JP2018065769A - 抗糖化用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】食品等に汎用性高く利用することができる、植物抽出物を有効成分とする抗糖化用組成物を提供する。【解決手段】クロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物をＡＧＥｓ生成抑制及びＡＧＥｓ低減のために用いられる抗糖化用組成物の有効成分とする。前記抽出物が、水又は有機溶媒含量５０体積％以下の含水有機溶媒による抽出物であることが好ましい。また、前記ＡＧＥｓ低減が、ＡＧＥｓのジケトン架橋構造分解、及び／又は、酸化蛋白質分解酵素の活性増強によりなされるものであることが好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、植物抽出物を有効成分とする、ＡＧＥｓ生成抑制及びＡＧＥｓ低減のために用いられる抗糖化用組成物に関する。

糖と蛋白質からＡＧＥｓ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；終末糖化産物）ができる反応を糖化という。ＡＧＥｓは、通常は代謝によって体外へ排出されにくいため、加齢や生活習慣病により蓄積され、肌の弾力の低下、動脈硬化、骨粗しょう症、白内障、認知症の原因になるとも考えられている。例えば、糖と、血管、肌、及び骨を形成しているコラーゲンが反応すると、コラーゲンの弾力が失われ、動脈硬化、肌のしわ・たるみ、骨粗しょう症の原因となる。また、目では白内障、脳では認知症の原因物質であるβアミロイドの生成にも深く関わっており、老化を促進する原因物質と考えられている。そのため、ＡＧＥｓやその中間体の産生を抑制することにより各疾病リスク軽減や老化の抑制につながることが期待されている。

一方、クスノキ科植物のクロモジは北海道の南部から九州まで広く分布している落葉低木であり、その枝葉は烏樟（うしょう）と呼ばれる生薬や民間薬の原料として用いられており、消化器系を助ける効果があるといわれている。また、枝葉に良い香りがあるのが特徴で、和菓子に添える高級爪楊枝の原料としても使われている。また、枝葉部分を水蒸気蒸留して採取した精油がアロマなどに利用されている。更に、下記特許文献１には、クロモジのメタノール抽出物にメイラード反応阻害活性があることが記載されている。

モニルザマン（Moniruzzaman）他，グリケイティブ・ストレス・リサーチ（Glycative Stress Research），２（３）巻，１２９乃至１３９頁，２０１５年

特開２０１０−７７１２３号公報

しかしながら、生体中の糖化反応は複雑かつ多経路であるため、１経路の反応を阻害してもＡＧＥｓの生成を有効に抑制することができない。また、天然物のＡＧＥｓ生成阻害作用は評価実験に使用する蛋白質の種類によって結果が異なることが知られている（非特許文献１）。この点、上記特許文献１に記載されたメイラード反応阻害活性はＢＳＡを基質として生成した蛍光性ＡＧＥｓのみを反応阻害活性の指標にしており、他の蛋白質を基質にしたときや蛍光性ＡＧＥｓ以外のＡＧＥｓについての有効性が明らかではなかった。また、上記特許文献１に記載されたクロモジのメタノール抽出物の作用効果として、ＡＧＥｓが関与する架橋構造を分解する作用効果や、糖化蛋白質を分解する酵素の活性を増強する作用効果があるという知見はなかった。一方、クロモジから水蒸気蒸留等により精油を採取した後に残る不揮発性抽出物については、従来廃棄されるのみで、その利用価値がほとんど注目されていなかった。

よって、本発明の目的は、食品等に汎用性高く利用することができ、クロモジから水蒸気蒸留等により精油を採取した後に残る不揮発性抽出物の有効利用にもつながる、植物抽出物を有効成分とする抗糖化用組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、水又は含水有機溶媒によるクロモジの抽出物には、ＡＧＥｓの生成を抑制する作用効果に加えて、ＡＧＥｓが関与する架橋構造を分解する作用効果や、糖化蛋白質を分解する酵素の活性を増強する作用効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の抗糖化用組成物は、クロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物を有効成分とし、ＡＧＥｓ生成抑制及びＡＧＥｓ低減のために用いられることを特徴とする。

本発明の抗糖化用組成物においては、前記抽出物が、水又は有機溶媒含量５０体積％以下の含水有機溶媒による抽出物であることが好ましい。

また、前記抽出物が、水又はエタノール含量５０体積％以下の含水エタノールによる抽出物であることが好ましい。

また、ＡＧＥｓ低減のために用いられることが好ましい。

また、前記ＡＧＥｓ低減が、ＡＧＥｓのジケトン架橋構造分解、及び／又は、酸化蛋白質分解酵素の活性増強によりなされるものであることが好ましい。

本発明によれば、クロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物を有効成分とするので、ＡＧＥｓの生成を多岐経路にわたって抑制する作用効果を有する。加えて、ＡＧＥｓが関与する架橋構造を分解する作用効果や、糖化蛋白質を分解する酵素の活性を増強する作用効果に優れている。また、特に、水又は有機溶媒含量５０体積％以下の含水有機溶媒による抽出物を有効成分とすると、より高い抗糖化の作用効果を得ることができる。よって、食品等に汎用性高く利用することができ、生体内におけるＡＧＥｓの生成や蓄積を有効に抑制することができる抗糖化用組成物を提供することができる。また、クロモジから水蒸気蒸留等により精油を採取した後に残る不揮発性抽出物の有効利用にもつながる。

試験例２においてクロモジ熱水抽出物によるＡＧＥｓ架橋切断効果を検証した結果を示す図表である。 試験例３においてクロモジ熱水抽出物による酸化蛋白質分解酵素の活性増強効果を検証した結果を示す図表である。

本発明に用いられるクロモジ属（Ｌｉｎｄｅｒａ）に属する植物としては、例えば、クロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ Ｔｈｕｎｂ．）、オオバクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｕｍｂｅｌｌａ ｖａｒ． ｍｅｍｂｒａｎａｃｅａ （Ｍａｘｉｍ．） Ｍｏｍｉｙａｍ）、ヒメクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｕｍｂｅｌｌａ ｖａｒ．ｌａｎｃｅａ Ｍｏｍｊｙａｍａ）、ケクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｓｅｒｉｃｅａ（Ｓｉｅｂ．ｅｔ Ｚｕｃｃ．）Ｂｌｕｍｅ）、ウスゲクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｓｅｒｉｃｅａ ｖａｒ．ｇｌａｂｒａｔａ Ｂｌｕｍｅ）、シロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｔｒｉｌｏｂａ（Ｓｉｅｂ．ｅｔ Ｚｕｃｃ．）Ｂｌｕｍｅ）、アメリカクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｂｅｎｚｏｉｎ（Ｌ．）Ｂｌｕｍｅ）、ヤマコウバシ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｇｌａｕｃａ Ｂｌｕｍｅ）、ダンコウバイ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｏｂｔｕｓｉｌｏｂａ Ｂｌｕｍｅ）、テンダイウヤク（Ｌｉｎｄｅｒａ ｓｔｒｙｃｈｎｉｆｏｌｉａ（Ｓｉｅｂ．ｅｔ Ｚｕｃｃ．）Ｆ．Ｖｉｌｌ．）などが挙げられる。これらの中でも、特に、クロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ Ｔｈｕｎｂ．）が好ましい。

上記植物の部位としては、特に制限はなく、例えば、幹枝、幹、枝葉、葉、樹皮、根、根茎、根皮、茎、花、種子、果皮、果肉、果実、地上部、地下部、全木などが挙げられる。これらの中でも、特に、幹枝が好ましい。

本発明においては、上記植物から水又は含水有機溶媒による抽出物を調製して抗糖化用組成物の有効成分として用いる。その抽出に用いられる含水有機溶媒の有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等の低級アルコール、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどが挙げられる。これら有機溶媒は二種以上を混合して用いることもできる。また、その抽出に用いられる含水有機溶媒の有機溶媒含量としては、５０体積％以下であることが好ましく、５〜５０体積％であることがより好ましく、１０〜４５体積％が更により好ましく、２０〜４０体積％が最も好ましい。これらの中でも、特に、エタノール含量５０体積％以下の含水エタノールが好ましく、エタノール含量５〜５０体積％の含水エタノールがより好ましく、エタノール含量１０〜４５体積％の含水エタノールが更により好ましく、エタノール含量２０〜４０体積％の含水エタノールが最も好ましい。

抽出の具体的手法としては、一般的な抽出手段を採用することができ、例えば、クロモジの幹枝の乾燥物を適当に裁断した後、その全質量に対して１〜５０倍、好ましくは５〜２０倍量の水又は上記に説明した含水有機溶媒を加え、１〜２４時間程度、室温〜使用溶媒の沸点の範囲で浸漬・加熱抽出を行うことができる。必要に応じて、加圧下に抽出を行ってもよい。抽出後には、必要に応じて濾過を行い、得られた抽出液を減圧濃縮したり、凍結乾燥したりして、使用した抽出溶媒を除去して、目的とする抽出物を調製することができる。乾燥手段は、減圧乾燥や噴霧乾燥であってもよい。なお、例えば、抽出溶媒が水である場合には、抽出温度は５〜１００℃であることが好ましく、３０〜１００℃であることがより好ましく、５０〜１００℃であることが更により好ましい。また、抽出溶媒が含水エタノールである場合には、抽出温度は５〜７０℃であることが好ましく、３０〜７０℃であることがより好ましく、５０〜７０℃であることが更により好ましい。

上記に説明したクロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物は、クロモジについて後述の実施例で示されるように、ＡＧＥｓの生成を多岐経路にわたって抑制する作用効果を有する。加えて、ＡＧＥｓが関与する架橋構造を分解する作用効果や、糖化蛋白質を分解する酵素の活性を増強する作用効果に優れている。よって、これを生体に作用させることにより、生体内におけるＡＧＥｓの生成や蓄積を有効に抑制することができ、例えば、肌の弾力の低下、動脈硬化、骨粗しょう症、白内障、認知症、メタボリックシンドローム、血管の老化、皮膚の老化等を効果的に予防することができる。特に、ＡＧＥｓの生成を抑えるという予防的な側面の用途のみならず、生体に蓄積したＡＧＥｓを分解して除去するという治療的な側面の用途もあらたに提供するので、すなわち、より優れた抗糖化用組成物となる。更には、クロモジから水蒸気蒸留等によりアロマに利用される精油を採取した後には、残渣として水又は含水有機溶媒による抽出物が残るので、その不揮発性抽出物の有効利用にもつながる。

本発明による抗糖化用組成物は、例えば、経口的に摂取するように用いることが好ましい。経口投与のための形態としては、特に制限はなく、上記に説明したクロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物と、経口摂取用として許容される基材や担体、溶媒等を用いて、固体状物、液状物、乳化状物、ペースト状物、ゼリー状物等の形態とすることができる。また、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、カプセル剤等の形態とすることができる。また、上記抽出物そのものを適当な担体、好ましくは脂肪酸トリグリセライドと混合し、液状のままソフトカプセル等に充填し、調製することもできる。

本発明による抗糖化用組成物は、例えば、皮膚外用等、非経口的に投与されるものであってもよい。そのための形態としては、特に制限はなく、溶液の形態や、分散剤、懸濁剤、安定剤などを添加した形態や、ハップ剤、ローション剤、軟膏剤、チンキ剤、クリーム剤等の形態で用いることができる。

製剤化においては、経口剤や非経口剤となす場合に限られず、必要に応じて、通常使用されている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、界面活性剤、溶解補助剤、還元剤、緩衝剤、吸着剤、流動化剤、帯電防止剤、抗酸化剤、甘味剤、矯味剤、清涼化剤、遮光剤、着香剤、香料、芳香剤、コーティング剤、可塑剤等の製剤添加物の１種または２種以上を適宜選択して添加してもよい。

そのような製剤添加物としては、具体的には、例えば、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、マルトデキストリン、エチルセルロース、乳糖、ソルビトール、無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸、オレイン酸、流動パラフィン、第二リン酸カルシウム、セバチン酸ジブチル、マクロゴール、プロピレングリコール、コーンスターチ、デンプン、アルファー化デンプン、ゼラチン、ポピドン、クロスポピドン、グリセリン、ポリソルベート８０、クエン酸、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、炭酸ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等を挙げることができる。

本発明による抗糖化用組成物においては、上記に説明したクロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物を有効成分とし、更に、本発明の作用効果を損なわない範囲で、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、脂肪酸、食物繊維等の他の成分を添加してもよいことは勿論である。

本発明による抗糖化用組成物においては、有効成分たる上記抽出物を全体中に乾燥分換算で０．００１〜９９質量％含有していることが好ましく、０．０１〜７０質量％含有していることがより好ましく、０．０５〜５０質量％含有していることが最も好ましい。

本発明による抗糖化用組成物をヒトに経口投与する場合、その投与量としては、年齢や体重によっても異なるが、例えば、成人１日当たり、上記に説明したクロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物の乾燥分換算で１．０ｍｇ〜５０ｇ程度であることが好ましく、５．０ｍｇ〜２０ｇ程度であることがより好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇ程度であることが最も好ましい。また、皮膚外用の形態で用いる場合の施与・塗布量としては、例えば、上記に説明したクロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物の乾燥分換算で塗布面積あたりに０．０１〜１０ｍｇ／ｃｍ²程度であることが好ましく、０．０５〜５ｍｇ／ｃｍ²程度であることがより好ましい。

本発明による抗糖化用組成物の使用形態としては、その作用効果を損なわない限り、特に制限はない。例えば、機能性食品、サプリメント、医薬品、化粧品などの形態であってよい。なお、これらの形態は、ヒト用だけに限られず、動物用であってもよい。より具体的には、機能性表示食品、特定保健用食品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、医薬品、医薬部外品、化粧品、動物用健康食品、動物用機能性食品、動物用栄養補助食品、動物用サプリメント、動物用医薬品、動物用医薬部外品、動物用化粧品など各種の製品形態で、あるいはそれら製品と組み合わせて使用されることが可能である。

本発明による抗糖化用組成物の使用形態としては、食品組成物の形態であってもよい。すなわち、上記に説明したクロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物を飲食物に所定量配合することにより、抗糖化用の食品組成物となすことができる。具体的には、例えば、固形状、粉末状、穎粒状のものとしては、ビスケット、クッキー、ケーキ、スナック、煎餅などの各種の菓子類、パン、粉末飲料（粉末コーヒー、粉末ココアなど）、飴、キャラメル等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、液状、乳化状、ペースト状、ゼリー状のものとしては、ジュース、炭酸飲料、乳酸菌飲料などの各種の飲料や薬用酒を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。更には、これら飲食物に配合するために用いられる食品添加用の組成物の形態であってもよい。

本発明による抗糖化用組成物の使用形態としては、化粧料組成物の形態であってもよい。すなわち、上記に説明したクロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物を化粧料に所定量配合することにより、抗糖化用の化粧料組成物となすことができる。具体的には、例えば、乳液、石鹸、洗顔料、入浴剤、クリーム、乳液、化粧水、日焼け・日焼け止めローション、パック、シャンプー、リンス、トリートメント、洗浄料等が挙げられる。

以下に実施例を挙げて本発明について更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

＜調製例１＞
クロモジの枝の乾燥粉砕物に１０倍量の水を加え、１００℃にて３時間加熱抽出を行なった。抽出後に濾過し、得られた溶液を減圧濃縮して減容した後、凍結乾燥を行って、クロモジの熱水抽出物を得た。

［試験例１］
調製例１で得られたクロモジ熱水抽出物（以下、「ＬＵ−Ｋ」ともいう。）を用いて、糖化反応阻害効果を検証した。

（概要）
クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）の存在下で、（Ａ）ヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）、（Ｂ）１型コラーゲン（以下、「Ｃｏｌ」ともいう。）、又は（Ｃ）エラスチン（以下、「Ｅｌａ」ともいう。）の各々と、グルコースを加熱反応させ、生成したＡＧＥｓ、具体的には、蛍光性ＡＧＥ類（ペントシジン、クロスリン、ピロピリジンなど）、３デオキシグルコソン（以下、「３ＤＧ」ともいう。）、グリオキサール（以下、「ＧＯ」ともいう。）、メチルグリオキサール（以下、「ＭＧＯ」ともいう。）、カルボキシメチルリジン（以下、「ＣＭＬ」ともいう。）、ペントシジンを測定し、ＬＵ−Ｋを添加しないコントロールと比較したＡＧＥｓ生成阻害効果を検証した。また、陽性対照として、ＡＧＥｓ生成阻害剤であることが知られているアミノグアニジンについても同様の試験を行った。

（方法）
（１）糖化反応
（Ａ）ヒト血清アルブミン反応系
０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、８ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及び０．２ｍｏｌ／Ｌグルコースからなる糖化反応液を準備した。これに、所定濃度に調製したサンプル溶液を１／１０容積濃度となるように添加し、６０℃で４０時間インキュベートした。また、サンプル溶液の代わりに蒸留水を添加したものをコントロールとした。

（Ｂ）Ｉ型コラーゲン反応系
０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１．２ｍｇ／ｍＬ牛皮由来１型コラーゲン（Ｃｏｌ）、 及び０．４ｍｏｌ／Ｌグルコースからなる糖化反応液中に、これに、所定濃度に調製したサンプル溶液を１／１０容積濃度となるように添加し、６０℃で１０日間インキュベートした。また、サンプル溶液の代わりに蒸留水を添加したものをコントロールとした。

（Ｃ）エラスチン反応系
０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、６ｍｇ／ｍＬ豚由来エラスチン（Ｅｌａ）、及び０．２ｍｏｌ／Ｌグルコースからなる糖化反応液中に、これに、所定濃度に調製したサンプル溶液を１／１０容積濃度となるように添加し、６０℃で１０日間インキュベートした。また、サンプル溶液の代わりに蒸留水を添加したものをコントロールとした。

（２）蛍光性ＡＧＥ類の測定
糖化反応終了後、反応液中に生成した蛍光性ＡＧＥｓをマイクロプレートリーダーで測定した（励起波長３７０ｎｍ／蛍光波長４４０ｎｍ）。

（３）３ＤＧの測定
糖化反応終了後、反応液中に生成した３ＤＧを2.3-diaminonaphthalen (DAN) プレラベル化逆相ＨＰＬＣ法により測定した。

（４）ＧＯの測定
糖化反応終了後、反応液中に生成したＧＯを2.3-diaminonaphthalen (DAN) プレラベル化逆相ＨＰＬＣ法により測定した。

（５）ＭＧＯの測定
糖化反応終了後、反応液中に生成したＭＧＯを2.3-diaminonaphthalen (DAN) プレラベル化逆相ＨＰＬＣ法により測定した。

（６）ＣＭＬの測定
糖化反応終了後、反応液中に生成したＣＭＬを「CircuLex CML/Nε-(Carboxymethyl)lysine ELISA Kit」（株式会社医学生物学研究所）を使用してＥＬＩＳＡ法により測定した。

（７）ペントシジンの測定
Scheijenaら（Joumal of Chromatography B,2009;877:610-614）の方法を参考に、糖化反応終了後の反応液を塩酸加水分解後、逆相ＨＰＬＣで測定した。

（８）各ＡＧＥｓの生成阻害率の算出
各ＡＧＥｓの生成阻害率は、糖化反応系にサンプル溶液を添加した反応液における測定値をＡとし、その反応液においてグルコース水溶液の代わりに蒸留水を添加したものにおける測定値をＢとし、その反応液においてサンプル溶液の代わりに蒸留水を添加したコントロールにおける測定値をＣとし、そのコントロールにおいてグルコース水溶液の代わりに蒸留水を添加したものにおける測定値をＤとして、下記の式に従って算出した。

ＡＧＥｓの生成阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００

（９）ＩＣ₅₀（５０％生成阻害濃度）の算出
ＩＣ₅₀（５０％生成阻害濃度）は、常法に従い、糖化反応系に添加した試験物質の濃度とそのときの生成阻害率の関係性に基づいて算出し、有効数字３桁で表示した。

結果を表１に示す。なお、試験は各３例で実施し、結果はその平均値で示した。また、表１の右欄には、陽性対照であるアミノグアニジンにおけるＩＣ₅₀の値を試験サンプルであるＬＵ−ＫにおけるＩＣ₅₀の値で除したＩＣ₅₀比を示した。

その結果、クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）は、各種蛋白質と反応して生成するＡＧＥｓの産生を阻害した。また、ＩＣ₅₀比による比較にみられるように、ほとんどの蛋白質及びその生成物の組み合わせにおいて、ＡＧＥｓ生成阻害剤であることが知られているアミノグアニジンに比べてクロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）のほうがその生成阻害効果が高かった。よって、クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）に、ＡＧＥｓの生成を多岐経路にわたって抑制する、優れたＡＧＥｓ生成阻害の作用効果があることが明らかとなった。

［試験例２］
調製例１で得られたクロモジ熱水抽出物を用いて、ＡＧＥｓ架橋切断効果を検証した。

（概要）
ＡＧＥｓが関与する架橋構造を分解する化合物としてＮ−フェナシルチアゾリウムプロミド（N-phenacyl thiazolium bromide：以下、「ＰＴＢ」ともいう。）が報告されている。ＰＴＢは、αジケトン構造のＣ−Ｃ結合を切断分解することで血管内のＡＧＥｓの蓄積を抑制し、糖尿病性血管合併症の治療に寄与する可能性が示唆されている。

そこで、本試験例では、αジケトン構造を有する１−フェニル−１，２−プロパンジオン （1-phenyl-1,2-propanedione：以下、「ＰＰＤ」ともいう。）をモデル基質とした反応系を使用して（下記式参照）、クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）によるＡＧＥｓ架橋切断効果を検証した。なお、陽性対照としてＰＴＢを使用した。

（方法）
（１）架橋切断反応
所定濃度に調製したＬＵ−Ｋのサンプル溶液（陽性対照であるＰＴＢの場合は濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌに調製した溶液）と、モデル基質としてＰＰＤを１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む溶液と、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とを５：１：４の割合（容積換算）で混合し、３７℃で８時間反応させた。反応終了後、塩酸を加えて反応停止させた。

（２）安息香酸の測定
架橋切断反応終了後、反応液を２０℃、３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清中の安息香酸量を逆相ＨＰＬＣで分析し、別途測定した架橋切断反応前のサンプル溶液中の安息香酸量を差し引いて、架橋切断反応中にモデル基質ＰＰＤから生成した安息香酸量を求めた。

（３）架橋切断率の算出
１ｍｏｌのＰＰＤは１ｍｏｌの安息香酸を生成可能であることから、下記の式に従って架橋切断率を算出した。また、陽性対照であるＰＴＢの切断率を１００としたときの、試験サンプルであるＬＵ−Ｋによる切断率の相対値を求めた。

架橋切断率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／Ｃ｝×１００
Ａ：反応後の反応液中の安息香酸量、Ｂ：反応前のサンプル溶液中の安息香酸量、Ｃ：反応に供したＰＰＤ量（基質量）

結果を表２、図１に示す。なお、試験は各３例で実施し、結果はその平均値及び標準偏差で示した。

その結果、クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）は、ＡＧＥｓ架橋切断剤であることが知られているＰＴＢと同じように、モデル基質であるＰＰＤのαジケトン構造のＣ−Ｃ結合を切断分解する活性を示した。また、その活性は、試験した０．００８〜５ｍｇ／ｍＬの範囲で濃度依存的であり、クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）の５ｍｇ／ｍＬでの活性は、ＰＴＢの濃度５ｍｍｏｌ／Ｌでの活性に相当するほどに達した。よって、クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）に、ＡＧＥｓが関与する架橋構造を分解する作用効果があることが明らかとなった。

［試験例３］
調製例１で得られたクロモジ熱水抽出物を用いて、酸化蛋白質分解酵素の活性増強効果を検証した。

（概要）
酸化蛋白分解酵素（oxidized protein hydrolase：以下、「ＯＰＨ」ともいう。）は、蛋白質のＮ末端アシル化アミノ酸を遊離するセリンプロテアーゼの１種で、アシルアミノ酸遊離酵素（acylamino-acid releasing enzyme：AARE）、あるいはアシル化ペプチド分解酵素（acylpeptide hydrolase：APH）などとも呼ばれている。ＯＰＨはブタ肝臓、ラット脳、ヒト血液、角層などの生体組織に広く存在している。ＯＰＨは酸化や糖化蛋白を優先的に分解するとともにプロテアソームと協働して老化蛋白質を分解すること、アルツハイマー病の原因であるアミロイドβを減少させることなどが報告されている。また、ＯＰＨがＡＧＥｓを分解することも確認されている。

そこで、本試験例では、ＯＰＨとその反応基質であるN-acetyl-L-alanine p-nitro-anilide（以下、「ＡＡＰＡ」ともいう。）を含む反応系を使用して、クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）による酸化蛋白質分解酵素の活性増強効果を検証した。

（方法）
（１）酸化蛋白質分解反応
ＯＰＨとしてはアシルアミノ酸遊離酵素（タカラバイオ株式会社製）を使用し、ＯＰＨの反応基質としてN-acetyl-L-alanine p-nitro-anilide（ＡＡＰＡ）を使用した。９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに０．２ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、最終濃度としてＯＰＨが０．０００４Ｕ／ｍＬ、ＡＡＰＡが４ｍｍｏｌ／Ｌ、クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）が２００μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれを添加混合し、全量２５０μＬとし、３７℃に設定したインキュベーター内で４時間反応させた。

（２）分解反応生成物の測定
糖化反応終了後、反応液の４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定することにより、反応液中に分解反応生成物として生成したｐ−ニトロアニリンを測定した。ＯＰＨの酵素活性は１時間当たりの吸光度変化量（反応速度）として求めた。別途、対照としてクロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）を添加しないときの反応速度を求め、下記の式に従って、対照の反応速度を１００％としたときの活性増強作用を算出した。なお、陰性対照としてエピガロカテキンガレート（以下、「ＥＧＣｇ」ともいう。）を使用し、同様の試験を行った。

ＯＰＨ活性増強作用（％）＝｛（試料のＯＰＨ反応速度）／（対照のＯＰＨ反応速度）｝×１００

結果を表３、図２に示す。なお、試験は各３例で実施し、結果はその平均値及び標準偏差で示した。

その結果、ＯＰＨとその反応基質であるN-acetyl-L-alanine p-nitro-anilide（ＡＡＰＡ）とを含む反応系にクロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）を共存させたところ、ＯＰＨの分解活性を増強させた。一方、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）は、ＯＰＨの分解活性を阻害した。よって、クロモジ熱水抽出物（ＬＵ−Ｋ）に、酸化蛋白質分解酵素の活性増強する作用効果があることが明らかとなった。

＜調製例２＞
クロモジの枝の乾燥粉砕物に５倍量の１００％メタノールを加え、室温に１週間静置して抽出を行なった。抽出後に濾過し、得られた溶液を減圧乾固して溶媒を除去し、クロモジの１００％メタノール抽出物を得た。その収率は２．８８質量％であった。

＜調製例３＞
クロモジの枝の乾燥粉砕物に５倍量の３０％エタノール／７０％水−混合液を加え、室温に１週間静置して抽出を行なった。抽出後に濾過し、得られた溶液を減圧乾固して溶媒を除去し、クロモジの３０％エタノール抽出物を得た。その収率は３．６０質量％であった。

＜調製例４＞
クロモジの枝の乾燥粉砕物に５倍量の５０％エタノール／５０％水−混合液を加え、６０℃で３時間抽出を行なった。抽出後に濾過し、得られた溶液を減圧乾固して溶媒を除去し、クロモジの５０％エタノール抽出物を得た。その収率は３．９６質量％であった。

＜調製例５＞
クロモジの枝の乾燥粉砕物に５倍量の３０％エタノール／７０％水−混合液を加え、６０℃で３時間抽出を行なった。抽出後に濾過し、得られた溶液を減圧乾固して溶媒を除去し、クロモジの３０％エタノール抽出物を得た。その収率は３．９６質量％であった。

＜調製例６＞
クロモジの枝の乾燥粉砕物に１０倍量の水を加え、１００℃にて１時間加熱抽出を行なった。抽出後に濾過し、得られた溶液を減圧乾固して溶媒を除去し、クロモジの熱水抽出物を得た。その収率は３．０３質量％であった。

［試験例４］
調製例２〜６で得られたクロモジの溶媒抽出物を用いて、糖化反応阻害効果を検証した。

具体的には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とグルコースを加熱反応させ、生成したＡＧＥｓ、具体的には、蛍光性ＡＧＥ類（ペントシジン、クロスリン、ピロピリジンなど）を測定し、クロモジの溶媒抽出物を添加しないコントロールと比較したＡＧＥｓ生成阻害効果を検証した。試験は、試験例１と同様にして行ない、各サンプルの反応濃度毎に生成阻害率を算出し、ＩＣ₅₀（５０％生成阻害濃度）を算出した。また、陽性対照として、ＡＧＥｓ生成阻害剤であることが知られているアミノグアニジンについても同様の試験を行った。

結果を表４に示す。なお、試験は各３例で実施し、結果はその平均値で示した。

その結果、各種溶媒によるクロモジ抽出物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と反応して生成するＡＧＥｓの産生を阻害した。また、ＩＣ₅₀値の比較にみられるように、ＡＧＥｓ生成阻害剤であることが知られているアミノグアニジンに比べてクロモジ溶媒抽出物のほうがその生成阻害効果が高かった。更に、熱水、３０％エタノール、５０％エタノールによる抽出物のほうが、１００％メタノールによる抽出物に比べてその生成阻害効果が高かった。よって、特に、有機溶媒含量５０体積％以下の抽出溶媒によるクロモジ抽出物のＡＧＥｓ生成阻害効果が顕著に高いことが明らかとなった。

Claims (5)

1. クロモジ属に属する植物の水又は含水有機溶媒による抽出物を有効成分とし、ＡＧＥｓ生成抑制及びＡＧＥｓ低減のために用いられることを特徴とする抗糖化用組成物。
2. 前記抽出物が、水又は有機溶媒含量５０体積％以下の含水有機溶媒による抽出物である、請求項１記載の抗糖化用組成物。
3. 前記抽出物が、水又はエタノール含量５０体積％以下の含水エタノールによる抽出物である、請求項２記載の抗糖化用組成物。
4. ＡＧＥｓ低減のために用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗糖化用組成物。
5. 前記ＡＧＥｓ低減が、ＡＧＥｓのジケトン架橋構造分解、及び／又は、酸化蛋白質分解酵素の活性増強によりなされるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗糖化用組成物。