JP2016513115A

JP2016513115A - ワクチン組成物

Info

Publication number: JP2016513115A
Application number: JP2015558314A
Authority: JP
Inventors: デイヴィッド，エフストドル，; ジョン，キャメロンベル，; ブライアンリクティー，; ジョナサンポル，
Original assignee: チルドレンズホスピタルオブイースタンオンタリオリサーチインスティチュートインコーポレイテッド; オタワホスピタルリサーチインスティチュート; マックマスターユニヴァーシティ
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2016-05-12
Also published as: RU2019107976A; EP3622965A1; MX2015010783A; US20190240301A1; IL240723A0; IL279395A; ES2741147T3; US10660947B2; RU2015135890A; IL279395B2; US20160106820A1; CA2901501A1; MX2020012144A; US10646557B2; EP2958994B1; AU2019202515A1; WO2014127478A1; CN105658790A; CA2901501C; RU2684211C2

Abstract

ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通型上皮抗原、若しくは癌精巣抗原１、又はその変異体を抗原タンパク質として発現し、哺乳動物においてタンパク質又はその変異体に対する免疫が生じるよう構築された、第１のウイルスを含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットが記載される。キットは、同一の抗原又は同一の抗原の変異体をコードするＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスも含む。ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築される。第１のウイルスはＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照

[0001]本出願は、２０１３年２月２１日付けで出願された米国特許仮出願第６１／７６７，７７６号の優先権を主張し、仮出願は、本明細書により、参照により組み込まれる。

分野

[0002]本開示は、免疫応答を誘導するための腫瘍退縮ウイルスに関する。

背景

[0003]腫瘍退縮ウイルス（ＯＶ）は、影響を受けていない正常な組織をそのままにしつつ、悪性細胞に特異的に感染し、悪性細胞の中で複製し、悪性細胞を殺傷する。幾つかのＯＶは、種々の新生物の処置について、進んだ段階の臨床評価に達した（ＲｕｓｓｅｌｌＳＪ．ら、（２０１２）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３０：６５８−６７０）。かつて承認されたかかるウイルス剤は、標準的な癌治療の代わりになるか、又は組み合わせることができ、低減された毒性及び改善された治療効果を可能にする。

[0004]水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（ＳｔｏｊｄｌＤＦ．ら、（２０００）ＮａｔＭｅｄ６：８２１−８２５；ＳｔｏｊｄｌＤＦ．ら、（２００３）ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ４：２６３−２７５）に加え、腫瘍退縮活性を発揮する他のラブドウイルスが最近記載されている（ＢｒｕｎＪ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９；ＭａｈｏｎｅｙＤＪ．ら、（２０１１）ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２０：４４３−４５６）。これらのウイルスのうち、非ＶＳＶＭａｒａｂａウイルスは、インビトロで広範な腫瘍指向性を示した（国際公開第２００９／０１６４３３号）。改善された腫瘍選択性及び正常細胞における低減された病原性を有する変異体Ｍａｒａｂａウイルスが操作された。弱毒株は、Ｇタンパク質変異（Ｑ２４２Ｒ）及びＭタンパク質変異（Ｌ１２３Ｗ）の両方を含有する二重変異体株である。ＭＧ１又はＭａｒａｂａＭＧ１と呼ばれるこの弱毒株は、インビボで、弱毒ＶＳＶ、ＶＳＶ△ＡＭ５１より優れた治療効果と共に、マウスの異種移植モデル及び同系腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示した（国際公開第２０１１／０７０４４０号）。

[0005]過去数年に亘り蓄積されたデータは、腫瘍退縮ウイルスの抗腫瘍効果はその直接的な腫瘍退縮に依存するばかりでなく、抗腫瘍免疫を刺激するその能力に依存し得ることを明らかにした（ＢｒｉｄｌｅＢＷ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８４：４２６９−４２７５）。この免疫により仲介される腫瘍制御は、ＯＶ治療の全体的な効果において重大な役割を果たすように思われる。実際に、腫瘍特異的適応免疫細胞は、組織を巡回でき、ＯＶから免れた腫瘍細胞を破壊することができる。さらに、その記憶コンパートメントは腫瘍の再発を防ぐことができる。

[0006]ＯＶにより誘導される抗腫瘍免疫を改善する種々の戦略が開発されている（ＰｏｌＪ．ら、（２０１２）ＶｉｒｕｓＡｄａｐｔａｔｉｏｎａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔ４：１−２１）。幾つかのグループは、免疫賦活性サイトカインを発現するＯＶを遺伝的に操作した。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現する単純ヘルペス及びワクシニアウイルスは、癌治療について、フェーズＩＩＩ及びＩＩＢの臨床評価にそれぞれ達し、一方ＩＦＮ−βを発現するＶＳＶはフェーズＩに丁度入った。

[0007]腫瘍退縮ワクチンとして定義される別の戦略は、腫瘍抗原をＯＶから発現させることからなる（ＲｕｓｓｅｌｌＳＪ．ら、（２０１２）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３０：６５８−６７０）。以前に、ＶＳＶが癌ワクチンベクターとしても用いられ得ることが示されている（ＢｒｉｄｌｅＢＷ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８４：４２６９−４２７５）。マウスメラノーマモデルを処置するために異種プライム−ブースト設定で適用されるとき、ＶＳＶヒトドパクロムトートメラーゼ（ｈＤＣＴ）腫瘍退縮ワクチンは、ＤＣＴに対する増大した腫瘍特異的免疫ばかりでなく、抗ウイルス適応免疫の随伴性低減を誘導した。結果として、治療効果は、生存期間中央値及び長期生存の両方の増大を伴い、劇的に改善された（国際公開第２０１０／１０５３４７号）。ＶＳＶは、ｈＤＣＴの腫瘍関連抗原としての有効な使用であることが示されたが、どの腫瘍関連抗原が異種プライム−ブースト設定において有効であるかを予測する方法はない。

[0008]正常組織に対する低減した毒性と共に、腫瘍細胞を殺傷する患者の免疫系を、例えば、抗体及び／又はリンパ球を腫瘍の腫瘍関連抗原に対して活性化させることにより、活性化させるために用いられ得るワクチンベクターを提供することが所望される。かかるワクチンベクターは、腫瘍退縮活性、及び適応細胞免疫をブースト（ｂｏｏｓｔ）する能力の両方を発揮するかが所望される。

概要

[0009]以下の概要は、読者に本明細書に記載される１つ又は複数の発明を紹介することを意図し、発明の任意の１つを定義することを意図しない。

[0010]従来の抗癌ワクチンの少なくとも１つの欠点を取り除くか、又は軽減することが、本開示の目的である。

[0011]本開示の著者らは、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通型上皮抗原、及び癌精巣抗原１を、異種プライム−ブースト設定において用いて、哺乳動物において免疫応答を誘導することが完全にできることを、驚くべきことに見つけ出した。全ての腫瘍関連抗原が、異種プライム−ブーストを介して免疫応答を誘導することができるとは限らないので、これらの結果は予想外であり、予測可能ではない。例えば、本開示の著者らは、胎盤特異的タンパク質１（ＰＬＡＣ−１）及びエプスタイン−バー核抗原１が、異種プライム−ブーストを介して免疫応答を刺激することができないことも見つけ出した。

[0012]第１の態様において、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットが提供される。キットは、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質として発現し、哺乳動物において上記タンパク質又はその変異体に対する免疫が生じるよう構築された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）、第１のウイルスを含む。キットは、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質としてコードし、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築された、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスも含み、第１のウイルスはＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる。第１のウイルスにより発現される抗原タンパク質、及びＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスにより発現される抗原タンパク質は、同一であってもよい。

[0013]第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方は、投与のため単離されたウイルスとして構築されてもよい。

[0014]ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、配列番号３のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0015]第１のウイルスが、プラスセンスＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、又はマイナスセンスＲＮＡウイルスであるかどうかに依存して、第１のウイルスは、配列番号２又は３のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含んでもよいか、又は配列番号２又は３のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0016]２つのウイルスは、配列番号１の配列を含むタンパク質の異なる変異体を発現する能力があってもよい。第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体は、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ、及びＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹからなる群より選択される少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含んでもよく、配列番号１と少なくとも７０％同一であってもよい。変異体は、配列番号１と少なくとも８０％同一であることが好ましい。変異体は、配列番号１と少なくとも９０％同一であることがより好ましい。変異体は、配列番号１と少なくとも９５％同一であることがなおより好ましい。

[0017]第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体は、配列番号４のアミノ酸配列を有してもよい。変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含んでもよい。

[0018]ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、配列番号５のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。第１のウイルスが、プラスセンスＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、又はマイナスセンスＲＮＡウイルスであるかどうかに依存して、第１のウイルスは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含んでもよいか、又は配列番号５のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0019]第１のウイルスがマイナスセンスＲＮＡウイルスである場合、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス又は第１のウイルスいずれかの一方は、配列番号２又は３のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよく、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び第１のウイルスの他方は、配列番号５の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0020]第１のウイルスがプラスセンスＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスである場合、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは配列番号２又は３のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよく、第１のウイルスは配列番号５のヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは配列番号５のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよく、第１のウイルスは配列番号２又は３のヌクレオチド配列を含んでもよい。

[0021]ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス又は第１のウイルスいずれかの一方は、配列番号１又は４の配列を含むタンパク質を発現する能力があってもよく、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び第１のウイルスの他方は、他の配列を含むタンパク質を発現する能力があってもよい。

[0022]第１のウイルスはアデノウイルスであってもよい。

[0023]別の態様によると、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体をコードするゲノムを有する、単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子が提供される。

[0024]配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体は、配列番号４のアミノ酸配列を有してもよい。

[0025]ゲノムは配列番号２又は３のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0026]ゲノムは配列番号５のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0027]ゲノムは配列番号６のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0028]別の態様において、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットが提供される。キットは、配列番号７のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質として発現し、哺乳動物において上記タンパク質又はその変異体に対する免疫が生じるよう構築された、第１のウイルスを含む。キットは、配列番号７のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質としてコードし、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築された、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスも含み、第１のウイルスはＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる。第１のウイルスにより発現される抗原タンパク質、及びＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスにより発現される抗原タンパク質は、同一であってもよい。

[0029]第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方は、投与のため単離されたウイルスとして構築されてもよい。

[0030]第１のウイルスがマイナスセンスＲＮＡウイルスである場合、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、第１のウイルス、又は両方は、配列番号８のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。第１のウイルスがＤＮＡウイルス又はプラスセンスＲＮＡウイルスである場合、第１のウイルスは、配列番号８のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子を含んでもよい。

[0031]第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される配列番号７のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体は、少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含んでもよく、配列番号７と少なくとも７０％同一であってもよい。変異体は、配列番号７と少なくとも８０％同一であることが好ましい。変異体は、配列番号７と少なくとも９０％同一であることがより好ましい。変異体は、配列番号７と少なくとも９５％同一であることがなおより好ましい。

[0032]ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス又は第１のウイルスいずれかの一方は、配列番号７の配列を含むタンパク質を発現する能力があってもよく、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び第１のウイルスの他方は、配列番号７の配列を含むタンパク質の変異体を発現する能力があってもよい。２つのウイルスは、配列番号７の配列を含むタンパク質の異なる変異体を発現する能力があってもよい。

[0033]第１のウイルスはレンチウイルスであってもよい。

[0034]別の態様によると、配列番号７のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体をコードするゲノムを有する、単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子が提供される。

[0035]ゲノムは配列番号８のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0036]ゲノムは、配列番号９の逆相補的ＲＮＡバージョンであるヌクレオチド配列を含んでもよい。

[0037]別の態様において、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットが提供される。キットは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質として発現し、哺乳動物において上記タンパク質又はその変異体に対する免疫が生じるよう構築された、第１のウイルスを含む。キットは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質としてコードし、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築された、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスも含み、第１のウイルスはＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる。第１のウイルスにより発現される抗原タンパク質、及びＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスにより発現される抗原タンパク質は、同一であってもよい。

[0038]第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方は、投与のため単離されたウイルスとして構築されてもよい。

[0039]第１のウイルスがマイナスセンスＲＮＡウイルスである場合、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、第１のウイルス、又は両方は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。第１のウイルスがＤＮＡウイルス又はプラスセンスＲＮＡウイルスである場合、第１のウイルスは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子を含んでもよい。

[0040]第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体は、少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含んでもよく、配列番号１０と少なくとも７０％同一であってもよい。変異体は、配列番号１０と少なくとも８０％同一であることが好ましい。変異体は、配列番号１０と少なくとも９０％同一であることがより好ましい。変異体は、配列番号１０と少なくとも９５％同一であることがなおより好ましい。

[0041]ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス又は第１のウイルスいずれかの一方は、配列番号１０の配列を含むタンパク質を発現する能力があってもよく、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び第１のウイルスの他方は、配列番号１０の配列を含むタンパク質の変異体を発現する能力があってもよい。２つのウイルスは、配列番号１０の配列を含むタンパク質の異なる変異体を発現する能力があってもよい。

[0042]第１のウイルスはレンチウイルスであってもよい。

[0043]別の態様によると、配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体をコードするゲノムを有する、単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子が提供される。

[0044]ゲノムは配列番号１１のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0045]ゲノムは、配列番号１２の逆相補的ＲＮＡバージョンであるヌクレオチド配列を含んでもよい。

[0046]別の態様において、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットが提供される。キットは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質として発現し、哺乳動物において上記タンパク質又はその変異体に対する免疫が生じるよう構築された、第１のウイルスを含む。キットは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質としてコードし、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築された、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスも含み、第１のウイルスはＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる。第１のウイルスにより発現される抗原タンパク質、及びＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスにより発現される抗原タンパク質は、同一であってもよい。

[0047]第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方は、投与のため単離されたウイルスとして構築されてもよい。

[0048]第１のウイルスがマイナスセンスＲＮＡウイルスである場合、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、第１のウイルス、又は両方は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。第１のウイルスがＤＮＡウイルス又はプラスセンスＲＮＡウイルスである場合、第１のウイルスは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子を含んでもよい。

[0049]第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体は、少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含んでもよく、配列番号１３と少なくとも７０％同一であってもよい。変異体は、配列番号１３と少なくとも８０％同一であることが好ましい。変異体は、配列番号１３と少なくとも９０％同一であることがより好ましい。変異体は、配列番号１３と少なくとも９５％同一であることがなおより好ましい。

[0050]ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス又は第１のウイルスいずれかの一方は、配列番号１３の配列を含むタンパク質を発現する能力があってもよく、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び第１のウイルスの他方は、配列番号１３の配列を含むタンパク質の変異体を発現する能力があってもよい。２つのウイルスは、配列番号１３の配列を含むタンパク質の異なる変異体を発現する能力を有してもよい。

[0051]第１のウイルスはレンチウイルスであってもよい。

[0052]別の態様によると、配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体をコードするゲノムを有する、単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子が提供される。

[0053]ゲノムは配列番号１４のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[0054]ゲノムは、配列番号１５の逆相補的ＲＮＡバージョンであるヌクレオチド配列を含んでもよい。

[0055]本開示の他の態様及び特徴は、添付の図面と併せて、以下の記載の特定の実施形態のレビューにて当業者に明らかとなるだろう。

[0056]本開示の実施形態は、ここで、ただ例示の目的で、添付の図面に関連して記載される。

図１Ａ：ＭＧ１−ｈＤＣＴを投与された、腫瘍を有するマウスでのＣＤ８^＋又はＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を示す図である。図１Ｂ：転移性肺癌マウスモデルでの初回免疫ベクター（ｐｒｉｍｉｎｇｖｅｃｔｏｒ）として投与されたＭＧ１−ｈＤＣＴの治療効果を示す図である。初回免疫ベクターとしてＡｄ−ｈＤＣＴ、及び追加免疫ベクター（ｂｏｏｓｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒ）としてＭａｒａｂａＭＧ１−ｈＤＣＴ又はＶＳＶ−ｈＤＣＴのいずれかでの、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにおけるプライム−ブーストワクチン接種の免疫応答の比較を示す図である。初回免疫ベクターとしてＡｄ−エンプティー又はＡｄ−ｈＤＣＴのみの後、又は初回免疫ベクターとしてＡｄ−ｈＤＣＴ、及び追加免疫ベクターとしてＭａｒａｂａＭＧ１ＧＦＰ又はＭａｒａｂａＭＧ１−ｈＤＣＴのいずれかでのプライム−ブーストワクチン接種後の転移性肺癌マウスモデルにおけるＴ細胞応答を示す図である。初回免疫ベクターとしてのＡｄ−エンプティー又はＡｄ−ｈＤＣＴのみの後、又は初回免疫ベクターとしてのＡｄ−ｈＤＣＴ、及び追加免疫ベクターとしての、ＭａｒａｂａＭＧ１ＧＦＰ又はＭａｒａｂａＭＧ１−ｈＤＣＴのいずれかでのプライム−ブーストワクチン接種後の転移性肺癌マウスモデルにおける生存プロットを示す図である。初回免疫ベクターとしてのＡｄ−エンプティー又はＡｄ−ｈＤＣＴのみの後、又は初回免疫ベクターとしてのＡｄ−ｈＤＣＴ、及び追加免疫ベクターとしてのＭａｒａｂａＭＧ１−ｈＤＣＴでのプライム−ブーストワクチン接種後の転移性脳癌マウスモデルにおける生存プロットを示す図である。霊長類毒性／免疫原性研究において利用される初回免疫ベクターＡｄ−ＭＡＧＥＡ３、追加免疫ベクターＭａｒａｂａＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３、及びプライム−ブースト戦略の図である。初回免疫ベクターとしてＡｄ−ＭＡＧＥＡ３、及び追加免疫ベクターとして高用量又は低用量のＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３を付与された霊長類における平均Ｔ細胞応答を示す図である。Ｔ細胞応答は、追加免疫ベクターの５、１３、及び８４日後に測定された。追加免疫ベクターの５日後、初回免疫ベクターとしてＡｄ−ＭＡＧＥＡ３、及び追加免疫ベクターとしてＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３を付与された個々の霊長類におけるＴ細胞応答を示す図である。Ｔ細胞応答は、応答を刺激するために用いられるＭＡＧＥＡ３ペプチドプールに関して分類された。初回免疫ベクターとしてＡｄ−ｈＤＣＴ対Ａｄ−ｈＤＣＴ＋シクロホスファミドのみの後、又は初回免疫ベクターとしてＡｄ−ｈＤＣＴ対Ａｄ−ｈＤＣＴ＋シクロホスファミド、及び追加免疫ベクターとしてＶＳＶ−ｈＤＣＴでプライム−ブーストワクチン接種後、転移性肺癌マウスモデルにおける生存プロットを示す図である。

詳細な説明

[0067]本開示は、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットを提供する。キットは、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通型上皮抗原若しくは癌精巣抗原１、又はその変異体を抗原として発現し、哺乳動物において上記抗原に対する免疫が生じるよう構築された、第１のウイルスを含む。キットは、同一の抗原、又は同一の抗原の変異体をコードし、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築された、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスも含む。第１のウイルスは、異種プライム−ブーストワクチン接種において「初回免疫」として作用し得るように、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる。

[0068]プライム−ブースト免疫（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）は、「異種」プライム−ブーストフォーマットにおいて、同一の抗原を用いる一方、不一致のワクチンデリバリー法で、又は「相同性」プライム−ブーストにおいて、一致のワクチンデリバリー法で付与され得る。ベクター化ワクチンプラットフォームを同種ワクチン接種として用いることにより、第２の応答においてベクターと導入遺伝子の両方に対する応答の追加免疫が導かれるとき、異種プライム−ブースト法が好ましい。対照的に、第１及び第２のベクターに対する応答は、一次応答であり、それ故、それほど強くないので、異種システムは、第２の応答（すなわち、追加免疫された応答）を抗原に集中させる。

[0069]本開示において、第１のウイルス及びＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、異種プライム−ブーストフォーマットにおいて用いられる。

[0070]上で挙げた抗原タンパク質は、胸腺でのしっかりと制御されたプロセスのマイナスセレクションを介した免疫系により（ＫｒｕｉｓｂｅｅｋＡＭ及びＡｍｓｅｎＤ，（１９９６）ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ８：２３３−２４４；ＳｔｏｃｋｉｎｇｅｒＢ（１９９９）ＡｄｖＩｍｍｕｎｏｌ７１：２２９−２６５）、又は末梢寛容化により、既に寛容化された自己抗原である。これらの抗原タンパク質、及び任意の他の自己抗原に対するワクチンを開発する主要な挑戦は、癌細胞に対して選択的に向けられた、強力な免疫応答を誘導することである。多数の腫瘍関連抗原ペプチドが発見されているが、本開示の著者らは、どの腫瘍関連抗原ペプチドが、ワクチンを開発するために首尾よく用いられ得るかを予測することが不可能であることを見つけ出した。

[0071]メラノーマ抗原，ファミリーＡ，３（ＭＡＧＥＡ３）は、「癌精巣抗原」である。ＭＡＧＥファミリーの、腫瘍特異的抗原をコードする遺伝子は、ＤｅＰｌａｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４０：３６０−３６９（１９９４）で考察され、ＭＡＧＥＡ３は、メラノーマ、結腸直腸、及び肺を含む、広範の腫瘍で発現される。このタンパク質は、本開示の著者らにより、第１のウイルスとＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスの両方で抗原タンパク質として用いられた。著者らは、ＭＡＧＥＡ３タンパク質の変異体も、第１のウイルスとＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスの両方で抗原タンパク質として用いた。

[0072]ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）腫瘍性タンパク質Ｅ６／Ｅ７は、頸癌で構造的に発現される（ＺｕｒＨａｕｓｅｎ，Ｈ（１９９６）ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１２８８：Ｆ５５−Ｆ７８）。さらに、ＨＰＶタイプ１６及び１８は、頸癌の原因の７５％のである（ＷａｌｂｏｏｍｅｒｓＪＭ（１９９９）ＪＰａｔｈｏｌ１８９：１２−１９）。本開示の著者らは、ＨＰＶタイプ１６及び１８のＥ６／Ｅ７腫瘍性タンパク質の融合タンパク質を抗原タンパク質として用いた。融合タンパク質は、ＨＰＶタイプ１６／１８Ｅ６／Ｅ７を融合タンパク質として共発現するヌクレオチド配列を用いて発現され、そして融合タンパク質を、発癌能を取り除くために変異させた。融合タンパク質は、本開示の著者らにより、第１のウイルスとＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスの両方で抗原タンパク質として用いられた。

[0073]前立腺の６回膜貫通型上皮抗原（ｈｕＳＴＥＡＰ）は、最近同定されたタンパク質であり、前立腺癌で過剰発現されること、並びに膵臓、結腸、乳房、精巣、頸部、膀胱、卵巣、急性リンパ性白血病及びユーイング肉腫を含む複数の癌細胞株でアップレギュレーションされることが示されている（ＨｕｂｅｒｔＲＳら、（１９９９）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ９６：１４５２３−１４５２８）。ＳＴＥＡＰ遺伝子は、親水性のアミノ末端ドメイン及びカルボキシル末端ドメインにより隣接された、６つの潜在的な膜貫通領域を有するタンパク質をコードする。このタンパク質は、本開示の著者らにより、第１のウイルスとＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスの両方で抗原タンパク質として用いられた。

[0074]癌精巣抗原１（ＮＹＥＳＯ１）は、精巣及び卵巣等の正常成人組織で、及び種々の癌で発現される癌／精巣抗原である（ＮｉｃｈｏｌａｏｕＴら、（２００６）ＩｍｍｕｎｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ８４：３０３−３１７）。癌精巣抗原は、固有ファミリーの抗原であり、正常な成人において精巣生殖細胞に制限された発現を有するが、軟部組織肉腫、メラノーマ及び上皮癌を含む、種々の固形腫瘍で異常に発現される。このタンパク質は、本開示の著者らにより、第１のウイルスとＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスの両方で抗原タンパク質として用いられた。

[0075]異種プライム−ブーストワクチンにおける抗原タンパク質としてのＭＡＧＥＡ３、ＨＰＶＥ６／Ｅ７融合、ｈｕＳＴＥＡＰ、及びＮＹＥＳＯ１タンパク質の良好な使用と対照的に、本開示の著者らは、エプスタイン−バー核抗原１（ＥＢＤＮＡ１、配列番号１６、配列番号１７によりコードされる）が、同様の免疫応答を生じることができないことを見つけ出した。ＥＢＤＮＡ１は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）と関連し（ＳｉｂｉｌｌｅＨら、（２００３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ１００：１０９８９−１０９９４）、ＥＢＶ関連腫瘍で一貫して発現される（ＹｏｕｎｇＬＳら、（２００４）ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓ−Ｃａｎｃｅｒ４：７５７−７６８）、多機能のウイルスタンパク質である。ＥＢＤＮＡ１は、タンパク質をアミノ末端ドメイン及びカルボキシ末端ドメインに分離させる、グリシン−アラニン繰り返し配列を有する（ＹｏｕｎｇＬＳ（２００４）ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓ−Ｃａｎｃｅｒ４：７５７−７６８）。この配列は、プロテアソーム破壊を防ぎ、並びに抗原プロセシング及びＭＨＣクラスＩ拘束性抗原提示を損ない、タンパク質を安定化させるようにも思われる。これにより、このタンパク質は、ウイルス感染細胞に対するＣＤ８拘束性細胞傷害性Ｔ細胞応答を阻害する（ＬｅｖｉｔｓｋａｙａＪら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７５：６８５−６８８）。

[0076]胎盤特異的タンパク質１（ＰＬＡＣ−１）は、異種プライム−ブーストワクチンにおいて免疫応答を生じることができない、腫瘍関連抗原タンパク質の別の例である。

[0077]本開示の内容において、腫瘍関連抗原タンパク質の「変異体」は、（ａ）腫瘍関連抗原タンパク質由来の少なくとも１つの腫瘍関連抗原エピトープを含み、（ｂ）腫瘍関連抗原タンパク質と少なくとも７０％同一である、タンパク質を指す。変異体は、腫瘍関連抗原タンパク質と少なくとも８０％同一であることが好ましい。変異体は、腫瘍関連抗原タンパク質と少なくとも９０％同一であることがより好ましい。変異体は、腫瘍関連抗原タンパク質と少なくとも９５％同一であることがなおより好ましい。より高い配列同一性を有する変異体は、エピトープが同様の３次元的様式で野生型抗原タンパク質に提示される、増大した可能性を有する。

[0078]一般的に、腫瘍関連抗原エピトープは、抗原タンパク質全体を重複する一連のペプチドにバラバラにするか、又は無作為のペプチドのライブラリーを作製し、ペプチドプールを用いて、タンパク質標的でワクチン接種した動物由来のＰＢＭＣ又は脾細胞を刺激することによるＴ細胞応答を探すことにより、同定され得る。応答を有するプールは、そのペプチドを潜在的抗原エピトープとして同定する。このアプローチは、Ｍｏｒｒｉｓ，ＧＥにより、ＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、２００７、１〜３ページ（ｄｏｉ：１０．１００２／９７８０４７００１５９０２．ａ０００２６２４．ｐｕｂ２）で考察される。

[0079]十分に受け入れられる抗原エピトープを集約するデータベースは、ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎＰ、ＳｔｒｏｏｂａｎｔＶ、ＶｉｇｎｅｒｏｎＮ、ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅＢにより、「Ｔ細胞確定ヒト腫瘍抗原のデータベース：２０１３年アップデート」ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎ２０１３１３：１５、及び＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ／＞で提供される。

[0080]腫瘍関連抗原エピトープは、ＭＡＧＥＡ３について既に同定されている。したがって、ＭＡＧＥＡ３タンパク質の変異体は、例えば、ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ、ＴＦＰＤＬＥＳＥＦ、ＶＡＥＬＶＨＦＬＬ、ＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹ、ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ、ＲＥＰＶＴＫＡＥＭＬ、ＡＥＬＶＨＦＬＬＬ、ＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹ、ＷＱＹＦＦＰＶＩＦ、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ、ＶＩＦＳＫＡＳＳＳＬＱＬ、ＶＩＦＳＫＡＳＳＳＬＱＬ、ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬ、ＧＤＮＱＩＭＰＫＡＧＬＬＩＩＶ、ＴＳＹＶＫＶＬＨＨＭＶＫＩＳＧ、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ、及びＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥからなる群より選択される少なくとも１つの腫瘍関連抗原エピトープを含み、ＭＡＧＥＡ３タンパク質と少なくとも７０％同一である抗原タンパク質であってもよい。

[0081]腫瘍関連抗原タンパク質の変異体が、高いアレル頻度、例えば、集団の４０％より高い頻度を有する抗原エピトープのみを含むことが所望されてもよい。したがって、ＭＡＧＥＡ３の変異体の好ましい例は、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ、及びＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹからなる群より選択される少なくとも１つの抗原エピトープを含み、ＭＡＧＥＡ３タンパク質と少なくとも７０％同一である、タンパク質を含んでもよい。

[0082]第１のウイルスにより発現される抗原は、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスにより発現される抗原と同一の配列を正確に有する必要はない。ＭａｒａｂａＭＧ１により発現される抗原は、第１のウイルスにより発現される抗原に対する重複した免疫応答をただ誘導しなければならない。例えば、第１のウイルスはＭＡＧＥＡ３を発現してもよく、ＭａｒａｂａＭＧウイルスはＭＡＧＥＡ３変異体を発現してもよく、又は逆であってもよい。ＭＡＧＥＡ３とＭＡＧＥＡ３の変異体の両方は、重複する免疫応答を誘導する（ＭＡＧＥＡ３とＭＡＧＥＡ３の変異体の両方は、少なくとも１つの同一の腫瘍関連抗原配列を含む）ので、第１のウイルスは初回免疫として作用し、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは追加免疫として作用する。ＭＧ１ウイルスが投与されるとき、哺乳動物において第１の抗原に対して生じた免疫応答は、主に、ＭＡＧＥＡ３又はＭＡＧＥＡ３変異体に対する免疫応答をもたらせば十分である。

[0083]ウイルスはそれ自体でタンパク質を発現する能力を有しないので、本開示の内容において、「ウイルスにより発現されるタンパク質」の全ての考察及び参照は、ウイルスに感染した細胞により発現されるタンパク質をより正確に指すことは理解されるべきである。同様に、「タンパク質を発現するウイルス」又は「タンパク質を発現できるウイルス」の全開示、及び参照は、タンパク質がウイルスに感染した細胞により発現されるのに必要な遺伝情報を含む、ウイルスをより正確に指す。

[0084]キットは、第１のウイルスを投与することにより、哺乳動物において生じた腫瘍関連抗原タンパク質に対する初回免疫応答を増大させる、免疫増強化合物（ｉｍｍｕｎｅ−ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇｃｏｍｐｏｕｎｄ）、例えば、シクロホスファミド（ＣＰＡ）をさらに含んでもよい。シクロホスファミドは、腫瘍関連抗原タンパク質に対する増強された免疫応答を導き得る、化学療法剤である。相乗マウスメラノーマ腫瘍モデルにおいて、初回免疫ベクターに先立ち投与されたＣＰＡは生存を有意に増大し、一方、追加免疫ベクターに先立ち投与されたＣＰＡは増大しなかった。

[0085]本明細書に開示される治療アプローチは、（１）ウイルスワクチン、及び（２）腫瘍退縮ウイルスワクチンとしてのＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス（両方が、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通型上皮抗原若しくは癌精巣抗原１、又はその変異体を発現する）を組み合わせる。腫瘍退縮ワクチンでの追加免疫は、ウイルスワクチンにより初回免疫された動物において、腫瘍退縮ウイルスによる腫瘍減量及び腫瘍特異的ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）の多大な増大の両方を導き得る。逆説的に、腫瘍退縮ウイルスの複製が、腫瘍のない動物と比較して、腫瘍を有する動物で増幅されるので、この方法は、腫瘍のない動物と比較して、腫瘍を生じる際により大きな抗腫瘍応答を実際に生じさせ、腫瘍のない動物での腫瘍退縮ウイルスの複製、及び抗原特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の関連数と比較したとき、抗原特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数の増大を導く。

[0086]これらの遺伝子の発現産物は、ペプチドへとプロセシングされ、順に、細胞表面に発現される。これは、特異的ＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を導き得る。外来抗原に対するＴ細胞応答は、細胞溶解性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を含む。ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞又は細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、活性化されたとき、ＨＬＡクラスＩ分子により提示された適当な抗原を提示する細胞を溶解するＴ細胞である。ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞は、適当な抗原をＨＬＡクラスＩＩ分子により表面に提示するマクロファージ及び抗原産生Ｂ細胞を刺激するための、サイトカインを分泌するＴ細胞である。

[0087]タンパク質「ＭＡＧＥＡ３」は、「ＭＡＧＥ−Ａ３」とも称され、メラノーマ関連抗原３を表す。本開示による抗原ＭＡＧＥＡ３タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質である。このアミノ酸配列は配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされてもよい。あるいは、アミノ酸配列は配列番号３のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子によりコードされてもよい。配列番号１のタンパク質を発現するマイナスセンスＲＮＡウイルスは、配列番号２又は３のポリヌクレオチドの逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。配列番号１のタンパク質を発現するプラスセンスＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスは、配列番号２又は３である配列を含んでもよい。

[0088]本開示による抗原ＭＡＧＥＡ３変異体タンパク質の例は、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質である。このアミノ酸配列は配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされてもよい。配列番号４のタンパク質を発現するマイナスセンスＲＮＡウイルスは、配列番号５の逆相補的ＲＮＡバージョンである配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。配列番号４のタンパク質を発現するＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスは、配列番号５である配列を含んでもよい。

[0089]かかるマイナスセンスＲＮＡウイルスの一例は、配列番号６の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むＭａｒａｂａウイルスである。

[0090]本開示による抗原タンパク質「Ｅ６／Ε７融合タンパク質」又は「ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質」は、配列番号７のアミノ酸配列を含むタンパク質である。このアミノ酸配列は配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされてもよい。配列番号７のタンパク質を発現するマイナスセンスＲＮＡウイルスは、配列番号８のポリヌクレオチドの逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。配列番号７のタンパク質を発現するＤＮＡウイルス又はプラスセンスＲＮＡウイルスは、配列番号８のポリヌクレオチドを含んでもよい。かかるマイナスセンスＲＮＡウイルスの一例は、配列番号９の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むＭａｒａｂａウイルスである。

[0091]本開示によるタンパク質「ｈｕＳＴＥＡＰ」又は「前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通型上皮抗原」は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質である。このアミノ酸配列は配列番号１１のヌクレオチド配列によりコードされてもよい。配列番号１０のタンパク質を発現するマイナスセンスＲＮＡウイルスは、配列番号１１のポリヌクレオチドの逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。配列番号１０のタンパク質を発現するＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスは、配列番号１１である配列を含んでもよい。かかるマイナスセンスＲＮＡウイルスの一例は、配列番号１２の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、Ｍａｒａｂａウイルスである。

[0092]本開示によるタンパク質「ＮＹＥＳＯ１」又は「ヒト癌精巣抗原１」は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質である。このアミノ酸配列は配列番号１４のヌクレオチド配列によりコードされてもよい。配列番号１３のタンパク質を発現するマイナスセンスＲＮＡウイルスは、配列番号１４のポリヌクレオチドの逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。配列番号１３のタンパク質を発現するＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスは、配列番号１４である配列を含んでもよい。かかるマイナスセンスＲＮＡウイルスの一例は、配列番号１５の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、Ｍａｒａｂａウイルスである。

[0093]上で示された配列は付録Ａに示される。

[0094]用語「哺乳動物」は、ヒト、及び非ヒト哺乳動物を指す。用語「癌」は、対象のウイルスで用いられる、腫瘍関連抗原タンパク質（すなわち、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通型上皮抗原、又は癌精巣抗原１）を発現する任意の癌を包含するよう、本明細書で用いられる。

[0095]例えば、ＭＡＧＥＡ３を抗原タンパク質とみなすとき、用語「癌」は、ＭＡＧＥＡ３を抗原として発現する任意の癌を包含する。かかる癌の例は、メラノーマ、非小細胞肺癌、頭部癌及び頸癌、結腸直腸癌、並びに膀胱癌を含むが、これらに限定されない。

[0096]Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質を抗原タンパク質とみなすとき、用語「癌」は、Ｅ６及びＥ７タンパク質を抗原タンパク質として発現する任意の癌を包含する。かかる癌の例は頸癌を含むが、これに限定されない。

[0097]第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方は、哺乳動物に、独立して、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は鼻腔内投与されてもよい。ウイルスの投与後、免疫応答は、哺乳動物により、免疫応答間隔内、例えば、約４日以内に生じ、月、年、又はもしかすると一生まで延長する。

[0098]第１のウイルスは、第１のウイルスが患者に投与された後、腫瘍関連抗原タンパク質又はその変異体に対する免疫応答を誘導する任意のウイルスであり得る。本開示により用いられ得るウイルスは、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）、ポックスウイルス、レトロウイルス、及びアルファウイルスを含む。ポックスウイルスの例はワクシニアウイルスである。レトロウイルスの例はレンチウイルスである。アルファウイルスの例はセムリキ森林ウイルスである。

[0099]腫瘍関連抗原タンパク質又はその変異体に対する免疫応答を確立するために、第１のウイルス及びＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスを用いたワクチン接種は、十分に確立された技術を用いて行われてもよい。当業者は、免疫応答を生じさせるのに必要なウイルスの量が、例えば、選択された抗原、抗原をデリバリーするために用いられるウイルスベクター、及び処置されるべき哺乳動物を含む多数の要素、例えば、種、年齢、大きさなどで変動することを理解するだろう。この点において、例えば、マウスへの少なくとも約１０^７ＰＦＵのアデノウイルスベクターの筋肉内投与は、免疫応答を生じさせるのに十分である。対応する量は、ヒトへの投与が免疫応答を生じさせるのに十分であろう。

[00100]哺乳動物において第１のウイルスの投与により免疫応答が生じた後、腫瘍関連抗原タンパク質又はその変異体をコードするＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、腫瘍退縮ウイルス治療に適当な量で、適当な免疫応答間隔内で投与される。適当な免疫応答間隔は、例えば、少なくとも約２４時間、好ましくは、少なくとも約２〜４日又はそれ以上、例えば、少なくとも約１週間、又は少なくとも約２週間であってもよい。当業者によって理解されるであろうように、腫瘍退縮ウイルス療法に適当なＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスの量は、処置すべき哺乳動物に応じて変動する。例えば、マウスに静脈内投与された１０^８ＰＦＵのＭＡＧＥＡ３をコードするＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、腫瘍退縮治療に十分である。対応する量は、ヒトにおける使用に十分であろう。

[00101]腫瘍関連抗原タンパク質又はその変異体をコードするＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、腫瘍関連抗原タンパク質又はその変異体をコードする導入遺伝子の逆相補鎖（ｒｅｖｅｒｓｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスに標準的組換え技術を用いて組み込むことにより、調製してもよい。例えば、導入遺伝子の逆相補鎖は、ＭａｒａｍａＭＧ１ウイルスのゲノムに組み込まれてもよいか、又は別法として、導入遺伝子を組み込んでいるプラスミドを用いて、ウイルスに組み込まれてもよい。腫瘍をコードする導入遺伝子は、コドン最適化導入遺伝子であってもよい。

[00102]腫瘍退縮ＭａｒａｂａＭＧ１は、強力な腫瘍退縮ワクチンプラットフォームである。ＭａｒａｂａＭＧ１−ワクチンは、メラノーマ関連抗原に対する検出可能な応答を刺激することが不可能である一方、既存の腫瘍特異的ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫をブーストする能力を発揮した。同系マウスメラノーマ腫瘍モデルの処置に適用するとき、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１により仲介されるリコール免疫化は、処置した動物の２０％より多くで、完全寛解と共に生存期間中央値の延長をもたらした。

[00103]霊長類の毒性研究において、Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３初回免疫、続いてＭａｒａｂａ−ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３追加免疫での異種プライム−ブーストワクチン接種は、同系マウス腫瘍モデルにおいて得られるＴ細胞応答に匹敵するＴ細胞応答をもたらし、これは、非近交系霊長類集団において、プライム−ブースト腫瘍退縮ワクチン戦略が、腫瘍を移植することができ且つ生存の劇的な延長を得る動物モデルに匹敵する、免疫応答を付与することを示す。

[00104]本開示の著者らは、配列番号７、１０、又は１３の配列を有するタンパク質を用いて、免疫応答を、患者においてＭａｒａｂａＭＧ１での異種プライムブーストを用いて、刺激することができることも見つけ出した。対照的に、本開示の著者らは、ＥＢＤＮＡ−１タンパク質又は胎盤特異的タンパク質１（ＰＬＡＣ−１）を発現する第１のウイルスの投与、続いてＥＢＤＮＡ−１タンパク質又はＰＬＡＣ−１をそれぞれ発現するＭａｒａｂａ−ＭＧ１の投与が、免疫応答を刺激することが不可能であることを見つけ出した。

[00105]実施例１：ＭＧ１−ｈＤＣＴは弱い初回免疫ベクターであるが、強力な追加免疫ベクターである。
[00106]Ａｄ−エンプティー及びＡｄ−ｈＤＣＴは、ヒトセロタイプ５に基づく、複製欠損アデノウイルス（Ｅ１／Ｅ３欠失）である（ＬａｎｅＣ．ら、（２００４）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６４：１５０９−１５１４；ＮｇＰ．ら、（２００１）ＭｏｌＴｈｅｒ３：８０９−８１５）。ｈＤＣＴ導入遺伝子を発現するよう、複製欠損アデノウイルスベクターを操作し、ベクターは全長ヒトメラノーマ関連抗原ＤＣＴ（ドパクロムトートメラーゼ）をコードし、一方、Ａｄ−エンプティーは導入遺伝子を有しない。得られたアデノウイルスベクターを「Ａｄ−ｈＤＣＴ」と呼ぶ。

[00107]メラノーマ関連抗原ｈＤＣＴ導入遺伝子のヒト形態を発現するよう、ＭａｒａｂａウイルスのＭＧ１変異体を操作した。得られたＭＧ１ウイルスベクターを、「ＭＧ１−ｈＤＣＴ」又は「ＭａｒａｂａＭＧ１−ｈＤＣＴ」と呼ぶ。他のウイルスベクターを、同様の慣習を用いて命名する。

[00108]Ｇウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子の間での導入遺伝子挿入により、組換えＭａｒａｂａ及びＶＳＶを作製した。ＶＳＶ−ｈＤＣＴは、ＶＳＶの野生型インディアナ（Ｉｎｄｉａｎａ）株に由来する（ＢｒｉｄｌｅＢＷ．ら、（２００９）１７：１８１４−１８２１；ＬａｗｓｏｎＮＤ．ら、（１９９５）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９２：４４７７−４４８１）。ＭＧ１−ＧＦＰ（対照非免疫原性導入遺伝子挿入として用いた緑色蛍光タンパク質）、及びＭＧ１−ｈＤＣＴは、Ｍａｒａｂａウイルスの弱毒株ＭＧ１に由来する。インビボ研究に先立ち、１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ（全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹより）にて培養した感染ベロ細胞由来の可溶化液のウエスタンブロットにより、ウイルスからのＤＣＴ（及びＧＦＰ）発現を確かめた。

[00109]単独療法として投与したＭＧ１−ｈＤＣＴの治療効果をまず評価した。肺転移を生じさせるために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（研究開始時に８〜１０週齢）に、生理食塩水２００μｌ中２．５×１０^５個のＢ１６−Ｆ１０細胞（マウスＤＣＴ抗原を発現するマウスメラノーマ細胞）を静脈内注射した。５又は１４日後に腫瘍退縮ワクチンを全身的に注射し、メラノーマ抗原ＤＣＴに対するＴ細胞応答を、１９日目の血液で測定した。ウイルスを、高用量（ＰＢＳ２００μｌ中１０^９ｐｆｕ、静脈内）で全身的に投与した。ＰＢＭＣ又は脾細胞を単離し、これらを、それぞれ、ＤＣＴのＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ拘束性免疫優性エピトープに対応するＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（ＳＶＹ）又はＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ（ＫＦＦ）ペプチドで刺激することにより、Ｔ細胞応答を測定した。ＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）後、フローサイトメトリーにより、応答しているＴ細胞を検出した。

[00110]図１Ａ及び１Ｂに示す通り、ＭＧ１−ｈＤＣＴは、腫瘍を有するマウスにおいて、ＤＣＴ特異的ＣＤ８^＋又はＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を刺激することができなかった（図１Ａ）。単独で投与したＭＧ１−ｈＤＣＴワクチンは、腫瘍の結果を改善しなかった。実際に、腫瘍曝露の１４日後に処置したマウスは、無処置のマウスと同様の時間フレームでエンドポイントに達した（Ａｄ−エンプティー対照群について２０日後、対してＡｄ−エンプティー＋ＭＧ１−ｈＤＣＴ群について２１日後）（図１Ｂ）。さらに、マウスをＭＧ１−ｈＤＣＴで処置したときでさえ、生存を延長せず、腫瘍移植の５日後の早さであった（ＭＧ１−ｈＤＣＴ群、図１Ｂ）。結論として、ＭＧ１−ｈＤＣＴは、抗ＤＣＴ免疫を誘導することに失敗したばかりでなく、ＭＧ１−ｈＤＣＴの腫瘍退縮活性は、治療上の利点を提示しなかった。これらの結果は、ＭＧ１−ｈＤＣＴが、腫瘍抗原ＤＣＴに対して有意なＴ細胞応答を刺激することができず、したがって、弱い初回免疫ベクターであることを示す。

[00111]腫瘍退縮ＶＳＶベクターが、既存の免疫の強力な追加免疫として働くことは、既に報告されている（ＢｒｉｄｌｅＢＷ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８４：４２６９−４２７５；国際公開第２０１０／１０５３４７号）。本開示において、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスの追加免疫ワクチンとして働く能力を調べた。アデノウイルスベクターを初回免疫ベクターとして用い、２×１０^８ｐｆｕ（大腿当たり、ＰＢＳ５０μｌ中１×１０^８ｐｆｕ）の総用量で、筋肉内（ｉ．ｍ．）投与した。アデノウイルス注射のため、５％吸入イソフルレンを含有する密閉チャンバー内でマウスを麻酔した。Ａｄ−ｈＤＣＴを初回免疫ベクターとして用いて、既存のＤＣＴ特異的応答の追加免疫としてＭＧ１−ｈＤＣＴを評価した。Ｍａｒａｂａウイルスを追加免疫ベクターとして評価するために、種々の投与経路を評価した。このマウス株において十分に許容される腫瘍退縮用量の１×１０^９ｐｆｕのウイルスを投与し、腫瘍モデルで実行可能である最長の間隔であるので、初回免疫後１２日の間隔を選択した。この用量のＭＧ１−Ｍａｒａｂａ−ｈＤＣＴを、静脈内（ｉ．ｖ．）、鼻腔内（ｉ．ｎ．）、及び筋肉内（ｉ．ｍ．）経路により投与したとき、静脈内経路は、末梢ＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γについてのＩＣＳにより測定した通り、十分に優れていることが明らかになった（静脈内による２８．３３％±３．８２に対して、鼻腔内による４．７３％±１．５２に対して、筋肉内１３．８４％±１．８８）。Ｍａｒａｂａ投与の５日後に応答を測定し、これは、ＭＧ１−ｈＤＣＴにより仲介される追加免疫応答のピークと一致した。静脈内で追加免疫した動物において、有意な割合のＤＣＴ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞も脾臓で測定し、これは、初回免疫のみした動物と比較して、両方のワクチンベクターを投与したマウスで３倍増大した（Ａｄ−ｈＤＣＴ群での３．４５％±０．４５に対して、Ａｄ−ｈＤＣＴ＋ＭＧ１−ｈＤＣＴ免疫動物で１１．０２％±２．１４（ｐ＝０．００８５^＊＊））。Ａｄ−ｈＤＣＴは、血中で検出可能なＤＣＴ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団及び脾臓においてかろうじて検出可能な集団を、誘導することができず、一方、ＭＧ１Ｍａｒａｂａ−ｈＤＣＴ追加免疫は、静脈内で投与したときのみ、はっきりとした全身性ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を生じることができた（０．３０％±０．１１）。応答は、０．１４％±０．０３の、ＤＣＴＫＦＦペプチド曝露に反応している脾臓のＣＤ４^＋Ｔ細胞を伴い、脾臓においても検出可能であった。ＶＳＶと同様に、ＭＧ１Ｍａｒａｂａウイルスによる最大追加免疫を、静脈内投与により達成する。結論として、１０^９ｐｆｕの用量でのＭａｒａｂａ−ベクター化ワクチンの全身性デリバリーが、抗原特異的ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋Ｔ細胞集団両方の効率的追加免疫を可能にするようであった。この理由のため、この経路及び用量を、ＭａｒａｂａＭＧ１投与のためのその後のインビボ実験で用いた。

[00112]ＭａｒａｂａＭＧ１−ｈＤＣＴがＶＳＶ−ｈＤＣＴより強力な追加免疫ベクターであることを示すために、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスをＡｄ−ｈＤＣＴで初回免疫し（導入遺伝子を欠く対照ベクターとして、Ａｄ−ＢＨＧを含んだ）、次に、１４日後に、静脈内用量のＶＳＶ−ｈＤＣＴ又はＭａｒａｂａ−ｈＤＣＴのいずれかで追加免疫した。追加免疫ベクターの５日後、末梢血において、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の免疫分析を測定した。均等用量で、Ｍａｒａｂａワクチン接種により誘導された応答は、ＶＳＶにより誘導された応答の３〜８倍の大きさであった（図２）。

[00113]実施例２：癌のマウスモデルにおけるＭＧ１−ｈＤＣＴワクチン戦略
[00114]追加免疫ベクターとして投与したＭＧ１−ｈＤＣＴの治療効果を、続いて調べた。動物において肺転移を生じさせるために、Ｂ１６−Ｆ１０移植の５日後に動物にＡｄ−ｈＤＣＴ初回免疫ワクチンを与え、続いて９日後に、腫瘍退縮追加免疫ワクチンとして１回静脈内用量のＭＧ１Ｍａｒａｂａ−ｈＤＣＴを与えた。Ａｄ−ｈＤＣＴ初回免疫−ＭＧ１−ｈＤＣＴ追加免疫ワクチン接種は、非常に強力なＤＣＴ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を生じ（平均％ＩＦＮ−γ^＋ＣＤ^８＋Ｔ細胞＝２７．５４±２．１７、図３）、これは追加免疫されていないマウス（Ａｄ−ｈＤＣＴ群で１．９５％±０．２９、及びＡｄ−ｈＤＣＴ＋ＭＧ１−ＧＦＰ群で１．９１％±０．５９、図３）におけるものより、１４倍強かった。同様に、ＤＣＴ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を、ＭＧ１−ｈＤＣＴ追加免疫動物で測定し、一方、初回免疫のみのマウスでは稀に検出した（Ａｄ−ｈＤＣＴ＋ＭＧ１−ｈＤＣＴ群での平均％ＩＦＮ−γ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞＝０．２５％±０．０６に対して、Ａｄ−ｈＤＣＴ及びＡｄ−ｈＤＣＴ＋ＭＧ１−ＧＦＰ群での＜０．０５％、図３）。

[00115]処置結果で見る通り、Ａｄ−ｈＤＣＴ免疫化は、無処置のマウスと比較して生存期間中央値の１０日間の延長を可能にした（Ａｄ−ｈＤＣＴ処置について３１日に対して、Ａｄ−エンプティー群について２０．５日（図４））。Ａｄ−ｈＤＣＴ処置、続くＭＧ１Ｍａｒａｂａ−ＧＦＰ腫瘍退縮処置は、生存を改善しなかった（Ａｄ−ｈＤＣＴ＋ＭＧ１−ＧＦＰ群について生存期間中央値２７．５日、図４）。しかしながら、ＭａｒａｂａＭＧ１−ＤＣＴワクチンで抗腫瘍免疫を追加免疫することは、Ａｄ−ｈＤＣＴ初回免疫のみの動物と比較して、生存期間中央値の２０日の延長を伴い、腫瘍結果を劇的に改善した（Ａｄ−ｈＤＣＴ＋ＭＧ１−ｈＤＣＴ群について５１日、図４）。さらに重要なことに、腫瘍退縮ＭＧ１−ｈＤＣＴ追加免疫処置は、２３．３％の長期生存をもたらした（図４）。

[00116]治療効果における腫瘍特異的ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞応答のそれぞれの寄与を特徴付けるために、各Ｔ細胞区画を選択的に枯渇させた（データは示していない）。追加免疫の時点でのＣＤ８^＋Ｔ細胞集団の枯渇は、ＭＧ１−ｈＤＣＴ投与の治療上の利点を無効にした。対照的に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の枯渇は治療効果に有意には影響しないようであり、このことは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＭａｒａｂａ免疫の追加免疫がＣＤ４^＋非依存性であることを示している。腫瘍成長の制御におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の重大な役割を認める一方、これらの結果は、Ｍａｒａｂａワクチンで腫瘍特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を追加免疫することが、癌治療の強力な改善方法であることを示す。

[00117]最後に、Ｍａｒａｂａワクチンを含むプライム−ブースト戦略の効果も、非常に挑戦的な、転移性メラノーマ脳癌の頭蓋内Ｂ１６−Ｆ１０モデルで評価した。Ａｄ−ｈＤＣＴにより仲介される免疫療法は、Ａｄ−エンプティー対照について１５日からＡｄ−ｈＤＣＴ群について２５．５日への中央値の延長を伴い、メラノーマ脳メチオニンを生じているマウスの生存を有意に改善した（図５）。既に報告した通り、かかる治療効果は、生じた腫瘍特異的エフェクターＴ細胞の血液脳関門を越え、腫瘍ベッドに浸潤する能力を示す（ＢｒｉｄｌｅＢＷ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８４：４２６９−４２７５）。ＭａｒａｂａＭＧ１−ｈＤＣＴ腫瘍退縮追加免疫のさらなる投与は、処置動物の２１．４％において観察した曲線と共に４２日に達した生存期間中央値を伴い、腫瘍結果をさらに改善した（Ａｄ−ｈＤＣＴ＋ＭＧ１−ｈＤＣＴ群、図５）。

[00118]実施例３：抗ｍＰＬＡＣ１Ｔ細胞応答を誘導するためのワクチン戦略の失敗
[00119]ＭａｒａｂａＭＧ１及びＶＳＶは、ｈＤＣＴを腫瘍関連抗原として用いた追加免疫ベクターとして作用することができるが、全ての腫瘍関連抗原が異種プライム−ブーストワクチン戦略で用いられ得るわけではない。本開示の著者らは、ｈｕＡｄ５−ｍＰＬＡＣ１を初回免疫ベクターとして、及びＶＳＶ−ｍＰＬＡＣ１を追加免疫ベクターとして用いる異種プライム−ブーストワクチン戦略を試験した。

[00120]ＰＬＡＣ１は、胎盤で発現するが、幾つかの腫瘍細胞株、及び乳癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、及び結腸直腸癌患者の腫瘍でも報告された、最近記載された腫瘍関連抗原である（Ｓｉｌｖａ，ＷＡら、（２００７）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎ７：１８）。

[00121]Ａｄ−ｍＰＬＡＣ１は、ヒトセロタイプ５に基づく複製欠損アデノウイルス（Ｅ１／Ｅ３欠失）である（ＬａｎｅＣ．ら、（２００４）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６４：１５０９−１５１４；ＮｇＰ．ら、（２００１）ＭｏｌＴｈｅｒ３：８０９−８１５）。複製欠損アデノウイルスベクターを、全長マウス抗原ＰＬＡＣ１（胎盤特異的１）をコードするｍＰＬＡＣ１導入遺伝子を発現するよう操作した。得られたアデノウイルスベクターを、「Ａｄ−ｍＰＬＡＣ１」又は「ｈｕＡｄ５−ｍＰＬＡＣ１」と呼ぶ。

[00122]ＶＳＶウイルスを、メラノーマ関連抗原ｍＰＬＡＣ１導入遺伝子のヒト形態を発現するよう操作した。得られたＶＳＶウイルスベクターを、「ＶＳＶ−ｍＰＬＡＣ１」と呼ぶ。組換えＶＳＶを、Ｇウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子の間での導入遺伝子挿入により作製した。ＶＳＶ−ｍＰＬＡＣ１は、ＶＳＶの野生型インディアナ株に由来する（ＢｒｉｄｌｅＢＷ．ら、（２００９）１７：１８１４−１８２１；ＬａｗｓｏｎＮＤ．ら、（１９９５）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９２：４４７７−４４８１）。

[00123]Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、Ａｄ−ｍＰＬＡＣ１（２×１０^９ＰＦＵ筋肉内注射）で初回免疫し、次に１４日後に、１回静脈内用量のＶＳＶ−ｍＰＬＡＣ１（２×１０^９ＰＦＵ）で追加免疫した。脾細胞を単離し、これを、オーバーラップＰＬＡＣ１ペプチドライブラリー（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＬＡＣ１ｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｙ）由来の個々の１５ｍｍｅｒのペプチドで、合計６時間刺激する（ゴルジプラグを刺激に１時間加えた）ことにより、Ｔ細胞応答を測定した。刺激後、脾細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＩＦＮγについて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ及びＦｌｏｗＪｏで分析した。フローサイトメトリーにより、ＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）後に、応答しているＴ細胞を検出した。ｍＰＬＡＣ１ペプチドのいずれも、ＣＤ８又はＣＤ４Ｔ細胞のいずれかにおいてＩＦＮ−γの産生を刺激することはできなかった。

[00124]実施例４：ＭＡＧＥＡ３又はその変異体を有する腫瘍退縮ワクチンベクターの構築
[00125]Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３は、全長ヒトＭＡＧＥＡ３遺伝子を含有する、ヒトセロタイプ５に基づく複製欠損アデノウイルス（Ｅ１／Ｅ３欠失）である（ＬａｎｅＣ．ら、（２００４）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６４：１５０９−１５１４；ＮｇＰ．ら、（２００１）ＭｏｌＴｈｅｒ３：８０９−８１５）。ＭａｒａｂａＭＧ１−ｈＭＡＧＥＡ３を開発し、これは、ＭａｒａｂａウイルスのＭＧ１の二重変異体のＧウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子の間で挿入された、コドン最適化全長ヒトＭＡＧＥＡ３遺伝子を含有する（ＢｒｕｎＪ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９）。ＭＡＧＥＡ３配列（ＮＣＢＩ遺伝子番号：４１０２ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／４１０２）を、哺乳動物での発現のためコドン最適化し、次に、３’末端のＦＬＡＧタグ、並びに３’及び５’末端のＭｌｕｌ制限酵素部位と共に合成した。この配列を、シャトルベクターｐＭＲＢ−ＭＧ１／ｐＮＦにそのＭｌｕｌ部位（Ｇ遺伝子とＬ遺伝子の間）でライゲーションし、そしてこれは、それぞれ、Ｋｐｎｌ及びＮｈｅｌ部位により隣接して、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１ゲノムの一部をＧ遺伝子の開始からＬ遺伝子の終わりに含有する。ここで、ＭＡＧＥＡ３フラグ（ＭＡＧＥＡ３Ｆｌａｇ）をＧとＬの間に含有する、ＫｐｎｌからＮｈｅｌへの全領域を、次に、ｐＭＲＢ−ＭＧ１／ｐＮＦから取り除き、Ｋｐｎｌ及びＮｈｅｌ部位を用いて、ｐＭＲＢ−ＭＧ１ゲノムプラスミドに再度ライゲーションした。次に、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３フラグを回収し、プラーク精製した。これを図６に説明する。

[00126]アデノウイルスにより発現される全長ヒトＭＡＧＥＡ３タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよい。アデノウイルスは、配列番号２のヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、アミノ酸配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子によりコードされてもよい。したがって、アデノウイルスは配列番号３のコドン最適化ヌクレオチド配列を含んでもよい。

[00127]ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、配列番号２のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。あるいは、アミノ酸配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子によりコードされてもよい。したがって、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、配列番号３のコドン最適化ヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[00128]ＭＡＧＥＡ３の１つの変異体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質である。このアミノ酸配列は、配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされてもよい。アデノウイルスは、配列番号５のヌクレオチド配列を含んでもよい。ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスは、配列番号５のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含んでもよい。

[00129]配列番号４のタンパク質を発現するマイナスセンスＲＮＡウイルス、例えば、Ｍａｒａｂａウイルスは、配列番号６の逆相補的ＲＮＡバージョンである配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。

[00130]実施例５：健常な霊長類におけるＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３ワクチン免疫応答
[00131]健常カニクイザルを、ヒトでの使用に可能性のあるＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３腫瘍退縮ワクチンを開発するための、毒性及び免疫原性データを集めるよう設計した研究で用いた。カニクイザルの使用は、ヒトで予測されるものと定量的及び定性的に類似する応答を同定する可能性を最大にする。研究の開始に先立ち、霊長類を、動物到着時から血管アクセスポート移植術の時まで、４〜６週間気候順化させた。手術後最短２〜３週間後、それぞれの足に１用量当たり０．５ｍｌ、合計１×１０^１０ｐｆｕ、ゆっくりとした筋肉内注射により、注射して、動物を非複製アデノウイルスＡｄ−ＭＡＧＥＡ３初回免疫ベクターでワクチン接種した。Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３／ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３プライム−ブースト研究のため、ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３追加免疫に先立ち、２週（−１４日目）、又は４週（−２８日目）のいずれかで、Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３初回免疫を行った。故に、Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３投与を−１４日目又は−２８日目に行い、ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３追加免疫を０日及び３日に行った。Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３投薬レベルの理論的根拠は、文献、及びマカク（及びヒト）での１×１０^１０ｐｆｕの用量が毒性を観察せず、安全な用量であることを示す従前の実験（Ｂｅｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１０）からもたらされる。２週間追加免疫する群の動物に対して、ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３ウイルスを、実験０日及び３日（Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３の１４日及び１７日後）で、低用量１×１０^１０、又は高用量１×１０^１１のいずれかで静脈内注射した。４週間追加免疫する群の動物に対して、ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３ウイルスを、実験０日及び３日（Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３の２８日及び３１日後）で、低用量１×１０^１０、又は高用量１×１０^１１のいずれかで静脈内注射した。追加免疫するウイルスを、滅菌食塩水（ｐＨ７．５）３０ｍｌ中、３０分かけて血管アクセスポートを通じて注入した。ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３低投薬レベルの理論的根拠は、マウスの最大許容可能用量が１×１０^９であることを示す、前臨床研究からもたらされる。マカクまでスケールアップした相対的体表面積は、これを計ｐｆｕ３．５×１０^１０とみなす。ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３高投薬レベルの理論的根拠は、２×１０^１１ｐｆｕの用量レベルで毒性を観察しない、パイロット非ヒト霊長類（ＮＨＰ）毒性学研究からもたらされる。プライム−ブースト研究での動物を、早期（１４日目）又は後期（８４日目）のいずれかで屠殺した。Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３／ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３プライム−ブースト研究のため、全ての動物から５つの異なる時間ポイントで、血液試料を採取した。２週間の異種プライム−ブーストコホートでの動物について、任意のワクチン接種に先立ち、及び−１４日目の前日（ベースライン）、並びに実験の５日目、１３日目、及び８４日目に、血液試料を集めた。４週間の異種プライム−ブーストコホートでの動物について、任意のワクチン接種に先立ち、及び−２８日目の前日（ベースライン）、並びに実験の５日目、１３日目、及び８４日目に、血液試料を集めた。

[00132]Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３／ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３での異種プライム−ブーストワクチン接種に対する霊長類における免疫応答を評価するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、４時間（最後の３時間、ブレフェルジンＡの存在下で）、Ｔ細胞（再）刺激のため、１０種のｈＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドのプールとインキュベーションした（又はバックグラウンドの評価のため無刺激のまま残した）。ペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで８７種のペプチド（それぞれ、１５ｍｅｒ）で全ｈＭＡＧＥ−Ａ３抗原をカバーする、オーバーラップペプチドライブラリーに由来した。刺激後、Ｔ細胞を、蛍光抗ＣＤ８及び抗ＣＤ４抗体で２５分間染色した。この表面染色後、細胞を透過処理し、ＢＤＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで２０分間固定した。次に、蛍光抗ＩＦＮγ及び抗ＴＮＦα抗体での２５分間の細胞内染色によってサイトカイン発現を見ることにより、ｈＭＡＧＥ−Ａ３特異的Ｔ細胞を検出した。細胞分析を、ＢＤＣａｎｔｏフローサイトメーターで行った。

[00133]図７は、Ａｄ−ＭＡＧＥＡ３初回免疫後、高用量及び低用量ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３を追加免疫ベクターとして投与したサルの平均ＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答を示す。低用量ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３動物において、追加免疫の５日後、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の有意な増大が存在し、そしてこれは時間が立つにつれてしぼみ、一方、高用量ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３動物において、追加免疫の５日後、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の同様の有意な増大が存在し、そしてこれは、時間が立つにつれより高いレベルで持続する。図８は、研究の動物全てが、高用量又は低用量に関係なく、ＭＧ１−ＭＡＧＥＡ３での追加免疫の５日後、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の有意な増大を発揮したことを示す。霊長類におけるこれらのピークＴ細胞応答は、非近交系集団において、プライム−ブースト腫瘍退縮ワクチン戦略が、腫瘍を移植することができ且つ生存の劇的な延長を得る動物モデルに匹敵する、免疫反応を付与することを示す。

[00134]実施例６：ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質を発現するレンチウイルス初回免疫ベクター及び腫瘍退縮ワクチンベクターの構築及び免疫試験
[00135]ＨＰＶ導入遺伝子は、Ｒｂ又はｐ５３結合に必要なジンクフィンガーを取り除く（タンパク質の発癌能を取り除く）ために、全４つのヌクレオチド配列において欠失を有する、ＨＰＶセロタイプ１６全長野生型Ｅ６（ｇｉ／４９２７７２０／ｇｂ／ＡＡＤ３３２５２．１／ＡＦ１２５６７３＿１Ｅ６ヒトパピローマウイルスタイプ１６）、及びＥ７（ｇｉ／４９２７７２１／ｇｂ／ＡＡＤ３３２５３．１／ＡＦ１２５６７３＿２Ｅ７ヒトパピローマウイルスタイプ１６）配列、及びＨＰＶセロタイプ１８全長野生型Ｅ６（ｇｉ／１３７７５８／ｓｐ／Ｐ０６４６３．１／ＶＥ６＿ＨＰＶ１８ＲｅｃＮａｍｅ：Ｆｕｌｌ＝タンパク質Ｅ６）及びＥ７（ｇｉ／１３７７９２／ｓｐ／Ｐ０６７８８．２／ＶＥ７＿ＨＰＶ１８ＲｅｃＮａｍｅ：Ｆｕｌｌ＝タンパク質Ｅ７）配列である。得られた融合タンパク質は、柔軟なグリシンリンカー＋ＡＡＹ配列（それぞれの抗原を、抗原提示のため通常作製されるペプチドにタンパク質分解性に分解することを確かにするための、プロテアソーム切断部位として働く）を有する。コドン最適化融合ヌクレオチド配列は、５２７アミノ酸のＨＰＶ１６／１８Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質（配列番号７）を生じる。

[00136]ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを用いて作製した。修飾したＨＰＶ導入遺伝子を、ＥｃｏＲＩ制限部位を含有するプライマー（フォワードプライマーＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＧＡＡＣＴＧＣ、配列番号１８）、及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を含有するプライマー（リバースプライマーＡＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＣ、配列番号１９）を用いてＰＣＲ増幅した。ＨＰＶ導入遺伝子ＰＣＲ産物をアガロースゲル精製した。ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位で切断してｅＧＦＰを取り除き、アガロースゲル精製し、ＣＩＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ１８００９−０１９）を用いて脱リン酸化した。次に、切断したベクターをさらにアガロースゲル精製した。次に、ＨＰＶ導入遺伝子ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断ベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてライゲーションした。ライゲーション反応物をコンピテント細胞を用いてトランスフォメーションし、陽性コロニー由来のプラスミドＤＮＡをミニプレップで増幅した。次に、修飾したＨＰＶ導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを、マキシプレップで増幅した。ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、３つのプラスミド：修飾したＨＰＶ導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクター、パッケージングｐＣＭＶ−８．８４プラスミド、及びエンベロープｐＭＤ２Ｇプラスミドそれぞれ６．４μｇのトランスフェクション後、２９３Ｔ細胞にレスキューした。ウイルス上清を集め、０．４５μΜのフィルターを通して濾過し、５０，０００×ｇ、１６℃で１２０分間遠心分離した。ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、ＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で保存した。

[00137]ＭａｒａｂａウイルスのＭＧ１二重変異体のＧウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子の間で挿入された、パピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合導入遺伝子を含有するよう、ＭａｒａｂａＭＧ１を操作した（ＢｒｕｎＪ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９）。導入遺伝子配列（配列番号８）は、哺乳動物細胞での発現のため、コドン最適化した。ＨＰＶＥ６／Ｅ７を含有する、得られたＭａｒａｂａＭＧ１を、「Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＨＰＶＥ６／Ｅ７」と一般的に命名した。修飾したＭａｒａｂａＭＧ１骨格を用いて、クローニングを促進した。サイレント変異を、ＭａｒａｂａＭＧ１ゲノム骨格のＬ遺伝子に導入して、Ｍｌｕｌ部位の１つを取り除いた。第２のＭｌｕｌ部位を、ＧとＬの間のクローニング領域で、ＢｓｉＷＩ部位で置き換えた。これらのＭａｒａｂａＭＧ１ゲノム骨格への修飾は、シャトルプラスミドｐＭＲＢ−ＭＧ１／ｐＮＦを用いることを回避するので、Ｂｒｕｎらの文献に記載されたものより、より直接的なクローニングシステムを可能にした。ＨＰＶＥ６／Ｅ７融合導入遺伝子配列を、修飾したＭａｒａｂａＭＧ１ゲノム骨格に、そのＭｌｕｌ部位及びＢｓｉＷＩ部位（ＧとＬの間のクローニング領域）でライゲーションした。次に、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＨＰＶＥ６／Ｅ７をレスキューし（Ｂｒｕｎら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９に既に記載される通り）、１回プラーク精製し、オプティプレップ精製した。Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＨＰＶＥ６／Ｅ７は、配列番号９の逆相補的ＲＮＡバージョンであるゲノム配列を有する。

[00138]一般的に、０日での初回免疫ベクター（レンチウイルス−ＨＰＶＥ６／Ｅ７＋アジュバントとしてのｐｏｌｙｌ：Ｃ）の投与、及び１４日での１ｅ９ＰＦＵの追加免疫ベクター（Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＨＰＶＥ６／Ｅ７）の投与により、動物を免疫した。対照動物を、ＨＰＶＥ６／Ｅ７導入遺伝子の代わりに対照非免疫原性導入遺伝子挿入としてＧＦＰをコードするウイルスベクターでプライム−ブーストした。初回免疫応答の分析を１４日目に、追加免疫応答の分析を１９日目に行った。それぞれのレンチウイルス−ＨＰＶＥ６／Ｅ７調製物を、初回免疫ウイルスにアジュバントとして加えたｐｏｌｙｌ：Ｃ２５０μｇと共に作製し、次に、それぞれのウイルスについて５匹の動物の間で分けた。マウスをイソフルレンで麻酔し、レンチウイルス−ＨＰＶＥ６／Ｅ７／ｐｏｌｙｌ：Ｃ３０μＬを、後足蹠に注射した。残りのウイルスを、左の鼠径部リンパ節近くに、皮下注射した。初回免疫の１４日後、血液を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。次に、１×１０^９ＰＦＵＭＧ１−ＨＰＶＥ６／Ｅ７で、マウスを静脈内で追加免疫した。追加免疫の５日後、血液を抜き、免疫応答をフローサイトメトリーにより評価した。

[00139]免疫分析を以下の通り行った。血液を、後眼窩出血を介して、ヘパリン処理した毛細管チューブを用いて集め、ヘパリン中に回収した。次に、赤血球をＡＣＫ溶解バッファーを用いて溶解し、得られたＰＢＭＣを、腫瘍抗原に対する免疫応答について分析した。ＰＢＭＣを、ペプチドの不存在下でインキュベーションするか、又は２μｇ／ｍＬペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）で、合計５時間刺激した（ゴルジプラグを刺激に１時間加えた）。刺激後、ＰＢＭＣを、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＩＦＮγについて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ及びＦｌｏｗＪｏにて分析した。応答するＴ細胞を、ＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）後、フローサイトメトリーにより検出した。無刺激のＰＢＭＣの値をバックグラウンドとみなし、刺激したＰＢＭＣから得た値から引いた。データは平均＋／−ＳＥＭを表す。表１において、ＨＰＶＥ６／Ｅ７ペプチドが、免疫応答の存在を示す、ＣＤ８細胞におけるＩＦＮ−γ産生を刺激することができることを示した。

[00140]実施例７：癌精巣抗原１を発現するレンチウイルス初回免疫ベクター及び腫瘍退縮ワクチンベクターの構築及び免疫試験
[00141]ＮＹＥＳＯ１導入遺伝子は、１８０アミノ酸のタンパク質（配列番号１３）が生じるようヒト及びマウスでの発現のためコドン最適化された、全長野生型配列（配列番号１４）である。

[00142]癌精巣抗原１導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを用いて作製した。ＮＹＥＳＯ１導入遺伝子を、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を含有するプライマー（フォワードプライマーＡＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧ、配列番号２０）、及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を含有するプライマー（リバースプライマーＡＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧ、配列番号２１）を用いてＰＣＲ増幅した。ＮＹＥＳＯ１導入遺伝子ＰＣＲ産物をアガロースゲル精製した。ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを、ＢａｍＨＩ部位で切断してｅＧＦＰを取り除き、アガロースゲル精製し、ＣＩＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ１８００９−０１９）を用いて脱リン酸化した。次に、切断したベクターをさらにアガロースゲル精製した。次に、ＮＹＥＳＯ１導入遺伝子ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ切断ベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてライゲーションした。ライゲーション反応物をコンピテント細胞を用いてトランスフォメーションし、陽性コロニー由来のプラスミドＤＮＡをミニプレップで増幅した。次に、修飾したＨＰＶ導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを、マキシプレップで増幅した。ＮＹＥＳＯ１導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、３つのプラスミド：ＮＹＥＳＯ１導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクター、パッケージングｐＣＭＶ−８．８４プラスミド、及びエンベロープｐＭＤ２Ｇプラスミドそれぞれ６．４μｇのトランスフェクション後、２９３Ｔ細胞にレスキューした。ウイルス上清を集め、０．４５μΜのフィルターを通して濾過し、５０，０００×ｇ、１６℃で１２０分間遠心分離した。ＮＹＥＳＯ１導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、ＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で保存した。

[00143]ＭａｒａｂａＭＧ１を、ＭａｒａｂａウイルスのＭＧ１二重変異体のＧウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子の間で挿入された、癌精巣抗原１導入遺伝子を含有するよう操作した（ＢｒｕｎＪ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９）。導入遺伝子配列を、哺乳動物細胞での発現のためコドン最適化した。ＮＹＥＳＯ１タンパク質を含有する、得られたＭａｒａｂａＭＧ１を、「Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＮＹＥＳＯ１」又は「ＭＧ１−ＮＹＥＳＯ１」と命名した。

[00144]ＮＹＥＳＯ１導入遺伝子を、シャトルベクターｐＭＲＢ−ＭＧ１／ｐＮＦにそのＭｌｕｌ部位（Ｇ遺伝子とＬ遺伝子の間）でライゲーションし、そしてこれは、それぞれ、Ｋｐｎｌ及びＮｈｅｌ部位により隣接して、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１ゲノムの一部をＧ遺伝子の開始からＬ遺伝子の終わりに含有する。ここで、挿入されたＮＹＥＳＯ１導入遺伝子をＧとＬの間に含有する、ＫｐｎｌからＮｈｅｌへの全領域を、次に、ｐＭＲＢ−ＭＧ１／ｐＮＦから取り除き、Ｋｐｎｌ及びＮｈｅｌ部位を用いて、ｐＭＲＢ−ＭＧ１ゲノムプラスミドに再度ライゲーションした。次に、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＮＹＥＳＯ１をレスキューした（ＢｒｕｎＪ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９で既に記載される通り）。Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＮＹＥＳＯ１を３回プラーク精製し、スクロースクッション精製を介して精製した。Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＮＹＥＳＯ１ウイルスは、配列番号１５の逆相補的ＲＮＡバージョンであるゲノム配列を有する。

[00145]一般的に、０日目の初回免疫ベクター（レンチウイルス−ＮＹＥＳＯ１＋アジュバントとしてのｐｏｌｙｌ：Ｃ）の投与、及び１４日目の１ｅ９ＰＦＵの追加免疫ベクター（Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＮＹＥＳＯ１）の投与により、動物を免疫した。対照動物を、ＮＹＥＳＯ１導入遺伝子の代わりに対照非免疫原性導入遺伝子挿入としてＧＦＰをコードするウイルスベクターでプライム−ブーストした。初回免疫応答の分析を、１４日目及び１９日目に行った。それぞれのレンチウイルス−ＮＹＥＳＯ１調製物を、初回免疫ウイルスにアジュバントとして加えたｐｏｌｙｌ：Ｃ２５０μｇと共に作製し、次に、それぞれのウイルスについて５匹の動物の間で分けた。マウスをイソフルレンで麻酔し、レンチウイルス−ＮＹＥＳＯ１／ｐｏｌｙｌ：Ｃ３０μＬを、それぞれの後足蹠に注射した。残りのウイルスを、左の鼠径部リンパ節近くに、皮下注射した。初回免疫の１４日後、血液を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。次に、１×１０^９ＰＦＵＭＧ１−ＮＹＥＳＯ１で、マウスを静脈内で追加免疫した。追加免疫の５日後、血液を抜き、免疫応答をフローサイトメトリーにより評価した。

[00146]免疫分析を以下の通り行った。血液を、後眼窩出血を介して、ヘパリン処理した毛細管チューブを用いて集め、ヘパリン中に回収した。次に、赤血球をＡＣＫ溶解バッファーを用いて溶解し、得られたＰＢＭＣを腫瘍抗原に対する免疫応答について分析した。ＰＢＭＣを、ペプチドの不存在下でインキュベーションするか、又は２μｇ／ｍＬペプチド（ＲＧＰＥＳＲＬＬ）で、合計５時間刺激した（ゴルジプラグを刺激に１時間加えた）。刺激後、ＰＢＭＣを、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＩＦＮγについて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ及びＦｌｏｗＪｏにて分析した。応答するＴ細胞を、ＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）後、フローサイトメトリーにより検出した。無刺激のＰＢＭＣの値をバックグラウンドとみなし、刺激したＰＢＭＣから得た値から引いた。データは平均＋／−ＳＥＭを表す。表２において、ＮＹＥＳ０１ペプチドが、免疫応答の存在を示す、ＣＤ８細胞におけるＩＦＮ−γ産生を刺激することができることを示した。

[00147]実施例８：前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通型上皮抗原を発現するレンチウイルス初回免疫ベクター及び腫瘍退縮ワクチンベクターの構築及び免疫試験
[00148]ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子は、３４１アミノ酸のタンパク質（配列番号１０）が生じるようヒト及びマウスでの発現のためコドン最適化された、全長野生型配列（配列番号１１）である。

[00149]前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通型上皮抗原を発現するレンチウイルスを、ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを用いて作製した。ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子を、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含有するプライマー（フォワードプライマーＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣ、配列番号２２）、及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を含有するプライマー（リバースプライマーＡＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧ、配列番号２３）を用いてＰＣＲ増幅した。ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子ＰＣＲ産物をアガロースゲル精製した。ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位で切断しｅＧＦＰを取り除き、アガロースゲル精製し、ＣＩＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ１８００９−０１９）を用いて脱リン酸化した。次に、切断したベクターをさらにアガロースゲル精製した。次に、ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断ベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてライゲーションした。ライゲーション反応物をコンピテント細胞を用いてトランスフォメーションし、陽性コロニー由来のプラスミドＤＮＡをミニプレップで増幅した。次に、修飾したｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを、マキシプレップで増幅した。ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、３つのプラスミド：ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクター、パッケージングｐＣＭＶ−８．８４プラスミド、及びエンベロープｐＭＤ２Ｇプラスミドそれぞれ６．４μｇのトランスフェクション後、２９３Ｔ細胞にレスキューした。ウイルス上清を集め、０．４５μΜのフィルターを通して濾過し、５０，０００×ｇ、１６℃で１２０分間遠心分離した。ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、ＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で保存した。

[00150]ＭａｒａｂａＭＧ１を、ＭａｒａｂａウイルスのＭＧ１二重変異体のＧウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子の間で挿入された、前立腺導入遺伝子のヒト６回膜貫通型上皮抗原を含有するよう操作した（ＢｒｕｎＪ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９）。導入遺伝子配列を、哺乳動物細胞での発現のためコドン最適化した。ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質を含有する、得られたＭａｒａｂａＭＧ１を、「Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰ」又は「ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰ」と命名した。修飾したＭａｒａｂａＭＧ１骨格を用いて、クローニングを促進した。サイレント変異を、ＭａｒａｂａＭＧ１ゲノム骨格のＬ遺伝子に導入して、Ｍｌｕｌ部位の１つを取り除いた。第２のＭｌｕｌ部位を、ＧとＬの間のクローニング領域で、ＢｓｉＷＩ部位で置き換えた。これらのＭａｒａｂａＭＧ１ゲノム骨格への修飾は、シャトルプラスミドｐＭＲＢ−ＭＧ１／ｐＮＦを用いることを回避するので、Ｂｒｕｎらの文献に記載されたものより、より直接的なクローニングシステムを可能にした。ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子配列を、修飾したＭａｒａｂａＭＧ１ゲノム骨格に、そのＭｌｕｌ部位及びＢｓｉＷＩ部位（ＧとＬの間のクローニング領域）でライゲーションした。次に、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰをレスキューし（ＢｒｕｎＪ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９に既に記載される通り）、１回プラーク精製し、オプティプレップ精製した。Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰは、配列番号１２の逆相補的ＲＮＡバージョンであるゲノム配列を有する。

[00151]一般的に、０日での初回免疫ベクター（レンチウイルス−ｈｕＳＴＥＡＰ＋アジュバントとしてのｐｏｌｙｌ：Ｃ）の投与、及び１４日での１ｅ９ＰＦＵの追加免疫ベクター（Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰ）の投与により、動物を免疫した。対照動物を、ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子の代わりに対照非免疫原性導入遺伝子挿入としてＧＦＰをコードするウイルスベクターでプライム−ブーストした。初回免疫応答の分析を、１４日及び１９日で行った。それぞれのレンチウイルス−ｈｕＳＴＥＡＰ調製物を、初回免疫ウイルスにアジュバントとして加えたｐｏｌｙｌ：Ｃ２５０μｇと共に作製し、次に、それぞれのウイルスについて５匹の動物の間で分けた。マウスをイソフルレンで麻酔し、レンチウイルス−ｈｕＳＴＥＡＰ／ｐｏｌｙｌ：Ｃ３０μＬを、それぞれの後足蹠に注射した。残りのウイルスを、左の鼠径部リンパ節近くに、皮下注射した。初回免疫の１４日後、血液を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。次に、１×１０^９ＰＦＵＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰで、マウスを静脈内で追加免疫した。追加免疫の５日後、血液を抜き、免疫応答をフローサイトメトリーにより評価した。

[00152]免疫分析を以下の通り行った。血液を、後眼窩出血を介して、ヘパリン処理した毛細管チューブを用いて集め、ヘパリン中に回収した。次に、赤血球をＡＣＫ溶解バッファーを用いて溶解し、得られたＰＢＭＣを腫瘍抗原に対する免疫応答について分析した。ＰＢＭＣを、ペプチドの不存在下でインキュベーションするか、又はペプチドで、合計５時間刺激した（ゴルジプラグを刺激に１時間加えた）。ＰＢＭＣを、ペプチドの不存在下でインキュベーションするか、又は２μｇ／ｍＬペプチド（ＲＳＲＹＫＬＬ）で、合計５時間刺激した（ゴルジプラグを刺激に１時間加えた）。刺激後、ＰＢＭＣを、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＩＦＮγについて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ及びＦｌｏｗＪｏにて分析した。応答するＴ細胞を、ＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）後、フローサイトメトリーにより検出した。無刺激のＰＢＭＣの値をバックグラウンドとみなし、刺激したＰＢＭＣから得た値から引いた。データは平均＋／−ＳＥＭを表す。表３において、ｈｕＳＴＥＡＰペプチドが、免疫応答の存在を示す、ＣＤ８細胞におけるＩＦＮ−γ産生を刺激することができることを示した。

[00153]実施例９：エプスタイン−バー核抗原１を発現するレンチウイルス初回免疫ベクター及び腫瘍退縮ワクチンベクターの構築及び免疫試験
[00154]ＥＢＤＮＡ１導入遺伝子は、欠失した反復性配列を生じるグリシン−アラニンを有する、全長野生型ＥＢＤＮＡ１の部分的ヌクレオチド配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｑ１ＨＶＦ７．１）である（タンパク質をアミノ末端ドメイン及びカルボキシ末端ドメインに分離する）。この配列は、タンパク質を安定化させ、プロテアソーム破壊を防ぎ、並びに抗原プロセシング及びＭＨＣクラスＩ拘束性抗原提示を障害するようである（ＬｅｖｉｔｓｋａｙａＪら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７５：６８５−６８８）。切断型ＥＢＤＮＡ１ヌクレオチド配列（配列番号１７）は、２３８アミノ酸のタンパク質（配列番号１６）を生じるようヒト及びマウスでの発現のためコドン最適化された。

[00155]エプスタイン−バー核抗原１タンパク質を発現するレンチウイルスを、ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを用いて作製した。修飾したＥＢＤＮＡ１導入遺伝子を、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含有するプライマー（フォワードプライマーＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧ、配列番号２４）、及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を含有するプライマー（リバースプライマーＡＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣ、配列番号２５）を用いてＰＣＲ増幅した。ＥＢＤＮＡ１導入遺伝子ＰＣＲ産物をアガロースゲル精製した。ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位で切断しｅＧＦＰを取り除き、アガロースゲル精製し、ＣＩＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ１８００９−０１９）を用いて脱リン酸化した。次に、切断したベクターをさらにアガロースゲル精製した。次に、ＥＢＤＮＡ１導入遺伝子ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断ベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてライゲーションした。ライゲーション反応物をコンピテント細胞を用いてトランスフォメーションし、陽性コロニー由来のプラスミドＤＮＡをミニプレップで増幅した。次に、ＥＢＤＮＡ１導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを、マキシプレップで増幅した。ＥＢＤＮＡ１導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、３つのプラスミド：ＥＢＤＮＡ１導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクター、パッケージングｐＣＭＶ−８．８４プラスミド、及びエンベロープｐＭＤ２Ｇプラスミドそれぞれ６．４μｇのトランスフェクション後、２９３Ｔ細胞にレスキューした。ウイルス上清を集め、０．４５μΜのフィルターを通して濾過し、５０，０００×ｇ、１６℃で１２０分間遠心分離した。ＥＢＤＮＡ１導入遺伝子を発現するレンチウイルスを、ＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で保存した。

[00156]ＭａｒａｂａＭＧ１を、ＭａｒａｂａウイルスのＭＧ１二重変異体のＧウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子の間で挿入された、エプスタイン−バー核抗原１導入遺伝子を含有するよう操作した（ＢｒｕｎＪ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９）。導入遺伝子配列を、哺乳動物細胞での発現のためコドン最適化した。ＥＢＶＤＮＡ１タンパク質を含有する、得られたＭａｒａｂａＭＧ１を、「Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＥＢＶＤＮＡ１」又は「ＭＧ１−ＥＤＶＤＮＡ１」と命名した。修飾したＭａｒａｂａＭＧ１骨格を用いて、クローニングを促進した。サイレント変異を、ＭａｒａｂａＭＧ１ゲノム骨格のＬ遺伝子に導入して、Ｍｌｕｌ部位の１つを取り除いた。第２のＭｌｕｌ部位を、ＧとＬの間のクローニング領域で、ＢｓｉＷＩ部位で置き換えた。これらのＭａｒａｂａＭＧ１ゲノム骨格への修飾は、シャトルプラスミドｐＭＲＢ−ＭＧ１／ｐＮＦを用いることを回避するので、Ｂｒｕｎらの文献に記載されたものより、より直接的なクローニングシステムを可能にした。ＥＢＤＮＡ１導入遺伝子配列を、修飾したＭａｒａｂａＭＧ１ゲノム骨格に、そのＭｌｕｌ部位及びＢｓｉＷＩ部位（ＧとＬの間のクローニング領域）でライゲーションした。次に、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＥＢＤＮＡ１導入遺伝子をレスキューし（ＢｒｕｎＪ．ら、（２０１０）ＭｏｌＴｈｅｒ１８：１４４０−１４４９に既に記載される通り）、１回プラーク精製し、オプティプレップ精製した。

[00157]一般的に、０日目で初回免疫ベクター（レンチウイルス−ＥＢＤＮＡ１＋アジュバントとしてのｐｏｌｙｌ：Ｃ）の投与、及び１４日目の１ｅ９ＰＦＵの追加免疫ベクター（Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＥＢＤＮＡ１）の投与により、動物を免疫した。対照動物を、ＴＡＡ導入遺伝子の代わりに対照非免疫原性導入遺伝子挿入としてＧＦＰをコードするウイルスベクターでプライム−ブーストした。初回免疫応答の分析を、１４日目及び１９日目に行った。それぞれのレンチウイルス−ＥＢＤＮＡ１調製物を、初回免疫ウイルスにアジュバントとして加えたｐｏｌｙｌ：Ｃ２５０μｇと共に作製し、次に、それぞれのウイルスについて５匹の動物の間で分けた。マウスをイソフルレンで麻酔し、レンチウイルス−ＥＢＤＮＡ１／ｐｏｌｙｌ：Ｃ３０μＬを、それぞれの後足蹠に注射した。残りのウイルスを、左の鼠径部リンパ節近くに、皮下注射した。初回免疫の１４日後、血液を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。次に、１×１０^９ＰＦＵＭＧ１−ＥＢＶＤＮＡ１で、マウスを静脈内で追加免疫した。追加免疫の５日後、血液を抜き、免疫応答をフローサイトメトリーにより評価した。

[00158]免疫分析を以下の通り行った。血液を、後眼窩出血を介して、ヘパリン処理した毛細管チューブを用いて集め、ヘパリン中に回収した。次に、赤血球をＡＣＫ溶解バッファーを用いて溶解し、得られたＰＢＭＣを腫瘍抗原に対する免疫応答について分析した。ＰＢＭＣを、ペプチドの不存在下でインキュベーションするか、又は２μｇ／ｍＬペプチド（ＶＹＧＧＳＫＴＳＬ）で、合計５時間刺激した（ゴルジプラグを刺激に１時間加えた）。刺激後、ＰＢＭＣを、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＩＦＮγについて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ及びＦｌｏｗＪｏにて分析した。応答するＴ細胞を、ＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）後、フローサイトメトリーにより検出した。無刺激のＰＢＭＣの値をバックグラウンドとみなし、刺激したＰＢＭＣから得た値から引いた。データは平均＋／−ＳＥＭを表す。ＥＢＶＤＮＡ１ペプチドは、表４に示す通り、免疫応答の欠如を示す、いずれかのＣＤ８Ｔ細胞でのＩＦＮ−γ産生を刺激することができなかった。

[00159]実施例１０：アデノウイルス−ＯＶワクチンプライム−ブースト戦略に対するシクロホスファミドの作用
[00160]シクロホスファミド（ＣＰＡ）は、種々のタイプの癌を処置するために用いられる化学療法剤である。高用量のこの薬剤が有効な化学療法に必要とされる。高用量のＣＰＡは免疫抑制を導くと考えられ、一方低用量の薬剤は様々な抗原に対する免疫応答の増強を導き得る。驚くべきことに、本開示の異種プライム−ブースト戦略において、ＣＰＡのみが、第１のウイルスによる免疫系の初回免疫に先立ち投与されたとき、免疫応答の増大をもたらす。

[00161]肺転移を生じさせるために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（研究開始時に８〜１０週齢）に、生理食塩水２００μｌ中２．５×１０^５個のＢ１６−Ｆ１０細胞（マウスＤＣＴ抗原を発現するマウスメラノーマ細胞）を０日で静脈内注射した。Ｂ１６−Ｆ１０移植の５日後、マウスにＡｄ−ｈＤＣＴ初回免疫ワクチン（ＰＢＳ２００μｌ中２×１０^８ｐｆｕ、筋肉内）を与え、続いて、１４日後に、腫瘍退縮追加免疫ワクチンとして１回静脈内用量のＶＳＶ−ｈＤＣＴ（ＰＢＳ２００μｌ中２×１０^９ｐｆｕ、静脈内）を与えた。加えて、初回免疫に先立ち−１日、及び／又は追加免疫に１３日先立ち、マウスにビークル又はＣＰＡ（１ｍｇ／マウス２０ｇ、腹腔内）を与えた。図９において、初回免疫ベクターに先立ち与えたＣＰＡが生存を有意に増大し、一方追加免疫ベクターに先立ち投与したＣＰＡは、生存を延長しない（データは示していない）ことを見ることができる。

[00162]上の記載において、説明の目的のため、実施例の徹底的な理解をもたらすために、多数の詳細が説明される。上述の実施例は、代表例のみであることが意図される。変化、修飾、及びバリエーションが、添付の請求の範囲により単に定義される、範囲から逸脱することなく、当業者により、特定の実施例にもたらされ得る。

付録Ａ−タンパク質及びヌクレオチド配列

Claims

配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質として発現し、哺乳動物において前記タンパク質又はその変異体に対する免疫が生じるよう構築された、第１のウイルス；及び
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質としてコードし、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築された、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス
を含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットであって、
前記第１のウイルスは前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる、キット。
前記第１のウイルスにより発現される前記抗原タンパク質、及び前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスにより発現される前記抗原タンパク質が、同一である、請求項１に記載のキット。
前記第１のウイルス、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方が、投与のため単離されたウイルスとして構築される、請求項１又は２に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、
前記第１のウイルスが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、配列番号２のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、
前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス又はプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号２のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、或いは
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含み、且つ
ａ）前記第１のウイルスが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、配列番号２のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、又は
ｂ）前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス若しくはプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号２のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、
前記第１のウイルスが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、配列番号３のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、或いは
前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス又はプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号３のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、或いは
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含み、且つ
ａ）前記第１のウイルスが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、配列番号３のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、又は
ｂ）前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス若しくはプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号３のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
前記第１のウイルス、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される前記タンパク質変異体が、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ、及びＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹからなる群より選択される少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含み、配列番号１と少なくとも７０％同一である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
前記変異体が配列番号１と少なくとも８０％同一である、請求項６に記載のキット。
前記変異体が配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項６に記載のキット。
前記変異体が配列番号１と少なくとも９５％同一である、請求項６に記載のキット。
前記第１のウイルス、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される前記タンパク質変異体が、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のキット。
前記タンパク質変異体が配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項６に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び前記第１のウイルスが、配列番号１の配列を含む前記タンパク質の異なる変異体を発現する、請求項１〜３及び６〜１１のいずれか一項に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが配列番号２又は３のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含み、前記第１のウイルスが、マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号５の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが配列番号５のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含み、前記第１のウイルスが、マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号２又は３の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが配列番号２又は３のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含み、前記第１のウイルスが、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスであり、配列番号５である配列を含む、或いは
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが配列番号５のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含み、前記第１のウイルスが、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスであり、配列番号２又は３である配列を含む、請求項１２に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス又は前記第１のウイルスいずれかの一方が、配列番号１又は４の配列を含むタンパク質を発現でき、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び前記第１のウイルスの他方が、他の配列を含むタンパク質を発現できる、請求項１２に記載のキット。
前記第１のウイルスがアデノウイルスである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のキット。
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体をコードするゲノムを有する、単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
配列番号１のアミノ酸配列を含む前記タンパク質の前記変異体が、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ、及びＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹからなる群より選択される少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを有し、配列番号１と少なくとも７０％同一である、請求項１６に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記変異体が配列番号１と少なくとも８０％同一である、請求項１７に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記変異体が配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１７に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記変異体が配列番号１と少なくとも９５％同一である、請求項１７に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
配列番号１のアミノ酸配列を含む前記タンパク質の前記変異体が、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記ゲノムが配列番号２、３、又は５のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、請求項１６に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記ゲノムが配列番号６のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、請求項１６に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
配列番号７のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質として発現し、哺乳動物において前記タンパク質又はその変異体に対する免疫が生じるよう構築された、第１のウイルス、及び
配列番号７のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質としてコードし、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築された、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス
を含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットであって、
前記第１のウイルスは前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる、キット。
前記第１のウイルスにより発現される前記抗原タンパク質、及び前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスにより発現される前記抗原タンパク質が、同一である、請求項２４に記載のキット。
前記第１のウイルス、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方が、投与のため単離されたウイルスとして構築される、請求項２４又は２５に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号８のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含む、
前記第１のウイルスが、マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号８のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含む、
前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス又はプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号８のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子を含む、或いは
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号８のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含み、且つ
ａ）前記第１のウイルスが、マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号８のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含む、又は
ｂ）前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス若しくはプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号８のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子を含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のキット。
前記第１のウイルス、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される前記タンパク質変異体が、配列番号７の少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含み、配列番号７と少なくとも７０％同一である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のキット。
前記変異体が配列番号７と少なくとも８０％同一である、請求項２８に記載のキット。
前記変異体が配列番号７と少なくとも９０％同一である、請求項２８に記載のキット。
前記変異体が配列番号７と少なくとも９５％同一である、請求項２８に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス又は前記第１のウイルスいずれかの一方が、配列番号７の配列を含むタンパク質を発現でき、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び前記第１のウイルスの他方が、配列番号７の配列を含むタンパク質の変異体を発現できる、請求項２４〜２６及び２８〜３１のいずれか一項に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び前記第１のウイルスが、配列番号７の配列を含むタンパク質の異なる変異体を発現できる、請求項２４〜２６及び２８〜３１のいずれか一項に記載のキット。
前記第１のウイルスがレンチウイルスである、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のキット。
配列番号７のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体をコードするゲノムを有する、単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記ゲノムが配列番号８のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、請求項３５に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記ゲノムが配列番号９のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、請求項３５に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質として発現し、哺乳動物において前記タンパク質又はその変異体に対する免疫が生じるよう構築された、第１のウイルス、及び
配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質としてコードし、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築された、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス
を含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットであって、
前記第１のウイルスは前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる、キット。
前記第１のウイルスにより発現される前記抗原タンパク質、及び前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスにより発現される前記抗原タンパク質が、同一である、請求項３８に記載のキット。
前記第１のウイルス、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方が、投与のため単離されたウイルスとして構築される、請求項３８又は３９に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号１１のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含む、
前記第１のウイルスが、マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号１１のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含む、
前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス又はプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子を含む、或いは
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号１１のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含み、且つ
ａ）前記第１のウイルスが、マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号１１のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含む、又は
ｂ）前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス若しくはプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子を含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のキット。
前記第１のウイルス、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される前記タンパク質変異体が、配列番号１０の少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含み、配列番号１０と少なくとも７０％同一である、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のキット。
前記変異体が配列番号１０と少なくとも８０％同一である、請求項４２に記載のキット。
前記変異体が配列番号１０と少なくとも９０％同一である、請求項４２に記載のキット。
前記変異体が配列番号１０と少なくとも９５％同一である、請求項４２に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス又は前記第１のウイルスいずれかの一方が、配列番号１０の配列を含むタンパク質を発現でき、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び前記第１のウイルスの他方が、配列番号１０の配列を含むタンパク質の変異体を発現できる、請求項３８〜４０及び４２〜４５のいずれか一項に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び前記第１のウイルスが、配列番号１０の配列を含むタンパク質の異なる変異体を発現できる、請求項３８〜４０及び４２〜４５のいずれか一項に記載のキット。
前記第１のウイルスがレンチウイルスである、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載のキット。
配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体をコードするゲノムを有する、単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記ゲノムが配列番号１１のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、請求項４９に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記ゲノムが配列番号１２のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、請求項４９に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質として発現し、哺乳動物において前記タンパク質又はその変異体に対する免疫が生じるよう構築された、第１のウイルス、及び
配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体を抗原タンパク質としてコードし、哺乳動物において免疫応答を誘導するよう構築された、ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス
を含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する際に使用するためのキットであって、
前記第１のウイルスは前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスと免疫学的に異なる、キット。
前記第１のウイルスにより発現される前記抗原タンパク質、及び前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスにより発現される前記抗原タンパク質が、同一である、請求項５２に記載のキット。
前記第１のウイルス、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方が、投与のため単離されたウイルスとして構築される、請求項５２又は５３に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号１４のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含む、
前記第１のウイルスが、マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号１４のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含む、
前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス又はプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子を含む、或いは
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルスが、配列番号１４のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含み、且つ
ａ）前記第１のウイルスが、マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号１４のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含むコドン最適化導入遺伝子を含む、又は
ｂ）前記第１のウイルスが、ＤＮＡウイルス若しくはプラスセンスＲＮＡウイルスであり、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むコドン最適化導入遺伝子を含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のキット。
前記第１のウイルス、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス、又は両方により発現される前記タンパク質変異体が、配列番号１３の少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含み、配列番号１３と少なくとも７０％同一である、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のキット。
前記変異体が配列番号１３と少なくとも８０％同一である、請求項５６に記載のキット。
前記変異体が配列番号１３と少なくとも９０％同一である、請求項５６に記載のキット。
前記変異体が配列番号１３と少なくとも９５％同一である、請求項５６に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス又は前記第１のウイルスいずれかの一方が、配列番号１３の配列を含むタンパク質を発現でき、前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び前記第１のウイルスの他方が、配列番号１３の配列を含むタンパク質の変異体を発現できる、請求項５２〜５４及び５６〜５９のいずれか一項に記載のキット。
前記ＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス及び前記第１のウイルスが、配列番号１３の配列を含むタンパク質の異なる変異体を発現できる、請求項５２〜５４及び５６〜５９のいずれか一項に記載のキット。
前記第１のウイルスがレンチウイルスである、請求項５２〜６１のいずれか一項に記載のキット。
配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体をコードするゲノムを有する、単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記ゲノムが配列番号１４のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、請求項６３に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。
前記ゲノムが配列番号１５のヌクレオチド配列の逆相補的ＲＮＡバージョンを含む、請求項６３に記載の単離されたＭａｒａｂａＭＧ１ウイルス粒子。