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JP2017507905A - Ｋｓｐ阻害剤との抗体薬物複合体（ａｄｃ） - Google Patents

Ｋｓｐ阻害剤との抗体薬物複合体（ａｄｃ） Download PDF

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JP2017507905A JP2016542170A JP2016542170A JP2017507905A JP 2017507905 A JP2017507905 A JP 2017507905A JP 2016542170 A JP2016542170 A JP 2016542170A JP 2016542170 A JP2016542170 A JP 2016542170A JP 2017507905 A JP2017507905 A JP 2017507905A
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マリオ・ロベル
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Abstract

本出願は、新規な抗体薬物複合体（ADC）、これらのADCの活性代謝産物、これらのADCを調製する方法、疾患を治療および／または予防するためのこれらのADCの使用、ならびに疾患、特に過剰増殖および／または血管新生障害（例えば、がん疾患など）を治療および／または予防するための医薬品を調製するためのこれらのADCの使用に関する。このような治療は、単独療法としてまたは他の医薬品もしくはさらなる治療手段と組み合わせて行うことができる。

Description

本発明は、キネシン紡錘体タンパク質阻害剤の抗体薬物複合体（antibody drug conjugate）（ADC）、これらのADCの活性代謝産物、これらのADCを調製する方法、疾患を治療および／または予防するためのこれらのADCの使用、ならびに疾患、特に過剰増殖および／または血管新生障害（例えば、がん疾患など）を治療および／または予防するための医薬品を調製するためのこれらのADCの使用に関する。このような治療は、単独療法としてまたは他の医薬品もしくはさらなる治療手段と組み合わせて行うことができる。
がん疾患は、最も多様な組織の制御されない細胞増殖の結果である。多くの場合、新しい細胞は既存の組織に進入する（進入性増殖）、または離れた器官に転移する。がん疾患は最も多様な器官で生じ、しばしば疾患の組織特異的経過を有する。そのため、総称としてのがんという用語は、種々の器官、組織および細胞型の定義された疾患の大群を記載するものである。
初期の腫瘍は、おそらく外科的および放射線療法手段によって除去することができる。転移した腫瘍は、一般に、化学療法剤によって一時しのぎで治療することができるのみである。ここでの目的は、生活の質の改善と延命の最適な組み合わせを達成することである。
結合剤タンパク質と1種または複数の活性化合物分子の複合体は、特に腫瘍関連抗原に対して向けられた内部移行抗体がリンカーを介して細胞毒性剤と共有結合している抗体薬物複合体（ADC）の形態で知られている。ADCの腫瘍細胞内への導入およびその後の複合体の解離後、細胞毒性剤自体またはそこから形成された細胞毒性代謝産物が腫瘍細胞内に放出され、直接的かつ選択的にその中での作用を展開することができる。このようにして、慣用的な化学療法と対照的に、正常な組織への損傷が有意に狭い限度に抑えられる［例えば、J．M．Lambert、Curr．Opin．Pharmacol．5、543〜549（2005）；A．M．WuおよびP．D．Senter、Nat．Biotechnol．23、1137〜1146（2005）；P．D．Senter、Curr．Opin．Chem．Biol．13、235〜244（2009）；L．DucryおよびB．Stump、Bioconjugate Chem．21、5〜13（2010）参照］。例えば、国際公開第2012／171020号パンフレットは、複数の担毒体分子がポリマーリンカーを介して抗体に結合しているADCを記載している。考えられる担毒体として、国際公開第2012／171020号パンフレットは、中でも、物質SB743921、SB715992（イスピネシブ）、MK−0371、AZD8477、AZ3146およびARRY−520を挙げている。
最後に挙げられている物質はキネシン紡錘体タンパク質阻害剤である。キネシン紡錘体タンパク質（Eg5、HsEg5、KNSL1またはKIF11としても知られているKSP）は、二極性紡錘体が機能するために必須のキネシン様モータータンパク質である。KSPの阻害は有糸分裂停止および比較的長期間にわたってアポトーシスをもたらす（Taoら、Cancer Cell 2005 Jul 8（1）、39〜59）。最初の細胞透過性KSP阻害剤、モナストロールの発見後、KSP阻害剤は新規な化学療法薬のクラスとして身を立てている（Mayerら、Science 286：971〜974、1999）、KSP阻害剤はいくつかの特許出願の主題である（例えば、国際公開第2006／044825号パンフレット；国際公開第2006／002236号パンフレット；国際公開第2005／051922号パンフレット；国際公開第2006／060737号パンフレット；国際公開第03／060064号パンフレット；国際公開第03／040979号パンフレット；および国際公開第03／049527号パンフレット）。しかしながら、KSPは有糸分裂期中の比較的短期間しかその作用を展開しないので、KSP阻害剤はこれらの初期段階中に十分高濃度で存在しなければならない。
国際公開第2012／171020号パンフレット 国際公開第2006／044825号パンフレット 国際公開第2006／002236号パンフレット 国際公開第2005／051922号パンフレット 国際公開第2006／060737号パンフレット 国際公開第03／060064号パンフレット 国際公開第03／040979号パンフレット 国際公開第03／049527号パンフレット
J．M．Lambert、Curr．Opin．Pharmacol．5、543〜549（2005） A．M．WuおよびP．D．Senter、Nat．Biotechnol．23、1137〜1146（2005） P．D．Senter、Curr．Opin．Chem．Biol．13、235〜244（2009） L．DucryおよびB．Stump、Bioconjugate Chem．21、5〜13（2010） Taoら、Cancer Cell 2005 Jul 8（1）、39〜59 Mayerら、Science 286：971〜974、1999
この背景に対して、比較的低濃度での投与後に、アポトーシス作用を展開し、それゆえにがん治療にとって有益となり得る物質を提供することが本発明の目的である。
この目的を達成するために、本発明は、結合剤またはその誘導体と、リンカーLを介して結合剤に結合しているキネシン紡錘体タンパク質阻害剤（KSP阻害剤）である1種または複数の活性化合物分子の複合体を提供する。結合剤は、好ましくは結合剤タンパク質またはペプチド、特に好ましくはヒト、ヒト化もしくはキメラモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、特に抗TWEAKR抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗EGFR抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。TWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する抗TWEAKR抗体、特に抗TWEAKR抗体TPP−2090または抗EGFR抗体セツキシマブもしくはニモツズマブが特に好ましい。
本発明者らは、上記目的を達成するために結合剤をKSP阻害剤に結合させるいくつかの方法を見出した。
本発明によると、キネシン紡錘体タンパク質阻害剤は、以下の部分構造（又は下部構造）I（sub）：
（＃aは分子の残りとの結合を表し；
R1aはHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、NH2、COOH、SO3H、SHまたはOHを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表す）
を有し得る。
本発明によると、キネシン紡錘体タンパク質阻害剤が、R1a、R2a、R4aまたはR10の水素原子の置換によってリンカーを介して結合剤に結合され得る。
この結合剤に結合しているKSP阻害剤（または、しばしば2個以上のKSP阻害剤が結合剤に結合しているのでKSP阻害剤（複数））は、好ましくは
以下の式（Ia）または（IIa）：
式（Ia）
（R1aはH、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、SO3H、NH2、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
R3aは−MODまたは場合により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、
好ましくは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R8aはC1〜10−アルキルまたは−（CH2）0〜2−（HZ2）を表し、HZ2はN、OおよびSからなる群から選択される最大2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環を表し；
HZはハロゲン、場合によりハロゲンによって置換されていてもよいC1〜10−アルキル基、C6〜10−アリール基およびC6〜10−アラルキル基からなる群から選択される1個または複数の置換基によって置換されていてもよい単環式または二環式複素環を表し；
−MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10はNH2を表さない）を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有し；
キネシン紡錘体タンパク質阻害剤はR1a、R2a、R3a、R4a、R8aもしくはR10の水素原子の置換によって、または場合によりHZの置換基の1個を介して、特にR1a、R2a、R3a、R4aもしくはR10を介してリンカーに結合している）
の化合物、ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩である。
式（IIa）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
（X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表すのが好ましい）；
R1はH、−L−＃1、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2は−L−＃1、H、−MOD、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
R4は−L−＃1、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表す；
あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−＃1、−MODまたは場合により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5は−L−＃1、H、NH2、NO2、ハロゲン（特に、F、Cl、Br）、−CN、CF3、−OCF3、−CH2F、−CH2F、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシ、NO2、NH2、COOHまたはハロゲン（特に、F、Cl、Br）を表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは−（CH2）0〜2−（HZ2）を表し、HZ2はN、OおよびSからなる群から選択される最大2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環を表し、これらの基の各々は−OH、CO2HまたはNH2または−L−＃1によって置換されていてもよく；
置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10の1個は−L−＃1を表すもしくは（R8の場合）含むか、または置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10のいずれも−L−＃1を表さずもしくは（R8の場合）含まず、
Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表し、
−MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10はNH2を表さない）を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有する）
その塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
本発明による複合体は、化学的に不安定なリンカー、酵素的に不安定なリンカーまたは安定なリンカーを有することができる。安定なリンカーおよびカテプシンによって切断され得るリンカーが特に好ましい。
本発明はさらに、本発明による複合体を調製する方法、ならびに調製のための前駆体および中間体も提供する。
本発明による複合体の調製は、以下のステップを規則的に含む：
（i）場合により保護基を有し、結合剤とカップリングすることができる反応基を有するリンカー前駆体を調製する；
（ii）リンカー前駆体を、低分子量KSP阻害剤（好ましくは、KSP阻害剤は、特に好ましくは式（Ia）、特に式（IIa）の部分構造I（sub）を有し、これらの式中、リンカーとの結合はまだ存在しない）の、場合により保護基を有する誘導体とカップリングして、場合により保護基を有する反応性KSP阻害剤／リンカー複合体を得る；
（iii）KSP阻害剤／リンカー複合体中に存在する保護基を除去する、および
（iv）結合剤をKSP阻害剤／リンカー複合体と結合して、本発明による結合剤／KSP阻害剤複合体を得る。
反応基の結合を、場合により保護されたKSP阻害剤／リンカー前駆体複合体の構築後に行ってもよい。
リンカーに応じて、スクシンイミド結合ADCを、結合後に、スキーム26により、有利な安定性プロファイルを有する開鎖スクシンアミドに変換してもよい。
上に示されるように、リンカー前駆体と低分子量KSP阻害剤の結合を、リンカーによる部分構造I（sub）中のR1a、R2a、R4aもしくはR10、式（Ia）中のR1a、R2a、R3a、R4a、R8aもしくはR10、または式（IIa）中のR1、R2、R3、R4、R5、R8もしくはR10の水素原子の置換によって行ってもよい。結合前の合成ステップでは、存在するいずれの官能基も保護された形態で存在してもよい。結合ステップ前に、これらの保護基をペプチド化学の既知の方法によって除去する。結合は、実施例のスキーム7〜31で例示的様式で示される種々の経路によって化学的に行うことができる。特に、例えば、保護基または脱離基の導入によって、リンカーとの結合のために低分子量KSP阻害剤を修飾して置換を容易にすることが場合により可能である。
特に、本発明は、場合により結合剤と結合させることができる新規な低分子量KSP阻害剤を提供する。これらのKSP阻害剤またはその結合剤複合体は、以下の一般式（IIIa）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
（X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表すのが好ましい）；
R1はH、−L−BINDER、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2は−L−BINDER、H、−MOD、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
R4は−L−BINDER、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表す；
あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10は−L−BINDER、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−BINDER、−MODまたは場合により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−BINDERあるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5は−L−BINDER、H、NH2、NO2、ハロゲン（特に、F、Cl、Br）、−CN、CF3、−OCF3、−CH2F、−CH2F、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは−（CH2）0〜2−（HZ2）を表し、HZ2はN、OおよびSからなる群から選択される最大2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環（好ましくはオキセタン）を表し、これらの基の各々は−OH、CO2HまたはNH2または−L−BINDERによって置換されていてもよく；
Lはリンカーを表し、BINDERは結合剤またはその誘導体を表し、結合剤は場合により複数の活性化合物分子に結合していてもよく、
R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10を表す最大で1個は−L−結合剤を表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシ、NO2、NH2、COOHまたはハロゲン（特に、F、Cl、Br）を表し、
−MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10はNH2を表さない）を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有する）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩を有する。
種々の種のTWEAKRシステインリッチドメイン（アミノ酸34〜68）のアラインメントを示す図である。（数字は、シグナル配列；配列番号169を含む完全長構築物中のアミノ酸位置を示している）。 TWEAKR（配列番号169）の構造の概略図である。図は、システインリッチドメイン（36〜67）を含む細胞外ドメイン（アミノ酸28〜80）（配列番号168）、膜貫通ドメイン−TM（81〜101）および細胞内ドメイン（102〜129）を示している。TPP−2202−hIgG1のFcドメインに融合している完全外部ドメイン（28〜80）。TPP−2203−hIgG1のFcドメインに融合している、N−およびC−末端欠損を有する細胞外ドメイン（34〜68）。ジスルフィド架橋Cys36−Cys49、Cys52−Cys67およびCys55−Cys64を黒線で示す。N末端およびC末端で、TPP−2203は、適切な折り畳みを確保するために、未修飾システインリッチドメインよりもそれぞれ2個多いアミノ酸および1個多いアミノ酸を含む。TPP−1984−HIS6タグに融合している、C末端欠損を有する細胞外ドメイン（28〜68）。3つの構築物全てが本発明による抗体およびPDL−192（TPP−1104）との類似の結合を示す。P4A8（TPP−1324）は完全長細胞外ドメイン（TPP−2202）とのみ結合する。 細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す図である：ここで決定されたように、アミノ酸64がTWEAKリガンド結合に必須であり、アミノ酸47が本発明による抗体の結合に必須であることが公開されている。 TWEAKR外部ドメインと抗体および基準抗体の相互作用を示す図である。示されているのは、TWEAKR−Fc融合タンパク質コーティング（TPP−2202、1μg／ml）と可溶性結合対としての0．08μg／ml（白抜き棒）および0．03μ／ml（黒抜き棒）のビオチン化IgGによるELISAの結果である。ストレプトアビジン−HRPおよびAmplex Red基質を用いて検出を行った。Yは「ELISAシグナル強度［Rfu」であり；Xは「試験した抗体構築物」であり；aは「TPP−2090」であり；bは「TPP−2084」であり；cは「PDL−192（TPP−1104）」であり；dは「P4A8（TPP−1324）」であり；eは「P3G5（TPP−2195）」であり；fは「136．1（TPP−2194）」であり；hは「品目1」であり；iは「品目4」であり；jはマウスアイソタイプ対照であり；kはヒトアイソタイプ対照である。試験した全ての抗体が80ng／mlの濃度で飽和結合を示す。 TWEAKRのシステインリッチドメインと本発明による抗体および基準抗体の相互作用を示す図である。示されているのは、TWEAKR（34〜68）−Fc融合タンパク質コーティング（TPP−2203、1μg／ml）と可溶性結合対としての0．08μg／ml（白抜き棒）および0．3μ／ml（黒抜き棒）のビオチン化IgGによるELISAの結果である。ストレプトアビジン−HRPおよびAmplex Red基質を用いて検出を行った。Xは「試験した抗体構築物」であり；aは「TPP−2090」であり；bは「TPP−2084」であり；cは「PDL−192（TPP−1104）」であり；dは「P4A8（TPP−1324）」であり；eは「P3G5（TPP−2195）」であり；fは「136．1（TPP−2194）」であり；hは「品目1」であり；iは「品目4」であり；jはマウスアイソタイプ対照であり；kはヒトアイソタイプ対照である。試験した全ての抗体が80ng／mlの濃度で飽和結合を示す。 TWEAKR（28〜68）と本発明による抗体および基準抗体の相互作用を示す図である。示されているのは、TWEAKR（28〜68）−HISコーティング（TTP−1984、1μg／ml）と可溶性結合対としての0．08μg／ml（白抜き棒）および0．3μ／ml（黒抜き棒）のビオチン化IgGによるELISAの結果である。ストレプトアビジン−HRPおよびAmplex Red基質を用いて検出を行った。Xは「試験した抗体構築物」であり；aは「TPP−2090」であり；bは「TPP−2084」であり；cは「PDL−192（TPP−1104）」であり；dは「P4A8（TPP−1324）」であり；eは「P3G5（TPP−2195）」であり；fは「136．1（TPP−2194）」であり；hは「品目1」であり；iは「品目4」であり；jはマウスアイソタイプ対照であり；kはヒトアイソタイプ対照である。試験した全ての抗体が80ng／mlの濃度で飽和結合を示す。 システインリッチドメインのアラニンスキャンを示す図である。PDL−192（TPP−1104）（X）−およびTPP−2090（Y）−結合についてTWEAKR（34〜68）−Fcの変異タンパク質を分析した。S37A、R38A、S40A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63AおよびL65A変異タンパク質をHEK293細胞（黒色菱形）で発現した。PFL192（TPP−1104）およびTPP−2090をコーティングし（1μg／ml）、HEK293発酵ブロスの8倍希釈上清をTWEAKRタンパク質結合のために添加した。Xは「PDL−192／TTP−1104相互作用のELISA強度［Rfu］」であり、Yは「TPP−2090相互作用のELISA強度［Rfu］」である。TPP−2090（Y）はD74A−TWEAKR変異タンパク質についての結合減少を示し（閉じた箱）、PDL−192（TPP−1104）（X）はR56Aとの結合減少を示す（点線箱）。 野生型結合シグナル［％］に正規化した結合（％）を示す図である。1は「TPP−2090」であり；2は「PDL−192（TPP−1104）であり；3は「P4A8（TPP−1324）」である。（1μg／ml）、TWEAKR変異型を250ng／mlで添加し、検出は抗HIS−HRPを介した。野生型構築物と比べて、TTP−2090は5％未満の結合を示す。 Pellegriniら（FEBS 280：1818〜1829）によって公開されているTWEAKR外部ドメインのNMR構造を示す図である。TWEAK結合はL46に依存し（Pellegriniら）、TTP−2090結合はD47に依存し、PDL−192はR56に結合する。PDL−192はTWEAKリガンド結合部位と反対に結合し、TPP−2090はTWEAKリガンド部位に直接結合する。
本発明は、結合剤またはその誘導体と、リンカーLを介して結合剤に結合しているキネシン紡錘体タンパク質阻害剤（KSP阻害剤）である1種または複数の活性化合物分子の複合体を提供する。
本発明による複合体は、一般式
（BINDERは結合剤、好ましくは抗体を表し、Lはリンカーを表し、KSPはKSP阻害剤を表し、mは1〜2、好ましくは1の数字を表し、nは1〜50、好ましくは1．2〜20、特に好ましくは2〜8の数字を表す）
によって表すことができる。ここで、mはリンカー1個当たりのKSP阻害剤の数であり、nはBINDER1個当たりのKSP阻害剤／リンカー複合体の数の平均値である。よって、複合体中に存在する全てのKSPの和はmとnの積となる。KSP−Lは好ましくは上に示される式（I）または（II）を有する。結合剤は好ましくは結合剤ペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体である。さらに、リンカーは好ましくは結合剤ペプチドもしくはタンパク質またはその誘導体の異なるアミノ酸に結合している。結合剤の異なるシステイン残基との結合が特に好ましい。
いかなる限定もなく組み合わせて使用することができる本発明により使用することができる結合剤、本発明により使用することができるKSP阻害剤および本発明により使用することができるリンカーを以下に記載する。特に、好ましいまたは特に好ましいとして各場合で表される結合剤を、好ましいまたは特に好ましいとして各場合で表されるKSP阻害剤と組み合わせて、場合により好ましいまたは特に好ましいとして各場合で表されるリンカーと組み合わせて使用することができる。
KSP阻害剤とその結合剤の複合体
低分子量KSP阻害剤は、例えば、国際公開第2006／044825号パンフレット；国際公開第2006／002236号パンフレット；国際公開第2005／051922号パンフレット；国際公開第2006／060737号パンフレット；国際公開第03／060064号パンフレット；国際公開第03／040979号パンフレットおよび国際公開第03／049527号パンフレットから知られている。
一般に、KSP阻害剤は、以下の部分構造I（sub）：
（＃aは分子の残りとの結合を表し；
R1aはHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、NH2、COOH、SO3H、SHまたはOHを表し、
Zは−H、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表す）
を有する。
以下の部分構造II（sub）
（＃a、R1a、R2a、R4aはI（sub）と同じ意味を有し、R12aおよびR13aはHを表す、あるいはR12aおよびR13aは一緒になって（ピペリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、NH2、COOH、SO3H、SHまたはOHを表し、
Zは−H、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表す）
に特に頻繁に遭遇する。
特に、いくつかのKSP阻害剤は、部分構造II（sub）（R1a、R2a、R4a、R12aおよびR13aはHを表す）を有する。
本発明によると、部分構造I（sub）または部分構造II（sub）のKSP阻害剤が使用され得る。本発明により使用されるKSP阻害剤には、例えば、イスピネシブ（Cytokinetics／GSK）、MK−0731（Merck）、AZD4877（AstraZeneca）、ARRY−520（Array BioPharma）およびARQ621（ArQule）も含まれる。
本発明により好まれるKSP阻害剤は、以下の基礎構造：
式（I）：
（R1aはH、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、SO3H、NH2、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
R3aは−MODまたは場合により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、
好ましくは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R8aはC1〜10−アルキルを表し；
HZはハロゲン、場合によりハロゲンによって置換されていてもよいC1〜10−アルキル基、C6〜10−アリール基およびC6〜10−アラルキル基からなる群から選択される1個または複数の置換基によって置換されていてもよい単環式または二環式複素環を表し；
−MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10はNH2を表さない）を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有する）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩を有する。
本発明によると、このようなキネシン紡錘体タンパク質阻害剤はR1a、R2a、R3a、R4a、R8aもしくはR10の水素原子の置換によって、または場合によりHZの置換基の1個を介して、特にR1a、R2a、R3a、R4aもしくはR10を介してリンカーに結合することができる。
式（I）の置換基は好ましくは以下の意味を有し、これらの好ましい意味は好ましくは互いに組み合わせられる：
R1aは好ましくはHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2aおよびR4aは互いに独立に、好ましくはH、−COCHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、SO3H、NH2、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表す。
R3は好ましくは場合により置換されているアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表す
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）。
R8aは好ましくはC1〜10−アルキルを表す。HZは好ましくはハロゲン、場合によりハロゲンによって置換されていてもよいC1〜10−アルキル基、C6〜10−アリール基およびC6〜10−アラルキル基からなる群から選択される1個または複数の置換基によって置換されていてもよい単環式または二環式複素環を表す。
本発明の文脈における（すなわち、上記式および以下の式中も）C1〜10−アルキルは、1〜10個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキル基を表す。好ましいものとして挙げられる例としては、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、1−メチルプロピルおよびtert−ブチルがある。
本発明の文脈におけるC6〜10−アリール−は単環式または二環式芳香族同素環、例えば、フェニルおよびナフチルを表す。
本発明の文脈におけるC6〜10−アラルキル基は、C1〜C4−アルキル基が結合した単環式芳香族同素環、例として、フェニルを表す。代表的なC6〜10−アラルキル基はベンジルである。
本発明の文脈におけるC5〜10−ヘテロアリールは、N、O、S、SOおよびSO2からなる群の1個または2個の環ヘテロ原子を含み、環炭素原子または場合により環窒素原子を介して結合している合計6〜10個の環原子を有する単環式または二環式芳香族複素環を表す。挙げることができる例としては、ピリジル、フラニル、ピリミジル、イミダゾリル、チエニル、チオフェニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、1，2，3−オキサジアゾリル、フラザニル、1，2，3−トリアゾリル、1，2，4−トリアゾリル、ピリダジル、ピロリル、トリアジニル、インドリル、キノリニル、キナゾリニル、1，3−ベンゾジオキソール、イソインドリル、インダゾリル、1H−ピラゾロ［3，4−d］ピリミジル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、プテリジニル、ナフチリジニル、ベンズイミダゾリニル、ベンゾチアゾリニル、ベンゾオキサゾリニル、3，4−メチレンジオキシフェニルおよびベンゾ［6］フラニルがある。
本発明の文脈における単環式または二環式複素環は、N、O、S、SOおよびSO2からなる群の1〜3個の環ヘテロ原子を含み、環炭素原子または場合により環窒素原子を介して結合している合計5〜10個の環炭素原子を有する単環式または二環式芳香族複素環を表す。挙げることができる例としては、ピペリジル、ピロリニル、モルホリニル、3，4−メチレンジオキシフェニルおよびテトラヒドロフラニルがある。
本発明の文脈におけるハロゲン原子はF、Cl、BrまたはIを表す。
部分構造I（sub）もしくは部分構造II（sub）中のR1a、R2a、R4aもしくはR10、または式（I）中のHZのR1a、R2a、R3a、R4a、R8aもしくはR10の水素原子の置換によって、式（I）の化合物を当業者に既知の様式でリンカーに結合することができる。特に好ましくは、水素原子の置換がR1a、R2a、R3a、R4aまたはR2aおよびR4aによって形成されたピロリジン環で行われる。この結合は、実施例のスキーム7〜31で例示的様式で示される種々の経路によって化学的に行うことができる。特に、例えば、保護基または脱離基の導入によって（反応中、水素原子ではなく前記脱離基がリンカーによって置換されるように）、リンカーとの結合のために低分子量KSP阻害剤を修飾して置換を容易にすることが場合により可能である。次いで、KSP阻害剤−こうして得られたリンカー分子（リンカーは結合剤とのカップリングのための反応基を有する）を結合剤と反応させて本発明による結合剤複合体を得ることができる。実験節で、この手順を多数の実施例により例示的様式で説明する。
R1aに好ましいのは、H、−COOH、−CONHNH2、−（CH2）1〜3NH2、−CONZ’’（CH2）1〜3NH2および−CONZ’’CH2COOH（Z’’はHまたはNH2を表す）である。
R2aおよびR4aに好ましいのはHである、あるいはR2aおよびR4aが一緒になって（ピロリジン環の形成により）CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−（R10はHを表す）を表す。
R3aに好ましいのは、−OH、O−アルキル、SH、S−アルキル、O−CO−アルキル、O−CO−NH−アルキル、NH−CO−アルキル、NH−CO−NH−アルキル、S（O）n−アルキル、SO2−NH−アルキル、NH−アルキル、N（アルキル）2またはNH2（アルキルは好ましくはC1〜3−アルキルである）によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル−である。
R8aに好ましいのは、分岐C1〜5−アルキル基、好ましくはメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、1−メチルプロピルおよびtert−ブチルである。
HZに好ましいのは、ハロゲン、場合によりハロゲンによって置換されていてもよいC1〜10−アルキル基、C6〜10−アリール基およびC6〜10−アラルキル基からなる群から選択される1個または複数の置換基によって置換されていてもよい単環式または二環式複素環である。
特に好ましくは、HZが場合により置換されているベンジル基によって（R1a等の置換基に関して）オルト位で置換されている置換ピロール、ピラゾール、イミダゾール、キナゾリンまたはジヒドロキナゾリンである。さらに、置換ピロール、ピラゾール、イミダゾールまたはキナゾリンは、好ましくは（ジヒドロキナゾリンの場合）オキソ、または1個もしくは2個のハロゲン原子によって置換されたフェニルによって置換されていてもよい。特に好ましくは、HZが置換ピロールである。
好ましく使用されるKSP阻害剤はイスピネシブである。さらに好ましいKSP阻害剤はArry−520である。
他の特に好ましい化合物は以下の式（IIa）または（II）を有する：
式（IIa）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
（X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表すのが好ましい）；
R1はH、−L−＃1、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2は−L−＃1、H、−MOD、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
R4は−L−＃1、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表す；
あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−＃1、−MODまたは場合により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH（（CH2CH2O）1〜20H）基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルである）；
R5は−L−＃1、H、−MOD、NH2、NO2、ハロゲン（特に、F、Cl、Br）、−CN、CF3、−OCF3、−CH2F、−CH2F、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシ、NO2、NH2、COOHまたはハロゲン（特に、F、Cl、Br）を表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは−（CH2）0〜2−（HZ2）を表し、HZ2はN、OおよびSからなる群から選択される最大2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環（好ましくはオキセタン）を表し、これらの基の各々は−OH、CO2HまたはNH2またはL−＃1によって置換されていてもよく；
置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10の1個または０個は−L−＃1を表す（またはR8の場合含み）、
Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表し、
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表し；
−MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10はNH2を表さない）を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有する）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
式（II）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し；
R1はH、−L−＃1または−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2およびR4は互いに独立に、H、−L−＃1、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、L−＃1、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は場合により置換されているアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5はH、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは場合により置換されたオキセタンを表し；
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
R1、R2、R3、R4、R5もしくはR8またはR2およびR4によって形成されたピロリジン環（R10）の水素原子の置換によって、当業者に既知の様式で、式（IIa）または（II）（式中、置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10のいずれも−L−＃1を表さない）の化合物をリンカーに結合することができる。これにより、式（IIa）または（II）（置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8またはR10の1つは−L−＃1を表し、Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表す）の複合体が得られる。例えば、式（IIa）または（II）によるKSP阻害剤が結合剤と結合している場合、置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8またはR10の1つは−L−＃1を表す（Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表す）。これは、置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10の1つが−L−＃1を表す（−L−＃1は結合剤、例えば、抗体に結合している）複合体の場合である。特に好ましくは、置換基R1およびR3の1つが−L−＃1を表す。結合剤は、好ましくはヒト、ヒト化もしくはキメラモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、特に抗TWEAKR抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗EGFR抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。TWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する抗TWEAKR抗体、特に抗TWEAKR抗体TPP−2090または抗EGFR抗体セツキシマブもしくはニモツズマブが特に好ましい。
−L−＃1の代わりに、基−L−＃3が化合物中に存在することも可能である（Lはリンカーを表し、＃3は結合剤またはその誘導体との結合のための反応基を表す）。−L−＃3を含む化合物は、結合剤またはその誘導体と反応する反応性化合物である。＃3は、好ましくは共有結合の形成によりアミノまたはチオール基と、好ましくはタンパク質中のシステイン残基と反応する基である。当然、タンパク質中のシステイン残基はタンパク質中に天然に存在してもよいし、または生化学的方法によって導入してもよいし、または好ましくは結合剤のジスルフィドの事前の還元によって生成してもよい。
式（IIa）または（II）（式中、置換基R1、R2、R3、R4、R5およびR10の1つは−L−＃1を表し、
X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表す）
の化合物、特に、
X1がNを表し、X2がNを表し、X3がCを表す；または
X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表す
ものが特に好ましい。X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表す化合物が特に好ましい。
Aについて、CO（カルボニル）が好ましい。
R1に好ましいのは、−L−＃1、H、−COOH、−CONHNH2、−（CH2）1〜3NH2、−CONZ’’（CH2）1〜3NH2および−CONZ’’CH2COOH（Z’’はHまたはNH2を表す）である。
R2およびR4に好ましいのはH、−L−＃1である、あるいはR2およびR4が一緒になって（ピロリジン環の形成により）CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−（R10はHまたは−L−＃1を表す）を表す。
R3に好ましいのは、−L−＃1あるいは場合により−OH、O−アルキル、SH、S−アルキル、O−CO−アルキル、O−CO−NH−アルキル、NH−CO−アルキル、NH−CO−NH−アルキル、S（O）n−アルキル、SO2−NH−アルキル、NH−アルキル、N（アルキル）2またはNH2（アルキルは好ましくはC1〜3−アルキルである）によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル−である。
R5に好ましいのは−L−＃1、HまたはFである。
R6およびR7に好ましいのは、互いに独立に、H、（場合によりフッ素化された）C1〜3−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンである。
R8に好ましいのは分岐C1〜5−アルキル基、特に式−C（CH3）2−（CH2）0〜2−Ry（Ryは−H、−OH、CO2H、NH2または−L−＃1を表す）の基である。式−C（CH3）2−（CH2）−Ry（Ryは−Hまたは−L−＃1を表す）の基が特に好ましい。
R9に好ましいのはHまたはFである。
式（IIa）または（II）（式中、置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10のいずれも−L−＃1を表さないまたは1つは−L−＃1を表し、
X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
AはCO（カルボニル）を表し；
R1はH、−COOH、−CONHNH2、−（CH2）1〜3NH2、−CONZ’’（CH2）1〜3NH2および−CONZ’’CH2COOHを表し、Z’’はHまたはNH2を表し；
R2およびR4はHを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はHまたは−L−＃1を表し；
R3はハロゲン（特にF）によって一置換もしくは多置換されていてもよいフェニル基、または場合によりフッ素化されたC1〜3−アルキルを表す、あるいは場合により−OY4、−SY4、−O−CO−Y4、−O−CO−NH−Y4、NH−CO−Y4、−NH−CO−NH−Y4、S（O）n−Y4（nは0、1もしくは2を表す）、−SO2−NH−Y4、NH−Y4またはN（Y4）2（Y4はH、フェニル（場合によりハロゲン（特にF）もしくは場合によりフッ素化されたC1〜3−アルキルによって一置換もしくは多置換されている）、またはアルキル（アルキル基は−OH、−COOHおよび／または−NHCO−C1〜3−アルキルによって置換されていてもよく、アルキルは好ましくはC1〜3−アルキルを表す）によって置換されていてもよいフッ素化C1〜10−アルキル基を表し；
特に好ましくはR3は−OH、O−アルキル、SH、S−アルキル、O−CO−アルキル、O−CO−NH−アルキル、NH−CO−アルキル、NH−CO−NH−アルキル、S（O）n−アルキル、SO2−NH−アルキル、NH−アルキル、N（アルキル）2またはNH2（アルキルは好ましくはC1〜3−アルキルを意味する）によって置換されていてもよく；
R5はHまたはFを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、（場合によりフッ素化された）C1〜3−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し；
R8は分岐C1〜5−アルキル基を表し；
R9はHまたはFを表す）
の化合物が特に好ましい。
さらに、（単独でまたは組み合わせて）
・R1が−L−＃1、COOHまたはHを表す、
・R2およびR4が互いに独立に、−L−＃1またはHを表す、あるいはR2およびR4が一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10がHまたは−L−＃1を表す、
・AがCOを表す、
・R3が1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のアミノ基たは1〜3個のアルキル基（場合によりハロゲン化されていてもよい）によって置換されていてもよい−（CH2）OH、−CH（CH3）OH、−CH2SCH2CH（COOH）NHCOCH3、−CH（CH3）OCH3、フェニル基を表す、あるいは−L−＃1を表す、
・R5が−L−＃1またはHを表す、
・R6およびR7が互いに独立に、H、C1〜3−アルキルまたはハロゲンを表す；特に、R6およびR7がFを表す；
・R8がC1〜4−アルキル（好ましくはtert−ブチル）を表す；および／または
・R9がHを表す
・ここでは、置換基R1、R2、R3、R4、R5およびR10の1つが−L−＃1を表す
場合が好ましい。
さらに、本発明によると、
・R1が−L−＃1、COOHまたはHを表す、
・R2およびR4が互いに独立に、−L−＃1またはHを表す、あるいはR2およびR4が一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10がHまたは−L−＃1を表す、
・AがCOを表す、
・R3が1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のアミノ基たは1〜3個のアルキル基（場合によりハロゲン化されていてもよい）によって置換されていてもよい−（CH2）OH、−CH（CH3）OH、−CH2SCH2CH（COOH）NHCOCH3、−CH（CH3）OCH3、フェニル基を表す、あるいは−L−＃1を表す、
・R5が−L−＃1またはHを表す、
・R6およびR7が互いに独立に、H、C1〜3−アルキルまたはハロゲンを表す；特に、R6およびR7がFを表す；
・R8がC1〜4−アルキル（好ましくはtert−ブチル）を表す；および
・R9がHを表す
・ここでは、置換基R1、R2、R3、R4、R5およびR10の1つが−L−＃1を表す
場合が好ましい。
他の特に好ましい化合物は以下の式（IIIa）または（III）を有する：
式（IIIa）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
（X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表すのが好ましい）；
R1はH、−L−BINDER、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH3）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、−COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2はH、−L−BINDER、−MOD、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
R4はH、−L−BINDER、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表す；
あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10は−L−BINDER、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−BINDER、−MODまたは場合により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5は−L−BINDER、H、NH2、NO2、ハロゲン（特に、F、Cl、Br）、−CN、CF3、−OCF3、−CH2F、−CH2F、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシ、NO2、NH2、COOHまたはハロゲン（特に、F、Cl、Br）を表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは−（CH2）0〜2−（HZ2）を表し、HZ2はN、OおよびSからなる群から選択される最大2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環を表し、これらの基の各々は−OH、CO2HまたはNH2または−L−BINDERによって置換されていてもよく；
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表し；
−MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10はNH2を表さない）を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有する）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
式（IIIa）のKSP阻害剤の結合剤複合体の場合、R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10を表す最大1個が（上に示される条件の1つの代わりに）−L−BINDER（Lはリンカーを表し、BINDERは結合剤またはその誘導体を表し、結合剤は場合により複数の活性化合物分子に結合していてもよい）を表してもよい。
式（III）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す、またはX1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表す、またはX1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す、またはX1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し；
R1は−L−BINDER、Hまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2およびR4は互いに独立に、−L−BINDER、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−BINDERまたは場合により置換されているアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5は−L−BINDER、H、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Lはリンカーを表し、BINDERは結合剤またはその誘導体を表し、結合剤は場合により複数の活性化合物分子に結合していてもよく、
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは場合により置換されたオキセタンを表し；
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
さらに、以下のKSP阻害剤およびその結合剤複合体が本発明により好ましい：
式（IIIb）：
（X1、X2、X3は式（IIIa）または（III）と同じ意味を有し（好ましくは、X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表し）、R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8およびR9は式（IIIa）または（III）と同じ意味を有し、AはCOを表し、Bは単結合、−O−CH2−または−CH2−O−を表し、R20はNH2、F、CF3またはCH3を表し、nは0、1または2を表す）。
式（IIIc）：
（X1、X2、X3は式（IIIa）または（III）と同じ意味を有し（好ましくは、X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表し）、A、R1、R3、R6、R7、R8およびR9は式（IIIa）または（III）と同じ意味を有し、Aは好ましくはCOを表し、R3は−CH2OH、−CH2OCH3、CH（CH3）OHまたはCH（CH3）OCH3を表す）。
式（IIId）：
（X1、X2、X3は式（IIIa）または（III）と同じ意味を有し（好ましくは、X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表し）、A、R3、R6、R7、R8およびR9は式（IIIa）または（III）と同じ意味を有し、Aは好ましくはCOを表し、R3は−CH2−Sx−（CH2）0〜4−CHY5−COOHを表し、xは0または1であり、Y5はHまたはNHY6を表し、Y6はHまたは−COCH3を表す）。
式（IIIe）：
（X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表し、A、R3、R6、R7、R8およびR9は式（IIIa）または（III）と同じ意味を有し、R1は−L−BINDER−を表す）。
さらに、式（III）、（IIIa）、（IIIb）、（IIIc）、（IIId）および（IIIe）の化合物で（単独でまたは組み合わせて）、
・ZがClまたはBrを表す；
・R1が−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−CO−NY1Y2を表し、Y2が−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表し、Y1がH、NH2または−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表す；
・Y1がHを表し、Y2が−（CH2CH2O）3−CH2CH2Z’を表し、Z’が−COOHを表す；
・Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−（CONHCHY4）2COOHを表す；
・Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−（CONHCHY4）2COOHを表し、Y4基の1つがi−プロピルを表し、残りが−（CH2）3−NHCONH2を表す；
・Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−（CONHCHY4）2COOHを表し、Y4基の1つが−CH3を表し、残りが−（CH2）3−NHCONH2を表す；
・Y4が場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表す；
・少なくとも1つの代表的なY4がi−プロピルおよび−CH3からなる群から選択される；
・Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−CONHCHY4COOHを表し、Y4が場合により−NH2によって置換されているアリールまたはベンジルを表す；
・Y4がアミノベンジルを表す；
・R2が−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−SY3を表す；
・R4が−CO−CHY4−NHY5を表し、Y5がHを表す；
・R4が−CO−CHY4−NHY5を表し、Y5が−CO−CHY6−NH2を表す；
・Y4が場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表す
場合が好ましい。
さらに、式（IIa）または（IIIa）中のR1、R2またはR3が−MODを表す場合、特に、R4が−L−＃1または−L−BINDERを表す場合（特に、−Lが、R4またはLがHによって置き換えられるように−N−R4または−N−L−＃1または−L−BINDERで直接切断する切断可能リンカーである場合）が好ましい。
特に好ましくは、R3が−MODを表し、R1またはR4が−L−＃1または−L−BINDERを表し、
−MODが−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
R10がHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1が−NHCO−、−CONH−または
（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10がNH2を表さない）を表し；
nが0または1であり；
oが0または1であり；
G2が1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODが好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有し；
特に好ましくは、基−MODが、例えば、ベタイン基中に（好ましくは末端）−COOH基を有する。好ましくは、基−MODが、式−CH2−Sx−（CH2）0〜4−CHY5−COOH（xは0または1であり、Y5はHまたはNHY6を表し、Y6はHまたは−COCH3を表す）を有する。
他の特に好ましい化合物は以下の式（IV）を有する：
（X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表し；
R1は−L−BINDER、Hまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2およびR4は互いに独立に、−L−BINDER、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−BINDER、場合により置換されているアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、または−CH2−Sx−（CH2）0〜4−CHY5−COOH（xは0または1であり、Y5はHまたはNHY6を表し、Y6はHまたは−COCH3を表す）、好ましくは−L−BINDERあるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5は−L−BINDER、H、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Lはリンカーを表し、BINDERは結合剤またはその誘導体を表し、結合剤は場合により複数の活性化合物分子に結合していてもよく、
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは場合により置換されたオキセタンを表し；
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩；
但し、R1、R2およびR4は同時にはHを表さない。
さらに、式（IIa）、（II）、（III）、（IIIa）、（IIIb）、（IIIc）、（IIId）、（IIIe）または（IV）で（単独でまたは組み合わせて）、
・ZがClまたはBrを表す；
・R1が−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−CO−NY1Y2を表し、Y2が−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表し、Y1がH、NH2または−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表す；
・Y1がHを表し、Y2が−（CH2CH2O）3−CH2CH2Z’を表し、Z’が−COOHを表す；
・Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−（CONHCHY4）2COOHを表す；
・Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−（CONHCHY4）2COOHを表し、1つの代表的なY4がi−プロピルを表し、残りが−（CH2）3−NHCONH2を表す；
・Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−（CONHCHY4）2COOHを表し、1つの代表的なY4が−CH3を表し、残りが−（CH2）3−NHCONH2を表す；
・Y4が場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表す；
・少なくとも1つの代表的なY4がi−プロピルおよび−CH3からなる群から選択される；
・Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−CONHCHY4COOHを表し、Y4が場合により−NH2によって置換されているアリールまたはベンジルを表す；
・Y4がアミノベンジルを表す；
・R2が−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−SY3を表す；
・R4が−CO−CHY4−NHY5を表し、Y5がHを表す；
・R4が−CO−CHY4−NHY5を表し、Y5が−CO−CHY6−NH2を表す；
・Y4が場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表す
場合が好ましい。
式（IIa）、（II）、（III）、（IIIa）または（IV）
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
（X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表すのが好ましい）；
R1はH、−L−＃1または−L−BINDER、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH3）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2はH、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
R4はHを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−＃1または−L−BINDER、−MODまたは場合により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH（（CH2CH2O）1〜20H）基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルである）；
R5はH、−MOD、NH2、NO2、ハロゲン（特に、F、Cl、Br）、−CN、CF3、−OCF3、−CH2F、−CH2F、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシ、NO2、NH2、COOHまたはハロゲン（特に、F、Cl、Br）を表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニルまたは（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルを表し；
置換基R1およびR3の1つは−L−＃1または−L−BINDERを表す、あるいはいずれも−L−＃1も−L−BINDERも表さず、
Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表し、BINDERは結合剤を表し、
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表し；
−MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10はNH2を表さない）を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有する）
の化合物ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩がさらに好ましい。
式（IIa）、（II）、（III）、（IIIa）または（IV）（式中、
X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
（X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表すのが好ましい）；
R1はH、−L−＃1または−L−BINDER、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH3）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2はH、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
R4はHを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−＃1または−L−BINDER、−MODまたは場合により置換されているアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH（（CH2CH2O）1〜20H）基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルである）；
R5はH、−MOD、NH2、NO2、ハロゲン（特に、F、Cl、Br）、−CN、CF3、−OCF3、−CH2F、−CH2F、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
R6およびR7は互いに独立に、Hまたはハロゲン（特に、F、Cl、Br）を表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキルを表し；
置換基R1およびR3の1つは−L−＃1または−L−BINDERを表す、あるいはいずれも−L−＃1も−L−BINDERも表さず、
Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表し、BINDERは結合剤を表し、
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表し；
−MODは−CH2−Sx−（CH2）0〜4−CHY5−COOHを表し、xは0または1であり、Y5はHまたはNHY6を表し、Y6はHまたは−COCH3を表す）
の化合物、ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩がさらに好ましい。
場合により例えば、トリフルオロ酢酸などの酸と一緒に存在し得る以下の化合物がさらに好ましい。これらの化合物を、リンカーを介してR1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10、特にR1およびR3位に対応する位置を介して結合剤に結合することができる（水素原子がリンカーによって置換される）：
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド；
（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−メチルブタンアミド（1：1）；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1S）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アセトアミド；
（15S，19R）−15−アミノ−19−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−18−グリコロイル−20，20−ジメチル−14−オキソ−4，7，10−トリオキサ−13，18−ジアザヘンイコサン−1−酸；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−L−オルニチン；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−4−アミノ−L−フェニルアラニン；
N−｛（1R）−1−［1−（3−アミノベンジル）−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N−（3−アミノプロピル）−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）；
（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタン酸；
N−［（3S）−3−アミノ−4−ヒドラジノ−4−オキソブチル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）；
N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N−［（3S）−3，4−ジアミノブチル］−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニン；
（2S）−2−アミノ−N−（2−アミノエチル）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタンアミド（2：1）；
（1−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）酢酸；
N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）；
4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド（2：1）；
N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）；
L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）；
L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1S）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド；
S−（1−｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン；
S−［1−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N−［4−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）フェニル］−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド；
S−（1−｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン；
S−［1−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン；N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N−［4−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）フェニル］−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド；
S−（1−｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン；
N−［6−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン；
S−［1−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン；
S−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−L−システイン；
S−｛1−［6−（2−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）−6−オキソヘキシル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン；
N−［19−（3（R／S）−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝ホモシステイン；
S−｛（3R／S）−1−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン；
N−［19−（3（R／S）−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝ホモシステイン；
S−［（3R／S）−1−（2−｛［6−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）ヘキサノイル］アミノ｝エチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン；
S−｛1−［2−（｛［（1R，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝アミノ）エチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン；
S−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−L−システイン；
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−D−アラニル）−L−リジン；
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−N2−｛N−［6−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル｝−L−リジン；
N−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−L−グルタミン；
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−L−リジン；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アセトアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−メトキシアセトアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，4−ジフルオロベンズアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−メチルベンズアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−エトキシアセトアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−3，3，3−トリフルオロプロパンアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−フルオロベンズアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アセトアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−（トリフルオロメチル）ベンズアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−エトキシアセトアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−エトキシアセトアミド；
（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタン酸；
（2S）−2−アミノ−N−（2−アミノエチル）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタンアミド；
4−［（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸；
4−［（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−2−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニン；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−セリン；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−アラニン；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝グリシン；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−メチルベンズアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−（メチルスルファニル）ベンズアミド；
（2S）−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシプロパンアミド；
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−（メチルスルファニル）アセトアミド；
（2S）−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシプロパンアミド；
4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−4−オキソ酪酸メチル；
4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−4−オキソブタン酸；
（2R）−22−［（3R／S）−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル］−2−［（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）メチル−4，20−ジオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−3，19−ジアザドコサン−1−酸；
4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド；
N−アセチル−S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−L−システイン；
N−アセチル−S−［2−（［3−（L−アラニルアミノ）プロピル］｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−オキソエチル］−L−システイン；
（2S）−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝テトラヒドロフラン−2−カルボキサミド；
3−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）プロパン酸；
S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝ホモシステイン；
4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド；
4−［（2−｛［（2R）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−2−カルボキシエチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸；
4−［（2−｛［（2R）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−2−カルボキシエチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−2−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸。
式V、VIおよびVII（R1、R2、R3、R4およびR5は上記の（例えば、式（IIa）または（IIIa）について言及される）意味を有する）の以下の化合物が本発明により特に好ましい。
式V、VI、VII（R1およびR5はHまたは−L−＃1を表し；R2およびR4は互いに独立に、−L−＃1またはHを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はHまたは−L−＃1を表し；R3はCH2OH、CH（CH3）OHまたは−L−＃1を表し、置換基R1、R2、R3、R4、R5およびR10の1つは−L−＃1を表す）の化合物が特に好ましい。式VIの対応する化合物が特に好ましい。
リンカー
文献は、有機分子を例えば、抗体などの結合剤と共有結合的にカップリングする（結合する）ための種々の選択肢を開示している（例えば、K．LangおよびJ．W．Chin．Chem．Rev．2014、114、4764〜4806、M．RashidianらBioconjugate Chem．2013、24、1277〜1294参照）。遊離チオールとして既に存在するもしくはジスルフィド架橋の還元によって生成される抗体のシステイン残基の1個もしくは複数の硫黄原子を介した、および／または抗体のリジン基の1個もしくは複数のNH基を介したKSP阻害剤と抗体の結合が本発明により好ましい。しかしながら、チロシン残基を介して、グルタミン残基を介して、非天然アミノ酸の残基を介して、遊離カルボキシル基を介してまたは抗体の糖残基を介して、KSP阻害剤を抗体に結合することも可能である。カップリングのために、リンカーが使用される。リンカーを、インビボで切断され得るリンカーの群と、インビボで安定なリンカーの群に分類することができる（L．DucryおよびB．Stump、Bioconjugate Chem．21、5〜13（2010）参照）。インビボで切断され得るリンカーは、インビボで切断され得る基を有し、今度は、これをインビボで化学的に切断可能な基とインビボで酵素的に切断可能な基に区別することができる。「インビボで化学的に切断可能」および「インビボで酵素的に切断可能」は、リンカーまたは基が循環中で安定であり、標的細胞でまたは標的細胞内でのみその中の化学的または酵素的に異なる環境（低いpH；上昇したグルタチオン濃度；カテプシンもしくはプラスミンなどのリソソーム酵素、または例えば、β−グルクロニダーゼなどのグリコシダーゼの存在）によって切断され、よって低分子量KSP阻害剤またはその誘導体を放出することを意味する。インビボで化学的に切断され得る基は特に、ジスルフィド、ヒドラゾン、アセタールおよびアミナールであり；インビボで酵素的に切断され得る基は特に、2〜8オリゴペプチド基、特にジペプチド基またはグリコシドである。ペプチド切断部位は、Bioconjugate Chem．2002、13、855〜869およびBioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters 8（1998）3341〜3346およびBioconjugate Chem．1998、9、618〜626にも開示されている。これには、例えば、バリン−アラニン、バリン−リジン、バリン−シトルリン、アラニン−リジンおよびフェニルアラニン−リジン（場合により追加のアミド基を含む）が含まれる。
インビボで安定なリンカーは高い安定性（血漿中で24時間後に5％未満代謝産物）によって区別され、上記の化学的インビボ切断可能基も酵素的インビボ切断可能基も有さない。
リンカー−L−は好ましくは以下の基礎構造（i）〜（iv）の1つを有する：
（i）−（CO）m−SG1−L1−L2−
（ii）−（CO）m−L1−SG−L1−L2−
（iii）−（CO）m−L1−L2−
（iv）−（CO）m−L1−SG−L2
（mは0または1であり；SGは（化学的または酵素的）インビボ切断可能基（特に、ジスルフィド、ヒドラゾン、アセタールおよびアミナール；またはカテプシンもしくはプラスミンによって切断され得る2〜8オリゴペプチド基）であり、SG1はオリゴペプチド基または好ましくはジペプチド基であり、L1は互いに独立に、インビボ安定有機基を表し、L2は結合剤とのカップリング基または単結合を表す）。ここで、カップリングは好ましくは結合剤のシステイン残基またはリジン残基とである。あるいは、カップリングは、結合剤のチロシン残基、グルタミン残基または非天然アミノ酸とであり得る。非天然アミノ酸は、例えば、アルデヒドもしくはケト基（例えば、ホルミルグリシンなど）またはアジドもしくはアルキン基を含み得る（Lan ＆ Chin、Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins、Chem．Rev．2014、114、4764〜4806参照）。
特に、結合剤が抗TWEAKR抗体または抗EGFR抗体である場合、基礎リンカー構造（iii）が本発明により特に好ましい。代謝を介して、基礎リンカー構造（iii）およびリンカーと結合剤タンパク質またはペプチドのシステインまたはリジン残基のカップリングを有する本発明による複合体の投与が、以下の式：
（L1はそれぞれ低分子量KSP阻害剤、例えば、式（I）、（IIa）、（II）、（III）、（IIIa）、（IIIb）、（IIIc）、（IIId）、（IIIe）または（IV）に結合している）
のシステインまたはリジン誘導体をもたらす。
特に、結合が（iii）位である場合、特に、基L1が以下の構造の1つを有する場合、基礎リンカー構造（ii）および（iv）も本発明により好ましい：
（a）−NH−（CH2）0〜4−（CHCH3）0〜4−CHY5−CO−Y7（切断後に対応する構造−NH−（CH2）0〜4−（CHCH3）0〜4−CHY5−COOHまたは−NH−（CH2）0〜4−（CHCH3）0〜4−CHY5−CO−NH−（CH2）0〜4−CHNH2−COOHが得られるようにY5はHまたはNHY6を表し、Y6はHまたは−COCH3を表し、Y7は単結合または−NH−（CH2）0〜4−CHNH2−CO−を表す）。
（b）−CH2−Sx−（CH2）0〜4−CHY5−CO−（切断後に対応する構造−CH2−Sx−（CH2）0〜4−CHY5−COOHが得られるようにxは0または1であり、Y5はHまたはNHY6を表し、Y6はHまたは−COCH3を表す）。
この実施形態は、L1がそれぞれ低分子量KSP阻害剤、例えば、式（I）、（IIa）、（II）、（III）、（IIIa）、（IIIb）、（IIIc）、（IIId）、（IIIe）または（IV）に特にR4位で結合している場合に好ましい。結合剤は好ましくは抗TWEAKR抗体または抗EGFR抗体である。
リンカーがシステイン側鎖またはシステイン残基に結合している場合、L2は好ましくはシステインのスルフヒドリル基と反応する基に由来する。これらには、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化化合物、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、TNBチオールおよびジスルフィド還元剤が含まれる。これらの基は一般的に、求電子的にスルフヒドリル結合と反応してスルフィド（例えば、チオエーテル）またはジスルフィド架橋を形成する。安定なスルフィド架橋が好ましい。L2は好ましくは
（＃1は結合剤の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は基L1との結合点を示し、
R22はCOOH、COOR、COR、CONHR、CONR2（RはそれぞれC1〜3−アルキルを表す）、CONH2、好ましくはCOOHを表す）
である。
L2に特に好ましいのは、
または
（＃1は結合剤の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は活性化合物との結合点を示し、
xは1または2を表し、
R22はCOOH、COOR、COR、CONHR（RはそれぞれC1〜3−アルキルを表す）、CONH2、好ましくはCOOHを表す）
である。x＝1およびR22がCOOHを表す場合が好ましい。
本発明による複合体または本発明による複合体の混合物では、結合剤のシステイン残基との結合が、好ましくは80％超、特に好ましくは90％超（各場合でリンカーと結合剤の結合の総数に基づく）の程度まで、特に好ましくは式A3またはA4の2つの構造の1つとして存在する。ここで、式A3またはA4の構造は一般的に一緒に、好ましくは結合剤との結合の数基準で60：40〜40：60の比で存在する。次いで、残りの結合は構造
として存在する。
本発明によると、L1は好ましくは式＃1−（NR10）n−（G1）o−G2−＃2
（R10はH、NH2またはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
を表し；（G1がNHCOまたは
を表す場合、R10は好ましくはNH2ではない）
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、−C（NH）NRy−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々がNHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）ならびに／あるいはN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
によって表される。
G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、または−SO−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい。
G2は好ましくはアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員、例えば、5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖を含む炭化水素鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい。
G2中のさらなる中断基は好ましくは
（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）
である。
ここで、＃1はKSP阻害剤との結合であり、＃2は結合剤（例えば、L2）とのカップリング基との結合である。
アリーレン基の直鎖または分岐炭化水素鎖ならびに／あるいは直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基は、一般的に明言される炭素原子のそれぞれの数を有するα，ω−二価アルキル基を含む。好ましいものとして挙げることができる例には、メチレン、エタン−1，2−ジイル（1，2−エチレン）、プロパン−1，3−ジイル（1，3−プロピレン）、ブタン−1，4−ジイル（1，4−ブチレン）、ペンタン−1，5−ジイル（1，5−ペンチレン）、ヘキサン−1，6−ジイル（1，6−ヘキシレン）、ヘプタン−1，7−ジイル（1，7−ヘキシレン）、オクタン−1，8−ジイル（1，8−オクチレン）、ノナン−1，9−ジイル（1，9−ノニレン）、デカン−1，10−ジイル（1，10−デシレン）がある。しかしながら、炭化水素鎖中のアルキレン基が分岐していてもよい、すなわち、上記直鎖アルキレン基の1個または複数の水素原子が場合によりC1〜10−アルキル基によって置換されて、側鎖を形成してもよい。炭化水素鎖が環状アルキレン基（シクロアルカンジイル）、例えば、1、4−シクロヘキサンジイルまたは1，3−シクロペンタンジイルをさらに含んでもよい。これらの環状基が不飽和であってもよい。特に、芳香族基（アリーレン基）、例えば、フェニレンが炭化水素基中に存在してもよい。同様に、環状アルキレン基およびアリーレン基中でも、1個または複数の水素原子が場合によりC1〜10−アルキル基によって置換されていてもよい。このようにして、場合により分岐した炭化水素鎖が形成される。この炭化水素鎖は、合計0〜100個の炭素原子、好ましくは1〜50個、特に好ましくは2〜25個の炭素原子を有する。
側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい。
炭化水素鎖が、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい。
G2中のさらなる中断基は好ましくは
である。
好ましくは、リンカーが以下の式：
§−（CO）m−L1−L2−§§
（mは0または1であり；
§は活性化合物分子との結合を表し、
§§は結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
L1およびL2は上に示される意味を有する）
に相当する。
特に好ましくは、L1が式−NR11B−
（R11はHまたはNH2を表し；
Bは−［（CH2）x−（X4）y］w−（CH2）z−を表し、
w＝0〜20；
x＝0〜5；
x＝0〜5；
y＝0または1；
z＝0〜5；および
X4は−O−、−CONH−、−NHCO−または
を表す）
を有する。
本発明により好ましいリンカーLは、以下の式：
（＃3は活性化合物分子との結合を表し、
＃4は結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
R11はHまたはNH2を表し；
Bは−［（CH2）x−（X4）y］w−（CH2）z−を表し、
w＝0〜20；
x＝0〜5；
y＝0または1；
z＝1〜5；および
X4は−O−、−CONH−、−NHCO−または
を表す）
を有する。

式（I）または（II）（式中、リンカーはR1の水素原子の置換によってまたはR4の切断可能リンカーSG1と組み合わせてカップリングしている、すなわち、R1は−L−＃1を表す、またはR4は−SG1−L−＃1を表し、＃1は結合剤との結合を表す）の複合体で上記リンカーが特に好ましい。
以下のリンカーが本発明によりさらに好ましい：本発明による複合体または本発明による複合体の混合物では、結合剤のシステイン残基との結合が、好ましくは80％超、特に好ましくは90％超（各場合でリンカーと結合剤の結合の総数に基づく）の程度まで、特に好ましくは式A5またはA6の2つの構造の1つとして存在する。
（＃1は結合剤の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は基L1との結合点を示し、
R22はCOOH、COOR、COR、CONHR（RはそれぞれC1〜3−アルキルを表す）、CONH2、好ましくはCOOHを表す）。
ここで、式A5またはA6の構造は一般的に一緒に、好ましくは結合剤との結合の数基準で60：40〜40：60の比で存在する。次いで、残りの結合は構造
として存在する。
システイン側鎖またはシステイン残基に結合している他のリンカー−L−は以下の式：
（§は活性化合物分子との結合を表し、
§§は結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
mは0、1、2または3であり；
nは0、1または2であり；
pは0〜20であり；
L3は
を表し；
oは0または1であり；
G3はアリーレン基および／または直鎖および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、−SO−またはSO2からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員（好ましくは5〜10員）芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
を有する。
上記式中、好ましくは、
mは1であり；
pは0であり；
nは0であり；
L3は
を表し；
oは0または1であり；
G3は−（CH2CH2O）s（CH2）t（CONH）u（CH2CH2O）v（CH2）w−（s、t、vおよびwはそれぞれ互いに独立に、0〜20であり、uは0または1である）を表す。
上記の式§§−（CO）m−L1−L2−§§中の好ましい基L1は以下のものである（rは各場合で互いに独立に、0〜20、好ましくは0〜15、特に好ましくは1〜20、特に好ましくは2〜10の数字を表す）：
L1のさらなる例を表Cに示す（この基をボックスで強調する）。
リンカー部分L1の例を以下の表AおよびA‘に示す。表はさらに、好ましくはL1のこれらの実施例を組み合わせる基L2、ならびに好ましいカップリング点（R1〜R5）およびmについての好ましい値を述べており、これはL1の前のカルボニル基があるかないかである（§−（CO）m−L1−L2−§§参照）。これらのリンカーは好ましくはシステイン残基とカップリングしている。最初の縦列はさらに、当のリンカーを使用するセツキシマブADCについての実施例を述べているが、同様に、各行でADCに他の抗体を適用するL2がスクシンイミドであるまたはこれに由来する場合、このイミドが上記のように完全にまたは部分的に加水分解された開鎖スクシンアミドの形態であってもよい。L1に応じて、開鎖スクシンアミドへのこの加水分解がいくぶん著しいまたは全く存在しない場合がある。
＊R2およびR4はリンカーによって置換されているピロリジン環を形成する。
＊＊特に好ましくは、これらの行に示されるリンカーL1が以下から選択されるリンカーL2に結合している：
および／または
（＃1は結合剤の硫黄原子との結合点を示し、＃2は基L1との結合点を示し、R22は好ましくはCOOHを表す）。本発明による複合体または本発明による複合体の混合物では、結合剤のシステイン残基との結合が、好ましくは80％超、特に好ましくは90％超（各場合でリンカーと結合剤の結合の総数に基づく）の程度まで、特に好ましくは式A7またはA8の2つの構造の1つとして存在する。ここで、式A7またはA8の構造は一般的に一緒に、好ましくは結合剤との結合の数基準で60：40〜40：60の比で存在する。次いで、残りの結合は構造
として存在する。
＊＊：表Aについての注＊＊参照
＊＊＊：この構造L2が存在する場合、同時に以下の式の構造L2が存在してもよい。
対応するリンカーを有する複合体の例は以下の構造を有する（X1、X2、X3およびL1は上に示される意味を有し、L2およびL3はL1と同じ意味を有し、AK1はシステイン残基を介して結合した抗体を表し、nは1〜10の数字である）。特に好ましくは、AK1がヒト、ヒト化もしくはキメラモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、特に抗TWEAKR抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗EGFR抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。TWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する抗TWEAKR抗体、特に抗TWEAKR抗体TPP−2090または抗EGFR抗体セツキシマブもしくはニモツズマブが特に好ましい。
リンカーがリジン側鎖またはリジン残基に結合している場合、これは好ましくは以下の式を有する：
−§−（SG）x−L4−CO−§§
（§は活性化合物分子との結合を表し、
§§は結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
xは0または1を表し、
SGは切断可能基、好ましくは2〜8オリゴペプチド、特に好ましくはジペプチドを表し、
L4は単結合または基−（CO）y−G4−（yは0または1を表し、
G4はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
を表す）。
以下の表Bはリジン残基とのリンカーの実施例を示す。表はさらに、好ましいカップリング点（R1〜R5）を示す。最初の列はさらに、対応するリンカーを使用する実施例の番号を述べている。
対応するリンカーを有する複合体の例は以下の構造を有する（X1、X2、X3およびL4は上に示される意味を有し、AK2はリジン残基を介して結合した抗体を表し、nは1〜10の数字ある）。特に好ましくは、AK2がヒト、ヒト化もしくはキメラモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、特に抗TWEAKR抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗EGFR抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。TWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する抗TWEAKR抗体、特に抗TWEAKR抗体TPP−2090または抗EGFR抗体セツキシマブもしくはニモツズマブが特に好ましい。
基礎構造（i）、（ii）または（iv）（SG1またはSGはカテプシンによって切断され得る基を表し、L1およびL2は上に示される意味を有する）が本発明によりさらに好ましい。
以下の群が特に好ましい：
・−Val−Ala−CONH−（これにより、アラニンのC末端アミドでのアミド結合の切断）
・−NH−Val−Lys−CONH−（リジンのC末端アミドでのアミド結合の切断）
・−NH−Val−Cit−CONH−（シトルリンのC末端アミドでのアミド結合の切断）
・−NH−Phe−Lys−CONH（リジンのC末端アミドでのアミド結合の切断）
・−NH−Ala−Lys−CONH−（リジンのC末端アミドでのアミド結合の切断）
・−NH−Ala−Cit−CONH−（シトルリンのC末端アミドでのアミド結合の切断）
SG1またはSGは好ましくは
（XはHまたは場合により−NHCONH2、−COOH、−OH、NH2、−NH−CNNH2もしくはスルホン酸によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル基を表す）
である。
以下の表Cは、リンカー部分−SG1−L1−または−L1−SG−L1−（SG1およびSGはカテプシンによって切断され得る基である）の例を示している。表Cはさらに、好ましくは−SG1−L1−および−L1−SG−L1−のこれらの実施例を組み合わせる基L2、ならびに好ましいカップリング点（R1〜R5）およびmについての好ましい値、よってL1の前のカルボニル基があるかないか（§−（CO）m−L1−L2−§§参照）を述べている。これらのリンカーは好ましくはシステイン残基とカップリングしている。最初の縦列はさらに、対応するリンカーを使用する、代表的な様式でセツキシマブADCについて示される実施例の番号を述べている。これを他の抗体との対応するADCにも同様に適用する。L1基をボックスで強調している。しかしながら、これらの基L1を、上記式§−（CO）m−L1−L2−§§について示される基L1の1つによって置き換えてもよい。L2がスクシンアミドであるまたはこれに由来する場合、このアミドが上記のように完全にまたは部分的に加水分解された開鎖スクシンアミドの形態であってもよい。
基礎構造（i）を有する複合体の例は以下の構造を有する（X1、X2およびX3は上に示される意味を有し、L4はL1と同じ意味を有し、AK1はシステイン残基を介して結合した抗体を表し、nは1〜10の数字である）。特に好ましくは、AK1が抗TWEAKR抗体、特にTWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する抗TWEAKR抗体、特に抗TWEAKR抗体TPP−2090である。
KSP阻害剤−リンカー中間体および複合体の調製
本発明による複合体は、最初に低分子量KSP阻害剤にリンカーを提供することによって調製する。次いで、こうして得られた中間体を結合剤（好ましくは抗体）と反応させる。
好ましくは、システイン残基とのカップリングのために、以下の化合物の1つを、場合によりこの目的のために部分的に還元された抗体などのシステイン含有結合剤と反応させる：
（Rは−Hまたは−COOHを表し、
Kは場合によりC1〜C6−アルコキシまたは−OHによって置換されている直鎖または分岐C1〜C6アルキルを表し、
X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3およびL4は上記と同じ意味を有する）。
化合物を、例えば、そのトリフルオロ酢酸塩の形態で使用してもよい。例えば、抗体などの結合剤と反応させるために、化合物を好ましくは、結合剤に対して2〜12倍モル過剰で使用する。
好ましくは、リジン残基とのカップリングのために、以下の化合物の1つを抗体などのリジン含有結合剤と反応させる：
（X1、X2、X3は式（II）と同じ意味を有し、L4はL1と同じ意味を有し、L1は上記と同じ意味を有する）。
システイン残基との中間体カップリングについて、反応を以下の通り示すことができる：
他の中間体と他の抗体を同様に反応させることができる。
システイン残基との中間体カップリングについて、反応を以下の通り示すことができる：
本発明によると、これにより以下の複合体が得られる：
リンカーに応じて、スクシンイミド結合ADCを、結合後に、有利な安定性プロファイルを有する開鎖スクシンアミドに変換してもよい。
この反応（開環）は、例えば、攪拌することによって、pH7．5〜9、好ましくはpH8で、25℃〜37℃の温度で行うことができる。好ましい攪拌時間は8〜30時間である。
上記式中、X1、X2、X3は式（II）と同じ意味を有し、SG1およびL1は上記と同じ意味を有し、L2、L3およびL4はL1と同じ意味を有し；RおよびKは上記と同じ意味を有する。AK1はシステイン残基を介してカップリングした抗体であり、AK2はリジン残基を介してカップリングした抗体である。特に好ましくは、AK1およびAK2が抗TWEAKR抗体、特にTWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する抗体、特に抗TWEAKR抗体TPP−2090である。
結合剤
広義には、「結合剤」という用語は、結合剤／活性化合物複合体によって扱われる一定の標的細胞集団に存在する標的分子に結合する分子を意味すると理解される。結合剤という用語は、広義の意味で理解されるべきであり、例えば、レクチン、一定の糖鎖に結合することができるタンパク質、およびリン脂質結合タンパク質も含む。このような結合剤には、例えば、高分子量タンパク質（結合タンパク質）、ポリペプチドまたはペプチド（結合ペプチド）、非ペプチド性（例えば、アプタマー（米国特許第5270163号明細書）Keefe AD．ら、Nat．Rev．Drug Discov．2010；9：537〜550による総説）またはビタミン）および他の全ての細胞結合分子または物質が含まれる。結合タンパク質は、例えば、抗体および抗体フラグメントまたは抗体模倣物（例えば、アフィボディ（affibody）、アドネクチン（adnectin）、アンチカリン（anticalin）、DARPin、アビマー（avimer）、ナノボディ（nanobody）など）である（Gebauer M．ら、Curr．Opinion in Chem． Biol．2009；13：245〜255；Nuttall S．D．ら、Curr．Opinion in Pharmacology 2008；8：608〜617による総説）。結合ペプチドは、例えば、リガンド／受容体対のリガンド、例えば、リガンド／受容体対VEGF／KDRのVEGF、例えば、リガンド／受容体対トランスフェリン／トランスフェリン受容体のトランスフェリン、またはサイトカイン／サイトカイン受容体、例えば、リガンド／受容体対TNFα／TNFα受容体のTNFαである。
文献はまた、有機分子と抗体の共有カップリング（結合）の種々の選択肢を開示している。抗体のシステイン残基の1個もしくは複数の硫黄原子を介した、および／または抗体のリジン基の1個もしくは複数のNH基を介した担毒体と抗体の結合が本発明により好ましい。しかしながら、遊離カルボキシル基を介してまたは抗体の糖残基を介して担毒体を抗体と結合することも可能である。
広義の「標的分子」は、標的細胞集団中に存在し、タンパク質（例えば、成長因子の受容体）または非ペプチド性分子（例えば、糖もしくはリン脂質）であり得る分子を意味すると理解される。これは好ましくは受容体または抗原である。
「細胞外」標的分子という用語は、細胞の外側に位置する、細胞に結合した標的分子、または細胞の外側に位置する標的分子の部分を記載するものである（すなわち、結合剤は無傷細胞上でその細胞外標的分子に結合し得る）。細胞外標的分子は細胞膜に固定されていてもよいし、または細胞膜の成分であってもよい。当業者であれば、細胞外標的分子を同定する方法を知っている。タンパク質については、これは膜中のタンパク質のこれは膜貫通ドメイン（複数可）および配向を決定することにより得る。これらのデータは通常、タンパク質データベース（例えば、SwissProt）に寄託されている。
「がん標的分子」という用語は、同じ組織型の非がん細胞よりも1種または複数のがん細胞種上に豊富に存在する標的分子を記載するものである。好ましくは、がん標的分子は、同じ組織型の非がん細胞と比べて1種または複数のがん細胞種上に選択的に存在し、選択的とは同じ組織型の非がん細胞と比べてがん細胞上に少なくとも2倍の富化を記載する（「選択的がん標的分子」）。がん標的分子の使用によって、本発明による複合体を用いたがん細胞の選択的療法が可能になる。
結合剤を結合を介してリンカーに結合することができる。結合剤の結合は結合剤のヘテロ原子を介し得る。結合に使用することができる結合剤の本発明によるヘテロ原子は硫黄（一実施形態では、結合剤のスルフヒドリル基を介する）、酸素（本発明によると、結合剤のカルボキシルまたはヒドロキシル基による）および窒素（一実施形態では、結合剤の一級もしくは二級アミン基またはアミド基を介する）である。これらのヘテロ原子は天然結合剤中に存在し得る、または化学的方法もしくは分子生物学の方法によって導入される。本発明によると、結合剤と担毒体の結合は、標的分子に関する結合剤の結合活性に軽微な影響しか及ぼさない。好ましい実施形態では、結合が標的分子に関する結合剤の結合活性に影響を及ぼさない。
本発明によると、「抗体」という用語は広義に理解されるべきであり、免疫グロブリン分子、例えば、無傷もしくは改変モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。免疫グロブリン分子は、好ましくは4本のポリペプチド鎖、典型的にはジスルフィド架橋によって連結した2本の重鎖（H鎖）および2本の軽鎖（L鎖）を有する分子を含む。各重鎖は重鎖の可変ドメイン（VHと略される）および重鎖の定常ドメインを含む。重鎖の定常ドメインは、例えば、3つのドメインCH1、CH2およびCH3を含み得る。各軽鎖は可変ドメイン（VLと略される）および定常ドメインを含む。軽鎖の定常ドメインはドメイン（CLと略される）を含む。VHおよびVLドメインを、相補性決定領域（CDRと略される）とも呼ばれる超可変性を有する領域および配列可変性が低い領域（フレームワーク領域、FRと略される）にさらに細分することができる。典型的には、各VHおよびVL領域は、3つのCDRおよび最大4つのFRで構成される。例えば、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序である：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体は任意の適当な種、例えば、ウサギ、ラマ、ラクダ、マウスまたはラットから得ることができる。一実施形態では、抗体がヒトまたはマウス由来である。抗体は、例えば、ヒト、ヒト化またはキメラであり得る。
「モノクローナル」抗体という用語は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、集団の個々の抗体が、少数で存在し得る天然の突然変異を除いて、同一である）から得た抗体を指す。モノクローナル抗体は、高い特異性で単一抗原結合部位を認識する。モノクローナル抗体という用語は、特定の調製方法を指さない。
「無傷」抗体という用語は、軽鎖および重鎖の抗原結合ドメインと定常ドメインの両方を含む抗体を指す。定常ドメインは天然ドメインであっても、またはいくつかの改変アミノ酸位置を有するその変異体であってもよい。
「改変無傷」抗体という用語は、抗体由来でないさらなるポリペプチドまたはタンパク質との共有結合（例えば、ペプチド結合）によって、そのアミノ末端またはカルボキシ末端を介して融合した無傷抗体を指す。さらに、抗体を、規定の位置で、反応性システインを導入して担毒体とのカップリングを容易にするように改変してもよい（JunutulaらNat Biotechnol．2008年8月；26（8）：925〜32参照）。
「ヒト」抗体という用語は、ヒトから得ることができる、または合成ヒト抗体である抗体を指す。「合成」ヒト抗体は、ヒト抗体配列の解析に基づく合成配列からインシリコで部分的にまたは完全に得ることができる抗体である。ヒト抗体は、例えば、ヒト由来の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によってコードされ得る。このような抗体の例は、Soderlindら、Nature Biotech．2000、18：853〜856に見出され得る。
「ヒト化」または「キメラ」抗体という用語は、配列の非ヒト部分およびヒト部分からなる抗体を記載するものである。これらの抗体では、ヒト免疫グロブリン（レシピエント）の配列の部分が非ヒト免疫グロブリン（ドナー）の配列部分によって置き換えられている。多くの場合、ドナーがマウス免疫グロブリンである。ヒト化抗体の場合、レシピエントのCDRのアミノ酸がドナーのアミノ酸によって置き換えられている。時々、フレームワークのアミノ酸も、ドナーの対応するアミノ酸によって置き換えられている。いくつかの場合、ヒト化抗体が、抗体の最適化中に導入されたレシピエント中にもドナー中にも存在しないアミノ酸を含む。キメラ抗体の場合、ドナー免疫グロブリンの可変ドメインがヒト抗体の定常領域と融合している。
本明細書で使用される相補性決定領域（CDR）という用語は、抗原との結合に要求される可変抗体ドメインのアミノ酸を指す。典型的には、各可変領域はCDR1、CDR2およびCDR3と呼ばれる3つのCDR領域を有する。各CDR領域は、Kabatの定義によるアミノ酸および／またはChotiaにより定義される超可変ループのアミノ酸を包含し得る。Kabatによる定義は、例えば、可変軽鎖の約アミノ酸位置24〜34（CDR1）、50〜56（CDR2）および89〜97（CDR3）ならびに可変重鎖の31〜35（CDR1）、50〜65（CDR2）および95〜102（CDR3）の領域を含む（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD．（1991））。Chotiaによる定義は、例えば、可変軽鎖の約アミノ酸位置26〜32（CDR1）、50〜52（CDR2）および91〜96（CDR3）ならびに可変重鎖の26〜32（CDR1）、53〜55（CDR2）および96〜101（CDR3）の領域を含む（ChothiaおよびLesk；J Mol Biol 196：901〜917（1987））。いくつかの場合、CDRがKabatおよびChotiaにより定義されるCDR領域のアミノ酸を含み得る。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに分類することができる。無傷抗体の5つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが存在し、これらのいくつかをさらなるサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に分けることができる。異なるクラスに対応する、重鎖の定常ドメインを［アルファ／α］、［デルタ／δ］、［イプシロン／ε］、［ガンマ／γ］および［ミュー／μ］と呼ぶ。抗体の三次元構造とサブユニット構造の両方が知られている。
抗体／免疫グロブリンの「機能的フラグメント」または「抗原結合抗体フラグメント」は、抗体／免疫グロブリンの抗原結合ドメインをまだ含む抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えば、IgGの可変ドメイン）として定義される。抗体の「抗原結合ドメイン」は、典型的には抗体の1つまたは複数の超可変領域、例えば、CDR、CDR2および／またはCDR3領域を含む。しかしながら、抗体の「フレームワーク」または「骨格」領域は、抗体と抗原の結合中にも役割を果たし得る。フレームワーク領域はCDRの骨格を形成する。好ましくは、抗原結合ドメインは、可変軽鎖の少なくともアミノ酸4〜103および可変重鎖のアミノ酸5〜109、より好ましくは可変軽鎖のアミノ酸3〜107および可変重鎖の4〜111、特に好ましくは完全な可変軽鎖および重鎖、すなわち、VLのアミノ酸1〜109およびVHの1〜113を含む（国際公開第97／08320号パンフレットによる番号付け）。
本発明の「機能的フラグメント」または「抗原結合抗体フラグメント」は、非決定的に、Fab、Fab’、F（ab’）2およびFvフラグメント、ダイアボディ（diabody）、単一ドメイン抗体（DAb）、直鎖状抗体、抗体の個々の鎖（単鎖Fv、scFvと略される）；ならびに多重特異性抗体、例えば、抗体フラグメントから形成される抗体フラグメント二重および三重特異性抗体を包含する（C．A．K Borrebaeck、編者（1995）Antibody Engineering（Breakthroughs in Molecular Biology）、Oxford University Press；R．Kontermann ＆ S．Duebel、編者（2001）Antibody Engineering（Springer Laboratory Manual）、Springer Verlag）。「多重特異性」または「多機能性」抗体以外の抗体は、同一の結合部位を有するものである。多重特異性抗体は抗原の異なるエピトープに特異的であり得る、または2つ以上の抗原のエピトープに特異的であり得る（例えば、国際公開第93／17715号パンフレット；国際公開第92／08802号パンフレット；国際公開第91／00360号パンフレット；国際公開第92／05793号パンフレット；Tuttら、1991、J．Immunol．147：60 69；米国特許第4474893号明細書；第4714681号明細書；第4925648号明細書；第5573920号明細書；第5601819号明細書；またはKostelnyら、1992、J．Immunol．148：1547 1553参照）。Ch1ドメインとCLドメインとの間で生じる分子間ジスルフィド相互作用の数を減少させるまたは完全に防ぐことができるように、F（ab’）2またはFab分子を構築することができる。
「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を指す。エピトープ決定基は通常、アミノ酸もしくは糖鎖またはこれらの組み合わせなどの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性も有する。
「機能的フラグメント」または「抗原結合抗体フラグメント」を、共有結合（例えば、ペプチド結合）によって、そのアミノ末端またはカルボキシル末端を介して、抗体に由来しない別のポリペプチドまたはタンパク質と融合してもよい。さらに、抗体および抗原結合フラグメントを、担毒体とのカップリングを容易にするために、規定の位置で反応性システインを導入して改変してもよい（JunutulaらNat Biotechnol．2008年8月；26（8）：925〜32参照）。
ポリクローナル抗体は、当業者に既知の方法によって調製することができる。モノクローナル抗体は、当業者に既知の方法によって調製することができる（KohlerおよびMilstein、Nature、256、495〜497、1975）。ヒトおよびヒト化モノクローナル抗体は、当業者に既知の方法によって調製することができる（Olssonら、Meth Enzymol．92、3〜16またはCabillyらの米国特許第4816567号明細書またはBossらの米国特許第4816397号明細書）。
当業者であれば、例えば、トランスジェニックマウス（N LonbergおよびD Huszar、Int Rev Immunol．1995；13（1）：65〜93）またはファージディスプレイ技術（Clacksonら、Nature．1991年8月15日；352（6336）：624〜8）などによって、ヒト抗体およびそのフラグメントを調製する様々な方法を知っている。本発明の抗体は、例えば、多数の健常者から収集した多様な抗体のアミノ酸配列からなる組換え抗体ライブラリーから得ることができる。抗体を既知の組換えDNA技術によって作製してもよい。抗体の核酸配列は日常的な配列決定によって得ることができる、または公に入手可能なデータベースから入手可能である。
「単離」抗体または結合剤を精製して細胞の他の成分を除去した。診断または治療的使用を妨害し得る細胞の汚染成分は、例えば、酵素、ホルモンまたは細胞の他のペプチド性もしくは非ペプチド性成分である。好ましい抗体または結合剤は、抗体または結合剤に関して95重量％超の程度まで精製したものである（例えば、Lowry法、UV−Vis分光法またはSDSキャピラリーゲル電気泳動によって測定される）。さらに、アミノ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15個のアミノ酸を決定することが可能となる程度まで精製した、または均質（均質は還元もしくは非還元条件下でSDS−PAGEによって決定される）まで精製した抗体（検出はCoomassie Blau染色または好ましくは銀呈色によって決定され得る）。しかしながら、抗体は通常は1つまたは複数の精製ステップによって調製する。
「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、所定の抗原／標的分子に結合する抗体または結合剤を指す。抗体または結合剤の特異的結合は、典型的には少なくとも10−7Mの親和性を有する抗体または結合剤（Kd値として；すなわち、好ましくは10−7Mより小さいKd値を有するもの）を記載するものであり、抗体または結合剤は所定の抗原／標的分子または密接に関連する抗原／標的分子ではない非特異的抗原／標的分子（例えば、ウシ血清アルブミンまたはカゼイン）に対するよりも少なくとも2倍高い所定の抗原／標的分子に対する親和性を有する。抗体は、好ましくは少なくとも10−7M（Kd値として；換言すれば、好ましくは10−7Mより小さいKd値を有するもの）、好ましくは少なくとも10−8M、より好ましくは10−9〜10−11Mの範囲の親和性を有する。Kd値は例えば、表面プラズモン共鳴分光法によって決定することができる。
本発明の抗体−薬物複合体も同様にこれらの範囲の親和性を示す。親和性は、好ましくは薬物の結合によって実質的に影響されない（一般に、親和性は1桁未満低下する、換言すれば、例えば、最大でも10−8Mから10−7Mである）。
本発明により使用される抗体はまた、好ましくは高い選択性についても注目に値する。本発明の抗体が独立した他の抗原、例えば、ヒト血清アルブミンに対するよりも、少なくとも2倍、好ましくは5倍またはより好ましくは10倍優れた標的タンパク質に対する親和性を示す場合に高い選択性が存在する（親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴分光法によって測定することができる）。
さらに、使用される本発明の抗体は、好ましくは交差反応性である。前臨床試験、例えば、毒性または活性試験（例えば、異種移植マウスにおける）を容易にし、よりうまく解釈するために、本発明により使用される抗体がヒト標的タンパク質に結合するだけでなく、試験に使用される種の種標的タンパク質にも結合すれば有利となる。一実施形態では、本発明により使用される抗体が、ヒト標的タンパク質に加えて、少なくとも1種のさらなる種の標的タンパク質に対して交差反応性である。毒性および活性試験のために、齧歯動物、イヌおよびヒト以外の霊長類の科の種を使用することが好ましい。好ましい齧歯動物種はマウスおよびラットである。好ましいヒト以外の霊長類はアカゲザル、チンパンジーおよびオナガマカクである。
一実施形態では、本発明により使用される抗体が、ヒト標的タンパク質に加えて、マウス、ラットおよびオナガマカク（カニクイザル（Macaca fascicularis））からなる群から選択される少なくとも1種のさらなる種の標的タンパク質に対して交差反応性である。ヒト標的タンパク質に加えて、少なくともマウス標的タンパク質に対して交差反応性である本発明により使用される抗体が特に好ましい。さらなるヒト以外の種の標的タンパク質に対するその親和性が、ヒト標的タンパク質に対する親和性と、50倍以下、さらに特に10倍以下で異なる交差反応性抗体が好ましい。
がん標的分子に向けた抗体
結合剤、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントが向けられている標的分子は、好ましくはがん標的分子である。「がん標的分子」という用語は、同じ組織型の非がん細胞よりも1種または複数のがん細胞種上に豊富に存在する標的分子を記載するものである。好ましくは、がん標的分子は、同じ組織型の非がん細胞と比べて1種または複数のがん細胞種上に選択的に存在し、選択的とは同じ組織型の非がん細胞と比べてがん細胞上に少なくとも2倍の富化を記載する（「選択的がん標的分子」）。がん標的分子の使用によって、本発明による複合体を用いたがん細胞の選択的療法が可能になる。
抗原、例えば、がん細胞抗原に対して特異的な抗体は、当業者が精通している（例えば、組換体発現など）または商業的に獲得することができる（例えば、Merck KGaA、ドイツ製として）方法によって、当業者によって調製され得る。がん治療で知られている商業的に入手可能な抗体の例としては、Erbitux（登録商標）（セツキシマブ、Merck KGaA）、Avastin（登録商標）（ベバシズマブ、Roche）およびHerceptin（登録商標）（トラスツズマブ、Genentech）がある。トラスツズマブは、細胞ベースのアッセイ（Kd＝5nM）で高い親和性でヒト上皮成長受容体の細胞外ドメインに結合するIgG1κ型の組換えヒト化モノクローナル抗体である。抗体はCHO細胞で組換えで作製される。
好ましい実施形態では、標的分子が選択的がん標的分子である。
特に好ましい実施形態では、標的分子がタンパク質である。
一実施形態では、標的分子が細胞外標的分子である。好ましい実施形態では、細胞外標的分子がタンパク質である。
がん標的分子は当業者に知られている。これらの例を以下に列挙する。
がん標的分子の例は以下である：
（1）EGF受容体（NCBI参照配列NP＿005219．2）、配列番号213（1210個アミノ酸）：
＞gi｜29725609｜ref｜NP_005219．2｜EGFR受容体前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA
細胞外ドメインを下線でマークしている。
（2）メソテリン（SwissProt参照Q13421−3）、配列番号214（622個アミノ酸）：
＞sp｜Q13421−3｜MSLN_HUMANメソテリンのアイソフォーム2 OS＝ヒト（Homo sapiens）GN＝MSLN
MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISS
LSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPL
DLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEA
DVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTW
SVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKT
ACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELY
PQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVK
GRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKA
RLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQ
KLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGT
PCLLGPGPVLTVLALLLASTLA
メソテリンはアミノ酸296〜598によってコードされている。アミノ酸37〜286は巨核球増強因子をコードしている。メソテリンは、GPIアンカーを介して細胞膜に固定されており、細胞外に局在している。
（3）カルボアンヒドラーゼ（carboanhydrase）IX（SwissProt参照Q16790）、配列番号215（459個アミノ酸）：
＞sp｜Q16790｜CAH9_HUMAN炭酸脱水酵素9 OS＝ヒト（Homo sapiens） GN＝CA9 PE＝1 SV＝2
MAPLCPSPWLPLLIPAPAPGLTVQLLLSLLLLVPVHPQRLPRMQEDSPLGGGSSGEDDPL
GEEDLPSEEDSPREEDPPGEEDLPGEEDLPGEEDLPEVKPKSEEEGSLKLEDLPTVEAPG
DPQEPQNNAHRDKEGDDQSHWRYGGDPPWPRVSPACAGRFQSPVDIRPQLAAFCPALRPL
ELLGFQLPPLPELRLRNNGHSVQLTLPPGLEMALGPGREYRALQLHLHWGAAGRPGSEHT
VEGHRFPAEIHVVHLSTAFARVDEALGRPGGLAVLAAFLEEGPEENSAYEQLLSRLEEIA
EEGSETQVPGLDISALLPSDFSRYFQYEGSLTTPPCAQGVIWTVFNQTVMLSAKQLHTLS
DTLWGPGDSRLQLNFRATQPLNGRVIEASFPAGVDSSPRAAEPVQLNSCLAAGDILALVF
GLLFAVTSVAFLVQMRRQHRRGTKGGVSYRPAEVAETGA
細胞外ドメインを下線でマークしている。
（4）C4．4a（NCBI参照配列NP＿055215．2；同義語LYPD3）、配列番号216（346個アミノ酸）：
＞gi｜93004088｜ref｜NP_055215．2｜ly6／PLAURドメイン含有タンパク質3−前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MDPARKAGAQAMIWTAGWLLLLLLRGGAQALECYSCVQKADDGCSPNKMKTVKCAPGVDVCTEAVGAVETIHGQFSLAVRGCGSGLPGKNDRGLDLHGLLAFIQLQQCAQDRCNAKLNLTSRALDPAGNESAYPPNGVECYSCVGLSREACQGTSPPVVSCYNASDHVYKGCFDGNVTLTAANVTVSLPVRGCVQDEFCTRDGVTGPGFTLSGSCCQGSRCNSDLRNKTYFSPRIPPLVRLPPPEPTTVASTTSVTTSTSAPVRPTSTTKPMPAPTSQTPRQGVEHEASRDEEPRLTGGAAGHQDRSNSGQYPAKGGPQQPHNKGCVAPTAGLAALLLAVAAGVLL
成熟細胞外ドメインを下線でマークしている。
（5）CD52（NCBI参照配列NP＿001794．2）、配列番号217
＞gi｜68342030｜ref｜NP_001794．2｜CAMPATH−1抗原前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MKRFLFLLLTISLLVMVQIQTGLSGQNDTSQTSSPSASSNISGGIFLFFVANAIIHLFCFS
（6）Her2（NCBI参照配列NP＿004439．2）、配列番号218
＞gi｜54792096｜ref｜NP_004439．2｜受容体チロシンプロテインキナーゼerbB−2アイソフォームa［ヒト（Homo sapiens）］
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV
（7）CD20（NCBI参照配列NP＿068769．2）、配列番号219
＞gi｜23110987｜ref｜NP_068769．2｜Bリンパ球抗原CD20［ヒト（Homo sapiens）］
MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP
（8）リンパ球活性化抗原CD30（SwissProt ID P28908）、配列番号220
＞gi｜68348711｜ref｜NP_001234．2｜腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー8アイソフォーム1前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MRVLLAALGLLFLGALRAFPQDRPFEDTCHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQCEPDYYLDEADRCTACVTCSRDDLVEKTPCAWNSSRVCECRPGMFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSRARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLCHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
（9）リンパ球接着分子CD22（SwissProt ID P20273）、配列番号221
＞gi｜157168355｜ref｜NP_001762．2｜B細胞受容体CD22アイソフォーム1前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MHLLGPWLLLLVLEYLAFSDSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFHNPEYNKNTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNKNCTLSIHPVHLNDSGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPFPPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPMRQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQWSHHGKIVTCQLQDADGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCEVSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTKDQSGKYCCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGSQVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILPWHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNPMPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNTTIACAACNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLLGKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLYAPRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFDWNNQSLPYHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRSPLSTLTVYYSPETIGRRVAVGLGSCLAILILAICGLKLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH
（10）骨髄性細胞表面抗原CD33（SwissProt ID P20138）、配列番号222
＞gi｜130979981｜ref｜NP_001763．3｜骨髄性細胞表面抗原CD33アイソフォーム1前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MPLLLLLPLLWAGALAMDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYSEVRTQ
（11）膜貫通糖タンパク質NMB（SwissProt ID Q14956）、配列番号223
＞gi｜52694752｜ref｜NP_001005340．1｜膜貫通糖タンパク質NMBアイソフォームa前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MECLYYFLGFLLLAARLPLDAAKRFHDVLGNERPSAYMREHNQLNGWSSDENDWNEKLYPVWKRGDMRWKNSWKGGRVQAVLTSDSPALVGSNITFAVNLIFPRCQKEDANGNIVYEKNCRNEAGLSADPYVYNWTAWSEDSDGENGTGQSHHNVFPDGKPFPHHPGWRRWNFIYVFHTLGQYFQKLGRCSVRVSVNTANVTLGPQLMEVTVYRRHGRAYVPIAQVKDVYVVTDQIPVFVTMFQKNDRNSSDETFLKDLPIMFDVLIHDPSHFLNYSTINYKWSFGDNTGLFVSTNHTVNHTYVLNGTFSLNLTVKAAAPGPCPPPPPPPRPSKPTPSLATTLKSYDSNTPGPAGDNPLELSRIPDENCQINRYGHFQATITIVEGILEVNIIQMTDVLMPVPWPESSLIDFVVTCQGSIPTEVCTIISDPTCEITQNTVCSPVDVDEMCLLTVRRTFNGSGTYCVNLTLGDDTSLALTSTLISVPDRDPASPLRMANSALISVGCLAIFVTVISLLVYKKHKEYNPIENSPGNVVRSKGLSVFLNRAKAVFFPGNQEKDPLLKNQEFKGVS
（12）接着分子CD56（SwissProt ID P13591）、配列番号224
＞gi｜94420689｜ref｜NP_000606．3｜神経細胞接着分子1アイソフォーム1［ヒト（Homo sapiens）］
MLQTKDLIWTLFFLGTAVSLQVDIVPSQGEISVGESKFFLCQVAGDAKDKDISWFSPNGEKLTPNQQRISVVWNDDSSSTLTIYNANIDDAGIYKCVVTGEDGSESEATVNVKIFQKLMFKNAPTPQEFREGEDAVIVCDVVSSLPPTIIWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNYLQIRGIKKTDEGTYRCEGRILARGEINFKDIQVIVNVPPTIQARQNIVNATANLGQSVTLVCDAEGFPEPTMSWTKDGEQIEQEEDDEKYIFSDDSSQLTIKKVDKNDEAEYICIAENKAGEQDATIHLKVFAKPKITYVENQTAMELEEQVTLTCEASGDPIPSITWRTSTRNISSEEKTLDGHMVVRSHARVSSLTLKSIQYTDAGEYICTASNTIGQDSQSMYLEVQYAPKLQGPVAVYTWEGN
QVNITCEVFAYPSATISWFRDGQLLPSSNYSNIKIYNTPSASYLEVTPDSENDFGNYNCTAVNRIGQESLEFILVQADTPSSPSIDQVEPYSSTAQVQFDEPEATGGVPILKYKAEWRAVGEEVWHSKWYDAKEASMEGIVTIVGLKPETTYAVRLAALNGKGLGEISAASEFKTQPVQGEPSAPKLEGQMGEDGNSIKVNLIKQDDGGSPIRHYLVRYRALSSEWKPEIRLPSGSDHVMLKSLDWNAEYEVYVVAENQQGKSKAAHFVFRTSAQPTAIPANGSPTSGLSTGAIVGILIVIFVLLLVVVDITCYFLNKCGLFMCIAVNLCGKAGPGAKGKDMEEGKAAFSKDESKEPIVEVRTEEERTPNHDGGKHTEPNETTPLTEPEKGPVEAKPECQETETKPAPAEVKTVPNDATQTKENESKA
（13）表面分子CD70（SwissProt ID P32970）、配列番号225
＞gi｜4507605｜ref｜NP_001243．1｜CD70抗原［ヒト（Homo sapiens）］
MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP
（14）表面分子CD74（SwissProt ID P04233）、配列番号226
＞gi｜10835071｜ref｜NP_004346．1｜HLAクラスII組織適合性抗原γ鎖アイソフォームb［ヒト（Homo sapiens）］
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPM
（15）Bリンパ球抗原CD19（SwissProt ID P15391）、配列番号227
＞gi｜296010921｜ref｜NP_001171569．1｜Bリンパ球抗原CD19アイソフォーム1前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLAGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR
（16）表面タンパク質ムチンー1（SwissProt ID P15941）、配列番号228
＞gi｜65301117｜ref｜NP_002447．4｜ムチンー1アイソフォーム1前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNALSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL
（17）表面タンパク質CD138（SwissProt ID P18827）、配列番号229
＞gi｜29568086｜ref｜NP_002988．3｜シンデカン−1前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MRRAALWLWLCALALSLQPALPQIVATNLPPEDQDGSGDDSDNFSGSGAGALQDITLSQQTPSTWKDTQLLTAIPTSPEPTGLEATAASTSTLPAGEGPKEGEAVVLPEVEPGLTAREQEATPRPRETTQLPTTHQASTTTATTAQEPATSHPHRDMQPGHHETSTPAGPSQADLHTPHTEDGGPSATERAAEDGASSQLPAAEGSGEQDFTFETSGENTAVVAVEPDRRNQSPVDQGATGASQGLLDRKEVLGGVIAGGLVGLIFAVCLVGFMLYRMKKKDEGSYSLEEPKQANGGAYQKPTKQEEFYA
（18）インテグリンαV（Genbank寄託番号：NP＿002201．1）、配列番号230
＞gi｜4504763｜ref｜NP_002201．1｜インテグリンαVアイソフォーム1前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MAFPPRRRLRLGPRGLPLLLSGLLLPLCRAFNLDVDSPAEYSGPEGSYFGFAVDFFVPSASSRMFLLVGAPKANTTQPGIVEGGQVLKCDWSSTRRCQPIEFDATGNRDYAKDDPLEFKSHQWFGASVRSKQDKILACAPLYHWRTEMKQEREPVGTCFLQDGTKTVEYAPCRSQDIDADGQGFCQGGFSIDFTKADRVLLGGPGSFYWQGQLISDQVAEIVSKYDPNVYSIKYNNQLATRTAQAIFDDSYLGYSVAVGDFNGDGIDDFVSGVPRAARTLGMVYIYDGKNMSSLYNFTGEQMAAYFGFSVAATDINGDDYADVFIGAPLFMDRGSDGKLQEVGQVSVSLQRASGDFQTTKLNGFEVFARFGSAIAPLGDLDQDGFNDIAIAAPYGGEDKKGIVYIFNGRSTGLNAVPSQILEGQWAARSMPPSFGYSMKGATDIDKNGYPDLIVGAFGVDRAILYRARPVITVNAGLEVYPSILNQDNKTCSLPGTALKVSCFNVRFCLKADGKGVLPRKLNFQVELLLDKLKQKGAIRRALFLYSRSPSHSKNMTISRGGLMQCEELIAYLRDESEFRDKLTPITIFMEYRLDYRTAADTTGLQPILNQFTPANISRQAHILLDCGEDNVCKPKLEVSVDSDQKKIYIGDDNPLTLIVKAQNQGEGAYEAELIVSIPLQADFIGVVRNNEALARLSCAFKTENQTRQVVCDLGNPMKAGTQLLAGLRFSVHQQSEMDTSVKFDLQIQSSNLFDKVSPVVSHKVDLAVLAAVEIRGVSSPDHIFLPIPNWEHKENPETEEDVGPVVQHIYELRNNGPSSFSKAMLHLQWPYKYNNNTLLYILHYDIDGPMNCTSDMEINPLRIKISSLQTTEKNDTVAGQGERDHLITKRDLALSEGDIHTLGCGVAQCLKIVCQVGRLDRGKSAILYVKSLLWTETFMNKENQNHSYSLKSSASFNVIEFPYKNLPIEDITNSTLVTTNVTWGIQPAPMPVPVWVIILAVLAGLLLLAVLVFVMYRMGFFKRVRPPQEEQEREQLQPHENGEGNSET
（19）奇形癌腫由来成長因子1タンパク質TDGF1（Genbank Accession寄託番号：NP＿003203．1）、配列番号231
＞gi｜4507425｜ref｜NP_003203．1｜奇形癌腫由来成長因子1アイソフォーム1前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYY
（20）前立腺特異的膜抗原PSMA（Swiss Prot ID：Q04609）、配列番号232
＞gi｜4758398｜ref｜NP_004467．1｜グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ2アイソフォーム1［ヒト（Homo sapiens）］
MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
（21）チロシンプロテインキナーゼEPHA2（Swiss Prot ID：P29317）、配列番号233
＞gi｜32967311｜ref｜NP_004422．2｜エフリンA型受容体2前駆体［ヒト（Homo sapiens）］
MELQAARACFALLWGCALAAAAAAQGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNLAVIGGVAVGVVLLLVLAGVGFFIHRRRKNQRARQSPEDVYFSKSEQLKPLKTYVDPHTYEDPNQAVLKFTTEIHPSCVTRQKVIGAGEFGEVYKGMLKTSSGKKEVPVAIKTLKAGYTEKQRVDFLGEAGIMGQFSHHNIIRLEGVISKYKPMMIITEYMENGALDKFLREKDGEFSVLQLVGMLRGIAAGMKYLANMNYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEATYTTSGGKIPIRWTAPEAISYRKFTSASDVWSFGIVMWEVMTYGERPYWELSNHEVMKAINDGFRLPTPMDCPSAIYQLMMQCWQQERARRPKFADIVSILDKLIRAPDSLKTLADFDPRVSIRLPSTSGSEGVPFRTVSEWLESIKMQQYTEHFMAAGYTAIEKVVQMTNDDIKRIGVRLPGHQKRIAYSLLGLKDQVNTVGIPI
（22）表面タンパク質SLC44A4（Genbank寄託番号：NP＿001171515）、配列番号234
＞gi｜295849282｜ref｜NP_001171515．1｜コリントランスポーター様タンパク質4アイソフォーム2［ヒト（Homo sapiens）］
MGGKQRDEDDEAYGKPVKYDPSFRGPIKNRSCTDVICCVLFLLFILGYIVVGIVAWLYGDPRQVLYPRNSTGAYCGMGENKDKPYLLYFNIFSCILSSNIISVAENGLQCPTPQTVITSLQQELCPSFLLPSAPALGRCFPWTNVTPPALPGITNDTTIQQGISGLIDSLNARDISVKIFEDFAQSWYWILVALGVALVLSLLFILLLRLVAGPLVLVLILGVLGVLAYGIYYCWEEYRVLRDKGASISQLGFTTNLSAYQSVQETWLAALIVLAVLEAILLLMLIFLRQRIRIAIALLKEASKAVGQMMSTMFYPLVTFVLLLICIAYWAMTALYLATSGQPQYVLWASNISSPGCEKVPINTSCNPTAHLVNSSCPGLMCVFQGYSSKGLIQRSVFNLQIYGVLGLFWTLNWVLALGQCVLAGAFASFYWAFHKPQDIPTFPLISAFIRTLRYHTGSLAFGALILTLVQIARVILEYIDHKLRGVQNPVARCIMCCFKCCLWCLEKFIKFLNRNAYIMIAIYGKNFCVSAKNAFMLLMRNIVRVVVLDKVTDLLLFFGKLLVVGGVGVLSFFFFSGRIPGLGKDFKSPHLNYYWLPIMTSILGAYVIASGFFSVFGMCVDTLFLCFLEDLERNNGSLDRPYYMSKSLLKILGKKNEAPPDNKKRKK
（23）表面タンパク質BMPR1B（SwissProt：O00238）
（24）輸送タンパク質SLC7A5（SwissProt：Q01650）
（25）上皮前立腺抗原STEAP1（SwissProt：Q9UHE8）
（26）卵巣癌抗原MUC16（SwissProt：Q8WXI7）
（27）輸送タンパク質SLC34A2（SwissProt：O95436）
（28）表面タンパク質SEMA5b（SwissProt：Q9P283）
（29）表面タンパク質LYPD1（SwissProt：Q8N2G4）
（30）エンドセリン受容体B型EDNRB（SwissProt：P24530）
（31）リングフィンガータンパク質RNF43（SwissProt：Q68DV7）
（32）前立腺癌関連タンパク質STEAP2（SwissProt：Q8NFT2）
（33）カチオンチャネルTRPM4（SwissProt：Q8TD43）
（34）補体受容体CD21（SwissProt：P20023）
（35）B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質CD79b（SwissProt：P40259）
（36）細胞接着抗原CEACAM6（SwissProt：P40199）
（37）ジペプチダーゼDPEP1（SwissProt：P16444）
（38）インターロイキン受容体IL20Rα（SwissProt：Q9UHF4）
（39）プロテオグリカンBCAN（SwissProt：Q96GW7）
（40）エフリン受容体EPHB2（SwissProt：P29323）
（41）前立腺幹細胞関連タンパク質PSCA（Genbank寄託番号：NP＿005663．2）
（42）表面タンパク質LHFPL3（SwissProt：Q86UP9）
（43）受容体タンパク質TNFRSF13C（SwissProt：Q96RJ3）
（44）B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質CD79a（SwissProt：P11912）
（45）受容体タンパク質CXCR5（SwissProt：P32302）
（46）イオンチャネルP2X5（SwissProt：Q93086）
（47）リンパ球抗原CD180（SwissProt：Q99467）
（48）受容体タンパク質FCRL1（SwissProt：Q96LA6）
（49）受容体タンパク質FCRL5（SwissProt：Q96RD9）
（50）MHCクラスII分子Ia抗原HLA−DOB（Genbank寄託番号：NP＿002111．1）
（51）T細胞タンパク質VTCN1（SwissProt：Q7Z7D3）
（52）TWEAKR（配列番号169（タンパク質）；配列番号170（DNA）。
（53）リンパ球抗原CD37（Swiss Prot：P11049）
（54）FGF受容体2；FGFR2（遺伝子ID：2263；公式記号：FGFR2）。FGFR2受容体は、異なるスプライスバリアント（α、β、IIIb、IIIc）で生じる。全てのスプライスバリアントが標的分子として作用し得る。
（55）膜貫通糖タンパク質B7H3（CD276；遺伝子ID：80381。
（56）B細胞受容体BAFFR（CD268；遺伝子ID：115650）
（57）受容体タンパク質ROR1（遺伝子ID：4919）
（58）表面受容体IL3RA（CD123；遺伝子ID：3561）
（59）CXCケモカイン受容体CXCR5（CD185；遺伝子ID643）
（60）受容体タンパク質シンシチン（遺伝子ID：30816）
本発明の好ましい主題では、がん標的分子が、がん標的分子（1）〜（60）、特に（1）、（6）および（52）からなる群から選択される。
本発明のさらに特に好ましい主題では、結合剤が、がん標的分子（1）〜（60）、特に（1）、（6）および（52）からなる群から選択される細胞外がん標的分子に結合する。
本発明のさらに特に好ましい主題では、結合剤が、がん標的分子（1）〜（60）、特に（1）、（6）および（52）からなる群から選択される細胞外がん標的分子に特異的に結合する。好ましい実施形態では、結合剤が、標的細胞上のその細胞外標的分子に結合した後、結合の結果として標的細胞によって内部移行する。これにより、標的細胞によって取り込まれる、免疫複合体またはADCとなり得る結合剤／活性化合物結合が引き起こされる。次いで、結合剤が、好ましくは細胞内で、好ましくはリソソームで（lysosomally）プロセシングされる。
一実施形態では、結合剤が結合タンパク質である。好ましい実施形態では、結合剤が抗体、抗原結合抗体フラグメント、多重特異性抗体または抗体模倣物である。
好ましい抗体模倣物はアフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、DARPin、アビマーまたはナノボディである。好ましい多重特異性抗体は二重特異性および三重特異性抗体である。
好ましい実施形態では、結合剤が抗原結合抗体フラグメント、より好ましくは単離抗体または単離抗原結合抗体フラグメントである。
好ましい抗原結合抗体フラグメントは、Fab、Fab’、F（ab’）2およびFvフラグメント、ダイアボディ、DAb、直鎖状抗体およびscFvである。Fab、ダイアボディおよびscFvが特に好ましい。
特に好ましい実施形態では、結合剤が抗体である。モノクローナル抗体またはその抗原結合抗体フラグメントが特に好ましい。ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体またはその抗原結合抗体フラグメントがさらに特に好ましい。
がん標的分子に結合する抗体または抗原結合抗体フラグメントは、例えば、化学合成または組換体発現などの既知の方法を用いて当業者によって調製され得る。がん標的分子のための結合剤は商業的に獲得することができる、または例えば、化学合成または組換体発現などの既知の方法を用いて当業者によって調製され得る。抗体または抗原結合抗体フラグメントを調製するためのさらなる方法は、国際公開第2007／070538号パンフレット（22頁の「抗体」参照）に記載されている。当業者であれば、ファージディスプレイライブラリー（例えば、Morphosys HuCAL Gold）などの方法を、抗体または抗原結合抗体フラグメントを発見するためにどのように編集および使用することができるか知っている（国際公開第2007／070538号パンフレット、24ff頁および70頁のAK実施例1、72頁のAK実施例2参照）。B細胞からのDNAライブラリーを使用する抗体を調製するためのさらなる方法は、例えば、26頁（国際公開第2007／070538号パンフレット）に記載されている。ヒト化抗体のための方法は、国際公開第2007070538号パンフレットの30〜32頁、および詳細にはQueenら、Pros．Natl．Acad．Sci．USA 86：10029〜10033、1989または国際公開第90／0786号パンフレットに記載されている。さらに、一般的にタンパク質および特に抗体の組換体発現のための方法は当業者に知られている（例えば、BergerおよびKimrnel（Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology、第152巻、Academic Press，Inc．）；Sambrookら（Molecular Cloning：A Laboratory Manual，（第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor、N．Y．；1989）第1〜3巻）；Current Protocols in Molecular Biology（F．M．Ausabelら［編者］、Current Protocols、Green Publishing Associates，Inc．／ John Wiley & Sons，Inc．）；Harlowら（Monoclonal Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1988、Paul［編者］）；Fundamental Immunology（Lippincott Williams & Wilkins（1998））；およびHarlowら（Using Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1998））参照）。当業者であれば、タンパク質／抗体の発現に必要な対応するベクター、プロモーターおよびシグナルペプチドを知っている。通常の方法は、国際公開第2007／070538号パンフレットの41〜45頁にも記載されている。IgG1抗体を調製する方法は、例えば、国際公開第2007／070538号パンフレットの74ff頁の実施例6に記載されている。抗原に結合した後の抗体の内部移行の決定を可能にする方法は当業者に知られており、例えば、国際公開第2007／070538号パンフレットの80頁に記載されている。当業者は、異なる標的分子特異性を有する抗体を調製するために、同様にカルボアンヒドラーゼIX抗体を調製するために使用した国際公開第2007／070538号パンフレットに記載される方法を使用することができる。
抗EGFR抗体
がん標的分子EGFRに結合する抗体の例としては、セツキシマブ（INN番号7906）、パニツムマブ（INN番号8499）およびニモツズマブ（INN番号8545）がある。セツキシマブ（Drug Bank寄託番号DB00002）は、SP2／0マウス骨髄腫細胞で産生され、ImClone Systems Inc／Merck KgaA／Bristol−Myers Squibb Coによって販売されているキメラ抗EGFR1抗体である。セツキシマブは、野生型K−Ras遺伝子による転移性の、EGFR発現している結腸直腸癌の治療に必要を示されている。セツキシマブは10−10Mの親和性を有する。
配列：
セツキシマブ軽鎖（κ）、配列番号235：
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
セツキシマブ重鎖、配列番号236：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
パニツムマブ（INN番号8499）（Drug Bank寄託番号DB01269）は、ヒトEGF受容体1に特異的に結合し、Abgenix／Amgenによって販売されている組換えモノクローナルヒトIgG2抗体である。パニツムマブは、トランスジェニックマウス（XenoMouse）の免疫化に由来するものである。これらのマウスは、ヒト免疫グロブリン（軽鎖および重鎖）を産生することができる。EGFRに対する抗体を産生する特異的B細胞クローンを選択し、このクローンをCHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）で不死化した。これらの細胞をここで100％ヒト抗体の作製に使用する。パニツムマブは、フルオロピリミジン、オキサリプラチンおよびイリノテカンによる化学療法的治療に耐性のEGFRを発現している、転移性結腸直腸癌の治療に必要を示されている。パニツムマブは10−11Mの親和性を有する。
配列：
パニツムマブ軽鎖（κ）、配列番号237：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
パニツムマブ重鎖、配列番号238：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ニモツズマブ（INN番号8545）（欧州特許第00586002号明細書、欧州特許第00712863号明細書）は、ヒトEGF受容体1に特異的に結合し、YM BioScienecs Inc．（Mississauga Canada）によって販売されているヒト化モノクローナルIgG1抗体である。これは非分泌NSO細胞（哺乳動物細胞株）で産生される。ニモツズマブは、頭頚部腫瘍、高度悪性星状細胞腫および多形性膠芽腫（欧州および米国ではない）ならびに膵癌（Orphan drug、EMA）の治療用に承認されている。ニモツズマブは10−8Mの親和性を有する。
ニモツズマブ軽鎖、配列番号239：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ニモツズマブ重鎖、配列番号240：
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
EGFR抗体のさらなる実施例は以下の通りである：
・ザルツムマブ／2F8／HuMax−EGFr、Genmab A／S製（国際公開第02／100348号パンフレット、国際公開第2004／056847号パンフレット、INN番号8605）
・ネシツムマブ（Necitumumab）／11F8、ImClone／IMC−11F8、ImClone Systems Inc．製［Eli Lilly & Co］（国際公開第2005／090407号パンフレット（欧州特許第01735348号明細書、米国特許出願公開第2007／0264253号明細書、米国特許第7598350号明細書、国際公開第2005／090407号パンフレット）、INN番号9083）
・マツズマブ／抗EGFR MAb、Merck KGaA／抗EGFR MAb、Takeda／EMD 72000／EMD−6200／EMD−72000およびEMD−55900／MAb 425／モノクローナル抗体425、Merck KGaA／Takeda製（国際公開第92／15683号パンフレット、INN番号8103（マツズマブ））
・RG−7160／GA−201／GA201／R−7160／R7160／RG7160／RO−4858696／RO−5083945／RO4858696／RO5083945、Glycart Biotechnology AG（Roche Holding AG）製（国際公開第2010／112413号パンフレット、国際公開第2010／115554号パンフレット）
・GT−MAB 5．2−GEX／CetuGEX、Glycotope GmbH製（国際公開第2008／028686号パンフレット（欧州特許第01900750号明細書、欧州特許第01911766号明細書、欧州特許第02073842号明細書、米国特許出願公開第2010／0028947号明細書）
・ISU−101、Isu Abxis Inc（ISU Chemical Co Ltd）／Scancell製（国際公開第2008／004834号パンフレット）
・ABT−806／mAb−806／ch−806／抗EGFRモノクローナル抗体806、Ludwig Institute for Cancer Research／Abbott／Life Science Pharmaceuticals製（国際公開第02／092771号パンフレット、国際公開第2005／081854号パンフレットおよび国際公開第2009／023265号パンフレット）
・SYM−004（2つのキメラIgG1抗体（992および1024）からなる）、Symphogen A／S製（国際公開第2010／022736号パンフレット）
・MR1−1／MR1−1KDEL、IVAX Corp（Teva Pharmaceutical Industries Ltd）（Duke University）製、（特許：国際公開第2001／062931号パンフレット）
・欠失変異体に対する抗体、EGFRvIII、Amgen／Abgenix製（国際公開第2005／010151号パンフレット、米国特許第7628986号明細書）
・SC−100、Scancell Ltd製（国際公開第01／088138号パンフレット）
・MDX−447／EMD82633／BAB−447／H447／MAb、EGFR、Medarex／Merck KgaA、Bristol−Myers Squibb（米国）／Merck KGaA（ドイツ）／Takeda（日本）製、（国際公開第91／05871号パンフレット、国際公開第92／15683号パンフレット）
・抗EGFR−Mab、Xencor製（国際公開第2005／056606号パンフレット）
・DXL−1218／抗EGFRモノクローナル抗体（がん）、InNexus、InNexus Biotechnology Inc製、Pharmaprojects PH048638
好ましい実施形態では、抗EGFR抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、マツズマブ、RG−716、GT−MAB 5．2−GEX、ISU−101、ABT−806、SYM−004、MR1−1、SC−100、MDX−447およびDXL−1218からなる群から選択される。
特に好ましい実施形態では、抗EGFR抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブおよびマツズマブからなる群から選択される。
当業者であれば、配列変異によって上記抗体のCDR領域から、さらなる抗体を調製するために使用することができる方法を知っており、これらのさらなる抗体は標的分子に対する同様のもしくは優れた親和性および／または特異性を有する。
さらなる実施形態では、抗EGFR抗体または抗原結合抗体フラグメントが、以下の抗体の1つの軽鎖の3つのCDR領域および重鎖の3つのCDR領域を含む抗体または抗原結合抗体フラグメントからなる群から選択される：セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、マツズマブ、RG−716、GT−MAB 5．2−GEX、ISU−101、ABT−806、SYM−004、MR1−1、SC−100、MDX−447およびDXL−1218。
さらなる実施形態では、抗EGFR抗体または抗原結合抗体フラグメントが、以下の抗体の1つの軽鎖の3つのCDR領域および重鎖の3つのCDR領域を含む抗体または抗原結合抗体フラグメントからなる群から選択される：セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、マツズマブ。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗カルボアンヒドラーゼIX抗体
がん標的分子カルボアンヒドラーゼIXに結合する抗体の例は、国際公開第2007／070538号パンフレット（例えば、請求項1〜16）に記載されている。
好ましい実施形態では、抗カルボアンヒドラーゼIX抗体または抗原結合抗体フラグメントが、抗カルボアンヒドラーゼIX抗体または抗原結合抗体フラグメント3ee9（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（a））、3ef2（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（b））、1e4（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（c））、3a4（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（d））、3ab4（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（e））、3ah10（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（f））、3bb2（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（g））、1aa1（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（h））、5a6（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（i））および5aa3（国際公開第2007／070538号パンフレットの請求項4（j））からなる群から選択される。
抗C4．4a抗体：
本発明によると、抗C4．4a抗体が使用され得る。
C4．4a抗体および抗原結合フラグメントの例は、国際公開第2012／143499号パンフレットに記載されている。参照により、国際公開第2012／143499号パンフレットの全ての抗体がこれにより本発明の明細書に組み込まれ、これらを本発明で使用することができる。抗体の配列は国際公開第2012／143499号パンフレットの表1に示されており、ここでは各行が1列に列挙される抗体の可変軽鎖または可変重鎖のそれぞれのCDRアミノ酸配列を示している。
一実施形態では、抗C4．4a抗体またはその抗原結合抗体フラグメントが、C4．4aを発現している細胞に結合した後、細胞によって内部移行する。
さらなる実施形態では、抗C4．4a抗体または抗原結合抗体フラグメントが、国際公開第2012／143499号パンフレットの表1または国際公開第2012／143499号パンフレットの表2に列挙されている抗体の少なくとも1つ、2つまたは3つのCDRアミノ酸配列を含む。このような抗体の好ましい実施形態も同様に国際公開第2012／143499号パンフレットに列挙されており、参照により本明細書に組み込まれる。
抗HER2抗体：
がん標的分子Her2に結合する抗体の例にトラスツズマブ（Genentech）がある。トラスツズマブは、特に乳がんの治療に使用されるヒト化抗体である。
HER2に結合する抗体のさらなる例には、トラスツズマブ（INN7637、CAS番号：RN：180288−69−1）およびペルツズマブ（CAS番号：380610−27−5）に加えて、国際公開第2009／123894号パンフレット、国際公開第200／8140603号パンフレットまたは国際公開第2011／044368号パンフレットに開示されている抗体がある。抗HER2複合体の例にはトラスツズマブ−エムタンシン（INN番号9295）がある。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗CD20抗体：
がん標的分子CD20に結合する抗体の例にリツキシマブ（Genentech）がある。リツキシマブ（CAS番号：174722−31−7）は、非ホジキンリンパ腫の治療に使用されるキメラ抗体である。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗CD52抗体：
がん標的分子CD52に結合する抗体の例にアレムツズマブ（Genzyme）がある。アレムツズマブ（CAS番号：216503−57−0）は、慢性リンパ性白血病の治療に使用されるヒト化抗体である。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗メソテリン抗体：
抗メソテリン抗体の例は、例えば、国際公開第2009／068204号パンフレットに記載されている。参照により、国際公開第2009／068204号パンフレットに記載されている全ての抗体はこれにより、これらの抗体を本明細書に開示される本発明の文脈で使用することができるように本明細書に組み込まれる。
本発明により使用される抗メソテリン抗体はまた、好ましくはメソテリンとの不変の結合についても注目に値する。不変の結合は、例えば、本発明により使用される抗体が、さらなる細胞外タンパク質によって隠され得ないメソテリンのエピトープに結合するという点を特徴とする。このようなさらなる細胞外タンパク質は、例えば、タンパク質卵巣がん抗原125（CA125）である。好ましく使用される抗体は、メソテリンとの結合がCA125によって遮断されないという点を特徴とする。
抗CD30抗体
がん標的分子CD30に結合し、がん、例えば、ホジキンリンパ腫の治療に使用することができる抗体の例には、ブレンツキシマブ、イラツムマブおよび国際公開第2008／092117号パンフレット、国際公開第2008／036688号パンフレットまたは国際公開第2006／089232号パンフレットに開示されている抗体がある。抗CD30複合体の例にはブレンツキシマブベドチン（INN番号9144）がある。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗CD22抗体
がん標的分子CD22に結合し、がん、例えば、リンパ腫の治療に使用することができる抗体の例には、イノツズマブおよびエプラツズマブがある。抗CD22複合体の例には、イノツズマブオゾガマイシン（INN番号8574）または抗CD22−MMAEおよび抗CD22−MC−MMAE（CAS RN：それぞれ、139504−50−0および474645−27−7）がある。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗CD33抗体
がん標的分子CD33に結合し、がん、例えば、白血病の治療に使用することができる抗体の例には、ゲムツズマブおよびリンツズマブ（INN7580）がある。抗CD33複合体の例にはゲムツズマブオゾガマイシンがある。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗NMB抗体
がん標的分子NMBに結合し、がん、例えば、黒色腫または乳がんの治療に使用することができる抗体の例には、グレムバツムマブ（glembatumumab）（INN9199）がある。抗NMB複合体の例には、グレムバツムマブベドチン（CAS RN：474645−27−7）がある。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗CD56抗体：
がん標的分子CD56に結合し、がん、例えば、多発性骨髄腫、小細胞肺癌、MCCまたは卵巣癌の治療に使用することができる抗体の例には、ロルボツズマブ（lorvotuzumab）がある。抗CD56複合体の例には、ロルボツズマブメルタンシン（CAS RN：139504−50−0）がある。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗CD70抗体
がん標的分子CD70に結合し、がん、例えば、非ホジキンリンパ腫または腎細胞がんの治療に使用することができる抗体の例は、国際公開第2007／038637号パンフレットおよび国際公開第2008／070593号パンフレットに開示されている。抗CD70複合体の例には、SGN−75（CD70 MMAF）がある。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗CD74抗体
がん標的分子CD74に結合し、がん、例えば、多発性骨髄腫の治療に使用することができる抗体の例には、ミラツズマブがある。抗CD74複合体の例には、ミラツズマブ−ドキソルビシン（CAS RN：23214−92−8）がある。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗CD19抗体
がん標的分子CD19に結合し、がん、例えば、非ホジキンリンパ腫の治療に使用することができる抗体の例は、国際公開第2008／031056号パンフレットに開示されている。さらなる抗体および抗CD19複合体（SAR3419）の例は、国際公開第2008／047242号パンフレットに開示されている。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗ムチン抗体
がん標的分子ムチン−1に結合し、がん、例えば、非ホジキンリンパ腫の治療に使用することができる抗体の例には、クリバツズマブ（clivatuzumab）および国際公開第2003／106495号パンフレット、国際公開第2008／028686号パンフレットに開示されている抗体がある。抗ムチン複合体の例は、国際公開第2005／009369号パンフレットに開示されている。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗CD138抗体
がん、例えば、多発せ骨髄腫の治療に使用することができる、がん標的分子CD138に結合する抗体およびその複合体の例は、国際公開第2009／080829号パンフレット、国際公開第2009／080830号パンフレットに開示されている。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗インテグリンαV抗体
がん標的分子インテグリンαVに結合し、がん、例えば、黒色腫、肉腫または癌腫の治療に使用することができる抗体の例には、インテツムマブ（intetumumab）（CAS RN：725735−28−4）、アブシキシマブ（CAS RN：143653−53−6）、エタラシズマブ（CAS RN：892553−42−3）ならびに米国特許第7465449号明細書、欧州特許第719859号明細書、国際公開第2002／012501号パンフレットおよび国際公開第2006／062779号パンフレットに開示されている抗体がある。抗インテグリンαV複合体の例には、インテツムマブ−DM4および国際公開第2007／024536号パンフレットに開示されているADCがある。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗TDGF1抗体
がん標的分子TDGF1に結合し、がんの治療に使用することができる抗体の例には、国際公開第02／077033号パンフレット、米国特許第7318924号明細書、国際公開第2003／083041号パンフレットおよび国際公開第2002／088170号パンフレットに開示されている抗体がある。抗TDGF1複合体の例は、国際公開第2002／088170号パンフレットに開示されている。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗PSMA抗体
がん標的分子PSMAに結合し、がん、例えば、前立腺癌の治療に使用することができる抗体の例には、国際公開第97／35616号パンフレット、国際公開第99／47554号パンフレット、国際公開第01／009192号パンフレットおよび国際公開第2003／034903号パンフレットに開示されている抗体がある。抗PSMA複合体の例は、国際公開第2009／026274号パンフレットおよび国際公開第2007／002222号パンフレットに開示されている。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗EPHA2抗体
がん標的分子EPHA2に結合し、複合体の調製およびがんの治療に使用することができる抗体の例は、国際公開第2004／091375号パンフレットに開示されている。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗SLC44A4抗体
がん標的分子SLC44A4に結合し、複合体の調製およびがん、例えば、膵癌または前立腺癌の治療に使用することができる抗体の例は、国際公開第2009／033094号パンフレットおよび米国特許出願公開第2009／0175796号明細書に開示されている。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗HLA−DOB抗体
がん標的分子HLA−DOBに結合する抗体の例には、がん、例えば、非ホジキンリンパ腫の治療に使用することができる抗体Lym−1（CAS RN：301344−99−0）がある。抗HLA−DOB複合体の例は、例えば、国際公開第2005／081711号パンフレットに開示されている。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗VTCN1抗体
がん標的分子VTCN1に結合し、複合体の調製およびがん、例えば、卵巣癌、すい臓、肺または乳がんの治療に使用することができる抗体の例は、国際公開第2006／074418号パンフレットに開示されている。参照により、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に組み込まれ、これらを本発明の文脈で使用することができる。
抗FGFR2抗体
本発明によると、抗FGFR2抗体が使用され得る。
FGFR2抗体および抗原結合フラグメントの例は、国際公開第2013076186号パンフレットに記載されている。参照により、国際公開第2013076186号パンフレットの全ての抗体がこれにより本発明の明細書に組み込まれ、これらを本発明で使用することができる。抗体の配列は国際公開第2013076186号パンフレットの表9および表10に示されている。M048−D01およびM047−D08と呼ばれる抗体に由来する抗体、抗体の抗原結合フラグメントおよび変異体が好ましい。好ましい抗FGFR2は、FGFR2の知られている種々のスプライスバリアントに結合する。
一実施形態では、抗FGFR2抗体またはその抗原結合抗体フラグメントが、FGFR2を発現している細胞に結合した後、細胞によって内部移行する。
さらなる実施形態では、抗FGFR2抗体または抗原結合抗体フラグメントが、国際公開第2013076186号パンフレットの表9または表10に列挙されている抗体の少なくとも1つ、2つまたは3つのCDRアミノ酸配列を含む。このような抗体の好ましい実施形態も同様に国際公開第2013076186号パンフレットに列挙されており、参照により本明細書に組み込まれる。
抗TWEAKR抗体
好ましい実施形態では、抗TWEAKR抗体またはその抗原結合フラグメントが本発明による方法に使用される場合、この抗体またはフラグメントが下記のものから選択される。さらに、TWEAKRに結合する抗体は、当業者に知られている（例えば、国際公開第2009／020933号パンフレットまたは国際公開第2009140177号パンフレット参照）。
本発明は特に、TWEAKRを発現している種々のがん細胞でアポトーシスの強力な誘導をもたらす、TWEAKR（配列番号169（タンパク質）；配列番号170（DNA））の強力な活性化をもたらす抗体もしくはその抗原結合抗体フラグメントまたはこれらの変異体との複合体に関する。
既に記載されている抗TWEAKR抗体（例えば、PDL−192）のアポトーシスの誘導および増殖の阻害に関するTWEAKRのアゴニスト活性は限定されており、内因性リガンドTWEAKの有効性に達しない。これらの抗体は、内因性リガンドTWEAKと比べて、類似の範囲にある親和性でTWEAKRで結合し（Michaelson JSら、MAbs．2011年7月〜8月；3（4）：362〜75；Culp PAら、Clin Cancer Res．2010年1月15日；16（2）：497〜508）、結合親和性が高い抗体でさえ有効なシグナル活性を必ずしも示さない（Culp PAら、Clin Cancer Res 2010年1月15日；16（2）：497〜508）ので、このアゴニスト活性の欠如は親和性低下に基づくものではない。さらに、既に記載されている抗体の抗腫瘍活性はFcエフェクター機能に依存することが示されており、ADCCがマウスモデルでインビボ有効性にとって重要な役割を果たすことが示された。
抗TWEAKR抗体の作製
完全ヒト抗体ファージライブラリー（Hoet RMら、Nat Biotechnol 2005；23（3）：344〜8）を使用して、固定化標的としてヒトおよびマウスTWEAKRの二量体Fc融合細胞外ドメインを用いたタンパク質パニング（Hoogenboom H．R．、Nat Biotechnol 2005；23（3）：1105〜16）によって本発明のTWEAKR特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。11個の異なるFabファージを同定し、対応する抗体を、可溶性FAbを欠くCH2−CH3ドメインを提供する哺乳動物EgG発現ベクターにクローニングした。好ましい抗体を同定した後、これらを完全長IgGとして発現させた。これらの構築物を、例えば、Tomら著、Micheal R．DysonおよびYves Durocherによって編集されたMethods Express：Expression Systemsの第12節、Scion Publishing Ltd、2007に記載されるように哺乳動物細胞で一過的に発現させた（AK実施例1参照）。抗体をプロテインAクロマトグラフィーによって精製し、AK実施例2に記載されるように、ELISAおよびBIAcore分析を用いて可溶性単量体TWEAKRに対する結合親和性によりさらに特徴付けた。抗TWEAKR抗体の細胞結合特性を決定するために、いくつかの細胞株（HT29、HS68、HS578）でフローサイトメトリーによって結合を試験した。NFκBレポーター遺伝子アッセイを行って同定した全11個の抗体（ヒトIgG1）のアゴニスト活性を調べた。インビトロ活性が最も高い抗体（TPP−883）をさらなる活性および親和性成熟のために選択した（詳細についてはAK実施例1参照）。アゴニスト活性が改善した単一置換変異体を検出した：CDR−H3のG102T。最後には、最良の単一置換変異体G102Tと比べて増加した親和性に基づいて、7種の変異体を選択した。その対応するDNAを哺乳動物IgG発現ベクターにクローニングし、上記NFκBレポーター遺伝子アッセイで機能的活性について調べた。最後に、得られた配列をヒト生殖系配列と比較し、親和性および有効性に対するいかなる有意な効果もない偏差を適合させた。抗体ライブラリースクリーニングならびに親和性および／または活性成熟によって、以下の抗体を得た。「TPP−2090」、「TPP−2149」、「TPP−2093」、「TPP−2148」、「TPP−2084」、「TPP−2077」、「TPP−1538」、「TPP−883」、「TPP−1854」、「TPP−1853」、「TPP−1857」および「TPP−1858」。
本発明の抗体は、抗体ファージディスプレイスクリーニング（例えば、Hoet RMら、Nat Biotechnol 2005；23（3）：344〜8参照）、確立したハイブリドーマ技術（例えば、KohlerおよびMilstein Nature．1975年8月7日；256（5517）：495〜7参照）またはマウスの免疫化、特に、hMAbマウス（例えば、VelocImmuneマウス（登録商標））の免疫化などの当技術分野で既知の方法によってさらに得ることができる。
抗TWEAKR抗体の特定の実施形態
本発明の一実施形態は、1つまたは複数のTWEAKR発現細胞株でカスパーゼ3／7の強力な誘導を示す抗体もしくは抗原結合抗体フラグメントまたはこれらの変異体を提供することである。好ましい実施形態では、1つまたは複数のTWEAKR発現細胞株が、WiDr、A253、NCI−H322、HT29および786−Oからなる群に存在する。「カスパーゼ3／7の誘導」は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で既知の慣用的な方法によって測定することができる。一実施形態では、「カスパーゼ3／7の誘導」が、カスパーゼ3／7溶液（Promega、＃G8093）を用いた活性測定およびVICTOR V（Perkin Elmer）での発光の読み取りを用いて本発明により測定される。インキュベーション時間の最後に、カスパーゼ3／7活性を測定し、カスパーゼ3／7の誘導係数を未処理細胞と比較して決定した。誘導係数が1．2より大きい、好ましくは1．5より大きい、さらにより好ましくは1．8より大きい、さらにより好ましくは2．1より大きい、さらにより好ましくは2．5より大きい場合に、抗体が「カスパーゼ3／7の強力な誘導」を示すと言われる。提供されるのは、既に記載されているアゴニスト抗体［例えば、PDL−192（TPP−1104）、P4A8（TPP−1324）、136．1（TPP−2194）］および300ng／mlの組換えヒトTWEAKとも比べて強いHT29細胞でカスパーゼ3／7の誘導をもたらす抗TWEAKR抗体である。がん細胞でカスパーゼ3／7を誘導するこの強力な活性がWiDr、A253、NIC−H322および786−O細胞でも観察され、ほとんどの実験で、調査した本発明の抗体が基準抗体［PDL−192（TPP−1104）、P4A8（TPP−1324）］および300ng／mlのTWEAKと比べて高い変化率を誘導した。本発明のいくつかの抗体は、内因性リガンドTWEAKの親和性よりも明らかに低く、他の既知のアゴニスト抗体と比べても低い中等度の親和性（＞10nM）でしかTWEAKRに結合しない。この特性は、例えば、腫瘍への潜在的に深い侵入などのさらなる考えられる利点を提供する。
この点について、本発明の一実施形態は、TWEAKR（配列番号169；図1も参照）の47位のアスパラギン酸（D）（D47）との選択的結合により特徴付けられる新規なエピトープでTWEAKRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体フラグメントを提供するものである。抗体相互作用について一定のTWEAKRアミノ酸について同定された依存度は、これらの抗体について測定されたアゴニスト活性と相関する。野生型リガンドTWEAKは、TWEAKRの有効な活性化を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインのロイシン46に依存して結合する（Pellegriniら、FEBS 280：1818〜1829）。P4A8は極めて低いアゴニスト活性を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインの外側のドメインと少なくとも部分的に相互作用する。PDL−192は、中等度のアゴニスト活性を示し、R56に依存して、システインリッチドメイン、但し、TWEAKリガンド部位の反対に結合する。本発明の抗体（例えば、TPP−2090）はD47に依存して結合し、TWEAKはL46に依存して結合する。よって、TWEAKは類似であるが異なる結合部位に結合する（図7）。したがって、強力なアゴニスト活性を示す本発明の抗体は、極めて高いアゴニスト活性を伴って抗体にとって新規のエピトープ（D47依存性）に結合する。
TWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸（D47）は、本発明による抗体の結合にとって重要であると考えられ、このことはAK実施例2および図6に記載されるように、抗体がこの残基のアラニンへの修正によってそのELISAシグナルの20％超、あるいは30％超、あるいは40％超、あるいは50％超、あるいは60％超、あるいは70％超、あるいは80％超、あるいは90％超、あるいは100％を失う場合に、抗体がTWEAKR（配列番号169）の47位のD（D47）に特異的に結合することを意味する。あるいは、抗体がTPP−2203と比べて、TPP−2614についてのそのELISAシグナルの20％超、あるいは30％超、あるいは40％超、あるいは50％超、あるいは60％超、あるいは70％超、あるいは80％超、あるいは90％超、あるいは100％を失う場合に、抗体はTWEAKR（配列番号169）の47位のD（D47）に特異的に結合する。好ましくは、抗体がTPP−2203と比べて、TPP−2614についてのそのELISAシグナルの80％超を失う場合に、抗体はTWEAKR（配列番号169）の47位のD（D47）に特異的に結合する。
本出願では、以下の表に示される、本発明の以下の好ましい抗体に言及する：「TPP−2090」、「TPP−2149」、「TPP−2093」、「TPP−2148」、「TPP−2084」、「TPP−2077」、「TPP−1538」、「TPP−883」、「TPP−1854」、「TPP−1853」、「TPP−1857」、「TPP−1858」。
TPP−2090は、配列番号2に相当する重鎖の領域および配列番号1に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−2149は、配列番号12に相当する重鎖の領域および配列番号11に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−2093は、配列番号22に相当する重鎖の領域および配列番号21に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−2148は、配列番号32に相当する重鎖の領域および配列番号31に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−2084は、配列番号42に相当する重鎖の領域および配列番号41に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−2077は、配列番号52に相当する重鎖の領域および配列番号51に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−1538は、配列番号62に相当する重鎖の領域および配列番号61に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−883は、配列番号72に相当する重鎖の領域および配列番号71に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−1854は、配列番号82に相当する重鎖の領域および配列番号81に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−1853は、配列番号92に相当する重鎖の領域および配列番号91に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−1857は、配列番号102に相当する重鎖の領域および配列番号101に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−1858は、配列番号112に相当する重鎖の領域および配列番号111に相当する軽鎖の領域を含む抗体である。
TPP−2090は、配列番号10に相当する重鎖の可変領域および配列番号9に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−2149は、配列番号20に相当する重鎖の可変領域および配列番号19に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−2093は、配列番号30に相当する重鎖の可変領域および配列番号29に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−2148は、配列番号40に相当する重鎖の可変領域および配列番号39に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−2084は、配列番号50に相当する重鎖の可変領域および配列番号49に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−2077は、配列番号60に相当する重鎖の可変領域および配列番号59に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−1538は、配列番号70に相当する重鎖の可変領域および配列番号69に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−883は、配列番号80に相当する重鎖の可変領域および配列番号79に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−1854は、配列番号90に相当する重鎖の可変領域および配列番号89に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−1853は、配列番号100に相当する重鎖の可変領域および配列番号99に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−1857は、配列番号110に相当する重鎖の可変領域および配列番号109に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
TPP−1858は、配列番号120に相当する重鎖の可変領域および配列番号119に相当する軽鎖の可変領域を含む抗体である。
抗TWEAKR抗体の好ましい実施形態は以下のものである：
1．TWEAKR（配列番号169）の47位のD（D47）に特異的に結合する抗TWEAKR抗体またはその抗原結合フラグメント。
2．抗体がアゴニスト抗体である、実施形態1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
3．
（a）式PYPMX（配列番号171）（XはIまたはMである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖のCDR1；
（b）式YISPSGGXTHYADSVKG（配列番号172）（XはSまたはKである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖のCDR2；および
（c）式GGDTYFDYFDY（配列番号173）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖のCDR3；
を含む可変重鎖
ならびに
（a）式RASQSISXYLN（配列番号174）（XはGまたはSである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖のCDR1；
（b）式XASSLQS（配列番号175）（XはQ、AまたはNである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖のCDR2；および
（c）式QQSYXXPXIT（配列番号176）（5位のXはTまたはSであり、6位のXはTまたはSであり、8位のXはGまたはFである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖のCDR3
を含む可変軽鎖
を含む、実施形態1または2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
4．
a．配列番号6に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号7に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号8に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号3に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号4に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号5に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
b．配列番号16に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号17に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号18に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号13に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号14に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号15に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
c．配列番号26に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号27に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号28に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号23に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号24に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号25に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
d．配列番号36に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号37に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号38に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号33に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号34に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号35に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
e．配列番号46に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号47に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号48に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号43に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号44に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号45に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
f．配列番号56に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号57に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号58に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号53に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号54に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号55に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
g．配列番号66に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号67に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号68に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号63に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号64に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号65に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
h．配列番号76に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号77に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号78に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号73に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号74に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号75に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
i．配列番号86に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号87に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号88に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号83に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号84に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号85に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
j．配列番号96に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号97に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号98に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号93に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号94に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号95に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
k．配列番号106に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号107に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号108に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号103に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号104に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号105に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖、または
l．配列番号116に示される重鎖の可変CDR1配列、配列番号117に示される重鎖の可変CDR2配列および配列番号118に示される重鎖の可変CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号113に示される軽鎖の可変CDR1配列、配列番号114に示される軽鎖の可変CDR2配列および配列番号115に示される軽鎖の可変CDR3配列を含む可変軽鎖
を含む、実施形態1から3のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
5．
a．配列番号10に示される重鎖の可変配列および配列番号9に示される軽鎖の可変配列、または
b．配列番号20に示される重鎖の可変配列および配列番号19に示される軽鎖の可変配列、または
c．配列番号30に示される重鎖の可変配列および配列番号29に示される軽鎖の可変配列、または
d．配列番号40に示される重鎖の可変配列および配列番号39に示される軽鎖の可変配列、または
e．配列番号50に示される重鎖の可変配列および配列番号49に示される軽鎖の可変配列、または
f．配列番号60に示される重鎖の可変配列および配列番号59に示される軽鎖の可変配列、または
g．配列番号70に示される重鎖の可変配列および配列番号69に示される軽鎖の可変配列、または
h．配列番号80に示される重鎖の可変配列および配列番号79に示される軽鎖の可変配列、または
i．配列番号90に示される重鎖の可変配列および配列番号89に示される軽鎖の可変配列、または
j．配列番号100に示される重鎖の可変配列および配列番号99に示される軽鎖の可変配列、または
k．配列番号110に示される重鎖の可変配列および配列番号109に示される軽鎖の可変配列、または
l．配列番号120に示される重鎖の可変配列および配列番号119に示される軽鎖の可変配列
を含む、実施形態1から4のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
6．IgG抗体である、実施形態1から5のいずれかに記載の抗体。
7．
a．配列番号2に示される重鎖の配列および配列番号1に示される軽鎖の配列、または
b．配列番号12に示される重鎖の配列および配列番号11に示される軽鎖の配列、または
c．配列番号22に示される重鎖の配列および配列番号21に示される軽鎖の配列、または
d．配列番号32に示される重鎖の配列および配列番号31に示される軽鎖の配列、または
e．配列番号42に示される重鎖の配列および配列番号41に示される軽鎖の配列、または
f．配列番号52に示される重鎖の配列および配列番号51に示される軽鎖の配列、または
g．配列番号62に示される重鎖の配列および配列番号61に示される軽鎖の配列、または
h．配列番号72に示される重鎖の配列および配列番号71に示される軽鎖の配列、または
i．配列番号82に示される重鎖の配列および配列番号81に示される軽鎖の配列、または
j．配列番号92に示される重鎖の配列および配列番号91に示される軽鎖の配列、または
k．配列番号102に示される重鎖の配列および配列番号101に示される軽鎖の配列、または
l．配列番号112に示される重鎖の配列および配列番号111に示される軽鎖の配列
を含む、実施形態1から6のいずれかに記載の抗体。
8．scFv、Fab、Fab’フラグメントまたはF（ab’）2フラグメントである、実施形態1から7のいずれかに記載の抗原結合フラグメントまたは実施形態1から7のいずれかに記載の抗体の抗原結合フラグメント。
9．モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、実施形態1から8のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
10．ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体または抗原結合フラグメントである、実施形態1から9のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
抗TWEAKR抗体TPP−2090が特に好ましい。
同位体、塩、溶媒和物、同位体変種
本発明はまた、本発明による化合物の全ての適当な同位体変種も包含する。本発明による化合物の同位体変種は、ここでは、本発明による化合物中の少なくとも1個の原子が同じ原子番号であるが通常または主に自然に生じる原子質量とは異なる原子質量を有する別の原子と交換された化合物を意味すると理解される。本発明による化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素の同位体、例えば、2H（重水素）、3H（トリチウム）、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129Iおよび131Iがある。本発明による化合物の特定の同位体変種、特に1種または複数の放射性同位元素が組み込まれたものは、例えば、体内での作用機構または活性化合物分布の調査に有益となり得、比較的容易な調製性（preparability）および検出性のために、特に3Hまたは14Cで標識された化合物がこの目的に適している。さらに、同位体、例えば、重水素の組込みにより、化合物のより大きな代謝安定性の結果としての特定の治療上の利益、例えば、体内での半減期の延長または要求される活性剤用量の減少がもたらされ得るので、本発明による化合物のこのような修飾も、いくつかの場合、本発明の好ましい実施形態を構成し得る。本発明による化合物の同位体変種は、当業者に既知の方法、例えば、以下に記載される方法および実施例に記載の手順によって、それぞれの試薬および／または出発化合物の対応する同位体修飾を用いることにより調製することができる。
本発明の文脈において好ましい塩は、本発明による化合物の生理学的に許容される塩である。それ自体が製薬用途に適していないが、例えば、本発明による化合物を単離または精製するために使用することができる塩も包含される。
本発明による化合物の生理学的に許容される塩には、鉱酸、カルボン酸およびスルホン酸の酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸および安息香酸の塩が含まれる。
本発明の化合物の生理学的に許容される塩には、従来の塩基の塩、例としておよび好ましくは、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムおよびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムおよびマグネシウム塩）、およびアンモニアまたは1〜16個の炭素原子を有する有機アミンに由来するアンモニウム塩、例としておよび好ましくは、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、プロカイン、ジベンジルアミン、N−メチルピペリジン、N−メチルモルホリン、アルギニン、リジンおよび1，2−エチレンジアミンも含まれる。
本発明の文脈における溶媒和物は、溶媒分子による配位によって固体または液体状態で錯体を形成する本発明による化合物の形態として記載される。水和物は、配位が水によるものである溶媒和物の特別な形態である。水和物が本発明の文脈において好まれる溶媒和物である。
さらに、本発明は、本発明による化合物のプロドラッグも包含する。「プロドラッグ」という用語は、ここでは、それ自体は生物学的に活性であっても不活性であってもよいが、体内での滞留時間中に本発明の化合物に（例えば、代謝的または加水分解的手段によって）変換される化合物を示す。
具体的な実施形態
以下の実施形態が特に好ましい：
実施形態A：
式
（KSP−L−は以下の式（II）、（IIa）、（IIb）、（IIc）、（IId）、（IIe）または以下の式（IIf）の化合物であり、結合剤は抗TWEAKR抗体（特に好ましくは、TWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する抗TWEAKR抗体、特に抗TWEAKR抗体TPP−2090）であり、nは1〜10の数字である）：
式（IIf）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；
X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
AはCO（カルボニル）を表し；
R1は−L−＃1、H、−COOH、−CONHNH2、−（CH2）1〜3NH2、−CONZ’’（CH2）1〜3NH2および−CONZ’’CH2COOHを表し、Z’’はHまたはNH2を表し；
R2およびR4はHまたは−L−＃1を表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はHまたは−L−＃1を表し；
R3は−L−＃1あるいは場合により−OH、O−アルキル、SH、S−アルキル、O−CO−アルキル、O−CO−NH−アルキル、NH−CO−アルキル、NH−CO−NH−アルキル、S（O）n−アルキル、SO2−NH−アルキル、NH−アルキル、N（アルキル）2またはNH2（アルキルは好ましくはC1〜3−アルキルである）によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル−を表し；
R5は−L−＃1、HまたはFを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、（場合によりフッ素化された）C1〜3−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し；
R8は−L−＃1によって置換されていてもよい分岐C1〜5−アルキル基を表し；
R9はHまたはFを表し、
置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10の1つは−L−＃1を表し、
−L−はリンカーを表し、＃1は抗体との結合を表す）
のADC、ならびにADCの塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
リンカーは、好ましくはリンカー
§−（CO）m−L1−L2−§§
（mは0または1であり、
§はKSPとの結合を表し、
§§は抗体との結合を表し、
L2は
（＃1は抗体の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は基L1との結合点を示す）
を表し、
L1は式＃1−（NR10）n−（G1）o−G2−＃2
（R10はH、NH2またはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−または
を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、または−SO−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
によって表される）
である。
ここで、＃1はKSP阻害剤との結合であり、＃2は結合剤（例えば、L2）とのカップリング基との結合である。
実施形態B：
式
（KSP−L−は以下の式（II）、（IIa）、（IIb）、（IIc）、（IId）、（IIe）、（IIf）または以下の式（IIg）の化合物であり、結合剤は抗体であり、nは1〜10の数字である）：
式（IIg）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；
X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
AはCO（カルボニル）を表し；
R1は−L−＃1、H、−COOH、−CONHNH2、−（CH2）1〜3NH2、−CONZ’’（CH2）1〜3NH2および−CONZ’’CH2COOHを表し、Z’’はHまたはNH2を表し；
R2およびR4はHまたは−L−＃1を表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はHまたは−L−＃1を表し；
R3は−L−＃1あるいは場合により−OH、O−アルキル、SH、S−アルキル、O−CO−アルキル、O−CO−NH−アルキル、NH−CO−アルキル、NH−CO−NH−アルキル、S（O）n−アルキル、SO2−NH−アルキル、NH−アルキル、N（アルキル）2またはNH2（アルキルは好ましくはC1〜3−アルキルである）によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル−を表し；
R5は−L−＃1、HまたはFを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、（場合によりフッ素化された）C1〜3−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し；
R8は分岐C1〜5−アルキル基を表し；
R9はHまたはFを表し、
置換基R1、R2、R3、R4、R5およびR10の1つは−L−＃1を表し、
−L−はリンカーを表し、＃1は抗体との結合を表し、
−L−は
§−（CO）m−L1−L2−§§
（mは0または1であり、
§はKSPとの結合を表し、
§§は抗体との結合を表し、
L2は
（＃1は抗体の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は基L1との結合点を示す）
を表し、
L1は式＃1−（NR10）n−（G1）o−G2−＃2
（R10はH、NH2またはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−または
を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、または−SO−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、
＃1はKSP阻害剤との結合であり、＃2は抗体（例えばL2）とのカップリング基との結合である）
によって表される）
によって表される）
のADC、ならびにADCの塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
実施形態C：
式
（KSP−L−は以下の構造I（sub）を有する化合物であり、結合剤は抗TWEAKR抗体（特に好ましくは、TWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する抗TWEAKR抗体、特に抗TWEAKR抗体TPP−2090）、抗HER2抗体または抗EGFR抗体（好ましくは、ニモツズマブ）であり、nは1〜10の数字である）：
（＃aは分子の残りとの結合を表し；
R1aは−L−＃1、Hまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−L−＃1、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10は−L−＃1、H、NH2、COOH、SO3H、SHまたはOHを表し、Zは−H、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表し；
置換基R1a、R2a、R4aまたはR10の1つは−L−＃1を表し、
−L−はリンカーを表し、＃1は抗体との結合を表し、
−L−は
§−（CO）m−L1−L2−§§
（mは0または1であり、
§はKSPとの結合を表し、
§§は抗体との結合を表し、
L2は
（＃1は抗体の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は基L1との結合点を示す）
を表し、
L1は式＃1−（NR10）n−（G1）o−G2−＃2
（R10はH、NH2またはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−または
を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、または−SO−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、
＃1はKSP阻害剤との結合であり、＃2は抗体（例えばL2）とのカップリング基との結合である）
によって表される）
によって表される）
のADC、ならびにADCの塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
実施形態D：
式
（KSP−L−は以下の式（II）、（IIa）、（IIb）、（IIc）、（IId）、（IIe）、（IIf）、（IIg）または以下の式（IIh）の化合物であり、結合剤は抗体であり、nは1〜10の数字である）：
式（IIh）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；
X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
AはCO（カルボニル）を表し；
R1は−L−＃1を表し；
R2およびR4はHを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はHを表し；
R3は場合により−OH、O−アルキル、SH、S−アルキル、O−CO−アルキル、O−CO−NH−アルキル、NH−CO−アルキル、NH−CO−NH−アルキル、S（O）n−アルキル、SO2−NH−アルキル、NH−アルキル、N（アルキル）2もしくはNH2（アルキルは好ましくはC1〜3−アルキルである）によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル−、または−MODを表し；
−MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−H
（R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
を表し（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10はNH2を表さない）；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有する）
を表し；
R5はHまたはFを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、（場合によりフッ素化された）C1〜3−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜4−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し；
R8は分岐C1〜5−アルキル基を表し；
R9はHまたはFを表し、
−L−はリンカーを表し、＃1は抗体との結合を表し、
−L−は
§−（CO）m−L1−L2−§§
（mは0または1であり、
§はKSPとの結合を表し、
§§は抗体との結合を表し、
L2は
（＃1は抗体の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は基L1との結合点を示す）
を表し、
L1は式＃1−（NR10）n−（G1）o−G2−＃2
（R10はH、NH2またはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−または
を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖を含む炭化水素鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、
＃1はKSP阻害剤との結合であり、＃2は抗体（例えばL2）とのカップリング基との結合である）
によって表される）
によって表される）
のADC、ならびにADCの塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
実施形態E：
式
（KSP−L−は以下の構造I（sub）を有する化合物であり、結合剤はニモツズマブであり、nは1〜10の数字である）：
（＃aは分子の残りとの結合を表し；
R1aは−L−＃1、Hまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−L−＃1、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10は−L−＃1、H、NH2、COOH、SO3H、SHまたはOHを表し、Zは−H、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表し；
置換基R1a、R2a、R4aまたはR10の1つは−L−＃1を表し、
−L−はリンカーを表し、＃1は抗体との結合を表し、
−L−は
§−（CO）m−L1−L2−§§
（mは0または1であり、
§はKSPとの結合を表し、
§§は抗体との結合を表し、
L2は
（＃1は抗体の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は基L1との結合点を示す）
を表し、
L1は式＃1−（NR10）n−（G1）o−G2−＃2
（R10はH、NH2またはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−または
を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、または−SO−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、
＃1はKSP阻害剤との結合であり、＃2は抗体（例えばL2）とのカップリング基との結合である）
によって表される）
によって表される）
のADC、ならびにADCの塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
この実施形態では、KSP−L−が特に好ましくは以下の式（IIi）を有する：
式（IIi）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
（X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表すのが好ましい）；
R1はH、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2はH、−MOD、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
R4はH、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Z、好ましくはHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表す；
あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−＃1を表し、
R5はH、NH2、NO2、ハロゲン（特に、F、Cl、Br）、−CN、CF3、−OCF3、−CH2F、−CH2F、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシ、NO2、NH2、COOHまたはハロゲン（特に、F、Cl、Br）を表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは−（CH2）0〜2−（HZ2）を表し、HZ2はN、OおよびSからなる群から選択される最大2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環を表し、これらの基の各々は−OH、CO2HまたはNH2によって置換されていてもよく；
Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表し、
−MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
（G1が−NHCO−または
を表す場合、R10はNH2を表さない）を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有する）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
実施形態F：
一般式：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す、またはX1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表し；
R1はHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し；WはHまたはOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2およびR4は互いに独立に、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は場合により置換されているアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5はH、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは場合により置換されたオキセタンを表し；
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
の化合物ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
実施形態G：
本発明はまた、以下の一般式の結合剤／活性化合物も提供する：
（BINDERは結合剤（好ましくは：抗体）またはその誘導体（好ましくは：システイン残基）、好ましくは抗体を表し、Lはリンカーを表し、WSは活性化合物、好ましくは例えば、式（II）、（IIa）、（IIb）、（IIc）、（IId）、（IIe）、（IIf）、（IIg）または（IIh）の1つの本発明によるKSP阻害剤などのKSP阻害剤を表し、mは1〜2、好ましくは1の数字を表し、nは1〜50、好ましくは1．2〜20、特に好ましくは2〜8の数字を表し、Lは以下の構造の1つを有する）。ここで、mはリンカー1個当たりの活性化合物の数であり、nはBINDER1個当たりの活性化合物／リンカー複合体の数の平均値である。そのため、複合体分子中に存在する全WSの和はmとnの積となる。
WSは動物、好ましくはヒトでの局所または全身性治療作用を有する活性化合物である。これらの活性化合物は、一般的に5kDa未満、好ましくは1．5kDa未満の分子量を有する。好ましい活性化合物は抗増殖物質、例えば、細胞毒性または細胞増殖抑制性物質である。好ましい活性化合物は細胞毒性物質、血管新生の阻害剤、細胞周期阻害剤、PI3キナーゼまたはm−TOR阻害剤、MAPKシグナル伝達カスケード経路の阻害剤、HDAC阻害剤、プロテアソーム阻害剤、PARP阻害剤、Wnt／ヘッジホッグシグナルカスケード経路阻害剤およびRNAポリメラーゼ阻害剤である。細胞毒性物質は、特に、DNA結合または介入物質、DNAアルキル化物質、微小管安定化物質または不安定化物質、白金化合物およびトポイソメラーゼI阻害剤である。代表的なDNA結合物質は、例えば、ドキソルビシンまたはダウノルビシンなどのアントラサイクリンである。代表的なDNAアルキル化物質は、例えば、カリケアマイシン、テモゾロミドまたはシクロホスファミドおよび誘導体である。代表的な微小管安定化物質または不安定化物質は、例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル、メイタンシノイドおよびアウリスタチンなど）、チューブリシン、ビンカアルカロイド、エポチロンおよびこれらの誘導体である。メイタンシノイドの例としては、メイタンシン、メイタンシノール、DM−1およびDM−4がある（例えば、米国特許第5208020号明細書参照）。アウリスタチンの例としては、アウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）、アウリスタチンF、モノメチルアウリスタチンF（MMAF）およびドラスチン（dolastin）がある（特に、国際公開第09／117531号パンフレット、国際公開第2005／081711号パンフレット、国際公開第04／010957号パンフレット；国際公開第02／088172号パンフレットまたは国際公開第01／24763号パンフレット参照）。ビンカアルカロイドの例としてはビンクリスチンおよびビンブラスチンがある。エポチロンの例としては、エポチロンA、B、C、D、EまたはFがある（特に、国際公開第98／13375号パンフレット；国際公開第2004／005269号パンフレット；国際公開第2008／138561号パンフレット；国際公開第2009／002993号パンフレット；国際公開第2009／055562号パンフレット；国際公開第2009／012958号パンフレット；国際公開第2009／026177号パンフレット；国際公開第2009／134279号パンフレット；国際公開第2010／033733号パンフレット；国際公開第2010／034724号パンフレット；国際公開第2011／017249号パンフレット；国際公開第2011／057805号パンフレット参照）。白金化合物の例としては、シスプラチンおよびカルボプラチンがある。トポイソメラーゼI阻害剤の例としては、カンプトテシおよび誘導体がある。血管新生の阻害剤の例としては、例えば、フマギロールなどのMetAP2阻害剤がある。細胞周期阻害剤の例としては、CDK阻害剤（例えば、BMS−387032またはPD0332991）、Rhoキナーゼ阻害剤（例えば、GSK429286など）、PLK阻害剤（例えば、ボラセルチブなど）、オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、AZD1152またはMLN805Zなど）がある。MAPKシグナル伝達カスケード経路の阻害剤の例としては、特に、MEK阻害剤（例えば、PD0325901）、Ras阻害剤、JNK阻害剤、B−Raf阻害剤（例えば、SB590885）またはp38 MAPK阻害剤（例えば、SB202190）がある。HDAC阻害剤の例としては、ベリノスタットおよびギビノスタット（givinostat）がある。PARP阻害剤の例としては、イニパリブおよびオラパリブがある。RNAポリメラーゼ阻害剤の例としては、例えば、α−アマニチン、アマニチンおよびアマヌリンなどのアマトキシンがある。特に好ましい活性化合物は、ビンカアルカロイド、アウリスタチン、メイタンシノイド、ツブリシン、デュオカルマイシン、キナーゼ阻害剤、MEK阻害剤およびKSP阻害剤である。
ここで、Lは以下の式A3およびA4の1つを表す。
（＃1は結合剤の硫黄原子との結合点を示し、＃2は活性化合物との結合点を示し、xは1または2を表し、R22はCOOH、COOR、COR（RはそれぞれC1〜3−アルキルを表す）、CONH2、Br好ましくはCOOHを表す）。
L1は上記と同じ意味を有する。好ましくは、−L1−＃2は以下の式：
＃3−（NR10）n−（G1）o−G2−＃2
（＃3は窒素原子との結合点を示し、
R10はH、NH2またはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−、−CONH−または
を表し（G1がNHCOまたは
を表す場合、R10はNH2を表さない）、
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、−C（NH）NRy−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々がNHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）ならびに／あるいはN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖はNHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
によって表される。
G2中のさらなる中断基は好ましくは
（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）
である。
本発明による複合体または本発明による複合体の混合物では、結合剤のシステイン残基との結合が、好ましくは80％超、特に好ましくは90％超（各場合でリンカーと結合剤の結合の総数に基づく）の程度まで、式A3またはA4の2つの構造の1つとして存在する。
式A3またはA4のリンカーを含む複合体は、結合剤を、以下のそれぞれ式A3‘およびA4‘の適当な臭素誘導体とカップリングすることによって得ることができる：
式A3‘またはA4‘のこれらの臭素誘導体は、以下のスキーム30〜32に代表的な様式で示されるように、HOOCCH2CHBrCOOR22またはHOOCCHBrCH2COOR22を結合剤のアミノ基と反応させることによって得ることができる。
スキーム30：
［a）：2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート（BEP）、DCM、ピリジン、室温；b）塩化亜鉛、トリフルオロエタノール、50℃、EDTA；c）3〜4当量のTCEP、PBS緩衝液；d）PBS緩衝液、20時間室温。］
スキーム31：
［a）：2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート（BEP）、DCM、ピリジン、室温；b）塩化亜鉛、トリフルオロエタノール、50℃、EDTA；c）3〜4当量のTCEP、PBS緩衝液；d）PBS緩衝液、20時間室温。］
実施形態H：
本発明はまた、以下の一般式の結合剤／活性化合物も提供する：
（BINDERは結合剤（好ましくは：抗体）またはその誘導体（好ましくは：システイン残基）、好ましくは抗体を表し、Lはリンカーを表し、WSは活性化合物、好ましくは例えば、式（II）、（IIa）、（III）または（IIIa）の1つの本発明によるKSP阻害剤などのKSP阻害剤を表し、mは1〜2、好ましくは1の数字を表し、nは1〜50、好ましくは1．2〜20、特に好ましくは2〜8の数字を表し、Lは以下の構造の1つを有する）。ここで、mはリンカー1個当たりの活性化合物の数であり、nはBINDER1個当たりの活性化合物／リンカー複合体の数の平均値である。そのため、複合体分子中に存在する全WSの和はmとnの積となる。
ここで、Lは以下を表す：
（＃1は結合剤の硫黄原子との結合点を示し、＃2は活性化合物との結合点を示し、R22はCOOH、COOR、COR（RはそれぞれC1〜3−アルキルを表す）、CONH2、Br好ましくはCOOHを表す）。よって、結合剤の硫黄原子との連結は、以下の構造の1つを有し得る：
活性化合物／結合剤複合体1個当たり2個以上の活性化合物分子WSを含む活性化合物／結合剤複合体の場合、式A1および／またはA2による両構造が活性化合物／結合剤複合体中に存在し得る。本発明による活性化合物／結合剤複合体は異なる活性化合物／結合剤複合体の混合物であってもよいので、この混合物が式A1または式A2の活性化合物／結合剤複合体と式A1およびA2のものの両方を含むことも可能である。
L5は−（CH2）m−（CHRS）n−（OCH2CH2）o−（X）p−（CH2）q−（m、n、o、pおよびqは互いに独立に、以下の値を有する：m＝0〜10；n＝0または1；o＝0〜10；p＝0または1；およびq＝0〜10、ここでm＋n＋o＝1〜15、好ましくは1〜6）から選択される基である。Xは5または6員芳香族または非芳香族複素環または同素環、好ましくは−C6H4−または−C6H10−を表す。RSは酸基、好ましくは−COOHまたはSO3Hを表す。
L6は−CONH−、−OCONH−、−NHCO−、−NHCOO−、
および
（rは1、2または3である）から選択される基である。
L7は単結合あるいはアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個（好ましくは1〜10個）の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、−C（NH）NRy−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々がNHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）ならびに／あるいはN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員、好ましくは5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素基から選択される基であり、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい。
L5は好ましくは基−（CH2）m−（CHRS）n−（OCH2CH2）o−（X）p−（CH2）q−（m＝1〜3、n＝0、o＝0〜7、p＝0およびq＝0または1）である。基−（CH2）m−（CHRS）n−（OCH2CH2）o−（X）p−（CH2）q−（m＝1または2、n＝0、o＝0または1、p＝0およびq＝0または1）が特に好ましい。
L6は好ましくは−CONH−および−NHCO−から選択される基である。
L7は好ましくは単結合または−［（CH2）x−（X4）y］w−（CH2）z−（w＝0〜20；x＝0〜5；y＝0または1；z＝1〜5；およびX4は−O−、−CONH−、−NHCO−または
を表す）である。
特に好ましくは、L7は単結合または基−［（CH2）x−NHCO−）］（x＝1〜5）である。
特に好ましくは、−L5−L6−L7−は−（CH2）m−（CHRS）n−（OCH2CH2）o−（X）p−（CH2）q−NHCO−［（CH2）x−NHCO−）］（m＝1または2、n＝0、o＝0または1、p＝0、およびq＝0または1、およびx＝1〜5）を表す。
しかしながら、これらの2つの構造が本発明による複合体中に一緒に存在することも可能である。
本発明によると、これらの結合剤／活性化合物複合体は、式
（Lは以下の式A‘を有する：）
の化合物から調製することができる。
好ましくは、A‘からAへの変換を、pH7．5〜8．5、好ましくは8のpH緩衝液中、37℃未満、好ましくは10〜25℃の温度で、最大40時間、好ましくは1〜15時間の期間にわたって攪拌することによって行う。
実施形態I：
式
（R2、R4およびR5はHを表し；
R3は−CH2OHを表し；
R1は−L1−L2−BINDERを表し、
L1は
（＃2はL2との結合を表し、＃1は他の結合との結合を表し；
L2は以下の式A5およびA6の構造の一方または両方を表す：
（＃1は結合剤の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は基L1との結合点を示し、
R22はCOOH、COOR、COR、CONHR（RはそれぞれC1〜3−アルキルを表す）、CONH2、好ましくはCOOHを表す））
の抗体複合体。
本発明による複合体または本発明による複合体の混合物では、結合剤のシステイン残基との結合が、好ましくは80％超、特に好ましくは90％超（各場合でリンカーと結合剤の結合の総数に基づく）の程度まで、特に好ましくは式A5またはA6の2つの構造の1つとして存在する。
ここで、式A5またはA6の構造は一般的に一緒に、好ましくは結合剤との結合の数基準で60：40〜40：60の比で存在する。次いで、残りの結合は構造
として存在する。
結合剤は、好ましくは結合剤タンパク質またはペプチド、特に好ましくはヒト、ヒト化もしくはキメラモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、特に抗TWEAKR抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗EGFR抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。TWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する抗TWEAKR抗体、特に抗TWEAKR抗体TPP−2090または抗EGFR抗体セツキシマブもしくはニモツズマブが特に好ましい。結合剤の代わりとして、システイン残基が存在してもよい。
治療的使用
その治療に本発明による化合物を使用することができる過剰増殖疾患には、特にがんおよび腫瘍疾患の群が含まれる。本発明の文脈において、これらは、これに限定されないが、特に以下の疾患を意味すると理解される：乳癌および乳腫瘍（乳管および小葉型、インサイツも含む乳癌）、呼吸器の腫瘍（小細胞および非小細胞癌、気管支癌）、脳腫瘍（例えば、脳幹および視床下部の、星状細胞腫、上衣腫、膠芽腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫ならびに神経外胚葉性および松果体部腫瘍）、消化器官の腫瘍（食堂、胃、胆のう、小腸、大腸、直腸および肛門癌）、肝臓腫瘍（特に、肝細胞癌、胆管細胞癌および肝細胞癌・胆管細胞混合癌）、頭頚部領域の腫瘍（喉頭、下咽頭、上咽頭、中咽頭、口唇および口腔癌、口腔黒色腫）、皮膚腫瘍（基底細胞癌、棘細胞腫、扁平細胞癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、非黒色腫皮膚がん、メルケル細胞がん、肥満細胞腫瘍）、軟部組織の腫瘍（特に、軟部肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫）、眼の腫瘍（特に、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫）、内分泌および外分泌腺の腫瘍（例えば、甲状腺および副甲状腺の、膵臓および唾液腺癌、腺癌）、尿路の腫瘍（膀胱、陰茎、腎臓、腎盂および尿管の腫瘍）ならびに生殖器の腫瘍（女性の子宮内膜、子宮頸部、卵巣、膣、外陰部および子宮の癌ならびに男性の前立腺および精巣の癌）。
これらにはまた、固形型のよび循環細胞としての、血液、リンパ系および脊髄の過剰増殖血液疾患、例えば、白血病、リンパ腫および骨髄増殖性疾患、例えば、急性骨髄性、急性リンパ芽球性、慢性リンパ性、慢性骨髄性およびヘアリーセル白血病、ならびにAIDS関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫および中枢神経系のリンパ腫も含まれる。
これらのヒトで十分特徴付けられた疾患は、他の哺乳動物でも比較可能な病因で生じ得るものであり、そこでも同様に本発明の化合物で治療することができる。
本発明による化合物による上記がん疾患の治療は、固形腫瘍の治療と、その転移または循環型の治療の両方を含む。
本発明の文脈において、「治療」または「治療する」という用語は、慣用的な意味で使用され、疾患または健康異常と戦う、これを減少させる、減弱するまたは軽減する、および例えば、がんのイベントにおけるように、この疾患によって損なわれる生活状態を改善することを目的として患者を担当する、介護するおよび看護することを意味する。
よって、本発明はさらに、障害、特に上記障害を治療および／または予防するための本発明による化合物の使用を提供する。
本発明はさらに、障害、特に上記障害を治療および／または予防するための医薬品を製造するための本発明による化合物の使用を提供する。
本発明はさらに、障害、特に上記障害を治療および／または予防する方法への本発明による化合物の使用を提供する。
本発明はさらに、有効量の本発明による化合物の少なくとも1種を使用して、障害、特に上記障害を治療および／または予防する方法を提供する。
本発明による化合物は、単独で、または必要に応じて、組み合わせが望ましくない、許容されない副作用をもたらさない限り、1種または複数の他の薬理学的に活性の物質と組み合わせて使用することができる。そのため、本発明はさらに、特に上記障害を治療および／または予防するための、本発明による化合物の少なくとも1種と、1種または複数のさらなる活性化合物とを含む医薬品を提供する。
例えば、本発明の化合物を、がん疾患を治療するために既知の抗過剰増殖、細胞増殖抑制性または細胞毒性物質と組み合わせることができる。適当な組み合わせ活性化合物の例としては、131I−chTNT、アバレリクス、アビラテロン、アクラルビシン、アファチニブ、アフリバーセプト、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリセルチブ、アリトレチノイン、アルファラディン（塩化ラジウム−223）、アルトレタミン、アミノグルテチミド、AMP−514、アムルビシン、アムサクリン、アナストロゾール、アルグラビン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、AT9283、アキシチニブ、アザシチジン、バシリキシマブ、ベロテカン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ビサントレン、ブレオマイシン、BMS−936559、ボスチニブ、ボルテゾミブ、ブレンツキシマブベドチン、ブセレリン、ブスルファン、カバジタキセル、ホリナートカルシウム、レボホリナートカルシウム、カペシタビン、カルボプラチン、カルフィルゾミブ（プロテアソーム阻害剤）、カルモフール、カルムスチン、カツマキソマブ、セレコキシブ、セルモロイキン、セツキシマブ、クロラムブシル、クロルマジノン、クロルメチン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロン酸、クロファラビン、コパンリシブ、クリサンタスパーゼ、クリゾチニブ、シクロホスファミド、CYC116、シプロテロン、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチン−α、ダブラフェニブ、ダヌセルチブ（danusertib）、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デスロレリン、塩化ジブロスピジウム、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキソルビシン＋エストロン、エクリズマブ、エドレコロマブ、酢酸エリプチニウム、エルトロンボパグ、エンドスタチン、ENMD−2076、エノシタビン、エピルビシン、エピチオスタノール、エポエチンα、エポエチンβ、エプタプラチン、エリブリン、エルロチニブ、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、ファドロゾール、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォルメスタン、フォテムスチン、フルベストラント、硝酸ガリウム、ガニレリクス、ゲフィチニブ、ゲムシタ
ビン、ゲムツズマブ、グルトキシム、ゴセレリン、ヒスタミン二塩酸塩、ヒストレリン、ヒドロキシカルバミド、I−125種、イバンドロン酸、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イミキモド、INCB24360、インプロスルファン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、イピリムマブ、イリノテカン、イキサベピロン、ラムブロリズマブ（lambrolizumab）、ランレオチド、ラパチニブ、レナリドミド、レノグラスチム、レンチナン、レトロゾール、リュープロレリン、レバミソール、リスリド、ロバプラチン、ロムスチン、ロニダミン、マソプロコール、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メピチオスタン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、アミノレブリン酸メチル、メチルテストステロン、ミファムルチド、ミルテホシン、ミリプラチン、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトラクトール、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、MLN−8054、Mps1阻害剤（国際公開第2013／087579号パンフレット、特に実施例01．01、国際公開第2014／131739号パンフレット、特に実施例2に開示されている）、ネダプラチン、ネララビン、ネモルビシン、ニロチニブ、ニルタミド、ニモツズマブ、ニムスチン、ニトラクリン、ニボルマブ、NMS−P715、NMS−P937、オファツムマブ、オメプラゾール、オプレルベキン、オキサリプラチン、p53遺伝子治療、パクリタキセル、パルボシクリブ、パリフェルミン、パラジウム103種、パミドロン酸、パニツムマブ、パゾパニブ、ペグアスパラガーゼ、PEG−エポエチンβ（メトキシPEG−エポエチンβ）、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンα−2b、ペメトレキセド、ペンタゾシン、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピシバニル、ピラルビシン、プレリキサフォル、プリカマイシン、ポリグルサム、リン酸ポリエストラジオール、ポリサッカリドK、ポナチニブ、ポルフィマーナトリウム、プララトレキサート、プレドニムスチン、プロカルバジン、キナゴリド、R763、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、ラニムスチン、ラゾキサン、ラファメチニブ、ラゴラフェニブ、リセドロン酸、リツキシマブ、ロミデプシン、
ロミプロスチム、ロニンシクリブ（roninciclib）、ルクソリチニブ、サルグラモスチム、シプロイセルT、シゾフィラン、ソブゾキサン、グリシジダゾールナトリウム、SNS−314、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、タラポルフィン、タミバロテン、タモキシフェン、タソネルミン、テセロイキン、テガフール、テガフール＋ギメラシル＋オテラシル、テモポルフィン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、テトロフォスミン、タリドミド、チオテパ、チマルファシン、TKM−PLK1、チオグアニン、トシリズマブ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トザセルチブ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トレオスルファン、トレチノイン、トリロスタン、トリプトレリン、トロホスファミド、トリプトファン、ウベニメクス、バルルビシン、バンデタニブ、バプレオチド、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ボラセルチブ、ボリノスタット、ボロゾール、XL228、イットリウム90ガラスミクロビーズ、ジノスタチン、ジノスタチンスチマラマー、ゾレドロン酸、ゾルビシンが挙げられる。
さらに、本発明の化合物を、例えば、例として、以下の標的：OX−40、CD137／4−1BB、DR3、IDO1／IDO2、LAG−3、CD40に結合することができる結合剤と組み合わせることができる。
さらに、本発明による化合物を放射線療法および／または外科的介入と組み合わせて使用することもできる。
一般的に、本発明の化合物と他の細胞増殖抑制または細胞毒性活性剤との組み合わせを用いて、以下の目的を追求することができる：
・個々の活性化合物による治療と比べて、腫瘍の成長の緩徐化、そのサイズの減少またはその完全な排除における改善した有効性；
・単独療法の場合によりも低い投与量で使用される化学療法薬の使用の可能性；
・個々の投与と比べて少ない副作用でのより許容できる治療の可能性；
・より広い範囲の腫瘍疾患の治療の可能性；
・治療に対する高い奏効率の達成；
・現代の標準的治療と比べて長い患者の生存期間。
さらに、本発明による化合物を放射線療法および／または外科的介入と組み合わせて使用することもできる。
本発明はさらに、典型的には1種または複数の不活性で、非毒性の、薬学的に適当な賦形剤と共に少なくとも1種の本発明による化合物を含む医薬品、および上記目的のためのその使用を提供する。
本発明による化合物は全身的におよび／または局所的に作用することができる。この目的のために、これらを適当な様式で、例えば、非経口的に、おそらくは吸入で（inhalatively）またはインプラントもしくはステントとして投与することができる。
本発明による化合物をこれらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。
非経口投与は、吸収ステップを迂回することができる（例えば、静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内または腰椎内）または吸収を含むことができる（例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮または腹腔内）。非経口投与に適した投与形態には、液剤、懸濁剤、乳剤または凍結乾燥物の形態の注射および注入用製剤が含まれる。非経口投与、特に、静脈内投与が好ましい。
一般に、非経口投与の場合、有効な結果を達成するために、約0．001〜1mg／kg、好ましくは約0．01〜0．5mg／kg体重の量を投与することが有利であることが分かった。
それにもかかわらず、該当する場合には、具体的には体重、投与経路、活性化合物に対する個体の反応、製剤の性質および投与が行われる時間または間隔の関数として言及する量から逸脱することが必要となり得る。したがって、上記最小量未満で十分となり得る場合がある一方で、言及する上限を超過しなければならない場合がある。より多量を投与する場合、これらを1日数回の個々の用量に分割することが賢明となり得る。
実施例
以下の実施例は本発明を説明する。本発明はこれらの実施例に制限されない。
特に明言しない限り、以下の試験および実施例中の百分率は、重量百分率であり、部は重量部である。液体／液体溶液の溶媒比、希釈比および濃度データは各場合において体積に基づく。
合成経路：
実施例に例示的に、以下のスキームは実施例をもたらす例示的合成経路を示す。
スキーム1：システイン結合ADCの合成
スキーム2：システイン結合ADCの合成
スキーム3：システイン結合ADCの合成
スキーム4：システイン結合ADCの合成
スキーム5：リジン結合ADCの合成
a）トリホスゲン、THF、アルゴン下
スキーム6：リジン結合ADCの合成
スキーム7
［a）：EDCI、HOBT、ジイソプロピルエチルアミン、室温；b）エタノール、ピペリジン、メチルアミン、水、室温；c）HATU、ジイソプロピルエチルアミン、室温；d）TFA、DCM、室温］
スキーム8
［a）：例えば、EDCI、HOBT、ジイソプロピルエチルアミン、DMF、室温；b）例えば、DCM／TFA20：1、室温；c）例えば、HATU、ジイソプロピルエチルアミン、DMF、室温；d）例えば、TFA、DCM、室温］
スキーム9
［a）：例えば、2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート、ジイソプロピルエチルアミン、DCM、室温；b）例えば、2M LiOH溶液、THF、水、室温、位置異性体のHPLC分離；c）例えば、EDCI、HOBT、ジイソプロピルエチルアミン、DMF、室温；d）例えば、TFA、DCM、室温］
スキーム10
［a）：例えば、H2、Pd−C、EtOH、室温；b）例えば、p−ニトロベンジルブロミド、K2CO3、DMF；c）例えば、エタノール、水中40％濃度メチルアミン溶液、50℃；d）例えば、亜ジチオン酸二ナトリウム、THF、水、50℃；e）例えば、HATU、ジイソプロピルエチルアミン、DMF、室温；f）例えば、ピペリジン、水中40％濃度メチルアミン溶液、エタノール、50℃；g）例えば、ジイソプロピルエチルアミン、DMF、室温；h）例えば、ピペリジン、DMF、室温；i）TFA、DCM、室温］
スキーム11
［a）：例えば、Et3N、DMF、室温；b）例えば、H2、Pd−C、EtOH／酢酸エチル／THF（1：1：1）、室温；c）例えば、4−メチルモルホリン、DMF、室温；d）例えば、HATU、HOAt、ジイソプロピルエチルアミン、DMF、室温；e）例えば、TFA、室温］
スキーム12
［a）：例えば、NaBH（OAc）3、HOAc、ジクロロメタン、室温；b）例えば、クロロアセチルクロリド、NEt3、DCM、室温；c）例えば、Cs2CO3、DMF、50℃；d）例えば、1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン塩酸塩（1：1）、T3P（登録商標）、ジイソプロピルエチルアミン、MeCN、室温；e）例えば、TFA、室温］
スキーム13
［a）：例えば、メタンスルホン酸クロリド、NEt3、ジクロロメタン、0℃；b）例えば、NaN3、DMF、40℃；c）例えば、H2、Pd−C、EtOH／酢酸エチル（1：1）、室温；d）例えば、TBAF、THF、室温；e）例えば、1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオン、NEt3、CaCO3、1，4−ジオキサン、室温；f）例えば、N−クロロスクシンイミド、TEMPO、テトラ−n−ブチルアンモニウムクロリド、クロロホルム、0．05N炭酸カリウム／0．05N重炭酸ナトリウム溶液（1：1）；g）例えば、NaBH（OAc）3、HOAc、ジクロロメタン、室温；h）例えば、クロロアセチルクロリド、NEt3、DCM、室温；i）例えば、TBAF、THF、水、室温；j）例えば、4−メチルモルホリン、DMF、室温；k）例えば、TFA、室温］
スキーム14
［a）：例えば、ホルムアルデヒド、Na2CO3、水、室温；b）例えば、Ac2O、ピリジン、THF、室温；c）例えば、ジ−tert−ブチルマロネート、KOtBu、THF、室温；d）例えば、LiBH4、THF、室温；e）例えば、TBDMSCl、イミダゾール、DCM、室温；f）例えば、デス−マーチンペルヨージナン、DCM；g）例えば、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、AcOH、DCM、室温；h）例えば、nBu4NF、THF、室温；i）例えば、SOCl2、THF、室温；j）例えば、AcSK、nBu4NI、DMF、90℃；k）例えば、NaOH、MeOH、THF、室温；l）例えば、TCEP、ジオキサン、室温；m）例えば、エピマーの分離；n）例えば、6N塩酸、THF、室温o）例えば、Mal−dPEG（3）−Mal、PBS緩衝液、ACN、室温］
スキーム15
［a）：例えば、Mal−dPEG（3）−Mal、PBS緩衝液、ACN、室温］
スキーム16
［a）：例えば、BF3OEt2、THF、0℃；b）：例えば、亜硝酸イソアミル、−10℃、0．5時間；c）例えば、2−クロロ−3−オキソ酪酸メチル、ピリジン、水、−5℃；d）：例えば、NEt3、トルエン、室温；e）：例えば、Et3SiH、TFA、室温；f）：例えば、LiBH4、THF、60℃；g）：例えば、デス−マーチンペルヨージナン、DCM、室温；h）；例えば、（R）−（＋）−メチル−2−プロパンスルフィンアミド、チタン（IV）イソプロポキシド、THF、室温；i）：例えば、tert−BuLi、ペンタン、THF、−78℃；j）：例えば、ジオキサン中HCl、THF、MeOH、室温；k）：例えば、3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロパナール、NaB（OAc）3H、AcOH、DCM、室温；l）：例えば、2−クロロ−2−オキソエチルアセテート、NEt3、DCM、室温；m）：例えば、メチルアミン、水、EtOH、50℃］
スキーム17
［a）：例えば、tert−ブチルN−（tert−ブトキシカルボニル）−5−オキソ−L−ノルバリネート、NaB（OAc）3H、AcOH、DCM、室温；b）：例えば、2−クロロ−2−オキソエチルアセテート、NEt3、DCM、室温；c）例えば、メチルアミン、水、EtOH、60℃；d）例えば、THF、DCM、50℃；e）例えば、Boc2O、NEt3、DCM、室温；f）：例えば、トリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）、HATU、ジイソプロピルエチルアミン、DMF、室温；f）：例えば、TFA、DCM、室温］
スキーム18：システイン結合ADCの合成
スキーム19：システイン結合ADCの合成
スキーム20：システイン結合ADCの合成
スキーム21：システイン結合ADCの合成
スキーム22
［a）：例えば、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、酢酸、DCM、室温；b）例えば、アセトキシアセチルクロリド、NEt3、DCM、室温；c）例えば、LiOH、THF／水、室温；d）例えば、H2、Pd−C、EtOH、室温；e）例えば、Teoc−OSu、NEt3、ジオキサン、室温；f）例えば、Fmoc−Cl、ジイソプロピルエチルアミン、ジオキサン／水2：1、室温］
スキーム23
［a）：例えば、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、酢酸、DCM、室温；b）例えば、アセトキシアセチルクロリド、NEt3、DCM、室温；c）例えば、LiOH、メタノール、室温；d）例えば、TFA、DCM、室温；e）例えば、Boc2O、ジイソプロピルエチルアミン、DCM、室温］
スキーム24
［a）：例えば、ベンジルブロミド、Cs2CO3、DMF、室温；b）例えば、Pd（dppf）2Cl2、DMF、Na2CO3、85℃；c）例えば、LiAlH4、THF、0℃；MnO2、DCM、室温；d）例えば、Ti（iOPr）4、THF、室温；e）例えば、tBuLi、THF、−78℃；MeOH、NH4Cl；f）例えば、HCl／1，4−ジオキサン］
スキーム25：システイン結合ADCの合成
スキーム26：加水分解スクシンアミドを介したシステイン結合ADCの合成
このプロセスを特に、ADC（L1＝CH2）を開鎖結合形態に変換するためにこれらのADCに使用した。
スキーム27：
［a）：ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、酢酸、DCM、室温；b）アセトキシアセチルクロリド、ジイソプロピルエチルアミン、DCM、室温；c）LiOH、MeOH、室温；d）トリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）HATU、DMF、ジイソプロピルエチルアミン、室温；e）塩化亜鉛、トリフルオロエタノール、50℃、EDTA。］
スキーム28
［a）：HATU、DMF、ジイソプロピルエチルアミン、室温；b）塩化亜鉛、トリフルオロエタノール、50℃、EDTA。］
スキーム29
［a）：ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、酢酸、DCM、室温；b）アセトキシアセチルクロリド、トリエチルアミン、DCM、室温；c）LiOH、MeOH、室温；d）トリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）HATU、DMF、ジイソプロピルエチルアミン、室温；e）塩化亜鉛、トリフルオロエタノール、50℃、EDTA。］
スキーム30：
［a）：2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート（BEP）、DCM、ピリジン、室温；b）塩化亜鉛、トリフルオロエタノール、50℃、EDTA；c）3〜4当量のTCEP、PBS緩衝液；d）PBS緩衝液、20時間室温。］
スキーム31：
［a）：2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート（BEP）、DCM、ピリジン、室温；b）塩化亜鉛、トリフルオロエタノール、50℃、EDTA；c）3〜4当量のTCEP、PBS緩衝液；d）PBS緩衝液、20時間室温。］
本開示の文脈中、温度が反応の記載において与えられていない場合、常に室温を想定すべきである。
HPLCおよびLC−MS法：
方法1（LC−MS）：
機器：Waters ACQUITY SQD UPLCシステム；カラム：Waters Acquity UPLC HSS T3 1．8μ 50×1mm；移動相A：水1l＋99％濃度ギ酸0．25ml；移動相B：アセトニトリル1l＋99％濃度ギ酸0．25ml；勾配：0．0分90％A→1．2分5％A→2．0分5％A；オーブン：50℃；流量：0．40ml／分；UV検出：208〜400nm。
方法2（LC−MS）：
MS機器型：Waters Synapt G2S；UPLC機器型：Waters Acquity I−CLASS；カラム：Waters、BEH300、2．1×150mm、C18 1．7μm；移動相A：水1l＋0．01％ギ酸；移動相B：アセトニトリル1l＋0．01％ギ酸；勾配：0．0分2％B→1．5分2％B→8．5分95％B→10．0分95％B；オーブン：50℃；流量：0．50ml／分；UV検出：220nm
方法3（LC−MS）：
MS機器：Waters（Micromass）QM；HPLC機器：Agilent 1100シリーズ；カラム：Agilent ZORBAX Extend−C18 3．0×50mm 3．5ミクロン；移動相A：水1l＋0．01molの炭酸アンモニウム、移動相B：アセトニトリル1l；勾配：0．0分98％A→0．2分98％A→3．0分5％A→4．5分5％A；オーブン：40℃；流量：1．75ml／分；UV検出：210nm
方法4（LC−MS）：
MS機器型：Waters Synapt G2S；UPLC機器型：Waters Acquity I−CLASS；カラム：Waters、HSST3、2．1×50mm、C18 1．8μm；移動相A：水1l＋0．01％ギ酸；移動相B：アセトニトリル1l＋0．01％ギ酸；勾配：0．0分10％B→0．3分10％B→1．7分95％B→2．5分95％B；オーブン：50℃；流量：1．20ml／分；UV検出：210nm
方法5（LC−MS）：
機器：Waters ACQUITY SQD UPLCシステム；カラム：Waters Acquity UPLC HSS T3 1．8μ 50×1mm；移動相A：水1l＋99％濃度ギ酸0．25ml；移動相B：アセトニトリル1l＋99％濃度ギ酸0．25ml；勾配：0．0分95％A→6．0分5％A→7．5分5％A；オーブン：50℃；流量：0．35ml／分；UV検出：210〜400nm。
方法6（LC−MS）：
機器：Micromass Quattro Premier with Waters UPLC Acquity；カラム：Thermo Hypersil GOLD 1．9μ 50×1mm；移動相A：水1l＋50％濃度ギ酸0．5ml；移動相B：アセトニトリル1l＋50％濃度ギ酸0．5ml；勾配：0．0分97％A→0．5分97％A→3．2分5％A→4．0分5％A；オーブン：50℃；流量：0．3ml／分；UV検出：210nm。
方法7（LC−MS）：
機器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；カラム：Waters Acquity UPLC HSS T3 1．8μ 50×2．1mm；移動相A：水1l＋99％濃度ギ酸0．25ml；移動相B：アセトニトリル1l＋99％濃度ギ酸0．25ml；勾配：0．0分90％A→0．3分90％A→1．7分5％A→3．0分5％A；オーブン：50℃；流量：1．20ml／分；UV検出：205〜305nm。
方法8（LC−MS）：
MS機器型：Waters Synapt G2S；UPLC機器型：Waters Acquity I−CLASS；カラム：Waters、HSST3、2．1×50mm、C18 1．8μm；移動相A：水1l＋0．01％ギ酸；移動相B：アセトニトリル1l＋0．01％ギ酸；勾配：0．0分2％B→2．0分2％B→13．0分90％B→15．0分90％B；オーブン：50℃；流量：1．20ml／分；UV検出：210nm
方法9：実施例181〜191のためのLC−MS−Prep精製法（方法LIND−LC−MS−Prep）
MS機器：Waters；HPLC機器：Waters（カラムWaters X−Bridge C18、19mm×50mm、5μm、移動相A：水＋0．05％アンモニア、移動相B：勾配を有するアセトニトリル（ULC）；流量：40ml／分；UV検出：DAD；210〜400nm）
または
MS機器：Waters；HPLC機器：Waters（カラムPhenomenex Luna 5μ C18（2）100A、AXIA Tech．50×21．2mm、移動相A：水＋0．05％ギ酸、移動相B：勾配を有するアセトニトリル（ULC）；流量：40ml／分；UV検出：DAD；210〜400nm）。
方法10：実施例181〜191のためのLC−MS分析法（LIND＿SQD＿SB＿AQ）
MS機器：Waters SQD；HPLC機器：Waters UPLC；カラム：Zorbax SB−Aq（Agilent）、50mm×2．1mm、1．8μm；移動相A：水＋0．025％ギ酸、移動相B：アセトニトリル（ULC）＋0．025％ギ酸；勾配：0．0分98％A−0．9分25％A−1．0分5％A−1．4分5％A−1．41分98％A−1．5分98％A；オーブン：40℃；流量：0．600ml／分；UV検出：DAD；210nm。
方法11（HPLC）：
機器：HP1100シリーズ
カラム：Merck Chromolith SpeedROD RP−18e、50〜4．6mm、カタログ番号1．51450．0001、プレカラムChromolith Guard Cartridge Kit、RP−18e、5〜4．6mm、カタログ番号1．51470．0001
勾配：流量5ml／分
注入体積5μl
溶媒A：水中HClO4（70％濃度）（4ml／l）
溶媒B：アセトニトリル
開始20％B
0．50分20％B
3．00分90％B
3．50分90％B
3．51分20％B
4．00分20％B
カラム温度：40℃
波長：210nm
その調製が以下で明示的に記載されていない全ての反応物質または試薬は、一般的に利用可能な供給源から商業的に購入した。同様にその調製が以下で記載されておらず、商業的に得ることができなかったまたは一般的に利用可能でない供給源から得た他の全ての反応物質または試薬については、その調製が記載されている公開文献が参照される。
出発材料および中間体：
中間体C1
トリフルオロ酢酸−（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン（1：1）
標記化合物を国際公開第2006／002326号パンフレットに記載されるように調製した。
中間体C2
（2S）−4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］酪酸−tert−ブチル
tert−ブチルN−（tert−ブトキシカルボニル）−L−ホモセリネート4．22g（14．5mmol）をジクロロメタン180mlに溶解し、次いで、ピリジン3．5mlおよび1，1，1−トリアセトキシ−1λ5，2−ベンゾヨードキソール−3（1H）−オン9．2g（21．7mmol）を添加した。反応物を室温で1時間攪拌し、次いで、ジクロロメタン500mlで希釈し、10％濃度チオ硫酸ナトリウム溶液で2回抽出し、次いで、5％濃度クエン酸で2回および10％濃度重炭酸ナトリウム溶液で2回連続的に抽出した。有機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次いで、減圧下で乾燥させた。残渣をジエチルエーテルに溶解し、HCl（ジエチルエーテル中溶液）を添加した。沈殿を濾別し、次いで、濾液を濃縮し、アセトニトリル／水から凍結乾燥した。これにより、（2S）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−4−オキソ酪酸−tert−ブチル3．7g（93％）が得られ、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。（Rf：0．5（DCM／メタノール95／5）。
中間体C1 3．5g（9．85mmol）をDCM160mlに溶解し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド3．13g（14．77mmol）および酢酸0．7mlを添加した。室温で5分攪拌した後、（2S）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−4−オキソ酪酸−tert−ブチル3．23g（11．85mmol）を添加し、反応物を室温でさらに30分間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をアセトニトリル／水に溶解した。沈殿した固体を濾別し、乾燥させると、標記化合物5．46g（84％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．5分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．13分；MS（ESIpos）：m／z＝613（M＋H）＋．
中間体C3
（2S）−4−［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸
中間体C2 5．46g（8．24mmol）をDCM160mlに溶解し、次いで、トリエチルアミン4．8mlおよびアセトキシアセチルクロリド2．2ml（20．6mmol）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液、次いで飽和塩化ナトリウム溶液で3回抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで、濃縮した。残渣を、移動相シクロヘキサン／酢酸エチル2：1を用いてBiotage／Isolera（SNAP 340g）でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、アシル化中間体4．57g（75％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．49分；MS（ESIpos）：m／z＝713（M＋H）＋．
この中間体1g（1．36mmol）をDCM20mlに溶解し、TFA20mlを添加した。室温で5時間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣をn−ペンタンを用いて2回研和した。各場合で、n−ペンタンをデカントし、残った固体を高真空下で乾燥させた。これにより、（2S）−4−［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−アミノブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）1．1gが得られた。LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝557（M＋H）＋．
この中間体0．91g（1．57mmol）をDCM70mlに溶解し、ジ−tert−ブチルジカーボネート3．43g（15．7mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン4．1mlを添加した。室温で30分間攪拌した後、反応物をDCMで希釈し、5％濃度クエン酸で抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣をn−ペンタンを用いて2回研和し、各場合で、n−ペンタンをデカントした。残った固体をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥すると、標記化合物1．11gが得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．55分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．3分；MS（ESIpos）：m／z＝657（M＋H）＋．
中間体C4
（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体C2 5．46g（8．24mmol）をDCM160mlに溶解し、トリエチルアミン4．8mlおよびアセトキシアセチルクロリド2．2ml（20．6mmol）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液、次いで飽和塩化ナトリウム溶液で3回抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで、濃縮した。残渣を、移動相シクロヘキサン／酢酸エチル2：1を用いてBiotage／Isolera（SNAP 340g）でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、アシル化中間体4．57g（75％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．49分；MS（ESIpos）：m／z＝713（M＋H）＋．
この中間体1．5g（2．035mmol）をエタノール50mlに溶解し、メタンアミンの水中40％濃度溶液5．8mlを添加した。反応物を50℃で4時間撹拌し、次いで、濃縮した。残渣をDCMに溶解し、水で2回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次いで、濃縮した。
残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、この中間体1．235mgが得られ、これをさらに精製することなくさらに反応させた。
この中間体1．235mg（1．5mmol）をDCM15mlに溶解し、TFA15mlを添加した。室温で4時間攪拌した後、混合物を濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮し、残渣をアセトニトリルから凍結乾燥した。これにより、標記化合物1．04g（定量的）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝515（M＋H）＋．
中間体C5
（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸
中間体C4 0．9g（1．24mmol）をDCM60mlに溶解し、ジ−tert−ブチルジカーボネート2．7g（12．5mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン3．3mlを添加した。室温で45分間攪拌した後、反応物を濃縮し、残渣をジエチルエーテルに溶解し、混合物が濁り始めるまでn−ペンタンを添加した。反応物を0℃に冷却し、次いで、デカントした。もう一度、n−ペンタンを残渣に添加し、混合物をデカントした。残った固体をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥すると、標記化合物0．95g（定量的）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．5分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．27分；MS（ESIpos）：m／z＝615（M＋H）＋．
中間体C6
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル｛（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−ヒドラジノ−1−オキソブタン−2−イル｝カルバメート（1：1）
中間体C3 150mg（0．16mmol）をDMF21mlに溶解し、次いで、N−（3−ジメチルアミノプロピル）−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）37．2mg（0．19mmol）、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール37mg（0．243mmol）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン85μlおよび最後に商業的に入手可能な9H−フルオレン−9−イルメチルヒドラジンカルボキシレート45mg（0．18mmol）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮し、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥した。これにより、保護された中間体60mg（理論値の41％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．47分；MS（ESIpos）：m／z＝893（M＋H）＋．
この中間体60mg（0．067mmol）をエタノール19mlに溶解し、ピペリジン681μlおよびメタンアミンの水中40％濃度溶液386μlを添加した。反応物を50℃で18時間撹拌し、次いで、濃縮した。残渣をアセトニトリル／水2：1に溶解し、TFAを用いてpH2に調整した。次いで、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮し、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥した。これにより、標記化合物25mg（理論値の51％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．2分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．27分；MS（ESIpos）：m／z＝629（M＋H）＋．
中間体C7
1−｛（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）酢酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体C3 0．2g（0．305mmol）をDCM80mlに溶解し、2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート（BEP）0．125g（0．46mmol）、商業的に入手可能なエチルヒドラジノアセテート塩酸塩94mg（0．61mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン159μlを添加し、次いで、混合物を室温で1時間攪拌した。次いで、酢酸エチルおよび水を反応混合物に添加し、相を分離した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で抽出し、次いで、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過および濃縮した。残渣を減圧下で乾燥させ、精製することなくさらに反応させた。このために、これをテトラヒドロフラン20mlに溶解し、水10mlおよび2N水酸化リチウム溶液3．2mlを添加した。反応物を室温で1時間攪拌し、次いで、TFAを用いてpH7に調整した。次いで、反応物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。こうして、標記化合物をその初期溶出位置異性体から分離した。対応する分画を合わせ、凍結乾燥し、乾燥させると、標記化合物19．7g（2ステップにわたって理論値の8％）が無色泡として得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．4分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．22分；MS（ESIpos）：m／z＝687（M＋H）＋．
位置異性体の構造割り当てを、NMR分光法による保護された中間体の段階での位置異性体の分離後に別の実験で行った。標記化合物の保護された中間体エチル（1−｛（2S）−4−［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）アセテートは以下の1H NMRスペクトルを有していた：
1H NMR（500MHz，DMSO−d6）：δ＝7．8（m，2H），7．4−7．2（m，6H），7．08（m，1H），6．73（d，1H），5．6（s，1H），5．25 and 4，89（2d，2H），4．89 and 4．77（2d，2H），4．62（t，1H），4．32 and 3．78（2d，2H），4．1（t，2H），3．62−3．47（m），2．13（s，3H），1．41 and 0．72（2m，2H），1．3（s，9H），1．18（t，3H），0．92（s，9H）．
中間体C8
N−｛（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニン
中間体C3 293mg（0．41mmol）をDMF25mlに溶解し、次いで、N−（3−ジメチルアミノプロピル）−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）144mg（0．75mmol）、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール128mg（0．83mmol）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン218μlおよび最後に商業的に入手可能な3−メトキシ−3−オキソプロパン−1−アミニウムクロリド70mg（0．5mmol）を添加した。反応物を室温で4時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、保護された中間体177mg（理論値の53％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．6分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．33分；MS（ESIpos）：m／z＝742（M＋H）＋．
この中間体177mg（0．22mmol）をメタノール20mlに溶解し、2N水酸化リチウム溶液2．8mlを添加した。反応物を室温で18時間撹拌した。次いで、混合物を濃縮し、残渣を水に溶解し、5％濃度クエン酸を用いて溶液をpH5に調整した。次いで、混合物をDCMで2回抽出し、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。最後に、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥すると標記化合物133mg（理論値の81％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．3分；
LC−MS（方法3）：Rt＝7．4分；MS（ESIpos）：m／z＝686（M＋H）＋．
中間体C9
（6S）−6−｛2−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］エチル｝−2，2−ジメチル−4，7−ジオキソ−3，11，14，17−テトラオキサ−5，8−ジアザイコサン−20−酸
第1のステップで、中間体C5 70mg（0．114mmol）を、1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩44mg（0．228mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物35mg（0．228mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン60μlの存在下で、DMF15ml中tert−ブチル3−｛2−［2−（2−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノエート32mg（0．114mmol）とカップリングした。
反応物を室温で一晩攪拌し、生成物を分取HPLCによって精製した。これにより、保護された中間体33mg（理論値の33％）が得られた。これをジクロロメタン11ml中トリフルオロ酢酸1．1mlと1時間攪拌すると、後処理後に、完全に脱保護された化合物26mg（98％）が得られた。
最後に、中間体をDCM2mlに溶解し、室温で3日間攪拌しながら、それぞれジ−tert−ブチルジカーボネート10mgおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミン79μlを2回添加することによって、tert−ブトキシカルボニル保護基を導入した。分取HPLCによる生成物の精製により、標記化合物16．4mg（理論値の66％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．3分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．22分；MS（ESIpos）：m／z＝818（M＋H）＋．
中間体C10
tert−ブチル｛3−［｛（1R）−1−［1−（3−アミノベンジル）−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝カルバメート
標記化合物を中間体C1から6ステップにわたって調製した：最初のステップで、中間体C1 1g（2．77mmol）およびtert−ブチル（3−オキソプロピル）カルバメート0．864g（5mmol）をメタノール100ml中で合わせ、酢酸400mlおよびボラン−ピリジン錯体1．288g（13．9mmol）を添加した。反応物を室温で3日間撹拌した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（移動相：ジクロロメタン／酢酸エチル9：1→ジクロロメタン／メタノール95：5）によって精製した。適当な分画を濃縮し、高真空下で乾燥させると、N−アルキル化中間体1．255g（理論値の80％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．0分；MS（ESIpos）：m／z＝513（M＋H）＋．
この中間体1．255g（2．2mmol）をDCM50mlに溶解し、次いで、トリエチルアミン1．2mlおよびアセトキシアセチルクロリド0．52ml（4．85mmol）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液、次いで飽和塩化ナトリウム溶液で3回抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで、濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。
これにより、アシル化中間体593mg（理論値の41％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．4分；MS（ESIpos）：m／z＝613（M＋H）＋．
この中間体993mg（0．91mmol）をエタノール100mlに溶解し、10％パラジウム活性炭60mgを添加した後、標準水素圧力下室温で3分間水素化した。次いで、触媒を濾別し、溶媒を減圧下で除去した。これにより、脱ベンジル化イミダゾール誘導体494mg（理論値の91％）が実質的に無色の油として得られた。LC−MS（方法1）：Rt＝1．17分；MS（ESIpos）：m／z＝523（M＋H）＋．
この中間体150mg（0．25mmol）を最初にDMF15mlに装入し、炭酸カリウム69．2mg（0．5mmol）を添加した。室温で15分間攪拌した後、p−ニトロベンジルブロミド60mg（0．28mmol）を添加し、混合物を一晩攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、分取HPLCによって精製した。適当な分画をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を1，4−ジオキサンから凍結乾燥した。これにより、中間体169mg（定量的）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．39分；MS（ESIpos）：m／z＝658（M＋H）＋．
この中間体165mg（0．251mmol）をエタノール30mlに溶解し、メタンアミンの40％濃度水溶液0．35mlを添加した。反応物を50℃で5時間攪拌し、次いで、同量のメチルアミン溶液を再度添加した。10時間攪拌した後、反応物を減圧下で濃縮した。留出物をジエチルエーテルで2回再蒸留し、次いで、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥した。これにより、この中間体148mg（理論値の89％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝2．97分；MS（ESIpos）：m／z＝616（M＋H）＋．
前駆体98mg（0．15mmol）をTHF15mlに溶解し、次いで、亜ジチオン酸二ナトリウム569mg（3．27mmol）の水6ml中溶液を室温で添加した。50℃で8時間攪拌した後、同量の亜ジチオン酸塩−H2O1mlに溶解した−を再度添加した。50℃でさらに16時間攪拌した後、反応物を室温に冷却し、酢酸エチルで抽出した。有機相を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。残渣を1，4−ジオキサンから凍結乾燥すると、標記化合物44．5mg（理論値の47％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．24分；MS（ESIpos）：m／z＝586（M＋H）＋．
中間体C11
R／S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−ホモシステイン／トリフルオロアセテート（1：1）
（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン990．0mg（2．79mmol）を最初にジクロロメタン15．0mlに装入し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド828．8mg（3．91mmol）および酢酸129．9mg（3．21mmol）を添加し、混合物を室温で5分間攪拌した。ジクロロメタン15．0mlに溶解した2−（トリメチルシリル）エチル（3−オキソプロピル）カルバメート（中間体L58）698．1mg（3．21mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相をそれぞれ飽和炭酸ナトリウム溶液および飽和NaCl溶液で2回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルを用いて精製した（移動相：ジクロロメタン／メタノール100：2）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート1．25g（理論値の73％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．09分；MS（ESIpos）：m／z＝556（M＋H）＋．
トリエチルアミン151．4mg（1．5mmol）およびクロロアセチルクロリド161．6mg（1．43mmol）を2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート400．0mg（0．65mmol）に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。酢酸エチルを反応混合物に添加し、有機相を水で3回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルを用いて精製した（移動相：シクロヘキサン／酢酸エチル3：1）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート254．4mg（理論値の57％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．49分；MS（ESIneg）：m／z＝676（M＋HCOO−）−．
2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート117．4mg（0．19mmol）をイソプロパノール10．0mlに溶解し、1M NaOH928．4μlおよびDL−ホモシステイン50．2mg（0．37mmol）を添加した。反応混合物を50℃で4．5時間撹拌した。酢酸エチルを反応混合物に添加し、有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液および飽和NaCl溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×40；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物75．3mg（理論値の48％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．24分；MS（ESIpos）：m／z＝731（M＋H）＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．03（s，9H），0．40（m，1H），0．75−0．91（m，11H），1．30（m，1H），1．99−2．23（m，2H），2．63−2．88（m，4H），3．18−3．61（m，5H），3．79−4．10（m，3H），4．89（d，1H），4．89（d，1H），5．16（d，1H），5．56（s，1H），6．82（m，1H），6．91（s，1H），6．97（m，1H），7．13−7．38（m，6H），7．49（s，1H），7．63（m，1H），8．26（s，3H）．
中間体C12
R／S−［（8S）−11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−8−カルボキシ−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル］ホモシステイン
出発材料として（2S）−4−オキソ−2−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）酪酸メチル（中間体L57）および中間体C52を用いて、中間体C11の合成と同様に合成を行った。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．18分；MS（ESIpos）：m／z＝775（M＋H）＋．
中間体C13
9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3−オキサ−12−チア−5，9−ジアザオクタデカン−18−酸
中間体C16 90．0mg（0．15mmol）および6−（アセチルスルファニル）ヘキサン酸43．6mg（0．23mmol）をメタノール9．0mlに溶解し、水1滴および炭酸カリウム73．9mg（0．54mmol）を添加した。反応混合物を50℃で4時間攪拌し、次いで、酢酸エチルで希釈した。有機相を水／飽和NaCl溶液および飽和NaCl溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフにかけた（移動相：ジクロロメタン／メタノール＝100：2）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物が理論値の83％で得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．44分；MS（ESIpos）：m／z＝701（M＋H）＋．
中間体C14
R／S−［2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝アミノ）−2−オキソエチル］ホモシステイン
tert−ブチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C16）100．0mg（0．17mmol）を最初にイソプロパノール4．0mlに装入し、1M NaOH溶液276．5mg（0．85mmol）およびD／L−ホモシステイン45．9mg（0．34mmol）を添加した。反応混合物を50℃で1時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈した。有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液および飽和NaCl溶液で洗浄した。乾燥は硫酸マグネシウム上とし、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil250×40；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。
これにより、標記化合物92．6mg（理論値の66％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．07分；MS（ESIpos）：m／z＝688（M＋H）＋．
中間体C15
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C1）750．0mg（2．11mmol）をジクロロメタン15．0mlに溶解し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド626．0mg（2．95mmol）およびHOAc139μl（2．43mmol）を添加し、混合物を室温で5分間攪拌した。次いで、tert−ブチル（3−オキソプロピル）カルバメート（文献手順J．Med．Chem．2003、46、3536による合成）420．3mg（2．43mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。酢酸エチルを添加し、反応混合物を飽和炭酸ナトリウム溶液で2回抽出した。有機相を飽和NaCl溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフにかけた（移動相：シクロヘキサン／酢酸エチル＝4：1）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物881．0mg（理論値の82％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．07分；MS（ESIpos）：m／z＝513［M＋H］＋．
中間体C16
tert−ブチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C15）373．4mg（0．73mmol）を最初にジクロロメタン5．0mlに装入し、トリエチルアミン169．5mg（1．68mmol）およびクロロアセチルクロリド181．0mg（1．60mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、酢酸エチルを添加し、混合物を水で繰り返し抽出した。有機相を飽和NaCl溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフにかけた（移動相：ジクロロメタン／メタノール＝100：0．5）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物336．0mg（理論値の75％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．48分；MS（ESIpos）：m／z＝589［M＋H］＋．
中間体C17
9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3，15，18，21，24−ペンタオキサ−12−チア−5，9−ジアザヘプタコサン−27−酸
tert−ブチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C16）50．0mg（0．09mmol）を最初にDMF2．0mlに装入し、炭酸セシウム69．1mg（0．21mmol）および1−スルファニル−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカン−15−酸28．8mg（0．10mmol）を添加した。混合物を50℃で一晩撹拌した。水を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物25．1mg（理論値の35％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．42分；MS（ESIpos）：m／z＝835［M＋H］＋．
中間体C18
tert−ブチル［22−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−4，21−ジオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−19−チア−3，22−ジアザペンタコサン−25−イル］カルバメート
9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3，15，18，21，24−ペンタオキサ−12−チア−5，9−ジアザヘプタコサン−27−酸（中間体C17）21．0mg（0．03mmol）および1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン塩酸塩（1：1）5．8mg（0．03mmol）を最初にアセトニトリル1．0mlに装入し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン26．1mg（0．20mmol）およびT3P（酢酸エチル中50％）20．9mg（0．03mmol）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物19．7mg（理論値の79％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．42分；MS（ESIpos）：m／z＝835［M＋H］＋．
中間体C19
tert−ブチル（13−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−10−チア−7，13−ジアザ−2−シラヘキサデカン−16−イル）カルバメート
tert−ブチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C16）58．5mg（0．10mmol）を最初にDMF2．0mlに装入し、2−（トリメチルシリル）エチル（2−スルファニルエチル）カルバメート（中間体L39）44．0mg（0．20mmol）および炭酸セシウム64．7mg（0．20mmol）を添加した。
混合物を50℃で4時間攪拌した。中間体C16 46．6mg（0．079mmol）を用いて反応を繰り返した。2つの反応混合物を合わせ、分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物98．0mg（理論値の71％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．62分；MS（ESIpos）：m／z＝774［M＋H］＋．
中間体C20
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル［3−（｛［（2−アミノエチル）スルファニル］アセチル｝｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート
tert−ブチル（13−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−10−チア−7，13−ジアザ−2−シラヘキサデカン−16−イル）カルバメート（中間体C19）98．0mg（0．13mmol）を最初にDMF／tert−ブタノール（9：1）2．0mlに装入し、CsF96．2mg（0．63mmol）を添加した。混合物を90℃で16時間攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を凍結乾燥した。これにより、標記化合物57．1mg（理論値の61％）が得られた。化合物は対応するスルホキシドも含んでいる。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．08分；MS（ESIpos）：m／z＝630［M＋H］＋．
中間体C21
tert−ブチル［38−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−3，31，37−トリオキソ−7，10，13，16，19，22，25，28−オクタオキサ−35−チア−4，32，38−トリアザヘンテトラコンタン−41−イル］カルバメート
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル［3−（｛［（2−アミノエチル）スルファニル］アセチル｝｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C20）57．1mg（0．08mmol）を最初にDMF3．0mlに装入し、3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛27−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−27−オキソ−3，6，9，12，15，18，21，24−オクタオキサヘプタコサ−1−イル｝プロパンアミド53．0mg（0．08mmol）およびトリエチルアミン15．5mg（0．15mmol）を添加した。混合物を室温で16時間攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を凍結乾燥した。これにより、標記化合物49．7mg（理論値の49％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．34分；MS（ESIpos）：m／z＝1204［M＋H］＋．
中間体C22
tert−ブチル［38−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−35−オキシド−3，31，37−トリオキソ−7，10，13，16，19，22，25，28−オクタオキサ−35λ4−チア−4，32，38−トリアザヘンテトラコンタン−41−イル］カルバメート
標記化合物は中間体C21の合成で副産物として形成された。これにより、標記化合物15．5mg（理論値の15％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．25分；MS（ESIpos）：m／z＝1220［M＋H］＋．
中間体C23
tert−ブチル3−アミノ−4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝ピロリジン−1−カルボキシレート
立体異性体の混合物。
tert−ブチル3−ホルミル−4−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ピロリジン−1−カルボキシレート（中間体L28）411．2mg（1．15mmol）およびN−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C1）339．7mg（0．96mmol）を最初にジクロロメタン6．0mlに装入し、HOAc68．9mg（1．15mmol）を添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド405．2mg（1．91mmol）を添加し、混合物を室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチルおよび水を残渣に添加した。水相を酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機相を飽和NaCl溶液で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をBiotage Isolera（シリカゲル、カラム50g SNAP、流量40ml／分、石油エーテル／酢酸エチル）を用いて精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−［（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）メチル］−4−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ピロリジン−1−カルボキシレート541．5mg（理論値の81％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．24および1．29分；MS（ESIpos）：m／z＝698［M＋H］＋．
tert−ブチル3−［（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）メチル］−4−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ピロリジン−1−カルボキシレート541．5mg（0．78mmol）をジクロロメタン13．0mlに溶解し、トリエチルアミン180．6mg（1．78mmol）を添加した。反応溶液を0℃に冷却し、アセトキシアセチルクロリド233．1mg（1．71mmol）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。さらにトリエチルアミン180．6mg（1．78mmol）およびアセトキシアセチルクロリド233．1mg（1．71mmol）を添加し、混合物を室温でさらに80時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を水と酢酸エチルに分配した。水相を酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機相を飽和NaCl溶液で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をBiotage Isolera（シリカゲル、カラム50g SNAP、流量40ml／分、石油エーテル／酢酸エチル）を用いて精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ピロリジン−1−カルボキシレート529．2mg（理論値の86％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．53および1．56分；MS（ESIpos）：m／z＝798［M＋H］＋．
tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ピロリジン−1−カルボキシレート529．2mg（0．66mmol）を最初にDMF／tert−ブタノール（9：1）10．0mlに装入し、CsF503．7mg（3．32mmol）を添加した。反応混合物を90℃で16時間撹拌した。反応混合物を水と酢酸エチルに分配した。水相を酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機相を飽和NaCl溶液で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をBiotage Isolera（シリカゲル、カラム50g SNAP、流量25ml／分、ジクロロメタン／メタノール）を用いて精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−アミノピロリジン−1−カルボキシレート172．4mg（理論値の40％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．05および1．35分；MS（ESIpos）：m／z＝654［M＋H］＋．
tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−アミノピロリジン−1−カルボキシレート172．4mg（0．26mmol）を最初にメタノール／水（2：1）4．5mlに装入し、炭酸カリウム80．2mg（0．58mmol）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。反応混合物を水と酢酸エチルに分配した。水相を酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機相を飽和NaCl溶液で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物116．0mg（理論値の72％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．01分および1．03分；MS（ESIpos）：m／z＝612［M＋H］＋．
中間体C24
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル3−（アミノメチル）−4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝ピロリジン−1−カルボキシレート（1：1）
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C1）26．8mgをジクロロメタン3．0mlに溶解し、HOAc5．2mg（0．09mmol）およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド22．4mg（0．11mmol）を添加し、混合物を室温で5分間攪拌した。tert−ブチル3−ホルミル−4−［（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）メチル］ピロリジン−1−カルボキシレート（中間体L29）62．4mg（0．09mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物トリフルオロ酢酸／tert−ブチル3−［（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）メチル］−4−［（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）メチル］ピロリジン−1−カルボキシレート57．6mg（理論値の91％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．25および1．27分；MS（ESIpos）：m／z＝712［M＋H］＋．
tert−ブチル3−［（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）メチル］−4−［（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）メチル］ピロリジン−1−カルボキシレート77．0mg（0．11mmol）を最初にジクロロメタン1．5mlに装入し、トリエチルアミン21．9mg（0．22mmol）を添加した。次いで、0℃で、アセトキシアセチルクロリド29．5mg（0．22mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解した。有機相を水、飽和重炭酸ナトリウム溶液および飽和NaCl溶液でそれぞれ1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させた。tert−ブチル3−［（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）メチル］−4−［（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）メチル］ピロリジン−1−カルボキシレート77．0mg（0．11mmol）を用いて反応を繰り返した。合わせた残渣をシリカゲルで精製した（移動相：シクロヘキサン／酢酸エチル＝2：1）。これにより、化合物tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−［（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）メチル］ピロリジン−1−カルボキシレート171．1mg（理論値の85％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．56および1．57分；MS（ESIpos）：m／z＝812［M＋H］＋．
tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−［（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）メチル］ピロリジン−1−カルボキシレート30．0mg（0．04mmol）を最初にTBAF溶液（THF中1M）0．5mlに装入した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物25．0mg（理論値の92％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．98分；MS（ESIpos）：m／z＝626［M＋H］＋．
中間体C25
4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−1−（tert−ブトキシカルボニル）ピロリジン−3−カルボン酸
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C1）171．4mg（0．48mmol）を最初にジクロロメタン4．0mlに装入し、tert−ブチル3−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−4−ホルミルピロリジン−1−カルボキシレート（中間体L30）248．5mg（0．72mmol）およびHOAc34．8mg（0．58mmol）を添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド204．4mg（0．97mmol）を添加し、混合物を室温で60時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をBiotage Isolera（シリカゲル、カラム25g SNAP、流量25ml／分、石油エーテル／酢酸エチル）を用いて精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−［（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）メチル］−4−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−1−カルボキシレート267．0mg（理論値の77％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．49分；MS（ESIpos）：m／z＝683［M＋H］＋．
tert−ブチル3−［（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）メチル］−4−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−1−カルボキシレート267．0mg（0．39mmol）をジクロロメタン5．0mlに溶解し、トリエチルアミン91．0mg（0．90mmol）を添加し、混合物を0℃に冷却した。アセトキシアセチルクロリド117．4mg（0．86mmol）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。さらにトリエチルアミン593．4mg（5．87mmol）およびアセトキシアセチルクロリド427．0mg（3．13mmol）を添加し、混合物を室温でさらに10時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−1−カルボキシレート216．3mg（理論値の71％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．70および1．72分；MS（ESIpos）：m／z＝783［M＋H］＋．
tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−1−カルボキシレート216．3mg（0．28mmol）を最初にTHF4．0mlに装入し、HOAc16．6mg（0．28mmol）およびTBAF溶液（THF中1M）361．1mg（1．38mmol）を添加した。反応溶液を室温で4時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−1−カルボキシレート94．0mg（理論値の51％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．34分；MS（ESIpos）：m／z＝669［M＋H］＋．
tert−ブチル3−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−4−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−1−カルボキシレート52．0mg（0．08mmol）を最初にPBS緩衝液／アセトニトリル（9：1）4．0mlに装入し、TEMPO1．2mg（0．01mmol）を添加した。次いで、水1．0ml中亜塩素酸ナトリウム14．1mg（0．16mmol）および10％濃度自亜塩素酸ナトリウム溶液115．8μl（0．16mmol）を同時に添加した。反応混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物を10％濃度亜流酸ナトリウム溶液に注ぎ入れ、酢酸エチルを添加した。水相を酢酸エチルで3回抽出し、合わせた有機相を飽和NaCl溶液で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をさらに精製することなく次の合成ステップに使用した。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．34分；MS（ESIpos）：m／z＝683［M＋H］＋．
4−｛［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］メチル｝−1−（tert−ブトキシカルボニル）ピロリジン−3−カルボン酸103．0mg（0．15mmol）を最初にメタノール／水（2：1）4．5mlに装入し、炭酸カリウム45．9mg（0．33mmol）を添加し、混合物を室温で3時間攪拌した。反応混合物を水と酢酸エチルに分配した。水相を酢酸エチルで3回抽出し、合わせた有機相を飽和NaCl溶液で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、標記化合物をさらに精製することなく次の合成ステップに使用した。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．35分；MS（ESIpos）：m／z＝641［M＋H］＋．
中間体C26
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）プロピル］カルバメート
ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド590mg（1．69mmol）および酢酸155μl（2．70mmol、162mg）を最初にジクロロメタン30mlに装入し、混合物を室温で30分間攪拌した。次いで、（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン600mg（1．687mmol）（1N水酸化ナトリウム水溶液での抽出によってトリフルオロ酢酸／（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン（1：1）から得た）およびジクロロメタン40mlに溶解したtert−ブチル（3−｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−2−ホルミルプロピル）カルバメート750mg（2．362mmol）を滴加した。混合物を室温で2時間攪拌した。次いで、酢酸エチルを添加し、混合物を飽和炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、有機相を濃縮した。残渣を分取HPLC（移動相：ACN／水、勾配）によって分離した。これにより、標的化合物510mg（理論値の46％）がジアステレオマー混合物として得られた。
異性体1：
LC−MS（方法1）：Rt＝1．36分（51％）；MS（EIpos）：m／z＝657［M＋H］＋．
異性体2：
LC−MS（方法1）：Rt＝1．41分（49％）；MS（EIpos）：m／z＝657［M＋H］＋．
中間体C27
2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−2−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）プロピル｝アミノ）−2−オキソエチルアセテート
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）プロピル］カルバメート510mg（0．776mmol）を最初にジクロロメタン30mlに装入し、トリエチルアミン181mg（249μl、1．786mmol）および2−クロロ−2−オキソエチルアセテート219mg（1．553mmol）を添加した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、次いで、飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を分取HPLC（移動相：ACN／水、勾配）によって分離した。これにより、標的化合物290mg（理論値の49％）がエピマー混合物として得られた。
異性体1：
LC−MS（方法1）：Rt＝1．70分；MS（EIpos）：m／z＝757［M＋H］＋．
異性体2：
LC−MS（方法1）：Rt＝1．72分；MS（EIpos）：m／z＝757［M＋H］＋．
中間体C28
2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−2−（ヒドロキシメチル）プロピル｝アミノ）−2−オキソエチルアセテート
2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−2−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）プロピル｝アミノ）−2−オキソエチルアセテート285mg（0．376mmol）をTHF5mlに溶解した。テトラ−n−ブチルアンモニウムフルオリドのTHF中1M溶液452μl（0．452mmol）を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。反応混合物を分取HPLC（移動相：ACN／水、勾配）によって分離し、凍結乾燥した。これにより、標的化合物214mg（理論値の81％、LC／MSによる純度＝92％）がエピマー混合物として得られた。
異性体1：
LC−MS（方法1）：Rt＝1．37分；MS（EIpos）：m／z＝643［M＋H］＋．
異性体2：
LC−MS（方法1）：Rt＝1．40分；MS（EIpos）：m／z＝643［M＋H］＋．
中間体C29
2−（［3−（アセチルスルファニル）−2−｛［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］メチル｝プロピル］｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−オキソエチルアセテート
2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−2−（ヒドロキシメチル）プロピル｝アミノ）−2−オキソエチルアセテート210mg（0．301mmol）を最初に無水THF8mlに装入し、無水THF8mlに溶解した塩化チオニル178mg（1．503mmol、109μl）を室温で滴加し、混合物を室温で40分間攪拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。残渣を無水DMF16mlに溶解し、チオ酢酸カリウム172mg（1．503mmol）およびテトラ−n−ブチルアンモニウムヨージド133mg（0．361mmol）を添加し、混合物を90℃で2時間攪拌した。冷却後、水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を分取HPLC（移動相：ACN／水、勾配）によって精製し、凍結乾燥した。これにより、標的化合物155mg（理論値の69％、LC／MSによる純度＝94％）がエピマー混合物として得られた。
異性体1：
LC−MS（方法1）：Rt＝1．50分；MS（EIpos）：m／z＝701［M＋H］＋．
異性体2：
LC−MS（方法1）：Rt＝1．51分；MS（EIpos）：m／z＝701［M＋H］＋．
中間体C30
ジ−tert−ブチル［ジスルファンジイルビス（2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロパン−3，1−ジイル）］ビスカルバメート
2−（［3−（アセチルスルファニル）−2−｛［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］メチル｝プロピル］｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−オキソエチルアセテート1．220g（1．010mmol、LC／MSによる純度＝58％）を最初にTHF30mlおよびメタノール30mlに装入し、1N塩酸化ナトリウム水溶液10mlを添加し、混合物を室温で2時間攪拌した。水を添加し、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を分取HPLC（移動相：ACN／水、勾配）によって精製した。これにより、標的化合物390mg（理論値の54％、LC／MSによる純度＝86％）がジアステレオマー混合物として得られた。
異性体：
LC−MS（方法1）：Rt＝1．81分；MS（EIpos）：m／z＝1232［M＋H］＋．
中間体C31
tert−ブチル3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−（スルファニルメチル）プロピル｝カルバメート
ジ−tert−ブチル［ジスルファンジイルビス（2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロパン−3，1−ジイル）］ビスカルバメート390mg（0．272mmol、LC／MSによる純度＝86％）を1，4−ジオキサン20mlおよびPBS緩衝液10mlに溶解し、3，3’，3’’−ホスファントリイルトリプロパン酸塩酸塩（1：1）234mg（0．817mmol）を添加した。混合物を室温で16時間攪拌した。次いで、反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、ジクロロメタンを用いて研和し、濾液を高真空下で濃縮した。残渣をイソプロパノール8mlに溶解し、キラルクロマトグラフィー（カラム：Daicel Chiralpak AZ−Hで充填した250×30mm、移動相：イソヘキサン／イソプロパノール＝90：10）によって精製した。これにより、標的化合物の2つの分画が得られた。分画1は異性体1 181．2mg（理論値の50％）を含んでおり、分画2は異性体2 90．2mg（理論値の25％）をもたらした。
異性体1：
キラルHPLC（カラム、Daicel Chiralpak AZ−Hで充填した250×4．6mm、移動相：イソヘキサン．エタノール90：10）：Rt＝6．98分。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．47分；MS（EIpos）：m／z＝617［M＋H］＋．
異性体2：
キラルHPLC（カラム、Daicel Chiralpak AZ−Hで充填した250×4．6mm、移動相：イソヘキサン．エタノール90：10）：Rt＝9．39分。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．47分；MS（EIpos）：m／z＝617［M＋H］＋．
中間体C32
N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）（異性体1）
tert−ブチル3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−（スルファニルメチル）プロピル｝カルバメート（異性体1）123mg（199．42μmol）をTHF2mlに溶解し、半濃縮（semiconcentrated）塩酸10mlと室温で1時間攪拌した。反応溶液をアルゴン下で脱気し、次いで、凍結乾燥した。これにより、標的化合物108mg（理論値の98％）が得られた。
異性体1
LC−MS（方法1）：Rt＝0．95分；MS（EIpos）：m／z＝517［M＋H］＋．
中間体C33
N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）（異性体2）
tert−ブチル3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−（スルファニルメチル）プロピル｝カルバメート（異性体2）123mg（199．42μmol）をTHF2mlに溶解し、半濃縮塩酸10mlと室温で1時間攪拌した。反応溶液をアルゴン下で脱気し、次いで、凍結乾燥した。これにより、標的化合物58mg（理論値の63％、LC／MSによる純度＝91％）が得られた。
異性体2
LC−MS（方法1）：Rt＝0．97分；MS（ESIpos）：m／z＝517［M＋H］＋．
中間体C34
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート
（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン3．790g（10．02mmol）（1N水酸化ナトリウム水溶液での抽出によってトリフルオロ酢酸／（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン（1：1）から得た）、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド3．186g（15．04mmol）および690μl（12．03mmol、722mg）を最初にジクロロメタン100mlに装入した。混合物を室温で5分間攪拌した。
次いで、tert−ブチル（3−オキソプロピル）カルバメート4．687g（27．06mmol）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（移動相：ジクロロメタン／酢酸エチル、勾配＝4：1→1：1）によって精製した。これにより、標的化合物2．57g（理論値の48％、LC／MSによる純度＝96％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．00分；MS（EIpos）：m／z＝513［M＋H］＋．
中間体C35
tert−ブチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（4−ニトロベンゾイル）アミノ］プロピル｝カルバメート
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート200mg（0．38mmol）を最初に無水ジクロロメタン9mlに装入し、トリエチルアミン120μl（0．86mmol、87mg）を室温で添加した。室温で、無水ジクロロメタン1mlに溶解した4−ニトロベンゾイルクロリド83mg（0．45mmol）を滴加し、混合物を室温で1時間攪拌した。水を添加し、混合物をロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって精製し、乾燥させた。これにより、標的化合物181mg（理論値の73％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．47分；MS（EIpos）：m／z＝662［M＋H］＋．
中間体C36
tert−ブチル｛3−［（4−アミノベンゾイル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝カルバメート
tert−ブチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（4−ニトロベンゾイル）アミノ］プロピル｝カルバメート170mg（0．26mmol）を最初に酢酸10mlに装入した。鉄粉143mg（2．57mmol）を添加し、混合物を50℃で16時間撹拌した。冷却後、水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣をHV下で乾燥させた。これにより、標的化合物154mg（理論値の77％、LC／MSによる純度＝82％）が得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝4．73分；MS（EIpos）：m／z＝632［M＋H］＋．
中間体C37
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝カルバモイル）フェニル］−L−アラニンアミド
tert−ブチル｛3−［（4−アミノベンゾイル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝カルバメート38．6mg（0．05mmol、LC／MS純度＝82％）を無水DMFに溶解し、HATU24．8mg（0．06mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン13．0mg（0．10mmol）を添加した。混合物を室温で5分間攪拌し、N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−L−アラニン63mg（0．06mmol）を添加し、混合物を室温で3時間攪拌した。3H−［1，2，3］トリアゾロ［4，5−b］ピリジン−3−オール（HOAt）7．5mg（0．06mmol）を添加し、混合物を16時間攪拌した。HATU19．1mg（0．05mmol）を添加し、混合物を50℃で2時間撹拌した。冷却後、反応混合物を分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって直接精製した。これにより、標的化合物6．5mg（理論値の9％、LC／MSによる純度＝83％）が得られた。
LC−MS（方法2）：Rt＝7．89分；MS（EIpos）：m／z＝1200．6［M＋H］＋．
中間体C38
2−［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］−1H−イソインドール−1，3（2H）−ジオン
2−［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］−1H−イソインドール−1，3（2H）−ジオン（中間体C1）300．0mg（0．84mmol）を最初にジクロロメタン4．0mlに装入し、HOAc58．3mg（0．97mmol）およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド250．4mg（1．18mmol）を添加し、混合物を室温で5分間攪拌した。3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロパナール197．2mg（0．97mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相を飽和炭酸ナトリウム溶液で2回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルで精製した（移動相：酢酸エチル／シクロヘキサン1：5）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物333．3mg（70％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．05分；MS（ESIpos）：m／z＝543［M＋H］＋．
中間体C39
2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロピル］アミノ）−2−オキソエチルアセテート
2−［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］−1H−イソインドール−1，3（2H）−ジオン（中間体C38）332．3mg（0．61mmol）を最初にジクロロメタン8．0mlに装入し、トリエチルアミン142．5mg（1．35mmol）を添加した。0℃で、アセトキシアセチルクロリド184．0mg（1．35mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液で2回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルで精製した（移動相：酢酸エチル／シクロヘキサン1：3）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物367．1mg（63％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．42分；MS（ESIpos）：m／z＝643［M＋H］＋．
中間体C40
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド
2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロピル］アミノ）−2−オキソエチルアセテート（中間体C39）583．1mg（0．91mmol）を最初にエタノール15．0mlに装入し、メタンアミン（水中40％）1．41g（18．15mmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をトルエンと3回共蒸留した（co−distilled）。残渣をシリカゲルで精製した（移動相：ジクロロメタン／メタノール＝100：5）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物324．9mg（73％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．97分；MS（ESIpos）：m／z＝471［M＋H］＋．
中間体C41
トリフルオロ酢酸／L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド（1：1）
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C40）50．0mg（0．11mol）および2，5−ジオキソピロリジン−1−イル−N−（tert−ブトキシカルボニル）−L−アラニネート30．4mg（0．11mmol）を最初にDMF2．0mlに装入し、4−メチルモルホリン32．2mg（0．32mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。HOAc19．1mg（0．32mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル［（2S）−1−（｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝アミノ）−1−オキソプロパン−2−イル］カルバメート38．0mg（56％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．26分；MS（ESIpos）：m／z＝642［M＋H］＋．
tert−ブチル［（2S）−1−（｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝アミノ）−1−オキソプロパン−2−イル］カルバメート33．6mg（0．05mmol）を最初にジクロロメタン3．0mlに装入した。TFA119．4mg（1．05mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物トリフルオロ酢酸／N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド（1：1）32．8mg（96％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝542［M＋H］＋．
トリフルオロ酢酸／N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド（1：1）29．5mg（0．05mmol）および2，5−ジオキソピロリジン−1−イル−N−（tert−ブトキシカルボニル）−L−バリネート14．1mg（0．05mmol）を最初にDMF1．0mlに装入し、4−メチルモルホリン18．2mg（0．18mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−（tert−ブトキシカルボニル）−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド23．1mg（69％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．30分；MS（ESIpos）：m／z＝741［M＋H］＋．
N−（tert−ブトキシカルボニル）−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド19．4mg（0．03mmol）をジクロロメタン1．5mlに溶解し、TFA59．7mg（0．52mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。TFA119．4mg（1．04mmol）を添加し、混合物をもう一度室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物19．2mg（97％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．96分；MS（ESIpos）：m／z＝641［M＋H］＋．
中間体C42
2，5−ジフルオロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボレート
三フッ化ホウ素−ジエチルエーテル錯体3．00g（21．16mmol、2．68ml）を最初に装入し、無水THF27mlに溶解した2，5−ジフルオロアニリン1．37g（10．58mmol）を0℃でゆっくり滴加した。−10℃で、無水THF3mlに溶解した亜硝酸イソアミル1．61g（13．75mmol、1．85ml）の溶液を滴加し、攪拌を同じ温度で30分間継続した。ジエチルエーテル15mlを添加し、沈殿したジアゾニウム塩を濾別し、少量のジエチルエーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させた。これにより、標的化合物2．27g（理論値の94％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝0．24分；MS（ESIpos）：m／z＝141［M］＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝8．11−8．17（m，1H），8．36−8．43（m，1H），8．69−8．73（m，1H）．
中間体C43
メチルクロロ［2−（2，5−ジフルオロフェニル）ヒドラジニリデン］アセテート
アルゴン雰囲気下で、2−クロロ−3−オキソ酪酸メチル3．63g（24．13mmol）を最初に水100mlに装入し、ピリジン48．90g（618．19mmol、50．00ml）を−5℃で添加し、混合物をこの温度で10分間攪拌した。次いで、−5℃で、2，5−ジフルオロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボレート5．00g（21．94mmol）を添加すると、オレンジ色懸濁液が形成した。混合物をこの温度で30分間攪拌し、反応物を水で希釈し、ジクロロメタンで3回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。これにより、標的化合物5．52g（理論値の97％、LC／MSによる純度＝96％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．03分；MS（ESIpos）：m／z＝249［M＋H］＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝3．85（s，3H），6．88−6．94（m，1H），7．16−7．21（m，1H），7．31−7．37（m，1H），10．00（s，1H）．
中間体C44
メチル4−ベンゾイル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−カルボキシレート
メチルクロロ［2−（2，5−ジフルオロフェニル）ヒドラジニリデン］アセテート（LC／MSによる純度96％）3．50g（13．52mmol）を無水トルエン9mlに溶解し、（2E）−3−（ジメチルアミノ）−1−フェニルプロパ−2−エン−1−オン2．61g（14．87mmol）およびトリエチルアミン3．01g（29．73mmol、4．14ml）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を分取HPLC（移動相：0．1％ギ酸を含むACN／水、勾配）によって分離した。これにより、標的化合物1．79g（理論値の39％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．07分；MS（ESIpos）：m／z＝343［M＋H］＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝3．86（s，3H），7．44−7．50（m，1H），7．55−7．72（m，4H），7．81−7．87（m，3H），8．80（d，1H）．
中間体C45
［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］メタノール
メチル4−ベンゾイル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−カルボキシレート（LC／MSによる純度＝96％）3．18g（8．92mmol）を最初にトリフルオロ酢酸50mlに装入し、トリエチルシラン8．74g（75．13mmol、12ml）を滴加し、混合物を室温で1時間攪拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。得られた残渣を無水THF120mlに溶解し、ボラン−テトラヒドロフラン錯体2．89g（33．63mmol、33．63ml）を0℃で滴加した。混合物を室温で一晩撹拌した。変換率が低かったため、THF中1Mリチウムボロヒドリド溶液さらに12．33ml（12．33mmol）を添加した。混合物を室温で1時間、60℃で30分間および80℃で2時間攪拌した。0℃で、飽和重炭酸ナトリウム溶液60mlを用いて反応物を慎重にクエンチした。混合物をそれぞれ酢酸エチル100mlで2回抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。これにより、標的化合物2．67g（理論値の76％、純度＝96％）が得られた。
LC−MS（方法3）：Rt＝2．79分；MS（ESIpos）：m／z＝329［M＋H］＋．
1HNMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝3．91（s，2H），4．45（d，2H），6．51（s，1H），7．18−7．23（m，2H），7．27−7．32（m，4H），7．46−7．53（m，1H），7．60−7．65（m，1H），7．95（d，1H）．
中間体C46
4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−カルバルデヒド
［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］メタノール（純度96％）2．66g（8．50mmol）をジクロロメタン150mlに溶解し、デス−マーチンペルヨージナン4．33g（10．20mmol）を一度に少量ずつ添加した。混合物を室温で2時間攪拌し、次いで、半濃縮重炭酸ナトリウム溶液100mlおよび10％濃度チオ硫酸ナトリウム溶液100mlを添加し、混合物を20分間攪拌した。有機相を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、高真空下で濃縮した。これにより、標的化合物2．35g（理論値の88％、純度＝95％）が得られた。
LC−MS（方法7）：Rt＝1．49分；MS（ESIpos）：m／z＝299［M＋H］＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝4．12（s，2H），7．17−7．21（m，1H），7．27−7．31（m，4H），7．37−7．42（m，1H），7．57−7．62（m，1H），7．75−7．78（m，1H），8．22（d，1H），10．06（s，1H）．
中間体C47
（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン
4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−カルバルデヒド2．35g（7．56mmol）を無水THF25mlに溶解し、（R）−（＋）−2−メチル−2−プロパンスルフィンアミド1．10g（9．08mmol）およびチタン（IV）イソプロポキシド4．73g（16．64mmol）を添加した。反応混合物を室温で16時間攪拌し、飽和塩化ナトリウム溶液20mlおよび酢酸エチル30mlを添加した。次いで、珪藻土約3gを添加し、混合物を還流下で1時間沸騰させた。混合物を濾過し、有機相を濾液から分離した。水相を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。残渣をさらに精製することなくさらに使用した。
アルゴン雰囲気下で、残渣を無水THF60mlに溶解し、−78℃に冷却し、tert−ブチルリチウムのペンタン中溶液（c＝1．6mol／l）14．5ml（23．24mmol）を滴加した。反応物を−78℃で3時間攪拌し、次いで、メタノール5mlおよび飽和塩化アンモニウム溶液15mlでクエンチした。攪拌しながら、反応混合物を室温に加温させた（約30分）。混合物を酢酸エチルで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で抽出し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。残渣をさらに精製することなくさらに使用した。
残渣をTHF30mlおよびメタノール6mlに溶解し、ジオキサン中4N塩化水素溶液6ml（24．00mmol）を添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。次いで、飽和炭酸ナトリウム溶液15mlを添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を分離し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。残渣を分取HPLC（移動相：ACN／水、勾配）によって分離した。これにより、標的化合物の2つの分画が得られた。第1の分画は生成物1．31g（理論値の72％、LC／MS純度＝97％）をもたらし、第2の分画は生成物0．37g（理論値の17％、LC／MS純度＝83％）をもたらした。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝356［M＋H］＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．91（s，9H），1．71（s，2H），3．59（s，1H），3．87（s，2H），7．17−7．32（m，6H），7．45−7．51（m，1H），7．61−7．65（m，1H），7．84（sbr，1H）．
中間体C48
（2S）−4−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］酪酸−tert−ブチル
（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン1．28g（3．35mmol、LC／MS純度93％）を無水ジクロロメタン100mlに溶解し、酢酸261mg（4．35mmol、250μl）およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド1．14g（4．34mmol）を室温で添加し、引き続いて5分間攪拌した後、（2S）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−4−オキソ酪酸−tert−ブチル1．19g（4．35mmol）を添加した。混合物を室温で15分間攪拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、アセトニトリルおよび水に溶解し、分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって精製した。これにより、標的化合物1．64g（理論値の80％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．10分；MS（ESIpos）：m／z＝613［M＋H］＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝1．01（s，9H），1．32（s，9H），1．35（s，9H），1．80−1．89（m，1H），2．01−2．11（m，1H），2．54−2．71（m，2H），3．75−3．81（m，1H），3．90（s，2H），4．18（d，1H），7．13（d，1H），7．20−7．24（m，1H），7．28−7．34（m，5H），7．52−7．58（m，1H），7．76−7．80（m，1H），8．10（sbr，1H），8．23（sbr，1H）．
中間体C49
（2S）−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸
（2S）−4−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］酪酸−tert−ブチル225mg（0．37mmol）を無水ジクロロメタン10mlに溶解し、トリエチルアミン156mg（1．54mmol）を添加した。0℃で、アセトキシアセチルクロリド125mg（0．92mmol）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。さらにアセトキシアセチルクロリド251mg（1．84mmol）およびトリエチルアミン186mg（1．84mmol）を添加し、混合物を室温で3時間攪拌した。少量のジクロロメタンを添加し、混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液および飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。残渣をエタノール10mlに溶解し、40％濃度メチルアミン水溶液0．91ml（12．67mmol）を添加し、混合物を50℃で3時間攪拌した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶解し、有機相を水で2回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。残渣をジクロロメタン2mlに溶解し、トリフルオロ酢酸2ml（25．96mmol）を添加し、混合物を50℃で4時間攪拌した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させた。残渣を無水ジクロロメタン10mlに溶解し、トリエチルアミン298mg（2．95mmol）およびジ−tert−ブチルジカーボネート429mg（1．97mmol）を添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を分取HPLC（移動相：ACN／水、勾配）によって精製した。これにより、標的化合物62mg（理論値の27％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．32分；MS（ESIpos）：m／z＝615［M＋H］＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．91（s，9H），1．32（s，9H），2．64−2．72（m，4H），3．50−3．58（m，1H），3．72（dd，2H），4．07−4．22（m，2H），4．47−4．54（m，1H），5．75（s，1H），6．84−6．89（m，1H），7．15−7．30（m，6H），7．47−7．53（m，1H），7．70−7．75（m，1H），8．09−8．13（m，1H），11．66（sbr，1H）．
中間体C50
tert−ブチル［（2S）−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−1−オキソブタン−2−イル］カルバメート
（2S）−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸60mg（0．1mmol）を無水DMF10mlに溶解し、HATU74mg（0．20mmol）を添加した。トリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）74mg（0．29mmol）を無水DMF2mlに別々に溶解し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン38mg（0．29mmol）を添加し、混合物を反応混合物に滴加した。反応物を室温で3日間撹拌した。混合物を分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって直接精製した。これにより、標的化合物9．3mg（理論値の13％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．34分；MS（ESIpos）：m／z＝737［M＋H］＋．
中間体C51
N−｛（2S）−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニン
最初に、中間体C47を中間体C2と同様にベンジルN−｛（2S）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−4−オキソブタノイル｝−β−アラニネートを用いて還元的にアルキル化した。次いで、二級アミノ基を中間体C27について記載されるように2−クロロ−2−オキソエチルアセテートを用いてアシル化し、次いで、2個のエステル基をメタノール中2M水酸化リチウム溶液で加水分解した。これにより、標記化合物23mgが得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．24分；MS（ESIpos）：m／z＝686（M＋H）＋．
中間体C52
（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン
メチル4−ブロモ−1H−ピロール−2−カルボキシレート10．00g（49．01mmol）を最初にDMF100．0mlに装入し、炭酸セシウム20．76g（63．72mmol）および臭化ベンジル9．22g（53．91mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水と酢酸エチルに分配し、水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。メチル4−ブロモ−1H−ピロール−2−カルボキシレート90．0gを用いて反応を繰り返した。
2つの合わせた反応物を分取RP−HPLC（カラム：Daiso300×100；10μ、流量：250ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物メチル1−ベンジル−4−ブロモ−1H−ピロール−2−カルボキシレート125．15g（理論値の87％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．18分；MS（ESIpos）：m／z＝295［M＋H］＋．
アルゴン下で、メチル1−ベンジル−4−ブロモ−1H−ピロール−2−カルボキシレート4．80g（16．32mmol）を最初にDMFに装入し、（2，5−ジフルオロフェニル）ボロン酸3．61g（22．85mmol）、飽和炭酸ナトリウム溶液19．20mlおよび［1，1’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］−ジクロロパラジウム（II）：ジクロロメタン1．33g（1．63mmol）を添加した。反応混合物を85℃で一晩撹拌した。反応混合物をCeliteを通して濾過し、濾過ケークを酢酸エチルで洗浄した。有機相を水で抽出し、次いで、飽和NaCl溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルで精製した（移動相：シクロヘキサン／酢酸エチル100：3）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物メチル1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−カルボキシレート3．60g（理論値の67％）が得られた。
LC−MS（方法7）：Rt＝1．59分；MS（ESIpos）：m／z＝328［M＋H］＋．
メチル1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−カルボキシレート3．60g（11．00mmol）を最初にTHF90．0mlに装入し、水素化アルミニウムリチウム（THF中2．4M）1．04g（27．50mmol）を0℃で添加した。反応混合物を0℃で30分間撹拌した。0℃で、飽和酒石酸カリウムナトリウムを添加し、酢酸エチルを反応混合物に添加した。有機相を飽和酒石酸カリウムナトリウム溶液で3回抽出した。有機相を飽和NaCl溶液で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン30．0mlに溶解した。酸化マンガン（IV）3．38g（32．99mmol）を添加し、混合物を室温で48時間攪拌した。酸化マンガン（IV）さらに2．20g（21．47mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物をCeliteを通して濾過し、濾過ケークをジクロロメタンで洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させ、（1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−カルバルデヒド）の残渣2．80gをさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
LC−MS（方法7）：Rt＝1．48分；MS（ESIpos）：m／z＝298［M＋H］＋．
1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−カルバルデヒド28．21g（94．88mmol）を（R）−2−メチルプロパン−2−スルフィンアミド23．00g（189．77mmol）と一緒に最初に無水THF403．0mlに装入し、チタン（IV）イソプロポキシド7．42g（237．21mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。飽和NaCl溶液500．0mlおよび酢酸エチル1000．0mlを添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。混合物を珪藻土を通して濾過し、濾液を飽和NaCl溶液で2回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をBiotage Isolera（シリカゲル、カラム1500＋340g SNAP、流量200ml／分、酢酸エチル／シクロヘキサン1：10）を用いて精製した。
LC−MS（方法7）：Rt＝1．63分；MS（ESIpos）：m／z＝401［M＋H］＋．
（R）−N−｛（E／Z）−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］メチレン｝−2−メチルプロパン−2−スルフィンアミド25．00g（62．42mmol）を最初にアルゴン下で無水THFに装入し、−78℃に冷却した。次いで、tert−ブチルリチウム（ペンタン中1．7M溶液）12．00g（187．27mmol）を−78℃で添加し、混合物をこの温度で3時間攪拌した。次いで、−78℃で、メタノール71．4mlおよび飽和塩化アンモニウム溶液214．3mlを連続して添加し、反応混合物を室温に加温させ、室温で1時間攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣（R）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−メチルプロパン−2−スルフィンアミドをさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
LC−MS（方法6）：Rt＝2．97分；MS（ESIpos）：m／z＝459［M＋H］＋．
（R）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−メチルプロパン−2−スルフィンアミド28．00g（61．05mmol）を最初に1，4−ジオキサン186．7mlに装入し、次いで、HClの1，4−ジオキサン中溶液（4．0M）45．8mlを添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：（カラム：Kinetix 100×30；流量：60ml／分、MeCN／水）によって精製した。アセトニトリルを減圧下で蒸発させ、ジクロロメタンを水性残渣に添加した。有機相を重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物16．2g（理論値の75％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝2．10分；MS（ESIpos）：m／z＝338［M−NH2］＋，709［2M＋H］＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．87（s，9H），1．53（s，2H），3．59（s，1H），5．24（d，2H），6．56（s，1H），6．94（m，1H），7．10（d，2H），7．20（m，1H），7．26（m，2H），7．34（m，2H），7．46（m，1H）．
中間体C53
（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−｛［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ブタン酸
最初に、中間体C52をC2と同様に（2S）−2−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−4−オキソ酪酸ベンジルを用いて還元的にアルキル化した。次いで、二級アミノ基を中間体C27について記載されるように2−クロロ−2−オキソエチルアセテートを用いてアシル化し、次いで、2個のエステル基をメタノール中2M水酸化リチウム溶液で加水分解した。こうして得られた中間体をエタノールに溶解し、パラジウム炭素（10％）を添加し、混合物を標準圧力下で1時間、水素を用いて室温で水素化した。脱保護された化合物をジオキサン／水2：1に溶解し、最後のステップで、N，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で9H−フルオレン−9−イルメチルクロロカルボネートを用いてFmoc保護基を導入した。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．37分；MS（ESIpos）：m／z＝734（M−H）−．
中間体C54
N−［（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−｛［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ブタノイル］−β−アラニン
最初に、中間体C52を中間体C2と同様にベンジルN−［（2S）−2−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−4−オキソブタノイル］−β−アラニネートを用いて還元的にアルキル化した。次いで、二級アミノ基を中間体C27について記載されるように2−クロロ−2−オキソエチルアセテートを用いてアシル化した。こうして得られた中間体をエタノールに溶解し、パラジウム炭素（10％）を添加し、混合物を標準圧力下で1時間、水素を用いて室温で水素化した。次いで、2個のエステル基をメタノール中2M水酸化リチウム溶液で加水分解した。脱保護された化合物をジオキサン／水2：1に溶解し、最後のステップで、N，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で9H−フルオレン−9−イルメチルクロロカルボネートを用いてFmoc保護基を導入した。これにより、標記化合物48mgが得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．38分；MS（ESIpos）：m／z＝807（M＋H）＋．
中間体C55
2−［3−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］−1H−イソインドール−1，3（2H）−ジオン
（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン340mg（0．96mmol）を無水DCM7mlに溶解し、酢酸69mg（1．15mmol、60μl）およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド284mg（1．34mmol）を室温で添加した。混合物を15分間攪拌し、次いで、3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロパナール233mg（1．15mmol）を添加した。混合物を室温で4．5時間攪拌した。さらに3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロパナール233mg（1．15mmol）、酢酸69mg（1．15mmol、60μl）およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド284mg（1．34mmol）を添加し、混合物を室温で7時間攪拌した。酢酸エチルを添加し、反応混合物を飽和炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を濃縮し、残渣を分取HPLCで2回［1．）移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配；2．）移動相：ACN／水＋1％TFA＋1．0％NEt3）］精製した。これにより、標的化合物108mg（理論値の21％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．96分；MS（ESIpos）：m／z＝543［M＋H］＋．
中間体C56
2−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロピル］アミノ）−2−オキソエチルアセテート
2−［3−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］−1H−イソインドール−1，3（2H）−ジオン102mg（0．19mmol）を最初に無水DCM2mlに装入し、トリエチルアミン44mg（0．43mmol）を室温で添加した。0℃で、無水DCM1mlに溶解した2−クロロ−2−オキソエチルアセテート31mg（0．23mmol）を添加した。混合物を室温で40分間攪拌した。無水DCM0．5mlに溶解した2−クロロ−2−オキソエチルアセテートさらに26mgおよびトリエチルアミン19mg（0．19mmol）を添加し、混合物を室温で60分間攪拌した。
水を添加し、混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって精製した。これにより、標的化合物106mg（理論値の88％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．37分；MS（ESIpos）：m／z＝643［M＋H］＋．
中間体C57
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル｛（2S）−1−［（2−アミノエチル）アミノ］−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−オキソブタン−2−イル｝カルバメート（1：1）
HATUの存在下で中間体C49を9H−フルオレン−9−イルメチル（2−アミノエチル）カルバメートとカップリングし、その後ピペリジンを用いてFmoc保護基を除去することによって、標記化合物を標準的な方法により調製した。これにより、標記化合物14mg（2ステップにわたり理論値の40％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．98分；MS（ESIpos）：m／z＝657（M＋H）＋．
中間体C58
（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ブタン酸
最初に、中間体C52を中間体C2と同様に（2S）−2−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−4−オキソ酪酸ベンジルを用いて還元的にアルキル化した。最初に、中間体C52をC2と同様に（2S）−2−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−4−オキソ酪酸ベンジルを用いて還元的にアルキル化した。次いで、二級アミノ基を中間体C27について記載されるように2−クロロ−2−オキソエチルアセテートを用いてアシル化し、次いで、2個のエステル基をメタノール中2M水酸化リチウム溶液で加水分解した。こうして得られた中間体をエタノールに溶解し、パラジウム炭素（10％）を添加し、混合物を標準圧力下で1時間、水素を用いて室温で水素化した。
この完全に脱保護された中間体500mg（0．886mmol）をジオキサン60mlに溶解し、1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオン253mg（0．975mmol）およびトリエチルアミン198μlを添加した。室温で24時間攪拌した後、反応物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、減圧下で濃縮し、高真空下で乾燥させると、標記化合物312mg（理論値の50％）が得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝4．61分；MS（ESIpos）：m／z＝658（M＋H）−．
中間体C59
（2S）−4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［（2S）−2−メトキシプロパノイル］アミノ）−2−｛［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ブタン酸
最初に、（2S）−4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝酪酸ベンジルの二級アミノ基を中間体C53について記載されるようにトリエチルアミンの存在下で（2S）−2−メトキシプロパノイルクロリド（中間体C53の中間体）を用いてアシル化した。得られた中間体をエタノールに溶解し、パラジウム炭素（10％）を添加し、混合物を標準圧力下で1時間、水素を用いて室温で水素化した。脱保護された化合物をジオキサン／水2：1に溶解し、最後のステップで、N，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で9H−フルオレン−9−イルメチルクロロカルボネートを用いてFmoc保護基を導入した。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．39分；MS（ESIpos）：m／z＝764（M−H）−．
中間体C60
（2S）−4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［（2S）−2−メトキシプロパノイル］アミノ）−2−｛［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ブタン酸
中間体C53と同様に合成を行った。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．41分；MS（ESIpos）：m／z＝750（M＋H）＋．
中間体C61
N−［（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ブタノイル］−β−アラニン
中間体C58 60mg（0．091mmol）をメチルβ−アラニネートとカップリングし、引き続いて2M水酸化リチウム溶液を用いてエステル開裂をすることによって、標記化合物を調製した。これにより、2ステップにわたって標記化合物67mg（理論値の61％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．29分；MS（ESIpos）：m／z＝729（M＋H）＋．
中間体C62
N−［（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ブタノイル］−D−アラニン
中間体C58およびメチルD−アラニネートから中間体C61と同様に標記化合物を調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．32分；MS（ESIpos）：m／z＝729（M＋H）＋．
中間体C63
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル｛（2S）−1−［（2−アミノエチル）アミノ］−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−オキソブタン−2−イル｝カルバメート（1：1）
1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩28．7mg（0．15mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物22．9mg（0．15mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン39μlの存在下で中間体C3 50mg（0．075mmol）を9H−フルオレン−9−イルメチル（2−アミノエチル）カルバメート塩酸塩（1：1）26．2mg（0．082mmol）とカップリングする第1のステップでこの中間体の合成を始めた。室温で18時間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、この中間体45mg（理論値の65％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．51分；MS（ESIpos）：m／z＝921（M＋H）＋．
この中間体45mg（0．049mmol）をエタノール10mlに溶解し、メタンアミンの水中40％濃度溶液176μlを添加した。反応物を50℃で攪拌し、同量のメタンアミン溶液を6時間後および9時間後に添加した。50℃でさらに14時間攪拌した後、メタンアミン溶液さらに700μlを添加し、さらに20時間攪拌した後、最後に混合物を濃縮した。残渣をDCMに溶解し、水で洗浄した。有機相を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させると、tert−ブチル｛（2S）−1−［（2−アミノエチル）アミノ］−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−オキソブタン−2−イル｝カルバメート32mg（理論値の99％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．95分；MS（ESIpos）：m／z＝657（M＋H）＋．
中間体C64
トリフルオロ酢酸／2−（トリメチルシリル）エチル｛（2S）−1−［（2−アミノエチル）アミノ］−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−オキソブタン−2−イル｝カルバメート（1：1）
C63と同様に中間体C58から標記化合物を調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝2．4分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．01分；MS（ESIpos）：m／z＝700（M＋H）＋．
中間体C65
（8S）−8−｛2−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］エチル｝−2，2−ジメチル−6，11−ジオキソ−5−オキサ−7，10−ジアザ−2−シラテトラデカン−14−酸
中間体L66 215mg（0．59mmol）を最初にジクロロメタン25mlに装入し、デス−マーチンペルヨージナン377mg（0．89mmol）およびピリジン144μl（1．78mmol）を添加した。混合物を室温で30分間攪拌した。次いで、反応物をジクロロメタン300mlで希釈し、有機相を10％濃度Na2S2O3溶液、10％濃度クエン酸溶液および飽和重炭酸ナトリウム溶液でそれぞれ2回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。これにより、アルデヒド305mgが得られ、これをさらに精製することなく反応させた。
中間体C52 175mg（0．49mmol）をジクロロメタン50mlに溶解し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド147mg（0．69mmol）および酢酸32．5μlを添加した。室温で5分間攪拌した後、上記アルデヒド214mg（0．593mmol）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。ここで、予想される生成物の代わりに、2−（トリメチルシリル）エチル［（2S）−4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−1−（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）ブタン−2−イル］カルバメートが形成した。このイミドも標記化合物に変換することができるので、反応物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当なイミド含有分画を合わせた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、上に示されるイミド195mg（58％）が得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝3．32分；MS（ESIpos）：m／z＝667（M＋H）＋．
このイミド65mg（97．5μmol）をジクロロメタン15mlに溶解し、アセトキシアセチルクロリド367μl（3．4mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン595μlを添加した。室温で30分間攪拌した後、反応物を減圧下で加熱することなく濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせると、溶媒を蒸発させ、高真空下で乾燥させた後、（8S）−11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−8−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）メチル］−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イルアセテート28mg（理論値の37％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．44分；MS（ESIpos）：m／z＝767（M＋H）＋．
この中間体28mg（37μmol）をメタノール3mlに溶解し、2M水酸化リチウム溶液548μlを添加した。室温で10分間攪拌した後、反応物をトリフルオロ酢酸でpH4に調整し、次いで、濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、溶媒を蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させると、標記化合物26mg（理論値の96％）が白色固体として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．33分；MS（ESIpos）：m／z＝743（M＋H）＋．
中間体C66
2−（トリメチルシリル）エチル［（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−｛［2−（グリシルアミノ）エチル］アミノ｝−1−オキソブタン−2−イル］カルバメート
最初に、トリフルオロ酢酸／ベンジル｛2−［（2−アミノエチル）アミノ］−2−オキソエチル｝カルバメート（1：1）を、ペプチド化学の古典的な方法（HATUカップリングおよびBoc除去）によりN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］グリシンおよびtert−ブチル（2−アミノエチル）カルバメートから調製した。
この中間体13mg（0．036mmol）および中間体C58 25mg（0．033mmol）をDMF3mlに溶解し、HATU19mg（0．05mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン17μlを添加した。
室温で10分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、中間体17．8mg（理論値の60％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．36分；MS（ESIpos）：m／z＝891（M＋H）＋．
この中間体17mg（0．019mmol）をエタノール10mlに溶解し、パラジウム炭素（10％）を添加し、混合物を標準圧力で2時間、水素を用いて室温で水素化した。触媒を濾別し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物9mg（理論値の62％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．03分；MS（ESIpos）：m／z＝757（M＋H）＋．
中間体C67
9H−フルオレン−9−イルメチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート
（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン（中間体C52）605．3mg（1．71mmol）を最初にジクロロメタン10．0mlに装入し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド506．7mg（2．39mmol）および酢酸117．9mg（1．96mmol）を添加し、混合物を室温で5分間攪拌した。ジクロロメタン10．0mlに溶解した9H−フルオレン−9−イルメチル（3−オキソプロピル）カルバメート（中間体L70）580．0mg（1．96mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相をそれぞれ飽和炭酸ナトリウム溶液および飽和NaCl溶液で2回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルで精製した（移動相：シクロヘキサン／酢酸エチル3：1）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物514．7mg（理論値の46％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．10分；MS（ESIpos）：m／z＝634（M＋H）＋．
中間体C68
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート
化合物中間体C67の合成と同様に合成を行った。
（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン（中間体C47）1000．0mg（2．81mmol）
ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド835．0mg（3．94mmol）
酢酸194．0mg（3．24mmol）
tert−ブチル（3−オキソプロピル）カルバメート560．0mg（3．24mmol）
これにより、標記化合物695．8mg（理論値の48％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．02分；MS（ESIpos）：m／z＝513（M＋H）＋．
中間体C69
11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸
（2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C70）117．0mg（0．19mmol）および3−スルファニルプロパン酸21．6mg（0．20mmol）を最初にメタノール3．0mlに装入し、炭酸カリウム89．5mg（0．65mmol）を添加し、混合物を50℃で4時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相を水および飽和NaCl溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。残渣をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。これにより、標記化合物106．1mg（理論値の73％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．42分；MS（ESIneg）：m／z＝700（M−H）−．
中間体C70
（2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート
2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C11の合成参照）908．1mg（1．63mmol）およびトリエチルアミン545．6mg（5．39mmol）を最初にジクロロメタン10．0mlに装入し、混合物を0℃に冷却した。この温度で、クロロアセチルクロリド590．5mg（5．23mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相をそれぞれ飽和重炭酸ナトリウム溶液および飽和塩化アンモニウム溶液で3回洗浄した。有機相を飽和NaCl溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物673．8mg（理論値の65％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．53分；MS（ESIneg）：m／z＝676（M＋HCOO−）−．
中間体C71
S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
L−システイン536．6mg（4．43mmol）を重炭酸ナトリウム531．5mg（6．33mmol）と一緒に水2．5mlに懸濁した。イソプロパノール25．0mlに溶解した2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C70）400．0mg（0．63mmol）および1，8−ジアザビシクロ［5．4．0］ウンデカ−7−エン1．16g（7．59mmol）を添加した。反応混合物を50℃で1．5時間撹拌した。酢酸エチルを反応混合物に添加し、有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液で繰り返しおよび飽和NaCl溶液で1回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物449．5mg（理論値の86％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．20分；MS（ESIpos）：m／z＝717（M＋H）＋．
中間体C72
（9S）−9−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−2，2−ジメチル−6，11−ジオキソ−5−オキサ−7，10−ジアザ−2−シラテトラデカン−14−酸
中間体L72 90mg（0．212mmol）を最初にジクロロメタン6mlに装入し、ピリジン86μl（1．06mmol）およびデス−マーチンペルヨージナン135mg（0．318mmol）を添加した。混合物を室温で30分間攪拌した。次いで、反応物をジクロロメタン30mlで希釈し、有機相を10％濃度Na2S2O3溶液で2回および5％濃度クエン酸溶液で1回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。こうして得られたアルデヒドをさらに精製することなく反応させた。
中間体C52 63mg（0．177mmol）をジクロロメタン15mlに溶解し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド52．4mg（0．247mmol）および酢酸20．2μlを添加した。室温で5分間攪拌した後、上記アルデヒド89．6mg（0．212mmol）を添加し、反応物を室温で20分間攪拌した。反応物を減圧下で濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥した。これにより、ベンジル（9R）−9−［（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）メチル］−2，2−ジメチル−6，11−ジオキソ−5−オキサ−7，10−ジアザ−2−シラテトラデカン−14−オエート71mg（2ステップにわたって理論値の53％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．21分；MS（ESIpos）：m／z＝761（M＋H）＋．
この中間体70mg（92μmol）をジクロロメタン15mlに溶解し、混合物を10℃に冷却し、トリエチルアミン54μlおよびアセトキシアセチルクロリド25．5μl（0．23mmol）を添加した。室温で1時間攪拌した後、同量の酸塩化物およびトリエチルアミンを添加し、もう一度室温でさらに1時間攪拌した。次いで、反応物を室温でさらに30分間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせると、溶媒を蒸発させ、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥した後、アシル化中間体46．5mg（理論値の59％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．53分；MS（ESIpos）：m／z＝861（M＋H）＋．
この中間体46mg（53μmol）をメタノール5mlに溶解し、2M水酸化リチウム溶液2．7mlを添加した。室温で10分間攪拌した後、反応物を酢酸でpH3〜4に調整し、次いで、水15mlで希釈した。水相を酢酸エチルで抽出し、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥すると、高真空下で残渣を乾燥させた後、標記化合物37mg（理論値の90％）が白色固体として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．32分；MS（ESIpos）：m／z＝729（M＋H）＋．
中間体C73
S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［3−（トリメチルシリル）プロパノイル］−L−システイン
S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）（中間体C71）619mg（0．86mmol）を最初にジクロロメタン8．8mlに装入し、トリエチルアミン87mg（0．86mmol）およびN−［2−（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］ピロリジン−2，5−ジオン224mg（0．86mmol）を添加した。1時間後、N−［2−（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］ピロリジン−2，5−ジオン45mg（0．17mmol）を添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶解し、次いで、有機相を水および飽和重炭酸ナトリウム溶液で2回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。残渣をさらに精製することなくさらに使用した。これにより、標記化合物602mg（71％、純度87％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．58分；MS（ESIpos）：m／z＝861（M＋H）＋．
中間体L1
トリフルオロ酢酸／N−（2−アミノエチル）−2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセトアミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能な（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）酢酸およびtert−ブチル（2−アミノエチル）カルバメートからペプチド化学の古典的方法によって調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝0．19分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．17分；MS（ESIpos）：m／z＝198（M＋H）＋．
中間体L2
トリフルオロ酢酸／rel−（1R，2S）−2−アミノ−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能なシス−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−1−シクロペンタンカルボン酸50mg（0．214mmol）および同様に商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）60mg（0．235mmol）からEDC／HOBTとカップリングし、その後、TFAを用いて脱保護することによって調製した。これにより、標記化合物36mg（2ステップにわたり理論値の38％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．2分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．17分；MS（ESIpos）：m／z＝252（M＋H）＋．
中間体L3
トリフルオロ酢酸／（1S，2R）−2−アミノ−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能な（1S，2R）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸50mg（0．214mmol）と同様に商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）72mg（0．283mmol）からEDC／HOBTとカップリングし、その後、TFAを用いて脱保護することによって調製した。これにより、標記化合物13mg（2ステップにわたり理論値の16％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．2分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．2分；MS（ESIpos）：m／z＝252（M＋H）＋．
中間体L4
トリフルオロ酢酸／N−（2−アミノエチル）−4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）シクロヘキサンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能な1−［（4−｛［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］カルボニル｝シクロヘキシル）メチル］−1H−ピロール−2，5−ジオンおよびtert−ブチル（2−アミノエチル）カルバメートからペプチド化学の古典的方法によって調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝0．26分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．25分；MS（ESIpos）：m／z＝280（M＋H）＋．
中間体L5
トリフルオロ酢酸／N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−β−アラニンアミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能な1−（4−アミノフェニル）−1H−ピロール−2，5−ジオンおよびN−（tert−ブトキシカルボニル）−β−アラニンからペプチド化学の古典的方法によって調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝0．22分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．22分；MS（ESIpos）：m／z＝260（M＋H）＋．
中間体L6
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル−N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−L−リジネート（1：1）
標記化合物を最初に、EDC／HOBTの存在下で、商業的に入手可能な6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサン酸を部分的に保護されたペプチドtert−ブチルL−バリル−L−アラニル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジネートとカップリングすることによって調製し、ペプチド化学の古典的方法によって調製した。これに引き続いて、DCM中5％濃度トリフルオロ酢酸中室温で攪拌することにより、穏やかな条件下でアミノ基で脱保護すると、標記化合物が37％の収率で得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．29分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．62分；MS（ESIpos）：m／z＝566（M＋H）＋．
中間体L7
トリフルオロ酢酸／β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物を、商業的に入手可能な1−（4−アミノフェニル）−1H−ピロール−2，5−ジオンからHATUの存在下で逐次N2−（tert−ブトキシカルボニル）−N5−カルバモイル−L−オルニチンとカップリングし、TFAを用いて脱保護し、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−（tert−ブトキシカルボニル）−L−バリネートとカップリングし、TFAを用いて脱保護し、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−（tert−ブトキシカルボニル）−β−アラニネートとカップリングし、さらにTFAを用いて脱保護することによってペプチド化学の古典的方法により調製した。これにより、標記化合物32mgが得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．31分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．47分；MS（ESIpos）：m／z＝516（M＋H）＋．
中間体L8
トリフルオロ酢酸／L−アラニル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物を、商業的に入手可能な1−（4−アミノフェニル）−1H−ピロール−2，5−ジオンからHATUの存在下で逐次N2−（tert−ブトキシカルボニル）−N5−カルバモイル−L−オルニチンとカップリングし、TFAを用いて脱保護し、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−（tert−ブトキシカルボニル）−L−アラニネートとカップリングし、さらにTFAを用いて脱保護することによってペプチド化学の古典的方法により調製した。これにより、標記化合物171mgが得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．23分；
LC−MS（方法7）：Rt＝0．3分；MS（ESIpos）：m／z＝417（M＋H）＋．
中間体L9
トリフルオロ酢酸／β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−N−［4−（2−メトキシ−2−オキソエチル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能なメチル（4−アミノフェニル）アセテートから中間体L7と同様に調製した。これにより、標記化合物320mgが得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．45分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．48分；MS（ESIpos）：m／z＝493（M＋H）＋．
中間体L10
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−rel−N6−｛［（1R，2S）−2−アミノシクロペンチル］カルボニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：2）
標記化合物を、中間体L6からEDC／HOBTを用いてシス−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−1−シクロペンタンカルボン酸とカップリングし、その後、TFAを用いて脱保護することによって調製した。これにより、標記化合物12mg（2ステップにわたり理論値の52％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．45分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．73分；MS（ESIpos）：m／z＝677（M＋H）＋．
中間体L11
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛［（1S，2R）−2−アミノシクロペンチル］カルボニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：2）
標記化合物を、中間体L6からEDC／HOBTを用いて（1S，2R）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸とカップリングし、その後、TFAを用いて脱保護することによって調製した。これにより、標記化合物11mg（2ステップにわたり理論値の39％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．45分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．74分；MS（ESIpos）：m／z＝677（M＋H）＋．
中間体L12
トリフルオロ酢酸／1−［2−（2−アミノエトキシ）エチル］−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）
メチル2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−カルボキシレート381mg（2．46mmol）を、ジオキサン／水1：1 7mlに溶解したtert−ブチル［2−（2−アミノエトキシ）エチル］カルバメート228mg（1．12mmol）に添加した。
次いで、飽和重炭酸ナトリウム溶液1．2mlを添加し、反応物を室温で攪拌した。合計5日間攪拌し、同量の重炭酸ナトリウム溶液をさらに2回添加した後、反応物をトリフルオロ酢酸で酸性化し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、分取HPLCによって精製することによって後処理した。適当な分画を合わせ、溶媒を減圧下で除去し、残渣をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。
残渣をジクロロメタン3mlに溶解し、トリフルオロ酢酸1mlを添加した。室温で15分間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。これにより、標記化合物70mg（2ステップにわたり理論値の67％）が樹脂性残渣として得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．2分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．18分；MS（ESIpos）：m／z＝185（M＋H）＋．
中間体L13
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル−N2−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］−L−リジネート（1：1）
標記化合物を、中間体L6と同様に、EDC／HOBTの存在下で（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）酢酸をtert−ブチルN6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジネート塩酸塩（1：1）とカップリングし、その後、tert−ブトキシカルボニル保護基を穏やかに除去することによって調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝0．42分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．43分；MS（ESIpos）：m／z＝340（M＋H）＋．
中間体L14
トリフルオロ酢酸／1−［2−（4−アミノピペラジン−1−イル）−2−オキソエチル］−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）
標記化合物をtert−ブチルピペラジン−1−イルカルバメートおよび（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）酢酸から2ステップにわたって中間体L2と同様に調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝0．2分；
LC−MS（方法3）：Rt＝0．25分；MS（ESIpos）：m／z＝239（M＋H）＋．
中間体L15
トリフルオロ酢酸／N−（2−アミノエチル）−3−（2−｛2−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパンアミド（1：1）
tert−ブチル3−｛2−［2−（2−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノエート2．93g（10．58mmol）をジオキサン／水1：1 100mlに溶解し、pH6〜7に達するまでメチル2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−カルボキシレート3．28g（21．15mmol）および飽和重炭酸ナトリウム溶液を添加した。溶液を室温で30分間攪拌し、次いで、1，4−ジオキサンを減圧下で蒸発させた。次いで、水200mlを添加し、混合物をそれぞれ酢酸エチル300mlで3回抽出した。有機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過した。濃縮すると、tert−ブチル3−（2−｛2−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパノエートが茶色油として得られ、次いで、これを高真空下で乾燥させた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．5分；
LC−MS（方法3）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝375（M＋NH4）＋．
この中間体を標準的方法（TFAを用いて脱保護し、tert−ブチル（2−アミノエチル）カルバメートとカップリングし、さらにTFAを用いて脱保護する）によって標記化合物に変換した。
HPLC（方法11）：Rt＝0．2分；
LC−MS（方法3）：Rt＝0．25分；MS（ESIpos）：m／z＝344（M＋H）＋．
中間体L16
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン
商業的に入手可能な1−｛6−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−6−オキソヘキシル｝−1H−ピロール−2，5−ジオン535mg（1．73mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン930mlを、L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン266mg（1．33mmol）のDMF24ml中溶液に添加した。反応物を超音波浴で24時間処理し、次いで、減圧下で濃縮乾固した。残った残渣を分取HPLCによって精製すると、適当な分画を濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させた後、標記化合物337mg（理論値の50％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．4分；
LC−MS（方法3）：Rt＝0．58分；MS（ESIpos）：m／z＝468（M＋H）＋．
中間体L17
トリフルオロ酢酸／tert−ブチルN−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−L−リジネート（1：1）
標記化合物を、最初にEDC／HOBTおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で中間体L16 172mg（0．37mmol）およびtert−ブチルN6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジネート塩酸塩（1：1）125mg（0．37mmol）をカップリングし、次いで、DCM中10％濃度トリフルオロ酢酸中室温で2時間攪拌することにより穏やかな条件下でアミノ基を脱保護することによって調製した。アセトニトリル／水からの凍結乾燥により、2ステップにわたって標記化合物194mg（理論値の49％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．1分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．58分；MS（ESIpos）：m／z＝652（M＋H）＋．
中間体L18
トリフルオロ酢酸／β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−N−［4−（2−メトキシ−2−オキソエチル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物を、メチル（4−アミノフェニル）アセテートからHATUの存在下でN2−（tert−ブトキシカルボニル）−N5−カルバモイル−L−オルニチンを結合し、TFAを用いて脱保護し、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−（tert−ブトキシカルボニル）−L−アラニネートとカップリングし、TFAを用いて脱保護し、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−（tert−ブトキシカルボニル）−β−アラニネートとカップリングし、さらにTFAを用いて脱保護することによってペプチド化学の古典的方法により逐次中間体L7と同様に調製した。これにより、標記化合物330mgが得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．29分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．41分；MS（ESIpos）：m／z＝465（M＋H）＋．
中間体L19
トリフルオロ酢酸／L−アラニル−N5−カルバモイル−N−（4−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝フェニル）−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物をペプチド化学の古典的方法により逐次1，4−フェニレンジアミンから調製した。第1のステップで、1，4−フェニレンジアミン942mg（8．72mmol）をHATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でN2−（tert−ブトキシカルボニル）−N5−カルバモイル−L−オルニチン0．8g（2．9mmol）を用いてモノアシル化（monoacylated）した。第2のステップで、同様に、第2のアニリンアミノ基を、HATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）酢酸を用いてアシル化した。次いで、TFAを用いて脱保護し、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−（tert−ブトキシカルボニル）−L−アラニネートとカップリングし、さらにTFAを用いて脱保護すると、3つのさらなる合成ステップで、標記化合物が得られ、その148mgがこの経路によって得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．21分；MS（ESIpos）：m／z＝474（M＋H）＋．
LC−MS（方法4）：Rt＝0．2分；MS（ESIpos）：m／z＝474（M＋H）＋．
中間体L20
トリフルオロ酢酸／L−バリル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物を、商業的に入手可能な1−（4−アミノフェニル）−1H−ピロール−2，5−ジオンからHATUの存在下で逐次N2−（tert−ブトキシカルボニル）−N5−カルバモイル−L−オルニチンとカップリングし、TFAを用いて脱保護し、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−（tert−ブトキシカルボニル）−L−バリネートとカップリングし、さらにTFAを用いて脱保護することによって中間体L8と同様にペプチド化学の古典的方法により調製した。これにより、標記化合物171mgが得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．28分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．39分；MS（ESIpos）：m／z＝445（M＋H）＋．
中間体L21
L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−N−［4−（2−メトキシ−2−オキソエチル）フェニル］−L−リジンアミド
標記化合物を、商業的に入手可能なメチル（4−アミノフェニル）アセテート0．42g（2．56mmol）からHATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下逐次N6−（tert−ブトキシカルボニル）−N2−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−リジンとカップリングし、ピペリジンを用いて脱保護し、N，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリネートとカップリングし、その後10％パラジウム活性炭上でベンジルオキシカルボニル保護基を水素化分解除去（hydrogenolytic removal）することによってペプチド化学の古典的方法により調製した。これにより、標記化合360mg（4ステップにわたり理論値の32％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．5分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．73分；MS（ESIpos）：m／z＝493（M＋H）＋．
中間体L22
トリフルオロ酢酸／N−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−バリル−N−｛4−［（2S）−2−アミノ−3−メトキシ−3−オキソプロピル］フェニル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物をペプチド化学の古典的方法により逐次N−（tert−ブトキシカルボニル）−4−ニトロ−L−フェニルアラニンから調製した。この出発材料2．5g（8．06mmol）を第1のステップで最初にセシウム塩に変換し、次いで、DMF中ヨードメタンを用いてメチルエステルに変換した。
次いで、10％パラジウム活性炭上メタノール中で水素化分解的に、ニトロ基をアミノ基に変換した。
次いで、こうして生成したアミノ基を、HATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でDMF中N5−カルバモイル−N2−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−オルニチンを用いてアシル化した。次のステップで、DMF中ピペリジンを用いてFmoc基を除去した。
次いで、カップリングをDMF中で1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物およびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下N−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−バリンと行い、最後に、トリフルオロ酢酸を用いてtert−ブトキシカルボニル基を除去した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．6分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．77分；MS（ESIpos）：m／z＝673（M＋H）＋．
中間体L23
トリフルオロ酢酸／N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］−β−アラニンアミド（1：1）
標記化合物を、商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）から、EDCI／HOBTおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でN−（tert−ブトキシカルボニル）−β−アラニンとカップリングし、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝0．19分。
中間体L24
トリフルオロ酢酸／1−アミノ−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロプロパンカルボキサミド（1：1）
商業的に入手可能な1−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロプロパン−カルボン酸114mg（0．67mmol）をDCM25mlに溶解し、商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）110mg（0．623mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン395μlを添加し、混合物を−10℃に冷却した。次いで、2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート217mg（0．793mmol）を添加し、混合物を室温で2時間攪拌した。次いで、混合物を酢酸エチルで希釈し、10％濃度クエン酸、飽和重炭酸ナトリウム溶液および飽和塩化ナトリウム溶液で連続的に抽出し、次いで、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。高真空下で乾燥させると、保護された中間体152mgが得られた。
次いで、これをDCM10mlに溶解し、トリフルオロ酢酸1mlを用いて脱保護した。アセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物158mg（2ステップにわたって理論値の71％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝0．19分。
LC−MS（方法3）：Rt＝0．98分；MS（ESIpos）：m／z＝224（M＋H）＋．
中間体L25
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−L−アラニン
バリル−L−アラニン31．4mg（0．17mmol）をDMF3．0mlに溶解し、3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛27−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−27−オキソ−3，6，9，12，15，18，21，24−オクタオキサヘプタコサ−1−イル｝プロパンアミド115．0mg（0．17mmol）およびトリエチルアミン33．7mg（0．033mmol）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物74．1mg（理論値の58％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．61分；MS（ESIpos）：m／z＝763［M＋H］＋．
中間体L26
L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン
N2−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン600．0mg（1．58mmol）を水／エタノール／THF（1：1：0．5）25．0mlに懸濁し、パラジウム炭素（10％）を添加し、混合物を減圧下で5時間水素を用いて室温で水素化した。触媒を濾別し、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた化合物をさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．42分；MS（ESIpos）：m／z＝247［M＋H］＋．
N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン180mg（0．73mmol）をDMF5．0mlに溶解し、トリエチルアミン74．0mg（0．73mmol）を添加した。次いで、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリネート254．6mg（0．73mmol）およびトリエチルアミン74．0mg（0．73mmol）を添加した。反応混合物を室温で3．5時間撹拌した。反応溶液を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン294．1mg（理論値の76％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．97分；MS（ESIpos）：m／z＝480［M＋H］＋．
N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン272．2mg（0．57mmol）を最初に酢酸エチル／エタノール／THF（1：1：1）20．0mlに装入し、パラジウム活性炭27．2mgを添加した。混合物を標準圧力下室温で5時間水素を用いて水素化した。混合物をCelite（登録商標）を用いて濾別し、濾過ケークを酢酸エチル／エタノール／THF（1：1：1）で洗浄した。
溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。標記化合物（182mg、理論値の72％）をさらに精製することなく次の反応ステップに使用した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．53分；MS（ESIpos）：m／z＝346［M＋H］＋．
中間体L27
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン
L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン（中間体L26）30mg（0．07mmol）および3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛27−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−27−オキソ−3，6，9，12，15，18，21，24−オクタオキサヘプタコサ−1−イル｝プロパンアミド46．1mg（0．07mmol）を最初にDMF1．5mlに装入し、4−メチルモルホリン6．8mg（0．07mmol）を添加した。
反応溶液を室温で一晩攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物55．6mg（理論値の90％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．77分；MS（ESIpos）：m／z＝920［M＋H］＋．
中間体L28
tert−ブチル3−ホルミル−4−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ピロリジン−1−カルボキシレート
1−tert−ブチル3−エチル−4−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ピロリジン−1，3−ジカルボキシレート（この化合物は国際公開第2006／066896号パンフレットの文献手順により調製した）461．7mg（1．15mmol）を最初に無水ジクロロメタン5．0mlに装入し、混合物を−78℃に冷却した。次いで、ジイソブチルアルミニウムヒドリド溶液（THF中1M）326．2mg（2．29mmol）をゆっくり滴加し、混合物を−78℃で2時間攪拌した（薄層クロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝3：1）によって監視）。水60mlに溶解した酒石酸カリウムナトリウム1．3g（4．59mmol）を滴加し、反応混合物を室温に加温させた。酢酸エチルを反応混合物に添加し、水相を酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機相を飽和NaCl溶液で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物629．0mgが粗生成物として得られ、これをさらに精製することなく次の反応ステップに直ちに使用した。
中間体L29
tert−ブチル3−ホルミル−4−［（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）メチル］ピロリジン−1−カルボキシレート
ジアステレオマーの混合物。
tert−ブチル3−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−4−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−1−カルボキシレート（国際公開第2006／100036号パンフレットの文献手順により調製した）807．1mg（2．34mmol）を最初にジクロロメタン8．0mlに装入し、トリエチルアミン236．4mg（2．34mmol）を添加した。0℃で、メタンスルホニルクロリド267．6mg（2．34mmol）を滴加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。メタンスルホニルクロリドさらに133．8mg（1．17mmol）およびトリエチルアミン118．2mg（1．17mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。混合物をジクロロメタンで希釈し、有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液、5％濃度硫酸水素カリウム溶液および飽和NaCl溶液でそれぞれ1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をBiotage Isolera（シリカゲル、カラム50gSNAP、流量66ml／分、シクロヘキサン／酢酸エチル）で精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−4−｛［（メチルスルホニル）オキシ］メチル｝ピロリジン−1−カルボキシレート402．0mg（理論値の41％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．38分；MS（ESIpos）：m／z＝424［M＋H］＋．
tert−ブチル3−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−4−｛［（メチルスルホニル）オキシ］メチル｝ピロリジン−1−カルボキシレート400．0mg（0．94mmol）を最初にDMF5．0mlに装入し、アジ化ナトリウム98．2mg（1．51mmol）を添加した。反応混合物を40℃で10時間撹拌した。次いで、アジ化ナトリウムさらに30．7mg（0．47mmol）を添加し、混合物を40℃でさらに10時間撹拌した。酢酸エチルを添加し、有機相を水で繰り返し洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−（アジドメチル）−4−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−1−カルボキシレート309．5mg（理論値の89％）が得られた。化合物をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．50分；MS（ESIpos）：m／z＝371［M＋H］＋．
tert−ブチル3−（アジドメチル）−4−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−1−カルボキシレート250mg（0．68mmol）を酢酸エチル／エタノール（1：1）10．0mlに溶解し、パラジウム活性炭（10％）25．0mgを添加した。混合物を標準圧力下室温で8時間水素を用いて水素化した。反応物をCelite（登録商標）を通して濾過し、濾過ケークを酢酸エチルで完全に洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−（アミノメチル）−4−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−1−カルボキシレート226．2mg（理論値の82％）が得られた。化合物をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝345［M＋H］＋．
tert−ブチル3−（アミノメチル）−4−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−1−カルボキシレート715．0mg（2．08mmol）をTHF15．0mlに溶解し、TBAF溶液（THF中1M）2．28ml（2．28mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣（1．54g）をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．41分；MS（ESIpos）：m／z＝231［M＋H］＋．
tert−ブチル3−（アミノメチル）−4−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−1−カルボキシレート1．54g（4．88mmol）を最初に1，4−ジオキサンに装入し、塩化カルシウム（無水）541．8mg（4．88mmol）および炭酸カルシウム488．6mg（4．88mmol）を添加し、混合物を激しく攪拌した。次いで、トリエチルアミン592．8mg（5．86mmol）および1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオン1．52g（5．86mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。HOAc644．9mg（10．7mmol）および酢酸エチルを添加した。有機相を水で2回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルで精製した（移動相：ジクロロメタン／メタノール＝100：1）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−（ヒドロキシメチル）−4−［（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）メチル］ピロリジン−1−カルボキシレート346．9mg（理論値の19％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．08分；MS（ESIpos）：m／z＝375［M＋H］＋．
tert−ブチル3−（ヒドロキシメチル）−4−［（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）メチル］ピロリジン−1−カルボキシレート804．0mg（2．15mmol）を最初にクロロホルム20．0mlおよび0．05N炭酸カリウム／0．05N重炭酸ナトリウム溶液（1：1）20．0mlに装入した。次いで、テトラ−n−ブチルアンモニウムクロリド59．7mg（0．22mmol）、N−クロロスクシンイミド429．9mg（3．22mmol）およびTEMPO33．5mg（0．22mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩激しく攪拌した。有機相を分離し、減圧下で溶媒を除去した。残渣をシリカゲルで精製した（移動相：シクロヘキサン／酢酸エチル＝3：1）。これにより、標記化合物517．0mg（理論値の46％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．13分；MS（ESIpos）：m／z＝373［M＋H］＋．
中間体L30
tert−ブチル3−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−4−ホルミルピロリジン−1−カルボキシレート
立体異性体の混合物
tert−ブチル3−（｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−4−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−1−カルボキシレート（化合物を国際公開第2006／100036号パンフレットの文献手順により調製した）250．0mg（0．72mmol）を最初にジクロロメタン／DMSO（4：1）12．5mlに装入し、トリエチルアミン219．6mg（2．17mmol）を添加した。2℃で、三酸化硫黄−ピリジン錯体345．5mg（2．17mmol）を一度に少量ずつ添加し、混合物を2℃で3時間攪拌した。三酸化硫黄−ピリジン錯体さらに345．5mg（2．17mmol）を一度に少量ずつ添加し、混合物を室温で17時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンと水に分配した。水相をジクロロメタンで3回抽出し、合わせた有機相を水で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。残渣をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した（薄層クロマトグラフィー：石油エーテル／酢酸エチル7：3）。
中間体L31
ジ−tert−ブチル｛［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］メチル｝マロネート
tert−ブチルカルバメート57．2g（488．27mmol）、ホルムアルデヒドの水中37％濃度溶液51．2ml（683．57mmol）および炭酸ナトリウム25．9g（244．13mmol）を水600mlに添加した。溶液が形成するまで混合物を加温し、次いで、室温で16時間攪拌した。形成した懸濁液をジクロロメタン500mlで抽出し、有機相を分離し、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させると結晶固体が得られた。残渣を無水THF1000mlに溶解し、無水酢酸322ml（3．414mol）およびピリジン138ml（1．707mol）の混合物を室温で滴加した。反応混合物を室温で16時間攪拌し、次いで、室温で水浴を用いてロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣をジエチルエーテルに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で3回および飽和塩化ナトリウム溶液で1回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を高真空下で2日間乾燥させた。残渣を無水THF2000mlに溶解し、カリウムtert−ブトキシドのTHF中1M溶液456ml（456．52mmol）を氷冷しながら添加した。混合物を0℃で20分間攪拌し、次いで、無水THF200mlに溶解したジ−tert−ブチルマロネート100．8g（456．52mmol）を滴加した。混合物を室温で48時間撹拌し、次いで、水を添加した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、酢酸エチル500mlに溶解した。有機相を水500mlおよび飽和塩化ナトリウム溶液100mlで洗浄し、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機相をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させた。残渣をシリカゲルを通した濾過によって精製した（移動相：シクロヘキサン／酢酸エチル、勾配＝30：1→5：1）。これにより、標的化合物37．07g（理論値の22％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝2．87分；MS（ESIpos）：m／z＝346［M＋H］＋．
中間体L32
tert−ブチル［3−ヒドロキシ−2−（ヒドロキシメチル）プロピル］カルバメート
ジ−tert−ブチル（アセトキシメチル）マロネート37．0g（107．11mmol）を無水THF1000mlに溶解し、リチウムボロヒドリドのTHF中2M溶液535．5ml（1071．10mmol）を氷冷しながら滴加した。水19．3ml（1071．10mmol）を滴加し、混合物を室温で4．5時間攪拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。残渣を酢酸エチル1500mlに溶解し、水100mlを添加し、混合物を30分間氷冷しながら（わずかに発熱性）攪拌した。有機相を分離し、水相を酢酸エチル500mlで2回抽出した。有機相をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標的化合物20．7g（理論値の94％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝1．49分；MS（EIpos）：m／z＝106［M−C5H8O2］＋．
中間体L33
tert−ブチル［3−｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−2−（ヒドロキシメチル）プロピル］カルバメート
tert−ブチル［3−ヒドロキシ−2−（ヒドロキシメチル）プロピル］カルバメート20．00g（97．44mmol）を無水ジクロロメタン1000mlに溶解し、イミダゾール6．63g（97．44mmol）およびtert−ブチル（クロロ）ジメチルシラン16．16g（107．18mmol）を室温で添加した。反応混合物を室温で16時間攪拌し、半濃縮塩化ナトリウム溶液で洗浄した。水相を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。これにより、標的化合物28．50g（理論値の92％）が得られた。
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．02（s，6H），0．86（s，9H），1．37（s，9H），1．58−1．73（m，1H），2．91（q，2H），3．33−3．36［m，（2H，obscured）］，3．53−3．58（m，2H），6．65−6．72（m，1H）．
中間体L34
tert−ブチル（3−｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−2−ホルミルプロピル）カルバメート
tert−ブチル［3−｛［tert−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−2−（ヒドロキシメチル）プロピル］カルバメート12．65g（39．591mmol）をジクロロメタン200mlに溶解し、ジクロロメタン150mlに溶解したデス−マーチンペルヨージナン19．31g（45．53mmol）を室温で滴加した。混合物を室温で2時間攪拌し、次いで、半濃縮重炭酸ナトリウム溶液250mlおよび10％濃度チオ硫酸ナトリウム溶液250mlを添加し、混合物を20分間攪拌した。有機相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を水300mlで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。これにより、標的化合物11．35g（理論値の90％）が得られた。
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．02（s，6H），0．84（s，9H），1．36（s，9H），1．48−1．51（m，1H），3．08−3．32［m，（1H，obscured）］，3．50−3．58（m，2H），3．81−3．91（m，1H），6．71（t，1H），9．60（d，1H）．
中間体L35
tert−ブチル（3−オキソプロピル）カルバメート
標記化合物を文献から既知の方法により調製した（例えば、Jean BastideらJ．Med．Chem．2003，46（16），3536−3545）．
中間体L36
N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン
N5−カルバモイル−L−オルニチン100mg（0．57mmol）をDMF4．0mlに溶解し、トリエチルアミン0．08ml（0．57mmol）を添加した。次いで、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリン199．0mg（0．57mmol）およびトリエチルアミン0．08ml（0．57mmol）を添加した。混合物を室温で48時間攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、0．1％TFAを含むMeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物75．7mg（理論値の33％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．69分；MS（ESIpos）：m／z＝409［M＋H］＋．
中間体L37
L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン
中間体L36 75．7mg（0．19mmol）を水／エタノール／THF25mlに懸濁し、パラジウム活性炭（10％）7．5mgを添加し、混合物を減圧下で4．5時間水素を用いて室温で水素化した。触媒を濾別し、反応混合物からを減圧下で溶媒を除去し、高真空下で乾燥させた。残渣をさらに精製することなく次のステップに使用した。これにより、標記化合物64．9mg（理論値の93％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝0．25分；MS（ESIpos）：m／z＝275［M＋H］＋．
中間体L38
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン
中間体L37 38．3mg（0．14mmol）を最初にDMF3．0mlに装入し、3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛27−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−27−オキソ−3，6，9，12，15，18，21，24−オクタオキサヘプタコサ−1−イル｝プロパンアミド96．4mg（0．14mmol）およびトリエチルアミン39．0μl（0．28mmol）を添加した。
混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、HOAc16．0μl（0．28mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物58．9mg（理論値の45％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．61分；MS（ESIpos）：m／z＝849［M＋H］＋．
中間体L39
2−（トリメチルシリル）エチル（2−スルファニルエチル）カルバメート
2−アミノエタンチオール塩酸塩（1：1）300mg（2．64mmol）を最初にジクロロメタン3．0mlに装入し、トリエチルアミン668．0mg（6．60mmol）および1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオン719．1mg（2．77mmol）を添加した。混合物を室温で2日間攪拌した（薄層クロマトグラフィー：ジクロロメタン／メタノール＝100：1．5によって監視した）。酢酸エチルを添加し、反応混合物を水で3回洗浄した。有機相を飽和NaCl溶液で2回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。化合物をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
中間体L40
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン
N2−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン600mg（1．58mmol）を水／エタノール／THF（1：1：0．5）25．0ml中で、パラジウム炭素（10％）を用いて、標準圧力下室温で水素を用いて水素化した。化合物N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジンをさらに精製することなく合成の次のステップに使用する。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．99分；MS（ESIpos）：m／z＝247［M＋H］＋．
N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン180．0g（0．73mmol）をDMF5．0mlに溶解し、トリエチルアミン74．0mg（0．73mmol）を添加した。次いで、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリネート254．6mg（0．73mmol）およびトリエチルアミン74．0mg（0．73mmol）を添加した。反応混合物を室温で3．5時間撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン294．1mg（理論値の76％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．97分；MS（ESIpos）：m／z＝480［M＋H］＋．
N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン272．2mg（0．57mmol）を酢酸エチル／エタノール／THF（1：1：1）20mlに溶解し、パラジウム活性炭27．2mgを添加し、混合物を標準圧力下および室温で水素を用いて水素化した。混合物をCelite（登録商標）を通して濾過し、濾過ケークを酢酸エチル／エタノール／THF（1：1：1）で完全に洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン182．0mg（理論値の72％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．53分；MS（ESIpos）：m／z＝346［M＋H］＋．
L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン30．0mg（0．07mmol）および3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛27−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−27−オキソ−3，6，9，12，15，18，21，24−オクタオキサヘプタコサ−1−イル｝プロパンアミド46．1mg（0．07mmol）をDMF1．5mlに溶解し、4−メチルモルホリン6．8mg（0．07mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物55．6mg（理論値の90％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．77分；MS（ESIpos）：m／z＝920［M＋H］＋．
中間体L41
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン
N2−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン600mg（1．58mmol）を水／エタノール／THF（1：1：0．5）25．0ml中で、パラジウム炭素（10％）を用いて、標準圧力下室温で水素を用いて水素化した。化合物N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジンをさらに精製することなく合成の次のステップに使用する。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．99分；MS（ESIpos）：m／z＝247［M＋H］＋．
N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン180．0g（0．73mmol）をDMF5．0mlに溶解し、トリエチルアミン74．0mg（0．73mmol）を添加した。次いで、2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリネート254．6mg（0．73mmol）およびトリエチルアミン74．0mg（0．73mmol）を添加した。反応混合物を室温で3．5時間撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン294．1mg（理論値の76％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．97分；MS（ESIpos）：m／z＝480［M＋H］＋．
N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン272．2mg（0．57mmol）を酢酸エチル／エタノール／THF（1：1：1）20．0mlに溶解し、パラジウム活性炭27．2mgを添加し、混合物を標準圧力下および室温で水素を用いて水素化した。混合物をCelite（登録商標）を通して濾過し、濾過ケークを酢酸エチル／エタノール／THF（1：1：1）で完全に洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン182．0mg（理論値の72％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．53分；MS（ESIpos）：m／z＝346［M＋H］＋．
L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン30．0mg（0．07mmol）および3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド34．3mg（0．07mmol）をDMF1．5mlに溶解し、4−メチルモルホリン6．8mg（0．07mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物40．6mg（理論値の82％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．73分；MS（ESIpos）：m／z＝744［M＋H］＋．
中間体L42
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン
L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン（中間体L37）50．0mg（0．18mmol）を最初にDMFに装入し、3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド93．6mg（0．18mmol）およびトリエチルアミン36．9mg（0．37mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。HOAc21．9mg（0．37mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物20．6mg（理論値の14％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．55分；MS（ESIpos）：m／z＝673［M＋H］＋．
中間体L43
N−［67−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−65−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40，43，46，49，52，55，58，61−イコサオキサ−64−アザヘプタヘキサコンタン−1−オイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン
L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン（中間体L37）11．3mg（0．04mmol）を最初にDMFに装入し、3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛63−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−63−オキソ−3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60−イコサオキサトリヘキサコンタ−1−イル｝プロパンアミド50．0mg（0．04mmol）およびトリエチルアミン8．3mg（0．08mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。HOAc4．9mg（0．08mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物15．8mg（理論値の20％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝0．94分；MS（ESIpos）：m／z＝1377［M＋H］＋．
中間体L44
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−L−アラニン
L−バリル−L−アラニン73．3mg（0．39mmol）をDMF7．0mlに溶解し、3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド200．0mg（0．39mmol）およびトリエチルアミン78．8mg（0．78mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物103．3mg（理論値の45％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．58分；MS（ESIpos）：m／z＝587［M＋H］＋．
中間体L45
（2S）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−4−オキソ酪酸−tert−ブチル
N−（tert−ブトキシカルボニル）−L−ホモセリン−tert−ブチル2．00g（7．26mmol）をジクロロメタン90mlに溶解し、次いで、ピリジン1．76mlおよび1，1，1−トリアセトキシ−1λ5，2−ベンゾヨードキソール−3（1H）−オン（デス−マーチンペルヨージナン）4．62g（10．90mmol）を添加した。反応物を室温で2時間攪拌し、次いで、ジクロロメタン200mlで希釈し、10％濃度チオ硫酸ナトリウム溶液で2回、次いで、5％濃度クエン酸で2回および飽和重炭酸ナトリウム溶液で2回連続的に抽出した。有機相を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで、減圧下で乾燥させた。ジエチルエーテルおよびシクロヘキサン（v／v＝1：1）100mlを残渣に添加すると、白色沈殿が形成した。これを吸引により濾別した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させると、標記化合物1．74g（理論値の88％）が淡黄色油として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（ESIpos）：m／z＝274［M＋H］＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝1．38（s，18H），2．64−2．81（m，2H），4．31−4．36（m，1H），7．23（d，1H），9．59（s，1H）．
中間体L46
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］−L−グルタミネート（1：1）
標記化合物を、最初にEDC／HOBTおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）200mg（0．79mmol）を（4S）−5−tert−ブトキシ−4−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−5−オキソペンタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）263mg（0．87mmol）とカップリングし、次いで、DCM中10％濃度トリフルオロ酢酸中室温で1時間攪拌することにより穏やかな条件下でアミノ基を脱保護することによって調製した。アセトニトリル／水からの凍結乾燥により、2ステップにわたって標記化合物85mg（理論値の20％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．37分；MS（ESIpos）：m／z＝326［M＋H］＋．
中間体L47
トリフルオロ酢酸／β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体L8を2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−（tert−ブトキシカルボニル）−β−アラニネートとカップリングし、その後、TFAを用いて脱保護することによって調製した。
LC−MS（方法3）：Rt＝1．36分；MS（ESIpos）：m／z＝488（M＋H）＋．
中間体L48
トリフルオロ酢酸／（1R，2S）−2−アミノ−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体L2と同様に商業的に入手可能な（1R，2S）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸から調製した。
LC−MS（方法3）：Rt＝1．22分；MS（ESIpos）：m／z＝252（M＋H）＋．
中間体L49
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル−N−（ブロモアセチル）−L−バリル−L−アラニル−L−リジネート（1：1）
標記化合物を最初に、ジクロロメタン中N，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、商業的に入手可能なブロモ酢酸無水物を、次いでペプチド化学の古典的方法により調製した部分的に脱保護されたペプチドtert−ブチルL−バリル−L−アラニル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジネートとカップリングすることによって調製した。これに引き続いて、DCM中10％濃度トリフルオロ酢酸中室温で攪拌することにより、穏やかな条件下でアミノ基で脱保護すると、標記化合物が2ステップにわたって49％の収率で得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．09分；MS（ESIpos）：m／z＝593 and 595（M＋H）＋．
中間体L50
トリフルオロ酢酸／（1S，3R）−3−アミノ−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能な（1S，3R）−3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸と同様に商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）からN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でHATUとカップリングし、その後、TFAを用いて脱保護することによって調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝0．2分；
LC−MS（方法3）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝252（M＋H）＋．
中間体L51
トリフルオロ酢酸／（1R，3R）−3−アミノ−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能な（1R，3R）−3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸と同様に商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）からN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でHATUとカップリングし、その後、TFAを用いて脱保護することによって調製した。
LC−MS（方法3）：Rt＝0．98分；MS（ESIpos）：m／z＝250（M−H）−．
中間体L52
トリフルオロ酢酸／N−（2−アミノエチル）−2−ブロモアセトアミド（1：1）
tert−ブチル（2−アミノエチル）カルバメート420mg（2．62mmol）をジクロロメタン50mlに溶解し、ブロモ酢酸無水物817mg（3．15mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン913μl（5．24mmol）を添加した。反応物を室温で1時間撹拌し、次いで、減圧下で乾燥させた。残渣を分取HPLCによって精製した。
これにより保護された中間体577mgが得られ、次いで、これをジクロロメタン50mlに溶解し、トリフルオロ酢酸10mlを添加した。室温で1時間攪拌した後、反応物を減圧下で濃縮し、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥した。これにより、標記化合物705mg（理論値の65％）が得られた。
LC−MS（方法3）：Rt＝0．34分；MS（ESIpos）：m／z＝181 and 183（M＋H）＋．
Intermediate L53
トリフルオロ酢酸／（1S，3S）−3−アミノ−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能な（1S，3S）−3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸と同様に商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）からN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でHATUとカップリングし、その後、TFAを用いて脱保護することによって調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝0．19分；
LC−MS（方法3）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝250（M−H）−．
中間体L54
トリフルオロ酢酸／（1R，3S）−3−アミノ−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能な（1R，3S）−3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸と同様に商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）からN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でHATUとカップリングし、その後、TFAを用いて脱保護することによって調製した。
LC−MS（方法3）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝252（M＋H）＋．
中間体L55
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル−N6−D−アラニル−N2−｛N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル｝−L−リジネート（1：1）
標記化合物を、最初にHATUの存在下で中間体L6をN−（tert−ブトキシカルボニル）−D−アラニンとカップリングし、引き続いてDCM中5％濃度トリフルオロ酢酸中室温で90分間攪拌することにより穏やかな条件下でアミノ基を脱保護することによって調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．35分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．67分；MS（ESIpos）：m／z＝637（M＋H）＋．
中間体L56
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル−N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛［（1R，3S）−3−アミノシクロペンチル］カルボニル｝−L−リジネート（1：1）
標記化合物を、最初にHATUの存在下で中間体L6を（1R，3S）−3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸とカップリングし、引き続いてDCM中25％濃度トリフルオロ酢酸中室温で15分間攪拌することにより穏やかな条件下でアミノ基を脱保護することによって調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．4分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．7分；MS（ESIpos）：m／z＝677（M＋H）＋．
中間体L57
（2S）−4−オキソ−2−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）酪酸メチル
メチルL−アスパラギネート塩酸塩500．0mg（2．72mmol）および2−（トリメチルシリル）エチル2，5−ジオキソピロリジン−1−カルボキシレート706．3mg（2．72mmol）を最初に1，4−ジオキサン5．0mlに装入し、トリエチルアミン826．8mg（8．17mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×40；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物（3S）−4−メトキシ−4−オキソ−3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ブタン酸583．9mg（理論値の74％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIneg）：m／z＝290（M−H）−．
（3S）−4−メトキシ−4−オキソ−3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ブタン酸592．9mgを最初に1，2−ジメトキシエタン10．0mlに装入し、混合物を−15℃に冷却し、4−メチルモルホリン205．8mg（2．04mmol）およびクロロギ酸イソブチル277．9mg（2．04mmol）を添加した。沈殿を15分後にそれぞれ1，2−ジメトキシエタン10．0mlで2回濾別した。濾液を−10℃に冷却し、水10mlに溶解した水素化ホウ素ナトリウム115．5mg（3．05mmol）を激しく攪拌しながら添加した。相を分離し、有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液および飽和NaCl溶液でそれぞれ1回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物メチルN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−ホモセリネート515．9mg（理論値の91％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（ESIpos）：m／z＝278（M＋H）＋．
メチルN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−ホモセリネート554．9mg（2．00mmol）を最初にジクロロメタン30．0mlに装入し、デス−マーチンペルヨージナン1．27g（3．0mmol）およびピリジン474．7mg（6．00mmol）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。4時間後、反応物をジクロロメタンで希釈し、有機相を10％濃度Na2S2O3溶液、10％濃度クエン酸溶液および飽和重炭酸ナトリウム溶液でそれぞれ3回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。これにより、標記化合物565．7mg（理論値の97％）が得られた。
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．03（s，9H），0．91（m，2H），2．70−2．79（m，1H），2．88（dd，1H），3．63（s，3H），4．04（m，2H），4．55（m，1H），7．54（d，1H），9．60（t，1H）．
中間体L58
2−（トリメチルシリル）エチル（3−オキソプロピル）カルバメート
3−アミノ−1−プロパノール434．4mg（5．78mmol）および2−（トリメチルシリル）エチル2，5−ジオキソピロリジン−1−カルボキシレート1．50g（5．78mmol）をジクロロメタン10．0mlに溶解し、トリエチルアミン585．3mg（5．78mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、有機相を水および飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、次いで、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣2−（トリメチルシリル）エチル（3−ヒドロキシプロピル）カルバメート（996．4mg、理論値の79％）を高真空下で乾燥させ、さらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
2−（トリメチルシリル）エチル（3−ヒドロキシプロピル）カルバメート807．0mg（3．68mmol）を最初にクロロホルム15．0mlおよび0．05N炭酸カリウム／0．05N重炭酸ナトリウム溶液（1：1）15．0mlに装入した。次いで、テトラ−n−ブチルアンモニウムクロリド102．2mg（0．37mmol）、N−クロロスクシンイミド736．9mg（5．52mmol）およびTEMPO57．5mg（0．37mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩激しく攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、有機相を水および飽和NaCl溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を高真空下で乾燥させ、さらに精製することなく合成の次のステップに使用した（890．3mg）。
中間体L59
トリフルオロ酢酸／1−｛2−［2−（2−アミノエトキシ）エトキシ］エチル｝−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）
tert−ブチル（2−｛2−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エトキシ］エトキシ｝エチル）カルバメート300．0mg（0．91mmol）を最初にジクロロメタンに装入し、TFA4．2g（36．54mmol）を添加し、混合物を室温で1時間攪拌した（TLC：ジクロロメタン／メタノール10：1によって監視した）。揮発性成分を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタンと4回共蒸留した。残渣を高真空下で乾燥させ、さらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．19分；MS（ESIpos）：m／z＝229（M＋H）＋．
中間体L60
6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイルクロリド
6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサン酸200．0mg（0．95mmol）をジクロロメタン4．0mlに溶解し、塩化チオニル338．0mg（2．84mmol）を添加した。反応混合物を室温で3時間撹拌し、次いで、DMF1滴を添加した。混合物をさらに1時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタンと3回共蒸留した。粗生成物をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
中間体L61
トリフルオロ酢酸／2−（トリメチルシリル）エチル−N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−L−リジネート（1：1）
最初に、トリペプチド誘導体2−（トリメチルシリル）エチル−L−バリル−L−アラニル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジネートを、N2−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジンから、ペプチド化学の古典的方法（EDCI／DMAPを用いた2−（トリメチルシリルエタノール）によるエステル化、水素化分解、HATUの存在下でのN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−L−アラニンとのカップリング、およびさらなる水素化分解）により調製した。標記化合物を、HATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でこの部分的に保護されたペプチド誘導体を商業的に入手可能な6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサン酸とカップリングすることによって調製した。これに引き続いて、エステル保護基を保持しながら、DCM中5％濃度トリフルオロ酢酸中室温で2．5時間攪拌することにより、穏やかな条件下でアミノ基で脱保護した。後処理および分取HPLCによる精製により、標記化合物438mgが得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．69分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．78分；MS（ESIpos）：m／z＝610（M＋H）＋．
中間体L62
トリフルオロ酢酸／2−（トリメチルシリル）エチル−N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−L−リジネート（1：1）
最初に、2−（トリメチルシリル）エチルN6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジネートを、ペプチド化学の古典的方法によりN2−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジンから調製した。次いで、この中間体148mg（0．43mmol）をHATU195mg（0．51mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン149μlの存在下で中間体L16 200mg（0．43mmol）とカップリングした。濃縮および残渣の分取HPLCによる精製後、保護された中間体をDCM20mlに溶解し、tert−ブトキシカルボニル保護基を、トリフルオロ酢酸2mlを添加し、室温で1時間攪拌することによって除去した。濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、254mg（2ステップにわたって理論値の63％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．51分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．68分；MS（ESIpos）：m／z＝696（M＋H）＋．
中間体L63
（4S）−4−｛［（2S）−2−｛［（2S）−2−｛［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］アミノ｝−3−メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝−5−オキソ−5−［2−（トリメチルシリル）エトキシ］ペンタン酸
最初に、トリペプチド誘導体（4S）−4−｛［（2S）−2−｛［（2S）−2−アミノ−3−メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝−5−オキソ−5−［2−（トリメチルシリル）エトキシ］ペンタン酸を、（2S）−5−（ベンジルオキシ）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−5−オキソペンタン酸から、ペプチド化学の古典的方法（EDCI／DMAPを用いた2−（トリメチルシリル）エタノールによるエステル化、トリフルオロ酢酸を用いたBoc保護基の除去、HATUの存在下でのN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−L−アラニンとのカップリングおよび10％パラジウム活性炭上メタノール中での水素化分解）により調製した。標記化合物を、この部分的に保護されたペプチド誘導体を商業的に入手可能な1−｛6−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−6−オキソヘキシル｝−1H−ピロール−2，5−ジオンとカップリングすることによって調製した。後処理および分取HPLCによる精製により、標記化合物601mgが得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．96分；MS（ESIpos）：m／z＝611（M＋H）＋．
中間体L64
（4S）−4−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝−5−オキソ−5−［2−（トリメチルシリル）エトキシ］ペンタン酸
標記化合物を、（2S）−5−（ベンジルオキシ）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−5−オキソペンタン酸から、ペプチド化学の古典的方法（EDCI／DMAPを用いた2−（トリメチルシリル）エタノールによるエステル化、トリフルオロ酢酸を用いたBoc保護基の除去、10％パラジウム活性炭上メタノール中でのベンジルエステルの水素化分解開裂およびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下での1−｛2−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−2−オキソエチル｝−1H−ピロール−2，5−ジオンとのカップリング）により調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（ESIpos）：m／z＝385（M＋H）＋．
中間体L65
トリフルオロ酢酸／2−（トリメチルシリル）エチル−3−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−L−アラニネート（1：1）
標記化合物を、3−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−N−（tert−ブトキシカルボニル）−L−アラニンから、ペプチド化学の古典的方法（EDCI／DMAPを用いた2−（トリメチルシリル）エタノールによるエステル化およびトリフルオロ酢酸を用いたBoc保護基の除去）により調製した。これにより、標記化合373mg（2ステップにわたり理論値の79％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．72分；MS（ESIpos）：m／z＝339（M＋H）＋．
中間体L66
メチル（8S）−8−（2−ヒドロキシエチル）−2，2−ジメチル−6，11−ジオキソ−5−オキサ−7，10−ジアザ−2−シラテトラデカン−14−オエート
（3S）−3−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−4−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸1000mg（2．84mmol）を最初に1，2−ジメトキシエタン10．0mlに装入し、4−メチルモルホリン344．4mg（3．4mmol）およびクロロギ酸イソブチル504mg（3．69mmol）を添加した。室温で10分間攪拌した後、反応物を5℃に冷却し、水3mlに溶解した水素化ホウ素ナトリウム161mg（4．26mmol）を激しく攪拌しながら一度に少量ずつ添加した。1時間後、同量の水素化ホウ素ナトリウムを再度添加し、次いで、反応物を室温にゆっくり加温した。水170mlを添加し、次いで、反応物をそれぞれ酢酸エチル200mlで4回抽出した。相を分離し、有機相をクエン酸、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液で1回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物ベンジルtert−ブチル［（2S）−4−ヒドロキシブタン−1，2−ジイル］ビスカルバメート760mg（理論値の78％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（ESIpos）：m／z＝339（M＋H）＋．
塩化水素／ジオキサン13mlに溶解したこの中間体760mg（2．16mmol）を室温で20分間攪拌した。次いで、反応物を5mlに濃縮し、ジエチルエーテルを添加した。沈殿を濾別し、アセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。
こうして得られた生成物をDMF132mlに溶解し、4−メトキシ−4−オキソブタン酸345．5mg（2．35mmol）、HATU970mg（2．55mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン1025μlを添加した。混合物を室温で5分間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残った残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、アセトニトリルを減圧下で蒸発させた。残った水相を酢酸エチルで2回抽出し、次いで、有機相を濃縮し、高真空下で乾燥させた。
こうして得られた中間体をメタノールに溶解し、水素標準圧力下室温で1時間、10％パラジウム活性炭上で水素化した。次いで、触媒を濾別し、溶媒を減圧下で除去した。
この脱保護された化合物247mgをDMF20mlに溶解し、1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオン352mg（1．36mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン592μlを添加した。反応混合物を室温で1時間攪拌し、次いで、濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、これらの5つの反応ステップにわたって、標記化合物218mgが21％の総収率で得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．74分；MS（ESIpos）：m／z＝363（M＋H）＋．
中間体L67
トリフルオロ酢酸／2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］−β−アラニネート（1：1）
標記化合物を、商業的に入手可能な1−（2−ヒドロキシエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン50mg（0．354mmol）から、1．5当量のEDCIおよび0．1当量の4−N，N−ジメチルアミノピリジンの存在下でジクロロメタン10ml中N−（tert−ブトキシカルボニル）−β−アラニン134mg（0．71mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。
収量：56mg（2段階にわたって理論値の48％）
LC−MS（方法3）：Rt＝1．15分；MS（ESIpos）：m／z＝213（M＋H）＋．
中間体L68
トリフルオロ酢酸／N−（2−アミノエチル）−2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）プロパンアミド（1：1）
標記化合物を商業的に入手可能な（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）プロパン酸およびtert−ブチル（2−アミノエチル）カルバメートからペプチド化学の古典的方法によって中間体L1と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．17分；MS（ESIpos）：m／z＝212（M＋H）＋．
中間体L69
トリフルオロ酢酸／1−［（ベンジルオキシ）カルボニル］ピペリジン−4−イル−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチネート（1：1）
標記化合物を、商業的に入手可能なベンジル4−ヒドロキシピペリジン−1−カルボキシレートから、EDCI／DMAPを用いたN2−（tert−ブトキシカルボニル）−N5−カルバモイル−L−オルニチンによるエステル化、引き続いてHATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でのN−［（tert−ブトキシ）カルボニル］−L−バリンとのカップリング、および最後にTFAを用いたさらなるBoc除去によってペプチド化学の古典的方法によって調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．62分；MS（ESIpos）：m／z＝492（M＋H）＋．
中間体L70
9H−フルオレン−9−イルメチル（3−オキソプロピル）カルバメート
9H−フルオレン−9−イルメチル（3−ヒドロキシプロピル）カルバメート1000．0mg（3．36mmol）を最初にクロロホルム15．0mlおよび0．05N炭酸カリウム／0．05N重炭酸ナトリウム溶液（1：1）15．0mlに装入した。次いで、テトラ−n−ブチルアンモニウムクロリド93．5mg（0．34mmol）、N−クロロスクシンイミド673．6mg（5．04mmol）およびTEMPO52．5mg（0．34mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩激しく攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、有機相を水および飽和NaCl溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を高真空下で乾燥させ、シリカゲルで精製した（移動相：シクロヘキサン／酢酸エチル3：1〜1：1）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物589．4mg（理論値の58％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝2．15分；MS（ESIpos）：m／z＝296（M−H）＋．
中間体L71
tert−ブチル［4−（クロロカルボニル）フェニル］カルバメート
4−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］安息香酸100．0mg（0．42mmol）を最初にジクロロメタン2．0mlに装入し、塩化オキサリル64．2mg（0．51mmol）を添加した。反応混合物を室温で30分間攪拌した（TLC：ジクロロメタン／メタノールによって監視した）。次いで、塩化オキサリルさらに192．6mg（1．53mmol）およびDMF1滴を添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタンと繰り返し共蒸留した。残渣をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。
中間体L72
ベンジル（9S）−9−（ヒドロキシメチル）−2，2−ジメチル−6，11−ジオキソ−5−オキサ−7，10−ジアザ−2−シラテトラデカン−14−オエート
標記化合物を、商業的に入手可能なベンジルtert−ブチル［（2S）−3−ヒドロキシプロパン−1，2−ジイル］ビスカルバメートから、Z保護基の水素化分解除去、その後のEDCI／HOBTの存在下での4−（ベンジルオキシ）−4−オキソブタン酸とのカップリング、引き続いてTFAを用いたBoc保護基の除去、および最後にトリエチルアミンの存在下での1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオンとの反応によってペプチド化学の古典的方法により調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．94分；MS（ESIpos）：m／z＝425［M＋H］＋．
中間体L73
N−（2−アミノエチル）−6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサンアミド
6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサン酸395．5mg（1．87mmol）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン1．21g（9．36mmol）およびHATU854．3mg（2．25mmol）をtert−ブチル（2−アミノエチル）カルバメート300mg（1．87mmol）のジメチルホルムアミド20ml中溶液に添加した。反応混合物を室温で5分間撹拌した。混合物を濃縮した後、残渣をDCMに溶解し、水で洗浄した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾別および濃縮した。これにより標記化合物408mg（33％、純度53％）が得られ、これをさらに精製することなく使用した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．75分；MS（ESIpos）：m／z＝354（M＋H）＋．
TFA1mlをtert−ブチル（2−｛［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］アミノ｝エチル）カルバメート（408mg、0．365mmol）のジクロロメタン7ml中溶液に添加した。反応混合物を室温で0．5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタンと2回共蒸留した。残渣をさらに精製することなくさらに使用した。これにより、標記化合物384mg（94％、純度57％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．26分；MS（ESIpos）：m／z＝254（M＋H）＋．
中間体F1
N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N−｛2−［（4S）−2，5−ジオキソ−1，3−オキサゾリジン−4−イル］エチル｝−2−ヒドロキシアセトアミド
アルゴン下で、（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタン酸塩酸塩（1：1）（中間体C4）77mg（0．14mmol）をTHFに溶解した。
次いで、活性炭2mgおよびトリホスゲン27．5mg（0．14mmol）を添加し、次いで、反応物を50℃で10分間攪拌した。それぞれトリホスゲン27．5mgをさらに2回添加し、室温で30分間攪拌した後、反応が終了した。
活性炭をシリンジフィルタを通して濾別し、次いで、溶媒を減圧下で除去した。アセトニトリルを添加し、混合物を減圧下でもう一度濃縮した。これにより標記化合物72mg（95％）が得られ、これをさらに精製することなくADCカップリングに使用した。
HPLC（方法11）：Rt＝2．28分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．2分；MS（ESIpos）：m／z＝541（M＋H）＋．
中間体F2
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］ブタンアミド（1：1）
（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸（中間体C5）55mg（0．089mmol）をDMF12mlに溶解し、商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）68mg（0．268mmol）、1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩34．3mg（0．18mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物27．4mg（0．18mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン47μl（0．27mmol）を連続して添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残った残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮すると、1，4−ジオキサンからの凍結乾燥後に、標記化合物20mg（理論値の30％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．48分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．29分；MS（ESIpos）：m／z＝737（M＋H）＋．
この中間体20mg（0．027mmol）をジクロロメタン5mlに溶解し、トリフルオロ酢酸1mlを添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、残った残渣をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。これにより、標記化合物19mg（理論値の95％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．0分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．9分；MS（ESIpos）：m／z＝637（M＋H）＋．
1H NMR（500MHz，DMSO−d6）：δ＝8．28（t，1H），7．9−8．1（m，3H），7．7−7．8（m，2H），7．2−7．4（m，6H）7．0−7．1（m，3H），5．7（s，1H），5．0 and 5．3（2d，2H），4．08 and 4．25（2d，2H），3．3−3．65（m，5H），3．1−3．25（m，2H），0．75 and 1．45（2m，2H），0．9（s，9H）．
中間体F3
トリフルオロ酢酸／N−［（3S）−3−アミノ−4−｛2−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］ヒドラジノ｝−4−オキソブチル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）
（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸（中間体C5）13mg（0．021mmol）をDMF5mlに溶解し、次いで、O−（7−アザベンゾトリアゾール−1−イル）−N，N，N’，N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート33mg（86μmol）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン15μlおよび商業的に入手可能な6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサンヒドラジド22mg（64μmol）を添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌した。次いで、混合物を高真空下で濃縮し、残った残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、保護された中間体9．5mg（理論値の53％）が無色泡として得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．1分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．33分；MS（ESIpos）：m／z＝822（M＋H）＋．
この中間体9．5mg（0．011mmol）をジクロロメタン3mlに溶解し、トリフルオロ酢酸1mlを添加し、混合物を室温で2時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、残った残渣をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。これにより、標記化合物7mg（理論値の70％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．75分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝722（M＋H）＋．
中間体F4
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（6−｛［（2R）−2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）プロパノイル］アミノ｝ヘキシル）ブタンアミド（1：1）
最初に、（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸（中間体C5）30mg（0．049mmol）を、HATUの存在下でトリフルオロ酢酸／9H−フルオレン−9−イルメチル−（6−アミノヘキシル）カルバメート（1：1）を用いて中間体F3と同様にカップリングした。次いで、Fmoc保護基を標準的な方法によりピペリジンを用いて除去した。次いで、このアミン成分を、N，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、塩化チオニルを用いて遊離酸から調製した（2R）−2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）プロパノイルクロリドとカップリングした。最後のステップで、Boc保護基をDCM中トリフルオロ酢酸を用いて除去した。これにより、標記化合1．1mg（4ステップにわたり3％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．83分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．96分；MS（ESIpos）：m／z＝764（M＋H）＋．
中間体F5
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（プロピオニル）アミノ］−N−｛2−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エトキシ］エチル｝ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 16mg（0．026mmol）および中間体L12 8．5mg（0．03mmol）から中間体F2と同様に調製した。これにより、標記化合3mg（2ステップにわたり理論値の13％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．0分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．96分；MS（ESIpos）：m／z＝681（M＋H）＋．
中間体F6
トリフルオロ酢酸／N−［（16S）−16−アミノ−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−12，15−ジオキソ−3，6，9−トリオキサ−13，14−ジアザオクタデカン−18−イル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル｛（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−ヒドラジノ−1−オキソブタン−2−イル｝カルバメート（1：1）（中間体C6）8mg（12．7μmol）をDMF8mlに溶解し、商業的に入手可能な3−（2−｛2−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパン酸6mg（19μmol）、O−（7−アザベンゾトリアゾール−1−イル）−N，N，N’，N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）5．8mg（15μmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン7μl（38μmol）を添加した。混合物を室温で15分間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣をアセトニトリル／水1：1に溶解し、トリフルオロ酢酸を用いてpH2に調整した。精製は分取HPLCによった。適当な分画を組み合わせ、アセトニトリル／水1：1から凍結乾燥すると、Boc保護中間体5mg（理論値の41％）が得られた。トリフルオロ酢酸を用いてBoc保護基を除去すると、標記化合物4mg（2ステップにわたって理論値の32％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．89分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝812（M＋H）＋．
中間体F7
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（2−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝エチル）ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 25mg（0．037mmol）および中間体L1 35mg（0．112mmol）から中間体F2と同様に調製した。これにより、標記化合14．4mg（2ステップにわたり理論値の29％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．0分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．9分；MS（ESIpos）：m／z＝694（M＋H）＋．
1H NMR（500MHz，DMSO−d6）：δ＝8．2（m，1H），7．9−8．1（m，3H），7．7−7．8（m，2H），7．2−7．4（m，6H），7．0−7．12（m，3H），5．7（s，1H），4．95and5．3（2d，2H），4．1and4．25（2d，2H），4．0（s，2H），3．3−3．65（m，5H），3．0−3．15（m，2H），0．7and1．45（2m，2H），0．88（s，9H）．
中間体F8
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C5 10mg（0．016mmol）および中間体L6 13mg（0．018mmol）から中間体F2と同様に調製した。これにより、標記化合10mg（2ステップにわたり理論値の49％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．97分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝1006（M＋H）＋．
中間体F9
トリフルオロ酢酸／N−｛（3S）−3−アミノ−4−［1−（2−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）ヒドラジノ］−4−オキソブチル｝−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C7 1．5mg（0．002mmol）および商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）0．95mg（0．004mmol）から中間体F2と同様に調製した。これにより、標記化合1．1mg（2ステップにわたり理論値の52％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝709（M＋H）＋．
中間体F10
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（3−｛［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］アミノ｝−3−オキソプロピル）ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 14mg（0．022mmol）および中間体L5 10mg（0．025mmol）から中間体F2と同様に調製した。これにより、標記化合4．5mg（2ステップにわたり理論値の22％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．0分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝756（M＋H）＋．
中間体F11
トリフルオロ酢酸／N−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）シクロヘキサンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 12mg（0．019mmol）および中間体L4 10mg（0．021mmol）から中間体F2と同様に調製した。これにより、標記化合7mg（2ステップにわたり理論値の38％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．04分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝776（M＋H）＋．
中間体F12
トリフルオロ酢酸／（1R，2S）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 43mg（0．071mmol）および中間体L2 30mg（0．071mmol）から中間体F2と同様に調製した。Boc保護中間体の段階で、形成したジアステレオマーを分取HPLC（Chromatorex C18−10／125×30／12ml／分）によって分離した。分離したジアステレオマーの立体化学を、商業的に入手可能な（1S，2R）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸から同様に調製した個々のジアステレオマーとの比較によって割り当てた：
分画1：1S2Rジアステレオマー
収量：13mg（22％）
HPLC（方法11）：Rt＝2．52分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．31分；MS（ESIpos）：m／z＝848（M＋H）＋．
分画2：1R2Sジアステレオマー
収量：10mg（17％）
HPLC（方法11）：Rt＝2．56分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．33分；MS（ESIpos）：m／z＝848（M＋H）＋．
次いで、TFAを用いた1R2Sジアステレオマー10mg（0．011mmol）の脱保護によって、標記化合物8mg（理論値の75％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．04分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝748（M＋H）＋．
中間体F13
トリフルオロ酢酸／（1S，2R）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
合成を中間体F13と同様に行い、標記化合物を1S2Rジアステレオマーの脱保護によって得た。
HPLC（方法11）：Rt＝2．1分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．94分；MS（ESIpos）：m／z＝748（M＋H）＋．
中間体F14
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物を、HATUの存在下で中間体C5 20mg（0．028mmol）および中間体L7 18mg（0．028mmol）をカップリングし、その後、TFAを用いてデブロッキングすることによって調製した。これにより、標記化合15mg（2ステップにわたり理論値の49％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．97分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝1012（M＋H）＋．
中間体F15
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
この中間体を、HATUの存在下で中間体C8 15mg（0．022mmol）および中間体L8 14mg（0．026mmol）をカップリングし、その後、TFAを用いてデブロッキングすることによって調製した。これにより、標記化合7mg（2ステップにわたり理論値の27％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．85分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（ESIpos）：m／z＝984（M＋H）＋．
中間体F16
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−N−［4−（2−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
最初に、中間体C3 20mg（0．03mmol）を、HATUの存在下でトリフルオロ酢酸／β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−N−［4−（2−メトキシ−2−オキソエチル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）（中間体L9）を用いて中間体F3と同様にカップリングした（収量：15mg（理論値の44％））。
この中間体N−｛（2S）−4−［（アセトキシアセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−N−［4−（2−メトキシ−2−オキソエチル）フェニル］−L−オルニチンアミド26mg（0．023mmol）をメタノール5mlに溶解し、2M水酸化リチウム溶液1mlを添加し、反応物を室温で90分間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣をアセトニトリル／水に溶解し、混合物を、TFAを用いてpH2に調整した。
次いで、混合物を再度濃縮すると、分取HPLCによる残渣の精製後に、カルボキシル化合物20mg（81％）が得られた。
次いで、この中間体をDMF5mlに溶解し、HATU8．4mg（0．022mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン16μlの存在下で商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）6mg（0．022mmol）とカップリングした。分取HPLCによる精製により、保護された中間体17mg（理論値の76％）が得られた。これらをDCM3mlに溶解し、TFA1mlを添加した。室温で45分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣をジメチルエーテルで消化した。吸引濾過し、高真空下で残渣を乾燥させると、標記化合物15mg（81％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．9分；MS（ESIpos）：m／z＝1097（M＋H）＋．
中間体F17
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛［（1R，2S）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C5 6mg（0．01mmol）および中間体L10 8mg（0．01mmol）から中間体F12と同様に調製した。Boc保護中間体の段階で、形成したジアステレオマーを分取HPLC（Chromatorex C18−10／125×30／12ml／分）によって分離した。分離したジアステレオマーの立体化学を、商業的に入手可能な（1S，2R）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸から同様に調製した個々のジアステレオマーとの比較によって割り当てた：
分画1：1S2Rジアステレオマー
収量：1mg
HPLC（方法11）：Rt＝2．73分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．37分；MS（ESIpos）：m／z＝1274（M＋H）＋．
分画2：1R2Sジアステレオマー
収量：0．7mg
HPLC（方法11）：Rt＝2．81分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．41分；MS（ESIpos）：m／z＝1274（M＋H）＋．
1R2Sジアステレオマー0．7mg（0．001mmol）の完全な脱保護を、DCM1mlへの溶解、TFA1mlの添加および室温での1時間の攪拌によって達成した。減圧下での濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物0．68mg（理論値の94％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．1分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．97分；MS（ESIpos）：m／z＝1117（M＋H）＋．
中間体F18
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛［（1S，2R）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C5 8．9mg（0．014mmol）および中間体L11 13mg（0．014mmol）から中間体F17と同様に調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝2．2分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．01分；MS（ESIpos）：m／z＝1117（M＋H）＋．
中間体F19
N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−N2−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C5 25mg（0．041mmol）を中間体L13 55mg（0．122mmol）とカップリングし、その後、脱保護することによって、中間体F2と同様に調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．84分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝780（M＋H）＋．
中間体F20
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−｛4−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］ピペラジン−1−イル｝ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 10mg（0．015mmol）を中間体L14 55mg（0．122mmol）とカップリングし、その後、脱保護することによって中間体F2と同様に調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（ESIpos）：m／z＝735（M＋H）＋．
中間体F21
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−12−オキソ−3，6，9−トリオキサ−13−アザペンタデカン−15−イル］ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 10mg（0．015mmol）を中間体L15 7mg（0．015mmol）とカップリングし、その後、脱保護することによって中間体F2と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝840（M＋H）＋．
中間体F22
トリフルオロ酢酸／N−［（3S）−3−アミノ−4−（1−｛2−［（2−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝エチル）アミノ］−2−オキソエチル｝ヒドラジノ）−4−オキソブチル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C7 13．7mg（0．017mmol）を中間体L1 5．9mg（0．017mmol）とカップリングし、その後、脱保護することによって中間体F9と同様に調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝2．3分；
LC−MS（方法1）：Rt＝1．2分；MS（ESIpos）：m／z＝866（M＋H）＋．
中間体F23
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、EDC／HOBTおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で中間体C5 10mg（0．016mmol）を中間体L17 16．8mg（0．016mmol）とカップリングし、その後、脱保護することによって中間体F2と同様に調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．9分；MS（ESIpos）：m／z＝1092（M＋H）＋．
中間体F24
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−N−［4−（2−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物の調製を中間体F16と同様に行った：
最初に、中間体C3 30mg（0．046mmol）を、HATUの存在下で中間体L18を用いて中間体F3と同様にカップリングした（収量：25mg（理論値の47％））。
この中間体27mg（0．024mmol）をメタノール5mlに溶解し、2M水酸化リチウム溶液1mlを添加し、混合物を室温で30分間攪拌すると、メチルエステルとアセチル基の両方の切断が得られた。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣をアセトニトリル／水に溶解し、混合物を、TFAを用いてpH2に調整した。次いで、混合物を再度濃縮すると、分取HPLCによる残渣の精製後に、カルボキシル化合物15mg（58％）が得られた。
次いで、この中間体をDMF3mlに溶解し、HATU6．5mg（0．017mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン12μlの存在下で商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）4．4mg（0．017mmol）とカップリングした。分取HPLCによる精製により、保護された中間体12mg（理論値の72％）が得られた。これらをDCM2mlに溶解し、TFA1mlを添加した。室温で30分間攪拌した後、混合物を濃縮し、アセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。高真空下で残渣を乾燥させると、標記化合物11mg（91％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．83分；MS（ESIpos）：m／z＝1069（M＋H）＋．
中間体F25
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−N−（4−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝フェニル）−L−オルニチンアミド（1：1）
この中間体を、HATU6．4mg（0．017mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン72μlの存在下で中間体C8 9．6mg（0．014mmol）を中間体L19 10．8mg（0．015mmol）とカップリングし、その後、TFAを用いてデブロッキングすることによって調製した。これにより、標記化合5mg（2ステップにわたり理論値の31％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．8分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（ESIpos）：m／z＝1041（M＋H）＋．
中間体F26
トリフルオロ酢酸／N−｛（15S，19R）−15−アミノ−19−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−18−グリコロイル−20，20−ジメチル−14−オキソ−4，7，10−トリオキサ−13，18−ジアザヘンイコサン−1−オイル｝−L−バリル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
この中間体を、1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩8mg（0．04mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物6mg（0．04mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン11μl（0．06mmol）の存在下で中間体C9 16．4mg（0．02mmol）を中間体L20 11．2mg（0．02mmol）とカップリングし、その後、TFAを用いてデブロッキングすることによって調製した。これにより、標記化合10mg（2ステップにわたり理論値の37％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．0分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝1144（M＋H）＋．
中間体F27
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N−［4−（2−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）フェニル］−L−リジンアミド（2：1）
この中間体を4ステップにわたって調製した：
第1のステップで、中間体C8 20mg（0．028mmol）を、DMF5ml中1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩11mg（0．057mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物8．7mg（0．057mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン15μl（0．085mmol）の存在下で、中間体L21 16．7mg（0．031mmol）とカップリングした。室温で4日間攪拌した後、反応物を濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。収量：18mg（理論値の54．5％）
この中間体18mg（0．016mmol）をメタノール4mlに溶解し、2M水酸化リチウム溶液194μlを添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。次いで、水酸化リチウム溶液さらに116μlを添加し、反応物を室温でさらに4時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣を水に溶解し、次いで、反応物を、5％濃度クエン酸を用いてpH5に調整した。混合物をジクロロメタンで2回抽出し、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。次いで、有機相を濾過および濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、カルボキシル化合物10．5mg（58％）が得られた。
次いで、この中間体10．5mg（0．009mmol）をDMF4mlに溶解し、1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチル−カルボジイミド塩酸塩3．5mg（0．018mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物2．8mg（0．018mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン6μlの存在下で商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）3mg（0．012mmol）とカップリングした。一晩攪拌した後、同量のカップリング試薬を再度添加し、反応物を室温でさらに3日間攪拌した。次いで、混合物を濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。収量：6mg（理論値の52％）
次いで、この中間体6mg（0．005mmol）をDCM3ml中トリフルオロ酢酸1mlを用いて脱保護した。アセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物6mg（理論値の83％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．84分；
LC−MS（方法4）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝1068（M＋H）＋．
中間体F28
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−4−（｛N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル｝アミノ）−L−フェニルアラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）
この中間体を5ステップにわたって調製した：
第1のステップで、中間体C8 40mg（0．058mmol）をHATU44．3mg（0．117mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン30μlの存在下で中間体L22 46mg（0．058mmol）とカップリングした。室温で1時間攪拌した後、反応物を濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。収量：53mg（理論値の62．5％）
次のステップで、DMF3ml中ピペリジン0．6mlを用いてFmoc基を除去した。室温で1時間攪拌した後、反応物を濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。収量：42mg（理論値の82％）
メチルエステルを開裂するために、この中間体42mg（0．033mmol）をTHF2mlおよび水1mlに溶解し、2M水酸化リチウム溶液330μlを添加し、反応物を室温で1時間攪拌した。
次いで、反応物をTFAを用いて中和し、濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。高真空下で乾燥させると、カルボキシル化合物32mg（78％）が得られた。
次いで、この中間体32mg（0．026mmol）を、N，N−ジイソプロピルエチルアミン18μlの存在下でDMF2．3ml中商業的に入手可能な1−｛6−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−6−オキソヘキシル｝−1H−ピロール−2，5−ジオン14．6mg（0．047mmol）とカップリングした。超音波浴中で4時間処理した後、反応物を濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。収量：20．4mg（理論値の60％）
最後のステップで、この中間体20．4mg（0．016mmol）をDCM中トリフルオロ酢酸を用いて脱保護した。アセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物20mg（理論値の85％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法5）：Rt＝2．84分；MS（ESIpos）：m／z＝1197（M＋H）＋．
中間体F29
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−4−（｛N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル｝アミノ）−L−フェニルアラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物の調製を中間体F28と同様に行った：
HPLC（方法11）：Rt＝2．0分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝1111（M＋H）＋．
中間体F30
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−｛2−［（3−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−3−オキソプロピル）スルフィニル］エチル｝ブタンアミド（1：1）
この中間体を4ステップにわたって調製した：
第1のステップで、中間体C3 37．5mg（0．055mmol）を、HATU25mg（0．066mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン29μlの存在下でDMF中商業的に入手可能なメチル3−［（2−アミノエチル）スルファニル］プロパノエート塩酸塩（1：1）15mg（0．066mmol）とカップリングした。室温で15分間攪拌した後、カップリング試薬を再度添加した。反応物を室温でさらに15分間攪拌し、次いで、濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。収量：21mg（理論値の48％）
LC−MS（方法1）：Rt＝1．41分；MS（ESIpos）：m／z＝802（M＋H）＋．
メチルエステルを開裂するために、この中間体21mg（0．026mmol）をメタノール5mlに溶解し、2M水酸化リチウム溶液655μlを添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。この時間中、硫黄での部分酸化が起こった。反応物を濃縮し、残渣を水に溶解し、次いで、酢酸を用いてpH3に調整した。混合物を酢酸エチル50mlで2回抽出し、次いで、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過および濃縮した。残渣を高真空下で乾燥させた後に得られた混合物をさらに精製することなく、HATU11．6mg（0．031mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン22μlの存在下で商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）8．4mg（0．033mmol）とカップリングするために次のステップに使用した。反応物を室温で5分間撹拌し、次いで、濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、溶液を5％濃度クエン酸、次いで、水で抽出した。次いで、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過および濃縮した。残渣を高真空下で乾燥させた後に得られた混合物をさらに精製することなく次のステップに使用した。
次いで、この粗物質22mgをDCM2mlに溶解し、トリフルオロ酢酸0．5mlを用いて脱保護した。室温で10分間攪拌した後、反応物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。高真空下で乾燥させると、標記化合物2．1mgが得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．8分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．83分；MS（ESIpos）：m／z＝784（M＋H）＋．
中間体F31
トリフルオロ酢酸／N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N−（3−｛［2−｛（1R）−1−［（3−アミノプロピル）（グリコロイル）アミノ］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−1−イル］メチル｝フェニル）−L−アラニンアミド（1：1）
この中間体を、ペプチド化学の古典的方法を用いて6ステップにわたって中間体C10から合成した。
第1のステップで、中間体C10 42mg（0．066mmol）をHATU100mg（0．266mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン46μlの存在下でDMF5ml中N−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−アラニン20．7mg（0．066mmol）とカップリングした。反応物を室温で一晩攪拌し、生成物を分取HPLCによって精製した。これにより、N−アシル化化合物16mg（理論値の27％）およびN−、O−ビスアシル化化合物9mg（理論値の12％）が得られた。
N−アシル化化合物の脱保護をDMF中ピペリジンを用いて行った。ビスアシル化化合物をエタノール中ピペリジンとメチルアミンの水溶液の両方で処理した。両方の場合で、tert−ブチル（3−｛［（1R）−1−｛1−［3−（L−アラニルアミノ）ベンジル］−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル｝−2，2−ジメチルプロピル］（グリコロイル）アミノ｝プロピル）カルバメートが形成し、分取HPLCによる精製によって純度95％で13mgが得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．95分；MS（ESIpos）：m／z＝657（M＋H）＋．
この中間体13mg（0．019mmol）を、N，N−ジイソプロピルエチルアミン7μlの存在下でDMF2ml中2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−バリネート9．1mg（0．021mmol）とカップリングした。室温で20時間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。1，4−ジオキサン／水からの凍結乾燥により、10mg（理論値の54％）が得られた。
その後DMF中でピペリジンを用いてFmoc保護基を除去すると、部分的に脱保護された中間体9mg（定量的）が得られた。
次いで、この中間体9mg（0．01mmol）を、N，N−ジイソプロピルエチルアミン5μlの存在下でDMF2ml中商業的に入手可能な1−｛6−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−6−オキソヘキシル｝−1H−ピロール−2，5−ジオン3．2mg（0．01mmol）とカップリングした。室温で一晩攪拌した後、反応物を濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。アセトニトリル／水および数滴の1，4−ジオキサンからの凍結乾燥により、3mg（理論値の32％）が得られ、これを最後のステップでDCM2ml中トリフルオロ酢酸0．5mlを用いて脱保護した。アセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物3．8mg（定量的）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝849（M＋H）＋．
中間体F32
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（3−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−3−オキソプロピル）ブタンアミド（1：1）
この中間体を、1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩10．5mg（0．055mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物8．4mg（0．055mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン14μl（0．08mmol）の存在下で中間体C5 15mg（0．041mmol）を中間体L23 16．8mg（0．027mmol）とカップリングし、その後、TFAを用いてデブロッキングすることによって調製した。これにより、標記化合3．4mg（2ステップにわたり理論値の15％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（ESIpos）：m／z＝708（M＋H）＋．
中間体F33
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−｛2−［（ブロモアセチル）アミノ］エチル｝ブタンアミド（1：1）
1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩28．7mg（0．15mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物22．9mg（0．15mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン39μlの存在下で中間体C3 50mg（0．075mmol）を9H−フルオレン−9−イルメチル（2−アミノエチル）カルバメート塩酸塩（1：1）26．2mg（0．082mmol）とカップリングする第1のステップでこの中間体の合成を始めた。室温で18時間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、この中間体45mg（理論値の65％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．51分；MS（ESIpos）：m／z＝921（M＋H）＋．
この中間体45mg（0．049mmol）をエタノール10mlに溶解し、メタンアミンの水中40％濃度溶液176μlを添加した。反応物を50℃で攪拌し、同量のメタンアミン溶液を6時間後および9時間後に添加した。50℃でさらに14時間攪拌した後、メタンアミン溶液さらに700μlを添加し、さらに20時間攪拌した後、最後に混合物を濃縮した。残渣をDCMに溶解し、水で洗浄した。有機相を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させると、tert−ブチル｛（2S）−1−［（2−アミノエチル）アミノ］−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−オキソブタン−2−イル｝カルバメート32mg（理論値の99％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．95分；MS（ESIpos）：m／z＝657（M＋H）＋．
この中間体8．3mg（0．013mmol）をジクロロメタン4mlに溶解し、ブロモ酢酸無水物3．3mg（0．013mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン2μlを添加した。室温で1時間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮し、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥した。残渣をジクロロメタン1mlに溶解し、トリフルオロ酢酸0．5mlを用いて脱保護した。濃縮およびアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物1．1mg（2ステップにわたって理論値の9％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝677／679（M＋H）＋．
中間体F34
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−アラニル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
この中間体を、HATU9．9mg（0．026mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン19μlの存在下で中間体C5 14mg（0．022mmol）を中間体L8 12．7mg（0．024mmol）とカップリングすることによって調製した。反応物を室温で30分間攪拌し、生成物を分取HPLCによって精製し、次いで、アセトニトリル／水から凍結乾燥した。
得られた中間体をジクロロメタン3mlに溶解し、トリフルオロ酢酸1mlを用いてデブロッキングした。室温で30分間攪拌した後、反応物を濃縮し、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥した。これにより、標記化合8．2mg（2ステップにわたり理論値の36％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．8分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（ESIpos）：m／z＝913（M＋H）＋．
中間体F35
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド
アルゴン下および0℃で、N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン（中間体L38）57．3mg（0．07mmol）、HOAt9．2mg（0．07mmol）およびHATU32mg（0．08mmol）を、DMF4．0ml中N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C40）31．8mg（0．07mmol）に添加した。
次いで、N，N−ジイソプロピルエチルアミン23．5μl（0．14mmol）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。HOAc7．7μlを添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物33．4mg（理論値の38％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．12分；MS（ESIpos）：m／z＝651［M＋2H］2＋．
中間体F36
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド
標記化合物の合成を中間体F35の調製と同様に行った。
N−（3−アミノプロピル）−N−（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C40）15．4mg（0．03mmol）。
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−L−アラニン（中間体L25）25．0mg（0．03mmol）。
これにより、標記化合物10．7mg（理論値の27％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．13分；MS（ESIpos）：m／z＝1215［M＋H］＋．
中間体F37
トリフルオロ酢酸／N−（4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝ピロリジン−3−イル）−31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−アミド（1：1）
ジアステレオマーの混合物。
化合物tert−ブチル3−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−4−｛［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］アミノ｝ピロリジン−1−カルボキシレートを中間体C21の合成と同様に調製した。
tert−ブチル3−アミノ−4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝ピロリジン−1−カルボキシレート（中間体C23）それぞれ8．0（0．01mmol）および13．0mg（0．02mmol）。
3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛27−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−27−オキソ−3，6，9，12，15，18，21，24−オクタオキサヘプタコサ−1−イル｝プロパンアミドそれぞれ9．0mg（0．01mmol）および14．7mg（0．02mmol）。
収量（両反応合わせて）：
ジアステレオマー1 10．5mg（42％）
ジアステレオマー2 11．6mg（46％）
標記化合物を中間体F38の合成と同様に調製した。
tert−ブチル3−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−4−｛［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］アミノ｝ピロリジン−1−カルボキシレート（ジアステレオマー1）10．5mg（0．01mmol）
TFA60．6mg（0．54mmol）。
これにより、標記化合物7．4mg（理論値の70％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．09分；MS（ESIpos）：m／z＝1086［M＋H］＋．
中間体F38
トリフルオロ酢酸／N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−37−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−7，35−ジオキソ−10，13，16，19，22，25，28，31−オクタオキサ−3−チア−6，34−ジアザヘプタトリアコンタン−1−アミド（1：1）
tert−ブチル［38−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−3，31，37−トリオキソ−7，10，13，16，19，22，25，28−オクタオキサ−35−チア−4，32，38−トリアザヘンテトラコンタン−41−イル］カルバメート（中間体C21）24．8mg（0．02mmol）を最初にジクロロメタン1．0mlに装入し、TFA85．8mg（0．75mmol）を添加した。混合物を室温で16時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物23．0mg（理論値の95％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．96分；MS（ESIpos）：m／z＝1104［M＋H］＋．
中間体F39
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド
標記化合物を中間体F35の合成と同様に調製した。
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−L−アラニン（中間体L44）56．1mg（0．10mmol）。
N−（3−アミノプロピル）−N−（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C40）45．0mg（0．10mmol）。
これにより、標記化合物20．9mg（理論値の21％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．16分；MS（ESIpos）：m／z＝1040［M＋H］＋．
中間体F40
トリフルオロ酢酸／N−［（4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝ピロリジン−3−イル）メチル］−31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−アミド（1：1）
tert−ブチル3−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−4−［33−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−3，31−ジオキソ−6，9，12，15，18，21，24，27−オクタオキサ−2，30−ジアザトリトリアコンタ−1−イル］ピロリジン−1−カルボキシレートを中間体C21の合成と同様に調製した。
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル3−（アミノメチル）−4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝ピロリジン−1−カルボキシレート（1：1）（中間体C24）25．0mg（0．04mmol）
3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛27−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−27−オキソ−3，6，9，12，15，18，21，24−オクタオキサヘプタコサ−1−イル｝プロパンアミド27．6mg（0．04mmol）。
収量：20．6mg（理論値の39％）
LC−MS（方法1）：Rt＝1．23分；MS（ESIpos）：m／z＝1200［M＋H］＋．
標記化合物を中間体F37の合成と同様に調製した。
tert−ブチル3−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−4−［33−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−3，31−ジオキソ−6，9，12，15，18，21，24，27−オクタオキサ−2，30−ジアザトリトリアコンタ−1−イル］ピロリジン−1−カルボキシレート26．1mg（0．02mmol）。
TFA90．6mg（0．80mmol）。
これにより、標記化合物22．9mg（理論値の95％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91および0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝1100［M＋H］＋．
中間体F41
トリフルオロ酢酸／N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−37−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−7，35−ジオキソ−10，13，16，19，22，25，28，31−オクタオキサ−3−チア−6，34−ジアザヘプタトリアコンタン−1−アミド3−オキシド（1：1）
標記化合物を、中間体C22 15．5mg（0．01mmol）から中間体F38と同様に調製した。これにより、標記化合物4．0mg（理論値の27％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．90分；MS（ESIpos）：m／z＝1120［M＋H］＋．
中間体F42
トリフルオロ酢酸／4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］ピロリジン−3−カルボキサミド（1：1）
4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−1−（tert−ブトキシカルボニル）ピロリジン−3−カルボン酸（中間体C25）40．5mg（0．06mmol）および1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン塩酸塩（1：1）14．5mg（0．08mmol）を最初にアセトニトリル1．0mlに装入し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン64．4mg（0．51mmol）およびT3P 50．0mg（0．08mmol）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。同量の1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン塩酸塩（1：1）、N，N−ジイソプロピルエチルアミンおよびT3Pを再度添加し、混合物を室温でさらに4時間攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル3−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−4−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］カルバモイル｝ピロリジン−1−カルボキシレート7．2mg（理論値の15％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．30分；MS（ESIpos）：m／z＝763［M＋H］＋．
tert−ブチル3−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−4−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］カルバモイル｝ピロリジン−1−カルボキシレート7．2mg（0．01mmol）を最初にジクロロメタン1．0mlに装入し、TFA43．0mg（0．38mmol）を添加した。反応混合物を室温で16時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物4．5mg（理論値の50％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝663［M＋H］＋．
中間体F43
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン（中間体L42）22．4mg（0．03mmol）をDMF2．0mlに溶解し、HOAt4．5mg（0．03mmol）、HATU15．8mg（0．04mmol）およびN−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C40）15．7mg（0．03mmol）を添加した。N，N−ジイソプロピルエチルアミン8．6mg（0．07mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物16．7mg（理論値の45％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．34分；MS（ESIpos）：m／z＝1125［M＋H］＋．
中間体F44
トリフルオロ酢酸／N−［（4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝ピロリジン−3−イル）メチル］−19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−アミド（1：1）
標記化合物を中間体F40の合成と同様に調製した。
トリフルオロ酢酸／tert−ブチル3−（アミノメチル）−4−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝ピロリジン−1−カルボキシレート（1：1）（中間体C24）25．0mg（0．04mmol）
3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド20．5mg（0．04mmol）。
これにより、化合物tert−ブチル3−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−4−［21−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−3，19−ジオキソ−6，9，12，15−テトラオキサ−2，18−ジアザヘンイコサ−1−イル］ピロリジン−1−カルボキシレート21．8mg（理論値の48％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．22分；MS（ESIpos）：m／z＝1025［M＋H］＋．
tert−ブチル3−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝−4−［21−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−3，19−ジオキソ−6，9，12，15−テトラオキサ−2，18−ジアザヘンイコサ−1−イル］ピロリジン−1−カルボキシレート21．0mg（0．02mmol）。
TFA168．3mg（1．48mmol）。
これにより、標記化合物17．3mg（理論値の90％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92および0．94分；MS（ESIpos）：m／z＝924［M＋H］＋．
中間体F45
トリフルオロ酢酸／N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−リジンアミド（1：1）
中間体F46の合成と同様に合成を行った。
N−（3−アミノプロピル）−N−（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C40）22．9mg（0．05mmol）。
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン（中間体L41）36．2mg（0．05mmol）。
これにより、化合物N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジンアミド19．8mg（34％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．20分；MS（ESIpos）：m／z＝1196［M＋H］＋．
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジンアミド17．0mg（0．01mmol）。
これにより、標記化合物13．6mg（理論値の79％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．94分；MS（ESIpos）：m／z＝1096［M＋H］＋．
中間体F46
トリフルオロ酢酸／N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−リジンアミド（1：1）
アルゴン下および0℃で、N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン（中間体L40）49．0mg（0．05mmol）、HOAt7．3mg（0．05mmol）およびHATU25．3mg（0．07mmol）を、DMF2．0ml中N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C40）25．1mg（0．05mmol）に添加した。次いで、N，N−ジイソプロピルエチルアミン18．6μl（0．11mmol）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジンアミド29．2mg（理論値の37％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．51分；MS（ESIpos）：m／z＝1372［M＋H］＋．
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジンアミド25．2mg（0．02mmol）を最初にジクロロメタン3．0mlに装入し、TFA83．7mg（0．73mmol）を添加した。反応溶液を室温で48時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物24．5mg（理論値の96％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．95分；MS（ESIpos）：m／z＝1272［M＋H］＋．
中間体F47
N−［67−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−65−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40，43，46，49，52，55，58，61−イコサオキサ−64−アザヘプタヘキサコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド
N−［67−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−65−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40，43，46，49，52，55，58，61−イコサオキサ−64−アザヘプタヘキサコンタン−1−オイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン（中間体L43）15．2mg（0．01mmol）をDMF1．0mlに溶解し、HOAt1．5mg（0．01mmol）、HATU5．2mg（0．01mmol）およびN−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C40）5．2mg（0．01mmol）を添加した。N，N−ジイソプロピルエチルアミン2．9mg（0．02mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物6．8mg（理論値の33％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．37分；MS（ESIpos）：m／z＝1831［M＋H］＋．
中間体F48
トリフルオロ酢酸／N1−（3−アミノプロピル）−N1−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N18−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］−6，9，12，15−テトラオキサ−3−チアオクタデカン−1，18−ジアミド（1：1）
tert−ブチル［22−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−4，21−ジオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−19−チア−3，22−ジアザペンタコサン−25−イル］カルバメート（中間体C18）16．1mg（0．02mmol）を最初にジクロロメタン1．5mlに装入し、TFA26μl（0．34mmol）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、TFAさらに26μl（0．34mmol）を添加した。混合物をもう一度室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を水に溶解し、凍結乾燥した。これにより、標記化合物10．8mg（理論値の66％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．98分；MS（ESIpos）：m／z＝857［M＋H］＋．
中間体F49
（25S）−25−アミノ−22−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−4，21−ジオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−19−チア−3，22−ジアザヘキサコサン−26−酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
化合物（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］酪酸−tert−ブチルの合成を中間体C16の合成と同様に行った。
中間体C2 50．0mg（0．08mmol）
クロロアセチルクロリド20．3mg（0．18mmol）
トリエチルアミン19．0mg（0．19mmol）
これにより、化合物（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］酪酸−tert−ブチル43．1mg（理論値の77％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．55分；MS（ESIpos）：m／z＝689［M＋H］＋．
化合物（6S）−9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−6−（tert−ブトキシカルボニル）−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3，15，18，21，24−ペンタオキサ−12−チア−5，9−ジアザヘプタコサン−27−酸の合成を中間体C17の合成と同様に行った。
これにより、（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］酪酸−tert−ブチル38．8mg（0．06mmol）。
1−スルファニル−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカン−15−酸19．1mg（0．07mmol）
炭酸セシウム45．9mg（0．14mmol）
これにより、化合物（6S）−9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−6−（tert−ブトキシカルボニル）−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3，15，18，21，24−ペンタオキサ−12−チア−5，9−ジアザヘプタコサン−27−酸40．7mg（理論値の77％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．45分；MS（ESIpos）：m／z＝935［M＋H］＋．
化合物tert−ブチル（25S）−22−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−25−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−4，21−ジオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−19−チア−3，22−ジアザヘキサコサン−26−オエートの合成を中間体C18の合成と同様に行った。
（6S）−9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−6−（tert−ブトキシカルボニル）−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3，15，18，21，24−ペンタオキサ−12−チア−5，9−ジアザヘプタコサン−27−酸37．4mg（0．04mmol）。
1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン塩酸塩（1：1）9．2mg（0．05mmol）。
これにより、化合物tert−ブチル（25S）−22−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−25−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−4，21−ジオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−19−チア−3，22−ジアザヘキサコサン−26−オエート23．4mg（理論値の49％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．47分；MS（ESIpos）：m／z＝1057［M＋H］＋．
標記化合物の合成を中間体F38の合成と同様に行った。
tert−ブチル（25S）−22−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−25−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−4，21−ジオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−19−チア−3，22−ジアザヘキサコサン−26−オエート20．8mg（0．02mmol）。
TFA157．0mg（1．37mmol）。
これにより、標記化合物13．0mg（65％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝901［M＋H］＋．
中間体F50
トリフルオロ酢酸／1−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロプロパンカルボキサミド（1：1）
中間体C5 15mg（0．024mmol）をDCM6．5mlに溶解し、中間体L24 19mg（0．049mmol）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン13μlおよび2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート10mg（0．037mmol）を添加した。反応物を室温で3時間撹拌し、次いで、減圧下で乾燥させた。残渣を分取HPLCによって精製すると、保護された中間体2．4mgが得られた。
次いで、これらをDCM1mlに溶解し、トリフルオロ酢酸0．1mlを用いて脱保護した。アセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物2．6mg（2ステップにわたって理論値の11％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝2．4分。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．25分；MS（ESIpos）：m／z＝819［M＋H］＋．
中間体F51
3−｛3−［（3−アミノ−2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロピル）スルファニル］−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル｝−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド（異性体1）
N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）（異性体1）10．0mg（18．079μmol）を最初にPBS緩衝液（Sigma D8537）100μlおよびACN200μlに装入した。3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド17．1mg（32．543μmol）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。反応溶液を分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって精製し、凍結乾燥した。これにより、標的化合物14．0mg（理論値の75％）が得られた。
異性体1
LC−MS（方法1）：Rt＝0．94分；MS（ESIpos）：m／z＝1039［M＋H］＋．
中間体F52
3−｛3−［（3−アミノ−2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロピル）スルファニル］−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル｝−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド（異性体2）
N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）（異性体2）6．5mg（10．694μmol、LC／MS純度＝91％）を最初にPBS緩衝液（Sigma D8537）100μlおよびACN200μlに装入した。3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド10．1mg（19．249μmol）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。反応溶液を分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって精製し、凍結乾燥した。これにより、標的化合物5．0mg（理論値の45％）が得られた。
異性体2
LC−MS（方法5）：Rt＝2．87分；MS（ESIpos）：m／z＝1039［M＋H］＋．
中間体F53
N−｛3−アミノ−2−［（｛1−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ブチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝スルファニル）メチル］プロピル｝−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（異性体1）
N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）（異性体1）10．0mg（18．079μmol）を最初にPBS緩衝液（Sigma D8537）200μlおよびACN400μlに装入した。1，1’−ブタン−1，4−ジイルビス（1H−ピロール−2，5−ジオン）8．1mg（32．543μmol）を添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。次いで、DMF300μlを添加し、混合物をさらに1．5時間攪拌した。反応溶液を分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって精製し、凍結乾燥した。これにより、標的化合物4．0mg（理論値の29％）が得られた。
異性体1
LC−MS（方法1）：Rt＝0．97分；MS（ESIpos）：m／z＝765［M＋H］＋．
中間体F54
N−｛3−アミノ−2−［（｛1−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ブチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝スルファニル）メチル］プロピル｝−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（異性体2）
N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）（異性体2）5．0mg（9．040μmol）を最初にDMF500μlに装入した。1，1’−ブタン−1，4−ジイルビス（1H−ピロール−2，5−ジオン）4．0mg（16．271μmol）を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。反応溶液を分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって精製し、凍結乾燥した。これにより、標的化合物1．1mg（理論値の16％）が得られた。
異性体2
LC−MS（方法6）：Rt＝2．41分；MS（ESIpos）：m／z＝765［M＋H］＋．
中間体F55
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝カルバモイル］フェニル｝−L−アラニンアミド
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝カルバモイル）フェニル］−L−アラニンアミド6．5mg（4．5μmol）をジクロロメタン441μlに溶解し、トリフルオロ酢酸44μl（573．1μmol）を添加した。反応物を室温においてロータリーエバポレーターで濃縮し、水およびACNに溶解し、凍結乾燥した。これにより、標的化合物5．6mg（理論値の94％、LC／MSによる純度＝92％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．01分；MS（ESIpos）：m／z＝1100．6［M＋H］＋．
中間体F56
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［（2S）−1−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−1−オキソプロパン−2−イル］ブタンアミド（1：1）
標記化合物を中間体F50と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．9分；MS（EIpos）：m／z＝708［M＋H］＋．
中間体F57
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［（2R）−1−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−1−オキソプロパン−2−イル］ブタンアミド（1：1）
標記化合物を中間体F56と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（EIpos）：m／z＝708［M＋H］＋．
中間体F58
N−｛5−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−5−オキソペンタノイル｝−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド
トリフルオロ酢酸／L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド（1：1）（中間体C41）16．2mg（0．02mmol）を最初にDMF1．0mlに装入し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン8．3mg（0．06mmol）および1，1’−［（1，5−ジオキソペンタン−1，5−ジイル）ビス（オキシ）］ジピロリジン−2，5−ジオン12．6mg（0．04mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物11．0mg（理論値の60％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．18分；MS（ESIpos）：m／z＝852［M＋H］＋．
中間体F82
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド
標記化合物の合成を中間体F83の合成と同様に行った。使用したラセミ中間体は、対応するR−異性体中間体と同様に得た。
LC−MS（方法2）：Rt＝7．07分；MS（EIpos）：m／z＝1236［M＋Na］＋．
中間体F83
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（実施例98）30．0mg（0．06mmol）および2，5−ジオキソピロリジン−1−イル−N−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−アラニネート26．1mg（0．06mmol）を最初にDMF2．0mlに装入し、4−メチルモルホリン19．4mg（0．19mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、HOAc11．5mg（0．19mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物9H−フルオレン−9−イルメチル［（2S）−1−（｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝アミノ）−1−オキソプロパン−2−イル］カルバメート41．9mg（理論値の79％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．44分；MS（ESIpos）：m／z＝763［M＋H］＋．
9H−フルオレン−9−イルメチル［（2S）−1−（｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝アミノ）−1−オキソプロパン−2−イル］カルバメート37．2mg（0．05mmol）をDMF1．5mlに溶解し、2−アミノエタノール124．6mg（1．46mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルと水に分配し、有機相を水で2回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルで精製した（移動相：ジクロロメタン／メタノール10：1）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド14．2mg（理論値の50％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝541［M＋H］＋．
N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド14．1mg（0．03mmol）および2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−バリネート11．4（0．03mmol）をDMF1．5mlに溶解し、4−メチルモルホリン7．9mg（0．08mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、HOAc4．7mg（0．08mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド15．9mg（理論値の71％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．46分；MS（ESIpos）：m／z＝862（M＋H）＋．
N−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド14．9mg（0．02mmol）をDMF1．5mlに溶解し、2−アミノエタノール44．2mg（0．52mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルと水に分配し、有機相を水で2回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルで精製した（移動相：ジクロロメタン／メタノール10：1）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド5．7mg（理論値の52％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝640（M＋H）＋．
L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド5．5mg（8．6μmol）および3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛27−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−27−オキソ−3，6，9，12，15，18，21，24−オクタオキサヘプタコサ−1−イル｝プロパンアミド6．5mg（6．5μmol）をDMF1．0mlに溶解し、4−メチルモルホリン0．9mg（8．6mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、HOAc0．8mg（0．01mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物7．7mg（理論値の74％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．10分；MS（ESIpos）：m／z＝1214（M＋H）＋．
中間体F84
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（3−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−3−オキソプロピル）ブタンアミド（1：1）
最初に、中間体C54 16．5mg（0．02mmol）をDMF5mlに溶解し、HATU11．7mg（0．03mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン18μlの存在下でトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）10．4mg（0．041mmol）と反応させた。室温で5分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣をアセトニトリル／水1：1に溶解した。トリフルオロ酢酸を用いてpHを2に調整し、反応物を再度濃縮した。残った残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、保護された中間体8mg（理論値の42％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．38分；MS（EIpos）：m／z＝929［M＋H］＋．
この中間体7．6mg（0．008mmol）をDMF3mlに溶解し、1，4−ジアザビシクロ［2．2．2］オクタン92mg（0．82mmol）を添加した。反応物を超音波浴で1時間処理した。次いで、酢酸31μlを添加し、反応物を高真空下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、標記化合物3mg（理論値の45％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（EIpos）：m／z＝707［M＋H］＋．
1H NMR（500MHz，DMSO−d6）：δ＝8．15（t，1H），7．9−8．1（m，4H），7．6（m，1H），7．5（s，1H），7．15−7．35（m，6H），6．9−7．0（m，3H），6．85（s，1H），5．6（s，1H），4．9 and 5．2（2d，2H），4．05 and 4．2（2d，2H），3．1−3．2（m，4H），2．15（m，2H），0．7 and 1．45（2m，2H），0．8（s，9H）．
中間体F85
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］ブタンアミド（1：1）
最初に、中間体C53 10mg（0．014mmol）をDMF3．4mlに溶解し、HATU7．8mg（0．02mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン12μlの存在下でトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）7mg（0．027mmol）と反応させた。室温で15分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、保護された中間体6．6mg（理論値の57％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．4分；MS（EIpos）：m／z＝858［M＋H］＋．
この中間体6．6mg（0．008mmol）をDMF2mlに溶解し、1，4−ジアザビシクロ［2．2．2］オクタン86mg（0．77mmol）を添加した。反応物を超音波浴で2時間処理した。次いで、酢酸44μlを添加し、反応物を高真空下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、標記化合物3．3mg（理論値の53％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（EIpos）：m／z＝636［M＋H］＋．
中間体F86
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（3−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−3−オキソプロピル）ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C51 8mg（0．012mmol）から、HATU5．8mg（0．015mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン10μlの存在下でトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）4．5mg（0．017mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより7mg（2ステップにわたり理論値の78％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．83分；MS（EIpos）：m／z＝708［M＋H］＋．
中間体F87
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（3−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−3−オキソプロピル）ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C49 16mg（0．025mmol）から、EDCI／HOBTおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で中間体L1 24mg（0．076mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって中間体F2と同様に調製した。これにより、標記化合物3mg（2ステップにわたり理論値の14％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（EIpos）：m／z＝694［M＋H］＋．
中間体F88
化合物を中間体F8と同様に調製した。
LC−MS（方法5）：Rt＝2．97分；MS（EIpos）：m／z＝1006［M＋H］＋．
中間体F89
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C51 8mg（0．012mmol）から、HATU5．8mg（0．015mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン10μlの存在下で中間体L8 7．4mg（0．014mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより10mg（2ステップにわたり理論値の78％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（EIpos）：m／z＝984［M＋H］＋．
中間体F90
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C49 11mg（0．018mmol）から、HATU34mg（0．089mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン19μlの存在下で中間体L17 13．7mg（0．018mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより7．5mg（2ステップにわたり理論値の35％）が得られた。
LC−MS（方法8）：Rt＝6．78分；MS（EIpos）：m／z＝1092［M＋H］＋．
中間体F91
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］ブタンアミド（1：1）
tert−ブチル［（2S）−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−1−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−1−オキソブタン−2−イル］カルバメート9．3mg（0．01mmol）をジクロロメタン2mlに溶解し、トリフルオロ酢酸740mg（6．49mmol、0．50ml）を添加し、混合物を室温で1．5時間攪拌した。次いで、反応混合物を濃縮し、残渣をアセトニトリルおよび水に溶解し、凍結乾燥した。これにより、標的化合物9．2mg（理論値の96％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（EIpos）：m／z＝637［M＋H］＋．
中間体F103
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−（3−｛［（1R）−1−（3−ベンジル−7−クロロ−4−オキソ−3，4−ジヒドロキナゾリン−2−イル）−2−メチルプロピル］（4−メチルベンゾイル）アミノ｝プロピル）−L−アラニンアミド
標記化合物を、N−（3−アミノプロピル）−N−［（1R）−1−（3−ベンジル−7−クロロ−4−オキソ−3，4−ジヒドロキナゾリン−2−イル）−2−メチルプロピル］−4−メチルベンズアミド10mg（0．019mmol）から、HATU8．8mg（0．023mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン10μlの存在下で中間体L44 11．3mg（0．019mmol）と反応させることによって調製した。
精製は分取HPLCによった。
収量：8．5mg（理論値の35％）
LC−MS（方法5）：Rt＝3．82分；MS（EIpos）：m／z＝1085［M＋H］＋．
中間体F104
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（2−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝エチル）ブタンアミド（1：1）
中間体C53 10mg（0．014mmol）をDMF3．3mlに溶解し、中間体L1 8．5mg（0．027mmol）、HATU7．8mg（0．02mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン12μlを添加した。反応物を室温で15分間撹拌し、次いで、濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製すると、凍結乾燥後に、保護された中間体5．6mg（理論値の38％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．32分；MS（ESIpos）：m／z＝915（M＋H）＋．
この中間体5．6mg（0．006mmol）をDMF2mlに溶解し、1，4−ジアザビシクロ［2．2．2］オクタン69mg（0．61mmol）を添加した。反応物を超音波浴で2時間処理した。次いで、酢酸35μlを添加し、反応物を高真空下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、標記化合物2．4mg（理論値の48％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（EIpos）：m／z＝693［M＋H］＋．
HPLC（方法11）：Rt＝1．91分；
あるいは、標記化合物を中間体C58からも調製した。中間体C58 15mg（0．023mmol）を最初にHATU13mg（0．034mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン10μlの存在下で中間体L1 11mg（0．036mmol）と反応させた。室温で60分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、保護された中間体12．3mg（理論値の63％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．3分；MS（EIpos）：m／z＝837［M＋H］＋．
第2のステップで、この中間体を2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛12mg（0．088mmol）を添加し、反応物を50℃で2時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸26mg（0．088mmol）および0．1％濃度トリフルオロ酢酸水溶液2mlを添加した。反応物を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物8．1mg（理論値の68％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝693（M＋H）＋．
中間体F105
N2−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］−L−グルタミン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体C5および中間体L46から中間体F32と同様に標記化合物を調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（EIpos）：m／z＝766［M＋H］＋．
中間体F106
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−N−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）フェニル］−L−オルニチンアミド（1：1）
中間体C53および中間体L47から中間体F104と同様に標記化合物を調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．85分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（ESIpos）：m／z＝983（M＋H）＋．
中間体F107
トリフルオロ酢酸／（1R，2S）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C49 15mg（0．024mmol）から、HATU14mg（0．037mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン21μlの存在下で中間体L48 22．3mg（0．049mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより13mg（2ステップにわたり理論値の60％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．9分；MS（EIpos）：m／z＝748［M＋H］＋．
中間体F108
トリフルオロ酢酸／（1R，2S）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C53 20mg（0．027mmol）および中間体L48 24mg（0．054mmol）から中間体F104と同様に調製した。これにより3mg（2ステップにわたり理論値の14％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（EIpos）：m／z＝747［M＋H］＋．
中間体F109
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−｛2−［（ブロモアセチル）アミノ］エチル｝ブタンアミド（1：1）
中間体C57 17mg（0．026mmol）をDMF3mlに溶解し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン14μlの存在下で商業的に入手可能な1−（2−ブロモアセトキシ）ピロリジン−2，5−ジオン7mg（0．027mmol）と反応させた。室温で15分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、この中間体7mg（理論値の33％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．29分；MS（ESIpos）：m／z＝777 and 779（M＋H）＋．
この中間体をジクロロメタン1mlに溶解し、トリフルオロ酢酸1mlを用いて脱保護した。濃縮およびアセトニトリル／水からの凍結乾燥後に、標記化合物6mg（理論値の88％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（ESIpos）：m／z＝677／679（M＋H）＋．
中間体F110
N−（ブロモアセチル）−L−バリル−L−アラニル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C5 16mg（0．023mmol）および中間体L49 17mg（0．025mmol）から中間体F109と同様に調製した。これにより、標記化合物6mg（2ステップにわたり理論値の24％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．93分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝933 and 935（M＋H）＋．
中間体F111
トリフルオロ酢酸／（1S，3R）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 15mg（0．022mmol）から、HATU12．5mg（0．032mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン19μlの存在下で中間体L50 16mg（0．044mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより13mg（2ステップにわたり理論値の67％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（EIpos）：m／z＝748［M＋H］＋．
中間体F112
トリフルオロ酢酸／（1S，3R）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C49 15mg（0．024mmol）から、HATU14mg（0．037mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン21μlの存在下で中間体L50 18mg（0．049mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより12mg（2ステップにわたり理論値の51％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（EIpos）：m／z＝748［M＋H］＋．
中間体F113
トリフルオロ酢酸／（1S，3R）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C53 15mg（0．019mmol）から、HATU11mg（0．029mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン17μlの存在下で中間体L50 14mg（0．038mmol）と反応させ、その後、DMF2ml中DABCO133mgを用いて脱保護することによって調製した。HPLCによる精製により4mg（2ステップにわたり理論値の24％）が得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝2．77分；MS（EIpos）：m／z＝747［M＋H］＋．
中間体F114
トリフルオロ酢酸／（1R，3R）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 15mg（0．022mmol）から、HATU12．6mg（0．032mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン19μlの存在下で中間体L51 16mg（0．044mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより11mg（2ステップにわたり理論値の53％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（EIpos）：m／z＝748［M＋H］＋．
中間体F115
トリフルオロ酢酸／（1R，3R）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C49 15mg（0．024mmol）から、HATU13mg（0．035mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン21μlの存在下で中間体L51 18mg（0．047mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより12mg（2ステップにわたり理論値の51％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（EIpos）：m／z＝748［M＋H］＋．
中間体F116
トリフルオロ酢酸／（1R，3R）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C51 11mg（0．014mmol）から、HATU8mg（0．021mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン12μlの存在下で中間体L51 11mg（0．028mmol）と反応させ、その後、DMF2ml中DABCO87mgを用いて脱保護することによって調製した。HPLCによる精製により3．3mg（2ステップにわたり理論値の28％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（EIpos）：m／z＝747［M＋H］＋．
中間体F117
トリフルオロ酢酸／N−［（3S）−3−アミノ−4−｛2−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］ヒドラジノ｝−4−オキソブチル］−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C49からペプチド化学の古典的方法により調製した。最初に、C49をHATUの存在下で9H−フルオレン−9−イルメチルヒドラジンカルボキシレートとカップリングした。次いで、Fmoc保護基をDMF中ピペリジンを用いて除去し、得られたヒドラジドをHATUの存在下で6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサン酸とカップリングした。最後のステップで、Boc保護基をジクロロメタン中TFAを用いて除去した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（EIpos）：m／z＝722［M＋H］＋．
中間体F118
トリフルオロ酢酸／N−［（3S）−3−アミノ−4−｛2−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］ヒドラジノ｝−4−オキソブチル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）
最初のステップで、標記化合物を、中間体C53 15mg（0．019mmol）から、HATUの存在下で商業的に入手可能な6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサンヒドラジドとカップリングすることによって中間体F3と同様に調製した。次いで、Fmoc保護基をDMF中DABCO142mgを用いて除去した。HPLCによる精製により、標記化合物3mg（理論値の19％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．90分；MS（EIpos）：m／z＝721［M＋H］＋．
中間体F119
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−｛2−［（ブロモアセチル）アミノ］エチル｝ブタンアミド（1：1）
中間体C58 29mg（0．044mmol）をDMF3．4mlに溶解し、中間体L52 36mg（0．087mmol）、HATU25mg（0．065mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン19μlを添加した。室温で60分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、中間体26．4mg（理論値の73％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．34分；MS（ESIpos）：m／z＝820 and 822（M＋H）＋．
この中間体を2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛6．5mg（0．048mmol）を添加し、反応物を50℃で4時間攪拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸13．9mg（0．048mmol）および0．1％濃度トリフルオロ酢酸水溶液2mlを添加した。反応物を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物14．4mg（理論値の58％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝676 and 678（M＋H）＋．
中間体F120
トリフルオロ酢酸／（1S，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 10mg（0．015mmol）から、HATU8．4mg（0．022mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン13μlの存在下で中間体L53 11mg（0．03mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより7．5mg（2ステップにわたり理論値の59％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（EIpos）：m／z＝748［M＋H］＋．
中間体F121
トリフルオロ酢酸／（1S，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C49 10mg（0．016mmol）から、HATU9mg（0．024mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン14μlの存在下で中間体L53 11．5mg（0．031mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより9mg（2ステップにわたり理論値の61％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（EIpos）：m／z＝748［M＋H］＋．
中間体F122
トリフルオロ酢酸／（1S，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C53 15mg（0．019mmol）から、HATU11mg（0．029mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン17μlの存在下で中間体L53 14mg（0．038mmol）と反応させ、その後、DMF3ml中DABCO202mgを用いて脱保護することによって調製した。HPLCによる精製により4mg（2ステップにわたり理論値の24％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（EIpos）：m／z＝747［M＋H］＋．
中間体F123
トリフルオロ酢酸／（1R，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C5 10mg（0．015mmol）から、HATU8．4mg（0．022mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン13μlの存在下で中間体L54 11mg（0．030mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより4mg（2ステップにわたり理論値の31％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（EIpos）：m／z＝748［M＋H］＋．
中間体F124
トリフルオロ酢酸／（1R，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C49 10mg（0．016mmol）から、HATU9mg（0．024mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン14μlの存在下で中間体L54 11．5mg（0．031mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより9mg（2ステップにわたり理論値の66％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（EIpos）：m／z＝748［M＋H］＋．
中間体F125
トリフルオロ酢酸／（1R，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
標記化合物を、中間体C53 15mg（0．019mmol）から、HATU11mg（0．029mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン17μlの存在下で中間体L54 14mg（0．038mmol）と反応させ、その後、DMF3ml中DABCO127mgを用いて脱保護することによって調製した。HPLCによる精製により3mg（2ステップにわたり理論値の17％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．08分；MS（EIpos）：m／z＝769［M＋Na］＋．
中間体F126
N−（ブロモアセチル）−L−バリル−L−アラニル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C49 18mg（0．027mmol）および中間体L49 21mg（0．027mmol）から中間体F110と同様に調製した。これにより、標記化合8．7mg（2段階にわたり理論値の30％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．94分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（ESIpos）：m／z＝933 and 935（M＋H）＋．
中間体F127
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛（2S）−2−メトキシプロパノイル］アミノ）−N−（2−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝エチル）ブタンアミド（1：1）
中間体C59 12mg（0．015mmol）を、DMF2．4mlに溶解し、中間体L1 14．6mg（0．046mmol）、1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩6mg（0．031mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物5．9mg（0．039mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン8μlを添加した。室温で1時間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、この中間体11mg（理論値の70％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．34分；MS（ESIpos）：m／z＝942（M＋H）＋．
この中間体11mg（0．011mmol）をDMF2mlに溶解し、1，4−ジアザビシクロ［2．2．2］オクタン123mg（1．1mmol）を添加した。反応物を超音波浴で2時間処理した。次いで、酢酸63μlを添加し、反応物を高真空下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、標記化合物2mg（理論値の22％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（EIpos）：m／z＝721［M＋H］＋．
HPLC（方法11）：Rt＝1．95分；
中間体F128
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−D−アラニル）−N2−｛N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C5 3mg（0．005mmol）から、HATU2．5mg（0．007mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン3μlの存在下で中間体L55 2．5mg（0．003mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって調製した。これにより1．4mg（2ステップにわたり理論値の32％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（EIpos）：m／z＝1077［M＋H］＋．
中間体F129
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛［（1R，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸
標記化合物を、中間体C49 10mg（0．016mmol）から、HATU12mg（0．031mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン14μlの存在下で中間体L56 19mg（0．024mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって中間体F128と同様に調製した。これにより13．5mg（2ステップにわたり理論値の70％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．9分；MS（EIpos）：m／z＝1117［M＋H］＋．
中間体F142
R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−ホモシステイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
R／S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−ホモシステイン／トリフルオロ酢酸（1：1）20．0mg（23．7μmol）および3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド13．4mg（26．04mmol）をDMF1．0mlに溶解し、4−メチルモルホリン4．8mg（47．34μmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。酢酸3．6mg（0．06mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物R／S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］ホモシステイン12．4mg（理論値の44％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．30分；MS（ESIpos）：m／z＝1129（M＋H）＋．
R／S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−ホモシステイン10．0mg（8．85μmol）をトリフルオロエタノールに溶解し、塩化亜鉛3．1mg（22．71μmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸3．9mg（0．01mmol）を添加し、反応混合物を短時間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を少量の水と共に凍結乾燥した。これにより、標記化合物7．6mg（理論値の78％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．94分；MS（ESIpos）：m／z＝983（M＋H）＋．
1H NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．50（m，1H），0．81（s，9H），1．49（m，1H），1．89（m，1H），2．05（m，1H），2．29−2．43（m，4H），2．45−2．55（m，2H），2．58−2．74（m，2H），3．10−3．20（m，2H），3．21−3．40（m，2H），3．42−3．54（m，16H），3．55−3．65（m，4H），4．28（m，1H），4．91（dd，1H），5．18（dd，1H），5．60（s，1H），6．95（m，1H），7．00（s，2H），7．15−7．38（m，7H），7．53（s，1H），7．68（m，1H），8．00（m，2H）．
中間体F143
トリフルオロ酢酸／6−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］ヘキサンアミド（1：1）
2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート30．0mg（0．05mmol）および6−（アセチルスルファニル）ヘキサン酸13．5mg（0．07mmol）を最初に1滴の水を含むメタノール2．0mlに装入した。炭酸カリウム23．0mg（0．17mmol）を添加した。反応混合物を50℃で4時間撹拌した。酢酸エチルを反応混合物に添加した。有機相を飽和NaCl溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シライコサン−20−酸54．2mg（理論値の90％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．49分；MS（ESIpos）：m／z＝1106（M＋H）＋．
11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シライコサン−20−酸54．0mg（0．07mmol）および1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン塩酸塩（1：1）16．7mg（0．09mmol）を最初にアセトニトリル3．0mlに装入し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン75．0mg（0．58mmol）を添加した。T3P（アセトニトリル中50％）60．0mg（0．09mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。反応物を水でクエンチし、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛［（6−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−6−オキソヘキシル）スルファニル］アセチル｝アミノ）プロピル］カルバメート42．8mg（理論値の68％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．48分；MS（ESIpos）：m／z＝866（M＋H）＋．
2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛［（6−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−6−オキソヘキシル）スルファニル］アセチル｝アミノ）プロピル］カルバメート20．0mg（0．02mmol）をトリフルオロエタノール2．0mlに溶解し、塩化亜鉛4．7mg（0．04mmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩攪拌し、次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸10．1mg（0．04mmol）を添加し、混合物を10分間攪拌した。水（0．1％TFA）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物9．2mg（理論値の48％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．98分；MS（ESIpos）：m／z＝722（M＋H）＋．
中間体F144
トリフルオロ酢酸／N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサンアミド（1：1）
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C15）50．0mg（0．1mmol）を最初にジクロロメタン2．0mlに装入し、トリエチルアミン22．7mg（0．22mmol）および6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイルクロリド（中間体L60）WISV1648−1−1 49．3mg（0．22mmol）を添加した。
反応混合物を室温で一晩撹拌した。2時間ごとに（3回）、1当量の中間体L60および1．2当量のトリエチルアミンを添加し、次いで、混合物を室温で一晩攪拌した。この手順をさらに2回繰り返した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］アミノ）プロピル］カルバメート30．9mg（理論値の43％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．51分；MS（ESIpos）：m／z＝706（M＋H）＋．
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］アミノ）プロピル］カルバメート24．6mg（0．04mmol）をジクロロメタン3．0mlに溶解し、TFA79．5mg（0．7mmol）を添加し、混合物を室温で6時間攪拌した。TFAさらに79．5mg（0．7mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタンと3回共蒸留した。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物24．2mg（理論値の97％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．02分；MS（ESIpos）：m／z＝606（M＋H）＋．
中間体F145
トリフルオロ酢酸／6−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］ヘキサンアミド
tert−ブチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C16）90．0mg（0．15mmol）および6−（アセチルスルファニル）ヘキサン酸43．6mg（0．23mmol）を最初に1滴の水を含むメタノール9．0mlに装入し、炭酸カリウム73．9mg（0．54mmol）を添加した。反応混合物を室温で4時間撹拌し、次いで、酢酸エチルを添加した。有機相を水／飽和NaCl溶液および飽和NaCl溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルで精製した（移動相：ジクロロメタン／メタノール100：2）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3−オキサ−12−チア−5，9−ジアザオクタデカン−18−酸98．7mg（理論値の83％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．44分；MS（ESIpos）：m／z＝701（M＋H）＋．
9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3−オキサ−12−チア−5，9−ジアザオクタデカン−18−酸20．0mg（0．03mmol）および1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン塩酸塩（1：1）6．5mg（0．04mmol）を最初にアセトニトリル1．5mlに装入し、T3P23．6mg（0．04mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン29．5mg（0．23mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、水を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛［（6−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−6−オキソヘキシル）スルファニル］アセチル｝アミノ）プロピル］カルバメート16．7mg（理論値の99％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．40分；MS（ESIpos）：m／z＝823（M＋H）＋．
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛［（6−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−6−オキソヘキシル）スルファニル］アセチル｝アミノ）プロピル］カルバメート14．8mg（0．02mmol）をジクロロメタン1．5mlに溶解し、TFA41．0mg（0．36mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。
次いで、さらに2回それぞれTFA41．0mg（0．36mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を1，4−ジオキサンおよび水に溶解し、凍結乾燥した。これにより、標記化合物2．9mg（理論値の19％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝723（M＋H）＋．
中間体F146
R／S−［2−（［（3S）−3−アミノ−3−カルボキシプロピル］｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−オキソエチル］−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］ホモシステイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
R／S−［（8S）−11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−8−カルボキシ−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル］ホモシステイン（中間体C12）25．0mg（28．12μmol）および3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド15．9mg（30．93μmol）をDMF2．0mlに溶解し、4−メチルモルホリン11．4mg（112．48μmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。酢酸7．6mg（0．13mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物R／S−［（8S）−11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−8−カルボキシ−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル］−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］ホモシステイン23．9mg（理論値の59％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．26分；MS（ESIpos）：m／z＝1173（M＋H）＋．
R／S−［（8S）−11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−8−カルボキシ−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル］−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］ホモシステイン11．8mg（8．23μmol）をトリフルオロエタノールに溶解し、塩化亜鉛1．7mg（12．35μmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸3．6mg（0．01mmol）を添加し、反応混合物を短時間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物5．8mg（理論値の62％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．20分；MS（ESIpos）：m／z＝1029（M＋H）＋．
中間体F147
トリフルオロ酢酸／N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−10−オキソ−3，6−ジチア−16−チア−9−アザオクタデカン−18−アミド（1：1）
9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3−オキサ−12−チア−5，9−ジアザオクタデカン−18−酸（中間体C13）15．0mg（0．03mmol）を最初にアセトニトリル1．5mlに装入し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン22．1mg（0．17mmol）および次いで、T3P 17．7mg（0．03mmol）を添加した。混合物を室温で5分間攪拌し、次いで、トリフルオロ酢酸／1−｛2−［2−（2−アミノエトキシ）エトキシ］エチル｝−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）（中間体L59）9．5mg（0．03mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、水でクエンチした。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル［19−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−10，18−ジオキソ−3，6−ジオキサ−16−チア−9，19−ジアザドコサン−22−イル］カルバメート14．8mg（理論値の57％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．40分；MS（ESIpos）：m／z＝911（M＋H）＋．
tert−ブチル［19−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−10，18−ジオキソ−3，6−ジオキサ−16−チア−9，19−ジアザドコサン−22−イル］カルバメート14．2mg（0．02mmol）をジクロロメタン1．5mlに溶解し、TFA35．5mg（0．31mmol）を添加し、混合物を室温一晩攪拌した。TFAさらに71．0mg（0．62mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を少量の水に溶解し、凍結乾燥した。これにより、標記化合物14．0mg（理論値の97％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．01分；MS（ESIpos）：m／z＝811（M＋H）＋．
中間体F148
トリフルオロ酢酸／6−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルフィニル）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］ヘキサンアミド（1：1）
標記化合物は中間体F145の合成で副産物として形成された。これにより、標記化合物8．1mg（理論値の53％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．25分；MS（ESIpos）：m／z＝739［M＋H］＋．
中間体F149
トリフルオロ酢酸／R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］ホモシステイン（1：1）
R／S−［2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝アミノ）−2−オキソエチル］ホモシステイン（中間体C14）20．0mg（24．94μmol）および3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド14．1mg（27．44μmol）をDMF1．0mlに装入し、4−メチルモルホリン5．1mg（49．88μmol）を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。酢酸3．7mg（0．06mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物R／S−［2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝アミノ）−2−オキソエチル］−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］ホモシステイン18．2mg（理論値の67％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．23分；MS（ESIpos）：m／z＝1086（M＋H）＋．
R／S−［2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝アミノ）−2−オキソエチル］−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］ホモシステイン17．6mg（0．02mmol）をジクロロメタン1．5mlに溶解し、TFA37．0mg（0．32mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。TFAさらに74．0mg（0．64mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を少量の水に溶解し、凍結乾燥した。これにより、標記化合物16．0mg（理論値の90％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝986（M＋H）＋．
中間体F150
トリフルオロ酢酸／N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−［2−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）エチル］−L−アラニンアミド（1：1）
アルゴン下および0℃で、DMF1．0ml中トリフルオロ酢酸／tert−ブチル［3−（｛［（2−アミノエチル）スルファニル］アセチル｝｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C20）10．0mg（0．02mmol）を、N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−L−アラニン（中間体L25）12．1mg（0．02mmol）、HOAt2．2mg（0．02mmol）およびHATU7．6mg（0．02mmol）で処理した。次いで、N，N−ジイソプロピルエチルアミン5．5μl（0．03mmol）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。HOAc1．8μlを添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−（9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3−オキサ−12−チア−5，9−ジアザテトラデカン−14−イル）−L−アラニンアミド10．4mg（理論値の48％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．60分；MS（ESIpos）：m／z＝687．5［M＋2H］2＋．
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−（9−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−4，10−ジオキソ−3−オキサ−12−チア−5，9−ジアザテトラデカン−14−イル）−L−アラニンアミド9．5mg（0．01mmol）を最初にジクロロメタン1．0mlに装入し、TFA15．8mg（0．14mmol）を添加し、混合物を一晩攪拌した。TFAさらに31．6mg（0．28mmol）を添加し、混合物を一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を少量の水に溶解し、凍結乾燥した。これにより、標記化合物10．2mg（理論値の98％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．13分；MS（ESIpos）：m／z＝637．5［M＋2H］2＋．
中間体F151
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−（3−｛（2S）−5−（2，5−ジフルオロフェニル）−3−［メトキシ（メチル）カルバモイル］−2−フェニル−2，3−ジヒドロ−1，3，4−チアジアゾール−2−イル｝プロピル）−L−アラニンアミド
（2S）−2−（3−アミノプロピル）−5−（2，5−ジフルオロフェニル）−N−メトキシ−N−メチル−2−フェニル−1，3，4−チアジアゾール−3（2H）−カルボキサミド5．0mg（0．01mmol）を最初にアセトニトリル1．0mlに装入し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン7．7mg（0．06mmol）およびT3P9．8（0．02mmol）を添加した。混合物を室温で5分間攪拌し、次いで、N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−L−アラニン（中間体L44）9．1mg（0．02mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。水を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×40；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物4．3mg（理論値の35％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．02分；MS（ESIpos）：m／z＝989［M＋H］＋．
中間体F152
N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−N−（3−｛（2S）−5−（2，5−ジフルオロフェニル）−3−［メトキシ（メチル）カルバモイル］−2−フェニル−2，3−ジヒドロ−1，3，4−チアジアゾール−2−イル｝プロピル）−L−アラニンアミド
（2S）−2−（3−アミノプロピル）−5−（2，5−ジフルオロフェニル）−N−メトキシ−N−メチル−2−フェニル−1，3，4−チアジアゾール−3（2H）−カルボキサミド5．0mg（0．01mmol）を最初にアセトニトリル1．0mlに装入し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン7．7mg（0．06mmol）およびT3P 9．8（0．02mmol）を添加した。混合物を室温で5分間攪拌し、次いで、N−［31−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−29−オキソ−4，7，10，13，16，19，22，25−オクタオキサ−28−アザヘントリアコンタン−1−オイル］−L−バリル−L−アラニン（中間体L25）11．8mg（0．02mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。水を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物4．7mg（理論値の34％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．34分；MS（ESIpos）：m／z＝1165［M＋H］＋．
中間体F153
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［（2S）−2−ヒドロキシプロパノイル］アミノ）−N−（2−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝エチル）ブタンアミド（1：1）
中間体C60から中間体F104と同様に合成を行った。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．1分；MS（ESIpos）：m／z＝707（M＋H）＋．
中間体F154
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−N2−｛N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C8 10mg（0．015mmol）および中間体L6 15mg（0．022mmol）から中間体F2と同様に調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．91分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝1077（M＋H）＋．
中間体F155
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−N2−｛N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATU8．7mg（0．023mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン17μlの存在下で中間体C61 14mg（0．019mmol）を中間体L61 15mg（0．021mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物13mg（2ステップにわたり理論値の59％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（ESIpos）：m／z＝1076（M＋H）＋．
中間体F156
N−（ブロモアセチル）−L−バリル−L−アラニル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
最初に、トリペプチド誘導体2−（トリメチルシリル）エチル−L−バリル−L−アラニル−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジネートを、N2−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−N6−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジンから、ペプチド化学の古典的方法（EDCI／DMAPを用いた2−（トリメチルシリルエタノール）によるエステル化、水素化分解、HATUの存在下でのN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−L−アラニンとのカップリング、およびさらなる水素化分解）により調製した。
この中間体84mg（0．163mmol）をDMF2．5mlに溶解し、1−（2−ブロモアセトキシ）ピロリジン−2，5−ジオン58mg（0．244mmol）を添加した。室温で10分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣をアセトニトリル／水1：1に溶解し、トリフルオロ酢酸を用いて混合物をpH2に調整し、分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮後、残渣をDCM中5％濃度トリフルオロ酢酸溶液15mlに溶解し、室温で2時間攪拌した。次いで、混合物をわずかに冷却しながら濃縮し、残渣をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。この中間体53mg（理論値の50％）を2ステップにわたって得た。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．72分；MS（ESIpos）：m／z＝537 and 539（M＋H）＋．
標記化合物を合成するために、この中間体18mg（0．027mmol）をDMF4mlに溶解し、中間体C61 16mg（0．025mmol）およびHATU19mgおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミン9μlを添加した。室温で5分間攪拌した後、数滴のトリフルオロ酢酸を添加し、反応物を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮およびアセトニトリル／水1：1からの凍結乾燥後、得られた中間体を2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛4．8mg（0．035mmol）を添加した後、反応物を50℃で2．5時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸10mg（0．035mmol）を添加し、反応物をアセトニトリル／水で希釈し、濾過した。精製を分取HPLCによって行った。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、2ステップにわたって標記化合物3．2mg（理論値の13％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt ＝1．94分；
LC−MS（方法5）：Rt＝2．79分；MS（ESIpos）：m／z＝932 and 934（M＋H）＋．
中間体F163
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATUの存在下で中間体C58 37mg（0．056mmol）および中間体L61 41mg（0．056mmol）をカップリングし、その後、塩化亜鉛を用いてデブロッキングすることによって調製した。これにより、標記化合物12mg（2ステップにわたり理論値の19％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．49分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝1005（M＋H）＋．
中間体F164
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、HATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で中間体C58 20mg（0．030mmol）を中間体L62 27mg（0．033mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって中間体F155と同様に調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．92分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（ESIpos）：m／z＝1091（M＋H）＋．
中間体F165
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−N2−｛N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、HATUの存在下で中間体C61 15mg（0．021mmol）を中間体L62 18mg（0．023mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって中間体F155と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝1162（M＋H）＋．
中間体F166
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−N6−｛［（1R，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
最初に、トリフルオロ酢酸／ベンジル（1R，3S）−3−アミノシクロペンタンカルボキシレート（1：1）を、EDCI／DMAPを用いたベンジルアルコールによるエステル化、およびその後のDCM中TFAを用いたtert−ブトキシカルボニル保護基の除去によって、ペプチド化学の古典的方法により商業的に入手可能な（1R，3S）−3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸から調製した
この中間体51mg（0．076mmol）をDMF6mlに溶解し、HATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で中間体C58 50mg（0．076mmol）とカップリングした。分取HPLCによる精製後、中間体をメタノールに溶解し、水素標準圧力下室温で2時間、10％パラジウム活性炭上で水素化した。次いで、触媒を濾別し、溶媒を減圧下で除去し、生成物を分取HPLCによって精製した。ジオキサンからの凍結乾燥により、（1R，3S）−3−｛［（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ブタノイル］アミノ｝シクロペンタンカルボン酸21mg（2ステップにわたり理論値の34％）が得られた。
標記化合物を、HATUの存在下でこの中間体10．5mg（0．013mmol）を中間体L62 11．4mg（0．014mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって中間体F155と同様に調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物8．6mg（2ステップにわたり理論値の48％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝1203（M＋H）＋．
中間体F167
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛［（1R，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C5 11mg（0．016mmol）から、HATU12mg（0．032mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン14μlの存在下で中間体L56 20mg（0．024mmol）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することによって中間体F129と同様に調製した。これにより11mg（2ステップにわたり理論値の46％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．13分；MS（EIpos）：m／z＝1117［M＋H］＋．
中間体F168
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛［（1R，2S）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
最初に、トリフルオロ酢酸／ベンジル（1R，2S）−2−アミノシクロペンタンカルボキシレート（1：1）を、EDCI／DMAPを用いたベンジルアルコールによるエステル化、およびその後のDCM中TFAを用いたtert−ブトキシカルボニル保護基の除去によって、ペプチド化学の古典的方法により商業的に入手可能な（1R，2S）−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロペンタンカルボン酸から調製した
この中間体102mg（0．305mmol）をDMF12mlに溶解し、HATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で中間体C58 100mg（0．152mmol）とカップリングした。分取HPLCによる精製後、中間体をメタノールに溶解し、水素標準圧力下室温で2時間、10％パラジウム活性炭上で水素化した。次いで、触媒を濾別し、溶媒を減圧下で除去し、生成物を分取HPLCによって精製した。アセトニトリル／水1：1からの凍結乾燥により、（1R，2S）−2−｛［（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ブタノイル］アミノ｝シクロペンタンカルボン酸70mg（2ステップにわたり理論値の59％）が得られた。
次いで、標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATU9．5mg（0．025mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン18μlの存在下でこの中間体20mg（0．013mmol）を中間体L61 16．6mg（0．023mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物9．3mg（2ステップにわたり理論値の30％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．98分；MS（ESIpos）：m／z＝1116（M＋H）＋．
中間体F169
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−N6−｛［（1R，2S）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物の合成を中間体C58およびL62から中間体F168と同様に行った。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝1202（M＋H）＋．
中間体F170
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−D−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物をそのジアスレレオマー中間体F23と同様に調製した。
HPLC（方法11）：Rt＝1．9分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．83分；MS（ESIpos）：m／z＝1092（M＋H）＋．
中間体F171
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−D−アラニル）−N2−｛N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物の合成を中間体C62およびL61から中間体F155と同様に行った。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝1076（M＋H）＋．
中間体F172
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−L−グルタミン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C63 10mg（0．013mmol）から、HATU5．5mg（0．014mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン11μlの存在下で中間体L63 9mg（0．014mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン1：1の溶液中で2．5時間攪拌することによって脱保護することによって調製した。これにより11mg（2ステップにわたり理論値の72％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．9分；MS（EIpos）：m／z＝1049［M＋H］＋．
中間体F173
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−L−グルタミン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体F119について記載されるように、中間体C64 15mg（0．018mmol）から、HATU7．7mg（0．02mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン16μlの存在下で中間体L63 12mg（0．02mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物12mg（2ステップにわたり理論値の58％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（EIpos）：m／z＝1048［M＋H］＋．
中間体F174
N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−L−グルタミン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C57およびL63から中間体F172と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．9分；MS（EIpos）：m／z＝1049［M＋H］＋．
中間体F175
トリフルオロ酢酸／N−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATU6．7mg（0．018mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン9μlの存在下で中間体C64 11mg（0．013mmol）を6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサン酸3．4mg（0．016mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物8mg（2ステップにわたり理論値の69％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．35分；MS（EIpos）：m／z＝893［M＋H］＋．
中間体F176
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−12−オキソ−3，6，9−トリオキサ−13−アザペンタデカン−15−イル］ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATU3．5mg（0．009mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン4μlの存在下で、中間体C64 5mg（0．006mmol）を、その調製が中間体L15に記載される3−（2−｛2−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロパン酸2mg（0．007mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物2mg（2ステップにわたり理論値の35％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（EIpos）：m／z＝839［M＋H］＋．
中間体F177
トリフルオロ酢酸／（1R，2S）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ−N−（2−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝エチル）シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
中間体L61の代わりに中間体L1を用いて、中間体F168と同様に標記化合物を調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（EIpos）：m／z＝804［M＋H］＋．
中間体F178
トリフルオロ酢酸／（1R，2S）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−N−｛2−［（ブロモアセチル）アミノ］エチル｝シクロペンタンカルボキサミド（1：1）
中間体L1の代わりに中間体L52を用いて、中間体F177と同様に標記化合物を調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（EIpos）：m／z＝787 and 789［M＋H］＋．
中間体F179
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキシル］ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATU13mg（0．034mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン16μlの存在下で中間体C58 15mg（0．023mmol）を1−（6−アミノヘキシル）−1H−ピロール−2，5−ジオン6mg（0．025mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物8．5mg（2ステップにわたり理論値の46％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝2．22分；MS（EIpos）：m／z＝692［M＋H］＋．
中間体F180
N−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−N2−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］−L−グルタミン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATU7mg（0．018mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン6μlの存在下で中間体C64 9．6mg（0．012mmol）を中間体L64 5mg（0．013mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物3．1mg（2ステップにわたり理論値の28％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（EIpos）：m／z＝822［M＋H］＋．
中間体F192
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−3−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝−L−アラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体C58 60mg（0．091mmol）をDMF8mlに溶解し、HATU42mg（0．11mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン64μlの存在下で中間体L65 45mg（0．100mmol）とカップリングした。分取HPLCによる精製後、中間体をエタノール10mlに溶解し、水素標準圧力下室温で45分間、10％パラジウム活性炭上で水素化した。次いで、触媒を濾別し、溶媒を減圧下で除去し、生成物を分取HPLCによって精製した。アセトニトリル／水1：1からの凍結乾燥により、2−（トリメチルシリル）エチル3−アミノ−N−［（2S）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ブタノイル］−L−アラニネート24．5mg（2ステップにわたり理論値の31％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．17分；MS（EIpos）：m／z＝844［M＋H］＋．
次いで、標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATU5．4mg（0．014mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン8μlの存在下でこの中間体10mg（0．012mmol）を商業的に入手可能な（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）酢酸中間体2mg（0．013mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物3．5mg（2ステップにわたり理論値の33％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（ESIpos）：m／z＝737（M＋H）＋．
中間体F193
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−3−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝−D−アラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物の合成を、3−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−N−（tert−ブトキシカルボニル）−D−アラニン／N−シクロヘキシルシクロヘキサンアミド（1：1）から中間体F192と同様に行った。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（ESIpos）：m／z＝737（M＋H）＋．
中間体F194
N−｛5−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−5−オキソペンタノイル｝−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド
標記化合物を、実施例98から、最初にHATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下でN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−L−アラニンとカップリングすることによって調製した。次のステップで、Z保護基を、水素標準圧力下室温で10％パラジウム活性炭上で1時間水素化することによって除去し、次いで、1，1’−［（1，5−ジオキソペンタン−1，5−ジイル）ビス（オキシ）］ジピロリジン−2，5−ジオンと反応させることによって中間体F58について記載されるように脱保護された中間体を標記化合物に変換した。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．19分；MS（ESIpos）：m／z＝851［M＋H］＋．
中間体F195
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブチル｝−N’−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］スクシンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATU40mg（0．1054mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン61μlの存在下で中間体C65 26mg（0．035mmol）をDMF8ml中商業的に入手可能なトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）18mg（0．07mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物16mg（2ステップにわたり理論値の43％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（ESIpos）：m／z＝721（M＋H）＋．
1H NMR（500MHz，DMSO−d6）：δ＝7．99（t，1H），7．95（t，1H），7．6−7．75（m，4H），7．5（s，1H）7．2−7．4（m，6H），6．8−7．0（m，4H），5．63（s，1H），4．9 and 5．2（2d，2H），4．26 and 4．0（2d，2H），3．3−3．6（m，4H），3．15−3．25（m，3H），2．85−3．0（m，2H），2．2−2．3（m，4H），0．64 and 1，49（2m，2H），0．81（s，9H）．
中間体F196
トリフルオロ酢酸／2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル−N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニネート（1：1）
最初に、中間体C58 15mg（0．023mmol）をDMF4mlに溶解し、HATU13．0mg（0．034mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン16μlの存在下で中間体L67 8．2mg（0．025mmol）と反応させた。室温で30分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた後、残渣をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。これにより、保護された中間体4．3mg（理論値の20％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．35分；MS（EIpos）：m／z＝852［M＋H］＋．
中間体F119について記載されるように、中間体4．3mg（4．5μmol）をトリフルオロエタノール1mlに溶解し、塩化亜鉛3．65mg（27μmol）を用いて脱保護した。分取HPLCによる精製により、標記化合物1mg（2ステップにわたり理論値の25％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝708（M＋H）＋
中間体F204
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（2−｛［3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）プロパノイル］アミノ｝エチル）ブタンアミド（1：1）
中間体C58 25mg（0．038mmol）を最初にHATU17mg（0．046mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン20μlの存在下で中間体L68 16．5mg（75％純度）（0．038mmol）と反応させた。室温で60分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、保護された中間体18．3mg（理論値の56％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．32分；MS（EIpos）：m／z＝851［M＋H］＋．
第2のステップで、この中間体を2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛12mg（0．086mmol）を添加し、反応物を50℃で2時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸25mg（0．086mmol）および0．1％濃度トリフルオロ酢酸水溶液2mlを添加した。反応物を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物11mg（理論値の62％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（ESIpos）：m／z＝707（M＋H）＋．
中間体F205
トリフルオロ酢酸／1−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］ピペリジン−4−イルN−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチネート（1：1）
合成を、HATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で中間体C61 25mg（0．034mmol）および中間体L69 29mg（0．041mmol）をカップリングし、引き続いて標準圧力下でパラジウム活性炭（10％）を用いて水素化し、次いで、HATUおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）酢酸とカップリングし、最後に、塩化亜鉛を用いて2−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル保護基を除去することによって行った。HPLC精製により11mg（4ステップにわたり理論値の26％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（ESIpos）：m／z＝1061（M＋H）＋．
中間体F206
トリフルオロ酢酸／1−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］ピペリジン−4−イルN−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−L−アラニネート（1：1）
中間体F205と同様に合成を行った。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（ESIpos）：m／z＝975（M＋H）＋．
中間体F207
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−N2−｛N−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］−L−バリル−L−アラニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を中間体F155と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（ESIpos）：m／z＝1020（M＋H）＋．
中間体F209
R−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
L−システイン93．9mg（0．78mmol）を重炭酸ナトリウム93．0mg（1．11mmol）および水0．9mlの溶液に懸濁した。イソプロパノール6．0mlに溶解した2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C70）70．0mg（0．11mmol）および1，8−ジアザビシクロ［5．4．0］ウンデカ−7−エン202．3mg（1．33mmol）を添加した。反応混合物を50℃で90分間撹拌した。水（0．1％TFA）を添加し、反応物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水；0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物R−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）53．9mg（理論値の59％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．24分；MS（ESIpos）：m／z＝717（M＋H）＋．
R−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）86．0mg（0．1mmol）および3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド58．5mg（0．11mmol）をDMF4．0mlに溶解し、4−メチルモルホリン20．9mg（0．21mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。HOAc15．5mg（0．26mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水；0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物R−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−システイン68．6mg（理論値の59％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝2．88分；MS（ESIpos）：m／z＝1115（M＋H）＋．
R−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−システイン46．4mg（0．04mmol）をトリフルオロエタノール2．0mlに溶解し、塩化亜鉛17．0mg（0．13mmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩撹拌した。塩化亜鉛さらに8．5mg（0．07mmol）を添加し、混合物を50℃で一晩攪拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸36．5mg（0．13mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物19．4mg（理論値の43％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．94分；MS（ESIpos）：m／z＝971（M＋H）＋．
中間体F210
S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−D−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物をD−システインを用いて中間体F209の合成と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝971（M＋H）＋．
中間体F211
トリフルオロ酢酸／3−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］プロパンアミド（1：1）
2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C70）30．0mg（0．05mmol）を最初に3−スルファニルプロパン酸5．5mg（0．05mmol）と一緒に1滴の水を含むメタノール0．5mlに装入した。次いで、炭酸カリウム23．0mg（0．17mmol）を添加し、反応混合物を50℃で4時間攪拌した。酢酸エチルを添加し、有機相を水で1回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。これにより、化合物11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸30．3mg（理論値の86％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．39分；MS（ESIpos）：m／z＝702（M＋H）＋．
11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸30．0mg（0．04mol）および1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン塩酸塩（1：1）9．8mg（0．06mmol）を最初にアセトニトリル2．0mlに装入し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン44．2mg（0．34mmol）を添加した。T3P（酢酸エチル中50％）35．4mg（0．06mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。水を添加し、精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛［（3−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−3−オキソプロピル）スルファニル］アセチル｝アミノ）プロピル］カルバメート22．0mg（理論値の63％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．41分；MS（ESIpos）：m／z＝824（M＋H）＋．
2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛［（3−｛［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］アミノ｝−3−オキソプロピル）スルファニル］アセチル｝アミノ）プロピル］カルバメート22．0mg（0．03mol）をトリフルオロエタノール1．0mlに溶解し、塩化亜鉛9．1mg（0．07mmol）を添加した。反応混合物を50℃で5時間撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸19．5mg（0．07mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物15．0mg（理論値の71％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝680（M＋H）＋．
中間体F212
トリフルオロ酢酸／N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−10−オキソ−3，6−ジオキサ−13−チア−9−アザペンタデカン−15−アミド（1：1）
11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸（中間体C69）28．8mg（0．04mmol）を最初にトリフルオロ酢酸／1−｛2−［2−（2−アミノエトキシ）エトキシ］エチル｝−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）（中間体L59）18．3mg（0．05mmol）と一緒にアセトニトリル1．9mlに装入した。次いで、N，N−ジイソプロピルエチルアミン42．4mg（0．33mmol）を添加し、T3P（酢酸エチル中50％）33．9mg（0．05mmol）を滴加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル［16−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−10，15−ジオキソ−3，6−ジオキサ−13−チア−9，16−ジアザノナデカン−19−イル］カルバメート10．7mg（理論値の26％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．44分；MS（ESIpos）：m／z＝812（M＋H）＋．
2−（トリメチルシリル）エチル［16−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−10，15−ジオキソ−3，6−ジオキサ−13−チア−9，16−ジアザノナデカン−19−イル］カルバメート10．7mg（0．01mol）をトリフルオロエタノール0．8mlに溶解し、塩化亜鉛8．0mg（0．06mmol）を添加した。反応混合物を50℃で5時間撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸17．1mg（0．06mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．03分；MS（ESIpos）：m／z＝768（M＋H）＋．
中間体F213
トリフルオロ酢酸／3−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）−N−（2−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝エチル）プロパンアミド（1：1）
11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸（中間体C69）27．5mg（0．04mmol）を最初にトリフルオロ酢酸／N−（2−アミノエチル）−2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセトアミド（1：1）（中間体L1）15．9mg（0．05mmol）と一緒にアセトニトリル1．8mlに装入した。次いで、N，N−ジイソプロピルエチルアミン32．4mg（0．31mmol）を添加し、T3P（酢酸エチル中50％）32．4mg（0．05mmol）を滴加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル［13−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−2，7，12−トリオキソ−10−チア−3，6，13−トリアザヘキサデカン−16−イル］カルバメート11．9mg（理論値の35％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．39分；MS（ESIpos）：m／z＝881（M＋H）＋．
2−（トリメチルシリル）エチル［13−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−1−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−2，7，12−トリオキソ−10−チア−3，6，13−トリアザヘキサデカン−16−イル］カルバメート11．9mg（0．01mol）をトリフルオロエタノール1．0mlに溶解し、塩化亜鉛5．5mg（0．04mmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸11．8mg（0．04mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物7．4mg（理論値の60％）が得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝2．75分；MS（ESIpos）：m／z＝737（M＋H）＋．
中間体F214
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−α−グルタミル−S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
（2S）−5−（ベンジルオキシ）−2−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−5−オキソペンタン酸111．7mg（0．30mmol）を最初にDMF3．0mlに装入し、HOBt46．1（0．30mmol）、TBTU96．6mg（0．30mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン38．9mg（0．30mmol）を添加した。反応混合物を室温で10分間撹拌した。次いで、N，N−ジイソプロピルエチルアミン116．3mg（0．9mmol）およびDMF3．0mlに溶解したS−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）（中間体C71）250．0mg（0．30mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物（16R）−11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−16−｛［（2S）−5−（ベンジルオキシ）−2−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−5−オキソペンタノイル］アミノ｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸257．0mg（理論値の80％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．55分；MS（ESIpos）：m／z＝1071（M＋H）＋．
アルゴン下で、酢酸パラジウム（II）24．6mg（0．11mmol）を最初にジクロロメタン5．0mlに装入し、トリエチルアミン33．2mg（0．33mmol）およびトリエチルシラン254．3mg（2．19mmol）を添加した。反応混合物を室温で5分間攪拌し、ジクロロメタン5．0mlに溶解した（16R）−11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−16−｛［（2S）−5−（ベンジルオキシ）−2−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−5−オキソペンタノイル］アミノ｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸234．1mg（0．22mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を厚紙フィルタを通して濾過し、濾過ケークをジクロロメタンで洗浄した。溶媒を加熱することなく減圧下で蒸発させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物L−α−グルタミル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）177．5mg（理論値の85％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．07分；MS（ESIpos）：m／z＝846（M＋H）＋．
L−α−グルタミル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）20．0mg（20．83μmol）を最初に3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド11．8mg（22．91μmol）と一緒にDMF1．5mlに装入し、4−メチルモルホリン6．3mg（62．49μmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、酢酸4．4mg（0．07mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−α−グルタミル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン19．1mg（理論値の74％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．24分；MS（ESIpos）：m／z＝1244（M＋H）＋．
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−α−グルタミル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン17．5mg（14．06μmol）をトリフルオロエタノール1．5mlに溶解し、塩化亜鉛11．5mg（84．37μmol）を添加した。反応混合物を50℃で4時間撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸24．7mg（0．08mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物10．8mg（理論値の63％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝1100（M＋H）＋．
中間体F215
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛3−［（｛［（2R）−2−アセトアミド−2−カルボキシエチル］スルファニル｝アセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド
N−アセチル−S−［2−（［3−（L−アラニルアミノ）プロピル］｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−オキソエチル］−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）（実施例229）14．9mg（0．02mmol）および2，5−ジオキソピロリジン−1−イル−N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリネート7．1mg（0．02mmol）を最初にDMF1．0mlに装入し、4−メチルモルホリン5．7mg（0．06mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、酢酸4．5mg（0．08mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N−｛3−［（｛［（2R）−2−アセトアミド−2−カルボキシエチル］スルファニル｝アセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド13．3mg（理論値の78％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．24分；MS（ESIpos）：m／z＝919（M＋H）＋．
N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N−｛3−［（｛［（2R）−2−アセトアミド−2−カルボキシエチル］スルファニル｝アセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド11．1mg（0．01mmol）をエタノール5．0mlに溶解し、パラジウム活性炭（10％）1．0mgを添加し、混合物を室温および標準圧力で一晩水素化した。反応混合物をCeliteを通して濾過し、濾過ケークをエタノール／THF／水混合物で洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を凍結乾燥した。これにより、化合物L−バリル−N−｛3−［（｛［（2R）−2−アセトアミド−2−カルボキシエチル］スルファニル｝アセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド／トリフルオロ酢酸（1：1）7．5mg（理論値の69％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（ESIpos）：m／z＝785（M＋H）＋．
L−バリル−N−｛3−［（｛［（2R）−2−アセトアミド−2−カルボキシエチル］スルファニル｝アセチル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝−L−アラニンアミド／トリフルオロ酢酸（1：1）7．3mg（8．12μmol）を最初に3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド4．6mg（8．93μmol）と一緒にDMF0．5mlに装入し、4−メチルモルホリン2．5mg（24．36μmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、酢酸4．4mg（0．03mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物4．9mg（理論値の50％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．07分；MS（ESIpos）：m／z＝1183（M＋H）＋．
中間体F216
S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−システイニル−β−アラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）
アルゴン下で、N，N’−ビス［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−システイン30．2mg（0．06mmol）を最初に水2．0mlおよびイソプロパノール2．0mlに装入し、TCEP56．7mg（0．20mmol）を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌した。次いで、イソプロパノール2．0mlに溶解した2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C70）50．0mg（0．08mmol）および1，8−ジアザビシクロ［5．4．0］ウンデカ−7−エン122．2mg（0．48mmol）を添加し、反応混合物を50℃で7時間攪拌した。次いで、1，8−ジアザビシクロ［5．4．0］ウンデカ−7−エンさらに122．2mg（0．48mmol）を添加し、反応混合物を50℃で1時間攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相を水および飽和重炭酸ナトリウム溶液で抽出し、飽和NaCl溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−システイン43．1mg（理論値の64％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．46分；MS（ESIpos）：m／z＝851（M＋H）＋．
4−メチルベンゼンスルホン酸／ベンジルβ−アラニネート（1：1）16．5mg（0．05mmol）を最初にN，N−ジイソプロピルエチルアミン14．0mg（0．11mmol）と一緒にアセトニトリル1．5mlに装入した。反応混合物を室温で3分間攪拌し、次いで、アセトニトリル1．5mlに溶解したS−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−システイン30．8mg（0．04mmol）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン23．4mg（0．18mmol）およびT3P（酢酸エチル中50％）29．9mg（0．05mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。水を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。得られた化合物は、ベンジルS−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−システイニル−β−アラニネートであった。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．59分；MS（ESIpos）：m／z＝1012（M＋H）＋．
ベンジルS−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−システイニル−β−アラニネート43．8mg（43．3μmol）をエタノール8．0mlに溶解し、パラジウム活性炭（10％）4．4mgを添加し、混合物を室温および標準圧力で一晩水素化した。反応混合物を厚紙フィルタを通して濾過し、濾過ケークをエタノールで洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させた。さらに2回、残渣を上記のように処理した。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイニル−β−アラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）4．9mg（理論値の50％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．08分；MS（ESIpos）：m／z＝788（M＋H）＋．
S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイニル−β−アラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）14．5mg（16．1μmol）を最初に3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド9．1mg（17．7μmol）と一緒にDMF1．0mlに装入し、4−メチルモルホリン4．9mg（48．2μmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、酢酸3．4mg（0．06mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイニル−β−アラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）4．9mg（理論値の50％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．28分；MS（ESIpos）：m／z＝1186（M＋H）＋．
S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−システイニル−β−アラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）14．1mg（11．9μmol）をトリフルオロエタノール1．5mlに溶解し、塩化亜鉛9．7mg（71．3μmol）を添加した。反応混合物を50℃で3時間撹拌した。塩化亜鉛さらに9．7mg（71．3μmol）を添加し、混合物を50℃で3時間攪拌した。塩化亜鉛さらに9．7mg（71．3μmol）を添加し、混合物を70℃で4時間攪拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸20．8mg（0．07mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を凍結乾燥した。これにより、標記化合物6．2mg（理論値の44％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝1042（M＋H）＋．
中間体F217
S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
アルゴン下で、（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）酢酸7．5mg（0．05mmol）を最初にDMF1．5mlに装入し、HOBt7．5mg（0．05mmol）、TBTU15．5mg（0．05mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン6．2mg（0．05mmol）を添加した。反応混合物を室温で10分間撹拌した。次いで、DMF1．5mlに溶解したS−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）（中間体C71）40．0mg（0．05mmol）、およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン18．7mg（0．14mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］−L−システイン11．2mg（理論値の25％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．37分；MS（ESIpos）：m／z＝854（M＋H）＋．
S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］−L−システイン10．9mg（12．8μmol）をトリフルオロエタノール2．0mlに溶解し、塩化亜鉛10．4mg（76．6μmol）を添加した。反応混合物を50℃で4時間撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸22．4mg（0．08mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を凍結乾燥した。これにより、標記化合物7．5mg（理論値の65％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝710（M＋H）＋．
中間体F218
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−γ−グルタミル−S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
アルゴン下で、（4S）−5−（ベンジルオキシ）−4−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−5−オキソペンタン酸22．9mg（0．06mmol）を最初にDMF2．0mlに装入し、HOBt9．4mg（0．05mmol）、TBTU19．8mg（0．06mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン8．0mg（0．06mmol）を添加した。反応混合物を室温で10分間撹拌した。次いで、DMF1．0mlに溶解したS−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン（中間体C71）51．2mg（0．06mmol）、およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン23．9mg（0．19mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物（16R）−11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−16−｛［（4S）−5−（ベンジルオキシ）−4−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−5−オキソペンタノイル］アミノ｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸11．2mg（理論値の25％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．52分；MS（ESIpos）：m／z＝1070（M＋H）＋．
アルゴン下で、酢酸パラジウム（II）3．9mg（0．02mmol）を最初にジクロロメタン1．0mlに装入し、トリエチルアミン5．3mg（0．05mmol）およびトリエチルシラン254．3mg（2．19mmol）を添加した。反応混合物を室温で5分間攪拌し、ジクロロメタン1．0mlに溶解した（16R）−11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−16−｛［（4S）−5−（ベンジルオキシ）−4−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−5−オキソペンタノイル］アミノ｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸18．6mg（0．02mmol）を添加した。溶媒を加熱することなく減圧下で蒸発させた。残渣をアセトニトリルに溶解し、シリンジフィルタを通して濾過し、分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物L−γ−グルタミル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）11．0mg（理論値の66％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．14分；MS（ESIpos）：m／z＝846（M＋H）＋．
L−γ−グルタミル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）15．0mg（15．6μmol）を最初に3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド8．8mg（17．2μmol）と一緒にDMF1．0mlに装入し、4−メチルモルホリン4．7mg（46．9μmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、酢酸3．3mg（0．06mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−γ−グルタミル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン14．2mg（理論値の70％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．24分；MS（ESIpos）：m／z＝1244（M＋H）＋．
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−γ−グルタミル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン13．8mg（11．1μmol）をトリフルオロエタノール2．0mlに溶解し、塩化亜鉛9．1mg（66．5μmol）を添加した。反応混合物を50℃で4時間撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸19．4mg（0．07mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物6．9mg（理論値の50％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝1100（M＋H）＋．
中間体F235
トリフルオロ酢酸／N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝カルバモイル］フェニル｝−L−アラニンアミド（1：1）
2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C11の合成参照）120．0mg（0．22mmol）および4−ニトロベンゾイルクロリド52．1mg（0．28mmol）をジクロロメタン8．0mlに溶解し、トリエチルアミン28．4mg（0．28mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（4−ニトロベンゾイル）アミノ］プロピル｝カルバメート97．7mg（理論値の64％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．54分；MS（ESIpos）：m／z＝705（M＋H）＋．
2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（4−ニトロベンゾイル）アミノ］プロピル｝カルバメート97．0mg（0．14mmol）をエタノール5．0mlに溶解し、パラジウム活性炭（10％）9．7mgを添加し、混合物を標準圧力で5時間水素化した。反応混合物を厚紙フィルタを通して濾過し、濾過ケークをエタノールで洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［（4−アミノベンゾイル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝カルバメート87．4mg（理論値の88％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．47分；MS（ESIpos）：m／z＝675（M＋H）＋．
2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［（4−アミノベンゾイル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝カルバメート59．3mg（0．09mmol）およびN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−アラニン25．5mg（0．11mmol）を最初にN，N−ジイソプロピルエチルアミン68．1mg（0．53mmol）と一緒にアセトニトリル5．0mlに装入した。T3P（酢酸エチル中50％）72．7mg（0．11mmol）をゆっくり添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物ベンジル［（2S）−1−｛［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロピル］カルバモイル）フェニル］アミノ｝−1−オキソプロパン−2−イル］カルバメート52．2mg（理論値の68％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．48分；MS（ESIpos）：m／z＝880（M＋H）＋．
ベンジル［（2S）−1−｛［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロピル］カルバモイル）フェニル］アミノ｝−1−オキソプロパン−2−イル］カルバメート23．9mg（0．03mmol）を酢酸エチル3．0mlに溶解し、パラジウム活性炭（10％）2．4mgを添加し、混合物を標準圧力で2時間水素化した。反応混合物を濾紙を通して濾過し、濾過ケークを酢酸エチルで洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をさらに精製することなく合成の次のステップに使用した。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル［3−（［4−（L−アラニルアミノ）ベンゾイル］｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート20．1mg（理論値の90％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．13分；MS（ESIpos）：m／z＝746（M＋H）＋．
2−（トリメチルシリル）エチル［3−（［4−（L−アラニルアミノ）ベンゾイル］｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート20．0mg（0．03mmol）を最初に2，5−ジオキソピロリジン−1−イルN−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリネート14．9mg（0．04mmol）と一緒にDMF2．0mlに装入し、4−メチルモルホリン5．4mg（0．05mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N−［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロピル］カルバモイル）フェニル］−L−アラニンアミドが得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．49分；MS（ESIpos）：m／z＝979（M＋H）＋．
N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−バリル−N−［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロピル］カルバモイル）フェニル］−L−アラニンアミド17．0mg（17．4μmol）を酢酸エチル2．5mlに溶解し、パラジウム活性炭（10％）1．7mgを添加し、混合物を標準圧力で一晩水素化した。反応混合物を濾紙を通して濾過し、濾過ケークを酢酸エチルで洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物L−バリル−N−［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロピル］カルバモイル）フェニル］−L−アラニンアミド15．3mg（理論値の60％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．15分；MS（ESIpos）：m／z＝845（M＋H）＋．
L−バリル−N−［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロピル］カルバモイル）フェニル］−L−アラニンアミド15．3mg（0．01mmol）を最初に3−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−N−｛15−［（2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）オキシ］−15−オキソ−3，6，9，12−テトラオキサペンタデカ−1−イル｝プロパンアミド7．9mg（0．02mmol）と一緒にDMF2．4mlに装入し、4−メチルモルホリン1．9mg（0．02mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、酢酸1．4mg（0．02mmol）を添加した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロピル］カルバモイル）フェニル］−L−アラニンアミド11．7mg（理論値の70％）が得られた。
N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−γ−グルタミル−S−（11−｛（1R）−1−［1−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−［4−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロピル］カルバモイル）フェニル］−L−アラニンアミド11．7mg（0．01mmol）をトリフルオロエタノール2．0mlに溶解し、塩化亜鉛3．9mg（0．03mmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸8．3mg（0．03mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物5．4mg（理論値の47％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．94分；MS（ESIpos）：m／z＝1100（M＋H）＋．
中間体F236
（2R）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−4−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝ブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物の合成を、（2R）−4−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−2−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸／N−シクロヘキシルシクロヘキサンアミド（1：1）から中間体F192と同様に行った。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．1分；MS（ESIpos）：m／z＝751（M＋H）＋．
中間体F238
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−1−アミノ−3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロパン−2−イル｝−N’−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］スクシンアミド（1：1）
中間体C72 18mg（0．025mmol）をDMF6mlに溶解し、HATU11．3mg（0．03mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン22μlの存在下でトリフルオロ酢酸／1−（2−アミノエチル）−1H−ピロール−2，5−ジオン（1：1）7．5mg（0．03mmol）とカップリングした。室温で1時間攪拌した後、反応物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮し、残渣をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。これにより、中間体15mg（理論値の67％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．71分；MS（EIpos）：m／z＝873［M＋Na］＋．
次いで、標記化合物を、この中間体から、中間体F119について記載されるようにトリフルオロエタノール4ml中で塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物8．5mg（理論値の63％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（ESIpos）：m／z＝707（M＋Na）＋．
中間体F241
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（2−｛［N−（ブロモアセチル）グリシル］アミノ｝エチル）ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C66から同様に、商業的に入手可能な1−（2−ブロモアセチル）ピロリジン−2，5−ジオンとカップリングし、その後、塩化亜鉛を用いてデブロッキングすることによって調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（EIpos）：m／z＝733 and 735［M＋H］＋．
中間体F242
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−（3−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝プロピル）ブタンアミド（1：1）
標記化合物の合成を中間体F104と同様に行った：
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（ESIpos）：m／z＝707（M＋H）＋．
中間体F243
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［2−（2−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝エトキシ）エチル］ブタンアミド（1：1）
標記化合物の合成を中間体F242と同様に行った：
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（ESIpos）：m／z＝737（M＋H）＋．
中間体F244
N−｛2−［（S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−L−システイニル）アミノ］エチル｝−6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサンアミド
S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−N−［3−（トリメチルシリル）プロパノイル］−L−システイン（中間体C73）100mg（約0．101mmol）を最初にジメチルホルムアミド88mlに装入し、N−（2−アミノエチル）−6−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ヘキサンアミド（L73）107mg（約0．15mmol）と共に、HATU46mg（0．12mmol）および88μl（0．50mmol）を添加した。反応混合物を室温で15分間撹拌した。水／ジクロロメタンを混合物に添加し、次いで、有機相を水および食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させた。残渣をさらに精製することなくさらに使用した。これにより、標記化合物92mg（59％、純度72％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．59分；MS（ESIpos）：m／z＝1096（M＋H）＋．
アルゴン下で、塩化亜鉛40mg（0．30mmol）を、2−（トリメチルシリル）エチル［（9R）−4−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−20−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−5，10，15−トリオキソ−9−｛［3−（トリメチルシリル）プロパノイル］アミノ｝−7−チア−4，11，14−トリアザイコサ−1−イル］カルバメート91mg（約0．06mmol）のトリフルオロエタノール1．45ml中溶液に添加した。反応混合物を50℃で2時間撹拌した。次いで、塩化亜鉛30mg（0．22mmol）を添加し、混合物を室温でさらに1時間攪拌した。EDTA52mg（0．18mmol）を添加し、室温で10分間攪拌した後、混合物を水／アセトニトリルでわずかに希釈し、分取HPLC（移動相：ACN／水＋0．1％TFA、勾配）によって精製した。これにより、標記化合物17mg（31％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．80分；MS（ESIpos）：m／z＝808（M＋H）＋．
中間体F245
トリフルオロ酢酸／N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブチル｝−N’−（2−｛［（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）アセチル］アミノ｝エチル）スクシンアミド（1：1）
標記化合物を、中間体F119について記載されるように、HATU15mg（0．04mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン9μlの存在下で中間体C65 10mg（0．0135mmol）をDMF8ml中中間体L1 8mg（0．027mmol）とカップリングし、その後、トリフルオロエタノール中塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。分取HPLCによる精製により、標記化合物8．8mg（2ステップにわたり理論値の58％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（ESIpos）：m／z＝778（M＋H）＋．
中間体F247
トリフルオロ酢酸／4−［（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−2−ブロモ−4−オキソ酪酸メチル（1：1）
中間体C66 14mg（0．018mmol）をDCM14mlに溶解し、2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート（BEP）10．1mg（0．037mmol）と共に、一度に少量ずつ、ピリジン合計250μlを添加し、pHを5〜6の間に保った。次いで、酢酸を用いてpHを4に調整し、反応物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、凍結乾燥し、乾燥させると、保護された中間体4mg（理論値の21％）が得られ、次いで、これを塩化亜鉛を用いてアミノ官能基で脱保護した。HPLC精製および凍結乾燥により、標記化合物3mg（理論値の72％）が無色泡として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝805 and 807（M＋H）＋．
中間体F248
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−｛2−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エトキシ］エチル｝ブタンアミド（1：1）
標記化合物を、HATUの存在下で中間体C58 10mg（0．015mmol）を中間体L12 5mg（0．017mmol）とカップリングし、その後、塩化亜鉛を用いて脱保護することによって調製した。これにより、標記化合物6．5mg（2ステップにわたり理論値の52％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝680（M＋H）＋．
中間体F254
トリフルオロ酢酸／（3S）−4−［（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−3−ブロモ−4−オキソ酪酸メチル（1：1）
標記化合物を、中間体C66 15mg（0．02mmol）を、（2S）−2−アミノ−4−メトキシ−4−オキソブタン酸塩酸塩（1：1）から（J．Org．Chem．200、65、517〜522）に記載されているように合成した（2S）−2−ブロモ−4−メトキシ−4−オキソブタン酸21mg（0．099mmol）とカップリングすることによって、中間体247と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝805 and 807（M＋H）＋．
B：抗体／活性化合物複合体（ADC）の調製
B−1．抗TWEAKR抗体を作製するための一般的方法
例えば、組換えヒトTWEAKR配列番号138およびマウスTWEAKR配列番号137についてファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、抗TWEAKR抗体を作製した。こうして得られた抗体を、ヒトIgG1フォーマットに再フォーマットし、ここに記載される実施例に使用した。さらに、TWEAKRに結合する抗体は、当業者に知られている（例えば、国際公開第2009／020933号パンフレットまたは国際公開第2009140177号パンフレット参照）。
配列番号138（ポリペプチド）：
EQAPGTAPCSRGSSWSADLDKCMDCASCRARPHSDFCLGCAAAPPAPFRLLWPRSDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号137（ポリペプチド）：
EQAPGTSPCSSGSSWSADLDKCMDCASCPARPHSDFCLGCAAAPPAHFRLLWPRSDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
B−2．哺乳動物細胞で抗TWEAKR抗体を発現するための一般的方法
抗体、例えば、TPP−2090を、Tomら著、Micheal R．DysonおよびYves Durocherによって編集されたMethods Express：Expression Systemsの第12節、Scion Publishing Ltd、2007に記載されるように一過的哺乳動物細胞培養物で作製した（AK実施例1参照）。
B−3．細胞上清から抗体を精製するための一般的方法
抗体、例えば、TPP−2090を細胞培養物上清から得た。細胞上清を細胞の遠心分離によって清澄化した。次いで、細胞上清をMabSelect Sure（GE Healthcare）クロマトグラフィーカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。このために、カラムをDPBS pH7．4（Sigma／Aldrich）で平衡化し、細胞上清をアプライし、カラムを約10カラム体積のDPBS pH7．4＋500mM塩化ナトリウムで洗浄した。抗体を50mM酢酸ナトリウムpH3．5＋500mM塩化ナトリウムに溶出し、次いで、DPBS pH7．4中Superdex 200カラム（GE Healthcare）でのゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製した。
商業的に入手可能な抗体セツキシマブ（商品名Erbitux）を、標準的なクロマトグラフィー法（プロテインA、分取SEC）によって市販品から精製した。
商業的に入手可能な抗体トラスツズマブ（商品名Herceptin）を、標準的なクロマトグラフィー法（プロテインA、分取SEC）によって市販品から精製した。
商業的に入手可能な製品（商品名CIMAher）から、抗体ニモツズマブを標準的なクロマトグラフィー法（プロテインA、分取SEC）によって市販品から精製した。
商業的に入手可能な製品（商品名Vectibix）から、抗体パニツムマブを標準的なクロマトグラフィー法（プロテインA、分取SEC）によって市販品から精製した。
B−4．システイン側鎖とのカップリングのための一般的方法
以下の抗体をカップリング反応に使用した：
セツキシマブ（抗EGFR AK）
抗TWEAKR AK1（TPP−2090）
トラスツズマブ（抗Her2 AK）
ニモツズマブ（抗EGFR AK）
パニツムマブ（抗EGFR AK）
PBS緩衝液に溶解した2〜5当量の間のトリス（2−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）を、1mg／ml〜20mg／mlの間の濃度範囲、好ましくは約10mg／ml〜15mg／mlの範囲の適当な抗体のPBS緩衝液中溶液に添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。この目的のために、使用するそれぞれの抗体の溶液を実施例で明言される濃度で使用することができる、またはこれを好ましい濃度範囲にもっていくために場合によりPBS緩衝液で明言される出発濃度の約半分に希釈してもよい。その後、意図した充填に応じて、2〜12当量、好ましくは約5〜10当量のカップリングするためのマレインイミド前駆体化合物またはハロゲン化物前駆体化合物をDMSO中溶液として添加することができる。ここでは、DMSOの量が全体積の10％を超えるべきでない。反応物を、マレインイミド前駆体の場合は室温で60〜240分間およびハロゲン化物前駆体の場合は室温で8〜24時間の間攪拌し、次いで、PBS平衡化PD 10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液で溶出した。一般的に、特に指示しない限り、PBS緩衝液中の当の抗体5mgを還元およびその後のカップリングに使用した。よって各場合でPD10カラムでの精製により、それぞれのADCの3．5ml PBS緩衝液中溶液が得られた。次いで、試料を超遠心分離によって濃縮し、場合によりPBS緩衝液で再希釈した。必要に応じて、低分子量成分をよりよく除去するために、限界濾過による濃縮をPBS緩衝液での再希釈後に繰り返した。生物学的試験のために、必要に応じて、最終的なADC試料の濃度を場合により希釈によって0．5〜15mg／mlの範囲に調整した。ADC溶液の実施例で明言されるそれぞれのタンパク質濃度を測定した。さらに、B−7で記載される方法を用いて、抗体負荷（薬物／mAb比）を測定した。
特に指示しない限り、実施例に示される免疫複合体をこの方法によって調製した。リンカーに応じて、実施例に示されるADCは多かれ少なかれ抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態でも存在し得る。
特に、抗体のチオール基にリンカー構造
を通して結合しているKSP−I−ADCを場合により、開鎖スクシンアミドを介して結合しているADCを介して、スキーム26によりカップリングおよびpH8で約20時間攪拌した後に再緩衝化することによって標的化した様式で調製することもできる。
＃1は抗体との硫黄架橋を表し、＃2は修飾KSP阻害剤との結合点を表す。
リンカーが加水分解された開鎖スクシンアミドを通して抗体に結合しているこのようなADCを、場合により以下の例示的手順によって標的化した様式で調製することもできる：
アルゴン下で、TCEP0．344mgのPBS緩衝液100μl中溶液をPBS5ml中当の抗体60mg（c約12mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO600μlに溶解したマレインイミド前駆体化合物0．003mmolを添加した。室温でさらに1．5〜2時間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1075μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をPBS緩衝液pH8で希釈して総体積14mlとした。溶液をアルゴン下室温で一晩攪拌した。次いで、必要に応じて、溶液をpH7．2に再緩衝化した。ADC溶液を超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、次いで、場合により再度濃縮して約10mg／mlの濃度にした。
実施例での抗体との他の潜在的に加水分解感受性のチアニルスクシンイミド架橋は、以下のリンカー部分構造を含む（＃1は抗体とのチオエーテル結合を表し、＃2は修飾KSP阻害剤との結合点を表す）：
これらのリンカー部分構造は抗体との連結単位を表し、（リンカー組成に加えて）腫瘍細胞中で形成される代謝産物の構造およびプロファイルに対する有意な効果を有する。
示される構造式中、AK1A、AK1B、AK1E、AK1I、AK1H、AK1Kは以下の意味を有する：
AK1A＝セツキシマブ（部分的に還元）−S§1
AK1B＝抗TWEAKR AK−1（部分的に還元）−S§1
AK1E＝トラスツズマブ（部分的に還元）−S§1
AK1I＝ニモツズマブ（部分的に還元）−S§1
AK1H＝パニツムマブ（部分的に還元）−S§1
（§1はスクシンイミド基または加水分解された開鎖スクシンアミドもしくはそこから得られたアルキレン基との結合を表し、Sは部分的に還元された抗体のシステイン残基の硫黄原子を表す）。
B−5．リジン側鎖とのカップリングのための一般的方法
以下の抗体をカップリング反応に使用した：
セツキシマブ（抗EGFR AK）
抗TWEAKR AK1（TPP−2090）
トラスツズマブ（抗Her2 AK）
ニモツズマブ（抗EGFR AK）
パニツムマブ（抗EGFR AK）
意図した充填に応じて、2〜8当量のカップリングするための前駆体化合物を、DMSO中溶液として、1mg／ml〜20mg／mlの間の濃度範囲、好ましくは約10mg／mlの当の抗体のPBS中溶液に添加することができる。室温で30分〜6時間攪拌した後、同量のDMSO中前駆体化合物を再度添加した。ここでは、DMSOの量が全体積の10％を超えるべきでない。室温でさらに30分〜6時間攪拌した後、反応物をPBSで平衡化したPD 10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液で溶出した。一般的に、特に指示しない限り、PBS緩衝液中の当の抗体5mgを還元およびその後のカップリングに使用した。よって各場合でPD10カラムでの精製により、それぞれのADCの3．5ml PBS緩衝液中溶液が得られた。次いで、試料を超遠心分離によって濃縮し、場合によりPBS緩衝液で再希釈した。必要に応じて、低分子量成分をよりよく除去するために、限界濾過による濃縮をPBS緩衝液での再希釈後に繰り返した。生物学的試験のために、必要に応じて、最終的なADC試料の濃度を場合により希釈によって0．5〜15mg／mlの範囲に調整した。
ADC溶液の実施例で明言されるそれぞれのタンパク質濃度を測定した。さらに、B−7で記載される方法を用いて、抗体負荷（薬物／mAb比）を測定した。
示される構造式中、AK2A、AK2B、AK2G、AK2E、AK2I、AK2H、AK2Kは以下の意味を有する：
AK2A＝セツキシマブ（抗EGFR AK）−NH§2
AK2B＝抗TWEAKR AK−1−NH§2
AK2E＝トラスツズマブ−NH§2
AK2I＝ニモツズマブ−NH§2
AK2H＝パニツムマブ−NH§2
（§2はカルボニル基との結合をあらわし、NHは抗体のリジン残基の側鎖アミノ基を表す）。
B−6a．閉じたスクシンイミド−システイン付加物を調製するための一般的方法：
代表的な実施形態では、上記マレインイミド前駆体化合物10μmolをDMF3〜5mlに溶解し、L−システイン2．1mg（20μmol）を添加した。反応混合物を室温で2時間〜24時間攪拌し、次いで、減圧下で乾燥させ、次いで、分取HPLCによって精製した。
B−6aa．異性体の開いたスクシンアミド−システイン付加物を調製するための一般的方法：
代表的な実施形態では、上記マレインイミド前駆体化合物68μmolをDMF15mlに溶解し、N−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システイン36mg（136μmol）を添加した。反応混合物を室温で約20時間攪拌し、次いで、減圧下で乾燥させ、次いで、分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させ、次いで、残渣をTHF／水1：1 15mlに溶解した。2M水酸化リチウム水溶液131μlを添加し、反応物を室温で1時間攪拌した。次いで、反応物を1M塩酸で中和し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、位置異性体の保護された中間体理論値の約50％が無色泡として得られた。
最後のステップで、これらの位置異性体の加水分解生成物0．023mmolを2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛12．5mg（0．092mmol）を添加し、反応物を50℃で4時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸27mg（0．092mmol）を添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、加水分解した開いたスルファニルスクシンアミドが位置異性体混合物として得られた。
B−6b．リジン付加物を調製するための一般的方法：
代表的な実施形態では、上記活性化エステル前駆体化合物10μmolをDMF3〜5mlに溶解し、α−アミノ保護L−リジンをN，N−ジイソプロピルエチルアミン30μmolの存在下で添加した。反応混合物を室温で2時間〜24時間攪拌し、次いで、減圧下で乾燥させ、次いで、分取HPLCによって精製した。次いで、保護基を既知の方法によって除去した。
本発明による複合体のさらなる精製および特徴付け
反応後、いくつかの例では、反応混合物を例えば、限界濾過によって濃縮し、次いで、脱塩し、例えば、Sephadex（登録商標）G−25カラムを用いて、クロマトグラフィーによって精製した。例えば、リン酸緩衝食塩水（PBS）を用いて溶出を行った。次いで、溶液を滅菌濾過し、凍結した。あるいは、複合体を凍結乾燥した。
B−7．抗体、担毒体負荷および開いたシステイン付加物の割合の測定
脱グリコシル化および／または変性後の分子量測定に加えて、タンパク質同定のために、変性、還元および誘導体化後に、見られるトリプシンペプチドを介したタンパク質の身元を確認するトリプシン消化を行った。
実施例に記載される複合体の得られたPBS緩衝溶液の担毒体負荷を以下の通り測定した：
リンカー連結ADCの担毒体負荷の測定を、個々の複合体種の分子量の質量分析によって行った。ここで、抗体複合体を最初にPNGaseFで脱グリコシル化し、試料を酸性化し、HPLC分離／脱塩後、ESI−MicroTofQ（Bruker Daltonik）を用いた質量分析によって分析した。TIC（全イオンクロマトグラム）のシグナル上の全スペクトルを合計し、異なる複合体種の分子量をMaxEntデコンボリューションに基づいて計算した。次いで、異なる種のシグナル積分後にDAR（＝薬物／抗体比）を計算した。
システイン連結複合体の担毒体負荷を、還元および変性したADCの逆相クロマトグラフィーによって測定した。グアニジニウム塩酸塩（GuHCl）（28．6mg）およびDL−ジチオトレイトール（DTT）の溶液（500mM、3μl）をADC溶液（1mg／ml、50μl）に添加した。混合物を55℃で1時間インキュベートし、HPLCによって分析した。
220nmでの検出によりAgilent 1260 HPLCシステムでHPLC分析を行った。Polymer Laboratories PLRP−Sポリマー逆相カラム（カタログ番号PL1912−3802）（2．1×150mm、8μm粒径、1000Å）を、以下の勾配により1ml／分の流量で使用した：0分、25％B；3分、25％B；28分、50％B。移動相Aは水中0．05％トリフルオロ酢酸（TFA）からなり、移動相Bはアセトニトリル中0．05％トリフルオロ酢酸からなっていた。
検出ピークを、非複合抗体の軽鎖（L0）および重鎖（H0）との保持時間比較によって割り当てた。もっぱら複合体試料で検出されたピークを、1個の担毒体を有する軽鎖（L1）と、1、2および3個の担毒体を有する重鎖（H1、H2、H3）に割り当てた。
担毒体による抗体の平均負荷を、全ピークの担毒体数荷重積分の和の2倍を全ピークの単独荷重積分結果の和で割ったものとして積分によって決定されるピーク面積から計算した。個々の場合で、いくつかのピークの共溶出のために、担毒体を正確に測定することができないことが考えられ得る。
軽鎖および重鎖をHPLCによって十分に分離することができない場合、システイン連結複合体の担毒体の測定を、軽鎖および重鎖で個々の複合体種の分子量の質量分析測定によって行った。
グアニジニウム塩酸塩（GuHCl）（28．6mg）およびDL−ジチオトレイトール（DTT）の溶液（500mM、3μl）をADC溶液（1mg／ml、50μl）に添加した。混合物を55℃で1時間インキュベートし、ESI−MicroTofQ（Bruker Daltonik）を用いてオンライン脱塩後に質量分析によって分析した。
DAR測定のために、TIC（全イオンクロマトグラム）のシグナル上の全スペクトルを合計し、軽鎖および重鎖で異なる複合体種の分子量をMaxEntデコンボリューションに基づいて計算した。担毒体による抗体の平均負荷を、全ピークの担毒体数荷重積分の和の2倍を全ピークの単独荷重積分結果の和で割ったものとして一定の分子量の積分によって決定した。
開いたシステイン付加物の割合を決定するために、全ての単一複合軽鎖および重鎖の閉じたシステイン付加物と開いたシステイン付加物（分子量δ18ダルトン）の分子量面積比を決定した。全ての変異体の平均値によって、開いたシステイン付加物の割合が得られた。
B−8．ADCの抗原結合の確認
結合剤が標的分子に結合する能力を、カップリングが行われた後に確認した。当業者であれば、この目的のために使用することができる多種多様な方法に精通しており；例えば、ELISA技術または表面プラズモン共鳴分析（BIAcore（商標）測定）を用いて複合体の親和性を確認することができる。複合体濃度は、例えば、タンパク質決定により、抗体複合体についての慣用的な方法を用いて当業者によって測定され得る（Doroninaら；Nature Biotechnol．2003；21：778〜784およびPolsonら、Blood 2007；1102：616〜623参照）。
実施例ADC
実施例1A
ここでは、PBS中セツキシマブ70mg（c＝5．1mg／ml）を中間体F1とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。
タンパク質濃度：10．8mg／ml
薬物／mAb比：2．6
挿入句
実施例1Aでは、n＝2．6の式の化合物および一定の抗体（セツキシマブ）を得た。
しかしながら、本発明は、この薬物／mAb比の正確にこの抗体を有するこの特定の複合体を提供するだけでなく、この式を有する他の結合剤複合体、すなわち、セツキシマブが異なる抗体またはその誘導体（システインなど）によって置き換えられており、n＝2．6がn＝1〜20、好ましくはn＝1〜10の範囲の任意の値によって置き換えられている複合体も提供する。
これは以下の実施例にも同様に当てはまる。
実施例2A
ここでは、PBS中セツキシマブ80mg（c＝5．1mg／ml）を中間体F2とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：11．0mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例2B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 50mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F2とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：11．7mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例2E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．4mg／ml）を中間体F2とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．77mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例3A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体F3とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．87mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例3B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝16．5mg／ml）を中間体F3とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．13mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例4A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体F4とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．11mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例4B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝16．5mg／ml）を中間体F4とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．69mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例5A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体F5とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．16mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例5B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝16．5mg／ml）を中間体F5とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．5mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例6A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体F6とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．24mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例6B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝16．5mg／ml）を中間体F6とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．88mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例7A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F7とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．46mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例7B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 40mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F7とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：11．27mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例8A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．7mg／ml）を中間体F8とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例8B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 40mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F8とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。
タンパク質濃度：11．54mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例8E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．4mg／ml）を中間体F8とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．97mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例8H
ここでは、PBS中パニツムマブ5．0mg（c＝10mg／ml）を中間体F8とのカップリングに使用した。TCEPを用いた還元の時間を4時間に増加し、ADCカップリングのための攪拌時間を20時間に増加した。次いで、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。
タンパク質濃度：1．79mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例9A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．6mg／ml）を中間体F9とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．05mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例9B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．2mg／ml）を中間体F9とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例10A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F10とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．04mg／ml
薬物／mAb比：1．8
実施例10B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．2mg／ml）を中間体F10とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例11A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F11とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．97mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例11B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．2mg／ml）を中間体F11とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．86mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例12A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F12とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例12B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 40mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F12とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：9．9mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例13A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F13とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．87mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例13B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．2mg／ml）を中間体F13とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例14A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．2mg／ml）を中間体F14とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．32mg／ml
薬物／mAb比：3．8
実施例14B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．2mg／ml）を中間体F14とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．23mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例14E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．4mg／ml）を中間体F14とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．21mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例15A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．2mg／ml）を中間体F15とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．39mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例15B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 32mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F15とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：11．82mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例15E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．4mg／ml）を中間体F15とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．57mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例16A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．2mg／ml）を中間体F16とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．15mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例16B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 30mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F16とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：9．54mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例16E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．4mg／ml）を中間体F16とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．26mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例17A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．6mg／ml）を中間体F17とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．02mg／ml
薬物／mAb比：未決定
実施例17B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．2mg／ml）を中間体F17とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．64mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例18A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．6mg／ml）を中間体F18とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．8mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例18B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．2mg／ml）を中間体F18とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．74mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例19A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F19とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．94mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例19B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．2mg／ml）を中間体F19とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．9mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例20A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F20とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．99mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例20B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F20とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．03mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例21A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F21とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．76mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例21B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F21とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．8mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例22A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．56mg／ml）を中間体F22とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．99mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例22B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F22とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．77mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例22E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．4mg／ml）を中間体F22とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．89mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例23A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．56mg／ml）を中間体F23とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．32mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例23B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F23とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例24A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．56mg／ml）を中間体F24とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例24B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F24とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例25A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．56mg／ml）を中間体F25とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．17mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例25B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F25とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．78mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例26A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．56mg／ml）を中間体F26とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．8mg／ml
薬物／mAb比：未決定
実施例26B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F26とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．02mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例27A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F27とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例27B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F27とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例28A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．59mg／ml）を中間体F28とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．13mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例28B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F28とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例29A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．59mg／ml）を中間体F29とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．49mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例29B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F29とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．82mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例30A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．59mg／ml）を中間体F30とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．04mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例30B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F30とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．85mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例31A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体F31とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．21mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例31B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝16．54mg／ml）を中間体F31とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．59mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例32A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．59mg／ml）を中間体F32とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例32B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10．1mg／ml）を中間体F32とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．78mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例33A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝8．95mg／ml）を中間体F33とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．78mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例33B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F33とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．46mg／ml
薬物／mAb比：3．9
実施例34A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝8．95mg／ml）を中間体F34とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．21mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例34B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F34とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．4mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例35A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F35とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：14．30mg／ml
薬物／mAb比：1．4
実施例35B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝16．54mg／ml）を中間体F35とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：0．93mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例35E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F35とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．61mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例36A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F36とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：13．86mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例36B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝16．54mg／ml）を中間体F36とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．08mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例36E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F36とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例37A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．08mg／ml）を中間体F37とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．52mg／ml
薬物／mAb比：1．5
実施例37B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝16．54mg／ml）を中間体F37とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例37E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F37とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．23mg／ml
薬物／mAb比：1．5
実施例38A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．08mg／ml）を中間体F38とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．45mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例38B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F38とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．54mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例38E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F38とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．90mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例39A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F39とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例39B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F39とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．40mg／ml
薬物／mAb比：1．4
実施例39E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F39とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．04mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例40A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F40とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．0mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例40B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F40とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．81mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例40E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F40とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例41A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．08mg／ml）を中間体F41とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．53mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例41B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F41とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．73mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例41E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F39とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．09mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例42A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F42とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．05mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例42B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F42とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．64mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例42E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F42とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．80mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例43A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F43とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．90mg／ml
薬物／mAb比：1．3
実施例43B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F43とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：0．85mg／ml
薬物／mAb比：1．3
実施例43E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F43とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．97mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例44A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F44とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．99mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例44B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F44とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．65mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例44E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F44とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例45A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F45とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例45B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F45とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．27mg／ml
薬物／mAb比：1．8
実施例45E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F45とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例46A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F46とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．0mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例46B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F46とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：11．21mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例46E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F46とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例47A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F47とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．51mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例47B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F47とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：0．89mg／ml
薬物／mAb比：1．7
実施例47E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F47とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．97mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例48A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F48とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．10mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例48B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝10．10mg／ml）を中間体F48とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．73mg／ml
薬物／mAb比：1．8
実施例48E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．39mg／ml）を中間体F48とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例49A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F49とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．09mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例49B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F49とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例49E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F49とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．96mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例50A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．02mg／ml）を中間体F50とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．89mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例50B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F50とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．82mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例51A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体3−｛3−［（3−アミノ−2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロピル）スルファニル］−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル｝−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド（異性体1）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．16mg／ml
実施例51B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝16．5mg／ml）を中間体3−｛3−［（3−アミノ−2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロピル）スルファニル］−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル｝−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド（異性体1）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．74mg／ml
薬物／mAb比：1．7
実施例51E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝8．2mg／ml）を中間体3−｛3−［（3−アミノ−2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロピル）スルファニル］−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル｝−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド（異性体1）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．67mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例52A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体3−｛3−［（3−アミノ−2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロピル）スルファニル］−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル｝−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド（異性体2）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．41mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例52B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝16．5mg／ml）を中間体3−｛3−［（3−アミノ−2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロピル）スルファニル］−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル｝−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド（異性体2）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．34mg／ml
薬物／mAb比：1．6
実施例52E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝8．2mg／ml）を中間体3−｛3−［（3−アミノ−2−｛［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］メチル｝プロピル）スルファニル］−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル｝−N−［17−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−15−オキソ−4，7，10−トリオキサ−14−アザヘプタデカ−1−イル］プロパンアミド（異性体2）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．16mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例53A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体N−｛3−アミノ−2−［（｛1−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ブチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝スルファニル）メチル］プロピル｝−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（異性体1）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．09mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例53B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝16．5mg／ml）を中間体N−｛3−アミノ−2−［（｛1−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ブチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝スルファニル）メチル］プロピル｝−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（異性体1）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：1．8
実施例53E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝8．2mg／ml）を中間体N−｛3−アミノ−2−［（｛1−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ブチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝スルファニル）メチル］プロピル｝−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（異性体1）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．15mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例54A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体N−｛3−アミノ−2−［（｛1−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ブチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝スルファニル）メチル］プロピル｝−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（異性体2）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．17mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例54B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝16．5mg／ml）を中間体N−｛3−アミノ−2−［（｛1−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ブチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝スルファニル）メチル］プロピル｝−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（異性体2）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例54E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝8．2mg／ml）を中間体N−｛3−アミノ−2−［（｛1−［4−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）ブチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝スルファニル）メチル］プロピル｝−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（異性体2）とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．90mg／ml
薬物／mAb比：1．8
実施例55A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．1mg／ml）を中間体N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝カルバモイル］フェニル｝−L−アラニンアミドとのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：0．47mg／ml
薬物／mAb比：未決定
実施例55B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．2mg／ml）を中間体N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−バリル−N−｛4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝カルバモイル］フェニル｝−L−アラニンアミドとのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．26mg／ml
薬物／mAb比：1．8
実施例56A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝15．33mg／ml）を中間体F56とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．74mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例56B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F56とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例57A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝15．33mg／ml）を中間体F57とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．04mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例57B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F57とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．93mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例58A
ここでは、PBS中セツキシマブ20mg（c＝21．32mg／ml）を中間体F58とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．33mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例58B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体20．0mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F58とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．54mg／ml
薬物／mAb比：4．6
実施例58E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F58とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．15mg／ml
実施例59
N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジントリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F1 8mg（15μmol）をDCM1．7mlに溶解し、N2−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジン7．3mg（30μmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン13μlを添加した。反応混合物を室温で15分間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。中間体をDCM1mlに溶解し、TFA1mlを用いて脱保護した。反応物を濃縮し、残渣をアセトニトリル／水1：1から凍結乾燥した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．8分；MS（ESIpos）：m／z＝643（M＋H）＋．
実施例60
S−｛1−［6−（2−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）−6−オキソヘキシル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン
中間体F3 4mg（5μmol）をDCM1mlに溶解し、L−システイン1．2mg（10μmol）を添加した。反応混合物を室温で20時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（ESIpos）：m／z＝843（M＋H）＋．
実施例61
S−｛1−［2−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン
中間体F2 7mg（9μmol）をDMF1．75mlに溶解し、L−システイン2．3mg（19μmol）を添加した。反応混合物を室温で20時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（ESIpos）：m／z＝758（M＋H）＋．
実施例62
S−（1−｛2−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エトキシ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン
中間体F5 2．9mg（3．6μmol）をDMF1mlに溶解し、L−システイン0．9mg（7．3μmol）を添加した。反応混合物を室温で3日間攪拌し、次いで、同量のシステインを添加した。室温でさらに24時間攪拌した後、混合物を減圧下で濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（ESIpos）：m／z＝802（M＋H）＋．
実施例63
N−［6−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジントリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F5 3mg（3μmol）をDMF2mlに溶解し、L−システイン1mg（8μmol）を添加した。反応混合物を室温で10分間攪拌し、水500μlを添加し、混合物をTFAを用いてpH2に調整し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝1127（M＋H）＋．
実施例64
S−［1−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイントリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F7 5．6mg（7μmol）をDMF1mlに溶解し、L−システイン1．7mg（14μmol）を添加した。反応混合物を室温で20時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（ESIpos）：m／z＝815（M＋H）＋．
実施例65
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N−（4−｛［（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）アセチル］アミノ｝フェニル）−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド
中間体F25 3mg（3μmol）をDMF2mlおよび水200μlに溶解し、L−システイン1mg（8μmol）を添加した。反応混合物を室温で4時間攪拌し、水500μlを添加し、混合物をTFAを用いてpH2に調整し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．76分；MS（ESIpos）：m／z＝1162（M＋H）＋．
実施例66
S−（1−｛4−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］フェニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン
中間体F10 3．5mg（3．8μmol）をDMF1mlに溶解し、L−システイン1．4mg（11μmol）を添加した。反応混合物を室温で23時間攪拌し、次いで、同量のシステインを添加した。室温でさらに24時間攪拌した後、混合物を減圧下で濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝877（M＋H）＋．
実施例67
S−｛1−［2−（｛［（1R，2S）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝アミノ）エチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン
中間体F12 3．3mg（4μmol）をDMF1mlに溶解し、L−システイン1．4mg（11μmol）を添加した。反応混合物を室温で3時間撹拌した。次いで、水500μlを添加し、混合物を減圧下で濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝869（M＋H）＋．
実施例68
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N−［4−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）フェニル］−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド
中間体F15 3mg（3μmol）をDMF2mlに溶解し、L−システイン1mg（8μmol）を添加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。次いで、水500μlを反応物に添加し、混合物をTFAを用いてpH2に調整した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．76分；MS（ESIpos）：m／z＝1105（M＋H）＋．
実施例69
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N−［4−（2−｛［2−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）フェニル］−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド
中間体F16 3mg（2μmol）をDMF2mlに溶解し、L−システイン0．8mg（7μmol）を添加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。次いで、水500μlを反応物に添加し、混合物をTFAを用いてpH2に調整した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝1218（M＋H）＋．
実施例70
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N−［4−（2−｛［2−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）フェニル］−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド
中間体F24 3mg（3μmol）をDMF2mlおよび水200μlに溶解し、L−システイン0．9mg（8μmol）を添加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。次いで、水500μlを反応物に添加し、混合物をTFAを用いてpH2に調整した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．77分；MS（ESIpos）：m／z＝1190（M＋H）＋．
実施例71
（15S，19R）−15−アミノ−19−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−18−グリコロイル−20，20−ジメチル−14−オキソ−4，7，10−トリオキサ−13，18−ジアザヘンイコサン−1−酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
第1のステップで、中間体C5 70mg（0．114mmol）を、1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩44mg（0．228mmol）、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール水和物35mg（0．228mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン60μlの存在下で、DMF15ml中tert−ブチル3−｛2−［2−（2−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ｝プロパノエート32mg（0．114mmol）とカップリングした。
反応物を室温で一晩攪拌し、生成物を分取HPLCによって精製した。これにより、保護された中間体33mg（理論値の33％）が得られた。これをジクロロメタン11ml中トリフルオロ酢酸1．1mlと1時間攪拌すると、後処理後に、標記化合物26mg（98％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝718（M＋H）＋．
実施例72
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、ペプチド化学の古典的方法を用いて中間体C3から調製した。
LC−MS（方法1）：Rt ＝0．87分；MS（ESIpos）：m／z＝842（M＋H）＋．
実施例73
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−L−オルニチン／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、ペプチド化学の古典的方法を用いて中間体C3から実施例72と同様に調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝814（M＋H）＋．
実施例74
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−4−アミノ−L−フェニルアラニン／トリフルオロ酢酸（1：2）
標記化合物を、中間体C8および商業的に入手可能なN−（tert−ブトキシカルボニル）−4−ニトロ−L−フェニルアラニンからペプチド化学の古典的方法を用いて調製したトリフルオロ酢酸／メチル4−アミノ−L−フェニルアラニネート（1：1）から合成した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝748（M＋H）＋．
実施例75
トリフルオロ酢酸／N−｛（1R）−1−［1−（3−アミノベンジル）−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N−（3−アミノプロピル）−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C10からトリフルオロ酢酸を用いた脱保護によって調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（ESIpos）：m／z＝486（M＋H）＋．
実施例76
（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
標記化合物を、中間体C5からトリフルオロ酢酸を用いた脱保護によって調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝515（M＋H）＋．
実施例77
トリフルオロ酢酸／N−［（3S）−3−アミノ−4−ヒドラジノ−4−オキソブチル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）
標記化合物を、中間体C6からトリフルオロ酢酸を用いた脱保護によって調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝529（M＋H）＋．
実施例78
トリフルオロ酢酸／N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N−［（3S）−3，4−ジアミノブチル］−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）
最初のステップで、中間体C1を、中間体C2と同様にベンジルtert−ブチル−［（2S）−4−オキソブタン−1，2−ジイル］ビスカルバメートと反応させた。使用したアルデヒドは、商業的に入手可能な（3S）−3−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−4−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸から、中間体C2と同様に還元およびその後の酸化によって調製した。
第2のステップで、N−アシル化を中間体C3と同様に行い、最後に、引き続いて最初に氷酢酸中33％濃度臭化水素酸および次いで、水酸化リチウムを用いて完全に脱保護した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．78分；MS（ESIpos）：m／z＝500（M＋H）＋．
実施例79
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニン
標記化合物を、中間体C8からトリフルオロ酢酸を用いた脱保護によって調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（ESIpos）：m／z＝586（M＋H）＋．
実施例80
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−N−（2−アミノエチル）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタンアミド（2：1）
標記化合物を、ペプチド化学の古典的方法を用いて中間体C5から調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．72分；MS（ESIpos）：m／z＝557（M＋H）＋．
実施例81
（1−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）酢酸／トリフルオロ酢酸（1：2）
標記化合物を、中間体C7からトリフルオロ酢酸を用いた脱保護によって調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝587（M＋H）＋．
実施例82A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F82とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．59mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例82B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝10．10mg／ml）を中間体F82とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．59mg／ml
薬物／mAb比：1．8
実施例82E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝11．50mg／ml）を中間体F82とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．15mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例83A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F83とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．77mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例83B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F83とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．29mg／ml
薬物／mAb比：1．3
実施例83E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F83とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例83H
ここでは、PBS中パニツムマブ5．0mg（c＝10mg／ml）を中間体F83とのカップリングに使用した。TCEPを用いた還元の時間を4時間に増加し、ADCカップリングのための攪拌時間を20時間に増加した。次いで、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．57mg／ml
薬物／mAb比：0．9
実施例84A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．02mg／ml）を中間体F84とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．94mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例84B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F84とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．77mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例85A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．02mg／ml）を中間体F85とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．13mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例85B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F85とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．63mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例86A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．59mg／ml）を中間体F86とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．96mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例86B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F86とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．55mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例87A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝8．95mg／ml）を中間体F87とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．08mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例87B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F87とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．93mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例88A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．02mg／ml）を中間体F88とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．03mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例88B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F88とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．9mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例89A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．02mg／ml）を中間体F89とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．2mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例89B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F89とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．03mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例90A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝13．33mg／ml）を中間体F90とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．19mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例90B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F90とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．97mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例91A
ここでは、PBS中セツキシマブ80mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F91とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：12．75mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例91B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F91とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：5．71mg／ml
薬物／mAb比：4．0
実施例92
S−（1−｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイントリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F86 3mg（4μmol）をDCM／水10：1 3mlに溶解し、L−システイン1．3mg（11μmol）を添加した。反応混合物を室温で10分間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．77分；MS（EIpos）：m／z＝829［M＋H］＋．
実施例93
N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）（異性体1）
化合物を中間体C32（異性体1）により得た。
実施例94
中間体C33（異性体2）N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）（異性体2）
化合物を中間体C33（異性体2）により得た。
実施例95
トリフルオロ酢酸／4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド（2：1）
標記化合物を、tert−ブチル｛3−［（4−アミノベンゾイル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］プロピル｝カルバメートからトリフルオロ酢酸を用いた脱保護によって得た。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（EIpos）：m／z＝532［M＋H］＋．
実施例96
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド
2−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロピル］アミノ）−2−オキソエチルアセテート101mg（0．16mmol）を最初に無水エタノール2mlに装入し、メタンアミンの水中40％濃度溶液244mg（3．14mmol、225μl）を添加した。混合物を50℃で1時間攪拌し、次いで、メタンアミンの水中40％濃度溶液さらに244mg（3．14mmol、225μl）を添加し、合計3．5時間後、混合物を分取HPLC（移動相：ACN／水＋1．0％NEt3、勾配）によって直接精製した。これにより、標的化合物52mg（理論値の70％）が得られた。
LC−MS（方法3）：Rt＝2．56分；MS（EIpos）：m／z＝471［M＋H］＋．
実施例97
S−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F33 3mg（4μmol）をDMF2mlおよび水200μlに溶解し、L−システイン1．4mg（12μmol）を添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌した。次いで、反応物を減圧下で濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（ESIpos）：m／z＝718（M＋H）＋．
実施例98
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド
（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン（中間体C52）150．0mg（0．42mmol）を最初にジクロロメタン2．0mlに装入し、HOAc29．2mg（0．49mmol）およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド125．6mg（0．59mmol）を添加し、混合物を室温で5分間攪拌した。3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロパナール98．9mg（0．49mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相を飽和炭酸ナトリウム溶液で2回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルを用いて精製した（移動相：ジクロロメタン／メタノール100：1）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物2−［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］−1H−イソインドール−1，3（2H）−ジオン188．6mg（74％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．00分；MS（ESIpos）：m／z＝541［M＋H］＋．
2−［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］−1H−イソインドール−1，3（2H）−ジオン171．2mg（0．32mmol）を最初にジクロロメタン5．0mlに装入し、トリエチルアミン73．6mg（0．73mmol）を添加した。0℃で、アセトキシアセチルクロリド94．9mg（0．70mmol）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液で2回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をBiotage Isolera（シリカゲル、カラム10g SNAP、流量12ml／分、酢酸エチル／シクロヘキサン1：3）を用いて精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロピル］アミノ）−2−オキソエチルアセテート159．0mg（77％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．35分；MS（ESIpos）：m／z＝642［M＋H］＋．
2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（1，3−ジオキソ−1，3−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル）プロピル］アミノ）−2−オキソエチルアセテート147．2mg（0．23mmol）を最初にエタノール4．0mlに装入し、メタンアミン（水中40％）356．2mg（4．59mmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をトルエンと3回共蒸留した。残渣をシリカゲルを用いて精製した（移動相：ジクロロメタン／メタノール10：1）。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物67．4mg（63％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝470［M＋H］＋．
実施例99
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−メチルブタンアミド（1：1）
最初に、中間体C52をC2と同様に（2S）−2−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−4−オキソ酪酸ベンジルを用いて還元的にアルキル化した。次いで、二級アミノ基を中間体C27で記載されるように2−クロロ−2−オキソエチルアセテートを用いてアシル化した。
この中間体190mg（0．244mmol）をエタノール7．5mlに溶解し、メタンアミンの水中40％濃度溶液0．35mlを添加した。反応物を50℃で3時間攪拌し、次いで、同量のメチルアミンを再度添加した。50℃でさらに5時間攪拌した後、反応物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、この標記化合物78mg（理論値の48％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．32分；MS（EIpos）：m／z＝661［M＋H］＋．
この中間体78mg（0．118mmol）をエタノール8mlに溶解し、10％パラジウム活性炭15mgを添加した後、標準水素圧力下室温で3分間水素化した。次いで、触媒を濾別し、溶媒を減圧下で除去し、生成物を分取HPLCによって精製した。アセトニトリル／水からの凍結乾燥後に、標記化合物33mg（理論値の44％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝527（M＋H）＋．
1H NMR（500MHz，DMSO−d6）：δ＝8．1（m，1H），8．0（m，3H），7．9（m，1H），7．65（m，1H），7．5（s，1H），7．15−7．35（m，5H）7．0（m，1H），6．85（m，1H），5．6（s，1H），4．9 and 5．2（2d，2H），4．02 and 4．22（2d，2H），3．2−3．5（m，6H），0．7 and 1．46（2m，2H），0．8（s，9H）．
実施例100
トリフルオロ酢酸／N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（中間体C40）100．0mg（0．21mol）およびN5−カルバモイル−N2−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル）−L−オルニチン109．8mg（0．28mmol）を最初にアセトニトリル5．0mlに装入し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン137．3mg（1．06mmol）およびT3P 175．8mg（0．28mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液と酢酸エチルに分配した。有機相を水で2回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−N2−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−オルニチンアミド118．9mg（66％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．31分；MS（ESIpos）：m／z＝850［M＋H］＋．
N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−N2−［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］−L−オルニチンアミド97．3mg（0．11mmol）を最初にDMF4．0mlに装入し、ピペリジン194．9mg（2．29mmol）を添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌し、次いで、HOAcで中和した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物101．4mgが得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．87分；MS（ESIpos）：m／z＝628［M＋H］＋．
実施例101
トリフルオロ酢酸／L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）
トリフルオロ酢酸／N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）（実施例100）96．2mg（0．13mmol）および2，5−ジオキソピロリジン−1−イル−N−（tert−ブトキシカルボニル）−L−バリネート40．8mg（0．13mmol）を最初にDMF2．0mlに装入し、4−メチルモルホリン39．4mg（0．39mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。4−メチルモルホリンさらに59．1mg（0．59mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を酢酸エチルと飽和塩化アンモニウム溶液に分配した。有機相を飽和NaCl溶液で1回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−（tert−ブトキシカルボニル）−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド74．1mg（69％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．27分；MS（ESIpos）：m／z＝827［M＋H］＋．
N−（tert−ブトキシカルボニル）−L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド68．1mg（0．08mmol）をジクロロメタン4．0mlに溶解し、TFA187．8mg（1．65mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、TFAさらに187．8mg（1．65mmol）を添加し、反応混合物をもう一度室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物67．2mg（97％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．97分；MS（ESIpos）：m／z＝727［M＋H］＋．
実施例102
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1S）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド
対応するS−異性体中間体を用いて実施例98の合成と同様に合成を行った。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝470［M＋H］＋．
実施例103A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝15．33mg／ml）を中間体F103とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：0．9mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例103B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F103とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：0．95mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例103E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F103とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．05mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例104A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝15．33mg／ml）を中間体F104とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例104B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 35mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F104とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：10．93mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例104E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F104とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．11mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例104I
ここでは、PBS中ニモツズマブ5．0mg（c＝13．1mg／ml）を中間体F104とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．89mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例104H
ここでは、PBS中パニツムマブ5．0mg（c＝12mg／ml）を中間体F104とのカップリングに使用した。TCEPを用いた還元の時間を4時間に増加し、ADCカップリングのための攪拌時間を20時間に増加した。次いで、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．79mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例105A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝5．9mg／ml）を中間体F105とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例105B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．23mg／ml）を中間体F105とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．01mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例106A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝15．33mg／ml）を中間体F106とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例106B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F106とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．76mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例106E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F106とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．5mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例107A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．3mg／ml）を中間体F107とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．16mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例107B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F107とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．9mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例107E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F107とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．48mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例108A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝15．3mg／ml）を中間体F108とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例108B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F108とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．22mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例109A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F109とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．1mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例109B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝34．4mg／ml）を中間体F109とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．63mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例110A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝15．33mg／ml）を中間体F110とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．86mg／ml
薬物／mAb比：3．8
実施例110B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F110とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．64mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例110E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F110とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．23mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例111A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F111とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．4mg／ml
薬物／mAb比：3
実施例111B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝34．4mg／ml）を中間体F111とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．71mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例112A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F122とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．2mg／ml
薬物／mAb比：3
実施例112B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝34．4mg／ml）を中間体F112とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．39mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例113A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F113とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例113B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝34．4mg／ml）を中間体F113とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．8mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例114A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F114とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．07mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例114B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝34．4mg／ml）を中間体F114とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．9mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例115A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F115とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．18mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例115B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝34．4mg／ml）を中間体F115とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．0mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例116A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F116とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．03mg／ml
薬物／mAb比：4．4
実施例116B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝34．4mg／ml）を中間体F116とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．96mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例117A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F117とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．02mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例117B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝34．4mg／ml）を中間体F117とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．77mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例118A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F118とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．38mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例118B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F118とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．14mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例118E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F118とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．27mg／ml
薬物／mAb比：3
実施例119A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．8mg／ml）を中間体F119とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．14mg／ml
薬物／mAb比：3．9
実施例119B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F119とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：0．91mg／ml
薬物／mAb比：4．1
実施例119E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F119とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．69mg／ml
薬物／mAb比：4．4
実施例120A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F120とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例120B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F120とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．71mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例121A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F121とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．1mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例121B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F121とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．88mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例122A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F122とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．78mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例122B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F122とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．64mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例123A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F123とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例123B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F123とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例124A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F124とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．93mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例124B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F124とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例125A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F125とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．14mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例125B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F125とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例126A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F126とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．89mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例126B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F126とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．62mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例126E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝8．23mg／ml）を中間体F126とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．93mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例127A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F127とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．54mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例127B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F127とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．62mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例127E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F127とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．07mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例128A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F128とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．99mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例128B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F128とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．99mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例129A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．84mg／ml）を中間体F129とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．28mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例129B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F129とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．06mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例129E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F129とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．0mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例130
S−（1−｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F32 4．2mg（5μmol）をDCM／水10：1 2mlに溶解し、L−システイン1．8mg（15μmol）を添加した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．8分；MS（EIpos）：m／z＝829［M＋H］＋．
実施例131
S−［1−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−2−オキソエチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F87 5mg（6μmol）をDMF1mlに溶解し、L−システイン7．5mg（62μmol）を添加した。反応混合物を室温で20時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（EIpos）：m／z＝815［M＋H］＋．
実施例132
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N−［4−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）フェニル］−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F89 5mg（5μmol）をDMF／水10：1 2mlに溶解し、L−システイン1．7mg（14μmol）を添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣をアセトニトリル／水に溶解し、混合物をTFAを用いてpH2に調整し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮すると、残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥後、標記化合物3mgが白色泡として得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝0．93分；MS（EIpos）：m／z＝1105［M＋H］＋．
実施例133
S−（1−｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F84 1．6mg（2μmol）をDMF／水10：1 1．5mlに溶解し、L−システイン0．74mg（6μmol）を添加した。反応混合物を室温で10分間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣をアセトニトリル／水に溶解し、混合物をTFAを用いてpH2に調整し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮すると、残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥後、標記化合物1．9mg（理論値の89％）が白色泡として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．8分；MS（EIpos）：m／z＝828［M＋H］＋．
実施例134
N−［6−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F90 3．8mg（3μmol）をDMF／水10：1 1．5mlに溶解し、L−システイン1．2mg（9μmol）を添加した。反応混合物を室温で15分間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣をアセトニトリル／水1：1に溶解し、再度濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮すると、残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥後、標記化合物2．3mg（理論値の56％）が白色泡として得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．0分；MS（EIpos）：m／z＝1213［M＋H］＋．
実施例135
S−［1−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F104 1．8mg（2μmol）をDMF1mlに溶解し、L−システイン2．7mg（22μmol）を添加した。反応混合物を室温で20時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。これにより、標記化合物0．6mg（理論値の26％）が無色泡として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．80分；MS（EIpos）：m／z＝814［M＋H］＋．
実施例136
S−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F109 3．3mg（4μmol）をDMF／水10：1 2mlに溶解し、L−システイン1．5mg（13μmol）を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣をアセトニトリル／水1：1に溶解し、再度濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮すると、残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥後、標記化合物1．9mg（理論値の55％）が白色泡として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．75分；MS（EIpos）：m／z＝718［M＋H］＋．
実施例137
S−｛1−［6−（2−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）−6−オキソヘキシル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F117 3．2mg（4μmol）をDMF／水10：1 2mlに溶解し、L−システイン1．6mg（13μmol）を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣をアセトニトリル／水1：1に溶解し、再度濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮すると、残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥後、標記化合物2mg（理論値の47％）が白色泡として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．76分；MS（EIpos）：m／z＝843［M＋H］＋．
実施例138
N−［19−（3（R／S）−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝ホモシステイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−ホモシステイン／トリフルオロ酢酸（1：1）（中間体F146）6．0mg（0．01mmol）を最初にDMF／水（10：1）2．2mlに装入し、L−システイン2．0mg（0．02mmol）を添加し、混合物を室温で10分間攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物5．5mg（理論値の76％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．07分；MS（ESIpos）：m／z＝1106（M＋H）＋．
実施例139
S−｛（3R／S）−1−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：2）
化合物実施例138の合成と同様に合成を行った。
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］ブタンアミド（1：1）6．0mg（0．01mmol）。
L−システイン2．6mg（0．02mmol）。
これにより、標記化合物3．4mg（理論値の43％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝757（M＋H）＋．
実施例140
N−［19−（3（R／S）−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝ホモシステイン／トリフルオロ酢酸（1：2）
化合物実施例138の合成と同様に合成を行った。
トリフルオロ酢酸／R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］ホモシステイン（1：1）（中間体F149）6．0mg（0．01mmol）
L−システイン2．0mg（0．02mmol）。
これにより、標記化合物6．1mg（理論値の84％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（ESIpos）：m／z＝1107（M＋H）＋．
実施例141
S−［（3R／S）−1−（2−｛［6−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）ヘキサノイル］アミノ｝エチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：2）
化合物実施例138の合成と同様に合成を行った。
トリフルオロ酢酸／6−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）−N−［2−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）エチル］ヘキサンアミド（1：1）（中間体F143）10．07mg（0．01mmol）。
L−システイン9．3mg（0．08mmol）。
これにより、標記化合物9．2mg（理論値の67％）が得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．05分；MS（ESIpos）：m／z＝843（M＋H）＋．
実施例142A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F142とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．08mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例142B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝34．42mg／ml）を中間体F142とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例142E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F142とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例142I
ここでは、PBS中ニモツズマブ5．0mg（c＝13．8mg／ml）を中間体F142とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例142H
ここでは、PBS中パニツムマブ5．0mg（c＝2．1mg／ml）を中間体F142とのカップリングに使用した。TCEPを用いた還元時間を1時間とし、ADCカップリングのための攪拌時間を1．5時間とした。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．7mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例143A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F143とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例143B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝34．42mg／ml）を中間体F143とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．05mg／ml
薬物／mAb比：1．6
実施例143E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F143とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例144B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F144とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。
タンパク質濃度：1．53mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例145A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F145とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．00mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例145B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F145とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．54mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例145E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F145とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．86mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例146A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F146とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．02mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例146B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝34．42mg／ml）を中間体F146とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．87mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例146E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F146とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例147A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F147とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．04mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例147B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F147とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．31mg／ml
薬物／mAb比：1．8
実施例147E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F147とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．86mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例148A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F148とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．11mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例148B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F148とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例148E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F148とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．62mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例149A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝5．90mg／ml）を中間体F149とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．09mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例149B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 40mg（c＝34．42mg／ml）を中間体F149とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：9．61mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例149E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F149とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．93mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例150A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝15．33mg／ml）を中間体F150とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例150B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F150とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．81mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例150E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F150とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例151A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝16．90mg／ml）を中間体F151とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．86mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例151B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F151とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．78mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例151E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝16．90mg／ml）を中間体F151とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．74mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例152A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝16．90mg／ml）を中間体F152とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．80mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例152B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝12．87mg／ml）を中間体F152とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．77mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例152E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝16．90mg／ml）を中間体F152とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．69mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例153A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝21．32mg／ml）を中間体F153とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．93mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例153B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F153とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．71mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例154A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝26．8mg／ml）を中間体F154とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．34mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例154B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F154とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：3．8
実施例155A
ここでは、PBS中セツキシマブ50mg（c＝8．51mg／ml）を中間体F155とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。
タンパク質濃度：14．85mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例155B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 40mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F155とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。
タンパク質濃度：11．25mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例156A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝21．3mg／ml）を中間体F156とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例156B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F156とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．79mg／ml
薬物／mAb比：3．9
実施例156E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F156とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：4．2
実施例157
S−｛1−［2−（｛［（1R，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝アミノ）エチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F125 2mg（2μmol）をDMF／水10：1 2mlに溶解し、L−システイン0．8mg（6μmol）を添加した。反応混合物を室温で20時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、次いで、分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（EIpos）：m／z＝868［M＋H］＋．
実施例158
S−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F119 6mg（8μmol）をDMF3mlに溶解し、L−システイン1．8mg（15μmol）を添加した。反応混合物を室温で6時間撹拌し、次いで、室温で3日間精置した。次いで、反応物を減圧下で濃縮し、生成物を分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（ESIpos）：m／z＝717（M＋H）＋．
実施例159
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−D−アラニル）−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
最初に、2，5−ジオキソピロリジン−1−イル−N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−D−アラニネートおよびメチルN2−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジネートで始めて、ペプチド化学の古典的方法を用いてメチルN6−D−アラニル−N2−（tert−ブトキシカルボニル）−L−リジネートを調製した。
標記化合物を合成するために、この中間体8．4mg（0．022mmol）をDMF4mlに溶解し、中間体C5 10mg（0．015mmol）およびHATU11mgおよびN，N−ジイソプロピルエチルアミン13μlを添加した。室温で5時間攪拌した後、反応物を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および高真空下での乾燥後、得られた中間体をメタノール4mlに溶解し、2M水酸化リチウム溶液83μlを添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。水酸化リチウム溶液さらに167μlを添加し、混合物をさらに4時間攪拌した。次いで、混合物を水で希釈し、5％濃度クエン酸を用いてpH＝5に調整した。濃縮後、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、Boc保護中間体3．5mg（理論値の26％）が得られた。DCM2ml中トリフルオロ酢酸1mlを用いた脱保護により、これにより、標記化合物3mg（理論値の95％）が得られた。
HPLC（方法11）：Rt＝1．76分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．75分；MS（ESIpos）：m／z＝714（M＋H）＋．
実施例160
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−N2−｛N−［6−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル｝−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F155 4mg（3μmol）をDMF／水10：1 2．5mlに溶解し、L−システイン1．2mg（10μmol）を添加した。反応混合物を室温で30分間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮し、アセトニトリル／水1：1に溶解し、次いで、分取HPLCによって精製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（EIpos）：m／z＝1197［M＋H］＋．
実施例161
N−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−L−グルタミン／トリフルオロ酢酸（1：1）
最初に、ペプチド化学の古典的方法を用いて、トリフルオロ酢酸／ベンジルN−（2−アミノエチル）−N2−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−グルタミネート（1：1）を調製した。次いで、HATUの存在下で、この中間体を中間体C58とカップリングした。その後、最初に、ベンジルオキシカルボニル保護基およびベンジルエステルを水素化分解開裂（hydrogenolytic cleavage）によって除去し、次いで、塩化亜鉛を用いて2−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル保護基を除去した。
LC−MS（方法6）：Rt＝1．91分；MS（EIpos）：m／z＝685［M＋H］＋．
実施例162
N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−L−リジン／トリフルオロ酢酸（1：1）
最初に、ペプチド化学で既知の古典的保護基操作を用いて、トリフルオロ酢酸／2−（トリメチルシリル）エチル−N2−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−リジネート（1：1）を調製した。次いで、HATUの存在下で、この中間体を中間体C61とカップリングした。その後、最初に塩化亜鉛を用いて2−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル保護基および2−（トリメチルシリル）エチルエステルを切断した。最後に、ベンジルオキシカルボニル保護基の水素化分解開裂および分取HPLCによる精製によって標記化合物を得た。
HPLC（方法11）：Rt＝1．65分；
LC−MS（方法1）：Rt＝0．76分；MS（EIpos）：m／z＝713［M＋H］＋．
実施例163A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．3mg／ml）を中間体F163とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．02mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例163B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F163とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．76mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例163H
ここでは、PBS中パニツムマブ5．0mg（c＝10mg／ml）を中間体F163とのカップリングに使用した。TCEPを用いた還元時間を30分間とし、ADCカップリングのための攪拌時間を2時間とした。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．61mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例164A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝16．9mg／ml）を中間体F164とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．15mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例164B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 30mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F164とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。
タンパク質濃度：14．8mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例164E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F164とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．11mg／ml
薬物／mAb比：3．8
実施例165A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝16．9mg／ml）を中間体F165とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．93mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例165B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 40mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F165とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。
タンパク質濃度：12．02mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例165E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F165とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．94mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例166A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝21．3mg／ml）を中間体F166とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．0mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例166B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F166とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．76mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例166E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F166とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．01mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例167A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝16．9mg／ml）を中間体F167とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．05mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例167B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F167とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．76mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例167E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F167とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．9mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例168A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．3mg／ml）を中間体F168とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．94mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例168B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F168とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．33mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例168E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F168とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．89mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例168H
ここでは、PBS中パニツムマブ5．0mg（c＝10mg／ml）を中間体F168とのカップリングに使用した。TCEPを用いた還元時間を4時間とし、ADCカップリングのための攪拌時間を20時間とした。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．76mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例169A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝16．9mg／ml）を中間体F169とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例169B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 40mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F169とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。
タンパク質濃度：11．2mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例169E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F169とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例170A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝16．9mg／ml）を中間体F170とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例170B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F170とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．72mg／ml
薬物／mAb比：3．07
実施例170E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F170とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例171A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．3mg／ml）を中間体F171とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．94mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例171B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝12．9mg／ml）を中間体F171とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．58mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例172A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．3mg／ml）を中間体F172とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．96mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例172B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F172とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．85mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例172E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F172とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例173A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．3mg／ml）を中間体F173とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．1mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例173B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F173とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。
タンパク質濃度：12．26mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例173E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F173とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．33mg／ml
薬物／mAb比：3．9
実施例174A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．3mg／ml）を中間体F174とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．18mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例174B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F174とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．99mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例174E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F174とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．03mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例175A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝16．9mg／ml）を中間体F175とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：3．8
実施例175B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 40mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F175とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。
タンパク質濃度：9．8mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例175E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F175とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．97mg／ml
薬物／mAb比：4．2
実施例176A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝21．3mg／ml）を中間体F176とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例176B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F176とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．93mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例176E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F176とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．85mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例177A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝21．3mg／ml）を中間体F177とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．96mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例177B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F177とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．2mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例177E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F177とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例178A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝21．3mg／ml）を中間体F178とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．8mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例178B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F178とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．45mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例178E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F178とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．8mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例179A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝11．3mg／ml）を中間体F179とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．04mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例179B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F179とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．65mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例179E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F179とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．89mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例180A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝8．51mg／ml）を中間体F180とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．72mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例180B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F180とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．82mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例180E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F180とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．01mg／ml
薬物／mAb比：4．7
実施例181
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アセトアミド
（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン1．01g（2．84mmol）を最初に1，2−ジクロロエタン20mlに装入し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド0．84g（3．98mmol）および酢酸2．56g（42．65mmol）を添加し、混合物を室温で5分間攪拌した。次いで、tert−ブチル（3−オキソプロピル）カルバメート0．54g（3．13mmol）の1，2−ジクロロエタン5ml中溶液を添加し、反応混合物を一晩攪拌した。次いで、混合物を蒸発乾固し、残渣を酢酸エチルに溶解し、濾過し、生成物含有濾液を蒸発乾固した。
残渣51．26mgを1，2−ジクロロメタン0．8mlに溶解し、深96ウェルマルチタイタープレート上塩化アセチル7．85mg（0．1mmol）に添加し、次いで、N，N−ジイソプロピルエチルアミン25．8mg（0．2mmol）を添加し、混合物を室温で一晩振盪した。次いで、遠心乾燥機を用いて溶媒を完全に除去し、1，2−ジクロロエタン0．4mlおよびトリフルオロ酢酸0．4mlを添加し、混合物を一晩振盪した。次いで、遠心乾燥機を用いて溶媒を完全に除去し、DMF0．8mlを残渣に添加した。次いで、混合物を濾過し、標的化合物を分取LC−MS（方法9）によって濾液から単離した。生成物含有分画を遠心脱水機を用いて減圧下で濃縮した。各生成物分画の残渣をDMSO0．6mlに溶解した。これらを合わせ、最後に、遠心脱水機において溶媒を取り除いた。これにより、標記化合物12．2mg（理論値の27％；純度100％）が得られた。
LC−MS（方法10）：Rt＝0．95分；MS（ESIpos）：m／z＝455［M＋H］＋
表XAに示される例示的化合物は、実施例181と同様に調製した：
実施例186
N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−3，3，3−トリフルオロプロパンアミド
（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロパン−1−アミン1．0g（2．82mmol）を最初に1，2−ジクロロエタン20mlに装入し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド1．4g（3．95mmol）および酢酸2．54g（42．32mmol）を添加し、混合物を室温で5分間攪拌した。次いで、tert−ブチル（3−オキソプロピル）カルバメート0．54g（3．10mmol）の1，2−ジクロロエタン5ml中溶液を添加し、反応混合物を一晩攪拌した。次いで、混合物を蒸発乾固し、残渣を酢酸エチルに溶解し、濾過し、生成物含有濾液を蒸発乾固した。
残渣51．16mgを1，2−ジクロロメタン0．8mlに溶解し、深96ウェルマルチタイタープレート上3，3，3−トリフルオロプロパノイルクロリド14．65mg（0．1mmol）に添加し、次いで、N，N−ジイソプロピルエチルアミン25．8mg（0．2mmol）を添加し、混合物を室温で一晩振盪した。次いで、遠心乾燥機を用いて溶媒を完全に除去し、1，2−ジクロロエタン0．4mlおよびトリフルオロ酢酸0．4mlを添加し、混合物を一晩振盪した。次いで、遠心乾燥機を用いて溶媒を完全に除去し、DMF0．8mlを残渣に添加した。次いで、混合物を濾過し、標的化合物を分取LC−MS（方法9）によって濾液から単離した。生成物含有分画を遠心脱水機を用いて減圧下で濃縮した。各生成物分画の残渣をDMSO0．6mlに溶解した。これらを合わせ、最後に、遠心脱水機において溶媒を取り除いた。これにより、標記化合物1．0mg（理論値の2％；純度82％）が得られた。
LC−MS（方法10）：Rt＝1．01分MS（ESIpos）：m／z＝522［M＋H］＋
実施例192A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝21．3mg／ml）を中間体F192とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．968mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例192B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F192とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例192E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F192とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．04mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例193A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝23．1mg／ml）を中間体F193とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．98mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例193B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F193とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．03mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例193E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F193とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．61mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例194A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝23．1mg／ml）を中間体F194とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．67mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例194B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F194とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：0．99mg／ml
薬物／mAb比：3．8
実施例194E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F194とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．39mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例195A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝23．1mg／ml）を中間体F195とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．79mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例195B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F195とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．53mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例195E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F195とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例196A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝23．1mg／ml）を中間体F196とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．85mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例196B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F196とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．73mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例196E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F196とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．86mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例197
（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタン酸塩酸塩（1：1）
中間体C53 150mg（0．2mmol）をDMF15mlに溶解し、DABCO2．29g（20．39mmol）。反応物を超音波浴で30分間処理した。次いで、酢酸1．17mlを添加することによって、反応物をpH3〜4に調整し、混合物を減圧下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製し、適当な分画を減圧下室温で濃縮した。残渣をアセトニトリル／水1：1に溶解し、4N塩酸5mlを添加し、次いで、混合物を凍結乾燥した。これにより、標記化合物81mg（理論値の68％）が得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝2．69分；MS（EIpos）：m／z＝514［M＋H］＋．
実施例198
トリフルオロ酢酸／（2S）−2−アミノ−N−（2−アミノエチル）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタンアミド（1：1）
中間体C64 15mg（0．018mmol）を2，2，2−トリフルオロエタノール4mlに溶解した。塩化亜鉛15ml（0．110mmol）を添加し、反応物を50℃で2時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸32mg（0．110mmol）を添加し、反応物を減圧下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物9．5mg（理論値の77％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．68分；MS（ESIpos）：m／z＝556（M＋H）＋．
実施例199
4−［（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
および
4−［（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−2−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
LC−MS（方法1）：Rt＝0．80分；MS（EIpos）：m／z＝814［M＋H］＋．
最初に、L−システインをN、N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下、DMF中1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオンを用いてN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システインに変換した。
N−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システイン406mg（1．53mmol）をDMF10mlに溶解し、無水マレイン酸157．5mg（1．606mmol）を添加し、反応物を室温で1時間攪拌した。中間体C66 7．5mg（0．01mmol）をこの溶液130μlに添加し、反応物を室温で5分間攪拌した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、保護された中間体10mg（89％）が得られた；HPLCによってもLC−MSによっても位置異性体を分離することは不可能であった。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．38分；MS（EIpos）：m／z＝1120［M＋H］＋．
最後のステップで、この中間体10mgを2，2，2−トリフルオロエタノール2mlに溶解した。塩化亜鉛12ml（0．088mmol）を添加し、反応物を50℃で30分間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸26mg（0．088mmol）を添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物8．3mg（理論値の99％）が比87：13の位置異性体混合物として得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝2．3分および2．43分；MS（ESIpos）：m／z＝832（M＋H）＋．
1H NMR main isomer：（500MHz，DMSO−d6）：δ＝8．7（m，1H），8．5（m，2H），8．1（m，1H），7．6（m，1H），7．5（s，1H）7．4−7．15（m，6H），6．9−7．0（m，1H），6．85（s，1H），5．61（s，1H），4．9 and 5．2（2d，2H），4．26 and 4．06（2d，2H），3．5−3．8（m，5H），3．0−3．4（m，5H），2．75−3．0（m，3H），2．58 and 2．57（dd，1H），0．77 and 1，5（2m，2H），0．81（s，9H）．
あるいは、位置異性体標記化合物を以下の通り分離した：
このために、最初に、L−システインをN、N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下、DMF中1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオンを用いてN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システインに変換した。
中間体F104 55mg（0．068mmol）およびN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システイン36mg（0．136mmol）をDMF15mlに溶解し、混合物を室温で20時間攪拌した。次いで、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させ、次いで、残渣をTHF／水1：1 15mlに溶解した。2M水酸化リチウム水溶液131μlを添加し、反応物を室温で1時間攪拌した。次いで、反応物を1M塩酸で中和し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、位置異性体の保護された中間体37mg（理論値の50％）が無色泡として得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝3．33分および3．36分；MS（ESIpos）：m／z＝976（M＋H）＋．
最後のステップで、この中間体25mgを2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛12．5ml（0．092mmol）を添加し、反応物を50℃で4時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸27mg（0．092mmol）を添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物18．5mg（理論値の85％）が比21：79の位置異性体混合物として得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝2．37分および3．44分；MS（ESIpos）：m／z＝832（M＋H）＋．
標記化合物の個々の位置異性体の標的にした調製を以下の通り行った：
実施例199−2
4−［（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−2−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
最初に、メチルL−システイネートをN、N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下、DMF中1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオンを用いてメチルN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システイネートに変換した。
商業的に入手可能な3−ブロモ−4−メトキシ−4−オキソブタン酸53mg（0．251mmol）およびメチルN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システイネート70mg（0．251mmol）をDMF5mlに溶解し、重炭酸ナトリウム水溶液をpHを監視しながら添加した。室温で15分間攪拌した後、混合物を酢酸を用いてpH＝4．3に調整し、反応物を濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させると、4−メトキシ−3−｛［（2R）−3−メトキシ−3−オキソ−2−（｛［2−（トリメチリシリル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロピル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸72mg（理論値の70％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝410（M＋H）＋．
この中間体をHATUの存在下で中間体C66とカップリングし、次いで、最初にメタノール中水酸化リチウムおよび次いで、塩化亜鉛を用いて上記のように完全に脱保護した。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物2mgが得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．78分；MS（ESIpos）：m／z＝832（M＋H）＋．
異性体1を同様に調製することができる。
実施例200
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体C61 10mg（0．014mmol）を2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛11ml（0．082mmol）を添加し、反応物を50℃で30分間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸24mg（0．082mmol）を添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物4．2mg（理論値の40％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．79分；MS（ESIpos）：m／z＝585（M＋H）＋．
実施例201
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−セリン／トリフルオロ酢酸（1：1）
この中間体C58 20mg（0．03mmol）およびベンジルL−セリネート塩酸塩（1：1）8．5mg（0．037mmol）をDMF5mlに溶解し、HATU17mg（0．046mmol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン21μlを添加した。室温で10分間攪拌した後、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、中間体12．5mg（理論値の49％）が得られた。LC−MS（方法1）：Rt＝1．42分；MS（ESIpos）：m／z＝835（M＋H）＋．
この中間体12．5mg（0．015mmol）をエタノール10mlに溶解し、パラジウム炭素（10％）を添加し、混合物を標準圧力で30分間、水素を用いて室温で水素化した。触媒を濾別し、溶媒を減圧下で蒸発させると、残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥後、中間体7．5mg（理論値の67％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．28分；MS（ESIpos）：m／z＝745（M＋H）＋．
この中間体7．5mg（0．01mmol）を2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛8ml（0．06mmol）を添加し、反応物を50℃で4．5時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸17．7mg（0．06mmol）を添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物4．2mg（理論値の58％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．75分；MS（ESIpos）：m／z＝601（M＋H）＋．
実施例202
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−アラニン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体C58およびベンジルL−アラニネート塩酸塩（1：1）から実施例201と同様に標記化合物を調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝585（M＋H）＋．
実施例203
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝グリシン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体C58およびベンジルグリシネート塩酸塩（1：1）から実施例201と同様に標記化合物を調製した。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．82分；MS（ESIpos）：m／z＝571（M＋H）＋．
実施例204A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝23．1mg／ml）を中間体F204とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．88mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例204B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 50mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F204とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：12．66mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例204E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F204とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．65mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例205A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝23．1mg／ml）を中間体F205とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．99mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例205B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F205とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：0．96mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例205E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F205とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．94mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例206A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝23．1mg／ml）を中間体F206とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．73mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例206B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F206とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．21mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例206E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F206とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例207A
ここでは、PBS中セツキシマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F207とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．79mg／ml
薬物／mAb比：3．4
実施例207B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 50mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F207とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈し、再度濃縮した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。このADC調製について、合成直後に、19％の割合が開環スクシンアミド型と決定された。
タンパク質濃度：12．99mg／ml
薬物／mAb比：4．3
実施例207E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝13．5mg／ml）を中間体F207とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．39mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例207I
ここでは、PBS中ニモツズマブ5．0mg（c＝13．1mg／ml）を中間体F207とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例207H
ここでは、PBS中パニツムマブ5．0mg（c＝13．6mg／ml）を中間体F207とのカップリングに使用した。TCEPを用いた還元時間を4時間とし、ADCカップリングのための攪拌時間を20時間とした。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．0mg／ml
薬物／mAb比：1．9
実施例208A
アルゴン下で、TCEP0．344mgのPBS緩衝液100μl中溶液をPBS5494μl中セツキシマブ60mg（c＝10．92mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO600μlに溶解した中間体F104 2．582mg（0．003mmol）を添加した。室温でさらに120分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1306μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をPBS緩衝液pH8で希釈して総体積14mlとした。この溶液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、もう一度再濃縮した。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：13．36mg／ml
薬物／mAb比：1．8
このADC調製について、94％の割合が開環スクシンアミド型と決定された。
実施例208B
アルゴン下、PBS3225μl中抗TWEAKR AK−1 60mg（c＝18．6mg／ml）をPBS緩衝液775μlで希釈し、次いで、TCEP0．344mgのPBS緩衝液100μl中溶液を添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO600μlに溶解した中間体F104 2．582mg（0．003mmol）を添加した。室温でさらに120分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液300μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をPBS緩衝液pH8で希釈して総体積14mlとした。この溶液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、もう一度再濃縮した。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：14．95mg／ml
薬物／mAb比：3．2
実施例208I
アルゴン下で、TCEP0．344mgのPBS緩衝液100μl中溶液をPBS4587μl中ニモツズマブ60mg（c＝13．1mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO600μlに溶解した中間体F104 2．582mg（0．003mmol）を添加した。室温でさらに120分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液2213μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をPBS緩衝液pH8で希釈して総体積14mlとした。この溶液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、もう一度再濃縮した。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：14．79mg／ml
薬物／mAb比：3．1
このADC調製について、91％の割合が開環スクシンアミド型と決定された。
実施例208K
アルゴン下で、TCEP0．23mgのPBS緩衝液67μl中溶液をPBS2759μl中抗TWEAKR AK−2 40mg（c＝14．5mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO400μlに溶解した中間体F104 1．72mg（0．002mmol）を添加した。室温でさらに120分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1774μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をPBS緩衝液pH8で希釈して総体積14mlとした。この溶液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、もう一度再濃縮した。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：11．66mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例209A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝21．32mg／ml）を中間体F209とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．75mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例209B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．60mg／ml）を中間体F209とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．30mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例209E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F209とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．03mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例209H
ここでは、PBS中パニツムマブ抗体5．0mg（c＝70．5mg／ml）を中間体F209とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：1．5
実施例209I
ここでは、PBS中ニモツズマブ抗体5．0mg（c＝13．1mg／ml）を中間体F209とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．81mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例210A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝21．32mg／ml）を中間体F210とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例210B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．60mg／ml）を中間体F210とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．41mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例210E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F210とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．79mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例211A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝12．33mg／ml）を中間体F211とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．82mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例211B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝34．42mg／ml）を中間体F211とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．52mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例211E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F211とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例212A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝11．3mg／ml）を中間体F212とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．94mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例212B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F212とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：0．85mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例212E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F212とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．55mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例213A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝21．32mg／ml）を中間体F213とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例213B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F213とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．4mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例213E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F213とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．94mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例214A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝15．21mg／ml）を中間体F214とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．00mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例214B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F214とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．01mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例214E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F214とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．86mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例215A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝15．21mg／ml）を中間体F215とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．99mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例215B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F215とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．64mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例215E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F215とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例215H
ここでは、PBS中パニツムマブ抗体5．0mg（c＝70．5mg／ml）を中間体F215とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．86mg／ml
薬物／mAb比：1．4
実施例215I
ここでは、PBS中ニモツズマブ5．0mg（c＝13．1mg／ml）を中間体F215とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例216A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝15．21mg／ml）を中間体F216とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．97mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例216B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F216とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．94mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例216E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F216とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．90mg／ml
薬物／mAb比：1．7
実施例217A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝15．21mg／ml）を中間体F217とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．05mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例217B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F217とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．44mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例217E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F217とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．85mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例218A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝15．21mg／ml）を中間体F218とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．05mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例218B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1抗体5．0mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F218とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．95mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例218E
ここでは、PBS中トラスツズマブ抗体5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F218とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例218H
ここでは、PBS中パニツムマブ抗体5．0mg（c＝20mg／ml）を中間体F218とのカップリングに使用した。TCEPを用いた還元の時間を4時間に増加し、ADCカップリングのための攪拌時間を20時間に増加した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．33mg／ml
薬物／mAb比：0．8
実施例218I
ここでは、PBS中ニモツズマブ抗体5．0mg（c＝13．8mg／ml）を中間体F218とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、再希釈した。ADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．48mg／ml
薬物／mAb比：3．0
実施例219
トリフルオロ酢酸／N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−メチルベンズアミド（1：1）
9H−フルオレン−9−イルメチル−［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C67）70．0mg（0．09mmol）を最初にジクロロメタン3．0mlに装入し、トリエチルアミン31．3mg（0．31mmol）および4−メチルベンゾイルクロリド31．8mg（0．21mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物9H−フルオレン−9−イルメチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（4−メチルベンゾイル）アミノ］プロピル｝カルバメート33．4mg（理論値の48％）が得られた。
LC−MS（方法2）：Rt＝11．91分；MS（ESIpos）：m／z＝774（M＋Na）＋．
DMF1．0ml中9H−フルオレン−9−イルメチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（4−メチルベンゾイル）アミノ］プロピル｝カルバメート33．0mg（0．04mmol）をモルホリン20．0mg（0．23mmol）と一晩攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物9．6mg（理論値の34％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．01分；MS（ESIpos）：m／z＝530（M＋H）＋．
実施例220
トリフルオロ酢酸／N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−（メチルスルファニル）ベンズアミド（1：1）
9H−フルオレン−9−イルメチル−［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C67）50．0mg（0．07mmol）を最初にジクロロメタン2．0mlに装入し、トリエチルアミン22．3mg（0．22mmol）および4−（メチルスルファニル）ベンゾイルクロリド27．5mg（0．15mmol）を添加した。反応混合物を40℃で4時間攪拌し、さらなにトリエチルアミン10．2mg（0．10mmol）および4−（メチルスルファニル）ベンゾイルクロリド27．5mg（0．15mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。次いで、さらにトリエチルアミン14．9mg（0．15mmol）および4−（メチルスルファニル）ベンゾイルクロリド27．5mg（0．15mmol）を添加し、混合物を40℃で2時間攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、有機相を水で3回および飽和NaCl溶液で1回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物9H−フルオレン−9−イルメチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［4−メチルスルファニル）ベンゾイル］アミノ）プロピル］カルバメート39．8mg（理論値の76％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．59分；MS（ESIpos）：m／z＝785（M＋H）＋．
DMF1．0ml中9H−フルオレン−9−イルメチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［4−メチルスルファニル）ベンゾイル］アミノ）プロピル］カルバメート18．0mg（0．02mmol）をモルホリン10．0mg（0．12mmol）と一晩攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物6．2mg（理論値の40％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．99分；MS（ESIpos）：m／z＝562（M＋H）＋．
実施例221
トリフルオロ酢酸／（2S）−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシプロパンアミド（1：1）
9H−フルオレン−9−イルメチル−［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C67）40．0mg（0．06mmol）を最初にジクロロメタン2．0mlに装入し、トリエチルアミン9．6mg（0．10mmol）および（2S）−1−クロロ−1−オキソプロパン−2−イルアセテート14．3mg（0．10mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物（2S）−1−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（3−｛［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝プロピル）アミノ］−1−オキソプロパン−2−イルアセテート39．7mg（理論値の84％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．51分；MS（ESIpos）：m／z＝748（M＋H）＋．
DMF1．0ml中（2S）−1−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（3−｛［（9H−フルオレン−9−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝プロピル）アミノ］−1−オキソプロパン−2−イルアセテート37．0mg（0．05mmol）をモルホリン0．1mlおよび3滴の水と50℃で10時間攪拌した。さらにモルホリン0．1mlおよび水0．1mlを添加し、混合物を50℃で10時間攪拌した。炭酸カリウム20．5mg（0．15mmol）を添加し、室温で72時間攪拌した後、1N NaOH溶液0．1mlを添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物20．5mg（理論値の69％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝484（M＋H）＋．
実施例222
トリフルオロ酢酸／N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−（メチルスルファニル）アセトアミド（1：1）
2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C70）70．0mg（0．11mmol）を最初にDMF3．0mlに装入した。ナトリウムメタンチオレート15．5mg（0．22mmol）を添加し、反応混合物を50℃で2時間攪拌した。
反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［（メチルスルファニル）アセチル］アミノ）プロピル］カルバメート60．0mg（理論値の84％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．50分；MS（ESIpos）：m／z＝644（M＋H）＋．
2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［（メチルスルファニル）アセチル］アミノ）プロピル］カルバメート40．0mg（0．06mol）をトリフルオロエタノール2．0mlに溶解し、塩化亜鉛21．2mg（0．16mmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸45．4mg（0．01mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物34．6mg（理論値の91％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝500（M＋H）＋．
実施例223
トリフルオロ酢酸／（2S）−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシプロパンアミド（1：1）
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート40．0mg（0．08mmol）をジクロロメタン2．0mlに溶解し、トリエチルアミン19．7mg（0．20mmol）および（2S）−1−クロロ−1−オキソプロパン−2−イルアセテート29．4mg（0．20mmol）を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物（2S）−1−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝アミノ）−1−オキソプロパン−2−イルアセテート21．2mg（理論値の43％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．46分；MS（ESIpos）：m／z＝627（M＋H）＋．
（2S）−1−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛3−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝アミノ）−1−オキソプロパン−2−イルアセテート21．2mg（0．03mmol）をジクロロメタン1．0mlに溶解し、トリフルオロ酢酸77．1mg（0．68mmol）を添加し、混合物を室温で2時間攪拌した。さらに2回トリフルオロ酢酸さらに77．1mg（0．68mmol）を添加し、各場合で混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタンと繰り返し共蒸留し、次いで、高真空下で乾燥させた。物質トリフルオロ酢酸／（2S）−1−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−1−オキソプロパン−2−イルアセテート（1：1）を含む残渣をさらに精製することなくさらに反応させた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝527（M＋H）＋．
トリフルオロ酢酸／（2S）−1−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−1−オキソプロパン−2−イルアセテート（1：1）26．5mg（0．04mmol）をTHF／メタノール／水（1．0ml／1．0ml／0．05ml）に溶解し、炭酸カリウム17．2mgを添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水；0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物17．3mg（理論値の70％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝485（M＋H）＋．
実施例224
トリフルオロ酢酸／4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−4−オキソ酪酸メチル（1：1）
2−（トリメチルシリル）エチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C11の合成参照）60．0mg（0．11mmol）をジクロロメタン1．0mlに溶解し、ピリジン19．6mg（0．25mmol）および4−クロロ−4−オキソ酪酸メチル35．8mg（0．24mmol）を添加した。反応混合物を40℃で一晩撹拌した。さらにピリジン19．6mg（0．25mmol）および4−クロロ−4−オキソ酪酸メチル35．8mg（0．24mmol）を添加し、混合物を40℃で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物メチル11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラペンタデカン−15−オエート16．1mg（理論値の22％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．52分；MS（ESIpos）：m／z＝670（M＋H）＋．
メチル11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラペンタデカン−15−オエート16．1mg（0．02mmol）をトリフルオロエタノール1．0mlに溶解し、塩化亜鉛16．4mg（0．12mmol）を添加した。反応混合物を50℃で5時間撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸35．1mg（0．12mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物11．1mg（理論値の72％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝526（M＋H）＋．
実施例225
4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
トリフルオロ酢酸／4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−4−オキソ酪酸メチル（1：1）（実施例224）9．7mg（0．02mmol）を最初にTHF／メタノール／水（1．0ml／0．2ml／0．04ml）に装入し、水酸化リチウム一水和物1．3mg（0．03mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。水酸化リチウム一水和物さらに1．3mg（0．03mmol）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。HOAc3．6mg（0．06mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水；0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物5．4mg（理論値の57％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．90分；MS（ESIpos）：m／z＝512（M＋H）＋．
実施例226
（2R）−22−［（3R／S）−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル］−2−［（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）メチル−4，20−ジオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−3，19−ジアザドコサン−1−酸／トリフルオロ酢酸（1：2）
R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）（中間体F209）10．3mg（mmol）を最初にDMF／水（2．0ml／0．2ml）に装入し、L−システインを添加し、混合物を室温で10分間攪拌した。水を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水；0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物10．3mg（理論値の82％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．84分；MS（ESIpos）：m／z＝1092（M＋H）＋．
実施例227
トリフルオロ酢酸／4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド（2：1）
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C68）50．0mg（0．10mol）を最初にジクロロメタンに装入し、tert−ブチル［4−（クロロカルボニル）フェニル］カルバメート（中間体L71）54．9mg（0．22mmol）およびトリエチルアミン22．7mg（0．22mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、さらにtert−ブチル［4−（クロロカルボニル）フェニル］カルバメート（中間体L71）54．9mg（0．22mmol）およびトリエチルアミン22．7mg（0．22mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×40；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛4−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ベンゾイル｝アミノ）プロピル］カルバメート26．2mg（理論値の37％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝5．34分；MS（ESIpos）：m／z＝732（M＋H）＋．
tert−ブチル［3−（｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝｛4−［（tert−ブトキシカルボニル）アミノ］ベンゾイル｝アミノ）プロピル］カルバメート26．2mg（0．04mmol）をジクロロメタン2．0mlに溶解し、TFA204．1mg（1．79mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物3．4mg（理論値の13％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝532（M＋H）＋．
実施例228
N−アセチル−S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
2−（トリメチルシリル）エチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（クロロアセチル）アミノ］プロピル｝カルバメート（中間体C70）50．0mg（0．08mol）を重炭酸ナトリウム66．43mgを含む水0．30mlに懸濁した。1，8−ジアザビシクロ（5．4．0）ウンデカ−7−エン144．47（0．95mmol）およびN−アセチル−L−システイン51．62mg（0．32mmol）のイソプロパノール3．0ml中溶液を懸濁液に添加した。反応混合物を50℃で2．5時間撹拌した。水（0．1％TFA）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−アセチル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン55．2mg（理論値の92％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．41分；MS（ESIpos）：m／z＝759（M＋H）＋．
N−アセチル−S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）−L−システイン53．1mg（69．96μmol）をトリフルオロエタノール5．0mlに溶解し、塩化亜鉛57．2mg（419．76μmol）を添加した。反応混合物を50℃で4時間撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸122．67mg（0．42mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。これにより、標記化合物32．5mg（理論値の64％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．90分；MS（ESIpos）：m／z＝615（M＋H）＋．
実施例229
N−アセチル−S−［2−（［3−（L−アラニルアミノ）プロピル］｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−オキソエチル］−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
N−アセチル−S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）（実施例228）30．3mg（41．58μmol）をDMF1．5mlに溶解し、4−メチルモルホリン8．4mg（83．15μmol）および2，5−ジオキソピロリジン−1−イル−N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−アラニネート14．65mg（45．73μmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次いで、4−メチルモルホリンさらに8．4mg（83．15μmol）を添加した。もう一度、反応混合物を室温で一晩撹拌した。酢酸10．0mg（0．17mmol）を添加し、反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物N−アセチル−S−［2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−アラニル｝アミノ）プロピル］アミノ）−2−オキソエチル］−L−システイン31．2mg（理論値の92％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．22分；MS（ESIpos）：m／z＝820（M＋H）＋．
N−アセチル−S−［2−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［3−（｛N−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−L−アラニル｝アミノ）プロピル］アミノ）−2−オキソエチル］−L−システイン28．6mg（0．04mmol）をエタノール5．0mlに溶解し、パラジウム活性炭（10％）2．9mgを添加した。反応混合物を標準圧力および室温で一晩水素付加した。混合物をCeliteを通して濾過し、濾過ケークをエタノールの混合物で洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 250×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を凍結乾燥した。これにより、標記化合物17．4mg（理論値の62％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（ESIpos）：m／z＝686（M＋H）＋．
実施例230
トリフルオロ酢酸／（2S）−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝テトラヒドロフラン−2−カルボキサミド（1：1）
9H−フルオレン−9−イルメチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C67）100．0mg（0．16mmol）をトリエチルアミン71．9mg（0．71mmol）を含むジクロロメタン5．0mlに溶解し、新たに調製した（2S）−テトラヒドロフラン−2−カルボニルクロリド（調製：（2S）−テトラヒドロフラン−2−カルボン酸54．7mg（0．39mmol）を最初にトルエン0．7mlに装入し、塩化チオニル0．04mlを添加し、混合物を90℃で1時間攪拌した。冷却後、粗反応溶液をさらに反応させた）の溶液に滴加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、化合物9H−フルオレン−9−イルメチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［（2S）−テトラヒドロフラン−2−イルカルボニル］アミノ）プロピル］カルバメート44．3mg（理論値の38％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．52分；MS（ESIpos）：m／z＝776（M＋HCOOH−H）−．
9H−フルオレン−9−イルメチル［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝［（2S）−テトラヒドロフラン−2−イルカルボニル］アミノ）プロピル］カルバメート26．0mg（0．04mmol）をDMF2．6mlに溶解し、モルホリン0．26mlを添加した。反応混合物を室温で3時間撹拌した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。これにより、標記化合物11．7mg（理論値の53％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝510（M＋H）＋．
実施例231
3−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）プロパン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−14−チア−7，11−ジアザ−2−シラヘプタデカン−17−酸（中間体C69）53．9mg（0．08mmol）をトリフルオロエタノール4．0mlに溶解し、塩化亜鉛31．4mg（0．23mmol）を添加した。反応混合物を50℃で一晩撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸67．3mg（0．23mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。これにより、標記化合物34．2mg（理論値の66％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．91分；MS（ESIpos）：m／z＝558（M＋H）＋．
実施例232
S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝ホモシステイン／トリフルオロ酢酸（1：2）
S−（11−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，2−ジメチル−6，12−ジオキソ−5−オキサ−7，11−ジアザ−2−シラトリデカン−13−イル）ホモシステイン（中間体C11）40．0mg（47．3μmol）をトリフルオロエタノール3．0mlに溶解し、塩化亜鉛38．7mg（0．28μmol）を添加した。反応混合物を50℃で6時間撹拌した。エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸83mg（0．28mmol）を添加し、反応混合物を10分間攪拌し、次いで、水（0．1％TFA）を添加した。精製を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって直接行った。これにより、標記化合物32．4mg（理論値の84％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．81分；MS（ESIpos）：m／z＝587（M＋H）＋．
実施例233
トリフルオロ酢酸／4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド（2：1）
9H−フルオレン−9−イルメチル−［3−（｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）プロピル］カルバメート（中間体C67）73．0mg（0．12mmol）および4−ニトロベンゾイルクロリド27．8mg（0．15mmol）をジクロロメタン2．0mlに溶解し、トリエチルアミン15．2mg（0．15mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。同量の4−ニトロベンゾイルクロリドおよびトリエチルアミンを再度添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。これにより、化合物9H−フルオレン−9−イルメチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（4−ニトロベンゾイル）アミノ］プロピル｝カルバメート39．3mg（理論値の44％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．54分；MS（ESIpos）：m／z＝783（M＋H）＋．
フルオレン−9−イルメチル｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（4−ニトロベンゾイル）アミノ］プロピル｝カルバメート39．3mg（0．05mmol）をエタノール2．0mlに溶解し、水酸化パラジウム活性炭（20％）3．9mgを添加し、混合物を標準圧力で一晩水素化した。反応混合物を濾紙を通して濾過し、濾過ケークをエタノールで洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水、0．1％TFA）によって精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、標記化合物32．9mg（理論値の86％）が得られた。LC−MS（方法1）：Rt＝0．93分；MS（ESIpos）：m／z＝531（M＋H）＋．
実施例234A
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS500μl中セツキシマブ5mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F85 0．2mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1900μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．68mg／ml
薬物／mAb比：3．8
実施例234B
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS269μl中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F85 0．2mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液2130μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．57mg／ml
薬物／mAb比：3．7
実施例234I
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS500μl中ニモツズマブ5mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F85 0．2mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1900μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．93mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例234H
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS500μl中パニツムマブ5mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で4時間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F85 0．2mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに120分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1900μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：2．12mg／ml
薬物／mAb比：1．4
実施例235A
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS329μl中セツキシマブ5mg（c＝15．2mg／ml）に添加し、次いで、混合物を事前にpH8に調整したPBS緩衝液2021μlで希釈した。反応物を室温で1時間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F235 0．28mgを添加した。次いで、室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．5mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例235B
実施例235Aと同様に、PBS269μl中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）をPBS緩衝液pH8で希釈して2mg／mlの濃度にし、中間体F235とカップリングした。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：0．56mg／ml
薬物／mAb比：1．0
実施例235E
実施例235Aと同様に、PBS370μl中トラスツズマブ5mg（c＝14．5mg／ml）をPBS緩衝液pH8で希釈して2mg／mlの濃度にし、中間体F235とカップリングした。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．67mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例235I
実施例235Aと同様に、PBS382μl中ニモツズマブ5mg（c＝13．08mg／ml）をPBS緩衝液pH8で希釈して2mg／mlの濃度にし、中間体F235とカップリングした。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．81mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例235H
実施例235Aと同様に、PBS74μl中パニツムマブ5mg（c＝67．4mg／ml）をPBS緩衝液pH8で希釈して2mg／mlの濃度にし、中間体F235とカップリングした。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．14mg／ml
薬物／mAb比：0．9
実施例236A
実施例234Aと同様に、PBS500μl中セツキシマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F236とカップリングした。これらの条件下で、ADCのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．85mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例236B
実施例234Aと同様に、PBS500μl中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10mg／ml）を中間体F236とカップリングした。これらの条件下で、ADCのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．67mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例236E
実施例234Aと同様に、PBS500μl中トラスツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F236とカップリングした。これらの条件下で、ADCのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．67mg／ml
薬物／mAb比：3．9
実施例237A
アルゴン下で、TCEP0．344mgのPBS緩衝液100μl中溶液をPBS4000μl中セツキシマブ60mg（c＝15mg／ml）に添加した。反応物を室温で1時間攪拌し、次いで、DMSO600μlに溶解した中間体F104 3．04mg（0．003mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液15mlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。この溶液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、もう一度再濃縮した。これらの条件下で、ADCのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：13．78mg／ml
薬物／mAb比：4．8
実施例237B
アルゴン下で、TCEP0．287mgのPBS緩衝液500μl中溶液をPBS2688μl中抗TWEAKR AK−1 50mg（c＝18．6mg／ml）に添加し、次いで、混合物を事前にpH8に調整したPBS緩衝液8812μlで希釈した。反応物を室温で1時間攪拌し、次いで、DMSO500μlに溶解した中間体F104 2．894mg（0．003mmol）を添加した。次いで、室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。この溶液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、もう一度再濃縮した。これらの条件下で、ADCのいくつかは閉環型でも存在し得る。このバッチについて、開環型の割合は、合成直後に23％であると決定された。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：11．1mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例237I
実施例237Aと同様に、PBS4587μl中ニモツズマブ60mg（c＝13．08mg／ml）を中間体F209とカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：15．88mg／ml
薬物／mAb比：4．0
実施例238A
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS500μl中セツキシマブ5mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F238 0．22mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1900μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．89mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例238B
実施例238Aと同様に、PBS500μl中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10mg／ml）を中間体F238とカップリングした。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．66mg／ml
薬物／mAb比：3．1
これらのカップリング条件下で、ADCの26％が、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在していた。
実施例238E
実施例238Aと同様に、PBS500μl中トラスツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F238とカップリングした。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例239A
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS458μl中セツキシマブ5mg（c＝10．92mg／ml）に添加した。反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1892μlで希釈し、室温で1時間攪拌した。次いで、DMSO100μlに溶解した中間体F217 0．19mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．86mg／ml
薬物／mAb比：2．8
実施例239B
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS269μl中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）に添加した。反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液2081μlで希釈し、室温で1時間攪拌した。次いで、DMSO100μlに溶解した中間体F217 0．19mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．28mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例239I
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS382μl中ニモツズマブ5mg（c＝13．1mg／ml）に添加した。反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1968μlで希釈し、室温で1時間攪拌した。次いで、DMSO100μlに溶解した中間体F217 0．19mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．32mg／ml
薬物／mAb比：2．9
このADC調製について、89％の割合が開環スクシンアミド型と決定された。
実施例239H
アルゴン下で、TCEP0．048mgのPBS緩衝液83μl中溶液をPBS74μl中パニツムマブ5mg（c＝67．5mg／ml）に添加した。反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液2243μlで希釈し、室温で4時間攪拌した。次いで、DMSO100μlに溶解した中間体F217 0．19mg（0．00027mmol）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．33mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例240A
アルゴン下で、TCEP0．29mgのPBS緩衝液500μl中溶液をPBS4579μl中セツキシマブ50mg（c＝10．92mg／ml）に添加した。反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液7421μlで希釈し、室温で1時間攪拌した。次いで、DMSO500μlに溶解した中間体F213 1．4mg（0．0027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：15．63mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例240B
実施例239Aと同様に、PBS500μl中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10mg／ml）を中間体F213とカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：0．9mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例240E
実施例239Aと同様に、PBS500μl中トラスツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F213とカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．4mg／ml
薬物／mAb比：2．1
実施例241A
アルゴン下で、TCEP0．172mgのPBS緩衝液300μl中溶液をPBS3ml中セツキシマブ30mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO330μlに溶解した中間体F241 1．36mg（1．6μmol）を添加した。室温で20時間攪拌した後、反応物をPBS緩衝液1．37mlで希釈し、PBS緩衝液を用いてPD 10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）を通して溶出した。次いで、溶離液を超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、もう一度再濃縮した。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：9．98mg／ml
薬物／mAb比：3．3
実施例241B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10mg／ml）を中間体F241とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．39mg／ml
薬物／mAb比：3．9
実施例241E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F241とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．83mg／ml
薬物／mAb比：4．7
実施例241I
ここでは、PBS中ニモツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F241とのカップリングに使用した。TCEP還元後、一晩攪拌して抗体とのカップリングを行い、引き続いてSephadex精製によってさらに後処理した。Sephadex精製後に、反応物を超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．6mg／ml
薬物／mAb比：4．0
実施例242A
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS500μl中セツキシマブ5mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F242 0．22mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1900μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：2．7
実施例242B
実施例242Aに記載されるように、PBS500μl中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10mg／ml）を中間体F242 0．22mgとカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．54mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例242E
実施例242Aに記載されるように、PBS500μl中トラスツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F242 0．22mgとカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．76mg／ml
薬物／mAb比：3．6
実施例243A
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS500μl中セツキシマブ5mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F243 0．23mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1900μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．92mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例243B
実施例243Aに記載されるように、PBS500μl中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10mg／ml）を中間体F243 0．23mgとカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．63mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例243E
実施例243Aに記載されるように、PBS500μl中トラスツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F243 0．23mgとカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．8mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例243I
実施例243Aに記載されるように、PBS500μl中ニモツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F243 0．23mgとカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．87mg／ml
薬物／mAb比：3．1
実施例244A
ここでは、PBS中セツキシマブ5．0mg（c＝23．10mg／ml）を中間体F244とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：2．12mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例244B
ここでは、PBS中抗TWEAK AK−1 5．0mg（c＝18．60mg／ml）を中間体F244とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．65mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例244E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5．0mg（c＝13．50mg／ml）を中間体F244とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例244I
ここでは、PBS中ニモツズマブ5．0mg（c＝13．08mg／ml）を中間体F244とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。
タンパク質濃度：1．91mg／ml
薬物／mAb比：2．9
実施例245A
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS500μl中セツキシマブ5mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F245 0．24mg（0．00027mmol）を添加した。室温でさらに90分間攪拌した後、反応物を、事前にpH8に調整したPBS緩衝液1900μlで希釈した。
次いで、この溶液を、PBS緩衝液pH8で平衡化したPD10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）にアプライし、PBS緩衝液pH8で溶出した。溶離液をアルゴン下室温で一晩攪拌し、次いで、超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈した。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．69mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例245B
実施例245Aに記載されるように、PBS500μl中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10mg／ml）を中間体F245 0．24mgとカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．51mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例245E
実施例245Aに記載されるように、PBS500μl中トラスツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F245 0．24mgとカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．8mg／ml
薬物／mAb比：3．5
実施例245I
実施例245Aに記載されるように、PBS500μl中ニモツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F245 0．24mgとカップリングした。これらの条件下で、ADSのいくつかは閉環型でも存在し得る。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．65mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例246
4−［（2−｛［（2R）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−2−カルボキシエチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸および4−［（2−｛［（2R）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−2−カルボキシエチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−2−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
最初に、L−システインをN、N−ジイソプロピルエチルアミンの存在下、DMF中1−（｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝オキシ）ピロリジン−2，5−ジオンを用いてN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システインに変換した。
中間体F193 11mg（0．013mmol）およびN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システイン8mg（0．016mmol）をDMF3mlに溶解し、混合物を室温で20時間攪拌した。次いで、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。
適当な分画を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させ、次いで、残渣をTHF／水1：1 2mlに溶解した。2M水酸化リチウム水溶液19μlを添加し、反応物を室温で1時間攪拌した。次いで、2M水酸化リチウム水溶液さらに19μlを添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。次いで、混合物を1M塩酸で中和し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、位置異性体の保護された中間体4．1mg（理論値の38％）が無色泡として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．03分（ブロード）；MS（ESIpos）：m／z＝1020（M＋H）＋．
最後のステップで、この中間体4．1mg（0．004mmol）を2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛3ml（0．022mmol）を添加し、反応物を50℃で1時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸6mg（0．022mmol）および0．1％濃度トリフルオロ酢酸水溶液2mlを添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物5mg（定量的）が比20：80の位置異性体混合物として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．78分（ブロード）；MS（ESIpos）：m／z＝876（M＋H）＋．
LC−MS（方法5）：Rt＝2．36分および2．39分；MS（ESIpos）：m／z＝876（M＋H）＋．
実施例247A
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS500μl中セツキシマブ5mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F247 0．264mg（0．27μmol）を添加した。室温で20時間攪拌した後、反応物をPBS緩衝液1．9mlで希釈し、PBS緩衝液を用いてPD 10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）を通して溶出した。次いで、溶離液を超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、もう一度再濃縮した。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．66mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例247B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10mg／ml）を中間体F247とのカップリングに使用し、カップリングおよび後処理を実施例247Aに記載されるように行った。
タンパク質濃度：1．49mg／ml
薬物／mAb比：2．6
実施例247E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F247とのカップリングに使用し、カップリングおよび後処理を実施例247Aに記載されるように行った。
タンパク質濃度：1．67mg／ml
薬物／mAb比：2．3
実施例247I
ここでは、PBS中ニモツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F247とのカップリングに使用し、カップリングおよび後処理を実施例247Aに記載されるように行った。
タンパク質濃度：1．62mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例248A
ここでは、実施例5Aと同様に、PBS中セツキシマブ5mg（c＝10．92mg／ml）を中間体F248とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：2．06mg／ml
薬物／mAb比：3．8
実施例248B
ここでは、実施例5Bと同様に、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝18．6mg／ml）を中間体F248とのカップリングに使用し、反応物を、Sephadex精製後に、超遠心分離によって濃縮し、PBSで再希釈した。このように調製したADCのいくつかは、抗体に結合した加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在し得る。
タンパク質濃度：1．84mg／ml
薬物／mAb比：4．1
実施例249
S−｛1−［6−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）ヘキシル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F179 11mg（14μmol）をDMF2．2mlに溶解し、L−システイン3．3mg（27μmol）を添加した。反応混合物を室温で3時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮すると、残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥後、標記化合物7．3mg（理論値の58％）が無色泡として得られた。
LC−MS（方法4）：Rt＝1．04分；MS（EIpos）：m／z＝813［M＋H］＋．
実施例250
4−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）および4−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F85 10mg（0．013mmol）およびN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システイン5．3mg（0．02mmol）をDMF3mlに溶解し、混合物を室温で3日間攪拌した。次いで、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させ、次いで、残渣をTHF／水1：1 2mlに溶解した。2M水酸化リチウム水溶液9μlを添加し、反応物を室温で1時間攪拌した。次いで、反応物を1M塩酸で約pH3に調整し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取HPLCによって精製した。これにより、位置異性体の保護された中間体3mg（2ステップにわたって理論値の24％）が無色泡として得られた。
LC−MS（方法5）：Rt＝3．39分および3．43分；MS（ESIpos）：m／z＝919（M＋H）＋．
最後のステップで、この中間体3mg（0．0033mmol）を2，2，2−トリフルオロエタノール3mlに溶解した。塩化亜鉛2．2ml（0．016mmol）を添加し、反応物を50℃で3．5時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸4．8mg（0．016mmol）を添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物1mg（理論値の33％）が比43：34の位置異性体混合物として得られた。異性体混合物は23％のさらなる異性体（RT＝2．51）を含んでいた。
LC−MS（方法5）：Rt＝2．57分および2．62分；MS（ESIpos）：m／z＝775（M＋H）＋．
実施例251
S−（1−｛2−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エトキシ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F248 3mg（4μmol）をDMF2mlに溶解し、L−システイン0．9mg（8μmol）を添加した。反応混合物を室温で18時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を濃縮すると、残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥後、標記化合物1．1mg（理論値の32％）が白色固体として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．78分；MS（EIpos）：m／z＝801［M＋H］＋．
実施例252
（3R，7S）−7−アミノ−17−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−3−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−4−グリコロイル−2，2−ジメチル−8，16−ジオキソ−12−オキサ−4，9，15−トリアザノナデカン−19−酸／トリフルオロ酢酸（1：1）および（3R，7S）−7−アミノ−18−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−3−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−4−グリコロイル−2，2−ジメチル−8，16−ジオキソ−12−オキサ−4，9，15−トリアザノナデカン−19−酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
中間体F248の保護された中間体8mg（0．010mmol）およびN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システイン5．1mg（0．02mmol）をDMF3mlに溶解し、混合物を室温で18時間攪拌し、次いで、超音波浴で2時間処理した。次いで、混合物を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させ、次いで、残渣をTHF／水1：1 2mlに溶解した。2M水酸化リチウム水溶液15μlを添加し、反応物を室温で15分間攪拌した。次いで、反応物を1M塩酸で約pH3に調整し、塩化ナトリウム溶液20mlで希釈し、酢酸エチル20mlで2回抽出した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮し、残渣をアセトニトリル／水から凍結乾燥した。これにより、位置異性体の保護された中間体8．4mg（2ステップにわたって理論値の78％）が無色泡として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝1．44分および3．43分；MS（ESIpos）：m／z＝1107（M＋H）＋．
最後のステップで、この中間体8mg（0．007mmol）を2，2，2−トリフルオロエタノール5mlに溶解した。塩化亜鉛9．8ml（0．072mmol）を添加し、反応物を50℃で1．5時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸を添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物4mg（理論値の59％）が比31：67の位置異性体混合物として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．79分および0．81分；MS（ESIpos）：m／z＝819（M＋H）＋．
実施例253
4−（｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝アミノ）−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）および4−（｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝アミノ）−2−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
異性体の標記化合物を中間体F84およびN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システインから実施例250と同様に調製した。
実施例254A
アルゴン下で、TCEP0．029mgのPBS緩衝液50μl中溶液をPBS500μl中セツキシマブ5mg（c＝10mg／ml）に添加した。反応物を室温で30分間攪拌し、次いで、DMSO50μlに溶解した中間体F254 0．264mg（0．27μmol）を添加した。室温で20時間攪拌した後、反応物をPBS緩衝液1．9mlで希釈し、PBS緩衝液を用いてPD 10カラム（Sephadex（登録商標）G−25、GE Healthcare）を通して溶出した。次いで、溶離液を超遠心分離によって濃縮し、PBS緩衝液（pH7．2）で再希釈し、もう一度再濃縮した。得られたADCバッチを以下の通り特徴付けた：
タンパク質濃度：1．74mg／ml
薬物／mAb比：2．2
実施例254B
ここでは、PBS中抗TWEAKR AK−1 5mg（c＝10mg／ml）を中間体F254とのカップリングに使用し、カップリングおよび後処理を実施例254Aに記載されるように行った。
タンパク質濃度：1．8mg／ml
薬物／mAb比：2．5
実施例254E
ここでは、PBS中トラスツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F254とのカップリングに使用し、カップリングおよび後処理を実施例254Aに記載されるように行った。
タンパク質濃度：1．74mg／ml
薬物／mAb比：2．4
実施例254I
ここでは、PBS中ニモツズマブ5mg（c＝10mg／ml）を中間体F254とのカップリングに使用し、カップリングおよび後処理を実施例254Aに記載されるように行った。
タンパク質濃度：1．73mg／ml
薬物／mAb比：2．0
実施例255
（2R，28R）−28−アミノ−2−［（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）メチル］−25−（カルボキシメチル）−4，20，24−トリオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−26−チア−3，19，23−トリアザノナコサン−1，29−二酸／トリフルオロ酢酸（1：2）および
（1R，28R，34R）−1−アミノ−33−（3−アミノプロピル）−34−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−35，35−ジメチル−6，10，26，32−テトラオキソ−14，17，20，23−テトラオキサ−3，30−ジチア−7，11，27，33−テトラアザヘキサトリアコンタン−1，4，28−トリカルボン酸／トリフルオロ酢酸（1：2）
R−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−N−［19−（2，5−ジオキソ−2，5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−L−システイン／トリフルオロ酢酸（1：1）（中間体F209）20mg（0．018mmol）およびN−｛［2−（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝−L−システイン9．78mg（0．036mmol）をDMF2mlに溶解し、混合物を室温で18時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣（47．7mg）をTHF／水1：1 3mlに溶解した。2M水酸化リチウム水溶液0．08mlを添加し、反応物を室温で1時間攪拌した。次いで、酢酸9．26mg（0．15mmol）を用いて反応物を約pH7に調整した。反応混合物を分取RP−HPLC（カラム：Reprosil 125×30；10μ、流量：50ml／分、MeCN／水；0．1％TFA）によって直接精製した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。これにより、位置異性体の保護された中間体15．3mg（2ステップにわたって29％）が得られた。
LC−MS（方法6）：Rt＝12．26分および12．30分；MS（ESIpos）：m／z＝1254（M＋H）＋．
最後のステップで、この中間体15．3mg（0．01mmol）を2，2，2−トリフルオロエタノール2mlに溶解した。塩化亜鉛6．1ml（0．05mmol）を添加し、反応物を50℃で2時間攪拌した。次いで、エチレンジアミン−N，N，N’，N’−四酢酸13．1mg（0．05mmol）を添加し、生成物を分取HPLCによって精製した。適当な分画の濃縮および残渣のアセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物11．9mg（79．5％）が位置異性体混合物として得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．85分；MS（ESIpos）：m／z＝1110（M＋H）＋．
実施例256
（3R）−6−｛（11S，15R）−11−アミノ−15−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−14−グリコロイル−16，16−ジメチル−2，5，10−トリオキソ−3，6，9，14−テトラアザヘプタデカ−1−イル｝−5−オキソチオモルホリン−3−カルボン酸／トリフルオロ酢酸（1：1）
実施例135の化合物4mg（0．004mmol）をTHF／水4mlに溶解し、2モル濃度水酸化リチウム水溶液48μlを添加した。反応物を室温で1時間攪拌し、次いで、濃縮し、分取HPLCによって精製した。適当な分画を合わせ、濃縮し、アセトニトリル／水からの凍結乾燥により、標記化合物2．4mg（理論値の60％）が得られた。
LC−MS（方法1）：Rt＝0．86分；MS（EIpos）：m／z＝814［M＋H］＋．
C．生物学的有効性の評価
本発明による化合物の生物学的活性を下記アッセイで示すことができる：
m．C−1a TWEAKRに向けられたADCの細胞毒性効果の測定
抗TWEAKR−ADCの細胞毒性効果の分析を種々の細胞株で行った：
NCI−H292：ヒト粘表皮肺癌細胞、ATCC−CRL−1848、標準培地：RPMI 1640（Biochrom；＃FG1215、安定剤グルタミン）＋10％FCS（Biochrom；S0415）、TWEAKR陽性、EGFR陽性。
BxPC3：ヒト膵癌細胞、ATCC−CRL−1687、標準培地：RPMI 1640（Biochrom；＃FG1215、安定剤グルタミン）＋10％FCS（Biochrom；S0415）、TWEAKR陽性。
KPL4：ヒト乳癌細胞、標準培地：RPMI 1640＋GlutaMAX I＋10％FBS、cell bank，Bayer Pharma AG（DSMZで2012年7月19日に同一性をチェックおよび確認した）、ベルリン、ERBB2陽性。
細胞を、それぞれの細胞株についてアメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）で指示される標準的方法によって培養する。
MTTアッセイ
AccutaseのPBS（Biochrom AG ＃L2143）中溶液を用いて細胞を剥離し、ペレット化し、培養培地に再懸濁し、計数し、白色底を有する96ウェル培養プレート（Costar＃3610）に蒔き（使用する細胞に応じて100μl／ウェルで1000〜2000個の細胞）、37℃および5％二酸化炭素でインキュベーター中でインキュベートすることによって試験を行う。48時間後、抗体薬物複合体を10−5M〜10−13Mの濃度で培養培地10μl中で細胞に添加し（3連）、37℃および5％二酸化炭素でインキュベーター中でインキュベートする。72時間後、MTTアッセイ（ATCC、Manassas、Virginia、米国、カタログ番号30−1010K）を用いて増殖を検出する。選択されたインキュベーション時間の終わりに、MTT試薬を細胞と4時間インキュベートし、引き続いて界面活性剤を添加して細胞を一晩溶解した。形成した色素を570nmで検出した。試験物質で処理していないが、それ以外は同一に処理した細胞の増殖を100％の数字として定義した。
CTGアッセイ
細胞を、C−1で列挙されている増殖培地を用いて標準的方法により培養した。トリプシン（0．05％）およびEDTA（0．02％）のPBS（Biochrom AG ＃L2143）中溶液を用いて細胞を剥離し、ペレット化し、培養培地に再懸濁し、計数し、白色底を有する96ウェル培養プレート（Costar＃3610）に蒔き（75μ／ウェル、以下の細胞数は1ウェル当たりとする：NCI−H292：2500個細胞／ウェル、BxPC3 2500個細胞／ウェル）、37℃および5％二酸化炭素でインキュベーター中でインキュベートすることによって試験を行った。24時間後、抗体薬物複合体を培養培地25μl（4倍濃縮）中細胞に添加して、細胞に対して最終抗体薬物複合体濃度3×10−7M〜3×10−11Mとした（3連）。次いで、細胞を37℃および5％二酸化炭素でインキュベーター中でインキュベートした。平行プレートで、活性化合物処理開始時（0日）の細胞活性を、Cell Titer Glow（CTG）発光細胞生存率アッセイ（Promega＃G7573および＃G7571）を用いて測定した。このために、1細胞バッチ当たり基質100μlを添加し、次いで、プレートをアルミ箔で覆い、プレート振盪機において180rpmで2分間振盪し、実験室ベンチで8分間静置させ、次いで、ルミノメータ（Victor X2、Perkin Elmer）を用いて測定した。基質は、その強度が細胞の生存率に正比例する発光シグナルを生成している生存細胞のATP含有量を検出する。次いで、抗体薬物複合体と72時間インキュベーションした後、これらの細胞の生存率を上記のようにCell Titer Glow発光細胞生存率アッセイを用いて測定した。測定したデータから、増殖抑制のIC50を、DRC（用量反応曲線）分析スプレッドシートおよび4パラメータ当てはめを用いて0日目との比較で計算した。DRC分析スプレッドシートは、IDBS E−WorkBook Suiteプラットホーム（IDBS：ID Business Solutions Ltd．、Guildford、英国）でBayer Pharma AGおよびBayer Business Servicesによって開発されたbiobookスプレッドシートである。
表1a、1bおよび1cはこのアッセイからの抗TWEAKR抗体を用いた代表的な実施例のIC50値を表にしている。
報告される活性データは、本実験節で記載される実施例に関連し、薬物／mAB比を示している。値は異なる薬物／mAB比でおそらく逸れ得る。IC50値は、いくつかの独立した実験の平均値または個々の値である。TWEAKR抗体薬物複合体の作用は、それぞれのリンカーおよび担毒体を含むそれぞれのアイソタイプ対照について選択的であった。
以下の表2は、MTTアッセイからのセツキシマブ抗体を用いた代表的な実施例のIC50値を表にしている。
報告される活性データは、本実験節で記載される実施例に関連し、薬物／mAB比を示している。値は異なる薬物／mAB比でおそらく逸れ得る。IC50値は、いくつかの独立した実験の平均値または個々の値である。セツキシマブ抗体薬物複合体の作用は、それぞれのリンカーおよび担毒体を含むそれぞれのアイソタイプ対照について選択的であった。
以下の表3は、MTTアッセイからのトラスツズマブ抗体を用いた代表的な実施例のIC50値を表にしている。
報告される活性データは、本実験節で記載される実施例に関連し、薬物／mAB比を示している。値は異なる薬物／mAB比でおそらく逸れ得る。IC50値は、いくつかの独立した実験の平均値または個々の値である。トラスツズマブ抗体薬物複合体の作用は、それぞれのリンカーおよび担毒体を含むそれぞれのアイソタイプ対照について選択的であった。
C−1b選択された実施例によるキネシン紡錘体タンパク質KSP／Eg5の阻害の測定
ヒトキネシン紡錘体タンパク質KSP／Eg5（tebu−bio／Cytoskeleton Inc製、番号027EG01−XL）のモータードメインを、15mM PIPES、pH6．8（5mM MgCl2および10mM DTT、Sigma製）中室温で5分間、50μg／mlタキソール（Sigma製番号T7191−5MG）安定化微小管（ウシまたはブタ、tebu−bio／Cytoskeleton Inc製）と共に10nMの濃度でインキュベートする。新たに調製した混合物を384ウェルMTPに分割する。次いで、1．0×10−6M〜1．0×10−13Mの濃度の試験する阻害剤およびATP（最終濃度500μM、Sigma製）を添加する。インキュベーションは室温で2時間とする。マラカイトグリーン（Biomol製）を用いて形成した無機リン酸を検出することによって、ATPアーゼ活性を検出する。試薬を添加した後、620nmの波長での吸収の検出前に、アッセイを室温で50分間インキュベートする。モナストロールおよびイスピネシブ（Adooq A10486製）を陽性対照として使用する。用量−活性曲線の個々のデータは8回測定回数とする。IC50値は3つの独立した実験の平均値とする。100％対照は、阻害剤で処理していない試料とした。
以下の表4は、記載されるアッセイからの代表的な実施例のIC50値を要約している：代表的な様式では、これらは記載される担毒体およびADC方法の標的で高い有効性を確認している。
報告される活性データは、本実験節で記載される実施例に関連する。
C−2内部移行アッセイ
内部移行は、抗体薬物複合体（ADC）を介した抗原発現がん細胞における細胞毒性ペイロードの特異的かつ有効な提供を可能にする重要な過程である。この過程を、特異的TWEAKR抗体およびアイソタイプ対照抗体（M014）の蛍光標識を介して監視する。最初に、蛍光色素を抗体のリジンと結合する。結合は、2倍モル過剰のCypHer 5EモノNHSエステル（Batch 357392、GE Healthcare）を用いてpH8．3で行う。カップリング後、反応混合物を4℃で一晩透析によって分離して（sSlide−A−Lyser Dialysis Cassettes MWCD 10kD、Pierce製）、過剰の色素を除去し、pHを調整し、次いで、タンパク質溶液を濃縮する（VIVASPIN 500、Sartorius stedim biotec製）。抗体の色素負荷の測定は、分光光度分析（NanoDrop）およびその後の計算（D：P＝A色素εタンパク質：（A280−0．16A色素）ε色素）による。ここで調べるTWEAKR抗体およびアイソタイプ対照の色素負荷は、比較可能な程度であった。細胞結合アッセイで、結合が抗体の親和性の変化をもたらさなかったことが確認される。
標識抗体を内部移行アッセイに使用する。処理の開始前に、細胞（2×104個／ウェル）を96ウェルMTP（平ら、黒色、透明底番号4308776、Applied Biosystems製）の100μl培地に蒔く。37℃／5％CO2で18時間のインキュベーション後、培地を交換し、標識抗TWEAKR抗体を異なる濃度（10、5、2．5、1、0．1μg／ml）で添加する。同じ処理プロトコルを標識アイソタイプ対照（陰性対照）にも適用する。選択するインキュベーション時間は0、0．25時間、0．5時間、1時間、1．5時間、2時間、3時間、6時間および24時間とする。InCellanalyser 1000（GE Healthcare製）を用いて、蛍光測定を行う。これに引き続いて、パラメータ顆粒数／細胞および総顆粒強度／細胞の測定を介して速度論的評価をした。
TWEAKRとの結合後、TWEAKR抗体を内部移行能力について調べた。この目的のために、TWEAKR発現レベルが異なる細胞を選択した。標的媒介特異的内部移行がTWEAKR抗体で観察された一方で、アイソタイプ対照は内部移行を示さなかった。
C−3細胞透過性を測定するためにインビトロ試験
物質の細胞透過性を、Caco−2細胞を用いたフラックスアッセイでのインビトロ試験によって調査することができる［M．D． TroutmanおよびD．R． Thakker、Pharm．Res．20（8）、1210〜1224（2003）］。この目的のために、細胞を24ウェルフィルタープレートで15〜16日間培養した。透過性を測定するために、それぞれの実施例をHEPES緩衝液中で細胞の頂端に（A）または基底に（B）適用し、2時間インキュベートした。0時間後および2時間後に、試料をシスおよびトランスコンパートメントから採取した。試料を逆相カラムを用いてHPLC（Agilent 1200、Boblingen、ドイツ）によって分離した。HPLCシステムをTurbo Ion Spray Interfaceを介して三連四重極型質量分析計API 4000（Applied Biosystems Applera、Darmstadt、ドイツ）と連結した。透過性を、Schwabら［D．Schwabら、J．Med．Chem．46、1716〜1725（2003）］によって公開されている式を用いて計算されるPapp値に基づいて評価した。Papp（B−A）対Papp（A−B）の比（流出比）が2より大きいまたは0．5より小さい場合に、物質を活発に輸送されると分類した。
細胞内に放出される担毒体にとって極めて重要なのは、BからAへの透過性［Papp（B−A）］およびPapp（B−A）対Papp（A−B）の比（流出比）である：この透過性が低いほど、Caco−2細胞の単層を通した物質の能動および受動輸送過程が遅くなる。さらに、流出比が能動輸送を示さない場合、物質は、細胞内放出後、細胞内に長く残り得る。よって、生化学標的（この場合：キネシン紡錘体タンパク質、KSP／Eg5）との相互作用に利用可能なより多くの時間がある。
以下の表5は、このアッセイからの代表的な実施例についての透過性データを示している：
C−4 P−糖タンパク質（P−gp）についての基質特性を決定するためのインビトロ試験
多くの腫瘍細胞は、薬物のための輸送体タンパク質を発現しており、これはしばしば細胞増殖抑制剤に対する耐性の発達を伴う。そのため、P−糖タンパク質（P−gp）またはBCRPなどの、このような輸送体タンパク質の基質でない物質は、改善した活性プロファイルを示すことができるだろう。
P−gp（ABCB1）についての物質の基質特性を、P−gpを過剰発現しているLLC−PK1細胞（L−MDR1細胞）を用いてフラックスアッセイによって決定した［［A．H．Schinkelら、J．Clin．Invest．96、1698〜1705（1995）］。この目的のために、LLC−PK1細胞またはL−MDR1細胞を96ウェルフィルタープレートで3〜4日間培養した。透過性を測定するために、単独で、または阻害剤（例えば、イベルメクチンまたはベラパミルなど）の存在下で、それぞれの試験物質を、HEPES緩衝液中で細胞の頂端に（A）または基底に（B）適用し、2時間インキュベートした。0時間後および2時間後に、試料をシスおよびトランスコンパートメントから採取した。試料を逆相カラムを用いてHPLCによって分離した。HPLCシステムをTurbo Ion Spray Interfaceを介して三連四重極型質量分析計API 3000（Applied Biosystems Applera、Darmstadt、ドイツ）と連結した。透過性を、Schwabら［D．Schwabら、J．Med．Chem．46、1716〜1725（2003）］によって公開されている式を用いて計算されるPapp値に基づいて評価した。Papp（B−A）対Papp（A−B）の流出比が2より大きい場合に、物質をP＝gp基質と分類した。
P−gp基質特性を評価するためのさらなる基準として、L−MDR1およびLLC−PK1細胞の流出比または阻害剤の存在もしくは非存在下での流出比を比較することができる。これらの値が2倍超異なる場合、当の物質はP−gp基質である。
C−5薬物速度論
C5a：インビトロ内部移行後のADC代謝産物の同定
方法の説明：
免疫複合体を用いた内部移行試験を行って、細胞内で形成された代謝産物を分析する。このために、ヒト肺腫瘍細胞NCI H292（3×105個／ウェル）を6ウェルプレートに蒔き、一晩（37℃、5％CO2）インキュベートする。細胞を10μg／mlの試験するADCで処理する。内部移行を37℃および5％CO2で行う。種々の時点（0、4、24、48、72時間）で、細胞試料をさらなる分析のために採取する。最初に、上清（約5ml）を採取し、遠心分離（2分、室温、1000rpm Heraeus Variofuge 3．0R）後に、−80℃で保管する。細胞をPBSで洗浄し、Accutaseで剥離し、細胞数を測定する。さらに洗浄した後、規定の数の細胞（2×105個）を溶解緩衝液（Mammalian Cell Lysis Kit（Sigma MCL1）100μlで処理し、Protein LoBindチューブ（エッペンドルフカタログ番号0030 108．116）中で連続的に振盪して（Thermomixer、15分、4℃、650rpm）インキュベートする。インキュベーション後、溶解物を遠心分離し（10分、4℃、12000g、エッペンドルフ5415R）、上清を採取する。得られた上清を−80℃で保管する。次いで、全ての試料を以下の通り分析する。
培養物上清または細胞溶解液中の化合物の測定を、三連四重極質量分析計（MS）と連結した高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）によってメタノールまたはアセトニトリルによるタンパク質の沈殿後に行う。
血漿50μlを後処理するために、沈殿試薬（一般的にアセトニトリル）150μlを添加し、混合物を10秒間振盪する。沈殿試薬は、適当な濃度（一般的には20〜100ng／mlの範囲）の内部標準（ISTD）を含んでいる。16000gでの3分間の遠心分離後、上清をオートサンプラーバイアルに移し、移動相に適した緩衝液500μlで仕上げ、再度振盪する。
次いで、2つのマトリックス試料を、AB SCIEX Deutschland GmbH製のHPLC連結三連四重極質量分析計API6500を用いて測定する。
較正のために、0．5〜2000μg／lの濃度を血漿試料に添加する。検出限界（LOQ）は約2μg／lである。直線範囲は2〜1000μg／lに広がる。
腫瘍試料の較正のために、0．5〜200μg／lの濃度を未処理腫瘍の上清に添加する。検出限界は4μg／lである。直線範囲は4〜200μg／lに広がる。
試験有効性のための品質管理は5および50μg／lを含む。
NCI−H292細胞をそれぞれ10μg／mlの実施例104b、119b、155b、165bおよび173bからのADCと共にインキュベートした。72時間後、細胞をPBSで洗浄し、溶解し、急速冷凍した（−80℃）。上記方法を用いて、細胞溶解液および細胞培養上清を後処理し、抽出後、以下の代謝産物を同定し、定量化した：
NCI−H292細胞をそれぞれ10μg／mlの実施例179a、226a、85bおよび208bからのADCと共にインキュベートした。72時間後、細胞をPBSで洗浄し、溶解し、急速冷凍した（−80℃）。上記方法を用いて、細胞溶解液および細胞培養上清を後処理し、抽出後、以下の代謝産物を同定し、定量化した：
C5b：インビボのADC代謝産物の同定
3〜30mg／kgの異なるADCの静脈内投与後、ADCおよび生じた代謝産物の血漿および腫瘍濃度を測定することができ、クリアランス（CL）、曲線下面積（AUC）および半減期（t1／2）などの薬物動態パラメータを計算することができる。
生じた代謝産物の定量化のための分析
血漿および腫瘍中の化合物の測定を、三連四重極質量分析計（MS）と連結した高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）によってメタノールまたはアセトニトリルによるタンパク質の沈殿後に行う。
血漿50μlを後処理するために、沈殿試薬（一般的にアセトニトリル）250μlを添加し、混合物を10秒間振盪する。沈殿試薬は、適当な濃度（一般的には20〜100ng／mlの範囲）の内部標準（ISTD）を含んでいる。16000gでの3分間の遠心分離後、上清をオートサンプラーバイアルに移し、移動相に適した緩衝液500μlで仕上げ、再度振盪する。
腫瘍の後処理中、後者を3倍の量の抽出緩衝液で処理する。抽出緩衝液は、組織タンパク質抽出試薬（Pierce、Rockford、IL）50ml、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、ドイツ）2ペレット、および1mMの最終濃度のフェニルメチルスルホニルフルオリド（Sigma、St．Louis、MO）を含む。試料を最大ストローク数でTissuelyser II（Qiagen）中20分間2回ホモジナイズする。ホモジネート50μlをオートサンプラーバイアルに移し、ISTDを含むメタノール150μlで仕上げる。16000gでの3分間の遠心分離後、上清10μlを移動相に適した緩衝液180μlで仕上げ、再度振盪する。次いで、腫瘍試料の測定の準備をする。
次いで、2つのマトリックス試料を、AB SCIEX Deutschland GmbH製のHPLC連結三連四重極質量分析計API6500を用いて測定する。
較正のために、0．5〜2000μg／lの濃度を血漿試料に添加する。検出限界（LOQ）は約2μg／lである。直線範囲は2〜1000μg／lに広がる。
腫瘍試料の較正のために、0．5〜2000μg／lの濃度を未処理腫瘍の上清に添加する。検出限界は5μg／lである。直線範囲は5〜200μg／lに広がる。
試験有効性のための品質管理は5および50μg／l、血漿ではさらに500μg／lを含む。
NCI−H292の異種移植モデルからの対照群に実施例119bおよび104bのADC 10mg／kgを投与した後、マウスを24時間後に屠殺し、血液を取り出し、腫瘍を単離した。上記方法を用いて、血漿および腫瘍試料を後処理し、抽出後、以下の代謝産物を同定し、定量化した：
使用した抗体の定量化のための分析
ADCの抗体部分を、血漿試料および腫瘍溶解物中の総IgG濃度としてリガンド結合アッセイ（ELISA）を用いて測定した。ここでは、サンドイッチELISAフォーマットを使用した。このELISAは、血漿および腫瘍試料での測定について適格とされ、有効と認められていた。ELISAプレートを抗ヒトヤギIgG Fc抗体でコーティングした。試料とのインキュベーション後、プレートを洗浄し、シミアン抗ヒトIgG（H＋L）抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の検出複合体とインキュベートした。さらなる洗浄ステップの後、HRP基質をOPDに添加し、490nmでの吸収を通して発色を監視した。既知のIgG濃度を有する標準試料を4パラメータ方程式を用いて当てはめた。定量下限（LLOQ）および定量上限（ULOQ）内で、未知の濃度を内挿によって決定した。
C−6 インビボ活性試験
本発明による複合体の活性を、例えば、異種移植モデルを用いて試験した。当業者であれば、本発明による化合物の活性を試験することを可能にする先行技術の方法に精通している（例えば、国際公開第2005／081711号パンフレット；Polsonら、Cancer Res．2009年3月15日；69（6）：2358〜64参照）。このために、結合剤の標的分子を発現している腫瘍細胞株を齧歯動物（例えば、マウス）に埋め込んだ。次いで、本発明による複合体、アイソタイプ対照複合体、対照抗体または等張食塩水をインプラント動物に投与した。投与は1回または2回以上行った。数日間のインキュベーション時間後、複合体処理動物と対照群を比較することによって、腫瘍サイズを測定した。複合体処理動物は小さい腫瘍サイズを示した。
C−6a．マウスにおける実験腫瘍の成長阻害／退縮
抗体薬物複合体にとっての抗原を発現しているヒト腫瘍細胞を、免疫抑制マウス、例えば、NMRiヌードまたはSCIDマウスの側腹部に皮下接種する。100万〜1000万個の細胞を細胞培養物から剥離し、遠心分離し、培地または培地／マトリゲルに再懸濁する。細胞懸濁液をマウスの皮膚の下に注射する。
数日以内に、腫瘍が成長する。約40mm2の腫瘍サイズで、腫瘍が定着した後、処理を開始する。大きな腫瘍に対する効果を調べるために、50〜100mm2の腫瘍サイズでのみ処理を開始することができる。
ADCによる処理を静脈内経路を介してマウスの尾静脈に行う。ADCを5ml／kgの体積で投与する。
処理プロトコルは抗体の薬物動態に依存する。標準として、処理を4日おきに連続して3回行う。迅速な評価のために、単独処理でのプロトコルを使用することができる。しかしながら、処理を継続してもよいし、または3回の処理日の第2のサイクルを後に続けてもよい。
標準として、1処理群当たり8匹の動物を使用する。活性物質を投与する群に加えて、1群を、対照群として、同じプロトコルにより、緩衝液でのみ処理する。
実験中、腫瘍面積を、ノギスを用いて二次元（長さ／幅）で定期的に測定する。腫瘍面積を長さ×幅として測定する。処理群の平均腫瘍面積と対照群の平均腫瘍面積の比をT／C面積とする。
処理の終了後、全実験群を同時に終わらせ、腫瘍を取り出し、秤量することができる。処理群の平均腫瘍重量と対照群の平均腫瘍重量の比をT／C重量とする。
C−6b．反復処理でのNCI−H292腫瘍モデルにおける抗EGFR抗体薬物複合体の有効性
100万個のNCI−H292細胞を雌NMRIヌードマウス（Janvier）の側腹部に皮下接種する。7日目の35mm2の腫瘍サイズで、3または10mg／kgの投与量で静脈内に処理を開始する（7、11、15日）。処理後、腫瘍成長を最大105日目まで監視する。
実施例01aおよび02aによる抗体薬物複合体による処理は、ビヒクルおよびアイソタイプ対照群と比べて、腫瘍の成長の著しい阻害をもたらす。最初に投与量と独立に、ほとんどの腫瘍の退縮がある。表6は、35日目に腫瘍面積を介して決定されたT／C面積値を示している。対照複合体（関連のない抗原に対するアイソタイプ抗体）による処理は、著しく弱い腫瘍成長阻害作用をもたらす。非複合抗体による処理も同様に成長の阻害をもたらすが、これは抗体薬物複合体の場合より小さかった。
C−6c．単独処理でのNCI−H292腫瘍モデルにおける抗EGFR抗体薬物複合体の有効性
100万個のNCI−H292細胞を雌NMRIヌードマウス（Janvier）の側腹部に皮下接種する。9日目の約37mm2の腫瘍サイズで、動物を3mg／kgのADCまたは2．5mg／kgの担毒体A（N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド）または担毒体B（N−［（3R）−3−アミノ−4−フルオロブチル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド）の用量で1回処理する。処理後、腫瘍成長を最大25日目まで監視する。
実施例35Aおよび02Aによる抗体薬物複合体による処理は、対照群と比べて、腫瘍の成長の著しい阻害をもたらす。3mg／kgでの処理中、ほとんどの腫瘍の退縮がある。表7は、25日目に腫瘍重量および腫瘍面積について決定されたT／C値を示している。ここで、抗体薬物複合体35Aは、セツキシマブおよび担毒体Aまたは担毒体Bよりも優れた有効性を示している。
C−6d．単独処理でのNCI−H292腫瘍モデルにおける抗EGFRおよび抗TWEAKR抗体薬物複合体の有効性
100万個のNCI−H292細胞を雌NMRIヌードマウス（Janvier）の側腹部に皮下接種する。7日目の37mm2の腫瘍サイズで、処理を、3または10mg／kgの抗体薬物複合体の用量で静脈内に1回行う。処理後、腫瘍成長を最大24日目まで監視する。
抗TWEAKR抗体薬物複合体02Bによる単独処理は、対照群および非複合抗TWEAKR抗体と比べて、腫瘍の成長の著しく、持続性の阻害をもたらす。表8は、24日目に腫瘍重量および腫瘍面積について決定されたT／C値を示している。
C−6e．反復処理でのBxPC3腫瘍モデルにおける抗TWEAKR抗体薬物複合体の有効性
200万個のBxPC3細胞を雌NMRIヌードマウス（Janvier）の側腹部に皮下接種する。10日目の45mm2の腫瘍サイズで、10mg／kgの投与量で静脈内に処理を開始する（10、14、18日）。処理後、腫瘍成長を最大42日目まで監視する。
実施例07B、08B、12B、15Bおよび46Bによる抗体薬物複合体による処理は、対照群と比べて、腫瘍の成長の著しい阻害をもたらす。表9は、42日目に腫瘍重量および腫瘍面積について決定されたT／C値を示している。それぞれの対照複合体（関連のない抗原に対するアイソタイプ抗体）による処理は、著しく弱い腫瘍成長阻害作用をもたらす。非複合抗体による処理も同様にいくつかの場合で、腫瘍の成長の弱い阻害をもたらす。
C−6f．単独処理でのNCI−H292腫瘍モデルにおける抗TWEAKR抗体薬物複合体の有効性（2つの独立した実験）
両実験で、100万個のNCI−H292細胞を雌NMRIヌードマウス（Janvier）の側腹部に皮下接種する。10日目（実験1）および8日目（実験2）の45mm2の腫瘍サイズで、処理を、3mg／kgの抗体薬物複合体の用量で静脈内に1回行う。処理後、腫瘍成長を最大18日目（実験1）または24日目（実験2）まで監視する。
実験1の抗TWEAKR抗体薬物複合体02B、07Bおよび08Bによる単独処理は、対照群および非複合抗TWEAKR抗体と比べて、腫瘍の成長の著しい阻害をもたらす。表10（実験1）は、18日目に腫瘍重量および腫瘍面積について決定されたT／C値を示している。実験2の抗TWEAKR抗体薬物複合体155B、173B、165Bおよび085Bによる単独処理も同様に、対照群およびそれぞれのアイソタイプ対照（未記載）と比べて、腫瘍の成長の著しい阻害をもたらす。表11（実験2）は、24日目に腫瘍面積について決定されたT／C値を示している。
C−6g．反復処理でのA375腫瘍モデルにおける抗TWEAKR抗体薬物複合体の有効性
500万個のA375（ヒト黒色腫）細胞を雌NMRIヌードマウス（Janvier）の側腹部に皮下接種する。10日目の41mm2の腫瘍サイズで、10mg／kgの投与量で静脈内に処理を開始する（10、14、18日）。処理後、腫瘍成長を最大22日目まで監視する。
実施例38Bおよび104Bによる抗体薬物複合体による処理は、対照群と比べて、腫瘍の成長の著しい阻害をもたらす。表10は、22日目に腫瘍重量および腫瘍面積について決定されたT／C値を示している。それぞれの対照複合体（関連のない抗原に対するアイソタイプ抗体）による処理は、著しく弱い腫瘍成長阻害作用をもたらす。非複合抗体による処理も同様にいくつかの場合で、腫瘍の成長の弱い阻害をもたらす。
C−6h．反復処理でのLoVo腫瘍モデルにおける抗TWEAKR抗体薬物複合体の有効性
500万個のLoVo（ヒト結腸癌）細胞を雌NMRIヌードマウス（Janvier）の側腹部に皮下接種する。7日目の43mm2の腫瘍サイズで、10mg／kgの投与量で静脈内に処理を開始する（7、11、15日）。処理後、腫瘍成長を最大45日目まで監視する。
実施例07B、87Bおよび104Bによる抗体薬物複合体による処理は、対照群と比べて、腫瘍の成長の著しい阻害をもたらす。表11は、45日目に腫瘍面積について決定されたT／C値を示している。07Bについての対照複合体（関連のない抗原に対するアイソタイプ抗体）による処理は、著しく弱い腫瘍成長阻害作用をもたらす。
D．医薬組成物の実施例
本発明による化合物を以下の通り医薬製剤に変換することができる：
静脈内溶液：
本発明による化合物を、生理学的に許容される溶媒（例えば、等張食塩水溶液、D−PBSまたはポリソルベート80を添加したクエン酸緩衝液中グリシンおよび塩化ナトリウムを含む配合物）に飽和溶解度未満の濃度で溶解する。溶液を滅菌濾過に供し、滅菌パイロジェンフリー注射容器に分配する。
静脈内溶液：
本発明による化合物を言及する投与形態に変換することができる。これは、不活性で、非毒性の薬学的に適当な賦形剤（例えば、緩衝物質、安定剤、可溶化剤、保存剤）「と混合する」または「に溶解する」ことによって、それ自体既知の様式で達成することができる。例えば、以下が存在し得る：アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、リジン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニンなど）、糖および関連化合物（グルコース、サッカロース、マンニトール、トレハロース、スクロース、マンノース、ラクトース、ソルビトール）、グリセロール、ナトリウム塩、カリウム、アンモニウム塩およびカルシウム塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたはリン酸水素二ナトリウムなど）、酢酸塩／酢酸緩衝系、リン酸塩緩衝系、クエン酸およびクエン酸塩緩衝系、トロメタモール（TRISおよびTRIS塩）、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート80およびポリソルベート20）、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー188およびポロキサマー171）、マクロゴールPEG誘導体、例えば、3350）、Triton X−100、EDTA塩、グルタチオン、アルブミン（例えば、ヒト）、尿素、ベンジルアルコール、フェノール、クロロクレゾール、メタクレゾール、塩化ベンザルコニウムなど。
静脈内、皮下または筋肉内溶液へのその後の変換のための凍結乾燥物
あるいは、本発明の化合物を安定な凍結乾燥物に変換し（おそらくは上記賦形剤を用いて）、投与する前に、適当な溶媒（例えば、注射等級水、等張食塩水液）を用いて再構築し、投与してもよい。
抗TWEAKR抗体の実施例
ここで詳細に記載しない限り、全ての実施例は当業者に既知の標準的な方法を用いて行った。以下の実施例の分子生物学の日常的な方法は、Sambrookら、Molecular Cloning：a Laboratory Manual、第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1989などの標準的な実験室教科書に記載されるように行うことができる。
AK実施例1：抗体ライブラリーを用いた抗体調製
完全ヒトファージディスプレイライブラリー（Hoet RMら、Nat Biotechnol 2005；23（3）：344〜8）を使用して、ヒトおよびマウスTWEAKRの二量体Fc融合細胞外ドメインを標的として固定したタンパク質パニング（Hoogenboom H．R．、Nat Biotechnol 2005；23（3）：1105〜16）により本発明のTWEAKR特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。
抗原を、製造業者の指示にしたがって約2倍モル過剰のビオチン−LC−NHS（Pierce；カタログ番号21347）を用いてビオチン化し、Zeba脱塩カラム（Pierce；カタログ番号89889）を用いて脱塩した。洗浄した磁気ビーズ（DynaBeads）を4℃で200nMビオチン化抗原と一晩インキュベートし、ブロッキング緩衝液（3％BSA、0．05％Tween−20を含むPBS）を用いて4℃で1時間ブロッキングした。ブロッキングしたFabファージライブラリーをブロッキングしたTWEAKRビーズ（DynaBeadsストレプトアビジン−M280−Invitrogen 112−06D）に添加し、室温で30分間インキュベートした。ストリンジェントな洗浄（3×ブロッキング緩衝液および9×0．05％Tween−20を含むPBS（150mM NaCl；8mM Na2HPO4；1．5mM KH2PO4；pH＝7．4〜7．6に調整））後、ビオチン化TWEAKRビーズ（DynaBeadsストレプトアビジン−M280−Invitrogen 112−06D）に特異的に結合したFabファージをPBSに再懸濁し、増幅のために、大腸菌（Escherichia coli）菌株TG1感染に直接使用した。第2の選択ラウンドで、2つのマウスTWEAKR（200nM）を使用して交差反応性結合剤を選択し、第3の選択ラウンドで、ヒトTWEAKRの濃度を低下させて（100nM）高親和性結合剤の選択圧を高めた。
11個の異なるFabファージを同定し、対応する抗体を、可溶性Fab中に存在しないCH2−CH3ドメイン欠損を提供する哺乳動物IgG発現ベクターにクローニングした。得られたIgGを、Tomら著、Micheal R．DysonおよびYves Durocherによって編集されたMethods Express：Expression Systemsの第12節、Scion Publishing Ltd、2007に記載されるように哺乳動物細胞で一過的に発現させた。手短に言えば、CMVプロモーター系発現プラスミドをHEK293−6E細胞にトランスフェクトし、FernbachボトルまたはWaveバッグ中でインキュベートした。発現をF17培地（Invitrogen）中37℃で5〜6日間行った。1％超低IgG FCS（Invitrogen）および0．5mMバルプロ酸（Sigma）をトランスフェクション24時間後に補助剤として添加した。抗体をプロテインAクロマトグラフィーによって精製し、AK実施例2に記載されるように、ELISAおよびBIAcore分析を用いて可溶性単量体TWEAKRに対する結合親和性によりさらに特徴付けた。
抗TWEAKR抗体の細胞結合特性を決定するために、いくつかの細胞株（HT29、HS68、HS578）との結合をフローサイトメトリーによって調べた。細胞を抗体のFACS緩衝液中希釈液（5μg／ml）に懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。次いで、二次抗体（PEヤギ−抗ヒトIgG、Dianova＃109−115−098）を添加した。氷上で1時間のインキュベーション後、FACSアレイ（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーによって細胞を分析した。
NFκBレポーター遺伝子アッセイを行って同定した全11個の抗体（ヒトIgG1）のアゴニスト活性を評価した。HEK293細胞を、製造業者の指示により293fectinを用いて、NFκBレポーター構築物（BioCat、カタログ番号LR−0051−PA）で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、白色ポリリジンコーティング384ウェルプレート（BD）中、37℃、5％CO2でF17培地（無血清；Invitrogen）に蒔いた。翌日、細胞を種々の濃度の精製抗体で6時間刺激し、次いで、標準的方法を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。
抗TWEAKR抗体の蛍光標識（CypHer 5EモノNHSエステル；GE Healthcare）を介して内部移行を監視した。処理前に、HT29細胞を96ウェルMTPプレート（厚い、黒色、透明底、番号4308776、Applied Biosystems）中の培地100μlに蒔いた（2×104個／ウェル）。37℃／5％CO2で18時間のインキュベーション後、培地を交換し、標識抗TWEAKR抗体を異なる濃度（10、5、2．5、1、0．1μg／ml）で添加した。選択したインキュベート時間は0、0．25、0．5、1、1．5、2、3、6および24時間であった。InCell分析装置1000（GE Healthcare）で蛍光測定を行った。
インビトロ活性が最も高い抗体（TPP−883）をさらなる活性および親和性成熟のために選択した。
TPP−883
配列番号71
AQDIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPGITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFI
FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号72
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDGYFDYFDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP−883の軽鎖（配列番号71）および重鎖（配列番号72）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
最初の変異回収ラウンドで成熟を行い、引き続いて親和性および活性を最も増加させるアミノ酸修飾の組換えをした。変異NNK（N＝AGCT、K＝GまたはT）を収集するために、NNKコドン多様化（連続アミノ酸命名）を含む合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異誘発によって以下の個々のアミノ酸位置でランダム化を行った：CDR−L1のS35、S36、Y37およびN39；CDR−L2のA51、S53、S54、Q56およびS57；CDR−L3のS92、Y93、S94、S95、G97およびI98；CDR−H1のP31、Y32、P33、M34およびM35；CDR−H2のY50、S52、P53、S54、G56、K57およびH59；CDR−H3のG99、G100、D101、G102、Y103、F104、D105およびY106。全ての個々のNNK飽和変異誘発ライブラリーのDNAを活性成熟のために哺乳動物IgG発現ベクターにまたは親和性成熟のためにファージミドベクターにクローニングした。親和性成熟をファージパニングによって行った。洗浄した磁気ビーズ（DynaBeads）を4℃で10nM、1nM、100pMまたは10pMビオチン化抗原と一晩インキュベートし、ブロッキング緩衝液（3％BSA、0．05％Tween−20を含むPBS）を用いて4℃で1時間ブロッキングした。ブロッキングしたFabファージライブラリーを、理論上のライブラリー複雑度と比べて10000倍、1000倍または100倍過剰でブロッキングしたTWEAKR−DynaBeadsに添加し、室温で30分間インキュベートした。それは合計で12の戦略（4つの抗原濃度×3つのFabファージ力価）を伴うことを意味する。ストリンジェントな洗浄（3×ブロッキング緩衝液および9×0．05％Tween−20を含むPBS）後、ビオチン化TWEAKR DynaBeads（DynaBeadsストレプトアビジン−M280−Invitrogen 112−06D）に特異的に結合したFabファージをPBSに再懸濁し、増幅のために、大腸菌（Escherichia coli）菌株TG1感染に直接使用した。選択ラウンド2で、ヒトTWEAKR−Fcの濃度を減少させ（1nM、100pM、10pMおよび1pM）、同じFabファージ力価を全12の戦略（4．4×1011）に使用した。可溶性Fabを発現するために、ファージミドべクターをMluIで消化して、ファージ上のFabディスプレイに要求される遺伝子III遺伝子アンカー配列を除去し、ベクターを再連結した。12個の選択プールの各々の96個の変異体を可溶性Fabとして発現し、ELISAフォーマットで調べた。このために、2．5nMのビオチン化TWEAKR−Fcを抗原コーティングし、抗c−Myc抗体（Abcam ab62928）を用いて可溶性Fabの結合を示した。TWEAKR−Fc（配列番号138）との改善した結合を有する7個の単一置換変異体（連続アミノ酸命名）を示した：CDR−L1のS36G、CDR−L2のA51QおよびS57K、CDR−L3のS94TおよびG97F、CDR−H1のM35I、ならびにCDR−H3のG102T。活性成熟のために、HEK293細胞をNFκBレポーター（BioCat、カタログ番号LR−0051−PA）でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、白色ポリリジンコーティング384ウェルプレート（BD）中のF17培地（無血清；Invitrogen）に蒔き、NNK多様化位置抗体（ヒトIgG1）ライブラリーの個々の変異体を哺乳動物細胞で一過的に発現させた。翌日、NFκBレポーター細胞を、6時間発現した個々のNNK抗体変異体で刺激し、次いで、標準的方法を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。アゴニスト活性が改善した1つの単一置換変異体を検出した：CDR−H3のG102T。この変異体も親和性成熟によって得たもので、ここでも親和性の最高の増強を示した。親和性および活性スクリーニングによる変異収集後、全7個の好ましい個々の置換（ライブラリー複雑度：128個の変異体）を組換えライブラリーに組換えた。このために、各選択された位置で選択された変異を導入するためのオリゴヌクレオチドまたは対応する野生型アミノ酸を合成した。連続したラウンドのオーバーラップエクステンションPCRを用いてライブラリーを構築した。最終的なPCR産物細菌可溶性Fab発現ベクターに連結し、528個の変異体を上記のように可溶性Fabを用いた平衡ELISAのためにランダムで（採取した試料の約4倍過剰）選択した。最後には、最良の単一置換変異体G102Tと比べて増加した親和性に基づいて、7種の変異体を選択した。これらの対応するDNAを哺乳動物IgG発現ベクターにクローニングし、上記NFκBレポーター細胞アッセイで機能的活性について調べた。最後に、得られた配列をヒト生殖系配列と比較し、親和性および有効性に対するいかなる有意な効果もない偏差を適合させた。抗体ライブラリースクリーニングならびに親和性および／または活性成熟によって、以下の配列を有する抗体を得た。
TPP−2090
配列番号1：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASSLQSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPFITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号2：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMIWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGSTHY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP−2090の軽鎖（配列番号1）および重鎖（配列番号2）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−2149
配列番号11
DIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASSLQSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPFITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
TLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号12
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMIWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP−2149の軽鎖（配列番号11）および重鎖（配列番号12）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−2093
配列番号21
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配列番号22
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TPP−2093の軽鎖（配列番号21）および重鎖（配列番号22）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−2148
配列番号31
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配列番号32
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TPP−2148の軽鎖（配列番号31）および重鎖（配列番号32）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−2084
配列番号41
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配列番号42
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TPP−2084の軽鎖（配列番号41）および重鎖（配列番号42）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−2077
配列番号51
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配列番号52
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TPP−2077の軽鎖（配列番号51）および重鎖（配列番号52）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−1538
配列番号61
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配列番号62
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TPP−1538の軽鎖（配列番号61）および重鎖（配列番号62）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−1854
配列番号81
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配列番号82
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TPP−1854の軽鎖（配列番号81）および重鎖（配列番号82）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−1853
配列番号91
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TPP−1853の軽鎖（配列番号91）および重鎖（配列番号92）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−1857
配列番号101
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配列番号102
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TPP−1857の軽鎖（配列番号101）および重鎖（配列番号102）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
TPP−1858
配列番号111
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配列番号112
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TPP−1858の軽鎖（配列番号111）および重鎖（配列番号112）のアミノ酸配列；重鎖と軽鎖両方のCDRに下線を引いている。
実施例２：抗体の生化学的特性
Biacore分析による結合親和性の測定：
Biacore T100装置（GE Healthcare Biacore，Inc．）での表面プラズモン共鳴分析を用いて、抗TWEAKR抗体の結合親和性を調べた。間接捕捉試薬、抗ヒトIgG（Fc）を用いて、抗体をCM5センサーチップに固定した。「Human Antibody Capture Kit」（BR−1008−39、GE Healthcare Biacore，Inc．）の試薬を、製造業者によって記載されるように使用した。抗TWEAKR抗体を10μg／mlの濃度で10μl／分で10秒間注射した。
HEPES−EP緩衝液（GE Healthcare Biacore，Inc．）中種々の濃度（200nM、100nM、50nM、25nM、12．5nM、6．25nM、3．12nM、1．56nM）の精製した組換えヒトTWEAKRタンパク質（TPP−2305、配列番号168）を固定化した抗TWEAKR抗体上に60μl／分の流量で3分間注射し、解離時間は5分とした。インライン基準細胞補正、引き続いて緩衝液試料の減算後に、センサグラムを作成した。1：1一次結合モデルを用いてセンサグラムを当てはめることによって得られた、会合定数（kon）と解離定数（koff）の比に基づいて、解離定数（KD）を計算した。
本発明の抗体が中等度の親和性（KD10〜200nM）でTWEAKRに結合する一方で、いくつかの比較上の抗体（例えば、PDL−192（TPP−1104）、136．1（TPP−2194）、18．3．3（TPP−2193）、P4A8（TPP−1324）、P3G5（TPP−2195）、P2D3（TPP−2196）、品目1、品目4）は高親和性結合（0．7〜3．7nM）を示す。抗体PDL−192、136．1、18．3．3、P4A8、P3G5およびP2D3の可変ドメインの配列を特許文献国際公開第2009／020933号パンフレットおよび国際公開第2009／140177号パンフレットから得て、ヒトIgG1およびマウスIgG2の定常領域をコードする配列を加えて、完全長IgG PDL−192（TPP−1104）、136．1（TPP−2194）、18．3．3（TPP−2193）、P4A8（TPP−1324）、P3G5（TPP−2195）、P2D3（TPP−2196）を得た。この試験で測定された親和性の範囲は公開されたデータとよく一致している：PDL−192、18．3．3および136．1については、5．5、0．2および0．7nMのKD値が公開されており（国際公開第2009／020933号パンフレット）；P4A8については2．6nMが公開されている（国際公開第2009／140177号パンフレット）。比較のために：野生型リガンドTWEAKは、0．8〜2．4nMのKD値でTWEAKRに結合する（Immunity．2001年11月；15（5）：837〜46；Biochem J．2006年7月15日；397（2）：297〜304；Arterioscler Thromb Vasc Biol．2003年4月1日；23（4）：594〜600）。
結果として、本発明の抗体（TPP−883、TPP−1538、TPP−2077、TPP−2084、TPP−2148、TPP−2093、TPP−2149およびTPP−2090）は中等度の親和性（KD10〜200nM）でTWEAKRに結合すると記録することができる。
TWEAKR外部ドメインのNおよびC末端切断変異体を用いたTPP−2090の結合エピトープの特徴付け
異なる種のTWEAKRのシステインリッチドメイン（アミノ酸34〜68）のアラインメント（図1−アラインメント）は、これが分析した全6種でよく保存されていたことを示している。PDL−192はR56に依存して結合する（国際公開第2009／020933号パンフレット：図2B）ので、ラット、ブタおよびマウスTWEAKRに結合しない。TPP−2090は保存されたアミノ酸D47に依存して結合するので、示される全ての種に結合する。
上記抗体の結合エピトープを特徴付けるための最初のアプローチでは、TWEAKR外部ドメインのNおよびC末端切断変異体を作製し、種々の抗TWEAKR抗体に結合するその能力について調べた。Cys36−Cys49、Cys52−Cys67およびCys55−Cys64間のジスルフィド架橋は無傷のままであるように、アミノ酸28〜33をN末端で欠失させ、アミノ酸69〜80をC末端で欠失させた（図2と比較）。両構築物、NおよびC末端ならびに切断された外部ドメイン34〜68を含む完全外部ドメイン28〜80を発現させ、Fc融合タンパク質TPP−2202およびTPP−2203としてそれぞれ精製した。
結合を分析するために、1μg／mlの対応する二量体TWEAKR Fc構築物をコーティングし、0．3μg／mlおよび0．08μg／mlのビオチン化IgGを可溶性対として使用した。ストレプトアビジン−HRPおよびAmplex Red基質を用いて検出を行った。IgGを、製造業者の指示にしたがって約2倍モル過剰のビオチン−LC−NHS（Pierce；カタログ番号21347）を用いてビオチン化し、Zeba脱塩カラム（Pierce；カタログ番号89889）を用いて脱塩した。可溶性リガンドの使用した全ての濃度で、本発明の抗体は両構築物との飽和結合を示した一方で、抗体P4A8（TPP−1324）、P3G5（TPP−2195）および品目4は完全長外部ドメインにのみ飽和結合を示したが、NおよびC末端切断構築物には悪化した結合を示した（図3および図4）。このことは、本発明の抗体の結合エピトープがアミノ酸34〜68の間のシステインリッチドメインに位置することを示している。TWEAKR外部ドメインのN末端またはC末端がP4A8（TPP−1324）およびP3G5（TPP−2195）結合に要求されるかどうかを分析するために、アミノ酸69〜80のC末端欠失を有する単量体外部ドメインを作製した。P4A8（TPP−1324）およびP3G5（TPP−2195）とC末端切断TWEAKR外部ドメインの結合も同様に悪化する一方で、本発明の抗体は飽和結合を示す（図5）。
よって、システインリッチドメイン中のTPP−2090、TPP−2084、PDL−192（TPP−1104）および136．1（TPP−2194）の結合エピトープならびにP4A8（TPP−1324）およびP3G5（TPP−2195）の結合エピトープは、少なくとも部分的にシステインリッチドメインの外側に位置している。
TWEAKR−Fc変異タンパク質の抗体親和性に対する効果
本発明の抗体の結合特性をより詳細に調査するために、既知のアゴニスト抗体（国際公開第2009／140177号パンフレット）の活性と関連することが示唆されているTWEAKRの一定の変異タンパク質を調べた。このために、以下の個々のアミノ酸置換を有する完全長外部ドメイン（アミノ酸28〜80）を発現させ、Fc融合タンパク質として精製した：T33Q；S40R；W42A；M50A；R56P；H60K；L65Q。
用量−反応データを得るために、異なるTWEAKR−Fc変異タンパク質を低濃度（62ng／ml）で384ウェルMaxisorb ELISAプレート上にコーティングし、100nMの濃度で始めてビオチン化IgGの連続2倍希釈を可溶性結合対として使用した。ストレプトアビジン−HRPおよびAmplex Redを用いて検出を行った。調べたIgGは本発明のTPP−2090およびTPP−2084、国際公開第2009／020933号パンフレットのPDL−192、136．1および18．3．3、国際公開第2009／140177号パンフレットのP4A8およびP3G5、ならびにNakayamaら［Biochem Biophys Res Com 306：819〜825］の品目1および品目4とした。
IgGを、製造業者の指示にしたがって約2倍モル過剰のビオチン−LC−NHS（Pierce；カタログ番号21347）を用いてビオチン化し、Zeba脱塩カラム（Pierce；カタログ番号89889）を用いて脱塩した。用量−反応データを当てはめ、IC50を決定した。結果を示すために、表を作成した；「−」は50nMより上のIC50を示し、「＋」は1〜150pMの範囲のIC50を示す。
既に公開されているように、品目4はH60K変異タンパク質［国際公開第2009／140177号パンフレット：図23F］との悪化した結合を示し、PDL−192はR56P変異タンパク質［国際公開第2009／020933号パンフレット：図22B］との悪化した結合を示す。公開されたデータと対照的に、品目1はR56Pとの悪化した結合を示し、全抗体がW42Aとの悪化した結合を示す［国際公開第2009／140177号パンフレット：図23E、図23F］。これらの差は選択した方法によって説明することができる。
品目1、品目4、PDL−192、136．1および18．3．3と対照的に、本発明の抗体はW42Aを除いて全ての置換と独立に結合する。
システインリッチドメインのアラニンスキャン：
本発明の抗体の結合部位の位置を突き止めるために、システインリッチドメイン（アミノ酸34〜68）のアラニンスキャンを行った。図6は、TWEAKRの完全長外部ドメインのNおよびC末端切断変異体が本発明の抗体の結合を悪化させないことを示している。したがって、結合エピトープはシステインリッチドメインに位置している。以下の置換をTWEAKR（34〜68）Fc構築物に導入した：S37A、R38A、S40A、S41A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63AおよびL65A。
これらのTWEAKR（34〜68）Fc変異タンパク質がHEK293細胞で発現していた。用量−反応データを得るために、IgGを384ウェルMaxisorp ELISAプレート上に1μg／mlに濃度でコーティングし、TWEAKR変異タンパク質を含む上清の連続2倍希釈を可溶性結合対として使用した。抗HIS−HRPおよびAmplex Redを用いて検出を行った。試験したIgGは本発明のTPP−2090、国際公開第2009／020933号パンフレットのPDL−192および国際公開第2009／140177号パンフレットのP4A8であった。
種々のIgGとの結合についてTWEAKR変異タンパク質の関連性を評価するために、一定の変異タンパク質濃度での相関プロットを作製した。例として、図6は、X軸にPDL−192（TPP−1104）およびY軸にTPP−2090を用いた、TWEAKR発現ブロスの8倍希釈上清についての相関プロットを示している。このプロットは、TPP−2090の結合が置換D47Aによって悪化し、PDL−192（TPP−1104）の結合が置換R56Aによって悪化したことを示している。P4A8（TPP−1324）との結合は構築物のいずれについても証明されず、このことは上で得られた結果と一致している（図6）。よって、P4A8エピトープは、システインリッチドメインの少なくとも部分的に外側に局在化している。抗体相互作用について一定のTWEAKRアミノ酸について同定された依存度は、これらの抗体について測定されたアゴニスト活性と相関する。野生型リガンドTWEAKは、TWEAKRの有効な活性化を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインのロイシン46に依存して結合する（Pellegriniら、FEBS 280：1818〜1829）。P4A8は極めて低いアゴニスト活性を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインの外側のドメインと少なくとも部分的に相互作用する。PDL−192は、中等度のアゴニスト活性を示し、R56に依存して、システインリッチドメイン、但し、TWEAKリガンド部位の反対に結合する。TPP−2090およびTWEAK結合は、それぞれ、D47およびL46に依存するので、これらは類似の結合部位に結合する（図7）。
本発明の抗体（例えば、TPP−2090）がD47に依存してTWEAKRに結合すると結論づけることができる。
抗体相互作用について一定のTWEAKRアミノ酸について同定された依存度は、これらの抗体について測定されたアゴニスト活性と相関する。野生型リガンドTWEAKは、TWEAKRの有効な活性化を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインのロイシン46に依存して結合する（Pellegriniら、FEBS 280：1818〜1829）。P4A8は極めて低いアゴニスト活性を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインの外側のドメインと少なくとも部分的に相互作用する。PDL−192は、中等度のアゴニスト活性を示し、R56に依存して、システインリッチドメイン、但し、TWEAKリガンド部位の反対に結合する。本発明の抗体（実施例TPP−2090）はD47に依存して結合し、TWEAKはL46に依存して結合し、類似であるが別個の結合部位に結合する（図7）。したがって、強力なアゴニスト活性を示す本発明の抗体は、極めて高いアゴニスト活性を伴って抗体にとって新規のエピトープ（D47依存性）に結合する。Michaelsonら（Michaelson JSら、MAbs．2011年7月〜8月；3（4）：362〜75の369頁、左欄参照）が、彼らが試験した全てのアゴニスト抗体が天然リガンドTWEAKよりも弱いアゴニスト活性を有するという事実についての説明を与えたことに留意することは興味深い。彼らは、有効性の低下は、抗体とTWEAKRの二量体結合相互作用の関数であり得、TWEAKはおそらく三量体相互作用に入ると結論づけている。そのため、本発明の抗体が、TWEAKRとの二量体相互作用にもかかわらず、高いアゴニスト活性を有することは驚くべき結果である。この驚くべき活性は、本発明の抗体の特異的結合特性、すなわち、TWEAKRのD47との特異的結合に関連する。
さらなる実施形態
1．結合剤またはその誘導体と、リンカーLを介して結合剤に結合しているキネシン紡錘体タンパク質阻害剤である1種または複数の活性化合物分子の複合体。
2．結合剤またはその誘導体が結合剤ペプチドもしくはタンパク質または結合剤ペプチドもしくはタンパク質の誘導体である、項目1に記載の複合体。
3．各活性化合物分子がリンカーを介して結合剤ペプチドもしくはタンパク質またはその誘導体の異なるアミノ酸に結合している、項目2に記載の複合体。
4．平均して結合剤1個当たり1．2〜20個の活性化合物分子を有する、項目1から3の1つまたは複数に記載の複合体。
5．結合剤ペプチドまたはタンパク質が結合剤ペプチドまたはタンパク質
または
の抗体または誘導体に相当する、項目2から4の1つまたは複数に記載の複合体。
6．結合剤ががん標的分子に結合する、項目1から5の1つまたは複数に記載の複合体。
7．結合剤が細胞外標的分子に結合する、項目6に記載の複合体。
8．結合剤が、細胞外標的分子に結合した後、内部移行し、標的分子を発現している細胞によって細胞内で（好ましくはリソソームで（lysosomally））プロセシングされる、項目7に記載の複合体。
9．結合剤ペプチドまたはタンパク質がヒト、ヒト化もしくはキメラモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目2から8の1つまたは複数に記載の複合体。
10．結合剤ペプチドまたはタンパク質が抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗TWEAKR抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目9に記載の複合体。
11．抗TWEAKR抗体がTWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する、好ましくは抗TWEAKR抗体TPP−2090である、項目10に記載の複合体。
12．キネシン紡錘体タンパク質阻害剤が、以下の部分構造：
（＃aは分子の残りとの結合を表し；
R1aはHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、−NHY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、NH2、COOH、SO3H、SHまたはOHを表し、
Zは−H、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；キネシン紡錘体タンパク質阻害剤はR1a、R2a、R4aまたはR2aおよびR4aによって形成されたピロリジン環の水素原子の置換によってリンカーに結合している）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩を有する、前項目の1つまたは複数に記載の複合体。
13．キネシン紡錘体タンパク質阻害剤が、一般式（I）：
（R1aはHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、−NHY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、SO3H、NH2、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
R3aは場合により置換されているアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、
好ましくは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有してもよい）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリール−またはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R8aはC1〜10−アルキルを表し；
HZはハロゲン、場合によりハロゲンによって置換されていてもよいC1〜10−アルキル基、C6〜10−アリール基およびC6〜10−アラルキル基からなる群から選択される1個または複数の置換基によって置換されていてもよい単環式または二環式複素環を表し；キネシン紡錘体タンパク質阻害剤はR1a、R2a、R3a、R4a、R8aまたはR2aおよびR4aによって形成されたピロリジン環の水素原子の置換によってリンカーに結合している）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩によって表される、前項目の1つまたは複数に記載の複合体。
14．活性化合物分子リンカーが一般式（II）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し；
R1はH、−L−＃1または−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2およびR4は互いに独立に、−L−＃1、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−＃1または場合により置換されているアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有してもよい）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリール、C6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリール−またはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5は−L−＃1、H、、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
置換基R1、R2、R3、R4およびR5の1個は−L−＃1を表し、
Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表し、
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、
R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは場合により置換されたオキセタンを表し；
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩によって表される、前項目の1つまたは複数に記載の複合体。
15．R1が−L−＃1、H、−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−H、−CO−NY1Y2、NHY3、OY3、−SY3または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2が互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3がHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’がH、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WがHまたはOHを表し、
Y4が互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2およびR4が互いに独立に、−L−＃1、−CO−CHY4−NHY5またはHを表す、あるいはR2およびR4が一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−を表し、R10がH、−L−＃1、NH2、COOH、SH、OHまたはSO3Hを表し、
Y4が互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5がHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6が直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
AがCOを表し、
R3が−（CH2）OHまたは−L−＃1を表し、
R5が−L−＃1またはHを表し、
置換基R1、R2、R3、R4およびR5の1つが−L−＃1を表す、
項目14に記載の複合体。
16．R6およびR7が互いに独立に、H、C1〜3−アルキルまたはハロゲンを表す、
項目14または15に記載の複合体。
17．R8がC1〜4−アルキル（好ましくはtert−ブチル）を表す、
項目14から16の1つまたは複数に記載の複合体。
18．R9がHを表す、
項目14から17の1つまたは複数に記載の複合体。
19．R6およびR7がFを表す、
項目14から18の1つまたは複数に記載の複合体。
20．リンカー−L−が以下の基本構造（i）〜（iv）の1つを有する、前項目の1つまたは複数に記載の複合体：
（i）−（CO）m−SG1−L1−L2−
（ii）−（CO）m−L1−SG−L1−L2−
（iii）−（CO）m−L1−L2−
（iv）−（CO）m−L1−SG−L2
（mは0または1であり、SGおよびSG1はインビボ切断可能基であり、L1は互いに独立に、有機基を表すが、インビボで切断可能でなく、L2は結合剤とのカップリング基を表す）。
21．インビボ切断可能基SGが2〜8オリゴペプチド基、好ましくはジペプチド基またはジスルフィド、ヒドラゾン、アセタールまたはアミナールであり、SG1が2〜8オリゴペプチド基、好ましくはジペプチド基である、項目20に記載の複合体。
22．リンカーがシステイン側鎖またはシステイン残基に結合しており、以下の式：
§−（CO）m−L1−L2−§§
（mは0または1であり；
§は活性化合物分子との結合を表し、
§§は結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
−L2−は
（＃1は結合剤の硫黄原子との結合点を示し、
＃2は基L1との結合点を示し、
L1は−（NR10）n−（G1）o−G2−を表し、
R10はH、NH2またはC1〜C3−アルキルを表し；
G1は−NHCO−または
を表し；
nは0または1であり；
oは0または1であり；
G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−NHCO−、−CONH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい、
あるいは以下の基：
（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）
の1つを表す）
を表す）
を有する、項目2から21の1つまたは複数に記載の複合体。
23．炭化水素鎖が以下の基：
（XはHまたは場合により−NHCONH2、−COOH、−OH、NH2、−NH−CNNH2、スルホン、スルホキシドもしくはスルホン酸によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル基を表す）
の1つによって中断されている、項目22に記載の複合体。
24．リンカーが以下の式：
（＃3は活性化合物分子との結合を表し、
＃4は結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
R11はHまたはNH2を表し；
Bは−［（CH2）x−（X4）y］w−（CH2）z−を表し、
w＝0〜20；
x＝0〜5；
x＝0〜5；
y＝0または1；
z＝0〜5；および
X4は−O−、−CONH−または−NHCO−
を表す）
を有する、項目22に記載の複合体。
25．R1またはR4が−L−＃1を表す、項目24に記載の複合体。
26．以下の式：
（X1、X2およびX3は項目14と同じ意味を有し、
AK1は結合剤の硫黄原子を介して結合している結合剤ペプチドまたはタンパク質を表し；
nは1〜20の数字を表し；
L1はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−CONH−、−NHCO−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表す、1〜70個の炭素原子を有する場合により分岐した炭化水素基を表し、
側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、
SG1は2〜8オリゴペプチド、好ましくはジペプチドであり；
L4は単結合または基−（CO）y−G4−
（yは0または1であり、
G4はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
である）
の1つを有する、項目21から25の1つまたは複数に記載の複合体。
27．リンカー−L−がシステイン側鎖またはシステイン残基に結合しており、以下の式：
（§は活性化合物分子との結合を表し、
§§は結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
mは0、1、2または3であり；
nは0、1または2であり；
pは0〜20であり；
L3は
（oは0または1であり；
G3はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、ならびにN、OおよびS、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
を表す）
を有する、項目1から21の1つまたは複数に記載の複合体。
28．リンカー−L−がシステイン側鎖またはシステイン残基に結合しており、以下の式：
（§は活性化合物分子との結合を表し、
§§は結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
mは1であり；
pは0であり；
nは0であり；
L3は
（oは0または1であり；
G3は−（CH2CH2O）s（CH2）t（CONH）u（CH2CH2O）v（CH2）w−
（s、t、vおよびwはそれぞれ互いに独立に、0〜20であり、uは0または1である）
を表す）
を表す）
を有する、項目27に記載の複合体。
29．R2またはR3が−L−＃1を表す、項目27または28に記載の複合体。
30．以下の式：
（X1、X2およびX3は項目14と同じ意味を有し、
AK1は結合剤の硫黄原子を介して結合している結合剤ペプチドまたはタンパク質を表し；
nは1〜20の数字を表し；
L2およびL3はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−NHCO−、−CONH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、
側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
の1つを有する、項目29に記載の複合体。
31．リンカー−L−がリジン側鎖に結合しており、以下の式を有する：
−§−（SG）x−L4−CO−§§
（§は活性化合物分子との結合を表し、
§§は結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
xは0または1を表し、
SGは切断可能基、好ましくは2〜8オリゴペプチド、特に好ましくはジペプチドを表し、
L4は単結合または基−（CO）y−G4−（yは0または1を表し、
G4はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、または−SO−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
を表す）
項目1から21の1つまたは複数に記載の複合体。
32．以下の式：
（X1、X2およびX3は項目14と同じ意味を有し、
AK2は結合剤の硫黄原子を介して結合している結合剤ペプチドまたはタンパク質を表し；
nは1〜20の数字を表し；
L4は場合によりアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−NHCO−、−CONH−、−CONHNH−ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、
側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、
SG1は切断可能基、好ましくは2〜8オリゴペプチド、特に好ましくはジペプチドを表す）
の1つを有する、項目31に記載の結合剤ペプチドまたはタンパク質の複合体。
33．抗TWEAKR抗体がアゴニスト抗体である、項目10から32の1つまたは複数に記載の複合体。
34．
a．式PYPMX（配列番号171）（XはIまたはMである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖のCDR1；
b．式YISPSGGXTHYADSVKG（配列番号172）（XはSまたはKである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖のCDR2；および
c．式GGDTYFDYFDY（配列番号173）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖のCDR3；
を含む可変重鎖
ならびに
d．式RASQSISXYLN（配列番号174）（XはGまたはSである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖のCDR1；
e．式XASSLQS（配列番号175）（XはQ、AまたはNである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖のCDR2；および
f．式QQSYXXPXIT（配列番号176）（5位のXはTまたはSであり、6位のXはTまたはSであり、8位のXはGまたはFである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖のCDR3
を含む可変軽鎖
を含む、項目10から33の1つまたは複数に記載の複合体。
35．
a．配列番号10に示される重鎖の可変配列および配列番号9に示される軽鎖の可変配列、または
b．配列番号20に示される重鎖の可変配列および配列番号19に示される軽鎖の可変配列、または
c．配列番号30に示される重鎖の可変配列および配列番号29に示される軽鎖の可変配列、または
d．配列番号40に示される重鎖の可変配列および配列番号39に示される軽鎖の可変配列、または
e．配列番号50に示される重鎖の可変配列および配列番号49に示される軽鎖の可変配列、または
f．配列番号60に示される重鎖の可変配列および配列番号59に示される軽鎖の可変配列、または
g．配列番号70に示される重鎖の可変配列および配列番号69に示される軽鎖の可変配列、または
h．配列番号80に示される重鎖の可変配列および配列番号79に示される軽鎖の可変配列、または
i．配列番号90に示される重鎖の可変配列および配列番号89に示される軽鎖の可変配列、または
j．配列番号100に示される重鎖の可変配列および配列番号99に示される軽鎖の可変配列、または
k．配列番号110に示される重鎖の可変配列および配列番号109に示される軽鎖の可変配列、または
l．配列番号120に示される重鎖の可変配列および配列番号119に示される軽鎖の可変配列
を含む、項目10から34の1つまたは複数に記載の複合体。
36．抗体がIgG抗体である、項目10から35の1つまたは複数に記載の複合体。
37．
a．配列番号2に示される重鎖の配列および配列番号1に示される軽鎖の配列、または
b．配列番号12に示される重鎖の配列および配列番号11に示される軽鎖の配列、または
c．配列番号22に示される重鎖の配列および配列番号21に示される軽鎖の配列、または
d．配列番号32に示される重鎖の配列および配列番号31に示される軽鎖の配列、または
e．配列番号42に示される重鎖の配列および配列番号41に示される軽鎖の配列、または
f．配列番号52に示される重鎖の配列および配列番号51に示される軽鎖の配列、または
g．配列番号62に示される重鎖の配列および配列番号61に示される軽鎖の配列、または
h．配列番号72に示される重鎖の配列および配列番号71に示される軽鎖の配列、または
i．配列番号82に示される重鎖の配列および配列番号81に示される軽鎖の配列、または
j．配列番号92に示される重鎖の配列および配列番号91に示される軽鎖の配列、または
k．配列番号102に示される重鎖の配列および配列番号101に示される軽鎖の配列、または
l．配列番号112に示される重鎖の配列および配列番号111に示される軽鎖の配列
を含む、項目10から36の1つまたは複数に記載の複合体。
38．結合剤ペプチドまたはタンパク質1個当たり1〜10個、好ましくは2〜8個の活性化合物分子を有する、項目1から37の1つまたは複数に記載の紡錘体複合体。
39．好ましくはそのトリフルオロ酢酸塩の形態の、以下の式の1つの化合物が、場合により事前に部分的に還元された結合剤ペプチドまたはタンパク質のシステイン残基に結合しており、化合物が好ましくは結合剤ペプチドまたはタンパク質に関して2〜12倍モル過剰で使用される、項目26または30に記載の複合体を調製する方法：
（Rは−Hまたは−COOHを表し、
Kは場合によりC1〜C6−アルコキシまたは−OH−C1〜C6−アルキルによって置換されている直鎖または分岐を表し、
X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3およびL4は項目26または30と同じ意味を有する）。
40．好ましくはそのトリフルオロ酢酸塩の形態の、以下の式の1つの化合物が、結合剤ペプチドまたはタンパク質のシステイン残基に結合しており、化合物が好ましくは結合剤ペプチドまたはタンパク質に関して2〜12倍モル過剰で使用される、項目32に記載の複合体を調製する方法：
（X1、X2、X3、SG1およびL4は項目32と同じ意味を有する）。
41．以下の式：
（Rは−Hまたは−COOHを表し、
Kは場合によりC1〜C6−アルコキシまたは−OH−C1〜C6−アルキルによって置換されている直鎖または分岐を表し、
X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3およびL4は項目26、30または32と同じ意味を有する）
の1つの化合物。
42．一般式（III）：
（X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す、またはX1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表す、またはX1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す、またはX1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し；
R1は−L−BINDER、Hまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2およびR4は互いに独立に、−L−BINDER、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−BINDERまたは場合により置換されているアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5は−L−BINDER、H、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Lはリンカーを表し、BINDERは結合剤またはその誘導体を表し、結合剤は場合により複数の活性化合物分子に結合していてもよく、
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは場合により置換されたオキセタンを表し；
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
の化合物ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩。
43．一般式（IV）：
（X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表し；
R1は−L−BINDER、Hまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し；WはHまたはOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し；
R2およびR4は互いに独立に、−L−BINDER、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Y4は互いに独立に、場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または場合により−NH2によって置換されているアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
R3は−L−BINDERまたは場合により置換されているアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリール、C6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリール−またはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
R5は−L−BINDER、H、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
Lはリンカーを表し、BINDERは結合剤またはその誘導体を表し、結合剤は場合により複数の活性化合物分子に結合していてもよく、
R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルケニル、（場合によりフッ素化された）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、R8は（場合によりフッ素化された）C1〜10−アルキル、（場合によりフッ素化された）C4〜10−シクロアルキルまたは場合により置換されたオキセタンを表し；
R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
の化合物ならびにその塩、溶媒和物および溶媒和物の塩；
但し、R1、R2およびR4は同時にはHを表さない。
44．ZがClまたはBrを表す、項目43に記載の化合物。
45．R1が−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−CO−NY1Y2を表し、Y2が−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表し、Y1がH、NH2または−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表す、項目43に記載の化合物。
46．Y1がHを表し、Y2が−（CH2CH2O）3−CH2CH2Z’を表し、Z’が−COOHを表す、項目43から44の1つまたは複数に記載の複合体。
47．Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−（CONHCHY4）2COOHを表す、項目43から44の1つまたは複数に記載の複合体。
48．Y4が場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表す、項目47に記載の化合物。
49．少なくとも1つの代表的なY4がi−プロピルおよび−CH3からなる群から選択される、項目48に記載の化合物。
50．Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−CONHCHY4COOHを表し、Y4が場合により−NH2によって置換されているアリールまたはベンジルを表す、項目43および45の1つまたは複数に記載の化合物。
51．Y4がアミノベンジルを表す、項目50に記載の化合物。
52．R2が−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−SY3を表す、項目43に記載の化合物。
53．R4が−CO−CHY4−NHY5を表し、Y5がHを表す、項目43に記載の化合物。
54．R4が−CO−CHY4−NHY5を表し、Y5が−CO−CHY6−NH2を表す、項目43に記載の化合物。
55．Y4が場合により−NHCONH2によって置換されている直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表す、項目53および54の1つまたは複数に記載の化合物。
56．以下の式の1つを有する項目43から55の1つまたは複数に記載の化合物：
（15S，19R）−15−アミノ−19−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−18−グリコロイル−20，20−ジメチル−14−オキソ−4，7，10−トリオキサ−13，18−ジアザヘンイコサン−1−酸；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−L−オルニチン；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−4−アミノ−L−フェニルアラニン；
N−｛（1R）−1−［1−（3−アミノベンジル）−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N−（3−アミノプロピル）−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）；
（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタン酸；
N−［（3S）−3−アミノ−4−ヒドラジノ−4−オキソブチル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）；
N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N−［（3S）−3，4−ジアミノブチル］−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）；
N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニン；
（2S）−2−アミノ−N−（2−アミノエチル）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタンアミド（2：1）；
（1−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）酢酸；
N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）；
4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド（2：1）；
N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）；
L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）；
L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）。
57．不活性で、非毒性の薬学的に適した補助剤と組み合わせた、項目1から38の1つもしくは複数に記載の複合体または項目42から56に記載の化合物を含む医薬組成物。
58．疾患を治療および／または予防する方法に使用するための項目1から38の1つもしくは複数に記載の複合体または項目42から56に記載の化合物。
59．過剰増殖および／または血管新生障害を治療する方法に使用するための項目1から38の1つもしくは複数に記載の複合体または項目42から56に記載の化合物。
60．
R3aまたはR3が−L−BINDERまたは置換アルキル、アリールまたはヘテロアリール基、好ましくは−L−＃1あるいは−OH、O−アルキル、SH、S−アルキル、O−CO−アルキル、O−CO−NH−アルキル、NH−CO−アルキル、NH−CO−NH−アルキル、S（O）n−アルキル、SO2−NH−アルキル、NH−アルキル、N（アルキル）2、NH2または−（CH2）0〜3Zによって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル基またはC5〜10−ヘテロアルキルを表し、Zが−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2が互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3がHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’がH、SO3H、NH2またはCOOHを表す
（「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）、
項目1から38の1つもしくは複数に記載の複合体または項目42から56に記載の化合物。
61．有効量の項目1から38の1つもしくは複数に記載の少なくとも1種の複合体または項目42から56に記載の化合物を用いてヒトおよび動物における過剰増殖および／または血管新生障害を治療および／または予防する方法。

Claims (71)

  1. 結合剤またはその誘導体と1種または複数の活性化合物分子の複合体であって、前記活性化合物分子はリンカーLを介して前記結合剤に結合しているキネシン紡錘体タンパク質阻害剤であり、前記キネシン紡錘体タンパク質阻害剤は以下の式（IIa）：
    （X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
    X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
    X1はCHもしくはCFを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
    X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
    X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し
    （X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表すのが好ましい）；
    R1はH、−L−＃1、−MODまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’（例えば、−（CH2）0〜3Z’）または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO2H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し；
    R2は−L−＃1、H、−MOD、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表すか、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
    Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されててもよい直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表す、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
    R4は−L−＃1、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表し、
    Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表す；
    あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し；
    AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
    R3は−L−＃1、−MODまたは置換されていてもよいアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
    （「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
    R5は−L−＃1、H、NH2、NO2、ハロゲン（特に、F、Cl、Br）、−CN、CF3、−OCF3、−CH2F、−CH2F、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（フッ素化されていてもよい）C1〜10−アルキル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルケニル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシ、NO2、NH2、COOHまたはハロゲン（特に、F、Cl、Br）を表し、
    R8は（フッ素化されていてもよい）C1〜10−アルキル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルケニル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルキニル、（フッ素化されていてもよい）C4〜10−シクロアルキルまたは−（CH2）0〜2−（HZ2）を表し、HZ2はN、OおよびSからなる群から選択される最大2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環を表し、これらの基の各々は−OH、CO2HまたはNH2または−L−＃1によって置換されていてもよく；
    置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10の1個が−L−＃1を表すかもしくは（R8の場合）含み、または置換基R1、R2、R3、R4、R5、R8およびR10のいずれも−L−＃1を表さずもしくは（R8の場合）含まず、
    Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表し、
    −MODは−（NR10）n−（G1）o−G2−Hを表し、
    R10はHまたはC1〜C3−アルキルを表し；
    G1は−NHCO−、−CONH−または
    （G1が−NHCO−または
    を表す場合、R10はNH2を表さない）を表し；
    nは0または1であり；
    oは0または1であり；
    G2は1〜10個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々が−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）の1個または複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖および／または分岐炭化水素基を表し、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、基−MODは好ましくは少なくとも1個の基−COOHを有する）
    を有する、複合体、またはその塩、溶媒和物もしくは溶媒和物の塩。
  2. X1がCHを表し、X2がCを表し、X3がNを表す、請求項1に記載の複合体。
  3. 前記置換基R1が−L−＃1を表す、請求項1または2に記載の複合体。
  4. 結合剤またはその誘導体と1種または複数の活性化合物分子の複合体であって、前記活性化合物分子はリンカーLを介して前記結合剤に結合しているキネシン紡錘体タンパク質阻害剤であり、前記キネシン紡錘体タンパク質阻害剤は以下の部分構造：
    （＃aは分子の残りとの結合を表し；
    R1aはHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、−NHY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し；
    R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表すか、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、NH2、COOH、SO3H、SHまたはOHを表し、
    Zは−H、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されててもよい直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
    前記キネシン紡錘体タンパク質阻害剤はR1a、R2a、R4aまたはR2aおよびR4aによって形成されたピロリジン環の水素原子の置換によって前記リンカーに結合している）
    を有する、複合体、またはその塩、溶媒和物もしくは溶媒和物の塩。
  5. 前記キネシン紡錘体タンパク質阻害剤が、一般式（I）：
    （R1aはHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−OY3、−SY3、−NHY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し；
    R2aおよびR4aは互いに独立に、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表すか、あるいはR2aおよびR4aは一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はH、SO3H、NH2、COOH、SHまたはOHを表し、
    Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
    R3aは置換されていてもよいアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、
    好ましくは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有してもよい）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリール−またはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
    （「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
    R8aはC1〜10−アルキルを表し；
    HZはハロゲン、ハロゲンによって置換されていてもよいC1〜10−アルキル基、C6〜10−アリール基およびC6〜10−アラルキル基からなる群から選択される1個または複数の置換基によって置換されていてもよい単環式または二環式複素環を表し；
    前記キネシン紡錘体タンパク質阻害剤はR1a、R2a、R3a、R4a、R8aまたはR2aおよびR4aによって形成されたピロリジン環の水素原子の置換によって前記リンカーに結合している）
    請求項4に記載の複合体、またはその塩、溶媒和物もしくは溶媒和物の塩。
  6. 前記活性化合物分子リンカーが一般式（II）：
    （X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す；または
    X1はNを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
    X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表す；または
    X1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す；または
    X1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し；
    R1はH、−L−＃1または−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し；
    R2およびR4は互いに独立に、−L−＃1、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表すか、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
    Zは−H、OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
    AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
    R3は−L−＃1または置換されていてもよいアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有してもよい）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリール、C6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリール−またはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
    （「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
    R5は−L−＃1、H、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、OY3、−SY3、ハロゲン、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    置換基R1、R2、R3、R4およびR5の1個は−L−＃1を表し、Lはリンカーを表し、＃1は結合剤またはその誘導体との結合を表し、
    R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（フッ素化されていてもよい）C1〜10−アルキル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルケニル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、
    R8は（フッ素化されていてもよい）C1〜10−アルキル、（フッ素化されていてもよい）C4〜10−シクロアルキルまたは置換されていてもよいオキセタンを表し；
    R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
    によって表される、請求項1から5のいずれか一項に記載の複合体、またはその塩、溶媒和物もしくは溶媒和物の塩。
  7. R1が−L−＃1、H、−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−H、−CO−NY1Y2、NHY3、OY3、−SY3または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2が互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3がHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’がH、NH2、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WがHまたはOHを表し、
    Y4が互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し；
    R2およびR4が互いに独立に、−L−＃1、−CO−CHY4−NHY5またはHを表すか、あるいはR2およびR4が一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−を表し、R10がH、−L−＃1、NH2、COOH、SH、OHまたはSO3Hを表し、
    Y4が互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し、Y5がHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6が直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
    AがCOを表し、
    R3が−（CH2）OHまたは−L−＃1を表し、
    R5が−L−＃1またはHを表し、
    置換基R1、R2、R3、R4およびR5の1つが−L−＃1を表す、
    請求項6に記載の複合体。
  8. R6およびR7が互いに独立に、H、C1〜3−アルキルまたはハロゲンを表す、請求項6または7に記載の複合体。
  9. R8がC1〜4−アルキル（好ましくはtert−ブチル）を表す、請求項6から8のいずれか一項に記載の複合体。
  10. R9がHを表す、請求項6から9のいずれか一項に記載の複合体。
  11. R6およびR7がFを表す、請求項6から10のいずれか一項に記載の複合体。
  12. 前記結合剤またはその誘導体が結合剤ペプチドもしくはタンパク質または結合剤ペプチドもしくはタンパク質の誘導体である、請求項1から11のいずれか一項に記載の複合体。
  13. 各活性化合物分子が前記リンカーを介して前記結合剤ペプチドもしくはタンパク質またはそれらの誘導体の異なるアミノ酸に結合している、請求項12に記載の複合体。
  14. 平均して結合剤1個当たり1．2〜20個の活性化合物分子を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の複合体。
  15. 前記結合剤ペプチドまたはタンパク質が結合剤ペプチドまたはタンパク質
    または
    の抗体または誘導体に相当する、請求項12から14のいずれか一項に記載の複合体。
  16. 前記結合剤ががん標的分子に結合する、請求項1から15のいずれか一項に記載の複合体。
  17. 前記結合剤が細胞外標的分子に結合する、請求項16に記載の複合体。
  18. 前記結合剤が、前記細胞外標的分子に結合した後、内部移行し、前記標的分子を発現している細胞によって細胞内で（好ましくはリソソームで）プロセシングされる、請求項17に記載の複合体。
  19. 前記結合剤ペプチドまたはタンパク質がヒト、ヒト化もしくはキメラモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項12から18のいずれか一項に記載の複合体。
  20. 前記結合剤ペプチドまたはタンパク質が抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗TWEAKR抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項19に記載の複合体。
  21. 前記抗TWEAKR抗体がTWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する、好ましくは抗TWEAKR抗体TPP−2090である、請求項20に記載の複合体。
  22. 前記結合剤ペプチドまたはタンパク質が抗EGFR抗体であり、R3が−L−＃1を表す、請求項20に記載の複合体。
  23. 前記リンカー−L−が以下の基本構造（i）〜（iv）の1つを有する、請求項1から22のいずれか一項に記載の複合体：
    （i）−（CO）m−SG1−L1−L2−
    （ii）−（CO）m−L1−SG−L1−L2−
    （iii）−（CO）m−L1−L2−
    （iv）−（CO）m−L1−SG−L2
    （mは0または1であり、SGおよびSG1はインビボ切断可能基であり、L1は互いに独立に、有機基を表すが、インビボで切断可能でなく、L2は前記結合剤とのカップリング基を表す）。
  24. 前記インビボ切断可能基SGが2〜8オリゴペプチド基、好ましくはジペプチド基またはジスルフィド、ヒドラゾン、アセタールまたはアミナールであり、SG1が2〜8オリゴペプチド基、好ましくはジペプチド基である、請求項23に記載の複合体。
  25. 前記リンカーがシステイン側鎖またはシステイン残基に結合しており、以下の式：
    §−（CO）m−L1−L2−§§
    （mは0または1であり；
    §は前記活性化合物分子との結合を表し、
    §§は前記結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
    −L2−は
    （＃1は前記結合剤の硫黄原子との結合点を示し、
    ＃2は基L1との結合点を示す）
    を表し、
    L1は−（NR10）n−（G1）o−G2−を表し、
    R10はH、NH2またはC1〜C3−アルキルを表し；
    G1は−NHCO−または
    を表し；
    nは0または1であり；
    oは0または1であり；
    G2はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−NHCO−、−CONH−、−CONHNH−、ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
    ）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、
    あるいは以下の基：
    （RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）
    の1つを表す）
    を有する、請求項1から24のいずれか一項に記載の複合体。
  26. L2が以下の式の一方または両方によって表される、請求項25に記載の複合体：
    （＃1は前記結合剤の硫黄原子との結合点を示し、＃2は基L1との結合点を示し、R22はCOOHを表し、前記結合剤の硫黄原子との結合の80％超（前記リンカーと結合剤の結合の総数に基づく）がこれらの2つの構造の1つで存在する）。
  27. 前記炭化水素鎖が以下の基：
    （XはHまたは−NHCONH2、−COOH、−OH、NH2、−NH−CNNH2、スルホン、スルホキシドもしくはスルホン酸によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル基を表す）
    の1つによって中断されている、請求項25または26に記載の複合体。
  28. 前記リンカーが以下の式：
    （＃3は前記活性化合物分子との結合を表し、
    ＃4は前記結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
    R11はHまたはNH2を表し；
    Bは−［（CH2）x−（X4）y］w−（CH2）z−を表し、
    w＝0〜20；
    x＝0〜5；
    x＝0〜5；
    y＝0または1；
    z＝0〜5；および
    X4は−O−、−CONH−または−NHCO−
    を表す）
    を有する、請求項25に記載の複合体。
  29. R1またはR4が−L−＃1を表す、請求項25に記載の複合体。
  30. 以下の式：
    （X1、X2およびX3は請求項4のものと同じ意味を有し、
    AK1は結合剤の硫黄原子を介して結合している結合剤ペプチドまたはタンパク質を表し；
    nは1〜20の数字を表し；
    L1はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−CONH−、−NHCO−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−、ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
    ）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐鎖を表す、1〜70個の炭素原子を有する分岐していてもよい炭化水素基を表し、
    側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、
    SG1は2〜8オリゴペプチド、好ましくはジペプチドであり；
    L4は単結合または基−（CO）y−G4−
    （yは0または1を表し、
    G4はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−、ならびにN、OおよびSまたは−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
    ）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
    である）
    の1つを有する、請求項25から29のいずれか一項に記載の複合体。
  31. 以下の式：
    （AK1Aは前記結合剤の硫黄原子を介して結合している結合剤ペプチドまたはタンパク質を表し；
    nは1〜20の数字を表し；
    L1はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−CONH−、−NHCO−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−、ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
    ）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、
    側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
    の一方または両方を有する、結合剤またはその誘導体と1種または複数の活性化合物分子の複合体。
  32. 前記リンカー−L−がシステイン側鎖またはシステイン残基に結合しており、以下の式：
    （§は前記活性化合物分子との結合を表し、
    §§は前記結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
    mは0、1、2または3であり；
    nは0、1または2であり；
    pは0〜20であり；
    L3は
    （oは0または1であり；
    G3はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、ならびにN、OおよびS、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
    ）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
    を表す）
    を有する、請求項1から31のいずれか一項に記載の複合体。
  33. 前記リンカー−L−がシステイン側鎖またはシステイン残基に結合しており、以下の式：
    （§は前記活性化合物分子との結合を表し、
    §§は前記結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
    mは1であり；
    pは0であり；
    nは0であり；
    L3は
    （oは0または1であり；
    G3は−（CH2CH2O）s（CH2）t（CONH）u（CH2CH2O）v（CH2）w−
    （s、t、vおよびwはそれぞれ互いに独立に、0〜20であり、uは0または1である）
    を表す）
    を表す）
    を有する、請求項32に記載の複合体。
  34. R2またはR3が−L−＃1を表す、請求項32または33に記載の複合体。
  35. 以下の式：
    （X1、X2およびX3は請求項4のものと同じ意味を有し、
    AK1は前記結合剤の硫黄原子を介して結合している結合剤ペプチドまたはタンパク質を表し；
    nは1〜20の数字を表し；
    L2およびL3はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−NHCO−、−CONH−、−CONHNH−、ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
    ）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、
    側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
    の1つを有する、請求項34に記載の複合体。
  36. 前記リンカー−L−がリジン側鎖に結合しており、以下の式を有する：
    −§−（SG）x−L4−CO−§§
    （§は前記活性化合物分子との結合を表し、
    §§は前記結合剤ペプチドまたはタンパク質との結合を表し、
    xは0または1を表し、
    SGは切断可能基、好ましくは2〜8オリゴペプチド、特に好ましくはジペプチドを表し、
    L4は単結合または基−（CO）y−G4−（yは0または1を表し、
    G4はアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NHCO−、−CONH−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−CONHNH−、ならびにN、OおよびS、または−SO−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
    ）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、側鎖は、存在する場合、NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい）
    を表す）
    請求項1から31のいずれか一項に記載の複合体。
  37. 以下の式：
    （X1、X2およびX3は請求項4のものと同じ意味を有し、
    AK2は前記結合剤の硫黄原子を介して結合している結合剤ペプチドまたはタンパク質を表し；
    nは1〜20の数字を表し；
    L4は場合によりアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NH−、−CO−、−NMe−、−NHNH−、−SO2NHNH−、−NHCO−、−CONH−、−CONHNH−、ならびにN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する5〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
    ）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素鎖を表し、
    側鎖は、存在する場合、−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよく、
    SG1は切断可能基、好ましくは2〜8オリゴペプチド、特に好ましくはジペプチドを表す）
    の1つを有する、請求項36に記載の結合剤ペプチドまたはタンパク質の複合体。
  38. 前記抗TWEAKR抗体がアゴニスト抗体である、請求項20から37のいずれか一項に記載の複合体。
  39. a．式PYPMX（配列番号171）（XはIまたはMである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖のCDR1；
    b．式YISPSGGXTHYADSVKG（配列番号172）（XはSまたはKである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖のCDR2；および
    c．式GGDTYFDYFDY（配列番号173）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖のCDR3；
    を含む可変重鎖
    ならびに
    d．式RASQSISXYLN（配列番号174）（XはGまたはSである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖のCDR1；
    e．式XASSLQS（配列番号175）（XはQ、AまたはNである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖のCDR2；および
    f．式QQSYXXPXIT（配列番号176）（5位のXはTまたはSであり、6位のXはTまたはSであり、8位のXはGまたはFである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖のCDR3
    を含む可変軽鎖
    を含む、請求項20から38のいずれか一項に記載の複合体。
  40. a．配列番号10に示される重鎖の可変配列および配列番号9に示される軽鎖の可変配列、または
    b．配列番号20に示される重鎖の可変配列および配列番号19に示される軽鎖の可変配列、または
    c．配列番号30に示される重鎖の可変配列および配列番号29に示される軽鎖の可変配列、または
    d．配列番号40に示される重鎖の可変配列および配列番号39に示される軽鎖の可変配列、または
    e．配列番号50に示される重鎖の可変配列および配列番号49に示される軽鎖の可変配列、または
    f．配列番号60に示される重鎖の可変配列および配列番号59に示される軽鎖の可変配列、または
    g．配列番号70に示される重鎖の可変配列および配列番号69に示される軽鎖の可変配列、または
    h．配列番号80に示される重鎖の可変配列および配列番号79に示される軽鎖の可変配列、または
    i．配列番号90に示される重鎖の可変配列および配列番号89に示される軽鎖の可変配列、または
    j．配列番号100に示される重鎖の可変配列および配列番号99に示される軽鎖の可変配列、または
    k．配列番号110に示される重鎖の可変配列および配列番号109に示される軽鎖の可変配列、または
    l．配列番号120に示される重鎖の可変配列および配列番号119に示される軽鎖の可変配列
    を含む、請求項20から39のいずれか一項に記載の複合体。
  41. 前記抗体がIgG抗体である、請求項20から40のいずれか一項に記載の複合体。
  42. a．配列番号2に示される重鎖の配列および配列番号1に示される軽鎖の配列、または
    b．配列番号12に示される重鎖の配列および配列番号11に示される軽鎖の配列、または
    c．配列番号22に示される重鎖の配列および配列番号21に示される軽鎖の配列、または
    d．配列番号32に示される重鎖の配列および配列番号31に示される軽鎖の配列、または
    e．配列番号42に示される重鎖の配列および配列番号41に示される軽鎖の配列、または
    f．配列番号52に示される重鎖の配列および配列番号51に示される軽鎖の配列、または
    g．配列番号62に示される重鎖の配列および配列番号61に示される軽鎖の配列、または
    h．配列番号72に示される重鎖の配列および配列番号71に示される軽鎖の配列、または
    i．配列番号82に示される重鎖の配列および配列番号81に示される軽鎖の配列、または
    j．配列番号92に示される重鎖の配列および配列番号91に示される軽鎖の配列、または
    k．配列番号102に示される重鎖の配列および配列番号101に示される軽鎖の配列、または
    l．配列番号112に示される重鎖の配列および配列番号111に示される軽鎖の配列
    を含む、請求項20から41のいずれか一項に記載の複合体。
  43. 結合剤ペプチドまたはタンパク質1個当たり1〜10個、好ましくは2〜8個の活性化合物分子を有する、請求項1から42のいずれか一項に記載の紡錘体複合体。
  44. 好ましくはそのトリフルオロ酢酸塩の形態の、以下の式の1つの化合物が、場合により事前に部分的に還元された結合剤ペプチドまたはタンパク質のシステイン残基に結合しており、前記化合物が好ましくは前記結合剤ペプチドまたはタンパク質に関して2〜12倍モル過剰で使用される、請求項30または34に記載の複合体を調製する方法：
    （Rは−Hまたは−COOHを表し、
    KはC1〜C6−アルコキシまたは−OH−C1〜C6−アルキルによって置換されていてもよい直鎖または分岐鎖を表し、
    X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3およびL4は請求項30または34と同じ意味を有する）。
  45. 好ましくはそのトリフルオロ酢酸塩の形態の、以下の式の1つの化合物が、結合剤ペプチドまたはタンパク質のシステイン残基に結合しており、前記化合物が好ましくは前記結合剤ペプチドまたはタンパク質に関して2〜12倍モル過剰で使用される、請求項44に記載の複合体を調製する方法：
    （X1、X2、X3、SG1およびL4は請求項36のものと同じ意味を有する）。
  46. 以下の1つの式：
    （Rは−Hまたは−COOHを表し、
    KはC1〜C6−アルコキシまたは−OH−C1〜C6−アルキルによって置換されていてもよい直鎖または分岐鎖を表し、
    X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3およびL4は請求項26、30または32のものと同じ意味を有する）
    の化合物。
  47. 一般式（III）：
    （X1はNを表し、X2はNを表し、X3はCを表す、またはX1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表す、またはX1はNHを表し、X2はCを表し、X3はCを表す、またはX1はCHを表し、X2はNを表し、X3はCを表し；
    R1は−L−BINDER、Hまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し、WはHまたはOHを表し、
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し；
    R2およびR4は互いに独立に、−L−BINDER、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表すか、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
    Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
    AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
    R3は−L−BINDERまたは置換されていてもよいアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリールまたはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
    （「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
    R5は−L−BINDER、H、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    Lはリンカーを表し、BINDERは結合剤またはその誘導体を表し、
    前記結合剤は複数の活性化合物分子と結合していてもよく、
    R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（フッ素化されていてもよい）C1〜10−アルキル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルケニル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、
    R8は（フッ素化されていてもよい）C1〜10−アルキル、（フッ素化されていてもよい）C4〜10−シクロアルキルまたは置換されていてもよいオキセタンを表し；
    R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
    の化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは溶媒和物の塩。
  48. 一般式（IV）：
    （X1はCHを表し、X2はCを表し、X3はNを表し；
    R1は−L−BINDER、Hまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、−NHY3、−OY3、−SY3、ハロゲン、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2、−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’または−CH（CH2W）Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、NH2、SO3H、COOH、−NH−CO−CH2−CH2−CH（NH2）COOHまたは−（CO−NH−CHY4）1〜3COOHを表し；WはHまたはOHを表し；
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6−アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し；
    R2およびR4は互いに独立に、−L−BINDER、H、−CO−CHY4−NHY5または−（CH2）0〜3Zを表す、あるいはR2およびR4は一緒になって（ピロリジン環の形成により）−CH2−CHR10−または−CHR10−CH2−を表し、R10はL−＃1、H、NH2、SO3H、COOH、SHまたはOHを表し、
    Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    Y4は互いに独立に、−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖もしくは分岐C1〜6アルキルを表すか、または−NH2によって置換されていてもよいアリールもしくはベンジルを表し、Y5はHまたは−CO−CHY6−NH2を表し、Y6は直鎖または分岐C1〜6アルキルを表し；
    AはCO、SO、SO2、SO2NHまたはCNNHを表し；
    R3は−L−BINDERまたは置換されていてもよいアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、好ましくは−L−＃1あるいは1〜3個の−OH基、1〜3個のハロゲン原子、1〜3個のハロゲン化アルキル基（それぞれ1〜3個のハロゲン原子を有する）、1〜3個のO−アルキル基、1〜3個の−SH基、1〜3個の−S−アルキル基、1〜3個の−O−CO−アルキル基、1〜3個の−O−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−アルキル基、1〜3個の−NH−CO−NH−アルキル基、1〜3個の−S（O）n−アルキル基、1〜3個の−SO2−NH−アルキル基、1〜3個の−NH−アルキル基、1〜3個の−N（アルキル）2基、1〜3個の−NH2基または1〜3個の−（CH2）0〜3Z基によって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリール、C6〜10−アラルキル、C5〜10−ヘテロアルキル、C1〜10−アルキル−O−C6〜10−アリール−またはC5〜10−ヘテロシクロアルキル基を表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はH、−（CH2）0〜3−CH（NHCOCH3）Z’、−（CH2）0〜3−CH（NH2）Z’または−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し、
    （「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）；
    R5は−L−BINDER、H、F、NH2、NO2、ハロゲン、SHまたは−（CH2）0〜3Zを表し、Zは−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、
    Y1およびY2は互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3はHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’はH、SO3H、NH2またはCOOHを表し；
    Lはリンカーを表し、BINDERは結合剤またはその誘導体を表し、結合剤は複数の活性化合物分子に結合していてもよく、
    R6およびR7は互いに独立に、H、シアノ、（フッ素化されていてもよい）C1〜10−アルキル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルケニル、（フッ素化されていてもよい）C2〜10−アルキニル、ヒドロキシまたはハロゲンを表し、R8は（フッ素化されていてもよい）C1〜10−アルキル、（フッ素化されていてもよい）C4〜10−シクロアルキルまたは置換されていてもよいオキセタンを表し；
    R9はH、F、CH3、CF3、CH2FまたはCHF2を表す）
    の化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは溶媒和物の塩。
  49. ZがClまたはBrを表す、請求項48に記載の化合物。
  50. R1が−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−CO−NY1Y2を表し、Y2が−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表し、Y1がH、NH2または−（CH2CH2O）0〜3−（CH2）0〜3Z’を表す、請求項48に記載の化合物。
  51. Y1がHを表し、Y2が−（CH2CH2O）3−CH2CH2Z’を表し、Z’が−COOHを表す、請求項48から50のいずれか一項に記載の化合物。
  52. Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−（CONHCHY4）2COOHを表す、請求項48から50のいずれか一項に記載の化合物。
  53. Y4が−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表す、請求項48に記載の化合物。
  54. 少なくとも1つのY4がi−プロピルおよび−CH3からなる群から選択される、請求項48に記載の化合物。
  55. Y1がHを表し、Y2が−CH2CH2Z’を表し、Z’が−CONHCHY4COOHを表し、Y4が−NH2によって置換されていてもよいアリールまたはベンジルを表す、請求項48または50に記載の化合物。
  56. Y4がアミノベンジルを表す、請求項55に記載の化合物。
  57. R2が−（CH2）0〜3Zを表し、Zが−SY3を表す、請求項48に記載の化合物。
  58. R4が−CO−CHY4−NHY5を表し、Y5がHを表す、請求項48に記載の化合物。
  59. R4が−CO−CHY4−NHY5を表し、Y5が−CO−CHY6−NH2を表す、請求項48に記載の化合物。
  60. Y4が−NHCONH2によって置換されていてもよい直鎖または分岐C1〜6−アルキルを表す、請求項58または59に記載の化合物。
  61. 以下の式の1つを有する請求項48から60のいずれか一項に記載の化合物：
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド；
    （2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］−N−メチルブタンアミド（1：1）；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1S）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アセトアミド；
    （15S，19R）−15−アミノ−19−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−18−グリコロイル−20，20−ジメチル−14−オキソ−4，7，10−トリオキサ−13，18−ジアザヘンイコサン−1−酸；
    N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチン；
    N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N5−カルバモイル−L−オルニチン；
    N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−4−アミノ−L−フェニルアラニン；
    N−｛（1R）−1−［1−（3−アミノベンジル）−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N−（3−アミノプロピル）−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）；
    （2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタン酸；
    N−［（3S）−3−アミノ−4−ヒドラジノ−4−オキソブチル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）；
    N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−N−［（3S）−3，4−ジアミノブチル］−2−ヒドロキシアセトアミド（1：1）；
    N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニン；
    （2S）−2−アミノ−N−（2−アミノエチル）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタンアミド（2：1）；
    （1−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）酢酸；
    N−［3−アミノ−2−（スルファニルメチル）プロピル］−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド塩酸塩（1：1）；
    4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド（2：1）；
    N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）；
    L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）；
    L−バリル−N−｛3−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］プロピル｝−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド（1：1）；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1S）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシアセトアミド；
    S−（1−｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン；
    S−［1−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン；
    N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N−［4−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）フェニル］−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド；
    S−（1−｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン；
    S−［1−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン； N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル−L−アラニル−N−［4−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）フェニル］−N5−カルバモイル−L−オルニチンアミド；
    S−（1−｛2−［（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）アミノ］エチル｝−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル）−L−システイン；
    N−［6−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−N5−カルバモイル−L−オルニチル−N6−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−リジン；
    S−［1−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン；
    S−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−L−システイン；
    S−｛1−［6−（2−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝ヒドラジノ）−6−オキソヘキシル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン；
    N−［19−（3（R／S）−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝ホモシステイン；
    S−｛（3R／S）−1−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン；
    N−［19−（3（R／S）−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）−17−オキソ−4，7，10，13−テトラオキサ−16−アザノナデカン−1−オイル］−R／S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝ホモシステイン；
    S−［（3R／S）−1−（2−｛［6−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）ヘキサノイル］アミノ｝エチル）−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル］−L−システイン；
    S−｛1−［2−（｛［（1R，3S）−3−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）シクロペンチル］カルボニル｝アミノ）エチル］−2，5−ジオキソピロリジン−3−イル｝−L−システイン；
    S−（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）−L−システイン；
    N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−イミダゾール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−D−アラニル）−L−リジン；
    N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−N2−｛N−［6−（3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル）ヘキサノイル］−L−バリル−L−アラニル｝−L−リジン；
    N−［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］−L−グルタミン；
    N6−（N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニル）−L−リジン；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アセトアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−メトキシアセトアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2，4−ジフルオロベンズアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−メチルベンズアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−エトキシアセトアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−3，3，3−トリフルオロプロパンアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−フルオロベンズアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アセトアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−（トリフルオロメチル）ベンズアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−エトキシアセトアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−エトキシアセトアミド；
    （2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタン酸；
    （2S）−2−アミノ−N−（2−アミノエチル）−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタンアミド；
    4−［（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸；
    4−［（2−｛［2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）エチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−2−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸；
    N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−β−アラニン；
    N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−セリン；
    N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝−L−アラニン；
    N−｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝グリシン；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−メチルベンズアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−4−（メチルスルファニル）ベンズアミド；
    （2S）−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシプロパンアミド；
    N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−（メチルスルファニル）アセトアミド；
    （2S）−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝−2−ヒドロキシプロパンアミド；
    4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−4−オキソ酪酸メチル；
    4−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−4−オキソブタン酸；
    （2R）−22−［（3R／S）−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−2，5−ジオキソピロリジン−1−イル］−2−［（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）メチル−4，20−ジオキソ−7，10，13，16−テトラオキサ−3，19−ジアザドコサン−1−酸；
    4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［4−ベンジル−1−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピラゾール−3−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド；
    N−アセチル−S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝−L−システイン；
    N−アセチル−S−［2−（［3−（L−アラニルアミノ）プロピル］｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ）−2−オキソエチル］−L−システイン；
    （2S）−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝テトラヒドロフラン−2−カルボキサミド；
    3−（｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝スルファニル）プロパン酸；
    S−｛2−［（3−アミノプロピル）｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝アミノ］−2−オキソエチル｝ホモシステイン；
    4−アミノ−N−（3−アミノプロピル）−N−｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝ベンズアミド；
    4−［（2−｛［（2R）−2−（｛（2S）−2−アミノ−4−［｛（1R）−1−［1−ベンジル−4−（2，5−ジフルオロフェニル）−1H−ピロール−2−イル］−2，2−ジメチルプロピル｝（グリコロイル）アミノ］ブタノイル｝アミノ）−2−カルボキシエチル］アミノ｝−2−オキソエチル）アミノ］−3−｛［（2R）−2−アミノ−2−カルボキシエチル］スルファニル｝−4−オキソブタン酸。
  62. 不活性で、非毒性の薬学的に適した補助剤と組み合わせた、請求項1から43のいずれか一項に記載の複合体または請求項48から61のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
  63. 疾患を治療および／または予防する方法に使用するための請求項1から43のいずれか一項に記載の複合体または請求項48から61のいずれか一項に記載の化合物。
  64. 過剰増殖および／または血管新生障害を治療する方法に使用するための請求項1から43のいずれか一項に記載の複合体または請求項48から61のいずれか一項に記載の化合物。
  65. R3aまたはR3が−L−BINDERまたは置換アルキル、アリールまたはヘテロアリール基、好ましくは−L−＃1あるいは−OH、O−アルキル、SH、S−アルキル、O−CO−アルキル、O−CO−NH−アルキル、NH−CO−アルキル、NH−CO−NH−アルキル、S（O）n−アルキル、SO2−NH−アルキル、NH−アルキル、N（アルキル）2、NH2または−（CH2）0〜3Zによって置換されていてもよいC1〜10−アルキル、C6〜10−アリールまたはC6〜10−アラルキル基またはC5〜10−ヘテロアルキルを表し、Zが−H、ハロゲン、−OY3、−SY3、−NHY3、−CO−NY1Y2または−CO−OY3を表し、Y1およびY2が互いに独立に、H、NH2または−（CH2）0〜3Z’を表し、Y3がHまたは−（CH2）0〜3Z’を表し、Z’がH、SO3H、NH2またはCOOHを表す
    （「アルキル」は好ましくはC1〜10−アルキルを表す）、
    請求項1から43のいずれか一項に記載の複合体または請求項48から61のいずれか一項に記載の化合物。
  66. 有効量の少なくとも1種の請求項1から43のいずれか一項に記載の複合体または請求項48から61のいずれか一項に記載の化合物を用いてヒトおよび動物における過剰増殖および／または血管新生障害を治療および／または予防する方法。
  67. 以下の式の1つによる抗体複合体
    （nは1〜20の数字であり、AK1AおよびAK2Aは抗体を表す）：
    （ADCは、基
    を介して抗体に結合している場合、この基の代わりに、少なくとも部分的に加水分解された開鎖スクシンアミドの形態で存在してもよい）。
  68. 以下の一般式の結合剤−活性化合物：
    （BINDERは結合剤（好ましくは：抗体）またはその誘導体（好ましくは：システイン残基）、好ましくは抗体を表し、Lはリンカーを表し、WSは活性化合物、好ましくはKSP阻害剤を表し、mは1〜2の数字を表し、nは1〜50の数字を表し、Lは以下の構造を有する：
    （＃1は前記結合剤の硫黄原子との結合点を示し、＃2は前記活性化合物との結合点を示し、R22はCOOH、COOR、COR（RはそれぞれC1〜3−アルキルを表す）、CONH2、Br、好ましくはCOOHを表し；
    L5は−（CH2）m−（CHRS）n−（OCH2CH2）o−（X）p−（CH2）q−（m、n、o、pおよびqは互いに独立に、以下の値を有する：m＝0〜10；n＝0または1；o＝0〜10；p＝0または1；およびq＝0〜10、ここでm＋n＋o＝1〜15、好ましくは1〜6である）から選択される基であり、Xは5または6員芳香族または非芳香族複素環または同素環、好ましくは−C6H4−または−C6H10−を表し、RSは酸基、好ましくは−COOHまたはSO3Hを表し、L6は−CONH−、−OCONH−、−NHCO−、−NHCOO−、
    および
    （rは1、2または3である）から選択される基であり、
    L7は単結合あるいはアリーレン基および／または直鎖および／または分岐および／または環状アルキレン基からの1〜100個（好ましくは1〜10個）の炭素原子を有し、基−O−、−S−、−SO−、SO2、−NRy−、−NRyCO−、−C（NH）NRy−、CONRy−、−NRyNRy−、−SO2NRyNRy−、−CONRyNRy−（RyはH、その各々がNHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよいフェニル、C1〜C10−アルキル、C2〜C10−アルケニルまたはC2〜C10−アルキニルを表す）、−CO−、−CRx＝N−O−（RxはH、C1〜C3−アルキルまたはフェニルを表す）、ならびに／あるいはN、OおよびS、−SO−または−SO2−からなる群から選択される最大4個のヘテロ原子を有する3〜10員芳香族または非芳香族複素環（好ましくは
    ）の1つまたは複数によって1回または2回以上中断されていてもよい直鎖または分岐炭化水素基から選択される基であり、任意の側鎖を含む炭化水素鎖は−NHCONH2、−COOH、−OH、−NH2、NH−CNNH2、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドまたはスルホン酸によって置換されていてもよい））。
  69. 前記抗体がヒト、ヒト化もしくはキメラモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項67または68に記載の複合体。
  70. 前記抗体が抗HER2抗体および抗EGFR抗体、抗TWEAKR抗体またはそれらの抗原結合フラグメントである、請求項69に記載の複合体。
  71. 前記抗TWEAKR抗体がTWEAKR（配列番号169）の47位のアミノ酸D（D47）に特異的に結合する、好ましくは抗TWEAKR抗体TPP−2090である、請求項70に記載の複合体。
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