JP2017534640A - アルファ−ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼおよびアルファガラクトシダーゼａの治療用組成物ならびにそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、血液脳関門ペプチド、およびアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）タンパク質、イズロン酸−２−スルファターゼタンパク質（ＩＤＳ）タンパク質、またはａガラクトシダーゼＡタンパク質（ａ−Ｇａｌ Ａ）タンパク質などのヒトペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明は、ハーラー症候群、ハーラー−シャイエ症候群およびシャイエ症候群を含むムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を処置するための使用方法；ハンター症候群を処置するための使用方法；ならびにファブリ病を処置するための使用方法をさらに提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１４年１１月１０日に出願された米国仮出願第６２／０７７，６５４号；２０１４年１１月１７日に出願された米国仮出願第６２／０８０，８３８号；２０１４年１２月１７日に出願された米国仮出願第６２／０９３，３１６号；および２０１５年６月９日に出願された米国仮出願第６２／１７３，０９１号への優先権を主張する。上記出願の各々の内容全体が、本明細書に明示的に参考として援用される。

ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）は、多数の体組織に影響を及ぼし、器官損傷をもたらす遺伝性障害である。ＭＰＳ Ｉは、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＵＤＡ）遺伝子中の欠陥によって生じる。ＭＰＳ ＩＨはハーラー症候群として公知であり、ＭＰＳ ＩＳはハーラー症候群と比較して減弱表現型を有するシャイエ症候群として公知である。ＭＰＳ Ｉの徴候は、硬直した関節、骨格異常、手根管症候群、心臓（弁）疾患、再発上気道感染症、閉塞性気道疾患（睡眠時無呼吸）、角膜薄濁、脊椎圧迫、肝脾腫大／巨脾腫、鼠径部または臍ヘルニア、難聴、精神遅滞、粗い顔貌（coarse facial features）、交通性水頭症および異常な形状の歯を含み得る。

アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ；ＥＣ３．２．１．７６）は、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合（iduronosidic linkage）の加水分解を触媒する酵素であり、グルコサミノグリカンのデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の分解に関与している。ＭＰＳ ＩではＩＤＵＡ欠損は、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸のリソソーム蓄積を生じ、この蓄積は、これだけに限らないが認知異常、水頭症、肥厚性頸部硬膜炎（hypertrophic cervical pachymeningitis）、神経圧迫および／または行動異常を含む呼吸器、心臓および脳神経系に種々の合併症を引き起こす。

ＭＰＳ Ｉが多系統疾患（multisystemic disease）であることから、ＭＰＳ Ｉ患者の処置は複雑で、その多数の徴候および症状の処置を必要とする。今日までのところ、ＭＰＳ Ｉについて治癒が得られていない。静脈内ＩＤＵＡを使用する酵素補充療法が実施されているが、ＩＤＵＡは、血液脳関門を通らないことが示されている。したがって現在のＩＤＵＡ酵素補充療法は、ＭＰＳ Ｉ患者が経験する神経学的障害（neurological involvement）を解決する助けにならない。

重度の精神遅滞、骨格変形および硬直関節から比較的穏やかな経過まで種々の表現型によって特徴付けられるハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型、ＭＰＳ−ＩＩ）は、ＩＤＳの活性の欠損によって生じ、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）およびデルマタン硫酸断片のリソソーム蓄積ならびにそれらの尿への排泄（exertion）をもたらす（Neufeldら、The Metabolic Basis of Inherited Disease、Scriverら編、１５６５〜１５８７頁、McGraw-Hill、New York １９８９年）。この臨床的不均一性は、ＩＤＳの発現、安定性または機能に影響を与えるＩＤＳのさまざまな変異を反映していると示唆されている。ハンター症候群は、Ｘ染色体連鎖である唯一のムコ多糖症である（Neufeldら、The Metabolic Basis of Inherited Disease、Scriverら編、１５６５〜１５８７頁、McGraw-Hill、New York １９８９年）。

ＩＤＳは、その機能がグルコサミノグリカンのヘパリン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からＣ２−硫酸エステル結合を加水分解することに関与するリソソーム中のエキソスルファターゼである（Neufeldら、The Metabolic Basis of Inherited Disease、Scriverら編、１５６５〜１５８７頁、McGraw-Hill、New York １９８９年）。ＩＤＳは、ヒト細胞において硫酸エステルを加水分解する少なくとも９種のスルファターゼのファミリーに属する。硫酸化３ベータ−ヒドロキシステロイドに作用する、アリールスルファターゼＣとしても公知のミクロソームのステロイドスルファターゼを除いて、これらのリソソーム酵素は種々の基質中の硫酸化単糖類残基に作用する（Neufeldら、The Metabolic Basis of Inherited Disease、Scriverら編、１５６５〜１５８７頁、McGraw-Hill、New York １９８９年；Shapiro、The Metabolic Basis of Inherited Disease、Scriverら編、１９４５〜１９６４頁、McGraw-Hill、New York １９８９年）。

ハンター症候群が多系統疾患であることから、ハンター症候群患者の処置は複雑で、その多数の徴候および症状の処置を必要とする。今日までのところ、ハンター症候群について治癒が得られていない。静脈内ＩＤＳを使用する酵素補充療法が実施されているが、ＩＤＳは、血液脳関門を通らないことが示されている。したがって現在のＩＤＳ酵素補充療法は、ハンター症候群患者が経験する神経学的障害を解決する助けにならない。

ファブリ病は、リソソームα−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）活性欠損によって生じるスフィンゴ糖脂質代謝のＸ連鎖先天性異常（error）である（Desnickら、The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease、第８版、Scriverら編、３７３３〜３７７４頁、McGraw-Hill、New York ２００１年；Bradyら、N. Engl. J. Med. １９６７年；２７６巻、１１６３〜１１６７頁）。α−Ｇａｌ Ａ遺伝子はＸｑ２２にマッピングされており（Bishopら、Am. J. Hum. Genet. １９８５年；３７巻：Ａ１４４）、全長ｃＤＮＡおよびα−Ｇａｌ Ａをコードする１２ｋｂゲノム配列全体が報告されている（Calhounら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA １９８５年；８２巻：７３６４〜７３６８頁；Bishopら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA １９８６年；８３巻：４８５９〜４８６３頁；Tsujiら、Eur. J. Biochem. １９８７年；１６５巻：２７５〜２８０頁およびKornreichら、Nucleic Acids Res. １９８９年；１７巻：３３０１〜３３０２頁）。ファブリ病を生じる変異には著しい遺伝的不均一性がある（The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease、第８版 ２００１年、Scriverら編、３７３３〜３７７４頁、McGraw-Hill、New York.；Engら、Am. J. Hum. Genet. １９９３年；５３巻：１１８６〜１１９７頁；Engら、Mol. Med. １９９７年；３巻：１７４〜１８２頁およびDaviesら、Eur. J. Hum. Genet. １９９６年；４巻：２１９〜２２４頁）。小さな欠失および挿入ならびに大きな遺伝子再構成に加えて、種々のミスセンス、ナンセンスおよびスプライシング変異が今日までに報告されている。これらの変異に関連する酵素的欠陥は、α−ガラクトシル残基を有する中性スフィンゴ糖脂質、主にグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）の体液および組織リソソーム中の進行性沈着をもたらす。

この疾患の発生頻度は、男性において約１：４０，０００と推定されており、全世界でさまざまな民族内において報告されている。古典的罹患男性において、臨床的発現は被角血管腫、肢端感覚異常、乏汗症ならびに特徴的な角膜および水晶体混濁を含む（The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease、第８版、２００１年、Scriverら編、３７３３〜３７７４頁、McGraw-Hill、New York）。罹患した男性の平均余命は短縮され、心臓、脳および／または腎臓の血管疾患の結果として４０代または５０代で通例死亡する。対照的に軽度の「心臓異型（cardiac variant）」を有する患者は、正常の５〜１５％のα−Ｇａｌ Ａ活性を通常有し、左心室肥大または心筋症を呈する。これらの心臓異型患者は本質的に無症候性のままであるのに、典型的に罹患した彼らのカウンターパートは重度に損なわれている。近年、心臓異型は未解明の左心室肥大性心筋症を有する成人男性患者の１１％において見出されたがこれは、ファブリ病が以前推定されたよりも頻繁である可能性があることを示唆している（Nakaoら、N. Engl. J. Med. １９９５年；３３３巻：２８８〜２９３頁）。

ファブリ病は抹消神経系および中枢神経系（ＣＮＳ）の両方においても現れ、シュワン細胞および後根神経節ならびにＣＮＳのニューロンにおいてグロボトリアオシルセラミドが蓄積する。ファブリ病に続発する脳血管症は、罹患した被験体における脳卒中の発生の増加を生じる。例えば、Mehta A、Beck M、Sunder-Plassmann G編、Fabry Disease: Perspectives from 5 Years of FOS. (Oxford：Oxford PharmaGenesis；２００６年)、２２章におけるSchiffmannおよびMoore、Neurological manifestations of Fabry diseaseを参照されたい。

ファブリ病が多系統疾患であることから、ファブリ病患者の処置は複雑で、その多数の徴候および症状の処置を必要とする。今日までのところ、ファブリ病について治癒が得られていない。α−Ｇａｌ Ａを使用する酵素補充療法が実施されているが、α−Ｇａｌ Ａは、血液脳関門を通らないことが示されている。したがって現在のα−Ｇａｌ Ａ酵素補充療法は、ファブリ病患者が経験する神経学的障害を解決する助けにならない。

Neufeldら、The Metabolic Basis of Inherited Disease、Scriverら編、１５６５〜１５８７頁、McGraw-Hill、New York １９８９年 Shapiro、The Metabolic Basis of Inherited Disease、Scriverら編、１９４５〜１９６４頁、McGraw-Hill、New York １９８９年 Desnickら、The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease、第８版、Scriverら編、３７３３〜３７７４頁、McGraw-Hill、New York ２００１年 Bradyら、N. Engl. J. Med. １９６７年；２７６巻、１１６３〜１１６７頁 Bishopら、Am. J. Hum. Genet. １９８５年；３７巻：Ａ１４４ Calhounら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA １９８５年；８２巻：７３６４〜７３６８頁 Bishopら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA １９８６年；８３巻：４８５９〜４８６３頁 Tsujiら、Eur. J. Biochem. １９８７年；１６５巻：２７５〜２８０頁 Kornreichら、Nucleic Acids Res. １９８９年；１７巻：３３０１〜３３０２頁 The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease、第８版 ２００１年、Scriverら編、３７３３〜３７７４頁、McGraw-Hill、New York. Engら、Am. J. Hum. Genet. １９９３年；５３巻：１１８６〜１１９７頁 Engら、Mol. Med. １９９７年；３巻：１７４〜１８２頁 Daviesら、Eur. J. Hum. Genet. １９９６年；４巻：２１９〜２２４頁 Nakaoら、N. Engl. J. Med. １９９５年；３３３巻：２８８〜２９３頁 Mehta A、Beck M、Sunder-Plassmann G編、Fabry Disease: Perspectives from 5 Years of FOS. (Oxford：Oxford PharmaGenesis；２００６年)、２２章におけるSchiffmannおよびMoore、Neurological manifestations of Fabry disease

静脈内ＩＤＵＡ、ＩＤＳおよびαガラクトシダーゼＡを使用する酵素補充療法は実施されているが、ＩＤＵＡ、ＩＤＳおよびαガラクトシダーゼＡは血液脳関門を通らないことが示されており、そのためＭＰＳ Ｉ、ハンター症候群およびファブリ病による中枢神経系病変の有効な処置ではない。本明細書に記載の方法および組成物は、ＭＰＳ Ｉ、ハンター症候群またはファブリ病を処置するために、治療上有意なレベルのＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはαガラクトシダーゼＡタンパク質を、血液脳関門を通して送達することにおいて重要な３つの要素に取り組む：１）血液脳関門を通ることができるＩＤＵＡタンパク質もしくは複合体、ＩＤＳタンパク質もしくは複合体またはαガラクトシダーゼＡタンパク質もしくは複合体を構築すること；２）ＩＤＵＡタンパク質もしくは複合体、ＩＤＳタンパク質もしくは複合体またはαガラクトシダーゼＡタンパク質もしくは複合体の適切な治療量（例えば複合体中の構成成分の相対量）を決定すること；および３）不都合な基質の量を減少させるための十分な活性を有したまま血液脳関門を通った後のＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはαガラクトシダーゼＡ酵素活性を保持すること、すなわち、治療有効量でＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはαガラクトシダーゼＡの酵素活性を保持すること。本発明は、血液脳キャリアペプチド（blood-brain carrier peptide）（「ＢＢＢキャリアペプチド」）および、酵素的に活性なイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質、ＩＤＵＡタンパク質またはαガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）タンパク質のいずれかを含む組成物を提供することによって、これらの要素に初めて対処する。本発明は、ＩＤＵＡ：ＢＢＢキャリアペプチド組成物、ＩＤＳ：ＢＢＢキャリアペプチド組成物およびα−Ｇａｌ Ａ：ＢＢＢキャリアペプチド組成物の治療有効用量も確立する。

したがって第１の態様では、本発明は、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａ）およびヒトタンパク質の血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る輸送を促進するキャリアペプチドを含む組成物であって、被験体の中枢神経系へのヒトタンパク質の送達を生じ、それによりハーラー症候群およびシャイエ症候群；ハンター症候群；またはファブリ病を含むＭＰＳ Ｉに関連する神経学的欠陥（ｄｅｆｉｃｉｔ）を処置する組成物を提供する。

一部の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは、トランスフェリンのトランスフェリン受容体結合部位、またはアポリポタンパク質の受容体結合ドメインを含む第１の部分であって、４〜５０個の親水性アミノ酸の親水性セグメントを含む第２の部分に連結された第１の部分を含む。一部の実施形態では、第１の部分はＡｐｏＡ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の受容体結合ドメインから選択されるアポリポタンパク質の受容体結合ドメインを含む。一部の実施形態では、親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、スレオニンおよびチロシンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは、配列Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｄ−Ａ（配列番号４５）を含むまたは該配列からなる。一部の実施形態では、ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはαガラクトシダーゼＡタンパク質は、血液脳関門キャリアペプチドと非共有結合的に複合体化されている。

一部の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３を含む。他の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である。他の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３を含む。他のＩＤＵＡタンパク質は、当技術分野において周知であり、例えばその内容全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第６，４２６，２０８号に記載されている。

一部の実施形態では、ＩＤＳタンパク質は配列番号５５を含む。他の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５５と少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５５と少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５５と少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５５と少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５５と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である。他の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５５のアミノ酸２６〜５５０を含む。

一部の実施形態では、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質は配列番号５６を含む。他の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５６と少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５６と少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５６と少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５６と少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である。他の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５６のアミノ酸３２〜４２９を含む。

一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、少なくとも１：２、例えば少なくとも１：２．５、少なくとも１：３、少なくとも１：４、少なくとも１：５、少なくとも１：６、少なくとも１：７、少なくとも１：８、少なくとも１：９、少なくとも１：１０、少なくとも１：１１、少なくとも１：１２、少なくとも１：１３、少なくとも１：１４、少なくとも１：１５、少なくとも１：２０またはより高いモル比で存在する。一実施形態では、ヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：１０から約１：１７０のモル比；約１：５０から約１：１７０のモル比；約１：１００から約１：１７０のモル比；約１：１６０から約１：１７０のモル比；約１：１６５から約１：１７０のモル比で存在する。

一実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：１２５、約１：１３０、約１：１４０、約１：１５０、約１：１６０、約１：１６５、約１：１６７または約１：１７０のモル比で存在する。

さらなる実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは、前述のモル比のいずれかで存在し、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）は、ヒトタンパク質約０．２〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量、例えば０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇでの投与のために製剤化される。別の実施形態では、ヒトタンパク質は、約５ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇの用量での投与のために製剤化される。

一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）は、約１ｍｇから約６５ｍｇ、約５ｍｇから約６０ｍｇ、約１０ｍｇから約５５ｍｇ、約２０ｍｇから約４５ｍｇまたは約３０ｍｇの用量で被験体に投与される。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０ｍｇを含む。

一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）は、少なくとも約１０ｎｍｏｌｅから約７５０ｎｍｏｌｅ、約１０ｎｍｏｌｅから約３５０ｎｍｏｌｅ、約１０ｎｍｏｌｅから約６００ｎｍｏｌｅ、約１００ｎｍｏｌｅから約６００ｎｍｏｌｅ、約３００ｎｍｏｌｅから約５００ｎｍｏｌｅ、約３５０ｎｍｏｌｅから約４５０ｎｍｏｌｅまたは約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５または７５０ｎｍｏｌｅの用量で投与される。

一部の実施形態ではＢＢＢキャリアペプチドは、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約２ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約５ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約６ｍｇ／ｋｇから約７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

一部の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約３μｍｏｌｅから約１５０μｍｏｌｅの用量で被験体に投与される。別の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約１０μｍｏｌｅから約１００μｍｏｌｅの用量で投与される。別の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約２５μｍｏｌｅから約７５μｍｏｌｅの用量で投与される。一実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約５０μｍｏｌｅの用量で投与される。別の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約３、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５または１３０μｍｏｌｅの用量で投与される。

一実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは約１０ｍｇから約６００ｍｇ、約７５ｍｇから約５００ｍｇ、約３７５ｍｇから約６００ｍｇ、約７５ｍｇから約３７５ｍｇ、約７５ｍｇから約６００ｍｇまたは約４８７．５ｍｇの用量で被験体に投与される。別の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドはＢＢＢキャリアペプチド約１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇまたは６００ｍｇの用量で被験体に投与される。

一実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは約１：１０から約１：１７０、約１：５０から約１：１７０、約１：１００から約１：１７０、約１：１６０から約１：１７０、約１：１６５から約１：１７０、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：１２５、約１：１３０、約１：１４０、約１：１５０、約１：１６０、約１：１６５、約１：１６７または約１：１７０のモル比で投与される。

特定の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：１５５から約１：１７５（例えば約１：１６０、１：１６５、１：１６７、１：１７０）のモル比で存在し、ヒトタンパク質は、ヒトタンパク質約０．２〜５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇの用量での投与のために製剤化される。一実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：１５５から約１：１７５（例えば約１：１６０、１：１６５、１：１６７または１：１７０）のモル比で存在し、ヒトタンパク質は、被験体の内臓組織または尿におけるヘパラン硫酸レベルを低減するおよび／またはさらなる蓄積を抑止するために有効な量での投与のために製剤化される。

一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは前述のモル比のいずれかで投与され、ヒトタンパク質は約０．２〜５、０．５〜５、０．５〜４、０．５〜３、０．５〜２または０．５〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは約１：１５５から約１：１７５（例えば約１：１６０、１：１６４、１：１６５、１：１６６、１：１６７、１：１６８、１：１６９または１：１７０）のモル比で投与され、ヒトタンパク質は、ヒトタンパク質約０．２〜５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：１５５から約１：１７５（例えば約１：１６０、１：１６５、１：１６７または１：１７０）のモル比で投与され、ヒトタンパク質は、被験体の内臓組織または尿におけるヘパラン硫酸レベルを低減するおよび／またはさらなる蓄積を抑止するために有効な量で投与される。

一実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、１：０．５から約１：１５、１：２から約１：１３、１：５から約１：９、１：８から約１：１１または約１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１もしくは１：０．５のｍｇ／ｋｇ用量比で投与される。

一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、前述のｍｇ／ｋｇ用量比のいずれかで投与され、ヒトタンパク質は約０．２〜５、０．５〜５、０．５〜４、０．５〜３、０．５〜２または０．５〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：６から約１：１２（例えば約１：７、１：８、１：９、１：１０または１：１１）のｍｇ／ｋｇ用量比で投与され、ヒトタンパク質はＩＤＵＡ約０．２から約５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：６から約１：１２（例えば約１：７、１：８、１：９、１：１０または１：１１）のｍｇ／ｋｇ用量比で投与され、ヒトタンパク質は、被験体の内臓組織または尿におけるヘパラン硫酸レベルを低減するおよび／またはさらなる蓄積を抑止するために有効な量で投与される。

一実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）の血液脳関門キャリアペプチドに対するモル比は１：１６７である。一実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、１：１１のｍｇ／ｋｇ用量比で投与され、ヒトタンパク質は、被験体におけるヘパラン硫酸のレベルを低減するおよび／またはさらなる蓄積を抑止するために有効な量で投与される。一実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）は約０．５８ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、ＢＢＢキャリアペプチドは約６．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）は約０．２１ｎｍｏｌｅの用量で投与され、ＢＢＢキャリアペプチドは約３５ｎｍｏｌｅの用量で投与される。別の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）は、血液脳キャリアペプチドと非共有結合的に複合体化されている。

一実施形態では、本発明の医薬組成物は毎週１回投与される。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は毎週２回投与される。

さらなる態様では、酵素的に活性なＩＤＵＡタンパク質、酵素的に活性なＩＤＳタンパク質、または酵素的に活性なα−ガラクトシダーゼＡタンパク質を被験体の中枢神経系に送達するための方法であって、被験体に本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。別の態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉを有する被験体の心臓に酵素的に活性なＩＤＵＡタンパク質を送達する方法であって、被験体に本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりＭＰＳ Ｉを有する被験体の心臓にＩＤＵＡタンパク質を送達する方法を提供する。

本発明は、ハンター症候群を有する被験体の心臓に酵素的に活性なＩＤＳタンパク質を送達する方法であって、被験体に本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりハンター症候群を有する被験体の心臓にＩＤＳタンパク質を送達する方法も提供する。

本発明は、ファブリ病を有する被験体の心臓に酵素的に活性なα−ガラクトシダーゼＡタンパク質を送達する方法であって、被験体に本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりファブリ病を有する被験体の心臓にα−ガラクトシダーゼＡタンパク質を送達する方法も提供する。

別の態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉを有する被験体の腎臓に酵素的に活性なＩＤＵＡタンパク質を送達する方法であって、被験体に本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりＭＰＳ Ｉを有する被験体の腎臓にＩＤＵＡタンパク質を送達する方法を提供する。

本発明は、ハンター症候群を有する被験体の腎臓に酵素的に活性なＩＤＳタンパク質を送達する方法であって、被験体に本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりハンター症候群を有する被験体の腎臓にＩＤＳタンパク質を送達する方法も提供する。

本発明は、ファブリ病を有する被験体の腎臓に酵素的に活性なα−ガラクトシダーゼＡタンパク質を送達する方法であって、被験体に本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりファブリ病を有する被験体の腎臓にα−ガラクトシダーゼＡタンパク質を送達する方法も提供する。

追加的態様では、ＭＰＳ Ｉ、ハンター症候群またはファブリ病を有する被験体を処置するための方法であって、被験体に治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物、すなわち組換えヒトＩＤＵＡおよびＢＢＢキャリアペプチド、組換えヒトＩＤＳおよびＢＢＢキャリアペプチドまたは組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡおよびＢＢＢキャリアペプチドの治療有効量を含む組成物を投与することを含む方法が提供される。

別の態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体を処置する方法であって、被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含み、被験体におけるヘパラン硫酸のレベルが低減され、および／または被験体においてヘパラン硫酸のさらなる蓄積が抑止され、それによりＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体を処置する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉを有する被験体の脳におけるデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解を増加させる方法であって、被験体に本発明の治療有効量の医薬組成物を投与することを含み、それによりＭＰＳ Ｉを有する被験体の脳におけるデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解を増加させる方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパリン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解を増加させる方法であって、被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパリン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解を増加させる方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸の分解を増加させる方法であって、被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸の分解を増加させる方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体の脳におけるデルマタン硫酸の分解を増加させる方法であって、被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体の脳におけるデルマタン硫酸の分解を増加させる方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ファブリ病を有する被験体を処置する方法であって、被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含み、α−ガラクトシル残基を有するスフィンゴ糖脂質、例えば、グロボトリアオシルセラミドおよび関連スフィンゴ糖脂質のレベルが低減され、および／または被験体においてスフィンゴ糖脂質のさらなる蓄積が抑止され、それによりファブリ病を有する被験体を処置する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ファブリ病を有する被験体の脳、例えばシュワン細胞、後根神経節（doral root ganglia）およびニューロンにおいて、α−ガラクトシル残基を有するスフィンゴ糖脂質、例えばグロボトリアオシルセラミドおよび関連スフィンゴ糖脂質の分解を増加させる方法であって、被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含み、それによりファブリ病を有する被験体の脳におけるα−ガラクトシル残基を有するスフィンゴ糖脂質、例えばグロボトリアオシルセラミドの分解を増加させる方法を提供する。

一部の実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内または皮下に投与される。

別の態様では、本発明は、酵素的に活性なヒトアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）タンパク質および血液脳関門キャリアペプチド（ＢＢＢキャリアペプチド）、酵素的に活性なヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質および血液脳関門キャリアペプチド（ＢＢＢキャリアペプチド）、または酵素的に活性なヒトα−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）タンパク質および血液脳関門キャリアペプチド（ＢＢＢキャリアペプチド）を含む組成物を作製する方法であって、酵素的に活性なヒトＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質の産生を可能にする条件下でヒトタンパク質をコードする宿主細胞を培養すること、酵素的に活性なヒトタンパク質を回収することおよび酵素的に活性なヒトタンパク質を血液脳関門キャリアペプチドと組み合わせることを含む方法を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉを有する被験体を処置するための方法を提供する。一実施形態では、ＭＰＳ Ｉ疾患はハーラー症候群である。別の実施形態では、ＭＰＳ Ｉ疾患はシャイエ症候群である。さらに別の実施形態では、ＭＰＳ Ｉ疾患はハーラー−シャイエ症候群である。さらに別の実施形態では、本発明は、ＩＤＵＡ発現または活性に欠損を有する被験体を処置するための方法を提供する。方法は、被験体（すなわちＭＰＳ Ｉを有するまたはそのような処置を必要とする被験体）に治療有効量の本明細書に記載の方法によって作製された組換えヒトＩＤＵＡタンパク質またはＩＤＵＡおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。被験体におけるＭＰＳ Ｉの処置における、組換えヒトＩＤＵＡタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドを含む本明細書に記載の医薬組成物の使用も提供される。

さらに別の態様では、本発明は、ハンター症候群を有する被験体を処置するための方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ＩＤＳ発現または活性に欠損を有する被験体を処置するための方法を提供する。方法は、被験体（すなわちハンター症候群を有するまたはそのような処置を必要とする被験体）に、治療有効量の本明細書に記載の方法により作製された組換えヒトＩＤＳタンパク質またはＩＤＳおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。被験体におけるハンター症候群の処置における、組換えヒトＩＤＳタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドを含む本明細書に記載の医薬組成物の使用も提供される。

さらに別の態様では、本発明は、ファブリ病を有する被験体を処置するための方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、α−ガラクトシダーゼＡ発現または活性に欠損を有する被験体を処置するための方法を提供する。方法は、被験体（すなわちファブリ病を有するまたはそのような処置を必要とする被験体）に治療有効量の本明細書に記載の方法により作製された組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。被験体におけるファブリ病の処置における、組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドを含む本明細書に記載の医薬組成物の使用も提供される。

他に定義する場合を除いて、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。方法および材料は、本発明の実施形態における使用について本明細書に記載されており、当技術分野において公知の他の好適な方法および材料も使用され得る。材料、方法および例は、単なる例示であり限定することを意図しない。すべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび本明細書に述べる他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。

本発明の他の特性および有利点は、次の詳細な記載および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。

図１は、ＰＢＳ（対照）を投与された野生型（ＷＴ）マウス、ＰＢＳ（対照）を投与されたＩＤＵＡノックアウト（ＫＯ）マウス、ＩＤＵＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＩＤＵＡノックアウトマウスおよびＩＤＵＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６−ＡｐｏＥ（０．１５ｍｇ）を投与されたＩＤＵＡノックアウトマウスの脳および肝臓におけるヘパラン硫酸のレベルを示す棒グラフである。

図２は、ＰＢＳ（対照）を投与された野生型（ＷＴ）マウス、ＰＢＳ（対照）を投与されたＩＤＵＡノックアウト（ＫＯ）マウス、ＩＤＵＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＩＤＵＡノックアウトマウスおよびＩＤＵＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６−ＡｐｏＥ（０．１５ｍｇ）を投与されたＩＤＵＡノックアウトマウスの腎臓および心臓におけるヘパラン硫酸のレベルを示す棒グラフである。

図３は、ＰＢＳ（対照）を投与された野生型（ＷＴ）マウス、ＰＢＳ（対照）を投与されたＩＤＵＡノックアウト（ＫＯ）マウス、０．５８ｍｇ／ｋｇ ＩＤＵＡを投与されたＩＤＵＡノックアウトマウス（ＫＯ ＩＤＵＡ）および０．５８ｍｇ／ｋｇ ＩＤＵＡ：６．５ｍｇ／ｋｇ Ｋ１６−ＡｐｏＥを投与されたＩＤＵＡノックアウトマウス（ＫＯ ＩＤＵＡ：Ｋ１６）の脳および肝臓におけるヘパラン硫酸のレベルを示す棒グラフである。ヘパラン硫酸レベルは４週間の処置および８週間の処置の後に示される。

図４Ａは、ＰＢＳ（対照）、ＩＤＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）またはＩＤＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６（４０ｎＭ）を投与された野生型動物の脳におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を示す棒グラフである。^＊ｐ＜０．０５。

図４Ｂは、ＰＢＳ（対照）、ＩＤＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）またはＩＤＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６（４０ｎＭ）を投与された野生型動物の肝臓におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を示す棒グラフである。

図５は、ＰＢＳ（対照）を投与された野生型（ＷＴ）マウス、ＰＢＳ（対照）を投与されたＩＤＳノックアウト（ＫＯ）マウス、１０ｍｇ／ｋｇ ＩＤＳを投与されたＩＤＳノックアウトマウス（ＫＯ ４５３）、１ｍｇ／ｋｇ ＩＤＳ：６．５ｍｇ／ｋｇ Ｋ１６−ＡｐｏＥを投与されたＩＤＳノックアウトマウス（ＫＯ ＩＤＳ（１ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６）および１０ｍｇ／ｋｇ ＩＤＳ：６．５ｍｇ／ｋｇ Ｋ１６−ＡｐｏＥを投与されたＩＤＳノックアウトマウス（ＫＯ ＩＤＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６）の脳および肝臓におけるヘパラン硫酸のレベルを示す棒グラフである。ヘパラン硫酸レベルは４週間の処置後に示される。

図６は、表示の処置：ＧＡＬ１０＝α−Ｇａｌ Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）；ＧＡＬ１０：Ｋ１６Ａ＝α−Ｇａｌ Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６Ａｐｏ−Ｅ［１：２］；ＧＡＬ１０：Ｋ１６Ｂ＝α−Ｇａｌ Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６Ａｐｏ−Ｅ［１：１０］を投与された野生型（ＷＴ）およびＧＬＡノックアウト（ＫＯ）マウスの脳（黒四角）および肝臓（縞四角）におけるα−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）活性を示す棒グラフである。

図７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄは、ＰＢＳ（対照）、α−Ｇａｌ Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ）またはα−Ｇａｌ Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６（４０ｎＭ）を投与された野生型動物の脳（図７Ａ〜７Ｂ）および肝臓（図７Ｃ〜７Ｄ）におけるα−Ｇａｌ Ａレベル（図７Ａ、７Ｃ）および活性（図７Ｂ、７Ｄ）を示すグラフである。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１。 図７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄは、ＰＢＳ（対照）、α−Ｇａｌ Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ）またはα−Ｇａｌ Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６（４０ｎＭ）を投与された野生型動物の脳（図７Ａ〜７Ｂ）および肝臓（図７Ｃ〜７Ｄ）におけるα−Ｇａｌ Ａレベル（図７Ａ、７Ｃ）および活性（図７Ｂ、７Ｄ）を示すグラフである。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１。

本発明は、ＭＰＳ Ｉ、ハンター症候群、および／またはファブリ病などの疾患に関連する神経学的欠陥（ｄｅｆｅｃｔ）を減少させるために有用である、治療有効量の酵素的に活性なヒトタンパク質（ＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質など）を脳および中枢神経系に送達するための方法を提供する。かかる治療用タンパク質の送達は、認知異常、水頭症、肥厚性頸部硬膜炎、神経圧迫、精神遅滞、行動異常、大脳血管症（cerebral vasculopathy）および脳卒中の危険を低減する。
神経学的疾患のための酵素補充療法

本発明は、組換えヒトタンパク質（ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−ガラクトシダーゼ Ａなど）および、ヒトタンパク質を、血液脳関門（ＢＢＢ）を通して輸送する本明細書において「ＢＢＢキャリアペプチド」と称されるキャリアペプチドを含む製剤を投与することによって、ＭＰＳ Ｉ、ハンター症候群またはファブリ病などの神経学的疾患を有するヒト被験体を処置する方法を提供する。

これらの組成物では、組換えヒトタンパク質は、ＢＢＢキャリアペプチドと非共有結合的に複合体化されてよい。本明細書において使用される「複合体化（complexed with）」は、ヒトタンパク質がＢＢＢキャリアペプチドと非共有結合的に会合されていることを意味する。

本方法および組成物では、ヒトタンパク質は、ＢＢＢキャリアペプチドに共有結合的に結合していない。本発明の具体的な実施形態は、ヒトタンパク質および配列番号４５（Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｄ−Ａ）の血液脳関門ペプチドを含む組成物を提供する。したがってＢＢＢキャリアペプチドは、ヒトタンパク質に共有結合的に結合していない、例えばヒトタンパク質を含む融合タンパク質の一部ではない。ＢＢＢキャリアペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成、例えば、液相ペプチド合成または固相ペプチド合成によって容易に産生され、または代替的に当技術分野において周知およびさらに本明細書に記載の発現技法によって細胞において発現され得る。

一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、所望のモル比で組み合わされ、患者への投与の前にインキュベートされてよい。ある特定の実施形態では、ヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは、被験体に所望のモル比で逐次的に（例えばＢＢＢキャリアペプチドに続いてヒトタンパク質、またはヒトタンパク質に続いてＢＢＢキャリアペプチド）または同時に（すなわち、予め組み合わせるまたは予め混合することなく、被験体にＢＢＢキャリアペプチドおよびヒトタンパク質を同時に投与すること）のいずれかで個々に投与されてよい。

ある特定の実施形態では、ヒトタンパク質のＢＢＢキャリアペプチドに対するモル比は、約１：１から約１：２００の範囲（例えば約１：２、１：３、１：５、１：８、１：１０、１：２５、１：３０、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：９０、１：１００、１：１２５、１：１３５、１：１４５、１：１５０、１：１６０、１：１６４、１：１６５、１：１６６、１：１６７、１：１６８、１：１６９、１：１７０、１：１７５、１：１８０、１：１８５および１：１９０）であってよい。一部の実施形態では、ヒトタンパク質に対してモル過剰のＢＢＢキャリアペプチドが使用される。ある特定の実施形態では、ヒトタンパク質のＢＢＢキャリアペプチドに対するモル比は、約１：２から約１：１０、約１：１０から約１：１９０、約１：１００から約１：１８０または約１：１５５から約１：１７５である。他の実施形態では、ヒトタンパク質のＢＢＢキャリアペプチドに対するモル比は、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９または約１：１０である。一実施形態では、ヒトタンパク質のＢＢＢキャリアペプチドに対するモル比は約１：１６７である。

さらなる実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、前述のモル比のいずれかで投与され、ヒトタンパク質はヒトタンパク質約０．２〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、前述のモル比のいずれかで投与され、ヒトタンパク質は約０．２〜５、０．５〜５、０．５〜４、０．５〜３、０．５〜２または０．５〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：１５５から約１：１７５（例えば約１：１６０、１：１６１、１：１６２、１：１６３、１：１６４、１：１６５、１：１６６、１：１６７、１：１６８、１：１６９、１：１７０）のモル比で投与され、ヒトタンパク質は、ＩＤＵＡ約０．２〜５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ 約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

他の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：１５５から約１：１７５（例えば約１：１６０、１：１６１、１：１６２、１：１６３、１：１６４、１：１６５、１：１６６、１：１６７、１：１６８、１：１６９または１：１７０）のモル比で投与され、ヒトタンパク質は、被験体の内臓組織または尿におけるヘパラン硫酸レベルを低減するおよび／またはさらなる蓄積を抑止するために有効な量で投与される。

一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、所望のｍｇ／ｋｇ用量比で組み合わされ、患者への投与の前にインキュベートされてよい。ある特定の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、被験体に所望のｍｇ／ｋｇ用量比で逐次的に（例えば、ＢＢＢキャリアペプチドに続いてヒトタンパク質、またはヒトタンパク質に続いてＢＢＢキャリアペプチド）または同時に（すなわち、予め組み合わせるまたは予め混合することなく、被験体にＢＢＢキャリアペプチドおよびＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質を同時に投与すること）のいずれかで個々に投与されてよい。

一実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、１：０．５から約１：１５、約１：２から約１：１３、約１：５から約１：９または約１：８から約１：１１のｍｇ／ｋｇ用量比で投与される。一実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１または１：０．５のｍｇ／ｋｇ用量比で投与される。

さらなる実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、前述のｍｇ／ｋｇ用量比のいずれかで投与され、ヒトタンパク質は、ヒトタンパク質約０．２〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、前述のｍｇ／ｋｇ用量比のいずれかで投与され、ヒトタンパク質は約０．２〜５、０．５〜５、０．５〜４、０．５〜３、０．５〜２または０．５〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：６から約１：１２（例えば約１：７、１：８、１：９、１：１０または１：１１）のｍｇ／ｋｇ用量比で投与され、ヒトタンパク質は、ヒトタンパク質約０．２から約５ｍｇ／ｋｇ体重の用量、例えば約０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、約１：６から約１：１２（例えば約１：７、１：８、１：９、１：１０または１：１１）のｍｇ／ｋｇ用量比で投与され、ヒトタンパク質は、被験体の内臓組織または尿におけるヘパラン硫酸レベルを低減するおよび／またはさらなる蓄積を抑止するために有効な量で投与される。

ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは、当技術分野において公知の手段によって複合体化されてよい。ある特定の実施形態では、ヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは、ヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドを室温で、例えばＩＤＵＡについて実施例１で記載のとおり、例えば少なくとも１分間、５分間または１０分間、例えば１０〜２４０分間または３０〜１２０分間組み合わせ、インキュベートすることによって複合体化される。

一部の実施形態では、方法は、被験体にＢＢＢキャリアペプチドおよび組換えヒトタンパク質をＭＰＳ Ｉの神経学的障害の１つまたは複数の態様を処置する（例えば低減する、軽減する）または予防するために十分な量で含む組成物を投与することを含む。実施例は、低投与量のＩＤＵＡ酵素（例えば１０ｍｇ／ｋｇおよび０．５８ｍｇ／ｋｇ）がｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて有効であったことを実証する。具体的には実施例は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたＩＤＵＡの臨床的に使用される投与量（０．５８ｍｇ／ｋｇ）がヘパラン硫酸の劇的な低減をもたらす活性ＩＤＵＡの哺乳動物の脳への送達のために有効であったことを実証する。Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化された他の酵素で本発明者らによって実施された他の研究において、脳における酵素の検出可能なレベルを達成するためにより高い酵素投与量（約５０ｍｇ／ｋｇ）が使用されたことから、これは驚くべきことである。

一部の実施形態では、方法は、被験体にＢＢＢキャリアペプチドおよび組換えヒトＩＤＳタンパク質をハンター症候群の神経学的障害の１つまたは複数の態様を処置する（例えば低減する、軽減する）または予防するために十分な量で含む組成物を投与することを含む。実施例は、低投与量のＩＤＳ酵素（例えば１０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ）がｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて有効であったことを実証する。具体的には実施例は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたＩＤＳの臨床的に使用される投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）がヘパリン硫酸の劇的な低減をもたらす活性ＩＤＳの哺乳動物の脳への送達のために有効であったことを実証する。

一部の実施形態では、方法は、被験体にＢＢＢキャリアペプチドおよび組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡタンパク質をファブリ病の神経学的障害の１つまたは複数の態様を処置する（例えば低減する、軽減する）または予防するために十分な量で含む組成物を投与することを含む。実施例は、比較的低投与量のα−ガラクトシダーゼＡ酵素（例えば５０ｍｇ／ｋｇ）がｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて有効であったことを実証する。具体的には実施例は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたα−ガラクトシダーゼＡの臨床的に使用される投与量（５０ｍｇ／ｋｇ）が活性α−ガラクトシダーゼＡの哺乳動物の脳への送達のために有効であったことを実証する。具体的には実施例は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたα−ガラクトシダーゼＡの臨床的に使用される投与量（５０ｍｇ／ｋｇ）が、活性α−ガラクトシダーゼＡの哺乳動物の脳への送達のために有効であり、α−ガラクトシダーゼＡ酵素活性に顕著な増加をもたらすことを実証する。

本発明の医薬組成物は、治療的もしくは予防的または両方で投与されてよい。ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドは被験体に、当技術分野において公知のとおり単独または他の治療様式との組合せで投与されてよい。

用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患もしくは症状を和らげる、減らすもしくは軽減する、追加的症状を予防する、症状の根底にある原因を軽減するもしくは予防する、疾患もしくは状態を抑制する、疾患もしくは状態の発達を抑止する、疾患もしくは状態を緩和する、疾患もしくは状態の退縮を生じさせる、疾患もしくは状態によって生じた状態を緩和する、または予防的におよび／もしくは症状が生じた後のいずれかで疾患もしくは状態の症状を停止させる方法を指す。

本明細書において使用される「治療有効用量」は、意図する治療応答（例えば、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸レベルの濃度を低減する、過剰なヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸レベルのさらなる蓄積を予防するもしくは軽減する、または認知異常、水頭症、肥厚性頸部硬膜炎、神経圧迫および／もしくは行動異常の処置；例えばグロボトリアオシルセラミドレベルを低減する、標的組織中のα−Ｇａｌ Ａ活性を増加させる、または認知異常、大脳血管症、脳卒中、乏汗症、延長拡張症および／もしくは白質病変の処置）を生じるために必要とされる薬物の用量（例えば量および／または間隔）を指す。治療有効用量は、かかる用量を受けていない対応する被験体と比較して、処置、治癒、予防の改善（すなわち疾患もしくは疾患症状の危険を低減するまたはその発症を遅らせる）または疾患、障害もしくは副作用の軽減、または疾患もしくは障害の発生もしくは進展の速度の減少を生じる用量を指す。用語はその範囲内に、生理的機能を増強するために有効な用量も含む。

本明細書において使用される用語「酵素的に活性」は、例えばＩＤＵＡ分子と非ＩＤＵＡ分子、ＩＤＳ分子と非ＩＤＳ分子、またはα−ガラクトシダーゼＡ分子と非α−ガラクトシダーゼＡ分子との間の相互作用に関与し、酵素活性を保持しているヒトタンパク質の断片を含むヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）を指す。代替的に「酵素的に活性」は、野生型ヒトタンパク質の１つまたは複数の活性を保持しているヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質およびα−Ｇａｌ Ａタンパク質）を指す。

一実施形態では、「酵素的に活性」なＩＤＵＡの活性は、これだけに限らないが、デルマタン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解を触媒すること、ヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解を触媒すること、またはデルマタン硫酸および／もしくはヘパラン硫酸の分解に関与することを含む。

一実施形態では、「酵素的に活性」なＩＤＳの活性は、これだけに限らないが、ヘパリン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解を触媒すること、デルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解を触媒すること、またはデルマタン硫酸および／もしくはヘパラン硫酸の分解に関与することを含む。

一実施形態では、「酵素的に活性」なα−ガラクトシダーゼＡの活性は、これだけに限らないが、スフィンゴ糖脂質の異化反応、またはグロボトリアオシルセラミドおよび関連するスフィンゴ糖脂質の分解もしくはグロボトリアオシルセラミドおよび関連するスフィンゴ糖脂質の還元に関与することを含む。

ＩＤＵＡタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＩＤＵＡタンパク質より少ないアミノ酸を含んでよく、本明細書に記載のＩＤＵＡタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、野生型ヒトＩＤＵＡタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号５３に示すアミノ酸配列と十分に同一な（例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には酵素的に活性な部分は、ＩＤＵＡタンパク質の少なくとも１つの活性を有する、例えばデルマタン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解を触媒する、ヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解を触媒する、デルマタン硫酸の分解に関与する、またはヘパラン硫酸の分解に関与するドメインまたはモチーフを含む。

ＩＤＳタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＩＤＳタンパク質より少ないアミノ酸を含んでよく、本明細書に記載のＩＤＳタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、野生型ヒトＩＤＳタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号５５に示すアミノ酸配列と十分に同一な（例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には酵素的に活性な部分は、ＩＤＳタンパク質の少なくとも１つの活性を有する、例えばヘパリン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解を触媒する、デルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解を触媒する、またはデルマタン硫酸および／もしくはヘパラン硫酸の分解に関与するドメインまたはモチーフを含む。

α−ガラクトシダーゼＡタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長α−ガラクトシダーゼＡタンパク質より少ないアミノ酸を含んでよく、本明細書に記載のα−ガラクトシダーゼＡタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、野生型ヒトα−ガラクトシダーゼＡタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号５６に示すアミノ酸配列と十分に同一な（例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には酵素的に活性な部分は、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質の少なくとも１つの活性を有する、例えばスフィンゴ糖脂質の異化反応、またはグロボトリアオシルセラミドおよび関連するスフィンゴ糖脂質の分解もしくはグロボトリアオシルセラミドおよび関連するスフィンゴ糖脂質の還元に関与するドメインまたはモチーフを含む。

「単離された」もしくは「精製された」タンパク質または生物学的に活性なその部分は、タンパク質が産生された細胞もしくは組織供給源に由来する細胞物質もしくは他の混入タンパク質を実質的に含まない、または化学的に合成された場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。語「実質的に細胞物質を含まない」は、タンパク質が、それが単離されたまたは組換え的に産生された細胞の細胞構成成分から分離されているタンパク質の調製物を含む。

一実施形態では、語「細胞物質を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量による）の非ヒトタンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも称される）、より好ましくは約２０％未満の非ＩＤＵＡ、非ＩＤＳまたは非α−ガラクトシダーゼＡタンパク質、さらにより好ましくは約１０％未満の非ＩＤＵＡ、非ＩＤＳまたは非α−ガラクトシダーゼＡタンパク質および最も好ましくは約５％未満の非ＩＤＵＡ、非ＩＤＳまたは非α−ガラクトシダーゼＡタンパク質を有するヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−Ｇａｌ Ａタンパク質）の調製物を含む。ＩＤＵＡ、ＩＤＳもしくはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分が組換え的に産生される場合、それはまた培養培地を好ましくは実質的に含まない、すなわち培養培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満および最も好ましくは約５％未満に相当する。

語「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−Ｇａｌ Ａタンパク質）／ＢＢＢキャリアペプチド組成物がタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている調製物を含む。一実施形態では、語「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量による）の化学的前駆体または非ＩＤＵＡ、非ＩＤＳもしくは非α−ガラクトシダーゼＡ化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＩＤＵＡ、非ＩＤＳもしくは非α−ガラクトシダーゼＡ化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＩＤＵＡ、非ＩＤＳもしくは非α−ガラクトシダーゼＡ化学物質および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＩＤＵＡ、非ＩＤＳもしくは非α−ガラクトシダーゼＡ化学物質を有するヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−Ｇａｌ Ａタンパク質）／ＢＢＢキャリアペプチド組成物の調製物を含む。

具体的に述べるまたは内容から明らかである場合を除いて、本明細書において使用される用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の２標準偏差内であるとして理解される。約は、述べられた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％内として理解され得る。内容から明らかである場合を除いて本明細書で提供されるすべての数値は、用語約によって修飾されてよい。

本明細書において使用される用語「被験体」または「患者」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物は、すべての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類およびは虫類などの哺乳動物および非哺乳動物を含む。好ましい被験体はヒト被験体を含む。一実施形態では、被験体はＭＰＳ Ｉを有するヒト被験体である。一実施形態では、被験体はハーラー症候群を有するヒト被験体である。別の実施形態では、被験体はシャイエ症候群を有するヒト被験体である。別の実施形態では、被験体はハーラー−シャイエ症候群を有するヒト被験体である。別の実施形態では、被験体はＩＤＵＡ発現または活性に欠損を有するヒト被験体である。好ましい被験体はハンター症候群を有するヒト被験体を含む。別の実施形態では、被験体はＩＤＳ発現または活性に欠損を有するヒト被験体である。好ましい被験体はファブリ病を有するヒト被験体を含む。別の実施形態では、被験体はα−ガラクトシダーゼＡ発現または活性に欠損を有するヒト被験体である。

本発明のある特定の実施形態は、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ＧａｌＡタンパク質）ならびに関連器官および組織、例えば被験体の脳または中枢神経系への組換えヒトタンパク質の取り込みまたは輸送を促進するＢＢＢキャリアペプチドの共製剤（co-formulation）を使用する治療方法を包含する。

一実施形態では、本発明の方法は、ＭＰＳ Ｉの処置のために本発明の組換えヒトＩＤＵＡを被験体のＣＮＳ（中枢神経系）に直接または間接的に送達することを含む。一実施形態では、本発明の方法は、ハンター症候群の処置のために本発明の組換えヒトＩＤＳを被験体のＣＮＳ（中枢神経系）に直接または間接的に送達することを含む。一実施形態では、本発明の方法は、ファブリ病の処置のために本発明の組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡを被験体のＣＮＳ（中枢神経系）に直接または間接的に送達することを含む。

例えば組換えヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは、患者に例えば、静脈内（例えば静脈内注射または静脈内注入を介して）、筋肉内、皮下、経口、経鼻、鼻腔内または経皮的投与を介して投与されてよい。一実施形態では、ヒトタンパク質／ＢＢＢキャリアペプチド組成物は被験体に静脈内投与される。

組換えヒトタンパク質およびＢＢＢキャリアペプチドは、１または複数の投与、適用または投与量で投与されてよい。組成物は、１日あたり１回または複数回から、１日おきに１回を含め、１週間あたり１回または複数回で投与されてよい。当業者は、これだけに限らないが疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の全身の健康および／または年齢、ならびに他に存在する疾患を含む、ある特定の要因が被験体を効果的に処置するために必要な投与量および時期に影響を与え得ることを理解している。さらに本明細書に記載の治療化合物の治療有効量での被験体の処置は、単回の処置または一連の処置を含んでよい。一実施形態では、医薬組成物は毎週１回投与されてよい。別の実施形態では、医薬組成物は毎週２回投与されてよい。別の実施形態では、医薬組成物は１週間おきに投与されてよい。別の実施形態では、医薬組成物は１ヵ月に１回投与されてよい。

本明細書に記載の組成物の投与量、毒性および治療有効性は、例えばＬＤ_５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％に治療有効性の用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的医薬手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表され得る。高い治療指数を示す化合物は好ましい。毒性の副作用を呈する化合物を使用してもよいが、非感染細胞への潜在的損傷を最小化し、それにより副作用を低減するために、そのような化合物を、罹患した組織の部位に標的化する送達系の設計に注意が払われるべきである。

細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲を定めることに使用され得る。そのような化合物の投与量は、好ましくは殆どまたは全く毒性がないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化してよい。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養において決定されたＩＣ_５０（すなわち、疾患の出現の徴候の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定められてよい。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって、測定されてよい。

例示的用量は、ＩＤＵＡ ０．２〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、ＩＤＳ ０．２〜５０ｍｇ／ｋｇ体重またはα−ガラクトシダーゼＡ ０．２〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。特定の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質の投与量は０．５８ｍｇ／ｋｇ体重である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質の投与量は１０ｍｇ／ｋｇ体重である。特定の実施形態では、ＩＤＳタンパク質の投与量は１０ｍｇ／ｋｇ体重である。別の実施形態では、ＩＤＳタンパク質の投与量は５０ｍｇ／ｋｇ体重である。特定の実施形態では、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質の投与量は１０ｍｇ／ｋｇ体重である。別の実施形態では、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質の投与量は５０ｍｇ／ｋｇ体重である。

一態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉを有する被験体に本発明の医薬組成物を投与することによって、該被験体の脳におけるデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解を増加させるための方法を提供する。本明細書において使用されるデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の「加水分解を増加させること」または「加水分解の増加」は、ＩＤＵＡおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物で処置されていない、またはＩＤＵＡおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物での処置前のデルマタン硫酸またはヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解のレベルと比較して、ＩＤＵＡおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物での処置後に増加する、デルマタン硫酸またはヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解のレベルを指す。

一実施形態では、ＭＰＳ Ｉを有する被験体の脳におけるデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解のレベルは、本発明の組成物での処置後に、組成物で処置されていないまたは処置前のデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解のレベルと比較して５０％、６０％、７０％、８０％または９０％増加する。別の実施形態では、ＭＰＳ Ｉを有する被験体の脳におけるデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解のレベルは、本発明の組成物での処置後に、組成物で処置されていないまたは処置前のデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解のレベルと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加する。デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解のレベルを決定するための方法は当技術分野において周知である。例えばWardaら、Glycoconj. J.、２００６年、２３巻：５５５〜５６３頁；Lawrenceら、Glycobiol.、２００４年、１４巻（５号）：４６７〜４７９頁；ShiおよびZaia、２００９年、J. Biol. Chem.、２００９年、２８４巻（１８号）：１１８０６〜１１８１４頁；ならびにLedinら、J. Biol. Chem.、２００４年、２７９巻（４１号）：４２７３２〜４２７４１頁を参照されたい。

一実施形態では、被験体におけるデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解のレベルは、代替的に、「正常」レベルまたは「対照」レベルとの比較によって決定され得る。加水分解の「正常」レベルは、ＭＰＳ Ｉを患っていない被験体におけるデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸の加水分解のレベルである。一部の実施形態では、加水分解の「正常」レベルは、非ＭＰＳ Ｉ罹患患者からまたは保存された（archived）患者試料から得られた患者試料中のデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸のレベルを評価することによって決定され得る。代替的に、デルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解の正常レベルについての集団平均値が使用されてもよい。

別の態様では、本発明は、被験体に本発明の医薬組成物を投与することによって、ハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解を増加させるための方法を提供する。本明細書において使用されるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の「加水分解を増加させる」または「加水分解の増加」は、ＩＤＳおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物で処置されていない、またはＩＤＳおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物での処置前のヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解のレベルと比較して、ＩＤＳおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物での処置後に増加する、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解のレベルを指す。

一実施形態では、ハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解のレベルは、本発明の組成物での処置後に、組成物で処置されていないまたは処置前のヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解のレベルと比較して５０％、６０％、７０％、８０％または９０％増加する。別の実施形態では、ハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解のレベルは、本発明の組成物での処置後に、組成物で処置されていないまたは処置前のヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解のレベルと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加する。ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸中の非還元末端イズロン酸残基からのＣ２−硫酸エステル結合の加水分解のレベルを測定するための方法は当技術分野において周知である。

別の態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉを有する被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することによって、該被験体の脳における、またはハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の分解を増加させるための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＭＰＳ Ｉを有する被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することによって、該被験体の脳における、またはハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸の分解を増加させるための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＭＰＳ Ｉを有する被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することによって、該被験体の脳における、またはハンター症候群を有する被験体の脳におけるデルマタン硫酸の分解を増加させるための方法を提供する。

本明細書において使用される「分解を増加させる」または「分解の増加」は、ＩＤＵＡおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物またはＩＤＳおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物で処置されていないまたは処置前のデルマタン硫酸またはヘパラン硫酸の分解のレベルと比較して、ＩＤＵＡおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物またはＩＤＳおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物での処置後に増加するデルマタン硫酸またはヘパラン硫酸の分解のレベルを指す。一実施形態では、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の両方の分解は増加する。別の実施形態では、ヘパラン硫酸の分解は増加する。別の実施形態では、デルマタン硫酸の分解は増加する。

一実施形態では、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸および／またはデルマタン硫酸の分解のレベルは、本発明の組成物での処置後に、組成物で処置されていないまたは処置前のヘパラン硫酸および／またはデルマタン硫酸の分解のレベルと比較して５０％、６０％、７０％、８０％または９０％増加する。別の実施形態では、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸および／またはデルマタン硫酸の分解のレベルは、本発明の組成物での処置後に、組成物で処置されていないまたは処置前のヘパラン硫酸および／またはデルマタン硫酸の分解のレベルと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加する。一実施形態では、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の両方の分解は増加する。別の実施形態では、ヘパラン硫酸の分解は増加する。別の実施形態では、デルマタン硫酸の分解は増加する。ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の分解のレベルを決定するための方法は当技術分野において周知である。例えばWardaら、Glycoconj. J.、２００６年、２３巻：５５５〜５６３頁；Lawrenceら、Glycobiol.、２００４年、１４巻（５号）：４６７〜４７９頁；ShiおよびZaia、２００９年、J. Biol. Chem.、２００９年、２８４巻（１８号）：１１８０６〜１１８１４頁；ならびにLedinら、J. Biol. Chem.、２００４年、２７９巻（４１号）：４２７３２〜４２７４１頁を参照されたい。

一実施形態では、被験体におけるデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸中の分解のレベルは、代替的に「正常」レベルまたは「対照」レベルとの比較によって決定され得る。分解の「正常」レベルは、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を患っていない被験体におけるデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸の分解のレベルである。一部の実施形態では、分解の「正常」レベルは、非ＭＰＳ Ｉ罹患患者、非ハンター症候群罹患患者からまたは保存された患者試料から得られた患者試料中のデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸のレベルを評価することによって決定され得る。代替的に、デルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸の分解の正常レベルについての集団平均値が使用されてもよい。

別の態様では、本発明は、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することによって、該被験体の脳におけるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸のレベルを減少させるための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することによって、該被験体の脳におけるヘパラン硫酸のレベルを減少させるための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することによって、該被験体の脳におけるデルマタン硫酸のレベルを減少させるための方法を提供する。

本明細書において使用される「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」または「減少している（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」は、ＩＤＵＡおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物で処置されていないまたは処置前のデルマタン硫酸またはヘパラン硫酸のレベルと比較して、ＩＤＵＡおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物での処置後のＭＰＳ Ｉを有する被験体の脳におけるデルマタン硫酸またはヘパラン硫酸のレベルを指す。本明細書において使用される用語「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」または「減少している（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」は、ＩＤＳおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物で処置されていないまたは処置前のデルマタン硫酸またはヘパラン硫酸のレベルと比較して、ＩＤＳおよびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物での処置後のハンター症候群を有する被験体の脳におけるデルマタン硫酸またはヘパラン硫酸のレベルも指す。一実施形態では、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の両方のレベルは減少する。別の実施形態では、ヘパラン硫酸のレベルは減少する。別の実施形態では、デルマタン硫酸のレベルは減少する。

一実施形態では、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸および／またはデルマタン硫酸のレベルは、本発明の組成物での処置後に、組成物で処置されていないまたは処置前のヘパラン硫酸および／またはデルマタン硫酸のレベルと比較して５０％、６０％、７０％、８０％または９０％減少する。

別の実施形態では、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を有する被験体の脳におけるヘパラン硫酸および／またはデルマタン硫酸のレベルは、本発明の組成物での処置後に、組成物で処置されていないまたは処置前のヘパラン硫酸および／またはデルマタン硫酸のレベルと比較して１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９または１／１０に減少する。一実施形態では、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の両方のレベルは減少する。別の実施形態では、ヘパラン硫酸のレベルは減少する。別の実施形態では、デルマタン硫酸のレベルは減少する。ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸のレベルを決定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Wardaら、Glycoconj. J.、２００６年、２３巻：５５５〜５６３頁；Lawrenceら、Glycobiol.、２００４年、１４巻（５号）：４６７〜４７９頁；ShiおよびZaia、２００９年、J. Biol. Chem.、２００９年、２８４巻（１８号）：１１８０６〜１１８１４頁；ならびにLedinら、J. Biol. Chem.、２００４年、２７９巻（４１号）：４２７３２〜４２７４１頁を参照されたい。

一実施形態では、被験体におけるデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸中のレベルは、代替的に「正常」レベルまたは「対照」レベルとの比較によって決定され得る。「正常」レベルは、ＭＰＳ Ｉまたはハンター症候群を患っていない被験体におけるデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸のレベルである。一部の実施形態では、ヘパラン硫酸またはデルマタン硫酸の「正常」レベルは、非ＭＰＳ Ｉ罹患患者、非ハンター症候群罹患患者からまたは保存された患者試料から得られた患者試料中のデルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸のレベルを評価することによって決定され得る。代替的に、デルマタン硫酸および／またはヘパラン硫酸の正常レベルについての集団平均値が使用されてもよい。
ＢＢＢキャリアペプチド

本発明のある特定の実施形態は、本明細書においてＢＢＢキャリアペプチドと称される、ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−Ｇａｌ Ａタンパク質）を、血液脳関門（ＢＢＢ）を通して輸送するキャリアペプチドを含む組成物を含む。好適なペプチドは、その開示全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる付与前公開第ＵＳ ２０１２／０１０７２４３号に記載のものを含む。例えば好適なペプチドは、トランスフェリンのトランスフェリン受容体結合部位、またはアポリポタンパク質の受容体結合ドメインを含むペプチド、例えばアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、スレオニンおよびチロシンまたはこれらの組合せから選択される４〜５０個の親水性アミノ酸の親水性セグメントに連結されたＡｐｏＡ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の受容体結合ドメイン由来のペプチドを含む。

一部の実施形態では、親水性セグメントは、リシンまたは非天然リシン誘導体、アルギニンまたは非天然アルギニン誘導体およびこれらの組合せから選択される親水性アミノ酸からなる。例示的配列はＫＫＫＫ（配列番号１）；ＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号２）；ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号３）；ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号４）；ＲＲＲＲ（配列番号５）；ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号６）；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７）；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号８）；ＫＲＫＲ（配列番号９）；ＫＫＫＲ（配列番号１０）；ＫＫＫＲＲＲＫＫＫＲＲＲ（配列番号１１）；およびＫＫＫＫＲＲＲＲＫＫＫＫＲＲＲＲ（配列番号１２）を含む。

一部の実施形態では、受容体結合ドメインは、次の配列の１つと少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含む：

上記において、Y*はチロシンまたはチロシン誘導体(例えばアミド化チロシン)である。例えばBallantyne、G. H.、Obesity Surgery、16巻:651〜658頁 2006年を参照されたい。

一部の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは、次の配列の１つと少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含む：

一部の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは、ペプチドＫ１６ＡｐｏＥ、すなわちＫ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｄ−Ａ（配列番号４５）を含む。一部の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは、Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｒ（配列番号５２）である。一部の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは、Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｒ（配列番号５２）ではない。

一実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）のヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号１３〜５１のいずれか１つと少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通るＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａの通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号１３〜５１のいずれか１つと少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通るＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａの通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号１３〜５１のいずれか１つと少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通るＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａの通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号１３〜５１のいずれか１つと少なくとも９５％同一である。さらに別の実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通るＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａの通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号１３〜５１のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。

一実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通るヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）の通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号４５と少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通るＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａの通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号４５と少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通るＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａの通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号４５と少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通るＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａの通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号４５と少なくとも９５％同一である。さらに別の実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通るＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａの通過を促進するキャリアペプチドは、配列番号４５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。

「配列同一性パーセント」は、任意の２つまたはそれ超の配列の間の配列同一性の程度を指す。比較される配列は、典型的には参照配列の長さの８０パーセントから２００パーセントである長さを有する（例えば参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００パーセント）。参照核酸またはポリペプチドと比較した任意の候補核酸またはポリペプチドの同一性パーセントは、次のとおり決定され得る。参照配列（例えば核酸配列またはアミノ酸配列）は、核酸配列またはポリペプチド配列の、それら全長にわたって実行される（グローバルアラインメント）アラインメントを可能にするコンピュータープログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．８３、初期パラメーター）を使用して１つまたは複数の候補配列とアラインメントされる。Chemaら、Nucleic Acids Res.、３１巻（１３号）：３４９７〜５００頁（２００３年）。

ＣｌｕｓｔａｌＷは、参照配列と１つまたは複数の候補配列との間の最良のマッチを算出し、同一性、類似性および差異が決定され得るようにそれらをアラインメントする。１つまたは複数残基のギャップは、配列アラインメントを最大化するように参照配列、候補配列または両方に挿入されてよい。核酸配列の高速ペアワイズアラインメントのために次の初期パラメーターが使用される：ワードサイズ：２；ウインドウサイズ：４；スコアリング方法：百分率；トップダイアゴナル（top diagonal）の数：４；およびギャップペナルティー：５。核酸配列のマルチプルアラインメントのために次のパラメーターが使用される：ギャップ開始ペナルティー：１０；ギャップ伸長ペナルティー：５．０；および重みの遷移：有。ペプチド配列の高速ペアワイズアラインメントのために次のパラメーターが使用される：ワードサイズ：１；ウインドウサイズ：５；スコアリング方法：百分率；トップダイアゴナルの数：５；ギャップペナルティー：３。ペプチド配列のマルチプルアラインメントのために次のパラメーターが使用される：ウェイトマトリックス：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップ開始ペナルティー：１０；ギャップ伸長ペナルティー：０．５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；残基特異的ギャップペナルティー：オン。ＣｌｕｓｔａｌＷアウトプットは、配列間の関係を反映する配列アラインメントである。ＣｌｕｓｔａｌＷは、いくつかのオンラインソースから実行され得る。

参照配列との候補核酸配列またはアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してアラインメントし、アラインメント中の同一性マッチの数を参照配列の長さで割り、その結果に１００を掛ける。なお、同一性パーセント値を小数第１位に丸める場合がある。例えば７８．１１、７８．１２、７８．１３および７８．１４を７８．１に切り捨て、一方７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８および７８．１９を７８．２に切り上げる。

一部の実施形態では、ＢＢＢキャリアペプチドは修飾される、例えばＮ末端でアミド化される（例えば合成反応の際に）。
医薬組成物

ヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）およびＢＢＢキャリアペプチドを含む組成物は、医薬組成物を調製するために生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と共に製剤化され得る。キャリアおよび組成物は滅菌され得る。製剤は投与の様式に適合されるべきである。

好適な薬学的に許容されるキャリアは、これだけに限らないが水、塩溶液（例えばＮａＣｌ）、食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、マンニトール、スクロース、その他、デキストロースなどの糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン（viscous paraffin）、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセロース、ポリビニルピロリドンなど、およびこれらの組合せを含む。医薬調製物は、所望により、活性化合物と有害に反応しない、またはそれらの活性に影響を与えない補助剤（例えば滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤（emulsifier）、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色料、香味物質および／または芳香物質など）と混合されてよい。一部の実施形態では、静脈内投与に好適な水溶性キャリアが使用される。

所望により組成物または医薬は、少量の湿潤剤または乳化剤（emulsifying agent）またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。組成物は、液剤（liquid solution）、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または粉剤・散剤（powder）であってよい。組成物は、伝統的結合剤および、トリグリセリドなどのキャリアを含む坐剤として製剤化されてもよい。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含んでよい。

組成物または医薬は、人間への投与のために適合された医薬組成物として日常的手順に従って製剤化されてよい。例えば一部の実施形態では、静脈内投与のための組成物は、典型的には滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて組成物は、可溶化剤、および注射部位の疼痛を緩和するための局所麻酔剤も含んでよい。一般に成分は、例えば、活性剤の量を表示したアンプルまたはサシェ（sachette）などの密封シールした容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは単位剤形中に一緒に混合されて供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌医薬品等級水、食塩水またはデキストロース／水を含有する輸液ビンに分注されてよい。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルは、成分が投与の前に混合され得るように提供されてよい。
組換えヒトＩＤＵＡ、ＩＤＳおよびα−Ｇａｌ Ａ

本組成物および方法は、天然酵素と同一のアミノ酸配列を有する組換えヒトＩＤＵＡ酵素を使用する。ヒトＩＤＵＡのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１９４で入手可能である。例示的ヒトＩＤＵＡ配列は次のとおりである。

一実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３を含む。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３からなる。一実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物において使用されるＩＤＵＡ酵素は、アミノ酸１〜１９（シグナル配列；上記下線部）を含まない上記配列番号５３を含む、すなわち、配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３を含む。タンパク質の臨床的および商業的量を支えるために一般に使用される発現系に適するシグナル配列は、当技術分野において周知である。一実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３を含む。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３からなる。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は融合タンパク質ではない。一実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３と少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３と少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３と少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３と少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、ＩＤＵＡタンパク質は配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。

他のＩＤＵＡタンパク質は、当技術分野において周知であり、例えばその内容全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第６，４２６，２０８号に記載されている。ＩＤＵＡタンパク質を発現するための方法も当技術分野において一般に公知であり、例えばその内容全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第６，４２６，２０８号に記載されている。

ＩＤＵＡタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＩＤＵＡタンパク質よりも少ないアミノ酸を含んでよく、本明細書に記載のＩＤＵＡタンパク質の少なくとも１つの活性を示し得る、野生型ヒトＩＤＵＡタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号５３に示すアミノ酸配列と十分に同一な（例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、酵素的に活性な部分は、ＩＤＵＡタンパク質の少なくとも１つの活性を有する、例えば、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸中の非硫酸化アルファ−Ｌ−イデュロノシド結合の加水分解を触媒する、デルマタン硫酸の分解に関与する、またはヘパラン硫酸の分解に関与するドメインまたはモチーフを含む。

一実施形態では、本発明は、野生型ＩＤＵＡと比較して安定性が増加したＩＤＵＡの変種を提供する。別の実施形態では、本発明は、野生型ＩＤＵＡと比較して免疫原性が減少したＩＤＵＡの変種を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、野生型ＩＤＵＡと比較して触媒活性が増加したＩＤＵＡの変種を提供する。

一部の実施形態では、本出願に記載のＩＤＵＡをコードする核酸配列は、培養細胞を含む好適な発現系における増殖（propagation）または発現のために好適なベクターに分子的にクローニング（挿入）されてよい。例示的核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋＮＭ＿０００２０３にある。例示的ヒトＩＤＵＡ核酸配列は次のとおりである。

本組成物および方法は、天然酵素と同一のアミノ酸配列を有する組換えヒトＩＤＳ酵素も使用する。ヒトＩＤＳのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１９３．１、ＮＰ＿００１１６００２２．１およびＮＰ＿００６１１４．１において入手可能である。ＵＳ５，９３２，２１１およびWilsonら、Proc Natl Acad Sci U S A.１９９０年１１月；８７巻（２１号）：８５３１〜８５３５頁も参照されたい。例示的ヒト配列は次のとおりである。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物において使用されるＩＤＳ酵素は、アミノ酸１〜２５（シグナル配列；上記下線部）を含まない上記配列番号５５を含む、すなわち配列番号５５のアミノ酸２６〜５５０を含む。タンパク質の臨床的および商業的量を支えるために一般に使用される発現系に適するシグナル配列は、当技術分野において周知である。

本出願において記載のＩＤＳをコードする核酸配列は、トランスジェニック動物および培養細胞を含む好適な発現系における増殖または発現のために好適なベクターに分子的にクローニング（挿入）されてよい。例示的核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋＮＭ＿０００２０２．６、ＮＭ＿００１１６６５５０．２およびＮＭ＿００６１２３．４にある。ＵＳ５，９３２，２１１およびＵＳ６５４１２５４も参照されたい。

本組成物および方法は、天然酵素と同一のアミノ酸配列を有する組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ酵素も使用する。ヒトα−ガラクトシダーゼＡのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１６０．１において入手可能である。ＷＯ２００８１２８０８９）も参照されたい。例示的ヒト配列は次のとおりである。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物において使用されるα−Ｇａｌ Ａ酵素は、アミノ酸１〜３１（シグナル配列；上記下線部）を含まない上記配列番号５６を含む、すなわち配列番号５６のアミノ酸３２〜４２９を含む。タンパク質の臨床的および商業的量を支えるために一般に使用される発現系に適するシグナル配列は、当技術分野において周知である。

本出願において記載のα−Ｇａｌ Ａをコードする核酸配列は、トランスジェニック動物および培養細胞を含む好適な発現系における増殖または発現のために好適なベクターに分子的にクローニング（挿入）されてよい。例示的核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋＮＭ＿０００１６９．２にある。ＷＯ２００８１２８０８９も参照されたい。

非限定的に原核発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、鳥類発現ベクターおよび哺乳動物発現ベクターを含め、多種多様な発現ベクターが、本発明を実施するために使用され得る。本発明のために好適な例示的ベクターは、これだけに限らないがウイルスに基づくベクター（例えば、ＡＡＶに基づくベクター、レトロウイルスに基づくベクターおよびプラスミドに基づくベクター）を含む。典型的にはヒトタンパク質をコードする核酸は、種々の制御配列または要素に作動可能に連結される。

一部の実施形態では、本明細書に記載の製剤および方法において使用される組換えＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａは、特定の実施形態では、ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａを大規模に産生するために好適である培養宿主細胞を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される。好適な宿主細胞は、これだけに限らないが、哺乳動物、植物、トリ（例えば鳥類系）、昆虫、酵母および細菌を含む種々の生物由来であってよい。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。

細胞培養およびポリペプチドの発現の助けとなる任意の哺乳動物細胞または細胞型は、本発明により宿主細胞として利用され得る。本発明により使用され得る哺乳動物細胞の非限定的例は、ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、ＨｅＬａ細胞；ＢＡＬＢ／ｃマウスミエローマ株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞、または懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Grahamら、J. Gen Virol.、３６巻：５９号（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、７７巻：４２１６頁（１９８０年）、Ｕ．Ｓ．５，３５６，８０４も参照されたい）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather、Biol. Reprod.、２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Matherら、Annals N.Y. Acad. Sci.、３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーム株（Ｈｅｐ Ｇ２）を含む。

細胞培養およびポリペプチドの発現が可能な任意の非哺乳動物由来細胞または細胞型は、ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａが、罹患した細胞への取り込みを促進し、リソソームへ標的化するのに適切なオリゴ糖で修飾される限り、本発明により宿主細胞として利用され得る。ＩＤＵＡ、ＩＤＳおよびα−Ｇａｌ Ａのグリコシル化は、十分に研究されており、タンパク質上のオリゴ糖を検出するための方法は当技術分野において周知である（例えばMillatら、Biochem J. １９９７年８月１５日；３２６巻（１部）：２４３〜２４７頁；Lee、Glycobiology、１３巻（４号）：３０５〜１３頁（２００３年）を参照されたい；ＵＳ５，９３２，２１１およびＵＳ６，５４１，２５４も参照されたい）。かかるグリコシル化は、細胞内または当技術分野において周知のオリゴ糖リモデリング技法を使用して発現した後、のいずれかで生じ得る。本発明により使用され得る非哺乳動物宿主細胞および細胞株の非限定的例は、酵母に関してＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来；昆虫に関してＳｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｓ ｎｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ；ならびに細菌に関してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；ならびに両生類由来Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｌａｅｖｉｓに由来する細胞および細胞株を含む。

種々の細胞培養培地および条件がヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質）を産生するために使用され得る。例えばＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａは、血清含有または血清を含まない培地において産生され得る。一部の実施形態では、組換えＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａは、血清を含まない培地において産生される。一部の実施形態では、組換えＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａは、動物不含有培地、すなわち動物由来構成成分を欠いている培地において産生される。一部の実施形態では、組換えＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａは、化学合成培地において産生される。本明細書において使用される、用語「化学合成栄養培地」は、実質的にすべての化学的構成成分が公知である培地を指す。一部の実施形態では、化学合成栄養培地は、血清、血清由来タンパク質（例えばアルブミンまたはフェチュイン）および他の構成成分などの動物由来構成成分を含有しない。一部の場合、化学合成培地は、１種または複数種のタンパク質（例えばタンパク質成長因子またはサイトカイン）を含む。一部の場合、化学合成栄養培地は、１種または複数種のタンパク質加水分解物を含む。他の場合、合成栄養培地は、タンパク質を含まない培地、すなわち、タンパク質、加水分解物または未知の組成の構成成分を含有しない血清を含まない培地である。

一部の実施形態では、化学合成培地は、１種または複数種の動物由来構成成分によって補充されてよい。かかる動物由来構成成分は、これだけに限らないが、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清、ヒト血清およびアルブミンなどの血清由来タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）を含む。血清の添加は、それがビタミン、アミノ酸、成長因子およびホルモンなどの構成要素を含有することから望ましい一方で、組換えタンパク質精製を妨害し得る外来性タンパク質の濃縮された供給源をも構成する。それにより一部の実施形態では、好適な培地は、異種由来成分を含まない培地、例えばいなかるウシ血清またはウシ血清由来構成成分も含有しない培地である。例えば異種由来成分を含まない培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリンおよびヒト脂質の１つまたは複数を含有し得る。一部の実施形態では、好適な培地は、フェチュイン枯渇（fetuin-depleted）血清を含有する。フェチュインは、当技術分野において公知の種々の方法を使用して血清から枯渇され得る。例えばフェチュインは、抗体親和性クロマトグラフィーによって血清から枯渇されてよい（例えばToroian DおよびPrice P A、Calcif Tissue Int（２００８年） ８２巻：１１６〜１２６頁を参照されたい）。一部の実施形態では、好適な培地は、フェチュイン不含有である。

種々の細胞培養条件が、これだけに限らないがローラーボトル培養、バイオリアクターバッチ培養およびバイオリアクター流加培養を含め、大規模に組換えリソソーム酵素タンパク質を産生するために使用され得る。一部の実施形態では、ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａは、懸濁での細胞培養によって産生される。一部の実施形態では、ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−Ｇａｌ Ａは、接着細胞によって産生される。

一部の実施形態では、本明細書に記載の製剤および方法において使用される組換えヒトタンパク質は、トランスジェニック家禽において産生される。トランスジェニック家禽は、外来性タンパク質を発現するおよび外来性タンパク質を含有する卵を産むように開発され；これらのトリは、例えばハンター症候群のためのＩＤＳ補充療法、ファブリ病のためのα−Ｇａｌ Ａ補充療法またはＭＰＳ ＩのためのＩＤＵＡ補充療法のためのヒトタンパク質の産生のための理想的な「バイオリアクター」である。例えば米国特許公開第２０１４／００６５６９０号を参照されたい。

本明細書に記載の方法において有用なトランスジェニック家禽は、当技術分野において公知の任意の方法によって作製されてよい。例えば生殖系列トランスジェニックニワトリは、複製欠陥レトロウイルスを新鮮産卵された卵のヒヨコ胚盤葉の胚下腔（subgerminal cavity）に注射することによって作製され得る（米国特許第５，１６２，２１５号および第６，３９７，７７７号；Bosselmanら、Science ２４３巻：５３３〜５３４頁（１９８９年）；Thoravalら、Transgenic Research ４巻：３６９〜３６頁（１９９５年））。代替的に、導入遺伝子は、Ｆ１世代に遺伝子を渡す安定な初代（founder）トランスジェニックトリを作製するために受精卵の胚盤にマイクロインジェクトされ得る（Loveら、Bio/Technology １２巻：６０〜６３頁（１９９４年））。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、複製欠損レトロウイルスベクターによって導入される、例えば米国特許第５１６２２１５号、第７５２１５９１号もしくは第７５２４６２６号またはＵＳＰＧ Ｐｕｂ．第２００９０３０７７８６号および第２００９０１９３５３４号に記載のとおり；リソソーム酸性リパーゼを含むタンパク質を鳥類発現系において発現するための追加的な例示的方法論は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０１５１２３号ならびに米国特許公開第２００６０１９１０２６号、第２００９０１７８１４７号、第２００９０１８０９８９号、第２０１０００８３３８９号および第２０１００３３２１９号、第２０１３０２０９４３６号、第２０１３００９５０９２号または第２０１４００４４６９７号に記載されている；前述のすべての開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。

「家禽」は、これだけに限らないが、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウズラおよび走鳥類を含む家畜類として保持され得る鳥類（avian）（トリ（bird））を指す。用語「家禽由来」または「鳥類由来」は、家禽によって産生されたまたは家禽から得られた組成物または物質を指す。例えば「家禽由来」は、ニワトリ由来、シチメンチョウ由来および／またはウズラ由来を指し得る。

種々の方法は、本明細書に記載の種々の方法により産生されたヒトタンパク質（例えばＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−ガラクトシダーゼＡ）を精製または単離するために使用され得る。一部の実施形態では、ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−ガラクトシダーゼＡは、培地に分泌され、それにより細胞および他の固体は、例えば精製工程の最初のステップとして遠心分離または濾過によって除去され得る。代替的にまたは追加的に、ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−ガラクトシダーゼＡは、宿主細胞の表面に結合している。本実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質を発現している宿主細胞は、精製のために溶解される。哺乳動物宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ条件への曝露を含む、当業者に周知の任意の数の手段によって達成され得る。

ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−ガラクトシダーゼＡは、これだけに限らないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、サイズ排除およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離または溶解度差（differential solubility）、エタノール沈殿を含む標準的方法によって、またはタンパク質の精製のための任意の他の利用可能な技法によって、単離および精製されてよい（例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれるＵＳ５，３５６，８０４；Scopes、Protein Purification Principles and Practice 第２版、Springer-Verlag、New York、１９８７年；Higgins, S. J.およびHames, B. D. （編）、Protein Expression: A Practical Approach、Oxford Univ Press、１９９９年；ならびにDeutscher, M. P.、Simon, M. I.、Abelson, J. N. （編）、Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology （Methods in Enzymology Series、１８２巻）、Academic Press、１９９７年を参照されたい）。免疫親和性クロマトグラフィーについて、特に、ＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−ガラクトシダーゼＡは、そのタンパク質に対して生じさせ、静置支持体に固定された抗体を含む親和性カラムへの結合によって単離されてよい。代替的にインフルエンザコート配列、ポリヒスチジンまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの親和性タグは、好適な親和性カラムを通すことによる容易な精製を可能にするために標準的組換え技法によってタンパク質に結合されてよい。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤は、精製工程の際のポリペプチドまたはタンパク質の分解を低減または除外するために任意のまたは全ての段階で加えられてよい。プロテアーゼ阻害剤は、発現されたＩＤＵＡ、ＩＤＳまたはα−ガラクトシダーゼＡを単離および精製するために細胞が溶解されなければならない場合に特に望ましい。

本明細書で提供する範囲は、範囲内のすべての値についての省略表現であると理解される。例えば１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０からなる群からの任意の数、数の組合せまたは部分的な範囲を含むと理解される。

本発明は、次の実施例においてさらに記載されるが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
ＩＤＵＡおよびＫ１６Ａｐｏ−Ｅ（配列番号４５）の体内分布

本実施例は、ＩＤＵＡノックアウトマウスでの２回の静脈内注入に続くＩＤＵＡの体内分布（biodistrubtion）および有効性を決定するために実施した実験を記載する。１２〜１３週齢および体重約３０ｇであったＣ５７／ＢＬ６野生型マウス（研究に４匹）６匹およびＩＤＵＡノックアウトマウス（研究に１２匹）１６匹を使用した。下の表１のとおりマウスを５分間の尾静脈注入（５００μＬ／マウス）の間にイソフルラン麻酔下で沈静させた。

ＩＤＵＡ／Ｋ１６Ａｐｏ−Ｅ共製剤を作製するために、ＩＤＵＡ（７２．６ｋＤａ）およびＫ１６−ＡｐｏＥ（４．５２ｋＤａ）を穏やかにボルテックスして混合し、室温で、１５分間置いた。５００μＬ用量を、各約５００μＬの１０回の少量ボーラスにより、各ボーラス間を３０秒間隔てて、５００ｃｃインスリンシリンジを介して投与した。動物に尾静脈注入を介して１日目に１回および４日目に１回投与した（合計２用量）。非絶食動物をこの研究のために使用した。

−２日目および７日目にすべての動物から血液を回収した。３日目に、全血１００μＬを、
下顎下静脈を介してＥＤＴＡ含有回収チューブに回収した。試料を穏やかに３回反転させ、３５００ｒｐｍ、２〜８℃で、１５分間、遠心分離し、回収３０分間以内に処理した。回収した血漿（約５０μＬ）を約５μＬ ＰｒｏＢｌｏｃｋプロテアーゼ阻害剤を含有するシラン処理したポリプロピレンチューブに入れ、ドライアイス上に保存し、次いで分析まで−７０℃に移した。

７日目に、血液を、心臓穿刺を介して回収し、約５００μＬをＫ２ ＥＤＴＡ抗凝固剤入りのチューブに入れ、穏やかに３回反転させた。試料を３５００ｒｐｍ、２〜８℃で、１５分間、遠心分離し、回収３０分間以内に処理した。血漿をそれぞれ約１０μＬ ＰｒｏＢｌｏｃｋプロテアーゼ阻害剤を含有するシラン処理したポリプロピレンチューブ２本へと１２０μＬアリコートに分割し、ドライアイス上に保存し、次いで分析まで−７０℃に移した。

動物を２回目の静脈内注射の７２時間後に安楽死させた。安楽死（ＣＯ_２窒息を介して）および終末心穿刺（terminal cardiac puncture）による血液回収後；動物をＰＢＳで灌流した。脳、肝臓、心臓、脾臓、腎臓および肺を回収し、ＰＢＳで簡単にすすぎ、次のとおり分割／保存した。
１．脳
ａ．一葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
ｂ．一葉から薄片を作製したので、解剖学的構造は両方の切片に保存される。
ｉ．一切片をホルマリン中に保存した。
ｉｉ．一切片をＯＣＴ媒体中に包埋した。
２．肝臓
ａ．左葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ（予め秤量され、阻害剤５μＬを含有している）中で急速凍結した。
ｂ．右葉を秤量し、２ｍＬチューブ中で凍結した。
３．心臓
ａ．心臓の半分を秤量し、２ｍＬチューブに急速凍結した。
ｂ．他の半分をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
４．脾臓
ａ．３分の１をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
ｂ．３分の１を秤量し、２ｍＬチューブ中で凍結した。
ｃ．３分の１をホルマリン媒体中に保存した。
５．腎臓
ａ．腎臓１個をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
ｂ．２個目の腎臓の半分を秤量し、２ｍＬチューブ中で凍結した。
ｃ．２個目の腎臓の他の半分をホルマリン媒体に保存した。
６．肺
ａ．肺１個をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
ｂ．２個目の肺の半分を秤量し、２ｍＬチューブ中で凍結した。
ｃ．２個目の肺の他の半分をホルマリン媒体中に保存した。

血漿および組織中のＩＤＵＡレベルおよび活性の評価を決定した。ヒトＩＤＵＡ酵素取り込みを増加させるおよび酵素補充療法（ＥＲＴ）有効性を改善するＫ１６−ＡｐｏＥ技術の能力を、ＭＰＳ Ｉノックアウトマウスモデルでのハーラー症候群において組織に蓄積する基質の１つであるヘパラン硫酸レベルを測定することによって評価した。ネズミおよびげっ歯類組織からヘパラン硫酸レベルを測定するための方法は、当技術分野において公知であり、例えばWardaら、Glycoconj. J.、２００６年、２３巻：５５５〜５６３頁；Lawrenceら、Glycobiol.、２００４年、１４巻（５号）：４６７〜４７９頁；ShiおよびZaia、２００９年、J. Biol. Chem.、２００９年、２８４巻（１８号）：１１８０６〜１１８１４頁ならびにLedinら、J. Biol. Chem.、２００４年、２７９巻（４１号）：４２７３２〜４２７４１頁に記載されている。
肝臓および脳

血液脳関門を通過するヒトＩＤＵＡ酵素取り込みを増加させるＫ１６−ＡｐｏＥ ＩＤＵＡの能力を脳におけるヘパラン硫酸レベルを測定することによって評価した。肝臓組織を対照として使用した。

予測されたとおりノックアウト動物は、野生型動物と比較して脳および肝臓においてヘパラン硫酸（ＨＳ）の劇的な蓄積を示す（図１を参照されたい；ノックアウト（ＫＯ）ＰＢＳ対照バー）。３日間隔てた２用量レジメンでの１０ｍｇ／ｋｇの投与量でのヒトＩＤＵＡ酵素による処置は、ノックアウト動物の脳におけるヘパラン硫酸の蓄積に有意に影響を与えなかった。しかし同じ処置は、肝臓においてヘパラン硫酸に劇的な低減を生じた。ＩＤＵＡが血液脳関門を通れないことが以前示されていることから、このことは予測されていた。

しかし驚くべきことに、Ｋ１６−ＡｐｏＥ ３５ｎｍｏｌｅの１０ｍｇ／ｋｇ ＩＤＵＡ用量への追加（ＩＤＵＡのＫ１６−ＡｐｏＥペプチドに対する最終モル比１：１０）は、ＩＤＵＡ単独での処置と比較して脳におけるヘパラン硫酸レベルに非常に有意な低減をもたらした（図１を参照されたい）。

ＩＤＵＡ処置へのＫ１６−ＡｐｏＥペプチドの追加は、単独処置に対して肝臓におけるヘパラン硫酸のレベルに影響を与えなかった。肝臓ヘパラン硫酸レベルは、Ｋ１６−ＡｐｏＥを投与した動物に、意図せずに、ＩＤＵＡを単独で投与した動物よりも多くのＩＤＵＡを与えなかったことを確実にするための対照としても役立つ。

これらの結果は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたＩＤＵＡの投与が、哺乳動物の脳への活性ＩＤＵＡの送達を生じることを示している。
腎臓および心臓

心臓および腎臓でのヒトＩＤＵＡ酵素取り込みを増加させるＫ１６−ＡｐｏＥ ＩＤＵＡの能力をＭＰＳ Ｉノックアウトマウスモデルでのハーラー症候群において組織に蓄積する基質の１つであるヘパラン硫酸レベルを測定することによって評価した。

予測されたとおりノックアウト動物は、野生型動物と比較して腎臓および心臓においてヘパラン硫酸（ＨＳ）の劇的な蓄積を示す（図２を参照されたい；ノックアウト（ＫＯ）ＰＢＳ対照バー）。３日間隔てた２用量レジメンでの１０ｍｇ／ｋｇの投与量でのヒトＩＤＵＡ酵素による処置は、腎臓および心臓の両方でヘパラン硫酸の劇的な低減を生じた。さらに、Ｋ１６−ＡｐｏＥ ３５ｎｍｏｌｅの１０ｍｇ／ｋｇ ＩＤＵＡ用量への追加（ＩＤＵＡのＫ１６−ＡｐｏＥペプチドに対する最終モル比１：１０）も、ＰＢＳ対照による処置と比較して腎臓および心臓におけるヘパラン硫酸レベルに非常に有意な低減をもたらした（図２を参照されたい）。

ＩＤＵＡ処置は、未処置ノックアウト動物対照に対して腎臓および心臓においてヘパラン硫酸レベルの有意な低減をもたらし、Ｋ１６−ＡｐｏＥペプチドの追加は、ＩＤＵＡ単独での処置に対して心臓または腎臓でのヘパラン硫酸の蓄積に影響を与えなかった。

これらの結果は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたＩＤＵＡの投与が、哺乳動物の腎臓および心臓への活性ＩＤＵＡの送達を生じることを示している。Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化された活性ＩＤＵＡの哺乳動物の腎臓および心臓への送達は、他の組織においてＫ１６−ＡｐｏＥ組成物がＩＤＵＡペプチドと相互作用するかどうか以前は不明であったことから驚くべきことである。

ＩＤＵＡがＫ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化された低投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）は、哺乳動物の脳への活性ＩＤＵＡの送達に有効であった。
（実施例２）
ＩＤＵＡおよびＫ１６Ａｐｏ−Ｅ（配列番号４５）の体内分布

本実施例は、ＩＤＵＡノックアウトマウスでの長期低用量注入後のＩＤＵＡの体内分布および有効性を決定するために実施した実験を記載する。１２〜１３週齢および体重約３０ｇであったＣ５７／ＢＬ６野生型マウス１０匹およびＩＤＵＡノックアウトマウス３０匹を使用した。下の表２のとおりマウスを５分間の尾静脈注入（２００μＬ／マウス）の間にイソフルラン麻酔下で沈静させた。

すべての動物は、最終投薬から４８時間後に取り出した。ＩＤＵＡ／Ｋ１６Ａｐｏ−Ｅ共製剤を作製するために、ＩＤＵＡおよびＫ１６−ＡｐｏＥを穏やかにボルテックスして混合し、室温で、１５分間置いた。２００μＬ用量をスローボーラス注入として５００ｃｃインスリンシリンジを介して投与した。動物に尾静脈注入を介して毎週１回投与した。動物のサブグループ（動物４匹）を研究開始のおよそ４週間後（合計５回注射）および最終注射４８の時間後に取り出した。残りの群（動物６匹）を研究開始のおよそ８週間後；最終注射の４８時間後（合計９回注射）に取り出した。非絶食動物をこの研究のために使用した。

−２日目、２７日目および５８日目にすべての動物から血液を回収した。−２日目および２７日目に、血液を、下顎下静脈を介してＥＤＴＡ含有回収チューブに回収した。試料を穏やかに３回反転させ、３５００ｒｐｍ、２〜８℃で、１５分間、遠心分離し、回収３０分間以内に処理した。回収した血漿（約５０μＬ）を約５μＬ ＰｒｏＢｌｏｃｋプロテアーゼ阻害剤を含有するシラン処理したポリプロピレンチューブに入れ、ドライアイス上に保存し、次いで分析まで−７０℃に移した。５８日目に、血液を、心臓穿刺を介して回収し、約５００μＬをＫ２ ＥＤＴＡ抗凝固剤入りのチューブに入れ、穏やかに３回反転させた。試料を３５００ｒｐｍ、２〜８℃で、１５分間、遠心分離し、回収３０分間以内に処理した。血漿をそれぞれ約１０μＬ ＰｒｏＢｌｏｃｋプロテアーゼ阻害剤を含有するシラン処理したポリプロピレンチューブ２本へと１２０μＬアリコートに分割し、ドライアイス上に保存し、次いで分析まで−７０℃に移した。

動物を最後の静脈内注射を受けた（２９日目または５８日目）４８時間後に安楽死させた。安楽死（ＣＯ_２窒息を介して）および終末心穿刺による血液回収後；動物をＰＢＳで灌流した。脳、肝臓、心臓、脾臓、腎臓および肺を回収し、ＰＢＳで簡単にすすぎ、次のとおり分割／保存した。
１．脳
ａ．一葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
ｂ．一葉から薄片を作製したので、解剖学的構造は両方の切片に保存される。
ｉ．一切片をホルマリン中に保存した。
ｉｉ．一切片をＯＣＴ媒体中に包埋した。
２．肝臓
ａ．左葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ（予め秤量され、阻害剤５μＬを含有している）中で急速凍結した。
ｂ．右葉を秤量し、２ｍＬチューブ中で凍結した。
３．心臓
ａ．心臓の半分を秤量し、２ｍＬチューブ中で急速凍結した。
ｂ．他の半分をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
４．脾臓
ａ．３分の１をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
ｂ．３分の１を秤量し、２ｍＬチューブ中で凍結した。
ｃ．３分の１をホルマリン媒体中に保存した。
５．腎臓
ａ．腎臓１個をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
ｂ．２個目の腎臓の半分を秤量し、２ｍＬチューブ中で凍結した。
ｃ．２個目の腎臓の他の半分をホルマリン媒体中に保存した。
６．肺
ａ．肺１個をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
ｂ．２個目の肺の半分を秤量し、２ｍＬチューブ中で凍結した。
ｃ．２個目の肺の他の半分をホルマリン媒体中に保存した。

組織におけるＩＤＵＡレベルおよび活性の評価は実施例１に記載のとおり決定された。
肝臓および脳

血液脳関門を通過するヒトＩＤＵＡ酵素取り込みを増加させるＫ１６−ＡｐｏＥ ＩＤＵＡの能力を脳におけるヘパラン硫酸レベルを測定することによって評価した。肝臓組織を対照として使用した。

予測されたとおりノックアウト動物は、野生型動物と比較して脳および肝臓においてヘパラン硫酸（ＨＳ）の劇的な蓄積を示す（図３を参照されたい；ノックアウト（ＫＯ）ＰＢＳ対照バー）。０．５８ｍｇ／ｋｇの投与量の、毎週１回の用量レジメン（すなわちラロニダーゼについて処方された用量レジメン、ＭＰＳ Ｉを有する患者に適応されるＩＤＵＡの規制当局によって承認された形態）でのヒトＩＤＵＡ酵素による処置は、４週間の処置（５用量）後のノックアウト動物の脳におけるヘパラン硫酸の蓄積に有意な影響を与えなかった。ＩＤＵＡが血液脳関門を通れないことが以前示されていることから、これは予測されていた。しかし同じ処置は、肝臓中のヘパラン硫酸の劇的な低減を生じた。

しかし驚くべきことに、Ｋ１６−ＡｐｏＥ ３５ｎｍｏｌｅの０．５８ｍｇ／ｋｇ ＩＤＵＡ用量への追加（ＩＤＵＡのＫ１６−ＡｐｏＥペプチドに対する最終モル比１：１６７で）は、ＩＤＵＡ単独での処置と比較して脳におけるヘパラン硫酸レベルに非常に有意な低減をもたらした（図３を参照されたい）。０．５８ｍｇ／ｋｇの投与量、毎週１回、８週間の用量レジメンでのヒトＩＤＵＡ酵素による処置は、脳でのヘパラン硫酸のレベルにおける中程度だが有意な低減をもたらし、これはＩＤＵＡが血液脳関門を通ることが公知ではないことからおそらく脳を覆う内皮細胞からのヘパラン基質のクリアランスのためである。しかし同じ処置は、Ｋ１６−ＡｐｏＥ ３５ｎｍｏｌｅが０．５８ｍｇ／ｋｇ ＩＤＵＡ用量に追加された場合、脳でのヘパラン硫酸レベルのはるかに劇的な低減を生じた（図３を参照されたい）。同じ処置は、予測されたとおりＩＤＵＡ対ＩＤＵＡ：Ｋ１６−ＡｐｏＥの間で差異のない肝臓でのヘパラン硫酸の低減を生じた。

ＩＤＵＡ処置へのＫ１６−ＡｐｏＥペプチドの追加は、ＩＤＵＡ単独処置に対して肝臓におけるヘパラン硫酸のレベルに影響を与えなかった。肝臓ヘパラン硫酸レベルは、Ｋ１６−ＡｐｏＥを投与した動物に、意図せずに、ＩＤＵＡを単独で投与した動物よりも多くのＩＤＵＡを与えなかったことを確実にするための対照としても役立つ。

これらの結果は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたＩＤＵＡの投与が、哺乳動物の脳への活性ＩＤＵＡの送達を生じることを示している。

これは、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたＩＤＵＡの低い、臨床で使用される投与量（０．５８ｍｇ／ｋｇ）が、活性ＩＤＵＡの哺乳動物の脳への送達によりヘパラン硫酸の劇的な低減をもたらすのに有効であったことを示す最初の報告である。Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化された他の酵素を用いて本発明者らによって実施された他の研究で、脳での酵素の検出可能なレベルを達成するために約５０ｍｇ／ｋｇのより高い酵素投与量が使用されたことから、これは驚くべきことである。
（実施例３）
ＩＤＳおよびＫ１６Ａｐｏ−Ｅの体内分布

本実施例は、ＩＤＳ（商業的供給源から得た）をＢＢＢキャリアペプチドＫ１６Ａｐｏ−Ｅと混合し、野生型マウスの尾静脈にスローボーラスで静脈内注射によって投与した実験の結果を記載する。オスマウス、１５〜１７週齢を次の表３のとおり処置した。

表３の処置混合物を室温で注射の約１時間前に調製し、注射前に数秒間、１５分間隔での遅いボルテックス（気泡を生じない）に供した（４ｘボルテックスした）。それぞれの構成成分を必要に応じてＡＭ体重測定によってアリコートした。各マウスについての注射の最終容積は滅菌ＰＢＳの５７５μＬに対して正規化した。非絶食動物をこの研究のために使用した。組織が投薬の約２４時間後に回収されることを確実にするために剖検の時期に基づいて１５分間ごとにマウス２匹のペースでマウスに投薬した。

マウスを５分間の尾静脈投薬（５７５μＬ／マウス）の間にイソフルラン麻酔下で沈静させた。５７５μＬ用量を約３から５分間にわたるスロー注射によってインスリンシリンジを介して投与した。動物３匹の内２匹は正常に回復した；１匹は嗜眠の徴候を示し、１時間モニターした。

動物を静脈内注射の２４時間後に安楽死させた。安楽死（ＣＯ_２窒息を介して）および終末心穿刺による血液回収後；動物をＰＢＳで灌流した。脳および肝臓を回収し、ＰＢＳで簡単にすすぎ、次のとおり分割／保存した。
１．脳
ａ．一葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ（予め秤量され、阻害剤５μＬを含有している）中で急速凍結した。
ｂ．一葉から薄片を作製したので、解剖学的構造は両方の切片に保存される。
ｉ．一切片をホルマリン中に保存した。
ｉｉ．一切片をＯＣＴ媒体中に包埋した。
２．肝臓
ａ．左葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ（予め秤量され、阻害剤５μＬを含有している）中で急速凍結した。
ｂ．右葉を、ホルマリン中に保存する半分とＯＣＴ媒体中に包埋する（平らにした（laid flat））半分に分割した。

血液を、心臓穿刺を介して回収し、約５００μＬをＫ２ ＥＤＴＡ抗凝固剤入りのチューブ（約１０μＬ ＰｒｏＢｌｏｃｋプロテアーゼ阻害剤を含有している）に入れ、穏やかに３回反転させた。試料を３５００ＲＰＭ、２〜８℃で、１５分間、遠心分離した（回収３０分間以内に処理）。血漿を、２つ組のシラン処理したポリプロピレンチューブに１２０μＬでアリコートしてドライアイス上に保存し、次いで分析まで−７０℃に移した。

数値の生前データ（in-life data）の統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して評価した。

ＷＴ動物でのＩＤＳ活性を、実質的にVoznyiら、J Inherit Metab Dis. ２００１年１１月；２４巻（６号）：６７５〜８０頁に記載のとおり決定し、マウスが５０ｍｇ／ｋｇ ＩＤＳを注射された場合に脳における増加を示した（図１Ａ）。１：２．６モル比のＩＤＳ：Ｋ１６−ＡｐｏＥの混合物は、ＩＤＳ酵素の脳透過の非常に有意な増強を示した（図４Ａ）。Ｋ１６−ＡｐｏＥは、注射前に混合物中に含まれた場合、脳におけるＩＤＳ酵素活性におよそ２倍の増加をもたらした（図４Ａ）。肝臓ＩＤＳレベルおよび活性は、Ｋ１６−ＡｐｏＥを追加しても有意な差は生じなかった（図４Ｂ）。これは、そのペプチドでの脳における活性およびレベルの増加が注射に伴う技術的問題によるものではなかったことを示している。どちらかと言えば肝臓におけるＩＤＳ活性は、ＩＤＳ：Ｋ１６−ＡｐｏＥ混合物で処置されたマウスにおいていくらか低い傾向にあったがこれは、注射された酵素の体内分布におけるシフトによる可能性がある。

これらの結果は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたＩＤＳの投与が哺乳動物の脳への活性ＩＤＳの送達を生じることを示している。
（実施例４）
ＭＰＳ ＩＩモデルでのＩＤＳおよびＫ１６Ａｐｏ−Ｅ（配列番号４５）の体内分布

本実施例は、ＭＰＳ ＩＩモデルにおけるＩＤＳノックアウトマウスでの４週間にわたり毎週５回の静脈内注入後のＩＤＳの体内分布および有効性を決定するために実施した実験を記載する。下の表４のとおりマウスを５分間の尾静脈注入（２００μＬ／マウス）の間にイソフルラン麻酔下で沈静させた。

動物を最後の静脈内注射を受けた（２９日目）２４時間後に安楽死させた。安楽死（ＣＯ_２窒息を介して）および終末心穿刺による血液回収後；動物をＰＢＳで灌流した。脳および肝臓を回収し、ＰＢＳで簡単にすすぎ、次のとおり分割／保存した。
１．脳
ａ．一葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ中で急速凍結した。
ｂ．一葉から薄片を作製したので、解剖学的構造は両方の切片に保存される。
ｉ．一切片をホルマリン中に保存した。
ｉｉ．一切片をＯＣＴ媒体中に包埋した。
２．肝臓
ａ．左葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ（予め秤量され、阻害剤５μＬを含有している）中で急速凍結した。
ｂ．右葉を秤量し、２ｍＬチューブ中で凍結した。

組織におけるＩＤＳレベルおよび活性の評価を実施例３に記載のとおり決定した。
肝臓および脳

血液脳関門を通過するヒトＩＤＳ酵素取り込みを増加させるＫ１６−ＡｐｏＥ ＩＤＳの能力を脳におけるヘパラン硫酸レベルを測定することによって評価した。肝臓組織を対照として使用した。

予測されたとおりノックアウト動物は、野生型動物と比較して脳および肝臓においてヘパラン硫酸（ＨＳ）の劇的な蓄積を示す（図５を参照されたい；ノックアウト（ＫＯ）ＰＢＳ対照バー）。毎週１回の用量レジメンによる１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの投与量のヒトＩＤＳ酵素による処置は、４週間の処置（５用量）後にノックアウト動物の脳におけるヘパラン硫酸の蓄積に有意に影響を与えなかった。しかし同じ処置は、肝臓においてヘパラン硫酸に劇的な低減を生じた。

しかし驚くべきことに、Ｋ１６−ＡｐｏＥの１０ｍｇ／ｋｇ ＩＤＳ用量への追加は、ＩＤＳ単独での処置と比較して脳におけるヘパラン硫酸レベルに有意な低減をもたらした（図５を参照されたい）。同じ処置は、予測されるとおりＩＤＳ対ＩＤＳ：Ｋ１６−ＡｐｏＥの間で差異のない肝臓におけるヘパラン硫酸の低減を生じた。Ｋ１６−ＡｐｏＥペプチドのＩＤＳ処置への追加は、ＩＤＳ単独処置に対して肝臓におけるヘパラン硫酸のレベルに影響を与えなかった。肝臓ヘパラン硫酸レベルは、Ｋ１６−ＡｐｏＥを投与した動物に、意図せずに、ＩＤＳを単独で投与した動物よりも多くのＩＤＳを与えなかったことを確実にするための対照としても役立つ。

これらの結果は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたＩＤＳの投与が、哺乳動物の脳への活性ＩＤＳの送達を生じることを示している。

これは、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたＩＤＳの比較的低い、臨床で使用される投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）が、活性ＩＤＳの哺乳動物の脳への送達によりヘパラン硫酸の劇的な低減をもたらすのに有効であったことを示す最初の報告である。
（実施例５）
α−Ｇａｌ ＡおよびＫ１６Ａｐｏ−Ｅの体内分布−研究１

本実施例は、α−Ｇａｌ Ａ（商業的供給源から得た）をＢＢＢキャリアペプチドＫ１６Ａｐｏ−Ｅと混合し、α−Ｇａｌ Ａ遺伝子を欠くマウス（ＧＬＡ ＫＯマウス；Ohshimaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９４巻：２５４０〜２５４４頁（１９９７年）に記載）および野生型マウスに静脈内投与した実験の結果を記載する。オスマウス、１５〜１７週齢を次の表５Ａのとおり処置した：

表５Ａの処置混合物を室温で注射の約１時間前に調製し、注射前に数秒間、１５分間隔での遅いボルテックス（気泡を生じない）に供した（４ｘボルテックスした）。それぞれの構成成分を必要に応じてＡＭ体重測定によってアリコートした。各マウスについての注射の最終容積は滅菌ＰＢＳの２００μＬに対して正規化した。非絶食動物をこの研究のために使用した。組織が投薬の約２４時間後に回収されることを確実にするために剖検の時期に基づいて１５分間ごとにマウス２匹のペースでマウスに投薬した。

マウスを５分間の尾静脈投薬（２００μＬ／マウス）の間にイソフルラン麻酔下で沈静させた。２００μＬ用量を、各約４０μＬの５回の少量ボーラスで、各ボーラス間を４５秒間隔てて、５００ｃｃインスリンシリンジを介して投与した。動物は嗜眠の徴候を示さずに正常に回復した。

血漿および組織中のα−Ｇａｌ Ａレベルの評価を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。活性の評価は、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、青色プロ蛍光原（pro-fluorogenic）基質を用い標準的プロトコールを使用して実施した（例えばMapesおよびSweeley、Biochem Biophys Res Commun. ５３巻（４号）：１３１７〜２４頁（１９７３年）；Hultbergら、Acta Paediatr Scand. ６４巻（１号）：１２３〜３１頁（１９７５年）に記載のとおり）。

動物を静脈内注射の２４時間後に安楽死させた。安楽死（ＣＯ_２窒息を介して）および終末心穿刺による血液回収後；動物をＰＢＳで灌流した。脳および肝臓を回収し、ＰＢＳで簡単にすすぎ、次のとおり分割／保存した。
１．脳
ａ．一葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ（予め秤量され、阻害剤５μＬを含有している）中で急速凍結した。
ｂ．一葉から薄片を作製したので、解剖学的構造は両方の切片に保存される。
ｉ．一切片をホルマリン中に保存した。
ｉｉ．一切片をＯＣＴ媒体中に包埋した。
２．肝臓
ａ．左葉をシラン処理したポリプロピレンチューブ（予め秤量され、阻害剤５μＬを含有している）中で急速凍結した。
ｂ．右葉を、ホルマリン中に保存する半分とＯＣＴ媒体中に包埋する（平らにした）半分に分割した。

血液を、心臓穿刺を介して回収し、約５００μＬをＫ２ ＥＤＴＡ抗凝固剤入りのチューブ（約１０μＬ ＰｒｏＢｌｏｃｋプロテアーゼ阻害剤を含有している）に入れ、穏やかに３回反転させた。試料を３５００ＲＰＭ、２〜８℃で、１５分間、遠心分離した（回収３０分間以内に処理）。血漿を、２つ組のシラン処理したポリプロピレンチューブに１２０μＬでアリコートしてドライアイス上に保存し、次いで分析まで−７０℃に移した。

数値の生前データの統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して評価した。

脳でのα−Ｇａｌ Ａ活性の評価は、予測されるとおり野生型動物と比較してＧＬＡノックアウト動物において活性の劇的な低減を示した。１０ｍｇ／ｋｇのα−Ｇａｌ Ａの注射は、ＫＯ動物の脳においてα−Ｇａｌ Ａ活性のおよそ３倍の増加をもたらし、有意であった。１：２モル比のＫ１６−ＡｐｏＥペプチドの１０ｍｇ／ｋｇ用量への追加はこの研究ではα−Ｇａｌ Ａの脳透過に有意に影響を与えなかったが、技術的問題がこの結果の主な原因である可能性がある。しかし図６および表５Ｂに示すとおり、１：１０モル比のα−Ｇａｌ Ａ：Ｋ１６−ＡｐｏＥ混合物（α−Ｇａｌ Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）：Ｋ１６−ＡｐｏＥ［１：１０］）は、α−Ｇａｌ Ａ活性によって判断されるとおり脳取り込みの増加をもたらした。しかしこの変化は、個々のマウスの応答における変動から統計的有意に達しなかった。図６の縞のバーは、注射についてのおよびα−Ｇａｌ Ａ活性についての対照として含まれた、肝臓におけるα−Ｇａｌ Ａ活性を示す。
（実施例６）
α−Ｇａｌ ＡおよびＫ１６Ａｐｏ−Ｅの体内分布−高用量研究

表６に示すとおりさらなる実験を高用量のα−Ｇａｌ Ａを用いて上に記載のとおり実行した。処置は、野生型マウスの尾静脈にスローボーラスで静脈内注射によって投与した。

実施例５のとおり動物を注射の２４時間後に安楽死させた。血液を心臓穿刺によって血清のために回収し、動物をＰＢＳで灌流した。肝臓および脳を回収し、直ちに凍結した。群３において動物２匹は嗜眠性であり、注射後の回復が困難であったため１時間モニターし；それらはさらに注射後６時間まで嗜眠性であった。

ＷＴ動物でのＥＬＩＳＡによるα−Ｇａｌ Ａレベルの評価は、マウスが５０ｍｇ／ｋｇ α−Ｇａｌ Ａを注射された場合に、脳でのα−Ｇａｌ Ａレベルの増加を示した（図７Ａ）。１：３．６モル比のα−Ｇａｌ Ａ：Ｋ１６−ＡｐｏＥの混合物は、α−Ｇａｌ Ａ酵素の脳透過の非常に有意な増強を示した（図７Ｂ）。α−Ｇａｌ Ａの脳透過を増強するＫ１６−ＡｐｏＥペプチドの能力は、上に記載のとおりアッセイされた酵素活性のレベルでも見られた。Ｋ１６−ＡｐｏＥは、注射前に混合物中に含まれた場合、脳におけるα−Ｇａｌ Ａ酵素活性に３０倍を超える増加をもたらした（図７Ｂ）。肝臓ＧＬＡレベルおよび活性は、Ｋ１６−ＡｐｏＥを追加しても有意な差は生じなかった（図７Ｃ〜Ｄ）。これは、そのペプチドでの脳における活性およびレベルの増加が注射に伴う技術的問題によるものではなかったことを示している。どちらかと言えば肝臓におけるα−Ｇａｌ Ａレベルおよび活性は、α−Ｇａｌ Ａ：Ｋ１６−ＡｐｏＥ混合物で処置されたマウスにおいていくらか低い傾向にあったがこれは、注射された酵素の体内分布におけるシフトによる可能性がある。

これらの結果は、Ｋ１６−ＡｐｏＥと共に製剤化されたα−Ｇａｌ Ａの投与が活性α−Ｇａｌ Ａの哺乳動物の脳への送達を生じることを示している。
他の実施形態

本発明をその詳細な記載と併せて記載したが、前述の記載は例示であって、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲の限定を意図しないことは理解されるべきである。他の態様、有利点および変更も、次の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (26)

1. 被験体の中枢神経系にヒトタンパク質を送達する方法であって、
   該被験体に該ヒトタンパク質および血液脳関門キャリアペプチド（ＢＢＢキャリアペプチド）を含む医薬組成物を投与することを含み、該ヒトタンパク質が酵素的に活性なヒトアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）タンパク質、ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質またはヒトαガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）タンパク質であり、
   それにより該ヒトタンパク質を該被験体の中枢神経系に送達する方法。
2. ＭＰＳ Ｉ、ハンター症候群またはファブリ病を有する被験体を処置する方法であって、
   該被験体に該ヒトタンパク質および血液脳関門キャリアペプチド（ＢＢＢキャリアペプチド）を含む医薬組成物を投与することを含み、該ヒトタンパク質が酵素的に活性なヒトアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）タンパク質、ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質またはヒトαガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）タンパク質であり、
   それによりＭＰＳ Ｉ、ハンター症候群またはファブリ病を有する該被験体を処置する方法。
3. 前記ＢＢＢキャリアペプチドが、トランスフェリンのトランスフェリン受容体結合部位、またはアポリポタンパク質の受容体結合ドメインを含む第１の部分であって、４〜５０個の親水性アミノ酸の親水性セグメントを含む第２の部分に連結された第１の部分を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記第１の部分が、ＡｐｏＡ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の受容体結合ドメインから選択されるアポリポタンパク質の受容体結合ドメインを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記親水性アミノ酸が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、スレオニンおよびチロシンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
6. 前記ＢＢＢキャリアペプチドが、配列Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｄ−Ａ（配列番号４５）を含むまたは該配列からなる、請求項１または請求項２に記載の方法。
7. 前記ＩＤＵＡタンパク質が配列番号５３のアミノ酸２０〜６５３を含む；
   前記ＩＤＳタンパク質が配列番号５５のアミノ酸２６〜５５０を含む；または
   前記α−ガラクトシダーゼＡタンパク質が配列番号５６のアミノ酸３２〜４２９を含む、
   請求項１または請求項２に記載の方法。
8. 前記ヒトタンパク質および前記ＢＢＢキャリアペプチドが、少なくとも約１：２またはそれより高いモル比で存在する、請求項１または請求項２に記載の方法。
9. 前記ヒトタンパク質および前記ＢＢＢキャリアペプチドが、約１：１０から約１：１７５のモル比で存在する、請求項１または請求項２に記載の方法。
10. 前記ヒトタンパク質および前記ＢＢＢキャリアペプチドが、約１：１５５から約１：１７５のモル比で存在する、請求項１または請求項２に記載の方法。
11. 前記ヒトタンパク質および前記ＢＢＢキャリアペプチドが、約１：１６７のモル比で存在する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＩＤＵＡタンパク質が体重１ｋｇあたりＩＤＵＡ約０．２〜５０．０ｍｇの用量での投与のために製剤化される；
    前記ＩＤＳタンパク質が体重１ｋｇあたりＩＤＳ約０．２〜５０．０ｍｇの用量での投与のために製剤化される；または
    前記α−ガラクトシダーゼＡタンパク質が体重１ｋｇあたりα−ガラクトシダーゼＡ約０．２〜５０．０ｍｇの用量での投与のために製剤化される、
    請求項１または請求項２に記載の方法。
13. 前記ヒトタンパク質が、被験体の内臓組織または尿におけるヘパラン硫酸レベルを低減するおよび／またはさらなる蓄積を抑止するために有効な量での投与のために製剤化される、請求項１または請求項２に記載の方法。
14. 前記ヒトタンパク質がヒトαガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）タンパク質であり、前記ヒトα−ガラクトシダーゼＡタンパク質が、被験体の血管内皮リソソーム中のグロボトリアオシルセラミドおよび関連スフィンゴ糖脂質を低減するおよび／またはさらなる蓄積を抑止するために有効な量での投与のために製剤化される、請求項１または請求項２に記載の方法。
15. 前記医薬組成物が、前記ヒトタンパク質約１．０ｍｇから約６５ｍｇを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
16. 前記医薬組成物が、前記ヒトタンパク質約５ｍｇから約６０ｍｇを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記医薬組成物が、前記ヒトタンパク質約２０ｍｇから約４５ｍｇを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記医薬組成物が、前記ヒトタンパク質約３０ｍｇを含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記医薬組成物が、前記ＢＢＢキャリアペプチド約１０ｍｇから約６００ｍｇを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
20. 前記医薬組成物が、前記ＢＢＢキャリアペプチド約７５ｍｇから約５００ｍｇを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記医薬組成物が、前記ＢＢＢキャリアペプチド約３７５ｍｇを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ＢＢＢキャリアペプチドが、約５ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１または請求項２に記載の方法。
23. 前記ＢＢＢキャリアペプチドが、約６．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記組成物が、静脈内、筋肉内または皮下に投与される、請求項１または請求項２に記載の方法。
25. 前記被験体が、ハーラー症候群、シャイエ症候群またはハーラー−シャイエ症候群を有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
26. ヒトタンパク質および血液脳関門キャリアペプチド（ＢＢＢキャリアペプチド）を含む組成物を作製する方法であって、該ヒトタンパク質が酵素的に活性なヒトＩＤＵＡタンパク質、ＩＤＳタンパク質またはαガラクトシダーゼＡタンパク質であり、該方法が、
    酵素的に活性なヒトタンパク質をコードする宿主細胞を該ヒトタンパク質の産生を可能にする条件下で培養すること、
    該ヒトタンパク質を回収すること、および
    該ヒトタンパク質を血液脳関門キャリアペプチドと組み合わせること
    を含む、方法。