JP2019503204A - アプタマーによるポリアデニル化の調節を通じての遺伝子発現制御 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｕ１核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）が媒介するポリアデニル化抑制のアプタマーによる調節により遺伝子発現を制御するためのポリヌクレオチド・コンストラクト、及びアプタマーに結合するリガンドの存在または不存在に応答して該コンストラクトを用いて遺伝子発現を制御する方法を提供する。該ポリヌクレオチド・コンストラクトは、エフェクター領域及びアプタマーを含むリボスイッチの場合、Ｕ１結合部位を含み、したがって、アプタマーがリガンドと結合すると標的遺伝子が発現することになる。

Description

本発明は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰが媒介するポリアデニル化抑制のアプタマーによる調節により遺伝子発現を制御するためのポリヌクレオチド・コンストラクト、及びアプタマーに結合するリガンドの存在または不存在に応答して該コンストラクトを用いて遺伝子発現を制御する方法を提供する。該ポリヌクレオチド・コンストラクトは、エフェクター領域及びアプタマーを含むリボスイッチの場合、Ｕ１結合部位を含み、したがって、アプタマーがリガンドと結合すると標的遺伝子が発現することになる。

真核生物の細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、前ｍＲＮＡ転写物から、５’末端キャッピング、スプライシングによるイントロンの除去、及び３’末端の切断・ポリアデニル化などの様々な転写後プロセシングによって生成する。スプライシングを担うのは、主として核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）で構成される大きなＲＮＡタンパク質複合体、スプライソソームである。主流の（Ｕ２型の）スプライソソームとしてはＵ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ６、及びＵ５ ｓｎＲＮＰがあり、もっと少数のＵ１２型スプライソソームとしてはＵ１１、Ｕ１２、Ｕ４ａｔａｃ、Ｕ６ａｔａｃ、及びＵ５ ｓｎＲＮＰがある。

ほぼ全ての真核生物ｍＲＮＡの３’末端は、２０〜２５０アデノシン残基のホモポリマー、ポリ（Ａ）尾部を含む。ポリ（Ａ）尾部は、切断及びポリアデニル化、つまり巨大なタンパク質複合体が触媒するプロセスにより、前ｍＲＮＡの核に付加される。脊椎動物では、ポリ（Ａ）尾部の付加は２つのシス作用ＲＮＡエレメント、ポリアデニル化部位の上流に見られる高度に保存されたＡＡＵＡＡＡポリアデニル化配列と、下流に見られる低度に保存されたＧＵリッチエレメントに依存する。ｍＲＮＡに付加されたポリ（Ａ）尾部の機能の一つが、ｍＲＮＡを劣化から保護することである。

Ｕ１ ｓｎＲＮＰは、前ｍＲＮＡのプロセシングにおいて、前ｍＲＮＡの３’末端のプロセシングを抑制し、異常なイントロンのポリアデニル化シグナルを阻害する、スプライシングとは無関係の機能をもち、プロモーターの方向性を確保することがわかっている。たとえば、Ｆｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ， １００：８２６４−６９、参照により本明細書に援用する）は、３’ＵＴＲに１〜３のＵ１結合部位を配置して、リポーター遺伝子の発現を低下させた。

一態様では、本発明は、リボスイッチを含む、標的遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチド・カセットを提供し、該リボスイッチは、エフェクター領域及びアプタマーを含み、該エフェクター領域は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びこのＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位の相補配列を含む。一実施形態では、アプタマーは、小分子リガンドに結合する。

一実施形態では、エフェクター配列は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びこのＵ１ ｓｎＲＮＰ結合の相補配列に加えて、アプタマーがリガンドに結合するとステムを形成できる追加配列を含む。一実施形態では、エフェクター領域は、９〜１１塩基対であるステム形成配列を含む。一実施形態では、エフェクター領域は、ステムに１つ以上のミスマッチ塩基を有するステム形成配列を含む。

一実施形態では、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、８〜１０ヌクレオチドである。一実施形態では、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、配列ＣＡＧＧＴＡＡＧを含む。一実施形態では、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡ、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴ、及びＣＡＧＧＴＡＡＧからなる群より選択される。

一実施形態では、ポリヌクレオチド・カセットは、２つ以上のリボスイッチを含み、各リボスイッチは、エフェクター領域及びアプタマーを含み、該エフェクター領域は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びこのＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位の相補配列を含む。一実施形態では、２つ以上のリボスイッチはそれぞれ、同じリガンドに結合するアプタマーを含む。一実施形態では、２つ以上のリボスイッチは、異なるリガンドに結合する異なるアプタマーを含む。

別の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を調節する方法を提供し、該方法は、

（ａ）上述の１つ以上のポリヌクレオチド・カセットを標的遺伝子の３’ＵＴＲに挿入すること、

（ｂ）該ポリヌクレオチド・カセットを含む該標的遺伝子を細胞に導入すること、及び

（ｃ）該細胞を、該アプタマーに特異的に結合する、該標的遺伝子の発現を増加させるのに有効な量のリガンドに曝露すること、
を含む。

一実施形態では、リガンドは小分子である。

一実施形態では、ポリヌクレオチド・カセットは、ポリアデニル化シグナルの５’側約８７及び／または約１４０ヌクレオチドのところに挿入される。一実施形態では、ポリヌクレオチド・カセットは、ポリアデニル化シグナルの５’側約７４、約１１０、または約１４９ヌクレオチドのうちの１つ以上のところに挿入される。

一実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチド・カセットが標的遺伝子の３’ＵＴＲに挿入される。一実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチド・カセットは、異なる小分子リガンドに特異的に結合する異なるアプタマーを含む。一実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチド・カセットは、同じアプタマーを含む。一実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチド・カセットは、標的遺伝子の３’ＵＴＲの異なる位置に挿入される。

別の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現のためにベクターに組み込まれている、上述のポリヌクレオチド・カセットを含む該標的遺伝子を提供する。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群より選択される。

別の態様では、本発明は、本明細書で説明するポリヌクレオチド・カセットを含む標的遺伝子を含むベクターを提供する。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群より選択される。

３’ＵＴＲ内のＵ１結合部位は標的遺伝子（ルシフェラーゼ）発現を抑制する。ｐＲＬ−ＳＶ４０ベクターにおいて３’ＵＴＲの異なる位置にＵ１結合配列を挿入する模式図である。野生型及びミュータントのＵ１コンセンサス結合配列を挙げる。 ３’ＵＴＲ内のＵ１結合部位は標的遺伝子（ルシフェラーゼ）発現を抑制する。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ・アッセイの結果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞に、３’ＵＴＲの様々な位置にコンセンサスＵ１結合配列またはミュータント配列を含む上述のコンストラクトで遺伝子導入した。結果を平均±ＳＤで表し（ｎ＝３）、低下倍率をミュータント・コンストラクトからのルシフェラーゼ活性と野生型コンストラクトからのルシフェラーゼ活性の比として計算した。 ３’ＵＴＲ内のＵ１結合配列の長さが遺伝子発現の抑制に及ぼす効果。３’ＵＴＲ内の−８７の位置に挿入されたＵ１結合部位の全長及び縮小型配列の図である。 ３’ＵＴＲ内のＵ１結合配列の長さが遺伝子発現の抑制に及ぼす効果。ＨＥＫ２９３細胞に、−８７のところに挿入された全長または縮小型Ｕ１結合配列を含む上述のコンストラクトで遺伝子導入し、ルシフェラーゼ活性を決定した。 ３’ＵＴＲ内のＵ１部位のステム−ループ構造が遺伝子発現に及ぼす効果。ステムのＵ１結合部位に埋め込まれたステム−ループ構造の配列を示す図である。変異させて破損ステムを作製した（右側に示す）。 ３’ＵＴＲ内のＵ１部位のステム−ループ構造が遺伝子発現に及ぼす効果。ルシフェラーゼ活性アッセイの結果は、Ｕ１結合部位を結合不可とするステム−ループ構造によって、遺伝子発現に対するＵ１干渉の抑制効果が完全に無効になったことを示す。 標的遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＵ１干渉を制御するためのテオフィリン・アプタマーの使用。３’ＵＴＲにおけるアプタマーによるＵ１干渉の調節、及び遺伝子発現を示す模式図である。アプタマーリガンドの非存在下では（上側パネル）、３’ＵＴＲに挿入されたＵ１部位はＵ１ ｓｎＲＮＰと結合可能であり、Ｕ１媒介性ポリアデニル化干渉が可能なので、標的遺伝子発現が抑制される。アプタマーリガンドの存在下では（下側パネル）、アプタマー／リガンド結合の結果、ステムが形成されて、Ｕ１結合部位はＵ１ ｓｎＲＮＰと結合不可となる。Ｕ１媒介性ポリアデニル化干渉は無効になり、その結果として標的遺伝子が発現する。 標的遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＵ１干渉を制御するためのテオフィリン・アプタマーの使用。ヘアピン型ステムを順次縮めて作製された、Ｕ１結合部位を結合不可とし、テオフィリン・アプタマーに接続するエフェクター領域ステム、及びテオフィリン・アプタマーのステム下部の配列。コンストラクトＵ１ ｔｈｅｏ＿１、８、及び９のステム配列を示す図である。テオフィリンを として示す。
標的遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＵ１干渉を制御するためのテオフィリン・アプタマーの使用。ＨＥＫ２９３細胞に上述のコンストラクトで遺伝子導入し、３ｍＭのテオフィリンで処理したかまたはしなかった。誘発倍率は、テオフィリン処理細胞から生じたルシフェラーゼ活性の値と、無処理細胞から生じたルシフェラーゼ活性の比として計算した。 Ｕ１部位アクセス可能度の制御性を高めるためのエフェクター領域ステム配列の最適化。配列変異を有するステム配列Ｕ１＿ｔｈｅｏ＿８及びＵ１＿ｔｈｅｏ＿９を対応するヌクレオチドの横に挙げた。これらの配列変異によりエフェクター領域ステムにミスマッチが作られる。 Ｕ１部位アクセス可能度の制御性を高めるためのエフェクター領域ステム配列の最適化。Ｕ１＿ｔｈｅｏ＿８の配列変異により全部で９個のコンストラクトを作製し、それぞれＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入細胞を３ｍＭのテオフィリンで処理しまたは処理せず、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を平均±ＳＤで表し、コンストラクトＵ１＿ｔｈｅｏ＿８からＵ１＿８＿５の誘発倍率を示した。 Ｕ１部位アクセス可能度の制御性を高めるためのエフェクター領域ステム配列の最適化。Ｕ１＿ｔｈｅｏ＿９の配列変異により全部で８個のコンストラクトを作製し、それぞれＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入細胞を３ｍＭのテオフィリンで処理しまたは処理せず、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を平均±ＳＤで表した。 ３’ＵＴＲ内の複数のＵ１＿ｔｈｅｏリボスイッチが標的遺伝子発現の制御に及ぼす効果。標的遺伝子（ルシフェラーゼ）の３’ＵＴＲ内の４コピーのＵ１＿ｔｈｅｏ＿８＿１を示す模式図である。 ３’ＵＴＲ内の複数のＵ１＿ｔｈｅｏリボスイッチが標的遺伝子発現の制御に及ぼす効果。ＨＥＫ２９３に上述のコンストラクトで遺伝子導入し、異なる濃度のテオフィリンで処理した。３’ＵＴＲ内の４コピーのＵ１＿ｔｈｅｏ＿８＿１は、６ｍＭの濃度で、４．３倍のルシフェラーゼ活性誘発を示した。 Ｕ１干渉を調節するためのグアニン・アプタマーの使用。ＳＶ４０初期ポリ（Ａ）シグナルを含む３’ＵＴＲ内の異なる位置のＵ１＿Ｇｕａ配列を示す模式図である。 Ｕ１干渉を調節するためのグアニン・アプタマーの使用。（グアニンリガンドの存在下で）Ｕ１部位を結合不可とし、グアニン・アプタマーに接続する、Ｕ１＿Ｇｕａスイッチのエフェクター領域ステム配列を示す模式図である。グアニンを として示す。
Ｕ１干渉を調節するためのグアニン・アプタマーの使用。グアニン・アプタマーは、グアニン処理に応答して、Ｕ１のポリアデニル化干渉を制御する。ＨＥＫ２９３に上述のコンストラクトで遺伝子導入した。ミュータントＵ１部位及びその相補配列を含むコンストラクトをコントロールとして用いた。結果を平均±ＳＤで表し、各コンストラクトの誘発倍率を示す。 Ｕ１＿Ｇｕａリボスイッチは、ヒトベータグロビンポリＡ配列の場合に機能する。

本発明は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰが媒介するポリアデニル化抑制のアプタマーによる調節により遺伝子発現を制御するためのポリヌクレオチド・コンストラクト、及びアプタマーに結合するリガンドの存在または不存在に応答して該コンストラクトを用いて遺伝子発現を制御する方法を提供する。ポリヌクレオチド・コンストラクトは、エフェクター領域及びセンサー領域を含む少なくとも１つのリボスイッチを含む。エフェクター領域は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びこのＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位の相補配列を含むので、この２つの配列はＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位を結合不可とするステムを形成することができ、そうすることでＵ１ ｓｎＲＮＰの結合を防止する。エフェクター領域は、エフェクター領域ステムがＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びその相補配列よりも長くなるように追加配列及びその相補配列を含むことができる。センサー領域は、リガンドに結合するＲＮＡ配列を含み、この結合に応答してエフェクター領域の立体構成が変わる。一実施形態では、センサー領域はアプタマーを含む。アプタマーリガンドが存在しない場合は、エフェクター領域はステムを形成しない。Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は結合可能なので、Ｕ１ ｓｎＲＮＰがこれに結合し、ｍＲＮＡのポリアデニル化が阻害される。アプタマーリガンドが存在する場合は、それがアプタマーに結合し、その結果エフェクター領域がステムを形成するので、Ｕ１ ｓｎＲＮＰをＵ１結合部位と結合させない。Ｕ１ ｓｎＲＮＰは標的遺伝子ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに動員されず、メッセージのポリアデニル化が生じる。

遺伝子制御ポリヌクレオチド・カセットとは、標的遺伝子のＤＮＡの３’ＵＴＲに組み込まれると、該標的遺伝子の発現をアプタマー／リガンド媒介性のＵ１ ｓｎＲＮＰによるポリアデニル化の抑制によって制御する能力を提供する、組換えＤＮＡコンストラクトを指す。本明細書では、ポリヌクレオチド・カセットまたはコンストラクトは、異なるソース（たとえば異なる生物、同じ生物からの異なる遺伝子など）に由来するエレメントを含む核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）である。ポリヌクレオチド・カセットは、リボスイッチを含む。本発明の文脈のリボスイッチは、センサー領域（たとえばアプタマー）とエフェクター領域とを含み、これらが一緒に、該センサー領域に結合するリガンドの存在を検知し、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びこのＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位の相補配列を含むエフェクター領域の立体構造を改変する役割を担う。一実施形態では、標的遺伝子の発現は、アプタマーリガンドが存在する場合は増加し、リガンドが不存在の場合は減少する。

リボスイッチ
本明細書では、「リボスイッチ」という用語は、ＲＮＡポリヌクレオチドの制御性セグメントを指す。本発明の文脈のリボスイッチは、センサー領域（たとえばアプタマー）とエフェクター領域とを含み、これらが一緒に、リガンド（たとえば小分子）の存在を検知し、エフェクター領域にあるＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位アクセス可能度を調節する役割を担っている。一実施形態では、リボスイッチは、２つ以上のソースからのポリヌクレオチドを用いた組換え体である。本明細書では、リボスイッチに関しての「合成」という用語は、自然発生しないリボスイッチを指す。一実施形態では、センサー領域とエフェクター領域は、ポリヌクレオチド・リンカーにより接合されている。一実施形態では、ポリヌクレオチド・リンカーは、ＲＮＡステムを形成する（すなわち二本鎖であるＲＮＡポリヌクレオチドの領域）。

エフェクター領域
リボスイッチのエフェクター領域は、リガンドのセンサー領域（たとえばアプタマー）結合に応答して、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位のＵ１ ｓｎＲＮＰへのアクセス可能度を低下させるステム構造（二本鎖領域）を形成するＲＮＡ配列を含む。エフェクター領域は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びこのＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位の相補配列を含む。アプタマーがそのリガンドに結合すると、エフェクター領域はステムを形成し、したがってＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位はＵ１ ｓｎＲＮＰと結合できなくなる。特定の条件下では（たとえば、アプタマーがそのリガンドと結合していない場合）、エフェクター領域はＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位へのアクセスを提供する状況にあり、Ｕ１ ｓｎＲＮＰがｍＲＮＡに結合してポリアデニル化を阻害するのを許容し、その結果メッセージは劣化することになる。

Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰと結合でき、そうすることでＵ１ ｓｎＲＮＰを標的遺伝子の３’ＵＴＲに動員し、標的遺伝子メッセージのポリアデニル化を抑制できるポリヌクレオチド配列であればどれでもよい。一実施形態では、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位（本明細書では「Ｕ１結合部位」または「Ｕ１部位」とも呼ぶ）は、コンセンサス部位ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡ（ｍＲＮＡではＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ）である。いくつかの実施形態では、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位はこのコンセンサス配列の変形であり、たとえばコンセンサス配列よりも短いか、または１つ以上のヌクレオチドが変えてある配列が挙げられる。一実施形態では、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は配列ＣＡＧＧＴＡＡＧを含む。いくつかの実施形態では、結合部位は、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡ、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴ、及びＣＡＧＧＴＡＡＧから選択される配列によってコードされている。Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、遺伝子からのあらゆる５’スプライス部位であってよく、たとえばヒトＤＨＦＲエキソン２からの５’スプライス部位である（実施例７及び８を参照されたい）。

エフェクター領域のステム部分は、リガンドがアプタマーに結合するとＵ１ ｓｎＲＮＰのＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位への結合を阻害するような、また、リガンドが十分な量だけ存在していない場合には、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位へのアクセスを許容するような、十分な長さ（及びＧＣ含有率）であるものとする。本発明の実施形態では、エフェクター領域のステム部分は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びその相補配列に加えて、ステム配列を含む。本発明の実施形態では、この追加ステム配列は、アプタマーステムからの配列を含む。ステム部分の長さと配列は、リガンドが存在しない場合の標的遺伝子の許容可能なバックグラウンド発現、及びリガンドが存在する場合の標的遺伝子の許容可能なバックグラウンド発現を許容するステムを特定するために、既知の技法を用いて修飾することができる。ステムがたとえば長すぎると、リガンドの存在下でも非存在下でも、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位へのアクセスを隠す可能性がある。ステムが短すぎると、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位を結合不可とすることができる安定したステムを形成できない可能性があり、その場合、リガンドの存在下でも非存在下でも、Ｕ１ ｓｎＲＮＰが結合してメッセージのポリアデニル化を阻害することになる（したがって、標的遺伝子ｍＲＮＡは劣化する）。一実施形態では、エフェクター領域ステムの全長は約７塩基対〜約２０塩基対である。いくつかの実施形態では、ステム長は約８塩基対〜約１１塩基対である。いくつかの実施形態では、ステム長は８塩基対〜１１塩基対である。ステムの長さに加えて、ステムのＧＣ塩基対含有量を変えて、ステムの安定性を改変することもできる。

いくつかの実施形態では、エフェクター領域ステムは、エフェクター領域ステムの相補性部分と塩基対を形成しない１つ以上のミスマッチのヌクレオチドを含む。

アプタマー/リガンド
一実施形態では、センサー領域はアプタマーを含む。本明細書では、「アプタマー」という用語は、リガンドに特異的に結合するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。「リガンド」という用語は、アプタマーが特異的に結合する分子を指す。一実施形態では、リガンドは低分子量（約１，０００ダルトン未満）分子であり、たとえば、脂質、モノサッカライド、二次メッセンジャー、補助因子、金属イオン、他の天然産物及び代謝物、核酸、ならびにほとんどの治療薬が挙げられる。一実施形態では、リガンドは、２つ以上のヌクレオチド塩基を有するポリヌクレオチドである。

一実施形態では、リガンドは、８−アザグアニン、アデノシン５’−モノホスファートモノヒドラート、アンホテリシンＢ、エバーメクチンＢ１、アザチオプリン、酢酸クロルマジノン、メルカプトプリン、塩酸モリシジン、Ｎ６−メチルアデノシン、ナダイド、プロゲステロン、塩酸プロマジン、パモ酸ピルビニウム、スルファグアニジン、プロピオン酸テストステロン、チオグアノシン、チロキサポール、及びボリノスタットからなる群より選択される。

アプタマーリガンドは、がん化などの特定の生理学的／病理学的条件下で大幅に増加する細胞内在性成分であってもよく、たとえば、ＧＴＰやＧＤＰなどの二次メッセンジャー分子、カルシウム；脂肪酸、または乳癌の１３−ＨＯＤＥなど不適切に代謝された脂肪酸（Ｆｌａｈｅｒｔｙ， ＪＴ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ， Ｖｏｌ． ８， ｅ６３０７６， ２０１３、参照により本明細書に援用する）；アミノ酸またはアミノ酸代謝物；がん細胞または代謝疾患の正常細胞でふつうは高レベルとなる、解糖経路の代謝物；ならびにがん関連分子のＲａｓまたはミュータントＲａｓタンパク質、肺癌のミュータントＥＧＦＲ、多種のがんのインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）が挙げられる。内在性リガンドとしては、ＪＰ Ｗｉｅｂｅ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ （２００６） １３：７１７−７３８、参照により本明細書に援用する）により開示されている乳癌のプロゲステロン代謝物が挙げられる。内在性リガンドとしては、Ｍｉｎｔｏｎ， ＤＲ ａｎｄ Ｎａｎｕｓ， ＤＭ（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｕｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １２， ２００５、参照により本明細書に援用する）により開示されている、乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）、グルタチオン、キヌレニンなど腎癌の主要代謝酵素の変異による増加レベルを示す代謝物も挙げられる。

アプタマーは、所期の標的分子（すなわちリガンド）と複合体を形成できる結合領域を有する。結合の特異性は、アプタマーのリガンドに対する解離定数（Ｋｄ）をアプタマーの無関係分子に対する解離定数と比較して定めることができる。したがって、リガンドは、無関係の物質よりも高い親和性でアプタマーに結合する分子である。一般に、アプタマーのリガンドに対するＫｄは、アプタマーと無関係分子のＫｄよりも少なくとも約１０倍小さくなる。他の実施形態では、Ｋｄは少なくとも約２０倍小さく、少なくとも約５０倍小さく、少なくとも約１００倍小さく、少なくとも約２００倍小さい。アプタマーは一般に、約１５〜約２００ヌクレオチド長である。より一般的には、アプタマーは約３０〜約１００ヌクレオチド長である。

リボスイッチの一部として組み込まれ得るアプタマーは、自然発生するアプタマーもしくはその修飾体か、またはデノボ設計の及び／または指数関数的増幅によるリガンドの試験管内進化（ＳＥＬＥＸ）法もしくは他のスクリーニング方法でスクリーニングされたアプタマーであってもよい。小分子リガンドに結合するアプタマーの例としては、限定ではないがテオフィリン、ドーパミン、スルホローダミンＢ、セロビオース、ケナマイシンＡ、リビドマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、バイオマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、サイトカイン、細胞表面分子、及び代謝物が挙げられる。小分子を認識するアプタマーの説明は、たとえばＦａｍｕｌｏｋ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：３２４−９ （１９９９）及びＭｃＫｅａｇｕｅ， Ｍ． ＆ ＤｅＲｏｓａ， Ｍ．Ｃ． Ｊ． Ｎｕｃ． Ａｃｉ． ２０１２（どちらも参照により本明細書に援用する）を参照されたい。別の実施形態では、アプタマーは相補的ポリヌクレオチドである。

アプタマー／リガンドを特定する方法
一実施形態では、アプタマーは、特定の小分子リガンドに結合するように設計される。特定のリガンドに結合するアプタマーを設計し選択する方法は、６２／３７０，５９９（参照により本明細書に援用する）に開示されている。アプタマーをスクリーニングする他の方法としては、たとえばＳＥＬＥＸが挙げられる。ＳＥＬＥＸを用いて、選択的に小分子に結合するアプタマーを設計する方法は、たとえば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，２７０，１６３号、及びＡｂｄｕｌｌａｈ Ｏｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃ． Ａｃｉ． ２０１４で開示されており、これらを参照により本明細書に援用する。ＳＥＬＥＸ法の改造が米国特許第５，５８０，７３７号及び同第５，５６７，５８８号で開示されており、これらを参照により本明細書に援用する。

アプタマーを特定するための選択法には、通常、ランダム化されたまたは変異誘発された領域を含む所望の長さのＤＮＡまたはＲＮＡ分子の巨大プールを調製することが含まれる。たとえば、アプタマー選択用のオリゴヌクレオチドのプールには、ＰＣＲプライマーの結合に有用な約１５〜２５ヌクレオチド長の所定の配列の領域が隣接する、ランダム化された２０〜１００ヌクレオチドの領域が含まれる場合がある。オリゴヌクレオチド・プールは標準的なＰＣＲ法、または選択された核酸配列の増幅を可能にする他の手段によって増幅される。ＤＮＡプールは、ＲＮＡアプタマーが望ましい場合、インビトロで転写されてＲＮＡ転写物プールを生じることができる。ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドのプールは次に、所望のリガンドに特異的に結合する能力に基づいて、選択にかけられる。選択法としては、たとえば親和性クロマトグラフィーが挙げられるが、別の分子に特異的に結合する能力に基づく核酸の選択を可能にするあらゆるプロトコルを使用することができる。小分子に結合し、細胞内で機能するアプタマーを特定するための選択法には、細胞ベースのスクリーニング法が含まれる場合がある。親和性クロマトグラフィーの場合、オリゴヌクレオチドを、カラム内の基質上または磁気ビーズ上に固定されている標的リガンドと接触させる。オリゴヌクレオチドは、塩濃度、温度、及び正常な生理条件を模倣する他の条件の存在下で、リガンド結合に関して好ましく選択される。プール内のオリゴヌクレオチドでリガンドに結合するものはカラムまたはビーズ上に保持され、結合しない配列は流出する。次に、リガンドに結合するオリゴヌクレオチドは、（通常は溶出後に）ＰＣＲにより（ＲＮＡ転写物を用いる場合は逆転写後に）増幅される。この選択法は、選択された配列について、全部で約３〜１０反復ラウンドの選択手順で繰り返される。こうして得られたオリゴヌクレオチドを増幅し、クローニングし、標準的な手順を用いて配列決定して、標的リガンドに結合できるオリゴヌクレオチドの配列を特定する。アプタマー配列が特定されると、変異誘発されたアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドのプールから開始して追加の選択ラウンドを行うことで、アプタマーをさらに最適化することができる。

１ラウンド以上のインビトロ選択の後に、インビボのアプタマースクリーニングを用いることができる（たとえばＳＥＬＥＸ）。たとえばＫｏｎｉｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ． ２００７， １３（４）：６１４−６２２、参照により本明細書に援用する）は、ＳＥＬＥＸと酵母３ハイブリッドシステムを組み合わせたアプタマーのインビボ選択を説明している。

標的遺伝子
本発明の遺伝子制御カセットは、標的細胞、組織、または生物で発現し得るあらゆる標的遺伝子の発現を制御するのに用いることができるプラットフォームである。「標的遺伝子」という用語は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写され翻訳され、かつ／または適切な条件下で発現できるポリヌクレオチドを指す。あるいは、標的遺伝子は標的細胞に内在し、本発明の遺伝子制御カセットは標的遺伝子内（たとえば内在性標的遺伝子の５’または３’ＵＴＲ）に配置される。標的遺伝子の一例は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。別の実施形態では、標的遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小型または長鎖ノンコーディングＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びあらゆる他の制御性ＲＮＡなどのＲＮＡをコードする。一実施形態では、標的遺伝子は、組換えＤＮＡコンストラクトが内部で転写されることになる細胞にとって外来性である。別の実施形態では、標的遺伝子は、組換えＤＮＡコンストラクトが内部で転写されることになる細胞に内在する。

本発明による標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子、または非タンパク質コーディングＲＮＡをコードする配列の場合がある。標的遺伝子は、たとえば、構造タンパク質、酵素、細胞シグナルタンパク質、ミトコンドリアタンパク質、ジンクフィンガータンパク質、ホルモン、輸送タンパク質、増殖因子、サイトカイン、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、受容体分子、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、翻訳機構、チャネルタンパク質、モータータンパク質、細胞接着分子、ミトコンドリアタンパク質、代謝酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、交換因子、シャペロンタンパク質、及びこれらのいずれかの調節因子をコードする遺伝子であってもよい。諸実施形態では、標的遺伝子は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ヒトインスリン、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｃａｓ９）、またはたとえば治療用抗体を含む免疫グロブリン（またはその一部分）をコードする。

発現コンストラクト
本発明では、標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に導入するための、本明細書で説明する遺伝子制御カセットを含む、組換えベクターの使用が意図される。多くの実施形態では、本発明の組換えＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞内でＤＮＡを複製させ、該細胞内で適切なレベルで標的遺伝子を発現させるＤＮＡセグメントを含む追加のＤＮＡエレメントを含む。当業者であれば、発現制御配列（プロモーター、エンハンサーなど）は、標的細胞における標的遺伝子の発現を促進する能力に基づき選択されることを理解しよう。「ベクター」は、インビトロまたはインビボで宿主細胞内に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ミニ染色体、ＤＮＡミニサークル、またはウイルス（ウイルス由来の配列も含む）を意味する。一実施形態では、組換えベクターは、ウイルスベクター、または複数のウイルスベクターの組合せである。

標的細胞、組織、または生物においてアプタマー媒介性の標的遺伝子発現をもたらすウイルスベクターは、当業界で知られており、アデノウイルス（ＡＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター、ならびに単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）ベクターが挙げられる。

アデノウイルスベクターとしては、たとえば、ヒトアデノウイルス２型及びヒトアデノウイルス５型に基づく、Ｅ１領域及びＥ３領域の欠失という欠損を有し複製されているものが挙げられる。転写カセットをＥ１領域に挿入して、組換えＥ１／Ｅ３欠失ＡＶベクターを得ることができる。アデノウイルスベクターとしては、ウイルスコード配列を含まない、ヘルパー依存型の高能力アデノウイルスベクター（高能力の「ｇｕｔｌｅｓｓ」または「ｇｕｔｔｅｄ）ベクターとしても知られている）も挙げられる。これらのベクターは、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なシス作用性エレメント、主として末端逆位配列（ＩＴＲ）及びパッケージングシグナル（Ψ）を含む。これらのヘルパー依存型ＡＶベクターゲノムは、数百の塩基対からおよそ３６ｋｂの外来ＤＮＡまで担持する能力がある。

組換えアデノ随伴ウイルス「ｒＡＡＶ」ベクターには、あらゆるアデノ随伴ウイルスセロタイプに由来するあらゆるベクターが含まれ、限定ではないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７、及びＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０などが挙げられる。ｒＡＡＶベクターは、全部または一部が欠失した１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはＲｅｐ及び／またはＣａｐ遺伝子を有する場合があるが、機能的な隣接するＩＴＲ配列は保持している。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの救済、複製、パッケージング、及び可能な染色体組込みのために保持されている。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列でなくてもよく、配列が機能的救済、複製、及びパッケージングを提供する限りは、（たとえば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により）改変されていてもよい。

あるいは、レンチウイルスベクターなどの他の系を本発明で使用することができる。レンチウイルス系は、分裂細胞だけでなく非分裂細胞にも形質導入することができ、これらをたとえばＣＮＳの非分裂細胞を標的とする用途で有用にし得る。レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス由来であり、同ウイルスと同じく、宿主ゲノムに組み込まれて長期の遺伝子発現の可能性を提供する。

遺伝子制御カセットを含む標的遺伝子を担持する、プラスミド、ＹＡＣ、ミニ染色体、及びミニサークルなどのポリヌクレオチドは、たとえばカチオン脂質、ポリマー、または両方を担体として用いる非ウイルスベクター系により、細胞または生物に導入される場合もある。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）ポリマーとポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーの複合系により、ベクターを細胞に送達することもできる。ベクターを細胞に送達する他の方法としては、細胞培養物の場合も生物の場合も、水力学的注入、及び電気穿孔、及び超音波の利用が挙げられる。遺伝子送達のウイルス及び非ウイルス送達系の説明は、Ｎａｙｅｒｏｓｓａｄａｔ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ． ２０１２；１：２７を参照されたい。参照により本明細書に援用する）。

標的遺伝子の発現を調節する方法
一態様では、本発明は、（ａ）本発明の遺伝子制御カセットを標的遺伝子の３’ＵＴＲに挿入すること、（ｂ）該遺伝子制御カセットを含む該標的遺伝子を細胞に導入すること、及び（ｃ）該細胞を、該アプタマーに結合するリガンドに曝露することによって、該標的遺伝子（たとえば治療用遺伝子）の発現を調節する方法を提供する。一実施形態では、リガンドは小分子である。諸態様では、標的細胞における標的遺伝子の発現は、それが導入された細胞に所望の特性を与えるか、そうではなく所望の治療結果をもたらす。

一実施形態では、１つ以上の遺伝子制御カセットが、標的遺伝子の３’非翻訳領域に挿入される。一実施形態では、１つの遺伝子制御カセットが、標的遺伝子の３’ＵＴＲに挿入される。他の実施形態では２つ、３つ、または４つ以上の遺伝子制御カセットが、この標的遺伝子に挿入される。一実施形態では、２つの遺伝子制御カセットが、この標的遺伝子に挿入される。複数の遺伝子制御カセットが１つの標的遺伝子に挿入される場合、それぞれが同一のアプタマーを含んで、複数のカセットのリボヌクレアーゼ切断の調節に１つのリガンドが用いられるようにし、それによって標的遺伝子発現が調節されるようにしてもよい。他の実施形態では、複数の遺伝子制御カセットが１つの標的遺伝子に挿入され、それぞれが異なるアプタマーを含んで、複数の異なる小分子リガンドへの曝露によって標的遺伝子発現が調節されるようにしてもよい。他の実施形態では、複数の遺伝子制御カセットが１つの標的遺伝子に挿入され、それぞれが異なるリボヌクレアーゼ基質配列を含んでいる。これは組換えを減らし、ウイルスベクターへの組込みをさらに容易にするという点で、有用であり得る。

本発明のポリヌクレオチド・カセットは、該ポリヌクレオチド・カセットが標的遺伝子の３’ＵＴＲにおいてポリアデニル化シグナル（たとえばＡＡＴＡＡＡ）の上流（５’）のどこかの位置にあるとき、標的遺伝子発現の調節に有効である。ポリヌクレオチド・カセットはまた、異なるポリ（Ａ）シグナル配列が存在する場合、たとえばＳＶ４０初期と後期のポリ（Ａ）シグナルが存在する場合（たとえば実施例４〜６、８を参照されたい）、ポリアデニル化を阻止することにより、標的遺伝子発現の調節に有効である。一実施形態では、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチド・カセットが、ポリアデニル化配列の５’側約８７または約１４０ヌクレオチドのところに挿入される。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド・カセットが、両方の位置またはその近傍に挿入される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド・カセットが、ポリアデニル化シグナルの５’側約７４、約１１０、または約１４９ヌクレオチドのうちの１つ以上のところに挿入される。

本発明のポリヌクレオチド・カセットは、標的遺伝子の発現を制御する他の機構と併用することができる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド・カセットは、ＷＯ２０１６／１２６７４７（参照により本明細書に援用する）で説明されている選択的スプライシングのアプタマー媒介性制御により標的遺伝子発現を調節する遺伝子制御カセットと併用される。

治療方法及び医薬組成物
本発明の一態様は、遺伝子治療により送達される治療用タンパク質のレベルを制御する方法を提供する。この実施形態では、「標的遺伝子」が治療用タンパク質をコードする場合がある。「標的遺伝子」は細胞に内在する、または外来性のタンパク質をコードする場合がある。

アプタマー駆動型リボスイッチを有する制御性カセットを含む治療用遺伝子配列は、インビトロまたはエクスビボで、たとえばベクターにより、標的細胞に送達される。「標的遺伝子」の細胞特異性は、ベクター内のプロモーターまたは他のエレメントによって制御することができる。標的遺伝子及びポリヌクレオチド・カセットを含むベクター・コンストラクトの送達及び標的組織の遺伝子導入の結果、制御された標的遺伝子の安定した遺伝子導入がもたらされることは、治療用タンパク質を生産する第１のステップであることが多い。

しかし、標的遺伝子配列内に制御性カセットが存在するせいで、標的遺伝子は有意なレベルで発現しない。すなわち、制御性カセットのリボスイッチに含まれるアダプタマーに結合する特異的リガンドの非存在下で「オフ状態」にある。アプタマーに特異的なリガンドが投与されてはじめて（あるいはそうではなく十分な量が存在する場合に）、標的遺伝子発現が活性化される。

標的遺伝子を含むベクター・コンストラクトの送達と、活性化リガンドの送達は、時間的に離すのが一般的である。活性化リガンドの送達により、タンパク質発現のレベルと同じく、標的遺伝子をいつ発現させるかが制御される。リガンドは、限定ではないが、経口、筋内（ＩＭ）、静脈内（ＩＶ）、眼内、または外用など、いくつもの経路で送達することができる。

リガンド送達のタイミングは、標的遺伝子の活性化の要件による。たとえば、標的遺伝子がコードする治療用タンパク質が常時必要とされる場合、経口小分子リガンドを毎日、または１日複数回送達して、標的遺伝子が確実に連続的に活性化されるようにし、したがって治療用タンパク質が連続的に発現するようにしてもよい。標的遺伝子が長時間作用性の場合、誘発リガンドはあまり頻繁に投与しなくてもよい。

本発明は、制御性ポリヌクレオチド・カセットのリボスイッチ内のアプタマーに特異的なリガンドの一時的投与により決定されるような、一時的に制御される治療用導入遺伝子の発現を可能にする。リガンド投与時だけ治療用導入遺伝子の発現が増加することは、リガンドの非存在下では標的遺伝子をオフにできることによって、遺伝子治療の安全性を高める。

異なるアプタマーを用いて、異なるリガンドに標的遺伝子を活性化させることができる。本発明の特定の実施形態では、制御性カセットを含む各治療用遺伝子が、特定の小分子により活性化される特定のアプタマーをカセット内に有することになる。このことは、各治療用遺伝子が、その内部に収容しているアプタマーに特異的なリガンドによってのみ活性化されることができることを意味する。これらの実施形態では、各リガンドは、１つの治療用遺伝子だけを活性化することになる。このため、いくつかの異なる「標的遺伝子」を一個体に送達することが可能になり、それぞれが、各標的遺伝子に収容されている制御性カセット内に含まれるアプタマーに特異的なリガンドが送達されると活性化する。

本発明は、その遺伝子を体に送達することができるあらゆる治療用タンパク質（エリスロポエチン（ＥＰＯ）または治療用抗体など）が、活性化リガンドが送達されると、該体によって生産されることを可能にする。この治療用タンパク質送達法は、そうした治療用タンパク質、たとえばがん治療、または炎症性疾患もしくは自己免疫疾患の阻止に用いる抗体を、体外で製造してから注射または注入することにとって代わることができる。制御された標的遺伝子を含有する体は生体製造工場となり、遺伝子に特異的なリガンドが投与されるとスイッチがオンになる。

治療用タンパク質の投与レベル及び投与のタイミングは、治療効果にとって重要であり得る。たとえば、がんの場合に送達されるＡＶＡＳＴＩＮ（抗ＶＥＧＦ抗体）である。本発明は、治療用タンパク質レベル及び効果のモニタリングに応答して、投与をますます容易にする。

一実施形態では、標的遺伝子は、特定のＤＮＡ配列を標的とし編集することができるヌクレアーゼをコードする場合がある。そのようなヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、ヌクレアーゼを含むジンクフィンガー、またはＴＡＬＥＮが挙げられる。これらのヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼタンパク質は、標的の内在性遺伝子の編集に十分な短期間だけ必要とされる場合がある。しかし、無制御のヌクレアーゼ遺伝子が体に送達されると、このタンパク質は残りの細胞寿命にわたって存在する可能性がある。ヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼが長く存在するほど、オフターゲット編集のリスクが高まる。そのようなタンパク質の発現の制御は、安全面で大きな利点となる。この場合、制御性カセットを含むヌクレアーゼ標的遺伝子を含むベクターを、体内の適切な細胞に送達することができる。標的遺伝子はカセットに特異的なリガンドの非存在下では「オフ」状態なので、ヌクレアーゼは生産されない。活性化リガンドが投与されたときだけ、ヌクレアーゼが生産される。十分な編集が行われるだけの時間が経過すると、リガンドは停止され、再投与されない。したがって、その後はヌクレアーゼ遺伝子は「オフ」状態になり、さらなるヌクレアーゼは生産されず、編集も停止している。このアプローチは、ＣＥＰ２９０の変異を原因とするＬＣＡ１０やＡＢＣＡ４の変異を原因とするＳｔａｒｇａｒｄｔ病など数々の遺伝性網膜症を含む、遺伝疾患の治療に用いることができる。

特異的リガンドの投与によってのみ活性化される、治療用タンパク質をコードする制御された標的遺伝子の投与は、多種の疾患の治療用遺伝子の制御に用いることができ、たとえばがん治療用抗体、免疫疾患用の免疫調節タンパク質もしくは抗体、代謝疾患、ＰＮＨなどの希少疾患用の制御された遺伝子としての抗Ｃ５抗体もしくは抗体断片、あるいは眼の血管新生の治療用抗体、ならびにドライ型ＡＭＤ用の免疫調節タンパク質がある。

多様な特定の疾患及び状態の治療を可能にする多様な特定の標的遺伝子が、本発明での使用に適している。たとえば、インスリンまたはインスリンアナログ（好ましくはヒトインスリンまたはヒトインスリンアナログ）を、標的遺伝子として、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、または代謝症候群の治療に用いることができ；ヒト成長ホルモンを、標的遺伝子として、成長障害の子どもまたは成長ホルモン欠損の成人の治療に用いることができ；エリスロポエチン（好ましくはヒトエリスロポエチン）を、標的遺伝子として、慢性腎疾患による貧血、脊髄形成異常症による貧血、またはがん化学療法による貧血の治療に用いることができる。

本発明は、単一遺伝子欠損による疾患、たとえば嚢胞性線維症、血友病、筋ジストロフィー、サラセミア、または鎌状赤血球貧血の治療に特に好適であり得る。したがって、ヒトβ−、γ−、δ−、またはζ−グロビンを、標的遺伝子として、β−サラセミアまたは鎌状赤血球貧血の治療に用いることができ；ヒト第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を、標的遺伝子として、血友病Ａまたは血友病Ｂの治療に用いることができる。

本発明で用いるリガンドは、一般には１つ以上の製薬上許容される担体と組み合せて、患者への投与に適した医薬組成物とされる。製薬上許容される担体としては、溶媒、結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑剤、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤など、製薬業界で一般的に使われるものが挙げられる。医薬組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどの剤形の場合があり、所期の投与経路に合うように製剤される。投与経路の例としては、非経口、たとえば、静脈内、皮内、鼻内、皮下、経口、吸引、経皮（外用）、経粘膜、及び直腸内が挙げられる。

リガンドを含む医薬組成物は、標的遺伝子を所望通りに制御するのに十分な量のリガンドが患者に送達されるような投与スケジュールで、患者に投与される。リガンドが小分子であって、剤形が錠剤やカプセルなどである場合、好ましくは医薬組成物は、０．１ｍｇ〜１０ｇのリガンド、０．５ｍｇ〜５ｇのリガンド、１ｍｇ〜１ｇのリガンド、２ｍｇ〜７５０ｍｇのリガンド、５ｍｇ〜５００ｍｇのリガンド、または１０ｍｇ〜２５０ｍｇのリガンドを含む。

医薬組成物は、１日１回、または１日複数回（たとえば１日２回、３回、４回、５回、またはそれ以上）投与される場合がある。あるいは、医薬組成物は、１日１回よりも少なく、たとえば２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、６日おき、７日おき、８日おき、９日おき、１０日おき、１１日おき、１２日おき、１３日おき、もしくは１４日おきに、または月１回かもしくは数か月おきに、投与される場合もある。本発明のいくつかの実施形態では、医薬組成物は患者にわずかな回数しか投与されない場合があり、たとえば、１回、２回、３回などである。

本発明は、標的遺伝子がコードする治療用タンパク質の発現の増加を必要とする患者を治療する方法を提供し、該方法は、アプタマー用のリガンドを含む医薬組成物を患者に投与することを含み、該患者は該標的遺伝子を含む組換えＤＮＡを既に投与されており、該標的遺伝子は本発明の遺伝子制御カセットを含んでおり、該カセットは該アプタマーの該リガンドにより該標的遺伝子のプレｍＲＮＡの選択的スプライシングによって該標的遺伝子の発現を制御する能力を提供し、したがって該治療用タンパク質の発現を増加させる。

製品及びキット
本明細書で説明する方法で使用されるキットまたは製品も提供される。諸態様では、キットは、好適な包装材に包まれた本明細書で説明する組成物（たとえば、遺伝子制御カセットを含む標的遺伝子を含むベクターの送達用組成物）を含む。本明細書で説明する組成物（眼内注入用の組成物など）用の好適な包装材は当業界で知られており、たとえば、バイアル（密封バイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、瓶、柔らかい包装材（たとえば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチック袋）などが挙げられる。これらの製品はさらに滅菌され、かつ／または密封される場合がある。

本発明はまた、本明細書で説明する組成物を含み、さらに、たとえば本明細書で説明する用途などの組成物の使用法についての使用説明（複数可）を含み得る、キットを提供する。本明細書で説明するキットはさらに、商業的にユーザー視点から望ましいその他の物、たとえばその他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び、たとえば本明細書で説明するあらゆる方法を含む投与の実施のための説明を記載した添付文書を含む場合もある。たとえば、いくつかの実施形態では、キットは、本発明の遺伝子制御カセットを含む標的遺伝子発現用のｒＡＡＶ、注入に適した製薬上許容される担体、ならびにバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び注入を実施するための説明を記載した添付文書のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは、眼内注入、筋内注入、静脈内注入などに適している。

本明細書では、「相同性」及び「相同の」は、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の同一性パーセントを指す。ある配列と別の配列間の対応は、当業界で知られている技法で決定することができる。たとえば、相同性は、容易に入手できるコンピュータープログラムを用いて配列情報を整合させることで、２つのポリペプチド分子を直接比較して決定することができる。２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列は、適切な挿入または欠失により最適に整合させた後、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、及び少なくとも約９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸が所定の分子長にわたって一致すると上述の方法で決定された場合に、互いに対して「実質的に相同」といえる。

基準ポリペプチド配列または核酸配列に対する「配列同一性パーセント」は、配列のアラインメント及び必要に応じてギャップの導入により最大配列同一性パーセントが得られた後、基準ポリペプチド配列または核酸配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である候補配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義される。アミノ酸配列または核酸配列の同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当業者には既知の方法で実行することができ、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピューター用ソフトウェアプログラムが使用される。

本明細書では、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでも、あらゆる長さの重合ヌクレオチドを指す。したがって、この用語には、限定ではないが、一本鎖の、二本鎖の、もしくは複数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基を含む高分子、あるいはその他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれる。

「異種の」または「外来性」は、それが比較されるかまたは導入されるかもしくは組み込まれる部分の要素とは遺伝子型が異なる要素に由来することを意味する。たとえば，遺伝子操作法により異なる細胞型に導入されるポリヌクレオチドは、異種のポリヌクレオチドである（したがって、発現すると、異種のポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれている細胞配列（たとえば遺伝子またはその一部分）は、そのベクターに対しては異種のヌクレオチド配列である。

以下の表には、本明細書で説明するコンストラクトのＤＮＡ配列、ならびに説明する他の配列のリストを記載する。Ｕ１結合部位及びそのミュータント配列は網掛け小文字、ステム−ループ構造（ＳＬ）は下線の小文字、アプタマー配列は波下線の小文字、ポリ（Ａ）シグナル配列は太下線の小文字、ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列は大文字である。

当業者であれば本明細書で開示する本発明の原理に変更を加えられることは理解され期待されるところであり、そうした変更形態も本発明の範囲内とする。以下の実施例は本発明をさらに例示するものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。引用する参照文献等は、すべて参照により本明細書に援用する。

実施例１
３’ＵＴＲ内のＵ１結合部位の位置及びコピー数が標的遺伝子発現に及ぼす効果

実験手順：プラスミド・コンストラクト：野生型コンセンサスＵ１結合配列またはそのミュータント配列を含むオリゴヌクレオチド（オリゴ）を合成した（ＩＤＴ）。合成したオリゴを、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、ｐＲＬ−ＳＶ４０ルシフェラーゼ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の３’ＵＴＲにクローニングした。コンストラクトを精製して（Ｑｉａｇｅｎ）、ＤＮＡシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）で確認した。

遺伝子導入：３．５ｘ１０^４個のＨＥＫ２９３細胞を、遺伝子導入の前日に、９６ウェル平底プレートに蒔いた。プラスミドＤＮＡ（５００ｎｇ）をチューブまたは９６ウェルＵ字型底プレートに加えた。別途、ＴｒａｎｓＩＴ−２９３試薬（Ｍｉｒｕｓ；１．４μｌ）を５０μｌのＯｐｔｉ−ｍｅｍ Ｉ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に加え、室温（「ＲＴ」）で５分放置した。次に、この希釈した遺伝子導入試薬５０μｌをＤＮＡに加え、混合し、ＲＴで２０分インキュベートした。最後に、この溶液７μｌを９６ウェルプレートの細胞の入ったウェルに加えた。

培養細胞のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ・アッセイ：培地交換の２４時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、実験台上で数分間かけてＲＴにしてから培地を吸引した。ｇｌｏ−ｌｙｓｉｓバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、１００μＬ、ＲＴ）を加え、プレートを室温で少なくとも５分放置した。次いでウェル内容物を５０μＬ研和により混合し、各ウェルの２０μＬを白色３８４ウェルプレートで２０μＬのＲｅｎｉｌｌａ−ｇｌｏ試薬と混合した。１０分後、発光をＴｅｃａｎ機で、リード時間５００ミリ秒で測定した。ルシフェラーゼ活性を平均相対光量（ＲＬＵ）±Ｓ．Ｄ．で表した。

結果：Ｕ１−ポリアデニル化に基づく遺伝子制御プラットフォームを構築するために、標的リポーター遺伝子の３’ＵＴＲにＵ１結合配列を挿入した。１０ヌクレオチド（「ｎｔ」）コンセンサスＵ１結合配列（本明細書では野生型またはｗｔと呼ぶ）を、図１ａに示すように、ｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター内のルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ内ＡＡＴＡＡＡポリ（Ａ）配列の上流８７ｎｔ（Ｕ１−８７）または１４０ｎｔ（Ｕ１−１４０）のところに配置した。図１ｂに示すように、−８７の位置に挿入した１０ｎｔミュータントＵ１結合配列（Ｕ１−８７ｍｕｔ）は、未修飾ｐＲＬ−ＳＶ４０コンストラクトからの発現と比べて、ルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制効果はなかった。ところが、−８７の位置に挿入した１０ｎｔ野生型Ｕ１結合配列（Ｕ１−８７ｗｔ）は、ｐＲＬ−ＳＶ４０コントロールベクターからのルシフェラーゼ活性と比べて、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発現を９８％阻害した。Ｕ１−８７ｍｕｔコンストラクトとの比較では、Ｕ１−８７ｗｔはルシフェラーゼ活性を５０倍減少させた。同様に、−１４０のミュータントＵ１部位（Ｕ１−１４０ｍｕｔ）は、ルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害をもたらさなかった。ところが、−１４０の位置の野生型Ｕ１結合配列（Ｕ１−１４０ｗｔ）は、ルシフェラーゼ活性を９１％阻害し、Ｕ１−１４０ｍｕｔと比べて１２倍のルシフェラーゼ活性阻害をもたらした。

３’ＵＴＲの−１４０のところに挿入された２コピーまたは３コピーのＵ１結合配列の阻害効果も試験した。図１ｂに示すように、野生型Ｕ１結合配列の２コピー（２ｘＵ１−１４０ｗｔ）または３コピー（３ｘＵ１−１４０ｗｔ）は、同位置の単一のＵ１部位（Ｕ１−１４０ｗｔ）よりもさらにルシフェラーゼ活性を低下させ、対応するミュータント・コンストラクトと比べてそれぞれ２７２倍と４６２倍の阻害をもたらした。このように、これらの結果は、Ｕ１結合配列の複数のコピーは遺伝子発現の抑制において共同作用することを示している。

実施例２
３’ＵＴＲ内のＵ１結合配列の長さが標的遺伝子発現に及ぼす効果

実験手順：実施例１で説明したとおり。

結果：実施例１で説明した結果に基づき、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル配列の上流８７ｎｔのところに挿入したＵ１結合部位（Ｕ１−８７）の抑制効果のさらなる特徴付けを行った。Ｕ１結合配列を３’に配置して標的遺伝子発現を抑制する最小限の長さを決定するために、図２ａに示すように、３’側を順次縮めたＵ１部位配列を含む一連のコンストラクト。図２ｂに示すように、９ｎｔのＵ１部位（８７−９）は１０ｎｔのＵ１部位（Ｕ１−８７）と同様に機能した。しかし、Ｕ１結合配列を８ｎｔまで縮めると、Ｕ１部位の抑制効果はやや低下し、効率は３倍減となった。Ｕ１部位配列が７ｎｔ以下の場合、抑制効果は大幅に減少した。これらの結果が示すのは、３’ＵＴＲのＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルの上流８７ｎｔのところに挿入されたＵ１結合部位は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰを効率よく動員してポリアデニル化を抑制するためには、少なくとも８ｎｔ長であれば、標的遺伝子発現の抑制により有効である、ということである。ＳＶ４０後期ポリＡシグナル配列の上流８７ｎｔのところに挿入された９ｎｔのＵ１結合配列を、さらなる特徴付けのために選択した。

実施例３
３’ＵＴＲ内のＵ１部位でのステム−ループ二次構造形成が遺伝子発現に及ぼす効果

実験手順：野生型９ｎｔ Ｕ１結合配列を含むステム−ループ配列を合成し（ＩＤＴ）、ｐＲＬ−ＳＶ４０ベクターにクローニングした。コンストラクト配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した（Ｇｅｎｅｗｉｚ）。ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ・アッセイを実施例１で説明したようにして実施した。

結果：ヘアピン型またはステム−ループ構造がＵ１部位媒介性の遺伝子発現抑制に及ぼす効果を決定するために、９ｎｔ Ｕ１部位をステム−ループ（ＳＬ）構造に埋め込んだ。このステム−ループ構造では、図３ａに示すように、Ｕ１部位とその相補配列がステムを形成する。ステムが形成されない（ＳＬ破損）コントロールとしてのミュータント配列を作製した。図３ｂに示すように、９ｎｔ Ｕ１部位をステム−ループ構造に埋め込むと（Ｕ１８７−９ＳＬ）、３’ＵＴＲにおけるＵ１部位の抑制効果が完全に無効となったが、ステム−ループ構造を形成できないコントロール配列（Ｕ１ ８７−９ ＳＬ破損）では、Ｕ１部位の抑制機能にほとんど影響がなかった。これらの結果は、ステム−ループ構造に埋め込まれたＵ１部位は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合のアクセスを許容せず、したがって遺伝子発現はＵ１ ｓｎＲＮＰが媒介するポリアデニル化抑制によって抑制されないことを裏付けている。

実施例４
Ｕ１のポリアデニル化干渉の調節により標的遺伝子発現を制御するためのテオフィリン・アプタマーの使用

実験手順：ステム−ループ構造及びテオフィリン・アプタマーのステムの全長配列または縮小型ステム配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し（ＩＤＴ）、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてｐＲＬ−ＳＶ４０ベクターにクローニングした。コンストラクト配列をＤＮＡシーケンシングで確認した（Ｇｅｎｅｗｉｚ）。

遺伝子導入及びアプタマーリガンド処理：ＨＥＫ２９３細胞に、実施例１で説明したようにして遺伝子導入した。遺伝子導入の４時間後、培地を吸引し、３ｍＭのテオフィリンを含むかまたは含まない新しい培地を加えた。テオフィリン処理の２０〜２４時間後に、実施例１で説明したようにしてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ・アッセイを実施した。誘発倍率は、アプタマーリガンドの存在下で得られたルシフェラーゼ活性をアプタマーリガンドの非存在下で得られた値で割った商として表した。

結果：標的遺伝子の３’ＵＴＲ内のＵ１部位アクセス可能度を制御し、そうすることで標的遺伝子発現を制御するために、アプタマー構造のステム配列を実施例３で試験したステム−ループ構造のステムに直接連結した。この立体配置では、図４ａに示すように、アプタマー配列の挿入によりステム構造の形成が妨害され、したがって３’ＵＴＲのＵ１部位はＵ１ ｓｎＲＮＰ結合に関しアクセス可能となる。しかし、アプタマーリガンドの存在下では、アプタマー／リガンド結合がＲＮＡ構造の立体構成を変化させ、ステム形成を促進し、３’ＵＴＲ内のＵ１部位はＵ１ ｓｎＲＮＰと結合不可となる。

この立体配置の合成テオフィリン・アプタマーを、図４ｂに示すように、テオフィリン・アプタマー構造の下部ステム配列をステム−ループ構造のステムに連結して１９塩基対ステムを作製することによって試験した。発明者らは、ステムの長さが長すぎると、ステム形成はアプタマー配列の存在に依存しなくなり、アプタマーリガンドの非存在下でも生じるのでは、と考えた。反対に、ステムが短すぎると、アプタマーリガンドの存在下でも安定したアプタマー構成は得られない。したがって、（アプタマーからのステム、及びＵ１結合部位を含むステムを全て含む）ステムの最適長さを決定するために、ステムを順次縮めていき、ステム長１９から１１ｂｐの全部で９個のコンストラクトを作製した。図４ｃに示すように、コンストラクトＵ１＿ｔｈｅｏ＿１からＵ１＿ｔｈｅｏ＿６では、テオフィリンの非存在下で、コンストラクトＵ１ ８７−９と比べてルシフェラーゼ活性は有意に抑制されておらず、ステム形成によりＵ１部位が結合不可となっていることが示唆された。さらに、テオフィリン処理後にルシフェラーゼ活性は増加しなかった。ところが、コンストラクト８及び９では、テオフィリン処理後にルシフェラーゼ活性は増加し、アプタマー／リガンド結合がさらにＵ１部位へのアクセスを阻止し、その結果として標的遺伝子発現が増加したことが示唆された。

実施例５
アプタマー／リガンド結合によるＵ１アクセス可能度の制御性を高めるためのステム配列最適化

実験手順：実施例４で説明したとおり。

結果：コンストラクトＵ１＿ｔｈｅｏ＿８及び９は、テオフィリン処理後にルシフェラーゼ活性のわずかな増加を示した。アプタマーにリガンドが結合していない場合のＵ１部位アクセス可能度の制御性をさらに高めるために、図５ａに示すように、ステム塩基の配列変異によってステム構造を弱化させた。図５ｃに示すように、この戦略ではコンストラクトＵ１＿ｔｈｅｏ＿９からのルシフェラーゼ活性の誘発は向上しなかったが、コンストラクトＵ１＿ｔｈｅｏ＿８の制御性は向上した。図５ｂに示すように、Ｕ１＿ｔｈｅｏ＿８から作成した一連の９個のコンストラクトのうち、コンストラクトＵ１＿ｔｈｅｏ＿８＿１〜５は、テオフィリン処理後、アプタマーリガンドの非存在下でのルシフェラーゼ活性と比べてルシフェラーゼ活性を増加させた。誘発倍率は、Ｕ１＿ｔｈｅｏ＿８コンストラクトの誘発倍率（１．３倍）よりも増加し、１．８〜２．６倍の範囲であった。したがって、発明者らは、アプタマー／リガンド結合によりＵ１のポリアデニル化干渉を制御する合成リボスイッチを作製したことになる。

実施例６
複数のＵ１＿ｔｈｅｏリボスイッチが標的遺伝子発現の制御に及ぼす影響

実験手順：直列に並んだ４コピーのＵ１＿ｔｈｅｏ＿８＿１配列を含むオリゴを合成し（ＩＤＴ）、Ｇｉｂｓｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、実施例４で説明したようにしてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ・アッセイを実施した。

結果：コンストラクトＵ１＿ｔｈｅｏ＿８−１は、テオフィリン処理後、ルシフェラーゼ遺伝子の比較的高い基底発現レベルにより、１．８倍の誘発をもたらした。標的遺伝子の基底発現レベルを下げるために、図６ａに示すように、４コピーのＵ１＿ｔｈｅｏ＿８＿１配列を３’ＵＴＲに直列式に配置した。実に、図６ｂに示すように、４コピーのＵ１−ｔｈｅｏ＿８＿１は単一コピーのＵ１＿ｔｈｅｏ＿８＿１と比べて基底発現レベルを８３％も低下させた。テオフィリン処理後、４コピーのコンストラクトは用量依存的にルシフェラーゼ活性を増加させ、６ｍＭのテオフィリンで、８７−９ＳＬコントロールベクターのルシフェラーゼ活性の４０％、最大４．３倍の誘発をもたらした。これらの結果は、直列に並べたＵ１部位リボスイッチの複数コピーは、標的遺伝子の基底発現レベルを低下させることができ、標的遺伝子の制御性を高めることを示している。このコンストラクトの立体配置では、制御カセットの４コピー全部に同じアプタマー配列を用いた。リボスイッチの各コピーに異なるアプタマー配列を用いることもできる。

実施例７
Ｕ１干渉の調節により標的遺伝子発現を制御するためのｘｐｔ−グアニン・アプタマーの使用

実験手順：プラスミド・コンストラクト：ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター内のＥＧＦＰ遺伝子をホタルルシフェラーゼ遺伝子コード配列で置き換えて、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列を含むｐＦＬｕｃベクターを作製した。ヒトＤＨＦＲエキソン２の５’スプライス部位からの野生型またはミュータントＵ１結合部位、及びｘｐｔ−グアニン・アプタマー配列、続いてＵ１部位配列の最後の７ｎｔの相補配列を含むオリゴを合成し（ＩＤＴ）、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｎｄ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてｐＦＬｕｃベクターにクローニングした。

遺伝子導入及びアプタマーリガンド処理：ＨＥＫ２９３細胞に、実施例１で説明したようにして遺伝子導入した。遺伝子導入の４時間後、培地を吸引し、５００μＭのグアニンを含むかまたは含まない新しい培地を加えた。

培養細胞のホタルルシフェラーゼ・アッセイ：培地交換の２４時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、実験台上で数分間かけてＲＴにしてから吸引した。ｇｌｏ−ｌｙｓｉｓバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、１００μＬ、ＲＴ）を加え、プレートをＲＴで少なくとも５分放置した。次に、ウェル内容物を５０μＬ研和により混合し、各試料２０μＬを２０μＬのｂｒｉｇｈｔ−ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ｇｌｏ−ｌｙｓｉｓバッファーで１０％まで希釈済）と混合した。９６ウェルを乳白色の３８４ウェルプレート上で離間させた。ＲＴで５分インキュベーションした後、発光をＴｅｃａｎ機で、リード時間５００ミリ秒で測定した。ルシフェラーゼ活性を平均相対光量（ＲＬＵ）±Ｓ．Ｄ．で表した。

結果：このＵ１干渉に基づく遺伝子制御プラットフォームでの合成または天然のアプタマーの追加アプタマー／リガンドペアの使用について、図７ａに示すように、１０ｎｔ Ｕ１部位、ＤＨＦＲエキソン２からの５’スプライス部位を、ｘｐｔ−グアニン・アプタマーと連結させてｐＲＬｕｃベクターの異なる位置に挿入して試験した。この１０ｎｔ Ｕ１部位では、図７ｂに示すように、最後の７ｎｔだけが、ｘｐｔ−グアニン・アプタマー配列の３’末端にあるその相補配列と塩基対を形成するように設計した。この配列の立体配置は、アプタマーＰ１ステムと、Ｕ１部位とその相補配列とで形成されるステムとを接続するステム配列を順次縮めて作製し、選択的スプライシングに基づくアプタマー・リボスイッチの広い動作範囲が示された。この試験では、発明者らはこの配列の立体配置を３’ＵＴＲ領域のＳＶ４０初期ポリ（Ａ）シグナル配列の上流１４９ｎｔ、１１０ｎｔ、または７４ｎｔに配置して、Ｕ１＿Ｇｕａｎ＿１、２、及び３コンストラクトを作製した。さらに、コントロール配列としてミュータントＵ１部位を作製した。図７ｃに示すように、グアニン処理後、Ｕ１＿Ｇｕａ＿１、２、３コンストラクトからのルシフェラーゼ活性は、それぞれ２．４倍、２．０倍、１．７倍増加した。

実施例８
ポリＡ配列に特異的ではないアプタマーによるＵ１干渉の調節

実験手順：プラスミド・コンストラクト：ｐＦＬｕｃベクターのＳＶ４０初期ポリアデニル化配列をヒトベータグロビンポリＡ配列で置き換えて、ｐＦＬｕｃ＿ＨＢＧＰＡを作製した。ヒトＤＨＦＲエキソン２の５’ｓｓからの野生型またはミュータントＵ１結合部位、及びｘｐｔ−グアニン・アプタマー配列、続いてＵ１部位配列の最後の７ｎｔの相補配列を含むオリゴを合成し（ＩＤＴ）、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｎｄ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてｐＦＬｕｃ＿ＨＢＧＰＡベクターにクローニングした。

遺伝子導入及びルシフェラーゼ・アッセイは実施例７で説明したとおりであった。

結果：実施例４〜６で示したように、発明者らは、ＳＶ４０後期ポリＡ配列またはＳＶ４０初期ポリＡ配列の場合の、Ｕ１のポリアデニル化干渉のアプタマーによる調節を実証してきた。アプタマーが調節するＵ１干渉をさらに実証するために、標的遺伝子発現をＳＶ４０ポリＡ配列に限定せず、グアニン・アプタマーによるＵ１干渉の調節を、ヒトベータグロビン遺伝子からのポリＡ配列の場合で試験した。図８に示すように、グアニン処理後、ｗｔＵ１＿Ｇｕａ＿ＨＢＧＰＡコンストラクトからのルシフェラーゼ活性は２．１倍増加した。これに対し、ｍｕｔＵ１＿Ｇｕａ＿ＨＢＧＰＡは、無処理試料と比べてルシフェラーゼ活性を誘発しなかった。これらの結果は、アプタマーによるＵ１干渉の調節は、ポリＡ配列に特異的ではないことを示している。

Claims (25)

1. リボスイッチを含む、標的遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチド・カセットであって、前記リボスイッチは、エフェクター領域及びアプタマーを含み、前記エフェクター領域は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びこのＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位の相補配列を含む、前記ポリヌクレオチド・カセット。
2. 前記アプタマーは、小分子リガンドに結合する、請求項１に記載のポリヌクレオチド・カセット。
3. 前記エフェクター配列は、前記アプタマーがリガンドに結合するとステムを形成できる追加配列を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド・カセット。
4. 前記エフェクター領域は、９〜１１塩基対であるステム形成配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド・カセット。
5. 前記エフェクター領域は、前記ステムに１つ以上のミスマッチ塩基を有するステム形成配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド・カセット。
6. 前記Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は８〜１０ヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド・カセット。
7. 前記Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、配列ＣＡＧＧＴＡＡＧを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド・カセット。
8. 前記Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡ、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴ、及びＣＡＧＧＴＡＡＧからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド・カセット。
9. ２つ以上のリボスイッチを含み、各リボスイッチはエフェクター領域及びアプタマーを含み、前記エフェクター領域はＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位及びこのＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位の相補配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド・カセット。
10. 前記２つ以上のリボスイッチはそれぞれ、同じリガンドに結合するアプタマーを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド・カセット。
11. 前記２つ以上のリボスイッチは、異なるリガンドに結合する異なるアプタマーを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド・カセット。
12. 標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
    ａ．請求項１〜１１に記載のポリヌクレオチド・カセット１つ以上を標的遺伝子の３’ＵＴＲに挿入すること、
    ｂ．前記ポリヌクレオチド・カセットを含む前記標的遺伝子を細胞に導入すること、及び
    ｃ．前記細胞を、前記アプタマーに特異的に結合する、前記標的遺伝子の発現を増加させるのに有効な量のリガンドに曝露すること、
    を含む、前記方法。
13. 前記リガンドは小分子である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ポリヌクレオチド・カセットは、ポリアデニル化シグナルの５’側約８７または約１４０ヌクレオチドのところに挿入される、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 前記ポリヌクレオチド・カセットは、ポリアデニル化シグナルの５’側約７４、約１１０、または約１４９ヌクレオチドのところに挿入される、請求項１２または１３に記載の方法。
16. ２つ以上のポリヌクレオチド・カセットが、前記標的遺伝子の３’ＵＴＲに挿入される、請求項１２または１３に記載の方法。
17. 前記２つ以上のポリヌクレオチド・カセットは、異なる小分子リガンドに特異的に結合する異なるアプタマーを含む、請求項１４に記載の方法。
18. 前記２つ以上のポリヌクレオチド・カセットは、同じアプタマーを含む、請求項１４に記載の方法。
19. 前記２つ以上のポリヌクレオチド・カセットは、前記標的遺伝子の３’ＵＴＲの異なる位置に挿入される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記ポリヌクレオチド・カセットを含む前記標的遺伝子は、前記標的遺伝子の発現のためにベクターに組み込まれている、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記ベクターはウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド・カセットを含む標的遺伝子を含む、ベクター。
24. 前記ベクターはウイルスベクターである、請求項２３に記載のベクター。
25. 前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群より選択される、請求項２４に記載のベクター。