JP2017197556A - ヒアルロナン分解酵素の安定な製剤 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒアルロナン分解酵素の安定な製剤又は速効性のインスリン及び組み換えヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０)を含むヒアルロナン分解酵素の安定な配合剤である組成物の提供。【解決手段】６.８〜７.８(両端値を含む)のｐＨを有し、ａ)治療有効量の速効性のインスリンと、ｂ)組成物を超速効性とするのに十分な量のヒアルロニダーゼと、ｃ)５０mM〜１２０mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌと、ｄ)１種又は複数種の安定化剤と、ｅ)フェノール防腐剤を含む１種又は複数種の防腐剤と、を含み、ここで、１種又は複数種の防腐剤の総量が製剤の重量濃度(ｗ／ｖ％)として０.１〜０.４％(両端値を含む)であり、それにより、２〜８℃(両端値を含む)の温度で少なくとも６ヶ月間及び／又は正確に又は２０〜３０℃(両端値を含む)の温度で少なくとも１４日間安定である、安定な配合剤組成物。【選択図】なし

Description

関連出願
優先権の利益を、“ヒアルロナン分解酵素およびインスリンの安定な配合剤”なる表題の２０１１年６月１７日出願の米国仮出願番号６１／５２０,９６２に基づいて主張する。

本出願は、これと同日出願の“ヒアルロナン分解酵素の安定な製剤”なる表題の米国出願番号１３／５０７,２６３に関連し、当該出願は米国仮出願番号６１／５２０,９６２に基づく優先権を主張する。本出願はまたこれと同日出願の“ヒアルロナン分解酵素の安定な製剤”なる表題の米国出願番号１３／５０７,２６２に関連し、当該出願は米国仮出願番号６１／５２０,９６２に基づく優先権を主張する。上記関連出願の対象を、その全体を引用により本明細書に包含させる。

本出願はまた、それぞれ、“ヒアルロナン分解酵素を伴う連続的皮下インスリン注入方法”なる表題の２０１１年６月１７日出願の米国仮出願番号６１／５２０,９４０、２０１１年１０月２７日出願の米国仮出願番号６１／６２８,３８９、および２０１２年６月８日出願の米国仮出願番号６１／６５７,６０６にも関連する。本出願はまたこれと同日出願の“ヒアルロナン分解酵素を伴う連続的皮下インスリン注入方法”なる表題の米国出願番号１３／５０７,２６１に関連し、当該出願は米国仮出願番号６１／５２０,９４０、６１／６２８,３８９および６１／６５７,６０６に基づく優先権を主張する。本出願はまたこれと同日出願の“ヒアルロナン分解酵素を伴う連続的皮下インスリン注入方法”なる表題の国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４２８１８にも関し、当該出願は米国仮出願番号６１／５２０,９４０、６１／６２８,３８９および６１／６５７,６０６に基づく優先権を主張する。

本出願はまた２００９年４月２８日出願の、発明者グレゴリー・フロスト、イゴー・ビリンスキー、ダニエル・ボーンおよびバリー・シュガーマンの、米国公報ＵＳ２００９０３０４６６５として公開された“超速効型インスリン組成物”なる表題の米国出願番号１２／３８７,２２５にも関し、当該出願は２００８年４月２８日出願の米国仮出願番号６１／１２５,８３５に基づく優先権を主張する。
上記参考出願の対象を、その全体を引用により本明細書に包含させる。

電子的に提出された配列を引用することによる取り込み
本出願と共に電子版の配列表が提出され、その内容をその全体を引用により本明細書に包含させる。電子ファイルは８６０キロバイトのサイズであり、ファイル名3085seqPC1.txtである。

発明の分野
提供されるのは、組み換えヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０)を含む、ヒアルロナン分解酵素の安定な製剤である組成物または速効性のインスリンおよびヒアルロナン分解酵素の安定な配合剤である組成物である。

背景
糖尿病は、膵臓が適切な量のインスリンを産生することができないためまたは細胞が適切にインスリンを合成かつ放出することができないために、慢性高血糖を生じる。高血糖はまた重症患者に発生する可能性があり、死亡率および罹病率の上昇に繋がる。インスリンは、例えば、１型糖尿病、２型糖尿病および妊娠性糖尿病を含む糖尿病を有する患者を処置するために、正常個体で生じる内因性インスリン応答を模倣するために、治療剤として投与されている。インスリンはまた血糖値を制御するために高血糖を伴う重症患者にも投与されている。

典型的に、速効性のインスリン類は、このような対象に、高血糖に応答して、または高血糖の予想に対応して、例えば、喫食後に投与され、血糖制御をもたらすことができる。しかしながら、現在のインスリン類の速効製剤は吸収および作用に遅れがあり、それ故に、即効的内因性インスリンの作用に近似していない。それ故に、このような製剤は、初期段階のインスリン放出の直後に起こる肝グルコース生産を遮断するのに十分な速度で作用しない。この薬理作用の遅延のために、速効性インスリン製剤は、所望の血糖制御を達成するためには、食前に投与される必要がある。さらに、投与されるべき投与量は作用時間の延長をもたらし、低血糖および、多くの場合、肥満をもたらす。

ヒアルロナン分解酵素群は、単独で治療活性を示す酵素群であり、またインスリンのような治療剤を伴わずに共投与される。例えば、ヒアルロナン分解酵素および速効性インスリン(例えば速効型インスリン類似体)を含む超速効性インスリン組成物が開発されており、これは、対象に投与したとき、速効性のインスリン単独と比較して、非糖尿病対象において内因性(すなわち、自然な)食後インスリン放出をより厳密に模倣する組成物となる(例えば米国公開番号ＵＳ２００９０３０４６６５参照)。改善されたヒアルロナン分解酵素群の製剤および配合剤の必要性がある。また、対象を処置するための、例えば糖尿病対象において血糖値を管理するための改善された安定なインスリン製剤の必要性もある。

要約
ここに提供されるのは、治療有効量の速効性のインスリンおよび組成物を超速効性とするのに十分な量のヒアルロナン分解酵素を含む、安定な配合剤組成物である。提供される安定な配合剤は、それぞれ安定性に対する要求が異なる頻回注射法(ＭＤＩ)のために製剤されまたは持続皮下インスリン注入療法(ＣＳＩＩ)のために製剤される。特に、ＣＳＩＩ用配合剤は、高温かつ撹拌下に安定であるように製剤され、一方、ＭＤＩ用配合剤は、冷蔵または環境温度で保存されたときに安定であるように製剤される。

ここに提供されるのは、治療有効量の速効性のインスリン、本組成物を超速効性とするのに十分な量のヒアルロナン分解酵素、５０mM〜２００mMまたは約５０mM〜２００mM濃度のＮａＣｌ、防腐剤の抗菌有効量または防腐剤と一種または複数種の安定化剤の混合物を含む、安定な配合剤組成物である。提供される配合剤は、６.８〜７.８または約６.８〜７.８のｐＨを有し、本組成物が正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間安定であるように製剤する。

数例において、ここに提供する安定な配合剤中のヒアルロナン分解酵素は、初期のヒアルロニダーゼ活性を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持し、および／またはインスリンは、正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間組成物中でインスリン初期レベルの少なくとも９０％力価を維持するかまたは回収させ、および／またはインスリンは、正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間初期インスリン純度の少なくとも９０％を維持し、および／またはインスリンは正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間高分子量(ＨＭＷｔ)インスリン種を２％未満に維持する。例えば、安定な配合剤中のヒアルロナン分解酵素は、正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間、初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上を維持し、インスリンの純度または力価は、正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。

いくつかの態様において、ここに提供される安定な配合剤組成物のｐＨは、正確にまたは約７.０〜７.６である。例えば、安定な配合剤のｐＨは、正確にまたは約６.８±０.２、６.９±０.２、７.０±０.２、７.１±０.２、７.２±０.２、７.３±０.２、７.４±０.２、７.５±０.２、７.６±０.２、７.７±０.２または７.８±０.２である。ここに提供される安定な配合剤組成物のＮａＣｌ濃度は、正確にまたは約８０mM〜２００mM、８０mM〜１４０mM、５０mM〜１００mM、８０mM〜１００mM、５０mM〜８０mM、１００mM〜１４０mMまたは１２０mM〜１４０mMである。例えば、安定な配合剤のＮａＣｌ濃度は、正確にまたは約５０mM、５５mM、６０mM、６５mM、７０mM、７５mM、８０mM、８５mM、９０mM、９５mM、１００mM、１２０mM、１２５mM、１３０mM、１３５mM、１４０mM、１４５mM、１５０mM、１５５mM、１６０mM、１６５mM、１７０mM、１７５mM、１８０mM、１８５mM、１９０mM、１９５mMまたは２００mMまたは少なくとも５０mM、５５mM、６０mM、６５mM、７０mM、７５mM、８０mM、８５mM、９０mM、９５mM、１００mM、１２０mM、１２５mM、１３０mM、１３５mM、１４０mM、１４５mM、１５０mM、１５５mM、１６０mM、１６５mM、１７０mM、１７５mM、１８０mM、１８５mM、１９０mM、１９５mMまたは２００mMである。このような例において、１００mM未満の組成物におけるＮａＣｌ量の上限は、最大１１０mM、１２０mM、１３０mM、１４０mM、１５０mM、１６０mM、１７０mM、１８０mM、１９０mMまたは２００mMである。数例において、ここで提供される安定な配合剤は、６.８〜７.８または約６.８〜７.８のｐＨ範囲を維持するために十分量の緩衝剤を含む。

一つの態様において、ここに提供される安定な配合剤は、２℃〜８℃または約２℃〜８℃(両端値を含む)の温度で、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２４ヶ月間、２５ヶ月間、２６ヶ月間、２７ヶ月間、２８ヶ月間、２９ヶ月間または３０ヶ月間安定である。例えば、本配合剤は、２℃〜８℃または約２℃〜８℃(両端値を含む)の温度で、少なくとも１８ヶ月間または少なくとも２４ヶ月間安定である。他の態様において、ここに提供される安定な配合剤は、正確にまたは約２０℃〜３０℃(両端値を含む)の温度で、少なくとも１５日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間または５０日間安定である。例えば、本配合剤は、正確にまたは約２０℃〜３０℃(両端値を含む)の温度で、少なくとも１ヶ月間安定である。

また、ここに提供されるのは、治療有効量の速効性のインスリン、本組成物を超速効性とするのに十分な量のヒアルロナン分解酵素、正確にまたは約１２０mM〜２００mMの濃度のＮａＣｌ、防腐剤の抗菌有効量または防腐剤と一種または複数種の安定化剤の混合物を含む、安定な配合剤組成物である。提供される配合剤は、正確にまたは約６.５〜７.５のｐＨを有し、本組成物は、正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で少なくとも３日間安定であるかまたは撹拌下に少なくとも３時間安定である。

数例において、安定な配合剤は、さらに有効量のタンパク質類、グリコサミノグリカン類(ＧＡＧ)、多糖類、脂肪酸類、ラノスタノイド類、抗生物質、抗線虫剤、合成有機化合物および／または植物由来生理活性成分を含むが、これらに限定されないヒアルロニダーゼ阻害剤を含む。植物由来生理活性成分の例は、アルカロイド、抗酸化剤、ポリフェノール、フラボノイド類、テルペノイド類および／または抗炎症剤である。数例において、ここで提供される安定な配合剤におけるヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロナン分解酵素またはインスリンと共有結合複合体を形成しない。ヒアルロニダーゼ阻害剤の例は、血清ヒアルロニダーゼ阻害剤、アシュワガンダ(Withania somnifera)糖タンパク質(ＷＳＧ)、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、キトサン類、β−(１,４)−ガラクト−オリゴ糖類、硫酸化ベルバスコース、硫酸化プランテオース、ペクチン、ポリ(スチレン−４−スルホネート)、デキストラン硫酸、アルギン酸ナトリウム、ワカメ(Undaria pinnatifida)由来の多糖、マンデル酸縮合重合体、エイコサトリエン酸、ネルボン酸、オレアノール酸、アリストロキン酸、アジマリン、レセルピン、フラボン、デスメトキシセンタウレイジン、ケルセチン、アピゲニン、ケンフェロール、シリビン、ルテオリン、ルテオリン−７−グルコシド、フロレチン、アピイン、ヘスペリジン、スルホン化ヘスペリジン、カリコシン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フラボン−７−硫酸ナトリウム、フラボン７−フルオロ−４’−ヒドロキシフラボン、４’−クロロ−４,６−ジメトキシカルコン、５−ヒドロキシフラボン−７−硫酸ナトリウム、ミリセチン、ルチン、モリン、グリチルリジン、ビタミンＣ、Ｄ−イソアスコルビン酸、Ｄ−糖酸１,４−ラクトン、Ｌ−アスコルビン酸−６−ヘキサデカノエート(Vcpal)、６−Ｏ−アシル化ビタミンＣ、カテキン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、クルクミン、没食子酸Ｎ−プロピル、タンニン酸、エラグ酸、没食子酸、フロロフコフレッコールＡ、ジエコール、８,８’−ビエコール、プロシアニジン、ゴシポール、セレコキシブ、ニメスリド、デキサメサゾン、インドメタシン、フェノプロフェン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、サリチレート、クロモグリク酸二ナトリウム、金チオリンゴ酸ナトリウム、トランシリスト、トラキサノクス、イベルメクチン、リンコマイシンおよびスペクチノマイシン、スルファメトキサゾールおよびトリメトプリム、ネオマイシン硫酸塩、３α−アセチルポリポレン酸Ａ、(２５Ｓ)−(＋)−１２α−ヒドロキシ−３α−メチルカルボキシアセテート−２４−メチルラノスタ−８,２４(３１)−ジエン−２６−オイック酸、ラノスタノイド、ポリポレン酸Ｃ、ＰＳ５３(ヒドロキノン−スルホン酸−ホルムアルデヒドポリマー)、ポリ(スチレン−４−スルホネート)のポリマー、VERSA-TL 502、１−テトラデカンスルホン酸、マンデル酸縮合重合体(ＳＡＭＭＡ)、１,３−ジアセチルベンゾイミダゾール−２−チオン、Ｎ−モノアシル化ベンズイミダゾール−２−チオン、Ｎ,Ｎ’−ジアシル化ベンズイミダゾール−２−チオン、アルキル−２−フェニルインドール誘導体、３−プロパノイルベンゾオキサゾール−２−チオン、Ｎ−アルキル化インドール誘導体、Ｎ−アシル化インドール誘導体、ベンゾチアゾール誘導体、Ｎ−置換インドール−２−および３−カルボキサミド誘導体、Ｎ−置換インドール−２−および３−カルボキサミド誘導体のハロゲン化類似体(クロロおよびフルオロ)、２−(４−ヒドロキシフェニル)−３−フェニルインドール、インドールカルボキサミド類、インドールアセトアミド類、３−ベンゾリル−１−メチル−４−フェニル−４−ピペリジノール、ベンゾイルフェニルベンゾエート誘導体、ｌ−アルギニン誘導体、グアニジウムＨＣＬ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＨＣＮ、リナマリン、アミグダリン、ヘデラゲニン、エスチン、ＣＩＳ−ヒノキレシノールおよび／または１,３−ジ−ｐ−ヒドロキシフェニル−４−ペンテン−１−オンである。

いくつかの態様において、ここで提供される安定な配合剤は、ヒアルロナン(ＨＡ)オリゴ糖であるヒアルロニダーゼ阻害剤を、正確にまたは約１mg／mL〜２０mg／mLの濃度で含む。数例において、ＨＡオリゴ糖は、二糖または四糖である。他の例において、ＨＡオリゴ糖は反応した還元末端を有する。

ここに提供される安定な配合剤は、本配合剤中のヒアルロナン分解酵素が、正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で少なくとも３日間初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を維持するようにまたは撹拌下に少なくとも３時間安定であるように、および／または本組成物中のインスリンが、正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で少なくとも３日間組成物中のインスリン初期レベルの少なくとも９０％力価を維持するかまたは回収させ、または撹拌下に少なくとも３時間安定であり、および／または正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で少なくとも３日間初期インスリン純度の少なくとも９０％を維持しまたは撹拌下に少なくとも３時間安定であり、および／または正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で少なくとも３日間高分子量(ＨＭＷｔ)インスリン種を２％未満に維持しまたは撹拌下に少なくとも３時間安定である。一例において、安定な配合剤は、本組成物中のヒアルロナン分解酵素が、正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で少なくとも３日間初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上維持するようにまたは撹拌下に少なくとも３時間安定であるように製剤する。他の例において、安定な配合剤を、インスリンの純度または力価が、正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で少なくとも３日間少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であるようにまたは撹拌下に少なくとも３時間安定であるように製剤する。

いくつかの態様において、ここで提供される安定な配合剤のｐＨは正確にまたは約６.３±０.２、６.４±０.２、６.５±０.２、６.６±０.２、６.７±０.２、６.８±０.２、６.９±０.２、７.０±０.２、７.１±０.２、７.２±０.２、７.３±０.２、７.４±０.２または７.５±０.２である。他の態様において、安定な配合剤のＮａＣｌ濃度組成物は正確にまたは約１５０mM〜２００mMまたは１６０mM〜１８０mMである。例えば、ＮａＣｌ濃度は正確にまたは約１２０mM、１３０mM、１４０mM、１５０mM、１５５mM、１６０mM、１６５mM、１７０mM、１７５mM、１８０mM、１８５mM、１９０mM、１９５mMまたは２００mMである。いくつかの態様において、安定な配合剤は、３７℃または約３７℃で少なくとも３日間安定である。他の態様において、安定な配合剤は、少なくとも４日間、少なくとも５日間または少なくとも６日間である。いくつかの態様において、安定な配合剤は、正確にまたは約６.５〜７.５の範囲のｐＨを維持するのに十分量の緩衝剤を含む。

ここに提供される安定な配合剤組成物に含まれるヒアルロナン分解酵素群は、例えば、ヒトを含む動物ヒアルロニダーゼ群のようなヒアルロニダーゼ群、特にその可溶性形態、および／またはコンドロイチナーゼ群を含む。ヒアルロナン分解酵素群の例は、ヒアルロニダーゼ群および／またはコンドロイチナーゼ群である。いくつかの態様において、ヒアルロナン分解酵素は、中性ｐＨで活性なヒアルロニダーゼである。他の態様において、ヒアルロナン分解酵素は、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを欠くか、または細胞から発現されたとき膜型ではない。例えば、ヒアルロナン分解酵素は、ＧＰＩアンカーの全部または一部を除去するために、１個以上のアミノ酸残基のＣ末端短縮化を含む。数例において、ここに提供する安定な配合剤中のヒアルロナン分解酵素は、ＰＨ２０であるヒアルロニダーゼである。ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ群の例は、非ヒトまたはヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼ群である。包含されるのは、配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列を有する、または配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列と少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ヒアルロニダーゼ活性を維持するＰＨ２０ヒアルロニダーゼ群である。例えば、ＰＨ２０は、配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列と少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有し、ヒアルロニダーゼ活性を維持する。包含されるのは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列を有するＰＨ２０ポリペプチド類である。変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列と少なくとも８５％配列同一性を示し、ヒアルロニダーゼ活性を維持するＰＨ２０ポリペプチド類である。数例において、ここで提供される安定な配合剤中のＰＨ２０は、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列と少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有し、ヒアルロニダーゼ活性を維持する。いくつかの態様において、ヒアルロナン分解酵素は、配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド類の任意の形態、またはその対立形質変異体および他の変異体を含む、Ｃ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチドである切断型ＰＨ２０である。

いくつかの態様において、ここで提供される安定な配合剤中のＰＨ２０の量は、正確にまたは約０.１μg／mL〜１００μg／mL、１μg／mL〜５０μg／mLまたは１μg／mL〜２０μg／mLである。例えば、ＰＨ２０の量は正確にまたは約５μg／mLである。他の態様において、ＰＨ２０の比活性は７５単位(Ｕ)／μg〜１２０Ｕ／μgであるかまたは少なくとも約または正確に７５単位(Ｕ)／μg、８０Ｕ／μg、８５Ｕ／μg、９０Ｕ／μg、１００Ｕ／μg、１１０Ｕ／μgまたは１２０Ｕ／μgである。ここに提供する安定な配合剤中のヒアルロナン分解酵素の量は正確にまたは約１０Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、または１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLである。例えば、ヒアルロナン分解酵素の量は少なくともまたは約または正確に３０Ｕ／mL、３５Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、２５０Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、３５０Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、４５０Ｕ／mL、５００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL、７００Ｕ／mL、８００Ｕ／mL、９００Ｕ／mL、１０００Ｕ／mLまたは２０００Ｕ／mLである。安定な配合剤の一例において、ヒアルロナン分解酵素の量は正確にまたは約６００Ｕ／mL。

速効性のインスリンは、例えば、単量体または多量体、例えば二量体または六量体であり得る。一つの態様において、速効性のインスリンは速効性のヒトインスリンである。他の態様において、速効性のインスリンはレギュラーインスリン、例えば、ヒトインスリンまたはブタインスリンである。一例において、速効性のインスリンはレギュラーインスリンであり、ここに提供される安定な配合剤のＮａＣｌ濃度は５０mM〜８０mMである。とりわけ速効性のインスリン類は、レギュラーインスリン類、例えば、配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１０４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンまたは配列番号１２３のアミノ酸残基８８〜１０８位に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１２３のアミノ酸残基２５〜５４位に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンである。インスリンは組み換えインスリンでも、合成でも、一部合成でも、天然源から単離されてもよい。速効性のインスリンはインスリン類似体であり得る。インスリン類似体の例は、インスリン類似体はとりわけ配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１４７〜１４９のいずれかに示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンから選択される。いくつかのここで提供される安定な配合剤の例として、速効性インスリンは、配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４７(Ｂ鎖)に示すアミノ酸配列を有し、ＮａＣｌ濃度は正確にまたは約８０mM〜１６０mMであるインスリンアスパルトである。ここで提供される安定な配合剤の他の例において、速効性インスリンは、配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４９(Ｂ鎖)に示すアミノ酸配列を有し、ＮａＣｌ濃度は正確にまたは約８０mM〜２００mMであるインスリングルリジンである。ここで提供される安定な配合剤のさらに別の例において、速効性インスリンは、配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４８(Ｂ鎖)に示すアミノ酸配列を有し、ＮａＣｌ濃度は正確にまたは約５０mM〜１２０mMであるインスリンリスプロである。

いくつかの態様において、ここで提供される安定な配合剤中のインスリンは、１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLまたは５００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量である。例えば、速効性のインスリンの量は少なくともまたは約または正確に１０Ｕ／mL、２０Ｕ／mL、３０Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、６０Ｕ／mL、７０Ｕ／mL、８０Ｕ／mL、９０Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、２５０Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、３５０Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、５００Ｕ／mLまたは１０００Ｕ／mLである。安定な配合剤の一例において、速効性のインスリンの量は正確にまたは約１００Ｕ／mLである。安定な配合剤の他の例において、速効性のインスリンはインスリン類似体であり、ヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０である。

ここで提供される安定な配合剤は、所望により、例えば、非金属結合剤または金属結合剤であるが、これらに限定されない緩衝剤を含む。数例において、緩衝剤はとりわけＴｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸またはクエン酸から選択される。安定な配合剤の一例において、緩衝剤はＴｒｉｓである。緩衝剤の濃度は正確にまたは約１mM〜１００mM、１０mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mMである。例えば、緩衝剤の濃度は正確にまたは約または少なくとも１mM、５mM、１０mM、１５mM、２０mM、２１mM、２２mM、２３mM、２４mM、２５mM、２６mM、２７mM、２８mM、２９mM、３０mM、３１mM、３２mM、３３mM、３４mM、３５mM、３６mM、３７mM、３８mM、３９mM、４０mM、４５mM、５０mM、５５mM、６０mM、６５mM、７０mM、７５mMまたはそれ以上である。安定な配合剤の一例において、緩衝剤の濃度は正確にまたは約３０mMである。

ここに提供される安定な配合剤組成物は、接種後７日間で細菌性微生物が少なくとも１.０log_１０単位減少するように、組成物サンプル中の微生物を死滅させるかまたは繁殖を阻止する防腐剤の抗菌有効量を含む。数例において、防腐剤の抗菌有効量は、組成物に微生物接種液接種後、抗菌防腐剤有効性試験(ＡＰＥＴ)で試験して、接種後７日間で細菌性微生物が少なくとも１.０log_１０単位減少するように、接種後１４日間で細菌性微生物が少なくとも３.０log_１０単位減少するように、少なくとも接種後２８日間細菌性微生物のさらなる増殖がないように、かつ少なくとも接種後７日間真菌性微生物の増殖がないように、微生物を死滅させるかまたは繁殖を阻止する。他の例において、防腐剤の抗菌有効量は、組成物に微生物接種液接種後、抗菌防腐剤有効性試験(ＡＰＥＴ)で試験したとき、接種後２４時間で細菌性微生物が少なくとも１.０log_１０単位減少するように、接種後７日間で細菌性微生物が少なくとも３.０log_１０単位減少するように、接種後２８日間細菌性微生物のさらなる増殖がないように、接種後１４日間で真菌性微生物が少なくとも１.０log_１０単位減少するように、および少なくとも接種後２８日間真菌性微生物のさらなる増殖がないように微生物を死滅させるかまたは繁殖を阻害する。さらに別の例において、防腐剤の抗菌有効量は、組成物に微生物接種液接種後、抗菌防腐剤有効性試験(ＡＰＥＴ)で試験したとき、接種後６時間で細菌性微生物が少なくとも２.０log_１０単位減少するように、接種２４時間後細菌性微生物が少なくとも３.０log_１０単位減少するように、接種後２８日間細菌性微生物の分離がないように、接種後７日間で真菌性微生物が少なくとも２.０log_１０単位減少するように、かつ少なくとも接種２８日間真菌性微生物のさらなる増殖がないように、微生物を死滅させるか、または繁殖を阻害する。

安定な配合剤中の防腐剤(複数も可)は、１種以上のフェノール防腐剤(複数も可)、非フェノール防腐剤(複数も可)またはフェノール防腐剤(複数も可)と非フェノール防腐剤(複数も可)である。例えば、防腐剤(複数も可)は、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、グルコン酸クロルヘキシジン、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール、酢酸フェニル水銀、グリセロール、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンおよびこれらのあらゆる組み合わせを含むが、これらに限定されないものから選択される。数例において、安定な配合剤は１種の防腐剤を含む。他の例において、安定な配合剤は、２種、３種または４種の防腐剤を含む防腐剤の混合物を含む。いくつかの態様において、安定な配合剤は少なくとも１種のフェノール防腐剤を含む。特定の態様において、１種以上の防腐剤(複数も可)はフェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールである。

ここで提供される安定な配合剤中の１種以上の防腐剤の総量は、重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)で０.１％および０.４％であるかその間、０.１％〜０.３％、０.１５％〜０.３２５％、０.１５％〜０.２５％、０.１％〜０.２％、０.２％〜０.３％または０.３％〜０.４％(両端値を含む)である。数例において、防腐剤はフェノールおよびｍ−クレゾールであり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての量は正確にまたは約０.１％〜０.２５％フェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.２％フェノールおよび正確にまたは約０.６％〜０１.８％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１％〜０.１５％フェノールおよび０.８％〜０.１５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.１５％フェノールおよび正確にまたは約０.０６〜０.０９％ｍ−クレゾールまたは正確にまたは約０.１２％〜０.１８％フェノールおよび正確にまたは約０.１４〜０.２２％ｍ−クレゾールである。配合剤の例において、防腐剤(複数も可)は、フェノールおよびｍ−クレゾールであり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての量は正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０８％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１５％フェノールおよび０.１７５％ｍ−クレゾールまたは正確にまたは約０.１７％フェノールおよび０.１３％ｍ−クレゾールである。

ここで提供される安定な配合剤は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール類、塩または界面活性剤から選択されるが、これらに限定されない安定化剤を含む。数例において、安定な配合剤は１種の安定化剤を含む。他の例において、安定な配合剤は２種、３種、４種、５種または６種の安定化剤を含む。数例において、安定化剤は、Ｌ−アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、トリメチルアミンオキシド(ＴＭＡＯ)、ベタインまたはその塩類から選択されるアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミンである。特定の例において、アミノ酸はグリシンまたはプロリンである。アミノ酸の濃度は正確にまたは約０.０１Ｍ〜１Ｍ、０.０１Ｍ〜０.１Ｍ、０.１Ｍ〜０.７５Ｍまたは０.２Ｍ〜０.５Ｍ(両端値を含む)である。数例において、安定化剤は、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、スクロースおよびトレハロースから選択されるが、これらに限定されない糖またはポリオールである。

安定な配合剤の一例において、安定化剤は界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量は正確にまたは約０.００５％〜１.０％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％、または０.０１％〜０.０２％である。例えば、安定化剤は界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量は正確にまたは約０.００１％、０.００５％、０.０１％、０.０１５％、０.０２％、０.０２５％、０.０３％、０.０３５％、０.０４％、０.０４５％、０.０５％、０.０５５％、０.０６％、０.０６５％、０.０７％、０.０８％または０.９％である。ここで提供される安定な配合剤中の界面活性剤は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートから選択される。例えば、界面活性剤はポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０から選択される。安定な配合剤の一例において、安定化剤はポロクサマー１８８である界面活性剤であり、重量濃度(ｗ／ｖ)％としての量で正確にまたは約０.０１％〜０.０５％で提供される。安定な配合剤の他の例において、安定化剤はポリソルベート２０である界面活性剤であり、重量濃度(ｗ／ｖ)％としての量で正確にまたは約０.０１％〜０.０５％で提供される。さらに別の安定な配合剤の例において、安定化剤はポリソルベート８０である界面活性剤であり、重量濃度(ｗ／ｖ)％としての量で正確にまたは約０.０１％〜０.０５％で提供される。

ここで提供される安定な配合剤は、所望により、正確にまたは約２４５mOsm／kg〜３０５mOsm／kgのモル浸透圧濃度を維持するために、グリセリン、塩、アミノ酸類、ポリアルコール類またはトレハロースから選択されるが、これらに限定されない浸透圧修飾剤を含む。数例において、浸透圧修飾剤は、約または正確に２４５mOsm／kg、２５０mOsm／kg、２５５mOsm／kg、２６０mOsm／kg、２６５mOsm／kg、２７０mOsm／kg、２７５mOsm／kg、２８０mOsm／kg、２８５mOsm／kg、２９０mOsm／kg、３００mOsm／kgまたは３０５mOsm／kgの製剤のモル浸透圧濃度を維持する。安定な配合剤の一例において、浸透圧修飾剤は、正確にまたは約２７５mOsm／kgの製剤のモル浸透圧濃度を維持する。一つの態様において、浸透圧修飾剤はグリセリンであり、それは配合剤中に６０mM未満、５５mM未満、５０mM未満、４５mM未満、４０mM未満、３５mM未満、３０mM未満、２５mM未満、２０mM未満、１５mM未満または１０mM未満の濃度で存在する。安定な配合剤の一例において、速効性のインスリンはインスリンアスパルトであるインスリン類似体であり、製剤は、正確にまたは約２０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリンを含む。安定な配合剤の他の例において、速効性インスリンはレギュラーインスリンまたはインスリンリスプロであり、製剤はグリセリンを正確にまたは約４０mM〜６０mM(両端値を含む)の濃度で含む。

いくつかの態様において、ここで提供される安定な配合剤は、所望により抗酸化剤を含む。他の態様において、ここで提供される安定な配合剤は、所望により界面活性剤および／またはヒアルロナンオリゴ糖類を含み、また抗酸化剤を含む。ここで提供される安定な配合剤に包含される抗酸化剤は、システイン、トリプトファンおよびメチオニンから選択されるが、これらに限定されない。安定な配合剤の一例において、抗酸化剤はメチオニンである。安定な配合剤中の抗酸化剤は正確にまたは約５mM〜５０mM、５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度である。例示的態様において、抗酸化剤はメチオニンであり、メチオニンの濃度は正確にまたは約１０mM〜２０mMである。

ここで提供される安定な配合剤は、所望により亜鉛を含む。例えば、一つの態様において、速効性のインスリンはレギュラーインスリン、インスリンリスプロまたはインスリンアスパルトであり、製剤は亜鉛を含む。安定な配合剤中の亜鉛は、酸化亜鉛、酢酸亜鉛またはから選択されるが、これらに限定されず、正確にまたは約０.００１〜０.１mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)、０.００１〜０.０５mg／１００Ｕまたは０.０１〜０.０５mg／１００Ｕの濃度で存在する。

ここで提供される安定な配合剤は、所望によりニコチンアミド、ニコチン酸、ナイアシン、ナイアシンアミド、ビタミンＢ３および／またはその塩類および／またはこれらのあらゆる組み合わせから選択されるが、これらに限定されないニコチン化合物を含む。ニコチン化合物(複数も可)は正確にまたは約１mm〜１５０mM、１０mM〜１５０mM、５０mM〜１００mMまたは正確にまたは約８０mMの濃度で存在する。

ここで提供される安定な配合剤は、所望により、アルギニン、グルタミン酸、および／またはその塩類および／またはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない１種以上のアミノ酸を含む。アミノ酸類は１〜１００mM、１０〜１００mM、または正確にまたは約３０mM、５０mMまたは８０mMの濃度で存在する。

ここで提供される安定な配合剤の例は、正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し、正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量の速効性のインスリン類似体；正確にまたは約１０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；正確にまたは約５０〜２００mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；正確にまたは約５mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；正確にまたは約０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；正確にまたは約０.０１％〜０.５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である界面活性剤；および正確にまたは約０.１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む。他の態様において、この安定な配合剤の例は、さらに０.００１〜０.１mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)の濃度の亜鉛を含む。一つの態様において、安定な配合剤中の防腐剤は正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.０１５％ｍ−クレゾール、０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、０.１３％フェノールおよび０.０８％ｍ−クレゾールまたは０.１７％フェノールおよび０.１３％ｍ−クレゾールである。

ここで提供される安定な配合剤の例は、正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し、正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリンリスプロである速効性のインスリン；正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；正確にまたは約２５mM〜３５mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；正確にまたは約５０mM〜１２０mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；正確にまたは約１０mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；正確にまたは約４０mM〜６０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である界面活性剤；０.０１７〜０.０２４mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)の濃度の亜鉛；および正確にまたは約０.０８％〜０.１７％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０７％〜０.１７％ｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む。一つの態様において、ＮａＣｌ濃度は正確にまたは約７０mM〜１００mMである。他の態様において、ｐＨは正確にまたは約７.１±０.２、７.２±０.２、７.３±０.２または７.４±０.２である。一つの態様において、安定な配合剤中の防腐剤は正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.０１５％ｍ−クレゾール、０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、０.１３％フェノールおよび０.０８％ｍ−クレゾールまたは０.１７％フェノールおよび０.１３％ｍ−クレゾールである。

ここで提供される安定な配合剤の例は、正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し、正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリンアスパルトである速効性のインスリン；正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；正確にまたは約２５mM〜３５mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；正確にまたは約８０mM〜１６０mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；正確にまたは約１０mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；正確にまたは約２０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である界面活性剤；０.０１７〜０.０２４mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)の濃度の亜鉛；および正確にまたは約０.０８％〜０.１７％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０７％〜０.１７％ｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む。一つの態様において、ＮａＣｌ濃度は正確にまたは約７０mM〜１００mMである。他の態様において、ｐＨは正確にまたは約７.２±０.２、７.３±０.２、７.４±０.２または７.５±０.２である。一つの態様において、安定な配合剤中の防腐剤は正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.０１５％ｍ−クレゾール、０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、０.１３％フェノールおよび０.０８％ｍ−クレゾールまたは０.１７％フェノールおよび０.１３％ｍ−クレゾールである。

ここで提供される安定な配合剤の例は正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し、正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリングルリジンである速効性のインスリン；正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；正確にまたは約２５mM〜３５mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；正確にまたは約８０mM〜２００mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；正確にまたは約１０mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；正確にまたは約４０mM〜６０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８である界面活性剤；および正確にまたは約０.０８％〜０.１７％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０７％〜０.１７％ｍ−クレゾールを有する防腐剤(複数も可)を含む。一つの態様において、ＮａＣｌ濃度は正確にまたは約１００mM〜１５０mMである。他の態様において、ｐＨは正確にまたは約７.２±０.２、７.３±０.２、７.４±０.２または７.５±０.２である。

一つの態様において、ここで提供される安定な配合剤中のＰＨ２０は、配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列を有するか、または配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％または９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつヒアルロニダーゼ活性を維持するヒトＰＨ２０である。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列を有するか、または配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列に対する少なくとも８５％、９０％または９５％配列同一性、かつヒアルロニダーゼ活性を維持するその変異体である。他の例において、ＰＨ２０ポリペプチド配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置４８２後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列を有するか、または配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置４８２後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％または９５％配列同一性を示し、かつヒアルロニダーゼ活性を維持するその変異体である。安定な配合剤の一例において、ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸配列を有する。ここで提供される安定な配合剤中のヒアルロナン分解酵素またはＰＨ２０は哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞で産生し、発現できる。特定の例において、ＰＨ２０は指定されたｒＨｕＰＨ２０である。

ここで提供される安定な配合剤は、多数回投与用に製剤できる。安定な配合剤の容積は、正確にまたは約０.５mL〜５０mL、１mL〜４０mL、１mL〜２０mL、１mL〜１０mL、または３mL〜１０mL(両端値を含む)であり得る。ここで提供される安定な配合剤は、バイアル、シリンジ、ペン、ポンプ用保存室または閉鎖ループ系を使用した送達のために製剤される。特定の例において、安定な配合剤は、閉鎖ループ系により提供される連続的皮下インスリン注入である。

ここで提供される安定な配合剤はシリンジまたはバイアル、閉鎖ループ系、インスリンポンプ、および／またはインスリンペン中に入れることができる。

安定な配合剤を投与する方法が提供される。例えば、ここに提供されるのは、ここで提供される安定な配合剤の治療有効量を対象に投与することによる、糖尿病の処置方法である。処置する糖尿病は１型糖尿病、２型糖尿病または妊娠性糖尿病を含む。またここに提供されるのは、ここで提供される安定な配合剤の治療有効量を対象に投与することによる、対象における血糖値を管理する方法である。ここに記載する方法の実施に際して、安定な配合剤を皮下にまたは腹腔内に、例えば、シリンジまたはインスリンペンまたは連続的皮下注入により投与する。ここに記載する方法の実施に際して、安定な配合剤は、食事のインスリン治療として食前に投与してよい。ここに提供する方法において、安定な配合剤を、例えばインスリンポンプまたは閉鎖ループ系を介する、連続的皮下インスリン注入を達成するための送達方法を使用して投与できる。ある例において、ここで提供する方法は、スルホニルウレア系、ビグアナイド系、メグリチナイド、チアゾリジンジオン系、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴン様ペプチド(ＧＬＰ)類似体および胃阻害ペプチド(ＧＩＰ)類似体を含むペプチド類似体ならびにＤＰＰ−４阻害剤から選択されるが、これらに限定されない、他の抗糖尿病剤の投与を含む。

またここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびヒアルロナン分解酵素を安定化する量のリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)を含む組成物である。数例において、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度は正確にまたは約５mM〜１２０mM、１０mM〜１００mM、１０mM〜５０mM、３０mM〜１１０mM、３０mM〜８０mM、５０mM〜１００mMまたは１００mM〜１２０mMである。他の例において、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度は少なくともまたは少なくとも約または正確に５mM、１０mM、１５mM、２０mM、３０mM、４０mM、５０mM、６０mM、７０mM、８０mM、９０mM、１００mM、１１０mMまたは１２０mM。ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも３日間、３７℃で維持するのに十分な量のリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)を含む、組成物である。数例において、ヒアルロナン分解酵素は、初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を、３７℃で少なくとも４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間またはそれ以上維持する。特定の例において、ヒアルロナン分解酵素は、初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を、少なくとも１ヶ月間、３７℃で維持する。他の例において、ヒアルロナン分解酵素は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の初期ヒアルロニダーゼ活性を維持する。

提供される組成物の数例において、製剤のｐＨは正確にまたは約６.５〜８.０、６.５〜７.４、６.８〜７.８、７.０〜７.６または６.８〜７.２(両端値を含む)である。例えば、製剤のｐＨは正確にまたは約または少なくとも６.５±０.２、６.６±０.２、６.７±０.２、６.８±０.２、６.９±０.２、７.０±０.２、７.１±０.２、７.２±０.２、７.３±０.２、７.４±０.２、７.５±０.２、７.６±０.２、７.７±０.２または７.８±０.２である。

治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)を含むあらゆる提供される組成物はさらに安定化剤を含み得る。例えば、本組成物はアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩および界面活性剤から選択される安定化剤を含み得る。数例において、安定化剤は界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量は正確にまたは約０.０００５％〜１.０％、０.０００５％〜０.００５％、０.００１％〜０.０１％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％、または０.０１％〜０.０２％(両端値を含む)である。他の例において、安定化剤は界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量は正確にまたは約または少なくとも０.００１％、０.００５％、０.０１％、０.０１５％、０.０２％、０.０２５％、０.０３％、０.０３５％、０.０４％、０.０４５％、０.０５％、０.０５５％、０.０６％、０.０６５％、０.０７％、０.０８％または０.９％である。界面活性剤はポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートから選択され得る。特定の例において、界面活性剤はポロクサマー１８８、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０から選択される。

数例において、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)を含む提供される組成物はまた抗酸化剤を含む。例えば、本組成物は、システイン、トリプトファンおよびメチオニンから選択される抗酸化剤を含む。特定の例において、抗酸化剤はメチオニンである。数例において、抗酸化剤は正確にまたは約５mM〜５０mM、５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度で存在する。他の例において、抗酸化剤は正確にまたは約または少なくとも５mM、１０mM、１５mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mMの濃度で存在する。

数例において、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)を含む提供される組成物はまた正確にまたは約２４５mOsm／kg〜５００mOsm／kg(両端値を含む)のモル浸透圧濃度を維持するための浸透圧修飾剤を含む。数例において、本組成物は、約または少なくとも約または正確に２４５mOsm／kg、２５０mOsm／kg、２５５mOsm／kg、２６０mOsm／kg、２６５mOsm／kg、２７０mOsm／kg、２７５mOsm／kg、２８０mOsm／kg、２８５mOsm／kg、２９０mOsm／kg、３００mOsm／kg、３５０mOsm／kg、４００mOsm／kg、４５０mOsm／kgまたは５００mOsm／kgの製剤のモル浸透圧濃度を維持するための浸透圧修飾剤を含む。数例において、浸透圧修飾剤はグリセリン、ＮａＣｌ、アミノ酸類、ポリアルコール類またはトレハロースから選択される。特定の例において、浸透圧修飾剤はＮａＣｌであり、ＮａＣｌの濃度は正確にまたは約２０mM〜２００mM、４０mM〜１６０mM、８０mM〜１２０mM、２０mM〜８０mMまたは５０mM〜１５０mM(両端値を含む)である。他の例において、浸透圧修飾剤はＮａＣｌであり、ＮａＣｌの濃度は０mM〜１５０mM、１０mM〜５０mM、５０mM〜１００mMおよび１００mM〜１３０mMである。数例において、ＮａＣｌは１５０mM未満、１４０mM未満、１３０mM未満、１２０mM未満、１１０mM未満、１００mM未満、９０mM未満、８０mM未満、７０mM未満、６０mM未満、５０mM未満、４０mM未満、３０mM未満、２０mM未満、１０mM未満またはそれ未満である。

治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)を含むあらゆる提供される組成物はまた正確にまたは約６.５〜８.０、６.８〜７.８、または７.０〜７.６、６.５〜７.２、６.８〜７.４(両端値を含む)のｐＨ範囲を維持するのに十分な量の緩衝剤を含み得る。数例において、緩衝剤はＴｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸およびクエン酸から選択される。特定の例において、緩衝剤はリン酸ナトリウムであるリン酸である。他の具体例において、緩衝剤はＴｒｉｓである。数例において、組成物中の緩衝剤の濃度は正確にまたは約１mM〜１００mM、１０mM〜８０mM、５mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mM(両端値を含む)である。

治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)を含むあらゆる提供される組成物中のヒアルロナン分解酵素はヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼであり得る。数例において、ヒアルロナン分解酵素は中性ｐＨで活性なヒアルロニダーゼである。数例において、ヒアルロナン分解酵素は細胞から発現されたときグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを欠くかまたは膜型ではない。他の例において、ヒアルロナン分解酵素はＧＰＩアンカーの全部または一部を除去するための１個以上のアミノ酸残基のＣ末端短縮化を含むヒアルロナン分解酵素である。

提供される組成物の他の例において、ヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０であるヒアルロニダーゼまたはそのＣ末端切断型フラグメントである。数例において、ヒアルロナン分解酵素は非ヒトまたはヒトＰＨ２０である、ＰＨ２０である。数例において、ＰＨ２０は配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列と少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつヒアルロニダーゼ活性を維持する。例えば、ＰＨ２０は配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列に対し少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有し、かつヒアルロニダーゼ活性を維持する。本組成物の数例において、ヒアルロナン分解酵素は配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列を有するＰＨ２０ポリペプチドであるか、または配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列に対し少なくとも８５％配列同一性を示し、かつヒアルロニダーゼ活性を維持するその変異体である。具体例において、ヒアルロナン分解酵素は、配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸の配列を有するＣ末端切断型ＰＨ２０である。

提供される組成物の数例において、ヒアルロナン分解酵素の量は正確にまたは約１０Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、２００Ｕ／mL〜８００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、または１５０Ｕ／mL〜３００Ｕ／ml(両端値を含む)である。例えば、ヒアルロナン分解酵素の量は少なくともまたは約または正確に３０Ｕ／mL、３５Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、４５Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、５５Ｕ／mL、６０Ｕ／mL、６５Ｕ／mL、７０Ｕ／mL、７５Ｕ／mL、８０Ｕ／mL、８５Ｕ／mL、９０Ｕ／mL、９５Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、１０５Ｕ／mL、１１０Ｕ／mL、１１５Ｕ／mL、１２０Ｕ／mL、１２５Ｕ／mL、１３０Ｕ／mL、１３５Ｕ／mL、１４０Ｕ／mL、１４５Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、１５５Ｕ／mL、１６０Ｕ／mL、１７０Ｕ／mL、１８０Ｕ／mL、１９０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、２５０Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、３５０Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、４５０Ｕ／mL、５００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL、７００Ｕ／mL、８００Ｕ／mL、９００Ｕ／mL、１０００Ｕ／mLまたは２０００Ｕ／mLである。

治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)を含む組成物の数例において、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度は５mM〜５０mM(両端値を含む)である。例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度は少なくとも５mM、１０mM、１５mM、２０mM、３０mMまたは５０mM；および／または５０mM未満、４０mM未満、３０mM未満、２０mM未満または１０mM未満である。

ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)を含む組成物であって、ここで、組成物のｐＨは正確にまたは約６.５〜７.２であり、組成物は正確にまたは約１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のヒアルロナン分解酵素；正確にまたは約５mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ；１４０mM未満ＮａＣｌの濃度のＮａＣｌ；正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート８０である界面活性剤；正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および正確にまたは約５mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のリン酸ナトリウムを含む。数例において、ヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０またはそのＣ末端切断型フラグメントである。

数例において、提供される組成物の容積は正確にまたは約０.５mL〜５０mL、１mL〜４０mL、１mL〜２０mL、１mL〜１０mL、または３mL〜１０mL(両端値を含む)である。組成物はバイアル、シリンジ、ペン、ポンプ用保存室または閉鎖ループ系を使用する送達のために製剤できる。ここでまた提供されるのは、ここで提供される組成物のいずれかを含むシリンジまたはバイアルである。

またここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン分解酵素を安定化させる量のリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)および速効性のインスリンを含む組成物である。数例において、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度は３０mM〜１２０mM、５０mM〜１０５mMまたは８０mM〜１００mM(両端値を含む)である。提供される組成物において、速効性のインスリンは単量体、二量体または六量体であり得る。数例において、速効性のインスリンは速効性のヒトインスリンである。他の例において、速効性のインスリンはレギュラーインスリンである。特定の例において、速効性のインスリンはヒトインスリンまたはブタインスリンであるレギュラーインスリンである。数例において、速効性のインスリンは、配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１０４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンまたは配列番号１２３のアミノ酸残基８８〜１０８位に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１２３のアミノ酸残基２５〜５４位に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンであるレギュラーインスリンである。提供される組成物のさらに別の例において、速効性のインスリンは組み換えインスリンである。速効性のインスリンは合成されていても、一部合成されていてもよい。数例において、インスリンは単離される。

提供される組成物の他の例において、速効性のインスリンはインスリン類似体である。数例において、インスリン類似体はインスリンアスパルト、インスリンリスプロおよびインスリングルリジンから選択される。例えば、インスリン類似体は、配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１４７〜１４９のいずれかに示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンから選択される。提供される組成物のいずれにおいても、速効性のインスリンは正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、２０Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜３００Ｕ／mLまたは２００Ｕ／mL〜８００Ｕ／mL(両端値を含む)の量で存在できる。例えば、速効性のインスリンの量は少なくともまたは約または正確に１０Ｕ／mL、２０Ｕ／mL、３０Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、６０Ｕ／mL、７０Ｕ／mL、８０Ｕ／mL、９０Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、２５０Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、３５０Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、５００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL、７００Ｕ／mL、８００Ｕ／mL、９００Ｕ／mLまたは１０００Ｕ／mLである。

治療有効量のヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン分解酵素を安定化させる量のリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)および速効性のインスリンを含む提供される組成物の具体例において、速効性のインスリンはインスリン類似体であり、ヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０またはそのＣ末端切断型フラグメントである。特定の例において、速効性のインスリンはグルリジンであるインスリン類似体であり、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度は５０〜１０５mMである。他の例において、速効性のインスリンはインスリンアスパルトまたはインスリンリスプロであるインスリン類似体またはインスリンリスプロであり、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度は８０〜１００mMである。

ここに提供される治療有効量のヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン分解酵素を安定化させる量のリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)および速効性のインスリンを含む組成物のいずれも単回投与または多回投与用であり得る。組成物が多回投与用である例において、組成物は抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物を含む。製剤中の防腐剤(複数も可)は１種以上のフェノール防腐剤(複数も可)、非フェノール防腐剤(複数も可)またはフェノール防腐剤(複数も可)および非フェノール防腐剤(複数も可)を含み得る。数例において、防腐剤(複数も可)はフェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、グルコン酸クロルヘキシジン、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール、酢酸フェニル水銀、グリセロール、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンおよびこれらのあらゆる組み合わせから選択される。多回投与用の提供される組成物の数例において、製剤は１種の防腐剤を含む。多回投与用の提供される組成物の他の例において、製剤は２種、３種または４種の防腐剤を含む防腐剤の混合物を含む。数例において、本組成物は少なくとも１種のフェノール防腐剤を含む。他の例において、防腐剤(複数も可)はフェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールである。

提供される組成物の数例において、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての１種以上の防腐剤の総量は正確にまたは０.１％〜０.４％、０.１％〜０.３％、０.１５％〜０.３２５％、０.１５％〜０.２５％、０.１％〜０.２％、０.２％〜０.３％または０.３％〜０.４％(両端値を含む)である。防腐剤がフェノールおよびｍ−クレゾールである提供される組成物の具体例において、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての量は正確にまたは約０.１％〜０.２５％フェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.２％フェノールおよび正確にまたは約０.０６％〜０.１８％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１％〜０.１５％フェノールおよび０.０８％〜０.１５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.１５％フェノールおよび正確にまたは約０.０６〜０.０９％ｍ−クレゾールまたは正確にまたは約０.１２％〜０.１８％フェノールおよび正確にまたは約０.１４〜０.２２％ｍ−クレゾール(両端値を含む)である。防腐剤がフェノールおよびｍ−クレゾールである提供される組成物である他の具体例において、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての量は正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０８％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１５％フェノールおよび０.１７５％ｍ−クレゾールまたは正確にまたは約０.１７％フェノールおよび０.１３％ｍ−クレゾールである。

ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン分解酵素を安定化させる量のリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)および速効性のインスリンを含む組成物であり、ここで、組成物のｐＨは正確にまたは約６.８〜７.４であり；組成物は正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリングルリジンである速効性のインスリン類似体；正確にまたは約５０mM〜１０５mM(両端値を含む)の濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ；１００mM未満の濃度のＮａＣｌ；正確にまたは約０.０００５％〜０.００５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート２０である界面活性剤；正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および正確にまたは約０.１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む。

ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン分解酵素を安定化させる量のリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)および速効性のインスリンを含む組成物であり、組成物のｐＨは正確にまたは約６.８〜７.４であり；組成物は正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリンアスパルトまたはインスリンリスプロである速効性のインスリン類似体；正確にまたは約８０mM〜１００mM(両端値を含む)の濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ；３０mM未満の濃度のＮａＣｌ；正確にまたは約０.０００５％〜０.００５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート２０である界面活性剤；正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および正確にまたは約０.１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む。

数例において、提供される組成物の容積は正確にまたは約０.５mL〜５０mL、１mL〜４０mL、１mL〜２０mL、１mL〜１０mL、または３mL〜１０mL(両端値を含む)である。組成物はバイアル、シリンジ、ペン、ポンプ用保存室または閉鎖ループ系を使用する送達のために製剤できる。数例において、本組成物は連続的皮下インスリン注入を使用する送達のために製剤される。ここでまた提供されるのは、ここで提供される組成物のいずれかを含むシリンジまたはバイアルである。

ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも３日間、３７℃で維持するのに十分な量のＭｇＣｌ_２を含む組成物である。数例において、本組成物は、正確にまたは約５０mM〜１５０mM、７５mM〜１２５mMまたは８０mM〜１００mM(両端値を含む)である濃度のＭｇＣｌ_２を含む。例えば、本組成物は少なくともまたは約または正確に５０mM、６０mM、７０mM、８０mM、９０mM、１００mM、１１０mM、１２０mM、１３０mM、１４０mMまたは１５０mMである濃度のＭｇＣｌ_２を含む。本組成物の数例において、ヒアルロナン分解酵素は初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を、３７℃で少なくとも４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間またはそれ以上維持する。例えば、ヒアルロナン分解酵素は、初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を、少なくとも１ヶ月間、３７℃で、例えば初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上を維持する。

治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびＭｇＣｌ_２を含む提供される組成物は、正確にまたは約６.５〜８.０、６.５〜７.４、６.８〜７.８、７.０〜７.６または６.８〜７.２であるｐＨを有する。数例において、組成物のｐＨは正確にまたは約または少なくとも６.５±０.２、６.６±０.２、６.７±０.２、６.８±０.２、６.９±０.２、７.０±０.２、７.１±０.２、７.２±０.２、７.３±０.２、７.４±０.２、７.５±０.２、７.６±０.２、７.７±０.２または７.８±０.２である。組成物はさらにアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩および界面活性剤から選択される安定化剤を含み得る。数例において、安定化剤は界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量は正確にまたは約０.０００５％〜１.０％、０.０００５％〜０.００５％、０.００１％〜０.０１％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％または０.０１％〜０.０２％(両端値を含む)である。例えば、安定化剤は界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量は正確にまたは約または少なくとも０.００１％、０.００５％、０.０１％、０.０１５％、０.０２％、０.０２５％、０.０３％、０.０３５％、０.０４％、０.０４５％、０.０５％、０.０５５％、０.０６％、０.０６５％、０.０７％、０.０８％または０.９％である。数例において、界面活性剤はポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートから選択される。具体例において、界面活性剤はポロクサマー１８８、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０から選択される。

数例において、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびＭｇＣｌ_２を含む提供される組成物はシステイン、トリプトファンおよびメチオニンから選択される抗酸化剤を含む。具体例において、抗酸化剤はメチオニンである。数例において、抗酸化剤は正確にまたは約５mM〜５０mM、５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度である。例えば、抗酸化剤はメチオニンであり、濃度は正確にまたは約または少なくとも５mM、１０mM、１５mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mMである。数例において、組成物は正確にまたは約６.５〜８.０、６.８〜７.８、７.０〜７.６、６.５〜７.２または６.８〜７.４のｐＨ範囲を維持するのに十分な量の緩衝剤を含む。数例において、緩衝剤はＴｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸およびクエン酸から選択される。特定の例において、緩衝剤はヒスチジン塩酸塩である。提供される組成物において中の緩衝剤の濃度は正確にまたは約１mM〜１００mM、１０mM〜８０mM、５mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mMであり得る。

数例において、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびＭｇＣｌ_２を含む提供される組成物は、ヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼであるヒアルロナン分解酵素を含む。数例において、ヒアルロナン分解酵素は中性ｐＨで活性なヒアルロニダーゼである。他の例において、ヒアルロナン分解酵素は細胞から発現されたときグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを欠くかまたは膜型ではない。例えば、ヒアルロナン分解酵素はＧＰＩアンカーの全部または一部を除去するための１個以上のアミノ酸残基のＣ末端短縮化を含むヒアルロナン分解酵素である。

他の例において、ヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０であるヒアルロニダーゼまたはそのＣ末端切断型フラグメントである。ＰＨ２０は非ヒトまたはヒトＰＨ２０であり得る。提供される組成物の数例において、ＰＨ２０は配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列と少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつヒアルロニダーゼ活性を維持する。例えば、ＰＨ２０は配列番号１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含むアミノ酸配列に対し少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有し、かつヒアルロニダーゼ活性を維持する。他の例において、ＰＨ２０ポリペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列を有するか、または配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後にＣ末端短縮化を含むアミノ酸配列に対し少なくとも８５％配列同一性を示し、かつヒアルロニダーゼ活性を維持するその変異体である。具体例において、ヒアルロナン分解酵素は配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸配列を有するＣ末端切断型ＰＨ２０である。

数例において、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびＭｇＣｌ_２を含む提供される組成物は、正確にまたは約１０Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、２００Ｕ／mL〜８００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、または１５０Ｕ／mL〜３００Ｕ／ml(両端値を含む)である量のヒアルロナン分解酵素を含む。例えば、本組成物は、少なくともまたは約または正確に３０Ｕ／mL、３５Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、４５Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、５５Ｕ／mL、６０Ｕ／mL、６５Ｕ／mL、７０Ｕ／mL、７５Ｕ／mL、８０Ｕ／mL、８５Ｕ／mL、９０Ｕ／mL、９５Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、１０５Ｕ／mL、１１０Ｕ／mL、１１５Ｕ／mL、１２０Ｕ／mL、１２５Ｕ／mL、１３０Ｕ／mL、１３５Ｕ／mL、１４０Ｕ／mL、１４５Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、１５５Ｕ／mL、１６０Ｕ／mL、１７０Ｕ／mL、１８０Ｕ／mL、１９０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、２５０Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、３５０Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、４５０Ｕ／mL、５００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL、７００Ｕ／mL、８００Ｕ／mL、９００Ｕ／mL、１０００Ｕ／mLまたは２０００Ｕ／mLである量のヒアルロナン分解酵素を含む。

ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素およびＭｇＣｌ_２を含む組成物であり、ここで、組成物のｐＨは正確にまたは約６.５〜７.２であり、組成物は正確にまたは約１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のヒアルロナン分解酵素；正確にまたは約５０mM〜１５０mM(両端値を含む)の濃度のＭｇＣｌ_２；正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート８０である界面活性剤；正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および正確にまたは約５mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のヒスチジン／ＨＣｌを含む。

数例において、提供される組成物の容積は正確にまたは約０.５mL〜５０mL、１mL〜４０mL、１mL〜２０mL、１mL〜１０mL、または３mL〜１０mL(両端値を含む)である。組成物はバイアル、シリンジ、ペン、ポンプ用保存室または閉鎖ループ系を使用する送達のために製剤できる。ここでまた提供されるのは、ここで提供される組成物のいずれかを含むシリンジまたはバイアルである。

インスリン、例えばレギュラーインスリンまたは速効型インスリン類似体(例えばアスパルト、リスプロまたはグルリジンまたは他のインスリン類似体)を含むここで提供される組成物は、糖尿病の処置方法および処置のための使用に使用できる。例えば、ここに提供されるのは、治療有効量のここに提供する上記のいずれかの安定な組成物を対象に投与することによる、糖尿病の処置方法である。処置される糖尿病は１型糖尿病、２型糖尿病または妊娠性糖尿病を含む。またここに提供されるのは、治療有効量の速効性のインスリンを含むここに提供される安定な組成物を対象に投与することによる、対象における血糖値を管理する方法である。ここに記載する方法の実施に際して、安定な組成物は皮下または腹腔内に、例えば、シリンジまたはインスリンペンを介してまたは連続的皮下注入により投与する。ここに記載する方法の実施に際して、安定な組成物は食事のインスリン治療として食前に投与してよい。ここに提供する方法において、安定な組成物は、連続的皮下インスリン注入を達成するための送達方法を使用して、例えばインスリンポンプまたは閉鎖ループ系を介して投与してよい。ある例において、ここで提供する方法は、スルホニルウレア系、ビグアナイド系、メグリチナイド、チアゾリジンジオン系、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴン様ペプチド(ＧＬＰ)類似体および胃阻害ペプチド(ＧＩＰ)類似体を含むペプチド類似体およびＤＰＰ−４阻害剤から選択されるが、これらに限定されない他の抗糖尿病剤の投与を含む。

詳細な記載
Ａ. 定義
Ｂ. ヒアルロナン分解酵素製剤およびインスリン配合剤産生
１. ヒアルロナン分解酵素製剤
２. 速効性のインスリン製剤
３. ヒアルロナン分解酵素およびインスリン配合剤
ａ. 安定性に関する対立要求
ｉ. 防腐剤
ii. ＮａＣｌおよびｐＨ
ｂ. 相溶性配合剤
Ｃ. ヒアルロナン分解酵素群
１. ヒアルロニダーゼ群
ａ. 哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群
ＰＨ２０
ｂ. 細菌ヒアルロニダーゼ群
ｃ. ヒル類、他の寄生虫および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ群
２. 他のヒアルロナン分解酵素群
３. 切断型ヒアルロナン分解酵素群または他の可溶性形態
ａ. Ｃ末端切断型ヒトＰＨ２０
ｂ. ｒＨｕＰＨ２０
４. ヒアルロナン分解酵素群のグリコシル化
５. 薬物動態学的特性を改善するためのヒアルロナン分解酵素群の修飾
Ｄ. 安定なヒアルロナン分解酵素製剤
１. ヒアルロナン分解酵素
２. 二価カチオン
３. ｐＨおよび緩衝剤
４. 界面活性剤
５. 抗酸化剤
６. 浸透圧修飾剤
７. 他の薬物または添加物
８. 安定なヒアルロナン分解酵素製剤の例
Ｅ. インスリンポリペプチド類
速効性のインスリン類
ａ. レギュラーインスリン
ｂ. 速効性の類似体(速効型インスリン類とも呼ぶ)
ｉ. インスリンリスプロ
ii. インスリンアスパルト
iii. インスリングルリジン
Ｆ. インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の安定な配合剤
１. 安定な配合剤の成分
ａ. 速効性のインスリン
ｂ. ヒアルロナン分解酵素
ｃ. 防腐剤
ｄ. ＮａＣｌ
ｅ. ｐＨ
ｆ. 緩衝剤
ｇ. Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
ｈ. 付加的な添加物または安定化剤の例
ｉ. 界面活性剤
ii. 浸透圧修飾剤
iii. グリセリン
iv. 抗酸化剤
ｖ. 亜鉛
vi. アミノ酸安定化剤
vii. ヒアルロニダーゼ阻害剤
viii. ニコチン化合物
ix. 他の添加物または薬物
２. 安定な配合剤の例
ａ. 例えば多回注射(ＭＤＩ)配合剤
ｂ. 例えば持続皮下インスリン注入療法(ＣＳＩＩ)配合剤
ｃ. 例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ配合剤
Ｇ. 投与量および投与
投与方法
ａ. シリンジ
ｂ. インスリンペン
ｃ. インスリンポンプおよび他のインスリン送達デバイス
ｄ. 連続的輸液ポンプ系
ｉ. 開放ループ系
ii. 閉鎖ループ系
Ｈ. インスリンまたはヒアルロナン分解酵素をコードする核酸およびそのポリペプチド類の製造方法
１. ベクターおよび細胞
２. リンカー部分
３. 発現
ａ. 原核細胞
ｂ. 酵母細胞
ｃ. 昆虫細胞
ｄ. 哺乳動物細胞
ｅ. 植物
４. 精製方法
Ｉ. 安定性および活性の評価方法
１. インスリン
２. ヒアルロナン分解酵素群
Ｊ. 治療用途
１. 糖尿病
ａ. １型糖尿病
ｂ. ２型糖尿病
ｃ. 妊娠性糖尿病
２. 重篤疾患患者のためのインスリン治療
Ｋ. 組み合わせ治療
Ｌ. 製造品およびキット
Ｍ. 実施例

Ａ. 定義
別に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により共通して認識されるものと同じ意味を有する。特に断らない限り、本明細書中で引用される全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイトおよび他の公表物は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。本明細書中で用語の定義が複数あるときは、ここに記載したものが優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスが引用されているとき、このような識別子は変化することがあり、インターネット上の特定の情報は消去または挿入されるが、同等な情報は知られており、例えばインターネットおよび／または適当なデータベースの検索により容易に入手できると解釈すべきである。それらの引用は当該情報が入手可能であることおよび公衆に頒布されていることを証明する。

ここで使用する“インスリン”は、グルコース取り込みおよび保存を増加させおよび／または内因性グルコース産生を減らすように作用するホルモン、前駆体またはその合成もしくは組み換え類似体を言う。ヒトインスリンは、タンパク質を小胞体(ＥＲ)に配向させる２４アミノ酸のシグナルペプチドを含む、プレプロインスリン(配列番号１０１)である１１０アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして翻訳され、小胞体(ＥＲ)でシグナル配列は開裂され、プロインスリン(配列番号１０２)を生じる。プロインスリンはさらに処理されて、３１アミノ酸Ｃ鎖または連結鎖ペプチド(配列番号１０１に示すプレプロインスリンポリペプチドのアミノ酸残基５７〜８７、および配列番号１０２に示すプロインスリンポリペプチドのアミノ酸残基３３〜６３に対応)を放出する。形成されたインスリンは、２１アミノ酸のＡ鎖(配列番号１０１に示すプレプロインスリンポリペプチドのアミノ酸残基９０〜１１０、および配列番号１０２に示すプロインスリンポリペプチドのアミノ酸残基６６〜８６に対応)および３０アミノ酸のＢ鎖(配列番号１０１に示すプレプロインスリンポリペプチドのアミノ酸残基２５〜５４、および配列番号１０２に示すプロインスリンポリペプチドのアミノ酸残基１〜３０)を含み、これらはジスルフィド結合で架橋されている。適切に架橋されたヒトインスリンは３個のジスルフィド架橋を有する。一つ目はＡ鎖の７位とＢ鎖の７位の間であり、二つ目はＡ鎖の２０位とＢ鎖の１９位の間であり、三つ目はＡ鎖の６位と１１位の間である。インスリンなる用語は、活性を有するその一本鎖または二本鎖形態、切断型形態のプレプロインスリン、プロインスリンおよびインスリンポリペプチド類を含み、対立形質変異体および種変異体、スプライス変態によりコードされる変異体、および他の変異体、例えば配列番号１０１に示す前駆体ポリペプチドと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド類を含むインスリン類似体またはその成熟形態を含む。インスリン類似体の例には、配列番号１４７〜１４９、１５２に示すもの、および配列番号１５０、１５６、１５８、１６０、１６２および１６４に示すＡ鎖および／または配列番号１５１、１５３〜１５５、１５７、１５９、１６１、１６３および１６５に示すＢ鎖を含むものが含まれる。

インスリンポリペプチド類の例はヒトを含む哺乳動物起源のものである。ヒト起源のインスリンのアミノ酸配列の例は配列番号１０１〜１０４に示す。インスリン類似体の例は配列番号１４７〜１４９、１５２に示すもの、および配列番号１５０、１５６、１５８、１６０、１６２および１６４に示すＡ鎖および／または配列番号１５１、１５３〜１５５、１５７、１５９、１６１、１６３および１６５に示すＢ鎖を含むものを含む。インスリンポリペプチド類はまた、配列番号１０５〜１４６に示す前駆体インスリンポリペプチド類のいずれも含むが、これらに限定されないあらゆる非ヒト起源のものを含む。インスリンなる用語は、単量体および六量体インスリン類を含む多量体インスリン類、ならびにヒト化インスリン類を含む。

ここで使用する“速効性のインスリン”は、速効性のインスリン(例えば、食事が原因のまたは食事により起こることが予測される食事性高血糖状態)の投与時に、または投与後約４時間以内に、糖尿病対象においける実際の、認知された、または予測される高血糖状態に応答して糖尿病対象に急性投与するためのあらゆるインスリンまたは速効性のインスリン組成物を言い、ここで、速効性のインスリンは急性高血糖状態を予防、制御または軽減できる。典型的に、速効性のインスリンは対象への皮下投与時にまたは約４時間を超えずに、ピークインスリンレベルを示すインスリンである。速効性のインスリン類は組み換えインスリン類および単離されたインスリン類(“レギュラー”インスリン類とも呼ぶ)、例えば、Humulin(登録商標)Ｒとして販売されているインスリン、ブタインスリン類およびウシインスリン類、ならびにアミノ酸改変により速効型であるように設計された速効型インスリン類似体(ここでは速効性のインスリン類似体とも呼ぶ)を含む。レギュラーインスリン製剤の例は、ヒトレギュラーインスリン類、例えば商品名Humulin^{(登録商標)}Ｒ、Novolin^{(登録商標)}ＲおよびVelosulin^{(登録商標)}、インスリンヒト、ＵＳＰおよびインスリンヒト注射、ＵＳＰ、ならびにインスリンの酸製剤、例えば、例えば、トロントインスリン、旧インスリン、およびクリアーインスリン、およびレギュラーブタインスリン類、例えばIletin II^{(登録商標)}(ブタインスリン)を含むが、これらに限定されない。レギュラーインスリン類は、典型的に投与後３０分間〜１時間で作用を発現し、２〜５時間でインスリンレベルがピークとなる。

ここで使用する速効型インスリン類似体(速効性のインスリン類似体とも呼ぶ)は、作用発現が急速なインスリン類である。急速インスリン類は、典型的にレギュラーインスリン類よりも速効型となるように、例えば、１個以上のアミノ酸置換の導入により操作されているインスリン類似体である。速効型インスリン類似体は、典型的に注射後１０〜３０分間で作用を発現し、注射後３０〜９０分間でピークインスリンレベルが観察される。速効型インスリン類似体は、例えば、インスリンリスプロ(例えばHumalog^{(登録商標)}インスリン)、インスリンアスパルト(例えばNovoLog^{(登録商標)}インスリン)、およびインスリングルリジン(例えばApidra^{(登録商標)}インスリン)、VIAject^{(登録商標)}およびVIAtab(登録商標)として販売されている速効性のインスリン組成物(例えば、米国特許７,２７９,４５７参照)を含むが、これらに限定されない。また、注射後３０分未満で作用が発現し、９０分以内、典型的に３０〜９０分以内にピークレベルとなるあらゆる他のインスリン類を含む。

ここで使用するヒトインスリンは、対立形質変異体および類似体を含むヒトポリペプチドとして合成または組み換えにより産生されたインスリンを言う。

ここで使用する速効性のヒトインスリン類またはヒト速効性のインスリン組成物は、速効性であるあらゆるヒトインスリンまたはヒトインスリンの組成物を含むが、非ヒトインスリン類、例えばレギュラーブタインスリンを除く。

ここで使用する用語“基礎作用(basal-acting)インスリン類”または“基礎(basal)インスリン類”は、糖尿病のような慢性状態の処置のための全体的処置レジメンの一部として基礎インスリンレベルを維持するために投与するインスリン類を言う。典型的に、基礎作用インスリンは、定期的(例えば１日１回または２回)投与したとき、インスリンの制御放出により凡そ定常状態インスリンレベルを維持するように製剤される。基礎作用インスリン類は、結晶インスリン類(例えばＮＰＨおよびLente^{(登録商標)}、プロタミンインスリン、サーフェンインスリン)、基礎インスリン類似体(インスリングラルジン、HOE 901、NovoSol Basal)およびレギュラーインスリンの吸収速度を遅延させるインスリンの他の化学製剤(例えばアラビアゴム、レシチンまたは油懸濁液)を含む。ここで使用する基礎作用型インスリン類は、典型的に長時間作用型(典型的に到達するピーク濃度は相対的に低いが、約２０〜３０時間を超える最大作用時間を有する)または中間型(典型的に投与約４〜１２時間後にピークインスリン濃度をもたらす)として理解されているインスリン類を含み得る。

ここで使用する用語“高血糖状態”または“高血糖”は望ましくない血糖上昇を言う。
ここで使用する用語“低血糖状態”または“低血糖”は望ましくない血糖低下を言う。

ここで使用する血糖コントロールまたは“血糖値のコントロール”は、所望のレベル、典型的に７０〜１３０mg／dLまたは９０〜１１０mg／dLでの血糖濃度の維持を言う。

ここで使用する閉鎖ループ系は、連続的血糖コントロールを提供するための集積系である。閉鎖ループ系は、血糖測定のための機構、インスリン組成物を含む１種以上の組成物送達のための機構、および血糖コントロールを達成するために送達が必要であるインスリンの量を決定するための機構を含む。典型的に、それ故に、閉鎖ループ系はグルコースセンサー、インスリン送達デバイス、例えばインスリンポンプ、およびグルコースセンサーからの情報を受け取り、インスリン送達デバイスに命令を発するコントローラーを含む。命令は、コントローラーのソフトウェアにより作成され得る。ソフトウェアは、典型的にグルコースセンサーにより検出されるまたは使用者により予測される血糖値に基づき、血糖コントロールを達成するために送達するのが必要なインスリン量を決定するためのアルゴリズムを含む。開放ループ系は、デバイスが自動的にグルコースレベルを測定し、応答しない以外、類似のデバイスを言う。

ここで使用する投与レジメは、インスリン投与量および投与頻度を言う。投与レジメは処置すべき疾患または状態の関数であり、故に変わり得る。

ここで使用するヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンポリマー(ヒアルロン酸またはＨＡとも言う)の小分子量フラグメントへの開裂を触媒する酵素を言う。ヒアルロナン分解酵素群の例はヒアルロニダーゼ群、および、ヒアルロナンを脱重合する能力を有する特定のコンドロイチナーゼ群およびリアーゼ群である。ヒアルロナン分解酵素群であるコンドロイチナーゼ群の例は、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ(コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られる)、コンドロイチンＡＣリアーゼ(コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られる)およびコンドロイチンＣリアーゼを含むが、これらに限定されない。コンドロイチンＡＢＣリアーゼは２種の酵素群、コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ(EC 4.2.2.20)およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ(EC 4.2.2.21)を含む。コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ群およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ群の例は、プロテウス・ブルガリスおよびフラボバクテリウム・ヘパリナム由来のものを含むが、これらに限定されない(プロテウス・ブルガリスコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼは配列番号９８に示す；Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46)。細菌由来のコンドロイチナーゼＡＣ酵素群の例は、配列番号９９に示すフラボバクテリウム・ヘパリナム、配列番号１００に示すビクチバリス・バンデンシスおよびアルスロバクタ・オウレセンス由来のものを含むが、これらに限定されない(Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)。細菌由来のコンドロイチナーゼＣ酵素群は、例えば、レンサ球菌およびフラボバクテリウム由来のものを含むが、これらに限定されない(Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)。

ここで使用するヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン分解酵素群を言う。ヒアルロニダーゼ群は、細菌ヒアルロニダーゼ群(EC 4.2.2.1またはEC 4.2.99.1)、ヒル類、他の寄生虫、および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ群(EC 3.2.1.36)、および哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群(EC 3.2.1.35)を含む。ヒアルロニダーゼ群は、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、サカナ、カエル、細菌を含むが、これらに限定されないすべての非ヒト起源、およびヒル類、他の寄生虫、および甲殻類のすべてを含む。非ヒトヒアルロニダーゼ群の例は、ウシ(配列番号１０、１１、６４およびＢＨ５５(米国特許５,７４７,０２７および５,８２７,７２１)、スズメバチ(配列番号１２および１３)、ミツバチ(配列番号１４)、北米産スズメバチ(配列番号１５)、アシナガバチ(配列番号１６)、マウス(配列番号１７〜１９、３２)、ブタ(配列番号２０〜２１)、ラット(配列番号２２〜２４、３１)、ウサギ(配列番号２５)、ヒツジ(配列番号２６、２７、６３および６５)、オランウータン(配列番号２８)、カニクイザル(配列番号２９)、モルモット(配列番号３０)、チンパンジー(配列番号１８５)、アカゲザル(配列番号１８６)、アルスロバクター属(株ＦＢ２４)(配列番号６７)、ブデロビブリオ・バクテリオヴォルス(配列番号６８)、プロピオニバクテリウム・アクネス(配列番号６９)、ストレプトコッカス・アガラクチア(配列番号７０)；１８ＲＳ２１(配列番号７１)；血清型Ｉａ(配列番号７２)；血清型III(配列番号７３)、黄色ブドウ球菌(株COL)(配列番号７４)；株MRSA252(配列番号７５および７６)；株MSSA476(配列番号７７)；株NCTC 8325(配列番号７８)；株ウシＲＦ１２２(配列番号７９および８０)；株USA300(配列番号８１)、肺炎レンサ球菌(配列番号８２)；株ATCC BAA-255/R6(配列番号８３)；血清型２、株D39/NCTC 7466(配列番号８４)、Ａ群溶血レンサ球菌(血清型Ｍ１)(配列番号８５)；血清型Ｍ２、株MGAS10270(配列番号８６)；血清型Ｍ４、株ＭGAS10750(配列番号８７)；血清型Ｍ６(配列番号８８)；血清型M12、株MGAS2096(配列番号８９および９０)；血清型Ｍ１２、株MGAS9429(配列番号９１)；血清型Ｍ２８(配列番号９２)；豚レンサ球菌(配列番号９３〜９５)；ビブリオ・フィッシェリ(株ATCC 700601/ES114(配列番号９６))由来のヒアルロニダーゼ群、およびヒアルロン酸に特異的であり、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を開裂しないストレプトマイセス・ヒアルロノリチクスヒアルロニダーゼ酵素を含むが、これらに限定されない(Ohya, T. and Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)。ヒアルロニダーゼ群はまたヒト起源のものを含む。ヒトヒアルロニダーゼ群の例は、ＨＹＡＬ１(配列番号３６)、ＨＹＡＬ２(配列番号３７)、ＨＹＡＬ３(配列番号３８)、ＨＹＡＬ４(配列番号３９)、およびＰＨ２０(配列番号１)を含む。またヒアルロニダーゼ群は、ヒツジおよびウシＰＨ２０、可溶性ヒトＰＨ２０および可溶性ｒＨｕＰＨ２０を含む、可溶性ヒアルロニダーゼ群を含む。市販のウシまたはヒツジ可溶性ヒアルロニダーゼ群の例は、Vitrase(登録商標)(ヒツジヒアルロニダーゼ)およびAmphadase(登録商標)(ウシヒアルロニダーゼ)である。

ヒアルロナン分解酵素、ヒアルロニダーゼまたはＰＨ２０について述べるとき、それは前駆体ヒアルロナン分解酵素ポリペプチド類および成熟ヒアルロナン分解酵素ポリペプチド類(例えば、シグナル配列が除去されているもの)、活性を有する切断形態(例えばＣ末端切断形態)を含み、対立形質変異体および種変異体、配列番号１および１０〜４８、６３〜６５、６７〜１００に示す前駆体ポリペプチドに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド類を含むスプライス変態によりコードされる変異体、および他の変異体、またはその成熟形態を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素(例えばＰＨ２０)について述べるとき、それは配列番号２に示す成熟ヒトＰＨ２０および活性を有するその切断形態を含み、対立形質変異体および種変異体、スプライス変異によりコードされる変異体、および配列番号２に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド類を含む他の変異体を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素について述べるとき、それはまた配列番号５０〜５１に示すヒトＰＨ２０前駆体ポリペプチド変異体を含む。ヒアルロナン分解酵素群はまた化学的または翻訳後修飾を含むものおよび化学的または翻訳後修飾を含まないものを含む。このような修飾は、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当分野で知られる他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。

ここで使用するＰＨ２０は、精子で発生し、中性で活性なヒアルロニダーゼ群を言う。ＰＨ−２０は精子表面および内部アクロソーム膜に結合する場所であるリソソーム由来アクロソームで発生する。ＰＨ２０は、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ウシ、ヒツジ、モルモット、ウサギおよびラット起源のものを含むが、これらに限定されず、あらゆる起源のものを含む。ＰＨ２０タンパク質類の例は、ヒト(配列番号１に示す前駆体ポリペプチド、配列番号２に示す成熟ポリペプチド)、ウシ(配列番号１１および６４)、ウサギ(配列番号２５)、ヒツジＰＨ２０(配列番号２７、６３および６５)、カニクイザル(配列番号２９)、モルモット(配列番号３０)、ラット(配列番号３１)、マウス(配列番号３２)、チンパンジー(配列番号１８５)およびアカゲザル(配列番号１８６)ＰＨ２０ポリペプチド類を含むが、これらに限定されない。ＰＨ２０について述べるとき、それは前駆体ＰＨ２０ポリペプチド類および成熟ＰＨ２０ポリペプチド類(例えば、シグナル配列が除去されているもの)、活性を有するその切断型形態を含み、対立形質変異体および種変異体、スプライス変異によりコードされる変異体、および配列番号１、１０、２５、２７、３０〜３１、６３〜６５、１８５〜１８６に示す前駆体ポリペプチド類に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する他の変異体を含むポリペプチド類、またはその成熟形態を含む。ＰＨ２０ポリペプチド類はまた化学的または翻訳後修飾を含むものおよび化学的または翻訳後修飾を含まないものを含む。このような修飾は、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当分野で知られる他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。市販のウシまたはヒツジ可溶性ヒアルロニダーゼ群の例は、Vitrase(登録商標)ヒアルロニダーゼ(ヒツジヒアルロニダーゼ)およびAmphadase(登録商標)ヒアルロニダーゼ(ウシヒアルロニダーゼ)である。

ここで使用する可溶性ヒアルロニダーゼは、細胞から分泌され、膜アンカー型または結合性ではなく、それ故に、生理的条件下でのその溶解性により特徴付けることができるポリペプチドである。可溶性ヒアルロニダーゼ群は、例えば、３７℃に温めたTriton X-114溶液の水相へのその分配により区別できる(Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7)。膜アンカー型、例えば脂質アンカーヒアルロニダーゼ群は、界面活性剤リッチ相に分配されるが、ホスホリパーゼ−Ｃ処置後は界面活性剤プアまたは水相に分配される。可溶性ヒアルロニダーゼ群に包含されるのは、ヒアルロニダーゼの膜へのアンカーと結合性の１カ所以上の領域が除去または修飾されており、可溶性形態がヒアルロニダーゼ活性を維持する、膜アンカー型ヒアルロニダーゼ群である。それ故に、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば可溶性ＰＨ２０ポリペプチド類は、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーの１個以上のアミノ酸類を欠くその切断型形態、例えば、Ｃ末端切断型形態を含む。可溶性ヒアルロニダーゼ群は、組み換え可溶性ヒアルロニダーゼ群および天然源中に含まれるものまたは、例えば、ヒツジまたはウシからの精巣抽出物のようなそこから単離されたものを含む。このような可溶性ヒアルロニダーゼ群の例は、可溶性ヒトＰＨ２０を含む。他の可溶性ヒアルロニダーゼ群はヒツジ(配列番号２７、６３、６５)およびウシ(配列番号１１、６４)ＰＨ２０を含む。

ここで使用する可溶性ヒトＰＨ２０またはｓＨｕＰＨ２０は、発現に際し、ポリペプチド類がそれらが産生された宿主細胞の膜と結合性ではなく、細胞培養培地に分泌され、それ故に、可溶性であるように、Ｃ末端でグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)結合部位の全てまたは一部を欠く成熟ＰＨ２０ポリペプチド類を含む。それ故に、可溶性ヒトＰＨ２０はＣ末端切断型ヒトＰＨ２０ポリペプチド類を含む。可溶性またはＣ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチド類の例は、配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかに示すアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド類、または配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すポリペプチドを含む。ｓＨｕＰＨ２０ポリペプチド類の例は、配列番号４〜９および４７〜４８のいずれかに示すアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド類を含む。このようなｓＨｕＰＨ２０ポリペプチド類の前駆体ポリペプチド類の例はシグナル配列を含む。前駆体の例は、配列番号３および４０〜４６に示すものであり、その各々がアミノ酸１〜３５位に３５アミノ酸シグナル配列を含む。可溶性ＨｕＰＨ２０ポリペプチド類はまたここに記載する産生および精製方法の途中でまたは後に分解するものも含む。

ここで使用するｒＨｕＰＨ２０と言う組み換えヒトＰＨ２０は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞で組み換え発現されたヒトＰＨ２０の分泌された可溶性形態を言う。可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、シグナル配列、例えば天然シグナル配列をコードする核酸により産生される生成物であり、アミノ酸類３６〜４８２をコードする核酸を含み、天然シグナル配列をコードする核酸を含むその配列の例を配列番号４９に示す。また包含されるのは、その対立形質変異体および他の可溶性変異体であるＤＮＡ分子である。可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸はＣＨＯ細胞で発現され、それは成熟ポリペプチドを分泌する。培養培地で産生されるため、生成物が種々の量で配列番号４〜９のいずれか１種以上を含み得る種の混合物を含むように、Ｃ末端に不均一性がある。配列番号５０〜５１に示す前駆体ヒトＰＨ２０ポリペプチド類に対応するものを含む、対応する対立形質変異体および他の変異体も含まれる。他の変異体は、ヒアルロニダーゼ活性を維持し、可溶性である限り、配列番号４〜９および４７〜４８のいずれかと６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し得る。

ここで使用する“超速効型のインスリン組成物”は、インスリン組成物が、対象への非経腸投与後の最初の４０分間に、同量の速効性のインスリンを同じ経路で、ヒアルロナン分解酵素非存在下に投与した後の対象における累積的全身インスリン暴露よりも多い対象における累積的全身インスリン暴露を提供するように、速効性のインスリン、特に速効型インスリン類似体、例えばインスリンのより急速な発現をするインスリン類似体、およびヒアルロナン分解酵素を含むインスリン組成物(例えば、ｒＨｕＰＨ２０製剤であるが、これに限定されない)を言う。超速効型のインスリン組成物は、所望により基礎作用インスリンを含み得る。

ここで使用する製剤は、少なくとも１種の活性剤または薬剤および１種以上の添加物を含む組成物を言う。

ここで使用する配合剤は、２種以上の活性剤または薬剤および１種以上の添加物を含む組成物を言う。例えば、速効性のインスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤は速効性のインスリン、ヒアルロナン分解酵素、および１種以上の添加物を含む。

ここで使用する本組成物は、初期活性および／または純度および／または効力または回収と比較して、その中の活性成分が少なくとも必要レベルの活性および／または純度および／または効力または回収を維持するならば、規定条件下で安定である。本発明の目的で、本組成物は、ヒアルロナン分解酵素活性の少なくとも５０％を維持するかおよび／またはインスリン効力または回収の少なくとも９０％を保持するときおよび／またはインスリン純度の少なくとも９０％を保持するとき、安定である。

ここで使用する少なくとも２種の活性成分を含む安定な配合剤は、初期活性および／または純度および／または効力または回収と比較して、各活性成分が少なくとも必要レベルの活性および／または純度および／または効力または回収を維持するならば、安定である。本発明の目的で、配合剤は、ヒアルロナン分解酵素活性の少なくとも５０％を維持するならばおよびインスリン効力または回収の少なくとも９０％および／またはインスリン純度の少なくとも９０％を維持するならば、安定である。

ここで使用する規定条件は保存および／または使用条件を言う。

ここで使用する“保存”は、製剤が製造後直ぐに対象に投与されず、使用前に一定期間特定の条件(例えば特定の温度；時間、液体または凍結乾燥形態)に維持されることを意味する。例えば、液体製剤は、冷蔵(０〜１０℃、例えば２℃〜８℃)、室温(例えば最高〜３２℃、例えば１８℃〜約または正確に３２℃の温度)、または高温(例えば、３０℃〜４２℃、例えば３２℃〜３７℃または３５℃〜３７℃)のような種々の温度下に、対象への投与前に数日間、数週間、数ヶ月または数年間維持できる。

安定性と関連する条件と関連してここで使用する“使用”は、特定の目的で製剤を用いる行動を言う。特定の適用はタンパク質または薬物の活性または特性に影響され得る。例えば、ある適用は、製剤を一定温度に一定時間維持すること、温度変化に付すことおよび／または混合、振盪、撹拌または活性剤の安定性(例えば活性および／または溶解性)に影響し得る同等な運動に付すことを必要とし得る。条件の例は、連続的注入方法であり、そこで、活性剤は、対象に、使用者が使用するポンプまたは注入器から数日間連続的に注入される。このような条件は撹拌および温度変動と関係し得る。

安定性を測定する、保存または使用に関して、ここで使用する規定条件は、温度条件、保存条件および／または使用条件の時間を含む。例えば、規定温度条件は２℃〜８℃の低温または冷蔵温度、２０℃〜３０℃の環境温度または３２℃〜４０℃の高温を含む。他の例において、規定時間条件は、種々の温度条件下での保存期間、例えば数日間(少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間または７日間)、数週間(少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間または少なくとも数週間)または数ヶ月間(少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、１８ヶ月間、２４ヶ月間以上)の保存を言う。さらなる例において、規定使用条件は、混合物である組成物混合物を攪拌するまたは変える条件、例えば撹拌条件を言う。

ここで使用する単回投与製剤は、直接投与用製剤または配合剤を言う。一般的に、単回投与製剤は、直接投与のための単回投与量治療剤を含む製剤を言う。単回投与製剤は、一般的に防腐剤を含まない。

ここで使用する多数回投与製剤は、治療剤の多数回投与量を含み、直接投与して治療剤の単回投与数回分の投与量を提供できる製剤を言う。多数回投与量は分、時、週、日または月単位にわたり投与し得る。多数回投与製剤は用量調節、用量貯蔵および／または用量分割が可能である。多数回投与製剤は長期間にわたり使用されるため、一般に微生物増殖を防止するための１種以上の防腐剤を含む。多数回投与製剤は注射または点滴(例えば連続的注入)用に製剤できる。

ここで使用する“安定な多数回注射用(ＭＤＩ)配合剤”は、初期活性および／または純度および／または効力または回収と比較して、必要レベルの活性および／または純度および／または効力または回収が一定時間および温度で維持されるように、正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間安定である安定な配合剤を言う。例えば、安定な多数回注射用製剤はヒアルロナン分解酵素活性の少なくとも５０％およびインスリン効力または回収の少なくとも９０％および／またはインスリン純度の少なくとも９０％を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持する。

ここで使用する“安定な連続的インスリン注入製剤”は、初期活性および／または純度および／または効力または回収と比較して、必要レベルの活性および／または純度および／または効力または回収が一定時間および温度で維持されるように、少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で安定である安定な配合剤を言う。例えば、安定な連続的インスリン注入製剤は、ヒアルロナン分解酵素活性の少なくとも５０％およびインスリン効力または回収の少なくとも９０％および／またはインスリン純度の少なくとも９０％を少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で維持する。

ここで使用する持続皮下インスリン注入療法(ＣＳＩＩ)は、インスリンがポンプに接続された注入セットを介して、小注入器またはポンプから数日間にわたり計画された速度で投与される、インスリン投与レジメンを言う。典型的に、ＣＳＩＩ治療は注入セットおよびポンプリザーバーを変えなければならなくなるまで２〜４日間続く。本処置は、食前および高血糖値に応答した連続的ベースラインインスリン放出(基礎速度)および付加的インスリンボーラス投与(すなわち補正ボーラス)を組み合わせる。ＣＳＩＩ治療は、一般的に投与レジメンに従い速効性のインスリン、特にインスリン類似体を送達するための電池式シリンジドライバー、インスリンポンプまたは他の類似デバイスを含む。一般的に、連続的ベースラインインスリン放出のスケジューリングは各患者対して医師が行う。ボーラス投与は食事上の必要および血糖応答に基づき決定する。それ故に、ＣＳＩＩ治療は患者特異的である。ある患者および他の患者の要求、例えば患者の体重、年齢、運動、食習慣および臨床症状のようなパラメータによって、患者毎に特定のインスリン投与レジメンを決定するのは熟練した医師および患者の技術レベルの範囲内であることは周知である。

ここで使用する安定化剤は、例えば配合剤が保存されまたは使用される塩、ｐＨおよび温度の条件下、ヒアルロナン分解酵素またはインスリンまたは両者を分解から保護するために製剤に添加される化合物を言う。それ故に、組成物中のタンパク質類が分解して他の成分になるのを防止する薬剤が含まれる。このような薬剤の例はアミノ酸類、アミノ酸誘導体、アミン類、糖類、ポリオール類、塩類および緩衝剤、界面活性剤、阻害剤または基質およびここに記載する他の薬剤である。

ここで使用するリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓまたはジリシン)は、Ｌｙｓ−Ｌｙｓジペプチド、その塩、誘導体、類似体または模倣体を言う。例えば、ここで言うＬｙｓ−Ｌｙｓにはその塩類、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓの二塩酸塩、すなわちＬｙｓ−Ｌｙｓ二塩酸塩(またはジリシン二塩酸塩；Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ ＨＣｌ)が含まれる。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ二塩酸塩は次の式により表される。

ここで言うＬｙｓ−Ｌｙｓはまたその誘導体、例えば、例えばＦｍｏｃ−、Ｎｏｃ−またはＣｂｚ保護基を含む誘導体を含む。市販のＬｙｓ−Ｌｙｓ二塩酸塩類の例は、Sigma Aldrich、RnD Chem.、MP Bio、Tetrahedron Scientific Inc.およびCrescent Chemical Companyから入手可能なものを含むが、これらに限定されない。市販のＬｙｓ−Ｌｙｓ二塩酸塩の例はSigma Aldrich(Product No. L5502)またはRnD Chem(Product No. G-2675)から入手可能なＬｙｓ−Ｌｙｓ二塩酸塩である。

ここで使用する抗微生物有効性試験は、製品中の防腐剤系の効果を証明する。製品に定められた量の特定の生物を接種する。続いて、２８日間にわたり対照サンプル対試験サンプルで見られる微生物レベルを比較する試験を行う。抗菌有効性試験を実施するためのパラメータはここに記載する分野の当業者には知られている。

ここで使用する防腐剤の抗微生物または抗菌有効量は、保存または使用により混入し得るサンプル中の微生物を死滅させるまたは繁殖を阻害する防腐剤の量を言う。例えば、多数回投与容器について、抗微生物有効量の防腐剤は、単回量の繰り返し吸引により混入し得る微生物の増殖を阻害し得る。ＵＳＰおよびＥＰ(ＥＰＡおよびＥＰＢ)は、防腐剤有効性を規定し、厳しさが異なる抗菌性条件がある。例えば、防腐剤の抗菌有効量は、抗菌防腐剤有効性試験(ＡＰＥＴ)において、接種７日間後に細菌性微生物の少なくとも１.０log_１０単位減少が起こる量である。特定の例において、防腐剤の抗菌有効量は、接種７日間後に細菌性微生物の少なくとも１.０log_１０単位減少が起こる、接種１４日間後に細菌性微生物の少なくとも３.０log_１０単位減少が起こる、少なくとも接種後２８日間細菌性微生物のさらなる増殖がない、および少なくとも接種後７日間真菌性微生物の増殖がないような量である。さらなる例において、防腐剤の抗菌有効量は、接種後２８日間細菌性微生物のさらなる増殖がない、せつ種後１４日間で真菌性微生物が少なくとも１.０log_１０単位減少する、接種７日間後に細菌性微生物の少なくとも３.０log_１０単位減少が起こる、少なくとも接種後２８日間細菌性微生物のさらなる増殖がない、接種１４日間後に細菌性微生物の少なくとも１.０log_１０単位減少が起こる、および少なくとも接種後２８日間真菌性微生物のさらなる増殖がないような量である。さらなる例において、防腐剤の抗菌有効量は、接種後６時間で細菌性微生物が少なくとも２.０log_１０単位減少する、接種２４時間後細菌性微生物が少なくとも３.０log_１０単位減少する、接種後２８日間細菌性微生物の回収がない、接種後７日間で真菌性微生物が少なくとも２.０log_１０単位減少する、および少なくとも接種２８日間真菌性微生物のさらなる増殖がないような量である。

ここで使用する“添加物”は、活性剤非存在下で投与したとき、活性剤の生物学的効果を提供しない、活性剤の製剤中の化合物を言う。添加物の例は、塩類、緩衝剤、安定化剤、浸透圧修飾剤、金属類、ポリマー類、界面活性剤、防腐剤、アミノ酸類および糖類を含むが、これらに限定されない。

ここで使用する“緩衝剤”は、強酸類または強塩基類の添加および温度、圧力、容積または酸化還元電位の外的影響の付加にかかわらずｐＨを一定に保ことができる、物質、一般的に溶液を言う。緩衝剤は他の化学物質の濃度変化を防止し、例えばプロトンドナーおよびアクセプター系は水素イオン濃度(ｐＨ)の著しい変化を防止する。全緩衝剤のｐＨ値は温度および濃度依存的である。ｐＨ値または範囲を維持するための緩衝剤の選択は、既知緩衝剤の既知緩衝能に基づき、当業者により経験的に決定できる。緩衝剤の例は、炭酸水素緩衝剤、カコジル酸緩衝剤、リン酸緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝剤を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｔｒｉｓ緩衝剤(トロメタミン)はアミンベースの緩衝剤であり、８.０６のｐＫａを有し、有効ｐＨ範囲は７.９〜９.２である。Ｔｒｉｓ緩衝剤について、ｐＨは温度が１℃下がるにつれて約０.０３単位上昇し、１０倍希釈当たり０.０３〜０.０５単位減少する。

ここで使用する活性は、ポリペプチドまたはその一部の、完全長(完全)タンパク質と関連する１種または複数種の機能的活性を言う。機能的活性は、触媒または酵素活性、抗原性(抗ポリペプチド抗体に対する結合能または当該結合についてポリペプチドと競合する能力)、免疫原性、多量体形成能、およびポリペプチドについての受容体またはリガンドと特異的に結合する能力を含むが、これらに限定されない。

ここで使用するヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロン酸開裂を酵素的に触媒する能力を言う。米国薬局方(ＵＳＰ)XXIIのヒアルロニダーゼアッセイは、酵素を３０分間、３７℃でＨＡを反応させた後の(ＨＡ)基質である高分子量ヒアルロン酸またはヒアルロナンの量を測定することにより間接的にヒアルロニダーゼ活性を測定する(USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD)。あらゆるヒアルロニダーゼの相対的活性を単位で確認するために、アッセイにおいて標準品溶液を使用できる。ヒアルロニダーゼ群、例えば可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性を測定するためのインビトロアッセイは当分野で知られ、ここに記載されている。アッセイの例は、非開裂ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合したときに形成される不溶性沈殿を検出することによりヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸開裂を間接的に測定する微少濁度アッセイ(例えば実施例２参照)である。試験するヒアルロニダーゼの活性を単位で決定するために、例えば、標準曲線を作成するために、標準品を使用できる。

ヒアルロナン分解酵素に関連してここで使用する“機能的等価量”は、参照酵素、例えばヒアルロニダーゼの一定量(例えば、ヒアルロニダーゼ活性の既知単位数)と同じ効果を達成するヒアルロナン分解酵素の量である。例えば、あらゆるヒアルロナン分解酵素の活性を、ｒＨｕＰＨ２０の既知量と同じ効果を達成できる機能的等価ヒアルロナン分解酵素の量を決定するために、ｒＨｕＰＨ２０の活性と比較できる。例えば、展着または拡散剤として作用するヒアルロナン分解酵素の能力を、マウスの脇腹皮膚にトリパンブルーと共に注射し(例えば米国特許公開番号２００５０２６０１８６参照)、例えば、１００単位のヒアルロニダーゼ標準品と同じ量の展着または拡散をするのに必要なヒアルロナン分解酵素の量を決定できる。必要なヒアルロナン分解酵素量は、それ故に、１００単位と機能的等価である。他の例において、併用インスリンの吸収レベルおよび速度を増加させるヒアルロナン分解酵素の能力を、ヒト対象において、例えば下の実施例１に記載のとおり測定でき、例えば、投与された量のｒＨｕＰＨ２０と同程度にインスリンの吸収レベルおよび速度を増加させるのに必要なヒアルロナン分解酵素の量を決定できる(例えば、血中最大インスリン濃度(Ｃ_ｍａｘ)、血中最大インスリン濃度に到達するまでの時間(ｔ_ｍａｘ)および一定時間にわたる累積的全身インスリン暴露(ＡＵＣ)を評価することによる)。

ここで使用する天然に存在するα−アミノ酸類の残基は、ヒトにおける同族ｍＲＮＡコドンによる荷電ｔＲＮＡ分子の特異的認識によりタンパク質に取り込まれる、自然に見られる２０種のα−アミノ酸類の残基である。

ここで使用する核酸類はペプチド核酸類(ＰＮＡ)およびそれらの混合物を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの類似体を含む。核酸類は一本鎖または二本鎖であり得る。所望により検出可能標識、例えば蛍光または放射標識で標識されていてよいプローブまたはプライマーを言うとき、一本鎖分子が意図される。このような分子は、典型的にその標的が、ライブラリー探索またはプライミングのために統計学的に独特であるまたは低コピー数である(典型的に５未満、一般的に３未満)ような長さである。一般的にプローブまたはプライマーは、目的遺伝子と相同的なまたは同一の配列の少なくとも１４、１６または３０連続ヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは１０、２０、３０、５０、１００以上の核酸長であり得る。

ここで使用するペプチドは、２アミノ酸長以上であり、４０アミノ酸長未満であるポリペプチドを言う。

ここに提供されるアミノ酸類の種々の配列に現れる、ここで使用するアミノ酸類は周知の三文字または一文字略語に従い同定する(表１)。種々の核酸フラグメントに現れるヌクレオチドは、当分野で慣用の標準的一文字命名法で指定する。

ここで使用する“アミノ酸”は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは２個以上のアミノ酸類を含む。本発明の目的で、アミノ酸類は２０種の天然に存在するアミノ酸類、非天然アミノ酸類およびアミノ酸類似体(すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸類)を含む。

ここで使用する“アミノ酸残基”は、ポリペプチドのペプチド結合の化学分解(加水分解)により形成されたアミノ酸を言う。ここに記載するアミノ酸残基は、“Ｌ”異性体形態であると推定される。“Ｄ”異性体形態の残基は、そう命名されているが、所望の機能的特性がポリペプチドにより維持されている限り、あらゆるＬ−アミノ酸残基と置き換えてよい。ＮＨ_２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を言う。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を言う。J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)に記載され、37 C.F.R. §§ 1.821-1.822に再用された標準ポリペプチド命名法を遵守して、アミノ酸残基の略語を表１に示す。

ここで使用する式で表されるアミノ酸残基配列は、全て、左から右に、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう通常の向きで表されている。また、“アミノ酸残基”という表現は、対応表(表１)に挙げたアミノ酸ならびに修飾アミノ酸および異常アミノ酸、例えば３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§§１.８２１〜１.８２２で言及され引用により本明細書に組み込まれるものを包含すると広く定義される。さらにまた、アミノ酸残基配列の最初または最後にあるハイフン記号は、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合、アミノ末端基(例えばＮＨ_２)またはカルボキシル末端基(例えばＣＯＯＨ)へのペプチド結合を示す。

ここで使用する“天然アミノ酸”とは、ポリペプチド中に見いだされる２０種のＬ−アミノ酸を言う。

ここで使用する“非天然アミノ酸”は、天然アミノ酸に類似する構造を持つが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に修飾されている有機化合物を言う。したがって非天然アミノ酸は、例えば２０種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸類似体を包含し、例えばアミノ酸のＤ−立体異性体を含むが、これらに限定されない。典型的な非天然アミノ酸は本明細書に記載され、当業者に知られている。

ここで使用するＤＮＡコンストラクトは、ＤＮＡのセグメントが自然界には見いだされない形で組み合わされ隣接して配置されている一本鎖または二本鎖の線状または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、人為的操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。

ここで使用するＤＮＡセグメントは、指定された属性を持つ、より大きなＤＮＡ分子の一部分である。例えば、指定されたポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミドフラグメントのような、より長いＤＮＡ分子の一部であって、５’から３’に向かう方向に読んだ場合に、指定されたポリペプチドのアミノ酸配列をコードするものである。

ここで使用する用語ポリヌクレオチドは、５’端から３’端に向かって読み取られるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドにはＲＮＡおよびＤＮＡが包含され、自然源から単離するか、インビトロで合成するか、天然分子と合成分子の組合せから製造することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書では、ヌクレオチド(“ｎｔ”と略記)または塩基対(“ｂｐ”と略記)の数で記載される。ヌクレオチドという用語は、文脈に応じて、一本鎖分子および二本鎖分子に使用される。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全長を表すために使用され、塩基対という用語と等価であると理解される。二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖の長さがわずかに異なり得ること、およびそれらの末端がずれていてもよいこと、したがって二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対を形成しているとは限らないことは、当業者には理解される。そのような非対合末端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えない。

ここで使用する２つのタンパク質または核酸間の“類似性”とは、タンパク質のアミノ酸配列間または核酸のヌクレオチド配列間の類縁性を言う。類似性は、残基の配列およびそこに含まれる残基の同一性および／または相同性の度合いに基づくことができる。タンパク質間または核酸間の類似性の度合いを評価するための方法は、当業者には知られている。例えば、配列類似性を評価する一方法では、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、それら配列間の同一性が最大レベルになるように整列させる。“同一性”とは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が不変である程度を言う。アミノ酸配列の整列では(また、ある程度はヌクレオチド配列の整列でも)、アミノ酸(またはヌクレオチド)の保存的相違および／または頻繁な置換も考慮することができる。保存的相違とは、関与する残基の物理化学的性質が維持されるような相違である。整列はグローバル(配列の全長にわたり、全ての残基を含む、比較配列の整列)またはローカル(配列のうち、最も類似する１または複数の領域だけを含む部分の整列)であることができる。

ここで使用する“同一性”そのものは、当技術分野で認められている意味を持ち、公表された技法を使って算出することができる(例えばComputational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991)参照)。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定するための方法はいくつか存在するが、“同一性”という用語は当業者にはよく知られている(Carrillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988))。

ここで使用する相同(核酸および／またはアミノ酸配列に関して)は、約２５％以上の配列相同性、典型的には、２５％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の配列相同性を意味し、必要であれば正確なパーセンテージを指定することができる。ここで使用するは、“相同性”および“同一性”という用語は、別段の表示がない限り、しばしば可換的に使用される。一般に、相同率または同一率を決定するには、最も高度な一致が得られるように配列が整列される(例えばComputational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照)。配列相同性により、保存されているアミノ酸の数は、標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムで決定され、各供給者によって設定されたデフォルトギャップペナルティを用いて使用することができる。実質的に相同な核酸分子は、典型的には、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーで、目的とする対象の核酸の全長にわたってハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重したコドンを含有する核酸分子も意図される。

任意の２分子が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％“同一”または“相同”なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を持つかどうかは、“ＦＡＳＴＡ”プログラムなどの公知コンピュータアルゴリズムを使用し、例えばPearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444に記載されているデフォルトパラメータを使って決定することができる(他のプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ(Altschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073)。例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センターデータベースのＢＬＡＳＴ機能を使って同一性を決定することができる。他の市販プログラムまたは公に利用可能なプログラムには、DNAStar “MegAlign” program (Madison, WI)およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) “Gap” program (Madison WI)などがある。タンパク質分子および／または核酸分子の相同率または同一率は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラム(例えばNeedleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, as revised by Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482)を使って配列情報を比較することによって決定することができる。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは、類似性を、整列させた記号(すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸)のうち、類似しているものの数を、それら２つの配列の短い方の配列中の記号の総数で割ったものと定義する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータとしては、(１)Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)に記載されているように、単項比較マトリックス(unary comparison matrix)(一致に対して１の値を、不一致に対して０の値を含む)およびGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の加重比較マトリックス(weighed comparison matix)；(２)各ギャップに対して３.０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対して０.１０の追加ペナルティ；ならびに(３)エンドギャップ(end gap)に対するペナルティなしを挙げることができる。

したがって、ここで使用する“同一性”または“相同性”という用語は、試験ポリペプチドまたは試験ポリヌクレオチドと基準ポリペプチドまたは基準ポリヌクレオチドの間の比較を表す。本明細書で使用する“〜に少なくとも９０％同一”という用語は、そのポリペプチドの基準核酸配列または基準アミノ酸配列に対する９０〜１００％の同一率を言う。９０％以上のレベルの同一性とは、例えば、比較される試験ポリペプチドと基準ポリペプチドの長さが１００アミノ酸であるとすると、基準ポリペプチド中のアミノ酸と異なる試験ポリペプチド中のアミノ酸が１０％(すなわち１００個中１０個)を上回らないことを示す。同様の比較を、試験ポリヌクレオチドと基準ポリヌクレオチドの間でも行うことができる。そのような相違は、ポリペプチドの全長にわたってランダムに分布する点突然変異として現れる場合も、許容される最大値までの、例えば１００個中１０個のアミノ酸相違(約９０％の同一性)までの、種々の長さを持つ１つ以上の位置にクラスターを形成する場合もあり得る。相違は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入または欠失と定義される。約８５〜９０％を上回る相同性または同一性のレベルでは、結果が、プログラムにも、設定されたギャップパラメータにも、依存しないはずであり、そのような高レベルの同一性は、多くの場合、ソフトウェアに頼らなくても手動での整列によって、容易に評価することができる。

ここで使用する、整列された配列とは、相同性(類似性および／または同一性)を使った、ヌクレオチド配列中またはアミノ酸配列中の対応する位置の整列を言う。典型的には、５０％以上が同一である関係する２つ以上の配列が整列される。整列された一組の配列とは、対応する位置で整列させた２つ以上の配列を指し、ＲＮＡに由来する配列、例えばＥＳＴおよび他のｃＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ配列と整列させたものを含み得る。

ここで使用するある生成物と実質的に同一であるとは、十分に類似しているので、その物品の代わりに実質的に同一な生成物を使用しても、目的とする対象の性質が十分に不変であることを意味する。

また、ここで使用する“実質的に同一”または“類似する”という用語は、当業者には理解されるとおり、文脈によってさまざまであると理解される。

ここで使用する対立遺伝子変異型または対立遺伝子変異は、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の変異形態のいずれかを言う。対立遺伝子変異は突然変異によって自然に発生し、集団内の表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異はサイレント(コードされるポリペプチドを変化させない)であるか、変化したアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードすることができる。“対立遺伝子変異型”という用語は、本明細書では、ある遺伝子の対立遺伝子変異型によってコードされるタンパク質を表すためにも使用される。典型的に、基準型の遺伝子は、ある集団から得られるまたはある種の単一の基準メンバーから得られるポリペプチドの野生型および／または優勢型をコードする。典型的に、対立遺伝子変異型(２種間および３種以上の間での変異型を含む)は、同じ種から得られる野生型および優勢型と、典型的には少なくとも８０％、９０％またはそれ以上のアミノ酸同一性を持つ。また、同一性の度合いは、遺伝子に依存し、比較が種間比較であるか種内比較であるかにも依存する。一般に、種内対立遺伝子変異型は、野生型および／または優勢型と少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の同一性(野生型および／または優勢型のポリペプチドと９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を含む)を持つ。本明細書において対立遺伝子変異型は、一般に、同じ種内のメンバー間でのタンパク質中の変異を言う。

ここで使用する“対立遺伝子”は、本明細書では“対立遺伝子変異型”と可換的に使用され、遺伝子またはその一部の変異型を言う。対立遺伝子は相同染色体上の同じ座または位置を占める。ある対象がある遺伝子について２つの同一対立遺伝子を持っている場合、その対象はその遺伝子または対立遺伝子に関してホモ接合であるという。ある対象がある遺伝子について２つの異なる対立遺伝子を持っている場合、その対象はその遺伝子についてヘテロ接合であるという。ある特定遺伝子の対立遺伝子は互いに１個のヌクレオチドが異なる場合または数個のヌクレオチドが異なる場合があり、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含む場合もある。ある遺伝子の対立遺伝子は、突然変異を含有する遺伝子の一形態であることもできる。

ここで使用する種変異型は、マウスとヒトのような異なる哺乳動物種間を含む異なる種間のポリペプチドにおける変異型を言う。

ここで使用する改変は、ポリペプチドのアミノ酸配列または核酸分子中のヌクレオチド配列の改変に関し、それぞれアミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。ポリペプチドを改変する方法は、組換えＤＮＡ法を用いる方法など、当業者にとっては日常的である。

ここで使用する単離されたまたは精製されたポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的活性部分は、そのタンパク質が得られる細胞または組織に由来する細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成された場合は化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない。当業者が純度を評価するために使用する薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)などの標準的分析方法で決定した場合に調製物が容易に検出できる不純物を含まないと考えられるか、または調製物が十分に純粋であって、さらなる精製を行ってもその物質の物理的および化学的性質(例えば酵素活性および生物学的活性)が検出できるほどには変化しないであろう場合に、調製物は不純物を実質的に含まないと決定することができる。化合物を精製して実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための方法は、当業者には知られている。ただし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であることができる。そのような場合は、さらなる精製により、化合物の比活性が増加するかもしれない。

細胞性物質を実質的に含まないという用語は、タンパク質がその単離源または組換え生産源となった細胞の細胞性構成要素から分離されているタンパク質の調製物を包含する。ある態様において、細胞性物質を実質的に含まないという用語は、約３０％未満(乾燥重量で)の非酵素タンパク質(ここでは夾雑タンパク質ともいう)、一般的には約２０％未満の非酵素タンパク質または約１０％未満の非酵素タンパク質または約５％未満の非酵素タンパク質を含む酵素タンパク質の調製物を包含する。酵素タンパク質が組換え生産される場合、それは培養培地も実質的に含まない。すなわち培養培地は、酵素タンパク質調製物の体積の約または正確に２０％、１０％もしくは５％未満に相当する。

本明細書で使用する、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないという用語は、タンパク質がそのタンパク質の合成に関与した化学的前駆体または他の化学物質から分離されている酵素タンパク質の調製物を包含する。この用語は、含まれる化学的前駆体または非酵素化学物質もしくは構成要素が約３０％(乾燥重量で)、２０％、１０％、５％またはそれ以下より少ない酵素タンパク質の調製物を包含する。

ここで使用する例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドなどに関していう合成とは、組換え法および／または化学合成法によって製造される核酸分子またはポリペプチド分子を言う。

ここで使用する組換えＤＮＡ法を使った生産とは、クローン化されたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させるために、分子生物学の周知の方法を使用することを意味する。

ここで使用するベクター(またはプラスミド)は、異種核酸をその発現またはその複製を目的として細胞中に導入するために使用される不連続な要素を言う。ベクターは典型的に、エピソームであり続けるが、ゲノムの染色体への遺伝子またはその一部の組込みが達成されるように設計することもできる。酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考えられる。そのような運搬体の選択と使用は当業者にはよく知られている。

ここで使用する発現ベクターは、当該ＤＮＡフラグメントの発現を達成する能力を持つプロモーター領域などの調節配列に作動的に連結されたＤＮＡを発現させる能力を持つベクターを包含する。そのような追加セグメントはプロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、場合によっては、１つ以上の複製起点、１つ以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなども含むことができる。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導されるか、または両方の要素を含有することができる。したがって、発現ベクターとは、適当な宿主細胞に導入された時にクローン化されたＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを言う。適当な発現ベクターは当業者にはよく知られており、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能なものや、エピソームであり続けるもの、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものがある。

ここで使用するベクターは、“ウイルスベクター”または“ウイルス様ベクター”も包含する。ウイルス様ベクターは、(運搬体またはシャトルとして)細胞中に外来遺伝子を導入するためにそれら外来遺伝子に作動的に連結された工学的改変ウイルスである。

ここで使用するＤＮＡセグメントに関して作動可能に連結または作動的に連結とは、複数のセグメントが、その意図された目的のために、それらが協力して機能するように、例えば転写がプロモーターの下流かつ任意の転写配列の上流で開始するように、配置されることを意味する。プロモーターとは、通常、転写装置がそこに結合して転写を開始するドメインであり、その転写装置はコードセグメントを通ってターミネーターまで進行する。

本明細書で使用する、評価するという用語は、試料中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性について絶対値を得るという意味での、そしてまた活性のレベルを示す指数、比、パーセンテージ、視覚化または他の値を得るという意味での、定量的および定性的決定を包含するものとする。評価は直接的または間接的であることができ、実際に検出される化学種は、もちろん、加水分解産物そのものである必要はなく、例えばその誘導体または他の何らかの物質であることができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルーを使ったタンパク質染色などによる、相補タンパク質の切断産物の検出が意図される。

ここで使用する生物学的活性とは、化合物のインビボ活性、または化合物、組成物もしくは他の混合物をインビボ投与した時に起こる生理学的応答を言う。したがって生物学的活性は、そのような化合物、組成物および混合物の治療効果および薬理活性を包含する。生物学的活性は、そのような活性を試験または使用するために設計されたインビトロ系で観察することができる。したがって、ここで使用するは、プロテアーゼの生物学的活性とは、ポリペプチドの加水分解がなされるその触媒活性である。

２つの核酸配列に関してここで使用する等価とは、問題の２つの配列が同じアミノ酸配列または等価なタンパク質をコードすることを意味する。２つのタンパク質またはペプチドに関して等価という場合、それは、それら２つのタンパク質またはペプチドが実質的に同じアミノ酸配列を持ち、アミノ酸置換はそのタンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化させないものだけであることを意味する。等価が性質を指す場合、その性質は同程度に存在する必要はないが(例えば２つのペプチドは同じタイプの酵素活性を異なる比率で示すことができる)、それらの活性は通常、実質的に同じである。

ここで使用する組成物は任意の混合物を言う。それは、水性、非水性またはその任意の組合せである溶液、懸濁液、液体、粉末、ペーストであることができる。

ここで使用する組合せは、２つまたはそれ以上の物の間の任意の関連を言う。組合せは、２つまたはそれ以上の別々の品目、例えば２つの組成物であるか、その混合物、例えばそれら２つまたはそれ以上の品目の単一混合物であるか、それらの任意の変更物であることができる。組合せの要素は、一般に、機能的に関連または関係する。

ここで使用する“疾患または障害”は、感染、後天的状態、遺伝的状態などを含むが、これらに限定されない原因または状態に起因し、同定可能な症状を特徴とする、ある生物における病理学的状態を言う。ここで目的とする疾患および障害は糖尿病を含む。

ここで使用する、ある疾患または状態を持つ対象を“処置する”とは、処置後に、その対象の症状が部分的にまたは完全に治癒すること、または静的状態を保つことを意味する。したがって、処置は、予防、治療および／または治癒を包含する。予防とは、潜在的疾患の防止および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の防止を言う。処置はまたここで提供するインスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤の医薬的使用も包含する。

ここで使用する医薬有効剤は、任意の治療剤または生物活性剤、例えば麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、従来の治療薬(小分子薬および治療用タンパク質を含む)を包含するが、これらに限定されない。

ここで使用する処置は、ある状態、障害もしくは疾患または他の適応の症状を寛解するか他の有益な形で変化させる、任意の方法を意味する。

ここで使用する治療効果は、疾患または状態の症状を変化(典型的に、改善または寛解)させるか、疾患または状態を治癒させる、対象の処置に起因する効果を意味する。治療有効量とは、対象への投与後に治療効果をもたらす、組成物、分子または化合物の量を言う。

本明細書で使用する“対象”という用語は、ヒトなどの哺乳動物を含む動物を言う。
ここで使用する患者は、疾患または障害の症状を示すヒト対象を言う。

ここで使用する処置による、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による、特定の疾患または障害の症状の寛解とは、その組成物または治療薬の投与に起因すると考えることができる、またはその組成物もしくは治療薬の投与に関連づけることができる、永続的であるか一時的であるか、持続的であるか一過性であるかを問わない症状の減少を言う。

ここで使用する防止または予防は、疾患または状態が発生するリスクを低下させる方法を言う。

ここで使用する“治療有効量”または“治療有効用量”は、少なくとも、治療効果をもたらすのに十分な、薬剤、化合物、物質、または化合物を含有する組成物の量を言う。したがって、これは、疾患または障害を防止し、治癒させ、寛解させ、抑止し、または部分的に抑止するのに必要な量である。

ここで使用する治療有効インスリン投与量は、血糖管理を達成するのに必要なまたは十分なインスリンの量である。この量は、グルコース負荷または食事負荷などにより、実験的に決定することができる。本明細書に記載する組成物は、治療有効投与量が投与されるように、治療有効量または治療有効濃度のインスリンを含有する。

ここで使用する単位投与形態は、当技術分野で知られているように、ヒトおよび動物対象に適し、個別に包装された、物理的に不連続な単位を言う。

ここで使用する“製品”は、製造され販売される物品である。本願の全体にわたって使用されるこの用語は、同じ包装物または別々の包装物に含まれている速効型インスリン組成物およびヒアルロナン分解酵素組成物を包含するものとする。

ここで使用する流体は、流動し得る任意の組成物を言う。したがって流体は、半固形、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のそれに類する組成物の形態をとる組成物を包含する。

ここで使用する“キット”は、本明細書に記載する組成物と、もう一つの品目、例えば再構成、活性化などを目的とするもの、送達、投与、診断および生物学的活性または性質の評価を行うためであるが、これらに限定されない機器／器具などとの組合せを言う。キットは、場合によっては、使用に関する指示を含む。

ここで使用する動物には、任意の動物、例えば限定するわけではないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類；マウスおよびラットなどの齧歯類；ニワトリなどの家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物；ブタおよび他の動物が含まれる。非ヒト動物として想定される動物にヒトは含まれない。本明細書に記載する酵素は、任意の供給源、動物、植物、原核生物および真菌に由来する。大半の酵素は哺乳動物由来を含む動物由来である。

ここで使用する対照は、それが試験パラメータで処置されない点以外は、またはそれが血漿試料である場合は、目的とする対象の状態を有さない健常ボランティアから得られたものであり得る点以外は、試験試料と実質的に同一な試料を言う。対照は内部対照であることもできる。

ここで使用する使用する単数表現は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数の指示物を包含する。したがって、例えば“細胞外ドメイン”を含む化合物への言及は、１つまたは複数の細胞外ドメインを持つ化合物を包含する。

ここで使用する範囲および量は、特定の値または範囲の“約”と表現する場合がある。この“約”には、まさにその量も包含される。したがって“約５塩基”は“約５塩基”を意味すると共に“５塩基”も意味する。

ここで使用する“任意”または“所望により”は、それに続けて述べられる事象または状況が起こることまたは起こらないこと、およびその説明が、該事象または状況が起こる場合と起こらない場合を包含することを意味する。例えば、場合により置換されている基とは、その基が無置換であるか、または置換されていることを意味する。

ここで使用する、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物の略号は、別段の表示がない限り、その一般的使用法、広く認識されている略号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会((1972) Biochemistry 11:1726参照)に従う。

Ｂ. ヒアルロナン分解酵素製剤およびインスリン配合剤の産生
ここに提供されるのは、ヒアルロナン分解酵素、例えば可溶性ヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０の安定な製剤である。一般的に、ヒアルロナン分解酵素群は、酵素活性を維持するために相対的に高い塩を必要とする(例えば米国特許公開番号ＵＳ２０１１００６６１１１参照)。既存の製剤はまた安定性のためにヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を含む。本発明により、Ｌｙｓ−Ｌｙｓおよび塩化マグネシウム(ＭｇＣｌ_２)がＮａＣｌよりもヒアルロナン分解酵素群(例えば可溶性ヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０)を安定化させることが判明した。さらに、Ｌｙｓ−ＬｙｓまたはＭｇＣｌ_２の存在により、ＨＳＡは必要でなくなり、要求もされない。ここに提供する製剤は、既存の製剤を超える、特に高温および長時間の、安定性向上の利益を提供する。ここに提供されるのは、Ｌｙｓ−Ｌｙｓおよび／またはＭｇＣｌ_２を含む安定な製剤である。特に、ここに提供されるのは、安定化剤としてＬｙｓ−Ｌｙｓを含む、ヒアルロナン分解酵素(例えば可溶性ヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０)の安定な製剤である。

ヒアルロナン分解酵素と他の治療剤の配合剤も種々の条件下で安定性を示すべきである。種々の治療剤の製剤要求が異なり、ある場合、ヒアルロナン分解酵素に対する製剤要求に反するために問題となり得る。本発明により、ヒアルロナン分解酵素およびインスリンの配合剤を混合したときこれに当てはまることが判明した。ここに提供されるのは、ヒアルロナン分解酵素(例えばＰＨ２０のような可溶性ヒアルロニダーゼ)およびインスリン、例えば、速効性のインスリンまたはインスリン類似体の安定な配合剤である。

速効性のインスリン類の安定な製剤は、市販製剤を含み、典型的にヒアルロナン分解酵素群、例えば可溶性ヒアルロニダーゼ群の安定な製剤で見られるよりも、インスリンの安定性、溶解性および活性のために必要な種々の添加物および成分および／または種々の濃度の添加物および成分を含む。インスリン類および可溶性ヒアルロニダーゼ群のこれらの最適化製剤は、配合されたインスリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼの安定性、溶解性および／または活性が大きく低下するように、配合剤に一緒に混合したときに不適合である。このような不適合性は、これらの薬剤の安定な配合剤を開発するための大きな障害である。

１. ヒアルロナン分解酵素製剤
ヒアルロナン分解酵素の既存の製剤は一般的にＮａＣｌ、典型的に１３０mM〜１５０mMのＮａＣｌを含む。例えば、Hylenex(登録商標)組み換え(ヒアルロニダーゼヒト注射)は、１mLあたり、８.５mgのＮａＣｌ(１４５mM)、１.４mgのリン酸二水素ナトリウム(９.９mM)、１.０mgのヒトアルブミン、０.９mgのエデト酸二ナトリウム(２.４mM)、０.３mgのＣａＣｌ_２(２.７mM)およびＰＨを７.４に調整するためのＮａＯＨを含む。ヒト可溶性ヒアルロニダーゼの他の製剤、例えば米国特許公開番号ＵＳ２０１１／００５３２４７に記載されたｒＨｕＰＨ２０製剤は、１３０mMのＮａＣｌ、１０mMのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７.０；または１０mMのヒスチジン、１３０mMのＮａＣｌ、ｐＨ６.０を含む。

ｒＨｕＰＨ２０のようなＰＨ２０を含むヒアルロナン分解酵素群、例えばヒアルロニダーゼ群の製剤は、インスリン類製剤よりも種々の成分を含む。例えば、ＰＨ２０は、ｐＨ５.５〜６.５の低ｐＨ値で最も安定である。低ｐＨに加えて、ヒトヒアルロニダーゼ製剤はインスリン製剤より多くのＮａＣｌを含み、このいずれもタンパク質の安定性を向上させ、酵素活性を維持する。また、ヒト可溶性ヒアルロニダーゼ製剤、例えばHylenex(登録商標)組み換え(ヒアルロニダーゼヒト注射)は今日まで単回投与製剤である。それ故、防腐剤を含まない。

２. 速効性のインスリン製剤
速効性のインスリン類は、レギュラーインスリンおよび速効型インスリン類似体を含み、典型的にインスリンの溶解性、安定性および純度が冷蔵温度(例えば４℃、例えば長期保存用に)ならびに高温(例えば２５℃および３０℃)で最適化されるように製剤される。製剤は特に、多数回投与使用およびパッケージングのために、長期安定性を提供するように製造される。例えば、市販インスリン製品のラベルは、Humulin(登録商標)、Humalog(登録商標)、NovoLog(登録商標)およびApidra(登録商標)を含み、２〜８℃の保存温度で少なくとも２４ヶ月間、および２５℃または３０℃保存で２８日間の安定性を示す。また、これらの製剤は、少なくとも６日間、正確にまたは約３７℃の保存温度で安定であると考えられる。

各インスリンについての最適製剤は異なり得るが、典型的に製剤におけるいくつかの共通項がある。例えば、インスリン製剤は典型的に緩衝剤、浸透圧修飾剤(複数もある)および１種以上の防腐剤を含む。多くの速効性のインスリン類はまた亜鉛を含み、一方いくつかはさらに安定化剤を含む。さらに、インスリン製剤は、典型的に高めの中性ｐＨ(例えば７.０〜７.８)で製造される。下の表２は、１種のレギュラーインスリンおよび２種の速効型インスリン類似体を含む、選択した３種の市販されている速効性のインスリン類の製剤を示す。

速効性のインスリン製剤は、多数回投与のための、反復利用、例えば、注射針の反復挿入による製剤に導入される微生物汚染を防止する防腐剤を含む。多くの防腐剤が現在非経腸医薬品における使用に承認されているが、フェノール、メタクレゾール(ｍ−クレゾール)およびパラベン類のようなフェノール化合物がインスリン製剤で最も一般的に使用されている。これらのフェノール化合物は有効抗菌剤として働くだけでなく、インスリン六量体のアロステリック部位と結合でき、インスリン高次構造の全体的配座を変える。これにより、六量体を、線維状凝集体(小線維)を形成することを阻止することにより安定化させ、当該線維状凝集体はインスリン単量体で六量体より容易に形成される(Rahuel-Clermont et al. (1997) Biochemistry 36:5837-5845)。これらの防腐剤は安定化剤として作用できるが、存在する濃度が高すぎるとインスリンの溶解性も低下させ得る。それ故に、インスリン中の防腐剤濃度は、薬剤の安定性および溶解性に重大である。

１種以上の張性調節剤が、典型的に製剤の等張性を調節するためにインスリン製剤に含まれる。インスリン製剤にしばしば存在する張性調節剤の例は、グリセリンおよび／またはＮａＣｌを含む。等張性に影響するだけでなく、ＮａＣｌはＮａＣｌ濃度が高くなれば、溶解性が低下するようにインスリンの溶解性に影響する。インスリン類似体を含む種々のインスリン類が異なる見かけの溶解性を有する。それ故に、溶解性に不利に影響することなく製剤中に存在できるＮａＣｌ量は各インスリン類で異なる。例えば、インスリングルリジン(例えばApidra(登録商標)インスリングルリジン)はインスリンアスパルト(例えばNovoLog(登録商標)インスリンアスパルト)よりも溶解性であり、故に製剤中により多くのＮａＣｌが容認される。対照的に、インスリンリスプロおよびレギュラーインスリンは速効性インスリン類の中で最低の溶解性であり、典型的に製剤中にＮａＣｌを含まない。

他の成分もまたインスリン製剤に含まれ得る。多くのインスリン製剤は、レギュラーインスリン製剤、インスリンアスパルト製剤およびインスリンリスプロ製剤を含み、六量体形成を促進し、安定化させるＺｎ^２＋イオン類を含む。インスリングルリジン製剤は亜鉛を含まないが、タンパク質安定化剤としてポリソルベート２０(Ｐ２０；Tween 20)を含む。速効性インスリン製剤において使用される緩衝剤は、例えば、リン酸二水素ナトリウム緩衝剤およびトロメタモール(ＴｒｉｓまたはＴＨＡＭとしても知られる)を含み得る。

３. ヒアルロナン分解酵素およびインスリン配合剤
速効性のインスリンおよびヒアルロナン分解酵素(例えば、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えばｒＨｕＰＨ２０)を含む組成物は、速効性のインスリン単独と比較して、より密接に非糖尿病対象の内因性(すなわち、自然な)食後インスリン放出を模倣する超速効型のインスリン組成物をもたらす(例えば米国公開番号ＵＳ２００９０３０４６６５参照)。それ故に、このような超速効型のインスリン組成物は、速効性のインスリン類単独と比較して、糖尿病対象に、血糖値をより正確にコントロールし、血糖急上昇を減らすように使用でき、故に、患者に相当な利益をもたらす。

速効性のインスリン類の多数回投与製剤とヒアルロナン分解酵素群の製剤は、しかしながら、不適合であり、この２種の混合は典型的にインスリンの溶解性および安定性の急速な消失に加えて、ヒアルロナン分解酵素の安定性および活性の急速な消失をもたらす。現在まで、それ故に、超速効型の組成物の投与は失活を避けるために、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素を組み合わせた直後に行わなければならなかった。これは糖尿病患者にとって非実用的であり、許容されない負担となる。

それ故に、ここに提供されるのは、速効性のインスリンおよびヒアルロナン分解酵素(例えば、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤である。ここに提供する配合剤は、糖尿病処置、特に食後血糖値のコントロールのための治療剤として使用できる。安定な配合剤は、バイアル、シリンジ、ペン、ポンプ用貯蔵室または閉鎖ループ系、またはあらゆる他の適切な容器に入れることができる多数回投与製剤を含む。

ａ. 安定性に関する対立要求
インスリンおよびヒアルロナン分解酵素群、例えば可溶性ヒアルロニダーゼ群(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤の開発を妨げている大きな障害は、冷蔵温度での速効性インスリン類の結晶化および沈殿、および高温でのヒアルロナン分解酵素の安定性を含む。典型的に、一般的にそのような結果を防止する添加物および条件はこれら２種の活性剤で異なる。インスリン製剤の溶解性および安定性を維持するために最適であるいくつかの添加物および条件のいくつかは、ヒアルロナン分解酵素群、例えば可溶性ヒアルロニダーゼ群(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定性および活性に悪影響を有し得る。逆に、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定性のために最適な添加物および条件は、インスリン類の安定性および溶解性に悪影響を有し得る。

単に速効型インスリン類似体を含む既存のインスリン製剤と、可溶性ヒアルロニダーゼ群の既存の製剤、例えばｒＨｕＰＨ２０を混合しただけでは、長期の冷蔵保存、または環境温度または高温での保存に安定ではない製剤となる。これはｒＨｕＰＨ２０の急速な凝集および酵素失活、ならびにインスリン失活による。これらの悪影響は、防腐剤の種類および濃度、ＮａＣｌ濃度、亜鉛濃度、ｐＨおよび保存温度を含むが、これらに限定されない複数の不適合な添加物および条件の結果である。それ故に、両剤ともに溶解性、安定性および活性を維持する製剤の同定は極めて困難である。

ｉ. 防腐剤
防腐剤は、製剤を含むバイアル、ペンカートリッジ、または他の多数回投与容器の反復利用により製剤に入り得る微生物汚染を防止するために多数回投与インスリン製剤に包含される。防腐剤は、典型的に行政規則を満たすために十分な濃度で存在しなければならない。例えば、行政規制上の要件は、製剤の抗菌有効性が意図する市場の防腐剤有効性試験(ＰＥＴ)基準を満たすことを要求する。米国薬局方(ＵＳＰ)および欧州薬局方(ＥＰ)のＰＥＴ要求は相当異なり、多数回投与製剤の開発にさらなる制約を加える。

市販のインスリン製剤は、典型的にフェノール、メタ−クレゾール(ｍ−クレゾール)および／またはメチルパラベンを含む。これらの化合物は有効抗菌剤として作用するだけでなく、インスリン分子の六量体形態の安定化にも作用し得る。しかしながら、インスリン製剤で使用する防腐剤の濃度および種類は重要である。例えば、フェノール化合物は最適濃度で六量体インスリン分子を安定化できるが、防腐剤の濃度が上がるに連れて、インスリンの溶解性は低下する。それ故に、インスリン製剤中の防腐剤の濃度は、安定性および溶解性の両者ならびに必須の抗菌活性を提供するために重要である。

必須成分である防腐剤は、典型的に水溶液中でタンパク質凝集を誘発するために、タンパク質類の安定な、多数回投与製剤の開発において大きな問題を提起する。例えば、フェノール、ｍ−クレゾール、およびベンジルアルコールのような防腐剤はヒト成長ホルモン(Maa and Hsu (1996) Int. J. Pharm.140:155-168)、組み換えインターロイキン−１受容体(Remmele (1998) Pharm. Res.15:200-208)、ヒトインシュリン様増殖因子Ｉ(Fransson (1997) Pharm. Res. 14:606-612)、ｒｈＩＦＮ−γ(Lam (1997) Pharm. Res. 14:725-729)およびチトクロムｃ(Singh et al. (2011) J. Pharm Sci., 100:1679-89)の凝集を誘発することが示されている。溶液中のタンパク質類に対して防腐剤が有する脱安定化効果は、多数回投与製剤の開発の制限因子であり、今日まで、ほとんどのタンパク質治療剤が単回使用のみで製剤されている。

ほとんどの他のタンパク質治療剤と同様、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ、例えばｒＨｕＰＨ２０は、おそらく、タンパク質変性および続く凝集体形成により、防腐剤存在下で急速に失活する。例えば、本明細書の実施例に示すとおり、防腐剤はＰＨ２０酵素活性を、特に高温で低下させる。動的光散乱法(ＤＬＳ)、示差走査熱量測定(ＤＳＣ)および他の物理化学的特徴付け方法によりここに示す結果は、フェノール防腐剤、例えばｍ−クレゾールを製剤に添加したとき、ヒアルロナン分解酵素の例であるｒＨｕＰＨ２０の融点が顕著に減少するものである。例えば、ｒＨｕＰＨ２０の変性温度は４４℃から２４℃に低下する。ＰＨ２０変性温度が低いほど、特に高温でのＰＨ２０凝集が増加し、酵素活性が低下する。

上記のとおり、これらのフェノール化合物、例えばフェノール、ｍ−クレゾール、およびパラベン類は、まさにインスリン製剤で使用されている防腐剤である。脱安定化効果は、フェノール防腐剤の疎水性性質によるものである可能性がある。フェノール化合物の疎水性は、タンパク質への非特異的結合を介するｒＨｕＰＨ２０との相互作用をもたらし得て、最終的にｒＨｕＰＨ２０の構造的完全性を脅かす。これは、防腐剤存在下のｒＨｕＰＨ２０酵素活性の顕著な消失となる。

本明細書の実施例において証明されているとおり、フェノール防腐剤(例えばフェノール、ｍ−クレゾールおよびメチルパラベン)のレベルが上昇するに連れて、および／または温度が上昇するに連れて、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する悪影響も増大する。例えば、ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性は、全体的防腐剤レベルが相対的に高い(＞０.２％)とき、３５℃のインキュベーションで１週間後に顕著に低下した。室温および低防腐剤濃度で、酵素はその活性を少なくとも１ヶ月間比較的よく維持した。さらに、フェノール化合物の種類もｒＨｕＰＨ２０活性に影響を与え、ｍ−クレゾールがｒＨｕＰＨ２０活性に最も有害であり、続いてフェノール、そしてメチルパラベンである。しかしながら、メチルパラベンは、フェノール化合物ではｒＨｕＰＨ２０活性に最も悪影響がないが、同時に抗微生物剤としても最も有効性が低く、故に最適な防腐剤ではない。他の防腐剤、例えばチメロサールおよびクロルヘキシジン塩類はｒＨｕＰＨ２０とより適合性であるように見えるが、広く認められていない。それ故に、これらの非伝統的防腐剤を含む製剤は、さらに規制上の障害がある。

ヒアルロナン分解酵素の例であるｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する防腐剤の悪影響は高温で大きく増大する。実施例に示すとおり、フェノール防腐剤は酵素の融点(Ｔ_ｍ)に対する負の影響を有する。例えば、ｒＨｕＰＨ２０のＴ_ｍは、防腐剤非存在下の４０℃以上から、例えば、０.２５％ｍ−クレゾール存在下で約２６℃まで低下する。それ故に、ｒＨｕＰＨ２０のＴ_ｍは、溶液中のｒＨｕＰＨ２０に防腐剤を添加したときに顕著に低下する。その結果、高温で、可溶性ヒアルロニダーゼは変性(unfold)する。実施例に示すとおり、この変性および続く凝集が高温で防腐剤存在下のｒＨｕＰＨ２０分子サイズの増加に反映される。

それ故に、防腐剤は抗菌活性のために必要であり、六量体インスリンに対する安定化効果のために有用であるが、ヒアルロナン分解酵素群、例えばｒＨｕＰＨ２０の安定性および活性およびインスリンの溶解性に対する有害な影響を有し得る。

ii. ＮａＣｌおよびｐＨ
インスリンおよびヒアルロナン分解酵素群(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤の開発における他の困難さは、インスリンの溶解性のための最適ｐＨおよびＮａＣｌ濃度範囲がｒＨｕＰＨ２０のための最適ｐＨおよびＮａＣｌ濃度範囲と異なることである。例えば、インスリンおよびインスリン類似体の溶解性は高ｐＨ(例えば＞７.２)および低ＮａＣｌ濃度(例えば＜１４０mM)で高まる傾向にあるが、この条件はヒアルロナン分解酵素の例であるｒＨｕＰＨ２０の安定性に、特に高温および長期保存で典型的に有害な影響を有する。この差異は、インスリンの溶解性およびｒＨｕＰＨ２０安定性を低下させる傾向にある防腐剤の存在下でさらに悪くなる。

レギュラーインスリンおよび速効型インスリン類似体の見かけの溶解度は様々であり、最低の溶解度であるレギュラーインスリン、インスリンリスプロ、次いで、インスリンアスパルト、そして最後に最も溶解性であるインスリングルリジンまで溶解度は増加する。溶解度は製剤中に含まれるＮａＣｌに対する耐容性と直接関係していて、例えば、レギュラーインスリンおよびインスリンリスプロを含む市販製剤にはＮａＣｌが存在せず、インスリンアスパルトの市販製剤には少量のＮａＣｌ(１０mM)が存在し、インスリングルリジンの市販製剤には大量のＮａＣｌ(８５mM)が存在する。

インスリン製剤のＮａＣｌ濃度の上昇は、特に低温でインスリンの結晶化／凝集をもたらし得る。溶解性はまたＮａＣｌにより大きく影響を受ける。実施例で証明されているとおり、冷蔵インスリン溶液中のＮａＣｌ濃度が５０mMから１４０mMに上がれば、レギュラーインスリン、インスリンアスパルトおよびインスリンリスプロの溶解性は顕著に低下する。実施例で証明されているとおり、しかしながら、例えばヒアルロナン分解酵素であるｒＨｕＰＨ２０安定性については逆である。高温(例えば２５℃および３０℃)での溶液中のｒＨｕＰＨ２０の安定性は、ＮａＣｌ濃度が１４０mMから５０mMに低下すると、時間と共に著しく低下する。

インスリンの溶解性はまたｐＨにより大きく影響を受ける。インスリンの溶解性に対する高濃度のＮａＣｌの影響と同様、ｐＨを７.６から６.６に下げると、インスリンの溶解性に対する負の影響が観察された。それ故に、低ｐＨおよび高ＮａＣｌで、インスリンの溶解性は大きく減少する。逆に、インスリン溶解性は低ＮａＣｌおよび高ｐＨで最高となる。インスリンとＰＨ２０におけるＮａＣｌ濃度の要求が逆であるのと同様、ｐＨ要求も逆である。溶液中のｒＨｕＰＨ２０の安定性は高温(例えば２５℃および３０℃)でｐＨを７.０から７.６に上げると、時間と共に著しく減少する。冷蔵温度で、ｒＨｕＰＨ２０はｐＨおよびＮａＣｌ濃度と無関係に比較的安定である。

それ故に、インスリンの溶解性およびヒアルロナン分解酵素(例えばｒＨｕＰＨ２０)安定性についての最適ＮａＣｌ濃度およびｐＨは明らかに合致しない。インスリンの溶解性は高ｐＨおよび低ＮａＣｌ濃度で最高である。しかしながら、これらの条件は、高ｐＨおよび低ＮａＣｌ濃度で安定性を失うヒアルロナン分解酵素の例であるｒＨｕＰＨ２０に対して有害である。ｒＨｕＰＨ２０の安定性はＮａＣｌ濃度を上げ、ｐＨを低下させれば高めることができる。しかしながら、このような条件は低ｐＨおよび高ＮａＣｌ濃度で沈殿するインスリンおよびインスリン類似体の溶解性に負の影響を有する。それ故に、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素(例えばｒＨｕＰＨ２０または他のヒアルロナン分解酵素)の安定な配合剤の開発に際しての主な困難さの一つは、インスリンが溶解性および活性のままであり、ヒアルロナン分解酵素(例えばｒＨｕＰＨ２０)が安定かつ活性のままであるＮａＣｌ濃度およびｐＨの同定である。これは本発明により達成された。

ｂ. 相溶性配合剤
インスリンおよびヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０ヒアルロニダーゼの安定性に対する対立要求は、配合剤における適合性を最適化するために、数種のパラメータのバランスを取らなければならないことを意味する。ここで提供される安定な配合剤は、許容されるレベルのヒアルロナン分解酵素活性およびインスリンの溶解性および活性を維持するための防腐剤、塩(例えばＮａＣｌ)、ｐＨ、安定化剤(複数も可)、および／または緩衝剤を必要なバランスで含む。上記のとおり、このバランスを同定する困難さは数倍であった。最初の例として、多数回投与製剤における抗細菌剤として必須の防腐剤、例えばフェノール防腐剤は、ヒアルロナン分解酵素群、例えばｒＨｕＰＨ２０に対する顕著な脱安定化効果を有し、急速な失活をもたらした。第二に、インスリンの溶解性および安定性にとっての最適ＮａＣｌ濃度およびｐＨはヒアルロナン分解酵素群の安定性にとってのものと極めて異なる。インスリンの溶解性は高ｐＨおよび低ＮａＣｌ濃度で最高である。しかしながら、これらの条件は、高ｐＨおよび低塩濃度で安定性を失うヒアルロナン分解酵素の例であるｒＨｕＰＨ２０には有害である。ｒＨｕＰＨ２０のこの不安定性は、さらに防腐剤の存在により悪化する。ｒＨｕＰＨ２０の安定性はＮａＣｌ濃度を上げ、ｐＨを下げれば上昇し得る。しかしながら、このような条件は低ｐＨおよび高塩濃度で沈殿するインスリンおよびインスリン類似体の溶解性に悪影響を有する。

それ故に、ヒアルロナン分解酵素および速効性のインスリンの両者が溶解性で、安定なおよび活性のままである条件を同定することは極めて困難である。ここに提供する配合剤は、それにも係わらず、このような条件を提供する。最適塩(例えばＮａＣｌ)、ｐＨおよび防腐剤の組み合わせを同定しただけでなく、互いに、および、ある場合に、記載する塩、ｐＨおよび防腐剤と組み合わせたとき、さらにヒアルロナン分解酵素およびインスリンを安定化させ、かつインスリンの溶解性を維持する付加的安定化剤および緩衝剤も同定した。例えば、本発明により、Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、ある場合、そしてあるインスリン類似体では、ＮａＣｌが不要であるか低濃度であるようにＮａＣｌの代替として使用でき、酵素活性およびインスリンの溶解性を維持しながら製剤中で使用できる安定化剤であることを発見した。

次の章は、製剤または配合剤に包含すべきヒアルロナン分解酵素群およびインスリン類、安定な製剤および配合剤、製剤および配合剤の安定性および活性を評価する方法、および種々の疾患および状態における製剤または配合剤の使用方法を記載する。

Ｃ. ヒアルロナン分解酵素群
ここに提供されるのは、ヒアルロナン分解酵素の安定な製剤である。またここに提供されるのは、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素を含む安定な配合剤である。例えば、本明細書の記載および実施例は、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼの安定な配合剤が、個々に安定性および活性に関する対立要求を有するにもかかわらず製造できることを示す。本明細書ではこれはＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)で例示しているが、他のヒアルロナン分解酵素群、例えば可溶性ヒアルロニダーゼ群または他のＰＨ２０ポリペプチド類に一般化できる。

特に、ここに提供されるのは、ＧＰＩアンカーモチーフの全てまたは一部を欠く切断型ヒアルロニダーゼ(例えばＣ末端切断型)のようなヒアルロニダーゼ群であるヒアルロナン分解酵素を含む製剤または配合剤である。このようなヒアルロニダーゼポリペプチド類は、組み換えにより発現され、発現により細胞から培地に分泌され得る。培地への分泌により、切断型であるとき、細胞膜と通常結合性であるヒアルロニダーゼ群は、可溶性タンパク質産物として存在できる。こ本明細書の記載および教示に基づくここに記載するまたは当分野で知られたヒアルロナン分解酵素群の製造および／または発現、および安定な製剤または配合剤の製造は当業者の技術の範囲内である。

ヒアルロナン分解酵素群は、交互のβ−１→４およびβ−１→３グリコシド結合を介して互いに結合している二糖類単位であるＤ−グルクロン酸(ＧｌｃＡ)およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)の反復からなるヒアルロナンポリマー類を開裂することにより、ヒアルロナンを分解するように働く。ヒアルロナン鎖は約２５,０００二糖反復以上の長さに達し、ヒアルロナンのポリマー類のサイズはインビボで約５,０００〜２０,０００,０００Daの範囲であり得る。ヒアルロン酸またはヒアルロナートとも呼ばれるヒアルロナンは、結合組織、上皮組織、および神経組織に広く分布する非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは、細胞外基質の必須成分であり、間質性障壁の主構成要素である。ヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロナン分解酵素群はヒアルロナンの粘度を下げ、それにより組織透過性を高め、非経腸的に投与された流体の吸収速度を上げる。そのようなものとして、ヒアルロナン分解酵素群、例えばヒアルロニダーゼ群は、例えば、分散および送達を亢進するために他の薬物、薬剤およびタンパク質類と組み合わせて展着または分散剤として使用されている。

従って、ヒアルロナン分解酵素群は、ヒアルロナン二糖鎖またはポリマーの開裂を触媒する能力を有するあらゆる酵素を含む。ある例において、分解酵素はヒアルロナン鎖またはポリマーにおけるβ−１→４グリコシド結合の開裂をする。他の例において、分解酵素はヒアルロナン鎖またはポリマーにおけるβ−１→３グリコシド結合の開裂を触媒する。ここに提供される配合剤中のヒアルロナン分解酵素群の例は、細胞発現系から発現されたとき培地に分泌されるヒアルロニダーゼ群であり、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを含まない天然のヒアルロニダーゼ群またはＧＰＩアンカーの１個以上のアミノ酸を欠く切断型ヒアルロニダーゼ群、または発現されたとき細胞膜と他の点で結合性ではないヒアルロニダーゼ群を含む。このようなヒアルロニダーゼ群は組み換えまたは合成により製造できる。ヒアルロナン分解酵素群の他の例は、ヒアルロナンを開裂する能力を有する特定のコンドロイチナーゼ群およびリアーゼ群を含むが、これらに限定されない。

本発明の配合剤中に提供されるヒアルロナン分解酵素群はまた、ここに記載するヒアルロナン分解酵素の対立形質または種変異体または他の変異体を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素群は、その一次配列に１種以上の変異、例えばアミノ酸置換、付加および／または欠失を含み得る。ヒアルロナン分解酵素の変異体は、一般的に変異を含まないヒアルロナン分解酵素と比較して、少なくともまたは約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す。酵素がヒアルロニダーゼ活性を変異を含まないヒアルロナン分解酵素の活性と比較して、例えば少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の活性を維持する限り、あらゆる変異が本発明の目的でヒアルロナン分解酵素に導入され得る(当分野で知られたおよびここに記載するインビトロおよび／またはインビボアッセイで測定)。

ヒアルロニダーゼ群を含む種々の形態のヒアルロナン分解酵素群が製造され、ヒトを含む対象における治療的使用が承認されている。例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ製剤はVitrase(登録商標)(ISTA Pharmaceuticals)、精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ、およびAmphadase(登録商標)(Amphastar Pharmaceuticals)、ウシ精巣ヒアルロニダーゼを含む。Hylenex(登録商標)(Baxter)は、切断型ヒトＰＨ２０ポリペプチド(ｒＨｕＰＨ２０で示される)をコードする核酸を含む遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞により産生されたヒト組み換えヒアルロニダーゼである。あらゆるヒアルロナン分解酵素、例えばあらゆるヒアルロニダーゼをここで提供される安定な配合剤に包含できることは理解されるべきである(例えば、本明細書に引用によりその全体を包含させる米国特許７,７６７,４２９、および米国公開番号２００４０２６８４２５および２０１００１４３４５７参照)。

典型的に、本明細書における製剤および配合剤での使用のために、ヒトヒアルロナン分解酵素、例えばヒトＰＨ２０および特にここに記載したＣ末端切断型ヒトＰＨ２０が使用される。他の動物由来のヒアルロナン分解酵素群、例えばＰＨ２０を使用できるが、このような製剤は、動物タンパク質であるために免疫原性である可能性がある。例えば、患者の相当な割合で、食物摂取に二次的な事前感作が示され、そして、これらが動物タンパク質類であるために、全患者にその後の感作のリスクがある。それ故に、非ヒト製剤は慢性使用には適していない可能性がある。非ヒト製剤が望ましいならば、免疫原性を低下させるように製造できる。このような修飾は当業者の技術の範囲であり、例えば、分子上の１子以上の抗原性エピトープの除去および／または置換を含み得る。

ここに提供する製剤および配合剤に使用されるヒアルロニダーゼ群(例えば、ＰＨ２０)を含むヒアルロナン分解酵素群は、組み換えにより製造できまたは、例えば、精巣抽出物のような天然源から精製または部分精製できる。組み換えヒアルロナン分解酵素群を含む組み換えタンパク質類の製造方法は、本明細書のあらゆる場所に提供され、そして当分野で周知である。

１. ヒアルロニダーゼ群
ヒアルロニダーゼ群はヒアルロナン分解酵素群の大ファミリーのメンバーである。ヒアルロニダーゼ群には哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群、細菌ヒアルロニダーゼ群およびヒル類、他の寄生虫および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ群の３種がある。このような酵素群をここに提供する配合剤に使用できる。

ａ. 哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群
哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群(EC 3.2.1.35)は、ヒアルロナンのβ−１→４グリコシド結合を四糖類および六糖類のような種々のオリゴ糖長に加水分解するｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類である。これらの酵素群は加水分解性およびトランスグリコシダーゼ活性の両者を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸(ＣＳ)、一般的にＣ４−ＳおよびＣ６−Ｓを分解できる。このタイプのヒアルロニダーゼ群は、ウシ(ウシ属)(配列番号１０、１１および６４およびＢＨ５５(米国特許５,７４７,０２７および５,８２７,７２１))、ヒツジ(Ovis aries)(配列番号２６、２７、６３および６５)、スズメバチ(配列番号１２および１３)、ミツバチ(配列番号１４)、北米産スズメバチ(配列番号１５)、アシナガバチ(配列番号１６)、マウス(配列番号１７〜１９、３２)、ブタ(配列番号２０〜２１)、ラット(配列番号２２〜２４、３１)、ウサギ(配列番号２５)、オランウータン(配列番号２８)、カニクイザル(配列番号２９)、モルモット(配列番号３０)、チンパンジー(配列番号１８５)、アカゲザル(配列番号１８６)およびヒトヒアルロニダーゼ群からのヒアルロニダーゼ群を含むが、これらに限定されない。

哺乳動物ヒアルロニダーゼ群は、さらに、主に精巣抽出物で見られる中性活性のもの、および主に肝臓のような臓器で見られる酸活性のものにさらに細分できる。中性活性ヒアルロニダーゼ群は、例えば、ヒツジ(配列番号２７)、ウシ(配列番号１１)およびヒト(配列番号１)のような種由来のＰＨ２０を含むが、これらに限定されないＰＨ２０を含む。ヒトＰＨ２０(ＳＰＡＭ１または精子表面タンパク質ＰＨ２０としても既知)は、一般的にグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを介して原形質膜に結合している。これは精子−卵付着に天然で関与し、ヒアルロン酸を消化することにより卵丘細胞の層への精子浸透を助ける。本発明の配合剤で使用されるヒアルロニダーゼ群の例は中性活性ヒアルロニダーゼ群である。

ヒトＰＨ２０(ＳＰＡＭ１とも呼ぶ)以外に、５種のヒアルロニダーゼ様遺伝子、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４およびＨＹＡＬＰ１がヒトゲノムで同定されている。ＨＹＡＬＰ１は偽遺伝子であり、ＨＹＡＬ３(配列番号３８)はあらゆる既知の基質に対して酵素活性を示さない。ＨＹＡＬ４(配列番号３９に示す前駆体ポリペプチド)はコンドロイチナーゼであり、ヒアルロナンに対してわずかに活性を示す。ＨＹＡＬ１(配列番号３６に示す前駆体ポリペプチド)はプロトタイプ酸活性酵素であり、ＰＨ２０(配列番号１に示す前駆体ポリペプチド)はプロトタイプ中性活性酵素である。酸活性ヒアルロニダーゼ群、例えばＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２(配列番号３７に示す前駆体ポリペプチド)は、一般的に中性ｐＨ(すなわちｐＨ７)で触媒活性を欠く。例えば、ＨＹＡＬ１は、インビトロでｐＨ４.５を超えるとほとんど触媒活性を有しない(Frost et al. (1997) Anal. Biochem. 251:263-269)。ＨＹＡＬ２は、インビトロで極めて低比活性の酸活性酵素である。ヒアルロニダーゼ様酵素群はまた一般的にヒトＨＹＡＬ２およびヒトＰＨ２０のようなグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを介して原形質膜に結合するもの(Danilkovitch-Miagkova, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5)、およびヒトＨＹＡＬ１のように一般的に溶解性であるもの(Frost et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5)により特徴付けもできる。

ＰＨ２０
ＰＨ２０は、他の哺乳動物ヒアルロニダーゼ群と同様、ヒアルロン酸のβ１→４グリコシド結合を四糖類および六糖類のような種々のオリゴ糖長に加水分解するｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。これらは加水分解性およびトランスグリコシダーゼ活性の両者を有し、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸、例えばＣ４−ＳおよびＣ６−Ｓを分解できる。ＰＨ２０は精子−卵付着に天然で関与し、ヒアルロン酸を消化することにより卵丘細胞の層への精子浸透を助ける。ＰＨ２０は精子表面およびリソソーム由来アクロソームに見られ、アクロソームでそれは内アクロソーム膜に結合する。原形質膜ＰＨ２０は、中性ｐＨでのみヒアルロニダーゼ活性を有するのに対し、内アクロソーム膜ＰＨ２０は、中性および酸ｐＨのいずれでも活性を有する。ヒアルロニダーゼである以外に、ＰＨ２０はまたＨＡ誘発細胞シグナリングの受容体、および卵母細胞を囲む透明帯の受容体であるように見える。

ＰＨ２０タンパク質類の例は、ヒト(配列番号１に示す前駆体ポリペプチド、配列番号２に示す成熟ポリペプチド)、ウシ(配列番号１１および６４)、ウサギ(配列番号２５)、ヒツジＰＨ２０(配列番号２７、６３および６５)、カニクイザル(配列番号２９)、モルモット(配列番号３０)、ラット(配列番号３１)、マウス(配列番号３２)、チンパンジー(配列番号１８５)およびアカゲザル(配列番号１８６)ＰＨ２０ポリペプチド類を含むが、これらに限定されない。

ウシＰＨ２０は５５３アミノ酸前駆体ポリペプチド(配列番号１１)である。ウシＰＨ２０とヒトＰＨ２０のアラインメントはわずかな相同性しか示さず、ウシポリペプチドにおけるＧＰＩアンカーの不存在により、アミノ酸４７０から各カルボキシ末端まで複数ギャップが存在する(例えば、Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440参照)。実際、明らかなＧＰＩアンカーはヒト以外の多くの他のＰＨ２０種で予測されない。それ故に、ヒツジおよびウシから産生されたＰＨ２０ポリペプチド類は、本来可溶性形態として存在する。ウシＰＨ２０は原形質膜への極めて緩い結合で存在するが、ホスホリパーゼ感受性アンカーを介して固定されていない(Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36)。ウシヒアルロニダーゼのこの独特な特徴は臨床使用のための抽出物としての可溶性ウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素の使用を可能にする(Wydase(登録商標)、Hyalase(登録商標))。

ヒトＰＨ２０ｍＲＮＡ転写物は通常翻訳されて、Ｎ末端に３５アミノ酸シグナル配列(アミノ酸残基１〜３５位)およびＣ末端に１９アミノ酸グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカー付着シグナル配列(アミノ酸残基４９１〜５０９位)を含む５０９アミノ酸前駆体ポリペプチド(配列番号１)を生じる。成熟ＰＨ２０は、それ故に、配列番号２に示す４７４アミノ酸ポリペプチドである。ＥＲの前駆体ポリペプチドへの輸送およびシグナルペプチドの除去に続き、Ｃ末端ＧＰＩ付着シグナルペプチドは開裂され、ＧＰＩアンカーの配列番号１に示す前駆体ポリペプチドの４９０位に対応するアミノ酸位置に新たに形成されたＣ末端アミノ酸との共有結合が促進される。それ故に、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する４７４アミノ酸ＧＰＩアンカー型成熟ポリペプチドが産生される。

ヒトＰＨ２０は、ＧＰＩアンカーを介して原形質膜に存在するとき中性活性ヒアルロニダーゼであるが、内アクロソーム膜上に発現されたとき中性および酸性ｐＨのいずれでも活性を示す。ＰＨ２０は、ポリペプチドのペプチド１およびペプチド３領域の２カ所の領域に二つの触媒部位を有するように見える(Cherr et al., (2001)Matrix Biology 20:515-525)。配列番号２に示す成熟ポリペプチドのアミノ酸１０７〜１３７位に対応するＰＨ２０のペプチド１領域および配列番号１に示す前駆体ポリペプチドの１４２〜１７２位が、中性ｐＨでの酵素活性に必要である。この領域内の１１１位および１１３位のアミノ酸(配列番号２に示す成熟ＰＨ２０ポリペプチドに対応)が、アミノ酸置換による変異原性が、それぞれ野生型ＰＨ２０と比較してＰＨ２０ポリペプチド類の３％ヒアルロニダーゼ活性および検出不能なヒアルロニダーゼ活性を生じるために、活性に必須であるように見える(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。

配列番号２に示す成熟ポリペプチドのアミノ酸２４２〜２６２位に対応するペプチド３領域、および配列番号１に示す前駆体ポリペプチドの２７７〜２９７位は、酸性ｐＨでの酵素活性に重要であるように見える。この領域内で、成熟ＰＨ２０ポリペプチドの２４９位および２５２位のアミノ酸は活性に必須であり、このいずれかの変異原性は、本質的に活性を欠くポリペプチドとなる(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。

触媒部位に加えて、ＰＨ２０またはヒアルロナン結合部位を含む。実験的証拠は、この部位が配列番号１に示す前駆体ポリペプチドのアミノ酸２０５〜２３５位および配列番号２に示す成熟ポリペプチドの１７０〜２００位に対応するペプチド２領域に位置することを示す。この領域はヒアルロニダーゼ群で高度に保存され、ヘパリン結合モチーフと類似する。アルギニン残基１７６位(配列番号２に示す成熟ＰＨ２０ポリペプチドに対応)のグリシンへの変異は、野生型ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の約１％しか活性がないポリペプチドとなる(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。

ヒトＰＨ２０において配列番号１に例示するポリペプチドのＮ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３、Ｎ４９０に、７カ所の潜在的Ｎ架橋グリコシル化部位がある。配列番号１のアミノ酸３６〜４６４が活性が最小のヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼドメインを含むように見えるため、Ｎ架橋グリコシル化部位Ｎ−４９０は適切なヒアルロニダーゼ活性に必須ではない。ヒトＰＨ２０において６個のジスルフィド結合がある。配列番号１に例示するポリペプチドのシステイン残基Ｃ６０とＣ３５１およびＣ２２４とＣ２３８の間の２個のジスルフィド結合(それぞれ配列番号２に示す成熟ポリペプチドの残基Ｃ２５とＣ３１６、およびＣ１８９とＣ２０３に対応)がある。さらに４カ所のジスルフィド結合が配列番号１に例示するポリペプチドのシステイン残基Ｃ３７６とＣ３８７；Ｃ３８１とＣ４３５；Ｃ４３７とＣ４４３；Ｃ４５８とＣ４６４(それぞれ配列番号２に示す成熟ポリペプチドの残基Ｃ３４１とＣ３５２；Ｃ３４６とＣ４００；Ｃ４０２とＣ４０８；およびＣ４２３とＣ４２９に対応)に形成される。

ｂ. 細菌ヒアルロニダーゼ群
細菌ヒアルロニダーゼ群(EC 4.2.2.1またはEC 4.2.99.1)はヒアルロナン、および種々の程度で、コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸を分解する。細菌から単離されたヒアルロナンリアーゼ群は、作用機序がヒアルロニダーゼ群と異なる(他の源由来、例えば、ヒアルロノグルコサミニダーゼ群、EC 3.2.1.35)。ヒアルロナンのＮ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸残基の間のβ１→４−グリコシド結合の加水分解ではなく、脱離反応を触媒するｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ類であり、３−(４−デオキシ−β−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル)−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンテトラ−および六糖類、および二糖最終産物を生じる。反応は、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸残基を伴うオリゴ糖類の形成を生じる。

ここに提供する配合剤のための細菌由来ヒアルロニダーゼ群は、例として、アルスロバクター属、デロビブリオ属、クロストリジウム属、ミクロコッカス属、レンサ球菌属、ペプトコッカス属、プロピオニバクテリウム属、バクテロイデス属、およびストレプトマイセス属の株を含む微生物におけるヒアルロナン分解酵素群を含むが、これらに限定されない。このような酵素群の具体例は、アルスロバクター属(株FB24)(配列番号６７)、ブデロビブリオ・バクテリオヴォルス(配列番号６８)、プロピオニバクテリウム・アクネス(配列番号６９)、ストレプトコッカス・アガラクチア((配列番号７０)；18RS21(配列番号７１)；血清型Ｉａ(配列番号７２)；血清型III(配列番号７３))、黄色ブドウ球菌(株ＣＯＬ)(配列番号７４)；株MRSA252(配列番号７５および７６)；株MSSA476(配列番号７７)；株NCTC 8325(配列番号７８)；株ウシRF122(配列番号７９および８０)；株USA300(配列番号８１)、肺炎レンサ球菌((配列番号８２)；株ATCC BAA-255/R6(配列番号８３)；血清型２、株D39/NCTC 7466(配列番号８４)、Ａ群溶血レンサ球菌(血清型Ｍ１)(配列番号８５)；血清型Ｍ２、株MGAS10270(配列番号８６)；血清型Ｍ４、株MGAS10750(配列番号８７)；血清型Ｍ６(配列番号８８)；血清型Ｍ１２、株MGAS2096(配列番号８９および９０)；血清型Ｍ１２、株MGAS9429(配列番号９１)；血清型Ｍ２８(配列番号９２)；豚レンサ球菌(配列番号９３〜９５)；ビブリオ・フィッシェリ(株ATCC 700601/ES114(配列番号９６))、およびヒアルロン酸に特異的であり、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を開裂しないストレプトマイセス・ヒアルロノリチクスヒアルロニダーゼ酵素を含むが、これらに限定されない(Ohya, T. and Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)。

ｃ. ヒル類、他の寄生虫および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ群
ヒル類、他の寄生虫、および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ群(EC 3.2.1.36)は、四糖類および六糖類最終産物を生じるｅｎｄｏ−β−グルクロニダーゼ群である。これらの酵素群は、ヒアルロナートのβ−Ｄ−グルクロネートとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の間の１→３−架橋の加水分解を触媒する。ヒル類由来のヒアルロニダーゼ群は、例えば、Hirudinidae(例えば、ドイツ蛭)、イシビル科(例えば、Nephelopsis obscuraおよびErpobdella punctata)、Glossiphoniidae(例えば、Desserobdella picta、Helobdella stagnalis、Glossiphonia complanata、Placobdella ornateおよびテロミゾン属)およびヘモピ科(Haemopis marmorata)を含むが、これらに限定されない(Hovingh et al. (1999) Comp Biochem Physiol B BiochemMol Biol. 124(3):319-26)ヒアルロニダーゼである。ヒルヒアルロニダーゼと同じ作用機序を有する細菌由来のヒアルロニダーゼの例は、シアノバクテリア、シネココックス属(株RCC307、配列番号９７)由来のものである。

２. 他のヒアルロナン分解酵素群
ヒアルロニダーゼファミリーに加えて、他のヒアルロナン分解酵素群が、ここに提供する安定な製剤または配合剤において、ここに提供されるインスリンと共に使用できる。例えば、ヒアルロナンを開裂する能力を有する特定のコンドロイチナーゼ群およびリアーゼ群を含む酵素群を用いることができる。ヒアルロナンを分解できるコンドロイチナーゼ群は、例えば、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ(コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られる)、コンドロイチンＡＣリアーゼ(コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られる)およびコンドロイチンＣリアーゼを含むが、これらに限定されない。このような酵素群のここに提供する組成物、組み合わせおよび方法において使用するための産生および精製方法は知られている(例えば、米国特許６,０５４,５６９；Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535;Yang et al. (1985) J. Biol. Chem. 160(30):1849-1857)。

コンドロイチンＡＢＣリアーゼは、２種の酵素群、コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ(EC 4.2.2.20)およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ(EC 4.2.2.21)(Hamai et al. (1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30)を含み、コンドロイチン−硫酸−およびデルマタン−硫酸タイプの種々のグリコサミノグリカン類を分解する。コンドロイチン硫酸、コンドロイチン−硫酸プロテオグリカンおよびデルマタン硫酸はコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼの好ましい基質であるが、本酵素はまたヒアルロナン上で低速で作用する。コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼはコンドロイチン−硫酸−およびデルマタン−硫酸型の種々のグリコサミノグリカン類を分解し、種々のサイズのΔ４−不飽和オリゴ糖類の混合物を生じ、それは最終的にΔ４−不飽和四糖類および二糖類に分解される。コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼは、類似の基質特異性を有するが、重合体コンドロイチン硫酸およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼにより産生されるそのオリゴ糖フラグメントの両方の非還元末端から二糖残基を事除去する(Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130)。コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ群およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ群は、例えばプロテウス・ブルガリスおよびフラボバクテリウム・ヘパリナム(プロテウス・ブルガリスコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼは配列番号９８に示す)を含むが、これらに限定されない(Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46)。

コンドロイチンＡＣリアーゼ(EC 4.2.2.5)は、コンドロイチン硫酸ＡおよびＣ、コンドロイチンおよびヒアルロン酸に活性であるが、デルマタン硫酸(コンドロイチン硫酸Ｂ)に活性ではない。細菌由来のコンドロイチナーゼＡＣ酵素群は、例えば、それぞれ配列番号９９および１００に示すフラボバクテリウム・ヘパリナムおよびビクチバリス・バンデンシス、およびアルスロバクタ・オウレセンス由来のものを含むが、これらに限定されない(Tkalec et al. (2000) Applied and EnvironmentalMicrobiology 66(1):29-35;Ernst et al. (1995) Critical Reviews in BiochemistryおよびMolecular Biology 30(5):387-444)。

コンドロイチナーゼＣはコンドロイチン硫酸Ｃを分解し、四糖と不飽和６−硫酸化二糖(デルタジ−６Ｓ)を産生する。それはまたヒアルロン酸を開裂し、不飽和非硫酸化二糖(デルタジ−ＯＳ)を産生する。細菌由来のコンドロイチナーゼＣ酵素群は、例えば、レンサ球菌およびフラボバクテリウム由来のものを含むが、これらに限定されない(Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4;Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8;Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)。

３. 切断型ヒアルロナン分解酵素群または他の可溶性形態
ヒアルロナン分解酵素群は、膜結合または膜型形態として存在でき、または細胞から発現されたとき培地に分泌され、それ故、可溶性形態として存在できる。本発明の目的で、ヒアルロナン分解酵素群は、細胞から発現され、分泌されたとき、細胞膜と結合性ではなく、それ故に可溶性形態で存在するあらゆるヒアルロナン分解酵素群を含む。可溶性ヒアルロナン分解酵素群は、非ヒトヒアルロニダーゼ群(例えば動物または細菌ヒアルロニダーゼ群)、例えばウシＰＨ２０またはヒツジＰＨ２０、およびヒトヒアルロニダーゼ群、例えばＨｙａｌ１、または非ヒトまたはヒト膜型ヒアルロニダーゼ群の切断型形態、特にヒトＰＨ２０の切断型形態、その対立形質変異体およびその他の変異体を含む、ヒアルロニダーゼ群を含むが、これらに限定されない。本発明の配合剤におけるヒアルロナン分解酵素群の例は、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーの１個以上のアミノ酸残基を欠き、ヒアルロニダーゼ活性を維持するヒアルロナン分解酵素の切断型形態である。一例において、通常ＧＰＩアンカーを介する膜アンカー型であるヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０を、Ｃ末端のＧＰＩアンカーの全てまたは一部の短縮化および除去により溶解性にできる。

それ故に、数例において、通常ＧＰＩアンカー型(例えば、ヒトＰＨ２０)であるヒアルロナン分解酵素を、Ｃ末端短縮化により溶解性にできる。このような短縮化は、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列の全ての除去であってよく、またはＧＰＩアンカー付着シグナル配列のいくつかのみの除去であってよい。得られるポリペプチドは、しかしながら、溶解性である。可溶性ヒアルロナン分解酵素がＧＰＩアンカー付着シグナル配列の一部を残すとき、ポリペプチドが溶解性であり(すなわち細胞で発現されたとき分泌され)、かつ活性である限り、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上アミノ酸残基を維持する。当業者は、当分野で知られた方法を使用してポリペプチドがＧＰＩアンカー型であるか否かを決定できる。このような方法は、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列およびω部位の存在および位置を予測するための既知アルゴリズムの使用、およびホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ(ＰＩ−ＰＬＣ)またはＤ(ＰＩ−ＰＬＤ)での消化前後の溶解度分析実施を含むが、これらに限定されない。

可溶性ヒアルロニダーゼの例は、ヒアルロニダーゼが溶解性であり、ヒアルロニダーゼ活性を維持する限り、あらゆる種由来のＰＨ２０、例えば配列番号１、２、１１、２５、２７、３０〜３２、６３〜６５および１８５〜１８６に示すいずれか、またはＣ末端ＧＰＩアンカーの全てまたは一部を欠くその切断型形態である。Ｃ末端切断型であり、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列の全てまたは一部を欠く可溶性ヒアルロニダーゼ群は、例えば、ヒトおよびチンパンジーＰＨ２０ポリペプチド類のような霊長類起源ＰＨ２０ポリペプチド類を含むが、これらに限定されない。例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチド類は、配列番号１、２または１８５に示す成熟または前駆体ポリペプチド、またはその活性フラグメントを含む、その対立形質または他の変異体のいずれかのＣ末端短縮化により製造でき、ここで、得られるポリペプチドは溶解性であり、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列由来のアミノ酸残基の全てまたは一部を欠く。また可溶性ヒアルロニダーゼ群に包含されるのは、配列番号１、２、１１、２５、２７、３０〜３２、６３〜６５および１８５〜１８６のいずれかの対立形質変異体または他の変異体、またはその切断型形態である。対立形質変異体および他の変異体は当業者に知られており、配列番号１、２、１１、２５、２７、３０〜３２、６３〜６５および１８５〜１８６、またはその切断型形態のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド類を含む。アミノ酸変異体は保存的および非保存的変異を含む。重要であるか、他の点でヒアルロニダーゼの活性に必要である残基、例えば上記のまたは当業者に知られたいずれかは、一般的に不変であり、変化できないことは理解されよう。これらは、例えば、活性部位残基を含む。それ故に、例えば、ヒトＰＨ２０ポリペプチド、またはその可溶性形態のアミノ酸残基１１１、１１３および１７６(配列番号２に示す成熟ＰＨ２０ポリペプチドの残基に対応)は一般的に不変であり、変えられない。グリコシル化および適切な折りたたみに必要なジスルフィド結合形成に関与する他の残基も不変であり得る。

ａ. Ｃ末端切断型ヒトＰＨ２０
可溶性ヒアルロニダーゼの例はＣ末端切断型ヒトＰＨ２０である。組み換えヒトＰＨ２０のＣ末端切断型形態は製造され、ここに記載する配合剤に使用できる。このような可溶性形態のＰＨ２０製造は米国特許７,７６７,４２９および米国特許出願番号ＵＳ２００４０２６８４２５、ＵＳ２００５０２６０１８６、ＵＳ２００６０１０４９６８およびＵＳ２０１００１４３４５７に記載されている。

例えば、Ｃ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチド類は、少なくともアミノ酸類３６〜４６４(ヒアルロニダーゼ活性に必須の最小部分)または配列番号１の少なくともアミノ酸類３６〜４６４と少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ヒアルロニダーゼ活性を維持するアミノ酸配列を含むポリペプチド類である。これらのポリペプチド類に包含されるのは、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列の全てを完全に欠くヒトＰＨ２０ポリペプチド類である。またこれらのポリペプチド類に包含されるのは、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列の連続アミノ酸残基のいくつかを欠くヒトＰＨ２０ポリペプチド類である(伸長可溶性ＰＨ２０(ｅｓＰＨ２０)と呼ぶ；例えばＵＳ２０１００１４３４５７参照)。Ｃ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチド類は、完全長野生型ポリペプチド、例えば配列番号１または２に示す配列を有する完全長野生型ポリペプチド、または対立形質または種変異体またはその他の変異体と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個以上アミノ酸によりＣ末端切断型である。それ故に、ＥＲにおけるタンパク質のＣ末端と共有結合し、原形質膜の細胞外小葉に固定されているＧＰＩアンカーを有する代わりに、これらのポリペプチド類は細胞から発現されたときに分泌され、溶解性である。

ここに提供されるＣ末端切断型ヒトＰＨ２０ポリペプチド類は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸類３６〜４６４を含み、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位または５００位の後でＣ末端切断型であるか、またはそれに対して少なくとも８５％配列同一性、例えば少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％配列同一性を示し、ヒアルロニダーゼ活性を維持するその変異体である。表３は、例示的なＣ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチド類の非限定的例を示す。Ｃ末端切断型ＰＨ２０タンパク質類の前駆体および成熟ポリペプチド類の例示的なアミノ酸配列が示される下記表３において、前駆体および成熟ポリペプチド類の長さ(アミノ酸長)、および配列識別子(配列番号)を提供する。野生型ＰＨ２０ポリペプチドもまた比較のために表３に包含させる。例えば、Ｃ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチド類は、配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかに示すポリペプチド類、または配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すポリペプチドを含むが、これらに限定されない。

ｂ. ｒＨｕＰＨ２０
配列番号１のＣ末端切断型形態の例は、配列番号１に示す配列のアミノ酸４８２の後で切断型であるそのポリペプチドである。このようなポリペプチドは、アミノ酸類１〜４８２をコードする核酸分子により産生できる(配列番号３に示す)。このような核酸分子の例を配列番号４９に示す。翻訳後処理は３５アミノ酸シグナル配列を除き、４４７アミノ酸可溶性組み換えヒトＰＨ２０(配列番号４)をもたらす。培養培地で産生されるため、ｒＨｕＰＨ２０と命名された生成物が種々の量で配列番号４〜９のいずれか１種以上を含み得る種の混合物を含むように、Ｃ末端に不均一性がある。典型的に、ｒＨｕＰＨ２０は、活性を維持するための正確なＮ−グリコシル化を促進する細胞、例えばＣＨＯ細胞(例えばＤＧ４４ ＣＨＯ細胞)で産生される。

４. ヒアルロナン分解酵素群のグリコシル化
ヒアルロニダーゼ群を含むいくつかのヒアルロナン分解酵素群の、Ｎ−およびＯ架橋グリコシル化を含むグリコシル化は、その触媒活性および安定性に重要である。糖タンパク質を修飾するグリカンのタイプの変更はタンパク質の抗原性、構造的折りたたみ、溶解性、および安定性に大きな影響を与え得るが、ほとんどの酵素群は、最適酵素活性のためにグリコシル化は不要であると考えられている。あるヒアルロニダーゼ群について、Ｎ架橋グリコシル化の除去は、ヒアルロニダーゼ活性をほぼ完全に不活化する。それ故に、このようなヒアルロニダーゼ群にとって、Ｎ架橋グリカン類の存在は活性酵素産生に重要である。

Ｎ架橋オリゴ糖類は大きく数種(オリゴマンノース、複合体、ハイブリッド、硫酸化)に分けられ、その全てが、−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−配列(ここで、ＸａａはＰｒｏではない)に入るＡｓｎ残基のアミド窒素を介して結合した(Ｍａｎ)_３−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−コアを有する。−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−部位でのグリコシル化は、凝固タンパク質Ｃについて報告されている。ある例において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼはＮ−グリコシド架橋およびＯ−グリコシド架橋の両者を含み得る。例えば、ＰＨ２０はＯ架橋オリゴ糖類ならびにＮ架橋オリゴ糖類を含む。配列番号１に例示するヒトＰＨ２０のＮ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３、Ｎ４９０に７カ所の潜在的Ｎ架橋グリコシル化部位がある。アミノ酸残基Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４は、複合体型グリカンで占拠され、アミノ酸残基Ｎ３６８およびＮ３９３は高マンノース型グリカンで占拠されている。アミノ酸残基Ｎ２３５は約８０％高マンノース型グリカンおよび２０％複合体型グリカンで占拠されている。上記のとおり、Ｎ４９０でのＮ架橋グリコシル化はヒアルロニダーゼ活性に必須ではない。

数例において、ここに提供される配合剤において使用するためのヒアルロナン分解酵素群は、グリコシル化部位の１カ所または全てでグリコシル化されている。例えば、ヒトＰＨ２０、またはその可溶性形態について、配列番号１のアミノ酸類Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、およびＮ３９３に対応する２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、または６箇所のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化される。数例において、ヒアルロナン分解酵素群は、１箇所以上の天然グリコシル化部位でグリコシル化される。一般的にＰＨ２０の可溶性形態は、グリコシル化がヒアルロニダーゼ群の触媒活性および安定性に重要であるために、ポリペプチドが活性を維持することを確実にするために、正確なＮ−グリコシル化を促進するタンパク質発現系を使用して産生される。このような細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(例えばＤＧ４４ ＣＨＯ細胞)を含む。

他の例において、ヒアルロナン分解酵素群は、１箇所以上の付加的部位でポリペプチドのグリコシル化を付与するために１箇所以上の非天然グリコシル化部位で修飾される。このような例において、付加的糖分子の付着は、分子の薬物動態学的特性を亢進でき、例えば半減期を改善しおよび／または活性を改善する。

ここに提供される配合剤に含まれる他の例において、ヒアルロナン分解酵素群、例えばＰＨ２０またはヒトＰＨ２０は、一部脱グリコシル化されている(またはＮ−部分的グリコシル化ポリペプチド類)(例えば米国特許公開番号ＵＳ２０１００１４３４５７参照)。グリコシダーゼ群、またはグリコシドヒドロラーゼ群は、２個の小さな糖類を産生するためにグリコシド結合の加水分解を触媒する酵素群である。Ｎ−グリカン類の主なタイプは高マンノースグリカン、ハイブリッドグリカンおよび複合体グリカンを含む。部分的タンパク質脱グリコシル化しか生じない数種のグリコシダーゼ群は以下のものを含む。高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ１；二分岐複合体型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ２；二分岐およびさらに分岐した複合体グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ３；および高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを開裂するＥｎｄｏＨ。例えば、ＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０と命名された組み換えＰＨ２０)の上記グリコシダーゼ群の一つまたは全て(例えばＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３および／またはＥｎｄｏＨ)での処理は、部分的脱グリコシル化をもたらす。これらの部分的脱グリコシル化ＰＨ２０ポリペプチド類は、完全グリコシル化ポリペプチド類と同等なヒアルロニダーゼ酵素活性を示し得る。対照的に、ＰＨ２０を、全てのＮ−グリカンを開裂するグリコシダーゼであるＰＮＧａｓｅＦまたはＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ(ＧＰＴ)阻害剤ツニカマイシンで処理すると、全Ｎ−グリカンの完全脱グリコシル化をもたらし、それ故に、ＰＨ２０を酵素的に不活性とする。それ故に、全てのＮ架橋グリコシル化部位(例えば、配列番号１に例示するヒトＰＨ２０のアミノ酸類Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、およびＮ３９３)をグリコシル化できるが、１種以上のグリコシダーゼ群での処理は、１種以上のグリコシダーゼ群で消化されていないヒアルロニダーゼと比較して、グリコシル化の程度を低下させ得る。

それ故に、部分的脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素群、例えば部分的脱グリコシル化可溶性ヒアルロニダーゼ群を、１種以上のグリコシダーゼ群、一般的に全てのＮ−グリカンを除去せず、タンパク質を部分的脱グリコシル化するグリコシダーゼで消化させることにより製造できる。部分的脱グリコシル化可溶性ＰＨ２０ポリペプチド類を含む部分的脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素群は、完全グリコシル化ポリペプチドのグリコシル化レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。一例において、配列番号１のアミノ酸類Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、およびＮ３９３に対応する１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所または６箇所のＮ−グリコシル化部位は、高マンノースまたは複合体型グリカンをもはや含まないが、少なくとも１個のＮ−アセチルグルコサミン部分を含むように、部分的脱グリコシル化される。数例において、配列番号１のアミノ酸類Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４に対応するＮ−グリコシル化部位の１箇所、２箇所または３箇所が脱グリコシル化され、すなわち、それは糖部分を含まない。他の例において、配列番号１のアミノ酸類Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、およびＮ３９３に対応する３箇所、４箇所、５箇所、または６箇所のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化される。グリコシル化アミノ酸残基はＮ−アセチルグルコサミン部分を最小限含む。典型的に、部分的脱グリコシル化可溶性ＰＨ２０ポリペプチド類を含む部分的脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素群は、完全グリコシル化ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示す。

５. 薬物動態学的特性を改善するためのヒアルロナン分解酵素群の修飾
ヒアルロナン分解酵素群を、その薬物動態学的特性を修飾するために、例えばインビボ半減期を延長するためにおよび／または活性を高めるために修飾できる。ここに提供する安定な製剤または配合剤またはここに提供するあらゆる組成物、組み合わせおよび／または方法において使用するためのヒアルロナン分解酵素群の修飾は、ポリマー、例えばデキストラン、ポリエチレングリコール(ペグ化(ＰＥＧ))またはシアリル部分、または他のこのようなポリマー類、例えば自然なまたは糖ポリマー類を、直接的なまたは、例えば共有結合したまたは他の安定な架橋を介するようなリンカーを介して間接的に結合することを含み得る。

治療剤のペグ化はタンパク質分解に対する抵抗性を高め、血漿半減期を延長し、抗原性および免疫原性を減少させることが知られている。重合体分子、例えばポリエチレングリコール部分(ＰＥＧ)のヒアルロナン分解酵素への共有結合性のまたは他の安定な付着(conjugation)は、故に、得られた酵素−ポリマー組成物に有利な特性を付与し得る。このような特性は生体適合性改善、対象、細胞および／または他の組織内の血中タンパク質(および酵素活性)半減期延長、プロテアーゼ群および加水分解からのタンパク質の有効な遮蔽、体内分布改善、薬物動態学および／または薬力学改善、および水溶性を含む。

ヒアルロナン分解酵素と組み合わせることができるポリマー類の例は、天然および合成ホモポリマー類、例えばポリオール類(すなわちポリ−ＯＨ)、ポリアミン類(すなわちポリ−ＮＨ_２)およびポリカルボキシル酸類(すなわちポリ−ＣＯＯＨ)、およびさらなるヘテロポリマー類、すなわち１種以上の種々のカップリング基、例えばヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマー類を含む。適当な重合体分子の例は、ポリアルキレンオキシド類(ＰＡＯ)、例えばポリプロピレングリコール類(ＰＥＧ)、メトキシポリエチレングリコール類(ｍＰＥＧ)およびポリプロピレングリコール類を含むポリアルキレングリコール類(ＰＡＧ)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル類(Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ)、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール(ＣＤＩ−ＰＥＧ)分枝ポリエチレングリコール類(ＰＥＧｓ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート類、ポリビニルピロリドン、ポリ−Ｄ,Ｌ−アミノ酸類、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、カルボキシメチル−デキストラン類を含むデキストラン類、ヘパリン、相同的アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースカルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースを含むセルロース類、キトサンの加水分解物、デンプン類、例えばヒドロキシエチル−デンプン類およびヒドロキシプロピル−デンプン類、グリコーゲン、アガロース類およびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物およびバイオポリマー類から選択される重合体分子である。

典型的に、ポリマー類は、多糖類、例えばデキストラン、プルランなどと比較して、架橋できる活性基が少ない、ポリアルキレンオキシド類(ＰＡＯ)、例えばポリエチレンオキシド類、例えばＰＥＧ、典型的にｍＰＥＧである。典型的に、ポリマー類は、非毒性重合体分子、例えば相対的に単純な化学反応を使用してヒアルロナン分解酵素(例えば、タンパク質表面上の付着基)と共有結合できる(ｍ)ポリエチレングリコール(ｍＰＥＧ)である。

ヒアルロナン分解酵素への結合のための適当な重合体分子は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびＰＥＧ誘導体、例えばメトキシ−ポリエチレングリコール類(ｍＰＥＧ)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル類(Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ)、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール(Ｃジ−ＰＥＧ)、分枝ＰＥＧｓ、およびポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)を含むが、これらに限定されない(例えばRoberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) “Poly(ethy1ene glycol), Chemistry and Biological Applications” ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews Drug Discovery 2:214 (2003); and Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004参照)。重合体分子は、典型的に約３kDa〜約６０kDaの範囲の分子量を有する。幾つかの態様において、タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０とコンジュゲートする重合体分子は、５kDa、１０kDa、１５kDa、２０kDa、２５kDa、３０kDa、３５kDa、４０kDa、４５kDa、５０kDa、５５kDa、６０kDaまたは６０kDaを超える分子量を有する。

ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体(すなわち“ペグ化”)を共有結合により結合(コンジュゲート)させることによりポリペプチド類を修飾する種々の方法が当分野で知られている(例えば、米国公開番号２００６０１０４９６８および米国２００４０２３５７３４；米国特許番号５,６７２,６６２および米国６,７３７,５０５参照)。ペグ化の方法は、特定化リンカーおよびカップリング化学(例えば、Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002参照)、単一コンジュゲーション部位への複数ＰＥＧ分子の付着(例えば、分枝ＰＥＧの使用を介する；例えば、Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002参照)、部位特異的ペグ化および／またはモノ−ペグ化(例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999参照)、および部位特異的酵素ペグ化(例えば、Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照)を含むが、これらに限定されない(また例えば、Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:140-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088-95; see also, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 and Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S参照)。文献に記載された方法および技術により、一タンパク質分子に結合した１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１０個を超えるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質類が産生される(例えば、米国特許公開番号２００６０１０４９６８参照)。

ペグ化のための多くの反応材が文献に記載されている。このような反応材は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル(ＮＨＳ)活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルアルファ−メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３−ヒドロキシブタノイック酸スクシンイミジルエステル、ホモ二官能的ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能的ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二官能的ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、ｐ−ニトロフェニル−カーボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカーボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブチルアルデヒド、分枝ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ“リンカーレス”マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジルジスルフィド、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ−ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ−ＮＨＳ、フルオレッセインＰＥＧ−ＮＨＳ、およびビオチンＰＥＧ−ＮＨＳを含むが、これらに限定されない(例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207；米国５,６７２,６６２；米国５,９３２,４６２；米国６,４９５,６５９；米国６,７３７,５０５；米国４,００２,５３１；米国４,１７９,３３７；米国５,１２２,６１４；米国５,３２４、８４４；米国５,４４６,０９０；米国５,６１２,４６０；米国５,６４３,５７５；米国５,７６６,５８１；米国５,７９５、５６９；米国５,８０８,０９６；米国５,９００,４６１；米国５,９１９,４５５；米国５,９８５,２６３；米国５,９９０、２３７；米国６,１１３,９０６；米国６,２１４,９６６；米国６,２５８,３５１；米国６,３４０,７４２；米国６,４１３,５０７；米国６,４２０,３３９；米国６,４３７,０２５；米国６,４４８,３６９；米国６,４６１,８０２；米国６,８２８,４０１；米国６,８５８,７３６；米国２００１／００２１７６３；米国２００１／００４４５２６；米国２００１／００４６４８１；米国２００２／００５２４３０；米国２００２／００７２５７３；米国２００２／０１５６０４７；米国２００３／０１１４６４７；米国２００３／０１４３５９６；米国２００３／０１５８３３３；米国２００３／０２２０４４７；米国２００４／００１３６３７；ＵＳ２００４／０２３５７３４；米国２００５／０１１４０３７；米国２００５／０１７１３２８；米国２００５／０２０９４１６；ＥＰ１０６４９５１；ＥＰ０８２２１９９；ＷＯ０１０７６６４０；ＷＯ０００２０１７；ＷＯ０２４９６７３；ＷＯ０５０００３６０；ＷＯ９４２８０２４；およびＷＯ０１８７９２５参照)。

Ｄ. 安定なヒアルロナン分解酵素製剤
ここに提供されるのは、二価カチオンである安定化添加物を含むヒアルロナン分解酵素の安定な製剤である。二価カチオンの例は、リシル−リシン(ジリシン；Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)またはマグネシウム(例えばＭｇＣｌ_２)、またはその塩類、誘導体、類似体または模倣体を含むが、これらに限定されない。具体例において、ヒアルロナン分解酵素の安定な製剤は安定化添加物としてＬｙｓ−Ｌｙｓ、またはその塩類、誘導体、類似体または模倣体を含む。他の例において、安定化剤としてＭｇＣｌ_２、またはその誘導体、類似体または模倣体を含むヒアルロナン分解酵素の安定な製剤である。二価カチオン、例えばＬｙｓ−ＬｙｓまたはＭｇＣｌ_２を含むヒアルロナン分解酵素群は、３７℃以上の温度で少なくとも３日間、および一般的に少なくとも６日間、７日間(１週間)、２週間、３週間または４週間(１ヶ月間)安定である。例えば、このような製剤は、３７℃〜４２℃以上の温度で、例えば少なくともまたは約４０℃で、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間またはそれ以上安定である。

ヒアルロナン分解酵素群の既存の製剤は、安定化剤としてヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を含む。例えば、Hylenex(登録商標)組み換えは１.０mgヒトアルブミンを含む。安定な無ＨＳＡヒアルロナン分解酵素製剤がいくつかの理由で望まれる。第一に、ＨＳＡは血液由来産物であり、故にしばしば純粋ではない。ＨＳＡの分解物および汚染物は酵素活性を妨害し得る。加えて、ＨＳＡ自体がまた、ある条件下で凝集体を形成し得るため、安定性の問題がある。本発明により、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０の安定な無ＨＳＡ製剤が、二価カチオン、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの包含により製造できることが判明した。

また、本明細書のあらゆる場所に記載するとおり、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０のほとんどの既存の製剤は、安定化剤としてＮａＣｌも含む。正確にまたは約１３０mM〜１５０mMのＮａＣｌまたはそれ以上の高濃度でのＮａＣｌの存在が、一般的に酵素の最適活性および安定性に必要である。例えば、市販のＰＨ２０製剤Hylenex(登録商標)は１４５mMのＮａＣｌを含む。本明細書の実施例において証明されているとおり、二価カチオンＬｙｓ−ＬｙｓおよびＭｇＣｌ_２は、ＮａＣｌより改善された安定性効果を例示的ヒアルロナン分解酵素ＰＨ２０に対して示す。ＮａＣｌが３７℃を超える高温または加速温度でのインキュベーションでＰＨ２０の安定化に十分ではないことが本発明により判明していたため、これは有利である(例えば実施例２３および２４参照)。対照的に、二価カチオン、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓを含む製剤中のＰＨ２０活性は、本製剤が４週間、３７℃以上の温度、例えば３７℃〜４２℃以上の温度、例えば少なくともまたは約４０℃でインキュベーションしたとき、少なくとも１ヶ月間、最大７０％またはそれ以上の活性、および一般的に少なくともまたは約８０％、８５％、９０％以上の活性を示すことができるように、高温で安定である。二価カチオン、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓを安定化剤として含む本発明の製剤例において、ヒアルロナン分解酵素活性は、少なくともまたは約３８℃〜４２℃、および特に４０℃の高温で、二価カチオンを含まない(例えば安定化剤としてＮａＣｌを含む)ヒアルロナン分解酵素の活性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上増加する。

ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)および３７℃以上の温度で少なくとも１ヶ月間製剤を安定化させる量の二価カチオン、例えばＬｙｓ−ＬｙｓまたはＭｇＣｌ_２を含む、安定なヒアルロナン分解酵素製剤である。具体例において、ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)および３７℃以上の温度で少なくとも１ヶ月間製剤を安定化させる量のＬｙｓ−Ｌｙｓを含む安定なヒアルロナン分解酵素製剤である。例えば、このような製剤は、３７℃〜４２℃以上の温度、例えば少なくともまたは約４０℃で、少なくとも１ヶ月間安定である。製剤は、一般的にまた界面活性剤、酸化防止剤(例えばメチオニン)、正確にまたは約６.５〜７.８のｐＨおよび該ｐＨ範囲を維持する緩衝剤を含む。所望により、製剤は１種以上の他の安定化剤、浸透圧修飾剤、防腐剤(複数も可)または添加物を含み得る。

典型的に、化合物は、当分野で周知の技術および方法を使用して医薬組成物に製剤される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126)。薬学的に許容される組成物は、一般的に動物およびヒトでの使用のための認められた薬局方に従い、準備される規制当局または他の当局の承認の観点で製造される。製剤は投与方法に適合させるべきである。

安定な製剤は、溶液、シロップまたは懸濁液としての液体形態の医薬製剤として提供できる。液体形態で、医薬製剤は使用前に治療的有効濃度に希釈すべき濃縮製剤として提供できる。一般的に、製剤は、使用時に希釈を必要としない投与形態、すなわち直接投与用製剤として提供される。このような液体製剤は、薬学的に許容される添加物、例えば懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化可食脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステル類、または分画植物油)；および防腐剤(例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸)と共に緩衝手段により製造できる。他の例において、医薬製剤は、使用前に水または他の適当な媒体で再構成するための凍結乾燥形態で提供できる。

ここに提供する製剤の容積は、それを入れる容器に適当なあらゆる容積である。数例において、製剤はバイアル、シリンジ、またはあらゆる他の適切な容器に入れられる。例えば、ここに提供される安定な製剤は、正確にまたは約０.１mL〜５００mL、例えば０.１mL〜１００mL、１mL〜１００mL、０.１mL〜５０mL、例えば少なくともまたは凡そ少なくともまたは約または０.１mL、１mL、２mL、３mL、４mL、５mL、１０mL、１５mL、２０mL、３０mL、４０mL、５０mLまたはそれ以上である。

下に記載するのは、ここに提供する安定なヒアルロナン分解酵素製剤に提供される成分についての記載である。次の安定な製剤は単なる例示であり、微細な調節をなし得る構築基盤を提供する。種々の添加物および他の成分の濃度の極めてわずかな変化(例えば記載濃度の±１５％)、またはｐＨのわずかな変化は、全てではなくても、ヒアルロナン分解酵素安定性を幾分保持しながらなし得ることは理解すべきである。さらなる変化も、添加物の付加または除去によりなし得る。例えば、安定化界面活性剤の種類を変え得る。

１. ヒアルロナン分解酵素
ここに提供する安定な製剤中のヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の量は、治療効果を達成するために十分な直接投与のための量である。一例において、量は、ヒト皮膚の該表面下の皮下空間でヒアルロン酸(ＨＡ)を分解させるための直接投与に十分な量である。例えば、製剤中のヒアルロナン分解酵素の量は、共注射または共投与される治療剤の分散および吸収を増加させるための直接投与のための量である。他の例において、量は、疾患組織または細胞と関連するヒアルロン酸(ＨＡ)を分解するのに十分な直接投与のための量である。例えば、量は、腫瘍細胞と関連するＨＡ分解に十分な直接投与のための量である。このような例において、量は、間質性流体圧力(ＩＦＰ)または腫瘍血管容積を減少させるまたは減らすための量である。

例えば、当該量は、少なくともまたはおよそ少なくとも３０単位／mLと機能的に等価な量である。例えば、ここに提供する製剤はヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を、正確にまたは約３０単位／mL〜２０,０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜１５,０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜１０,０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜５,０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜３０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０,０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜１５,０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜１０,０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜６０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、６０Ｕ／mL〜６００Ｕ／mL、または１００Ｕ／mL〜３００Ｕ／mL、例えば少なくともまたはおよそ少なくとも３０Ｕ／mL、３５Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、５００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL、７００Ｕ／mL、８００Ｕ／mL、９００Ｕ／mL、１０００Ｕ／ml、２０００Ｕ／mL、３０００Ｕ／mL、４０００Ｕ／mL、５０００Ｕ／mL、６０００Ｕ／mL、７０００Ｕ／mL、８０００Ｕ／mL、９０００Ｕ／mL、１０,０００Ｕ／mL、１２,０００Ｕ／mL、１５,０００Ｕ／mLまたは２０,０００Ｕ／mLの量で含む。例えば、ここに提供する製剤は、ＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を、少なくとも１００Ｕ／mL〜３００Ｕ／mL、例えば少なくともまたは少なくともおよそ１００Ｕ／mL、１１５Ｕ／mL、１２０Ｕ／mL、１２５Ｕ／mL、１３０Ｕ／mL、１３５Ｕ／mL、１４０Ｕ／mL、１４５Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、１５５Ｕ／mL、１６０Ｕ／mL、１６５Ｕ／mL、１７０Ｕ／mL、１７５Ｕ／mL、１８０Ｕ／mL、１８５Ｕ／mL、１９０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、２２０Ｕ／mL、２４０Ｕ／mL、２６０Ｕ／mL、２８０Ｕ／mLまたは３００Ｕ／mLの量で含む。

ここに提供する安定な製剤において、製剤中のヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を含むヒアルロナン分解酵素の安定性は、上記のとおり、３７℃〜４２℃以上の高温、例えば少なくともまたは約またはおよそ３７℃または４０℃で、少なくとも３日間、および一般的に少なくとも１ヶ月間酵素の回収および／または活性の関数である。これらのパラメータを評価するためのアッセイをここに記載する。ここに提供する製剤は、ここに記載する治療的使用に適当であるようにヒアルロニダーゼ回収および／または活性を保持する。ここに提供する安定な製剤において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０の活性は、典型的にここに記載するとおり、３７℃〜４２℃以上の温度に少なくとも３日間、および一般的に少なくとも１ヶ月間に暴露前の製剤における酵素の初期活性の正確にまたは約５０％以上、例えば少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上またはそれ以上を維持する。例えば、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０の活性は、典型的に、４℃で少なくとも１ヶ月間保存した同じ酵素製剤の活性の正確にまたは約５０％以上、例えば少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。典型的に、ここに提供する安定なヒアルロナン分解酵素製剤は、３７℃〜４２℃以上の温度、例えば少なくともまたは約３７℃または４０℃の保存または使用下で少なくとも１ヶ月間酵素の初期活性の少なくとも７０％を維持する。それ故に、例えば、６００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばｒＨｕＰＨ２０で製剤された溶液において、少なくともまたは凡そ少なくとも３６０単位／mL、３６５Ｕ／mL、３７０Ｕ／mL、３７５Ｕ／mL、３８０Ｕ／mL、３９０Ｕ／mL、４２０Ｕ／mL、４８０Ｕ／mL、５４０Ｕ／mL、５４６Ｕ／mL、５５２Ｕ／mL、５５８Ｕ／mL、５６４Ｕ／mL、５７０Ｕ／mL、５７６Ｕ／mL、５８２Ｕ／mL、５８８Ｕ／mL、５９４Ｕ／mL以上の活性が、３７℃〜４２℃以上の温度、例えば少なくともまたは約３７℃または４０℃で、少なくとも１ヶ月間保持される。他の例において、安定性を、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、酵素の回収の関数として評価できる。このような例において、ここに提供する製剤において、ヒアルロニダーゼ酵素回収は正確にまたは約６０％〜１４０％である。例えば、ここに提供する製剤において、ヒアルロニダーゼ酵素回収は正確にまたは約３−７μg／mLである。

２. 二価カチオン
ここに提供する安定なヒアルロナン分解酵素製剤は、ここに記載のとおり、正確にまたは約３７℃〜４２℃、例えば少なくともまたはおよそ少なくともまたは約３７℃または４０℃の温度で、少なくとも３日間および一般的に少なくとも１ヶ月間(例えば４週間)ヒアルロナン分解酵素の初期酵素活性の少なくとも５０％、および一般的に少なくとも７０％を達成する量で二価カチオンを含む。例えば、二価カチオンの量は正確にまたは約３７℃〜４２℃、例えば少なくともまたはおよそ少なくとも４０℃の温度で少なくとも３日間、および一般的に少なくとも４週間ヒアルロナン分解酵素の初期酵素活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を達成する。

例えば、ここに提供する安定なヒアルロナン分解製剤は、正確にまたは約３７℃〜４２℃、例えば少なくともまたはおよそ少なくとも４０℃の温度で、少なくとも３日間および一般的に少なくとも４週間ヒアルロナン分解酵素の初期酵素活性の少なくとも５０％、および一般的に少なくとも７０％を達成する量のＬｙｓ−Ｌｙｓ、その塩、誘導体、類似体または模倣体を含む。ここに提供するこのような安定なヒアルロナン分解酵素(例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０)製剤は、正確にまたは約５mM〜３００mMのＬｙｓ−Ｌｙｓ、例えば１０mM〜２００mM、５０mM〜１５０mMまたは１０mM〜５０mMを含む。例えば、ここに提供する安定なヒアルロナン分解酵素(例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０)製剤は、少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mM、５０mM、６０mM、７０mM、８０mM、９０mM、１００mM、１２５mM、１５０mM、２００mM、３００mM以上のＬｙｓ−Ｌｙｓを含む。

他の例において、ここに提供する安定なヒアルロナン分解製剤は、正確にまたは約３７℃〜４２℃、例えば少なくともまたは約または約４０℃の温度で、少なくとも３日間および一般的に少なくとも４週間で、ヒアルロナン分解酵素の初期酵素活性の少なくとも５０％、および一般的に少なくとも７０％を達成する量のＭｇＣｌ_２、その誘導体、類似体または模倣体を含む。このようなここに提供する安定なヒアルロナン分解酵素(例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０)製剤は、正確にまたは約５mM〜３００mMのＭｇＣｌ_２、例えば１０mM〜２００mM、５０mM〜１５０mMまたは１０mM〜５０mM。例えば、ここに提供する安定なヒアルロナン分解酵素(例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０)製剤は少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mM、５０mM、６０mM、７０mM、８０mM、９０mM、１００mM、１２５mM、１５０mM、２００mM、３００mM以上のＭｇＣｌ_２を含む。

下記のとおり、二価カチオン(例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ)を含む製剤は、必要であれば、浸透圧修飾剤(例えばＮａＣｌ)も含み得る。

３. ｐＨおよび緩衝剤
ここに提供されるのは、正確にまたは約６.５〜７.８または６.８〜７.８、例えば正確にまたは約６.５〜７.５または７.０〜７.６のｐＨを有する安定なヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の製剤である。本明細書でのｐＨについての言及は、室温でのｐＨ測定に基づく。ｐＨは保存中時間と共に変わるが、典型的に正確にまたは約ｐＨ６.５〜７.８、例えば正確にまたは約６.８〜または〜約７.８を維持すると理解される。例えば、ｐＨは±０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.２、１.３、１.４、１.５またはそれ以上で変化し得る。それ故に、製剤がおよそまたは少なくともｐＨ６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４または７.６のｐＨをとの記載は、製造時およそまたは少なくとも６.５±０.２、６.６±０.２、６.７±０.２、６.８±０.２、６.９±０.２、７.０±０.２、７.１±０.２、７.２±０.２、７.３±０.２、７.４±０.２、７.５±０.２または７.６±０.２のｐＨを有する配合剤を含む。

必要であれば、ｐＨを低下させるための酸性化剤またはｐＨを上昇させるためのアルカリ化剤を使用してｐＨを調節できる。酸性化剤の例は、酢酸、クエン酸、硫酸、塩酸、リン酸二水素ナトリウム溶液、およびリン酸を含むが、これらに限定されない。アルカリ化剤の例は、リン酸水素ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリウムを含むが、これらに限定されない。

あらゆる緩衝剤が、製剤の安定性に不利に影響しない限り、そして必要ｐＨ範囲を支持する限り、ここに提供する配合剤において使用できる。特に適当な緩衝剤はＴｒｉｓ、コハク酸、酢酸、リン酸緩衝液、ヒスチジン、クエン酸、アコニテート、マレートおよびカーボネートを含む。しかしながら、当業者は、ここに提供される製剤は、緩衝剤が許容されるｐＨ安定性程度または示す範囲の“緩衝能”を提供する限り、特定の緩衝剤に限定されないことを認識する。一般的に、緩衝剤は、そのｐＫの約１ｐＨ単位以内で適切な緩衝能を有する(Lachman et al. 1986)。緩衝剤適合性は、公開されているｐＫ集計により推定でき、または当分野で周知の方法により経験的に決定できる。溶液のｐＨは、例えば、あらゆる許容される酸または塩基を使用して、上記範囲内の所望のエンドポイントに調節できる。

ここに提供する配合剤に包含できる緩衝剤は、Ｔｒｉｓ(トロメタミン)、ヒスチジン、リン酸緩衝液、例えばリン酸水素ナトリウム、およびクエン酸緩衝剤を含むが、これらに限定されない。例えば、緩衝剤はヒスチジン塩酸塩(ヒスチジン／ＨＣｌ)緩衝剤であり得る。一般的に、緩衝剤は、配合剤のｐＨ範囲を正確にまたは約６.５〜７.８、例えば正確にまたは約６.８〜７.８、例えば正確にまたは約７.０〜７.６に維持する量で存在する。このような緩衝剤は、製剤中に、正確にまたは約１mM〜１００mM、例えば１０mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mM、例えば正確にまたは約３０mMの濃度で存在できる。例えば、このような緩衝剤は、配合剤中に正確にまたは約または少なくとも１mM、２mM、３mM、４mM、５mM、６mM、７mM、８mM、９mM、１０mM、１１mM、１２mM、１３mM、１４mM、１５mM、１６mM、１７mM、１８mM、１９mM、２０mM、２５mM、３０mM、３５mM、４０mM、４５mM、５０mM、５５mM、６０mM、６５mM、７０mM、７５mM、またはそれ以上の濃度で存在できる。
いくつかの実施例において、緩衝剤は不要である。

４. 界面活性剤
ここに提供する安定な製剤は、１種以上の界面活性剤を含む。このような界面活性剤はヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の凝集を阻止し、吸着損失を最小化する。界面活性剤は、一般的に非イオン性界面活性剤である。本発明の製剤に包含できる界面活性剤は、多価アルコール類、例えばグリセロール、またはソルビトールの部分的および脂肪酸エステル類およびエーテル類、ポロクサマー類およびポリソルベート類を含むが、これらに限定されない。例えば、本発明の製剤における界面活性剤の例は、ポロクサマー１８８(PLURONICS(登録商標)、例えばPLURONIC(登録商標)Ｆ６８)、TETRONICS(登録商標)、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、PEG400、PEG3000、Tween(登録商標)(例えばTween(登録商標)２０またはTween(登録商標)８０)、Triton(登録商標)X-100、SPAN(登録商標)、MYRJ(登録商標)、BRIJ(登録商標)、CREMOPHOR(登録商標)、ポリプロピレングリコール類またはポリエチレングリコール類のあらゆる１種以上を含むが、これらに限定されない。数例において、本発明の製剤はポロクサマー１８８、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、一般的にポロクサマー１８８(PLURONIC F68)を含む。ここに提供する製剤は、一般的に少なくとも１種の界面活性剤、例えば１種、２種または３種の界面活性剤を含む。

ここに提供する製剤において、製剤中の１種以上の界面活性剤の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての総量は、例えば、正確にまたは約０.０００５％〜１.０％、例えば正確にまたは約０.０００５％〜０.００５％、０.００１％〜.０１％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％または０.０１％〜０.０２％である。一般的に、製剤は少なくとも０.０１％の界面活性剤を含み、１.０％未満、例えば０.５％未満または０.１％未満の界面活性剤を含む。例えば、ここに提供する製剤は、正確にまたは約０.００１％、０.００５％、０.０１％、０.０１５％、０.０２％、０.０２５％、０.０３％、０.０３５％、０.０４％、０.０４５％、０.０５％、０.０５５％、０.０６％、０.０６５％、０.０７％、０.０８％、または０.０９％界面活性剤を含む。具体例において、ここに提供する製剤は、正確にまたは約０.０１％〜または〜約０.０５％界面活性剤を含む。

本発明により、酵素の酸化が、界面活性剤のレベルを上げるに連れて増加することが判明した。また、界面活性剤ポロクサマー１８８は、ポリソルベート類より酸化を起こさない。それ故に、本発明の製剤は、一般的にポロクサマー１８８を含む。それ故に、界面活性剤はヒアルロナン分解酵素を安定化できるが、ここに提供する製剤への界面活性剤の包含は、高濃度でヒアルロナン分解酵素酸化をもたらす。それ故に、一般的に、例えば、重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)で１.０％未満および一般的に正確にまたは約０.０１％または０.０５％、例えば０.０１％のような低濃度の界面活性剤が本発明の配合剤で使用される。また、下記のとおり、所望により酸化を減らすかまたは阻止するために、製剤中に酸化防止剤を包含させ得る。

５. 抗酸化剤
ここに提供する製剤はまた酸化、特にヒアルロナン分解酵素の酸化を減らすかまたは阻止するために抗酸化剤を含み得る。例えば、本明細書の実施例は、酸化が高濃度の界面活性剤で起こり得ることを示す。抗酸化剤の例は、システイン、トリプトファンおよびメチオニンを含むが、これらに限定されない。具体例において、抗酸化剤はメチオニンである。ここに提供する製剤は、抗酸化剤を正確にまたは約５mM〜または〜約５０mM、例えば５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mMの濃度で含み得る。例えば、メチオニンを、本発明の製剤に正確にまたは約５mM〜または〜約５０mM、例えば５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mMの濃度で入れ得る。例えば、抗酸化剤、例えばメチオニンを、正確にまたは約または少なくとも５mM、１０mM、１１mM、１２mM、１３mM、１４mM、１５mM、１６mM、１７mM、１８mM、１９mM、２０mM、２１mM、２２mM、２３mM、２４mM、２５mM、２６mM、２７mM、２８mM、２９mM、３０mM、３５mM、４０mM、４５mMまたは５０mMの濃度で入れ得る。数例において、配合剤は１０mM〜２０mMのメチオニン、例えばまたは約または少なくとも１０mMまたは２０mMのメチオニンを含む。

６. 張度調節剤
所望により、ここに提供する安定なヒアルロナン分解酵素製剤は張度調節剤を含み得る。特に、張度調節剤は、低濃度の二価カチオン、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓを含む製剤において、十分な張性が達成されないために必要である。

例えば、張度調節剤は、所望のモル浸透圧濃度の溶液を製造するために本発明の製剤に包含される。ここに提供する製剤は、正確にまたは約２４５mOsm／kg〜５００mOsm／kgである。例えば、モル浸透圧濃度は正確にまたは約または少なくとも２４５mOsm／kg、２５０mOsm／kg、２５５mOsm／kg、２６０mOsm／kg、２６５mOsm／kg、２７０mOsm／kg、２７５mOsm／kg、２８０mOsm／kg、２８５mOsm／kg、２９０mOsm／kg、２９５mOsm／kg、３００mOsm／kg、３５０mOsm／kg、４００mOsm／kg、４５０mOsm／kgまたは５００mOsm／kgのモル浸透圧濃度を有する。典型的に、張度調節剤は、二価カチオン、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓを、１００mM未満、例えば８０mM未満、７０mM、６０mM、５０mM、４０mM、３０mM、２０mM、１０mM以下の濃度で含む本発明の製剤に包含される。例えば、張度調節剤は、二価カチオン、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓを正確にまたは約１０mM〜５０mM、例えば約または約１０mM、１５mM、２０mM、２５mM、３０mM、３５mM、４０mM、４５mMまたは５０mMの濃度で含む本発明の製剤に包含される。

張度調節剤は、グリセリン、ＮａＣｌ、アミノ酸類、ポリアルコール類、トレハロース、および他の塩類および／または糖類を含むが、これらに限定されない。例えば、ここに提供する製剤は、所望により張度調節剤としてＮａＣｌを含む。ＮａＣｌは、正確にまたは約０mM〜２００mM、例えば一般的に３０mM〜１００mM、５０mM〜１６０mM、例えば５０mM〜１２０mMまたは８０mM〜１４０mMの濃度で包含される。一般的に、ＮａＣｌは１５０mM未満、および一般的に１４０mM未満、１３０mM、１２０mM、１１０mM、１００mM、９０mM、８０mM、７０mM、６０mM、５０mM、４０mM、３０mM、２０mM、１０mM以下である。具体的量は二価カチオン、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓの関数である。例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ濃度が高いほど、ＮａＣｌは少ない(またはＮａＣｌはない)。具体的量は、酵素活性および／または張性を維持するために経験的に決定できる。

他の例において、グリセリン(グリセロール)は、所望により安定な製剤に包含される。例えば、ここに提供する製剤は、典型的にグリセリンを６０mM未満、例えば５５mM未満、５０mM未満、４５mM未満、４０mM未満、３５mM未満、３０mM未満、２５mM未満、２０mM未満、１５mM未満、１０mM以下で含む。グリセリン量は、典型的に存在する二価カチオン(例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ)量による。製剤に存在する二価カチオン(例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ)が多い程、所望のモル浸透圧濃度を達成するために必要なグリセリンは少ない。それ故に、ある場合、グリセリンは製剤にわずかしか入れる必要がないか、または入れる必要がない。

７. 他の薬物または添加物
ここに提供する安定な製剤は、所望により１種以上の他の薬剤、担体、添加物または防腐剤を含み得る。例えば、所望によりここに提供する安定なヒアルロナン分解酵素製剤に包含され得る安定化剤の例は、アミノ酸類、アミノ酸誘導体、アミン類、糖類、ポリオール類、塩類および緩衝剤、界面活性剤、および他の薬剤を含むが、これらに限定されない。例えば、所望により本発明の製剤に包含され得る安定化剤でとりわけ包含されるのが、アミノ酸安定化剤またはヒアルロニダーゼ阻害剤(例えばヒアルロニダーゼ基質、例えばヒアルロナン)である。アミノ酸安定化剤、アミノ酸誘導体またはアミン類の例は、Ｌ−アルギニン、グルタミン、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、トリメチルアミンオキシド(ＴＭＡＯ)またはベタインを含むが、これらに限定されない。糖類およびポリオール類の例は、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、スクロースまたはトレハロースを含むが、これらに限定されない。塩類および緩衝剤の例は、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、例えばＴｒｉｓ(１００mM)、または安息香酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。界面活性剤の例は、ポロクサマー１８８(例えばPLURONIC(登録商標)Ｆ６８)、ポリソルベート８０(ＰＳ８０)、ポリソルベート２０(ＰＳ２０)を含むが、これらに限定されない。他の安定化剤は、ヒアルロン酸(ＨＡ)、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、フェニル酪酸、タウロコール酸、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)または亜鉛を含むが、これらに限定されない。本発明の具体例において、安定なヒアルロナン分解酵素群はＨＳＡを含まず、無ＨＳＡ製剤である。

多数回投与量投与用に製剤された安定な製剤について、製剤はまた所望により、上記成分と組み合わせたとき、安定な製剤となる一定量の防腐剤(複数も可)を含んでよい。包含されるとき、防腐剤は、例えば、米国薬局方(ＵＳＰ)および欧州薬局方(ＥＰ)の抗菌性要求を提供するのに十分な濃度で存在する。下記実施例７Ｅの表２３はこれらの要求を示し、最小ＥＰ抗菌性要求(ＥＰＡ)および好ましいＥＰ抗菌性要求(ＥＰＢ)を示す。典型的に、ＥＰ(ＥＰＡまたはＥＰＢ)抗菌性要求を満たす製剤は、ＵＳＰ抗菌性要求のみを満たすために製剤されたものより多くの防腐剤を含む。一般的に、包含されるとき、ここに提供する製剤は、本明細書の他の箇所に記載したとおり、抗菌防腐剤有効性試験(ＡＰＥＴ)で評価して組成物サンプルにおける微生物を死滅させるか繁殖を阻止することにより抗菌活性を示す量で防腐剤(複数も可)を含む。ここに提供する製剤に包含できる防腐剤の非限定的例は、フェノール、メタ−クレゾール(ｍ−クレゾール)、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、グルコン酸クロルヘキシジン、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール(２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１,３−ジオール)、酢酸フェニル水銀、グリセロール(グリセリン)、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、オルト−クレゾール(ｏ−クレゾール)、パラ−クレゾール(ｐ−クレゾール)、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベンまたはブチルパラベンおよびこれらのあらゆる組み合わせを含むが、これらに限定されない。一例において、製剤中の防腐剤は少なくとも１種のフェノール防腐剤を含む。例えば、製剤はフェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールを含む。ここに提供する製剤に包含されるとき、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての１種以上の防腐剤の総量は、例えば、正確にまたは約０.１％〜０.４％、例えば０.１％〜０.３％、０.１５％〜０.３２５％、０.１５％〜０.２５％、０.１％〜０.２％、０.２％〜０.３％、または０.３％〜０.４％、および一般的に０.４％(ｗ／ｖ)未満の防腐剤、例えば、少なくともまたはおよそ少なくとも０.１％、０.１２％、０.１２５％、０.１３％、０.１４％、０.１５％、０.１６％、０.１７％、０.１７５％、０.１８％、０.１９％、０.２％、０.２５％、０.３％、０.３２５％、０.３５％であるが、総量０.４％未満の防腐剤である。

所望により、製剤は、製剤が投与される担体、例えば希釈剤、アジュバント、添加物、または媒体を含み得る。適当な医薬担体の例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martinに記載されている。このような組成物は、治療有効量の、一般的に精製形態または部分的精製形態の化合物を、患者への適切な投与のための形態を提供するための適当な量の担体と共に含む。このような医薬担体は滅菌液体、例えば水および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油を含む。水は、医薬組成物を静脈内投与するときの典型的担体である。食塩水溶液および水性のデキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射液のための液体担体として使用できる。

例えば、非経腸製剤に使用される薬学的に許容される担体は、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張化剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁および分散剤、乳化剤、隔離またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質を含む。水性媒体の例は、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張デキストロース注射、滅菌水注射、デキストロースおよび乳酸リンゲル注射を含む。非水性非経腸媒体は、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油およびピーナツ油を含む。静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤を、多数回投与容器に包装された非経腸製剤に添加でき、それはフェノール類またはクレゾール類、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムであり得る。等張化剤は塩化ナトリウムおよびデキストロースを含む。緩衝剤はリン酸およびクエン酸を含む。抗酸化剤は硫酸水素ナトリウムを含む。局所麻酔剤は塩酸プロカインを含む。懸濁および分散剤はナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを含む。乳化剤はポリソルベート８０(ＴＷＥＥＮ ８０)を含む。金属イオンの隔離またはキレート剤はＥＤＴＡを含む。医薬担体はまた水混和性媒体のためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールおよびｐＨ調節のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を含む。

組成物はまた活性成分意外に、希釈剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク；および結合剤、例えばデンプン、天然ゴム、例えばアカシアガム、ゼラチン、グルコース、モラセス、ポリビニルピロリドン、セルロース類およびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン類および当業者に知られた他のこのような結合剤を含み得る。

例えば、あらゆる数の薬学的に許容されるタンパク質類またはペプチドであり得る、添加物タンパク質を製剤に添加できる。一般的に、添加物タンパク質は、免疫応答を誘発せずに哺乳動物対象に投与できる能力により選択する。例えば、ヒト血清アルブミンは、安定な本発明の製剤には典型的に包含されないが、医薬製剤における使用に一般的によく適する。他の既知医薬タンパク質添加物は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、一ステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールを含む。添加物は、製剤に、保持容器またはバイアルへのタンパク質の吸着を妨げる十分な濃度で包含される。添加物濃度は添加物の性質および配合剤中のタンパク質濃度により異なる。

組成物は、望むならば、また少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエート、および他のこのような薬剤を含み得る。

８.安定なヒアルロナン分解酵素製剤の例
ここに提供されるのは、３７℃〜４２℃、例えば３７℃または４０℃以上の温度で、少なくとも３日間、および一般的に少なくとも１ヶ月間安定である安定なヒアルロナン分解酵素製剤である。

一例において、製剤は１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、例えば１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mLまたは１００Ｕ／mL〜３００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、および特に少なくともまたは凡そ少なくともまたは約１５５Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)；正確にまたは約５mM〜または〜約２００mM、例えば１０mM〜５０mMまたは５mM〜２０mMのＬｙｓ−Ｌｙｓ(例えば少なくともまたは凡そ少なくとも１０mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mM)；正確にまたは約０mM〜または〜約３００mMのリン酸水素ナトリウム(例えば正確にまたは約０mM〜１５０mMまたは５mM〜５０mMのリン酸水素ナトリウム、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mM、１００mMまたは１５０mM)；０mM〜または〜約５０mMのメチオニン(例えば正確にまたは約５mM〜２０mM、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mMのメチオニン)；および正確にまたは約０.０１％〜または〜約０.５％ポロクサマー１８８、例えば０.０１％〜０.０５％(例えば少なくともまたは凡そ少なくとも０.０１％、０.０２％、０.０３％、０.０４％または０.０５％ポリソルベート８０)を含む。製剤は正確にまたは約６.５〜７.６、例えば正確にまたは約６.５〜７.２または７.０〜または〜約７.６のｐＨ(例えば少なくともまたは凡そ少なくともｐＨ６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５または７.６)で製剤される。さらなる例において、ＮａＣｌは濃度１４０mM未満で包含される。例えば、ＮａＣｌは正確にまたは約５０mM〜１５０mM、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５０mM、６０mM、７０mM、８０mM、９０mMまたは１００mMの濃度で包含される。

他の例において、製剤の例は１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、例えば１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mLまたは１００Ｕ／mL〜３００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、および特に少なくともまたは凡そ少なくともまたは約１５５Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)；正確にまたは約５mM〜または〜約２００mM、例えば正確にまたは約５０mM〜１５０mMのＭｇＣｌ_２(例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５０mM、６０mM、７０mM、８０mM、９０mM、１００mM、１１０mM、１２０mM、１３０mMまたは１５０mM)；正確にまたは約０mM〜または〜約３００mMのヒスチジン塩酸塩(例えば正確にまたは約０mM〜１５０mMまたは５mM〜５０mMのヒスチジン塩酸塩、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mM、１００mMまたは１５０mM)；正確にまたは約０mM〜または〜約５０mMのメチオニン(例えば正確にまたは約５mM〜２０mM、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mMのメチオニン)；および正確にまたは約０.０１％〜または〜約０.５％ポロクサマー１８８、例えば０.０１％〜０.０５％(例えば少なくともまたは凡そ少なくとも０.０１％、０.０２％、０.０３％、０.０４％または０.０５％ポリソルベート８０)を含む。製剤は正確にまたは約６.５〜７.６、例えば正確にまたは約６.５〜７.２または７.０〜または〜約７.６のｐＨ(例えば少なくともまたは凡そ少なくともｐＨ６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５または７.６)で製剤される。

Ｅ. インスリンポリペプチド類
ここに提供されるのは、ヒアルロナン分解酵素およびインスリンの配合剤である。ここに提供する配合剤は、インスリンの自己会合を減らし、六量体のより急速な解離をもたらすために修飾(例えばアミノ酸置換による)された、速効性のインスリン、例えばレギュラーインスリンまたはインスリン類似体(例えばここで同義に使用する速効性の類似体または速効型類似体と呼ぶ)を含む。

インスリンは、５８０８ダルトン分子量の５１アミノ酸残基から成るポリペプチドである。これは膵臓中のランゲルハンスβ細胞島で産生される。典型的なヒトインスリンは、ＥＲに向かう２４アミノ酸シグナルペプチドを含有する１１０アミノ酸前駆体ポリペプチド、プレプロインスリン(配列番号１０１)として翻訳され、シグナル配列が切断されてプロインスリン(配列番号１０２)をもたらす。プロインスリン分子は、次に、プロホルモン変換酵素(ＰＣ１およびＰＣ２)と呼ばれるタンパク質分解酵素の作用およびエキソプロテアーゼカルボキシペプチダーゼＥの作用によって、成熟インスリンに変換される。これにより、４つの塩基性アミノ酸残基と、残っている３１アミノ酸のＣ−ペプチド、すなわち連結鎖(配列番号１０１に記載するプレプロインスリンポリペプチドのアミノ酸残基５７〜８７に相当)とが除去される。結果として生じるインスリンは、２１アミノ酸のＡ鎖(配列番号１０２に記載するプロインスリンポリペプチドのアミノ酸残基６６〜８６に相当)と、３０アミノ酸のＢ鎖(配列番号１０２に記載するプロインスリンポリペプチドのアミノ酸残基１〜３０に相当)とを含有し、それらがジスルフィド結合で架橋されている。典型的に、成熟インスリンは３つのジスルフィド橋を含有し、１つはＡ鎖の位置７とＢ鎖の位置７の間、２つ目はＡ鎖の位置２０とＢ鎖の位置１９の間、そして３つ目はＡ鎖の位置６と１１の間にある。成熟インスリンのＡ鎖の配列を配列番号１０３に記載し、Ｂ鎖の配列を配列番号１０４に記載する。

インスリンへの言及は、単鎖型または二鎖型のプレプロインスリン、プロインスリンおよびインスリンポリペプチド、活性を持つその切断型を包含し、対立遺伝子変異型および種変異型、スプライス変異型によってコードされる変異型、ならびに他の変異型、例えばインスリン類似体または他の誘導体型、例えば配列番号１０１に記載する前駆体ポリペプチドまたはその成熟型に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を持つポリペプチドを、そのインスリンがヒトインスリン受容体に結合して、グルコース取り込みおよびグルコース貯蔵の増加および／または内因性グルコース産生の減少をもたらすシグナリングカスケードを開始させる限りにおいて、包含する。例えば、インスリンには、インスリンの種変異型が包含される。これらには、ウシ由来のインスリン(配列番号１３３に記載)およびブタ由来のインスリン(配列番号１２３)が含まれるが、これらに限定されない。ウシインスリンは、Ａ鎖のアミノ酸８および１０、ならびにＢ鎖のアミノ酸３０が、ヒトインスリンとは異なる。ブタインスリンはＢ鎖のアミノ酸３０だけがヒトインスリンとは異なり、そこでは、ウシ配列と同じように、スレオニンの代わりにアラニン置換が起こっている。インスリンの他の典型的種変異型を配列番号１０５〜１４６のいずれかに記載する。

インスリンの変異型には、配列番号１０３および１０４(Ａ鎖およびＢ鎖)に記載するヒトインスリンと比較して１つ以上のアミノ酸修飾を含有するインスリン類似体も含まれる。これらの変異体は速効性のまたは長時間作用型インスリン類似体(全てここでは速効性のインスリン類似体と呼ぶが、本発明の目的で、速効型および長時間作用型インスリン類似体形態を含む)。典型的なインスリン類似体(Ａ鎖およびＢ鎖)を、速効型類似体と、それより持効性の類似体を含めて、配列番号１４７〜１６５、１８２〜１８４に記載する。例えばインスリン類似体には、グルリジン(ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９；配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４９(Ｂ鎖)に記載)、ＨＭＲ−１ １５３(ＬｙｓＢ３、ＩｌｅＢ２８；配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１８２(Ｂ鎖)に記載)、ＨＭＲ−１４２３(ＧｌｙＡ２１、ＨｉｓＢ３１、ＨｉｓＢ３２；配列番号１８３(Ａ鎖)および配列番号１８４(Ｂ鎖)に記載)、インスリンアスパルト(ＡｓｐＢ２８；配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４７(Ｂ鎖)に記載)、およびインスリンリスプロ(ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９；配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４８(Ｂ鎖)に記載)が含まれるが、これらに限定されない。上記のどの例でも、類似体の命名法は、鎖のＮ末端から数えたインスリンＡ鎖またはＢ鎖上の特定位置におけるアミノ酸置換の説明に基づいており、残りの配列は天然ヒトインスリンの配列である。

それ故に、ここに提供される配合剤中のレギュラーインスリンは、配列番号１０３および１０４に示すアミノ酸配列を含む成熟インスリンである。レギュラーヒトインスリンの例はHumulin(登録商標)Ｒと命名された組み換えヒトインスリンである。レギュラーインスリン類はまたＡ鎖およびＢ鎖を有する成熟インスリンの種変異体、例えば、配列番号１０５〜１４６のいずれかの成熟形態を含む。本発明の配合剤に包含される他のインスリン類似体の例は、配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４９(Ｂ鎖)に示すアミノ酸配列；配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４７(Ｂ鎖)に示すアミノ酸配列；または配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４８(Ｂ鎖)に示すアミノ酸配列を有するインスリンである。

上記インスリンポリペプチドはいずれも、任意の種(例えばヒト)の膵臓によって産生されるものを包含すると共に、合成的にまたは組換え技法を使って生産されるインスリンも包含する。例えば、本明細書のどこか他の項で述べるように、インスリンは、インスリンのＡ鎖およびＢ鎖の合成遺伝子を発現させることによって、またはプロインスリン全体を発現させ、それを適当な酵素法および化学法にさらして成熟インスリンを生成させることによって、またはリンカーペプチドで連結されたＡ鎖およびＢ鎖を発現させることによって、生合成的に生産することができる(例えばDeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional参照)。

インスリンには、単量体型およびオリゴマー型、例えば六量体型も包含される。インスリンは、血漿中を循環する時は単量体として存在することができ、単量体型である時にはその受容体にも結合する。しかしインスリンは二量体に自己会合する傾向を持ち、Ｚｎ^２＋などの金属イオンの存在下では、六量体などの高次構造へと容易に会合することができる。Ｚｎ^２＋に対して２つの対称的高アフィニティ結合部位が存在するが、他の弱い亜鉛結合部位も報告されてはいる(例えばDeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional参照)。自己会合は、化学的分解および物理的変性を防止するために、この分子の安定化にとって重要である。したがって、膵β細胞の貯蔵小胞では、インスリンは六量体として存在する。しかし細胞外間隙に放出されると、インスリン六量体はより中性条件へのｐＨ変化を体験することになり、亜鉛イオン含有六量体が希釈されて、それが六量体を不安定にすると考えられている。細胞外間隙におけるインスリン六量体の不安定化に寄与する他の理由も存在し得る。こうしてインスリンは血液中では主として単量体として見いだされる。安定化効果を利用するために、大半の市販インスリン製剤は、六量体への自己会合を促進するのに十分な量の亜鉛イオンを含有している。しかし六量体構造は、皮下投与された時のこれらの製剤の吸収速度を遅くする。

インスリンは血糖管理用の治療薬として糖尿病患者などで使用される。グルコースを管理するために投与されるインスリンが、基礎治療用であるか、食事時治療用であるか、その組合せ用であるかに応じて、種々のタイプの既存インスリン製剤がある。インスリン製剤は、もっぱら速効型製剤として提供するか、もっぱら基礎作用型製剤(すなわち中間型および／または持効型)として提供するか、それらの混合物として提供することができる(例えば表４参照)。典型的に、混合物は速効型インスリンと中間型または持効型インスリンとを含有する。例えば速効型インスリンは、ＮＰＨインスリン(後述する典型的中間型インスリン)と、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０および５０：５０などといった種々の混合比で組み合わせることができる。そのような混合済み調製物は、食事関連インスリン要求量と基礎インスリン要求量をどちらも単一の製剤で都合よく提供することにより、毎日のインスリン注射の数を減らすことができる。

特定の方法で製剤されたインスリン製剤はインスリンポリペプチドまたはその変異体(すなわち類似体)を含む。ある例において、それは、インスリンに異なる特性、例えば異なる作用時間を付与する製剤中の成分および物質である。例えば、ほとんどのインスリン製剤は、製剤中に金属イオン、例えば亜鉛を含み、それはインスリンを分子自己会合を促進することにより安定化させる。六量体形態への自己会合は、投与によるインスリン吸収を変える。さらに、いくつかの持効型基礎インスリン製剤は(リン酸緩衝液ではなく)酢酸緩衝液から亜鉛の添加によってインスリンを沈殿させることで製造される。亜鉛含有量が高いインスリンの大きな結晶は、収集して酢酸ナトリウム−塩化ナトリウム(ｐＨ７.２〜７.５)の溶液中に再懸濁した場合、皮下注射後にゆっくりと吸収され、持続時間の長い作用を発揮する。この結晶調製物は長時間型(extended)インスリン亜鉛懸濁剤(ウルトラレンテインスリン)と呼ばれている。他の亜鉛含有インスリン調製物には、例えばセミレンテインスリン(即時型(prompt)インスリン亜鉛懸濁剤)およびレンテインスリン(インスリン亜鉛懸濁剤)などがあり、これらは主として、使用される亜鉛含量が異なっている。亜鉛含有インスリン調製物には、プロタミンで修飾されたもの、例えばＮＰＨインスリンなども包含される。

もう一つの例では、微結晶懸濁液を生成させるために、プロタミンなどの沈殿剤をインスリンポリペプチドに加えることができる。典型的に、結晶性インスリンは、結晶型では存在しないインスリンと比較して、長時間にわたる作用持続時間を持つ。プロタミン亜鉛インスリンは、水性懸濁液として皮下注射した場合、沈着部位でゆっくりとしか溶解せず、インスリンは遅延した速度で吸収される。プロタミン亜鉛懸濁液インスリンは、大半が、ＮＰＨインスリンとも呼ばれるイソフェンインスリン懸濁液で置き換えられている。これは、結晶性の修飾プロタミン亜鉛インスリン懸濁液である。インスリン、プロタミンおよび亜鉛の濃度は、調製物の作用発現および作用持続時間が、レギュラーインスリンとプロタミン亜鉛インスリン懸濁液との中間になるように配分される。

さらにまた、調製物のｐＨの相違もインスリンのタイプおよび性質に影響を及ぼす。大半のインスリンは中性ｐＨで製剤化される。例外はｐＨ４.０の市販製剤として提供されるインスリングラルギンである。Ｂ鎖のＣ末端に２つのアルギニンが付加されたことにより、グラルギンインスリンの等電点がシフトして、それを酸性ｐＨでより安定なものにしている。酸感受性アスパラギンに起因する脱アミド化および二量体化を防止するために、さらにもう一つのアミノ酸変異が、Ａ鎖中に存在する(Ｎ２１Ｇ)。グラルギンインスリンのＡ鎖の配列を配列番号１５０に記載し、Ｂ鎖を配列番号１５１に記載する。投与後は生理的ｐＨへの曝露が起こるので、微小沈殿物(microprecipitate)が形成され、それがグラルギンを結晶性持効型インスリンと類似するものにする。

以下の表４に、種々のタイプのインスリンと、それらの作用発現およびそれらの応用を要約する。

最もよく使用されるインスリンは速効型インスリンであり、これにはレギュラーインスリン(すなわち、天然型(native)または野生型インスリン、その対立遺伝子変異型および種変異型を含む)および速効型インスリン類似体が包含される。ここで使用するインスリンという場合、それは別段の注記が特にない限り、速効型インスリンである。

速効性のインスリン類
ここに提供するインスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の配合剤において使用できる速効性インスリン類は、野生型または天然インスリンであるレギュラーインスリン、および速効性のインスリン類似体を含む。基礎作用型インスリン類と比較した速い吸収速度のために、速効性のインスリン類は、食後コントロール目的で主に使用される。速効性のインスリン類の例を下記表５に示す。速効性のインスリン類は当分野で既知のあらゆるものを含み、例えば、米国特許７,２７９,４５７および米国公開番号２００７０２３５３６５、２００８００３９３６８、２００８００３９３６５、２００７００８６９５２、２００７０２４４４６７、および２００７０１９１７５７に開示されたあらゆるインスリン製剤およびデバイスを含むが、これらに限定されない。あらゆる速効性のインスリンを、配合剤においてここに提供されるヒアルロナン分解酵素と組み合わせ得る。このような製剤はまたさらにヒアルロナン分解酵素に加えて、速効性のインスリと中程度または長時間作用型インスリンの混合物を含み得る。

ａ. レギュラーインスリン
レギュラーインスリン類は天然または野生型インスリンポリペプチドを含む。これらはヒトインスリン、ならびにウシ、ブタおよび他の種由来のインスリン類を含む。レギュラーヒトインスリン類はHumulin(登録商標)Ｒ、Novolin(登録商標)ＲおよびVelosulin(登録商標)として市販されている。ブタインスリンはIletin II(登録商標)として市販された。一般的に、レギュラーインスリンは、単独で皮下投与したとき、作用開始まで３０分間かかる。最高血漿レベルは１〜３時間で見られ、作用期間は投与量が増えると伸びる。皮下投与後の血漿半減期は約１.５時間である。

ｂ. 速効性の類似体(速効型インスリン類とも呼ぶ)
速効型インスリン類とも呼ぶ速効型インスリン類似体は、典型的に、１つ以上のアミノ酸変異を含有する改変型インスリンである。類似体は、レギュラーインスリンと比較して吸収速度を増加させ、作用発現を速める目的で、インスリン分子の自己会合が減少するように設計される。一般にそのような類似体は亜鉛の存在下で製剤化されるので、安定な亜鉛六量体として存在する。しかし、その改変ゆえに、これらは皮下投与後にレギュラーインスリンよりも迅速に六量体状態から解離する。

ｉ. インスリンリスプロ
ヒトインスリンリスプロは、Ｂ鎖の位置２８および２９にアミノ酸変異を含有して、配列番号１０４に記載する野生型インスリンＢ鎖のこの位置にあるＰｒｏ−ＬｙｓがＬｙｓ−Ｐｒｏに逆位している、インスリンポリペプチド製剤である。インスリンリスプロの配列を配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４８(Ｂ鎖)に記載する。これはHumalog(登録商標)(インスリンリスプロ、ｒＤＮＡ起源)という名称で販売されている。これら２つのアミノ酸の逆位の結果は、自己会合傾向が減少していて、そのことが、より迅速な作用の発現を可能にする、ポリペプチドである。具体的に述べると、Ｂ鎖における配列逆位は、２つの疎水相互作用の排除と、二量体を安定化する２つのβプリーツシートの弱化をもたらす(例えばDeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional参照)。このポリペプチドは、製剤中に用意される賦形剤、例えば抗微生物剤(例：ｍ−クレゾール)および安定化のための亜鉛の結果として、自己会合し、六量体を形成する。それでもなお、そのアミノ酸改変ゆえに、インスリンリスプロはレギュラーインスリンより迅速に作用する。

ii. インスリンアスパルト
ヒトインスリンアスパルトは、配列番号１０４に記載するヒトインスリンのＢ鎖の位置２８にプロリンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換を含有するインスリンポリペプチド製剤である。インスリンアスパルトの配列を配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４７(Ｂ鎖)に記載する。これはNovoLog(登録商標)(インスリンアスパルト[ｒＤＮＡ起源]注射)という名称で販売されている。インスリンアスパルトにおける改変は、負に帯電した側鎖カルボキシル基を付与して、電荷斥力を生じさせ、単量体−単量体相互作用を不安定にする。さらに、プロリンの除去により、単量体間の重要な疎水相互作用が排除される(例えばDeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional参照)。この類似体は大部分が単量体として存在し、リスプロなどの他の速効型類似体と比較して凝集しにくい。一般に、インスリンアスパルトとインスリンリスプロは、各々の薬物動態的性質および薬力学的性質が似ている。

iii. インスリングルリジン
ヒトインスリングルリジンは、配列番号１０４に記載するヒトインスリンのＢ鎖の配列と比較して、Ｂ鎖の位置Ｂ３にアスパラギンからリジンへのアミノ酸置換を含有し、アミノ酸Ｂ２９にリジンからグルタミン酸へのアミノ酸置換を含有する、インスリンポリペプチド製剤である。インスリングルリジンの配列を配列番号１０３(Ａ鎖)および配列番号１４９(Ｂ鎖)に記載する。それはApidra(登録商標)の名で市販されている(インスリングルリジン[ｒＤＮＡ起源]注射)。修飾により、ヒトインスリンと比較してポリペプチド分子が自己会合する傾向が低い。他のインスリン類似体と異なり、ポリペプチドは、六量体促進亜鉛非存在下で商業的に製剤される(Becker et al. (2008) Clinical Pharmacokinetics, 47:7-20)。それ故に、インスリングルリジンは、インスリンリスプロおよびインスリンアスパルトより作用発現が速い。

Ｆ. インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の安定な配合剤
ここに提供されるのは、インスリン、特にレギュラーインスリンおよび速効型インスリン類似体(速効性のインスリン類似体とも呼ぶ)を含む速効性のインスリン類、およびヒアルロナン分解酵素群、例えば可溶性ヒアルロニダーゼ群(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤である。ここに提供される製剤の例は、速効型インスリン類似体およびＰＨ２０または溶解性および活性であるそのＣ末端切断型フラグメント(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤である。ヒアルロナン分解酵素および速効性のインスリンを含む提供される組成物は、種々の温度または種々の条件下で安定なように製剤される。ここに提供される配合剤は、ここに記載するとおり、正確にまたは約０℃〜４０℃または種々のストレス条件下(例えば撹拌)で数時間、数日間、数週間、数ヶ月または数年間安定である。それ故に、製剤は多数回投与使用に適当であり、または高温または撹拌が必要である他の使用条件に適当である。例えば、本配合剤は、多数回投与注射(ＭＤＩ)製剤ならびに連続的皮下注入(ＣＳＩ)製剤に適する。ここに提供される配合剤は、皮下、腹腔内、皮内、筋肉内、注射および経皮経路用に製剤される。例示的な製剤は皮下投与用に製剤される。

ここに提供される安定な配合剤は、多数回投与製剤である。それ故に、全てのここに提供する製剤は、インスリン(例えば速効性のインスリン、例えば速効型インスリン類似体)、ヒアルロナン分解酵素(例えばＰＨ２０)、防腐剤、および１種以上の他の安定化添加物を含む。

ここに記載し、実施例に例示するとおり、ヒアルロナン分解酵素群、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、および速効性のインスリンの安定性に関する対立要求のために、配合剤がこれら２種の製剤の単なる混合で達成できないことが判明した。例えば、正確なＮａＣｌ濃度およびｐＨがインスリンおよびヒアルロナン分解酵素(例えばｒＨｕＰＨ２０または他の可溶性ヒアルロニダーゼ群およびヒアルロナン分解酵素群)の配合剤の安定性に必要である。適ＮａＣｌ濃度およびｐＨの決定は、インスリンおよび例示的ヒアルロナン分解酵素であるｒＨｕＰＨ２０に対してこれらのパラメータが逆に作用するために複雑である。インスリンの溶解性は抗ｐＨおよび低ＮａＣｌ濃度で最高である。しかしながら、これらの条件は、高ｐＨおよび低ＮａＣｌ濃度で安定性を失うｒＨｕＰＨ２０には有害である。例示的ヒアルロナン分解酵素であるｒＨｕＰＨ２０の安定性はＮａＣｌ濃度を上げ、ｐＨを下げることにより改善される。しかしながら、このような条件は、低ｐＨおよび高ＮａＣｌ濃度で沈殿するインスリンおよびインスリン類似体の溶解性に負に影響する。それ故に、ここに提供する目的は、インスリンおよびｒＨｕＰＨ２０(または他の可溶性ヒアルロニダーゼ群およびヒアルロナン分解酵素群)の安定な製剤のための最適ＮａＣｌ濃度およびｐＨの提供またはＮａＣｌを含まないかまたは低ＮａＣｌ濃度である安定な配合剤の提供である。

ここに記載するとおり、種々の安定な製剤が頻回注射法(ＭＤＩ)様用に使用でき、または持続皮下インスリン注入療法(ＣＳＩＩ)用に使用できる。２種の投与法は安定性に対する要求が異なる。特に、ＣＳＩＩ用配合剤は加速(または負荷)条件下、例えば高温および撹拌下で安定であることが必要であるのに対し、使用するまで冷蔵または環境温度で保存できるＭＤＩ用配合剤は、高温および撹拌下に安定である必要はない。それ故に、本明細書のあらゆる場所に記載するとおり、これらの各保存条件下で安定性を亢進するための添加物または添加物の濃度は必ずしも同じではない。例えば、正確にまたは約２０〜３０℃または正確にまたは約２〜８℃のヒアルロナン分解酵素および／またはインスリンの安定性を維持するのに必要なものと別の添加物または安定化剤または異なる濃度の添加物または安定化剤が、約３２〜４０℃または撹拌下での安定性を維持するために必要である。これらの同じ安定化剤は、低温での製剤の安定性と適合性でないかもしれない。

例えば、本発明により、インスリンは一般的に３２℃以下の低温で保存または使用したとき高ＮａＣｌ濃度および低ｐＨ条件下で安定ではないが、このような条件は、３２℃〜４０℃の高温で少なくとも３日間のインスリンの溶解性の助けとなる。それ故に、高ＮａＣｌおよび低ｐＨの条件は、高温安定性を必要とする投与治療であるＣＳＩＩで使用する配合剤では存在し得る。本明細書により、低ｐＨ(例えばｐＨ６.８)および高ＮａＣｌ(例えば２００mM)を含む製剤が高温で安定であり、故にＣＳＩＩ用に少なくとも３日間、３７℃で適当であることが判明した。低ｐＨ(例えばｐＨ６.８)および高ＮａＣｌ(例えば２００mM)は、低保存温度、例えば冷蔵下または環境温度の安定性には適さない。

また、安定化剤ヒアルロナン(ＨＡ)は優れた安定化剤であり、ヒアルロナン分解酵素の安定性を、ＣＳＩＩにおいて高温で使用するときインスリンの溶解性に悪影響を与えることなく維持する。この場合、ヒアルロナンはヒアルロナン分解酵素の安定性を高温で促進するが、冷蔵温度でのインスリンの溶解性は低下する。それ故に、長期低温保存のためのＭＤＩ製剤中のＨＡの存在は、インスリンの溶解性に影響を与え得る。

本発明により、Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、特に３７℃を超える高温で特に良好なヒアルロナン分解酵素の安定化剤であることが判明した。また特に高温でヒアルロナン分解酵素の強い安定化剤であるＭｇＣｌ_２と異なり、Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、溶解性を維持しながらインスリン類と適合性である。例えば、低濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓおよび１種以上の他の安定化剤の存在は、高温のような加速条件下でヒアルロナン分解酵素活性およびインスリンの溶解性を維持する。それ故に、このようなＬｙｓ−Ｌｙｓ含有配合剤はまたＣＳＩＩ適用に適する。

安定なＭＤＩまたはＣＳＩＩ製剤用の添加物または添加物の濃度はかならずしも同じではないが、ここに提供するＭＤＩ製剤は安定なＣＳＩＩ製剤の製造に使用できる。それ故に、数例において、冷蔵および環境温度であるが、必ずしも高温および負荷下に安定ではないＭＤＩ配合剤を、低ｐＨおよび高塩濃度を有する希釈剤で希釈する。これは、ＭＤＩ製剤と比較して低ｐＨおよび高塩濃度の製剤を生じ、それは、それ故に高温およびストレス条件下(例えば撹拌下)で安定であり、ＣＳＩＩに適する。典型的に、このようなＣＳＩＩ配合剤は、低ｐＨおよび高塩濃度の組成物中のインスリン不溶性により冷蔵温度で保存されない。

典型的に、化合物は、当分野で周知の技術および方法を使用して医薬組成物に製剤される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126)。薬学的に許容される組成物は、一般的に動物およびヒトでの使用のための認められた薬局方に従い、準備される規制当局または他の当局の承認の観点で製造される。製剤は投与方法に適合させるべきである。

配合剤は、溶液、シロップまたは懸濁液としての液体形態の医薬製剤として提供できる。液体形態で、医薬製剤は使用前に治療的有効濃度に希釈すべき濃縮製剤として提供できる。一般的に、製剤は、使用時に希釈を必要としない投与形態、すなわち直接投与用製剤として提供される。このような液体製剤は、薬学的に許容される添加物、例えば懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化可食脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステル類、または分画植物油)；および防腐剤(例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸)と共に緩衝手段により製造できる。他の例において、医薬製剤は、使用前に水または他の適当な媒体で再構成するための凍結乾燥形態で提供できる。製剤は単回投与量または多数回投与量製剤として製剤できる。

ここに提供する製剤の容積は、それを入れる容器に適当なあらゆる容積である。数例において、配合剤はバイアル、シリンジ、ペン、ポンプ用保存室または閉鎖ループ系、またはあらゆる他の適切な容器に入れられる。例えば、ここに提供される配合剤は、正確にまたは約０.１mL〜５００mL、例えば０.１mL〜１００mL、１mL〜１００mL、０.１mL〜５０mL、例えば少なくともまたは凡そ少なくともまたは約または０.１mL、１mL、２mL、３mL、４mL、５mL、１０mL、１５mL、２０mL、３０mL、４０mL、５０mLまたはそれ以上である。

下記のとおり、数例において、配合剤インスリンおよびヒアルロナン分解酵素群の濃縮製剤として提供され、それは使用時に適当な希釈剤で実質的に希釈される。このような場合、濃縮配合剤は特に例えば、正確にまたは約２℃〜または〜約８℃での長期保存用に製剤される。希釈により、配合剤は直接ＭＤＩ適用に使用できる。他方で、ＭＤＩで使用される多数回投与製剤またはＣＳＩＩ治療に対する要求が異なり得るため、希釈剤の成分を、高温または撹拌下での配合剤適用のための、希釈配合剤の安定性を確実にするよう選択し得る。例えば、上におよびさらに下に記載するとおり、希釈剤は、例えば、ＣＳＩＩ治療の特徴的条件である高温またはストレス条件下(例えば撹拌)の配合剤の安定性と適合性である必要量またはレベルの成分または安定化剤を含み得る。それ故に、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の濃縮配合剤を希釈剤で希釈し、新規希釈配合剤は、例えば、ＣＳＩＩ治療での使用のために、例えば、少なくともまたは凡そ少なくとも３２℃〜４０℃、例えば約または３７℃のような高温または他のストレス条件(例えば撹拌)で安定である。

下に、本発明の安定な配合剤に添加される成分を記載する。ここに提供する配合剤に包含されるタンパク質類の安定性を最大化する要求の特定のバランスにより、配合剤の多数回投与注射製剤およびＣＳＩＩ系(例えば閉ポンプ投与)の投与がここで可能となった。成分または条件、例えば添加物、安定化剤またはｐＨの各々の条件を下に提供する。

１. 安定な配合剤の成分
ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を含む安定な配合剤である。配合剤はまた治療有効量の速効性のインスリン、例えば速効型(例えば速効性)インスリン類似体を含む。ここに提供する配合剤の例において、配合剤はさらに正確にまたは約５０mM〜２００mM、例えば８０〜１４０mMの濃度のＮａＣｌ、正確にまたは約６.５〜８.０、例えば、６.５〜７.８または６.８〜７.８、例えば正確にまたは約６.５〜７.５または７.０〜７.６のｐＨ、該ｐＨ範囲を維持する緩衝剤、抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物、および保存(温度および時間)中にヒアルロナン分解酵素活性の少なくとも５０％を維持し、かつインスリン純度、回収および／または効力の少なくとも９０％を維持する。例えば、ここに提供する配合剤は０.０１％〜０.５％界面活性剤を安定化剤として含む。配合剤は所望により付加的安定化剤または抗酸化剤を含み得る。本明細書におけるある実施例において、配合剤は、少なくとも６ヶ月間、正確にまたは約２℃〜または〜約８℃の温度でおよび少なくとも１４日間(すなわち２週間)正確にまたは約２０℃〜または〜約３０℃の温度で安定である。このような配合剤は多数回投与注射(ＭＤＩ)使用に使用できる。他の例において、ここに提供される配合剤、正確にまたはおおよそ３２℃を超える、例えば３５℃〜４０℃、特に正確にまたは約または３７℃または４０℃の高温のような加速条件下および／または撹拌条件下で少なくとも３時間、および一般的に少なくとも３日間安定である。このような配合剤は持続皮下インスリン注入療法(ＣＳＩＩ)方法に使用できる。

またここに提供されるのは、ＮａＣｌを含まないまたは小量のＮａＣｌ、例えば１４０mM未満のＮａＣｌ、および一般的に０mM〜１００mMのＮａＣｌ、例えば、０mM〜５０mM、１０mM〜４０mM、２０mM〜３０mM、例えば少なくともまたは凡そ少なくともまたは３０mMのＮａＣｌを含む配合剤である。このような例において、本明細書において、Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、ＮａＣｌ非存在下でさえ、ヒアルロナン分解酵素およびインスリンを安定化する量で包含できることが判明した。所望により、ＮａＣｌは、このような製剤に、例えば、浸透圧修飾剤として包含できる。これは、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度が５０mMのＬｙｓ−Ｌｙｓ以下である場合、必要である。

それ故に、ここに提供する配合剤の数例において、配合剤は治療有効量のヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を含む。配合剤はまた治療有効量の速効性のインスリン、例えば速効型(例えば速効性)インスリン類似体を含む。ここに提供する配合剤の例において、配合剤はさらに正確にまたは約５０mM〜１２０mM、例えば５０〜８０mM、８０mM〜１００mMまたは１００mM〜１２０mMの濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓを含み、正確にまたは約６.５〜８.０、例えば、６.５〜７.８または６.８〜７.８、例えば正確にまたは約６.５〜７.５または７.０〜７.６のｐＨであり、該ｐＨ範囲を維持する緩衝剤、抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物を含み、そして保存(温度および時間)中にヒアルロナン分解酵素活性の少なくとも５０％を維持し、かつインスリン純度、回収および／または効力の少なくとも９０％を維持する。例えば、ここに提供する配合剤は、安定化剤として０.０００５％〜１.０％(例えば０.０００５％〜０.００５％)界面活性剤を含む。配合剤は所望により付加的安定化剤、浸透圧修飾剤、抗酸化剤および／または他の添加物を含み得る。例えば、本配合剤は１４０mM未満、例えば正確にまたは約０mM〜１００mM、例えば正確にまたは約０mM〜５０mM、１０mM〜４０mMまたは２０mM〜３０mMの濃度のＮａＣｌを含む。本明細書におけるある実施例において、配合剤は少なくとも６ヶ月間、正確にまたは約２℃〜または〜約８℃の温度でおよび少なくとも１４日間(すなわち２週間)正確にまたは約２０℃〜または〜約３０℃の温度で安定である。このような配合剤は多数回投与注射(ＭＤＩ)使用に使用できる。他の例において、ここに提供される配合剤は正確にまたはおおよそ３２℃を超える、例えば３５℃〜４０℃、特に正確にまたは約または３７℃または４０℃の高温のような加速条件下および／または撹拌条件下で少なくとも３時間、および一般的に少なくとも３日間安定である。このような配合剤は持続皮下インスリン注入療法(ＣＳＩＩ)方法に使用できる。

ａ. 速効性のインスリン
ここに提供する配合剤は、治療有効量の速効性のインスリン、例えば速効型インスリン類似体を含む。インスリンはセクションＥに記載するあらゆる速効性のインスリンであり得る。速効性のインスリンはレギュラーインスリンであり得る。具体例において、インスリンは、速効型インスリン類似体、例えば、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトまたはインスリングルリジンである速効性のインスリンである。例えば、治療有効量は正確にまたは約１０単位／mL〜１０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、または５００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも１０Ｕ／mL、２０Ｕ／mL、３０Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、６０Ｕ／mL、７０Ｕ／mL、８０Ｕ／mL、９０Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、２５０Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、３５０Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、４５０Ｕ／ml、５００Ｕ／mLまたは１０００Ｕ／mLの量であり得る。例えば、ここに提供する配合剤は、速効性のインスリン、例えば速効型インスリン類似体(例えばインスリンリスプロ、インスリンアスパルトまたはインスリングルリジン)を少なくともまたは少なくとも約または正確にまたは約１００Ｕ／mLの量で含む。

ここで提供される安定な配合剤において、製剤中のインスリン類似体を含むインスリンの安定性は、ここに記載するとおり種々の温度(例えば２℃〜８℃、２０℃〜３０℃または少なくともまたは約３２℃〜４０℃の高温)および時間(例えば数時間、数日間、数週間または数ヶ月)または使用条件(例えば撹拌)の保存下のインスリン回収、純度および／または活性の関数である。これらのパラメータを評価するためのアッセイを下に記載する。ここに提供する製剤はインスリン回収、純度および／または活性を、製剤が使用ここに記載するとおり治療使用に適当であるように維持する。例えば、ここに提供する製剤において、ここに記載するとおりの時間および保存または使用条件下のインスリン純度(例えばＲＰ−ＨＰＬＣまたは他の類似法で測定して)は、保存または使用前の製剤におけるインスリン純度の少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。一般的に、インスリン純度(例えばＲＰ−ＨＰＬＣによる)について、目標とする許容される明細は少なくともまたは約９０％純度または約または９０％を超える純度である。他の例において、インスリン純度は、例えば、非変性または変性サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を使用して、インスリン凝集の関数として評価できる。このような例において、ここに提供する製剤において、ここに記載するとおりの時間および保存または使用条件下、製剤中のインスリンはピーク面積で２％未満の高分子量(ＨＭＷｔ)インスリン種、例えば、１.９％、１.８％、１.７％、１.６％、１.５％、１.４％、１.３％、１.２％、１.１％、１.０％未満またはそれ以下含む。ここに記載するとおりの時間(例えば数時間、数日間、数週間または数ヶ月間)および保存(例えば種々の温度および時間)または使用(例えば撹拌)条件下、ここに提供する製剤においてインスリンは正確にまたは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のその回収または活性を保持する。それ故に、１００単位／mLのインスリンで製剤された溶液において、少なくともまたは約９０Ｕ／mL、９１Ｕ／mL、９２Ｕ／mL、９３Ｕ／mL、９４Ｕ／mL、９５Ｕ／mL、９６Ｕ／mL、９７Ｕ／mL、９８Ｕ／mLまたは９９Ｕ／mL が、ここに記載するとおり、２℃〜８℃、２０℃〜３０℃の温度の保温または使用下、または少なくともまたは約３２℃〜４０℃の高温または撹拌条件下下、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間にわたり残る。

ｂ. ヒアルロナン分解酵素
ここに提供する配合剤は、治療有効量のヒアルロナン分解酵素、例えばセクションＣに記載するあらゆるもの、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を含む。ここに提供する配合剤中のヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の量は、組成物を超速効性とするのに十分な量である。例えば、量は少なくともまたは凡そ少なくとも３０単位／mLと機能的等価である。例えば、ここに提供する配合剤は、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を正確にまたは約３０単位／mL〜２０,０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜１５,０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜１０,０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜５,０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜３０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０,０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜１５,０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜１０,０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜６０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、６０Ｕ／mL〜６００Ｕ／mL、または１００Ｕ／mL〜３００Ｕ／mL、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも３０Ｕ／mL、３５Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、５００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL、７００Ｕ／mL、８００Ｕ／mL、９００Ｕ／mL、１０００Ｕ／ml、２０００Ｕ／mL、３０００Ｕ／mL、４０００Ｕ／mL、５０００Ｕ／mL、６０００Ｕ／mL、７０００Ｕ／mL、８０００Ｕ／mL、９０００Ｕ／mL、１０,０００Ｕ／mL、１２,０００Ｕ／mL、１５,０００Ｕ／mLまたは２０,０００Ｕ／mLの量で含む。例えば、ここに提供する配合剤は少なくとも１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、例えば少なくともまたは凡そ少なくともまたは約または６００Ｕ／mLの量のＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を含む。

ここに提供する配合剤において、製剤中のヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を含むヒアルロナン分解酵素の安定性は、ここに記載するとおり種々の温度(例えば２℃〜８℃、２０℃〜３０℃または少なくともまたは約３２℃〜４０℃の高温)および時間(例えば時間、日間、数週間または数ヶ月)または使用条件(例えば撹拌)での保存下の酵素の回収および／または活性の関数である。これらのパラメータを評価するためのアッセイを下に記載する。ここに提供する製剤は、ヒアルロニダーゼ回収および／または活性を、製剤がここに記載するとおり治療使用に適当であるように保持する。ここで提供される安定な配合剤において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０の活性は、典型的に保存または使用前の製剤の酵素活性の正確にまたは約５０％以上、例えば少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上またはそれ以上である。一般的に、ヒアルロニダーゼ活性について、安定性の目標とする許容される明細は、ここに記載するとおり、２℃〜８℃、２０℃〜３０℃の温度での保存または使用または少なくともまたは約３２℃〜４０℃の高温または撹拌条件下、少なくとも酵素初期活性の６２％を数時間、数日間、数週間または数ヶ月間維持する。それ故に、例えば、６００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばｒＨｕＰＨ２０で製剤した溶液において、少なくともまたは凡そ少なくとも３６０単位／mL、３６５Ｕ／mL、３７０Ｕ／mL、３７５Ｕ／mL、３８０Ｕ／mL、３９０Ｕ／mL、４２０Ｕ／mL、４８０Ｕ／mL、５４０Ｕ／mL、５４６Ｕ／mL、５５２Ｕ／mL、５５８Ｕ／mL、５６４Ｕ／mL、５７０Ｕ／mL、５７６Ｕ／mL、５８２Ｕ／mL、５８８Ｕ／mL、５９４Ｕ／mL以上の活性が一定時間かつ保存または使用条件下維持される。例えば、ここで提供される安定な配合剤において、一定時間および保存または使用条件(例えば撹拌)下、少なくとも３７５Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素活性が維持される。他の例において、安定性は、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、酵素の回収の関数として評価できる。このような例において、ここに提供する製剤において、ヒアルロニダーゼ酵素回収は正確にまたは約６０％〜１４０％である。例えば、ここに提供する製剤において、ヒアルロニダーゼ酵素回収は正確にまたは約３−７μg／mLである。

ｃ. 防腐剤
多数回投与製剤として使用するために、ここに提供する配合剤は防腐剤(複数も可)を含む。上記のとおり、防腐剤はインスリンの溶解性およびヒアルロナン分解酵素群、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定性および活性に有害な影響を有し得るが、同時に六量体インスリン分子を安定化し、多数回投与製剤において抗菌剤として必要である。それ故に、ここに記載する目的の一つは速効型インスリン類似体を含むインスリン、およびヒアルロナン分解酵素群、例えば可溶性ヒアルロニダーゼ群(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤において使用できる防腐剤の種類および濃度(複数も可)の同定である。

配合剤に存在する１種以上の防腐剤は、ここに記載するとおり保存条件(例えば一定時間および種々の温度で)活性を失うように、実質的にヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を脱安定化させてはならない。さらに、これらの防腐剤は、インスリン六量体を安定化し、必要な抗菌効果を発揮するのに十分な濃度で存在しなければならないが、インスリンの溶解性を減少させるほど濃くではならない。重要なことに、防腐剤は例えば、米国薬局方(ＵＳＰ)および欧州薬局方(ＥＰ)の抗菌要求を提供するために十分な濃度で存在しなければならない。下記実施例７Ｅにおける表２３において、最小ＥＰ抗菌要求(ＥＰＡ)および推奨ＥＰ抗菌要求(ＥＰＢ)を含むこれらの要求を示す。典型的に、ＥＰ(ＥＰＡまたはＥＰＢ)抗菌要求を満たす製剤は、ＵＳＰ抗菌要求のみを満たすように製剤したものより多くの防腐剤を含む。

それ故に、ここに提供する配合剤は、抗菌防腐剤有効性試験(ＡＰＥＴ)で評価して、組成物サンプル中の微生物を殺すかまたは繁殖を阻止することにより抗菌活性を示す量で防腐剤(複数も可)を含む。最少要求を満たすためのＵＳＰおよびＥＰＡまたはＥＰＢ下の満たすべき抗菌防腐剤有効性試験および標準は当業者に周知である。一般に、抗菌防腐剤有効性試験は組成物、例えば、ここに提供する配合剤を、適当な微生物、すなわち、細菌、酵母および真菌の処方接種菌液で攻撃し、接種調整物を処方温度で貯蔵し、サンプルを一定時間間隔で取り、サンプル中の生物を計数することを含む(Sutton and Porter, (2002) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 56(6);300-311; The United States Pharmacopeial Convention, Inc., (effective January 1, 2002), The United States Pharmacopeia 25^th Revision, Rockville, MD, Chapter <51> Antimicrobial Effectiveness Testing; and European Pharmacopoeia, Chapter 5.1.3, Efficacy of Antimicrobial Preservation参照)。攻撃に使用する微生物は、一般的に３種の細菌株、すなわち大腸菌(ATCC No. 8739)、緑膿菌(ATCC No. 9027)および黄色ブドウ球菌(ATCC No. 6538)、酵母(カンジダ・アルビカンスATCC No. 10231)および真菌(クロコウジカビATCC No. 16404)を含み、その全て接種組成物が１０^５または１０^６コロニー形成単位(ｃｆｕ)の微生物／mLの組成物を含むように添加する。組成物の防腐剤特性は、試験条件下、下記表６に明記するとおり、処方された時間および温度後に接種組成物中の微生物数が顕著に減少するかまたは増加がないならば、適切であると考えられる。評価基準は初期サンプルまたは前の時点と比較して、生存微生物数のlog減少の点で示される。

具体的に、組成物、例えば、本配合剤を少なくとも５個の容器に分配し、細菌または真菌(大腸菌(ATCC No. 8739)、緑膿菌(ATCC No. 9027)、黄色ブドウ球菌(ATCC No. 6538)、カンジダ・アルビカンス(ATCC No. 10231)およびクロコウジカビ(ATCC No. 16404))１種につき１容器である。次いで各容器に試験生物の１種を接種して、１０^５または１０^６微生物／mLの組成物の接種菌液を得て、接種菌液は組成物容積の１％を超えない。接種組成物を２０〜２５℃の温度で２８日間維持し、サンプルを６時間、２４時間、７日間、１４日間および２８日間に、上記表６に示す基準に従い、取る。各サンプルの生存微生物数(ｃｆｕ)をプレート数または膜濾過により決定する。最後に、各サンプルのｃｆｕを、接種菌液または先のサンプルと比較し、log減少を決定する。

ＵＳＰ標準下、微生物を接種したサンプルにおける防腐剤の抗菌活性の割合またはレベルは、組成物に微生物接種菌液播種後、播種後７日間で細菌性微生物が少なくとも１.０log_１０単位減少；播種後１４日間で細菌性微生物が少なくとも３.０log_１０単位減少；少なくとも播種後２８日間細菌性微生物のさらなる増殖がない、すなわち、多くて０.５log_１０単位増加であることを必要とする。ＵＳＰ標準に従う真菌性微生物について、微生物を接種したサンプルにおける防腐剤の抗菌活性の割合またはレベルは、組成物に微生物接種菌液播種後、少なくとも播種後７日間、１４日間および２８日間真菌性微生物の増殖がないことを必要とする。ＥＰＢ、または最少ＥＰ標準下、微生物を接種したサンプルにおける防腐剤の抗菌活性の割合またはレベルは、組成物に微生物接種菌液播種後、播種後２４時間で細菌性微生物が少なくとも１.０log_１０単位減少；播種後７日間で細菌性微生物が少なくとも３.０log_１０単位減少；および播種後２８日間細菌性微生物のさらなる増殖がない、すなわち、多くて０.５log_１０単位増加であることを必要とする。ＥＰＡ標準は、播種後２８日間細菌性微生物の回収がないように、播種後７日間で真菌性微生物が少なくとも２.０log_１０単位減少と、播種２４時間後細菌性微生物が少なくとも３.０log_１０単位減少、および播種後２８日間細菌性微生物の回収がないことを必要とする。最少ＥＰＢ標準に従う真菌性微生物について、微生物を接種したサンプルにおける防腐剤の抗菌活性の割合またはレベルは、播種後１４日間で真菌性微生物が少なくとも１.０log_１０単位減少および少なくとも播種後２８日間真菌性微生物のさらなる増殖がないことを必要とする、および増加ＥＰＡ標準は、組成物に微生物接種菌液播種後播種後７日間で真菌性微生物が少なくとも２.０log_１０単位減少および少なくとも播種２８日間真菌性微生物のさらなる増殖がないことを必要とする。

ここに提供する配合剤に包含できる防腐剤の非限定的例は、フェノール、メタ−クレゾール(ｍ−クレゾール)、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、グルコン酸クロルヘキシジン、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール(２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１,３−ジオール)、酢酸フェニル水銀、グリセロール(グリセリン)、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、オルト−クレゾール(ｏ−クレゾール)、パラ−クレゾール(ｐ−クレゾール)、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベンまたはブチルパラベンおよびこれらのあらゆる組み合わせを含むが、これらに限定されない。例えば、ここに提供する配合剤は１種の防腐剤を含み得る。他の例において、配合剤は少なくとも２種の防腐剤または少なくとも３種の防腐剤を含み得る。例えば、ここに提供する配合剤はＬ−フェニルアラニンおよびｍ−クレゾール、Ｌ−フェニルアラニンおよびメチルパラベン、Ｌ−フェニルアラニンおよびフェノール、ｍ−クレゾールおよびメチルパラベン、フェノールおよびメチルパラベン、ｍ−クレゾールおよびフェノールまたは他の類似の組み合わせのような２種の防腐剤を含み得る。一例において、配合剤中の防腐剤は少なくとも１種のフェノール防腐剤を含む。例えば、本配合剤はフェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールを含む。

ここに提供する配合剤において、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての１種以上の防腐剤の総量は、例えば、正確にまたは約０.１％〜０.４％、例えば０.１％〜０.３％、０.１５％〜０.３２５％、０.１５％〜０.２５％、０.１％〜０.２％、０.２％〜０.３％、または０.３％〜０.４％であり得る。一般的に、配合剤は０.４％(ｗ／ｖ)未満の防腐剤を含む。例えば、ここに提供する配合剤は少なくともまたは凡そ少なくとも０.１％、０.１２％、０.１２５％、０.１３％、０.１４％、０.１５％、０.１６％、０.１７％、０.１７５％、０.１８％、０.１９％、０.２％、０.２５％、０.３％、０.３２５％、０.３５％であるが、０.４％未満の総防腐剤を含む。

インスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤において使用される防腐剤の例はフェノールおよびｍ−クレゾールである。数例において、配合剤中のフェノールの重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)は、ｍ−クレゾールの重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)を超える。これは、少なくとも一部、フェノールと比較して、特に高温で、溶液でｍ−クレゾールがヒアルロナン分解酵素(例えばｒＨｕＰＨ２０) の安定性により悪影響を有するためである(例えば実施例７参照)。それ故に、ここに提供する配合剤において、フェノール：メタ−クレゾールの重量濃度のパーセンテージとしての比率は正確にまたは約１：１、１.１：１、１.２：１、１.３：１、１.４：１、１.５：１、１.６：１、１.７：１、１.８：１、１.９：１、２：１、２.１：１、２.２：１、２.３：１、２.４：１、２.５：１、２.６：１、２.７：１、２.８：１、２.９：１、３：１またはそれ以上である。

数例において、ここで提供される安定な配合剤は正確にまたは約０.１％〜０.２５％フェノール、および正確にまたは約０.０５％〜０.２％ｍ−クレゾール、例えば正確にまたは約０.１０％〜０.２％フェノールおよび正確にまたは約０.０６％〜０.１８％ｍ−クレゾールまたは正確にまたは約０.１％〜０.１５％フェノールおよび正確にまたは約０.０８％〜０.１５％ｍ−クレゾールを含む。例えば、ここで提供される安定な配合剤は、正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール；０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾール；０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール；０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール；０.１３％フェノールおよび０.０８％ｍ−クレゾール；０.１５％フェノールおよび０.１７５％ｍ−クレゾール；または０.１７％フェノールおよび０.１３％ｍ−クレゾールを含む。

ｄ. ＮａＣｌ
ここで提供されるインスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤は安定化剤としてＮａＣｌを含み得る。安定化剤としてＮａＣｌを含むここに提供する配合剤において、配合剤のＮａＣｌ濃度は正確にまたは約５０mM〜２００mM、例えば正確にまたは約８０mM〜１４０mM、８０mM〜１２０mM、８０mM〜１００mM、１００mM〜１４０mMまたは１２０mM〜１４０mMであり得る。例えば、ここに提供されるのは、約または少なくともまたは５０mM、６０mM、７０mM、８０mM、８５mM、９０mM、９５mM、１００mM、１０５mM、１１０mM、１１５mM、１２０mM、１２５mM、１３０mM、１３５mM、１４０mM、１５０mM、１６０mM、１７０mM、１８０mM、１９０mMまたは２００mMのＮａＣｌを含むインスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤である。

加えて、本発明により、インスリン類は、一般的に高ＮａＣｌ濃度および低ｐＨ条件で十分溶解性ではないが、そこでヒアルロナン分解酵素活性は最適であり、インスリンの溶解性は高温の加速条件下でＮａＣｌにほとんど影響されないことが判明した。それ故に、加速条件(例えば高温または撹拌)下、例えばＣＳＩＩ治療で使用されるものの下で安定な配合剤は、典型的に３２℃未満の温度で安定である製剤より高ＮａＣｌ濃度である。

ここに提供する配合剤において、配合剤の特定のｐＨがＮａＣｌ濃度の関数であり、その逆も真であることもまた理解されるべきである。例えば、ｐＨ正確にまたは約７.２、例えば７.２±０.２または以下の配合剤において、配合剤は、一般的に正確にまたは約１００mM〜１４０mMの塩濃度を有する。ｐＨ正確にまたは約７.３、例えば７.３±０.２またはそれ以上の配合剤において、配合剤は、一般的に正確にまたは約５０〜１００mMのＮａＣｌの塩濃度を有する。

また、本明細書における実施例に示すとおり、インスリンおよびインスリン類似体は各々種々の溶解性要求を融資、それは、製剤中のＮａＣｌおよびｐＨのレベルに影響される。一般的に、インスリンおよびインスリンの溶解性は高ｐＨおよび低塩高ＮａＣｌ濃度を好む。例えば、レギュラーインスリンは、８０mMを超えるおよび低ｐＨ７.０で１週間以内に沈殿を形成する。しかし、レギュラーインスリンは、ＮａＣｌ濃度の８０mM以下および高ｐＨ７.６で１５ヶ月間を超える試験したあらゆる期間で沈殿を形成しない。同様に、インスリン類似体リスプロおよびアスパルトも溶解性に対する塩−およびｐＨ−依存的を有し、沈殿は、一般的に８０mMを超える塩濃度および７.２または７.０の低ｐＨで形成される。対照的に、８０mM以下の低塩濃度および７.４または７.６の高ｐＨで、インスリン類は大きな安定性を示し、一定時間でほとんど沈殿せず、または全く沈殿しない。インスリングルリジンは最も溶解性である。それ故に、最低の溶解性インスリン類は最も溶解性のインスリン類と比較して、塩にほとんど許容性ではない。それ故に、種々のインスリン類の見かけの溶解性の差異のため、ここに提供する製剤の塩濃度は、インスリンの溶解性が直接塩の許容性と関連するために、製剤中のインスリンの種類に依存し得る。

本明細書の記載の点から、ここに記載するインスリンおよびヒアルロナン分解酵素群の溶解性および安定性を経験的にＮａＣｌ濃度、特定のインスリンおよび特定の製剤の必要な安定性パラメータの関数として評価することは当業者のレベルの範囲内である。

ｅ. ｐＨ
ここに提供されるのは、正確にまたは約６.５〜８.０、例えば、６.５〜７.８または６.８〜７.８、例えば正確にまたは約６.５〜７.５または７.０〜７.６のｐＨを有するインスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤である。本明細書でのｐＨについての言及は、室温でのｐＨ測定に基づく。ｐＨは保存中時間的に変わり得るが、典型的に正確にまたは約ｐＨ６.５〜８.０、例えば正確にまたは約６.８〜または〜約７.８のままであることは理解される。例えば、ｐＨは±０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.２、１.３、１.４、１.５またはそれ以上で変わり得る。それ故に、約または少なくともｐＨ７.０、７.１、７.２、７.３、７.４または７.６のｐＨである配合剤への言及は、調製時約または少なくとも７.０±０.２、７.１±０.２、７.２±０.２、７.３±０.２、７.４±０.２、７.５±０.２または７.６±０.２のｐＨｏｆを有する配合剤を含む。

塩およびｐＨの両者とも、インスリンの溶解性およびヒアルロナン分解酵素活性に影響を与える相反するパラメータであるため、配合剤におけるそれらの導入は従ってバランスを取らなければならない。それ故に、例えば、一般的に、ここに提供する製剤において、塩濃度を下げ、ｐＨを上げる。ここに提供する配合剤の他の例において、塩濃度を上げ、ｐＨを下げる。ここに記載するとおり所望の安定性を達成し、かつヒアルロナン分解酵素活性およびインスリンの溶解性を保持するように０におけるｐＨおよび塩要求を経験的に試験することは当業者のレベルの範囲内である。例えば、最適ｐＨおよび塩要求は、当業者に知られ、かつ本明細書に例示する製剤技術により達成できる。例えば、最適ｐＨおよび塩濃度は、ヒアルロナン分解酵素の活性または回収およびインスリンの溶解性、凝集または回収を、例えば、セクションＨ.２に記載のとおり、当業者に知られる種々の方法を使用する種々のｐＨまたは塩条件下に評価することにより決定できる。

例えば、本明細書の他の場所に記載するとおり、本発明により、インスリン類は、一般的に高塩濃度および低ｐＨ条件で十分溶解性ではないが、そこでヒアルロナン分解酵素活性は最適であり、インスリンの溶解性は高温の加速条件下、低ｐＨ条件にほとんど影響されないことが判明した。それ故に、加速条件(例えば高温または撹拌)下、例えばＣＳＩＩ治療で使用されるものの下安定な配合剤は、典型的に、３２℃未満の温度で安定である製剤より低ｐＨである。

必要であれば、ｐＨを、ｐＨを下げるための酸性化剤またはｐＨを上げるためのアルカリ化剤を使用して調製できる。酸性化剤の例は、酢酸、クエン酸、硫酸、塩酸、リン酸二水素ナトリウム溶液、およびリン酸を含むが、これらに限定されない。アルカリ化剤の例は、リン酸水素ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリウムを含むが、これらに限定されない。

ｆ. 緩衝剤
あらゆる緩衝剤を、配合剤の安定性に不利に影響せず、必要ｐＨ範囲要求を支持する限り、ここに提供する配合剤において使用できる。特に適当な緩衝剤の例は、Ｔｒｉｓ、コハク酸、酢酸、リン酸緩衝液、クエン酸、アコニテート、マレートおよびカーボネートを含む。しかしながら、当業者は、ここに提供される製剤は、緩衝剤が許容される程度のｐＨ安定性、または示す範囲の“緩衝能”を提供する限り、特定の緩衝剤に限定されないことを認識する。一般的に、緩衝剤は、そのｐＫの約１ｐＨ単位以内で適切な緩衝能を有する(Lachman et al. 1986)。緩衝剤適合性は、公開されているｐＫ集計により推定でき、または当分野で周知の方法により経験的に決定できる。溶液のｐＨは、例えば、あらゆる許容される酸または塩基を使用して、上記範囲内の所望のエンドポイントに調節できる。

ここに提供する配合剤において包含できる緩衝剤は、Ｔｒｉｓ(トロメタミン)、ヒスチジン、リン酸緩衝液、例えばリン酸水素ナトリウム、およびクエン酸緩衝剤を含むが、これらに限定されない。一般的に、緩衝剤は、配合剤のｐＨ範囲を正確にまたは約６.５〜８.０、例えば正確にまたは約６.８〜７.８、例えば正確にまたは約７.０〜７.６に維持する量で存在する。このような緩衝剤は、配合剤中に正確にまたは約１mM〜１００mM、例えば１０mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mM、例えば正確にまたは約３０mMで存在できる。例えば、このような緩衝剤は配合剤中に正確にまたは約または少なくとも１mM、２mM、３mM、４mM、５mM、６mM、７mM、８mM、９mM、１０mM、１１mM、１２mM、１３mM、１４mM、１５mM、１６mM、１７mM、１８mM、１９mM、２０mM、２５mM、３０mM、３５mM、４０mM、４５mM、５０mM、５５mM、６０mM、６５mM、７０mM、７５mM、またはそれ以上の濃度で存在できる。

本発明の配合剤中の緩衝剤の例は、金属結合性緩衝剤、例えばリン酸緩衝液と比較して、インスリン沈殿を減少させるＴｒｉｓのような非金属結合性緩衝剤である。ここに提供する配合剤における緩衝剤としてのＴｒｉｓの包含は、付加的利益を有する。例えば、Ｔｒｉｓで緩衝化した溶液ｐＨは、溶液を維持する温度に影響される。それ故に、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素配合剤を室温でｐＨ７.３で調製したとき、冷蔵により、ｐＨは約ｐＨ７.６まで上がる。このようなｐＨは、インスリンがそうでなければ不溶性である可能性のある温度でインスリンの溶解性を促進する。逆に、高温で、製剤のｐＨは約ｐＨ７.１まで下がり得て、それはヒアルロナン分解酵素がそうでなければ不安定となる可能性のある温度で酵素の安定性を促進する。それ故に、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の溶解性および安定性は、他の緩衝剤と比較して、配合剤が緩衝剤としてのＴｒｉｓを含むとき最大である。さらに、Ｔｒｉｓが陽イオンであるため、カウンターイオンとしてのＮａＣｌの溶液への添加は不要である。これは、高濃度のＮａＣｌが〜インスリンの溶解性に有害であるため、配合剤の全体的安定性にも有利である。

例えば、Ｔｒｉｓは、ここに提供する配合剤において正確にまたは約１０mM〜５０mM、例えば、例えば、１０mM、１５mM、２０mM、２５mM、３０mM、３５mM、４０mM、４５mMまたは５０mMの濃度で含まれる。具体例において、配合剤は正確にまたは約２０mM〜３０mMのＴｒｉｓ、例えば２１mM、２２mM、２３mM、２４mM、２５mM、２６mM、２７mM、２８mM、２９mMまたは３０mMのＴｒｉｓを含む。具体例において、ここに提供する配合剤はＴｒｉｓを正確にまたは約３０mMの濃度で含む。

ｇ. Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
本明細書における例において、配合剤は、本配合剤中のヒアルロナン分解酵素を安定化するのに十分量の二価カチオン、および特にリシル−リシン(ジリシン；Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)、またはその塩、誘導体、類似体または模倣体を含む。例えば、二価カチオンＬｙｓ−Ｌｙｓは、ＭｇＣｌ_２よりもインスリンの溶解性に対する影響が少ない。Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、上記のとおり、防腐剤、および他の安定化剤と、適当なｐＨで組み合わせたとき、上記のとおりヒアルロナン分解活性が効果を維持し、インスリンの溶解性に対する影響が最少であるような安定な配合剤を生じる量で存在する。

例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、ここに提供する配合剤に正確にまたは約５０mM〜１２０mM、例えば正確にまたは約５０〜８０mM、８０〜１００mMまたは１００〜１２０mMの量で包含され得る。例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、ここに提供する配合剤において少なくともまたは少なくとも約または正確に５０mM、６０mM、７０mM、８０mM、９０mM、１００mM、１１０mMまたは１２０mMの量で包含され得る。

典型的に、Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度が高いほど、ＰＨ２０およびインスリンまたはインスリン類似体を含む配合剤の安定性は良好である。しかしながら、製剤中の特定の量のＬｙｓ−Ｌｙｓは特定のインスリンの関数であり得る。例えば、配合剤において類似の安定性を達成するために、インスリン類似体グルリジンは最少量のＬｙｓ−Ｌｙｓ(例えば５０〜１０５mM)を必要とし、続いてインスリン類似体アスパルトおよびリスプロ(例えば８０〜１００mM)であり、レギュラーインスリンは最高量(例えば１００〜１２０mM)を必要とする。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ濃度、特定のインスリンおよび特定の製剤の必要な安定性パラメータの関数として、ここに記載するインスリンおよびヒアルロナン分解酵素群の溶解性および安定性を経験的に評価することは、当業者のレベルの範囲内である。

一例において、レギュラーインスリンを含む配合剤は、一般的に１００〜１２０mMのＬｙｓ−Ｌｙｓ、例えば少なくともまたは凡そ少なくともまたは１００mM、１０５mM、１１０mM、１１５mMまたは１２０mMを含む。他の例において、インスリンアスパルトまたはインスリンリスプロを含む配合剤は、８０〜１２０mMのＬｙｓ−Ｌｙｓ、例えば少なくともまたは凡そ少なくともまたは８０mM、８５mM、９０mM、９５mMまたは１００mMを含む。さらなる例において、インスリングルリジンを含む配合剤は、５０〜１０５mMのＬｙｓ−Ｌｙｓ、例えば少なくともまたは凡そ少なくともまたは５０mM、５５mM、６０mM、６５mM、７０mM、７５mM、８０mM、８５mM、９０mM、９５mM、１００mMまたは１０５mMを含む。

典型的に、配合剤がＬｙｓ−Ｌｙｓを含む例において、成分の安定性を維持するための安定化剤としてのＮａＣｌの添加は必要ではない。数例において、浸透圧修飾剤が張性の理由のために必要である。例えば、配合剤中のＬｙｓ−Ｌｙｓの量が５０mM未満／mLであり、浸透圧修飾剤が必要であり得る。浸透圧修飾剤を配合剤に包含するか否かの決定は当業者のレベルの範囲内である。下記のとおり、浸透圧修飾剤の例は、グリセリン、ＮａＣｌ、アミノ酸類、ポリアルコール類、トレハロース、および他の塩類および／または糖類を含むが、これらに限定されない。それ故に、数例において、Ｌｙｓ−Ｌｙｓを含むここで提供される安定な配合剤は、所望によりＮａＣｌも含み得る。このような例において、ＮａＣｌは一般的に１４０mM未満、および典型的に１００mM未満、９０mM、８０mM、７０mM、５０mM、４０mM、３０mM、２０mM、１０mM以下である。浸透圧修飾剤の特定の量は、酵素活性および／または張性を維持するために経験的に決定できる。

ｈ. 付加的な添加物または安定化剤の例
ここに提供する配合剤は、所望により、上記のとおり防腐剤と、塩および安定化剤と適当なｐＨで組み合わせたとき、安定な配合剤を生じる他の成分を含み得る。他の成分は、例えば、１種以上の浸透圧修飾剤、１種以上の抗酸化剤、亜鉛または他の安定化剤を含む。

例えば、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定性は、配合剤が低ＮａＣｌ、高ｐＨであり、防腐剤を含み、高温(例えば２０℃〜３０℃以上)で保存するとき、大きく低下する。同様に、インスリン安定性はまたこれらおよび他のパラメータに影響を受け得る。このような不安定性は、１種以上の安定化剤の添加によりある程度解消できる。一般的に、ここに提供する製剤は、１種または複数種の安定化剤を、保存(温度および時間)中、少なくとも５０％の初期活性(例えば３７５Ｕ／mL)のヒアルロナン分解酵素活性が維持される濃度で存在する。

ここに提供される製剤に包含できる安定化剤の種類に包含されるのは、アミノ酸類、アミノ酸誘導体、アミン類、糖類、ポリオール類、塩類および緩衝剤、界面活性剤、および他の薬剤である。ここに提供する配合剤は少なくとも１種の安定化剤を含む。例えば、ここに提供する配合剤は少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種以上の安定化剤を含む。それ故に、アミノ酸類、アミノ酸誘導体、アミン類、糖類、ポリオール類、塩類および緩衝剤、界面活性剤、および他の薬剤の任意の１種以上を本発明の配合剤に包含できる。一般的に、本発明の配合剤は、少なくとも界面活性剤および適当な緩衝剤を含む。所望により、ここに提供する配合剤は他の付加的安定化剤を含み得る。

アミノ酸安定化剤、アミノ酸誘導体またはアミン類の例は、Ｌ−アルギニン、グルタミン、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、トリメチルアミンオキシド(ＴＭＡＯ)またはベタインを含むが、これらに限定されない。糖類およびポリオール類の例は、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、スクロースまたはトレハロースを含むが、これらに限定されない。塩類および緩衝剤の例は、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、例えばＴｒｉｓ(１００mM)、または安息香酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。界面活性剤の例は、ポロクサマー１８８(例えばPLURONIC(登録商標)Ｆ６８)、ポリソルベート８０(ＰＳ８０)、ポリソルベート２０(ＰＳ２０)を含むが、これらに限定されない。他の防腐剤は、ヒアルロン酸(ＨＡ)、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、フェニル酪酸、タウロコール酸、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)または亜鉛を含むが、これらに限定されない。

ｉ. 界面活性剤
数例において、ここに提供する配合剤は１種以上の界面活性剤を含む。このような界面活性剤はヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の凝集を阻害し、吸着損失を最小化する。界面活性剤は、一般的に非イオン性界面活性剤である。本発明の配合剤に包含できる界面活性剤は、多価アルコール類、例えばグリセロール、またはソルビトールの部分的および脂肪酸エステル類およびエーテル類、ポロクサマー類およびポリソルベート類を含む。例えば、本発明の配合剤中の界面活性剤の例は、ポロクサマー１８８(PLURONICS(登録商標)、例えばPLURONIC(登録商標)Ｆ６８)、TETRONICS(登録商標)、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、PEG400、PEG3000、Tween(登録商標)(例えばTween(登録商標)２０またはTween(登録商標)８０)、Triton(登録商標)X-100、SPAN(登録商標)、MYRJ(登録商標)、BRIJ(登録商標)、CREMOPHOR(登録商標)、ポリプロピレングリコール類またはポリエチレングリコール類のあらゆる１種類以上を含む。数例において、本発明の配合剤はポロクサマー１８８、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、一般的にポロクサマー１８８(PLURONIC F68)を含む。ここに提供する配合剤は、一般的に少なくとも１種の界面活性剤、例えば１種、２種または３種の界面活性剤を含む。

ここに提供する配合剤において、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての１種以上の界面活性剤の総量は、例えば、正確にまたは約０.０００５％〜１.０％、例えば正確にまたは約０.０００５％〜０.００５％、０.００１％〜０.０１％、０.０１％〜０.５％、例えば０.０１％〜０.１％または０.０１％〜０.０２％であり得る。一般的に、配合剤は少なくとも０.０００５％、０.００５％、０.０５％または０.０１％界面活性剤を含み、１.０％未満、例えば０.５％未満または０.１％未満界面活性剤を含む。例えば、ここに提供する配合剤は正確にまたは約０.０００５％、０.０００１％、０.００５％、０.００１％、０.００５％、０.０１％、０.０１５％、０.０２％、０.０２５％、０.０３％、０.０３５％、０.０４％、０.０４５％、０.０５％、０.０５５％、０.０６％、０.０６５％、０.０７％、０.０８％、または０.０９％界面活性剤を含み得る。具体例において、ここに提供する配合剤は正確にまたは約０.０１％〜または〜約０.０５％界面活性剤を含み得る。

本明細書の実施例に示すとおり、安定性および酵素ヒアルロナン分解酵素活性(例えばｒＨｕＰＨ２０)は、一般的に種々の界面活性剤または界面活性剤濃度に影響されない。それにもかかわらず、本発明で、酵素の酸化が界面活性剤のレベルが上がるにつれて上がることが判明した。また、界面活性剤ポロクサマー１８８は、ポリソルベート類より少ない酸を生じる。それ故に、本発明の配合剤は、一般的にポロクサマー１８８を含む。それ故に、界面活性剤がヒアルロナン分解酵素を安定化させるが、ここに提供する配合剤における界面活性剤の包含は、高濃度でヒアルロナン分解酵素の酸化をもたらし得る。それ故に、一般的に低濃度の界面活性剤を本発明の配合剤で使用し、例えば、１.０％未満および一般的に正確にまたは約０.０００５％〜０.１％、例えば正確にまたは約０.０１％または０.０５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)である。また、下記のとおり、所望により、酸化防止剤を製剤に包含し、酸化を減少または阻止できる。

ここに提供する配合剤の例は、ポロクサマー１８８を含む。ポロクサマー１８８は高臨界ミセル濃度(cmｃ)を有する。それ故に、ポロクサマー１８８の使用は、防腐剤の有効性を低下させ得る、製剤中のミセル形成を減少できる。それ故に、ここに提供される配合剤の中で、正確にまたは約０.０１％または０.０５％ポロクサマー１８８を含む。

他の例において、ここに提供する配合剤の例はポリソルベート２０を含む。例えば、ここに提供する配合剤は０.０００５％〜０.１％、例えば０.０００５％〜０.０１％、例えば少なくともまたは凡そ少なくともまたは０.００１％ポリソルベート２０を含む。

ii. 浸透圧修飾剤
例えば、浸透圧修飾剤は、ここに提供する製剤において所望のモル浸透圧濃度の溶液を提供するために包含され得る。ここに提供する配合剤は正確にまたは約２４５mOsm／kg〜３０５mOsm／kgのモル浸透圧濃度を有する。例えば、モル浸透圧濃度は正確にまたは約２４５mOsm／kg、２５０mOsm／kg、２５５mOsm／kg、２６０mOsm／kg、２６５mOsm／kg、２７０mOsm／kg、２７５mOsm／kg、２８０mOsm／kg、２８５mOsm／kg、２９０mOsm／kg、２９５mOsm／kg、３００mOsm／kgまたは３０５mOsm／kgである。数例において、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の配合剤は正確にまたは約２７５mOsm／kgのモル浸透圧濃度を有する。

浸透圧修飾剤は、グリセリン、ＮａＣｌ、アミノ酸類、ポリアルコール類、トレハロース、および他の塩類および／または糖類を含むが、これらに限定されない。例えば、ＮａＣｌは、ここに提供する配合剤において正確にまたは約０mM〜２００mM、例えば一般的に３０mM〜１００mM、５０mM〜１６０mM、例えば５０mM〜１２０mMまたは８０mM〜１４０mM、または５０mM〜２００mMの濃度で包含され得る。典型的に、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓを含む配合剤において、浸透圧修飾剤として包含されるとき、ＮａＣｌは１４０mM未満、および一般的に１３０mM未満、１２０mM、１１０mM、１００mM、９０mM、８０mM、７０mM、６０mM、５０mM、４０mM、３０mM、２０mM、１０mM以下の濃度で包含される。特定の量は、酵素活性、インスリンの溶解性および／または張性を保持するために経験的に決定できる。

iii. グリセリン
他の例において、グリセリン(グリセロール)は配合剤に包含される。例えば、ここに提供する配合剤は、典型的に６０mM未満 グリセリン、例えば５５mM未満、５０mM未満、４５mM未満、４０mM未満、３５mM未満、３０mM未満、２５mM未満、２０mM未満、１５mM未満、１０mM以下を含む。グリセリン量は、典型的に存在するＮａＣｌ量による。配合剤に存在するＮａＣｌが多いほど、所望のモル浸透圧濃度の達成に必要なグリセリンは少ない。それ故に、例えば、高ＮａＣｌ濃度を含む配合剤において、例えば高い見かけの溶解性を有するインスリン類(例えばインスリングルリジン)で製剤されたものにおいて、製剤に包含するのに必要なグリセリンはわずかであるか、必要ない。対照的に、わずかに低ＮａＣｌ濃度を含む配合剤において、例えば低い見かけの溶解性を有するインスリン類(例えばインスリンアスパルト)で製剤されたものにおいて、グリセリンは包含され得る。例えば、インスリンアスパルトを含むここに提供する配合剤は、グリセリンを５０mM未満、例えば２０mM〜５０mM、例えば正確にまたは約５０mMの濃度で含む。さらに低いＮａＣｌ濃度を含む配合剤において、例えばさらに低い見かけの溶解性を有するインスリン類(例えばインスリンリスプロまたはレギュラーインスリン)で製剤されたものにおいて、グリセリンは正確にまたは約、例えば４０mM〜６０mMの濃度で包含され得る。

iv. 抗酸化剤
ここに提供する配合剤はまた酸化、特にヒアルロナン分解酵素の酸化を減少または阻止するために抗酸化剤も含み得る。例えば、本明細書の実施例は、酸化が高濃度の界面活性剤またはヒアルロナンオリゴマー類で起こり得ることを示す。抗酸化剤の例は、システイン、トリプトファンおよびメチオニンを含むが、これらに限定されない。具体例において、抗酸化剤はメチオニンである。インスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)を含むここに提供する配合剤は、抗酸化剤を正確にまたは約５mM〜または〜約５０mM、例えば５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mMの濃度で含み得る。例えば、メチオニンは、本発明の配合剤に正確にまたは約５mM〜または〜約５０mM、例えば５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mMの濃度で存在できる。例えば、抗酸化剤、例えばメチオニン、は、正確にまたは約５mM、１０mM、１１mM、１２mM、１３mM、１４mM、１５mM、１６mM、１７mM、１８mM、１９mM、２０mM、２１mM、２２mM、２３mM、２４mM、２５mM、２６mM、２７mM、２８mM、２９mM、３０mM、３５mM、４０mM、４５mMまたは５０mMの濃度で存在できる。数例において、配合剤は１０mM〜２０mMのメチオニン、例えば正確にまたは約１０mMまたは２０mMのメチオニンを含む。

ｖ. 亜鉛
ある例において、亜鉛は、配合剤にインスリン六量体の安定化剤として包含される。例えば、レギュラーインスリン、インスリンリスプロまたはインスリンアスパルトを含む製剤は典型的に亜鉛を含み、一方インスリングルリジンを含む製剤は亜鉛を含まない。亜鉛は、例えば、酸化亜鉛、酢酸亜鉛または塩化亜鉛として提供され得る。亜鉛は、ここに提供する組成物において、正確にまたは約０.００１〜０.１mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)、０.００１〜０.０５mg／１００Ｕまたは０.０１〜０５mg／１００Ｕで存在し得る。例えば、ここに提供する配合剤は、亜鉛を正確にまたは約０.００２mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)、０.００５mg／１００Ｕ、０.０１mg／１００Ｕ、０.０１２mg／１００Ｕ、０.０１４mg／１００Ｕ、０.０１６mg／１００Ｕ、０.０１７mg／１００Ｕ、０.０１８mg／１００Ｕ、０.０２mg／１００Ｕ、０.０２２mg／１００Ｕ、０.０２４mg／１００Ｕ、０.０２６mg／１００Ｕ、０.０２８mg／１００Ｕ、０.０３mg／１００Ｕ、０.０４mg／１００Ｕ、０.０５mg／１００Ｕ、０.０６mg／１００Ｕ、０.０７mg／１００Ｕ、０.０８mg／１００Ｕまたは０.１mg／１００Ｕ含み得る。

vi. アミノ酸安定化剤
ここに提供する配合剤はまた、製剤安定性に寄与するアミノ酸安定化剤も含み得る。安定化剤は非極性および塩基性アミノ酸であり得る。非極性および塩基性アミノ酸類の例は、アラニン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、オルニチン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グリシンおよびプロリンを含むが、これらに限定されない。例えば、アミノ酸安定化剤はグリシンまたはプロリン、典型的にグリシンである。安定化剤は１種のアミノ酸であってよく、または２種以上のこのようなアミノ酸類の組み合わせであり得る。アミノ酸安定化剤は天然アミノ酸類、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸類またはアミノ酸等価体であり得る。一般的に、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。例えば、プロリンを安定化剤として使用するとき、一般的にＬ−プロリンである。アミノ酸等価体、例えば、プロリン類似体を使用することも可能である。配合剤に包含されるアミノ酸安定化剤、例えばグリシンの濃度は、０.１Ｍ〜１Ｍアミノ酸、典型的に０.１Ｍ〜０.７５Ｍ、一般的に０.２Ｍ〜０.５Ｍ、例えば、少なくとも正確にまたは約０.１Ｍ、０.１５Ｍ、０.２Ｍ、０.２５Ｍ、０.３Ｍ、０.３５Ｍ、０.４Ｍ、０.４５Ｍ、０.５Ｍ、０.６Ｍ、０.７Ｍ、０.７５Ｍまたはそれ以上の範囲である。アミノ酸、例えばグリシンは薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩などの形で使用できる。アミノ酸、例えばグリシンの純度は少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９.５％またはそれ以上でなければならない。

vii. ヒアルロニダーゼ阻害剤
ここに提供する配合剤の数例において、上記のとおりヒアルロナン分解酵素および速効性のインスリンの安定性正確にまたは約２０℃〜または〜約３０℃の温度で少なくとも１４日間(すなわち２週間の安定性は、ヒアルロニダーゼ阻害剤の包含により上昇させ得る。このような阻害剤は、一般的に、ここで使用するヒアルロナン(ＨＡ)で観察されるとおり、低温でインスリン凝集体をもたらし得るために、２℃〜８℃で保存する製剤には不適である。数例において、ヒアルロニダーゼ阻害剤を、２℃〜８℃での使用に適切なように選択できる。

特に、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、配合剤にフェノール防腐剤の影響に対してヒアルロナン分解酵素を安定化するために包含される。具体例において、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、インスリンまたはヒアルロナン分解酵素と、結合性および非共有結合性方法で反応し、インスリンまたはヒアルロナン分解酵素と共有結合複合体を形成しないものである。ヒアルロニダーゼ阻害剤は、少なくともその平衡濃度で存在する。当業者は、種々のクラスのヒアルロニダーゼ阻害剤をよく知っている(例えばGirish et al. (2009) Current Medicinal Chemistry, 16:2261-2288、およびその中の引用文献参照)。当業者は、反応または本発明の安定な組成物におけるヒアルロニダーゼ阻害剤の平衡濃度を知っているか、または当分野の標準方法により決定できる。ヒアルロニダーゼ阻害剤の選択は、組成物で使用される特定のヒアルロナン分解酵素による。例えば、ヒアルロナンは、ヒアルロナン分解酵素がＰＨ２０であるとき、本発明の安定な組成物で使用される例示的ヒアルロニダーゼ阻害剤である。

本発明で安定化剤として使用されるヒアルロニダーゼ阻害剤の例は、タンパク質、グリコサミノグリカン(ＧＡＧ)、多糖類、脂肪酸、ラノスタノイド類、抗生物質、抗線虫剤、合成有機化合物または植物由来生理活性成分を含むが、これらに限定されない。例えば、ヒアルロニダーゼ植物由来生理活性成分はアルカノイド、抗酸化剤、ポリフェノール、フラボノイド類、テルペノイド類および抗炎症剤であり得る。ヒアルロニダーゼ阻害剤の例は、例えば、血清ヒアルロニダーゼ阻害剤、アシュワガンダ(Withania somnifera)糖タンパク質(ＷＳＧ)、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、キトサン類、β−(１,４)−ガラクト−オリゴ糖類、硫酸化ベルバスコース、硫酸化プランテオース、ペクチン、ポリ(スチレン−４−スルホネート)、デキストラン硫酸、アルギン酸ナトリウム、ワカメ(Undaria pinnatifida)由来の多糖、マンデル酸縮合重合体、エイコサトリエン酸、ネルボン酸、オレアノール酸、アリストロキン酸、アジマリン、レセルピン、フラボン、デスメトキシセンタウレイジン、ケルセチン、アピゲニン、ケンフェロール、シリビン、ルテオリン、ルテオリン−７−グルコシド、フロレチン、アピイン、ヘスペリジン、スルホン化ヘスペリジン、カリコシン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フラボン−７−硫酸ナトリウム、フラボン７−フルオロ−４’−ヒドロキシフラボン、４’−クロロ−４,６−ジメトキシカルコン、５−ヒドロキシフラボン−７−硫酸ナトリウム、ミリセチン、ルチン、モリン、グリチルリジン、ビタミンＣ、Ｄ−イソアスコルビン酸、Ｄ−糖酸１,４−ラクトン、Ｌ−アスコルビン酸−６−ヘキサデカノエート(Vcpal)、６−Ｏ−アシル化ビタミンＣ、カテキン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、クルクミン、没食子酸Ｎ−プロピル、タンニン酸、エラグ酸、没食子酸、フロロフコフレッコールＡ、ジエコール、８,８’−ビエコール、プロシアニジン、ゴシポール、セレコキシブ、ニメスリド、デキサメサゾン、インドメタシン(indomethcin)、フェノプロフェン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、サリチレート、クロモグリク酸二ナトリウム、金チオリンゴ酸ナトリウム、transilist、トラキサノクス、イベルメクチン、リンコマイシン(linocomycin)およびスペクチノマイシン、スルファメトキサゾールおよびトリメトプリム(trimerthoprim)、ネオマイシン硫酸塩、３α−アセチルポリポレン酸Ａ、(２５Ｓ)−(＋)−１２α−ヒドロキシ−３α−メチルカルボキシアセテート−２４−メチルラノスタ−８,２４(３１)−ジエン−２６−オイック酸、ラノスタノイド、ポリポレン酸ｃ、ＰＳ５３(ヒドロキノン−スルホン酸−ホルムアルデヒドポリマー)、ポリ(スチレン−４−スルホネート)のポリマー、VERSA-TL 502、１−テトラデカンスルホン酸、マンデル酸縮合重合体(ＳＡＭＭＡ)、１,３−ジアセチルベンゾイミダゾール−２−チオン、Ｎ−モノアシル化ベンズイミダゾール−２チオン、Ｎ,Ｎ’−ジアシル化ベンズイミダゾール−２−チオン、アルキル−２−フェニルインドール誘導体、３−プロパノイルベンゾオキサゾール−２−チオン、Ｎ−アルキル化インドール誘導体、Ｎ−アシル化インドール誘導体、ベンゾチアゾール誘導体、Ｎ−置換インドール−２−および３−カルボキサミド誘導体、Ｎ−置換インドール−２−および３−カルボキサミド誘導体のハロゲン化類似体(クロロおよびフルオロ)、２−(４−ヒドロキシフェニル)−３−フェニルインドール、インドールカルボキサミド類、インドールアセトアミド類、３−ベンゾリル−１−メチル−４−フェニル−４−ピペリジノール、ベンゾイルフェニルベンゾエート誘導体、ｌ−アルギニン誘導体、グアニジウムＨＣＬ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＨＣＮ、リナマリン、アミグダリン、ヘデラゲニン、エスチン、ＣＩＳ−ヒノキレシノールおよび１,３−ジ−ｐ−ヒドロキシフェニル−４−ペンテン−１−オンを含む。

数例において、ヒアルロニダーゼ阻害剤である安定化剤は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン(glurcuronic)酸の多糖である。他の例において、ヒアルロニダーゼ阻害剤である安定化剤は、負に荷電された糖を有するアミン糖である。さらなる例において、ヒアルロニダーゼ阻害剤である安定化剤は、アミノメチルインドールまたはアスコルビン酸誘導体である。

ここに提供する配合剤の例は、ヒアルロナン(ヒアルロン酸；ＨＡ)である安定化剤を含む。ヒアルロン酸(ＨＡ、ヒアルロナンおよびヒアルロナートとしても知られる)は、ヒアルロナン分解酵素群、例えばヒアルロニダーゼ、例えばｒＨｕＰＨ２０を含むＰＨ２０の天然基質である。ＨＡは、結合組織、上皮組織、および神経組織に広く分布する非硫酸化グリコサミノグリカンである。最大２５,０００二糖単位のポリマーであり、それ自体Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンから成る。ＨＡの分子量は約５kDa〜２００,０００kDaの範囲である。ヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ｒＨｕＰＨ２０(および他のヒアルロニダーゼ群およびヒアルロナン分解酵素群) はヒアルロナンの粘度を下げ、それにより組織透過性を高め、非経腸的に投与された流体の吸収速度を上げる。

ここで証明されるとおり、ヒアルロン酸(ＨＡ)は、例えば、低塩、高ｐＨ、防腐剤存在および高温のような、他脱安定化剤および条件の存在下でヒアルロナン分解酵素群の安定化剤である。特に、ＨＡは、高ｐＨおよび／または高温が典型的にｒＨｕＰＨ２０および他の可溶性ヒアルロニダーゼ群およびヒアルロナン分解酵素群に、特にフェノール防腐剤に有する負の影響を減らすか、無くすように見える。例えば、下記試験に示されるとおり(例えば実施例１０Ｄおよび実施例１５参照)、ｒＨｕＰＨ２０安定性は、ＨＡオリゴマー類(４〜１６量体)がインスリン配合剤に包含されているとき、顕著に増加する。ＨＡ濃度を上げると、安定化特性は上がる。例えば、１mg／mLのＨＡおよび７５mMのＮａＣｌと共に１週間、３０℃でｐＨ７.１の後、ｒＨｕＰＨ２０／インスリン配合剤のｒＨｕＰＨ２０活性は６００Ｕ／mLから３４１Ｕ／mLに減少した(すなわち元の活性の５７％保持)。ＨＡ濃度を１０mg／mLに上げたとき、ｒＨｕＰＨ２０活性は６００Ｕ／mLから５１０Ｕ／mLまでしか減少しなかった(すなわち元の活性の８５％保持)。さらに、ＨＡは、高ｐＨがｒＨｕＰＨ２０に有する脱安定化効果を減少させるか、無くす。例えば、５.５mg／mLのＨＡおよび１００mMのＮａＣｌと共に１週間、３０℃でｐＨ７.１の後、元のｒＨｕＰＨ２０の６８％が残った。このパーセンテージは、ｐＨを７.５まで上げても本質的に変化しなかった。ＨＡのｒＨｕＰＨ２０ｒＨｕＰＨ２０の安定性に対する類似の正の効果が、高温でも観察された(例えば実施例１５参照)。それ故に、本発明で、ＨＡは、ｒＨｕＰＨ２０を有効に安定化するために、インスリンおよびｒＨｕＰＨ２０(または他の可溶性ヒアルロニダーゼ群およびヒアルロナン分解酵素群)の製剤に包含できることが決定された。

それ故に、ここに提供されるのは、ＨＡを含む配合剤である。あらゆるサイズのＨＡが、組成物において安定化剤として使用できる。数例において、ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンから成る二糖である。他の例において、ＨＡは、オリゴ糖、例えば２反復二糖単位を含む四糖であるか、あるいは、ここに提供する配合剤において使用されるＨＡは複数反復二糖単位、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０以上の二糖単位を含む。他の例において、ここに提供する配合剤において使用されるＨＡは、正確にまたは約５kDa〜または〜約５,０００kDa；正確にまたは約５kDa〜または〜約１,０００kDa；正確にまたは約５kDa〜または〜約５００kDa；または正確にまたは約５kDa〜または〜約２００kDaの分子量を有する。本発明の配合剤において使用されるＨＡオリゴ糖類の例は、正確にまたは約６.４kDa、７４.０kDaまたは２３４.４kDaの分子量を有する。例えば、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ(例えばｒＨｕＰＨ２０)のここに提供される組成物に包含されるのは、少なくともまたは約５kDa、６kDa、７kDa、８kDa、９kDa、１０kDa、１５kDa、２０kDa、３０kDa、４０kDa、５０kDa、６０kDa、７０kDa、８０kDa、９０kDa、１００kDa、１２０kDa、１４０kDa、１６０kDa、１８０kDa、２００kDa、２２０kDa、２４０kDa、２６０kDa、２８０kDa、３００kDa、３５０kDa、４００kDa、４５０kDa、または５００kDaの分子量を有するＨＡである。一例において、配合剤中のＨＡの分子量は１０kDa未満である。

ここで提供されるのは、それ故に、ＨＡオリゴ糖を含むインスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の配合剤である。配合剤は１mg／mL〜２０mg／mLのＨＡ、例えば少なくともまたは約１mg／mL、２mg／mL、３mg／mL、４mg／mL、５mg／mL、６mg／mL、７mg／mL、８mg／mL、９mg／mL、１０mg／mL、１１mg／mL、１２mg／mL、１３mg／mL、１４mg／mL、１５mg／mL、１６mg／mL、１７mg／mL、１８mg／mL、１９mg／mLまたは２０mg／mL以上のＨＡを含む。インスリンおよびｒＨｕＰＨ２０の安定な配合剤の例は、正確にまたは約８mg／mL〜または〜約１２mg／mLのＨＡ、例えば１０mg／mLまたは約１０mg／mLを含む。数例において、ＨＡ対ヒアルロナン分解酵素のモル比は正確にまたは約１００,０００：１、９５,０００：１、９０,０００：１、８５,０００：１、８０,０００：１、７５,０００：１、７０,０００：１、６５,０００：１、６０,０００：１、５５,０００：１、５０,０００：１、４５,０００：１、４０,０００：１、３５,０００：１、３０,０００：１、２５,０００：１、２０,０００：１、１５,０００：１、１０,０００：１、５,０００：１、１,０００：１、９００：１、８００：１、７００：１、６００：１、５００：１、４００：１、３００：１、２００：１、または１００：１以下である。

viii. ニコチン化合物
数例において、ニコチン化合物が安定化剤として包含される。ニコチン化合物は、ニコチンアミド、ニコチン酸、ナイアシン、ナイアシンアミド、ビタミンＢ３および／またはその塩類および／またはこれらのあらゆる組み合わせを含むが、これらに限定されない。具体的適用において、安定化剤はニコチン化合物およびアミノ酸またはアミノ酸類を含み得る(例えば国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１０１４９７７２参照)。例えば、アミノ酸はアルギニン、グルタミン酸および／またはその塩類またはそれらの組み合わせであり得る。

ix. 他の添加物または薬物
所望により、配合剤は配合剤が投与される、担体、例えば希釈剤、アジュバント、添加物、または媒体を含み得る。適当な医薬担体の例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martinに記載されている。このような組成物は、治療有効量の、一般的に精製形態または部分的精製形態の化合物を、患者への適切な投与のための形態を提供するための適当な量の担体と共に含む。このような医薬担体は滅菌液体、例えば水および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油を含む。水は、医薬組成物を静脈内投与するときの典型的担体である。食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射液のための液体担体として使用できる。

例えば、非経腸製剤に使用される薬学的に許容される担体は、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張化剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁および分散剤、乳化剤、隔離またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質を含む。水性媒体の例は、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張デキストロース注射、滅菌水注射、デキストロースおよび乳酸リンゲル注射を含む。非水性非経腸媒体は、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油およびピーナツ油を含む。静菌的または静真菌的濃度の抗菌剤を、多数回投与容器に包装される非経腸製剤に添加でき、それはフェノール類またはクレゾール類、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む。等張化剤は塩化ナトリウムおよびデキストロースを含む。緩衝剤はリン酸およびクエン酸を含む。抗酸化剤は硫酸水素ナトリウムを含む。局所麻酔剤は塩酸プロカインを含む。懸濁および分散剤はナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを含む。乳化剤はポリソルベート８０(Tween ８０)を含む。金属イオンの隔離またはキレート剤はＥＤＴＡを含む。医薬担体はまた水混和性媒体のためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールおよびｐＨ調節のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を含む。

組成物はまた活性成分意外に、希釈剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク；および結合剤、例えばデンプン、天然ゴム、例えばアカシアガム、ゼラチン、グルコース、モラセス、ポリビニルピロリドン、セルロース類およびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン類および当業者に知られた他のこのような結合剤を含み得る。

例えば、あらゆる数の薬学的に許容されるタンパク質類またはペプチドであり得る、添加物タンパク質を配合剤に添加できる。一般的に、添加物タンパク質は、免疫応答を誘発せずに哺乳動物対象に投与できる能力により選択する。例えば、ヒト血清アルブミンは、医薬製剤における使用によく適する。他の既知医薬タンパク質添加物は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、一ステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールを含むが、これらに限定されない。添加物は、製剤に、保持容器またはバイアルへのタンパク質の吸着を妨げる十分な濃度で包含される。添加物濃度は添加物の性質および配合剤中のタンパク質濃度により異なる。

組成物は、望むならば、また少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエート、および他のこのような薬剤を含み得る。

２.安定な配合剤の例
ａ.多回注射(ＭＤＩ)配合剤の例
ここに提供されるのは、少なくとも６ヶ月間、正確にまたは約２℃〜または〜約８℃の温度でおよび少なくとも１４日間(すなわち２週間)正確にまたは約２０℃〜または〜約３０℃の温度で安定な速効性インスリン、例えば速効型(速効性)インスリン類似体、およびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤である。ＭＤＩ配合剤の例は、少なくともまたは約６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１５ヶ月間、２０ヶ月間、２４ヶ月間、３０ヶ月間、３６ヶ月間、４２ヶ月間、４８ヶ月間、５４ヶ月間、６０ヶ月間以上、正確にまたは約２℃〜または〜約８℃の温度で、および少なくともまたは約１４日間、１５日間、２０日間、２５日間、２８日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間または５０日間以上、正確にまたは約２０℃〜または〜約３０℃の温度で安定なものである。

例えば、ここに提供される製剤、正確にまたは約２〜８℃で少なくとも１年間、例えば少なくとも１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２４ヶ月間、２５ヶ月間、２６ヶ月間、２７ヶ月間、２８ヶ月間、２９ヶ月間、３０ヶ月間、３１ヶ月間、３２ヶ月間、３３ヶ月間、３４ヶ月間、３５ヶ月間、３６ヶ月間またはそれ以上安定である。特に、ここに提供される製剤は、正確にまたは約２〜８℃で少なくとも２４ヶ月間安定である。

他の例において、ここに提供される製剤は、少なくとも１週間正確にまたは約２０〜３０℃、例えば正確にまたは約２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃または３０℃で、少なくとも１週間安定である。例えば、ここに提供される製剤は、正確にまたは約２０〜３０℃で少なくとも７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間またはそれ以上安定である。特に、ここに提供される製剤は、正確にまたは約２０〜３０℃、例えば正確にまたは約２５℃または３０℃で少なくとも１ヶ月間安定である。

数例において、ここで提供される安定な配合剤は、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、および特に正確にまたは約または少なくとも６００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)；１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、および特に少なくともまたは約１００Ｕ／mLの速効性のインスリン；５０mM〜２００mMまたは約５０mM〜２００mM濃度のＮａＣｌ；６.８〜７.８または約６.８〜７.８、例えば正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨ；該正確にまたは約６.８〜７.８または７.０〜７.６ｐＨ範囲を維持する緩衝剤；重量濃度(ｗ／ｖ)として０.１％〜０.４％防腐剤の抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物；および保存(温度および時間)中、少なくとも５０％の初期ヒアルロナン分解酵素活性、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも３７５Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素活性が維持される量の安定化剤を含む。緩衝剤に関して、あらゆる緩衝剤を、正確にまたは約６.８〜７.８、例えば正確にまたは約７.０〜７.６の配合剤のｐＨ範囲を維持するようで包含するように使用できる。典型的に、Ｔｒｉｓが、ここに提供する配合剤において正確にまたは約１０mM〜５０mM、例えば、例えば、１０mM、１５mM、２０mM、２５mM、３０mM、３５mM、４０mM、４５mMまたは５０mMの濃度で包含される。具体例において、配合剤は正確にまたは約２０mM〜３０mMのＴｒｉｓ、例えば２１mM、２２mM、２３mM、２４mM、２５mM、２６mM、２７mM、２８mM、２９mMまたは３０mMのＴｒｉｓを含む。具体例において、ここに提供する配合剤はＴｒｉｓを正確にまたは約３０mMの濃度で包含する。

例えば、このような配合剤の例は、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、および特に正確にまたは約または少なくとも６００Ｕ／mL；１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLの速効性のインスリン、および特に少なくともまたは約１００Ｕ／mL；正確にまたは約８０〜１４０mMの濃度のＮａＣｌ；正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨ；正確にまたは約７.０〜７.６の該ｐＨ範囲を維持する緩衝剤；重量濃度(ｗ／ｖ)として０.１％〜０.４％防腐剤；および保存(温度および時間)中、少なくとも５０％の初期ヒアルロナン分解酵素活性を維持する、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも３７５Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素活性が維持される量の安定化剤を含む。例えば、ここに提供する配合剤は１mM〜１００mMの緩衝剤(例えばＴｒｉｓ)を含む。例えば、ここに提供する配合剤は０.０１％〜０.５％界面活性剤を含む。ここに提供する配合剤の例はまた６０mM未満 グリセリン(グリセロール)および５mM〜または〜約５０mMの抗酸化剤を含み得る。

次の安定な製剤は単なる例であり、微細な調節をなし得る構築基盤を提供する。種々の添加物および他の成分の濃度の極めてわずかな変化(例えば記載濃度の±１５％)、またはｐＨのわずかな変化は、インスリンの溶解性、インスリンの安定性およびヒアルロナン分解酵素の安定性の全てではなくても、いくつかを保持しながらなし得ることは理解されるべきである。さらなる変化も、添加物の付加または除去によりなし得る。例えば、安定化界面活性剤の種類を変え得る。例えば、本発明の配合剤は１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、および特に少なくともまたは約６００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)；１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLの速効性のインスリン、および特に少なくともまたは凡そ少なくともまたは大凡約１００Ｕ／mLの速効性のインスリン；正確にまたは約１０mM〜または〜約５０mMのＴｒｉｓ(例えば正確にまたは約２０mM〜４０mMのＴｒｉｓ、例えば少なくともまたは約またはすくなくとも凡そ少なくとも２０mM、２５mM、３０mM、３５mMまたは４０mM)；正確にまたは約８０mM〜または〜約１４０mMのＮａＣｌ(例えば少なくともまたは約または少なくとも約８０mM、９０mM、１００mM、１１０mM １２０mM、１３０mM、１４０mM、１５０mMまたは１６０mMのＮａＣｌ)；正確にまたは約５mM〜または〜約５０mMのメチオニン(例えば少なくともまたは約または少なくとも凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mMのメチオニン)；正確にまたは約０mM〜または〜約５０mMのグリセリン(例えば少なくともまたは約または少なくとも凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mMのグリセリン)；正確にまたは約０.０１％〜または〜約０.５％ポロクサマー１８８、例えば０.０１％〜０.０５％(例えば少なくともまたは約または少なくとも約０.０１％、０.０２％、０.０３％、０.０４％または０.０５％ポロクサマー１８８)；正確にまたは約０.１％〜または〜約０.２５％フェノール(例えば少なくともまたは約または少なくとも約０.１％、０.１２％、０.１２５％、０.１３％、０.１４％、０.１５％、０.１６％または０.１７％フェノール)；および正確にまたは約０.０５％〜または〜約０.２％ｍ−クレゾール(例えば少なくともまたは約または少なくとも凡そ少なくとも０.０７５％、０.０８％、０.０９％、０.１％、０.１２％、０.１３％、０.１４％、０.１５％、０.１６％または０.１７％ｍ−クレゾール)を含む。製剤はｐＨ正確にまたは約７.０〜または〜約７.６(例えば少なくともまたは約または少なくとも約ｐＨ７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５または７.６)で製剤される。さらなる例において、亜鉛が正確にまたは約０.０１７mg／１００Ｕ、０.０１８mg／１００Ｕ、０.０２mg／１００Ｕ、０.０２２mg／１００Ｕまたは０.０２４mg／１００Ｕインスリンの濃度で包含される。

上記のとおり、製剤中の種々の成分の濃度は、インスリンの具体的特性により増やしたり減らしたりできる。例えば、高い見かけの溶解度のインスリン類、例えばインスリンアスパルトの製剤は、典型的に低い見かけの溶解度のインスリン類、例えばインスリンリスプロの製剤と比較して高濃度のＮａＣｌおよび低濃度のグリセリンを含む。ＮａＣｌ濃度によって、特定の製剤のｐＨはまた種々のインスリン類により異なる。

例えば、ここに提供される安定な配合剤に包含されるのは、正確にまたは約５０〜１２０mMのＮａＣｌ、例えば５０mM〜１００mM、例えば５０mM〜９０mMまたは８０mM〜１００mMを含むインスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤である。このような配合剤はインスリン類似体インスリンリスプロを含むものを含む。他の例において、ここに提供される安定な配合剤は、正確にまたは約８０mM〜１６０mMのＮａＣｌ、例えば１００mM〜１４０mM、例えば１２０mMを含むインスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤である。このような配合剤は、インスリンアスパルトを含むものを含む。例えばここに提供されるのは、正確にまたは約８０mMまたは１００mMのＮａＣｌを含むｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトまたはインスリンリスプロの配合剤である。

他の例において、ここに提供される安定な配合剤に包含されるのは、正確にまたは約８０mM〜２００mM、例えば、１００mM〜１５０mM、例えば１３０mM〜１５０mM、１２０mM〜１４０mMまたは１１０mM〜１３０mMを含む、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の安定な配合剤である。このような配合剤はインスリン類似体グルリジンを含むものを含む。数例において、例えばインスリングルリジンを含む配合剤は、塩(ＮａＣｌ)濃度正確にまたは約８０mM、９０mM、１００mM、１１０mM、１２０mM、１２１mM、１２２mM、１２３mM、１２４mM、１２５mM、１２６mM、１２７mM、１２８mM、１２９mM、１３０mM、１３１mM、１３２mM、１３３mM、１３４mM、１３５mM、１３６mM、１３７mM、１３８mM、１３９mM、１４０mM、１５０mM、１６０mM、１７０mM、１８０mM、１９０mMまたは２００mMを有する。例えばここに提供されるのは、正確にまたは約１２０mMまたは１４０mMのＮａＣｌを含むｒＨｕＰＨ２０およびインスリングルリジンの配合剤である。

ここに提供される配合剤の例において、ｐＨ正確にまたは約７.２、例えば７.２±０.２のインスリン、例えばインスリンアスパルト、およびｒＨｕＰＨ２０の配合剤である。他の例において、インスリン、例えばインスリンリスプロ、およびｒＨｕＰＨ２０の配合剤はｐＨ正確にまたは約７.４、例えば７.４±０.２を有する。さらなる例において、インスリン、例えばインスリングルリジン、およびｒＨｕＰＨ２０の配合剤はｐＨ正確にまたは約７.３または７.４、例えば７.３±０.２または７.４±０.２を有する。

ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、およびインスリンリスプロを含むここに提供する配合剤の例は、正確にまたは約２５mM〜または〜約３５mMのＴｒｉｓ(例えば正確にまたは約３０mM)；正確にまたは約７０mM〜または〜約１００mMのＮａＣｌ(例えば正確にまたは約８０mMまたは１００mMのＮａＣｌ)；正確にまたは約１０mM〜または〜約３０mMのメチオニン(例えば正確にまたは約１０mMまたは２０mMのメチオニン)；正確にまたは約４０mM〜または〜約６０mMのグリセリン(例えば正確にまたは約５０mMのグリセリン)；正確にまたは約０.００５％〜または〜約０.０５％ポロクサマー１８８(例えば正確にまたは約０.０１％ポロクサマー１８８)；正確にまたは約０.０１７mgの亜鉛／１００Ｕインスリン〜または〜約０.０２４mgの亜鉛／１００Ｕインスリン(例えば０.０１７mgの亜鉛／１００Ｕインスリン、０.０１８mg／１００Ｕ、０.０２mg／１００Ｕ、０.０２２mg／１００Ｕまたは０.０２４mgの亜鉛／１００Ｕインスリン)；正確にまたは約０.０８％〜または〜約０.１７％フェノール(例えば０.１％、０.１２５％または０.１３％フェノール)；および正確にまたは約０.０７％〜または〜約０.１７％ｍ−クレゾール(例えば０.０７５％、０.０８％、０.１３％または０.１５％ｍ−クレゾール)を含む。例えば、本配合剤は正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.０１５％ｍ−クレゾール；正確にまたは約０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール；正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール；正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０８％ｍ−クレゾール；または正確にまたは約０.１７％フェノールおよび０.１３％ｍ−クレゾールを含み得る。インスリンリスプロおよびヒアルロナン分解酵素、例えば可溶性ヒアルロニダーゼ(例えばｒＨｕＰＨ２０)のこのような製剤は、ｐＨ正確にまたは約７.０〜または〜約７.５(典型的にｐＨ正確にまたは約ｐＨ７.２)で調製される。

ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、およびインスリンアスパルトを含むここに提供する配合剤の例は、正確にまたは約２５mM〜または〜約３５mMのＴｒｉｓ(例えば正確にまたは約３０mM)；正確にまたは約７０mM〜または〜約１００mMのＮａＣｌ(例えば正確にまたは約８０mMまたは１００mMのＮａＣｌ)；正確にまたは約１０mM〜または〜約３０mMのメチオニン(例えば正確にまたは約１０mMまたは２０mMのメチオニン)；正確にまたは約４０mM〜または〜約６０mMのグリセリン(例えば正確にまたは約５０mMのグリセリン)；正確にまたは約０.００５％〜または〜約０.０５％ポロクサマー１８８(例えば正確にまたは約０.０１％ポロクサマー１８８)；正確にまたは約０.０１７mgの亜鉛／１００Ｕインスリン〜または〜約０.０２４mgの亜鉛／１００Ｕインスリン(例えば０.０１７mgの亜鉛／１００Ｕインスリン、０.０１８mg／１００Ｕ、０.０２mg／１００Ｕ、０.０２２mg／１００Ｕまたは０.０２４mgの亜鉛／１００Ｕインスリン)；正確にまたは約０.０８％〜または〜約０.１７％フェノール(例えば０.１％、０.１２５％または０.１３％フェノール)；および正確にまたは約０.０７％〜または〜約０.１７％ｍ−クレゾール(例えば０.０７５％、０.０８％、０.１３％または０.１５％ｍ−クレゾール)で調製される。例えば、本配合剤は正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.０１５％ｍ−クレゾール；正確にまたは約０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール；正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール；正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０８％ｍ−クレゾール；または正確にまたは約０.１７％フェノールおよび０.１３％ｍ−クレゾールを含み得る。インスリンアスパルトおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)のこのような製剤は、ｐＨ正確にまたは約７.０〜または〜約７.６(典型的にｐＨ正確にまたは約ｐＨ７.４)で調製される。

ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、およびインスリングルリジンを含むここに提供する配合剤の例は、正確にまたは約２５mM〜または〜約３５mMのＴｒｉｓ(例えば正確にまたは約３０mM)；正確にまたは約１００mM〜または〜約１５０mMのＮａＣｌ(例えば正確にまたは約１００mMまたは１４０mMのＮａＣｌ)；正確にまたは約１０mM〜または〜約３０mMのメチオニン(例えば正確にまたは約１０mMまたは２０mMのメチオニン)；正確にまたは約４０mM〜または〜約６０mMのグリセリン(例えば正確にまたは約５０mMのグリセリン)；正確にまたは約０.００５％〜または〜約０.０５％ポロクサマー１８８(例えば正確にまたは約０.０１％ポロクサマー１８８)；正確にまたは約０.０８％〜または〜約０.１７％フェノール(例えば０.１％、０.１２５％または０.１３％フェノール)；および正確にまたは約０.０７％〜または〜約０.１７％ｍ−クレゾール(例えば０.０７５％、０.０８％、０.１３％または０.１５％ｍ−クレゾール)で調製される。例えば、本配合剤は正確にまたは約０.１％フェノールおよび０.０１５％ｍ−クレゾール；正確にまたは約０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール；正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール；正確にまたは約０.１３％フェノールおよび０.０８％ｍ−クレゾール；または正確にまたは約０.１７％フェノールおよび０.１３％ｍ−クレゾールを含むものである。インスリングルリジンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ(例えばｒＨｕＰＨ２０)を含むこのような製剤はｐＨ正確にまたは約７.０〜または〜約７.６(典型的にｐＨ正確にまたは約ｐＨ７.４)を含み得る。

ｂ. 持続皮下インスリン注入療法(ＣＳＩＩ)配合剤の例
ここに提供されるのは、正確にまたは約３２℃以上の高温、例えば３５℃〜４０℃、特に正確にまたは約または３７℃または４０℃以上および／または撹拌条件下のような加速またはストレス条件下で少なくとも３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間または少なくとも７日間、および一般的に少なくとも３時間または少なくとも３日間安定な、安定な配合剤である。これらの安定な配合剤は、持続皮下インスリン注入療法(ＣＳＩＩ)による投与に適する。

上記のとおり、本発明の配合剤に少なくとも６ヶ月間、正確にまたは約２℃〜または〜約８℃の温度および少なくとも１４日間(すなわち２週間)正確にまたは約２０℃〜または〜約３０℃の温度で安定性を付与する濃度、量またはレベルは、一般的に配合剤に高温のようなストレス条件下で安定性を付与するには不十分である。一般的に、このような配合剤は、２４時間未満、および一般的に８時間未満このようなストレス条件(例えば高温)で安定なであり、これは、このような条件が存在する多数回投与適用における使用に実質的障害となり得る。例えば、ＣＳＩＩ治療は、１日２４時間、２〜３日間、外に体の近くに接続されているポンプまたは他のデバイスによる製剤の連続的注入と関連する。インスリン製剤または配合剤は、腹壁または大腿に針を介して注射され、その注射は、インスリン製剤または配合剤が連続的に注入されるように計画されたポンプにより制御され得る。それ故に、ＣＳＩＩ治療に使用される配合剤は、少なくともまたは約または３７℃以上の高い体温および撹拌条件に付される。

例えば、ヒアルロナン分解酵素は、特に３２℃以上、および典型的に３７℃または４０℃以上の高温で不安定である。本発明により、インスリンは２℃〜８℃で高塩濃度および低ｐＨで結晶化するが、高塩濃度および低ｐＨで３２℃〜４０℃の高温で結晶化しないことが判明した。従って、３２℃〜４０℃の高温でヒアルロナン分解酵素群(例えばＰＨ２０)の安定性を維持するために必要なものの逆の高塩濃度および低ｐＨ要求が、高温で少なくとも数時間、少なくとも３日間に対して、より適合性である。また、同じ高塩および低ｐＨ製剤が、低温でインスリン安定性に影響する見かけの溶解度の差異にかかわらず、インスリン類似体で同様の安定性が得られる。

例えばＣＳＩＩ治療での使用のためのストレス条件下で安定である安定な配合剤は、一般的にここで提供する他の配合剤と同じ成分を含む。このような配合剤、しかしながら、ストレス条件下で安定な配合剤が、一般的に高塩濃度、低ｐＨおよび／またはヒアルロナン分解酵素および／またはインスリンを一般的に少なくとも２〜３日間、正確にまたは約３２℃以上の高温、例えば３５℃〜４０℃、特に正確にまたは約または３７℃または４０℃以上および／または撹拌条件で安定化させるのに十分な１種以上の他の添加物が存在する点で異なる。例えば、高温または撹拌のストレス条件で安定なここに提供する配合剤は、一般的に添加物としてヒアルロニダーゼ阻害剤、例えばヒアルロニダーゼ基質(例えばヒアルロナン)を含む。

一例において、高温または撹拌のストレス条件で安定なここに提供する配合剤は、セクションＥ.１.ａで提供する配合剤より高い塩濃度および低いｐＨを有する。例えば、ここに提供されるのは、１２０mMのＮａＣｌ〜２００mMのＮａＣｌおよびｐＨ６.５〜７.５を含む、ストレス条件下(例えば３２℃〜４０℃の高温または撹拌)で少なくとも３日間または３時間安定な配合剤である。しかしながら、上記のとおり、特に冷蔵温度で、インスリンの溶解性は、これらの低ｐＨおよび高塩条件で減少する。それ故、このような製剤は、典型的に使用前に冷蔵または環境温度で保存しない。

他の例において、高温(例えば３２℃〜４０℃)のストレス条件で少なくとも３日間または撹拌で少なくとも３時間安定であるここに提供する配合剤は、配合剤中のヒアルロナン分解酵素を安定化するためのヒアルロニダーゼ阻害剤を含む。上記ヒアルロニダーゼ阻害剤のいずれも、高温(例えば３２℃〜４０℃)のストレス条件で少なくとも３日間または撹拌で少なくとも３時間安定な本発明の配合剤に包含できる。具体例において、ヒアルロニダーゼ阻害剤はヒアルロニダーゼ基質、例えば、ヒアルロナンである。

ヒアルロニダーゼ阻害剤ヒアルロナンを用いる本明細書の実施例に示すとおり、ヒアルロニダーゼ阻害剤の存在は、ＰＨ２０活性を、特に防腐剤存在下、特に高温で、例えば３２℃〜４０℃の温度のストレス条件下で安定化させる。ＨＡオリゴマー類が、ヒアルロナン分解酵素とヒアルロナンの酵素反応の基質／生成物であるため、ヒアルロナンオリゴマー類は酵素活性部位と結合でき、安定化効果を生じる。しかしながら、一定時間、３２℃〜４０℃の高温のストレス条件下、例えば３７℃で、１週間または２週間以上で、配合剤中のヒアルロニダーゼ阻害剤、例えばＨＡの存在はインスリン分解を起こして、共有結合性ＨＡ−インスリン類似体付加物を生じ得ることも見出された。例えば、ここに提供する配合剤における高濃度のＨＡの存在は、３７℃で１週間後にインスリンアスパルト(登録商標)を、そして３０℃で２週間後にインスリングルリジン(登録商標)を分解させることが、逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)により示された。液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー(ＬＣ−ＭＳ)分析は、分解産物のいくつかが、インスリンとＨＡの還元末端の反応により形成された共有結合性ＨＡ−インスリン類似体糖化付加物であることを示した。例えば、１つのピークはインスリンアスパルト(登録商標)とＨＡ７量体の生成物と同定され、他のピークはインスリンアスパルト(登録商標)とＨＡ２量体の生成物であった。

ヒアルロニダーゼ阻害剤、例えばＨＡの存在は、配合剤の沈殿形成および変色にも効果を有し得る。それ故に、ＨＡはヒアルロナン分解酵素を３２℃〜４０℃の高温のストレス条件で安定性を改善するが、配合剤におけるインスリン分解、沈殿形成および変色にも影響を有し得る。これらの条件を所望の安全性および薬理的パラメータおよびガイドライン内でモニターすることは当業者のレベルの範囲内である。一般的に、ヒアルロニダーゼ阻害剤、例えばＨＡを含むここで提供される安定な配合剤は、高温で、例えば３２℃〜４０℃の温度のストレス条件下で少なくとも３時間安定であるが、これらのパラメータに対する効果のために７日間を超えられない。

ここに提供するいくつかの例において、インスリンまたはヒアルロナン分解酵素群と共有結合複合体を形成できないヒアルロニダーゼ阻害剤を使用する。それ故に、会合性結合により作用する非共有結合性阻害剤が本発明の製剤において意図される。例えば、ここに提供されるのは、インスリンと糖化付加物を形成しないように、反応した還元末端を有するＨＡを含む配合剤である。例えば、数例において、ここに提供する配合剤において使用するＨＡは還元的アミノ化により修飾されている。還元的アミノ化は、アルデヒドおよびアミンの間のシッフ塩基の形成を含み、これは次いで還元されたより安定なアミンを形成する。糖、すなわち、ＨＡの還元末端は、環状ヘミアセタール形態と開鎖アルデヒド形態の平衡混合物である。当業者に知られた適当な条件下、アミン基は糖アルデヒドと縮合してイミニウムイオンを形成し、これは還元剤、例えばナトリウムシアノボロハイドライドでアミンに還元できる(例えば、Gildersleeve et al., (2008) Bioconjug Chem 19(7):1485-1490参照)。得られたＨＡはインスリンと反応せず、インスリン糖化付加物を形成できない。

特に、ここに提供されるのは、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、および特に正確にまたは約または少なくとも６００Ｕ／mL；１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLの速効性のインスリン、および特に少なくともまたは約１００Ｕ／mL；正確にまたは約１２０mM〜２００mMの濃度のＮａＣｌ；正確にまたは約６.５〜７.５のｐＨ；抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物；および少なくとも５０％の初期ヒアルロナン分解酵素活性、例えば少なくともまたは少なくとも約３７５Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素活性が維持されるような１種以上のさらなる安定化剤、例えばヒアルロニダーゼ阻害剤を含む、少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度でおよび／または撹拌下に少なくとも３時間安定である、安定な配合剤組成物である。例えば、本配合剤は、ＨＡを正確にまたは約１mg／mL〜２０mg／mLの濃度で含み得る。安定な配合剤はまた正確にまたは約１mM〜１００mMの量で正確にまたは約ｐＨ６.５のｐＨ範囲を維持するための緩衝剤(例えばＴｒｉｓ)；製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての総量正確にまたは０.１％および０.４％の抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物、例えば、フェノール防腐剤(例えばフェノールおよび／またはｍ−クレゾール)；重量濃度(ｗ／ｖ)として正確にまたは約０.００５％〜１.０％の％の界面活性剤(例えばポロクサマー１８８)；および所望によりさらなる安定化剤を含み得る。

例えば、ストレス条件下(例えば３２℃〜４０℃の高温または撹拌)で少なくとも３日間または３時間安定なここに提供する配合剤は、１２０mM〜２００mM、例えば１５０mMのＮａＣｌ〜２００mMのＮａＣｌまたは１６０mMのＮａＣｌ〜１８０mMのＮａＣｌ、例えば正確にまたは約１２０mM、１３０mM、１４０mM、１５０mM、１５５mM、１６０mM、１６５mM、１７０mM、１７５mM、１８０mM、１８５mM、１９０mM、１９５mMまたは２００mMのＮａＣｌを含む。また、ストレス条件下(例えば３２℃〜４０℃の高温または撹拌)で少なくとも３日間または３時間安定なここに提供する配合剤は６.５〜７.５または６.５〜７.２のｐＨ、例えば正確にまたは約６.５±０.２、６.６±０.２、６.７±０.２、６.８±０.２、６.９±０.２、７.０±０.２、７.１±０.２、７.２±０.２、７.３±０.２、７.４±０.２または７.５±０.２のｐＨである。

本明細書における例において、高温(例えば３２℃〜４０℃)または撹拌のストレス条件で少なくとも３日間または３時間安定なここに提供する配合剤は、５kDa〜５,０００kDa、５kDa〜または〜約１,０００kDa、５kDa〜または〜約２００kDa、または５kDa〜または〜約５０kDaの分子量を有するヒアルロナン(ヒアルロン酸；ＨＡ)を含む。特に、ＨＡの分子量は１０kDa未満である。ＨＡは、二糖類から成るオリゴ糖、例えば２量体〜３０量体または４量体〜１６量体であり得る。インスリンおよびヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えば、ＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)の配合剤はＨＡを正確にまたは約１mg／mL〜２０mg／mLの濃度で、例えば少なくともまたは約１mg／mL、２mg／mL、３mg／mL、４mg／mL、５mg／mL、６mg／mL、７mg／mL、８mg／mL、９mg／mL、１０mg／mL、１１mg／mL、１２mg／mL、１３mg／mL、１４mg／mL、１５mg／mL、１６mg／mL、１７mg／mL、１８mg／mL、１９mg／mLまたは２０mg／mL以上のＨＡを含む。安定な配合剤の例は、正確にまたは約８mg／mL〜または〜約１２mg／mLのＨＡ、例えば、例えば１０mg／mLまたは約１０mg／mLを含む。数例において、ＨＡ対ヒアルロナン分解酵素のモル比は正確にまたは約１００,０００：１、９５,０００：１、９０,０００：１、８５,０００：１、８０,０００：１、７５,０００：１、７０,０００：１、６５,０００：１、６０,０００：１、５５,０００：１、５０,０００：１、４５,０００：１、４０,０００：１、３５,０００：１、３０,０００：１、２５,０００：１、２０,０００：１、１５,０００：１、１０,０００：１、５,０００：１、１,０００：１、９００：１、８００：１、７００：１、６００：１、５００：１、４００：１、３００：１、２００：１、または１００：１以下である。

例えばＣＳＩＩ製剤で望まれる高温(例えば３２℃〜４０℃)または撹拌で安定な配合剤が、セクションＥ.１.ａで示すものより低いｐＨおよび高い塩濃度を有するため、それらはそこから調製でき、または由来し得る。これは、例えば、ＭＤＩに適当な例えばセクションＥ.１.ａに提供するいずれかの配合剤を、低ｐＨおよび高塩濃度を有する安定化希釈剤で希釈することにより達成できる。例えば、希釈剤は、低ｐＨで緩衝化され、防腐剤を含む高ＮａＣｌ溶液であり得る。例えば、希釈剤は１０mM〜５０mMのＴｒｉｓまたは他の類似緩衝剤；１２０mM〜２００mMのＮａＣｌ；０.１％〜０.４％防腐剤を含み得る。希釈剤は、正確にまたは約６.５〜７.８のｐＨで調製し得る。それ故に、２℃〜８℃または２０℃〜３０℃で安定なここで提供される安定な配合剤を、提供し、希釈剤と混合して、高温(例えば３２℃〜４０℃)のストレス条件下で少なくとも３日間または撹拌で少なくとも３時間安定な製剤を提供し得る。

例えば、セクションＥ.１.ａの上記ＭＤＩ配合剤のいずれかを安定化希釈剤で希釈して、低インスリン濃度、正確にまたは約６.８〜または〜約７.０のｐＨ(例えば正確にまたは約６.８、６.９または７.０)および正確にまたは約１５０mM〜または〜約２００mMのＮａＣｌ濃度のＣＳＩＩ製剤を提供し得る。

他の例において、安定なＭＤＩ配合剤を、安定化添加物希釈剤と混合後に許容される張性および低ｐＨを提供するために、高インスリン濃度および高ＰＨ２０濃度および低ＮａＣｌ(正確にまたは約８０mM〜１５０mM)および低緩衝能を有する修飾高濃度ＭＤＩ製剤として提供できる。例えば、高インスリン濃度は、例えば、１２０〜５００単位、例えば１５０、２００または５００単位(Ｕ)であってよく、高ＰＨ２０濃度は６〜２５μg／mL、例えば６〜２５、６、７.５、１０または２５μg／mLであり得る。修飾高濃度ＭＤＩ製剤の安定化希釈剤での希釈は、上記セクションＥ.１.ａで提供されるあらゆるＭＤＩ配合剤より低ｐＨ(例えば６.５〜７.２)および高ＮａＣｌ(１４０mM〜２００mM)のＣＳＩＩ製剤を提供し得る。

さらなる例において、セクションＥ.１.ａに提供するここに提供するＭＤＩ製剤のいずれも、凍結乾燥形態で製造し、保存できる。ストレス条件下で使用直前に、凍結乾燥生成物を、低ｐＨ(例えば６.５〜７.８)および高ＮａＣｌ(１２０mM〜２００mM)を含む安定化希釈剤で希釈して、上記セクションＥ.１.ａに提供されるあらゆるＭＤＩ配合剤より低ｐＨ(例えば６.５〜７.８)および高ＮａＣｌ(１２０mM〜２００mM)のＣＳＩＩ製剤を提供し得る。

本明細書の実施例に示すとおり、しかしながら、ヒアルロナンは、低温でインスリンの凝集を起こすために、２℃〜８℃で保存する製剤の使用に適しない。それ故に、安定なＣＳＩＩ製剤をＭＤＩ製剤の希釈により製造する上記例において、ＭＤＩ配合剤または修飾濃縮ＭＤＩ配合剤はヒアルロニダーゼ阻害剤を含まず、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、配合剤の安定性を高温(例えば３２℃〜４０℃)のストレス条件下で少なくとも３日間または撹拌で少なくとも３時間維持するためにヒアルロニダーゼ阻害剤の適当な濃度を提供するために安定化希釈剤に提供され得る。

ｃ. Ｌｙｓ−Ｌｙｓ配合剤の例
ここに提供されるのは、治療有効量のヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、治療有効量の速効性のインスリン、例えば速効型(例えば速効性)インスリン類似体、および配合剤を安定化する量のＬｙｓ−Ｌｙｓを含む安定な配合剤である。典型的に、配合剤は多数回投与製剤であり、微生物的に有効量の１種以上の防腐剤を含む。配合剤はまた１種以上の他の安定化剤または添加物を含み得る。このような配合剤は、少なくとも６ヶ月間、正確にまたは約２℃〜または〜約８℃の温度でおよび少なくとも１４日間(すなわち２週間)正確にまたは約２０℃〜または〜約３０℃の温度で安定である。特に、このような配合剤は、正確にまたは約３２℃以上のような高温、例えば３５℃〜４０℃、特に正確にまたは約または３７℃または４０℃以上のような加速条件および／または撹拌条件下で少なくとも３時間、および一般的に少なくとも３日間安定である。配合剤は多数回投与注射(ＭＤＩ)使用または持続皮下インスリン注入療法(ＣＳＩＩ)方法に使用できる。

安定なＬｙｓ−Ｌｙｓ含有製剤の例を下に記載する。次の安定な製剤は単なる例示であり、微細な調節をなし得る構築基盤を提供する。種々の添加物および他の成分の濃度の極めてわずかな変化(例えば記載濃度の±１５％)、またはｐＨのわずかな変化は、全てではなくても、インスリンの溶解性および安定性およびヒアルロナン分解酵素安定性を幾分保持しながらなし得ることは理解すべきである。さらなる変化も、添加物の付加または除去によりなし得る。

例えば、ここに提供する配合剤は１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、および特に正確にまたは約または少なくとも６００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)；１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、および特に少なくともまたは約１００Ｕ／mLの速効性のインスリンを含み、配合剤はさらに正確にまたは約５０mM〜１２０mM、例えば５０〜８０mM、８０mM〜１００mMまたは１００mM〜１２０mMの濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ、正確にまたは約６.５〜８.０、例えば、６.５〜７.８または６.８〜７.８、例えば正確にまたは約６.５〜７.５、６.８〜７.４または７.０〜７.６のｐＨ、該ｐＨ範囲を維持する緩衝剤、抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物、および保存(温度および時間)中にヒアルロナン分解酵素活性の少なくとも５０％を維持し、かつインスリン純度、回収および／または効力の少なくとも９０％を維持する安定化剤を含む。例えば、ここに提供する配合剤は安定化剤として０.０００５％〜１.０％(例えば０.０００５％〜０.００５％)界面活性剤を含む。配合剤は、所望により付加的安定化剤、浸透圧修飾剤、抗酸化剤および／または他の添加物を含み得る。例えば、本配合剤はＮａＣｌを１４０mM未満、例えば正確にまたは約０mM〜１００mM、例えば正確にまたは約０mM〜５０mM、１０mM〜４０mMまたは２０mM〜３０mMの濃度で含む。

一例において、製剤の例は１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、および特に少なくともまたは凡そ少なくともまたは約６００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)；１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、および特に少なくともまたは約１００Ｕ／mLのインスリングルリジン、正確にまたは約５０mM〜または〜約１０５mMのＬｙｓ−Ｌｙｓ(例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５０mM、６０mM、７０mM、８０mM、９０mMまたは１００mM)；０mM〜または〜約５０mMのメチオニン(例えば正確にまたは約５mM〜２０mM、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mMのメチオニン)；および正確にまたは約０.０００５％〜または〜約０.００５％ポリソルベート２０、例えば０.００１％〜０.００５％(例えば少なくともまたは凡そ少なくとも０.０００５％、０.０００１％、０.００５％または０.００１％ポリソルベート２０)；および正確にまたは約０.０１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む。製剤はｐＨ正確にまたは約６.８〜７.４(例えば少なくともまたは凡そ少なくともｐＨ６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３または７.４)で調製する。さらなる例において、ＮａＣｌは１４０mM未満の濃度で包含される。例えば、ＮａＣｌは１００mM未満、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも０mM〜１００mM、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mM、５０mM、６０mM、７０mM、８０mMまたは９０mMの濃度で包含される。

他の例において、製剤の例は１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)、および特に少なくともまたは凡そ少なくともまたは約６００Ｕ／mLのヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０)；１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、および特に少なくともまたは約１００Ｕ／mLのインスリンリスプロまたはアスパルト、正確にまたは約８０mM〜または〜約１００mMのＬｙｓ−Ｌｙｓ(例えば少なくともまたは凡そ少なくとも８０mM、８５mM、９０mM、９５mMまたは１００mM)；０mM〜または〜約５０mMのメチオニン(例えば正確にまたは約５mM〜２０mM、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mMまたは５０mMのメチオニン)；正確にまたは約０.０００５％〜または〜約０.００５％ポリソルベート２０、例えば０.００１％〜０.００５％(例えば少なくともまたは凡そ少なくとも０.０００５％、０.０００１％、０.００５％または０.００１％ポリソルベート２０)；および正確にまたは約０.０１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)フェノールを含む。製剤はｐＨ正確にまたは約６.８〜７.４(例えば少なくともまたは凡そ少なくともｐＨ６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３または７.４)で調製される。さらなる例において、ＮａＣｌは１４０mM未満の濃度で包含される。例えば、ＮａＣｌは１００mM未満、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも０mM〜１００mM、例えば少なくともまたは凡そ少なくとも５mM、１０mM、２０mM、３０mM、４０mM、５０mM、６０mM、７０mM、８０mMまたは９０mMの濃度で包含される。

Ｇ. 投与量および投与
ヒアルロナン分解酵素の安定な製剤であるここに提供する組成物は、単回または多回投与用医薬組成物として製剤できる。ヒアルロナン分解酵素および速効性のインスリンの配合剤は多回投与用医薬組成物として製剤される。製剤および配合剤は、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮内投与を含む非経腸投与のような任意の適当な経路用に製剤され得る。典型的に、製剤またはここに提供される配合剤は、皮下投与される。

治療的有効投与量は、経験的に既知インビトロおよびインビボ系で製剤または配合剤を試験し、また代謝、食物摂取および疾患重症度のような因子に基づき各対象に個別化できる。製剤または配合剤中のヒアルロナン分解酵素および／または選択したインスリンの濃度は、例えば、複合体の吸収、不活性化および排泄率、複合体の物理化学特徴、投与スケジュール、および投与量ならびに当業者に知られる他の因子による。例えば、インスリンを含む配合剤について、処置の厳密な投与量は、対象における血糖値の関数であり、経験的に既知のアルゴリズムを使用して、またはインビボまたはインビトロ試験データの外挿により、対象の過去の経験により、食事中の炭水化物含量を決定するための炭水化物計数により、それ故に、概算される食事の血糖上昇および続くインスリンの必要性により決定できる。濃度および投与量値は各処置対象で変わることは注意すべきである。さらに、あらゆる特定の対象において、特定の投与レジメンは、個々の要求および製剤を投与者または監督者の専門的判断に従い、時間の経過と共に調整すべきであり、ここに示す濃度範囲は単なる例であり、その量に限定されないことも注意すべきである。糖尿病状態の処置のために投与すべき選択したインスリンの量は、標準的臨床技術により決定できる。加えて、インビトロアッセイおよび動物モデルを最適投与量範囲の決定を補助するために用い得る。

それ故に、経験的に決定できる厳密な投与量は、製剤または配合剤に含まれる特定のヒアルロナン分解酵素および／またはインスリン、レジメおよび投与スケジュール、投与経路、処置すべき糖尿病のタイプ、処置する疾患および対象の重症度に依存し得る。一般的に、インスリンは血糖コントロールを達成する量で提供される。例えば、食後血糖コントロールを達成するために、インスリンがヒアルロナン分解酵素を伴わずに送達されるとき、糖尿病対象に典型的にボーラス注射として正確にまたは約０.０５Ｕの速効性のインスリン／kg体重(Ｕ／kg)〜１.０Ｕ／kgを、食事３０分間〜５分間前に投与する。この投与量は、例えば、特定の対象の代謝、食事の内容、および血糖値に基づき、適宜増減できることは当然である。さらに、食後血糖コントロールのためにインスリンを送達する時間は、食事の摂取とさらに近いまたは遠い時間に変えてよく、数例において、インスリンを食事時または食後に送達されるように変え得ることは当然である。

速効性のインスリン類は、典型的に０.０５単位／kg〜０.２５単位／kg、例えば、０.１０単位／kgの投与量で投与さえるが、特定の投与量は変わり得る。ヒアルロナン分解酵素群(例えばｒＨｕＰＨ２０)と配合されたインスリンの改善された薬物動態学的および薬力学的特性により、提供される配合剤は、ヒアルロナン分解酵素非存在下で投与される速効性のインスリンより低投与量で投与できる。ヒアルロナン分解酵素との配合剤として投与するにより減らせる速効性のインスリンの量は、患者の糖尿病のタイプおよび配合剤に包含されるインスリンのタイプによる。典型的に、ヒアルロナン分解酵素との配合剤として投与したときに２型糖尿病患者に投与する速効性のインスリンの量の減少は、ヒアルロナン分解酵素との配合剤として投与したとき１型糖尿病患者に投与する速効性のインスリンの量の減少より多い。例えば、１型糖尿病患者および２型糖尿病患者の両者に０.２０Ｕ／kgの速効性のインスリンを、食後グルコースレベルをコントロールするために投与したとき、１型糖尿病患者に、同じまたは良好な血糖コントロールを達成するために０.１５Ｕ／kgのヒアルロナン分解酵素と配合された速効性のインスリンを投与でき、２型糖尿病患者に同じまたは良好な血糖コントロールを達成するために０.１０Ｕ／kgのヒアルロナン分解酵素と配合された速効性のインスリンを投与できる

食後血糖値をコントロールするためのここで提供するヒアルロナン分解酵素との配合剤を使用したインスリンの非経腸、例えば皮下投与のための投与量範囲の例は、正確にまたは約０.０５Ｕ／kg〜０.５０Ｕ／kg、例えば０.０５Ｕ／kg、０.０６Ｕ／kg、０.０７Ｕ／kg、０.０８Ｕ／kg、０.０９Ｕ／kg、０.１０Ｕ／kg、０.１１Ｕ／kg、０.１２Ｕ／kg、０.１３Ｕ／kg、０.１４Ｕ／kg、０.１５Ｕ／kg、０.２０Ｕ／kg、０.２５Ｕ／kg、０.３０Ｕ／kg、０.４０Ｕ／kg、０.５０Ｕ／kgまたは１.０Ｕ／kgである。特定の投与量は疾患および個体による。

ここに提供するインスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤はまた食後血糖コントロールに加えて、日中および夜間を通して血糖コントロールを発揮するために糖尿病対象に投与できる。典型的に、連続的血糖コントロールを提供するために投与されるインスリンの投与量は、食後血糖コントロールを達成するために必要なものより少ない。しかしながら、投与量は血糖値に基づき増やしても減らしてもよい。連続的血糖コントロールを達成するためにヒアルロナン分解酵素との配合剤として投与されるインスリンの非経腸、例えば皮下投与のための投与量範囲の例は正確にまたは約０.００１Ｕ／kg〜０.３０Ｕ／kg、例えば０.００１Ｕ／kg、０.００５Ｕ／kg、０.０１Ｕ／kg、０.０２Ｕ／kg、０.０５Ｕ／kg〜０.３０Ｕ／kg、例えば０.０５Ｕ／kg、０.０６Ｕ／kg、０.０７Ｕ／kg、０.０８Ｕ／kg、０.０９Ｕ／kg、０.１０Ｕ／kg、０.１１Ｕ／kg、０.１２Ｕ／kg、０.１３Ｕ／kg、０.１４Ｕ／kg、０.１５Ｕ／kg、０.２０Ｕ／kg、０.２５Ｕ／kg、０.３０Ｕ／kg、０.４０Ｕ／kg、０.５０Ｕ／kgまたは１.０Ｕ／kgである。特定の投与量は疾患、投与時間、および個体による。必要であれば、投与量を経験的に決定できる。

正確な投与量および処置期間は処置する糖尿病の関数であり、既知試験プロトコルを使用してまたはインビボまたはインビトロ試験データからの外挿により経験的に決定できることは理解されるべきである。投与量もまた糖尿病重症度および他の因子、例えば対象の代謝、食物摂取、および体重により変わり得ることは注意すべきである。あらゆる特定の対象について、特定の投与レジメンは個々の必要性および組成物の投与者またはその監督者の専門的判断により時間の経過に従って調整されるべきであり、ここに示す濃度範囲は単なる例であり、組成物およびそれを含む組み合わせの範囲または使用を限定しないことは当然である。組成物は１分毎、数分毎、１時間毎、１日毎、１週間毎、１ヶ月毎、１年毎または単回、対象および糖尿病状態によって投与してよい。一般的に、投与レジメンは、毒性および／または他の負の影響、例えばインスリン過剰を避けるように選択される。担当医は、どのようにそしていつ治療を停止するか、中断するか、低投与量に調節するか理解している。逆に、担当医はまた臨床応答が十分ではないとき、どのようにそしていつ処置を高レベルに調節するかも理解している(毒性副作用を避けながら)。

投与方法
ａ. シリンジまたはバイアル
ここに提供する製剤または配合剤は、単回投与量または多数回投与量製剤に適当なシリンジ、バイアルまたは他の容器を含むが、これらに限定されない数種の投与方法の１種以上を使用して対象に非経腸的に投与される。例えば、インスリンシリンジを含む単回使用シリンジを、組成物の個々の注射、例えばボーラス注射投与をするために使用できる。ここに提供される組成物の投与に有用なシリンジは、１００Ｕ／ml濃度のインスリン製剤を含む標準濃度のインスリン製剤を装填するように設計され、投与を容易にするためにインスリン単位の目盛りを付したインスリンシリンジである。

ｂ. インスリンペン
インスリンペンは、ここに提供する配合剤の投与に使用できる投与手段である。インスリンペンは、投与すべき組成物を満たした交換式カートリッジを有するものおよび非交換式カートリッジを有するものを含む。非交換式カートリッジのインスリンペンは、典型的に、カートリッジが空になったときに廃棄されるものである。インスリンペンは、例えば、半単位、１単位または２単位漸増で投与でき、これは、一般的に投与ダイアルまたは投与量を設定するための他の機構を使用して決定される(例えば米国特許番号５,９４７,９３４、６,０７４,３７２、６,１１０,１４９、６,５２４,２８０、６,５８２,４０４参照)。次いで、配合剤をペンに結合した細針を通して投与する。インスリンペンは当分野で知られ、米国特許番号５,９４７,９３４、４,９７３,３１８、５,４６２,５３５、５,５９９,３２３、５,６２６,５６６、５,９８４,９０６、６,０７４,３７２、６,１１０,１４９、６,３０２,８６９、６,３７９,３３９および７,２４１,２７８)を含むが、これらに限定されないあらゆるところに記載されている。例えば、米国特許番号５,９４７,９３４、６,０７４,３７２、６,１１０,１４９および６,３７９,３３９に記載のような他の類似の投与デバイスも、インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤としてまたはインスリン組成物およびヒアルロナン分解酵素組成物の別々のいずれかでここに提供される組成物を投与するために使用できる。場合により、インスリンペンまたは類似デバイスはまた対象血糖値を測定できるセンサーまたはモニターも含む(例えばＷＯ２００３０４７４２６参照)。

ここに提供される配合剤の投与に使用できる、または使用するために修飾できるインスリンペンおよび類似の投与デバイスは当分野で知られており、商品名Autopen^{(登録商標)}(OwenMumford、Inc.)、Disetronic Pen(Disetronic Medical Systems)、Humalog^{(登録商標)}Pen(Eli Lilly and Company)、Humalog^{(登録商標)}Mix 75/25 Pen(Eli Lilly and Company)、Humulin^{(登録商標)}70/30 Pen(Eli Lilly and Company)、Humulin^{(登録商標)}N Pen(Eli Lilly and Company)、NovoLog^{(登録商標)}FlexPen(Novo Nordisk)、NovoPen^{(登録商標)}3(Novo Nordisk)、NovoPen^{(登録商標)}4(Novo Nordisk)、NovoPen^{(登録商標)}Junior(Novo Nordisk)、NovoLog^{(登録商標)}Mix 70/30 FlexPen(Novo Nordisk)、InDuo^{(登録商標)}(Novo Nordisk)、Novolin^{(登録商標)}InnoLet^{(登録商標)}(Novo Nordisk)、Innovo^{(登録商標)}(Novo Nordisk)、OptiPen^{(登録商標)}(Sanofi-Aventis) OptiPen^{(登録商標)}Pro2(Sanofi-Aventis)、OptiSet^{(登録商標)}(Sanofi-Aventis)およびSoloSTAR^{(登録商標)}(Sanofi-Aventis)で販売されているものを含むが、これらに限定されない。

ｃ. インスリンポンプおよび他のインスリン投与デバイス
ここに提供する配合剤は、インスリン送達デバイス、例えばインスリンポンプまたは他の類似の連続的注入デバイスを使用して糖尿病対象に投与される。インスリン投与デバイスは、典型的にインスリン製剤を含む少なくとも１個の使い捨てリザーバー、ポンプ(すべてのコントロール、ソフトウェア、処理モジュールおよび／またはバッテリーを含む)および皮下注射用のカニューレまたは針およびインスリンリザーバーにカニューレまたは針を連結するチューブを含む使い捨て注入セットを含む。ここで提供される安定な配合剤で使用するために、インスリン投与デバイスは配合されたインスリンおよびヒアルロナン分解酵素を含むリザーバーを含む。配合剤は連続的にまたはボーラスで注射投与できる。さらに、インスリン投与デバイス使用者は、ボーラスを利用することにより使用中のインスリンのプロファイルに影響を与えることができる。例えば、標準的ボーラスで投与することができ、これは、全ての投与量を一挙にポンプ投与する個別注射に類似する注入である。拡張的ボーラスは、高初期投与量を避け、組成物の作用を持続させる長時間にわたる注入である。標準的ボーラスおよび拡張ボーラスの両者を含む組み合わせボーラスもインスリンポンプまたは他の連続的送達系を利用して投与できる。インスリン投与デバイスは当分野で知られており、米国特許番号６,５５４,７９８、６,６４１,５３３、６,７４４,３５０、６,８５２,１０４、６,８７２,２００、６,９３６,０２９、６,９７９,３２６、６,９９９,８５４、７,０２５,７４３および７,１０９,８７８を含むが、これらに限定されず、多くの文献に記載されている。インスリン投与デバイスは、グルコースモニターまたはセンサーに接続でき、さらに血糖値、食事の炭水化物量、または他の入力に基づく推奨インスリン量を計算するための手段を含み得る。さらにインスリン投与デバイスはインプラント可能であり、また対象に外付けすることもできる。

ｄ. 連続的輸液ポンプ系
本発明の配合剤に使用するインスリン投与デバイスは、インスリンポンプまたは連続的皮下インスリン注入を可能にする他の類似デバイスを含む。開放ループ系または閉鎖ループ系を含むインスリン投与デバイスは、典型的に少なくとも１個のインスリン配合剤を含む使い捨てリザーバー、ポンプ(すべてのコントロール、ソフトウェア、処理モジュールおよび／またはバッテリーを含む)および皮下注射用カニューレまたは針およびインスリンリザーバーにカニューレまたは針を連結するチューブを含む使い捨て注入セットを含む。閉鎖ループ系投与デバイスは、さらにグルコースモニターまたはセンサーを含む。インスリン投与デバイスは、超速効性インスリンインスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤を含むリザーバーを含み得る。

インスリン配合剤は連続的におよび／またはボーラス注射で投与し得る。使用者は、安定した点滴または“基礎量”のインスリン製剤を、１日をとおして連続的に提供するようにポンプを設定できる。ポンプはまた付加的放出(“ボーラス”)投与量のインスリン製剤を食事時および使用者摂取により過血糖となったときに放出する。頻繁な血糖モニタリングが、インスリン投与量決定およびインスリンが適切に投与されることを確実にするために必要である。これは、手動モニタリングにより、または別のまたは付属グルコースモニターにより達成できる。さらに、インスリン投与デバイス使用者は、ボーラスを利用することにより使用中のインスリンのプロファイルに影響を与えることができる。例えば、標準的ボーラスで投与することができ、これは、全ての投与量を一挙にポンプ輸送する個別の注射に類似する注入である。拡張的ボーラスは、高初期投与量を避け、組成物の作用を持続させる長時間にわたる注入である。標準的ボーラスおよび拡張ボーラスの両者を含む組み合わせボーラスもインスリンポンプまたは他の連続的送達系を利用して投与できる。

インスリン投与デバイスは当分野で知られており、米国特許番号６,５５４,７９８、６,６４１,５３３、６,７４４,３５０、６,８５２,１０４、６,８７２,２００、６,９３６,０２９、６,９７９,３２６、６,９９９,８５４、７,０２５,７４３および７,１０９,８７８を含むが、これらに限定されないあらゆる場所に記載されている。インスリン投与デバイスはまたグルコースモニターまたはセンサー、例えば、閉鎖ループ系に接続でき、および／または血糖値、食事の炭水化物量、または他の入力に基づく推奨インスリンを計算するための手段を含み得る。さらにインスリン投与デバイスはインプラント可能であるまたは対象に外付けもできる。外的インスリン注入ポンプの使用者は、個体の注意深い選択、注意深いモニタリング、および十分な教育および長期フォローアップが必要である。このケアは、一般的にインスリンポンプ処置の特定の専門知識および経験を有する医療従事者の多領域チームにより提供される。

ｉ. 開放ループ系
開放ループ系を、ここに提供する配合剤で使用できる。開放ループ系は、典型的にインスリン製剤を含む少なくとも１個の使い捨てリザーバー、ポンプ(すべてコントロール、ソフトウェア、処理モジュールおよび／またはバッテリーを含む)および皮下注射用カニューレまたは針およびインスリンリザーバーにカニューレまたは針を連結するチューブを含む使い捨て注入セットを含む。開放ループ系は小(基礎)投与量を数分毎に、そして患者が手動で設定する大(ボーラス)投与量を注入する。しかし、開放ループ系は、一般的にグルコースモニターまたはセンサーを含まず、それ故に、患者の血清グルコースレベル変換に応答できない。血糖値を測定するための種々の方法およびデバイスは当業者に知られている。多くの糖尿病患者で個人的に血糖値をモニタリングするために使用される慣用の技術は定期的採血、試験紙への血液の塗布、および熱量、電気化学、または光学系を使用する血糖値の決定を含む。多様なデバイスが、血流または間質性体液中の検体、例えばグルコースの連続的または自動モニタリングのために開発されている。これらのデバイスのいくつかは、患者の血管または皮下組織に直接インプラントされる電気化学センサーを使用する。グルコースレベルをモニタリングするための方法およびデバイスは、例えば、引用により本明細書に包含させる米国特許番号５,００１,０５４、５,００９,２３０,５,７１３,３５３、６,５６０,４７１、６,５７４,４９０、６,８９２,０８５、６,９５８,８０９、７,２９９,０８１、７,７７４,１４５、７,８２６,８７９、７,８５７,７６０および７,８８５,６９９に記載のものを含むが、これらに限定されない。

インスリン送達系、例えばインスリンポンプは当分野で知られており、開放ループ系で使用できる。開放ループインスリン投与デバイスの例(例えば上記のもの)は、引用により本明細書に包含させる米国特許番号４,５６２,７５１、４,６７８,４０８、４,６８５,９０３、４,３７３,５２７、４,５７３,９９４、６,５５４,７９８、６,６４１,５３３、６,７４４,３５０、６,８５２,１０４、６,８７２,２００、６,９３６,０２９、６,９７９,３２６、６,９９９,８５４、７,１０９,８７８、７,９３８,７９７および７,９５９,５９８に記載のものを含むが、これらに限定されない。これらおよび当業者により容易に同定できる類似の系を、ここに提供する配合剤の投与に使用できる。インスリン投与デバイス典型的には、インスリン製剤、例えば本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤を含む、一般的に使い捨てである１個以上のリザーバーを含む。数例において、配合剤は、注入チューブおよびカニューレまたは針を使用して投与される。他の例において、注入デバイスを直接皮膚に結合し、配合剤は、注入デバイスから、カニューレまたは針を通して、チューブを使用することなく体内に流れる。さらなる例において、注入デバイスは体内にあり、注入チューブを所望により使用して配合剤を投与できる。

ii. 閉鎖ループ系
閉鎖ループ系は、ある場合人工膵臓と呼ばれるが、ここに提供する配合剤の使用のために特に興味深い。閉鎖ループ系は、統合された連続的グルコースモニター、インスリンポンプまたは他の送液系および血糖値のリアルタイム測定に基づく血糖コントロールのための必要インスリン注入を常に計算する数学アルゴリズムを含むコントローラーを備えた系である。このような系は、最適化されたとき、健常非糖尿病対象で観察される自然なインスリン応答および血糖コントロールに類似する、一定で非常に密接な血糖コントロールを容易にできる。しかしながら、効果的であるためには、閉鎖ループ系は、信頼できかつ正確な連続的グルコースモニターおよび極めて即効性のインスリン投与を必要とする。例えば、速効性のインスリン類の皮下投与と関連したインスリン吸収および作用の遅延は、大きな食後血糖変動を起こし得る(Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12)。対外モニタリング系のインスリン吸収、インスリン作用、間質性グルコース動態、および投与時間の遅延、例えば微小透析技術によるものは、インスリン投与からその検出可能なグルコース低下効果のピークまで全体で１００分間以上のタイムラグを生じ得る(Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12)。こうして、一旦投与された後、インスリンはその測定可能な効果を約２時間上げ続ける。これは閉鎖ループ系を使用した、食後グルコース濃度の有効低下を複雑化し得る。最初に、グルコース上昇が検出されなければならない。しかしながら、これは典型的に約１０〜４０分間の遅延後のみに起こる。系は食事が消化されていることおよび適当な量のインスリンが投与されていることを決定しなければならない。系が‘誤った’インスリン投与量を後で相殺する能力は、長期遅延および一旦投与されたインスリンを‘撤回’できないことにより解決される。このような問題は、少なくとも一部、薬動力学的改善を伴う吸収速度およびレベルの増加を示し得る速効性のインスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤、例えばここに提供されるものの使用により解消され得る(例えばＵＳ２００９０３０４６６５およびＷＯ２００９１３４３８０参照)。速効性のインスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤は速効性のインスリン類単独と比較して減少したｔ_ｍａｘ(すなわち速い最高濃度達成)を有し、血糖値のコントロールを、速効性のインスリン類単独より速く開始する。この吸収の増加および作用開始はインスリン作用およびグルコースモニタリングおよび入力のラグを減らし、血糖値をより密接にコントロールでき、血糖変動を減らす、より有効な閉鎖ループ系をもたらし得る。

閉鎖ループ系は当分野で知られ、引用により本明細書に包含させる米国特許番号５,２７９,５４３、５,５６９,１８６、６,５５８,３５１、６,５５８,３４５、６,５８９,２２９、６,６６９,６６３、６,７４０,０７２、７,２６７,６６５および７,３５４,４２０を含むが、これに限定されない多くの文献に記載されている。これらおよび当業者により容易に選定される類似の系は、ここに提供する配合剤の投与に使用できる。閉鎖ループ系は、血糖値を測定するセンサー系、コントローラーおよび送達系を含む。この集積系は、体内の血糖濃度変化に応答したときに完全に機能しているヒトβ細胞でなされるのと類似の濃度プロファイルで対象にインスリンを投与するように注入デバイスを制御するように、膵臓ベータ細胞(β細胞)を模倣する。それ故に、系は体内の血糖値に対する自然なインスリン応答を模倣し、インスリンを有効に使用させるだけでなく、インスリンが代謝効果および分裂促進的効果を有するために、他の身体機能にも関係する。さらに、閉鎖ループ系を使用して達成される血糖コントロールは、食事の量および時間、または他の因子について何ら情報を必要としない。系は、単にリアルタイム血糖測定値のみに従い得る。グルコースセンサーは、体内の血糖値を表すセンサーシグナルを発生させ、センサーシグナルをコントローラーに送る。コントローラーはセンサーシグナルを受信し、インスリン送達系と連絡する命令を発生させる。インスリン投与系は命令を受信し、命令に応答してインスリンを体内に注入する。下に、ここに提供する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤の投与に使用できる閉鎖ループ系の構成部分を示す。当業者は、配合剤に使用するための適当な閉鎖ループ系を容易に選択できることは理解される。このような系は、米国特許番号５,２７９,５４３、５,５６９,１８６、６,５５８,３５１、６,５５８,３４５、６,５８９,２２９、６,６６９,６６３、６,７４０,０７２、７,２６７,６６５および７,３５４,４２０のものを含み、これらに限定されない文献に記載されている。系の個々の部分はまた文献に個々におよび血糖コントロールを達成するために使用する閉鎖ループ系全体で記載されている。ここに提供される例は、単なる例であり、他の閉鎖ループ系または個々の部分をここに提供する配合剤の投与に使用できることは理解される。

閉鎖ループ系は、連続的に機能するグルコースセンサーまたはモニターを含む。このようなデバイスは、皮下に挿入し、小レシーバーに無線周波数遠隔測定法によりワイアレスにグルコースデータを送信する小トランスミッターと結合した針型センサー類を含み得る。数例において、センサーを、センサーが皮下組織に配置されたら除去され、廃棄される挿入針を使用して対象の皮膚に挿入される。挿入針は、皮膚への挿入中センサーを維持するための鋭い先およびオープンスロットを有する(例えば米国特許番号５,５８６,５５３および５,９５４,６４３参照)。閉鎖ループ系において使用されるセンサーは、所望により皮下組織の間質性体液(ＩＳＦ)に暴露される３個の電極を含む。３個の電極は回路を形成するために使用される作用電極、基準電極および対電極を含む。適当な電圧を作用電極および基準電極を介して適用したとき、ＩＳＦはこれらの電極間にインピーダンスを提供する。アナログ電流シグナルが作用電極から体をとおり、対電極に流れる。作用電極の電圧は、一般的に既定に維持され、基準電極の電圧は、例えば、３００〜７００mVのような設定電圧Ｖ設定に維持できる。電極間の電圧差異により刺激されるほとんどの顕著な反応は、最初にグルコン酸および過酸化水素(Ｈ_２Ｏ_２)を産生するためにグルコースオキシダーゼ酵素(ＧＯＸ)と反応するため、グルコースの減少である。次いで、Ｈ_２Ｏ_２が作用電極表面で水(Ｈ_２Ｏ)および(Ｏ⁻)に還元される。Ｏ⁻はセンサー電気成分から正荷電を取り、故に電子を反発させ、電流を起こす。これは、センサー電極に接触するＩＳＦ中のグルコース濃度に比例するアナログ電流シグナルを生じる(例えば米国特許７,３５４,４２０参照)。

いくつかの例において、１個を超えるセンサーを血糖の測定に使用する。例えば、冗長なセンサー類を使用でき、対象は、テレメーターの特徴的送信電子回路によりセンサーが拒否されたとき気づき得る。インディケーターも、そのセンサーがまた機能しているおよび／またはまた機能しているセンサー数を対象に知らせ得る。他の例において、センサーシグナルを平均化または他の手段により組み合わせ得る。さらに、種々のタイプのセンサー類を使用できる。例えば、内部グルコースセンサーおよび外部グルコースセンサーを同時に血糖を測定するために使用できる。

閉鎖ループ系で使用できるグルコースセンサー類は周知であり、容易に同定でき、所望により、さらに当業者により修飾できる。内部グルコースセンサー類の例は、米国特許番号５,４９７,７７２、５,６６０,１６３、５,７９１,３４４、５,５６９,１８６および６,８９５,２６５に記載のものを含むが、これらに限定されない。盛んに使用されているグルコースセンサーの例は、米国特許６,０１１,９８４に記載されているものである。グルコースセンサー系はまた、光線、伝導性、ジェットサンプリング、微小透析、マイクロポーレーション、超音波サンプリング、逆イオントフォレシス、または他の方法(例えば米国特許番号５,４３３,１９７および５,９４５,６７６、および国際特許公開ＷＯ１９９９２９２３０)を含む他の検知技術も使用する。数例において、作用電極のみが皮下組織に位置し、ＩＳＦと接触し、および対電極および基準電極は体外に位置し、皮膚と接触する。対電極および基準電極はモニターハウジング表面に位置でき、皮膚にテレメーターの特徴的モニターの一部として固定され得る。さらなる例において、対電極および基準電極は他のデバイスを使用して皮膚に固定され、例えばワイヤを電極にまき、電極を皮膚にテーピングし、電極を皮膚に接触する監視の下側に置く。なおさらに、１個を超える作用電極を冗長性のために皮下組織下に置き得る。間質性体液もまた対象から回収し、体内にインプラントされていない外部センサー上を流し得る。

コントローラーはグルコースセンサーからの入力を受信する。コントローラーは、膵臓ベータ細胞(β細胞)を模倣するように設計され、血糖コントロールに必要な量のインスリンを注入するようにインスリン投与デバイスに命令する。コントローラーは、グルコースセンサーで検出されたグルコースレベルに基づき必要量のインスリンを計算するアルゴリズムを備えたソフトウェアを利用する。アルゴリズムの例は、どの程度インスリンが送達されたかに関わらず体内のグルコース変動が最少となるように設計されたアルゴリズムは過度の体重増加、高血圧、およびアテローム性動脈硬化症を生じ得るため、β細胞を密接に模倣するものを含む。典型的に、系はインビボインスリン分泌パターンを模倣し、正常健常個体で経験されるインビボβ細胞と一致してこのパターンを調節することを意図する。閉鎖ループ系で有用なコントロールアルゴリズは、比例積分制御(ＰＩＤ)コントローラーで使用されているものを意味する。比例制御コントローラーおよびモデル予測制御(ＭＰＣ)アルゴリズムもある系で使用できる(Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12)。アルゴリズムの例はHovorka et al. (Diabetic Med. (2006) 23:1-12), Shimoda et al., (Front Med Biol Eng (1997) 8:197-211), Shichiri et al. (Artif. Organs (1998) 22:32-42), Steil et al. (Diabetes Technol Ther (2003) 5: 953-964), Kalatz et al., (Acta Diabetol. (1999) 36:215)および米国特許番号５,２７９,５４３、５,５６９,１８６、６,５５８,３５１、６,５５８,３４５、６,５８９,２２９、６,７４０,０４２、６,６６９,６６３、６,７４０,０７２、７,２６７,６６５および７,３５４,４２０および米国特許公開番号２００７０２４３５６７により記載されているものを含むが、これらに限定されない。

一例において、ＰＩＤコントローラーは閉鎖ループ系で使用される。ＰＩＤコントローラーはインスリン注入を、グルコース変動を、標的グルコース(比例的要素)からの逸脱、環境および標的グルコース間の曲線化面積 (積分要素)、および環境グルコース(誘導要素)変化の３点の評価により連続的に調節する。一般的に、グルコース変化に対するインビボβ細胞応答は、“第一”相および“第二”相インスリン応答により特徴づけられる。β細胞の二相インスリン応答は、比例的要素に積分および誘導(ＰＩＤ)コントローラーを使用して模倣できる(例えば米国特許７,３５４,４２０参照)。

コントローラーは所望のインスリン投与のための命令を生じる。インスリン送達系、例えばインスリンポンプは当分野で知られており、閉鎖ループ系で使用できる。インスリン投与デバイス(例えば上記のもの)の例は、米国特許番号４,５６２,７５１、４,６７８,４０８、４,６８５,９０３、４,３７３,５２７、４,５７３,９９４、６,５５４,７９８、６,６４１,５３３、６,７４４,３５０、６,８５２,１０４、６,８７２,２００、６,９３６,０２９、６,９７９,３２６、６,９９９,８５４、７,０２５,７４３および７,１０９,８７８に記載のものを含むが、これらに限定されない。インスリン投与デバイスは典型的に一般的に使い捨てであり、インスリン製剤、例えば本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤を含む１個以上のリザーバーを含む。数例において、配合剤は注入チューブおよびカニューレまたは針を介して投与される。他の例において、注入デバイスは直接皮膚に接続され、配合剤は注入デバイスからカニューレまたは針を介して、直接チューブを使用せずに注入される。さらなる例において、注入デバイスは体内であり、注入チューブは、所望により配合剤の送達に使用できる。閉鎖ループ系はまたフィルター、キャリブレータおよびトランスミッターを含むが、これらに限定されない付加的要素を含み得る。

Ｈ. インスリンまたはヒアルロナン分解酵素をコードする核酸およびそのポリペプチド類の製造方法
本明細書に記載するインスリンおよびヒアルロナン分解酵素のポリペプチドは、当技術分野で周知のタンパク質精製方法および組換えタンパク質発現方法によって得ることができる。ポリペプチドは化学的に合成することもできる。例えばインスリンのＡ鎖およびＢ鎖を化学合成してから、それらを、例えば還元−再酸化反応などにより、ジスルフィド結合で架橋することができる。ポリペプチドを組換え手段によって製造する場合は、所望の遺伝子をコードする核酸を同定するための当業者に知られる任意の方法を使用することができる。当技術分野で利用できる任意の方法を使って、例えば細胞または組織供給源から、ヒアルロニダーゼをコードする完全長(すなわち全コード領域を包含する)ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得ることができる。改変型または変異型インスリンまたはヒアルロナン分解酵素は、野生型ポリペプチドから、部位特異的突然変異誘発法などによって工学的に作製することができる。

ポリペプチドは、核酸分子をクローン化または単離するための当技術分野で知られる任意の利用可能な方法を使って、クローン化または単離することができる。そのような方法には、核酸のＰＣＲ増幅およびライブラリーのスクリーニング、例えば核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づくスクリーニング、および活性に基づくスクリーニングが含まれる。

例えばポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法を含む核酸増幅法を使って、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる。核酸含有材料を出発物質として使用して、そこから所望のポリペプチドコード核酸分子を単離することができる。増幅方法では、例えばＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物、体液試料(例えば血液、精子、唾液)、および健常被験者および／または罹患被験者から得た試料を使用することができる。核酸ライブラリーも出発物質の供給源として使用することができる。所望のポリペプチドが増幅されるようにプライマーを設計することができる。例えば、所望のポリペプチドがそこから生成される発現された配列に基づいて、プライマーを設計することができる。プライマーは、逆翻訳に基づいて設計することができる。増幅によって生成した核酸分子を配列決定し、所望のポリペプチドがコードされていることを確認することができる。

追加ヌクレオチド配列、例えば合成遺伝子をベクター(例えばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コードＤＮＡ配列を増幅するために設計されたベクター)中にクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列などを、ポリペプチドコード核酸分子につなぐことができる。さらにまた、機能的ＤＮＡ要素を指定する追加ヌクレオチド配列をポリペプチドコード核酸分子に作動的に連結することもできる。そのような配列の例には、細胞内タンパク質発現が容易になるように設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌が容易になるように設計された分泌配列、例えば異種シグナル配列などがあるが、これらに限定されない。そのような配列は当業者には知られている。タンパク質結合領域を指定する塩基配列などの追加ヌクレオチド残基配列も酵素コード核酸分子に連結することができる。そのような領域には、特異的標的細胞への酵素の取り込みを容易にするか、合成遺伝子の産物の薬物動態を他の形で変化させる残基の配列、または特異的標的細胞への酵素の取り込みを容易にするか、合成遺伝子の産物の薬物動態を他の形で変化させるタンパク質をコードする残基の配列などがあるが、これらに限定されない。例えば酵素をＰＥＧ部分に連結することができる。

さらに、例えばポリペプチドの検出またはアフィニティ精製を助けるためなどの目的で、タグまたは他の部分を付加することもできる。例えば、エピトープタグまたは他の検出可能マーカーを指定する塩基配列などの追加ヌクレオチド残基配列も、酵素コード核酸分子に連結することができる。そのような配列の典型例には、Ｈｉｓタグ(例えば６×Ｈｉｓ、ＨＨＨＨＨＨ；配列番号５４)またはＦｌａｇタグ(ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号５５)などがある。

次に、同定され単離された核酸を適当なクローニングベクターに挿入することができる。当技術分野で知られる多数のベクター−宿主系を使用することができる。考えられるベクターには、プラスミドまたは改変ウイルスなどがあり、これらに限定されないが、ベクター系は使用する宿主細胞と適合しなければならない。そのようなベクターには、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＣＭＶ４、ｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、またはBluescriptベクター(Stratagene, La Jolla, CA)などがあるが、これらに限定されない。他の発現ベクターには、本明細書に例示するＨＺ２４発現ベクターがある。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を持つクローニングベクター中に、ＤＮＡフラグメントをライゲートすることによって達成することができる。挿入はＴＯＰＯクローニングベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使って達成することができる。ＤＮＡをフラグメント化するために使用される相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいは、ヌクレオチド配列(リンカー)をＤＮＡ末端にライゲートすることによって所望する任意の部位を作り出すこともでき、これらのライゲートされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成オリゴヌクレオチドを含有することができる。これに代わる方法として、切断されたベクターおよびタンパク質遺伝子を、ホモポリマーテーリング(homopolymer tailing)によって修飾することもできる。組換え分子は、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションなどによって、その遺伝子配列のコピーが数多く生成するように、宿主細胞中に導入することができる。

インスリンは種々の技法を使って製造することができる(例えばLadisch et al. (1992) Biotechnol. Prog. 8:469-478参照)。いくつかの例では、プレプロインスリンポリペプチドまたはプロインスリンポリペプチドをコードする核酸を、発現ベクター中に挿入する。発現させた後、プレプロインスリンポリペプチドまたはプロインスリンポリペプチドは、シグナル配列および／またはＣペプチドを切断する酵素的方法または化学的方法(これは、Ａ鎖およびＢ鎖をもたらし、それらが例えば還元−再酸化反応などによってジスルフィド結合で架橋される)によって、インスリンに変換される(例えばCousens et al., (1987) Gene 61:265-275, Chance et al., (1993) Diabetes Care 4:147-154参照)。もう一つの例では、インスリンのＡ鎖およびＢ鎖をコードする核酸を、１つまたは２つの発現ベクターに挿入して、１つの発現ベクターから単一ポリペプチドとして共発現させるか、１つまたは２つの発現ベクターから２つのポリペプチドとして発現させる。したがって、Ｃ鎖の非存在下で、Ａ鎖ポリペプチドとＢ鎖ポリペプチドを、別々に発現させてからそれらを組み合わせてインスリンを生成させるか、共発現させることができる。Ａ鎖およびＢ鎖を単一ポリペプチドとして共発現させる例では、サブユニットをコードする核酸が、後述するリンカーまたはスペーサーのようなリンカーまたはスペーサーを、Ｂ鎖とＡ鎖の間にコードすることもできる。発現ベクター中に挿入される核酸は、例えばインスリンＢ鎖、リンカー(例えばアラニン−アラニン−リジンリンカーなど)およびＡ鎖をコードする核酸を含有して、例えば“インスリンＢ鎖−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−インスリンＡ鎖”の発現をもたらすことができる。

特別な態様では、宿主細胞を、単離されたタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を組み込んだ組換えＤＮＡ分子で形質転換することにより、その遺伝子のコピーを多数生成させることができる。こうして、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要であれば、単離した組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、遺伝子を大量に得ることができる。

１. ベクターおよび細胞
本明細書に記載する任意のタンパク質など、所望のタンパク質の１つ以上を組換え発現させるために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全部または一部を含有する核酸を、適当な発現ベクター中に、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に、挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、酵素遺伝子の天然プロモーターおよび／またはそれらの隣接領域によって供給され得る。

酵素をコードする核酸を含有するベクターも提供する。ベクターを含有する細胞も提供する。細胞には真核細胞および原核細胞が含まれ、ベクターはそこでの使用に適した任意のベクターである。

ベクターを含有する原核細胞および真核細胞(内皮細胞を含む)を提供する。そのような細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞などがある。細胞は、コードされているタンパク質が細胞によって発現されるような条件下で上述の細胞を成長させ、発現されたタンパク質を回収することにより、そのタンパク質を生産するために使用される。本発明では、例えば酵素を、培地中に分泌させることができる。

天然のまたは異種のシグナル配列に結合された可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ならびにその複数コピーを含有するベクターを提供する。ベクターは酵素タンパク質が細胞中で発現されるように選択するか、酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。

種々の宿主−ベクター系を使って、タンパク質コード配列を発現させることができる。これらには、ウイルス(例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス)に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌などがあるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素はその強さおよび特異性がさまざまである。使用する宿主−ベクター系に依存して、数ある適切な転写および翻訳要素のどれでも１つを使用することができる。

ベクター中にＤＮＡフラグメントを挿入するための当業者に知られる任意の方法を使用して、適当な転写／翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列とを含むキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技法、ならびにインビボ組換え体(遺伝子組換え)を含めることができる。タンパク質またはそのドメイン、誘導体、フラグメントもしくはホモログをコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはそのフラグメントが組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように、第２の核酸配列によって調節することができる。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で知られる任意のプロモーター／エンハンサーで制御することができる。具体的一態様では、プロモーターが、所望するタンパク質の遺伝子にとって天然のプロモーターではない。使用することができるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)))、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列(long terminal repeat)に含まれるプロモーター(Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982))；原核発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター(Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543)またはｔａｃプロモーター(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983))；“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”: in Scientific American 242:74-94 (1980)も参照；ノパリンシンテターゼプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984))またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター(Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981))、および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984))を含有する植物発現ベクター；酵母および他の真菌由来のプロモーター要素、例えばＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し、トランスジェニック動物で使用されてきた、以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域(Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987))；膵β細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985))、リンパ球様細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987))、精巣、乳房、リンパ球様細胞およびマスト細胞中で活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域(Leder et al., Cell 45:485-495 (1986))、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987))、肝臓中で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987))、肝臓中で活性なα−１アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987))、骨髄性細胞中で活性なβグロビン遺伝子制御領域(Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986))、脳の希突起膠細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987))、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域(Shani, Nature 314:283-286 (1985))、および視床下部の性腺刺激細胞中で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))を含むが、これらに限定されない。

具体的態様において、所望のタンパク質またはそのドメイン、フラグメント、誘導体もしくはホモログをコードする核酸に作動的に連結されたプロモーター、１つ以上の複製起点、および場合によっては、１つ以上の選択可能マーカー(例えば抗生物質耐性遺伝子)を含有するベクターを使用する。大腸菌細胞を形質転換するための典型的プラスミドベクターには、例えばｐＱＥ発現ベクター(Qiagen, Valencia, CA)から入手可能；Ｑｉａｇｅｎが発行したこの系に関する文献も参照されたい)がある。ｐＱＥベクターは、ファージＴ５プロモーター(大腸菌ＲＮＡポリメラーゼによって認識される)と、大腸菌における組換えタンパク質の緻密に調節された高レベル発現をもたらすための二重ｌａｃオペレーター抑制モジュール(double lac operator repression module)、効率のよい翻訳のための合成リボソーム結合部位(ＲＢＳ II)、６×Ｈｉｓタグコード配列、ｔ_０およびＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製起点、およびアンピシリン耐性を付与するためのβ−ラクタマーゼ遺伝子を持つ。ｐＱＥベクターは６×Ｈｉｓタグを組換えタンパク質のＮ末端またはＣ末端に置くことを可能にする。そのようなプラスミドには、３つの読み枠全てにマルチクローニング部位を与え、Ｎ末端が６×Ｈｉｓタグで標識されたタンパク質の発現をもたらす、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０、およびｐＱＥ３１がある。大腸菌細胞を形質転換するための他の典型的プラスミドベクターには、例えばｐＥＴ発現ベクター(米国特許第４,９５２,４９６号；NOVAGEN(Madison, WI)から入手可能；NOVAGENが発行したこの系に関する文献も参照されたい)などがある。そのようなプラスミドには、ｐＥＴ１１ａ(これは、Ｔ７ ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性大腸菌ｌａｃオペレーター、およびｌａｃリプレッサー遺伝子を含有する)；ｐＥＴ１２ａ−ｃ(これは、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、および大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含有する)；ならびにｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ(NOVAGEN, MADISON, WI)(これらは、Ｈｉｓカラムによる精製に使用するためのＨｉｓ−Ｔａｇ(商標)リーダー配列、およびカラムでの精製後に行われる切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含有する)などがある。

哺乳動物細胞発現用ベクターの例は、ＨＺ２４発現ベクターである。ＨＺ２４発現ベクターはｐＣＩベクターバックボーン(Promega)から誘導された。これは、β−ラクタマーゼ耐性遺伝子(ＡｍｐＲ)をコードするＤＮＡ、Ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー／プロモーター領域(ＣＭＶ)、およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル(ＳＶ４０)を含有する。この発現ベクターは、ＥＣＭＶウイルス(Clontech)由来の配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子も持つ。

２. リンカー部分
いくつかの例では、例えばＢ鎖のＣ末端が短いリンカーでＡ鎖のＮ末端に接合されるようになっている、リンカーを持つＡ鎖ポリペプチドとＢ鎖ポリペプチドを作製することによって、インスリンが製造される。Ａ鎖とＢ鎖は、リンカーを含有する単一ポリペプチドから発現させるか、別々に発現させてからリンカーで接合することができる。リンカー部分は、所望する性質に応じて選択される。

リンカー部分は、Ａ鎖とＢ鎖がインスリンの天然のコンフォメーションを模倣することができるように、十分に長くフレキシブルでなければならない。リンカーは、インスリンＡ鎖およびＢ鎖に適した部分であれば、なんでもよい。そのような部分には、ペプチド性結合(peptidic linkage)；アミノ酸およびペプチド結合、典型的に、１〜約６０個のアミノ酸を含有するもの；化学的リンカー、例えばヘテロ二官能性切断可能架橋剤、光切断可能リンカー、および酸切断可能リンカーなどがあるが、これらに限定されない。

リンカー部分はペプチドであることができる。ペプチドリンカーは、典型的に、約２〜約６０個のアミノ酸残基、例えば約５〜約４０個、または約１０〜約３０個のアミノ酸残基を持つ。好都合なことに、ペプチド性リンカー(peptidic linker)は核酸にコードして、大腸菌などの宿主細胞における発現時に融合タンパク質に組み込むことができる。ある例では、発現時に“インスリンＢ鎖−ＡＡＫ−インスリンＡ鎖”ポリペプチドが生成するように、インスリンＢ鎖をコードする核酸とＡ鎖をコードする核酸との間にある核酸中に、アラニン−アラニン−リジン(ＡＡＫ)(配列番号１７８)リンカーをコードする。ペプチドリンカーは、フレキシブルなスペーサーアミノ酸配列、例えば単鎖抗体研究で知られているものなどであることができる。そのような既知リンカーの例には、ＲＰＰＰＰＣ(配列番号１６６)またはＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号１６７)、ＧＧＧＧＳ(配列番号１６８)、(ＧＧＧＧＳ)_ｎ(配列番号１６９)、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ(配列番号１７０)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号１７１)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ(配列番号１７２)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号１７３)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号１７４)、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ(配列番号１７５)、ＳＲＳＳＧ(配列番号１７６)およびＳＧＳＳＣ(配列番号１７７)があるが、これらに限定されない。

あるいは、ペプチドリンカー部分はＶＭ(配列番号１７９)またはＡＭ(配列番号１８０)であるか、式：ＡＭ(Ｇ_２−４Ｓ)_ｘＡＭ［式中、Ｘは１〜１１の整数である］(配列番号１８１)で記述される構造を持つこともできる。例えばHuston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883; Whitlow, M., et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995; Newton et al. (1996) Biochemistry 35:545-553; A. J. Cumber et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:397-401; Ladurner et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:330-337；および米国特許第４,８９４,４４３号などには、さらなる連結部分が記載されている。

いくつかの例では、ペプチドリンカーが核酸によってコードされ、大腸菌や出芽酵母(S. cerevisiae)などの宿主細胞中で発現させた時に、Ｂ鎖とＡ鎖の間に組み込まれる。別の例では、ペプチドリンカーが化学的方法によって合成される。これは、Ａ鎖およびＢ鎖の一つ以上の合成とは別個のプロトコルで行うことができ、構成要素は、その後に、例えばヘテロ二官能性リンカーなどを使って接合される。あるいは、ペプチドリンカーを一方のインスリン鎖のＮ末端またはＣ末端に合成し、次にそれを他方の鎖に、そのペプチドリンカーを介して、例えばヘテロ二官能性リンカーなどを使って連結することもできる。

ここでは、インスリンＡ鎖およびＢ鎖を連結するために、当業者に知られる任意のリンカーを使用することができる。鎖を化学的に連結するのに適したリンカーおよび結合様式には、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ヒンダード(hindered)ジスルフィド結合、およびアミン基やチオール基などの遊離反応性基間の共有結合などがあるが、これらに限定されない。これらの結合は、ヘテロ二官能性試薬を使って一方または両方のポリペプチド上に反応性チオール基を生成させた後、一方のポリペプチド上のチオール基を、他方の鎖上の反応性チオール基または反応性マレイミド基もしくはチオール基を結合させることができるアミン基と反応させることによって作られる。他のリンカーには、酸性が強い細胞内区画では切断されるであろう酸切断可能リンカー、例えばビスマレイミドエトキシプロパン(bismaleimideothoxy propane)、酸不安定性トランスフェリンコンジュゲートおよびアジピン酸ジヒドラジド(adipic acid diihydrazide)；ＵＶまたは視覚光に曝露すると切断される架橋剤、ならびにヒトＩｇＧ１の定常領域に由来する種々のドメイン(例えばＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３)などのリンカー(Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386参照)などがある。いくつかの態様では、各リンカーの望ましい性質を利用するために、数個のリンカーを含めることができる。化学的リンカーおよびペプチドリンカーは、リンカーをインスリンＡ鎖およびＢ鎖に共有結合でカップリングすることによって挿入することができる。そのような共有結合的カップリングは、下記のヘテロ二官能性剤を使って達成することができる。Ｂ鎖とＡ鎖の間にリンカーをコードしているＤＮＡを発現させることによって、ペプチドリンカーを連結することもできる。

インスリンのＡ鎖とＢ鎖を接合するために使用することができる他のリンカーには、次に挙げるものがある：酵素基質、例えばカテプシンＢ基質、カテプシンＤ基質、トリプシン基質、トロンビン基質、スブチリシン基質、第Ｘａ因子基質、およびエンテロキナーゼ基質；溶解性、可撓性(flexibility)および／または細胞内切断可能性を増加させるリンカーには、(ｇｌｙ_ｍｓｅｒ)_ｎおよび(ｓｅｒ_mｇｌｙ)_ｎ［式中、ｍは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４であり、ｎは１〜３０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜４である］などのリンカーがある(例えば典型的リンカーが記載されているＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／０６６４１を参照されたい)。いくつかの態様では、各リンカーの望ましい性質を利用するために、数個のリンカーを含めることができる。

３. 発現
インスリンおよびヒアルロナン分解酵素ポリペプチドは、インビボ法およびインビトロ法を含む、当業者に知られる任意の方法によって製造することができる。所望のタンパク質は、要求される量および形態(例えば投与および処置に必要とされる量および形態)でそのタンパク質を生産するのに適した任意の生物中で発現させることができる。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えば大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞(ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む)が含まれる。発現宿主は、そのタンパク質産生レベルが異なり得ると共に、発現されたタンパク質上に存在する翻訳後修飾のタイプも異なり得る。発現宿主の選択は、これらの因子および他の因子、例えば調節および安全性の問題、生産コスト、ならびに精製の必要性および精製の方法などに基づいて行うことができる。

多くの発現ベクターが利用可能であり、当業者に知られており、それらをタンパク質の発現に使用することができる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって左右されるだろう。一般に発現ベクターは、転写プロモーターを含み、場合によってはエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定形質転換に使用される発現ベクターは、典型的に、形質転換細胞の選択と維持を可能にする選択可能マーカーを持つ。複製起点を使用してベクターのコピー数を増幅することができる場合もある。

可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドは、タンパク質融合物として利用し、または発現させることもできる。例えば、酵素に付加的機能を加えるために、酵素融合物を作製することができる。酵素融合タンパク質の例には、シグナル配列、タグ、例えば位置確認(localization)用のタグ、例えばｈｉｓ_６タグもしくはｍｙｃタグ、または精製用タグ、例えばＧＳＴ融合物、ならびにタンパク質分泌および／または膜会合を指示するための配列の融合物などがあるが、これらに限定されない。

ａ. 原核細胞
原核生物、特に大腸菌は、大量のタンパク質を生産するための系になる。大腸菌の形質転換は当業者に周知の簡便で迅速な技法である。大腸菌用の発現ベクターは誘導性プロモーターを含有することができ、そのようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに有用であり、宿主細胞に対して何らかの毒性を示すタンパク質を発現させるのにも有用である。誘導性プロモーターの例には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター、ならびに温度感受性λＰＬプロモーターなどがある。

タンパク質(例えば本明細書に記載する任意のタンパク質)は、大腸菌の細胞質環境中で発現させることができる。細胞質は還元的環境であり、一部の分子にとって、これは不溶性封入体の形成をもたらし得る。タンパク質を再可溶化するにはジチオスレイトールやβ−メルカプトエタノールなどの還元剤およびグアニジン−ＨＣｌや尿素などの変性剤を使用することができる。代替的アプローチは、酸化的環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生をもたらすことができる周辺腔におけるタンパク質の発現である。典型的に、タンパク質をペリプラズムに向かわせるリーダー配列が、発現されるべきタンパク質に融合される。その場合、リーダーは、ペリプラズム内で、シグナルペプチダーゼによって除去される。ペリプラズムを標的とする(periplasmic-targeting)リーダー配列には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダー、およびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーなどがある。ペリプラズム発現により、発現されたタンパク質の培養培地への漏出が可能になる場合もある。タンパク質の分泌は培養上清からの迅速かつ簡便な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は浸透圧溶解によってペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、時には、タンパク質が不溶性になることもあり、可溶化および再フォールディングが容易になるように、変性剤および還元剤を使用することができる。誘導温度および成長温度も、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼすことがあり、典型的に、２５℃〜３７℃の温度が使用される。典型的に、細菌は非グリコシル化タンパク質を産生する。タンパク質が機能するためにグリコシル化を要求する場合は、宿主細胞から精製した後に、インビトロでグリコシル化を追加することができる。

ｂ. 酵母細胞
サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母は、タンパク質(例えば本明細書に記載する任意のタンパク質)の生産に使用することができる周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターで形質転換させるか、相同組換えによる安定染色体組込みで形質転換させることができる。典型的に、遺伝子発現を調節するために、誘導性プロモーターが使用される。そのようなプロモーターの例には、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えばＣＵＰ１、ＡＯＸ１、または他のピキア(Ｐｉｃｈｉａ)プロモーターもしくは他の酵母プロモーターがある。発現ベクターは、多くの場合、形質転換されたＤＮＡを選択し維持するために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３などの選択可能マーカーを含む。酵母中で発現されたタンパク質は溶解性であることが多い。Ｂｉｐなどのシャペロニン類およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現により、発現レベルおよび溶解性が改善され得る。また、酵母中で発現されるタンパク質は、例えばサッカロミセス・セレビシェに由来する酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物、およびＡｇａ２ｐ接合付着受容体(mating adhesion receptor)またはアークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を使って、分泌するように指示することもできる。発現されたポリペプチドが分泌経路を出た時に、融合された配列を発現されたポリペプチドから除去するために、プロテアーゼ切断部位、例えばＫｅｘ−２プロテアーゼの切断部位を、工学的に作ることができる。酵母はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化を行う能力も持つ。

ｃ. 昆虫細胞
昆虫細胞、特にバキュロウイルス発現を用いるものは、ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物が使用する翻訳後修飾の大半を行う能力を持つ。バキュロウイルスは宿主域が制限されており、それが安全性を向上させ、真核細胞発現に関する規制上の懸念を減少させる。典型的な発現ベクターは、高レベル発現用のプロモーター、例えばバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系は、例えばオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)およびカイコ(Bombyx mori)核多核体病ウイルス(ＢｍＮＰＶ)などのバキュロウイルスと、例えばツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)に由来するＳｆ９、シューダレチア・ユニパンクタ(Pseudaletia unipuncta)(Ａ７Ｓ)およびオオカバマダラ(Danaus plexippus)(ＤｐＮ１)などの昆虫細胞株を含む。高レベル発現には、発現されるべき分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳類分泌シグナルは昆虫細胞では正確にプロセシングされ、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌させるには、これらのシグナルを使用することができる。加えて、細胞株シューダレチア・ユニパンクタ(Ａ７Ｓ)およびオオカバマダラ(ＤｐＮ１)は、哺乳動物細胞系と類似するグリコシル化パターンを持つタンパク質を産生する。

昆虫細胞におけるもう一つの発現系は安定形質転換細胞の使用である。発現には、シュナイダー(Schneider)２(Ｓ２)細胞およびＫｃ細胞(キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster))およびＣ７細胞(ヒトスジシマカ(Aedes albopictus))などの細胞株を使用することができる。カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下で高レベル発現を誘導するために、ショウジョウバエ(Drosophila)メタロチオネインプロモーターを使用することができる。発現ベクターは、典型的には、ネオマイシンやハイグロマイシンなどの選択可能マーカーの使用によって維持される。

ｄ. 哺乳動物細胞
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのタンパク質を発現させるために、哺乳類発現系を使用することができる。発現コンストラクトは、アデノウイルスなどのウイルス感染によって、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接的ＤＮＡ導入によって、また、エレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの物理的手段によって、哺乳動物細胞に導入することができる。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、典型的に、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列(コザック(Ｋｏｚａｋ)コンセンサス配列)およびポリアデニル化要素を含む。選択可能マーカーなどのもう一つの遺伝子との２シストロン性発現が可能になるように、ＩＲＥＳ要素も加えることができる。そのようなベクターは、多くの場合、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)の末端反復配列などを含む。これらのプロモーター−エンハンサーは多くの細胞タイプにおいて活性である。発現には、組織型および細胞型のプロモーターおよびエンハンサー領域も使用することができる。典型的なプロモーター／エンハンサー領域には、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(gonadotropic releasing hormone gene control)などの遺伝子に由来するものがあるが、これらに限定されない。発現コンストラクトを持つ細胞を選択し、維持するために、選択可能マーカーを使用することができる。選択可能マーカー遺伝子の例には、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)およびチミジンキナーゼなどがあるが、これらに限定されない。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を発現させる細胞だけを選択するために、メトトレキサートの存在下で発現を行うことができる。ＴＣＲ−ζやＦｃ_εＲＩ−γなどの細胞表面シグナリング分子との融合により、細胞表面上で活性な状態にあるタンパク質の発現を指示することができる。

哺乳類発現には、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞およびハムスター細胞など、多くの細胞株を利用することができる。典型的細胞株には、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０(非分泌性)および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８、およびＨＫＢ細胞などがあるが、これらに限定されない。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を容易にする無血清培地に適応した細胞株も利用できる。例として、ＣＨＯ−Ｓ細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 11619-012)および無血清ＥＢＮＡ−１細胞株(Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42)が挙げられる。発現量が最大になるように最適化された特別な培地での成長に適応した細胞株も利用できる。例えばＤＧ４４ ＣＨＯ細胞は、動物性産物を含まない合成培地における懸濁培養での成長に適応している。

ｅ. 植物
タンパク質(例えば本明細書に記載する任意のタンパク質)を発現させるために、トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を使用することができる。発現コンストラクトは、典型的に、微粒子銃(microprojectile bombardment)やプロトプラストへのＰＥＧによる導入などといった直接的ＤＮＡ導入を使って、またアグロバクテリウムによる形質転換を使って、植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結要素および翻訳制御要素を含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技法は、通常は、アラビドプシス(Arabidopsis)やタバコなどの双子葉植物宿主用と、トウモロコシやイネなどの単子葉植物宿主用とに分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびＵＢＱ３プロモーターなどがある。形質転換細胞の選択と維持が容易になるように、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択可能マーカーが、多くの場合、使用される。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体(カルス組織)として培養維持するか、全植物体に再生させることができる。トランスジェニック植物細胞には、ヒアルロニダーゼポリペプチドを産生するように工学的に操作された藻類も含めることができる。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを持つので、これは、これらの宿主中で生産されたタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。

４. 精製方法
インスリンポリペプチドおよびヒアルロナン分解酵素ポリペプチドまたは他のタンパク質などといったポリペプチドを宿主細胞から精製するための方法は、選択した宿主細胞と発現系に依存するだろう。分泌される分子の場合、タンパク質は一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現の場合は、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック植物やトランスジェニック動物などのトランスジェニック生物を発現に使用する場合は、組織または臓器を、溶解細胞抽出物を作るための出発物質として使用することができる。また、トランスジェニック動物生産には、乳または卵におけるポリペプチドの生産を含めることができ、それらは、収集し、必要であれば、当技術分野における標準的方法を使って、タンパク質を抽出し、さらに精製することができる。

インスリンポリペプチドまたはヒアルロナン分解酵素ポリペプチドなどのタンパク質は、当技術分野において知られる標準的なタンパク質精製技法、例えば限定するわけではないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、およびアニオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィーなどを使って精製することができる。効率および調製物の純度を改善するためにアフィニティ精製技法を利用することもできる。アフィニティ精製では、例えばヒアルロニダーゼ酵素を結合する抗体、受容体および他の分子を使用することができる。発現コンストラクトを工学的に操作して、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ_６などのアフィニティタグをタンパク質に付加し、それぞれｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂を使ってアフィニティ精製することもできる。純度は、当技術分野で知られる任意の方法、例えばゲル電気泳動、オルソゴナルなＨＰＬＣ法、染色および分光測光技法などによって評価することができる。

Ｉ. 安定性および活性の評価方法
アッセイを使用して、ここに提供する速効性のインスリンおよびヒアルロナン分解酵素を含む配合剤を含む、ここに提供する製剤または配合剤を評価できる。このようなアッセイは配合剤中のヒアルロナン分解酵素の安定性および活性および／または速効性のインスリンの安定性、活性および溶解性を評価できる。このようなアッセイは、例えば、長時間、特定の保存温度および条件における配合剤の安定性を、保存前、およびその後の種々の時点で評価することにより活性、溶解性、および安定性(例えば凝集体形成など)を決定するために使用できる。アッセイはまた両活性剤の安定性を維持しながらここに提供する製剤をわずかに調節するためにも使用できる。

１. インスリン
ここに提供する配合剤のインスリン安定性および溶解性は、当分野で周知の方法およびアッセイを使用して評価できる。例えば、インスリン安定性および溶解性は視覚評価、酸浄化、光学顕微鏡、逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)、インビボバイオアッセイおよび変性および非変性サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)により評価できる。一例において、インスリンの溶解性および安定性を、色の変化、透明度、凝集体存在またはクランピングおよび物質接着、またはここに提供する配合剤を含む溶液へのフロスティングを含む視覚評価で評価できる。視覚変化は、酸化後の溶解の欠如がここに提供する配合剤におけるインスリンの不要性変性を確認する、酸浄化により確認できる。ここに提供する配合剤におけるインスリンの視覚変化はまた光学顕微鏡および／または蛍光バックライトにより顕微鏡でも確認できる。ここに提供する配合剤における速効性インスリンの見かけの溶解性は、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、例えば実施例３に記載のとおり評価する。実施例３に示す方法において、見かけの溶解性は、種々の条件および時点で保存後のインスリン回収パーセントとして測定する。回収パーセントは、参照サンプルとの比較として示す。加えて、インスリン分解産物、例えばデスアミドインスリンは、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定できる。一例において、ここに提供する配合剤におけるインスリン安定性は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用する凝集体形成の測定により評価する(例えば、実施例４参照)。この例において、ＳＥＣを高分子量タンパク質類、すなわち、凝集体の存在の測定に使用する。

インスリン活性はまた当分野で知られた方法およびアッセイを使用して評価できる。例えば、インスリン組成物および配合剤を含むインスリンが治療剤として作用する能力を、インビトロまたはインビボで評価できる。例えば、当技術分野で周知のインビトロアッセイを行って、インスリン受容体に結合するインスリンの能力を評価することができる。ある例では、ヒト胎盤細胞膜をインスリン受容体の供給源として調製し、それを、非標識インスリン類似体と共に、または非標識インスリン類似体なしで、放射標識ヒトインスリンとインキュベートするという、競合的結合アッセイを行う。次に、結合した放射標識インスリンの量を検出して、結合について競合するインスリン類似体の能力を決定し、胎盤インスリン受容体に対するインスリン類似体の相対的アフィニティを算出する(例えばWeiss et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:40018-40024参照)。他のインスリン受容体供給源、例えばインスリン受容体を天然にまたは組換え的に発現させる他の細胞も、そのような競合的結合アッセイに使用することができる(Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258)。

グルコース取り込みを刺激し、またはその典型的な代謝的帰結の他のいずれかを達成するという、インスリンの能力は、インビトロで評価することができる。インスリンが刺激するグルコース取り込みを測定するには、脂肪細胞を、インスリンと共に、またはインスリンなしで、２−デオキシ−Ｄ−［２,６^３−Ｈ］グルコースまたはＤ−［Ｕ−^１４Ｃ］グルコースなどの標識グルコースとインキュベートする。次に、取り込まれた放射能を測定して、インスリンの存在下または非存在下でのグルコース取り込みの量を決定する(Louveau et al., (2004) J Endocrin. 181:271-280, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258)。インスリン類似体の活性を評価する場合は、ヒトインスリンの活性も評価して、それを比較に使用することができる。インスリン存在下でのＨ４IIＥ細胞におけるグルコース産生を評価するためのインビトロアッセイを行うこともできる(Wang et al., (2000) J. Biochem., 275:14717-14721, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258)。

インスリン組成物および配合剤を含み、インスリンの治療活性を評価するために、糖尿病のまたは健常な動物モデルまたはヒト被験者を用いるインビボ試験も行うことができる。インスリンを糖尿病の動物モデルに投与して、例えば血中グルコースレベル、循環インスリンレベル、およびヘモグロビンＡ１ｃに対する効果を評価することができる。ヘモグロビンＡ１ｃは、グルコースがヘモグロビンに結合した時に形成され、これは血中グルコースレベルが上昇した時に起こる。血液試料中のＨｂＡ１ｃレベルは、例えばＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは他のイムノアッセイによって評価することができる。健常被験者の正常ＨｂＡ１ｃ値は約４.０〜６.２パーセントである。米国糖尿病学会(American Diabetes Association)は、糖尿病からの合併症を防止するのに役立つように、糖尿病を持つ患者については、７％未満(または一定の人では６％未満)にすべきであると勧告している。インスリンレベルは、例えばＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって測定することができる。グルコースレベルは典型的に、グルコースセンサーまたはグルコースアナライザーを使って測定される。

Ｉ型糖尿病の動物モデルには、非肥満糖尿病(ＮＯＤ)マウスおよびバイオブリーディング(BioBreeding)(ＢＢ)ラットがある(Atkinson et al., (1999) Nature Med. 5:601-604)。２型糖尿病の動物モデルには、それぞれレプチン遺伝子またはレプチン受容体に突然変異を持つｏｂ／ｏｂマウスおよびｄｂ／ｄｂマウス、ＫＫマウス、ナゴヤ−シバタ−ヤスダ(Nagoya-Shibata-Yasuda)(ＮＳＹ)マウス、ズッカー糖尿病肥満(Zucker diabetic fatty)(ＺＤＦ)ラットおよび後藤−柿崎(Gato-Katazaki)(ＧＫ)ラットがあるが、これらに限定されない(Cefalu (2006) ILAR Journal 47:186-198)。他の例では、健常動物を使って、ヒアルロナン分解酵素を伴う、またはヒアルロナン分解酵素を伴わない、インスリンの活性を調べる。

２. ヒアルロナン分解酵素群
ヒアルロナン分解酵素の活性は当技術分野で周知の方法を使って評価することができる。例えば、ヒアルロニダーゼに関するUSP XXIIアッセイでは、酵素をＨＡと３７℃で３０分間反応させた後に残存する未分解ヒアルロン酸またはヒアルロナン(ＨＡ)基質の量を測定することにより、活性が間接的に決定される(USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD)。アッセイでは、ヒアルロニダーゼ参照標準(ＵＳＰ)または国民医薬品集(National Formulary)(ＮＦ)標準ヒアルロニダーゼ溶液を使って、任意のヒアルロニダーゼの活性を単位数として確認することができる。ある例では微小濁度アッセイを使って活性を測定する。これはヒアルロン酸が血清アルブミンと結合した時に起こる不溶性沈殿物の形成に基づく。活性は、ヒアルロニダーゼをヒアルロン酸ナトリウム(ヒアルロン酸)と共に設定された時間(例えば１０分間)インキュベートした後、酸性化血清アルブミンを添加して未消化のヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させることによって測定される。得られた試料の濁度をさらなる発現期間後に６４０ｎｍで測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対するヒアルロニダーゼ活性に起因する濁度の低下が、ヒアルロニダーゼ酵素活性の尺度である(例えば実施例２参照)。

もう一つの例では、ヒアルロニダーゼと共にインキュベートした後に残存ビオチン化ヒアルロン酸を測定するマイクロタイターアッセイを使って、ヒアルロニダーゼ活性が測定される(例えばFrost and Stern (1997) Anal.Biochem. 251:263-269、米国特許出願公開第２００５０２６０１８６号参照)。ヒアルロン酸のグルクロン酸残基上の遊離カルボキシル基をビオチン化し、そのビオチン化ヒアルロン酸基質をマイクロタイタープレートに共有結合させる。ヒアルロニダーゼと共にインキュベートした後、アビジン−ペルオキシダーゼ反応を使って残存ビオチン化ヒアルロン酸基質を検出し、既知の活性を持つヒアルロニダーゼ標準品による反応後に得られるものと比較する。ヒアルロニダーゼ活性を測定するための他のアッセイも当技術分野では知られており、本発明の方法において使用することができる(例えばDelpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263参照)。

展着または拡散剤として作用するヒアルロナン分解酵素の能力も評価することができる。例えばトリパンブルー色素を、ヒアルロナン分解酵素と共に、またはヒアルロナン分解酵素なしで、ヌードマウスの左右の外側皮膚に皮下注射することができる。次に、色素面積を、例えばマイクロキャリパーを使って測定することで、展着剤として作用するヒアルロナン分解酵素の能力を決定する(米国特許第２００６０１０４９６８号)。ヒアルロニダーゼを別の薬剤、例えばインスリンと共投与することが、その薬剤の薬物動態および薬力学的性質に及ぼす効果も、動物モデルを使って、および／または、例えば臨床試験などにおいて、ヒト被験者を使って、インビボで評価することができる。ヒアルロニダーゼでないヒアルロナン分解酵素の機能的活性は、これらのアッセイのいずれかを使って、ヒアルロニダーゼと比較することができる。これは、機能的に等価な量のヒアルロナン分解酵素がどれくらいかを決定するために行うことができる。例えば、展着剤または拡散剤として作用するヒアルロナン分解酵素の能力は、それをトリパンブルーと一緒にマウスの外側皮膚に注射することによって評価することができ、例えば１００単位のヒアルロニダーゼ参照標準と同じ量の拡散を達成するのに要求される量を決定することができる。したがって、要求されるヒアルロナン分解酵素の量は、１００ヒアルロニダーゼ単位と機能的に等価である。

組成物、例えばここに提供する配合剤におけるヒアルロナン分解酵素群の安定性はまた当分野で知られた他の方法およびアッセイを使用して評価できる。例えば、安定性は、上におよび実施例２に記載するとおり、逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)(ｓｅｅ、例えば、実施例３)、および見かけの融点により測定する一定時間の回収パーセントおよびタンパク質純度としての目視によりヒアルロニダーゼ活性を決定することにより評価できる。タンパク質純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣで決定して、全ヒアルロニダーゼ種に対する本配合剤中の主ヒアルロナン分解酵素、例えば、ｒＨｕＰＨ２０のパーセントである。回収パーセントは、参照サンプルと比較した一定時間および種々の保存条件での配合剤のヒアルロニダーゼの相対的パーセンテージである。一例において、ここに提供する配合剤におけるヒアルロニダーゼの融点は、動的光散乱法による粒子の流体力学半径測定により決定する(例えば、実施例７.Ｂ参照)。粒子サイズ増加および融点減少は、変性および続くヒアルロニダーゼ凝集の指標である。ここに提供する配合剤におけるヒアルロニダーゼ安定性は、ＲＰ−ＨＰＬＣによるヒアルロニダーゼ、例えばｒＨｕＰＨ２０の酸化の測定により決定できる。酸化パーセントは主(ｏｘ−１)および副(ｏｘ−２)ピークのピーク面積の合計の指標である(例えば、実施例１０.Ｂ参照)。ここに提供する配合剤におけるヒアルロニダーゼの安定性の決定に使用できる当業者に既知の他の方法は、ポリアミドアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)、免疫ブロッティング、核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピー、マススペクトロメトリー、円偏光二色性(ＣＤ)および色素ベース蛍光アッセイを含む。

Ｊ. 治療用途
本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤は、速効性のインスリンを用いるあらゆる状態の処置に使用できる。配合剤は、インスリンでの処置に影響され得るあらゆる状態の処置に皮下投与できる。このセクションは、速効性のインスリンの例示的な治療用途を示す。下記治療用途は例であり、ここに記載する配合剤の適用を限定しない。治療用途は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、および重篤疾患患者における血糖コントロールを含むが、これらに限定されない。例えば、速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤は別々の投与量で、例えばシリンジまたはインスリンペンを介して、食事前に、血糖コントロールを達成するために糖尿病対象に食事のインスリン治療のために皮下投与できる。配合剤はまたインスリンポンプを使用してまたは閉鎖ループ系の状況で、日中および夜間および／または食後血糖変動を制御するために皮下または腹腔内に投与できる。このような疾患または状態の同定は処置医の技術の範囲内である。

上記のとおり、特定の投与量および処置プロトコルは典型的に各対象に個別的である。必要であれば、特定の投与量および期間および処置プロトコルを経験的に決定または外挿できる。例えば、ヒアルロナン分解酵素を伴わない速効性のインスリンの例示的投与量を出発点として使用して、ここに提供する配合剤の適当な投与量を決定できる。投与レベルは多様な因子、例えば個体の体重、一般的健康、年齢、用いる特定化合物の活性、性別、食習慣、代謝活性、血糖濃度、投与時間、排泄速度、薬剤組み合わせ、疾患の重症度および経過、および患者の疾患に対する素質および処置医の判断により決定できる。特に例えば血糖センサーで測定した、血糖値を測定し、使用して、血糖コントロールを達成するために投与すべきインスリンおよびヒアルロナン分解酵素の量を決定できる。アルゴリズムは当分野で知られており、ここに提供する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤の吸収速度および吸収レベルに基づき、およびまた血糖値に基づき決定するために使用できる。食後血糖コントロールのためのインスリン投与量は、例えば、食事の炭水化物量の決定により計算または調節できる(例えば、Bergenstal et al., (2008) Diabetes Care 31:1305-1310, Lowe et al., (2008) Diabetes Res. Clin. Pract. 80:439-443, Chiesa et al.,(2005) Acta Biomed. 76:44-48参照)。

１. 糖尿病
真性糖尿病(または糖尿病)はグルコース代謝障害を特徴とする。血中グルコースは腸で吸収された糖質に由来し、肝臓で産生される。血中グルコースレベルの増加はインスリン放出を刺激する。食後グルコースインフラックスは食間に観察されるグルコースの肝産生量より２０〜３０倍高くなり得る。１０分前後続く初期相インスリン放出は肝グルコース産生を抑制し、その後に、２時間以上持続して食事時間糖質インフラックスをカバーする長い(後期)放出相が起こる。食間は、低い連続的インスリンレベル(基礎インスリン)が進行中の代謝要件をカバーして、特に、肝糖産生を調節すると共に、脂肪組織、筋組織および他の標的部位によるグルコース利用を調節する。糖尿病を持つ患者は高い血中グルコースレベル(高血糖)を示す。糖尿病は、１型糖尿病と２型糖尿病の２つに大別することができる。１型糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病(ＩＤＤＭ)は、インスリンの欠乏につながる膵臓におけるランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の消失を特徴とする。β細胞欠乏の主要原因はＴ細胞による自己免疫である。２型糖尿病またはインスリン非依存性真性糖尿病(ＮＩＤＤＭ)はβ細胞機能異常を持つ患者で起こる。これらの患者は、インスリン抵抗性または低下したインスリン感受性と、インスリン分泌量の減少とを併せ持つ。２型糖尿病は最終的には１型糖尿病に進展し得る。糖尿病には妊娠糖尿病も含まれる。糖尿病を持つ患者には、基礎インスリンレベルを維持するためにも、食事後などに起こる血糖エクスカーションを防止するためにも、インスリンを投与することができる。

ａ. １型糖尿病
１型糖尿病は、膵臓の内分泌単位であるランゲルハンス島の浸潤およびβ細胞の破壊を特徴とし、それがインスリン産生量の不足と高血糖につながる、Ｔ細胞依存的自己免疫疾患である。１型糖尿病は、最も一般的には小児および若年成人で診断されるが、どの年齢でも診断され得る。１型糖尿病を持つ患者は、低いインスリンレベルおよび高い血中グルコースレベルに加えて、多尿症、多飲症(polydispia)、多食症、かすみ目および疲労を示し得る。１２６mg／dL(７.０mmol／ｌ)以上の空腹時血漿中グルコースレベル、例えばグルコース耐性検査などにおける７５ｇ経口グルコース負荷の２時間後に２００mg／dL(１１.１mmol／ｌ)以上の血漿中グルコースレベル、および／または２００mg／dL(１１.１mmol／ｌ)以上の随時血漿中グルコースレベルを示すことによって、患者を診断することができる。

１型糖尿病を持つ患者に対する主要な処置は、典型的に、血中グルコースモニタリングと合わせて行われる補充療法としてのインスリンの投与である。十分なインスリンの補充がないと、糖尿病性ケトアシドーシスが発生する可能性があり、それは昏睡または死をもたらし得る。患者には、１日中適切な血中グルコースレベルを維持するためにも、食後グルコースレベルを管理するためにも、例えばシリンジもしくはインスリンペン、またはインスリンポンプを使って、速効型インスリンの皮下注射を投与することができる。いくつかの例では、インスリンポンプ(クローズドループ系におけるものを含む)を使ってインスリンを腹腔内投与することができる。このように、１型糖尿病を持つ患者には、血中グルコースレベルおよび血中インスリンレベルをより迅速に管理するために、本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤を、シリンジ、インスリンペン、もしくはインスリンポンプ、またインスリンを送達するのに役立つ他の任意の手段によって、皮下投与または腹腔内投与することができる。

ｂ. ２型糖尿病
２型糖尿病はインスリン抵抗性に関連し、いくつかの集団では、インスリン減少症(β細胞機能の消失)にも関連する。２型糖尿病では、インスリンの第１相放出がなく、第２相放出が遅延し、しかも不十分である。食事中および食事後に健常な被験者で起こるインスリン放出の鋭いスパイクが、２型糖尿病を持つ患者では遅延し、長引き、量的に不十分になり、その結果、高血糖になる。２型糖尿病を持つ患者には、血中グルコースレベルを管理するために、インスリンを投与することができる(Mayfield et al. (2004) Am Fam Physican 70:489-500)。これは、他の処置および処置レジメ、例えば食事制限、運動および他の抗糖尿病治療(例えばスルホニル尿素類、ビグアニド類、メグリチニド類、チアゾリジンジオン類およびα−グルコシダーゼ阻害剤)などと組み合わせて行うことができる。したがって、２型糖尿病を持つ患者には、血中グルコースレベルおよび血中インスリンレベルをより迅速に管理するために、シリンジ、インスリンペン、もしくはインスリンポンプ、またはインスリンを送達するのに役立つ他の任意の手段により、本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤を皮下投与または腹腔内投与することができる。

ｃ. 妊娠性糖尿病
今までに糖尿病を患ったことは一度もないが、妊娠中に高い血中グルコースレベルを持つ妊婦は、妊娠糖尿病と診断される。このタイプの糖尿病は、試験対象の集団に依存して、全妊婦の約１〜１４％を冒す(Carr et al. (1998) Clinical Diabetes 16)。基礎となる原因はまだわかっていないが、おそらく妊娠中に産生されるホルモンがインスリンに対する妊婦の感受性を低下させるものと思われる。インスリン感受性細胞による正常なインスリン結合が証明されているので、インスリン抵抗性の機序はおそらく受容体後の欠陥(postreceptor defect)である。膵臓は、結果として起こるインスリン抵抗性の増加に応答するために、１.５〜２.５倍多いインスリンを放出する。正常な膵臓機能を持つ患者はこれらの需要を満たすことができる。境界的な膵臓機能を持つ患者は、インスリン分泌を増加させることが困難であり、その結果、不十分なレベルのインスリンを産生する。こうして、増加した末梢インスリン抵抗性の存在下で、遅延したまたは不十分なインスリン分泌が起こる場合に、妊娠糖尿病が生じる。

妊娠糖尿病を持つ患者には、血中グルコースレベルを管理するために、インスリンを投与することができる。したがって妊娠糖尿病を持つ患者には、血中グルコースレベルおよび血中インスリンレベルをより迅速に管理するために、シリンジ、インスリンペン、インスリンポンプもしくは人工膵臓、または他の任意の手段により、本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤を皮下投与することができる。

２. 重篤疾患患者のためのインスリン治療
高血糖およびインスリン抵抗性は内科的および／または外科的に重篤な患者においてしばしば起こり、糖尿病患者でも被糖尿病患者でも、また外傷性傷害、脳卒中、無酸素性脳損傷、急性心筋梗塞、心臓手術後、および重篤疾患の他の原因を持つ患者でも、罹病率および死亡率の増加と関連づけられている(McCowen et al. (2001) Crit Clin.Care 17:107-124)。高血糖を持つ重篤患者は、血中グルコースレベルを管理するためにインスリンで処置されてきた。そのような処置はこの群における罹病率および死亡率を低下させることができる(Van den Berghe et al. (2006) N.Eng.J Med. 354:449-461)。インスリンは典型的に、例えば開業医によるシリンジを使った注射によって、またはインスリンポンプを使った注入によって、患者に静脈内投与される。いくつかの例では、アルゴリズムおよびソフトウェアを使って用量が算出される。したがって、高血糖を持つ重篤患者には、血中グルコースレベルを管理するために、本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤を投与し、それによって高血糖を軽減し、罹病率および死亡率を減少させることができる。

Ｋ. 組み合わせ治療
本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤どれでも、他の治療剤または他の治療法(例えば他の生物製剤および小分子化合物であるが、これらに限定されない)と組み合わせて、その前に、それとは間欠的に、またはその後に、投与することができる。速効型インスリンが適応となるか、速効型インスリンが使用されてきた疾患または状態であって、他の薬剤および処置を利用することができるものには、上に例示したものを全て含めてどれでも、配合剤をそれらと組み合わせて使用することができる。処置される疾患または状態に応じて、典型的な組合せには、抗糖尿病薬、例えば限定するわけではないが、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤、ペプチド類似体、例えばグルカゴン様ペプチド(ＧＬＰ)類似体、および胃抑制ペプチド(ＧＩＰ)類似体、ならびにＤＰＰ−４阻害剤との組合せなどがあるが、これらに限定されない。もう一つの例では、本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤を、速効型インスリンおよび基礎作用型インスリンを含む１つ以上の他のインスリンと組み合わせて、その前に、それとは間欠的に、またはその後に投与することができる。

Ｌ. 製造品およびキット
本明細書に記載する速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤は、包装材料、例えば糖尿病対象または重篤対象などにおける血中グルコースレベルを管理するのに有効な医薬組成物、ならびにその配合剤が血中グルコースレベルを管理するために使用されるべきものであることを示すラベルを含む製品として包装することができる。

本明細書に記載する製品は包装材料を含む。医薬品を包装するのに使用される包装材料は当業者にはよく知られている。例えば米国特許５,３２３,９０７、５,０５２,５５８および５,０３３,２５２(これらはそれぞれその全てが本明細書に組み込まれる)参照。医薬包装材料の例として、ブリスター包装、瓶、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、瓶、およびに選ばれた製剤および意図する投与および処置の様式に適した任意の包装材料が挙げられるが、これらに限定されない。

速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤はキットとして提供することもできる。キットは本明細書に記載する配合剤および投与のための品目を含むことができる。キットは付加的医薬組成物も含むことができる。ある例において、キットは、本明細書に記載する配合剤の１つ以上と、１つ以上の他のインスリン組成物、例えば結晶性インスリンを含む遅効型(slow acting)もしくは中間型インスリン、またはその任意の組合せとを含むことができる。速効性インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の配合剤は、投与用の器具、例えばシリンジ、インスリンペン、ポンプ、またはインスリンペン、ポンプもしくは他の送達器具に挿入されるリザーバーと共に供給することができる。キットは、場合によっては、投与量、投与レジメンを含む適用に関する指示および投与様式に関する指示を含むことができる。キットは本明細書に記載する配合剤および診断用の品目も含むことができる。例えば、そのようなキットは、グルコースモニターまたはグルコースセンサーを含むことができる。

Ｍ. 実施例
以下に掲載する実施例は例示を目的とし、本発明の範囲を限定しようとするものではない。

実施例１
インスリンおよびインスリン類似体ストック製造
Ａ. レギュラーインスリン
レギュラーインスリンについて、粉末(Organon Insulin API、組み換えヒトインスリンSIHR 143)を秤量し、適量の水と溶液が約１０〜２５mg／mLのインスリンを含むまで混合した。１ＭのＨＣｌを、最終濃度２０mMＨＣｌとなるまで濁った混合物に添加した。溶液を撹拌子でインスリンが完全に溶解するまで穏やかに撹拌し、２５０mMのＴｒｉｓ、ｐＨ１０.７(Trizma、Cat. No. T6066、Sigma)を、最終Ｔｒｉｓ濃度２０mMまで添加した。ｐＨを１Ｍ ＮａＯＨを使用して調節し、次いで水を、インスリンが下の個々の例において記載するとおり製剤されるように添加した。このインスリンは約１３μg／mLの亜鉛を含む。

Ｂ. インスリン類似体
インスリン類似体(インスリンアスパルトまたはインスリンリスプロ)について、市販品(インスリンリスプロ：Eli Lilly Humalog(登録商標)(インスリンリスプロ)１００Ｕ／mL、Lot A572364；インスリンアスパルト：Novo Nordisk、NovoRapid(登録商標)(インスリンアスパルト)、Lot XS60195；インスリングルリジン：Apidra^{(登録商標)}インスリン)の１２個のバイアル(各１０mL)を貯留し、Amicon Ultracel-10 K(インスリンリスプロ)または3K(インスリンアスパルト)カラム濃縮器を使用して、最終濃度が最初の濃度の約５倍になるまで濃縮した。インスリン類似体を、１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５.３および３０mMの塩化亜鉛(ＺｎＣｌ_２、EMD, Cat No. ZX0065-1)をタンパク質溶液容積の１／１０添加することにより沈殿させた。溶液を氷上に３０分間置き、続いて５６００rpmで２０分間、Avanti J-E CentrifugeでJS-5.3スインギングバケットローター(Beckman Coulter)を用いて遠心分離した。上清を傾捨し、ペレットを再懸濁し、２０mMの酢酸ナトリウム、２mMの塩化亜鉛、ｐＨ５.５溶液で洗浄した。再懸濁溶液を上記のとおり遠心分離した。洗浄工程を合計５回繰り返した。最終洗浄を全ての痕跡量の塩化亜鉛を除去するために２０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５で行った。得られたタンパク質ペーストを２０mMのＨＣｌ含有水で溶解した。完全に溶解後、２５０mMのＴｒｉｓ、ｐＨ１０.７を、最終Ｔｒｉｓ濃度２０mMまで添加した。得られた溶液のｐＨを、インスリン類似体が下の個々の例において記載するとおり製剤されるように調製し、タンパク質濃度を約１５〜２０mg／mLに調節した。この方法で製造したインスリン類似体は、典型的に約９０％の収率を有し、残留防腐剤濃度は出発物質の１００倍少なかった。

実施例２
ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の決定
ｒＨｕＰＨ２０(配列番号１のアミノ酸類３６〜４８２をコードする核酸のＣＨＯ細胞における発現および分泌により得た)のヒアルロニダーゼ活性を、比濁法アッセイを使用して決定した。最初の２回のアッセイ(ＡおよびＢ)で、ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性を可溶性ｒＨｕＰＨ２０をヒアルロン酸ナトリウム(ヒアルロン酸)とインキュベートし、次いで未消化ヒアルロン酸ナトリウムを酸性化血清アルブミンの添加により沈殿させて測定した。３回目のアッセイ(Ｃ)で、ｒＨｕＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性を、ヒアルロン酸(ＨＡ)が塩化セチルピリジニウム(ＣＰＣ)と結合したときの不溶性沈殿の形成に基づき測定した。６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０(５μg／mL)を含む全アッセイにおいて、合格基準は３７５Ｕ／mLを超える酵素活性であった。

Ａ. 微少濁度アッセイ
本アッセイにおいて、ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性を、可溶性ｒＨｕＰＨ２０とヒアルロン酸ナトリウム(ヒアルロン酸)を一定時間(１０分間)インキュベートし、次いで未消化ヒアルロン酸ナトリウムを酸性化血清アルブミン添加により沈殿させることにより測定した。得られたサンプルの濁度を、６４０nmで３０分間展開時間後に測定した。ヒアルロン酸ナトリウム基質上の酵素活性由来の濁度の減少は可溶性ｒＨｕＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性の指標であった。本方法を、可溶性ｒＨｕＰＨ２０アッセイ作業標準品の希釈により作成した検量線を使用して行い、サンプル活性測定をこの検量線に対して行った。サンプル希釈を酵素希釈剤溶液で調製した。酵素希釈剤溶液を、３３.０±０.０５mgの加水分解ゼラチンを２５.０mLの５０mMのＰＩＰＥＳ反応緩衝剤(１４０mMのＮａＣｌ、５０mMのＰＩＰＥＳ、ｐＨ５.５)および２５.０mLの注射用滅菌水(ＳＷＦＩ；Braun, product number R5000-1)に溶解し、０.２mLの２５％ヒト血清アルブミン(US Biologicals)溶液で混合物を希釈し、３０秒間ボルテックス処理することにより調製した。これを使用前２時間以内に行い、必要となるまで氷上で保存した。サンプルを概算１〜２Ｕ／mLまで希釈した。一般的に、工程あたりの最大希釈は１：１００を超えず、最初の希釈用の初期サンプルサイズは少なくとも２０μLであった。アッセイを実施するのに必要な最少サンプル容積は、工程内サンプル、ＦＰＬＣフラクション：８０μL；組織培養上清：１mL；濃縮物質８０μL；精製または最終工程物質：８０μLであった。希釈を低タンパク質結合９６ウェルプレートで３連で行い、各希釈物の３０μLをOptilux黒色／透明底プレート(BD BioSciences)に移した。

濃度２.５Ｕ／mLの既知可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、標準曲線作成のために酵素希釈剤溶液で作製し、Optiluxプレートに３連で添加した。希釈は０Ｕ／mL、０.２５Ｕ／mL、０.５Ｕ／mL、１.０Ｕ／mL、１.５Ｕ／mL、２.０Ｕ／mL、および２.５Ｕ／mLを含んだ。６０μLの酵素希釈剤溶液を含む“無試薬”ウェルを、プレートにネガティブコントロールとして包含させた。次いで、プレートを覆い、ヒートブロックで５分間、３７℃で加温した。覆いを取り、プレートを１０秒間振盪させた。振盪後、プレートをヒートブロックに戻し、MULTIDROP 384 Liquid Handlingデバイスを温かい０.２５mg／mLのヒアルロン酸ナトリウム溶液(１００mgのヒアルロン酸ナトリウム(LifeCore Biomedical)を２０.０mLのＳＷＦＩに溶解することにより作製した。これを２〜８℃で２〜４時間または完全に溶解するまで穏やかな回転および／または振盪により混合した)で開始させた。反応プレートをMULTIDROP 384に移し、３０μLのヒアルロン酸ナトリウムを各ウェルに分配させるためにスタートキーを押して、反応を開始させた。次いでプレートをMULTIDROP 384から除き、１０秒間振盪させ、プレートカバーを置き換えたヒートブロックに移した。プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。

MULTIDROP 384を、血清作業溶液で機械をプライミングし、容積設定を２４０μLに変えることにより反応を停止させる準備をした。(２５mLの血清ストック溶液[１容積のウマ血清(Sigma)を９容積の５００mM酢酸緩衝液で希釈し、塩酸でｐＨを３.１に調節した]の７５mLの５００mM酢酸緩衝液)。プレートをヒートブロックから除き、MULTIDROP 384に置き、２４０μLの血清作業溶液をウェルに分配した。プレートを除き、プレートリーダー上で１０秒間振盪させた。さらに１５分間後、サンプルの濁度を６４０nmで測定し、各サンプルのヒアルロニダーゼ活性(Ｕ／mL)を標準曲線に適合させることにより決定した。

比活性(単位／mg)を、ヒアルロニダーゼ活性(Ｕ／ml)をタンパク質濃度(mg／mL)で割ることにより計算した。

Ｂ. ｒＨｕＰＨ２０酵素活性の濁度アッセイ
サンプルを酵素希釈剤[５０mLのリン酸緩衝液(２５mMのリン酸、ｐＨ６.３、１４０mMのＮａＣｌ)および５０mLの脱イオン(ＤＩ)水に溶解した６６mgのゼラチン加水分解物(Sigma #G0262)]で希釈して、予測酵素濃度０.３〜１.５Ｕ／mLを達成した。

標準１、２、３、４、５、または６とラベルした２本の試験管の各々、および分析すべき各サンプルの２本の試験管(適宜ラベル)を３７℃のブロックヒーターに入れた。次の表に示す酵素希釈剤の容積を標準試験管に２連で添加した。０.５０mLのＨＡ基質溶液[１.０mLの５mg／mLヒアルロン酸(ICN # 362421)のＤＩ水溶液、９mLのＤＩ水、１０mLのリン酸緩衝液]を全標準およびサンプル試験管に分配した。酵素希釈剤中の１.５Ｕ／mLのＵＳＰヒアルロニダーゼ標準(USP # 31200)容積を、下記表７に示すとおり２連標準試験管に添加した。標準試験管が全て完成したとき、０.５０mLの各サンプルを２連サンプル試験管の各々に添加した。３０分間、３７℃でインキュベーション後、４.０mLの血清作業溶液{５０mLの血清ストック溶液[１容積のウマ血清(ドナー群、細胞培養試験、ハイブリドーマ培養試験、ＵＳＡ起源)、９容積の５００mM酢酸緩衝液、ｐＨ３.１に調製、室温で１８〜２４時間静置、４℃で貯蔵]および１５０mLの５００mM酢酸緩衝液}を標準試験管に添加し、次いでそれをブロックヒーターから除き、混合し、室温に置いた。サンプル試験管を、全標準およびサンプル試験管が処理されるまでこの方法で処理した。

“ブランク”溶液を、０.５mLの酵素希釈剤、０.２５mLのＤＩ水、０.２５mLのリン酸緩衝液および４.０mLの血清作業溶液を混合することにより調製した。溶液を混合し、一定量を使い捨てキュベットに移した。このサンプルを６４０nmで分光光度計を０とするために使用した。

室温で３０分間インキュベーション後、各標準試験管からの一定量を次いで使い捨てキュベットに移し、６４０nmの吸光度を測定した。この工程を２連サンプル試験管で繰り返した。

直線状検量線を、ヒアルロニダーゼ濃度(Ｕ／mL)対実測吸光度をプロットすることにより構築した。線形回帰分析をデータフィット(０.０Ｕ／mLのキャリブレーション標準を除く)に使用し、傾斜、切片および相関係数(ｒ^２)を決定した。標準曲線回帰方程式および実測サンプル吸光度を使用して、サンプル濃度を決定した。

Ｃ. ｒＨｕＰＨ２０酵素活性の濁度アッセイ
ヒアルロニダーゼ活性および酵素濃度を決定するための比濁法は、ヒアルロン酸(ＨＡ)が塩化セチルピリジニウム(ＣＰＣ)と結合したときの不溶性沈殿の形成に基づいた。活性を、ヒアルロニダーゼとヒアルロナンを一定時間(３０分間)インキュベートし、次いで未消化ヒアルロナンをＣＰＣ添加により沈殿させることにより測定した。得られたサンプルの濁度を６４０nmで測定し、ＨＡ基質上の酵素活性由来の濁度減少は、ヒアルロニダーゼ力価の指標であった。本方法を、ｒＨｕＰＨ２０アッセイ作業標準品の希釈により作成した検量線を使用して行い、サンプル活性測定をこの検量線に対して行った。本方法は、〜２Ｕ／mL濃度まで希釈後の溶液中のｒＨｕＰＨ２０活性の分析のために意図された。定量的範囲は０.３〜３Ｕ／mLであったが、定常的試験のための最適性能は１〜３Ｕ／mLの範囲で得られた。

酵素希釈剤を、１００mg±１０mgのゼラチン加水分解物(Sigma #G0262)を７５mLの反応緩衝液(１４０mMのＮａＣｌ、５０mMのＰＩＰＥＳ(１,４−ピペラジンビス(２−エタノスルホン酸))、ｐＨ５.３)遊離酸(Mallinckrodt #V249)および７４.４mLの灌注用滅菌水(ＳＷＦＩ)に溶解し、０.６mLの２５％ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を添加することにより新たに調製した。分光光度計ブランクを１.０mLの酵素希釈剤を試験管に添加し、３７℃に予熱したヒーティングブロックに入れることにより調製した。希釈標準品を、ｒＨｕＰＨ２０アッセイ作業標準品の１：２５希釈を、３連で、１２０μLのアッセイ作業標準品を２９.８８０mLの酵素希釈剤に添加することにより調製した。各サンプルの適当な希釈を３連で行い、〜２Ｕ／mL溶液を得た。

酵素希釈剤の一定容積を、標準試験管に表８に従い３連で分配した。５００μLの１.０mg／mLのヒアルロン酸ナトリウム(Lifecore, #81、平均分子量２０〜５０kDa)のＳＷＦＩ溶液を、ブランク以外の全試験管に分配し、試験管を、３７℃のヒーティングブロックに５分間入れた。表７に示す希釈標準品の量を適当な標準試験管に添加し、混合し、ヒーティングブロックに戻した。５００μLの各サンプルを３連で適当な試験管に入れた。最初の標準試験管開始３０分間後、４.０mLの停止溶液(ＳＷＦＩに溶解し、０.２２ミクロンフィルターを通した５.０mg／mLの塩化セチルピリジニウム(Sigma、Cat # C-5460))を全試験管(ブランクを含む)に添加し、それを次いで混合し、室温に置いた。

分光光度計を６４０nm固定波長でブランクとした。３０分、室温でインキュベーション後、約１mLの標準またはサンプルを使い捨てキュベットに移し、吸光度を６４０nmで読んだ。標準品およびサンプル生データ値をGRAPHPAD PRISM(登録商標)コンピュータソフトウェア(Hearne Scientific Software)を用いて、完全減衰で０に拘束された指数関数的減衰関数を使用して分析した。最良適合標準曲線を決定し、対応するサンプル濃度の計算に使用した。

実施例３
ＲＰ−ＨＰＬＣ
この実施例において、逆相ＨＰＬＣ(ＲＰ−ＨＰＬＣ)を使用して、外観のインスリンおよびインスリン類似体の溶解度およびｒＨｕＰＨ２０のパーセント純度を決定した。見かけの溶解度は、初期製剤／条件と比較したインスリン回収パーセントとして決定した。

標準品
レギュラーインスリンについて、Humulin(登録商標)(レギュラーインスリン、１００Ｕ)を標準として使用した。インスリンリスプロについて、ＵＳＰリスプロ１バイアルを１.７２mLの０.０１ＮのＨＣｌで再構成して、３.５mg／mLのＵＳＰリスプロ(１００Ｕ／mL)標準品を得た。インスリンアスパルトについて、ＥＰアスパルト１バイアルを１.００mLの０.０１ＮのＨＣｌで再構成して、３.８９mg／mLのＥＰアスパルト標準品を得た。ｒＨｕＰＨ２０について、３個の標準品を使用し、各々、５０μg／mLのｒＨｕＰＨ２０サンプル(Lot HUB0701EB)を適当な量のサンプル希釈剤(２０mMのＴｒｉｓ、１３０mMのＮａＣｌ、０.０１％ポロクサマー１８８、ｐＨ７.３)で希釈して産生した２.５μg／mL、５.０μg／mLまたは７.５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０を含んだ。

防腐剤標準
３種の防腐剤標準品を使用し、各々０.０５％メタクレゾール／フェノール、０.１０％メタクレゾール／フェノールまたは０.１５％メタクレゾール／フェノールを含んだ。

サンプル調製
サンプルを、必要であれば、サンプル希釈剤でインスリン／インスリン類似体が１００Ｕ／mLで存在し、ｒＨｕＰＨ２０が５μg／mLで存在するように希釈した。サンプルを全時点で各バイアルから１００μLを抜き取り、負荷前に遠心分離することにより調製した。サンプルを使用前に４℃でオートサンプラーに保存し、調製後３日間安定であると見なした。全サンプルを２連で試験した。

インスリンについて、２０μLを各ＨＰＬＣ実施時に注入した。ｒＨｕＰＨ２０について、１００μLを各ＨＰＬＣ実施時に注入した。ＨＰＬＣカラムおよび方法パラメータを下記表９に示す。ＨＰＬＣ勾配を下記表１０に示す。

Ａ. インスリン溶解度
見かけの溶解度を決定するために、インスリン／インスリン類似体主ピークおよびデスアミドピークのピーク面積を統合し、一緒にして、標準に対するパーセンテージを計算した。溶解度を標準に対する相対的パーセンテージとして示し、１００％が１２０Ｕ／mLである。データをDesign-Expert(登録商標)7.0(StatEase)および“ヒストリカル・データ”特性を使用して処理した。インスリンパーセント純度を主インスリン対全インスリン種のパーセントとして表した。

Ｂ. ｒＨｕＰＨ２０パーセント純度およびパーセント回収
ｒＨｕＰＨ２０パーセント純度を、ｒＨｕＰＨ２０対全ｒＨｕＰＨ２０種のパーセントとして示した。ｒＨｕＰＨ２０回収パーセントを標準に対する相対的パーセンテージとして表し、１００％が５μg／mLである。目標仕様は３〜７μg／mL(６０〜１４０％)である。

実施例４
サイズ排除クロマトグラフィー
この例において、インスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤を、サンプルに存在する高分子量タンパク質(ＨＭＷＰ)、すなわち、共有結合により結合したインスリンおよびｒＨｕＰＨ２０の凝集体の相対的量を決定するために、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(ＳＥＣ−ＨＰＬＣ)により分析した。変性ＳＥＣについて、移動相はＬ−アルギニンおよび氷酢酸のアセトニトリル溶液であった。実施例２９に記載のとおりに使用した非変性ＳＥＣについて、移動相はリン酸緩衝化食塩水であった。

Ａ. 変性ＳＥＣ
１. 標準品
Humulin(登録商標)Ｒ(レギュラーインスリン、Lilly、濃縮、NDC 0002-8501-01)またはＵＳＰヒトインスリン(USP Cat # I1F270)およびｒＨｕＰＨ２０(それぞれ比活性１２０,０００Ｕ／mgおよび１１０,０００Ｕ／mgを有するロットHUA0703MAまたはHUB0701EB)を標準品として指標した。インスリンおよびｒＨｕＰＨ２０の両者を含む標準品を、予測サンプル濃度、すなわち、１００Ｕ／mLのインスリンおよび５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０に類似して調製した。液体製剤を２５mMのＴｒｉｓ希釈剤、ｐＨ７.３で希釈した。秤量したＵＳＰヒトインスリンをＴＦＡ添加Ｔｒｉｓ希釈剤(２μLのＴＦＡ／mLのＴｒｉｓ)で希釈した。参照サンプルを使用前ＨＰＬＣバイアルで１０℃で保存した。

２. サンプル調製
必要であれば、サンプルを、インスリンが１〜１００Ｕ／mLの範囲に存在し、ｒＨｕＰＨ２０が１〜１０００μg／mLの範囲に存在するようにＴｒｉｓ希釈剤で希釈した。サンプルを使用前ＨＰＬＣバイアルで１０℃で、最大３日間保存した。

３. ＨＰＬＣ調製
移動相を、６５０mLの１.０mg／mLのＬ−アルギニン、１５０mLの氷酢酸および２００mLのアセトニトリルを合わせることにより調製した。ＨＰＬＣカラムおよび方法パラメータを下記表１１に示す。ｒＨｕＰＨ２０ピークは約１３.８分で出現し、インスリンピークは約２０.２分で出現する。

Ｂ. 非変性ＳＥＣ
１. 標準品
Humalog(登録商標)１００(インスリンリスプロ、Eli Lilly Cat # VL-1510)、NovoLog(登録商標)１００(インスリンアスパルト、Novo Nordisk Cat # 750111)およびｒＨｕＰＨ２０(ロットT09RD02[比活性１２２,０００Ｕ／mg]、HUA0703MA[比活性１２０,０００Ｕ／mg]またはHUB0701EB[比活性１２２,０００Ｕ／mg])を標準品として指標した。インスリンおよびｒＨｕＰＨ２０の両者を含む標準品を、予測サンプル濃度、すなわち、１００Ｕ／mLのインスリンおよび５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０に類似して調製した。参照サンプルを使用前ＨＰＬＣバイアルで１０℃で保存した。

２. サンプル調製
必要であれば、サンプルを、インスリンが１〜１００Ｕ／mLの範囲で存在し、ｒＨｕＰＨ２０が１〜２０μg／mLの範囲で存在するようにサンプル希釈剤(２０mMのＴｒｉｓ、１３０mMのＮａＣｌ、０.０１％ポロクサマー１８８、ｐＨ７.３)で希釈した。サンプルを使用前ＨＰＬＣバイアルで１０℃で、最大３日間保存した。

３. ＨＰＬＣ調製
０.５Ｘリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)溶液を、ＨＰＬＣグレード水で１０倍ＰＢＳを希釈することにより調製した。ＨＰＬＣカラムおよび方法パラメータは下記表１２に示す。ｒＨｕＰＨ２０ピークは約１３分に出現し、インスリンピークは約１８.６分に出現した。

Ｃ. インスリンパーセント純度
インスリンパーセント純度を、インスリン種ピーク対総インスリンピークのパーセンテージとして示した。目標仕様は２％未満の高分子量タンパク質、すなわち、インスリン凝集体である。

実施例５
試験方法 − 浸透圧濃度、濁度およびｐＨ
この実施例において、インスリン／インスリン類似体およびｒＨｕＰＨ２０製剤の外観、浸透圧濃度、濁度およびｐＨの決定に使用した試験方法を記載する。これらの試験方法を続く実施例で使用する。

Ａ. 外観
１. 視覚分析
インスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤の外観を、タイプＩガラスバイアル中のインスリン／ｒＨｕＰＨ２０溶液の定性的視覚分析により決定した。溶液の着色および透明性の評価をＵＳＰ(または同等物)灌注用滅菌水(ＳＷＦＩ)のものと比較することにより決定した。水溶液は、透明性がＳＷＦＩと同程度ならば透明と見なした。水溶液は、ＳＷＦＩの外観を有するならば無色と決定した。バイアルを室温で試験し、旋回および／または反転中溶液に不要な乱流および／または気泡を生じないよう注意した。必要であれば、バイアルを試験前に、繊維が抜け落ちない拭布および７０％エタノールで拭いた。手順は次のとおりであった。１５０Ｗ以上のランプの指向性光源を点灯した。サンプルをフード内で調製した。試験すべきサンプルを穏やかに倒置して、均一性を確実にし、＞０.５mLを無菌的に、試験用タイプＩガラスバイアルに移した。ＳＷＦＩサンプルを同様の方法で調製した。調製した試験サンプルおよびＳＷＦＩバイアルを穏やかに倒置して、均一性を確実にし、気泡を入れないように注意した。試験サンプルおよびＳＷＦＩバイアルを、バイアルの底からの角度で照射する光源を用いて白色背景に対して色を視覚的に比較した。溶液は、ＳＷＦＩと同じ外観を有するならば、無色と見なした。試験サンプルおよびＳＷＦＩバイアルをバイアルの底からの角度で照射する光源を用いて黒色背景に対して透明性を視覚的に比較した。溶液は、透明性がＳＷＦＩと同程度であるならば透明と見なした。色、透明性およびあらゆる可視粒子および／または異物の存在および程度を記録した。合格基準は透明、無色溶液であった。

２. イルミネーター方法
この方法において、液体の透明性および着色の程度を適用可能な外観規格に対して(視覚的に)製品品質を確実にするために評価した。検査を、高輝度光の特別設計検査ブースで、白色背景および黒色背景に対して行った。液体は、乳白光が対照懸濁液Ｉを超えて発せられないならば透明である。水溶液は、水の外観を有するか、または特別参照溶液(参照溶液Ｂ９)よりも強い色がないとき、無色である。

対照溶液の調製
対照溶液を、下記表１３に示す希ＨＣｌおよびＥＰ色標準Ｂ(褐色標準溶液、Ricca Chemical, #2880)の混合により調製した。対照溶液Ｂ_９、Ｂ_８、Ｂ_７、Ｂ_６をストッパーで封し、オーバーシールした２mLのバイアルに保存した。対照溶液を毎日調製した。２mLのＳＷＦＩをストッパーで封し、オーバーシールしたバイアルに入れ、最大１年間保存した。

透明性対照溶液を次のとおり調製した。基礎的乳白色懸濁液を２５mLのヘキサメチレンテトラミン(２５mLのＳＷＦＩ中２.５ｇ)および２５mLの硫酸ヒドラジン(１００mLのＳＷＦＩ中１ｇ)を混合し、溶液を２４時間静置させることにより調製した。懸濁液を最大２ヶ月間ガラス容器に保存した。標準または乳白光溶液を４５μLの基礎的乳白色溶液を２９５５μLのＳＷＦＩで希釈し、良く混合することにより調製した。この溶液は３ヶ月間安定であった。対照懸濁液ＩおよびIIを、標準または乳白光およびＳＷＦＩを下記表１３に示すとおり混合して調製した。対照懸濁液をストッパーで封し、オーバーシールした２mLのバイアルに貯蔵し、毎日調製した。

製品サンプルを、クラス１００フードで作業しながら最初に製品溶液を混合し、２mLをバイアルに移すことにより調製した。バイアルをストッパーおよびオーバーシールで封した。目視ブースを準備し、光源強度が１７５０Luxを超えることを確認した。製品サンプルを対照溶液および懸濁液と目視により比較した。色を白色背景に対して水平に見て、ＳＷＦＩおよび対照溶液Ｂ_６、Ｂ_７、Ｂ_８およびＢ_９と比較した。透明性を黒色背景に対して垂直に見て、対照懸濁液ＩおよびIIと比較した。着色および透明性の程度および乳白光の程度を下記表１４に示すとおり記録した。

Ｂ. 浸透圧濃度
浸透圧濃度は凝固点降下測定により決定した。試験方法は、１００〜５００mOsm／kg水の浸透圧濃度を有する水溶液の分析を意図する。凝固点降下浸透圧法は試験すべき溶液サンプルを試験管にピペッティングし、試験管を浸透圧計の冷却チャンバーに置くことを含む。サンプルを過冷却し(凝固点以下に冷却)、次いで多数の方法(すなわち、機械的振動、超音波振動、熱衝撃または固形種粒子添加により)の一つにより種晶添加した(結晶化開始)。サンプル温度は、平衡まで凍結過程中に放出される融解熱により上がる。この時点で、水のわずかな画分しか凍結しておらず、その後さらに水が凍結し、温度が減少し始め、冷却曲線の平領域、またはプラトーとなる。プラトーの温度がサンプルの凝固点であり、１.０Osmoleが水凝固点を１.８５８℃低下させるとの観察により浸透圧濃度単位に変換でき、ここで、１.０Osmole＝浸透圧活性粒子の１.０mole＝Φ(ｎ)(Ｃ)であり、ここで：
Φ＝浸透圧係数；
ｎ＝溶液中の各分子の解離により得られた粒子数；そして
Ｃ＝各分子の濃度(mol／kg水)である。

キャリブレーションチェック(０〜２０００mOsm／kg水)を浸透圧計(MicroOsmette Freeze Point Osmometer, Model #5004, Precision Systems Inc.)使用前にそれぞれ５００mOsm／kgおよび２００mOsm／kg標準で行った。最初に着ける前に、１０〜１５分間の暖機運転をして、温度を完全に平衡化させた。サンプル、プローブおよびシード・ワイヤ(seed wire)を各使用前にKimWipeで拭いた。試験用サンプルを、５０μLのインスリン／ｒＨｕＰＨ２０溶液を清潔な、乾燥サンプル試験管に移すことにより調製した。試験管を冷蔵庫のウェルに置き、浸透圧濃度を標準操作法に従い測定した。この方法をさらに２回繰り返し、インスリン／ｒＨｕＰＨ２０サンプルについて合計３回の独立した結果を得た。各読み取り値の生データを記録し、全３回の読み取り値が±５mOsm／kgであるとき、読み取り値が有効であると見なした。各サンプルの平均値を報告した。浸透圧濃度は製剤により変わり、合格基準を個々の例において下に列記する。

Ｃ. 濁度
濁度を、インスリン／ｒＨｕＰＨ２０溶液の吸光度を３５０nmで測定することにより決定した。光が溶液を通ったとき、強度は溶液の吸光度および光散乱効果により減弱する。溶液中のタンパク質による光散乱効果を測定するために、３５０nmの波長を、タンパク質からの吸光度の影響を避けるために選択した。散乱する光の量は、濃度および分子／粒子サイズに大きく影響される。タンパク質以外の全成分を含むブランク溶液のＯＤ_３５０を減算し、最終読み取り値を得る。２００μLの試験すべき各インスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤のサンプルを、９６ウェルＵＶ平底マイクロタイタープレートの３個の隣接ウェルに移した。２００μLの各サンプルの各添加物混合物(タンパク質以外)を、サンプルブランクとして使用するためにマイクロタイタープレートの３個の隣接ウェルに添加した。ＳＷＦＩ(２００μL)をプレートブランクとして使用した。各サンプルのＯＤ_３５０をUV-Vis Spectramax 384plus(Molecule Devices)プレートリーダーで読んだ。各読み取り値を記録し、３連の読み取り値を平均し、各添加物ブランクの平均吸光度を減じ、得られたブランク補正濁度を記録した。

Ｄ. ｐＨ
ｐＨをU.S. Pharmacopeia Compendial <791> (pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c791.html)に記載のとおり測定した。合格基準は製剤で異なり、各例について下に列記する。一般に、厳密なｐＨコントロール(すなわち、±０.２)がインスリンの溶解度およびＰＨ２０の安定性を保証にするために必要であった。しかしながら、防腐剤不添加インスリンにおいて、インスリンの溶解度はｐＨに影響されず、それ故に合格基準の範囲は広い(すなわち、ｐＨ７.０〜７.８)。

実施例６
インスリンおよびインスリン類似体の市販製剤におけるｒＨｕＰＨ２０の安定性
この実施例において、市販インスリンおよびインスリン類似体製剤中のｒＨｕＰＨ２０安定性を、５℃および２５℃で保存後のｒＨｕＰＨ２０酵素活性の測定により試験した。要約すると、約１５００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０を、１０mMのＨｅｐｅｓおよび１３０mMのＮａＣｌ、ｐＨ７.０含有緩衝剤で調製した。続いて、０.４mLの市販Humulin(登録商標)(１mLあたりの含量１００Ｕインスリン、２.５mg／mLのメタクレゾールおよび１６mLのグリセリン(Eli Lilly))またはHumalog(登録商標)(１mLあたりの含量１００Ｕインスリン、３.１５mg／mLのメタクレゾール、１６mg グリセリン、１.８８mgのＮａ_２ＨＰＯ_４、０.０１９７mgの亜鉛イオン(酸化亜鉛)、および痕跡量のフェノール(Eli Lilly))を３.６mLのｒＨｕＰＨ２０溶液に添加し、インスリン−ｒＨｕＰＨ２０またはインスリン−類似体ｒＨｕＰＨ２０混合物を作成した(インスリン製品について１０倍希釈、最終ｒＨｕＰＨ２０濃度１３５０Ｕ／mL)。これらの溶液を５℃および２５℃で最長１週間保存した。ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性を、上記実施例２Ｂのとおり０日目、１日目、２日目、３日目、および７日目に測定。結果を下記表１５に示す。表１５に示すとおり、２日間またはそれ以上２５℃でインキュベートしたとき、５０％のｒＨｕＰＨ２０活性がHumalog(登録商標)−ｒＨｕＰＨ２０(インスリンリスプロ−ｒＨｕＰＨ２０)組み合わせから消失した。おそらくこの特定の製品中の低レベルの防腐剤の存在および希釈係数のために、２５℃で保存したHumulin(登録商標)−ｒＨｕＰＨ２０で顕著な活性消失は見られなかった。

実施例７
ｒＨｕＰＨ２０に対する防腐剤の影響
この実施例において、種々の一般的インスリンおよびインスリン類似体防腐剤について、酵素活性およびｒＨｕＰＨ２０の安定性に対するそれらの影響を試験した。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を上記実施例２と同様に測定した。適用できるとき、ｒＨｕＰＨ２０安定性を上記実施例４のとおりサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)で決定した。

Ａ. ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性
この実施例において、一般的インスリンおよびインスリン類似体防腐剤フェノール、ｍ−クレゾールおよびメチルパラベンを、種々の濃度、温度および時間でｒＨｕＰＨ２０の酵素活性に対するそれらの影響を評価した。各防腐剤(最終濃度は下記表１６に示す)を、３.７mg／mLのインスリン(Organon Insulin API[組み換えヒトインスリンSIHR 143]粉末を使用して、実施例１に詳述のとおりストック溶液を製造した)、および２０μg／mLのｒＨｕＰＨ２０を２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.１および１４０mMのＮａＣｌ中に含むインスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤に添加し、サンプルを表に示す温度で、所定の期間、インキュベートした。

結果を下記表１６に、防腐剤およびその濃度、インキュベーション時間、温度およびｒＨｕＰＨ２０の酵素活性を記載して示す。結果は温度依存的である。ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性は、全防腐剤レベルが相対的に高い(＞０.２％)とき、３５℃で１週間のインキュベーション後顕著に低下した。対照的に、室温(２５℃)および低防腐剤濃度で、ｒＨｕＰＨ２０はその相対的活性を少なくとも１ヶ月間維持した。一般的に、防腐剤レベルが高くなると、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性が低下する。さらに、３種の防腐剤で、ｍ−クレゾールがｒＨｕＰＨ２０に最も有害であり、続いてフェノールおよびメチルパラベンであることが分かる。

ＬＯＤ、検出のレベル；^１ メチルパラベンは０.４％で不溶性である；^２ これらの数値は予想外に低く、“異常値”として処理した。

Ｂ. ｒＨｕＰＨ２０の見かけの融点(Ｔｍ)
この実施例において、ｍ−クレゾール、プロピルパラベンまたはフェノキシエタノール存在下および非存在下のｒＨｕＰＨ２０の融点(Ｔｍ)を、動的光散乱法を使用する粒子の流体力学半径の測定により決定した。粒子径増加は、おそらく、ｒＨｕＰＨ２０の変性および続く凝集による。温度が上がると、タンパク質類は変性し、凝集体形成へと至る。

簡単に言うと、ｒＨｕＰＨ２０(ロットＨｕＢ、１０mg／mLのストック)を２５mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５で１mg／mLに希釈した。示す防腐剤を１００％ストック溶液からのＰＨ２０サンプルに添加した。Ｚ−平均粒子径を、温度増加の関数として、Malvern Zeta sizer Nano-ZSを使用する動的光散乱法により測定した。計３回の測定を各温度で低容積石英キュベット(Helma、３.００mm)で行った。温度は２０℃で開始し、２℃の傾斜で、各温度で５分間平衡化時間を有し、最終温度６６℃まで上昇させた。装置を備えた光散乱強度を１７３°後方散乱検出器で測定し、累積的Ｚ−平均粒子データをＤＴＳ(dispersion technology software)ソフトウェアで、屈折率１.４５をタンパク質サンプルに使用し、屈折率１.３３を分散剤としての水に使用して計算した。粒子径の顕著な増加がある温度軸の変曲点を、タンパク質が変性し、凝集を始める見かけのＴｍ(融点)と見なす。

結果を下記表１７に示し、そこに下記表１７に示すとおり、５種のＰＨ２０製剤について種々の温度の平均粒子径を示す。表１７のデータは２℃温度増分点と５分間平衡化点あたり３回測定の平均である。結果は、ｒＨｕＰＨ２０のＴｍが防腐剤無しの４０℃以上から、０.２５％ｍ−クレゾール存在下の２６℃に下がることを示す。類似の傾向が、ｍ−クレゾール存在下および非存在下のｒＨｕＰＨ２０のＴｍを測定する示差走査熱量測定(ＤＳＣ)を使用して得られたが、しかしながらＴｍは０.２５％ｍ−クレゾール存在下で約２℃しか下がらなかった。

Ｃ. ｒＨｕＰＨ２０の結合親和性
滴定蛍光スペクトロスコピーを使用して、さらにどのように防腐剤がｒＨｕＰＨ２０と相互作用するかを理解するために、防腐剤のｒＨｕＰＨ２０に対する見かけの結合親和性を測定した。この研究はLegacy BioDesign, LLC(Johnstown, CO)で行った。

インスリン類似体リスプロ(ＵＳＰ標準品、Cat. #1342321)およびアスパルト(ＥＵ標準品、Cat. #Y0000349)を粉末形態で受け取り、８５７μLの１８ＭΩ脱イオン水および２３μLの１ＭのＨＣｌで再構成した。１２０μLの２５０mMのＴｒｉｓ(ｐＨ１０.６５)を各標準溶液に添加して、ｐＨ７.４および容積１mLとした。２.５mLの１mg／mLの各標準溶液および２種のインスリン溶液を、３０mMのＴｒｉｓｐＨ７.４での希釈により調製した。希釈により濁ったが、調製１時間以内に透明となったＵＳＰインスリンリスプロ標準以外、全溶液とも希釈時は無色透明であった。標準品および製造物質である各２サンプルをインスリンアスパルトおよびインスリンリスプロについて調製した。１mg／mLのインスリン溶液の蛍光発光スペクトルをAviv Model ATF 105 SpectrofluorometerおよびAviv 105 software version 1.3を使用して回収した。石英蛍光セルに各測定で２.５mLの溶液を入れた。励起を２７５nmで４nmのバンド幅で行った。発光スペクトルを１nmの解像度で３４０nm〜２８０nmで回収した。ＰＭＴ電圧を８５０Ｖに設定し、参照(ＱＣ)ＰＭＴ電圧を２５０Ｖに設定した。

データは、防腐剤とｒＨｕＰＨ２０の間に幾分相互作用があるものの、３種の試験した防腐剤(ｍ−クレゾール、フェノール、およびベンジルアルコール)はｒＨｕＰＨ２０の構造を変えないことを示した。ｒＨｕＰＨ２０と防腐剤の相互作用についての見かけの解離定数(Ｋ_Ｄ)は４０〜３０００μMの範囲であり、ほとんどのデータは典型的に５０〜１００μM範囲であった。データはまたｒＨｕＰＨ２０がフェノール化合物に感受性であるが、これは非特異的相互作用によるものであり、環境温度に極めて依存的であることを示した。非特異的相互作用の結果は、さらに構造が類似した化合物であるフェニルアラニンの添加がｍ−クレゾールまたはフェノールによる分解に対してｒＨｕＰＨ２０を保護しなかったとの事実により支持された(下記セクションＥ参照)。

Ｄ. 他の一般的防腐剤
ｒＨｕＰＨ２０が全防腐剤に対して感受性であるか、インスリン製品に典型的に使用されるものに対してのみ感受性であるのかを決定するために、種々の他の市販防腐剤を、そのｒＨｕＰＨ２０酵素活性および安定性に対する影響について試験した。さらに、フェニルアラニンを、ｒＨｕＰＨ２０活性に対する防腐剤の悪影響が単に数種の有害な防腐剤に存在するフェノール環によりもたらされるか否かを評価するための潜在的安定化剤として添加した。フェニルアラニンがフェノール防腐剤と競合し、安定化効果を提供できると仮説立てられた。

これらの試験において、計１００μg／mLのｒＨｕＰＨ２０を、２５mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.３、１４０mMのＮａＣｌ、０.０１％ポリソルベート８０および選択した防腐剤を特定レベルで含む基礎製剤に添加した。防腐剤の各々について選択した濃度は主に文献のデータ(例えば、Kibbe, A. H., (2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd edition, Pharmaceutical Press; Powell et al., (1998) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology参照)および既存の市販製品に存在することが知られているレベルに基づいた。

結果は下記表１８〜２０に示す。結果は、クロルヘキシジン塩類およびチメロサールはｒＨｕＰＨ２０酵素活性に影響しないことを示す。対照的に、塩化ベンザルコニウムまたは４−クロロ−１−ブタノールの添加は、わずか２４時間、２５℃の後ｒＨｕＰＨ２０酵素活性の顕著な減少をもたらした。フェノキシエタノールまたはｍ−クレゾールの添加は、温度依存的方法でｒＨｕＰＨ２０活性の減少をもたらした。４℃で、ｒＨｕＰＨ２０の活性は防腐剤を含まない対照サンプルと同等であったが、３５℃で、ｒＨｕＰＨ２０活性はわずか４８時間で無くなった(表２０参照)。メチルパラベンが、一般的に２５℃でまたは短時間、例えば、２４時間、３５℃でｒＨｕＰＨ２０酵素活性にほとんど影響しないが、全酵素活性は３５℃で６日間インキュベーション後に無くなった。さらに、メチルパラベンは、ｍ−クレゾールまたはフェノールと比較して最も有効ではない防腐剤である。フェニルアラニンの低濃度(５mM)または高濃度(５０mM)の添加は、フェノール防腐剤であるｍ−クレゾールおよびメチルパラベン存在下のｒＨｕＰＨ２０失活に影響しなかった。

防腐剤添加および高温による酵素失活は主にｒＨｕＰＨ２０凝集体形成に起因した。下記表２１〜２２に示すとおり、３５℃で、サイズ排除クロマトグラフィーで測定して主ピークの消失がｒＨｕＰＨ２０酵素失活と相関した(表２１〜２２参照)。さらに、顕著な凝集体ピークが、３５℃で保存したときｍ−クレゾール含有サンプルで見られた。一般的防腐剤は、高温でかつ経時的にｒＨｕＰＨ２０を消失させた。より適合性の防腐剤、例えば、チメロサールおよびクロルヘキシジン塩類を同定した。

ＬＯＤ：検出限界

Ｅ. 防腐剤レベルおよび抗菌有効性
現在各国の規制当局が、多数回投与用に設計された医薬品に対する抗菌有効性について種々の局方基準を有する。表２３は、ＵＳＰおよびＥＰ基準を満たすための注射薬の基準を示す。したがって、ｒＨｕＰＨ２０に対する防腐剤の効果を評価するために、各国の基準を満たすために必要な最少防腐剤濃度を測定する必要がある。

＊ 最初に測定した接種菌液からのLog_１０単位減少；増加なし：先の測定値より多くて０.５log_１０単位。

種々のレベルの防腐剤を標的量のインスリンおよびｒＨｕＰＨ２０と共に含む数バッチの製剤を微生物有効性試験用に調製した。試験を委託分析機関(Quadrants Scientific, Inc., San Diego, CA)によりＥＰおよびＵＳＰの指示に従い実施した。インスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤は１００Ｕ／mLのインスリン(Organon Insulin API、組み換えヒトインスリンSIHR 143)、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０、２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.２、１５０mMのＮａＣｌおよび０.０２％ポロクサマー１８８を含んだ。インスリンを上記実施例１のとおりに調製した。種々の防腐剤含有製剤を、クロコウジカビ、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌およびカンジダ・アルビカンスに対する抗菌有効性について試験した。試験を、１)初期接種菌液(少なくとも１０^５ＣＦＵ／mL)の各種細菌のサンプルへの添加、および２)６時間、１日間および７日間の各種細菌のＣＦＵ／mLの測定により行った。生データ(ＣＦＵ／mL)を、測定接種菌液からlog１０単位減少に変換した。製剤を３７℃の温度で試験し、各被験生物を各製剤と個別にインキュベートした。

結果は表２４に示し、同表は防腐剤のパーセンテージおよび組み合わせがＥＰＡ、ＥＰＢおよびＵＳＰの抗菌有効性基準に合格か不合格かを示す。

＊ ７日値に基づく結果。

ＵＳＰ抗菌有効性基準を満たす適当な防腐剤レベルを決定するために、さらにベンジルアルコール、フェノールおよびｍ−クレゾールの組み合わせの研究を進めた。基本製剤は３.７５mg／mLのインスリン(Organon Insulin API、組み換えヒトインスリンSIHR 143およびストック溶液は実施例１に記載のものと同じ方法で製造した)、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０、２０mMのｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１４０mMのＮａＣｌおよび０.０２％ポロクサマー１８８を含んだ。結果は下記表２５に示し、これは、防腐剤のパーセンテージおよび組み合わせがＵＳＰの抗菌有効性基準に合格か不合格かを示す。製剤＃２以外、全組み合わせがＵＳＰ微生物有効性基準に合格した。

類似の実験を、フェノールおよびｍ−クレゾールの異なるパーセンテージの組み合わせで行った。結果は表２６に記載する。

ＰＡ：緑膿菌；ＥＣ：大腸菌；ＳＡ：黄色ブドウ球菌；ＡＮ：クロコウジカビ；ＣＡ：カンジダ・アルビカンス。

実施例８
インスリンの溶解度およびｒＨｕＰＨ２０の酵素活性に対する防腐剤およびＮａＣｌおよびｐＨの組み合わせの効果
Ａ. ｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する防腐剤の組み合わせの効果
この実施例において、一般的インスリンおよびインスリン類似体防腐剤の組み合わせを、種々の濃度で、３０℃の温度で１ヶ月、ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性に対するその効果を試験した。各防腐剤(最終パーセンテージは下記表２７に示す)を１００Ｕ／mLのインスリン、５μg／mLの(６００Ｕ／mL)ｒＨｕＰＨ２０、２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.２、１５０mMのＮａＣｌおよび０.０２％ポロクサマー１８８を含むインスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤に添加し、サンプルをＴ＝０および１ヶ月間、３０℃でインキュベーション後に試験した。インスリンを上記実施例１のとおりに調製し、ｒＨｕＰｈ２０を実施例２に記載のとおり調製した。

結果は下記表２７に示し、これは防腐剤およびそのパーセンテージ、および時間Ｔ＝０および１ヶ月間、３０℃でインキュベーション後のｒＨｕＰＨ２０酵素活性を示す。結果は、１ヶ月間、３０℃で１種または組み合わせのフェノール防腐剤存在下のインスリン／ｒＨｕＰＨ２０のインキュベーションは、ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性の低下を生じることを示す。

この実施例において、フェノールおよびｍ−クレゾールの組み合わせを、種々の濃度、温度およびインキュベーション時間でｒＨｕＰＨ２０の酵素活性に対するその効果を試験した。各防腐剤(最終パーセンテージは下記表２８に示す)を１００Ｕ／mLのインスリン、５μg／mLの(６００Ｕ／mL)ｒＨｕＰＨ２０、２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、５０mMのＮａＣｌ、５０mLのグリセリン、５０mMのメチオニン、および０.０１％ポロクサマー１８８を含むインスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤に添加した。

結果は下記表２８に示し、これは防腐剤およびそのパーセンテージ、および種々のインキュベーション時間および温度でのｒＨｕＰＨ２０酵素活性を示す。上で観察されたのと同様、保存温度は酵素活性に顕著な影響を有した。防腐剤と無関係に、３０℃または３７℃でインキュベートしたサンプルの酵素活性は、２５℃でインキュベートしたものより顕著に低下した。さらに、ｍ−クレゾールはフェノールよりｒＨｕＰＨ２０に有害である。ｍ−クレゾールのパーセンテージが増加すると、ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性が減少した。

ＮＤ、測定せず。

Ｂ. インスリンリスプロの溶解度およびｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対するＮａＣｌおよびｐＨの効果
この実施例において、完全要因研究設計を用いて、０.１５％メタ−クレゾール(ｍ−クレゾール)および０.１５％フェノール存在下のインスリンリスプロの溶解度およびｒＨｕＰＨ２０の酵素活性に対するＮａＣｌおよびｐＨの効果を決定した。４種のｐＨ値および４濃度のＮａＣｌを評価し、計１６個のサンプルを作製した。

ｐＨおよびＮａＣｌ以外の全成分を、１２０Ｕ／mLのインスリンリスプロ、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０、２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ(Trizma、Sigma、Cat No. T6066)、０.１５％ｍ−クレゾール、０.１５％フェノール、０.０１％ポロクサマー１８８(ポロクサマー１８８、Spectrum, Cat No. P1169)および０.１mMび添加ＺｎＣｌ_２(ＥＭＤ、Cat No. ZX0065-1)に固定した。試験したｐＨ値は７.０、７.２、７.４および７.６であった。試験したＮａＣｌ濃度は５０mM、８０mM、１１０mMおよび１４０mMであった。防腐剤はフェノール(Riedel-dh Haen, 16017, multiple compendia)およびｍ−クレゾール(Fluka, Cat No. 65996)でった。パーセントインスリンリスプロ回収を、２〜８℃で０ヶ月間、０.２５ヶ月間、０.５ヶ月間、１ヶ月間、３ヶ月間、５ヶ月間、９ヶ月間および１２ヶ月間保存後に各サンプルで決定した。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を５℃で２週間、１ヶ月間、５ヶ月間、９ヶ月間および１２ヶ月間、２５℃で１週間、２週間および１ヶ月間、３０℃で１週間および２週間、および３５℃で１週間保存後に各サンプルで測定した。

１６個のサンプルを調製するために、種々のＮａＣｌ濃度の４個のストック溶液を調製した。インスリンリスプロを上記実施例１のとおりに調製し、最終インスリンｐＨを７.６に設定した。他の一般的成分を全てその最終濃度で添加した。各ストック溶液のｐＨを１Ｎまたは０.１ＮのＮａＯＨで７.６から７.０まで滴定しながら下げた。ｐＨの精度は±０.０２で制御された。指定されたｐＨに到達したときそれぞれ１mLの溶液を取り、２mLのタイプ１ガラスバイアルに入れた。全サンプルを調製したら、それらを試験を実施するまで２〜８℃で保存した。逆相ＨＰＬＣ(ＲＰ−ＨＰＬＣ)を、次の改変を伴い実施理恵３に記載のとおり行った。移動相を７５％０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)の水溶液(Ａ)で開始し、２５％０.１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液(Ｂ)で直線勾配で６８％Ａ＋３２％Ｂまで１６分間、４分間維持し、続いて１００％Ｂまで５分間直線的に増加させた。

下記表２９は、２〜８℃で１２ヶ月間保存後の元の濃度(１２０Ｕ／mL)の残存％としての溶解度を示す。下記表３０〜３１は、種々の温度で種々の時点後のｒＨｕＰＨ２０酵素活性を示す。下記表３２は、種々の温度で種々の時点後のｒＨｕＰＨ２０回収パーセントを示す。インスリンリスプロの溶解度およびｒＨｕＰＨ２０の活性試験の結果を下に要約する。

インスリンリスプロの溶解性
下記表２９に示すとおり、インスリンリスプロは低塩濃度および高ｐＨで安定である。例えば、ｐＨ７.６で、インスリンリスプロは少なくとも１２ヶ月間、５０mMおよび８０mMのＮａＣｌで安定であるが、１４０mMのＮａＣｌでは２週間しか安定ではない。対照的に、ｐＨ７.０、インスリンリスプロは５０mMのＮａＣｌで５ヶ月間しか安定ではない。溶解性は、８０mM、１１０mMまたは１４０mMのＮａＣｌで、わずか１週間後に６５％より下がる。

ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性
下記表２９〜３０に示すとおり、ｒＨｕＰＨ２０は高塩濃度および低ｐＨで安定である。ｒＨｕＰＨ２０は５℃で１２ヶ月間安定であるが、１４０mMのＮａＣｌより５０mMのＮａＣｌで低ｒＨｕＰＨ２０活性である。２５℃で、ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性は、低塩濃度において、ｐＨ７.６で僅か１週間後に、そして低ｐＨで２週間後に、それぞれ大きく低下した。３０℃では、ｒＨｕＰＨ２０は有用な酵素活性を僅か１４０mMのＮａＣｌの濃度およびｐＨ７.０で維持した。３５℃で１週間後には、有意なｒＨｕＰＨ２０酵素活性は残存しなかった。

Ｗ＝週、Ｍ＝月 ＊ 検出限界未満。

Ｗ＝週、Ｍ＝月

Ｗ＝週間、Ｍ＝ヶ月

実施例９
種々の防腐剤組み合わせ存在下のインスリン安定性およびｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対するＮａＣｌおよびｐＨの効果
この実施例において、インスリン(レギュラーインスリン)および／またはインスリン類似体(リスプロまたはアスパルト)安定性、およびｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対するＮａＣｌおよびｐＨの効果を、２〜８℃の短期および長期保存(７日間、５ヶ月間または９ヶ月間)、および３５℃、３０℃および２５℃を含む高温の短期保存(１ヶ月間以下)を含む種々の保存条件下で決定した。

基本製剤は下記セクションＡ〜Ｃに示す。各試験について、ｐＨおよびＮａＣｌ濃度を変え、一方組成物の他の成分は同じままとした。予定した防腐剤組み合わせの各々でインスリン／インスリン類似体のサンプルをそれぞれ製造するために、４種のストック溶液を各インスリンおよび／またはインスリン類似体について調製した。インスリンおよびインスリン類似体ストックは上記実施例１のとおりに調製し、最終インスリンｐＨを７.６に設定した。各ストック溶液は適切なレベルの防腐剤およびＮａＣｌ濃度(５０、８０、１１０または１４０mM)および、最終濃度で添加した他の全ての一般的成分を含んだ。各ストック溶液のｐＨを次いで１Ｎまたは０.１ＮのＮａＯＨで７.６から最終標的ｐＨまで滴定しながら下げた。ｐＨの精度は±０.０２で制御された。指定されたｐＨに到達したときそれぞれ１mLの溶液を取り、０.２ミクロンＰＥＳフィルターを通し、２mLのタイプ１ガラスバイアルに入れた。全サンプルは調製後、試験実施まで２〜８℃で保存した。

Ａ. ２〜８℃で７日間のインスリン／インスリン類似体の溶解度に対するＮａＣｌおよびｐＨの効果についての全要因試験
この実施例において、設計した全要因試験を用いて、種々の防腐剤の組み合わせにおけるレギュラーインスリンおよび類似体リスプロまたはアスパルトの溶解度に対するＮａＣｌおよびｐＨの効果を試験した。ｐＨ、ＮａＣｌおよび防腐剤以外の他の製剤成分は、１２０Ｕ／mLのインスリン／インスリン類似体、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０(６００Ｕ／mL)、２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ(Trizma、Sigma、Cat No. T6066)、０.０２％PLURONIC(登録商標)F68(ポロクサマー１８８、Spectrum, Cat No. P1169)、および０.１mMのＺｎＣｌ_２(ＥＭＤ、Cat No. ZX0065-1)で一定とした。３種の防腐剤組み合わせレベルを使用した。１) ０.１５％ｍ−クレゾール(Fluka, Cat No. 65996)および０.２％フェノール(Riedel-dh Haen, 16017, multiple compendia)；２) ０.１５％ｍ−クレゾールおよび０.１５％フェノール；および３) ０.１５％ｍ−クレゾールおよび０.２％メチルパラベン(Fluka, Cat No. 85265)。各防腐剤組み合わせで、６レベルのｐＨおよび４レベルのＮａＣｌ濃度(計２４サンプル)の完全組み合わせを作製した。試験したｐＨ値は６.６、６.８、７.０、７.２、７.４および７.６であった。試験したＮａＣｌ濃度は５０mM、８０mM、１１０mMおよび１４０mMであった。

逆相ＨＰＬＣ(ＲＰ−ＨＰＬＣ)を、次の改変を伴って実施例３に記載のとおり行った。移動相を７５％０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)の水溶液(Ａ)で開始し、２５％０.１％ＴＦＡのアセトニトリル(Ｂ)で直線勾配で６８％Ａ＋３２％Ｂまで１６分間、４分間維持し、続いて１００％Ｂまで５分間直線的に増加させた。結果は下記表３３〜３５に示し、これは２〜８℃で７日間保存後の元の濃度(１２０Ｕ／mL)の残存％として表す溶解度を示す。表３３はリスプロの結果を示す。表３４はレギュラーインスリンの結果を示す。表３５はインスリンアスパルトの結果を示す。

全３種のインスリン／インスリン類似体分子は同様にｐＨおよびＮａＣｌ濃度に応答した。低ｐＨおよび高ＮａＣｌ濃度で、インスリン／インスリン類似体は、残存インスリン／インスリン類似体のパーセンテージの減少により示されるとおり、結晶を形成し、沈殿した。これらの結果は目視により確認された。全３種のインスリン／インスリン類似体は、ｐＨ≧７.２で５０mMのＮａＣｌ、ｐＨ≧７.４で８０mMのＮａＣｌおよびｐＨ≧７.６で１１０mMのＮａＣｌについて全防腐剤組み合わせに溶解性であった。同様に、全３種のインスリン／インスリン類似体は、ｐＨ≦６.８で１４０mMのＮａＣｌおよびｐＨ６.６で８０mMおよび１１０mMのＮａＣｌの両者に適切な溶解性は有しなかった(観察される濃度＜９０Ｕ／mLまたは７５％)。溶解性の正確な傾向は３種のインスリン／インスリン類似体で変わった。試験した条件下、インスリンアスパルトは最も溶解性であり、続いてインスリンリスプロおよび最低の溶解性であるレギュラーインスリンであった。防腐剤適合性にも差があり、インスリンアスパルトおよびレギュラーインスリンが０.１５％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾールに最も溶解性であり、インスリンリスプロが０.１５％ｍ−クレゾールおよび０.２％メチルパラベンに最も溶解性であった。メチルパラベンは、塩濃度が低いとき良好な防腐剤であるように見えるが、しかしながら、高塩濃度で、フェノールまたはメチルパラベンを含むサンプルで差は見られなかった。

レギュラーインスリンは高(＞１１０mM)ＮａＣｌ濃度に、高ｐＨでも溶解しなかった。表３４はインスリンの低溶解性を確認し、５０％を超える試験条件で、わずか７日間、２〜８℃の後に、元の値の９０％を下回るインスリン濃度であった。フェノール濃度の減少および／またはフェノールのメチルパラベンへの置換はわずかに溶解性を高めた。これらの実験下、ＮａＣｌ濃度の３０mM増加に伴う溶解性の低下は０.２ｐＨ単位減少と同等であった。これらのデータは、高ＮａＣｌ濃度が５℃で保存中にインスリンの溶解度に影響を与え、故にレギュラーインスリン製剤はインスリン類似体と比較して低ＮａＣｌ濃度および／または高ｐＨを必要とすることを証明している。

Ｂ. 低ｍ−クレゾールレベルでの追加検討
インスリン溶解度を、さらに低ｍ−クレゾールレベルで単純化した試験で評価した。４種の防腐剤レベルの組み合わせを使用した。１) ０.１％ｍ−クレゾールおよび０.１５％フェノール；２) ０.１％ｍ−クレゾールおよび０.２％フェノール；３) ０.１％ｍ−クレゾールおよび０.１５％メチルパラベン；および４) ０.１％ｍ−クレゾールおよび０.２％メチルパラベン。２種のｐＨレベル(７.３および７.１)および２種のＮａＣｌ濃度(１２０および１００mM)を評価した。残りの製剤成分は１２０Ｕ／mLのレギュラーインスリン、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０(６００Ｕ／mL)、２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ(Trizma、Sigma、Cat No. T6066)、０.０２％ポロクサマー１８８(ポロクサマー１８８、Spectrum, Cat No. P1169)、および０.１mMのＺｎＣｌ_２(ＥＭＤ、Cat No. ZX0065-1)で一定とした。製剤を上記のとおり調製および試験した。

結果を下記表３６に示す。レギュラーインスリンの総体的溶解度は低量のｍ−クレゾールでわずかに増加し、さらに、フェノールをメチルパラベンに変えたとき増加した。

Ｃ. ｒＨｕＰＨ２０およびインスリン安定性に対するｐＨおよびＮａＣｌの長期効果
この実施例において、全要因試験設計を用いて、インスリンの溶解度を２〜８℃で最大化とし、ｒＨｕＰＨ２０安定性を室温以上で、高防腐剤レベルで最大化する条件を決定するために、レギュラーインスリンおよびｒＨｕＰＨ２０溶解度に対するｐＨおよびＮａＣｌの効果を決定した。防腐剤レベルはＥＰ−Ａ基準に合うようにした。４レベルのＮａＣｌ濃度および４レベルのｐＨを評価し、計１６個のサンプルを製造した。サンプルを短期条件(高温度)および２〜８℃の長期保存下の両者で安定性について評価した。

レギュラーインスリン(１００Ｕ／mL、上記実施例１のとおり調製した、最終ｐＨ７.０)および５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０を、２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０.１mMのＺｎＣｌ_２、０.０１％ポロクサマー１８８、０.１５％ｍ−クレゾールおよび０.２％フェノールを含む一般の緩衝剤中に調製した。溶解度を上記実施例３のとおりＲＰ−ＨＰＬＣで決定した。溶解度を標準と比較した相対的パーセントで表し、１００％は１００Ｕ／mLであった。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を上記実施例2のとおり評価した。ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、総含有量およびｒＨｕＰＨ２０純度をモニターした(上記実施例３参照)。データをDesign Expert 7.0(StatEase)で処理した。ＡＮＯＶＡおよび相関分析をJMP 8.0ソフトウェアで行った。

結果は下記表３７〜４２に示す。表３７〜３８はｒＨｕＰＨ２０の酵素活性を示し、表３９はｒＨｕＰＨ２０の回収パーセントを示す。短期加速条件下、ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性は、下記表３７に示すとおり、ｐＨ、ＮａＣｌおよび保存温度に影響を受けた。１週間、３５℃の保存で、有意なｒＨｕＰＨ２０活性は残らなかった。３０℃で保存後の酵素活性は３５℃と比較して改善されたが、＞３７５Ｕ／mLを有する唯一の製剤は、高ＮａＣｌ濃度(１４０mM)および低ｐＨ(７.０)であった。一般に、ｐＨが上がるほど、そして塩濃度がだがるほど、酵素活性が低い。２５℃の保存温度でｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する影響は減ったが、３０℃で見られた傾向は、特に低塩および高ｐＨを有する製剤でそのままであった。大多数の製剤は４週間時点で３７５Ｕ／mLの上記基準を超える酵素活性を維持した。５℃で、１ヶ月間保存後ですら本質的にｒＨｕＰＨ２０酵素活性の消失はなかった。この傾向は、下記表３８に示すとおり、２〜８℃で９ヶ月間保存でも続いた。要約すると、ｒＨｕＰＨ２０は、２５℃または低温で、特にＮａＣｌ濃度が８０mMを超えて維持されるとき、酵素活性は維持される。安定性は２５℃を超える温度で急速に低下する。ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、ｒＨｕＰＨ２０の総含有量およびその純度をモニターした。下記表３９に示すとおり、酵素失活はｒＨｕＰＨ２０含有量の損失と相関する(統計的分析、ｐ＜０.００１)。ｒＨｕＰＨ２０純度の分析は、ｒＨｕＰＨ２０主ピーク面積に関する相対的ピーク面積純度に顕著な傾向または差異がないことを確認し(データは示していない)、純度は一定であり、それ故に、失活が総含有量の損失によるものであることを示す。含有量の消失はおそらくｒＨｕＰＨ２０の凝集および沈殿をもたらす高防腐剤濃度および温度でのタンパク質変性によるものである。

表４０〜４１は、２〜８℃で長期保存後のインスリン主ピークのパーセントおよびインスリン回収のパーセントを示す。表３８において、インスリン回収のパーセントはインスリン主ピークおよびデスアミドピークの合計に基づいた。表４０に示すとおり、インスリン主ピークパーセンテージは顕著な変化なく高いまま(約９７％)であり、損失はインスリンの化学的または物理的分解、例えば脱アミドまたは凝集によるものであることを示唆した。バイアルの目視は、小さな光る砂状物または透明結晶または結晶様粒子の混合物を示し、どきどき濁った溶液であった。表４１のデータは、各時点で製剤の溶液に残るインスリン含有量を要約する。最初の条件と比較したインスリン回収は溶解度の指標である。インスリン沈殿／結晶化は試験したｐＨおよびＮａＣｌ濃度範囲による。一般的に、ｐＨが低く塩濃度が高いとき(ｒＨｕＰＨ２０活性に有利な条件)、インスリンは急速に結晶を形成し、数ヶ月で平衡条件に達する。低塩濃度および高ｐＨで、結晶化は遅く、ほとんどのインスリン分子が９ヶ月間溶液のままである。インスリン回収データの統計的分析(下記表４２参照)は、ｐＨ、ＮａＣｌ、時間、ｐＨ×ＮａＣｌおよびＮａＣｌ×時間の全てが顕著にインスリン溶解度に影響することを示す。これらの結果は、長時間のインスリン溶解度が高ｐＨ(７.４を超える)および低ＮａＣｌ(８０mM未満)に依存し、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を維持する条件と正反対であることを示した。

−−− 検出限界未満

＊％回収は既知標準品と比較した測定したピーク面積。

＊有意

実施例１０
インスリン類似体製剤開発：ｒＨｕＰＨ２０と製剤するためのインスリンに対する安定化剤スクリーニング
防腐剤は、多数回投与により起こり得るインスリンの潜在的微生物汚染を保護する。典型的防腐剤はｍ−クレゾール、フェノールおよびパラベン類である。これらの防腐剤は抗微生物剤として作用するだけでなく、インスリンの高次構造の安定化にも作用する。フェノール防腐剤はｒＨｕＰＨ２０の安定性を減少させることが示されている(実施例７参照)。この実施例において、種々の安定化剤を、フェノール防腐剤存在下で、インスリン／インスリン類似体安定性を維持しながらｒＨｕＰＨ２０の分解を防止する能力についてスクリーニングした。スクリーニングした安定化剤は一般的に使用されている、アミノ酸類およびそれらの誘導体、塩類および緩衝剤種、ポリオール類および他の化合物を含む医薬添加物であった。安定性はｒＨｕＰＨ２０酵素活性およびインスリン溶解度により決定した。特異的安定化効果は、ｒＨｕＰＨ２０の吸着損失および／または酸化の防止およびｒＨｕＰＨ２０酵素活性で測定した一般的安定化効果を含んだ。

Ａ. ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性に対する種々の界面活性剤の効果
数種の一般的界面活性剤、すなわちポリソルベート８０(ＰＳ８０)、ポリソルベート２０(ＰＳ２０)およびポロクサマー１８８(PLURONIC(登録商標)Ｆ６８)を、ｒＨｕＰＨ２０製剤を保存する能力についてスクリーニングした。全製剤は１００μg／mLのｒＨｕＰＨ２０(１２,０００Ｕ)および１５０mMのＮａＣｌをｐＨ６.５で含んだ。製剤は界面活性剤および界面活性剤濃度および緩衝剤(ヒスチジンまたはリン酸)が異なった。製剤を３５℃で１０日間撹拌に付し、３日目および１０日目にｒＨｕＰＨ２０活性についてサンプルを分析した。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を上記実施例２のとおり決定した。ｒＨｕＰＨ２０安定性をＲＰ−ＨＰＬＣおよびサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)(上記実施例３および４参照)によるｒＨｕＰＨ２０の酸化ピークの測定により決定した。

製剤およびｒＨｕＰＨ２０酵素活性の結果を下記表４３に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣで測定したｒＨｕＰＨ２０酸化のＡＮＯＶＡ分析は、界面活性剤種、界面活性剤濃度、緩衝剤または撹拌時間について酵素活性の有意差を示さなかった(Ｆ＝０.６８３２、ｐ＝０.６３９７)。さらに、ＳＥＣ結果は、主ピークのサイズについて検出可能な差を示さなかった(データは示していない)。

ｒＨｕＰＨ２０酸化の結果を下記表４４に示す。結果は、酸化ピーク面積が界面活性剤のレベルの上昇および撹拌時間延長に連れて増加することを示す。ポリソルベート２０は測定可能な量のペルオキシド活性を含むことが知られている(例えば、Donbrow et al., (1978) J. Pharm Sci. 67(12):1676-1681, or Kibbe, A.H., ed. (2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients. 3rd Edition, American Pharmaceutical Association & Pharmaceutical Press: Washington, DC & London, UK参照)。本実験で、使用したポリソルベート２０は古いロットであり、ｒＨｕＰＨ２０の高い酸化をもたらした。対照的に、ポロクサマー１８８は痕跡量しか酸化をもたらさなかった。多変量分散分析は、撹拌時間ならびに界面活性剤種および濃度がｒＨｕＰＨ２０の酸化レベルに影響することを示した(下記表４５参照)。また、顕著なのは、界面活性剤対濃度、界面活性剤対時間および濃度対時間を含む相互作用項である。

これらの結果に基づき、界面活性剤のｒＨｕＰＨ２０製剤への添加は、おそらく、吸着損失および空気−水界面で可能性のある変性を防止するために、ｒＨｕＰＨ２０の消失に有効であることが明らかである。しかしながら、界面活性剤添加による潜在的欠点は、ｒＨｕＰＨ２０の酸化を増加させ得ることである。

＊ 有意

Ｂ. メチオニン
１. ｒＨｕＰＨ２０酸化の防止に対するメチオニンの効果
ｒＨｕＰＨ２０は２カ所の潜在的酸化部位であるＭｅｔ４５８およびＭｅｔ３５を有する。“ｏｘ−１”ピークはＭｅｔ４５８に対応し、ＲＰ−ＨＰＬＣでアッセイしたときの主酸化ピークである。“ｏｘ−２”ピークは両者のメチオニン酸化を含む。メチオニン酸化は、潜在的酸化的化合物と反応するためのスカベンジャーとして遊離メチオニンを添加することにより防止できる。

ａ. ｒＨｕＰＨ２０製剤
本試験において、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０および／またはポロクサマー１８８存在下のｒＨｕＰＨ２０酸化に対する遊離メチオニンの添加の効果を評価した。各製剤は５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０、０.０２％指定された界面活性剤、５０mMのリン酸、ｐＨ６.５、１５０mMのＮａＣｌおよびメチオニン(０〜５０mM)を含んだ。サンプルを３０℃で７２時間インキュベートし、上記実施例３に示すとおりＲＰ−ＨＰＬＣで試験した。結果を下記表４６に示す。統計的分析は下記表４７に示す。結果は、メチオニンがｒＨｕＰＨ２０酸化を２mMの濃度で防止することを示した。

＊ 有意

ｂ. ｒＨｕＰＨ２０／インスリン製剤
メチオニンを、ｒＨｕＰＨ２０／インスリン製剤におけるｒＨｕＰＨ２０酸化の防止効果について試験した。製剤は１００Ｕ／mLのインスリン(Organon Insulin API、組み換えヒトインスリンSIHR 143、ストック溶液は実施例１に記載のとおり調製した)、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０、２０mMのｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、８０mMのＮａＣｌ、０.０３％ポロクサマー１８８、０.１％フェノールおよび０.１％ｍ−クレゾールを４０mMのメチオニン存在下または非存在下に含んだ。製剤を３０℃で５週間インキュベートして、ｒＨｕＰＨ２０の酸化ピークを評価した。結果は、ｏｘ−１ピークが、メチオニンを含まない製剤と比較して、メチオニンを含む製剤で、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して顕著に小さいことを示した。

２. 一般的安定化剤としてのメチオニン
メチオニンを、さらに高温および防腐剤含有量でｒＨｕＰＨ２０酵素活性の消失を防止する能力について試験した。実験の設計(ＤＯＥ)効果表面反応法試験(ＲＳＭ)を行い、種々のレベルのＮａＣｌ濃度およびｐＨでのｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対するメチオニンの効果を評価した。基本製剤は１００Ｕ／mLのインスリン(Organon Insulin API、組み換えヒトインスリンSIHR 143、ストック溶液は実施例１に記載のとおり調製した)、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０、２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０.１％ｍ−クレゾール、０.１％フェノールおよび０.０１％ポロクサマー１８８を含んだ。メチオニン濃度範囲は４０〜８０mMで変わり、ＮａＣｌ濃度範囲は７０〜１１０mMで変わり、ｐＨ範囲は７.２〜７.６であった。製剤を３０℃で４週間または３５℃で５日間インキュベートし、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を上記実施例２に示すとおり決定した。

データを下記表４８に示す。データの統計的分析を下記表４９〜５０に示す。データは、ＮａＣｌの濃度がｒＨｕＰＨ２０の安定性に３０℃および３５℃のいずれでも有意な効果を有することを示す。ｐＨは３５℃で有意な効果を有する。メチオニンは４０〜８０mMでｒＨｕＰＨ２０に対する安定化効果を示さなかった。追跡研究は、この結果がメチオニンの存在下または非存在下で同じであることを示した。６５０Ｕ／mLの出発ｒＨｕＰＨ２０酵素活性の製剤は、３０℃で１ヶ月間保存後、１mMおよび２０mMのメチオニンでそれぞれ５２５および５２２Ｕ／mLに低下した。それ故に、メチオニンは抗酸化剤として作用するが、防腐剤および熱負荷に対する全体的ｒＨｕＰＨ２０の安定性を改善しない。

＊ 有意

＊ 有意

Ｃ. ｒＨｕＰＨ２０／インスリン製剤に対する潜在的安定化剤のスクリーニング
種々の化合物を、ｒＨｕＰＨ２０／インスリン製剤におけるタンパク質安定化剤として作用する能力についてスクリーニングした。添加物はアミノ酸類およびその誘導体、アミン類、ポリオール類、塩類および緩衝剤および他の化合物(下記表５１参照)を含んだ。各化合物を、典型的に２種の濃度で、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性およびインスリン溶解度に対する効果についてスクリーニングした。基本製剤は、典型的に１００Ｕ／mLのインスリン／インスリン類似体、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０、２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０.１５％ｍ−クレゾールおよび０.２％フェノールをｐＨ７.３±０.１で含んだ。１００〜１４０mMのＮａＣｌを含む製剤を参照製剤として使用し、潜在的安定化剤を製剤中のＮａＣｌの全てまたは一部と置き換えた。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を上記実施例２のとおり、３０℃で約１週間インキュベートしたサンプルで測定した。インスリン溶解度を５℃で保存したサンプルでＲＰ−ＨＰＬＣ(上記実施例３参照)により評価した。

結果を下記表５１に示す。評価は、ＮａＣｌと比較した半定量的であった。大部分の試験した化合物はインスリンの溶解度に効果がなく、残りはインスリン溶解性を低下させた。先のデータ(実施例８〜９)は、溶液中のタンパク質の荷電に影響する可能性のある２つの条件であるｐＨおよび塩がインスリンの溶解度に影響することを示した。本スクリーニングでは、二価カチオン含有分子または化合物(Ｍｇ^２＋(塩化マグネシウム)およびＳＯ_４ ^２−(硫酸ナトリウム)およびＬｙｓ−Ｌｙｓ)がインスリンの多量の沈殿をもたらした。電荷反発機構がインスリン分子の互いの相互作用を維持するために需要であるように見える。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、塩化マグネシウムおよびヒアルロン酸オリゴマー類(ＨＡ、４〜１６量体)がＮａＣｌよりもｒＨｕＰＨ２０を安定化させる分子として同定された。Ｌｙｓ−Ｌｙｓおよび塩化マグネシウムのいずれもインスリン溶解度を低下させるとの事実とのために、これらの分子は高濃度で価値ある安定化剤とは考えられなかった。Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度を下げると、そのンスリン溶解度に対する影響が得る。

Ｄ. ｒＨｕＰＨ２０／インスリン製剤に対するＨＡオリゴマー類の効果
ＨＡオリゴマー類ｗを、さらにｒＨｕＰＨ２０／インスリン製剤の安定性に対する能力について試験した。ＨＡオリゴマー類はｒＨｕＰＨ２０酵素とヒアルロナンの反応基質／産物であり、そのようなものとして酵素活性部位に結合でき、それにより安定化効果をもたらす。実験の設計(ＤＯＥ)研究を行い、ｐＨ、ＮａＣｌ濃度およびＨＡオリゴマー濃度の全体的ｒＨｕＰＨ２０／インスリンの安定性に対する効果を試験した。

基本製剤は３.７５mg／mLのインスリン(Organon Insulin API、組み換えヒトインスリンSIHR 143、ストック溶液は実施例１に記載のとおり調製した)、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０、１５mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０.０１％ＺｎＣｌ_２、０.０１％ポロクサマー１８８、０.１５％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾールを含んだ。計１７個のサンプルを評価し、３種のｐＨレベル(７.１、７.３および７.５)、３種のＮａＣｌ濃度(５０、７５および１００mM)および３種のＨＡオリゴマー濃度(１、５.５および１０mg／mL)を含んだ。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を、３０℃で１週間インキュベートしたサンプルまたは２〜８℃で９ヶ月間保存したサンプルで測定した。ｒＨｕＰＨ２０酸化を、５℃で９ヶ月間保存したサンプルでＲＰ−ＨＰＬＣで測定した。インスリン含有量を２〜８℃で９ヶ月間保存したサンプルについてＲＰ−ＨＰＬＣで測定した。

製剤および結果を下記表５２に示す。インスリン含有量をＵＳＰ標準品に対する％回収として示す。パーセント(％)ｒＨｕＰＨ２０酸化ピーク面積はｏｘ−１(主)ピークおよびｏｘ−２(副)ピークの合計である。統計的分析を下記表５３に示す。表５３に示すとおり、ＨＡおよびＮａＣｌ濃度のいずれも、３０℃で１週間インキュベーション後の測定したとき、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する顕著な効果を有した。ＮａＣｌの濃度およびＨＡが上がるに連れ、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性も同様に増加した。これは、両添加物濃度が高いほど特に当てはまり、２因子の有意な相互作用を示す(表５３参照、Ｐ＝０.０１５０)。

＊ 有意

ＨＡ非存在下でのインスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤を評価したほとんど全ての先の試験において、ｐＨ増加は有意に負のｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する効果を、特にｐＨ範囲６.０〜８.０で有したことに注意すべきである。対照的に、ＨＡが製剤に包含されている本試験において、ｐＨはｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する効果がほとんどないか全くないように見える。それ故に、インスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤におけるＨＡの存在は、高ｐＨがｒＨｕＰＨ２０の酵素活性に対して有し得る負の効果を減らすか、または無くし得る。

安定化剤としてのＨＡの有用性をさらに評価するために、インスリン含有量を、２〜８℃で９ヶ月間保存したサンプルでＲＰ−ＨＰＬＣにより評価した。インスリン含有量データおよび統計的分析結果は下記表５４および５５に示す。結果は、インスリンの溶解度に対するｐＨおよびＮａＣｌ濃度の有意差を明らかに証明した(両因子でｐ＜０.０００１)。ｐＨが上がると、インスリンの溶解度は低下した。ＮａＣｌ濃度が上がると、インスリンの溶解度は低下した。インスリン溶解度／含有量に対するＨＡの効果は有意ではなかった(ｐ＝０.２７５５)。それ故に、ＨＡオリゴマー類はｒＨｕＰＨ２０／インスリンまたはｒＨｕＰＨ２０／インスリン類似体製剤の添加物／安定化剤であり得る。

ＨＡオリゴマー類含有製剤の長期保存は、ＨＡ添加物を含まない製剤と比較して、ｒＨｕＰＨ２０酸化レベルが有意に増加した。酸化のレベルはＨＡ濃度と良く相関しているように見えるが、ｐＨまたはＮａＣｌ濃度に非依存性であった(下記表５５および５６参照)。ＨＡはグルクロン酸を含み、これは潜在的酸素ドナーで有り得て、抗酸化剤または酸素スカベンジャーが、ＨＡが最終ｒＨｕＰＨ２０−インスリン製剤の添加物であるとき求められるはずである。本試験において、製剤のいくつかは相当酸化されたが、酵素活性はかなり無傷のままであり(表５５参照)、これは、酸化ｒＨｕＰＨ２０がなお有意な酵素活性を維持することを示す。多変量統計解析は、これらの長期低温保存サンプルのｒＨｕＰＨ２０酵素活性がＨＡ(ｐ＝０.００４、酵素活性低下)により有意に影響されるが、ｐＨまたはＮａＣｌ(それぞれｐ＝０.１７１５および０.４７６６)に影響されないことを示した(下記表５６参照)。

＊ 有意

＊ 有意

＊ 有意

実施例１１
メチルパラベン存在下のｒＨｕＰＨ２０に対する塩濃度、ｐＨおよび緩衝剤濃度の効果
この実施例において、Box-Behnken実験設計を使用して、高温でフェノール防腐剤メチルパラベン存在下のｒＨｕＰＨ２０の安定性に対する最適ｐＨ、塩濃度(ＮａＣｌ)および緩衝剤濃度(Ｈｅｐｅｓ)を決定した。この実験の設計(ＤＯＥ)効果表面反応法(ＲＳＭ)実験において、３因子、すなわち種々の濃度の緩衝剤および塩、およびｐＨを、サンプルを高温および撹拌を含む負荷にさらす加速条件下のｒＨｕＰＨ２０活性に対する効果を試験した。測定した応答は、逆相ＨＰＬＣで測定する酵素活性および純度／含有量を含む。

研究は、ＤＯＥソフトウェアパッケージDesign-Expert(登録商標)7.1. (StatEase, Minneapolis, MN)に基づいた。実験に使用したＨｅｐｅｓ濃度、ＮａＣｌ濃度およびｐＨの範囲および中点を下記表５７に記載する。本実験を行うために、５反復中心点を伴い、計１３種の製剤をソフトウェアが作製した無作為配列に基づき作製した。各サンプルは１００μg／mLのｒＨｕＰＨ２０(ヒスチジン／ＨＣｌ中１０mg／mL溶液、ｐＨ６.５、１３０mMのＮａＣｌ)、０.２０％メチルパラベン(Fluka, Cat. No. 85265)および０.０２５％プロピルパラベン(American Custom Chemicals, San Diego, Cat. No. CHEM-19713)と、下記表５８に示す種々の濃度のＨｅｐｅｓ(Calbiochem, Cat No. 391338)およびＮａＣｌ(ＥＭＤ, SX0418-1)およびｐＨを含んだ。ｐＨを１.０ＮのＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して調節した。溶液をゴム栓(Wheaton, Cat. No. 224100-072)を有する２mLの１型ガラスバイアル(Wheaton, Cat. No. 223683)に等分し、アルミナキャップで蓋し、製剤たり２バイアルとした。サンプルを３５℃に温度設定したインキュベータに入れた。１セットのバイアルを、Titerプレートシェーカー(LabLine)を使用して６００rpmで３日間撹拌した(３５＋ａｇ)。他セットのバイアルは撹拌せずに３５℃で５日間維持した。サンプルをインキュベーション期間後試験した。

＊：参照と比較したサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)主ピークパーセンテージ

酵素活性を上記実施例２ｂのとおり測定した。サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を使用して、参照サンプルと比較した主ピークのパーセンテージを測定することにより純度を評価した(上記実施例４参照)。ＳＥＣは次の条件を使用して行った。１Ｘリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、Toso BioScience G2000 SWXLカラム、および流速１mL／分に設定。データを上記のとおり回収し、平均を記載し、ＤＯＥソフトウェアにより提供されるサンプル配列に従う設計表に入力した。データは上記表５８に示す。

データ解析に関して、生データを次のとおり分析した。簡単に言うと、データを出発点として二次モデルに適合させた。ＡＮＯＶＡを二次モデルに基づき行うが、パラメータは、典型的にモデルが次の基準の全てを満たすように減らす必要があった。モデル有意レベルＰ＜０.０５、不適合度のｐ値(Ｐ＞０.１)、適切な精度レベル＞４、および調節Ｒ−ｓ二乗の０.２以内の予測Ｒ−ｓ二乗。最後に、残差分析および特徴的プロット(diagnostic plots)を確認して、ＡＮＯＶＡ仮定に合うことを確実にした。数例において、データは、これらの基準に合うように変換する必要があった。このような場合、生データを適当な数式により変換し、続いて先に記載の統計的分析に従った。各応答に使用したモデルのＡＮＯＶＡ試験モデルを下記表５９に示し、それは応答、モデル式、変換を使用したか否かおよび変換のタイプ、モデルＰ値および不適合度Ｐ値を示す。

＊ Ａ − ＮａＣｌ；Ｂ − Ｈｅｐｅｓ緩衝剤；Ｃ − ｐＨ

Ａ. 撹拌を伴う加速温度でのｒＨｕＰＨ２０に対するｐＨ、ＮａＣｌおよび緩衝剤濃度の効果
ＡＮＯＶＡモデルは、３５℃で過度の撹拌下、緩衝剤濃度はｒＨｕＰＨ２０の酵素活性および含有量／純度に効果を有しないことを示す(上記表５９参照、応答１および２、ここで、モデル式は緩衝剤を含まない)。ｒＨｕＰＨ２０は、ｐＨ６.５〜７.３かつＮａＣｌ濃度１４５〜１８０mMで最も安定であると予測された。これらの範囲外で、モデル予測ｒＨｕＰＨ２０活性は、特に、ｐＨが８.０であるときおよび塩濃度が最低濃度(１２０mM)であるとき減少する。こでらの加速条件下、測定された最高ｒＨｕＰＨ２０活性は約８１００Ｕ／mL(上記表５６のＳＴＤ９)であり、これは１００μg／mLの酵素に基づく予測ｒＨｕＰＨ２０活性(約１２,０００Ｕ／mL)の約６５％であった。類似の結果が、ＳＥＣで決定してｒＨｕＰＨ２０の純度／含有量で見られ、最も安定な製剤の主ピーク含有量損失は予測の約２０％であった。

ｒＨｕＰＨ２０酵素活性のための塩濃度およびｐＨの最適範囲はｒＨｕＰＨ２０含有量／純度よりわずかに狭い。それ故に、ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性はストレス条件により感受性であり、それ故にｒＨｕＰＨ２０の酵素活性が安定性を示す良好な方法であることを示す。

Ｂ. 撹拌なしの加速温度でのｒＨｕＰＨ２０に対するｐＨ、ＮａＣｌおよび緩衝剤濃度の効果
データは低ストレス条件(すなわち、撹拌なし)で、酵素活性低下は少なく、かつ観察される主ピーク消失が少ないことを示す。例えば、良好なサンプルについて、観察された活性消失はわずか２０％であり(撹拌しながらインキュベートしたサンプルの３５％と比較)、観察される主ピーク消失は５％未満であった(撹拌しながらインキュベートしたサンプルの２０％と比較)。さらに、ＡＮＯＶＡモデルは、塩濃度は酵素活性に有意効果を有しないことを示した。ｒＨｕＰＨ２０は、塩濃度が少なくとも１３０mMである限り、６.５未満のｐＨで酵素活性のままであった。さらに、最適酵素活性は、７未満のｐＨで見られた。

実施例１２
防腐剤を含有するインスリンリスプロ／ｒＨｕＰＨ２０またはインスリンアスパルト／ＲＨｕＰＨ２０の安定性試験
６ヶ月間暫定データ表
この実施例において、種々のインスリンリスプロ／ｒＨｕＰＨ２０製剤の安定性を３保存条件である５℃、２５℃および３０℃で経時的に評価した。１個の製剤はまた複数凍結／融解サイクルおよび２５℃で撹拌下の２種の物理的加速ストレス条件で評価した。製剤のｐＨおよび防腐剤レベルは変化した。安定性は一般的外観および特徴、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性およびｒＨｕＰＨ２０およびインスリン類似体純度の測定により評価した。

インスリンリスプロ／ｒＨｕＰＨ２０製剤は下記表６０に示す。

１mLの各製剤を、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えた２mLのＵＳＰ１型ホウケイ酸ガラスバイアルに保存した。各製剤を個々に５±３℃、２５±２℃および３０±３℃でインキュベートし、安定性測定を０ヶ月間、０.５ヶ月間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間および６ヶ月間で記録した。製剤＃２を２５℃で２４時間の撹拌に付した(振盪６５０rpm)。製剤＃２を−３０℃フリーザーおよび作業台で室温の保存条件を交互に行うことにより５サイクルの凍結／融解に付した。サンプルを、各サイクルで各条件下に少なくとも２時間置いた(すなわち、２時間−３０℃フリーザー、取り出し、作業台上に室温で２時間が１サイクルと見なされる)。

安定性をｐＨ、浸透圧濃度、３５０nmの濁度および定性的観察を含む外観、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒＨｕＰＨ２０のパーセント純度および回収パーセント、ＲＰ−ＨＰＬＣによるインスリンリスプロのパーセント純度および回収パーセント、および非変性および変性ＳＥＣによるインスリンリスプロのパーセント純度により評価した(実施例２〜５参照)。浸透圧濃度について、安定性合格基準は２７５±３０mOsm／kgであった。外観について、安定性合格基準は無色透明溶液であることであった。ｒＨｕＰＨ２０活性について、安定性合格基準は製剤が＞３７５Ｕ／mLを示すことであった(＞７５Ｕ／μgに基づく)。ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒＨｕＰＨ２０回収パーセントについて、許容される目標仕様は、ＲＰ−ＨＰＬＣで３〜７μg／mLの(６０〜１４０％)であった。ＲＰ−ＨＰＬＣによるインスリン純度について、許容される目標仕様は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる≧９０％純度であった。ＲＰ−ＨＰＬＣによるインスリン回収について、許容される目標仕様は、ＲＰ−ＨＰＬＣで９０〜１００Ｕ／mLの(９０〜１１０％)であった。非変性ＳＥＣによるパーセント純度について、許容される目標仕様は、ピーク面積で≦２％高分子量(ＨＭＷｔ)インスリン種であった。変性ＳＥＣによるインスリン純度について、許容される目標仕様は、変性ＳＥＣのピーク面積により≦２％高分子量(ＨＭＷｔ)インスリン種であった。

結果は下に要約する。表６０に示すインスリンリスプロ／ｒＨｕＰＨ２０製剤において、製剤＃１、＃２および＃３を、Ｔ＝０にインスリンリスプロの低含有量(それぞれ９１.２２％、９１.４０％または９１.３０％)で調製したが、他の製剤は約１００％タンパク質含有量を含んだことが決定された。

１. ３ヶ月時点
ａ. インスリンリスプロ
試験した全製剤は、５±３℃で３ヶ月時点まで、ｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロのいずれも安定であった。全製剤は無色透明で、全時点および温度で粒子はなかった。製剤＃１−＃３についてインスリンリスプロ含有量は低かったが(目標の約９１％回収)、これは、回収パーセントが５℃で予測されるとおり一定であるため、製剤調製誤差であると考えられた。

２５±２℃で、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性について２〜３ヶ月間の間に目標仕様の３７５Ｕ／mLより低くなった製剤＃８以外、全製剤のｒＨｕＰＨ２０は安定であった。製剤＃８が高ｐＨおよび高防腐剤濃度であり、一般に、ｒＨｕＰＨ２０が低ｐＨおよび低防腐剤濃度であるため、予想外ではなかった。インスリンリスプロは一般的に全製剤で２５℃で３ヶ月時点まで安定であったが、純度は約１ヶ後ＲＰ−ＨＰＬＣで評価してわずかに減少した。

３０±３℃で、最低ｐＨ製剤(＃１および＃４、両者ともｐＨ７.２)のみが１ヶ月、３０℃でｒＨｕＰＨ２０酵素活性の目標仕様(＞３７５Ｕ／mL)を超えていた。製剤＃２は２週間、３０℃で目標仕様を超えていたが、１ヶ月までに３７５Ｕ／mLを下回った。インスリンリスプロは一般的に全製剤で３０℃で３ヶ月間目標仕様範囲内で安定であったが、２５℃で見られるよりわずかに大きな純度の低下があった。純度の低下は、２５℃で見られない３０℃での含有量の減少を伴った。３ヶ月時点の後、３０℃条件を終えた。

ｂ. インスリンアスパルト
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。試験した全製剤は５±３℃で３ヶ月までの時点でｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトは安定であった。

ｒＨｕＰＨ２０は、２〜３ヶ月間の間にｒＨｕＰＨ２０活性の目標仕様の３７５Ｕ／mLを下回った製剤＃７以外、２５±２℃で３ヶ月間維持した全製剤で目標仕様に合った。剤＃７および＃８がｐＨ値(それぞれ７.２および７.６)以外同一であり、一般に、ｒＨｕＰＨ２０は低ｐＨでより安定であるために、これは若干予想外であった。この予想外の結果は、おそらく、製剤＃７が目標(それぞれ６００Ｕ／mLおよび１００％)より低い活性(５００Ｕ／mL)および含有量(９３.８％)で出発することによるものであり、さらに製剤＃７および＃８の許容される純度値により支持された。インスリンアスパルトは、２５℃で３ヶ月時点で全製剤で安定であったが、純度および％回収がわずかに減少傾向にあった。

ｒＨｕＰＨ２０は、２５℃と比較して、３０±３℃で保持した全製剤で不安定であった。最低ｐＨ製剤(＃１および＃４、いずれもｐＨ７.２)および最低合計防腐剤製剤(＃４および＃５、合計防腐剤レベル＝０.１７５％)は１ヶ月間、３０℃の後、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性の目標仕様を上回った。製剤＃２は１ヶ月間、３０℃の後目標仕様のわずかしたであり、製剤＃６は１ヶ月間後活性の目標仕様を上回ったが、２週間後わずかに下回った。製剤＃１−＃６は一般的に２週間、３０℃の後、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性の目標仕様の範囲内であった。インスリンアスパルトは３０℃で３ヶ月間、全製剤で目標仕様内で安定であったが、２５℃よりわずかに大きな純度および％回収の減少傾向があった。実験の３０±３℃部分は、３ヶ月時点後に収量した。

２. ６ヶ月時点
ａ. インスリンリスプロ
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。試験した全製剤は５℃で、６ヶ月時点でｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロの両者で安定であった。製剤＃１−＃３について先に観察された低インスリンリスプロ含有量(標的の約９１％回収)であるが、回収パーセント５℃でなお一定であった。

２５℃で、ｒＨｕＰＨ２０はまた製剤＃１、＃２、＃４、および＃５について安定なままであった(＞３７５Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０活性)。これらの製剤は全て低ｐＨ(７.２または７.４)であり、現在のＵＳＰ防腐剤レベル(＃１、＃２：０.１２５％フェノール、０.０７５％ｍ−クレゾール)またはわずかに低い防腐剤レベル(＃４、＃５：０.１％フェノール、０.０７５％ｍ−クレゾール)であった。全８種の製剤は６ヶ月間ｒＨｕＰＨ２０回収パーセント目標仕様の範囲内のままであったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒＨｕＰＨ２０純度および回収の両者で明らかな減少があった。インスリンリスプロで３ヶ月間、２５℃の後に見られたＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、ＲＰ−ＨＰＬＣによる含有量、および非変性ＳＥＣによる純度減少は６ヶ月でより明らかとなった。変性ＳＥＣによる純度はわずかに減少し得るが、全主ピーク値はなお＞９９.４％であり、この時点まで損失は極めて少ない。

ｂ. インスリンアスパルト
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。試験した全製剤は５±３℃で、６ヶ月時点で、ｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトの両者で安定であった。

ｒＨｕＰＨ２０は、６ヶ月間、２５±２℃に維持した４種の製剤(＃１、＃２、＃４、および＃５)については酵素活性(＞３７５Ｕ／mL)の活性目標仕様の範囲内であった。これらの製剤は全て低ｐＨ(７.２または７.４)であり、現在のＵＳＰ防腐剤レベル(＃１、＃２：０.１２５％フェノール、０.０７５％ｍ−クレゾール)またはわずかに低い防腐剤レベル(＃４、＃５：０.１％フェノール、０.０７５％ｍ−クレゾール)であった。全８種の製剤は６ヶ月間ｒＨｕＰＨ２０回収パーセント目標仕様の範囲内のままであったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによりｒＨｕＰＨ２０純度および回収の両者で明らかな減少が観察された。３ヶ月間、２５℃で示されたインスリンアスパルトの下方傾向は、６ヶ月間でＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、ＲＰ−ＨＰＬＣによる含有量、および非変性ＳＥＣによる純度でさらに明らかであった。変性ＳＥＣによる純度は、わずかに減少傾向であり得るが、主ピーク値はなお＞９９.５％であり、この時点まで損失は極めて少ない。

３. 加速条件 − 撹拌２５℃でおよび凍結／融解
ａ. インスリンリスプロ
製剤＃２は撹拌２５℃でで２４時間後濁った。インスリンリスプロは両条件で安定であったが、回収パーセントは５凍結／融解サイクル後約７５％に低下した。ｒＨｕＰＨ２０は、２５℃でで２４時間撹拌に付したサンプルについて活性目標仕様(＞３７５Ｕ／mL)を満たした。５凍結／融解サイクル後、ｒＨｕＰＨ２０は酵素的に不活性であった。

ｂ. インスリンアスパルト
インスリンリスプロ製剤撹拌下または凍結／融解条件下で得られたのと類似の結果が、インスリンアスパルト製剤＃２で得られた。

実施例１３
種々の防腐剤を含むインスリンリスプロ／ｒＨｕＰＨ２０、インスリンアスパルト／ｒＨｕＰＨ２０またはインスリングルリジン／ｒＨｕＰＨ２０の安定性試験
２または３ヶ月暫定データ表
この実施例において、種々のインスリンリスプロ−ｒＨｕＰＨ２０、インスリンアスパルト−ｒＨｕＰＨ２０またはインスリングルリジン−ｒＨｕＰＨ２０製剤の安定性を、４種の保存条件である５℃、１５℃、２５℃および３０℃で経時的に評価した。製剤のｐＨ、塩濃度およびグリセリン濃度は変わった。安定性は一般的外観および特徴、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性およびｒＨｕＰＨ２０およびインスリン類似体純度の測定により評価した。この研究は、市販インスリン製剤(NovoLog)に含まれる防腐剤レベルまたはＥＰ−Ｂ(欧州薬局方)およびＵＳＰ(米国薬局方)防腐剤レベルの３防腐剤レベルの第３相臨床開発の支持データを提供する。

インスリンリスプロ／ｒＨｕＰＨ２０製剤を下記表６１に示す。インスリンアスパルト／ｒＨｕＰＨ２０製剤を表６２に示す。インスリングルリジン／ｒＨｕＰＨ２０製剤を表６３に示す。基本製剤は３.５mg／mLのインスリンリスプロまたはアスパルト、６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２０mMのメチオニンおよび０.０１％ポロクサマー１８８を含んだ。ｐＨ、ＮａＣｌ濃度およびグリセリン濃度は３種の基本防腐剤濃度で異なった。

表６１および６２に示すインスリンリスプロ／ｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルト／ｒＨｕＰＨ２０製剤について、製剤Ａ１〜Ａ４は市販NovoLog(登録商標)防腐剤レベル(０.１５％フェノールおよび０.１７２％ｍ−クレゾール)を有し、製剤Ｂ１〜Ｂ５はＥＰ−Ｂ防腐剤レベル(０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾール)を有し、製剤Ｕ１はＵＳＰ防腐剤レベル(０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール)を有した。

加えて、表６３に示すインスリングルリジン／ｒＨｕＰＨ２０製剤について、製剤１は市販NovoLog(登録商標)防腐剤レベル(０.１５％フェノールおよび０.１７２％ｍ−クレゾール)を有した。製剤２はＥＰ−Ｂ防腐剤レベル(０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾール)を有した。製剤３はＵＳＰ防腐剤レベル(０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール)を有した。製剤４〜７はNovoLog(登録商標)市販防腐剤レベルを有し、製剤１との比較のために１種以上の因子を変えた。製剤間の差異を太字で示す。製剤４は高濃度のＮａＣｌを有し、製剤７は種々の界面活性剤を有する。製剤５および６は製剤４とメチオニン濃度およびｐＨが異なる。

１mLの各製剤をクロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えたＵＳＰ１型ホウケイ酸２mLのガラスバイアルで、上記実施例１２のとおり、保存し、種々の温度でインキュベートした。安定性測定を種々の時間に記録した。ｔ＝０ヶ月目、０.２５ヶ月目、０.５ヶ月目、１ヶ月目、２ヶ月目、３ヶ月目、６ヶ月目または９ヶ月目。安定性はまたｐＨ、外観、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒＨｕＰＨ２０のパーセント純度および回収パーセント、ＲＰ−ＨＰＬＣによるインスリンリスプロのパーセント純度および回収パーセント、および非変性および変性ＳＥＣによるインスリンリスプロのパーセント純度の測定により評価した(実施例２〜５および実施例１２参照)。試験した各パラメータの安定性合格基準または目標仕様は実施例１２に記載のものと同一である。結果が初期レベルの≧３０％を示すサンプルのみ、続く時点で評価した。
結果を下に要約する。

１. １ヶ月目時点
ａ. インスリンリスプロ
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。試験した全製剤は５±３℃で１ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロのいずれも安定であった。１５±２℃の製剤は１ヶ月目時点で評価しなかった。

ｒＨｕＰＨ２０は、製剤Ａ１、Ａ２、Ａ４およびＢ４以外、２５±２℃で１ヶ月目まで維持したほとんどの製剤で安定であった。２５℃で保存して、製剤Ａ１、Ａ２、およびＢ４はｒＨｕＰＨ２０酵素活性の目標仕様の３７５Ｕ／mLを２週間〜１ヶ月目で下回り、製剤Ａ４は目標仕様を１〜２週間で下回った。これらの製剤は市販NovoLogまたはＥＰ−Ｂレベルの防腐剤と高ｐＨ(ｐＨ７.６)を有し、これはｒＨｕＰＨ２０安定性に好ましくない。１ヶ月目、２５℃で＜３７５Ｕ／mLヒアルロニダーゼ活性を有した一つのＥＰ−Ｂ製剤(Ｂ４)はｐＨ７.６および低塩化ナトリウム濃度(５０mM)であり、この組み合わせはｒＨｕＰＨ２０に好ましくなかった。ｐＨ７.６で高塩化ナトリウム濃度(８０mMまたは１００mM)の他のＥＰ−Ｂ製剤は両者とも１ヶ月目、２５℃でで標的レベルの３７５Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０酵素活性を超えた。他の全ての製剤は２５℃で１ヶ月間保存後、目標仕様を十分超えた。インスリンリスプロは、１ヶ月目時点まで２５℃でで全製剤で安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによるパーセント純度はわずかに減少し始めた。

ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃と比較して、３０±２℃で維持した全製剤が不安定であった。ＵＳＰ製剤は、１ヶ月目まで３０℃で許容されるｒＨｕＰＨ２０活性を維持したが、市販防腐剤(Ａ１〜Ａ４)またはＥＰ−Ｂ(Ｂ１〜Ｂ５)製剤は、３０℃で１週間保存後目標仕様を超えたままであった。インスリンリスプロは１ヶ月目、全製剤で３０℃で目標仕様範囲内で安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによるパーセント純度はわずかに減少する。

ｂ. インスリンアスパルト
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。全製剤は、ｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトの両者について、１ヶ月目時点まで５±３℃で安定であった。１５±２℃の製剤は１ヶ月目時点で評価しなかった。

ｒＨｕＰＨ２０は、それぞれ１〜２週間および２週間〜１ヶ月目で３７５Ｕ／mLの目標仕様を下回った製剤Ａ４およびＢ４以外、２５±２℃で１ヶ月目まで維持した全製剤で安定であった。これらの製剤は市販NovoLog(登録商標)またはＥＰ−Ｂレベルの防腐剤と低塩(５０mM)および高ｐＨ(７.６)を有し、これらは各々ｒＨｕＰＨ２０安定性に好ましくない条件である。全ての他の製剤は、２５℃で１ヶ月間保存で、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性について目標仕様を超えた。インスリンアスパルトは全製剤で、２５℃でで１ヶ月目時点まで安定であった。インスリンアスパルト合計含有量は予測値を下回ったが、時間＝０と一致した。

ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃と比較して、３０±２℃に維持した全製剤で不安定であった。ＵＳＰ製剤(Ｕ１)は許容されるｒＨｕＰＨ２０活性を１ヶ月目、３０℃で維持した。数種のＥＰ−Ｂ製剤は１週間まで許容されるｒＨｕＰＨ２０活性を維持したが、NovoLog(登録商標)防腐剤製剤は、いずれも１週間、３０℃の保存で許容される活性を維持しなかった。インスリンアスパルトは全製剤で３０℃で１ヶ月目で目標仕様内で安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによるパーセント純度でわずかな減少傾向が見られた。

ｃ. インスリングルリジン
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。全製剤は５±３℃で１ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリングルリジンの両者で安定であった。１５±２℃の製剤は１ヶ月目時点で評価しなかった。

ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃で１ヶ月目の全製剤で安定であった。製剤のいくつかでｒＨｕＰＨ２０活性およびｒＨｕＰＨ２０ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度にわずかな減少傾向があった。インスリングルリジンは、全製剤で２５℃で１ヶ月目時点で安定であったが、純度および回収パーセントにまたわずかな減少傾向が見られた。

ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃と比較して、３０±２℃で維持した全製剤で不安定であった。７試験品中４品が、１週間、３０℃の後、＞３７５Ｕ／mLののｒＨｕＰＨ２０活性目標仕様を下回った。製剤６は許容される活性を１週間しか示さず、製剤２は許容される活性を２週間示し、ＵＳＰ製剤(＃３)は許容されるｒＨｕＰＨ２０活性(５３２Ｕ／mL)を１ヶ月目、３０℃で示した。インスリングルリジンは目標仕様内で１ヶ月目全製剤で３０℃で安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによりパーセント純度および回収パーセントの明らかな減少傾向が示された。

２. ２ヶ月目時点
ａ. インスリンリスプロ
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。試験した全製剤は安定な５±３℃で２ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロの両者で安定であった。

全試験品はまた１５±２℃で２ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロの両者で安定であった。極めてわずかなｒＨｕＰＨ２０酵素活性が存在し得るが、安定性に他の明らかな減少傾向はなかった。

ｒＨｕＰＨ２０は市販防腐剤製剤(Ａ１〜Ａ４)で２５±２℃で、２ヶ月目まで安定ではなかったが、製剤Ａ３は良好な活性を１ヶ月目(４３６Ｕ／mL)で有し、２ヶ月目(３６１Ｕ／mL)で意図する＞３７５Ｕ／mLの仕様よりわずかに低くなった。５種のＥＰ−Ｂ製剤中４種(Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ５)が２ヶ月目、２５℃の後３７５Ｕ／mLの目標仕様を超え、良好なｒＨｕＰＨ２０純度および回収であった。ＵＳＰ製剤(Ｕ１)もまた２ヶ月目、２５℃でｒＨｕＰＨ２０活性目標仕様を超え、５１０Ｕ／mLの値であり、相応して高い純度および回収値であった。インスリンリスプロは全製剤で２５℃で２ヶ月目時点まで安定であったが、１ヶ月目で同定された減少傾向は続いた。

１ヶ月目で示されるとおり、ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃と比較して３０±２℃で維持される全製で不安定であり、全てのＡ(市販防腐剤)およびＢ(ＥＰ−Ｂ防腐剤)製剤はｒＨｕＰＨ２０活性目標仕様を、３０℃で２ヶ月目までに下回った。ＵＳＰ製剤は２ヶ月目まで、３０℃で正確に許容されるｒＨｕＰＨ２０活性(３７５Ｕ／mL)を維持したが、１ヶ月目時点(３３４Ｕ／mL)で仕様より低くなった。これは、ｒＨｕＰＨ２０活性アッセイの固有の変動またはサンプル変動による可能性があるが、３０℃での一般的安定性減少傾向はなお証明される。インスリンリスプロは目標仕様内で、２ヶ月目、全製剤で３０℃で安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによるパーセント純度および回収ならびにパーセント非変性ＳＥＣによる純度により顕著な減少傾向があった。

ｂ. インスリンアスパルト
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。全製剤は５±３℃で２ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトの両者で安定であった。全試験品はまた１５±２℃で２ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトの両者で安定であった。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性、純度、および回収にわずかな減少傾向が見られた。

ｒＨｕＰＨ２０は４種中３種の市販防腐剤製剤(Ａ２、Ａ３およびＡ４)で２５±２℃で２ヶ月目まで安定ではなかったが、製剤Ａ１は許容される活性(３８５Ｕ／mL)を２ヶ月目に有し、試験品Ａ３は意図する＞３７５Ｕ／mLの仕様を２ヶ月目でわずかに下回った(３５７Ｕ／mL)。５種のＥＰ−Ｂ製剤中３種(Ｂ１、Ｂ２およびＢ３)は２ヶ月目、２５℃の後ｒＨｕＰＨ２０酵素活性の目標仕様の３７５Ｕ／mLを十分上回り、許容されるが、類似製剤での経験に基づく予測ｒＨｕＰＨ２０純度および回収より特徴的でなく低かった。ＵＳＰ製剤(Ｕ１)は２ヶ月目、２５℃の後ｒＨｕＰＨ２０活性目標仕様を十分超え、４４４Ｕ／mLの値であり、許容される純度および回収であった。インスリンアスパルトは、２５℃で２ヶ月目時点まで全製剤で安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度および非変性ＳＥＣにわずかな減少傾向があった。

１ヶ月目で示されたとおり、ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃と比較して３０±２℃で維持された全製剤で不安定であり、および全てのＡおよびＢ製剤はｒＨｕＰＨ２０酵素活性目標仕様を２ヶ月目、３０℃で下回った。ＵＳＰ製剤(Ｕ１)は許容されるｒＨｕＰＨ２０活性(３８２Ｕ／mL)を２ヶ月目、３０℃で維持した。ＵＳＰ製剤のｒＨｕＰＨ２０パーセント純度および回収は、上記のとおり類似製剤での経験に基づく予測よりわずかに低かったが、許容される限度内であった。インスリンアスパルトは、２ヶ月目、全製剤で３０℃で目標仕様内で安定なであったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによるパーセント純度ならびに変性および非変性ＳＥＣによるパーセント純度に減少傾向が見られた。先の時点で観察された低パーセント回収はもはや明らかであり、ＲＰ−ＨＰＬＣによるインスリンアスパルトの回収パーセント値は、全温度で１ヶ月目から２ヶ月目の間にわずかに増加していた(３０℃で最も明らか)。

ｃ. インスリングルリジン
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。試験した全製剤は、目標仕様内で、５±３℃で２ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリングルリジンの両者で安定であった。

全試験品は１５±２℃で２ヶ月目時点で目標仕様内でｒＨｕＰＨ２０およびインスリングルリジンの両者とも安定であった。２ヶ月目データは一般的にｒＨｕＰＨ２０活性および回収についてわずかに低かったが、２ヶ月目で有意に低いパーセント純度を示した製剤＃５(メチオニン添加なし)以外、パーセント純度は同じままであった。インスリングルリジンもまた目標仕様内で１５℃で２ヶ月目時点まで安定であり、２ヶ月目、１５℃の後、パーセント純度および回収でわずかに低い値を示した。

ｒＨｕＰＨ２０活性は、２５±２℃で２ヶ月目維持した７種中３種の製剤(＃２、＃３および＃６)で初期仕様(＜３７５Ｕ／mL)を十分超え、製剤＃４は僅かに上であった。一般に、これらの製剤は低レベルの防腐剤(＃２および＃３)または高塩および低ｐＨ(＃６)であった。ｒＨｕＰＨ２０活性仕様を僅かに超えた製剤＃４は、実験中最高レベルの防腐剤およびｐＨであっただけでなく、最高濃度のＮａＣｌを含んだ。ｒＨｕＰＨ２０活性、純度、および含有量について全製剤で減少傾向があった。インスリングルリジンは全製剤で２５℃で２ヶ月目時点まで安定であったが、１ヶ月目で同定された純度および回収パーセントのわずかな減少傾向は続いた。

ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃と比較して、３０±２℃で維持した全製剤で不安定であった。ＵＳＰ防腐剤レベル製剤(＃３)のみが２ヶ月目、３０℃の後＞３７５Ｕ／mLの活性目標仕様を満たした。製剤＃３はまた許容されるｒＨｕＰＨ２０純度および回収を２ヶ月目時点で示した。インスリングルリジンは目標仕様内で３０℃で２ヶ月目、全製剤で安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによるパーセント純度および回収パーセントで明らかな減少傾向があった。

３. ３ヶ月目時点
ａ. インスリンリスプロ
全製剤は、５±３℃で３ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロの両者で安定であった。ｒＨｕＰＨ２０ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度は幾分予測より低かったが、これは通常のアッセイ変動の範囲内であると考えられた。“２個の赤色外来小片”を含むことが同定された製剤Ａ３以外、全製剤は無色透明であり、粒子は全時点および温度でなかった。

全製剤は、全目標仕様を、１５±２℃で３ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロの両者で満たした。ｒＨｕＰＨ２０ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度もまた予測値より幾分低かったが、これは先に記載のとおり通常のアッセイ変動によるものであると考えた。ｒＨｕＰＨ２０活性およびインスリンリスプロ非変性ＳＥＣによる純度についてわずかな減少傾向があるが、他の明らかな減少傾向はない。

ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃で３ヶ月目まで市販防腐剤製剤(Ａ１−Ａ４)で安定ではなかった。５種のＥＰ−Ｂ製剤中４種(Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ５)は３ヶ月目、２５℃の後なおｒＨｕＰＨ２０酵素活性の目標仕様の３７５Ｕ／mを超え、減少傾向であったが、許容されるｒＨｕＰＨ２０純度および回収であった。ＵＳＰ製剤(Ｕ１)は３ヶ月目、２５℃の後ｒＨｕＰＨ２０活性目標仕様を十分に超え、５２２Ｕ／mLの値であり、相応して高い純度および回収値であった。インスリンリスプロは全製剤で２５℃で３ヶ月目時間まで安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによるおよび非変性ＳＥＣによるインスリンリスプロ純度の減少は明らかであった。

先に同定したとおり、ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃と比較して３０±２℃で維持した全製剤で不安定であり、全製剤はｒＨｕＰＨ２０活性目標仕様を３ヶ月目、３０℃の後下回った。インスリンリスプロは、３ヶ月目、３０℃で全製剤で目標仕様内で安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによるパーセント純度ならびにパーセント非変性ＳＥＣによる純度の顕著な減少傾向があった。

ｂ. インスリンアスパルト
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。試験した全製剤は５±３℃で３ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトの両者で安定であった。全製剤は１５±２℃で３ヶ月目時点まで全目標仕様をｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトの両者で満たした。ｒＨｕＰＨ２０活性、純度、および回収が幾分減少傾向であった。非変性ＳＥＣによるインスリンアスパルト純度は２ヶ月目時点より低かったが、これが減少傾向であるのか、通常のアッセイ変動であるのか明らかではない。

ｒＨｕＰＨ２０は市販防腐剤製剤で安定ではないが、製剤Ａ１は唯一ｒＨｕＰＨ２０活性目標仕様(＜３７５Ｕ／mL)を３ヶ月目でわずかに下回った(３６９Ｕ／mL)。５種のＥＰ−Ｂ製剤中３種(Ｂ１、Ｂ２およびＢ３)はなお３ヶ月目、２５±２℃の後３７５Ｕ／mLの目標仕様を十分超え、許容されるが、２ヶ月目の要約に記載したとおり予想外に低いｒＨｕＰＨ２０純度および回収であった。ＵＳＰ製剤(Ｕ１)は３ヶ月目、２５℃の後ｒＨｕＰＨ２０活性目標仕様を十分に超え、４９２Ｕ／mLの値であり、許容される純度および回収であった。インスリンアスパルトは全製剤で２５℃で３ヶ月目時点まで安定であったが、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度および非変性ＳＥＣに明らかな減少傾向があった。

先に記載したとおり、ｒＨｕＰＨ２０は２５±２℃と比較して、３０±２℃で維持した全製剤で不安定なであった。全てのＡおよびＢ製剤はｒＨｕＰＨ２０活性目標仕様を１ヶ月目、３０℃で下回った。ＵＳＰ製剤(Ｕ１)は意図した＞３７５Ｕ／mLの仕様を３ヶ月目でわずかに下回ったが(３７１Ｕ／mL)、またＲＰ−ＨＰＬＣによるｒＨｕＰＨ２０パーセント純度および回収パーセントも低かった。インスリンアスパルトは、全製剤で約９７％までの主ピークの極めてわずかな減少を示した非変性ＳＥＣ以外、目標仕様内で、３ヶ月目、全製剤で３０℃で、全技術で安定であった。

４. ６ヶ月目時点
ａ. インスリンリスプロ
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。３０±２℃で製剤は６ヶ月目時点で評価しなかった。

全製剤は５±３℃および１５±２℃で６ヶ月目時点でｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロのいずれについても安定であった。全製剤でｒＨｕＰＨ２０活性およびｒＨｕＰＨ２０回収パーセントで幾分わずかな減少傾向があった。製剤Ａ４は両温度で最も不安定であった。

製剤Ｂ３およびＵ１のみが２５±２℃で安定性要求を満たした。これらの製剤のいずれもｐＨ７.４および８０mM塩を有する。残りの製剤は、３７５Ｕ／mL未満のｒＨｕＰＨ２０酵素活性であった。失活はｒＨｕＰＨ２０回収パーセントの低下と相関した。非変性ＳＥＣはインスリンリスプロパーセント純度でわずかな減少傾向を示した。

ｂ. インスリンアスパルト
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。３０±２℃で製剤は６ヶ月目時点で評価しなかった。

全製剤は５±３℃および１５±２℃で６ヶ月目時までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトのいずれについても安定であった。全製剤でｒＨｕＰＨ２０活性およびｒＨｕＰＨ２０回収パーセントについてわずかな減少傾向がった。製剤Ａ４は両温度で最も不安定であった。

製剤Ｕ１のみが２５±２℃で安定性要求を満たした。残りの製剤は３７５Ｕ／mL未満のｒＨｕＰＨ２０酵素活性であった。失活はｒＨｕＰＨ２０回収パーセントの低下と相関した。非変性ＳＥＣは、インスリンアスパルトパーセント純度のわずかな減少傾向を示した。

５. ９ヶ月目時点
ａ. インスリンリスプロ
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。２５±２℃および３０±２℃で製剤は９ヶ月目時点で評価しなかった。

全製剤は５±３℃および１５±２℃で９ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロのいずれも安定であった。全製剤でｒＨｕＰＨ２０活性およびｒＨｕＰＨ２０回収パーセントのわずかな減少傾向があった。６ヶ月目で見られるとおり、製剤Ａ４は両温度で最も不安定である。

ｂ. インスリンアスパルト
全製剤は、全時点および温度で無色透明であり、粒子はなかった。２５±２℃および３０±２℃の製剤は９ヶ月目時点で評価しなかった。

全製剤は５±３℃および１５±２℃で９ヶ月目時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトのいずれも安定であった。全製剤でｒＨｕＰＨ２０活性およびｒＨｕＰＨ２０回収パーセントのわずかな減少傾向が見られた。６ヶ月目で見られるとおり、製剤Ａ４は両温度で最も不安定であった。

実施例１４
アスパルト−ｒＨｕＰＨ２０およびリスプロ−ｒＨｕＰＨ２０の加速安定性試験：凍結／融解、撹拌および高保存温度
この実施例において、種々のインスリンアスパルト−ｒＨｕＰＨ２０およびインスリンリスプロ−ｒＨｕＰＨ２０製剤の安定性を、多数回凍結／融解サイクル、２５℃で撹拌、および３７℃の熱負荷の複数の加速ストレス条件で評価した。安定性安定性は一般的外観および特徴、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性およびｒＨｕＰＨ２０およびインスリン類似体純度で評価した。

インスリン類似体／ｒＨｕＰＨ２０製剤を下記表６４に示す。Humalog(登録商標)サンプル(インスリンリスプロ、製剤４)およびNovoLog(登録商標)サンプル(インスリンアスパルト、製剤８)を対照として使用した。基本製剤は３.４７mg／mLのインスリンリスプロまたは３.５mg／mLのインスリンアスパルト、６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、および０.０１％ポロクサマー１８８を含んだ。製剤１および５はさらに５０mMのＮａＣｌ、１００mMのメチオニン、０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾールを、ｐＨ７.４で含んだ。製剤２および６(ＥＰ−Ｂ製剤)はさらに８０mMのＮａＣｌ、２０mMのメチオニンおよび５０mMのグリセリンと、ＥＰ−Ｂ防腐剤レベル(０.１５％フェノールおよび０.１７５％ｍ−クレゾール)を含んだ。製剤３および７(ＵＳＰ製剤)はさらに８０mMのＮａＣｌ、２０mMのメチオニンおよび５０mMのグリセリンとＵＳＰ防腐剤レベル(０.１３％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール)を含んだ。

各製剤を次の加速分解条件に曝した：
(１) ２５℃で撹拌：各製剤をシェーカーを備えた２５℃インキュベータに入れた。バイアルを６５０rpmでの振盪時直立させた。サンプルを６時間、１２時間および２４時間振盪後分析用に取った。全サンプルを分析前２〜８℃で貯蔵した。

(２)複数サイクル凍結／融解：各製剤を、−３０℃フリーザーおよび作業台で室温の間で保存条件を交互に変えることにより５サイクルの凍結／融解に付した。サンプルを各条件に、各サイクルにつき少なくとも２時間置いた(すなわち、２時間−３０℃フリーザー中、取り出し、作業台に室温で２時間静置を１サイクルと見なした)。サンプルを１サイクル、３サイクルおよび５サイクル後取り、分析前２〜８℃で保存した。

(３) 熱負荷：各製剤を３７℃インキュベータに入れた。サンプルを８時間、２４時間および４８時間後に取り、サンプルを分析前２〜８℃で保存した。

分析をストレス条件の適用前後に行った。全製剤を、外観、浸透圧濃度、ｐＨ、濁度、ヒアルロニダーゼ酵素活性、ヒアルロニダーゼ純度、およびインスリン純度、ＨＷＭ純度および含有量を含む完全セットの分析試験により特徴付けした(試験法については上記実施例２〜５および１２参照)。試験した各パラメータの安定性合格基準または目標仕様は実施例１２に記載したものと同じである。結果を下に要約する。

１. ２５℃で撹拌
ＥＰ−Ｂ製剤(＃２および＃６)および対照製剤(＃４および＃８)は全時点で無色透明であり、粒子はなかった。ＵＰＳ製剤(＃３および＃７)は６撹拌時間後無色透明であったが、１２時間時点で沈殿が形成された。製剤＃１および＃５は６時間時点で沈殿があった。

ｒＨｕＰＨ２０は全製剤で、全時点で＞３７５Ｕ／mLの酵素活性を有し、安定であった。ｒＨｕＰＨ２０回収パーセントは全時点で経過と共に減少傾向にあったが、全製剤は許容される回収レベルであった。インスリンアスパルトおよびインスリンリスプロは全時点で安定であった。NovoLog(登録商標)(インスリンアスパルト)およびHumalog(登録商標)(インスリンリスプロ)対照は時点で安定であった。

２. 凍結／融解
全製剤は全時点で無色透明であった。１凍結／融解サイクル後、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性は顕著に低下したが(最高製剤である＃３は１６８Ｕ／mLの活性を有した)パーセント純度は全製剤および全時点で＞９５％のままであった。ｒＨｕＰＨ２０回収パーセントはほとんどの製剤で許容されるレベルを下回った。インスリンアスパルトおよびインスリンリスプロは全時点で安定であった。NovoLog(登録商標)(インスリンアスパルト)およびHumalog(登録商標)(インスリンリスプロ)は全時点で安定であった。

３. ３７℃の熱負荷
全製剤は全時点で無色透明であり、粒子はなかった。８時間、３７℃の後、製剤＃１、＃３、＃５および＃７は許容されるｒＨｕＰＨ２０酵素活性(＞３７５Ｕ／mL)を有した。ｒＨｕＰＨ２０安定性は、ｒＨｕＰＨ２０活性低下(３７５Ｕ／mL未満)および回収パーセント減少により証明されるとおり、全時点で経過と共に減少傾向にあった。インスリンアスパルトおよびインスリンリスプロは全時点で安定であった。NovoLog(登録商標)(インスリンアスパルト)およびHumalog(登録商標)(インスリンリスプロ)対照は全時点で安定であった。

実施例１５
インスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤安定性に対するＨＡオリゴマー類の効果
この実施例において、種々のインスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤の安定性に対するＨＡオリゴマー類添加の効果を評価した。第一に、試験は、５℃、２５℃、３０℃および３５℃の保存条件下で経時的に安定性を評価することにより完了した。第二に、種々の防腐剤存在下のｒＨｕＰＨ２０安定性におけるＨＡオリゴマー類の効果を試験した。第三に、種々のサイズのＨＡオリゴマー類の安定化効果をインスリンアスパルト−ｒＨｕＰＨ２０製剤について評価した。

Ａ. 保存安定性に対するＨＡオリゴマー類の効果
製剤は種々の量のＨＡ(１０mg／mL、１５mg／mLまたは２０mg／mL)を含んだ。付加的製剤は１５mg／mLのＨＡを含み、種々のｐＨ、グリセリンおよび塩濃度であった。

インスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤を下記表６５に示す。基本製剤は３.５mg／mLのインスリン、６００Ｕ／mLの(５μg／mL)ｒＨｕＰＨ２０、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、８０mMのＮａＣｌ、２０mMのメチオニンおよび０.０１％ポロクサマー１８８(ポロクサマー１８８)と０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾールをｐＨ７.４で含んだ。製剤＃２〜＃４はさらにそれぞれ１０mg／mL、１５mg／mLおよび２０mg／mLのＨＡオリゴマー類を含んだ。製剤＃１および＃６はさらに５０mMのグリセリンを含み、製剤＃６は１５mg／mLのＨＡオリゴマー類を含んだ。製剤＃５および＃７は、ｐＨおよびＮａＣｌ濃度が製剤＃３と異なった。評価した３種の付加的製剤(＃８〜＃１０)は、メチオニンを含まず、それぞれ３.５mg／mLのインスリン、６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、１５mg／mLのＨＡオリゴマー類、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、８０mMのＮａＣｌおよび０.０１％ポロクサマー１８８と０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾールをｐＨ７.４で含んだ。製剤＃８はさらに２０mMのメチオニンを含み、製剤＃１０はさらに５０mMのグリセリンを含んだ。

１mLの各製剤をクロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えたＵＳＰ１型ホウケイ酸２mLのガラスバイアルに保存した。各製剤を個々に、５±３℃、２５±２℃、３０±２℃および３５±２℃でインキュベートし、安定性測定を時間ｔ＝０、２、５、７および９日間、１および２週間、１ヶ月または２ヶ月に記録した。安定性をｐＨ、外観、浸透圧濃度、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒＨｕＰＨ２０の含有量、ＲＰ−ＨＰＬＣによるインスリンの含有量、および非変性ＳＥＣによるインスリンのパーセント純度を測定することにより評価した(実施例２〜５および実施例１２参照)。試験した各パラメータの安定性合格基準または目標仕様は実施例１２に記載するとおりである。

１. ５℃
少なくとも１５mg／mLのＨＡオリゴマー類を含む全製剤は、わずか１週間、５℃の後、可視粒子を含んだ。１０mg／mLのＨＡオリゴマー類しか含まないまたはＨＡオリゴマー類を含まない製剤は２週間、５℃の後無色透明であり、粒子を含まなかったが、粒子は１ヶ月後観察された。試験した全製剤は５℃で２ヶ月時点までｒＨｕＰＨ２０についてanチエであった。インスリンは、２０mg／mLのＨＡオリゴマー類を含む(＃４)、低ｐＨである(＃５)および高塩を含む(＃７)製剤で、１ヶ月間、５℃で不安定であった。

２. ２５℃
製剤＃５(低ｐＨ)および＃７(高塩)は、１週間、２５℃の後粒子を含んだ。残りの製剤は全て無色透明であり、粒子を含まなかった。試験した全製剤は、２５℃で２ヶ月時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンの両者で安定であった。

３. ３０℃
製剤＃５(低ｐＨ)および＃７(高塩)は、わずか１週間、３０℃の後粒子を含んだ。残りの製剤は全て無色透明であり、粒子を含まなかった。ＨＡを含む全製剤は、１ヶ月間、３０℃でｒＨｕＰＨ２０について安定であった。２ヶ月時点まで、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性は許容されるレベルの３７５Ｕ／mLを下回った。インスリンは全製剤で、１ヶ月時点で安定であったが、２ヶ月間、２５℃の後安定性の明らかな低下が観察された。ＨＡオリゴマー類の添加は、２５℃でインスリン安定性に影響することなく、ｒＨｕＰＨ２０安定性に対して明らかな正の効果を有した。

製剤＃８−＃１０をｒＨｕＰＨ２０酸化に付いて０時および３日間、２５℃の後試験した。５０mMのグリセリンを含む製剤＃１０は、わずか３日間、２５℃の後、酸化の増加を示した。

４. ３５℃
ＨＡオリゴマー類を含む製剤は、２日間、３５℃でｒＨｕＰＨ２０について安定であった。５日間で、種々のｐＨで１５mg／mLのＨＡオリゴマー類を含む製剤＃３および＃５のみがｒＨｕＰＨ２０について安定であった。ｒＨｕＰＨ２０含有量は、わずか２日間、３５℃の後、全製剤で低かった。ＨＡオリゴマー類の添加は、３５℃でインスリン安定性に影響することなく、ｒＨｕＰＨ２０安定性に対して明らかな正の効果を有した。

Ｂ. 防腐剤効果
１. ＵＳＰ防腐剤
この実施例において、ＨＡオリゴマー類が、ＵＳＰレベルの防腐剤を含むインスリンアスパルト−ｒＨｕＰＨ２０またはインスリンリスプロ−ｒＨｕＰＨ２０製剤を安定化させる能力を、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性について測定することにより評価した。製剤Ｆ１〜Ｆ７を試験した。基本製剤は３.５mg／mLのインスリンアスパルトまたはインスリンリスプロ、６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、５mMのメチオニン、０.０１％ポロクサマー１８８、０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾールを含んだ。製剤Ｆ１はインスリンアスパルトを含まなかった。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性は上記実施例２Ｂのとおり測定した。結果は下記表６６〜６７に示す。全製剤は５℃で３日間または６日間安定であった。ＨＡを含む全製剤は、ｐＨおよびＮａＣｌ濃度に係わらず、ＨＡを含まない類似製剤より高酵素活性であった。下記表６６に示すとおり、１０mg／mLのＨＡを含む製剤Ｆ４は、同じまたは低ｐＨでＨＡを含まない製剤Ｆ２およびＦ３と比較して、３７℃でずっと高ｒＨｕＰＨ２０酵素活性であった。低濃度のＮａＣｌである製剤Ｆ５(下記表６７参照)について、ｒＨｕＰＨ２０に付いて脱安定化である低ＮａＣｌ濃度による、ｒＨｕＰＨ２０活性の消失を製剤への１０mg／mLの添加により制限した(例えば、Ｆ３参照)。

２. ＥＰ−Ｂレベル防腐剤
この実施例において、ＨＡオリゴマー類が、ＥＰ−Ｂレベルの防腐剤を含むインスリン−ｒＨｕＰＨ２０製剤を安定化する能力を、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性により測定して評価した。基本製剤は３.５mg／mLのインスリン、６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、２０mMのメチオニン、０.０１％ポロクサマー１８８、０.１０％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾールを含んだ。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性は上記実施例２Ｂのとおりに測定した。結果を下記表６８に示す。３５℃で、ＨＡを含む製剤(Ｆ２〜Ｆ６)は、全てＨＡを含まない製剤Ｆ１より高ｒＨｕＰＨ２０酵素活性であった。９日目に、Ｆ１にはわずか約１０％の酵素活性しか残っていなかったが、製剤Ｆ２〜Ｆ６は、ｐＨ、ＨＡおよびＮａＣｌ濃度によって、なお約３０％〜６０％ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を有した。類似の結果が３０℃で長期安定性試験でインキュベートしたこれらの製剤でも見られた。下記表６８に示すとおり、３０℃で３ヶ月間保存の終了時、約３０％のｒＨｕＰＨ２０酵素活性が、ＨＡを含まない製剤Ｆ１で残っており、ＨＡを含む他の全製剤、平均して、わずかに５０％を超えるｒＨｕＰＨ２０酵素活性が残っていた。

低温で、ｒＨｕＰＨ２０は熱負荷の経験が少なく、これは、ＨＡ含有および不含有製剤間の相対的酵素活性変化に関するわずかな差異を説明するであろう。同一ｐＨおよびＮａＣｌ条件下で、ｒＨｕＰＨ２０活性は本試験において試験したＨＡ濃度と相関しないことは注意すべきである。ＨＡがｒＨｕＰＨ２０の基質であるため、その安定化機構はおそらくほとんど特異的酵素−基質結合効果と関連する。この相互作用は明らかにこれら２分子のモル比に影響される。一定基質：酵素比で、最高安定化効果が達成され、ＨＡのさらなる添加は活性をさらに改善はしない。この実施例において、約１０mg／mLのＨＡが５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０の安定化に必要である。

Ｃ. ｒＨｕＰＨ２０安定化に対するＨＡの分子量の効果
この実施例において、種々のサイズのＨＡオリゴマー類の安定化効果を、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性の測定により決定するインスリンアスパルト−ｒＨｕＰＨ２０製剤に対する効果について評価した。３種の分子量のヒアルロン酸ナトリウム類をBiomedical(Minnesota, USA)から得た。６.４kDa(Lot:GSP252-5-7)、７４kDa(Lot:GSP252-60-2)および２３４.４kDa(Lot:002799)。１０mgの各ＨＡを、１００Ｕ／mLのインスリンアスパルト、５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、８０mMのＮａＣｌ、５０mMのグリセロール、２０mMのメチオニン、０.０１％ポロクサマー１８８、０.１０％フェノール、および０.１５％ｍ−クレゾールを含む１mLのインスリンアスパルト−ＰＨ２０製剤に添加した。ＨＡを含まない製剤も対照として本試験に含んだ。これらの溶液を５℃および３７℃で９日間までインキュベートして、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する種々のサイズのＨＡの安定化効果を試験した。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性は上記実施例２Ｂのとおり測定した。

結果は下記表６９に示す。ＨＡを含まないインスリンアスパルト−ｒＨｕＰＨ２０製剤(Ｆ１)は、３日間、３７℃でインキュベーション後酵素的に不活性であった。対照的に、製剤Ｆ２〜Ｆ４は、約３０〜４０％ｒＨｕＰＨ２０酵素活性を維持した。一般に、ＨＡポリマーが小さい程、大きいものより良好な保護を提供するように見えた。これは、おそらくＨＡサイズ単独またはＨＡ対ｒＨｕＰＨ２０モル比によるものである。

実施例１６
インスリンアスパルト／ｒＨｕＰＨ２０製剤の安定性試験
この実施例において、種々のインスリンアスパルト／ｒＨｕＰＨ２０製剤を、３０℃および３７℃の２種の保存条件下、および加速条件(撹拌２５℃でで９日間)の安定性について評価した。試験したインスリン／ｒＨｕＰＨ２０製剤を下記表７０に示す。参照製剤(＃７)は３.５mg／mLのインスリンアスパルト、６００Ｕ／mLの(５μg／mL)ｒＨｕＰＨ２０、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、８０mMのＮａＣｌ、５０mMのグリセリン、２０mMのメチオニンおよび０.０１％ポロクサマー１８８(ポロクサマー１８８)と０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾールをｐＨ７.４で含んだ。製剤＃１〜＃３は、防腐剤レベルの０.１３％フェノールおよび０.１２％ｍ−クレゾールと３種のレベルの安定化剤ポロクサマー１８８で試験した。製剤＃４〜＃６は、防腐剤レベルの０.１５％フェノールおよび０.１２％ｍ−クレゾールと３種のレベルの安定化剤ポロクサマー１８８で試験した。製剤＃８および＃９はさらに１０mg／mLのＨＡオリゴマー類を含み、製剤＃８は低レベルのグリセリン(２０mM)を有した。製剤＃１０および＃１１は低レベルのメチオニン(５mM)を含み、＃１１はさらに１０mg／mLのＨＡオリゴマー類を含んだ。

１mLの各製剤をクロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えたＵＳＰ１型ホウケイ酸２mLのガラスバイアルに保存した。各製剤を独立して、３０±２℃および３７±２℃でインキュベートし、安定性測定を時間ｔ＝０、２日間、４日間、７日間および９日間、２週間、１ヶ月間または１.５ヶ月間で行った。各製剤について、１セットのバイアルをTiterプレートシェーカー(LabLine)を使用する撹拌に、６００rpmで９日間、２５℃で付した。NovoLog(登録商標)(インスリンアスパルト)も対照と同じ撹拌条件下に付した。

安定性をｐＨ、外観、浸透圧濃度、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒＨｕＰＨ２０の含有量およびＲＰ−ＨＰＬＣによるインスリンの含有量の測定により評価した(実施例２〜５および１２参照)。安定性パラメータの許容される基準または目標仕様は実施例１２に記載のものと同一である。

１. ３０℃
全製剤は、２週間、３０℃の後、全て無色透明であり、粒子を含まなかった。試験した全製剤は３０℃で２週間時点までｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトの両者で安定であったが、安定性についてのわずかな減少が、全製剤で時間と共に見られた。ｒＨｕＰＨ２０活性に対する安定化効果が、ＨＡオリゴマー類を含まない製剤と比較して高酵素活性および含有量により証明されるとおり、ＨＡオリゴマー類(＃８、＃９、＃１１)で見られた。さらに、グリセリンおよびメチオニン濃度の減少は、これらの製剤の安定性について目に見える結果をもたらさなかった(＃８、＃９、および＃１１)。

防腐剤濃度の比較は、メタクレゾール量の減少およびフェノール量の中程度の増加がｒＨｕＰＨ２０安定性に有益であるが、この利益はフェノールが高濃度であるときないことを示した。対照的に、防腐剤濃度変化は、全製剤でインスリンアスパルト含有量の中程度の減少が観察された点で、インスリンアスパルト安定性にほとんど効果がなかった。例えば、ｒＨｕＰＨ２０は０.１５％フェノール(＃４−＃６)を含む製剤より、０.１３％フェノール(＃１〜＃３)を含む製剤でより安定であった。高フェノール濃度および低メタクレゾール濃度(＃１〜＃３)の製剤は、低量のフェノールおよび高量のメタクレゾールを含む参照製剤(＃７)より安定であった。対照的に、製剤＃４〜＃６は参照製剤＃７と同程度に安定であった。

２. ３７℃
全製剤は、９日間、３７℃の後、全て無色透明であり、粒子を含まなかった。ｒＨｕＰＨ２０活性に対する安定化効果は、ＨＡオリゴマー類を含まない製剤と比較した２日間、３７℃後の高酵素活性および含有量により証明されるとおり、ＨＡオリゴマー類含有製剤(＃８、＃９、および＃１１)で観察されたが、製剤はいずれも許容されるレベルのｒＨｕＰＨ２０酵素活性を有していなかった。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性消失は、ｒＨｕＰＨ２０含有量の消失と関連した。対照的に、インスリンアスパルト含有量は、ＨＡオリゴマー類含有製剤で減少傾向にあり、インスリンアスパルトが３７℃でＨＡオリゴマー類存在下安定ではないことを示す。

２５℃で見られた効果に類似して、防腐剤濃度の比較は、メタクレゾール量の減少およびフェノール量の中程度の増加がｒＨｕＰＨ２０安定性に有益であるが、この利益はフェノールが高濃度であるときない。対照的に、防腐剤濃度変は、インスリン含有量の中程度の減少が全製剤で観察されたため、インスリンアスパルト安定性にほとんど効果がなかった。

３. ２５℃で撹拌
ｒＨｕＰＨ２０およびインスリンアスパルトは、２４時間または４８時間、２５℃で撹拌後全製剤出安定であったが、ＨＡオリゴマー類を含む製剤(＃８、＃９、および＃１１)は２４時間後濁った。NovoLog(登録商標)は４時間、２５℃で撹拌して安定であった。防腐剤濃度はｒＨｕＰＨ２０またはインスリンアスパルト安定性に効果がなかった。

実施例１７
ＨＡオリゴマー類および二価金属イオン(Ｍｇ^２＋)含有製剤
この実施例において、ＥＰ−Ｂレベルの防腐剤のｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する効果を、５℃で５日間および３７℃で３〜５日間の２種の条件下で評価した。製剤は種々の量のＨＡオリゴマー類および二価金属イオン(Ｍｇ^２＋)を含んだ。

ｒＨｕＰＨ２０製剤を下記表７１に示す。基本製剤は６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２００mMのＮａＣｌ、５mMのメチオニン、０.０１％ポロクサマー１８８(ポロクサマー１８８)と０.１００％フェノールおよび０.１５０％ｍ−クレゾールをｐＨ６.８で含んだ。製剤２および４はさらに１０mg／mLのＨＡオリゴマー類を含み、製剤３および５は２０mg／mLのＨＡオリゴマー類を含んだ。製剤２および３はさらに３mMのＭｇ^２＋を含み、製剤４および５は１０mMのＭｇ^２＋を含んだ。

１mLの各製剤をクロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えたＵＳＰ１型ホウケイ酸２mLのガラスバイアルに保存した。各製剤を、ここに５および３７℃でインキュベートし、安定性測定を時間ｔ＝３日間、４日間および／または５日間に測定した。安定性をｐＨ、外観、浸透圧濃度、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性およびＲＰ−ＨＰＬＣによるｒＨｕＰＨ２０の含有量の測定により評価した(実施例２〜３および５および実施例１２参照)。上記パラメータの各々の合格基準または目標仕様は実施例１２に示すものと同じである。

結果は、全製剤が無色透明であり、粒子がないことを示した。モル浸透圧濃度はＭｇ^２＋の添加により増加する傾向にあった。ｒＨｕＰＨ２０酵素活性および含有量は５℃で全製剤で安定であった。３７℃で、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性は３日後に減少し、４日後、３７５Ｕ／mLで目標仕様で許容された。５日後、約半量の初期ｒＨｕＰＨ２０酵素活性が残った。活性低下は、ｒＨｕＰＨ２０含有量低下と相関した。

実施例１８
５℃または３７℃でのＵＳＰ防腐剤製剤の研究
この実施例において、ＵＳＰレベルの防腐剤のｒＨｕＰＨ２０酵素活性に対する効果を、５℃で４日間および３７℃で２日間、４日間、６日間、８日間および１２日間の２種の保存条件下に評価した。製剤は種々の量のＨＡオリゴマー類および塩を含み、種々のｐＨであった。ｒＨｕＰＨ２０製剤を下記表７２に示す。基本製剤は６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３.５mg／mLのインスリンアスパルト、インスリンリスプロまたはレギュラーインスリン、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、５mMのメチオニン、０.０１％ポロクサマー１８８(ポロクサマー１８８と０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾールを含んだ。製剤１はインスリンを含まなかった。製剤２〜５はインスリンアスパルト、製剤６〜９はレギュラーインスリンおよび製剤１０〜１３はインスリンリスプロを含んだ。４種の基本製剤を各インスリン類似体について調製した。製剤２、６および１０は、３、７および１１、とそれぞれ同じであり、ｐＨが変わった(７.０対７.２)。製剤３、８および１２はそれぞれ４、９および１３と同じであり、ＮａＣｌが変わった。これらの製剤はさらに１０mg／mLのＨＡオリゴマー類を含んだ。

１mLの各製剤をクロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えたＵＳＰ１型ホウケイ酸２mLのガラスバイアルに保存した。各製剤を、個々に、５℃および３７℃でインキュベートし、安定性測定を時間ｔ＝２日間、４日間、６日間、８日間および／または１２日間に記録した。安定性を、ｐＨ、外観、浸透圧濃度、ｒＨｕＰＨ２０酵素活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒＨｕＰＨ２０の含有量およびＲＰ−ＨＰＬＣによるインスリンの含有量の測定により記録した(実施例２〜３、５および１２参照)。試験した各パラメータの安定性についての許容される基準および目標仕様は実施例１２に記載のものと同じであった。

結果は、製剤１および全インスリンアスパルト製剤(＃２〜５)が、１２日間、５℃または３７℃の後無色透明であｒうことを示した。製剤６および８〜９および１１〜１３で６日間、５℃の後に結晶が観察され、製剤１０でほんの２日間、５℃の後に結晶が観察された。

全製剤は、４日間、５℃で安定であった。インスリンリスプロ製剤(＃１０〜１３)は８日間、３７℃であり、一方インスリン製剤(＃６〜９)は２日間しか(＃７以外)３７℃で安定ではなかった。インスリンアスパルト製剤(＃２〜５)は４〜６日間、３７℃で安定であった。ｒＨｕＰＨ２０含有量は全製剤で３７℃で時間と共に低下した。インスリン含有量は全製剤で時間と共に低下した。

実施例１９
種々の防腐剤レベルの抗菌有効性試験
この実施例において、種々のレベルの防腐剤と標的量のインスリンおよびｒＨｕＰＨ２０を含む数バッチの製剤を微生物有効性試験のために調製した。ＥＰおよびＵＳＰのガイダンスに従い、試験を契約分析実験室(Quadrants Scientific, Inc., San Diego, CAおよびLancaster Laboratories, Lancaster, PA)で実施した。種々の防腐剤含有製剤を、細菌緑膿菌、大腸菌および黄色ブドウ球菌および真菌クロコウジカビおよびカンジダ・アルビカンスに対して抗菌効果を試験した。試験は、１)初期接種菌液(少なくとも１０^５ＣＦＵ／mL)の各種細菌のサンプルへの添加、および２)２４時間、７日間および１４日間の各細菌または真菌のＣＦＵ／mLのの測定により行った。生データ(ＣＦＵ／mL)を、測定接種菌液からlog１０単位減少に変換した。製剤を３７℃の温度で試験した。

全製剤は１００Ｕ／mLのインスリンまたはインスリン類似体および５μg／mLのｒＨｕＰＨ２０を含んだ。残りの成分は、種々の成分の効果を比較できるように、製剤間で変えた。結果は表７３に要約し、これは種々の製剤成分の抗菌有効性に対する効果を要約する。中立効果は成分および濃度が抗菌有効性に効果がないことを示す。例えば、インスリン類似体は、インスリン類似体、すなわち、インスリンアスパルトまたはインスリンリスプロのみが異なる２製剤を比較したとき、抗菌有効性に対する中立効果を有する。ＮａＣｌ濃度は、製剤によって抗菌有効性に対する中立または負の効果を有する。

実施例２０
可溶性ｒＨｕＰＨ２０発現細胞株の産生
ＨＺ２４プラスミド(配列番号５２に示す)を使用して、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ細胞)をトランスフェクトした(例えば米国特許番号７,７６,４２９および７,７８１,６０７および米国公開番号２００６−０１０４９６８参照)。可溶性ｒＨｕＰＨ２０を発現させるためのＨＺ２４プラスミドベクターは、ｐＣＩベクターバックボーン(Promega)、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸１〜４８２をコードするＤＮＡ(配列番号４９)、ＥＣＭＶウイルス由来の配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)(Clontech)、およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子を含有する。ｐＣＩベクターバックボーンは、ベータ−ラクタマーゼ耐性遺伝子(ＡｍｐＲ)をコードするＤＮＡ、ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー／プロモーター領域(ＣＭＶ)、キメライントロン、およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル(ＳＶ４０)も含んでいる。可溶性ｒＨｕＰＨ２０コンストラクトをコードするＤＮＡは、ヒトＰＨ２０のネイティブ３５アミノ酸シグナル配列のアミノ酸位置１のメチオニンをコードするＤＮＡの前にＮｈｅＩ部位とコザックコンセンサス配列とを含有し、配列番号１に記載のヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸位置４８２に対応するチロシンをコードするＤＮＡの後に停止コドンを含有し、その後ろに、ＢａｍＨＩ制限部位が続いている。したがって、コンストラクトｐＣＩ−ＰＨ２０−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ＳＶ４０ｐａ(ＨＺ２４)は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される単一のｍＲＮＡ種であって、配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)によって分離された、ヒトＰＨ２０のアミノ酸１〜４８２(配列番号３に記載)とマウスジヒドロ葉酸レダクターゼのアミノ酸１〜１８６(配列番号５３に記載)とをコードするものをもたらす。

トランスフェクションの準備として、４mMのグルタミンおよび１８ml／Ｌ Plurionic Ｆ６８／Ｌ(Gibco)を補足したＤＨＦＲ(−)細胞用のGIBCO変法ＣＤ−ＣＨＯ培地で成長させた非トランスフェクトＤＧ４４ ＣＨＯ細胞を、０.５×１０^６細胞／mlの密度でシェーカーフラスコに播種した。細胞を湿潤インキュベータ中、５％ＣＯ_２下、３７℃において、１２０rpmで振とうしながら成長させた。トランスフェクションに先立ち、対数増殖期の非トランスフェクトＤＧ４４ ＣＨＯ細胞を、生存度について調べた。

非トランスフェクトＤＧ４４ ＣＨＯ細胞培養の生細胞６千万個をペレット化し、２×トランスフェクションバッファー(２×ＨｅＢＳ：４０mMのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.０、２７４mMのＮａＣｌ、１０mMのＫＣｌ、１.４mMのＮａ_２ＨＰＯ_４、１２mMのデキストロース)０.７mLに、２×１０^７細胞の密度で再懸濁した。再懸濁した細胞の各アリコートに、０.０９mL(２５０μg)の線状ＨＺ２４プラスミド(ＣｌａＩ(New England Biolabs)で終夜消化することによって線状化したもの)を加え、その細胞／ＤＮＡ溶液を、室温で、間隙０.４cmのＢＴＸ(Gentronics)エレクトロポレーションキュベットに移した。陰性対照エレクトロポレーションは、プラスミドＤＮＡを細胞と混合せずに行った。細胞／プラスミド混合物を、３３０Ｖおよび９６０μFまたは３５０Ｖおよび９６０μFのコンデンサ放電でエレクトポレートした。

細胞をエレクトロポレーション後のキュベットから取り出して、４mMのグルタミンおよび１８ml／Ｌ Plurionic Ｆ６８／Ｌ(Gibco)を補足した５mLのＤＨＦＲ(−)細胞用変法ＣＤ−ＣＨＯ培地に移し、湿潤インキュベータ中、５％ＣＯ_２下、３７℃において、選択圧を加えずに、６穴組織培養プレートのウェルで２日間成長させた。

エレクトロポレーションの２日後に、０.５mLの組織培養培地を各ウェルから取り出し、実施例２に記載の微小濁度アッセイを使って、ヒアルロニダーゼ活性の存在について試験した。

トランスフェクション２(３５０Ｖ)で得た細胞を組織培養ウェルから集め、計数し、１mLあたり１×１０^４〜２×１０^４個の生細胞になるように希釈した。５枚の９６穴丸底組織培養プレートの各ウェルに、細胞懸濁液を０.１mLずつ移した。４mM GlutaMAX(商標)−１補助剤(GIBCO(商標)、Invitrogen Corporation)を含有しヒポキサンチンおよびチミジン補助剤を含有しないＣＤ−ＣＨＯ培地(GIBCO)１００マイクロリットルを、細胞を含むウェルに加えた(最終体積０.２mL)。

メトトレキサートなしで成長させた５枚のプレートから１０個のクローンを同定した。

６個のＨＺ２４クローンを拡大培養し、単一細胞懸濁液としてシェーカーフラスコに移した。クローン３Ｄ３、３Ｅ５、２Ｇ８、２Ｄ９、１Ｅ１１、および４Ｄ１０を、左上のウェルの５０００細胞から開始して、細胞をプレートの縦方向に１：２希釈し、プレートの横方向に１：３希釈する二次元無限希釈法を使って、９６穴丸底組織培養プレートにプレーティングした。培養の初期に必要な成長因子を供給するために１ウェルあたり５００個の非トランスフェクトＤＧ４４ ＣＨＯ細胞のバックグラウンドで、希釈クローンを成長させた。５０nMメトトレキサートを含有する５枚とメトトレキサートを含有しない５枚で、１サブクローンあたり１０枚のプレートを作製した。

クローン３Ｄ３は、２４個の目に見えるサブクローンを産生した(メトトレキサート処理なしから１３個、および５０nMメトトレキサート処理から１１個)。それら２４個のサブクローンのうち８個から得られる上清に、有意なヒアルロニダーゼ活性(＞５０単位／mL)が測定され、それら８個のサブクローンをＴ−２５組織培養フラスコに拡大培養した。メトトレキサート処理プロトコルから単離されたクローンは、５０nMメトトレキサートの存在下で拡大培養した。クローン３Ｄ３５Ｍをさらに５００nMメトトレキサート中で拡大培養したところ、シェーカーフラスコ中で１,０００単位／mL以上を産生するクローンが生じた(クローン３Ｄ３５Ｍ；または第１世代(Ｇｅｎ１)３Ｄ３５Ｍ)。次に、３Ｄ３５Ｍ細胞のマスター細胞バンク(master cell bank)(ＭＣＢ)を調製した。

実施例２１
可溶性ヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０)を含有する第２世代(Ｇｅｎ２)細胞の作出
実施例２０に記載の第１世代３Ｄ３５Ｍ細胞株を、さらに高いメトトレキサートレベルに適応させて、第２世代(Ｇｅｎ２)クローンを作出した。樹立メトトレキサート含有培養物から、４mM GlutaMAX−１(商標)および１.０μMメトトレキサートを含有するＣＤ ＣＨＯ培地に、３Ｄ３５Ｍ細胞を播種した。３７℃、７％ＣＯ_２湿潤インキュベータ中で、４６日間にわたって、細胞を成長させ、それらを９回継代することにより、細胞を、より高いメトトレキサートレベルに適応させた。２.０μMメトトレキサートを含む培地が入っている９６穴組織培養プレートでの限界希釈法により、増幅された細胞集団をクローンアウト(clone out)した。約４週間後に、クローンを同定し、クローン３Ｅ１０Ｂを拡大培養のために選択した。４mM GlutaMAX−１(商標)および２.０μMメトトレキサートを含有するＣＤ ＣＨＯ培地中で、継代２０代にわたって、３Ｅ１０Ｂ細胞を成長させた。３Ｅ１０Ｂ細胞株のマスター細胞バンク(ＭＣＢ)を作製し、凍結し、以後の研究に使用した。

４mM GlutaMAX−１(商標)および４.０μMメトトレキサートを含有するＣＤ ＣＨＯ培地中で３Ｅ１０Ｂ細胞を培養することによって、この細胞株の増幅を続けた。１２回目の継代後に、細胞を研究用細胞バンク(research cell bank)(ＲＣＢ)としてバイアル中で凍結した。ＲＣＢのバイアルを１本融解し、８.０μMメトトレキサートを含有する培地で培養した。５日後に、培地中のメトトレキサート濃度を１６.０μMに増加させ、次いで１８日後に２０.０μMに増加させた。２０.０μMメトトレキサートを含有する培地における８回目の継代培養から得た細胞を、４mM GlutaMAX−１(商標)および２０.０μMメトトレキサートを含有するＣＤ ＣＨＯ培地が入っている９６穴組織培養プレートでの限界希釈法によってクローンアウトした。５〜６週間後にクローンを同定し、クローン２Ｂ２を２０.０μMメトトレキサートを含有する培地での拡大培養のために選択した。１１回目の継代後に、２Ｂ２細胞を研究用細胞バンク(ＲＣＢ)としてバイアル中で凍結した。

得られた２Ｂ２細胞は、可溶性組換えヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０)を発現させるジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損性(ｄｈｆｒ−)ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞である。可溶性ＰＨ２０は２Ｂ２細胞中に、約２０６コピー／細胞のコピー数で存在する。ＳｐｅＩ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIで消化したゲノム２Ｂ２細胞ＤＮＡを、ｒＨｕＰＨ２０特異的プローブを使ってサザンブロット解析したところ、以下の制限消化プロファイルが明らかになった：ＳｐｅＩで消化したＤＮＡでは１本の主要ハイブリダイズバンド約７.７kbと４本の副ハイブリダイズバンド(約１３.９、約６.６、約５.７および約４.６kb)；ＸｂａＩで消化したＤＮＡでは、１本の主要ハイブリダイズバンド約５.０kbと２本の副ハイブリダイズバンド(約１３.９および約６.５kb)；ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIで消化した２Ｂ２ ＤＮＡを使うと、約１.４kbの単一ハイブリダイズバンドが観察された。ｍＲＮＡ転写物の配列解析により、得られたｃＤＮＡ(配列番号５６)は、位置１１３１における１塩基対の相違(これは予想されるシトシン(Ｃ)の代わりにチミジン(Ｔ)であることがわかった)を除いて、基準配列(配列番号４９)と同一であることが示された。これはサイレント突然変異であり、アミノ酸配列には影響しない。

実施例２２
Ａ. ３００Ｌバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の産生
ＨＺ２４−２Ｂ２のバイアルを融解し、シェーカーフラスコから３６Ｌスピナーフラスコを通して２０μMのメトトレキサートおよびGlutaMAX−１(商標)(Invitrogen)添加ＣＤ−ＣＨＯ培地(Invitrogen、Carlsbad, CA)に拡大した。簡単に述べると、細胞のバイアルを３７℃の水浴で融解し、培地を加え、細胞を遠心分離した。細胞を、２０mLの新鮮培地が入っている１２５mL浸透フラスコに再懸濁し、３７℃、７％ＣＯ_２のインキュベータに入れた。細胞を１２５mL振とうフラスコ中で４０mLまで拡大培養した。細胞密度が１.５×１０^６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を１２５mLスピナーフラスコに１００mLの培養体積で拡大した。フラスコを３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞密度が１.５×１０^６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を２５０mLスピナーフラスコに２００mLの培養体積で拡大し、フラスコを３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞密度が１.５×１０^６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を１Ｌスピナーフラスコに８００mLの培養体積で拡大し、３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞密度が１.５×１０^６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を６Ｌスピナーフラスコに５０００mLの培養体積で拡大し、３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞密度が１.５×１０６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を３６Ｌスピナーフラスコに３２Ｌの培養体積で拡大し、３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。

４００Ｌリアクターを滅菌し、２３０mLのＣＤ ＣＨＯ培地を加えた。使用前に、リアクターを汚染についてチェックした。約３０Ｌの細胞を３６Ｌスピナーフラスコから４００Ｌバイオリアクター(Ｂｒａｕｎ)に、１mlあたり４.０×１０^５個の生細胞という接種密度および２６０Ｌの総体積で移した。パラメータは温度設定値：３７℃；インペラー速度４０〜５５ＲＰＭ；容器圧：３ｐｓｉ；空気散布量０.５〜１.５Ｌ／分；空気オーバーレイ：３Ｌ／分とした。細胞数、ｐＨ確認、培地分析、タンパク質の生産および貯留を調べるために、リアクターから毎日試料を採取した。また、運転中に栄養フィードを加えた。１２０時間(５日目)の時点で、１０.４Ｌの第１フィード培地(４×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋１６０mL／Ｌ GlutaMAX−１(商標)＋８３mL／Ｌイーストレート(Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ)＋３３mg／Ｌ ｒＨｕインスリン)を加えた。１６８時間(７日目)の時点で、１０.８Ｌの第２フィード(２×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋８０mL／Ｌ GlutaMAX−１(商標)＋１６７mL／Ｌイーストレート＋０.９２ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を３６.５℃に変えた。２１６時間(９日目)の時点で、１０.８Ｌの第３フィード(１×ＣＤ−ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋５０mL／Ｌ GlutaMAX−１(商標)＋２５０mL／Ｌイーストレート＋１.８０ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を３６℃に変えた。２６４時間(１１日目)の時点で、１０.８Ｌの第４フィード(１×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋３３mL／Ｌ GlutaMAX−１(商標)＋２５０mL／Ｌイーストレート＋０.９２ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を３５.５℃に変えた。フィード培地の添加は生産の最終段階における可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産を劇的に強化することが観察された。１４日時点もしくは１５日時点で、または細胞の生存度が４０％未満に低下した時に、リアクターを収集した。このプロセスにより、１２００万細胞／mLの最大細胞密度で１７,０００単位／mlの最終生産能力が得られた。マイコプラズマ、生物汚染度、エンドトキシンならびにインビトロおよびインビボでのウイルス、ウイルス粒子に関するＴＥＭ、ならびに酵素活性を調べるために、収集時に、培養物を試料採取した。

それぞれが４〜８μmに分級された珪藻土の層と１.４〜１.１μmに分級された珪藻土の層とを含有し、その後にセルロースメンブレンが設けられている、並列した４つのMillistak濾過系モジュール(Millipore)に、培養物を蠕動ポンプで通し、次に、０.４〜０.１１μmに分級された珪藻土の層と、＜０.１μmに分級された珪藻土の層とを含有し、その後にセルロースメンブレンが設けられている、第２の単一Millistak濾過系(Millipore)に通し、次に０.２２μm最終フィルターを通して、３５０Ｌの容量を持つ滅菌使い捨てフレキシブルバッグ中に入れた。その収集細胞培養液に１０mMのＥＤＴＡおよび１０mMのＴｒｉｓをｐＨが７.５になるように補足した。培養物を、４つのSartoslice TFF ３０kDa分子量分画(ＭＷＣＯ)ポリエーテルスルホン(ＰＥＳ)フィルタ(Sartorius)を使用するタンジェンシャルフロー濾過(ＴＦＦ)装置で１０倍濃縮した後、１０mMのＴｒｉｓ、２０mMのＮａ_２ＳＯ_４、ｐＨ７.５で１０回のバッファー交換を行い、０.２２μm最終フィルターを通して、５０Ｌ滅菌保存バッグに濾過した。

濃縮しダイアフィルトレーションに付した収集物を、ウイルスに関して不活化した。ウイルス不活化に先だって、１０％Triton X-１00、３％リン酸トリ(ｎ−ブチル)(ＴＮＢＰ)の溶液を調製した。濃縮しダイアフィルトレーションに付した収集物を、Ｑカラムで精製する直前に、３６Ｌガラス反応容器中で、１％Triton X-１00、０.３％ＴＮＢＰに１時間曝露した。

Ｂ. Ｇｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の精製
Q Sepharose(Pharmacia)イオン交換カラム(樹脂９Ｌ、Ｈ＝２９cm、Ｄ＝２０cm)を調製した。ｐＨおよび伝導度の決定ならびにエンドトキシン(ＬＡＬ)アッセイのために洗浄液試料を集めた。カラムを５カラム体積の１０mMのＴｒｉｓ、２０mMのＮａ_２ＳＯ_４、ｐＨ７.５で平衡化した。濃縮しダイアフィルトレーションに付した収集物を、ウイルス不活化後に、１００cm／時間の流速でＱカラムに負荷した。カラムを、５カラム体積の１０mMのＴｒｉｓ、２０mMのＮａ_２ＳＯ_４、ｐＨ７.５および１０mMのＨＥＰＥＳ、５０mMのＮａＣｌ、ｐＨ７.０で洗浄した。タンパク質を１０mMのＨＥＰＥＳ、４００mMのＮａＣｌ、ｐＨ７.０で溶出させ、０.２２μm最終フィルターを通して滅菌バッグに濾過した。溶出液試料を生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。この交換の最初と最後にＡ_２８０吸光度を読み取った。

次にPhenyl-Sepharose(Pharmacia)疎水相互作用クロマトグラフィーを行った。Phenyl-Sepharose(ＰＳ)カラム(樹脂１９〜２１Ｌ、Ｈ＝２９cm、Ｄ＝３０cm)を調製した。洗浄液を集め、ｐＨ、伝導度およびエンドトキシン(ＬＡＬアッセイ)用の試料を採取した。カラムを５カラム体積の５mMのリン酸カリウム、０.５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１mMのＣａＣｌ_２、ｐＨ７.０で平衡化した。Q Sepharoseカラムから得たタンパク質溶出液に２Ｍ硫酸アンモニウム、１Ｍのリン酸カリウムおよび１ＭのＣａＣｌ_２保存液を補足して、最終濃度をそれぞれ５mM、０.５Ｍおよび０.１mMにした。タンパク質を１００cm／時間の流速でＰＳカラムに負荷し、素通り画分を集めた。１００cm／時間の５mMのリン酸カリウム、０.５Ｍ硫酸アンモニウムおよび０.１mMのＣａＣｌ_２ ｐＨ７.０でカラムを洗浄し、その洗浄液を、集めた素通り画分に加えた。カラム洗浄液と合わせた素通り画分を０.２２μm最終フィルターを通して滅菌バッグに入れた。生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性を調べるために素通り画分の試料を採取した。

アミノフェニルボロネートカラム(ProMedics)を調製した。洗浄液を集め、ｐＨ、伝導度およびエンドトキシン(ＬＡＬアッセイ)用の試料を採取した。カラムを５カラム体積の５mMのリン酸カリウム、０.５Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した。精製タンパク質を含有するＰＳ素通り画分を１００cm／時間の流速でアミノフェニルボロネートカラムに負荷した。カラムを５mMのリン酸カリウム、０.５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７.０で洗浄した。カラムを２０mMビシン、０.５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ９.０で洗浄した。カラムを２０mMビシン、１００mM塩化ナトリウム、ｐＨ９.０で洗浄した。タンパク質を５０mMのＨＥＰＥＳ、１００mMのＮａＣｌ、ｐＨ６.９で溶出させ、滅菌フィルターを通して滅菌バッグに入れた。溶出した試料を生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。

ヒドロキシアパタイト(ＨＡＰ)カラム(BioRad)を調製した。洗浄液を集めて、ｐＨ、伝導度およびエンドトキシン(ＬＡＬアッセイ)について調べた。カラムを５mMのリン酸カリウム、１００mMのＮａＣｌ、０.１mMのＣａＣｌ_２、ｐＨ７.０で平衡化した。アミノフェニルボロネートで精製したタンパク質を、最終濃度が５mMのリン酸カリウムおよび０.１mMのＣａＣｌ_２になるように補足し、１００cm／時間の流速でＨＡＰカラムに負荷した。カラムを５mMのリン酸カリウム、ｐＨ７、１００mMのＮａＣｌ、０.１mMのＣａＣｌ_２で洗浄した。次に、カラムを１０mMのリン酸カリウム、ｐＨ７、１００mMのＮａＣｌ、０.１mMのＣａＣｌ_２で洗浄した。タンパク質を７０mMのリン酸カリウム、ｐＨ７.０で溶出させ、０.２２μm滅菌フィルターを通して滅菌バッグに入れた。溶出した試料を生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。

次に、ＨＡＰで精製したタンパク質をウイルス除去フィルターに通した。滅菌したVirosartフィルタ(Sartorius)を、まず、２Ｌの７０mMのリン酸カリウム、ｐＨ７.０で洗浄することによって調製した。使用前に、ｐＨおよび伝導度を調べるために、濾過されたバッファーを試料採取した。ＨＡＰで精製したタンパク質を蠕動ポンプで２０nMウイルス除去フィルターに通した。７０mMのリン酸カリウム、ｐＨ７.０中の濾過されたタンパク質を０.２２μm最終フィルターを通して滅菌バッグに入れた。ウイルス濾過された試料をタンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖およびシアル酸プロファイリングについて調べた。試料をプロセス関連不純物についても試験した。

次に、１０ｋＤ分子量分画(ＭＷＣＯ)Sartocon Sliceタンジェンシャルフロー濾過(ＴＦＦ)系(Sartorius)を使って、濾液中のタンパク質を１０mg／mLに濃縮した。フィルターを、まず、１０mMのヒスチジン、１３０mMのＮａＣｌ、ｐＨ６.０で洗浄することによって調製し、ｐＨおよび伝導度を調べるために透過液を試料採取した。濃縮後に、濃縮タンパク質を試料採取して、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。濃縮タンパク質に対して、最終バッファー：１０mMのヒスチジン、１３０mMのＮａＣｌ、ｐＨ６.０への６回のバッファー交換を行った。バッファー交換後に、０.２２μmフィルターを通して、濃縮タンパク質を２０Ｌ滅菌保存バッグに入れた。タンパク質を試料採取し、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロファイリングおよびモル浸透圧濃度について調べた。

次に、滅菌濾過したバルクタンパク質を、３０mL滅菌テフロンバイアル(Nalgene)中に、２０mLずつ、無菌的に分注した。次に、バイアルを急速冷凍し、−２０±５℃で保存した。

実施例２３
ｒＨｕＰＨ２０の安定化剤としてのリシルリシンの効果
リシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓまたはジリシン)を、高温でｒＨｕＰＨ２０を安定化させる能力について試験した。８製剤を下記表７６のとおり調製した。対照として、Hylenex(商標)(１６７Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、１２.５mMのＮａ_２ＰＯ_４、１４５mMのＮａＣｌ、１mg／mLのＨＳＡ、２.７mMのＣａＣｌ_２、０.１％ＥＤＴＡ ｐＨ７.４；指定されたＦ１含有)を試験した。残りの製剤を１７０Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、０.０１％Tween ８０および表７６に示す種々の添加物／安定化剤を含んで作製した。各試験製剤に、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ二塩酸塩(Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ ＨＣｌ；RnD Chem #G-2675)を５０mM、１００mMまたは１５０mMのいずれかの濃度で添加した。Ｌｙｓ−Ｌｙｓをクロライド塩として使用したため、浸透圧濃度は、下記表７６に見られるとおり、組成物で異なった。

全製剤を１３mm ４４３２／５０灰色ゴム栓を備えた２mLのＵＳＰＩ型ホウケイ酸ガラスバイアルにいれ、アルミナシールで封した。バイアルを５℃、２５℃および４０℃の３種の温度で３ヶ月までインキュベートした。サンプルを０時間、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月間および３ヶ月間に、温度によって試験した(表７７〜７９参照)。各試験時点で、サンプルをインキュベータから取り、ヒアルロニダーゼ活性について実施例２に記載のとおり試験した。

結果は下記表７７〜７９に示し、これはヒアルロニダーゼ活性をＵ／mLで示す。５℃または２５℃で保存したサンプル類について、ｒＨｕＰＨ２０活性のわずかな減少が観察されたが、全サンプルは少なくとも１３５Ｕ／mLヒアルロニダーゼ活性を維持した(表７７および７８)。さらに、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ含有組成物とＬｙｓ−Ｌｙｓ不含有組成物でヒアルロニダーゼ活性に有意な差は観察されなかった。４０℃で保存した全サンプルについて、全サンプルは経時的に酵素活性が低下した。Ｌｙｓ−Ｌｙｓを含まない製剤Ｆ１およびＦ２のヒアルロニダーゼ活性低下が最大でった。２週間、４０℃の後、製剤Ｆ１およびＦ２の活性は１３５Ｕ／mLを下回った。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ含有製剤は、どんな濃度でも、全て１３５Ｕ／mLを超える活性を、少なくとも１ヶ月間、４０℃で維持した。

実施例２４
ｒＨｕＰＨ２０安定性に対する低濃度リシルリシンの効果
種々のｒＨｕＰＨ２０製剤を、高温でｒＨｕＰＨ２０の活性に対する低濃度のリシルリシンおよびｐＨの影響を試験した。３種のＬｙｓ−Ｌｙｓ濃度(１０mM、３０mMおよび５０mM)および３種のｐＨ(６.５、７.０および７.５)を評価し、計９サンプルを作製した。試験した製剤を下記表８０に示す。対照として、Hylenex(商標)(実施例２３に示す；Ｆ１)を試験した。製剤Ｆ２〜Ｆ１０を全て約１６０Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、１０mMのＬ−メチオニン(Spectrum #M1441)、および０.０１％ポリソルベート８０(Baker #4117-04)および種々の量のＨ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ ＨＣｌ(RnD Chem #G-2675)およびＮａＣｌ(Baker #3628)を標的とした。１ＮのＮａＯＨ(EMD #SX0607H-6)を使用してｐＨを調節した。ＮａＣｌ濃度を、全製剤がほぼ同じ浸透圧濃度(３００mOsm／Kg)となるように調節した。全製剤を０.２ミクロンフィルターを通して滅菌濾過した。

全製剤を、バイアルあたり０.５mLで１３mm ４４３２／５０灰色ゴム栓を備えた２mLのＵＳＰＩ型ホウケイ酸ガラスバイアルに入れ、アルミナシールで封した。バイアルを４０℃で８週間までインキュベートした。サンプルを時間０、および１週間、２週間、３週間、４週間、および８週間に試験した。各試験時点で、サンプルをインキュベータから取り、ヒアルロニダーゼ活性について実施例２に記載のとおり試験した。

結果は下記表８１に示し、これはヒアルロニダーゼ活性をＵ／mLでおよび時間０と比較した活性比を示す。全てＬｙｓ−Ｌｙｓを含む製剤Ｆ２〜Ｆ９は、参照製剤１と比較して、ｐＨに係わらずｒＨｕＰＨ２０安定性の改善を示した。１０mM、３０mMまたは５０mMのＬｙｓ−Ｌｙｓを含むサンプル間で有意差は観察されず、１０mMのＬｙｓ−Ｌｙｓの添加が、ｒＨｕＰＨ２０安定性を４０℃で改善するのに十分であることを示す。高ｐＨ(７.５)の製剤は、低ｐＨ(６.５または７.０)の全サンプルと比較して低酵素活性であった。例えば、ｐＨ６.５または７.０のサンプルについて、４週間、４０℃でインキュベーション後のヒアルロニダーゼ活性は初期活性の８０％を超えて残っているが、ｐＨ７.５のサンプルは、初期活性わずか約７０％のしか残っていなかった。４週間後、５０％未満のｒＨｕＰＨ２０活性が参照ｒＨｕＰＨ２０サンプル(Ｆ１)で残っていた。

実施例２５
ｒＨｕＰＨ２０／インスリン配合剤におけるｒＨｕＰＨ２０活性およびインスリン安定性に対するリシルリシンの効果
リシルリシンを、ｒＨｕＰＨ２０およびインスリン類似体の両者を含む配合剤を安定化する能力について試験した。製剤を下記表８２に示す。全製剤は６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３.５mg／mLのインスリングルリジン、３０mMのＴｒｉｓＨＣＬ、５mMのメチオニン、０.００１％ポリソルベート２０、ｐＨ７.２、および防腐剤として０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾール(ＥＰ−Ｂ防腐剤レベル)を含んだ。製剤Ｆ５、Ｆ１、Ｆ２およびＦ３は５０mMのＮａＣｌおよび０mM、２０mM、４０mMおよび８０mMのＬｙｓ−Ｌｙｓをそれぞれ含んだ。製剤Ｆ４は高濃度のＮａＣｌ(１４０mM)を含み、Ｌｙｓ−Ｌｙｓを含まなかった。製剤Ｆ３およびＦ４の浸透圧濃度をＮａＣｌでほぼ同じとなるよう調節した。

各製剤を、１.０mLで分配し、１３mm ４４３２／５０灰色ゴム栓を備えた２mLのＵＳＰＩ型ホウケイ酸ガラスバイアルに入れ、アルミナシールで封した。バイアルを５℃および３７℃でインキュベートした。サンプルを３日目および６日目にとり、実施例２および３に記載のとおり、ヒアルロニダーゼ酵素活性、ｐＨ、浸透圧濃度および外観について試験した。

リシルリシン添加は、全製剤が無色透明であり、可視粒子がないため、外観に影響を与えず、インスリン安定性を示す。試験製剤の、標準曲線から外挿したヒアルロニダーゼ活性を下記表８３に示す。全製剤は、ヒアルロニダーゼ活性を、６日間、５℃でインキュベーション後に維持した。８０mMのＬｙｓ−Ｌｙｓを含む製剤Ｆ３のみ、３日間、３７℃の後、幾分ヒアルロニダーゼ酵素活性を維持した。６日間、３７℃の後、Ｆ３はそのヒアルロニダーゼ酵素活性の大部分を消失した。製剤Ｆ３およびＦ４のように浸透圧濃度がほぼ同等に制御されたとき、Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、ヒアルロニダーゼ活性上昇により証明さえるとおり、ＮａＣｌより良好なｒＨｕＰＨ２０安定化剤であった。

実施例２６
ｒＨｕＰＨ２０／インスリン配合剤におけるｒＨｕＰＨ２０安定性に対するリシルリシンおよびＮａＣｌの比較
インスリンおよびｒＨｕＰＨ２０の配合剤を、ｒＨｕＰＨ２０安定性に対するリシルリシンおよびＮａＣｌの効果について試験した。試験した製剤は同等なイオン強度を有したが、１製剤はリシルリシンおよびＮａＣｌを含み、他の製剤はＮａＣｌのみを含んだ。具体的に、３組の種々のレベルのイオン強度のインスリングルリジンおよびｒＨｕＰＨ２０製剤を調製した。製剤を下記表８４に示す。全製剤は６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３.５mg／mLのインスリングルリジン、３０mMのＴｒｉｓＨＣＬ、５mMのメチオニン、０.００１％ポリソルベート２０、ｐＨ７.２、および防腐剤としての０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾール(ＥＰ−Ｂ防腐剤レベル)を含んだ。製剤Ｆ１、Ｆ３およびＦ５はリシルリシンおよびＮａＣｌを下記表８４に示すとおり含んだ。製剤Ｆ２、Ｆ４およびＦ６はＮａＣｌのみを含んだ。製剤をその実際のｐＨおよび浸透圧濃度について試験した。

各製剤を１.０mLで分配し、１３mm ４４３２／５０灰色ゴム栓を備えた２mLのＵＳＰＩ型ホウケイ酸ガラスバイアルに入れ、アルミナシールで封した。バイアルを５℃および３０℃で４週間までインキュベートした。サンプルを６日目および２週間後および４週間後に取り、実施例２に記載のとおりヒアルロニダーゼ酵素活性について試験した。

結果は下記表８５に示し、これは試験した日のヒアルロニダーゼ酵素活性(Ｕ／mL)ならびにＴ０で示された活性と比較した％ヒアルロニダーゼ活性(Ｔ０に対する％)を示す。インキュベーション時間、リシルリシン濃度およびイオン強度に応答したｒＨｕＰＨ２０酵素活性の多変量分析をＴ０に対する相対的活性に基づき行い、JMP v. 8.02 (SAS Institutes)により分析した。高イオン強度の製剤(Ｆ５およびＦ６)は、低イオン強度製剤(Ｆ１およびＦ２)よりヒアルロニダーゼ酵素活性を維持した(ｐ＜０.００１)。さらに、リシルリシン含有製剤は、含まないものより有意に高活性であった(ｐ＝０.０４)。ヒアルロニダーゼ酵素失活速度はイオン強度に逆比例し、高イオン強度が分解速度を有意に減じることを示した。同じイオン強度の溶液(例えば、Ｆ５およびＦ６)について、２週間で有意差は見られなかったが、４週間、３０℃の後、ヒアルロニダーゼ酵素活性で有意な差が見られ、リシルリシン含有Ｆ５は９１％活性を維持したが、リシルリシンを含まないＦ６はわずか７５％しか活性が維持されなかった。同じ傾向が低イオン強度製剤デモ見られ、リシルリシン含有製剤は、リシルリシン不含有のものと比較して高活性を有した。

実施例２７
リシルリシンの緩衝剤としての効果およびｒＨｕＰＨ２０／インスリン配合剤のｐＨ変化に対する温度の効果
リシルリシンを、ｒＨｕＰＨ２０およびインスリンを含む配合剤における緩衝剤として作用する能力について、Ｔｒｉｓをリシルリシンに置き換えて試験した。試験した製剤を下記表８６に示す。全製剤は、６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３.５mg／mLのインスリングルリジン、５mMのメチオニン、０.００１％ポリソルベート２０、ｐＨ７.２、および防腐剤として０.１％フェノールおよび０.１５％ｍ−クレゾール(ＥＰ−Ｂ防腐剤レベル)を含んで調製した。各製剤は３０mM、５０mM、８０mMまたは１０５mMのリシルリシン(Biopeptide, G-2675, Lot#1037762を含んだ)。ＴｒｉｓＨＣｌ含有製剤はなかった。ＮａＣｌを最終浸透圧濃度を３８０±３０mOsmに調節するために使用した。

各製剤を、１.０mLで分配し、１３mm ４４３２／５０灰色ゴム栓を備えた２mLのＵＳＰＩ型ホウケイ酸ガラスバイアルに入れ、アルミナシールで封した。バイアルを５℃および３７℃でインキュベートした。サンプルを１日目、４日目および６日目に取り、実施例２および３に記載のとおり、ヒアルロニダーゼ酵素活性、ｐＨおよび浸透圧濃度について試験した。各製剤はまたリシルリシンがｐＨ６.５〜８.０の標的ｐＨ範囲内で緩衝剤として働く能力を評価するために、添加した量の滴定剤(１ＮのＮａＯＨ；EMD, Cat No. SX0607H-6, ロットHC067239)の関数としてｐＨの滴定曲線を作成することにより試験した。

結果は表８７に示し、そこには浸透圧濃度およびヒアルロニダーゼ酵素活性を示す。先の実施例に示されるとおり、Ｌｙｓ−Ｌｙｓは製剤中のｒＨｕＰＨ２０を、ヒアルロニダーゼ活性が高濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓで減少が少ないため、安定化させた。さらに、リシルリシンは、類似のレベルのイオン強度でＮａＣｌよりｒＨｕＰＨ２０を安定化させた。

下記表８８は、種々の温度でのｐＨおよび温度のｐＨに対する効果を示す。リシルリシンのＮａＯＨでの滴定は、リシルリシンが６.５〜８.０のｐＨ範囲で、特に高濃度(例えば、８０mMまたは１０５mM)で緩衝剤として作用できることを示す。表８８に示すとおり、温度効果(ｄｐＨ／ｄＴ)、またはｐＨ変化対温度変化比は−０.０３３Ｕ／℃で一定であり、これは、Ｔｒｉｓ(−０.０２８Ｕ／℃)で報告されているものより幾分高い。理想の緩衝剤は、低保存温度(例えば、２〜８℃)で、インスリンは高ｐＨで有利であるのに対し、高温で、ｒＨｕＰＨ２０は低ｐＨで有利であるため、大きな温度効果を有する。それ故に、リシルリシンは、インスリンおよびｒＨｕＰＨ２０の両者を含む製剤で、最適緩衝剤および安定化剤の両者であることが示される。

実施例２８
リシルリシン含有インスリン配合剤における５℃、３０℃および３７℃での経時的ｒＨｕＰＨ２０の安定性
リシルリシンを、ＵＳＰレベルの防腐剤を含むインスリン類似体−ｒＨｕＰＨ２０配合剤について安定化する能力について試験した。製剤を下記表８９に示す。各製剤は６００Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、３.５mg／mLのインスリン類似体(インスリングルリジンまたはインスリンアスパルト)、５mMのメチオニン、０.００１％界面活性剤(ポロクサマー１８８またはポリソルベート２０)、およびＵＳＰレベルの防腐剤(０.１２５％フェノールおよび０.０７５％ｍ−クレゾール)を含む。各インスリン類似体について、２種の製剤はｐＨ７.０であり、２種の製剤はｐＨ７.２であった。さらに、各ｐＨで、１個の製剤は１００mMのリシルリシンのみを含み、他の製剤は３０mMのＮａＣｌおよび８０mMのリシルリシンを含んだ。インスリンアスパルトの比較として、３０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌを含むＦ９を調製した。

各製剤を、１.０mLで分配し、１３mm ４４３２／５０灰色ゴム栓を備えた２mLのＵＳＰＩ型ホウケイ酸ガラスバイアルに入れ、アルミナシールで封した。バイアルを５℃、３０℃および３７℃で４週間までインキュベートした。サンプルを表９０および９１に示すとおり取って、実施例２に記載のとおりｒＨｕＰＨ２０酵素活性を試験した。結果は下記表９０および９１に示し、これはヒアルロニダーゼ酵素活性をＵ／mLで示す。

＊Ｆ６８＝ポロクサマー１８８(PLURONIC(登録商標)Ｆ６８)；ＰＳ２０＝ポリソルベート２０。

１. ｒＨｕＰＨ２０−インスリングルリジン配合剤
表９０に示すとおり、ｒＨｕＰＨ２０−インスリングルリジン製剤について、ヒアルロニダーゼ活性は全製剤で５℃および３０℃で残った。３７℃で、ヒアルロニダーゼ活性は全製剤で時間と共に見られた。試験した時間を通して、製剤は、製剤のヒアルロニダーゼ活性が３７５Ｕ／mLを下回らなかったため、安定であると示された。

２. ｒＨｕＰＨ２０−インスリンアスパルト配合剤
表９１に示すとおり、ｒＨｕＰＨ２０−インスリンアスパルト製剤について、全製剤は３ヶ月まで、５℃で安定であった。３０℃で、リシルリシンを含む全製剤は４週間まで安定であったが、製剤Ｆ９(Ｌｙｓ−Ｌｙｓを含まない)はヒアルロニダーゼ活性の消失を示した。３７℃で、全製剤は時間とともにヒアルロニダーゼ活性が減少し、減少速度は製剤に依存した。例えば、６日間、３７℃の後、製剤Ｆ５(１００mMのＬｙｓ−ＬｙｓおよびｐＨ７.０を有する)は、製剤Ｆ８(８０mMのＬｙｓ−ＬｙｓおよびｐＨ７.２を有する)より高活性であった。この時点および温度で、リシルリシンを含まない製剤Ｆ９はほとんど全てのヒアルロニダーゼ活性を消失した。

実施例２９
ｒＨｕＰＨ２０の安定性撹拌下および熱負荷に対するヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)またはリシルリシンの効果
ｒＨｕＰＨ２０製剤を、撹拌および熱負荷を含む加速条件下の安定性について試験した。製剤は下記表９２に示す。各製剤は１６０Ｕ／mLのｒＨｕＰＨ２０、１２.５mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ７.０および１４５mMのＮａＣｌを含んだ。各製剤はさらに下記表９２に示すとおり、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、ＣａＣｌ_２、ＥＤＴＡ、ポリソルベート８０、メチオニンおよびリシルリシンの１種以上を含んだ。

各製剤を、１.５mLで分配し、１３mm ４４３２／５０灰色ゴム栓を備えた２mLのＵＳＰＩ型ホウケイ酸ガラスバイアルに入れ、アルミナシールで封した。可視粒子を含むバイアルは試験から外した。製剤を撹拌および熱負荷の両者について試験した。撹拌試験について、各製剤の２サンプルを２５℃で、６５０rpmで７２時間撹拌しながらインキュベートした。熱負荷試験について、各製剤の４サンプルを４０℃で４週間までインキュベートし、毎週サンプルを取った。

全サンプルを、実施例２に記載のとおりヒアルロニダーゼ活性について試験した。不溶性および溶解性粒子の存在を、MicroFlowImaging(ＭＦＩ)を使用して試験した。これについて、各ｒＨｕＰＨ２０製剤または対照サンプルをMicro-Flow Imagin装置モデル４２００(Brightwell Technologies, Inc., Ottawa, Canada)で測定した。各操作前に、ブランク緩衝剤を、０.２２ミクロンフィルターを通し、明確な背景および最適化照度を得るためにシステムを通した。システムを平衡化するために、少なくとも２mLのサンプルを分析前に分配した。１mlサンプルを１７０μL／分の流速で、蠕動ポンプを使用して流した。倍率設定は、１〜１００μmの範囲内の粒子を検出できるように５倍に設定し、分析深度は１００μmであった。粒子を機械により計数し、自動で記録し、粒子数／mLとして示した。ｒＨｕＰＨ２０を含むが、撹拌に付さない緩衝剤およびまたは製剤を対照として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーも実施例４に記載のとおり行った。結果は下記表９３〜９５に示す。

１. ヒアルロニダーゼ活性
表９３はヒアルロニダーゼ活性をＵ／mLでおよび時間０(Ｔ０)と比較した％の活性を示す。結果は、８日間、４０℃の後、ＨＳＡを含まない製剤(Ｆ４、Ｆ５およびＦ６)は、ＨＳＡ含有製剤Ｆ１、Ｆ２およびＦ３と比較して、ヒアルロニダーゼ活性が低かった。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ含有製剤Ｆ７は、最高レベルのヒアルロニダーゼ活性を、１５日間、４０℃の後維持した。

撹拌負荷後少なくとも０.０４％ポリソルベート８０および１０mMのメチオニンを含む、製剤は、ヒアルロニダーゼ活性を維持し、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ含有製剤も同様であった。製剤Ｆ１〜Ｆ４のヒアルロニダーゼ活性はわずかに減少した。全体として、製剤Ｆ７(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ含有)は、熱負荷試験および撹拌試験の量条件下で、最大のｒＨｕＰＨ２０酵素活性を維持した。

２. 凝集体化タンパク質または不溶性凝集体の存在
表９４は、各ミクロンサイズ範囲での粒子数／mLで粒子数(不溶性凝集体)を示す。例えば、ＭＦＩを使用して試験したミクロンサイズ範囲は、５マイクロメートル(μm)を超えるが、１０μm未満(５≦ｐ＜１０)、１０≦ｐ＜２５、２５≦ｐ＜５０およびｐ≧５０の粒子(ｐ)であった。Ｆ１およびＦ４の対照製剤をｒＨｕＰＨ２０を含まず作製し、Ｆ２、Ｆ４およびＦ６サンプルの対照製剤を撹拌しない同じ製剤で製造した。

ＨＳＡの存在または不存在は、対照非撹拌サンプルに影響を与えず、各々ほぼ同じ粒子数であった。撹拌したら、ＨＳＡを含むが、ポリソルベート８０を欠く製剤(Ｆ１およびＦ２)が、ポリソルベート８０の添加のみＦ２と異なるＦ３を含む他の製剤より有意に粒子が多かった。多量のポリソルベート８０(Ｆ４と比較したＦ５およびＦ６)の添加は、凝集体形成減少に有意な効果を有しなかった。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ含有製剤Ｆ７は、撹拌後含まれる不溶性凝集体の数は最小であった。

ｐ − 粒子径(ミクロン)

３. サイズ排除クロマトグラフィー
可溶性凝集体をまたサイズ排除クロマトグラフィーでも測定した。表９５は溶解性凝集体(高分子量凝集体)をmAu*minおよび合計ピーク面積のパーセンテージで示す。製剤Ｆ４〜Ｆ７は、サイズ排除クロマトグラフィーで検出するには包含されるタンパク質が少なすぎた。ＨＳＡ含有製剤Ｆ１〜Ｆ３は、低レベルの高分子量凝集体を、２５℃で撹拌後示した。ポリソルベート８０添加は、全体的凝集体数を減らした(Ｆ１またはＦ２と比較したＦ３)。

ＨＭＷ＝高分子量

修飾は当業者には明白であるため、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。

修飾は当業者には明白であるため、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
さらに、本願発明は、次の態様を包含する。
１. 正確に６.８〜７.８または約６.８〜７.８のｐＨであり；
治療有効量の速効性のインスリン；
組成物を超速効性とするのに十分な量のヒアルロナン分解酵素；
５０mM〜２００mMまたは約５０mM〜２００mM濃度のＮａＣｌ；
抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物；および
１種または複数種の安定化剤を含み、
それにより、正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間安定である、安定な配合剤組成物。
２. 配合剤中のヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持し；および／または
組成物中のインスリンが：
組成物における初期レベルのインスリンの少なくとも９０％力価または回収を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持し；および／または
少なくとも９０％の初期インスリン純度を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持し；および／または
２％未満の高分子量(ＨＭＷｔ)インスリン種を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持する、項１記載の安定な配合剤。
３. ＮａＣｌ濃度が正確にまたは約８０mM〜２００mM、８０mM〜１４０mM、５０mM〜１００mM、８０mM〜１００mM、５０mM〜８０mM、１００mM〜１４０mMまたは１２０mM〜１４０mMである項１または２記載の安定な配合剤。
４. 正確にまたは約６.８〜７.８のｐＨ範囲を維持するのに十分量の緩衝剤を含む、項１〜３のいずれか記載の安定な配合剤。
５. 正確にまたは約６.５〜７.５のｐＨを有し；
治療有効量の速効性のインスリン；
組成物を超速効性とするのに十分な量のヒアルロナン分解酵素；
正確にまたは約１２０mM〜２００mMの濃度のＮａＣｌ；
抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物；および
１種または複数種の安定化剤を含み、
それにより少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で安定であるおよび／または撹拌下に少なくとも３時間安定である、安定な配合剤組成物。
６. 安定化剤が有効量のヒアルロニダーゼ阻害剤を含む、項５記載の安定な配合剤。
７. ヒアルロニダーゼ阻害剤がタンパク質、ヒアルロナン分解酵素の基質、多糖類、脂肪酸類、ラノスタノイド類、抗生物質、抗線虫剤、合成有機化合物および植物由来生理活性成分から選択される、項６記載の安定な配合剤。
８. ヒアルロニダーゼ阻害剤がグリコサミノグリカン(ＧＡＧ)、血清ヒアルロニダーゼ阻害剤、アシュワガンダ(Withania somnifera)糖タンパク質(ＷＳＧ)、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、キトサン類、β−(１,４)−ガラクト−オリゴ糖類、硫酸化ベルバスコース、硫酸化プランテオース、ペクチン、ポリ(スチレン−４−スルホネート)、デキストラン硫酸、アルギン酸ナトリウム、ワカメ(Undaria pinnatifida)由来の多糖、マンデル酸縮合重合体、エイコサトリエン酸、ネルボン酸、オレアノール酸、アリストロキン酸、アジマリン、レセルピン、フラボン、デスメトキシセンタウレイジン、ケルセチン、アピゲニン、ケンフェロール、シリビン、ルテオリン、ルテオリン−７−グルコシド、フロレチン、アピイン、ヘスペリジン、スルホン化ヘスペリジン、カリコシン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フラボン−７−硫酸ナトリウム、フラボン７−フルオロ−４’−ヒドロキシフラボン、４’−クロロ−４,６−ジメトキシカルコン、５−ヒドロキシフラボン−７−硫酸ナトリウム、ミリセチン、ルチン、モリン、グリチルリジン、ビタミンＣ、Ｄ−イソアスコルビン酸、Ｄ−糖酸１,４−ラクトン、Ｌ−アスコルビン酸−６−ヘキサデカノエート(Vcpal)、６−Ｏ−アシル化ビタミンＣ、カテキン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、クルクミン、没食子酸Ｎ−プロピル、タンニン酸、エラグ酸、没食子酸、フロロフコフレッコールＡ、ジエコール、８,８’−ビエコール、プロシアニジン、ゴシポール、セレコキシブ、ニメスリド、デキサメサゾン、インドメタシン(indomethcin)、フェノプロフェン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、サリチレート、クロモグリク酸二ナトリウム、金チオリンゴ酸ナトリウム、transilist、トラキサノクス、イベルメクチン、リンコマイシン(linocomycin)およびスペクチノマイシン、スルファメトキサゾールおよびトリメトプリム(trimerthoprim)、ネオマイシン硫酸塩、３α−アセチルポリポレン酸Ａ、(２５Ｓ)−(＋)−１２α−ヒドロキシ−３α−メチルカルボキシアセテート−２４−メチルラノスタ−８,２４(３１)−ジエン−２６−オイック酸、ラノスタノイド、ポリポレン酸ｃ、ＰＳ５３(ヒドロキノン−スルホン酸−ホルムアルデヒドポリマー)、ポリ(スチレン−４−スルホネート)のポリマー、VERSA-TL 502、１−テトラデカンスルホン酸、マンデル酸縮合重合体(ＳＡＭＭＡ)、１,３−ジアセチルベンゾイミダゾール−２−チオン、Ｎ−モノアシル化ベンズイミダゾール−２チオン、Ｎ,Ｎ’−ジアシル化ベンズイミダゾール−２−チオン、アルキル−２−フェニルインドール誘導体、３−プロパノイルベンゾオキサゾール−２−チオン、Ｎ−アルキル化インドール誘導体、Ｎ−アシル化インドール誘導体、ベンゾチアゾール誘導体、Ｎ−置換インドール−２−および３−カルボキサミド誘導体、Ｎ−置換インドール−２−および３−カルボキサミド誘導体のハロゲン化類似体(クロロおよびフルオロ)、２−(４−ヒドロキシフェニル)−３−フェニルインドール、インドールカルボキサミド類、インドールアセトアミド類、３−ベンゾリル−１−メチル−４−フェニル−４−ピペリジノール、ベンゾイルフェニルベンゾエート誘導体、Ｌ−アルギニン誘導体、グアニジウムＨＣＬ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＨＣＮ、リナマリン、アミグダリン、ヘデラゲニン、エスチン、ＣＩＳ−ヒノキレシノールおよび１,３−ジ−ｐ−ヒドロキシフェニル−４−ペンテン−１−オンから選択される、項６または７の安定な配合剤。
９. ヒアルロニダーゼ阻害剤がヒアルロナン(ＨＡ)オリゴ糖であるヒアルロニダーゼ基質である、項６〜８のいずれか記載の安定な配合剤。
１０. ＨＡの濃度が正確にまたは約１mg／mL〜２０mg／mLである、項９記載の安定な配合剤。
１１. 配合剤中のヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で維持しまたは少なくとも３日間撹拌下安定であり；そして
組成物中のインスリンが：
組成物における初期レベルのインスリンの少なくとも９０％力価または回収を少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で維持しまたは少なくとも３日間撹拌下安定であり；および／または
少なくとも９０％の初期インスリン純度少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で維持しまたは撹拌下に少なくとも３時間安定であり；および／または
２％未満の高分子量(ＨＭＷｔ)インスリン種少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で維持しまたは少なくとも３日間撹拌下安定である、
項５〜１０のいずれか記載の安定な配合剤。
１２. ＮａＣｌ濃度が１５０mM〜２００mMまたは１６０mM〜１８０mMまたは約１５０mM〜２００mMまたは約１６０mM〜１８０mMである、項５〜１１のいずれか記載の安定な配合剤。
１３. 正確にまたは約６.５〜７.５の範囲のｐＨを維持するのに十分な量の緩衝剤を含む、項５〜１２のいずれか記載の安定な配合剤。
１４. ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼである、項１〜１３のいずれか記載の安定な配合剤。
１５. ヒアルロナン分解酵素が中性ｐＨで活性なヒアルロニダーゼである、項１〜１４のいずれか記載の安定な配合剤。
１６. ヒアルロナン分解酵素が細胞から発現されたときグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを欠くかまたは膜型ではない；または
ヒアルロナン分解酵素がＧＰＩアンカーの全部または一部を除去するための１個以上のアミノ酸残基のＣ末端短縮化を含む、
項１〜１５のいずれか記載の安定な配合剤。
１７. ヒアルロナン分解酵素がＰＨ２０であるヒアルロニダーゼまたはそのＣ末端切断型である、項１〜１６のいずれか記載の安定な配合剤。
１８. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するＰＨ２０ポリペプチドである、項１〜１７のいずれか記載の安定な配合剤。
１９. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸配列を含むＣ末端切断型ＰＨ２０である、項１〜１８のいずれか記載の安定な配合剤。
２０. ヒアルロナン分解酵素の量が正確にまたは約１０Ｕ／mL〜２００００Ｕ／mL、１０Ｕ／mL〜１５０００Ｕ／mL、１０Ｕ／mL〜１００００Ｕ／mL、１０Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１００００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、または１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLである、項１〜１９のいずれか記載の安定な配合剤。
２１. ヒアルロナン分解酵素の量が少なくともまたは約または正確に３０Ｕ／mL、３５Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、２５０Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、３５０Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、４５０Ｕ／mL、５００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL、７００Ｕ／mL、８００Ｕ／mL、９００Ｕ／mL、１０００Ｕ／mL、２０００Ｕ／mL、３０００Ｕ／mL、４０００Ｕ／mL、５０００Ｕ／mL、１００００Ｕ／mL、１５０００Ｕ／mLまたは２００００Ｕ／mLである、項１〜２０のいずれか記載の安定な配合剤。
２２. 速効性のインスリンがレギュラーインスリンである、項１〜２１のいずれか記載の安定な配合剤。
２３. レギュラーインスリンがヒトインスリンまたはブタインスリンである、項２２記載の安定な配合剤。
２４. レギュラーインスリンが配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１０４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリン；または配列番号１２３のアミノ酸残基位置８８〜１０８に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１２３のアミノ酸残基位置２５〜５４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンである、項２２または２３記載の安定な配合剤。
２５. 速効性のインスリンがインスリン類似体である、項１〜２１のいずれか記載の安定な配合剤。
２６. 速効性のインスリンがインスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリジンから選択されるインスリン類似体である、項１〜２５のいずれか記載の安定な配合剤。
２７. インスリン類似体が配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１４７〜１４９のいずれかに示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンから選択される、項２５または２６記載の安定な配合剤。
２８. 速効性のインスリンの量が１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLまたは５００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)である、項１〜２７のいずれか記載の安定な配合剤。
２９. 緩衝剤がＴｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸およびクエン酸から選択される、項４および１３〜２８のいずれか記載の安定な配合剤。
３０. 緩衝剤がＴｒｉｓであるである、項４および１３〜２９のいずれか記載の安定な配合剤。
３１. 緩衝剤の濃度が正確にまたは約１mM〜１００mM、１０mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mMである、項４および１３〜３０のいずれか記載の安定な配合剤。
３２. 製剤中の防腐剤(複数も可)が１種以上のフェノール防腐剤(複数も可)、非フェノール防腐剤(複数も可)またはフェノール防腐剤(複数も可)および非フェノール防腐剤(複数も可)を含む、項１〜３１のいずれか記載の安定な配合剤。
３３. 防腐剤(複数も可)がフェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、グルコン酸クロルヘキシジン、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール、酢酸フェニル水銀、グリセロール、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンおよびこれらのあらゆる組み合わせから選択される、項１〜３２のいずれか記載の安定な配合剤。
３４. 製剤が１種の防腐剤または２種、３種または４種の防腐剤を含む防腐剤の混合物を含む、項１〜３３のいずれか記載の安定な配合剤。
３５. 少なくとも１種のフェノール防腐剤を含む、項１〜３４のいずれか記載の安定な配合剤。
３６. 防腐剤(複数も可)がフェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールである、項１〜３５のいずれか記載の安定な配合剤。
３７. 製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての１種以上の防腐剤の総量が正確にまたは０.１％および０.４％、０.１％〜０.３％、０.１５％〜０.３２５％、０.１５％〜０.２５％、０.１％〜０.２％、０.２％〜０.３％または０.３％〜０.４％(両端値を含む)である、項１〜３６のいずれか記載の安定な配合剤。
３８. 防腐剤がフェノールおよびｍ−クレゾールであり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての量が正確にまたは約０.１％〜０.２５％フェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.２％フェノールおよび正確にまたは約０.６％〜０１.８％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１％〜０.１５％フェノールおよび０.８％〜０.１５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.１５％フェノールおよび正確にまたは約０.０６〜０.０９％ｍ−クレゾールまたは正確にまたは約０.１２％〜０.１８％フェノールおよび正確にまたは約０.１４〜０.２２％ｍ−クレゾールである、項１〜３７のいずれか記載の安定な配合剤。
３９. アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール類、塩および界面活性剤から選択される安定化剤を含む、項１〜３８のいずれか記載の安定な配合剤。
４０. 安定化剤がグリシンまたはプロリンであるアミノ酸である、項３９記載の安定な配合剤。
４１. アミノ酸の濃度が正確にまたは約０.０１Ｍ〜１Ｍ、０.０１Ｍ〜０.１Ｍ、０.１Ｍ〜０.７５Ｍまたは０.２Ｍ〜０.５Ｍ(両端値を含む)であるである、項３９または４０記載の安定な配合剤。
４２. 安定化剤がアルギニン、グルタミン酸、および／またはその塩類および／またはそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸である、項３９記載の安定な配合剤。
４３. アミノ酸類の濃度が１〜１００mM、１０〜１００mM、または正確にまたは約３０mM、５０mMまたは８０mMである、項４２記載の安定な配合剤。
４４. 安定化剤が界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量が正確にまたは約０.００５％〜１.０％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％、または０.０１％〜０.０２％である、項１〜４３のいずれか記載の安定な配合剤。
４５. 界面活性剤がポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートから選択される、項４４記載の安定な配合剤。
４６. 界面活性剤がポロクサマー１８８、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０から選択される、項４４または４５記載の安定な配合剤。
４７. 安定化剤がポロクサマー１８８である界面活性剤であり、重量濃度(ｗ／ｖ)％としての量正確にまたは約０.０１％〜０.０５％で含むか；または
安定化剤がポリソルベート２０である界面活性剤であり、重量濃度(ｗ／ｖ)％としての量正確にまたは約０.０１％〜０.０５％で含むか；または
安定化剤がポリソルベート８０である界面活性剤であり、重量濃度(ｗ／ｖ)％としての量正確にまたは約０.０１％〜０.０５％で含む、
項１〜４６のいずれか記載の安定な配合剤。
４８. 正確にまたは約２４５mOsm／kg〜３０５mOsm／kgのモル浸透圧濃度を維持するための浸透圧修飾剤を含む、項１〜４７のいずれか記載の安定な配合剤。
４９. 浸透圧修飾剤がグリセリン、塩、アミノ酸類、ポリアルコール類およびトレハロースから選択される、項４８記載の安定な配合剤。
５０. グリセリンを６０mM未満、５５mM未満、５０mM未満、４５mM未満、４０mM未満、３５mM未満、３０mM未満、２５mM未満、２０mM未満、１５mM未満、１０mM未満の濃度で含む、項４８または４９記載の安定な配合剤。
５１. 速効性のインスリンがインスリンアスパルトであるインスリン類似体であり、製剤がグリセリンを正確にまたは約２０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度で含む；または
速効性インスリンがレギュラーインスリンまたはがインスリンリスプロであり、製剤がグリセリンを正確にまたは約４０mM〜６０mM(両端値を含む)で含む、
項４８〜５０のいずれか記載の安定な配合剤。
５２. 抗酸化剤を含む、項１〜５１のいずれか記載の安定な配合剤。
５３. 抗酸化剤がシステイン、トリプトファンおよびメチオニンから選択される、項５２記載の安定な配合剤。
５４. 抗酸化剤が正確にまたは約５mM〜５０mM、５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度である、項５２または５３記載の安定な配合剤。
５５. 抗酸化剤がメチオニンであり、濃度が正確にまたは約１０mM〜２０mMである、項５３記載の安定な配合剤。
５６. 亜鉛を含む、項１〜５５のいずれか記載の安定な配合剤。
５７. 亜鉛の濃度が正確にまたは約０.００１〜０.１mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)、０.００１〜０.０５mg／１００Ｕまたは０.０１〜０.０５mg／１００Ｕである、項５６記載の安定な配合剤。
５８. ニコチン化合物を含む、項１〜５７のいずれか記載の安定な配合剤。
５９. ニコチン化合物がニコチンアミド、ニコチン酸、ナイアシン、ナイアシンアミド、ビタミンＢ３および／またはその塩類および／またはこれらのあらゆる組み合わせから選択される、項５８記載の安定な配合剤。
６０. ニコチン化合物(複数も可)が正確にまたは約１mm〜１５０mM、１０mM〜１５０mM、５０mM〜１００mMまたは正確にまたは約８０mMの濃度で存在する、項５８または５９記載の安定な配合剤。
６１. 製剤が正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し：
正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量の速効性のインスリン類似体；
正確にまたは約１０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；
正確にまたは約５０〜２００mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；
正確にまたは約５mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；
正確にまたは約０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；
正確にまたは約０.０１％〜０.５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である界面活性剤；および
正確にまたは約０.１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)
を含む、項１〜６０のいずれか記載の安定な配合剤。
６２. ０.００１〜０.１mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)の濃度の亜鉛を含む、項６１記載の安定な配合剤。
６３. 速効性のインスリンがインスリンリスプロである速効性のインスリン類似体であり、
製剤が正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し；
正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリンリスプロ；
正確にまたは約２５mM〜３５mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；
正確にまたは約５０mM〜１２０mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；
正確にまたは約１０mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；
正確にまたは約４０mM〜６０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；
正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である界面活性剤；
０.０１７〜０.０２４mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)の濃度の亜鉛；および
重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)ので正確にまたは約０.０８％〜０.１７％(両端値も可)フェノールおよび正確にまたは約０.０７％〜０.１７％ｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
項６１または６２記載の安定な配合剤。
６４. ＮａＣｌ濃度が正確にまたは約７０mM〜１００mMである、項６３記載の安定な配合剤。
６５. 速効性のインスリンが速効性のインスリンアスパルトであるインスリン類似体であり、
製剤が正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し；
正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリンアスパルト；
正確にまたは約２５mM〜３５mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；
正確にまたは約８０mM〜１６０mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；
正確にまたは約１０mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；
正確にまたは約２０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；
正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である界面活性剤；
０.０１７〜０.０２４mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)の濃度の亜鉛；および
重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)ので正確にまたは約０.０８％〜０.１７％(両端値も可)フェノールおよび正確にまたは約０.０７％〜０.１７％ｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
項６１または６２記載の安定な配合剤。
６６. ＮａＣｌ濃度が正確にまたは約７０mM〜１００mMである、項６５記載の安定な配合剤。
６７. 速効性のインスリンがインスリングルリジンである速効性のインスリン類似体を含み；
製剤が正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し；
正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリングルリジン；
正確にまたは約２５mM〜３５mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；
正確にまたは約８０mM〜２００mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；
正確にまたは約１０mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；
正確にまたは約４０mM〜６０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；
正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８である界面活性剤；および
重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)ので正確にまたは約０.０８％〜０.１７％(両端値も可)フェノールおよび正確にまたは約０.０７％〜０.１７％ｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
項６１または６２記載の安定な配合剤。
６８. ＮａＣｌ濃度が正確にまたは約１００mM〜１５０mMである、項６７記載の安定な配合剤。
６９. 多数回投与用に製剤されている、項１〜６８のいずれか記載の安定な配合剤。
７０. 治療有効量のヒアルロナン分解酵素；および
ヒアルロナン分解酵素を安定化する量のリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)
を含む、組成物。
７１. Ｌｙｓ−Ｌｙｓの量がヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも３日間、３７℃で維持するのに十分である、項７０記載の組成物。
７２. ヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を３７℃で少なくとも４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間またはそれ以上維持する、項７０または７１記載の組成物。
７３. ヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも１ヶ月間、３７℃で維持する、項７０〜７２のいずれか記載の組成物。
７４. Ｌｙｓ−Ｌｙｓ濃度が正確にまたは約５mM〜１２０mM、１０mM〜１００mM、１０mM〜５０mM、３０mM〜１１０mM、３０mM〜８０mM、５０mM〜１００mMまたは１００mM〜１２０mMである、項７０〜７３のいずれか記載の組成物。
７５. 製剤のｐＨが正確にまたは約６.５〜８.０、６.５〜７.４、６.８〜７.８、７.０〜７.６または６.８〜７.２(両端値を含む)である、項７０〜７４記載の組成物。
７６. 製剤がさらに安定化剤を含む、項７０〜７５のいずれか記載の組成物。
７７. 安定化剤がアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩および界面活性剤から選択される、項７６記載の組成物。
７８. 安定化剤が界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量が正確にまたは約０.０００５％〜１.０％、０.０００５％〜０.００５％、０.００１％〜０.０１％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％、または０.０１％〜０.０２％(両端値を含む)である、項７６または７７記載の組成物。
７９. 界面活性剤がポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートから選択される、項７７または７８記載の組成物。
８０. 界面活性剤がポロクサマー１８８、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０から選択される、項７７〜７９のいずれか記載の組成物。
８１. 組成物が抗酸化剤を含む、項７０〜８０のいずれか記載の組成物。
８２. 抗酸化剤がシステイン、トリプトファンおよびメチオニンから選択される、項８１記載の組成物。
８３. 抗酸化剤がメチオニンである、項８２記載の組成物。
８４. 抗酸化剤が正確にまたは約５mM〜５０mM、５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度である、項８１〜８３のいずれか記載の組成物。
８５. 正確にまたは約２４５mOsm／kg〜５００mOsm／kg(両端値を含む)の浸透圧濃度を維持するための浸透圧修飾剤を含む、項７０〜８４のいずれか記載の組成物。
８６. 浸透圧修飾剤がグリセリン、塩、アミノ酸類、ポリアルコール類およびトレハロースから選択される、項８５記載の組成物。
８７. 浸透圧修飾剤がＮａＣｌである塩であり、ＮａＣｌの濃度が正確にまたは約２０mM〜２００mM、４０mM〜１６０mM、８０mM〜１２０mM、２０mM〜８０mMまたは５０mM〜１５０mM(両端値を含む)である、項８５または８６記載の組成物。
８８. ＮａＣｌを１５０mM未満、１４０mM未満、１３０mM未満、１２０mM未満、１１０mM未満、１００mM未満、９０mM未満、８０mM未満、７０mM未満、６０mM未満、５０mM未満、４０mM未満、３０mM未満、２０mM未満、１０mM未満またはそれ未満の濃度で含む、項７０〜８７のいずれか記載の組成物。
８９. 正確にまたは約６.５〜８.０、６.８〜７.８、７.０〜７.６、６.５〜７.２、または６.８〜７.４(両端値を含む)のｐＨ範囲を維持するために十分量の緩衝剤を含む、項７０〜８８のいずれか記載の組成物。
９０. 緩衝剤がＴｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸およびクエン酸から選択される項８９記載の組成物。
９１. 緩衝剤がリン酸ナトリウムであるリン酸である、項８９または９０記載の組成物。
９２. 緩衝剤の濃度が正確にまたは約１mM〜１００mM、１０mM〜８０mM、５mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mM(両端値を含む)である、項８９〜９１のいずれか記載の組成物。
９３. ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼである、項７０〜９２のいずれか記載の組成物。
９４. ヒアルロナン分解酵素が中性ｐＨで活性なヒアルロニダーゼである、項７０〜９３のいずれか記載の組成物。
９５. ヒアルロナン分解酵素が細胞から発現されたときグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを欠くかまたは膜型ではない；または
ヒアルロナン分解がＧＰＩアンカーの全部または一部を除去するための１個以上のアミノ酸残基のＣ末端短縮化を含む、
項７０〜９４のいずれか記載の組成物。
９６. ヒアルロナン分解酵素がＰＨ２０であるヒアルロニダーゼまたはそのＣ末端切断型フラグメントである、項７０〜９５のいずれか記載の組成物。
９７. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するＰＨ２０ポリペプチドである、項７０〜９６のいずれか記載の組成物。
９８. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸配列を含むＣ末端切断型ＰＨ２０である、項７０〜９７のいずれか記載の組成物。
９９. ヒアルロナン分解酵素の量が正確にまたは約１０Ｕ／mL〜２０,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１５,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１０,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１００００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、２００Ｕ／mL〜８００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、または１５０Ｕ／mL〜３００Ｕ／ml(両端値を含む)である、項７０〜９８のいずれか記載の組成物。
１００. Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度が５mM〜５０mM(両端値を含む)である、項７０〜９９のいずれか記載の組成物。
１０１. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.５〜７.２であり；
正確にまたは約１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のヒアルロナン分解酵素；
正確にまたは約５mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ；
１４０mM未満ＮａＣｌの濃度のＮａＣｌ；
正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート８０である界面活性剤；
正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および
正確にまたは約５mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のリン酸ナトリウムを含む、
項７０〜１００のいずれか記載の組成物。
１０２. ヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０またはそのＣ末端切断型フラグメントである、項７０〜１０１のいずれか記載の組成物。
１０３. さらに速効性のインスリンを含む、項７０〜１０２のいずれか記載の組成物。
１０４. Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度が３０mM〜１２０mM、５０mM〜１０５mMまたは８０mM〜１００mM(両端値を含む)である、項１０３記載の組成物。
１０５. 速効性のインスリンがレギュラーインスリンである、項１０３または１０４記載の組成物。
１０６. レギュラーインスリンがヒトインスリンまたはブタインスリンである、項１０５記載の組成物。
１０７. レギュラーインスリンが配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１０４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリン；または配列番号１２３のアミノ酸残基位置８８〜１０８に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１２３のアミノ酸残基位置２５〜５４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンである、項１０５または１０６記載の組成物。
１０８. 速効性のインスリンがインスリン類似体である、項１０３〜１０７のいずれか記載の組成物。
１０９. インスリン類似体がインスリンアスパルト、インスリンリスプロおよびインスリングルリジンから選択される、項１０８記載の組成物。
１１０. インスリン類似体が配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１４７〜１４９のいずれかに示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンから選択される、項１０８または１０９記載の組成物。
１１１. 速効性のインスリンの量が正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、２０Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜３００Ｕ／mLまたは２００Ｕ／mL〜８００Ｕ／mL(両端値を含む)である、項１０３〜１１０のいずれか記載の組成物。
１１２. 速効性のインスリンがインスリン類似体およびヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０またはそのＣ末端切断型フラグメントである、項１０３〜１１１のいずれか記載の組成物。
１１３. 速効性のインスリンがグルリジンであるインスリン類似体およびＬｙｓ−Ｌｙｓの濃度が５０〜１０５mMである；または
速効性のインスリンがインスリンアスパルトまたはインスリンリスプロであるインスリン類似体またはインスリンリスプロおよびＬｙｓ−Ｌｙｓの濃度が８０〜１００mMである、
項１０３〜１１２のいずれか記載の組成物。
１１４. 単回投与または多回投与用である、項７０〜１１３のいずれか記載の組成物。
１１５. 組成物が多回投与用であり、抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物を含む、項１１４記載の組成物。
１１６. 製剤中の防腐剤(複数も可)が１種以上のフェノール防腐剤(複数も可)、非フェノール防腐剤(複数も可)またはフェノール防腐剤(複数も可)および非フェノール防腐剤(複数も可)を含む、項１１５記載の組成物。
１１７. 防腐剤(複数も可)がフェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、グルコン酸クロルヘキシジン、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール、酢酸フェニル水銀、グリセロール、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンおよびこれらのあらゆる組み合わせから選択される、項１１５または１１６記載の組成物。
１１８. 製剤が１種の防腐剤を含む；または
２種、３種または４種の防腐剤を含む防腐剤の混合物を含む、
項１１５〜１１７のいずれか記載の組成物。
１１９. 少なくとも１種のフェノール防腐剤を含む、項１１５〜１１８のいずれか記載の組成物。
１２０. 防腐剤(複数も可)がフェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールである、項１１５〜１１９のいずれか記載の組成物。
１２１. 製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての１種以上の防腐剤の総量が正確にまたは０.１％および０.４％、０.１％〜０.３％、０.１５％〜０.３２５％、０.１５％〜０.２５％、０.１％〜０.２％、０.２％〜０.３％または０.３％〜０.４％(両端値を含む)である、項１１５〜１２０のいずれか記載の組成物。
１２２. 防腐剤がフェノールおよびｍ−クレゾールであり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての量が正確にまたは約０.１％〜０.２５％フェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.２％フェノールおよび正確にまたは約０.０６％〜０.１８％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１％〜０.１５％フェノールおよび０.０８％〜０.１５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.１５％フェノールおよび正確にまたは約０.０６〜０.０９％ｍ−クレゾールまたはが正確にまたは約０.１２％〜０.１８％フェノールおよび正確にまたは約０.１４〜０.２２％ｍ−クレゾール(両端値を含む)である、項１１５〜１２１のいずれか記載の組成物。
１２３. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.８〜７.４であり；
正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリングルリジンである速効性のインスリン類似体；
正確にまたは約５０mM〜１０５mM(両端値を含む)の濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ；
１００mM未満の濃度のＮａＣｌ；
正確にまたは約０.０００５％〜０.００５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート２０である界面活性剤；
正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および
正確にまたは約０.１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
項７０〜１２２のいずれか記載の組成物。
１２４. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.８〜７.４であり；
正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリンアスパルトまたはインスリンリスプロである速効性のインスリン類似体；
正確にまたは約８０mM〜１００mM(両端値を含む)の濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ；
３０mM未満の濃度のＮａＣｌ；
正確にまたは約０.０００５％〜０.００５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート２０である界面活性剤；
正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および
正確にまたは約０.１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
項７０〜１２２のいずれか記載の組成物。
１２５. 治療有効量のヒアルロナン分解酵素；および
ヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも３日間、３７℃で維持するのに十分な量のＭｇＣｌ<->２<->を含む、
組成物。
１２６. ＭｇＣｌ<->２<->濃度が正確にまたは約５０mM〜１５０mM、７５mM〜１２５mMまたは８０mM〜１００mM(両端値を含む)である、項１２５記載の組成物。
１２７. ヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を３７℃で少なくとも４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間またはそれ以上維持する、項１２５または１２６記載の組成物。
１２８. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.５〜８.０、６.５〜７.４、６.８〜７.８、７.０〜７.６または６.８〜７.２である、項１２５〜１２７のいずれか記載の組成物。
１２９. 組成物がさらに安定化剤を含む、項１２５〜１２８のいずれか記載の組成物。
１３０. 安定化剤がアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩および界面活性剤から選択される、項１２５〜１２９のいずれか記載の組成物。
１３１. 安定化剤が界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量が正確にまたは約０.０００５％〜１.０％、０.０００５％〜０.００５％、０.００１％〜０.０１％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％、または０.０１％〜０.０２％(両端値を含む)である、項１３０記載の組成物。
１３２. 界面活性剤がポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートから選択される、項１３０または１３１記載の組成物。
１３３. 界面活性剤がポロクサマー１８８、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０から選択される、項１３０〜１３２のいずれか記載の組成物。
１３４. 組成物が抗酸化剤を含む、項１２５〜１３３のいずれか記載の組成物。
１３５. 抗酸化剤がシステイン、トリプトファンおよびメチオニンから選択される、項１３４記載の組成物。
１３６. 抗酸化剤がメチオニンである、項１３５記載の組成物。
１３７. 抗酸化剤が正確にまたは約５mM〜５０mM、５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度である、項１３４〜１３６のいずれか記載の組成物。
１３８. 正確にまたは約６.５〜８.０、６.８〜７.８、７.０〜７.６、６.５〜７.２、または６.８〜７.４のｐＨ範囲を維持するために十分量の緩衝剤を含む、項１２５〜１３７のいずれか記載の組成物。
１３９. 緩衝剤がＴｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸およびクエン酸から選択される、項１３８記載の組成物。
１４０. 緩衝剤がヒスチジン塩酸塩である、項１３８または１３９記載の組成物。
１４１. 緩衝剤の濃度が正確にまたは約１mM〜１００mM、１０mM〜８０mM、５mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mMである、項１３８〜１４０のいずれか記載の組成物。
１４２. ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼである、項１２５〜１４１のいずれか記載の組成物。
１４３. ヒアルロナン分解酵素が中性ｐＨで活性なヒアルロニダーゼである、項１２５〜１４２のいずれか記載の組成物。
１４４. ヒアルロナン分解酵素が細胞から発現されたときグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを欠くかまたは膜型ではない；またはヒアルロナン分解酵素がＧＰＩアンカーの全部または一部を除去するための１個以上のアミノ酸残基のＣ末端短縮化を含むヒアルロナン分解酵素である、項１２５〜１４３のいずれか記載の組成物。
１４５. ヒアルロナン分解酵素がＰＨ２０であるヒアルロニダーゼまたはそのＣ末端切断型フラグメントである、項１２５〜１４４のいずれか記載の組成物。
１４６. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するＰＨ２０ポリペプチドである、項１２５〜１４５のいずれか記載の組成物。
１４７. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸配列を含むＣ末端切断型ＰＨ２０である、項１２５〜１４６のいずれか記載の組成物。
１４８. ヒアルロナン分解酵素の量が正確にまたは約１０Ｕ／mL〜２０,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１５,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１０,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１００００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、２００Ｕ／mL〜８００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、または１５０Ｕ／mL〜３００Ｕ／ml(両端値を含む)である、項１２５〜１４７のいずれか記載の組成物。
１４９. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.５〜７.２であり；
正確にまたは約１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のヒアルロナン分解酵素；
正確にまたは約５０mM〜１５０mM(両端値を含む)の濃度のＭｇＣｌ<->２<->；
正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート８０である界面活性剤；
正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および
正確にまたは約５mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のヒスチジン／ＨＣｌを含む、
項１２５〜１４８のいずれか記載の組成物。
１５０. 組成物の容積が正確にまたは約０.５mL〜５０mL、１mL〜４０mL、１mL〜２０mL、１mL〜１０mL、または３mL〜１０mL(両端値を含む)である、項１〜１４９のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
１５１. バイアル、シリンジ、ペン、ポンプ用保存室または閉鎖ループ系を使用した送達用に製剤されている、項１〜１５０のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
１５２. 連続的皮下インスリン注入を使用する送達のために製剤される、項１〜１５１のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
１５３. ｐＨが正確にまたは約６.８〜７.２である、項１〜１５２のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
１５４. 項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物を含む、シリンジまたはバイアル。
１５５. 項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物を含む、閉鎖ループ系。
１５６. 項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物を含む、インスリンポンプ。
１５７. 項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物を含む、インスリンペン。
１５８. 項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、糖尿病の処置方法。
１５９. 糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病および妊娠性糖尿病から選択される、項１５８記載の方法。
１６０. 項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物の治療を対象に投与することを含む、対象における血糖値のコントロール方法。
１６１. さらに他の抗糖尿病剤を投与することを含む、項１５８〜１６０のいずれか記載の方法。
１６２. 糖尿病の処置に使用するためのまたは対象における血糖値のコントロールに使用するための、項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
１６３. 糖尿病の処置または対象における血糖値のコントロールのための、項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物の使用。
１６４. 糖尿病の処置または対象における血糖値のコントロールのための医薬の製造における、項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物の使用。
１６５. 糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病および妊娠性糖尿病から選択される、項１６２〜１６４のいずれか記載の安定な配合剤または組成物または使用。

Claims (165)

1. 正確に６.８〜７.８または約６.８〜７.８のｐＨであり；
   治療有効量の速効性のインスリン；
   組成物を超速効性とするのに十分な量のヒアルロナン分解酵素；
   ５０mM〜２００mMまたは約５０mM〜２００mM濃度のＮａＣｌ；
   抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物；および
   １種または複数種の安定化剤を含み、
   それにより、正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間安定である、安定な配合剤組成物。
2. 配合剤中のヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持し；および／または
   組成物中のインスリンが：
   組成物における初期レベルのインスリンの少なくとも９０％力価または回収を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持し；および／または
   少なくとも９０％の初期インスリン純度を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持し；および／または
   ２％未満の高分子量(ＨＭＷｔ)インスリン種を正確にまたは約２℃〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間および／または正確にまたは約２０℃〜３０℃の温度で少なくとも１４日間維持する、請求項１記載の安定な配合剤。
3. ＮａＣｌ濃度が正確にまたは約８０mM〜２００mM、８０mM〜１４０mM、５０mM〜１００mM、８０mM〜１００mM、５０mM〜８０mM、１００mM〜１４０mMまたは１２０mM〜１４０mMである請求項１または２記載の安定な配合剤。
4. 正確にまたは約６.８〜７.８のｐＨ範囲を維持するのに十分量の緩衝剤を含む、請求項１〜３のいずれか記載の安定な配合剤。
5. 正確にまたは約６.５〜７.５のｐＨを有し；
   治療有効量の速効性のインスリン；
   組成物を超速効性とするのに十分な量のヒアルロナン分解酵素；
   正確にまたは約１２０mM〜２００mMの濃度のＮａＣｌ；
   抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物；および
   １種または複数種の安定化剤を含み、
   それにより少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で安定であるおよび／または撹拌下に少なくとも３時間安定である、安定な配合剤組成物。
6. 安定化剤が有効量のヒアルロニダーゼ阻害剤を含む、請求項５記載の安定な配合剤。
7. ヒアルロニダーゼ阻害剤がタンパク質、ヒアルロナン分解酵素の基質、多糖類、脂肪酸類、ラノスタノイド類、抗生物質、抗線虫剤、合成有機化合物および植物由来生理活性成分から選択される、請求項６記載の安定な配合剤。
8. ヒアルロニダーゼ阻害剤がグリコサミノグリカン(ＧＡＧ)、血清ヒアルロニダーゼ阻害剤、アシュワガンダ(Withania somnifera)糖タンパク質(ＷＳＧ)、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、キトサン類、β−(１,４)−ガラクト−オリゴ糖類、硫酸化ベルバスコース、硫酸化プランテオース、ペクチン、ポリ(スチレン−４−スルホネート)、デキストラン硫酸、アルギン酸ナトリウム、ワカメ(Undaria pinnatifida)由来の多糖、マンデル酸縮合重合体、エイコサトリエン酸、ネルボン酸、オレアノール酸、アリストロキン酸、アジマリン、レセルピン、フラボン、デスメトキシセンタウレイジン、ケルセチン、アピゲニン、ケンフェロール、シリビン、ルテオリン、ルテオリン−７−グルコシド、フロレチン、アピイン、ヘスペリジン、スルホン化ヘスペリジン、カリコシン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フラボン−７−硫酸ナトリウム、フラボン７−フルオロ−４’−ヒドロキシフラボン、４’−クロロ−４,６−ジメトキシカルコン、５−ヒドロキシフラボン−７−硫酸ナトリウム、ミリセチン、ルチン、モリン、グリチルリジン、ビタミンＣ、Ｄ−イソアスコルビン酸、Ｄ−糖酸１,４−ラクトン、Ｌ−アスコルビン酸−６−ヘキサデカノエート(Vcpal)、６−Ｏ−アシル化ビタミンＣ、カテキン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、クルクミン、没食子酸Ｎ−プロピル、タンニン酸、エラグ酸、没食子酸、フロロフコフレッコールＡ、ジエコール、８,８’−ビエコール、プロシアニジン、ゴシポール、セレコキシブ、ニメスリド、デキサメサゾン、インドメタシン(indomethcin)、フェノプロフェン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、サリチレート、クロモグリク酸二ナトリウム、金チオリンゴ酸ナトリウム、transilist、トラキサノクス、イベルメクチン、リンコマイシン(linocomycin)およびスペクチノマイシン、スルファメトキサゾールおよびトリメトプリム(trimerthoprim)、ネオマイシン硫酸塩、３α−アセチルポリポレン酸Ａ、(２５Ｓ)−(＋)−１２α−ヒドロキシ−３α−メチルカルボキシアセテート−２４−メチルラノスタ−８,２４(３１)−ジエン−２６−オイック酸、ラノスタノイド、ポリポレン酸ｃ、ＰＳ５３(ヒドロキノン−スルホン酸−ホルムアルデヒドポリマー)、ポリ(スチレン−４−スルホネート)のポリマー、VERSA-TL 502、１−テトラデカンスルホン酸、マンデル酸縮合重合体(ＳＡＭＭＡ)、１,３−ジアセチルベンゾイミダゾール−２−チオン、Ｎ−モノアシル化ベンズイミダゾール−２チオン、Ｎ,Ｎ’−ジアシル化ベンズイミダゾール−２−チオン、アルキル−２−フェニルインドール誘導体、３−プロパノイルベンゾオキサゾール−２−チオン、Ｎ−アルキル化インドール誘導体、Ｎ−アシル化インドール誘導体、ベンゾチアゾール誘導体、Ｎ−置換インドール−２−および３−カルボキサミド誘導体、Ｎ−置換インドール−２−および３−カルボキサミド誘導体のハロゲン化類似体(クロロおよびフルオロ)、２−(４−ヒドロキシフェニル)−３−フェニルインドール、インドールカルボキサミド類、インドールアセトアミド類、３−ベンゾリル−１−メチル−４−フェニル−４−ピペリジノール、ベンゾイルフェニルベンゾエート誘導体、Ｌ−アルギニン誘導体、グアニジウムＨＣＬ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＨＣＮ、リナマリン、アミグダリン、ヘデラゲニン、エスチン、ＣＩＳ−ヒノキレシノールおよび１,３−ジ−ｐ−ヒドロキシフェニル−４−ペンテン−１−オンから選択される、請求項６または７の安定な配合剤。
9. ヒアルロニダーゼ阻害剤がヒアルロナン(ＨＡ)オリゴ糖であるヒアルロニダーゼ基質である、請求項６〜８のいずれか記載の安定な配合剤。
10. ＨＡの濃度が正確にまたは約１mg／mL〜２０mg／mLである、請求項９記載の安定な配合剤。
11. 配合剤中のヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で維持しまたは少なくとも３日間撹拌下安定であり；そして
    組成物中のインスリンが：
    組成物における初期レベルのインスリンの少なくとも９０％力価または回収を少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で維持しまたは少なくとも３日間撹拌下安定であり；および／または
    少なくとも９０％の初期インスリン純度少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で維持しまたは撹拌下に少なくとも３時間安定であり；および／または
    ２％未満の高分子量(ＨＭＷｔ)インスリン種少なくとも３日間正確にまたは約３２℃〜４０℃の温度で維持しまたは少なくとも３日間撹拌下安定である、
    請求項５〜１０のいずれか記載の安定な配合剤。
12. ＮａＣｌ濃度が１５０mM〜２００mMまたは１６０mM〜１８０mMまたは約１５０mM〜２００mMまたは約１６０mM〜１８０mMである、請求項５〜１１のいずれか記載の安定な配合剤。
13. 正確にまたは約６.５〜７.５の範囲のｐＨを維持するのに十分な量の緩衝剤を含む、請求項５〜１２のいずれか記載の安定な配合剤。
14. ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼである、請求項１〜１３のいずれか記載の安定な配合剤。
15. ヒアルロナン分解酵素が中性ｐＨで活性なヒアルロニダーゼである、請求項１〜１４のいずれか記載の安定な配合剤。
16. ヒアルロナン分解酵素が細胞から発現されたときグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを欠くかまたは膜型ではない；または
    ヒアルロナン分解酵素がＧＰＩアンカーの全部または一部を除去するための１個以上のアミノ酸残基のＣ末端短縮化を含む、
    請求項１〜１５のいずれか記載の安定な配合剤。
17. ヒアルロナン分解酵素がＰＨ２０であるヒアルロニダーゼまたはそのＣ末端切断型である、請求項１〜１６のいずれか記載の安定な配合剤。
18. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するＰＨ２０ポリペプチドである、請求項１〜１７のいずれか記載の安定な配合剤。
19. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸配列を含むＣ末端切断型ＰＨ２０である、請求項１〜１８のいずれか記載の安定な配合剤。
20. ヒアルロナン分解酵素の量が正確にまたは約１０Ｕ／mL〜２００００Ｕ／mL、１０Ｕ／mL〜１５０００Ｕ／mL、１０Ｕ／mL〜１００００Ｕ／mL、１０Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１００００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、または１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLである、請求項１〜１９のいずれか記載の安定な配合剤。
21. ヒアルロナン分解酵素の量が少なくともまたは約または正確に３０Ｕ／mL、３５Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、５０Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、２５０Ｕ／mL、３００Ｕ／mL、３５０Ｕ／mL、４００Ｕ／mL、４５０Ｕ／mL、５００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL、７００Ｕ／mL、８００Ｕ／mL、９００Ｕ／mL、１０００Ｕ／mL、２０００Ｕ／mL、３０００Ｕ／mL、４０００Ｕ／mL、５０００Ｕ／mL、１００００Ｕ／mL、１５０００Ｕ／mLまたは２００００Ｕ／mLである、請求項１〜２０のいずれか記載の安定な配合剤。
22. 速効性のインスリンがレギュラーインスリンである、請求項１〜２１のいずれか記載の安定な配合剤。
23. レギュラーインスリンがヒトインスリンまたはブタインスリンである、請求項２２記載の安定な配合剤。
24. レギュラーインスリンが配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１０４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリン；または配列番号１２３のアミノ酸残基位置８８〜１０８に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１２３のアミノ酸残基位置２５〜５４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンである、請求項２２または２３記載の安定な配合剤。
25. 速効性のインスリンがインスリン類似体である、請求項１〜２１のいずれか記載の安定な配合剤。
26. 速効性のインスリンがインスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリジンから選択されるインスリン類似体である、請求項１〜２５のいずれか記載の安定な配合剤。
27. インスリン類似体が配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１４７〜１４９のいずれかに示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンから選択される、請求項２５または２６記載の安定な配合剤。
28. 速効性のインスリンの量が１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mLまたは５００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)である、請求項１〜２７のいずれか記載の安定な配合剤。
29. 緩衝剤がＴｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸およびクエン酸から選択される、請求項４および１３〜２８のいずれか記載の安定な配合剤。
30. 緩衝剤がＴｒｉｓであるである、請求項４および１３〜２９のいずれか記載の安定な配合剤。
31. 緩衝剤の濃度が正確にまたは約１mM〜１００mM、１０mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mMである、請求項４および１３〜３０のいずれか記載の安定な配合剤。
32. 製剤中の防腐剤(複数も可)が１種以上のフェノール防腐剤(複数も可)、非フェノール防腐剤(複数も可)またはフェノール防腐剤(複数も可)および非フェノール防腐剤(複数も可)を含む、請求項１〜３１のいずれか記載の安定な配合剤。
33. 防腐剤(複数も可)がフェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、グルコン酸クロルヘキシジン、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール、酢酸フェニル水銀、グリセロール、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンおよびこれらのあらゆる組み合わせから選択される、請求項１〜３２のいずれか記載の安定な配合剤。
34. 製剤が１種の防腐剤または２種、３種または４種の防腐剤を含む防腐剤の混合物を含む、請求項１〜３３のいずれか記載の安定な配合剤。
35. 少なくとも１種のフェノール防腐剤を含む、請求項１〜３４のいずれか記載の安定な配合剤。
36. 防腐剤(複数も可)がフェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールである、請求項１〜３５のいずれか記載の安定な配合剤。
37. 製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての１種以上の防腐剤の総量が正確にまたは０.１％および０.４％、０.１％〜０.３％、０.１５％〜０.３２５％、０.１５％〜０.２５％、０.１％〜０.２％、０.２％〜０.３％または０.３％〜０.４％(両端値を含む)である、請求項１〜３６のいずれか記載の安定な配合剤。
38. 防腐剤がフェノールおよびｍ−クレゾールであり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての量が正確にまたは約０.１％〜０.２５％フェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.２％フェノールおよび正確にまたは約０.６％〜０１.８％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１％〜０.１５％フェノールおよび０.８％〜０.１５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.１５％フェノールおよび正確にまたは約０.０６〜０.０９％ｍ−クレゾールまたは正確にまたは約０.１２％〜０.１８％フェノールおよび正確にまたは約０.１４〜０.２２％ｍ−クレゾールである、請求項１〜３７のいずれか記載の安定な配合剤。
39. アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール類、塩および界面活性剤から選択される安定化剤を含む、請求項１〜３８のいずれか記載の安定な配合剤。
40. 安定化剤がグリシンまたはプロリンであるアミノ酸である、請求項３９記載の安定な配合剤。
41. アミノ酸の濃度が正確にまたは約０.０１Ｍ〜１Ｍ、０.０１Ｍ〜０.１Ｍ、０.１Ｍ〜０.７５Ｍまたは０.２Ｍ〜０.５Ｍ(両端値を含む)であるである、請求項３９または４０記載の安定な配合剤。
42. 安定化剤がアルギニン、グルタミン酸、および／またはその塩類および／またはそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸である、請求項３９記載の安定な配合剤。
43. アミノ酸類の濃度が１〜１００mM、１０〜１００mM、または正確にまたは約３０mM、５０mMまたは８０mMである、請求項４２記載の安定な配合剤。
44. 安定化剤が界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量が正確にまたは約０.００５％〜１.０％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％、または０.０１％〜０.０２％である、請求項１〜４３のいずれか記載の安定な配合剤。
45. 界面活性剤がポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートから選択される、請求項４４記載の安定な配合剤。
46. 界面活性剤がポロクサマー１８８、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０から選択される、請求項４４または４５記載の安定な配合剤。
47. 安定化剤がポロクサマー１８８である界面活性剤であり、重量濃度(ｗ／ｖ)％としての量正確にまたは約０.０１％〜０.０５％で含むか；または
    安定化剤がポリソルベート２０である界面活性剤であり、重量濃度(ｗ／ｖ)％としての量正確にまたは約０.０１％〜０.０５％で含むか；または
    安定化剤がポリソルベート８０である界面活性剤であり、重量濃度(ｗ／ｖ)％としての量正確にまたは約０.０１％〜０.０５％で含む、
    請求項１〜４６のいずれか記載の安定な配合剤。
48. 正確にまたは約２４５mOsm／kg〜３０５mOsm／kgのモル浸透圧濃度を維持するための浸透圧修飾剤を含む、請求項１〜４７のいずれか記載の安定な配合剤。
49. 浸透圧修飾剤がグリセリン、塩、アミノ酸類、ポリアルコール類およびトレハロースから選択される、請求項４８記載の安定な配合剤。
50. グリセリンを６０mM未満、５５mM未満、５０mM未満、４５mM未満、４０mM未満、３５mM未満、３０mM未満、２５mM未満、２０mM未満、１５mM未満、１０mM未満の濃度で含む、請求項４８または４９記載の安定な配合剤。
51. 速効性のインスリンがインスリンアスパルトであるインスリン類似体であり、製剤がグリセリンを正確にまたは約２０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度で含む；または
    速効性インスリンがレギュラーインスリンまたはがインスリンリスプロであり、製剤がグリセリンを正確にまたは約４０mM〜６０mM(両端値を含む)で含む、
    請求項４８〜５０のいずれか記載の安定な配合剤。
52. 抗酸化剤を含む、請求項１〜５１のいずれか記載の安定な配合剤。
53. 抗酸化剤がシステイン、トリプトファンおよびメチオニンから選択される、請求項５２記載の安定な配合剤。
54. 抗酸化剤が正確にまたは約５mM〜５０mM、５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度である、請求項５２または５３記載の安定な配合剤。
55. 抗酸化剤がメチオニンであり、濃度が正確にまたは約１０mM〜２０mMである、請求項５３記載の安定な配合剤。
56. 亜鉛を含む、請求項１〜５５のいずれか記載の安定な配合剤。
57. 亜鉛の濃度が正確にまたは約０.００１〜０.１mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)、０.００１〜０.０５mg／１００Ｕまたは０.０１〜０.０５mg／１００Ｕである、請求項５６記載の安定な配合剤。
58. ニコチン化合物を含む、請求項１〜５７のいずれか記載の安定な配合剤。
59. ニコチン化合物がニコチンアミド、ニコチン酸、ナイアシン、ナイアシンアミド、ビタミンＢ３および／またはその塩類および／またはこれらのあらゆる組み合わせから選択される、請求項５８記載の安定な配合剤。
60. ニコチン化合物(複数も可)が正確にまたは約１mm〜１５０mM、１０mM〜１５０mM、５０mM〜１００mMまたは正確にまたは約８０mMの濃度で存在する、請求項５８または５９記載の安定な配合剤。
61. 製剤が正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し：
    正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
    正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量の速効性のインスリン類似体；
    正確にまたは約１０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；
    正確にまたは約５０〜２００mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；
    正確にまたは約５mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；
    正確にまたは約０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；
    正確にまたは約０.０１％〜０.５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である界面活性剤；および
    正確にまたは約０.１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)
    を含む、請求項１〜６０のいずれか記載の安定な配合剤。
62. ０.００１〜０.１mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)の濃度の亜鉛を含む、請求項６１記載の安定な配合剤。
63. 速効性のインスリンがインスリンリスプロである速効性のインスリン類似体であり、
    製剤が正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し；
    正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
    正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリンリスプロ；
    正確にまたは約２５mM〜３５mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；
    正確にまたは約５０mM〜１２０mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；
    正確にまたは約１０mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；
    正確にまたは約４０mM〜６０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；
    正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である界面活性剤；
    ０.０１７〜０.０２４mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)の濃度の亜鉛；および
    重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)ので正確にまたは約０.０８％〜０.１７％(両端値も可)フェノールおよび正確にまたは約０.０７％〜０.１７％ｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
    請求項６１または６２記載の安定な配合剤。
64. ＮａＣｌ濃度が正確にまたは約７０mM〜１００mMである、請求項６３記載の安定な配合剤。
65. 速効性のインスリンが速効性のインスリンアスパルトであるインスリン類似体であり、
    製剤が正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し；
    正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
    正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリンアスパルト；
    正確にまたは約２５mM〜３５mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；
    正確にまたは約８０mM〜１６０mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；
    正確にまたは約１０mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；
    正確にまたは約２０mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；
    正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である界面活性剤；
    ０.０１７〜０.０２４mg／インスリン１００単位(mg／１００Ｕ)の濃度の亜鉛；および
    重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)ので正確にまたは約０.０８％〜０.１７％(両端値も可)フェノールおよび正確にまたは約０.０７％〜０.１７％ｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
    請求項６１または６２記載の安定な配合剤。
66. ＮａＣｌ濃度が正確にまたは約７０mM〜１００mMである、請求項６５記載の安定な配合剤。
67. 速効性のインスリンがインスリングルリジンである速効性のインスリン類似体を含み；
    製剤が正確にまたは約７.０〜７.６のｐＨを有し；
    正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
    正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリングルリジン；
    正確にまたは約２５mM〜３５mM(両端値を含む)の濃度のＴｒｉｓ緩衝剤；
    正確にまたは約８０mM〜２００mM(両端値を含む)の濃度のＮａＣｌ；
    正確にまたは約１０mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；
    正確にまたは約４０mM〜６０mM(両端値を含む)の濃度のグリセリン；
    正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポロクサマー１８８である界面活性剤；および
    重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)ので正確にまたは約０.０８％〜０.１７％(両端値も可)フェノールおよび正確にまたは約０.０７％〜０.１７％ｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
    請求項６１または６２記載の安定な配合剤。
68. ＮａＣｌ濃度が正確にまたは約１００mM〜１５０mMである、請求項６７記載の安定な配合剤。
69. 多数回投与用に製剤されている、請求項１〜６８のいずれか記載の安定な配合剤。
70. 治療有効量のヒアルロナン分解酵素；および
    ヒアルロナン分解酵素を安定化する量のリシルリシン(Ｌｙｓ−Ｌｙｓ)
    を含む、組成物。
71. Ｌｙｓ−Ｌｙｓの量がヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも３日間、３７℃で維持するのに十分である、請求項７０記載の組成物。
72. ヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を３７℃で少なくとも４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間またはそれ以上維持する、請求項７０または７１記載の組成物。
73. ヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも１ヶ月間、３７℃で維持する、請求項７０〜７２のいずれか記載の組成物。
74. Ｌｙｓ−Ｌｙｓ濃度が正確にまたは約５mM〜１２０mM、１０mM〜１００mM、１０mM〜５０mM、３０mM〜１１０mM、３０mM〜８０mM、５０mM〜１００mMまたは１００mM〜１２０mMである、請求項７０〜７３のいずれか記載の組成物。
75. 製剤のｐＨが正確にまたは約６.５〜８.０、６.５〜７.４、６.８〜７.８、７.０〜７.６または６.８〜７.２(両端値を含む)である、請求項７０〜７４記載の組成物。
76. 製剤がさらに安定化剤を含む、請求項７０〜７５のいずれか記載の組成物。
77. 安定化剤がアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩および界面活性剤から選択される、請求項７６記載の組成物。
78. 安定化剤が界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量が正確にまたは約０.０００５％〜１.０％、０.０００５％〜０.００５％、０.００１％〜０.０１％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％、または０.０１％〜０.０２％(両端値を含む)である、請求項７６または７７記載の組成物。
79. 界面活性剤がポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートから選択される、請求項７７または７８記載の組成物。
80. 界面活性剤がポロクサマー１８８、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０から選択される、請求項７７〜７９のいずれか記載の組成物。
81. 組成物が抗酸化剤を含む、請求項７０〜８０のいずれか記載の組成物。
82. 抗酸化剤がシステイン、トリプトファンおよびメチオニンから選択される、請求項８１記載の組成物。
83. 抗酸化剤がメチオニンである、請求項８２記載の組成物。
84. 抗酸化剤が正確にまたは約５mM〜５０mM、５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度である、請求項８１〜８３のいずれか記載の組成物。
85. 正確にまたは約２４５mOsm／kg〜５００mOsm／kg(両端値を含む)の浸透圧濃度を維持するための浸透圧修飾剤を含む、請求項７０〜８４のいずれか記載の組成物。
86. 浸透圧修飾剤がグリセリン、塩、アミノ酸類、ポリアルコール類およびトレハロースから選択される、請求項８５記載の組成物。
87. 浸透圧修飾剤がＮａＣｌである塩であり、ＮａＣｌの濃度が正確にまたは約２０mM〜２００mM、４０mM〜１６０mM、８０mM〜１２０mM、２０mM〜８０mMまたは５０mM〜１５０mM(両端値を含む)である、請求項８５または８６記載の組成物。
88. ＮａＣｌを１５０mM未満、１４０mM未満、１３０mM未満、１２０mM未満、１１０mM未満、１００mM未満、９０mM未満、８０mM未満、７０mM未満、６０mM未満、５０mM未満、４０mM未満、３０mM未満、２０mM未満、１０mM未満またはそれ未満の濃度で含む、請求項７０〜８７のいずれか記載の組成物。
89. 正確にまたは約６.５〜８.０、６.８〜７.８、７.０〜７.６、６.５〜７.２、または６.８〜７.４(両端値を含む)のｐＨ範囲を維持するために十分量の緩衝剤を含む、請求項７０〜８８のいずれか記載の組成物。
90. 緩衝剤がＴｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸およびクエン酸から選択される請求項８９記載の組成物。
91. 緩衝剤がリン酸ナトリウムであるリン酸である、請求項８９または９０記載の組成物。
92. 緩衝剤の濃度が正確にまたは約１mM〜１００mM、１０mM〜８０mM、５mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mM(両端値を含む)である、請求項８９〜９１のいずれか記載の組成物。
93. ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼである、請求項７０〜９２のいずれか記載の組成物。
94. ヒアルロナン分解酵素が中性ｐＨで活性なヒアルロニダーゼである、請求項７０〜９３のいずれか記載の組成物。
95. ヒアルロナン分解酵素が細胞から発現されたときグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを欠くかまたは膜型ではない；または
    ヒアルロナン分解がＧＰＩアンカーの全部または一部を除去するための１個以上のアミノ酸残基のＣ末端短縮化を含む、
    請求項７０〜９４のいずれか記載の組成物。
96. ヒアルロナン分解酵素がＰＨ２０であるヒアルロニダーゼまたはそのＣ末端切断型フラグメントである、請求項７０〜９５のいずれか記載の組成物。
97. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するＰＨ２０ポリペプチドである、請求項７０〜９６のいずれか記載の組成物。
98. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸配列を含むＣ末端切断型ＰＨ２０である、請求項７０〜９７のいずれか記載の組成物。
99. ヒアルロナン分解酵素の量が正確にまたは約１０Ｕ／mL〜２０,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１５,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１０,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１００００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、２００Ｕ／mL〜８００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、または１５０Ｕ／mL〜３００Ｕ／ml(両端値を含む)である、請求項７０〜９８のいずれか記載の組成物。
100. Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度が５mM〜５０mM(両端値を含む)である、請求項７０〜９９のいずれか記載の組成物。
101. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.５〜７.２であり；
     正確にまたは約１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のヒアルロナン分解酵素；
     正確にまたは約５mM〜３０mM(両端値を含む)の濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ；
     １４０mM未満ＮａＣｌの濃度のＮａＣｌ；
     正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート８０である界面活性剤；
     正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および
     正確にまたは約５mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のリン酸ナトリウムを含む、
     請求項７０〜１００のいずれか記載の組成物。
102. ヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０またはそのＣ末端切断型フラグメントである、請求項７０〜１０１のいずれか記載の組成物。
103. さらに速効性のインスリンを含む、請求項７０〜１０２のいずれか記載の組成物。
104. Ｌｙｓ−Ｌｙｓの濃度が３０mM〜１２０mM、５０mM〜１０５mMまたは８０mM〜１００mM(両端値を含む)である、請求項１０３記載の組成物。
105. 速効性のインスリンがレギュラーインスリンである、請求項１０３または１０４記載の組成物。
106. レギュラーインスリンがヒトインスリンまたはブタインスリンである、請求項１０５記載の組成物。
107. レギュラーインスリンが配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１０４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリン；または配列番号１２３のアミノ酸残基位置８８〜１０８に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１２３のアミノ酸残基位置２５〜５４に示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンである、請求項１０５または１０６記載の組成物。
108. 速効性のインスリンがインスリン類似体である、請求項１０３〜１０７のいずれか記載の組成物。
109. インスリン類似体がインスリンアスパルト、インスリンリスプロおよびインスリングルリジンから選択される、請求項１０８記載の組成物。
110. インスリン類似体が配列番号１０３に示すアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号１４７〜１４９のいずれかに示すアミノ酸配列を有するＢ鎖を有するインスリンから選択される、請求項１０８または１０９記載の組成物。
111. 速効性のインスリンの量が正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、２０Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜３００Ｕ／mLまたは２００Ｕ／mL〜８００Ｕ／mL(両端値を含む)である、請求項１０３〜１１０のいずれか記載の組成物。
112. 速効性のインスリンがインスリン類似体およびヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０またはそのＣ末端切断型フラグメントである、請求項１０３〜１１１のいずれか記載の組成物。
113. 速効性のインスリンがグルリジンであるインスリン類似体およびＬｙｓ−Ｌｙｓの濃度が５０〜１０５mMである；または
     速効性のインスリンがインスリンアスパルトまたはインスリンリスプロであるインスリン類似体またはインスリンリスプロおよびＬｙｓ−Ｌｙｓの濃度が８０〜１００mMである、
     請求項１０３〜１１２のいずれか記載の組成物。
114. 単回投与または多回投与用である、請求項７０〜１１３のいずれか記載の組成物。
115. 組成物が多回投与用であり、抗微生物有効量の防腐剤または防腐剤の混合物を含む、請求項１１４記載の組成物。
116. 製剤中の防腐剤(複数も可)が１種以上のフェノール防腐剤(複数も可)、非フェノール防腐剤(複数も可)またはフェノール防腐剤(複数も可)および非フェノール防腐剤(複数も可)を含む、請求項１１５記載の組成物。
117. 防腐剤(複数も可)がフェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、グルコン酸クロルヘキシジン、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール、酢酸フェニル水銀、グリセロール、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンおよびこれらのあらゆる組み合わせから選択される、請求項１１５または１１６記載の組成物。
118. 製剤が１種の防腐剤を含む；または
     ２種、３種または４種の防腐剤を含む防腐剤の混合物を含む、
     請求項１１５〜１１７のいずれか記載の組成物。
119. 少なくとも１種のフェノール防腐剤を含む、請求項１１５〜１１８のいずれか記載の組成物。
120. 防腐剤(複数も可)がフェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールである、請求項１１５〜１１９のいずれか記載の組成物。
121. 製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての１種以上の防腐剤の総量が正確にまたは０.１％および０.４％、０.１％〜０.３％、０.１５％〜０.３２５％、０.１５％〜０.２５％、０.１％〜０.２％、０.２％〜０.３％または０.３％〜０.４％(両端値を含む)である、請求項１１５〜１２０のいずれか記載の組成物。
122. 防腐剤がフェノールおよびｍ−クレゾールであり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)としての量が正確にまたは約０.１％〜０.２５％フェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.２％フェノールおよび正確にまたは約０.０６％〜０.１８％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１％〜０.１５％フェノールおよび０.０８％〜０.１５％ｍ−クレゾール、正確にまたは約０.１０％〜０.１５％フェノールおよび正確にまたは約０.０６〜０.０９％ｍ−クレゾールまたはが正確にまたは約０.１２％〜０.１８％フェノールおよび正確にまたは約０.１４〜０.２２％ｍ−クレゾール(両端値を含む)である、請求項１１５〜１２１のいずれか記載の組成物。
123. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.８〜７.４であり；
     正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
     正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリングルリジンである速効性のインスリン類似体；
     正確にまたは約５０mM〜１０５mM(両端値を含む)の濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ；
     １００mM未満の濃度のＮａＣｌ；
     正確にまたは約０.０００５％〜０.００５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート２０である界面活性剤；
     正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および
     正確にまたは約０.１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
     請求項７０〜１２２のいずれか記載の組成物。
124. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.８〜７.４であり；
     正確にまたは約１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のＰＨ２０であるヒアルロナン分解酵素；
     正確にまたは約１０Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のインスリンアスパルトまたはインスリンリスプロである速効性のインスリン類似体；
     正確にまたは約８０mM〜１００mM(両端値を含む)の濃度のＬｙｓ−Ｌｙｓ；
     ３０mM未満の濃度のＮａＣｌ；
     正確にまたは約０.０００５％〜０.００５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート２０である界面活性剤；
     正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および
     正確にまたは約０.１％〜０.２５％の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のフェノールおよび正確にまたは約０.０５％〜０.２％の％ｗ／ｖのｍ−クレゾールを含む防腐剤(複数も可)を含む、
     請求項７０〜１２２のいずれか記載の組成物。
125. 治療有効量のヒアルロナン分解酵素；および
     ヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を少なくとも３日間、３７℃で維持するのに十分な量のＭｇＣｌ_２を含む、
     組成物。
126. ＭｇＣｌ_２濃度が正確にまたは約５０mM〜１５０mM、７５mM〜１２５mMまたは８０mM〜１００mM(両端値を含む)である、請求項１２５記載の組成物。
127. ヒアルロナン分解酵素が初期ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％を３７℃で少なくとも４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間またはそれ以上維持する、請求項１２５または１２６記載の組成物。
128. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.５〜８.０、６.５〜７.４、６.８〜７.８、７.０〜７.６または６.８〜７.２である、請求項１２５〜１２７のいずれか記載の組成物。
129. 組成物がさらに安定化剤を含む、請求項１２５〜１２８のいずれか記載の組成物。
130. 安定化剤がアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩および界面活性剤から選択される、請求項１２５〜１２９のいずれか記載の組成物。
131. 安定化剤が界面活性剤であり、製剤中の重量濃度(ｗ／ｖ)の％としての界面活性剤の量が正確にまたは約０.０００５％〜１.０％、０.０００５％〜０.００５％、０.００１％〜０.０１％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％、または０.０１％〜０.０２％(両端値を含む)である、請求項１３０記載の組成物。
132. 界面活性剤がポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートから選択される、請求項１３０または１３１記載の組成物。
133. 界面活性剤がポロクサマー１８８、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０から選択される、請求項１３０〜１３２のいずれか記載の組成物。
134. 組成物が抗酸化剤を含む、請求項１２５〜１３３のいずれか記載の組成物。
135. 抗酸化剤がシステイン、トリプトファンおよびメチオニンから選択される、請求項１３４記載の組成物。
136. 抗酸化剤がメチオニンである、請求項１３５記載の組成物。
137. 抗酸化剤が正確にまたは約５mM〜５０mM、５mM〜４０mM、５mM〜２０mMまたは１０mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度である、請求項１３４〜１３６のいずれか記載の組成物。
138. 正確にまたは約６.５〜８.０、６.８〜７.８、７.０〜７.６、６.５〜７.２、または６.８〜７.４のｐＨ範囲を維持するために十分量の緩衝剤を含む、請求項１２５〜１３７のいずれか記載の組成物。
139. 緩衝剤がＴｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸およびクエン酸から選択される、請求項１３８記載の組成物。
140. 緩衝剤がヒスチジン塩酸塩である、請求項１３８または１３９記載の組成物。
141. 緩衝剤の濃度が正確にまたは約１mM〜１００mM、１０mM〜８０mM、５mM〜５０mMまたは２０mM〜４０mMである、請求項１３８〜１４０のいずれか記載の組成物。
142. ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼである、請求項１２５〜１４１のいずれか記載の組成物。
143. ヒアルロナン分解酵素が中性ｐＨで活性なヒアルロニダーゼである、請求項１２５〜１４２のいずれか記載の組成物。
144. ヒアルロナン分解酵素が細胞から発現されたときグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを欠くかまたは膜型ではない；またはヒアルロナン分解酵素がＧＰＩアンカーの全部または一部を除去するための１個以上のアミノ酸残基のＣ末端短縮化を含むヒアルロナン分解酵素である、請求項１２５〜１４３のいずれか記載の組成物。
145. ヒアルロナン分解酵素がＰＨ２０であるヒアルロニダーゼまたはそのＣ末端切断型フラグメントである、請求項１２５〜１４４のいずれか記載の組成物。
146. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４〜９、４７〜４８、２３４〜２５４、および２６７〜２７３のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するＰＨ２０ポリペプチドである、請求項１２５〜１４５のいずれか記載の組成物。
147. ヒアルロナン分解酵素が配列番号４〜９のいずれかに示すアミノ酸配列を含むＣ末端切断型ＰＨ２０である、請求項１２５〜１４６のいずれか記載の組成物。
148. ヒアルロナン分解酵素の量が正確にまたは約１０Ｕ／mL〜２０,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１５,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜１０,０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、５０Ｕ／mL〜４０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１００００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、３００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜５０００Ｕ／mL、６００Ｕ／mL〜２０００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜１０００Ｕ／mL、２００Ｕ／mL〜８００Ｕ／mL、１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL、または１５０Ｕ／mL〜３００Ｕ／ml(両端値を含む)である、請求項１２５〜１４７のいずれか記載の組成物。
149. 組成物のｐＨが正確にまたは約６.５〜７.２であり；
     正確にまたは約１００Ｕ／mL〜５００Ｕ／mL(両端値を含む)の量のヒアルロナン分解酵素；
     正確にまたは約５０mM〜１５０mM(両端値を含む)の濃度のＭｇＣｌ_２；
     正確にまたは約０.０１％〜０.０５％(両端値を含む)の重量濃度(ｗ／ｖ)のパーセンテージ(％)のポリソルベート８０である界面活性剤；
     正確にまたは約５mM〜２０mM(両端値を含む)の濃度のメチオニン；および
     正確にまたは約５mM〜５０mM(両端値を含む)の濃度のヒスチジン／ＨＣｌを含む、
     請求項１２５〜１４８のいずれか記載の組成物。
150. 組成物の容積が正確にまたは約０.５mL〜５０mL、１mL〜４０mL、１mL〜２０mL、１mL〜１０mL、または３mL〜１０mL(両端値を含む)である、請求項１〜１４９のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
151. バイアル、シリンジ、ペン、ポンプ用保存室または閉鎖ループ系を使用した送達用に製剤されている、請求項１〜１５０のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
152. 連続的皮下インスリン注入を使用する送達のために製剤される、請求項１〜１５１のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
153. ｐＨが正確にまたは約６.８〜７.２である、請求項１〜１５２のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
154. 請求項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物を含む、シリンジまたはバイアル。
155. 請求項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物を含む、閉鎖ループ系。
156. 請求項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物を含む、インスリンポンプ。
157. 請求項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物を含む、インスリンペン。
158. 請求項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、糖尿病の処置方法。
159. 糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病および妊娠性糖尿病から選択される、請求項１５８記載の方法。
160. 請求項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物の治療を対象に投与することを含む、対象における血糖値のコントロール方法。
161. さらに他の抗糖尿病剤を投与することを含む、請求項１５８〜１６０のいずれか記載の方法。
162. 糖尿病の処置に使用するためのまたは対象における血糖値のコントロールに使用するための、請求項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物。
163. 糖尿病の処置または対象における血糖値のコントロールのための、請求項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物の使用。
164. 糖尿病の処置または対象における血糖値のコントロールのための医薬の製造における、請求項１〜１５３のいずれか記載の安定な配合剤または組成物の使用。
165. 糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病および妊娠性糖尿病から選択される、請求項１６２〜１６４のいずれか記載の安定な配合剤または組成物または使用。