JP2017522867A5

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Publication number: JP2017522867A5
Application number: JP2016575111A
Authority: JP
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2018-08-02
Anticipated expiration: 2035-06-26

Description

本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び以下の添付の図面（本明細書の「Ｆｉｇｕｒｅ（図面）」及び「ＦＩＧ．」）を参照することによって、本発明の特徴及び利点がより良く理解されることになる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞から核酸を分析する方法であって、
（ａ）個々の細胞に由来する核酸を離散区分に提供することと、
（ｂ）前記離散区分内の前記核酸に由来する１つまたは複数の第１の核酸配列であって、共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを結合させている前記１つまたは複数の第１の核酸配列を生成することと、
（ｃ）前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第１の核酸配列に由来する１つもしくは複数の第２の核酸配列であって、共通のバーコード配列を含む前記１つもしくは複数の第２の核酸配列の特徴付けを行うことと、
（ｄ）（ｃ）で行われた前記特徴付けにおける前記共通の核酸バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、前記個々の細胞に由来する前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列を識別することと、を含む、前記方法。
（項目２）
前記離散区分が離散液滴である、項目１に記載の方法。
（項目３）
（ａ）において、前記オリゴヌクレオチドが、前記個々の細胞に由来する前記核酸と前記離散区分に共に区分される、項目１に記載の方法。
（項目４）
（ａ）において、少なくとも１０，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、項目３に記載の方法。
（項目５）
（ａ）において、少なくとも１００，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、項目４に記載の方法。
（項目６）
（ａ）において、少なくとも５００，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、項目５に記載の方法。
（項目７）
（ａ）において、前記オリゴヌクレオチドがビーズに付着されて提供され、ビーズ上の各オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含み、前記ビーズが前記離散区分に前記個々の細胞と共に区分される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記オリゴヌクレオチドが前記ビーズに放出可能に付着している、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ビーズが分解性ビーズを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
（ｂ）の前または最中に、前記ビーズの分解を介して前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを放出することをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
（ｃ）の前に、前記離散区分から前記１つまたは複数の第１の核酸配列を放出することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
（ｃ）が、前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列を配列決定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列から、前記個々の細胞のゲノムの少なくとも一部の連続核酸配列をアセンブルすることをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記個々の細胞が、前記個々の細胞の前記ゲノムの少なくとも一部の前記核酸配列に基づいて特徴付けされる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記核酸が、前記離散区分内の前記個々の細胞から放出される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
（b）が、前記1つまたは複数の第1の核酸配列をもたらす条件下で前記核酸を逆転写させることをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記逆転写が前記離散区分で生じる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に提供され、かつポリＴ配列をさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記逆転写が、前記ポリＴ配列を前記核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、前記ポリＴ配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記オリゴヌクレオチドが、前記ポリＴ配列のハイブリダイゼーションを促進するアンカー配列をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記オリゴヌクレオチドが、ランダムプライミング配列をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記ランダムプライミング配列がランダム六量体である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記逆転写が、前記ランダムプライミング配列を前記核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、前記ランダムプライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記1つまたは複数の第１の核酸配列のうちの所与の１つが、前記核酸の所与の１つの少なくとも一部に対する配列相補性を有する、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記離散区分が、複数の細胞の中で、最大でも前記個々の細胞のみを含む、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記オリゴヌクレオチドが、固有の分子配列セグメントをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記固有の分子配列セグメントの存在に少なくとも部分的に基づいて、前記核酸の所与の核酸に由来する前記１つもしくは複数の第１の核酸配列、または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列の個々の核酸配列を識別することをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記固有の分子配列セグメントの存在に基づいて前記所与の核酸の量を決定することをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の配列を生成するために、１つまたは複数の追加配列を前記１つまたは複数の第１の配列に追加することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３２）
スイッチオリゴヌクレオチドを用いて、第１の追加核酸配列を前記１つまたは複数の第１の核酸配列に追加することをさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記スイッチオリゴヌクレオチドが、前記１つまたは複数の第１の核酸配列の少なくとも一部にハイブリダイズさせ、前記第１の追加核酸配列を前記１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させるためにテンプレート指向様式で伸長する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の追加核酸配列に結合する前記より多くの第１の核酸配列のうちの１つを増幅させることをさらに含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記増幅が前記離散区分で生じる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記増幅が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列を前記離散区分から放出した後に生じる、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記増幅後に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記第１の追加配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列に１つまたは複数の第２の追加核酸配列を追加することをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記１つまたは複数の第２の追加配列の追加が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数の第１の核酸配列に前記１つまたは複数の第２の追加核酸配列を結合させることと、を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記除去が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列の剪断によって完了する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記結合が連結によって完了する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
（ｃ）の前に、１つまたは複数のＲＮＡ断片を生成するために、前記１つまたは複数の第１の核酸配列を転写させることをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目４２）
前記転写が、離散区分からの前記1つまたは複数の第１の核酸配列の放出後に生じる、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記オリゴヌクレオチドが、Ｔ７プロモーター配列をさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列に追加配列を結合させることと、をさらに含む、項目
４３に記載の方法。
（項目４５）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記追加配列に結合する前記１つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることをさらに含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
（ｃ）の前に、１つまたは複数のＤＮＡ配列を生成するために、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４８）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記１つまたは複数のＤＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数のＤＮＡ配列に１つまたは複数の追加配列を結合させることと、をさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることをさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記核酸が、前記個々の細胞からのＲＮＡの逆転写から生成された相補的（ｃＤＮＡ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目５１）
前記オリゴヌクレオチドがプライミング配列をさらに含む、離散区分に提供される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記プライミング配列が、ランダムＮ量体を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
（ｂ）が、前記ライミング配列を前記ｃＤＮＡにハイブリダイズさせることと、前記プライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記離散区分が、前記オリゴヌクレオチドの相補配列を含むスイッチオリゴヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目５５）
（ｂ）が、前記スイッチオリゴヌクレオチドを前記核酸由来の核酸断片の少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、前記スイッチオリゴヌクレオチドをテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドを前記１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目５７）
前記１つまたは複数の第１の核酸配列が前記核酸由来の核酸断片である、項目１に記載の方法。
（項目５８）
前記（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に結合させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目５９）
前記結合させることが連結させることを含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
複数の区分が離散区分を含む、項目１に記載の方法。
（項目６１）
前記複数の区分が、１つの区分あたり平均１つ未満の細胞を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記複数の区分の２５％未満の区分が細胞を含まない、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記複数の区分が、それぞれ少なくとも１つの区分された細胞を有する離散区分を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
前記離散区分の２５％未満が複数の細胞を含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
少なくとも離散区分のサブセットがビーズを含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記離散区分の少なくとも７５％が、少なくとも１つの細胞及び少なくとも１つのビーズを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記離散区分が、区分された核酸バーコード配列をさらに含む、項目６３に記載の方法。
（項目６８）
前記離散区分が、少なくとも１，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記離散区分が、少なくとも１０，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記離散区分が、少なくとも１００，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記複数の区分が、少なくとも１，０００の区分を含む、項目６０に記載の方法。
（項目７２）
前記複数の区分が少なくとも１０，０００の区分を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記複数の区分が、少なくとも１００，０００の区分を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
複数の異なる細胞タイプの集団における細胞を特徴付ける方法であって、
（ａ）前記集団内の個々の細胞からの核酸を離散区分へ提供することと、
（ｂ）共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記離散区分であって、複数の異なる区分が異なる共通の核酸バーコード配列を含む、前記離散区分内の個々の細胞からの前記核酸の１つまたは複数の断片に結合させることと、
（ｃ）前記複数の離散区分からの前記核酸の前記１つまたは複数の断片を特徴付けて、共通バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、前記１つまたは複数の断片を個々の細胞に帰属させることと、
（ｄ）前記複数の離散区分における前記１つまたは複数の断片の前記特徴付けに基づいて、前記集団内の複数の個々の細胞を特徴付けることと、を含む、前記方法。
（項目７５）
前記核酸を断片化することをさらに含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記離散区分が液滴である、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
前記核酸の前記１つまたは複数の断片を特徴付けることが、前記個々の細胞からのリボソームデオキシリボ核酸を配列決定することを含み、前記個々の細胞を特徴付けることが、細胞の属、種、株または変異体を識別することを含む、項目７４に記載の方法。
（項目７８）
前記個々の細胞がマイクロバイオームサンプルに由来する、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記個々の細胞がヒト組織サンプルに由来する、項目７４に記載の方法。
（項目８０）
前記個々の細胞が哺乳類の循環細胞に由来する、項目７４に記載の方法。
（項目８１）
前記個々の細胞が法医学的サンプルに由来する、項目７４に記載の方法。
（項目８２）
前記核酸が、前記離散区分の前記個々の細胞から放出される、項目７４に記載の方法。
（項目８３）
個々の細胞または細胞集団を特徴付ける方法であって、
（ａ）複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプであって、各異なる細胞表面結合基タイプは異なる細胞表面特徴に結合することができ、かつ存在する場合は、１つまたは複数の細胞表面特徴結合基とその細胞表面特徴それぞれとの間の結合を可能にする条件下で、それに結合したレポーターオリゴヌクレオチドを含む、前記複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプを有する細胞をインキュベートすることと、
（ｂ）前記細胞を、バーコード配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む区分に区分することと、
（ｃ）前記バーコード配列を前記区分に存在するオリゴヌクレオチドレポーター基に結合させることと、
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドレポーター基及び結合したバーコードを配列決定することと、
（ｅ）配列決定されたレポーターオリゴヌクレオチドに基づいて前記細胞上に存在する細胞表面特徴を特徴付けることと、を含む方法。
（項目８４）
複数の区分を含む組成物であって、前記複数の区分のそれぞれが、（ｉ）個々の細胞、及び（ｉｉ）共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む組成物。
（項目８５）
前記複数の区分がエマルジョン中の液滴を含む、項目８４に記載の組成物。
（項目８６）
前記複数の区分のそれぞれの中の前記オリゴヌクレオチドの集団が、前記複数の区分のそれぞれの中に配置されたビーズに結合される、項目８４に記載の組成物。
（項目８７）
前記個々の細胞には、それらのそれぞれの細胞表面特徴に関連する複数の異なる細胞表面特徴結合基が結合しており、各異なるタイプの細胞表面特徴結合基は、異なるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドレポーター基を含む、項目８４に記載の組成物。
（項目８８）
前記複数の異なる細胞表面特徴結合基が、複数の異なる細胞表面特徴に対して結合親和性を有する複数の異なる抗体または抗体断片を含む、項目８７に記載の組成物。 The novel features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. By reference to the following detailed description illustrating exemplary embodiments in which the principles of the present invention are utilized, and the accompanying drawings (“Figure” and “FIG.” Herein). The features and advantages of the present invention will be better understood.
For example, the present invention provides the following items.
(Item 1)
A method for analyzing nucleic acids from cells, comprising:
(A) providing nucleic acids derived from individual cells in discrete sections;
(B) one or more first nucleic acid sequences derived from the nucleic acid in the discrete section, the one or more first nucleic acids bound to an oligonucleotide comprising a common nucleic acid barcode sequence Generating a nucleic acid sequence of
(C) the one or more first nucleic acid sequences or the one or more second nucleic acid sequences derived from the one or more first nucleic acid sequences, comprising a common barcode sequence Characterizing the one or more second nucleic acid sequences;
(D) the one or more first nucleic acid sequences derived from the individual cells, based at least in part on the presence of the common nucleic acid barcode sequence in the characterization performed in (c); Identifying one or more second nucleic acid sequences.
(Item 2)
The method of item 1, wherein the discrete segment is a discrete droplet.
(Item 3)
The method according to item 1, wherein in (a), the oligonucleotide is divided into the nucleic acid derived from the individual cells and the discrete section.
(Item 4)
4. The method of item 3, wherein in (a), at least 10,000 of the oligonucleotides are partitioned with the nucleic acids from the individual cells into the discrete sections.
(Item 5)
5. The method of item 4, wherein in (a) at least 100,000 of the oligonucleotides are partitioned with the nucleic acids from the individual cells into the discrete partitions.
(Item 6)
6. The method of item 5, wherein in (a) at least 500,000 of the oligonucleotides are partitioned with the nucleic acids derived from the individual cells into the discrete partitions.
(Item 7)
In (a), the oligonucleotide is provided attached to a bead, each oligonucleotide on the bead comprises the same barcode sequence, and the bead is partitioned with the individual cells into the discrete sections. The method described.
(Item 8)
8. The method of item 7, wherein the oligonucleotide is releasably attached to the bead.
(Item 9)
9. A method according to item 8, wherein the beads comprise degradable beads.
(Item 10)
10. The method of item 9, further comprising releasing the oligonucleotide from the bead via degradation of the bead prior to or during (b).
(Item 11)
2. The method of item 1, further comprising releasing the one or more first nucleic acid sequences from the discrete section prior to (c).
(Item 12)
2. The method of item 1, wherein (c) comprises sequencing the one or more first nucleic acid sequences or the one or more second nucleic acid sequences.
(Item 13)
Item 12. The method further comprises assembling a continuous nucleic acid sequence of at least a portion of the genome of the individual cell from the one or more first nucleic acid sequences or the one or more second nucleic acid sequences. The method described.
(Item 14)
14. The method of item 13, wherein the individual cell is characterized based on the nucleic acid sequence of at least a portion of the genome of the individual cell.
(Item 15)
The method of claim 1, wherein the nucleic acid is released from the individual cells in the discrete section.
(Item 16)
Item 2. The method according to Item 1, wherein the nucleic acid comprises ribonucleic acid (RNA).
(Item 17)
The method according to item 16, wherein the RNA is messenger RNA (mRNA).
(Item 18)
17. The method of item 16, wherein (b) further comprises reverse transcribing the nucleic acid under conditions that result in the one or more first nucleic acid sequences.
(Item 19)
19. A method according to item 18, wherein the reverse transcription occurs in the discrete sections.
(Item 20)
19. The method of item 18, wherein the oligonucleotide is provided in the discrete section and further comprises a poly T sequence.
(Item 21)
21. The method of item 20, wherein the reverse transcription comprises hybridizing the poly T sequence to at least a portion of each of the nucleic acids and extending the poly T sequence in a template-oriented manner.
(Item 22)
24. The method of item 21, wherein the oligonucleotide further comprises an anchor sequence that facilitates hybridization of the poly-T sequence.
(Item 23)
21. The method of item 20, wherein the oligonucleotide further comprises a random priming sequence.
(Item 24)
24. The method of item 23, wherein the random priming sequence is a random hexamer.
(Item 25)
25. The method of item 24, wherein the reverse transcription comprises hybridizing the random priming sequence to at least a portion of each of the nucleic acids and extending the random priming sequence in a template-oriented manner.
(Item 26)
2. The method of item 1, wherein a given one of the one or more first nucleic acid sequences has sequence complementarity to at least a portion of the given one of the nucleic acids.
(Item 27)
Item 2. The method according to Item 1, wherein the discrete segment includes at most only the individual cell among a plurality of cells.
(Item 28)
The method of claim 1, wherein the oligonucleotide further comprises a unique molecular sequence segment.
(Item 29)
The one or more first nucleic acid sequences derived from a given nucleic acid of the nucleic acid, or the one or more second nucleic acid sequences based at least in part on the presence of the unique molecular sequence segment 29. The method of item 28, further comprising identifying individual nucleic acid sequences.
(Item 30)
30. The method of item 29, further comprising determining the amount of the given nucleic acid based on the presence of the unique molecular sequence segment.
(Item 31)
Prior to (c), further comprising adding one or more additional sequences to the one or more first sequences to generate the one or more second sequences. The method according to 1.
(Item 32)
32. The method of item 31, further comprising adding a first additional nucleic acid sequence to the one or more first nucleic acid sequences using a switch oligonucleotide.
(Item 33)
The switch oligonucleotide hybridizes to at least a portion of the one or more first nucleic acid sequences and binds the first additional nucleic acid sequence to the one or more first nucleic acid sequences; 33. A method according to item 32, wherein the decompression is performed in a template-oriented manner.
(Item 34)
34. The method of item 33, further comprising amplifying one of the more first nucleic acid sequences that binds to the first additional nucleic acid sequence.
(Item 35)
35. A method according to item 34, wherein the amplification occurs in the discrete sections.
(Item 36)
35. The method of item 34, wherein the amplification occurs after releasing the one or more first nucleic acid sequences that bind to the first additional nucleic acid sequence from the discrete section.
(Item 37)
After the amplification, the one or more first nucleic acid sequences that bind to the first additional sequence to produce the one or more second nucleic acid sequences have one or more second nucleic acid sequences. 35. The method of item 34, further comprising adding additional nucleic acid sequences.
(Item 38)
The addition of the one or more second additional sequences removes a portion of each of the one or more first nucleic acid sequences that binds to the first additional nucleic acid sequence; Or binding said one or more second additional nucleic acid sequences to a plurality of first nucleic acid sequences.
(Item 39)
40. The method of item 38, wherein the removal is completed by shearing the one or more first nucleic acid sequences that bind to the first additional nucleic acid sequence.
(Item 40)
40. The method of item 39, wherein the coupling is completed by concatenation.
(Item 41)
19. The method of item 18, further comprising transcribing the one or more first nucleic acid sequences to generate one or more RNA fragments prior to (c).
(Item 42)
42. The method of item 41, wherein the transcription occurs after release of the one or more first nucleic acid sequences from a discrete section.
(Item 43)
42. The method of item 41, wherein the oligonucleotide further comprises a T7 promoter sequence.
(Item 44)
Further comprising, prior to (c), removing a portion of each of the one or more RNA sequences and attaching additional sequences to the one or more RNA sequences.
44. The method according to 43.
(Item 45)
Item 44. further comprising, prior to (c), reverse transcribing the one or more RNA sequences that bind to the additional sequence to generate the one or more second nucleic acid sequences. The method described.
(Item 46)
46. The method of item 45, further comprising amplifying the one or more second nucleic acid sequences prior to (c).
(Item 47)
42. The method of item 41, further comprising reverse transcribing said one or more RNA sequences to generate one or more DNA sequences prior to (c).
(Item 48)
Prior to (c), removing a portion of each of the one or more DNA sequences to produce the one or more second nucleic acid sequences; and 48. The method of item 47, further comprising combining one or more additional sequences to the sequence.
(Item 49)
49. The method of item 48, further comprising amplifying the one or more second nucleic acid sequences prior to (c).
(Item 50)
2. The method of item 1, wherein the nucleic acid comprises complementary (cDNA) generated from reverse transcription of RNA from the individual cells.
(Item 51)
51. The method of item 50, wherein the oligonucleotide is provided in discrete sections, further comprising a priming sequence.
(Item 52)
52. The method of item 51, wherein the priming sequence comprises a random N-mer.
(Item 53)
52. The method of item 51, wherein (b) comprises hybridizing the priming sequence to the cDNA and extending the priming sequence in a template-oriented manner.
(Item 54)
The method of item 1, wherein the discrete section comprises a switch oligonucleotide comprising a complementary sequence of the oligonucleotide.
(Item 55)
55. Item 54, wherein (b) comprises hybridizing the switch oligonucleotide to at least a portion of a nucleic acid fragment derived from the nucleic acid and extending the switch oligonucleotide in a template-oriented manner. Method.
(Item 56)
2. The method of item 1, wherein (b) comprises binding the oligonucleotide to the one or more first nucleic acid sequences.
(Item 57)
2. The method of item 1, wherein the one or more first nucleic acid sequences are nucleic acid fragments derived from the nucleic acid.
(Item 58)
Item 2. The method according to Item 1, wherein (b) comprises binding the oligonucleotide to the nucleic acid.
(Item 59)
59. The method of item 58, wherein the combining includes linking.
(Item 60)
The method of item 1, wherein the plurality of segments includes discrete segments.
(Item 61)
61. The method of item 60, wherein the plurality of segments comprises an average of less than 1 cell per segment.
(Item 62)
61. The method of item 60, wherein less than 25% of the plurality of segments do not contain cells.
(Item 63)
61. The method of item 60, wherein the plurality of partitions comprise discrete partitions each having at least one partitioned cell.
(Item 64)
64. The method of item 63, wherein less than 25% of the discrete segments comprise a plurality of cells.
(Item 65)
65. The method of item 64, wherein at least a subset of the discrete segments comprises beads.
(Item 66)
66. The method of item 65, wherein at least 75% of the discrete sections comprise at least one cell and at least one bead.
(Item 67)
64. The method of item 63, wherein the discrete segment further comprises a segmented nucleic acid barcode sequence.
(Item 68)
68. The method of item 67, wherein the discrete segments comprise at least 1,000 different segmented nucleic acid barcode sequences.
(Item 69)
69. The method of item 68, wherein the discrete segment comprises at least 10,000 different segmented nucleic acid barcode sequences.
(Item 70)
70. The method of item 69, wherein the discrete segment comprises at least 100,000 different segmented nucleic acid barcode sequences.
(Item 71)
61. The method of item 60, wherein the plurality of sections includes at least 1,000 sections.
(Item 72)
72. The method of item 71, wherein the plurality of sections includes at least 10,000 sections.
(Item 73)
73. A method according to item 72, wherein the plurality of sections includes at least 100,000 sections.
(Item 74)
A method for characterizing cells in a population of different cell types, comprising:
(A) providing nucleic acids from individual cells in the population to discrete sections;
(B) an oligonucleotide comprising a common nucleic acid barcode sequence, said nucleic acid from an individual cell in said discrete section, wherein said discrete section comprises a common nucleic acid barcode sequence in a plurality of different sections; Binding to one or more fragments;
(C) characterizing the one or more fragments of the nucleic acid from the plurality of discrete sections to convert the one or more fragments into individual cells based at least in part on the presence of a common barcode sequence; Belonging to
(D) characterizing a plurality of individual cells in the population based on the characterization of the one or more fragments in the plurality of discrete segments.
(Item 75)
75. The method of item 74, further comprising fragmenting the nucleic acid.
(Item 76)
75. A method according to item 74, wherein the discrete section is a droplet.
(Item 77)
Characterization of the one or more fragments of the nucleic acid comprises sequencing ribosomal deoxyribonucleic acid from the individual cell, and characterizing the individual cell comprises cell genus, species, strain or mutation 75. A method according to item 74, comprising identifying a body.
(Item 78)
78. A method according to item 77, wherein the individual cells are derived from a microbiome sample.
(Item 79)
75. A method according to item 74, wherein the individual cells are derived from a human tissue sample.
(Item 80)
75. A method according to item 74, wherein the individual cells are derived from mammalian circulating cells.
(Item 81)
75. A method according to item 74, wherein the individual cells are derived from a forensic sample.
(Item 82)
75. The method of item 74, wherein the nucleic acid is released from the individual cells of the discrete section.
(Item 83)
A method of characterizing individual cells or cell populations,
(A) a plurality of different cell surface feature binding group types, each different cell surface binding group type capable of binding to a different cell surface feature and, if present, one or more cell surface feature bindings Incubating cells having the plurality of different cell surface feature binding group types comprising reporter oligonucleotides bound thereto under conditions that allow binding between the group and each of its cell surface features;
(B) dividing the cells into sections comprising a plurality of oligonucleotides comprising barcode sequences;
(C) binding the barcode sequence to an oligonucleotide reporter group present in the compartment;
(D) sequencing the oligonucleotide reporter group and the associated barcode;
(E) characterizing the cell surface features present on the cells based on the sequenced reporter oligonucleotide.
(Item 84)
A composition comprising a plurality of sections, wherein each of the plurality of sections comprises (i) an individual cell, and (ii) a population of oligonucleotides comprising a common nucleic acid barcode sequence.
(Item 85)
85. A composition according to item 84, wherein the plurality of sections comprise droplets in an emulsion.
(Item 86)
85. The composition of item 84, wherein the population of oligonucleotides in each of the plurality of sections is bound to beads disposed in each of the plurality of sections.
(Item 87)
The individual cells are bound to a plurality of different cell surface feature binding groups associated with their respective cell surface features, each different type of cell surface feature binding group comprising an oligonucleotide reporter comprising a different nucleotide sequence. 85. The composition according to item 84, comprising a group.
(Item 88)
90. The composition of item 87, wherein the plurality of different cell surface feature binding groups comprises a plurality of different antibodies or antibody fragments having binding affinity for a plurality of different cell surface features.

Claims

A method of characterizing individual cells or cell populations,
(A) conditions sufficient to cause a cell having one or more cell surface feature binding groups to bind one cell surface feature binding group from said one or more cell surface feature binding groups to said cell; Incubating each of said one or more cell surface feature binding groups with a reporter oligonucleotide comprising a reporter oligonucleotide sequence;
(B) partitioning the cells into sections comprising a plurality of oligonucleotides each comprising a sequence comprising a barcode sequence;
(C) using the barcode sequence and the reporter oligonucleotide to generate a nucleic acid molecule comprising (i) the barcode sequence or complement thereof, and (ii) the reporter oligonucleotide sequence or complement thereof. And including the method.

2. The method of claim 1, wherein the one or more cell surface feature binding groups are one or more antibodies.

2. The method of claim 1, wherein the one or more cell surface feature binding groups are one or more antibody fragments.

The method of claim 1, further comprising sequencing the nucleic acid molecule to characterize the cell.

The method of claim 1, wherein the plurality of oligonucleotides are bound to beads and the section further comprises the beads.

The method of claim 1, wherein the plurality of oligonucleotides comprises at least 1 million oligonucleotides each comprising the barcode sequence.

The method of claim 1, wherein the segment is a droplet.

The method of claim 1, wherein the section is a well.

The method of claim 1, wherein (c) is performed in the section.

The method of claim 9, further comprising releasing or removing the nucleic acid molecule from the droplet.

11. The method of claim 10, further comprising subjecting the nucleic acid molecule to one or more reactions after releasing or removing the nucleic acid molecule from the droplet.

The method of claim 11, wherein the one or more reactions comprise a polymerase chain reaction.

12. The method of claim 11, wherein the one or more reactions comprises the addition of one or more functional sequences configured to allow attachment of a sequencer to the flow cell.

The method of claim 5, wherein the beads are gel beads.

Sequencing the nucleic acid molecule to identify the barcode sequence or complement thereof and the reporter oligonucleotide sequence or complement thereof, wherein the oligonucleotide sequence or complement thereof binds to the cell surface feature The method of claim 1, further comprising identifying a cell surface feature that is specific for a group, and wherein the barcode sequence or its complement identifies the cell.

The method of claim 1, wherein the cell surface feature is a cell surface protein.

2. Each of the plurality of oligonucleotides comprises an identifier sequence, wherein the identifier sequence of each oligonucleotide of the plurality of oligonucleotides is different from the identifier sequence of other oligonucleotides of the plurality of oligonucleotides. Method.

The method of claim 1, wherein each of the plurality of oligonucleotides comprises a sequence that is complementary to the sequence of the reporter oligonucleotide.

19. The method of claim 18, wherein the sequence complementary to the sequence of the reporter oligonucleotide is a polythymine (polyT) sequence and the reporter oligonucleotide comprises a polyadenine (polyA) sequence.

The method of claim 1, wherein generating (c) comprises performing a nucleic acid extension reaction.

The method according to claim 1, wherein the generation of (c) comprises performing a nucleic acid amplification reaction.

The method of claim 1, wherein generating (c) comprises performing a reverse transcription reaction.

The method of claim 1, wherein generating (c) comprises performing a template switching reaction.

The method of claim 1, wherein at least in (a), the cell surface feature binding group is covalently attached to the reporter oligonucleotide.

The method of claim 1, wherein at least in (a), the cell surface feature binding group is non-covalently attached to the reporter oligonucleotide.

26. The method of claim 25, wherein at least in (a), the reporter oligonucleotide hybridizes to an oligonucleotide to which the cell surface feature binding group is covalently attached.

6. The method of claim 5, wherein the sequence comprising the barcode sequence is releasable from the beads.

28. The method of claim 27, wherein the sequence comprising the barcode sequence is attached to the bead via a disulfide bond.

28. The method of claim 27, wherein the sequence comprising the barcode sequence is releasable from the beads upon exposure to a chemical stimulus.

28. The method of claim 27, further comprising releasing the sequence comprising the barcode sequence from the bead prior to (c).