JP2019502407A - 神経オルガノイド組成物および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年1月14日に出願された米国仮特許出願第62/278,857号および2016年2月23日に出願された同第62/298,872号の利益を主張するものであり、これらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
成人のほぼ3分の1が、人生で少なくとも一度は神経発達疾患、神経精神疾患または神経疾患(例えば自閉症、不安、気分障害、神経変性疾患)に罹患する。米国および欧州経済への脳疾患のコストは、年間数千億ドルと推定される。神経科学は、典型的には生体脳または生体組織試料の実験的操作に頼ってきたが、科学の進歩は多くの要因によって制限されてきた。倫理的および技術的理由から、ほとんどの侵襲的技術はヒトで使用することが不可能である。動物における実験は費用がかかり、動物で得られた結果は、長くて費用のかかるヒトでの臨床試験で検証されなければならない。疾患の機構を理解し、潜在的な治療法を試験するためにヒト脳の改善された実験モデルが緊急に必要とされている。
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くについての一般的な定義を当業者に提供する:Singleton et al,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);およびHale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書において使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、下記でこれらに与えられる意味を有する。
1つの態様では、TSC2ポリペプチドは、脳発生に影響を及ぼす突然変異を含む。別の態様では、TSC2ポリペプチドは、N末端から1743番目の位置のアルギニンがグルタミンで置換されたARG1743GLNを含む。ARG1743GLNは、R1743Qとも称され得る。
1つの態様では、PSEN1ポリペプチドは突然変異(例えばALA246GLU)を包含する。1つの態様では、PSEN1ポリペプチドは、グルタミン酸によって置換された、例示的なPSEN1ポリペプチドのN末端から246番目の位置のアラニンに対応する、アラニンを含む。ALA246GLUは、A246Eとも称され得る。
本発明は、ヒト障害に関連する遺伝的、分子的および細胞性異常を研究するためのインビトロモデルとして有用な、誘導多能性幹細胞(iPSC)由来のオルガノイドを特徴とする。このオルガノイドは、脳(例えばヒト、げっ歯動物)の発生、生理学および他の特徴をインビトロで再現する。本発明はさらに、疾患を研究しかつ神経疾患および障害の治療のための治療薬を同定するためにこの神経オルガノイドを使用する方法を提供する。
神経オルガノイドは、神経学的状態の発症を治療または予防する剤の毒性および有効性スクリーニングに使用することができる。1つの態様では、本明細書に記載の方法に従って生成されたオルガノイドを候補の剤と接触させる。オルガノイド(またはオルガノイド内の様々な細胞)の生存率を未処理対照オルガノイドの生存率と比較して、候補化合物の毒性を特徴付ける。細胞生存率を測定するためのアッセイは当技術分野において公知であり、例えばCrouch et al.(J.Immunol.Meth.160,81-8);Kangas et al.(Med.Biol.62,338-43,1984);Lundin et al.,(Meth.Enzymol.133,27-42,1986);Petty et al.(Comparison of J.Biolum.Chemilum 10,29-34,1995);およびCree et al.(Anticancer Drugs 6:398-404,1995)によって記述されている。細胞生存率は、MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾリル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)(Barltrop,Bioorg.&Med.Chem.Lett.1:611,1991;Cory et al.,Cancer Comm.3,207-12,1991;Paull J.Heterocyclic Chem.25,911,1988)を含む様々な方法を用いて検定することができる。細胞生存率アッセイは市販もされている。これらのアッセイには、ルシフェラーゼ技術を使用してATPを検出し、培養中の細胞の健康状態または数を定量化するCELLTITER-GLO(登録商標)発光細胞生存率アッセイ(Promega)、および乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)細胞毒性アッセイであるCellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存率アッセイ(Promega)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
一般に、本発明において有用な剤は、当技術分野で公知の方法に従って、天然産物もしくは合成(もしくは半合成)抽出物の大きなライブラリから、または化学物質ライブラリから、またはポリペプチドもしくは核酸ライブラリから同定される。創薬および開発の分野の当業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源が本発明のスクリーニング手順に重要ではないことを理解するであろう。スクリーニングに使用される剤は、神経学的状態の治療のための治療薬として公知のものを含み得る。あるいは、実質的にあらゆる未知の化学抽出物または化合物が、本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングできる。そのような抽出物または化合物の例には、植物、真菌、原核生物または動物ベースの抽出物、発酵ブロスおよび合成化合物、ならびに既存のポリペプチドの修飾物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
1つの態様では、本発明は、本発明のオルガノイドを含むキットを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のオルガノイドを得るための試薬を、単独でまたはそのような試薬の使用のための指示と組み合わせて提供する。そのようなキットは、生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知を伴うことがあり、この通知は、ヒトでの投与のための製造、使用または販売の前記機関による承認を反映する。
ヒト誘導多能性幹細胞由来の神経オルガノイドを以下のように生成した。
・MEF培地中のゼラチン被覆した培養基上に、ウェル当たり2×105細胞の密度で、照射したマウス胚線維芽細胞(MEF)を播種する。プレートを37℃のインキュベータ中に一晩置く。
・予め温めたPBSでMEFを洗浄する。培地を1ウェルあたり1mlのiPSC培地/ROCK阻害剤と交換する。
・インキュベータからiPSCプレートを取り出す。iPSC細胞にiPSC培地を供給する。滅菌StemPro EZPassageツールを使用して、iPSCコロニーを切り出し、再懸濁する。細胞を穏やかに再懸濁し、分割して、MEF含有ウェルに移す(1:1)。
・100mm培養皿を0.1%ゼラチンで被覆する。37℃のインキュベータに20分間入れる。
ゼラチンを取り除き、BSC中ですぐに使える状態まで皿を空気乾燥させる。
・6ウェルプレートの2つのウェルは、96ウェルプレートに十分な細胞を提供するはずである。iPSCとMEFを含むウェルを、Ca2+/Mg2+を欠く予め温めたPBSで洗浄する。PBS溶液を除去し、タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素の予め温めた細胞剥離溶液、ACCUTASE(商標)1ml/ウェルと置き換える。すべての細胞が剥離されるまで37℃のインキュベータで20分間プレートをインキュベートする。
・予め温めたiPSC培地を各ウェルに添加し、穏やかに粉砕して可視のコロニーを分割する。
・予め温めたさらなる培地を添加して15mlにし、ゼラチン被覆した培養プレート上に細胞を移して、37℃のインキュベータで60分間、MEFを被覆表面に接着させる。細胞懸濁液中に存在するiPSCを計数する。
・室温で5分間、300xgで懸濁液を遠心分離する。上清を廃棄し、ROCK阻害剤(最終濃度50μM)を含むEB培地中に、9,000細胞/150μLの体積になるように細胞を再懸濁する。
・LIPIDURE(登録商標)低接着性U底96ウェルプレートに150μlを播種し、37℃でインキュベートする。LIPIDUREコーティングは、ホスホリルコリンによって構成される生体適合性ポリマーであるMPCポリマーを含有する。
・ウェルの底部でのEB形成を妨げることなく、EB培地の3/4を静かに交換することによって1日おきにEBに供給する。EB内のiPSC細胞間の相互作用がピペット操作中のせん断応力によってかき乱されないことが重要である。最初の4日間、EB培地は50μM ROCK阻害剤および4ng/mLのbFGFを含む。残りの2〜3日間は、ROCK阻害剤もbFGFもEBに添加しない。
・LIPIDURE(登録商標)96ウェルプレート中のEBを、6日目または7日目に、500μl/ウェルの神経誘導培地を含む2つの24ウェルプレートに移す。2つのEBを各ウェルに静かに播種する。
・2日後、培地を交換する。EBは、神経外胚葉分化を示す「ハロー」をそれらの外周に帯びるはずである。「ハロー」を有するEBだけを、マトリゲルに包埋するために選択する。他のEBは廃棄する。
・長方形[5cmx7cm]のプラスチックパラフィンフィルム(PARAFILM)を、3%過酸化水素を用いて滅菌し、長方形の中に一連のくぼみを作る。これは、例えば、長方形を空の滅菌200ulチップボックスプレスの中心に置き、長方形を静かに押してくぼみを作り、ボックス内に穴の跡をつけることによって達成され得る。ボックスにエタノールを噴霧し、BSC中に置いて乾燥させる。
・4℃で平衡に達するまで、冷蔵庫内で氷上にて2〜3時間、凍結マトリゲルマトリックスアリコート(500μl)を解凍する。
・工程3からの単一EBをフィルムの各々のくぼみに移す。7cm×5cmの長方形は20のEBを保持するはずである。余分な培地をピペットで除去した後、マトリゲルの20μlアリコートをEB上に移す。37℃で30分間インキュベートしてマトリゲルを重合させる。粘性マトリゲルの20μlの小滴は、必須の栄養素およびガスの交換を可能にしつつ、初期にEB内の細胞によって分泌されたモルフォゲンおよび成長因子の勾配を捕捉することによって、EBからの脳オルガノイドの適切な成長を支持する最適な3D環境を形成することが認められた。組織培養インキュベータ(37℃/5%CO2)内で1日2回数分間、手で穏やかに振動させることによって、包埋されたEBへのガスおよび栄養素の最適な交換がさらに可能になる。
・100mm組織培養皿に分化培地1を添加する。マトリゲル中のEBを含むフィルムを培地上に裏返して置き、37℃で16時間インキュベートする。
・16時間後、EB/マトリゲル小滴を、フィルムから培地を含む培養皿に移す。37℃での静置培養を4日間継続し、安定な神経オルガノイドを形成させる。
オルガノイドを、分化培地2を含む培養皿に静かに移す。フラスコを、37℃/5%インキュベータ内の40rpmで回転するオービタルシェーカー上に置く。理論に拘束されることを望むものではないが、網膜、皮質、中脳、後脳および脊髄を含む、より複雑で完全な構造体への脳オルガノイドの発生中のパターン形成に影響を及ぼし得る種々の系統のニューロンの初期前駆体間の拡散勾配の乱れを最小限に抑えるため;オルガノイドの生存のためのマトリックス内のガスの最適な交換を提供し、アポトーシスを防止するため;栄養素を提供してマトリックス内に最適に拡散させるため;ならびに脳脊髄液の機能を有効に模倣する廃棄物の流出を可能にするために、これらの条件を選択した。モルフォゲンおよび成長因子勾配が、脳の関連構造体を形成するレシピエント細胞内の標的に作用するのに十分な時間を与えるために、培地をフラスコ中で3〜4日ごとに交換する。培地の交換は、構造体がより大きなオルガノイドに成長するにつれて、オルガノイドの最外周に配置されるモルフォゲン/分泌された成長因子の勾配に対する不必要なかく乱を避けるために注意して行う。
インビトロでの約12週間の培養後、トランスクリプトームおよび免疫組織化学分析は、実施例1で記述した方法に従って生成されたオルガノイドが、ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアおよび血管系に特徴的なマーカーを発現する細胞(図1〜図14)ならびに神経外胚葉起源のすべての主要な脳構造体を含むことを示す。形態学的には、明視野イメージングにより、オルガノイドは、大脳皮質、頭屈および眼茎を含む容易に識別可能な神経構造体(グレイ解剖学テキスト)を含む。それらの遺伝子発現パターンは、成人のヒト脳参照(Clontech)のものと>98%一致する。それらはまた、以前に記述された発生学的に組織された方法で遺伝子を発現する(例えば中脳の中脳ドーパミン作動性ニューロンについては、Blaese et al.,2015)。それらはまた、複数の神経特異的マーカー(樹状突起、軸索、核)、皮質ニューロン(ダブルコルチン)、中脳ドーパミンニューロン(チロシンヒドロキシラーゼ)および星状細胞(免疫組織学によるGFAP)を染色する。
・ヒトiPSC、フィーダー依存性(System Bioscience. WT SC600A-W)
・CF-1マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞、γ線照射(Applied StemCell,Inc. No.ASF-1217)
・DMEM非必須アミノ酸(MEM-NEAA,Invitrogen No.11140-050)
・リン酸緩衝生理食塩水、滅菌(Invitrogen No.14040-091)
・リン酸緩衝生理食塩水、Ca++およびMg++不含(Invitrogen No.14190-094)
・ゲンタマイシン試薬溶液(Invitrogen No.15750-060)
・抗生物質-抗真菌剤(Invitrogen No.15240-062)
・2-メルカプトエタノール(EmbryoMAX、EMBMillipore No.ES-007-E)
・塩基性線維芽細胞成長因子(FGF、PeproTech No.051408-1)
・ヘパリン(Sigma、No.H3149-25KU)
・インスリン溶液(Sigma No.I9278-5ml)
・ジメチルスルホキシド(No.D9170-5VL)
・ROCK阻害剤Y27632(Millipore No.SCM075)
・ゼラチン溶液、B型(Sigma No.G1393-100ml)
・マトリゲルマトリックス(BD Bioscience No.354234)、成長因子非減少型マトリゲル
・(Sigma No.A6964)
・過酸化水素(Fisher No.H325-500)
・エタノール
・無菌H2O
MEF培地:以下を添加したDMEM培地:
・10%ウシ胎仔血清
・100単位/mlペニシリン
・100μg/mlストレプトマイシン
・0.25μg/ml Fungizone
・IPSC培地:以下を添加したDMEM/F12培地:
・20%ノックアウト置換血清
・3%ウシ胎仔血清 o 2mM Glutamax
・1X最小必須培地非必須アミノ酸
・20ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子
・20%ノックアウト置換血清
・3%ウシ胎仔血清 o 2mM Glutamax
・1X最小必須培地非必須アミノ酸
・55μMのβ-メルカプトエタノール
・4ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子
・神経誘導培地:以下を添加したDMEM/F12培地:
・1:50希釈のN2添加物
・1:50希釈のGlutaMax
・1:50希釈のMEM-NEAA
・10μg/mlヘパリン
・1:200希釈のN2添加物
・1:100希釈のB27-ビタミンA
・2.5μg/mlインスリン
・窒素マスク下に保持し、-20℃で凍結させた55μMのβ-メルカプトエタノール
・100単位/mlペニシリン
・100μg/mlストレプトマイシン
・0.25μg/ml Fungizone
・1:200希釈のN2添加物
・1:100希釈のB27+ビタミンA
・2.5μg/mlインスリン
・窒素マスク下に保持し、-20℃で凍結させた55μMのβ-メルカプトエタノール。理論に拘束されることを望むものではないが、β-メルカプトエタノールは、インキュベータ内の、毒性の反応性酸素種の産生を促進する可能性が高い20%酸素環境において、適切なiPSCの健康およびEBへの成長のための酸化還元条件を提供する。不適切な保存条件に起因するその酸化還元能力の喪失は、iPSC由来のEBからのオルガノイドの適切な発生を損ない得る。
・100単位/mlペニシリン
・100μg/mlストレプトマイシン
・0.25μg/ml Fungizone
・1:200希釈のN2添加物 1:100希釈のB27+ビタミンA
・2.5μg/mlインスリン
・窒素マスク下に保持し、-20℃で凍結させた55μMのβ-メルカプトエタノール。理論に拘束されることを意図しないが、β-メルカプトエタノールは、EB由来の脳オルガノイドにおける中脳構造体の発生に寄与し得る。
・100単位/mlペニシリン
・100μg/mlストレプトマイシン
・0.25μg/ml Fungizone
・メラトニン
・TSH
・StemPro EZPassage(Invitrogen No.23181-010)理論に拘束されることを望むものではないが、EZPassageツールは、サブクローニングのためのより均一なiPScコロニーをもたらす、iPSCの均一な正方形を切り出す。均一性は、EBを作製する際に下流の均一性を高める。
・組織培養フラスコ、再密閉可能な115cm2(TPP No.TP90652)
・組織培養フラスコ、再密閉可能な150cm2(TPP No.TP90552)
・Lipidure被覆プレート、96ウェル、U底(LCU96)
・Lipidure被覆マルチディッシュ、24ウェル(510101619)
・Parafilm(Sigma No.P7793)150ml/250ml溶液用の滅菌ろ過ユニット(TPP99150、TPP99250)
・37℃および5%CO2で維持した、ベンチトップ組織培養遠心分離機CO2インキュベータ
結節性硬化症複合体(TSC)は、脳を含む多くの異なる器官において非悪性腫瘍を形成させる遺伝的障害である。TSCは、患者が発作、発達遅延、知的障害および自閉症を有するため、生活の質に強い影響を及ぼす。結節性硬化症複合体を引き起こし得る2つの遺伝子が同定されている。TSC1遺伝子は9番染色体上に位置し、ハマルチン遺伝子と呼ばれる。他方の遺伝子、TSC2は16番染色体上に位置し、ツベリン遺伝子と呼ばれる。
モデル
アルツハイマー病は、記憶障害および日常生活を妨げる他の知的能力に関連する、認知症の一般的な形態である。アルツハイマー病は認知症症例の60〜80%を占める。プラークおよびもつれと呼ばれる2つの異常な構造体が神経細胞を損傷し、死滅させると考えられている。プラークは、神経細胞間の間隙に蓄積するβ-アミロイドと呼ばれるタンパク質断片の沈着物である。もつれは、細胞の内部に蓄積するタウと呼ばれる別のタンパク質のねじれた線維である。
前記の説明から、様々な用途および条件に適合させるために、本明細書に記載された本発明に変更および修正を加え得ることは明らかであろう。そのような態様もまた、添付の特許請求の範囲内である。
Claims (24)
- ヒト誘導多能性幹細胞(hIPSC)に由来する、インビトロで生成された三次元神経オルガノイドであって、網膜マーカーまたは皮質マーカーを発現する第一領域と、脳幹、小脳、および/または脊髄のマーカーを各々発現する1つまたは複数のさらなる神経領域とを含む前記オルガノイド。
- 1つまたは複数の神経マーカーを発現する細胞と、星状細胞マーカー、乏突起膠細胞マーカー、ミクログリアマーカー、および/または血管マーカーからなる群より選択されるマーカーを発現する細胞とを含む、請求項1に記載のオルガノイド。
- hIPSCが、神経学的異常に関連する遺伝子変異を含む、請求項1に記載のオルガノイド。
- 遺伝子変異が、TSC1、TSC2、PSEN1、またはAPPに存在する、請求項1に記載のオルガノイド。
- ヒト誘導多能性幹細胞に由来する、インビトロで生成された三次元神経オルガノイドであって、神経マーカーを発現する第一細胞型と、星状細胞マーカー、乏突起膠細胞マーカー、ミクログリアマーカー、または血管マーカーを発現する第二細胞型とを含む前記オルガノイド。
- 神経マーカーが、網膜特異的グアニル酸シクラーゼ(GUY2D、GUY2F)、網膜および前神経ひだホメオボックス(Retina And Anterior Neural Fold Homeobox)(RAX)、ならびに網膜特異的銅含有アミンオキシダーゼ2(RAX)からなる群より選択される網膜マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
- 神経マーカーが、ダブルコルチン、NeuN、FOXP2、CNTN4、およびTBR1からなる群より選択される皮質マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
- 神経マーカーが、チロシンヒドロキシラーゼ、小胞モノアミントランスポーター2(VMAT2)、ドーパミンアクティブトランスポーター(DAT)、およびドーパミン受容体D2(D2R)からなる群より選択されるドーパミン作動性ニューロンのマーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
- 神経マーカーが、ATOH1、PAX6、SOX2、LHX2、GRID2、または別の小脳マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
- 神経マーカーが、SOX2、NeuroD1、DCX、EMX2、FOXG1、PROX1、または別の顆粒ニューロンマーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
- 神経マーカーが、FGF8、INSM1、GATA2、ASCL1、GATA3、または別の脳幹マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
- 神経マーカーが、HOXA1、A2、A3、B4、A5、C8、またはD13からなる群より選択されるホメオボックス遺伝子である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
- 神経マーカーが、NKCC1、KCC2、または別のGABA作動性マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
- 星状細胞マーカーがGFAPであり、乏突起膠細胞マーカーがOLIG2またはMBPであり、ミクログリアマーカーがAIF1またはCD4であり、かつ血管マーカーがNOS3である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
- (a)ヒト誘導多能性幹細胞(hIPSC)とガンマ線照射マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞(MEF)との混合培養物から最小限に接着性であるhIPSCを選択し、かつ、胚様体(EB)を得るためにスフェア形成を促進する条件下でIPSCを培養する工程;
(b)EBをプレートに移し、かつ、神経外胚葉分化を誘導する条件下で培養する工程;
(c)静的条件下で約3〜5日間、成長因子を含む三次元マトリックス中でEBを培養する工程;
(d)増殖培地の層流を促進する条件下、三次元マトリックス中でEBを培養し、それによって神経オルガノイドを得る工程
を含む、神経オルガノイドを得るための方法。 - (a)iPSCを単独でまたは照射したMEFの存在下で培養する工程;
(b)胚葉分化を促進する条件下、ROCK阻害剤およびbFGFの存在下で約4日間、低接着性U底プレート中で、工程(a)からのiPSCを培養し、次いで形成のためにROCK阻害剤またはbFGFを欠く培地中でiPSCを培養する工程;
(c)神経誘導を促進する条件下で低接着性プレートに(b)からのiPSCを播種し、かつ、胚様体からの神経外胚葉形成を示す胚様体を選択する工程;
(d)選択した胚様体を三次元培養マトリックス中に包埋し、かつ、神経オルガノイド発生を促進する条件下で、1日2〜3回、培養物を穏やかに振動させながら培養する工程;ならびに
(e)神経オルガノイドを静置培養する工程
を含む、神経オルガノイドを得るための方法。 - 酸化を最小限に抑える条件下で保存したβ-メルカプトエタノールが、工程(a)〜(e)の各々において培地に添加される、請求項15または16に記載の方法。
- 培養物において培地の緩やかな層流を誘導するために、1日2回、培養物を約2分間穏やかに振動させる、請求項16に記載の方法。
- 三次元培養マトリックスの量が、栄養素およびガスの交換を可能にしつつモルフォゲンおよび成長因子を捕捉するように最適化される、請求項15または16に記載の方法。
- 胚様体が、約10、20、または30μlの三次元培養マトリックス中に包埋される、請求項19に記載の方法。
- hIPSCが、MEFを培養基に接着させ、次いで非接着性hIPSCを除去することによって選択される、請求項15に記載の方法。
- 三次元マトリックスが、エンゲルブレス-ホルム-スワーム(Engelbreth-Holm-Swarm)(EHS)肉腫細胞から抽出された可溶化基底膜調製物である、請求項15または16に記載の方法。
- 網膜マーカーまたは皮質マーカーを発現する第一領域と、中脳、脳幹、小脳、および/または脊髄のマーカーを発現する1つまたは複数のさらなる領域とを含む、請求項15または16に記載の方法に従って生成されたインビトロ由来の神経オルガノイド。
- アルツハイマー病または結節性硬化症に関連する突然変異を含む、請求項23に記載のオルガノイド。
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