医薬用途での使用に許容され、有効成分と有害に相互作用をしない物質を指す。
本発明の化合物の薬学的に許容される適した塩は、例えば、十分に塩基性の、例えば鎖中または環内に窒素原子を有する本発明の化合物の酸付加塩、例えば無機酸、または「鉱酸」による酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、重硫酸、リン酸または硝酸など、または有機酸〜による酸付加塩、例えば、ギ酸、酢酸、アセト酢酸、ピルビン酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ウンデカン酸、ラウリル酸、安息香酸、サリチル酸、2−（4−ヒドロキシベンゾイル）−安息香酸、ショウノウ酸、ケイヒ酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、ニコチン酸、パモ酸、ペクチニン酸、3−フェニルプロピオン酸、ピバル酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、イタコン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、2−ナフタレンスルホン酸、ナフタリンジスルホン酸、ンファースルホン酸、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、アジピン酸、アルギン酸、マレイン酸、フマル酸、D−グルコン酸、マンデル酸、アスコルビン酸、グルコヘプタン酸、グリセロリン酸、アスパラギン酸、スルホサリチル酸、またはチオシアン酸による酸付加塩であってよい。
適切な酸塩のさらなる例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモエート（palmoate）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられる。本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製には、それ自体は薬学的に許容されるものではないシュウ酸などの他の酸を使用することができる。
さらに、化合物1〜6の、特に十分に酸性の化合物6の別の適切な薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム、マグネシウムまたはストロンチウム塩、あるいはアルミニウムまたは亜鉛塩、あるいはアンモニアまたは1〜20個の炭素原子を有する有機第一級、第二級または第三級アミンから誘導されたアンモニウム塩、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、ジエチルアミノエタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、プロカイン、ジベンジルアミン、N−メチルモルホリン、アルギニン、リジン、1,2−エチレンジアミン、N−メチルピペリジン、N−メチル−グルカミン、N,N−ジメチル−グルカミン、N−エチル−グルカミン、1,6−ヘキサンジアミン、グルコサミン、サルコシン、セリノール、2−アミノ−1,3−プロパンジオール、3−アミノ−1,2−プロパンジオール、4−アミノ−1,2,3−ブタントリオールなど、あるいは、1〜20個の炭素原子を有する第四級アンモニウムイオンによる塩、例えばテトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラ（n−プロピル）アンモニウム、テトラ（n−ブチル）アンモニウム、N−ベンジル−N,N,N−トリメチルアンモニウム、コリンまたはベンザルコニウムなどである。
ある種の実施形態では、塩は、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウムおよびN−（アルキル）4 ＋塩を含む、適切な塩基から誘導される。本発明はまた、本明細書で開示される化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も想定している。このような四級化によって水または油−溶性または分散性の生成物を得ることができる。本明細書中の式のいずれかの化合物の塩形態は、カルボキシル基のアミノ酸塩（例えば、L−アルギニン、−リジン、−ヒスチジン塩）であり得る。
適切な塩のリストは、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第17版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、1985、1418頁；Journal of Pharmaceutical Science、66、2（1977）；および「Pharmaceutical Salts：Properties, Selection, and Use A Handbook；Wermuth, C. G. およびStahl, P. H. （編）Verlag Helvetica Chimica Acta、Zurich、2002［ISBN 3−906390−26−8］に見出される。当業者であれば、請求される化合物の酸付加塩が、いくつかの既知の方法のいずれかを介して化合物と適当な無機酸または有機酸の反応によって調製されることが可能であることをさらに認識するであろう。あるいは、本発明の酸性化合物のアルカリおよびアルカリ土類金属塩は、種々の既知の方法を介して本発明の化合物を適当な塩基と反応させることによって調製される。
本発明は、単一の塩として、または任意の比の前記塩の任意の混合物として本発明の化合物の全ての可能な塩を含む。
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を慣用的な方法で単離することによって再生することができる。化合物の親形態は、極性溶媒への溶解性などの一定の物理的特性において種々の塩形態とは異なるが、その他の点では、塩は本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。
塩形態に加えて、本発明は、プロドラッグ形態である化合物を提供する。本明細書に記載される化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で化学変化を受けて本発明の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグを、生体外環境において化学的または生化学的方法によって本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグを、適切な酵素または化学試薬によって、経皮パッチリザーバーに入れた場合に、本発明の化合物にゆっくりと変換することができる。プロドラッグは、状況によっては、親薬物よりも投与が容易であり得るので、しばしば有用である。これらは、例えば、親薬物より経口投与によって生物学的に利用可能である場合がある。プロドラッグはまた、親薬物よりも薬理学的組成物における改善された溶解性を有し得る。プロドラッグの加水分解的切断または酸化的活性化によるものなど、多種多様なプロドラッグ誘導体が当該分野で公知である。限定されないが、プロドラッグの一例は、エステル（「プロドラッグ」）として投与されるが、その後、代謝的に加水分解されて活性物質であるカルボン酸になる本発明の化合物であろう。さらなる例としては、本発明の化合物のペプチジル誘導体が挙げられる。
本発明はまた、化合物の種々の水和物および溶媒和物形態も含む。
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する原子の1個または複数において不自然な割合の原子同位体を含有してもよい。例えば、化合物は、例えばトリチウム（3H）、ヨウ素−125（125I）または炭素−14（14C）などの放射性同位元素で放射標識されてもよい。本発明の化合物の全ての同位体変種は、放射性であろうとなかろうと、本発明の範囲内に包含されることが意図される。特に重水素含有化合物。
化合物または試薬の「同位体変異体」という用語は、そのような化合物を構成する、不自然な比率の1または複数の同位体を示す化合物と定義される。
「不自然な比率」という表現は、そのような同位体のその自然存在比よりも高い比率を意味する。この文脈に適用される同位体の自然存在比は、“Isotopic Compositions of the Elements 1997”, Pure Appl. Chem., 70（1）, 217−235, 1998に記載されている。
そのような同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素の安定した放射性の同位元素、例えば、それぞれ、2H（重水素）、3H（トリチウム）、11C、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、125I、129Iおよび131Iが挙げられる。
本明細書において指定される障害の処置および／または予防に関して、化合物1〜6の、特に化合物6の1または複数の同位体変異体は、好ましくは重水素を含む（「重水素含有」）。1または複数の放射性同位元素、例えば、3Hまたは14Cなどが組み込まれている化合物1〜6の、特に化合物6の同位体変異体は、例えば薬剤および／または基質組織分布研究に有用である。これらの同位体は、その組み込みの容易さおよび検出性のために特に好ましい。18Fまたは11Cなどのポジトロン放出同位体は、化合物1〜6、特に化合物6に組み込まれることができる。化合物1〜6のこれらの同位体変異体は、インビボイメージング用途に有用である。重水素含有および13C含有化合物1〜6は、前臨床または臨床研究の状況において質量分析で使用されることができる。
化合物1〜6の同位体変異体は、前記試薬同位体変異体の代わりに試薬、好ましくは重水素含有試薬を用いることによって、当業者に公知の方法、例えば本明細書中のスキームおよび／または例に記載される方法などによって一般的に調製することができる。重水素化の望ましい場所に応じて、一部の例では、D2Oの重水素は、化合物に直接組み込まれるか、またはそのような化合物を合成するのに有用な試薬に組み込まれることができる。重水素ガスも重水素を分子に組み込むために有用な試薬である。オオレフィン結合およびアセチレン結合の接触重水素化は、重水素の取り込みのための迅速な経路である。金属触媒（すなわち、Pd、Pt、およびRh）は、重水素ガスの存在下で、炭化水素を含有する官能基において重水素を水素に直接交換するために使用され得る。多様な重水素化試薬および合成ビルディングブロックが、例えばC／D／N Isotopes、ケベック、カナダ；Cambridge Isotope Laboratories Inc.、Andover、米国マサチューセッツ州；およびCombiPhos Catalysts、Inc.、Princeton、米国ニュージャージー州などの会社から市販されている。
用語「重水素含有化合物1〜6」は、1または複数の水素原子が1または複数の重水素原子によって置き換えられていて、化合物1〜6のいずれか1つの重水素化された位置での重水素の存在比が、重水素の自然存在比（約0.015％）よりも高い化合物として定義される。特に、重水素含有化合物1〜6のいずれか1つにおいて、化合物の各々の重水素化された位置での重水素の存在比は、前記1または複数の位置で10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％または80％よりも高い、好ましくは90％、95％、96％または97％よりも高い、さらにより好ましくは98％または99％よりも高い。各々の重水素化された位置の重水素の存在比が、他の1または複数の重水素化された位置の重水素の存在比とは無関係であることは理解される。
1または複数の重水素原子の化合物1〜6のいずれか1つへの選択的取り込みは、分子の物理化学的特性（例えば、酸度［C. L. Perrinら, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 4490］ 、塩基性度［C. L. Perrinら, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 9641］、親油性［B. Testaら, Int. J. Pharm., 1984, 19（3）, 271］）および／または代謝プロフィールを変えることがあり、親化合物と代謝産物の比、または生じる代謝産物の量に変化をもたらすことがある。そのような変化は、結果としてある特定の治療上の利点となることがあり、それゆえに一部の状況で好ましいことがある。代謝産物の比率が変化している、代謝および代謝切り替えの割合の低下は報告されている（A. E. Mutlibら、Toxicol. Appl. Pharmacol.、2000、169、102）。親薬物および代謝産物への曝露におけるこれらの変化は、一般式（I）の重水素含有化合物の薬動力学、忍容性および効力に関して重要な結果を有し得る。一部の例では、重水素置換は、望ましくないかまたは有毒な代謝産物の形成を減らすかまたは無くし、望ましい代謝産物の形成を強化する（例えばNevirapine：A. M. Sharmaら、Chem. Res. Toxicol.、2013、26、410；Efavirenz：A. E. Mutlibら、Toxicol. Appl. Pharmacol.、2000、169、102）。その他の例では、重水素化の主な効果は、全身クリアランスの比率を低下させることである。結果として、化合物の生物学的半減期は増加する。有望な臨床上の利益には、ピーク値の低下およびトラフ値の増加を伴う、同様の全身曝露を維持する能力が含まれるであろう。これは、特定の化合物の薬物動態／薬力学の関係に応じて、副作用の低下および効力の増強という結果をもたらし得る。ML−337（C. J. Wenthurら, J. Med. Chem., 2013, 56, 5208）およびOdanacatib（K. Kassahunら, 国際公開第2012／112363号）は、この重水素効果の例である。代謝速度の低下が全身クリアランス速度を変えることなく薬物の曝露を増加させるさらに他のケースが報告されている（例えばロフェコキシブ：F. Schneiderら, Arzneim. Forsch. ／Drug. Res., 2006, 56, 295；テラプレビル：F. Maltaisら, J. Med. Chem., 2009, 52, 7993）。この効果を示す重水素化薬物は、投薬の要件の減少（例えば望ましい効果を実現するための用量数を低下または投薬量の低下）を減らすことがあり、かつ／あるいは、代謝産物量の低下を生じることがある。
化合物1〜6は、代謝を攻撃する、複数の可能性のある場所を有することがある。物理化学的性質および代謝プロファイルに対する上記の効果を最適化するため、ある特定のパターンの1または複数の重水素−水素交換を有する、重水素含有化合物1〜6を選択することができる。特に、1または複数の重水素含有化合物1〜6の1または複数の重水素原子は、炭素原子と結合していて、かつ／または、例えばシトクロムP450などの酵素を代謝するための攻撃の場所である、化合物1〜6の位置に位置している。
「医薬組成物」
化合物1〜6、特に化合物6は、全身および／または局所活性を有することが可能である。この目的のために、これらを適当な様式で、例えば、経口、非経口、肺、経鼻、舌下、舌、頬側、直腸、真皮、経皮、結膜、耳経路により、またはインプラントもしくはステントとして投与することができる。
これらの投与経路のために、化合物1〜6を適した投与形態で投与することが可能である。
経口投与のために、本発明の化合物を迅速にかつ／または変更された様式で送達する当技術分野で公知の剤形に化合物1〜6を製剤化することが可能であり、それは例えば、錠剤（コーティングされていないか、あるいは、例えば遅れて溶解するかまたは不溶性の腸溶もしくは制御放出コーティングによってコーティングされた錠剤）、口腔内崩壊錠、フィルム／ウエハ、フィルム／凍結乾燥物、カプセル剤（例えば硬質もしくは軟質ゼラチンカプセル剤）、糖衣錠、顆粒剤、ペレット剤、散剤、乳剤、懸濁剤、エアゾール剤または液剤である。化合物1〜6を結晶形および／または無定形および／または溶解形で前記剤形に組み込むことが可能である。
非経口投与は、（例えば、静脈内、動脈内、心臓内、髄腔内もしくは腰椎内）吸収工程を回避して、または（例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮もしくは腹腔内）吸収を含めることによって達成することができる。非経口投与に適した投与形態は、とりわけ、液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥物または滅菌散剤の形態の注射および点滴用製剤が含まれる。
その他の投与経路に適した例は、吸入用の剤形［特に粉末吸入器、ネブライザー］、点鼻剤、点鼻液、鼻腔スプレー；舌、舌下または頬側投与用の錠剤／フィルム／ウエハ／カプセル剤；坐剤；点眼剤、眼軟膏、洗眼器、眼球インサート、点耳剤、耳スプレー、イヤーパウダー、イヤーリンス、耳タンポン；膣カプセル剤、水性懸濁液（ローション、振盪混合物mixturae agitandae）、親油性懸濁剤、乳剤、軟膏、クリーム、経皮治療系（例えば、パッチなど）、ミルク、ペースト、フォーム、散布剤、インプラントまたはステントである。
本発明による化合物は、述べた投与形態に組み込むことができる。これは、薬学的に適した賦形剤と混合することによって、それ自体は既知の方法で達成することができる。薬学的に適した賦形剤としては、とりわけ、
・増量剤および担体（例えばセルロース、微結晶性セルロース（例えば、Avicel（登録商標）など）、ラクトース、マンニトール、デンプン、リン酸カルシウム（例えば、Di−Cafos（登録商標））など）、
・軟膏基剤（例えばワセリン、パラフィン、トリグリセリド、ワックス、羊毛脂、羊毛脂アルコール、ラノリン、親水性軟膏、ポリエチレングリコール）、
・坐剤用基剤（例えばポリエチレングリコール、カカオバター、ハードファット）、
・溶媒（例えば水、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、プロピレングリコール、中鎖長トリグリセリド脂肪油、液体ポリエチレングリコール、パラフィン）、
・界面活性剤、乳化剤、分散剤または湿潤剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、レシチン、リン脂質、脂肪アルコール（例えば、Lanette（登録商標）など）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Span（登録商標）など）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Tween（登録商標）など）、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド（例えば、Cremophor（登録商標）など）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、グリセロール脂肪酸エステル、ポロキサマー（例えば、Pluronic（登録商標）など）、
・緩衝剤および酸および塩基（例えば、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム溶液、炭酸アンモニウム、トロメタモール、トリエタノールアミン）
・等張剤（例えば、グルコース、塩化ナトリウム）、
・吸着剤（例えば、高分散シリカ）
・増粘剤、ゲル形成剤、増粘剤および／または結合剤（例えばポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、カルボマー、ポリアクリル酸（例えば、Carbopol（登録商標）など）；アルギン酸塩、ゼラチン）、
・崩壊剤（例えば、修飾デンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン（例えば、Explotab（登録商標）など）、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウム（例えば、AcDiSol（登録商標）など））
・流動調節剤、滑沢剤、磨砕剤および離型剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、高分散性シリカシリカ（例えば、Aerosil（登録商標）など））、
・塗料（例えば、砂糖、セラック）および迅速にまたは変更された様式で溶解するフィルムまたは拡散膜のためのフィルム形成剤（例えばポリビニルピロリドン（例えば、Kollidon（登録商標）など）、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、例えば、Eudragit（登録商標）など））
・カプセル材料（例えば、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、
・合成ポリマー（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート（例えば、Eudragit（登録商標）など）、ポリビニルピロリドン（例えば、Kollidon（登録商標）など）、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコールならびにそれらの共重合体およびブロック共重合体）、
・可塑剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、トリアセチン、クエン酸トリアセチル、フタル酸ジブチル）、
・浸透促進剤、
・安定剤（例えば、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピルなどの抗酸化剤）、
・防腐剤（例えば、パラベン、ソルビン酸、チオメルサール、塩化ベンザルコニウム、酢酸クロルヘキシジン、安息香酸ナトリウム）、
・着色剤（例えば無機顔料、例えば、酸化鉄、二酸化チタンなど）、
・香料、甘味料、風味および／または臭気マスキング剤
が挙げられる。
本発明はさらに、少なくとも1つの化合物1〜6、特に化合物6を慣習的に1または複数の薬学的に適した賦形剤とともに含む医薬組成物、および本発明によるそれらの使用に関する。
「組合せ」
別の態様によれば、本発明は、特に過剰増殖性疾患、特に癌の治療および／または予防のための、少なくとも1つの化合物1〜6、特に化合物6と、少なくとも1または複数のさらなる有効成分を含む医薬組合せ、特に医薬を包含する。
特に、本発明は、
・1または複数の第1の有効成分、特に上に定義される化合物1〜6の1つ、特に化合物6および、
・1または複数のさらなる有効成分、特に過剰増殖性疾患、特に癌
を含む医薬品の組合せを包含する。
本発明の用語「組合せ」は、当業者に公知のように使用され、前記組合せは固定された組合せ、固定されていない組合せまたはパーツキットであることが可能である。
本発明の「固定された組合せ」は、当業者に公知のように使用され、例えば、第1の有効成分、例えば1または複数の化合物1〜6と、さらなる有効成分が1つの単位用量または単一実体中に一緒に存在する組合せとして定義される。「固定された組合せ」の一例は、第1の有効成分とさらなる有効成分が同時投与用の混和物、例えば、製剤中に存在する医薬組成物である。「固定された組合せ」の別の例は、第1の有効成分とさらなる有効成分が混和していないが一単位中に存在する医薬組合せである。
本発明の固定されていない組合せまたは「パーツキット」は、当業者に公知のように使用され、第1の有効成分とさらなる有効成分が2つ以上の単位中に存在する組合せとして定義される。固定されていない組合せまたはパーツキットの一例は、第1の有効成分とさらなる有効成分が別々に存在する組合せである。固定されていない組合せまたはパーツキットの成分は、別々に、順次に、同時に、同時発生的にまたは経時的に交互に投与することができる。
本発明の化合物は、唯一の医薬剤として、または組合せが許容されない有害作用を引き起こさない1種または複数の他の医薬有効成分と組み合わせて投与することができる。本発明は、このような医薬品の組合せも包含する。例えば、本発明の化合物は、既知の抗癌剤およびこれらの抗癌剤が有するかもしれない潜在的な副作用を改善する薬剤と組み合わせることができる。
これらの薬剤の例としては以下が挙げられる：
131I−chTNT、アバレリックス、アビラテロン、アクラルビシン、アダリムマブ、ado−トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アフリベルセプト、アルデスロイキン、アレクチニブ、アレムツズマブ、アレンドロン酸、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、ヘキシルアミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナストロゾール、アンセスチム、アネトールジチオールチオン、アネツマブ・ラブタンシン、アンジオテンシンII、抗トロンビンIII、アプレピタント、アルシツモマブ、アルグラビン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アテゾリズマブ、アキシチニブ、アザシチジン、バシリキシマブ、ベロテカン、ベンダムスチン、ベシレソマブ、ベリノスタット、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ビサントレン、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ボルテゾミブ、ブセレリン、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブ、カルシトニン、ホリナートカルシウム、レボホリナートカルシウム、カペシタビン、カプロマブ、カルバマゼピン、カルボプラチン、カルボコン、カルフィルゾミブ、カルモフール、カルムスチン、カツマキソマブ、セレコキシブ、セルモロイキン、セリチニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、クロルマジノン、クロルメチン、シドホビル、シナカルセト、シスプラチン、クラドリビン、クロドロン酸、クロファラビン、コビメチニブ、コパンリシブ、クリサンタスパーゼ、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダルベポエチンアルファ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デプレオチド、デスロレリン、ジアンヒドロガラクチトール、デクスラゾキサン、塩化ジブロスピジウム、ジアンヒドロガラクチトール、ジクロフェナク、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキソルビシン＋エストロン、ドロナビノール、エクリズマブ、エドレコロマブ、酢酸エリプチニウム、エロツズマブ、エルトロンボパグ、エンドスタチン、エノシタビン、エンザルタミド、エピルビシン、エピチオスタノール、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンゼータ、エプタプラチン、エリブリン、エルロチニブ、エソメプラゾール、エストラジオール、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、ファドロゾール、フェンタニル、フィルグラスチム、フルオキシメステロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸、フォルメスタン、ホスアプレピタント、ホテムスチン、フルベストラント、ガドブトロール、ガドテリドール、ガドテル酸メグルミン、ガドベルセタミド、ガドキセト酸、硝酸ガリウム、ガニレリクス、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、グルカルピダーゼ、グルトキシム、GM−CSF、ゴセレリン、グラニセトロン、顆粒球コロニー刺激因子、ヒスタミン二塩酸塩、ヒストレリン、ヒドロキシカルバミド、I−125シード、ランソプラゾール、イバンドロン酸、イブリツモマブ・ティウキセタン、イブルチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イミキモド、インプロスルファン、インジセトロン、インカドロン酸、インゲノールメブテート、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、イオビトリドール、イオベングアン（123I）、イオメプロール、イピリムマブ、イリノテカン、イトラコナゾール、イクサベピロン、イキサゾミブ、ランレオチド、ランソプラゾール、ラパチニブ、IASOコリン（Iasocholine）、レナリドミド、レンバチニブ、レノグラスチム、レンチナン、レトロゾール、ロイプロレリン、レバミソール、レボノルゲストレル、レボチロキシンナトリウム、リスリド、ロバプラチン、ロムスチン、ロニダミン、マソプロコール、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メラルソプロール、メルファラン、メピチオスタン、メルカプトプリン、メスナ、メタドン、メトトレキサート、メトキサレン、アミノレブリン酸メチル、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、メチロシン、ミファムルチド、ミルテホシン、ミリプラチン、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、モガムリズマブ、モルグラモスチム、モピダモール、モルヒネ塩酸塩、モルヒネ硫酸塩、ナビロン、ナビキシモルス、ナファレリン、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナルトレキソン、ナルトグラスチム、ネシツムマブ、ネダプラチン、ネララビン、ネリドロン酸、ネツピタント／パロノセトロン、ニボルマブ、ペンテトレオチド、ニロチニブ、ニルタミド、ニモラゾール、ニモツズマブ、ニムスチン、ニンテダニブ、ニトラクリン、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オクトレオチド、オファツムマブ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシン・メペサクシネート、オメプラゾール、オンダンセトロン、オプレルベキン、オルゴテイン、オリロチモド、オシメルチニブ、オキサリプラチン、オキシコドン、オキシメトロン、オゾガマイシン、p53遺伝子療法、パクリタキセル、パルボシクリブ、パリフェルミン、パラジウム−103シード、パロノセトロン、パミドロン酸、パニツムマブ、パノビノスタット、パントプラゾール、パゾパニブ、ペグアスパルガーゼ、PEG−エポエチンベータ（メトキシPEG−エポエチンベータ）、ペムブロリズマブ、ベグフィルグラスチム、pegインターフェロンアルファ−2b、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、ペンタゾシン、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルフルブタン、ペルホスファミド、ペルツズマブ、ピシバニール、ピロカルピン、ピラルビシン、ピクサントロン、プレリキサホル、プリカマイシン、ポリグルサム、リン酸ポリエストラジオール、ポリビニルピロリドン＋ヒアルロン酸ナトリウム、ポリサッカリド−K、ポマリドミド、ポナチニブ、ポルフィマーナトリウム、プララトレキサート、プレドニムスチン、プレドニゾン、プロカルバジン、プロコダゾール、プロプラノロール、キナゴリド、ラベプラゾール、ラコツモマブ、塩化ラジウム223、ラドチニブ、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ラムシルマブ、ラニムスチン、ラスブリカーゼ、ラゾキサン、レファメチニブ、レゴラフェニブ、リセドロン酸、エチドロン酸レニウム−186、リツキシマブ、ロラピタント、ロミデプシン、ロミプロスチム、ロムルチド、ロニシクリブ、サマリウム（153Sm）レキシドロナム、サルグラモスチム、サツモマブ、セクレチン、シルツキシマブ、シプロイセルT、シゾフィラン、ソブゾキサン、グリシジダゾールナトリウム、ソニデギブ、ソラフェニブ、スタノゾロール、ストレプトゾシン、スニチニブ、タラポルフィン、タリモジーン・ラハーパレプベック、タミバロテン、タモキシフェン、タペンタドール、タソネルミン、テセロイキン、テクネチウム（99mTc）ノフェツモマブメルペンタン、99mTc−HYNIC−［Tyr3］−オクトレオチド、テガフール、テガフール＋ギメラシル＋オテラシル、テモポルフィン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、テトロホスミン、サリドマイド、チオテパ、チマルファシン、サイロトロピンアルファ、チオグアニン、トシリズマブ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラマドール、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トレオスルファン、トレチノイン、トリフルリジン＋チピラシル、トリロスタン、トリプトレリン、トラメチニブ、トロフォスファミド、トロンボポエチン、トリプトファン、ウベニメクス、バラチニブ、バルルビシン、バンデタニブ、バプレオチド、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ビスモデギブ、ボリノスタット、ボロゾール、イットリウム90ガラスミクロスフェア、ジノスタチン、ジノスタチンスチマラマー、ゾレドロン酸、ゾルビシン。
「有用性」
化合物6は、PDE3A阻害剤であり、したがってホスホジエステラーゼ阻害剤で癌を標的化することが有望な手法であり得るという事実によれば、化合物6は癌の治療に有用である。
本発明のさらなる態様は、過剰増殖性疾患の治療で用いる化合物6である。
本発明のさらなる態様は、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、原発性骨髄線維症などを含む造血過剰増殖性疾患である、過剰増殖性疾患の治療で用いる化合物6である。
さらなる態様は、化合物6の1または複数の化合物の有効量を投与することを含む、過剰増殖性疾患の予防および／または治療の方法、特に過剰増殖性疾患の治療の方法である。
化合物6は、良性過剰増殖性疾患、例えば子宮内膜症、平滑筋腫および良性前立腺過形成の予防および／または治療にも適している。
したがって、さらなる態様は、過剰増殖性疾患が良性過剰増殖性疾患であることである。
本発明の別の態様は、癌の治療で用いる化合物6である。それらは転移性または悪性腫瘍の治療に特に有用である。
したがって本発明の別の態様は、有効量の少なくとも1つの化合物6を投与することを含む、癌の治療の方法である。
本発明のさらなる態様は、有効量の化合物6を投与することを含む、転移性または悪性腫瘍の治療の方法である。
本発明の別の態様は、固形腫瘍の治療のための化合物6の使用である。
本発明のさらなる態様は、固形腫瘍の治療で用いる化合物6である。
本発明のさらなる態様は、有効量の化合物6を投与することを含む、固形腫瘍の治療の方法である。
本発明のさらなる態様は、乳房、気道、脳、骨、中枢神経系および末梢神経系、結腸、直腸、肛門、生殖器（例えば、子宮頸部、卵巣、前立腺）、胃腸管（消化管間質腫瘍を含む）、尿生殖路、内分泌腺（例えば、甲状腺および副腎皮質）、甲状腺、副甲状腺、食道、子宮内膜、眼、生殖細胞、頭頚部、腎臓、肝臓、喉頭および下咽頭、肺、中皮腫、膵臓、前立腺、直腸、腎臓、小腸、皮膚、軟組織、胃、精巣、尿管、膣および外陰部の腫瘍ならびにこれらの腫瘍の結合組織および転移として治療することのできる、固形腫瘍の治療のための化合物6の使用である。悪性新生物には、網膜芽細胞腫およびウィルムス腫瘍によって例示される遺伝性癌が含まれる。
本発明のさらに別の態様は、有効量の化合物6を投与することを含む、上述の腫瘍の治療の方法である。
本発明の別の態様は、血液腫瘍の治療のための化合物6の使用である。
本発明のさらなる態様は、血液腫瘍の治療で用いる化合物6である。
本発明のさらなる態様は、有効量の化合物6を投与することを含む、血液腫瘍の治療の方法である。
本発明の別の態様は、癌の治療のための化合物6の使用であり、その癌の種類は、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌（特に頭部癌、より具体的には神経膠腫、神経膠芽腫）、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である。
本発明のさらに別の態様は、黒色腫、腺癌、乳癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、神経膠芽腫、造血系／リンパ系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、または尿路癌の治療のための化合物6の使用である。
本発明の別の態様は、癌の治療のための化合物6の使用であり、その癌の種類は、黒色腫、子宮内膜癌、肺癌、造血系癌、リンパ系癌、卵巣癌、子宮頚癌、軟部組織肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、膵癌、甲状腺癌である。
本発明のなお別の態様は、皮膚癌（特に黒色腫）、肺癌（特に肺腺癌）および子宮頸癌の治療のための化合物6の使用である。
本発明のさらなる態様は、骨、中枢神経系（特に多形神経膠芽腫および神経膠腫）、結腸、造血およびリンパ組織（特に赤白血病（erythroleucemia）およびT細胞リンパ腫）、肝臓、肺（特に肺腺癌および小細胞肺癌（SCLC））、卵巣、皮膚（特に黒色腫）の癌の治療のための化合物6の使用である。
「診断」
本発明は、癌の特徴付けのための診断アッセイを特徴とする。一実施形態では、PDE3A、Schlafen12（SLFN12）、またはCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを対象試料で測定し、PDE3Aモジュレーターによる治療に反応性である癌の指標として使用する。もう一つの実施形態では、CREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルは、対象の生体試料で測定される。参照と比較して対象の生体試料（例えば、癌細胞を含む生体試料）でのCREB3L1またはSLFN12ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現レベルの消失または低下は、その癌がPDE3Aモジュレーターによる治療に抵抗性であることを示す。PDE3A、Schlafen12および／またはCREB3L1ポリヌクレオチドのレベルは、定量的PCR、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析およびインサイチュハイブリダイゼーションなどの標準的な方法によって測定することができる。標準的な方法を使用して腫瘍由来の生体試料中のPDE3A、Schlafen12、および／またはCREB3L1ポリペプチドのレベルを測定することができる。このような方法には、PDE3A、Schlafen12、および／またはCREB3L1に結合する抗体を用いるイムノアッセイ、ELISA、ウェスタンブロット法、ならびにラジオイムノアッセイが含まれる。参照と比較してPDE3AおよびSchlafen12ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルが上昇していることは、PDE3Aモジュレーターによる治療に反応性の癌の陽性指標と考えられる。CREB3L1またはSLFN12ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルの低下は、PDE3Aモジュレーターによる治療に抵抗性である癌の指標と考えられる。
「生体試料の種類」
PDE3Aモジュレーター治療に対する対象の悪性腫瘍の反応性を特徴付ける際に、PDE3A、SLFN12および／またはCREB3L1発現のレベルを、様々な種類の生体試料で測定する。一実施形態では、生体試料が腫瘍試料である。
PDE3Aおよび／またはSLFN12発現は、非反応性対象における発現レベルよりもPDE3Aモジュレーター治療に反応性の対象から得られた試料で高い。別の実施形態では、PDE3Aおよび／またはSLFN12が、健常対照よりも悪性腫瘍を有する対象で少なくとも約5、10、20または30倍高い。倍数変化値は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定される。一実施形態では、CREB3L1またはSLFN12発現は、参照と比較して低下しているかまたは検出限界以下である。特定の実施形態では、CREB3L1またはSLFN12発現は、約10％、25％、50％、75％、85％、95％またはそれ以上低下している。一実施形態では、変化は、非反応性癌細胞に存在するレベルまたは対応する健常対照細胞に存在するレベルに対する、癌細胞でのPDE3A、SLFN12および／またはCREB3L1の発現の差異を計算することによって求められる。
「治療方法の選択」
本明細書で以下に報告されるように、過剰増殖性疾患に罹患している対象を、治療方法を選択する過程でPDE3A、SLFN12および／またはCREB3L1発現について試験することができる。参照と比較してPDE3Aおよび／またはSLFN12が増加していると特徴付けられた患者は、PDE3Aモジュレーター治療に反応性であると特定される。参照と比較してSLFN12またはCREB3L1発現レベルが低下しているかまたは検出限界以下である対象は、PDE3Aモジュレーター治療に抵抗性があると特定される。
「キット」
本発明は、PDE3Aモジュレーター治療に対する対象の反応性または耐性を特徴付けるためのキットを提供する。
例えば単位剤形で有効量のPDE3Aモジュレーターを含有する治療用組成物を含むことができるキットも本明細書で提供される。
一実施形態では、本発明の診断キットが、PDE3AおよびSLFN12の相対的発現を測定するための試薬を提供する。このような試薬は、捕捉分子（例えば、PDE3AおよびSLFN12ポリペプチドを認識する抗体またはPDE3AおよびSLFN12ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸プローブ）を含む。
もう一つの実施形態では、診断キットには、CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する捕捉試薬（例えば、抗体または核酸プローブ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、キットが、治療用または診断用組成物を含む滅菌容器であって、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパックまたは当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る容器を含む。このような容器は、プラスチック、ガラス、積層紙、金属箔、または医薬を保持するのに適した他の材料でできていてよい。
一実施形態では、本発明のキットが、PDE3A、SLFN12および／またはCREB3L1レベルを測定するための試薬を含む。所望であれば、キットは、PDE3Aおよび／またはSLFN12を測定するための指示書ならびに／あるいはPDE3AモジュレーターをPDE3Aモジュレーター治療に反応性であるとして選択された悪性腫瘍を有する対象に投与するための指示書をさらに含む。特定の実施形態では、指示書には以下のうちの少なくとも1つが含まれる：治療剤の説明；悪性腫瘍またはその症状を治療または予防するための投薬スケジュールおよび投与；注意事項；警告；適応症；禁忌；過剰投与情報；副作用；動物薬理学；臨床試験；および／または参考文献。指示書は、（存在する場合）容器に直接、または容器に貼られたラベルとして、または容器に入れられたもしくは容器と共に提供される別のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダとして印刷され得る。
本発明の実施は、特に指示しない限り、当業者の理解の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的な技術を使用する。このような技術は、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第2版（Sambrook、1989）；「Oligonucleotide Synthesis」（Gait、1984）；「Animal Cell Culture」（Freshney、1987）；「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」（Weir、1996）；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」（MillerおよびCalos、1987）；「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubel、1987）；「PCR：The Polymerase Chain Reaction」、（Mullis、1994）；「Current Protocols in Immunology」（Coligan、1991）などの文献に十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に適用可能であり、よって、本発明の作製および実施において考慮され得る。特定の実施形態のための特に有用な技術については、以下の節で論じる。
以下の実施例は、当業者に本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法の作製および使用法の完全な開示および説明を提供するために提示されており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
「実施例1．細胞選択的細胞傷害性小分子の同定」
細胞選択的細胞傷害活性を有する抗癌化合物を同定するために、2つの肺腺癌細胞株、A549およびNCI−H1734（いずれも発癌性KRAS変異および短縮型STK11変異を有し、それぞれTP53野生型および変異体（R273L）であった）で不偏化学スクリーニングを行った。1924種の化合物を、2連で384ウェルフォーマットの10μMの単一濃度でA549およびNCI−H1734細胞株の分子ライブラリー小分子貯蔵確認セットからスクリーニングした。細胞生存率の代理として、化合物処理の48時間後にATP含量を測定した。
3種の化合物が、A549細胞株と比較してNCI−H1734細胞株の細胞生存率の選択的低下を示し、NCI−H1734細胞株の約50％の低下を示したが、これはA549細胞株における中央値から1未満の中央絶対偏差の最小変化と比較して、負の方向の中央値から4超の絶対偏差である（図1A）。3種の化合物を用量−反応分析で再試験することによって、1種の化合物、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン、すなわちDNMDPが、NCI−H1734細胞株に特異的に毒性であることが確認された（図2）。
DNMDPを用いたさらなる細胞株の試験は、2つのさらなる肺腺癌細胞株、NCI−H1563およびNCI−H2122、ならびにHeLa子宮頸癌細胞についてEC50が10〜100nMで明確な細胞選択的細胞傷害性を示したが、A549、MCF7およびPC3細胞についてはEC50が1μM超であった（図1B；図1C）。したがって本発明の一態様は、肺腺癌および子宮頸癌の治療のためのDNMDPの使用である。カスパーゼ活性は、DNMDP処理後のHeLa細胞におけるカスパーゼ感受性ルシフェラーゼアッセイおよびポリADPリボースポリメラーゼ（PARP）切断によって検出され、DNMDP曝露後に感受性細胞がアポトーシスを受けることを示した（図17A〜図17B）。
DNMDPに対する細胞感受性をさらに特徴付けるために、766のゲノム的に特徴付けられた癌細胞株を、2倍希釈段階の66.4μM〜2nMに及ぶ濃度で72時間DMNDP感受性についてスクリーニングした（さらに下に説明される「大規模な細胞株生存力測定」を参照）。これらの細胞株から、22の細胞株が、特に、複数の黒色腫細胞株を含む複数の系統を代表する−4より低いロバストZスコアを有し感受性として分類された（表1）。
次に、キラル超臨界流体（SCF）クロマトグラフィーによってDNMDPエナンチオマーを分離した。1つのエナンチオマーは、他のものよりもHeLa細胞で500倍強力であった（図1Cおよび図1D）。（R）−エナンチオマーを市販の出発材料から合成した（図3）。この合成エナンチオマーは、より強力な分離された物質と類似の活性を有し、キラルSCFクロマトグラフィーにより同一であり、活性エナンチオマーの立体化学を確認した（図4A〜図4C）。DNMDPの2つの（R）−デス−ニトロ類似体を合成し、両方とも（R）−DNMDPと同様に試験した（図3）。図4A〜図4Cは、6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）の超臨界流体（SCF）クロマトグラフを示す（上から下に：ES＋、ダイオードアレイ、ES−トレース）。図4Aはピーク1（CRO分離）を示し；図4Bは、ピーク2（CRO分離）を示し；図4Cは、合成（R）−DNMDPを示す（uvにより5：95比ピーク1：2）。
「実施例1b」
（細胞増殖）
一般式（I）の化合物の増殖抑制作用を、インビトロでヒト癌細胞で調査した。この目的のために、適切な増殖培地を含む384ウェルプレートに1000個の細胞を蒔き、37℃で一晩インキュベートした。24時間後、1つのプレート上の細胞（0hプレート）を30μl／穴のCTG溶液（Promega Cell Titer Glo（カタログ番号G755BおよびG756B））で処理し、室温で10分間インキュベートし、処理開始時の細胞生存力を求めるためにVICTOR V（Perkin Elmer）を用いて発光を測定した。試験プレートの細胞を一般式（I）の化合物で処理し、37℃で72時間インキュベートした。HP D300デジタルディスペンサーを10段階2.5倍希釈系列で用いて化合物を細胞に添加した。対照として、細胞をビヒクル（終濃度0.3％のDMSO）で処理した。72時間後、細胞を30μl／穴のCTG溶液（Promega Cell Titer Glo（カタログ番号G755BおよびG756B））で処理し、室温で10分間インキュベートし、処理の終了時の細胞生存力を求めるためにVICTOR V（Perkin Elmer）を用いて発光を測定した。細胞増殖への効果率と、それから導いたIC50を、0hプレート（＝最大抑制）の値とDMSO対照（＝最小抑制）の値を用いて試験物質ごとに求めた。4パラメータ当てはめを用いて、IC50値を計算した。
化合物6には、以下のIC50が得られた：
したがって本発明の別の態様は、皮膚癌（特に黒色腫）、および子宮頸癌の治療のための化合物6の使用である。
「実施例2．予測的ケモゲノミクスの適用およびDNMDPの推定標的としてのPDE3Aの同定」
6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）による強力な細胞選択的増殖阻害を考慮して、その作用機序をより詳細に調べた。DNMDPの分子標的を決定するために、癌細胞株百科事典（CCLE、Barretinaら、2012）の一部として突然変異、コピー数および遺伝子発現特徴について以前特徴付けられた766の試験細胞株のケモゲノミクス分析を行って、これらのゲノム特徴とDNMDP感受性との間の相関を探した。細胞株セットにわたるDNMDP感受性と個々の遺伝子の発現との間のピアソン相関の分析は、ホスホジエステラーゼ3AをコードするPDE3A遺伝子の発現と強い相関を示した（図5A）。DNMDP感受性とPDE3A発現との間の相関は完全ではなく（図18）、全766細胞株の手動検証がロジスティックに実行可能ではないため、細胞株感受性特性のハイスループット性のためいくつかの誤差が導入される可能性がある。対照的に、突然変異およびコピー数の特徴はDNMDP感受性と相関しなかった。逆に、試験した480種の化合物で、DNMDP感受性はPDE3A発現と最も相関しており（図5B）、PDE3A発現の高い癌細胞株は他の試験化合物よりもDNMDPに対してより明確に感受性であることが示された。最初のスクリーニングの動機とは対照的に、TP53突然変異またはp53機能の他の尺度とDNMDP感受性との間に相関はなかった。
これらの結果および公知のPDE3阻害剤、例えばレボシメンダンおよびシグアゾダンに対するDNMDPの明確な構造類似性を考慮して（図6A〜図6C）、11のPDEスーパーファミリーを表す19個のホスホジエステラーゼに対するDNMDPの生化学分析を行った。100nMの濃度で、DNMDPはPDE3AとPDE3Bの両方を特異的に阻害し、PDE10を弱く阻害し、他のホスホジエステラーゼに対してほとんどまたは全く検出可能な効果を有さなかった（表2）。
PDE3A発現とDNMDP感受性との間の細胞相関、DNMDPによるPDE3AおよびPDE3Bのインビトロ阻害、ならびに公知のPDE3阻害剤に対するDNMDPの構造類似性のために、全てのPDE3阻害剤がDNMDPと同様の細胞傷害性プロファイルを示すかどうかを分析した。驚くべきことに、インビトロ酵素PDE3A阻害についてのIC50と、一連の試験化合物にわたるHeLa細胞細胞傷害性との間にはほとんど相関がなかった（図5Cおよび図7Aおよび図7B）。実際、強力なPDE3阻害剤トレキンシン（PDE3 IC50＝0.25nM、Ruppertら、Life Sci. 31、2037〜2043、1982）は、検出可能な方法でHeLa細胞生存率に影響を与えなかった。HeLa細胞生存率に対する差異効果にもかかわらず、非細胞傷害性PDE3阻害剤トレキンシンおよび強力な細胞傷害性化合物DNMDPは、フォルスコリン処理HeLa細胞における細胞内cAMPレベルに対する類似の効果を有した（図8Aおよび図8B）。この結果は、PDE3AのcAMPおよびcGMP加水分解機能の阻害がDNMDPの細胞傷害活性に十分ではなかったことを示している。
「実施例3．PDE3Aの標的検証」
6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）およびいくつかのPDE3阻害剤がHeLaおよび他のDNMDP感受性細胞を死滅させるが、他のPDE3阻害剤は細胞生存率に影響を与えない、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）阻害と細胞死滅との複雑な関係は、以下を含むいくつかの可能な解釈を示した：1）細胞傷害活性はPDE3非依存性であり、スクリーニングを通した異なるタンパク質に対する作用により、234種のキナーゼは10μMのDNMDPによるキナーゼ阻害を見出さなかった；2）細胞傷害性および非細胞傷害性のPDE3阻害剤は、タンパク質内の異なる部位に結合し、異なる活性を発揮する可能性がある；または3）細胞傷害性および非細胞傷害性のPDE3阻害剤はPDE3活性部位に結合するが、タンパク質の立体配座および活性に異なる効果を有する可能性がある。この第3の可能性は予期されないかもしれないが、PDE4のアロステリックモジュレーターはPDE4活性部位に結合し、上流（UCR2）および下流（CR3）調節ドメインと相互作用し、それによって特異的な不活性コンフォメーションを安定化することが示されている（Burginら、Nat Biotechnol 28巻、63〜70頁、2010）。最も重要なことに、インビトロでのcAMP加水分解について類似のIC50を有するPDE4競合阻害剤およびPDE4アロステリックモジュレーターは、動物試験において異なる細胞活性および安全性プロファイルを有していた（Burginら、Nat Biotechnol 28、63〜70、2010）。PDE阻害剤または他の小分子がDNMDPと競合するかどうかを評価するために、1600種の生物活性化合物のPHARMAKON 1600コレクション（PHARMAKON 1600は米国および国際薬局方の1600の既知の薬物の独特なコレクションである）をスクリーニングして、DNMDPによって誘発される細胞死を救済することができた化合物を同定した。HeLa細胞を30nMのDNMDP（EC70濃度）および20μMの各生物活性化合物で同時処理した。48時間処理後の細胞生存率を、先に記載されるようにATP消費によって評価した。DNMDPによって誘発された細胞死を救済した5種の最も強力な化合物は全てPDE阻害剤であり、3種の最も強力な化合物、レボシメンダン、ミルリノンおよびシロスタゾールは全て選択的PDE3阻害剤であった（図9A）。
フォローアップ実験で、シロスタミド、レボシメンダン、ミルリノンおよび他のいくつかの非細胞傷害性選択的PDE3阻害剤が用量依存的にDNMDP細胞傷害性を救済することができることが確認された（図9B）。最も強力なDNMDP競合剤はトレキンシンであり、「RC50」（50％救済を達成した濃度）が1nM未満であった；対照的に、シルデナフィルおよびバルデナフィルなどのPDE5阻害剤ならびにpan−PDE阻害剤イヅブラスト（idubulast）およびジピリダモールは、このアッセイにおいて最大10μMの有効な競合物質ではなかった（図9B）。これは、非細胞傷害性PDE3阻害剤およびDNMDPが、細胞傷害性表現型を媒介する同じ分子標的への結合について競合することを示した。
DNMDPの分子標的を同定するために、HeLa細胞溶解物と共にインキュベートした（R）−デス−ニトロ−DNMDP固相連結リンカー類似体（図10A）を用いて親和性精製を行った。このリンカー類似体は、上記の非細胞傷害性PDE3阻害剤（図10B）と同じDNMDP細胞傷害性救済表現型を有し、これも同じ分子標的に結合することを示した。これは過剰のトレキンシンまたはDNMDPの別個のエナンチオマーを添加することによって分子標的について競合したが、ここでは（R）−エナンチオマーのみが細胞傷害性であった。アフィニティー精製物質のPDE3Aについての免疫ブロットは、PDE3Aが実際にリンカー類似体に結合することを示した。リンカー類似体へのPDE3Aの結合は、トレキンシンと（R）−DNMDPの両方によって遮断されたが、非細胞傷害性エナンチオマー（S）−DNMDPによっては遮断されなかった（図9C）。したがって、トレキンシンと（R）−DNMDPの両方が、連結DNMDP類似体へのPDE3Aの結合を妨げ、両分子がPDE3Aに直接結合すると結論づけられた。
DNMDP感受性細胞が高レベルのPDE3Aを発現し、DNMDPがPDE3A結合について非細胞傷害性阻害剤と競合するという観察に基づいて、DNMDPがPDE3Aとの相互作用を通してその細胞傷害性表現型を媒介し、PDE3A存在量がDNMDP感受性の直接細胞決定因子であると仮定された。この仮説を立証するために、DNMDPへの反応に対するPDE3Aレベル低下の効果を試験した。PDE3A遺伝子座における3つの異なる部位を標的とする3つのガイドRNA（sgRNA）で標的化された、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列（CRISPR）関連CAS9酵素は、PDE3A発現の完全な消失をもたらした（Congら、Science 339、819〜823、2013）。sgRNA2およびsgRNA3はPDE3Aタンパク質レベルをほぼ完全に低下させたが、sgRNA1はPDE3A発現に対して中程度の効果を有していた（図11A）。重要なことに、sgRNA2とsgRNA3の両方が、活性細胞傷害性DNMDP類似体3による毒性の有意な救済をもたらした（図11Aおよび図11Bならびに図5A〜図5C）。sgRNA2とsgRNA3の両方がDNMDPによる毒性の有意な救済をもたらした（図11C）。PDE3A発現の低下したHeLa細胞における増殖速度または形態の変化は観察されず、PDE3Aが細胞生存に必要でないことが示された。PDE3Aを標的とする4つの異なるsiRNAを含有するsiRNAスマートプールを用いた独立したアプローチにおいて、PDE3A発現は、トランスフェクション後24〜72時間の間に最大効率70％でHeLa細胞株で低下した。siPDE3Aで処理したHeLa細胞は、対照siRNA条件と比較してDNMDP類似体に対するEC50が高かった（図12Aおよび図12B）。理論によって拘束されないが、DNMDP細胞傷害性はPDE3Aを必要とし、DNMDPはPDE3Aの機能を調節する可能性があると結論づけられた。
「実施例4．DNMDPの作用機序の決定」
ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）タンパク質存在量への6−（4−（ジエチルアミノ）−3−ニトロフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（DNMDP）細胞傷害性の依存性は、セレブロンとIKAROSファミリージンクフィンガー1（IKZF1）およびIKZF3との間の相互作用を安定化することによって新形態または高次形態機序によって作用するレナリドミドについて最近観測されたものと同様の可能な機序を示した（Kronkeら、Science 343、301〜305、2014；Luら、Science343、305〜309、2014）。さらに、PDE4アロステリックモジュレーターは、競合阻害剤ではないが、PDE4パートナータンパク質DISC1に独特に結合することが独立に示されている「閉じた」タンパク質コンフォメーションに結合し、これを安定化することが示されている（Millarら、Science 310、1187〜1191、2005）。PDE3Aが存在するタンパク質複合体を正常条件下で特徴付け、PDE3AがDNMDPまたは非細胞傷害性PDE3阻害剤トレキンシンに結合した場合、これらの複合体がどのように変化するかを調べた。Hela細胞からのPDE3Aおよび相互作用タンパク質を、DNMDPおよびトレキンシンの存在下で免疫沈降させ、引き続いて相対存在量のために同重体安定同位体タグによる標識化をし、質量分析によって定量化した（iTRAQ／MS、図13A）。HeLa細胞からのPDE3A免疫沈降物は、タンパク質ホスファターゼ2サブユニット（PPP2CA、PPP2R1A、PPP2R1B、PPP2R2A、PPP2R2D）、カルシニューリン（PPP3R1、PPP3CA、Becaら、Circ. Res. 112、289〜297、2013）、14−3−3（YWHAB、YWHAQ、YWHAG、YWHAZ、Pozuelo Rubioら、Biochem. J. 392、163〜172、2005）およびチューブリン（TUBA1C、TUBA1B）ファミリーメンバーを含む複数のタンパク質ホスファターゼサブユニットについて濃縮されていた（図13Bおよび図14A）。さらに、PDE3AおよびPDE3Bは以前に報告された同じタンパク質複合体に存在することが見出された（Malovannayaら、Cell 145、787〜799、2011）。
DNMDPの結合は、PDE3Aと共免疫沈降した相互作用タンパク質の組成を変化させた。DNMDPによる処理後にPDE3A免疫沈降物が特異的に濃縮されたタンパク質は、サーチュイン7（SIRT7）およびSchlafen 12（SLFN12）を含んでいた（図13Cおよび図14B）。これらのタンパク質は、DNMDPの存在下でPDE3Aと特異的に相互作用し、トレキンシン処理対照では観察されなかったが、公知のPDE3B相互作用物質、アブヒドロラーゼドメイン含有タンパク質15（ABHD15、Chavezら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 342、1218〜1222、2006）は、トレキンシン処理細胞からの免疫沈降物で濃縮されていた（図13Cおよび図14C）。PDE3AとSIRT7とSLFN12の両方との間のDNMDPによって促進される相互作用を、親和性試薬で確認した。共免疫沈降によって証明されるように、DMSOまたはトレキンシンではなく、DNMDPで処理したHeLa細胞における内因性PDE3Aの免疫沈降は、異所的発現V5タグSIRT7およびSLFN12とPDE3Aとの複合体形成を増強した（図19）。DNMDPおよび（弱く）アナグレリドがPDE3AとSLFN12の複合体形成を誘導したがトレキンシンはしなかったことを示す（図20）。理論に縛られるものではないが、PDE3A／SLFN12複合体形成は、細胞死滅能力に相関した（図21A〜図21C）。
PDE3Aと同様に、SLFN12の過剰発現は、DNMDP感受性細胞株において細胞傷害性効果を有するように思われ、全細胞溶解物中のSLFN12の検出の困難性に寄与する。
PDE3AとSIRT7およびSLFN12との相互作用の増強は、これらの相互作用タンパク質の1つまたは複数がDNMDP感受性に寄与する可能性を示した。SIRT7 mRNA発現は、試験した全ての細胞において比較的一定であったが、SLFN12とPDE3A mRNAの同時発現はDNMDP感受性との強い相関を示した；ほとんど全てのDNMDP感受性細胞株が高レベルのSLFN12を発現した（図15A〜図15C）。重要なことに、高レベルのSLFN12およびPDE3Aを発現する感受性細胞株のほぼ半分が黒色腫細胞株であることが分かった（図15B）。SLFN12発現単独も、DNMDPに対する感受性と相関する最上位の遺伝子の1つであり、SLFN12がDNMDP誘発細胞傷害性に機能的に関与するという仮説を裏付けている（図16A）。さらに、PDE3A発現について補正すると、SLFN12発現はDNMDP感受性と最も相関の高い遺伝子であった（図16B）。SLFN12がDMNDPの細胞傷害性表現型に必要であるかどうかを評価するために、本発明者らはHeLa細胞において2つのshRNAによるノックダウンによりSLFN12 mRNA発現を60％低下させた（図15D）。PDE3A発現の低下と同様に、SLFN12発現の低下は細胞傷害性をもたらさず、実際、DNMDPに対する感受性を低下させた（図15E）。これらの結果は、PDE3Aと同様にSLFN12がDMNDPの細胞傷害性表現型に必要であることを示している。GTEXコンソーシアムによるSLFN12およびPDE3Aの正常な発現の特徴付け（Pierson、E. ら. PLoS Comput. Biol. 11、e1004220（2015））は、正常な組織においてSLFN12の低発現を示すが、PDE3AとSLFN12の高い同時発現はめったに観察されない（表3）。これは、DNMDPおよび関連する化合物の的を射た毒性が潜在的に限定されている可能性があることを示唆し得る。
図22は、SLFN12およびCREB3L1が、DNMDPに対する耐性を獲得した細胞で失われていることを示す。最初はDNMDPに感受性の細胞株を、DNMDPへの持続的な曝露によって耐性にし、その後、RNA−seqによって分析した。2つの遺伝子がHeLaおよびH2122：SLFN12およびCREB3L1の両方で下方制御された。したがって、CREB3L1および／またはSLFN12レベルの低下は、細胞がDNMDPおよび他のPDE3Aモジュレーターに対して耐性になったことを示す。
長期曝露によってDNMDPに耐性にした2つの異なる細胞株、HeLaおよびH2122は、一般に2つの遺伝子、SLFN12およびCREB3L1の発現を下方制御した（図22）。SLFN12の再発現は、DNMDPに対する感受性を回復させた（図23A）。理論に縛られるものではないが、回復した感受性はPDE3A阻害剤トレキンシンによって競合が弱まったので、PDE3Aに依存していた。SLFN12の発現またはSLFN12とPDE3Aの発現によってDNMDP耐性細胞株A549を感作させた（図23B）。SLFN12の発現はA549細胞にDNMDP感受性を付与するのに十分であった。PDE3A発現の付加は、さらなる感作をもたらした。
平滑筋肉腫は悪性平滑筋腫瘍である。平滑筋肉腫からの患者腫瘍試料をPDE3AおよびSLFN12の発現について分析して、平滑筋肉腫（LMS）のDNMDPに対する感受性を特徴付けた。平滑筋肉腫は、高レベルのPDE3AおよびSLFN12を発現する高純度TCGA試料間の有病率のために、DNMDPに対して感受性であると予測される（図24、表4）。バイオマーカー発現と平滑筋肉腫の関連性のP値：0.0001。
示差走査熱量測定（DSF）を使用して、DNMDPと精製PDE3A触媒ドメインPDE3A（677〜1141）の結合を実証した。この実験では、5μMのhsPDE3A（640〜1141）を、表5に示されるように、100μMの化合物の非存在下または存在下でインキュベートした。結合緩衝液：20mM Hepes pH7.4、100μM TCEP、1mM MgCl2、150mM NaCl。
予測的ケモゲノミクスを用いて、PDE3Aの小分子調節による新規な癌依存性を標的とした化合物のクラス（DNMDPによって例示される）が発見された。これらの化合物は、PDE3Aを非細胞傷害性PDE3阻害剤と相互に排他的に結合させ、PDE3Aの機能に新形態または高次形態（hypermorphic）効果を及ぼし、そのタンパク質−タンパク質相互作用の変化をもたらした。1つのユニークなタンパク質相互作用パートナーであるSLFN12は、DNMDP感受性細胞株において高度に発現されており、細胞傷害性シグナルが伝達される経路における機能的役割を示している。結果として、DNMDPは、癌細胞株の大きなパネル全体にわたって選択的かつ強力であった。
ここで、新規な細胞傷害性化合物を、複数の系統にわたる癌細胞株に対して大きな選択性および低いnM効力で同定した。予測的ケモゲノミクスの遺伝子発現相関を用いて、PDE3Aをこの小分子DNMDPの推定標的として同定した。興味深いことに、PDE3A発現の消失はDNMDPに対する耐性をもたらした。さらに、PDE3A免疫沈降後、引き続いて相対存在量のための同重体安定同位体タグおよび質量分析による定量化によって（iTRAQ／MS）、おそらくPDE3Aの機能のアロステリック調節による、DNMDP結合時のPDE3Aの新規なタンパク質−タンパク質相互作用パートナーとしてのSLFN12およびSIRT7が同定された。重要なことに、SLFN12発現は、PDE3A発現について補正した場合、DNMDP感受性を有する最も相関性の高い遺伝子であった。単一遺伝子または多遺伝子発現相関は、小分子の作用機序および関連するシグナル伝達経路を解明するのに役立つことが示されている。機能喪失スクリーニングまたはゲノム解析などの標的同定アプローチによって発見される可能性の低い、癌治療のための新規な生化学標的を同定した。
PDE3Aはホスホジエステラーゼのスーパーファミリーに属し、PDE3Bと共にPDE3ファミリーを形成する。PDE3ファミリーは二重基質親和性を有し、cAMPとcGMPの両方を加水分解する。PDE3Aの発現は、心血管系、血小板、腎臓および卵母細胞において最も高い（Ahmadら、Horm Metab Res 44、776〜785、2012）。血小板におけるPDE3A阻害が活性化および血小板凝固を損なうため、臨床PDE3阻害剤シロスタゾールが間欠性跛行を治療するために開発されている（Bedenisら、Cochrane Database Syst Rev 10、CD003748、2014）。ミルリノン、アムリノンおよびレボシメンダンなどの他のPDE3阻害剤は、血管拡張と心臓cAMPレベルの上昇の組合せが心収縮性を増加させるうっ血性心不全を治療することが示されている（Movsesianら、Curr Opin Pharmacol 11、707〜713、2011）。これらの臨床的阻害剤のいずれも、DNMDPの細胞傷害性表現型を複製することができず、環状ヌクレオチド加水分解がDNMDP感受性細胞株において細胞死を誘導するのに十分でなかったことを示している。
しかしながら、興味深いことに、ザルダベリン、アナグレリドおよびクアジノンなどの他のPDE3阻害剤は、選択された数の癌細胞株において細胞の細胞傷害特性を有することが以前に報告されている（Sunら、PLoS ONE 9、e90627、2014；Fryknasら、J Biomol Screen 11、457〜468、2006）。この知見と一致して、他のPDE3およびPDE4阻害剤は、ザルダベリンの細胞傷害性表現型を複製しないことが分かり、網膜芽腫タンパク質網膜芽腫1（RB1）発現がゼルダベリン感受性細胞株を非感受性細胞株から分離することが報告された（Sunら、PLoS ONE 9、e90627、2014）。この知見は、DNMDPの細胞傷害活性とRB1のコピー数またはmRNA発現との間の相関が同定されなかった本データとは対照的であった。別のPDE3阻害剤、アナグレリドは、巨核球分化をユニークに阻害し、アポトーシスをもたらした。試験した他のPDE3阻害剤は、この活性を有さなかった（Wangら, Br. J. Pharmacol. 146, 324〜332, 2005；Espasandin, Y. ら, J. Thromb. Haemost. n／a−n／a, 2015, doi：10.1111／jth.12850）。ザルダベリンの細胞生存率およびアナグレリドの巨核球分化に対する報告された効果は、この研究で記載されているのと同じPDE3A調節を通して媒介されると仮定された。
複数のPDE3阻害剤は競合阻害剤であり、cAMPおよびcGMPの触媒結合部位を占めることが示されている（Cardら, Structure 12, 2233−2247, 2004；Zhanら, Mol. Pharmacol. 62, 514−520, 2002ら, Mol. Pharmacol. 62, 514−520, 2002）。さらに、ザルダベリンは、cAMP結合部位を占めるPDE4Dとの複合体において共結晶化され、同様の方法でPDE3Bに結合するようモデル化されている（Leeら, FEBS Lett. 530, 53−58, 2002）。DNMDPとザルダベリンの構造的類似性、およびDNMDPがPDE3AとPDE3Bの両方を阻害することを考えると、DNMDPの結合様式はザルダベリンのものと非常に類似していると仮定された。このことは、cAMP／cGMP競合阻害剤として作用することに加えて、DNMDPが、その細胞傷害性表現型を担う立体配座をアロステリックに誘導することを示した。ホスホジエステラーゼのアロステリック調節は、小分子が活性部位に結合し、同時にPDE4活性部位を横切る調節ドメインと相互作用するPDE4について以前に記載されている。結果として、アロステリックモジュレーターは、異なるPDE4パートナータンパク質に示差的に結合することが示されているタンパク質コンフォメーションを安定化させた（Burginら, Nat Biotechnol 28, 63−70, 2010）。
PDE3Aに関連するタンパク質の研究は、その正常な機能とDNMDPなどのPDE3Aモジュレーターが癌細胞を死滅させる方法の両方を明らかにする可能性がある。PDE3Aは、発癌性ウイルス形質転換に関与し、ヒト癌において突然変異しているタンパク質ホスファターゼ2サブユニットと相互作用し（Nagaoら, Int. Symp. Princess Takamatsu Cancer Res. Fund 20, 177−184, 1989；Imielinskiら, Cell 150, 1107−1120, 2012；Lawrenceら, Nature 499, 214〜218, 2013）、癌細胞シグナル伝達におけるPDE3Aの役割を示している。これらの相互作用はDNMDP結合によって誘導されなかったが、癌生物学におけるタンパク質ホスファターゼの重要性は、さらなる研究を正当化するであろう。
PDE3AとのDNMDPの結合によって促進されるPDE3AとSLFN12との間の相互作用の強化、およびDNMDPに対する感受性とSLFN12発現の間の相関は、PDE3A−SLFN12相互作用の機能的影響を理解することが必要であることを強く示した。しかしながら、この時点では、ヒト生理学および癌生物学におけるSLFN12の機能的役割についてはほとんど知られていない。SLFN12は、ヒトとげっ歯類との間で大きく異なるschlafen遺伝子ファミリーの一部である。大きな相違は、迅速な遺伝子進化および陽性選択によるものである（Bustosら, Gene 447, 1−11, 2009）。そのため、SLFN12はマウスオルソログを持たず、よく理解されているモデル生物におけるSLFN12の研究を妨げる。SLFN12の単一の刊行物は、SLFN12の異所性発現後の前立腺癌細胞株の調節を示した（Kovalenkoら, J. Surg. Res. 190, 177−184, 2014）。SLFN12の機能およびそのPDE3Aとの相互作用へのさらなる調査により、DNMDP細胞傷害性の機構を解明することができた。2つの観察が、DNMDPがPDE3A機能に対して新形態または高次形態として作用することを示した：1）DNMDP感受性癌細胞株は生存についてPDE3A発現に依存せず、むしろPDE3AノックダウンがDNMDP耐性をもたらした；および2）DNMDPはPDE3Aに結合するとタンパク質−タンパク質相互作用を誘導または増強した。レナリドミドは、酵素阻害剤としてではなく、新形態または高次形態として作用する小分子の例であった。レナリドミドは、セレブロンユビキチンリガーゼとイカロス転写因子との間の特定のタンパク質−タンパク質相互作用を調節し、その後、これらが分解の標的となった（Kronkeら, Science 343, 301−305, 2014；Luら, Science 343, 305−309, 2014）。類推によると、DNMDPはPDE3A−SLFN12相互作用を直接安定化する、またはDNMDPはSLFN12に結合するPDE3コンフォメーションをアロステリックに安定化させることができるだろう。これらの機序のいずれかが新形態または高次形態表現型をもたらし得る。DNMDPによって誘導される新形態表現型のさらなる特徴付けは、PDE3Aによる環状ヌクレオチド加水分解を阻害しない小分子の合成を促進し得る。このような小分子の毒性プロファイルは、心血管適応症に対して処方されるPDE3阻害剤とは異なるはずである。
この研究は、その機能がPDE3阻害剤のサブセットによって修飾され、癌細胞株のサブセットに毒性をもたらす、癌維持におけるPDE3Aのこれまで知られていない役割を明らかにした。これらのデータは、DNMDPおよびその類似体が、細胞PDE3Aのレベル低下とともに細胞がDNMDPにあまり感受性でなくなることによって実証される細胞毒性をもたらす、PDE3Aに対する高次形態または新形態効果を有することを示した。これらの観察は、ホスホジエステラーゼのアロステリック調節の他の報告（Burginら, Nat Biotechnol 28, 63−70, 2010）に匹敵し、DNMDPおよび類似体がPDE3Aに対して同様の効果を有し得ることを示している。細胞選択的細胞傷害性の正確な機序は今のところ未知のままであるが、SLFN12、およびおそらくSIRT7との新規な相互作用についてのさらなる研究は有益となり得る。
要約すると、本明細書における研究は、示差的細胞傷害性スクリーニングを用いて癌細胞細胞傷害性小分子DNMDPを発見した。766のゲノム的に特徴付けられた癌細胞株におけるDNMDPのプロファイリングは、試験した細胞株の約3％において立体特異的なナノモル効力を明らかにした。感受性を予測したゲノム特徴の検索により、PDE3A発現の上昇がDNMDP反応と強く相関することが明らかになった。DNMDPはPDE3AおよびPDE3Bを阻害し、他のPDEに対して活性はほとんどまたは全くなかった。しかしながら、予期しないことに、試験したほとんどの他のPDE3A阻害剤は、強力かつ選択的なPDE3A阻害剤であるトレキンシンを含むDNMDPを表現型模写しなかった。トレキンシンによるDNMDP感受性細胞の同時処理は、DNMDPの癌細胞細胞傷害活性と競合し、PDE3AのノックアウトがDNMDP誘発細胞傷害性から感受性細胞を救済し、PDE3Aの新形態変化を誘導する、DNMDPによる癌細胞殺傷にPDE3Aが必要であると仮定させた。単独またはDNMDPもしくはトレキンシンの存在下でのPDE3A免疫沈降物の質量分析は、DNMDPの存在下でのみのSLFN12およびSIRT7の示差的結合を明らかにした。PDE3Aと同様に、SLFN12発現レベルはDNMDP感受性細胞株において上昇し、shRNAによるSLFN12のノックダウンがDNMDPに対する細胞の感受性を低下させ、PDE3AとSLFN12のDNMDP誘導複合体形成が癌細胞細胞傷害性表現型にとって重要であることを示した。そのため、本明細書における結果は、候補癌治療剤としてのPDE3Aモジュレーターを示し、小分子発見における予測的ケモゲノミクスの能力を実証している。
上記の実験は、以下の方法および材料を用いて行った：
（NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニング）
1500個のNCI−H1734または1000個のA549細胞を、10％ウシ胎児血清および1％Pen／Strepを補充した40μlのRPMI中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、1924種の小分子の化合物ライブラリーを10μMの濃度で添加した。スタウロスポリンを10μMの濃度で細胞傷害性についての陽性対照として使用し、DMSOを1％の濃度で陰性対照として使用した。全ての化合物を、示される小分子と共に48時間インキュベートした。48時間後、384ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、20分間室温に冷却させた。THERMO COMBI（商標）またはマルチチャネルピペットを用いてPBS中25％CELLTITERGLO（登録商標）（Promega）40μlを添加し、10分間インキュベートすることによって細胞生存率を評価した。Perkin−Elmer EnVisionを用いて発光シグナルを読み取った。生存率を、DMSO対照に正規化することによって計算した。
（細胞株における化合物感受性試験）
1000個のHeLa（DMEM）、1000個のA549（RPMI）、500個のMCF−7（DMEM）、4000個のPC3（F12−K）、1000個のNCI−H2122（RPMI）または1500個のNCI−H1563（RPMI）細胞を、10％ウシ胎児血清を補充した対応する増殖培地40μl中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、示される化合物を示される濃度で添加し、48時間インキュベートした。NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存率を評価した。化合物6をHeLa細胞生存力アッセイで試験し、そのEC50が1.1nMであると求めた。
（HeLa細胞におけるカスパーゼ活性）
1000個のHeLa細胞を、10％ウシ胎児血清を補充した対応する増殖培地40μl中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、示される化合物を示される濃度で添加し、48時間インキュベートした。Promega製のCaspase−Gloを製造者の推奨に従って添加し、NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように発光を測定した。
（大規模な細胞株生存率測定）
DNMDPに対する、23の異なる系統から引き抜いた777の癌細胞株（CCL）の感受性を測定した。癌細胞株は、Cancer Cell Line Encyclopediaの一部であり、その同一性がSNPアレイおよび体細胞DNAの変化によって確かめられた。各細胞株を、500個の細胞／ウェルの密度で、白色不透明の1536個のプレート中の好ましい培地に蒔いた。一晩インキュベートした後、DNMDPを、2連で、2倍段階で66.4μM〜2nMに及ぶ16濃度で音響伝達により添加した（Labcyte Echo 555, Labcyte Inc.、Sunnyvale、CA）。72時間の処理後、ViewLux Microplateイメージャ（PerkinElmer、Waltham、MA）を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞ATPレベルを生存率の代用として測定し（CELLTITERGLO（登録商標）、Promega Corporation、Madison、WI）、バックグラウンド（媒体のみ）およびビヒクル（DMSO）処理対照ウェルに正規化した。
濃度反応曲線を、DMSO正規化値に設定された低濃度漸近線により16の濃度の全てを通して2または3パラメータシグモイド関数に対する非線形当てはめを用いて当てはめ、化合物感受性の範囲にわたる最適な8点用量曲線を同定した。8点線量曲線下面積（AUC）を、さらなる分析のための感受性のメトリックとして数値積分によって計算した。DNMDPに独特に反応する細胞株を同定する分析を可能にする480種の他の化合物の集合について同様の感度測定値が得られている（化合物の完全なリストについて、ヒト癌細胞株の遺伝的特徴および系統的特徴と小分子感受性との間の関係を包括的に確認するためのデータベース、Broad Institute Cancer Therapeutics Response Portalを参照されたい）。
（感受性測定と基礎遺伝子発現の相関）
Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayで測定された遺伝子中心ロバストマルチチップ平均（RMA）−正規化基礎mRNA遺伝子発現データを、癌細胞株百科事典（CCLE、ヒト癌細胞の大きなパネルの詳細な遺伝的特徴付け；Barretinaら, Nature 483, 603〜607, 2012）からダウンロードした。ピアソン相関係数を、760個の重複するCCLにわたり遺伝子発現（18988個の転写産物）と曲線下面積（AUC）との間で計算した。異なる数のCCLに曝露された小分子間の比較のために、フィッシャーの変換を用いて相関係数を変換した。
（PDE3A酵素を抑制する方法）
市販の3H−cAMPシンチレーション近接アッセイ（SPA、Perkin Elmer）系を酵素抑制研究に使用した。インビトロでの被験物質のPDE3A反応への効果を決定するために、DMSO中のそれぞれの被験化合物溶液（段階希釈）2μlをマイクロタイタープレート（Isoplate−96／200W；Perkin Elmer）のウェルに入れた。緩衝液A（50mM Tris／HCl pH7.5、8.3mM MgCl2、1.7mM EDTA、0.2％BSA）中の、ヒト全長PDE3Aを過剰発現するSf9細胞由来のPDE3A細胞抽出物（SB Drug Discovery、UK）の希釈物50μlを添加した。PDE3A細胞抽出物の希釈物は、反応速度が線形であり、基質の70％未満が消費されるように選択した（典型的な希釈1：5000）。BSAを含まない緩衝液A中1：2000に希釈した基質［8−3H］アデノシン3’,5’−環状リン酸（1μCi／μl；Perkin Elmer）50μl（0.025μCi）を添加することによって反応を開始させた。室温で60分間のインキュベーションの後、18mg／mlイットリウムシンチレーション近接ビーズを含有する水中懸濁液（Perkin Elmer）25μlの添加によって反応を停止した。マイクロタイタープレートを密封し、Microbetaシンチレーションカウンター（PerkinElmer Wallac）で測定した。IC50値は、化合物濃度に対するPDE3A活性百分率をプロットすることによってシグモイド曲線から求めた。化合物6について、IC50値は、それぞれ2.4nM（PDE3A IC50）および3.4nM（PDE3B IC50）である。
（ヒト凍結肝細胞のための方法：）
凍結保存したヒト肝細胞におけるインビトロ代謝安定性の研究（肝臓インビボ血液クリアランス（CL）および最大経口バイオアベイラビリティ（Fmax）の計算を含む）
凍結保存肝細胞（例えば、Celsis InVitro Technologiesより購入）を短時間解凍し、予熱したインビトロGRO HT培地45mLで洗浄し、50xgで5分間遠心分離した。細胞ペレットをクレブス−ヘンゼライト緩衝液（KHB）5mlに再懸濁した。細胞生存率をトリパンブルー排除によって決定した。
代謝安定性アッセイのために、肝細胞を、1.0×106個の生活細胞／mlの密度で、ガラスバイアルに5％FCSを含有するWME中に分配した。試験化合物を最終濃度1μMまで添加した。インキュベーション中、肝細胞懸濁物を580rpmで連続的に振盪し、一定分量を2、8、16、30、45および90分にとり、これに等体積の冷メタノールを直ちに添加した。試料を−20℃で一晩凍結し、その後3000rpmで15分間遠心分離した後、上清をLCMS／MS検出を備えるAgilent 1290 HPLCシステムによって分析した。
試験化合物の半減期を濃度−時間プロットから決定した。半減期から、固有クリアランスを計算した。追加のパラメータである肝血流、インビボおよびインビトロの肝細胞の量と一緒に。肝臓インビボ血液クリアランス（CL）および最大経口バイオアベイラビリティ（Fmax）を計算した。肝臓インビボ血液クリアランス（CL血液）および最大経口バイオアベイラビリティ（Fmax）を、以下の式を用いて計算した：CL’固有［ml／（分＊kg）］＝kel［1／分］／（（cellno／インキュベーション体積［ml］）＊fu, inc）＊（cellno／肝重量［g］）＊（特異的肝重量［g肝臓／kg体重］）；CLよく撹拌した血液［L／（h＊kg）］＝（QH［L／（h＊kg）＊fu, 血液＊CL’固有［L／（h＊kg）］）／（QH［L／（h＊kg）＋fu, 血液＊CL’固有［L／（h＊kg）］）；Fmax＝1−CL血液／QHを用いておよび以下のパラメータ値：肝血流量1.32L／h／kgヒト；特異的肝重量−21g／kg体重；インビボ肝細胞−1.1×108個細胞／g肝臓、インビトロ肝細胞−1.0×106／ml；fu, incおよびfu、血液を1とみなす。
（5R）−6−［3−クロロ−5−フルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（化合物6、）は、（5R）−6−［3−フルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（国際公開第2014／164704号の化合物3）（平均代謝安定性安定性（Fmax）＝49％）と比較して、ヒト肝細胞の安定性の増加（平均代謝安定性（Fmax）＝93％）を示す。
（化学実験方法）
（全体的な詳細）
全ての反応は窒素（N2）雰囲気下で行った。全ての試薬および溶媒は、商業的供給業者から購入し、受け取ったまま使用した。核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、Bruker（300または400MHz 1H、75または101MHz 13C）分光計で記録した。プロトンおよび炭素化学シフトは、NMR溶媒を参照とするppm（δ）で報告する。データを以下の通り報告する：化学シフト、多重度（br＝ブロード、s＝一重項、d＝二重項、t＝三重項、q＝四重項、m＝多重項；1つまたは複数のカップリング定数（Hz））。フラッシュクロマトグラフィーは、Teledyne Isco Combiflash Rfで40〜60μmのシリカゲル（60Åメッシュ）を用いて行った。一定の0.1％ギ酸を含む2.5分にわたり水中0〜100％CH3CNの勾配を用いるWaters Symmetry C18カラム（3.5μm、4.6×100mm）を用いて、Waters 2795分離モジュールおよび3100質量検出器で、タンデム液体クロマトグラフィー／質量分析（LC／MS）を行った。分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）は、EM Reagent 0.25mmシリカゲル60−Fプレートで行った。元素分析は、Robertson Microlit Laboratories、Ledgewood NJによって行った。
（（R）−DNMDPの合成）
無水酢酸5mL中で、（R）−6−（4−アミノフェニル）−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（A, Toronto Research Chemicals）2.00g（9.84mmol）を1時間撹拌した後、水30mLを添加し、濾過し、固体を水ですすぎ、乾燥させると、生成物B 2.20g（91％）が得られた。1H NMR（300 MHz, DMSO−d6）δ10.92（s, 1H）, 10.13（s, 1H）, 7.74（d, J＝8.9, 2H）, 7.65（d, J＝8.8, 2H）, 3.41−3.33（m, 1H）, 2.68（dd, J＝6.8, 16.8, 1H）, 2.23（d, J＝16.7, 1H）, 2.08（s, 3H）, 1.07（d, J＝7.3, 3H）.13C NMR（75 MHz, DMSO−d6）δ168.50, 166.27, 152.25, 140.27, 129.24, 126.24, 118.70, 33.47, 26.91, 24.02, 15.87. HPLC：Rt 0.72分、純度＞95％。MS：246（M＋1）。
硫酸30mL溶解し、氷浴中で冷却したB3.09g（15.3mmol）に、硫酸8mL中90％硝酸0.72mL（15mmol）を添加漏斗を介して10分間にわたって添加した。1時間撹拌した後、混合物を氷上に注いだ。黄色固体を濾別し、水をEtOAcで数回すすいだ後、乾燥させ、黄色固体と合わせた。ヘキサン中40〜60％EtOAcでのクロマトグラフィーにより、生成物1.12g（25％）が黄色固体として得られ、これをEtOAcから再結晶化した。1H NMR（300 MHz, DMSO−d6）δ11.13（s, 1H）, 10.41（s, 1H）, 8.25（d, J＝1.8, 1H）, 8.07（dd, J＝1.8, 8.6, 1H）, 7.71（d, J＝8.6, 1H）, 3.55−3.40（m, 1H）, 2.74（dd, J＝6.9, 16.8, 1H）, 2.27（d, J＝16.8, 1H）, 2.09（s, 3H）, 1.08（d, J＝7.2, 3H）. 13C NMR（75 MHz, DMSO−d6）δ168.57, 166.31, 150.37, 142.19, 131.69, 131.32, 130.60, 125.07, 121.70, 33.30, 26.81, 23.44, 15.64.TLC：Rf 0.25（1：1 EtOAc：ヘキサン）。HPLC：Rt 0.87分、純度＞95％。MS：291（M＋1）。HRMS 正確な質量（M＋1）：291.1088。測定値：291.1091
MeOH10mLに溶解したC58mg（0.20mmol）に、NaOH48mg（1.2mmol）の水0.5mL中溶液を添加した。1時間後、反応物を濃縮し、水を添加し、EtOAcですすぎ、EtOAcを乾燥させ、濃縮すると、生成物D48mg（93％）が得られた。1H NMR（300 MHz, DMSO−d6）δ10.92（s, 1H）, 8.28（d, J＝2.0, 1H）, 7.87（dd, J＝2.1, 9.0, 1H）, 7.76（s, 2H）, 7.06（d, J＝9.0, 1H）, 3.33（s, 1H）, 2.67（dd, J＝6.8, 16.8, 1H）, 2.22（d, J＝16.6, 1H）, 1.06（d, J＝7.3, 3H）.13C NMR（75 MHz, DMSO−d6）δ166.25, 151.12, 146.69, 132.72, 129.80, 122.57, 122.19, 119.80, 33.43, 26.70, 15.77.MS：249（M＋1）.
ジメチルホルムアミド（DMF）0.5mLに溶解したアミンD35mg（0.14mmol）に、アセトアルデヒド70mg（1.6mmol）およびNaBH（OAc）3 170mg（0.80mmol）およびHOAc10μL（0.2mmol）を添加した。3時間撹拌した後、水およびEtOAcを添加し、EtOAcを分離し、乾燥させ、濃縮し、ヘキサン中30〜50％EtOAcでクロマトグラフィーを行って、（R）−DNMDP3mg（7％）を単離した。合成した物質は、TLC、HPLCおよび1H NMRにより、購入したラセミ物質と同一であった。1H NMR（300 MHz, CDCl3）δ8.58（s, 1H）, 8.04（d, J＝2.3, 1H）, 7.84（dd, J＝2.3, 9.0, 1H）, 7.11（d, J＝9.0, 1H）, 3.30−3.36（m, 1H）, 3.26（q, J＝7.1, 4H）, 2.71（dd, J＝6.8, 16.9, 1H）, 2.48（d, J＝17.0, 1H）, 1.25（d, J＝7.4, 3H）, 1.16（t, J＝7.1, 6H）. TLC：Rf 0.25（1：1 EtOAc：ヘキサン）。HPLC：Rt 1.27分、純度＞95％。MS：305（M＋1）。正確な質量（M＋1）：305.1608。測定値：305.1616。13C NMR（75 MHz, CDCl3, purchased material）δ166.28, 152.02, 145.24, 141.21, 129.77, 124.94, 123.94, 121.00, 46.10, 33.80, 27.81, 16.24, 12.56.
（R）−DNMDPの光学純度を、キラルSCFクロマトグラフィーおよび市販のラセミ物質との比較を用いて決定した：カラム：ChiralPak AS−H、250×4.6mm、5μm、移動相改質剤：100％メタノール、勾配：10分間にわたり5〜50％メタノール、流量：4mL／分、背圧：100bar、カラム温度：40℃。UV検出は200〜400nmであった。分離した異性体の保持時間：5.36分、6.64分；（R）−DNMDPの保持時間、6.60分、1：19比のエナンチオマーが検出された。
2．MeOH5mLに溶解したA200mg（0.98mmol）に、アセトアルデヒド87mg（2.0mmol）、HOAc113uL（2.0mmol）およびNaBH3CN124mg（2.0mmol）を添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。翌日、同量の試薬を添加し、反応物をさらに24時間撹拌した。混合物を濃縮し、CH2Cl2と水に分配し、CH2Cl2を分離し、乾燥させ、濃縮した後、ヘキサン中20〜40％EtOAcでのクロマトグラフィーにより、生成物210mgを白色固体（82％）として単離した。1H NMR（300 MHz, CDCl3）δ8.95（s, 1H）, 7.64（d, J＝8.7, 2H）, 6.66（d, J＝8.7, 2H）, 3.37（dd, J＝9.6, 16.4, 5H）, 2.67（dd, J＝6.5, 16.8, 1H）, 2.43（d, J＝16.8, 1H）, 1.41−1.02（m, 10H）. 13C NMR（75 MHz, CDCl3）δ166.82, 154.55, 148.79, 127.32, 120.81, 111.08, 44.32, 33.92, 27.74, 16.37, 12.50. TLC：Rf 0.25（1：1 EtOAc：ヘキサン）。HPLC：Rt 1.05分、純度＞95％。MS：260（M＋1）。HRMS 正確な質量（M＋1）：260.1757。測定値：260.1764
3．ジメチルホルムアミド（DMF）1mLに溶解したA200mg（0.984mmol）に、ビス（2−ブロモエチル）エーテル250μL（2.00mmol）とK2CO3 400mgの混合物を添加し、60℃で一晩撹拌した。翌日、さらにビス（2−ブロモエチル）エーテル250μLおよびK2CO3 170mgを添加した。3時間後、EtOAcおよび水を添加し、水をEtOAcですすぎ、合わせたEtOAc洗浄液を乾燥させ、濃縮した。CH2Cl2中0〜4％MeOHでのクロマトグラフィーにより、生成物125mg（46％）が得られた。1H NMR（300 MHz, CDCl3）δ8.61（s, 1H）, 7.68（d, J＝8.8, 2H）, 6.92（d, J＝8.8, 2H）, 3.99−3.76（m, 4H）, 3.44−3.31（m, 1H）, 3.29−3.22（m, 4H）, 2.70（dd, J＝6.7, 16.8, 1H）, 2.46（d, J＝16.7, 1H）, 1.24（d, J＝7.3, 3H）. 13C NMR（75 MHz, CDCl3）δ166.64, 154.05, 152.18, 127.10, 125.33, 114.73, 66.69, 48.33, 33.93, 27.94, 16.36. TLC：Rf 0.1（1：50 MeOH：CH2Cl2）。HPLC：Rt 1.05分、純度＞95％。MS：274（M＋1）。HRMS：計算値274.1556（M＋1）；測定値274.1552。分析。C15H19N3O2についての計算値：C, 65.91；H, 7.01；N, 15.37；測定値65.81, H, 6.66, N, 15.26。
DNMDP−2L．ジメチルホルムアミド（DMF）0.4mLに溶解したA130mg（0.64mmol）に、tert−ブチル2−（2−（2−ブロモエトキシ）エトキシ）−エチルカルバメート100mg（Toronto Research Chemical、0.32mmol）およびK2CO3 90mg（64mmol）を添加し、混合物を60℃で一晩撹拌した。冷却後、水を添加し、EtOAcで数回すすいだ。合わせたEtOAc層を乾燥させ、濃縮し、50〜70％EtOAcでクロマトグラフィーを行うと、生成物81mg（58％）が得られた。1H NMR（300 MHz, CDCl3）δ9.06（s, 1H）, 7.59（d, J＝8.8 Hz, 2H）, 6.62（d, J＝8.8 Hz, 2H）, 5.15（s, 1H）, 4.53（s, 1H）, 3.72（t, J＝5.2 Hz, 2H）, 3.65（s, 4H）, 3.55（t, J＝5.2 Hz, 2H）, 3.32（m, 5H）, 2.67（dd, J＝16.8, 6.7 Hz, 1H）, 2.42（d, J＝16.4 Hz, 1H）, 1.44（s, 9H）, 1.22（d, J＝7.4 Hz, 3H）. 13C NMR（75 MHz, CDCl3）δ166.83, 155.99, 154.45, 149.64, 127.33, 123.24, 112.58, 79.28, 70.30, 70.26, 70.22, 69.45, 43.14, 40.39, 33.96, 28.43, 27.89, 16.40； HPLC：Rt 2.50分（実行時間7.5分）、純度＞95％。MS：435（M＋1）。この生成物（0.19mmol）をMeOH1mLに溶解し、溶液にアセトアルデヒド（50μL、0.89mmol）、HOAc10μL（0.2mmol）およびNaBH3CN12mg（0.19mmol）を添加した。1時間後、NaHCO3（水溶液）およびCH2Cl2を添加し、CH2Cl2を分離し、水をCH2Cl2で2回洗浄した。合わせたCH2Cl2を乾燥させ、濃縮し、ヘキサン中60〜70％EtOAcでのクロマトグラフィーにより、生成物71mgが透明油（82％）として得られた。1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ8.91（s, 1H）, 7.63（d, J＝8.9 Hz, 2H）, 6.69（d, J＝8.9 Hz, 2H）, 5.07（s, 1H）, 3.65（t, J＝6.0 Hz, 2H）, 3.61（s, 4H）, 3.55（dt, J＝9.9, 5.5 Hz, 4H）, 3.46（q, J＝7.0 Hz, 2H）, 3.38−3.22（m, 3H）, 2.67（dd, J＝16.8, 6.7 Hz, 1H）, 2.43（d, J＝16.7 Hz, 1H）, 1.45（s, 10H）, 1.23（d, J＝7.3 Hz, 3H）, 1.18（t, J＝7.0 Hz, 3H）. 13C NMR（101 MHz, CDCl3）δ166.84, 155.96, 154.46, 148.89, 127.35, 121.38, 111.28, 79.22, 70.68, 70.27, 70.24, 68.74, 49.95, 45.49, 40.32, 33.97, 28.43, 27.80, 16.43, 12.14.Rt 2.99分（実行時間7.5分）、純度＞95％。MS：463（M＋1）。
（化合物6の合成）
（A．化合物3）
化合物3は、2つの異なる経路を経由して得ることができ得る：
経路1
または
経路2
（1−（3−フルオロ−4−モルホリノフェニル）プロパン−1−オン。）
1L一口フラスコに、3,4−ジフルオロプロピオフェノン40g（235mmol）、CH3CN400mL、モルホリン250mL（2.86mol）、およびDIPEA50mL（360mmol）を添加し、溶液を一晩100℃に加熱した。翌日、反応物を冷却し、濃縮した。この混合物をCH2Cl2に溶解し、水、次にブラインで数回すすぎ、乾燥させ（MgSO4）、濾過し、濃縮した。粗生成物の大部分を約1Lの熱ヘキサンに溶解し、一晩冷却した。濾過すると、さらに多くの結晶が母液に現れた。母液を濃縮し、ヘキサンから再結晶させた。合計52.5gの乾燥白色固体を得た（94％）。1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ7.72（dd, J＝8.4, 1.9 Hz, 1H）, 7.66（dd, J＝14.0, 2.0 Hz, 1H）, 6.93（t, J＝8.5 Hz, 1H）, 3.94−3.85（m, 4H）, 3.26−3.17（m, 4H）, 2.94（q, J＝7.3 Hz, 2H）, 1.23（t, J＝7.3 Hz, 3H）. 19F NMR（376 MHz, CDCl3）δ−121.48. MS：238（M＋1）.
（4−（3−フルオロ−4−モルホリノフェニル）−3−メチル−4−オキソブタン酸エチル。）
2L三口フラスコに、無水THF200mLおよびLiHMDS溶液（THF中1M）200mLを添加し、ドライアイス／イソプロパノール浴でフラスコを冷却した。冷たくなったら、THF300mLに溶解した3−フルオロ−4−モルホリノ）プロピオフェノン（196mmol）46.5gを、カニューレを介して添加した。1時間撹拌した後、THF44mLに溶解したブロモ酢酸エチル（202mmol）44mLを添加し、反応混合物を一晩撹拌し、室温まで温めた。翌朝、反応物はまだ少し冷たかった。それにNH4Cl溶液を添加し、それに続いてEtOAcおよびヘキサンを添加した。層を分離し、水層をEtOAcで2回すすぎ、合わせた有機層をブラインですすぎ、乾燥させ（MgSO4）、濃縮して65.6gの淡黄色の油状物質（100％）とし、それを粗製のまま続けた。
1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ7.74（dd, J＝8.4, 1.8 Hz, 1H）, 7.67（dd, J＝14.1, 1.9 Hz, 1H）, 6.93（t, J＝8.5 Hz, 1H）, 4.09（q, J＝6.9 Hz, 2H）, 3.93−3.78（m, 5H）, 3.28−3.14（m, 4H）, 2.93（dd, J＝16.8, 8.5 Hz, 1H）, 2.43（dd, J＝16.8, 5.6 Hz, 1H）, 1.21（dt, J＝7.1, 3.6 Hz, 6H）. 19F NMR（376 MHz, CDCl3）δ−121.33. 1H NMR、19F NMR、およびLCは、不純物が5〜10％であることを示した。
（5R）−6−［3−フルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン化合物3a（化合物3−ラセミ化合物））
粗4−（3−フルオロ−4−モルホリノフェニル）−3−メチル−4−オキソブタン酸エチル（65.6g、202mmol）をEtOH400mLに溶解し、それにヒドラジン（1.01mol）31.6mLを添加し、反応物を還流温度で一晩加熱した。翌朝、多量の白色の沈殿が室温に冷却されたフラスコの中に存在していた、固体を濾過し、冷EtOHですすいだ。固体を1L一口フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターに設置して残留するEtOHを除去し、42gの正常な固体を得た（71％）。
1H NMR（300 MHz, CDCl3）δ8.46（s, 1H）, 7.50（dd, J＝2.1, 14.4, 1H）, 7.43（dd, J＝1.8, 8.4, 1H）, 6.93（t, J＝8.7, 1H）, 3.95−3.83（m, 4H）, 3.37−3.23（m, 1H）, 3.21−3.11（m, 4H）, 2.70（dd, J＝6.8, 16.9, 1H）, 2.47（d, J＝17.1, 1H）, 1.24（d, J＝7.4, 3H）. 13C NMR（75 MHz, CDCl3）δ166.45, 155.33（d, JC−F＝246.3）, 152.71, 141.1（d, JC−F＝8.6）, 128.75（d, JC−F＝7.6）, 122.20（d, JC−F＝3.0）, 118.09（d, JC−F＝3.6）, 113.80（d, JC−F＝23.0）, 66.83, 50.50（d, JC−F＝3.9）, 33.84, 27.96, 16.29.19F NMR（282 MHz, CDCl3）δ−121.51. 質量：292（M＋1）。
（分析分離方法）
計測器：Thar analytical SFC
カラム：ChiralPak AS−H、250×4.6mm
移動相：CO2用のAおよびMeOH（0.05％DEA）用のB
勾配：B 40％
流量：2.4mL／分
背圧：100bar
カラム温度：35℃
波長：220nm
（分取分離方法）
計測器：Thar200 preparative SFC
カカラム：ChiralPak AS−10μm、300×50mmI.D.
移動相：CO2用のAおよびEtOH（0.1％NH3・H2O）用のB
勾配：B 45％
流量：200mL／分
背圧：100bar
カラム温度：38℃
波長：220nm
（試料調製：）
化合物3aをエタノールに溶解して約100mg／mlとした。注射：5ml／注射。
（後処理：）
分離後、画分を湯浴温度40℃のロータリーエバポレーターで乾燥させて所望の異性体化合物3
を得た、それは溶出の遅いエナンチオマーで、保持時間は3.76分であった（その他のエナンチオマー−化合物3b
保持時間2.76分）。
エナンチオマー的に純粋な化合物3（330mmol）95mgの溶液をHOAc2mLに溶解した。これに、10〜15％NaOCl（aq）溶液0.13mLをシリンジを経由して添加した。約30分後、別の10〜15％NaOCl（aq）溶液0.25mLを反応混合物に添加し、それを約30分間撹拌した後に、水およびCH2Cl2を添加した。層を分離し、CH2Cl2層をNaHSO3（aq）、およびNaHCO3（aq）ですすいだ。溶液を乾燥させ（MgSO4）、濃縮し、ヘキサン中0〜50％EtOAcでクロマトグラフして52mgの化合物6を白色固体として得た（49％）。
1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ9.08（s, 1H）, 7.62−7.55（m, 1H）, 7.40（dd, J＝13.3, 2.1 Hz, 1H）, 3.92−3.77（m, 4H）, 3.32−3.18（m, 5H）, 2.72（dd, J＝17.0, 6.9 Hz, 1H）, 2.50（d, J＝17.0 Hz, 1H）, 1.25（d, J＝7.4 Hz, 3H）. 19F NMR（376 MHz, CDCl3）δ−118.69. 13C NMR（101 MHz, CDCl3）δ166.50, 159.68（d, J＝249.9 Hz）, 151.35（d, J＝2.9 Hz）, 137.26（d, J＝13.4 Hz）, 133.00（d, J＝7.3 Hz）, 131.36（d, J＝8.9 Hz）, 123.41（d, J＝2.6 Hz）, 112.97（d, J＝24.0 Hz）, 67.57, 51.08（d, J＝4.7 Hz）, 33.72, 27.84, 16.23. 質量326（M＋1）。
生成物のキラルSCFクロマトグラフィーは、エナンチオマー純度の低下がないことを示した：
カラム：ChiralPak AS−H、250×4.6mm、5um
移動相修飾剤：100％メタノール
勾配：10分間で5〜50％メタノール
流量：4mL／分
背圧：100bar
カラム温度：40℃
UV検出は200〜400nmであった。
分離されたエナンチオマーの保持時間：6.11（（R））および8.82（（S））分。
（エナンチオマーの分析分離−化合物6a。）
計測器：Waters Acquity UPC2
カラム：ChiralPak AS−H、250×4.6mm I.D.
移動相：CO2用のAおよびMeOH用のB
勾配：3〜50B、5分、10分運転
流量：1.5ml／分
背圧：100bar
カラム温度：45℃
波長：210nm
化合物6
の保持時間−7.23 min；不活性エナンチオマー化合物6b
の保持時間−6.28分。
化合物6をHeLa細胞生存力アッセイで試験し、そのEC50が1.1nMであると求めた。
（樹脂への吸着）
DNMDP−2L 18mg（0.04mmol）のCH2Cl2 0.8mL中溶液に、トリフルオロ酢酸（TFA）0.2mLを添加し、溶液を2時間撹拌した後、濃縮し、DMSO0.5mLに溶解した。これに、Et3N10uL（0.07mmol）およびN,N’−ジスクシンイミジルカーボネート（DSC）12mg（0.05mmol）を添加し、溶液を一晩撹拌した。LC分析が反応が完了していないことを示したので、さらなるN,N’−ジスクシンイミジルカーボネート25mg（0.1mmol）を添加した。2時間後のLC分析は、約5：1比のDSC生成物：アミンを示した。Affi−Gel 102樹脂の1mL試料を遠心分離機を用いてDMSOで5回すすぎ、次いで、DMSO0.5mLに懸濁した。樹脂にDSC生成物溶液30μLおよびEt3N 25μLを添加し、混合物を旋回させた。2日後、DMSO溶液のLC分析は、DCS付加物の完全な消失を示した。未誘導体化アミンが依然として存在していた。DMSOを遠心分離によって除去し、デカントし、樹脂をDMSOで数回すすぎ、PBS緩衝液に保存した。
（DNMDP誘導細胞傷害性を救済するための生理活性剤スクリーニング）
1000個のHeLa細胞を、10％ウシ胎児血清および1％Pen／Strepを補充した40μlのDMEM中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、1600種の生理活性分子（Pharmacon）の化合物ライブラリーを20μMの濃度で添加した。生物活性化合物のインキュベーションと並行して、DNMDPを30nMの最終濃度まで添加し、48時間インキュベートした。NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存率を評価した。
（DNMDPの分子標的のリンカー親和性精製と免疫ブロット）
HeLa細胞を氷冷PBSで洗浄した後、EDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤（Roche）ならびにホスファターゼ阻害剤混合物IおよびII（Calbiochem）を補充したNP−40溶解緩衝液（150mM NaCl、10％グリセロール、50mMトリス−Cl pH8.0、50mM MgCl2、1％NP−40）で溶解した。細胞溶解物を氷上で少なくとも2分間インキュベートし、その後、4℃で15700×gで10分間遠心分離し、その後、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce）を用いて上清を定量化した。合計200μgのHeLa細胞溶解物を、親和性リンカーDNMDP−2Lに結合した3μlのAffi−Gel102樹脂（BioRad）と総体積400μlで4時間インキュベートした。インキュベーションの前に、示される化合物を10μMの最終濃度で親和性精製に添加した。10μMの対応する化合物濃度を含有する溶解緩衝液で試料を3回洗浄した。Affi−Gel 102樹脂に結合したタンパク質を、還元し、変性させ、トリス−グリシンゲル（Novex）を用いて分離し、iBlot移送システム（Novex）を用いてニトロセルロース膜に移した。膜をPDE3Aに対する一次抗体（1：1000、Bethyl）と共に4℃で一晩インキュベートした。室温で2時間の二次抗体（1：20,000、LI−COR Biosciences）とのインキュベーションおよびその後の検出（Odyssey Imaging System、LI−COR Biosciences）を、製造業者の推奨に従って行った。
（PARP−切断免疫ブロット）
HeLa細胞を示される濃度のDNMDPおよびスタウロスポリンで36時間処理した。HeLa細胞を溶解し、DNMDPの分子標的のリンカー親和性精製および免疫ブロットに記載されるように処理した。膜をPARPに対する抗体（1：1000、Cell Signaling＃9532）およびアクチンと共にインキュベートし、その後、DNMDPの分子標的のリンカー親和性精製および免疫ブロットに記載されるように画像化した。
（CRISPRを用いたPDE3A遺伝子座の標的化）
CRISPR標的部位を、MIT CRISPR設計ツール（オンラインMIT CRISPR設計ポータル）を用いて同定した。sgRNAのクローニングのために、順方向および逆方向オリゴヌクレオチド（オリゴ）をアニールし、リン酸化し、BsmBI消化pXPR＿BRD001に連結した。オリゴ配列は以下の通りである：
レンチウイルスを産生するために、リン酸カルシウムを用いて、293個のT細胞にpXPR＿BRD001、psPAX2およびpMD2.Gを同時導入した。感染したHeLa細胞を2μg／mlのピューロマイシンで選択した。
（siRNAを用いたPDE3A発現の低下）
HeLa細胞を96ウェルプレートに蒔き、製造者の推奨に従って、PDE3Aおよび非標的siRNAスマートプール（On Target Plus、Thermo Scientific）で24時間後にトランスフェクトした。HeLa細胞溶解物をトランスフェクションの24時間後および72時間後に得て、DNMDPの分子標的のリンカー−親和性精製および免疫ブロットに記載されるように、PDE3Aおよびアクチン（1：20,000、Cell Signaling）について免疫ブロットした。HeLa細胞を示される濃度の化合物3で48時間処理した。NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存率を評価した。
（HeLa細胞における細胞cAMP濃度の測定）
5000個のHeLa細胞を96ウェルプレートに蒔いた。プレーティングの24時間後、HeLa細胞を示される濃度の示される化合物と共に1時間インキュベートした。cAMPレベルを、製造業者の推奨に従ってCAMP−GLO（商標）アッセイ（Promega）を用いて測定した。製造業者の推奨に従って作成された標準曲線に正規化することによって、cAMPの細胞濃度を決定した。
（PDE3A−タンパク質相互作用研究のための拡張プロテオミクス法）
（HeLa細胞におけるPDE3Aの免疫沈降）
HeLa細胞を、10μMの示される化合物：DMSO、DNMDPおよびトレキンシンで溶解前に4時間処理した。DNMDPの分子標的のリンカー−親和性精製および免疫ブロットに記載されるように、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、ならびに最終濃度10μMまでの上記の示される化合物を補充したModRipa溶解緩衝液（1％NP−40：50mM トリス−HCl、pH7.8、150mM NaCl、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDTA）でHeLa細胞を溶解した。HeLa全細胞溶解物13mgを0.5％PDE3A抗体（Bethyl）と共にインキュベートし、一晩インキュベートした。PDE3A抗体に対するブロッキングペプチド（Bethyl）を、対応する条件でPDE3A抗体と同時に添加した。次いで、全細胞溶解物と抗体混合物をプロテインAプラスアガロース10μl（Fisher Scientific）と共に4℃で30分間インキュベートした。次いで、プロテインAプラスアガロースを、10μMの濃度の示される化合物を含有する溶解緩衝液で2回洗浄した。最後に、プロテインAプラスアガロースを、NP−40を含有せず、10μMの濃度の示される化合物を含有する溶解緩衝液で1回洗浄した。
（オンビーズ消化）
免疫精製からのビーズをIP溶解緩衝液で1回洗浄し、次いで、PBSで3回洗浄し、各反復の3つの異なる溶解物を90μL消化緩衝液（2M尿素、50mMトリスHCl）に再懸濁し、配列決定グレードのトリプシン2μgを添加し、700rpmで1時間振盪した。上清を取り出し、新しいチューブに入れた。次いで、ビーズを消化緩衝液50μLで2回洗浄し、上清と合わせた。合わせた上清を還元し（2μL500mM DTT、30分間、室温）、アルキル化し（4μL500mM IAA、45分間、暗所）、より長い一晩の消化を行った：トリプシン2μg（4μL）、一晩振盪。次いで、試料を10％葉酸（FA）20uLでクエンチし、10mgのSEP−PAK（登録商標）カラムで脱塩した。
（ペプチドのiTRAQ標識および強陽イオン交換（scx）分画）
脱塩されたペプチドを、製造者の指示（AB Sciex、Foster City、CA）に従って相対および絶対定量（iTRAQ）−試薬のために同重体タグで標識した。ペプチドを0.5M TEAB pH8.5溶液30μlに溶解し、標識試薬をエタノール70μlに添加した。1時間のインキュベーション後、50mM Tris／HCl pH7.5で反応を停止させた。示差的に標識したペプチドを混合し、その後、10mgのSEP−PAK（登録商標）カラムで脱塩した。
示差的に標識され、結合されたペプチドのSCX分画を、Rappsilberら（Rappsilberら、Nat Protoc 2、1896〜1906、2007）に記載されているように、以下のように6つのpH段階（緩衝液−全て25％アセトニトリルを含有する）で行った：
1：酢酸アンモニウム50mM、pH4.5
2：酢酸アンモニウム50mM pH5.5
3：酢酸アンモニウム50mM、pH6.5
4：重炭酸アンモニウム50mM pH8
5：水酸化アンモニウム0.1％pH9
6：水酸化アンモニウム0.1％pH11
この論文に記載されているように、Empore SCXディスクを使用してストップアンドゴー抽出チップ（StageTips）を作成した。
（MS分析）
再構成されたペプチドを、オンラインナノフローEASY−NLC（商標）1000UHPLCシステム（Thermo Fisher Scientific）上で分離し、卓上Orbitrap Q EXACTIVE（商標）質量分析計（Thermo Fisher Scientific）で分析した。ペプチド試料を、20cm C18シリカ材料（1.9μm REPROSIL−PUR（登録商標）C18−AQ培地、Dr. Maisch GmbH、r119.aq）を用いて社内で充填したキャピラリーカラム（10μm先端開口部／直径75μmのPICOFRIT（登録商標）、New Objective、PF360−75−10−N−5）に注入した。UHPLCセットアップを、カスタムフィットマイクロ適合ティー（360μm、IDEX Health＆Science、UH−753）と接続し、キャピラリーカラムをカラムヒータースリーブ（Phoenix−ST）で50℃に加熱して、UHPLC分離中の背圧を低減した。注入したペプチドを、100％溶媒A（3％アセトニトリル、0.1％ギ酸）から30％溶媒B（90％アセトニトリル、0.1％ギ酸）の線形80分勾配、引き続いて30％溶媒Bから90％溶媒Bの直線形6分勾配で、200nL／分の流量で分離した。各試料を、試料ローディングおよびカラム平衡時間を含めて120分間流した。Q EXACTIVE（商標）装置を、3×106イオンのMS1イオン標的および5×104イオンのMS2標的を用いて、12種の上位の最も豊富なイオンで各MS1スキャン（R＝70000）後の高エネルギー衝突解離（HCD）MS／MSスキャン（R＝17500）を取得するデータ依存モードで運転した。MS／MSスキャンに利用した最大イオン時間は120msであった；HCD正規化衝突エネルギーを27に設定した；動的排除時間を20秒に設定し、ペプチドの一致および同位体排除機能を使用可能にした。
（ペプチドおよびタンパク質の定量化および同定）
全ての質量スペクトルを、相対および絶対定量（iTRAQ）に基づく定量のための同重体タグのために出願人によって開発されたモジュールを含むSpectrum Millソフトウェアパッケージv4.1ベータ（Agilent Technologies）を用いて処理した。前駆体イオン定量を、各前駆体イオンについて抽出イオンクロマトグラム（XIC’s）を用いて行った。MS／MSに供された各前駆体イオンのXICのピーク面積を、Spectrum Millソフトウェアによって、同位体クラスターの各個々のメンバーの周りの狭い窓を用いた液体クロマトグラフィー（LC）−MS／MS実行の介在する高分解能MS1スキャンで自動的に計算した。同位体クラスター内のピークの相対的分布に関する品質メトリクス対理論を条件に、MSスキャン分解能、前駆体電荷およびm／zに基づいて、時間とm／z領域の両方におけるピーク幅を動的に決定した。＋／−60秒以内に同じ解離モードで同じ前駆体m／zで得られた類似のMS／MSスペクトルを併合した。シーケンスタグ長＞1（すなわち、アミノ酸の鎖内質量によって分離される3質量の最小）を有さないことによって品質フィルタに不合格であった前駆体電荷＞7および品質の悪いMS／MSスペクトルを有するMS／MSスペクトルを検索から除外した。
ペプチド同定のために、共通の実験室汚染タンパク質のセットが添付されたヒトユニバーサルタンパク質資源（Uniprot）データベースに対してMS／MSスペクトルを検索した。検索パラメータには、ESI−Q EXACTIVE（商標）−HCDスコアリングパラメータ、最大2つの欠けた切断を伴うトリプシン酵素特異性、40％最小一致ピーク強度、＋／−20ppm前駆体質量許容差、＋／−20ppm生成物質量許容差、および固定化修飾としてのシステインのカルバミドメチル化ならびにリジンおよびペプチドn末端のiTRAQ標識が含まれる。許容される可変修飾は、メチオニン、N末端アセチル化、ピログルタミン酸（N−末端Q）、脱アミド化（N）、ピロカルバミドメチルCys（N−termC）、前駆体MH＋シフト範囲−18〜64Daであった。個々のスペクトルについて解釈された同一性を、各液体クロマトグラフィー（LC）−MS／MSにおける各前駆体電荷状態について別々にスコアおよびデルタランク1ランク〜ランク2スコア閾値を最適化することによって、自動的に有効と示し、スペクトルレベルで1.0％の最大標的−デコイベースの偽陽性率（FDR）を可能にした。
タンパク質レベルでスコアを計算し、同定されたタンパク質を報告する際に、冗長性を以下のように扱う：タンパク質スコアは異なるペプチドのスコアの合計である。別個のペプチドは、MS／MSスペクトルを通して検出されたペプチドの単一の最も高い得点の例である。特定のペプチドについてのMS／MSスペクトルは複数回記録された可能性があるが、（すなわち、異なる前駆体電荷状態として、隣接するSCX画分から単離され、Metの酸化によって修飾される）、依然として単一の別個のペプチドとして数えられる。配列データベース内の複数のタンパク質エントリーに8個超の残基長のペプチド配列が含まれる場合、タンパク質をグループ化し、最も高い得点1およびその受入番号を報告する。タンパク質配列がこのようにグループ分けされる場合、グループのより低い得点のメンバー（アイソフォームまたはファミリーメンバー）を一意的に表す別個のペプチドが存在する場合がある。これらの例の各々はサブグループを生み出し、複数のサブグループが報告され、タンパク質の総数に向かってカウントされる。Spectrum Millのタンパク質比較エクスポート表からiTRAQ比を得た。iTRAQタンパク質比を得るために、各反復のタンパク質サブグループに割り当てられた全ての異なるペプチドにわたって中央値を計算した。相互作用タンパク質を割り当てるために、R環境のLimmaパッケージを使用して、以前に記載されたように緩和されたt検定pを計算し、再現性のCIが95％未満であるタンパク質を除外するBlandt−Altman検定を追加した（Udeshiら, Mol Cell Proteomics 11, 148〜159, 2012）。
（免疫沈降および免疫ブロットを用いたDNMDP誘導PDE3Aタンパク質相互作用の検証）
HeLa細胞を、V5タグ化SIRT7、V5タグ化SLFN12またはV5タグ化GFPを発現するORF過剰発現構築物でトランスフェクトした。ORF発現構築物を、TRC（クローンID：TRCN0000468231、TRCN0000476272、ccsbBroad304＿99997）から得た。トランスフェクションの72時間後、細胞を10μM DNMDPまたはトレキンシンで4時間処理し、引き続いてModRipa溶解緩衝液を用いて溶解し、PDE3Aを免疫沈降させた。各条件について、全タンパク質溶解物2mgを抗PDE3A抗体1μgと4℃で一晩インキュベートし、その後、プロテインA−およびプロテインG−Dynabeadsそれぞれ7.5μl（Life Technologies 10001Dおよび10003D）を添加し、さらに1時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、結合したタンパク質をLDS PAGEゲルローディング緩衝液30μlで溶出させた。4〜12％トリス−グリシンPAGEゲル上でインプット（全タンパク質溶解物約60μg）およびIP生成物を分離し、抗V5抗体（Life Technologies R96205、1：5000）、Bethyl抗PDE3A抗体（1：1000）およびLiCOR Biosciences製の二次抗体（カタログ番号926−32210および926068021、それぞれ1：10,000）で免疫ブロットした。ブロットを洗浄し、LiCOR Odyssey赤外線撮像装置を用いて画像化した。
（shRNAを用いたSLFN12発現のノックダウンと薬物感受性の試験）
SLFN12を標的とするshRNAを発現する構築物、または対照ベクターをレンチウイルスにパッケージングし、ウイルス形質導入によってHeLa細胞に送達した。3つのSLFN12標的化shRNAを使用したが、これらの全てをTRC（クローンID：TRCN0000152141およびTRCN0000153520）から得た。感染した細胞を1μg／mlピューロマイシンを用いて3日間選択し、次いで、非選択培地でさらに3日間増殖させた。次いで、細胞を384ウェルアッセイプレートに蒔き、上記のように薬物感受性について試験した。SLFN12のノックダウンをqPCRによって検証した。キット試薬（RNeasy Mini Kit（Qiagen＃74104）およびQIAschredder（Qiagen＃79656））を用いて全RNAを抽出した。キット試薬（SuperScript III First−Strand Synthesis System（Life Technologies＃18080−051））を用いてcDNAを作製した。qPCRを、製造業者の推奨に従ってGAPDHおよびSLFN12（Life Technologies Hs00430118＿m1）について行った。SLFN12発現を、対応する試料GAPDH ct値に正規化した。
「その他の実施形態」
上記の説明から、種々の使用および条件に採用するために、本明細書に記載される本発明に対して変更および修正を行うことができることは明らかであろう。このような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一の要素または列挙される要素の組合せ（もしくは部分的組み合わせ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、その実施形態を任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せで含む。
「参照による組み込み」
本明細書で言及した全ての特許および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が具体的かつ個別的に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (27)

  1. ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞を死滅させるかまたはその生存を減少させる方法であって、前記細胞を、構造：
    を有する化合物から選択されるPDE3Aモジュレーターと接触させる工程を含み、前記細胞が、PDE3Aおよび／またはSchlafen12（SLFN12）のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが参照と比較して増加しているとして選択されたものであり、前記工程により前記癌細胞の生存を減少させる、方法。
  2. PDE3Aモジュレーターに反応性である癌を有するとして予め選択された対象において癌細胞増殖を減少させる方法であって、前記対象に、構造：
    を有する化合物から選択されるPDE3Aモジュレーターを投与する工程を含み、前記対象が、PDE3Aおよび／またはSchlafen12（SLFN12）のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが参照と比較して増加していることを検出することによって予め選択されたものであり、前記工程により前記対象での癌細胞増殖を減少させる、方法。
  3. 前記PDE3Aモジュレーターが、構造：
    を有する、請求項1または2に記載の方法。
  4. CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルが参照と比較して低下していないことを検出する工程をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
  5. PDE3A調節に抵抗性の癌を有する対象を特定する方法であって、前記対象の生体試料中のCREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが参照と比較して低下していることを検出する工程を含み、それにより前記対象をPDE3A調節に抵抗性の癌を有すると特定する、方法。
  6. SLFN12のレベルの低下を検出する工程をさらに含む、請求項5に記載の方法。
  7. PDE3A、SLFN12、またはCREB3L1ポリペプチドの前記レベルが、免疫ブロット法、質量分析、および免疫沈降からなる群から選択される方法によって検出される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. PDE3A、SLFN12、またはCREB3L1ポリヌクレオチドの前記レベルが、定量的PCR、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析、およびインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法によって検出される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  9. ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性であるとして選択された前記癌細胞が、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記PDE3AモジュレーターがPDE3Aの活性を低下させる、請求項1または2に記載の方法。
  11. 前記PDE3Aモジュレーターが経口投与または静脈内投与される、請求項2に記載の方法。
  12. 前記生体試料が癌細胞を含む組織試料である、請求項5に記載の方法。
  13. PDE3A調節に反応性の癌を有する対象を特定するためのキットであって、CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する捕捉試薬を含む、キット。
  14. SLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する捕捉試薬をさらに含む、請求項13に記載のキット。
  15. 構造：
    を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
  16. 1以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と、構造：
    を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグとを含む医薬組成物。
  17. 治療を必要とする対象に、構造：
    を有する化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを投与する工程を含む、過剰増殖性疾患を治療する方法。
  18. 前記過剰増殖性疾患が癌である、請求項17に記載の方法。
  19. 前記対象が、PDE3Aモジュレーターに反応性である癌と診断されている、請求項17に記載の方法。
  20. 前記癌が、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である、請求項17に記載の方法。
  21. PDE3Aモジュレーターに反応性であるとして予め選択された対象において癌細胞増殖を減少させるためのキットであって、構造：
    を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む、キット。
  22. 癌の治療のための医薬の製造のためのPDE3Aモジュレーターの使用であって、前記PDE3Aモジュレーターが、構造：
    を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグである、使用。
  23. 前記癌が、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である、請求項22に記載の使用。
  24. 請求項15に記載の化合物6を調製する方法であって、ラセミ化合物3a
    を、10℃〜15℃（10℃および15℃を含む）の温度範囲で酢酸中のNaOClと反応させて、ラセミ化合物6a
    を得、その後、化合物6aのエナンチオマーの分離を行って、化合物6
    を得る工程を含む、方法。
  25. 先行する工程において化合物3aのエナンチオマーの分離を行って化合物3
    を得ることを場合によりさらに含み、10℃〜15℃（10℃および15℃を含む）の温度範囲の酢酸中のNaOClとの前記反応工程をエナンチオマー化合物3を用いて行い、場合によりその後にエナンチオマーを分離することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
  26. エナンチオマー化合物3
    を反応させて、エナンチオマー化合物6
    を得る、請求項24に記載の方法。
  27. 化合物3
    の、化合物6
    の調製のための使用。
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