JP2018521129A - タンパク質の安定化のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、緩衝液安定化タンパク質組成物およびその作製方法に関する。開示された組成物および方法は、タンパク質またはペプチドが、その天然の立体配座および構造を維持し、生物学的活性を維持し、凝集を防止するように、タンパク質またはペプチドを安定化および保存する手段を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月７日提出の米国仮特許出願 第６２／１８９，５９５号および２０１５年９月１４日提出の米国仮特許出願 第６２／２１８，３２０号の優先権を主張するものであり、その開示は、そっくりそのまま、本質的に本明細書に組み入れられる。

本願の技術分野
本出願は、タンパク質、タンパク質抗原および／またはキャリアタンパク質を安定化する方法ならびに組成物を目指している。開示された、安定化のための組成物ならびに方法は、タンパク質を含んでいる、種々の医薬用、治療用および／または研究用の組成物の調合、貯蔵および輸送において有用であり得る。

発明の背景
Ａ．タンパク質の安定化

不安定な生成物を安定化させるために、貯蔵サンプルの水分の不動化または低減が試みられている。例えば、一部の生物学的材料は、冷蔵または冷凍により安定化させることができる。しかしながら、凍結サンプルの維持および運搬は費用がかかり、また、冷凍装置の故障により、価値のある生成物が完全に失われることになるかもしれない。また、バイオ生成物を凍結乾燥することにより、乾燥し、活性な、常温保存可能で、また、容易に溶解できる生成物を提供することができる。しかしながら、タンパク質または生物学的医薬生成物は、凍結乾燥過程中に、数多くの機構によって、損傷され得る。穏やかな手段と見なされることが多いが、凍結乾燥は、実際には、潜在的には、ダメージを与えるプロセスであり、その個別の加工段階は、その各々が傷つきやすいバイオ生成物に損傷を与える可能性がある、相互に関係している、一連のストレスと見做すべきである。そのプロセスの一つの工程中に引き継がれた損傷は、プロセス鎖における続いて起こる段階において、増悪されることもあり、そして、容器の交換のような、プロセス中の些細に見える変化でも、良好なプロセスを、不適切なものに変えるのに充分である。氷の形成を伴う。温度の低下が、生体分子に負荷される最初の主なストレスである。ワクチン生成物中の生体分子は、氷が形成するための、溶質濃度の増加によって、損傷される可能性が高い。さらに、凍結乾燥は、その材料は、低い融点を有している、油性または非水性溶液には、ほとんど適していない。

Ｂ．ワクチンおよび医薬品中のタンパク質

免疫形成は、ヒトの健康を向上させるための主要な特性である。多くの一般疾患に対して成功した種々のワクチンが利用可能であるものの、感染症は、健康障害および死亡の主な原因のままである。現在のワクチンに内在される重大な問題として、繰り返し予防接種の必要性、および、広範囲の疾患に対する、現在のワクチン供給システムの非有効性が挙げられる。

この分野において存在している一つの問題は、ワクチン配合組成中に存在している、タンパク質抗原の高頻度の変性である。多くのワクチンは、防御免疫を付与するためのタンパク質抗原を含んでいる。これは、抗体が、侵襲した病原菌の表面に結合して、その破壊の誘因となる際には、大概、防御となるからである。幾つかのワクチンでは、精製された表面分子を採用している。例えば、インフルエンザワクチンは、最近世界中で流行しているウイルス由来の精製ヘマグルチニンを含有している。さらに、Ｂ型肝炎表面抗原またはＨＢｓＡｇと称される、Ｂ型肝炎ウイルスの表面に発現されているタンパク質をコードしている遺伝子は、今では、大腸菌細胞中で発現させることができ、そして、有効なワクチンのための材料を提供している。ヒトパピロマウイルス（ＨＰＶ）の４種の株のカプシドタンパク質をコードしている遺伝子は、酵母中で発現させることができ、そして、得られる組み換えタンパク質は、ワクチン（Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標））中に組み込まれている。ＨＰＶのこれらの株の一部による感染は、子宮頸癌を引き起こすたま、ＨＰＶワクチンは、特定の種類の癌の予防に有用である。

他の種類のワクチンは、（好ましくは同じ微生物に由来する）キャリアタンパク質に連結された、免疫原性が乏しい（多糖有機体）抗原を利用することができ、それにより、付着された抗原に、キャリアの免疫学的特性が付与される。有効な免疫原を創り出すためのこの技術は、侵襲性細菌性疾患の予防のために、細菌の多糖に最も頻繁に適用されている。

タンパク質抗原あるいはキャリアタンパク質を含むワクチンの一つの欠点は、ワクチン配合組成中に存在する、タンパク質が不安定になり、タンパク質変性をもたらすことである。タンパク質抗原の変性は、有効な結合の消失、および、その結果、防御抗体の生成の減少を引き起こし得る。同様に、連結体型ワクチン中に存在するキャリアタンパク質の変性も、有効な結合の欠失、および、それによる防御抗体の生成の減少を引き起こし得る。

すなわち、タンパク質抗原またはキャリアタンパク質を含むワクチン産物を、凍結乾燥または氷点下温度（−２０〜−８０℃）での貯蔵条件を必要とすることなく、安定化することができれば、この分野の大きな進歩である。普通の冷蔵温度（２〜８℃）、または、さらには、室温（２５℃）において、ワクチン組成物中に存在するタンパク質の保存可能期間を延ばす、安定した液体系溶液の開発は、製造コスト（例えば、高額な凍結乾燥費用）および、−２０℃〜−８０℃での貯蔵を必要とする生成物のサプライ・チェーンの必要性が、大幅に減少される。

医薬用、治療用および研究用の全てについてのタンパク質の効果的な安定化および保存が当該分野において依然として必要とされている。これらの目的を達成するために、タンパク質産物の安定化のための新規な方法および組成物を開発することが必要とされている。本開示はこれらの要求を満たすものである。

発明の概要
本開示は、主に、溶液中のタンパク質を安定化および保存する方法および組成物に関する。開示された方法および組成物は、治療目的と同様に研究目的にも有用である。

一つの態様において、本開示は、安定化系の中にタンパク質を配合する工程を含んでなる、 組成物中のタンパク質を安定化させる方法に関しており、
その際、該安定化系は、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の、少なくとも１種の緩衝液と、
（１）少なくとも１種の塩、（２）トレハロース、スクロース、グリセロールまたはマンノース等の、少なくとも１種の糖、（３）少なくとも１種の酸化防止剤、（４）少なくとも１種のアミノ酸、または（５）それらの任意の組み合わせのうち、少なくとも１種を含む。

一部の実施形態においては、該緩衝液はＰＢＳとすることができ、また、他の実施形態においては、ＴＲＩＳとすることができる。該緩衝液がＰＢＳである実施形態においては、その濃度は、約１〜約５０ｍＭ、より具体的には、約１０ｍＭであってよい。該緩衝液がＴＲＩＳである実施形態においては、その濃度は、約５〜約１００ｍＭ、より具体的には、約１０ｍＭ、ないしは約８０ｍＭであってよい。

一部の実施形態においては、塩は塩化ナトリウムであってよく、また、他の実施形態においては、塩は塩化カルシウムであってよい。塩の濃度は、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭであってよい。

一部の実施形態においては、糖はトレハロースであってよく、また、他の実施形態においては、糖はスクロースであってよい。さらに別の実施形態においては、糖はグリセロールまたはマンノースであってよい。糖の濃度は、約５％、約１０％、ないしは、約１５％であってよい。

一部の実施形態においては、アミノ酸はヒスチジンであってよく、また、他の実施形態においては、アミノ酸はアラニンであってよく、さらに別の実施形態においては、アミノ酸はグルタチオンであってよい。アミノ酸がヒスチジンである実施形態においては、その濃度は約２０〜約７０ｍＭ、より具体的には、約６０ｍＭであってよい。アミノ酸がアラニンである実施形態においては、その濃度は約５〜約１５ｍＭ、より具体的には、約１０ｍＭであってよい。アミノ酸がグルタチオンである実施形態においては、その濃度は約１０〜約２０ｍＭ、より具体的には、約１６ｍＭであってよい。

もう一つの態様において、本開示は、安定化系の中に配合されている、少なくとも１種のタンパク質またはペプチドを含んでなる安定化組成物に関しており、
その際、該安定化系は、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の、少なくとも１種の緩衝液と、
（１）少なくとも１種の塩、（２）トレハロース、スクロース、グリセロールまたはマンノース等の、少なくとも１種の糖、（３）少なくとも１種の酸化防止剤、（４）少なくとも１種のアミノ酸、または（５）それらの任意の組み合わせのうち、少なくとも１種を含む。該組成物のための、緩衝液、塩、糖およびアミノ酸は、前記方法に関して、上で記載したものと同じである。

一部の実施形態においては、該組成物は、医薬組成物、例えば、ワクチンに製剤化することができる。

以下の一般的記載、ならびに、以下の図面の簡単な説明および詳細な説明は、例示的かつ説明的であり、そして、請求された開示のさらなる説明を提供することを意図している。他の対象、利点ならびに新規な特色は、以下の開示の詳細な記載に基づき、当業者にとっては、容易に明らかであろう。

図１は、タンパク質変性の一例を示す。 図２は、基本形１のフローチャートを示す。 図３は、基本形２のフローチャートを示す。 図４は、基本形３のフローチャートを示す。 図５は、例示的なタンパク質、炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）の凝集を防御するための最適ｐＨを示す。 図６は、トレハロースによる、例示的なタンパク質、ｒＰＡの凝集の防御における、トレハロースの最適濃度を示す（トレハロースの６種類の異なる濃度を示している）。 図７は、２〜８℃で４週間貯蔵された緩衝液中におけるマンニトールの結晶化を示す。 図８は、種々の製剤中における、組み換えインフルエンザ Ｈ５（ｒＨ５またはｒＨＡ）の粒径の経時的な増加％のグラフ表示を示す。 図９は、いずれも１５％のトレハロースを含む、（Ａ）リン酸および（Ｂ）ＴＲＩＳ緩衝液系における、加熱前後のｒＨ５の粒径分布を示す。 図１０は、加熱の後に、ＨＰＬＣにより分析されたｒＨ５モノマーおよびダイマー（合計）の％を示す。 図１１は、加熱の後に、ＨＰＬＣにより分析されたｒＨ５モノマーの％を示す。 図１２は、ｄ１、ｄ２、ｄ３およびｄ４ドメインを示す、ｒＰＡの三次構造のリボン図を示し、＊は、カルシウムが結合していることを示している。 図１３は、４９℃で、１分間ならびに５分間インキュベーションした後の、ｒＰＡ溶液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。 図１４は、ＰＡＧＥゲルを用いて測定された、ｒＰＡの物理的安定性への温度および時間の効果を示す。 図１５は、異なる添加物を用いた場合の、リン酸ナトリウム系における５００μｇ／ｍｌ ｒＰＡの外観を示す。非加熱対照（左バイアル）ならびに、４９℃で５分間加熱（右バイアル）。 図１６は、付加的な安定化添加物を加えたリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中におけるｒＰＡの、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定された、ｒＰＡピーク領域の対比を示す。パネル（Ａ）は、ヒスチジンを含まない配合組成を示し、パネル（Ｂ）は、ヒスチジンを含む配合組成を示す。 図１６は、付加的な安定化添加物を加えたリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中におけるｒＰＡの、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定された、ｒＰＡピーク領域の対比を示す。パネル（Ａ）は、ヒスチジンを含まない配合組成を示し、パネル（Ｂ）は、ヒスチジンを含む配合組成を示す。 図１７は、４９℃で５分間加熱した後の、異なる添加物を含むＴＲＩＳ緩衝液中の５００μｇ／ｍｌ ｒＰＡの外観を示す。 図１８は、ＴＲＩＳ緩衝液を含む種々の配合組成のＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決められたｒＰＡピーク面積の対比を示す。 図１９は、種々の添加物中におけるｒＰＡのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。 図２０は、ｒＰＡ緩衝水溶液の物質的許容基準の例を示す。 図２１は、ｒＰＡ緩衝水溶液の物質的許容基準の例を示す。 図２２は、１００μｇ／ｍＬ ｒＰＡ水溶液（基本形１：Ｘ−１５９６）の粒径プロフィールを示す。パネル（Ａ）は、−２０℃、５℃および２５℃で１か月における安定性データを示し、パネル（Ｂ）は、５℃および４０℃で１か月における安定性データを示す。 図２３は、ｒＰＡ水性（ＡＱ）（５％トレハロース）配合組成の温度および月による変化を示す。 図２４は、ｒＰＡ水性（ＡＱ）（５％トレハロース）配合組成の温度および月による変化を示す。 図２５は、ｒＰＡ水性（ＡＱ）（Ｐ３−ＧＴ）配合組成の温度および月による変化を示す。 図２６は、ｒＰＡ水性（ＡＱ）（Ｐ３＋ＧＴ）配合組成の温度および月による変化を示す。 図２７は、低用量ｒＰＡのｒＰＡ水溶液の１２か月にわたる安定性を示す。パネル（Ａ）および（Ｂ）は、グルタチオンを含まない配合組成を示し、パネル（Ｃ）および（Ｄ）はグルタチオンを含む配合組成を示す。 図２８は、高用量ｒＰＡのｒＰＡ水溶液における、ｒＰＡ水溶液の安定性を示す。−２０℃、５℃および２５℃で貯蔵した後、１２か月間、ｒＰＡの安定性を測定した（ＲＰ／ＳＥＣ、＋ＧＴ）。パネル（Ａ）および（Ｂ）は、グルタチオンを含まない配合組成を示し、パネル（Ｃ）および（Ｄ）はグルタチオンを含む配合組成を示す。 図２９は、ｒＰＡ配合組成の基本形１の経時的なｐＨ評価結果を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、１００μｇのｒＰＡを含む配合組成を示し、パネル（Ｃ）および（Ｄ）は、５００μｇのｒＰＡを含む配合組成を示す。 図３０は、基本形２のｒＰＡ配合組成の経時的なｐＨ評価結果を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、１００μｇのｒＰＡを含む配合組成を示し、パネル（Ｃ）および（Ｄ）は、５００μｇのｒＰＡを含む配合組成を示す。 図３１は、基本形３のｒＰＡ配合組成の経時的なｐＨ評価結果を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、１００μｇのｒＰＡを含む配合組成を示し、パネル（Ｃ）および（Ｄ）は、５００μｇのｒＰＡを含む配合組成を示す。 図３２は、定性ウエスタンブロット法の許容基準を示す。

詳細な記載
Ｉ．概要
開示される組成物および方法の主要な目的の一つは、水性配合組成中に存在している、種々のタンパク質またはペプチドの、保存された生物学的機能および構造をはじめとする、長期安定性を達成することである。製品の貯蔵寿命を増すために、安定化作用剤／添加物を配合組成に添加することができることは知られている。しかしながら、現状の技術水準では、多くの課題が残されている。本発明は、対象のタンパク質およびペプチドに対して、熱不安定性に対する、驚くべきかつ予想外の優れた防護を提供する添加物を選択するための、スクリーニングの種々の新規な方法論を活用した。

下記の表７は、本発明の一部として開発された、例示的な緩衝液系および付加的な安定化添加物の一部を示している。これらの系は、配合組成の開発および特定の添加物の選択を進めるために用いることができる、安定性の研究において、熱的にスクリーニングされた。

Ａ．開示された方法および組成物用のタンパク質
本開示が適用することができる、タンパク質、前駆体タンパク質、タンパク質抗原、キャリアタンパク質、治療用タンパク質、抗体等は、自然界から単離される、あるいは、組み換えＤＮＡ技術を用いた生合成により生み出すことができ、これ以降、「組み換えタンパク質」または「組み換え技術によって生成されたタンパク質」と呼ぶ。当業者は、本開示のタンパク質および前駆体タンパク質を生合成するための組み換え技術を用いる方法を知っている。ここに開示さえる、組成物または方法に有用に組み込むことができる、そのようなタンパク質は、また、「目的のタンパク質」または「目的のペプチド」とも呼ぶことができる。

本開示の好ましいタンパク質として、折り畳まれた、球状タンパク質が挙げられるが、開示は、球状タンパク質には限定されない。本開示の新規な配合組成は、その中に組み入れられている、タンパク質の物理的、化学的および生物学的な安定性を保持すると共に、患者への投与が意図されている、タンパク質が凝集体および／または微粒子を形成することを防止する。開示された方法および組成物は、さらに、タンパク質変性を防止し、そして、長期間、溶液中において、安定化されたタンパク質あるいはタンパク質類を守る。

一般的に認識されている、タンパク質の２種類の一般的区分、すなわち、繊維状タンパク質および球状タンパク質がある。ケラチン、コラーゲンおよびエラスチンのような繊維状タンパク質は、容易には変性しない。それらは、生命体の物理的構造において重要な役割を果たしている、丈夫な、比較的不溶性の、四次構造を有するタンパク質である。この構造的機能に対応して、それらは、比較的に、水に不溶性であり、温度およびｐＨの穏やかな変化により、影響を受けない。毛髪の、より柔軟で弾性のケラチンは、哺乳動物の指の爪、ひずめ、および鉤爪中のケラチンよりも、鎖間ジスルフィド架橋の量が少ない。

「折り畳まれた、球状タンパク質」という用語は、適切に折り畳まれた、三次元の立体配置をとるタンパク質を意味し、タンパク質のシステイン残基を連結している、ジスルフィド結合の、故意の、所望のまたは必要な配置を含んでいる。通常、この適切に折り畳まれたジスルフィドの配置は、類似の天然タンパク質中に存在するものと同等または相当している。好ましくは、本開示の方法により安定化される、折り畳まれたタンパク質は、２つまたは３つのジスルフィド結合を有する。「折り畳まれた、球状タンパク質」としては、例えば、組み換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）および組み換えインフルエンザＨ５（ｒＨ５またはｒＨＡ）が挙げられるが、これらには、限定されない。

球状タンパク質は、対応する繊維状タンパク質よりも、水溶液において、可溶性であり、かつ、通常、温度およびｐＨに対して、より過敏であり；さらに、グリシンの高含量または繊維状タンパク質の繰り返し配列を有していない。球状タンパク質には、種々のアミノ酸、大きな側鎖および反応性官能基を有する、多くのアミノ酸が組み込まれている。しばしば、極性および非極性の両方の、これらの置換基の相互作用が、このクラスにその名前を与えている、球状の立体配置に、タンパク質が折り畳まれる原因となっている。繊維状タンパク質により奏される構造的機能と対照的に、球状タンパク質は、化学的に反応性であり、酵素（触媒）として作用し、薬剤ならびに調節性メッセンジャー物質を輸送する。そのようなタンパク質は、通常、対応する繊維状タンパク質よりも、温度およびｐＨ変化に対して、より過敏である。

熱は、タンパク質の立体配座および構造に影響を及ぼす一つの因子である。熱不安定性という用語は、熱に応答して、破壊／分解または変化を受けやすい物質を意味する。この用語は、タンパク質をはじめとする、生化学的物質を記載するために用いられることが多い。タンパク質またはペプチドは、熱に曝される間に、タンパク質の三次元構造の変化により、活性を失うことがある。後述の実施例において使用されるモデルタンパク質(すなわち、ｒＰＡおよびｒＨ５)をはじめとする、多くのタンパク質は、熱不安定性である。熱変性は、主に、非極性残基の増加したエントロピー効果が原因である(すなわち、折り畳まれていない鎖の増加したエントロピー増加は、溶質に起因する少量のエントロピー損失によりは、あまり減少しない)。

本開示にかかる方法および組成物を用いて安定化することができるタンパク質として、三次構造を有する球状タンパク質が挙げられる。球状タンパク質（「折り畳まれた、球状タンパク質」）の三次構造は、静電相互作用、水素結合ならびに共有ジスルフィド架橋を伴っている。これら三次構造は、ドメインとして知られている、樽状の領域である。各ドメインは、潜在的に、タンパク質または抗原ペプチドの抗原決定基とは独立に、存在することができる、天然の三次構造に含まれる領域である。これらは、サブユニットの接触部位における非極性側鎖の疎水性引力；反対電荷のイオン性基の間の静電相互作用；極性基の間の水素結合；およびジスルフィド結合を含んでいる。三次構造を有するタンパク質には、例えば、ｒＰＡおよびｒＨ５がある。開示された組成物および方法を適用することができる、更なるタンパク質およびタンパク質抗原として、治療用タンパク質が挙げられ、以下の５種類の群に大きく分けることができる：（ａ）不完全または異常であるタンパク質の置き換え；（ｂ）現存の経路の増強；（ｃ）新規機能または活性の提供；（ｄ）分子または有機体の妨害；および（ｅ）放射性核種、細胞傷害性薬剤またはエフェクタータンパク質等の、他の化合物またはタンパク質の送達。

治療用タンパク質は、分子型に基づいて分類することもでき、抗体系薬剤、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝血剤、血液因子、骨形成タンパク質、改変された足場タンパク質、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、ならびに、血栓溶解剤が含まれる。それらは、活性の分子機構に基づいて、（ａ）標的に非共有結合的に結合する、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）；（ｂ）共有結合に影響を及ぼす、例えば、酵素；および（ｃ）特定の相互作用に因らずに活性を呈する、例えば、血清アルブミン；に類別することもできる。

現状上梓されている、タンパク質治療薬の大部分は、組み換えタンパク質であるが、開示された安定化系は、天然の単離タンパク質を用いても機能するので、開示は、組み換えタンパク質に限定されない。多くのタンパク質治療薬が、癌、免疫異常、感染症および他の疾患の治療のために臨床試験されている。二重特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）および多特異的融合タンパク質、低分子薬剤と抱合化されたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、および最適薬物動態を有するタンパク質をはじめとする、新規な改変タンパク質が、現在開発中である。全てのそのようなタンパク質治療薬は、開示された安定化系への組み込みにより恩恵を受けることができる。

開示された安定化系に組み込むことができる更なるタンパク質として、フルゾン（登録商標）中に存在する抗原、フルビリン（登録商標）中に存在する抗原、βＰＬ−Ｈ３Ｎ２、ＮＥ−ｓｐｌｉｔ Ｈ３Ｎ２、ＮＥ−ｓｐｌｉｔ ＲＳＶ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）タンパク質、例えば、ＲＳＶ由来のＦタンパク質およびＲＳＶ由来のＧタンパク質、百日咳由来のａＰ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１または２由来のタンパク質（例えば、ＨＳＶ−１ ｇＢ、ＨＳＶ−２ ｇＢ、ＨＳＶ−１ ｇＣ、ＨＳＶ−２ ｇＣ、ＨＳＶ−１ ｇＤ、ＨＳＶ−２ ｇＤ、ＨＳＶ−１ ｇＥおよびＨＳＶ−２ ｇＥ）、ＮＥ−ｓｐｌｉｔ ＨＳＶ２、Ｇｐ１２０、エリスロポイエチン（すなわちＥＰＯ）、治療用および診断用抗体（例えば、ムロモナブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリジズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリトモマブ、アダリムマブ、アレファセプト、オマリズマブ、トシツモマブ、エファリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブおよびセルトリズマブ中に存在する抗体）、インスリンおよびインスリンアナログ、および他の治療的または薬学的に関連のあるタンパク質またはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｂ．タンパク質構造の安定化に関する事項
タンパク質の安定化には、４つの分野、すなわち、タンパク質の水和、タンパク質折り畳み、タンパク質結晶化およびタンパク質変性がある。

タンパク質の水和：タンパク質が充分に水和された場合、ポテンシャル・エネルギーが低下し、そのタンパク質は、最低エネルギー立体配座を達成することができる。水分子は、水素結合の交換のための、アミノ酸主鎖および側鎖の動きを円滑にすることができる。そのような水は、タンパク質の折り畳み速度および安定性の両方を促進する。

タンパク質折り畳み：タンパク質の折り畳みは、水性環境、望ましくないエントロピーの減少（大部分は、水に対する、非極性基の大きな表面積を翻訳的に形成する）に起因する、特に、疎水性相互作用によって、駆動される。水素結合できない表面に隣接している、水分子を考慮する。かかる表面上に形成される低密度水と、該表面との不適合性が、タンパク質の三次構造形成を引き起こす、表面の最小化を促進する。相性の良い溶質または浸透圧調節物質は、表面低密度水を安定化させ、また、表面張力を増加させることができ、それにより、タンパク質の構造を安定化させる（ホフマイスター効果および非極性気体の溶解性）。多くのタンパク質では、グリコシル化して、安定性を増す。

タンパク質結晶化：タンパク質は、(例えば、硫酸アンモニウムの)水溶液からゆっくりと析出させた際、結晶を形成する。非常に多数の小さな結晶ではなく、少数のより大きな結晶をつくるためには、ゆっくりとした析出が必要とされる。構造分析のための非変性タンパク質の結晶は、結晶格子中に保持されている水分子を伴って、形成されることが最適である。明らかに、天然タンパク質の結晶化は、濃厚液のメソスコピック準安定タンパク質クラスターが規則正しい結晶核への前駆体として作用し、続いて結晶が生じる、核形成を含む、３段階機構を有している。

タンパク質変性：タンパク質変性は、図１に示すように、活性の損失を伴うタンパク質構造の変化（通常は、アンフォールディング）を含む。タンパク質の正確な折り畳みのためだけではなく、この構造の維持のためにも、水が重要である。熱変性および生物学的活性の損失は、（温度と共に増加する水素結合破壊による）タンパク質を取り巻く、２次元的に広がる水の網目組織（前記参照）の破壊と関連しており、それ以外に、タンパク質の振動の動力学に個々に作用する。折り畳みまたはアンフォールディング時における自由エネルギー変化は、タンパク質折り畳み／アンフォールディングおよび水和変化の両方の組み合わせ効果に由来している。これらは、かなりの程度、相殺して、典型的タンパク質の安定性の自由エネルギーは僅かに４０〜９０ｋＪ ｍｏｌ^−１（極わずかな水素結合に相当）であるが、一方、エンタルピー変化（そして、温度がエントロピー変化を除する）は、±５００ｋＪ ｍｏｌ^−１以上異なる。この自由エネルギーには、エンタルピーおよびエントロピーの両方が寄与し、温度と共に変化して、熱変性および、ある場合には、低温変性をも引き起こす。高温でアンフォールディング（熱変性）するタンパク質は、理解が容易であるが、特に、予想外にもエントロピーの低下を伴うので、低温でアンフォールディングするタンパク質が多く存在することは驚きである。

本開示の方法および組成物は、タンパク質がその構造、立体配座および生物学的活性を維持するように、溶液中でタンパク質を安定化させることにより、タンパク質安定化の課題を取り扱っている。本開示により提供されるタイプの安定化は、種々のもののうち、ワクチンおよび抗体を含むタンパク質およびペプチド治療薬の研究、開発、商品化および治療／投与にとって、科学的、学問的および商業的に価値がある。

II．タンパク質を安定化させる新規な方法
本開示は、タンパク質構造に影響を及ぼし、また、タンパク質の凝集および／または分解に導く、不安定化または非安定化因子の全てを積極的に検査および処理することにより、球状タンパク質、タンパク質抗原またはキャリアタンパク質の二次および三次構造を安定化させるために組成物を最適化する方法に関する。

Ａ．炭水化物又は糖
疎水性効果：タンパク質折り畳みにおける主な駆動力は、疎水性効果である。これは、疎水性分子が、水との接触から自身を分離する傾向である。結果として、タンパク質折り畳み中に、疎水性側鎖が、タンパク質の内側に埋もれる。水中における、疎水性分子の挙動の正確な物理的説明は複雑であり、そして、その熱力学的特性の観点から、最適に記述することができる。疎水性効果に関して、知られていることの多くは、液相から水中への炭化水素の移動を研究することから導き出されているが、実際に、タンパク質折り畳みの熱力学は、水中の単純な疎水性分子の挙動に概ね従っている。水に曝される、疎水性側鎖の数を最少化することは、折り畳みプロセスの陰に隠れている、重要な駆動力である。分子内水素結合の形成は、タンパク質安定化へのもう一つの重要な寄与である。水素結合の強さは、その環境に依存し、すなわち、疎水性コア中に包まれたＨ−ボンドは、水性環境に曝されているＨ−ボンドよりも、天然状態の安定性に貢献する。

炭水化物または糖等の、水結合剤の添加を介して、本開示の緩衝液安定化系中において、重要な分子内結合を構築することができる。好ましい実施形態において、開示方法の水結合性の糖として、トレハロース、スクロース、グリセロール、マンニトール、単純な糖類、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、または、スクロース、ラクトース、マルトース、グルコースは勿論のこと、糖アルコール、例えば、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロール、ならびに、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、異なる分子量のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、および、ポリマー、例えば、カルボキシル化ポリ−Ｌ−リシン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または低分子量ポリビニルアルコールおよびポリグリセロールのＸ−１０００およびＺ−１０００が挙げられるが、これらに限定されない。開示された方法および組成物中への、１種またはそれより多くの糖の組み込みは、タンパク質の天然の立体配座の保護を促進し、等張性を変え、ならびに、重量オスモル濃度を変える。

１種またはそれより多くの糖は、当業者が決定できる様々な濃度で、本発明の方法および組成物中に、含有させることができる。例えば、開示された方法の特定の実施形態において、糖の濃度は、約２．５％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％または約２５％、またはこれらの値の間の任意の量とすることができる。すなわち、開示された方法において、選択された糖の濃度は、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５または５０％とできる。また、糖は、約２．５％から約４０％までの、あるいは、その間の任意の量からなる群より選択される量、例えば、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％あるいは、約５０％、または、これらの値の間の任意の量で存在することができる。

Ｂ．緩衝液
水素結合：水素結合は、本質的に、主に静電的であり、そして、電気的陰性原子に結合した水素と、孤立電子対を有する別の電気的陰性アクセプター原子（Ａ）との間の相互作用を必要とする。生物学的系において、両方の場合における、電気的陰性原子は、通常、窒素または酸素である。タンパク質中において、水素結合の多くは、各ドナーがアクセプターとの多重相互作用に参加しており、そして、各アクセプターは複数のドナーと相互作用している、ネットワーク中に生じている。これは、タンパク質中における、水素結合のイオン性と矛盾していない。水素結合の安定化に関連する、提案された安定化フローチャートの例が、図２に示されている。

タンパク質安定性は、アンフォールディング状態と折り畳まれた状態との間の自由エネルギーの差違である。アンフォールディング状態では、極性成分は、タンパク質の三次構造中に見出されたものに相当する、完全に、充分な水との水素結合を形成することができる。すなわち、タンパク質安定性に関して、水素結合は、エネルギー的に中性であり、但し、折り畳まれたタンパク質中における、水素結合の不存在は、熱力学的には極めて不利である。

緩衝液の選択を介して、本開示の緩衝液安定化系中において、最適の水素結合、ならびに、遊離エネルギーの安定化バランスを確立することができる。好ましい実施形態において、開示された方法および組成物の緩衝液として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。開示された安定化系中においての使用に適する、さらなる緩衝液として、Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ：（２−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）、ＡＤＡ：（Ｎ−［２−アセトアミド］−２−イミノ二酢酸）、ＡＣＥＳ：（２−［２−アセトアミノ］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ：（１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ：（３−［Ｎ−モルホリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ：（１，３ ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパン］）、ＢＥＳ：（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ：（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ：（２−［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチルアミノ］エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ：（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン）酸）、ＤＩＰＳＯ：（３−Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン）酸）、ＭＯＢＳ：（４−Ｎ−モルホリノブタンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ：（３［Ｎ−トリス−ヒドロキシメチル−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＲＩＳ：（２−アミノ−２−［ヒドロキシメチル］−１，３−プロパンジオール）、ＨＥＰＰＳＯ：（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ′−［２−ヒドロキシプロパンスルホン］酸）、ＰＯＰＳＯ：（ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス［２−ヒドロキシプロパンスルホン］酸）、ＴＥＡ：（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ：（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ′−［３−プロパンスルホン］酸）、ＴＲＩＣＩＮＥ：（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチルグリシン）、ＧＬＹ−ＧＬＹ：（ジグリシン）、ＢＩＣＩＮＥ：（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−グリシン）、ＨＥＰＢＳ：（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ′−［４−ブタンスルホン］酸）、ＴＡＰＳ：（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン］酸）、ＡＭＰＤ：（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）、ＴＡＢＳ：（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−４−アミノブタンスルホン酸）、ＡＭＰＳＯ：（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ：（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ：（３−［シクロヘキシルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＡＭＰ：（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ＣＡＰＳ：（３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸）またはＣＡＢＳ：（４−［シクロヘキシルアミノ］−１−ブタンスルホン酸）が、好ましくは、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳまたはＣＡＢＳを挙げられる。開示された方法および組成物中における、少なくとも１種の利用される緩衝液の選択は、系のｐＨの制御、目的のタンパク質またはペプチドの等電点（ｐＩ）に基づく可溶性の最適化、ならびに、ｐＨ調整（ｐＩを達成させる）のための成分の緩衝を促進する。

開示された方法および組成物中に含まれる、緩衝液は、当業者が決定できる様々な濃度とすることができる。例えば、開示方法の特定の実施形態において、緩衝液の濃度は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１４５ｍＭまたは約１５０ｍＭ、または、これらの値の間の任意の量とすることができる。例えば、ＰＢＳ緩衝液系を利用する、例示的な実施形態において、濃度は、約１０ｍＭ ＰＢＳとすることができる。また、ＴＲＩＳ緩衝液系を利用する、例示的な実施形態において、濃度は、約１０ｍＭ ＴＲＩＳまたは約８０ｍＭ ＴＲＩＳとすることができる。

加えて、理想的なタンパク質安定化の達成および維持には、緩衝液系のｐＨが、重要である。開示された系中に含まれる、緩衝液は、当業者が決定できる様々なｐＨ水準に、設定することができる。例えば、開示方法の特定の実施形態において、緩衝液のｐＨは、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、または 約８．５、約９、約９．５、約１０、またはこれらの値の間の値である。すなわち、開示方法における選択緩衝液のｐＨは、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０，約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９、または約１０とすることができる。例えば、ＰＢＳ緩衝液系を利用する、例示的な実施形態において、ｐＨは、約７．４とすることができる。また、ＴＲＩＳ緩衝液系を利用する、例示的な実施形態において、ｐＨは、約８．０とすることができる。

開示された方法および組成物は、医薬的に許容される緩衝剤等の、さらなる緩衝剤を含むことができる。緩衝剤として、例えば、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール≧９９．５％（ＮＴ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール≧９９．０％（ＧＣ）、Ｌ−（＋）−酒石酸≧９９．５％（Ｔ）、ＡＣＥＳ≧９９．５％（Ｔ）、ＡＤＡ≧９９．０％（Ｔ）、酢酸≧９９．５％（ＧＣ／Ｔ）、酢酸：発光用 ≧９９．５％（ＧＣ／Ｔ）、酢酸アンモニウム溶液：分子生物学用 Ｈ_２Ｏ中〜５Ｍ、酢酸アンモニウム：発光用 ≧９９．０％（乾燥物質を基準に計算、Ｔ）、重炭酸アンモニウム≧９９．５％（Ｔ）、クエン酸アンモニウム 二塩基≧９９．０％（Ｔ）、ギ酸アンモニウム溶液：Ｈ_２Ｏ中１０Ｍ、ギ酸アンモニウム≧９９．０％（乾燥物質を基準に計算、ＮＴ）、シュウ酸アンモニウム一水和物≧９９．５％（ＲＴ）、リン酸アンモニウム 二塩基溶液：Ｈ_２Ｏ中２．５Ｍ、リン酸アンモニウム 二塩基≧９９．０％（Ｔ）、リン酸アンモニウム一塩基溶液：Ｈ_２Ｏ中２．５Ｍ、リン酸アンモニウム 一塩基≧９９．５％（Ｔ）、リン酸アンモニウムナトリウム 二塩基・四水和物≧９９．５％（ＮＴ）、硫酸アンモニウム溶液：分子生物学用 Ｈ_２Ｏ中３．２Ｍ、酒石酸アンモニウム 二塩基溶液：Ｈ_２Ｏ中２Ｍ（２０℃で無色溶液）、酒石酸アンモニウム 二塩基≧９９．５％（Ｔ）、ＢＥＳ緩衝生理食塩水：分子生物学用、２倍濃度 ＢＥＳ≧９９．５％（Ｔ）、ＢＥＳ：分子生物学用 ≧９９．５％（Ｔ）、ＢＩＣＩＮＥ緩衝液：分子生物学用 Ｈ_２Ｏ中１Ｍ、ＢＩＣＩＮＥ≧９９．５％（Ｔ）、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ≧９９．０％（ＮＴ）、重炭酸緩衝液＞０．１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３、＞０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３、ホウ酸≧９９．５％（Ｔ）、ホウ酸：分子生物学用 ≧９９．５％（Ｔ）、ＣＡＰＳ≧９９．０％（ＴＬＣ）、ＣＨＥＳ≧９９．５％（Ｔ）、酢酸カルシウム水和物≧９９．０％（乾燥物質を基準に計算、ＫＴ）、炭酸カルシウム：沈殿物 ≧９９．０％（ＫＴ）、クエン酸カルシウム 三塩基・四水和物≧９８．０％（乾燥物質を基準に計算、ＫＴ）、クエン酸濃厚溶液：分子生物学用 Ｈ_２Ｏ中１Ｍ、クエン酸無水物≧９９．５％（Ｔ）、クエン酸無水物：発光用 ≧９９．５％（Ｔ）、ジエタノールアミン≧９９．５％（ＧＣ）、ＥＰＰＳ≧９９．０％（Ｔ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物：分子生物学用 ≧９９．０％（Ｔ）、ギ酸溶液：Ｈ_２Ｏ中１．０Ｍ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ≧９９．０％（ＮＴ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ≧９９．５％（ＮＴ）、グリシン≧９９．０％（ＮＴ）、グリシン：発光用 ≧９９．０％（ＮＴ）、グリシン：分子生物学用 ≧９９．０％（ＮＴ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水：分子生物学用 ２倍濃度 ＨＥＰＥＳ≧９９．５％（Ｔ）、ＨＥＰＥＳ：分子生物学用 ≧９９．５％（Ｔ）、イミダゾール緩衝液：Ｈ_２Ｏ中１Ｍ、イミダゾール≧９９．５％（ＧＣ）、イミダゾール：発光用 ≧９９．５％（ＧＣ）、イミダゾール：分子生物学用 ≧９９．５％（ＧＣ）、リポタンパク質再折り畳み緩衝液：酢酸リチウム・二水和物≧９９．０％（ＮＴ）、クエン酸リチウム 三塩基・四水和物≧９９．５％（ＮＴ）、ＭＥＳ水和物≧９９．５％（Ｔ）、ＭＥＳ一水和物：発光≧９９．５％（Ｔ）、ＭＥＳ溶液：分子生物学用Ｈ_２Ｏ中０．５Ｍ、ＭＯＰＳ≧９９．５％（Ｔ）、ＭＯＰＳ：発光用 ≧９９．５％（Ｔ）、ＭＯＰＳ：分子生物学用 ≧９９．５％（Ｔ）、酢酸マグネシウム溶液：分子生物学用 Ｈ_２Ｏ中〜１Ｍ、酢酸マグネシウム・四水和物≧９９．０％（ＫＴ）、クエン酸マグネシウム 三塩基一水和物≧９８．０％（乾燥物質を基準に計算、ＫＴ）、ギ酸マグネシウム溶液：Ｈ_２Ｏ中０．５Ｍ、リン酸マグネシウム 二塩基・三水和物≧９８．０％（ＫＴ）、ｉｎ−ｓｉｔｕ ハイブリッド形成法用の中和溶液：分子生物学用、シュウ酸二水和物≧９９．５％（ＲＴ）、ＰＩＰＥＳ≧９９．５％（Ｔ）、ＰＩＰＥＳ：分子生物学用 、≧９９．５％（Ｔ）、リン酸緩衝生理食塩水（オートクレーブ処理）、リン酸緩衝生理食塩水：ウエスタンブロット中、ペルオキシダーゼ抱合体の洗浄用緩衝液 １０倍濃度、ピペラジン 無水物≧９９．０％（Ｔ）、Ｄ−酒石酸カリウム 一塩基≧９９．０％（Ｔ）、酢酸カリウム溶液：分子生物学用、酢酸カリウム溶液：分子生物学用 Ｈ_２Ｏ中５Ｍ、酢酸カリウム溶液：分子生物学用 Ｈ_２Ｏ中〜１Ｍ、酢酸カリウム≧９９．０％（ＮＴ）、酢酸カリウム：発光用 ≧９９．０％（ＮＴ）、酢酸カリウム：分子生物学用 ≧９９．０％（ＮＴ）、重炭酸カリウム≧９９．５％（Ｔ）、炭酸カリウム 無水物≧９９．０％（Ｔ）、塩化カリウム≧９９．５％（ＡＴ）、クエン酸カリウム 一塩基≧９９．０％（乾燥物、ＮＴ）、クエン酸カリウム 三塩基 溶液：Ｈ_２Ｏ中１Ｍ、ギ酸カリウム溶液：Ｈ_２Ｏ中１４Ｍ、ギ酸カリウム≧９９．５％（ＮＴ）、シュウ酸カリウム 一水和物≧９９．０％（ＲＴ）、リン酸カリウム 二塩基、無水物≧９９．０％（Ｔ）、リン酸カリウム 二塩基、無水物：発光用 ≧９９．０％（Ｔ）、リン酸カリウム 二塩基、無水物：分子生物学用 ≧９９．０％（Ｔ）、リン酸カリウム 一塩基、無水物≧９９．５％（Ｔ）、リン酸カリウム 一塩基、無水物：分子生物学用 ≧９９．５％（Ｔ）、リン酸カリウム 三塩基 一水和物≧９５％（Ｔ）、フタル酸カリウム 一塩基≧９９．５％（Ｔ）、酒石酸カリウムナトリウム溶液：Ｈ_２Ｏ中１．５Ｍ、酒石酸カリウムナトリウム 四水和物≧９９．５％（ＮＴ）、四ホウ酸カリウム 四水和物≧９９．０％（Ｔ）、四シュウ酸カリウム 二水和物≧９９．５％（ＲＴ）、プロピオン酸溶液：Ｈ_２Ｏ中１．０Ｍ、ＳＴＥ緩衝液：分子生物学用 ｐＨ７．８、ＳＴＥＴ緩衝液：分子生物学用 ｐＨ８．０、５，５−ジエチルバルビツール酸ナトリウム≧９９．５％（ＮＴ）、酢酸ナトリウム溶液：分子生物学用 Ｈ_２Ｏ中〜３Ｍ、酢酸ナトリウム 三水和物≧９９．５％（ＮＴ）、酢酸ナトリウム、無水物≧９９．０％（ＮＴ）、酢酸ナトリウム、無水物：発光用 ≧９９．０％（ＮＴ）、酢酸ナトリウム、無水物：分子生物学用 ≧９９．０％（ＮＴ）、重炭酸ナトリウム≧９９．５％（Ｔ）、二酒石酸ナトリウム、一水和物≧９９．０％（Ｔ）、炭酸ナトリウム、十水和物≧９９．５％（Ｔ）、炭酸ナトリウム、無水物≧９９．５％（乾燥物質基準で計算、Ｔ）、クエン酸ナトリウム 一塩基、無水物≧９９．５％（Ｔ）、クエン酸ナトリウム 三塩基、二水和物≧９９．０％（ＮＴ）、クエン酸ナトリウム 三塩基、二水和物：発光用 ≧９９．０％（ＮＴ）、クエン酸ナトリウム 三塩基、二水和物：分子生物学用 ≧９９．５％（ＮＴ）、ギ酸ナトリウム溶液：Ｈ_２Ｏ中８Ｍ、シュウ酸ナトリウム≧９９．５％（ＲＴ）、リン酸ナトリウム 二塩基、二水和物≧９９．０％（Ｔ）、リン酸ナトリウム 二塩基、二水和物：発光用 ≧９９．０％（Ｔ）、リン酸ナトリウム 二塩基、二水和物：分子生物学用 ≧９９．０％（Ｔ）、リン酸ナトリウム 二塩基、十水和物≧９９．０％（Ｔ）、リン酸ナトリウム 二塩基溶液：Ｈ_２Ｏ中０．５Ｍ、リン酸ナトリウム二塩基 無水物≧９９．５％（Ｔ）、リン酸ナトリウム 二塩基：分子生物学用 ≧９９．５％（Ｔ）、リン酸ナトリウム 一塩基、二水和物≧９９．０％（Ｔ）、リン酸ナトリウム 一塩基、二水和物：分子生物学用 ≧９９．０％（Ｔ）、リン酸ナトリウム 一塩基、一水和物：分子生物学用 ≧９９．５％（Ｔ）、リン酸ナトリウム 一塩基溶液：Ｈ_２Ｏ中５Ｍ、ピロリン酸ナトリウム 二塩基≧９９．０％（Ｔ）、ピロリン酸ナトリウム 四塩基、十水和物≧９９．５％（Ｔ）、酒石酸ナトリウム 二塩基、二水和物≧９９．０％（ＮＴ）、酒石酸ナトリウム 二塩基溶液：Ｈ_２Ｏ中１．５Ｍ（２０℃で無色溶液）、四ホウ酸ナトリウム、十水和物≧９９．５％（Ｔ）、ＴＡＰＳ≧９９．５％（Ｔ）、ＴＥＳ≧９９．５％（乾燥物質を基準に計算、Ｔ）、ＴＭ緩衝液：分子生物学用 ｐＨ７．４、ＴＮＴ緩衝液：分子生物学用 ｐＨ８．０、ＴＲＩＳグリシン緩衝液、１０倍濃度、ＴＲＩＳ酢酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液：分子生物学用、ＴＲＩＳ緩衝食塩水１０倍濃度、ＴＲＩＳグリシンＳＤＳ緩衝液：電気泳動用 １０倍濃度、ＴＲＩＳリン酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液：分子生物学用：濃縮１０倍濃度、Ｔｒｉｃｉｎｅ≧９９．５％（ＮＴ）、トリエタノールアミン≧９９．５％（ＧＣ）、トリエチルアミン≧９９．５％（ＧＣ）、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液：揮発性緩衝液、Ｈ_２Ｏ中〜１．０Ｍ、リン酸トリエチルアンモニウム溶液：揮発性緩衝液、Ｈ_２Ｏ中〜１．０Ｍ、酢酸トリメチルアンモニウム溶液：揮発性緩衝液、Ｈ_２Ｏ中〜１．０Ｍ、リン酸トリメチルアンモニウム溶液：揮発性緩衝液、Ｈ_２Ｏ中〜１Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液：分子生物学用：濃縮物１００倍濃度、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液：分子生物学用 ｐＨ７．４、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ 緩衝液：分子生物学用 ｐＨ８．０、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）酢酸塩≧９９．０％（ＮＴ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基≧９９．８％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基≧９９．８％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基：発光用≧９９．８％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基：分子生物学用≧９９．８％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）炭酸塩≧９８．５％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩緩衝液：分子生物学ｐＨ７．２、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩緩衝液：分子生物学ｐＨ７．４、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩 緩衝液：分子生物学用ｐＨ７．６、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩 緩衝液：分子生物学用ｐＨ８．０、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩≧９９．０％（ＡＴ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩：発光用 ≧９９．０％（ＡＴ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩：分子生物学用≧９９．０％（ＡＴ）およびＴｒｉｚｍａ（登録商標）マレイン酸塩≧９９．５％（ＮＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｃ．還元剤
ジスルフィド結合：多くの細胞外タンパク質は、ジスルフィド結合を含んでいる。これらのタンパク質中において、ジスルフィド結合の存在は、折り畳まれた状態にかなりの安定性を付加し、多くの場合、シスチン結合の還元はアンフォールディングを誘発するのに充分である。安定性の源泉は、エンタルピーの要因よりは、寧ろ、エントロピーの要因ようである。ジスルフィド結合の導入は、無秩序なポリペプチド鎖に利用可能な自由度を減少させることにより、アンフォールディング状態のエントロピーを低減させる。これは、折り畳まれた状態と、アンフォールディング状態との間のエントロピー差を減少させることにより、折り畳まれた状態を安定化させる。ジスルフィド結合の安定化に関連して、提案された安定化フローチャートの例を、図３に示す。

１種またはそれ以上の還元剤の添加を介して、本開示の緩衝液安定化系中において、重要なジスルフィド結合を、強化または構築することができる。開示された安定化系中での使用に適する還元剤として、医薬的に許容される還元剤、例えば、システイン、グルタチオン、グルタチオンとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの組み合わせ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システアミン、チオレドキシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、アルファリポ酸、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタンスルホン酸、メルカプトプロピオニルグリシン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）ならびに、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。キレート化剤として、ＥＤＴＡは、スルフヒドリル基の金属で触媒された酸化を阻害し、そして、それによりジスルフィドで連結された凝集体の形成を低減させることができる。ＥＤＴＡの好ましい濃度は、０．００１〜０．５％、より好ましくは、０．００５〜０．４％、より好ましくは、０．００７５〜０．３％、あるいは、さらにより好ましくは０．０１〜０．２％である。

Ｄ．塩
イオン性相互作用：タンパク質中における、２つの反対電荷のイオン性基の会合は、塩架橋またはイオン対として知られており、そして、大部分のタンパク質に一般的な特徴である。一般に、これらの相互作用は、単離したイオン基は、水により非常に効果的に溶媒和されるため、タンパク質の安定性に、ほとんど寄与していない。その結果、タンパク質の内部には、極わずかな非溶媒和塩架橋が見られるのみである。

１種またはそれ以上の塩の添加を介して、本開示の緩衝液安定化系中において、重要なイオン性相互作用を強化または構築することができる。好ましい実施形態において、開示された方法中で利用される塩として、塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムならびに塩化カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。開示された方法および組成物中への、１種またはそれ以上の塩の組み入れは、イオン強度に依る水の表面張力の増大、および、特に、タンパク質ドメインのイオン依存性折り畳みを安定化させる際（例えば、ｒＰＡはカルシウム依存性結合ドメインを有する）、イオン強度の最適化を助ける。

塩は、浸透圧調節剤として機能し、調合組成の等張性に貢献し、開示された組成物中に添加することができる。本発明に有用な浸透圧調節剤として、先に列挙した塩が挙げられる。

１種またはそれ以上の塩を、当業者が決定できる様々な濃度で、開示される系中に含むことができる。例えば、開示された方法の特定の実施形態において、塩化カルシウムの濃度は、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１４５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１５５ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１６５ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１８５ｍＭ、約１９０ｍＭ、約１９５ｍＭ、約２００ｍＭ、またはこれらの値の間の任意の値とすることができる。例えば、塩化ナトリウムを利用する、例示的な実施形態において、濃度は、約１００〜約１５０ｍＭとすることができる。塩化カルシウムを利用する、例示的な実施形態において、濃度は、約１００〜約１５０ｍＭとすることができる。すなわち、例えば、開示された方法中において、選択された塩の濃度は、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９、約２００ｍＭ、またはこれらの値の間の任意の値とすることができる。塩化マグネシウムを利用する、例示的な実施形態において、濃度は、約１〜約１５０ｍＭである。すなわち、例えば、開示された方法中において、選択された塩の濃度は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０ｍＭ、またはこれらの値の間の値とすることができる。

本発明のために好ましい塩として、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ_２が挙げられる。ＮａＣｌの好ましい濃度は、約７５〜１５０ｍＭである。ＭｇＣｌ_２の好ましい濃度は、約１〜１５０ｍＭである。

Ｅ．アミノ酸
双極子-双極子相互作用：双極子-双極子相互作用は、永久双極子または誘起双極子の近接会合よって、生起される弱い相互作用である。総称的に、これらの力は、ファンデルワールス相互作用として知られている。タンパク質は、その強度がかなり異っている、多数のこの種の相互作用を含んでいる。最も強い相互作用は、永久双極子の間で観察され、そして、ペプチド結合の重要な特徴である。ロンドンまたは分散力は、全ての双極子-双極子作用のうち、最弱である。一つの群として、リガンドがタンパク質であっても小さい分子であっても、タンパク質と、その相補的なリガンドとの間の相互作用を安定化させるためにファンデルワールス力が重要である。双極子-双極子相互作用の安定化に関連する、提案された安定化フローチャートの例を図４に示す。

アミノ酸の添加を介して、本開示の緩衝液安定化系中において、重要な双極子-双極子相互作用を強化または構築することができる。好ましい実施形態において、開示された方法中において利用される、１種またはそれ以上のアミノ酸として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の方法および組成物中においては、アミノ酸の修飾体および／または合成型も、利用することができ、例えば、非天然的にコードされたアミノ酸として、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸エステル、ボロン酸エステル、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトまたはアミノで置換されたアミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせ；光活性化性架橋剤を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射活性アミノ酸；フォトケージおよび／または光異性化性アミノ酸；ビオチンまたはビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化または炭水化物変性アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的分解性または光分解性アミノ酸；延長側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば、糖置換セリン等；炭素連結糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，α二置換アミノ酸；α，β−アミノ酸、およびプロリン以外の環式アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態において、アミノ酸は、ヒスチジン、グルタチオンまたはアラニンとすることができる。開示された方法および組成物中への、１種またはそれ以上のアミノ酸の組み込みは、折り畳み中間体の凝集、反応性酸素および窒素種によるラジカル攻撃の抑制、および変性の防止は勿論のこと、タンパク質結合、緩衝性能および酸化防止剤特性の誘導を促進する。

上述の塩と同様に、アミノ酸も、浸透圧調節剤と見なすこともできる。医薬的に許容され、この目的に適しているアミノ酸として、プロリン、アラニン、Ｌ−アルギニン、アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、セリン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。本発明にとって好ましいアミノ酸は、ヒスチジンである。ヒスチジンの好ましい濃度は、およそ５〜８０ｍＭである。

１種またはそれ以上のアミノ酸を、当業者が決定できる様々な濃度で、開示された系中に含ませることができる。例えば、開示された方法の特定の実施形態において、アミノ酸の濃度は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、またはこれらの値の間の任意の値とすることができる。例えば、グルタチオンを利用する、例示的な実施態様において、グルタチオンの濃度は、約１６ｍＭである。ヒスチジンを利用する、例示的な実施態様において、ヒスチジンの濃度は、約２０ｍＭまたは約６０ｍＭである。アラニンを利用する、例示的な実施形態において、アラニンの濃度は、約１０ｍＭである。すなわち、開示された方法中において選択されたアミノ酸の濃度は、例えば、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００ｍＭ、またはこれらの値の間の任意の値とすることができる。

Ｆ．付加的な成分
開示された方法または組成物中における使用に適する、付加的な化合物として、１種またはそれ以上の溶媒、例えば、有機リン酸塩系溶媒、充填剤、着色剤、医薬的に許容される添加物、防腐剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、キレート化剤などが挙げられるが、これらに限定されない。予め調製された組成物中に、該付加的な化合物を混入することができる、あるいは、該付加的な化合物を、さらに調性されるべき、当初の混合物に添加することもできる。これらのうち特定の実施形態において、１種またはそれ以上の付加的な化合物を、使用直前に、存在している開示された組成物中に混入することができる。

開示された組成物中において、適切な防腐剤としは、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンズアルコニウム、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン、イミダゾリジニル尿素、フェノール、ソルビン酸カリウム、安息香酸、ブロノポール、クロロクレゾール、パラベンエステル、フェノキシエタノール、ソルビン酸、アルファ−トコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、クエン酸、エデト酸、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な防止剤としては、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン（ビス（ｐ−クロロフェニルジグアニド）ヘキサン）、クロルフェネシン（３−（−４−クロロフェノキシ）−プロパン−１，２−ジオール）、Ｋａｔｈｏｎ ＣＧ（メチルおよびメチルクロロイソチアゾリノン）、パラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルヒドロベンゾエート）、フェノキシエタノール（２−フェノキシエタノール）、ソルビン酸（ソルビン酸カリウム、ソルビン酸）、Ｐｈｅｎｏｎｉｐ（フェノキシエタノール、メチル、エチル、ブチル、プロピルパラベン）、Ｐｈｅｎｏｒｏｃ（フェノキシエタノール０．７３％、メチル パラベン０．２％、プロピル パラベン ０．０７％）、Ｌｉｑｕｉｐａｒ Ｏｉｌ（イソプロピル、イソブチル、ブチルパラベン）、Ｌｉｑｕｉｐａｒ ＰＥ（７０％フェノキシエタノール、３０％Ｌｉｑｕｉｐａｒオイル）、Ｎｉｐａｇｕａｒｄ ＭＰＡ（ベンジルアルコール（７０％）、メチル＆プロピルパラベン）、Ｎｉｐａｇｕａｒｄ ＭＰＳ（プロピレングリコール、メチル＆プロピルパラベン）、Ｎｉｐａｓｅｐｔ（メチル、エチルおよびプロピルパラベン）、Ｎｉｐａｓｔａｔ（メチル、ブチル、エチルおよびプロピルパラベン）、Ｅｌｅｓｔａｂ ３８８（プロピレングリコール中フェノキシエタノール＋クロルフェネシンおよびメチルパラベン）、および Ｋｉｌｌｉｔｏｌ（７．５％クロルフェネシンおよび７．５％メチルパラベン）が挙げられるが、これらに限定されない。

開示された組成物は、さらに、少なくとも１種のｐＨ調整剤を含んでもよい。開示された組成物中における、適切なｐＨ調整剤として、ジエタノールアミノ、乳酸、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

加えて、開示された組成物は、キレート化剤を含むことができる。開示の一つの実施形態において、キレート化剤は、約０．０００５％〜約１％の量で存在する。キレート化剤として、例えば、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フィチン酸、ポリリン酸、クエン酸、グルコン酸、酢酸、乳酸およびジメルカプロールが挙げられるが、これらに限定されず、好ましいキレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸である。

開示された方法および組成物は、エマルジョンの形成を補助するために、１種またはそれ以上の乳化剤を含むことができる。乳化剤として、油／水界面において凝集して、２つの隣接液滴の間の直接接触を妨げる一種の連続薄膜を形成する化合物が挙げられる。本開示の特定の実施形態は、所望の特性を損なうことなく、水または別の水性相で所望の濃度まで容易に希釈されるナノエマルジョン組成物を特徴とする。

III．緩衝液安定化タンパク質組成物
本発明に包含される組成物は、タンパク質安定化緩衝液系と組み合わされた、折り畳まれた、球状タンパク質等の、目的のタンパク質またはペプチドを含む。

本開示は、一部分において、タンパク質構造に影響を及ぼし、そして、タンパク質の凝集および／または分解に導く、不安定または非安定化因子の全てを積極的に検査および処理することにより、タンパク質の二次および三次構造を安定化させるための、新規な最適化された組成物を目指している。

開示された緩衝液安定化タンパク質組成物は、少なくとも１種の目的のタンパク質またはペプチド、少なくとも１種の緩衝液、少なくとも１種の塩、少なくとも１種の糖、少なくとも１種の酸化防止剤、および少なくとも１種のアミノ酸を含んでいる。例示的な成分（すなわち、緩衝液、塩、糖、酸化防止剤およびアミノ酸）は、明細書および実施例の全体を通して、開示されている。開示された組成物は、熱等の、潜在的にタンパク質の変性または凝集を引き起こし得るストレス因子に導かれた場合であっても、長期間にわたって、溶液中において、タンパク質およびペプチドの驚くべきかつ予想外の安定性を呈することが証明された。

開示組成物の一つの実施形態において、安定化緩衝液系は、（１）ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）緩衝液またはＰＢＳ緩衝液；（２）少なくとも１種の塩、例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カルシウム；（３）少なくとも１種の糖、例えば、トレハロース、スクロース、グリセロールまたはマンノース；および（４）少なくとも１種のアミノ酸、例えば、ヒスチジン、アラニンまたはグルタチオンを含む。

一部の実施形態において、組成物のｐＨは、約５〜約１０の間、約６〜約９の間、または約７〜約８の間である。例えば、開示された緩衝液安定化組成物のｐＨは、例えば、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９、約１０、またはこれらの値の間の任意の値とすることができる。

もう一つの実施形態において、開示された組成物は、少なくとも１種の糖を含む。好ましい糖として、トレハロースおよびスクロースが挙げられるが、これらに限定されない。糖は、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％または約４５％等の、約２．５％〜約４０％またはその間の任意の量からなる群より選択される量で存在することができる。開示された組成物の他の実施形態では、糖の濃度は、約２．５％、約５％、約１０％、約１５％または約２０％とすることができる。従って、開示された方法において選択された糖の濃度は、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、約１１、約１１．５、約１２、約１２．５、約１３、約１３．５、約１４、約１４．５、約１５、約１５．５、約１６、約１６．５、約１７、約１７．５、約１８、約１８．５、約１９、約１９．５、約２０、約２０．５、約２１、約２１．５、約２２、約２２．５、約２３、約２３．５、約２４、約２４．５、約２５％、またはこれらの値の間の任意の量とすることができる。

１種またはそれ以上の塩を、当業者が決定できる様々な濃度で、開示された系（例えば、方法ならびに組成物）中に含ませることができる。例えば、開示された組成物の特定の実施形態において、アミノ酸の濃度は、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１４５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１５５ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１６５ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１８５ｍＭ、約１９０ｍＭ、約１９５ｍＭまたは約２００ｍＭとすることができる。例えば、塩化ナトリウムを利用する、例示的な実施形態において、その濃度は、約１００〜約１５０ｍＭとすることができる。塩化カルシウムを利用する、例示的な実施形態において、その濃度は、約１００〜１５０ｍＭとすることができる。すなわち、開示された組成物中における、選択された塩の濃度は、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９、約２００ｍＭ、またはこれらの値の間の任意の量とすることができる。

アミノ酸の添加を介して、本開示の緩衝液安定化系中において、重要な双極子-双極子相互作用を強化または構築することができる。好ましい実施形態において、開示された方法中において利用される、１種またはそれ以上のアミノ酸として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の方法および組成物中においては、アミノ酸の修飾体および／または合成型も、利用することができ、例えば、非天然的にコードされたアミノ酸として、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸エステル、ボロン酸エステル、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトまたはアミノで置換されたアミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせ；光活性化性架橋剤を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射活性アミノ酸；フォトケージおよび／または光異性化性アミノ酸；ビオチンまたはビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化または炭水化物変性アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的分解性または光分解性アミノ酸；延長側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば、糖置換セリン等；炭素連結糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，α二置換アミノ酸；α，β−アミノ酸、およびプロリン以外の環式アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態において、アミノ酸は、ヒスチジン、グルタチオンまたはアラニンとすることができる。開示された組成物中への、１種またはそれ以上のアミノ酸の組み込みは、折り畳み中間体の凝集、反応性酸素および窒素種によるラジカル攻撃の抑制、および変性の防止は勿論のこと、タンパク質結合、緩衝性能および酸化防止剤特性の誘導を促進する。

アミノ酸を、当業者が決定できる様々な濃度で、開示された系中に含ませることができる。例えば、開示された方法の特定の実施形態において、アミノ酸の濃度は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、またはこれらの値の間の任意の値とすることができる。例えば、グルタチオンを利用する、例示的な実施形態において、グルタチオンの濃度は、約１６ｍＭとすることができる。ヒスチジンを利用する、例示的な実施形態において、ヒスチジンの濃度は、約２０ｍＭまたは約６０ｍＭとすることができる。アラニンを利用する、例示的な実施形態において、アラニンの濃度は、約１０ｍＭとすることができる。すなわち、開示された組成物中における、選択されたアミノ酸の濃度は、例えば、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００ｍＭ、またはこれらの値の間の任意の値とすることができる。

開示された組成物中における使用に適する、付加的な化合物として、１種またはそれ以上の溶媒、例えば、有機リン酸塩系溶媒、充填剤、着色剤、医薬的に許容される添加物、防腐剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、キレート化剤などが挙げられるが、これらに限定されない。予め調製された組成物中に、該付加的な化合物を混入することができる、あるいは、該付加的な化合物を、さらに調性されるべき、当初の混合物に添加することもできる。これらの実施形態うち特定の場合おいて、１種またはそれ以上の付加的な化合物を、使用直前に、存在している開示された組成物中に混入することができる。そのような付加的な成分として、セクションＣの「タンパク質を安定化させる新規な方法」中において、先に列挙した成分が挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態において、開示された緩衝液安定化組成物は、さらに、少なくとも１種の還元剤を含むことができる。開示された組成物中における使用に適する、還元剤は、当該分野で知られており、そして、緩衝液安定化系中において、ジスルフィド結合を強化または構築するために、重要であり得る。開示された安定化系中における使用に適する、還元剤としは、医薬的に許容される還元剤、例えば、システイン、グルタチオン、グルタチオンとグルタチオンS-トランスフェラーゼとの組み合わせ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システアミン、チオレドキシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、アルファリポ酸、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタンスルホン酸、メルカプト−プロピオニルグリシン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ならびに、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。キレート化剤としてのＥＤＴＡは、金属で触媒された、スルフヒドリル基の酸化を阻害し、従って、ジスルフィドで連結された凝集体の生成を低減させることができる。ＥＤＴＡの好ましい濃度は、０．００１〜０．５％、より好ましくは、０．００５〜０．４％、より好ましくは。０．００７５〜０．３％、または、さらにより好ましくは、０．０１〜０．２％である。

タンパク質の安定性は、以下の因子の１種またはそれ以上により評価することができる。（１）タンパク質の物理的、化学的および／または生物学的安定性を評価する；（２）タンパク質の凝集体または微粒子が、混合組成中に存在するかを決定する；（３）タンパク質が、変性に敏感である、あるいは、変性を受けているかを測定する；（４）タンパク質を高温に曝し、そして、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、またはこれらの値の間の任意の値を超える、濃度で、タンパク質が変性または変化するかを測定することにより、タンパク質の熱安定性を評価する；（５）濃度が経時的に変化するか決定するため、タンパク質濃度を測定し、タンパク質の不安定性を実証する。例えば、タンパク質の濃度が、１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、またはこれらの値の間の値を超えて、経時的に変化する場合、それは、タンパク質の不安定性の証拠となる；（６）安定化タンパク質を含む開示された組成物の色を評価し、その際、白色ないしオフホワイトは容認され、また、黄色（明〜暗）、褐色および／または茶色は、タンパク質不安定性の指標なので、容認されない；および／または（７）不安定組成物の証拠である、粒径が経時的に著しく変化する（例えば、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％または約５０％、またはこれらの値の間の値を超える変化）かを決定するために、安定化タンパク質を含む組成物を評価する。加えて、タンパク質またはペプチドの安定性を、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約７か月、約８か月、約９か月、約１０か月、約１１か月、約１２か月、約１８か月、約２年、約２．５年、約３年、約３．５年、約４年、約４．５年、約５年、またはこれらの値の間の期間等の、所望の期間、測定することができる。

IV．医薬組成物
本開示の緩衝液安定化タンパク質組成物は、それは治療的有効量で患者に投与される、治療用タンパク質またはペプチドを含むワクチンまたは溶液等の、医薬組成物に調合することができ、そして、１種またはそれ以上の適切な医薬的に許容される佐剤、添加剤または防腐剤を含有することができる。適切な佐剤、添加剤ならびに防腐剤は、当該分野において良く知られている。

「治療的有効量」という表記により、緩衝液安定化組成物中に存在している、タンパク質または抗原が関係している、疾患、病原体、悪性腫瘍または症状を予防、治療または改善するのに効果的な組成物の任意の量が意味される。「防御免疫反応」により、該免疫反応は、疾患の予防、治療または改善に関与していることが意味される。本開示に包含されてはいるが、完全な予防までは、必要とされてはない。該免疫反応は、ここに説明している方法を用いて、あるいは、当業者により知られている方法により、評価することができる。

医薬組成物は、即時放出、持続放出、制御放出、遅延放出、あるいは、それらの組み合わせ用に、調合することができる。

本開示の作用物質は、任意の適切な投与経路により、治療のために投与することができる。好ましい経路は、投与対象者の症状および年齢、ならびに、治療される疾患に応じて、変わりえることも理解される。例えば、該組成物は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、嚢内注射または点滴、皮下注射またはインプラント）、吸入、肺吸入、鼻腔スプレーまたは点滴、粘膜、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道座薬）または局所的投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾル等）で投与することができる。本発明の組成物は、投与の各経路に適合する、従来の非毒性の医薬的に許容されるキャリア、アジュバント、賦形剤およびビヒクルを含む、適切な投与単位の混合組成に、単独でまたは組み合わせて、調合することができる。キャリアの非限定的な例として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水または生体適合性マトリクス材料、例えば、局所または局部投与用の脱細胞化肝臓マトリクス（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ． Ａ．， １０２（４）：１０１７−１０２５ （２０１４）に開示されているＤＣＭ）が挙げられる。該組成物は、任意に、プロテアーゼ阻害剤、グリセロールおよび／またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むことができる。

該組成物は、常法に従って、投与単位型で存在することができ、そして、薬学分野で良く知られている方法により調製することができる。該組成物は、例えば、活性成分を、液体キャリア、微粉砕された固体キャリまたはその両方と、均一かつ親密に接触させ、その後、必要な場合、所望の混合組成に成型することにより、調製することができる。該組成物中に、タンパク質またはペプチドは、所望の治療効果を得るのに充分な量で含有されている。例えば、開示された医薬組成物は、例えば、局所、眼内、経口、口腔内、全身、鼻腔、注入、経皮、直腸および膣を含む実質的に任意の投与態様に適合する形状、または、吸入または送気による投与に適合する形状を取ることができる。

鼻腔内投与は、投与中に、付随的な吸入を伴って、また伴うことなく、鼻を経由した投与を含む、特に好ましい投与態様である。そのような投与は、通常、該組成物を含む医薬組成物を、鼻粘膜、鼻甲介または副鼻腔との接触を介する。吸入投与は、鼻腔内投与を含み、あるいは、経口吸入を含むことができる。そのような投与は、口腔粘膜、気管支粘膜および他の上皮との接触も含むことができる。

該開示は、鼻腔内投与には限定されず、そして、該開示の医薬組成物は、経口または注射投与等の、別の手段で投与することもできる。有用な注射製剤として、水性または油性ビヒクル中の、該活性化合物の無菌の懸濁液、溶液またはエマルジョンが挙げられる。該組成物は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤等の、調製助剤も含むことができる。注射用製剤は、例えば、アンプル中、または複数回投与用容器中の単位投与形態で存在することができ、また、添加された防腐剤を含むことができる。

経口使用向けの組成物は、医薬組成物の製造の分野において知られている、任意の方法により調製することができ、そして、かかる組成物は、医薬的に洗練された口当たりの良い調製物を提供するために、甘味料、香味料、着色剤および防腐剤からなる群より選択される１種またはそれ以上の薬剤を含むことができる。錠剤は、錠剤の製造に適している、非毒性の医薬的に許容される賦形剤と混合された、活性成分（薬剤および／またはプロドラッグ）を含む。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム等も、不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチまたはアルギン酸）；結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）；および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）であり得る。錠剤は、被覆しないままとすることもでき、あるいは、崩壊および胃腸管での吸収を遅延させ、それにより長期間の持続作用を提供するために、既知の技術によって被覆することもできる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の、時間遅延材料を採用することができる。これらは、制御放出用の浸透性治療錠剤を形成するために、米国特許明細書第４，２５６，１０８、４，１６６，４５２および４，２６５，８７４号に記載されている技術により被覆することもできる。該開示の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形状とすることもできる。

経口投与用の液体調製物は、例えば、エリキシル、溶液、シロップまたは懸濁液の形状を取ることができ、あるいは、使用前に、水または他の適当なビヒクルを用いて構成するための、乾燥粉末として存在することもできる。かかる液体製剤は、例えば、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、cremophore(商標)または分画植物油)ならびに、防腐剤(例えば、p ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、またはソルビン酸) 等の、医薬的に許容される添加剤を用いて、従来法により調製することができる。該調製物は、適切な場合には、緩衝塩、防腐剤、風味量、着色剤、および甘味料も含むことができる。

医薬的投与のための例示的な投与剤形を、ここに説明する。例としては、液体、軟膏、クリーム、エマルジョン、ローション、ゲル、生体接着性ゲル、スプレー、エアロゾル、ペースト、泡、日焼け止め、カプセル、マイクロカプセル、懸濁液、ペッサリー、粉末、半固体投与剤形などが挙げられるが、これらに限定されない。

該投与用の医薬組成物は、単回投与または複数回投与として、塗用、または投与することができる。

本開示は、記載した組成物の多くの変形は、本開示の方法において有用であると期待している。候補組成物が医薬用途に適しているかを決定するために、３つの基準が検討されている。ここに記載の方法および基準を用いて、候補組成物を、適しているかを決定するために、容易に試験することができる。まず、緩衝液安定化組成物を形成することができるかどうか決定するために、ここに記載の方法を用いて、所望の成分を調製する。緩衝液安定化組成物を形成することができないと、該候補は却下される。第二に、候補緩衝液安定化組成物は、安定でなくてはならない。緩衝液安定化組成物が溶液中に維持され、タンパク質またはペプチドの生物学的活性が、目的の用途に許容されるように、充分な期間保存されるなら、緩衝液安定化組成物は安定である。例えば、貯蔵や運搬などに付される、医薬用緩衝液安定化組成物について、該緩衝液安定化組成物が、数か月から数年間、溶液中で維持されることが望まれる。比較的に不安定な、典型的緩衝液安定化組成物は、１日のうちにその状態を失う。第三に、候補医薬用緩衝液安定化組成物は、その目的の用途のための効果を有さなくてはならない。例えば、ここに開示された、医薬用緩衝液安定化組成物は、防御免疫反応または治療的効果を検出可能レベルまで誘発しなくてはならない。

多くの異なるタイプの容器中、および送達システム中において、開示された組成物を提供することができる。例えば、開示の一部の実施形態において、該組成物は、クリームまたは他の固体もしくは半固体形状で提供される。開示された組成物は、ヒドロゲル混合組成中に組み込むこともできる。

該組成物を、適切な容器中に入れて、（例えば、患者または利用者へ）配送することができる。所望の用途のために、１種またはそれ以上の単回使用、または複数回使用量を提供する、適切な容器を用いることができる。開示の一部の実施形態において、該組成物は、懸濁液または液体の形態で提供される。かかる組成物は、スプレー瓶や任意の適切な加圧スプレー装置をはじめとする、適切な容器中に入れて送達することができる。かかるスプレー瓶は、該組成物を経鼻的または吸入により、送達するのに適している。これらの容器は、キットを作製するための使用のための指示書とともに、さらに包装することができる。

V．定義
ここで使用する際、「約」は、当業者により理解され、そして、それが使用されている内容に依存して、ある程度変異する。それが使用されている、与えられた内容において、当業者に明らかでない用語が用いられている場合、「約」は、その特定の用語のプラスマイナス１０％までを意味する。

ここで使用する際、「アジュバント」という用語は、抗原（例えば、病原菌）に対する免疫反応を増加させる物質を意味する。

ここで使用する際、「免疫反応」という用語は、対象者の免疫システムが、異物と認識する、免疫原(すなわち、抗原)に対する、免疫システムによる対象者(例えば、ヒトまたは別の動物)の反応を意味する。免疫反応には、細胞媒介免疫反応(免疫システムの抗原特異的Ｔ細胞および非特異的細胞により媒介される反応)と体液性免疫反応(血漿、リンパ液および組織液中に存在する抗体により媒介される反応)との両方がある。「免疫反応」という用語は、免疫原(例えば、病原菌)に対する初期反応と、「獲得免疫」の結果としてのメモリー応答の両方を含む。

「キレーター」または「キレート化剤」という用語は、金属イオンと結合するために利用することができる孤立電子対を有する、一つより多くの原子を有する材料を意味する。

ここで使用する際、「増強された免疫」という用語は、本開示のワクチンを投与していない場合の獲得免疫の水準と比較した、本開示のワクチンを投与した後の付与病原菌への獲得免疫の水準の増加を意味する。

ここで使用する際、「免疫原」という用語は、対象者中において免疫反応を引き起こすことができる抗原を意味する。好ましい実施形態において、本開示のナノエマルジョンと組み合わせて投与した場合、免疫原は、該免疫原(例えば、病原菌または病原菌産物)に対する免疫を引き起こす。

ここで使用する際、「鼻腔内(に)」という用語は、鼻腔の皮膚および粘膜細胞および組織、例えば、鼻粘膜、副鼻腔、鼻甲介、あるいは、鼻腔を覆う他の組織および細胞の表面に、本開示の組成物を適用することを意味する。

ここで使用する際、「ナノエマルジョン」という用語は、水中小油型分散液または液滴、ならびに、水と混和しない油相を水相と混ぜたときに非極性残基(すなわち、長炭化水素鎖)を水から離し極性頭部基を水に近づける疎水性力の結果として形成することができる他の脂質構造を含む。これらの他の脂質構造として、単層、寡層および多層脂質小胞、ミセル、およびラメラ相が挙げられるが、これらに限定されない。本開示は、ここに開示された特定の実施形態の理解のために必要な場合、当業者はこの差違を識別できると期待する。

ここで使用する際、「医薬的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、ホスト(例えば、動物またはヒト)に投与した際、有害なアレルギーまたは有害な免疫反応を実質的に生じさせない、組成物を意味する。かかる配合組成として、医薬的に許容される投与剤形が挙げられる。かかる医薬的に許容される投与形態として、例えば、ディップ、スプレー、種子粉衣、茎部注入、凍結乾燥投与形態、スプレーおよびミストが挙げられるが、これらに限定されない。ここで使用する際、「医薬的に許容されるキャリア」という用語は、任意かつ全ての溶媒、分散媒、被覆剤、湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)、等張剤および吸収遅延剤、崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン)等を含む。

ここで使用する際、「局所的(に)」という用語は、皮膚および粘膜細胞および組織(例えば、口腔内、舌、舌下、咀嚼器官、呼吸器官または鼻粘膜、鼻甲介、および中空器官または体腔の内側を覆う他の組織および細胞)の表面に、本開示の組成物を適用することを意味する。

ここで使用する際、「ウイルス粒子」という用語は、成熟したビリオン、部分的ビリオン、空カプシド、欠陥干渉粒子およびウイルス外皮を意味する。

「投与」は、治療の経過全体を通して、単回、連続的または間欠的に実施することができる。投与の最も効果的な手段および投与量を決定する方法は、当業者に知られており、そして、治療に使用される組成物、治療の目的、治療される標的細胞、治療される疾患および治療される患者に依存して、変動させることができる。単回または複数回投与は、治療医師により選択される、投与水準およびパターンに従って、実施することができる。適切な投与混合組成および投与方法は、当該分野で知られている。投与経路も決定することができ、そして、最も効果的な投与経路を決定する方法は、当業者に知られており、そして、治療に使用される組成物、治療の目的、治療される患者の健康状態および病期、および標的細胞または組織によって、変動することができる。投与経路の非限定的の例として、経口投与、鼻腔内投与、吸入、注射、および局所投与が挙げられる。

ここで使用する際、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が列挙した要素を含んでいるが、しかし、他の要素を排除していないことを意味する。該組成物および方法を定義するために使用された場合、「から本質的になる」は、該組成物または方法に対して、本質的に意義がある他の要素を排除することを意味している。「からなる」は、規定された組成物および実質的方法工程のための、他の成分の微量な要素すらも排除していることを意味している。これらの推移する用語の各々により定義された実施形態は、本開示の技術的範囲に含まれる。従って、該方法および組成物は、さらなる工程および成分を含むことができる（「含む」）、または、重要性のない工程および組成物を含む（「から本質的になる」）、あるいは、記載された方法工程または組成物のみを含む（「からなる」）ことが意図される。

該開示は、説明目的でのみ提供される、以下の実施例を参照してさらに説明される。該開示は、それら実施例には限定されず、むしろ、ここに提供された教示から明らかな全ての変形を含む。米国特許に限定はさらないが、ここで引用された全ての公共的に利用できる文献は、参照によって、具体的に援用される。

例
例１−ｒＰＡの安定化
この例の目的は、構造に影響を与えて、そして、タンパク質の凝集および分解に導く、不安定化または非安定化因子の全てを積極的に検査および処理することにより、球状タンパク質の二次および三次構造を安定化するために、種々の組成物を最適化することであった。

ワクチン配合組成用の安定化添加物の選択：
以下の表に示す種々の配合組成について、スクリーニング研究を実施した。さらに、表１０〜１２は、ここで試験された基本形１、２および３用の配合組成を列挙している。これらは、配合組成開発を導くため、ならびに、最終的な配合組成選択において使用する、添加物を絞り込むために用いられた、スクリーニング安定性研究である。種々の基本形の配合組成を、安定性試験にかけた。

表１は、調査された、種々の緩衝液系および付加的な安定化添加物を記載している。様々な基本形の配合組成を、安定性試験にかけ、そして、以下の表中に説明されている。特に、リン酸緩衝液またはＴＲＩＳ緩衝液の、異なる緩衝液系が、主成分として評価され、次に、付加的な添加物を、マトリクス型デザインで添加した。

安定化糖の選択は、高温における、モデルタンパク質抗原ｒＰＡの保護を助ける。モデルタンパク質抗原ｒＰＡを凝集から保護するための、最適ｐＨは、図５に示され、トレハロースの最適濃度は、図６に示されている。Jiangら著「Anthrax Vaccine Powder Formulations for Nasal Mucosal Delivery」 Journal of Pharmaceutical Sciences, 95: 80-96 (2006)を参照。

ｐＨおよび温度の効果は、相図によって評価され、そして、最も安定な相が、ｐＨが７〜８である、図５の下方右側の角に見出された。これより低いｐＨでは、ｐＨ３付近では、溶融球様構造が明らかである。すなわち、ｐＨ７．４〜８が、基本形のタンパク質抗原配合組成のための目標ｐＨであった。

ｒＰＡ溶液を加熱しながら、トレハロースを含むタンパク質抗原配合組成の幾つかの濃度が評価され、そして、可能性のある安定化剤、トレハロースは、Ｊｉａｎｇらにおいても同定されている。二糖類である、トレハロースが、最も効果的な凝集阻害剤の一つであると判明した。図６に示すように、ｒＰＡ凝集の阻害の程度は、濃度依存的であった。この場合、トレハロースの約５％またはそれより高い濃度が、二次構造分子の混合物（例えば、ａ−ヘリックスとｂ−シート）からなっている、タンパク質凝集の５０％阻害を引き起こした。すなわち、５％および１５％のトレハロースが、タンパク質抗原の安定性の促進に関して、さらに検討した２つの濃度であった。さらなる検討のため、スクロースおよびマンニトールを選択した。しかしながら、この選択に引き続いて、図７に示すように、２〜８℃で長期間保存において、マンニトールは、溶液から晶出することが発見された。よって、この特定タンパク質に対する、評価のための更なる配合組成考察から、マンニトールは除かれた。

例２−ｒＰＡを含む基本形配合組成
この例の目的は、タンパク質抗原の安定性のための基本形配合組成デザインを特定することであった。組み換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）を、モデルタンパク質抗原として用いた。安定化系の例示的な配合組成を表１０〜１２に示す。

研究において使用するｒＰＡ濃度は、１００μｇ ｒＰＡ／ｍＬおよび５００μｇ ｒＰＡ／ｍＬの濃度に区分した。リン酸緩衝液系中の基礎の配合組成を、５℃、２５℃および４０℃で１か月および３か月の安定性試験にかけた。基本形配合組成を、−２０℃、５℃および２５℃で、より長い安定性時点（例えば、１、３、６および１２か月まで）まで貯蔵した。基本形配合組成は、４０℃でも貯蔵し、１、３および６か月において、分析した。

安定性アッセイは、外観、ｐＨ、粒径、塩化セチルピリジニウム有効性（ＣＰＣ有効性、％ＣＰＣ）およびｒＰＡ用定性ウエスタンブロット（ＭＷ＝８３ｋＤａ）を含み、ｒＰＡ有効性（％ｒＰＡ）は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定した。ＣＰＣは、試験した組成物（全てナノエマルジョン）中に存在する化合物であり、そして、ＣＰＣの測定は、ナノエマルジョン組成物の有効性が経時的に低下するかを決定するための「マーカー」として使用することができる。

図2〜4は、本発明の方法における。安定化添加物の選択に使用された、決定木の模式図を示す。最適化された、３シリーズの基本形配合組成および添加物変数を、図中において強調している。

例３−ｒＨ５の熱安定性に対する添加物の効果
この例の目的は、リン酸緩衝液（１０ｍＭ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）またはＴＲＩＳ緩衝液（１０ｍＭ、１５０ｍＭ）への異なる添加物の添加が、熱的ストレスがかかった状態において、モデルタンパク質ｒＨ５に影響を及ぼすかを評価することであった。

ｒＨ５溶液の濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬであった。ｒＨ５は、約５０〜６０℃付近までの温度では、熱安定性である。この温度を超える熱ストレスは、アンフォールディングおよび凝集を引き起こす。

０．５ｍｇ／ｍＬ ｒＨ５を含む溶液（対照および試験配合組成）を調製し、ガラス瓶およびキャップ中に配置した。配合組成のまとめを、表２中に示す。サンプルを、予備設定温度６０℃の加熱ブロック内に、５分間配置した。ｒＨ５の安定性の評価は、粒径分析およびサイズ排除ＨＰＬＣを用いて実施した。

安定性評価は、動的光散乱を用いる粒径分析により測定した。対照サンプル（非加熱）および加熱サンプルについて、平均粒径（Ｚ平均）を測定し決めた。サンプルの粒径およびＰｄＩを、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０（マルバーン・インスツルメンツ、ウスターシャー州、英国）を使用し、光子相関分光法を使用する動的光散乱により測定した。全ての測定は、希釈することなく、２５℃にて実施した。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるｒＨ５の純度決定のための分析法。

用いられた方法のパラメーターを、表３：ｒＨ５決定用のサイズ排除ＨＰＬＣパラメーター、に示す。

例４−熱安定化ｒＨ５の粒径分析
配合組成の粒径に対する、緩衝液系の効果を評価するために、全ての対照および加熱サンプルについて、平均粒径（Ｚ平均）を測定した。図１０に示すように、これは、不安定なタンパク質に結びつく、タンパク質の凝集を評価するために行った。

サンプルの粒径およびＰｄＩは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０（マルバーン・インスツルメンツ， ウスターシャー州， 英国）を使用して、光子相関分光法を用いる動的光散乱により測定した。全ての測定は２５℃で行った。表２に示す、配合組成の各々について、粒径を測定した。

粒径分析は、配合組成が加熱された際、ｒＨ５の平均粒径が増加することを示している。表４は、加熱後の、ｒＨ５の粒径の増加％を示している。リン酸緩衝液系中への、添加物の添加は、ｒＨ５の安定性を増加させていないようである。しかしながら、ＴＲＩＳ系中に、同じ添加物が配置されると、実質的な利益がある。表５は、安定化添加物が添加されていない場合（ロットＸ−１７２６）、ｒＨ５のサイズは、５５％増加し、該タンパク質の凝集を示している。スクロースの添加は、スクロースを用いてないＴＲＩＳ系と比較して、寸法安定性ではないようであった（５１％対５８％）。しかしながら、ＴＲＩＳ系への５％トレハロースの添加は、緩衝液のみと比較して、安定性を向上させた。加熱後の寸法増加は、トレハロースを用いていない際の５８％と比べて、僅か３９％であった。１５％のトレハロースを添加すると、％増加は、僅か２２％であった。図８は、表３および４からの、ｒＨ５の粒径の％増加のグラフ表示である。図９は、加熱前後の、いずれも、１５％トレハロースを含んでいる、リン酸緩衝液系およびＴＲＩ緩衝液系中における、ｒＨ５の粒径分布を示している。ＴＲＩＳ緩衝液系と比較して、リン酸緩衝液系を用いた際、粒径分布が拡張していることが明らかである。この拡張は、溶液中における、タンパク質の凝集を示している。

結果は、ＨＰＬＣを用いた、さらなるスクリーニングにより、さらに確認された。使用された、ＨＰＬＣスクリーニング法および選択基準を以下に記載する。

１）所望のｒＨ５水性配合組成を調製する（対照および試験配合組成）
２）６０℃に設定された加熱ブロック内の試験配合組成を５分間加熱する
３）ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、対照と対比して、インキュベーション後のｒＨ５ピークの面積％を評価する
４）モノマー＋ダイマーが、＞８０％のピーク面積を有する水性配合組成は、安定と見なされ、また、＞９０％のピーク面積のモノマーも安定と見なされる。

ｒＨ５モノマーおよびダイマーの形成に関するさらなる結果を、図１０および１１において見つけることができる。

例５−ｒＰＡの熱安定性に対する添加物の効果
目的のタンパク質またはペプチドを安定化させるための、開示された方法および組成物の普遍的な適用可能性のもう一つの例として、開示された組成物および方法は、ｒＰＡを安定化および保存することもできることを検証するため、様々な系が試験された。表７は、検討された、様々な緩衝液系および付加的な安定化添加物を記述している。これらは、配合組成開発を導くため、ならびに、添加物を絞り込むために用いられた熱スクリーニング安定性研究である。

種々の基本形配合組成が、非公式の安定性にかけられ、そして、表９に記載の如く、記述される。

タンパク質を製剤化するために使用される緩衝液の選択は、タンパク質の安定性に対して、大きな影響を有することが示された。低温において、リン酸緩衝液のｐＨは著しく変化することも理解されており、そして、これは、冷却時の緩衝液成分の選択的沈降、ならびに、プロトン平衡に対するエンタルピー的効果に帰されてきた。十分な説明はなされていないものの、これらのｐＨ変化は、低温での貯蔵時における、タンパク質構造への損傷を導くであろう。また、リン酸塩が、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋等の、二価カチオンを隔離する。このことは、図１２に示されるように、タンパク質構造のｄ１ドメイン中に位置している、カルシウム分子に起因して、長期間の貯蔵において、ｒＰＡおよび他の類似タンパク質にとって問題となる。

ＴＲＩＳは、ｐＨを比較的狭い範囲内に維持するために用いられる緩衝液である。ＴＲＩＳは、７〜９．２ｐＨ範囲において、僅かにアルカリ性の緩衝性能を有する。ＴＲＩＳは、２５℃で、８．０６のｐＫａを有している。それは、低く塩効果を有しており、等張性食塩溶液からの干渉はなく、そして、解離定数に対する、最小限の濃度の影響を有する。カルシウムまたはマグネシウムカチオンと結合せず、このタイプの干渉または沈降を回避する。単独および水溶液中の両方において、化学的に安定しており、貯蔵溶液の貯蔵に好都合である。２４０ｎｍ〜７００ｎｍの間において、僅かな光吸収特性しか有してなく、その使用は、比色測定における妨害とならない。許容できる毒性を有し、医薬用途において広く用いられている。よって、リン酸緩衝系およびＴＲＩＳ緩衝系を研究した。

時にｐＩと略記される、等電点は、特定の分子または表面が、正味の電荷を帯びないｐＨである。ｐＩ値は、所定のｐＨにおいて、分子の溶解性に影響を及ぼすことがある。タンパク質を構築するアミノ酸は、本来、陽性、陰性、中性、または極性となることがあり、そして、一緒になってタンパク質に、その総体的な電荷を与える。そのｐＩを下回るｐＨにおいて、タンパク質は、正味陽性電荷を有し、そのｐＩを超えると、正味陰性電荷を有する。ｐＩとｐＨとの差が大きいほど、タンパク質上の正味電荷が大きくなる。ｒＰＡのｐＩは、５．６である。従って、他の添加物を用いてｐＨを最適化する他の研究を行うのでない限り（例えば、下記のトレハロースの考察を参照されたい）、ｐＩを超える２つのｐＨ単位（例えば、５．６〜７．６）が、理論的にはｐＩに基づいてｒＰＡにとっての最適のｐＨである。すなわち、基本形配合組成に対して、ｐＨ７．４〜８が標的ｐＨ範囲であった。二糖類のトレハロースが、最も効果的な凝集阻害剤であることが判明した。すなわち、５％および１５％のトレハロースが、研究した２つの濃度であった。スクロースも評価した。

タンパク質は、特定のアミノ酸と、その環境中に存在する酸素ラジカルとの反応を介する、酸化的損傷に感受性が高い。メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンは、酸化に敏感である。酸化は、タンパク質の物理的化学的特性（例えば、折り畳み）を変化させることができ、そして、凝集または分裂を導くことができる。特に、ヒスチジン残基は、イミダゾール環との反応を介して、酸化を高度に過敏である。ｐＨ、温度、露光および緩衝液組成等の、制御または増強因子は、酸化の影響を低減する。ヒスチジン等の、溶解しやすいアミノ酸の添加は、無傷のタンパク質の酸化を促進する、酸化的化学的種に対して、代替物として作用することにより、ｒＰＡの天然のタンパク質立体配座を保護することを助ける。これらの遊離アミノ酸は、実際には、実効的な酸化防止剤として作用する。ｒＰＡタンパク質においては、酸化から保護される必要のある、構造中のヒスチジン残基の割合が高い。そのため、ヒスチジンを、単独でおよび他のアミノ酸と組み合わせて、ｒＰＡの熱的に不安定な安定性の向上について検討した。

例６−ｒＰＡの熱スクリーニング研究
この例の目的は、モデルタンパク質ｒＰＡを含む、開示に従って調合されたタンパク質組成物の安定性を評価することであった。熱スクリーニング研究は、２種類の緩衝液（ＰＢＳまたはＴＲＩＳ）と、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、スクロース、ヒスチジンおよびグリセロール等の添加物とを含む、試験配合組成に集中した。

試験したｒＰＡ水溶液を、表９に列挙する。ｒＰＡの濃度は、５００μｇ／ｍＬであった。

以下は、手順およびｒＰＡ水溶液についての合格基準、ならびに、添加物スクリーニング実験である。

１）所望のｒＰＡ緩衝液配合組成（対照および試験配合組成）を調製する。

２）４９℃に設定された加熱ブロック内において、試験配合組成を５分間加熱する。

３）対照と対比して、インキュベーション後のｒＰＡピークの面積％を評価する。

４）ＳＥＣで評価する際、７０％を超える面積を有し、また、１５分の派生的なピークのない緩衝液配合組成を選択する。

例７−ｒＰＡのＳＥＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣ法の開発
この例の目的は、開示に従った、安定なタンパク質配合組成を特定するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用したスクリーニング法を開発することにあった。

加熱ブロックを用いた、４９℃、５分間のｒＰＡ溶液のインキュベーションは、ｒＰＡの熱的凝集を引き起こした（表８および図１３）が、一方、他の条件では、ｒＰＡは安定であった。この条件での熱的凝集は、天然ＰＡＧＥを用いても確認された（図１４）。すなわち、４９℃、５分間は、表９に示す様々なｒＰＡ配合組成を迅速にスクリーニングするために選択された条件であった。

安定化添加物用のスクリーニング法は、非加熱サンプルと比較して、４９℃で５分間加熱した、異なるｒＰＡ配合組成におけるｒＰＡピークの面積を比較するための、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）の使用からなっていた。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにおいて、８０％を超えるピーク面積を有し、１５分の派生的なピークがない、配合組成が選択され、安定と見做された。

図１５は、リン酸ナトリウム系を加熱すると、溶液が濁ることを示している。溶液が濁った場合、それは、モデルｒＰＡタンパク質の凝集および沈降を示している。図１５に示す３つの組成物は、外観安定性評価に明らかに不合格である。図１６は、リン酸ナトリウムおよび付加的な添加物を用いて試験した全ての配合組成が、加熱した場合、ｒＰＡの回収の損失があることを示している。２つのものを除いて、全ての配合組成が、７０％の下限点を充分に下回っていた。２種類の配合組成は、７０％を超えていたが、星印で示すように、滞留時間１５分にｒＰＡ凝集体ピークを示した。

図１７は、種々の添加物を伴ったＴＲＩＳ系の加熱前後における外観を示している。加熱後、２種の混濁溶液（＋ＮａＣｌ、＋ＮａＣｌ＋ヒスチジン）が出現し、これは、ｒＰＡタンパク質の凝集および沈降を示している。図１８は、４種類の組成物が合格基準に適合したことを示している。

要約すると、スクリーニング法は、ｒＰＡの安定性に関して、リン酸緩衝液系よりは、ＴＲＩＳ緩衝液系の方が、いっそう優れている緩衝液であることを示した（図１７および図１８）。先の表中に列挙したｒＰＡ ＰＢＳ溶液のいずれも、成功したタンパク質安定性についての合格基準は満たしていなかった。加熱後の全てのサンプルについて、ｒＰＡの回収率は、７０％未満であった。これらの溶液のうち２種類のみ、すなわち、ＮａＣｌを伴う、あるいは、伴っていない、ヒスチジンおよびスクロースは、７０％を超えるｒＰＡの回収率を有していた。他の全ての配合組成は、６０％を下回る、％ｒＰＡ回収率を有していた。さらに、これらの配合組成の全てについて、非加熱対照および４９℃で５分間加熱した配合組成は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定されるように、１５分の滞留時間に、凝集体ピークを示していた。図１９は、一部の事例のクロマトグラフを示している。図１９に示すように、熱処理済のＴＲＩＳ緩衝液配合組成のうち４種類は、合格基準を満たしていた。

例８−ｒＰＡ（基本形配合組成）の長期安定性に対する添加物の効果
この例の目的は、ｒＰＡタンパク質を含む基本形配合組成の長期安定性に対する、添加物の効果を評価することであった。

使用したｒＰＡ濃度は、１００μｇ ｒＰＡ／ｍｌおよび５００μｇ ｒＰＡ／ｍＬに区分けした。基本形配合組成は、−２０℃、＋５℃および＋２５℃で貯蔵され、そして、異なる配合組成の安定性を、１、３、６、９および１２か月後に測定した。配合組成は４０℃でも貯蔵され、そして、１、３および６か月後に分析された。安定性アッセイは、別表１、２および３中に列挙し、そして、外観、ｐＨ、粒径、ｒＰＡに関する定性ウエスタンブロット、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定されたｒＰＡを含んでいる。ｒＰＡに関するウエスタンブロット法では、一次抗体として、ノバス（Ｎｏｖｕｓ）ウサギ多クローン性全血清抗体を用いて、調べた。

図２〜４は、安定化配合組成の選択において使用される、決定木の模式図を示す。各配合組成間において、添加物の少なくとも１種を最適化するための、追加のスクリーニング工程があった（すなわち、基本形１中の緩衝液／図２；基本形２中のトレハロース／図３；および基本形３中のグルタチオン／図４）。

表１０〜１２は、種々の時点における、−２０℃、５℃、２５℃および４０℃において安定性にかけられた、基本形１、２および３のための、配合組成を列挙している。

種々の配合組成を、ＰＴＦＥで裏張りされたスクリューキャップを有する、１．８ｍＬ タイプ１ガラス バイアル中に満たした。これらの配合組成について評価された、安定性パラメーターは、表１３に記載のように、外観、ｐＨ、平均粒径、非定量ｒＰＡウエスタンブロット、ならびに、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによる、ｒＰＡであった。粒径、粒径分布プロフィールおよび多分散性指数を測定するため、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いる動的光散乱を使用した。

スクリーニング配合組成および基本形の解析のために、多くの安定性を示す分析方法を開発した。表１３は、開発された方法、および各方法に対する合格基準を示している。

例９−外見試験方法
配合組成の外見は、最初の時点、および種々の貯蔵条件下での異なる時点において、測定された。次に、外見の観察結果を記録し、そして、表１４中の合格基準を用いて評価した。図２０および２１は、合格基準の例を示している。

例１０−ｐＨ評価
ＴＲＩＳ緩衝液系とＰＢＳ緩衝液系の両方に用いることができる適切なプローブを有する標準的ｐＨ計を用いて、ｐＨを測定した。表１０〜１２に示す配合組成は、該配合組成を種々の温度で貯蔵しながら経時的にｐＨを評価する配合組成である。これらの結果を図２９〜３１に示す。

例１1−粒径分析および多分散性指数(PdI)
試験したサンプルの全てについて、平均粒径（Ｚ平均）および多分散性指数（ＰｄＩ）を測定した。サンプルの粒径およびＰｄＩは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０（マルバーン・インスツルメンツ， ウスターシャー州， 英国）を用いて光子相関分光法を使用して動的光散乱により測定した。全ての測定は、希釈することなく２５℃において行った。

図２２は、１００μｇ／ｍＬ ｒＰＡ水溶液（基本形１：Ｘ １５９６）の粒径プロフィールを示す。このプロフィールから、ｒＰＡ粒径ピークが１０ｎｍ付近に現れることが明らかである。他の２つのピークは、外部相緩衝液に由来する。図２２Ａは、−２０℃、５℃および２５℃の種々の１か月安定性温度における溶液を示している。ｒＰＡのピークは維持されている。しかしながら、図２２Ｂにおいて、ｒＰＡのピークは、４０℃では消滅しており、これは、この温度および時点におけるｒＰＡの不安定性を意味している。

例１２−ＲＰ−ＨＰＬＣまたはＳＥＣ−ＨＰＬＣ試験方法に基づく、ｒＰＡのラベル・クレーム
ｒＰＡの％ラベル・クレーム（回収率）は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて決定された。表１５および１６は、各方法のパラメーターを記載している。

安定化添加物を添加していない、ｒＰＡ配合組成の非公式安定性研究を開始した。配合組成の組成を表１７中に示す。

安定性について試験した、ｒＰＡの濃度は、１００μｇ ｒＰＡ／ｍＬおよび５００μｇ ｒＰＡ／ｍＬに区分された。該配合組成を、−２０℃、５℃および２５℃で貯蔵され、そして、配合組成の安定性を、１、３および６か月に評価した。配合組成は４０℃でも貯蔵され、そして、１、３および６か月に分析した。安定性アッセイには、外観、ｐＨ、粒径、ｒＰＡ用定性ウエスタンブロット、ならびに、％ｒＰＡラベル・クレームが含まれる。％ｒＰＡラベル・クレームは、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定された。これら一組の配合組成における、ウエスタンブロットは示さないが、定性ウエスタンブロット用の合格基準は、図３２に示される。分子量ラダーに続く、レーン１〜５に示されるように、８３ｋＤＡのバンドまたは淡いバンドが存在する場合、合格と見なされた。レーン７および８に示されるように、バンドが存在しない場合、不合格と見なされた。

この実験の目的は、安定化添加物を添加していなく、100mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液系において、ｒＰＡを試験することであった。

表１８は、なんらの安定化添加物も含まれない、リン酸緩衝液中の、低用量（１００μｇ／ｍＬ）ｒＰＡ水性配合組成（Ｘ−１６６８）の安全性データを示す。これは、５℃および２５℃において、３か月間安定であった。しかしながら、表１９に示す、高用量（５００μｇ／ｍＬ ｒＰＡ）ｒＰＡ水性配合組成（Ｘ−１６７０）は、安定性に劣ることが示された。Ｘ−１６７０は、５℃では、３か月の時点で安定であったが、２５℃では、不合格となっていた。

このデータは、より長期間、より高い温度における、ｒＰＡの安定性の向上を助けるためには、安定化添加物が必要であることを示した。

表１０に示す配合組成について、種々のｒＰＡ水性配合組成の非公式安全性試験を開始した。先のスクリーニング安定性研究は、配合組成の開発および最終的な配合組成の選択を進めるのに役立った。最初の基本形シリーズは、リン酸緩衝液またはＴＲＩＳ緩衝液を含む２種類の配合組成であった。試験方法ならびに非公式安定性にかけた配合組成についての合格基準は上に示している。安定性について示されるｒＰＡ濃度は、１００μｇ ｒＰＡ／ｍＬおよび５００μｇ ｒＰＡ／ｍＬに区分された。配合組成を、−２０℃、５℃および２５℃で貯蔵し、そして、安定性を、１、３、６、９および１２か月に評価した。配合組成は、４０℃でも貯蔵し、そして、１、３および６か月に分析した。安定性評価は、外見、ｐＨ、粒径および定性ウエスタンブロットを含む。より遅い時点で、ｒＰＡ回収率をＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定した。

このセットの目的は、ＰＢＳとＴＲＩＳとの間で、最適の緩衝液を選択することであった。配合組成中におけるｒＰＡの安定化について、ＴＲＩＳ系はＰＢＳより優れていることが明らかであった。低用量１００μｇ／ｍＬ ｒＰＡにおいて、ＰＢＳ系は、５℃で３か月のｒＰＡ安定性を示した。しかしながら、高用量５００μｇ／ｍＬ ｒＰＡにおいては、ＰＢＳ系は、５℃で６か月の安定性を有するのみで、一方、ＴＲＩＳ系は、高容量について、５℃で１２か月のｒＰＡ安定性を提供した。

例１３−基本形２配合組成（５％または１５％のトレハロースを添加したＴＲＩＳ）についての安定性データ
第二の基本形は、表１１に示すように、ＴＲＩＳ緩衝系中に５％または１５％のトレハロースを含む２種類の配合組成であった。試験方法および非公式安定性にかけた配合組成についての合格基準を表１３に示す。安定性について示されたｒＰＡ濃度を、１００μｇ ｒＰＡ／ｍＬおよび５００μｇ ｒＰＡ／ｍＬに区分した。配合組成を、−２０℃、５℃および２５℃に貯蔵し、そして、安定性を、１、３、６および９か月に評価した。配合組成を４０℃でも貯蔵し、そして、１、３および６か月に分析した。安定性評価は、外見、ｐＨ、粒径および定性ウエスタンブロットを含む。ｒＰＡ回収率は、ＲＰ ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定した。

このセットの目的は、ＴＲＩＳ緩衝系に組み込まれるトレハロースの最適濃度を選択することであった。低用量のｒＰＡ水性系を除いて、該ｒＰＡ水性系は、同等の安定性プロフィールを示した。低用量（１００μｇ／ｍＬ ｒＰＡ水性系）は、５℃で６か月安定であったが、他の全ての系は、５℃で９か月安定であった。４０℃で６か月を除いて、ｐＨは、全ての温度について安定であった。これは、基本形１の配合組成と比べて、ｐＨ安定性プロフィールの向上である。ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるｒＰＡの有効性は、配合組成の安定性の違いを最もよく示す。１〜６か月の２５℃の条件でのｒＰＡ水性系の中におけるｒＰＡの有効性は、４０〜８５％の範囲である。

トレハロースの水準については、トレハロースを、５％から１５％に増加させる利点が、図２３〜２４に明らかに示されている。

安定ｒＰＡの水準における、この増加は、５％のトレハロースと比較して、追加的トレハロースが、長期間に渡って、高温でｒＰＡの保護を助けることを示した。

例１４−基本形３配合組成（グルタチオン添加／無添加のＴＲＩＳ緩衝系）の安定性データ
第三の基本形は、表１２に示すように、ＴＲＩＳ緩衝系の中に１６ｍＭのグルタチオンを添加したまたは添加していない２種類の配合組成であった。ｒＰＡ濃度を、１００μｇ ｒＰＡ／ｍＬおよび５００μｇ ｒＰＡ／ｍＬに区分した。配合組成を、−２０℃、５℃および２５℃で貯蔵し、そして、安定性を、１、３および６か月に評価した。配合組成は４０℃でも貯蔵し、そして、１、３および６か月に分析した。安定性評価は、外見、ｐＨ、粒径および定性ウエスタンブロットを含む。一次抗体として、ノバスウサギ多クローン性全血清抗体を、また、ｒＰＡに対する調和ウエスタンブロット法を用いて、ウエスタンブロットを実施した。ｒＰＡ回収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定した。

これらの基本形の目的は、ＴＲＩＳ緩衝系に組み込んだ際の、グルタチオンおよびヒスチジンの貢献を理解することであった。

図２５および２６は、ｒＰＡ水性系について、時間および温度に対するｒＰＡ回収率を示している。２５℃でのｒＰＡ水性系におけるｒＰＡ回収率は、試験した全ての配合組成について８０％を超えていた。これは、４０％〜８０％の範囲である、基本形２からの、ｒＰＡ水性系に対する改良である。

グルタチオンの添加について、ｒＰＡ安定性のためのこの添加物の大きな利点は現れない。ｒＰＡ有効性を、グルタチオンの添加および無添加と比べると、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて測定した場合、ｒＰＡ回収率に対する、極僅かな効果である。

図２７および２８は、ＲＰおよびＳＥ−ＨＰＬＣ法の比較を示す。ここで、低濃度ｒＰＡ配合組成は、グルタチオンを組み込んだ場合、安定性が劣り、一方、高濃度配合組成は、ＳＥ−ＨＰＬＣにより測定すると、安定である。

グルタチオンを添加していない低用量ｒＰＡ水溶液は、ＲＰおよびＳＥＣ ＨＰＬＣを用いて回収されたｒＰＡ％により測定すると、２５℃におけるｒＰＡ安定性が１２か月である。グルタチオンを組み込んだ場合、安定性は、ＲＰ−ＨＰＬＣによると２５℃で１２か月であるが、ＳＥ−ＨＰＬＣを用いると５℃で１２か月である（図２７を参照されたい）。

グルタチオンを添加していない高用量ｒＰＡ水溶液は、ＲＰおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて回収したｒＰＡ％により測定すると、２５℃でのｒＰＡ安定性が１２か月である。グルタチオンを組み込んだ場合にも、安定性は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣの両方の方法により、２５℃で１２か月である（図２８を参照されたい）。

Claims (20)

1. 組成物中のタンパク質を安定化させる方法であって、
   安定化系の中に該タンパク質を配合する工程を含んでなり、
   安定化系は、
   ＴＲＩＳまたはＰＢＳである、少なくとも１種の緩衝液と、
   （ａ）塩、
   （ｂ）トレハロースまたはスクロースのような糖、
   （ｃ）酸化防止剤、
   （ｄ）アミノ酸、または
   （ｅ）それらの任意の組み合わせ
   のうちの少なくとも１種とを含む
   ことを特徴とする、方法。
2. 緩衝液がＰＢＳまたはＴＲＩＳである
   ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. （ａ）ＰＢＳの濃度が約１〜約５０ｍＭである、
   （ｂ）ＰＢＳの濃度が約１０ｍＭである、
   （ｃ）ＴＲＩＳの濃度が約５〜約１００ｍＭである、または
   （ｂ）ＴＲＩＳの濃度が約１０ｍＭまたは約８０ｍＭである
   ことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 塩が塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムである
   ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. （ａ）塩化ナトリウムの濃度が約５０〜約１５０ｍＭである、または
   （ｂ）塩化カルシウムの濃度が約５０〜約１５０ｍＭである
   ことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 糖が、トレハロース、スクロース、グリセロールおよびマンニトールからなる群より選択される
   ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. （ａ）トレハロースの濃度が約５〜約１５％である、
   （ｂ）スクロースの濃度が約５〜約１５％である、
   （ｃ）グリセロールの濃度が約５〜約１５％である、または
   （ｄ）マンニトールの濃度が約５〜約１５％である
   ことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. アミノ酸が、ヒスチジン、グルタチオンおよびアラニンからなる群より選択される
   ことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. （ａ）ヒスチジンの濃度が約２０〜約７０ｍＭである、
   （ｂ）ヒスチジンの濃度が約６０ｍＭである、
   （ｃ）グルタチオンの濃度が約１０〜約２０ｍＭである、
   （ｄ）グルタチオンの濃度が約１６ｍＭである、
   （ｅ）アラニンの濃度が約５〜約１５ｍＭである、または
   （ｆ）アラニンの濃度が約１０ｍＭである
   ことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 安定化系の中に配合されている、少なくとも１種のタンパク質またはペプチドを含んでなる安定化組成物であって、
    安定化系は、
    ＴＲＩＳまたはＰＢＳ等の、少なくとも１種の緩衝液と、
    （ａ）少なくとも１種の塩、
    （ｂ）トレハロースまたはスクロース等の、少なくとも１種の糖、
    （ｃ）少なくとも１種のアミノ酸、
    （ｄ）少なくとも１種の酸化防止剤、または
    （ｅ）それらの任意の組み合わせ
    のうちの少なくとも１種とを含む
    ことを特徴とする、組成物。
11. 緩衝液がＰＢＳまたはＴＲＩＳである
    ことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
12. （ａ）ＰＢＳの濃度が約１〜約５０ｍＭである、
    （ｂ）ＰＢＳの濃度が約１０ｍＭである、
    （ｃ）ＴＲＩＳの濃度が約５〜約１００ｍＭである、または
    （ｄ）ＴＲＩＳの濃度が約１０ｍＭまたは約８０ｍＭである
    ことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
13. 塩が塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムである
    ことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. （ａ）塩化ナトリウムの濃度が約５０〜約１５０ｍＭである、または
    （ｂ）塩化カルシウムの濃度が約５０〜約１５０ｍＭである
    ことを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
15. 糖が、トレハロース、スクロース、グリセロールおよびマンニトールからなる群より選択される
    ことを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. （ａ）トレハロースの濃度が約５〜約１５％である、
    （ｂ）スクロースの濃度が約５〜約１５％である、
    （ｃ）グリセロールの濃度が約５〜約１５％である、または
    （ｄ）マンニトールの濃度が約５〜約１５％である
    ことを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
17. アミノ酸が、ヒスチジン、グルタチオンおよびアラニンからなる群より選択される
    ことを特徴とする、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. （ａ）ヒスチジンの濃度が約２０〜約７０ｍＭである、
    （ｂ）ヒスチジンの濃度が約６０ｍＭである、
    （ｃ）グルタチオンの濃度が約１０〜約２０ｍＭである、
    （ｄ）グルタチオンの濃度が約１６ｍＭである、
    （ｅ）アラニンの濃度が約５〜約１５ｍＭである、または
    （ｆ）アラニンの濃度が約１０ｍＭである
    ことを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
19. 組成物が、医薬組成物に製剤化されている
    ことを特徴とする、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 組成物が、ワクチンに製剤化されている
    ことを特徴とする、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の組成物。