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JP2018080194A - 両性イオン性試薬 - Google Patents

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JP2018080194A JP2018000502A JP2018000502A JP2018080194A JP 2018080194 A JP2018080194 A JP 2018080194A JP 2018000502 A JP2018000502 A JP 2018000502A JP 2018000502 A JP2018000502 A JP 2018000502A JP 2018080194 A JP2018080194 A JP 2018080194A
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Abstract

【課題】水溶解度を改善するため及び／又は非特異的な結合を低減するために疎水性分子を修飾するための両性イオン含有化合物の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物。[Ｌ１は−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝１〜６）の形式の二価のラジカル；Ｌ２は結合、又は−（ＣＨ２）ｍ−（ｍ＝１〜４）の形式の二価のラジカル；Ｚはカルボキシレート、スルホネート、ホスフェート等より選択されるアニオン含有基；Ｙ１は、特定の反応性官能基；Ｒ１及びＲ２はメチル基等]【効果】該両性イオン含有化合物は、水溶解度を改善するために、ビオチン及びフルオレセイン等の検出可能な標識を修飾するのに適している。また、前記両性イオン含有化合物は、タンパク質、ペプチド、又は他の巨大分子の複合体を調製する、或いは分子及び／又は巨大分子を架橋するのに有用である。【選択図】なし

Description

本発明は親水性の両性イオン性試薬に関する。これら試薬は、その親水性に起因して、疎水性分子の溶解度を改善し、そして、微粒子等の固相に対する前記疎水性分子の非特異的な結合を低減するのに有用である。また、本発明は、フルオレセイン及びビオチン等の検出可能な標識の水溶解度を改善するため、そして、これら標識とハプテンとの複合体を合成するための両性イオン含有リンカーについて記載する。また、本発明は、ペプチド、タンパク質及び他の巨大分子の複合体を調製するのに有用な両性イオン性架橋剤について記載する。
背景技術
試薬の水溶解度の改善、試薬の凝集の阻止、試薬の非特異的な結合の低減、及び血清又は全血におけるサンプル成分と試薬との非特異的な相互作用の低減は、臨床診断アッセイにおける継続的課題である。商用の診断イムノアッセイは、水溶解度が限定されている疎水性の化学発光標識及び蛍光標識を用いることが多く、そして、これら標識は、抗体等のタンパク質の非特異的な結合に悪影響を及ぼすことがある。診断において組換え型タンパク質及びペプチドが使用される機会が増加しており、そして、多くの場合、これらポリペプチドは、水溶解度が低いことに加えて、ミスフォールディング又は変性により不溶性の凝集体を形成する傾向がある。また、試薬は、非特異的にサンプル成分と相互作用する場合があり、これは、アッセイにおいて偽陽性を生じさせる。
上記の問題の一部に取り組むための幾つかのストラテジーが文献に記載されている。例えば、Basu et al. (Bioconjugate Chem. 2006, 17, 618-630)及びMarsac et al. (Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1492-1498)には、ポリペプチド及びタンパク質の溶解度を改善するためのポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）の使用について記載されている。他方、Natrajan et al.(米国特許第6,664,032号及び米国特許第7,309,615号)には、疎水性の化学発光アクリジニウムエステル標識の水溶解度を改善するためのＰＥＧの使用について記載されている。Goldberg及び共同研究者ら(Biophysical Chem. 2003, 100, 569-479)は、様々な非界面活性の両性イオン性スルホベタイン(NDSB)を合成し、そして、これら化合物がBSAならびに酵素及びモノクローナル抗体等のタンパク質のリフォールディングに役立つ有用な添加剤であることを示した。同様に、D’Amico and Feller(Anal. Biochem. 2009, 385, 389-391)は、NDSBの添加が、幾つかのタンパク質の熱変性を阻害することを示した。別のアプローチでは、Tolbert及び共同研究者ら(Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1113-1118)は、近年、２つの凝集しやすいポリペプチドをベタイン（トリメチルアンモニウム部分）により部位特異的修飾すると、前記２つのポリペプチドの水溶解度が著しく改善され、そして、凝集体形成が阻害されたことを報告している。
タンパク質の溶解度を改善するための前記タンパク質の修飾に加えて、タンパク質吸着に対して耐性を有する不活性表面を案出するためにＰＥＧが用いられている。例えば、Ostuni et al. (J. Am. Chem. Soc. 2000, 17, 5605-5620) は、自己組織化単層に結合している多数の官能基をタンパク質吸着に対する耐性について評価し、そして、ポリ（エチレン）グリコール官能基が最も高い耐性を付与することを見出した。より最近では、Jiang及び共同研究者ら(Biomacromolecules 2008, 9, 1357-1361)及び他の文献に、両性イオンで修飾された親水性表面が、ＰＥＧと同程度タンパク質吸着に対して不活性であることが報告されている。スルホベタイン、カルボキシベタイン、ホスホベタイン、及びアミンオキシド等の幾つかの両性イオンの構造を、以下の例示的な構造に示す。ＰＥＧのように、これら両性イオンは、所与の構造（Ｒ１〜Ｒ４は典型的にアルキル基である）内の正電荷と負電荷とのバランスにより、通常、電気的に中性である。
Figure 2018080194
窒素原子が四級であるスルホベタインは、広いpH範囲にわたって電気的中性を維持する。他方、窒素で脱プロトン化されてその正電荷を中和することができるので、三置換窒素を含むスルホベタインは、より高いpH（pH＞７）において負電荷を獲得することができる。同様に、カルボキシベタインは、より高いpHでは電気的に中性であるが、カルボキシレート基でプロトン化され、そして、低pH（pH＜５）において正味の正電荷を獲得することができる。
プロテオーム解析及び他の生物学的解析における標識のための両性イオン性色素分子が、米国特許出願第2007/0259333 A1号（Dratz et al.）に報告されている。これら両性イオン性色素分子では、前記色素分子の両性イオン性部分を形成するカチオン性部分とアニオン性部分とが炭化水素部分によって互いに直接結合することはない。
本発明の両性イオン含有化合物は、その溶解度を改善し、そして、その非特異的な結合を低減するために疎水性分子に両性イオンを導入するのに有用であり、先行技術には記載されていない。また、水溶解度の高い複合体を合成するために有用であり得る本発明の両性イオン含有架橋試薬及び両性イオン含有リンカーも先行技術には記載されていない。
疎水性分子の水溶解度を改善すること、及びイムノアッセイ等のための改善された試薬が、当技術分野において継続的に必要とされている。したがって、本発明の目的は、被検体等の分子又は巨大分子の溶解度を改善することができ、そして、固相に対する非特異的な結合を低減することができる両性イオン含有分子を提供することである。
発明の概要
前述の目的及び他の目的に従って、驚くべきことに、両性イオン性基を疎水性分子と共有結合させることにより疎水性化合物の特性が改善されて、その親水性、水溶液に対する溶解度が上昇し、その結果、固相との非特異的な結合が減少することが見出された。
本発明の１つの態様では、ペプチド、タンパク質又は巨大分子と複合体を形成するための両性イオン含有化合物を提供する。前記両性イオン含有化合物は、式（Ｉ）：
Figure 2018080194
（式中、
Ｌ１は、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基であり；
Ｌ２は、結合、又は場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基であり；
Ｚは、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、スルホネート（−ＳＯ３ −）、スルフェート（−ＯＳＯ３ −）、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））及びオキシド（−Ｏ−）（式中、Ｒは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１２アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルである）からなる群より選択されるアニオン含有基であり；
Ｙ１は、ペプチド、タンパク質又は巨大分子と共有結合を形成するための反応性官能基であって、求電子基、求核基又は光反応性基を含む官能基であり；そして、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される）
で表される構造を有する。
１つの実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
別の実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
別の実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
別の実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
別の実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
本発明の別の態様では、被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを標識するための両性イオン含有化合物を提供する。前記両性イオン含有化合物は、式（II）：
Figure 2018080194
（式中、
Ｌ１及びＬ３は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；
Ｌ２は、結合、又は場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基であり；
Ｚは、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、スルホネート（−ＳＯ３ −）、スルフェート（−ＯＳＯ３ −）、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））及びオキシド（−Ｏ−）（式中、Ｒは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１２アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、又はアラルキルである）からなる群より選択されるアニオン含有基であり；
Ｙ１は、被検体、被検体類似体、又は被検体の結合パートナーと共有結合を形成するための反応性官能基であって、求電子基、求核基又は光反応性基を含む官能基であり；
Ｇは、検出可能な標識であり；そして、
Ｒ１は、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基である）
で表される構造を有する。
１つの実施形態では、Ｌ３は、基−ＸＧ−ＲＧ−（式中、ＸＧはＧに結合しており、ＸＧは、結合、酸素、硫黄、アミン、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲＮ−若しくは−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−）、エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）又は尿素（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）から選択され、そして、ＲＮは、水素、又は場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルであり；そして、ＲＧは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基である）である。
１つの実施形態では、式（II）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
別の実施形態では、式（II）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
別の実施形態では、式（II）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
別の実施形態では、式（II）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
本発明の更なる態様では、ペプチド、タンパク質、及び／又は巨大分子を架橋するための両性イオン含有化合物を提供する。前記両性イオン含有化合物は、式（III）：
Figure 2018080194
（式中、Ωは、以下の形態：
Figure 2018080194
の両性イオン含有基であり、
Ｌ１及びＬ４は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；
Ｌ２は、結合、又は場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基であり；
Ｌ５、Ｌ６及びＬ７は、独立して、各出現時において、結合、又はそれぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基から選択され；
Ｑは、炭素原子又は窒素原子から選択されるが、但しＱが窒素である場合、Ｌ５、Ｌ６及びＬ７は、それぞれ結合ではなく；
Ｚは、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、スルホネート（−ＳＯ３ −）、スルフェート（−ＯＳＯ３ −）、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））及びオキシド（−Ｏ−）（式中、Ｒは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１２アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルである）からなる群より選択されるアニオン含有基であり；
Ｙ１及びＹ２は、独立して、各出現時において、求電子基、求核基又は光反応性基を含むペプチド、タンパク質又は巨大分子と共有結合を形成するための反応性官能基から選択され；そして、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される）
で表される構造を有する。
１つの実施形態では、式（III）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
具体的には、前記両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有し得る。
別の実施形態では、式（III）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
別の実施形態では、Ωは、以下の形態：
Figure 2018080194
の両性イオン含有基であり、
そして、
Ｌ５、Ｌ６及びＬ７は、それぞれ基−Ｘａ−Ｒａ−（式中、ＸａはＱに結合しており、そして、独立して、各出現時において、結合、酸素、硫黄、アミン、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲＮ−若しくは−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−）、エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）又は尿素（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）から選択され、そして、ＲＮは、独立して、各出現時において、水素、又は場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基であり；そして、Ｒａは、独立して、各出現時において、結合、又はそれぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基から選択されるが、但し、Ｑが窒素である場合、Ｒａは結合ではない）である。
別の実施形態では、ペプチド、タンパク質、及び／又は巨大分子を架橋するための両性イオン含有化合物を提供する。前記両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍ＝１〜４である）型で表される二価ラジカルであり；そして、Ｒａ及びＲ＊は、独立して、各出現時において、結合、又はそれぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−１５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基から選択される）
を有し得る。
具体的には、ペプチド、タンパク質、及び／又は巨大分子を架橋するための両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有し得る。
１つの実施形態では、ペプチド、タンパク質又は巨大分子の水溶解度を改善する方法を提供する。前記方法は、式Ｉで表される両性イオン含有化合物をペプチド、タンパク質又は巨大分子に共有結合させることを含む。
別の実施形態では、生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーの非特異的結合を低減する方法を提供する。前記方法は、式Ｉで表される両性イオン含有化合物を被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーに共有結合させることを含む。
更なる実施形態では、生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを標識する方法を提供する。前記方法は、式IIで表される両性イオン含有化合物を被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーに共有結合させることを含む。
更に別の実施形態では、第１の分子又は巨大分子と第２の分子又は巨大分子とに、式IIIで表される両性イオン含有化合物を共有結合させることを含む、２つの分子及び／又は巨大分子の複合体を調製する方法。
本発明のこれら及び他の態様は、添付の特許請求の範囲を含む以下の詳細な説明を参照することにより、より深く理解される。
本発明の複数の例示的な両性イオン含有化合物の化学構造を提供する。 被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを標識するための、本発明の複数の例示的な両性イオン含有化合物の化学構造を提供する。 本発明の両性イオン含有化合物に共有結合している被検体をそれぞれ有する、２つの例示的な複合体の化学構造を提供する。 本発明の例示的な両性イオン含有化合物と複合体を形成している、未修飾疎水性分子及び修飾疎水性分子の水溶解度を提供する。 本発明の例示的な両性イオン含有化合物と複合体を形成している疎水性分子の化学構造を提供する。
発明の詳細な説明
本発明の１つの目的は、溶解度を改善するため及び／又は非特異的な結合を低減するために疎水性分子を修飾するための両性イオン含有化合物の構造を提供することである。本発明の別の目的は、溶解度を改善するためにビオチン及びフルオレセイン等の検出可能な標識を修飾するための、そして、水溶解度の高い複合体を合成するための両性イオン性リンカーを提供することである。本発明の更に別の目的は、タンパク質、ペプチド及び他の巨大分子の複合体の調製に有用な両性イオン含有架橋試薬を提供することである。
本発明に係る両性イオン含有化合物は、前記両性イオン含有化合物によって修飾されていない他の疎水性分子に比べて水性溶媒における溶解度を改善する及び／又は固相における非特異的な結合を低減するための疎水性分子の修飾に有用であり得る。粒子又はマイクロタイタープレート等の固相を用いるアッセイにおいて、非特異的な結合は、例えば、生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体、又は被検体の結合パートナーであり得る生体分子を含む疎水性分子と前記固相との望ましくない結合相互作用である。これら望ましくない結合相互作用は、典型的に、アッセイのバックグラウンドを上昇させてアッセイにおけるシグナル対バックグラウンド比を正味低下させ、それによってアッセイの感度を低下させる。
特定の実施形態では、疎水性分子は、ペプチド、タンパク質又は巨大分子からなる群から選択してよい。１つの実施形態では、両性イオン含有化合物は、（ｉ）結合、又は場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている直鎖若しくは分枝状の炭化水素部分によって四級アンモニウムの窒素原子に結合している負電荷基と；（ｉｉ）結合、又は場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている直鎖若しくは分枝状の炭化水素部分によって四級アンモニウムの窒素原子に結合している求電子基、求核基又は光反応性基とを含み得る。好ましい実施形態では、求電子基、求核基又は光反応性基が四級アンモニウムの窒素原子に結合によって結合している分子と比べて、求電子基、求核基又は光反応性基が直鎖又は分枝状の炭化水素部分によって四級アンモニウムの窒素原子に結合させ、より安定な分子を提供する。窒素原子に結合している負電荷基は、ともに両性イオン性基を構成し得、例えば、スルホベタインの場合、四級窒素に正電荷が存在し、そして、二価アルキル部分により前記四級窒素に結合している−ＳＯ３基に負電荷が存在する。求電子基、求核基又は光反応性基を窒素原子に結合させる炭化水素部分は、好ましくは、二価のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基を含む。より好ましくは、求電子基、求核基又は光反応性基を窒素原子に結合させる炭化水素部分は、Ｃ１−６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基からの二価ラジカルを含む。他の実施形態では、前記炭化水素部分は、アルコキシ、カルボキシル、アミン及び／又はカルボニル基を含み得る。
用語「アルキル」、「アルケニル」及び「アルキニル」は、本明細書で使用するとき、特に規定しない限り、直鎖、分枝状、又は環状（シクロアルキルとも呼ばれる）の一級、二級、又は三級の炭化水素が挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基の実例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、ｓｅｃブチル、イソブチル、ｔｅｒｔブチル、シクロブチル、１−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル及びシクロヘキシルである。特に規定しない限り、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基は、非置換であってもよく、１以上のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されてもよい。
好適なヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルキルイミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アミド、エステル、カルボキサミド、カルバメート、アルコキシル、アリールオキシル、アルキルチオール、アルキルスルホネート、ニトロ、シアノ、オキソ、オキサ、アゾ、チオ、スルホニル、エステル、ホスホニル、ホスフィニル、チオール、チオエーテル、チオエステル、チオアルコキシ、チオシアネート、ペルフルオロ、ホスフェート、オキシム、スルフェート、スルホアルキル、これらの組合せ、又は疎水性分子、好ましくはペプチド、タンパク質若しくは巨大分子と複合体を形成するためのこの化合物の反応性を阻害しない任意の他の官能基が挙げられる。好ましいヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分の置換基としては、窒素、酸素、カルボキシル、アミン及び／又はカルボニル基が挙げられる。
別の実施形態では、両性イオン含有化合物は、被検体を測定又は定量するための生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーと共有結合を形成するのに有用であり得る。このようなアッセイにおいて典型的に測定される被検体は、多くの場合、幾らか臨床的に関連する物質であり、そして、タンパク質、核酸、ウイルス細菌等の大きな巨大分子からエタノール、ビタミン、ステロイド、ホルモン、治療薬等の小分子まで広範な分子に及び得る。「サンドイッチ」イムノアッセイは、典型的に、抗体等の２つの結合分子を用いる大きな分子（巨大分子状被検体とも呼ばれる）を検出することを含む。一方の抗体は、粒子、ビーズ、膜、マイクロタイタープレート又は任意の他の固体表面等の固相に固定化されているか又は付着している。例えば、抗体は、グルタルアルデヒド等の架橋分子を用いることにより、表面にアミンを含有する粒子に共有結合し得る。また、結合は、非共有結合であってもよく、そして、ポリスチレンビーズ及びマイクロタイタープレート等の固相の表面に対する結合分子の単なる吸着を含んでもよい。第２の抗体は、化学発光性又は蛍光性の分子と共有結合することができる。例示的なアッセイでは、２つの抗体は、巨大分子状被検体の異なる領域に結合することができる。巨大分子状被検体は、例えば、抗体、抗体断片、細胞、ウイルス、受容体又は合成高分子であってよい。結合分子は、抗体、抗体断片、核酸、ペプチド、結合タンパク質又は合成結合ポリマーであってよい。例えば、葉酸結合タンパク質（「ＦＢＰ」）は、被検体である葉酸に結合する。また、様々な被検体に結合できる合成結合分子が、Mossbach et al. Biotechnology vol. 14, pp. 163-170 (1995)に報告されている。
１つの実施形態では、両性イオン含有化合物は、式Ｉで示される以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
Ｚは、任意の適切なアニオン含有基であってよい。幾つかの実施形態では、アニオン含有基Ｚは、式Ｉで表される化合物の四級窒素とともに両性イオン部分を形成する。適切なアニオン含有基としては、例えば、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、スルホネート（−ＳＯ３ −）、スルフェート（−ＯＳＯ３ −）、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））及びオキシド（−Ｏ−）（式中、Ｒは炭化水素部分である）が挙げられる。好ましくは、Ｒは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基であってよい。幾つかの実施形態では、Ｒは、場合により３、５、１０、１５又は２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０、Ｃ１−１５、Ｃ１−１０、Ｃ１−５又はＣ１−３アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルであってよい。１つの例示的な実施形態では、Ｚは、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、スルホネート（−ＳＯ３ −）、スルフェート（−ＯＳＯ３ −）、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））及びオキシド（−Ｏ−）（式中、Ｒは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１２アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルである）からなる群より選択されるアニオン含有基である。
Ｚがスルホネート（−ＳＯ３ −）である場合に特に言及してよい。別の特に適切な負電荷基は、Ｚがホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））であり、そして、Ｒが、場合により酸素、硫黄及び窒素の原子等の１〜２０個のヘテロ原子を含むＣ１−１２アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルであり；Ｒが、好ましくは、置換又は非置換の、分枝状、直鎖又は環状の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ベンジル、アルキル−アリール、アリール−アルキル、二環式アルキル又はアリールのラジカル、及びこれらの組合せから選択され；そして、ここで前述のラジカルはそれぞれ、１〜６個のヘテロ原子ならびに／又は例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルキルイミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アミド、エステル、カルボキサミド、カルバメート、アルコキシル、アリールオキシル、アルキルチオール、アルキルスルホネート、ニトロ、シアノ、オキソ、オキサ、アゾ、チオ、スルホニル、エステル、ホスホニル、ホスフィニル、チオール、チオエーテル、チオエステル、チオアルコキシ、チオシアネート、ペルフルオロ、ホスフェート、オキシム、スルフェート、スルホ−アルキル、及びこれらの組合せを含む任意のヘテロ原子含有部分で置換されていてもよい。
Ｙ１は、例えば、ペプチド、タンパク質、又は巨大分子等の疎水性分子と共有結合を形成するための任意の適切な反応性官能基を含み得る。より具体的には、Ｙ１は、疎水性分子と複合体を形成するのに適切な任意の求電子基、求核基又は光反応性基を含んでもよい。例えば、Ｙ１は、被検体を測定又は定量するための生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーと共有結合を形成するための反応性官能基を含み得る。特定の実施形態では、Ｙ１に適切な官能基は、例えば、アミン反応性基、チオール反応性基、カルボキシ反応性基、マレイミジル反応性基、炭水化物反応性基、又は光反応性基を含んでよい。より具体的には、Ｙ１に適切な官能基は、例えば、以下：
Figure 2018080194
を含んでよい。
特定の好ましい態様では、Ｙ１は、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、マレイミド、アミン又はＮ−スクシンイミジルオキシカルボニルであってよい。
Ｌ１は、場合により少なくとも１個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている任意の二価の炭化水素部分であってよい。連結基Ｌ１の長さは本質的に制限されないが、長脂肪鎖は分子の疎水性を低下させるのであまり望ましくないことに留意すべきである。無論、ポリエチレングリコール鎖等の親水性リンカーの長さは本質的に制限されない。例えば、Ｌ１は、例えば、場合により窒素、酸素、カルボキシル、アミン、及び／又はカルボニル基等の１〜２０個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基等のＣ１−Ｃ３０炭化水素ラジカルから選択してよい。幾つかの実施形態では、Ｌ１は、独立して、各出現時において、場合により１〜２０、１〜１０、１〜５又は１〜３個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むＣ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４又はＣ１−Ｃ３の炭化水素ラジカルから選択してよい。他の実施形態では、Ｌ１は、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている、置換又は非置換の、分枝状又は直鎖の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基からなる群から選択してよく、例えば、制限するものではないが、−（ＣＨ２）ａ−（式中、「ａ」は１〜２０の整数である）型の直鎖アルキル部分、例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−（ＣＨ２）ａＯ−又は−Ｏ（ＣＨ２）ａ−（式中、「ａ」は１〜１９の整数である）型の直鎖アルコキシ部分、例えば−ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−Ｏ（ＣＨ２）ａＯ−（式中、「ａ」は上に定義した通りである）；あるいは−（ＣＨ２）ｂＯ（ＣＨ２）ｃ−、−（ＣＨ２）ｂＳ（ＣＨ２）ｃ−又は−（ＣＨ２）ｂＮＲＬ（ＣＨ２）ｃ−（式中、「ｂ」及び「ｃ」は、独立して、１〜１８の整数であり、そして、ＲＬは、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基である）型の部分を含む。好ましくは、Ｌ１は、場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基である。
他の実施形態では、Ｌ１は、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１０アルキルからの二価ラジカルから選択してよい。別の実施形態では、Ｌ１は、二価のＣ１−２０アルキル基、より好ましくは二価のＣ１−１５アルキル基、更に好ましくは二価のＣ１−１０アルキル基、そして、より更に好ましくは二価のＣ１−６アルキル基である。特定の実施形態では、Ｌ１は二価のＣ１−６アルキル基である。他の実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎ＝１〜２０である）型の二価ラジカルであってよい。あるいは、ｎは、１〜１５、１〜１２、１〜１０、１〜８又は１〜６であってよい。
Ｌ２は、存在してもよく、存在しなくてもよい（Ｌ２が結合である場合）。リンカーＬ２は、好ましくは、アニオンとカチオンとの間の分離を最小限にして、好ましくは実質的に電荷を中性に維持するために結合又は短い炭化水素鎖であるが、米国特許出願第2007/0259333 A1号（Dratzら）に開示されている両性イオンは、より大きな電荷分離を有し、その結果、前記公報に開示されているアニオン及びカチオンは、より分離された電荷特性を有する。好ましくは、Ｌ２は、結合、又は場合により１０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている二価のＣ１−６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基である。１つの実施形態では、Ｌ２は、結合、又は場合により１０、８、４又は２個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている二価のＣ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ５、Ｃ１−Ｃ４若しくはＣ１−Ｃ３アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基である。別の実施形態では、Ｌ２は、結合、又は場合により４個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている二価のＣ２アルキル、アルケニル、若しくはアルキニル基である。別の実施形態では、Ｌ２は、結合、又は場合により１０、８、４、又は２個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている二価のＣ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ５、Ｃ１−Ｃ４若しくはＣ１−Ｃ３アルキル基である。特定の実施形態では、Ｌ２は二価のＣ１−４アルキル基である。他の実施形態では、Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）型の二価のラジカルであってよい。
あるいは、Ｌ２は、場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている、置換又は非置換の、分枝状又は直鎖の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基からなる群から選択してよい。
Ｒ１及びＲ２は、独立して、場合により少なくとも１個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている任意の炭化水素部分を表してよい。例えば、Ｒ１及び／又はＲ２は、独立して、各出現時において、例えば、場合により窒素、酸素、カルボキシル、アミン及び／又はカルボニル基等の１〜２０個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基等のＣ１−Ｃ３０炭化水素ラジカルから選択してよい。幾つかの実施形態では、Ｒ１及び／又はＲ２は、独立して、各出現時において、場合により１〜２０、１〜１０、１〜５又は１〜３個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むＣ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６、又はＣ１−Ｃ４炭化水素ラジカルから選択してよい。１つの例示的な実施形態では、Ｒ１及び／又はＲ２は、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている、置換又は非置換の、分枝状又は直鎖の、Ｃ１−２０炭化水素部分、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基であってよい。他の例示的な実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、又はアラルキル基から選択される。好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、独立して、各出現時において、Ｃ１−１５アルキル基から、より好ましくはＣ１−１０アルキル基から選択される。特定の具体的な実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、一方又は両方においてＣ１−６アルキル基である。他の実施形態では、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも１つは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、ｓｅｃブチル、イソブチル、ｔｅｒｔブチル、シクロブチル、１−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル及びシクロヘキシルであり、これらは、非置換であってもよく、あるいはハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルキルイミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アミド、エステル、カルボキサミド、カルバメート、アルコキシル、アリールオキシ、アルキルチオール、アルキルスルホネート、ニトロ、シアノ、オキソ、オキサ、アゾ、チオ、スルホニル、エステル、ホスホニル、ホスフィニル、チオール、チオエーテル、チオエステル、チオアルコキシ、チオシアネート、ペルフルオロ、ホスフェート、オキシム、スルフェート、スルホアルキル、これらの組合せ、又は疎水性分子、好ましくはペプチド、タンパク質又は巨大分子と複合体を形成するためのこの化合物の反応性を阻害しない任意の他の官能基からなる群から選択される１以上のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されていてもよい。好ましい置換基としては、窒素、酸素、カルボキシル、アミン及び／又はカルボニル基が挙げられる。例示的な実施形態では、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも１つはメチル基である。別の実施形態では、Ｒ１及びＲ２の両方がメチル基である。
１つの実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、
ｎ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４であり；そして、
ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
別の実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、
ｎ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４であり；
ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４であり；そして、
ｒ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
別の実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、
ｎ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４であり；そして、
ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
別の実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、
ｎ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４であり；そして、
ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
別の実施形態では、式（Ｉ）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、
ｎ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４であり；
ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４であり；そして、
ｙ＝１〜６、好ましくは２〜５、そしてより好ましくは３〜５である）
を有する。
１つの特定の実施形態では、式Ｉで表される両性イオン含有化合物は、ペプチド、タンパク質又は巨大分子の水溶解度を改善する方法において使用することができる。前記方法は、式Ｉで表される両性イオン含有化合物をペプチド、タンパク質又は巨大分子に結合させることを含んでよい。特に、両性イオン含有化合物は、ペプチド、タンパク質又は巨大分子と共有結合を形成することができる。具体的には、Ｙ１部分は、例えば、ペプチド、タンパク質又は巨大分子内のアミン基、チオール基又は炭水化物基等の反応性基と共有結合を形成することができる。
別の実施形態では、式Ｉで表される両性イオン含有化合物は、生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーの非特異的な結合を低減する方法において使用することができる。前記方法は、式Ｉで表される両性イオン含有化合物をペプチド、タンパク質又は巨大分子に結合させることを含んでよい。特に、両性イオン含有化合物は、被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーと共有結合を形成することができる。具体的には、Ｙ１部分は、例えば、被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナー内のアミン基、チオール基又は炭水化物基等の反応性基と共有結合を形成することができる。
疎水性分子、例えばペプチド、タンパク質及び他の巨大分子を修飾するための両性イオン含有化合物の例示的な実施形態を図１に提供する。化合物Ｚ２−ＰＦＰ（化合物１ｄ）、Ｚ３−ＰＦＰ（化合物２ｃ）、Ｚ４−ＰＦＰ（化合物３ｃ）及びＺＰＢ−ＰＦＰ（化合物４ｃ、ＺＰＢ＝両性イオンホスホベタイン）は、スルホベタイン又はホスホベタイン、ならびに反応性ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステルを有するアミン反応性両性イオン化合物である。３つのスルホベタインＺ２−ＰＦＰ、Ｚ３−ＰＦＰ及びＺ４−ＰＦＰは、両性イオンを構成する四級アンモニウムとスルホネート部分との間の電荷分離が増加している。これらアミン反応性両性イオン標識の合成について、実施例１〜４に詳細に記載する。
また、図１は、カルボン酸部分に対するカップリングに有用な求核性アミン部分を有する両性イオン化合物（化合物５ｃ）に加えて、２つのチオール反応性両性イオン標識Ｚ−マレイミド−１（化合物６ｂ）及びＺ−マレイミド−２（化合物７ａ）を提供する。チオール反応性両性イオン標識は、同時にその水溶解度を改善しながら、タンパク質及びペプチドにおける遊離チオールをキャッピングしてその酸化及び凝集を防ぐのに有用である。
別の実施形態では、本発明に係る両性イオン含有化合物は、その溶解度を改善するための、例えば、蛍光標識、化学発光標識、ビオチン等の被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを標識するための生物学的結合アッセイにおいて用いられる標識等の検出可能な標識を修飾するため、そして、水溶解度の上昇した複合体を合成するための両性イオン性リンカーとして機能し得る。蛍光標識（例えば、フルオレセイン）及びビオチンで作製される検出可能な標識について特に言及する。１つの実施形態では、両性イオン含有化合物は、（ｉ）結合、又は場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている炭化水素部分によって四級アンモニウムの窒素原子に結合している負電荷基と；（ii）場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている炭化水素部分によって四級アンモニウムの窒素原子に結合している求電子基、求核基、又は光反応性基と；（iii）場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている炭化水素部分によって四級アンモニウムの窒素原子に結合している蛍光標識又はビオチンとを含み得る。窒素原子に結合している負電荷基は、ともに両性イオン性基を構成し得、例えば、スルホベタインの場合、四級窒素に正電荷が存在し、そして、二価アルキル部分により前記四級窒素に結合している−ＳＯ３基に負電荷が存在する。求電子基、求核基又は光反応性基を窒素原子に結合させる炭化水素部分は、好ましくは、二価のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基を含む。より好ましくは、求電子基、求核基又は光反応性基を窒素原子に結合させる炭化水素部分は、二価のＣ１−６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基を含む。
１つの実施形態では、被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを標識するための両性イオン含有化合物は、式IIで示される以下の構造：
Figure 2018080194
を有する。
Ｇは、任意の検出可能な標識であってよい。より具体的には、Ｇは、生物学的アッセイに適する任意の検出可能な標識であってよい。幾つかの実施形態では、Ｇは、蛍光標識、化学発光標識又はビオチンから選択される。好ましくは、Ｇは、蛍光標識、例えば、フルオレセインである。検出可能な標識がビオチンである場合に特に言及する。
Ｌ３は、場合により少なくとも１個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている任意の二価の炭化水素部分であってよい。連結基Ｌ３の長さは本質的に制限されないが、Ｌ１に関して論じた親水性に関する考察と同じ考察に従う。例えば、Ｌ３は、例えば、場合により窒素、酸素、カルボキシル、アミン及び／又はカルボニル基等の１〜２０個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基等のＣ１−Ｃ３０炭化水素ラジカルから選択してよい。幾つかの実施形態では、Ｌ３は、独立して、各出現時において、場合により１〜２０、１〜１０、１〜５、又は１〜３個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むＣ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４又はＣ１−Ｃ３の炭化水素ラジカルから選択してよい。他の実施形態では、Ｌ３は、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている、置換又は非置換の、分枝状又は直鎖の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基からなる群から選択してよい。
特定の実施形態では、Ｌ３は、基−ＸＧ−ＲＧ−であり得る（式中、ＸＧはＧに結合しており、ＸＧは、結合、又は例えば酸素、硫黄、アミン、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲＮ−若しくは−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−）、エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）又は尿素（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）等のリンカー部分であり、そして、ＲＮは、例えば、場合により３、５、１０、又は２０個以下のヘテロ原子で置換されている水素又はＣ１−２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６若しくはＣ１−Ｃ４アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル等の任意の炭化水素部分であってよい）。幾つかの実施形態では、ＲＮは、例えば、場合により酸素、硫黄及び窒素の原子等の２０個以下のヘテロ原子で置換されている水素又はＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基であってよく；ＲＮは、好ましくは、置換又は非置換の、分枝状、直鎖、又は環状の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール、アルキル−アリール、アリール−アルキル、アルキル−ヘテロアリール、ヘテロアリール−アルキル、ヘテロアリール−アリール、アリール−ヘテロアリール、二環式アルキル、アリール又はヘテロアリールのラジカル、及びこれらの組合せから選択され；そして、前述のラジカルはそれぞれ、１〜２０個のヘテロ原子ならびに／又は例えば、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルコキシル、アルキルアミノ、アルキルチオール、アルキルイミノ、アルキルスルホネート、アミド、アゾ、カルボキシル、カルボキサミド、カルバミド、シアノ、ジアルキルアミノ、エステル、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、オキソ、オキサ、オキシム、ペルフルオロ、ホスフェート、ホスホニル、ホスフィニル、スルフェート、スルフェート、スルホ−アルキル、チオール、チオエーテル、チオエステル、チオアルコキシ、チオシアナネート及びこれらの組合せを含む任意のヘテロ原子含有部分で置換されていてもよい。好ましくは、ＲＮは、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルキル又はＣ１−４アルキルである。特定の実施形態では、ＲＮはメチレン基である。
ＲＧは、場合により少なくとも１個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている任意の二価の炭化水素部分であってよい。例えば、ＲＧは、場合により窒素、酸素、カルボキシル、アミン及び／又はカルボニル基等の１〜２０個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、又はアルキル−アリール基等のＣ１−Ｃ３０炭化水素ラジカルから選択してよい。幾つかの実施形態では、ＲＧは、独立して、各出現時において、場合により１〜２０、１〜１０、１〜５又は１〜３個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むＣ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４又はＣ１−Ｃ３の炭化水素ラジカルから選択してよい。他の実施形態では、ＲＧは、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている、置換又は非置換の、分枝状又は直鎖の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、又はアルキル−アリール基からなる群から選択してよく、例えば、制限するものではないが、−（ＣＨ２）ａ−（式中、「ａ」は１〜２０の整数である）型の直鎖アルキル部分、例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−（ＣＨ２）ａＯ−又は−Ｏ（ＣＨ２）ａ−（式中、「ａ」は１〜１９の整数である）型の直鎖アルコキシ部分、例えば−ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−Ｏ（ＣＨ２）ａＯ−（式中、「ａ」は上に定義した通りである）；あるいは−（ＣＨ２）ｂＯ（ＣＨ２）ｃ−、−（ＣＨ２）ｂＳ（ＣＨ２）ｃ−又は−（ＣＨ２）ｂＮＲＬ（ＣＨ２）ｃ−（式中、「ｂ」及び「ｃ」は、独立して、１〜１８の整数であり、そして、ＲＬは、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基である）型の部分を含む。
他の実施形態では、ＲＧは、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１０アルキルからの二価ラジカルである。別の実施形態では、ＲＧは、二価のＣ１−１５アルキル基、より好ましくは二価のＣ１−１０アルキル基、更に好ましくは二価のＣ１−６アルキル基、そして、より更に好ましくは二価のＣ１−４アルキル基である。特定の実施形態では、ＲＧはメチレン基である。他の実施形態では、ＲＧは、−（ＣＨ２）ｇ−（式中、ｇ＝１〜１５である）型の二価ラジカルであってよい。あるいは、ｇは、１〜１０、１〜８、１〜６又は１〜４であってよい。
式Ｉに関連して定義した、その選好性を含む置換基Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１、Ｚ、Ｙ１等の選択は、したがって、式IIに係る同様のパラメータの選択にも等しく適用されることを理解されたい。
１つの実施形態では、式（II）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
別の実施形態では、式（II）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
別の実施形態では、式（II）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
別の実施形態では、式（II）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
１つの特定の実施形態では、式IIで表される両性イオン含有化合物は、生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを標識する方法において使用することができる。前記方法は、前記両性イオン含有化合物をペプチド、タンパク質又は巨大分子に結合させることを含んでよい。特に、前記両性イオン含有化合物は、被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーと共有結合を形成することができる。具体的には、Ｙ１部分は、例えば、被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナー内のアミン基、チオール基又は炭水化物基等の反応性基と共有結合を形成することができる。
生物学的結合アッセイのための被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを標識するための本発明に係る両性イオン含有化合物の例示的な実施形態は、前記被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーの溶解度を改善したり、水溶解度の上昇した標識複合体の合成を促進したりすることができる。検出可能な標識を含む部分がフルオレセイン又はビオチンのいずれかである例示的な実施形態を図２ａ及び図２ｂに提供する。化合物ビオチン−Ｚ−ＮＨ２（化合物１０ａ）及びフルオレセイン−Ｚ−ＮＨ２（化合物１１ａ）は、両性イオン性スルホベタインリンカーとカルボン酸とのカップリングに有用な求核性アミン部分とを含有する。化合物ビオチン−Ｚ−ＮＨＳ（化合物１０ｃ）及びフルオレセイン−Ｚ−ＮＨＳ（化合物１１ｃ）は、これら両化合物がアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳエステル）を含有することを除いて、同じスルホベタイン両性イオンリンカーを含有する。ビオチン−ストレプトアビジン及びフルオレセイン−抗フルオレセイン抗体の結合相互作用は、イムノアッセイを考案するために使用することができる。例えば、ストレプトアビジン又は抗フルオレセイン抗体を、微粒子等の固相上に固定してよく、そして、ビオチン標識分子又はフルオレセイン標識分子を、イムノアッセイの過程中に前記固相上に捕捉してよい。標識分子が疎水性である場合、両性イオン、ビオチン又はフルオレセイン誘導体によりその水溶解度を緩和すると、非特異的な結合を低減することによりアッセイ性能が改善される可能性がある。このような複合体の２つの例を図２ｂに図示し、これらは、ステロイドであるプロゲステロン（１１ｄ）と免疫抑制剤であるＦＫ５０６（１１ｅ）との両性イオン性フルオレセイン複合体の構造を示す。プロゲステロン及びＦＫ５０６は、両方とも疎水性の被検体であり、イムノアッセイにおいて測定又は定量するのに適する例示的な被検体である。
更に別の実施形態では、本発明に係る両性イオン含有化合物は、特に水性溶媒において、疎水性分子を架橋するのに適している場合がある。また、両性イオン含有化合物は、前記両性イオン含有化合物により架橋されていない他の疎水性分子と比べて固相における架橋複合体の非特異的な結合を低減することができる。特定の実施形態では、疎水性分子は、ペプチド、タンパク質又は巨大分子からなる群から選択してよい。１つの実施形態では、両性イオン含有化合物は、（ｉ）結合、又は場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている炭化水素部分によって四級アンモニウムの窒素原子に結合している負電荷基と；（ii）四級アンモニウムの窒素原子に結合している、同じであっても異なっていてもよい２つの求電子基、求核基又は光反応性基とを含み得る。幾つかの実施形態では、求電子基、求核基又は光反応性基は、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている炭化水素部分によって窒素原子に結合し得る。他の実施形態では、求電子基、求核基又は光反応性基は、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている炭化水素部分によって互いに結合し得、次に、結合、又は場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている炭化水素部分によって窒素原子に結合する。窒素原子に結合している負電荷基は、ともに両性イオン性基を構成し得、例えば、スルホベタインの場合、四級窒素に正電荷が存在し、そして、二価アルキル部分により前記四級窒素に結合している−ＳＯ３基に負電荷が存在する。求電子基、求核基又は光反応性基を窒素原子に結合させる炭化水素部分は、好ましくは、二価のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基を含む。より好ましくは、求電子基、求核基又は光反応性基を窒素原子に結合させる炭化水素部分は、Ｃ１−６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基からの二価ラジカルを含む。
大部分の商用架橋試薬は、疎水性である傾向があるが、水溶解度を限定的に改善するためにＰＥＧ修飾されている場合もある（オリゴ（エチレン）グリコールリンカーを有する）。しかし、本発明の両性イオン性架橋剤は、両性イオンの強い親水性により、遥かに極性が高く、優れた水溶解度を有する可能性がある。
別の実施形態では、両性イオン含有化合物は、上記の通り、被検体を測定又は定量するための生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを含むがこれらに限定されない生体分子を架橋するのに有用であり得る。両性イオン含有化合物は、同じであっても異なっていてもよい任意の２つの生体分子を架橋するのに適している場合があると想到される。本発明の両性イオン含有化合物により架橋するための生体分子としては、例えば：（ａ）小さな有機生体分子、ハプテン、又は甲状腺ホルモン、ステロイド、ビタミン、抗生物質、酵素補助因子、治療薬、代謝産物、脂質、神経伝達物質、若しくは制御されている化学物質等のリガンド、（ｂ）生物活性タンパク質（アビジン、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、ヒストン及び他のタンパク質を含む）、多糖、オリゴ糖、糖タンパク質、グリコサミノグルカン、レクチン、リポタンパク質、リポ多糖、単離された又はインタクトなＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、不活化タンパク質、ホルモン、ウイルス抗原、細菌抗原、真核生物抗原、免疫グロブリン結合タンパク質、毒素、サイトカイン、抗体断片又は受容体タンパク質等の巨大分子、（ｃ）ウイルス、細菌、真核細胞、特にリボソーム等の細胞内成分等のより高位の生物学的実体が挙げられる。
１つの実施形態では、ペプチド、タンパク質、及び／又は巨大分子を架橋するための両性イオン含有化合物は、式（III）：
Figure 2018080194
（式中、
Ωは、以下の形態：






Figure 2018080194
の両性イオン含有基であり、
Ｙ１及びＹ２は、例えば、ペプチド、タンパク質、又は巨大分子等の疎水性分子と共有結合を形成するための任意の適切な反応性官能基を含み得る）で表される構造を有する。より具体的には、Ｙ１及び／又はＹ２は、疎水性分子と複合体を形成するのに適切な任意の求電子基、求核基又は光反応性基を含んでもよい。例えば、Ｙ１及び／又はＹ２は、被検体を測定又は定量するための生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーと共有結合を形成するための反応性官能基を含み得る。特定の態様では、Ｙ１及び／又はＹ２は、独立して、各出現時において、アミン反応性基、チオール反応性基、カルボキシ反応性基、マレイミジル反応性基、炭水化物反応性基、又は光反応性基から選択される。より具体的には、Ｙ１及びＹ２に適切な官能基は、例えば、以下：
Figure 2018080194
を含んでよい。
特定の好ましい実施形態では、Ｙ１又はＹ２は、一方の出現時において、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、マレイミド、アミン又はＮ−スクシンイミジルオキシカルボニルである。
幾つかの実施形態では、両性イオン含有化合物が同じ２つの求電子基を含む場合、例えば、Ｙ１及びＹ２の両方がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるか、又はＹ１及びＹ２の両方がマレイミドである場合、この試薬をホモ二官能性架橋剤と呼ぶ。また、ホモ二官能性架橋剤試薬は、２つの求核基又は２つの光反応性基で構成される場合もある。他方、ヘテロ二官能性架橋剤は、典型的に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基等のアミン反応性官能基、及びマレイミド又はヨードアセトアミドの部分等のチオール反応性官能基を含有する。また、これらは、アミン反応性部分、チオール反応性部分、カルボキシ反応性部分、マレイミジル反応性部分、又は炭水化物反応性部分及び光反応性部分のいずれかを含有してもよい。例えば、アリールアジ化物を非選択的な光反応性基として用いてもよい。
Ｌ４は、場合により少なくとも１個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている任意の二価の炭化水素部分であってよい。連結基Ｌ４の長さは本質的に制限されないが、Ｌ１に関して論じた親水性に関する考察と同じ考察に従う。例えば、Ｌ４は、例えば、場合により窒素、酸素、カルボキシル、アミン、及び／又はカルボニル基等の１〜２０個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基等のＣ１−Ｃ３０炭化水素ラジカルから選択してよい。幾つかの実施形態では、Ｌ４は、独立して、各出現時において、場合により１〜２０、１〜１０、１〜５又は１〜３個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むＣ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４又はＣ１−Ｃ３の炭化水素ラジカルから選択してよい。他の実施形態では、Ｌ４は、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている、置換又は非置換の、分枝状又は直鎖の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、又はアルキル−アリール基からなる群から選択してよく、例えば、制限するものではないが、−（ＣＨ２）ａ−（式中、「ａ」は１〜２０の整数である）型の直鎖アルキル部分、例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−（ＣＨ２）ａＯ−又は−Ｏ（ＣＨ２）ａ−（式中、「ａ」は１〜１９の整数である）型の直鎖アルコキシ部分、例えば−ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−Ｏ（ＣＨ２）ａＯ−（式中、「ａ」は上に定義した通りである）；あるいは−（ＣＨ２）ｂＯ（ＣＨ２）ｃ−、−（ＣＨ２）ｂＳ（ＣＨ２）ｃ−又は−（ＣＨ２）ｂＮＲＬ（ＣＨ２）ｃ（式中、「ｂ」及び「ｃ」は、独立して、１〜１８の整数であり、そして、ＲＬは、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基である）型の部分を含む。好ましくは、Ｌ４は、場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基である。
他の実施形態では、Ｌ４は、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１０アルキルからの二価ラジカルから選択してよい。別の実施形態では、Ｌ４は、二価のＣ１−２０アルキル基、より好ましくは二価のＣ１−１５アルキル基、更に好ましくは二価のＣ１−１０アルキル基、そして、より更に好ましくは二価のＣ１−６アルキル基である。特定の実施形態では、Ｌ４は二価のＣ１−６アルキル基である。他の実施形態では、Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｐ＝１〜２０である）型の二価ラジカルであってよい。あるいは、ｐは、１〜１５、１〜１２、１〜１０、１〜８又は１〜６であってよい。
Ｌ５、Ｌ６及び／又はＬ７は、存在してもよく、又は存在しなくてもよい（Ｌ５、Ｌ６及び／又はＬ７が結合である場合）。しかし、以下で更に論じるように、Ｑが窒素である場合、Ｌ５、Ｌ６及びＬ７は、それぞれ結合ではない。Ｌ５、Ｌ６及び／又はＬ７は、存在する場合、場合により少なくとも１個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている任意の二価の炭化水素部分であってよい。連結基Ｌ５、Ｌ６及びＬ７の長さは本質的に制限されないが、Ｌ１に関して論じた親水性に関する考察と同じ考察に従う。例えば、Ｌ５、Ｌ６及び／又はＬ７は、例えば、場合により窒素、酸素、カルボキシル、アミン、及び／又はカルボニル基等の１〜２０個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基等のＣ１−Ｃ３０炭化水素ラジカルから選択してよい。幾つかの実施形態では、Ｌ５、Ｌ６及び／又はＬ７は、独立して、各出現時において、場合により１〜２０、１〜１０、１〜５又は１〜３個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むＣ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４又はＣ１−Ｃ３の炭化水素ラジカルから選択してよい。他の実施形態では、Ｌ５、Ｌ６及び／又はＬ７は、場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている、置換又は非置換の、分枝状又は直鎖の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基からなる群から選択してよい。
幾つかの実施形態では、Ｌ５、Ｌ６及び／又はＬ７は、基−Ｘａ−Ｒａ−であってよい（式中、ＸａはＱに結合しており、そして、独立して、各出現時において、結合又はリンカー部分、例えば、酸素、硫黄、アミン、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲＮ−若しくは−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−）、エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）又は尿素（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）から選択され、そして、ＲＮは、場合により３、５、１０、若しくは２０個のヘテロ原子で置換されている水素又は任意の炭化水素部分、例えば、Ｃ１−２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６又はＣ１−Ｃ４アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルであってよい。幾つかの実施形態では、ＲＮは、例えば、場合により酸素、硫黄、及び窒素原子等の２０個以下のヘテロ原子で置換されている水素又はＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルであってよく；ＲＮは、好ましくは、置換又は非置換の、分枝状、直鎖、又は環状の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール、アルキル−アリール、アリール−アルキル、アルキル−ヘテロアリール、ヘテロアリール−アルキル、ヘテロアリール−アリール、アリール−ヘテロアリール、二環式アルキル、アリール又はヘテロアリールのラジカル、及びこれらの組合せから選択され；そして、前述のラジカルのそれぞれが、１〜２０個のヘテロ原子及び／又は例えば、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルコキシル、アルキルアミノ、アルキルチオール、アルキルイミノ、アルキルスルホネート、アミド、アゾ、カルボキシル、カルボキサミド、カルバミド、シアノ、ジアルキルアミノ、エステル、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、オキソ、オキサ、オキシム、ペルフルオロ、ホスフェート、ホスホニル、スルフェート、スルフェート、スルホ−アルキル、チオール、チオエーテル、チオエステル、チオアルコキシ、チオシアナネート、及びこれらの組合せを含む任意のヘテロ原子含有部分で置換されていてもよい。好ましくは、ＲＮは、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルキル、又はＣ１−４アルキルである。特定の実施形態では、ＲＮはメチレン基である。Ｘａが、１以上の出現時において、アミン又はアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲＮ−又は−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−）であり、そして、Ｑが炭素である場合に特に言及する。
Ｒａは、場合により少なくとも１個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている任意の二価の炭化水素部分であってよい。例えば、Ｒａは、独立して、各出現時において、場合により窒素、酸素、カルボキシル、アミン、及び／又はカルボニル基等の１〜２０個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、又はアルキル−アリール基等のＣ１−Ｃ３０炭化水素ラジカルから選択してよい。幾つかの実施形態では、Ｒａは、独立して、各出現時において、場合により１〜２０、１〜１０、１〜５、又は１〜３個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含む水素又はＣ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４若しくはＣ１−Ｃ３の炭化水素ラジカルから選択してよい。好ましくは、Ｒａは、結合、又はそれぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−１５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基から選択される。他の実施形態では、Ｒａは、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている、置換又は非置換の、分枝状又は直鎖の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基からなる群から選択してよく、例えば、制限するものではないが、−（ＣＨ２）ａ−（式中、「ａ」は１〜２０の整数である）型の直鎖アルキル部分、例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−Ｏ（ＣＨ２）ａＯ−又は−Ｏ（ＣＨ２）ａＯ−（式中、「ａ」は１〜１９の整数である）型の直鎖アルコキシ部分、例えば−ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−Ｏ（ＣＨ２）ａＯ−（式中、「ａ」は上に定義した通りである）；あるいは−（ＣＨ２）ｂＯ（ＣＨ２）ｃ−、−（ＣＨ２）ｂＳ（ＣＨ２）ｃ−又は−（ＣＨ２）ｂＮＲＬ（ＣＨ２）ｃ−（式中、「ｂ」及び「ｃ」は、独立して、１〜１８の整数であり、そして、ＲＬは、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基である）型の部分を含む。
他の実施形態では、Ｒａは、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１０アルキルからの二価ラジカルである。別の実施形態では、Ｒａは、二価のＣ１−１５アルキル基、より好ましくは二価のＣ１−１０アルキル基、更に好ましくは二価のＣ１−６アルキル基、そして、より更に好ましくは二価のＣ１−４アルキル基である。特定の実施形態では、Ｒａはメチレン基である。他の実施形態では、Ｒａは、−（ＣＨ２）ｑ−（式中、ｑ＝１〜１５である）型の二価ラジカルであってよい。あるいは、ｑは、１〜１０、１〜８、１〜６又は１〜４であってよい。
Ｑは、任意の適切な三価ラジカルであってよい。具体的には、Ｑは、例えば、炭素又は窒素の原子であってよい。より具体的には、Ｑが窒素である場合、Ｌ５、Ｌ６及びＬ７は、それぞれ結合ではない。
式Ｉ及びIIに関連して定義した、その選好性を含む置換基Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ等の選択は、式IIIに係る同様のパラメータの選択にも等しく適用されることを理解されたい。
１つの実施形態では、式（III）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、
ｎ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４であり；
ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４であり；そして、
ｑ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
具体的には、両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
を有し得る。
別の実施形態では、式（III）で表される両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有する。
別の実施形態では、式IIIに係る両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍ＝１〜４である）型で表される二価ラジカルであり；
Ｒａ及びＲ＊は、場合により少なくとも１個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている任意の二価の炭化水素部分であってよい）を有する。例えば、Ｒａ及び／又はＲ＊は、独立して、各出現時において、例えば、場合により窒素、酸素、カルボキシル、アミン、及び／又はカルボニル基等の１〜２０個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基等のＣ１−Ｃ３０炭化水素ラジカルから選択してよい。幾つかの実施形態では、Ｒａ及びＲ＊は、独立して、各出現時において、場合により１〜２０、１〜１０、１〜５又は１〜３個のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分を含む水素又はＣ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４若しくはＣ１−Ｃ３の炭化水素ラジカルから選択してよい。好ましくは、Ｒａ及びＲ＊は、独立して、各出現時において、結合、又はそれぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−１５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、若しくはアラルキル基から選択される。他の実施形態では、Ｒａ及びＲ＊は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子又はヘテロ原子含有部分で置換されている、置換又は非置換の、分枝状又は直鎖の、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基からなる群から選択してよく、例えば、制限するものではないが、−（ＣＨ２）ａ−（式中、「ａ」は１〜２０の整数である）型の直鎖アルキル部分、例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−Ｏ（ＣＨ２）ａＯ−又は−Ｏ（ＣＨ２）ａＯ−（式中、「ａ」は１〜１９の整数である）型の直鎖アルコキシ部分、例えば−ＣＨ２Ｏ−、又は−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−；−Ｏ（ＣＨ２）ａＯ−（式中、「ａ」は上に定義した通りである）；あるいは−（ＣＨ２）ｂＯ（ＣＨ２）ｃ−、−（ＣＨ２）ｂＳ（ＣＨ２）ｃ−、又は−（ＣＨ２）ｂＮＲＬ（ＣＨ２）ｃ−（式中、「ｂ」及び「ｃ」は、独立して、１〜１８の整数であり、そして、ＲＬは、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキル−アリール基である）型の部分を含む。
他の実施形態では、Ｒａ及びＲ＊は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１０アルキルからの二価ラジカルから選択してよい。別の実施形態では、Ｒａ及び／又はＲ＊は、二価のＣ１−１５アルキル基、より好ましくは二価のＣ１−１０アルキル基、更に好ましくは二価のＣ１−６アルキル基、そして、より更に好ましくは二価のＣ１−４アルキル基である。特定の実施形態では、Ｒａ及び／又はＲ＊はメチレン基である。他の実施形態では、Ｒａ及びＲ＊は、独立して、各出現時において、−（ＣＨ２）ｑ−（式中、ｑ＝１〜１５である）型の二価ラジカルであってよい。あるいは、ｑは、１〜１０、１〜８、１〜６又は１〜４であってよい。
具体的には、ペプチド、タンパク質、及び／又は巨大分子を架橋するための両性イオン含有化合物は、以下の構造：
Figure 2018080194
（式中、ｍ＝１〜６、好ましくは１〜４、そしてより好ましくは２〜４である）
を有し得る。
１つの特定の実施形態では、式IIIで表される両性イオン含有化合物は、２つの分子及び／又は巨大分子の複合体を調製する方法において用いることができる。前記方法は、第１の分子又は巨大分子及び第２の分子又は巨大分子に両性イオン含有化合物を結合させることを含んでよい。具体的には、両性イオン含有化合物は、第１及び第２の分子又は巨大分子と共有結合を形成し得る。具体的には、Ｙ１部分は、例えば、第１の分子又は巨大分子内のアミン基、チオール基、又は炭水化物基等の反応性基と共有結合を形成し得、そして、Ｙ１部分は、第２の分子又は巨大分子内のアミン基、チオール基、又は炭水化物基等の反応性基と共有結合を形成し得る。
ペプチド、タンパク質、及び／又は巨大分子を架橋するための両性イオン含有化合物の例示的な実施形態を図１中の構造８ｃ、８ｄ、及び９ｅにより提供する。有機合成化学における様々な技術を使用して、架橋するために両性イオン含有化合物と２つの反応性基とを強力に合わせる他の構造的変形例を考案することができる。
式Ｉで表される両性イオン含有化合物は、例えば、図３ａ及び３ｂ中に示す通り、疎水性ペプチドの水溶解度を改善するのに有用であり得る。具体的には、４つの代表的な疎水性ペプチドであるペンタ（フェニルアラニン）、配列Phe-Gly-Gly-Pheを有するテトラペプチド、ペンタ（ロイシン）、及びペンタ（イソロイシン）の全てのα−アミノ基を、アミン反応性両性イオン性試薬Ｚ３−ＰＦＰ（図１中の化合物２ｃ）を用いて標識した。このような標識実験を実施例１２に例証する。両性イオン修飾ペプチドをクロマトグラフィーにより精製し、そして、透明で均質な溶液が得られる濃度で脱イオン水に溶解させることにより、その水溶解度を評価した。標識されていないペプチドは水に対して識別可能な溶解度を示さなかったが、両性イオン修飾ペプチドは、図３ａに示す通り著しく改善された水溶解度を示した。両性イオン含有化合物Ｚ３−ＰＦＰ（化合物２ｃ）によって修飾されたペンタ（フェニルアラニン）は、水に溶解し、約０．５mMの濃度の透明な溶液が得られた。より疎水性の低いテトラペプチドPhe-Gly-Gly-Pheは、両性イオン含有化合物Ｚ３−ＰＦＰで修飾されたとき、約３．０mMの水溶解度を示した。また、非常に疎水性の高いペンタ（ロイシン）及びペンタ（イソロイシン）のペプチドは、両性イオン含有化合物Ｚ３−ＰＦＰで修飾されたとき、約０．１mMの著しい水溶解度を示した。したがって、本発明の両性イオン含有化合物は、疎水性のポリペプチド及び他の巨大分子の水溶解度を著しく改善する可能性を提供する。
また、本発明の両性イオン含有化合物は、疎水性且つ「粘着質」のタンパク質の非特異的な結合を低減するのに有用であり得る。１つの実験では、図１に示す特定の例示的なアミン反応性両性イオン含有化合物の化学的能力を、アクリジニウムエステル（例えば２’，６’−ジメチル−４’−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル１０−メチル−９−アクリジンカルボキシレートメチルスルフェート（NSP-DMAE）又は参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,656,426号にLawによって記載されている他の適切なアクリジニウムエステル）で標識されているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、１０及び２０当量の両性イオン含有化合物で処理し、次いで、質量分光法により前記両性イオン含有化合物の取込みを測定することにより評価した。実施例１５に、詳細な実験のプロトコールを記載する。表１に示す通り、両性イオン含有化合物は全て、化学的に有能であり、様々な両性イオン含有化合物取り込み量でＢＳＡ及びＢＧＧの両方を標識した。例えば、NSP-DMAEで標識されたＢＳＡと、両性イオン性標識としての１０当量の両性イオン含有化合物との反応により、３〜５標識が取り込まれた。NSP-DMAEで標識されたＢＧＧと、両性イオン性標識としての１０当量の両性イオン含有化合物との反応では、約４〜９標識が取り込まれた。両性イオン含有化合物の量が増加すると、取込み量も増加することが観察された。
Figure 2018080194
本発明の両性イオン含有化合物は、タンパク質と複合体を形成したとき、非特異的な結合が少ない。粒子又はマイクロタイタープレート等の固相を用いるアッセイにおいて、上述のような非特異的な結合は、複合体と前記固相との望ましくない結合相互作用である。これら望ましくない結合相互作用は、典型的に、アッセイのバックグラウンドを上昇させてアッセイにおけるシグナル対バックグラウンド比を正味低下させ、それによってアッセイの感度を低下させる。実施例１６及び１７に詳細なプロトコールが記載されている別の実験では、３つの「粘着質」タンパク質であるアビジン、ポリクローナルウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）及びウシフィブリノゲン（ＦＢＮ）を、１０当量のアクリジニウムエステルNSP-DMAEで標識した。これら３つのタンパク質を用いて、自己集合単層を有する表面のタンパク質吸着特性を測定することができる。実施例１６に記載する通り、各アクリジニウムエステル複合体の一部を２５当量のＺ３−ＰＦＰ（図１中の化合物２ｃ）で更に標識した。次いで、これら複合体と３つの異なる微粒子固相との非特異的な結合を評価し、結果を表２にまとめる。
２つの異なる種類の粒子；商用供給元（Dynal（商標））製の常磁性粒子（ＰＭＰ）及び磁気ラテックス粒子（ＭＬＰ）上で非特異的な結合を測定した。２つの粒子は、その固有の組成が異なる。ＰＭＰは、主に、アミンを含有するシランでコーティングされた酸化鉄粒子で作製される。アミンは、グルタルアルデヒド等の試薬を用いてタンパク質を粒子表面に架橋するために用いられる。他方、ＭＬＰは、磁気分離を可能にするために磁鉄鉱をドープした多孔性ポリスチレンで作製される。グルタルアルデヒドカップリング化学作用を用いて、本評価で用いたＰＭＰの粒子表面を抗ＴＳＨ抗体（ＴＳＨ＝甲状腺刺激ホルモン）でコーティングした（表２中固相「ＰＭＰ」）。本評価で用いたＭＬＰは、ビオチン化されたポリクローナルヤギ抗ＰＴＨ抗体が結合しているDynal M280ストレプトアビジン粒子（表２中「Ｍ２８０」と略記）及びビオチン化されたモノクローナルマウス抗ｃＴｎＩ抗体が結合しているDynal M270ストレプトアビジン粒子（表２中「Ｍ２７０」と略記）であった。これら２つのＭＬＰは、表面上にストレプトアビジンが固定化されており、前記ストレプトアビジンは、次いで、それぞれ、被検体であるＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）又はｃＴＮＩ（心臓トロポニンＩ）と結合することができるビオチン標識抗体を更に固定化するために用いられた。ストレプトアビジン−ビオチン結合相互作用は、アッセイで使用するのに適している。２種類の粒子（ＰＭＰ及びＭＬＰ）を、１０分間アクリジニウムエステル及び両性イオン標識複合体の溶液と混合した。次いで、粒子を磁気的に分離し、水で２回洗浄し、次いで、粒子に結合している化学発光物質を測定した。（実験の詳細は、実施例１７に見出すことができる。）化学発光物質の合計投入量と比較したこの化学発光値の比率を、非特異的結合率（fNSB）と呼ぶ。fNSBが低いほど、非特異的な結合が少ないことを意味する。様々な複合体について計算されたfNSB値を表２にまとめる。表２から、ＰＭＰ上のNSP-DMAE標識アビジンは、fNSB＝１．３×１０−３を有する。この複合体をＺ３−ＰＦＰで更に標識すると、fNSBが１．７×１０−４に低下した。同様に、Dynal-M280及びDynal-M270のＭＬＰ粒子上のNSP-DMAE−アビジン複合体のfNSB値は、それぞれ１．６×１０−４及び６．３×１０−２であると測定されたが、両性イオンで標識された前記複合体は、それぞれ、８．３×１０−５及び５．２×１０−４とはるかに低いfNSB値を示した。以上のように、NSP-DMAE−アビジン複合体を両性イオン標識すると、この複合体の非特異的な結合は著しく低下する。NSP-DMAE-BGG複合体は、類似の挙動を示した。ＰＭＰ、Dynal-M280及びDynal-M270のＭＬＰ上のこの複合体は、それぞれ、１．２×１０−４、１．３×１０−４及び１．８×１０−３のfNSB値を示したが、両性イオン含有化合物Ｚ３−ＰＦＰにより前記複合体を更に標識すると、これらfNSB値はそれぞれ６．８×１０−５、８．１×１０−５及び３．９×１０−４に低下した。表１に示した結果と同様の結果が、フィブリノゲンでも観察された。
Figure 2018080194
実施例１６及び１７のプロトコールに従った別の例示的な実施形態では、NSP-DMAE−アビジン複合体を、図１に記載する他のアミン反応性両性イオン含有化合物（Ｚ２−ＰＦＰ（化合物１ｄ）、Ｚ４−ＰＦＰ（化合物３ｃ）、及びＺＰＢ−ＰＦＰ（化合物４ｃ））で標識して、アビジン複合体の非特異的な結合を低減する効果について判定した。これら測定の結果を表３にまとめた。これは、両性イオン標識が全てアビジン複合体の非特異的な結合を低減するのに有効であることを示す。例としてＰＭＰの粒子を使用すると、NSP-DMAE−アビジンのfNSB値（１．３×１０−３）は、１０当量のＺ２−ＰＦＰで標識することにより４．１×１０−４に低下し；２０当量のＺ４−ＰＦＰで標識することにより５．０×１０−４に低下し、そして、１０当量のホスホベタイン標識ＺＰＢ−ＰＦＰで標識することにより５．７×１０−４に低下する。他の粒子でも同様の結果が観察された。
Figure 2018080194
アミン反応性両性イオン含有化合物に加えて、図１は、チオール反応性両性イオン標識（化合物６ｂ及び７ａ）の構造、ならびに求核性アミン官能基を有する両性イオン含有化合物（化合物５ｃ及び８ｃ）の構造も提供する。これら両性イオン含有化合物は、水溶解度を改善し、そして、様々な分子の非特異的な結合を低減するために、異なる化学作用を利用してこれら両性イオン性構造を導入することを可能にする。例えば、チオールの酸化によって媒介される凝集を防ぐために、例えば、チオール反応性化合物を用いて、ペプチド、タンパク質等における遊離チオール部分をキャッピングすることができる。溶解度を改善するために、アミノ部分を有する化合物５ｃを用いて、ペプチド、タンパク質等におけるカルボキシル基を修飾することができる。化合物８ｃは、２つのアミノ基を有し、リンカーを用いて任意の２つの分子を複合体化させることができる。例えば、化合物８ｃを用いて、蛍光標識又は化学発光標識がハプテンと複合体を形成することができるトレーサを作製することができる。このような複合体の２つの例を図２ｂに図示し、これらは、ステロイドであるプロゲステロン及び免疫抑制剤であるＦＫ５０６（１１ｅ）のフルオレセイン複合体の構造を示す。２つのアミンを含有している両性イオン性化合物８ｃを用いて、実施例１１に詳細に記載する通り、２つのハプテンと蛍光分子フルオレセインとの複合体を形成することができる。
図１中の化合物８ｄ（ジ−Ｚ−ＮＨＳ）は、ペプチド、タンパク質、又は他の巨大分子を複合体化するために用いることができる、２つのアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基を有する両性イオン性ホモ二官能性架橋試薬の例である。実施例８に、この化合物の合成について記載する。実施例１３は、化合物８ｄを用いる、２つの疎水性ペプチド、ペンタ（フェニルアラニン）及びテトラペプチドPhe-Gly-Phe-Glyの複合体形成について例証する。実施例１３に記載するこの反応順において、まず、ペンタ（フェニルアラニン）におけるα−アミノ基を過剰の化合物８ｄと反応させ、次いで、精製工程を行い、次いで、両性イオン性ペンタ（フェニルアラニン）複合体１３ａのα−アミノ基とテトラペプチドとを反応させた。スルホベタイン含有試薬８ｄによって結合している２つの疎水性ペプチドを含む純粋な最終ノナペプチド１３ｂが形成された。
図１中の化合物９ｅ（Ｚ−マレイミド−ＮＨＳ）は、複合体形成に用いることができるアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びチオール反応性マレイミド基を有する両性イオン性ヘテロ二官能性架橋試薬の特に好ましい実施形態である。実施例９に、この化合物の合成について記載する。実施例１４は、９ｅを使用する２つのペプチド、ペンタ（フェニルアラニン）及びジペプチドＣｙｓ−Ｇｌｙの複合体形成を例証する。実施例１４に記載の反応の第１工程では、ペンタ（フェニルアラニン）のα−アミノ基を９ｅのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させて、マレイミド基も含有するスルホベタイン修飾ペンタペプチドを得た。第２の工程では、ジペプチドＣｙｓ−Ｇｌｙのスルフヒドリル部分をマレイミド基と反応させて、ヘプタペプチド複合体１４ｂを得た。
要約すると、本発明は、水溶解度を改善し、加えて固相に対する非特異的な結合を低減するために、疎水性分子を修飾するのに有用な様々な両性イオン含有化合物を提供する。また、本発明は、フルオレセイン及びビオチン等の検出可能な標識の水溶解度を改善するための両性イオン含有リンカー、ならびにペプチド、タンパク質、及び他の巨大分子の複合体を調製するのに有用な両性イオン性架橋剤についても記載する。
実施例１
Ｚ２−ＰＦＰ（化合物１ｄ）の合成
ａ） 化合物１ａ
無水トルエン（５０mL）中４−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（２ｇ、０．０１２モル、Aldrich）、ｐ−トルエンスルホン酸（１．５３ｇ、１．０５当量）及びベンジルアルコール（２．２ｇ、０．０２０４モル）の混合物を、水を共沸除去しながら窒素雰囲気下で還流させた。２時間後、反応物を室温に冷却し、そして、水（７５mL）及び酢酸エチル（５０mL）で希釈した。生成物を含有する水溶液を酢酸エチルで３回抽出した（３×５０mL）。次いで、水溶液のpHを５％のＫＯＨでpH９に調節し、そして、得られた懸濁液を酢酸エチルで抽出した（２×５０mL）。合わせた酢酸エチル抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、濾過し、そして、減圧下で濃縮して、粘着性の油状物を得た。収量＝０．９ｇ（３４％）。
ｂ） 化合物１ｂ
［ＢＭＩＭ］ＢＦ４］（１mL、Aldrich）中化合物１ａ（０．１ｇ、０．４５mmol）、ナトリウム２−ブロモエタンスルホネート（０．１９ｇ、２当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（９９μL、０．４５mmol）の混合物を、１６時間激しく撹拌しながら１５０℃の油浴中で加熱した。次いで、反応物を室温に冷却し、そして、反応混合物のごく一部を回収し、メタノール／水で希釈し、そして、Phenomenex、Ｃ１８、４．６×２５０mmカラム、ならびに流速１．０mL／分の１０→７０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配、ならびに２６０nm及び２２０nmのＵＶ検出を使用して、分析的ＨＰＬＣによって分析した。生成物は、Ｒｔ＝１３．３分で溶離することが観察された（約４０％変換）。それを水（１５mL）で希釈し、そして、この溶液を酢酸エチル（２×２５mL）で洗浄することにより、反応混合物を調製した。次いで、水溶液をアンモニア３〜４滴で処理し、そして、酢酸エチル（２×２５mL）で更に抽出した。次いで、回転蒸発により水溶液を約７mLに濃縮した。次いで、ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム、及び流速２０mL／分の上記と同じ勾配を使用して、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、減圧下で濃縮した。収量＝３０mg（２０％、白色固体）；MALDI-TOF MS ３３０．６（実測値）。
ｃ） 化合物１ｃ
１０％水メタノール（２０mL）中化合物１ｂの溶液を、４８時間室温にて５％パラジウム炭素３０mg超で水素化させた。次いで、懸濁液を濾過し、触媒を１：１水メタノール（５mL）ですすいだ。合わせた濾液を減圧下で濃縮した。収量＝２６mg（定量）；MALDI-TOF MS ２４０．５（実測値）。
ｄ） 化合物１ｄ
１：１の０．１Ｎ ＨＣｌ／ＭｅＣＮ（４mL）中化合物１ｃ（２５mg、０．１０４mmol）及びペンタフルオロフェノール（４５mg、０．２５mmol）の溶液を、ＥＤＣ．ＨＣｌ（５０mg、２．５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１．５時間後に、セクション（ｂ）に記載したＨＰＬＣ解析により、生成物がＲｔ＝１７分で溶離することが示された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→１００％のＭｅＯＨ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。２７分で溶離する生成物画分を回収し、等体積の水で希釈し、−８０℃で凍結させ、凍結乾固させた。収量＝１３．２mg（３１％）；MALDI-TOF MS ４０６．６（実測値）。
以下の反応は、Ｚ２−ＰＦＰ（化合物１ｄ）の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例２
Ｚ３−ＰＦＰ（化合物２ｃ）の合成
ａ） 化合物２ａ
無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５mL）中化合物１ａ（０．２ｇ、０．９０５mmol）の溶液を１，３−プロパンスルトン（０．１６５ｇ、１．５当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（０．２４mL、１．２当量）で処理した。窒素雰囲気下で１５０℃にて反応物を加熱した。１時間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６×２５０mmカラム、ならびに流速１．０mL／分の１０→４０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の４０分間勾配、ならびに２６０nm及び２２０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。生成物は、Ｒｔ＝１４分で、出発物質はＲｔ＝１３分で溶離することが観察された。反応を室温に冷却し、減圧下で溶媒を除去した。残渣を酢酸エチル（５０mL）と水（５０mL）の間で分配した。水溶液を分離し、酢酸エチル（２×５０mL）で洗浄した。水溶液をアンモニア５滴で処理し、そして、酢酸エチル（２×２５mL）で更に抽出した。次いで、減圧下で水溶液を濃縮して、粘着質のゴム状物を得た。収量＝０．３５ｇ；MALDI-TOF MS ３４４．３（実測値）。
ｂ） 化合物２ｂ
メタノール（４０mL）中化合物２ａ（０．４２ｇ、１．２２mmol）の溶液を、１０％のパラジウム炭素０．２５ｇで処理した。懸濁液を室温にて２時間４０psiでＰａｒｒシェーカー内にて水素化した。次いで、反応物を濾過し、メタノール溶液を減圧下で濃縮して、白色の固体を得た。
収量＝０．２３４ｇ（定量）；MALDI-TOF MS ２５４．３（実測値）。
ｃ） 化合物２ｃ
０．１Ｎ ＨＣｌ／ＭｅＣＮの１：１混合物（６mL）中化合物２ｂ（０．１１４ｇ、０．４５mmol）の溶液を、ペンタフルオロフェノール（０．１２５ｇ、１．５当量）及びＥＤＣ／ＨＣｌ（０．２３０ｇ、２．５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１時間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６×２５０mmカラム、ならびに流速１．０mL／分の１０→６０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の４０分間勾配、ならびに２６０nm及び２２０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。生成物は、Ｒｔ＝１８分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→６０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の４０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝７８mg（４１％）；MALDI-TOF MS ４２０（実測値）。
以下の反応は、Ｚ３−ＰＦＰ（化合物２ｃ）の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例３
Ｚ４−ＰＦＰ（化合物３ｃ）の合成
ａ） 化合物３ａ
無水ＤＭＦ（５mL）中化合物１ａ（０．１５ｇ、０．６８mmol）及び１,４−ブタンスルトン（０．１８５ｇ、２当量）の混合物を、１６時間窒素雰囲気下で１４０〜１４５℃にて加熱した。次いで、反応物を室温に冷却し、減圧下で溶媒を除去した。残渣を水（３０mL）と酢酸エチル（３０mL）との間で分配した。水層を酢酸エチル（３０mL）で１回洗浄した。次いで、水溶液をアンモニア２滴で処理し、そして、酢酸エチル（３０mL）で更に抽出した。Phenomenex、Ｃ１８、１０×２５０mm「PRODIGY」カラム、及び流速４．０mL／分の１０→４０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の４０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。生成物は、Ｒｔ＝２０分で非常にシャープなピークとして溶離し、Ｒｔ＝２５分でごく微量の出発物質が溶離することが観察された。減圧下で水溶液を濃縮して、茶色の粘着質の固体を得た。収量＝０．３ｇ；MALDI-TOF MS ３５８．２（実測値）。
ｂ） 化合物３ｂ
粗化合物３ａ（０．３ｇ、０．８４mmol）をメタノール（２５mL）に溶解させ、５％プラチナ炭素（０．３ｇ）で処理した。バルーンを使用して、室温で３日間室温にて反応物を水素化した。次いで、反応物を濾過し、触媒をメタノール（１０mL）ですすいだ。減圧下でメタノール溶液を濃縮して、粘着質の固体を得た。収量＝０．２４５ｇ（定量）；MALDI-TOF MS ２６８．３（実測値）。
ｃ） 化合物３ｃ
１：１の０．１Ｎ ＨＣｌ／ＭｅＣＮ（６mL）中化合物３ｂ（０．１６ｇ、０．６mmol）及びペンタフルオロフェノール（０．１６５ｇ、１．５当量）の溶液を、ＥＤＣ．ＨＣｌ（０．２８６ｇ、２．５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１時間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６×２５０mmカラム、及び流速１．０mL／分の１０→７０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。生成物は、Ｒｔ＝１９分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→１００％のＭｅＯＨ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を２体積の水で希釈し、−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝１２０mg（４６％）；MALDI-TOF MS ４３４．５（実測値）。
以下の反応は、Ｚ４−ＰＦＰ（化合物３ｃ）の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例４
ＺＰＢ−ＰＦＰ（化合物４ｃ）の合成
ａ） 化合物４ａ
［ＢＭＩＭ］［ＢＦ４］（１mL）の中化合物１ａ（０．１ｇ、０．４５mmol）、及びｎ−プロピルシクロホスフェートエステル（０．１１２ｇ、１．５当量、Peresypkin and MengerによるOrg. Lett. 1999, 9, 1347-1350に記載の通り１，３，２−ジオキサホスホラン−２−オキシド及びｎ−プロパノールから合成）の混合物を１５０℃で３時間加熱した。次いで、反応物を室温に冷却し、そして、その一部（５μL）を回収し、メタノール（０．１mL）で希釈し、そして、Phenomenex、Ｃ１８、４．６×２５０mmカラム、及び流速１．０mL／分の１０→７０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣによって分析した。生成物（＞５０％変換）はＲｔ＝２１分で溶離することが観察された。次いで、実施例１のセクション（ｂ）に記載の通り反応混合物を処理した。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→１００％のＭｅＯＨ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を減圧下で濃縮した。収量＝１００mg（５７％）；MALDI-TOF MS ３８８．９（実測値）。
ｂ） 化合物４ｂ
メタノール（２０mL）中化合物４ａ（０．１ｇ、０．２６mmol）の溶液を５％プラチナ炭素０．１ｇで処理し、バルーンを用いて室温で水素化した。１６時間後、反応物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。収量＝７８mg（定量）；MALDI-TOF MS ２９８．３（実測値）。
ｃ） 化合物４ｃ
１：１の０．１Ｎ ＨＣｌ／ＭｅＣＮ（４mL）中化合物４ｂ（４０mg、０．１３４mmol）及びペンタフルオロフェノール（３７mg、１．５当量）の溶液を、ＥＤＣ．ＨＣｌ（６４mg、２．５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１時間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６×２５０mmカラム、及び流速１．０mL／分の１０→７０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。生成物は、Ｒｔ＝２６分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→７０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝５．５mg（９％）；MALDI-TOF MS ４６４．４（実測値）。
以下の反応は、ＺＰＢ−ＰＦＰ（化合物４ｃ）の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例５
Ｚ−ＮＨ２（化合物５ｃ）の合成
ａ） 化合物５ａ
クロロホルム（２５mL）中Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（６．３０ｇ、２４．７９mmol、Aldrich）の撹拌溶液を、０℃で窒素雰囲気下にて、クロロホルム（１５mL）に溶解しているＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（２．００ｇ、２１．５５mmol）の溶液に滴下した。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、次いで、室温で１時間攪拌した。得られた反応混合物をクロロホルム（４０mL）で希釈し、飽和水性重炭酸ナトリウム（３×２０mL）で洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濾液を濃縮して、わずかにピンク色の油状物として望ましい生成物５．１６ｇを得た。MALDI-TOF MS ２２３．５（実測値）。
ｂ） 化合物５ｂ
化合物５ａ（１．００ｇ、４．５mmol）を封管内の無水酢酸エチル（５mL）に溶解させ、窒素雰囲気下で３−プロパンスルトン（１．１０ｇ、９．０mmol）を添加した。封管を１６時間かけて９０℃に加熱し、次いで室温に冷却した。白色の沈殿物を濾過し、無水酢酸エチル（２０mL×３）で洗浄した。得られた白色の固体を高真空下で乾燥させて、望ましい生成物１．３１ｇ（８５％）を得た。MALDI-TOF MS ３４４．９（実測値）。
ｃ） 化合物５ｃ
化合物５ｂ（５８０mg、１．７mmol）をメタノール／水（９５／５、４０mL）に溶解させ、そして、１０％パラジウム活性炭（５８mg）を添加した。反応物を室温で４時間バルーンを使用して水素化した。次いで、反応混合物を濾過し、そして、濾液を濃縮乾固させて、白色の固体として望ましい生成物を得た。MALDI-TOF MS ２１１（実測値）。
以下の反応は、Ｚ−ＮＨ２（化合物５ｃ）の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例６
Ｚ−マレイミド−１（化合物６ｂ）の合成
無水ＴＨＦ（５mL）中メトキシカルボニルマレイミド（０．１８３ｇ、０．００１２モル、Keller and Rudinger Hel. Chim. Acta. 1975, 58, 531-541）の溶液を、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（６４μL、０．５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌し、そして、１時間後、溶離剤としてＭｅＯＨを用いるシリカでのＴＬＣによって、極性生成物６ａ（Ｒｆ約０．２、すじ状）の形成が示された。粗反応混合物のMALDI-TOF質量分光分析は、１６９．５において強い生成物イオンを示した。ガラスウールによって反応混合物を濾過し、濾液を蒸留プロパンスルトン（０．２８８ｇ、２当量）で処理した。４〜５時間窒素雰囲気下で反応物を還流させた。反応において白色の固体が形成されたことが観察された。反応物を酢酸エチル（１０〜１５mL）で希釈し、３６時間冷蔵庫で冷却して、沈殿を完了させた。次いで、濾過により生成物を回収し、そして、酢酸エチル（５mL）ですすいだ。次いで、粘着質の固体を水（１０mL、０．０５％のＴＦＡを含有）に溶解させた。MALDI-TOF質量分光分析は、２９１．５において生成物を表す強いイオンを示し、そして、出発物質は示されなかった。水溶液を−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させて、白色のふわふわした粉末を得た。収量＝５３mg（２０％）；
以下の反応は、Ｚ−マレイミド−１（化合物６ｂ）の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例７
Ｚ−マレイミド−２（化合物７ａ）の合成
無水ジメチルスルホキシド（１mL）中化合物５ｃ（２１．０mg、０．１mmol）及び４−マレイミド酪酸（１８．３mg、０．１mmol）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（３５μL、０．２mmol）及びＢＯＰ試薬（６６．２mg、０．１５mmol）を添加した。反応物を１時間室温で撹拌した。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記０→４０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の４０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝４３mg（定量）；MALDI-TOF MS ３７６．７（実測値）。
以下の反応は、Ｚ−マレイミド−２（化合物７ａ）の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例８
Ｚ−ジアミン（化合物８ｃ）及びＺ−ジ−ＮＨＳ（化合物８ｄ）の合成
ａ） 化合物８ａ
クロロホルム（４０mL）中Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミン（１ｇ、６．９mmol、ＴＣＩ）の溶液をベンジルオキシカルボニルスクシンイミド（３．７８ｇ、２．２当量）で処理した。反応物を１６時間室温で撹拌した。酢酸エチル中１５％メタノールを使用して反応混合物をシリカでのＴＬＣで分析することにより、透明な反応物中に極性生成物が形成されたことが示された。反応混合物をクロロホルム（４０mL）で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。次いで、無水硫酸マグネシウム上でそれを乾燥して、濾過し、そして、減圧下で濃縮して、保存中に固化してろう状の固体になる粘着性の油状物を得た。収量＝３．２ｇ；MALDI-TOF MS ４１４．４（実測値）。
ｂ） 化合物８ｂ
無水ＤＭＦ（１５mL）中化合物８ａ（１．２ｇ、２．９mmol）の溶液を１，３−プロパンスルトン（０．７１ｇ、２当量）で処理した。反応物を１時間窒素下で１４５℃にて加熱した。Phenomenex、Ｃ１８、４．６mm×２５cmカラム、及び流速１．０mL／分の１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、反応混合物のごく一部をＨＰＬＣ分析した。生成物は、Ｒｔ＝１９．６分（約８０％変換）で、出発物質はＲｔ＝２１．６分で溶離することが観察された。反応混合物を減圧下で濃縮し、回収した油状物をメタノール（２０mL）に溶解させた。４０％のメタノール、６０％の酢酸エチルを使用するシリカでのＴＬＣ分析により、出発物質（Ｒｆ約０．３）から純粋な生成物（Ｒｆ約０．２）が分離されたことが示された。同じ規模で上記反応を繰り返し、そして、合わせた反応混合物を４０％のメタノール、６０％の酢酸エチルを溶離剤として使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量＝１．５５ｇ（６０％）；白色の発泡体；MALDI-TOF MS ５３６．４（実測値）。
ｃ） 化合物８ｃ
２４時間室温で３３％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ１５mL中にて、化合物８ｂ（０．８ｇ、１．４９mmol）を撹拌した。次いで、エーテル（１００mL）を添加したところ、白色の粒状固体が分離した。生成物を沈降させ、エーテルをデカンタした。エーテルで２回（２×５０mL）この工程を繰り返した。最後に、真空下で生成物を乾燥させた。回収した粘着性の油状物を５〜６mLの水に溶解させ、−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させてガラス質の固体を得た。収量＝０．７６６ｇ（定量）；MALDI-TOF MS ２６８．２（実測値）。２５％のアンモニア、７５％のメタノール及び可視化用のニンヒドリンを使用するシリカでのＴＬＣ分析により、Ｒｆ約０．２のシングルスポットが示された。
ｄ） 化合物８ｄ
ＤＭＳＯ（１mL）中化合物８ｃ（２５mg、５６μmol）の溶液をジイソプロピルエチルアミン（３９μL、４当量）で処理し、この溶液をＤＭＳＯ（２mL）中ジスクシンイミジルカーボネート（９６mg、０．３７mmol）の溶液に滴下した。反応物を室温で撹拌した。３０分間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６mm×２５cmカラム、及び流速１．０mL／分の１０→４０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配、及び２２０nmのＵＶ検出を使用して、反応混合物の一部をＨＰＬＣによって分析した。生成物は、Ｒｔ＝１０分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記０→４０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の４０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝１５mg（５０％）；MALDI-TOF MS ５４９．８（実測値）。
以下の反応は、Ｚ−ジ−ＮＨＳ（化合物８ｄ）の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例９
Ｚ−マレイミド−ＮＨＳ（化合物９ｅ）の合成
ａ） 化合物９ａ
無水ＤＭＳＯ（２mL）中化合物５ｃ（１０５mg、０．５mmol）の溶液をトリエチルアミン（７０μL、０．５mmol）及びＮ−α−ｔ−ＢＯＣ−Ｎ−ε−ＣＢＺ−リシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２３９mg、０．５mmol、Aldrich）で処理した。懸濁液を２４時間室温で撹拌し、次いで、ＹＭＣ、Ｃ１８、５０×４．０mm、３ミクロンカラム、及び流速１．０mL／分の１０→９０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の１０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣにより分析した。生成物は、Ｒｔ＝６．２分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の１０→７０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。生成物画分を回収し、そして、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。白色の粉末として生成物を得た。収量＝２２５mg（７９％）；MALDI-TOF MS ５７２．６（実測値）。
ｂ） 化合物９ｂ
ＭｅＯＨ及びＨ２Ｏ（２０mL、９５／５）の混合物に化合物９ａ（２００mg、０．３５mmol）を添加した。次いで、１０％Ｐｄ／Ｃ（２０mg）を添加した。得られた懸濁液を、バルーンを用いて室温で４時間水素化した。次いで、反応混合物を濾過した。室温で減圧下にて濾液を濃縮した。透明な油状物として望ましい生成物を得た。収量＝１７６mg（定量）；MALDI-TOF MS ４４０．３（実測値）。
ｃ） 化合物９ｃ
無水ＤＭＳＯ（４mL）中化合物９ｂ（１７６mg、０．４mmol）の溶液を、４−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５０mg、０．１７８mmol、Thermo）及びトリエチルアミン（５４μL、０．４mmol）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１〜２時間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６×２５０mmカラム、ならびに流速１．０mL／分の０→４０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の４０分間勾配、ならびに２６０nm及び２２０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。生成物は、Ｒｔ＝２７．５分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の０→４０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の４０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝４５mg（４０％）；MALDI-TOF MS ６０４．９（実測値）。
ｄ） 化合物９ｄ
トリフルオロ酢酸（２mL）中化合物９ｃ（２５mg、４１μmol）の溶液を３時間氷浴中で撹拌した。次いで、無水エーテル（７５mL）を反応混合物に添加して、生成物を沈殿させ、これを濾過により回収し、そして、エーテルですすいだ。次いで、生成物をメタノール（１５〜２０mL）に溶解させ、実施例９のセクション（ｃ）に記載の通りＨＰＬＣによって分析した。生成物は、Ｒｔ＝１３．７分で溶離することが観察された（完全に変換）。メタノール溶液を無水トルエン（１０mL）で希釈し、次いで、減圧下で濃縮して、白色の粘着質の固体を得た。収量＝４５mg（定量）；MALDI-TOF MS ５０４．４（実測値）。
ｅ） 化合物９ｅ
無水ＤＭＳＯ（２mL）中の粗化合物９ｄ（２４mg、３８．６μmol）及びジスクシンイミジルグルタレート（５０mg、４当量、Thermo）の溶液を、トリエチルアミン（６μL、１．１当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後に、実施例９のセクション（ｃ）に記載の通りＨＰＬＣ分析を行った。生成物は、Ｒｔ＝２４分で溶離することが観察された。実施例９のセクション（ｃ）に記載の通り、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝８mg（３０％）；MALDI-TOF MS ７１７．１（実測値）。
以下の反応は、化合物９ｅの合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例１０
ビオチン−Ｚ−ＮＨ２（化合物１０ａ）及びビオチン−Ｚ−ＮＨＳ（化合物１０ｂ）の合成
ａ） 化合物１０ａ
無水ＤＭＦ（１．５mL）中ビオチン−ｐ−ニトロフェニルエステル（１１mg、３０μmol）の溶液を、水（０．８mL）及び０．１Ｍ炭酸ナトリウム pH９（１．０mL）の混合物に溶解している化合物８ｃ（４０mg、８９．４μmol、ＨＢｒ塩）の撹拌溶液に滴下した。反応物を室温で撹拌した。３０分間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６mm×２５cmカラム、及び流速１．０mL／分の０→４０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配、及び２２０nmのＵＶ検出を使用して、反応混合物のごく一部をＨＰＬＣ分析した。生成物は、Ｒｔ＝１３分で溶離することが観察された。上記勾配を用いて実施例４のセクション（ｃ）に記載の通り、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を減圧下で濃縮した。収量＝１８．２mg（定量）；MALDI-TOF MS ４９４（実測値）。
ｂ） 化合物１０ｂ
メタノール（２mL）中化合物１０ａ（１８．２mg、３７μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（３２．２μL、５当量）及び無水グルタル酸（２１mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分間後、セクション（ｄ）に記載したＨＰＬＣ分析により、生成物がＲｔ＝１７．５分で溶離することが示された。０→４０％ＭｅＣＮ／水（０．０５％ＴＦＡを含む）の４０分間勾配を用いて実施例４のセクション（ｃ）に記載の通り、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を減圧下で濃縮した。収量＝１９．７mg（８８％）；MALDI-TOF MS ６０８．５（実測値）。
ｃ） 化合物１０ｃ
無水ＤＭＦ（１mL）中化合物１０ｂ（１９．７mg、３２．４μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１１．３μL、２当量）及びＴＳＴＵ（１５mg、１．５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分間後、実施例１０のセクション（ａ）に記載したＨＰＬＣ分析により、生成物がＲｔ＝２２分で溶離することが示された。０→４０％ＭｅＣＮ／水（０．０５％ＴＦＡを含む）の４０分間勾配を用いて実施例４のセクション（ｃ）に記載の通り、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させて、白色のふわふわした粉末を得た。収量＝６．３mg（２８％）；MALDI-TOF MS ７０５（実測値）。
以下の反応は、ビオチン−Ｚ−ＮＨＳ（化合物１０ｃ）の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例１１
フルオレセイン−Ｚ−ＮＨ２（化合物１１ａ）、フルオレセイン−Ｚ−ＮＨＳ（化合物１１ｃ）、フルオレセイン−Ｚ−３−ＣＭＯ−プロゲステロン（化合物１１ｄ）、及びフルオレセイン−Ｚ−２２−ＣＭＯ−ＦＫ５０６（化合物１１ｅ）の合成
ａ） 化合物１１ａ
ＤＭＦ（１mL）中カルボキシフルオレスセイン−ＮＨＳエステル（５及び６つの異性体、１０mg、２１．１μmol）の溶液を、２５％のＤＭＦ、７５％の０．１Ｍ炭酸ナトリウム（pH９）１．５mLに溶解している化合物８ａ（２８mg、６２．６μmol、ＨＢｒ塩）の撹拌溶液に滴下した。反応物を室温で撹拌した。３０分間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６mm×２５cmカラム、及び流速１．０mL／分の０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、反応混合物のごく一部をＨＰＬＣ分析した。生成物は、Ｒｔ＝１２．５分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→７０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を減圧下で濃縮した。収量＝１２．３mg（９３％）；MALDI-TOF MS ６２６．４（実測値）。
ｂ） 化合物１１ｂ
メタノール（２mL）中化合物９ａ（１２．３mg、１９．６μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１７μL、５当量）及び無水グルタル酸（１１mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６mm×２５cmカラム、及び流速１．０mL／分の１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、反応混合物のごく一部をＨＰＬＣ分析した。Ｒｔ＝１７．５分（フェノールで反応）で溶離する副生成物とともに、生成物がＲｔ＝１４．５分で溶離されることが観察された。０．５Ｍ水性ピペリジン０．２mLで反応混合物を処理し、３０分間撹拌した。後続のＨＰＬＣ分析により、フェノールエステルが完全に加水分解されており、Ｒｔ＝１４．５分で溶離する純粋な生成物が形成されたことが示された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→７０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を減圧下で濃縮した。収量＝８．１mg（５６％）；MALDI-TOF MS ７３９．８（実測値）。
ｃ） 化合物１１ｃ
無水ＤＭＦ（２mL）中化合物９ｂ（１２．３mg、１６．６μmol）の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９．６mg、５当量）及びＥＤＣ．ＨＣｌ（１０mg、３当量）で処理した。反応物を室温で撹拌し、そして、３０分間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６mm×２５cmカラム、及び流速１．０mL／分の０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、反応混合物のごく一部をＨＰＬＣ分析した。生成物（約３０％変換）はＲｔ＝１６分で溶離することが観察された。更なるＥＤＣ．ＨＣｌ（１０mg、３当量）を添加し、そして、反応を継続した。２時間後のＨＰＬＣ分析により、約７０％の変換が示された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→７０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝１０mg（７１％）；MALDI-TOF MS ８３６．６（実測値）。
ｄ） 化合物１１ｄ
プロゲステロン−３−ＣＭＯ（８．１mg、２１μmol）の無水ＤＭＦ（１mL）溶液に、化合物１１ａ（１３mg、２１μmol）、ジイソプロピルエチルアミン（７．３μL、４２μmol）及びＢＯＰ試薬（１３．８mg、３１μmol）を添加した。反応物を２４時間室温で撹拌し、次いで、ＹＭＣ、Ｃ１８、５０×４．０mm、３ミクロンカラム及び流速１．０mL／分の１０→９０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の１０分間勾配、及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣにより分析した。生成物は、Ｒｔ＝７．８分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→９０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。生成物画分を回収し、そして、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。黄色の粉末を得た。収量＝１４．４mg（７０％）；MALDI-TOF MS ９９５．１（実測値）。
ｅ） 化合物１１ｅ
無水ジメチルホルムアミド（０．５mL）に、ＦＫ５０６−Ｃ２２−ＣＭＯ（８．８mg、１０μmol、国際公開第93/25533号）、１１ａ（７．５mg、１２μmol）、ジイソプロピルエチルアミン（４．４μL、２５μmol）及びＢＯＰ試薬（８．９mg、２０μmol）を添加した。混合物を２４時間室温で撹拌した。次いで、Phenomenex Luna PFP(2)、１５０×４．６mm、３ミクロンカラム、ならびに流速１．０mL／分の１０→９０％ＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の２０分間勾配、ならびに２６０nm及び２２０nmのＵＶ検出を使用して、反応混合物をＨＰＬＣにより分析した。生成物は１４．８〜５．１分で溶離し、そして、出発物質は１７．８分で溶離した。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→９０％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。望ましい生成物として黄色の粉末（８．２mg）を得た（MALDI-TOF MS: MH+ １４８４．３０、収率５５％）。
以下の反応は、図２ａ及び２ｂに例証する化合物の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例１２
両性イオンを用いる疎水性ペプチドの標識
以下は、図３ｂに示す通り、Ｚ３−ＰＦＰ（化合物２ｃ）を用いてペンタ（フェニルアラニン）を標識するための例示的な手順である。
ジメチルスルホキシド（０．８mL）中ペンタ（フェニルアラニン）（２mg、２．６５μmol）の溶液を、１：１ジメチルスルホキシド／水（０．１mL）に溶解しているＺ３−ＰＦＰ（化合物２ｃ）（２mg、４．８μmol）で処理し、次いで、水性炭酸ナトリウム（０．１mL、１００mM、pH９）で処理した。反応物を１６時間室温で撹拌した。Phenomenex、Ｃ１８、４．６mm×２５cmカラム、ならびに流速１．０mL／分の１０→１００％ＭｅＣＮ／水（０．０５％ＴＦＡを含む）の３０分間勾配、ならびに２２０nm及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、反応混合物のごく一部をＨＰＬＣ分析した。標識ペプチドは、Ｒｔ＝１８．５分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→１００％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝２．４mg（９２％）；MALDI-TOF MS ９８８．４（実測値）。
実施例１３
Ｚ−ジ−ＮＨＳ（化合物８ｄ）を用いるペンタ（フェニルアラニン）とPhe-Gly-Gly-Pheとの複合体形成
ａ） 化合物１３ａ
無水ジメチルスルホキシド（２mL）中化合物８ｄ、Ｚ−ジ−ＮＨＳ（４．５mg、８．３μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２μL、１１．４μmol）とともにペンタ（フェニルアラニン）（２mg、２．７μmol）に添加した。反応物を室温で撹拌した。１６時間後、Phenomenex、Ｃ１８、４．６mm×２５cmカラム、ならびに流速１．０mL／分の１０→１００％ＭｅＣＮ／水（０．０５％ＴＦＡを含む）の３０分間勾配、ならびに２２０nm及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、反応混合物をＨＰＬＣ分析した。生成物１３ａ（約６５％変換）はＲｔ＝１７分で溶離することが観察された。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→１００％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣにより粗反応混合物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝２．０mg（６４％）；MALDI-TOF MS １１８７．８（実測値）。
ｂ） 化合物１３ｂ
ジメチルスルホキシド（２．５mL）中化合物１３ａ（２mg、１．６８μmol）、Phe-Gly-Gly-Phe（３．６mg、５当量）及びジイソプロピルエチルアミン（１．５μL、５当量）の混合物を室温で撹拌した。１時間後に、実施例１３のセクション（ａ）に記載の通りＨＰＬＣ分析を行った。生成物１３ｂは、Ｒｔ＝１９分で溶離することが観察された。セクション（ａ）に記載の通り生成物を精製した。収量＝１．６mg（６３％）；MALDI-TOF MS １５００．２（実測値）。
以下の反応は、Ｚ−ジ−ＮＨＳ（化合物１３ｂ）によって結合されるペンタ（フェニルアラニン）とPhe-Gly-Gly-Pheとの複合体の合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例１４
Ｚ−マレイミド−ＮＨＳ（化合物９ｅ）を用いるペンタ（フェニルアラニン）とCys-Glyとの複合体形成
無水ＤＭＦ（３mL）中ペンタ（フェニルアラニン）（８mg、１１．２μmol）及び化合物９ｅ（４mg、５．６μmol）の溶液をトリエチルアミン（４μL、４当量）で処理した。反応物を１６時間室温で撹拌し、次いで、Phenomenex、Ｃ１８、４．６mm×２５cmカラム及び流速１．０mL／分の１０→１００％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配、ならびに２２０及び２６０nmのＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣにより分析した。生成物１４ａはＲｔ＝１８．４分で溶離することが観察された（MALDI-TOF MS １３５５．８（実測値））。Ｒｔ＝１０分で溶離する出発物質９ｅは完全に消費されていた。反応混合物に、ジペプチドCys-Gly（２mg、１１．１μmol）を添加した。反応物を室温で撹拌した。２０分後、ＨＰＬＣ解析は、Ｒｔ＝１６．５分で溶離する純粋なヘプタペプチド１４ｂが形成されたことを示したが、Ｒｔ＝１８．４分で１４ａは溶離しなかった。ＹＭＣ、Ｃ１８、３０×２５０mmカラム及び流速２０mL／分の上記１０→１００％のＭｅＣＮ／水（０．０５％のＴＦＡを含む）の３０分間勾配を使用して、ＨＰＬＣによりヘプタペプチドを精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を−８０℃で凍結させ、そして、凍結乾固させた。収量＝８．８mg（定量）、MALDI-TOF MS １５３５．３（実測値）。
以下の反応は、ヘプタペプチド１４ｂの合成について記載する。
Figure 2018080194
実施例１５
アクリジニウムエステル及び両性イオン標識１ｄ、２ｃ、３ｃ、及び４ｃを用いたＢＳＡの標識の一般手順（表１）
０．１Ｍ重炭酸ナトリウム１mL中ＢＳＡ（４mg、６０nmol）の溶液を、ＤＭＦ溶液（ＤＭＦ中２mg/mL溶液７２μL）として添加される５当量の２’，６’−ジメチル−４’−Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル１０−（３’−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキシレート（NSP-DMAE-NHS）で処理した。反応物を４時間室温で撹拌した。次いで、４mLのamiconフィルタ（カットオフＭＷ ３０，０００）に反応物を移し、脱イオン水３mLで希釈した。８分間４０００Ｇでフィルタを遠心分離して、体積を約０．２５mLに減らした。最終複合体を脱イオン水で０．８mLに希釈して、５mg/mLの溶液を得た。マトリクスとしてシナピン酸を用いるMALDI-TOF質量分光法によって測定されたアクリジニウムエステル標識取込みでは、１．４標識の取込みが示された。
両性イオン標識１ｄ、２ｃ、３ｃ及び４ｃを用いたアクリジニウムエステル標識ＢＳＡ複合体の更なる標識を以下の通り実施した。複合体（０．５mg、７．５nmol、１００μL）を炭酸ナトリウム（pH９）１００μLで希釈した。この複合体に、４つの別々の反応において、ＤＭＳＯに溶解している１０当量の４つの両性イオン標識１ｄ、２ｃ、３ｃ、及び４ｃに添加した。これらは、１ｄの２．５mg/mL溶液１２．８μL；２ｃの２mg/mL溶液１６．５μL；３ｃの２mg/mL溶液１６．５μL、及び４ｃの２．５mg/mL溶液１４μLに対応していた。反応物を４時間室温で撹拌し、次いで、上記の通り処理した。MALDI-TOF質量分光法により両性イオン標識の取込みを測定し、表１に結果を列挙する。
実施例１６
アクリジニウムエステル及び両性イオン標識Ｚ３−ＰＦＰ（化合物２ｃ）を用いるタンパク質の標識の一般手順（表２）
０．１Ｍ炭酸ナトリウム（pH９）１mL中において、卵白アビジン（ＡＶＤ）、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）及びウシフィブリノゲン（ＦＢＮ）の２mg/mL溶液を調製した。次いで、米国特許第5,656,246号にNatrajanらによって記載されている１０当量のNSP-DMAE-NHS（ＤＭＳＯ溶液の形態で添加された）でタンパク質溶液を処理した。具体的には、ＤＭＳＯ中アクリジニウムエステルの２mg/mL溶液を調製し、そして、８９μL、４０μL及び１８μLのこの溶液を、それぞれＡＶＤ、ＢＧＧ及びＦＢＮに添加した。反応物を３時間４℃で撹拌した。各反応物の一部（０．５mL）を２５当量のＺ３−ＰＦＰ（化合物２ｃ）（ＤＭＳＯ溶液の形態で添加した）で更に処理した。具体的には、ＤＭＳＯ中Ｚ３−ＰＦＰの５mg/mL溶液を調製し、そして、３２μL、１４μL及び６μLのこの溶液を、それぞれアクリジニウムエステルで標識されたＡＶＤ、ＢＧＧ及びＦＢＮに添加した。反応物を１６時間４℃で撹拌した。次いで、６つの複合体全てをそれぞれ０．１Ｍのホスフェート（pH７．４）０．５mLで希釈し、４mLのcentriconフィルタに移した。更に３mLのバッファで複合体を希釈し、７分間４０００Ｇで遠心分離して、体積を約０．２mLに減らした。この工程を更に２回繰り返した。最終複合体をリン酸バッファで総体積０．５〜１．０mLに希釈し、そして、４℃で保存した。
実施例１７
非特異的な結合の測定
それぞれNSP-DMAE及び両性イオン標識Ｚ３−ＰＦＰで標識された３つのタンパク質アビジン、ウシガンマグロブリン及びフィブリノゲンの非特異的結合率（fNSB）を測定し、そして、NSP-DMAEのみで標識された３つの同じタンパク質の非特異的結合と比較した。０．１モル濃度のナトリウムＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホネート（ＨＥＰＥＳ）、０．１５モル濃度の塩化ナトリウム、７．７ミリモル濃度のアジ化ナトリウム、１．０ミリモル濃度のエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１２ミリモル濃度のｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（TritonX-100）、７６マイクロモル濃度のウシ血清アルブミン、７ミリモル濃度のマウス免疫グロブリン（pH７．７）からなる溶液中１０ナノモル濃度の当量濃度になるように複合体を希釈した。これら１０ナノモル濃度のタンパク質−アクリジニウムエステル溶液１００マイクロリットルを、それぞれ、ウマ血清２００マイクロリットル及び３つの固相のうちのいずれか２００マイクロリットルと混合した。第１の固相は、ヒツジ抗体で共有結合的に被覆されているSiemens Healthcare Diagnostics常磁性微粒子（ＰＭＰ）０．３５グラム／リットルであった。第２の固相は、ストレプトアビジンで共有結合的に被覆されているポリスチレントシル活性化ビーズ（Invitrogen Corporation M-280磁気ラテックスマイクロ粒子（ＭＬＰ）Dynalbeads）０．３５グラム／リットルであった。第３の固相は、ストレプトアビジンで共有結合的に被覆されているグリシジルエーテル（エポキシ）カルボン酸ビーズ（Invitrogen Corporation M-270磁気ラテックスマイクロ粒子（ＭＬＰ）Dynalbeads）０．３５グラム／リットルであった。以下の規格を有する、第２及び第３の固相用の特別なビーズを使用した：
Figure 2018080194
固相を磁気的に回収し、そして、１０分間インキュベートした後に水で２回洗浄して、アクリジニウムエステルと共有結合しているタンパク質と固相とを相互作用させた。投入したアクリジニウムエステルの化学発光及び粒子に結合しているアクリジニウムエステルの化学発光の両方の化学発光を、Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 1（０．１Ｍ硝酸及び０．５％過酸化水素）及びSiemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 2（０．２５Ｍ水酸化ナトリウム及び０．０５％セチルトリメチルアンモニウムクロリド）各２５０マイクロリットルを順次添加しながら、Berthold Technologies' Autolumat LB953照度計において標準的な条件下で５秒間測定した。非特異的結合率は、投入したアクリジニウムエステルの合計化学発光物質で除した、固相に結合しているアクリジニウムエステルの粒子結合化学発光物質の比として計算する。

Claims (60)

  1. ペプチド、タンパク質又は巨大分子と複合体を形成するための両性イオン含有化合物であって、式（Ｉ）：
    Figure 2018080194
    （式中、
    Ｌ１は、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基であり；
    Ｌ２は、結合、又は場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基であり；
    Ｚは、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、スルホネート（−ＳＯ３ −）、スルフェート（−ＯＳＯ３ −）、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））及びオキシド（−Ｏ−）（式中、Ｒは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１２アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルである）からなる群より選択されるアニオン含有基であり；
    Ｙ１は、ペプチド、タンパク質又は巨大分子と共有結合を形成するための反応性官能基であって、求電子基、求核基又は光反応性基を含む官能基であり；そして、
    Ｒ１及びＲ２は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される）
    で表される構造を有する両性イオン含有化合物。
  2. Ｙ１が、アミン反応性基、チオール反応性基、カルボキシ反応性基、マレイミジル反応性基、炭水化物反応性基又は光反応性基から選択される、請求項１に記載の両性イオン含有化合物。
  3. Ｙ１が、
    Figure 2018080194
    からなる群より選択される、請求項２に記載の両性イオン含有化合物。
  4. Ｙ１が、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、マレイミド、アミン又はＮ−スクシンイミジルオキシカルボニルから選択される、請求項３に記載の両性イオン含有化合物。
  5. Ｌ１が、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−１０アルキルである、請求項１に記載の両性イオン含有化合物。
  6. Ｌ１が、−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎ＝１〜６である）型の二価ラジカルである、請求項５に記載の両性イオン含有化合物。
  7. Ｌ２が、場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキルである、請求項５に記載の両性イオン含有化合物。
  8. Ｌ２が、−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍ＝１〜４である）型の二価ラジカルである、請求項７に記載の両性イオン含有化合物。
  9. Ｚが、スルホネート（−ＳＯ３ −）である、請求項８に記載の両性イオン含有化合物。
  10. Ｚが、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））である、請求項８に記載の両性イオン含有化合物。
  11. Ｚが、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）である、請求項８に記載の両性イオン含有化合物。
  12. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項９に記載の両性イオン含有化合物。
  13. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項９に記載の両性イオン含有化合物。
  14. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項９に記載の両性イオン含有化合物。
  15. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項９に記載の両性イオン含有化合物。
  16. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項１に記載の両性イオン含有化合物。
  17. 被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを標識するための両性イオン含有化合物であって、式（II）：
    Figure 2018080194
    （式中、
    Ｌ１及びＬ３は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；
    Ｌ２は、結合、又は場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基であり；
    Ｚは、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、スルホネート（−ＳＯ３ −）、スルフェート（−ＯＳＯ３ −）、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））及びオキシド（−Ｏ−）（式中、Ｒは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１２アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルである）からなる群より選択されるアニオン含有基であり；
    Ｙ１は、被検体、被検体類似体、又は被検体の結合パートナーと共有結合を形成するための反応性官能基であって、求電子基、求核基又は光反応性基を含む官能基であり；
    Ｇは、検出可能な標識であり；そして、
    Ｒ１は、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基である）
    で表される構造を有する両性イオン含有化合物。
  18. Ｇが、蛍光標識、化学発光標識又はビオチンから選択される、請求項１７に記載の両性イオン含有化合物。
  19. Ｇが、フルオレセイン又はビオチンである、請求項１８に記載の両性イオン含有化合物。
  20. Ｙ１が、アミン反応性基、チオール反応性基、カルボキシ反応性基、マレイミジル反応性基、炭水化物反応性基又は光反応性基である、請求項１７に記載の両性イオン含有化合物。
  21. Ｙ１が、
    Figure 2018080194
    からなる群より選択される、請求項２０に記載の両性イオン含有化合物。
  22. Ｙ１が、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、マレイミド、アミン又はＮ−スクシンイミジルオキシカルボニルである、請求項２１に記載の両性イオン含有化合物。
  23. Ｌ３が、基−ＸＧ−ＲＧ−（式中、ＸＧはＧに結合しており、ＸＧは、結合、酸素、硫黄、アミン、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲＮ−若しくは−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−）、エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）又は尿素（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）から選択され、そして、ＲＮは、水素、又は場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルであり；そして、ＲＧは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルである）である、請求項１７に記載の両性イオン含有化合物。
  24. Ｌ１が、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−１０アルキルから選択され、そして、
    ＲＧが、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−１０アルキルである、請求項２３に記載の両性イオン含有化合物。
  25. Ｌ１が、−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎ＝１〜６である）型の二価ラジカルである、請求項２４に記載の両性イオン含有化合物。
  26. ＲＧが、−（ＣＨ２）ｇ−（式中、ｇ＝１〜６である）型の二価ラジカルである、請求項２４に記載の両性イオン含有化合物。
  27. Ｌ２が、場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキルである、請求項２４に記載の両性イオン含有化合物。
  28. Ｌ２が、−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍ＝１〜４である）型の二価ラジカルである、請求項２７に記載の両性イオン含有化合物。
  29. Ｚが、スルホネート（−ＳＯ３ −）である、請求項１７に記載の両性イオン含有化合物。
  30. Ｚが、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））である、請求項１７に記載の両性イオン含有化合物。
  31. Ｚが、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）である、請求項１７に記載の両性イオン含有化合物。
  32. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項２９に記載の両性イオン含有化合物。
  33. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項２９に記載の両性イオン含有化合物。
  34. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項２９に記載の両性イオン含有化合物。
  35. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項２９に記載の両性イオン含有化合物。
  36. ペプチド、タンパク質、及び／又は巨大分子を架橋するための両性イオン含有化合物であって、式（III）：
    Figure 2018080194
    （式中、
    Ωは、以下の形態：






    Figure 2018080194
    の両性イオン含有基であり、
    Ｌ１及びＬ４は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；
    Ｌ２は、結合、又は場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基であり；
    Ｌ５、Ｌ６及びＬ７は、独立して、各出現時において、結合、又はそれぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基から選択され；
    Ｑは、炭素原子又は窒素原子から選択されるが、但しＱが窒素である場合、Ｌ５、Ｌ６及びＬ７は、それぞれ結合ではなく；
    Ｚは、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、スルホネート（−ＳＯ３ −）、スルフェート（−ＯＳＯ３ −）、ホスフェート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−））及びオキシド（−Ｏ−）（式中、Ｒは、場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−１２アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルである）からなる群より選択されるアニオン含有基であり；
    Ｙ１及びＹ２は、独立して、各出現時において、求電子基、求核基又は光反応性基を含むペプチド、タンパク質又は巨大分子と共有結合を形成するための反応性官能基から選択され；そして、
    Ｒ１及びＲ２は、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される）
    で表される構造を有する両性イオン含有化合物。
  37. Ｙ１及びＹ２が、独立して、各出現時において、アミン反応性基、チオール反応性基、カルボキシ反応性基、マレイミジル反応性基、炭水化物反応性基又は光反応性基から選択される、請求項３６に記載の両性イオン含有化合物。
  38. Ｙ１及びＹ２が、独立して、各出現時において、
    Figure 2018080194
    からなる群より選択される、請求項３７に記載の両性イオン含有化合物。
  39. Ｙ１又はＹ２が、一方の出現時において、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、マレイミド、アミン又はＮ−スクシンイミジルオキシカルボニルである、請求項３８に記載の両性イオン含有化合物。
  40. Ｌ２が、場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキルである、請求項３６に記載の両性イオン含有化合物。
  41. Ｌ２が、−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍ＝１〜４である）型の二価ラジカルである、請求項４０に記載の両性イオン含有化合物。
  42. Ωが、以下の形態：






    Figure 2018080194
    の両性イオン含有基であり、
    Ｌ１及びＬ４が、独立して、各出現時において、それぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−１０アルキル基から選択され；
    Ｌ２が、結合、又は場合により１０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−４アルキル基である、請求項３６に記載の両性イオン含有化合物。
  43. Ｌ２が、−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍ＝１〜４である）型の二価ラジカルである、請求項４２に記載の両性イオン含有化合物。
  44. Ｌ１が、−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎ＝１〜６である）型の二価ラジカルである、請求項４２に記載の両性イオン含有化合物。
  45. Ｌ４が、−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｐ＝１〜６である）型の二価ラジカルである、請求項４２に記載の両性イオン含有化合物。
  46. Ｚが、スルホネート（−ＳＯ３ −）である、請求項４２に記載の両性イオン含有化合物。
  47. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項４６に記載の両性イオン含有化合物。
  48. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項４７に記載の両性イオン含有化合物。
  49. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項４６に記載の両性イオン含有化合物。
  50. Ωが、以下の形態：
    Figure 2018080194
    の両性イオン含有基であり、
    Ｌ５、Ｌ６及びＬ７が、それぞれ基−Ｘａ−Ｒａ−
    （式中、ＸａはＱに結合しており、そして、独立して、各出現時において、結合、酸素、硫黄、アミン、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲＮ−若しくは−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−）、エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）又は尿素（−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＮ−）から選択され、そして、ＲＮは、独立して、各出現時において、水素、又は場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されているＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基であり；そして、
    Ｒａは、独立して、各出現時において、結合、又はそれぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基から選択されるが、但し、Ｑが窒素である場合、Ｒａは結合ではない）
    である、請求項３６に記載の両性イオン含有化合物。
  51. Ｌ２が、−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍ＝１〜４である）型の二価ラジカルである、請求項５０に記載の両性イオン含有化合物。
  52. Ｒａが、独立して、各出現時において、−（ＣＨ２）ｑ−（式中、ｑ＝１〜６である）型の二価ラジカルから選択される、請求項５０に記載の両性イオン含有化合物。
  53. Ｘａが、ある出現時において、アミン又はアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲＮ−又は−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）−）であり、そして、Ｑが炭素である、請求項５０に記載の両性イオン含有化合物。
  54. Ｚが、スルホネート（−ＳＯ３ −）である、請求項５０に記載の両性イオン含有化合物。
  55. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    （式中、Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍ＝１〜４である）型で表される二価ラジカルであり；
    Ｒａ及びＲ＊は、独立して、各出現時において、結合、又はそれぞれ場合により２０個以下のヘテロ原子で置換されている二価のＣ１−２０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキル基から選択される）
    を有する、請求項５４に記載の両性イオン含有化合物。
  56. 以下の構造：
    Figure 2018080194
    を有する、請求項５５に記載の両性イオン含有化合物。
  57. ペプチド、タンパク質、又は巨大分子の水溶解度を改善する方法であって、請求項１に記載の両性イオン含有化合物を前記ペプチド、タンパク質又は巨大分子に共有結合させることを含む方法。
  58. 生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーの非特異的結合を低減する方法であって、請求項１に記載の両性イオン含有化合物を前記被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーに共有結合させることを含む方法。
  59. 生物学的結合アッセイにおける被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーを標識する方法であって、請求項１７に記載の両性イオン含有化合物を前記被検体、被検体類似体又は被検体の結合パートナーに共有結合させることを含む方法。
  60. ２つの分子及び／又は巨大分子の複合体を調製する方法であって、請求項３６に記載の両性イオン含有化合物を第１の分子又は巨大分子と第２の分子又は巨大分子とに共有結合させることを含む方法。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008019381A1 (en) 2006-08-07 2008-02-14 University Of Washington Mixed charge copolymers and hydrogels
EP4183773A1 (en) * 2010-05-21 2023-05-24 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Zwitterionic reagents
WO2016025752A1 (en) * 2014-08-14 2016-02-18 Prolynx Llc Reagents for thiol conjugation and conjugates formed therefrom
US9381147B2 (en) 2014-10-20 2016-07-05 Johnson & Johnson Consumer Inc. Compositions comprising zwitterionic ester ammonioalkanoates
US9533951B2 (en) 2014-10-20 2017-01-03 Eastman Chemical Company Heterocyclic amphoteric compounds
US9943816B2 (en) 2014-10-20 2018-04-17 Eastman Chemical Company Amphoteric ester sulfonates
EP3288932A4 (en) * 2015-04-29 2018-12-05 Sanford-Burnham Medical Research Institute Novel epha4 inhibitors targeting its ligand binding domain
US9993408B2 (en) 2015-09-17 2018-06-12 Johnson & Johnson Consumer Inc. Compositions comprising zwitterionic alkyl-alkanoylamides and/or alkyl alkanoates
US11414380B2 (en) 2015-09-17 2022-08-16 Eastman Chemical Company Amphoteric compounds
US10822323B2 (en) * 2018-02-26 2020-11-03 Waters Technologies Corporation Acid labile surfactants

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003105671A (ja) * 2001-09-28 2003-04-09 Lion Corp 液体柔軟剤組成物
WO2004038378A2 (en) * 2002-10-25 2004-05-06 Li-Cor, Inc. Phthalocyanine dyes
WO2004067776A1 (en) * 2003-01-24 2004-08-12 Mirus Corporation COMPOUNDS AND PROCESSES FOR SINGLE-POT ATTACHMENT OF A LABEL TO siRNA
US20060183863A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-17 Ciphergen Biosystems, Inc. Zwitterionic polymers
JP2010506857A (ja) * 2006-10-13 2010-03-04 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド 迅速に発光する安定なアクリジニウムエステル
JP5852578B2 (ja) * 2009-11-16 2016-02-03 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 両性イオン含有アクリジニウム化合物

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3871929A (en) 1974-01-30 1975-03-18 Allied Chem Polymeric etch resist strippers and method of using same
US4478598A (en) * 1981-02-26 1984-10-23 Ciba-Geigy Corporation Amphoteric styrene derivatives useful as fluorescent brighteners
DE3265157D1 (en) 1981-03-30 1985-09-12 Takeda Chemical Industries Ltd Ethyleneglycol derivatives, their production and use
JPS5839651A (ja) 1981-09-04 1983-03-08 Ajinomoto Co Inc 新規ジアミノモノカルボン酸誘導体及びこれを活性成分とする界面活性剤
JPH0411075Y2 (ja) 1985-09-13 1992-03-18
JPH0411073Y2 (ja) 1986-03-07 1992-03-18
AU609824B2 (en) 1987-06-15 1991-05-09 Southern Cross Biotech Pty Ltd. Production of proteins in active forms
JPH0434078Y2 (ja) 1987-08-21 1992-08-13
JPH01225494A (ja) 1988-03-07 1989-09-08 Toukuri Lab:Kk 水不溶性融合蛋白質の可溶化方法
US5656426A (en) 1988-08-01 1997-08-12 Chiron Diagnostics Corporation Functionaized hydrophilic acridinium esters
US4962024A (en) 1988-08-11 1990-10-09 Becton, Dickinson And Company Signal enhancement in assay for an enzyme
JPH0434079Y2 (ja) 1989-08-14 1992-08-13
US5418295A (en) * 1989-10-13 1995-05-23 Biocompatibles Limited Method of reducing protein deposition in sight correction devices
JPH043079A (ja) 1990-04-20 1992-01-08 Seiko Epson Corp 電子写真装置
JPH0434079A (ja) * 1990-04-24 1992-02-05 Nippon Shokubai Co Ltd 羊毛及び羊毛製品のセット加工用剤
JPH0434078A (ja) 1990-04-25 1992-02-05 Nippon Shokubai Co Ltd 羊毛及び羊毛製品のセット加工用剤
JP2724022B2 (ja) 1990-04-26 1998-03-09 株式会社日本触媒 繊維及び繊維製品の柔軟加工用剤
JP2724023B2 (ja) 1990-04-27 1998-03-09 株式会社日本触媒 繊維及び繊維製品の抗菌加工用剤
US6017895A (en) * 1992-02-10 2000-01-25 Genzyme Corporation Oligonucleotides possessing zwitterionic moieties
US5760021A (en) 1992-05-29 1998-06-02 The Procter & Gamble Company Phosphonocarboxylate compounds pharmaceutical compositions, and methods for treating abnormal calcium and phosphate metabolism
WO1993025533A1 (en) 1992-06-05 1993-12-23 Abbott Laboratories Methods and reagents for the determination of immunosuppressive agents
US5656246A (en) 1995-10-30 1997-08-12 International Ecoscience, Inc. Contaminant destruction by oxidation processing via enhanced ozonation
JPH10730A (ja) 1996-06-17 1998-01-06 Toyo Ink Mfg Co Ltd 光反射フィルム
AU4892897A (en) 1996-09-17 1998-04-14 Amur Pharmaceuticals, Inc. Phospholipid drug derivatives
JPH10158979A (ja) 1996-11-20 1998-06-16 Matsushita Electric Ind Co Ltd 洗濯用仕上げ剤
US5830432A (en) 1997-03-31 1998-11-03 Amur Pharmacuticals, Inc. Phospholipid drug derivatives
SE9803838D0 (sv) 1998-11-09 1998-11-09 Knut Irgum A chromatography method and a column material useful in said method
JP3437517B2 (ja) 1999-02-16 2003-08-18 キヤノン株式会社 二次元位相型光学素子の作製方法
JP3818001B2 (ja) 1999-04-20 2006-09-06 コニカミノルタホールディングス株式会社 インクジェット記録用インク
JP2002052714A (ja) 2000-05-30 2002-02-19 Kyocera Corp インクジェット記録ヘッド
ES2291613T3 (es) * 2002-01-16 2008-03-01 Biocompatibles Uk Limited Conjugados de polimeros.
AUPS298102A0 (en) * 2002-06-13 2002-07-04 Nucleics Pty Ltd Method for performing chemical reactions
US7582260B2 (en) 2002-07-18 2009-09-01 Montana State University Zwitterionic dyes for labeling in proteomic and other biological analyses
US7309615B2 (en) 2002-09-27 2007-12-18 Siemens Medical Solutions Diagnostic High quantum yield acridinium compounds and their uses in improving assay sensitivity
DE10304219B3 (de) 2003-01-30 2004-08-19 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität
DE10307725B4 (de) 2003-02-24 2007-04-19 Clariant Produkte (Deutschland) Gmbh Korrosions-und Gashydratinhibitoren mit verbesserter Wasserlöslichkeit und erhöhter biologischer Abbaubarkeit
US7767834B2 (en) 2004-08-13 2010-08-03 Elitech Holding B.V. Phosphonylated fluorescent dyes and conjugates
DE102005051587A1 (de) 2005-10-27 2007-05-03 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Zwitterionische Strukturelemente aufweisende Partikel
JP5232769B2 (ja) 2006-04-07 2013-07-10 モドプロ アーベー Ｃ−反応性タンパク質についての結合剤
CA2686997A1 (en) 2007-05-11 2008-11-20 Mpex Pharmaceuticals, Inc. Quaternary alkyl ammonium bacterial efflux pump inhibitors and therapeutic uses thereof
MX2010005295A (es) 2007-11-19 2010-06-23 Univ Washington Precursores cationicos de betaina para betainas zwitterionicas que poseen propiedades biologicas controladas.
US7745670B2 (en) * 2008-06-27 2010-06-29 Codman & Shurtleff, Inc. Curcumin-Resveratrol hybrid molecule
EP4183773A1 (en) * 2010-05-21 2023-05-24 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Zwitterionic reagents

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003105671A (ja) * 2001-09-28 2003-04-09 Lion Corp 液体柔軟剤組成物
WO2004038378A2 (en) * 2002-10-25 2004-05-06 Li-Cor, Inc. Phthalocyanine dyes
WO2004067776A1 (en) * 2003-01-24 2004-08-12 Mirus Corporation COMPOUNDS AND PROCESSES FOR SINGLE-POT ATTACHMENT OF A LABEL TO siRNA
US20060183863A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-17 Ciphergen Biosystems, Inc. Zwitterionic polymers
JP2010506857A (ja) * 2006-10-13 2010-03-04 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド 迅速に発光する安定なアクリジニウムエステル
JP5852578B2 (ja) * 2009-11-16 2016-02-03 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 両性イオン含有アクリジニウム化合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NOMURA, KOHJI: "Incomplete dialysis of protein samples containing 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesu", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 290(1), JPN6015011033, 2001, pages 98 - 101, ISSN: 0003911503 *
SANDBHOR, MAHENDRA S.; KEY, JESSIE A.; STRELKOV, ILEANA S.; CAIRO, CHRISTOPHER W.: "A Modular Synthesis of Alkynyl-Phosphocholine Head-Groups for Labeling Sphingomyelin and Phosphatidy", JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 74(22), JPN6018043136, 2009, pages 8669 - 8674, ISSN: 0003911501 *
YAN-FENG WANG, TIAN-MING CHEN, YU-JUN LI, MASAYA KITAMURA, IKUKO SAKURAI AND TADAO NAKAYA: "Studies on syntheses and properties of novel polyamides containing phosphatidylcholine analogous moi", JOURNAL OF POLYMER SCIENCE PART A: POLYMER CHEMISTRY, vol. Volume 35, Issue 14, JPN6015011038, 1997, pages 3065 - 3074, XP055141815, ISSN: 0003911502, DOI: 10.1002/(SICI)1099-0518(199710)35:14<3065::AID-POLA26>3.0.CO;2-F *

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